KR20140054322A - 이중특이적 항-egfr/항-igf-1r 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체, 이의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약학 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체{BISPECIFIC ANTI-EGFR/ANTI-IGF-1R ANTIBODIES}
본 발명은 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체, 이의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약학 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
문헌(Lu, D., et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 318 (2004) 507-513); 문헌(J. Biol. Chem., 279 (2004) 2856-2865); 및 문헌(J. Biol Chem. 280 (2005) 19665-19672)은 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R에 대한 이중특이적 항체에 관한 것이다.
국제 특허출원 공개 제WO 2010/034441호는 <IGF-1R> HUMAB 클론 및 인간화된 <EGFR>ICR62의 서열(서열번호 1 내지 16(하기 나열됨))에 의거한 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R에 대한 이중특이적 항체에 관한 것이다.
본 발명의 한 양태는 인간 EGFR에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 IGF-1R에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R에 결합하는 이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 3의 CDR3을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 4의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2 및 서열번호 6의 CDR3을 포함하고;
ii) 상기 제2 항원 결합 부위가 서열번호 9의 CDR1, 서열번호 10의 CDR2 및 서열번호 11의 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 서열번호 12의 CDR1, 서열번호 13의 CDR2 및 서열번호 14의 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인에 의거한 변경된 항원 결합 부위이고;
이때, 변경된 제2 항원 결합 부위가 상기 CDR들 중 하나 이상의 CDR 내에 하나 이상의 변경을 포함하고;
변경된 제2 항원 결합 부위가 비-변경된 제2 항원 결합 부위에 비해 인간 IGF-1R과의 결합에 대한 결합 친화성의 10배 이상 증가된 KD 값을 갖는, 이중특이적 항체이다.
본 발명의 한 실시양태는 인간 EGFR에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 IGF-1R에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R에 결합하는 이중특이적 항체로서,
i) 제1 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 3의 CDR3을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 4의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2 및 서열번호 6의 CDR3을 포함하고;
ii) a) 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 17의 CDR1, 서열번호 18의 CDR2 및 서열번호 19의 CDR3을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 20의 CDR1, 서열번호 21의 CDR2 및 서열번호 22의 CDR3을 포함하거나;
b) 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 25의 CDR1, 서열번호 26의 CDR2 및 서열번호 27의 CDR3을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 28의 CDR1, 서열번호 29의 CDR2 및 서열번호 30의 CDR3을 포함하거나;
c) 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 33의 CDR1, 서열번호 34의 CDR2 및 서열번호 35의 CDR3을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 36의 CDR1, 서열번호 37의 CDR2 및 서열번호 38의 CDR3을 포함하거나;
d) 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 41의 CDR1, 서열번호 42의 CDR2 및 서열번호 43의 CDR3을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 44의 CDR1, 서열번호 45의 CDR2 및 서열번호 46의 CDR3을 포함하거나;
e) 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 49의 CDR1, 서열번호 50의 CDR2 및 서열번호 51의 CDR3을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 52의 CDR1, 서열번호 53의 CDR2 및 서열번호 54의 CDR3을 포함하는 것
을 특징으로 하는 이중특이적 항체이다.
본 발명의 한 실시양태는 인간 EGFR에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 IGF-1R에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R에 결합하는 이중특이적 항체로서,
i) 제1 항원 결합 부위가 서열번호 7의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 8의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하고;
ii) a) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 23의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 24의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하거나;
b) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 31의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 32의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하거나;
c) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 39의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 40의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하거나;
d) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 47의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 48의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하거나;
e) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 55의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 56의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하는 것
을 특징으로 하는 이중특이적 항체이다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 상기 항체가 2가, 3가 또는 4가 항체인 것을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 상기 항체가 Asn297에서 당쇄로 글리코실화되고, 이에 의해 상기 당쇄 내의 푸코스의 양이 65% 이하인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 한 실시양태는 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 포함하는 약학 제제이다.
본 발명의 한 실시양태는 암의 치료에 사용되는 본 발명에 따른 이중특이적 항체이다.
본 발명의 한 실시양태는 암 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 용도이다.
본 발명의 한 실시양태는 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 암의 치료가 필요한 환자에게 투여함으로써 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이다.
본 발명의 한 실시양태는 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 암호화하는 핵산이다. 본 발명의 한 실시양태는 숙주 세포에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 발현시키기 위한 상기 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터이다. 본 발명의 한 실시양태는 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포이다. 본 발명의 한 실시양태는 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 제조 방법로서, 숙주 세포에서 상기 핵산을 발현시키고 상기 세포 또는 세포 배양 상청액으로부터 상기 이중특이적 항체를 회수하는 것을 특징으로 하는 제조 방법이다.
이러한 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체는 매우 귀중한 성질, 예컨대, 매우 효과적인 종양 세포 생존력 억제 및 종양 성장 억제, 및 IGF-1R 및 IGF-1R 신호전달 둘다의 억제(예를 들면, 인산화)를 갖는다. 상기 항체는 귀중한 결합 성질, 예컨대, 높은 결합 친화성 및 효율적인 세포 결합을 갖는다. 상기 항체는 특히 당조작되어 있을 때 높은 ADCC 활성을 보인다. 나아가, 본 발명에 따른 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체는 스트레스 하에서 높은 안정성을 나타내고, 이것은 제조 및 그의 약물동력학적 성질을 위해 중요하다.
도 1a 및 1b는 <EGFR-IGF-1R> 항체 OA-Ak18-scFab-GA201과 비교될 때 변경된 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체 OA F13B5-scFab-GA201 및 OA-L31D11-scFab-GA201에 의한 A549 암세포(도 1a) 및 RD-ES 암세포(도 1b)의 암세포 증식의 억제를 보여준다. 본 발명에 따른 친화성 성숙된 이중특이적 항체 OA-F13B5-scFab-GA201 및 OA-L31D11-scFab-GA201의 경우 효능이 현저히 증가된다.
도 2a 및 2b는 2종의 상이한 암세포주 H460M2(도 2a) 및 H322M(도 2b)을 사용한 ADCC 시험관내 분석을 보여준다. 친화성 성숙된 이중특이적 당조작된 <EGFR-IGF-1R> 항체 OA-F13B5-scFab-GA201-GE 및 OA-L31D11-scFab-GA201-GE는 비-변경된 당조작된 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체 OA-Ak18-scFab-GA201-GE에 비해 ADCC의 명확한 증가를 보였다.
본원에서 사용된 "항체"는 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질을 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "결합 부위" 또는 "항원 결합 부위"는 리간드가 실제로 결합하는 항체 분자의 영역을 의미한다. 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 결합 부위는 한 쌍의 2개 가변 도메인, 즉 1개의 중쇄 가변 도메인 및 1개의 경쇄 가변 도메인에 의해 각각 형성될 수 있다. 항체의 최소 결합 부위 결정인자는 중쇄 CDR3이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 각각의 결합 부위는 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및/또는 항체 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하고, 바람직하게는 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 가변 도메인(VH)으로 구성된 한 쌍에 의해 형성된다.
"항체 특이성"은 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의 선별적 인식을 지칭한다. 천연 항체는 예를 들면, 단일특이적 항체이다. 본 발명에 따른 "이중특이적 항체"는 2종의 상이한 항원 결합 특이성을 갖는 항체이다. 항체가 1종 초과의 특이성을 갖는 경우, 인식된 에피토프는 단일 항원 또는 1종 초과의 항원과 관련될 수 있다. 본 발명의 항체는 2종의 상이한 항원, 즉 제1 항원으로서 EGFR 및 제2 항원으로서 IGF-1R에 대해 특이적이다.
본원에서 사용된 용어 "단일특이적" 항체는 동일한 항원의 동일한 에피토프에 각각 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "가(valent)"는 특정된 수의 결합 부위가 항체 분자에 존재한다는 것을 의미한다. 따라서, 용어 "2가", "4가" 및 "6가"는 각각 2개의 결합 부위, 4개의 결합 부위 및 6개의 결합 부위가 항체 분자에 존재한다는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 "2가" 이상의 항체이고, "3가" 또는 "다가"(예를 들면, "4가" 또는 "6가") 항체일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 2가, 3가 또는 4가 항체이다. 한 실시양태에서, 상기 이중특이적 항체는 2가 항체이다. 한 실시양태에서, 상기 이중특이적 항체는 3가 항체이다. 한 실시양태에서, 상기 이중특이적 항체는 4가 항체이다.
본 발명의 항체는 2개 이상의 결합 부위를 갖고 이중특이적 항체이다. 즉, 상기 항체는 2개 초과의 결합 부위가 존재하는 경우(즉, 상기 항체가 3가 또는 다가 항체인 경우)조차도 이중특이적일 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항체는 예를 들면, 다가 단일쇄 항체, 다이아바디 및 트라이아바디뿐만 아니라 추가 항원 결합 부위(예를 들면, 단일쇄 Fv, VH 도메인 및/또는 VL 도메인, Fab, 또는 (Fab)2)가 하나 이상의 펩티드-연결제를 통해 연결되어 있는 전장 항체의 불변 도메인 구조를 갖는 항체도 포함한다. 상기 항체는 단일 종으로부터 유래된 전장 항체일 수 있거나 키메라화된 또는 인간화된 항체일 수 있다. 2개 초과의 항원 결합 부위를 갖는 항체의 경우, 단백질이 2개의 상이한 항원들에 대한 결합 부위를 갖는 한, 몇몇 결합 부위는 동일할 수 있다. 즉, 제1 결합 부위는 인간 EGFR에 대해 특이적인 반면, 제2 결합 부위는 인간 IGF-1R에 대해 특이적이다.
천연 항체와 마찬가지로, 본 발명의 항체의 항원 결합 부위는 전형적으로 항원에 대한 결합 부위의 친화성에 다양한 정도로 기여하는 6개의 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다. 3개의 중쇄 가변 도메인 CDR(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 3개의 경쇄 가변 도메인 CDR(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)이 존재한다. CDR 영역 및 골격 영역(FR)의 정도는 상기 영역들이 서열들 사이의 가변성에 따라 정의되어 있는 아미노산 서열의 편집된 데이터베이스와의 비교에 의해 결정된다. 보다 적은 수의 CDR로 구성된(즉, 결합 특이성이 3개, 4개 또는 5개의 CDR에 의해 결정되는 경우) 기능성 항원 결합 부위도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들면, 6개의 CDR로 구성된 완전한 세트보다 적은 수의 CDR이 결합을 위해 충분할 수 있다. 몇몇 경우, VH 또는 VL 도메인이 충분할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 면역글로불린 클래스의 면역글로불린 불변 영역을 추가로 포함한다. 면역글로불린 클래스는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 동종형, 및 IgG 및 IgA의 경우 이들의 하위형을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgG 유형 항체의 불변 도메인 구조를 갖는다.
본원에서 사용된 용어 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물"은 단일 아미노산 조성물의 항체 분자의 제제를 의미한다.
용어 "키메라 항체"는 통상적으로 재조합 DNA 기법에 의해 제조된, 한 공급원 또는 종으로부터 유래된 가변 도메인, 즉 결합 영역 및 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 항체를 의미한다. 뮤린 가변 도메인 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체가 바람직하다. 본 발명에 의해 포괄되는 "키메라 항체"의 다른 바람직한 형태는 특히, C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합과 관련하여 본 발명에 따른 성질을 발생시키도록 불변 영역이 원래의 항체의 불변 영역으로부터 변경되어 있거나 변화되어 있는 키메라 항체이다. 이러한 키메라 항체는 "클래스-전환된 항체"로도 지칭된다. 키메라 항체는 면역글로불린 가변 도메인을 암호화하는 DNA 분절 및 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 DNA 분절을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 생성물이다. 키메라 항체의 제조 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있는 통상적인 재조합 DNA 및 유전자 형질감염 기법을 포함한다. 예를 들면, 문헌(Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855), 미국 특허 제5,202,238호 및 미국 특허 제5,204,244호를 참조한다.
용어 "인간화된 항체"는 골격 또는 "상보성 결정 영역"(CDR)이 모 면역글로불린의 CDR에 비해 상이한 특이성을 갖는 면역글로불린의 CDR을 포함하도록 변경되어 있는 항체를 의미한다. 바람직한 실시양태에서, "인간화된 항체"를 제조하기 위해 뮤린 CDR을 인간 항체의 골격 영역 내로 이식한다. 예를 들면, 문헌(Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327) 및 문헌(Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270)을 참조한다. 특히 바람직한 CDR은 키메라 항체에 대해 전술된 바와 같이 항원을 인식하는 서열을 나타내는 CDR에 상응한다. 본 발명에 의해 포괄되는 "인간화된 항체"의 다른 형태는 특히, C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합과 관련하여 본 발명에 따른 성질을 발생시키도록 불변 영역이 원래의 항체의 불변 영역으로부터 추가로 변경되어 있거나 변화되어 있는 인간화된 항체이다.
본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 생식세포주 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하기 위한 것이다. 인간 항체는 최신 기술에서 잘 공지되어 있다(van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). 인간 항체는 면역화 시 내생성 면역글로불린 제조의 부재 하에서 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있거나 선별할 수 있는 형질전환 동물(예를 들면, 마우스)에서 생성될 수도 있다. 이러한 생식세포주 돌연변이체 마우스 내로의 인간 생식세포주 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 챌린지 시 인간 항체의 생성을 일으킬 것이다(예를 들면, 문헌(Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555), 문헌(Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258), 및 문헌(Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40) 참조). 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리에서도 생성될 수 있다(Hoogenboom, H.R., and Winter, G.J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). 문헌(Cole, et al.) 및 문헌(Boerner, et al.)의 기법들도 인간 단일클론 항체의 제조를 위해 이용될 수 있다(Cole, S.P.C., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss (1985) 77-96; and Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). 본 발명에 따른 키메라 항체 및 인간화된 항체에 대해 이미 언급된 바와 같이, 본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는 예를 들면, "클래스 전환", 즉 Fc 부분의 변화 또는 돌연변이(예를 들면, IgG1로부터 IgG4로의 돌연변이 및/또는 IgG1/IgG4 돌연변이)에 의해 특히, C1q 결합 및/또는 FcR 결합과 관련하여 본 발명에 따른 성질을 발생시키도록 불변 영역에서 변경되어 있는 이러한 항체도 포함한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체와 항원의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 이때 각각의 도메인은 3개의 "초가변 영역"(또는 상보성 결정 영역, CDR)에 의해 연결된, 널리 보존되어 있는 서열을 갖는 4개의 골격 영역(FR)을 포함한다. 골격 영역은 베타-시트 입체구조를 채택하고, CDR은 베타-시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각각의 쇄에서 CDR들은 골격 영역에 의해 그들의 3차원적 구조로 유지되고 다른 쇄의 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에 있어서 특히 중요한 역할을 수행하므로 본 발명의 추가 목적을 제공한다(예를 들면, 문헌(Kindt, T.J., et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91) 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 나아가, 특정 항원에 결합하는 항체는, 이 항원에 결합하는 항체의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Portolano, S., et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887) 및 문헌(Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628)을 참조한다.
용어 "상보성 결정 영역" 또는 "초가변 영역"은 본원에서 사용될 때 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격" 또는 "FR" 영역은 본원에서 정의된 "상보성 결정 영역" 잔기 이외의 가변 도메인 영역이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄는 N-말단부터 C-말단까지 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각의 쇄 상의 CDR은 이러한 골격 아미노산에 의해 분리되어 있다. 특히, 중쇄의 CDR3은 항원 결합에 가장 많이 기여하는 영역이다. CDR 영역 및 FR 영역은 문헌(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) NIH Publication No. 91-3242)의 표준 정의에 따라 결정된다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체는 <IGF-1R> 결합 친화성을 증가시키는, <IGF-1R> 항원 결합 부위의 CDR의 친화성 성숙 이외에 "보존적 서열 변경"을 갖는 항체를 포함한다. 이것은 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 본원에서 언급된 특성에 영향을 미치지 않거나 변경시키지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변경을 의미한다. 변경은 당분야에서 공지된 표준 기법, 예컨대, 부위-지정된 돌연변이유발 및 PCR 매개 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 교체되는 아미노산 치환을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당분야에서 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 쓰레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체의 예측된 비-필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리의 또 다른 아미노산 잔기로 교체될 수 있다. 아미노산 치환은 문헌(Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327) 및 문헌(Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033)에 기재된 바와 같이 분자 모델링에 의거한 돌연변이유발에 의해 수행될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "에 결합", "에 특이적으로 결합", "에 결합하는" 또는 "에 특이적으로 결합하는"은 상호교환적으로 사용되고 시험관내 분석, 바람직하게는 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에서 항체와 항원의 에피토프의 결합을 의미한다. "에 결합", "에 특이적으로 결합", "에 결합하는" 또는 "에 특이적으로 결합하는"은 항체/항원 결합 부위가 1.0 x 10-8 M 이하의 결합 친화성(KD) 값, 한 실시양태에서 5.0 x 10-9 M 이하의 KD 값, 한 실시양태에서 2.0 x 10-9 M 내지 1.0 x 10-13 M의 KD 값으로 각각의 항원에 결합한다는 것을 의미한다. 결합 친화성은 용어 ka(항체/항원 복합체로부터 항체의 결합에 대한 속도 상수), kd(해리 상수) 및 KD(kd/ka)에 의해 정의된다. 결합 친화성은 표면 플라스몬 공명 기법(예를 들면, 비아코어(BIAcore, 등록상표), 지이-헬쓰케어(GE-Healthcare), 스웨덴 업살라 소재)으로 측정된다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정인자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프 결정인자는 분자의 화학 활성 표면 기, 예컨대, 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐을 포함하고, 일부 실시양태에서 특정 3차원적 구조 특성 및/또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다. 일부 실시양태에서, 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합체 혼합물에서 그의 표적 항원을 우선적으로 인식할 때 항원에 특이적으로 결합한다고 주장된다.
