JP6041882B2 - 二重特異性抗ｅｇｆｒ／抗ｉｇｆ−１ｒ抗体 - Google Patents

Description

本発明は、二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、その産生方法、前記抗体を含む薬学的組成物及びそれらの使用に関する。

Ｌｕ，Ｄ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３１８（２００４）５０７〜５１３；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９（２００４）２８５６〜２８６５；及びＪ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８０（２００５）１９６６５〜１９６７２は、ヒトＥＧＦＲ及びヒトＩＧＦ−１Ｒに対する二重特異性抗体に関する。

国際公開第２０１０／０３４４４１号は、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン及びヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２（配列番号１〜１６（下に収載））の配列に基づく、ヒトＥＧＦＲ及びヒトＩＧＦ−１Ｒに対する二重特異性抗体に関する。

本発明の一態様は、ヒトＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位とヒトＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ヒトＥＧＦＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとに結合する二重特異性抗体であって、
ｉ）第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２及び配列番号３のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２及び配列番号６のＣＤＲ３を含み、
ｉｉ）第２の抗原結合部位が、配列番号９のＣＤＲ１、配列番号１０のＣＤＲ２及び配列番号１１のＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１２のＣＤＲ１、配列番号１３のＣＤＲ２及び配列番号１４のＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインとに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第２の抗原結合部位が、ＣＤＲの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第２の抗原結合部位が、未改変の第２の抗原結合部位と比較して少なくとも１０倍増加した、ヒトＩＧＦ−１Ｒとの結合に対する結合親和性のＫＤ値を有する、
二重特異性抗体である。

本発明の一実施態様は、ヒトＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位とヒトＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ヒトＥＧＦＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとに結合する二重特異性抗体であって、
ｉ）第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２及び配列番号３のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２及び配列番号６のＣＤＲ３を含み、
ｉｉ）ａ）第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号１７のＣＤＲ１、配列番号１８のＣＤＲ２及び配列番号１９のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号２０のＣＤＲ１、配列番号２１のＣＤＲ２及び配列番号２２のＣＤＲ３を含む、
ｂ）第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号２５のＣＤＲ１、配列番号２６のＣＤＲ２及び配列番号２７のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号２８のＣＤＲ１、配列番号２９のＣＤＲ２及び配列番号３０のＣＤＲ３を含む、
ｃ）第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号３３のＣＤＲ１、配列番号３４のＣＤＲ２及び配列番号３５のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号３６のＣＤＲ１、配列番号３７のＣＤＲ２及び配列番号３８のＣＤＲ３を含む、
ｄ）第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号４１のＣＤＲ１、配列番号４２のＣＤＲ２及び配列番号４３のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号４４のＣＤＲ１、配列番号４５のＣＤＲ２及び配列番号４６のＣＤＲ３を含む、又は
ｅ）第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号４９のＣＤＲ１、配列番号５０のＣＤＲ２及び配列番号５１のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号５２のＣＤＲ１、配列番号５３のＣＤＲ２及び配列番号５４のＣＤＲ３を含む、
ことを特徴とする二重特異性抗体である。

本発明の一実施態様は、ヒトＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ヒトＥＧＦＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとに結合する二重特異性抗体において、
ｉ）第１の抗原結合部位が、配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬとを含み、
ｉｉ）ａ）第２の抗原結合部位が、配列番号２３の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号２４の軽鎖可変ドメインＶＬとを含む、
ｂ）第２の抗原結合部位が、配列番号３１の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号３２の軽鎖可変ドメインＶＬとを含む、
ｃ）第２の抗原結合部位が、配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬとを含む、
ｄ）第２の抗原結合部位が、配列番号４７の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号４８の軽鎖可変ドメインＶＬとを含む、又は
ｅ）第２の抗原結合部位が、配列番号５５の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号５６の軽鎖可変ドメインＶＬとを含む、
ことを特徴とする二重特異性抗体である。

一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、前記抗体が、二価、三価又は四価であることを特徴とする。

一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、前記抗体が、Ａｓｎ２９７において糖鎖を付加され、前記糖鎖内のフコースの量が、６５％以下であることを特徴とする。

本発明の一実施態様は、本発明に係る二重特異性抗体を含む薬学的製剤である。

本発明の一実施態様は、癌の治療において使用するための本発明に係る二重特異性抗体である。

本発明の一実施態様は、癌の治療のための医薬の製造のための、本発明に係る二重特異性抗体の使用である。

本発明の一実施態様は、本発明に係る二重特異性抗体を、このような治療を必要とする患者に投与することによる、癌を患う患者の治療方法である。

本発明の一実施態様は、本発明に係る二重特異性抗体をコードする核酸である。本発明の一実施態様は、宿主細胞における本発明に係る二重特異性抗体の発現のための、前記核酸を含むことを特徴とする発現ベクターである。本発明の一実施態様は、前記発現ベクターを含む宿主細胞である。本発明の一実施態様は、本発明に係る二重特異性抗体を産生するための方法において、宿主細胞中で前記核酸を発現させることと、前記細胞又は細胞培養物上清から前記二重特異性抗体を回収することを特徴とする方法である。

このような二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、非常に有効な腫瘍細胞生存阻害及び腫瘍増殖阻害、ＩＧＦ−１ＲとＩＧＦ−１Ｒ双方のシグナル伝達（例えば、リン酸化）阻害のような、非常に役立つ特性を有する。それらは、高い結合親和性やまた効率的な細胞結合のような、役立つ結合特性を有する。それらは、特に、糖鎖工学的に操作された場合に、高いＡＤＣＣ活性を示す。本発明に係る二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は更にストレス下において高度に安定的であり、この特性は、生産及びその薬物動態特性に重要である。

＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１と比較した、改変された二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ＯＡ−Ｆ１３Ｂ５−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１及びＯＡ−Ｌ３１Ｄ１１−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１による、Ａ５４９癌細胞（図１ａ）及びＲＤ−ＥＳ癌細胞（図１ｂ）の癌細胞増殖の阻害を示す図である。本発明に係る親和性成熟化された二重特異性抗体ＯＡ−Ｆ１３Ｂ５−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１及びＯＡ−Ｌ３１Ｄ１１−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１に関して、効力は顕著に増加する。 ２種の異なる癌細胞株Ｈ４６０Ｍ２（図２ａ）及びＨ３２２Ｍ（図２ｂ）による、ＡＤＣＣインビトロアッセイを示す図である。親和性成熟、二重特異性の糖鎖工学的に操作された＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ＯＡ−Ｆ１３Ｂ５−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１−ＧＥ及びＯＡ−Ｌ３１Ｄ１１−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１−ＧＥは両者共に、未改変の糖鎖工学的に操作された二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体ＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１−ＧＥと比較して、ＡＤＣＣの明らかな増加を示した。

本明細書において、「抗体」は、抗原結合部位を含む結合タンパク質を指す。本明細書における用語「結合部位」又は「抗原結合部位」は、リガンドが実際に結合する抗体分子の領域（複数可）を示す。本発明に係る二重特異性抗体における結合部位は、それぞれ一対の２個の可変ドメイン、即ち、１個の重鎖可変ドメイン及び１個の軽鎖可変ドメインにより形成され得る。抗体における最小の結合部位決定基は、重鎖ＣＤＲ３である。本発明の一実施態様では、結合部位のそれぞれは、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、好ましくは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からなる一対により形成される。

「抗体特異性」は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す。天然抗体は、例えば、単一特異性である。本発明に係る「二重特異性抗体」は、２種の異なる抗原結合特異性を有する抗体である。抗体が、一を越える特異性を有する場合、認識されるエピトープは、単一の抗原又は一を越える抗原と結合され得る。本発明の抗体は、２種の異なる抗原、即ち、第１の抗原としてのＥＧＦＲと第２の抗原としてのＩＧＦ−１Ｒに対して特異的である。

本明細書における用語「単一特異性」抗体は、そのそれぞれが同一抗原の同一エピトープと結合する、一又は複数の結合部位を有する抗体を示す。

本出願内で用いられる用語「結合価」は、抗体分子における特定された数の結合部位の存在を示す。よって、用語「二価」、「四価」及び「六価」は、抗体分子におけるそれぞれ２個の結合部位、４個の結合部位及び６個の結合部位の存在を示している。本発明に係る二重特異性抗体は、少なくとも「二価」であり、「三価」又は「多価」（例えば、（「四価」又は「六価」）であり得る。好ましくは、本発明に係る二重特異性抗体は、二価、三価又は四価である。一実施態様では、前記二重特異性抗体は二価である。一実施態様では、前記二重特異性抗体は三価である。一実施態様では、前記二重特異性抗体は四価である。

本発明の抗体は、２つより多い結合部位を有しかつ二重特異性である。即ち、抗体は、２つより多い結合部位が存在する（即ち、抗体が三価又は多価である）場合であっても、二重特異性であり得る。本発明の二重特異性抗体は、例えば、多価単鎖抗体、ダイアボディ及びトリアボディ、並びに一又は複数のペプチドリンカーを介して更なる抗原結合部位（例えば、単鎖Ｆｖ、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン、Ｆａｂ又は（Ｆａｂ）２）が連結された全長抗体の定常ドメイン構造を有する抗体を包含する。抗体は、単一種由来の全長であっても、あるいはキメラ化又はヒト化されていてもよい。２つより多い抗原結合部位を有する抗体では、タンパク質が２種の異なる抗原に対して結合部位を有する限り、幾つかの結合部位は同一であってよい。即ち、第１の結合部位が、ヒトＥＧＦＲに特異的である一方、第２の結合部位は、ヒトＩＧＦ−１Ｒに特異的である。

天然抗体と同様に、本発明の抗体の抗原結合部位は、典型的には、変動的な度合いで抗原に対する結合部位の親和性に寄与する６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。３個の重鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）並びに３個の軽鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）が存在する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）の規模は、アミノ酸配列のコンパイルされたデータベースとの比較により決定され、そこでは、これらの領域は配列間の可変性に従って定義されている。より少数のＣＤＲで構成された機能的抗原結合部位（即ち、結合特異性が、３、４又は５個のＣＤＲにより決定される場合）もまた本発明の範囲内に包含される。例えば、完全セットの６個に満たないＣＤＲであっても、結合に十分となり得る。一部の事例において、ＶＨ又はＶＬドメインで十分となるであろう。

所定の実施態様では、本発明の抗体は、一又は複数の免疫グロブリンクラスの免疫グロブリン定常領域を更に含む。免疫グロブリンクラスは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥアイソタイプを包含し、ＩｇＧ及びＩｇＡの場合、これらのサブタイプを包含する。一実施態様では、本発明の抗体は、ＩｇＧ型抗体の定常ドメイン構造を有する。

本明細書における用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物を指す。

用語「キメラ抗体」は、組換えＤＮＡ技法により通常調製される、可変ドメイン、即ち、ある供給源又は種由来の結合領域と、異なる供給源又は種に由来する定常領域の少なくとも一部とを含む抗体を指す。マウス可変ドメイン及びヒト定常領域を含むキメラ抗体が好ましい。本発明により網羅される「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、本来の抗体から定常領域が改変又は変化されて、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関する、本発明に係る特性を生じたキメラ抗体である。このようなキメラ抗体は、「クラススイッチ抗体」とも称される。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変ドメインをコードするＤＮＡセグメントと、免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントとを含む免疫グロブリン遺伝子の、発現された産物である。キメラ抗体を産生するための方法は、従来の組換えＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション技法に関与し、本技術分野において周知のものである。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１９８４）６８５１〜６８５５；米国特許第５２０２２３８号明細書及び米国特許第５２０４２４４号明細書を参照されたい。

用語「ヒト化抗体」は、フレームワーク又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンと比較して異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含むよう改変された抗体を指す。好ましい一実施態様では、マウスＣＤＲは、ヒト抗体のフレームワーク領域へと接ぎ合わされて（ｇｒａｆｔ）、「ヒト化抗体」を調製する。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）３２３〜３２７；及びＮｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４（１９８５）２６８〜２７０を参照されたい。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体に関する上述の抗原を認識する配列を表すＣＤＲに相当する。本発明に網羅される「ヒト化抗体」の他の形態は、本来の抗体から定常領域が更に改変又は変化されて、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関する本発明に係る特性を生じたヒト化抗体である。

本明細書における用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する抗体を包含することを目的とする。ヒト抗体は、本技術水準において周知のものである（ｖａｎ Ｄｉｊｋ，Ｍ．Ａ．及びｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５（２００１）３６８〜３７４）。ヒト抗体は、免疫化により、内在性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全レパートリー又は選択を産生することのできる、トランスジェニック動物（例えば、マウス）において産生することもできる。このような生殖系列変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移植は、抗原曝露によりヒト抗体の産生をもたらすであろう（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）２５５１〜２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３）２５５〜２５８；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（１９９３）３３〜４０を参照）。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーにおいて産生することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７（１９９２）３８１〜３８８；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９１）５８１〜５９７）。Ｃｏｌｅら及びＢｏｅｒｎｅｒらの技法をヒトモノクローナル抗体の調製に利用することもできる（Ｃｏｌｅ，Ｓ．Ｐ．Ｃ．ら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ（１９８５）７７〜９６；及びＢｏｅｒｎｅｒ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）８６〜９５）。本発明に係るキメラ及びヒト化抗体に関して既に言及されている通り、本明細書における用語「ヒト抗体」は、例えば、「クラススイッチ」、即ち、Ｆｃ部分の変化又は変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４変異）により、定常領域において改変されて、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合に関する本発明に係る特性を生じたこのような抗体も含む。

用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体と抗原との結合に関与する抗体重又は軽鎖のドメインを指す。自然（ｎａｔｉｖｅ）抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）の可変ドメインは一般に、同様の構造を有し、各ドメインは、３個の「高頻度可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）により接続された、その配列が広く保存された４個のフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、ベータ−シート高次構造の形をとり、ＣＤＲは、該ベータ−シート構造を接続するループを形成することができる。各鎖におけるＣＤＲは、フレームワーク領域によりその三次元構造に保持され、他の鎖由来のＣＤＲと共に、抗原結合部位を形成する。抗体重及び軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明に係る抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たし、従って、本発明の更に別の目的を提供する（例えば、Ｋｉｎｄｔ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．（２００７）、９１頁を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分となり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを用いて、それぞれ相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（１９９３）８８０〜８８７；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２（１９９１）６２４〜６２８）を参照されたい。

用語「相補性決定領域」又は「高頻度可変領域」は、本明細書において用いられる場合、抗原結合の原因となる抗体のアミノ酸残基を指す。高頻度可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書において定義されている「相補性決定領域」残基以外の該可変ドメイン領域である。従って、抗体の軽及び重鎖は、ＮからＣ末端にかけて、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。各鎖におけるＣＤＲは、このようにフレームワークアミノ酸に隔てられている。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与する領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国公衆衛生局（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ）、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、メリーランド州ベセスダ（１９９１）ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２の標準的定義に従って決定される。

本発明に係る二重特異性抗体は、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞結合親和性の増加をもたらす＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗原結合部位のＣＤＲの親和性成熟化に加えて、「保存的配列改変」を有する抗体を包含する。これは、本発明に係る二重特異性抗体の本明細書において言及されている特徴に影響しない又はこれを変更しないヌクレオチド及びアミノ酸配列改変を意味する。改変は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲによる変異誘発等、本技術分野において公知の標準技法により導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換を包含する。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、本技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ−分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を包含する。よって、二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体における予測される非必須のアミノ酸残基は、好ましくは、同一側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基に置き換えることができる。アミノ酸置換は、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）３２３〜３２７及びＱｕｅｅｎ，Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１９８９）１００２９〜１００３３により記載されている分子モデリングに基づく変異誘発により行うことができる。

本明細書において、用語「に結合している」、「に特異的に結合している」、「に結合する」又は「に特異的に結合する」は、互換的に用いられ、インビトロアッセイ、好ましくは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイにおける抗原のエピトープと抗体との結合を指す。「に結合している」、「に特異的に結合している」、「に結合する」又は「に特異的に結合する」は、抗体／抗原結合部位が、１．０×１０^−８Ｍ以下の結合親和性（ＫＤ）のＫＤ値で、一実施態様においては、５．０×１０^−９Ｍ以下のＫＤで、一実施態様においては、２．０×１０^−９Ｍ〜１．０×１０^−１３Ｍの間のＫＤで、それぞれの抗原に結合することを意味する。結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体への抗体の結合の速度定数）、ｋｄ（解離定数）及びＫＤ（ｋｄ／ｋａ）により定義される。結合親和性は、表面プラズモン共鳴技法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン、ウプサラ）により決定される。

用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することのできるいずれかのポリペプチド決定基を包含する。所定の実施態様では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニル等、分子の化学活性を有する表面のグループ分けを包含し、所定の実施態様では、特異的な三次元構造の特徴及び／又は特異的な電荷特徴を有し得る。エピトープは、抗体により結合される抗原の領域である。所定の実施態様では、抗体は、タンパク質及び／又は巨大分子の複合体混合物においてその標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合すると考えられる。

ヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ−１又はＥｒｂ−Ｂ１としても公知、本明細書において、「ＥＧＦＲ」と称される）は、ｃ−ｅｒｂＢ癌原遺伝子にコードされる１７０ｋＤａの膜貫通型受容体であり、内因性チロシンキナーゼ活性を提示する（Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ，Ｈ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７３（１９９６）２２８〜２３５；Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．Ｓ．及びＳｈｉｎ，Ｄ．Ｍ．、Ｃａｎｃｅｒ ９４（２００２）１５９３〜１６１１）。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースエントリーＰ００５３３は、ＥＧＦＲ（配列番号７５）の配列を提供する。ＥＧＦＲのアイソフォーム及びバリアントも存在し（例えば、オルタナティブＲＮＡ転写産物、切断型バージョン、多型等）、その例としてＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースエントリー番号Ｐ００５３３−１、Ｐ００５３３−２、Ｐ００５３３−３及びＰ００５３３−４により同定されるアイソフォーム及びバリアント等が挙げられるがこれらに限定されない。ＥＧＦＲは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）アンフィレギュリン、ヘパリン結合型ＥＧＦ（ｈｂ−ＥＧＦ）、ベータセルリン及びエピレギュリンを包含するリガンドに結合することが知られている（Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．Ｓ．及びＳｈｉｎ，Ｄ．Ｍ．、Ｃａｎｃｅｒ ９４（２００２）１５９３〜１６１１；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ，Ｊ．及びＢａｓｅｌｇａ，Ｊ．、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９（２０００）６５５０〜６５６５）。ＥＧＦＲは、チロシンキナーゼ媒介性シグナル伝達経路を介して多数の細胞過程を調節し、その例として、細胞増殖、分化、細胞生存、アポトーシス、血管新生、有糸分裂誘発及び転移を制御するシグナル伝達経路の活性化等が挙げられるがこれらに限定されない（Ａｔａｌａｙ，Ｇ．ら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １４（２００３）１３４６〜１３６３；Ｔｓａｏ，Ａ．Ｓ．及びＨｅｒｂｓｔ，Ｒ．Ｓ．、Ｓｉｇｎａｌ ４（２００３）４〜９；Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．Ｓ．及びＳｈｉｎ，Ｄ．Ｍ．、Ｃａｎｃｅｒ ９４（２００２）１５９３〜１６１１；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ，Ｈ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７３（１９９６）２２８〜２３５）。

ヒトインスリン様増殖因子Ｉ受容体（ヒトＩＧＦ−ＩＲ；異名、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２２１抗原）は、膜貫通型タンパク質チロシンキナーゼのファミリーに属する（ＬｅＲｏｉｔｈ，Ｄ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｒｅｖ．１６（１９９５）１４３〜１６３；及びＡｄａｍｓ，Ｔ．Ｅ．ら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５７（２０００）１０５０〜１０６３）。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０８０６９は、ＩＧＦ−１Ｒ（配列番号７６）の配列を提供する。ＩＧＦ−ＩＲは、高い親和性でＩＧＦ Ｉに結合し、インビボにおいて該リガンドに対する生理応答を惹起する。ＩＧＦ ＩＲは、ＩＧＦ ＩＩにも結合するが、これは、僅かにより低い親和性で行われる。ＩＧＦ ＩＲ過剰発現は、細胞の腫瘍性形質転換を促進し、ＩＧＦ ＩＲは、細胞の悪性形質転換に関与することの証拠が存在し、従って、癌の治療のための治療剤開発の有用な標的である（Ａｄａｍｓ，Ｔ．Ｅ．ら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５７（２０００）１０５０〜１０６３）。

組成物及び方法
一態様では、本発明は、一部には、ヒトＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位とヒトＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ヒトＥＧＦＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとに結合する二重特異性抗体であって、
ｉ）第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２及び配列番号３のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２及び配列番号６のＣＤＲ３を含み、
ｉｉ）第２の抗原結合部位が、配列番号９のＣＤＲ１、配列番号１０のＣＤＲ２及び配列番号１１のＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン並びに配列番号１２のＣＤＲ１、配列番号１３のＣＤＲ２及び配列番号１４のＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第２の抗原結合部位が、ＣＤＲの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第２の抗原結合部位が、未改変の第２の抗原結合部位と比較して少なくとも１０倍増加した、ヒトＩＧＦ−１Ｒとの結合に対する結合親和性のＫＤ値を有する、二重特異性抗体に基づく。

「未改変の第２の抗原結合部位」は、重鎖可変ドメイン中に、配列番号９のＣＤＲ１、配列番号１０のＣＤＲ２及び配列番号１１のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号１２のＣＤＲ１、配列番号１３のＣＤＲ２及び配列番号１４のＣＤＲ３を含む。

これらの二重特異性抗体は、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（配列番号９〜１６）及びヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２（配列番号１〜８）に基づく、国際公開第２０１０／０３４４４１号に記載されている抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒの＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗原結合部位の親和性成熟化を経て派生し、結合親和性が増加した、新たな改変された二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体である。

本発明の一実施態様は、ヒトＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位とヒトＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ヒトＥＧＦＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとに結合する二重特異性抗体であって、
ｉ）第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２及び配列番号３のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２及び配列番号６のＣＤＲ３を含み、
ｉｉ）第２の抗原結合部位が、配列番号９のＣＤＲ１、配列番号１０のＣＤＲ２及び配列番号１１のＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン並びに配列番号１２のＣＤＲ１、配列番号１３のＣＤＲ２及び配列番号１４のＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインのＣＤＲの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第２の抗原結合部位が、未改変の第２の抗原結合部位と比較して少なくとも１０倍増加した、ヒトＩＧＦ−１Ｒとの結合に対する結合親和性のＫＤ値を有する、
二重特異性抗体である。

本発明の一実施態様は、ヒトＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位とヒトＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ヒトＥＧＦＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとに結合する二重特異性抗体であって、
ｉ）第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２及び配列番号３のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２及び配列番号６のＣＤＲ３を含み、
ｉｉ）第２の抗原結合部位が、配列番号９のＣＤＲ１、配列番号１０のＣＤＲ２及び配列番号１１のＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン並びに配列番号１２のＣＤＲ１、配列番号１３のＣＤＲ２及び配列番号１４のＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第２の抗原結合部位が、軽鎖可変ドメインのＣＤＲの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第２の抗原結合部位が、未改変の第２の抗原結合部位と比較して少なくとも１０倍増加した、ヒトＩＧＦ−１Ｒとの結合に対する結合親和性のＫＤ値を有する、
二重特異性抗体である。

本明細書における用語「ＣＤＲの一又は複数における一又は複数の改変」は、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入等、１個から最大５個（一実施態様においては、１個から最大３個、一実施態様においては、２個から最大５個、実施形態において、２個又は３個）の改変（総計）を指し、各ＣＤＲは、互いに独立的に、０個〜３個の間の改変を含む。一実施態様では、改変は、アミノ酸置換である。

本明細書における用語「未改変の抗原結合部位と比較して少なくとも１０倍増加した、結合親和性のＫＤ値」は、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（配列番号９〜１６）の未改変の（＝親の）抗原結合部位と比較した、改変された親和性成熟化＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗原結合部位の、ヒトＩＧＦ−１Ｒに対する結合親和性のＫＤ値の１０倍以上の増加を言う。結合親和性の増加を決定するため、改変された親和性成熟化された＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗原結合部位及び未改変の親＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（配列番号９〜１６）のＫＤ値は、それらのＦａｂ断片により、実施例１に詳細に記載する２５℃における表面プラズモン共鳴アッセイにおいて決定される。ＫＤ値の増加は、ＫＤ（未改変）／ＫＤ（改変）の比として計算される。

本発明の一実施態様は、ヒトＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位とヒトＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ヒトＥＧＦＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとに結合する二重特異性抗体であって、
ｉ）第１の抗原結合部位が、配列番号７の重鎖可変ドメイン及び配列番号８の軽鎖可変ドメインを含み、
ｉｉ）第２の抗原結合部位が、配列番号１５の重鎖可変ドメイン及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第２の抗原結合部位が、ＣＤＲの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第２の抗原結合部位が、未改変の第２の抗原結合部位と比較して少なくとも１０倍増加した、ヒトＩＧＦ−１Ｒとの結合に対する結合親和性のＫＤ値を有する、
二重特異性抗体である。

「未改変の抗原結合部位」は、配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む。

本発明の一実施態様は、ヒトＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位とヒトＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ヒトＥＧＦＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとに結合する二重特異性抗体であって、
ｉ）第１の抗原結合部位が、配列番号７の重鎖可変ドメイン及び配列番号８の軽鎖可変ドメインを含み、
ｉｉ）第２の抗原結合部位が、配列番号１５の重鎖可変ドメイン及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインのＣＤＲの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第２の抗原結合部位が、未改変の第２の抗原結合部位と比較して少なくとも１０倍増加した、ヒトＩＧＦ−１Ｒとの結合に対する結合親和性のＫＤ値を有する、
二重特異性抗体である。

本発明の一実施態様は、ヒトＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位とヒトＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ヒトＥＧＦＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとに結合する二重特異性抗体であって、
ｉ）第１の抗原結合部位が、配列番号７の重鎖可変ドメイン及び配列番号８の軽鎖可変ドメインを含み、
ｉｉ）第２の抗原結合部位が、配列番号１５の重鎖可変ドメイン及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第２の抗原結合部位が、軽鎖可変ドメインのＣＤＲの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第２の抗原結合部位が、未改変の第２の抗原結合部位と比較して少なくとも１０倍増加した、ヒトＩＧＦ−１Ｒとの結合に対する結合親和性のＫＤ値を有する、
二重特異性抗体である。

従って、本発明の一実施態様は、ヒトＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位とヒトＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ヒトＥＧＦＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとに結合する二重特異性抗体であって、
ｉ）第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２及び配列番号３のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２及び配列番号６のＣＤＲ３を含み、
ｉｉ）ａ）第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号１７のＣＤＲ１、配列番号１８のＣＤＲ２及び配列番号１９のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号２０のＣＤＲ１、配列番号２１のＣＤＲ２及び配列番号２２のＣＤＲ３を含む、
ｂ）第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号２５のＣＤＲ１、配列番号２６のＣＤＲ２及び配列番号２７のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号２８のＣＤＲ１、配列番号２９のＣＤＲ２及び配列番号３０のＣＤＲ３を含む、
ｃ）第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号３３のＣＤＲ１、配列番号３４のＣＤＲ２及び配列番号３５のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号３６のＣＤＲ１、配列番号３７のＣＤＲ２及び配列番号３８のＣＤＲ３を含む、
ｄ）第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号４１のＣＤＲ１、配列番号４２のＣＤＲ２及び配列番号４３のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号４４のＣＤＲ１、配列番号４５のＣＤＲ２及び配列番号４６のＣＤＲ３を含む、又は
ｅ）第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号４９のＣＤＲ１、配列番号５０のＣＤＲ２及び配列番号５１のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号５２のＣＤＲ１、配列番号５３のＣＤＲ２及び配列番号５４のＣＤＲ３を含む
ことを特徴とする二重特異性抗体である。

本発明の一実施態様は、ヒトＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位とヒトＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ヒトＥＧＦＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとに結合する二重特異性抗体であって、
ｉ）第１の抗原結合部位が、配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬとを含み、
ｉｉ）ａ）第２の抗原結合部位が、配列番号２３の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号２４の軽鎖可変ドメインＶＬとを含む、
ｂ）第２の抗原結合部位が、配列番号３１の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号３２の軽鎖可変ドメインＶＬとを含む、
ｃ）第２の抗原結合部位が、配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬとを含む、
ｄ）第２の抗原結合部位が、配列番号４７の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号４８の軽鎖可変ドメインＶＬとを含む、又は
ｅ）第２の抗原結合部位が、配列番号５５の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号５６の軽鎖可変ドメインＶＬとを含む
ことを特徴とする二重特異性抗体である。

本発明の一実施態様は、ヒトＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位とヒトＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ヒトＥＧＦＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとに結合する二重特異性抗体であって、
ｉ）第１の抗原結合部位が、配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬとを含み、
ｉｉ）第２の抗原結合部位が、配列番号２３の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号２４の軽鎖可変ドメインＶＬとを含む
ことを特徴とする二重特異性抗体である。

本発明の一実施態様は、ヒトＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位とヒトＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ヒトＥＧＦＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとに結合する二重特異性抗体であって、
ｉ）第１の抗原結合部位が、配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬとを含み、
ｉｉ）第２の抗原結合部位が、配列番号３１の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号３２の軽鎖可変ドメインＶＬとを含む
ことを特徴とする二重特異性抗体である。

本発明の一実施態様は、ＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位と、ＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ヒトＥＧＦＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとに結合する二重特異性抗体であって、
ｉ）第１の抗原結合部位が、配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬとを含み、
ｉｉ）第２の抗原結合部位が、配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬとを含む
ことを特徴とする二重特異性抗体である。

本発明の一実施態様は、ヒトＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位とヒトＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ヒトＥＧＦＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとに結合する二重特異性抗体であって、
ｉ）第１の抗原結合部位が、配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬとを含み、
ｉｉ）第２の抗原結合部位が、配列番号４７の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号４８の軽鎖可変ドメインＶＬとを含む
ことを特徴とする二重特異性抗体である。

本発明の一実施態様は、ヒトＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位とヒトＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ヒトＥＧＦＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとに結合する二重特異性抗体であって、
ｉ）第１の抗原結合部位が、配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬとを含み、
ｉｉ）第２の抗原結合部位が、配列番号５５の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号５６の軽鎖可変ドメインＶＬとを含む
ことを特徴とする二重特異性抗体である。

このような二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、非常に有効な腫瘍細胞生存阻害及び腫瘍増殖阻害、ＩＧＦ−１ＲとＩＧＦ−１Ｒの双方のシグナル伝達（例えば、リン酸化）阻害のような、非常に役立つ特性を有する。それらは、高い結合親和性やまた効率的な細胞結合のような、役立つ結合特性を有する。それらは、特に、糖鎖工学的に操作された（ＧＥ）場合に、高いＡＤＣＣ活性を示す。

本発明の一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、ＩＧＦ−１Ｒリン酸化とＥＧＦＲリン酸化を阻害する（実施例４を参照）。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、０．１０ｎＭ以下のＩＣ５０で、Ａ５４９癌細胞におけるＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害する。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、０．１０ｎＭ以下のＩＣ５０で、ＢｘＰＣ３癌細胞におけるＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害する。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、０．１０ｎＭ以下のＩＣ５０で、ＴＣ−７１癌細胞におけるＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害する。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、０．２３ｎＭ以下のＩＣ５０で、Ａ５４９癌細胞におけるＥＧＦＲリン酸化を阻害する。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、０．９０ｎＭ以下のＩＣ５０で、ＢｘＰＣ３癌細胞におけるＥＧＦＲリン酸化を阻害する。

本発明の一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、癌細胞増殖又は腫瘍細胞増殖を阻害する（実施例５を参照）。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、０．２０ｎＭ以下のＩＣ５０で（好ましくは、０．１５ｎＭ以下のＩＣ５０で）、Ａ５４９癌細胞の増殖を阻害する。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、０．１０ｎＭ以下のＩＣ５０で（好ましくは、０．０５ｎＭ以下のＩＣ５０で）、ＲＤ−ＥＳ癌細胞の増殖を阻害する。

本発明の一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、６５％以下（好ましくは、５０〜５％の間）の量のフコースとなるように糖鎖工学的に操作され、癌細胞においてＡＤＣＣを誘導する（実施例７を参照）。本発明の一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、６５％以下（好ましくは、５０〜５％の間）の量のフコースとなるように糖鎖工学的に操作され、０．１０ｎＭ以下のＥＣ５０でＨ４６０Ｍ２癌細胞におけるＡＤＣＣを誘導する。本発明の一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、６５％以下（好ましくは、５０〜５％の間）の量のフコースとなるように糖鎖工学的に操作され、０．１５ｎＭ以下のＥＣ５０でＨ３２２Ｍ癌細胞におけるＡＤＣＣを誘導する。よって、本発明の二重特異性抗体は、例えば、癌の診断又は治療に有用である。

一実施態様では、前記二重特異性抗体は、例えば、ａ）国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号もしくはＳｃｈａｅｆｅｒら、ＰＮＡＳ １０８（２０１１）１１１８７〜１１１９２（ドメイン交換抗体 − 実施例２を参照 − 配列番号６３〜６６もしくは配列番号６７〜７０のＣｒｏｓｓＭａｂ（ＣＭ））又は例えば、ｂ）欧州特許出願公開第１０００３２７０．５号明細書（実施例２を参照、配列番号５７〜５９もしくは配列番号６０〜６２のＯＡ−ｓｃＦａｂを参照）又は例えば、ｃ）Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７〜６２１；国際公開第９６／０２７０１１号；Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １６（１９９８）６７７〜６８１；Ａｔｗｅｌｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６〜３５及び欧州特許第１８７０４５９（Ａ１）号明細書に記載されているフォーマットを用いた二価である。

一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、配列番号５７、配列番号５８及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、配列番号６０、配列番号６１及び配列番号６２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５及び配列番号６６のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、その配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９及び配列番号７０のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。これらのアミノ酸配列は、ａ）＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｆ１３Ｂ５（配列番号１７〜２４）又は＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３１Ｄ１１（配列番号４１〜４８）（両者共に、親和性成熟されたＨＵＭＡＢ＜ＩＧＦ−１Ｒ＞クローン１８抗体）及びｂ）ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２（配列番号１〜８；国際公開第２００６／０８２５１５号も参照、＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２として省略）の抗原結合部位に基づく。

一実施態様では、前記二重特異性抗体は、三価であり、これは例えば、２種の受容体ＥＧＦＲ又はＩＧＦ−１Ｒのうち一方に特異的に結合する全長抗体であって、その一方の重鎖のＣ末端／又はＮ末端の一方のみにおいて、２種の受容体ＥＧＦＲ又はＩＧＦ−１Ｒの他方に特異的に結合するｓｃＦａｂ断片が融合した全長抗体に基づくフォーマット（例えば、国際公開第２０１０／１１２１９３号に記載されているノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）技術等）、あるいは、例えば、２種の受容体ＥＧＦＲ又はＩＧＦ−１Ｒの一方に特異的に結合する全長抗体であって、その一方の重鎖の一方のＣ末端において、２種の受容体ＥＧＦＲ又はＩＧＦ−１Ｒの他方に特異的に結合するＶＨ又はＶＨ−ＣＨ１断片が融合し、その第２の重鎖の他方のＣ末端において、ＶＬ又はＶＬ−ＣＬ断片が融合した全長抗体に基づくフォーマット（例えば、国際公開第２０１０／１１５５８９号に記載されているノブ・イントゥ・ホール技術等）を用いる。他の三価フォーマットは、例えば、欧州特許出願公開第１０１７３９１４．２号明細書に記載されている。ノブ・イントゥ・ホール技術及びその変種に関して、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７〜６２１；国際公開第９６／０２７０１１号、Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １６（１９９８）６７７〜６８１；Ａｔｗｅｌｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６〜３５；及び欧州特許第１８７０４５９（Ａ１）号明細書も参照されたい。

