CN113874083A - 抗-tnfr2抗体及其用途 - Google Patents

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CN113874083A CN202080032324.7A CN202080032324A CN113874083A CN 113874083 A CN113874083 A CN 113874083A CN 202080032324 A CN202080032324 A CN 202080032324A CN 113874083 A CN113874083 A CN 113874083A
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Y·周
J·D·马克思
M·穆达
J·F·桑普森
E·M·塔姆
R·B·富尔顿
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University of California
Merrimack Pharmaceuticals Inc
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    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
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Abstract

本文公开了抗‑TNFR2抗体、包含所述抗‑TNFR2抗体的治疗组合物，以及使用此类抗体和组合物治疗癌症和自身免疫性疾病的方法。

Description

抗-TNFR2抗体及其用途
相关申请
本申请要求于2019年3月1日提交的美国临时申请US62/812,875和于2019年9月18日提交的美国临时申请US62/902,164的优先权和权益。上述申请的内容通过引用整体并入本文。
发明背景
最近的研究表明，通过调节免疫应答来增强人体自身对抗疾病的能力，是对传统治疗平台的一种有吸引力的替代和/或补充。例如，研究表明，增强T淋巴细胞的活性以靶向和治疗各种疾病(例如癌症或传染病)在治疗上是有益的。抑制T调节性细胞(Treg)以抑制T淋巴细胞活性的能力，是增加针对疾病的免疫应答的一种潜在机制。
肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)，也称为TNFRSFIB和CD120b，是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)的共刺激成员，包括诸如GITR、OX40、CD27、CD40和4-1BB(CD137)的蛋白质。TNFR2是一种在T细胞上表达的细胞表面受体，已被证明可增强效应T(Teff)细胞的活化并减少Treg介导的抑制。通过调节TRAF2/3和NF-kB信号转导，TNFR2可以介导促进细胞存活和增殖的基因的转录。TNFR2可以在癌细胞、肿瘤浸润性Treg和效应T细胞上表达。鉴于对靶向诸如癌症的疾病的改进策略的持续需求，从增强的免疫应答(特别是T细胞应答)、调节Treg活性的新药剂和方法中获益是非常需要的。
发明概述
本文提供的是分离的抗体如重组单克隆抗体(例如，人抗体)，其特异性结合TNFR2(例如，人TNFR2)并具有治疗所需的特性。因此，本文所述的抗体可用于，例如，抑制肿瘤生长、治疗癌症、治疗自身免疫性疾病、治疗移植物抗宿主病和促进移植物存活和/或减少移植物排斥。
在一个实施方案中，本文提供了抗体(例如，分离的单克隆抗体)，其结合人TNFR2并包含选自下述的重链和轻链可变区对的重链CDR和轻链CDR：
(a)分别为SEQ ID NOs:48-49；[UC2.3]
(b)分别为SEQ ID NOs:71-72；[UC2.3.3]
(c)分别为SEQ ID NOs:94-95；[UC2.3.7]
(d)分别为SEQ ID NOs:117-118；[UC2.3.8]
(e)分别为SEQ ID NOs:140-141；[UC2.3.9]
(f)分别为SEQ ID NOs:163-164；[UC2.3.10]
(g)分别为SEQ ID NOs:186-187；[UC2.3.11]
(h)分别为SEQ ID NOs:209-210；[UC2.3.12]
(i)分别为SEQ ID NOs:232-233；[UC2.3.13]
(j)分别为SEQ ID NOs:255-256；[UC2.3.14]
(k)分别为SEQ ID NOs:278-279；[UC2.3.15]
(l)分别为SEQ ID NOs:301-302；[UC1]
(m)分别为SEQ ID NOs:322-323；[UC1.1]
(n)分别为SEQ ID NOs:343-344；[UC1.2]
(o)分别为SEQ ID NOs:364-364；[UC1.3]
(p)分别为SEQ ID NOs:25-26；[UC2]
(q)分别为SEQ ID NOs:385-386；[UC3]
(r)分别为SEQ ID NOs:406-407；[UC4]
(s)分别为SEQ ID NOs:427-428；[UC5]
(t)分别为SEQ ID NOs:448-449；[UC6]
(u)分别为SEQ ID NOs:469-470；[UC7]和
(v)分别为SEQ ID NOs:490-491。[UC8]
在另一个实施方案中，本文提供的结合人TNFR2的抗体包含：
(a)分别包含SEQ ID NOs:36-38的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQID NOs:39-41的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3]
(b)分别包含SEQ ID NOs:59-61的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQID NOs:62-64的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.3]
(c)分别包含SEQ ID NOs:82-84的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQID NOs:85-87的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.7]
(d)分别包含SEQ ID NOs:105-107的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:108-110的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.8]
(e)分别包含SEQ ID NOs:128-130的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:131-133的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.9]
(f)分别包含SEQ ID NOs:151-153的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:154-156的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.10]
(g)分别包含SEQ ID NOs:174-176的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:177-179的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.11]
(h)分别包含SEQ ID NOs:197-199的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:200-202的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.12]
(i)分别包含SEQ ID NOs:220-222的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:223-225的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.13]
(j)分别包含SEQ ID NOs:243-245的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:246-248的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.14]
(k)分别包含SEQ ID NOs:266-268的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:269-271的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.15]
(l)分别包含SEQ ID NOs:289-291的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:292-294的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC1]
(m)分别包含SEQ ID NOs:310-312的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:313-315的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC1.1]
(n)分别包含SEQ ID NOs:331-333的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:334-336的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC1.2]
(o)分别包含SEQ ID NOs:352-354的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:355-357的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC1.3]
(p)分别包含SEQ ID NOs:13-15的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQID NOs:16-18的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2]
(q)分别包含SEQ ID NOs:373-375的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:376-378的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC3]
(r)分别包含SEQ ID NOs:394-396的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:397-399的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC4]
(s)分别包含SEQ ID NOs:415-417的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:418-420的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC5]
(t)分别包含SEQ ID NOs:436-438的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:439-441的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC6]
(u)分别包含SEQ ID NOs:457-459的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:460-462的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC7]
(v)分别包含SEQ ID NOs:478-480的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:481-483的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。[UC8]
在另一个实施方案中，本文提供的结合人TNFR2的抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含选自下述的氨基酸序列或与选自下述的氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列：SEQ IDNOs:25、48、71、94、117、140、163、186、209、232、255、278、301、322、343、364、385、406、427、448、469和490。
在另一个实施方案中，本文提供的结合人TNFR2的抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述轻链可变区包含选自下述的氨基酸序列或与选自下述的氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列：SEQ IDNOs:26、49、72、95、118、141、164、187、210、233、256、279、302、323、344、365、386、407、428、449、470和491。
在另一个实施方案中，本文提供的结合人TNFR2的抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含选自下述的氨基酸序列或与选自下述的氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列：SEQ IDNOs:25、48、71、94、117、140、163、186、209、232、255、278、301、322、343、364、385、406、427、448、469和490，所述轻链可变区包含选自下述的氨基酸序列或与选自下述的氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列：SEQID NOs:26、49、72、95、118、141、164、187、210、233、256、279、302、323、344、365、386、407、428、449、470和491。
在另一个实施方案中，本文提供的结合人TNFR2的抗体包含与选自下述的氨基酸序列具有至少80％(85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)或100％同一性的重链可变区序列和轻链可变区序列：
(a)分别为SEQ ID NOs:48-49；[UC2.3]
(b)分别为SEQ ID NOs:71-72；[UC2.3.3]
(c)分别为SEQ ID NOs:94-95；[UC2.3.7]
(d)分别为SEQ ID NOs:117-118；[UC2.3.8]
(e)分别为SEQ ID NOs:140-141；[UC2.3.9]
(f)分别为SEQ ID NOs:163-164；[UC2.3.10]
(g)分别为SEQ ID NOs:186-187；[UC2.3.11]
(h)分别为SEQ ID NOs:209-210；[UC2.3.12]
(i)分别为SEQ ID NOs:232-233；[UC2.3.13]
(j)分别为SEQ ID NOs:255-256；[UC2.3.14]
(k)分别为SEQ ID NOs:278-279；[UC2.3.15]
(l)分别为SEQ ID NOs:301-302；[UC1]
(m)分别为SEQ ID NOs:322-323；[UC1.1]
(n)分别为SEQ ID NOs:343-344；[UC1.2]
(o)分别为SEQ ID NOs:364-364；[UC1.3]
(p)分别为SEQ ID NOs:25-26；[UC2]
(q)分别为SEQ ID NOs:385-386；[UC3]
(r)分别为SEQ ID NOs:406-407；[UC4]
(s)分别为SEQ ID NOs:427-428；[UC5]
(t)分别为SEQ ID NOs:448-449；[UC6]
(u)分别为SEQ ID NOs:469-470；[UC7]和
(v)分别为SEQ ID NOs:490-491。[UC8]
在另一个实施方案中，本文提供的结合人TNFR2的抗体包含与选自下述氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)或100％同一性的重链可变区序列和轻链可变区序列：
(a)分别为SEQ ID NOs:50-51；[UC2.3]
(b)分别为SEQ ID NOs:73-74；[UC2.3.3]
(c)分别为SEQ ID NOs:96-97；[UC2.3.7]
(d)分别为SEQ ID NOs:119-120；[UC2.3.8]
(e)分别为SEQ ID NOs:142-143；[UC2.3.9]
(f)分别为SEQ ID NOs:165-166；[UC2.3.10]
(g)分别为SEQ ID NOs:188-189；[UC2.3.11]
(h)分别为SEQ ID NOs:211-212；[UC2.3.12]
(i)分别为SEQ ID NOs:234-235；[UC2.3.13]
(j)分别为SEQ ID NOs:257-258；[UC2.3.14]
(k)分别为SEQ ID NOs:280-281；[UC2.3.15]以及
(l)分别为SEQ ID NOs:27-28。[UC2]
在一些实施方案中，本文所述的抗体是激动性抗体。例如，在一些实施方案中，所述抗体激活NF-κB信号转导、促进T细胞增殖(例如CD4+和CD8+T细胞)和/或共刺激T细胞。在其他实施方案中，所述抗体降低调节性T细胞的丰度(例如，在T细胞区室中)。在其他实施方案中，所述抗体诱导长期抗癌作用，例如通过诱导抗癌记忆T细胞的发育。
在一些实施方案中，本文所述的抗体是IgG2、IgG2、IgG3或IgG4，或其变体。在其他实施方案中，所述抗体包含变体Fc区。在其他实施方案中，相对于相应的非变体Fc区观察到的结合，所述变体Fc区增加了与Fcγ受体(例如，FcγRIIb受体)的结合。在其他实施方案中，相对于相应的非变体Fc区，所述变体Fc区增加了抗体聚类。在其他实施方案中，所述抗体共刺激T细胞(例如，CD8+T细胞)。在其他实施方案中，所述变体Fc区是变体IgG1 Fc区。在其他实施方案中，所述变体IgGl Fc区包含选自下述的一个或多个替换：(a)S267E、(b)S267E/L328F、(c)G237D/P238D/P271G/A330R、(d)E233D/P238D/H268D/P271G/A330R、(e)G237D/P238D/H268D/P271G/A330R和(f)E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R。
在一些实施方案中，本文所述的抗体是单克隆抗体。在其他实施方案中，所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在其他实施方案中，所述抗体是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或免疫缀合物，其包含本文所述的抗-TNFR2抗体的抗原结合结构域(例如，重链可变区和轻链可变区)。在其他实施方案中，所述抗体选自：单链抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv或结构域抗体。
在另一个方面，本文提供了编码本文所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的核酸。还提供了包含所述核酸的表达载体和用所述表达载体转化的细胞(例如，宿主细胞)。
在另一个方面，本文提供了组合物(例如，药物组合物)，其包含本文所述的抗体和载体(例如，药学上可接受的载体)。还提供了包含本文所述抗体和使用说明书的试剂盒。
在另一个方面，本文提供了在受试者中增加T细胞增殖、共刺激效应T细胞和/或减少或消耗调节性T细胞数量的方法，包括向所述受试者施用有效量的本文所述的抗体以实现T细胞增殖的增加、效应T细胞共刺激和/或调节性T细胞数量的减少或消耗。
在另一个方面，本文提供了治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的抗-TNFR2抗体。在一些实施方案中，提供了本文所述的抗-TNFR2抗体在制备用于治疗患有癌症的受试者的药物中的用途，或本文所述的抗-TNFR2抗体用于治疗患有癌症的受试者。
在一些实施方案中，待治疗的癌症是非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌或结肠直肠癌。
在一些实施方案中，在上述治疗癌症的方法中施用一种或多种另外的治疗剂(例如，免疫调节药物、细胞毒性药物、靶向治疗剂、癌症疫苗)。在其他实施方案中，本文所述的方法、用途或抗体诱导长期抗癌作用。在其他实施方案中，本文所述的方法、用途或抗体诱导抗癌记忆T细胞的发育。
在另一方面，本文提供了治疗自身免疫性疾病或病症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的抗-TNFR2抗体。在一些实施方案中，提供了本文所述的抗-TNFR2抗体在制备用于治疗患有自身免疫性疾病或病症的受试者的药物中的用途，或本文所述的抗-TNFR2抗体用于治疗患有自身免疫性疾病或病症的受试者。
在一些实施方案中，待治疗的自身免疫性疾病或病症是：移植物抗宿主病、类风湿性关节炎、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、多发性硬化症、结肠炎、银屑病、自身免疫性葡萄膜炎、天疱疮、大疱性表皮松解症或1型糖尿病。在其他实施方案中，在治疗自身免疫性疾病或病症的方法中施用一种或多种另外的治疗剂。
在另一个方面，本文提供了在已经接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者中促进移植物存活或减少移植物排斥的方法，包括向所述受试者施用有效量(例如，治疗有效量)的本文所述的抗-TNFR2抗体以促进移植物存活或减少移植物排斥。在一些实施方案中，提供了本文所述的抗-TNFR2抗体在制备用于在已经接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者中促进移植物存活或减少移植物排斥的药物中的用途，或本文所述的抗-TNFR2抗体用于在已经接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者中促进移植物存活或减少移植物排斥。
在一些实施方案中，所述移植物是同种异体移植物(例如，细胞、组织或器官同种异体移植物)。在其他实施方案中，移植物排斥发生在已经接受或将接受细胞、组织或器官同种异体移植物的受体中。在其他实施方案中，在促进移植物存活或减少移植物排斥的方法中施用一种或多种另外的治疗剂。
在另一个方面，本文提供了治疗、预防或减少已经接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者的移植物抗宿主病的方法，包括向所述受试者施用有效量(例如，治疗性有效量)的本文所述的抗-TNFR2抗体。在一些实施方案中，提供了本文所述的抗-TNFR2抗体在制备用于治疗、预防或减少已经接受或将接受细胞、组织或器官的受试者的移植物抗宿主病的药物中的用途，或本文所述的抗-TNFR2抗体用于治疗、预防或减少已经接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者的移植物抗宿主病。在其他实施方案中，在治疗、预防或减少移植物抗宿主病的方法中施用一种或多种另外的治疗剂。
本文还提供了检测TNFR2(例如，人TNFR2)的方法，包括在允许抗体和TNFR2蛋白之间形成复合物的条件下将样品(例如，生物样品)与本文所述的抗-TNFR2抗体接触，并检测所述复合物。在一些实施方案中，提供了本文所述的抗-TNFR2抗体用于检测样品(例如，生物样品)中的TNFR2(例如，人TNFR2)的用途，包括在允许抗体和TNFR2蛋白之间形成复合物的条件下将所述样品与所述抗-TNFR2抗体接触，并检测所述复合物的形成。
附图说明
图1图示了通过流式细胞术测量的可溶性scFv克隆(200nM)与CHO-hTNFR2细胞和CHO细胞的结合。
图2图示了通过流式细胞术测量的来自图1的可溶性scFv克隆子集与CHO-hTNFR2细胞的结合。使用一个位点结合非线性拟合确定KD值。
图3图示了可溶性scFv克隆对TNF(1nM)与过表达人TNFR2的CHO细胞结合的抑制。使用四参数非线性拟合确定IC50值。各IC50值如下：7-2E8为67.61nM，8-2A10为746.45nM，9-1A6为69.66nM，9-1B5为25.59nM，9-2A4为21.48nM，S4-2 1B5为4.44nM，S4-2 1D10为39.63nM，以及S4-21E5为110.41nM。
图4显示了通过流式细胞术测量的hTNFR2-Fc与酵母上指定的突变体scFv克隆和野生型scFv克隆的结合。使用一个位点结合非线性拟合确定KD值。各KD值如下：UC1为18.13nM，UC1.1为2.59nM，UC2为42.8nM，以及UC2.3为8.88nM。
图5A和5B图示了可溶性亲本(UC1和UC2)scFv和突变体(UC1.1和UC2.3)scFv对TNF(1nM)与CHO-hTNFR2细胞结合的抑制。使用四参数非线性拟合确定IC50值。各IC50值如下：UC1为4.44nM，UC1.1为10.67nM，UC2为39.63nM，以及UC2.3为6.59nM。
图6A-6C图示了通过流式细胞术测量的hTNFR2-Fc与酵母上的变体scFv克隆和野生型scFv克隆的结合。使用一个位点结合非线性拟合确定KD值。图6A：各KD值如下：1B5-1D9为2.87nM，1B5-1A5为0.57nM，以及1B5-1B3为0.64nM。图6B：各KD值如下：1D10-1G9为8.16nM，1D10-1G9-1F10为1.35nM，1D10-1G9-1F12为1.79nM，1D10-1G9-1G2为0.63nM，1D10-1G9-1G3为1.52nM，以及1D10-1G9-1H1为1.98nM。图6C：各KD值如下：1D10-1G9为8.16nM，1D10-1G9-1G11为0.87nM，1D10-1G9-1H11为0.65nM，以及1D10-1G9-1H12为0.78nM。
图7图示了可溶性亲本scFv克隆US2.3(S4-21D10)和UC2.3.3(S4-21D10-1G9)对TNF(1nM)与CHO-hTNFR2细胞结合的抑制。使用四参数非线性拟合确定IC50值。各IC50值如下：UC2.3为4.85nM，UC2.3.3(单体)为3.94nM，以及UC2.3.3(二聚体)为1.72nM。
图8图示了通过流式细胞术评估的酵母展示scFv克隆对hTNFR2-His的结合。各EC50值如下：UC2.3为33.89nM，克隆1为26.14nM，克隆2为15.06nM，克隆3为27.22nM，克隆4为15.67nM，克隆5为11.03nM，克隆6为16.47nM，克隆7为8.97nM、克隆8为13.70nM，克隆9为17.74nM，以及克隆10为14.34nM。
图9A和9B分别显示了所述指定的抗-TNFR2抗体的重链可变区和轻链可变区序列的序列比对。UC2的序列是完整显示的，而对于亲和力成熟的变体UC2.3、UC2.3.3、UC2.3.7和UC2.3.8，仅表示相比共有序列的变化。CDR使用Chothia定义进行注释。
图10图示了抗-人TNFR2 IgG UC2和抗-人TNFR2 IgG UC2.3与CHO-hTNFR2细胞结合。使用四参数非线性拟合确定EC50值。UC2的EC50值为97.9nM，UC2.3的EC50值为3.4nM。
图11显示了抗-人TNFR2 IgG UC2.3.3、UC2.3.7和UC2.3.8通过生物膜层干涉技术(BLI)的传感图和拟合(平滑线)。各KD值如下：UC2.3.3为0.573nM，UC2.3.7为17.1nM，以及UC2.3.8为0.344nM。
图12图示了抗-人TNFR2 IgG：UC2和UC2.3对TNF(1nM)与CHO-hTNFR2细胞结合的抑制。使用四参数非线性拟合确定IC50值。UC2.3的IC50值为12.4nM，无法确定UC2的IC50值。
图13A和13B图示了抗-人TNFR2 IgG UC2.3、UC2.3.3、UC2.3.7和UC2.3.8对TNF(1nM)与CHO-hTNFR2细胞结合的抑制。使用四参数非线性拟合确定IC50值。图13A中各IC50值如下：UC2.3为48.01nM，UC2.3.3为0.89nM，以及UC2.3.7为8.69nM。图13B中各IC50值如下：UC2.3.3为0.68nM，以及UC2.3.8为0.088nM。
图14图示了人抗-TNFR2抗体UC2.3的激动活性，其通过报告细胞系中NF-kB信号转导的诱导来评估。
图15所示的传感图展示了UC2.3.8和比较抗体(20μg/ml)与固定的人TNFR2(5μg/mL)同时结合。比较抗体与人TNFR2上的表位结合，所述人TNFR2上的表位包括位置Y24、Q26、Q29、M30和K47(编号基于没有前导序列的人TNFR2)。
图16A和16B显示抗体UC2.3对来自卵巢癌腹水的T细胞群的影响。图16B显示了流式细胞术分析的设门策略。
图17A显示了UC2.3和对照(同种型对照和同种型对照/无免疫细胞)的ADCC活性。图17B显示了流式细胞术分析的设门策略。
图18A-18C显示了人抗-TNFR2抗体UC2.3.8对CD4+T细胞的体外扩增、活化标记物和细胞因子的诱导。用5ug/mL板结合的CD3、1ug/mL可溶性CD28和各种浓度的板结合的同种型对照、抗-TNFR2(UC2.3.8)、抗-4-lBB(Urelumab)或抗-GITR(TRX518)mAb刺激初始CD45RA+CD8+或CD4+T细胞4天。图18A和图18B显示了来自3个个体的数据，并对在没有任何抗-TNFRSF抗体的情况下刺激的样品进行了标准化。星号显示同种型和UC2.3.8之间的统计显著性。图18C显示了用20ug/mL同种型、UC2.3.8或抗-GITR抗体刺激的CD4+T细胞的代表性流式图。
图19显示了抗体UC2.3-IgG1对异种GvHD模型存活的影响。
图20A的一系列图显示了人抗-TNFR2抗体UC2.3.8在混合淋巴细胞反应中对激活CD4+T细胞和CD8+T细胞的影响。从4个个体中分离出完整的PBMC。来自所有供体组合的细胞以2:1的刺激物:反应物比例混合，并在不同浓度的可溶性UC2.3.8(含有或不含有50μg/ml无关的IgGl)或同种型对照(5μg/ml)存在下培养7天。数据来自4个个体的12次反应。虚线水平线代表同种型对照。在UC2.3.8和含有IgG1的UC2.3.8之间没有观察到统计学上的显著差异。图20B显示了用5μg/ml同种型、UC2.3.8(含有或不含有IgG1)刺激的CD4T细胞的代表性流式图。
图21A-21E图示了通过流式细胞术评估的抗体UC2.3、UC2.3.8和现有技术比较抗体A-C对CD4+T细胞增殖(图21A和图21B)、CD4+T细胞扩增(图21C)和PD-1-阳性CD4+T细胞百分比的影响(图21D)，以及通过报告基因测定评估的NF-kB活性(图21E)。IgG1用作阴性对照。
图22A-22F图示了通过Luminex平台评估的抗体UC2.3.8对CD8+T细胞产生的细胞因子的影响(图22A：IL-2，图22B：IFN-γ，图22C：TNF，图22D：LTα，图22E：IL-18，图22F：GM-CSF)。数据来自单个供体，其代表4个单个供体。IgG1用作阴性对照。
图23A-23F图示了通过Luminex平台评估的抗体UC2.3.8对CD4+T细胞产生的细胞因子的影响(图23A：IL-2，图23B：IFN-γ，图23C：TNF，图23D：LTα，图23E：IL-18，图23F：GM-CSF)。数据来自单个供体，其代表2个单个供体。IgG1用作阴性对照。
图24图示了在人源化小鼠的来源于患者的异种移植模型中抗-人TNFR2抗体UC2.3.8的抗肿瘤活性。显示了具有平均值和平均值标准误差的肿瘤生长动力学(每臂(arm)N＝9只动物)。在第72天研究结束时，使用方差分析来评估统计显著性，并用Tukey真实显著差异程序进行多重比较校正。
图25A图示了1mg或0.3mg M36(有或没有影响效应子功能的突变)对CT26小鼠模型肿瘤生长的影响。图25B显示了表示随机化后第18天肿瘤大小的直方图。图25C图示了0.3mgM3(有或没有影响效应子功能的突变)对CT26小鼠模型肿瘤生长的影响。图25D显示了表示随机化后第18天肿瘤大小的直方图。将CT26细胞(5x10E5)皮下接种在6周龄雌性Balb/c小鼠(7只小鼠/组)。图25E-25J图示了3x0.3mg Y9(有或没有影响效应子功能的突变)对CT26小鼠模型(图25E-25G)或Wehil64(图25H-25J)小鼠模型肿瘤生长的影响。
图26A图示了指定的抗-小鼠TNFR2抗体对CT26小鼠模型肿瘤生长的影响。图26B显示了表示随机化后第18天肿瘤大小的直方图。
图27A-27I图示了1mg(图27A-27F)或0.3mg(图27G-27I)的指定抗体对EMT6小鼠模型肿瘤生长的影响。
图28A和28B图示了抗体Y9和抗-PD-1抗体对抗-PD-1抗性(MBT-2)和抗-PD-1敏感(Sal/N)肿瘤模型的抗肿瘤反应。
图29的一系列图显示了在各种同源模型(WEHI164、Sal/N、MBT2、CT26和EMT6)中，单独的抗体Y9、单独的抗-PD-1抗体以及Y9和抗-PD-1抗体组合的抗肿瘤活性。
图30图示了抗体Y9和抗-CTLA4抗体对健康小鼠体重的影响。
图31图示了抗体Y9和抗-CTLA4抗体对健康小鼠脾脏重量的影响。
图32A和32B图示了抗体Y9和抗-CTLA4抗体对健康小鼠中的丙氨酸氨基转移酶(ALT；图32A)和天冬氨酸氨基转移酶(AST；图32B)水平的影响。
图33A-33D显示了抗体Y9和抗-CTLA4抗体对从皮肤引流淋巴结分离的外周血淋巴细胞和树突细胞的免疫细胞表型的影响。图33A图示了指定处理对CD4+T细胞增殖的影响。图33B图示了指定处理对CD8+T细胞增殖的影响。图33C的一系列点图显示了描述流式细胞术的设门策略。图33D图示了指定处理对CD86(B7.2)表达的影响，所述CD86(B7.2)是在T细胞的树突细胞活化中重要的共刺激分子。
图34的一系列图显示了CT26同源小鼠肿瘤模型中抗体Y9在野生型小鼠、FcGR2BKO小鼠和Fc常规γKO小鼠的抗肿瘤活性。
图35的一系列图显示了CT26同源小鼠肿瘤模型中具有不同抗体同种型和变体Fc区的抗体Y9的抗肿瘤活性。
图36的一系列图显示了抗体Y9对CD8+T细胞各个方面的影响，包括增殖、CD25+细胞百分比、GrnB+细胞百分比和PD-1+细胞百分比。
图37是小鼠TNFR2(空间填充模型)与小鼠TNF(飘带模型，ribbon model)结合的同源模型。绘制了Y9结合被突变显著破坏的氨基酸位置(-，黑色)。
图38A-38D的一系列图展示了单剂量PBS抗-TNFR2抗体(1mg、0.3mg和0.1mg)在具有结肠直肠CT26癌细胞的同源肿瘤模型中的抗肿瘤反应。
图39A-39D的一系列图展示了单剂量PBS或抗-TNFR2抗体(1mg、0.3mg和0.1mg)在具有EMT6乳腺癌细胞的同源肿瘤模型中的抗肿瘤反应。
图40A-40D的一系列图展示了单剂量PBS或抗-TNFR2抗体(1mg、0.3mg和0.1mg)在具有Wehi64纤维肉瘤细胞的同源肿瘤模型中的抗肿瘤反应。
图41A-41D的一系列图展示了单剂量PBS或抗-TNFR2抗体(1mg、0.3mg和0.1mg)在具有A20B细胞淋巴瘤细胞的同源肿瘤模型中的抗肿瘤反应。
图42图示了单剂量抗-TNFR2抗体(1mg、0.3mg和0.1mg)在具有Wehi64纤维肉瘤细胞的同基因肿瘤模型中与未处理的年龄匹配对照相比的持续抗肿瘤反应。
图43A和43B图示了抗体Y9和Y9 DANA对EMT-6同源模型的肿瘤和肿瘤引流淋巴结中CD4+常规T细胞、Treg和CD8+T细胞中CTLA4表达的影响。
图44A-44C图示了抗体Y9和Y9 DANA对EMT-6同源模型的肿瘤中CD4+常规T细胞、Tregs和CD8+T细胞中GITR(图44A)、GARP(图44B)和PD-1(图44C)表达的影响。
图45A-45C图示了抗体Y9和Y9 DANA对CT26、MC38和WEHI-164同源模型的肿瘤中CD4+常规T细胞(图45A)、Tregs(图45B)和CD8+T细胞(图45C)中TNFR2表达的影响。
