CN109071640B - 经修饰抗生腱蛋白抗体及使用方法 - Google Patents

经修饰抗生腱蛋白抗体及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及改良的对生腱蛋白‑C(TnC)特异性的抗体，特别是具有改善的交叉物种反应性的域特异性抗TnC抗体。另外，本发明涉及编码此类抗体的多核苷酸，和包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成该抗体的方法和在疾病的治疗中使用它们的方法。

Description

经修饰抗生腱蛋白抗体及使用方法
发明领域
本发明涉及对生腱蛋白-C(TnC)特异性的改良抗体，特别是具有改良的交叉物种反应性的域特异性抗TnC抗体。另外，本发明涉及编码此类抗体的多核苷酸，及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成该抗体的方法和在疾病的治疗中使用它们的方法。
发明背景
TnC和抗TnC抗体
生腱蛋白是在脊椎动物中找到的，较大多聚体细胞外基质(ECM)糖蛋白的一个高度保守的家族。已经在哺乳动物中鉴定出四种生腱蛋白旁系同源物(paralogue)，称作生腱蛋白-C(TnC)，生腱蛋白-R，生腱蛋白-X和生腱蛋白-W。生腱蛋白家族蛋白质具有共同的一级结构，其包含N端七段重复，表皮生长因子(EGF)样重复，纤连蛋白III型结构域重复和C端纤连蛋白样球状结构域。经由N端寡聚化结构域，亚基个体装配成三聚体，或在生腱蛋白-C的情况中，装配成六聚体。
哺乳动物TnC单体通常具有由所有TnC同等型共享的14.5个EGF样重复和8个纤连蛋白III型结构域重复。然而，通过可变剪接，能独立包括或排除多至9个另外的纤连蛋白III型结构域重复(结构域A1至D)，产生多种TnC同等型(参见例如Hsia and Schwarzbauer,J Biol Chem 280,26641-26644(2005))。
TnC在发育的胚胎中瞬时表达，但是在成年组织中实际上缺失。然而，它在经历重塑过程的组织中再现，包括某些病理状况，诸如伤口愈合，炎症和癌症(综述Chiquet-Ehrismann&Chiquet,J Pathol 200,488-499(2003))。
重要的是，TnC在大多数恶性实体瘤中高度表达，包括脑，乳房/乳腺，结肠，肺，皮肤和其它器官的肿瘤(综述Orend and Chiquet-Ehrismann,Cancer Letters 244,143-163(2006))，在那里它可以由转化的上皮细胞以及肿瘤微环境中的基质细胞表达(Yoshida etal.,J Pathol 182,421-428(1997),Hanamura et al.,Int J Cancer 73,10-15(1997))。特别地，含有可变剪接结构域A1至D的TnC“较大同等型”在侵入性癌瘤中表达，而在健康成年组织中几乎检测不到(Borsi et al.,Int J Cancer 52,688-692(1992),Carnemolla etal.,EurJ Biochem 205,561-567(1992))。
它的表达样式使得TnC(特别是它的可变剪接结构域)成为肿瘤靶向应用的一种有希望抗原，而且因此开发了针对该蛋白质中数种结构域的一些抗体(参见例如Brack etal.,Clin Cancer Res 12,3200-3208(2006)或EP 1 817345，描述针对TnCA1结构域的抗体；Silacci et al.,Prot Eng Des Sel 19,471-478(2006)或EP 1 173 766，描述针对TnCC结构域的抗体；Wang et al.,Hybridoma 29,13-16(2010)，描述针对TnC D结构域的抗体；或Balza et al.,FEBS 332,39-43(1993)，描述针对人生腱蛋白不同结构域的数种抗体)。最近，还描述了识别人TnC A2结构域中特定表位的抗体(WO 2009/089998和WO 2012/020038)。
还有，仍然需要对于人疗法具有改善的治疗潜力的生腱蛋白抗体。以高亲和力和交叉物种反应性特异性靶向生腱蛋白同等型是改良的癌症疗法非常需要的，包括但不限于人。
发明概述
本发明提供了特异性结合TnC，具有高亲和力和/或改善的交叉物种反应性的抗体。
在一个方面，本发明涉及特异性结合TnC的抗体，其包含SEQ ID NO:37，SEQ IDNO:38，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:49，SEQ IDNO:50，SEQ ID NO:51，SEQID NO:52，SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54所列至少一个(即一个，两个，三个，四个，五个或六个)互补决定区(CDR)。在一个实施方案中，该抗体包含选自SEQID NO:37，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:42，SEQID NO:49，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54的三个重链CDR(即HCDR1，HCDR2，和HCDR3)和/或三个轻链CDR(即LCDR1，LCDR2，和LCDR3)。
在一个实施方案中，该抗体特异性结合生腱蛋白C(TnC)，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，
该重链可变区包含
(a)选自SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:52的组的重链CDR1；
(b)选自SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:53的组的重链CDR2；和
(c)选自SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:54的组的重链CDR3，
该轻链可变区包含
(a)选自SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:40的组的轻链CDR1；
(b)选自SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:41的组的轻链CDR2；和
(c)选自SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:42的组的轻链CDR3。
在一个特定实施方案中，该抗体特异性结合生腱蛋白C(TnC)，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，
该重链可变区包含
(a)SEQ ID NO:49的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO:50的重链CDR2；和
(c)SEQ ID NO:51的重链CDR3，
该轻链可变区包含
(a)SEQ ID NO:37的轻链CDR1；
(b)SEQ ID NO:38的轻链CDR2；和
(c)SEQ ID NO:39的轻链CDR3。
在另一个特定实施方案中，该抗体特异性结合生腱蛋白C(TnC)，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，
该重链可变区包含
(a)SEQ ID NO:52的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO:53的重链CDR2；和
(c)SEQ ID NO:54的重链CDR3，
该轻链可变区包含
(a)SEQ ID NO:40的轻链CDR1；
(b)SEQ ID NO:41的轻链CDR2；和
(c)SEQ ID NO:42的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该抗体包含选自SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所列重和轻链可变区序列的抗体重链可变区和/或抗体轻链可变区，特别是重和轻链可变区二者。在一个特定实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个特定实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，该抗体包含Fc区或与免疫球蛋白Fc区等同的区域。在一个实施方案中，该抗体包含Fc区，特别是IgG Fc区。在又一个实施方案中，该抗体是全长抗体，特别是IgG类抗体。在另一个实施方案中，该抗体包含人抗体恒定区。在一个实施方案中，该抗体是人抗体。在一个实施方案中，该抗体包含选自SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:60，SEQ IDNO:61，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66中所列重和轻链区序列的抗体重链区和/或抗体轻链区，特别是重和轻链区二者。在一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ IDNO:59的氨基酸序列的轻链区和包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的重链区。在一个实施方案中，该抗体包含包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的轻链区和包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链区。在又一个实施方案中，该抗体是包含IgG类重链区的全长抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗体具有改善的亲和力。在另一个实施方案中，该抗体以低于约1μM，优选低于约100nM，更优选低于约10nM，最优选低于约1nM的KD值结合人TnC。在一个特定实施方案中，该抗体以低于约1nM的KD值结合人TnC。在一个实施方案中，该抗体结合人组织中的TnC。在又一个实施方案中，该抗体具有交叉物种反应性。在一个实施方案中，所述抗体以低于约1μM，优选低于约100nM，更优选低于约10nM，最优选低于约2nM的KD值结合人，小鼠和食蟹猴TnC中至少一种。在一个特定实施方案中，所述抗体以低于约2nM的KD值结合人，小鼠和食蟹猴TnC中至少一种。在另一个特定实施方案中，所述抗体以第一KD值KD1结合人TnC，其中所述抗体以第二KD值KD2结合小鼠TnC，且其中所述抗体以第三KD值KD3结合食蟹猴TnC，其中所有选自由KD1，KD2和KD3组成的组的KD值低于约2nM。在还有另一个特定实施方案中，所述抗体以第一KD值KD1结合人TnC，其中所述抗体以第二KD值KD2结合小鼠TnC，且其中所述抗体以第三KD值KD3结合食蟹猴TnC，其中所有选自由KD1，KD2和KD3组成的组的KD值在2nM至0.1nM的范围中。在一个实施方案中，该抗体是对至少一种选自由A1，A2，A3，A4，B，AD1，AD2，C和D组成的组的TnC域特异性的。在一个特定实施方案中，所述抗体是对TnC域A1和A4特异性的。在一个特定实施方案中，所述抗体是对TnC域C特异性的。
在一个实施方案中，该抗体包含Fc区，该Fc区包含Fc区中的至少一处氨基酸替代。在一个特定实施方案中，所述抗体的亲本非替代重链区包含氨基酸残基Leu234，Leu235和Pro329，其中替代Fc区相对于亲本非替代Fc区包含至少一处选自由Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly组成的组的氨基酸替代。在另一个实施方案中，包含替代Fc区的抗体具有与包含亲本非替代重链区的抗体相比降低的效应器功能和/或降低的Fc受体结合亲和力。在一个实施方案中，该抗体相对于亲本非替代重链区包含氨基酸替代Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly，其中对FcγR和C1q的结合消除和/或其中Fc介导的效应器功能消除。在还有另一个实施方案中，所述消除的效应器功能是消除的ADCC。在一个特定实施方案中，包含替代Fc区的抗体包含包含选自SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66的组的氨基酸序列的重链区。
在一个实施方案中，该抗体糖工程化改造成具有Fc区中经过修饰的寡糖。在一个实施方案中，与非糖工程化抗体相比，该抗体具有Fc区中比例升高的非岩藻糖基化和/或两分型寡糖(bisected oligosaccharide)。在另一个实施方案中，所述Fc区中至少约20％至约100％的N连接寡糖是非岩藻糖基化的。在又一个实施方案中，与非糖工程化抗体相比，所述抗体具有所述Fc区中比例升高的两分型寡糖。在还有又一个实施方案中，所述Fc区中至少约20％至约100％的N连接寡糖是两分型的。在一个具体的实施方案中，所述Fc区中至少约20％至约50％的N连接寡糖是两分型，非岩藻糖基化的。在又一个实施方案中，该抗体具有升高的效应器功能和/或升高的Fc受体结合亲和力。在一个特别的实施方案中，升高的效应器功能是升高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在其它方面，本发明还涉及与该抗体有关的多肽，多核苷酸，宿主细胞，和表达载体。在又一个方面，本发明涉及制备该抗体的方法。在又一个方面，本发明涉及使用该抗体的方法，特别是用于治疗以TnC表达为特征的疾病(诸如癌症)。
附图简述
图1显示100倍放大倍数时LS174T异种移植物肿瘤中的免疫组织学染色，如用抗TnC克隆18D4和抗TnC克隆11C7染色的。染色样式对应于特定的TnC基质纤维。克隆18D4和11C7二者的TnC染色以中等强度总体表达。阴性同种型对照信号验证该技术的特异性。
图2显示人肿瘤阵列中用家兔同种型对照的免疫组织学染色的结果。测试的所有组织中的阴性同种型对照信号验证该技术的特异性。
图3显示人肿瘤阵列中用抗TnC克隆18D4的免疫组织学染色的结果。染色样式对应于特定的TnC基质纤维。TnC染色在大多数肿瘤组织中以与对照正常配对组织相比更高的水平表达。
图4显示人肿瘤阵列中用抗TnC克隆11C7的免疫组织学染色的结果。染色样式对应于特定的TnC基质纤维。TnC染色在大多数肿瘤组织中以与对照正常配对组织相比更高的水平表达。
发明详述
I.定义
出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少，或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)来表述，它是解离和结合速率常数(分别为koff和kon)之比。如此，等同的亲和力可包含不同的速率常数，只要速率常数之比保持相同。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)(例如CDR)中具有一处或多处改变(例如氨基酸突变)的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。典型地，亲和力成熟的抗体与亲本抗体结合相同表位。
术语“抗TnC抗体”和“结合TnC的抗体”指能够以足够亲和力结合生腱蛋白-C(TnC)，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向TnC的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(RIA)的测量，抗TnC抗体结合无关的，非TnC的蛋白质的程度小于该抗体对TnC的结合的约10％。在某些实施方案中，结合TnC的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤5nM，≤2nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10- 8M到10-13M，例如10-9M到10-13M，例如10nM至0.1nM，例如5nM至0.1nM，例如2nM至0.1nM)的解离常数(KD)。在某些实施方案中，抗TnC抗体结合在来自不同物种的TnC中保守的TnC表位。在某些实施方案中，结合TnC表位的抗体是对至少一种选自由A1，A2，A3，A4，B，AD1，AD2，C和D组成的组的域特异性的。在某些实施方案中，提供对TnCA1和TnC A4域特异性的抗体。在某些实施方案中，提供对TnC C域特异性的抗体。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。还包括具有Fc区的抗体片段，和包含与免疫球蛋白Fc区等同的区域的融合蛋白。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体结合的抗原的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。本文中提供了例示性的竞争测定法。
术语“抗原结合域”指抗原结合分子中包含特异性结合部分或整个抗原并与部分或整个抗原互补的区域的部分。在抗原较大的情况中，抗原结合分子可以仅结合抗原的特定部分，该部分称作表位。抗原结合域可以由例如一个或多个抗体可变域(也称作抗体可变区)提供。优选地，抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。对于例如嵌合抗体，非抗原结合构件可以自极其多种物种，包括灵长类诸如黑猩猩和人衍生。人源化抗体是嵌合抗体的一种特别优选的形式。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，和IgA2。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α，δ，ε，γ，和μ。
“细胞因子释放综合征”(它是一种“输注反应”)是使用抗体输注时发生的一种常见即时并发症。发病机制特征在于抗体结合T细胞受体，活化所述T细胞。由活化的T细胞释放的细胞因子引起一类与在严重感染中找到的相似的系统性炎性应答，特征在于低血压，发热和僵直。已经报告了细胞因子释放综合征所致死亡，而且它能引起危及生命的肺水肿，如果患者液体过载的话。
在用于本文时，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于：放射性同位素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)C，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌，真菌，植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
“交叉物种反应性”指某些抗体特异性结合它们的相应靶抗原的能力，其中所述靶抗原可衍生自不同物种(例如人，小鼠，食蟹猴，等)。交叉物种反应性抗体以低于约1μM，优选低于约100nM，更优选低于约10nM，更优选低于约5nM，最优选低于约2nM的KD值结合自至少两种不同物种衍生的它的相应靶抗原。术语“以低于……的KD值结合自至少两种不同物种衍生的它的相应靶抗原”意味着相应抗体以低于指定KD值的解离常数KD结合自指定物种中每一种衍生的靶抗原。在优选的实施方案中，交叉物种反应性抗体以相似亲和力结合来自所有指定物种的靶抗原，优选在10nM至0.1nM，更优选5nM至0.1nM，最优选2nM至0.1nM的KD范围内。在一些实施方案中，相似的对自数种物种衍生的抗原的亲和力(其意味着对于所有感兴趣物种在窄KD范围内(例如在10nM至0.1nM或更窄的范围内)结合靶抗原)是有利的，例如对于人疾病的诊断测定法或动物模型。在进一步优选的实施方案中，交叉物种反应性抗体以相似亲和力结合来自所有指定物种(例如人，小鼠和食蟹猴)的靶抗原，特别是在因数为100的KD范围内，在因数为50的KD范围内，在因数为20的KD范围内，在因数为10的KD范围内，在因数为5的KD范围内。在一个优选的实施方案中，交叉物种反应性抗体以相似亲和力结合来自人，小鼠和食蟹猴的靶抗原，特别是在因数为10的KD范围内。为了清楚起见，交叉物种反应性抗体以与其它指定物种相比最高的亲和力结合指定物种之一。相应地，交叉物种反应性抗体以与其它指定物种相比最低的亲和力结合指定物种之一。在限定因数X的KD范围内意味着对具有最高亲和力的指定物种的亲和力没有超过比具有最低亲和力的指定物种的亲和力高X倍。换言之，对具有最低亲和力的指定物种的KD值没有超出对具有最高亲和力的指定物种的KD值的X倍。本领域清楚任何用于测量亲和力或亲合力的方法可用于验证交叉物种反应性抗体在本文所述给定KD因数范围内结合来自所有指定物种的靶抗原，只要将相同条件应用于对所有指定物种的KD测量。优选地，使用SPR，特别是在25℃测量KD值。优选地，作为Fab片段使用交叉物种反应性抗体测量亲和力。
“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。如本文中使用的，术语“降低”或“升高”在联合效应器功能时指由本发明的包含经修饰Fc区的抗体诱导的效应器功能与由相应的不包含Fc区中的修饰的亲本抗体诱导的效应器功能相比的可测量降低或升高。效应器功能可如本文中公开的及参照本文中公开的实施例测量。如本文中使用的，术语“强烈降低”，“消除”和“残余/残留”在联合效应器功能时考虑指由本发明的包含经修饰Fc区的抗体诱导的所述效应器功能与由相应的不包含Fc区中的修饰的亲本抗体诱导的效应器功能相比的降低。“强烈降低”意味着降低至50％或更少，“消除”意味着降低至10％或更少而“残余/残留”意味着与由相应亲本非修饰(例如非替代)抗体诱导的相应效应器功能相比大于10％。因而，本发明的包含Fc变体的抗体包含至少一项或多项下述特性：降低或消除的ADCC，降低或消除的CDC，降低或消除的ADCP，降低或消除的对Fc受体的结合，降低或消除的对Clq的结合和降低或消除的输注反应(细胞因子释放综合征)。
药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作EU索引，如记载于Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。
术语“与免疫球蛋白的Fc区等同的区域”意图包括免疫球蛋白的Fc区的天然存在等位变体及具有产生替代，添加，或删除的变化，但是没有实质性降低免疫球蛋白介导效应器功能(诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性)的能力的变体。例如，可以在没有实质性生物学功能损失的情况中自免疫球蛋白Fc区的N端或C端删除一个或多个氨基酸。可以依照本领域中已知的一般规则来选择此类变体，使得对活性具有最小的影响。(见例如Bowie,J.U.等,Science 247:1306-10(1990))。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)(或CDR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成：FR1，FR2，FR3，和FR4。因而，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下的顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”，“完整抗体”，和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”，和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。在一个实施方案中，将宿主细胞工程化改造成容许生成具有经修饰寡糖的抗体。在某些实施方案中，已经对宿主细胞进一步操作以表达升高水平的一种或多种具有β(1,4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII)活性的多肽。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞，诸如CHO细胞，BHK细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，YO骨髓瘤细胞，P3X63小鼠骨髓瘤细胞，PER细胞，PER.C6细胞或杂交瘤细胞，酵母细胞，昆虫细胞，和植物细胞等等，而且还有转基因动物，转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,NIHPublication 91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
在用于本文时，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR；三个在VH中(H1，H2，H3)，且三个在VL中(L1，L2，L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。除了VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。“高变区”(HVR)又称为互补决定区(CDR)，而且这些术语在本文中提及形成抗原结合区的可变区部分时可互换使用。此特定区域已经由Kabat等,美国卫生与公众服务部(U.S.Dept.of Health and Human Services),“Sequences ofProteins of Immunological Interest”(1983)及由Chothia等,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)描述，其中定义包括在彼此比较时氨基酸残基的交叠或子集。然而，任一个定义指抗体或其变体的CDR的应用意图在该术语的范围内，如本文中定义并使用的。涵盖如由上文所引用的每篇参考文献定义的CDR的合适的氨基酸残基在下文在表1中列出作为比较。涵盖特定CDR的精确残基编号会随CDR的序列和大小而有所变化。给出抗体的可变区氨基酸序列时，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基构成特定的CDR。
表1：CDR定义1
CDR Kabat Chothia AbM<sup>2</sup>
V<sub>H</sub> CDR1 31-35 26-32 26-35
V<sub>H</sub> CDR2 50-65 52-58 50-58
V<sub>H</sub> CDR3 95-102 95-102 95-102
V<sub>L</sub> CDR1 24-34 26-32 24-34
V<sub>L</sub> CDR2 50-56 50-52 50-56
V<sub>L</sub> CDR3 89-97 91-96 89-97
1表1中的所有CDR定义的编号依照由Kabat等所列的编号约定(见下文)。
2如表1中所使用的具有小写字母“b”的“AbM”指如由Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
Kabat等还限定了可应用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以将“Kabat编号方式”的此系统明确指派给任何可变区序列，而不依赖于超出序列自身的任何实验数据。如本文中所使用的，“Kabat编号方式”指由Kabat等,美国卫生与公众服务部,“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)所列的编号系统。除非另有规定，提及抗体可变区中的特定氨基酸残基位置的编号是依照Kabat编号系统。
CDR还包含“特异性决定残基”，或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的-CDR，或a-CDR的CDR区内。一般地，给定CDR中仅五分之一至三分之一的残基参与抗原结合。可以通过例如自三维建模计算原子间接触，并依照记载于Padlan等,FASEB J.9(1):133-139(1995)的方法测定给定残基位置处的序列变异性来鉴定特定CDR中的特异性决定残基。例示性的a-CDR(a-CDR-L1，a-CDR-L2，a-CDR-L3，a-CDR-H1，a-CDR-H2，和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34，L2的50-55，L3的89-96，H1的31-35B，H2的50-58，和H3的95-102(见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基(例如，FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号。
“抗体缀合物”或“免疫缀合物”指与细胞毒剂缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如，牛，绵羊，猫，犬，和马)，灵长类(例如，人和非人灵长类诸如猴)，家兔，和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如Flatman等,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的”的多核苷酸指已经与其天然环境的组分分开的多核苷酸分子。分离的多核苷酸包括通常含有多核苷酸分子的细胞中含有的多核苷酸分子，但是多核苷酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。
“编码抗TnC抗体的分离的多核苷酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种多核苷酸分子，包括单一载体或不同载体中的此类多核苷酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类多核苷酸分子。
在用于本文时，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体展示方法，和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1，CH2，和CH3)，也称作重链恒定区。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域，也称作轻链恒定区。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“没有实质性交叉反应性”意指分子(例如抗体)不识别或特异性结合与该分子的实际靶抗原不同的抗原(例如与靶抗原密切相关的抗原)，特别地在与该靶抗原相比时。例如，抗体可以结合少于约10％至少于约5％的与实际靶抗原不同的抗原，或者可以结合选自由少于约10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.2％，或0.1％组成的组的量的所述与实际靶抗原不同的抗原，优选地少于约2％，1％，或0.5％与实际靶抗原不同的抗原，且最优选地少于约0.2％或0.1％与实际靶抗原不同的抗原。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症，用法，剂量，施用，联合疗法，禁忌症和/或警告的信息。
术语“亲本”抗体指作为制备变体的起始点或基础使用的抗体。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于比对序列的合适参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office,Washington D.C.,20559)，其中其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech,Inc.,South San Francisco,California可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，包括数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)，与(with)，或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于，与，或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
类似地，具有与本发明的参照核苷酸序列至少例如95％“相同”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸意指多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同，只是多核苷酸序列可以按参照核苷酸序列的每100个核苷酸包含多至5处点突变。换言之，为了获得具有与参照核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，可以将参照序列中的多至5％的核苷酸删除或用另一个核苷酸替换，或者可以将占参照序列中的总核苷酸的多至5％数目的核苷酸插入参照序列中。参照序列的这些变化可以在参照核苷酸序列的5’或3’端位置或者在那些末端位置间的任何地方发生，个别地在参照序列中的残基间或在参照序列内的一个或多个连续组中散布。实际上，可以使用已知的计算机程序(诸如上文所列的)来常规地测定任何特定的多核苷酸或多肽是否与本发明的核苷酸序列或多肽序列至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同。
术语“药物配制剂”指处于如下的形式，使得容许其中含有的活性成分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的组分的制剂。
“药学可接受载体”指药物配制剂中与活性成分不同的，且对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂，或防腐剂。
如本文中使用的，术语“生腱蛋白-C”或“TnC”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人和食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然TnC，除非另外指明。该术语涵盖“全长”，未加工的TnC以及TnC因细胞中的加工所致的任何形式。该术语还涵盖TnC的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。一种例示性人TnC抗原序列的氨基酸序列(带N端GST和6x His标签；和C端avi标签和6x His标签)显示于SEQ ID NO：4。一种例示性小鼠TnC抗原序列的氨基酸序列(带N端GST和6x His标签；和C端avi标签和6x His标签)显示于SEQ ID NO：5。一种例示性食蟹猴TnC抗原序列的氨基酸序列(带N端GST和6x His标签；和C端avi标签和6x His标签)显示于SEQ ID NO：6。在人TnC分子中，已知多至九个可变剪接纤连蛋白III型结构域，它们可以插入第五个和第六个恒定纤连蛋白III型结构域之间(TnC的结构域结构的示意图参见例如Orend and Chiquet-Ehrismann,Cancer Letters244,143-163(2006))。类似地，在小鼠TnC分子中，记载了六个可变剪接纤连蛋白III型结构域(例如Joestner and Faissner,J Biol Chem 274,17144-17151(1999))。
在用于本文时，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的疾病的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，减轻症状，减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。(见例如Kindt等Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman andCo.,第91页(2007))。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。见例如，Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature 352:624-628(1991)。
在用于本文时，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及并入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