一実施態様では、前記二重特異性抗体は、例えば、国際公開第２００７／０２４７１５号、国際公開第２００７／１０９２５４号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１４５７９２号又は国際公開第２０１０／１４５７９３号に記載されているフォーマットを用いた四価である（例えば、実施例２、Ｔｖ−Ｌ３１Ｄ１１−ＧＡ２０１及びＴｖ−Ｆ１３Ｂ５−ＧＡ２０１を参照）。

一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、配列番号７１及び配列番号７２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、配列番号７３及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。これらのアミノ酸配列は、ａ）＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｆ１３Ｂ５（配列番号１７〜２４）又は＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３１Ｄ１１（配列番号４１〜４８）（両者共に親和性成熟されたＨＵＭＡＢ＜ＩＧＦ−１Ｒ＞クローン１８抗体）及びｂ）ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２（配列番号１〜８；国際公開第２００６／０８２５１５号も参照、＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２と省略）の抗原結合部位に基づく。

更に別の一実施態様では、前記二重特異性抗体は、定常領域がヒト起源に由来することを特徴とする。

本願内で用いられる用語「定常領域」は、可変領域以外の抗体のドメインの総体を表示する。定常領域は、抗原の結合に直接的に関与しないが、様々なエフェクター機能を提示する。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体は、次のクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ分けられ、これらのいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２等のサブクラスへと更に分けることができる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。全５種の抗体クラスに存在し得る軽鎖定常領域は、κ（カッパー）及びλ（ラムダ）と呼ばれる。本明細書において他に特段の定めがなければ、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国公衆衛生局、国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（１９９１）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２に記載されている、ＥＵ指数とも呼ばれるＥＵ番号付け方式に従う。

本願において用いられる用語「ヒト起源に由来する定常領域」は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のヒト抗体の定常重鎖領域及び／又は定常軽鎖カッパーもしくはラムダ領域を表示する。このような定常領域は、本技術水準において周知のものであり、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国公衆衛生局、国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（１９９１）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２；例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．及びＷｕ，Ｔ．Ｔ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（２０００）２１４〜２１８；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２（１９７５）２７８５〜２７８８を参照）により記載されている。ＩｇＧ４サブクラスの抗体は、Ｆｃ受容体（ＦｃガンマＲＩＩＩａ）結合の低下を示すが、他のＩｇＧサブクラスの抗体は、強い結合を示す。しかし、Ｐｒｏ２３８、Ａｓｐ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２９７（Ｆｃ糖質の損失）、Ｐｒｏ３２９、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４及びＨｉｓ４３５は、変更されると、同様にＦｃ受容体結合の低下をもたらす残基である（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１〜６６０４；Ｌｕｎｄ，Ｊ．ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．９（１９９５）１１５〜１１９；Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６（１９９５）３１９〜３２４；欧州特許第０３０７４３４号明細書）。

一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、ヒト起源に由来する定常領域を含み、定常領域がヒトＩｇＧサブクラスのものであることを特徴とする。

一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、ヒト起源に由来する定常領域を含み、定常領域がヒトＩｇＧ１サブクラスのものであることを特徴とする。

一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、ヒト起源に由来する定常領域を含み、定常領域がヒトＩｇＧ２サブクラスのものであることを特徴とする。

一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、ヒト起源に由来する定常領域を含み、定常領域がヒトＩｇＧ３サブクラスのものであることを特徴とする。

一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、ヒト起源に由来する定常領域を含み、定常領域がヒトＩｇＧ４サブクラスのものであることを特徴とする。

典型的なヒト定常領域を配列番号７７〜８１に示す。

抗体の定常領域は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害作用）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害作用）に直接的に関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、多くのＩｇＧ抗体サブクラスの定常領域への補体因子Ｃ１ｑの結合により惹起される。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位における定義されたタンパク質−タンパク質相互作用に起因する。このような定常領域結合部位は、本技術水準において公知のものであり、例えば、Ｌｕｋａｓ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（１９８１）２５５５〜２５６０；Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ，Ｒ．及びＣｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（１９７９）９０７〜９１７；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら Ｎａｔｕｒｅ ２８８（１９８０）３３８〜３４４；Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２０００）９９５〜１００４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８〜４１８４；Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２００１）１２１６１〜１２１６８；Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６（１９９５）３１９〜３２４；及び欧州特許第０３０７４３４号明細書により記載されている。このような定常領域結合部位は、例えば、アミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵ指数に従った番号付け、上記参照）により特徴づけられる。

用語「抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）」は、エフェクター細胞の存在下における、本発明に係る抗体によるヒト標的細胞の溶解を指す。ＡＤＣＣは、好ましくは、新鮮に単離されたＰＢＭＣ又は単球もしくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のようにバフィーコートから精製されたエフェクター細胞又は永続的に増殖するＮＫ細胞株等、エフェクター細胞の存在下における、本発明に係る抗体によるＩＧＦ−１Ｒ及びＥＧＦＲ発現細胞の調製物の処理により測定される。

用語「補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）」は、大部分のＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補体因子Ｃ１ｑの結合により惹起される過程を表示する。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位における定義されたタンパク質−タンパク質相互作用に起因する。このようなＦｃ部分結合部位は、本技術水準において公知のものである（上述を参照）。このようなＦｃ部分結合部位は、例えば、アミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵ指数に従った番号付け）により特徴づけられる。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の抗体は通常、Ｃ１ｑ及びＣ３結合を包含する補体活性化を示し、一方、ＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、Ｃ１ｑ及び／又はＣ３と結合しない。

モノクローナル抗体の細胞介在性エフェクター機能は、Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６〜１８０及び米国特許第６，６０２，６８４号明細書に記載されている通り、そのオリゴ糖構成成分を操作することにより増強され得る。最も一般的に用いられる治療抗体であるＩｇＧ１型抗体は、各ＣＨ２ドメインにおけるＡｓｎ２９７に保存されたＮ結合型糖鎖付加部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に付着した２種の複合体二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメイン間に埋め込まれてポリペプチド主鎖と広範な接触を形成し、その存在は、抗体が、抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）等のエフェクター機能を媒介するために必須である（Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５（１９９５）８１３〜８２２；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６３（１９９８）５９〜７６；Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．及びＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１９９７）２６〜３２）。Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６〜１８０及び国際公開第９９／５４３４２号は、二分されたオリゴ糖の生成を触媒する糖転移酵素であるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（「ＧｎＴＩＩＩ」）のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における過剰発現が、抗体のインビトロＡＤＣＣ活性を有意に増加させることを示した。Ａｓｎ２９７糖質組成の変更又はその排除は、ＦｃγＲ及びＣ１ｑへの結合にも影響する（Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６〜１８０；Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７４（２００１）２８８〜２９４；Ｍｉｍｕｒａ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）４５５３９〜４５５４７；Ｒａｄａｅｖ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）１６４７８〜１６４８３；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１〜６６０４；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２００２）２６７３３〜２６７４０；Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｌ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３（２００２）１３３〜１４７）。

モノクローナル抗体の細胞介在性エフェクター機能を増強するための方法は、例えば、国際公開第２００５／０４４８５９号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００７／０３１８７５号、Ｕｍａｎａ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６〜１８０、国際公開第９９／５４３４２号、国際公開第２００５／０１８５７２号、国際公開第２００６／１１６２６０号、国際公開第２００６／１１４７００号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００５／０１１７３５号、国際公開第２００５／０２７９６６号、国際公開第１９９７／０２８２６７号、米国特許出願公開第２００６／０１３４７０９号明細書、米国特許出願公開第２００５／００５４０４８号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１５２８９４号明細書、国際公開第２００３／０３５８３５号及び国際公開第２０００／０６１７３９号において、あるいは例えば、Ｎｉｗａ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０６（２００５）１５１〜１６０；Ｓｈｉｎｋａｗａ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（２００３）３４６６〜３４７３；国際公開第０３／０５５９９３号及び米国特許出願公開第２００５／０２４９７２２号明細書において報告されている。

従って、本発明の一実施態様では、二重特異性抗体は、Ａｓｎ２９７（Ｋａｂａｔに従った番号付け）において糖鎖を付加され（ＩｇＧ１又はＩｇＧ３のＦｃ部分を含む場合）、前記糖鎖内のフコースの量は、６５％以下となる。別の一実施態様では、前記糖鎖内のフコースの量は、５％〜６５％の間であり、一実施態様においては、２０％〜５０％の間である。別の一実施態様では、前記糖鎖内のフコースの量は、０％〜５％の間である。本発明に係る「Ａｓｎ２９７」は、Ｆｃ領域における２９７位前後に位置するアミノ酸アスパラギン（Ｋａｂａｔに従った番号付け）を意味する。抗体の軽微な配列変種に基づき、Ａｓｎ２９７は、２９７位の数アミノ酸（通常＋３アミノ酸を越えない）上流又は下流に、即ち、２９４〜３００位の間に位置してもよい。

本発明に係る糖鎖付加された抗体の一実施態様では、ＩｇＧサブクラスは、ヒトＩｇＧ１サブクラス又はＩｇＧ３サブクラスのものである。更に別の一実施態様では、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）の量は、１％以下である、及び／又はＮ末端アルファ−１，３−ガラクトースの量は、前記糖鎖内の１％以下である。糖鎖は、好ましくは、ＣＨＯ細胞において組換えにより発現される抗体のＡｓｎ２９７に付着したＮ結合型グリカンの特徴を示す。

用語「糖鎖は、ＣＨＯ細胞において組換えにより発現される抗体のＡｓｎ２９７に付着したＮ結合型グリカンの特徴を示す」は、本発明に係る二重特異性抗体の定常領域のＡｓｎ２９７における糖鎖が、例えば、国際公開第２００６／１０３１００号において報告されるような、未改変のＣＨＯ細胞において発現される同一抗体のものと同一の構造及びフコース残基を除く糖残基配列を有することを表示する。

本願内で用いられる用語「ＮＧＮＡ」は、糖残基Ｎ−グリコリルノイラミン酸を表示する。

ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３の糖鎖付加は、最大２個のＧａｌ残基で終止するコアフコシル化した二分岐複合体オリゴ糖の糖鎖付加として、Ａｓｎ２９７において起こる。ＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスのヒト定常重鎖領域は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国公衆衛生局、国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（１９９１）ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１−３２４２及びＢｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６（１９８７）１３５１〜１３６１；Ｌｏｖｅ，Ｔ．Ｗ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８（１９８９）５１５〜５２７により詳細に報告されている。これらの構造は、末端Ｇａｌ残基の量に応じて、Ｇ０、Ｇ１（α−１，６−又はα−１，３−）又はＧ２グリカン残基と命名される（Ｒａｊｕ，Ｔ．Ｓ．、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔ．１（２００３）４４〜５３）。抗体Ｆｃ部分のＣＨＯ型糖鎖付加は、例えば、Ｒｏｕｔｉｅｒ，Ｆ．Ｈ．、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．１４（１９９７）２０１〜２０７により記載されている。糖改変（ｇｌｙｃｏｍｏｄｉｆｙ）されていないＣＨＯ宿主細胞において組換えにより発現される抗体は通常、少なくとも８５％の量でＡｓｎ２９７においてフコシル化されている。本発明に係る二重特異性抗体の定常領域の改変されたオリゴ糖は、ハイブリッド又は複合体となり得る。好ましくは、二分された低下された／非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッドである。別の一実施態様では、二分された低下された／非フコシル化オリゴ糖は、複合体である。

本発明において、「フコースの量」は、逆相ＵＰＬＣ（ＲＰ−ＵＰＬＣ）により測定され、実施例９に記載されている平均値として計算される、Ａｓｎ２９７に付着した全糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）の合計に関係する、Ａｓｎ２９７における糖鎖内の前記糖の量を意味する。試料のｎｏｎＦｕｃ含量の相対レベルの定量化のため、フコースを除くオリゴ糖を表す全ピークの面積がまとめられ、全オリゴ糖ピークの総ピーク面積に関連付けられる。

本発明に係るあらゆる二重特異性抗体に関して、「ＧＥ」は、糖鎖工学的に操作されていることを意味し、「ＷＴ」（野生型）は、糖鎖工学的に操作されていないことを意味する。

本発明の更に別の一態様において、本発明に係る二重特異性抗体は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを有する抗体であり、Ｆｃ−ガンマ受容体及び／又は補体因子Ｃ１ｑと結合する、ヒト起源のＩｇＧ１又はＩｇＧ３（好ましくは、ＩｇＧ１）サブクラスの定常領域を有する。Ｆｃ受容体及び／又は補体因子Ｃ１ｑと結合するこのような抗体は、抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を誘発する。

組換え方法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されている組換え方法及び組成物を用いて産生することができる。一実施態様では、本明細書に記載されている二重特異性抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽及び／又は重鎖）をコードすることができる。更に別の一実施態様では、このような核酸を含む一又は複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更に別の一実施態様では、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような一実施態様では、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列コードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、これで形質転換されている）。一実施態様では、宿主細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様では、抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒの方法であって、上述の抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養することと、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を必要に応じて回収することを含む方法が提供される。

抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒの組換え産生のため、例えば上述の抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞において更にクローニング及び／又は発現するために一又は複数のベクターに挿入される。このような核酸は、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に単離及び配列決定することができる。

抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞は、本明細書に記載されている原核生物又は真核生物の細胞を包含する。例えば、抗体は、特に、糖鎖付加及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、細菌において産生することができる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現に関して、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号明細書、米国特許第５，７８９，１９９号明細書及び米国特許第５，８４０，５２３号明細書を参照されたい（大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）における抗体断片の発現について記載する、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｋ．Ａ．、Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８巻、Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州トトワ（２００３）、２４５〜２５４頁も参照されたい）。発現後に、抗体は、可溶性画分において細菌細胞ペーストから単離し、更に精製することができる。

原核生物に加えて、糸状菌類又は酵母等、真核生物微生物は、抗体をコードするベクターのクローニング又は発現宿主に適しており、これは、その糖鎖付加経路が「ヒト化」されて、部分的に又は完全にヒトの糖鎖付加パターンを有する抗体の産生をもたらす真菌及び酵母株を包含する。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（２００４）１４０９〜１４１４；及びＬｉ，Ｈ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４（２００６）２１０〜２１５を参照されたい。

糖鎖付加された抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（非脊椎動物（ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ）及び脊椎動物）に由来する。非脊椎動物細胞の例として、植物及び昆虫細胞が挙げられる。特に、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて用いることのできる、多数のバキュロウイルス株が同定された。

植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号及び同第６，４１７，４２９号明細書（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術について記載）を参照されたい。

脊椎動物細胞を宿主として用いることもできる。例えば、浮遊状態での育成に順応された哺乳類細胞株が有用となり得る。有用な哺乳類宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統；ヒト胚性腎臓系統（例えば、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９〜７４に記載されている２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３（１９８０）２４３〜２５２に記載されているＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ ｒａｔ）肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３（１９８２）４４〜６８に記載されているＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳類宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（１９８０）４２１６〜４２２０）を包含するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；並びにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０等、骨髄腫細胞株を包含する。抗体産生に適した特定の哺乳類宿主細胞株の総説に関して、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ．及びＷｕ，Ａ．Ｍ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８巻、Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州トトワ（２００４）、２５５〜２６８頁を参照されたい。

本発明に係る二重特異性抗体は、組換え手段により産生される。よって、本発明の一態様は、本発明に係る抗体をコードする核酸であり、更に別の一態様は、本発明に係る抗体をコードする前記核酸を含む宿主細胞である。組換え産生のための方法は、本技術水準において広く知られており、原核生物及び真核生物の細胞におけるタンパク質発現と、続く抗体の単離及び通常、薬学的に許容される純度への精製を含む。宿主細胞における上述の抗体の発現のため、それぞれ改変された軽及び重鎖をコードする核酸は、標準方法により発現ベクターに挿入される。ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母又は大腸菌細胞のような、適切な原核生物又は真核生物の宿主細胞において発現が行われ、細胞（上清又は溶解後の細胞）から抗体が回収される。抗体の組換え産生のための一般方法は、本技術水準において周知のものであり、例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１７（１９９９）１８３〜２０２；Ｇｅｉｓｓｅ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．８（１９９６）２７１〜２８２；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２０００）１５１〜１６０；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．、Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．４８（１９９８）８７０〜８８０の総説論文に記載されている。

二重特異性抗体は、適宜、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィー等、従来の免疫グロブリン精製手順により培養培地から分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、従来の手順を用いて容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡ及びＲＮＡの供給源として役立つことができる。ＤＮＡを単離したら、発現ベクターに挿入し、次に、そのままでは免疫グロブリンタンパク質を産生することのないＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞又は骨髄腫細胞等、宿主細胞にトランスフェクトして、宿主細胞における組換えモノクローナル抗体の合成を得ることができる。

本願において用いられる用語「宿主細胞」は、本発明に係る抗体を作製するために操作することのできるいずれかの種類の細胞系を表示する。一実施態様では、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞が、宿主細胞として用いられる。本明細書において、表現「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」は、互換的に用いられ、このような命名は全て、後代を包含する。よって、単語「形質転換体」及び「形質転換された細胞」は、初代対象（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｕｂｊｅｃｔ）細胞及び継代（ｔｒａｎｓｆｅｒ）の数を問わずそれから派生する培養物を包含する。あらゆる後代が、計画的又は偶発性の変異により、ＤＮＡ含量が正確に同一であるとは限らないことも理解される。本来の形質転換細胞においてスクリーニングされたものと同一機能又は生物活性を有するバリアント後代が包含される。

ＮＳ０細胞における発現は、例えば、Ｂａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（２０００）１０９〜１２３；Ｂａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．７３（２００１）２６１〜２７０により記載されている。一過性発現は、例えば、Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３０ Ｅ９（２００２）により記載されている。可変ドメインのクローニングは、Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１９８９）３８３３〜３８３７；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（１９９２）４２８５〜４２８９；及びＮｏｒｄｅｒｈａｕｇ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０４（１９９７）７７〜８７により記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．−Ｊ．ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｋ．、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０（１９９９）７１〜８３及びＳｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．−Ｊ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９４（１９９６）１９１〜１９９により記載されている。

原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列及びリボソーム結合部位を包含する。真核生物の細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。