发明详述
I.概述
本文提供了与TNFR2(例如人TNFR2)特异性结合的分离抗体，特别是重组单克隆抗体，例如人单克隆抗体。本文还提供了制备抗体、免疫缀合物和多特异性分子以及包含所述抗体的药物组合物的方法，以及使用所述抗体抑制肿瘤生长、治疗癌症、治疗自身免疫性疾病、治疗移植物抗宿主病和促进移植物存活和/或减少移植物排斥的方法。
II.定义
为了更容易理解本说明，首先定义某些术语。在整个详细说明书阐述了其他定义。
术语“肿瘤坏死因子受体2”、“TNFR2”、“CD120b”、“p75”、“p75TNFR”、“p80 TNF-α受体”、“TBPII”、“TNFBR”、“TNFR1B”、“TNF-R75”和“TNFR80”在本文中可互换使用，包括所有家族成员、突变体、等位基因、片段和物种，并且是指具有下述氨基酸序列(人和小鼠)的蛋白。TNFR2的胞外结构域包括四个富含半胱氨酸的结构域(CRD1-CRD4)，其序列总结在表1中。表1中CRD区域的编号是基于具有前导序列的人TNFR2和小鼠TNFR2(即SEQ ID NOs:1和4)。
人TNFR2(NP_001057)(前导序列带有下划线)：
Figure BDA0003327556080000141
小鼠TNFR2(NP_035740)(前导序列带有下划线)：
Figure BDA0003327556080000142
表1：
Figure BDA0003327556080000143
Figure BDA0003327556080000151
A–小鼠TNFR2(UniProt ID:P25119)
B–人TNFR2(UniProt ID:P20333)
TNFR2与TNFR1一起介导TNFα的活性。TNFR1是一种55kD的膜结合蛋白，而TNFR2是一种75kD的膜结合蛋白。TNFR2可以调节TNFα与TNFR1的结合，从而可以调节刺激NF-kB作用所需的TNFα水平。TNFR2也可以被金属蛋白酶切割(或进行选择性剪接)，产生保持对TNFα亲和力的可溶性受体。
本文可互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”，包括全抗体(whole antibody)和任何抗原结合片段(抗原结合部分)或其单链同源物。“抗体”包含至少一条重(H)链和一条轻(L)链。例如，在天然存在的IgG中，这些重链和轻链通过二硫键相互连接，并且有两条成对的重链和轻链，这两条链也通过二硫键相互连接。每条重链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。所述重链恒定区包含三个结构域(CH1、CH2和CH3)。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。所述轻链恒定区包含一个结构域CL。VH区和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更保守的区域，称为框架区(FR)或连接(J)区(在重链和轻链中分别为JH或JL)。每个VH和VL包含三个CDR、三个FR和一个J结构域，其从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、J。重链和轻链的可变区与抗原结合。所述抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，其包含免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)或体液因子，如经典补体系统的第一组分(Clq)。已经表明全长抗体的片段可以执行抗体的抗原结合功能。表示为抗体的抗原结合部分或片段的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是包含通过铰链区二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其由抗体单臂的VL结构域和VH结构域组成，(v)包括VH结构域和VL结构域的dAb；(vi)dAb片段(Ward et al.(1989)Nature 341,544-546)，其由VH结构域组成；(vii)由VH结构域或VL结构域组成的dAb；以及(viii)分离的互补决定区(CDR)，或(ix)两个或更多个分离的CDR的组合，所述CDR可以任选地通过合成接头连接。此外，虽然Fv片段的两个结构域(VL和VH)由不同的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头连接，合成接头使它们能够形成单个蛋白质链，其中所述VL区和VH区配对形成单价分子，免疫球蛋白片段的该单链同源物被称为单链Fv(scFv)。此类单链抗体也旨在包含在术语“抗体”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得抗体片段，并以与全抗体(intact antibodies)相同的一般方式筛选所述片段的效用。抗原结合部分可以通过重组DNA技术产生，或者通过全免疫球蛋白的酶促或化学裂解产生。除非另有说明，本文所述抗体中氨基酸位置的编号(例如，Fc区中的氨基酸残基)和目标区(例如CDR)的确定均使用Kabat系统(Kabat,E.A.et.al..(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版，美国卫生与公共服务部，NIH出版物No.91-3242)。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质性抗体群体获得的抗体，即，除了可能以少量存在的天然存在的突变之外，包含所述群体的个体抗体是相同的。此类免疫球蛋白的抗原结合片段(包括scFv)也包含在如本文所用的术语“单克隆抗体”中。单克隆抗体针对单个抗原位点具有高度特异性。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。单克隆抗体可以使用任何本领域公认的技术和本文所述的技术来制备，例如杂交瘤方法、转基因动物、重组DNA方法(参见，例如，美国专利US4,816,567)；或使用噬菌体抗体文库，其使用以下文献中描述的技术：例如美国专利US7,388,088和美国专利申请US09/856,907(PCT国际公开WO00/31246)。单克隆抗体包括嵌合抗体、人抗体和人源化抗体，可以天然存在或重组产生。
如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgD和IgE抗体)。
术语“重组抗体”是指通过重组方式制备、表达、产生或分离的抗体，诸如：(a)从针对免疫球蛋白基因(例如，人免疫球蛋白基因)的转基因或转染色体的动物(例如小鼠)中分离的抗体或由此制备的杂交瘤，(b)从转化以表达所述抗体的宿主细胞(例如从转染瘤)中分离的抗体，(c)使用噬菌体展示从重组的组合抗体文库(例如，含有人抗体序列)中分离的抗体，以及(d)通过涉及将免疫球蛋白基因序列(例如，人免疫球蛋白基因)与其他DNA序列拼接的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组抗体可具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，此类重组人抗体可进行体外诱变，因此所述重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是这样的序列：虽然源自人种系VH序列和VL序列并与之相关，但可能不天然存在于体内人抗体种系库中。
术语“嵌合免疫球蛋白”或“嵌合抗体”是指其可变区来源于第一物种而其恒定区来源于第二物种的免疫球蛋白或抗体。例如可以通过基因工程从属于不同物种的免疫球蛋白基因区段构建嵌合免疫球蛋白或嵌合抗体。
术语“人源化抗体”是指包含至少一条人源化抗体链(即，至少一条人源化轻链或重链)的抗体。术语“人源化抗体链”(即“人源化免疫球蛋白轻链”)是指具有可变区的抗体链(即，分别为轻链或重链)，所述可变区包括基本上来自人抗体的可变框架区和基本上来自非人抗体的互补决定区(CDR)(例如，至少一个CDR、两个CDR或三个CDR)。在一些实施方案中，所述人源化抗体链还包括恒定区(例如，在轻链的情况下，一个恒定区或其部分；在重链的情况下，优选三个恒定区)。
如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均衍生自人种系免疫球蛋白序列，其描述于例如Rabat et.al.(参见，Kabat et.al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，美国卫生与公共服务部，NIH出版物No.91-3242)。此外，如果所述抗体含有恒定区，则所述恒定区也衍生自人种系免疫球蛋白序列。所述人抗体可以包含不是由人种系免疫球蛋白序列(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)编码的氨基酸残基。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中衍生自另一哺乳动物物种(例如小鼠)的CDR序列已移植到人框架序列上的抗体。
所述人抗体可以具有至少一个或多个被如下氨基酸残基替换的氨基酸：例如，不是由人种系免疫球蛋白序列编码的增强活性的氨基酸残基。通常，所述人抗体可以具有多达20个位置被不是人种系免疫球蛋白序列的一部分的氨基酸残基替换。在一个特定的实施方案中，这些替换在如下详细描述的CDR区内。
“双特异性”或“双功能抗体”是具有两个不同重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过多种方法产生，包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见例如，Songsivilai&Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)；Kostelnyet.al.,J.Immunol.148,1547-1553(1992)。
如本文所用，“分离的”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。此外，分离的抗体通常基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
“效应子功能”是指抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用，或由此产生的生化事件。示例性的“效应子功能”包括Clq结合、补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、FcγR介导的效应子功能(如ADCC和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP))，以及细胞表面受体的下调(例如，B细胞受体；BCR)。此类效应子功能通常需要将Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合。
“Fc区”、“Fc结构域”或“Fc”是指抗体重链的C末端区域。因此，Fc区包含除了第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如，CH1或CL)外的抗体恒定区。
“抗原”是抗体结合的实体(例如蛋白实体或肽)，例如TNFR2。
术语“特异性结合”、“特异性地结合(specifically binds)”、“选择性结合”和“选择性地结合(selectively binds)”，是指抗体对特定抗原或表位表现出明显的亲和力，并且通常不表现出与其他抗原和表位的显著交叉反应性。“明显的”或优选的结合包括以10-7、10-8、10-9或10-10M或更高的KD结合。抗体抗原相互作用的KD(亲和力常数)表明50％的抗体和抗原分子结合在一起时的抗体浓度。因此，在合适的固定抗原浓度下，相比用较低亲和力的抗体实现相同百分比的结合所需的抗体浓度，50％的较高(即较强)亲和力的抗体将以较低的抗体浓度结合抗原分子。因此，较低的KD值表示较高(较强)的亲和力。如本文所用，“较好的”亲和力是比它们的比较抗体具有更强的亲和力，并且数值更低，10-7M的KD数值更低，并且因此代表比10-6M的KD具有更好的亲和力。通常优选比10-7M更好(即具有更低的KD值，并因此更强)，优选地优于10-8M的亲和力。还考虑了本文所述那些的中间值，并且优选的结合亲和力可以表示为亲和力的范围，例如本文公开的抗-TNFR2抗体的优选结合亲和力是10-7至10-12M，更优选10-8至10-12M。“不表现出显著交叉反应性”或“不以生理相关亲和力结合”的抗体，是不会明显结合脱靶抗原(例如，非TNFR2蛋白)或表位的抗体。例如，在一个实施方案中，特异性结合TNFR2的抗体针对TNFR2相比例如除TNFR2之外的蛋白，将表现出至少两个，优选三个，或四个或更多个数量级的更好的结合亲和力(即其结合表现出两个、三个或四个或更多个数量级的低KD值)。特异性或选择性结合可根据用于确定此类结合的任何本领域公认的方法来确定，包括例如根据本文所述的Scatchard分析、Biacore分析、生物膜层干涉技术和/或竞争性(竞争)结合测定。
如本文所用，术语“KD”旨在指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数或抗体对抗原的亲和力，其由kd与ka的比率(即，kd/ka)得到，并表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以使用本领域公知的方法来确定。在一些实施方案中，当在BIACORE3000仪器中通过使用PallForteBio Octet RED96生物膜层干涉测量系统或表面等离子共振(SPR)技术，使用重组TNFR2作为分析物以及抗体作为配体进行生物膜层干涉技术测定时，抗体以约小于10-7M，如约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的亲和力(KD)结合抗原，且结合预定抗原的亲和力比其结合除所述预定抗原或密切相关抗原以外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)的亲和力至少高两倍。其他确定KD的方法包括：通过流式细胞术(FACS)或使用
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技术在溶液中与表达TNFR2的活细胞平衡结合。如本文所用，KD值是指单价KD。
如本文所用，术语“kassoc”或“ka”意在指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而如本文所用，术语“kdis”或“kd”意在指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位既可以由连续氨基酸(通常是线性表位)形成，也可以通过蛋白质三级折叠并置的非连续氨基酸(通常是构象表位)形成。由连续氨基酸形成的表位通常(但并非总是)在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。用于确定给定抗体结合哪些表位的方法(即表位作图)是本领域众所周知的，包括例如免疫印迹测定和免疫沉淀测定，其中测试了重叠肽或连续肽与给定抗体的反应性。确定表位空间构象的方法包括本领域的技术，例如X射线晶体学、二维核磁共振和HDX-MS(参见，例如，Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996))。术语“表位作图”是指确定用于抗体-抗原识别的分子决定簇的过程。
关于两个或多个抗体的术语“结合相同的表位”，是指通过给定方法确定了抗体结合相同的氨基酸残基片段。用本文所述的抗体确定抗体是否结合“TNFR2上的相同表位”的技术，包括例如表位作图方法，如对抗原:抗体复合物晶体进行X射线分析，其提供表位和氢/氘交换质谱(HDX-MS)的原子分辨率。其他方法监测抗体与抗原片段或抗原突变变异的结合，其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰导致的结合丧失通常认为是表位组分的指示。此外，还可以使用用于表位作图的计算组合方法。这些方法依赖于目标抗体亲和组合噬菌体展示肽文库中游离的特定短肽的能力。具有相同VH和VL或相同CDR1、2和3序列的抗体有望与相同的表位结合。
“与另一种抗体竞争结合靶标”的抗体，是指(部分或完全地)抑制另一种抗体与靶标结合的抗体。两种抗体是否相互竞争结合靶标，即一种抗体是否抑制另一种抗体与靶标的结合以及抑制到何种程度，可以使用已知的竞争实验来确定。在某些实施方案中，抗体与另一抗体竞争并抑制另一抗体与靶标的结合至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。抑制或竞争水平可能有所不同，这取决于哪种抗体是“封闭抗体”(即首先与靶标孵育的冷抗体)。竞争测定可按下述进行，例如，Ed Harlow和David Lane,ColdSpring Harb Protoc；2006；doi:10.1101/pdb.prot4277或Ed Harlow和David Lane“UsingAntibodies”的第11章,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,USA 1999。竞争性抗体结合相同的表位、重叠的表位或相邻的表位(例如，如通过空间位阻所证明的)。其他竞争性结合测定包括：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(ElA)、夹心竞争测定(参见，Stahli et.al.,Methods in Enzymology 9:242(1983))；固相直接生物素-亲和素EIA(参见，Kirkland et.al.,J.Immunol.137:3614(1986))；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见，Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见，Morel et.al.,Mol.Immunol.25(1):7(1988))；固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung et.al.,Virology 176:546(1990))；以及直接标记的RIA(Moldenhauer et.al.,Scand.J.Immunol.32:77(1990))。
如本文所用，术语“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。
如本文所用，关于编码抗体或抗体片段(例如，VH、VL、CDR3)的核酸的术语“分离的核酸分子”，旨在指其中核苷酸序列基本上不含其他基因组核苷酸序列的核酸分子，例如编码除TNFR2以外的结合抗原的抗体的那些，这些其他序列可以天然地位于人基因组DNA中的核酸的侧翼。
如本文所用，术语“修饰(modifying)”或“修饰(modification)”是指改变抗体或其抗原结合部分中或重组TNFR2蛋白上的一个或多个氨基酸(例如，用于表位作图)。可以通过在一个或多个位置处添加、替换或缺失氨基酸来产生所述改变。可以使用已知技术，如PCR诱变来产生所述改变。例如，在一些实施方案中，可以修饰使用本文提供的方法确定的抗体或其抗原结合部分，从而改变抗体或其抗原结合部分对TNFR2的结合亲和力。
抗体序列中的“保守氨基酸替换”是指核苷酸和氨基酸序列修饰，其不会消除由该核苷酸序列编码或含有该氨基酸序列的抗体与抗原(例如，TNFR2)的结合。保守氨基酸替换包括一类氨基酸被同一类别的氨基酸替换，其中一类是由常见的物理化学氨基酸侧链性质和自然界中发现的同源蛋白的高替换频率来定义的，例如通过标准Dayhoff频率交换矩阵或BLOSUM矩阵来确定。氨基酸侧链分为六大类，包括：I类(Cys)；II类(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)；III类(Asn、Asp、Gln、Glu)；IV类(His、Arg、Lys)；V类(Ile、Leu、Val、Met)；和VI类(Phe、Tyr、Trp)。例如，将Asp替换为另一个III类残基如Asn、Gln或Glu，是一种保守替换。因此，抗-TNFR2抗体中预测的非必需氨基酸残基，优选被同一类别的另一个氨基酸残基替换。确定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守替换的方法是本领域公知的。
术语“非保守氨基酸替换”是指将一类中的氨基酸替换为另一类的氨基酸；例如，将Ala(II类残基)替换为III类残基例如Asp、Asn、Glu或Gln。
或者，在另一个实施方案中，可以沿抗-TNFR2抗体编码序列的全部或部分随机引入突变(保守或非保守)，如通过饱和诱变，并且可以针对结合活性来筛选所得修饰的抗-TNFR2抗体。
如本文所用，术语“载体”旨在指能够转运已与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接另外的DNA片段。另一种载体是病毒载体，其中可以将另外的DNA片段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒形式。术语“质粒”和“载体”可以互换使用。然而，也可以考虑提供等效功能的其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)旨在指已将重组表达载体引入其中的细胞。应当理解，这些术语不仅旨在指特定的受试细胞，而且还指该细胞的后代。因为由于突变或环境的影响，某些修饰可能发生在后代，因此该后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用术语“宿主细胞”的范围内。
如本文所用，术语“连接的”是指两个或更多个分子的结合。连接可以是共价的或非共价的。连接也可以是遗传的(即，重组融合)。可以使用多种本领域公认的技术来实现此类连接，如化学缀合和重组蛋白生产。
还提供了本文所述序列的“保守序列修饰”，即不消除由核苷酸序列编码的或含有氨基酸序列的抗体与抗原的结合的氨基酸序列修饰。此类保守序列修饰包括保守核苷酸替换和氨基酸替换，以及核苷酸和氨基酸的添加和缺失。例如，可以通过本领域已知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变，可将修饰引入表5中的序列。保守氨基酸替换包括其中氨基酸残基被替换为具有相似侧链的氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、具有β-支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，抗-TNFR2抗体中预测的非必需氨基酸残基，优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替换。用于确定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守替换的方法是本领域公知的(参见例如Brummell et.al.,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi et.al..Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burkset.al..Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997))。或者，在另一个实施方案中，可以沿抗-TNFR2抗体编码序列的全部或部分随机引入突变，如通过饱和诱变，并且可以针对结合活性筛选所得修饰的抗-TNFR2抗体。
对于核酸，术语“基本同源性”表示当具有合适的核苷酸插入或缺失的两个核酸或其指定的序列进行最佳比对和比较时，有至少约80％的核苷酸，通常至少约90％至95％，更优选至少约98％至99.5％的核苷酸是相同的。或者，当片段将在选择性杂交条件下与该链的互补序列杂交时，存在基本同源性。
对于多肽，术语“基本同源”表示当具有合适的氨基酸插入或缺失的两个多肽或其指定的序列进行最佳比对和比较时，有至少约80％的氨基酸，通常至少为约90％至95％，更优选至少约98％至99.5％的氨基酸是相同的。
两个序列之间的百分比同一性是序列共有的相同位置数量的函数(即，同源性％＝相同位置数/总位置数x100)，考虑到空位(gap)的数量和每个空位的长度，其需要引入以实现两个序列的最佳比对。如下述非限制性实例中所述，可以使用数学算法来完成序列的比较和两个序列之间的百分比同一性的确定。
两个核苷酸序列之间的百分比同一性，可以使用GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序确定，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80，以及长度权重1、2、3、4、5或6。两个核苷酸序列或两个氨基酸序列之间的百分比同一性，也可以使用已并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller(CABIOS,4:11-17(1989))的算法来确定，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，以及空位罚分为4。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性，可以使用已并入GCG软件包(可从http://www.gcg.com上获得)中的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法来确定，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4，以及长度权重1、2、3、4、5或6。
本文所述的核酸序列和蛋白质序列可进一步用作“查询序列”，以对公共数据库进行搜索以例如确定相关序列。可以使用Altschul et.al..(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)执行此类搜索。可以使用NBLAST程序，得分＝100，字长＝12，进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。可以使用XBLAST程序，得分＝50，字长＝3，进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本文所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul et.al.,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402所述的使用空位BLAST。在使用BLAST程序和空位BLAST程序时，可以使用各自程序的默认参数(例如XBLAST和NBLAST)。参见，www.ncbi.nlm.nih.gov。
如本文所用，术语“抑制”是指生物活性的任何统计学上的显著降低，包括活性的部分阻断和完全阻断。例如，“抑制”可指生物活性在统计学上显著降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
如本文所用，短语“抑制TNFR2配体与TNFR2的结合”是指相对于不存在抗体(对照)的TNFR2配体的结合，抗体在统计学上显著降低TNFR2配体与TNFR2结合的能力。换言之，在抗体存在的情况下，与对照(无抗体)相比，结合TNFR2的TNFR2配体的量在统计学上显著降低。在本文公开的抗-TNFR2抗体存在的情况下，结合TNFR2的TNFR2配体的量相对于不存在抗体(对照)时的量，可以降低至少约10％，或至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％，或约100％。TNFR2配体结合的降低可以使用本领域公认的技术来测量，该技术在抗体存在或不存在(对照)的情况下测量标记的TNFR2配体(例如，放射性标记的TNFα)与表达TNFR2的细胞的结合水平。
如本文所用，术语“抑制肿瘤的生长”包括肿瘤生长的任何可测量的降低，例如抑制肿瘤生长至少约10％，例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约99％或约100％。
如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”是指本文所述的治疗或预防措施。“治疗”的方法为向患有诸如移植物抗宿主病的疾病的受试者或可能发展为所述疾病的受试者(例如，将接受细胞或器官移植的受试者)施用本文所述的抗-TNFR2抗体(例如，抗-人TNFR2抗体)，以预防、治愈、延迟、降低疾病或病症或复发性疾病或病症的的严重程度或减轻一种或多种症状，或延长受试者的生存期，使其超过不进行此类治疗的预期生存期。
术语“癌症”和“癌性的”是指或描述哺乳动物中通常以不受控制的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于：癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体实例包括：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌、神经胶质细胞肿瘤如成胶质细胞瘤和神经纤维瘤病、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤、结直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer)、肾癌(renalcancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌及各类头颈癌。
如本文所用，短语“长期抗癌作用”是指在用抗体初始治疗后，抗体诱导抑制癌症生长持续一段时间(例如至少6个月或更长时间)的能力。可以例如通过测量肿瘤生长或通过定期检测缓解期受试者的血液样本中针对原发癌的记忆T细胞(例如检测对原始活检样本的反应性)的存在来评估持续的抗癌效果。
术语“有效剂量(effective dose/effective dosage)”定义为足以达到或至少部分达到所需效果的量。术语“治疗有效剂量”定义为在已经患有该疾病的患者中足以治愈或至少部分阻止疾病及其并发症的量。用于此用途的有效量将取决于所治疗病症的严重程度和患者自身免疫系统的总体状况。
术语“治疗剂”旨在包括具有下述能力的任何或所有化合物：降低或抑制疾病或病症的症状的严重程度，或增加疾病或病症无症状或症状减轻期的频率和/或持续时间，或抑制或预防由于疾病或病症折磨导致的损伤或残疾，或抑制或延迟疾病或病症的进展，或抑制或延迟疾病或病症的发作。治疗剂的非限制性实例包括：有机小分子、单克隆抗体、双特异性抗体、重组工程生物制剂、RNAi化合物和市售抗体。
如本文所用，“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种，将包含治疗剂的组合物物理引入受试者。本文所述抗体的示例性施用途径包括：静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”是指通常通过注射而不是肠内和局部施用的施用方式，包括但不限于：静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及活体电穿孔。或者，本文所述的抗体可以通过非肠胃外途径施用，如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。施用也可以例如一次、多次和/或经过一个或多个延长的时间段内进行。
术语“患者”包括接受预防性治疗或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。
术语“受试者”包括任何哺乳动物。例如，本文公开的方法和组合物可用于治疗患有癌症的受试者。在一个特定的实施方案中，所述受试者是人。
术语“样品”是指取自患者或受试者的组织、体液或细胞(或任何上述物质的一部分)。通常，将从患者体内取出组织或细胞，但也考虑了体内诊断。在实体瘤的情况下，可以从手术切除的肿瘤中取出组织样品，并准备好用于通过常规技术进行检测。在淋巴瘤和白血病的情况下，可以获得淋巴细胞、白血病细胞或淋巴组织(例如，来自血液的白血病细胞)并适当地准备好。其他样品，包括尿液、泪液、血清、血浆、脑脊液、粪便、痰、细胞提取物等，也可用于特定的癌症。
如本文所用，术语“约”是指指定值的正负10％。
如本文所用，术语“和/或”包括相关所列项目中一个或多个的任何和所有组合。例如，短语“A、B和/或C”旨在包含A；B；C；A和B；A和C；B和C；以及A、B和C。
如在本发明的描述和所附权利要求中使用的，单数形式“一/一个(a/an)”和“所述/该(the)”也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确指出。
在以下小节中进一步详细地描述了本公开的各个方面。
III.抗-TNFR2抗体
本文公开的抗-TNFR2抗体(例如，分离的抗-人TNFR2抗体)通过特定的功能特征和结构特征(例如，CDR、可变区、重链和轻链)来表征。
因此，在一个实施方案中，所述抗体结合人TNFR2，其包含选自以下的重链和轻链可变区对的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列：
(a)分别为SEQ ID NOs:48-49；[UC2.3]
(b)分别为SEQ ID NOs:71-72；[UC2.3.3]
(c)分别为SEQ ID NOs:94-95；[UC2.3.7]
(d)分别为SEQ ID NOs:117-118；[UC2.3.8]
(e)分别为SEQ ID NOs:140-141；[UC2.3.9]
(f)分别为SEQ ID NOs:163-164；[UC2.3.10]
(g)分别为SEQ ID NOs:186-187；[UC2.3.11]
(h)分别为SEQ ID NOs:209-210；[UC2.3.12]
(i)分别为SEQ ID NOs:232-233；[UC2.3.13]
(j)分别为SEQ ID NOs:255-256；[UC2.3.14]
(k)分别为SEQ ID NOs:278-279；[UC2.3.15]
(l)分别为SEQ ID NOs:301-302；[UC1]
(m)分别为SEQ ID NOs:322-323；[UC1.1]
(n)分别为SEQ ID NOs:343-344；[UC1.2]
(o)分别为SEQ ID NOs:364-364；[UC1.3]
(p)分别为SEQ ID NOs:25-26；[UC2]
(q)分别为SEQ ID NOs:385-386；[UC3]
(r)分别为SEQ ID NOs:406-407；[UC4]
(s)分别为SEQ ID NOs:427-428；[UC5]
(t)分别为SEQ ID NOs:448-449；[UC6]
(u)分别为SEQ ID NOs:469-470；[UC7]和
(v)分别为SEQ ID NOs:490-491。[UC8]
在一些实施方案中，所述CDR序列是使用Kabat编号定义的。在其他实施方案中，所述CDR序列是使用Chothia编号定义的。在其他实施方案中，所述CDR序列是使用IMGT编号定义的。
在一些实施方案中，所述抗-TNFR2抗体包含：
(a)分别包含SEQ ID NOs:36-38的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQID NOs:39-41的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3]
(b)分别包含SEQ ID NOs:59-61的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQID NOs:62-64的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.3]
(c)分别包含SEQ ID NOs:82-84的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQID NOs:85-87的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.7]
(d)分别包含SEQ ID NOs:105-107的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:108-110的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.8]