如本文中所使用的，术语“具有GnTIII活性的多肽”指能够催化将N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基以β-1-4连接添加至N连接的寡糖的三甘露糖基核心的β-连接的甘露糖苷的多肽。这包括以或不以剂量依赖性展现出与β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(依照国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(Nomenclature Committee of theInternational Union of Biochemistry and Molecular Biology,NC-IUBMB)，又称为β-1,4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖胺基转移酶(EC 2.4.1.144))活性相似，但不必相同的酶活性的融合多肽，如特定的生物学测定法中测量的。在剂量依赖性确实存在的情况中，它不需要与GnTIII的剂量依赖性相同，而是与GnTIII相比与给定活性的剂量依赖性基本上相似(即，相对于GnTIII，候选多肽会展现出更大的活性或小不超过约25倍且优选地，小不超过约10倍的活性，且最优选地，小不超过约3倍的活性)。
如本文中所使用的，术语“高尔基(Golgi)定位域”指高尔基驻留多肽中负责将多肽锚定至高尔基复合体内的某个位置的氨基酸序列。一般地，定位域包含酶的氨基端“尾部”。
如本文中所使用的，认为特别地具有前缀“糖”的术语“工程化”或“工程化改造”及术语“糖基化工程”包括对天然存在的或重组的多肽或其片段的糖基化样式的任何操作。糖基化工程包括细胞的糖基化机器的代谢工程，包括对寡糖合成途径的遗传操作以实现细胞中表达的糖蛋白的改变的糖基化。此外，糖基化工程包括突变和细胞环境对糖基化的影响。在一个实施方案中，糖基化工程是糖基转移酶活性的变化。在一个具体的实施方案中，工程化改造导致改变的葡糖胺基转移酶活性和/或岩藻糖基转移酶活性。
如本文中所使用的，术语“Fc介导的细胞的细胞毒性”包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和由含有人Fc区的可溶性Fc-融合蛋白介导的细胞的细胞毒性。它是一种导致“人免疫效应细胞”裂解“靶定细胞”的免疫机制。
如本文中所使用的，术语“人免疫效应细胞”指在其表面上展示Fc受体的白细胞群体，它们通过Fc受体结合抗体或Fc融合蛋白的Fc区并执行效应器功能。此类群体可以包括但不限于外周血单个核细胞(PBMC)和/或天然杀伤(NK)细胞。
如本文中所使用的，术语“靶定细胞”指包含Fc区的抗原结合分子(例如，抗体或其包含Fc区的片段)或Fc融合蛋白特异性结合的细胞。抗原结合分子或Fc融合蛋白经由Fc区N端的蛋白质部分结合靶细胞。
如本文中所使用的，术语“升高的Fc介导的细胞的细胞毒性”定义为通过上文限定的Fc介导的细胞的细胞毒性的机制在靶细胞周围的介质中给定浓度的抗体或Fc融合蛋白在给定时间中裂解的“靶定细胞”的数目增加和/或通过Fc介导的细胞的细胞毒性的机制在给定时间中实现给定数目的“靶定细胞”裂解需要的靶细胞周围的介质中的抗体或Fc融合蛋白的浓度降低。Fc介导的细胞的细胞毒性的升高相对于使用相同的标准生成，纯化，配制和贮存方法(其是本领域技术人员已知的)，由相同类型的宿主细胞产生的，但是并非由通过本文中所描述的方法工程化改造成具有改变的糖基化样式(例如，表达糖基转移酶GnTIII，或其它糖基转移酶)的宿主细胞产生的相同抗原结合分子或Fc融合蛋白介导的细胞的细胞毒性。
如本文中所使用的，术语“降低的Fc介导的细胞的细胞毒性”定义为通过上文限定的Fc介导的细胞的细胞毒性的机制在靶细胞周围的介质中给定浓度的抗体或Fc融合蛋白在给定时间中裂解的“靶定细胞”的数目减少和/或通过Fc介导的细胞的细胞毒性的机制在给定时间中实现给定数目的“靶定细胞”裂解需要的靶细胞周围的介质中的抗体或Fc融合蛋白的浓度升高。Fc介导的细胞的细胞毒性的降低相对于使用相同的标准生成，纯化，配制和贮存方法(其是本领域技术人员已知的)，但是没有通过抗体Fc区中的氨基酸替代而修饰的，由相同类型的宿主细胞产生的相同抗原结合分子或Fc融合蛋白介导的细胞的细胞毒性。
具有升高的或降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗体(如所述术语在本文中定义的)诱导升高的或降低的ADCC，如通过本领域普通技术人员已知的任何合适的方法测定的。一种公认的体外ADCC测定法如下：
1)该测定法使用已知表达被抗体的抗原结合区识别的靶抗原的靶细胞；
2)该测定法使用自随机选定的健康供体的血液分离的人外周血单个核细胞(PBMC)作为效应细胞；
3)依照如下的方案实施该测定法：
i)将PBMC使用标准的密度离心规程来分离，并以5x 106个细胞/ml在RPMI细胞培养基中悬浮；
ii)将靶细胞通过标准的组织培养方法来培养，自具有高于90％的存活力的指数生长期收获，在RPMI细胞培养基中清洗，用100微居里的51Cr标记，用细胞培养基清洗两次，并以105个细胞/ml的密度在细胞培养基中重悬；
iii)将100微升上述最终的靶细胞悬浮液转移至96孔微量滴定板的每孔；
iv)将抗体在细胞培养基中自4000ng/ml至0.04ng/ml连续稀释，并将50微升所得抗体溶液添加至96孔微量滴定板中的靶细胞，一式三份测试覆盖上述整个浓度范围的各个抗体浓度；
v)对于最大释放(MR)对照，含有经标记的靶细胞的板中的3个额外的孔接受50微升2％(V/V)非离子型去污剂(Nonidet,Sigma,St.Louis)的水溶液，替代抗体溶液(上述的第iv点)；
vi)对于自发释放(SR)对照，含有经标记的靶细胞的板中的3个额外的孔接受50微升RPMI细胞培养基，替代抗体溶液(上述的第iv点)；
vii)然后，将96孔微量滴定板以50x g离心1分钟，并于4℃温育1小时；
viii)将50微升PBMC悬浮液(上述第i点)添加至每孔以产生效应:靶细胞比率25:1，并将平板在培养箱中在5％CO2气氛下于37℃放置4小时；
ix)收获来自每孔的无细胞上清液，并使用γ计数器来量化实验释放的放射性(ER)；
x)依照公式(ER-MR)/(MR-SR)x 100对每个抗体浓度计算比裂解的百分比，其中ER是对所述抗体浓度量化(见上述第ix点)的平均放射性，MR是对MR对照(见上述第v点)量化(见上述第ix点)的平均放射性，而SR是对SR对照(见上述第vi点)量化(见上述第ix点)的平均放射性；
4)“升高的ADCC”定义为上文测试的抗体浓度范围内观察到的比裂解的最大百分比的增加和/或达到上文测试的抗体浓度范围内观察到的比裂解的最大百分比的一半所需要的抗体浓度的降低。ADCC的升高相对于用上述测定法测量的，使用本领域技术人员已知的相同的标准生成，纯化，配制和贮存方法，由相同类型的宿主细胞产生的，但是并非由工程化改造成过表达GnTIII的宿主细胞产生的相同抗体介导的ADCC。“降低的ADCC”定义为上文测试的抗体浓度范围内观察到的比裂解的最大百分比的减少和/或达到上文测试的抗体浓度范围内观察到的比裂解的最大百分比的一半所需要的抗体浓度的升高。ADCC的降低相对于用上述测定法测量的，使用本领域技术人员已知的相同的标准生成，纯化，配制和贮存方法，但是没有通过抗体Fc区中的氨基酸替代而修饰的，由相同类型的宿主细胞产生的相同抗体介导的ADCC。
II.组合物和方法
生腱蛋白-C(TnC)的独特可变剪接同等型在某些病理状况中特异性表达，但是在健康成年组织中基本上缺失，如此，靶向TnC的抗体具有极大的治疗潜力。本发明提供了结合TnC的抗体，特别是具有较高亲和力和较好交叉物种反应性的抗体。本发明的抗体可用于例如以TnC表达为特征的疾病，诸如癌症的诊断或治疗。
本发明提供了特异性结合TnC的抗体。特别地，本发明提供了特异性结合TnC的抗体，其中所述抗体具有改善的亲和力和/或交叉物种反应性。
在一个实施方案中，本发明的抗TnC抗体包含至少一种(例如一种，两种，三种，四种，五种，或六种)选自下组的重或轻链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54，或其变异或截短形式(其至少含有特异性决定残基(SDR))，作为所述CDR。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含至少一种，至少两种，或所有三种重链CDR(HCDR)序列，其选自(a)包含选自由SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:52组成的组的氨基酸序列的HCDR1；(b)包含选自由SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:53组成的组的氨基酸序列的HCDR2；和(c)包含选自由SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:54组成的组的氨基酸序列的HCDR3。在又一个实施方案中，该抗体包含重链可变区，其包含(a)选自由SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:52组成的组的重链CDR1；(b)选自由SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:53组成的组的重链CDR2；和(c)选自由SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:54组成的组的重链CDR3，或上述CDR的变异或截短形式(其至少含有SDR)，作为所述CDR。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含至少一种，至少两种，或所有三种轻链CDR(LCDR)序列，其选自(a)包含选自由SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:40组成的组的氨基酸序列的LCDR1；(b)包含选自由SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:41组成的组的氨基酸序列的LCDR2；和(c)包含选自由SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:42组成的组的氨基酸序列的LCDR3。在又一个实施方案中，该抗体包含轻链可变区，其包含(a)选自由SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:40组成的组的轻链CDR1；(b)选自由SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:41组成的组的轻链CDR2；和(c)选自由SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:42组成的组的轻链CDR3，或其变异或截短形式(其至少含有的SDR)，作为所述CDR。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含选自由SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:52组成的组的重链CDR1；选自由SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:53组成的组的重链CDR2；和选自由SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:54组成的组的重链CDR3，该轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:40组成的组的轻链CDR1；选自由SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:41组成的组的轻链CDR2；和由SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:42组成的组轻链CDR3，或上述CDR的变异或截短形式(其至少含有SDR)，作为所述CDR。
在还有另一个具体实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:49的重链CDR1；SEQ ID NO:50的重链CDR2；和SEQ ID NO:51的重链CDR3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:37的轻链CDR1；SEQ ID NO:38的轻链CDR2；和SEQID NO:39的轻链CDR3。
在还有另一个具体实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:52的重链CDR1；SEQ ID NO:53的重链CDR2；和SEQ ID NO:54的重链CDR3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:40的轻链CDR1；SEQ ID NO:41的轻链CDR2；和SEQID NO:42的轻链CDR3。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区(VH)，该重链可变区(VH)包含与选自由SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30组成的组的序列具有至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，该抗体包含重链可变区，该重链可变区包含选自由SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30组成的组的氨基酸序列。
在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗TnC抗体保留结合TnC的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:28或SEQID NO:30中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在HVR或CDR外部的区域(即在FR中)发生替代，插入，或删除。任选地，依照本发明的抗TnC抗体包含SEQ IDNO:28或SEQ ID NO:30中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一个特别的实施方案中，VH包含1，2或3个选自SEQ IDNO:49，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:52，SEQ IDNO:53和SEQ ID NO:54所示序列的重链CDR作为HCDR1，HCDR2和HCDR3。
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29组成的组的序列具有至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的氨基酸序列。在还有另一个实施方案中，该抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列。
在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗TnC抗体保留结合TnC的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:27或SEQID NO:29中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，在HVR或CDR外部的区域(即在FR中)发生替代，插入，或删除。任选地，本发明的抗TnC抗体包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:29中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰序列。在一个特别的实施方案中，VL包含1，2或3个选自SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:40，SEQ IDNO:41和SEQ ID NO:42所示序列的轻链CDR作为LCDR1，LCDR2和LCDR3。
在另一个方面，提供了抗TnC抗体，其中该抗体包含如上文提供的任何实施方案中的VH和如上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含与选自SEQID NO:28和SEQ ID NO:30的组的序列至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列，该轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29的组的序列至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO:28或SEQ IDNO:30和SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:29中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在一个具体的实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一个特别的实施方案中，依照任何上述实施方案的抗体额外包含Fc区或与免疫球蛋白Fc区等同的区域。在一个实施方案中，本发明的抗体包含Fc区，特别是IgG Fc区，最特别地IgG1Fc区。在一个特别的实施方案中，本发明的抗体是全长抗体，特别是IgG类抗体，最特别地IgG1同种型抗体。在另一个实施方案中，本发明的抗体是抗体片段，其选自下组：scFv片段，Fv片段，Fab片段，和F(ab’)2片段。在又一个实施方案中，本发明的抗体是具有Fc区的抗体片段，或包含与免疫球蛋白Fc区等同的区域的融合蛋白。在一个实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体是嵌合的，最特别地人源化的。在一个特别的实施方案中，本发明的抗体是人的。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含人恒定区。在一个实施方案中，本发明的抗体包含人Fc区，优选人IgG Fc区，最优选人IgG1Fc区。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链恒定区，其中所述重链恒定区是人IgG恒定区，特别是人IgG1恒定区，其包含Fc区。在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链区，其中所述重链区是人IgG重链区，特别是人IgG1重链区，其包含Fc区。在一个具体的实施方案中，该抗体包含重链区，其包含选自由SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:65，和SEQ ID NO:66组成的组的氨基酸序列。在另一个具体的实施方案中，本发明的抗体包含轻链区，其包含选自由SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:61组成的组的氨基酸序列。在还有另一个具体的实施方案中，本发明的抗体包含重链区和轻链区，该重链区包含氨基酸序列SEQ IDNO:60，该轻链区包含氨基酸序列SEQ ID NO:59。在还有另一个具体的实施方案中，本发明的抗体包含重链区和轻链区，该重链区包含氨基酸序列SEQ ID NO:62，该轻链区包含氨基酸序列SEQ ID NO:61。
在一个特定实施方案中，本发明提供包含Fc区或与免疫球蛋白Fc区等同的区域的特异性结合TnC的抗体，其中所述抗体包含a)包含与选自由SEQ IDNO:60和SEQ ID NO:62组成的组的序列至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链区，或包含与选自由SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:61组成的组的序列至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链区，或其组合。
在一个实施方案中，提供本发明的抗体，其中所述抗体具有改善的亲和力。在一个实施方案中，本发明的抗体以低于约1μM至约0.001nM的解离常数(KD)值，特别是低于约100nM，低于约10nM，或低于约1nM的KD值结合生腱蛋白-C(TnC)。在一个具体的实施方案中，本发明的抗体以低于约1nM的解离常数(KD)值结合人生腱蛋白-C(TnC)。在一个实施方案中，本发明的抗体结合人，小鼠，和食蟹猴TnC。在一个实施方案中，本发明的抗体具有交叉物种反应性。在另一个具体的实施方案中，本发明的抗体结合人，小鼠，和食蟹猴TnC的C域。在一个实施方案中，本发明的抗体具有交叉物种反应性。在一个实施方案中，本发明的抗体以低于约100nM，低于10nM，低于5nM或低于2nM的KD值结合人，小鼠和食蟹猴TnC中至少一种。在一个具体的实施方案中，本发明的抗体以低于约2nM的KD值结合人，小鼠和食蟹猴TnC中至少一种。在又一些实施方案中本发明抗体以第一KD值KD1结合人TnC，其中所述抗体以第二KD值KD2结合小鼠TnC，且其中所述抗体以第三KD值KD3结合食蟹猴TnC，其中所有选自由KD1，KD2和KD3组成的组的KD值低于约10nM，低于约5nM或低于约2nM。在还有又一些实施方案中，本发明抗体以第一KD值KD1结合人TnC，其中所述抗体以第二KD值KD2结合小鼠TnC，且其中所述抗体以第三KD值KD3结合食蟹猴TnC，其中所有选自由KD1，KD2和KD3组成的组的KD值在10nM至0.1nM的范围中，在5nM至0.1nM的范围中或在2nM至0.1nM的范围中。在又一个实施方案中，本发明抗体以第一KD值KD1结合人TnC，其中所述抗体以第二KD值KD2结合小鼠TnC，且其中所述抗体以第三KD值KD3结合食蟹猴TnC，其中所有选自由KD1，KD2和KD3组成的组的KD值在因数为20的KD范围中。在又一个实施方案中，本发明抗体以第一KD值KD1结合人TnC，其中所述抗体以第二KD值KD2结合小鼠TnC，且其中所述抗体以第三KD值KD3结合食蟹猴TnC，其中所有选自由KD1，KD2和KD3组成的组的KD值在因数为10的KD范围中。在一个实施方案中，本发明的抗体是对至少一种选自由A1，A2，A3，A4，B，AD1，AD2，C和D组成的组的TnC域特异性的。在一个实施方案中，提供抗体，其中所述抗体能够结合至少一种选自由A1，A4和C组成的组的TnC域。在一个实施方案中，本发明的抗体是对TnC域A1和A4特异性的。在一个实施方案中，本发明的抗体是对TnC域C特异性的。在一个具体的实施方案中，本发明的抗体结合人，小鼠，和食蟹猴TnC的A1和A4域。在另一个具体的实施方案中，本发明的抗体结合人，小鼠，和食蟹猴TnC的C域。在一个实施方案中，本发明的抗体具有交叉物种反应性。在一个更具体的实施方案中，本发明的抗体以低于约100nM，低于约10nM，低于约5nM或低于约2nM的KD值结合人，小鼠和食蟹猴TnC A1的A1域和至人，小鼠和食蟹猴TnC A4的A4域。作为Fab或IgG使用抗体，通过表面等离振子共振测定KD值。在一个实施方案中，本发明的抗TnC抗体结合人组织中的TnC。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含Fc区，其中所述抗体包含Fc区中的至少一处氨基酸替代。在一个实施方案中，本发明的包含Fc区中的至少一处氨基酸替代的抗体与包含亲本非替代Fc区的抗体相比具有降低的效应器功能和/或降低的Fc受体结合亲和力。在一个具体的实施方案中，所述亲本非替代Fc区包含氨基酸残基Leu234，Leu235和Pro329，其中替代Fc区相对于亲本非替代Fc区包含至少一处选自由Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly组成的组的氨基酸替代。在一个特定实施方案中，本发明提供特异性结合TnC的抗体，其中所述抗体包含a)包含与选自由SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66组成的组的序列至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链区和包含与选自由SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:61组成的组的序列至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链区。在一个具体的实施方案中，本发明的抗体包含包含选自SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66的组的氨基酸序列的重链区。在又一个实施方案中，包含替代Fc区的抗体与包含亲本非替代重链区的抗体相比具有降低的效应器功能和/或降低的Fc受体结合亲和力。在又一个具体的实施方案中，本发明的包含所述替代Fc区的抗体相对于亲本非替代Fc区包含氨基酸替代Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly，其中对FcγR和C1q的结合消除和/或其中Fc介导的效应器功能消除。在一个实施方案中，本发明的抗体具有降低的效应器功能和/或降低的Fc受体结合亲和力。在一个实施方案中，降低的效应器功能和/或降低的Fc受体结合是抗体Fc区中的氨基酸替代的结果。降低的效应器功能可包括但不限于下述一项或多项：降低的Fc介导的细胞的细胞毒性(包括降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))，降低的抗体依赖性细胞的吞噬(ADCP)，降低的细胞因子分泌，降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取，降低的对NK细胞的结合，降低的对巨噬细胞的结合，降低的对单核细胞的结合，降低的对多形核细胞的结合，降低的树突细胞成熟，或降低的T细胞引发。在一个特定实施方案中，降低的效应器功能是降低的ADCC。在另一个特定实施方案中，降低的效应器功能是消除的ADCC。降低的Fc受体结合优选是降低的对活化性Fc受体，最优选FcγRIIIa的结合。在一个实施方案中，本发明的抗体在以治疗有效量对个体施用时不引起临床显著水平的毒性。
在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合TnC的抗体，其中所述抗体包含a)重链可变区或轻链可变区，该重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30组成的组的序列至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列，该轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29组成的组的序列至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列，或其组合，和b)Fc区或与免疫球蛋白Fc区等同的区域。在一个实施方案中，本发明的抗体包含Fc区，其中所述Fc区是糖工程化的Fc区。在又一个实施方案中，本发明的抗体经过糖工程化改造成具有Fc区中修饰的寡糖。在一个具体的实施方案中，与非糖工程化抗体相比，该抗体具有Fc区中比例升高的两分型寡糖。在一个更具体的实施方案中，该抗体的Fc区中至少约10％，约15％，约20％，约25％，约30％，约35％，约40％，约45％，约50％，约55％，约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，或约100％，优选至少约50％，更优选至少约70％的N连接寡糖是两分型的。该两分型寡糖可以是杂合物或复合物类型。在另一个具体的实施方案中，与非糖工程化抗体相比，本发明的抗体具有Fc区中比例升高的非岩藻糖基化寡糖。在一个更具体的实施方案中，该抗体的Fc区中至少约20％，约25％，约30％，约35％，约40％，约45％，约50％，约55％，约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，或约100％，优选至少约50％，更优选至少约70％的N连接寡糖是非岩藻糖基化的。该非岩藻糖基化寡糖可以是杂合物或复合物类型。在一个特别的实施方案中，与非糖工程化抗体相比，本发明的抗体具有Fc区中比例升高的两分型，非岩藻糖基化寡糖。具体地，该抗体包含Fc区，其中至少约10％，约15％，约20％，约25％，约30％，约35％，约40％，约45％，约50％，约55％，约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，或约100％，优选至少约15％，更优选至少约25％，至少约35％或至少约50％的N连接寡糖是两分型，非岩藻糖基化的。该两分型，非岩藻糖基化寡糖可以是杂合物或复合物类型。在一个实施方案中，本发明的抗体具有升高的效应器功能和/或升高的Fc受体结合亲和力。升高的效应器功能和/或升高的Fc受体结合可源自例如抗体的糖工程和/或亲和力成熟。在一个实施方案中，升高的效应器功能和/或升高的Fc受体结合是糖工程化改造抗体Fc区的结果。在另一个实施方案中，升高的效应器功能和/或升高的Fc受体结合是升高的亲和力和糖工程组合的结果。升高的效应器功能可包括但不限于下述一项或多项：升高的Fc介导的细胞的细胞毒性(包括升高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))，升高的抗体依赖性细胞的吞噬(ADCP)，升高的细胞因子分泌，升高的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取，升高的对NK细胞的结合，升高的对巨噬细胞的结合，升高的对单核细胞的结合，升高的对多形核细胞的结合，升高的诱导凋亡的直接信号传导，升高的靶物结合的抗体的交联，升高的树突细胞成熟，或升高的T细胞引发。在一个特别的实施方案中，升高的效应器功能是升高的ADCC。升高的Fc受体结合优选升高对Fc活化受体的结合，最优选对FcγRIIIa的结合。在一个实施方案中，本发明的抗体在以治疗有效量对个体施用时不引起临床显著水平的毒性。
在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合TnC的A1和A4结构域的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，轻链可变区，和人IgG Fc区，该重链可变区包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合TnC的C结构域的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，轻链可变区，和人IgG Fc区，该重链可变区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合TnC的A1和A4结构域的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，轻链可变区，和人IgG Fc区，该重链可变区包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，且其中所述抗体糖工程化改造成具有升高的效应器功能和/或Fc受体结合亲和力。
在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合TnC的C结构域的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，轻链可变区，和人IgG Fc区，该重链可变区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，且其中所述抗体糖工程化改造成具有升高的效应器功能和/或Fc受体结合亲和力。
在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合TnC的A1和A4结构域的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，轻链可变区，和人IgG Fc区，该重链可变区包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，其中所述抗体包含Fc区中的至少一处氨基酸替代，其中亲本非替代Fc区包含氨基酸残基Leu234，Leu235和Pro329，其中替代Fc区相对于亲本非替代Fc区包含至少一处选自由Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly组成的组的氨基酸替代，其中包含替代Fc区的抗体具有与包含亲本非替代Fc区的抗体相比降低的效应器功能和/或降低的Fc受体结合亲和力。
在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合TnC的C结构域的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，轻链可变区，和人IgG Fc区，该重链可变区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，其中所述抗体包含Fc区中的至少一处氨基酸替代，其中亲本非替代Fc区包含氨基酸残基Leu234，Leu235和Pro329，其中替代Fc区相对于亲本非替代Fc区包含至少一处选自由Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly组成的组的氨基酸替代，其中包含替代Fc区的抗体具有与包含亲本非替代Fc区的抗体相比降低的效应器功能和/或降低的Fc受体结合亲和力。
在一个特定实施方案中，本发明提供特异性结合TnC的A1和A4结构域的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，
该重链可变区包含
(a)SEQ ID NO:49的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO:50的重链CDR2；和
(c)SEQ ID NO:51的重链CDR3，
该轻链可变区包含
(a)SEQ ID NO:37的轻链CDR1；
(b)SEQ ID NO:38的轻链CDR2；和
(c)SEQ ID NO:39的轻链CDR3。
在一个特定实施方案中，本发明提供特异性结合TnC的C结构域的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，
该重链可变区包含
(a)SEQ ID NO:52的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO:53的重链CDR2；和
(c)SEQ ID NO:54的重链CDR3，
该轻链可变区包含
(a)SEQ ID NO:40的轻链CDR1；
(b)SEQ ID NO:41的轻链CDR2；和
(c)SEQ ID NO:42的轻链CDR3。
在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合TnC的A1和A4结构域的抗体，其中所述抗体包含重链区和轻链区，该重链区包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，该轻链区包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合人，小鼠和食蟹猴TnC的A1和A4结构域的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，轻链可变区，和人IgG Fc区，该重链可变区包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合TnC的C结构域的抗体，其中所述抗体包含重链区和轻链区，该重链区包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，该轻链区包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合人，小鼠和食蟹猴TnC的C结构域的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，轻链可变区，和人IgG Fc区，该重链可变区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
在另一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合TnC的A1和A4结构域的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，轻链可变区，和人IgG Fc区，该重链可变区包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，且其中所述抗体具有所述Fc区中比例升高的非岩藻糖基化寡糖和/或比例升高的两分型寡糖。
在另一个特别的实施方案中，本发明提供了特异性结合TnC的C结构域的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，轻链可变区，和人IgG Fc区，该重链可变区包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列，且其中所述抗体具有所述Fc区中比例升高的非岩藻糖基化寡糖和/或比例升高的两分型寡糖。在一个方面，本发明提供了特异性结合TnC的抗体，其中所述抗体在该亲本抗体的至少一种重或轻链CDR中包含至少一处氨基酸替代。例如，该抗体可以在亲本抗体的一种或多种高变区或CDR(即1，2，3，4，5，或6种高变区或CDR)中包含至少一处，例如约一处至约十处(即约1，2，3，4，5，6，7，8，9，或10处)，特别是约两处至约五处替代。