核酸は、別の核酸配列と機能的な関係性に置かれている場合、「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列又は分泌型リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現される場合、該ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されている。プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、該コード配列に作動可能に連結されている。あるいは、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするよう配置されている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結」は、連結されているＤＮＡ配列が、近接していることを意味し、分泌型リーダーの場合、近接し、読み枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、近接していなくてもよい。連結は、簡便な制限部位におけるライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーは、従来の慣例を踏まえて用いられる。

フコースの量が低下した本発明に係る抗体は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチド及びＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１種の核酸を、Ｆｃ領域におけるオリゴ糖を本発明に従ってフコシル化できる量で発現するよう操作された、糖改変された宿主細胞において発現させることができる。一実施態様では、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、融合ポリペプチドである。あるいは、米国特許第６，９４６，２９２号明細書に従って宿主細胞のα１，６−フコシル基転移酵素活性を減少又は排除させて、糖改変された宿主細胞を作製することができる。抗体フコシル化の量は、例えば、発酵条件又は異なるフコシル化量を有する少なくとも２種の抗体の組み合わせのいずれかにより予め定めることができる。

フコースの量が低下した本発明に係る抗体は、（ａ）前記抗体の産生を可能にする条件かつ本発明に係る量で前記抗体のＦｃ領域に存在するオリゴ糖のフコシル化を可能にする条件下で、ＧｎＴＩＩＩ活性及び／又はＭａｎＩＩ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを発現するよう操作された宿主細胞を培養することと、（ｂ）前記抗体を単離することとを含む方法により、宿主細胞において産生することができる。一実施態様では、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、融合ポリペプチドであり、好ましくは、ＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインと、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ（「ＧｎＴＩ」）の局在化ドメイン、マンノシダーゼ（ｍａｒｍｏｓｉｄａｓｅ）Ｉの局在化ドメイン、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩ（「ＧｎＴＩＩ」）の局在化ドメイン及びα−１，６コアフコシル基転移酵素の局在化ドメインからなる群から選択される異種ゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインとを含む。好ましくは、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩ又はＧｎＴＩ由来である。

本明細書において、「ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチド」は、Ｎ結合型オリゴ糖のトリマンノシルコアのβ−結合型マンノシドへのβ−１，４結合におけるＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基の付加を触媒することができるポリペプチドを指す。これは、用量依存性あり又はなしで特定の生物学的アッセイにおいて測定した際に、国際生化学分子生物学連合の命名法委員会（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）に従ったβ−１，４−マンノシル−糖タンパク質４−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（ＥＣ２．４．１．１４４）としても知られるβ−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩの活性と同様の、但し必ずしも同一でなくてもよい酵素活性を提示する融合ポリペプチドを包含する。用量依存性が存在する場合、これは、ＧｎＴＩＩＩと同一である必要はないが、寧ろＧｎＴＩＩＩと比較して所定の活性における用量依存と実質的に同様である（即ち、候補ポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩと比べてより大きい活性、あるいはせいぜい約２５倍低い、好ましくは、せいぜい約１０倍低い活性、最も好ましくは、せいぜい約３倍低い活性を提示するであろう）。本明細書において、用語「ゴルジ局在化ドメイン」は、ゴルジ複合体内の位置におけるポリペプチド繋留の原因となるゴルジ常在性ポリペプチドのアミノ酸配列を指す。一般に、局在化ドメインは、酵素のアミノ末端「テール」を含む。

フコースの量が低下した本発明に係る抗体の産生のため、同様に、改変されたグリコフォームを有する抗体を産生することができ、それが可能になるよう操作された宿主細胞を用いることができる。このような宿主細胞は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有する一又は複数のポリペプチドを増加レベルで発現するよう更に操作されている。ＣＨＯ細胞は、このような宿主細胞として好ましい。同様に、ＡＤＣＣが増加した抗体組成物を産生する細胞が、米国特許第６，９４６，２９２号明細書において報告されている。

抗体の精製は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成（ｂａｎｄｉｎｇ）、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び本技術分野において周知のその他を包含する標準技法により、細胞構成成分又は他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸又はタンパク質を排除するために行われる。Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照されたい。微生物タンパク質によるアフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）及び混合モード（ｍｉｘｅｄ−ｍｏｄｅ）の交換）、チオフィリック（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ）吸着（例えば、ベータ−メルカプトエタノール及び他のＳＨリガンドによる）、疎水性相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニル−セファロース、アザ−アレノフィリック（ａｒｅｎｏｐｈｉｌｉｃ）樹脂又はｍ−アミノフェニルボロン酸による）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ（ＩＩ）及びＣｕ（ＩＩ）親和性材料による）、分子ふるいクロマトグラフィー並びに電気泳動的方法（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等）等、タンパク質精製のために、様々に異なる方法が十分に確立され、広く用いられている（Ｖｉｊａｙａｌａｋｓｈｍｉ，Ｍ．、Ａ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７５（１９９８）９３〜１０２）。

本明細書において、表現「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」は、互換的に用いられ、このような命名は全て、後代を包含する。よって、単語「形質転換体」及び「形質転換された細胞」は、初代対象細胞及び継代の数を問わずそれから派生する培養物を包含する。あらゆる後代は、計画的又は偶発性の変異により、ＤＮＡ含量が正確に同一であるとは限らないことも理解される。本来の形質転換細胞においてスクリーニングされたものと同一機能又は生物活性を有するバリアント後代が包含される。別個の命名が企図されている場合、文脈から明らかになるであろう。

本明細書における用語「形質転換」は、宿主細胞にベクター／核酸を移入させる過程を指す。手強い細胞壁の障壁を持たない細胞が宿主細胞として用いられる場合、例えば、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ａ．Ｊ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（１９７３）４５６〜４６７により記載されているリン酸カルシウム沈殿方法によりトランスフェクションが行われる。しかし、核インジェクション又はプロトプラスト融合による等、ＤＮＡを細胞に導入するための他の方法を用いることもできる。原核生物の細胞又は実質的な細胞壁構築物を含有する細胞が用いられる場合、例えば、トランスフェクションの一方法は、Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ら、ＰＮＡＳ．６９（１９７２）２１１０〜２１１４により記載されている、塩化カルシウムを用いたカルシウム処理である。

本明細書において、「発現」は、核酸がｍＲＮＡに転写される過程及び／又は転写されたｍＲＮＡ（転写産物とも称される）が、続いてペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳される過程を指す。転写産物及びコードされたポリペプチドは、遺伝子産物と総称される。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、真核生物の細胞における発現は、ｍＲＮＡのスプライシングを包含し得る。

「ベクター」は、挿入された核酸分子を宿主細胞の内部及び／又はその間に移入する、特に自己複製する核酸分子である。この用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを細胞に挿入するために主として機能するベクター（例えば、染色体組み込み）、ＤＮＡ又はＲＮＡを複製するために主として機能する複製ベクター、及びＤＮＡ又はＲＮＡを転写及び／又は翻訳させるために機能する発現ベクターを包含する。記載されている機能のうち２種以上を提供するベクターも包含される。

「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入されると、転写され、ポリペプチドに翻訳されることのできるポリヌクレオチドである。「発現系」は通常、所望の発現産物を生じるよう機能できる発現ベクターで構成された、適した宿主細胞を指す。

「単離された」抗体は、その天然の環境の構成成分から分離された抗体である。一部の実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定される、９５％又は９９％を超える純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法の総説に関して、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８（２００７）７９〜８７を参照されたい。

イムノコンジュゲート
本発明は、また、化学療法の薬剤もしくは薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源のタンパク質毒素、酵素活性毒素もしくはこれらの断片）又は放射性同位元素等、一又は複数の細胞傷害性薬物にコンジュゲートされた本発明に係る抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。

「イムノコンジュゲート」は、細胞傷害性薬物等が挙げられるがこれらに限定されない一又は複数の異種分子にコンジュゲートされた抗体である。

本明細書における用語「細胞傷害性薬物」は、細胞機能を阻害もしくは防止する、及び／又は細胞死もしくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性薬物として、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位元素）；化学療法の薬剤又は薬物（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｉｃｉｎ）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；成長阻害剤；核酸分解酵素等、酵素及びその断片；抗生物質；細菌、真菌、植物又は動物起源の小分子毒素又は酵素活性毒素等、毒素（これらの断片及び／又はバリアントを包含）；並びに下に開示する様々な抗腫瘍又は抗癌剤が挙げられるがこれらに限定されない。

一実施態様では、イムノコンジュゲートは、抗体が、一又は複数の医薬にコンジュゲートされた抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であり、薬物の例として、マイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号明細書、米国特許第５，４１６，０６４号明細書及び欧州特許第０４２５２３５（Ｂ１）号明細書を参照）；モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）等、オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）（米国特許第５，６３５，４８３号明細書、米国特許第５，７８０，５８８号明細書及び米国特許第７，４９８，２９８号明細書を参照）；ドラスタチン；カリチアマイシン又はその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号明細書、米国特許第５，７１４，５８６号明細書、米国特許第５，７３９，１１６号明細書、米国特許第５，７６７，２８５号明細書、米国特許第５，７７０，７０１号明細書、米国特許第５，７７０，７１０号明細書、米国特許第５，７７３，００１号明細書及び米国特許第５，８７７，２９６号明細書；Ｈｉｎｍａｎ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３（１９９３）３３３６〜３３４２；及びＬｏｄｅ，Ｈ．Ｎ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１９９８）２９２５〜２９２８を参照）；ダウノマイシン又はドキソルビシン等、アントラサイクリン（Ｋｒａｔｚ，Ｆ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３（２００６）４７７〜５２３；Ｊｅｆｆｒｅｙ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１６（２００６）３５８〜３６２；Ｔｏｒｇｏｖ，Ｍ．Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１６（２００５）７１７〜７２１；Ｎａｇｙ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７（２０００）８２９〜８３４；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １２（２００２）１５２９〜１５３２；Ｋｉｎｇ，Ｈ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５（２００２）４３３６〜４３４３；及び米国特許第６，６３０，５７９号明細書を参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル（ｌａｒｏｔａｘｅｌ）、テセタキセル（ｔｅｓｅｔａｘｅｌ）及びオルタタキセル（ｏｒｔａｔａｘｅｌ）等、タキサン；トリコテシン；並びにＣＣ１０６５等が挙げられるがこれらに限定されない。

別の一実施態様では、イムノコンジュゲートは、酵素活性毒素又はその断片にコンジュゲートされた本明細書に記載されている抗体を含み、酵素活性毒素又はその断片の例として、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、アレウリテス・フォルディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、カーシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サポナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテシン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）等が挙げられるがこれらに限定されない。

別の一実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされて放射性コンジュゲートを形成した、本明細書に記載されている抗体を含む。種々の放射性同位元素が、放射性コンジュゲートの産生に利用できる。例として、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位元素が挙げられる。放射性コンジュゲートが検出に用いられる場合、放射性コンジュゲートは、シンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばＴＣ９９ｍもしくはＩ１２３、又は再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄等、核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像（磁気共鳴画像、ＭＲＩとしても知られる）のためのスピン標識を含むことができる。

Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジプイミデート（ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ）ＨＣｌ等）、活性エステル（スベリン酸ジサクシニミジル等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネート等）及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）等、種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて、抗体及び細胞傷害性薬物のコンジュゲートを作製することができる。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａ，Ｅ．Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８（１９８７）１０９８〜１１０４に記載されている通り、リシン免疫毒素を調製することができる。炭素−１４標識された１−イソチオシアネートベンジル（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｂｅｎｚｙｌ）−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体へと放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは、細胞における細胞傷害性薬物の放出を容易にする「開裂可能リンカー」となり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ，Ｒ．Ｖ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２（１９９２）１２７〜１３１；米国特許第５，２０８，０２０号明細書）を用いることができる。

イムノ（ｉｍｍｕｎｕｏ）コンジュゲート又はＡＤＣとして、クロスリンカー試薬により調製されたこのようなコンジュゲートを本明細書において明確に考慮するがこれらに限定されず、クロスリンカー試薬の例として、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ及びスルホ−ＳＭＰＢ並びにＳＶＳＢ（サクシニミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）等が挙げられるがこれらに限定されず、これらは（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、米国イリノイ州ロックフォードから）市販されている。

診断及び検出のための方法及び組成物
所定の実施態様では、本明細書において提供される抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体は、生体試料におけるＥＧＦＲ及び／又はＩＧＦ−１Ｒの存在の検出に有用である。本明細書における用語「検出」は、定量的又は定性的検出を網羅する。所定の実施態様では、生体試料は、腫瘍組織等、細胞又は組織を含む。

一実施態様では、診断又は検出の方法において用いるための本発明に係る抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体が提供される。更に別の一態様において、生体試料におけるＥＧＦＲ及び／又はＩＧＦ−１Ｒの存在を検出する方法が提供される。所定の実施態様では、方法は、ＥＧＦＲ及び／又はＩＧＦ−１Ｒと本発明に係る抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体との結合に許容的な条件下で、本明細書に記載されている抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体と生体試料を接触させることと、抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体とＥＧＦＲ及び／又はＩＧＦ−１Ｒとの間で複合体が形成されるか検出することとを含む。このような方法は、インビトロ又はインビボ方法となり得る。一実施態様では、例えば、ＥＧＦＲ及び／又はＩＧＦ−１Ｒが、患者の選択のためのバイオマーカーである場合、本発明に係る抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体は、抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を用いた治療法に適格な対象の選択に用いられる。

本発明の抗体を用いて診断され得る例示的な障害として、癌が挙げられる。

所定の実施態様では、標識された抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体が提供される。標識として、直接的に検出される標識又は部分（蛍光、発色団、高電子密度、化学発光及び放射性標識等）と共に、間接的に、例えば、酵素反応又は分子相互作用により検出される酵素又はリガンド等の部分が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な標識として、放射性同位元素３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ、希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体等のフルオロフォア、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅ）、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号明細書）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素、ウリカーゼ等の複素環オキシダーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、ＨＲＰ等の色素前駆物質を酸化するために過酸化水素を用いる酵素とカップリングしたもの、ラクトペルオキシダーゼ又はミクロペルオキシダーゼ（ｍｉｃｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定的なフリーラジカルその他が挙げられるがこれらに限定されない。

薬学的製剤
本明細書において提供される二重特異性抗体の薬学的製剤は、一又は複数の必要に応じた薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．（編）（１９８０））と、所望の程度の純度を有するこのような抗体を混合することにより、凍結乾燥された製剤又は水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体は、一般に、用いられる薬用量及び濃度においてレシピエントに対し無毒性であり、その例として：リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸等、バッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを包含する抗酸化剤；保存料（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等、アルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等、タンパク質；ポリ（ビニルピロリドン）等、親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等、アミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを包含する単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等、キレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等、糖；ナトリウム等、塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等、非イオン性界面活性剤が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）等のヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質等、間質性（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ）薬物分散剤を更に包含する。ｒｈｕＰＨ２０を包含する特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号明細書に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼ等、一又は複数の追加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。

例示的な凍結乾燥された抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号明細書に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６，１７１，５８６号明細書及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されている製剤を包含し、後者の製剤は、酢酸ヒスチジンバッファーを包含する。

本明細書における製剤は、処置されている特定の徴候の必要に応じて、２種以上の有効成分、好ましくは、互いに有害な影響を与えることのない相補的活性を有する有効成分を含有することもできる。このような有効成分は、企図される目的に有効な量で組み合わせて適宜存在する。

有効成分は、例えば、コロイド性薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションにおいて、コアセルベーション技法により又は界面重合により調製されたマイクロカプセルに、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに封入することができる。このような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．（編）（１９８０）において開示されている。

徐放調製物を調製することができる。徐放調製物の適した例として、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスであって、成形された物品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態のマトリクスが挙げられる。

用語「薬学的製剤」は、そこに含有される有効成分の生物活性が有効となることを可能にするような形態の、製剤が投与される対象が許容できない毒性を有する追加的な構成成分を含有しない調製物を指す。

「薬学的に許容される担体」は、対象にとって無毒性の、有効成分以外の薬学的製剤における成分を指す。薬学的に許容される担体として、バッファー、賦形剤、安定剤又は保存料が挙げられるがこれらに限定されない。

インビボ投与に用いられる製剤は一般に、無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成することができる。

本発明の一実施態様は、本発明に係る二重特異性抗体を含む薬学的製剤である。

治療の方法及び組成物
本明細書に提供される二重特異性抗体のいずれかを、治療方法において用いることができる。

一態様において、薬物として用いるための二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が提供される。更に別の態様において、癌の治療において使用するための二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が提供される。所定の実施態様では、処置方法において用いるための二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が提供される。所定の実施態様では、本発明は、有効量の二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を個体に投与することを含む、癌を有する個体を処置する方法において用いるための二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を提供する。このような一実施態様では、方法は、有効量の少なくとも１種の追加的な治療剤、例えば、後述する治療剤を個体に投与することを更に含む。更に別の実施形態において、本発明は、細胞増殖、特に、癌細胞増殖の阻害において用いるための二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を提供する。所定の実施態様では、本発明は、有効量の二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を個体に投与して、細胞増殖、特に、癌細胞増殖を阻害することを含む、個体における細胞増殖、特に、癌細胞増殖を阻害する方法において用いるための二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を提供する。上述の実施形態のいずれかに係る「個体」は、好ましくは、ヒトである。

更に別の一態様において、本発明は、薬物の製造又は調製における、二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の使用を提供する。一実施態様では、薬物は、癌を処置するためのものである。更に別の一実施態様では、薬物は、癌を有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、癌を処置する方法において用いるためのものである。このような一実施態様では、方法は、有効量の少なくとも１種の追加的な治療剤、例えば、後述する治療剤を個体に投与することを更に含む。更に別の一実施態様では、薬物は、細胞増殖、特に、癌細胞増殖を阻害するためのものである。更に別の一実施態様では、薬物は、有効な量の医薬を個体に投与して、細胞増殖、特に、癌細胞増殖を阻害することを含む、個体における細胞増殖、特に、癌細胞増殖を阻害する方法において用いるためのものである。上述の実施形態のいずれかに係る「個体」は、ヒトとなり得る。一実施態様では、「個体」は、ヒトである。