(e)分别包含SEQ ID NOs:128-130的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:131-133的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.9]
(f)分别包含SEQ ID NOs:151-153的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:154-156的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.10]
(g)分别包含SEQ ID NOs:174-176的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:177-179的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.11]
(h)分别包含SEQ ID NOs:197-199的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:200-202的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.12]
(i)分别包含SEQ ID NOs:220-222的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:223-225的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.13]
(j)分别包含SEQ ID NOs:243-245的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:246-248的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.14]
(k)分别包含SEQ ID NOs:266-268的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:269-271的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.15]
(l)分别包含SEQ ID NOs:289-291的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:292-294的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC1]
(m)分别包含SEQ ID NOs:310-312的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:313-315的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC1.1]
(n)分别包含SEQ ID NOs:331-333的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:334-336的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC1.2]
(o)分别包含SEQ ID NOs:352-354的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:355-357的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC1.3]
(p)分别包含SEQ ID NOs:13-15的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQID NOs:16-18的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2]
(q)分别包含SEQ ID NOs:373-375的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:376-378的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC3]
(r)分别包含SEQ ID NOs:394-396的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:397-399的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC4]
(s)分别包含SEQ ID NOs:415-417的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:418-420的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC5]
(t)分别包含SEQ ID NOs:436-438的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:439-441的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC6]
(u)分别包含SEQ ID NOs:457-459的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:460-462的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；或[UC7]
(v)分别包含SEQ ID NOs:478-480的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:481-483的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。[UC8]
在一些实施方案中，所述抗-TNFR2抗体包含：
(a)分别包含SEQ ID NOs:30-32的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQID NOs:33-35的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3]
(b)分别包含SEQ ID NOs:53-55的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQID NOs:56-58的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.3]
(c)分别包含SEQ ID NOs:76-78的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQID NOs:79-81的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.7]
(d)分别包含SEQ ID NOs:99-101的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQID NOs:102-104的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.8]
(e)分别包含SEQ ID NOs:122-124的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:125-127的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.9]
(f)分别包含SEQ ID NOs:145-147的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:148-150的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.10]
(g)分别包含SEQ ID NOs:168-170的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:171-173的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.11]
(h)分别包含SEQ ID NOs:191-193的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:194-196的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.12]
(i)分别包含SEQ ID NOs:214-216的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:217-219的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.13]
(j)分别包含SEQ ID NOs:237-239的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:240-242的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.14]
(k)分别包含SEQ ID NOs:260-262的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:263-265的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.15]
(l)分别包含SEQ ID NOs:283-285的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:286-288的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC1]
(m)分别包含SEQ ID NOs:304-306的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:307-309的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC1.1]
(n)分别包含SEQ ID NOs:325-327的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:328-330的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC1.2]
(o)分别包含SEQ ID NOs:346-348的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:349-351的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC1.3]
(p)分别包含SEQ ID NOs:7-9的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:10-12的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2]
(q)分别包含SEQ ID NOs:367-369的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:370-372的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC3]
(r)分别包含SEQ ID NOs:388-390的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:391-393的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC4]
(s)分别包含SEQ ID NOs:409-411的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:412-414的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC5]
(t)分别包含SEQ ID NOs:430-432的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:433-435的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC6]
(u)分别包含SEQ ID NOs:451-453的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:454-456的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；或[UC7]
(v)分别包含SEQ ID NOs:472-474的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:475-477的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。[UC8]
在一些实施方案中，所述抗-TNFR2抗体包含：
(a)分别包含SEQ ID NOs:42-44的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQID NOs:45-47的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3]
(b)分别包含SEQ ID NOs:65-67的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQID NOs:68-70的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.3]
(c)分别包含SEQ ID NOs:88-90的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQID NOs:91-93的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.7]
(d)分别包含SEQ ID NOs:111-113的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:114-116的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.8]
(e)分别包含SEQ ID NOs:134-136的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:137-139的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.9]
(f)分别包含SEQ ID NOs:157-159的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:160-162的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.10]
(g)分别包含SEQ ID NOs:180-182的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:183-185的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.11]
(h)分别包含SEQ ID NOs:203-205的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:206-208的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.12]
(i)分别包含SEQ ID NOs:226-228的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:229-231的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.13]
(j)分别包含SEQ ID NOs:249-251的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:252-254的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.14]
(k)分别包含SEQ ID NOs:272-274的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:275-277的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.15]
(l)分别包含SEQ ID NOs:295-297的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:298-300的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC1]
(m)分别包含SEQ ID NOs:316-318的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:319-321的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC1.1]
(n)分别包含SEQ ID NOs:337-339的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:340-342的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC1.2]
(o)分别包含SEQ ID NOs:358-360的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:361-363的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC1.3]
(p)分别包含SEQ ID NOs:19-21的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQID NOs:22-24的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2]
(q)分别包含SEQ ID NOs:379-381的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:382-384的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC3]
(r)分别包含SEQ ID NOs:400-402的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:403-405的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC4]
(s)分别包含SEQ ID NOs:421-423的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:424-426的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC5]
(t)分别包含SEQ ID NOs:442-444的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:445-447的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC6]
(u)分别包含SEQ ID NOs:463-465的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:466-468的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；或[UC7]
(v)分别包含SEQ ID NOs:484-486的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NOs:487-489的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。[UC8]
在一些实施方案中，所述抗-TNFR2抗体包含上述的重链CDR序列和恒定区，例如人IgG恒定区(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，或其变体)。在一些实施方案中，包含上述重链CDR序列的重链可变区可连接至恒定结构域以形成重链(例如，全长重链)。类似地，包含上述轻链CDR序列的轻链可变区可连接至恒定区以形成轻链(例如，全长轻链)。全长重链(C末端赖氨酸(K)或C末端甘氨酸和赖氨酸(GK)除外，其可能缺失或被去除)和全长轻链结合形成全长抗体。
在一些实施方案中，所述抗-TNFR2抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NOs:25、48、71、94、117、140、163、186、209、232、255、278、301、322、343、364、385、406、427、448、469和490。在其他实施方案中，所述抗-TNFR2抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述轻链可变区包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NOs:26、49、72、95、118、141、164、187、210、233、256、279、302、323、344、365、386、407、428、449、470和491。在其他实施方案中，所述抗-TNFR2抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NOs:25、48、71、94、117、140、163、186、209、232、255、278、301、322、343、364、385、406、427、448、469和490，并且所述轻链可变区包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NOs:26、49、72、95、118、141、164、187、210、233、256、279、302、323、344、365、386、407、428、449、470和491。在其他实施方案中，所述抗-TNFR2抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区序列和/或轻链可变区序列与上述重链可变区序列和/或轻链可变区序列(例如，SEQ ID NOs:25、26、48、49、71、72、94、95、117、118、140、141、163、164、186、187、209、210、232、233、255、256、278、279、301、302、322、323、343、344、364、365、385、386、406、407、427、428、448、449、469、470、490和491)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在其他实施方案中，SEQ ID NOs:25、26、48、49、71、72、94、95、117、118、140、141、163、164、186、187、209、210、232、233、255、256、278、279、301、302、322、323、343、344、364、365、385、386、406、407、427、428、448、449、469、470、490和491中任一个的重链可变区序列和/或轻链可变区序列，具有1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个氨基酸替换(例如，保守氨基酸替换)。
在一些实施方案中，所述抗-TNFR2抗体包含重链可变区序列和轻链可变区序列，所述重链可变区序列和所述轻链可变区序列与选自下述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性：
(a)分别为SEQ ID NOs:48-49；[UC2.3]
(b)分别为SEQ ID NOs:71-72；[UC2.3.3]
(c)分别为SEQ ID NOs:94-95；[UC2.3.7]
(d)分别为SEQ ID NOs:117-118；[UC2.3.8]
(e)分别为SEQ ID NOs:140-141；[UC2.3.9]
(f)分别为SEQ ID NOs:163-164；[UC2.3.10]
(g)分别为SEQ ID NOs:186-187；[UC2.3.11]
(h)分别为SEQ ID NOs:209-210；[UC2.3.12]
(i)分别为SEQ ID NOs:232-233；[UC2.3.13]
(j)分别为SEQ ID NOs:255-256；[UC2.3.14]
(k)分别为SEQ ID NOs:278-279；[UC2.3.15]
(l)分别为SEQ ID NOs:301-302；[UC1]
(m)分别为SEQ ID NOs:322-323；[UC1.1]
(n)分别为SEQ ID NOs:343-344；[UC1.2]
(o)分别为SEQ ID NOs:364-364；[UC1.3]
(p)分别为SEQ ID NOs:25-26；[UC2]
(q)分别为SEQ ID NOs:385-386；[UC3]
(r)分别为SEQ ID NOs:406-407；[UC4]
(s)分别为SEQ ID NOs:427-428；[UC5]
(t)分别为SEQ ID NOs:448-449；[UC6]
(u)分别为SEQ ID NOs:469-470；[UC7]和
(v)分别为SEQ ID NOs:490-491。[UC8]
在一些实施方案中，上述重链可变区序列和/或轻链可变区序列具有1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个氨基酸替换(例如，保守氨基酸替换)。
在一些实施方案中，包含本文所述的重链CDR序列和轻链CDR序列或重链可变区序列和轻链可变区序列的抗体，是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体(例如重组人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。
在一些实施方案中，所述抗-人TNFR2抗体包含上述重链可变区序列和恒定区，例如人IgG恒定区(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，或其变体)以形成重链(例如，全长重链)。类似地，包含上述轻链可变区序列的轻链可变区可以连接至恒定区以形成轻链(例如，全长轻链)。全长重链(C末端赖氨酸(K)或C末端甘氨酸和赖氨酸(GK)除外，其可能缺失或被去除)和全长轻链结合形成全长抗体。
在一些实施方案中，所述抗-TNFR2抗体包含重链序列和轻链序列，所述重链序列和轻链序列与选自下述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性：
(a)分别为SEQ ID NOs:50-51；[UC2.3]
(b)分别为SEQ ID NOs:73-74；[UC2.3.3]
(c)分别为SEQ ID NOs:96-97；[UC2.3.7]
(d)分别为SEQ ID NOs:119-120；[UC2.3.8]
(e)分别为SEQ ID NOs:142-143；[UC2.3.9]
(f)分别为SEQ ID NOs:165-166；[UC2.3.10]
(g)分别为SEQ ID NOs:188-189；[UC2.3.11]
(h)分别为SEQ ID NOs:211-212；[UC2.3.12]
(i)分别为SEQ ID NOs:234-235；[UC2.3.13]
(j)分别为SEQ ID NOs:257-258；[UC2.3.14]
(k)分别为SEQ ID NOs:280-281；[UC2.3.15]和
(l)分别为SEQ ID NOs:27-28。[UC2]
在一些实施方案中，上述重链序列和/或轻链序列具有1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个氨基酸替换(例如，保守氨基酸替换)。
在一些实施方案中，如通过例如生物膜层干涉技术所评估的，所述抗-TNFR2抗体结合TNFR2(例如人TNFR2的胞外结构域)的KD为：约100nM或更小、约75nM或更小、约50nM或更小、约25nM或更小、约10nM或更小、约1nM或更小、约750pM或更小、约500pM或更小、约250pM或更小、约100pM或更小、约10pM或更小、约1pM或更小、约1pM至约100nM、约10pM至约100nM、约100pM至约100nM、约250pM至约100nM、约500pM至约100nM、约750pM至约100nM、约100pM至约10nM、约250pM至约10nM、约500pM至约10nM、约750pM至约10nM、约100pM至约10nM、约250pM至约10nM、约500pM至约10nM、约750pM至约10nM、约100pM至约1nM、约250pM至约750pM、约300pM至约600pM、约250pM至约1nM、约500pM至约1nM、约750pM至约1nM、约1nM至约100nM、约1nM至约75nM、约1nM至约50nM、或约1nM至约25nM。
在一些实施方案中，如通过例如流式细胞术所评估的，所述抗-TNFR2抗体结合膜结合的人TNFR2(例如，在细胞上表达的人TNFR2)的EC50为：约500nM或更小、约250nM或更小、约100nM或更小、约50nM或更少、约25nM或更少、约10nM或更少、约1nM或更少、约100pM或更小、约10pM或更小、约100pM到约500nM、约100pM到约250nM、约100pM至约100nM、约1pM至约250nM、约1pM至约100nM、约500pM至约100nM、约1nM至约100nM。
在一些实施方案中，所述抗-TNFR2抗体抑制TNFR2配体(例如，TNFα)与TNFR2的结合。在一些实施方案中，相对于对照抗体(例如，不与TNFR2结合的抗体)，所述抗-TNFR2抗体抑制TNFR2配体(例如，TNFα)与TNFR2的结合至少10％，例如至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，如通过例如流式细胞术所评估的，所述抗-TNFR2抗体抑制TNFR2配体(例如TNFα)与膜TNFR2(例如，在细胞上表达的人TNFR2)结合的IC50为：约250nM或更小、约100nM或更小、约50nM或更小、约25nM或更小、约10nM或更小、约5nM或更小、约1nM或更小、约750pM或更小、约500pM或更小、约100pM或更小、约10pM至约250nM、约10pM至约100nM、约10pM至约50nM、约50pM至约250nM、约50pM至约100nM、约50pM至约50nM、约75pM至约250nM、约75pM至约100nM、约75pM至约50nM、约100pM至约250nM、约100pM至约100nM、约100pM至约100nM、约500pM至约250nM、约500pM至约100nM、约500pM至约50nM、约500pM至约10nM、约1nM至约250nM、约1nM至约100nM，或约1nM至约50nM。其他本领域公认的方法可用于测量配体竞争，如生物膜层干涉技术和表面等离子体共振。
在一些实施方案中，所述抗-TNFR2抗体是激动性抗体，即激活细胞中TNFR2信号转导途径的抗-TNFR2抗体。
在一些实施方案中，所述抗-TNFR2抗体增加NF-kB活性，例如，如通过NF-kB报告基因细胞系(例如，工程化以表达人TNFR2的NF-kB报告基因细胞系)所评估的。在其他实施方案中，相对于对照(例如，同种型对照抗体或不表达人TNFR2的NF-kB报告基因细胞系)，所述抗-TNFR2抗体将NF-kB活性提高例如至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍或至少20倍。
在一些实施方案中，相对于对照(例如，无抗体对照或同种型抗体对照)，所述抗-TNFR2抗体降低CD4+T细胞区室内调节性T细胞(Treg)的百分比。在其他实施方案中，相对于对照(例如，无抗体对照或同种型抗体对照)，所述抗-TNFR2抗体将CD4+T细胞区室内Treg细胞的百分比降低约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、或约80％。
在一些实施方案中，所述抗-TNFR2抗体在NK细胞存在下诱导ADCC。
在一些实施方案中，所述抗-TNFR2抗体增强T细胞活化。在其他实施方案中，所述抗-TNFR2抗体增强CD4+和CD8+T细胞的活化，例如，如通过例如流式细胞术评估的活化标记物(例如CD25、PD1)的表达增加所反映的。
在一些实施方案中，所述抗-TNFR2抗体增加T细胞增殖。在其他实施方案中，所述抗-TNFR2抗体增加CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖。
在一些实施方案中，所述抗-TNFR2抗体减少(防止)移植物排斥，例如，如在移植物抗宿主病(GvHD)模型中所评估的。例如，可以通过与对照比较(例如，相对于用对照抗体或溶媒或无关抗体的治疗，提高了生存期)来评估减少的移植物排斥。
在一些实施方案中，相对于对照疗法，所述抗-TNFR2抗体抑制肿瘤生长，例如，抑制10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、或95％或更多。
在一些实施方案中，所述抗-TNFR2抗体抑制肿瘤生长，与激动TNFR2信号转导的能力无关。
在一些实施方案中，所述抗-TNFR2抗体抑制肿瘤生长，与抑制TNF-α与TNFR2结合的能力无关。
在一些实施方案中，所述抗-TNFR2抗体诱导长期抗癌作用(例如，在用抗-TNFR2抗体治疗后的持续时间段内抑制(inhibit)和/或抑制(suppress)肿瘤生长)。在一个特定的实施方案中，与对照(例如，未用抗-TNFR2抗体治疗的受试者)相比，所述抗-TNFR2抗体诱导抗癌记忆T细胞的发育。
本文还提供了诱导长期抗癌作用的方法，包括向患有癌症的受试者施用本文所述的抗-TNFR2抗体。
在一个实施方案中，可以在人类癌症的小鼠模型(例如，转基因模型、人源化模型和/或嵌合、同种异体移植物和异种移植物模型)中，测量长期抗癌作用。在用抗-TNFR2抗体初始治疗后表现出肿瘤消退的小鼠中，可以监测肿瘤复发(或抑制)，例如至少6个月。在其他实施方案中，可以监测肿瘤复发(或抑制)至少1年或更多年，或至少2年或更多年。
在另一个实施方案中，为了确定细胞毒性T淋巴细胞(CTL)是否已经发育成记忆T细胞，可以在肿瘤消退后的不同时间点将不同剂量的相同肿瘤细胞重新接种到肿瘤消退的小鼠中，然后监测接受者小鼠的肿瘤生长。野生型小鼠可以接种与对照相同的肿瘤。为了确定肿瘤消退小鼠中肿瘤特异性记忆T细胞的频率，可以使用特定的癌细胞抗原作为靶标进行体外细胞毒性测定。
在一些实施方案中，本文所述的抗-TNFR2抗体是单克隆抗体，例如单克隆人抗体。
如根据本领域已知的方法和本文描述的方法确定的表现出一种或多种上述功能特性(例如，生物化学、免疫化学、细胞、生理或其他生物活性等)的抗体，将被理解为涉及相对于不存在抗体(例如，或当存在不相关特异性的对照抗体时)所见的特定活性的统计学上的显著差异。优选地，所述抗-TNFR2抗体诱导的测量参数的增加，在统计学上的显著增加了测量参数的至少10％，更优选增加了至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％(即2倍)、3倍、5倍或10倍。相反，所述抗-TNFR2抗体诱导的测量参数(例如，TNFα与TNFR2结合)的降低，在统计学上显著降低了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。
本文公开的抗体包括所有已知形式的抗体和具有抗体样特性的其他蛋白质支架。例如，所述抗体可以是人抗体、人源化抗体、双特异性抗体、免疫缀合物、嵌合抗体或具有抗体样特性的蛋白质支架，如纤连蛋白或锚蛋白重复序列。所述抗体还可以是Fab、Fab’2、scFv、亲合体(AFFIBODY)、avimer、纳米抗体或结构域抗体。所述抗体还可以具有任何同种型，包括以下同种型中任一种：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE。可以使用标准重组DNA技术和编码要与可变区序列可操作连接的所需恒定区序列的核酸，由VH序列和VL序列制备全长抗体。