另外，与亲本抗体相比，该抗体还可包含一种或多种重或轻链的框架区中的一处或多处添加，删除和/或替代。在一个实施方案中，所述至少一种CDR中的至少一处氨基酸替代促成该抗体的结合亲和力与其亲本抗体相比升高。在另一个实施方案中，所述抗体具有比亲本抗体大至少约2倍约10倍的对TnC的亲和力(在以相同形式，例如Fab形式比较本发明的抗体和亲本抗体时)。另外，自亲本抗体衍生的抗体可单一地或组合地并入前述段落中涉及本发明抗体描述的任何特征。
本发明还提供了编码特异性结合TnC的抗体的多核苷酸。在一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸，编码构成依照上文所述发明的抗TnC抗体一部分的多肽。在一个实施方案中，该分离的多核苷酸编码构成依照上文所述发明的抗TnC抗体一部分的抗体重链和/或抗体轻链。
在一个实施方案中，本发明涉及一种分离的多核苷酸，其包含编码SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:40，SEQ IDNO:41，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54所示一种或多种(例如一种，两种，三种，四种，五种，或六种)重或轻链互补决定区(CDR)，或其变异或截短形式(其至少含有特异性决定残基(SDR))的序列，作为所述CDR。在另一个实施方案中，该多核苷酸包含编码选自SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:40，SEQ IDNO:41，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:52，SEQ IDNO:53和SEQ ID NO:54，或其变异或截短形式(其至少含有SDR)的三种重链CDR(例如HCDR1，HCDR2，和HCDR3)或三种轻链CDR(例如LCDR1，LCDR2，和LCDR3)的序列，作为所述三种互补决定区每一种。在还有另一个实施方案中，该多核苷酸包含编码选自SEQ ID NO:37，SEQ IDNO:38，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:49，SEQ IDNO:50，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54的三种重链CDR(例如HCDR1，HCDR2，和HCDR3)和三种轻链CDR(例如LCDR1，LCDR2，和LCDR3)的序列。在一个特别的实施方案中，该多核苷酸编码一种或多种CDR，包含与SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:32，SEQ IDNO:33，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:44，SEQ IDNO:45，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48中一种或多种CDR核苷酸序列至少约90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列。
在又一个实施方案中，该多核苷酸包含编码选自SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30的重链可变区的序列和/或编码选自SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29的轻链可变区的序列。在一个特别的实施方案中，该多核苷酸编码重链和/或轻链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26组成的可变区核苷酸序列组的序列，或其组合。
在一个具体的实施方案中，该多核苷酸包含编码选自SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30的重链可变区的序列和编码重链恒定区，特别是人重链恒定区的序列。在一个特别的实施方案中，所述重链恒定区是包含Fc区的人IgG重链恒定区，具体是人IgG1重链恒定区。在另一个具体的实施方案中，该多核苷酸包含编码选自SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29的轻链可变区的序列和编码轻链恒定区，特别是人轻链恒定区的序列。
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含第一分离的多核苷酸和第二分离的多核苷酸，该第一分离的多核苷酸编码包含与选自由SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:61组成的组的序列至少约90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的氨基酸序列的多肽，该第二分离的多核苷酸编码包含与选自由SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:62组成的组的序列至少约90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含第一分离的多核苷酸和第二分离的多核苷酸，该第一分离的多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:61组成的组的序列至少约90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列，该第二分离的多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66组成的组的序列至少约90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％相同的序列。
在又一个方面，本发明还涉及分离的多肽，其由依照上文所述发明的任何多核苷酸编码。
在又一个方面，依照任何上述实施方案的抗TnC抗体可单一地或组合地并入下文1-7节中描述的任何特征：
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤5nM，≤2nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM的解离常数(KD)(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)。在一个实施方案中，KD是通过如下述测定法所述用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施的放射性标记抗原结合测定法(RIA)测量的。通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立测定法的条件，将
Figure BDA0001824445090000331
多孔板(ThermoScientific)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白于室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的感兴趣Fab(例如与Presta等,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)混合。然后将感兴趣的Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时间(例如约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板，于室温温育(例如1小时)。然后除去溶液，并用PBS中的0.1％聚山梨酯20
Figure BDA0001824445090000332
洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20TM；Packard)，然后在TOPCOUNTTM伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一个实施方案，KD是使用表面等离振子共振测定法使用
Figure BDA0001824445090000333
或
Figure BDA0001824445090000334
(BIAcore,Inc.，Piscataway，NJ)于25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简言之，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，于25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(
Figure BDA0001824445090000335
Evaluation Softwareversion 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)以比率koff/kon计算。见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1s-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBS pH 7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2，Fv，和scFv片段，及下文所描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，见例如Plückthun,于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；还可见WO 93/16185；及美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基，并且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，见美国专利No.5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)。
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；见例如美国专利No.6,248,516B1)。
可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。
3.嵌合的和人源化的抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567；及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，自小鼠，大鼠，仓鼠，家兔，或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann等,Nature332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods 36:25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“重修表面”)；Dall’Acqua等,Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；及Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer 83:252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(见例如Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(见例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；及Presta等J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了
Figure BDA0001824445090000361
技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M
Figure BDA0001824445090000362
技术，和美国专利申请公开文本No.US 2007/0061900，其描述了
Figure BDA0001824445090000363
技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers和Brandlein,Histologyand Histopathology,20(3):927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,Methods andFindings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等于Methods in MolecularBiology 178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,2001)，并且进一步记载于例如McCafferty等,Nature 348:552-554；Clackson等,Nature 352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,于Methods in MolecularBiology248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；及Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆天然全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373，和美国专利公开文本No.2005/0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764,2007/0292936和2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对TnC，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合TnC的两个不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达TnC的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983)，WO 93/08829，和Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991))，和“突起-入-空穴”工程化(见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利No.4,676,980,及Brennan等,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；及如例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(见例如US 2006/0025576A1)。
本文中的抗体或片段还包括包含结合TnC及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(见例如US 2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除，和/或插入和/或替代。可以进行删除，插入，和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如，抗原结合。
a)替代，插入，和删除变体
在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表2中在“保守替代”的标题下显示。更实质的变化在表2中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
表2
Figure BDA0001824445090000381
Figure BDA0001824445090000391
依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；
(2)中性，亲水性的：Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；
(3)酸性的：Asp,Glu；
(4)碱性的：His,Lys,Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly,Pro；
(6)芳香族的：Trp,Tyr,Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力，降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
可以对HVR做出变化(例如，替代)，例如以改善抗体亲和力。可以对HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)做出此类变化，其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom等于Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等编,HumanPress,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR，链改组，或寡核苷酸指导的诱变)将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的方法，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代，插入，或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR做出保守变化(例如，保守替代，如本文中提供的)，其不实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或者含有不超过1，2或3处氨基酸替代。
一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述的。在此方法中，将残基或靶残基的组(例如，带电荷的残基诸如Arg，Asp，His，Lys，和Glu)鉴定，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，可使用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
b)糖基化变体
在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。在一方面，本发明提供了具有升高的效应器功能，包括抗体依赖性细胞的细胞毒性的抗TnC抗体的糖形。先前已经描述了抗体的糖基化工程。见例如美国专利No.6,602,684，通过提及而将其完整收入本文。本文中还详细描述了自具有牵涉糖基化的基因的改变的活性的宿主细胞生成抗TnC抗体的方法(见例如下文题目为“重组方法和组合物”的部分)。
提供了具有两分型寡糖的抗体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6,602,684(
Figure BDA0001824445090000411
等)；及US 2005/0123546(
Figure BDA0001824445090000412
等)。
在一个实施方案中，本发明的抗TnC抗体由于通过本发明的方法对其寡糖的修饰而具有Fc区中比例增加的两分型寡糖。在一个实施方案中，本发明抗TnC抗体的Fc区中两分型N连接寡糖的百分比是总寡糖的至少约10％至约100％，特别地至少约50％，更特别地至少约60％，至少约70％，至少约80％，或至少约90-95％。两分型寡糖可以是杂合物或复合物类型。
在另一个实施方案中，本发明的抗TnC抗体由于通过本发明的方法对其寡糖的修饰而具有Fc区中比例增加的非岩藻糖基化寡糖。在一个实施方案中，非岩藻糖基化寡糖的百分比是至少约20％至约100％，特别地至少约50％，至少约60％至约70％，且更特别地至少约75％。非岩藻糖基化寡糖可以是杂合物或复合物类型。
通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如，复合的，杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO 2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的EU编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。岩藻糖的相对量指根据MALDI-TOF MS，含有岩藻糖的结构相对于N-糖苷酶F处理的样品中鉴定的所有糖结构(例如复合，杂合和高甘露糖结构)的百分比。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。
可用于本发明抗TnC抗体的糖工程方法已经极为详细地记载于美国专利No.6,602,684；美国专利申请公开文本No.2004/0241817A1；美国专利申请公开文本No.2003/0175884 A1；美国临时专利申请No.60/441,307及WO2004/065540，通过述及将每一篇的全部内容完整收入本文。或者，依照美国专利申请公开文本No.2003/0157108(Genentech)或EP 1 176 195A1；WO03/084570；WO 03/085119及美国专利申请公开文本No.2003/0115614；No.2004/093621；No.2004/110282；No.2004/110704；No.2004/132140；Niwa et al.,JImmunol Methods 306,151/160(2006)；美国专利No.6,946,292(Kyowa)中披露的技术，本发明的抗TnC抗体可以糖工程化改造成具有Fc区中减少的岩藻糖残基。也可以在生成经修饰糖蛋白的表达系统(诸如美国专利申请公开文本No.60/344,169和WO 03/056914(GlycoFi,Inc.)中或WO2004/057002和WO 2004/024927(Greenovation)中教导的那些)中生成本发明的糖工程化抗TnC抗体。
涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的其它例子包括：WO2000/61739；WO 2001/29246；US 2002/0164328；US 2004/0109865；WO 2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请No US 2003/0157108A1,Presta,L；及WO2004/056312A1,Adams等，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；及WO2003/085107)。
在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。
还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO1997/30087(Patel等)；WO1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)。
也通过提高抗原结合分子对TnC的亲和力，例如通过亲和力成熟或其它改善亲和力的方法(见Tang等,J.Immunol.2007,179:2815-2823)或通过Fc区中的氨基酸修饰(如下文描述的)来实现本发明抗TnC抗体的ADCC或其它效应器功能的升高。本发明也涵盖这些办法的组合。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如，人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于本文和美国专利No.5,500,362(见例如Hellstrom,I.等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性方法(见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.MountainView,CA；和CytoTox
Figure BDA0001824445090000431
非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes等Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 95:652-656(1998)的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法(见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood 101:1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(见例如Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
在一个方面，本发明的抗体的Fc域包含一处或多处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。通常，在Fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。特别是，Fc域包含在位置E233，L234，L235，N297，P331和P329(EU编号方式)处的至少一处氨基酸替代。特别是，Fc域包含在IgG重链的位置234和235(EU编号方式)和/或329(EU编号方式)处的氨基酸替代。更加特别地，提供的是一种依照本发明的抗体，其包含具有IgG重链中的氨基酸替代L234A，L235A和P329G(“P329G LALA”，EU编号方式)的Fc域。氨基酸替代L234A和L235A指所谓的LALA突变。氨基酸替代组合“P329G LALA”几乎完全消除人IgG1Fc域的Fcγ受体结合且描述于国际专利申请公开文本No.WO 2012/130831A1，其还描述了制备此类突变体Fc域的方法及用于测定它的特性诸如Fc受体结合或效应器功能的方法。
具有降低的Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域还包括那些具有Fc区残基238,265,269,270,297,327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265，269，270，297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
在另一个方面，Fc域是IgG4Fc域。IgG4抗体展现与IgG1抗体相比降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。在一个更加具体的方面，Fc域是包含位置S228(Kabat编号方式)处的氨基酸替代，特别是氨基酸替代S228P的IgG4Fc域。在一个更加具体的方面，Fc域是包含氨基酸替代L235E和S228P和P329G(EU编号方式)的IgG4Fc域。此类IgG4Fc域突变体和它们的Fcγ受体结合特性也描述于WO 2012/130831。
描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的别的抗体变体(见例如美国专利No.6,737,056；WO 2004/056312，及Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区的位置298，333，和/或334(残基的EU编号方式)的替代的Fc区。在一些实施方案中，对Fc区做出改变，其导致改变的(即，改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551，WO 99/51642，及Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)的。
可通过本领域已知的方法来测量Fc域或包含Fc域的本发明抗体的效应器功能。本文中描述了用于测量ADCC的一种合适的测定法。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的其它例子描述于美国专利No.5,500,362；Hellstrom et al.，Proc Natl Acad Sci USA83:7059-7063(1986)及Hellstrom etal.,Proc Natl Acad Sci USA 82:1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；Bruggemann et al.,J Exp Med 166:1351-1361(1987)。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；和CytoTox
Figure BDA0001824445090000451
非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如公开于Clynes et al.,ProcNatl Acad Sci USA 95:652-656(1998)的。
在一些方面，该Fc域对补体成分，具体是对C1q的结合是降低的。因而，在该Fc域工程化改造成具有降低的效应器功能的一些实施方案中，所述降低的效应器功能包括降低的CDC。可进行C1q结合测定法来测定本发明的抗体是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro et al.,J Immunol Methods 202:163(1996)；Cragg et al.,Blood 101:1045-1052(2003)；及Cragg and Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。
具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434中的一处或多处具有替代，例如，Fc区残基434的替代的(美国专利No.7,371,826)。
至于关注Fc区变体的其它例子，还可见美国专利申请No.60/439,498；60/456,041；60/514,549；或WO 2004/063351(由于氨基酸修饰而具有升高的结合亲和力的变体Fc区)；或美国专利申请No.10/672,280或WO2004/099249(由于氨基酸修饰的具有改变的对FcγR的结合的Fc变体)；Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO 94/29351。
d)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如，“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，右旋糖苷，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧戊环，聚-1,3,6-三口恶烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)，和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能，抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，并且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物来生成抗体，例如，如记载于美国专利No.4,816,567的。在一个实施方案中，提供了编码本文中所描述的抗TnC抗体的分离的多核苷酸。此类多核苷酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻和/或重链)。在又一个实施方案中，提供了包含此类多核苷酸的一种或多种载体(例如，克隆载体或表达载体)。在又一个实施方案中，提供了包含此类多核苷酸或此类载体的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用下列载体转化)：(1)包含多核苷酸的载体，所述多核苷酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列(例如多顺反子载体)，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的多核苷酸，所述第二载体包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的多核苷酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，特别是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，幼仓鼠肾细胞(BHK)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了生成抗TnC抗体的方法，其中该方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码抗体的多核苷酸的宿主细胞，如上文提供的，并且任选地，自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收抗体。
对于抗TnC抗体的重组生成，将一种或多种编码抗体的多核苷酸(例如如上文所描述的)分离，并插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建与合适的转录/翻译控制信号一起含有抗TnC抗体的编码序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内重组/遗传重组。见例如记载于Maniatis等,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold SpringHarborLaboratory,N.Y.(1989)及Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,GreenePublishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)的技术。
在一个实施方案中，可以在组成性启动子或备选地调节性表达系统的控制下表达一种或几种编码抗TnC抗体的多核苷酸。合适的调节性表达系统包括但不限于四环素调节性表达系统，蜕皮激素诱导型表达系统，lac转换表达系统，糖皮质素诱导型表达系统，温度诱导型启动子系统，和金属硫蛋白金属诱导型表达系统。若编码本发明抗体的几种不同多核苷酸包含在宿主细胞系统内，则它们中的一些可以在组成性启动子的控制下表达，而其它在调节性启动子的控制下表达。
适合于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括本文中所描述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见例如美国专利No.5,648,237,5,789,199和5,840,523(还可见Charlton,Methods in MolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌(E.coli.)中的表达)。表达后，可以将抗体在可溶性级分中自细菌细胞团糊分离，并可以进一步纯化。
在原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是适合于抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),及Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。此类表达系统还教导于美国专利申请No.60/344,169和WO 03/056914(用于在非人真核宿主细胞中生成人样糖蛋白的方法)。
