JP2015502739A - 二重特異性抗egfr/抗igf−1r抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
i)第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号1のCDR1、配列番号2のCDR2及び配列番号3のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号4のCDR1、配列番号5のCDR2及び配列番号6のCDR3を含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号9のCDR1、配列番号10のCDR2及び配列番号11のCDR3を含む重鎖可変ドメインと、配列番号12のCDR1、配列番号13のCDR2及び配列番号14のCDR3を含む軽鎖可変ドメインとに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第2の抗原結合部位が、CDRの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第2の抗原結合部位が、未改変の第2の抗原結合部位と比較して少なくとも10倍増加した、ヒトIGF−1Rとの結合に対する結合親和性のKD値を有する、
二重特異性抗体である。
i)第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号1のCDR1、配列番号2のCDR2及び配列番号3のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号4のCDR1、配列番号5のCDR2及び配列番号6のCDR3を含み、
ii)a)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号17のCDR1、配列番号18のCDR2及び配列番号19のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号20のCDR1、配列番号21のCDR2及び配列番号22のCDR3を含む、
b)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号25のCDR1、配列番号26のCDR2及び配列番号27のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号28のCDR1、配列番号29のCDR2及び配列番号30のCDR3を含む、
c)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号33のCDR1、配列番号34のCDR2及び配列番号35のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号36のCDR1、配列番号37のCDR2及び配列番号38のCDR3を含む、
d)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号41のCDR1、配列番号42のCDR2及び配列番号43のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号44のCDR1、配列番号45のCDR2及び配列番号46のCDR3を含む、又は
e)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号49のCDR1、配列番号50のCDR2及び配列番号51のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号52のCDR1、配列番号53のCDR2及び配列番号54のCDR3を含む、
ことを特徴とする二重特異性抗体である。
i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメインVHと、配列番号8の軽鎖可変ドメインVLとを含み、
ii)a)第2の抗原結合部位が、配列番号23の重鎖可変ドメインVHと、配列番号24の軽鎖可変ドメインVLとを含む、
b)第2の抗原結合部位が、配列番号31の重鎖可変ドメインVHと、配列番号32の軽鎖可変ドメインVLとを含む、
c)第2の抗原結合部位が、配列番号39の重鎖可変ドメインVHと、配列番号40の軽鎖可変ドメインVLとを含む、
d)第2の抗原結合部位が、配列番号47の重鎖可変ドメインVHと、配列番号48の軽鎖可変ドメインVLとを含む、又は
e)第2の抗原結合部位が、配列番号55の重鎖可変ドメインVHと、配列番号56の軽鎖可変ドメインVLとを含む、
ことを特徴とする二重特異性抗体である。
一態様では、本発明は、一部には、ヒトEGFRに結合する第1の抗原結合部位とヒトIGF−1Rに結合する第2の抗原結合部位とを含む、ヒトEGFRとヒトIGF−1Rとに結合する二重特異性抗体であって、
i)第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号1のCDR1、配列番号2のCDR2及び配列番号3のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号4のCDR1、配列番号5のCDR2及び配列番号6のCDR3を含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号9のCDR1、配列番号10のCDR2及び配列番号11のCDR3を含む重鎖可変ドメイン並びに配列番号12のCDR1、配列番号13のCDR2及び配列番号14のCDR3を含む軽鎖可変ドメインに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第2の抗原結合部位が、CDRの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第2の抗原結合部位が、未改変の第2の抗原結合部位と比較して少なくとも10倍増加した、ヒトIGF−1Rとの結合に対する結合親和性のKD値を有する、二重特異性抗体に基づく。
i)第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号1のCDR1、配列番号2のCDR2及び配列番号3のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号4のCDR1、配列番号5のCDR2及び配列番号6のCDR3を含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号9のCDR1、配列番号10のCDR2及び配列番号11のCDR3を含む重鎖可変ドメイン並びに配列番号12のCDR1、配列番号13のCDR2及び配列番号14のCDR3を含む軽鎖可変ドメインに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び/又は軽鎖可変ドメインのCDRの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第2の抗原結合部位が、未改変の第2の抗原結合部位と比較して少なくとも10倍増加した、ヒトIGF−1Rとの結合に対する結合親和性のKD値を有する、
二重特異性抗体である。
i)第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号1のCDR1、配列番号2のCDR2及び配列番号3のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号4のCDR1、配列番号5のCDR2及び配列番号6のCDR3を含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号9のCDR1、配列番号10のCDR2及び配列番号11のCDR3を含む重鎖可変ドメイン並びに配列番号12のCDR1、配列番号13のCDR2及び配列番号14のCDR3を含む軽鎖可変ドメインに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第2の抗原結合部位が、軽鎖可変ドメインのCDRの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第2の抗原結合部位が、未改変の第2の抗原結合部位と比較して少なくとも10倍増加した、ヒトIGF−1Rとの結合に対する結合親和性のKD値を有する、
二重特異性抗体である。