인간 표피 성장인자 수용체(HER-1 또는 Erb-B1로서도 공지되어 있고, 본원에서 "EGFR"로서 지칭됨)는 c-erbB 원발암유전자에 의해 암호화된 170 kDa의 경막 수용체이고 고유의 티로신 키나제 활성을 나타낸다(Modjtahedi, H., et al., Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235; Herbst, R.S., and Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611). 스위스프롯(SwissProt) 데이터베이스 입력 P00533은 EGFR의 서열(서열번호 75)을 제공한다. 스위스프롯 데이터베이스 입력 번호 P00533-1, P00533-2, P00533-3 및 P00533-4에 의해 확인된 EGFR의 동형체 및 변이체를 포함하나 이들로 한정되지 않는 EGFR의 동형체 및 변이체(예를 들면, 대안적 RNA 전사체, 절두된 버전, 다형체 등)도 존재한다. EGFR은 α), 표피 성장인자(EGF), 형질전이 성장인자-α(TGf-암피레귤린), 헤파린 결합 EGF(hb-EGF), 베타셀룰린 및 에피레귤린을 포함하는 리간드에 결합하는 것으로 공지되어 있다(Herbst, R.S., and Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611; Mendelsohn, J., and Baselga, J., Oncogene 19 (2000) 6550-6565). EGFR은 세포 증식, 분화, 세포 생존, 아폽토시스, 혈관신생, 유사분열유도 및 전이를 조절하는 신호 전달도입 경로의 활성화를 포함하나 이들로 한정되지 않는 티로신-키나제 매개 신호 전달도입 경로를 통해 다수의 세포내 과정을 조절한다(Atalay, G., et al., Ann. Oncology 14 (2003) 1346-1363; Tsao, A.S., and Herbst, R.S., Signal 4 (2003) 4-9; Herbst, R.S., and Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611; Modjtahedi, H., et al., Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235).
인간 인슐린 유사 성장인자 I 수용체(인간 IGF-IR; 동의어 IGF-1R, CD 221 항원)는 경막 단백질 티로신 키나제의 패밀리에 속한다(LeRoith, D., et al., Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163; and Adams, T.E., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063). 스위스프롯 데이터베이스 입력 P08069는 IGF-1R의 서열(서열번호 76)을 제공한다. IGF-IR은 고친화성으로 IGF-I에 결합하고 생체내에서 이 리간드에 대한 생리학적 반응을 개시한다. 그러나, IGF-IR은 약간 더 낮은 친화성으로 IGF-II에도 결합한다. IGF-IR 과다발현은 세포의 신생물 형질전환을 촉진하고, IGF-IR이 세포의 악성 형질전환에 관여하므로 암 치료용 치료제의 개발에 유용한 표적이라는 증거가 존재한다(Adams, T.E., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063).
조성물 및 방법
한 양태에서, 본 발명은 인간 EGFR에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 IGF-1R에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R에 결합하는 이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 3의 CDR3을 포함하고 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 4의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2 및 서열번호 6의 CDR3을 포함하고;
ii) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 9의 CDR1, 서열번호 10의 CDR2 및 서열번호 11의 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 12의 CDR1, 서열번호 13의 CDR2 및 서열번호 14의 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인에 의거한 변경된 항원 결합 부위이고;
이때, 변경된 제2 항원 결합 부위가 상기 CDR들 중 하나 이상의 CDR 내에 하나 이상의 변경을 포함하고;
변경된 제2 항원 결합 부위가 비-변경된 제2 항원 결합 부위에 비해 인간 IGF-1R과의 결합에 대한 결합 친화성의 10배 이상 증가된 KD 값을 갖는, 이중특이적 항체에 부분적으로 의거한다.
"비-변경된 제2 항원 결합 부위"는 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 9의 CDR1, 서열번호 10의 CDR2 및 서열번호 11의 CDR3을 포함하고 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 12의 CDR1, 서열번호 13의 CDR2 및 서열번호 14의 CDR3을 포함한다.
이들 이중특이적 항체는 <IGF-1R> HUMAB 클론 18(서열번호 9 내지 16) 및 인간화된 <EGFR>ICR62(서열번호 1 내지 8)에 의거한, 국제 특허출원 공개 제WO 2010/034441호에 기재된 항-EGFR/항-IGF-1R의 <IGF-1R> 항원 결합 부위의 친화성 성숙을 통해 유도된 증가된 결합 친화성을 갖는 신규 변경된 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체이다.
본 발명의 한 실시양태는 인간 EGFR에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 IGF-1R에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R에 결합하는 이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 3의 CDR3을 포함하고 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 4의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2 및 서열번호 6의 CDR3을 포함하고;
ii) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 9의 CDR1, 서열번호 10의 CDR2 및 서열번호 11의 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 12의 CDR1, 서열번호 13의 CDR2 및 서열번호 14의 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인에 의거한 변경된 항원 결합 부위이고;
이때, 변경된 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인의 상기 CDR들 중 하나 이상의 CDR 내에 하나 이상의 변경을 포함하고;
변경된 제2 항원 결합 부위가 비-변경된 제2 항원 결합 부위에 비해 인간 IGF-1R과의 결합에 대한 결합 친화성의 10배 이상 증가된 KD 값을 갖는, 이중특이적 항체이다.
본 발명의 한 실시양태는 인간 EGFR에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 IGF-1R에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R에 결합하는 이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 3의 CDR3을 포함하고 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 4의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2 및 서열번호 6의 CDR3을 포함하고;
ii) 상기 제2 항원 결합 부위가 서열번호 9의 CDR1, 서열번호 10의 CDR2 및 서열번호 11의 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 12의 CDR1, 서열번호 13의 CDR2 및 서열번호 14의 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인에 의거한 변경된 항원 결합 부위이고;
이때, 변경된 제2 항원 결합 부위가 경쇄 가변 도메인의 상기 CDR들 중 하나 이상의 CDR 내에 하나 이상의 변경을 포함하고;
변경된 제2 항원 결합 부위가 비-변경된 제2 항원 결합 부위에 비해 인간 IGF-1R과의 결합에 대한 결합 친화성의 10배 이상 증가된 KD 값을 갖는, 이중특이적 항체이다.
본원에서 사용된 용어 "상기 CDR들 중 하나 이상의 CDR 내에 하나 이상의 변경"은 (총) 1개 내지 5개(한 실시양태에서 1개 내지 3개, 한 실시양태에서 2개 내지 5개, 일부 실시양태에서 2개 또는 3개)의 변경, 예컨대, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 의미하고, 이때 각각의 CDR은 서로 독립적으로 0개 내지 3개의 변경을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 변경은 아미노산 치환이다.
본원에서 사용된 용어 "비-변경된 항원 결합 부위에 비해 결합 친화성의 10배 이상 증가된 KD 값"은 변경된 친화성 성숙된 <IGF-1R> 항원 결합 부위의 인간 IGF-1R에 대한 결합 친화성의 KD 값이 <IGF-1R> HUMAB 클론 18(서열번호 9 내지 16)의 비-변경된(= 모) 항원 결합 부위에 비해 10배 이상 증가되었다는 것을 의미한다. 결합 친화성의 증가를 측정하기 위해, 변경된 친화성 성숙된 <IGF-1R> 항원 결합 부위 및 비-변경된 모 <IGF-1R> HUMAB 클론 18(서열번호 9 내지 16)의 KD 값을 실시예 1에 상세히 기재된 바와 같이 25℃에서 표면 플라스몬 공명 분석에서 그들의 Fab 단편을 통해 측정한다. KD 값의 증가는 비 KD(비-변경된)/KD(변경된)로서 계산된다.
본 발명의 한 실시양태는 인간 EGFR에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 IGF-1R에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R에 결합하는 이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위가 서열번호 7의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 8의 경쇄 가변 도메인을 포함하고;
ii) 상기 제2 항원 결합 부위가 서열번호 15의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 16의 경쇄 가변 도메인에 근거한 변경된 항원 결합 부위이고;
이때, 변경된 제2 항원 결합 부위가 상기 CDR들 중 하나 이상의 CDR 내에 하나 이상의 변경을 포함하고;
변경된 제2 항원 결합 부위가 비-변경된 제2 항원 결합 부위에 비해 인간 IGF-1R과의 결합에 대한 결합 친화성의 10배 이상 증가된 KD 값을 갖는, 이중특이적 항체이다.
"비-변경된 항원 결합 부위"는 서열번호 15의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 16의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태는 인간 EGFR에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 IGF-1R에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R에 결합하는 이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위가 서열번호 7의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 8의 경쇄 가변 도메인을 포함하고;
ii) 상기 제2 항원 결합 부위가 서열번호 15의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 16의 경쇄 가변 도메인에 근거한 변경된 항원 결합 부위이고;
이때, 변경된 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인의 상기 CDR들 중 하나 이상의 CDR 내에 하나 이상의 변경을 포함하고;
변경된 제2 항원 결합 부위가 비-변경된 제2 항원 결합 부위에 비해 인간 IGF-1R과의 결합에 대한 결합 친화성의 10배 이상 증가된 KD 값을 갖는, 이중특이적 항체이다.
본 발명의 한 실시양태는 인간 EGFR에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 IGF-1R에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R에 결합하는 이중특이적 항체로서,
i) 상기 제1 항원 결합 부위가 서열번호 7의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 8의 경쇄 가변 도메인을 포함하고;
ii) 상기 제2 항원 결합 부위가 서열번호 15의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 16의 경쇄 가변 도메인에 근거한 변경된 항원 결합 부위이고;
이때, 변경된 제2 항원 결합 부위가 경쇄 가변 도메인의 상기 CDR들 중 하나 이상의 CDR 내에 하나 이상의 변경을 포함하고;
변경된 제2 항원 결합 부위가 비-변경된 제2 항원 결합 부위에 비해 인간 IGF-1R과의 결합에 대한 결합 친화성의 10배 이상 증가된 KD 값을 갖는, 이중특이적 항체이다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 인간 EGFR에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 IGF-1R에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R에 결합하는 이중특이적 항체로서,
i) 제1 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 3의 CDR3을 포함하고 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 4의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2 및 서열번호 6의 CDR3을 포함하고;
ii) a) 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 17의 CDR1, 서열번호 18의 CDR2 및 서열번호 19의 CDR3을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 20의 CDR1, 서열번호 21의 CDR2 및 서열번호 22의 CDR3을 포함하거나;
b) 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 25의 CDR1, 서열번호 26의 CDR2 및 서열번호 27의 CDR3을 포함하고 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 28의 CDR1, 서열번호 29의 CDR2 및 서열번호 30의 CDR3을 포함하거나;
c) 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 33의 CDR1, 서열번호 34의 CDR2 및 서열번호 35의 CDR3을 포함하고 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 36의 CDR1, 서열번호 37의 CDR2 및 서열번호 38의 CDR3을 포함하거나;
d) 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 41의 CDR1, 서열번호 42의 CDR2 및 서열번호 43의 CDR3을 포함하고 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 44의 CDR1, 서열번호 45의 CDR2 및 서열번호 46의 CDR3을 포함하거나;
e) 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 49의 CDR1, 서열번호 50의 CDR2 및 서열번호 51의 CDR3을 포함하고 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 52의 CDR1, 서열번호 53의 CDR2 및 서열번호 54의 CDR3을 포함하는 것
을 특징으로 하는 이중특이적 항체이다.
본 발명의 한 실시양태는 인간 EGFR에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 IGF-1R에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R에 결합하는 이중특이적 항체로서,
i) 제1 항원 결합 부위가 서열번호 7의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 8의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하고;
ii) a) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 23의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 24의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하거나;
b) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 31의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 32의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하거나;
c) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 39의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 40의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하거나;
d) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 47의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 48의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하거나;
e) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 55의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 56의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하는 것
을 특징으로 하는 이중특이적 항체이다.
본 발명의 한 실시양태는 인간 EGFR에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 IGF-1R에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R에 결합하는 이중특이적 항체로서,
i) 제1 항원 결합 부위가 서열번호 7의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 8의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하고;
ii) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 23의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 24의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하는 것
을 특징으로 하는 이중특이적 항체이다.
본 발명의 한 실시양태는 인간 EGFR에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 IGF-1R에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R에 결합하는 이중특이적 항체로서,
i) 제1 항원 결합 부위가 서열번호 7의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 8의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하고;
ii) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 31의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 32의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하는 것
을 특징으로 하는 이중특이적 항체이다.
본 발명의 한 실시양태는 EGFR에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 IGF-1R에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R에 결합하는 이중특이적 항체로서,
i) 제1 항원 결합 부위가 서열번호 7의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 8의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하고;
ii) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 39의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 40의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하는 것
을 특징으로 하는 이중특이적 항체이다.
본 발명의 한 실시양태는 인간 EGFR에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 IGF-1R에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R에 결합하는 이중특이적 항체로서,
i) 제1 항원 결합 부위가 서열번호 7의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 8의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하고;
ii) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 47의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 48의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하는 것
을 특징으로 하는 이중특이적 항체이다.
본 발명의 한 실시양태는 인간 EGFR에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 IGF-1R에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R에 결합하는 이중특이적 항체로서,
i) 제1 항원 결합 부위가 서열번호 7의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 8의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하고;
ii) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 55의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 56의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하는 것
을 특징으로 하는 이중특이적 항체이다.
이러한 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체는 매우 귀중한 성질, 예컨대, 매우 효과적인 종양 세포 생존력 억제 및 종양 성장 억제, 및 IGF-1R 및 IGF-1R 신호전달 둘다의 억제(예를 들면, 인산화)를 갖는다. 상기 항체는 귀중한 결합 성질, 예컨대, 높은 결합 친화성 및 효율적인 세포 결합을 갖는다. 상기 항체는 특히 당조작되어(GE) 있을 때 높은 ADCC 활성을 보인다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 IGF-1R 인산화 및 EGFR 인산화를 억제한다(실시예 4 참조). 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 0.10 nM 이하의 IC50으로 A549 암세포에서 IGF-1R 인산화를 억제한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 0.10 nM 이하의 IC50으로 BxPC3 암세포에서 IGF-1R 인산화를 억제한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 0.10 nM 이하의 IC50으로 TC-71 암세포에서 IGF-1R 인산화를 억제한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 0.23 nM 이하의 IC50으로 A549 암세포에서 EGFR 인산화를 억제한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 0.90 nM 이하의 IC50으로 BxPC3 암세포에서 EGFR 인산화를 억제한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 암세포 증식 또는 종양 세포 증식을 억제한다(실시예 5 참조). 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 0.20 nM 이하의 IC50(바람직하게는 0.15 nM 이하의 IC50)으로 A549 암세포의 증식을 억제한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 0.10 nM 이하의 IC50(바람직하게는 0.05 nM 이하의 IC50)으로 RD-ES 암세포의 증식을 억제한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 65% 이하(바람직하게는 50% 내지 5%)의 양의 푸코스로 당조작되어 있고 암세포에서 ADCC를 유도한다(실시예 7 참조). 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 65% 이하(바람직하게는 50% 내지 5%)의 양의 푸코스로 당조작되어 있고 0.10 nM 이하의 EC50으로 H460M2 암세포에서 ADCC를 유도한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 65% 이하(바람직하게는 50% 내지 5%)의 양의 푸코스로 당조작되어 있고 0.15 nM 이하의 EC50으로 H322M 암세포에서 ADCC를 유도한다. 따라서, 본 발명의 이중특이적 항체는 예를 들면, 암의 진단 또는 치료에 유용하다.
한 실시양태에서, 상기 이중특이적 항체는 a) 국제 특허출원 공개 제WO 2009/080251호, 제WO 2009/080252호 또는 제WO 2009/080253호, 또는 문헌(Schaefer et al, PNAS 108 (2011) 11187-11192)(도메인 교환된 항체 - 실시예 2 참조 - 서열번호 63 내지 66 또는 서열번호 67 내지 70의 교차Mab(CM)), b) 유럽 특허출원 제10003270.5호(실시예 2 참조, 서열번호 57 내지 59 또는 서열번호 60 내지 62의 OA-scFab 참조), 또는 c) 문헌(Ridgway, J.B., Protein Eng. 9 (1996) 617-621); 국제 특허출원 공개 제WO 96/027011호, 문헌(Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681), 문헌(Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) 및 유럽 특허출원 공개 제1 870 459 A1호에 기재된 바와 같은 포맷을 사용하는 2가 항체이다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 서열번호 57, 서열번호 58 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 서열번호 60, 서열번호 61 및 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65 및 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69 및 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 이들 아미노산 서열들은 a) <IGF-1R> F13B5(서열번호 17 내지 24) 또는 <IGF-1R> L31D11(서열번호 41 내지 48)(둘다 친화성 성숙된 HUMAB <IGF-1R> 클론 18 항체임), 및 b) 인간화된 <EGFR>ICR62(서열번호 1 내지 8; 국제 특허출원 공개 제WO 2006/082515호 또한 참조, <EGFR>ICR62로서도 약칭됨)의 항원 결합 부위에 의거한다.
한 실시양태에서, 상기 이중특이적 항체는 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 2010/112193호에 기재된 바와 같이 2개의 수용체 EGFR 및 IGF-1R 중 하나에 특이적으로 결합하고 한 중쇄의 한 C-말단 또는 N-말단에서만 상기 2개의 수용체 EGFR 및 IGF-1R 중 나머지 수용체에 특이적으로 결합하는 scFab 단편이 융합되어 있는 전장 항체에 의거한 포맷(놉스-인투-홀스(knobs-into-holes) 기술을 포함함), 또는 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 2010/115589호에 기재된 바와 같이 2개의 수용체 EGFR 및 IGF-1R 중 하나에 특이적으로 결합하고 한 중쇄의 한 C-말단에서 VH 또는 VH-CH1 단편이 융합되어 있고 제2 중쇄의 다른 C-말단에서 상기 2개의 수용체 EGFR 및 IGF-1R 중 나머지 수용체에 특이적으로 결합하는 VL 또는 VL-CL 단편이 융합되어 있는 전장 항체에 의거한 포맷(놉스-인투-홀스 기술을 포함함)을 사용하는 3가 항체이다. 다른 3가 포맷은 예를 들면, 유럽 특허출원 제10173914.2호에 기재되어 있다. 놉스-인투-홀스 기술 및 이의 변경에 대해서는 문헌(Ridgway, J.B., Protein Eng. 9 (1996) 617-621), 국제 특허출원 공개 제WO 96/027011호, 문헌(Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681), 문헌(Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) 및 유럽 특허출원 공개 제1 870 459 A1호도 참조한다.
한 실시양태에서, 상기 이중특이적 항체는 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 2007/024715호, 제WO 2007/109254호, 제WO 2010/112193호, 제WO 2010/145792호 또는 제WO2010/145793호에 기재된 바와 같은 포맷을 사용하는 4가 항체이다(예를 들면, 실시예 2의 Tv-L31D11-GA201 및 Tv-F13B5-GA201 참조).
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 서열번호 71 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 서열번호 73 및 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 이들 아미노산 서열들은 a) <IGF-1R> F13B5(서열번호 17 내지 24) 또는 <IGF-1R> L31D11(서열번호 41 내지 48)(둘다 친화성 성숙된 HUMAB <IGF-1R> 클론 18 항체임), 및 b) 인간화된 <EGFR>ICR62(서열번호 1 내지 8; 국제 특허출원 공개 제WO 2006/082515호 참조, <EGFR>ICR62로서 약칭됨)의 항원 결합 부위에 근거한다.