适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。也可以利用植物细胞培养物作为宿主。见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(其描述了用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适合于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如记载于例如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977)的)；幼年仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如记载于例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如记载于例如Mather等,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)的；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0，NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见例如Yazaki和Wu,Methods in MolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。
一般地，稳定的表达对于瞬时表达而言是优选的，因为它通常实现更加可再现的结果，而且还更适合于大规模生产；然而，本领域技术人员技术内的是测定瞬时表达对于特定的情况是否更好。
本发明还涉及一种用于生成抗TnC抗体的方法，其包括(a)在容许依照本发明的抗TnC抗体表达的条件下在培养基中培养包含至少一种编码该抗体的多核苷酸的宿主细胞；并(b)回收该抗体。
本发明进一步涉及用于修饰由宿主细胞生成的本发明抗TnC抗体的糖基化概况的方法，包括在所述宿主细胞中表达一种或多种编码抗TnC抗体的多核苷酸和一种或多种编码具有糖基转移酶活性的多肽的多核苷酸，或包含此类多核苷酸的载体。一般地，可以使用任何类型的培养细胞系，包括上文所讨论的细胞系来生成用于生成具有改变的糖基化样式的抗TnC抗体的细胞系。优选的细胞系包括CHO细胞，BHK细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，YO骨髓瘤细胞，P3X63小鼠骨髓瘤细胞，PER细胞，PER.C6细胞或杂交瘤细胞，和其它哺乳动物细胞。具有糖基转移酶活性的多肽包括β(1,4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII)，α-甘露糖苷酶II(ManII)，β(1,4)-半乳糖基转移酶(GalT)，β(1,2)-N-乙酰葡糖氨基转移酶I(GnTI)，和β(1,2)-N-乙酰葡糖氨基转移酶II(GnTII)。在一个实施方案中，在宿主细胞中表达编码具有糖基转移酶活性的多肽的多核苷酸的组合(例如，GnTIII和Man II)。同样地，该方法还涵盖在已经破坏或以其它方式灭活糖基转移酶基因的宿主细胞(例如，已经敲除编码α1,6核心岩藻糖基转移酶的基因的活性的宿主细胞)中表达一种或多种编码抗TnC抗体的多核苷酸。在一个具体的实施方案中，可以在进一步表达编码具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸以修饰所述抗体的糖基化样式的宿主细胞中生成本发明的抗TnC抗体。在一个具体的实施方案中，具有GnTIII活性的多肽是包含高尔基驻留多肽的高尔基定位域的融合多肽。在另一个具体的实施方案中，表达编码具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸的宿主细胞中本发明抗TnC抗体的表达生成具有升高的Fc受体结合亲和力和/或升高的效应器功能的抗TnC抗体。因而，在一个实施方案中，本发明涉及宿主细胞，其包含(a)一种或多种包含编码具有GnTIII活性的多肽的序列的分离的多核苷酸；和(b)一种或多种编码本发明抗TnC抗体的分离的多核苷酸。在一个具体的实施方案中，具有GnTIII活性的多肽是包含GnTIII的催化域和异源高尔基驻留多肽的高尔基定位域的融合多肽。特别地，所述高尔基定位域是甘露糖苷酶II的高尔基定位域。用于生成此类融合多肽及使用它们来生成具有升高的效应器功能的抗体的方法披露于WO2004/065540；美国临时专利申请No.60/495,142和美国专利申请公开文本No.2004/0241817，通过提及而将其全部内容明确收入本文。在另一个实施方案中，宿主细胞另外包含分离的多核苷酸，其包含编码具有甘露糖苷酶II(ManII)活性的多肽的序列。可以在组成性启动子或备选地调节性表达系统的控制下表达编码多肽的多核苷酸，像编码抗TnC抗体的多核苷酸。此类系统是本领域中公知的，并且包括上文所讨论的系统。
可以例如通过下述方法来鉴定含有抗TnC抗体的编码序列和/或具有糖基转移酶活性的多肽的编码序列，并且表达生物学活性基因产物的宿主细胞：DNA-DNA或DNA-RNA杂交；“标志物”基因功能的存在或缺乏；评估转录水平，如通过宿主细胞中的各自mRNA转录物的表达测量的；或检测基因产物，如通过免疫测定法或通过其生物学活性(本领域公知的方法)测量的。GnTIII或Man II活性可以例如通过采用分别结合GnTIII或ManII的生物合成产物的凝集素来检测。此类凝集素的一个例子是优先结合含有两分型GlcNAc的寡糖的E4-PHA凝集素。具有GnTIII或ManII活性的多肽的生物合成产物(即具体寡糖结构)也可以通过自由表达所述多肽的细胞生成的糖蛋白释放的寡糖的质谱分析来检测。或者，可以使用如下的功能性测定法，其测量由用如下多核苷酸工程化改造的细胞生成的抗体介导的升高的效应器功能或升高的Fc受体结合，所述多核苷酸编码具有GnTIII活性的多肽。
本发明还涉及用于生成具有经修饰的寡糖的抗TnC抗体的方法，包括(a)在容许生成依照本发明的抗TnC抗体的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞工程化改造为表达编码具有糖基转移酶活性的多肽的至少一种多核苷酸，其中所述具有糖基转移酶活性的多肽以足以修饰由所述宿主细胞生成的所述抗TnC抗体的Fc区中的寡糖的量表达；并(b)分离所述抗TnC抗体。在一个实施方案中，具有糖基转移酶活性的多肽是GnTIII。在另一个实施方案中，存在两种具有糖基转移酶活性的多肽。在一个具体的实施方案中，两种具有糖基转移酶活性的肽是GnTIII和ManII。在另一个实施方案中，具有糖基转移酶活性的多肽是包含GnTIII的催化域的融合多肽。在一个更具体的实施方案中，融合多肽进一步包含高尔基驻留多肽的高尔基定位域。特别地，高尔基定位域是甘露糖苷酶II或GnTI的定位域，最特别地甘露糖苷酶II的定位域。或者，高尔基定位域选自下组：甘露糖苷酶I的定位域，GnTII的定位域，和α1,6核心岩藻糖基转移酶的定位域。
在一个具体的实施方案中，由上文所述方法或宿主细胞生成的经修饰的抗TnC抗体具有包含Fc区的IgG恒定区或其片段。在另一个具体的实施方案中，抗TnC抗体是包含Fc区的人源化或人抗体或其片段。
由上文所述方法或宿主细胞生成的具有改变的糖基化的抗TnC抗体通常由于宿主细胞的修饰(例如，通过表达糖基转移酶基因)而展现出升高的Fc受体结合亲和力和/或升高的效应器功能。优选地，升高的Fc受体结合亲和力是升高的对Fcγ活化受体，最优选FcγRIIIa受体的结合。优选地，升高的效应器功能是下列一项或多项的升高：升高的抗体依赖性细胞的细胞毒性，升高的抗体依赖性细胞的吞噬(ADCP)，升高的细胞因子分泌，升高的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取，升高的Fc介导的细胞的细胞毒性，升高的对NK细胞的结合，升高的对巨噬细胞的结合，升高的对多形核细胞(PMNC)的结合，升高的对单核细胞的结合，靶物-结合的抗体的交联升高，升高的诱导凋亡的直接信号传导，升高的树突细胞成熟，和升高的T细胞引发。
测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗TnC抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
a)结合测定法和其它测定法
一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，Western印迹等来进行。
另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与其它抗TnC抗体竞争对TnC的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与所述其它特异性抗TnC抗体所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法见Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)。
在一种例示性竞争测定法中，在包含第一经标记抗体(其结合TnC，例如实施例中描述的18D4抗体)和第二未标记抗体(其要测试与第一抗体竞争对TnC的结合的能力)的溶液中温育固定化TnC。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化TnC。在允许第一抗体结合TnC的条件下温育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定化TnC联合的标记物的量。如果测试样品中与固定化TnC联合的标记物的量与对照样品相比实质性降低，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对TnC的结合。参见Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manualch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,NY)。
b)活性测定法
一方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的抗TnC抗体的测定法。生物学活性可包括例如靶定细胞的裂解，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，补体依赖性细胞毒性(CDC)，或凋亡的诱导。还提供了在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。在某些实施方案中，对本发明的抗体测试此类生物学活性。
上文(见“定义”下：“具有升高的ADCC的抗体”)描述了“用于测试ADCC的例示性测定法。用于检测细胞裂解(例如通过测量LDH释放)或凋亡(例如使用TUNEL测定法)的测定法是本领域公知的。用于测量ADCC或CDC的测定法还记载于WO 2004/065540(参见其中的实施例1)，通过述及将其完整内容收入本文。
免疫缀合物
本发明还提供了包含与一种或多种细胞毒剂，诸如化学治疗剂或药物，生长抑制剂，毒素(例如，蛋白质毒素，细菌，真菌，植物，或动物起源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素缀合的本文中的抗TnC抗体的免疫缀合物。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，包括但不限于美登木素生物碱(见美国专利No.5,208,020，5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235B1)；auristatin诸如单甲基auristatin药物模块DE和DF(MMAE和MMAF)(见美国专利No.5,635,483和5,780,588及7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(见美国专利No.5,712,374,5,714,586,5,739,116,5,767,285,5,770,701,5,770,710,5,773,001和5,877,296；Hinman等,Cancer Res.53:3336-3342(1993)；及Lode等,Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环类抗生素诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(见Kratz等,Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等,Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgov等,Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:829-834(2000)；Dubowchik等,Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King等,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；及美国专利No.6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)诸如多西他赛(docetaxel)，帕利他塞，larotaxel，tesetaxel，和ortataxel；单端孢霉素(trichothecene)；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文中所描述的抗体，所述酶活性毒素包括但不限于白喉A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))，蓖麻毒蛋白(ricin)A链，相思豆毒蛋白(abrin)A链，蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链，α-帚曲霉素(sarcin)，油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白，香石竹(dianthin)毒蛋白，美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜(Momordica charantia)抑制物，麻疯树毒蛋白(curcin)，巴豆毒蛋白(crotin)，肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒蛋白(gelonin)，丝林霉素(mitogellin)，局限曲菌素(restrictocin)，酚霉素(phenomycin)，依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文中所描述的抗体。多种放射性同位素可用于生成放射性缀合物。例子包括211At，131I，125I，90Y，186Re，188Re，153Sm，212Bi，32P，212Pb和Lu的放射性同位素。在使用放射性缀合物进行检测时，它可以包含供闪烁法研究用的放射性原子，例如99mTc或123I，或供核磁共振(NMR)成像(又称为磁共振成像，mri)用的自旋标记物，诸如再一次的碘-123，碘-131，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白质偶联剂来生成抗体和细胞毒剂的缀合物，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)，活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)，醛类(诸如戊二醛)，双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)，双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异硫氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)，和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头，肽酶敏感性接头，光不稳定接头，二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Res 52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖，但不限于用交联试剂制备的此类缀合物，所述交联试剂包括但不限于BMPS，EMCS，GMBS，HBVS，LC-SMCC，MBS，MPBH，SBAP，SIA，SIAB，SMCC，SMPB，SMPH，sulfo-EMCS，sulfo-GMBS，sulfo-KMUS，sulfo-MBS，sulfo-SIAB，sulfo-SMCC，和sulfo-SMPB，及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们是商品化的(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。
用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文中提供的任何抗TnC抗体可用于检测生物学样品中TnC的存在。在用于本文时，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物学样品包含细胞或组织，诸如来自脑，乳腺/乳房，结肠，肾，肝，肺，卵巢，胰，前列腺，骨骼肌，皮肤，小肠，胃或子宫的细胞或组织，也包括这些器官的细胞或组织肿瘤。
在一个实施方案中，提供了在诊断或检测方法中使用的抗TnC抗体。在又一方面，提供了检测生物学样品中TnC的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括在容许抗TnC抗体结合TnC的条件下使生物学样品与抗TnC抗体接触，如本文中所描述的，并检测是否在抗TnC抗体与TnC之间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗TnC抗体来选择适合用抗TnC抗体治疗的受试者，例如其中TnC是一种用于选择患者的生物标志。
在某些实施方案中，提供了经标记的抗TnC抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(诸如荧光，发色，电子致密，化学发光，和放射性标记物)，及例如经由酶反应或分子相互作用间接检测的模块，诸如酶或配体。例示性的标记物包括但不限于放射性同位素32P，14C，125I，3H，和131I，荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明(rhodamine)及其衍生物，丹酰，伞形酮，萤光素酶，例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456)，萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联)，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶，生物素/亲合素，自旋标记物，噬菌体标记物，稳定的自由基，等等。
药物配制剂
通过混合具有期望纯度的此类抗体与一种或多种任选的药学可接受载体(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))混合以冻干配制剂或水性溶液形式制备如本文中所描述的抗TnC抗体的药物配制剂。一般地，药学可接受载体在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐，柠檬酸盐，和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵，苯索氯铵；酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性的药学可接受载体进一步包含间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(
Figure BDA0001824445090000561
Baxter International,Inc.)。某些例示性的sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968。在一方面，将sHASEGP与一种或多种别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
例示性的冻干抗体配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性抗体配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性组分，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。例如，如果要治疗的疾病是癌症的话，可能希望进一步提供一种或多种抗癌剂，例如化疗剂，肿瘤细胞增殖抑制剂，或肿瘤细胞凋亡激活剂。此类活性组分适于以有效用于所需目的的量而组合存在。
活性成分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体，清蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形商品形式，例如膜，或微胶囊。
用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。
本文中所描述的分子可以为多种剂量形式，其包括但不限于液体溶液或悬浮液，片剂，丸剂，粉剂，栓剂，聚合物微胶囊或微泡，脂质体，和可注射或可输注溶液。优选的形式取决于施用模式和治疗应用，但是通常会是可注射或可输注溶液。
治疗性方法和组合物
可以在治疗性方法中使用本文中提供的任何抗TnC抗体或包含抗TnC抗体的药物配制剂。
本文中提供的抗TnC抗体可用于治疗以TnC表达，特别是与相同细胞类型的正常组织相比的TnC异常表达(例如细胞中的过表达或不同样式的表达)为特征的疾病。与相同细胞类型的非肿瘤组织相比，TnC在许多人肿瘤中异常表达(例如过表达)。如此，本文中提供的抗TnC抗体特别可用于预防肿瘤形成，根除肿瘤和抑制肿瘤生长或转移。本文中提供的抗TnC抗体可用于治疗任何表达TnC的肿瘤。可通过本文中提供的抗TnC抗体来治疗的具体恶性肿瘤包括例如肺癌，结肠癌，胃癌，乳腺癌，头和颈癌，皮肤癌，肝癌，肾癌，前列腺癌，胰腺癌，脑癌，骨骼肌癌。
本文中公开的抗TnC抗体可用于抑制肿瘤生长或杀死肿瘤细胞。例如，抗TnC抗体能结合癌性细胞(肿瘤细胞或肿瘤基质细胞)的膜或细胞表面上的TnC并引发例如ADCC或其它效应器介导的杀死癌性细胞。
或者，抗TnC抗体可用于阻断TnC的功能，特别是通过物理上干扰它与其它化合物的结合。例如，抗原结合分子可用于阻断TnC介导的细胞粘附，传播或迁移。
在一个方面，提供了作为药物使用的抗TnC抗体。在又一些方面，提供了在治疗以TnC表达为特征的疾病中使用的抗TnC抗体。在某些实施方案中，提供了在治疗方法中使用的抗TnC抗体。在某些实施方案中，本发明提供了在治疗具有以TnC表达为特征的疾病的个体的方法中使用的抗TnC抗体，所述治疗包括对个体施用有效量的抗TnC抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。在又一些实施方案中，本发明提供了在诱导细胞裂解中使用的抗TnC抗体。在某些实施方案中，本发明提供了在个体中诱导细胞裂解的方法中使用的抗TnC抗体，所述方法包括对个体施用有效量的抗TnC抗体以诱导细胞裂解。依照任何上述实施方案的“个体”优选是人。依照任何上述实施方案的“以TnC表达为特征的疾病”优选是癌症，最优选选自下组的癌症：肺癌，结肠癌，胃癌，乳腺癌，头和颈癌，皮肤癌，肝癌，肾癌，前列腺癌，胰腺癌，脑癌，骨骼肌癌。依照任何上述实施方案的“细胞”优选是肿瘤中存在的细胞，诸如肿瘤细胞或肿瘤基质细胞，最优选肿瘤细胞。依照任何上述实施方案的“TnC表达”优选是与相同细胞类型的正常组织相比，细胞中的异常表达，诸如过表达或不同样式的表达。
在又一方面，本发明提供了抗TnC抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗以TnC表达为特征的疾病。在又一个实施方案中，所述药物用于治疗以TnC表达为特征的疾病的方法，包括对具有以TnC表达为特征的疾病的个体施用有效量的药物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。在又一个实施方案中，药物用于诱导细胞裂解。在又一个实施方案中，药物用于在个体中诱导细胞裂解的方法，所述方法包括对个体施用有效量的药物以诱导细胞裂解。依照任何上述实施方案的“个体”优选是人。依照任何上述实施方案的“以TnC表达为特征的疾病”优选是癌症，最优选选自下组的癌症：肺癌，结肠癌，胃癌，乳腺癌，皮肤癌，肝癌，肾癌，前列腺癌，胰腺癌，脑癌，骨骼肌癌。依照任何上述实施方案的“细胞”优选是肿瘤中存在的细胞，诸如肿瘤细胞或肿瘤基质细胞，最优选肿瘤细胞。依照任何上述实施方案的“TnC表达”优选是与相同细胞类型的正常组织相比，细胞中的异常表达，诸如过表达或不同样式的表达。
在又一方面，本发明提供了治疗以TnC表达为特征的疾病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对具有此类以TnC表达为特征的疾病的个体施用有效量的抗TnC抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，如下文所描述的。在又一个实施方案中，本发明提供了用于在个体中诱导细胞裂解的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对个体施用有效量的抗TnC抗体以诱导细胞裂解。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。依照任何上述实施方案的“以TnC表达为特征的疾病”优选是癌症，最优选选自下组的癌症：肺癌，结肠癌，胃癌，乳腺癌，皮肤癌，肝癌，肾癌，前列腺癌，胰腺癌，脑癌，骨骼肌癌。依照任何上述实施方案的“细胞”优选是肿瘤中存在的细胞，诸如肿瘤细胞或肿瘤基质细胞，最优选肿瘤细胞。依照任何上述实施方案的“TnC表达”优选是与相同细胞类型的正常组织相比，细胞中的异常表达，诸如过表达或不同样式的表达。
在又一方面，本发明提供了药物配制剂，其包含本文中提供的任何抗TnC抗体，例如在任何上述治疗性方法中使用。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗TnC抗体和一种或多种药学可接受载体。在另一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗TnC抗体和至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。
可以单独或与疗法中的其它药剂组合使用本发明的抗体。例如，可以与至少一种别的治疗剂共施用本发明的抗体。在某些实施方案中，别的治疗剂是抗癌剂。合适的抗癌剂是例如化疗剂，肿瘤细胞增殖的抑制剂，或肿瘤细胞凋亡的激活剂。
上文记录的此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的治疗剂和/或佐剂之前，同时，和/或之后发生本发明的抗体的施用。也可以与放射疗法组合使用本发明的抗体。
可以通过任何合适的手段，包括胃肠外，肺内，和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用本发明的抗体(和任何别的治疗剂)。胃肠外施用包括肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。静脉内施用通常是优选的。然而，预期腹膜内路径特别可用于例如治疗结肠直肠肿瘤。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用，推注施用，和脉冲输注。
本发明的抗体应当以一种符合良好的医学实践的方式配制，确定剂量及给药。关于这一点考虑的因素包括在治疗的特定病症，在治疗的特定哺乳动物，患者个体的临床状态，病因，药物递送部位，给药方法，服药日程以及其它为开业医生所知的因素。抗体无需但可任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所述病症的药物一起配制。上述其它药物的有效量取决于配方中所存在的抗体的量，所治疗病症的类型，以及其它上述讨论的因素。这些药物通常以相同的剂量使用并具有本文中所描述的给药途径，或以约1-99％的本文所描述的剂量使用，或以任何剂量并通过任何途径使用，所述剂量和途径是凭经验确定的/经临床测定合适的。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体(当单独或与一种或多种其它别的治疗剂联合使用时)的合适剂量应取决于所要治疗的疾病的类型，抗体的种类，疾病的严重性和病程，所给予抗体的预防或治疗目的，之前的治疗，患者的临床史和对抗体的应答，以及主治医师的斟酌决定。抗体适合于在一次或一系列的治疗中给予患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可作为首次候选用量给予患者，无论是例如通过一次或多次分开的给药或通过连续输注。取决予上述提及的因素，一个典型的日剂量可在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复给药，取决于病情，治疗应通常持续直至出现疾病症状得到期望的遏制为止。抗体的一种例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此，可以对患者施用约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任意组合)的一剂或多剂。上述剂量可间歇给予，如每周或每三周给予一次(如使得患者得到约2-约20个，或例如约6个剂量的抗体)。可给予初始较高的加载剂量，接着给予一个或多个较低的剂量。然而，可使用其它给药方案。通过常规技术和测定方法易于监测该治疗的进展。
应当理解，可以替换抗TnC抗体或在抗TnC抗体外使用本发明的抗体缀合物实施任何上述配制剂或治疗性方法。
制品
在本发明的另一方面，提供了一种制品，其含有可用于治疗，预防和/或诊断上文所描述的病症的材料。制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，管形瓶，注射器，IV溶液袋，等等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳单独或与另一种组合物组合有效治疗，预防和/或诊断状况的组合物，并且可以具有无菌存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外，制品可以包含(a)具有其中含有的组合物的第一容器，其中组合物包含本发明的抗体；和(b)具有其中含有的组合物的第二容器，其中组合物包含别的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。在本发明的此实施方案中的制品可以进一步包含包装插页，其指示可以使用组合物来治疗特定的状况。或者/另外，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学可接受缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，Ringer氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液，稀释剂，滤器，针，和注射器。
应当理解，任何上述制品可包括本发明的免疫缀合物来代替或补充抗TnC抗体。
具体的实施方案
1.一种特异性结合生腱蛋白C(TnC)的抗体，其中所述抗体包含重链可变
区和轻链可变区，
该重链可变区包含
(a)选自SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:52的组的重链CDR1；
(b)选自SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:53的组的重链CDR2；和
(c)选自SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:54的组的重链CDR3，
该轻链可变区包含
(a)选自SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:40的组的轻链CDR1；
(b)选自SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:41的组的轻链CDR2；和
(c)选自SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:42的组的轻链CDR3。
2.一种特异性结合生腱蛋白C(TnC)的抗体，其中所述抗体包含：
(i)重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:49的重链
CDR1，SEQ ID NO:50的重链CDR2和SEQ ID NO:51的重链CDR3，该
轻链可变区包含SEQ ID NO:37的轻链CDR1，SEQ ID NO:38的轻链
CDR2和SEQ ID NO:39的轻链CDR3；或
(ii)重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:52的重链
CDR1，SEQ ID NO:53的重链CDR2和SEQ ID NO:54的重链CDR3，该
轻链可变区包含SEQ ID NO:40的轻链CDR1，SEQ ID NO:41的轻链
CDR2和SEQ ID NO:42的轻链CDR3；
其中所述抗体具有交叉物种反应性。
3.实施方案1或2任一项的实施方案的抗体，其中所述抗体包含重链可变区
和轻链可变区，
该重链可变区包含
(a)SEQ ID NO:49的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO:50的重链CDR2；和
(c)SEQ ID NO:51的重链CDR3，
该轻链可变区包含
(a)SEQ ID NO:37的轻链CDR1；
(b)SEQ ID NO:38的轻链CDR2；和
(c)SEQ ID NO:39的轻链CDR3。
4.实施方案1或2任一项的实施方案的抗体，其中所述抗体包含重链可变区
和轻链可变区，
该重链可变区包含
(a)SEQ ID NO:52的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO:53的重链CDR2；和
(c)SEQ ID NO:54的重链CDR3，
该轻链可变区包含
(a)SEQ ID NO:40的轻链CDR1；
(b)SEQ ID NO:41的轻链CDR2；和
(c)SEQ ID NO:42的轻链CDR3。
5.实施方案1至4任一项的抗体，其中所述抗体包含包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的轻链可变区。
6.实施方案1至4任一项的抗体，其中所述抗体包含包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的轻链可变区。
7.实施方案1至6任一项的抗体，其中所述抗体包含Fc区或与免疫球蛋白Fc区等同的区域。
8.实施方案1至7任一项的抗体，其中所述Fc区是IgG1Fc区。
9.实施方案1至8任一项的抗体，其中所述抗体是全长IgG1类抗体。
10.实施方案1至9任一项的抗体，其中所述抗体包含人恒定区。
11.实施方案1至10任一项的抗体，其中所述抗体是人抗体。
12.实施方案1至11任一项的抗体，其中所述抗体包含包含氨基酸序列SEQ ID NO:59的轻链区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:60的重链区。
13.实施方案1至12任一项的抗体，其中所述抗体包含包含氨基酸序列SEQ ID NO:61的轻链区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:62的重链区。
14.实施方案1至13任一项的抗体，其中所述抗体具有改善的亲和力。
15.实施方案1至14任一项的抗体，其中所述抗体以低于约1nM的KD值结合人TnC。
16.实施方案1至15任一项的抗体，其中所述抗体具有交叉物种反应性。
17.实施方案1至16任一项的抗体，其中所述抗体以低于约2nM的KD值结合人，小鼠和食蟹猴TnC中的至少一种。
18.实施方案1至17任一项的抗体，其中所述抗体结合人，小鼠和食蟹猴TnC。
19.实施方案1至18任一项的抗体，其中所述抗体以相似亲和力结合来自所有指定物种的靶抗原。
20.实施方案1至19任一项的抗体，其中所述抗体以相似亲和力结合来自所有指定物种的靶抗原，特别是在因数为100的KD范围内，在因数为50的KD范围内，在因数为20的KD范围内，在因数为10的KD范围内，在因数为5的KD范围内。
21.实施方案1至20任一项的抗体，其中所述抗体以相似亲和力结合来自所有指定物种的靶抗原，特别是在因数为10的KD范围内。