在一些实施方案中，所述抗-TNFR2抗体结合TNFR2上与本文所述的抗-TNFR2抗体相同的表位。在其他实施方案中，所述抗体与本文所述的抗-TNFR2抗体竞争结合TNFR2。
在一些实施方案中，相对于未修饰形式的相同抗体，修饰所述抗-TNFR2抗体以增强效应子功能。在其他实施方案中，相对于未修饰形式的相同抗体，所述抗-TNFR2抗体表现出增加的抗肿瘤活性。
因此，所述抗-TNFR抗体的可变区可以连接至非天然存在的Fc区，例如与一种或多种活化Fc受体(FcγI、FcγIIa或FcγIIIa)结合增强的Fc。一般而言，本文所述的可变区可以连接至包含一个或多个修饰(例如，氨基酸替换、缺失和/或插入)的Fc，相对于亲本Fc序列(例如未修饰的Fc多肽)，通常用于增强抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。此外，可以对所述抗体进行化学修饰(例如，可以将一种或多种化学部分连接至所述抗体上)或对其进行修饰以改变其糖基化，从而改变所述抗体的一种或多种功能特性。下面更详细地描述这些实施方案中的每一个。Fc区的残基编号是Kabat的EU指数的编号。
治疗性抗体的Fcγ受体参与对其活性可能是重要的(Clynes et.al.,Nat Med2000；6:443-6)。小鼠和人类均具有活化Fcγ受体(例如，小鼠中的mFcγRI、mFcγRIII或mFcγRIV，以及人类中的hFcγRI、hFcγRIIa、hFcγRIIc、mFcγRIIIa或mFcγRIIIb)和抑制性Fcγ受体(小鼠中的mFcγRIIb和人类中的hFcγRIIb)(Nimmerjahn et al.,Nat RevImmunol 2008；8:34-47)。Fcγ受体的参与可以表明：1)抗体的效应子功能的贡献，如通过活化Fcγ受体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、调理作用或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)(Dahan et.al.,Cancer Cell 2015；28:285-95)；或2)通过在表达Fcγ受体的细胞类型上聚集所述抗体来增强激动作用(Nimmerjahn et.al.,Trends in Immunology 2015；36:325-36)。因此，在一些实施方案中，本文提供了介导T细胞的激动活性和共刺激的抗-TNFR2抗体。为了增强的激动作用，所述抑制性Fcγ受体FcγRIIb被描述为对促进激动作用最重要(参见，例如，Dahan et.al.,Cancer Cell 2016；29:820–31)。
各种抗体IgG同种型对结合某些Fcγ受体具有不同的偏好(Bruhns et.al.,Blood2012；119:5640-9)。在人类中，IgG1抗体是用于介导效应子功能如ADCC或ADCP的优选同种型，因为它们对活化Fcγ受体具有高亲和力。已经描述了抗体Fc的各种突变，它们改变了与各种Fcγ受体的结合特性，因此可以调节抗体的活性。N297A突变(NA)、D265A/N297A突变(DANA)或D265A/N297G突变(DANG)减少或消除与所有Fcγ受体的结合(Lo et.al.,J BiolChem 2017；292:3900-8)，从而降低效应子功能或增强激动作用的能力。L234A/L235A突变(LALA)减少或消除与所有Fcγ受体的结合(Arduin et al.,Mol Immunol 2015；63:456-63)。类似地，已经描述了与FcγRIIb结合增强并因此增加激动活性的突变(参见例如,Dahan et.al.,Cancer Cell 2016；29:820-31)，如S267E突变(SE)、S267E和L328F突变(SELF)、G237D/P238D/P271G/A330R突变(V9)、G237D/P238D/P271G/A330R突变(V10)、G237D/P238D/H268D/P271G/A330R突变(V11)，或E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R突变(V12)(Mimoto et.al.,Protein Eng Des Sel 2013；26:589-98)。
因此，所述抗-TNFR2抗体可以包含变体Fc区(例如，变体IgG1 Fc区)。在一些实施方案中，相对于用相应的非变体形式的Fc区所观察到的结合，变体Fc区增加了与Fcγ受体的结合(例如，如果变体Fc区是变体IgG1 Fc区，则相应的非变体形式是野生型IgG1 Fc区)。在一些实施方案中，所述变体Fc区(例如，变体IgG1 Fc区)增加了与FcγRIIb受体的结合。在一些实施方案中，相对于相应的野生型Fc区，所述变体Fc区增加了抗体聚类。在一些实施方案中，所述抗体包含变体Fc区，相对于具有相应的非变体形式的Fc区的抗体，表现出增加的激动活性。在一些实施方案中，所述抗体共刺激T细胞。在一些实施方案中，所述变体Fc区是变体IgG1 Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区具有267E突变(SE)、S267E/L328F突变(SELF)、G237D/P238D/P271G/A330R突变、E233D/P238D/H268D/P271G/A330R突变、G237D/P238D/H268D/P271G/A330R突变，或E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R突变。下面描述了用于改变效应子功能的Fc区的其他示例性修饰。
可以在Fc区进行修饰以产生Fc变体，其相对于亲本Fc，(a)具有增加的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，(b)具有增加的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，(c)具有增加的补体介导的细胞毒性(CDC)，(d)具有增加的对C1q的亲和力，和/或(e)具有增加的对Fc受体的亲和力。此类Fc区变体通常在Fc区中包含至少一个氨基酸修饰。组合的氨基酸修饰被认为是特别需要的。例如，变体Fc区可以在其中包括：两个、三个、四个、五个等替换，例如本文确定的特定Fc区位置的替换。
在一些实施方案中，通过用不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基替换，使得抗体对效应子配体具有改变的亲和力但保留了亲本抗体的抗原结合能力。亲和力改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的Cl组分。这种方法详细描述于Winter et.al.的美国专利US5,624,821和US5,648,260中。
在一些实施方案中，可以通过修饰以下位置的一个或多个氨基酸来修饰Fc区以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或增加对Fcγ受体的亲和力：234、235、236、238、239、240、241、243、244、245、247、248、249、252、254、255、256、258、262、263、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、299、301、303、305、307、309、312、313、315、320、322、324、325、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、433、434、435、436、437、438或439。示例性替换包括：236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D和332E。示例性替换的组合包括239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T和267E/268F/324T。用于增强FcyR和补体相互作用的其他修饰包括但不限于以下替换：298A、333A、334A、326A、247I、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、305I和396L。这些修饰和其他修饰综述于：Strohl et.al.,Current Opinionin Biotechnology 2009；20:685-691。
增加与Fcγ受体结合的Fc修饰包括：在Fc区的以下氨基酸位置中任意一个或多个位置的氨基酸修饰：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、279、280、283、285、298、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、312、315、324、327、329、330、335、337、3338、340、360、373、376、379、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，其中Fc区中残基的编号是如Kabat中EU指数的编号(WO00/42072)。
也可以使用增强对抑制性受体FcyRllb的亲和力的Fc变体。此类变体可以提供具有与FcyRllb+细胞相关的免疫调节活性的Fc融合蛋白，包括例如B细胞和单核细胞。在一个实施方案中，相对于一种或多种活化受体，所述Fc变体提供对FcyRllb的选择性增强的亲和力。根据EU指数，用于改变与FcyRllb结合的修饰，包括选自下述位置处的一个或多个修饰：234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328和332。用于增强FcyRllb亲和力的示例性替换，包括但不限于：234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y和332E。用于增强与FcyRllb结合的其他Fc变体包括：235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268E和267E/328F。
Fc区与其配体的亲和力和结合特性，可以通过本领域已知的多种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定)来确定，包括但不限于：平衡方法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA))，或动力学(例如，BIACORE分析)，以及其他方法，如间接结合测定、竞争性抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱法(例如，凝胶过滤)。这些方法和其他方法可以利用被检查的一种或多种成分上的标记和/或采用多种检测方法，包括但不限于：显色、荧光、发光或同位素标记。结合亲和力和动力学的详细描述，可以参见Paul,W.E.,ed.,Fundamental Immunology,4th Ed.,Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)，其重点是抗体-免疫原相互作用。
在某些实施方案中，对抗体进行修饰以增加其生物半衰期。例如，这可以通过突变残基252、254、256、433、435和436中的一个或多个以增加Fc区对FcRn的结合亲和力来实现，如在美国专利US6,277,375所描述的。具体的示例性替换包括以下的一种或多种：T252L、T254S和/或T256F。或者，为了增加生物半衰期，可以在CH1或CL区内对抗体进行改变，以包含取自IgG的Fc区CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta et.al.在美国专利US5,869,046和US6,121,022中描述的。增加与FcRn的结合和/或提高药代动力学特性的其他示例性变体，包括在259、308、428和434位置处的替换，包括例如259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y和434M。增加Fc与FcRn结合的其他变体包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton et.al.,2004,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216,Hintonet.al..2006Journal of Immunology 176:346-356)、256A、272A、286A、305A、307A、307Q、311A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shields et.al.,Journal of BiologicalChemistry,2001,276(9):6591-6604)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、311S、433R、433S、433I、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S(Dall Acqua et.al..Journal of Immunology,2002,169:5171-5180,Dall'Acqua et.al.,2006,Journal of Biological Chemistry281:23514-23524)。用于调节FcRn结合的其他修饰描述于Yeung et.al.,2010,J Immunol,182:7663-7671。
已经对人IgGl上FcγRl、FcγRII、FcγRII和FcRn的结合位点进行了绘制，已经描述了具有提高结合的变体(参见Shields,R.L.et.al.(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。在位置256、290、298、333、334和339处的特定突变显示出提高了与FcγRIII的结合。此外，以下组合突变体显示出提高了FcγRIII结合和ADCC活性：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A(Shields et.al.，同上)。已经确定了与FcγRIIIa结合强烈增强的其他IgG1变体，包括具有S239D/I332E突变和S239D/I332E/A330L突变的变体，这些变体显示在食蟹猴中对FcγRIIIa亲和力的增加最大、FcγRIIb结合的减少和细胞毒活性强(Lazar et.al.，2006)。将三重突变引入抗体，如阿仑单抗(CD52特异性)、曲妥珠单抗(HER2/neu特异性)、利妥昔单抗(CD20特异性)和西妥昔单抗(EGFR特异性)，在体外转化为大大增强的ADCC活性，并且S239D/I332E变体显示出增强的消耗猴子B细胞的能力(Lazar et.al.，2006)。此外，在B细胞恶性肿瘤和乳腺癌模型中表达人FcγRIIIa的转基因小鼠中，已确定出含有L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L突变的IgG1突变体，其表现出与FcγRIIIa结合增强并伴随增强的ADCC活性(Stavenhagen et al.,2007；Nordstrom etal.,2011)。可以使用的其他Fc突变体包括：S298A/E333A/L334A、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L和M428L/N434S。
在另一个实施方案中，对抗体的糖基化进行修饰。例如，可以制备非糖基化抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以进行一个或多个氨基酸替换，其导致一个或多个可变区框架糖基化位点的消除，从而消除该位点的糖基化。此方法在Co et.al.的美国专利US5,714,350和US6,350,861中进一步详细描述。在一个实施方案中，可以通过将N297残基突变为另一残基例如N297A，和/或通过突变相邻氨基酸例如298，来防止N297上恒定区的糖基化，从而减少N297上的糖基化。
另外或或者，可以制备具有改变的糖基化类型抗体，如具有减少的岩藻糖基残基量的低岩藻糖基化抗体，或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已证明此类改变的糖基化模式增加了抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来完成。本领域已经描述了具有改变的糖基化机制的细胞，并且可以将其用作宿主细胞以在其中表达重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。在一些实施方案中，可以进行突变以恢复无糖基化抗体中的效应子功能，例如，如美国专利US8,815,237中所描述的。示例性突变包括：E269D、D270E、N297D、N297H、S298A、S298G、S298T、T299A、T299G、T299H、K326E、K326I、A327E、A327Y、L328A和L328G。
变体Fc区还可以包含序列改变，其中参与二硫键形成的氨基酸被去除或被其他氨基酸替换。这种去除可以避免与用于产生抗体的宿主细胞中存在的其他含半胱氨酸的蛋白质发生反应。即使去除了半胱氨酸残基时，单链Fc结构域仍可形成非共价结合在一起的二聚Fc结构域。
IV.与抗-TNFR2抗体结合相同表位或与之竞争的抗体
还提供了与本文所述的抗-TNFR2抗体相比，结合TNFR2上相同表位的抗体。在一些实施方案中，所述抗体与本文所述的抗-TNFR2抗体竞争结合TNFR2。
可以使用标准结合测定法(例如ELISA、Biacore)，基于它们与本文所述的抗-TNFR2抗体交叉竞争的能力来筛选交叉竞争抗体。
用于确定与本文所述的抗体相比结合“TNFR2上的相同表位”抗体的技术，包括对抗原：抗体复合物晶体的X射线分析，这提供了表位的原子分辨率。其他方法监测抗体与抗原片段或抗原突变体的结合，其中由于抗原序列内的氨基酸修饰而导致的结合丧失表明了表位成分。方法也可能依赖于目标抗体亲和组合噬菌体展示肽文库或靶蛋白的蛋白酶消化物中分离的特定短肽(天然三维形式或变性形式)的能力。然后将肽视为对应于用于筛选肽文库的抗体的表位定义的先导。对于表位作图，还开发了计算算法，这些算法已被证明可以对构象不连续表位进行作图。
还可以通过筛选与跨越TNFR2的一系列重叠肽的结合来确定表位或包含该表位的区域。或者，Jespers et.al.(1994)Biotechnology 12:899的方法，可用于指导选择具有相同表位并因此与本文所述的抗-TNFR2抗体具有相似特性的抗体。使用噬菌体展示，首先，将抗-TNFR2抗体的重链与全部(例如，人的)轻链配对以选择TNFR2结合抗体，然后将新的轻链与全部(例如，人的)重链配对以选择与本文所述的抗-TNFR2抗体具有相同表位或表位区的(例如，人)TNFR2结合抗体。或者，可通过诱变编码抗体重链和轻链的cDNA序列来获得本文所述抗体的变体。
如Cunningham&Wells(1989)Science 244:1081所描述的丙氨酸扫描诱变，或TNFR2中氨基酸残基的一些其他形式的点诱变，也可用于确定抗-TNFR2抗体的功能表位。
也可以通过评估抗体与包含TNFR2片段的肽的结合，来确定被特异性抗体结合的表位或表位区(“表位区”是包含表位或与该表位重叠的区)。可以合成包含TNFR2序列的一系列重叠肽，并筛选结合，例如在直接ELISA，竞争性ELISA(其中评估了所述肽防止抗体与结合到微量滴定板孔的TNFR2结合的能力)中，或在芯片上。此类肽筛选方法可能无法检测一些不连续的功能表位，即涉及沿TNFR2多肽链的主要序列不连续的氨基酸残基的功能表位。
表位也可以通过基于MS的蛋白质足迹法来确定，如HDX-MS和蛋白质的快速光化学氧化(FPOP)。可以进行HDX-MS，例如，如Wei et.al..(2014)Drug Discovery Today 19:95进一步所描述的，其方法通过引用特别地并入本文。可以例如，如Hambley&Gross(2005)J.American Soc.Mass Spectrometry 16:2057所描述的进行FPOP，其方法通过引用特别地并入本文。
由抗-TNFR2抗体结合的表位也可以通过结构方法确定，如X射线晶体结构确定(例如，WO2005/044853)、分子建模和核磁共振(NMR)光谱法，包括当TNFR2中不稳定酰胺氢游离时以及结合含有目标抗体的复合物时，NMR测定TNFR2中不稳定酰胺氢的H-D交换的的比率(Zinn-Justin et.al.(1992)Biochemistry 31:11335；Zinn-Justin et.al.(1993)Biochemistry 32:6884)。
V.核酸分子
本文还提供了编码本文所述抗体的核酸分子。所述核酸可以存在于全细胞中、细胞裂解物中，或者以部分纯化的或基本上纯的形式存在。本文所述的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以包含也可以不包含内含子序列。在某些实施方案中，所述核酸是cDNA分子。可以使用标准分子生物学技术获得本文所述的核酸。对于由杂交瘤(例如，如下文进一步描述的由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，可以通过标准PCR扩增技术或cDNA克隆技术获得编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库(例如，使用噬菌体展示技术)获得的抗体，可以从文库中回收编码所述抗体的核酸。
在一些实施方案中，本文提供了编码本文所述的任何抗-TFNR2抗体的VH和/或VL序列或重链和/或轻链序列的核酸分子。包含本文所述的核苷酸序列(例如，核酸分子)的宿主细胞包括在本文中。
一旦获得编码VH区段和VL区段的DNA片段，就可以通过标准重组DNA技术将这些DNA片段进一步操作，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白(如抗体恒定区或柔性接头)的另一DNA片段可操作地连接。在上下文中使用的术语“可操作连接”旨在表示两个DNA片段连接以使得由这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内。
通过将编码VH的DNA与另一个编码重链恒定区(铰链、CH1、CH2和/或CH3)的DNA分子可操作地连接，可以将编码VH区的分离的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat,E.A.,el al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242)，且包含这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。
通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一个DNA分子可操作地连接，可以将编码VL区的分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat,E.A.,el al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242)，且包含这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
本文还提供具有保守替换的核酸分子，所述保守替换在核酸分子翻译时不改变所得氨基酸序列。
VI.筛选和生产抗体的方法
本文提供的抗-TNFR2抗体(例如，抗-人TNFR2抗体)通常通过标准重组DNA技术制备。此外，可以使用多种已知技术生产单克隆抗体，如标准体细胞杂交技术、B淋巴细胞的病毒或致癌转化，或使用人抗体基因文库的酵母或噬菌体展示技术。在特定实施方案中，抗体是全人单克隆抗体。
在一个实施方案中，本文提供了用于产生单克隆抗-人TNFR2抗体的方法。单克隆抗体可以使用众所周知的技术容易地制备(参见，例如，Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988；通过引用并入本文)。通常，该技术包括用缀合至载体蛋白(例如，KLH、牛血清白蛋白)的所选多肽(例如，人TNFR2的胞外结构域，或包括目标人TNFR2表位的多肽)免疫合适的动物。
以有效刺激产生抗体的细胞的方式，施用所述免疫组合物。啮齿动物如小鼠和大鼠是优选的，然而，也可以使用兔、绵羊和青蛙细胞。使用大鼠可以提供某些优势(Goding,1986,pp.60-61；通过引用并入本文)，但优选小鼠，最优选BALB/c小鼠，因为这是最常用的，并且通常具有较高的稳定融合的百分比。免疫后，选择B淋巴细胞(B细胞)用于抗体生成方案。这些细胞可以从活检的脾脏、扁桃体或淋巴结中获得，也可以从外周血样品中获得。通常对一组动物进行免疫，将去除抗体滴度最高的动物的脾脏，然后通过将脾脏用注射器匀浆脾脏获得淋巴细胞。然后将来自免疫动物的产生抗-人TNFR2抗体的B淋巴细胞与永生骨髓瘤细胞的细胞融合，该细胞通常是与被免疫动物相同物种的细胞。适用于产生杂交瘤的融合程序的骨髓瘤细胞系，优选地不产生抗体并具有高融合效率和酶缺陷，这使得其不能在仅支持所需融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择性培养基中生长。示例性骨髓瘤细胞包括，例如，用于小鼠的P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0 Bul；用于大鼠的R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F、4B210或以上列出的小鼠细胞系之一；以及U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6，均可用于与人类细胞融合相关的。
生产杂交瘤
产生抗体产生脾或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂交体的方法，通常包括：在促进细胞膜融合的一种或多种药剂(化学或电学)的存在下，将体细胞与骨髓瘤细胞以4:1的比例混合(尽管该比例可分别从约20:1至约1:1变化)。使用仙台病毒或聚乙二醇(PEG)如37％(v/v)PEG的融合方法是本领域已知的。使用电诱导融合方法也是合适的。
通过在通常含有在组织培养基中阻断核苷酸从头合成的药剂的选择性培养基中进行培养，可将有活力的融合杂交体与亲代未融合细胞区分开来。示例性药剂是氨基蝶呤、甲氨蝶呤和重氮丝氨酸。如果使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤，则培养基中补充有次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸来源(HAT培养基)。如果使用重氮丝氨酸，则培养基中补充有次黄嘌呤。当使用HAT培养基时，只有能够操作核苷酸补救途径的细胞才能在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞缺乏补救途径的关键酶，例如次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，因此无法存活。可以在选择性培养基中存活的唯一细胞是由骨髓瘤和B细胞形成的那些杂交体。该培养过程提供了从中选择特定杂交瘤的杂交瘤群体。通常，杂交瘤的选择按如下进行：在微量滴定板中通过单克隆稀释培养细胞，然后测试分别的克隆上清液(大约两到三周后)是否具有所需的抗-人TNFR2反应性。示例性测定包括放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬斑测定、点免疫结合测定、生物膜层干涉技术等。
将所选的杂交瘤进行连续稀释，并克隆到产生抗-人TNFR2抗体的单独的细胞系中，然后可以无限地繁殖这些克隆以提供单克隆抗体。所述细胞系可以两种基本方式用于生产单克隆抗体。可以将杂交瘤样品注射(通常注入腹腔)到用于为原始融合提供体细胞和骨髓瘤细胞的组织相容性动物类型中。被注射的动物会产生肿瘤，其分泌由融合的细胞杂交体产生的特定单克隆抗体。然后可以采用动物的体液，例如血清或腹水，以提供高浓度的单克隆抗体。也可以在体外培养所述单独的细胞系，其中单克隆抗体自然分泌到培养基中，很容易从中获得高浓度的单克隆抗体。通过任一方式产生的单克隆抗体通常将进一步纯化，例如使用过滤、离心和各种色谱方法，如HPLC或亲和色谱，所有这些纯化技术是本领域技术人员众所周知的。这些纯化技术均涉及分级分离，以将所需抗体与混合物的其他成分分离。特别适用于制备抗体的分析方法，包括例如蛋白A-琼脂糖和/或蛋白G-琼脂糖层析法。
抗-TNFR2抗体的高通量筛选
本文还提供了高通量筛选结合人TNFR2表位(例如，本文所述的抗-TNFR2抗体识别的相同表位)的分子文库的方法，例如，噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物展示、核糖体展示、mRNA展示和cDNA展示。
在一个实施方案中，本文提供了使用噬菌粒文库筛选抗-人TNFR2抗体的方法。示例性噬菌体展示方案，可参见例如US7,846,892、US8,846,867、WO1997/002342和WO2007/13291，其通过引用并入本文。现在，重组技术允许由编码一系列抗体的重组基因来制备具有所需特异性的抗体。某些重组技术涉及通过对组合免疫球蛋白噬菌体表达文库的免疫学筛选来分离抗体基因，所述组合免疫球蛋白噬菌体表达文库是由从免疫动物(例如，用人TNFR2的胞外结构域或包含目标人TNFR2表位的肽进行免疫的动物)的脾脏中分离的RNA制备的。对于此类方法，组合免疫球蛋白噬菌粒文库由从免疫动物脾脏中分离的RNA制备，并通过使用表达抗原的细胞和对照细胞进行淘选(panning)来选择表达合适抗体的噬菌粒。与常规杂交瘤技术相比这种方法优势在于，在单轮中可以产生和筛选的抗体数量大约为104倍，并且通过H链和L链组合产生新的特异性，这进一步增加了产生的合适抗体的百分比。
一种在细菌中生产大量多样抗体分子的方法，利用噬菌体λ作为载体(Huseet.al.,1989；通过引用并入本文)。使用λ载体产生抗体涉及将DNA序列的重链群体和轻链群体克隆到单独的起始载体中。随后将所述载体随机组合以形成指导重链和轻链的共表达以形成抗体片段的单一载体。重链DNA序列和轻链DNA序列是由mRNA通过扩增，优选通过PCR或相关扩增技术获得的，所述mRNA是从已用选定抗原(例如，人TNFR2的胞外结构域或包含目标人TNFR2表位的肽)免疫的动物的脾细胞(或其杂交瘤)中分离的。所述重链序列和轻链序列通常使用引物进行扩增，所述引物将限制性位点并入扩增的DNA区段的末端，以便将重链区段和轻链区段克隆到起始载体中。
用于产生和筛选完全或部分合成的抗体结合位点或互补位的大型文库的另一种方法，是利用源自丝状噬菌体(如M13、fl或fd)的展示载体。这些丝状噬菌体展示载体，称为“噬菌粒”，产生具有多样和新颖免疫特异性的单克隆抗体的大型文库。所述技术使用丝状噬菌体外壳蛋白膜锚定结构域作为在丝状噬菌体复制组装阶段连接基因产物和基因的手段，并已用于克隆和表达来自组合文库的抗体。通常意义上，该方法提供了一种使用单个载体系统从抗体基因库中同时克隆和筛选预选的配体结合特异性的系统。针对预选的配体结合能力筛选文库的分离的成员，允许将表达的抗体分子的结合能力与从文库中分离编码该成员的基因的便利手段相关联。
基于丝状噬菌体的组合抗体文库的多样性，可以通过下述手段增加：改组重链基因和轻链基因、改变文库的克隆重链基因的一个或多个互补决定区、或通过易错聚合酶链反应将随机突变引入文库。用于筛选噬菌粒文库的另外的方法，描述于美国专利US5,580,717、US5,427,908、US5,403,484和US5,223,409，其各自通过引用并入本文。
在另一个实施方案中，本文提供了使用基于细胞的展示技术，如酵母展示(Boderet.al.,Nat Biotechnol 1997；15:553)和细菌展示来筛选抗-人TNFR2抗体的方法。产生和筛选表达含有随机化高变区的多肽(如单链多肽、抗体或抗体片段)的细菌细胞或酵母细胞的文库的既定程序，可参见例如美国专利US7,749,501、US2013/0085072、de Bruinet.al.,Nat Biotechnol 1999；17:397；其各自的教导通过引用并入本文。
在另一个实施方案中，本文提供了使用核苷酸展示技术来筛选抗-人TNFR2抗体的方法，所述方法使用编码单链多肽、抗体或抗原结合片段的随机化多核苷酸文库的体外翻译，所述单链多肽、抗体或抗原结合片段在指定的高变区内含有突变(参见，例如，WO2006/072773，美国专利US7,074,557)。也可以使用cDNA展示(一种类似于mRNA展示的技术)产生抗体，不同之处在于使用的是cDNA而不是mRNA。cDNA展示技术描述于，例如，Uenoet.al.Methods Mol.Biol.2012；805:113-135。
上述体外展示技术也可用于提高本文所述抗-TNFR2抗体的亲和力。例如，可以使用在特定抗-TNFR2抗体的高变区内特定位点具有靶向突变的单链多肽、抗体及其抗原结合片段的文库。然后可将编码这些突变抗体或其抗原结合片段的多核苷酸用于核糖体展示、mRNA展示、cDNA展示，以筛选与目标人TNFR2表位特异性结合的多肽。
还可以筛选多肽的组合文库，以确定与目标人TNFR2表位结合的抗-TNFR2抗体。组合多肽文库(如抗体或抗体片段文库)，可以例如通过使用本领域公认的基因表达技术在真核细胞或原核细胞中表达编码抗体或其抗原结合片段的随机化高变区的多核苷酸来获得。可以使用标准技术从细胞中分离所得的异质抗体混合物，并针对其与由固定在表面的TNFR2衍生的肽结合的能力进行筛选。使用合适的缓冲液洗掉未结合的抗体，可以使用基于ELISA的检测方案检测保持结合的抗体。与TNFR2肽特异性结合的抗体片段的序列，可以通过本领域已知的技术来确定，包括例如埃德曼降解、串联质谱、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)、核磁共振(NMR)和2D凝胶电泳等(参见例如，WO2004/062553)。
使用重组DNA技术、宿主细胞转染瘤和转基因动物产生抗-TNFR2抗体
本文还提供了使用例如本领域已知的重组DNA技术和基因转染方法的组合，在宿主细胞转染瘤中产生抗-人TNFR2抗体的方法(Morrison,S.(1985)Science 229:1202)。例如，为了表达抗体或其抗体片段，编码部分或全长轻链和重链的DNA可以通过标准分子生物学技术(例如使用表达目标抗体杂交瘤(如上述那些)的PCR扩增或cDNA克隆)，并且可以将DNA插入表达载体中，从而使基因与转录控制序列和翻译控制序列可操作地连接。在本文中，术语“可操作地连接”是指将抗体基因连接到载体中，使得载体内的转录控制序列和翻译控制序列发挥其调节抗体基因转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达控制序列以与所使用的表达宿主细胞相容。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入不同的载体，或者将两种基因插入相同的表达载体。通过标准方法(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补限制性位点，或者如果不存在限制性位点，则平端连接)，将抗体基因插入表达载体。本文描述的抗体的轻链可变区和重链可变区，通过下述方法可以用于创建任何抗体同种型的全长抗体基因：将它们插入已经编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH区段与载体内的CH区段可操作地连接，并且VL区段与载体内的CL区段可操作地连接。
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。尽管有可能在原核宿主细胞或真核宿主细胞中表达本文所述的抗体，但最优选在真核细胞，最优选哺乳动物宿主细胞中表达抗体，因为此类真核细胞，特别是哺乳动物细胞比原核细胞更可能组装和分泌适当折叠且具有免疫活性的抗体。用于表达本文所述重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞，包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfir-CHO细胞，描述于Urlaub and Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220,其与DHFR选择性标记一起使用，例如，如在R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621所描述的)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养一段时间(足以允许抗体在宿主细胞中表达或更优选地将抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基中)来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