本発明の一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、ＩＧＦ−１Ｒリン酸化及びＥＧＦＲリン酸化を阻害する（実施例４を参照）。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、０．１０ｎＭ以下のＩＣ５０で、Ａ５４９癌細胞におけるＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害する。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、０．１０ｎＭ以下のＩＣ５０で、ＢｘＰＣ３癌細胞におけるＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害する。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、０．１０ｎＭ以下のＩＣ５０で、ＴＣ−７１癌細胞におけるＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害する。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、０．２３ｎＭ以下のＩＣ５０で、Ａ５４９癌細胞におけるＥＧＦＲリン酸化を阻害する。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、０．９０ｎＭ以下のＩＣ５０で、ＢｘＰＣ３癌細胞におけるＥＧＦＲリン酸化を阻害する。

本発明の一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、癌細胞増殖又は腫瘍細胞増殖を阻害する（実施例５を参照）。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、０．２０ｎＭ以下のＩＣ５０で（好ましくは、０．１５ｎＭ以下のＩＣ５０で）、Ａ５４９癌細胞の増殖を阻害する。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、０．１０ｎＭ以下のＩＣ５０で（好ましくは、０．０５ｎＭ以下のＩＣ５０で）、ＲＤ−ＥＳ癌細胞の増殖を阻害する。

本発明の一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、６５％以下（好ましくは、５０〜５％の間）の量のフコースにより糖鎖工学的に操作され、癌細胞においてＡＤＣＣを誘導する（実施例７を参照）。本発明の一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、６５％以下（好ましくは、５０〜５％の間）の量のフコースにより糖鎖工学的に操作され、０．１０ｎＭ以下のＥＣ５０でＨ４６０Ｍ２癌細胞におけるＡＤＣＣを誘導する。本発明の一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、６５％以下（好ましくは、５０〜５％の間）の量のフコースにより糖鎖工学的に操作され、０．１５ｎＭ以下のＥＣ５０でＨ３２２Ｍ癌細胞におけるＡＤＣＣを誘導する。

本明細書における用語「癌」は、リンパ腫、リンパ性白血病、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、細気管支肺胞性（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｏａｌｖｉｏｌａｒ）細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部もしくは頸部の癌、皮膚性もしくは眼内メラノーマ、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、胃の癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管のがん、子宮内膜のがん、子宮頸部のがん、腟のがん、外陰部のがん、ホジキン病、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟部組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、膀胱の癌、腎臓もしくは尿管の癌、腎臓細胞がん、腎盂のがん、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫（ｓｃｈｗａｎｏｍａ）、上衣腫（ｅｐｅｎｄｙｍｏｎａ）、髄芽腫、髄膜腫、扁平細胞がん、下垂体腺腫及びユーイング肉腫等、上述の癌のいずれかの不応性バージョン又は上述の癌のうち１種もしくは複数種の組み合わせを包含する、増殖性疾患を指す。

「個体」又は「対象」は、哺乳類である。哺乳類として、飼い慣らされた動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるがこれらに限定されない。所定の実施態様では、個体又は対象は、ヒトである。

「有効量」の薬剤、例えば、薬学的製剤は、所望の治療的又は予防的結果を達成するための、必要な薬用量及び期間における有効な量を指す。

本明細書において、「処置」（及びその文法上の変種、「処置する」又は「処置している」等）は、処置されている個体の自然の経過を変更する試みにおける臨床介入を指し、予防法のため、あるいは臨床病理学の経過において行うことができる。処置の望ましい効果として、疾患の発生又は再発の予防、症状の軽減、疾患のいずれかの直接的又は間接的病理学的結果の縮小、転移の予防、疾患進行速度の減少、病状の寛解又は緩和及び緩解又は改善された予後が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるため、あるいは疾患の進行を遅らせるために用いられる。

更に別の一態様において、本発明は、例えば上述の治療方法のいずれかにおける使用のための、本明細書に提供される二重特異性抗体のいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様では、薬学的製剤は、本明細書に提供される二重特異性抗体のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の一実施態様では、薬学的製剤は、本明細書に提供される二重特異性抗体のいずれかと、少なくとも１種の追加的な治療剤、例えば、後述する治療剤とを含む。

本発明の抗体は、治療法において単独で、あるいは他の薬剤と組み合わせて用いることができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１種の追加的な治療剤と同時投与することができる。

上記のこのような併用療法は、組み合わせた投与（同一又は別々の製剤に２種以上の治療剤が包含される場合）と、別々の投与とを網羅し、別々の投与の場合、本発明の抗体の投与は、追加的な治療剤及び／又はアジュバントの投与の前に、同時に及び／又は後に行うことができる。本発明の抗体は、放射線療法と組み合わせて用いることもできる。本発明の抗体（及びいずれかの追加的な治療剤）は、非経口的、肺内及び鼻腔内を包含するいずれかの適した手段により投与することができ、局所的処置に望ましい場合、病巣内投与を包含する。非経口的注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与を包含する。投薬は、一部には、投与が短期であるか慢性であるかに応じて、いずれかの適した経路、例えば、静脈内又は皮下注射等、注射により行うことができる。様々な時点に及ぶ単数又は複数回投与、ボーラス投与及びパルス注入等が挙げられるがこれらに限定されない様々な投薬スケジュールが、本明細書において考慮される。

本発明の抗体は、優れた医療行為と調和した様式で処方、服用及び投与されるであろう。本文脈における検討のための因子は、処置されている特定の障害、処置されている特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与のスケジューリング及び医師にとって公知の他の因子を包含する。抗体は、そうである必要はないが、必要に応じて、問題になっている障害の予防又は処置に現在用いられている一又は複数の薬剤と共に処方される。このような他の薬剤の有効量は、製剤に存在する抗体の量、障害又は処置の種類及び上に記す他の因子に依存する。これらは、一般に、同一薬用量で、本明細書に記載されている投与経路により、あるいは本明細書に記載されている薬用量の約１〜９９％で、あるいは適切であると経験的に／臨床的に決定されるいずれかの薬用量で、いずれかの経路により用いられる。

疾患の予防又は処置のため、本発明の抗体（単独で、あるいは一又は複数の他の追加的な治療剤と組み合わせて用いられる場合）の適切な薬用量は、処置される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的のために投与されるのか治療目的のために投与されるか、以前の治療法、患者の臨床歴及び抗体に対する応答及び通院中の医者の裁量に依存するであろう。抗体は、一度に、あるいは一連の処置にわたり患者に適宜投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば、１回又は複数回の別々の投与によるものであれ、持続的注入によるものであれ、患者への投与のための初回の候補薬用量となり得る。ある典型的な一日薬用量は、上述の因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上に及び得る。数日又はそれ以上にわたる反復投与のため、状態に依存して、処置は一般に、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続されるであろう。抗体のある例示的な薬用量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲となるであろう。よって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はそのいずれかの組み合わせ）の１又は複数の用量を、患者に投与することができる。このような用量は、断続的に、例えば、１週間毎又は３週間毎に投与することができる（例えば、患者が、約２〜約２０又は例えば、約６用量の抗体を受けるように）。初回により高い負荷用量、続いて１回又は複数回のより低い用量を投与してもよい。例示的な投薬レジメンは、例えば、約４ｍｇ／ｋｇの初回負荷用量、続いて約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量の抗体の投与を含む。しかし、他の薬用量レジメンも有用となり得る。この治療法の進行は、従来の技法及びアッセイにより容易にモニターされる。

本発明に係る抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の代わりに又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを用いて、上述の製剤又は治療方法のいずれかを行うことができると理解される。

本発明の別の一態様は、癌の治療において使用するための本発明に係る二重特異性抗体である。

本発明の別の一態様は、癌の治療のための医薬の製造のための、本発明に係る二重特異性抗体の使用である。

本発明の別の一態様は、このような治療を必要とする患者に、本発明に係る二重特異性抗体を投与することによる、癌を患う患者の処置の方法である。

製造品
本発明の別の一態様において、上に記載されている障害の処置、予防及び／又は診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、該容器上の又はこれに付随するラベル又は添付文書とを含む。適した容器は、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等を包含する。容器は、ガラス又はプラスチック等、種々の材料から形成することができる。容器は、それ自体のみで、あるいは別の組成物と組み合わせて状態の処置、予防及び／又は診断に有効な組成物を保持し、無菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、あるいは皮下注射針で刺し通すことができる栓を有するバイアルとなり得る）。組成物における少なくとも１種の活性薬剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が、最適な状態の処置に用いられることを示す。更に、製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物が含有された第１の容器と、（ｂ）更に別の細胞傷害性さもなければ治療剤を含む組成物が含有された第２の容器とを含むことができる。本発明の本実施形態における製造品は、該組成物を特定の状態の処置に用いることができることを示す添付文書を更に含むことができる。あるいは、又は更に、製造品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液等、薬学的に許容されるバッファーを含む第２の（又は第３の）容器を更に含むことができる。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを包含する、商業上及び利用者の観点から望ましい他の材料を更に包含することができる。

用語「添付文書」は、このような治療薬品の使用に関与する徴候、利用法、薬用量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告に関する情報を含有する、治療用薬品の商用パッケージに通例包含される説明書を指すよう用いられる。

上述の製造品のいずれかが、本発明に係る抗ＥＧＦＲ／抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の代わりに、あるいはそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを包含し得ることが理解される。

配列の説明
ａ）アミノ酸配列：
配列番号１ 重鎖ＣＤＲ１、ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２
配列番号２ 重鎖ＣＤＲ２、ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２
配列番号３ 重鎖ＣＤＲ３、ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２
配列番号４ 軽鎖ＣＤＲ１、ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２
配列番号５ 軽鎖ＣＤＲ２、ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２
配列番号６ 軽鎖ＣＤＲ３、ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２
配列番号７ 重鎖可変ドメイン、ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２−Ｉ−ＨＨＤ
配列番号８ 軽鎖可変ドメイン、ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２−Ｉ−ＫＣ
配列番号９ 重鎖ＣＤＲ１、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号１０ 重鎖ＣＤＲ２、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号１１ 重鎖ＣＤＲ３、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号１２ 軽鎖ＣＤＲ１、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号１３ 軽鎖ＣＤＲ２、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号１４ 軽鎖ＣＤＲ３、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号１５ 重鎖可変ドメイン、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号１６ 軽鎖可変ドメイン、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８
配列番号１７ 重鎖ＣＤＲ１、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｆ１３Ｂ５（改変された＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８）
配列番号１８ 重鎖ＣＤＲ２、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｆ１３Ｂ５
配列番号１９ 重鎖ＣＤＲ３、＜＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｆ１３Ｂ５
配列番号２０ 軽鎖ＣＤＲ１、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｆ１３Ｂ５
配列番号２１ 軽鎖ＣＤＲ２、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｆ１３Ｂ５
配列番号２２ 軽鎖ＣＤＲ３、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｆ１３Ｂ５
配列番号２３ 重鎖可変ドメイン、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｆ１３Ｂ５
配列番号２４ 軽鎖可変ドメイン、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｆ１３Ｂ５
配列番号２５ 重鎖ＣＤＲ１、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３７Ｆ７（改変された＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８）
配列番号２６ 重鎖ＣＤＲ２、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３７Ｆ７
配列番号２７ 重鎖ＣＤＲ３、＜＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３７Ｆ７
配列番号２８ 軽鎖ＣＤＲ１、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３７Ｆ７
配列番号２９ 軽鎖ＣＤＲ２、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３７Ｆ７
配列番号３０ 軽鎖ＣＤＲ３、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３７Ｆ７
配列番号３１ 重鎖可変ドメイン、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３７Ｆ７
配列番号３２ 軽鎖可変ドメイン、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３７Ｆ７
配列番号３３ 重鎖ＣＤＲ１、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３９Ｄ７（改変された＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８）
配列番号３４ 重鎖ＣＤＲ２、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３９Ｄ７
配列番号３５ 重鎖ＣＤＲ３、＜＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３９Ｄ７
配列番号３６ 軽鎖ＣＤＲ１、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３９Ｄ７
配列番号３７ 軽鎖ＣＤＲ２、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３９Ｄ７
配列番号３８ 軽鎖ＣＤＲ３、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３９Ｄ７
配列番号３９ 重鎖可変ドメイン、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３９Ｄ７
配列番号４０ 軽鎖可変ドメイン、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３９Ｄ７
配列番号４１ 重鎖ＣＤＲ１、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３１Ｄ１１（改変された＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８）
配列番号４２ 重鎖ＣＤＲ２、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３１Ｄ１１
配列番号４３ 重鎖ＣＤＲ３、＜＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３１Ｄ１１
配列番号４４ 軽鎖ＣＤＲ１、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３１Ｄ１１
配列番号４５ 軽鎖ＣＤＲ２、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３１Ｄ１１
配列番号４６ 軽鎖ＣＤＲ３、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３１Ｄ１１
配列番号４７ 重鎖可変ドメイン、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３１Ｄ１１
配列番号４８ 軽鎖可変ドメイン、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３１Ｄ１１
配列番号４９ 重鎖ＣＤＲ１、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３１Ｄ７（改変された＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８）
配列番号５０ 重鎖ＣＤＲ２、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３１Ｄ７
配列番号５１ 重鎖ＣＤＲ３、＜＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３１Ｄ７
配列番号５２ 軽鎖ＣＤＲ１、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３１Ｄ７
配列番号５３ 軽鎖ＣＤＲ２、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３１Ｄ７
配列番号５４ 軽鎖ＣＤＲ３、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３１Ｄ７
配列番号５５ 重鎖可変ドメイン、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３１Ｄ７
配列番号５６ 軽鎖可変ドメイン、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３１Ｄ７
配列番号５７ ＯＡ−Ｆ１３Ｂ５−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１重鎖１
配列番号５８ ＯＡ−Ｆ１３Ｂ５−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１重鎖２
配列番号５９ ＯＡ−Ｆ１３Ｂ５−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１軽鎖
配列番号６０ ＯＡ−Ｌ３１Ｄ１１−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１重鎖１
配列番号６１ ＯＡ−Ｌ３１Ｄ１１−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１重鎖２
配列番号６２ ＯＡ−Ｌ３１Ｄ１１−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１軽鎖
配列番号６３ ＣＭ−Ｆ１３Ｂ５−ＧＡ２０１重鎖１
配列番号６４ ＣＭ−Ｆ１３Ｂ５−ＧＡ２０１重鎖２
配列番号６５ ＣＭ−Ｆ１３Ｂ５−ＧＡ２０１軽鎖１
配列番号６６ ＣＭ−Ｆ１３Ｂ５−ＧＡ２０１軽鎖２
配列番号６７ ＣＭ−Ｌ３１Ｄ１１−ＧＡ２０１重鎖１
配列番号６８ ＣＭ−Ｌ３１Ｄ１１−ＧＡ２０１重鎖２
配列番号６９ ＣＭ−Ｌ３１Ｄ１１−ＧＡ２０１軽鎖１
配列番号７０ ＣＭ−Ｌ３１Ｄ１１−ＧＡ２０１軽鎖２
配列番号７１ Ｔｖ−Ｆ１３Ｂ５−ＧＡ２０１鎖１
配列番号７２ Ｔｖ−Ｆ１３Ｂ５−ＧＡ２０１鎖２
配列番号７３ Ｔｖ−Ｌ３１Ｄ１１−ＧＡ２０１鎖１
配列番号７４ Ｔｖ−Ｌ３１Ｄ１１−ＧＡ２０１鎖２
配列番号７５ ヒトＥＧＦＲ
配列番号７６ ヒトＩＧＦ−１Ｒ
配列番号７７ ヒトカッパー定常軽鎖領域
配列番号７８ ヒトラムダ定常軽鎖領域
配列番号７９ ヒト定常重鎖領域ＩｇＧ１（コーカサス人種アロタイプ）
配列番号８０ ヒト定常重鎖領域ＩｇＧ１（アフリカ系アメリカ人アロタイプ）
配列番号８１ ヒト定常重鎖領域ＩｇＧ４

ｂ）核酸配列：
配列番号８２ Ａｋ１８ＶＬ及びＶＨライブラリーのライブラリー鋳型（ｐＲＪＨ６１）
配列番号８３ ライブラリープライマー配列ＡＭ＿ＶＬ＿ＡＫ１８＿Ｌ１＿ｂａ
配列番号８４ ライブラリープライマー配列ＡＭ＿ＶＬ＿ＡＫ１８＿Ｌ２＿ｆｏ
配列番号８５ ライブラリープライマー配列ＡＭ＿ＶＨ＿ＡＫ１８＿Ｈ１＿ｂａ
配列番号８６ ライブラリープライマー配列ＡＭ＿ＶＨ＿ＡＫ１８＿Ｈ２＿ｆｏ

次の実施例、配列表及び図面は、本発明の理解を助けるために提供されており、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に表記されている。本発明の精神から逸脱することなく、表記された手順において修正を行ってよいことが理解される。

実験手順
実施例
材料及び方法
組換えＤＮＡ技法
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）に記載されている通り、標準方法を用いてＤＮＡを操作した。メーカーの説明書に従って、分子生物学的試薬を用いた。

ＤＮＡ及びタンパク質配列解析及び配列データ管理
ヒト免疫グロブリン軽及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国公衆衛生局（１９９１）ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１−３２４２において提示されている。抗体鎖のアミノ酸は、ＥＵ番号付け（Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ら、ＰＮＡＳ ６３（１９６９）７８〜８５；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国公衆衛生局（１９９１）ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１−３２４２）に従って番号付けされる。ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン州マディソン）のソフトウェアパッケージバージョン１０．２及びＩｎｆｏｍａｘのＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ ｓｕｉｔｅバージョン８．０を、配列作成、マッピング、解析、アノテーション及び図解に用いた。

ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ（ドイツ、バターステッテン）及びＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（ドイツ、レーゲンスブルク）において、二本鎖配列決定により決定された。