22.实施方案1至21任一项的抗体，其中所述抗体以第一KD值KD1结合人TnC，其中所述抗体以第二KD值KD2结合小鼠TnC，且其中所述抗体以第三KD值KD3结合食蟹猴TnC，其中所有选自由KD1，KD2和KD3组成的组的KD值低于约2nM。
23.实施方案1至22任一项的抗体，其中所述抗体以第一KD值KD1结合人TnC，其中所述抗体以第二KD值KD2结合小鼠TnC，且其中所述抗体以第三KD值KD3结合食蟹猴TnC，其中所有选自由KD1，KD2和KD3组成的组的KD值在2nM至0.1nM的范围中。
24.实施方案1至23任一项的抗体，其中所述抗体是对至少一种选自由A1，A2，A3，A4，B，AD1，AD2，C和D组成的组的TnC域特异性的。
25.实施方案1，2，3，5或12任一项的抗体，其中所述抗体是对TnC域A1和A4特异性的。
26.实施方案1，2，4，6或13任一项的抗体，其中所述抗体是对TnC域C特异性的。
27.实施方案1至26任一项的抗体，其中所述抗体包含Fc区，该Fc区包含Fc区中的至少一处氨基酸替代。
28.实施方案27的抗体，其中亲本非替代Fc区包含氨基酸残基Leu234，Leu235和Pro329，其中替代Fc区相对于亲本非替代Fc区包含至少一处选自由Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly组成的组的氨基酸替代。
29.实施方案28的抗体，其中包含替代Fc区的抗体具有与包含亲本非替代重链区的抗体相比降低的效应器功能和/或降低的Fc受体结合亲和力。
30.实施方案27至29任一项的抗体，其相对于亲本非替代Fc区包含氨基酸替代Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly，其中对FcγR和C1q的结合消除和/或其中Fc介导的效应器功能消除。
31.实施方案30的抗体，其中所述消除的效应器功能是消除的ADCC。
32.实施方案1至31任一项的抗体，其中所述抗体包含包含选自SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66的组的氨基酸序列的重链区。
33.实施方案1至32任一项的抗体，其中所述抗体包含糖工程化Fc区。
34.实施方案33的抗体，其中与非糖工程化抗体相比，所述抗体具有所述Fc区中比例升高的非岩藻糖基化寡糖。
35.实施方案33或34的抗体，其中所述Fc区中至少约20％至约100％的N连接寡糖是非岩藻糖基化的。
36.实施方案33至35任一项的抗体，其中与非糖工程化抗体相比，所述抗体具有所述Fc区中比例升高的两分型寡糖。
37.实施方案33至36任一项的抗体，其中所述Fc区中至少约20％至约100％的N连接寡糖是两分型的。
38.实施方案33至37任一项的抗体，其中所述Fc区中至少约20％至约50％的N连接寡糖是两分型，非岩藻糖基化的。
39.实施方案33至38任一项的抗体，其中所述抗体具有升高的效应器功能和/或升高的Fc受体结合亲和力。
40.实施方案39的抗体，其中所述升高的效应器功能是升高的ADCC。
41.实施方案1至40任一项的抗体，其中所述抗体是多特异性抗体。
42.实施方案1至41任一项的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体。
43.一种分离的多核苷酸，其编码形成依照实施方案1至42任一项的抗体一部分的多肽。
44.一种分离的多肽，其由实施方案43的多核苷酸编码。
45.一种组合物，其包含第一分离的多核苷酸和第二分离的多核苷酸，该第一分离的多核苷酸编码包含选自SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:65，和SEQ ID NO:66的序列的多肽，该第二分离的多核苷酸编码包含选自SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:61的序列的多肽。
46.一种载体，其包含实施方案43的多核苷酸。
47.一种宿主细胞，其包含实施方案43的多核苷酸，实施方案45的组合物，或实施方案46的载体。
48.实施方案47的宿主细胞，其中所述宿主细胞经过处理，表达升高水平的一种或多种具有GnTIII活性的多肽。
49.实施方案48的宿主细胞，其中所述具有GnTIII活性的多肽是融合多肽，该融合多肽包含GnTIII的催化结构域和ManII的Golgi定位结构域。
50.实施方案48或49的宿主细胞，其中所述宿主细胞经过进一步处理，表达升高水平的一种或多种具有ManII活性的多肽。
51.一种生成特异性结合TnC的抗体的方法，所述方法包括
a)在容许该抗体表达的条件下在培养基中培养实施方案47至50任一项的宿主细胞，和
b)回收该抗体。
52.一种生成特异性结合TnC的抗体的方法，所述方法包括
a)在容许该抗体表达和所述具有GnTIII活性的多肽修饰所述抗体Fc区上存在的寡糖的条件下在培养基中培养实施方案48至50任一项的宿主细胞，和
b)回收该抗体。
53.一种特异性结合TnC的抗体，其中所述抗体通过实施方案51或52的方法
来生成。
54.一种抗体缀合物，其包含实施方案1至40任一项的抗体和细胞毒剂。
55.一种药物配制剂，其包含实施方案1至42任一项的抗体和药学可接受载体。
56.实施方案55的药物配制剂，其进一步包含别的治疗剂。
57.实施方案1至42任一项的抗体，其作为药物使用。
58.实施方案1至42任一项的抗体，其在以TnC表达为特征的疾病的治疗中使用。
59.实施方案58的抗体，其中所述疾病是癌症。
60.实施方案1至42任一项的抗体，其用于诱导肿瘤细胞或肿瘤基质细胞的细胞裂解。
61.实施方案1至42任一项的抗体在制造用于治疗以TnC表达为特征的疾病的药物中的用途。
62.实施方案61的用途，其中所述疾病是癌症。
63.实施方案1至42任一项的抗体在制造用于诱导肿瘤细胞或肿瘤基质细胞的细胞裂解的药物中的用途。
64.一种治疗具有以TnC表达为特征的疾病的个体的方法，包括对该个体施用有效量的实施方案1至42任一项的抗体或实施方案55或56的药物配制剂。
65.实施方案64的方法，进一步包括对该个体施用别的治疗剂。
66.实施方案64或65的方法，其中所述疾病是癌症。
67.一种诱导肿瘤细胞或肿瘤基质细胞的细胞裂解的方法，所述方法包括使所述肿瘤细胞或肿瘤基质细胞与实施方案1至42任一项的抗体接触。
68.实施方案67的方法，其中所述细胞裂解是通过该抗体的抗体依赖性细胞毒性诱导的。
69.一种诊断个体中的疾病的方法，所述方法包含对该个体施用有效量的诊断剂，其中所述诊断剂包含实施方案1至42任一项的抗体和标记物，该标记物容许检测所述诊断剂和TnC的复合物。
70.如本文描述的发明。
III.实施例
下面是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施各种其它实施方案。
重组DNA技术
使用标准方法来操作DNA，如记载于Sambrook,J.et al.,Molecular cloning:Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork,1989。依照制造商的说明书使用分子生物学试剂。通过双链测序测定DNA序列。在一些情况中，由Geneart AG(Regensburg,Germany)通过自动化基因合成自合成寡核苷酸和PCR产物制备期望的基因区段。将侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆入指定质粒中。自经过转化的细菌纯化质粒DNA，并通过UV光谱术测定浓度。通过DNA测序确认亚克隆基因片段的DNA序列。基因区段设计成具有合适的限制性位点以容许亚克隆入相应表达载体中。
关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息见Kabat,E.A.et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Ed.,NIHPublication No 91-3242。为了表达，所有构建物含有编码将蛋白质靶向真核细胞中分泌的前导肽的5’端DNA序列。例示性前导肽和编码它们的多核苷酸序列见SEQ ID NO 67至SEQID NO 75。
实施例1
TnC抗原序列和抗原生成
将表3和表4的所有构建物融合至GST的C端并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。对于位点特异性生物素化，Avi标签添加至生腱蛋白序列的C端，并在分开的质粒上共表达BirA生物素连接酶(Avidity，Colorado，USA)。生长培养基是含100μg/ml氨苄青霉素和20μg/ml氯霉素的2YT。添加生物素至50μM的终浓度。用1mM IPTG于22℃诱导蛋白质表达过夜。通过离心收获细胞，并通过B-PER试剂(pierce 78260)存在下的超声波处理和1mg/ml溶菌酶(Sigma L6876)实施细胞裂解。将裂解物离心并将澄清后的裂解物加载到谷胱甘肽Sepharose柱(GE Healthcare；产品号17-0756-01)上。清洗后，于4℃经由凝血酶(SigmaAldrich；产品号10602400001)自GST切割TnC分子过夜。在50mM Tris缓冲液pH 8.0；200mMNaCl，5mM MgCl2，1mM DTT和10％甘油中实施洗脱。最终的纯化步骤是在凝胶过滤柱(Superdex 75 16/60；GE Healthcare)上。将样品在液氮中闪冻直至加工。
表3：用于交叉物种亲和力测定(参见表26)的TnC抗原的序列
Figure BDA0001824445090000671
Figure BDA0001824445090000681
Figure BDA0001824445090000691
Figure BDA0001824445090000701
Figure BDA0001824445090000711
表4：用于亲和力测定(参见表5)的TnC抗原的序列
Figure BDA0001824445090000712
Figure BDA0001824445090000721
Figure BDA0001824445090000731
实施例2
自通用Fab文库选择抗TnC抗体
自两种不同通用噬菌体展示文库：DP88-4(克隆18D4)和λ-DP47(克隆11C7)选择抗TnC抗体。
文库构建
DP88-4文库是使用包含轻链CDR3(L3，3种不同长度)和重链CDR3(H3，3种不同长度)中的随机化序列间隙的V域配对Vk1_5(κ轻链)和VH1_69(重链)基于人种系基因构建的。文库生成是通过交叠延伸(SOE)PCR应用剪接，通过装配3种PCR扩增片段而实施的。片段1包含抗体基因的5’端，包括随机化L3，片段2是中央恒定片段，跨越L3至H3，而片段3包含随机化H3和抗体基因的3’部分。分别使用下面的引物组合来生成用于DP88-4文库的这些文库片段：片段1(正向引物LMB3与反向引物Vk1_5_L3r_S或Vk1_5_L3r_SY或Vk1_5_L3r_SPY组合)，片段2(正向引物RJH31与反向引物RJH32组合)和片段3(正向引物DP88-v4-4或DP88-v4-6或DP88-v4-8与反向引物fdseqlong组合)。用于生成文库片段的PCR参数是初始变性5分钟94℃，25个循环的1分钟94℃，1分钟58℃，1分钟72℃和终末延长10分钟72℃。为了装配PCR，使用等摩尔比率的凝胶纯化的单一片段作为模板，参数是初始变性3分钟94℃和5个循环的30秒94℃，1分钟58℃，2分钟72℃。在这个阶段，添加外部引物(LMB3和fdseqlong)并实施另外20个循环，之后是终末延长10分钟72℃。装配足够量的全长随机化Fab构建物后，将它们用NcoI/NheI消化并连接入类似处理的受体噬菌粒载体。将经过纯化的连接体系用于约60次电感受态大肠杆菌TG1的转化。挽救展示Fab文库的噬菌粒颗粒并通过PEG/NaCl纯化来纯化，待用于选择。将这些文库构建步骤重复三次以获得最终文库容量4.4×109。通过点印迹中的C端标签检测测定的功能性克隆的百分比分别是轻链的92.6％和重链的93.7％。
λ-DP47文库是使用下面的V域配对基于人种系基因构建的：Vl3_19λ轻链与VH3_23重链。文库在轻链CDR3(L3)和重链CDR3(H3)中随机化并通过“交叠延伸剪接”(SOE)PCR自3种片段装配。片段1包含抗体基因的5’端，包括随机化L3，片段2是中央恒定片段，跨越L3的结束至H3的开始，而片段3包含随机化H3和Fab片段的3’部分。分别使用下面的引物组合来生成用于文库的文库片段：片段1(LMB3-Vl_3_19_L3r_V/Vl_3_19_L3r_HV/Vl_3_19_L3r_HLV)，片段2(RJH80–DP47CDR3_ba(mod))和片段3(DP47-v4-4/DP47-v4-6/DP47-v4-8–fdseqlong)。用于生成文库片段的PCR参数是初始变性5分钟94℃，25个循环的60秒94℃，60秒55℃，60秒72℃和终末延长10分钟72℃。为了装配PCR，使用等摩尔比率的3种片段作为模板，参数是初始变性3分钟94℃和5个循环的60秒94℃，60秒55℃，120秒72℃。在这个阶段，添加外部引物并实施另外20个循环，之后是终末延长10分钟72℃。装配足够量的全长随机化Fab片段后，将它们用NcoI/NheI消化，伴随类似处理受体噬菌粒载体。连接15μg Fab文库插入物与13.3μg噬菌粒载体。将经过纯化的连接体系用于60次转化，产生1.5×109个转化子。挽救展示Fab文库的噬菌粒颗粒并通过PEG/NaCl纯化来纯化，待用于选择。
噬菌体展示选择和ELISA筛选
在大肠杆菌中表达作为抗原用于噬菌体展示选择的人GST融合的TNCfn5A1234BCfn6并在位于融合蛋白C端的avi标签识别序列处经由共表达BirA生物素连接酶而体内位点特异性生物素化(抗原生成依照实施例1，序列衍生自表4)。此抗原包含位于两个纤连蛋白III型域5和6之间的人TnC外剪接域A1，A2，A3，A4，B，和C。噬菌体展示选择目标在于选择针对这些外剪接域任一的结合物并在后续步骤中使用包含较少外剪接域的另外的抗原构建物通过表面等离振子共振测定域特异性。
依照下面的样式在溶液中实施选择轮次(生物淘选)：1.用也携带与TnC靶抗原相似的avi标签和His6标签的无关GST-融合蛋白预清洁约1012个噬菌粒颗粒以对文库消减识别三种不同标签的抗体，2.在1ml总体积中在无关非生物素化GST-融合蛋白存在下将预清洁后的噬菌粒颗粒在含100nM生物素化人GST融合的TNC fn5A1234BC fn6的上清液中温育0.5小时以进一步消减标签结合物，3.通过转移至中性亲合素预包被微量滴定板的4个孔达10分钟来捕捉生物素化人GST融合的TNC fn5A1234BC fn6和附着的特异性结合噬菌体(在第1和3轮中)，4.使用5x PBS/Tween20和5x PBS清洗相应孔，5.通过添加250μl 100mM TEA(三乙胺)每孔达10分钟来洗脱噬菌体颗粒并通过对来自4个孔的合并洗出液添加500μl 1MTris/HCl pH 7.4来中和，6.用洗脱的噬菌体颗粒的上清液再感染对数期大肠杆菌TG1细胞，用辅助噬菌体VCSM13感染，在摇床上于30℃温育过夜，随后用PEG/NaCl沉淀噬菌粒颗粒，待用于下一个选择轮次。使用恒定抗原浓度100nM进行3轮选择。在第2轮中，为了避免富集针对中性亲合素的结合物，通过添加5.4×107个链霉亲合素包被的磁珠来实施抗原:噬菌体复合物的捕捉。在第2和3轮后如下通过ELISA鉴定特异性结合物：在中性亲合素板上包被100μl 100nM生物素化人GST融合的TNC fn5A1234BC fn6。添加含有Fab的细菌上清液并使用抗Flag/HRP二抗经由它们的Flag标签检测结合性Fab。对人GST融合的TNCfn5A1234BCfn6展现信号且对与靶携带相同标签的无关GST融合蛋白呈现阴性的克隆通过初审用于进一步分析。它们在0.5升培养体积中由细菌表达，亲和纯化并使用BioRad的ProteOn XPR36生物传感器通过SPR分析进一步表征以测试对鼠TnC的交叉反应性及测定抗体识别哪些外剪接域。
使用BioRad的ProteOn XPR36生物传感器的SPR分析
以通过中性亲合素捕捉在NLC芯片上固定化的生物素化人和鼠TnC抗原，于25℃使用ProteOn XPR36仪器(Biorad)通过表面等离振子共振(SPR)测量选定克隆的亲和力(KD)。抗原(配体)的固定化：将重组抗原用PBST(10mM磷酸盐，150mM氯化钠pH 7.4，0.005％Tween20)稀释至10μg/ml，然后以垂直方向以30μl/min注射。分析物的注射：对于‘一击动力学’测量，注射方向改成水平取向，沿着分开的通道1-5分别同时注射经过纯化的Fab的两倍稀释系列，结合时间200秒，解离时间240秒。沿着第六通道注射缓冲液(PBST)以提供“在线”空白用于参照。通过同时拟合结合和解离传感图使用ProteOn Manager v3.1软件中的简单一对一朗格缪尔结合模型计算结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)。作为比率koff/kon计算平衡解离常数(KD)。表5列出两个选定克隆18D4和11C7对在物种和外剪接域组成方面不同的数种TnC抗原的平衡解离常数(KD)。
表5：克隆18D4和11C7的平衡解离常数(KD)
Figure BDA0001824445090000761
表6：用于PCR的通用噬菌体展示DP88-4文库(Vk1_5/VH1_69)模板的DNA序列
Figure BDA0001824445090000762
Figure BDA0001824445090000771
表7：DP88-4文库(Vk1_5/VH1_69)种系模板的碱基对序列
Figure BDA0001824445090000772
表8：DP88-4文库(Vk1_5/VH1_69)种系模板的氨基酸序列
Figure BDA0001824445090000773
Figure BDA0001824445090000781
表9：用于生成DP88-4文库(Vk1_5/VH1_69)的引物序列
Figure BDA0001824445090000782
下划线碱基：60％给定序列和40％N；斜体碱基：60％给定序列和40％M。1:G/D＝20％，E/V/S＝10％，A/P/R/L/T/Y＝5％；2:G/Y/S＝15％，A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E＝4.6％；3:G/A/Y＝20％，P/W/S/D/T＝8％；4:F＝46％，L/M＝15％，G/I/Y＝8％。
表10：用于PCR的通用噬菌体展示λ-DP47文库(Vl3_19/VH3_23)模板的DNA序列
Figure BDA0001824445090000783
Figure BDA0001824445090000791
表11：λ-DP47文库(Vl3_19/VH3_23)种系模板的碱基对序列
Figure BDA0001824445090000792
Figure BDA0001824445090000801
表12：λ-DP47文库(Vl3_19/VH3_23)种系模板的氨基酸序列
Figure BDA0001824445090000802
表13：用于生成λ-DP47文库(Vl3_19/VH3_23)的引物序列
Figure BDA0001824445090000803
随机化引物中的三核苷酸混合物：1(G/D＝20％，E/V/S＝10％，A/P/R/L/T/Y＝5％)；2(G/Y/S＝15％，A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E＝4.6％)；3(G/A/Y＝20，P/W/S/D/T＝8％)；4(F＝46％，L/M＝15％，G/I/Y＝8％)；5(K＝70％，R＝30％)
实施例3
将可变抗体域克隆入表达载体
与人IgG1的恒定重链或恒定轻链任一同框亚克隆选定抗TnC结合物的重和轻链可变区DNA序列(表14至表19)。或是作为野生型人IgG1主链或是作为含有Pro329Gly，Leu234Ala和Leu235Ala突变的变体制备抗体，所述突变依照公开号WO 2012/130831A1的国际专利申请中描述的方法引入以消除对Fcγ受体的结合。
抗TnC结合物的CDR序列显示于表16至表19。
抗TnC IgG的碱基对和氨基酸序列在表20和表21中显示。抗TnCP319GLALAIgG的碱基对和氨基酸序列在表22和表23中显示。将所有抗体编码序列克隆入以嵌合MPSV启动子驱动插入物转录且含有位于CDS的3’端的合成的polyA信号序列的表达载体。另外，载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。
通过噬菌体展示选择的克隆11C7的LCDR3(NSINSTRNEV)含有潜在的N-糖基化位点，即NST，其可潜在地通过氨基酸替代去除以便于生成均质产物。同时，对靶的结合应当保留。N(位置1)可优选通过Q，S或T替代。或者，S(位置2)可通过P替换。或者，T(位置3)可优选通过G或N或通过除了S或C以外的任何其它蛋白质原性氨基酸替代。哪种/哪些替代会是最好的可以由本领域技术人员凭经验确定。
表14：噬菌体衍生抗TnC抗体的可变区碱基对序列
Figure BDA0001824445090000811
Figure BDA0001824445090000821
表15：噬菌体衍生抗TnC抗体的可变区多肽序列
Figure BDA0001824445090000822
表16：抗TnC抗体轻链的CDR碱基对序列
Figure BDA0001824445090000823
表17：抗TnC抗体轻链的CDR多肽序列
Figure BDA0001824445090000824
表18：抗TnC抗体重链的CDR碱基对序列
Figure BDA0001824445090000831
表19：抗TnC抗体重链的CDR多肽序列
Figure BDA0001824445090000832
表20：野生型人IgG1型式的抗TnC克隆的碱基对序列
Figure BDA0001824445090000833
Figure BDA0001824445090000841
Figure BDA0001824445090000851
表21：野生型人IgG1型式的抗TnC克隆的多肽序列
Figure BDA0001824445090000852
表22：P329GLALA人IgG1型式的抗TnC克隆的碱基对序列
Figure BDA0001824445090000853
Figure BDA0001824445090000861
表23：P329GLALA人IgG1型式的抗TnC克隆的多肽序列
Figure BDA0001824445090000862
Figure BDA0001824445090000871
实施例4
抗TnC IgG的纯化
所有基因在由MPSV核心启动子与CMV启动子增强子片段组合组成的嵌合MPSV启动子控制下瞬时表达。表达载体还含有用于含有EBNA(埃巴病毒核抗原)的宿主细胞中的附加体复制的oriP区。
通过使用聚乙烯亚胺用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞来生成抗TnCIgG。以1:1比率(“载体HC”:“载体HLC”)用相应表达载体转染细胞。
为了500mL摇瓶中的200mL生成，在转染前24小时在具有补充物的Excell培养基中接种250x 106个HEK293EBNA细胞。为了转染，将细胞以210x g离心5分钟，并用预温热的CD-CHO培养基替换上清液。在20mLCD-CHO培养基中混合表达载体至200μg DNA的最终量。添加540μL PEI(1mg/mL)后，将溶液漩涡震荡15秒并于室温温育10分钟。之后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500mL摇瓶并在具有5％CO2气氛且以165rpm摇动的温箱中于37℃温育3小时。温育后，添加160mL具有补充物的Excell培养基并将细胞培养24小时。此时，丙戊酸浓度为1mM(培养基另外包含5g/LPepSoy和6mM L-谷氨酰胺)。转染后24小时，以12％最终体积(24mL)和3g/L葡萄糖(来自500g/L储液的1.2mL)对细胞补充氨基酸和葡萄糖补料。培养7天后，通过以2000-3000x g离心45分钟来收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，补充叠氮化钠至终浓度0.01％(w/v)，并于4℃保持。
使用MabSelectSure通过亲和层析进行自细胞培养物上清液纯化抗TnCIgG。浓缩并过滤蛋白质，之后在用pH 6.0的20mM组氨酸，140mMNaCl，0.01％Tween-20溶液平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上加载。
为了亲和层析，在用36mL 20mM柠檬酸钠，20mM磷酸钠，pH 7.5平衡的ProtAMabSelect Sure柱(CV＝6mL，GE Healthcare)上加载上清液。通过用6-10个柱体积的含有20mM柠檬酸钠，20mM磷酸钠，pH 7.5的缓冲液清洗来去除未结合的蛋白质。使用15个CV的20mM柠檬酸钠，100mM氯化钠，100mM甘氨酸，0.01％(v/v)Tween-20，pH 3.0的氯化钠(20至100％)的线性pH梯度任一洗脱结合的蛋白质。然后用4个柱体积的含有20mM柠檬酸钠，100mM氯化钠，100mM甘氨酸，0.01％(v/v)Tween-20，pH 3.0的溶液清洗柱，接着是再平衡步骤。
通过添加1/10(v/v)0.5M Na2HPO4，pH8.0来调节收集的级分的pH。浓缩并过滤蛋白质，之后在用20mM组氨酸，140mM氯化钠，pH 6.0，0.01％Tween20平衡的HiLoad Superdex200柱(GE Healthcare)上加载。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过以280nm测量OD来测定经过纯化的IgG的蛋白质浓度。使用LabChipGXII(Caliper)通过还原剂(Invitrogen，USA)存在和缺失下的CE-SDS来分析IgG的纯度和分子量。于25℃使用在25mM K2HPO4，125mM NaCl，200mM单盐酸L-精氨酸，0.02％(w/v)NaN3，pH 6.7运行缓冲液中平衡的TSKgel G3000SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)分析经过纯化的蛋白质的聚集体含量(表25)。
表25：抗TnC IgG1的生化分析
克隆 产率[mg/l] 单体[％]
a-TnC(18D4)huIgG1 6.8 98.3
a-TnC(18D4)P329GLALAhuIgG1 26.7 100
实施例5
表面等离振子共振(TnC结合)
通过表面等离振子共振(SPR)评估抗TnC IgG 18D4，11C7和抗TnC18D4的Fab片段对人，鼠和食蟹猴TnC(抗原依照表4)的结合。所有SPR实验是用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/Germany)于25℃在Biacore T200上实施的。
使用固定化向导功能在SA芯片上注射生物素化人，鼠或食蟹猴TnC的20μg/ml储液，目标是固定化高至100RU。最终的固定化水平介于79-400RU之间。
然后以范围为0.02-12.5nM(IgG)和0.02-50nM(Fab片段)的浓度以30μl/min的流速使抗TnC IgG 18D4(PGLALA和wtFc)，11C7(rb IgG)和18D4Fab片段立即通过芯片表面达180秒，接着是180秒的解离步骤。对IgG的最高浓度实施另外的1800秒的解离步骤。在每一个步骤之后，遵循两次连续注射10mM甘氨酸pH 2.1达60秒来再生表面。通过减去在没有TnC的参照流动室中获得的响应来修正本体折射率差异。使用朗格缪尔1:1动力学模型计算亲和力和亲合力。然而，因为二价相互作用的1:1拟合的KD仅仅是表观值，所以它应当仅仅用于比较。
表26：KD值和物种交叉反应性
Figure BDA0001824445090000891
抗TnC结合物18D4以pM范围中的相似亲合力与小鼠和食蟹猴TnC交叉反应。18D4Fab片段对TnC的单价结合导致低nM范围中的KD。抗TNC结合物11C7也在pM范围中结合人TnC。由于这个Biacore实验中使用的鼠和食蟹猴TNC构建物中C域的缺失，不能对结合物11C7评估物种交叉反应性(表26)。
热稳定性
通过静态光散射(SLS)和通过测量响应所应用的温度应力的内在蛋白质荧光来监测热稳定性。一式两份以1mg/ml的蛋白质浓度将30μg经过过滤的蛋白质样品应用于Optim2仪器(Avacta Analytical Ltd)。以0.1℃/min使温度自25斜升至85℃，收集半径和总散射强度。为了测定内在蛋白质荧光，于266nm激发样品并在275nm和460nm之间收集发射。
表27：热稳定性
构建物 Tagg(℃)
18D4IgG PGLALA 62
18D4IgG wtFc 62
两种IgG均具有62℃的聚集温度(表27)。
实施例6
LS174T异种移植物衍生肿瘤组织和人组织阵列中TnC染色的结果
用免疫组织化学技术在LS174T异种移植物衍生肿瘤组织和人组织阵列中对作为家兔IgG抗体的抗TnC克隆18D4和11C7测试TnC检测。
将LS174T结肠直肠癌冷冻肿瘤样品在Cryostat中以12μm厚度切片，在Superfrost载片(Thermo Scientific，Germany)上封固。包括配对的正常和肿瘤样品的人组织阵列的冷冻样品购自Biochain(San Francisco，USA)。容许组织切片融化30分钟。将载片在PBS中清洗，在冷丙酮中固定10分钟，并实施水中0.03％过氧化氢酶的温育步骤以阻断内源过氧化物酶。然后将切片与PBS中的5％山羊血清一起温育1小时，接着与0.5μg/ml抗TnC克隆18D4或11C7或同种型对照抗体(Serotec，Germany)一起于4℃温育过夜。之后，将切片用PBS清洗三次，每次5分钟并使用过氧化物酶家兔Vectastain ABC试剂盒遵循制造商的用法说明书(PK-6101，Vector laboratories，California，USA)显影。然后将载片在渐增浓度的乙醇中脱水并在二甲苯中温育2分钟。将一滴Permount mounting medium(FischerChemical，Germany)添加至切片和盖片。用Olympus扫描仪VS120(Olympus，Germany)获得图像并分析。
LS174T异种移植物肿瘤中的组织学染色样式对应于特定的TnC基质纤维(图1)。克隆18D4和11C7二者的TnC染色以中等强度总体表达。阴性同种型对照信号验证该技术的特异性。染色的特异性得到家兔同种型对照的相应组织学染色中的阴性同种型对照信号验证(图2)。人肿瘤阵列中用抗TnC克隆18D4的组织学染色对应于特定的TnC基质纤维。TnC染色在大多数肿瘤组织中以与对照正常配对组织相比更高的水平表达(图3)。人肿瘤阵列中用抗TnC克隆11C7的组织学染色对应于特定的TnC基质纤维。TnC染色在大多数肿瘤组织中以与对照正常配对组织相比更高的水平表达(图4)。
***
虽然出于清楚理解的目的，前述发明已经作为例示和例子相当详细地进行了描述，但是说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过提及而明确将本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容完整收录。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）
<120> 经修饰抗生腱蛋白抗体及使用方法
<130> P33585
<160> 93
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3102
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> huTNC
<400> 1
atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60
ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120
tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180
ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240
atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300
gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360
gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420
acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480
gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540
aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600
tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660
ggttcaacta gtggttctgg tcatcaccat caccatcact ccgcgggtct ggtgccacgc 720
ggtagtactg caattggtat gaaagaaacc gctgctgcta aattcgaacg ccagcacatg 780
gacagcccag atctgggtac cggtggtggc tccggtattg agggacgcgg gtccatggga 840
tatcggggat ccgagctgga cacccccaag gacctgcagg tgtccgagac agccgagaca 900
agcctgaccc tgctgtggaa aacccccctg gccaagttcg accggtacag actgaactac 960
agcctgccca ctggacagtg ggtcggcgtg cagctgcccc ggaacaccac ctcctacgtg 1020
ctgcggggcc tggaacccgg ccaggaatac aacgtcctgc tgacggccga gaagggccgg 1080
cacaagagca agcccgccag agtgaaggcc agcaccgagc aggcccccga gctggaaaac 1140
ctgaccgtga ccgaagtggg ctgggacggc ctgcggctga actggaccgc ggctgaccag 1200
gcctatgagc actttatcat tcaggtgcag gaggccaaca aggtggaggc agctcggaac 1260
ctcaccgtgc ctggcagcct tcgggctgtg gacataccgg gcctcaaggc tgctacgcct 1320
tatacagtct ccatctatgg ggtgatccag ggctatagaa caccagtgct ctctgctgag 1380
gcctccacag gcgaaacacc gaacctgggc gaagtggtgg tggcggaagt gggttgggat 1440
gcgctgaaac tgaactggac cgcgccggaa ggcgcgtatg aatatttttt catccaggtg 1500
caggaagcgg ataccgttga agcggcgcag aacctgaccg ttccgggcgg tctgcgtagc 1560
accgatctgc cgggcctgaa agcggcgacc cattatacca ttaccatccg tggggtgacc 1620
caggacttct ctaccacccc tctgagcgtg gaggtgctga ccgaggaggt acccgacatg 1680
ggcaacctga ccgtgaccga ggtgtcctgg gacgccctgc ggctgaactg gaccaccccc 1740
gacggcacct acgaccagtt cacaatccag gtgcaggaag ccgaccaggt ggaagaagca 1800
cataatctga ccgttccggg tagcctgcgt agcatggaaa ttccgggtct gcgtgcaggc 1860
accccgtata ccgttaccct gcatggtgaa gttcgtggtc atagcacccg tccgctggca 1920
gttgaagttg ttaccgaaga tctgccgcag ctgggtgatc tggcagttag cgaagttggt 1980
tgggatggtc tgcgtctgaa ttggaccgca gcagataatg catatgaaca ttttgtgatc 2040
caggtgcaag aggtgaataa agttgaagca gcccagaatc tgaccctgcc tggttcactg 2100
