EA015992B1 - Стабилизированное антитело и многовалентная антигенсвязывающая молекула на его основе, способы получения и использования вышеназванного стабилизированного антитела - Google Patents

Стабилизированное антитело и многовалентная антигенсвязывающая молекула на его основе, способы получения и использования вышеназванного стабилизированного антитела Download PDF

Info

Publication number
EA015992B1
EA015992B1 EA200802005A EA200802005A EA015992B1 EA 015992 B1 EA015992 B1 EA 015992B1 EA 200802005 A EA200802005 A EA 200802005A EA 200802005 A EA200802005 A EA 200802005A EA 015992 B1 EA015992 B1 EA 015992B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
amino acid
sequence
accordance
antibody
domain
Prior art date
Application number
EA200802005A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200802005A1 (ru
Inventor
Стивен Демарест
Скотт Глейзер
Брайан Роберт Миллер
Сюфен Ву
Вильям Б. Снайдер
Норман Ван
Лиза Дж. Кроунер
Алексей Александрович Луговской
Original Assignee
Байоджен Айдек Эмэй Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Байоджен Айдек Эмэй Инк. filed Critical Байоджен Айдек Эмэй Инк.
Publication of EA200802005A1 publication Critical patent/EA200802005A1/ru
Publication of EA015992B1 publication Critical patent/EA015992B1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B15/00—ICT specially adapted for analysing two-dimensional or three-dimensional molecular structures, e.g. structural or functional relations or structure alignment
    • G16B15/20—Protein or domain folding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B15/00—ICT specially adapted for analysing two-dimensional or three-dimensional molecular structures, e.g. structural or functional relations or structure alignment
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/30—Detection of binding sites or motifs
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/50—Mutagenesis
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G16B30/10—Sequence alignment; Homology search
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение основано, по крайней мере, частично на разработке стабилизированных связывающих молекул, состоящих из или включающих стабилизированные молекулы scFv, а также способы приготовления таких стабилизированных молекул.

Description

Настоящее изобретение относится к стабилизированным молекулам ксРу, содержащим ее химерным белкам и стабилизированной многовалентной антигенсвязывающей молекуле, популяции стабилизированных молекул ксРу, популяциям стабилизированных многовалентных антигенсвязывающих молекул, молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей стабилизированную молекулу ксРу, и клетке-хозяину, включающей вектор с указанной нуклеиновой кислотой, способу получения стабилизированной связывающей молекулы, способу получения стабилизированной молекулы ксРу (варианты), способу стабилизации молекулы ксРу, способам получения стабилизированного химерного белка, способу получения стабилизированного многовалентного антитела, способу повышения стабильности многовалентной молекулы, способу получения библиотеки, включающей стабилизированную молекулу ксРу, способу получения полипептида надсемейства иммуноглобулинов и полипептиду, полученному вышеуказанным способом, способу получения антитела или модифицированного антитела с повышенной стабильностью, способу прогнозирования стабильности белка-кандидата, способу лечения субъекта с помощью связывающей молекулы, а также графическому интерфейсу для пользователя.
Сведения о предшествующем уровне техники
В настоящее время признано, что стабильность белков является центральной проблемой при разработке и масштабировании белков, например молекул антител. Тяжелые и легкие цепи вариабельных последовательностей доменов антител находятся под селективным давлением, и их последовательность может сильно отличаться от одного антитела к другому (\Уи и КаЬа1, 1970). В геном человека входит множество функциональных вариабельных тяжелых (~40; ТотЛпкоп с1 а1., 1992; ТошЛикои с1 а1., 1994; Ма1киба апб Ноп)о. 1996), вариабельных каппа (~40; Мешб1 с1 а1., 1989; Сох с1 а1., 1994; ВатЫе апб ЛеРгапс, 1998) и вариабельных лямбда (~30; ^йЛашк е1 а1., 1996; Ка^акак1, е1 а1., 1997) генов зародышевой линии. Способность иммунной системы создавать большое количество комбинаций тяжелых и легких вариабельных цепей является одним из механизмов создания многообразия антител (Ебе1тап, 1959; Ргапек, 1961). Разнообразие достигается также включением вариабельного соединяющего пептидного участка, Ι-соединяющего пептида (плюс Ό-соединяющего пептида для тяжелых доменов) между вариабельным и константным доменами (Лебег, 1982). После выбора зародышевого антитела против конкретного антигена В-клетки, экспрессирующие антитела с отобранными зародышевыми линиями вариабельного домена и (О-)1-соединяющие пептиды, подвергаются процессу гиперсоматической мутации в вариабельных доменах тяжелых и легких цепей с целью повышения сродства антитела по отношению к антигену (Лебег, 1982; ТотЛпкоп е1 а1., 1996). Кроме того, обычно наблюдаются гиперсоматические включения или делеции в вариабельных доменах, хотя и значительно реже гиперсоматических мутаций (бе \УИб1 е1 а1., 1999). Таким образом, созревшее антитело против конкретного антигена характеризуется уникальными последовательностями вариабельных доменов, необязательно оптимизированных в отношении стабильности.
Низкая стабильность может повлиять на способность антитела или домена антитела правильно свертываться при экспрессии в различных клеточных системах, например в системах экспрессии бактерий или млекопитающих. Неправильное свертывание или низкая стабильность также могут привести к появлению популяций нефункционального материала (Майкеу е1 а1., 1998) и/или антител с тенденцией к образованию больших растворимых агрегатов, потенциально опасных или иммуногенных при терапевтическом применении. Другие связанные со стабильностью проблемы включают рефолдинг, деградацию, нарушения авидности, агрегацию или потерю активности при хранении.
Проблемы стабильности не ограничиваются природными антителами, они могут иметь место и в сконструированных антигенсвязывающих молекулах, таких как библиотеки рекомбинантных антител (НоодепЬоот, 2005), фрагменты антител (Но11 е1 а1., 2003; Тобогоукка е1 а1., 2001; \Уогп и ИискШип, 2001; Лебег и Рак!ап, 1996), а также сконструированные или гуманизированные терапевтические антитела для производственных и клинических целей (Е\тег1 е1 а1., 2004; Сайет апб Метсйап!, 1997). Проблемы стабильности могут возникать также и в поливалентных формах антител, таких как биспецифичные молекулы. Хотя из-за терапевтического применения у людей биспецифичные антитела нежелательны, их образование непредсказуемо. Например, биспецифичные антитела могут приводить к существенному снижению термической стабильности, выходу продукта или образованию агрегатов низкого молекулярного веса.
Неестественные изменения доменов УН и Уь могут возникать также при гуманизации антител грызунов. Обычно гуманизацию проводят, прививая определяющие комплементарность участки (СЭК.) грызунов на наиболее похожие человеческие зародышевые домены вариабельных цепей (Ниг1е и Отокк, 1994). Выбранные для гуманизации зародышевые линии могут использоваться иммунной системой не слишком часто, и для достижения адекватного связывания антигена часто бывает необходимо провести изменения в базовой структуре.
Нестабильность белков приводит к множеству проблем, включая одну или более из следующих: непригодность для масштабного производства в биореакторах (например, из-за низкого выхода, конечного содержания нежелательных сопутствующих продуктов, таких как несобранный продукт и/или агрегированный материал), трудности очистки, а также непригодность для фармацевтического приготовле
- 1 015992 ния и использования (например, из-за большого количества продуктов распада, низкого качества продуктов и/или неблагоприятных фармакокинетических свойств). Нестабильность вариабельных доменов антител, РаЬз, Ρνβ или одноцепочечного Ρνβ (ксРук) может приводить к множеству таких проблем. Конструкты 8сРу, в особенности, демонстрируют проблемы стабильности, растворимости, экспрессии, агрегации, образования продуктов распада, а также общей способности к образованию в системах экспрессии бактерий и млекопитающих (см. \Уогп и Р1иск1йип, 2001). Кроме того, включение молекул 8сΡν в ранее стабильные рекомбинантные антитела часто приводит к появлению этих нежелательных характеристик у новых продуктов.
Таким образом, в настоящее время наблюдается потребность в разработке новых усовершенствованных способов прогнозирования стабильности белков, таких как антитела, а также улучшенных, стабильных антигенсвязывающих молекул, пригодных для масштабного производства. Существует также потребность в разработке усовершенствованных способов масштабируемого производства популяции стабильных антигенсвязывающих молекул, пригодных для применения в области фармацевтики.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится, по меньшей мере частично, к разработке улучшенных полипептидных композиций, например молекул с улучшенным связыванием, включающих или состоящих из молекул 8сΡν с улучшенной стабильностью, а также к способам их приготовления.
В соответствии с одним аспектом изобретение относится к популяции стабилизированных молекул 8сΡν, в которой стабилизированные молекулы 8сΡν включают:
ί) 8сΡν-линкер, расположенный между доменами Ун и Уь, где домены νΗ и Уъ связаны дисульфидным мостиком, образованным между аминокислотой Ун домена и аминокислотой V домена, и где домены Ун и Уъ молекул 8сΡν характеризуются Тм выше 55°С; или ίί) 8сΡν-линкер, расположенный между доменами Ун и Уъ, где домены Ун и Уъ связаны дисульфидным мостиком, образованным между аминокислотой Ун домена и аминокислотой Уъ домена, и где молекулы 8сΡν характеризуются Т50 выше 49°С.
В соответствии с другим своим аспектом изобретение относится к стабилизированной молекуле 8сΡν, которая включает:
ί) 8сΡν-линкер с аминокислотной последовательностью (С1у48ет)п, расположенный между доменами Ун и Уъ, где домены Ун и Уъ связаны дисульфидным мостиком, образованным между аминокислотой Ун домена 44 и аминокислотой Уъ домена 100;
ίί) домены Ун и Уъ, где молекула включает по меньшей мере одну замену, выбранную из нижеследующей группы:
а) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 13 домена Ун;
б) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 домена Ун;
в) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 домена Уъ;
г) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 49 домена Уъ;
д) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 50 домена Уъ;
е) замену аминокислотных остатков в положениях Кэбата 49 и 50 домена Уъ;
ж) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 101 домена Ун;
з) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 20 домена Ун;
и) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 48 домена Ун;
к) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 3 домена Уь;
л) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 55 домена Ун;
м) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 67 домена Ун;
н) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 6 домена Ун;
о) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 32 домена Ун;
п) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 49 домена Ун;
р) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 43 домена Ун;
с) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 72 домена Ун;
т) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 79 домена Ун;
у) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 50 домена Уь;
ф) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 75 домена Уь;
х) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 80 домена Уь;
ц) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 83 домена Уь; или ίίί) Ун домен и Уъ домен со стабилизированной областью контакта между Ун и Уъ молекулы 8сΡν, где полученная молекула включает по меньшей мере одну замену в аминокислотной последовательности непосредственно в области контакта и/или аминокислотной последовательности, обеспечивающей взаимодействие между Ун и Уъ, где по меньшей мере одно положение аминокислотного остатка выбрано из группы, включающей 47Н, 37Н, 45Н, 46Н, 51Н, 59Н, 109Н, 14Н, 26Н, 27Н, 40Н, 69Н, 103Н, 29Н, 38Н, 44Н, 49Н, 55Н, 63Н, 54Н, 68Н, 72Н, 74Н, 79Н, 82Ьн, 8Н, 32Н, 39Н, 41Н, 62Н, 85Н, 91Н, 24Н, 60Н, 37Ь, 36Ь, 44Ь, 59Ь, 57Ь, 64Ь, 46Ь, 48Ь, 63Ь, 67Ь, 68Ь, 39Ь, 45Ь, 47Ь, 54Ь, 56Ь, 79Ь, 85Ь, 98Ь, 58Ь, 74Ь, 77Ь, 83Ь, 89Ь и 104Ь в соответствии с нумерацией Кэбата, и где Т50 стабилизированной молекулы 8сΡν боль
- 2 015992 ше, чем у молекулы 5сЕу без такой замены.
В соответствии с другим аспектом изобретение относится к стабилизированной молекуле 5сЕу. включающей ксРу-линкер (61у48ет)4, расположенный между νΗ доменом и Уъ доменом, где домены νΗ и У|, связаны дисульфидным мостиком, образованным между аминокислотным остатком домена νΗ и аминокислотным остатком домена Уь.
В соответствии с другим аспектом изобретение относится к стабилизированной молекуле 5сЕу. включающей домены νΗ и Ур и по меньшей мере одну замену, выбранную из следующей группы:
a) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 домена νΗ, например, на глутамат или глютамин и замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 домена Уъ, например, на лизин;
b) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 домена νΗ, например, на глутамат или глютамин, замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 домена Уъ, например, на лизин и замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 55 домена νΗ, например, на глицин; а также
c) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 домена νΗ, например, на глутамат или глютамин, замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 домена Уъ, например, на лизин, замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 55 домена νΗ, например, на глицин и замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 101 домена νΗ, например, на аспарагиновую кислоту.
В соответствии с другим аспектом стабилизированная молекула 5сЕу характеризуется эквивалентом стабильности, соответствующим обычному фрагменту РаЬ, в условиях термической проверки.
В соответствии с одним аспектом стабильность определяют, измеряя способность связываться с молекулой-мишенью.
В соответствии с одним аспектом молекула 5сЕу включает аминокислотную последовательность, закодированную нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей 8ЕО ГО N0: 9, 14, 16 и 18.
В соответствии с одним аспектом молекула 5сЕу включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 10, 15, 17 и 19.
В соответствии с другим аспектом изобретение относится к химерному белку, включающему стабилизированную молекулу 5сЕу.
В соответствии с одним аспектом химерный белок включает по меньшей мере два сайта связывания антигена.
В соответствии с другим аспектом изобретение относится к популяции стабилизированных многовалентных антигенсвязывающих молекул, где стабилизированные связывающие молекулы включают по меньшей мере одну стабилизированную молекулу 5сЕу. содержащую ксРу-линкер, расположенный между доменами νΗ и Уъ, где домены νΗ и У|, связаны дисульфидным мостиком, образованным между аминокислотой в домене νΗ и аминокислотой в домене Уь, и где популяция стабилизированных связывающих молекул включает мономерные растворимые белки, из которых в агрегированной форме находится не более 10%.
В соответствии с одним аспектом стабилизированные многовалентные антигенсвязывающие молекулы экспрессируются в клетках СНО или N80.
В соответствии с другим аспектом изобретение относится к популяции стабилизированных многовалентных антигенсвязывающих молекул, где каждая многовалентная антигенсвязывающая молекула включает:
ί) по меньшей мере одну молекулу 5сЕу. содержащую ксРу-линкер, расположенный между доменами νΗ и Уъ, где домены νΗ и У|, связаны дисульфидным мостиком, образованным между аминокислотой в домене νΗ и аминокислотой в домене Уъ, и где Тм доменов νΗ и νι, по меньшей мере одной молекулы 8сРу превышает 55°С; либо ίί) по меньшей мере одну молекулу 5сЕу. содержащую ксРу-линкер, расположенный между доменами νΗ и Уь, где домены νΗ и νι, связаны дисульфидным мостиком, образованным между аминокислотой в домене νΗ и аминокислотой в домене Уъ, и Т50 по меньшей мере одной молекулы 5сЕу многовалентной антигенсвязывающей молекулы превышает 49°С.
В соответствии с другим аспектом изобретение относится к стабилизированной многовалентной антигенсвязывающей молекуле, включающей:
ί) по меньшей мере одну стабилизированную молекулу 5сЕу. где стабилизированная молекула 5сЕу содержит (С1у48ет)п ксРу-линкер, расположенный между доменами νΗ и Уъ, и где домены νΗ и Уъ связаны дисульфидным мостиком;
ίί) по меньшей мере одну стабилизированную молекулу 5сЕу. содержащую (С1у48ет)п ксРу-линкер, расположенный между доменами νΗ и Уъ, где домены νΗ и У|, связаны дисульфидным мостиком, образованным между аминокислотным остатком 44 домена νΗ и аминокислотным остатком 100 домена Уь;
ϊϊΐ) по меньшей мере одну стабилизированную молекулу 5сЕу. где стабилизированная молекула 5сЕу включает по меньшей мере одну замену, выбранную из нижеследующей группы:
а) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 13 домена νΗ;
б) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 домена νΗ;
в) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 домена Уь;
- 3 015992
г) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 49 домена Уъ;
д) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 50 домена Уъ;
е) замену аминокислотных остатков в положениях Кэбата 49 и 50 домена Уъ;
ж) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 101 домена Ун;
з) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 20 домена Ун;
и) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 48 домена Ун;
к) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 3 домена Уъ;
л) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 55 домена Ун;
м) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 67 домена Ун;
н) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 6 домена Ун;
о) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 32 домена Ун;
п) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 49 домена Ун;
р) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 43 домена Ун;
с) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 72 домена Ун;
т) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 79 домена Ун;
и) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 50 домена Уь;
ф) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 75 домена Уь;
х) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 80 домена Ун;
ц) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 83 домена Ун, а также ίν) Ун домен и Уь домен со стабилизированным областью контакта между Ун и Уъ молекулы 8сЕу, где полученная молекула включает по меньшей мере одну замену в аминокислотной последовательности непосредственно в области контакта и/или аминокислотной последовательности, обеспечивающей взаимодействие между Ун и Уь, где по меньшей мере одно положение аминокислотного остатка выбрано из группы, включающей 47Н, 37Н, 45Н, 46Н, 51Н, 59Н, 109Н, 14Н, 26Н, 27Н, 40Н, 69Н, 103Н, 29Н, 38Н, 44Н, 49Н, 55Н, 63Н, 54Н, 68Н, 72Н, 74Н, 79Н, 82Ьн, 8Н, 32Н, 39Н, 41Н, 62Н, 85Н, 91Н, 24Н, 60Н, 37Ь, 36Ь, 44Ь, 59Ь, 57Ь, 64Ь, 46Ь, 48Ь, 63Ь, 67Ь, 68Ь, 39Ь, 45Ь, 47Ь, 54Ь, 56Ь, 79Ь, 85Ь, 98Ь, 58Ь, 74Ь, 77Ь, 83Ь, 89Ь и 104Ь в соответствии с нумерацией Кэбата.
В соответствии с другим аспектом изобретение относится к стабилизированной многовалентной антигенсвязывающей молекуле, включающей:
ί) по меньшей мере одну стабилизированную молекулу ^Ρν, включающую линкер (61у48ег)4 5сР\' между Ун доменом и Уъ доменом, где домены Ун и Уъ связаны дисульфидным мостиком между аминокислотным остатком домена Ун и аминокислотным остатком домена Уь;
ίί) по меньшей мере одну стабилизированную молекулу 5сР\'. включающую линкер 5сР\' с аминокислотной последовательностью (С1у48ег)п, расположенной между Ун доменом и Уъ доменом, где домены Ун и Уь связаны дисульфидным мостиком между аминокислотным остатком 44 домена Ун и аминокислотным остатком 100 домена Уъ; а также ϊϊΐ) по меньшей мере одну стабилизированную молекулу 5сР\'. где стабилизированная молекула 5сР\' включает по меньшей мере одну серию замен, выбранную из следующей группы:
а) замену аминокислотного остатка (например, глутамина) в положении Кэбата 3 домена Уь, например, на аланин, серин, валин, аспарагиновую кислоту или глицин;
б) замену аминокислотного остатка (например, серина) в положении Кэбата 46 домена Уь, например, на лейцин;
в) замену аминокислотного остатка (например, серина) в положении Кэбата 49 домена Уь, например, на тирозин или серин;
г) замену аминокислотного остатка (например, серина или валина) в положении Кэбата 50 домена Уь, например, на серин, треонин, аргинин, аспарагиновую кислоту, глицин или лизин;
д) замену аминокислотного остатка (например, серина) в положении Кэбата 49 и (например, серина) в положении Кэбата 50 домена Уъ соответственно на тирозин и серин; на тирозин и треонин; на тирозин и аргинин; тирозин и глицин; серин и аргинин; или серин и лизин;
е) замену аминокислотного остатка (например, валина) в положении Кэбата 75 домена Уъ, например, на изолейцин;
ж) замену аминокислотного остатка (например, пролина) в положении Кэбата 80 домена Уь, например, на серин или глицин;
з) замену аминокислотного остатка (например, фенилаланина) в положении Кэбата 83 домена Уь, например, на серин, аланин, глицин или треонин;
и) замену аминокислотного остатка (например, глутаминовой кислоты) в положении Кэбата 6 домена Ун, например, на глутамин;
к) замену аминокислотного остатка (например, лизина) в положении Кэбата 13 домена Ун, например, на глутамат;
л) замену аминокислотного остатка (например, серина) в положении Кэбата 16 домена Ун, например, на глутамат или глутамин;
м) замену аминокислотного остатка (например, валина) в положении Кэбата 20 домена Ун, напри
- 4 015992 мер, на изолейцин;
н) замену аминокислотного остатка (например, аспарагина) в положении Кэбата 32 домена Ун, например, на серин;
о) замену аминокислотного остатка (например, глутамина) в положении Кэбата 43 домена Ун, например, на лизин или аргинин;
п) замену аминокислотного остатка (например, метионина) в положении Кэбата 48 домена Ун, например, на изолейцин или глицин;
р) замену аминокислотного остатка (например, серина) в положении Кэбата 49 домена Ун, например, на глицин или аланин;
с) замену аминокислотного остатка (например, валина) в положении Кэбата 55 домена Ун, например, на глицин;
т) замену аминокислотного остатка (например, валина) в положении Кэбата 67 домена Ун, например, на изолейцин или лейцин;
у) замену аминокислотного остатка (например, глутаминовой кислоты) в положении Кэбата 72 домена Ун, например, на аспартат или аспарагин;
ф) замену аминокислотного остатка (например, фенилаланина) в положении Кэбата 79 домена Ун, например, на серин, валин или тирозин; а также
х) замену аминокислотного остатка (например, пролина) в положении Кэбата 101 домена Ун, например, на аспарагиновую кислоту.
В соответствии с другим аспектом изобретение относится к многовалентной антигенсвязывающей молекуле, включающей по меньшей мере одну стабилизированную молекулу 5сЕу, которая включает по меньшей мере одну серию замен, выбранную из нижеследующей группы:
а) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 домена Ун, например, на глутамат или глутамин и замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 домена Уь, например, на лизин;
б) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 домена Ун, например, на глутамат или глутамин, замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 домена Уъ, например, на лизин и замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 55 домена Ун, например, на глицин; а также
в) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 домена Ун, например, на глутамат или глутамин, замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 домена Уь, например, на лизин; замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 55 домена Ун, например, на глицин и замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 101 домена Ун, например, на аспарагиновую кислоту.
В соответствии с одним вариантом осуществления по меньшей мере одна стабилизированная молекула 5сЕу генетически гибридизована с антителом.
В соответствии с другим вариантом осуществления две стабилизированные молекулы 5сЕу генетически гибридизованы с антителом.
В соответствии с одним вариантом осуществления по меньшей мере одна стабилизированная молекула 5сЕу генетически гибридизована с карбоксиконцом легкой или тяжелой цепи антитела.
В соответствии с одним вариантом осуществления по меньшей мере одна стабилизированная молекула 5сЕу генетически гибридизована с Ν-концом легкой или тяжелой цепи антитела.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один сайт связывания, который связывается с молекулой, предпочтительно экспрессируемой в раковых клетках.
В соответствии с одним вариантом осуществления домен Ун молекулы 5сЕу изобретения получают из антитела ВНА10.
В соответствии с одним вариантом осуществления домен Уъ молекулы 5сЕу по изобретению получают из антитела ВНА10.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один сайт связывания, специфичный для молекулы, выбранной из группы, включающей нЕК1, нЕВ3, ΟΌ80, (3)86, ΡΌ-1, СТЬА4, В7-Н4, ΒΟΝ, ΟΌ200, ΟΌ4, ВАЕ В, ЕСЕК, 1СЕВ, УЕСЕВ, членов семейства рецепторов ΤΝΕ, рецептора Т1е, МЕТ, 1СЕ1, 1СЕ2, ΤΝΕ, лиганда ΤΝΕ, 1Ь-6, Т^ЕАК, Еп14, СЭ20. СЭ23. СВ1РТО, ИСЕ. альфа4бета1 интегрина, альфа5бета1 интегрина, альфа6бета4 интегрина и альфа5бета6 интегрина.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один сайт связывания, который связывается с молекулой, принимающей участие в модулировании иммунных ответов. В соответствии с одним вариантом осуществления молекула представляет собой рецептор Ес.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретения включает по меньшей мере один сайт связывания, который связывается с молекулой, принимающей участие в модулировании ангиогенеза. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению связывается с УЕСЕ или ангиопоэтином.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один сайт связывания, который связывается с неврологической мишенью.
- 5 015992
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению полиспецифична. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению биспецифична.
В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению связывается с двумя членами семейства рецепторов ΤΝΒ. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению связывается с ΕΤβΚ. и ТтаП К.2. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает молекулу ВНА10 зсЕу. генетически гибридизованную с антителом 14 А2.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает тяжелую цепь, последовательность которой выбрана из группы, включающей 8ЕО ГО N0: 33, 8Е0 ГО N0: 35, 8ЕС) ΙΌ N0: 37, 8Ер ГО N0: 47, 8ЕС) ГО N0: 49, 8ЕС) ГО N0: 51, 8ЕС) ГО N0: 53 и 8ЕС) ГО N0: 55.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид молекулы по любому из пунктов формулы изобретения 4-8, 11, 12 и 18-22.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая кодирует стабилизированную молекулу зсЕу, или к связывающей молекуле, включающей стабилизированную молекулу зсЕу по изобретению.
В соответствии с одним вариантом осуществления молекула нуклеиновой кислоты представлена в векторе. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретение относится к клетке-хозяину, включающей такой вектор.
В соответствии с одним вариантом осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, например клетку СНО или N80.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретение относится к популяции связывающих молекул, включающих молекулы зсЕу. причем эта популяция включает по меньшей мере на 10% меньше агрегатов по сравнению с клетками-хозяевами, экспрессирующими популяцию связывающих молекул, которые содержат обычные молекулы зсЕу.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретение относится к способу получения стабилизированной связывающей молекулы, в котором выращивание клетки-хозяина осуществляют в условиях, необходимых для продуцирования связывающих молекул.
В соответствии с одним вариантом осуществления на каждый литр культуральной среды, включающей клетки-хозяева, продуцируется по меньшей мере 10 мг стабилизированных связывающих молекул, при этом в такой среде не более 10% связывающих молекул присутствует в агрегированной форме.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретение относится к способу лечения субъекта, для которого лечение связывающей молекулой по изобретению может оказаться эффективным, в котором указанному субъекту вводят связывающую молекулу.
В соответствии с одним вариантом осуществления субъект страдает от заболевания или расстройства, выбранного из группы, включающей рак, аутоиммунное заболевание или расстройство и неврологическое заболевание или расстройство.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретение относится к способу стабилизации молекулы зсЕу. включающему генетическую гибридизацию Ун домена и Уъ домена с использованием линкера (61у48ет)п зсЕу и конструирование домена Ун так, чтобы он включал остаток цистеина в положении 44 аминокислотной последовательности, а также конструирование домена Уъ так, чтобы он включал остаток цистеина в положении 100 аминокислотной последовательности с получением стабилизированной молекулы зсЕу.
В соответствии с одним аспектом изобретение относится к способу продуцирования стабилизированного поливалентного антитела со стабилизированной молекулой зсЕу. в котором осуществляют генетическую гибридизацию стабилизированной молекулы зсЕу с Мконцом или С-концом легкой или тяжелой цепи молекулы антитела.
В соответствии с одним аспектом изобретение относится к относится к способу продуцирования стабилизированной молекулы зсЕу. в котором осуществляют замещение по меньшей мере одного аминокислотного остатка области контакта Ун/Уь молекулы зсЕу и/или по меньшей мере одного аминокислотного остатка каркаса Ун/Уъ молекулы зсЕу. улучшающего термическую стабильность доменов Ун и Уь молекулы зсЕу по сравнению с обычной молекулой зсЕу.
В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к способу продуцирования стабилизированной молекулы зсЕу. в котором осуществляют замещение по меньшей мере одного аминокислотного остатка Ун домена или У|, домена, который коварьируется с двумя или более аминокислотными остатками области контакта между доменами Ун и Уь.
В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к способу продуцирования стабилизированного химерного белка, включающего молекулу зсЕу; в котором осуществляют замещение по меньшей мере одного аминокислотного остатка в области контакта Ун/Уь молекулы зсЕу и/или по меньшей мере одного аминокислотного остатка каркаса Ун/Уъ молекулы зсЕу, а также генетическую гибри
- 6 015992 дизацию молекулы 5сЕу с полипептидом с получением стабилизированного химерного белка.
В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к способу повышения стабильности поливалентной молекулы, с по меньшей мере одной молекулой 5сЕу. в котором по меньшей мере в одной молекуле 5сЕу проводят по меньшей мере одну стабилизирующую мутацию, что и приводит к повышению стабильности многовалентной молекулы.
В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к способу повышения стабильности молекулы 5сЕу. в котором проводят по меньшей мере одну стабилизирующую мутацию в молекулу 5сЕу. что и приводит к повышению стабильности молекулы 5сЕу.
В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к способу крупномасштабного продуцирования стабилизированных химерных белков, включающему:
(а) проведение исследования термической стабильности молекулы 5сЕу с целью определить ее термическую стабильность;
(б) сравнение термической стабильности предполагаемой молекулы 5сЕу с подходящим контролем с целью идентифицировать стабилизированную молекулу 5сЕу. термическая стабильность которой повышена, по сравнению с контролем;
(в) отбор стабилизированных молекул 5сЕу. обнаруженных на этапе (Ь);
(г) генетическую гибридизацию по меньшей мере одной стабилизированной молекулы 5сЕу с белком с получением стабилизированного химерного белка;
(д) трансфицирование клетки-хозяина от млекопитающего молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей стабилизированный химерный белок;
(е) культивирование клетки-хозяина, полученной на этапе (£), в условиях, при которых экспрессируется стабилизированный химерный белок, где стабилизированный химерный белок экспрессируется не более чем с 10% агрегацией при выращивании в 10 л или более культуральной среды.
В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к способу определения термической стабильности укладки (фолдинг) белка из полипептидного надсемейства иммуноглобулинов (1д), включающего предполагаемые кандидаты аминокислотных последовательностей, который включает следующие этапы:
(а) выравнивание соответствующего референсного набора последовательностей, соответствующих укладке 1д полипептида;
(б) расчет ковариации между аминокислотными остатками последовательностей выравнивания с данными ковариации;
(в) определение счета ковариации, специфического для положения в последовательностикандидате, на основании данных ковариации; а также (г) сохранение или вывод специфического для положения аминокислоты счета ковариации последовательности как степени стабильности полипептида.
В соответствии с одним вариантом осуществления способ включает повторное проведение по меньшей мере этапов с) и б) для множества полипептидов надсемейства иммуноглобулинов (1д). В соответствии с еще одним аспектом способ дополнительно включает этап выбора из множества представителей полипептидов надсемейства иммуноглобулинов (1д) полипептида для получения, на основании специфического для положения в последовательности счета ковариации последовательности-кандидата.
В соответствии с другим вариантом осуществления способ дополнительно включает этап получения отобранного полипептида надсемейства 1д и его продуцирования для терапевтического использования.
В соответствии с другим вариантом осуществления полипептид надсемейства 1д получают из белка, выбранного из группы, включающей иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент, рецептор иммуноглобулина, белок клеточной адгезии, интегрин, аллерген, рецептор Т-клеток, а также главный комплекс гистосовместимости (МНС).
В соответствии с одним вариантом осуществления полипептид надсемейства 1д выбран из группы, включающей вариабельную область тяжелой цепи (Ун), вариабельную область легкой цепи (Уь), а также одноцепочечное антитело (5сЕу).
В соответствии с другим вариантом осуществления укладка 1д выбрана из группы, включающей укладки У-класса, укладки 1-класса, укладки С1-класса и укладки С2-класса.
В соответствии с одним вариантом осуществления разнообразие исследуемого набора сравнения или выравнивания составляет не менее 50%.
В соответствии с одним вариантом осуществления каждая последовательность в выравнивании характеризуется менее чем 90% идентичностью с каждой другой последовательностью в выравнивании.
В соответствии с другим вариантом осуществления по меньшей мере одна последовательность берется из представителей млекопитающих и по меньшей мере одна последовательность берется не из представителей млекопитающих.
В соответствии с одним вариантом осуществления остаткам в последовательности-кандидате назначается положительный специфический для последовательности счет ковариации для удовлетворения положительным ковариациям, включающимся в соответствующих положениях в выравнивании.
- 7 015992
В соответствии с одним вариантом осуществления остаткам в последовательности-кандидате назначается отрицательный специфический для последовательности счет ковариации для удовлетворения отрицательным ковариациям, включающимся в соответствующих положениях в выравнивании.
В соответствии с одним вариантом осуществления положительная ковариация характеризуется коэффициентом ассоциации фи (φ) приблизительно от +0,25 до +1,0.
В соответствии с одним вариантом осуществления отрицательная ковариация характеризуется коэффициентом ассоциации фи (φ) приблизительно от -0,25 до -1,0.
В соответствии с одним вариантом осуществления выравнивание выбрано из группы, включающей основанное на структуре выравнивание последовательности, основанное на последовательности выравнивание последовательности, а также основанное на структуре структурное выравнивание.
В соответствии с одним вариантом осуществления специфический для положения счет ковариации определяют для всех возможных пар остатков для каждого положения остатка в выравнивании.
В соответствии с одним вариантом осуществления выравнивание получают путем (ί) генерации модели Н1ббеи Магкоу Мобе1 (НММ) из начального выравнивания; (и) запроса дополнительных последовательностей с НММ и (ίίί) выравнивания дополнительных последовательностей с начальным выравниванием.
В соответствии с одним аспектом изобретение относится к компьютерной программе или компьютерному программному продукту, а также к предназначенному для чтения на компьютере носителю, включающим набор выполняемых процессором команд, следуя которым компьютер и осуществляет реализацию способа по изобретению.
В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к компьютерной программе или компьютерному программному продукту, а также к предназначенному для чтения на компьютере носителю, пригодным для использования в электронных устройствах, включающих данные, требуемые для выравнивания по способу изобретения.
В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к компьютерной программе или компьютерному программному продукту, а также к предназначенному для чтения на компьютере носителю, который пригоден для использования в электронных устройствах, включающих данные ковариации, способа изобретения.
В соответствии с одним аспектом изобретение относится к устройству, предназначенному для реализации способа изобретения.
В соответствии с одним аспектом изобретение относится к системе в компьютерном устройстве, включающей:
(ί) начальный этап накопления последовательности;
(ίί) место хранения, пригодное для хранения информации о последовательностях из выравнивания, в соответствии с пунктами формулы;
(ίίί) средство анализа, которое программно анализируют ковариацию между парами остатков в выравнивании с целью получения данных ковариации;
(ίν) устройство вывода, связанное с указанным электронным устройством, на которое будут выводиться вышеупомянутые данные ковариации.
В соответствии с одним аспектом изобретение относится к носителю в компьютерном устройстве, хранящему исполняемые команды, требуемые для выполнения любого этапа способа изобретения.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления данные по частоте использования остатков составляют матрицу, включающую (ί) непрерывные фрагменты из аминокислотных остатков, соответствующих полипептидной последовательности; и (ίί) частоты использования остатков для остатков каждого типа и каждого их положения.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления частоту использования остатков отображают символически.
В соответствии с одним вариантом осуществления представлены все 20 аминокислот, пробелы и неясные остатки. В соответствии с одним вариантом осуществления частота использования остатков коррелирует с размером символа.
В соответствии с одним вариантом осуществления частота использования остатков положительно коррелирует с размером символа.
В соответствии с одним вариантом осуществления (ί) положения остатков отображаются в столбцах; а (ίί) частоты использования остатков располагаются в строках.
В соответствии с другим вариантом осуществления ковариацию между ковариантными остатками отображают в виде сетки наложений.
В соответствии с одним аспектом изобретение относится к графическому пользовательскому интерфейсу, с помощью которого графически отображается (ί) графическая сетка, включающая набор данных о частоте использования остатков для набора последовательностей полипептидов сравнения; и (ίί) наложение ковариаций.
В соответствии с одним вариантом осуществления область контакта также включает (ίίί) отображе
- 8 015992 ние интересующей последовательности.
В соответствии с одним аспектом изобретение относится к способу продуцирования полипептида надсемейства иммуноглобулинов (1д) с улучшенным биофизическим свойством, который включает следующие этапы:
(a) осуществление выравнивания набора последовательностей сравнения, соответствующих 1дукладке полипептида;
(b) расчет ковариации между остатками последовательностей выравнивания с целью идентифицировать коварьирующие остатки;
(c) замещение остатков полипептида, которые не удовлетворяют ковариации коварьирующим остатком из соответствующего положения выравнивания.
В соответствии с другим вариантом осуществления биофизическое свойство выбрано из группы, включающей термическую стабильность, профиль развертывания под действием рН, стабильное устранение гликозилирования, растворимость, биохимическую функцию и их комбинации.
В соответствии с одним вариантом осуществления биохимическая функция выбрана из группы, включающей распознавание белковой мишени или химического объекта, где химический объект выбран из группы, включающей фосфат, метил, ацетил, липид, детергент, ион металла, галоген, РНК, ДНК, олигонуклеотид и олигонуклеозид.
В соответствии с одним вариантом осуществления полипептид надсемейства 1д получают из белка, выбранного из группы, включающей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, иммуноглобулиновый рецептор, белок клеточной адгезии, интегрин, аллерген, рецептор Т-клеток и молекулу главного комплекса гистосовместимости (МНС).
В соответствии с одним вариантом осуществления полипептид надсемейства 1д выбирают из группы, включающей вариабельную область тяжелой цепи (Ун), вариабельную область легкой цепи (Уъ), а также одноцепочечное антитело (кеРу).
В соответствии с одним вариантом осуществления укладка 1д выбрана из группы, включающей укладки У-класса, укладки 1-класса, укладки С1-класса и укладки С2-класса.
В соответствии с другим вариантом осуществления полипептид надсемейства 1д представляет собой модифицированное антитело, выбранное из группы, включающей доменное антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело, нечеловеческое моноклональное антитело, химерное антитело, биспецифичное антитело, кеРу-содержащее антитело и антитело с удаленным доменом.
В соответствии с одним вариантом осуществления коварьирующие остатки входят в состав структурного элемента, выбранного из группы, включающей дисульфидный мостик, солевой мостик, фрагмент лигандсвязывающего кармана или поверхности, а также сеть Ван-Дер-Ваальса, водородный мостик и/или взаимодействия заряд-заряд.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретение относится к способу получения антитела или модифицированного антитела с улучшенной стабильностью, в котором осуществляют следующие этапы:
(а) создание структурной модели образца антитела высокого разрешения, стабильность которого подтверждена экспериментально;
(б) использование структурной модели для идентификации области контакта Уц/У|. и/или каркасных остатков области контакта в образце антитела;
(в) использование гомологичной модели для идентификации соответствующих остатков области контакта Ун/Уь антитела или модифицированного антитела, которые важны для стабилизации указанной области контакта, а также (г) замещение соответствующих остатков области контакта Уц/У|. антитела или модифицированного антитела на остатки области контакта белка образца.
В соответствии с одним вариантом осуществления остаток области контакта белка образца накрывает собой по меньшей мере 10 А2 площади поверхности в области контакта.