추가 실시양태에서, 상기 이중특이적 항체는 불변 영역이 인간으로부터 유래되는 것을 특징으로 한다.
본원에서 사용된 용어 "불변 영역"은 가변 영역을 제외한 항체의 도메인들 전부를 의미한다. 불변 영역은 항원의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. 항체는 그의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라 클래스 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 분류되고, 이들 중 몇몇은 서브클래스, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 항체의 상이한 클래스들에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다. 모든 5종의 항체 클래스들에서 발견될 수 있는 경쇄 불변 영역은 κ(카파) 및 λ(람다)로 지칭된다. 본원에서 달리 특정되어 있지 않은 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌(Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242)에 기재된 바와 같이 EU 지수로도 지칭되는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
본원에서 사용된 용어 "인간으로부터 유래된 불변 영역"은 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 항체의 불변 중쇄 영역, 및/또는 불변 경쇄 카파 또는 람다 영역을 의미한다. 이러한 불변 영역은 최신 기술에서 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 카바트 이.에이.(Kabat, E.A.)에 의해 기재되어 있다(문헌(Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242), 문헌(Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218) 및 문헌(Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788) 참조). IgG4 서브클래스의 항체는 감소된 Fc 수용체(Fc 감마 RIIIa) 결합을 보이지만, 다른 IgG 서브클래스의 항체들은 강한 결합을 보인다. 그러나, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297(Fc 탄수화물의 상실), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435도 변경된 경우 감소된 Fc 수용체 결합을 제공하는 잔기이다(Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; 유럽 특허 제0 307 434호).
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 인간으로부터 유래된 불변 영역을 포함하고, 상기 불변 영역이 인간 IgG 서브클래스의 불변 영역임을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 인간으로부터 유래된 불변 영역을 포함하고 상기 불변 영역이 인간 IgG1 서브클래스의 불변 영역임을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 인간으로부터 유래된 불변 영역을 포함하고 상기 불변 영역이 인간 IgG2 서브클래스의 불변 영역임을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 인간으로부터 유래된 불변 영역을 포함하고 상기 불변 영역이 인간 IgG3 서브클래스의 불변 영역임을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 인간으로부터 유래된 불변 영역을 포함하고 상기 불변 영역이 인간 IgG4 서브클래스의 불변 영역임을 특징으로 한다.
전형적인 인간 불변 영역은 서열번호 77 내지 81에 표시되어 있다.
항체의 불변 영역은 ADCC(항체 의존적 세포 매개 세포독성) 및 CDC(보체 의존적 세포독성)에 직접적으로 관여한다. 보체 활성화(CDC)는 보체 인자 C1q와 대다수의 IgG 항체 서브클래스의 불변 영역의 결합에 의해 개시된다. C1q와 항체의 결합은 소위 결합 부위에서 정의된 단백질-단백질 상호작용에 의해 야기된다. 이러한 불변 영역 결합 부위는 최신 기술에서 공지되어 있고 예를 들면, 문헌(Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560); 문헌(Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917); 문헌(Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344); 문헌(Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004); 문헌(Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184); 문헌(Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168); 문헌(Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324)); 및 유럽 특허 제0 307 434호에 기재되어 있다. 이러한 불변 영역 결합 부위는 예를 들면, 아미노산 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329(상기 카바트의 EU 지수에 따른 넘버링)를 특징으로 한다.
용어 "항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)"은 이펙터 세포의 존재 하에서 본 발명에 따른 항체 의한 인간 표적 세포의 용해를 의미한다. ADCC는 바람직하게는 IGF-1R 및 EGFR 발현 세포의 제제를 이펙터 세포, 예컨대, 새로 단리된 PBMC, 또는 버피 코트로부터 정제된 이펙터 세포, 예컨대, 단핵세포 또는 자연 살해(NK) 세포 또는 영구적으로 생장하는 NK 세포주의 존재 하에서 본 발명에 따른 항체로 처리함으로써 측정된다.
용어 "보체 의존적 세포독성(CDC)"은 보체 인자 C1q와 대다수의 IgG 항체 서브클래스의 Fc 부분의 결합에 의해 개시된 과정을 의미한다. C1q와 항체의 결합은 소위 결합 부위에서 정의된 단백질-단백질 상호작용에 의해 야기된다. 이러한 Fc 부분 결합 부위는 최신 기술에서 공지되어 있다(상기 참조). 이러한 Fc 부분 결합 부위는 예를 들면, 아미노산 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329(카바트의 EU 지수에 따른 넘버링)를 특징으로 한다. 서브클래스 IgG1, IgG2 및 IgG3의 항체는 통상적으로 C1q 및 C3 결합을 포함하는 보체 활성화를 보이는 반면, IgG4는 보체 시스템을 활성화시키지 않고 C1q 및/또는 C3에 결합하지 않는다.
단일클론 항체의 세포 매개 이펙터 작용은 문헌(Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180) 및 미국 특허 제6,602,684호에 기재된 바와 같이 그의 올리고사카라이드 성분을 조작함으로써 향상될 수 있다. 가장 통상적으로 사용되는 치료 항체인 IgG1 유형의 항체는 각각의 CH2 도메인 내의 Asn297에서 보존된 N-연결된 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297에 부착된 2개의 복합체 바이안테나리(biantennary) 올리고사카라이드가 CH2 도메인들 사이에 묻혀 폴리펩티드 골격과의 광범위한 접촉을 형성하고, 그들의 존재는 항체가 이펙터 작용, 예컨대, 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 매개하는 데에 필수적이다(Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., and Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32). 문헌(Umana, P., et al. Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180) 및 국제 특허출원 공개 제WO 99/54342호는 이등분된 올리고사카라이드의 형성을 촉매작용하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III("GnTIII")을 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 과다발현시키는 것이 항체의 시험관내 ADCC 활성을 유의하게 증가시킨다는 것을 보여주었다. Asn297 탄수화물의 조성의 변경 또는 그의 제거는 FcγR 및 C1q와의 결합에도 영향을 미친다(Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294; Mimura, Y., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547; Radaev, S., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740; Simmons, L.C., et al., J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147).
단일클론 항체의 세포 매개 이펙터 작용을 향상시키는 방법은 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 2005/044859호, 제WO 2004/065540호 및 제WO2007/031875호, 문헌(Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180), 국제 특허출원 공개 제WO 99/54342호, 제WO 2005/018572호, 제WO 2006/116260호, 제WO 2006/114700호, 제WO 2004/065540호, 제WO 2005/011735호, 제WO 2005/027966호 및 제WO 1997/028267호, 미국 특허출원 공개 제2006/0134709호, 제2005/0054048호 및 제2005/0152894호, 국제 특허출원 공개 제WO 2003/035835호 및 제WO 2000/061739호, 또는 예를 들면, 문헌(Niwa, R., et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160), 문헌(Shinkawa, T., et al, J. Biol. Chem. 278 (2003) 3466-3473), 국제 특허출원 공개 제WO 03/055993호, 및 미국 특허출원 공개 제2005/0249722호에 보고되어 있다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 (IgG1 또는 IgG3의 Fc 부분을 포함하는 경우) Asn297(카바트에 따른 넘버링)에서 당쇄로 글리코실화되고, 이에 의해 상기 당쇄 내의 푸코스의 양은 65% 이하이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 당쇄 내의 푸코스의 양은 5% 내지 65%이고, 한 실시양태에서 20% 내지 50%이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 당쇄 내의 푸코스의 양은 0% 내지 5%이다. 본 발명에 따른 "Asn297"은 Fc 영역 내의 약 위치 297(카바트에 따른 넘버링)에 위치하는 아미노산 아스파라긴을 의미한다. 항체의 소수 서열 변경에 의거할 때, Asn297은 위치 297의 몇몇 아미노산(통상적으로 +3 이하의 아미노산) 업스트림 또는 다운스트림, 즉 위치 294 내지 300에 위치할 수도 있다.
본 발명에 따른 글리코실화된 항체의 한 실시양태에서, IgG 서브클래스는 인간 IgG1 서브클래스 또는 IgG3 서브클래스이다. 추가 실시양태에서, 상기 당쇄 내에서 N-글리콜릴뉴라민산(NGNA)의 양은 1% 이하이고/이거나 N-말단 α-1,3-갈락토스의 양은 1% 이하이다. 바람직하게는, 상기 당쇄는 CHO 세포에서 재조합적으로 발현된 항체의 Asn297에 부착된 N-연결된 글리칸의 특성을 보인다.
용어 "상기 당쇄는 CHO 세포에서 재조합적으로 발현된 항체의 Asn297에 부착된 N-연결된 글리칸의 특성을 보인다"는 것은 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 불변 영역의 Asn297에 존재하는 당쇄가 푸코스 잔기를 제외하고 비-변경된 CHO 세포, 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 2006/103100호에 보고된 비-변경된 CHO 세포에서 발현된 상기 항체의 구조 및 당 잔기 서열과 동일한 구조 및 당 잔기 서열을 갖는다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "NGNA"는 당 잔기 N-글리콜릴뉴라민산을 의미한다.
인간 IgG1 또는 IgG3의 글리코실화는 2개 이하의 Gal 잔기로 종결된 코어 푸코실화된 바이안테나리 복합체 올리고사카라이드 글리코실화로서 Asn297에서 발생한다. IgG1 또는 IgG3 서브클래스의 인간 불변 중쇄 영역은 문헌(Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) NIH Publication No 91-3242), 문헌(Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361) 및 문헌(Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527)에 상세히 보고되어 있다. 이들 구조들은 말단 Gal 잔기의 양에 따라 GO, G1(α-1,6- 또는 α-1,3-) 또는 G2 글리칸 잔기로서 표기된다. 항체 Fc 부분의 CHO 유형 글리코실화는 예를 들면, 문헌(Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207)에 기재되어 있다. 비-당변경된 CHO 숙주 세포에서 재조합적으로 발현된 항체는 통상적으로 85% 이상의 양으로 Asn297에서 푸코실화되어 있다. 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 불변 영역의 변경된 올리고사카라이드는 하이브리드 또는 복합체일 수 있다. 바람직하게는, 이등분된 감소된/비-푸코실화된 올리고사카라이드는 하이브리드이다. 또 다른 실시양태에서, 이등분된 감소된/비-푸코실화된 올리고사카라이드는 복합체이다.
본 발명에 따라, "푸코스의 양"은 실시예 9에 기재된 바와 같이 역상 UPLC(RP-UPLC)에 의해 측정되고 평균 값으로서 계산된, Asn297에 부착된 모든 당구조들(복합체 구조, 하이브리드 구조 및 고만노스 구조)의 합계와 관련된, Asn297에 존재하는 당쇄 내의 상기 당의 양을 의미한다. 샘플의 비-Fuc 함량의 상대적인 수준을 정량하기 위해, 푸코스를 갖지 않는 올리고사카라이드를 나타내는 모든 피크들의 면적을 요약하고 모든 올리고사카라이드 피크들의 총 피크 면적과 관련시켰다.
본 발명에 따른 모든 이중특이적 항체의 경우, "GE"는 당조작된 것을 의미하고, "WT"(야생형)는 당조작되지 않은 것을 의미한다.
본 발명의 한 추가 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 ADCC 및/또는 CDC를 갖는 항체이고, Fc 감마 수용체 및/또는 보체 인자 C1q에 결합하는, 인간으로부터 유래된 IgG1 또는 IgG3(바람직하게는 IgG1) 서브클래스의 불변 영역을 갖는다. Fc 수용체 및/또는 보체 인자 C1q에 결합하는 이러한 항체는 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 유발한다.
재조합 방법 및 조성물
항체는 예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 사용함으로써 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체를 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들면, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 암호화할 수 있다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들면, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한 이러한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터, 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다(예를 들면, 이러한 벡터로 형질전환되어 있다). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵세포, 예를 들면, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프 세포(예를 들면, Y0, NS0, Sp2/0 세포)이다. 한 실시양태에서, 항-EGFR/항-IGF-1R의 제조 방법이 제공되고, 이때 상기 방법은 상기 제공된 바와 같은 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 상기 항체의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계, 및 임의적으로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
항-EGFR/항-IGF-1R의 재조합 제조를 위해, 예를 들면, 전술된 바와 같은 항체를 암호화하는 핵산을 단리하고 숙주 세포에서의 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입한다. 이러한 핵산은 통상적인 절차를 이용함으로써(예를 들면, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다.
항체 암호화 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵세포 또는 진핵세포를 포함한다. 예를 들면, 항체는 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우 세균에서 제조될 수 있다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는 예를 들면, 미국 특허 제5,648,237호, 제5,789,199호 및 제5,840,523호를 참조한다(이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현이 기재되어 있는 문헌(Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254) 또한 참조). 발현 후, 항체는 가용성 분획으로 세균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 더 정제될 수 있다.
원핵생물 이외에, 진핵 미생물, 예컨대, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 있어 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생성하는 진균 및 효모 균주를 포함하는 사상 진균 또는 효모가 항체 암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌(Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414) 및 문헌(Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215)을 참조한다.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터도 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주들이 동정되어 있다.
식물 세포 배양물도 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, (형질전환 식물에서 항체를 생성하기 위한 플랜트바디스(PLANTIBODIES, 상표) 기술이 기재되어 있는) 미국 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호 및 제6,417,429호를 참조한다.
척추동물 세포도 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액으로 생장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 배아 신장 세포주(예를 들면, 문헌(Graham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74)에 기재된 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(예를 들면, 문헌(Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252)에 기재된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유선 종양(MMT 060562); 예를 들면, 문헌(Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68)에 기재된 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR-CHO 세포를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 및 골수종 세포주, 예컨대, Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 제조에 적합한 일부 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는 예를 들면, 문헌(Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268)을 참조한다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체는 재조합 수단에 의해 제조된다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 본 발명에 따른 항체를 암호화하는 핵산이고, 추가 양태는 본 발명에 따른 항체를 암호화하는 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포이다. 재조합 제조 방법은 최신 기술에서 널리 공지되어 있고 원핵세포 및 진핵세포에서 단백질을 발현시키는 단계, 후속적으로 상기 항체를 단리하는 단계 및 통상적으로 약학적으로 허용가능한 순도까지 정제하는 단계를 포함한다. 숙주 세포에서 상기 언급된 항체를 발현시키기 위해, 각각의 변경된 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 핵산을 표준 방법으로 발현 벡터 내로 삽입한다. 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 세포, 예컨대, CHO 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, PER.C6 세포, 효모 또는 이. 콜라이 세포에서 발현을 수행하고, 상기 항체를 세포(상청액 또는 용해 후 세포)로부터 회수한다. 항체의 재조합 제조에 대한 일반적인 방법은 최신 기술에서 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 평론 논문(Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202); Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880)에 기재되어 있다.
이중특이적 항체를 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예컨대, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피로 배양 배지로부터 적절하게 분리한다. 단일클론 항체를 암호화하는 DNA 및 RNA를 통상적인 절차를 이용하여 용이하게 단리하고 서열분석한다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA 및 RNA의 공급원으로서 작용할 수 있다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 내로 삽입할 수 있고, 그 후 상기 발현 벡터를, 면역글로불린 단백질을 달리 생성하지 않는 숙주 세포, 예컨대, HEK293 세포, CHO 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜 숙주 세포에서 재조합 단일클론 항체의 합성을 달성한다.
본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 발명에 따른 항체를 발생시키도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 의미한다. 한 실시양태에서, HEK293 세포 및 CHO 세포는 숙주 세포로서 사용된다. 본원에서 사용된 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 모든 이러한 표기들은 자손을 포함한다. 따라서, 용어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 일차 대상 세포 및 전달의 수와 관계없이 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 모든 자손은 의도적 또는 우발적 돌연변이로 인해 DNA 함량 면에서 정확히 동일하지 않을 수 있다는 것도 이해된다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝된 기능 또는 생물학적 활성과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다.
NS0 세포에서의 발현은 예를 들면, 문헌(Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123) 및 문헌(Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270)에 기재되어 있다. 일시적 발현은 예를 들면, 문헌(Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 E9 (2002))에 기재되어 있다. 가변 도메인의 클로닝은 문헌(Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837), 문헌(Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289) 및 문헌(Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87)에 기재되어 있다. 바람직한 일시적 발현 시스템(HEK293)은 문헌(Schlaeger, E.-J., and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83) 및 문헌(Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199)에 기재되어 있다.
원핵생물에 적합한 조절 서열은 예를 들면, 프로모터, 임의적으로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여 있을 때 "작동가능하게 연결된"다. 예를 들면, 전구서열 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구단백질로서 발현되는 경우 상기 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되어 있거나; 프로모터 또는 인핸서는 암호화 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 상기 암호화 서열에 작동가능하게 연결되어 있거나; 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 위치되어 있는 경우 암호화 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되어 있는 DNA 서열들이 인접하여 존재하고 분비 리더의 경우 인접하여 판독 프레임으로 존재한다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하여 존재할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어답터 또는 연결제가 통상적인 관행에 따라 사용된다.
감소된 양의 푸코스를 갖는 본 발명에 따른 항체는 GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드, 및 본 발명에 따라 Fc 영역 내의 올리고사카라이드를 푸코실화하는 양으로 ManII 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 발현하도록 조작된 당변경된 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 한 실시양태에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드이다. 대안적으로, 숙주 세포의 α1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성은 당변경된 숙주 세포를 발생시키도록 미국 특허 제6,946,292호에 따라 감소될 수 있거나 제거될 수 있다. 항체 푸코실화의 양은 예를 들면, 발효 조건에 의해, 또는 상이한 푸코실화 양을 갖는 2개 이상의 항체의 조합에 의해 미리 측정될 수 있다.
감소된 양의 푸코스를 갖는 본 발명에 따른 항체는 하기 단계들을 포함하는 방법에 의해 숙주 세포에서 제조될 수 있다: (a) 상기 항체의 제조를 허용하고 상기 항체의 Fc 영역 상에 존재하는 올리고사카라이드의 푸코실화를 본 발명에 따른 양으로 허용하는 조건 하에서 GnTIII 활성 및/또는 ManII 활성을 갖는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 조작된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 항체를 단리하는 단계. 한 실시양태에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드는 바람직하게는 GnTIII의 촉매 도메인; 및 만노시다제 II의 국소화 도메인, β(1,2)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 I("GnTI")의 국소화 도메인, 마모시다제 I의 국소화 도메인, β(1,2)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 II("GnTII")의 국소화 도메인 및 α-1,6 코어 푸코실트랜스퍼라제의 국소화 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 이종 골지(Golgi) 체류 폴리펩티드의 골지 국소화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 골지 국소화 도메인은 만노시다제 II 또는 GnTI로부터 유래된다.