cgtgcagttg atattccggg actcgaggca gcaaccccgt atcgtgttag catttatggt 2160
gttattcgcg gttatcgtac accggttctg agcgcagaag caagcaccgc aaaagaaccg 2220
gaaattggta atctgaacgt gagcgatatt acaccggaat catttaatct gagctggatg 2280
gcaaccgatg gtatttttga aacctttacc atcgagatca tcgatagcaa tcgtctgctg 2340
gaaaccgtgg aatataatat tagcggtgca gaacgtaccg cacatattag cggtctgcct 2400
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attagcgcaa ccgcaaccac cgaagcactg ccgctgctgg aaaatctgac cattagcgat 2520
attaacccgt atggttttac cgtttcatgg atggcaagcg aaaatgcatt tgatagcttt 2580
ctggttacag ttgtggatag cggtaaactg ctggacccgc aagaatttac cctgagcggc 2640
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<211> 2566
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> muTNC
<400> 2
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tggtgatgtt aaattaacac agtctatggc catcatacgt tatatagctg acaagcacaa 240
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ggatattaga tacggtgttt cgagaattgc atatagtaaa gactttgaaa ctctcaaagt 360
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tgttgtttta tacatggacc caatgtgcct ggatgcgttc ccaaaattag tttgttttaa 540
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tggttcaact agtggttctg gtcatcacca tcaccatcac tccgcgggtc tggtgccacg 720
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atatcgggga tccgagctgg acacccccaa ggacctgcag gtgtccgaga cagccgagac 900
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cttcaccgtg cccggcaacc tgagagccgc cgacatcccc ggcctgaagg tggccacatc 1320
ctaccgggtg tccatctacg gcgtggccag gggctaccgg acccccgtgc tgtccgccga 1380
gacaagcacc ggcaccacgc cgaacctggg cgaagtgacc gtggcggaag tgggttggga 1440
tgcgctgacc ctgaattgga ccgcaccgga aggcgcgtat aaaaactttt tcatccaggt 1500
gctggaagcg gataccaccc agaccgtgca gaacctgacc gtgccgggtg gtctgcgtag 1560
cgtagatctg cctggtctga aagcagcaac ccgctattac attaccctgc gtggtgttac 1620
ccaggatttt ggcaccgcac cgctgagcgt tgaagttctg accgaggatc tgccgcagct 1680
gggtggtctg agcgttaccg aagttagttg ggatggtctg accctgaatt ggaccaccga 1740
tgatctggca tataaacatt ttgtggtgca ggttcaagag gccaataatg ttgaagcagc 1800
acagaatctg accgttccgg gtagcctgcg tgcagttgat attccgggac tgaaagccga 1860
taccccgtat cgtgttagca tttatggtgt tattcagggt tatcgtaccc cgatgctgag 1920
caccgatgtt agcacagcac gtgaaccgga aattggtaat ctgaatgtta gtgatgtgac 1980
cccgaaatca tttaatctga gctggaccgc aaccgatggt atttttgata tgtttaccat 2040
tgaaattatt gatagcaatc gcctgctgca gaccgcagaa cataacatta gcggtgcaga 2100
acgtaccgca catattagcg gtctgcctcc gagcaccgat tttattgttt atctgagcgg 2160
tattgcaccg agcattcgta ccaaaaccat tagcaccacc gcaaccaccg aagcactgac 2220
cgcaatgggt agcccgaaag aagtgatttt tagcgatatt accgaaaata gcgccaccgt 2280
ttcatggcgt gcaccgaccg cacaggttga aagctttcgt attacctatg ttccgattac 2340
cggtggcacc ccgagcatgg ttaccgttga tggcaccaaa acccagaccc gtctggttaa 2400
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cgaaccggtt agcggtagct ttaccacagc tagcggcctg aacgacatct tcgaggctca 2520
gaaaatcgaa tggcacgaag gtacccatca ccatcaccac cactaa 2566
<210> 3
<211> 2559
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> cynoTNC
<400> 3
atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60
ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120
tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180
ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240
atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300
gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360
gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420
acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480
gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540
aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600
tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660
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ggtagtactg caattggtat gaaagaaacc gctgctgcta aattcgaacg ccagcacatg 780
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tatcggggat ccgaactgga taccccgaaa gatctgcgtg ttagcgaaac cgcagaaacc 900
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ctgcgtggtc tggaaccggg tcaagaatat aacgttctgc tgaccgcaga aaaaggtcgt 1080
cataaaagca aaccggcacg tgttaaagca agcaccgaac aggcaccgga actggaaaat 1140
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caagaagcgg ataccgttga agccgctcag aatcataccg ttccgggtgg tctgcgtagc 1560
accgatctgc ctggcctgaa agccgctacc cattacacca ttaccattcg tggtgttacc 1620
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accccgtata ccgttagcat ttatggtgtt attcgcggtt atcgtacacc ggttctgagc 1920
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ccggaaagtt ttagcctgag ctggaccgca accgatggta tttttgaaac ctttaccatc 2040
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cgtaccgcac atattagcgg tctgcctccg agcaccgatt ttattgttta tctgagcggt 2160
ctggcaccga gctttcgtac caaaaccatt agcgcaaccg caaccaccga agcactgacc 2220
gcaatgggta gcccgaaaga agtgattttt agcgatatta ccgaaaatag cgccaccgtt 2280
tcatggcgtg caccgaccgc acaggttgaa agctttcgta ttacctatgt tccgattacc 2340
ggtggcaccc cgagcatggt taccgtggat ggcaccaaaa cccagacccg tctggttaaa 2400
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gaaccggtta gcggtagctt taccaccgct agcggcctga acgacatctt cgaggctcag 2520
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<211> 1033
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> huTNC
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Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
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Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
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Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
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Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
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Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
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210 215 220
Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg
225 230 235 240
Gly Ser Thr Ala Ile Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu
245 250 255
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260 265 270
Ile Glu Gly Arg Gly Ser Met Gly Tyr Arg Gly Ser Glu Leu Asp Thr
275 280 285
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<211> 854
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> cynoTNC
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<211> 1033
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> GST huTNC fn5 A1234 BC fn6 B
<400> 7
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Gly Ser Thr Ser
210 215 220
Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg
225 230 235 240
Gly Ser Thr Ala Ile Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu
245 250 255
Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Ile Glu Gly Arg Gly Ser Met Gly Tyr Arg Gly Ser Glu Leu Asp Thr
275 280 285
Pro Lys Asp Leu Gln Val Ser Glu Thr Ala Glu Thr Ser Leu Thr Leu
290 295 300
Leu Trp Lys Thr Pro Leu Ala Lys Phe Asp Arg Tyr Arg Leu Asn Tyr
305 310 315 320
Ser Leu Pro Thr Gly Gln Trp Val Gly Val Gln Leu Pro Arg Asn Thr
325 330 335
Thr Ser Tyr Val Leu Arg Gly Leu Glu Pro Gly Gln Glu Tyr Asn Val
340 345 350
Leu Leu Thr Ala Glu Lys Gly Arg His Lys Ser Lys Pro Ala Arg Val
355 360 365
Lys Ala Ser Thr Glu Gln Ala Pro Glu Leu Glu Asn Leu Thr Val Thr
370 375 380
Glu Val Gly Trp Asp Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp Gln
385 390 395 400
Ala Tyr Glu His Phe Ile Ile Gln Val Gln Glu Ala Asn Lys Val Glu
405 410 415
Ala Ala Arg Asn Leu Thr Val Pro Gly Ser Leu Arg Ala Val Asp Ile
420 425 430
Pro Gly Leu Lys Ala Ala Thr Pro Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val
435 440 445
Ile Gln Gly Tyr Arg Thr Pro Val Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly
450 455 460
Glu Thr Pro Asn Leu Gly Glu Val Val Val Ala Glu Val Gly Trp Asp
465 470 475 480
Ala Leu Lys Leu Asn Trp Thr Ala Pro Glu Gly Ala Tyr Glu Tyr Phe
485 490 495
Phe Ile Gln Val Gln Glu Ala Asp Thr Val Glu Ala Ala Gln Asn Leu
500 505 510
Thr Val Pro Gly Gly Leu Arg Ser Thr Asp Leu Pro Gly Leu Lys Ala
515 520 525
Ala Thr His Tyr Thr Ile Thr Ile Arg Gly Val Thr Gln Asp Phe Ser
530 535 540
Thr Thr Pro Leu Ser Val Glu Val Leu Thr Glu Glu Val Pro Asp Met
545 550 555 560
Gly Asn Leu Thr Val Thr Glu Val Ser Trp Asp Ala Leu Arg Leu Asn
565 570 575
Trp Thr Thr Pro Asp Gly Thr Tyr Asp Gln Phe Thr Ile Gln Val Gln
580 585 590
Glu Ala Asp Gln Val Glu Glu Ala His Asn Leu Thr Val Pro Gly Ser
595 600 605
Leu Arg Ser Met Glu Ile Pro Gly Leu Arg Ala Gly Thr Pro Tyr Thr
610 615 620
Val Thr Leu His Gly Glu Val Arg Gly His Ser Thr Arg Pro Leu Ala
625 630 635 640
Val Glu Val Val Thr Glu Asp Leu Pro Gln Leu Gly Asp Leu Ala Val
645 650 655
Ser Glu Val Gly Trp Asp Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp
660 665 670
Asn Ala Tyr Glu His Phe Val Ile Gln Val Gln Glu Val Asn Lys Val
675 680 685
Glu Ala Ala Gln Asn Leu Thr Leu Pro Gly Ser Leu Arg Ala Val Asp
690 695 700
Ile Pro Gly Leu Glu Ala Ala Thr Pro Tyr Arg Val Ser Ile Tyr Gly
705 710 715 720
Val Ile Arg Gly Tyr Arg Thr Pro Val Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr
725 730 735
Ala Lys Glu Pro Glu Ile Gly Asn Leu Asn Val Ser Asp Ile Thr Pro
740 745 750
Glu Ser Phe Asn Leu Ser Trp Met Ala Thr Asp Gly Ile Phe Glu Thr
755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
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805 810 815
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
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Leu Val Lys Leu Ile Pro Gly Val Glu Tyr Leu Val Ser Ile Ile Ala
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<210> 8
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<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> GST huTNCfn5 mu A124 BC hu fn6 B
<400> 8
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1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
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Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
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Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
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Ile Glu Gly Arg Gly Ser Met Gly Tyr Arg Gly Ser Glu Leu Asp Thr
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Leu Leu Thr Ala Glu Lys Gly Arg His Lys Ser Lys Pro Ala Arg Val
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370 375 380
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450 455 460
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530 535 540
Thr Ala Pro Leu Ser Val Glu Val Leu Thr Glu Asp Leu Pro Gln Leu
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595 600 605
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
Ile Ser Gly Leu Pro Pro Ser Thr Asp Phe Ile Val Tyr Leu Ser Gly
705 710 715 720
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770 775 780
Phe Thr Leu Ser Gly Thr Gln Arg Lys Leu Glu Leu Arg Gly Leu Ile
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Thr Gly Ile Gly Tyr Glu Val Leu Val Ser Gly Phe Thr Gln Gly His
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820 825 830
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835 840 845
Trp Arg Ala Pro Thr Ala Gln Val Glu Ser Phe Arg Ile Thr Tyr Val
850 855 860
Pro Ile Thr Gly Gly Thr Pro Ser Met Val Thr Val Asp Gly Thr Lys
865 870 875 880
Thr Gln Thr Arg Leu Val Lys Leu Ile Pro Gly Val Glu Tyr Leu Val
885 890 895
Ser Ile Ile Ala Met Lys Gly Phe Glu Glu Ser Glu Pro Val Ser Gly
900 905 910
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915 920 925
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<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> GST TNC hu fn5 B-C fn6 B
<400> 9
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Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Gly Ser Thr Ser
210 215 220
Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg
225 230 235 240
Gly Ser Thr Ala Ile Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu
245 250 255
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260 265 270
Ile Glu Gly Arg Gly Ser Met Gly Tyr Arg Gly Ser Glu Leu Asp Thr
275 280 285
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290 295 300
Leu Trp Lys Thr Pro Leu Ala Lys Phe Asp Arg Tyr Arg Leu Asn Tyr
305 310 315 320
Ser Leu Pro Thr Gly Gln Trp Val Gly Val Gln Leu Pro Arg Asn Thr
325 330 335
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340 345 350
Leu Leu Thr Ala Glu Lys Gly Arg His Lys Ser Lys Pro Ala Arg Val
355 360 365
Lys Ala Ser Thr Ala Lys Glu Pro Glu Ile Gly Asn Leu Asn Val Ser
370 375 380
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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Gly Ile Gly Tyr Glu Val Met Val Ser Gly Phe Thr Gln Gly His Gln
530 535 540
Thr Lys Pro Leu Arg Ala Glu Ile Val Thr Ala Met Gly Ser Pro Lys
545 550 555 560
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580 585 590
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Glu Trp His Glu Gly Thr His His His His His His
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<210> 10
<211> 853
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> GST huTNC fn5 A1234 fn6 B
<400> 10
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
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Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
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Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
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Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
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Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Gly Ser Thr Ser
210 215 220
Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg
225 230 235 240
Gly Ser Thr Ala Ile Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu
245 250 255
Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Ile Glu Gly Arg Gly Ser Met Gly Tyr Arg Gly Ser Glu Leu Asp Thr
275 280 285
Pro Lys Asp Leu Gln Val Ser Glu Thr Ala Glu Thr Ser Leu Thr Leu
290 295 300
Leu Trp Lys Thr Pro Leu Ala Lys Phe Asp Arg Tyr Arg Leu Asn Tyr
305 310 315 320
Ser Leu Pro Thr Gly Gln Trp Val Gly Val Gln Leu Pro Arg Asn Thr
325 330 335
Thr Ser Tyr Val Leu Arg Gly Leu Glu Pro Gly Gln Glu Tyr Asn Val
340 345 350
Leu Leu Thr Ala Glu Lys Gly Arg His Lys Ser Lys Pro Ala Arg Val
355 360 365
Lys Ala Ser Thr Glu Gln Ala Pro Glu Leu Glu Asn Leu Thr Val Thr
370 375 380
Glu Val Gly Trp Asp Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp Gln
385 390 395 400
Ala Tyr Glu His Phe Ile Ile Gln Val Gln Glu Ala Asn Lys Val Glu
405 410 415
Ala Ala Arg Asn Leu Thr Val Pro Gly Ser Leu Arg Ala Val Asp Ile
420 425 430
Pro Gly Leu Lys Ala Ala Thr Pro Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val
435 440 445
Ile Gln Gly Tyr Arg Thr Pro Val Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly
450 455 460
Glu Thr Pro Asn Leu Gly Glu Val Val Val Ala Glu Val Gly Trp Asp
465 470 475 480
Ala Leu Lys Leu Asn Trp Thr Ala Pro Glu Gly Ala Tyr Glu Tyr Phe
485 490 495
Phe Ile Gln Val Gln Glu Ala Asp Thr Val Glu Ala Ala Gln Asn Leu
500 505 510
Thr Val Pro Gly Gly Leu Arg Ser Thr Asp Leu Pro Gly Leu Lys Ala
515 520 525
Ala Thr His Tyr Thr Ile Thr Ile Arg Gly Val Thr Gln Asp Phe Ser
530 535 540
Thr Thr Pro Leu Ser Val Glu Val Leu Thr Glu Glu Val Pro Asp Met
545 550 555 560
Gly Asn Leu Thr Val Thr Glu Val Ser Trp Asp Ala Leu Arg Leu Asn
565 570 575
Trp Thr Thr Pro Asp Gly Thr Tyr Asp Gln Phe Thr Ile Gln Val Gln
580 585 590
Glu Ala Asp Gln Val Glu Glu Ala His Asn Leu Thr Val Pro Gly Ser
595 600 605
Leu Arg Ser Met Glu Ile Pro Gly Leu Arg Ala Gly Thr Pro Tyr Thr
610 615 620
Val Thr Leu His Gly Glu Val Arg Gly His Ser Thr Arg Pro Leu Ala
625 630 635 640
Val Glu Val Val Thr Glu Asp Leu Pro Gln Leu Gly Asp Leu Ala Val
645 650 655
Ser Glu Val Gly Trp Asp Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp
660 665 670
Asn Ala Tyr Glu His Phe Val Ile Gln Val Gln Glu Val Asn Lys Val
675 680 685
Glu Ala Ala Gln Asn Leu Thr Leu Pro Gly Ser Leu Arg Ala Val Asp
690 695 700
Ile Pro Gly Leu Glu Ala Ala Thr Pro Tyr Arg Val Ser Ile Tyr Gly
705 710 715 720
Val Ile Arg Gly Tyr Arg Thr Pro Val Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr
725 730 735
Ala Lys Glu Ala Met Gly Ser Pro Lys Glu Val Ile Phe Ser Asp Ile
740 745 750
Thr Glu Asn Ser Ala Thr Val Ser Trp Arg Ala Pro Thr Ala Gln Val
755 760 765
Glu Ser Phe Arg Ile Thr Tyr Val Pro Ile Thr Gly Gly Thr Pro Ser
770 775 780
Met Val Thr Val Asp Gly Thr Lys Thr Gln Thr Arg Leu Val Lys Leu
785 790 795 800