В соответствии с одним вариантом осуществления модифицированное антитело выбрано из группы, включающей доменное антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело, нечеловеческое моноклональное антитело, химерное антитело, биспецифичное антитело, кеРу-содержащее антитело, химерное антитело, а также антитело с удаленным доменом.
В соответствии с другим аспектом изобретение относится к полипептидам, полученным способом по изобретению.
В соответствии с одним вариантом осуществления полипептид обладает улучшенным биофизическим свойством, выбранным из группы, включающей термическую стабильность, профиль развертывания под действием рН, стабильное устранение гликозилирования, растворимость, биохимическую функцию и их комбинации.
В соответствии с одним вариантом осуществления биохимическая функция представляет собой сродство к лиганду или специфичность.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретение относится к способу создания библиотеки, включающей стабилизированную молекулу кеРу, который включает:
- 9 015992 (a) создание набора последовательностей сравнения, соответствующих последовательности вариабельного домена молекулы ксРу;
(b) идентификацию аминокислоты внутри вариабельного домена, отсутствующей в наборе сравнения или встречающейся там с низкой частотой; а также (c) комбинирование этой информации с данными ковариации, предполагая, что модификация аминокислоты, идентифицированной в наборе сравнения с низкой частотой, может удовлетворить существующим ограничениям ковариации внутри вариабельного домена; а также (б) замещение аминокислоты этапа (Ь) стабилизированной аминокислотой-кандидатом с целью создания библиотеки, включающей стабилизированную молекулу ксРук.
В соответствии с одним вариантом осуществления аминокислота этапа (Ь) характеризуется консенсусным счетом менее 0,5. В соответствии с другим вариантом осуществления аминокислота этапа (Ь) присутствует в менее чем 10% последовательностей набора сравнения. В соответствии с другим вариантом осуществления аминокислота этапа (Ь) представляет собой неконсенсусный остаток.
В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная аминокислота-кандидат находится в соответствующем положении в наборе сравнения.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления стабилизированная аминокислота-кандидат представляет собой консенсусную аминокислоту.
В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированную аминокислоту-кандидата можно обнаружить путем анализа 3-Ό структуры вариабельной области последовательности. В соответствии с другим вариантом осуществления стабилизированную аминокислоту-кандидата идентифицируют расчетом упаковки боковых цепей.
В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к способу продуцирования стабилизированной молекулы ксРу, который включает:
(a) создание библиотеки ксРу, спроектированной в соответствии со способом;
(b) скрининг библиотеки ксРу анализа в жестких температурных условиях с целью идентифицировать молекулы-кандидаты ксРу;
(c) сравнение термической стабильности молекул-кандидатов ксРу из библиотеки ксРу с подходящим контролем, в котором повышение термической стабильности молекулы-кандидата ксРу относительно контроля характеризует молекулу-кандидата ксРу как стабилизированную молекулу ксРу.
В соответствии с другим аспектом изобретение относится к стабилизированной молекуле ксРу, идентифицированной с помощью способа по изобретению, или к химерному белку, включающему стабилизированную молекулу ксРу по изобретению.
В соответствии с другим аспектом изобретение относится к способу прогнозирования стабильности белка-кандидата, включающего аминокислотную последовательность, в состав которой входят последовательности доменов-кандидатов, при этом указанный способ включает:
(a) создание набора сравнения аминокислотных последовательностей, соответствующих последовательности домена-кандидата белка-кандидата;
(b) определение частот встречаемости остатков в индивидуальных положениях аминокислот исследуемой последовательности домена с целью получения консенсусного счета; а также (c) использование консенсусного счета для прогнозирования стабильности белка-кандидата, где консенсусный счет коррелирует со стабильностью белка-кандидата.
В соответствии с другим аспектом изобретение относится к способу прогнозирования стабильности белка-кандидата, который включает:
(a) создание набора последовательностей сравнения, соответствующих исследуемой последовательности домена белка-кандидата;
(b) определение частот встречаемости остатков в индивидуальных положениях аминокислот в исследуемой последовательности домена с получением консенсусного счета и (c) использование консенсусного счета для прогнозирования стабильности белка-кандидата, где консенсусный счет коррелирует со стабильностью белка-кандидата.
В соответствии с другим аспектом изобретение относится к способу прогнозирования стабильности белка-кандидата, в котором осуществляют следующие этапы:
(a) создание набора последовательностей сравнения, соответствующих исследуемой последовательности домена белка-кандидата;
(b) определение частот встречаемости остатков в положениях аминокислот в исследуемой последовательности домена с получением консенсусного счета;
(c) определение частот встречаемости остатков в соответствующих положениях аминокислот в последовательности набора сравнения с получением среднего консенсусного счета;
(б) сравнение консенсусного счета со средним консенсусным счетом с получением счета последовательности и (е) использование консенсусного счета для прогнозирования стабильности белка-кандидата, где консенсусный счет непосредственно коррелирует со стабильностью белка-кандидата.
В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к способу прогнозирования стабиль
- 10 015992 ности антитела-кандидата или модифицированного антитела-кандидата, в котором осуществляют следующие этапы:
(a) создание набора сравнения последовательностей νΗ домена, соответствующих исследуемой последовательности νΗ домена антитела-кандидата или модифицированного антитела;
(b) определение частот встречаемости аминокислотных остатков в положениях исследуемой последовательности νΗ домена с получением консенсусного счета;
(c) определение частот встречаемости остатков в соответствующих положениях аминокислот в последовательности набора сравнения с получением среднего консенсусного счета;
(б) сравнение консенсусного счета со средним консенсусным счетом с получением счета последовательности; а также (е) использование консенсусного счета для прогнозирования стабильности антитела-кандидата или модифицированного антитела, где консенсусный счет непосредственно коррелирует со стабильностью антитела-кандидата или модифицированного антитела.
В соответствии с одним вариантом осуществления набор сравнения включает последовательности белков с таким же типом укладки, что и у белка-кандидата.
В соответствии с другим вариантом осуществления набор сравнения включает ортологичные по следовательности.
В соответствии с одним вариантом осуществления набор сравнения включает последовательности человека, например последовательность νΗ человека того же класса Кэбата.
В соответствии с одним вариантом осуществления набор сравнения включает зародышевые последовательности νΗ человека.
В соответствии с одним вариантом осуществления исследуемая последовательность домена представляет собой фрагмент последовательности домена белка-кандидата.
В соответствии с одним вариантом осуществления консенсусный счет определяют для каждого положения в исследуемой последовательности и на основании этих данных получают общий консенсусный счет, причем общий консенсусный счет коррелирует со стабильностью белка.
В соответствии с другим вариантом осуществления общий консенсусный счет рассчитывают по следующей формуле:
где ксоге - счет с1(г) соответствует частоте встречаемости консенсусных аминокислотных остатков в положении консенсусной последовательности;
й1(г) равняется частоте исследуемых аминокислотных остатков в положении исследуемой последовательности;
соответствует количеству аминокислотных положений в пределах исследуемой последовательности.
В соответствии с одним вариантом осуществления стабильность белка определяют, сравнивая консенсусный счет белка-кандидата с консенсусным счетом подходящего контроля.
В соответствии с другим вариантом осуществления стабильность белка определяют, сравнивая консенсусный счет белка-кандидата с идеальным консенсусным счетом белка-кандидата.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления стабильность белка определяют, сравнивая консенсусный счет белка-кандидата с подходящим контролем.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления стабильность белка определяют, сравнивая счет последовательности антитела-кандидата или модифицированного антитела с подходящим контролем.
В соответствии с одним вариантом осуществления белок представляет собой полидоменный белок, причем последовательность домена-мишени получают из наименее стабильного домена полидоменного белка.
В соответствии с другим вариантом осуществления белок представляет собой модифицированное антитело, выбранное из группы, включающей антитело верблюда, гуманизированное антитело, человеческое антитело, нечеловеческое моноклональное антитело, химерное антитело, биспецифичное антитело, 8сΕν-содержащее антитело и антитело с удаленным доменом.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретение относится к способу отбора белков-кандидатов для экспрессии, включающему определение стабильности белка-кандитата способом по изобретению, где белок-кандитат отбирается для экспрессии, если его консенсусный счет или счет последовательности прогнозирует высокую стабильность.
В соответствии с другим аспектом изобретение относится к способу отбора белков-кандидатов для экспрессии, включающему определение стабильности белка-кандитата способом по изобретению, в котором белок-кандитат отбирается для экспрессии, если его специфический для положения в последовательности счет ковариации прогнозирует высокую стабильность.
В соответствии с другим аспектом изобретение относится к способу отбора исследуемой последо
- 11 015992 вательности вариабельной области акцепторного иммуноглобулина для использования при гуманизации антитела донора, причем этот способ включает определение стабильности последовательностикандидата способом по изобретению, где последовательность-кандидат отбирают, если ее счет последовательности прогнозирует высокую стабильность.
В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к способу отбора исследуемой последовательности вариабельной области акцепторного иммуноглобулина для использования при гуманизации антитела донора, причем этот способ включает определение стабильности последовательностикандидата способом по изобретению, где последовательность-кандидат отбирают, если ее специфический для положения в последовательности счет ковариации прогнозирует высокую стабильность.
В соответствии с другим вариантом осуществления исследуемая последовательность представляет собой зародышевую последовательность человека.
Перечень фигур, чертежей и иных материалов
На фиг. 1 показана последовательность ДНК (8Е() ГО N0: 3), кодирующая обычный конструкт ВНА10 5сВу. который включает линкер (С1у48ет)3 (выделен полужирным шрифтом).
На фиг. 2 показана последовательность (8Е0 ГО N0: 4), кодирующая обычный конструкт ВНА10 8сЕу.
На фиг. 3, 4 отражены результаты измерения способом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) очищенных обычных фрагментов ЕаЬ или 5сВу последовательности ВНА10. На фиг. 3 показаны результаты ДСК-анализа, в котором сравнивали развертывание обычных фрагментов ЕаЬ или 8сЕу последовательности ВНА10. На фиг. 4 показаны результаты ДСК-анализа очищенного ВНА10 5сВу при скорости сканирования 1 и 2°С/мин.
На фиг. 5 показана последовательность ДНК (8Е0 ГО N0: 9), кодирующая стабилизированный дисульфидом между Ун44/Уъ100 ВНА10 5сВу конструкт, включающий линкер (С1у48ет)3 (показан полужирным шрифтом).
На фиг. 6 показана аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 10) стабилизированного дисульфидом между Ун44/Уъ100 ВНА10 5сВу конструкта. Цистеиновые остатки, формирующие Ун44/Уъ100 дисульфидный мостик, выделены полужирным шрифтом и курсивом.
На фиг. 7 показана последовательность ДНК (8Е0 ГО N0: 14), кодирующая стабилизированный ВНА10 5сВу конструкт, включающий линкер (С1у48ет)4 (показан полужирным шрифтом).
На фиг. 8 показана аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 15) (61у48ет)4 ВНА10 5сВу конструкта. Пояснение такое же, как и для фиг. 7.
На фиг. 9 показана последовательность ДНК (8Е0 ГО N0: 16), кодирующая ВНА10 5сВу конструкт, включающий линкер (С1у48ет)5 (показан полужирным шрифтом).
На фиг. 10 показана аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 17) (61у48ет)5 ВНА10 5сВу конструкта. Аннотация такая же, что и для фиг. 9.
На фиг. 11 отражены результаты анализа Вестерн Блот (вестерн-блоттинг), в котором сравнивались уровни экспрессии обычного ВНА10 5сВу (полоса 1) и стабилизированной ВНА10 молекулы 5сВу5 изобретения (полосы 2-4). Каждый образец подвергался электрофорезу как в восстанавливающих (левая панель), так и в невосстанавливающих (правая панель) условиях.
На фиг. 12 показана последовательность ДНК (8Е0 ГО N0: 18), кодирующая стабилизированный дисульфидом между Ун44/Уъ100 ВНА10 5сВу конструкт, включающий линкер (С1у48ет)4 (показан полужирным шрифтом).
На фиг. 13 показана аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 19) стабилизированного дисульфидом между Ун44/Уь100 и (61у48ет)4 ВНА10 5сВу конструкта. Цистеиновые остатки, формирующие Уц44/У|,100 дисульфидный мостик, выделены полужирным шрифтом и курсивом. Пояснение такое же, как и для фиг. 12.
На фиг. 14 отражены результаты анализа термической проверки, в ходе которого термическую стабильность стабилизированной ВНА10 молекулы 5сВу5 изобретения сравнили с традиционной ВНА10 молекулой 5сВу. В подписях к фигуре указана температура, при которой 50% молекул 5сВу сохраняют свою связывающую активность (Т50).
На фиг. 15 отражены результаты анализа способом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), выполненного с обычными ВНА10 ксЕу и ВНА10 УН44:Уь100/(61у48ет)4 5сВу.
На фиг. 16 показаны результаты связывания гидрофобного флуоресцентного красителя 1-анилино-
8-нафталинсульфоната (АЛ8) с обычным ВНА10 ксЕу, ВНА10 (61у48ет)4 5сВу и ВНА10
Ун44:Уъ100/(61у48ет)4 ксЕу.
На фиг. 17, 18 отражены результаты анализа частоты остатков доменов ВНА10 Ун и Уъ. На фиг. 17 перечислены положения ВНА10 Ун из библиотеки для скрининга на основании анализа частоты остатков последовательностей вариабельного домена 1дС. На фиг. 18 перечислены положения ВНА10 У|, из библиотеки для скрининга на основании анализа частоты остатков последовательностей вариабельного домена 1дС.
На фиг. 19 отражены результаты анализа термической проверки, в ходе исследовали влияние стабилизирующих мутаций ВНА10 ксЕу на термическую стабильность и аддитивность стабилизирующих
- 12 015992 мутаций (683 означает (648)3 и 684 означает (648)4; 88 означает сульфидную связь).
На фиг. 20 показан пример стабилизированного ЬТвК/ТКА1Ь-К2 биспецифичного антитела (антитела Геркулес) изобретения. Антитела Геркулес образуют гибридизацией стабилизированной молекулы ВНА10 δсΡν изобретения с антителом 14А2 1д6. Молекулу 8сΡν можно гибридизовать с С- или Νконцом тяжелой цепи (С-Геркулес или МН-Геркулес) или с Ν-концом легкой цепи (ΝΗ-Геркулес).
На фиг. 21, 22 схематически отображены последовательные ПЦР-реакции, используемые для гибридизации обычных и сконструированных ВНА10 8сΡν с аминоконцом (фиг. 21) или карбоксиконцом (фиг. 22) тяжелой цепи 14А2.
На фиг. 23 показана последовательность ДНК (8ЕО ΙΌ N0: 28) химерной легкой цепи 14А2, включающей сигнальный пептид (подчеркнуто).
На фиг. 24 показана аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 29) химерной легкой цепи 14А2.
На фиг. 25 показана последовательность ДНК (8Е0 ΙΌ N0: 30) тяжелой цепи обычного ВНА10 8сΡν N (-Геркулес.
На фиг. 26 показана аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 31) тяжелой цепи обычного ВНА10 δсΡν ЦгГеркулес.
На фиг. 27 показана последовательность ДНК (8Е0 ΙΌ N0: 32) тяжелой цепи ВНА10 8сΡν (61у48ег)4 N (-Геркулес.
На фиг. 28 показана аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 33) тяжелой цепи ВНА10 δсΡν (61у48ег)4 N (-Геркулес.
На фиг. 29 показана последовательность ДНК (8Е0 ΙΌ N0: 34) тяжелой цепи ВНА10 8сΡν Ун44:Уъ100 ^Геркулес.
На фиг. 30 показана аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 35) тяжелой цепи ВНА10 δсΡν Ун44:Уъ100 N (-Геркулес.
На фиг. 31 показана последовательность ДНК (8Е0 ΙΌ N0: 36) тяжелой цепи ВНА10 8сΡν Ун44;Уъ100/(61у48ег)4 N (-Геркулес.
На фиг. 32 показана аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 37) тяжелой цепи ВНА10 δсΡν Ун44:Уъ100/(61у48ег)4 ^-Геркулес.
На фиг. 33 показана последовательность ДНК (8Е0 ΙΌ N0: 44) тяжелой цепи обычной ВНА10 8сΡν С-Геркулес.
На фиг. 34 показана аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 45) тяжелой цепи обычной ВНА10 δсΡν С-Геркулес.
На фиг. 35 показана последовательность ДНК (8Е0 ΙΌ N0: 46) тяжелой цепи ВНА10 8сΡν (61у48ег)4 С- Геркулес.
На фиг. 36 показана аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 47) тяжелой цепи ВНА10 δсΡν (61у48ег)4 С-Геркулес.
На фиг. 37 показана последовательность ДНК (8Е0 ΙΌ N0: 48) тяжелой цепи ВНА10 8сΡν Ун44:Уъ100 С-Геркулес.
На фиг. 38 показана аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 49) тяжелой цепи ВНА10 δсΡν Ун44:Уъ100 С-Геркулес.
На фиг. 39 показана последовательность ДНК (8Е0 ΙΌ N0: 50) тяжелой цепи ВНА10 8сΡν Ун44:Уъ100/(61у48ег)4 С-Геркулес.
На фиг. 40 показана аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 51) тяжелой цепи ВНА10 δсΡν Ун44:Уъ100/(61у48ег)4 С-Геркулес.
На фиг. 41 показаны результаты анализа Вестерн Блот кратковременно экспрессируемых С- и Геркулес биспецифичных антител в клетках СНО. Левая панель содержит анализ в невосстанавливающих условиях, а правая - в восстанавливающих условиях.
На фиг. 42, 43 показаны результаты анализа ЕЫ8А, оценивающего активность связывания стабилизированных антител Геркулес настоящего изобретения с рецепторами ΕΤβΒ На фиг. 42 отражены результаты со стабилизированными антителами С-Геркулес. На фиг. 43 показаны результаты со стабилизированными антителами ^Геркулес. Сокращение М означает обычное антитело N Геркулес. 684 означает стабилизированное антитело N Геркулес, включающее стабилизированную (61у48ег)4 8сΡν. άδ соответствует стабилизированному антителу Геркулес, включающему стабилизированную 8сΡν с Ун44/Уъ100 дисульфидным линкером.
На фиг. 44, 45 показаны результаты анализа ЕЫ8А, оценивающего активность связывания стабилизированных антител Геркулес настоящего изобретения с рецепторами ТКАТЬ К2. На фиг. 44 отражены результаты со стабилизированными антителами С-Геркулес. На фиг. 45 показаны результаты со стабилизированными антителами N ι-Геркулес. Сокращение М означает обычное антитело N Геркулес. 684 означает стабилизированное антитело Геркулес, включающее стабилизированную (61у48ег)48сРу. άδ соответствует стабилизированному антителу Геркулес, включающему стабилизированную δсΡν с Ун44/Уъ100 дисульфидным линкером.
- 13 015992
На фиг. 46 показаны результаты 8ЕС анализа стабилизированных биспецифичных антител СГеркулес после хроматографии белка А.
На фиг. 47, 48 показаны результаты 808-РАСЕ анализа очищенных стабилизированных биспецифичных антител Геркулес. На фиг. 47 отображены результаты для биспецифичных антител Ын-Геркулес. На фиг. 48 отображены результаты для биспецифичных антител С-Геркулес. В каждую полосу загружали по 5 мкг образца.
На фиг. 49 показаны результаты аналитического 8ЕС анализа очищенных стабилизированных биспецифичных антител Ν-Геркулес. Панель А отображает профиль Ν-Геркулес с Ун44:Уь100 ВнА10 8сР\' после хроматографии Белка А, а панель В - после препаративного 8ЕС. Панель С отображает профиль ΝГеркулес с УН44:Уъ100/(648)4 ВнА10 8сР\' после хроматографии Белка А, а панель Ό - после препаративного 8ЕС.
На фиг. 50 показаны результаты аналитического 8ЕС анализа очищенных стабилизированных биспецифичных антител С-Геркулес. Панель А отображает профиль С-Геркулес с Ун44:Уъ100 ВНА10 8сР\' после хроматографии белка А, а панель В - после препаративного 8ЕС. Панель С отображает профиль СГеркулес с УН44:Уъ100/(648)4 ВНА10 8сР\' после хроматографии белка А, а панель Ό - после препаративного 8ЕС.
На фиг. 51 показаны результаты анализа способом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), выполненного для С-Геркулес с УН44:Уь100/(648)4 ВНА10 8сР\' и С-Геркулес обычным ВНА10 8СΡν.
На фиг. 52 показаны результаты анализа ЕЫ8А, оценивающего активность биспецифичного связывания стабилизированных антител Геркулес настоящего изобретения с рецепторами ТКА1Ь-К2 и ЬТ[/К 1д. Ν-''Геркулес Суз и С-''ГеркулесСу8 представляют собой антитела Геркулес, включающие Νη- или С-концевые 8сΡν с дисульфидной связью Ун44/Уь100. №''ГеркулесСу8 и Ν-''Геркулес ΌΜ представляют собой антитела Геркулес, включающие Νη- или С-концевые 8сΡν с дисульфидной связью Ун44/Уь100 и линкером (61у48ег)4. Пентамер СВЕ11 представляет собой контрольное антитело с неспецифичной ЬТвК-связывающей активностью.
На фиг. 53-56 отображены эффекты стабилизированных Ν- и С-Геркулес биспецифичных антител на рост клеток опухолей. На фиг. 53-56 показаны эффекты на рост опухолевых клеток ХУЮг. опухолевых клеток Ме 180, ΜΌΑ231 и НИУЕС соответственно.
Фиг. 57 представляет собой схематическую диаграмму стабилизированных двухцепочечных димерных мини-тел, включающих стабилизированные 8сΡν. Пример мини-тела включает первый цепочечный фрагмент, включающий стабилизированный 8сΡν со специфичностью связывания к антигену ТКАГЬ К2, и второй цепочечный фрагмент, включающий стабилизированный 8сΡν со специфичностью связывания к антигену ΕΤβΚ. Ориентация доменов Ун и Уъ в 8сΡν может меняться, и соответствующие специфичности связывания также могут быть изменены.
Фиг. 58 представляет собой схематическую диаграмму стабилизированного биспецифичного двухцепочечного димерного тетравалентного мини-тела (стабилизированного биспецифичного Ν-8θΡν тетравалентного мини-тела), включающего стабилизированные фрагменты 8сΡν изобретения, соединенные с аминоконцом. Пример стабилизированного димерного тетравалентного мини-тела включает первый цепочечный фрагмент, включающий два стабилизированных 8сΡν8 со специфичностью связывания к антигену ТКАГЬ К2, и второй цепочечный фрагмент, включающий два стабилизированных 8сΡν8 со специфичностью связывания к антигену ΕΤβΚ. Возможны также и другие конфигурации, например, можно так сконструировать биспецифичное тетравалентное мини-тело, что каждый такой фрагмент будет содержать два стабилизированных фрагмента 8сΡν с различными специфичностями. В соответствии с другим аспектом ориентацию доменов Ун и Уъ в 8сΡν можно изменить. В соответствии с другим вариантом осуществления 8сΡν стабилизировано меньше всех.
Фиг. 59 представляет собой схематическую диаграмму примера стабилизированного биспецифичного двухцепочечного димерного тетравалентного мини-тела (стабилизированного биспецифичного С8сΡν тетравалентного мини-тела), включающего стабилизированные фрагменты 8сΡν изобретения, соединенные с обоими карбоксильными концами бивалентного мини-тела. Пример стабилизированного димерного тетравалентного мини-тела включает первый цепочечный фрагмент, включающий два стабилизированных 8сΡν8 со специфичностью связывания к антигену ТКАГЬ К2, и второй цепочечный фрагмент, включающий два стабилизированных 8сΡν8 со специфичностью связывания к антигену ЬТ[/К. Возможны также и другие конфигурации, например, можно так сконструировать биспецифичное двухцепочечное димерное тетравалентное мини-тело, что каждая такая цепочка будет содержать два стабилизированных фрагмента 8сΡν с различными специфичностями. В соответствии с другим вариантом осуществления ориентацию доменов Ун и Уъ в 8сΡν можно изменить. В соответствии с другим вариантом осуществления 8сΡν стабилизировано меньше всех.
Фиг. 60 представляет собой схематическую диаграмму стабилизированного биспецифичного четырехцепочечного димерного диатела, включающего стабилизированные 8сΡν изобретения. Возможны также и другие конфигурации, например, можно так сконструировать стабилизированное биспецифич
- 14 015992 ное двухцепочечное димерное тетравалентное мини-тело, что каждое такое плечо будет содержать стабилизированные фрагменты ксРу с различными специфичностями. Ориентацию доменов Ун и Уъ можно изменить. В соответствии с другим вариантом осуществления ксРу стабилизировано меньше всех.
Фиг. 61 представляет собой схематическую диаграмму стабилизированного биспецифичного четырехцепочечного димерного тетравалентного ксРу антитела (стабилизированного С-ксРу тетравалентного антитела), включающего стабилизированные ксРу, соединенные с карбоксильным концом Сн3 и пептидом, присоединенным к шарниру. Ориентацию доменов Ун и Уъ в стабилизированном ксРу можно изменить. Альтернативно, стабилизированные ксРу фрагменты можно присоединять к аминоконцу либо тяжелой, либо легкой цепи с образованием Ын-ксРу тетравалентных антител или Ыъ-ксРу тетравалентных антител соответственно.
Фиг. 62 представляет собой схематическую диаграмму стабилизированного четырехцепочечного тетравалентного биспецифичного антитела ксРу без домена Сн3 (стабилизированного С-ксРу тетравалентного биспецифичного антитела с удаленным доменом Сн3), включающего стабилизированное антитело ксРу, присоединенное к карбоксильному концу Сн3 и пептидом, присоединенным к шарниру. Каждый участок тяжелой цепочки биспецифичного антитела включает область Ρν со специфичностью связывания к антигену ТКАГБ К2 и стабилизированную область ксРу со специфичностью связывания к антигену ΕΤβΚ. Ориентацию Ун и Уъ доменов в стабилизированном ксРу можно изменять и менять соответствующие антигенсвязывающие специфичности. В соответствии с другим вариантом осуществления ксРу стабилизировано меньше всех.
Фиг. 63 представляет собой схематическую диаграмму стабилизированного четырехцепочечного тетравалентного биспецифичного антитела ксРу с удаленным доменом Сн3 (стабилизированного Ын-8сРу тетравалентного биспецифичного антитела с удаленным доменом Сн3), включающего стабилизированное антитело ксРу. присоединенное к аминоконцу Ун и включающее пептид, присоединенный к шарниру. Каждый участок тяжелой цепи биспецифичного антитела включает область Ρν со специфичностью связывания к антигену ТКА1Е К.2 и стабилизированную область ксРу со специфичностью связывания к антигену ΕΤβΚ. Ориентацию Ун и Уъ доменов в стабилизированном ксРу можно изменять и менять соответствующие антигенсвязывающие специфичности. В соответствии с другим вариантом осуществления ксРу стабилизировано меньше всех.
Фиг. 64 представляет собой схематическую диаграмму стабилизированного четырехцепочечного тетравалентного биспецифичного антитела ксРу с удаленным доменом Сн3 (стабилизированного N-ксРу тетравалентного биспецифичного антитела с удаленным доменом Сн3), включающего стабилизированное антитело ксРу, присоединенное к аминоконцу Уъ и включающее пептид, присоединенный к шарниру. Каждый участок тяжелой цепи биспецифичного антитела включает область Ρν со специфичностью связывания к антигену ТКА1Е К2 и стабилизированную область ксРу со специфичностью связывания к антигену ΕΤβΚ. Ориентацию Ун и Уъ доменов в стабилизированном ксРу можно изменять и менять соответствующие антигенсвязывающие специфичности. В соответствии с другим вариантом осуществления ксРу стабилизировано меньше всех.
На фиг. 65 изображены кривые Т50 ВНА10 ксРу дикого типа (закрашенные кружки) по сравнению со стабилизирующими мутациями ВНА10 ксРУ, включающими УЪ-846Е (фиг. 65А, пустые кружки), УнУ55О (фиг. 65В, пустые кружки) и Ун Ρ101Ό (фиг. 65С, пустые кружки).
На фиг. 66, 67 изображены кривые ДСК Уц-(С8)4-У|-6И|к ВнА10 ксРу дикого типа (серая линия) по сравнению с ВН10 ксРу, включающими стабилизирующие мутации Уъ 846Б (черная линия) (фиг. 66) и Ун У55О (черная линия) (фиг. 67).
На фиг. 68 изображены кривые ДСК Уц-(С8)4-У|-6И|к ВнА10 ксРу дикого типа (серая линия) по сравнению с ВН10 ксРу, включающими стабилизирующую мутацию Ун-Р101Б (черная линия).
На фиг. 69 изображен анализ 808-РАСЕ ксРу дикого типа (ЭДТ (О48)Х3) и стабилизированного мутантного ксРу. Все мутантные ксРу содержат связывающий пептид типа 01у-8ет и формулы (О1у48ег)4 между Ν-концом Ун и С-концом У|, ((О48)Х4). Показана идентичность ксРу в каждой полосе. Полосы 12-14 содержат ВНА10 ксРу с дисульфидным мостиком между Ун44 и Уь100. (О48)Х4/дисульфид стабилизирующие ксРу обозначены как ΌΜ, что означает йоиЫе ти!ап1 (двойной мутант). Две последние полосы включают заданные мутации, которые также стабилизировали связанные через дисульфиды ксРу.
На фиг. 70, 71 изображены кривые ДСК ВНА10 ксРу дикого типа ксРу (Ун-(О8)4-Уь-6н1к) (пунктирная линия), Ун 816Е мутантное ксРу (тонкая серая линия), Уъ 846Б мутантное ксРу (тонкая черная линия), Ун У55О мутантное ксРу (толстая серая линия), а также Ун Ρ101Ό мутантное ксРу (толстая черная линия). На фиг. 71 показана зависящая от температуры флуоресценция 10 мМ ΛΝ8 в РВ8 (пустые кружки) или в присутствии ВНА10 ксРу дикого типа (Ун-(С8)4-Уь-6н1к) (закрашенные серые кружки), Ун 816Е мутантных ксРу (ромбики), У|, 846Б мутантных ксРу (квадратики), Ун У55О мутантных ксРу (обратные треугольники), а также Ун Ρ101Ό мутантных ксРу (треугольники). Проведенные через кривые линии построены на основании модели развертывания с двумя состояниями.
На фиг. 72, 73 показана флуоресценция АЫ8 при 15°С в присутствии ксРук дикого типа и мутантных. Индуцированная каждым ксРу флуоресценция АЫ8 нанесена на график против ТМ домена Ун того
- 15 015992 же 8сЕу, как определено способом ДСК (фиг. 72) и температурозависимым увеличением флуоресценции ΑΝ8, вызванным развертыванием каждой зсЕу (фиг. 73).
На фиг. 74-76 представлены данные гель-хроматографии (8ЕС) высоких концентраций стабилизированного Ν-Геркулес (Х\И028; ВНА10 зсЕу Ун44:Ур100/(С1у.18ег).1Н-Геркулес; фиг. 74), стабилизированного С-Геркулес (Х\И036; ВНА10 зсЕу Ун44:Уъ100/(С1у48ег)4 С-Геркулес; фиг. 75), а также антител ВНА10 дикого типа (фиг. 76) в шести временных точках (Т=0, Т=1 неделя, Т=2 недели, Т=1 месяц, Т=2 месяца и Т=3 месяца) и низких температурах (2-8°С). По оси X отложено время (минуты), по оси у тАи (единицы поглощения) при 280 нм. За время эксперимента значительных изменений в профиле элюирования отмечено не было.
На фиг. 77 представлены данные анализа δΌδ-РАСЕ для Х\И028 и Х\И036 до хранения и через 3 месяца после их передачи на хранение при 2-8°С. Панель А. Ранее восстановленные образцы были окислены до первоначального состояния (обозначены как ΝΒ). Предполагаемая молекулярная масса, М\, ~200 кДа, наблюдалась для биспецифических образцов. ВНА10 показал свою ожидаемую М\ ~150 кДа. Полосы 1-4 соответствуют образцам Х\И028. Полосы 5-8 соответствуют образцам Х\И036. Полосы 9-10 соответствуют образцам ВНА10 1дС. Панель В. Образцы восстановили ОТТ (обозначены как Веб, восстановленные). Предполагаемая молекулярная масса для тяжелой цепи составляет ~75 кДа, а для легкой цепи ~25 кДа, они наблюдались для биспецифичных образцов в восстановительных условиях. Тяжелые и легкие цепи ВНА10 показали свои ожидаемые М\ 50 и 25 кДа соответственно в восстановительных условиях. Панели 1, 2, 6 и 7 соответствуют образцам Х\И028. Панели 3, 4, 8 и 9 соответствуют образцам Х\И036. Панели 5 и 10 соответствуют образцам ВНА10 1дС.
На фиг. 78, 79 показаны данные интактного масс-анализа для Х\И028 (панель А) и Х\И036 (панель В) при Т=0, Т=1 месяц и Т=3 месяца. Для каждого белка наблюдалось несколько пиков из-за высокого уровня сиалилирования Ν-связанных углеводов в Сн3. Распределение углеводов биспецифичных антител типично для стандартных белков 1дС1.
На фиг. 80, 81 отображены результаты сэндвич-анализа ЕЫ8А, в котором измерялось биспецифичное связывание образцов сыворотки, включающей Ν-концевой Геркулес (Х\И028; фиг. 74) или Сконцевой Геркулес (Х\И036; фиг. 75), с рецепторами ТВА1Й-В2 и ЬТЗВ.
Фиг. 82 отражает результаты эксперимента по оценке относительной активности ίη νίνο стабилизированных биспецифичных антител (Х\И028 (ромбики) и Х\И036 (пустые квадратики)), моноспецифичных антител, вводившихся по отдельности (11СВЕ11 (закрашенные треугольники) и ЬВнА10 (обращенные треугольники) и С1114А2 (ромбики)) и совместно (пустые треугольники) против мышиной модели ксенотрансплантата. Введения начались на день 13. 11СВЕ11 ν. УС: Р<0,001; 11ВнА10 ν. УС: Р<0,001; СЙ14А2 ν. УС: Р<0,01; Геркулес-ΙΙ ХАЕ028 ν. УС.: Р<0,001; Геркулес-ΙΙ ХА'Е'028 ν.йВΗΑ10: Р<0,05; Геркулес-ПХ\и028у.сЫ4А2: Р<0,005; Геркулес-11Х\И036 ν. УС: Р<0,001; Геркулес-ΙΙ Х\И036 ν. йВнА10: Р<0,01; Геркулес-ΙΙ Х\И036 ν. СЙ14А2: Р<0,05; комбо ν. У.С. : Р<0,001.
На фиг. 83 показана последовательность ДНК (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 52) тяжелой цепи С-Геркулес ВНА10 8сΕν Ун 816Е+Уъ 846Ь биспецифичного антитела.
На фиг. 84 показана аминокислотная последовательность (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 53) тяжелой цепи СГеркулес ВНА10 8сΕν Ун 816Е+Уъ 846Ь биспецифичного антитела.
На фиг. 85 показана последовательность ДНК (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 54) тяжелой цепи С-Геркулес ВНА10 8сΕν Ун44-Уъ100/Ун 816Е+Уъ 846Ь биспецифичного антитела.
На фиг. 86 показана аминокислотная последовательность (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 55) тяжелой цепи СГеркулес ВНА10 8сΕν Ун44-Уь100/Ун 816Е+Уь 846Ь биспецифичного антитела.
На фиг. 87 показаны результаты аналитической гель-хроматографии (8ЕС) элюатов белка А из супернатантов, включающих С-Геркулес со стабилизированным Ун 816Е+Уь 846Ь ВНА10 8сΕν (Х\И054) и С-Геркулес с обычным (\Т) ВнА10 8сΕν.
На фиг. 88, 89 показаны гели δΌδ-РАСЕ очищенного С-концевого Геркулес с Ун 816Е+Уь 846Ь ВНА10 8сΕν (фиг. 88) и очищенного С-концевого Геркулес с Ун44:Уь100/Ун 816Е+Уь 846Ь ВнА10 8сΕν (фиг. 89).
На фиг. 90, 91 показаны профили элюирования аналитической 8ЕС для С-концевого Геркулес с Ун 816Е+Уъ 846Ь ВНА10 8сΕν (фиг. 90) и С-концевого Геркулес с Ун44:Уъ100/Ун 816Е+Уъ 846Ь ВНА10 8сΕν (фиг. 91) после первоначального этапа очистки белка.
На фиг. 92, 93 показаны результаты ίη νίΐτο анализов пролиферации опухолевых клеток, демонстрирующих активность С-концевого Геркулес с Ун 816Е+Уь 846Ь ВНА10 8сΕν (Х\И054) и С-концевого Геркулес с Ун44:Уъ100/Ун 816Е+Уъ 846Ь ВНА10 8сΕν (Х\И055). Клеткам МОА231 (фиг. 92) и \ίΌτ (фиг. 93) вводили антитела. Активность для антител Геркулес сравнивали со стабилизированными Х\И036 биспецифичными антителами и соответствующими моноспецифичными антителами (ЬВнА 10 и СЙ14А2), вводившимися по отдельности или совместно.
На фиг. 94 отображена кривая развертывания ДСК для ВПВ7 !дС1, сделанная в условиях, идентичных тем, что использовались для остальных человеческих (гуманизированных) антител 18 ВИВ (сплошная линия). Индивидуальные ЕаЬ, Сн3 и Сн3 переходы, хорошо заметные на кривой ДСК, помечены и представлены пунктирными линиями.
- 16 015992
На фиг. 95 показана кривая развертывания ДСК антител ΒΙΙΒ7 в форматах 1дС1 и 1дС4.
На фиг. 96 показаны кривые термического развертывания четырех человеческих (гуманизированных) антител Ι§01: ΒΙΙΒ16, ΒΙΙΒ6, ΒΙΙΒ4 и ΒΙΙΒ1. Переходы при развертывании между Сн3 и Сн3 доменами для всех четырех конструктов Ι§01 идентичны, но переходы при развертывании РаЬ высоковариабельны.
На фиг. 97 представлены результаты консенсусного счета для 182 вариабельных последовательностей доменов человеческих антител человеческих антител и консенсусных последовательностей индивидуальных подклассов. А. Счеты последовательностей подкласса Ун, полученные способом анализа частоты остатков в базе данных Ун млекопитающих. В. Распределение счетов последовательности сравнения Ун из ΝΕΒΙ. Счеты последовательностей Ун кластеризованы в соответствии с подклассом С. Счеты последовательностей подкласса Ук, полученные способом анализа частоты остатков в базе данных млекопитающих Ук. Ό. Распределение счетов из последовательности Ук сравнения из Ν€ΒΙ. Счеты последовательностей Ук кластеризованы в соответствии с подклассом.