i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメイン及び配列番号8の軽鎖可変ドメインを含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号15の重鎖可変ドメイン及び配列番号16の軽鎖可変ドメインに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第2の抗原結合部位が、CDRの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第2の抗原結合部位が、未改変の第2の抗原結合部位と比較して少なくとも10倍増加した、ヒトIGF−1Rとの結合に対する結合親和性のKD値を有する、
二重特異性抗体である。
i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメイン及び配列番号8の軽鎖可変ドメインを含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号15の重鎖可変ドメイン及び配列番号16の軽鎖可変ドメインに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び/又は軽鎖可変ドメインのCDRの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第2の抗原結合部位が、未改変の第2の抗原結合部位と比較して少なくとも10倍増加した、ヒトIGF−1Rとの結合に対する結合親和性のKD値を有する、
二重特異性抗体である。
i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメイン及び配列番号8の軽鎖可変ドメインを含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号15の重鎖可変ドメイン及び配列番号16の軽鎖可変ドメインに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第2の抗原結合部位が、軽鎖可変ドメインのCDRの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第2の抗原結合部位が、未改変の第2の抗原結合部位と比較して少なくとも10倍増加した、ヒトIGF−1Rとの結合に対する結合親和性のKD値を有する、
二重特異性抗体である。
i)第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号1のCDR1、配列番号2のCDR2及び配列番号3のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号4のCDR1、配列番号5のCDR2及び配列番号6のCDR3を含み、
ii)a)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号17のCDR1、配列番号18のCDR2及び配列番号19のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号20のCDR1、配列番号21のCDR2及び配列番号22のCDR3を含む、
b)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号25のCDR1、配列番号26のCDR2及び配列番号27のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号28のCDR1、配列番号29のCDR2及び配列番号30のCDR3を含む、
c)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号33のCDR1、配列番号34のCDR2及び配列番号35のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号36のCDR1、配列番号37のCDR2及び配列番号38のCDR3を含む、
d)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号41のCDR1、配列番号42のCDR2及び配列番号43のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号44のCDR1、配列番号45のCDR2及び配列番号46のCDR3を含む、又は
e)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号49のCDR1、配列番号50のCDR2及び配列番号51のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号52のCDR1、配列番号53のCDR2及び配列番号54のCDR3を含む
ことを特徴とする二重特異性抗体である。
i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメインVHと、配列番号8の軽鎖可変ドメインVLとを含み、
ii)a)第2の抗原結合部位が、配列番号23の重鎖可変ドメインVHと、配列番号24の軽鎖可変ドメインVLとを含む、
b)第2の抗原結合部位が、配列番号31の重鎖可変ドメインVHと、配列番号32の軽鎖可変ドメインVLとを含む、
c)第2の抗原結合部位が、配列番号39の重鎖可変ドメインVHと、配列番号40の軽鎖可変ドメインVLとを含む、
d)第2の抗原結合部位が、配列番号47の重鎖可変ドメインVHと、配列番号48の軽鎖可変ドメインVLとを含む、又は
e)第2の抗原結合部位が、配列番号55の重鎖可変ドメインVHと、配列番号56の軽鎖可変ドメインVLとを含む
ことを特徴とする二重特異性抗体である。
i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメインVHと、配列番号8の軽鎖可変ドメインVLとを含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号23の重鎖可変ドメインVHと、配列番号24の軽鎖可変ドメインVLとを含む
ことを特徴とする二重特異性抗体である。
i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメインVHと、配列番号8の軽鎖可変ドメインVLとを含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号31の重鎖可変ドメインVHと、配列番号32の軽鎖可変ドメインVLとを含む
ことを特徴とする二重特異性抗体である。
i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメインVHと、配列番号8の軽鎖可変ドメインVLとを含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号39の重鎖可変ドメインVHと、配列番号40の軽鎖可変ドメインVLとを含む
ことを特徴とする二重特異性抗体である。
i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメインVHと、配列番号8の軽鎖可変ドメインVLとを含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号47の重鎖可変ドメインVHと、配列番号48の軽鎖可変ドメインVLとを含む
ことを特徴とする二重特異性抗体である。
i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメインVHと、配列番号8の軽鎖可変ドメインVLとを含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号55の重鎖可変ドメインVHと、配列番号56の軽鎖可変ドメインVLとを含む
ことを特徴とする二重特異性抗体である。
抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号明細書に記載されている組換え方法及び組成物を用いて産生することができる。一実施態様では、本明細書に記載されている二重特異性抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列及び/又はVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽及び/又は重鎖)をコードすることができる。更に別の一実施態様では、このような核酸を含む一又は複数のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。更に別の一実施態様では、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような一実施態様では、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター又は(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター及び抗体のVHを含むアミノ酸配列コードする核酸を含む第2のベクターを含む(例えば、これで形質転換されている)。一実施態様では、宿主細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。一実施態様では、抗EGFR/抗IGF−1Rの方法であって、上述の抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養することと、宿主細胞(又は宿主細胞培養培地)から抗体を必要に応じて回収することを含む方法が提供される。