在又一个实施方案中，可以使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠，产生针对人TNFR2上特定表位的人单克隆抗体(参见例如，Lonberg和Kay的美国专利US5,545,806；US5,569,825；US5,625,126；US5,633,425；US5,789,650；US5,877,397；US5,661,016；US5,814,318；US5,874,299和US5,770,429；Surani et.al.的美国专利US5,545,807；Lonberg和Kay的PCT公开WO92/03918、WO93/12227、WO94/25585、WO97/13852、WO98/24884和WO99/45962；以及Korman et.al.的PCT公开WO01/14424)。
在另一个实施方案中，可以使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠，产生针对人TNFR2特定表位(例如被本文所述的抗-TNFR2识别的相同表位)的人抗体(参见例如Ishida et.al.的PCT公开WO02/43478)。
更进一步，表达人免疫球蛋白基因的替代性转基因动物系统在本领域是可用的，并且可用于产生识别特定人TNFR2表位(例如，被本文所述的抗-TNFR2抗体识别的相同表位)的抗-人TNFR2抗体。例如，可以使用一种称为Xenomouse(Abgenix,Inc.)的替代性转基因系统；此类小鼠描述于例如Kucherlapati et.al.的美国专利US5,939,598；US6,075,181；US6,114,598；US6,150,584和US6,162,963。另一种合适的转基因动物系统是HuMAb小鼠(Medarex,Inc)，其包含编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，以及使内源性μ和κ链失活的靶向突变基因座(参见例如，Lonberget.al.(1994)Nature 368(6474):856-859)。另一种合适的转基因动物系统是KM小鼠，其详细描述于PCT公开WO02/43478中。
表达人免疫球蛋白基因的替代性转染色体动物系统是本领域可用的，并且可用于产生抗-TNFR2抗体。例如，可以使用携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠。此外，本领域已经描述了携带人重链和轻链转染色体的牛，它们可用于产生抗-TNFR2抗体。
在又一个实施方案中，可以使用产生此类抗体的转基因植物和/或培养的植物细胞(例如烟草、玉米和浮萍)来制备抗体。例如，通过例如使用诱导型启动子，表达抗体的转基因烟草叶可用于产生此类抗体。此外，转基因玉米可用于表达此类抗体及其抗原结合部分。抗体还可以从包含抗体部分如单链抗体(scFv's)的转基因植物种子中大量产生，例如，使用烟草种子和马铃薯块茎。
在上述实施方案中，用于免疫动物的抗原可以是例如人TNFR2的胞外结构域。当人TNFR2的胞外结构域用作抗原时，将针对选择性结合人TNFR2上的特定表位(例如，被本文所述的抗-TNFR2抗体识别的相同表位)的能力来进一步筛选产生的抗体。可以进行筛选，例如使用测定(例如ELISA)评估与包括目标人TNFR2表位的肽的结合，或使用本文所述的TNFR2嵌合体进行结合测定。然后选择具有本文所述抗-TNFR2抗体的表位或TNFR2嵌合体结合特征的抗-人TNFR2抗体。
在另一个实施方案中，用于免疫动物的抗原或用于筛选文库(例如，噬菌粒文库、酵母表面展示文库)的靶标，是包含被本文所述的抗-TNFR2抗体识别的人TNFR2表位的肽。包含这些序列的肽可用于使用上面列出的技术来免疫动物或筛选文库。可以针对选择性结合用作免疫原的肽，来筛选使用这种方法产生的抗-人TNFR2抗体。
产生人源化和/或嵌合TNFR2抗体
嵌合和/或人源化抗体可以基于鼠单克隆抗体的序列(如本文所述的那些)生产。可以从目标鼠杂交瘤获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并使用标准分子生物学技术将其改造成包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。
例如，嵌合抗体及其抗原结合片段包含来自两种或更多种不同物种(例如，小鼠和人)的部分。为了创建嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠可变区连接到人恒定区(参见例如，Cabilly et.al.的美国专利US4,816,567)。以这种方式，可以修饰非人抗体以使其更适合于人类临床应用(例如用于治疗或预防人类受试者癌症的方法)。
或者，人源化抗体是来自非人类物种的抗体，其蛋白质序列已被修饰以增加其与人类天然产生的抗体变体的相似性。人源化或CDR移植的mAb特别适用于治疗人类的治疗剂，因为它们不像小鼠抗体那样迅速从循环中被清除，并且通常不会引起不良的免疫反应。
制备人源化抗体的方法是本领域众所周知的。例如，基本上可以按照Winter和同事的方法进行人源化(Jones et.al.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et.al.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen et.al.,Science,239:1534-1536(1988))。此外，本文所述的人源化TNFR2抗体可以使用本领域已知的多种技术产生，包括但不限于：CDR移植(参见例如，欧洲专利EP 239,400；国际公开WO 91/09967；和美国专利US4,816,567、US6,331,415、US5,225,539、US5,530,101和US5,585,089，在此通过引入并入本文)，镶饰或重塑(参见例如，欧洲专利EP592,106和EP519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka et.al.,1994,Protein Engineering,7(6):805-814；和Roguskaet.al.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.,91:969-973，其各自均通过引用并入本文)，链改组(参见例如，美国专利US5,565,332，其通过引用并入本文)，以及在以下文献中公开的技术，例如美国专利US6,407,213、US5,766,886，国际公开WO 9317105，Tan et.al.,J.Immunol.,169:1119-25(2002),Caldas et.al.,Protein Eng.,13(5):353-60(2000),Morea et.al.,Methods,20(3):267-79(2000),Baca et.al.,J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997),Roguska et.al.,Protein Eng.,9(10):895-904(1996),Couto et.al.,Cancer Res.,55(23Supp):5973s-5977s(1995),Couto et.al.,Cancer Res.,55(8):1717-22(1995),Sandhu J S,Gene,150(2):409-10(1994)，以及Pedersen et.al.,J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994)，其各自均通过引用并入本文。通常，FW区中的框架(FW)残基将被来自CDR供体抗体的相应残基替换，以改变(优选提高)抗原结合。这些FW替换是通过本领域众所周知的方法确定的，例如，通过对CDR和FW残基的相互作用进行建模以确定对抗原结合重要的FW残基，以及通过序列比较以确定特定位置的异常FW残基。(参见例如，Queen et.al.，美国专利US5,585,089；以及Riechmann et.al.,1988,Nature,332:323，其通过引用整体并入本文。)
在一些实施方案中，非人抗体的人源化形式是人抗体(接受者抗体)，其中接受者抗体的高变(CDR)区残基被来自非人物种(供体抗体)如具有所需特异性、亲和力和结合能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区残基也被相应的非人残基替换(所谓的“回复突变”)。此外，噬菌体展示文库可用于改变抗体序列中所选位置的氨基酸。人源化抗体的特性也受人框架选择的影响。此外，可以修饰人源化抗体和/或嵌合抗体以包含在接受者抗体或供体抗体中未发现的残基，以进一步改善抗体特性，例如亲和力或效应子功能。
在此类人源化嵌合抗体中，基本上少于完整的人可变域被来自非人类物种的相应序列替换。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FW残基被来自于啮齿动物抗体中类似位点的残基替换。抗-TNFR2抗体的人源化也可以通过镶饰或重塑(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka et.al.,Protein Engineering,7(6):805-814(1994)；和Roguska et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,91:969-973(1994))，或链改组(美国专利5,565,332)来实现，其内容通过引用整体并入本文。
用于制备人源化抗体的人可变结构域(重链和轻链)的选择，是为了降低抗原性。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域序列。然后筛选与啮齿动物序列最密切相关的人序列中是否存在特定残基，所述特定残基对抗原结合、适当结构形态和/或预期人源化mAb稳定性至关重要(Simset.al.,J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia et.al.,J.Mol.Biol.,196:901(1987)，其内容通过引用整体并入本文)。然后将得到的符合所需标准的FW序列用作人源化抗体的人供体FW区。
另一种方法使用源自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定FW。相同的FW可用于几种不同的人源化抗-TNFR2抗体(Carter et.al..,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta et.al.,J.Immunol.,151:2623(1993)，其内容通过引用整体并入本文)。
抗-TNFR2抗体可以人源化，同时保留对人TNFR2的高亲和力和其他有利的生物学特性。根据本发明的一个方面，人源化抗体是使用亲本序列和人源化序列的三维模型，通过分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备。三维免疫球蛋白模型是普遍可用的，并且是本领域技术人员熟悉的。可用计算机程序来说明和显示所选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合TNFR2的能力的残基。以这种方式，可以从接受者和导入序列中选择和组合FW残基，从而实现所需的抗体特征，例如对TNFR2的亲和力。一般而言，CDR残基直接且最基本上参与影响抗原结合。
使用包括本文公开的技术在内的任何技术制备的结合TNFR2的单克隆抗体(或其部分)的结合特异性，可以通过免疫沉淀或体外结合测定确定，如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、生物膜层干涉技术(例如ForteBio测定)和/或Scatchard分析。
在某些实施方案中，可以使用本领域公认的技术如本文所述的那些，进一步改变或优化使用上述任何方法产生的抗-TNFR2抗体，以实现所需的结合特异性和/或亲和力。
VII.多特异性抗体
本文提供的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)至少包括对本文所述的TNFR2(例如，人TNFR2)的结合亲和力，以及至少一种其他结合特异性。多特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2抗体)。
制备多特异性抗体的方法是本领域众所周知的(参见例如，WO 05117973和WO06091209)。例如，全长多特异性抗体的产生可以基于两条配对的免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两条链具有不同的特异性。还描述了直接从重组细胞培养物中制备和分离多特异性抗体片段的各种技术。例如，可以使用亮氨酸拉链产生多特异性抗体。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备多特异性抗体片段的另一种策略。
在一个特定的实施方案中，多特异性抗体包含第一抗体(或其结合部分)，其与衍生或连接至另一种功能分子，例如另一种肽或蛋白质(例如，另一种抗体或受体的配体)的TNFR2上的目标表位结合，以产生与TNFR2上的表位和另一个靶分子结合的多特异性分子。抗体可以衍生或连接至一种以上的其他功能分子，以产生与两种以上不同结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子。为了创建多特异性分子，本文公开的抗体可以功能性连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)至一个或更多个其他结合分子(如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)，从而产生多特异性分子。
因此，考虑了包含针对TNFR2(例如，人TNFR2)上的特定表位的至少一个第一结合特异性和针对另一靶表位的第二结合特异性的多特异性分子。在一个特定的实施方案中，第二靶表位是Fc受体，例如人FcγRI(CD64)或人Fcα受体(CD89)。因此，还提供了能够结合表达FcγR、FcαR或FcεR的效应细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))和表达TNFR2的靶细胞的多特异性分子。这些多特异性分子将表达TNFR2的细胞靶向效应细胞，并触发Fc受体介导的效应细胞活性，如表达TNFR2的细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放或超氧阴离子的产生。
在一个实施方案中，所述多特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段作为结合特异性，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv。所述抗体也可以是轻链或重链二聚体，或其任何最小片段，如Fv或单链构建体，其描述于Ladner et.al.的美国专利US4,946,778。
可以使用本领域已知的方法通过缀合成分结合特异性，例如抗-FcR和抗-TNFR2结合特异性来制备所述多特异性分子。例如，所述多特异性分子的每种结合特异性可以分别产生，然后彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，多种偶联剂或交联剂可用于共价缀合。交联剂的实例包括：蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯撑二马来酰亚胺(oPDM)、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)。优选的缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)获得。
当结合特异性是抗体时，它们可以通过两条重链的C末端铰链区的巯基键合进行缀合。在一个特别优选的实施方案中，在缀合之前，将铰链区修饰为含有奇数个巯基残基，优选一个。
或者，两种结合特异性都可以在相同的载体中编码，并在相同的宿主细胞中表达和组装。当多特异性分子是mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab')2或配体x Fab融合蛋白时，该方法特别有用。多特异性分子可以是包含一个单链抗体和一个结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。多特异性分子可包含至少两个单链分子。制备多特异性分子的方法，描述于例如，美国专利US5,260,203；美国专利US5,455,030；美国专利US4,881,175；美国专利US5,132,405；美国专利US5,091,513；美国专利US5,476,786；美国专利US5,013,653；美国专利US5,258,498；以及美国专利US5,482,858。
多特异性分子与其特异性靶标的结合，可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定来确认。这些测定中的每一个通常通过使用对目标复合物具有特异性的标记试剂(例如，抗体)，来检测特定目标蛋白-抗体复合物的存在。例如，可以使用例如识别并特异性结合抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测FcR-抗体复合物。或者，可以使用多种其他免疫测定法中的任何一种来检测所述复合物。例如，所述抗体可以被放射性标记，并用于放射免疫测定(RIA)。可通过使用αγ-β计数器或闪烁计数器的方法或通过放射自显影来检测放射性同位素。
VIII.免疫缀合物
可以通过将本文所述的抗体(例如，抗-人TNFR2抗体)与另一种治疗剂缀合来形成本文提供的免疫缀合物。合适的试剂包括：例如细胞毒素剂(例如化疗剂)、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)和/或放射性同位素(即，放射性缀合物)。
可使用的酶活性毒素及其片段包括：白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-八叠球菌、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆素蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、丝林霉素(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、新霉素和单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。细胞毒素或细胞毒剂的其他实例包括：例如紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂包括但不限于：抗代谢药(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺(5-fluorouracil decarbazine))、烷化剂(例如氮芥、硫喷妥苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类药物(例如，柔红霉素(原来的道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，更生霉素(原来的放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。
多种放射性核素可用于产生放射性偶联缀合的抗-TNFR2抗体。实例包括：212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
免疫缀合物也可用于改变给定的生物应答，并且药物部分不应解释为仅限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽(例如淋巴因子、肿瘤坏死因子、IFNγ、生长因子)。
可以使用多种双功能蛋白质偶联剂制备免疫缀合物，如3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(iminothiolane，IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛(glutareldehyde))、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。碳-14-标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂(参见例如，WO94/11026)。
将此类治疗部分与抗体缀合的技术是众所周知的，参见例如，Arnon et al.,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy",inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld et al.(eds.),pp.243-56(AlanR.Liss,Inc.1985)；Hellstrom et al.,"Antibodies For Drug Delivery",inControlled Drug Delivery(2nd Ed.),Robinson et al.(eds.),pp.623-53(MarcelDekker,Inc.1987)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy:A Review",in Monoclonal Antibodies'84:Biological And ClinicalApplications,Pinchera et al.(eds.),pp.475-506(1985)；"Analysis,Results,AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy",in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin etal.(eds.),pp.303-16(Academic Press 1985),以及Thorpe et al.,"The PreparationAnd Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates",Immunol.Rev.,62:119-58(1982)。
IX.测定
在产生抗体(例如，具有本文公开的抗-TNFR2抗体的CDR序列的抗体)之后，可以使用本领域已知的多种测定筛选或测试它们的各种特性，如本文所述的那些(例如，与TNFR2的结合)。
在一个实施方案中，使用例如纯化的TNFR2(例如纯化的人TNFR2的胞外结构域)和/或表达TNFR2的细胞，筛选或测试(例如通过流式细胞术、ELISA、Biacore或生物膜层干涉技术)所述抗体与TNFR2结合的能力。其他方法监测抗体与抗原片段或人TNFR2的突变变体的结合，其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰导致的结合丧失通常认为是表位成分的指示。
在一些实施方案中，通过蛋白质印迹筛选或测试抗体与TNFR2的结合。简而言之，可以制备来自表达TNFR2(例如，TNFR2的胞外结构域)的细胞的细胞提取物，并对其进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用血清封闭，并用待测试的单克隆抗体进行探测。可以使用抗-IgG碱性磷酸酶检测IgG结合，并使用BCIP/NBT底物片(Sigma Chem.Co.,St.Louis,MO)进行显色。
用于分析各种抗-TNFR2抗体的结合亲和力、交叉反应性和结合动力学的方法，包括本领域已知的标准测定，例如使用BiacoreTM 2000SPR仪器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)的BiacoreTM表面等离子体共振(SPR)分析，或生物膜层干涉技术(例如ForteBio测定)，如实施例中所述。
在一些实施方案中，使用本领域公认的方法，例如流式细胞术、表面等离子体共振和生物膜层干涉技术，筛选或测试抗-TNFR2抗体抑制TNF-α与TNFR2结合的能力，例如，如实施例1和2中所述。
在一些实施方案中，针对激动活性筛选或测试抗-TNFR2抗体。可以使用报告基因测定(例如NF-kB报告基因测定)来测试激动活性。在一些实施方案中，抗体与报告基因细胞系接触，通过流式细胞术确定报告基因活性，例如，如实施例3中所述。在一些实施方案中，通过评估原代分离的T细胞中活化标志物表达的增殖和/或诱导，来确定抗-TNFR2抗体的激动活性，例如，如实施例7、9和16中所述。
还可以筛选或测试本文所述的抗-TNFR2抗体诱导ADCC的能力。简而言之，在存在或不存在目标抗体(例如，抗-TNFR2抗体)和/或对照抗体(例如，同种型对照)的情况下，将效应细胞(例如，NK细胞)与靶细胞一起培养。然后使用流式细胞术，例如基于可检测标记的量化(例如荧光，如果靶细胞被荧光标记)评估靶细胞的死亡，例如，如实施例5中所述。
还可以使用本领域公认的技术(包括CellTiter-Glo测定、氚标记的胸苷掺入测定或流式细胞术)，筛选或测试抗体促进或抑制细胞(如CD4+(例如Treg)和CD8+T细胞(体内或体外))增殖或活力的能力。
X.组合物
在另一方面，本文提供了包含本文公开的抗-TNFR2抗体(例如，抗-人TNFR2抗体)与药学上可接受的载体一起配制的组合物，例如药物组合物。使用本领域已知的标准方法，通过将具有所需纯度的活性成分(例如，本文所述的抗-TNFR2抗体)与任选的生理学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合以制备药物组合物(Remington's Pharmaceutical Sciences(20th edition),ed.A.Gennaro,2000,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.)。优选的药物组合物是无菌组合物、适合注射的组合物和适合通过所需施用途径(如通过静脉注射)进行注射的无菌组合物。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，所述载体适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物，即抗体，包被在材料中以保护化合物免受酸和其他可能使化合物失活的自然条件的作用。
组合物可以单独施用或联合治疗，即与其他药剂联合施用。例如，联合治疗可以包括本文提供的组合物与至少一种或更多种另外的治疗剂，例如其他化合物、药物和/或用于治疗自身免疫性疾病的药剂(例如免疫抑制剂)或治疗癌症的药剂(例如抗癌剂)。抗-TNFR2抗体的特定组合在有或没有另外的治疗剂的情况下也可以分别或依次施用。
组合物可以通过本领域已知的多种方法施用。本领域技术人员将理解，施用途径和/或模式将根据所需结果而变化。所述抗体可以与保护抗体免于快速释放的载体一起制备，如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化传递系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法已获得专利，或通常是本领域技术人员已知的。
为了通过某些施用途径施用组合物，可能需要用材料包被其成分，例如抗体，或所述组合物与材料共同施用以防止其失活。例如，可以在合适的载体例如脂质体或稀释剂中将所述组合物施用于受试者。可接受的稀释剂包括盐水和缓冲水溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳剂以及常规脂质体。
可接受的载体包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。用于药物活性物质的此类介质和试剂的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与抗体不相容，否则考虑将其用于本文提供的组合物中。补充活性成分也可以掺入到所述组合物中。
治疗组合物在制造和储存条件下通常必须是无菌和稳定的。可以将所述组合物配制成溶液、微乳液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。例如，可以通过使用诸如卵磷脂的包衣，在分散的情况下通过保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖类、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。在组合物中包括延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可引起可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可通过下述制备：将所需量的单克隆抗体和所需的上文列举的成分中一种或其组合掺入适当的溶剂中，然后进行灭菌微滤。通常，通过将抗体掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物包含碱性分散介质和所需的来自上文列举的那些其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干法)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何其他所需成分的粉末。
调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次推注，可以随着时间的推移施用数个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急情况按比例减少或增加剂量。例如，人抗体可以通过皮下注射每周一次或两次施用，或通过皮下注射每月一次或两次施用。
以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便于施用和剂量均匀是尤其有利的。如本文所用，剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单一剂量的物理离散单位；每个单位包含预定量的抗体，所述抗体经计算可与所需的药物载体结合产生所需的治疗效果。本文提供的剂量单位形式的规格，决定于并直接取决于：(a)抗体的独特特性和要实现的特定治疗效果，以及(b)针对在个体中的治疗敏感性在混合此类抗体的领域中固有的局限性。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
对于治疗组合物，制剂包括适合于口服、鼻腔、局部(包括颊和舌下)、直肠和肠胃外施用的那些。肠胃外施用是包含抗体的治疗组合物最常见的施用途径。所述制剂可以便利地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域已知的任何方法制备。可与载体材料组合以产生单一剂型的抗体的量，将根据被治疗的受试者和特定的施用方式而变化。该抗体量通常是足以产生治疗效果的量。通常，在100％中，该量占抗体质量的约0.001％至约90％，优选约0.005％至约70％，最优选约0.01％至约30％。
如本文所用，短语“肠胃外施用(parenteral administration)”和“经肠胃外施用(administered parenterally)”是指肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，包括但不限于：静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
可用于本文提供的药物组合物中的合适的水性载体和非水性载体的实例包括：水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。例如，可以通过使用包衣材料如卵磷脂在分散体的情况下通过保持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。
这些组合物还可包含佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。本领域众所周知的佐剂的特定实例包括：例如无机佐剂(如铝盐，例如磷酸铝和氢氧化铝)、有机佐剂(例如角鲨烯)、油基佐剂、病毒体(例如，含有源自流感病毒的膜结合血凝素(heagglutinin)和神经氨酸酶的病毒体)。
可以通过灭菌程序和通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等来确保防止微生物的存在。还可能需要在组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等。此外，可通过包含一种或多种延迟吸收的药剂如单硬脂酸铝或明胶，可以引起可注射药物形式的延长吸收。
当组合物作为药物施用于人和动物时，它们可以单独给药，或作为含有例如0.001-90％(更优选地，0.005-70％，如0.01-30％)的活性成分与药学上可接受的载体组合的药物组合物给药。
无论选择何种施用途径如何，本文提供的组合物均可以合适的水合形式使用，并且它们可以通过本领域技术人员已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。
可以改变本文提供的药物组合物中抗体的实际剂量水平，以获得有效实现针对特定患者、组合物和施用方式的所需治疗反应的活性成分的量，而不会对所述患者产生毒性。所选剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所用特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所用特定化合物的排泄率、治疗持续时间、与所用特定组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史，以及医学领域众所周知的类似因素。具有本领域普通技术的医师或兽医可以容易地确定和开出所需组合物的有效量。例如，医生或兽医可以以低于实现所需治疗效果所需的水平开始抗体的剂量，并逐渐增加剂量直至实现所需效果。通常，本文提供的组合物的合适日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的抗体量。这种有效剂量通常取决于上述因素。优选通过静脉内、肌内、腹膜内或皮下施用，优选在靶位点附近施用。如果需要，治疗组合物的有效日剂量可以在全天以适当的间隔分别以二、三、四、五、六或更多个亚剂量施用，任选地以单位剂型施用。尽管可以单独施用抗体，但优选以制剂(组合物)的形式施用抗体。
施用的剂量和频率可以根据诸如施用途径和所使用的特定抗体、待治疗疾病的性质和严重程度以及受试者的大小和一般状况的因素而变化。合适的剂量可以通过相关领域中已知的程序来确定，例如，在可能涉及剂量递增研究的临床试验中。
治疗组合物可以与本领域已知的医疗装置一起施用，例如在美国专US5,399,163、US5,383,851、US5,312,335、US5,064,413、US4,941,880、US4,790,824、US4,596,556、US4,487,603、US4,486,194、US4,447,233、US4,447,224、US4,439,196和US4,475,196中公开的那些。
可以在预测人类肿瘤功效的动物模型系统中，评估化合物抑制癌症的能力。或者，可以通过熟练从业者已知的测定，通过检查化合物抑制此类体外抑制的能力来评估组合物的这种性质。治疗有效量的治疗化合物可以减小肿瘤大小，或以其他方式改善受试者的症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者的体型、受试者症状的严重程度和所选的特定组合物或施用途径等因素来确定此类量。
提供了上述抗-TNFR2抗体和包含其的组合物在制备用于治疗与TNFR2依赖性信号转导相关的疾病的药物中的用途。例如，本文所述的抗-TNFR2抗体和组合物用于治疗癌症(或用于制备治疗癌症的药物)。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。示例性癌症包括但不限于：肺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、肾细胞癌、肺癌、宫颈癌、前列腺癌、黑色素瘤、头颈癌、淋巴瘤和结肠直肠癌.