На фиг. 98, 99 представлены двумерные графики, на которых сравниваются счеты последовательностей для антител 18 ΒΙΙΒ с соответствующими температурами РаЬ Тм, измеренными способом ДСК. Фиг. 98 отражает счеты ΒΙΙΒ1-18 Ун против РаЬ Тм. Идентичность каждой точки включается в табл. 20. Значения Ун ΒΙΙΒ15 и ΒΙΙΒ16 содержат необычные включения/делеции в своих областях СОЯ. Результаты для ΒΙΙΒ15 и ΒΙΙΒ16 показаны в виде квадратиков. Тм для ΒΙΙΒ18 искусственно помечен как 57,2°С (чтобы привести в соответствие с минимальным измеренным ТМ из ΒΙΙΒ17), так как его собственную ТМ измерить не удалось в виду отсутствия экспрессии. Вероятно, ТМ для ΒΙΙΒ18 будет значительно меньше, так как его счет последовательности чрезвычайно мал, и он не может экспрессироваться. Данные РаЬ для ΒΙΙΒ18 представлены в виде треугольников. Результаты для Ун оставшихся антител ΒΙΙΒ представлены в виде кружков. На фиг. 99 показаны счеты ΒΙΙΒ1-18 Ук против РаЬ Тм. Символы соответствуют графику (А), если не считать счетов для Ук.
На фиг. 100 показаны репрезентативные структуры У-класса, С-класса и Ι-класса укладки Ι§.
На фиг. 101 отображена гистограмма длин последовательностей У-, Ι-, С1- и С2-классов укладок Ι§, полученных из 8СОР.
На фиг. 102 показан вывод ΝΑΡΜΑΡ У18иа1 Тоо1, включающий фрагмент платформы выравнивания, на котором накладываются данные ковариационного анализа. Платформа отображает колонки (столбцы), включающие все аминокислотные остатки, включая пропуски (тип остатка), для каждого положения в вариабельной области (№ положения остатка).
На фиг. 103 показано наложение статистик ковариации укладки Ι§ на шаблон ΝΑΡΜΑΡ. Интересующая последовательность представлена в виде изогнутой линии, проходящей через соответствующие аминокислоты. Ковариации показаны в виде прямых полосок между соответствующими коварьирующими аминокислотными остатками.
На фиг. 104 показаны детали ковариационного анализа ВНА10 Уъ с выделением ковариации между Туг в положении Кэбата 36 (положение остатка № 48) и мутации 8егЬеи в положении Кэбата 46 (положение остатка № 67), как описано в примере 7.
На фиг. 105 показаны детали ковариационного анализа ВНА10 Ун с выделением конфликтующей ковариации между Уа1 в положении Кэбата 67 (положение остатка № 100), Тйг в положении Кэбата 70 (положение остатка № 104) и мутации Ме!Ьеи в положении Кэбата 80 (положение остатка № 116).
На фиг. 106 показана последовательность одноцепочечной ДНК (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 63) тяжелой цепи Сконцевого тетравалентного антитела ΡЯIΜΑТIΖЕ^® р5Е8, включающего обычный 5сЕу.
На фиг. 107 показана аминокислотная последовательность (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 64) тяжелой цепи Сконцевого тетравалентного антитела ΡΒΙΜΑΉΖΕΌ® р5Е8, включающего обычный 5сЕу.
На фиг. 108 показана последовательность одноцепочечной ДНК (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 65) легкой цепи ΡΒΙΜΑΉΖΕΌ® р5Е8. Последовательность сигнального пептида выделена.
На фиг. 109 показана аминокислотная последовательность (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 66) легкой цепи ΡΒΙΜΑΉΖΕΌ® р5Е8.
На фиг. 110 показана последовательность одноцепочечной ДНК (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 67) обычной ΡΒΙΜΑΉΖΕΌ® р5Е8 (Уь/Ун) 8сЕу. Последовательность сигнального пептида выделена.
На фиг. 111 показана аминокислотная последовательность (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 68) обычной
ΡΡΙΜΑΤΙΖΕΩ® р5Е8 (Уъ/Ун) ксРу.
На фиг. 112 показана последовательность одноцепочечной ДНК (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 69) обычной ΡΡΙΜΑΤΙΖΕΩ® р5Е8 (Ун/Уъ) ксРу.
На фиг. 113 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 70) показана аминокислотная последовательность обычной
ΡΡΙΜΑΤΙΖΕΩ® р5Е8 (Ун/Уъ) ксРу.
На фиг. 114 показаны кривые Т50 обычной р5Е8 (Ун/Уь) ксЕу (закрашенные кружки) по сравнению с обычной р5Е8 (Уь/Ун) ксЕу (пустые кружки).
На фиг. 115 показаны результаты исследования по оценке относительной стабильности ίη νίνο стабилизированных биспецифичных антител Геркулес-ΙΙ (Х^И036 (закрашенные кружки)) и моноспеци
- 17 015992 фичных антител, вводившихся по отдельности (НВИЛ10 (обращенные закрашенные треугольники) и С1114А2 (закрашенные ромбы)) и совместно (пустые обращенные треугольники) на мышиной модели опухолевых ксенотрансплантантов рака молочной железы человека (ΜΌΆ-ΜΒ-231).
На фиг. 116, 117 показаны остатки Ун, участвующие в ковариационной сети, которые важны для поддержания области контакта (фиг. 116), и остатки области контакта, участвующие в создании прямых контактов с областью контакта Ун/Уъ и которые непосредственно отображаются на поверхность домена Ун (фиг. 117). Стрелки указывают на положение остатков вне фактической области контакта, которые по данным ковариационного анализа важны для стабилизации взаимодействия Ун/Уъ и для стабильности Ун/Уъ. Локализация гипервариабельных остатков СИКЗ, осуществляющих непосредственные контакты в области контакта между Ун и Уъ, выделена рамкой.
На фиг. 118, 119 показаны остатки Уъ, участвующие в ковариационной сети, которые важны для поддержки области контакта (фиг. 118), и остатки области контакта, участвующие в создании прямых контактов с областью контата Ун/Уъ и которые непосредственно отображаются на поверхность Уъ (фиг. 119). Стрелки указывают на положение остатков вне фактической области контакта, которые по данным ковариационного анализа важны для стабилизации взаимодействия Ун/Уъ и для стабильности Ун/Уъ. Локализация гипервариабельных остатков СИКЗ, осуществляющих непосредственные контакты в области контакта между Ун и Уъ, выделена рамкой.
На фиг. 120 показан пример окружающих условий, подходящих для практического осуществления аспекта изобретения.
Фиг. 121 представляет собой блок-схему последовательности действий, которых надо придерживаться в соответствии с аспектом изобретения, чтобы определить счет ковариации последовательности, который можно затем использовать как меру стабильности полипептида.
Фиг. 122 представляет собой блок-схему последовательности действий, которых надо придерживаться в соответствии с аспектом изобретения, чтобы определить консенсусный счет и затем использовать его для прогнозирования стабильности белка-кандидата.
Фиг. 123 представляет собой блок-схему последовательности действий, которых надо придерживаться в соответствии с аспектом изобретения, чтобы определить средний консенсусный счет и затем использовать его для прогнозирования стабильности белка-кандидата.
Фиг. 124 представляет собой блок-схему последовательности действий, которых надо придерживаться в соответствии с аспектом изобретения, чтобы с помощью остатка замещения полипептида определить для него улучшенную последовательность.
Фиг. 125(А-В) показывают аминокислотные последовательности стабилизированных ВНА10 ксРУ, включающих 846Ь(Уь) стабилизирующую мутацию (8Е0 Ш N0: 137) и У55С(Ун) стабилизирующую мутацию (8Е0 Ш N0: 138). Стабилизирующая мутация заключена в рамку. Ведущая последовательность, д1у/кет-соединяющий пептид и домен Сн1 выделены нижним подчеркиванием, полужирным шрифтом и курсивом соответственно.
На фиг. 126 отображена гистограмма коэффициентов корреляции £-значений, вычисленных для каждого остатка внутри группы данных для С-класса.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Изобретение основано, по крайней мере частично, на разработке стабилизированных связывающих мишень молекул, включающих стабилизированные молекулы ксРу и способы приготовления таких стабилизированных связывающих молекул. Кроме того, настоящее изобретение относится также к способам конструирования стабильных белков, таких как молекулы антител.
Стабилизированные молекулы ксРу настоящего изобретения особенно эффективны при создании стабильных полиспецифичных, например биспецифичных, молекул. Стабилизированные связывающие молекулы изобретения, например полиспецифичные связывающие молекулы, могут быть стабильно экспрессированы в культуре, подходят для крупномасштабного изготовления и стабильны ίη νίνο. Изобретение основано, по крайней мере частично, на разработке стабилизированных связывающих молекул, состоящих из или включающих стабилизированную молекулу ксРν, и на способах получения таких связывающих молекул. Кроме того, настоящее изобретение относится также к способам конструирования стабильных белков и прогнозирования стабильности белков, таких как молекулы антител.
Перед тем как приступить к более детальному описанию изобретения, далее для удобства приводится значение некоторых терминов.
I. Определения.
Термин молекула ксРν здесь включает связывающие молекулы, состоящие из одного вариабельного домена легкой цепи (Уъ) или его фрагмента и одного вариабельного домена тяжелой цепи (Ун) или его фрагмента, где каждый вариабельный домен или его фрагмент получают из одних и тех же или различных антител. Молекула ксРν предпочтительно включает линкер ксРν, расположенный между Ун доменом и Уъ доменом. Молекула ксРν известна в уровне техники и описана, например, в патенте США № 5892019 (Но е! а1.), 1989. Сепе 77:51; Βίτά е! а1. 1988 8с1епсе 242:423; Рап!ойапо е! а1. 1991. Вюсйетщйу 30:10117; Мйешс е! а1. 1991. Сапсег Векеатсй 51:6363; Такктеп е! а1. 1991. Рто!еш Епдшееппд 4:837.
Термин линкер ксРν здесь означает объект, расположенный между доменами Уъ и Ун молекулы
- 18 015992
8сРу. Предпочтительно линкеры ксРу поддерживают молекулу ксРу в антигенсвязывающей конформации. В соответствии с одним вариантом осуществления линкер ксРу включает или состоит из пептидного линкера ксРу. В соответствии с некоторыми аспектами пептидный линкер ксРу включает или состоит из связывающего пептида С1у-8ег. В соответствии с другими аспектами линкер ксРу включает дисульфидную связь.
Термин связывающий пептид С1у-8ег означает пептид, состоящий из остатков глицина и серина. Пример связывающего пептида С1у-8ег включает аминокислотную последовательность (С1у48ег)п. В соответствии с одним вариантом осуществления п=1. В соответствии с одним вариантом осуществления п=2. В соответствии с другим вариантом осуществления п=3. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления п=4, т.е. (С1у48ег)4. В соответствии с другим вариантом осуществления п=5. В соответствии с еще одним вариантом осуществления п=6.
Еще один пример связывающего пептида С1у-8ег включает аминокислотную последовательность 8ег(С1у48ег)п. В соответствии с одним вариантом осуществления п=1. В соответствии с одним вариантом осуществления п=2. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления п=3. В соответствии с другим вариантом осуществления п=4. В соответствии с другим вариантом осуществления п=5. В соответствии с еще одним вариантом осуществления п=6.
Термин дисульфидный мостик в настоящем изобретении означает ковалентную связь, образованную двумя атомами серы. Аминокислота цистеин включает тиоловую группу, которая может сформировать дисульфидную связь или мостик со второй тиольной группой.
Термин обычная молекула ксРу здесь означает молекулу ксРу, которая не является стабилизированной молекулой йсРу. Например, в типичной обычной молекуле отсутствуют стабилизирующие мутации, и включается домен νΗ и Уъ, связанные линкером (С48)3.
Стабилизированная молекула ксРу изобретения - молекула ксРу, включающая по меньшей мере одно изменение по сравнению с обычной молекулой ксРу, которое приводит к стабилизации молекулы ксРу. Здесь термин стабилизирующая мутация включает мутацию, придающую улучшенную белковую стабильность (например, термическую стабильность) молекуле ксРу и/или более крупному белку, включающему указанную молекулу ксРу. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизирующая мутация включает замещение дестабилизирующей аминокислоты другой аминокислотой, которая сообщает белку улучшенную стабильность (здесь стабилизирующая аминокислота). В соответствии с одним вариантом осуществления длина линкера ксРу в стабилизирующей мутации оптимизирована. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная молекула ксРу изобретения включает одну или более аминокислотных замен. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления стабилизирующая мутация включает замену по меньшей мере одного аминокислотного остатка, приводящую к повышению стабильности области контакта νΗ и Уъ молекулы ксРу. В соответствии с одним вариантом осуществления аминокислота находится внутри области контакта В соответствии с другим вариантом осуществления аминокислота поддерживает взаимодействие между νΗ и Уъ. В соответствии с другим вариантом осуществления стабилизирующая мутация включает замену по меньшей мере одного аминокислотного остатка в домене νΗ или домене Уъ, коварьирующими с двумя или более аминокислотами области контакта между доменами νΗ и Уь. В соответствии с другим вариантом осуществления при стабилизирующей мутации вводится по меньшей мере один остаток цистеина (т.е. он встраивается в один или более домен νΗ или Уъ), так что домены νΗ и Уъ связаны по меньшей мере одним дисульфидным мостиком между аминокислотами домена νΗ и аминокислотами домена Уь. В соответствии с некоторыми предпочтительными аспектами стабилизированная молекула ксРу изобретения характеризуется оптимизированной длиной линкера ксРу, а также у нее замещен по меньшей мере один аминокислотный остаток и/или домены νΗ и Уъ связаны дисульфидным мостиком между аминокислотой домена νΗ и аминокислотой домена Уь. В соответствии с одним вариантом осуществления в молекуле ксРу можно сделать более одной описанной здесь стабилизирующей мутации.
В соответствии с одним вариантом осуществления одна или более стабилизирующая мутация, сделанная в молекуле ксРу, одновременно повышает термическую стабильность доменов νΗ и Уъ молекулы ксРу по сравнению с обычной молекулой ксРу.
Предпочтительно, если популяция одной или более стабилизированных молекул ксРу изобретения экспрессируется как популяция мономерных, стабильных белков. В соответствии с одним вариантом осуществления в агрегированной форме присутствует не более 10% молекул. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная молекула ксРу популяции может содержать ту же стабилизирующую мутацию или комбинацию стабилизирующих мутаций. В соответствии с другими аспектами индивидуальные стабилизированные молекулы ксРу популяции содержат различные стабилизирующие мутации.
Стабилизированная молекула ксРу может быть использована одна для связывания целевых молекул, а может быть связана с другим полипептидом с образованием стабилизирующей связывающей молекулы, включающей стабилизированную молекулу ксРу. Например, связывающая молекула по изобретению может содержать молекулу ксРу, связанную с второй молекулой ксРу или не с молекулой ксРу, например с молекулой, которая нарушает специфичность связывания, такой как антитело.
- 19 015992
Термин стабильность белка в настоящем изобретении означает признанную в уровне техники характеристику сохранения одного или более физических свойств белка при изменении условий окружающей среды (например, на повышение или снижение температуры). В соответствии с одним вариантом осуществления физическое свойство представляет собой поддержание ковалентной структуры белка (например, отсутствие протеолитического расщепления, нежелательного окисления или деаминирования). В соответствии с другим вариантом осуществления физическое свойство представляет собой нахождение белка в правильно уложенном состоянии (например, отсутствии растворимых или нерастворимых агрегатов или преципитатов). В соответствии с одним вариантом осуществления стабильность белка измеряют, анализируя биофизическое свойство белка, например термическую стабильность, профиль развертывания как функцию от рН, стабильное удаление гликозилирования, растворимость, биохимическую функцию (например, способность связываться с белком (например, лигандом, рецептором, антигеном и т.д.) или химической группой и т.д.) и/или их комбинации. В соответствии с другим вариантом осуществления биохимическая функция определяется по сродству связывания при взаимодействии. В соответствии с одним вариантом осуществления характеристикой стабильности белка является его термическая стабильность, т.е. сопротивляемость температурным изменениям. Стабильность можно измерять способами, известными в уровне техники и/или описанными там.
Домены Уъ и Ун молекулы зсЕу получают из одной или более молекул антитела. Специалист понимает также, что вариабельные области молекул зсЕу изобретения можно модифицировать так, что их аминокислотная последовательность будет отличаться от молекулы антитела, из которой они были взяты. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления, можно произвести нуклеотидные или аминокислотные замены, ведущие к консервативным замещениям или изменениям в аминокислотных остатках (например, в аминокислотных остатках СЭЯ и/или каркаса). Альтернативно или в дополнение, в аминокислотных остатках СОЯ можно произвести мутации с целью оптимизации связывания антигенов, используя при этом известные технологии. Связывающие молекулы изобретения сохраняют способность связываться с антигеном.
Термин производный от (полученный из) указанного белка означает происхождение полипептида. В соответствии с одним вариантом осуществления полипептидная или аминокислотная последовательность, производная от конкретного исходного полипептида, представляет собой последовательность вариабельной области (например, Ун или Уь) или родственную им последовательность (например, каркасный область или СОЯ). В соответствии с одним вариантом осуществления аминокислотная последовательность, производная от конкретного исходного полипептида, не является сплошной. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления, из исходного антитела можно получить одну, две, три, четыре, пять или шесть областей СОЯ. В соответствии с одним вариантом осуществления полипептидная или аминокислотная последовательность, производная от конкретного исходного полипептида или аминокислотной последовательности, включает аминокислотную последовательность, практически идентичную исходной последовательности или ее фрагменту, где фрагмент включает по меньшей мере 3-5 аминокислот, 5-10 аминокислот, по меньшей мере 10-20 аминокислот, по меньшей мере 20-30 аминокислот или по меньшей мере 30-50 аминокислот, или которую специалист может иным способом идентифицировать как происходящую от исходной последовательности.
Выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую стабилизированную молекулу зсЕу или ее фрагмент, можно создать, вводя одну или несколько нуклеотидных замен, вставок или делеций в нуклеотидную последовательность обычной молекулы зсЕу или иммуноглобулина, из которого она была получена, так что в кодируемом белке образуется одна или более замен, вставок или делеций. Мутации можно вводить стандартными технологиями, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦРопосредованный мутагенез. В соответствии с одним вариантом осуществления консервативные аминокислотные замены производят в одном или более остатках несущественных аминокислот. Консервативной аминокислотной заменой называется такая замена, при которой аминокислотный остаток заменяется на другой аминокислотный остаток с такой же боковой цепью. В уровне техники определены семейства аминокислотных остатков с одинаковыми боковыми цепями, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-ветвящиеся боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, аминокислотный остаток в полипептиде иммуноглобулина можно заменить другим аминокислотным остатком из того же семейства боковых цепей. В соответствии с другим вариантом осуществления строку аминокислот можно заменить структурно похожей строкой, отличающейся только порядком и/или композицией членов семейства боковых цепей. В соответствии с другим вариантом осуществления мутацию вводят для того, чтобы ввести по меньшей мере одну молекулу цистеина в домены Ун и Уь и, таким образом, ввести дисульфидную связь в молекулу зсЕу. В соответствии с другим вариантом осуществления аминокислоту из обычной молекулы зсЕу можно заместить на аминокислоту с такими же физическими (например, пространственными) или функциональными свойствами. Предпочтительно,
- 20 015992 чтобы аминокислотные замены в обычной молекуле χΕν были бы совместимы с целостностью области контакта ν2/νΗ. конформациями СЭР и упаковкой νΗ и/или νΣ.
Альтернативно, в соответствии с другим вариантом осуществления мутации можно вводить случайным образом по всей или части кодирующей последовательности иммуноглобулина.
Стабилизированная молекула χΕν изобретения или полипептиды, включающие стабилизированную молекулу 5сН\ представляют собой связывающие молекулы, т.е. они связываются с целевой интересующей молекулой, например с антигеном. Когда стабилизированная молекула χΕν изобретения сплавляется с другой молекулой, вторая молекула может также вносить дополнительную специфичность связывания в химерный белок. Связывающие молекулы изобретения состоят из молекулы χΕν (например, доменов νΗ и ν^ соединенных линкером χΕν) или содержат стабилизированную молекулу χΕν изобретения.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения моновалентны, т.е. содержат один целевой сайт связывания (например, это имеет место в случае молекулы χΕν). В соответствии с одним вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения поливалентны, т.е. содержат более одного целевого сайта связывания. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы содержат по меньшей мере два сайта связывания. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы содержат два сайта связывания. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающие молекулы содержат три сайта связывания. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы содержат четыре сайта связывания. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы содержат более четырех сайтов связывания.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения представляют собой мономеры. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения представляют собой полимеры. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения представляют собой димеры. В соответствии с одним вариантом осуществления димеры изобретения представляют собой гомодимеры, включающие две идентичные мономерные субъединицы. В соответствии с другим вариантом осуществления димеры изобретения представляют собой гетеродимеры, включающие две не идентичные мономерные субъединицы. Субъединицы димера могут содержать одну или более полипептидных цепей. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления димеры содержат по меньшей мере две полипептидные цепи. В соответствии с одним вариантом осуществления димеры содержат две полипептидные цепочки. В соответствии с другим вариантом осуществления димеры содержат четыре полипептидные цепи (например, как в случае молекул антител).
Термин валентность здесь означает количество потенциальных мишеньсвязывающих сайтов в полипептиде. Каждый такой сайт специфически связывает одну молекулу мишени или специфический сайт на молекуле мишени. Если полипептид включает более одного сайта связывания мишени, то каждый такой сайт может специфично связываться с одной и той же или с различными молекулами (например, может связываться с различными молекулами, например, различными антигенами или различными эпитопами одной молекулы).
Термин специфичность означает способность специфично связываться (например, иммунореагировать) с данной мишенью. Полипептид может быть моноспецифичным и содержать один или более сайтов связывания, которые специфично связываются с мишенью, или полипептид может быть полиспецифичным (например, биспецифичным или триспецифичным) и содержать два или более сайтов связывания, которые специфично связываются с одной или различными мишенями. Специфическое связывание может быть привнесено стабизированной молекулой χΕν изобретения и/или группой не-хсРу, с которой соединена молекула хсРу изобретения.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению полиспецифична. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления полиспецифичная связывающая молекула по изобретению представляет собой биспецифичную молекулу (например, антитело, минитело, антитело с удаленным доменом или химерный белок, однодоменное антитело (например, верблюда, акулы, человека), включающее по меньшей мере одну стабилизированную молекулу хсРу), обладающую специфичностью связывания по меньшей мере с двумя мишенями, например более чем с одной молекулой мишени или более чем с одним эпитопом одной молекулы мишени. В соответствии с одним вариантом осуществления полиспецифичная молекула включает по меньшей мере один сайт связывания, специфичный для молекулы с функцией восстановления или элиминирования или для молекулы-мишени в клетке. В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичная молекула включает по меньшей мере один сайт связывания, специфичный для молекулы с функцией восстановления или элиминирования, и по меньшей мере один сайт связывания, специфичный для лекарства. В соответствии с еще одним вариантом осуществления полиспецифичная молекула включает по меньшей мере один сайт связывания, специфичный для молекулы с функцией восстановления или элиминирования, и по меньшей мере один сайт связывания, специфичный для пролекарства.
В соответствии с одним вариантом осуществления полиспецифичная молекула включает одну спе
- 21 015992 цифичность для растворимых молекул и одну специфичность для молекул клеточной поверхности. В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичная молекула включает две специфичности связывания для двух мишеней в одной или более растворимых молекулах. В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичная молекула включает две специфичности связывания для двух мишеней в одной или более молекулах клеточной поверхности (которые могут присутствовать в одной или более клетках).
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающие молекулы содержат по меньшей мере один сайт связывания мишени, специфичный для молекулы, опосредующей биологические эффекты (например, модулирующей активацию клеток (например, путем связывания с рецептором клеточной поверхности, что приводит к передаче или ингибированию активирующего или ингибирующего сигнала), что приводит к смерти клетки (например, в результате индуцированного клеточного сигнала, комплементарной фиксации или экспозиции дополнительной функции на связывающейся молекуле), или модулирует заболевание или расстройство у субъекта (например, опосредуя или стимулируя уничтожение клеток, стимулируя лизис фибриновых тромбов или их образование, либо модулируя количество биодоступного вещества (например, усиливая или уменьшая количество у субъекта такого лиганда, как ΤΝΒα)).
В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения связываются по меньшей мере с одной мишенью, трансдуцирующей сигнал в клетку, например, путем связывания с рецептором клеточной поверхности, таким как рецептор семейства ΤΝΒ. Выражение трансдуцирует сигнал означает, что, связываясь с клеткой, связывающая молекула преобразует внеклеточное влияние на рецептор клеточной поверхности в клеточный ответ, например, модулируя путь трансдукции сигнала.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающие молекулы связываются по меньшей мере с одной мишенью, специфичной для молекулы с функцией восстановления или элиминирования, например с антигеном клеточной поверхности или с растворимым антигеном. В соответствии с одним вариантом осуществления связывание связывающей молекулы с мишенью приводит к восстановлению или элиминированию мишени, например, из ткани или из кровотока. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы содержат по меньшей мере один сайт связывания, специфичный для молекулы, которая может быть использована для детекции целевой молекулы (например, для детекции примеси или диагностики состояния или расстройства). В соответствии с еще одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один сайт связывания, который нацеливает связанную молекулу в специфичную область организма субъекта (например, в опухолевую клетку или тромб).
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления полиспецифичная молекула представляет собой тетравалентное антитело с четырьмя сайтами связывания. Тетравалентная молекула может быть биспецифичной и бивалентной по каждой специфичности. Далее приводится более подробное описание примеров биспецифичных молекул.
Предпочтительные связывающие молекулы изобретения содержат аминокислотные последовательности каркаса и константной области, производные от аминокислотных последовательностей человека. Однако связывающиеся полипептиды могут содержать последовательности каркаса и/или константной области производные от других видов млекопитающих. Например, в некоторых применениях могут использоваться связывающие молекулы, включающие последовательности мыши. В соответствии с одним вариантом осуществления в состав молекулы связывания может входить выделенная у приматов (например, не человека) каркасная область, фрагмент тяжелой цепи и/или концевой участок. В соответствии с одним вариантом осуществления в каркасной области связывающегося полипептида может присутствовать одна или несколько мышиных аминокислот, например, каркасная аминокислотная последовательность человека или человекообразной обезьяны может содержать одну или более аминокислотных обратный мутаций, в которых присутствуют соответствующие остатки мышиных аминокислот, и/или содержать одну или более мутаций в различных аминокислотных остатках, не обнаруживаемых в исходных мышиных антителах. Предпочтительные связывающиеся молекулы изобретения менее иммуногенны, чем мышиные антитела.
Слитый белок, или химерный белок, включает первую аминокислотную последовательность, связанную со второй аминокислотной последовательностью, причем эти последовательности в природе друг с другом не связаны. Они, обычно, могут существовать в составе различных белков, которые затем можно соединить в составе химерного белка, или они могут существовать в составе одного белка, но в химерном белке их взаимное расположение будет другим. Химерный белок можно приготовить, например, в ходе химического синтеза или путем создания и трансляции полинуклеотида, кодирующего требуемые пептидные участки,расположенные требуемым образом.
Термин гетерологичный применяется к полинуклеотиду или полипептиду, он означает, что полинуклеотид или полипептид является производным от объекта, отличающегося по генотипу от объекта, с которым производится сравнение. Например, гетерологичный полинуклеотид или антиген можно получить из различных видов животных, различных клеточных типов индивидуума или из клеток одного или
- 22 015992 различных типов различных индивидуумов.
Термин лигандсвязывающий домен или лигандсвязывающий фрагмент здесь означает любой нативный рецептор (например, рецептор клеточной поверхности) или любую область или производное рецептора, сохраняющие, по меньшей мере, качественную способность к связыванию лиганда и предпочтительно биологическую активность соответствующего нативного рецептора.
Термин рецепторсвязывающий домен или рецепторсвязывающий фрагмент здесь означает любой нативный лиганд или любую область или производное лиганда, сохраняющие, по меньшей мере, качественную способность к связыванию с рецептором и предпочтительно биологическую активность соответствующего нативного лиганда.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения представляют собой молекулы стабилизированных антител или иммуноглобулинов, например, природные молекулы антител или иммуноглобулинов (или их антигенсвязывающих фрагментов) или генетически сконструированные молекул антител, связывающие антиген тем же способом, что и молекулы антител, и включающих молекулу ксРу изобретения.
Термин иммуноглобулин в настоящем изобретении включает полипептид с комбинацией двух тяжелых и двух легких цепей, независимо от того, обладает ли он какой-либо специфичной иммунореактивностью. Антитела - такие сборки, которые проявляют значимую специфичную иммунореактивность по отношению к интересующему антигену (например, к антигену, связанному с опухолями). Антитела и иммуноглобулины содержат легкие и тяжелые цепи с или без ковалентных связей между ними. Основные структуры иммуноглобулинов в системах позвоночных сравнительно хорошо изучены.
Как более подробно будет рассматриваться ниже, общий термин иммуноглобулин включает пять различных классов, которые можно различить биохимически. Все пять классов антител входят в область действия настоящего изобретения, но следующее ниже обсуждение в основном относится к классу 1дС иммуноглобулинов. Молекула 1дС иммуноглобулина содержат две идентичные легкие полипептидные цепи с молекулярным весом приблизительно 23000 Да и две идентичные тяжелые цепи весом 5300070000. Четыре цепи соединяются дисульфидными мостиками в Υ конфигурации, причем легкие цепи обхватывают тяжелые цепи, начиная от рта буквы Υ и продолжаясь в вариабельную область.
Легкие и тяжелые цепи содержат области структурной и функциональной гомологии. Термины константный и вариабельный используются функционально. В этом отношении необходимо понимать, что вариабельный домен как легких (Уь), так и тяжелых (УН) фрагментов цепи определяет узнавание и специфичность антигена. Наоборот, константные домены легкой (Сь) и тяжелой цепи (Сн1, Сн3 или Сн3) несут в себе важные биологические свойства, такие как секреция, трансплацентарная подвижность, связывание рецептора Рс, комплементарное связывание и подобные им. Согласно действующему соглашению номера константных областей доменов возрастают по мере их удаления от антигенсвязывающего сайта или Ν-конца антитела. Ν-конец представляет собой вариабельную область, а С-конец константную область, домены Сн3 и Съ, фактически, содержат карбоксиконцы тяжелой и легкой цепи соответственно. Стабилизирующие мутации в молекуле ксРу могут быть в составе как аминокислот СОВ, так и каркасных областей вариабельных тяжелых и/или легких цепей ксРу. Термин аминокислотные остатки вариабельной области СОВ включает аминокислоты в СОВ (области, определяющие комплементарность), обнаруженные способами, основанными на структуре или последовательности. Термин СЭВ или область, определяющая комплементарность здесь означает несплошные узнающие антиген сайты из вариабельной области полипептидов тяжелых и легких цепей. Эти конкретные области были описаны в работах КаЬа! е! а1., 1. Вю1. СУет. 252, 6609-6616 (1977) и КаЬа! е! а1., 8ес.|иепсек о£ рго!ет о£ 1ттипо1одюа1 т!егек!. (1991), и Ьу Сйо!Ыа е! а1., I. Мо1. Вю1. 196:901-917 (1987) и Ьу МасСа11ит е! а1., I. Мо1. Вю1. 262:732-745 (1996), причем определения включают наложения или подмножества аминокислотных остатков, наблюдаемые при их сравнении друг с другом. Для сравнения далее приводятся окружающие СЭВ аминокислотные остатки, определенные в каждой из приведенных выше ссылок. Предпочтительно определять термин СЭВ по способу Кэбата (КаЬа!), основанному на сравнении последовательностей.
- 23 015992
Определение СОВ МасСаПит3
КаЬа1' СНоНна2
νΗ СОВ1 31-35 26-32 . 30-35
νΗ С0В2 50-65 53-55 47-58
ΟϋΒ3 95-102 96-101 93-101
УЬСОН1 24-34 26-32 30-36
Уь СЭН2 50-56 50-52 46-55
ук сэнз 89-97 91-96 89-96
1 Нумерация остатков соответствует номенклатуре КаЬа! с1 а1., кирга.
2 Нумерация остатков соответствует номенклатуре С1о!Ыа с1 а1., кирга.
3 Нумерация остатков соответствует номенклатуре МасСа11ит с1 а1., кирга.
Термин аминокислотные остатки каркаса (Ггатсетогк, РМ) вариабельной области означает аминокислотные остатки каркасной области цепи 1д. Термин каркасная область или область РК здесь включает аминокислотные остатки, входящие в состав вариабельной области, но не являющиеся частью СОК (например, в соответствии с определением СОК по Кэбату). Таким образом, каркас вариабельной области включает от 100 до 200 аминокислотных остатков, но включает только аминокислоты, не входящие в состав СОК. В качестве конкретного примера вариабельной области тяжелой цепи и СОК в соответствии с определением по Кэбату можно сказать, что каркасная область 1 соответствует домену вариабельной области, охватывающему аминокислотные остатки 1-30; каркасная область 2 соответствует домену вариабельной области, охватывающему аминокислотные остатки 36-49; каркасная область 3 соответствует домену вариабельной области, охватывающему аминокислотные остатки 66-94, и каркасная область 4 соответствует домену вариабельной области, охватывающему аминокислотные остатки от 103 до конца вариабельной области. Каркасные области легкой цепи распределены по СОК вариабельных областей легкой цепи аналогичным образом. Точно так же на основании определений СОК, сделанных в работах С'Нобиа с1 а1. или МсСа11ит с1 а1., можно распределить границы каркасных областей по соответствующим концам СОК, как описано выше. В соответствии с предпочтительными аспектами области СОК определяются по Кэбату.
В природных антителах шесть областей СОК в каждом мономерном антителе представляют собой короткие несмежные последовательности аминокислот, специфично так расположенные, чтобы сформировать антигенсвязывающий сайт в трехмерной конфигурации антитела в водной среде. Оставшаяся часть тяжелых и легких цепей вариабельных доменов демонстрирует меньше межмолекулярной вариабельности в своей аминокислотной последовательности и потому называется каркасными областями. В основном каркасные области находятся в конфигурации β-листа, а СОК образует петли, которые соединяют, а в некоторых случаях формируют часть этой структуры. Таким образом, эти каркасные области формируют структуру (каркас, ксаГГЫб), обеспечивающую правильную ориентацию шести областей СОК путем межцепочечных нековалентных взаимодействий. Антигенсвязывающий сайт, сформированный правильно расположенными СОК, определяет поверхностную комплементарность эпитопу иммунореактивного антигена. Эта комплементарная поверхность стимулирует нековалентное связывание антитела с иммунореактивным эпитопом антигена. Специалист легко может идентифицировать положения областей СЭК.
Как уже упоминалось, структура субъединиц и трехмерная конфигурация константных областей различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Здесь термин Ун домен включает аминоконцевой вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина. Термин Уъ домен включает аминоконцевой вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина.
Термин фрагмент означает часть или фрагмент полипептида (например, антитела или его цепи), включающую меньше аминокислотных остатков, чем интактный или полный полипептид. Термин антигенсвязывающий фрагмент означает полипептидный фрагмент иммуноглобулина или антитела, которое связывает антиген или конкурирует с интактным антителом (т.е. с интактным антителом, из которого они были получены) за связывание антигена (т.е. специфичное связывание). Здесь термин фрагмент молекулы антитела включает антигенсвязывающие фрагменты антител, например легкую цепь антитела (Уь), тяжелую цепь антитела (Ун), одноцепочечное антитело (ксРу), фрагмент Р(аЬ')2, фрагмент РаЬ, фрагмент Рб, фрагмент Ρν, однодоменный фрагмент антитела (ЭЛЬ). Фрагменты можно получить, например, химической или ферментативной обработкой интактного или полного антитела или его цепи, а также рекомбинантными способами.
- 24 015992
Термин сайт связывания здесь означает область полипептида, ответственную за селективное связывание с интересующей молекулой мишени (например, с антигеном, лигандом, рецептором, субстратом или ингибитором). Домены связывания содержат по меньшей мере один сайт связывания мишени. Примеры доменов связывания включают вариабельный домен антитела, рецепторсвязывающий домен лиганда, лигандсвязывающий домен рецептора или ферментативный домен.
Связывающие молекулы изобретения могут быть изготовлены способами, известными в уровне техники. В соответствии с одним вариантом осуществления полипептиды изобретения производят рекомбинантно, т.е. с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Примеры технологий получения таких молекул подробнее рассматриваются ниже.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению представляет собой природное антитело, с которым сплавляется стабилизированная молекула χΡν. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению представляет собой модифицированное антитело, с которым сплавляется стабилизированная молекула 5сРу. Термин модифицированное антитело включает здесь синтетические формы антител, измененные таким способом, которого нет в природе. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению представляет собой химерный белок, включающий по меньшей мере одну молекулу χΡν.
В соответствии с предпочтительными аспектами полипептид изобретения не индуцирует вредных иммунных ответов у людей.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает константную область, например константную область тяжелой цепи. В соответствии с одним вариантом осуществления такая константная область модифицирована по сравнению с константной областью дикого типа. Это означает, что описанные здесь полипептиды изобретения могут содержать изменения или модификации в одной или более из трех тяжелых цепей константных областей доменов (С^, С^ или С||3) и/или в легких цепях константных областей доменов (Сь). Примеры модификаций включают замены, делеции или вставки одной или более аминокислот в одном или более доменах. Такие изменения можно включать для оптимизации эффекторной функции, времени полужизни и т.д.
Термин злокачественность означает здесь недоброкачественную опухоль или рак. Термин рак включает злокачественность, характеризующуюся нарушением регуляции или неконтролируемым клеточным ростом. Примеры рака включают карциномы, саркомы, лейкемии и лимфомы. Термин рак включает первичные злокачественные опухоли (например, в которых клетки еще не успели мигрировать от первоначальной опухоли к другим местам организма) и вторичные злокачественные опухоли (например, возникшие из метастаз, в результате миграции опухолевых клеток от первоначальной опухоли к другим участкам организма).
Термин сконструированный означает результат манипулирования нуклеотидными или полипептидными молекулами синтетическими средствами (например, рекомбинантными технологиями, синтезом пептидов ίη νίίτο, ферментативным или химических сопряжением пептидов или комбинацией описанных способов). Предпочтительно, если связывающие молекулы изобретения приготовлены с помощью таких способов.
Термины связанный, слитый или сплавленный используются здесь попеременно, заменяя друг друга. Они означают соединение двух элементов или компонентов любыми средствами, включая химическое конъюгирование или рекомбинантные средства. Предпочтительно, если полипептиды гибридизованы генетически, т.е. с использованием рекомбинантных технологий ДНК. Гибридизация в рамке означает объединение двух или более открытых рамок считывания (ОРС, ореп геабтд Ггатех (ОВР)) с образованием сплошной более длинной ОРС способом, сохраняющим корректную рамку считывания первоначального ОРС. Так, полученный химерный белок представляет собой один белок, включающий два или более сегментов, соответствующих полипептидам, кодируемым первоначальной ОРС (эти сегменты, обычно, таким способом в природе не соединяются). Хотя рамка считывания при этом будет сплошной на протяжении гибридизованных сегментов, сами сегменты могут быть физически или пространственно разделены, например, линкерной последовательностью χΡν в рамке.
В контексте полипептидов линейная последовательность или последовательность представляют собой порядок аминокислот в полипептиде в направлении к амино- или С-концу, причем соседние остатки в этой последовательности в первичной структуре белка следуют подряд друг за другом.