本発明は、また、化学療法の薬剤もしくは薬物、成長阻害剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源のタンパク質毒素、酵素活性毒素もしくはこれらの断片)又は放射性同位元素等、一又は複数の細胞傷害性薬物にコンジュゲートされた本発明に係る抗EGFR/抗IGF−1R二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
所定の実施態様では、本明細書において提供される抗EGFR/抗IGF−1R二重特異性抗体は、生体試料におけるEGFR及び/又はIGF−1Rの存在の検出に有用である。本明細書における用語「検出」は、定量的又は定性的検出を網羅する。所定の実施態様では、生体試料は、腫瘍組織等、細胞又は組織を含む。
本明細書において提供される二重特異性抗体の薬学的製剤は、一又は複数の必要に応じた薬学的に許容される担体(Remington’s Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol,A.(編)(1980))と、所望の程度の純度を有するこのような抗体を混合することにより、凍結乾燥された製剤又は水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体は、一般に、用いられる薬用量及び濃度においてレシピエントに対し無毒性であり、その例として:リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸等、バッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを包含する抗酸化剤;保存料(塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等、アルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール等);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等、タンパク質;ポリ(ビニルピロリドン)等、親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等、アミノ酸;グルコース、マンノース又はデキストリンを包含する単糖類、二糖類及び他の炭水化物;EDTA等、キレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等、糖;ナトリウム等、塩形成対イオン;金属複合体(例えば、Zn−タンパク質複合体);及び/又はポリエチレングリコール(PEG)等、非イオン性界面活性剤が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、rhuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International,Inc.)等のヒト可溶性PH−20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質等、間質性(interstitial)薬物分散剤を更に包含する。rhuPH20を包含する特定の例示的なsHASEGP及び使用方法は、米国特許出願公開第2005/0260186号及び同第2006/0104968号明細書に記載されている。一態様において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼ等、一又は複数の追加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
本明細書に提供される二重特異性抗体のいずれかを、治療方法において用いることができる。
本発明の別の一態様において、上に記載されている障害の処置、予防及び/又は診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、該容器上の又はこれに付随するラベル又は添付文書とを含む。適した容器は、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグ等を包含する。容器は、ガラス又はプラスチック等、種々の材料から形成することができる。容器は、それ自体のみで、あるいは別の組成物と組み合わせて状態の処置、予防及び/又は診断に有効な組成物を保持し、無菌アクセスポートを有することができる(例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、あるいは皮下注射針で刺し通すことができる栓を有するバイアルとなり得る)。組成物における少なくとも1種の活性薬剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が、最適な状態の処置に用いられることを示す。更に、製造品は、(a)本発明の抗体を含む組成物が含有された第1の容器と、(b)更に別の細胞傷害性さもなければ治療剤を含む組成物が含有された第2の容器とを含むことができる。本発明の本実施形態における製造品は、該組成物を特定の状態の処置に用いることができることを示す添付文書を更に含むことができる。あるいは、又は更に、製造品は、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液等、薬学的に許容されるバッファーを含む第2の(又は第3の)容器を更に含むことができる。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを包含する、商業上及び利用者の観点から望ましい他の材料を更に包含することができる。
a)アミノ酸配列:
配列番号1 重鎖CDR1、ヒト化<EGFR>ICR62
配列番号2 重鎖CDR2、ヒト化<EGFR>ICR62
配列番号3 重鎖CDR3、ヒト化<EGFR>ICR62
配列番号4 軽鎖CDR1、ヒト化<EGFR>ICR62
配列番号5 軽鎖CDR2、ヒト化<EGFR>ICR62
配列番号6 軽鎖CDR3、ヒト化<EGFR>ICR62
配列番号7 重鎖可変ドメイン、ヒト化<EGFR>ICR62−I−HHD
配列番号8 軽鎖可変ドメイン、ヒト化<EGFR>ICR62−I−KC
配列番号9 重鎖CDR1、<IGF−1R>HUMAB−クローン18
配列番号10 重鎖CDR2、<IGF−1R>HUMAB−クローン18
配列番号11 重鎖CDR3、<IGF−1R>HUMAB−クローン18
配列番号12 軽鎖CDR1、<IGF−1R>HUMAB−クローン18
配列番号13 軽鎖CDR2、<IGF−1R>HUMAB−クローン18
配列番号14 軽鎖CDR3、<IGF−1R>HUMAB−クローン18
配列番号15 重鎖可変ドメイン、<IGF−1R>HUMAB−クローン18
配列番号16 軽鎖可変ドメイン、<IGF−1R>HUMAB−クローン18
配列番号17 重鎖CDR1、<IGF−1R>F13B5(改変された<IGF−1R>HUMAB−クローン18)
配列番号18 重鎖CDR2、<IGF−1R>F13B5
配列番号19 重鎖CDR3、<<IGF−1R>F13B5
配列番号20 軽鎖CDR1、<IGF−1R>F13B5
配列番号21 軽鎖CDR2、<IGF−1R>F13B5
配列番号22 軽鎖CDR3、<IGF−1R>F13B5
配列番号23 重鎖可変ドメイン、<IGF−1R>F13B5
配列番号24 軽鎖可変ドメイン、<IGF−1R>F13B5
配列番号25 重鎖CDR1、<IGF−1R>L37F7(改変された<IGF−1R>HUMAB−クローン18)
配列番号26 重鎖CDR2、<IGF−1R>L37F7
配列番号27 重鎖CDR3、<<IGF−1R>L37F7
配列番号28 軽鎖CDR1、<IGF−1R>L37F7
配列番号29 軽鎖CDR2、<IGF−1R>L37F7
配列番号30 軽鎖CDR3、<IGF−1R>L37F7
配列番号31 重鎖可変ドメイン、<IGF−1R>L37F7
配列番号32 軽鎖可変ドメイン、<IGF−1R>L37F7