在一些实施方案中，本文所述的抗-TNFR2抗体和组合物用于治疗自身免疫性疾病或病症(或用于制备治疗自身免疫性疾病的药物)。示例性自身免疫性疾病包括但不限于：移植物抗宿主病、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、多发性硬化症、结肠炎、银屑病、自身免疫性葡萄膜炎、天疱疮、大疱性表皮松解症和1型糖尿病。
在一些实施方案中，本文所述的抗-TNFR2抗体和组合物用于在已经接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者中促进移植物存活或减少移植物排斥(或用于制备促进移植物存活或减少移植物排斥的药物)。在其他实施方案中，本文所述的抗-TNFR2抗体和组合物用于治疗、预防或减少移植物抗宿主病(或用于制备治疗、预防或减少移植物抗宿主病的药物)。
此外，预期的组合物可进一步包括或制备用作与另外的治疗剂组合治疗的药物。药物治疗(例如，使用本文公开的抗体组合物)可以在没有其他治疗的情况下施用，或与其他治疗组合施用。
本文所述的抗-TNFR2抗体或组合物的“治疗有效剂量”，优选导致疾病症状严重程度降低、疾病无症状期的频率和持续时间增加，或预防由于疾病折磨而导致的损伤或残疾。在癌症的情况下，治疗有效剂量优选导致存活增加和/或预防与癌症相关的身体症状的进一步恶化。治疗有效剂量可以预防或延迟癌症的发作，如当疾病的早期或初步迹象出现时可能需要的剂量。在自身免疫性疾病的情况下，治疗有效剂量优选导致预防与自身免疫性疾病相关的身体症状的进一步恶化。在移植的情况下，治疗有效剂量优选促进移植物存活和/或减少移植物排斥。
XI.试剂盒
还提供了包含本文公开的抗-TNFR2抗体、多特异性分子或免疫缀合物的试剂盒，任选地包含在单个小瓶或容器中，并且包括例如用于治疗或诊断疾病如癌症的说明书。所述试剂盒可包括指示试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括试剂盒上提供的或随试剂盒提供的任何文字、营销材料或记录材料，或试剂盒随附的其他材料。此类试剂盒可包含单位剂型中的抗体、多特异性分子或免疫缀合物，如在单剂量小瓶或单剂量预装注射器中。
XII.使用抗体的方法
本文公开的抗体和组合物可用于多种治疗应用和诊断应用，例如治疗癌症(肿瘤学应用)、治疗自身免疫性疾病或病症、在移植受者中促进移植物存活和/或减少移植物排斥，或治疗、预防或减少移植物抗宿主病。
因此，在一个实施方案中，本文提供了一种治疗增殖病症例如癌症的方法，其包括以有效量(例如，治疗有效量)向受试者施用本文所述的抗-TNFR2抗体以治疗所述病症。在一些实施方案中，所述病症是癌症。示例性癌症包括但不限于：实体瘤，如肺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、肾细胞癌、肺癌、宫颈癌、前列腺癌、黑色素瘤、头颈癌、淋巴瘤和结肠直肠癌。可以在治疗期间检查受试者以监测抗-TNFR2抗体减轻癌症进展的功效(例如，如减少一种或多种肿瘤的体积所反映的)。
在一些实施方案中，相对于开始抗-TNFR2抗体治疗之前的肿瘤体积，本文所述的抗-TNFR2抗体能够将肿瘤体积减小至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或约100％。
在另一个实施方案中，本文提供了一种抑制肿瘤生长的方法，包括以有效量(例如，治疗有效量)向受试者施用本文所述的抗-TNFR2抗体以抑制肿瘤生长。
在另一个实施方案中，本文提供了一种抑制肿瘤细胞生长的方法，包括以有效量(例如，治疗有效量)向受试者施用本文所述的抗-TNFR2抗体以抑制肿瘤细胞的生长。
在一些实施方案中，本文所述的抗-TNFR2抗体诱导长期抗癌作用。在一些实施方案中，本文所述的抗-TNFR2抗体诱导抗癌记忆T细胞的发育。
在另一个实施方案中，本文提供了一种增强结合人TNFR2的抗体的抗肿瘤活性的方法，包括修饰该抗体以相对于未修饰形式的相同抗体增加其效应子功能，例如，通过在Fc区引入一种或更多种氨基酸替换。在一些实施方案中，增加的抗肿瘤活性与抗体结合的人TNFR2的表位无关。在其他实施方案中，肿瘤生长的抑制与抗体激动(agonize)TNFR2信号转导的能力无关。在其他实施方案中，肿瘤生长的抑制与抗体抑制TNF-α与TNFR2结合的能力无关。
在另一个实施方案中，本文提供了一种治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的抗-TNFR2抗体，其中所述抗体具有效应子功能并激动TNFR2受体信号转导。
在本文所述的方法中，抗-TNFR2抗体可以单独施用或与一种或多种治疗剂(例如抗癌剂)或标准癌症治疗一起施用，所述标准癌症治疗与抗体联合或协同作用以治疗患有肿瘤或癌症的受试者。例如，本文所述的抗-TNFR2抗体可与免疫检查点阻滞剂组合使用。与本文所述的抗-TNFR2抗体组合使用的合适的免疫检查点阻断剂包括例如，抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、抗-CTLA-4抗体、抗-TIGIT抗体或抗-TIM3抗体。
PD-1检查点抑制剂和PD-L1检查点抑制剂在癌症治疗中提供了重要的前景(Brahmer et.al.,NEJM 2012；366:2455-65；Topalian et.al.,NEJM 2012；366:2443-54)。不幸的是，它们的活性仍然仅限于适应症中的部分患者，所述适应症如转移性膀胱癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤和头颈癌，许多随着时间的推移而进展(Swaika et.al.,Molecular Immunology 2015；67:4-17；Grigg et.al.,Journal for ImmunoTherapy ofCancer 2016；4:48)。与化学疗法或其他免疫疗法(如CTLA4抑制剂，伊匹单抗)的组合已被证明可以提高功效，但与单独使用PD-1抑制剂相比，通常以许多毒性显著增加为代价(Weber,Oncologist 2016；21:1230-40；Paz-Ares et.al.,NEJM 2018印刷前公开-PMID:30280635)。如实施例12所示，TNFR2激动剂抗体(Y9)与PD-1或PD-L1抑制剂的组合显著提高了抗肿瘤活性，而在长期给药时没有用抗-CTLA4抗体治疗所观察到的毒性(参见实施例13)。这表明激动性TNFR2 mAb与PD-1或PD-L1抑制剂的组合，具有显著高于PD-1抑制剂与CTLA4抑制剂(如伊匹单抗)的治疗指数。
本文所述的抗-TNFR2抗体和组合抗体治疗也可以与其他众所周知的治疗联合使用，这些疗法因其针对所治疗的适应症(例如，癌症)的特定用途而被选择。
例如，本文所述的抗-TNFR2抗体可以与其他的治疗组合(例如，同时或分开)使用，所述其他治疗如放射、手术、化学疗法(例如，使用喜树碱(CPT-11)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂、多柔比星、伊立替康、紫杉醇、吉西他滨、顺铂、紫杉醇、卡铂-紫杉醇(紫杉酚)、多柔比星、5-fu或喜树碱+apo21/TRAIL(6X组合))、一种或多种蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米或MG132)、一种或多种Bcl-2抑制剂(例如BH3I-2'(bcl-xl抑制剂)、吲哚胺双加氧酶-1抑制剂(例如，INCB24360、吲哚莫德(indoximod)、NLG-919或F001287)、AT-101(R-(-)-棉酚衍生物)、ABT-263(小分子)、GX-15-070(奥巴克拉)或MCL-1(髓性白血病细胞分化蛋白-1)拮抗剂)、iAP(凋亡蛋白抑制剂)拮抗剂(例如，smac7、smac4、小分子smac模拟物、合成smac肽(参见Fulda et.al.,Nat Med 2002；8:808-15)、ISIS23722(LY2181308)或AEG-35156(GEM-640)、HDAC(组蛋白去乙酰化酶)抑制剂、抗-CD20抗体(例如利妥昔单抗)、血管生成抑制剂(例如，贝伐珠单抗)、靶向VEGF和VEGFR的抗血管生成剂(例如阿瓦斯汀)、合成三萜类化合物(参见Hyer et.al.,Cancer Research 2005；65:4799-808)、c-FLIP(细胞FLICE抑制蛋白)调节剂(例如，PPARγ的天然配体和合成配体(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)、5809354或5569100)、激酶抑制剂(例如索拉非尼)、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、替西罗莫司、mTOR抑制剂如雷帕霉素和替西罗莫司、硼替佐米、JAK2抑制剂、HSP90抑制剂、PI3K-AKT抑制剂、来那度胺(Lenalildomide)、GSK3β抑制剂、IAP抑制剂、遗传毒性药物、靶向治疗和/或癌症疫苗。
所述抗-TNFR2抗体也可与用于治疗癌症的治疗性抗体组合使用，所述治疗性抗体如
Figure BDA0003327556080000681
(利妥昔单抗)、
Figure BDA0003327556080000682
(曲妥珠单抗)、
Figure BDA0003327556080000683
(托西莫单抗)、
Figure BDA0003327556080000684
(替伊莫单抗)、
Figure BDA0003327556080000685
(阿仑单抗)、
Figure BDA0003327556080000686
(依帕珠单抗)、
Figure BDA0003327556080000687
(贝伐珠单抗)和
Figure BDA0003327556080000688
(埃罗替尼)，以及靶向TNF和TNFR分子家族成员(配体或受体)的抗体，如CD40和CD40L、OX-40、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TL1A、TRAMP/DR3、EDA1、EDA2、TNFR1、淋巴毒素α/TNFβ、TNFα、LTβR、淋巴毒素α1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY和NGFR。
可用于与本文所述的抗-TNFR2抗体组合治疗癌症的细胞毒素剂包括烷化剂、抗代谢物和其他本领域公认的抗增殖剂。示例性的烷化剂包括：氮芥(nitrogen mustards)、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯，例如尿嘧啶芥、氮芥(Chlormethine)、环磷酰胺(CYTOXANTM)磷酰胺(fosfamide)、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三乙烯三聚氰胺、三乙烯硫代磷酰胺、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲佐菌素、达卡巴嗪和替莫唑胺。示例性抗代谢物包括：叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂，例如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫基鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、喷司他汀(Pentostatine)和吉西他滨。除了本领域已知的其他微管蛋白稳定剂之外，与本文所述的抗-TNFR2抗体组合使用的其他合适的抗增殖剂包括：例如紫杉烷类、紫杉醇(紫杉醇可以TAXOLTM形式商购)、多烯紫杉醇、圆皮海绵内酯(discodermolide)(DDM)、迪克司汀(dictyostatin)(DCT)、佩洛鲁西德(Peloruside)A、埃坡霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、埃坡霉素D、埃坡霉素E、埃坡霉素F、呋喃埃坡霉素D、脱氧埃坡霉素B1、[17]-脱氢脱氧埃坡霉素B、[18]脱氢脱氧埃坡霉素B、C12,13-环丙基-埃坡霉素A、C6-C8桥接埃坡霉素A、反式-9,10-脱氢埃坡霉素D、顺式-9,10-脱氢埃坡霉素D、16-去甲基埃坡霉素B、埃坡霉素B10、迪斯莫利得(discoderomolide)、帕土匹龙(EPO-906)、KOS-862、KOS-1584、ZK-EPO、ABJ-789、XAA296A(圆皮海绵内酯)、TZT-1027(索利多汀(soblidotin))、ILX-651(盐酸泰斯多汀(tasidotin hydrochloride))、软海绵素B、甲磺酸艾日布林(E-7389)、哈米特林(Hemiasterlin)(HTI-286)、E-7974、赛普非汀(Cyrptophycins)、LY-355703、美登醇(Maytansinoid)免疫缀合物(DM-1)、MKC-1、ABT-751、Tl-38067、T-900607、SB-715992(伊斯平斯)、SB-743921、MK-0731、STA-5312、五加苷素(eleutherobin)、17β-乙酰氧基-2-乙氧基-6-氧代-B-高-雌甾-l,3,5(10)-三烯-3-醇、环链霉素(cyclostreptin)、异莱利霉素(isolaulimalide)、莱利霉素(laulimalide)、4-表-7-去羟基-14,16-二去甲基-(+)-圆皮海绵内酯和克瑞赛龙(cryptothilone)1。
在结合本文所述的抗-TNFR2抗体或在用其治疗之前需要使异常增殖细胞静止的情况下，激素和类固醇(包括合成类似物)，如17a-炔雌醇、己烯雌酚、睾酮、泼尼松、氟甲睾酮、屈他雄酮丙酸酯，睾丸内酯，甲地孕酮、甲基强的松龙、甲基睾酮、强的松龙、曲安西龙、氯烯雌醚、羟孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀、醋酸甲羟孕酮、亮丙瑞林、氟他胺、托瑞米芬、ZOLADEXTM，也可以施用给患者。当采用本文所述的方法或组合物时，也可以根据需要施用用于在临床环境中调节肿瘤生长或转移的其他药剂，如抗模拟药。
本文所述的抗-TNFR2抗体可以与本领域公认的疫苗接种方案(例如，癌症疫苗)组合。已经设计了许多针对肿瘤疫苗接种的实验策略(参见Rosenberg,S.,2000,Developmentof Cancer Vaccines,ASCO Educational Book Spring:60-62；Logothetis,C.,2000,ASCOEducational Book Spring:300-302；Khayat,D.2000,ASCO Educational Book Spring:414-428；Foon,K.2000,ASCO Educational Book Spring:730-738；还参见Restifo,N.andSznol,M.,Cancer Vaccines,Ch.61,pp.3023-3043in DeVita et al.(eds.),1997,Cancer:Principles and Practice of Oncology,Fifth Edition)。在一些实施方案中，使用自体肿瘤细胞或同种异体肿瘤细胞制备疫苗。当肿瘤细胞被转导以表达GM-CSF时，这些细胞疫苗已被证明是最有效的。GM-CSF已被证明是肿瘤疫苗接种的抗原呈递的有效激活剂(Dranoff et.al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.90:3539-43)。
本文所述的抗-TNFR2抗体也可用于治疗自身免疫性疾病和病症。因此，在一个实施方案中，本文提供一种治疗自身免疫性疾病和病症的方法，包括以有效量(例如，治疗有效量)向受试者施用本文所述的抗-TNFR2抗体以治疗自身免疫性疾病和病症。用本文所述的抗-TNFR2抗体治疗的示例性自身免疫性疾病和病症包括：例如移植物抗宿主病、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、多发性硬化症、结肠炎、银屑病、自身免疫性葡萄膜炎、天疱疮、大疱性表皮松解症和1型糖尿病。可以在治疗期间检查受试者，以监测抗-TNFR2抗体减轻自身免疫性疾病的症状或病理的功效。可以通过比较施用前后抗体和/或联合治疗的效果来监测治疗的功效。
本文所述的抗-TNFR2抗体可单独施用，或与一种或多种治疗剂一起施用，所述治疗剂与抗体联合或协同作用以治疗患有自身免疫性疾病的受试者。例如，本文所述的抗-TNFR2抗体可与下述药剂组合使用：皮质类固醇(例如，泼尼松、布地奈德、泼尼松龙)、钙调神经磷酸酶抑制剂(例如，环孢霉素、他克莫司)、mTOR抑制剂(例如，西罗莫司、依维莫司)、EVIDH抑制剂(例如，硫唑嘌呤、来氟米特、霉酚酸酯)、生物制剂(例如，阿巴西普、阿达木单抗、阿那白滞素、赛妥珠单抗、依那西普、戈利木单抗、英夫利昔单抗、伊克珠单抗(ixekizumab)、那他珠单抗、利妥昔单抗、苏金单抗、托珠单抗、优特克单抗、维多珠单抗)和单克隆抗体(例如巴利昔单抗、达利珠单抗、莫罗单抗)。
本文所述的抗-TNFR2抗体也可用于移植(例如，细胞、组织或器官移植)的情况。因此，在一些实施方案中，本文提供了在已经接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者(例如，人类移植接受者)中促进移植物存活和/或减少移植物排斥的方法，包括向受试者施用有效量(例如，治疗有效量)的本文所述的抗-TNFR2以促进移植物存活和/或减少移植物排斥。在一些实施方案中，所述移植物对于受者而言是自体的、同种异体的或异种的。在一些实施方案中，可以在移植前、移植时和/或移植后施用抗-TNFR2抗体(或联合治疗)以促进移植物存活和/或减少移植物排斥。
在一些实施方案中，所述移植物排斥发生在细胞、组织或器官同种异体移植物的接受者中。在一些实施方案中，所述移植物接受者是造血细胞或骨髓移植物、胰岛细胞的同种异体移植物或选自下述实体器官移植物的接受者：心脏移植物、肾-胰腺移植物、肾移植物、肝移植物、肺移植物和胰腺移植物。移植物的另外的实例包括但不限于：同种异体移植的细胞、组织或器官，如血管组织、眼睛、角膜、晶状体、皮肤、骨髓、肌肉、结缔组织、胃肠组织、神经组织、骨骼、干细胞、软骨、肝细胞或造血细胞。
在一些实施方案中，与在对照接受者中所观察到的移植物存活相比，促进移植物存活和/或减少移植物排斥的方法使接受者中的移植物存活增加了至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、与至少约40％，或至少约50％。对照接受者可以是例如移植后不接受治疗或在移植后接受单一治疗的移植物接受者。在某些实施方案中，促进移植物存活的方法促进长期移植物存活(例如，移植后至少约6个月、至少1年、至少5年、至少约10年或更长时间)。
本文还提供了一种治疗、预防或减少移植物抗宿主病(例如，在已经或将接受细胞、组织或器官移植的受试者中)的方法，包括向有需要的受试者施用有效量(例如，治疗有效量)的本文所述的抗-TNFR2以治疗、预防或减少移植物抗宿主病。可在移植前、移植时和/或移植后施用所述抗-TNFR2抗体(或联合治疗)以治疗、预防或减少移植物抗宿主病。
本文所述的抗-TNFR2抗体可单独施用或与一种或多种治疗剂一起施用，所述治疗剂与抗体联合或协同作用以促进移植物存活和/或减少移植物排斥，或治疗、预防或减弱移植物抗宿主病。例如，本文所述的抗-TNFR2抗体可与免疫调节剂或免疫抑制剂组合使用，例如阿霉素、硫唑嘌呤、白消安、布雷青霉素、布雷奎那(brequinar)、来氟洛米(leflunamide)、环磷酰胺、环孢素A、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、6-巯基嘌呤、皮质类固醇、非甾体类抗炎药、西罗莫司(雷帕霉素)、他克莫司(FK-506)、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、莫罗单抗-CD3、OKT3、阿仑单抗、巴利昔单抗、达克珠单抗、利妥昔单抗、抗胸腺细胞球蛋白和IVIg。
在本文所述的联合治疗中，本文所述的抗-TNFR2抗体可以在一种或多种另外的药剂之前、之后或同时施用。
在一些实施方案中，本文提供了一种阻断细胞中TNFα与TNFR2结合的方法，包括使所述细胞与有效量的本文所述抗-TNFR2抗体接触。
在一些实施方案中，本文提供了一种激活细胞中TNFR2介导的信号转导的方法，包括使所述细胞与有效量的本文所述的抗-TNFR2抗体接触。
在一些实施方案中，本文提供了一种在细胞或受试者中激活NF-κB信号转导的方法，包括使细胞接触或向受试者施用有效量的本文所述的抗-TNFR2抗体以激活NF-κB信号转导。
在一些实施方案中，本文提供了一种在体外(例如，在培养物中)或体内(即在受试者中)促进(例如，增加)T细胞增殖(例如，CD4+T细胞、CD8+T细胞，或CD4+T细胞和CD8+T细胞两者)的方法，包括使细胞(例如，T细胞)接触或向受试者施用有效量的本文所述的抗-TNFR2抗体以促进T细胞增殖。
在一些实施方案中，本文提供了一种在体外(例如，在培养物中)或体内(即，在受试者中)共刺激T细胞的方法，包括使细胞(例如，T细胞)接触或向受试者施用有效量的本文所述抗-TNFR2抗体以共刺激T细胞。
在一些实施方案中，本文提供了一种降低调节性T细胞(例如，在T细胞区室中)的丰度的方法，包括使细胞(例如，T细胞)接触或向受试者施用有效量的本文所述的抗-TNFR2抗体以降低调节性T细胞的丰度。在一些实施方案中，调节性T细胞丰度的降低涉及ADCC。在其他实施方案中，调节性T细胞丰度的降低涉及抑制或减少增殖或诱导细胞死亡。
本文还提供了检测样品中TNFR2存在的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在允许抗体和TNFR2蛋白之间形成复合物的条件下，将所述样品与本文所述的抗-TNFR2抗体接触，并检测所述复合物。在一些实施方案中，本文所述的抗-TNFR2抗体可用于检测细胞培养物或细胞群中细胞表面上TNFR2蛋白的存在或表达水平。在另一个实施方案中，本文所述的抗-TNFR2抗体可用于检测生物样品(例如活组织检查)中TNFR2蛋白的量。在又一个实施方案中，本文所述的抗-TNFR2抗体可用于体外测定(例如免疫测定，如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA)以检测TNFR2蛋白。本文所述的抗-TNFR2抗体也可用于荧光激活细胞分选(FACS)。
通过以下实施例进一步说明本发明，但不应将其解释为进一步限制。本申请引用的序列表、附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容在此明确通过引用并入本文。
实施例
除非另有说明，否则根据制造商的说明书使用以下实施例中提及的市售试剂。本发明使用本领域公认的重组DNA技术程序，如上文和以下教科书中所述的那些：Sambrooket al.,supra；Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(GreenPublishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.,1989)；Innis et al.,PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press,Inc.:N.Y.,1990)；Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press:ColdSpring Harbor,1988)；Gait,Oligonucleotide Synthesis(IRL Press:Oxford,1984)；Freshney,Animal Cell Culture,1987；Coligan et al.,Current Protocols inImmunology,1991。
实施例1：人抗-TNFR2抗体的产生
按照如下产生人抗-TNFR2抗体。由起始库(6.7e9成员)(PMID：9600934)、HV3-23/KV1-33配对(2e9成员)的自然多样性和HV1-69/KV3-20配对(5e8成员)组成的人单链Fv抗体噬菌体文库，分别针对人TNFR2-Fc进行了两轮淘选。为了富集与人TNFR2的CRD1结构域的结合物，针对嵌合体4TNFR2构建体进行最后一轮淘选，所述嵌合体4TNFR2构建体由与Fc融合的人TNFR2(23-75)的CRD1和小鼠TNFR2(77-258)的CRD2-4组成。
当表达为可溶性scFv时，从最后一轮淘选所选的克隆中富集其特异性结合过表达hTNFR2的CHO细胞(CHO-hTNFR2细胞)而不是CHO细胞的(图1和图2)。测试了许多这些克隆，并显示它们抑制TNF与CHO-hTNFR2细胞的结合(图3)。
实施例2：人抗-TNFR2抗体的亲和力成熟
将两个scFv候选物(UC1)S4-2 1B5和(UC2)S4-2 1D10通过易错PCR进行突变，克隆到酵母展示载体pYD3中，并构建了突变体scFv文库。在用递减浓度的重组人TNFR2-hFc蛋白进行两轮分选后，针对每个scFv确定了一个显性亲和力成熟的变体。如通过流式细胞术所测量的，变体scFv UC1.1和UC2.3以大约5倍的较高亲和力结合靶标(图4)。
当表达为可溶性scFv时，这些变体抑制人TNF与过表达人TNFR2的CHO细胞结合(图5A和图5B)。为了进一步提高结合亲和力和对TNF结合的抑制，以更高的平均突变率(每个scFv有5个氨基酸变化)将scFv候选物UC1(S4-2 1B5)和UC2.3(S4-2 1D10-1G9)通过易错PCR进行突变，克隆到酵母展示载体pYD3中，并构建了突变体scFv文库。在用递减浓度的重组TNFR2-Fc蛋白进行四轮分选后，确定了许多变体，如通过流式细胞术所测量的，这些变体以10倍的较高亲和力结合靶标(图6A-6C)。在这些变体中，UC2.3.3表达为可溶性scFv，并进一步评估了抑制TNF与CHO-hTNFR2细胞的结合。如图7所示，与亲本UC2.3 scFv相比，UC2.3.3scFv对TNF与CHO-hTNFR2细胞的结合显示出更强的抑制作用。
对于饱和诱变，使用含有简并密码子NNS或VNS的诱变PCR引物，将UC2.3轻链CDR1中的24-34位和CDR2中的50-56位随机化。针对重组人TNFR2-His，对所得到的突变文库进行两轮选择。确定了在酵母表面测量的显示出与TNFR2-His结合提高的几种scFv变体(图8)。
来自两种亲和力成熟策略(随机诱变(UC2.3.3)和饱和诱变(UC2.3.7))的最具改进的scFv变体，被重新格式化并表达为全长人IgG1蛋白。因为UC2.3.3和UC2.3.7分别仅包含VH区和VL区的突变(图9A和图9B)，所以将UC2.3.3重链与UC2.3.7轻链组合以创建新的变体UC2.3.8。测量了IgGl形式的抗体对CHO-hTNFR2细胞(图10；UC2和UC2.3)或对TNFR2-His蛋白(图11；UC2.3.3、UC2.3.7和UC2.3.8)的亲和力，以及它们抑制TNF与CHO-hTNFR2细胞结合的能力(图12：UC2和UC2.3；图13A：UC2.3、UC2.3.3和UC2.3.7；图13B：UC2.3.3和UC2.3.8))。
实施例3：人抗-TNFR2抗体的激动活性
在人TNFR2报告基因细胞系中，按照如下测试人抗-TNFR2抗体的激动活性。
简而言之，使用Lipofectamine 3000(ThermoFisher)，用全长人TNFR2基因(Origene)转染GloResponseTM NF-kB-RE-luc2p HEK293细胞系(Promega)，并使其在DMEM/10％FBS中恢复。转染两天后，将培养基替换为含有
Figure BDA0003327556080000751
(0.2mg/ml)的培养基。在含有遗传霉素的培养基中培养14天后，通过流式细胞术证实了人TNFR2的稳定表达。为了测量TNFR2诱导的NF-kB信号转导，将人TNFR2报告基因细胞和载体对照细胞(1x104)与人UC2.3(0.14-100nM)在37℃下孵育5小时。然后加入ONE-GloTM荧光素酶试剂，并在SYNERGY H1酶标仪(BioTek)上测量发光。
如图14所示，在与人抗-TNFR2抗体UC2.3孵育后，NF-kB信号转导呈剂量依赖性增加。
实施例4：UC2.3.8识别人TNFR2上的不同表位
该实施例显示，相对于结合人TNFR2上包括位置Y24、Q26、Q29、M30和K47的表位的抗体(比较抗体)，UC2.3.8结合不同的非重叠表位。
简而言之，进行了BLI测定，其中使用链霉亲和素生物传感器捕获生物素标记的人TNFR2(5ug/ml)，然后与UC2.3.8(20ug/ml)结合。
如图15所示，比较抗体和UC2.3.8同时结合固定的人TNFR2，表明抗体结合不同的非重叠表位。
实施例5：人抗-TNFR2抗体对卵巢癌腹水中Tregs的影响
据报道，来自患有卵巢癌患者的调节性T细胞(Tregs)具有高水平的TNFR2，并且具有高度的免疫抑制性。其他人已经表明，TNFR2拮抗作用会降低腹水Treg细胞的活力(Torrey et.al.,Sci Signal 2017；10:eaaf8608)。在该实施例中，检查了人抗-TNFR2抗体对Tregs的影响。
简而言之，获得卵巢癌腹水，并用指定的浓度的抗-TNFR2抗体UC2.3培养48小时。使用表2中所示的抗体处理后，用流式细胞术确定CD4+T细胞区室中Treg细胞的相对丰度。
如图16所示，UC2.3降低了CD4区室中表达Treg-谱系标志物Foxp3的细胞百分比，表明UC2.3选择性抑制Treg细胞而不是效应CD4 T细胞。
表2
靶标 克隆 来源 荧光染料 激光 稀释
TruStain Fcx Poly BioLegend 100