遺伝子合成
Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ（ドイツ、レーゲンスブルク）によって、合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から自動遺伝子合成により、所望の遺伝子セグメントを調製した。ｓｃＦｖ抗体断片のＣ末端付着を有する重又は軽鎖、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ変異を保有する「ノブ・イントゥ・ホール」抗体重鎖、並びに未改変のＶＨドメイン、交差性（ｃｒｏｓｓｅｄ）Ｃカッパードメイン又はｓｃＦａｂ抗体断片と組み合わせた、ＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ変異を保有する「ノブ・イントゥ・ホール」重鎖と共に、未改変の抗体軽鎖又はＣＨ１ドメイン交換軽鎖をコードする遺伝子セグメントは、唯一の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位（ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ−ＸｍｎＩ又はＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ）に隣接し、これをｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミドにクローニングした。形質転換細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光測定法により濃度を決定した。ＤＮＡ配列決定により、サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列を確認した。全コンストラクトは、真核生物の細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチド（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）をコードする５’端ＤＮＡ配列を有するよう設計した。

発現プラスミドの構築
抗体軽鎖をコードする発現プラスミドと共に、全「ノブ・イントゥ・ホール」重鎖の構築のためにＲｏｃｈｅ発現ベクターを用いた。ベクターは、次のエレメントで構成される：
− 選択マーカーとしてのハイグロマイシン抵抗性遺伝子、
− エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点、ｏｒｉＰ、
− 大腸菌における本プラスミドの複製を可能にする、ベクターｐＵＣ１８由来の複製起点、
− 大腸菌におけるアンピシリン抵抗性を与えるベータ−ラクタマーゼ遺伝子、
− ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来の最初期エンハンサー及びプロモーター、
− ヒト１−免疫グロブリンポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列及び
− 独自のＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限部位。

ｓｃＦｖ抗体断片のＣ末端付着を有する重又は軽鎖、未改変のＶＨドメイン、交差性Ｃカッパードメイン又はｓｃＦａｂ断片を有する「ノブ・イントゥ・ホール」重鎖と共に未改変の軽鎖又はＣＨ１ドメイン交換軽鎖を含む免疫グロブリン遺伝子を遺伝子合成により調製し、記載されているｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミドにクローニングした。合成ＤＮＡセグメントを保有するｐＧ１８（ａｍｐＲ）プラスミド及びＲｏｃｈｅ発現ベクターをＢａｍＨＩとＸｂａＩ、ＢａｍＨＩとＸｍｎＩ又はＢａｍＨＩとＫｐｎＩの制限酵素（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で消化し、アガロースゲル電気泳動に付した。次に、精製された、ｓｃＦｖ抗体断片のＣ末端付着を有する重又は軽鎖、「ノブ・イントゥ・ホール」重鎖及び未改変又はドメイン交換軽鎖をコードするＤＮＡセグメントを、単離されたＲｏｃｈｅ発現ベクターＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ／ＸｍｎＩ又はＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ断片にライゲーションして、最終発現ベクターを得た。最終発現ベクターを大腸菌細胞に形質転換し、発現プラスミドＤＮＡを単離し（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）、制限酵素解析及びＤＮＡ配列決定に付した。正しいクローンを１５０ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ培地において培養し、再度プラスミドＤＮＡを単離し（Ｍａｘｉｐｒｅｐ）、ＤＮＡ配列決定により配列整合性を確認した。

ＨＥＫ２９３細胞における二重特異性抗体の一過性発現
メーカーの説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）に従ったＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現系を用いたヒト胚性腎臓２９３−Ｆ細胞の一過性トランスフェクションにより、組換え二重特異性抗体を発現させた。簡単に説明すると、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地において３７℃／８％ＣＯ_２で、浮遊ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞を培養し、この細胞を、トランスフェクションの１日前に新鮮培地において１×１０^６生細胞／ｍｌの密度で播種した。トランスフェクションのため、２５０ｍｌの最終トランスフェクション容量において、１６２．５μｌの２９３−Ｆｒｅｅ（商標）トランスフェクション試薬（Ｍｅｒｃｋ、米国）及び１２５μｇのｓｃＦｖのＣ末端付着を有する重又は軽鎖をコードするＤＮＡをプラスミド比１：１で、又は「ノブ・イントゥ・ホール」重鎖１及び２並びに軽鎖プラスミドＤＮＡを１：２：１もしくは１：３：１モル比で用いて、１０ｍｌのダルベッコのＰＢＳ（ＰＡＡ、オーストリア）においてＤＮＡを調製した。Ｃｒｏｓｓ Ｍａｂのトランスフェクションのため、プラスミド比１：１：２：２又は１：１：３：２の「ノブ・イントゥ・ホール」重鎖１：未改変の軽鎖：Ｃカッパードメイン交換「ノブ・イントゥ・ホール」重鎖２：ＣＨ１ドメイン交換軽鎖を調製した。トランスフェクションの７日後に、抗体を含有する細胞培養物上清を、１４０００ｇ、３０分間の遠心分離により収集し、滅菌フィルター（０．２２μｍ）を通して濾過した。精製まで−２０℃で上清を貯蔵した。

二重特異性抗体の精製
ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ−セファロース（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）及びＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００分子ふるい（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）クロマトグラフィーを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、細胞培養物上清から二重特異性抗体を精製した。簡単に説明すると、滅菌濾過した細胞培養物上清を、ＰＢＳバッファー（１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ及び２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ樹脂において捕捉し、平衡化バッファーで洗浄し、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０で溶出した。溶出されたタンパク質画分をプールし、２Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０で中和し、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ２６／６０ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）カラムを用いた分子ふるいクロマトグラフィーにより更に精製した。ＣＥ−ＳＤＳ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、米国）により分子ふるいクロマトグラフィー画分を解析し、二重特異性抗体含有画分をプールし、−８０℃で貯蔵した。

精製されたタンパク質の解析
アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を測定することにより、精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度を決定した。マイクロ流体Ｌａｂｃｈｉｐ技術（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を用いたＣＥ−ＳＤＳにより、二重特異性及び対照抗体の純度、抗体整合性及び分子量を解析した。メーカーの説明書に従い、ＨＴタンパク質発現試薬キットを用いたＣＥ−ＳＤＳ解析のため、５μｌのタンパク質溶液を調製し、ＨＴタンパク質発現チップを用いたＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステムにおいて解析した。ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸソフトウェアバージョン３．０．６１８．０を用いてデータを解析した。２００ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、２５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．０ランニングバッファーにおいて２５℃で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００分析的分子ふるいカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）を用いた高速ＳＥＣにより、二重特異性及び対照抗体試料の凝集体含量を解析した。２５μｇのタンパク質をカラムに流速０．５ｍｌ／分で注射し、均一濃度で５０分間にわたり溶出した。ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いた酵素処理によるＮ−グリカンの除去後に、ＮａｎｏＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｑ−ＴＯＦ質量分析により、低下した二重特異性抗体軽及び重鎖のアミノ酸主鎖の整合性を検証した。

表面プラズモン共鳴
Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアにより、会合及び解離相の表面プラズモン共鳴シグナルの観察された時間経過を、二重参照（ｄｏｕｂｌｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｉｎｇ）（ｃ＝０ｎＭ及びＦＣ１＝ブランク表面に対する）あり、局所的バルク効果（ＲＩ＝０）なしでラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）１：１結合モデルと適合させることにより、標準動態を評価した。

ＭＡｂへのヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＩＧＦ−１Ｒの結合
チップＣ１における、メーカーの説明書に従った標準アミンカップリング；ランニングバッファーＨＢＳ−Ｎ、Ｔ＝２５℃、ＥＤＣ／ＮＨＳの混合物による活性化；カップリングバッファー１０ｎＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．５、ｃ＝１μｇ／ｍＬにおいて抗ｈｕＦｃ捕捉抗体を希釈し、プログラムされた標的レベル２００ＲＵ（ＦＣ１〜ＦＣ４における実際の固定化レベル、ほぼ１８９〜１９５ＲＵ）によりカップリングした；最後に、残りの活性化カルボキシル基を、１Ｍエタノールアミンの注射により遮断した。ＰＢＳＴ＋０．１％ＢＳＡにおいて１．３ｎＭになるよう二重特異性又は親抗体を希釈し、別々のサイクルにおいて、１０μｌ／分、３０秒間の注射によりリガンドとして捕捉した。捕捉レベル５．４〜９．２ＲＵ。ＦＣ２〜４において１ラン当たり３種のＭＡｂ、ＦＣ１は参照として捕捉抗体のみ。分析物としてヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＩＧＦ−１Ｒ結合の動態を３７℃、ランニングバッファーＰＢＳＴで測定した。一連の３倍増加濃度（ＰＢＳＴ＋０．１％ＢＳＡにおける１．６５〜４００ｎＭ）において、流速５０μｌ／分、１２０秒間の会合、６００秒間の解離で分析物を注射した。１０ｍＭグリシンｐＨ１．７５／３０μｌ／分を６０秒間による各サイクルの後に、捕捉抗体を再生した。

ＭＡｂへのヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＥＧＦＲの結合
チップＣＭ５における、メーカーの説明書に従った標準アミンカップリング；ランニングバッファーＨＢＳ−Ｎ、Ｔ＝２５℃、ＥＤＣ／ＮＨＳの混合物による活性化；カップリングバッファー１０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．５、ｃ＝４μｇ／ｍＬにおいて抗ｈｕＦｃ捕捉抗体を希釈し、プログラムされた標的レベル１０００ＲＵ（ＦＣ１〜ＦＣ４における実際の固定化レベル、ほぼ１１７０〜１２６０ＲＵ）によりカップリングした；最後に、残りの活性化カルボキシル基を、１Ｍエタノールアミンの注射により遮断した。ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡにおいて１０ｎＭになるよう二重特異性又は親抗体を希釈し、別々のサイクルにおいて、１０μｌ／分、３０秒間の注射によりリガンドとして捕捉した。捕捉レベル１５〜７９ＲＵ。ＦＣ２〜４において１ラン当たり３種のＭＡｂ、ＦＣ１は参照として捕捉抗体のみ。分析物として単量体ヒトＨＥＲ１−ＥＣＤ及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＥＧＦＲ結合の動態を３７℃、ランニングバッファーＰＢＳで測定した。一連の３倍増加濃度（ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡにおける４．１２〜１０００ｎＭ）において、流速５０μｌ／分、１２０秒間の会合、１２００秒間の解離で分析物を注射した。１０ｍＭグリシンｐＨ１．７５／３０μｌ／分を６０秒間による各サイクルの後に、捕捉抗体を再生した。

ＭＡｂへのヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＦｃｇＲＩＩＩａの結合
チップＣ１における、メーカーの説明書に従った標準アミンカップリング；ランニングバッファーＨＢＳ−Ｎ、Ｔ＝２５℃、ＥＤＣ／ＮＨＳの混合物による活性化；カップリングバッファー１０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．５、ｃ＝３０μｇ／ｍＬにおいて単量体ｈｕＨＥＲ１−ＥＣＤを希釈し、プログラムされた標的レベル４００ＲＵ（ＦＣ１〜ＦＣ４における実際の固定化レベル、ほぼ３９０〜４４５ＲＵ）によりカップリングした；最後に、残りの活性化カルボキシル基を、１Ｍエタノールアミンの注射により遮断した。ＰＢＳＴ＋０．１％ＢＳＡにおいて２０ｎＭになるよう二重特異性又は親抗体を希釈し、別々のサイクルにおいて、１０μｌ／分、６０秒間の注射によりリガンドとして捕捉した。ＦＣ２〜４において３種のＭＡｂ、ＦＣ１は参照として捕捉抗体のみ。分析物としてヒトＦｃｇＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）、ｈｕＦｃｇＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＦｃｇＲＩＩＩａ結合の動態を２５℃、ランニングバッファーＰＢＳＴで測定した。一連の３倍増加濃度（ＰＢＳＴ＋０．１％ＢＳＡにおける２．７４〜２０００ｎＭ）において、流速５０μｌ／分、１８０秒間の会合、９００秒間の解離で分析物を注射した。１５ｍＭ ＮａＯＨ／５０μｌ／分を６０秒間、続いて１８０秒間の安定化期間による各サイクルの後に、遊離ＨＥＲ１−ＥＣＤを再生した。ラングミュア１：１適合解析に加えて、分析物濃度の関数としてのＲ（平衡）から定常状態親和性を計算した。

ＭＡｂへのｈｕＥＧＦＲ及びｈｕＩＧＦ−１Ｒの同時結合
チップＣ１における、メーカーの説明書に従った標準アミンカップリング；ランニングバッファーＨＢＳ−Ｎ、Ｔ＝２５℃、ＥＤＣ／ＮＨＳの混合物による活性化；カップリングバッファー１０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０、ｃ＝５０μｇ／ｍＬにおいて抗ｈｕＦＡＢ捕捉抗体を希釈し、プログラムされた標的レベル１０００ＲＵ（ＦＣ１〜ＦＣ４における実際の固定化レベル、ほぼ９５５〜１０４０ＲＵ）によりカップリングした；最後に、残りの活性化カルボキシル基を、１Ｍエタノールアミンの注射により遮断した。ＰＢＳＴ＋０．１％ＢＳＡにおいて２０ｎＭになるよう二重特異性抗体を希釈し、別々のサイクルにおいて、１０μｌ／分、６０秒間の注射によりリガンドとして捕捉した。１ラン当たりＦＣ２〜４における３種のＭＡｂ、ＦＣ１は参照として捕捉抗体のみ。２５℃、ランニングバッファーＰＢＳＴにおいて、分析物としてヒトＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒの結合を測定した。ＰＢＳＴ＋０．１％ＢＳＡにおける４００ｎＭの濃度、流速３０μｌ／分、１８０秒間の会合、６００秒間の解離による「二重注射」モードで分析物を継続的に注射した。対照としてのブランクバッファー注射を包含する異なるサイクルにおいて受容体の順序を並べ替えた。１０ｍＭグリシンｐＨ２．１／３０μｌ／分を６０秒間による各サイクルの後に、捕捉抗体を再生した。

抗ＩＧＦ−１Ｒ ＨＵＭＡＢクローン１８（Ａｋ１８）に基づく親和性成熟化ライブラリーの構築
続くファージディスプレイ選択を可能にするファージミドベクターにクローニングされた＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８（ＤＳＭ ＡＣＣ２５８７；国際公開第２００５／００５６３５号、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞クローン１８、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＡＫ１８と省略、配列番号９〜１６の配列を参照）のＦａｂ断片に基づき、親和性成熟化ライブラリーを構築した。より正確には、それぞれ軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１（Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従った残基３０、３１、３２、３４）及びＣＤＲ２（残基５０、５１、５２、５３）におけるランダム化位置（Ａｋ１８ ＶＬライブラリー）並びに重鎖可変ドメインのＣＤＲ１（残基３１、３２、３３、３４、３５）及びＣＤＲ２（残基５０、５２、５３、５４、５６、５８）におけるランダム化位置（Ａｋ１８ ＶＨライブラリー）を有する、２種のサブライブラリーを構築した。ランダム化可変ドメインは、ＣＤＲ１にわたるランダム化リバースプライマー及びＣＤＲ２にわたるランダム化フォワードプライマーを用いることにより別々にＰＣＲ増幅した。これらをそれぞれの外側プライマーと組み合わせて、Ｖ−ドメインにつき２種のＰＣＲ断片を作製し、続いてライブラリープライマーの５’端の定常部分における配列相同性により集合させた（例えば、リバースプライマーＡＭ＿ＶＬ＿ＡＫ１８＿Ｌ１＿ｂａは、フォワードプライマーＡＭ＿ＶＬ＿ＡＫ１８＿Ｌ２＿ｆｏにアニーリングする）。それぞれの外側プライマーの添加により集合産物を増幅させ、それぞれＮｃｏＩ／ＢｓｉＷＩ（Ａｋ１８ ＶＬライブラリー）及びＡｓｃＩ／ＳａｃＩＩ（Ａｋ１８ ＶＨライブラリー）で消化し、同様に消化したアクセプターベクターにクローニングした。エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌ＴＧ１への、１種のサブライブラリー当たりほぼ６０種の形質転換のため、精製したライゲーション産物を用いて、Ａｋ１８ ＶＬライブラリーは１．４×１０１０、Ａｋ１８ ＶＨライブラリーは８．７×１０９の最終ライブラリーサイズの、それぞれ６５．３％及び７３％の機能的クローンを得た。Ｆａｂライブラリーを提示するファージミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿により精製して、選択に用いた。

親ｍＡｂ Ａｋ１８に由来する親和性成熟した抗ＩＧＦ−１Ｒ ｍＡｂの選択
Ａｋ１８ ＶＬ及びＶＨライブラリーファージのプールを用いて、ヒト及び／又はカニクイザルＩＧＦ−１Ｒの細胞外ドメインに対する選択を行った。３種の異なる選択戦略を行った：１．続くバイオパニングのラウンドにわたる抗原濃度の減少（第１の選択ラウンドにおける１０ｎＭから、第３〜５の選択ラウンドにおける０．８ｎＭへの下降に及ぶ）、２．結合反応への１０倍抗原濃度における親ＩｇＧ Ａｋ１８の添加による又は１μＭ非ビオチン化ヒトＩＧＦ−１Ｒの添加（標的としてビオチン化カニクイザルＩＧＦ−１Ｒが用いられたラウンドのみ）による競合選択、あるいは３．ファージ−抗体：抗原複合体を３時間又は３日間解離させることによる、オフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）選択。続く選択ラウンドにおいてヒトのみ又はカニクイザルのみのＩＧＦ−１Ｒを用いる、あるいはこれら２種を交替させて１種のみに向けた親和性成熟化を回避することにより、選択を行った。ＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６を用いたＳＰＲにより、バイオパニングラウンド２〜５の選択アウトプットをスクリーニングして、親Ａｋ１８と比較してより優れた動態速度定数及び親和性を有するクローンを同定した。選択されたクローンのＶＬ及びＶＨ配列を下の表１に示す。