본원에서 사용된 "GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드"는 N-아세틸글루코스아민(GlcNAc) 잔기를 N-연결된 올리고사카라이드의 트라이만노실 코어의 β-연결된 만노사이드에 β-1,4 연결로 첨가하는 것을 촉매작용할 수 있는 폴리펩티드를 의미한다. 이것은 특정 생물학적 분석에서 측정되었을 때 β-1,4-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III(국제 생화학 및 분자생물학 연합의 명명위원회(NC-IUBMB)에 따라 β-1,4-만노실-당단백질 4-베타-N-아세틸글루코스아미닐-트랜스퍼라제(EC 2.4.1.144)로서도 공지되어 있음)의 활성과 유사한(그러나, 반드시 동일할 필요는 없는) 효소 활성을 용량 의존적으로 또는 비의존적으로 나타내는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 용량 의존성이 존재하는 경우, 상기 효소 활성은 GnTIII과 비교되었을 때 GnTIII의 효소 활성과 동일할 필요는 없고 오히려 주어진 활성에서의 용량 의존성과 실질적으로 유사하다(즉, 후보 폴리펩티드는 GnTIII에 비해 상대적으로 더 높은 활성 또는 약 25배 이하만큼 더 낮은, 바람직하게는 약 10배 이하만큼 더 낮은 활성, 가장 바람직하게는 약 3배 이하만큼 더 낮은 활성을 나타낼 것이다). 본원에서 사용된 용어 "골지 국소화 도메인"은 폴리펩티드를 골지 복합체 내의 위치에 고착시키는 것을 담당하는 골지 체류 폴리펩티드의 아미노산 서열을 의미한다. 일반적으로, 국소화 도메인은 효소의 아미노 말단 "꼬리"를 포함한다.
감소된 양의 푸코스를 갖는 본 발명에 따른 항체의 제조를 위해, 변경된 당형태를 갖는 항체의 제조를 가능하게 하도록 조작될 수 있는 숙주 세포도 사용될 수 있다. 이러한 숙주 세포는 GnTIII 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 증가된 수준으로 발현하도록 더 조작되어 있다. CHO 세포는 이러한 숙주 세포로서 바람직하다. 증가된 ADCC를 갖는 항체 조성물을 생성하는 세포도 미국 특허 제6,946,292호에 보고되어 있다.
세포 성분 또는 다른 오염물질, 예를 들면, 다른 세포 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당분야에서 잘 공지되어 있는 기타 기법을 포함하는 표준 기법으로 항체의 정제를 수행한다. 문헌(Ausubel, F., et al., (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987))을 참조한다. 상이한 방법들, 예컨대, 미생물 단백질을 사용하는 친화성 크로마토그래피(예를 들면, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피(예를 들면, 양이온 교환(카복시메틸 수지), 음이온 교환(아미노 에틸 수지) 및 혼합 방식 교환), (예를 들면, β-머캡토에탄올 또는 다른 SH 리간드를 사용하는) 티오친화성 흡착, (예를 들면, 페닐-세파로스, 아자-아레노친화성 수지 또는 m-아미노페닐보론산을 사용하는) 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피, (예를 들면, Ni(II) 및 Cu(II) 친화성 물질을 사용하는) 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 전기영동 방법(예컨대, 겔 전기영동, 모세관 전기영동)이 잘 확립되어 있고 단백질 정제를 위해 널리 이용된다(문헌(Viyalakshmi, M., A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102)).
본원에서 사용된 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 모든 이러한 표기들은 자손을 포함한다. 따라서, 용어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 일차 대상 세포 및 전달의 수와 관계없이 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 모든 자손은 의도적 또는 우발적 돌연변이로 인해 DNA 함량 면에서 정확히 동일하지 않을 수 있다는 것도 이해된다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝된 기능 또는 생물학적 활성과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다. 상이한 표기가 의도되는 경우, 그것은 내용으로부터 명확할 것이다.
본원에서 사용된 용어 "형질전환"은 숙주 세포 내로의 벡터/핵산의 전달 과정을 의미한다. 가공할 세포벽 차단막을 갖지 않는 세포가 숙주 세포로서 사용되는 경우, 형질감염은 예를 들면, 문헌(Graham, F.L., and Van der Eb, A.J., Virology 52 (1973) 456-467)에 기재된 바와 같은 인산칼슘 침전 방법에 의해 수행된다. 그러나, DNA를 세포 내로 도입하는 다른 방법, 예컨대, 핵 주입 또는 원형질체 융합도 이용될 수 있다. 원핵세포, 또는 실질적인 세포벽 구축물을 함유하는 세포가 사용되는 경우, 예를 들면, 한 형질감염 방법은 문헌(Cohen, S.N., et al, PNAS. 69 (1972) 2110-2114)에 기재된 바와 같이 염화칼슘을 이용하는 칼슘 처리이다.
본원에서 사용된 "발현"은 핵산이 mRNA로 전사되는 과정, 및/또는 그 후 전사된 mRNA(전사체로도 지칭됨)가 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 의미한다. 전사체 및 암호화된 폴리펩티드는 유전자 생성물로서 총칭된다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래되는 경우, 진핵세포에서의 발현은 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
"벡터"는 삽입된 핵산 분자를 숙주 세포 내로 및/또는 숙주 세포 사이에 전달하는 핵산 분자, 특히 자가 복제 핵산 분자이다. 상기 용어는 주로 세포 내로의 DNA 또는 RNA의 삽입(예를 들면, 염색체 삽입)을 담당하는 벡터, 주로 DNA 또는 RNA의 복제를 담당하는 복제 벡터, 및 DNA 또는 RNA의 전사 및/또는 번역을 담당하는 발현 벡터를 포함한다. 기재된 기능들 중 하나 초과의 기능을 제공하는 벡터도 포함된다.
"발현 벡터"는 적절한 숙주 세포 내로 도입되었을 때 폴리펩티드로 전사되고 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. "발현 시스템"은 통상적으로 원하는 발현 생성물을 생성하도록 작용할 수 있는 발현 벡터를 포함하는 적합한 숙주 세포를 의미한다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 예를 들면, 전기영동(예를 들면, SDS-PAGE, 등전점 포커싱(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되었을 때 95% 또는 99% 초과의 순도까지 정제된다. 항체 순도 평가 방법의 검토를 위해서는 예를 들면, 문헌(Flatman, S., et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87)을 참조한다.
면역접합체
본 발명은 하나 이상의 세포독성제, 예컨대, 화학치료제 또는 화학치료 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들면, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물로부터 유래된 효소 활성 독소, 또는 이들의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된 본 발명에 따른 항-EGFR/항-IGF-1R 이중특이적 항체를 포함하는 면역접합체도 제공한다.
"면역접합체"는 세포독성제를 포함하나 이것으로 한정되지 않는 1개 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
본원에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제하거나 방해하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 야기하는 물질을 의미한다. 세포독성제는 방사성 동위원소(예를 들면, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학치료제 또는 화학치료 약물(예를 들면, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 인터칼레이팅제); 성장 억제제; 효소 및 이의 단편, 예컨대, 핵용해 효소; 항생제; 독소, 예컨대, 소분자 독소, 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물로부터 유래된 효소 활성 독소(이의 단편 및/또는 변이체를 포함함); 및 하기 개시된 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
한 실시양태에서, 면역접합체는 항체가 메이탄시노이드(미국 특허 제5,208,020호, 미국 특허 제5,416,064호 및 유럽 특허 제0 425 235 B1호 참조); 아우리스타틴, 예컨대, 모노메틸 아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국 특허 제5,635,483호, 미국 특허 제5,780,588호 및 미국 특허 제7,498,298호 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 이의 유도체(미국 특허 제5,712,374호, 미국 특허 제5,714,586호, 미국 특허 제5,739,116호, 미국 특허 제5,767,285호, 미국 특허 제5,770,701호, 미국 특허 제5,770,710호, 미국 특허 제5,773,001호 및 미국 특허 제5,877,296호, 문헌(Hinman, L.M., et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342) 및 문헌(Lode, H.N., et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928) 참조); 안쓰라사이클린, 예컨대, 다우노마이신 또는 독소루비신(예를 들면, 문헌(Kratz, F., et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523), 문헌(Jeffrey, S.C., et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362), 문헌(Torgov, M.Y., et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721), 문헌(Nagy, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834), 문헌(Dubowchik, G.M., et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532), 문헌(King, H.D., et al., J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343) 및 미국 특허 제6,630,579호 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예컨대, 독세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트라이코테센; 및 CC1065를 포함하나 이들로 한정되지 않는 1개 이상의 약물에 접합되어 있는 항체-약물 접합체(ADC)이다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, (슈도모나스 애루기노사의) 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 애브린 A 쇄, 모덱신 A 쇄, 알파-사르신, 유동나무(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트라이코테센을 포함하나 이들로 한정되지 않는 효소 활성 독소 또는 이의 단편에 접합된, 본원에 기재된 항체를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 방사성 원자에 접합되어 방사접합체를 형성하는, 본원에 기재된 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소들이 방사접합체의 제조를 위해 사용될 수 있다. 예에는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 방사접합체가 검출을 위해 사용되는 경우, 방사접합체는 신티그래픽 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들면, TC99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명(NMR) 영상화(자기 공명 영상화, MRI로도 공지되어 있음)를 위한 스핀 표지, 예컨대, 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체와 세포독성제의 접합체는 다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예컨대, N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이작용성 유도체(예컨대, 다이메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스터(예컨대, 다이석신이미딜 수버레이트), 알데하이드(예컨대, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이이소시아네이트(예컨대, 톨루엔 2,6-다이이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예컨대, 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠)을 사용함으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 문헌(Vitetta, E.S., et al., Science 238 (1987) 1098-1104)에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민 펜타아세트산(MX-DTPA)이 방사성 뉴클레오티드를 항체에 접합시키는 예시적 킬레이팅제이다. 국제 특허출원 공개 제WO 94/11026호를 참조한다. 연결제는 세포 내에서의 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 연결제"일 수 있다. 예를 들면, 산 불안정성 연결제, 펩티다제 민감성 연결제, 광 불안정성 연결제, 다이메틸 연결제 또는 다이설파이드 함유 연결제(Chari, R.V., et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131; 미국 특허 제5,208,020호)가 사용될 수 있다.
본원의 면역접합체 또는 ADC는 (예를 들면, 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc.)(미국 일리노이주 록포드 소재)로부터) 상업적으로 입수될 수 있는 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC 및 설포-SMPB, 및 SVSB(석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 가교연결제 시약에 의해 제조된 이러한 접합체들을 명확히 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항-EGFR/항-IGF-1R 이중특이적 항체가 생물학적 생물에서 EGFR 및/또는 IGF-1R의 존재를 검출하는 데에 유용하다. 본원에서 사용된 용어 "검출"은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대, 종양 조직을 포함한다.
한 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에서 사용되는 본 발명에 따른 항-EGFR/항-IGF-1R 이중특이적 항체가 제공된다. 추가 양태에서, 생물학적 샘플에서 EGFR 및/또는 IGF-1R의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본 발명에 따른 항-EGFR/항-IGF-1R 이중특이적 항체와 EGFR 및/또는 IGF-1R의 결합을 허용하는 조건 하에서 생물학적 샘플을 본원에 기재된 항-EGFR/항-IGF-1R 이중특이적 항체와 접촉시키는 단계, 및 항-EGFR/항-IGF-1R 이중특이적 항체와 EGFR 및/또는 IGF-1R 사이에 복합체가 형성되는지를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항-EGFR/항-IGF-1R 이중특이적 항체는 예를 들면, EGFR 및/또는 IGF-1R이 환자의 선별을 위한 생체마커인 경우 항-EGFR/항-IGF-1R 이중특이적 항체를 사용하는 치료에 적합한 대상체를 선택하는 데에 사용된다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단할 수 있는 예시적 장애는 암을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표지된 항-EGFR/항-IGF-1R 이중특이적 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티(예컨대, 형광, 발색, 전자-조밀, 화학발광 및 방사성 표지)뿐만 아니라, 예를 들면, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예컨대, 효소 또는 리간드도 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 예시적 표지는 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예컨대, 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 댄실, 움벨리페론, 루시퍼라제, 예를 들면, 초파리 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제(미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진다이온, 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들면, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 과산화수소를 사용하여 염료 전구체, 예컨대, HRP를 산화시키는 효소와 커플링된 헤테로사이클릭 옥시다제, 예컨대, 유리카제 및 잔틴 옥시다제, 락토퍼록시다제 또는 마이크로퍼록시다제, 바이오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
약학 제제
본원에서 제공된 이중특이적 항체의 약학 제제는 원하는 순도를 갖는 이러한 항체를 임의적으로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합함으로써 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 제조된다(문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980))). 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 독성을 나타내지 않고, 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예컨대, 옥타데실 다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 모노사카라이드, 다이사카라이드 및 다른 탄수화물; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대, 나트륨; 금속 착물(예를 들면, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본원에서 예시적 약학적으로 허용가능한 담체는 간질 약물 분산제, 예컨대, 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대, rhuPH20(하이리넥스(HYLENEX, 등록상표), 박스터 인터내셔날 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rhuPH20을 포함하는 일부 예시적 sHASEGP들 및 사용 방법은 미국 특허 공개 제2005/0260186호 및 미국 특허 공개 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가 글리코스아미노글리카나제, 예컨대, 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적 동결건조된 항체 제제는 미국 특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수성 항체 제제는 미국 특허 제6,171,586호 및 국제 특허출원 공개 제WO 2006/044908호에 기재된 항체 제제를 포함하고, 후자 제제는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본원의 제제는 치료되는 구체적인 증상에 필요한 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 활성 성분도 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 함께 적절하게 존재한다.
활성 성분은 예를 들면, 코아세르베이션 기법 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중의 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기법들은 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980))에 개시되어 있다.
지속 방출 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 상기 매트릭스는 성형된 제품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 존재한다.
용어 "약학 제제"는 내부에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이게 하는 형태로 존재하고 상기 제제가 투여될 대상체에게 허용불가능한 독성을 나타내는 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 의미한다.
"약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분 이외에 대상체에게 독성을 나타내지 않는 약학 제제 중의 성분을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 방부제를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
생체내 투여를 위해 사용되는 제제는 일반적으로 멸균 상태이다. 멸균성은 예를 들면, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태는 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 포함하는 약학 제제이다.
치료 방법 및 조성물
본원에서 제공된 이중특이적 항체들 중 임의의 이중특이적 항체가 치료 방법에서 사용될 수 있다.
한 양태에서, 약제로서 사용되는 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체가 제공된다. 추가 양태에서, 암의 치료에 사용되는 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 치료 방법에서 사용되는 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체를 암을 갖는 개체에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법에서 사용되는 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체를 제공한다. 한 이러한 실시양태에서, 상기 방법은 예를 들면, 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가 치료제를 상기 개체에게 유효량으로 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 세포 증식, 특히 암세포 증식을 억제하는 데에 사용되는 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 세포 증식, 특히 암세포 증식을 억제하기에 효과적인 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 세포 증식, 특히 암세포 증식을 억제하는 방법에서 사용되는 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체를 제공한다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
추가 양태에서, 본 발명은 약제의 제작 또는 제조에 있어서 이중특이적 항-EGFR/항-IGF-1R 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 약제는 암의 치료를 위한 약제이다. 추가 실시양태에서, 상기 약제는 유효량의 약제를 암을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법에서 사용되는 약제이다. 한 이러한 실시양태에서, 상기 방법은 예를 들면, 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가 치료제를 상기 개체에게 유효량으로 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 약제는 세포 증식, 특히 암세포 증식을 억제하기 위한 약제이다. 추가 실시양태에서, 약제는 세포 증식, 특히 암세포 증식을 억제하기에 효과적인 양의 약제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 세포 증식, 특히 암세포 증식을 억제하는 방법에서 사용되는 약제이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다. 한 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 IGF-1R 인산화 및 EGFR 인산화를 억제한다(실시예 4 참조). 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 0.10 nM 이하의 IC50으로 A549 암세포에서 IGF-1R 인산화를 억제한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 0.10 nM 이하의 IC50으로 BxPC3 암세포에서 IGF-1R 인산화를 억제한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 0.10 nM 이하의 IC50으로 TC-71 암세포에서 IGF-1R 인산화를 억제한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 0.23 nM 이하의 IC50으로 A549 암세포에서 EGFR 인산화를 억제한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 0.90 nM 이하의 IC50으로 BxPC3 암세포에서 EGFR 인산화를 억제한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 암세포 증식 또는 종양 세포 증식을 억제한다(실시예 5 참조). 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 0.20 nM 이하의 IC50(바람직하게는 0.15 nM 이하의 IC50)으로 A549 암세포의 증식을 억제한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 0.10 nM 이하의 IC50(바람직하게는 0.05 nM 이하의 IC50)으로 RD-ES 암세포의 증식을 억제한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 65% 이하(바람직하게는 50% 내지 5%)의 양의 푸코스로 당조작되어 있고 암세포에서 ADCC를 유도한다(실시예 7 참조). 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 65% 이하(바람직하게는 50% 내지 5%)의 양의 푸코스로 당조작되어 있고 0.10 nM 이하의 EC50으로 H460M2 암세포에서 ADCC를 유도한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 65% 이하(바람직하게는 50% 내지 5%)의 양의 푸코스로 당조작되어 있고 0.15 nM 이하의 EC50으로 H322M 암세포에서 ADCC를 유도한다.
본원에서 사용된 용어 "암"은 증식 질환, 예컨대, 림프종, 림프구성 백혈병, 폐암, 비소세포 폐암(NSCL), 세기관지폐포세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 위암, 위장암, 결장암, 유방암, 난관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 외음부암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신장세포암종, 신우암종, 중피종, 간세포암, 담낭암, 중추신경계(CNS)의 신생물, 척추 종양, 뇌간 신경아교종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 뇌실막종, 수모세포종, 수막종, 편평세포암종, 뇌하수체 선종 및 에윙 육종(상기 암들 중 임의의 암의 불응성 버전, 또는 상기 암들 중 하나 이상의 암의 조합을 포함함)을 의미한다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축(예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들면, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대, 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
약제, 예를 들면, 약학 제제의 "유효량"은 필요한 시간 동안 필요한 용량에서 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 효과적인 양을 의미한다.