CD4 OKT4 BioLegend BV785 405 200
CD8 SK1 BioLegend APC/Cy7 633 200
TNFR2 3G7A02 BioLegend PE 488 200
Foxp3 206D BioLegend PE/Dazzle 594 488 100
实施例6：人抗-TNFR2抗体对ADCC的影响
按照如下测试人抗-TNFR2抗体在人细胞中诱导ADCC的能力。
简而言之，从健康供体的外周血中分离出NK细胞(RosetteSep人NK细胞富集混合物，StemCell)，并与羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的JJN3(浆细胞骨髓瘤)靶细胞一起培养，该细胞表达高水平的TNFR2，在浓度为5μg/mL下，在UC2.3存在或不存在的情况下，效应子(NK细胞)与靶细胞之比为5:1，持续4小时。随着靶细胞死亡，细胞膜变得可渗透，细胞内蛋白质泄漏，导致可通过流式细胞术量化的每个细胞的CFSE荧光下降。
在多个供体中，在NK细胞存在的情况下，与单独使用同种型对照抗体的靶细胞或使用同种型对照抗体的靶细胞加NK细胞相比，UC2.3增加了死细胞的数量(图17A和图17B)。这些数据表明，UC2.3可以介导人靶细胞的ADCC。
实施例7：人抗-TNFR2抗体对CD4+和CD8+T细胞共刺激活性、增殖和功能的影响
按照如下测试人抗-TNFR2抗体对T细胞功能各个方面的影响。
简而言之，将96孔平底板(Corning)用滴定量的功能级抗-CD3(克隆OKT3，BioLegend)和人抗-TNFR2抗体包被。单核细胞在50mL SepMate-50管(StemCellTechnologies)中通过Ficoll-PaquePlus密度梯度(GE Healthcare)分离。总CD8T细胞或初始CD45RA+CD4 T细胞，通过阴性选择(人CD8+T细胞分离试剂盒，或初始CD4+T细胞分离试剂盒II，Miltenyi)进行纯化，并用5μM CellTraceViolet(ThermoFisher Scientific)标记。在添加有10％FBS、5mM HEPES(Gibco)、pen/strep(Gibco)、50μMβ-ME(G-Biosciences)、2mML-谷氨酰胺(Gibco)的RPMI1640(Gibco)中，每孔加入2-5x104个细胞(CD8 T细胞纯度通常>85％，CD4T细胞纯度>90％)以及1μg/mL可溶性抗-CD28(克隆CD28.2，BioLegend)，并按指示在37℃下孵育72或96小时。在最后5小时内，将高尔基体抑制剂Brefeldin A(BioLegend)添加到CD8+T细胞培养物中。然后对细胞的活化标志物和细胞内细胞因子进行染色，并通过流式细胞术进行分析。细胞首先用来自BioLegend的以下抗体进行孵育和染色：CD4(OKT4)、CD8(SK1或HIT8a)、CD25(BC96)、PD-1(EH12.2H7)。单细胞悬浮液首先在PBS中与Fc Block(BDBiosciences)和活/死Ghost Dye red710(TonboBiosciences)一起在4℃下孵育10分钟。然后4℃下在FACS缓冲液(含1％FBS和0.02％叠氮化钠的PBS)中，对细胞进行细胞外标记物染色30分钟。当对CD8+T细胞的细胞内胞质蛋白进行染色时，使用BioLegend的固定和细胞内染色Perm缓冲液对细胞进行透性化。样品在LSR Fortessa流式细胞仪(BDBiosciences)上运行，使用FlowJo分析软件(TreeStar)10.5.3版对数据进行分析。使用带有Dunnett多重比较后测试的双向ANOVA分析，对数据进行分析。数据绘制为平均值±S.E.M.。表明了与同种型的统计学显著差异(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
如图18A-18C所示，UC2.3.8在体外扩增并诱导CD4+和CD8+T细胞上的活化标记物。此外，与抗-GITR抗体(TRX518)或抗-4-IBB抗体(Urelumab)相比，UC2.3.8引起更大扩增和更强诱导的活化标记物。
实施例8：人抗-TNFR2抗体在移植物抗宿主病模型中的作用
按照如下使用异种GvHD模型测试人抗-TNFR2抗体预防疾病的能力。
简而言之，向三至六周龄的雌性NSG-SGM3(NOD Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl Tg(CMV-IL-3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySz)小鼠经静脉施用来自健康供体的107PBMC，并每天监测体重减轻和身体状况的变化。如果观察到>20％的初始体重减轻或身体状况显著恶化，则对动物实施安乐死。在第14、23和30天，使用300μg抗-TNFR2(UC2.3)、抗-4-1BB(乌托米单抗,Utomilumab)或同种型对照抗体对小鼠进行腹腔治疗。使用对数秩检验在对照组和治疗组之间进行比较。表明了与PBS的统计学显著差异(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。如图19所示，UC2.3增加了异种GvHD模型中的存活。保护作用大于激动抗-4-1BB抗体(乌托米单抗)。
实施例9：混合淋巴细胞反应测定中的人抗-TNFR2抗体
为了测试在生理相关的TCR刺激环境中UC2.3.8的共刺激活性，我们使用了混合淋巴细胞反应测定(MLR)(Bain et.al.,Fed.Proc.1963；22:4281)。通过Ficoll-PaquePlus密度梯度(GE Healthcare)，在50mL SepMate-50管(StemCell Technologies)中从健康人血液(Research Blood Components；Watertown，MA)中分离单核细胞。对于MLR，来自每个供体的一半细胞用来自X射线源(Faxitron)的20Gy辐照，并以4x105个细胞/孔接种在添加有10％FBS、5mM HEPES(Gibco)、pen/strep(Gibco)、50uMβ-ME(G-Biosciences)和2mM L-谷氨酰胺(Gibco)的RPMI 1640(Gibco)中，在96孔U型底板中用作刺激细胞，而另一半用5μMCellTrace Violet(ThermoFisher Scientific)标记，并以2x105个细胞/孔接种作为反应细胞。将细胞与50ug/ml人IgG1(BioXCell)预孵育15分钟，所述人IgG1具有不相关的阻断FcγR的特异性。然后加入不同浓度的UC2.3.8或同种型对照(5ug/ml)。细胞在37℃下孵育7天，然后对细胞进行活化标记物染色，并通过流式细胞术进行分析。细胞用来自BioLegend的以下抗体染色：CD4(OKT4)、CD8(SK1)、CD25(BC96)。单细胞悬浮液首先在PBS中与FcBlock(BDBiosciences)和活/死Ghost Dye red710(Tonbo Biosciences)一起在4℃下孵育10分钟。然后4℃下在FACS缓冲液(含1％FBS和0.02％叠氮化钠的PBS)中对细胞进行细胞外标记物染色30分钟。样品在LSR Fortessa流式细胞仪(BD Biosciences)上运行，使用FlowJo分析软件(TreeStar)10.5.3版对数据进行分析。数据(绘制为平均值±S.E.M.)使用带有Dunnett多重比较后检验的双向ANOVA进行分析。
如图20A和图20B所示，人抗-TNFR2抗体UC2.3.8促进CD4+和CD8+T细胞的体外扩增和CD25诱导。这与FcγR的结合无关，因为与过量的IgG1孵育并没有减弱效果。
实施例10：与现有技术比较抗体相比，人抗-TNFR2抗体具有优异的T细胞共刺激
在低亲和力人抗-TNFR2抗体(UC2.3)、UC2.3.8和现有技术比较抗体抗-TNFR2抗体A-C之间，比较T细胞共刺激的各个方面。
使用人初始CD4+T细胞分离试剂盒II(Miltenyi)，通过阴性选择富集来自3个健康供体的人初始CD4T细胞，然后用5mM CellTrace Violet标记。96孔平底板(Costar)，在37℃下用5mg/mL抗-CD3(克隆OKT3，BioLegend)和滴定量的抗-TNFR2抗体包被2小时。然后用完全RPMI洗涤板，在室温下封闭>10分钟，并添加4x104个细胞以及1mg/mL可溶性抗-CD28(BioLegend)。将细胞刺激4天，然后通过流式细胞术进行分析。评估活CD4+T细胞的增殖、扩增和急性活化标志物PD-1的上调。
为了评估NF-kB活性，使用GloResponseTM NF-kB-RE-luc2p HEK293细胞(Promega)生成人TNFR2报告基因细胞系，所述HEK293细胞使用采用Lipofectamine 3000(ThermoFisher)的全长鼠TNFR2基因(Origene)或使用载体对照进行稳定转染。细胞保存在含有遗传霉素(0.2mg/mL)的DMEM/10％FBS中。96孔黑壁组织培养板，在37℃下用滴定浓度的抗-TNFR2 mAb包被2小时，然后用完全培养基洗涤并封闭。每孔加入4x104表达TNFR2的细胞或对照HEK293细胞，体积为50mL，在37°下培养5小时，然后每孔加入50uL ONE-Glo荧光素酶试剂。在SYNERGY H1酶标仪(BioTek)上测量发光。
在最高测试浓度时，UC2.3.8刺激了62％的CD4+T细胞进行分裂，而相比之下UC2.3为15％，比较抗体A为30％，比较抗体B为24％，比较抗体C为32％，同种型对照为15％(图21A)。与同种型对照(1.5倍)相比，由20μg/ml UC2.3.8(4.3倍)诱导的细胞增殖的平均倍数变化通过双向ANOVA被确定为显著的(p<0.05)。相比之下，与同种型对照相比，UC2.3(0.9倍)、比较抗体A(2.6倍)、比较抗体B(2.0倍)和比较抗体C(3.3倍)的平均倍数变化均不显著(图21B)。
与同种型对照(0.96倍)相比，由20μg/ml UC2.3.8(1.9倍)诱导的CD4+T细胞扩增的平均倍数变化通过双向ANOVA被确定为显著的(p<0.05)。相比之下，与同种型对照相比，UC2.3(0.9倍)、比较抗体A(1.2倍)、比较抗体B(1.2倍)和比较抗体C(1.5倍)的平均倍数变化均不显著(图21C)。
与同种型对照(1.3倍)相比，由20μg/ml UC2.3.8(3.2倍)诱导的CD4+T细胞的PD-1上调的平均倍数变化通过双向ANOVA被确定为显著的(p<0.01)。相比之下，与同种型对照相比，UC2.3(0.7倍)、比较抗体A(2.2倍)、比较抗体B(1.8倍)和比较抗体C(2.6倍)的平均倍数变化均不显著(图21D)。
UC2.3.8诱导NF-kB活性的EC50为1.0μg/ml，发现比UC2.3(EC50＝4μg/ml)、比较抗体A(EC50＝9.7μg/ml)、比较抗体B(EC50＝16.6μg/ml)和比较抗体C(EC50＝44μg/ml)更有活性(图21E)。
总体而言，UC2.3.8优于低亲和力版本UC2.3和现有技术的比较抗体A、B和C。
实施例11：人抗-TNFR2抗体产生细胞因子
在使用实施例10中描述的相同条件，体外刺激分离的人初始CD8T细胞和CD4T细胞后，收集上清液并使用Luminex平台(ThermoFisher Invitrogen:Thl/Th2细胞因子18-PlexHuman ProcartaPlex Panel 1C，18种分析物)分析细胞因子。数据来自单个供体，并且代表图22A-22F的4个单个供体和图23A-23F的2个单个供体。
如图22A-22F和图23A-23F所示，UC2.3.8在CD4T细胞和CD8T细胞中诱导IL-2、IFN-γ、TNF、LTα、IL-18和GM-CSF的产生。
实施例12：抗-人TNFR2抗体在人源化小鼠的患者来源异种移植模型中的抗肿瘤活性
为了测试抗-人TNFR2抗体在肿瘤模型中的活性，将3周龄的NSG-SGM3雌性小鼠(JacksonLaboratories)用140cGy辐照，然后在同一天使用来自混合供体(AllCells)的2x104人脐血CD34+干细胞经静脉注射。在休息12周以允许造血干细胞植入并用人免疫系统重建后，通过用抗-人CD45和抗-小鼠CD45的流动抗体染色来筛选外周血中的人免疫细胞植入。当>25％的总CD45+细胞来自人类时，小鼠被认为是人源化的。人源化小鼠用5x106个患者来源的异种移植细胞系LG1306(Jackson Laboratories)的细胞经皮下注射。当平均肿瘤大小为～75mm3时，小鼠平均分成3个治疗组，并用0.3mg人同种型IgGl(BioXCell)、单独的纳武单抗(抗-PD-1、IgG1)或纳武单抗加UC2.3.8(IgG1)的组合经腹腔注射，每7天共注射5次。每2-3天测量一次肿瘤体积。
如图24所示，在同种型对照和纳武单抗加UC2.3.8臂(arms)之间，以及纳武单抗和纳武单抗加UC2.3.8臂之间，观察到肿瘤体积的统计学显著差异(ANOVA，Tukey的真实显著差异程序)。
实施例13：抗-小鼠TNFR2抗体在同源肿瘤模型中的治疗功效
本实施例显示了抗-小鼠TNFR2抗体在同源肿瘤模型中的抗肿瘤作用的影响，以及Fc效应子功能对抗肿瘤作用的影响。
抗体Y9是抗-小鼠TNFR2抗体，其完全阻断小鼠TNFα与小鼠TNFR2的结合，并结合在小鼠TNFR2的CRD1区域的A1模块内。抗体M3是一种非配体竞争剂，并与小鼠TNFR2中CRD1的B2模块和CRD2的A1模块内的表位结合。M36是部分配体竞争剂。
在小鼠中建立了CT26肿瘤，并向小鼠施用抗体M3和M36(野生型或Fc突变型)。Fc突变体具有两个单氨基酸替换D265A和N297G，其消除了Fc介导的效应子功能。将CT26细胞(5x10E5)皮下接种到6周龄雌性Balb/c小鼠(7只小鼠/组)中。指定的抗体通过腹腔注射到携带平均大小为80-90mm3的肿瘤的小鼠中。以两种不同的剂量方案测试抗体M36(野生型或Fc突变)：(i)第0、2、4、6和8天剂量为1000μg，或(ii)第0、2、4、6和8天剂量为300μg。在第0、2、4、6和8天以300μg施用抗体M3。如图25A-25D所示，需要Fc介导的效应子功能，以在CT26小鼠模型中达到抗-小鼠TNFR2抗体的最大抗癌治疗功效。
此外，Y9也观察到了类似的结果。在小鼠中建立CT26和Wehil64肿瘤，将Y9或Fc突变的(D265A和N297A)Y9经腹腔注射到携带平均大小为60-90mm3的肿瘤的小鼠中，每周一次，每次0.3mg的三个剂量(每组n＝15)。如图25E-25J所示，Fc突变严重消除了Y9的抗肿瘤作用。
抗体Y9、M3和M36靶向小鼠TNFR2上的不同表位。此外，M3是非配体竞争剂，M36是部分配体竞争剂。重要的是，实现了最大的抗癌治疗功效，而这与表位靶向和配体竞争特性无关。
实施例14：在同源肿瘤模型中靶向不同表位的抗-小鼠TNFR2抗体的治疗功效。
本实施例证明了几种候选抗-小鼠TNFR2抗体的治疗功效，这些抗体靶向小鼠TNFR2上的不同表位。
如实施例7中所述在小鼠中建立CT26肿瘤，并在第0天以1mg施用指定的抗体。测试的所有抗体在饱和剂量(未显示)下同样有效，但在次最佳剂量下，抗体Y9和M3显示出最好的体内抗肿瘤效果(图26A和图26B)，其中Y9更好。
在单独的实验中，如实施例7所述在小鼠中建立EMT6肿瘤，以1mg(图27A-27F)或0.3mg(图27G-27I)的单剂量施用指定的抗体。抗体Y9和M3显示出最好的体内抗肿瘤效果，Y9还是更好，尤其是在较低剂量水平时。
实施例15：抗体Y9在抗-PD-1敏感和耐药的同源小鼠模型中的治疗功效
本实施例比较了抗体Y9和抗-PD-1抗体在对抗-PD-1治疗敏感或耐药的同源小鼠模型中的功效。
为了评估抗体Y9相对于抗-PD-1抗体的活性，通过用具有D265A和N297A替换的鼠IgG2a Fc替换仓鼠Fc来产生仓鼠抗-小鼠PD-1抗体的小鼠版本(J43克隆；Agata et.al.IntImmunol.1996；8:765-72)。两种抗体均在抗-PD-1敏感(SaI/N)和耐药(MBT-2)同源小鼠模型中进行了测试。在受控条件下将6至8周龄的雌性小鼠饲养(housed)在无病原体的环境中。通过将200μL PBS中的1x106 MBT-2(C3H膀胱)或5x106 Sal/N(NCI 1/JCR纤维肉瘤)细胞，经皮下注射到右协腹(10-15只小鼠/组)来建立肿瘤。使用卡尺监测肿瘤生长，并根据以下公式计算体积：π/6x(长度x宽x宽)。当肿瘤平均大小达到50-100mm3时，经腹腔注射300μg抗体，如所示，每周一次，持续三周，总体积为200μL。在Sal/N(抗-PD-1敏感)和MBT-2(抗-PD-1耐药)模型中，单独的抗-TNFR2(Y9)治疗导致所有治疗动物的肿瘤完全消退。然而，用抗-PD-1mAb处理MBT-2膀胱模型仅导致有限的活性(图28)。
实施例16：用抗体Y9和抗-PD-1或抗-PD-L1抗体联合治疗在同源小鼠模型中的治疗功效
本实施例描述了在各种同源小鼠模型中使用抗体Y9和抗-PD-1或抗PD-L1抗体的联合治疗。
为了评估用鼠替代性抗-TNFR2抗体(Y9)的治疗是否会与抗-PD-1或抗PD-Ll抗体治疗产生协同作用，如实施例12中所述生产J43的小鼠版本。PD-L1抗体的小鼠版本MPDL3280a(Powles et.al.,Nature 2014；515:558-62)也通过用具有D265A和N297A替换的鼠IgG2a Fc替换人Fc来产生。在同源小鼠模型中测试抗体组合的活性。在受控条件下将6至8周龄的雌性小鼠饲养在无病原体的环境中。通过将200μL PBS中的3x105 CT26(Balb/C结肠)、EMT6(Balb/C乳腺)或Wehil64(Balb/C纤维肉瘤)细胞、1x106 MBT-2(C3H膀胱)细胞或5x106SaI/N(NCI 1/JCR纤维肉瘤)细胞，经皮下注射到右协腹(7-15只小鼠/组)来建立肿瘤。使用卡尺监测肿瘤生长，并根据以下公式计算体积：π/6x(长x宽x宽)。当肿瘤平均大小达到50-100mm3时，经腹腔注射300μg抗体，如所示，每周一次，持续三周，总体积为200μL。在WEHI164、SaI/N和MBT2模型中，长期存活是由单独的抗-TNFR2(Y9)治疗驱动，而在CT26和EMT6模型中，抗-TNFR2(Y9)和抗-PD-1的组合治疗显示出最大的长期存活(图29)。抗PD-Ll单独和与Y9组合治疗均获得了类似的结果(数据未显示)。
实施例17：与抗-CTLA4抗体相比，Y9抗体的安全性特征
本实施例描述了抗体Y9与抗-CTLA4抗体相比的各种安全性/毒性参数。
为了比较抗体Y9与抗-CTLA4抗体的毒性特征，产生了具有小鼠IgG2a Fc的小鼠抗-小鼠CTLA-4抗体，9D9克隆(Quezada et.al.，2006年)的重组版本(与抗体Y9相同的同种型)。在20只6至8周龄的Balb/c雌性小鼠中，进行了使用该抗体的长期暴露研究。在受控条件下将小鼠饲养在无病原体的环境中。总共8周，用1mg抗体(PBS、小鼠IgG2a同种型对照、抗-TNFR2(Y9)或抗-CTLA4，每组n＝5)经腹腔注射到小鼠中，每周一次，总体积为200μl。每周测量两次小鼠体重，并在整个研究过程中跟踪小鼠的身体健康状况。按照治疗计划，每周收集一次所有组的隐静脉血，并进行一次治疗前放血作为基线对照。在最后一次(第8次)每周治疗后48小时处死所有小鼠，收获脾脏并称重，并通过心脏穿刺收集血液。如图30所示，在治疗的前6周，各组之间未检测到体重差异，但在第7次抗体给药后，抗-CTLA4组体重迅速下降，而所有其他组均没有体重变化。当与Y9或对照组对比时，在用抗-CTLA4抗体处理的小鼠中观察到脾肿大，这反映在抗-CTLA4组的脾脏重量显著增加(图31)。
使用Catalyst Dx化学分析仪(IDEXX,Westbrook,ME)评估血液中肝酶的水平。简而言之，通过心脏穿刺收集血液样本，并将其转移到肝素锂全血分离器(IDEXX,#98-14323-00)中。使用NSAID 6CLIP(IDEXX,#98-11007-01)，分析ALT(丙氨酸氨基转移酶)和AST(天冬氨酸氨基转移酶)的血液水平。尽管所有组都在正常范围内，但在抗-CTLA4组中观察到血液ALT(图32A)和AST(图32B)的显著增加。
为了描述治疗对免疫细胞表型的影响，通过流式细胞术分析来自最终治疗后48小时的皮肤引流淋巴结的外周血淋巴细胞和树突细胞(图33A-33D)。为了制备用于流式细胞术的血液，使用ACK裂解缓冲液(Lonza)裂解红色血细胞，并在流式细胞术缓冲液(含有1％FCS和0.02％叠氮化钠的PBS)中洗涤。对于DC分析，按照制造商的说明，使用脾脏分离试剂盒(Miltenyi Biotec)消化皮肤引流淋巴结。单细胞悬浮液，首先在PBS中用Fc-Block和活/死染色剂在4℃下染色10分钟。然后在4℃下对细胞进行细胞外标记物染色30分钟。为了确定CD4 Tregs，按照制造商的说明，使用Foxp3染色试剂盒(BioLegend)对细胞进行固定和透性化，并对Ki-67、Foxp3和CTLA-4进行细胞内染色。Ki-67的表达(在除G0之外细胞周期的所有阶段都表达)，用于评估T细胞增殖。用抗-CTLA-4抗体处理的小鼠中，CD4和CD8T细胞增殖的频率相对于同种型对照大幅增加(图33A和33B)。相比之下，用Y9治疗的小鼠没有表现出T细胞增殖的增加，这表明与抗-CTLA-4抗体不同，Y9不会引起外周T细胞的自发活化和增殖。与此一致，Y9不上调CD86(B7.2)表达，这是一种对T细胞的树突细胞活化很重要的共刺激分子，而抗-CTLA-4抗体则上调CD86(B7.2)表达(图33D)。总之，这些数据表明，在健康小鼠中施用抗-TNFR2抗体Y9不会导致自发性免疫细胞活化。
实施例18：抗体Y9在不同的工程化小鼠模型和不同的抗体同种型变体之间的治疗功效比较
鼠替代性抗-TNFR2抗体Y9的Fcγ受体结合对其体内活性很重要。Fcγ受体接合可以表明：1)抗体的效应子功能的贡献，如通过激活Fcγ受体mFcγRI、mFcγRIII或mFcγRIV的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)；或2)通过抗体在Fcγ受体表达细胞类型上的聚类增强激动作用(Nimmerjahn et.al.,Trends in Immunology2015；36:325-36)。对于后者，抑制性Fcγ受体mFcγRII被认为是促进激动作用最重要的(参加例如，Dahan et.al.,Cancer Cell 2016；29:820-31)。
为了评估哪些Fcγ受体对Y9的功效最重要，使用了Fcγ受体野生型(“WT”，Balb/C)、缺乏mFcγRII(“FcGR2BKO”；Fcgr2b-579模型，Taconic)，或缺乏常规Fc-γ链(“Fc常规γKO”；Fcerlg-584模型，Taconic)的同源小鼠模型。Fc常规γKO小鼠在mFcγRI、mFcγRIII或mFcγRIV的表达方面存在缺陷。在受控条件下，将6至8周龄的雌性小鼠饲养在无病原体的环境中。通过将200μL PBS中的3x105 CT26(结肠)细胞经皮下注射到右胁腹(10只小鼠/组)来建立肿瘤。使用卡尺监测肿瘤生长，并根据以下公式计算体积：π/6x(长x宽x宽)。当肿瘤平均大小达到50-100mm3时，经腹腔注射300ug Y9抗体或PBS作为对照，如所示，每周一次，持续三周，总体积为200μL。如图34所示，Y9活性在FcGR2B KO小鼠和Fc常规γKO小鼠中均降低。该数据表明，通过Fcγ受体聚类增强的激动活性以及ADCC或ADCP，都可能在体内促进Y9的活性。
为了评估哪种抗体同种型通过Fcγ受体的接合赋予最高的活性，使用不同的Fc同种型和突变的同种型创建了Y9的变体：1)对mFcγRI、mFcγRIII和mFcγRIV具有高亲和力的鼠IgG2a；2)对mFcγRII和mFcγRIII具有中等亲和力的鼠IgG1；具有不结合任何mFcγR的D265A和N297A突变(DANA)的鼠IgG2a；以及具有确实增加了对mFcγRII的亲和力的S267E和L328F突变(SELF)的鼠IgG2a。在CT26(结肠)同基因小鼠模型中，比较了不同变体的活性。在受控条件下，将6至8周龄的雌性小鼠饲养在无病原体的环境中。CT26模型的产生和Y9变体的施用条件如上所述。如图35所示，SELF变体具有最高的活性，其次是mIgG1同种型，然后是mIgG2a同种型。DANA变体缺乏功效。该数据表明，通过聚类增强的激动活性是Fcγ受体介导的活性的主要因素。
实施例19：抗体Y9的共刺激活性以及对体外CD8+T细胞增殖和功能的影响
本实施例描述了Y9介导的CD8+T细胞交联对CD8+T细胞的共刺激活性、增殖和功能的直接影响。
在滴定浓度的Y9存在下，用抗-CD3/CD28体外刺激鼠CD8+T细胞。将96孔平底板在4℃下与滴定量的悬浮在PBS中的功能级抗-CD3(克隆17A2；ThermoFisher Scientific)和Y9孵育过夜。通过阴性选择(CD8+T细胞分离试剂盒，小鼠；MiltenyiBiotec)，从BALB/c小鼠的脾脏和皮肤引流淋巴结中纯化总CD8+T细胞。然后用5μM CellTrace Violet(Invitrogen)标记CD8 T细胞。在加入细胞之前，从96孔板中吸出抗体，在室温下用含有10％FCS的RPMI封闭孔10分钟，然后再次吸出。每孔加入4x104 CD8+T细胞以及1μg/mL可溶性抗-CD28(克隆37.51)，并在37℃孵育72小时。然后对细胞进行活化标记物和细胞内颗粒酶B染色，并通过流式细胞术进行分析。如图36所示，Y9表现出共刺激活性，并在体外增加了CD8+T细胞的增殖和功能。显示的数据使用了1.67μg/mL板结合的抗-CD3、1μg/mL抗-CD28和滴定浓度的Y9。增殖定义为细胞经历至少1轮分裂，由CellTrace Violet平均荧光强度的2倍稀释表示。
实施例20：抗体Y9的表位作图
本实施例描述了使用酵母表面展示的抗体Y9精细表位作图。
结构域水平作图确定了Y9抗体针对小鼠TNFR2的CRD1区的表位。使用精细表位作图策略以氨基酸分辨率进一步定义表位(Levy et.al.,JMB 2007；365:196-210)。在酵母表面上展示了总共15个TNFR2突变体，每个突变体在表面暴露的位置含有单个氨基酸替换。为了评估每个位置对Y9结合的贡献，在每个位置替换为丙氨酸或天冬氨酸(表3)。
表3：TNFR2突变体组
替换 Y9结合<sup>A</sup> 相应的人残基
G37D +++ G37
E39A +++ T39
I42A +++ L42
R49A – Q48
K50A +++ T49
Q52A +++ Q51
K57A +++ K56
H66A +++ V65
F67A +++ F66
N69A – T68
K70A +++ K69
V87A +++ L86
Q90A +++ W89
F91A ++ V90
R92A +++ P91
A+++，Y9结合没有减少；++，减少0-50％；+,减少50-90％；-,减少>90％
确定了所有15个突变体和野生型序列(表3)与Y9(400nM)的结合等温线。Y9结合被显著破坏(-)的位置被作图到小鼠TNFR2的同源模型上(图37)。R49与受体/配体界面的接近性与Y9可以与配体竞争结合TNFR2的观察结果一致。
实施例21：单剂量抗-小鼠TNFR2抗体在同源肿瘤模型中的抗肿瘤作用
本实施例证明了单剂量抗-TNFR2抗体在多个同源肿瘤模型中的抗肿瘤应答。在受控条件下，将6-8周龄的雌性Balb/C小鼠饲养在无病原体的环境中。通过将200μL PBS中的3x105 CT26(结肠)、EMT6(乳腺)、Wehi64(纤维肉瘤)或A20(B细胞淋巴瘤)细胞，经皮下注射到右协腹(6-7只小鼠/组)来建立肿瘤。使用卡尺监测肿瘤生长，并根据以下公式计算体积：π/6x(长x宽x宽)。当肿瘤平均大小达到50-70mm3时，经腹腔注射Y9抗体，单剂量(0.1mg、0.3mg或1mg)，总体积为200μL。在所有四种模型中，仅用一剂抗体就能观察到显著的抗肿瘤活性(表4、图38A-38D、39A-39D和40A-40D和41A-41D)
表4：单剂量抗-小鼠TNFR2抗体的抗肿瘤作用
Figure BDA0003327556080000871
PBS：磷酸盐缓冲盐水，PR：部分应答，CR：完全应答
对11名Wehi64完全应答者进行再激发，以确定是否引发了持久的抗肿瘤应答。在初始接种后第214天，CR小鼠和年龄匹配的对照小鼠(5)，通过将200μLPBS中的3x105Wehi64细胞经皮下注射到左协腹(与初始接种相反)进行再刺激。如上所述监测肿瘤大小。最初施用0.1、0.3或1mg Y9中任何一种的小鼠均未经历肿瘤生长，而年龄匹配的对照均具有肿瘤生长(图42)。
这个实施例显示，单剂量的抗-TNFR2抗体在多个同源肿瘤模型中表现出抗肿瘤作用，并且在肿瘤清除后可能会保留这种作用。
实施例22：抗-TNFR2抗体对表面CTLA4表达的影响
本实施例描述了抗-小鼠TNFR2抗体对T细胞上CTLA4表达的影响。
C57BL/6小鼠经皮下注射3x105 EMT-6细胞。当肿瘤平均大小达到200-300mm3时，用PBS或300μg Y9或Y9-DANA(即具有D265A和N297A替换的Fc区的Y9)处理小鼠。36小时后收获肿瘤，按照制造商的说明使用肿瘤解离试剂盒、小鼠(MiltenyiBiotec)进行消化，并对T细胞谱系标记物和CTLA-4(克隆UC10-4B9，BioLegend)进行染色。如图43A和图43B所示，Y9处理(以及在较小程度上，Y9 DANA处理)显著降低了CTLA4在肿瘤中CD4+常规T细胞、Tregs和CD8+T细胞的表面表达，而在肿瘤引流淋巴结中未观察到变化。
实施例23：抗-TNFR2抗体对肿瘤中GITR、GARP和PD-1表达的影响
本实施例描述了抗-小鼠TNFR2抗体对肿瘤中GITR、GARP和PD-1表达的影响。