Ile Pro Gly Val Glu Tyr Leu Val Ser Ile Ile Ala Met Lys Gly Phe
805 810 815
Glu Glu Ser Glu Pro Val Ser Gly Ser Phe Thr Thr Ala Ser Gly Leu
820 825 830
Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly Thr His
835 840 845
His His His His His
850
<210> 11
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> huTNC A4 B
<400> 11
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Gly Ser Thr Ser
210 215 220
Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg
225 230 235 240
Gly Ser Thr Ala Ile Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu
245 250 255
Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Ile Glu Gly Arg Gly Ser Met Gly Tyr Arg Gly Ser Glu Asp Leu Pro
275 280 285
Gln Leu Gly Asp Leu Ala Val Ser Glu Val Gly Trp Asp Gly Leu Arg
290 295 300
Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp Asn Ala Tyr Glu His Phe Val Ile Gln
305 310 315 320
Val Gln Glu Val Asn Lys Val Glu Ala Ala Gln Asn Leu Thr Leu Pro
325 330 335
Gly Ser Leu Arg Ala Val Asp Ile Pro Gly Leu Glu Ala Ala Thr Pro
340 345 350
Tyr Arg Val Ser Ile Tyr Gly Val Ile Arg Gly Tyr Arg Thr Pro Val
355 360 365
Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr Ala Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu
370 375 380
Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly Thr His His His His His His
385 390 395 400
<210> 12
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> huTNC A1 B
<400> 12
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Gly Ser Thr Ser
210 215 220
Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg
225 230 235 240
Gly Ser Thr Ala Ile Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu
245 250 255
Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Ile Glu Gly Arg Gly Ser Met Gly Tyr Arg Gly Ser Glu Gln Ala Pro
275 280 285
Glu Leu Glu Asn Leu Thr Val Thr Glu Val Gly Trp Asp Gly Leu Arg
290 295 300
Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp Gln Ala Tyr Glu His Phe Ile Ile Gln
305 310 315 320
Val Gln Glu Ala Asn Lys Val Glu Ala Ala Arg Asn Leu Thr Val Pro
325 330 335
Gly Ser Leu Arg Ala Val Asp Ile Pro Gly Leu Lys Ala Ala Thr Pro
340 345 350
Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Ile Gln Gly Tyr Arg Thr Pro Val
355 360 365
Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr Ala Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu
370 375 380
Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly Thr His His His His His His
385 390 395 400
<210> 13
<211> 1614
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> pRJH33文库模板DP88-4文库; 完整Fab编码区
包含用于轻链的PelB前导序列 + Vk1_5卡帕V域 + CL恒定域
和用于重链的PelB + VH1_69 V域 + CH1恒定域
<400> 13
atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60
atggccgaca tccagatgac ccagtctcct tccaccctgt ctgcatctgt aggagaccgt 120
gtcaccatca cttgccgtgc cagtcagagt attagtagct ggttggcctg gtatcagcag 180
aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatgatgcct ccagtttgga aagtggggtc 240
ccatcacgtt tcagcggcag tggatccggg acagaattca ctctcaccat cagcagcttg 300
cagcctgatg attttgcaac ttattactgc caacagtata atagttattc tacgtttggc 360
cagggcacca aagtcgagat caagcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgtggagc cgcagaacaa 720
aaactcatct cagaagagga tctgaatgga gccgcagact acaaggacga cgacgacaag 780
ggtgccgcat aataaggcgc gccaattcta tttcaaggag acagtcatat gaaatacctg 840
ctgccgaccg ctgctgctgg tctgctgctc ctcgctgccc agccggcgat ggcccaggtg 900
caattggtgc agtctggggc tgaggtgaag aagcctgggt cctcggtgaa ggtctcctgc 960
aaggcctccg gaggcacatt cagcagctac gctataagct gggtgcgaca ggcccctgga 1020
caagggctcg agtggatggg agggatcatc cctatctttg gtacagcaaa ctacgcacag 1080
aagttccagg gcagggtcac cattactgca gacaaatcca cgagcacagc ctacatggag 1140
ctgagcagcc tgagatctga ggacaccgcc gtgtattact gtgcgagact atccccaggc 1200
ggttactatg ttatggatgc ctggggccaa gggaccaccg tgaccgtctc ctcagctagc 1260
accaaaggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 1320
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 1380
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 1440
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 1500
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaagtggaca agaaagttga gcccaaatct 1560
tgtgacgcgg ccgcaagcac tagtgcccat caccatcacc atcacgccgc ggca 1614
<210> 14
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> Fab轻链V1_5
<400> 14
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60
atcacttgcc gtgccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
cgtttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt attctacgtt tggccagggc 300
accaaagtcg agatcaagcg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtg gagccgcaga acaaaaactc 660
atctcagaag aggatctgaa tggagccgca gactacaagg acgacgacga caagggtgcc 720
gca 723
<210> 15
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> Fab重链VH1_69
<400> 15
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gagactatcc 300
ccaggcggtt actatgttat ggatgcctgg ggccaaggga ccaccgtgac cgtctcctca 360
gctagcacca aaggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaaag tggacaagaa agttgagccc 660
aaatcttgtg acgcggccgc aagcactagt gcccatcacc atcaccatca cgccgcggca 720
<210> 16
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> Fab轻链Vk1_5
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
210 215 220
Asp Leu Asn Gly Ala Ala
225 230
<210> 17
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> Fab重链VH1_69 (DP88)
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Ala Ala Ala Ser Thr Ser Ala His His His His His His Ala Ala Ala
225 230 235 240
<210> 18
<211> 1605
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> λ-DP47文库Vl3_19/VH3_23的pRJH53文库模板
<400> 18
atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60
atggcctcgt ctgagctgac tcaggaccct gctgtgtctg tggccttggg acagacagtc 120
aggatcacat gccaaggaga cagcctcaga agttattatg caagctggta ccagcagaag 180
ccaggacagg cccctgtact tgtcatctat ggtaaaaaca accggccctc agggatccca 240
gaccgattct ctggctccag ctcaggaaac acagcttcct tgaccatcac tggggctcag 300
gcggaagatg aggctgacta ttactgtaac tcccgtgata gtagcggtaa tcatgtggta 360
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggacaaccca aggctgcccc cagcgtgacc 420
ctgttccccc ccagcagcga ggaattgcag gccaacaagg ccaccctggt ctgcctgatc 480
agcgacttct acccaggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ccgacagcag ccccgtgaag 540
gccggcgtgg agaccaccac ccccagcaag cagagcaaca acaagtacgc cgccagcagc 600
tacctgagcc tgacccccga gcagtggaag agccacaggt cctacagctg ccaggtgacc 660
cacgagggca gcaccgtgga gaaaaccgtg gcccccaccg agtgcagcgg agccgcagaa 720
caaaaactca tctcagaaga ggatctgaat ggagccgcag actacaagga cgacgacgac 780
aagggtgccg cataataagg cgcgccaatt ctatttcaag gagacagtca tatgaaatac 840
ctgctgccga ccgctgctgc tggtctgctg ctcctcgctg cccagccggc gatggccgag 900
gtgcaattgc tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 960
tgtgcagcct ccggattcac ctttagcagt tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 1020
gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatt agtggtagtg gtggtagcac atactacgca 1080
gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 1140
cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa accgtttccg 1200
tattttgact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cgagtgctag caccaaaggc 1260
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 1320
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 1380
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 1440
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 1500
aatcacaagc ccagcaacac caaagtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacgcg 1560
gccgcaagca ctagtgccca tcaccatcac catcacgccg cggca 1605
<210> 19
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> Fab轻链Vl3_19
<400> 19
tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60
acatgccaag gagacagcct cagaagttat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120
caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180
ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240
gatgaggctg actattactg taactcccgt gatagtagcg gtaatcatgt ggtattcggc 300
ggagggacca agctgaccgt cctaggacaa cccaaggctg cccccagcgt gaccctgttc 360
ccccccagca gcgaggaatt gcaggccaac aaggccaccc tggtctgcct gatcagcgac 420
ttctacccag gcgccgtgac cgtggcctgg aaggccgaca gcagccccgt gaaggccggc 480
gtggagacca ccacccccag caagcagagc aacaacaagt acgccgccag cagctacctg 540
agcctgaccc ccgagcagtg gaagagccac aggtcctaca gctgccaggt gacccacgag 600
ggcagcaccg tggagaaaac cgtggccccc accgagtgca gcggagccgc agaacaaaaa 660
ctcatctcag aagaggatct gaatggagcc gcagactaca aggacgacga cgacaagggt 720
gccgca 726
<210> 20
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> Fab重链VH3_23
<400> 20
gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaccgttt 300
ccgtattttg actactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcgagtgc tagcaccaaa 360
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaagtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660
gcggccgcaa gcactagtgc ccatcaccat caccatcacg ccgcggca 708
<210> 21
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> Fab轻链Vl3_19
<400> 21
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
115 120 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
130 135 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
195 200 205
Ala Pro Thr Glu Cys Ser Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
210 215 220
Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly
225 230 235 240
Ala Ala
<210> 22
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> Fab重链VH3_23 (DP47)
<400> 22
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Ala Ala Ala Ser
210 215 220
Thr Ser Ala His His His His His His Ala Ala Ala
225 230 235
<210> 23
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 18D4 VL
<400> 23
gacatccaga tgacccagtc tccatccacc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60
atcacttgcc gtgccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
cgtttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag aataagaagt ttccttcggg gacgtttggc 300
cagggcacca aagtcgagat caag 324
<210> 24
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 18D4 VH
<400> 24
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gaaaggtaac 300
ttctacggtg gtctggacta ctggggccaa gggaccaccg tgaccgtctc ctca 354
<210> 25
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7 VL
<400> 25
tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcagggtc 60
acatgccaag gagacagcct cagaagttat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120
caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180
ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240
gatgaggctg actattactg taactccatt aatagtactc gtaatgaggt attcggcgga 300
gggaccaagc tgaccgtcct a 321
<210> 26
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7 VH
<400> 26
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagcggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccaaagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaacttct 300
ccgcgtgttc cgctggacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc gagt 354
<210> 27
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 18D4 VL
<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys Lys Phe Pro Ser
85 90 95
Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 18D4 VH
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Asn Phe Tyr Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7 VL
<400> 29
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Val Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ile Asn Ser Thr Arg Asn Glu
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 30
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7 VH
<400> 30
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Thr Ser Pro Arg Val Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 18D4 LCDR1
<400> 31
cgtgccagtc agagtattag tagctggttg gcc 33
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 18D4 LCDR2
<400> 32
gatgcctcca gtttggaaag t 21
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 18D4 LCDR3
<400> 33
caacagaata agaagtttcc ttcggggacg 30
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7 LCDR1
<400> 34
caaggagaca gcctcagaag ttattatgca agc 33
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7 LCDR2
<400> 35
ggtaaaaaca accggccctc a 21
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7 LCDR3
<400> 36
aactccatta atagtactcg taatgaggta 30
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 18D4 LCDR1
<400> 37
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 18D4 LCDR2
<400> 38
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 18D4 LCDR3
<400> 39
Gln Gln Asn Lys Lys Phe Pro Ser Gly Thr
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7 LCDR1
<400> 40
Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7 LCDR2
<400> 41
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7 LCDR3
<400> 42
Asn Ser Ile Asn Ser Thr Arg Asn Glu Val
1 5 10
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<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 18D4 HCDR1
<400> 43
agctacgcta taagc 15
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<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 18D4 HCDR2
<400> 44
gggatcatcc ctatctttgg tacagcaaac tacgcacaga agttccaggg c 51
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<212> DNA
<213> 人工系列
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<223> 18D4 HCDR3
<400> 45
ggtaacttct acggtggtct ggactac 27
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<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7 HCDR1
<400> 46
ggattcacct ttagcagtta tgccatgagc 30
<210> 47
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7 HCDR2
<400> 47
gctattagcg gtagtggtgg tagcacatac tacgcagact ccgtgaaggg c 51
<210> 48
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7 HCDR3
<400> 48
acttctccgc gtgttccgct ggactac 27
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 18D4 HCDR1
<400> 49
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 18D4 HCDR2
<400> 50
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 18D4 HCDR3
<400> 51
Gly Asn Phe Tyr Gly Gly Leu Asp Tyr
1 5
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7 HCDR1
<400> 52
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
1 5 10
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7 HCDR2
<400> 53
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7 HCDR3
<400> 54
Thr Ser Pro Arg Val Pro Leu Asp Tyr
1 5
<210> 55
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 18D4轻链
<400> 55
gacatccaga tgacccagtc tccatccacc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60
atcacttgcc gtgccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
cgtttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cttgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag aataagaagt ttccttcggg gacgtttggc 300
cagggcacca aagtcgagat caagcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 56
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 18D4重链
<400> 56
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gaaaggtaac 300
ttctacggtg gtctggacta ctggggccaa gggaccaccg tgaccgtctc ctcagctagc 360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320
agcctctccc tgtctccggg taaa 1344
<210> 57
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7轻链
<400> 57
tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcagggtc 60
acatgccaag gagacagcct cagaagttat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120
caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180
ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240
gatgaggctg actattactg taactccatt aatagtactc gtaatgaggt attcggcgga 300
gggaccaagc tgaccgtcct aggtcaaccc aaggctgccc ccagcgtgac cctgttcccc 360
cccagcagcg aggaactgca ggccaacaag gccaccctgg tctgcctgat cagcgacttc 420
tacccaggcg ccgtgaccgt ggcctggaag gccgacagca gccccgtgaa ggccggcgtg 480
gagaccacca cccccagcaa gcagagcaac aacaagtacg ccgccagcag ctacctgagc 540
ctgacccccg agcagtggaa gagccacagg tcctacagct gccaggtgac ccacgagggc 600
agcaccgtgg agaaaaccgt ggcccccacc gagtgcagc 639
<210> 58
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7重链
<400> 58
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagcggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccaaagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaacttct 300
ccgcgtgttc cgctggacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc gagtgctagc 360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320
agcctctccc tgtctccggg taaa 1344
<210> 59
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 18D4轻链
<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys Lys Phe Pro Ser