본원에서 사용된 "치료"(및 이의 문법적 어미변화, 예컨대, "치료한다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체의 자연 경과를 변경시키기 위한 시도에서의 임상 시술을 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리의 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 경감, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
추가 양태에서, 본 발명은 예를 들면, 상기 치료 방법들 중 임의의 치료 방법에서 사용되는 본원에서 제공된 이중특이적 항체들 중 임의의 이중특이적 항체를 포함하는 약학 제제를 제공한다. 한 실시양태에서, 약학 제제는 본원에서 제공된 이중특이적 항체 중 임의의 이중특이적 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학 제제는 본원에서 제공된 이중특이적 항체 중 임의의 이중특이적 항체, 및 예를 들면, 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체는 치료에 단독으로 사용될 수 있거나 다른 약제와 병용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 하나 이상의 추가 치료제와 공투여될 수 있다.
상기 인지된 이러한 병용치료는 병용 투여(2종 이상의 치료제가 동일한 또는 별도의 제제에 포함된 경우) 및 분리 투여를 포괄하고, 어느 경우에서든 본 발명의 항체의 투여는 추가 치료제 및/또는 보조제의 투여 전에, 동시에 및/또는 후에 일어날 수 있다. 본 발명의 항체는 방사선 치료와 함께 사용될 수도 있다. 본 발명의 항체(및 임의의 추가 치료제)는 비경구 투여, 폐내 투여 및 비내 투여, 및 국소 치료가 요구되는 경우 병변내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 관주는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 부분적으로 투여가 단기 투여인지 아니면 장기 투여인지에 따라 임의의 적합한 경로, 예를 들면, 주사, 예컨대, 정맥내 또는 피하 주사에 의해 달성될 수 있다. 단회 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다회 투여, 볼루스 투여 및 펄스 관주를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 투약 스케쥴이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체는 우수한 의학적 관행에 일치하는 방식으로 제제화되고 조제되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려될 인자는 치료될 구체적인 장애, 치료될 구체적인 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴 및 의료인에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 상기 항체는 해당 장애의 예방 또는 치료를 위해 현재 사용되는 하나 이상의 약제와 함께 제제화될 필요는 없지만 임의적으로 이러한 약제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 약제의 유효량은 제제에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형 및 상기 논의된 다른 인자에 의해 좌우된다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 용량 및 투여 경로와 동일한 용량 및 투여 경로로 사용되거나, 본원에 기재된 용량의 약 1% 내지 99%의 용량으로 사용되거나, 적절한 용량 및 경로로서 실험적으로/임상적으로 확인된 임의의 용량 및 임의의 경로로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, (단독으로 사용되거나 하나 이상의 다른 추가 치료제와 병용될 때) 본 발명의 항체의 적절한 용량은 치료되는 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 목적으로 투여되는지 아니면 치료 목적으로 투여되는지, 선행 치료, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의해 좌우될 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들면, 0.5 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 항체가 예를 들면, 1회 이상의 분리 투여에 의해 또는 연속 관주에 의해 환자에게 투여될 초기 후보 용량일 수 있다. 한 전형적인 1일 용량은 상기 언급된 인자들에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상일 것이다. 수일 또는 이보다 오랜 시간에 걸친 반복된 투여의 경우, 상태에 따라 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. 항체의 한 예시적 용량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위 내에 있을 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이들의 임의의 조합)의 1회 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 (예를 들면, 환자가 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들면, 약 6회 용량의 항체를 제공받도록) 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다. 초기 보다 높은 적재 용량에 이어서 1회 이상의 보다 낮은 용량이 투여될 수 있다. 예시적 투약 요법은 예를 들면, 초기 적재 용량인 약 4 mg/kg의 항체를 투여한 후 매주 유지 용량인 약 2 mg/kg의 항체를 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투약 요법이 유용할 수 있다. 이 치료의 진행은 통상적인 기법 및 어세이에 의해 용이하게 모니터링된다.
본 발명에 따른 항-EGFR/항-IGF-1R 이중특이적 항체 대신에 또는 이러한 항체 이외에 본 발명의 면역접합체를 사용하여 상기 제제들 또는 치료 방법들 중 임의의 제제 또는 치료 방법을 수행할 수 있다는 것이 이해된다.
본 발명의 또 다른 양태는 암의 치료에 사용되는 본 발명에 따른 이중특이적 항체이다.
본 발명의 또 다른 양태는 암 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 용도이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 이러한 치료가 필요한 환자에게 투여하여 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이다.
제품
본 발명의 또 다른 양태에서, 전술된 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기; 및 용기 상에 존재하거나 용기와 연결되어 있는 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 그 자체로 존재하거나 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 조합되어 있는 조성물을 보유하고, 멸균 출입구를 가질 수 있다(예를 들면, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 하나 이상의 활성 물질은 본 발명의 항체이다. 상기 표지 또는 포장 삽입물은 상기 조성물이 선택된 병태의 치료에 사용된다는 것을 표시한다. 나아가, 제품은 (a) 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 그 내부에 함유하는 제1 용기; 및 (b) 추가 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물을 그 내부에 함유하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 실시양태에서 제품은 상기 조성물이 특정 병태의 치료에 사용될 수 있다는 것을 표시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제품은 약학적으로 허용가능한 완충제, 예컨대, 정균성 주사용수(BWFI), 포스페이트 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하는, 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
용어 "포장 삽입물"은 치료 제품의 상업적 포장물 내에 통상적으로 포함되는 설명서로서, 증상, 용법, 용량, 투여, 병용 치료, 사용금지사유, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고에 대한 정보를 함유하는 설명서를 의미하기 위해 사용된다.
상기 제품들 중 임의의 제품은 본 발명에 따른 항-EGFR/항-IGF-1R 이중특이적 항체 대신에 또는 이러한 항체 이외에 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있다는 것이 이해된다.
서열의 설명
a) 아미노산 서열:
서열번호 1 중쇄 CDR1, 인간화된 <EGFR>ICR62
서열번호 2 중쇄 CDR2, 인간화된 <EGFR>ICR62
서열번호 3 중쇄 CDR3, 인간화된 <EGFR>ICR62
서열번호 4 경쇄 CDR1, 인간화된 <EGFR>ICR62
서열번호 5 경쇄 CDR2, 인간화된 <EGFR>ICR62
서열번호 6 경쇄 CDR3, 인간화된 <EGFR>ICR62
서열번호 7 중쇄 가변 도메인, 인간화된 <EGFR>ICR62-I-HHD
서열번호 8 경쇄 가변 도메인, 인간화된 <EGFR>ICR62-I-KC
서열번호 9 중쇄 CDR1, <IGF-1R> HUMAB-클론 18
서열번호 10 중쇄 CDR2, <IGF-1R> HUMAB-클론 18
서열번호 11 중쇄 CDR3, <IGF-1R> HUMAB-클론 18
서열번호 12 경쇄 CDR1, <IGF-1R> HUMAB-클론 18
서열번호 13 경쇄 CDR2, <IGF-1R> HUMAB-클론 18
서열번호 14 경쇄 CDR3, <IGF-1R> HUMAB-클론 18
서열번호 15 중쇄 가변 도메인, <IGF-1R> HUMAB-클론 18
서열번호 16 경쇄 가변 도메인, <IGF-1R> HUMAB-클론 18
서열번호 17 중쇄 CDR1, <IGF-1R> F13B5(변경된 <IGF-1R> HUMAB-클론 18)
서열번호 18 중쇄 CDR2, <IGF-1R> F13B5
서열번호 19 중쇄 CDR3, <<IGF-1R> F13B5
서열번호 20 경쇄 CDR1, <IGF-1R> F13B5
서열번호 21 경쇄 CDR2, <IGF-1R> F13B5
서열번호 22 경쇄 CDR3, <IGF-1R> F13B5
서열번호 23 중쇄 가변 도메인, <IGF-1R> F13B5
서열번호 24 경쇄 가변 도메인, <IGF-1R> F13B5
서열번호 25 중쇄 CDR1, <IGF-1R> L37F7(변경된 <IGF-1R> HUMAB-클론 18)
서열번호 26 중쇄 CDR2, <IGF-1R> L37F7
서열번호 27 중쇄 CDR3, <<IGF-1R> L37F7
서열번호 28 경쇄 CDR1, <IGF-1R> L37F7
서열번호 29 경쇄 CDR2, <IGF-1R> L37F7
서열번호 30 경쇄 CDR3, <IGF-1R> L37F7
서열번호 31 중쇄 가변 도메인, <IGF-1R> L37F7
서열번호 32 경쇄 가변 도메인, <IGF-1R> L37F7
서열번호 33 중쇄 CDR1, <IGF-1R> L39D7(변경된 <IGF-1R> HUMAB-클론 18)
서열번호 34 중쇄 CDR2, <IGF-1R> L39D7
서열번호 35 중쇄 CDR3, <<IGF-1R> L39D7
서열번호 36 경쇄 CDR1, <IGF-1R> L39D7
서열번호 37 경쇄 CDR2, <IGF-1R> L39D7
서열번호 38 경쇄 CDR3, <IGF-1R> L39D7
서열번호 39 중쇄 가변 도메인, <IGF-1R> L39D7
서열번호 40 경쇄 가변 도메인, <IGF-1R> L39D7
서열번호 41 중쇄 CDR1, <IGF-1R> L31D11(변경된 <IGF-1R> HUMAB-클론 18)
서열번호 42 중쇄 CDR2, <IGF-1R> L31D11
서열번호 43 중쇄 CDR3, <<IGF-1R> L31D11
서열번호 44 경쇄 CDR1, <IGF-1R> L31D11
서열번호 45 경쇄 CDR2, <IGF-1R> L31D11
서열번호 46 경쇄 CDR3, <IGF-1R> L31D11
서열번호 47 중쇄 가변 도메인, <IGF-1R> L31D11
서열번호 48 경쇄 가변 도메인, <IGF-1R> L31D11
서열번호 49 중쇄 CDR1, <IGF-1R> L31D7(변경된 <IGF-1R> HUMAB-클론 18)
서열번호 50 중쇄 CDR2, <IGF-1R> L31D7
서열번호 51 중쇄 CDR3, <<IGF-1R> L31D7
서열번호 52 경쇄 CDR1, <IGF-1R> L31D7
서열번호 53 경쇄 CDR2, <IGF-1R> L31D7
서열번호 54 경쇄 CDR3, <IGF-1R> L31D7
서열번호 55 중쇄 가변 도메인, <IGF-1R> L31D7
서열번호 56 경쇄 가변 도메인, <IGF-1R> L31D7
서열번호 57 OA-F13B5-scFab-GA201 중쇄 1
서열번호 58 OA-F13B5-scFab-GA201 중쇄 2
서열번호 59 OA-F13B5-scFab-GA201 경쇄
서열번호 60 OA- L31D11-scFab-GA201 중쇄 1
서열번호 61 OA- L31D11-scFab-GA201 중쇄 2
서열번호 62 OA- L31D11-scFab-GA201 경쇄
서열번호 63 CM-F13B5-GA201 중쇄 1
서열번호 64 CM-F13B5-GA201 중쇄 2
서열번호 65 CM-F13B5-GA201 경쇄 1
서열번호 66 CM-F13B5-GA201 경쇄 2
서열번호 67 CM- L31D11-GA201 중쇄 1
서열번호 68 CM- L31D11-GA201 중쇄 2
서열번호 69 CM- L31D11-GA201 경쇄 1
서열번호 70 CM- L31D11-GA201 경쇄 2
서열번호 71 Tv-F13B5-GA201 쇄 1
서열번호 72 Tv-F13B5-GA201 쇄 2
서열번호 73 Tv- L31D11-GA201 쇄 1
서열번호 74 Tv- L31D11-GA201 쇄 2
서열번호 75 인간 EGFR
서열번호 76 인간 IGF-1R
서열번호 77 인간 카파 불변 경쇄 영역
서열번호 78 인간 람다 불변 경쇄 영역
서열번호 79 인간 불변 중쇄 영역 IgG1(백인 동종이형)
서열번호 80 인간 불변 중쇄 영역 IgG1(미국 흑인 동종이형)
서열번호 81 인간 불변 중쇄 영역 IgG4
b) 핵산 서열:
서열번호 82 Ak18 VL 및 VH 라이브러리를 위한 라이브러리 주형(pRJH61)
서열번호 83 라이브러리 프라이머 서열 AM_VL_AK18_L1_ ba
서열번호 84 라이브러리 프라이머 서열 AM_VL_AK18_L2_ fo
서열번호 85 라이브러리 프라이머 서열 AM_VH_AK18_H1_ ba
서열번호 86 라이브러리 프라이머 서열 AM_VH_AK18_H2_ fo
하기 실시예, 서열목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않으면서 기재된 절차를 변경시킬 수 있다는 것이 이해된다.
실험 절차
실시예
재료 및 방법
재조합 DNA 기법
문헌(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (1989))에 기재된 바와 같이 표준 방법을 이용하여 DNA를 조작하였다. 분자생물학 시약을 제조자의 설명서에 따라 사용하였다.
DNA 및 단백질 서열 분석, 및 서열 데이터 관리
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적인 정보는 문헌(Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, (1991) NIH Publication No 91-3242)에 제시되어 있다. 항체 쇄의 아미노산은 EU 넘버링에 따라 넘버링된다(Edelman, G.M., et al., PNAS 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service (1991) NIH Publication No 91-3242). GCG(제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)의 소프트웨어 팩키지 버전 10.2 및 인포맥스(Informax)의 벡터 NTI 어드밴스 스위트(Advance suite) 버전 8.0을 서열 생성, 맵핑, 분석, 주해 및 예증을 위해 사용하였다.
DNA 서열분석
세퀴서브(SequiServe)(독일 바터스테텐 소재) 및 진아트 아게(Geneart AG)(독일 레겐스부르그 소재)에서 수행된 이중 가닥 서열분석으로 DNA 서열을 확인하였다.
유전자 합성
원하는 유전자 분절은 자동화된 유전자 합성에 의해 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 생성물로부터 진아트 아게(독일 레겐스부르그 소재)에 의해 제조되었다. scFv 항체 단편의 C-말단 부착을 갖는 중쇄 또는 경쇄, S354C 및 T366W 돌연변이를 보유하는 "놉스-인투-홀" 항체 중쇄 및 비-변경된 VH 도메인과 조합된 CH3 도메인 내에 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 보유하는 "놉스-인투-홀" 중쇄, 교차된 C 카파 도메인 또는 scFab 항체 단편뿐만 아니라 비-변경된 항체 경쇄 또는 CH1 도메인 교환된 경쇄를 암호화하는 유전자 절편은 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위(BamHI - XbaI, BamHI - XmnI 또는 BamHI - KpnI)에 의해 플랭킹되어 있고 pGA18(ampR) 플라스미드 내로 클로닝되었다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 세균으로부터 정제하고 농도를 UV 분광법으로 측정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석으로 확인하였다. 진핵세포에서 분비를 위해 단백질을 표적화하는 리더 펩티드(MGWSCIILFLVATATGVHS)를 암호화하는 5'-말단 DNA 서열을 갖는 모든 구축물들을 디자인하였다.
발현 플라스미드의 구축
로슈 발현 벡터를 모든 "놉스-인투-홀" 중쇄뿐만 아니라 항체 경쇄를 암호화하는 발현 플라스미드의 구축을 위해 사용하였다. 상기 벡터는 하기 요소들로 구성된다:
- 선별 마커로서 하이그로마이신 내성 유전자,
- 엡스테인-바(Epstein-Barr) 바이러스(EBV)의 복제기점인 oriP,
- 이. 콜라이에서 이 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18의 복제 기점,
- 이. 콜라이에서 앰피실린 내성을 부여하는 β-락타마제 유전자,
- 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 즉시 초기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 1-면역글로불린 폴리아데닐화("폴리 A") 신호 서열, 및
- 독특한 BamHI 및 XbaI 제한부위.
scFv 항체 단편의 C-말단 부착을 갖는 중쇄 또는 경쇄, 비-변경된 VH 도메인을 갖는 "놉스-인투-홀" 중쇄, 교차된 C 카파 도메인 또는 scFab 단편뿐만 아니라 비-변경된 경쇄 또는 CH1 도메인 교환된 경쇄를 포함하는 면역글로불린 유전자를 전술된 바와 같이 유전자 합성으로 제조하여 pGA18(ampR) 플라스미드 내로 클로닝하였다. 합성된 DNA 분절을 보유하는 pGA18(ampR) 플라스미드 및 로슈 발현 벡터를 BamHI 및 XbaI, BamHI 및 XmnI, 또는 BamHI 및 KpnI 제한효소(로슈 몰레큘라 바이오케미칼스(Roche Molecular Biochemicals))로 절단하고 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다. 그 다음, scFv 항체 단편의 C-말단 부착을 갖는 중쇄 또는 경쇄, "놉스-인투-홀" 중쇄 및 비-변경된 또는 도메인 교환된 경쇄를 암호화하는 정제된 DNA 분절을 단리된 로슈 발현 벡터 BamHI/XbaI, BamHI/XmnI 또는 BamHI/KpnI 단편과 라이게이션시켜 최종 발현 벡터를 발생시켰다. 최종 발현 벡터를 이. 콜라이 세포 내로 형질전환시키고, 발현 플라스미드 DNA를 단리하고(미니프렙) 제한효소 분석 및 DNA 서열분석을 수행하였다. 정확한 클론을 150 ㎖의 LB-Amp 배지에서 생장시켰고 플라스미드 DNA를 다시 단리하였고(맥시프렙) 서열 온전성을 DNA 서열분석으로 확인하였다.