配列番号33 重鎖CDR1、<IGF−1R>L39D7(改変された<IGF−1R>HUMAB−クローン18)
配列番号34 重鎖CDR2、<IGF−1R>L39D7
配列番号35 重鎖CDR3、<<IGF−1R>L39D7
配列番号36 軽鎖CDR1、<IGF−1R>L39D7
配列番号37 軽鎖CDR2、<IGF−1R>L39D7
配列番号38 軽鎖CDR3、<IGF−1R>L39D7
配列番号39 重鎖可変ドメイン、<IGF−1R>L39D7
配列番号40 軽鎖可変ドメイン、<IGF−1R>L39D7
配列番号41 重鎖CDR1、<IGF−1R>L31D11(改変された<IGF−1R>HUMAB−クローン18)
配列番号42 重鎖CDR2、<IGF−1R>L31D11
配列番号43 重鎖CDR3、<<IGF−1R>L31D11
配列番号44 軽鎖CDR1、<IGF−1R>L31D11
配列番号45 軽鎖CDR2、<IGF−1R>L31D11
配列番号46 軽鎖CDR3、<IGF−1R>L31D11
配列番号47 重鎖可変ドメイン、<IGF−1R>L31D11
配列番号48 軽鎖可変ドメイン、<IGF−1R>L31D11
配列番号49 重鎖CDR1、<IGF−1R>L31D7(改変された<IGF−1R>HUMAB−クローン18)
配列番号50 重鎖CDR2、<IGF−1R>L31D7
配列番号51 重鎖CDR3、<<IGF−1R>L31D7
配列番号52 軽鎖CDR1、<IGF−1R>L31D7
配列番号53 軽鎖CDR2、<IGF−1R>L31D7
配列番号54 軽鎖CDR3、<IGF−1R>L31D7
配列番号55 重鎖可変ドメイン、<IGF−1R>L31D7
配列番号56 軽鎖可変ドメイン、<IGF−1R>L31D7
配列番号57 OA−F13B5−scFab−GA201重鎖1
配列番号58 OA−F13B5−scFab−GA201重鎖2
配列番号59 OA−F13B5−scFab−GA201軽鎖
配列番号60 OA−L31D11−scFab−GA201重鎖1
配列番号61 OA−L31D11−scFab−GA201重鎖2
配列番号62 OA−L31D11−scFab−GA201軽鎖
配列番号63 CM−F13B5−GA201重鎖1
配列番号64 CM−F13B5−GA201重鎖2
配列番号65 CM−F13B5−GA201軽鎖1
配列番号66 CM−F13B5−GA201軽鎖2
配列番号67 CM−L31D11−GA201重鎖1
配列番号68 CM−L31D11−GA201重鎖2
配列番号69 CM−L31D11−GA201軽鎖1
配列番号70 CM−L31D11−GA201軽鎖2
配列番号71 Tv−F13B5−GA201鎖1
配列番号72 Tv−F13B5−GA201鎖2
配列番号73 Tv−L31D11−GA201鎖1
配列番号74 Tv−L31D11−GA201鎖2
配列番号75 ヒトEGFR
配列番号76 ヒトIGF−1R
配列番号77 ヒトカッパー定常軽鎖領域
配列番号78 ヒトラムダ定常軽鎖領域
配列番号79 ヒト定常重鎖領域IgG1(コーカサス人種アロタイプ)
配列番号80 ヒト定常重鎖領域IgG1(アフリカ系アメリカ人アロタイプ)
配列番号81 ヒト定常重鎖領域IgG4
配列番号82 Ak18VL及びVHライブラリーのライブラリー鋳型(pRJH61)
配列番号83 ライブラリープライマー配列AM_VL_AK18_L1_ba
配列番号84 ライブラリープライマー配列AM_VL_AK18_L2_fo
配列番号85 ライブラリープライマー配列AM_VH_AK18_H1_ba
配列番号86 ライブラリープライマー配列AM_VH_AK18_H2_fo
実施例
材料及び方法
組換えDNA技法
Sambrook,J.ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(1989)に記載されている通り、標準方法を用いてDNAを操作した。メーカーの説明書に従って、分子生物学的試薬を用いた。
ヒト免疫グロブリン軽及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat,E.A.ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、米国公衆衛生局(1991)NIH Publication No 91−3242において提示されている。抗体鎖のアミノ酸は、EU番号付け(Edelman,G.M.ら、PNAS 63(1969)78〜85;Kabat,E.A.ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、米国公衆衛生局(1991)NIH Publication No 91−3242)に従って番号付けされる。GCG(Genetics Computer Group、ウィスコンシン州マディソン)のソフトウェアパッケージバージョン10.2及びInfomaxのVector NTI Advance suiteバージョン8.0を、配列作成、マッピング、解析、アノテーション及び図解に用いた。
DNA配列は、SequiServe(ドイツ、バターステッテン)及びGeneart AG(ドイツ、レーゲンスブルク)において、二本鎖配列決定により決定された。
Geneart AG(ドイツ、レーゲンスブルク)によって、合成オリゴヌクレオチド及びPCR産物から自動遺伝子合成により、所望の遺伝子セグメントを調製した。scFv抗体断片のC末端付着を有する重又は軽鎖、S354C及びT366W変異を保有する「ノブ・イントゥ・ホール」抗体重鎖、並びに未改変のVHドメイン、交差性(crossed)Cカッパードメイン又はscFab抗体断片と組み合わせた、CH3ドメインにY349C、T366S、L368A及びY407V変異を保有する「ノブ・イントゥ・ホール」重鎖と共に、未改変の抗体軽鎖又はCH1ドメイン交換軽鎖をコードする遺伝子セグメントは、唯一の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位(BamHI−XbaI、BamHI−XmnI又はBamHI−KpnI)に隣接し、これをpGA18(ampR)プラスミドにクローニングした。形質転換細菌からプラスミドDNAを精製し、UV分光測定法により濃度を決定した。DNA配列決定により、サブクローニングした遺伝子断片のDNA配列を確認した。全コンストラクトは、真核生物の細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチド(MGWSCIILFLVATATGVHS)をコードする5’端DNA配列を有するよう設計した。
抗体軽鎖をコードする発現プラスミドと共に、全「ノブ・イントゥ・ホール」重鎖の構築のためにRoche発現ベクターを用いた。ベクターは、次のエレメントで構成される:
− 選択マーカーとしてのハイグロマイシン抵抗性遺伝子、
− エプスタイン・バーウイルス(EBV)の複製起点、oriP、
− 大腸菌における本プラスミドの複製を可能にする、ベクターpUC18由来の複製起点、
− 大腸菌におけるアンピシリン抵抗性を与えるベータ−ラクタマーゼ遺伝子、
− ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)由来の最初期エンハンサー及びプロモーター、
− ヒト1−免疫グロブリンポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列及び
− 独自のBamHI及びXbaI制限部位。
メーカーの説明書(Invitrogen、米国)に従ったFreeStyle(商標)293発現系を用いたヒト胚性腎臓293−F細胞の一過性トランスフェクションにより、組換え二重特異性抗体を発現させた。簡単に説明すると、FreeStyle(商標)293発現培地において37℃/8%CO2で、浮遊FreeStyle(商標)293−F細胞を培養し、この細胞を、トランスフェクションの1日前に新鮮培地において1×106生細胞/mlの密度で播種した。トランスフェクションのため、250mlの最終トランスフェクション容量において、162.5μlの293−Free(商標)トランスフェクション試薬(Merck、米国)及び125μgのscFvのC末端付着を有する重又は軽鎖をコードするDNAをプラスミド比1:1で、又は「ノブ・イントゥ・ホール」重鎖1及び2並びに軽鎖プラスミドDNAを1:2:1もしくは1:3:1モル比で用いて、10mlのダルベッコのPBS(PAA、オーストリア)においてDNAを調製した。Cross Mabのトランスフェクションのため、プラスミド比1:1:2:2又は1:1:3:2の「ノブ・イントゥ・ホール」重鎖1:未改変の軽鎖:Cカッパードメイン交換「ノブ・イントゥ・ホール」重鎖2:CH1ドメイン交換軽鎖を調製した。トランスフェクションの7日後に、抗体を含有する細胞培養物上清を、14000g、30分間の遠心分離により収集し、滅菌フィルター(0.22μm)を通して濾過した。精製まで−20℃で上清を貯蔵した。