C57BL/6小鼠经皮下注射3x105个EMT-6细胞。当肿瘤平均大小达到200-300mm3时，用PBS或300μg Y9或Y9-DANA处理小鼠。36小时后收获肿瘤，按照制造商的说明，使用肿瘤解离试剂，小鼠(Miltenyi Biotec)进行消化，并对T细胞谱系标记物、GITR(克隆DTA-1，BioLegend)、GARP(克隆F011-5，BioLegend)、LAP(TW7-16B4，BioLegend)和PD-1(RMP1-30，BioLegend)进行染色。用Y9处理后，GITR表面表达显著降低；而用Y9 DANA处理后，表面表达降低程度较小(图44A)。Y9，但不是Y9 DANA，引起GARP表达的协调下降，这充当潜在TGF-b以及与TGF-b相关的LAP(潜在相关肽)的停靠站(图44B)。与GITR类似，Y9导致PD-1+效应T细胞的频率降低，以及CD8 T细胞上每个细胞表达的显著降低(显示为中值荧光强度)(图44C)。
实施例24：抗-TNFR2抗体对TNFR2表达的影响
本实施例描述了抗-小鼠TNFR2抗体对肿瘤中TNFR2表达的影响。
C57BL/6小鼠经皮下注射3x105个CT26、MC38和WEHI-164同源肿瘤模型的细胞。当肿瘤平均大小达到200-300mm3时，用PBS或300μg Y9或Y9-DANA处理小鼠。36小时(CT26)或24小时(MC38和WEHI-164)后收获肿瘤，按照制造商的说明使用肿瘤解离试剂盒、小鼠(Miltenyi Biotec)进行消化，并对T细胞谱系标记物和TNFR2(克隆TR75-89，BioLegend)进行染色。如图45A-45C所示，用Y9处理观察到TNFR2的表面表达显著降低，用Y9 DANA处理降低程度较小。
表5：序列表
Figure BDA0003327556080000881
Figure BDA0003327556080000891
Figure BDA0003327556080000901
Figure BDA0003327556080000911
Figure BDA0003327556080000921
Figure BDA0003327556080000931
Figure BDA0003327556080000941
Figure BDA0003327556080000951
Figure BDA0003327556080000961
Figure BDA0003327556080000971
Figure BDA0003327556080000981
Figure BDA0003327556080000991
Figure BDA0003327556080001001
Figure BDA0003327556080001011
Figure BDA0003327556080001021
Figure BDA0003327556080001031
Figure BDA0003327556080001041
Figure BDA0003327556080001051
Figure BDA0003327556080001061
Figure BDA0003327556080001071
Figure BDA0003327556080001081
Figure BDA0003327556080001091
Figure BDA0003327556080001101
Figure BDA0003327556080001111
Figure BDA0003327556080001121
Figure BDA0003327556080001131
Figure BDA0003327556080001141
Figure BDA0003327556080001151
Figure BDA0003327556080001161
等同物：
仅使用常规实验，领域技术人员将认识到或能够来确定本文公开的特定实施例的许多等同物。此类等同物旨在包含在所附的权利要求中。

Claims (62)

1.一种结合人TNFR2的分离的抗体，其包含选自以下的重链和轻链可变区对的重链CDR和轻链CDR：
(a)分别为SEQ ID NOs:117-118；[UC2.3.8]
(b)分别为SEQ ID NOs:48-49；[UC2.3]
(c)分别为SEQ ID NOs:71-72；[UC2.3.3]
(d)分别为SEQ ID NOs:94-95；[UC2.3.7]
(e)分别为SEQ ID NOs:140-141；[UC2.3.9]
(f)分别为SEQ ID NOs:163-164；[UC2.3.10]
(g)分别为SEQ ID NOs:186-187；[UC2.3.11]
(h)分别为SEQ ID NOs:209-210；[UC2.3.12]
(i)分别为SEQ ID NOs:232-233；[UC2.3.13]
G)分别为SEQ ID NOs:255-256；[UC2.3.14]
(k)分别为SEQ ID NOs:278-279；[UC2.3.15]
(l)分别为SEQ ID NOs:301-302；[UC1]
(m)分别为SEQ ID NOs:322-323；[UC1.1]
(n)分别为SEQ ID NOs:343-344；[UC1.2]
(o)分别为SEQ ID NOs:364-364；[UC1.3]
(p)分别为SEQ ID NOs:25-26；[UC2]
(q)分别为SEQ ID NOs:385-386；[UC3]
(r)分别为SEQ ID NOs:406-407；[UC4]
(s)分别为SEQ ID NOs:427-428；[UC5]
(t)分别为SEQ ID NOs:448-449；[UC6]
(u)分别为SEQ ID NOs:469-470；[UC7]和
(v)分别为SEQ ID NOs:490-491。[UC8]。
2.一种结合人TNFR2的分离的抗体，其包含：
(a)分别包含SEQ ID NOs:105-107的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:108-110的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.8]
(b)分别包含SEQ ID NOs:36-38的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:39-41的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3]
(c)分别包含SEQ ID NOs:59-61的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:62-64的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.3]
(d)分别包含SEQ ID NOs:82-84的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:85-87的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.7]
(e)分别包含SEQ ID NOs:128-130的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:131-133的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.9]
(f)分别包含SEQ ID NOs:151-153的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:154-156的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.10]
(g)分别包含SEQ ID NOs:174-176的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:177-179的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.11]
(h)分别包含SEQ ID NOs:197-199的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:200-202的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.12]
(i)分别包含SEQ ID NOs:220-222的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:223-225的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.13]
(j)分别包含SEQ ID NOs:243-245的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:246-248的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.14]
(k)分别包含SEQ ID NOs:266-268的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:269-271的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2.3.15]
(l)分别包含SEQ ID NOs:289-291的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:292-294的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC1]
(m)分别包含SEQ ID NOs:310-312的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:313-315的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC1.1]
(n)分别包含SEQ ID NOs:331-333的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:334-336的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC1.2]
(o)分别包含SEQ ID NOs:352-354的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:355-357的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC1.3]
(p)分别包含SEQ ID NOs:13-15的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:16-18的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC2]
(q)分别包含SEQ ID NOs:373-375的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:376-378的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC3]
(r)分别包含SEQ ID NOs:394-396的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:397-399的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC4]
(s)分别包含SEQ ID NOs:415-417的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:418-420的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC5]
(t)分别包含SEQ ID NOs:436-438的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:439-441的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC6]
(u)分别包含SEQ ID NOs:457-459的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:460-462的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；[UC7]
(v)分别包含SEQ ID NOs:478-480的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ IDNOs:481-483的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。[UC8]。
3.一种结合人TNFR2的分离的抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含选自下述的氨基酸序列或与选自下述的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NOs:117、25、48、71、94、140、163、186、209、232、255、278、301、322、343、364、385、406、427、448、469和490。
4.一种结合人TNFR2的分离的抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述轻链可变区包含选自下述的氨基酸序列或与选自下述的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NOs:118、26、49、72、95、141、164、187、210、233、256、279、302、323、344、365、386、407、428、449、470和491。
5.一种结合人TNFR2的分离的抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含选自下述的氨基酸序列或与选自下述的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NOs:117、25、48、71、94、140、163、186、209、232、255、278、301、322、343、364、385、406、427、448、469和490；且所述轻链可变区包含选自下述的氨基酸序列或与选自下述的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NOs:118、26、49、72、95、141、164、187、210、233、256、279、302、323、344、365、386、407、428、449、470和491。
6.一种结合人TNFR2的分离的抗体，其包含与选自下述氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链可变区序列和轻链可变区序列：
(a)分别为SEQ ID NOs:117-118；[UC2.3.8]
(b)分别为SEQ ID NOs:48-49；[UC2.3]
(c)分别为SEQ ID NOs:71-72；[UC2.3.3]
(d)分别为SEQ ID NOs:94-95；[UC2.3.7]
(e)分别为SEQ ID NOs:140-141；[UC2.3.9]
(f)分别为SEQ ID NOs:163-164；[UC2.3.10]
(g)分别为SEQ ID NOs:186-187；[UC2.3.11]
(h)分别为SEQ ID NOs:209-210；[UC2.3.12]
(i)分别为SEQ ID NOs:232-233；[UC2.3.13]
(j)分别为SEQ ID NOs:255-256；[UC2.3.14]
(k)分别为SEQ ID NOs:278-279；[UC2.3.15]
(l)分别为SEQ ID NOs:301-302；[UC1]
(m)分别为SEQ ID NOs:322-323；[UC1.1]
(n)分别为SEQ ID NOs:343-344；[UC1.2]
(o)分别为SEQ ID NOs:364-364；[UC1.3]
(p)分别为SEQ ID NOs:25-26；[UC2]
(q)分别为SEQ ID NOs:385-386；[UC3]
(r)分别为SEQ ID NOs:406-407；[UC4]
(s)分别为SEQ ID NOs:427-428；[UC5]
(t)分别为SEQ ID NOs:448-449；[UC6]
(u)分别为SEQ ID NOs:469-470；[UC7]和
(v)分别为SEQ ID NOs:490-491。[UC8]。
7.根据权利要求6所述的分离的抗体，其中所述重链可变区和轻链可变区包含选自(a)-(v)的氨基酸序列。
8.一种结合人TNFR2的分离的抗体，其包含与选自下述氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链序列和轻链序列：
(a)分别为SEQ ID NOs:119-120；[UC2.3.8]
(b)分别为SEQ ID NOs:50-51；[UC2.3]
(c)分别为SEQ ID NOs:73-74；[UC2.3.3]
(d)分别为SEQ ID NOs:96-97；[UC2.3.7]
(e)分别为SEQ ID NOs:142-143；[UC2.3.9]
(f)分别为SEQ ID NOs:165-166；[UC2.3.10]
(g)分别为SEQ ID NOs:188-189；[UC2.3.11]
(h)分别为SEQ ID NOs:211-212；[UC2.3.12]
(i)分别为SEQ ID NOs:234-235；[UC2.3.13]
(j)分别为SEQ ID NOs:257-258；[UC2.3.14]
(k)分别为SEQ ID NOs:280-281；[UC2.3.15]和
(l)分别为SEQ ID NOs:27-28。[UC2]。
9.根据权利要求8所述的分离的抗体，其中所述重链可变区和轻链可变区包含选自(a)-(l)的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是激动性抗体。
11.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体选自：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4或其变体。
12.根据权利要求1-8和11中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含变体Fc区。
13.根据权利要求12所述的分离的抗体，其中相对于相应的非变体Fc区观察到的结合，所述变体Fc区增加了与Fcγ受体的结合。
14.根据权利要求13所述的分离的抗体，其中所述Fcγ受体是FcγRIIb受体。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的分离的抗体，其中相对于相应的野生型Fc区，所述变体Fc区增加了抗体聚类。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的分离的抗体，其中相对于具有相应野生型Fc区的抗体，所述抗体表现出增加的激动活性。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的分离的抗体，其中所述变体Fc区是变体IgG1Fc区。
18.根据权利要求17所述的分离的抗体，其中所述变体IgGl Fc区包含选自下述的一个或多个替换：
(a)S267E，
(b)S267E/L328F，
(c)G237D/P238D/P271G/A330R，
(d)E233D/P238D/H268D/P271G/A330R，
(e)G237D/P238D/H268D/P271G/A330R，和
(f)E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的抗体，其中所述抗体激活NF-κB信号转导。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体促进T细胞增殖。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体共刺激T细胞。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的抗体，其中所述抗体促进CD4+和CD8+T细胞增殖。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的抗体，其中所述抗体降低调节性T细胞的丰度。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体诱导长期抗癌作用。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体诱导抗癌记忆T细胞的发育。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是单链抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv或结构域抗体。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
28.一种双特异性抗体，其包含权利要求1-27中任一项所述抗体的抗原结合区和第二不同的抗原结合区。
29.一种免疫缀合物，其包含与药剂连接的权利要求1-27中任一项所述的抗体。
30.一种核酸，其编码权利要求1-27中任一项所述的抗体或抗原结合片段的重链可变区和/或轻链可变区。
31.一种表达载体，其包含权利要求30所述的核酸分子。
32.一种细胞，其用权利要求31所述的表达载体转化。
33.一种组合物，其包含权利要求1-29中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，以及载体。
34.一种试剂盒，其包含权利要求1-29中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，以及使用说明书。
35.一种制备抗-TNFR2抗体的方法，其包括在权利要求32所述的细胞中表达所述抗体，并从所述细胞中分离所述抗体或其抗原结合部分。
36.一种增加受试者T细胞增殖的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-29中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物以实现T细胞增殖的增加。
37.一种共刺激效应T细胞的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-29中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物以实现效应T细胞共刺激。
38.一种减少或消耗受试者的调节性T细胞数量的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-29中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，以实现调节性T细胞数量的减少或消耗。
39.一种治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1-29中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物。
40.权利要求1-29中任一项所述抗体、双特异性抗体或免疫缀合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
41.权利要求1-29中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物用于治疗癌症。
42.根据权利要求39-41中任一项所述的方法、用途或抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，其中所述癌症选自：非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌和结肠直肠癌。
43.根据权利要求39-42中任一项所述的方法、用途或抗体，其中所述方法、用途或抗体还包括施用一种或多种另外的治疗剂。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述一种或多种另外的治疗剂选自：免疫调节药物、细胞毒性药物、靶向治疗剂和癌症疫苗。
45.根据权利要求39-44中任一项所述的方法、用途或抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，其中所述抗体、双特异性抗体或免疫缀合物诱导长期抗癌作用。
46.根据权利要求39-45中任一项所述的方法、用途或抗体，其中所述抗体、双特异性抗体或免疫缀合物诱导抗癌记忆T细胞的发育。
47.一种治疗自身免疫性疾病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1-29中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物。
48.权利要求1-29中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物在制备用于治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。
49.权利要求1-29中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物用于治疗自身免疫性疾病。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的方法、用途或抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，其中所述自身免疫病选自：移植物抗宿主病、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、多发性硬化症、结肠炎、银屑病、自身免疫性葡萄膜炎、天疱疮、大疱性表皮松解症和1型糖尿病。
51.根据权利要求47-50中任一项所述的方法、用途或抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，其还包括施用一种或多种另外的治疗剂。
52.一种在已经接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者中促进移植物存活或减少移植物排斥的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-29中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物以促进移植物存活或减少移植物排斥。
53.权利要求1-29中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物在制备用于在已经接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者中促进移植物存活或减少移植物排斥的药物中的用途。
54.权利要求1-29中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，用于在已经接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者中促进移植物存活或减少移植物排斥。
55.根据权利要求52-54中任一项所述的方法、用途或抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，其中所述移植物是同种异体移植物。
56.根据权利要求52-55中任一项所述的方法、用途或抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，其中所述移植物排斥发生在细胞、组织或器官同种异体移植物的受体中。
57.根据权利要求52-56中任一项所述的方法、用途或抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，其还包括施用一种或多种另外的治疗剂。
58.一种治疗、预防或减少患有或将接受细胞、组织或器官移植的受试者的移植物抗宿主病的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-29中任一项所述抗体、双特异性抗体或免疫缀合物以治疗、预防或减少移植物抗宿主病。
59.权利要求1-29中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物在制备用于治疗、预防或减少移植物抗宿主病的药物中的用途。
60.权利要求1-29中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物用于治疗、预防或减少移植物抗宿主病。
61.根据权利要求58-60中任一项所述的方法、用途或抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，其还包括施用一种或多种另外的治疗剂。
62.一种检测样品中TNFR2存在的方法，包括在允许权利要求1-27中任一项所述的抗体和TNFR2之间形成复合物的条件下使样品与所述抗体接触，并检测所述复合物。
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