HEK293 세포에서의 이중특이적 항체의 일시적 발현
제조자(인비트로겐(Invitrogen), 미국 소재)의 설명서에 따라 프리스타일(FreeStyle, 상표) 293 발현 시스템을 사용하여 인간 배아 신장 293-F 세포를 일시적으로 형질감염시켜 재조합 이중특이적 항체를 발현시켰다. 요약하건대, 현탁액 프리스타일 293-F 세포를 37℃/8% CO2에서 프리스타 293 발현 배지에서 배양하였고, 세포를 형질감염 1일 전에 1x106개 생존 세포/㎖의 밀도로 새로운 배지에 시딩하였다. 형질감염을 위해, 162.5 ㎕의 293-프리(Free)형질감염 시약(머크(Merck), 미국 소재), 및 125 ㎍의 scFv C-말단 부착을 갖는 중쇄 또는 경쇄 암호화 DNA(1:1의 플라스미드 비) 또는 "놉스-인투-홀" 중쇄 1 및 2 및 경쇄 플라스미드 DNA(1:2:1 또는 1:3:1 몰비)를 250 ㎖의 최종 형질감염 부피로 사용하여 10 ㎖의 둘베코 PBS(PAA, 오스트리아 소재)에서 DNA를 제조하였다. 교차 Mab의 형질감염을 위해, 1:1:2:2 또는 1:1:3:2의 플라스미드 비의 "놉스-인투-홀" 중쇄 1 : 비-변경된 경쇄 : C 카파 도메인 교환된 "놉스-인투-홀" 중쇄 2 : CH1 도메인 교환된 경쇄를 제조하였다. 항체 함유 세포 배양 상청액을 14000 g에서 30분 동안 원심분리하여 형질감염으로부터 7일 후 수거하고 멸균 필터(0.22 ㎛)를 통해 여과하였다. 상청액을 정제할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
이중특이적 항체의 정제
맙셀렉트슈어-세파로스(MabSelectSure-Sepharose, 상표)(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재)를 사용하는 친화성 크로마토그래피 및 수퍼덱스 200 크기 배지(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 크로마토그래피로 세포 배양 상청액으로부터 이중특이적 항체를 정제하였다. 요약하건대, 멸균 여과된 세포 배양 상청액을 PBS 완충제(10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4)로 평형화된 맙셀렉트슈어 수지 상에 포획하고 평형화 완충제로 세척하고 pH 3.0에서 25 mM 시트르산나트륨으로 용출하였다. 용출된 단백질 분획을 풀링하고 2 M 트라이스(Tris)(pH 9.0)로 중화하고 20 mM 히스티딘 및 140 mM NaCl(pH 6.0)로 평형화된 수퍼덱스 200 26/60 GL(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 컬럼을 이용하여 크기 배제 크로마토그래피로 더 정제하였다. 크기 배제 크로마토그래피 분획을 CE-SDS(칼리퍼 라이프 사이언스(Caliper Life Science), 미국 소재)로 분석하고, 이중특이적 항체 함유 분획을 풀링하여 -80℃에서 저장하였다.
정제된 단백질의 분석
아미노산 서열에 의거하여 계산된 몰 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 측정하였다. 이중특이적 항체 및 대조군 항체의 순도, 항체 온전성 및 분자량을 미세유체 랩칩 기술(칼리퍼 라이프 사이언스, 미국 소재)을 이용하여 CE-SDS로 분석하였다. 제조자의 설명서에 따라 HT 단백질 발현 시약 키트를 사용하여 CE-SDS 분석을 위해 5 ㎕의 단백질 용액을 제조하고 HT 단백질 발현 칩을 이용하여 랩칩 GXII 시스템 상에서 분석하였다. 랩칩 GX 소프트웨어 버전 3.0.618.0을 이용하여 데이터를 분석하였다. 25℃에서 200 mM KH2PO4 및 250 mM KCl(pH 7.0) 런닝 완충제에서 수퍼덱스 200 분석 크기 배제 컬럼(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재)을 사용하여 고성능 SEC로 이중특이적 항체 샘플 및 대조군 항체 샘플의 응집체 함량을 분석하였다. 25 ㎍의 단백질을 0.5 ㎖/분의 유속으로 상기 컬럼 상에 주입하고 50분에 걸쳐 등용매 용출하였다. 펩티드-N-글리코시다제 F(로슈 몰레큘라 바이오케미칼스)를 사용한 효소 처리로 N-글리칸을 제거한 후 나노전기분무(NanoElectrospray) Q-TOF 질량 분광계로 환원된 이중특이적 항체 경쇄 및 중쇄의 아미노산 골격의 온전성을 검증하였다.
표면 플라스몬 공명
국소 벌크 효과 없이(RI=0) (c = 0 nM 및 FC1 = 블랭크 표면에 대한) 이중 기준을 갖는 랭뮤어(Langmuir) 1:1 결합 모델을 이용하여 결합 및 해리 상에 대한 표면 플라스몬 공명 신호의 관찰된 시간 경과를 피팅함으로써 비아코어(Biacore) 평가 소프트웨어로 표준 반응속도를 평가하였다.
인간 및 사이노몰구스 IGF-1R과 MAb의 결합
제조자의 설명서에 따라 칩 C1 상에의 표준 아민 커플링을 수행하였고(런닝 완충제 HBS-N, T=25℃, EDC/NHS의 혼합물에 의한 활성화), 항-huFc 포획 항체를 커플링 완충제 10 nM NaAc(pH 4.5)로 희석하고(c = 1 ㎍/㎖), 프로그래밍된 표적 수준 200 RU(FC1 내지 FC4에 대한 실제 고정 수준 약 189 RU 내지 195 RU)로 커플링하였고, 최종적으로 1 M 에탄올아민을 주입하여 남은 활성화된 카복실 기를 차단하였다. 이중특이적 또는 모 항체를 PBST + 0.1% BSA로 1.3 nM까지 희석하고 10 ㎕/분의 속도로 30초 동안 주입하여 별도의 주기에서 리간드로서 포획하였다: 포획 수준 5.4 RU 내지 9.2 RU, FC2 내지 FC4에 대해 런닝 당 3개의 MAb, 기준물로서 FC1 단독 포획 항체. 분석물로서 인간 및 사이노몰구스 IGF-1R 결합의 반응속도를 37℃의 런닝 완충제 PBST에서 측정하였다. 유속 50 ㎕/분, 120초 결합 및 600초 해리를 이용하여 상기 분석물을 일련의 3배 증가 농도(PBST + 0.1% BSA 중의 1.65 nM 내지 400 nM)로 주입하였다. 10 mM 글리신(pH 1.75)/30 ㎕/분을 이용하여 각각의 주기 후 포획 항체를 60초 동안 재생시켰다.
인간 및 사이노몰구스 EGFR과 MAb의 결합
제조자의 설명서에 따라 칩 CM5 상에의 표준 아민 커플링을 수행하였고(런닝 완충제 HBS-N, T=25℃, EDC/NHS의 혼합물에 의한 활성화), 항-huFc 포획 항체를 커플링 완충제 10 mM NaAc(pH 4.5)로 희석하고(c = 4 ㎍/㎖), 프로그래밍된 표적 수준 1000 RU(FC1 내지 FC4에 대한 실제 고정 수준 약 1170 RU 내지 1260 RU)로 커플링하였고, 최종적으로 1 M 에탄올아민을 주입하여 남은 활성화된 카복실 기를 차단하였다. 이중특이적 또는 모 항체를 PBS + 0.1% BSA로 10 nM까지 희석하고 10 ㎕/분의 속도로 30초 동안 주입하여 별도의 주기에서 리간드로서 포획하였다: 포획 수준 15 RU 내지 79 RU, FC2 내지 FC4에 대해 런닝 당 3개의 MAb, 기준물로서 FC1 단독 포획 항체. 분석물로서 단량체 인간 HER1-ECD 및 사이노몰구스 EGFR 결합의 반응속도를 37℃의 런닝 완충제 PBS에서 측정하였다. 유속 50 ㎕/분, 120초 결합 및 1200초 해리를 이용하여 상기 분석물을 일련의 3배 증가 농도(PBS + 0.1% BSA 중의 4.12 nM 내지 1000 nM)로 주입하였다. 10 mM 글리신(pH 1.75)/30 ㎕/분을 이용하여 각각의 주기 후 포획 항체를 60초 동안 재생시켰다.
인간 및 사이노몰구스 FcgRIIIa와 MAb의 결합
제조자의 설명서에 따라 칩 C1 상에의 표준 아민 커플링을 수행하였고(런닝 완충제 HBS-N, T=25℃, EDC/NHS의 혼합물에 의한 활성화), 단량체 huHER1-ECD를 커플링 완충제 10 mM NaAc(pH 4.5)로 희석하고(c = 30 ㎍/㎖), 프로그래밍된 표적 수준 400 RU(FC1 내지 FC4에 대한 실제 고정 수준 약 390 RU 내지 445 RU)로 커플링하였고, 최종적으로 1 M 에탄올아민을 주입하여 남은 활성화된 카복실 기를 차단하였다. 이중특이적 또는 모 항체를 PBST + 0.1% BSA로 20 nM까지 희석하고 10 ㎕/분의 속도로 60초 동안 주입하여 별도의 주기에서 리간드로서 포획하였다: FC2 내지 FC4에 대한 3개의 MAb, 기준물로서 FC1 단독 포획 항체. 분석물로서 인간 FcgRIIIa(V158), huFcgRIIIa(F158) 및 사이노몰구스 FcgRIIIa 결합의 반응속도를 25℃의 런닝 완충제 PBST에서 측정하였다. 유속 50 ㎕/분, 180초 결합 및 900초 해리를 이용하여 상기 분석물을 일련의 3배 증가 농도(PBST + 0.1% BSA 중의 2.74 nM 내지 2000 nM)로 주입하였다. 15 mM NaOH/50 ㎕/분을 이용하여 각각의 주기 후 자유 HER1-ECD를 60초 동안 재생시킨 후, 180초 동안 안정화시켰다. 랭뮤어 1:1 피트 분석 이외에, 정상 상태 친화성을 분석물 농도의 함수로서 R(평형)로부터 계산하였다.
huEGFR 및 huIGF-1R과 MAb의 동시적인 결합
제조자의 설명서에 따라 칩 C1 상에의 표준 아민 커플링을 수행하였고(런닝 완충제 HBS-N, T=25℃, EDC/NHS의 혼합물에 의한 활성화), 항-huFAB 포획 항체를 커플링 완충제 10 mM NaAc(pH 5.0)로 희석하고(c = 50 ㎍/㎖), 프로그래밍된 표적 수준 1000 RU(FC1 내지 FC4에 대한 실제 고정 수준 약 955 RU 내지 1040 RU)로 커플링하였고, 최종적으로 1 M 에탄올아민을 주입하여 남은 활성화된 카복실 기를 차단하였다. 이중특이적 항체를 PBST + 0.1% BSA로 20 nM까지 희석하고 10 ㎕/분의 속도로 60초 동안 주입하여 별도의 주기에서 리간드로서 포획하였다: 런닝 당 FC2 내지 FC4에 대한 3개의 MAb, 기준물로서 FC1 단독 포획 항체. 분석물로서 인간 EGFR 및 IGF-1R의 결합을 25℃의 런닝 완충제 PBST에서 측정하였다. 유속 30 ㎕/분, 180초 결합 및 600초 해리를 이용하여 상기 분석물을 PBST + 0.1% BSA 중의 400 nM의 농도로 "이중 주입" 방식으로 연속적으로 주입하였다. 대조군으로서 블랭크 완충제 주입물을 포함하는 상이한 주기에서 상기 수용체들의 순서를 순열하였다. 10 mM 글리신(pH 2.1)/30 ㎕/분을 이용하여 각각의 주기 후 포획 항체를 60초 동안 재생시켰다.
실시예 1
항-IGF-1R HUMAB 클론 18(Ak18)에 의거한 친화성 성숙 라이브러리의 구축
후속 파지 디스플레이 선별을 가능하게 하는 파지미드 벡터 내로 클로닝된 <IGF-1R> HUMAB 클론 18(DSM ACC 2587; 국제 특허출원 공개 제WO 2005/005635호, <IGF-1R> 클론 18 또는 <IGF-1R> AK18로서 약칭됨, 서열번호 9 내지 16 참조)의 Fab 단편에 의거하여 친화성 성숙 라이브러리를 구축하였다. 보다 정확하게는, 2개의 서브라이브러리, 즉 경쇄 가변 도메인의 CDR1(카바트 넘버링 체계에 따른 잔기 30, 31, 32 및 34) 및 CDR2(잔기 50, 51, 52 및 53) 내의 무작위화된 위치를 갖는 서브라이브러리(Ak18 VL 라이브러리), 및 중쇄 가변 도메인의 CDR1(잔기 31, 32, 33, 34 및 35) 및 CDR2(잔기 50, 52, 53, 54, 56 및 58) 내의 무작위화된 위치를 갖는 서브라이브러리(Ak18 VH 라이브러리)를 구축하였다. CDR1에 대한 무작위화된 역방향 프라이머 및 CDR2에 대한 무작위화된 정방향 프라이머를 사용하여 무작위화된 가변 도메인들을 따로 PCR 증폭하였다. 이들을 각각의 외부 프라이머와 조합하여 라이브러리 프라이머(예를 들면, 정방향 프라이머 AM_VL_AK18_L2_ fo에 어닐링하는 역방향 프라이머 AM_VL_AK18_L1_ ba)의 5' 말단 불변 부분에서 서열 상동성에 의해 후속적으로 조립되는 PCR 단편들을 V-도메인 당 2개씩 발생시켰다. 각각의 외부 프라이머, 절단된 NcoI/BsiWI(Ak18 VL 라이브러리) 및 AscI/SacII(Ak18 VH 라이브러리) 각각을 첨가하여 조립 생성물을 증폭하고 유사하게 절단된 수용자 벡터 내로 클로닝하였다. 정제된 라이게이션물을 사용하여 전기형질전환능(electrocompetent) 이. 콜라이 TG1 내로 서브라이브러리 당 약 60회 형질전환시킴으로써 Ak18 VL 라이브러리에 대해 1.4 X 1010의 최종 라이브러리 크기 및 Ak18 VH 라이브러리에 대해 8.7 X 109의 최종 라이브러리 크기(각각 65.3% 및 73%의 기능성 클론을 가짐)를 수득하였다. Fab 라이브러리를 표시하는 파지미드 입자를 레스큐하고 PEG/NaCl 침전으로 정제하여 선별을 위해 사용하였다.
모 mAb Ak18로부터 유래된 친화성 성숙된 항-IGF-1R mAb의 선별
Ak18 VL 및 VH 라이브러리 파지의 풀을 사용하여 인간 및/또는 사이노몰구스 IGF-1R의 세포외 도메인에 대한 선별을 수행하였다. 3종의 상이한 선별 방법을 수행하였다: 1. 후속 바이오-패닝(bio-panning) 라운드에 걸친 항원 농도의 감소(제1 선별 라운드에서 10 nM부터 제3 내지 제5 선별 라운드에서 0.8 nM까지 감소), 2. 10배 항원 농도에서 모 IgG Ak18의 첨가, 또는 (바이오티닐화된 사이노몰구스 IGF-1R이 표적으로서 사용된 라운드에서만) 결합 반응에의 1 μM 비-바이오티닐화된 인간 IGF-1R의 첨가에 의한 경쟁 선별, 또는 3. 파지-항체:항원 복합체의 해리를 3시간 또는 3일 동안 허용함에 의한 해리속도 선별. 후속 선별 라운드 동안 인간 또는 사이노몰구스 IGF-1R만을 사용하거나 이들 2개 종들을 교대로 사용하여 오로지 한 종을 향한 친화성 성숙을 방지함으로써 선별을 수행하였다. 바이오라드(BioRad)의 프로테온(ProteOn) XPR36을 이용하여 SPR로 바이오-패닝 라운드 2 내지 5로부터의 선별 결과를 스크리닝하여 모 Ak18에 비해 우수한 반응속도 상수 및 친화성을 갖는 클론을 확인하였다. 선별된 클론의 VL 및 VH 서열은 하기 표 1에 기재되어 있다.
SPR(프로테온 XPR36)에 의한 선별 결과의 스크리닝
Fab 단편에 대한 포획 방법을 적용하는 프로테온 XPR36(바이오라드) 기계를 25℃에서 이용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)으로 친화성 성숙된 클론의 반응속도 상수 kon 및 koff뿐만 아니라 친화성(KD)도 측정하였다. 요약하건대, 모든 채널들을 EDC와 SNHS의 새로 제조된 혼합물로 5분 동안 동시에 활성화시킨 후 10 mM Na-아세테이트 완충제(pH 5.0) 중의 24 ㎍/㎖ 항-Fab를 5분 동안 주입함으로써 항-Fab 포획 항체(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), #109-005-006)를 30 ㎕/분의 속도에서 고수준(9,000 RU 내지 10,000 RU)으로 GLM 칩의 분리된 수직 채널들 상에 고정시켰다. 5분 동안의 에탄올아민 주입을 이용하여 채널을 차단하였다. 친화성 성숙된 클론의 Fab 단편을 수직 채널을 따라 30 ㎕/분의 속도에서 100초 동안 세균 배양 상청액 또는 정제된 단백질 제제로부터 포획하여 약 250 RU의 리간드 밀도를 달성하였다. 원-숏(one-shot) 반응속도 분석 셋업(OSK)에서, 33 nM 내지 0.4 nM의 3배 연속 희석물로 인간 또는 사이노몰구스 IGF-1R을 50 ㎕/분의 속도, 200초의 결합 시간 및 600초의 해리 시간에서 수평 채널을 따라 분석물로서 주입하였다. 런닝 완충제(PBST)를 6번째 채널을 따라 주입하여 기준을 위한 "인-라인(in-line)" 블랭크를 제공하였다. 결합 센소그램 및 해리 센소그램을 동시에 피팅함으로써 단순 1:1 랭뮤어 결합 모델(프로테온 매니저 소프트웨어 버전 2.1)을 이용하여 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)를 계산하였다. 평형 해리 상수(KD)를 비 koff/kon으로서 계산하였다. 결과는 하기 표 2에 기재되어 있다.
Ak18 VL 및 VH 라이브러리를 위한 라이브러리 주형( pRJH61 )(서열번호 82)
(즉, PelB 리더 서열 + VL Ak18 + 경쇄를 위한 c-myc 및 FLAG-태그를 포함하는 CL 불변 도메인, 및 PelB + VH Ak18 + 중쇄를 위한 His6-태그를 포함하는 CH1 불변 도메인을 포함하는 완전한 Fab 암호화 영역)
Figure pct00001
라이브러리 프라이머 서열
AM_VL_AK18_L1_ ba(서열번호 83)
Figure pct00002
AM_VL_AK18_L2_ fo(서열번호 84)
Figure pct00003
AM_VH_AK18_H1_ ba(서열번호 85)
Figure pct00004
AM_VH_AK18_H2_ fo(서열번호 86)
Figure pct00005
IUPAC는 뉴클레오티드에 대한 부호를 표기하였다. 5개(A, G, C, T/U)의 염기와 별개로, 특히 PCR 프라이머의 디자인을 위해 종종 축퇴 염기가 사용된다. 이들 뉴클레오티드 코드는 여기에 나열되어 있다.