ＳＰＲ（ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６）による選択アウトプットのスクリーニング
Ｆａｂ断片の捕捉方法を適用した、２５℃におけるＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（ＢｉｏＲａｄ）機器を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、親和性成熟したクローンの動態速度定数ｋｏｎ及びｋｏｆｆ並びに親和性（ＫＤ）を測定した。簡単に説明すると、ＥＤＣ及びＳＮＨＳの新たに調製した混合物により全チャネルを５分間同時に活性化し、次に、１０ｍＭ酢酸ＮａバッファーｐＨ５．０における２４ｕｇ／ｍｌの抗Ｆａｂを５分間注射することにより、抗Ｆａｂ捕捉抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１０９−００５−００６）を高レベル（９．０００〜１０．０００ＲＵ）で３０ｕｌ／分にて、ＧＬＭチップの別々の垂直チャネルに固定化した。エタノールアミンの５分間の注射を用いて、チャネルを遮断した。垂直チャネルに沿って１００秒間３０ｕｌ／分にて、細菌培養物上清から、あるいは精製タンパク質調製物から、親和性成熟したクローンのＦａｂ断片を捕捉して、ほぼ２５０ＲＵのリガンド密度を達成した。ワンショット動態アッセイセットアップ（ＯＳＫ）において、水平チャネルに沿って５０ｕｌ／分、会合時間２００秒間、解離時間６００秒間、３３〜０．４ｎＭに及ぶ３倍希釈系列において、ヒト又はカニクイザルＩＧＦ−１Ｒを分析物として注射した。第６のチャネルに沿ってランニングバッファー（ＰＢＳＴ）を注射して、参照のための「インライン（ｉｎ−ｌｉｎｅ）」ブランクを得た。会合及び解離センサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）を同時に適合させることにより、単純な１：１ラングミュア結合モデル（ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアバージョン２．１）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を計算した。ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として平衡解離定数（ＫＤ）を計算した。結果を下の表２に示す。

Ａｋ１８ ＶＬ及びＶＨライブラリーのためのライブラリー鋳型（ｐＲＪＨ６１）（配列番号８２）
（即ち、ＰｅｌＢリーダー配列＋ＶＬ Ａｋ１８＋ｃ−ｍｙｃ及び軽鎖のためのＦＬＡＧタグ及びＰｅｌＢを包含するＣＬ定常ドメイン＋ＶＨ Ａｋ１８＋重鎖のためのＨｉｓ６タグを包含するＣＨ１定常ドメインを含む領域をコードする完全Ｆａｂ）
ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCC
ATGGCCGAAATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAACCCTGAGCCTGAGTCCGGGTGAACGT
GCAACCCTGTCTTGTCGTGCAAGCCAGAGCGTTAGTAGCTACCTGGCCTGGTATCAGCAG
AAACCGGGTCAGGCACCGCGTCTGCTGATTTATGATGCATCCAAGCGTGCAACCGGTATT
CCGGCACGTTTTAGCGGTAGCGGATCCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTG
GAACCGGAAGATTTTGCCGTTTATTATTGTCAGCAGCGTAGCAAATGGCCTCCGTGGACC
TTTGGTCAGGGCACCAAAGTTGAAAGCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC
TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAAT
AACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGT
AACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGC
ACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACC
CATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGCCGCA
GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGAGCCGCAGACTACAAGGACGACGAC
GACAAGGGTGCCGCATAATAAGGCGCGCCAATTCTATTTCAAGGAGACAGTCATATGAAA
TACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCC
CAGGTTGAACTGGTTGAAAGCGGTGGTGGTGTTGTTCAGCCTGGTCGTAGCCAGCGTCTG
AGCTGTGCAGCATCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGGCATGCACTGGGTTCGTCAGGCA
CCGGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCAATTATTTGGTTTGATGGAAGCAGTACCTACTAT
GCAGATAGCGTTCGTGGTCGTTTTACCATTAGCCGTGATAATAGCAAAAACACCCTGTAT
CTGCAGATGAATAGCCTGCGTGCAGAAGATACCGCAGTTTATTTTTGTGCACGTGAACTG
GGTCGTCGTTATTTTGATCTGTGGGGTCGTGGCACCCTGGTTAGCGTTAGCAGCGCTAGC
ACCAAAGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACA
GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAAC
TCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC
TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATC
TGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCT
TGTGACGCGGCCGCAAGCACTAGTGCCCATCACCATCACCATCACGCCGCGGCATAG

ライブラリープライマー配列
ＡＭ＿ＶＬ＿ＡＫ１８＿Ｌ１＿ｂａ（配列番号８３）
TCAGCAGACGCGGTGCCTGACCCGGTTTCTGCTGATACCA GGC CAG ATA GCT GCT AACGCTCTGGCTTGCACGACAAGACAGG
1 2 3 4
１ ６０％鋳型塩基＋４０％Ｎ／＋４０％Ｋ／＋４０％Ｍ
２ ７０％鋳型塩基＋３０％Ｎ／＋３０％Ｍ
３ ６０％鋳型塩基＋４０％Ｎ／＋４０％Ｍ
４ ６０％鋳型塩基＋４０％Ｎ／＋４０％Ｍ

ＡＭ＿ＶＬ＿ＡＫ１８＿Ｌ２＿ｆｏ（配列番号８４）
CAGAAACCGGGTCAGGCACCGCGTCTGCTGATTTAT GAT GCG AGC AAA CGTGCAACCGGTATTCCGGCACGTTTTAG
1 2 3 4
１ ６０％鋳型塩基＋４０％Ｎ／＋４０％Ｋ
２ １００％鋳型塩基／７０％鋳型＋３０％Ｇ
３ １００％鋳型塩基／７０％鋳型＋３０％Ｃ
４ ６０％鋳型塩基＋４０％Ｎ／＋４０％Ｖ／＋４０％Ｋ

ＡＭ＿ＶＨ＿ＡＫ１８＿Ｈ１＿ｂａ（配列番号８５）
CAACCCATTCCAGACCTTTACCCGGTGCCTGACGAACCCA ATG CAT ACC ATA AGA GCTAAAGGTAAATCCGGATGCTG
1 2 3 4 5
１ ６０％鋳型塩基＋４０％Ｎ
２ １００％鋳型塩基／６０％Ｃ＋４０％Ａ
３ ６０％鋳型塩基＋４０％Ｎ／＋４０％Ｍ
４ ６０％鋳型塩基＋４０％Ｎ／＋４０％Ｍ
５ ６０％鋳型塩基＋４０％Ｎ／＋４０％Ｂ

ＡＭ＿ＶＨ＿ＡＫ１８＿Ｈ２＿ｆｏ（配列番号８６）
AGGCACCGGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCA ATT ATT TGG TTT GAT GGC AGC
1 2 3 4
TCT ACC TAT TATGCAGATAGCGTTCGTGGTC
5 6
１ ６０％鋳型塩基＋４０％Ｎ／＋４０％Ｋ
２ ６０％鋳型塩基＋４０％Ｎ／＋４０％Ｋ
３ ６０％鋳型塩基＋４０％Ｒ／＋４０％Ｖ／＋４０％Ｋ
４ ６０％鋳型塩基＋４０％Ｎ／＋４０％Ｖ／＋４０％Ｋ
５ ６０％鋳型塩基＋４０％Ｎ／＋４０％Ｋ
６ ６０％鋳型塩基＋４０％Ｎ／＋４０％Ｋ

ＩＵＰＡＣは、ヌクレオチドの記号を命名した。５種の（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ／Ｕ）塩基を別として、多くの場合、特にＰＣＲプライマーを設計するために縮重塩基が用いられる。これらのヌクレオチドコードをここに収載する。

ＩＵＰＡＣヌクレオチドコード 塩基
Ａ アデニン
Ｃ シトシン
Ｇ グアニン
Ｔ（又はＵ） チミン（又はウラシル）
Ｒ Ａ又はＧ
Ｙ Ｃ又はＴ（Ｕ）
Ｓ Ｇ又はＣ
Ｗ Ａ又はＴ（Ｕ）
Ｍ Ａ又はＣ
Ｂ Ｃ又はＧ又はＴ（Ｕ）
Ｄ Ａ又はＧ又はＴ（Ｕ）
Ｈ Ａ又はＣ又はＴ（Ｕ）
Ｖ Ａ又はＣ又はＧ
Ｎ 任意の塩基

＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗原結合部位の上述の親和性成熟化と、続く選択は、１０倍増加した＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗原結合部位の結合親和性ＫＤ値を有する抗体を含む、次の＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗原結合部位をもたらした。

表1:親和性成熟した<IGF-1R>抗原結合部位及び親AK18の可変軽鎖ドメイン(VL)及び可変重鎖ドメイン(VH)のアミノ酸配列

表2:親AK18と比較したCDR改変抗体の<IGF-1R>抗原結合部位のヒトIGF-1Rに対する結合親和性と、結合親和性のx倍増加(KD(未改変=親)/KD(改変）の比として計算）

表3:AK18の親の未改変CDRと比較して少なくとも10倍増加した結合親和性を有する、<IGF-1R>抗原結合部位のCDRにおける改変(<IGF-1R>HUMABクローン18、配列番号9〜14の配列を参照)

*=欠失

二重特異性、二価＜ＩＧＦ−１Ｒ − ＥＧＦＲ＞抗体分子の発現＆精製

表4:二重特異性、二価<IGF-1R - EGFR>抗体分子の概要

上述の材料と方法に記載されている手順に従い、二重特異性、二価＜ＩＧＦ−１Ｒ／ＥＧＦＲ＞抗体分子ＯＡ−Ｆ１３Ｂ５−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１、ＯＡ−Ｌ３１Ｄ１１−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１、ＣＭ−Ｆ１３Ｂ５−ＧＡ２０１、ＣＭ−Ｌ３１Ｄ１１−ＧＡ２０１、Ｔｖ−Ｆ１３Ｂ５−ＧＡ２０１及びＴｖ−Ｌ３１Ｄ１１−ＧＡ２０１を、ＨＥｋ２９３細胞において一過的に発現させ、同種的となるよう精製した。

二重特異性抗体は、ａ）＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｆ１３Ｂ５（配列番号１７〜２４）又は＜ＩＧＦ−１Ｒ＞Ｌ３１Ｄ１１（配列番号４１〜４８）（両者共に親和性成熟されたＨＵＭＡＢ＜ＩＧＦ−１Ｒ＞クローン１８抗体である）及びｂ）ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２（配列番号１〜８；国際公開第２００６／０８２５１５号を参照、＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２と省略）の抗原結合部位に基づく。全二重特異性抗体の発現は、ウエスタンブロットにより確認した。細胞培養物上清のプロテインＡ精製の後、全コンストラクトは、分析的ＳＥＣにより検出された予想分子量を有する７０〜９８％の間の二重特異性抗体を示した。ＳＥＣ精製の後、全コンストラクトは、分析的ＳＥＣにより検出された＞９７％同種単量体と、Ｃａｌｉｐｅｒ解析における８４〜９５％の間の生成物純度を示した。

結合及び他の特性は、記載されている通りに決定した。

二重特異性、二価＜ＩＧＦ−１Ｒ − ＥＧＦＲ＞抗体分子Ｔｖ−Ｆ１３Ｂ５−ＧＡ２０１及びＴｖ−Ｌ３１Ｄ１１−ＧＡ２０１（配列番号７１〜７４に示す関連する軽及び重鎖アミノ酸配列を有する）は、類似的に発現及び精製することができる。

二重特異性抗体の安定性
変性温度（ＳＹＰＲＯオレンジ法）
タンパク質変性（即ち、温度誘導性のタンパク質構造損失）が起こる温度を決定するため、疎水性環境において強い蛍光を提示する疎水性蛍光色素（ＳＹＰＲＯオレンジ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に頼った方法を用いた。タンパク質が変性すると、疎水性パッチは溶媒に曝露されるようになり、蛍光の増加をもたらす。変性温度を上回る温度においては、蛍光強度は再び減少し、従って、最大強度に達する温度が変性温度として定義される。この方法は、Ｅｒｉｃｓｓｏｎ，Ｕ．Ｂ．ら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３５７（２００６）２８９〜２９８及びＨｅ，Ｆ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９９（２０１０）１７０７〜１７２０により記載されている。

２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨｉｓＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０におけるおよそ１ｍｇ／ｍＬ濃度のタンパク質試料を、１：５０００の最終希釈に達するようＳＹＰＲＯオレンジ（５０００×ストック溶液）と混合した。２０μＬの容量を、３８４ウェルプレートに移し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において、０．３６℃／分の加熱速度（ｈｅａｔ ｒａｔｅ）で温度依存性蛍光を記録した。

動的光散乱法（ＤＬＳ）による凝集温度
動的光散乱法（ＤＬＳ）により、熱的に誘導されたタンパク質凝集が起こる温度を決定した。ＤＬＳは、マイクロ秒スケールの散乱光強度のゆらぎに由来する、溶液における巨大分子のサイズ分布に関する情報をもたらす。試料を徐々に加熱すると、一定の温度で凝集が始まり、成長する粒子サイズを生じる。粒子サイズが増加し始める温度が、凝集温度として定義される。変性は、必ずしも凝集に必須でない場合もあるため、凝集及び変性温度は、必ずしも同一である必要はない。

凝集温度測定のため、ＤｙｎａＰｒｏ ＤＬＳプレートリーダー（Ｗｙａｔｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。測定に先立ち、３８４ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ３８４ウェル濾過システム、０．４５μｍ）を通して試料を濾過し、光学３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３５４０）に入れた。製剤バッファー（２０ｍＭクエン酸塩、１８０ｍＭスクロース、２０ｍＭアルギニン、０．０２％ポリソルベート２０）におけるおよそ１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度の試料容量３５μＬを用いた。各ウェルを２０μＬのパラフィンオイル（Ｓｉｇｍａ）で覆って、蒸発を回避した。試料を０．０５℃／分の速度で２５℃から８０℃へと加熱し、１ラン当たり１５試料の最大数で、ＤＬＳデータを持続的に取得した。

ＤＬＳ当たりの凝集速度
凝集体は、強い光散乱シグナルを生じるため、ＤＬＳは、溶液における巨大分子の凝集体を検出するための高感度の方法である。従って、分子が凝集する傾向は、ＤＬＳデータの反復的取得により経時的に追跡することができる。潜在的な凝集を実際的な速度へと加速するため、５０℃で測定を行った。

上述の通りに試料調製を行った。ＤＬＳデータは、最大１００時間記録した。経時的な平均直径の線形適合の傾きとして、凝集速度（ｎｍ／日）を計算した。

製剤バッファーにおける安定性
凝集／断片化に関連するその安定性に関して二重特異性分子を評価するため、製剤バッファー（２０ｍＭクエン酸塩、１８０ｍＭスクロース、２０ｍＭアルギニン、０．０２％ポリソルベート２０）においておよそ１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、試料を４０℃で３週間インキュベートした。対照試料を３週間−８０℃で貯蔵した。

凝集体及び低分子量（ＬＭＷ）種の定量化のための分子ふるいクロマトグラフィーをＨＰＬＣにより行った。Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ ＨＰＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ）において、２５〜１００μｇの量のタンパク質を、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．５においてＴｏｓｏｈ ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬカラムにアプライした。２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度により、溶出されたタンパク質を定量化した。

ＩＧＦ−１Ｒ親和性成熟化した二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体、ＯＡ−Ｆ１３Ｂ５−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１及びＯＡ−Ｌ３１Ｄ１１−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１は、未改変のＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１（データ図示せず）と比較して、明瞭に改善された安定性を示す。

両抗原との二重特異性抗体の同時結合
材料と方法における上述の通りＢＩＡｃｏｒｅにより、二重特異性抗体の同時結合を解析した。

二重特異性ＯＡ−Ｆ１３Ｂ５−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１は、ヒトＥＧＦＲ及びヒトＩＧＦ−１Ｒとの同時結合を示した（データ図示せず）。

二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体によるＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒのシグナル伝達経路の阻害
新たな親和性成熟化された二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体、ＯＡ−Ｆ１３Ｂ５−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１及びＯＡ−Ｌ３１Ｄ１１−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１の潜在的な阻害活性を評価するため、未改変の＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８（ＡＫ１８）に基づく類似的に構築された二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体、ＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１と比較して、異なる比率のＩＧＦ−１Ｒ及びＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞において、両経路に向かうシグナル伝達の阻害の程度を解析した。Ａ５４９及びＢｘＰＣ３細胞は、ＩＧＦ−１Ｒ及びＥＧＦＲの両方を発現するが、ＴＣ−７１細胞は、ＩＧＦ−１Ｒのみを発現する。

１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミンを補充した培養培地におけるヒト腫瘍細胞（Ａ５４９、ＢｘＰＣ３又はＴＣ−７１、３×１０^４細胞／ウェル）を、９６ウェルマイクロタイタープレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩培養した。培地を慎重に除去し、１００μｌの無血清培養培地（１ｍｇ／ｍｌ ＲＳＡ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐを補充）に置き換え、３７℃、５％ＣＯ２で少なくとも２．０時間インキュベートした。培地を再度慎重に除去し、５０μｌ／ウェルの、無血清培養培地における二重特異性抗体及び対照抗体の系列希釈（濃度４００ｎＭ、希釈ステップ１：４）に置き換え、続いて、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベーションした。５０μｌ／ウェルのＩＧＦ−１（１０ｎＭ）又はＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）（無血清培養培地において希釈）の添加により、細胞を刺激し、３７℃、５％ＣＯ２で１０分間インキュベートした。培地を慎重に除去し、細胞を１００μｌ／ウェルの氷冷ＰＢＳで１回洗浄した。１００μｌ／ウェルのＢｉｏＲａｄ細胞溶解バッファー（ＢｉｏＲａｄ細胞溶解キット（ＢｉｏＲａｄ Ｃａｔ＃１７１−３０４０１２）の添加により、細胞を溶解した。プレートをさらなる解析まで−２０℃で貯蔵した。５００ｇ５分間の遠心分離によりＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＨＴＳ−フィルタープレートを通して細胞ライセートを濾過することにより、細胞デブリを除去した。濾過された細胞ライセートにおけるＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒリン酸化を、ＥＧＦＲリン酸化の解析のためのＰ−ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ）ビーズキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃａｔ．＃４６−６０３）及びＩＧＦ−１Ｒリン酸化の解析のためのＰ−ＩＧＦ−１Ｒ（Ｔｙｒ１１３１）ビーズキット（ＢｉｏＲａｄ Ｃａｔ．＃１７１Ｖ２７３４３）を用いたＬｕｍｉｎｅｘシステムにより解析した。リン酸化タンパク質検出試薬キット（ＢｉｏＲａｄ Ｃａｔ．＃１７１−３０４００４）を用いて、ＢｉｏＰｌｅｘリン酸化タンパク質検出マニュアル（ＢｉｏＲａｄ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ＃２９０３）に記載されている通りにＬｕｍｉｎｅｘアッセイを行った。