Фраза субъект, для которого лечение связывающей молекулой по изобретению может оказаться эффективным включает субъекты, например млекопитающих, которые получают пользу от введения связывающей молекулы, используемой, например, для детекции антигена, распознаваемого связывающей молекулой (например, в диагностической процедуре), и/или от лечения связывающей молекулой для уменьшения или уничтожения мишени, распознаваемой связывающей молекулой. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления субъект может получить пользу от уменьшения количества или элиминирования растворимых или нерастворимых молекул из крови или сыворотки (например, выведение оттуда токсина или патогена) или от уменьшения количества или элиминирования популяции клеток, экспрессирующих мишень (например, опухолевых клеток). Как более подробно описано ниже, связывающая молекула может использоваться в неконъюгированной форме или быть конъюгированной,
- 25 015992 например, с детектируемой группой, лекарством, пролекарством или изотопом.
Термин ЮТ-рецептор или член семейства ТОТ-рецепторов относится к любому рецептору, принадлежащему надсемейству рецепторов фактора некроза опухолей (Титог №сгоз1з Работ (ЮТ)). Члены надсемейства ТОТ-рецепторов (МетЬегз оГ 111е Т№ ЯесерФт 8ирегГатЛу (ТОТЯ8Е)) характеризуются внеклеточным участком, включающим два или более обогащенных цистеином домена (длиной около 40 аминокислот каждый), собранных в виде цистеиновых клубков (см. Эешрзеу е1 а1., СуЮкте Сго\\111 Бас1ог Яеу. (2003). 14(3-4): 193-209). После связывания с родственными Т№-лигандами, рецепторы Т№ трансдуцируют сигналы, прямо или косвенно взаимодействуя с цитоплазматическими адапторными белками, называемыми ТЯАР (Т№ гесерЮг аззос1а1е ГасЮгз. факторы, ассоциированные с рецепторами ТОТ). ТЯЛР могут индуцировать активацию нескольких киназных каскадов, которые окончательно ведут к активации путей трансдукции сигнала, таких как ОТ-КарраБ, ^NΚ, ЕЯК, р38 и ΡΙ3Κ, которые, в свою очередь, регулируют клеточные процессы, от иммунной функции и дифференциации тканей до апоптоза.
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности нескольких членов семейства рецепторов ТОТ известны в уровне техники и содержат по меньшей мере 29 генов человека: ТОТЯ8Е1Л (ТОТЯ1, известный также как ΌΒ1. СЭ120а. ТОТ-Я-Ι р55, ТОТ-Я, ЮТЯ1, ТОТЛЯ, ТОТ-Я55, р55ТОТЯ, р55Я или ТОТЯ60, СепБапк 61 № 4507575; см. также И8 5395760), ТОТЯ8Е1В (СО120Ь, известный также как р75, ТОТ-Я, ЮТ-Я-ΙΙ, ТОТЯ80, ТОТЯ2, ТОТ-Я75, ЮТВЯ или р75ТОТЯ; бепВапк 6Ι № 4507577), ТОТЯ8Р3 (Ьутркокхт Бета ЯесерЮг (ЬТЗЯ), известные также как ТОТЯ2-ЯР, СЭ18. ЮТЯ-ЯР, ТОТСЯ, а также ТОТ-Я-ΙΙΙ; 6Ι № 4505038 и 20072212), ТОТЯ8Р4 (0X40, известный также как АСТ35, ТХ6Р1Б, или СЭ134 антиген; 6Ι № 4507579 и 8926702), ТОТЯ8Е5 (СО40, известный также как р50 или Вр50; 6Ι № 4507581 и 23312371), ТОТЯ8Е6 (ЕА8, известный также как ЕА8-Я, ОсЯ-2, ОЯ2, С1Э95, АРО-1 или АРТ1; 6епВапк 6Ι № 4507583, 23510421, 23510423, 23510425, 23510427, 23510429, 23510431 и 23510434), ТОТЯ8Е6В (ПсЯ3, ПЯ3; 6епВапк 6Ι № 4507569, 23200021, 23200023, 23200025, 23200027, 23200029, 23200031, 23200033, 23200035, 23200037 и 23200039), ТОТЯ8Р7 (СП27, известный также как Тр55 или 8152; 6епВапк 6Ι № 4507587), ТОТЯ8Е8 (СЭ30, известный также как Κί-1, или О18166Е; 6епВапк 6Ι № 4507589 и 23510437), ЮТЯ8Р9 (4-1-ВВ, известный также как СП137 или ША; 6Ι № 5730095 и 728738), ТОТЯ8Е10А (ТЯАШ-Як известный также как ΌΒ4 или Аро2; 6епВапк 6Ι № 21361086), ТОТЯ8Е10В ('ШАШ-Я) известный также как ΌΒ5. КЯЕЕЯ ТЯКЛОА или ТЯК’КВ; 6епВапк 6Ι № 22547116 и 22547119), ТОТЯ8Е10С (ТКАГО-КЗ, известный также как ОсЯ1, ЫТ или ТЯГО; 6епВапк 6Ι № 22547121), ЮТЯ8Е10П (ТЯАГО^, известный также как 1)сЯ2 или ТЯИ№П), ТОТЯ8Р11А (ЯΑNΚ; 6епВапк 6Ι № 4507565; см. патенты США № 6562948; 6537763; 6528482; 6479635; 6271349; 6017729), ТОТЯ8Е11В (остеопротегерин (0Р6), известный также как 0С.ЧР или ТЯ1; 6Ι № 38530116, 22547122 и 33878056), ТОТЯ8Е12 (Тгапз1осаБпд скат-АззоааПоп МетЬгапе Рго1ет (ТЯАМР), известный также как ОЯ3, ЭД8Б-1, ЬАЯО, ЭД8Ь-ЬЯ, ОПЯ3, ТЯ3, АР0-3, Рп14, ог ТЭДЕАКЯ; 6епВапк 6Ι № 7706186; И8 Ра1еи1 АррНсаПоп РиЫюаПоп № 2004/0033225А1), ЮТЯ8Е12Ь (ПЯ3Ь), ТОТЯ8Р13В (ТАШ; 61 № 6912694), ТОТЯ8Е13С (ВАЕЕЯ; 6Ι № 16445027), ТОТЯ8Е14 (медиатор вируса герпеса, негрез Уииз ЕпРу МеФа1ог (нУЕМ), известный также как АТАЯ, ТЯ2, ЬЮнТЯ или нУЕА; 6епВапк 6Ι № 23200041, 12803895 и 3878821), ТОТЯ8Е16 (Ьоте-АГДийу №гуе 6го\\111 Работ ЯесерЮг (^N6ΕЯ), рецептор фактора роста нервов низкого сродства, известный также как ОТигойорЫп ЯесерЮг или р75(№ТЯ); 6еиВаик 6Ι № 128156 и 4505393), ЮТЯ8Е17 (ВСМ, известный также как ВСМА; 6Ι № 23238192), ЮТЯ8Е18 (АНЯ, известный также как 6РГЯ; 6еиВаик 6Ι № 4759246, 23238194 и 23238197), ТОТЯ8Е19 (Тгоу/Тгабе, известный также как ТА) 6еиВаик 6Ι № 23238202 и 23238204), ТОТЯ8Е20 (ЯЕЬТ, известный также как ЕЫ14993; 6Ι № 21361873 и 23238200), ТОТЯ8Е21 (ЭЯ6), ЮТЯ8Е22 (80Ва, известный также как Т1ГТ112 или 2810028К06Я1к), а также ТОТЯ8Е23 (т80В, известный также как ТпГгЫ). Другие члены семейства ТОТ-рецепторов включают ЕОАЯ1 (рецептор эктодисплазина А, известный также как Оо\уп1езз (ЭЬ), ЕО3, ЕО5, ЕО1Я, ЕОА3, ЕОА1Я, ЕОА-А1Я; 6еиВаик 6Ι № 11641231; патент США № 6355782), ХЕОАЯ (известный также как ЕОА-А2Я; 6еиВаик 6Ι № 11140823) и СП39 (6Ι № 2135580 и 765256).
Термин ТОТ-лиганд или член семейства ТОТ'-лигандов означает лиганд, принадлежащий к надсемейству фактора некроза опухолей (ТОТ). ТОТ-лиганды связываются с отдельными рецепторами надсемейства ТОТ-рецепторов и обладают 15-25% гомологией друг с другом (6аиг е1 а1., Вюскет. РйагтасоР (2003), 66(8): 1403-8). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности некоторых лигандов надсемейства ТОТ1 -рецепторов (ТОТ8Е) хорошо известны в уровне техники и включают по меньшей мере 16 человеческих генов: ТОТ8Е1 (также известный как лимфотоксин-α (ЬТА), ТОТЗ или ЬТ, 6Ι № 34444 и 6806893), ЮТ8Е2 (также известный как ТОТ, ТОТа или ΌΙΕ; 6Ι № 25952111), ТОТ8Е3 (также известный как лимфотоксин-β (ЬТВ), ТОТС или р33), ТОТ8Е4 (также известный как 0Х-40Б, др34, СО134Б. или такс-транскрипционно активируемый гликобелок 1,34 кО (ТХ6Р1); 6Ι № 4507603), ТОТ8Е5 (также известный как С040Р6. БИП3, Ш6М1, С040Р. РС040Р. ТЯАР, СП154 или др39; 6Ι № 4557433), ТОТ8Е6 (также известный как ЕазЬ или АРТ1Б61; 6еиВаик 6Ι № 4557329), ТОТ8Е7 (также известный как СЭ70. СО27Б или СЭ27Б6; 6Ι № 4507605), ТОТ8Е8 (также известный как СЭ30Е6, СО30Б или СЭ153; 6Ι № 4507607), ТОТ8Е9 (также известный как 4-1ВВ-Б или !БА лиганд; 6Ι
- 26 015992 № 4507609), ШЕЬЕЮ (также известный как ТЯА1Ь, Аро-2Ь или ТЬ2; 61 № 4507593), ТХЕ8Е11 (также известный как ТКАЦСЕ, КАНКЬ, 0Р6Ь или 0ЭЕ; 61 № 4507595 и 14790152), ТХЕ8Е12 (также известный как Еп14Ь, Т^ЕАК, ОЯ3Ь6 или АР03Ь; 61 № 4507597 и 23510441), Т№§Е13 (также известный как АРЯ1Я), ТЫЕ8Е14 (также известный как ЬЮНТ, ЬТд или НУЕМ-Ь; 61 № 25952144 и 25952147), Т№8Е15 (также известный как ТЬ1 или УЕ61) или ТХЕ8Е16 (также известный как А1ТЯЯ, ТЬ6, Й61ТКЬ или 61ТЯЯ; 61 № 4827034). Другие члены семейства ТЯЕ-лигандов включают ЕЭАЯ1 и ХЕЭАЯ лиганд (ΕΌ1; 61 № 4503449; Мопгеа1 е! а1. (1998), Ат I Нит 6епе1. 63:380), Тгоу/Тгабе лиганд, ВАРЕ (также известный как ТАЬЬ1; 61 № 5730097) и N6Е-лиганды (например, N6Е-β (61 № 4505391), N6Е-2/NТР3; 61 № 4505469), ЦТЕ5 (61 № 5453808), ВОКЕ (61 № 25306267, 25306235, 25306253, 25306257, 25306261, 25306264; 1ЕЯО1 (61 № 4504607)).
Термин ТМ, называемый также температура перехода, обозначает температуру, при которой 50% макромолекулы, например связывающей молекулы, становится денатурированной, и считается стандартным параметром при описании термической стабильности белка.
Термин поддерживающий остаток (каркасный остаток) означает аминокислотные остатки или их положения, не входящие в состав области контакта (например, области контакта Ун/Уъ), но важные в его обеспечении. Эти аминокислотные остатки не взаимодействуют с остатками области контакта соответствующего домена физически и не присутствуют на поверхности области контакта, но тем не менее они важны для создания правильного структурного контекста остатков области контакта. Например, такие аминокислотные остатки поддерживают взаимодействие между Ун и Уъ.
Если два или более аминокислотных положения в последовательности полипептида-кандидата обычно появляются совместно, то говорят, что они коварьируют (коварьирующие положения остатков или ковариантные положения остатков). Ковариация между двумя или более положениями аминокислотных остатков наблюдается, когда тип аминокислоты в первом положении зависит от типа аминокислоты, расположенной во втором положении. Это означает, что, если одна указанная аминокислота располагается в первом положении последовательности, во втором положении обычно будет располагаться вторая конкретная аминокислота.
Термин укладка 1д включает домен белка, принадлежащего к иммуноглобулиновому надсемейству. Как хорошо известно, укладка 1д является отличительным признаком этого надсемейства (см., например, Вогк, Р., Но1т, Ь & Ьапбег, С. 1994. ТНе 1ттипод1оЬи1т Ео1б. I Мо1. Вю1. 242, 309-320). Соответствующие структуры для каждого класса укладки 1д приведены на фиг. 100.
II. Стабилизированные молекулы ксЕук.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению представляет собой стабилизированную молекулу ксЕу. Стабилизированная молекула ксЕук изобретения может содержать ксЕу линкер между доменами Ун и Уъ, где домены Ун и У|, связаны дисульфидной связью между аминокислотой домена Ун и аминокислотой домена Уъ. В соответствии с другими аспектами стабилизированная молекула ксЕук изобретения включает ксЕу линкер оптимизированной длины и состава. В соответствии с еще одними аспектами стабилизированная молекула ксЕук изобретения включает Ун или Уъ домен, включающие по меньшей мере одну стабилизирующую аминокислотную замену (замены). В соответствии с еще одним вариантом осуществления стабилизированная молекула ксЕу изобретения включает по меньшей мере две указанные стабилизирующие характеристики.
Стабилизированные молекулы ксЕу изобретения обладают улучшеной стабильностью. В соответствии с одним вариантом осуществления популяции стабилизированных молекул ксЕу изобретения или включающих их полипептидов экспрессируются как мономерные, растворимые белки, не более 10% которых находится в димерной, тетрамерной или агрегированной другим способом форме. В соответствии с другим вариантом осуществления популяции стабилизированных молекул ксЕу изобретения содержат Ун и У|, домены с ТМ более 55°С. В соответствии с другим вариантом осуществления популяции стабилизированных молекул ксЕу изобретения характеризуются Т50 больше 49°С. В соответствии с другим вариантом осуществления популяции стабилизированных молекул ксЕу изобретения характеризуются Т50 больше 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 или 48°С. В соответствии с еще одним вариантом осуществления популяции стабилизированных молекул ксЕу изобретения характеризуются Т50 больше 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 или 49°С.
Молекула ксЕук изобретения связывается с интересующей мишенью. Домены Ун и Уъ, из которых получают ксЕу, могут быть производными от одних и тех же или различных антител. В соответствии с другим вариантом осуществления Ун или У|, для использования в стабилизированных ксЕу изобретения могут содержать одну или более областей СЭЯ, связывающихся с интересующей мишенью, а другие домены Ун или У|, могут быть производными от других антител или быть синтетическими. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один СЭЯ антитела, о котором известно, что оно связывается с интересующей мишенью. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере два СЭЯ данного антитела. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере три СЭЯ данного антитела. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по мень
- 27 015992 шей мере четыре СОК данного антитела. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере пять СОК данного антитела. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере шесть СОК данного антитела. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один Ун домен антитела, о котором известно, что оно связывается с интересующей мишенью. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один Уъ домен данного антитела. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один Ун домен и один Уъ домен антитела, о котором известно, что оно связывается с интересующей мишенью. Молекулу 8сРу можно сконструировать в ориентации УН-линкер-Уь или Уъ-линкер-УН.
Стабильность молекул 8сРу изобретения или включающих их химерных белков можно оценить с точки зрения биофизических свойств (например, термической стабильности) обычной (нестабилизированной) молекулы 8сРу или связывающей молекулы, включающей обычную молекулу 8сРу. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула изобретения характеризуется термической стабильностью, большей приблизительно на 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10°С, чем контрольная связывающая молекула (например, обычная молекула 8сРу). Стабилизированная молекула 8сРу8 изобретения включает и такие молекулы. которые были идентифицированы с помощью способа изобретения и описаны здесь в разделе III.
В соответствии с другими аспектами стабилизированная молекула 8сРу изобретения включает 8сРу линкер с оптимизированной длиной и/или аминокислотным составом. Предпочтительные 8сРу линкеры изобретения улучшают термическую стабильность связывающей молекулы изобретения по меньшей мере приблизительно на 2 или 3° по сравнению с обычной связывающей молекулой. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению характеризуется улучшенной на 1°С термической стабильностью по сравнению с обычной связывающей молекулой. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению характеризуется улучшенной на 2°С термической стабильностью по сравнению с обычной связывающей молекулой. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению характеризуется улучшенной на 4, 5, 6°С термической стабильностью по сравнению с обычной связывающей молекулой. Сравнения можно проводить, например, между молекулой 8сРу изобретения и молекулами 8сРу. приготовленными с помощью описанных здесь способов из уровня техники, а также между фрагментами молекул 8сРу8 и ГаЬ антитела, из которого были получены 8сРу Ун и Уъ. Термическую стабильность можно измерить известными в уровне техники способами. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления можно измерить ТМ. Способы измерения ТМ и другие способы определения стабильности белков подробнее будут описаны ниже.
В соответствии с одним вариантом осуществления 8сРу линкер состоит из аминокислотной последовательности (С1у48ег)4 или включает эту последовательность. Другие примеры линкеров включают или состоят из последовательностей (61у48ег)3 и (61у48ег)5. Длина 8сРу линкеров изобретения может быть различной. В соответствии с одним вариантом осуществления длина 8сРу линкера изобретения составляет приблизительно от 5 до 50 аминокислот. В соответствии с другим вариантом осуществления длина 8сΡν линкера изобретения составляет приблизительно от 10 до 40 аминокислот. В соответствии с другим вариантом осуществления длина 8сΡν линкера изобретения составляет приблизительно от 15 до 30 аминокислот. В соответствии с другим вариантом осуществления длина 8сΡν линкера изобретения составляет приблизительно от 17 до 28 аминокислот. В соответствии с другим вариантом осуществления длина 8сΡν линкера изобретения составляет приблизительно от 19 до 26 аминокислот. В соответствии с другим вариантом осуществления длина 8сΡν линкера изобретения составляет приблизительно от 21 до 24 аминокислот.
8сΡν линкеры можно включать в полипептидные последовательности известными способами. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления можно использовать ПЦР мутагенез. Сделанные модификации подтвержают анализом последовательности ДНК. Плазмидная ДНК может использоваться для трансформации клеток-хозяев, обеспечивающей стабильную продукцию получаемых полипептидов.
В соответствии с некоторыми аспектами стабилизированные молекулы 8сΡν изобретения содержат по меньшей мере одну дисульфидную связь (мостик), соединяющую аминокислоту домена Уь и аминокислоту домена Ун. Для обеспечения дисульфидной связи необходимо наличие остатков цистеина. Дисульфидные связи могут быть включены в молекулу 8сΡν изобретения, например, чтобы соединить РК4 из Уь и РК2 из Ун или РК2 из Уь и РК4 из Ун. Примеры положений для дисульфидной связи включают 43, 44, 45, 46, 47, 103, 104, 105 и 106 из Ун и 42, 43, 44, 45, 46, 98, 99, 100 и 101 из Уь в соответствии с нумерацией Кэбата. Примеры комбинаций аминокислотных положений, мутировавших на цистеиновые остатки, включают Ун44-Уъ100, Ун105-Уъ43, Ун105-Уъ42, Ун44-Уъ101, Ун106-Уъ43, Ун104-Уъ43, Ун44Уъ99, Ун45-Уъ98, Ун46-Уъ98, Ун103-Уъ43, Ун103-Уъ44 и Ун103-Уъ45.
В соответствии с одним вариантом осуществления дисульфидная связь соединяет Ун аминокислоту
- 28 015992 и Уь аминокислоту 100.
Модификации в генах, которые кодируют домены Ун и Уъ, можно сделать, используя технологии, известные в уровне техники, например сайт-направленный мутагенез.
В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная молекула ксРу изобретения включает ксРу линкер с аминокислотной последовательностью (61у48ег)4 между доменами Ун и Уъ, где эти домены связаны дисульфидным мостиком между аминокислотой в положении 44 ΥΗ и аминокислотой в положении 100 Уь.
В соответствии с другими аспектами стабилизированные молекулы ксРу изобретения содержат одну или более стабилизирующих мутаций в вариабельном домене (Ун или Уь) ксРу. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизирующая мутация выбрана из следующей группы:
а) замена аминокислоты (например, глутамина) в положении Кэбата 3 Уъ, например, на аланин, серин, валин, аспарагиновую кислоту или глицин;
б) замена аминокислоты (например, серина) в положении Кэбата 46 Уъ, например, на лейцин;
в) замена аминокислоты (например, серина) в положении Кэбата 49 Уъ, например, на тирозин или серин;
г) замена аминокислоты (например, серина или валина) в положении Кэбата 50 Уъ, например, на серин, треонин, аргинин, аспарагиновую кислоту или лизин;
д) замена аминокислоты (например, серина) в положении Кэбата 49 и (например, серина) в положении Кэбата 50 Уъ соответственно на тирозин и серин, тирозин и треонин, тирозин и аргинин, тирозин и глицин, серин и аргинин или серин и лизин;
е) замена аминокислоты (например, валина) в положении Кэбата 75 Уъ, например, на изолейцин;
ж) замена аминокислоты (например, пролина) в положении Кэбата 80 Уъ, например, на серин или глицин;
з) замена аминокислоты (например, фенилаланина) в положении Кэбата 83 Уъ, например, на серин, аланин, глицин или треонин;
и) замена аминокислоты (например, глутаминовой кислоты) в положении Кэбата 6 Ун, например, на глутамин;
к) замена аминокислоты (например, лизина) в положении Кэбата 13 Ун, например, на глутамат;
л) замена аминокислоты (например, серина) в положении Кэбата 16Ун, например, на глутамат или глутамин;
м) замена аминокислоты (например, валина) в положении Кэбата 20 Ун, например, на изолейцин;
н) замена аминокислоты (например, аспарагина) в положении Кэбата 32 Ун, например, на серин;
о) замена аминокислоты (например, глутамина) в положении Кэбата 43 Ун, например, на лизин или аргинин;
п) замена аминокислоты (например, метионина) в положении Кэбата 48 Ун, например, на изолейцин или глицин;
р) замена аминокислоты (например, серина) в положении Кэбата 49 Ун, например, на глицин или аланин;
с) замена аминокислоты (например, валина) в положении Кэбата 55 Ун, например, на глицин;
т) замена аминокислоты (например, валина) в положении Кэбата 67 Ун, например, на изолейцин или лейцин;
и) замена аминокислоты (например, глутаминовой кислоты) в положении Кэбата 72 Ун, например, на аспартат или аспарагин;
ф) замена аминокислоты (например, фенилаланина) в положении Кэбата 79 Ун, например, на серин, валин или тирозин; а также
х) замена аминокислоты (например, пролина) в положении Кэбата 101 Ун, например, на аспарагиновую кислоту.
В соответствии с одним из аспектов стабилизированная молекула ксРу изобретения включает две или более стабилизирующих мутаций, описанных в пунктах а)-х) выше. В соответствии с одним из аспектов стабилизированная молекула ксРу изобретения включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 49 Уъ, например, на тирозин или серин и замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 50 Уъ, например, на треонин, аргинин, аспарагиновую кислоту или лизин. В соответствии с другим вариантом осуществления стабилизированная молекула ксРу изобретения включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 Ун, например, на глутамат и глутамин и замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 Уъ, например, на лизин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 Ун, например, на глутамат или глутамин; замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 Уъ, например, на лизин и замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 55 Ун, например, на глицин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 Ун, например, на глутамат или глутамин; замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 Уъ, например, на лизин; замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 55 Ун, например, на глицин и замену аминокислотного
- 29 015992 остатка в положении Кэбата 101 Ун, например, на аспарагиновую кислоту. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 6 Ун, например, на глутамин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 13 Ун, например, на глутамат. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 Ун, например, на глутамат или глутамин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 20 Ун, например, на изолейцин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 32 Ун, например, на серин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 43 Ун, например, на лизин или аргинин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 48 Ун, например, на изолейцин или глицин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 49 Ун, например, на глицин или аланин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 55 Ун, например, на глицин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 67 Ун, например, на изолейцин или лейцин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 72 Ун, например, на аспартат или аспарагин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 79 Ун, например, на серин, валин или тирозин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 101 Ун, например, на аспарагиновую кислоту.
В соответствии с другим примером реализации изобретения стабилизированная молекула ксРν изобретения включает одну или более описанных здесь замен стабилизирующих аминокислот и линкер ксРν оптимизированной длины и состава (например, (61у48ег)4). В соответствии с другим примером реализации стабилизированная молекула ксРν изобретения включает одну или более описанных здесь замен стабилизирующих аминокислот и дисульфидную связь, соединяющую аминокислоту из домена Уъ и аминокислоту из домена Ун (например, Ун44-Уъ100). В соответствии с другим примером реализации стабилизированная молекула ксРν изобретения включает одну или более описанных здесь замен стабилизирующих аминокислот, линкер ксРν оптимизированной длины и состава (например, (61у48ег)4), а также дисульфидную связь, соединяющую аминокислоту из домена Уъ и аминокислоту из домена Ун (например, Ун44-Уъ100).
Стабилизированные молекулы ксРν можно экспрессировать с помощью известных в уровне техники способов. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления такие молекулы можно экспрессировать с использованием вектора экспрессии, пригодного для экспрессии в клеточной системе экспрессии, например в системе экспрессии бактерий или млекопитающих.
В соответствии с одним вариантом осуществления молекулу ксРν можно экспрессировать в Е.сой, например, с использованием вектора, подходящего для периплазмической экспрессии. Для оптимизации экспрессии можно включить дополнительные последовательности, например сигнальную последовательность и/или метку (тэг), облегчающую очистку и/или детекцию ксРν.
В соответствии с одним вариантом осуществления для облегчения секреции из периплазмы в среду в систему можно вводить добавки, такие как 1-2% тритон (например, Тритон х-100) или 1-2% глицин и их комбинации (например, 1% глицин и 1% тритон).
III. Способы прогнозирования/определения стабильности белков.
В соответствии с определенными аспектами изобретение относится к способам прогнозирования а рпоп, потенциальных биофизических проблем с белками, выбранными для крупномасштабной экспрессии, например терапевтическими белками и промышленными ферментами. В соответствии с некоторыми примерами аспектов способы изобретения позволяют специалисту избежать экспрессии последовательностей белков, характеризующихся согласно прогнозу низкой стабильностью при рекомбинантной экспрессии, например, в клетках млекопитающих. В соответствии с альтернативными аспектами способы изобретения можно использовать для идентификации варианта последовательности, обладающего согласно прогнозу улучшенными биофизическими свойствами, включая, но не ограничиваясь, улучшенную стабильность, в том числе, и при изменении рН, а также улучшенной биохимической функцией.
В соответствии с некоторыми аспектами изобретение относится к вычислительным способам прогнозирования биофизического свойства (например, термической стабильности) белка-кандидата или варианта последовательности или его гомолога на основании полипептидной последовательности (например, аминокислотной последовательности) белка-кандидата. В соответствии с другими аспектами спосо
- 30 015992 бы изобретения используют способы структурного моделирования для прогнозирования стабильности белка-кандидата или для идентификации его гомологов или вариантов с известной, например, стабильностью, которые могут использоваться для улучшения стабильности белка-кандидата, например молекулы 5сЕ\'.
а. Анализ ковариаций.
В соответствии с некоторыми иллюстративными аспектами изобретение относится к улучшенному вычислительному способу, называемому анализом ковариаций (ковариационным анализом) прогнозирования биофизического свойства (например, стабильности белка).
Термин анализ ковариаций здесь означает вычислительный способ идентификации двух или более позиций аминокислотных остатков в последовательности белка-кандидата, которые обычно присутствуют совместно и коварьируют у гомологов кандидата (здесь коварьирующие положения остатков или ковариантные положения остатков). Ковариация между двумя или более аминокислотными положениями наблюдается, если тип аминокислоты в первом положении зависит от типа аминокислоты во втором положении. Это означает, что, когда одна конкретная аминокислота находится в первом положении последовательности, вторая конкретная аминокислота обычно присутствует во втором ее положении.
Так как такие коварьирующие остатки, скорее всего, эволюционировали совместно, наличие ковариации показывает, что совместимость аминокислотных остатков в коварьирующих положениях, вероятно, важна по функциональным или структурным причинам. Соответственно ковариационный способ изобретения можно использовать для идентификации одного или более коварьирующих остатков или групп остатков (например, коварьирующих пар остатков) в полипептидной последовательности (например, последовательности белка-кандидата). Здесь термин коварьирующий остаток (называемый также связанным остатком) означает аминокислоту, статистически превалирующую в положении коварьирующего остатка в полипептидной последовательности.
В соответствии с некоторыми аспектами ковариационные способы изобретения можно использовать для идентификации функциональных остатков последовательности-кандидата. Более того, поскольку количество коварьирующих остатков в полипептиде-кандидате позволяет спрогнозировать его стабильность, ковариационный способ изобретения можно использовать для прогнозирования стабильности белка-кандидата.
В соответствии с другими аспектами ковариационные способы изобретения можно использовать для руководства успешным дизайном белков. В соответствии с одним демонстративным вариантом осуществления ковариационный способ изобретения позволяет идентифицировать коварьирующие аминокислоты в последовательности-кандидате. В настоящее время коварьирующие остатки предпочтительно сохраняют в ходе последующего конструирования последовательности белка. В соответствии с другим демонстративным вариантом осуществления ковариационные способы изобретения можно использовать для идентификации аминокислотных позиций нековарьирующих остатков в последовательности белкакандидата, где соответствующие аминокислоты у других белков (например, белков, соответствующих последовательностям набора сравнения) обычно представляют собой коварьирующие аминокислоты. После их обнаружения нековарьирующие остатки можно заменить (например, способами рекомбинантной ДНК) на соответствующие коварьирующие остатки, чтобы усилить функцию или улучшить биофизические свойства (например, стабильность) последовательности белка-кандидата.
Положения коварьирующих остатков можно идентифицировать статистическим анализом (например, корреляционным анализом) положений остатков в базе данных родственных полипептидных последовательностей (например, выровненного набора сравнения или результата выравнивания нескольких последовательностей). В соответствии с предпочтительными аспектами ковариационный анализ вовлекает статистическое сравнение полипептидных последовательностей-кандидатов с базой данных различных полипептидных последовательностей (с различной структурой), обладающих одной структурной укладкой (например, укладкой Ι§).
В соответствии с новым описанным здесь способом ковариационного анализа для прогнозирования стабильности полипептида-кандидата необходимо предпринять следующие действия.
1. Получить набор гомологичных последовательностей (здесь набор сравнения), соответствующих последовательности полипептида-кандитата или домена полипептида или фрагмента домена (здесь исследуемая последовательность домена).
2. Выровнять последовательности набора сравнения с генерацией выровненного набора гомологичных последовательностей (здесь выровненный набор).
3. Определить ковариацию между двумя или более положениями остатков (например, по меньшей мере между одной парой аминокислотных остатков) с набором сравнения для генерации данных ковариации или набора данных ковариации (база данных ковариации).
4. Воспользоваться данными ковариации для прогнозирования стабильности белка-кандидата.
Этап 1. Получение набора сравнения.
В способах ковариации изобретения используется набор последовательностей (набор сравнения), гомологичных (т.е. родственных) интересующей последовательности, или исследуемой последователь
- 31 015992 ности. Набор сравнения может содержать набор гомологичных последовательностей с умеренной или высокой степенью сходства с исследуемой последовательностью. В соответствии с некоторыми аспектами гомологичные последовательности набора сравнения характеризуются умеренной или высокой степенью сходства аминокислотных последовательностей (последовательное сходство). В соответствии с более предпочтительными аспектами гомологичные последовательности набора сравнения характеризуются умеренной или высокой степенью структурного сходства. В соответствии с еще более предпочтительными аспектами гомологичные последовательности набора сравнения характеризуются высокой степенью структурного сходства (например, в них присутствует одинаковый домен или укладка белка). Не требуется, чтобы набор гомологичных последовательностей был большим, главное, чтобы можно было получить разумно беспристрастный выбор.
В примерах реализации изобретения ковариационный способ изобретения использует исправленный набор сравнения. Термин исправленный набор сравнения здесь означает набор сравнения, в котором были удалены последовательности некоторых компонентов или добавлены новые последовательности в соответствии с определенными критериями выбора. Соответственно, если неисправленный набор последовательностей был сгенерирован на основании беспристрастного, объективного выбора компонентов, исправленный набор получают пристрастным выбором.
Например, можно провести выбраковку в наборе сравнения гомологичных последовательностей, чтобы устранить некоторые из них, например гомологичные последовательности. Альтернативно, исправленный набор можно расширить, например, включив подходящее количество не избыточных или не идентичных последовательностей.
В соответствии с определенными аспектами исправленная база данных включает по меньшей мере сотню последовательностей (например, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750 или больше последовательностей). В соответствии с одним вариантом осуществления исправленная база данных включает по меньшей мере тысячу последовательностей (например, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 или больше последовательностей). В соответствии с другим вариантом осуществления исправленная база данных включает по меньшей мере десять тысяч последовательностей (например, 10000, 20000, 50000, 100000, 250000, 500000, 750000 или больше последовательностей). В соответствии с одним вариантом осуществления исправленная база данных включает по меньшей мере один миллион индивидуальных последовательностей (например, 1 млн, 2 млн, 5 млн, 10 млн или больше последовательностей).
В соответствии с предпочтительными аспектами в ковариационном способе изобретения используется исправленный набор, включающий по меньшей мере 50% разнообразие (например, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или еще большее разнообразие), с целью минимизации количества искусственных или неинформативных ковариаций. Здесь термин % разнообразия означает процент последовательностей в наборе сравнения, которые не избыточны или не идентичны. Термин не избыточный означает здесь последовательность с менее чем 100% последовательной идентичностью с каждой другой последовательностью набора сравнения, т.е. последовательность, которая отличается по меньшей мере на одно аминокислотное положение от каждой другой последовательности набора сравнения. В соответствии с некоторыми аспектами последовательность из набора сравнения обладает менее чем 99%, менее чем 95%, менее чем 90% или менее чем 85% последовательной идентичностью с каждой другой последовательностью набора сравнения. В соответствии с предпочтительными аспектами последовательность из набора сравнения обладает менее чем 80% последовательной идентичностью с каждой другой последовательностью набора сравнения (например, менее чем 75%, менее чем 70%, менее чем 65%, менее чем 60% или менее чем 50% последовательной идентичностью).
В соответствии с особо предпочтительными аспектами каждая последовательность из набора сравнения обладает менее чем 80% последовательной идентичностью с каждой другой последовательностью набора сравнения. В соответствии с примерами реализации изобретения последовательности набора сравнения исправляют для достижения предпочтительного разнообразия с помощью инструментов фильтрования, которые отбраковывают последовательности более общих типов (например, инструмент сортировки Хеникова (нешкой)). Если длина двух последовательностей одинакова, сортировка по весам Хеникова гарантирует сохранность последовательностей с остатками редких типов и выбраковку последовательностей с более распространенными типами остатков (нешкой е1 а1., 1. Мо1. Вю1., 243: 574-578 (1994)).
В соответствии с предпочтительными аспектами набор сравнения включает последовательности, кодируемые генами, не являющимися эволюционно близкими генам, кодирующим другие последовательности в базе данных. Например, для повышения разнообразия набор сравнения может содержать одну или более ортологичных последовательностей, т.е. последовательностей из других видов (например, из других видов млекопитающих), обладающих такой же или похожей биохимической функцией. В соответствии с одним примером реализации набор сравнения может содержать одну человеческую последовательность и по меньшей мере одну нечеловеческую последовательность (например, нечеловеческую последовательность млекопитающего). В соответствии с другим примером реализации набор срав
- 32 015992 нения может содержать одну последовательность млекопитающего (например, человека, шимпанзе, собаки, коровы, свиньи, кошки, крысы или мыши) и по меньшей мере одну последовательность не млекопитающего (например, последовательность немлекопитающих позвоночных животных (например, последовательность рыб или птиц), последовательности непозвоночных (например, насекомых (например, дрозофил)) или нематод (например, последовательность С. е1едапк) или последовательность грибков, растений, бактерий или вирусов). В соответствии с другими аспектами набор сравнения может содержать одну или больше паралогичных последовательностей, т.е. последовательностей из тех же видов, что и первая последовательность, и обладающих такой же или похожей биохимической функцией.
В соответствии с другими аспектами длина последовательностей набора сравнения превышает определенное пороговое значение. Предпочтительно, чтобы последовательности набора сравнения были длиной по меньшей мере 20 остатков (например, 25, 30 или 40 остатков). Более предпочтительно, чтобы последовательности набора сравнения были длиной по меньшей мере 50 остатков (например, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95 остатков). Еще более предпочтительно, чтобы последовательности набора сравнения были длиной по меньшей мере 100 остатков (например, 110,120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 или больше остатков). В соответствии с примерами реализации последовательности набора сравнения исправляют для достижения предпочтительной длины, фильтруя их с использованием инструмента фильтрования (например, счет остатков без пробелов). Ранжирование в сторону уменьшения такого счета гарантирует, что более короткие последовательности (например, с пробелами) будут отфильтрованы быстрее, чем более длинные.
Последовательности получают в результате основанного на последовательностях поиска по гомологии в любой из известных баз данных последовательностей, таких как базы данных ЫСВ1 или ТЮК. В соответствии с примером реализации можно выполнить стандартный поиск ВЬА8Т для исследуемой последовательности с параметрами по умолчанию; это поможет получить гомологичные интересующие последовательности. Для включения в набор сравнения можно выбрать последовательности с минимальным процентом идентичности (например, больше 25, 30, 35, 40, 45 или 50% последовательной идентичности, предпочтительно более 30% идентичности) по сравнению с исследуемой последовательностью.
В соответствии с предпочтительными аспектами набор сравнения исправляют, включая в него последовательности белков с укладкой того же типа (например, белки с укладкой БИ3, ТРК, ОРСК, типа сериновых протеаз, аспарагиновых протеаз, глобина, иммуноглобулинов и других типов). Такие белки и структуры можно обнаружить и собрать способами биоинформатики, известными в уровне техники (например, в результате структурного поиска в базе данных консервативных доменов (ООО) Национального института здравоохранения (Ναΐίοηαΐ 1пк111и(ек о£ Иеа1111) или в базе данных АЗТКАЬ или базе данных белков КС8В (рго!ет йа!аЬаке (РОВ)) с использованием желаемой классификации 8СОР). Предпочтительно выделять последовательности из белков, трехмерная структура которых была разрешена с высоким разрешением, например способами рентгеновской кристаллографии.
В соответствии с предпочтительными аспектами последовательности, соответствующие выбранным структурам, выделяются известными в уровне техники способами, чтобы удалить ошибочно категоризированные, неполные, избыточные структуры и структуры с заменой доменов. В соответствии с одним вариантом осуществления структуры проверяют визуально (например, с использованием программы 8\\зккРОВ У|е\уег) на предмет поиска разрывов в соответствующих последовательностях из-за неразрешенных плотностей и замены доменов. Файлы РОВ с неверными структурами вручную удаляют из соответствующего набора структур. В соответствии с другим вариантом осуществления последовательности (например, последовательности РА8ТА), соответствующие собранным структурам, фильтруют, чтобы удалить все последовательности, идентичные на 100%, а также правильно соотнести подстроки оставшихся последовательностей. В соответствии с другими аспектами структуры РОВ с ошибочно длинными или короткими аминокислотными последовательностями (признак ошибочной структурной категоризации) выбраковывают из базы данных структур. Критерий отсева по длине можно определить, например, изучив гистограмму всех длин последовательностей набора сравнения. В соответствии с другими аспектами структуры инспектируются визуально (например, с использованием программы 8\\зккРОВ У1е\\'ег) на предмет поиска неправильной укладки. Структуры, не соответствующие стандартной топологии укладки белка, предпочтительно удаляются.