Figure pct00006
<IGF-1R> 항원 결합 부위의 전술된 친화성 성숙 및 후속 선별은 <IGF-1R> 항원 결합 부위의 결합 친화성의 10배 증가된 KD 값을 갖는 하기 <IGF-1R> 항원 결합 부위 포함 항체를 발생시켰다:
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
실시예 2
이중특이적 2가 <IGF-1R - EGFR> 항체 분자의 발현 및 정제
Figure pct00011
상기 재료 및 방법 단락에 기재된 절차에 따라, 이중특이적 2가 <IGF-1R/EGFR> 항체 분자 OA-F13B5-scFab-GA201, OA-L31D11-scFab-GA201, CM-F13B5-GA201, CM-L31D11-GA201, Tv-F13B5-GA201 및 Tv-L31D11-GA201을 HEK293 세포에서 일시적으로 발현시키고 균질할 때까지 정제하였다.
상기 이중특이적 항체들은 a) <IGF-1R> F13B5(서열번호 17 내지 24) 또는 <IGF-1R> L31D11(서열번호 41 내지 48)(둘다 친화성 성숙된 HUMAB <IGF-1R> 클론 18 항체들임), 및 b) 인간화된 <EGFR>ICR62(서열번호 1 내지 8; 국제 특허출원 공개 제WO 2006/082515호 참조, <EGFR>ICR62로서 약칭됨)의 항원 결합 부위에 의거한다. 모든 이중특이적 항체들의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 세포 배양 상청액의 단백질 A 정제 후, 모든 구축물들은 분석 SEC로 검출하였을 때 예측된 분자량을 갖는 70% 내지 98%의 이중특이적 항체를 보여주었다. SEC 정제 후, 모든 구축물들은 분석 SEC로 검출하였을 때 97% 초과의 균질한 단량체를 보여주었고 칼리퍼 분석에서 84% 내지 95%의 생성물 순도를 보여주었다.
결합 및 다른 성질들을 전술된 바와 같이 측정하였다.
(서열번호 71 내지 74에 제시된 관련 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 갖는) 이중특이적 2가 <IGF-1R - EGFR> 항체 분자 Tv-F13B5-GA201 및 Tv-L31D11-GA201을 유사하게 발현시키고 정제할 수 있다.
이중특이적 항체의 안정성
변성 온도(SYPRO 오랜지 방법)
단백질 변성(즉, 단백질 구조의 온도-유도된 상실)이 일어나는 온도를 측정하기 위해, 소수성 환경에서 강한 형광을 나타내는 소수성 형광 염료(SYPRO 오랜지, 인비트로겐)에 의존하는 방법을 이용하였다. 단백질 변성 시, 소수성 패치는 용매에 노출되게 되어 증가된 형광을 이끌어낸다. 변성 온도 초과의 온도에서, 형광 강도는 다시 감소되므로, 최대 강도에 도달하는 온도는 변성 온도로서 정의된다. 상기 방법은 문헌(Ericsson, U.B., et al., Anal Biochem 357 (2006) 289-298) 및 문헌(He, F., et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 99 (2010) 1707-1720)에 기재되어 있다.
20 mM His/HisCl 및 140 mM NaCl(pH 6.0) 중의 약 1 mg/㎖의 농도로 단백질 샘플을 SYPRO 오랜지(5000x 원액)와 혼합하여 1:5000의 최종 희석에 도달하였다. 20 ㎕의 부피를 384웰 플레이트 내로 옮기고 온도 의존적 형광을 0.36℃/분의 가열 속도로 라이트사이클러(LightCycler, 등록상표) 480 실시간 PCR 시스템(로슈 어플라이드 사이언시스(Roche Applied Sciences))에서 기록하였다.
동적 광 산란(DLS)에 의한 응집 온도
열적으로 유도된 단백질 응집이 일어나는 온도를 동적 광 산란(DLS)으로 측정하였다. DLS는 산란된 광 강도의 변동으로부터 유도된, 용액 중의 거대분자의 크기 분포에 대한 정보를 마이크로초 크기로 제공한다. 샘플이 점진적으로 가열될 때, 응집이 일정한 온도에서 시작되어 입자 크기의 증가를 일으킨다. 입자 크기가 증가하기 시작하는 온도는 응집 온도로서 정의된다. 응집 온도와 변성 온도는 변성이 반드시 응집을 위한 필수조건이 아닐 수 있기 때문에 반드시 동일할 필요는 없다.
응집 온도 측정을 위해, DynaPro DLS 플레이트 판독기(와이야트 테크놀로지스(Wyatt technologies))를 이용하였다. 측정 전, 샘플을 384웰 필터 플레이트(밀리포어(Millipore) 멀티스크린 384웰 여과 시스템, 0.45 ㎛)를 통해 광학 384웰 플레이트(코닝 #3540) 내로 여과하였다. 35 ㎕의 샘플 부피를 제제화 완충제(20 mM 시트레이트, 180 mM 수크로스, 20 mM 아르기닌, 0.02% 폴리소르베이트 20) 중의 약 1 mg/㎖의 단백질 농도로 사용하였다. 각각의 웰을 20 ㎕의 파라핀 오일(시그마)로 덮어 증발을 방지하였다. 샘플을 0.05℃/분의 속도로 25℃부터 80℃까지 가열하고 DLS 데이터를 런닝 당 최대 수 15개의 샘플에 대해 연속적으로 획득하였다.
DLS 당 응집 속도
응집체가 강한 광 산란 신호를 일으키기 때문에 DLS는 용액 중의 거대분자의 응집체를 검출하는 민감한 방법이다. 따라서, DLS 데이터의 반복된 획득을 통해 분자가 응집하는 경향을 시간의 경과에 따라 추적할 수 있다. 잠재적 응집을 실제 속도까지 가속화하기 위해, 측정을 50℃에서 수행하였다.
샘플 제조를 전술된 바와 같이 수행하였다. DLS 데이터를 최대 100시간 동안 기록하였다. 응집 속도(nm/일)를 시간의 경과에 따라 평균 직경의 선형 피트의 기울기로서 계산하였다.
제제화 완충제에서의 안정성
이중특이적 분자들을 응집/단편화에 대한 그들의 안정성에 대해 평가하기 위해, 샘플을 약 1 mg/㎖의 단백질 농도로 40℃의 제제화 완충제(20 mM 시트레이트, 180 mM 수크로스, 20 mM 아르기닌, 0.02% 폴리소르베이트 20)에서 3주 동안 항온처리하였다. 대조군 샘플을 -80℃에서 3주 동안 저장하였다.
응집체 및 저분자량(LMW) 종의 정량을 위한 크기 배제 크로마토그래피를 HPLC로 수행하였다. 25 ㎍ 내지 100 ㎍의 양의 단백질을 울티메이트(Ultimate) 3000 HPLC 시스템(다이오넥스(Dionex)) 상에서 300 mM NaCl 및 50 mM 인산칼륨(pH 7.5) 중의 토소(Tosoh) TSKgel G3000SWXL 컬럼에 적용하였다. 용출된 단백질을 280 nm에서 UV 흡광도로 정량하였다.
IGF-1R 친화성 성숙된 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체 OA-F13B5-scFab-GA201 및 OA-L31D11-scFab-GA201은 비-변경된 OA-Ak18-scFab-GA201에 비해 명확히 개선된 안정성을 보인다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 3
이중특이적 항체와 두 항원들의 동시적인 결합
이중특이적 항체의 동시적인 결합을 상기 재료 및 방법 단락에 기재된 바와 같이 비아코어를 통해 분석하였다.
이중특이적 OA-F13B5-scFab-GA201은 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R과의 동시적인 결합을 보였다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 4
이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체에 의한 EGFR 신호전달 경로 및 IGF-1R 신호전달 경로의 억제
신규 친화성 성숙된 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체 OA-F13B5-scFab-GA201 및 OA-L31D11-scFab-GA201의 잠재적 억제 활성을 평가하기 위해, 상기 두 경로들을 향한 신호전달의 억제 정도를 상이한 비의 IGF-1R 및 EGFR을 발현하는 종양 세포에서 분석하고 비-변경된 <IGF-1R> HUMAB-클론 18(AK18)에 의거하여 유사하게 구축된 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체 OA-Ak18-scFab-GA201과 비교하였다. A549 및 BxPC3 세포는 IGF-1R 및 EGFR 둘다를 발현하지만, TC-71 세포는 IGF-1R만을 발현한다.
10% 태아 소 혈청 및 2 mM L-글루타민으로 보충된 배양 배지 중의 인간 종양 세포(A549, BxPC3 또는 TC-71, 3 x 104개 세포/웰)를 96웰 마이크로타이터 플레이트에 시딩하고 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 배지를 조심스럽게 제거하고 (1 mg/㎖ RSA, 10 mM 헤페스(HEPES) 및 1% 펜스트렙(PenStrep)으로 보충된) 100 ㎕의 무혈청 배양 배지로 교체하고 37℃ 및 5% CO2에서 2.0시간 이상 동안 항온처리하였다. 배지를 다시 조심스럽게 제거하고 무혈청 배양 배지 중의 연속 이중특이적 항체 및 대조군 항체 희석물(50 ㎕/웰)로 교체한 후 37℃ 및 5% CO2에서 30분 동안 항온처리하였다. 50 ㎕/웰의 IGF-1(10 nM) 또는 EGF(20 ng/㎖)(무혈청 배양 배지로 희석됨)를 첨가하여 세포를 자극하고 37℃ 및 5% CO2에서 10분 동안 항온처리하였다. 배지를 조심스럽게 제거하고 세포를 100 ㎕/웰의 빙냉 PBS로 1회 세척하였다. 100 ㎕/웰의 바이오라드 세포 용해 완충제(바이오라드 세포 용해 키트(바이오라드 카달로그 #171-304012))를 첨가하여 세포를 용해하였다. 플레이트를 추가 분석할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 500 g에서 5분 동안 원심분리하여 멀티스크린 HTS 필터 플레이트를 통해 세포 용해물을 여과함으로써 세포 데브리스(debris)를 제거하였다. EGFR 인산화의 분석을 위한 P-EGFR(Tyr) 비드 키트(밀리포어 카달로그 # 46-603) 및 IGF-1R 인산화의 분석을 위한 P-IGF-1R(Tyr1131) 비드 키트(바이오라드 카달로그 # 171V27343)를 사용하여 여과된 세포 용해물에서의 EGFR 및 IGF-1R 인산화를 루미넥스(Luminex) 시스템으로 분석하였다. 인단백질 검출 시약 키트(바이오라드 카달로그 # 171-304004)를 사용하여 바이오플렉스(BioPlex) 인단백질 검출 매뉴얼(바이오라드 게시물 # 2903)에 기재된 바와 같이 상기 루미넥스 분석을 수행하였다.
IGF-1R 친화성 성숙된 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체 OA-F13B5-scFab-GA201 및 OA-L31D11-scFab-GA201은 IGF-1R 및 EGFR의 인산화를 효과적으로 억제한다(< 1 nM)(표 5 및 6 참조). IGF-1R 억제의 효능은 비-변경된 OA-Ak18-scFab-GA201에 비해 현저히 증가된다(A549: 2배 내지 4배; BxPC3: 2배 내지 6배; TC-71: 25배 내지 50배).
Figure pct00012
Figure pct00013
실시예 5
이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체에 의한 3D 배양에서의 A549 및 RD-ES 암세포의 증식 억제
이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체 OA-Ak18-scFab-GA201은 IGF-1R 및/또는 EGFR을 발현하는 암세포주의 생장을 억제한다.
암세포주의 세포 증식 분석에서 친화성 성숙된 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체 OA-F13B5-scFab-GA201 및 OA-L31D11-scFab-GA201의 잠재적 억제 활성을 평가하기 위해, (EGFR 및 IGF-1R을 발현하는) A549 암세포 및 (IGF-1R을 발현하는) RD-ES 암세포에 대한 억제 정도를 분석하였다.
인간 종양 세포(A549 또는 RD-ES)를 10% FBS(PAA), 1 mM 피루브산나트륨(깁코(Gibco), 독일 다름스타츠 소재), 비-필수 아미노산(깁코) 및 2 mM L 글루타민(시그마, 독일 스타인하임 소재)으로 보충된 RPMI 1640 배지(PAA, 오스트리아 파싱 소재)에서 배양하였다. 배양 배지를 함유하는 96웰 폴리-HEMA(폴리(2-하이드록시에틸메타크릴레이트)(폴리사이언시스(Polysciences), 미국 펜실베니아주 와링톤 소재)-코팅된 플레이트에 웰 당 1000개의 세포(A459 RD-ES)를 시딩하였다. 동시에, 상이한 농도의 이중특이적 항체 또는 대조군 항체를 첨가하고 7일 동안 항온처리하였다. 셀타이터글로(CellTiterGlo, 등록상표)(프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 분석을 이용하여 제조자의 설명서에 따라 세포의 ATP 함량을 측정함으로써 세포 생존력을 검출하였다.
결과는 도 1a 및 1b, 및 표 7에 나타나 있다. 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체 OA-F13B5-scFab-GA201 및 OA-L31D11-scFab-GA201은 A549 및 RD-ES 세포의 세포 증식을 효과적으로 억제한다(< 1 nM). 비-친화성 성숙된 비-변경된 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체 OA-Ak18-scFab-GA201과 비교될 때, 본 발명에 따른 친화성 성숙된 이중특이적 항체 OA-F13B5-scFab-GA201 및 OA-L31D11-scFab-GA201의 경우 효능이 현저히 증가된다(A549의 경우 3배 내지 5배, 및 RD-ES의 경우 약 20배)(표 7 참조).
실시예 6
이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체와, 상이한 EGFR 및 IGF-1R 발현을 갖는 세포의 결합
이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체 OA-Ak18-scFab-GA201은 IGF-1R 및/또는 EGFR을 발현하는 세포에 결합한다.
친화성 성숙된 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체 OA-F13B5-scFab-GA201 및 OA-L31D11-scFab-GA201과 인간 종양 세포의 잠재적 결합을 평가하기 위해, 상이한 IGF-1R/EGFR 발현 비를 갖는 세포에 대해 경쟁 결합 분석을 수행하였다.
빙냉 완충제(PBS + 2% FCS, 깁코)로 희석된 인간 종양 세포(A549 또는 TC-71, 2 x 105개 세포/웰)를 96웰 마이크로타이터 플레이트 내의 표지된 단일특이적 IGF-1R 항체 R1507(1 ㎍/㎖의 최종 농도)과, 상이한 농도의 비-표지된 IGF-1R-EGFR 이중특이적 항체 또는 대조군인 비-표지된 단일특이적 항체 또는 Fab 단편의 혼합물에 첨가하였다(100 ㎍/㎖ 내지 0.002 ㎍/㎖의 최종 적정 범위). 혼합물을 얼음 상에서 45분 동안 항온처리하였다. 150 ㎕ 내지 200 ㎕의 완충제(PBS + 2% FCS)를 첨가한 후 원심분리(300 g; 5분, 4℃)를 수행하여 세포를 2회 세척하였다. 그 다음, 세포를 6.25 ㎕/㎖의 7-AAD(BD #559925)를 함유하는 200 ㎕의 고정 완충제(1x 셀픽스(CellFix), BD #340181)에 재현탁하고 얼음 상에서 10분 내지 20분 동안 항온처리하여 7-AAD가 사멸된 세포에서 고정되고 침투되게 하였다. 샘플의 형광 신호를 FACS로 분석하고 IC50 값을 계산하였다.
<IGF-1R> HUMAB 클론 18(IC50 값)에 대한 경쟁 결합 분석의 결과는 표 8에 기재되어 있다. IGF-1R 및 EGFR 둘다를 발현하는 A549 종양 세포에 대한 친화성 성숙된 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체 OA-F13B5-scFab-GA201 및 OA-L31D11-scFab-GA201의 결합은 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체 OA-Ak18-scFab보다 약간 더 우수하였다(약 2배). IGF-1R을 발현하지만 EGFR을 발현하지 않는 TC-71 종양 세포에 대한 친화성 성숙된 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체 OA-F13B5-scFab-GA201 및 OA-L31D11-scFab-GA201의 결합은 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체 OA-Ak18-scFab에 비해 강하게 향상되었다(10배 내지 25배). IGF-1R만이 발현되고 EGFR이 발현되지 않는 이 상황에서 1+1 이중특이적 항체만이 1개의 결합 아암을 갖는 IGF-1R에 결합할 수 있으므로, IGF-1R 친화성의 차이는 보다 더 중요해질 것이다.
Figure pct00015
실시예 7
이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체의 당조작된 유도체의 제조
인산칼슘 형질감염 방법을 이용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유동물 항체 중쇄 및 경쇄 발현 벡터로 공형질감염시켜 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체의 당조작된 유도체를 제조하였다. 기하급수적으로 생장하는 HEK293-EBNA 세포를 인산칼슘 방법으로 형질감염시켰다. 당조작된 항체의 제조를 위해, 상기 세포를 각각 융합 GnTIII 폴리펩티드 발현용 플라스미드 및 만노시다제 II 발현용 제2 플라스미드로 공형질감염시켰다. 플라스미드 비의 이중특이적 항체를 상기 재료 및 방법 단락에 기재된 바와 같이 첨가하였다. 10% FCS로 보충된 DMEM 배양 배지를 사용하여 세포를 T 플라스크에서 부착 단일층 배양물로서 생장시키고, 상기 세포가 50% 내지 80%의 전면생장률에 도달하였을 때 형질감염시켰다. T75 플라스크의 형질감염을 위해, 형질감염 24시간 전에 7.5 (내지 8) x 106개의 세포를 FCS(최종 10% 부피/부피)로 보충된 약 14 ㎖의 DMEM 배양 배지에 시딩하고(궁극적으로 250 ㎍/㎖의 네오마이신), 세포를 5% CO2 대기를 갖는 37℃의 항온처리기 내에 밤새 넣어두었다. 각각의 T75 플라스크를 형질감염시키기 위해, 47 ㎍의 총 플라스미드 벡터 DNA와 235 ㎕의 1 M CaCl2 용액을 혼합하고 물을 469 ㎕의 최종 부피까지 첨가하여 DNA, CaCl2 및 물로 구성된 용액을 제조하였다. 이 용액에, 469 ㎕의 50 mM 헤페스, 280 mM NaCl 및 1.5 mM Na2HPO4 용액(pH 7.05)을 첨가하고 10초 동안 즉시 혼합하고 실온에서 20초 동안 방치하였다. 현탁액을 2% FCS로 보충된 약 12 ㎖의 DMEM으로 희석하고 기존 배지 대신에 T75에 첨가하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 약 17시간 내지 20시간 동안 항온처리한 후, 배지를 10% FCS로 보충된 약 12 ㎖의 DMEM으로 교체하였다. 형질감염으로부터 5일 내지 7일 후, 컨디셔닝된 배양 배지를 210 g 내지 300 g에서 5분 동안 원심분리하여 모으고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 멸균 여과하고(또는 대안적으로 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 4000 rpm에서 10분 동안 제2 원심분리를 수행하고) 4℃에서 보관하였다.