ＩＧＦ−１Ｒ親和性成熟化された二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体、ＯＡ−Ｆ１３Ｂ５−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１及びＯＡ−Ｌ３１Ｄ１１−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１は、ＩＧＦ−１Ｒ及びＥＧＦＲ（＜１ｎＭ）のリン酸化を有効に阻害する（表５及び表６を参照）。ＩＧＦ−１Ｒ阻害の効力は、未改変のＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１と比較して、顕著に増加される（Ａ５４９：２〜４×；ＢｘＰＣ３：２〜６×；ＴＣ−７１：２５〜５０×）。

表5:IC50値IGF-1Rリン酸化アッセイ

表6:IC50値EGFRリン酸化アッセイ

二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体による３Ｄ培養におけるＡ５４９及びＲＤ−ＥＳ癌細胞の増殖阻害
二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体、ＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１は、ＩＧＦ−１Ｒ及び／又はＥＧＦＲを発現する癌細胞株の成長を阻害する。

癌細胞株の細胞増殖アッセイにおける親和性成熟化された二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体、ＯＡ−Ｆ１３Ｂ５−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１及びＯＡ−Ｌ３１Ｄ１１−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１の潜在的な阻害活性を評価するため、Ａ５４９癌細胞（ＥＧＦＲとＩＧＦ−１Ｒを発現する）及びＲＤ−ＥＳ癌細胞（ＩＧＦ−１Ｒを発現する）における阻害の程度を解析した。

１０％ＦＢＳ（ＰＡＡ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、ドイツ、ダルムシュタット）、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）及び２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ、ドイツ、シュタインハイム）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＰＡＡ、オーストリア、パスチング（Ｐａｓｃｈｉｎｇ））において、ヒト腫瘍細胞（Ａ５４９又はＲＤ−ＥＳ）を培養した。１０００細胞／ウェル（Ａ４５９ ＲＤ−ＥＳ）を、培養培地を含有する９６ウェルのポリＨＥＭＡ（ポリ（２−メタクリル酸ヒドロキシエチル）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ペンシルベニア州ウォリントン））コーティングしたプレートに播種した。同時に、異なる濃度の二重特異性抗体又は対照抗体を添加し、７日間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン）アッセイを用いて、メーカーの説明書に従って細胞のＡＴＰ含量を測定することにより、細胞生存率を検出する。

結果を図１ａ及び図１ｂ並びに表７に示す。二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体、ＯＡ−Ｆ１３Ｂ５−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１及びＯＡ−Ｌ３１Ｄ１１−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１は、Ａ５４９及びＲＤ−ＥＳ細胞の細胞増殖を有効に阻害する（＜１ｎＭ）。親和性成熟化されていない未改変の二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体、ＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１と比較すると、本発明に係る親和性成熟化された二重特異性抗体、ＯＡ−Ｆ１３Ｂ５−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１及びＯＡ−Ｌ３１Ｄ１１−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１の効力は、顕著に増加される（Ａ５４９は３〜５×、ＲＤ−ＥＳはほぼ２０×）（表７を参照）。

表7:IC50値3D増殖アッセイ

異なるＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒ発現を有する細胞への二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の結合
二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体、ＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１は、ＩＧＦ−１Ｒ及び／又はＥＧＦＲを発現する細胞に結合する。

ヒト腫瘍細胞への親和性成熟化された二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体、ＯＡ−Ｆ１３Ｂ５−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１及びＯＡ−Ｌ３１Ｄ１１−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１の潜在的な結合を評価するため、異なるＩＧＦ−１Ｒ／ＥＧＦＲ発現比を有する細胞において、競合結合アッセイを行った。

氷冷バッファー（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ）において希釈したヒト腫瘍細胞（Ａ５４９又はＴＣ−７１、２×１０５細胞／ウェル）を、９６ウェルマイクロタイタープレートにおける、標識された単一特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体Ｒ１５０７（最終濃度１μｇ／ｍｌ）及び異なる濃度の未標識ＩＧＦ１Ｒ−ＥＧＦＲ二重特異性抗体の混合物又は対照としての未標識の単一特異性抗体もしくはＦａｂ断片（最終滴定範囲１００〜０．００２μｇ／ｍｌ）に添加した。この混合物を氷上で４５分間インキュベートした。１５０〜２００μｌのバッファー（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ）の添加と、続く遠心分離（３００ｇ；５分間、４℃）により、細胞を２回洗浄した。次に、６．２５μｌ／ｍｌの７−ＡＡＤ（ＢＤ＃５５９９２５）を含有する２００μｌの固定バッファー（１×ＣｅｌｌＦｉｘ、ＢＤ＃３４０１８１）に細胞を再懸濁し、氷上で１０〜２０分間インキュベートして、固定及び死細胞における７−ＡＡＤの浸透を行った。ＦＡＣＳにより試料の蛍光シグナルを解析し、ＩＣ５０値を計算した。

対＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８の競合結合解析の結果（ＩＣ５０値）を表８に示す。ＩＧＦ−１Ｒ及びＥＧＦＲの両方を発現するＡ５４９腫瘍細胞において、親和性成熟化された二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体、ＯＡ−Ｆ１３Ｂ５−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１及びＯＡ−Ｌ３１Ｄ１１−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１の結合は、二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体、ＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂよりも僅かに優れていた（ほぼ２×）。ＩＧＦ−１Ｒを発現するがＥＧＦＲを発現しないＴＣ−７１腫瘍細胞において、親和性成熟化された二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体、ＯＡ−Ｆ１３Ｂ５−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１及びＯＡ−Ｌ３１Ｄ１１−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１の結合は、二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体、ＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂと比較して強く増強された（１０〜２５×）。ＩＧＦ−１Ｒのみが発現されＥＧＦＲが発現されないこの設定において、１＋１二重特異性抗体は、一方の結合腕でＩＧＦ−１Ｒに結合することしかできず、よって、ＩＧＦ−１Ｒ親和性における差は、より重大となったと思われる。

表8:IC50値細胞結合アッセイ

二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の糖鎖工学的に操作された誘導体の調製
リン酸カルシウムトランスフェクションアプローチを用いて、哺乳類抗体重及び軽鎖発現ベクターをＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時トランスフェクトすることにより、二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の糖鎖工学的に操作された誘導体を産生した。指数関数的に増殖しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞をリン酸カルシウム方法によりトランスフェクトした。糖鎖工学的に操作された抗体の産生のため、それぞれ融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現のためのプラスミド及びマンノシダーゼＩＩ発現のための第２のプラスミドを細胞に同時トランスフェクトした。上述の材料と方法の節に記載されているプラスミド比の二重特異性抗体を添加した。１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ培養培地を用いて、細胞をＴフラスコにおいて接着単層培養物として育成し、５０〜８０％の間のコンフルエントになったときにトランスフェクトした。Ｔ７５フラスコのトランスフェクションのため、トランスフェクション２４時間前に、ＦＣＳ（１０％Ｖ／Ｖ最終）、（最終的に２５０μｇ／ｍｌネオマイシン）を補充した約１４ｍｌのＤＭＥＭ培養培地において、７５０（から８００）万個の細胞を播種し、細胞をインキュベーターにおける３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下に一晩置いた。トランスフェクトするＴ７５フラスコ毎に、４７μｇの総プラスミドベクターＤＮＡ、２３５μｌの１Ｍ ＣａＣｌ２溶液を混合し、最終容量４６９μｌとなるまで水を添加することにより、ＤＮＡ、ＣａＣｌ２及び水の溶液を調製した。この溶液に、４６９μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４溶液、ｐＨ７．０５を添加し、直ちに１０秒間混合し、室温で２０秒間放置した。この懸濁液を、２％ＦＣＳを補充した約１２ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、既に存在する培地に代えてＴ７５に添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で約１７〜２０時間インキュベートし、次に、培地を約１２ｍｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳに置き換えた。トランスフェクション５〜７日後に馴化培養培地を収集し、５分間２１０〜３００＊ｇで遠心分離し、０．２２μｍフィルターを通して滅菌濾過し（あるいは、５分間１２００ｒｐｍで遠心分離し、続いて１０分間４０００ｒｐｍで２回目の遠心分離を行う）、４℃で維持した。

糖鎖工学的に操作されていない抗体に関する上述の通り、糖鎖工学的に操作された抗体を精製し、処方した。後述の通り、抗体のＦｃ領域に付着したオリゴ糖を解析して、フコースの量を決定した。

二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体のＦｃｇＲＩＩＩａへの結合及びＡＤＣＣインビトロアッセイ
所定の抗体によるＡＤＣＣ媒介の程度は、結合している抗原のみに依存するのではなく、ＡＤＣＣ反応を誘発するＦｃ受容体として公知のＦｃｇＲＩＩＩａに対する定常領域の親和性にも依存性である。ＦｃｇＲＩＩＩａへの二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の結合の解析のため、Ｂｉａｃｏｒｅ技術を適用した。この技術により、組換えにより産生されたＦｃｇＲＩＩＩａドメインへの二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の結合を評価した。材料と方法における上述の通り、全表面プラズモン共鳴測定を行った。糖鎖工学的に操作されたＯＡ−Ｆ１３Ｂ５−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１−ＧＥ及びＯＡ−Ｌ３１Ｄ１１−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１−ＧＥは、それぞれ７，５×１０^−０９Ｍ及び６，４×１０^−０９ＭのＫＤ値の結合親和性で、ヒトＦｃガンマＲＩＩＩａへの結合を示した（対、ＷＴ（糖鎖工学的に操作されていないバージョン）の３，３×１０^−０８Ｍ及び６，４×１０^−０８Ｍ）。

いかなる程度まで、ＦｃｇＲＩＩＩａへの二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の結合適格性が、腫瘍細胞に向かうインビトロＡＤＣＣ活性も説明できるか解析するため、細胞アッセイにおいてＡＤＣＣ適格性を決定した。これらのアッセイのため糖改変された誘導体二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体を調製し、後述するインビトロＡＤＣＣアッセイにおいて検査した。

ヘパリン血液を、氷冷ＰＢＳで１：１（ｖ／ｖ）希釈し、Ｌｅｕｃｏｓｅｐチューブの上部（２０〜２５ｍｌ／チューブ）に分布させた。８００×ｇ、４℃、３０分間のブレーキなしの遠心分離後に、上清の上部における血漿及び血小板を除去し、ＭＮＣを含有する相間（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ）を５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブに収集した。同一容量の氷冷ＰＢＳで希釈し、チューブを１０分間４５０×ｇ、４℃で遠心分離して、フィコールを洗い流した。ペレットを３ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、最大５０ｍｌのＰＢＳで満たし、４５０×ｇ、４℃で１０分間スピンダウン（ｓｐｕｎ ｄｏｗｎ）した。この洗浄ステップをもう１度反復した。ペレットをＡＩＭ−Ｖ培地（およそ１０ｍｌ）に再懸濁し、トリパンブルー染色後に計数することにより細胞数を決定した。標的対エフェクター細胞比１：２５となるよう、５０００００Ｚ／ウェルの適切な細胞密度まで細胞を希釈した。標的細胞をＰＢＳで２回洗浄した。接着細胞をトリプシン処理して、これを培養フラスコから得た。３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターにおける５分間のインキュベーションの後に、培養培地によりトリプシンを停止させた。細胞を９１０ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを培養培地で再懸濁し、計数した。２００００個の標的細胞／ウェルを、各ウェル５０μｌとなるよう９６ウェルＥ−プレートに播種した。ＰＢＭＮＣの調製後に、Ｅ−プレートのウェルから培養培地を除去した。５０μｌの無血清ＡＩＭ−Ｖ培地、５０μｌの抗体溶液及び５０μｌのエフェクター細胞（血液バンクＲｏｃｈｅのドナーから新鮮に単離されたＰＢＭＮＣ）をウェルに送達した。標的対エフェクター細胞の比は、１：２５であった。全希釈は、無血清ＡＩＭ−Ｖ培地で行う。次の対照が包含された：抗体なしの標的及びエフェクター細胞（＝自発的放出）、標的細胞のみ、培地のみ、並びに抗体ありエフェクター細胞なしの標的細胞。抗体希釈は、等価用量を考慮して計算する。これは、二重特異性フォーマットが、２倍濃縮される必要があることと、組み合わせ１＋１を意味する。抗体及びエフェクター細胞の添加の３時間及び５時間後に、次式に従ってＡＤＣＣの評価を決定した：
− 正規化時間：抗体及びエフェクター細胞の添加時間
− 自発的放出：標的細胞＋培地、抗体なし＋エフェクター細胞
− パーセンテージＡＤＣＣ＝（（正規化された細胞指数（ＮＣＩ）自発的放出−ＮＣＩ試料）／ＮＣＩ自発的放出）×１００
結果を図２ａ及び図２ｂに示す。親和性成熟された二重特異性糖鎖工学的に操作された＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体、ＯＡ−Ｆ１３Ｂ５−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１−ＧＥ及びＯＡ−Ｌ３１Ｄ１１−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１−ＧＥは両者共に、２種の異なる腫瘍細胞株（Ｈ４６０Ｍ２及びＨ３２２Ｍ）により、未改変の＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８（ＡＫ１８）に基づく親和性成熟されていない類似的に構築された二重特異性糖鎖工学的に操作された＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体、ＯＡ−Ａｋ１８−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１−ＧＥと比較して、ＡＤＣＣの明瞭な増加を示した。

二重特異性＜ＥＧＦＲ−ＩＧＦ１Ｒ＞抗体の糖構造の解析
オリゴ糖構造を含有するフコース及び非フコース（ａ−フコース）の相対比の決定のため、逆相ＵＰＬＣ（ＲＰ−ＵＰＬＣ）により、精製抗体材料の放出されたグリカンを解析した。このため、グリカンを、Ｎ−グリコシダーゼＦを用いてタンパク質から放出及び分離し、２−ＡＢ標識（２−アミノベンズアミド）で還元末端を蛍光標識した。過剰な２−ＡＢ色素を除去するための清浄化（ｃｌｅａｎ−ｕｐ）ステップの後、標識されたオリゴ糖プールを、蛍光検出器を備えるＵＰＬＣシステムにアプライした。逆相カラムを用いてオリゴ糖化学種の分離を達成した。試料のｎｏｎＦｕｃ含量の相対レベルの定量化のため、フコースを含まないオリゴ糖を表す全ピークの面積をまとめ、全オリゴ糖ピークの総ピーク面積に関連付けた。

次の通り、フコースの量を決定した：
ＯＡ−Ｌ３１Ｄ１１−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１：２４％
ＯＡ−Ｆ１３Ｂ５−ｓｃＦａｂ−ＧＡ２０１：２３％

Claims (12)

1. ヒトＥＧＦＲに結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＧＦ−１Ｒに結合する第２の抗原結合部位とを含む、ヒトＥＧＦＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとに結合する二重特異性抗体において、
   ｉ）第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２及び配列番号３のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２及び配列番号６のＣＤＲ３を含み、並びに
   ｉｉ）ａ）第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号１７のＣＤＲ１、配列番号１８のＣＤＲ２及び配列番号１９のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号２０のＣＤＲ１、配列番号２１のＣＤＲ２及び配列番号２２のＣＤＲ３を含むか、
   ｂ）第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号２５のＣＤＲ１、配列番号２６のＣＤＲ２及び配列番号２７のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号２８のＣＤＲ１、配列番号２９のＣＤＲ２及び配列番号３０のＣＤＲ３を含むか、
   ｃ）第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号３３のＣＤＲ１、配列番号３４のＣＤＲ２及び配列番号３５のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号３６のＣＤＲ１、配列番号３７のＣＤＲ２及び配列番号３８のＣＤＲ３を含むか、
   ｄ）第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号４１のＣＤＲ１、配列番号４２のＣＤＲ２及び配列番号４３のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号４４のＣＤＲ１、配列番号４５のＣＤＲ２及び配列番号４６のＣＤＲ３を含むか、又は
   ｅ）第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号４９のＣＤＲ１、配列番号５０のＣＤＲ２及び配列番号５１のＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号５２のＣＤＲ１、配列番号５３のＣＤＲ２及び配列番号５４のＣＤＲ３を含む
   ことを特徴とする二重特異性抗体。
2. ｉ）第１の抗原結合部位が、配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬとを含み、
   ｉｉ）ａ）第２の抗原結合部位が、配列番号２３の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号２４の軽鎖可変ドメインＶＬとを含むか、
   ｂ）第２の抗原結合部位が、配列番号３１の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号３２の軽鎖可変ドメインＶＬとを含むか、
   ｃ）第２の抗原結合部位が、配列番号３９の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号４０の軽鎖可変ドメインＶＬとを含むか、
   ｄ）第２の抗原結合部位が、配列番号４７の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号４８の軽鎖可変ドメインＶＬとを含むか、又は
   ｅ）第２の抗原結合部位が、配列番号５５の重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号５６の軽鎖可変ドメインＶＬとを含む
   ことを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体。
3. 前記抗体が、二価、三価又は四価であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の二重特異性抗体。
4. 前記抗体が、Ａｓｎ２９７において糖鎖を付加され、前記糖鎖内のフコースの量が、６５％以下であることを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
5. 請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗体を含む薬学的製剤。
6. 癌の治療において使用するための請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
7. 癌の治療のための医薬の製造のための、請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗体の使用。
8. 請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗体を含む、癌を患う患者を治療するための医薬。
9. 請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗体をコードする核酸。
10. 請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗体の宿主細胞中での発現のための、請求項９に記載の核酸を含むことを特徴とする発現ベクター。
11. 請求項１０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
12. 請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗体を産生するための方法において、請求項９に記載の核酸を宿主細胞中で発現させることと、前記細胞又は細胞培養物上清から前記二重特異性抗体を回収することを特徴とする方法。

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