В соответствии с примерами реализации изобретения исправленный набор сравнения включает последовательности, соответствующие укладке типа иммуноглобулина (укладка 1д), и описывающие белки, принадлежащие иммуноглобулиновому надсемейству белков. Как хорошо известно в уровне техники, укладка 1д является отличительной чертой иммуноглобулинового надсемейства (см., например, Вогк, Р., но1т, Ь. & 8апйег, С. 1994. Тке 1ттипод1оЬи1т Ро1й. 1. Μο1. Вю1. 242, 309-320). Укладка 1д часто представлена у белков млекопитающих и служит платформой для различных функций - в особенности, взаимодействия белок-белок. Например, все иммуноглобулины и большая часть иммуноглобулиновых рецепторов состоят из нескольких доменов с укладкой 1д. Эту укладку можно подразделить на несколько подсемейств, включая С1, С2, I и У. Хотя члены всех подсемейств характеризуются топологией типа греческий ключ (дгеек-кеу), включающей два β-листа, они различаются по количеству β-нитей в каждом листе и по способу соединения листов (см., например, А.Р. УПКатк. 1ттипо1оду Тойау, 8 (1987)).
- 33 015992
Репрезентативные структуры каждого класса 1д-укладки отображены на фиг. 100.
В соответствии с одним вариантом осуществления набор сравнения включает последовательность с 1д-укладкой белков недсемейства иммуноглобулинов, выбранных из группы, включающей белок клеточной адгезии, интегрин, аллерген, рецептор Т-клеток, белковый комплекс большой гистосовместимости (например, белок МНС С1акк I или МНС С1акк II), иммуноглобулиновый рецептор (например, Рс гамма рецептор (например, РсуВ1, РсуВПа)), а также иммуноглобулин (например, 1д6, 1дМ, 1дЛ или 1дЕ).
В соответствии с определенными предпочтительными направлениями реализации изобретения все последовательности набора сравнения соответствуют укладке 1д или ее фрагменту. В соответствии с одним вариантом осуществления укладка 1д представляет собой укладку С1. В соответствии с другим вариантом осуществления укладка 1д представляет собой укладку С2. В соответствии с другим вариантом осуществления укладка 1д представляет собой У-укладку. В соответствии с еще одним вариантом осуществления укладка 1д представляет собой Ι-укладку. В соответствии с другим вариантом осуществления все последовательности набора сравнения соответствуют укладке С1. В соответствии с другим вариантом осуществления все последовательности набора сравнения соответствуют укладке С2. В соответствии с другим вариантом осуществления все последовательности набора сравнения соответствуют Ι-укладке.
В соответствии с некоторыми предпочтительными аспектами длина последовательностей укладки 1д набора сравнения составляет от 75 до 150 остатков.
Этап 2. Выравнивание набора сравнения.
На втором этапе последовательности набора сравнения точно выравнивают, чтобы сгенерировать выровненный набор последовательностей (или выравнивание). В соответствии с одним вариантом осуществления последовательности набора сравнения выравнивают с помощью алгоритмов выравнивания последовательностей (например, ΕΛΟΟΝ или ВЬЛ8Т и другие известные в уровне техники способы выравнивания, описанные в этой работе) и создают в результате выровненный набор последовательностей (здесь этот способ называют выравниванием, основанным на последовательности). В соответствии с другим вариантом осуществления структуры, соответствующие последовательностям набора сравнения, выравнивают с использованием алгоритма структурного выравнивания (например, алгоритм вторичного структурного выравнивания (8есопбагу 8!гис!иге Ма!сЫпд (88М)) используется в программном пакете 8с11гобтдег к1гис!а11дп фирмы Шредингер) и создают в результате выровненный набор структур (здесь этот способ называют выравниванием, основанным на структурах, или структурным выравниванием). Предпочтительно, чтобы алгоритм структурного выравнивания гарантировал выравнивание центральных областей (например, цепей β-листа) каждой структуры, а не промежуточных петель. В соответствии с еще одним вариантом осуществления последовательности набора сравнения выравнивают структурными способами (например, приводя аминокислоты из одной наложенной структуры аминокислотам другой структуры на основании кратчайшего расстояния между α-углеродными атомами полипептидных каркасных цепей, например, с помощью пакета компании Шредингер).
В соответствии с другим вариантом осуществления последовательности набора сравнения выравнивают с использованием алгоритмов, как основанных на последовательности, так и на структуре. Предпочтительно, чтобы соответствующие последовательностям набора сравнения структуры выравнивали сначала с использованием алгоритма структурного выравнивания или другого основанного на структуре инструмента выравнивания, а затем выравнивали соответствующие последовательности алгоритмом, основанным на последовательностях. Более предпочтительно сначала выравнивать структуры, соответствующие последовательностям набора сравнения, а затем выравнивать последовательности с использованием структурных алгоритмов выравнивания.
В соответствии с некоторыми дополнительными аспектами выровненный набор последовательностей затем дополнительно исправляется. Например, его можно расширить (например, сортировкой без пробелов или по Хеникову), что повысит его разнообразие (например, позволит получить очень большие наборы гомологичных последовательностей с такой же укладкой). В соответствии с другими аспектами выровненный набор последовательностей можно подвергнуть затем нескольким циклам исправления и, необязательно, дополнительного выравнивания (например, структурного).
В соответствии с некоторыми предпочтительными аспектами изобретение относится к способам исправления выровненного набора, включающего относительно малое количество последовательностей, чтобы усилить его разнообразие. С повышением количества последовательностей в выравнивании возрастает мощность ковариационного анализа. В соответствии с одним вариантом осуществления способы могут использовать эвристическую модель или профиль для поиска дополнительных гомологичных последовательностей из большой, общественно доступной базы данных последовательностей (например, базы данных NВ, обслуживаемой NСВI). Эвристические модели можно получить с помощью одного или более алгоритмов регрессии, выбранных из числа, например, следующих: регрессия по способу частичных наименьших квадратов, множественная линейная регрессия, регрессия по способу обратных наименьших квадратов, регрессия по способу главных компонентов, переменной важности для проекции и подобные им. В соответствии с другими аспектами эвристическая модель получается с использованием одного или более алгоритмов, основанных на паттерне, выбранных, например, из числа следующих:
- 34 015992 скрытая модель Маркова (Шббеп Магкоу тобе1), алгоритм Смита-Ватермана, нейронные сети, дерево классификации и регрессии, сплайновая кривая многомерной адаптивной регрессии и подобные им. В соответствии с демонстративным вариантом осуществления алгоритм распознавания паттерна представляет собой скрытую модель Маркова. НММ - статистическая модель, где моделируемая система включает скрытые параметры, которые можно определить с помощью наблюдаемых параметров и использовать для анализа распознавания паттернов. Например, в признанных НММ могут использоваться предсказанные вторичные структуры, позволяющие найти антитела такой же укладки, что и данное антитело, а не просто антитела с чисто последовательным сходством (см., например, Рго1ешк 36(1), 68-76). Примерами основанных на НММ инструментов распознавания паттерном являются Ме!аРат (811уегк1еш е! а1. №с1ек Ас1бк Кек 29(1), 49-51 (2001)), 1п1егрго (Артеейег, е! а1., №.1с1ею АсИк Кек, 29(1), 37-40 (2001)) и ΗΜΜΕΚ (Ва!етап е! а1., №.1с1ею Ас1бк Кек 27(1), 260-2 (1999)).
В соответствии с некоторыми дополнительными аспектами последовательности, извлеченные с помощью алгоритма НММ, можно валидировать (проверить их допустимость), проверив их правильное выравнивание в структурном классе, использовав при этом признанное программное обеспечение по биоинформатике. Примером инструмента валидации является средство классификации РРАМ, разработанное \Уе11соте Тгик! 8апдег 1пк111и1е и публично доступное в сети Интернет. Например, инструмент РРАМ под названием рГатуепГу можно применить к каждой извлеченной последовательности и подтвердить ее корректную классификацию класс-специфическим НММ, созданным на основании структурного выравнивания, основанного на структуре (Ршп е! а1., №.1с1ею АсИк Кек, 24 (Иа1аЬаке 1ккие), Ό24751 (2006)). Профили НММ, соответствующие клану РРАМ (или родственному семейству белков, например укладке клана 1д), можно выгрузить с тееЬ-сайта РРАМ, что позволит облегчить определение ранга (ксогшд) извлеченных последовательностей. Последовательности, чей ранг (счет) не укладывается в рекомендованные границы, предпочтительно удалять из набора сравнения.
В соответствии с другими аспектами последовательности, полученные по алгоритму НММ, можно выровнять также с помощью алгоритма НММС. Так как эти алгоритмы НММ основаны на тщательном структурном выравнивании, этот процесс гарантирует структурное выравнивание дополнительных проэкстрагированных последовательностей. Например, с помощью модуля ΗΜΜЕΚ можно генерировать выравнивание типа ''тара11'' в формате вывода РА8ТА.
В соответствии с предпочтительными аспектами способ изобретения относится к новому алгоритму НММ, который не только позволяет найти последовательности, похожие на выровненный набор, но также и выравнивает новые последовательности, гарантируя правильное выравнивание области ядра. Например, новый алгоритм НММ изобретения позволяет искать отдельные домены (например, укладку 1д доменов) внутри отдельного белка (например, представителя надсемейства иммуноглобулинов), отдельно экстрагировать каждый домен и добавлять его к выровненному набору последовательностей. Алгоритмы и профили НММ можно создавать на основании структурного выравнивания последовательностей (например, с использованием программного модуля ΗΜΜЕΚ, который публично доступен в сети Интернет, например, на сайте тетете.ркс.еби). Для каждого структурно-специфичного поиска НММ, предпочтительно, последовательности, превышающие пороговое значение выбора, сохраняются в качестве кандидатов в структурный класс, для которого и использовался НММ. В случае отбора участков выбранной последовательности можно экстрагировать точную подпоследовательность, соответствующую критериям отбора.
В соответствии с другими примерами аспектов изобретение относится к способам исправления выровненного набора последовательностей, чтобы снизить его избыточность. Например, хотя большое количество последовательностей в структурно выровненном наборе (например, выровненный набор укладок 1д) представляет богатый источник таких последовательностей, некоторые подсемейства (например, некоторые подклассы укладок 1д) могут быть представлены избыточно, а другие в недостаточной степени. Такие пере- или недопредставления приводят к существенному смещению из-за близкого сходства предков и ограничивают общую полезность ковариационного анализа. Соответственно в соответствии с предпочтительными аспектами выравнивание следует подвергнуть дополнительному фильтрованию, чтобы снизить его избыточность. В соответствии с предпочтительными аспектами по меньшей мере одну последовательность с более чем 90% идентичностью с другой последовательностью (например, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью) удаляют из выравнивания. В соответствии с особенно предпочтительными аспектами из выравнивания удаляют по меньшей мере одну последовательность с более чем 80% идентичностью с другой последовательностью (например, 81, 82, 83, 84, 87, 88, 89 или 90% идентичностью).
В соответствии с примером реализации изобретение относится к новому способу снижения избыточности выравнивания. Такие способы включают использование эвристического алгоритма для поиска и ранжирования с требуемым порогом идентичности. При этом используется один или более следующих последовательных действий: (1) расчет процента идентичности всех пар последовательностей в выравнивании; (2) группирование значений идентичности в одну или более групп идентичности; (3) ранжирование последовательностей из каждой группы путем снижения счета беспробельных остатков и/или путем взвешивания последовательностей по Хеникову; и (4) удаление избыточных последовательностей в
- 35 015992 соответствии с критерием отсечения (например, уровень отсечения по проценту идентичности).
Удаление избыточных последовательностей можно осуществить различными способами. В соответствии с одним вариантом осуществления ранжированные последовательностей группируют в несколько групп (бинов) идентичности (например, 99% бин, 98% бин, 97% бин и т.д.). Последовательности затем систематически удаляют на основании их ранга (например, сначала удаляют с наибольшим рангом). Этапы расчета идентичности, группировки и/или ранжирования (этапы (1)-(3)) можно повторить после каждого этапа удаления, пока не будет удален последний бин, соответствующий критериям отсечения. В соответствии с другим вариантом осуществления по критерию отсечения создают один бин ранжированных последовательностей, и последовательности систематически удаляют из этого бина, в соответствии с их рангом. Расчет идентичности и/или этапы ранжирования (этапы (1)-(3)) можно повторить после каждого этапа удаления.
В соответствии с предпочтительными аспектами критерий отсечения - это 90% или выше (например, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98, 99% или больше). В соответствии с особо предпочтительными аспектами критерий отсечения - это 80% или выше (например, 81, 82, 83, 84, 87, 88, 89 или 90% идентичности).
В соответствии с другим дополнительным этапом длины последовательностей в выровненном наборе можно уменьшить. В соответствии с одним вариантом осуществления можно удалить пробельные области в выравнивании, чтобы избежать вычислений в этих менее информативных областях. Например, можно удалить столбцы, не соответствующие состояниям профиля НММ. В соответствии с другим вариантом осуществления сокращают последовательности в выравнивании, накладывающиеся в области консенсусной длины выравнивания, при этом удаляют выступающие участки последовательностей. В соответствии с другим вариантом осуществления накладывающиеся последовательности удаляют из выравнивания.
Этап 3. Ковариационный анализ выровненного набора.
После компиляции набора сравнения к одной или более пар аминокислотных остатков выровненного набора применяют ковариационный анализ. Последний приводит к генерации нового набора данных (здесь ковариационный набор данных), описывающего статистическую значимость коррелирующих остатков выравнивания. В соответствии с некоторыми аспектами ковариационный набор данных включает корреляции между всеми возможными парами остатков в выравнивании.
В соответствии с предпочтительными аспектами расчет ковариаций представляет собой процесс, реализуемый на компьютере (например, в среде 1ауа). Расчет ковариации может привести к получению нескольких признаваемых в уровне техники статистических параметров. В соответствии с одним вариантом осуществления статистическая значимость (например, значение χ2) ковариации рассчитывается анализом Хи-квадрат. В соответствии с другим вариантом осуществления определяется статистическая длина (например, значение φ) ковариации. Например, отрицательное значение φ может прогнозировать негативную корреляцию. Это означает, что наличие одного аминокислотного остатка в первом положении выравнивания благоприятствует отсутствию другого конкретного аминокислотного остатка во втором положении. Напротив, положительное значение φ может прогнозировать положительную корреляцию, показывая, что аминокислотный остаток в первом положении выравнивания благоприятствует наличию другого конкретного аминокислотного остатка во втором положении.
В соответствии с одним вариантом осуществления значение φ рассчитывают по формуле (I)
где а 1Ь; означает, сколько раз остатки типов а или Ь присутствуют в одной и той же последовательности в положениях ί и _) соответственно;
—
А означает, сколько раз остатки обоих типов отсутствуют в одной последовательности;
1 означает, сколько раз остаток а присутствует, а Ь отсутствует;
означает, сколько раз остаток а отсутствует, а Ь присутствует.
В соответствии с одним вариантом осуществления значение φ рассчитывают по формуле (II)
где параметры с-] представлены в матрице:
- 36 015992
а,а | Сумма
Ь,с б 9
ьу I И
Сумма ί ί
и с = а(Ь? б = ДЬ), е = а^, ΐ = а^, д = с + б, ή = е + I, Ϊ = с + е и ] = 6+ΐ.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления значение χ2 можно рассчитать по формуле, основанной на частоте возникновения. В соответствии с другими аспектами значение χ2 рассчитывается по формуле, основанной на событиях (т.е. количестве случаев). Пример формулы, основанной на событиях, приведен ниже (формула (III)) ₽(0·ρ€0·<40 где р(1) и р(]) - частоты остатков любых двух интересующих типов остатков в положениях ί и) соответственно, выровненного набора последовательностей;
с(1, .)) означает, сколько раз р(1) и р(|) присутствуют в одной последовательности;
с(!) - общее число последовательностей в выравнивании; и где частоты остатков определены как количество раз, которое остаток данного типа наблюдался в конкретном положении выравнивания, деленное на общее количество последовательностей в выравнивании.
В соответствии с определенными аспектами только остатки аминокислот природного типа считаются при подсчете типа остатков для задач вычисления ковариаций. В соответствии с предпочтительными аспектами, однако, тип остатка может также включать пробел как отдельный тип, так как пробелы (особенно, в положениях в петле) часто позволяют отличить один мотив от другого.
В соответствии с определенными аспектами расчет ковариации может включать функцию взвешивания разнообразия (например, по схеме взвешивания Хеникова).
В соответствии с другими аспектами для фильтрования коварьирующих пар можно использовать средние идентичности последовательностей (8ес.|иепсе Ауегаде ШепШек (8ΑΙ)). Например, 8ΑΙ позволяют отделить ковариации от пар с более чем средней идентичностью последовательностей, чтобы устранить потенциальные ковариации-артефакты, возникающие среди близкородственных последовательностей. В аспектах, где выравнивание подвергалось исправлению с высоким порогом идентичности (например, 80% идентичность в качестве критерия отсечения), предпочтительно обходиться без расчета 8ΑΙ.
В соответствии с определенными аспектами сведения о коварьирующих парах не выводятся, если только они не наблюдались минимальное количество раз (здесь порог события). В соответствии с одним вариантом осуществления порогом является 10 или более событий. В соответствии с более предпочтительным вариантом осуществления порог события составляет 2 или более, но меньше 10 (например, 9, 8, 7, 6 или 5 событий).
Этап 4. Использование данных ковариации для прогнозирования стабильности белка.
В соответствии с определенными аспектами статистически значимые ковариации из набора ковариации используются для поиска соответствующих ковариацией в последовательности-кандидате и исследуемой последовательности. В частности, консервация одного или более ковариантных аминокислотных остатков набора сравнения в соответствующих положениях последовательности-кандидата и исследуемой последовательности показывает, что эти остатки функционально важны и прогнозируют благоприятную стабильность белка. Соответственно для прогнозирования стабильности последовательности можно использовать количество ковариантных аминокислотных остатков, консервативных для последовательности-кандидата и исследуемой последовательности.
В соответствии с примерами некоторых аспектов для визуализации важных ковариаций можно использовать графическую пользовательскую область контакта (СИ1) изобретения (например, инструмент ЫАРМАР, описанный в разделе ν ниже), это облегчает анализ данных ковариаций. Из-за того, что интерпретация данных набора ковариаций может быть утомительной, графическая пользовательская область контакта позволяет облегчить анализ данных, а также дизайн и функциональный анализ белков.
В соответствии с демонстративными направлениями реализации наличие или отсутствие коварьирующих остатков в наборе сравнения или выравнивании, которые присутствуют или отсутствуют в последовательности-кандидате, позволяют установить счет, коррелирующий со стабильностью белка. Например, если ковариантная пара остатков (например, позитивно ковариантная) существует и в последовательности-кандидате, то ей можно назначить первый балл счета (например, положительный). Напротив, если ковариантная пара остатков (например, позитивно ковариантная) отсутствует в последователь
- 37 015992 ности-кандидате, то ей можно назначить второй балл со знаком, противоположным первому (например, отрицательный). В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления при отсутствии отрицательно ковариантных пар остатков в исследуемой последовательности ей назначают положительный балл, а наличие таких остатков приводит к отрицательному баллу. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления при наличии положительно ковариантных пар остатков в исследуемой последовательности ей назначают положительный балл, а отсутствие таких остатков приводит к отрицательному баллу.
В соответствии с определенными аспектами счет ковариации генерируют только для таких ковариаций, которые удовлетворяют пороговому уровню статистической значимости. В соответствии с одним вариантом осуществления счеты ковариаций генерируют только для ковариаций выше (или ниже) определенного значения χ2 или ф. Например, порогом для назначения отрицательного балла может быть ковариация с коэффициентом ассоциации фи (ф) менее чем +0,2 (приблизительно от +0,2 до -1,0), а более предпочтительно менее -0,2. В соответствии с другим примером реализации ковариации назначают положительный балл, если ее коэффициент ассоциации фи больше -0,2, предпочтительно больше чем +0,2. В соответствии с предпочтительными аспектами отрицательный балл ковариации назначают ковариациям с коэффициентом ассоциации фи менее чем -0,5 (например, -0,5, -0,6, -0,7, -0,8, -0,9 или -1,0), а положительный балл ковариации назначают ковариациям с коэффициентом ассоциации фи более чем +0,5 (например, +0,5, +0,6, +0,7, +0,8, +0,9 или +1,0), а все остальные ковариации маскируют, назначая нейтральный балл (например, ноль).
В соответствии с определенными аспектами отрицательный или положительный счет ковариации можно взвесить, чтобы отразить статистическую значимость и силу соответствующей ковариации. В соответствии с демонстративным примером реализации положительной ковариации можно назначить высокоположительный балл, если ее коэффициент ассоциации фи также высок, или небольшой положительный балл, если ее ф мал. Например, в случае последовательности-кандидата, у которой первая и вторая ковариации характеризуются соответственно значениями ф +0,5 и +1,0, можно назначить небольшой положительный балл (например, +1) для первой ковариации и более высокий положительный балл (например, +2) для второй ковариации.
В соответствии с другими аспектами счет ковариации назначают только таким ковариациям, которые валидированы другими средствами, а не просто расчетной статистической значимостью. Для валидации можно использовать несколько нестатистических критериев, позволяющих показать, что рассчитанные ковариации значимы и несут в себе биологический смысл. В соответствии с одним вариантом осуществления ковариацию валидируют, определяя, существует ли корреляция или тренд между остатками, коварьирующими друг с другом, и их близостью друг с другом в структурной модели соответствующего белка. Если указанные остатки располагаются близко друг к другу (например, на 30 А или меньше, предпочтительно 10 А или меньше) в этой структуре, предсказанная ковариация валидируется как истинная ковариация. В соответствии с другим вариантом осуществления ковариацию валидируют, определяя, образуют ли коварьирующие аминокислоты связь, о которой известно, что она существует в подмножестве белков, соответствующих последовательности набора сравнения (например, известные дисульфидные связи). Например, остатки 6-10 с Ν-конца человеческой или мышиной укладки вариабельной тяжелой цепи ^С образуют очень специфичную конформацию, основанную на консервации коварьирующих пар аминокислот (Е\тей е1 а1., МеШобз, 34: 184-199 (2004)).
В соответствии с другими аспектами счет ковариации аминокислоты в последовательностикандидате можно взвесить, чтобы отразить тем самым количество ковариаций в наборе сравнения или выравнивании, которое было бы удовлетворительным (или нет). В соответствии с одним вариантом осуществления последовательности-кандидату назначают положительный балл ковариации за каждую ковариацию в наборе или выравнивании сравнения, которая присутствует в последовательности-кандидате, и отрицательный балл за каждую ковариацию, которая там отсутствует. В соответствии с предпочтительными аспектами счет ковариации для конкретной аминокислоты из исследуемой последовательности представляет собой сумму положительных баллов ковариации за вычетом суммы отрицательных баллов. Например, если для аминокислотного положения из набора сравнения наблюдалось две отрицательные и девять положительных ковариаций при сравнении с аминокислотой из последовательности-кандидата, то общий счет ковариации аминокислоты из последовательности кандидата составляет 7.
В соответствии с определенными аспектами общие баллы ковариации суммируются для всех аминокислот последовательности кандидата (или их фрагментов) с получением счета ковариации последовательности (балла ковариации последовательности). Этот счет можно использовать для прогнозирования стабильности последовательности. В целом, отрицательный счет ковариации позволяет спрогнозировать низкую стабильность белка, а положительный счет говорит о высокой стабильности.
Ь. Подсчет консенсуса.
В соответствии с другими аспектами в вычислительных способах изобретения используется новая технология подсчета, называемая подсчет, основанный на консенсусе, консенсусный подсчет, в которой полипептидные последовательности-кандидаты сравниваются с базой данных родственных полипеп
- 38 015992 тидных последовательностей с целью идентификации белков, обладающих потенциально низкой стабильностью. Термин консенсусный подсчет означает здесь расчет количества неконсенсусных аминокислот в белке (например, в исследуемом белке), на основании информации, доступной из последовательностей родственных белков. Этот расчет позволяет получить консенсусный счет белка. Как показано в примерах ниже, консенсусный счет белка хорошо коррелирует с эмпирически определенной стабильностью белка. Соответственно задачей изобретения является использование консенсусного подсчета для прогнозирования стабильности белка. Чем сильнее отклонение исследуемой последовательности белка от консенсусной последовательности, тем выше консенсусный счет, и тем более вероятно, что исследуемый белок включает аминокислоты, ухудшающие его стабильность.
В соответствии с предлагаемым здесь новым консенсусным подходом для прогнозирования стабильности белка-кандидата или исследуемого белка необходимо предпринять следующие основные действия.
1. Получение набора гомологичных последовательностей (например, набора сравнения), соответствующего последовательности домена (или его части) белка-кандидата (здесь исследуемой последовательности домена).
2. Определение частоты остатков для каждого положения остатков в исследуемой последовательности домена (или его части) с получением консенсусного счета.
3. Прогнозирование на основании консенсусного счета стабильности белка-кандидата или исследуемого белка.
В соответствии с демонстративными направлениями реализации для повышения прогнозирующей силы консенсусного счета можно выполнить следующие необязательные действия.
1. Определение частоты остатков в каждом соответствующем положении в каждой последовательности набора сравнения (или его подмножества) с получением среднего счета.
2. Сравнение консенсусного счета со средним консенсусным счетом для определения счета последовательности.
3. Использование счета последовательности для прогнозирования стабильности белка-кандидата или исследуемого белка.
Этап 1. Получение набора сравнения.
Основанные на консенсусном подсчете способы изобретения используют набор последовательностей (набор сравнения), которые гомологичны (т.е. родственны) интересующей последовательности, или исследуемой последовательности. Набор сравнения может содержать группу гомологичных последовательностей, демонстрирующих от среднего до высокого сходства с исследуемой последовательностью.
Специалист может определить набор гомологичных последовательностей и включить в него достаточное количество не избыточных последовательностей. Набор гомологичных последовательностей не должен быть большим, главное получить разумно несмещенную выборку. Важно не число последовательностей, но отношение частот.
Такие последовательности можно получить гомологичным поиском в любой базе данных последовательностей, известных в уровне техники (например, базы данных ИСВ1, ТЮК). В примере реализации можно выполнить стандартный поиск ВЬЛБТ с параметрами по умолчанию и с исследуемой последовательностью, чтобы найти гомологичные интересующие последовательности. Для включения в набор сравнения можно выбрать последовательности с минимальным процентом идентичности (например, больше 25, 30, 35, 40, 45 или 50% идентичности, предпочтительно больше 30% идентичности). В соответствии с определенными аспектами последовательности с высокой степенью идентичности (например, больше 85, 90, 95 или 98%, предпочтительно больше 95%) исключают из набора сравнения, чтобы не допустить смещения.
В соответствии с определенными аспектами набор сравнения можно исправить, включив туда только последовательности, удовлетворяющие одному или больше критериев включения в набор. Например, в соответствии с определенными аспектами набор сравнения может содержать ортологичные последовательности (например, последовательности из различных видов (например, различных видов млекопитающих), но обладающие одной биохимической функцией). В соответствии с другими аспектами набор сравнения включает человеческие последовательности. В соответствии с примером реализации набор сравнения включает только зародышевые последовательности млекопитающих. В соответствии с предпочтительными аспектами набор сравнения включает последовательности белков того же класса укладки (например, из того же домена белков), что и исследуемый белок (например, белки с укладкой иммуноглобулинового типа). Такие белки можно идентифицировать способами биоинформатики, известными в уровне техники (например, выполнив поиск в базе данных консервативных доменов (Сопксгл'сб Домен Иа!аЬаке (СИИ) Национального института здравоохранения США).
Этап 2. Определение консенсусного счета исследуемой последовательности.
После того как последовательности набора сравнения скомпилированы, определяют консенсусную последовательность набора сравнения, это делается, чтобы облегчить консенсусный подсчет изобретения. Термин консенсусная последовательность означает последовательность, остатки в которой (на
- 39 015992 пример, аминокислотные остатки) в каждом положении соответствуют наболее распространенным остаткам в этом положении в выровненном наборе родственных последовательностей (т.е. в наборе сравнения).
Чтобы определить консенсусную последовательность, последовательности из набора сравнения необходимо сначала выровнять, воспользовавшись алгоритмами выравнивания последовательностей, известными в уровне техники. Предпочтительным неограничивающим примером алгоритма локального выравнивания, применяемым для сравнения последовательностей, является алгоритм каг1ш и Л115сйи1 (1990) Ρτοα №И. Αсаά. 8с1. υδΑ 87:2264-68, модифицированный, как описано в работе 1<аг1т и Α1ΐ8Λπ1 (1993) Ρτοα №!1. Αсаά. δα. υδΑ 90:5858-77. Такой алгоритм встроен в программу Β^ΑδТ (версию 2,0) авторов Α1ί8θΗϋ1, е! а1. (1990), 1. Μο1. Βίο1. 215:403-10. В соответствии с другим вариантом осуществления выравнивание оптимизируют, включив соответствующие пробелы, и процент идентичности определяют по длине выровненных последовательностей (т.е. выравнивание с пробелами). Чтобы получить выравнивание с пробелами для целей сравнения, можно воспользоваться Оарреб ΒΕΑδΈ как описано в работе Α1ΐ8Λπ1 е! а1. (1997), ШОею Ααάδ Яек. 25(17):3389-3402. В соответствии с другим вариантом осуществления выравнивание оптимизируют, включив соответствующие пробелы, и процент идентичности определяют по всей длине выровненных последовательностей (т.е. глобальное выравнивание). Предпочтительным, неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для глобального сравнения последовательностей, является алгоритм Μ\όιέ и Μί1^τ, СΑΒIΟδ (1989). Такой алгоритм входит в состав программы ΑΜΟΝ (версия 2,0), входящей в состав программного пакета выравнивания последовательностей ОСО. При использовании программы ΑΜΟΝ для сравнения последовательностей можно применять таблицу весовых остатков РАМ 120, значение параметра дар 1епд!й репа11у 12 и дар репайу (штраф за пропуск в последовательности) 4.
Чтобы определить консенсусную последовательность выровненного набора последовательностей, определяют наиболее часто встречающиеся остатки в каждом положении выровненного набора последовательностей. Консенсусную последовательность можно определить визуально, а можно анализом на компьютере с использованием публично доступной программы по биоинформатике (например, инструмент ΕΜΒΟδδ ί'ΌΝδ. доступный из Нейх δу8ΐет8 Национального института здравоохранения).
Консенсусную последовательность используют в способах изобретения для определения консенсусного счета. В соответствии с определенными аспектами консенсусный счет представляет собой численное значение, соотносящее частоту остатков или вхождение в набор сравнения консенсусного остатка в каждом аминокислотном положении консенсусной последовательности (т.е. частоту консенсусных остатков) и частоту остатков или вхождение в набор сравнения консенсусного остатка в каждом аминокислотном положении исследуемой последовательности (т.е. частоту исследуемых остатков). Частоты остатков в положении исследуемой или консенсусной последовательности рассчитывают, суммируя количество раз, которое аминокислота в этом положении присутствует в соответствующем положении выровненного набора сравнения, и разделив полученное значение на общее количество последовательно стей в наборе сравнения. В соответствии с примером реализации консенсусный счет (балл) по каждому аминокислотному положению определяют, разделив частоту остатков в исследуемой последовательности на частоту остатков в консенсусной последовательности и получив ненулевое значение больше 0, но не больше 1. Например, остатку, идентичному консенсусной аминокислоте в этом положении, назначают идеальный балл 1, но чем реже аминокислота встречается в этом положении, тем ближе балл к нулю.
В соответствии с предпочтительными аспектами консенсусный счет можно просуммировать по всем положениям исследуемой последовательности (или ее фрагмента) с получением общего консенсусного счета. Например, идеальным общим консенсусным счетом является количество аминокислотных остатков в исследуемой последовательности, показывая, что исследуемая последовательность идентична соответствующей консенсусной последовательности.
Пример формулы для расчета общего консенсусного счета белка представлен ниже
где с1(г) соответствует частоте консенсусных остатков в аминокислотном положении консенсусной последовательности;
й1(г) соответствует исследуемой частоте аминокислотного положения исследуемой последовательности;
соответствует количеству аминокислот в исследуемой последовательности.
Этап 3. Использование консенсусного счета для прогнозирования стабильности белка.
Консенсусный счет можно затем использовать для прогнозирования стабильности исследуемого белка. В целом, чем больше значение консенсусного счета, тем выше вероятность, что стабильность исследуемого белка будет адекватная его предполагаемому использованию. В соответствии с определенными аспектами консенсусный счет исследуемого белка можно сравнить с консенсусным счетом контрольной последовательности. В соответствии с одним примером реализации контрольная последовательность соответствует белку, о котором известно, что он обладает плохими или нежелательными свой
- 40 015992 ствами стабильности (здесь отрицательный контроль). Соответственно для исследуемого белка можно спрогнозировать улучшенную стабильность, если его консенсусный счет выше, чем у отрицательного контроля. В соответствии с одним примером реализации контрольная последовательность соответствует белку, о котором известно, что он обладает желательными свойствами стабильности (здесь положительный контроль). Соответственно для исследуемого белка можно спрогнозировать улучшенную стабильность, если его консенсусный счет в значительной степени одинаков или даже выше, чем у положительного контроля. В соответствии с другими аспектами консенсусный счет исследуемой последовательности можно сравнить с ее гипотетическим идеальным консенсусным счетом, т.е. значением, соответствующим общему числу аминокислотных остатков в исследуемой последовательности.
Этап 4. Определение среднего консенсусного счета набора сравнения.
В соответствии с определенными аспектами средние консенсусные счеты по некоторым или всем аминокислотным положениям последовательностей набора сравнения определяют для сравнения с консенсусным счетом по соответствующим положениям в исследуемой последовательности. В соответствии с предпочтительными аспектами средний общий консенсусный счет набора сравнения определяют для сравнения с общим консенсусным счетом исследуемой последовательности. Средний общий консенсусный счет набора сравнения представляет собой сумму частот остатков по всем аминокислотным положениям последовательности набора сравнения, деленную на общее количество последовательностей в этом наборе сравнения.
Этап 5. Определение счета последовательности.
В соответствии с определенными аспектами счет последовательности определяют, сравнивая средний консенсусный счет набора сравнения с консенсусным счетом исследуемой последовательности. Разница этих значений представляет собой счет последовательности исследуемой последовательности (также называемый Δ счетом). Счет последовательности можно определить, вычитая консенсусный счет из среднего консенсусного счета.
Этап 6. Использование счета последовательности для прогнозирования стабильности белка.
Счет последовательности является мерой отклонения консенсусного счета исследуемой последовательности от среднего консенсусного счета набора сравнения. Приводимые ниже примеры демонстрируют, что счет последовательности белка хорошо коррелирует с его стабильностью (например, термической стабильностью). Соответственно в соответствии с определенными аспектами счет последовательности также можно использовать для прогнозирования стабильности белка. Если Δ счет белка отрицателен (т.е. консенсусный счет ниже среднего консенсусного счета), то можно предположить, что интересующий белок будет обладать меньшей стабильностью, чем большая часть белков набора сравнения.
В соответствии с определенными аспектами используемые в способах изобретения исследуемые последовательности представляют собой однодоменные белки. Здесь термин однодоменный белок означает белок, состоящий из одного или более доменов, где все домены одного типа (например, вариабельные тяжелые домены - Ун).
В соответствии с другими аспектами используемые в способах изобретения исследуемые последовательности представляют собой полидоменные белки. Здесь термин полидоменный белок означает белок, состоящей из двух или более доменов, где по меньшей мере два домена относятся к разным типам. Например, антитела - белки, как правило, состоящие из шести доменов (т.е. Ун, Уь, Сь, Сн1, Сн3 и Сн3). В соответствии с предпочтительными аспектами стабильность наименее стабильного домена полидоменного белка можно спрогнозировать способами изобретения. Приводимые ниже примеры показывают, что способы изобретения особенно эффективны для прогнозирования термической стабильности, если в исследуемой последовательности используется наименее стабильный домен (или его фрагмент) полидоменного белка (например, домен Ун антитела).
Если наименее стабильный домен а рпоп неизвестен, его можно определить экспериментальными способами, известными в уровне техники (например, с использованием любого из описанных ниже способов, таких как дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК), температурно-зависимые круговой дихроизм (КД) или флуоресценция). Такие способы позволяют определить несколько переходов при термическом развертывании, где наименее стабильный домен либо развертывается первым (см. фиг. 94), либо ограничивает общий порог стабильности полидоменной единицы, которая развертывается кооперативно (т.е. у полидоменного белка, демонстрирующего единый переход развертывания). Наименее стабильный белок можно определить множеством дополнительных способов. Чтобы выяснить, какой домен ограничивает общую стабильность, можно использовать мутагенез. Кроме того, можно проверить сопротивляемость полидоменного белка действию протеаз в условиях, когда известно, что наименее стабильный домен, действительно, развертывается (это можно определить ДСК или другими спектроскопическими способами (Еоп!апа, е! а1., Ро1б. Эек., 2: К17-26, 1997). После того как наименее стабильный домен идентифицирован, кодирующую его (или его фрагмент) последовательность можно использовать как исследуемую последовательность в способах изобретения.
В соответствии с демонстративными направлениями реализации полидоменные белки, оцениваемые способами изобретения, представляют собой антитела. Способы изобретения позволяют специали
- 41 015992 сту исключить неправильные домены вариабельных областей из огромного разнообразия последовательностей вариабельных областей, создаваемых механизмами разнообразия иммунной системы. В соответствии с демонстративными направлениями реализации, например, молекула зсЕуз или молекулы антител, включающие домены вариабельных областей (Ρν) с относительно высокой стабильностью, можно идентифицировать способами изобретения и затем выбрать. В соответствии с другими примерами реализации домены вариабельной области иммуноглобулина человека (Ρν) с приемлемой стабильностью можно идентифицировать способами изобретения и затем выбрать в качестве цепей акцепторного иммуноглобулина при гуманизации антитела. В соответствии с другими примерами реализации способы изобретения можно использовать для просеивания вариабельных последовательностей сконструированных антител-кандидатов (например, гуманизированных последовательностей Уъ или Ун) по их стабильности до перехода к синтезу связывающей молекулы, включающей последовательность-кандидата.
Как известно в уровне техники, стабильность белков колеблется от одного антитела к другому и зависит от множества различных вариаций природных и сконструированных антител. Например, селективное давление иммунной системы по развитию разнообразия вариабельных доменов природных антител может негативно повлиять на их стабильность и свертываемость в рекомбинантных системах экспрессии (Кпарр1к и Р1иск111ип. Рго!ет Епдпд., 8: 81-89 (1995); ^а11 и Р1искШип, РгсЛет Епдпд, 12: 605-11 (1999); Кпарр1к е1 а1., 1. Мо1. Вю1., 296: 57-86 (2000); Е\уег( е1 а1., 1. Мо1. Вю1., 3325: 531-33 (2003)). Состоящие из одного изотипа и подкласса антитела (из которых чаще всего используют для терапии антителами человеческий Ι§61) различаются друг от друга по стабильности, в зависимости от различий в их вариабельных доменах, так как остальная часть их последовательностей идентична. Термическое развертывание фрагментов антител РаЬ преимущественно происходит в виде одного заметного перехода. Чаще всего, общая термостабильность РаЬ ограничивается областями Ρν антител, за исключением редких случаев, когда стабильность Ρν (или одного только Ун или Уъ) чрезвычайно мала или высока, и переход развертывания Ρν происходит отдельно от области Сн1/Съ (8ЫтЬа, е1 а1., 1995; КоШПкЬегдег е1 а1., 2005).