85 90 95
Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 60
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 18D4重链
<400> 60
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Asn Phe Tyr Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 61
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7轻链
<400> 61
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Val Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ile Asn Ser Thr Arg Asn Glu
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala
115 120 125
Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala
130 135 140
Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val
145 150 155 160
Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser
165 170 175
Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr
180 185 190
Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala
195 200 205
Pro Thr Glu Cys Ser
210
<210> 62
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7重链
<400> 62
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Thr Ser Pro Arg Val Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 63
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 18D4重链PGLALA
<400> 63
caggtgcaat tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctccggagg cacattcagc agctacgcta taagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt actgcagaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac accgccgtgt attactgtgc gaaaggtaac 300
ttctacggtg gtctggacta ctggggccaa gggaccaccg tgaccgtctc ctcagctagc 360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagctgcagg gggaccgtca 720
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960
aagtgcaagg tctccaacaa agccctcggc gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320
agcctctccc tgtctccggg taaa 1344
<210> 64
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7重链PGLALA
<400> 64
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagcggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccaaagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaacttct 300
ccgcgtgttc cgctggacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc gagtgctagc 360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagctgcagg gggaccgtca 720
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960
aagtgcaagg tctccaacaa agccctcggc gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320
agcctctccc tgtctccggg taaa 1344
<210> 65
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 18D4重链PGLALA
<400> 65
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Asn Phe Tyr Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 66
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 11C7重链PGLALA
<400> 66
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Thr Ser Pro Arg Val Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 67
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 前导序列1
<400> 67
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser
<210> 68
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 前导序列1 (DNA1)
<400> 68
atggactgga cctggagaat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactcc 57
<210> 69
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 前导序列1 (DNA 2)
<400> 69
atggactgga cctggaggat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactcc 57
<210> 70
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 前导序列2
<400> 70
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala
20
<210> 71
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 前导序列 2(DNA)
<400> 71
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg ggcctcctgc tgctctggtt cccaggtgcc 60
aggtgt 66
<210> 72
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<223> 前导序列3
<400> 72
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 73
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 前导序列3 (DNA 1)
<400> 73
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattcg 57
<210> 74
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 前导序列3 (DNA 2)
<400> 74
atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggctaccg ccactggagt gcattcc 57
<210> 75
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> 前导序列3 (DNA 3)
<400> 75
atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtcgccacag ccaccggcgt gcactct 57
<210> 76
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> LMB3
<400> 76
caggaaacag ctatgaccat gattac 26
<210> 77
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> Vk1_5_L3r_S
<220>
<221> 混杂特征
<222> (28)..(28)
<223> 60% 给定序列 和 40% M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (29)..(30)
<223> 60% 给定序列 和 40% N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (31)..(31)
<223> 60% 给定序列 和 40% M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (32)..(33)
<223> 60% 给定序列 和 40% N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (34)..(34)
<223> 60% 给定序列 和 40% M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (35)..(36)
<223> 60% 给定序列 和 40% N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (37)..(37)
<223> 60% 给定序列 和 40% M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (38)..(39)
<223> 60% 给定序列 和 40% N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (40)..(40)
<223> 60% 给定序列 和 40% M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (41)..(42)
<223> 60% 给定序列 和 40% N
<400> 77
ctcgactttg gtgccctggc caaacgtsba atacgaatta tactgttggc agtaataagt 60
tgcaaaatca t 71
<210> 78
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> Vk1_5_L3r_SY
<220>
<221> 混杂特征
<222> (28)..(28)
<223> 60% 给定序列 和 40% M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (29)..(30)
<223> 60% 给定序列 和 40% N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (31)..(31)
<223> 60% 给定序列 和 40% M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (32)..(33)
<223> 60% 给定序列 和 40% N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (34)..(34)
<223> 60% 给定序列 和 40% M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (35)..(36)
<223> 60% 给定序列 和 40% N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (37)..(37)
<223> 60% 给定序列 和 40% M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (38)..(39)
<223> 60% 给定序列 和 40% N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (40)..(40)
<223> 60% 给定序列 和 40% M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (41)..(42)
<223> 60% 给定序列 和 40% N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (43)..(43)
<223> 60% 给定序列 和 40% M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (44)..(45)
<223> 60% 给定序列 和 40% N
<400> 78
ctcgactttg gtgccctggc caaacgtmhr sgratacgaa ttatactgtt ggcagtaata 60
agttgcaaaa tcat 74
<210> 79
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> Vk1_5_L3r_SPY
<220>
<221> 混杂特征
<222> (28)..(28)
<223> 60% 给定序列 和 40% M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (29)..(30)
<223> 60% 给定序列 和 40% N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (31)..(31)
<223> 60% 给定序列 和 40% M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (32)..(33)
<223> 60% 给定序列 和 40% N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (34)..(34)
<223> 60% 给定序列 和 40% M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (35)..(36)
<223> 60% 给定序列 和 40% N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (37)..(37)
<223> 60% 给定序列 和 40% M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (38)..(39)
<223> 60% 给定序列 和 40% N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (40)..(40)
<223> 60% 给定序列 和 40% M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (41)..(42)
<223> 60% 给定序列 和 40% N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (43)..(43)
<223> 60% 给定序列 和 40% M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (44)..(45)
<223> 60% 给定序列 和 40% N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (46)..(46)
<223> 60% 给定序列 和 40% M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (47)..(48)
<223> 60% 给定序列 和 40% N
<400> 79
ctcgactttg gtgccctggc caaacgtmhh msssgratac gaattatact gttggcagta 60
ataagttgca aaatcat 77
<210> 80
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> RJH31
<400> 80
acgtttggcc agggcaccaa agtcgag 27
<210> 81
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> RJH32
<400> 81
tctcgcacag taatacacgg cggtgtcc 28
<210> 82
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> DP88-v4-4
<220>
<221> 混杂特征
<222> (29)..(29)
<223> G/D = 20%, E/V/S = 10%, A/P/R/L/T/Y=5%
<220>
<221> 混杂特征
<222> (30)..(31)
<223> G/Y/S=15%, A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E = 4,6%
<220>
<221> 混杂特征
<222> (32)..(32)
<223> G/A/Y = 20%, P/W/S/D/T = 8%
<220>
<221> 混杂特征
<222> (33)..(33)
<223> F = 46%, L/M = 15%, G/I/Y = 8%
<400> 82
ggacaccgcc gtgtattact gtgcgagann nnngactact ggggccaagg gaccaccgtg 60
accgtctcc 69
<210> 83
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> DP88-v4-6
<220>
<221> 混杂特征
<222> (29)..(29)
<223> G/D = 20%, E/V/S = 10%, A/P/R/L/T/Y=5%
<220>
<221> 混杂特征
<222> (30)..(33)
<223> G/Y/S=15%, A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E = 4,6%
<220>
<221> 混杂特征
<222> (34)..(34)
<223> G/A/Y = 20%, P/W/S/D/T = 8%
<220>
<221> 混杂特征
<222> (35)..(35)
<223> F = 46%, L/M = 15%, G/I/Y = 8%
<400> 83
ggacaccgcc gtgtattact gtgcgagann nnnnngacta ctggggccaa gggaccaccg 60
tgaccgtctc c 71
<210> 84
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> DP88-v4-8
<220>
<221> 混杂特征
<222> (29)..(29)
<223> G/D = 20%, E/V/S = 10%, A/P/R/L/T/Y=5%
<220>
<221> 混杂特征
<222> (30)..(35)
<223> G/Y/S=15%, A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E = 4,6%
<220>
<221> 混杂特征
<222> (36)..(36)
<223> G/A/Y = 20%, P/W/S/D/T = 8%
<220>
<221> 混杂特征
<222> (37)..(37)
<223> F = 46%, L/M = 15%, G/I/Y = 8%
<400> 84
ggacaccgcc gtgtattact gtgcgagann nnnnnnngac tactggggcc aagggaccac 60
cgtgaccgtc tcc 73
<210> 85
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> fdseqlong
<400> 85
gacgttagta aatgaatttt ctgtatgagg 30
<210> 86
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> Vl_3_19_L3r_V
<220>
<221> 混杂特征
<222> (32)..(32)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (33)..(34)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (35)..(35)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (36)..(37)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (38)..(38)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (39)..(40)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (41)..(41)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (42)..(43)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (44)..(44)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (45)..(46)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (47)..(47)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (48)..(49)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (50)..(50)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (51)..(52)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<400> 86
ggacggtcag cttggtccct ccgccgaata cvhvattacc gctactatca cgggagttac 60
agtaatagtc agcctcatct tccgc 85
<210> 87
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> Vl_3_19_L3r_HV
<220>
<221> 混杂特征
<222> (32)..(32)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (33)..(34)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (35)..(35)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (36)..(37)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (38)..(38)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (39)..(40)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (41)..(41)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (42)..(43)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (44)..(44)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (45)..(46)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (47)..(47)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (48)..(49)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (50)..(50)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (51)..(52)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (53)..(53)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (54)..(55)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<400> 87
ggacggtcag cttggtccct ccgccgaata ccmmatgatt accgctacta tcacgggagt 60
tacagtaata gtcagcctca tcttccgc 88
<210> 88
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> Vl_3_19_L3r_HLV
<220>
<221> 混杂特征
<222> (32)..(32)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (33)..(34)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (35)..(35)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (36)..(37)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (38)..(38)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (39)..(40)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (41)..(41)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (42)..(43)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (44)..(44)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (45)..(46)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (47)..(47)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (48)..(49)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (50)..(50)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (51)..(52)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (53)..(53)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (54)..(55)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<220>
<221> 混杂特征
<222> (56)..(56)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为M
<220>
<221> 混杂特征
<222> (57)..(58)
<223> 60% 原始碱基 和 40% 随机化为N
<400> 88
ggacggtcag cttggtccct ccgccgaata crhmvwgatg attaccgcta ctatcacggg 60
agttacagta atagtcagcc tcatcttccg c 91
<210> 89
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> RJH80
<400> 89
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtcc 28
<210> 90
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> DP47CDR3_ba (修饰)
<400> 90
cgcacagtaa tatacggccg tgtcc 25
<210> 91
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> DP47-v4-4
<220>
<221> 混杂特征
<222> (29)..(29)
<223> K=70%, R=30%)
<220>
<221> 混杂特征
<222> (30)..(30)
<223> G/D=20%, E/V/S=10%, A/P/R/L/T/Y=5%
<220>
<221> 混杂特征
<222> (31)..(32)
<223> G/Y/S=15%, A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E=4,6%
<220>
<221> 混杂特征
<222> (33)..(33)
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<220>
<221> 混杂特征
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<400> 91
cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgnn nnnngactac tggggccaag gaaccctggt 60
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<210> 92
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> DP47-v4-6
<220>
<221> 混杂特征
<222> (29)..(29)
<223> K=70%, R=30%
<220>
<221> 混杂特征
<222> (30)..(30)
<223> G/D=20%, E/V/S=10%, A/P/R/L/T/Y=5%
<220>
<221> 混杂特征
<222> (31)..(34)
<223> G/Y/S=15%, A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E=4,6%
<220>
<221> 混杂特征
<222> (35)..(35)
<223> G/A/Y=20, P/W/S/D/T=8%
<220>
<221> 混杂特征
<222> (36)..(36)
<223> F=46%, L/M=15%, G/I/Y=8%
<400> 92
cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgnn nnnnnngact actggggcca aggaaccctg 60
gtcaccgtct cg 72
<210> 93
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<223> DP47-v4-8
<220>
<221> 混杂特征
<222> (29)..(29)
<223> K=70%, R=30%
<220>
<221> 混杂特征
<222> (30)..(30)
<223> G/D=20%, E/V/S=10%, A/P/R/L/T/Y=5%
<220>
<221> 混杂特征
<222> (31)..(36)
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<220>
<221> 混杂特征
<222> (37)..(37)
<223> G/A/Y=20, P/W/S/D/T=8%
<220>
<221> 混杂特征
<222> (38)..(38)
<223> F=46%, L/M=15%, G/I/Y=8%
<400> 93
cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgnn nnnnnnnnga ctactggggc caaggaaccc 60
tggtcaccgt ctcg 74

Claims (15)

1.一种特异性结合生腱蛋白C(TnC)的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，
该重链可变区包含
(a)如SEQ ID NO:49所示的重链CDR1；
(b)如SEQ ID NO:50所示的重链CDR2；和
(c)如SEQ ID NO:51所示的重链CDR3，
该轻链可变区包含
(a)如SEQ ID NO:37所示的轻链CDR1；
(b)如SEQ ID NO:38所示的轻链CDR2；和
(c)如SEQ ID NO:39所示的轻链CDR3。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区如SEQ ID NO:28所示，所述轻链可变区如SEQ ID NO:27所示。
3.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体包含Fc区。
4.权利要求1至3任一项的抗体，其中所述Fc区是IgG1 Fc区。
5.权利要求1至4任一项的抗体，其中所述抗体是人抗体。
6.权利要求1至5任一项的抗体，其中所述抗体以低于10nM的KD值结合人、小鼠和食蟹猴TnC中的至少一种。
7.权利要求1至6任一项的抗体，其中所述抗体以低于2nM的KD值结合人、小鼠和食蟹猴TnC中的至少一种。
8.权利要求1至7任一项的抗体，其中所述抗体结合人、小鼠和食蟹猴TnC。
9.权利要求7或8任一项的抗体，其中所述抗体以因数为50的KD范围内的亲和力结合来自所有指定物种的靶抗原。
10.权利要求7至9任一项的抗体，其中所述抗体以因数为10的KD范围内的亲和力结合来自所有指定物种的靶抗原。
11.权利要求1至10任一项的抗体，其中所述抗体是多特异性抗体。
12.权利要求1至11任一项的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体。
13.一种药物配制剂，其包含权利要求1至12任一项的抗体。
14.有效量的权利要求1至12任一项的抗体或权利要求13的药物配制剂在制造用于治疗具有以TnC表达为特征的疾病的个体的药物中的用途。
15.权利要求14的用途，其中该药物用于诱导肿瘤细胞或肿瘤基质细胞的裂解。
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