MabSelectSure−セファロース(商標)(GE Healthcare、スウェーデン)及びSuperdex 200分子ふるい(GE Healthcare、スウェーデン)クロマトグラフィーを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、細胞培養物上清から二重特異性抗体を精製した。簡単に説明すると、滅菌濾過した細胞培養物上清を、PBSバッファー(10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaCl及び2.7mM KCl、pH7.4)で平衡化したMabSelectSuRe樹脂において捕捉し、平衡化バッファーで洗浄し、25mMクエン酸ナトリウム、pH3.0で溶出した。溶出されたタンパク質画分をプールし、2M Tris、pH9.0で中和し、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0で平衡化したSuperdex 200 26/60GL(GE Healthcare、スウェーデン)カラムを用いた分子ふるいクロマトグラフィーにより更に精製した。CE−SDS(Caliper Life Science、米国)により分子ふるいクロマトグラフィー画分を解析し、二重特異性抗体含有画分をプールし、−80℃で貯蔵した。
アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いて、280nmにおける光学密度(OD)を測定することにより、精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度を決定した。マイクロ流体Labchip技術(Caliper Life Science、米国)を用いたCE−SDSにより、二重特異性及び対照抗体の純度、抗体整合性及び分子量を解析した。メーカーの説明書に従い、HTタンパク質発現試薬キットを用いたCE−SDS解析のため、5μlのタンパク質溶液を調製し、HTタンパク質発現チップを用いたLabChip GXIIシステムにおいて解析した。LabChip GXソフトウェアバージョン3.0.618.0を用いてデータを解析した。200mM KH2PO4、250mM KCl、pH7.0ランニングバッファーにおいて25℃で、Superdex200分析的分子ふるいカラム(GE Healthcare、スウェーデン)を用いた高速SECにより、二重特異性及び対照抗体試料の凝集体含量を解析した。25μgのタンパク質をカラムに流速0.5ml/分で注射し、均一濃度で50分間にわたり溶出した。ペプチド−N−グリコシダーゼF(Roche Molecular Biochemicals)を用いた酵素処理によるN−グリカンの除去後に、NanoElectrospray Q−TOF質量分析により、低下した二重特異性抗体軽及び重鎖のアミノ酸主鎖の整合性を検証した。
Biacore評価ソフトウェアにより、会合及び解離相の表面プラズモン共鳴シグナルの観察された時間経過を、二重参照(double referencing)(c=0nM及びFC1=ブランク表面に対する)あり、局所的バルク効果(RI=0)なしでラングミュア(Langmuir)1:1結合モデルと適合させることにより、標準動態を評価した。
チップC1における、メーカーの説明書に従った標準アミンカップリング;ランニングバッファーHBS−N、T=25℃、EDC/NHSの混合物による活性化;カップリングバッファー10nM NaAc、pH4.5、c=1μg/mLにおいて抗huFc捕捉抗体を希釈し、プログラムされた標的レベル200RU(FC1〜FC4における実際の固定化レベル、ほぼ189〜195RU)によりカップリングした;最後に、残りの活性化カルボキシル基を、1Mエタノールアミンの注射により遮断した。PBST+0.1%BSAにおいて1.3nMになるよう二重特異性又は親抗体を希釈し、別々のサイクルにおいて、10μl/分、30秒間の注射によりリガンドとして捕捉した。捕捉レベル5.4〜9.2RU。FC2〜4において1ラン当たり3種のMAb、FC1は参照として捕捉抗体のみ。分析物としてヒト及びカニクイザル(cyno)IGF−1R結合の動態を37℃、ランニングバッファーPBSTで測定した。一連の3倍増加濃度(PBST+0.1%BSAにおける1.65〜400nM)において、流速50μl/分、120秒間の会合、600秒間の解離で分析物を注射した。10mMグリシンpH1.75/30μl/分を60秒間による各サイクルの後に、捕捉抗体を再生した。
チップCM5における、メーカーの説明書に従った標準アミンカップリング;ランニングバッファーHBS−N、T=25℃、EDC/NHSの混合物による活性化;カップリングバッファー10mM NaAc、pH4.5、c=4μg/mLにおいて抗huFc捕捉抗体を希釈し、プログラムされた標的レベル1000RU(FC1〜FC4における実際の固定化レベル、ほぼ1170〜1260RU)によりカップリングした;最後に、残りの活性化カルボキシル基を、1Mエタノールアミンの注射により遮断した。PBS+0.1%BSAにおいて10nMになるよう二重特異性又は親抗体を希釈し、別々のサイクルにおいて、10μl/分、30秒間の注射によりリガンドとして捕捉した。捕捉レベル15〜79RU。FC2〜4において1ラン当たり3種のMAb、FC1は参照として捕捉抗体のみ。分析物として単量体ヒトHER1−ECD及びカニクイザル(cyno)EGFR結合の動態を37℃、ランニングバッファーPBSで測定した。一連の3倍増加濃度(PBS+0.1%BSAにおける4.12〜1000nM)において、流速50μl/分、120秒間の会合、1200秒間の解離で分析物を注射した。10mMグリシンpH1.75/30μl/分を60秒間による各サイクルの後に、捕捉抗体を再生した。
チップC1における、メーカーの説明書に従った標準アミンカップリング;ランニングバッファーHBS−N、T=25℃、EDC/NHSの混合物による活性化;カップリングバッファー10mM NaAc、pH4.5、c=30μg/mLにおいて単量体huHER1−ECDを希釈し、プログラムされた標的レベル400RU(FC1〜FC4における実際の固定化レベル、ほぼ390〜445RU)によりカップリングした;最後に、残りの活性化カルボキシル基を、1Mエタノールアミンの注射により遮断した。PBST+0.1%BSAにおいて20nMになるよう二重特異性又は親抗体を希釈し、別々のサイクルにおいて、10μl/分、60秒間の注射によりリガンドとして捕捉した。FC2〜4において3種のMAb、FC1は参照として捕捉抗体のみ。分析物としてヒトFcgRIIIa(V158)、huFcgRIIIa(F158)及びカニクイザル(cyno)FcgRIIIa結合の動態を25℃、ランニングバッファーPBSTで測定した。一連の3倍増加濃度(PBST+0.1%BSAにおける2.74〜2000nM)において、流速50μl/分、180秒間の会合、900秒間の解離で分析物を注射した。15mM NaOH/50μl/分を60秒間、続いて180秒間の安定化期間による各サイクルの後に、遊離HER1−ECDを再生した。ラングミュア1:1適合解析に加えて、分析物濃度の関数としてのR(平衡)から定常状態親和性を計算した。
チップC1における、メーカーの説明書に従った標準アミンカップリング;ランニングバッファーHBS−N、T=25℃、EDC/NHSの混合物による活性化;カップリングバッファー10mM NaAc、pH5.0、c=50μg/mLにおいて抗huFAB捕捉抗体を希釈し、プログラムされた標的レベル1000RU(FC1〜FC4における実際の固定化レベル、ほぼ955〜1040RU)によりカップリングした;最後に、残りの活性化カルボキシル基を、1Mエタノールアミンの注射により遮断した。PBST+0.1%BSAにおいて20nMになるよう二重特異性抗体を希釈し、別々のサイクルにおいて、10μl/分、60秒間の注射によりリガンドとして捕捉した。1ラン当たりFC2〜4における3種のMAb、FC1は参照として捕捉抗体のみ。25℃、ランニングバッファーPBSTにおいて、分析物としてヒトEGFR及びIGF−1Rの結合を測定した。PBST+0.1%BSAにおける400nMの濃度、流速30μl/分、180秒間の会合、600秒間の解離による「二重注射」モードで分析物を継続的に注射した。対照としてのブランクバッファー注射を包含する異なるサイクルにおいて受容体の順序を並べ替えた。10mMグリシンpH2.1/30μl/分を60秒間による各サイクルの後に、捕捉抗体を再生した。