В соответствии с определенными аспектами способы изобретения используют последовательность вариабельных областей антитела в качестве исследуемой. В соответствии с предпочтительными аспектами способы изобретения используют тяжелую цепь вариабельных доменов (Ун) (или ее фрагмент) в качестве исследуемой последовательности. В примерах ниже показано, что Ун домен хорошо позволяет прогнозировать стабильность антитела, включающего указанный домен.
В соответствии с определенными аспектами исследуемая последовательность вариабельного домена сравнивается с набором сравнения, включающим или исключительно состоящим из последовательностей вариабельных доменов. Такие последовательности можно скомпилировать из базы данных Кэбата последовательностей иммуноглобулинов (КаЬа1 е1 а1., 0181г1Ьи(1оп Рйек ой 1Не ΕίΠΙι ЕбШоп ой 8ециепсе5 ой Рто1еш8 оГ [1птипо1ощса1 [тегез!, 1992). В соответствии с предпочтительными аспектами набор сравнения может содержать или состоять из последовательностей иммуноглобулинов человека.
В соответствии с другими предпочтительными аспектами набор сравнения может содержать или состоять исключительно из человеческих зародышевых последовательностей. В соответствии с одним вариантом осуществления набор сравнения включает последовательности вариабельных доменов из того же подкласса Кэбата последовательностей антител.
В соответствии с другими аспектами часть вариабельного домена (например, домена Ун) используется в способах изобретения в качестве исследуемой последовательности. Примером части вариабельного домена является последовательность, включающая меньше чем все последовательности каркасных областей или СОК вариабельной области (например, последовательность Ун, усеченную, чтобы удалить СЭЕ3 и РК4).
В соответствии с одним вариантом осуществления последовательности домена Ун входят в подкласс зародышевых последовательностей Ун1 по Кэбату. В соответствии с другим вариантом осуществления вариабельные последовательности домена входят в подкласс зародышевых последовательностей Ун2 по Кэбату. В соответствии с другим вариантом осуществления вариабельные последовательности домена входят в подкласс зародышевых последовательностей Ун3 по Кэбату. В соответствии с другим вариантом осуществления вариабельные последовательности домена входят в подкласс зародышевых последовательностей Ун4 по Кэбату. В соответствии с другим вариантом осуществления вариабельные последовательности домена входят в подкласс зародышевых последовательностей Ун5 по Кэбату. В соответствии с другим вариантом осуществления вариабельные последовательности домена входят в подкласс зародышевых последовательностей Ун7 по Кэбату.
Способы изобретения могут быть использованы совместно с белками, известными в уровне техники. В соответствии с одним вариантом осуществления белок представляет собой антитело или его фрагмент. В соответствии с определенными аспектами антитело - гуманизированное антитело. В соответствии с другими аспектами антитело - человеческое антитело. В соответствии с другими аспектами антитело - нечеловеческое антитело (например, мышиное моноклональное антитело). В соответствии с другими аспектами антитело - однодоменное антитело (например, верблюда, акулы, человека). В соответствии с дополнительными аспектами антитело является химерным. Другие примеры модифицированных антител для использования в способах изобретения включают антитела с удаленными доменами и биспецифич
- 42 015992 ные связывающие молекулы. Дополнительные примеры антител включают есЕу-включающие антитела и модифицированные антитела, описанные далее. В соответствии с предпочтительными аспектами стабильность упомянутых выше связывающих белков оценивается в способах изобретения по их вариабельной последовательности тяжелой цепи (или ее фрагментам) как исследуемая последовательность.
В соответствии с одним аспектом изобретения данные, полученные для данного полипептида, сохраняются и выводятся как характеристика стабильности полипептида. В соответствии с одним вариантом осуществления описанные здесь способы можно повторить для большого числа полипептидов. В соответствии с одним вариантом осуществления выбор полипептида может быть основан на полученных данных. В соответствии с другим вариантом осуществления отобранный полипептид можно сформулировать для терапевтического применения.
IV. Способы конструирования/изготовления белков с улучшенными биофизическими свойствами (например, стабильностью белка).
(a) Ковариационный дизайн.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретение включает способы конструирования вариантов белков с биофизическими свойствами, улучшенными по сравнению с родительской молекулой, от которых они получены, с использованием результатов ковариационного анализа. Известно множество способов конструирования белков, которые можно облегчить данными ковариационного анализа, включая, но не ограничиваясь, конструирование белков с улучшенной стабильностью, модификацию рН-профилей развертывания, стабильное устранение гликозилирования и изменение биохимической функции.
В соответствии с определенными аспектами изобретение относится к способам конструирования белков с улучшенной стабильностью, основанным на идентификации счетов ковариации (или самих ковариаций), которые позволяют спрогнозировать улучшенную или ухудшенную стабильность белков, в соответствии со способами из раздела III выше. Например, если в последовательности, принадлежащей интересующему белку, отсутствует или нарушены несколько ключевых ковариаций, это можно исправить способами конструирования белков. Можно включать также модификации, улучшающие рассчитанное количество сильных ковариаций, наблюдаемых в отдельной последовательности.
Для стабилизации доменов ВНА10 есЕу νΗ и ν4 разработано большое количество видов дизайна. В частности, результаты первоначального скрининга библиотеки двух доменов есЕу ВНА10 позволяют оценить возможности инструмента ковариационного анализа по дизайну стабильности белка. Первый пример включает успешное прогнозирование стабилизирующей мутации (846Ь) домена ВНА10 Ж, которая существенно улучшает термическую стабильность (ДТ50=+10°С), определенную способом анализа термической проверки. Мутация от 8ег к Ьеи в положении 46 по системе нумерации Кэбата ведет к положительному соединению с существующим Туг в положении 36, который по данным инструмента сильно коварьирует с Ьеи 46 (фиг. 104). Вторым примером применения инструмента ковариационного анализа является аналитическое решение проблемы негативных эффектов мутации ВНА10 νΗ О6Е. Анализ частоты одиночных остатков показал, что мутация в этом положении на значительно более часто встречающийся С1и приведет к повышению стабильности белка. Однако по данным инструмента ковариационного анализа одиночная мутация на О1и нарушает несколько существующих ковариаций последовательности ВНА10 νΗ. Для улучшения стабильности следует заменить несколько аминокислот, предпочтительно стабилизирующих О1и в этом положении.
Другой пример прогнозирующей значимости инструмента ковариационного анализа показан на фиг. 105. Как часть процесса конструирования библиотеки по одному остатку, Ме1 80 мутировали в Ьеи. Полагали, что эта мутация окажется высокостабилизирующей, так как Ьеи представляет собой аминокислоту, чаще всего наблюдающуюся в этом положении в базе данных последовательностей. Однако ковариационный анализ показал, что для гармоничной ковариаций необходимо мутировать две другие аминокислоты (ν67Ε и Т708).
(b) Дизайн области контакта.
В соответствии с другими аспектами изобретение представляет способы усиления биофизического свойства (например, стабильности белка) у второго белка или белка-кандидата (например, антитела), используя при этом первый белок как белок-образец для рационального дизайна.
Термин белок-образец здесь означает белок с требуемым биофизическим свойством (например, высокой термической стабильностью), который используется для моделирования того же самого свойства у второго белка, для которого улучшение этого биофизического свойства также желательно. В соответствии с предпочтительными аспектами белок-образец относится к тому же структурному классу, что и второй белок (например, если второй белок является антителом, то белком-образцом также будет антитело).
В соответствии с определенными аспектами белок-образец можно определить как обладающий биофизическим свойством (например, растворимостью), желательным в соответствии со способом изобретения. В соответствии с одним примером реализации белок-образец с желательными свойствами стабильности можно выделить в группе белков (такой как ВПВ1-4 из табл. 20, ниже) экспериментальными способами, такими как описаны в примере 15. Этот белок-образец будет затем использоваться как плат
- 43 015992 форма последовательности для дизайна. В соответствии с одним примером реализации описанный здесь способ ковариационного анализа позволяет спрогнозировать в белке-образце улучшенное биофизическое свойство (например, стабильность белка). В соответствии с другими примерами реализации описанный здесь способ консенсусного счета позволяет показать, что белок-образец является желательным белком (например, стабилизированным белком). В соответствии с еще одним примером реализации белокобразец идентифицируется способами скрининга изобретения.
В соответствии с другими аспектами белок-образец конструируют в соответствии со способом изобретения. В соответствии с примером реализации белок-образец конструируют так, чтобы он отличался улучшенным биофизическим свойством (например, улучшенной стабильностью), делая это с помощью ковариационного способа изобретения. В соответствии с еще одним примером реализации белок-образец конструируют так, чтобы он отличался улучшенным биофизическим свойством, делая это с помощью способа подсчета консенсуса.
Способы настоящего изобретения включают следующие этапы:
(1) получение структурных моделей белка-образца и белка-кандидата;
(2) идентификация остатков в белке-образце, важных для стабильности; и (3) замена остатков в белке-кандидате, которые соответствуют существенным остаткам в белкеобразце.
В соответствии с одним вариантом осуществления структурная модель образца белка представляет собой кристаллическую структуру (например, полученную с помощью рентгеновского излучения), и белок-кандидат моделируется способом гомологичного моделирования с использованием структурной модели образца белка. В соответствии с другим вариантом осуществления важным остатком является остаток области контакта Ун/Уь. Здесь термин остаток области контакта означает остаток, участвующий в домен-доменном взаимодействии внутри белка или между белками.
Предпочтительно остатки области контакта располагаются на границе, т.е. в области контакта между двумя доменами белков и вносят вклад в поверхность по меньшей мере одного домена (предпочтительно обоих). Остатки, на которых расходуется значительно больше площади поверхности области контакта, чем на другие, т.е. такие остатки, которые не предъявляют значительную часть своей поверхности свернутой части белка, считаются более важными для стабильности белка. Площадь поверхности, которую каждый остаток занимает на области контакта, можно определить признаваемыми в уровне техники способами (например, анализом с помощью программного обеспечения МОЬМОЬ). В соответствии с определенными аспектами остатки области контакта занимают по меньшей мере 10 А2 площади поверхности (например, 10 А2, 15 А2, 20 А2, 25 А2 или больше).
Остатки белка-кандидата, локализованные в аминокислотных положениях, соответствующих положениям важных остатков (например, остатки на области контакта) белка-образца, предпочтительно замещаются, если они не идентичного типа. В соответствии с определенными аспектами делаются только неконсервативные замены. В соответствии с другими аспектами делаются только консервативные замены.
В соответствии с демонстративными направлениями реализации образец и белок-кандидат представляют собой связывающие молекулы (например, антитела или их варианты (например, молекула 8сРу)). В соответствии с одним вариантом осуществления изучаемая область контакта расположена между доменом Рс (например, петля, Сн3 и Сн3) и другим доменом Рс. В соответствии с другим вариантом осуществления область контакта располагается между Ун доменом и Уъ доменом.
В соответствии с предпочтительными аспектами конструирование сосредоточено на области контакта между доменами Ун и Уъ антитела. Биофизические данные (см. данные ДСК - пример 15) позволяют предположить, что сродство доменов Ун и Уь друг к другу маргинально для формата зсРу (т.е. в отсутствие доменов РаЬ Сн1 и Сь). В особенности, взаимодействия Ун и Уъ не всегда достаточно сильны (т.е. у них недостаточно сродства, чтобы привести к образованию совместно свернутого единого объекта). Это означает, что улучшение стабильности области контакта Ун/Уъ (т.е. возрастание сродства между доменами Ун и Уъ) может быть предпочтительным маршрутом усиления стабильности антитело/зсРу.
Стабилизируя область контакта, можно превратить переходы свертывания антитела в единое событие, повысить сродство доменов друг к другу и допустить менее динамичные флуктуации, которые могут привести к экспонированию площади гидрофобной поверхности (как наблюдалось в экспериментах по связыванию ΑΝ8).
В соответствии с другими аспектами результаты конструирования можно валидировать с помощью способа дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), который дает специалисту возможность неколичественно наблюдать реальное возрастание сродства между Ун и Уь.
(с) Объединение ковариаций и конструирования области контакта.
В соответствии с другими аспектами изобретения два или больше описанных здесь инструментов дизайна, основанного на последовательностях, можно использовать для конструирования оптимизированных вариантов белков. В соответствии с одним демонстративным направлением реализации изобретения способ конструирования области контакта используется совместно с ковариационным анализом для определения остатков и их положений, важных для структуры и функции белков, включая, напри
- 44 015992 мер, стабильность. В соответствии с одним примером реализации ковариационный анализ позволяет определить остатки или их положения вне области контакта (например, называемые поддерживающие остатки), которые не взаимодействуют физически с остатками области контакта противоположного домена и не вносят вклад в область области контакта, но тем не менее важны для создания правильного структурного контекста остатков области контакта. Например, можно провести ковариационный анализ остатков, локализованных на поверхности, чтобы найти поддерживающие остатки, коварьирующие с остатками области контакта. Предпочтительно для ковариационного анализа отбирать остатки области контакта, занимающие значительную часть площади поверхности (например, остатки, занимающие по меньшей мере 40 А2 площади). Поддерживающие остатки, коварьирующие с отобранными остатками области контакта, можно затем определить ковариационными способами изобретения. Предпочтительно отбирать поддерживающие остатки, коварьирующие сильно (например, значение фи не меньше 0,25). В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления поддерживающие остатки отбирают, если они коварьируют по меньшей мере с двумя остатками области контакта (например, с 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше остатков). Чем больше количество ковариаций, тем больший ковариационный счет можно назначить поддерживающему остатку, так как число ковариаций позволяет спрогнозировать вклад, вносимый поддерживающим остатком для стабилизации области контакта Ун/Уь.
Способы этого аспекта изобретения включают следующие этапы:
(1) получение структурной модели белка-образца и белка-кандидата;
(2) идентификация остатков области контакта (например, Ун/Уь) белка-образца, важных для стабильности;
(3) идентификация поддерживающих остатков, коварьирующих с остатками области контакта этапа (2), например, с использованием описанного здесь инструмента ковариационного анализа;
(4) замещение одного или более остатков области контакта или поддерживающих остатков белкакандидата на соответствующие остатки или поддерживающие остатки, идентифицированные на этапах (2) и (3).
Остатки белка-кандидата, локализованные в аминокислотных положениях, соответствующих положениям наиболее важных остатков (например, остатков области контакта или поддерживающих) образца белка, предпочтительно замещаются, если только они не идентичного типа. В соответствии с определенными аспектами делаются только неконсервативные замены. В соответствии с другими аспектами делаются только консервативные замены.
В соответствии с одним аспектом изобретения улучшенную последовательность данного белка сохраняют или выводят на внешнее устройство. В соответствии с другим вариантом осуществления отобранный полипептид можно сформулировать для терапевтического применения.
У. Системы, области контакта и компьютерные способы.
Один аспект изобретения относится к способам (например, реализованным на компьютере), устройствам и программному обеспечению для реализации способов изобретения, связанных с отбором или дизайном.
В соответствии с демонстративными направлениями реализации изобретение относится к компьютерному способу и устройству для идентификации аминокислотных остатков (например, коварьирующих аминокислотных остатков) в последовательности-кандидате. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретение относится к компьютерным способам и устройству для ранжирования одной или более исследуемых последовательностей или последовательностей-кандидатов на основании их счета (например, консенсусного счета или ковариационного счета), который позволяет спрогнозировать биофизическое свойство (например, стабильность белка, его каталитическую активность, терапевтическую активность, сопротивляемость патогенам или токсинам, токсичность и т.д.).
Аспекты компьютерных способов можно описать следующей последовательностью операций: (а) получение данных (например, данных последовательности или структурных), характеризующих набор последовательностей и исследуемую последовательность; (Ь) вычисление счета на основании этих данных (например, счета ковариации или консенсусного счета); (с) ранжирование счета с целью идентификации одной или больше интересующих последовательностей или аминокислотных остатков.
В соответствии с некоторыми аспектами счета ранжируют, чтобы определить один или больше аминокислотных остатков, которые надо зафиксировать и сохранить в исследуемой последовательности или последовательности-кандидате. В соответствии с другими аспектами счеты ранжируют, чтобы определить один или больше аминокислотных остатков, которые будут кандидатами на замену. В соответствии с примером реализации компьютерные способы ранжируют положения остатков (или конкретных остатков в определенных положениях) в порядке счета ковариации. В соответствии с другим примером реализации компьютерные способы ранжируют последовательности-кандидаты в порядке их консенсусного счета.
Еще один аспект изобретения относится к устройствам и носителям информации с программными командами и/или данными для реализации описанных здесь способов. Часто программные команды представляют собой код для выполнения операций определенных способов. Данные, если они нужны для реализации свойств настоящего изобретения, могут быть предоставлены в виде структур данных, таблиц
- 45 015992 базы данных, объектов данных и других соответствующих форм объединения указанной информации. Любой способ и систему изобретения можно представить, полностью или частично, в виде таких программируемых инструкций и/или данных на носителе, предназначенном для чтения на компьютере.
Компьютерные способы изобретения могут включать устройство вывода, отображающее информацию пользователю (например, дисплей СВТ, Л-СО. принтер, коммуникационное устройство, такое как модем, аудиовыход и т.д.). Кроме того, инструкции (например, алгоритмы) по выполнению расчетов, частично или полностью, можно сохранять, частично или полностью, на носителе, пригодном для использования в электронном устройстве для выполнения инструкций. Так, способы изобретения применимы как к программному обеспечению, реализующему высокопроизводительный подход (например, к инструкциям, читаемым компьютером), так и к соответствующему оборудованию (например, компьютеры, роботы и чипы). Реализуемый на компьютере процесс не ограничивается конкретной компьютерной платформой, конкретным процессором или конкретным языком программирования высокого уровня.
В соответствии с определенными аспектами расчеты, используемые в способах изобретения, выполняются компьютерным алгоритмом, подходящим для использования с языком программирования на компьютере (например, РЕВЬ). В соответствии с демонстративными направлениями реализации компьютерный алгоритм предназначен для распознавания (ί) выравнивания последовательностей набора сравнения и/или (ίί) одной или больше исследуемых последовательностей, поступаемых на вход алгоритма.
(ί) Компьютерная реализация консенсусного подсчета.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретение относится к способам, реализованным на компьютере, к устройствам и программному обеспечению для выполнения описанного выше компьютерного подсчета консенсуса с использованием компьютерного алгоритма. В соответствии с демонстративными направлениями реализации алгоритм предназначен для выполнения одного или больше следующих действий: (1) представление каждого положения остатка в выравнивании в виде столбца и подсчет консенсусной частоты остатков в этом положении; (2) расчет частоты исследуемых остатков для каждого положения остатка в исследуемой последовательности (последовательностях) и (3) деление частоты остатков в исследуемой последовательности на консенсусную частоту остатков с получением консенсусного счета; и/или (4) суммирование консенсусного счета в каждом положении с получением общего консенсусного счета. В соответствии с другими аспектами алгоритм можно спроектировать на выполнение одного или больше следующих действий: (5) расчет среднего консенсусного счета набора сравнения и/или (6) счета последовательности для исследуемой последовательности.
Эти аспекты изобретения реализованы также в системе для осуществления способа консенсусного подсчета изобретения. Система включает (а) компьютер, который включает базу данных, способную вместить в себя по меньшей мере одну популяцию наборов сравнения, и (Ь) системное программное обеспечение. Последнее включает одну или более логических команд по осуществлению любого из этапов (1)-(6) компьютерного способа подсчета консенсуса.
Изобретение относится также к компьютерному программному продукту для выполнения способа консенсусного подсчета изобретения. Этот продукт включает читаемый на компьютере носитель информации, включающий одну или более логическую команду для выполнения этапов (1)-(6).
(ίί) Компьютерная реализация ковариационного анализа.
Еще один аспект изобретения относится к компьютерной реализации способов проведения описанного ковариационного анализа изобретения с использованием компьютерного алгоритма. В соответствии с демонстративными направлениями реализации алгоритм предназначен для выполнения одного или более следующих действий: (1) представление каждого положения остатка в выравнивании в виде столбца; (2) объединение столбцов в матрицу; (3) расчет корреляции между различными столбцами матрицы с получением фактора корреляции (согге1а!1уе !егт); (4) прибавление факторов корреляции к линейным факторам, которые соответствуют аминокислотным остаткам с целью генерации расширенной матрицы прогнозирования; (5) генерация эвристической модели (например, скрытой модели Маркова) из расширенной матрицы прогнозирования с целью идентификации важных корреляций.
Эти аспекты изобретения реализуются также в системе для выполнения способа ковариационного анализа изобретения. Система включает (а) компьютер, который включает базу данных, способную вместить в себя по меньшей мере одну популяцию библиотек символьных строк, и (Ь) системное программное обеспечение. Последнее включает одну или более логических инструкций по проведению любого из этапов (1)-(5) компьютерного способа подсчета ковариаций.
Изобретение относится также к компьютерному программному продукту для проведения ковариационного анализа изобретения. Этот продукт включает читаемый на компьютере носитель информации, включающий одну или более логическую инструкцию для выполнения этапов (1)-(5).
(ш) Графический интерфейс пользователя для ковариационного анализа.
В соответствии с некоторыми примерами аспектов изобретение относится к новому графическому интерфейсу пользователя (СИ1), используемому совместно с ковариационными способами изобретения. Этот инструмент ковариационного анализа, называемый NΑРМΑР, помогает пользователю визуализировать ковариации в контексте выровненного набора последовательностей. Новый графический интерфейс пользователя реализован на компьютере на языке программирования, признанном в уровне техники (на
- 46 015992 пример, на ίηνη 1.4.2 с библиотекой обработки из файла ргоСеккшд.огд).
(a) Структура сетки.
В соответствии с одним вариантом осуществления графический пользовательский интерфейс изобретения включает графическую картину выравнивания (например, выравнивания последовательностей, созданного в соответствии с описанными здесь способами изобретения) и соответствующие ему данные. Простой формой такого интерфейса является сетчатая структура. Термин сетчатая структура (также известный как платформа выравнивания) обозначает здесь матрицу, в которой представлены свойства выравнивания. В соответствии с одним вариантом осуществления сетчатая структура графически представляет положения остатков последовательностей в выравнивании. В соответствии с другим вариантом осуществления она графически представляет типы остатков последовательностей в выравнивании. В соответствии с другим вариантом осуществления она графически представляет частоты типов остатков (или частоты использования остатков) в выравнивании. В соответствии с другими аспектами она представляет одно или больше свойств остатков в выравнивании (например, гидрофобность, заряд, размер, рКа и т.д.).
В соответствии с демонстративными направлениями реализации сетчатая структура включает репрезентативный вывод на экран: (1) непрерывных положений остатков, соответствующих последовательности выравнивания; и (ίί) частоты использования остатков для типов остатков в каждом положении остатков в последовательности выравнивания. В соответствии с одним вариантом осуществления частоты использования остатков изображают символически (например, кружками или квадратиками). В соответствии с другими аспектами представлены все 20 природных аминокислот, пробелы и избыточные остатки. В соответствии с определенными аспектами положения остатков выводятся в строках, а частоты их использования в столбцах. В соответствии с определенными аспектами положения остатков положения остатков выводятся в столбцах, а частоты их использования в строках.
В соответствии с одним вариантом осуществления частота использования остатка коррелирует (например, положительно или отрицательно) с размером символа (например, размером кружка), так что более консервативные остатки можно визуально отделить от наблюдаемых реже. Например, частоты остатков можно представить в виде кружков различных размеров, причем площади кружков пропорциональны частоте использования соответствующих остатков. Радиус каждого кружка ® для рисования узла с можно определить по следующей формуле (1У):
(Та (ίν) где А - требуемая площадь поверхности всех узлов;
N - число последовательностей, использующих этот остаток;
М - среднее количество последовательностей, использующих каждый остаток.
В соответствии с примером реализации структура сетки составляет матрицу непрерывных столбцов и строк, где (ί) сплошные столбцы графически представляют соответствующие сплошные положения остатков в выравнивании; (ίί) каждая сплошная строка графически представляет специфичный тип аминокислот и (ίίί) частота использования остатков в каждом положении графически представлена в ячейках матрицы. Предпочтительно, если все типы остатков (например, все 20 аминокислот и/или возможные пробелы) представлены отдельной строкой в структуре сетки. Более предпочтительно, если частоты использования остатков в каждом положении выравнивания графически представлены в ячейках матрицы символом (например, кружком), размер которого коррелирует (например, положительно коррелирует) с частотой использования остатков.
Пример сетчатой структуры представлен на фиг. 102.
(b) Наложение ковариаций.
В соответствии с другими аспектами графический пользовательский интерфейс изобретения включает графическое изображение одной или более ковариаций (например, ковариаций, идентифицированных в соответствии с описанными здесь способами изобретения) и соответствующих им данных.
В соответствии с определенными аспектами графический интерфейс пользователя настоящего изобретения включает графическое изображение как (ί) структуры сетки, так и (ίί) одной или более ковариаций. В соответствии с этими аспектами структура сетки может служить платформой выравнивания для отображения данных ковариации. Данные ковариации можно показать, например, накладывая их на сетчатую структуру. Организованные таким образом данные ковариации называются ковариационным наложением. Например, ковариации можно показывать в наложении в виде линий или сетки линий, соединяющих две или больше коварьирующие аминокислоты, которые графически отображаются в структуре сетки.
Линии наложения ковариаций могут быть различной толщины (например, тонкие линии и столбики) или непрерывности (например, пунктирная или твердая, сплошная или рваная), главное, чтобы соединение между двумя или более коварьирующими аминокислотами было бы очевидно пользователю (см., например, фиг. 103, где ковариации изображены в виде полупрозрачных столбиков, соединяющих
- 47 015992 две коварьирующие аминокислоты). В соответствии с демонстративными направлениями реализации графическое представление ковариаций может также представлять ее статистическую значимость (например, значения φ или χ2). В соответствии с одним примером реализации толщина линии в ковариационном наложении может быть пропорциональна статистической значимости ковариации. Например, толщина линии ковариационного наложения может быть нарисована в такой пропорции к значению φ, которую можно рассчитать по формуле (ν)
где - толщина линии;
Ф - фи (коэффициент корреляции);
N - увеличивающий множитель;
М - максимальная толщина линии.
В соответствии с другим примером реализации положительные и отрицательные ковариации можно графически отделить друг от друга (например, различным цветом линий или различной толщиной). В соответствии с другими примерами реализации пользователю показывают только ковариации выше определенного порогового уровня статистической значимости. Например, в соответствии с определенными аспектами, для просмотра ковариации только желательной силы можно использовать критерии отсечения по значению φ.
(с) Следы последовательностей.
В соответствии с другими дополнительными аспектами графический пользовательский интерфейс включает графическое изображение интересующей последовательности в помощь возможным усилиям по дизайну белков. Интересующая последовательность может быть исследуемой последовательностью или последовательностью-кандидатом (т.е. последовательностью ввода), или она может быть последовательностью, в которой интегрированы желательные ковариации (т.е. последовательностью вывода). Интересующая последовательность может быть графически представлена в виде линии.
В соответствии с одним вариантом осуществления графический интерфейс включает как (ί) отображение интересующей последовательности; так и (ίί) структуру сетки (например, интересующую последовательность, наложенную на структуру сетки). В соответствии с другим вариантом осуществления графический интерфейс включает как (ί) отображение интересующей последовательности; так и (ίί) наложение ковариаций (например, интересующую последовательность, наложенную на структуру ковариаций). В соответствии с другими аспектами графический интерфейс включает (ί) отображение интересующей последовательности; (ίί) наложение ковариаций и (ίίί) структуру сетки (например, интересующую последовательность, наложенную (например, трассированную) на структуру ковариаций, которая, в свою очередь, наложена на структуру сетки). Интересующая последовательность может быть показана в виде структуры сетки, например в виде кривой, соединяющей соседние аминокислоты, которые графически показаны в структуре сетки. Показанная таким способом интересующая последовательность называется следом последовательности.
В соответствии с предпочтительными аспектами след последовательности может проходить только через одну ячейку (или графическую репрезентацию типа аминокислоты) для конкретной строки или столбца структуры сетки, которые представляют положение конкретного остатка. Более предпочтительно, если след последовательности проходит через ячейку, графически представляющую тип остатка в конкретном положении интересующей последовательности. След последовательности может проходить через каждую ячейку структуры сетки, которые представляют остаток в интересующей последовательности, и может проходить только через ячейки, представляющие часть интересующей последовательности. Пример следа интересующей последовательности показан на фиг. 103. Отображенные там следы последовательностей (сплайновые кривые типа са!ти11-гот крБпек) нарисованы с помощью функции Безье. Если даны два узла и надо нарисовать кривую Безье перехода последовательности, то предыдущий и следующий узлы пары используются как якорные точки, а сами два узла используются как первая и вторая контрольные точки. Для узлов в первом столбце (представляющих первые остатки аминокислотной последовательности) первая контрольная точка удваивается, чтобы играть также роль якорной точки; для узлов в последнем столбце вторая контрольная точка удваивается, чтобы играть также роль якорной точки.
В соответствии с предпочтительными аспектами график следа последовательности делают интерактивным и открытым для манипуляций со стороны пользователей. Например, структуру сетки можно сделать интерактивной. В соответствии с одним вариантом осуществления избранным ячейкам можно назначать конкретное состояние выбора (например, положительное, нейтральное или отрицательное состояния). В соответствии с одним примером реализации ячейку, представляющую конкретный остаток, можно положительно выбрать, так чтобы провести след последовательности через нее. Например, если ячейка положительно отобрана пользователем, для всех интересующих последовательностей (например, для всех последовательностей внутри набора сравнения или выравнивания) можно сгенерировать несколько следов, использующих остаток, представленный положительно выбранной ячейкой. В соответствии с альтернативным направлением реализации ячейку, представляющую конкретный остаток, можно
- 48 015992 выбрать отрицательно, так чтобы след последовательности не проходил через нее. Соответственно для всех интересующих последовательностей (например, для всех последовательностей внутри набора сравнения или выравнивания) можно сгенерировать несколько следов, которые исключают остаток, представленный отрицательно выбранной ячейкой.
Можно графически отобразить несколько интересующих последовательностей, если только их сможет различить пользователь (например, используя различную толщину линий или их тип). Например, чтобы сравнить различные выравнивания последовательностей, следы последовательностей, представляющие несколько интересующих последовательностей из двух или более выравниваний, можно наложить на структуру ячейки (например, изобразив их различными цветами, предпочтительно противоположными цветами), визуализировав различное использование остатков в глобальном масштабе.
(б) Режимы вывода на экран.
Графический интерфейс пользователя может облегчить любую признанную в уровне техники функциональность. Например, в соответствии с определенными аспектами графический интерфейс пользователя обеспечивает прокрутку и зум различных фрагментов структуры сетки. Например, можно изменить размер окна просмотра структуры ячейки в зависимости от разрешения экрана компьютера пользователя, можно увеличивать или уменьшать масштаб изображения и прокручивать изображение выравнивания, которое первоначально не укладывается в окно просмотра.
В соответствии с предпочтительными аспектами используется маскировка данных, например, чтобы подчеркнуть наиболее важные ковариационные пары и/или сети из нескольких пар. Графический интерфейс пользователя изобретения может использовать один или несколько режимов просмотра ковариаций (например, статистически значимых ковариаций). Предпочтительно указанные режимы просмотра доступны в интерактивном графике при просмотре следа интересующей последовательности. В качестве примеров можно привести следующие режимы просмотра:
Режим № 1: показаны только ковариации между остатками, которые также присутствуют в интересующей последовательности. Можно рассматривать эти ковариации в контексте гипотетического взаимодействия между остатками (например, обнаруживаемых в результате статистического анализа частоты пар остатков), которое удерживает соответствующую молекулу белка вместе и может быть важно для ее функционирования.
Режим № 2: показаны только ковариации между парами остатков, у которых только один остаток из пары присутствует в интересующей последовательности. Эти ковариации отражают взаимодейстие между остатками, которое консервативно, но отсутствует в интересующей последовательности, и отсутствие которой может ухудшить стабильность белка. Этот режим особенно предпочтителен, когда для конструирования белка используется инструмент анализа ковариации (см. раздел ГУ выше).
Режим № 3: показаны только ковариации между парами остатков, у которых ни одна аминокислота из пары не присутствует в интересующей последовательности.
В соответствии с определенными аспектами все режимы просмотра могут быть показаны пользователю, но каждый в уникальном формате просмотра. В соответствии с другим вариантом осуществления все режимы просмотра выводятся по отдельности (например, в отдельных окнах просмотра).
На фиг. 120 показан пример среды, подходящей для практической реализации аспекта изобретения. Компьютеризированное устройство 8900 поддерживает первоначальный процесс сбора последовательности 8902 и средства анализа 8904. В качестве компьютеризированного устройства 8900 может использоваться рабочая станция, сервер, настольный компьютер, мэйнфрейм, РОА или другое вычислительное устройство с одним или несколькими процессорами, поддерживающее первоначальный процесс сбора последовательности 8902 и средства анализа 8904. Компьютеризированное устройство 8900 может представлять собой один процессор или несколько процессоров, а каждый процессор может содержать одно или несколько ядер. Средства анализа 8904 реализованы программно, они анализируют ковариации между парами остатков выравнивания с целью получения данных ковариации. Компьютеризированное устройство 8900 взаимодействует и выводит данные на дисплей вывода 8910. Дисплей вывода 8910 отображает графическую область контакта пользователя (6ИГ) 8912, генерируемую средствами анализа 8904. 6иГ 8912 может содержать структуру сетки 8914 и наложение ковариаций 8916. Компьютеризированное устройство 8900 может также взаимодействовать с сетью 8920, включающей одно или больше мест хранения 8930 и 8940, которые соответственно содержат данные о последовательностях 8932 и 8942. Первоначальный процесс сбора последовательности 8902 программно отбирает последовательности-кандидаты из данных о последовательностях 8932 и 8942 на основании введенных пользователем и/или определенных заранее параметров. Извлеченные данные анализируются средствами анализа 8904. Специалист понимает, что, хотя первоначальный процесс сбора последовательности 8902 и средства анализа 8904 показаны на фиг. 120 по отдельности, их можно реализовать как части интегрированного приложения, процесса или подключаемой программы. Аналогично, необходимо понимать, что первоначальный процесс сбора последовательности 8902 и средства анализа 8904 могут и по отдельности представлять собой задачу, поток, процесс, приложение или подключаемую программу. Компьютеризированное устройство 8900 может взимодействовать по сети 8920 с местами хранения 8930 и 8940 с помощью различных сред и конфигураций. Например, сеть 8920 можно организовать в виде локальной сети (^АN), глобальной
- 49 015992 сети (\ΆΝ), сети интранет, Интернет и/или беспроводной сети, телефонной линии или сети другого типа, позволяющей компьютеризированному устройству 8900 взаимодействовать с местами хранения 8930 и 8940. Места хранения 8930 и 8940 могут представлять собой базы данных или структуры данных хранения другого типа, устанавливаемые на компьютеризированных устройствах и доступные по сети 8920. Следует отметить, что, хотя компоненты настоящего изобретения отображены на фиг. 120 в виде отдельной конфигурации, в области настоящего изобретения возможны и другие конфигурации. Например, первоначальный процесс сбора последовательности 8902 и средства анализа 8904 могут располагаться на различных компьютеризированных устройствах, и/или данные последовательностей 8932 и 8942 могут храниться в одной или более баз данных на компьютеризированном устройстве 8900.
Фиг. 121 представляет собой пример блок-схемы серии этапов, которые могут сопровождаться аспектом изобретения с целью определения счета ковариации последовательности, используемого как характеристика стабильности белка. Серия начинается с того, что первоначальный процесс сбора последовательности 8902 создает выравнивание исправленного набора последовательностей, соответствующих укладке Ιβ полипептида (этап 9000).
Затем средства анализа 8904 рассчитывают ковариацию между остатками последовательностей выравнивания, как описано здесь, и генерируют данные ковариации (этап 9002). Средства анализа 8904 используют данные ковариации для определения счета ковариации последовательностей применительно к последовательности-кандидату из ковариации данных ковариации (этап 9004). Полученный счет ковариации последовательностей представляет собой индикатор для измерения стабильности полипептида и может сохраняться и/или выводиться пользователю посредством СШ 8912 или другим способом (этап 9006).
Как уже упоминалось выше, средства анализа 8904 могут использоваться для определения консенсусного счета. Фиг. 122 представляет собой пример блок-схемы серии этапов, которые могут использоваться аспектом изобретения с целью определения и использования консенсусного счета для прогнозирования стабильности белка-кандидата. Серия начинается с того, что первоначальный процесс сбора последовательности 8902 создает набор сравнения последовательностей, соответствующих последовательности исследуемого домена белка-кандидата (этап 9100). Затем средства анализа 8904 определяют частоты остатков в аминокислотных положениях последовательности исследуемого домена с целью получения консенсусного счета (этап 9102). Полученный консенсусный счет можно затем сохранить и/или вывести пользователю с целью прогнозирования стабильности белка-кандидата (этап 9104).
Средства анализа 8904 могут использоваться для определения среднего консенсусного счета. Фиг. 123 представляет собой пример блок-схемы серии этапов, которые могут использоваться аспектом изобретения с целью определения и использования среднего консенсусного счета, используемого как характеристика стабильности белка. Серия начинается с того, что первоначальный процесс сбора последовательности 8902 создает набор сравнения последовательностей, соответствующих последовательности исследуемого домена белка-кандидата (этап 9200). Затем средства анализа 8904 определяют частоты остатков в аминокислотных положениях последовательности исследуемого домена с целью получения консенсусного счета (этап 9202). Кроме того, средства анализа 8904 определяют частоты остатков в последовательности набора сравнения с целью получения среднего консенсусного счета (этап 9204). Консенсусный счет сравнивается со средним консенсусным счетом для определения счета последовательности (этап 9206), а затем полученный счет последовательности можно сохранить и/или вывести пользователю с целью прогнозирования стабильности белка-кандидата (этап 9206).
Фиг. 124 представляет собой пример блок-схемы серии этапов, которые могут использоваться аспектом изобретения с целью идентификации и замены аминокислотных остатков, не удовлетворяющих ковариации с коварьирующими остатками в соответствующих положениях выравнивания с целью определения улучшенной аминокислотной последовательности полипептида. Серия начинается с того, что первоначальный процесс сбора последовательности 8902 создает выравнивание исправленного набора сравнения последовательностей, соответствующих укладке Ιβ полипептида (этап 9300). Затем средства анализа 8904 рассчитывают ковариацию между остатками последовательности выравнивания с целью идентификации коварьирующих остатков (этап 9302). Средства анализа 8904 могут обнаружить конкретный остаток полипептида, который не может удовлетворить ковариации и может замещать коварьирующий остаток в соответствующем положении выравнивания (этап 9304) с целью улучшения последовательности полипептида. Улучшенную последовательность можно сохранить или вывести пользователю (этап 9306).