당조작된 항체를 비-당조작된 항체에 대해 전술된 바와 같이 정제하고 제제화하였다. 항체의 Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드를 하기 기재된 바와 같이 분석하여 푸코스의 양을 측정하였다.
실시예 8
시험관내 분석에서 이중특이적 < EGFR - IGF -1R> 항체와 FcgRIIIa 및 ADCC 의 결합
주어진 항체에 의한 ADCC 매개의 정도는 결합된 항원에 의해 좌우될 뿐만 아니라 FcgRIIIa(ADCC 반응을 유발하는 Fc 수용체로서 공지되어 있음)에 대한 불변 영역의 친화성에 의해서도 좌우된다. 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체와 FcgRIIIa의 결합을 분석하기 위해, 비아코어 기술을 적용하였다. 이 기술로 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체와 재조합적으로 제조된 FcgRIIIa 도메인의 결합을 평가하였다. 모든 표면 플라스몬 공명 측정을 상기 재료 및 방법 단락에 기재된 바와 같이 수행하였다. 당조작된 OA-F13B5-scFab-GA201-GE 및 OA-L31D11-scFab-GA201-GE는 (WT(비-당조작된 버전)의 3.3 x 10-08 M 및 6.4 x 10-08 M에 비해) 각각 7.5 x 10-09 M 및 6.4 x 10-09 M의 KD 값의 결합 친화성으로 인간 Fc 감마 RIIIa와의 결합을 보였다.
FcgRIIIa에 대한 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체의 결합 능력이 종양 세포를 향한 시험관내 ADCC 활성으로도 어느 정도까지 해석되는지를 분석하기 위해, ADCC 능력을 세포 분석에서 측정하였다. 이들 분석을 위해, 당변경된 유도체 이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체를 하기 기재된 바와 같이 제조하고 시험관내 ADCC 분석에서 시험하였다.
헤파린 처리된 혈액을 빙냉 PBS로 1:1(부피/부피)로 희석하고 류코셉(Leucosep) 튜브의 상부 부분 상으로 분배하였다(20 ㎖ 내지 25 ㎖/튜브). 중단 없이 800 x g 및 4℃에서 30분 동안 원심분리한 후, 상청액의 상부 부분에 존재하는 혈장 및 혈소판을 제거하고, 간기 함유 MNC를 50 ㎖ 팔콘 튜브 내에 수집하였다. 동일한 부피의 빙냉 PBS로 희석하고 튜브를 450 x g 및 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 피콜을 세척하였다. 펠렛을 3 ㎖의 PBS에 재현탁하고 PBS로 50 ㎖까지 충전시키고 450 x g 및 4℃에서 10분 동안 회전시켰다. 이 세척 단계를 1회 더 반복하였다. 펠렛을 AIM-V 배지(약 10 ㎖)에 재현탁하고 트립판 블루 염색 후 카운팅하여 세포 수를 측정하였다. 세포를 1:25의 표적 대 이펙터 세포 비에 적합한 세포 밀도인 500000Z/웰까지 희석하였다. 표적 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 부착된 세포를 트립신으로 처리하여 이들을 배양 플라스크로부터 떼어내었다. 37℃ 및 5% CO2의 항온처리기 내에서 5분 동안 항온처리한 후, 트립신 처리를 배양 배지로 중단시켰다. 세포를 910 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 펠렛을 배양 배지로 재현탁하고 카운팅하였다. 웰 당 20000개의 표적 세포를 웰 당 50 ㎕씩 96웰 E-플레이트에 시딩하였다. PBMNC의 제조 후, 배양 배지를 E-플레이트의 웰로부터 제거하였다. 50 ㎕의 무혈청 AIM-V 배지, 50 ㎕의 항체 용액 및 50 ㎕의 이펙터 세포(혈액 은행 로슈의 공여자로부터 새로 단리된 PBMNC)를 1:25의 표적 대 이펙터 세포 비로 웰에 전달하였다. 모든 희석물들을 무혈청 AIM-V 배지로 제조하였다. 하기 대조군들을 포함시켰다: 항체 없이 표적 세포 및 이펙터 세포(= 자발적 방출), 표적 세포 단독, 배지 단독, 및 이펙터 세포 없이 항체를 갖는 표적 세포. 등가 용량을 고려하여 항체 희석물을 계산하였다. 이것은 이중특이적 포맷이 이중 농축되어야 하고 1+1로 조합되어야 한다는 것을 의미한다. 항체 및 이펙터 세포의 첨가로부터 3시간 및 5시간 후 하기 식에 따라 ADCC의 평가를 확인하였다:
- 표준화 시간: 항체 및 이펙터 세포의 첨가 시간
- 자발적 방출: 표적 세포 + 항체 없는 배지 + 이펙터 세포
- ADCC 백분율 = ((표준화된 세포 지수(NCI) 자발적 방출 - NCI 샘플)/NCI 자발적 방출) X 100
결과는 도 2a 및 2b에 나타나 있다. 친화성 성숙된 이중특이적 당조작된 <EGFR-IGF-1R> 항체 OA-F13B5-scFab-GA201-GE 및 OA-L31D11-scFab-GA201-GE는 비-변경된 <IGF-1R> HUMAB-클론 18(AK18)에 의거하여 유사하게 구축된 비-친화성 성숙된 이중특이적 당조작된 <EGFR-IGF-1R> 항체 OA-Ak18-scFab-GA201-GE에 비해 2종의 상이한 종양 세포주(H460M2 및 H322M)에 대한 ADCC의 명확한 증가를 보였다.
실시예 9
이중특이적 <EGFR-IGF-1R> 항체의 당구조의 분석
푸코스 함유 올리고사카라이드 구조 및 푸코스 비함유(푸코스 결여) 올리고사카라이드 구조의 상대적인 비를 측정하기 위해, 정제된 항체 물질의 방출된 글리칸을 역상 UPLC(RP-UPLC)로 분석하였다. 이를 위해, N-글리코시다제 F를 사용하여 글리칸을 단백질로부터 방출시키고 분리하고 2-AB 표지(2-아미노 벤즈아미드)로 환원 말단에서 형광 표지하였다. 과량의 2-AB 염료를 제거하기 위한 세정 단계 후, 표지된 올리고사카라이드 풀을 형광 검출기를 갖춘 UPLC 시스템에 적용하였다. 역상 컬럼을 사용하여 올리고사카라이드 종의 분리를 달성하였다. 샘플의 비-Fuc 함량의 상대적인 수준을 정량하기 위해, 푸코스를 갖지 않는 올리고사카라이드를 나타내는 모든 피크들의 면적을 요약하고 모든 올리고사카라이드 피크들의 총 피크 면적과 관련시켰다.
푸코스의 양은 다음과 같이 측정되었다:
OA-L31D11-scFab-GA201: 24%
OA-F13B5-scFab-GA201: 23%
SEQUENCE LISTING <110> Roche Glycart AG <120> Bispecific anti-EGFR/anti-IGF-1R antibodies <130> 30638 WO1 <140> PCT/EP2012/068133 <141> 2012-09-14 <150> PCT/CN2011/080135 <151> 2011-09-23 <160> 86 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR1, humanized <EGFR>ICR62 <400> 1 Asp Tyr Lys Ile His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR2, humanized <EGFR>ICR62 <400> 2 Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR3, humanized <EGFR>ICR62 <400> 3 Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR1, humanized <EGFR>ICR62 <400> 4 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR2, humanized <EGFR>ICR62 <400> 5 Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR3, humanized <EGFR>ICR62 <400> 6 Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr 1 5 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain variable domain, humanized <EGFR>ICR62-I-HHD <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain variable domain, humanized <EGFR>ICR62 -I-KC <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR1, <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 <400> 9 Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR2, <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 <400> 10 Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR3, <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 <400> 11 Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu 1 5 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR1, <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 <400> 12 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR2, <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 <400> 13 Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr 1 5 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR3, <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 <400> 14 Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro Trp Thr 1 5 10 <210> 15 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain variable domain, <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 <400> 15 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain variable domain, <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 <400> 16 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys 100 105 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR1, <IGF-1R> F13B5 (modified <IGF-1R> HUMAB-Clone 18) <400> 17 Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR2, <IGF-1R> F13B5 <400> 18 Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR3, <IGF-1R> F13B5 <400> 19 Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu 1 5 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR1, <IGF-1R> F13B5 <400> 20 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR2, <IGF-1R> F13B5 <400> 21 Gln Ala Ser Lys Arg Ala Thr 1 5 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain CDR3, <IGF-1R> F13B5 <400> 22 Gln Gln Arg Ser Lys Tyr Pro Pro Trp Thr 1 5 10 <210> 23 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain variable domain, <IGF-1R> F13B5 <400> 23 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain variable domain, <IGF-1R> F13B5 <400> 24 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gln Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Tyr Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys 100 105 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain CDR1, <IGF-1R> L37F7 (modified <IGF-1R> HUMAB-Clone 18) <400> 25 Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 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Val 965 970 975 Asn Pro Glu Tyr Phe Ser Ala Ala Asp Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp 980 985 990 Glu Val Ala Arg Glu Lys Ile Thr Met Ser Arg Glu Leu Gly Gln Gly 995 1000 1005 Ser Phe Gly Met Val Tyr Glu Gly Val Ala Lys Gly Val Val Lys 1010 1015 1020 Asp Glu Pro Glu Thr Arg Val Ala Ile Lys Thr Val Asn Glu Ala 1025 1030 1035 Ala Ser Met Arg Glu Arg Ile Glu Phe Leu Asn Glu Ala Ser Val 1040 1045 1050 Met Lys Glu Phe Asn Cys His His Val Val Arg Leu Leu Gly Val 1055 1060 1065 Val Ser Gln Gly Gln Pro Thr Leu Val Ile Met Glu Leu Met Thr 1070 1075 1080 Arg Gly Asp Leu Lys Ser Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Pro Glu Met 1085 1090 1095 Glu Asn Asn Pro Val Leu Ala Pro Pro Ser Leu Ser Lys Met Ile 1100 1105 1110 Gln Met Ala Gly Glu Ile Ala Asp Gly Met Ala Tyr Leu Asn Ala 1115 1120 1125 Asn Lys Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Val 1130 1135 1140 Ala Glu Asp Phe Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Thr Arg 1145 1150 1155 Asp Ile Tyr Glu Thr Asp Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly Lys Gly Leu 1160 1165 1170 Leu Pro Val Arg Trp Met Ser Pro Glu Ser Leu Lys Asp Gly Val 1175 1180 1185 Phe Thr Thr Tyr Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp 1190 1195 1200 Glu Ile Ala Thr Leu Ala Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu Ser Asn 1205 1210 1215 Glu Gln Val Leu Arg Phe Val Met Glu Gly Gly Leu Leu Asp Lys 1220 1225 1230 Pro Asp Asn Cys Pro Asp Met Leu Phe Glu Leu Met Arg Met Cys 1235 1240 1245 Trp Gln Tyr Asn Pro Lys Met Arg Pro Ser Phe Leu Glu Ile Ile 1250 1255 1260 Ser Ser Ile Lys Glu Glu Met Glu Pro Gly Phe Arg Glu Val Ser 1265 1270 1275 Phe Tyr Tyr Ser Glu Glu Asn Lys Leu Pro Glu Pro Glu Glu Leu 1280 1285 1290 Asp Leu Glu Pro Glu Asn Met Glu Ser Val Pro Leu Asp Pro Ser 1295 1300 1305 Ala Ser Ser Ser Ser Leu Pro Leu Pro Asp Arg His 1310 1315 1320 <210> 77 <211> 107 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 77 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 78 <211> 105 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 78 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 79 <211> 330 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 79 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 80 <211> 330 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 80 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 81 <211> 327 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 81 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 82 <211> 1617 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Library template for Ak18 VL and VH library (pRJH61) <400> 82 atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60 atggccgaaa ttgttctgac ccagagtccg gcaaccctga gcctgagtcc gggtgaacgt 120 gcaaccctgt cttgtcgtgc aagccagagc gttagtagct acctggcctg gtatcagcag 180 aaaccgggtc aggcaccgcg tctgctgatt tatgatgcat ccaagcgtgc aaccggtatt 240 ccggcacgtt ttagcggtag cggatccggc accgatttta ccctgaccat tagcagcctg 300 gaaccggaag attttgccgt ttattattgt cagcagcgta gcaaatggcc tccgtggacc 360 tttggtcagg gcaccaaagt tgaaagcaaa cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420 ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480 aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540 aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600 accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 660 catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg tggagccgca 720 gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg aatggagccg cagactacaa ggacgacgac 780 gacaagggtg ccgcataata aggcgcgcca attctatttc aaggagacag tcatatgaaa 840 tacctgctgc cgaccgctgc tgctggtctg ctgctcctcg ctgcccagcc ggcgatggcc 900 caggttgaac tggttgaaag cggtggtggt gttgttcagc ctggtcgtag ccagcgtctg 960 agctgtgcag catccggatt tacctttagc agctatggca tgcactgggt tcgtcaggca 1020 ccgggtaaag gtctggaatg ggttgcaatt atttggtttg atggaagcag tacctactat 1080 gcagatagcg ttcgtggtcg ttttaccatt agccgtgata atagcaaaaa caccctgtat 1140 ctgcagatga atagcctgcg tgcagaagat accgcagttt atttttgtgc acgtgaactg 1200 ggtcgtcgtt attttgatct gtggggtcgt ggcaccctgg ttagcgttag cagcgctagc 1260 accaaaggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 1320 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 1380 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 1440 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 1500 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaagtggaca agaaagttga gcccaaatct 1560 tgtgacgcgg ccgcaagcac tagtgcccat caccatcacc atcacgccgc ggcatag 1617 <210> 83 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Library primer sequences AM_VL_AK18_L1_ ba <400> 83 tcagcagacg cggtgcctga cccggtttct gctgatacca ggccagatag ctgctaacgc 60 tctggcttgc acgacaagac agg 83 <210> 84 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Library primer sequences AM_VL_AK18_L2_ fo <400> 84 cagaaaccgg gtcaggcacc gcgtctgctg atttatgatg cgagcaaacg tgcaaccggt 60 attccggcac gttttag 77 <210> 85 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Library primer sequences AM_VH_AK18_H1_ ba <400> 85 caacccattc cagaccttta cccggtgcct gacgaaccca atgcatacca taagagctaa 60 aggtaaatcc ggatgctg 78 <210> 86 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Library primer sequences AM_VH_AK18_H2_ fo <400> 86 aggcaccggg taaaggtctg gaatgggttg caattatttg gtttgatggc agctctacct 60 attatgcaga tagcgttcgt ggtc 84

Claims (13)

  1. 인간 EGFR에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 IGF-1R에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R에 결합하는 이중특이적 항체로서,
    i) 상기 제1 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 3의 CDR3을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 4의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2 및 서열번호 6의 CDR3을 포함하고;
    ii) 상기 제2 항원 결합 부위가 서열번호 9의 CDR1, 서열번호 10의 CDR2 및 서열번호 11의 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 서열번호 12의 CDR1, 서열번호 13의 CDR2 및 서열번호 14의 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인에 의거한 변경된 항원 결합 부위이고;
    이때, 변경된 제2 항원 결합 부위가 상기 CDR들 중 하나 이상의 CDR 내에 하나 이상의 변경을 포함하고;
    변경된 제2 항원 결합 부위가 비-변경된 제2 항원 결합 부위에 비해 인간 IGF-1R과의 결합에 대한 결합 친화성의 10배 이상 증가된 KD 값을 갖는, 이중특이적 항체.
  2. 인간 EGFR에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 인간 IGF-1R에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 인간 EGFR 및 인간 IGF-1R에 결합하는 이중특이적 항체로서,
    i) 제1 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 3의 CDR3을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 4의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2 및 서열번호 6의 CDR3을 포함하고;
    ii) a) 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 17의 CDR1, 서열번호 18의 CDR2 및 서열번호 19의 CDR3을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 20의 CDR1, 서열번호 21의 CDR2 및 서열번호 22의 CDR3을 포함하거나;
    b) 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 25의 CDR1, 서열번호 26의 CDR2 및 서열번호 27의 CDR3을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 28의 CDR1, 서열번호 29의 CDR2 및 서열번호 30의 CDR3을 포함하거나;
    c) 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 33의 CDR1, 서열번호 34의 CDR2 및 서열번호 35의 CDR3을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 36의 CDR1, 서열번호 37의 CDR2 및 서열번호 38의 CDR3을 포함하거나;
    d) 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 41의 CDR1, 서열번호 42의 CDR2 및 서열번호 43의 CDR3을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 44의 CDR1, 서열번호 45의 CDR2 및 서열번호 46의 CDR3을 포함하거나;
    e) 제2 항원 결합 부위가 중쇄 가변 도메인 내에 서열번호 49의 CDR1, 서열번호 50의 CDR2 및 서열번호 51의 CDR3을 포함하고, 경쇄 가변 도메인 내에 서열번호 52의 CDR1, 서열번호 53의 CDR2 및 서열번호 54의 CDR3을 포함하는 것
    을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    i) 제1 항원 결합 부위가 서열번호 7의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 8의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하고;
    ii) a) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 23의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 24의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하거나;
    b) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 31의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 32의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하거나;
    c) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 39의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 40의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하거나;
    d) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 47의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 48의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하거나;
    e) 제2 항원 결합 부위가 서열번호 55의 중쇄 가변 도메인 VH 및 서열번호 56의 경쇄 가변 도메인 VL을 포함하는 것
    을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 2가, 3가 또는 4가 항체인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 Asn297에서 당쇄로 글리코실화되어 있고, 이에 의해 상기 당쇄 내의 푸코스의 양이 65% 이하인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 포함하는 약학 제제.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    암의 치료에 사용되는 이중특이적 항체.
  8. 암 치료용 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체의 용도.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 암의 치료가 필요한 환자에게 투여하여 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 암호화하는 핵산.
  11. 숙주 세포에서 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 발현시키기 위한 제10항에 따른 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  12. 제11항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체의 제조 방법으로서, 제10항에 따른 핵산을 숙주 세포에서 발현시키고 상기 이중특이적 항체를 상기 세포 또는 세포 배양 상청액으로부터 회수하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
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