続くファージディスプレイ選択を可能にするファージミドベクターにクローニングされた<IGF−1R>HUMABクローン18(DSM ACC2587;国際公開第2005/005635号、<IGF−1R>クローン18、<IGF−1R>AK18と省略、配列番号9〜16の配列を参照)のFab断片に基づき、親和性成熟化ライブラリーを構築した。より正確には、それぞれ軽鎖可変ドメインのCDR1(Kabat番号付けスキームに従った残基30、31、32、34)及びCDR2(残基50、51、52、53)におけるランダム化位置(Ak18 VLライブラリー)並びに重鎖可変ドメインのCDR1(残基31、32、33、34、35)及びCDR2(残基50、52、53、54、56、58)におけるランダム化位置(Ak18 VHライブラリー)を有する、2種のサブライブラリーを構築した。ランダム化可変ドメインは、CDR1にわたるランダム化リバースプライマー及びCDR2にわたるランダム化フォワードプライマーを用いることにより別々にPCR増幅した。これらをそれぞれの外側プライマーと組み合わせて、V−ドメインにつき2種のPCR断片を作製し、続いてライブラリープライマーの5’端の定常部分における配列相同性により集合させた(例えば、リバースプライマーAM_VL_AK18_L1_baは、フォワードプライマーAM_VL_AK18_L2_foにアニーリングする)。それぞれの外側プライマーの添加により集合産物を増幅させ、それぞれNcoI/BsiWI(Ak18 VLライブラリー)及びAscI/SacII(Ak18 VHライブラリー)で消化し、同様に消化したアクセプターベクターにクローニングした。エレクトロコンピテント(electrocompetent)大腸菌TG1への、1種のサブライブラリー当たりほぼ60種の形質転換のため、精製したライゲーション産物を用いて、Ak18 VLライブラリーは1.4×1010、Ak18 VHライブラリーは8.7×109の最終ライブラリーサイズの、それぞれ65.3%及び73%の機能的クローンを得た。Fabライブラリーを提示するファージミド粒子をレスキューし、PEG/NaCl沈殿により精製して、選択に用いた。
Ak18 VL及びVHライブラリーファージのプールを用いて、ヒト及び/又はカニクイザルIGF−1Rの細胞外ドメインに対する選択を行った。3種の異なる選択戦略を行った:1.続くバイオパニングのラウンドにわたる抗原濃度の減少(第1の選択ラウンドにおける10nMから、第3〜5の選択ラウンドにおける0.8nMへの下降に及ぶ)、2.結合反応への10倍抗原濃度における親IgG Ak18の添加による又は1μM非ビオチン化ヒトIGF−1Rの添加(標的としてビオチン化カニクイザルIGF−1Rが用いられたラウンドのみ)による競合選択、あるいは3.ファージ−抗体:抗原複合体を3時間又は3日間解離させることによる、オフレート(off−rate)選択。続く選択ラウンドにおいてヒトのみ又はカニクイザルのみのIGF−1Rを用いる、あるいはこれら2種を交替させて1種のみに向けた親和性成熟化を回避することにより、選択を行った。BioRadのProteOn XPR36を用いたSPRにより、バイオパニングラウンド2〜5の選択アウトプットをスクリーニングして、親Ak18と比較してより優れた動態速度定数及び親和性を有するクローンを同定した。選択されたクローンのVL及びVH配列を下の表1に示す。
Fab断片の捕捉方法を適用した、25℃におけるProteOn XPR36(BioRad)機器を用いた表面プラズモン共鳴(SPR)により、親和性成熟したクローンの動態速度定数kon及びkoff並びに親和性(KD)を測定した。簡単に説明すると、EDC及びSNHSの新たに調製した混合物により全チャネルを5分間同時に活性化し、次に、10mM酢酸NaバッファーpH5.0における24ug/mlの抗Fabを5分間注射することにより、抗Fab捕捉抗体(Jackson ImmunoResearch、#109−005−006)を高レベル(9.000〜10.000RU)で30ul/分にて、GLMチップの別々の垂直チャネルに固定化した。エタノールアミンの5分間の注射を用いて、チャネルを遮断した。垂直チャネルに沿って100秒間30ul/分にて、細菌培養物上清から、あるいは精製タンパク質調製物から、親和性成熟したクローンのFab断片を捕捉して、ほぼ250RUのリガンド密度を達成した。ワンショット動態アッセイセットアップ(OSK)において、水平チャネルに沿って50ul/分、会合時間200秒間、解離時間600秒間、33〜0.4nMに及ぶ3倍希釈系列において、ヒト又はカニクイザルIGF−1Rを分析物として注射した。第6のチャネルに沿ってランニングバッファー(PBST)を注射して、参照のための「インライン(in−line)」ブランクを得た。会合及び解離センサーグラム(sensorgram)を同時に適合させることにより、単純な1:1ラングミュア結合モデル(ProteOn Managerソフトウェアバージョン2.1)を用いて、会合速度(kon)及び解離速度(koff)を計算した。koff/konの比として平衡解離定数(KD)を計算した。結果を下の表2に示す。
(即ち、PelBリーダー配列+VL Ak18+c−myc及び軽鎖のためのFLAGタグ及びPelBを包含するCL定常ドメイン+VH Ak18+重鎖のためのHis6タグを包含するCH1定常ドメインを含む領域をコードする完全Fab)
ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCC
ATGGCCGAAATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAACCCTGAGCCTGAGTCCGGGTGAACGT
GCAACCCTGTCTTGTCGTGCAAGCCAGAGCGTTAGTAGCTACCTGGCCTGGTATCAGCAG
AAACCGGGTCAGGCACCGCGTCTGCTGATTTATGATGCATCCAAGCGTGCAACCGGTATT
CCGGCACGTTTTAGCGGTAGCGGATCCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTG
GAACCGGAAGATTTTGCCGTTTATTATTGTCAGCAGCGTAGCAAATGGCCTCCGTGGACC
TTTGGTCAGGGCACCAAAGTTGAAAGCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC
TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAAT
AACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGT
AACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGC
ACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACC
CATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGCCGCA
GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGAGCCGCAGACTACAAGGACGACGAC
GACAAGGGTGCCGCATAATAAGGCGCGCCAATTCTATTTCAAGGAGACAGTCATATGAAA
TACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCC
CAGGTTGAACTGGTTGAAAGCGGTGGTGGTGTTGTTCAGCCTGGTCGTAGCCAGCGTCTG
AGCTGTGCAGCATCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGGCATGCACTGGGTTCGTCAGGCA
CCGGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCAATTATTTGGTTTGATGGAAGCAGTACCTACTAT
GCAGATAGCGTTCGTGGTCGTTTTACCATTAGCCGTGATAATAGCAAAAACACCCTGTAT
CTGCAGATGAATAGCCTGCGTGCAGAAGATACCGCAGTTTATTTTTGTGCACGTGAACTG
GGTCGTCGTTATTTTGATCTGTGGGGTCGTGGCACCCTGGTTAGCGTTAGCAGCGCTAGC
ACCAAAGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACA
GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAAC
TCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC
TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATC
TGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCT
TGTGACGCGGCCGCAAGCACTAGTGCCCATCACCATCACCATCACGCCGCGGCATAG
AM_VL_AK18_L1_ba(配列番号83)
TCAGCAGACGCGGTGCCTGACCCGGTTTCTGCTGATACCA GGC CAG ATA GCT GCT AACGCTCTGGCTTGCACGACAAGACAGG
1 2 3 4
1 60%鋳型塩基+40%N/+40%K/+40%M
2 70%鋳型塩基+30%N/+30%M
3 60%鋳型塩基+40%N/+40%M
4 60%鋳型塩基+40%N/+40%M
CAGAAACCGGGTCAGGCACCGCGTCTGCTGATTTAT GAT GCG AGC AAA CGTGCAACCGGTATTCCGGCACGTTTTAG
1 2 3 4
1 60%鋳型塩基+40%N/+40%K
2 100%鋳型塩基/70%鋳型+30%G
3 100%鋳型塩基/70%鋳型+30%C
4 60%鋳型塩基+40%N/+40%V/+40%K
CAACCCATTCCAGACCTTTACCCGGTGCCTGACGAACCCA ATG CAT ACC ATA AGA GCTAAAGGTAAATCCGGATGCTG
1 2 3 4 5
1 60%鋳型塩基+40%N
2 100%鋳型塩基/60%C+40%A
3 60%鋳型塩基+40%N/+40%M
4 60%鋳型塩基+40%N/+40%M
5 60%鋳型塩基+40%N/+40%B
AGGCACCGGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCA ATT ATT TGG TTT GAT GGC AGC
1 2 3 4
TCT ACC TAT TATGCAGATAGCGTTCGTGGTC
5 6
1 60%鋳型塩基+40%N/+40%K
2 60%鋳型塩基+40%N/+40%K
3 60%鋳型塩基+40%R/+40%V/+40%K
4 60%鋳型塩基+40%N/+40%V/+40%K
5 60%鋳型塩基+40%N/+40%K
6 60%鋳型塩基+40%N/+40%K
IUPACヌクレオチドコード 塩基
A アデニン
C シトシン
G グアニン
T(又はU) チミン(又はウラシル)
R A又はG
Y C又はT(U)
S G又はC
W A又はT(U)
M A又はC
B C又はG又はT(U)
D A又はG又はT(U)
H A又はC又はT(U)
V A又はC又はG
N 任意の塩基
変性温度(SYPROオレンジ法)
タンパク質変性(即ち、温度誘導性のタンパク質構造損失)が起こる温度を決定するため、疎水性環境において強い蛍光を提示する疎水性蛍光色素(SYPROオレンジ、Invitrogen)に頼った方法を用いた。タンパク質が変性すると、疎水性パッチは溶媒に曝露されるようになり、蛍光の増加をもたらす。変性温度を上回る温度においては、蛍光強度は再び減少し、従って、最大強度に達する温度が変性温度として定義される。この方法は、Ericsson,U.B.ら、Anal Biochem 357(2006)289〜298及びHe,F.ら、Journal of Pharmaceutical Sciences 99(2010)1707〜1720により記載されている。
動的光散乱法(DLS)により、熱的に誘導されたタンパク質凝集が起こる温度を決定した。DLSは、マイクロ秒スケールの散乱光強度のゆらぎに由来する、溶液における巨大分子のサイズ分布に関する情報をもたらす。試料を徐々に加熱すると、一定の温度で凝集が始まり、成長する粒子サイズを生じる。粒子サイズが増加し始める温度が、凝集温度として定義される。変性は、必ずしも凝集に必須でない場合もあるため、凝集及び変性温度は、必ずしも同一である必要はない。
凝集体は、強い光散乱シグナルを生じるため、DLSは、溶液における巨大分子の凝集体を検出するための高感度の方法である。従って、分子が凝集する傾向は、DLSデータの反復的取得により経時的に追跡することができる。潜在的な凝集を実際的な速度へと加速するため、50℃で測定を行った。
凝集/断片化に関連するその安定性に関して二重特異性分子を評価するため、製剤バッファー(20mMクエン酸塩、180mMスクロース、20mMアルギニン、0.02%ポリソルベート20)においておよそ1mg/mLのタンパク質濃度で、試料を40℃で3週間インキュベートした。対照試料を3週間−80℃で貯蔵した。
材料と方法における上述の通りBIAcoreにより、二重特異性抗体の同時結合を解析した。
新たな親和性成熟化された二重特異性<EGFR−IGF1R>抗体、OA−F13B5−scFab−GA201及びOA−L31D11−scFab−GA201の潜在的な阻害活性を評価するため、未改変の<IGF−1R>HUMAB−クローン18(AK18)に基づく類似的に構築された二重特異性<EGFR−IGF1R>抗体、OA−Ak18−scFab−GA201と比較して、異なる比率のIGF−1R及びEGFRを発現する腫瘍細胞において、両経路に向かうシグナル伝達の阻害の程度を解析した。A549及びBxPC3細胞は、IGF−1R及びEGFRの両方を発現するが、TC−71細胞は、IGF−1Rのみを発現する。
二重特異性<EGFR−IGF1R>抗体、OA−Ak18−scFab−GA201は、IGF−1R及び/又はEGFRを発現する癌細胞株の成長を阻害する。
二重特異性<EGFR−IGF1R>抗体、OA−Ak18−scFab−GA201は、IGF−1R及び/又はEGFRを発現する細胞に結合する。
リン酸カルシウムトランスフェクションアプローチを用いて、哺乳類抗体重及び軽鎖発現ベクターをHEK293−EBNA細胞に同時トランスフェクトすることにより、二重特異性<EGFR−IGF1R>抗体の糖鎖工学的に操作された誘導体を産生した。指数関数的に増殖しているHEK293−EBNA細胞をリン酸カルシウム方法によりトランスフェクトした。糖鎖工学的に操作された抗体の産生のため、それぞれ融合GnTIIIポリペプチド発現のためのプラスミド及びマンノシダーゼII発現のための第2のプラスミドを細胞に同時トランスフェクトした。上述の材料と方法の節に記載されているプラスミド比の二重特異性抗体を添加した。10%FCSを補充したDMEM培養培地を用いて、細胞をTフラスコにおいて接着単層培養物として育成し、50〜80%の間のコンフルエントになったときにトランスフェクトした。T75フラスコのトランスフェクションのため、トランスフェクション24時間前に、FCS(10%V/V最終)、(最終的に250μg/mlネオマイシン)を補充した約14mlのDMEM培養培地において、750(から800)万個の細胞を播種し、細胞をインキュベーターにおける37℃、5%CO2雰囲気下に一晩置いた。トランスフェクトするT75フラスコ毎に、47μgの総プラスミドベクターDNA、235μlの1M CaCl2溶液を混合し、最終容量469μlとなるまで水を添加することにより、DNA、CaCl2及び水の溶液を調製した。この溶液に、469μlの50mM HEPES、280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4溶液、pH7.05を添加し、直ちに10秒間混合し、室温で20秒間放置した。この懸濁液を、2%FCSを補充した約12mlのDMEMで希釈し、既に存在する培地に代えてT75に添加した。細胞を37℃、5%CO2で約17〜20時間インキュベートし、次に、培地を約12mlのDMEM、10%FCSに置き換えた。トランスフェクション5〜7日後に馴化培養培地を収集し、5分間210〜300*gで遠心分離し、0.22μmフィルターを通して滅菌濾過し(あるいは、5分間1200rpmで遠心分離し、続いて10分間4000rpmで2回目の遠心分離を行う)、4℃で維持した。