Настоящее изобретение может быть реализовано в виде одной или более читаемых на компьютере программ, сохраняемых на одном или больше носителей. Носители могут представлять собой дискету, жесткий диск, компакт-диск, цифровой двусторонний диск, карту памяти, РВОМ, МВАМ, ВАМ, ВОМ или магнитную ленту. В целом компьютерные программы могут быть реализованы на любом языке программирования. Некоторые примеры возможных языков включают ЕОВТВАН С, С++, С#, Рубюн или 1ауа. Программы можно сохранять на или в одном или нескольких носителей в виде объектного кода. Можно использовать устройствное ускорение, а также весь код или его части могут работать на ЕРСА, А8ГР или А8Ю Код может выполняться также в виртуальном окружении, например на виртуальной ма
- 50 015992 шине. На одном процессоре может находиться несколько виртуальных машин с выполняющимся кодом.
VI. Способы оценки стабильности белков.
Свойства стабильности композиций изобретения можно анализировать с использованием способов, известных в уровне техники. Можно использовать характеристики стабильности, принятые в уровне техники. Примеры параметров подробно описаны ниже. В соответствии с демонстративными направлениями реализации оценивают термическую стабильность. В соответствии с предпочтительными аспектами оценивают уровни экспрессии белков (например, выраженные как % выхода) композиций изобретения. В соответствии с другими предпочтительными аспектами оценивают уровни агрегации композиций изобретения.
В соответствии с определенными аспектами свойства стабильности композиций изобретения сравнивают с подходящим контролем. Пример контролей включает обычную молекулу ксРу. Особо предпочтительным контролем является (С1у48ег)3 молекула ксРу.
В соответствии с одним вариантом осуществления измеряют один или больше описанных ниже параметров. В соответствии с одним вариантом осуществления измеряют один или больше этих параметров после экспрессии в клетках млекопитающих. В соответствии с одним вариантом осуществления один или более описанных ниже параметров измеряют в условиях крупномасштабного изготовления (например, экспрессию ксРу или включающих ксРу молекул в биореакторе).
а) Термическая стабильность.
Термическую стабильность композиций изобретения можно проанализировать с использованием большого количества (без ограничений) биофизических или биохимических способов, известных в уровне техники. В соответствии с определенными аспектами термическую стабильность оценивают способом аналитической спектроскопии.
Примером способа аналитической спектроскопии является дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК). В этом способе используется калориметр, чувствительный к поглощению тепла, сопровождающему развертывание большинства белков и доменов белков (см., например, 8апс11ех-Кшх. е! а1., Вюс11еш1к1гу. 27: 1648-52, 1988). Для того чтобы определить термическую стабильность белка, образец белка помещают в калориметр и поднимают температуру до развертывания РаЬ или ксРу.
Температура, при которой развертывается белок, позволяет сделать вывод о его общей стабильности.
Еще одним способом аналитической спектроскопии является круговой дихроизм (КД). КДспектрометрия измеряет оптическую активность композиции в зависимости от возрастающей температуры. При этом определяется разница в поглощении левополяризованного и правополяризованного света, обусловленная структурной асимметрией. Спектр КД неупорядоченной и развернутой структуры сильно отличается от спектра упорядоченной и свернутой структуры. Спектр КД отражает чувствительность белка к денатурирующему действию возрастающей температуры и, таким образом, показывает термическую стабильность белка (см. уап М1ег1о и 8!ееткта, I. Вю!есйпо1., 79(3):281-98, 2000). Еще одним примером способа аналитической спектроскопии, применяемого для измерения термической стабильности белка, является флуоресцентная эмиссионная спектроскопия (см. уап М1ег1о и 8!ееткта, кирга). Еще одним примером способа аналитической спектроскопии, применяемого для измерения термической стабильности белка, является спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (см., например, уап М1ег1о и 8!ееткта, кирга).
В соответствии с другими аспектами термическую стабильность композиции изобретения измеряют биохимически. Пример такого способа определения термической стабильности - анализ температурной проверки. В ходе анализа термической проверки (!йегта1 сйа11епде аккау) композицию изобретения помещают в условия повышенной температуры на заданное время. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления, исследуемые молекулы ксРу или молекулы, включающие молекулы ксРу, подвергают действию повышенной температуры, например, в течение 1-1,5 ч. Затем активность белка анализируют подходящим биохимическим способом. Например, если белок представляет собой белок связывания (например, ксРу или ксРу-включающий полипептид изобретения), то активность связывания такого белка можно определить функциональным или количественным ЕЬ18А.
В соответствии с одним вариантом осуществления такой анализ можно поставить в формате высокопроизводительного скрининга. В соответствии с другим вариантом осуществления библиотеку вариантов ксРу можно создать способами, известными в уровне техники. Можно индуцировать экспрессию ксРу и подвергнуть эти молекулы термической проверке. После проверки образцы анализируют на связывание и стабильные ксРу можно масштабировать и охарактеризовать дополнительно.
В соответствии с определенными аспектами термическую стабильность оценивают, измеряя температуру плавления ™ композиции изобретения с использованием одной из приведенных выше методик (например, способы аналитической спектроскопии). Температура плавления - температура средней точки на кривой температурного перехода, где 50% молекул композиции находится в свернутом состоянии.
В соответствии с другими аспектами термическую стабильность оценивают, измеряя специфичное тепло или теплоемкость (Ср) композиции изобретения с использованием аналитического калориметрического способа (например, ДСК). Специфическое тепло композиции - энергия (например, выраженная в
- 51 015992 ккал/моль), требуемая для того, чтобы повысить на 1°С температуру 1 моль воды. Большое Ср является признаком денатурировавшей или неактивной белковой композиции. В соответствии с определенными аспектами изменение теплоемкости (АСр) композиции измеряют, определяя специфичное тепло композиции до и после термического перехода. В соответствии с другими аспектами термическую стабильность можно оценить, измеряя и определяя другие параметры термодинамической стабильности, включая свободную энергию Гиббса развертывания (ΔΟ), энтальпию развертывания (АН) или энтропию развертывания (Δδ).
В соответствии с другими аспектами один или более описанных выше биохимических анализов (например, анализ температурной проверки) применяются для определения температуры (т.е. значения ТС), при которой 50% композиции сохраняет свою активность (например, активность связывания).
b) % Агрегации.
В соответствии с определенными аспектами стабильность композиции изобретения измеряют, определяя ее склонность к агрегации. Агрегацию можно измерить множеством биохимических и биофизических способов без ограничения. Например, агрегацию композиции изобретения можно оценить с использованием хроматографии, такой как гель-хроматография (Ы/е-Ехс1икюп Сйгота!одгару (8ЕС)). 8ЕС разделяет молекулы по их размеру. Колонку наполняют полутвердыми шариками полимерного геля, который пропускает через себя ионы и маленькие молекулы, но задерживает большие. Когда белковую композицию наносят на вершину колонки, компактно свернутые белки (например, неагрегированные белки) оказываются распределены в большем объеме растворителя, чем доступен для больших агрегатов. Соответственно большие агрегаты быстрее проходят через колонку, и таким способом удается разделить смесь, фракционировав ее на компоненты. Каждую фракцию можно оценить количественно (например, по рассеянию света) по мере ее выхода с геля. Соответственно % агрегации состава изобретения можно определить, сравнивая концентрацию фракции с общим содержанием белка, нанесенного на гель. Стабильные композиции элюируют с колонки, фактически, в виде одной фракции и в профиле элюирования или хроматограмме выглядят в виде одного пика.
В соответствии с предпочтительными аспектами 8ЕС используется совместно со способом определения светорассеяния (например, классическим или динамическим светорассеянием) для определения процента агрегации композиции. В соответствии с предпочтительными аспектами статическое светорассеяние используется для измерения массы каждой фракции или пика, независимо от формы пика или положения элюирования. В соответствии с другими предпочтительными аспектами динамическое светорассеяние используется для измерения гидродинамического размера композиции. Другие примеры способов оценки стабильности белков включают высокоскоростную 8ЕС (Н1дй-8рееб 8ЕС (см., например, СогЬей е! а1., Вюсйет1кйу. 23(8): 1888-94, 1984)).
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления % агрегации определяется путем измерения доли агрегатов белка в его образце. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления % агрегации белка определяется путем измерения доли свернутого белка в его образце.
c) % Выхода.
В соответствии с другими аспектами стабильность композиции изобретения оценивают путем измерения количества белка, восстановленного (здесь % выхода) после его экспрессии (например, рекомбинантной экспрессии). Например, % выхода можно измерить, определяя количество миллиграмм белка, восстановленного на каждый мл среды культуры клеток-хозяев (т.е. мг/мл белка). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления % выхода определяют после экспрессии в хозяйских клетках млекопитающих (например, в клетке СНО).
б) % Потери.
В соответствии с другими аспектами стабильность композиции изобретения оценивают путем мониторинга потери белка в диапазоне температур (например, от -80 до 25°С) после хранения в течение определенного времени. Количество и концентрацию восстановленного белка можно определить любым известным способом количественного анализа белков и сравнить с начальной концентрацией белка. Примеры способов количественного анализа белков включают анализ 8Э8-РЛСЕ и способ анализа Брэдфорда (ВгабГогб, е! а1., Апа1. Вюсйет. 72, 248 (1976)). Предпочтительный способ оценки потери белка использует любой из описанных здесь аналитических способов 8ЕС. Необходимо понимать, что измерения % потери можно выполнить для любых требуемых состояний хранения или составов хранения, включая, например, лиофилизированный белок.
е) % Протеолиза.
В соответствии с другими аспектами стабильность композиции изобретения оценивают путем определения количества белка, протеолизируемого после хранения в стандартных условиях. В соответствии с примером реализации протеолиз определяют способом δΌδ-РАСЕ образца белка, при котором количество интактного белка сравнивают с количеством фрагментов белка низкого молекулярного веса, представленного в геле δΌδ-РАСЕ. В соответствии с другим примером реализации протеолиз определяют способом масс-спектрометрии (Μδ), в соответствии с которым количество белка ожидаемого молекулярного веса сравнивают с количеством белковых фрагментов низкого молекулярного веса в образце.
- 52 015992
ί) Сродство связывания.
В соответствии с дополнительными аспектами стабильность композиции изобретения можно оценить путем определения его сродства связывания с мишенью. Известно большое количество способов определения сродства связывания. В качестве примера такого способа можно привести поверхностный плазмонный резонанс. Поверхностный плазмонный резонанс представляет собой оптическое явление, позволяющее анализировать биоспецифичные взаимодействия в режиме реального времени путем детекции изменения концентрации белков в биосенсорной матрице, например, с помощью системы Высоте (Рйагтас1а Вюкепког АВ, Иррка1а, 8^ебеп и Р1кса!а^ау, N1). Дополнительную информацию см. в работах 1опккоп, и., е! а1. (1993), Апп. Вю1. С1т. 51:19-26; 1опккоп, и., е! а1. (1991), Вю1ес11пк|иек 11:620627; 1оЬпккоп, В., е! а1. (1995), 1. Мо1. Яесодпй. 8:125-131; и 1оЬппкоп, В., е! а1. (1991), Апа1. Вюсйет. 198:268-277.
д) Другие исследования стабильности.
В соответствии с другими аспектами стабильность композиции изобретения можно определить, количественно измеряя связывание меченого соединения с денатурированным и развернутым фрагментом связывающей молекулы. Такие молекулы предпочтительно гидрофобны, так как они предпочтительно связываются и взаимодействуют с большими гидрофобными группами аминокислот, обычно находящимися в глубине нативного белка, но экспонируемые денатурированной или развернутой связывающей молекуле. Примером меченого соединения является гидрофобный флуоресцентный краситель, 1анилино-8-нафталин сульфонат (ΑΝ8).
УН. Способы выбора стабильных белков.
Описанные здесь способы прогнозирования стабильности белков могут использоваться также для выбора белка-кандидата (например, антител) для дальнейшего использования. В соответствии с определенными аспектами способы изобретения используются для выбора белка для экспрессии. В соответствии с другими аспектами способы изобретения используются для выбора белка-кандидата для модификации. В соответствии с демонстративными направлениями реализации способы прогнозирования изобретения могут использоваться в процессе гуманизации нечеловеческих донорных антител (например, чтобы выбрать иммуноглобулин-акцептор). Белок-кандидат можно выбрать на основании его общего консенсусного счета или счета последовательности, определенных способами изобретения. В соответствии с определенными аспектами белок-кандидат выбирают, если его консенсусный счет больше, чем подходящий отрицательный контроль (например, больше 5%, предпочтительно больше 10%, более предпочтительно больше 20%). В соответствии с другими аспектами белок-кандидат выбирают, если его консенсусный счет фактически такой же (например, укладывается в 20, 10 или 5%) или больше (например, больше 5%, предпочтительно больше 10%, более предпочтительно больше 20%) подходящего положительного контроля.
В соответствии с другими аспектами белок-кандидат выбирают, если его консенсусный счет в значительной степени такой же, что и идеальный или правильный консенсусный счет (например, укладывается в 30%, предпочтительно в 20%, более предпочтительно в 10%).
В соответствии с другими аспектами белок-кандидат выбирают, если его счет последовательности больше нуля. В соответствии с одним вариантом осуществления белок-кандидат выбирают, если его счет последовательности больше 0,5. В соответствии с другим вариантом осуществления белок-кандидат выбирают, если его счет последовательности больше 1. В соответствии с другим вариантом осуществления белок-кандидат выбирают, если его счет последовательности больше 2. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления белок-кандидат выбирают, если его счет последовательности больше 3.
В соответствии с другими аспектами белок-кандидат выбирают, если его Δ-счет не меньше -3, не меньше -2 или не меньше -1, предпочтительно не меньше 0, более предпочтительно не меньше 1.
а. Выбор акцепторного иммуноглобулина для гуманизации антител.
Гуманизированные антитела можно получить рекомбинантными способами ДНК, см., например, Оиееп е! а1., Ргос. №!1. Асай. δα. И8А (1989), 86:10029-10033; ,1опек е! а1., Уинге (1986), 321:522-25; Ктесйтапп е! а1., №-11иге (1988), 332:323-27; Уегйоеуеп е! а1., 8аепсе (1988), 239:1534-36; 0г1апй1 е! а1., Ргос. №!1. Асай. δα. И8А (1989), 86:3833-37; патенты США № 5225539, 5530101, 5585089, 5693761, 5693762, 6180370. Если для гуманизации выбрано предпочтительное нечеловеческое донорное антитело, то соответствующее человеческое акцепторное антитело можно получить, например, из генов баз данных последовательностей экспрессируемых человеческих антител, из зародышевых последовательностей к или из консенсусных последовательностей нескольких человеческих антител. Скорее всего, введение нечеловеческих участков СОЯ в каркас человеческого вариабельного домена приведет к сохранению их корректной пространственной ориентации, если каркас человеческого вариабельного домена примет такую же или похожую конформацию, что и у нечеловеческого вариабельного каркаса, из которого взят СОЯ. Это достигается выделением человеческих вариабельных доменов из человеческих акцепторных антител, каркасные последовательности которых демонстрируют высокую степень идентичности последовательностей с нечеловеческими вариабельными доменами, из которых эти СОЯ были получены. Каркасные вариабельные области тяжелых и легких цепей можно получить из одних и тех же или разных последовательностей антител человека. Предпочтительно, чтобы человеческое акцепторное антитело
- 53 015992 сохраняло канонические и остатки области контакта донорного антитела. Кроме того, предпочтительно, чтобы человеческое акцепторное антитело проявляло значительное сходство по длине петель СОК. См. КеШеЬогоидй е1 а1., Рго1ет Епдшеегшд 4:758 (1991); Ко1Ьтдег е1 а1., РгсЛет Епдтеегшд 6:971 (1993) и Сайег е1 а1., УО 92/22653.
Идентифицировав области СЭК донорного антитела и соответствующее человеческое акцепторное антитело, надо определить, какие (если есть) остатки этих компонентов следует заменить, чтобы оптимизировать свойства полученного гуманизированного антитела. Как правило, некоторые или все аминокислоты легкой или тяжелой цепи нечеловеческого, донорного иммуноглобулина, необходимые для связывания антигена (например, один или больше СЭК), замещают соответствующие аминокислоты легкой или тяжелой цепи человеческого акцепторного антитела. Человеческое акцепторное антитело сохраняет некоторые или все аминокислоты, не требуемые для связывания антигена. При необходимости один или больше остатков человеческих каркасных областей можно заменить на остатки из соответствующих положений мышиных антител, чтобы сохранить сродство связывания гуманизированного антитела к антигену. Это изменение иногда называют обратной мутацией. Некоторые аминокислоты человеческих вариабельных каркасных областей выбирают для обратной мутации на основании их возможного влияния на конформацию СЭК и/или связывание с антигеном.
Иногда, однако, процесс гуманизации приводит к неестественным изменениям в вариабельном домене, вносящим в гуманизированное антитело нежелательную нестабильность. Например, акцепторный иммуноглобулин может содержать редкие вариации в последовательности, которые придают ей низкую стабильность. Это особенно верно для некоторых зародышевых последовательностей, которые могут не использоваться часто иммунной системой.
Способы изобретения включают усовершенствованные способы гуманизации. В частности, способы изобретения позволяют опытному специалисту спрогнозировать, какая исследуемая последовательность (например, зародышевая исследуемая последовательность) с набором сравнения акцепторных последовательностей кандидатов (например, зародышевых последовательностей) будет приемлемо стабильна для использования при гуманизации акцепторной последовательности. Исследуемые акцепторные последовательности (например, зародышевые последовательности), обладающие счетом, который позволяет спрогнозировать приемлемую стабильность (например, с высоким консенсусным счетом по сравнению со средним консенсусным счетом набора сравнения), можно выбрать как акцепторный иммуноглобулин.
УШ. Основанные на библиотеках способы идентификации стабилизированных молекул 8сРу.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способам идентификации молекул 8сРу с повышенной стабильностью белка, например с повышенной термической стабильностью. Способы изобретения включают следующие: (ί) получение библиотеки, включающей молекулы-кандидаты 8сРу; и (ίί) скрининг библиотеки для идентификации молекул-кандидатов, стабильность которых повышена по сравнению с подходящим контролем (например, контрольной молекулой 8сΡν). Здесь термин молекула-кандидат 8сΡν означает молекулу 8сΡν, полученную путем введения одной или более стабилизирующих мутаций в молекулу 8сΡν, где эффект стабилизирующей мутации на стабильность молекулы 8сΡν заранее неизвестен, т.е. молекулу 8сΡν, в которую была введена мутация и которую необходимо проанализировать, чтобы определить, привела ли мутация к повышению стабильности. В соответствии с одним вариантом осуществления молекула-кандидат 8сΡν формируется путем введения одной или больше стабилизирующих мутаций в обычную (т.е. нестабилизированную) молекулу 8сΡν. В соответствии с другим вариантом осуществления молекула-кандидат 8сΡν формируется путем введения одной или больше стабилизирующих мутаций в стабилизированную молекулу 8сΡν, описанную в разделе II.
Библиотека молекул-кандидатов 8сΡν здесь означает по меньшей мере две не избыточные молекулы-кандидаты 8сΡν, предпочтительно по меньшей мере 10, особо предпочтительно по меньшей мере 100 и чрезвычайно предпочтительно по меньшей мере 1000 (например, по меньшей мере около 104, 105, 106, 107 или 108 молекул 8сΡν). В соответствии с одним вариантом осуществления библиотека рандомизируется, при этом неспецифичные мутации генерируются случайным образом по всей молекуле. В соответствии с другим вариантом осуществления библиотека рандомизируется частично или конструируется. Это означает, что конкретные аминокислотные остатки или их класс вводятся случайным образом в любой позиции 8сΡν или для мутагенеза неспецифицированными аминокислотными остатками, остатками конкретного класса или конкретными остатками выбираются конкретные положения аминокислот. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления библиотеку 8сΡν конструируют, замещая указанный остаток молекулы 8сΡν аминокислотой заданного класса, например гидрофобной аминокислотой, основной аминокислотой, гидрофильной аминокислотой, заряженной аминокислотой, аминокислотой с объемными группами (большими или маленькими) или цистеином, способным образовывать дисульфидные мостики.
В соответствии с определенными аспектами библиотека 8сΡν включает молекулы-кандидаты 8сΡν со стабилизирующими мутациями, которые включены в вариабельную область (Уъ и/или Ун) молекулы 8сΡν. В соответствии с другими аспектами библиотека 8сΡν включает молекулы-кандидаты 8сΡν со ста- 54 015992 билизирующими мутациями, которые включены в линкер есЕу молекулы есЕу. В соответствии с другими аспектами библиотека есЕу включает молекулы-кандидаты есЕу со стабилизирующими мутациями, которые включены в линкер есЕу молекулы есЕу, и стабилизирующими мутациями, которые включены в вариабельный область (ν и/или νΗ) молекулы есЕу.
а. Дизайн библиотек есЕу.
В помощь способам конструирования библиотек есЕу можно использовать молекулярное или компьютерное моделирование. В соответствии с определенными аспектами дизайн библиотеки можно проводить ίη еШсо. В соответствии с определенными аспектами библиотеку есЕу можно сконструировать с использованием следующего двухстадийного подхода:
1) идентификация аминокислотных остатков мишени есЕу, которые при внесении в них мутаций (например, путем замены аминокислотных остатков) согласно прогнозу повышают стабильность есЕу (здесь кандидатуры дестабилизирующих остатков); и
2) замена аминокислотных остатков мишеней кандидатурами стабилизирующих остатков.
Этап 1. Идентификация кандидатур дестабилизирующих остатков.
В соответствии с определенными аспектами кандидатуры дестабилизирующих аминокислотных остатков можно идентифицировать анализом, основанным на последовательности. Например, кандидатуры дестабилизирующих аминокислотных остатков можно определить, сравнивая последовательности вариабельных областей есЕу с набором сравнения последовательностей вариабельных областей, например последовательностей вариабельных областей природных человеческих антител, и выбирая такие аминокислотные остатки есЕу, наличие которых в соответствующих аминокислотных положениях набора сравнения необычно, или они встречаются там редко. В соответствии с предпочтительными аспектами анализируют только каркасные области последовательностей вариабельных областей есЕу, а области, определяющие комплементарность (СЭЕ) вариабельных областей, консервируют, чтобы не испортить связывающую активность молекул есЕу.
В соответствии с определенными аспектами кандидатура дестабилизирующего аминокислотного остатка отсутствует в соответствующем положении набора сравнения гомологичных последовательностей вариабельной области или присутствует там редко.
Способы компилирования набора сравнения описаны в разделах Ш-ν настоящего изобретения. В соответствии с предпочтительными аспектами кандидатура дестабилизирующего аминокислотного остатка присутствует в соответствующих положениях менее чем 10% последовательностей набора сравнения. В соответствии с более предпочтительными аспектами кандидатура дестабилизирующего аминокислотного остатка присутствует в соответствующих положениях менее чем 5% последовательностей набора сравнения. В соответствии с особенно предпочтительными аспектами кандидатура дестабилизирующего аминокислотного остатка присутствует в соответствующих положениях менее чем 2% последовательностей (например, 0,5, 0,75 или 1%) набора сравнения.
В соответствии с другим вариантом осуществления кандидатура дестабилизирующего аминокислотного остатка отличается от аминокислоты в соответствующем положении консенсусной последовательности набора сравнения последовательностей вариабельной области (т.е. консенсусного аминокислотного остатка). Способы определения консенсусной последовательности набора сравнения описаны в разделах Ш-ν настоящего изобретения.
В соответствии с другим вариантом осуществления кандидатура дестабилизирующего аминокислотного остатка характеризуется низким консенсусным счетом. Способы определения консенсусного счета аминокислотного остатка описаны в разделах Ш-ν настоящего изобретения. В соответствии с одним вариантом осуществления кандидатура дестабилизирующего аминокислотного остатка характеризуется консенсусным счетом менее 0,5 (например, менее 0,4, менее 0,3, менее 0,2 или менее 0,1). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления кандидатура дестабилизирующего аминокислотного остатка характеризуется консенсусным счетом менее 0,3.
Этап 2. Выбор кандидатур стабилизирующих мутаций.
Определив одну или более кандидатур дестабилизирующих аминокислотных остатков, далее надо для каждого дестабилизирующего аминокислотного остатка выбрать одну или более кандидатур стабилизирующих мутаций. Библиотеку есЕу можно затем так сконструировать, чтобы она включала репрезентативные кандидатуры молекул есЕу для каждой выбранной кандидатуры стабилизирующих мутаций.
В соответствии с определенными аспектами каждый природный аминокислотный вариант конкретной дестабилизирующей аминокислоты выбирают в качестве кандидатуры стабилизирующей мутации (т.е. 19 кандидатур стабилизирующей мутации для каждой дестабилизирующей аминокислоты).
В соответствии с более предпочтительными аспектами в качестве кандидатуры стабилизирующей мутации выбирают подмножество природных аминокислотных вариантов конкретной дестабилизирующей аминокислоты (т.е. 1-18 кандидатур стабилизирующих аминокислот для каждой дестабилизирую щей аминокислоты). В соответствии с одним вариантом осуществления подмножество кандидатур стабилизирующих мутаций включает замены аминокислот определенного класса, например гидрофобных аминокислот, основных аминокислот, гидрофильных аминокислот, заряженных аминокислот и стерически объемных аминокислот (маленьких либо больших).
- 55 015992
В соответствии с одним вариантом осуществления подмножество кандидатур стабилизирующих мутаций включает замены аминокислот, присутствующих с высокой частотой в положениях дестабилизирующих аминокислот в наборе сравнения гомологичных последовательностей вариабельных областей. В соответствии с предпочтительными аспектами кандидатура стабилизирующей мутации включает замены аминокислотами, представленными в базе данных с частотой более 10%. В соответствии с более предпочтительными аспектами аминокислоты представлены в базе данных с частотой более 15%. В соответствии с еще более предпочтительными аспектами аминокислоты представлены в базе данных с частотой более 20%. В соответствии с еще более предпочтительными аспектами аминокислоты представлены в базе данных с частотой более 25%.
В соответствии с другим вариантом осуществления кандидатура стабилизирующей мутации представляет собой замену консенсусной аминокислотой (т.е. наиболее частым остатком), включающейся в наборе сравнения в положении дестабилизирующей аминокислоты.
В соответствии с другим вариантом осуществления подмножество кандидатур стабилизирующих мутаций включает замены каждой аминокислотой из набора сравнения гомологичных последовательностей вариабельных областей, присутствующих в положении дестабилизирующей аминокислоты. Соответственно библиотеку зсРу можно так спроектировать, чтобы она включала репрезентативную кандидатуру молекулы ксРу для каждой кандидатуры стабилизирующей мутации из набора сравнения.
В соответствии с другими аспектами подмножество кандидатур стабилизирующих мутаций можно идентифицировать и расставить приоритеты для скрининга путем анализа (например, визуального или на компьютере) трехмерной структуры или модели вариабельной области молекулы зсРу. Трехмерная структура полипептида влияет на его биологическую активность и стабильность, и эту структуру можно определить и спрогнозировать различными способами. Четвертичную структуру можно спрогнозировать, строя модель трехмерных структур одного или более гомологичных белков (или белковых комплексов) с известными трехмерными структурами. Возможно, лучшим способом определения структуры белков является рентгеновская кристаллография (соответственно, термин кристаллическая структура можно использовать вместо термина структура), но можно сделать определенные оценки на основании данных кругового дихроизма, рассеяния света или измеряя поглощение и эмиссию лучистой энергии. Другие полезные методики включают дифракцию нейтронов, ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и моделирование гомологии. Все эти способы хорошо известны специалистам и описаны в типовых учебниках (см., например, РЬу81са1 СЬет181гу, 4111 Ей., V.! Мооге, РгеиЙ88-на11, Ν.Σ., 1972 или РЬу81са1 ВюсЬет181гу, К.Е. Уап но1йе, РгепЙ88-на11, Ν.Ε, 1971)) и многочисленных публикациях. Все эти способы позволяют определить структуру молекулы, включающей вариабельную область молекулы зсРу (например, антитела, РаЬ или самой молекулы зсРу).
Структуру вариабельной области можно моделировать ίη зШсо. Например, совместимость кандидатуры стабилизирующей мутации с трехмерной структурой можно проанализировать, моделируя на компьютере замену дестабилизирующей мутации на кандидатуру стабилизирующей мутации. Кандидатура стабилизирующей мутации может быть выбрана для включения в библиотеку зсРу, если она совместима с общей структурой молекулы зсРу. В соответствии с одним вариантом осуществления кандидатура стабилизирующей мутации может быть отобрана, если она не мешает естественному свертыванию или конформации вариабельной области молекулы зсРу или одному или нескольким областям, определяющим комплементарность (СОВ). В соответствии с другим вариантом осуществления кандидатура стабилизирующей мутации может быть отобрана, если она не мешает способности вариабельной области формировать нативную область контакта Уь/Ун.
В соответствии с определенными аспектами кандидатура стабилизирующей мутации может быть отобрана путем применения технологии повторной упаковки боковых цепей к структуре (например, кристаллической структуре или модели) вариабельной области. В ходе расчетов повторной упаковки боковых цепей кандидатуры стабилизирующих остатков можно модифицировать на компьютере, и стабильность полученных мутантов также оценивают на компьютере. Расчеты повторной упаковки боковых цепей генерируют ранжированный список мутаций, изменяющих стабильность (т.е. изменяющих внутримолекулярную энергию). Число белковых мутантов, оцениваемых вычислительными способами, может быть очень большим, так как каждое вариабельное аминокислотное положение можно мутировать во все 20 стандартных аминокислот. Примеры компьютерных алгоритмов, используемых для ранжирования результатов компьютерного анализа, включают алгоритмы устранения тупиков и поисков по дереву (см., например, Ьа81ег8 е1 а1. (Рго1ет Еид. 8:815-822, 1995), Ьоодег и неШида (й. Мо1. Вю1. 307:429-445, 2001), и ЭаЫуа! и Мауо (Рго1ет 8сг 5:895-903, 1996)). Соответственно библиотеку зсРу можно сконструировать так, чтобы она включала репрезентативные кандидаты молекул зсРу для каждой кандидатуры стабилизирующей мутации с максимальным рангом из ранжированного списка мутаций, генерированного расчетом по способу повторной упаковки боковых цепей. В соответствии с определенными аспектами выбирают, по меньшей мере, мутацию с максимальным рангом (например, одну мутацию с максимальным рангом, две мутации с максимальным рангом, три мутации с максимальным рангом, четыре мутации с максимальным рангом и пять мутаций с максимальным рангом).
- 56 015992
b. Конструирование библиотек ксРу.
Определив кандидатуры стабилизирующих мутаций для включения в библиотеку ксРу, получить кандидатуры молекул ксРу, включающих мутации, можно любым из множества доступных способов. Такие полипептиды можно, например, производить рекомбинантными способами. Более того, из-за дегенерации генетического кода для кодирования каждой желаемой ксРу можно использовать множество последовательностей нуклеиновых кислот.
Примеры признаваемых способов получения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей кандидатуру молекулы ксРу, включают, но не ограничиваются, сайт-направленный (или опосредованный нуклеотидами) мутагенез, ПЦР мутагенез и кассетный мутагенез ранее приготовленных ДНК, кодирующих кандидата ксРу.
Сайт-направленный мутагенез представляет собой предпочтительный способ приготовления вариантов замены. Эта технология хорошо известна в уровне техники (см., например, Сайег е! а1. М.1с1е1С Ас1бк Век. 13:4431-4443 (1985) и Кипке1 е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А 82:488 (1987)). Кратко, при выполнении сайт-направленного мутагенеза ДНК родительская молекула ДНК изменяется сначала путем гибридизации олигонуклеотида, кодирующего желательную мутацию, в одной цепочке такой родительской ДНК. После гибридизации ДНК-полимераза используется для синтеза целой второй цепочки, при этом гибридизованный олигонуклеотид выступает в роли праймера, а одна цепь родительской ДНК - в роли образца. Таким способом кодирующий желательную мутацию олигонуклеотид встраивается в полученную двухцепочечную ДНК, которая затем может быть лигирована в плазмиду или другой подходящий вектор.
Для получения молекул-кандидатов ксРу подходит также ПЦР-мутагенез. См. ШдисЫ, ш РСВ Рго!осо1к, р. 177-183 (Асабетю Ргекк, 1990); и Уа11ейе е! а1., Шс. Ас1бк Век. 17:723-583 (1989). Кратко, когда небольшие количества образца ДНК используются в качестве исходного материала в ПЦР, праймеры, последовательность которых слегка отличается от последовательности соответствующей области образца ДНК, можно использовать для генерации относительно больших количеств специфичного фрагмента ДНК, отличающегося от последовательности образца только в тех положениях, в которых праймеры отличаются от образца. Праймеры ПЦР могут также быть сконструированы так, чтобы включать сайты рестрикции, так что продукт ДНК ПЦР-реакции можно было затем непосредственно лигировать в плазмиду или другой подходящий вектор.
Другой способ приготовления вариантов, кассетный мутагенез, основан на технике, описанной в работе ^е11к е! а1., Сепе 34:315-323 (1985). Исходный материал - это плазмида (или другой вектор), включающий исходную полипептидную ДНК, которую предстоит мутировать. Идентифицируются кодоны родительской ДНК, которые предстоит мутировать. На каждой стороне идентифицированных сайтов мутации должны быть уникальные сайты эндонуклеазы рестрикции. Если таких сайтов нет, их необходимо сгенерировать с помощью описанного выше способа олигонуклеотид-опосредованного мутагенеза и ввести в соответствующие положения исходной полипептидной ДНК. Для линеаризации ДНК плазмиды разрезается по этим сайтам. Двухцепочечный олигонуклеотид, кодирующий последовательность ДНК между сайтами рестрикции, но включающий желаемые мутации, синтезируют с помощью стандартных процедур, причем две цепочки нуклеотида синтезируют по отдельности, а затем гибридизуют стандартными способами. Такой двухцепочечный олигонуклеотид называется кассетой. 5' и 3' концы кассеты должны быть совместимы с концами линеаризованной плазмиды, так что она может быть непосредственно лигирована туда.
Вышеприведенными способами можно сгенерировать репрезентативные аминокислоты для каждой кандидатуры молекулы ксРу. Затем нуклеиновые кислоты можно клонировать в векторы экспрессии с формированием библиотеки векторов экспрессии. Затем хозяйские клетки трансформируют полученной библиотекой векторов и выращивают в соответствующих условиях, чтобы экспрессировать кандидатуры молекул ксРу.
c. Способы скрининга.
Библиотеку ксРу изобретения можно скринировать в анализе (например, в высокопроизводительном способе анализа), чтобы идентифицировать кандидатуры молекул ксРу с желательной стабильностью. Такой анализ может использовать любой из способов для оценки стабильности белка, описанные в разделе У1 выше. Особо предпочтительным способом является анализ термической стабильности. Такие способы анализа в целом вовлекают сравнение термической стабильности кандидатуры молекулы ксРу с подходящим контролем и выбор кандидатуры молекулы ксРу, если ее термическая стабильность больше, чем у контроля. Примеры подходящих контролей включают обычные молекулы ксРу, например молекулу (С1у48ег)3ксРу. Кандидатуры молекул ксРу могут быть отобраны, если их термическая стабильность больше контроля приблизительно на 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10°С. В примере реализации кандидатуры молекулы ксРу отбирают, если их термическая стабильность больше контроля приблизительно на 3°С.
Библиотеки ксРу можно представить в различных форматах анализа.
Например, молекулы ксРу можно представить в растворе (например, НоидЙеп (1992), Вю1ес11шс.|иек 13:412-421), на шариках (Ьат (1991), №1й.1ге 354:82-84), чипах (Робог (1993), №1й.1ге 364:555-556), в бак
- 57 015992 териях (Ьабпет υδΡ 5223409), спорах (Ьабпет υδΡ '409) или на фаге (δ^ΐΐ и διηίΐΐι (1990), δ^ι^ 249:386390); (1)е\1т (1990), δα^'ΐ^ 249:404-406); (Стопа е! а1. (1990), Ρτοα ЫаИ. Лсаб. δα. 87:6378-6382); (Ре11С1 (1991), 1. Μο1. Βίο1. 222:301-310); (Ьабпет кирга.).
В соответствии с демонстративными направлениями реализации кандидатуры молекул 8сРν анализируют в виде раствора. В соответствии с одним вариантом осуществления каждый образец включает аликвоту раствора с кандидатурами молекул 8сРν, обладающими одной и той же кандидатурой стабилизирующей мутации или мутаций. Такой раствор можно сгенерировать, выделяя колонии индивидуальных клеток-хозяев из библиотеки хозяйских клеток, трансформированных библиотекой плазмид экспрессии, и выращивая эти колонии в соответствующем сосуде в условиях, облегчающих экспрессию молекул 8сРν. В соответствии с одним вариантом осуществления кандидатуры молекул 8сРν можно выделить из клеток-хозяев и заново растворить в соответствующем растворе для анализа. В соответствии с более предпочтительным вариантом осуществления кандидатуры молекулы 8сРν сплавляют с отщепляемой последовательностью сигнального пептида, так что молекула 8сРν секретируется хозяйской клеткой в клеточную среду. В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления хозяйские клетки можно выращивать в условиях, когда кандидатуры молекулы 8сРν выделяются в среду совместно с белками хозяйской клетки.
Иногда может быть желательно автоматизировать любой из описанных выше форматов анализа. Например, можно использовать роботизированные установки для выделения каждого члена семейства 8сРν (например, в виде индивидуальной колонии хозяйских клеток), позволяющих это делать быстро, так что их можно анализировать в различных сосудах. Примеры таких сосудов включают планшеты для микротитрования (например, 96-луночные планшеты), пробирки (обычные и микроцентрифужные).
б. Дополнительная оптимизация стабилизированных молекул 8сРν.
Стабильную молекулу 8сРν, идентифицированную описанными выше способами скрининга, можно ремоделировать и дополнительно оптимизировать, чтобы улучшить стабильность белка. Так, описанные выше этапы можно повторить со стабильной молекулой 8сРν, обнаруженной на начальном этапе оптимизации. Альтернативно, стабилизирующие мутации из двух или более стабилизированных молекул 8сРν можно объединить в одной молекуле 8сРν, чтобы еще больше повысить стабильность белка.
В соответствии с определенными аспектами стабильную молекулу 8сРν, идентифицированную способами изобретения, можно дополнительно оптимизировать. Например, в нее можно внести одно или больше следующих дополнительных изменений. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная молекула 8сРν может быть стабилизирована еще больше путем ввода дисульфидной связи, связывающей аминокислоту из домена Уъ и аминокислоту из домена УН. Примеры дисульфидных связей включают любые связи, описанные в разделе ΙΙ выше. Особо предпочтительной дисульфидной связью является связь УН44-УЪ100.
В соответствии с другими аспектами идентифицированная способами изобретения стабильная молекула 8сРν может быть далее оптимизирована путем ввода 8сРν линкера с оптимальной длиной или композицией. Примеры 8сРν-линкеров описаны в разделе ΙΙ выше. Особо предпочтительным 8сРν линкером является (О1у^ет)4.
В соответствии с другим вариантом осуществления стабильная молекула 8сРν, идентифицированная способами изобретения, может быть оптимизирована еще больше путем ввода стабилизирующей мутации по меньшей мере в один из доменов УН или Уь.