所定の抗体によるADCC媒介の程度は、結合している抗原のみに依存するのではなく、ADCC反応を誘発するFc受容体として公知のFcgRIIIaに対する定常領域の親和性にも依存性である。FcgRIIIaへの二重特異性<EGFR−IGF1R>抗体の結合の解析のため、Biacore技術を適用した。この技術により、組換えにより産生されたFcgRIIIaドメインへの二重特異性<EGFR−IGF1R>抗体の結合を評価した。材料と方法における上述の通り、全表面プラズモン共鳴測定を行った。糖鎖工学的に操作されたOA−F13B5−scFab−GA201−GE及びOA−L31D11−scFab−GA201−GEは、それぞれ7,5×10−09M及び6,4×10−09MのKD値の結合親和性で、ヒトFcガンマRIIIaへの結合を示した(対、WT(糖鎖工学的に操作されていないバージョン)の3,3×10−08M及び6,4×10−08M)。
− 正規化時間:抗体及びエフェクター細胞の添加時間
− 自発的放出:標的細胞+培地、抗体なし+エフェクター細胞
− パーセンテージADCC=((正規化された細胞指数(NCI)自発的放出−NCI試料)/NCI自発的放出)×100
結果を図2a及び図2bに示す。親和性成熟された二重特異性糖鎖工学的に操作された<EGFR−IGF1R>抗体、OA−F13B5−scFab−GA201−GE及びOA−L31D11−scFab−GA201−GEは両者共に、2種の異なる腫瘍細胞株(H460M2及びH322M)により、未改変の<IGF−1R>HUMAB−クローン18(AK18)に基づく親和性成熟されていない類似的に構築された二重特異性糖鎖工学的に操作された<EGFR−IGF1R>抗体、OA−Ak18−scFab−GA201−GEと比較して、ADCCの明瞭な増加を示した。
オリゴ糖構造を含有するフコース及び非フコース(a−フコース)の相対比の決定のため、逆相UPLC(RP−UPLC)により、精製抗体材料の放出されたグリカンを解析した。このため、グリカンを、N−グリコシダーゼFを用いてタンパク質から放出及び分離し、2−AB標識(2−アミノベンズアミド)で還元末端を蛍光標識した。過剰な2−AB色素を除去するための清浄化(clean−up)ステップの後、標識されたオリゴ糖プールを、蛍光検出器を備えるUPLCシステムにアプライした。逆相カラムを用いてオリゴ糖化学種の分離を達成した。試料のnonFuc含量の相対レベルの定量化のため、フコースを含まないオリゴ糖を表す全ピークの面積をまとめ、全オリゴ糖ピークの総ピーク面積に関連付けた。
OA−L31D11−scFab−GA201:24%
OA−F13B5−scFab−GA201:23%
Claims (13)
- ヒトEGFRに結合する第1の抗原結合部位と、ヒトIGF−1Rに結合する第2の抗原結合部位とを含む、ヒトEGFRとヒトIGF−1Rとに結合する二重特異性抗体であって、
i)第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号1のCDR1、配列番号2のCDR2及び配列番号3のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号4のCDR1、配列番号5のCDR2及び配列番号6のCDR3を含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号9のCDR1、配列番号10のCDR2及び配列番号11のCDR3を含む重鎖可変ドメインと、配列番号12のCDR1、配列番号13のCDR2及び配列番号14のCDR3を含む軽鎖可変ドメインとに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第2の抗原結合部位が、CDRの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第2の抗原結合部位が、未改変の第2の抗原結合部位と比較して少なくとも10倍増加した、ヒトIGF−1Rとの結合に対する結合親和性のKD値を有する、二重特異性抗体。 - ヒトEGFRに結合する第1の抗原結合部位と、ヒトIGF−1Rに結合する第2の抗原結合部位とを含む、ヒトEGFRとヒトIGF−1Rとに結合する二重特異性抗体において、
i)第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号1のCDR1、配列番号2のCDR2及び配列番号3のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号4のCDR1、配列番号5のCDR2及び配列番号6のCDR3を含み、
ii)a)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号17のCDR1、配列番号18のCDR2及び配列番号19のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号20のCDR1、配列番号21のCDR2及び配列番号22のCDR3を含む、
b)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号25のCDR1、配列番号26のCDR2及び配列番号27のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号28のCDR1、配列番号29のCDR2及び配列番号30のCDR3を含む、
c)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号33のCDR1、配列番号34のCDR2及び配列番号35のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号36のCDR1、配列番号37のCDR2及び配列番号38のCDR3を含む、
d)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号41のCDR1、配列番号42のCDR2及び配列番号43のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号44のCDR1、配列番号45のCDR2及び配列番号46のCDR3を含む、又は
e)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号49のCDR1、配列番号50のCDR2及び配列番号51のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号52のCDR1、配列番号53のCDR2及び配列番号54のCDR3を含む、
ことを特徴とする二重特異性抗体。 - i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメインVHと、配列番号8の軽鎖可変ドメインVLとを含み、
ii)a)第2の抗原結合部位が、配列番号23の重鎖可変ドメインVHと、配列番号24の軽鎖可変ドメインVLとを含む、
b)第2の抗原結合部位が、配列番号31の重鎖可変ドメインVHと、配列番号32の軽鎖可変ドメインVLとを含む、
c)第2の抗原結合部位が、配列番号39の重鎖可変ドメインVHと、配列番号40の軽鎖可変ドメインVLとを含む、
d)第2の抗原結合部位が、配列番号47の重鎖可変ドメインVHと、配列番号48の軽鎖可変ドメインVLとを含む、又は
e)第2の抗原結合部位が、配列番号55の重鎖可変ドメインVHと、配列番号56の軽鎖可変ドメインVLとを含む、
ことを特徴とする、請求項1又は2に記載の二重特異性抗体。 - 前記抗体が、二価、三価又は四価であることを特徴とする、請求項1から3の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
- 前記抗体が、Asn297において糖鎖を付加され、前記糖鎖内のフコースの量が、65%以下であることを特徴とする、請求項1から4の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
- 請求項1から5に記載の二重特異性抗体を含む薬学的製剤。
- 癌の治療において使用するための請求項1から5の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
- 癌の治療のための医薬の製造のための、請求項1から5に記載の二重特異性抗体の使用。
- 請求項1から5に記載の二重特異性抗体を、そのような治療を必要とする患者に投与することによる、癌を患う患者の治療方法。
- 請求項1から5に記載の二重特異性抗体をコードする核酸。
- 請求項1から5に記載の二重特異性抗体の宿主細胞中での発現のための、請求項10に記載の核酸を含むことを特徴とする発現ベクター。
- 請求項11に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1から5に記載の二重特異性抗体を産生するための方法において、請求項10に記載の核酸を宿主細胞中で発現させることと、前記細胞又は細胞培養物上清から前記二重特異性抗体を回収することを特徴とする方法。
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