ΙΧ. Способы стабилизации связывающих молекул.
В соответствии с другими аспектами изобретение относится к способам повышения свойств стабильности связывающих молекул. В общем случае, эти способы включают включение или добавление стабилизированной молекулы 8сРν изобретения к связывающей молекуле. К удивлению, было обнаружено, что, как показано в приведенных ниже рабочих примерах, молекулы 8сРν изобретения не только стабильны сами по себе, но также и улучшают стабильность связывающих молекул, в которые они были включены. Соответственно способы изобретения предоставляют удобные и надежные средства улучшения стабильности коммерчески значимых связывающих молекул, крупномасштабное производство которых часто бывает ограничено плохой стабильностью (например, полиспецифичных антител (например, биспецифичных антител) и других модифицированных антител).
Стабилизированные молекулы 8сРν можно встроить в связывающие молекулы способами конъюгации белков, хорошо известными в уровне техники. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная 8сРν сплавляется непосредственно с Ν- или С-концами полипептида, например, молекулы антитела. В соответствии с другим вариантом осуществления, чтобы связать стабилизированную 8сРν с Ν- или С-концами полипептида, используется непептидный линкер. В соответствии с еще одним вариантом осуществления для связи стабилизированной 8сРν с полипептидом используется связывающий пептид. В соответствии с примером реализации связывающим пептидом является короткий пептид, обогащенный парами д1у/кег. Примеры таких пептидов приведены в табл. 1 ниже. Другие примеры связывающих пептидов хорошо известны в уровне техники (см., например, кИетабогиб ΡСТ Лрр1^саΐ^οη Νοκ. \νΟ 2005/000898 и νΟ 2005/000899). В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированную 8сРν изобретения связывают с С-терминальным концом связывающей молекулы, например
- 58 015992 молекулы антитела, линкером 8(648)3. В соответствии с другим вариантом осуществления стабилизированную ксРу изобретения связывают с Ν-терминальным концом связывающей молекулы, например молекулы антитела, линкером (648)5.
Таблица 1
Связывающие пептиды
Линкер 8Ε<ίΠ) ΝΟ ДНК иля аминокислотная последовательность
(О1у48ег)5 132 5’- ОССООТООАОСОТССООТООАОООСССТСТООА ООСООСОСТТСАООССССООТООАТСОООСОО АООТООСТСС-3’
133 0000800008000080000800008
8ег(О1у48ег)з 42 5’ТССООСОООСОТООАТССОСТООАОССООСТСС ООСООТООССОСТСС-3 ’
43 8000080000800008
В соответствии с одним вариантом осуществления по меньшей мере одну стабилизированную молекулу ксРу присоединяют к молекуле антитела с получением биспецифичной молекулы. В соответствии с другим вариантом осуществления две стабилизированные молекулы ксРу присоединяют к молекуле антитела с получением биспецифичной молекулы.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления стабилизирование связывающих молекулы изобретения приводит к повышению выхода по сравнению с обычными молекулами ксРу или связывающими молекулами, включающими обычные молекулы ксРу. Способы оценки выхода описаны в разделе νΐ. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула, полученная способами изобретения, улучшает выход по меньшей мере на 1% по сравнению с нестабилизированной связывающей молекулой. В соответствии с другими аспектами стабилизированная связывающая молекула, полученная способами изобретения, улучшает выход по меньшей мере на 2%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 75% или по меньшей мере на 100% по сравнению с нестабилизированной связывающей молекулой.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления связывающие молекулы изобретения снижают агрегацию по сравнению с обычными молекулами ксРу или связывающими молекулами, включающими обычные молекулы ксРу. Способы оценки агрегации описаны в разделе νΐ. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула, полученная способами изобретения, уменьшает агрегацию по меньшей мере на 1% по сравнению с нестабилизированной связывающей молекулой. В соответствии с другими аспектами стабилизированная связывающая молекула уменьшает агрегацию по меньшей мере на 2%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 75% или по меньшей мере на 100% по сравнению с нестабилизированной связывающей молекулой.
В соответствии с другими аспектами связывающие молекулы изобретения увеличивают срок хранения или долгосрочную стабильность по сравнению с обычными молекулами ксРу или связывающими молекулами, включающими обычные молекулы ксРу. Способы оценки полужизни включают % потери или % протеолиза, описанные в разделе νΐ. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула, полученная способами изобретения, повышает срок хранения по меньшей мере на один день по сравнению с нестабилизированной связывающей молекулой. Это означает, что препарат из связывающих молекул включает, фактически, такое же количество связывающих молекул, как было накануне. В соответствии с другими аспектами стабилизированная связывающая молекула повышает срок хранения по меньшей мере на два дня, по меньшей мере на пять дней, по меньшей мере на неделю, по меньшей мере на две недели, по меньшей мере на один месяц, по меньшей мере на два месяца, по меньшей мере на шесть месяцев или по меньшей мере на один год по сравнению с нестабилизированной связывающей молекулой.
В соответствии с другими аспектами связывающие молекулы изобретения улучшают стабильность, например при экспрессии в клетках-хозяевах конкретных типов по сравнению с обычными молекулами ксРу или связывающими молекулами, включающими обычные молекулы ксРу.
В соответствии с демонстративными направлениями реализации способы изобретения приводят к получению связывающих молекул, характеризующихся повышенной стабильностью (например, улучшенным выходом), при экспрессии в клетках-хозяевах, например, бактерий или эукариотов (например, грибков или млекопитающих). Примеры клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичек китайского хомячка (СЫпеке ИашЦег Оуагу (ΟΗΟ)), клетки ΗΕΕΑ (йитап сег\зса1 сагстота, карцинома шейки матки человека), клетки СУ1 (топкеу к1бпеу 1те, линия почек мартышек), клетки СО8 (производные СУ1 с антигеном 8ν40 Т), клетки В1610 (СЫпеке йатк!ег ВЬгоЫак!, фибробласты китайского хомячка), клетки ВАЬВС/3Т3 (фибробласты мыши), клетки ΗΑΚ (йатк1ег к1бпеу 1те, линия почек хомячка), клетки 8Р2/О (миелома мыши), клетки ΒΡΑ-1ΜΒΡΤ (бычьи эндотелиальные клетки), КЛЛ (человеческие лимфоциты)
- 59 015992 и клетки 293 (почка человека). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления две стабилизированные молекулы ксРу присоединяются к молекуле антитела с созданием стабилизированной биспецифичной молекулы для секреции в клетках СНО.
В соответствии с другими аспектами клетки-хозяева, способные экспрессировать стабилизированные связывающие молекулы, можно проскринировать, чтобы выбрать изоляты отдельных клеток, способные экспрессировать высокие уровни солюбилизированных и правильно свернутых стабилизированных связывающих молекул (например, связывающих молекул, демонстрирующих менее чем 10% агрегацию). В таких способах может использоваться сортировка флуоресцентно активируемых клеток (технология РАС8) (см., например, Вгехтку е! а1., 1. 1ттипо1 Ме111 (2003). 277:141-155). В соответствии с одним вариантом осуществления изоляты отдельных клеток адаптируются к бессывороточной среде, чтобы получить стабильную линию клеток-производителей. Такую линию можно затем выращивать, чтобы облегчить крупномасштабное производство стабилизированной связывающей молекулы изобретения.
В соответствии с другими аспектами способы изобретения используются для повышения стабильности связывающей молекулы, экспрессируемой клетками-хозяевами в большой объем культуральной среды.
В соответствии с демонстративными направлениями реализации способы изобретения приводят к повышению стабильности (например, к увеличению выхода), если связывающая молекула экспрессируется по меньшей мере в 1 л культуральной среды. В соответствии с другими аспектами способы изобретения используются для получения стабилизированной связывающей молекулы с увеличенной стабильностью (например, выходом) при экспрессии из клеток-хозяев по меньшей мере в 2 л, по меньшей мере в 10 л, по меньшей мере в 20 л, по меньшей мере в 50 л, по меньшей мере в 75 л, по меньшей мере в 100 л, по меньшей мере в 200 л или по меньшей мере в 500 л культуральной среды. В соответствии с примером реализации способы изобретения используются для получения по меньшей мере 10 мг стабилизированной связывающей молекулы на каждый литр культуральной среды.
X. Стабилизированные связывающие молекулы, включающие стабилизированные молекулы ксРу.
В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению представляет собой химерный белок. Например, стабилизированную молекулу ксРу изобретения можно связать со второй молекулой ксРу или молекулой не ксРу. В соответствии с одним вариантом осуществления молекула не ксРу, с которой может быть связана стабилизированная молекула ксРу изобретения, включает по меньшей мере один дополнительный сайт связывания. Например, сайты связывания, которые возможно ввести в связывающую молекулу изобретения, включают рецепторсвязывающий участок лиганда, лигандсвязывающий участок рецептора, субстратсвязывающий фрагмент фермента, ферментсвязывающий фрагмент субстрата или один или более антигенсвязывающих участков антитела. Молекулы ксРу можно связать, например, с молекулами антител с формированием модифицированных молекул антител или с другими пептидами с формированием химерных белков. Ниже описано несколько примеров этих процессов.
А. Модифицированные молекулы антител.
В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная молекула ксРу изобретения связывается с антителом или его фрагментом с формированием стабилизированного белка связывания, которые представляет собой модифицированное антитело. В соответствии с другим вариантом осуществления стабилизированная ксРу изобретения связывается с модифицированным антителом, т.е. не встречающейся в природе молекулой антитела, с формированием стабилизированного белка связывания. Ниже подробнее описаны предпочтительные конструкты из модифицированных антител. Термин модифицированное антитело здесь включает синтетические формы антител, измененных таким образом, чтобы они не встречались в природе, например антитела, включающие по меньшей мере два фрагмента тяжелой цепи, но не две полные тяжелые цепи (например, антитела без доменов или мини-тела); полиспецифичные формы антител (например, биспецифичные, триспецифичные и т.д.), измененные так, чтобы связывать два или больше различных антигенов или два разных эпитопа на одном антигене. Кроме того, термин модифицированное антитело включает поливалентные формы антител (например, трехвалентные, четырехвалентные и т.д. антитела, связывающиеся с тремя или больше копиями одного антигена).
Необходимо понимать, что при описании связывающих молекул изобретения описываемые здесь особенности связывания можно реализовать, введя стабилизированную молекулу ксРу изобретения, связывающую молекулу, включающую молекулу ксРу изобретения или и то, и другое.
В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированные связывающие белки изобретения могут быть иммунореактивны с одним или более опухолевыми антигенами или антигенами, ассоциированными с иммунными расстройствами. Например, для неопластических расстройств сайт связывания (т.е. вариабельная область, иммунореактивный фрагмент или их рекомбинант) рассматриваемой связывающей молекулы связывается с выбранным ассоциированным с опухолью антигеном в месте злокачественного новообразования. Аналогично, в соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула может связываться по меньшей мере с одним избранным маркером, присутствующим в иммунных клетках. С учетом числа известных антигенов, ассоциированных с неоплазиями и иммунными расстройствами, и числа связанных с ними антител, специалист поймет, что раскрываемые в настоящем
- 60 015992 изобретении молекулы могут быть получены из любого из множества антител. Обобщая, можно сказать, что используемые в настоящем изобретении полипептиды могут быть получены из любого антитела (включая описанные ранее в литературе), которые реагируют с молекулой или маркером, ассоциированным с выбранным состоянием. Далее, родительские антитела, антитела-предшественники и их фрагменты, используемые для генерации стабилизированных связывающих молекул изобретения, могут быть мышиными, человеческими, химерными, гуманизированными, из нечеловеческих приматов и приматизированными.
Термин антигены, ассоциированные с опухолями здесь включает антигены, которые в целом ассоциированы с опухолевыми клетками, например экспрессируются в опухолевых клетках. Обобщая, можно сказать, что антигены, ассоциированные с опухолями, включают антигены, предусмотренные для локализации иммунореактивных антител в неопластических клетках, независимо от их экспрессии в незлокачественных клетках. Такие антигены могут быть относительно специфичны для опухоли, например их экспрессия может быть ограничена поверхностью злокачественных клеток. Альтернативно, такие антигены могут содержаться как в злокачественных, так и в незлокачественных клетках. Например, СЭ20 предсталяет собой антиген пан-В, включающийся на поверхности как злокачественных, так и незлокачественных В-клеток, который оказался чрезвычайно эффективной мишенью для иммунотерапевтических антител при лечении лимфоны не-Ходжкинса. В этом отношении пан-Т-клеточные антигены, такие как СИ2, СИ3, СЭ5, СЭ6 и СЭ7, также содержат антигены, ассоциированные с опухолями, попадающие в область настоящего изобретения. Другие примеры ассоциированных с опухолями антигенов включают, но не ограничиваются, МА6Е-1, МА6Е-3, МИС-1, нРУ 16, нРУ Е6 и Е7, ТА6-72, СЕА, Ь6-антиген, СИ19, СЭ22, СЭ37, СЭ52, нЬА-ИК, Е6Р-рецептор и нЕК2-рецептор. Об иммунореактивных антителах для каждого из этих антигенов часто сообщалось в публикациях. Специалисты понимают, что каждое из этих антител может служить предшественником антител изобретения в соответствии с настоящим изобретением.
В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированные связывающие молекулы изобретения предпочтительно ассоциированы и связываются с описанными выше антигенами, ассоциированными с опухолями и иммунитетом. Соответственно как более подробно рассматривается далее, стабилизированные связывающие молекулы настоящего изобретения можно выделить, сгенерировать или изготовить из любого из множества антител, реагирующих с антигенами, ассоциированными с опухолями. В соответствии с определенными аспектами стабилизированные связывающие молекулы изобретения представляют собой антитела без доменов, которые получают обычными способами генетической инженерии, причем по меньшей мере один или более доменов константных областей удалены или заменены, так чтобы получить желательные биохимические характеристики, такие как сниженный период полужизни в сыворотке. Более конкретно, специалист легко может выделить генетическую последовательность, соответствующую вариабельным и/или константным областям стабилизированной связывающей молекулы, и изменить или удалить соответствующие нуклеотиды с получением полипептидов изобретения для использования в виде мономерных субъединиц в соответствии с настоящим изобретением.
Известные антитела, реагирующие с ассоциированными с опухолями антигенами, могут быть стабилизированы, как описано здесь, с получением стабилизированных связывающих молекул настоящего изобретения. Примеры антител, которы могут использоваться для получения антигенсвязывающих областей с целью генерации или выделения описанных здесь стабилизированных связывающих молекул, включают, но не ограничиваются, 2В8 и С2В8 (Зевалин® и Ритуксан®, ЮЕС Рйагтасеийсак Согр., 8ап И1едо), Ьут 1 и Ьут 2 (ТесНтс1опе), ЬЬ2 Цттипотейюк Согр., №\у Легзеу), нЕК2 (Герцептин®, 6епеп1есН Шс., 8ои1Н 8ап Ргапсксо), В1 (Бексар®, Сои11ег РНагт., 8ап Ргапсксо), Кампат® (МШептит РНагтасеийсак, СатЬгйде), абаговомаб (Мепапш, Йа1у), СЕА-8сап™ (Iттипотеά^С8, Моггк Р1ат8, N1), капромаб (РютЛаксш!®, Су1одеп Согр.), едреколомаб (Рапогех®, ЛоНпзоп & ЛоНнзоп, №\у Вгипзгюк, N1), иговомаб (08 Вю Ιπίί., Ргапсе), митумотмаб (ВЕС2, Тте1опе 8у§1ет5, 8отегуй1е, N1), нофетумомаб (Уег1ита®, Воейгтдег Ι^Κ^™, КИдейеИ, СТ), ОваРекс (АИагех Согр., ^аИйат, МА), сатумомаб (0позС1п(®, Су!одеп Согр.), цеткусимаб (ЕгЬйих®, Тшс1опе 8у§1ет5, №\у Уогк, NΥ), бевацизумаб (АУА8ТШ®, 6епеп1есН Шс., 8. 8ап Ргапсксо, СА), аполизумаб (КЕМIΤ06ЕN™, РгсИет ИезЛдп ЬаЬз, Ргетоп!, СА), лабетузомаб (СЕАСЮЕ'™, Iттипотеά^С8 Шс., Моггк РЫпз, N1), пертузумаб (0ММТАК6™, 6епеп1есН Шс., 8. 8ап Ргапсксо, СА), МВ1, ВН3, В4, В72,3 (Су!одеп Согр.), СС49 (№Июпа1 Сапсег ТпзЙи^е) и 5Е10 (ишуегзЕу оГ Шга). Другие сайты связывания, которые можно включить в связывающие мишень молекулы, выбирают в следующем списке: Ортоклон ОКТ3 (СИ3), РеоПро (6р11Ь/д11а), Зепанах (С25), Ремикад (Т№-а), Симулект (СИ25), Синагис (К8У), Милотарг (СИ33) и Кампат (СИ52). В соответствии с предпочтительными аспектами стабилизированные связывающие молекулы настоящего изобретения связываются с такими же ассоциированными с опухолями антигенами, как и перечисленные выше антитела. В соответствии с особенно предпочтительными аспектами стабилизированные связывающие молекулы получены из (и связаны с) одними и теми же антигенами, такими как 2В8, С2В8, СС49 и С5Е10, и даже более предпочтительно в них полностью или частично отсутствует домен Сн2.
- 61 015992
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению может содержать один или более сайтов связывания, полученных из одного или более следующих антител: тоситумомаб (Бекксар®), муромонаб (ОРТОКЛОН®) и ибритумомаб (ЗЕВАЛИН®), цетуксимаб (ЕРБИТУБ™), ритуксимаб (МАБТЕРА®/РИТУКСАН®), инфликсимаб (РЕМИКАД®), абциксимаб (РЕОПРО®) и базиликсимаб (СИМУЛЕКТ®), ефализумаб (РАПТИВА®), бевацизумаб (АВАСТИН®), алемтузумаб (КАМПАТ®), трастузумаб (ГЕРЦЕПТИН®), гемтузумаб (МИЛОТАРГ®), паливизумаб (СИНАГИС®), омализумаб (КСОЛАИР®), даклизумаб (ЗЕНАПАКС®), натализумаб (ТИЗАБРИ®) и ранибизумаб (ЛУВЕНТИС®), адалимумаб (ХУМИРА®) и панитумумаб (ВЕКТИБИКС®).
В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению связывается с С.'Э23 (И8 патент 6011138). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению связывается с тем же эпитопом, что и антитело 5Е8. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один СОЯ (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 СОЯ) из анти-СЭ23 антитела, например антитела 5Е8.
В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению связывается с ТИЕ-рецептором. В соответствии с одним примером реализации стабилизированная связывающая молекула по изобретению связывается с Ы^Я. В соответствии с другим примером реализации стабилизированная связывающая молекула по изобретению связывается с ТЯАГЬрецептором. В соответствии с другим вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению включает по крайней мере один СОЯ (например, по крайней мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 СОЯ) из анти-ТЯА1Ь-Я2 антитела (например, мышиного или химерного 14 А2). В соответствии с другим вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению включает по крайней мере один СОЯ из анти-ЬТвЯ антитела. Примеры анти-ЬТвЯ антител включают ВКА11, СОН10, ВС66, А6Н1, В1)А8, СВЕ11 и ВНА10.
В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению связывается с СЯ1РТ0-1 антигеном (\У0 02/088170 А2 или \У0 03/083041 А2). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению связывается с тем же эпитопом, что и В3Е6 антитело. В соответствии с другим вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению включает по крайней мере один СОЯ из анти-СЯ1РТ0-1 антитела, например В3Е6 антитела.
В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула связывается с тем же ассоциированным с опухолью антигеном, что и Ритуксан®. Ритуксан® (также известный как ритуксимаб, ГОЕС-С2В8 и С2В8) был первым одобренным ЕЭА моноклональным антителом для лечения человеческой лимфомы В-клеток (см. патенты США № 5843439; 5776456 и 5736137, каждый из которых включен сюда по ссылке). У2В8 (90Υ меченый 2В8; Зевалин®; ибритумонаба тиуксетан) представляет собой мышиного предка С2В8. Ритуксан® - это химерное, анти-СЭ20 моноклональное антитело, которое ингибирует рост и согласно имеющейся информации сенситизирует определенные клетки лимфомы к апоптозу под действием химиотерапевтических агентов ш νίΙΐΌ. Антитело эффективно связывается с человеческим комплементом, проявляет сильное связывание ЕсЯ и может эффективно убивать человеческие лимфоциты ш νίΙΐΌ посредством как комплемент-зависимого (СОС), так и антителозависимого (АЭСС) механизмов (ЯеЕЕ е1 а1., В1ооб 83: 435-445 (1994)). Специалисты понимают, что димерные варианты (гомодимеры или гетеродимеры) С2В8 или 2В8, модифицированные в соответствии с настоящим изобретением, могут использоваться в конъюгированной или неконъюгированной формах для эффективного лечения пациентов с опосредованными СЭ20+ злокачественными новообразованиями. Обобщая, необходимо понимать, что рассматриваемая здесь стабилизированная связывающая молекула может использоваться как в голом, или неконъюгированном состоянии, так и быть конъюгирована с цитотоксическим агентом для эффективного лечения любого из расстройств.
В соответствии с другими предпочтительными аспектами настоящего изобретения стабилизированная связывающая молекула по изобретению получается из или связывается с тем же ассоциированным с опухолью антигеном, что и СС49. СС49 связывается с человеческим ассоциированным с опухолью антигеном ТА6-72, который ассоциирован с поверхностью некоторых опухолевых клеток человеческого происхождения, конкретно, линии клеток Ь8174Т. Ь8174Т [Атепсап Туре СиЙиге Со11есбоп (йегет АТСС) № С'|, 188] представляет собой вариант линии клеток аденокарциномы толстого кишечника Ь8180 (АТСС № Съ 187).
Следует также понимать, что было разработано множество мышиных моноклональных антител со специфичностью связывания с ТА6-72. Одно из этих моноклональных антител, а именно В72.3, представляет собой мышиный 1д61, полученный из гибридомы В72.3 (АТСС № НВ-8108). В72.3 представляет собой моноклональное антитело первого поколения, разработанное с использованием экстракта карциномы молочной железы человека как иммуноген (см. Со1сйег е1 а1., Ргос. №И. Асаб. 8сЕ (И8А), 78:31993203 (1981); патенты США № 4522918 и 4612282, все эти работы влючены сюда по ссылке). Другие моноклональные антитела, направленные против ТА6-72, помечены как СС (для рака толстого кишечни
- 62 015992 ка). Как описано в работе 8с111от е1 а1. (патент США № 5512443, которая влючена сюда по ссылке), моноклональные СС антитела представляют собой семейство мышиных моноклональных антител второго поколения, полученных с использованием ТАС-72, очищенных с помощью В72,3. Из-за своего относительно хорошего сродства связывания с ТАС-72 следующие СС антитела были включены в АТСС, и к ним открыт ограниченный доступ: СС49 (АТСС № НВ 9459); СС83 (АТСС № НВ 9453); СС46 (АТСС № нВ 9458); СС92 (АТТСС № НВ 9454); СС30 (АТСС № НВ 9457); СС11 (АТСС № 9455); СС15 (АТСС № НВ 9460). Патент υ.δΡ.Ν. 5512443 также показывает, что рассматриваемые там антитела можно превратить в их химерные формы, замещая, например, домены человеческих константных областей (Ес) на мышиные константные области рекомбинантными способами ДНК, известными в уровне техники. Помимо описанных мышиных и химерных анти-ТАС-72 антител, 8с111огп е1 а1. получили также варианты гуманизированного СС49 антитела, как описано в работе РСТ/и899/25552, и одноцепочечные конструкты, как описано в патенте США № 5892019, каждая из которых включена сюда по ссылке. Специалисты понимают, что каждое из описанных антител, конструктов и рекомбинантов, а также их вариаций можно модифицировать и использовать для получения полипептидов в соответствии с настоящим изобретением.
Помимо описанных выше анти-ТАС-72 антител, разнообразные группы исследователей сообщали о конструкциях и частично характеризовали бездоменные СС49 и 1372,3 антитела (например, Сако е1 а1. Сапсег ВюШегару, 8(1):95-109 (1993), 81аут-СЫобш е! а1. Ιηΐ. I. Сапсег 53:97-103 (1993) и 81ауш-СЬюпп1 е! а1. Сапсег. Вез. 55:5957-5967 (1995)).
Остальные предпочтительные аспекты настоящего изобретения содержат сайты связывания, производные от и связывающиеся с теми же опухоль-ассоциированными антигенами, что и С5Е10. Как отмечено в совместно поданной заявке 09/104717, С5Е10 представляет собой антитело, распознающее гликобелковую детерминанту весом приблизительно 115 кДа, специфичную для клеточных линий рака простаты (например, Όυ145, РС3 или ΝΏ1). Так, в соответствии с настоящим изобретением, стабилизированные связывающие молекулы (например, антител без Сн3 доменов), которые специфично связываются с таким же ассоциированным с опухолью антигеном, распознаваемым С5Е10 антителами, можно получить и использовать в конъюгированной или неконъюгированной форме для лечения неопластических расстройств. В соответствии с особо предпочтительными аспектами стабилизированная связывающая молекула является производной (или включает весь или часть антигенсвязывающей области от С5Е10 антитела, выделяемого из клеточной линии гибридомы с АТСС № РТА-865). Полученная стабилизированная связывающая молекула может затем быть конъюгирована с радионуклидом, как описано ниже, и введена пациенту, больному раком простаты, в соответствии с описанными здесь способами.
В соответствии с вариантами осуществления стабилизированная связывающая молекула изобретения включает по крайней мере одну описанную здесь специфичность связывания, например описанную в секции С. В соответствии с другим вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению может связываться с молекулой интересующей мишени, например, описанной здесь, например, в секциях В или С.
Ранее известные антитела, реагирующие с антигенами, которые ассоциированы с расстройствами иммунных клеток (например, расстройствами В-клеток), могут быть стабилизированы, как описано здесь, образуя стабилизированные связывающие молекулы настоящего изобретения. Примеры антител, которые могут использоваться для получения антигенсвязывающих областей с последующей генерацией и извлечением описываемых здесь стабилизированных связывающих молекул, включают, но не ограничиваются, анти-ТИЕа антитело (например, инфликсимаб (Ремикад®, Центокор, Хоршам, РА); МАК195Е (АЬЬоб ЬаЬз., АЬЬоб Рагк, Ш); адалимумаб (Хумира®, АЬЬоб ЬаЬз, АЬЬоб Рагк, Ш)); анти-СЭ3 антитело (например, Ортоклон (ОКТ3®, ОйкоВюЮск Вббдетеа!ег, ΝΕ); МЕПЕ500 (МеЛттипе, Са1!йегзЪигд, МО); визилизумаб (Νυ УЮША Рго1ет Оезфп ЬаЬз (Егетоп!, СА, и8А)); анти-ΙβΕ антитело (например, омализумаб, ХОЬАШ®, СепегИеск 8ои1к 8ап Егапс1зсо, СА); анти-УЪА-4 антитело (например, ТИСАБРИ, ВюдепИес, СатЬббде, МА); анти-СЭ147 антитело (например, АВХ-СВЬ (АЬдешх, Егетоп!, СА)); анти-СО25 антитело (например, базиликсимаб, 8ппи1ес1® (Еаз! напоуег, ΝΕ); инолиномаб (ОРЕ Егапсе)); анти-СО18 антитело (например, одулимомаб, Антилфа®, Ра!еиг Мегшех, Егапсе); анти-1МСА90 (например, сулесомаб, Лейкоскан®, Iттиηοтеά^сз, Могбз Р1атз, ΝΕ); анти-Ср11Ь/д11а антитело (например, абциксимаб, РеоПро®, Центокор, Хоршам, РА); анти-С25 антитело (например, Зенапакс); анти-СР33 антитело (например, Милотарг) и анти-СО25 антитело (например, алемтузумаб, Кампат® (МШепеит Рйагтасеибсак, СатЬббде, МА)). В соответствии с предпочтительными аспектами стабилизированная связывающая молекула настоящего изобретения связывается с теми же ассоциированными с иммунными клетками антигенами, что и антитела, перечисленные в этом абзаце.
В соответствии с одним вариантом осуществления термин модифицированное антитело в соответствии с настоящим изобретением включает иммуноглобулины, антитела или их иммунореактивные фрагменты или рекомбинанты, в которых по крайней мере часть одного или более константных областей доменов была удалена или изменена другим способом, так чтобы получить требуемые биохимические характеристики, такие как способность к нековалентной димеризации, улучшенная способность локали
- 63 015992 зации в сайте опухоли или сниженный период полужизни в сыворотке по сравнению с целым, неизмененным антителом, приблизительно такой же иммуногенности. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления полипептиды настоящего изобретения представляют собой бездоменные антитела, включающие полипептидную цепочку, подобную тяжелой цепи иммуноглобулина, но в которых отсутствует по меньшей мере часть одного или нескольких доменов тяжелой цепи. В соответствии с одним вариантом осуществления один целый домен константной области стабилизированного белка связывания будет удален. В соответствии с другим вариантом осуществления удаляются все или часть Сц3 домена.
В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированные белки связывания изобретения представляют собой мини-тела. Мини-тела представляют собой димерные молекулы, состоящие из двух полипептидных цепочек, каждая из которых включает стабилизированную молекулу ксРу (один полипептид включает один или более антигенсвязывающих сайтов, например, Уь домен связан гибким линкером с νΗ доменом, гибридизованным с Си3 доменом с помощью связывающего пептида).
Мини-тела можно получать, конструируя компонент ксРу и связывающий пептид-Сц3 компонент, используя описанные в уровне техники способы (см., например, патент США № 5837821 или \У0 94/09817А1). Эти компоненты можно выделить из различных плазмид как фрагменты рестрикции и затем лигировать и реклонировать в соответствующий вектор. Верифицировать правильную сборку можно рестрикционным поглощением и анализом последовательности ДНК.
В соответствии с другим вариантом осуществления можно сконструировать четырехвалентное мини-тело. Четырехвалентные мини-тела конструируют таким же способом, что и мини-тела, но только две молекула ксРу связывают гибким линкером, например, включающим аминокислотную последовательность (С48)4С3А8.
В соответствии с одним вариантом осуществления четырехвалентные антитела можно получить, комбинируя кодирующие антитело последовательности ДНК с молекулой ксРу. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления эти последовательности объединяют так, что молекула ксРу оказывается связанной со стороны своего Ν-конца с Си3 доменом антитела через гибкий линкер (например, д1у/кег линкер, такой как (С1у48ег)3).
В соответствии с еще одним вариантом осуществления четырехвалентное антитело можно изготовить гибридизацией стабилизированных молекул ксРу со связывающим пептидом, который гибридизован с Сц1 доменом с получением стабилизированной ксРу-РаЬ четырехвалентной молекулы (Со1ота и Моткоп, 1997, №!иге Вю!есйпо1оду. 15:159; \У0 95/09917).
В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению включает четырехвалентное или биспецифичное четырехвалентное антитело с ксРу со стороны Ν-конца легкой цепи. В соответствии с другим направлением реализации изобретения связывающая молекула включает четырехвалентное или биспецифичное четырехвалентное антитело без домена Си2 с ксРу со стороны Ν-конца тяжелой цепи. В соответствии с одним вариантом осуществления прикрепление ксРу к Ν-концу приводит к снижению агрегации молекул по сравнению с молекулами, у которых ксРу прикреплен к карбоксиконцу.
Антитела или их фрагменты, используемые в стабилизированных связывающих молекулах изобретения, могут быть получены с помощью известных протоколов. Например, сначала антитела выращивают в организме млекопитающих, делая им множественные подкожные или внутрибрюшинные инъекции соответствующего антигена (например, очищенных ассоциированных с опухолями антигенов или включающих такие антигены клетки или клеточные экстракты) и адъюванта. Эта иммунизация, обычно, вызывает иммунный ответ, включающий производство антиген-реактивных антител активированными спленоцитами или лимфоцитами. Хотя образующиеся антитела можно собрать в сыворотке животного и получить поликлональный препарат, часто бывает желательно изолировать индивидуальные лимфоциты из селезенки, лимфотических узлов или периферической крови, получив гомогенные препараты моноклональных антител (МаЬ). Предпочтительно выделять лимфоциты из селезенки.
В соответствии с этим хорошо известным способом (КоЫег е! а1., №!иге, 256:495 (1975)) относительно короткоживущие и смертные лимфоциты млекопитающих, которым были сделаны инъекции антигена, сплавляют с бессмертной опухолевой клеточной линией (например, линией миеломы), получая тем самым гибридные клетки или гибридомы, одновременно бессмертные и способные генерировать генетически закодированное антитело В-клеток. Полученные гибриды сегрегируют в отдельные клеточные штаммы, отбирая, разбавляя и заново выращивая каждый индивидуальный штамм, включающий специфичные гены для образования отдельного антитела. Они производят антитела, гомогенные относительно желательного антигена и по сравнению с их чистым генетическим предком называемые моноклональными.
Приготовленные таким способом клетки гибридомы высевают и выращивают в подходящей культуральной среде, предпочтительно включающей одно или более веществ, ингибирующих рост или выживание негибридизованных родительских клеток миеломы. Специалисты понимают, что реагенты, клеточные линии и среды для образования, селекции и роста гибридом коммерчески доступны из большого количества источников, а также установлены стандартизированные протоколы. В общем случае культу
- 64 015992 ральная среда, в которой растут клетки гибридомы, анализируется на производство моноклональных антител против желательного антигена. Предпочтительно, если специфичность связывания моноклональных антител из клеток гибридомы определяют иммуноосаждением или анализами ίη νίίΐΌ, такими как радиоиммуноанализ (К1А) или твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА или епхуте-бпкеб бптипоаЬкогЬегИ аккау (Ек-ΙδΛ)). После идентификации клеток гибридомы, производящих антитела желательной специфичности, сродства и/или активности, клоны можно субклонировать, ограничивая процедуры разбавления и роста стандартными способами (Собшд, Мопос1опа1 Антител: Рппар1ек и РгасЕсе, рр 59-103 (Асабетю Ргекк, 1986)). Необходимо понимать также, что моноклональные антитела, секретируемые субклонами, можно отделить от культуральной среды, удалить жидкость и сыворотку стандартными процедурами очистки, такими как, например, белок-А, гидроксилапатит хроматография, гельэлектрофорез, диализ или аффинная хроматография.
В соответствии с другим вариантом осуществления ДНК, кодирующие желательные моноклональные антитела, можно легко выделить и секвенировать обычными способами (например, с помощью олигонуклеотидных зондов, способных специфично связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Выделенные и субклонированные клетки гибридомы служат предпочтительным источником ДНК. После выделения ДНК можно поместить в векторы экспрессии, затем трансфицируемые в прокариотические и эукариотические клетки-хозяева, такие как Е.сой, обезьяньи клетки СΟδ, клетки яичников китайского хомячка (СНО) и клетки миеломы, которые в другом случае не производят иммуноглобулины. Более конкретно выделенную ДНК (которую можно и синтезировать описанными здесь способами) можно использовать для клонирования последовательностей константных и вариабельных областей для изготовления антител, как описано в работе Ые^тап е! а1., υδ Ра!. № 5658570, подана 25, 1995, включенной сюда по ссылке. Фактически, процесс включает в себя экстракцию РНК из выбранных клеток, преобразование ее в кДНК и амплификацию ее способом ПЦР с использованием 18специфичных праймеров. Подходящие для этой цели праймеры описаны в υδ Ра!. № 5658570. Как подробно обсуждается ниже, экспрессирующие желаемые антитела трансформированные клетки можно вырастить в относительно больших количествах, получив клинические и коммерческие источники иммуноглобулина.
Специалисты должны понимать, что ДНК, кодирующие антитела или их фрагменты (например, антигенсвязывающие сайты), можно также получить из библиотек фагов антител, например, по технологии рб рйаде или Рб рйадет1б. Примеры способов описаны, например, в ЕР 368684 В1; патент υδ 5969108, НоодепЬоот, Н.К. и Сйатек. 2000. 1ттипо1. Тобау 21:371; Ыаду е! а1. 2002. Ыа!. Меб. 8:801; Нше е! а1. 2001. Ргос. Ыа!1. Асаб. δα. ХА 98:2682; Ьш е! а1. 2002. I. Мо1. Вю1. 315:1063, каждый из которых включен сюда по ссылке. Некоторые публикации (например, Магкк е! а1. Вю/Тесйпо1оду 10:779-783 (1992)) описали производство человеческих антител высокого сродства способом тасования цепей, а также комбинаторной инфекцией и ίη νί\Ό рекомбинацией как стратегии конструирования больших библиотек фагов.
В соответствии с другим вариантом осуществления для замены бактериофага можно использовать рибосомальный дисплей в качестве платформы дисплея (см., например, Напек е! а1. 2000. Ыа!. Вю!есйпо1. 18:1287; ХУбкоп е! а1. 2001. Ргос. Ыа!1. Асаб. δα. 98:3750; или ΐΓνίη§ е! а1. 2001 I. 1ттипо1. Ме!1обк
248:31). В соответствии с еще одним вариантом осуществления библиотеки клеточной поверхности можно скринировать на наличие антител (Вобег е! а1. 2000, Ргос. Ыа!1. Асаб. δα. ХА 97:10701; ЭаидбеПу е! а1. 2000, I. 1ттипо1. Ме!1обк 243:211). Такие процедуры представляют собой альтернативу традиционным гибридомных технологиям выделения и последующего клонирования моноклональных антител.
В соответствии с другим направлением реализации настоящего изобретения сайт связывания связывающей молекулы изобретения можно получить из человеческого или в значительной степени человеческого антитела. Последние можно изготовить в трансгенных животных (например, мыши), неспособных к эндогенному производству иммуноглобулина (см., например, υδ Ра!. № 6075181, 5939598, 5591669 и 5589369, каждый из которых включен сюда по ссылке). Например, показано, что гомозиготное удаление областей, объединяющих тяжелые цепи антител в химерных и зародышевых линиях мутантных мышей, приводит к полному ингибированию эндогенной выработки антител. Перенос гена человеческого иммуноглобулина в такой зародышевый мутант приводит к продукции человеческого антитела после действия антигена. Другие предпочтительные способы генерации человеческих антител с помощью мыши δΟΌ описаны в υδ Ра!. № 5811524, который включен сюда по ссылке. Необходимо понимать, что связанный с этими человеческими антителами генетический материал можно также выделить и манипулировать с ним, как описано в настоящем изобретении.
Еще одно высокоэффективное средство генерации рекомбинантных антител описано в работе Ые^тап, Вю!есйпо1оду, 10: 1455-1460 (1992). Конкретно, этот способ приводит к генерации приматизированных антител, включающих вариабельные домены мартышки и константные последовательности человека. Эта работа включена сюда по ссылке во всей своей полноте. Более того, указанная техника описана также в υδ Ра!. № 5658570, 5693780 и 5756096, каждый из которых включен сюда по ссылке. В соответствии с другим вариантом осуществления лимфоциты можно выбрать путем микроманипулирования и изоляции вариабельных генов. Например, моноядерные клетки периферической крови можно
- 65 015992 выделить из иммунизированного млекопитающего и выращивать ίη νίίτο около 7 дней. Культуры затем скринируют на наличие специфичных [§С. соответствующих критериям скрининга. Можно выделять клетки из ячеек с положительным ответом. Индивидуальные ^-продуцирующие В-клетки выделяют способом ЕЛС8 или идентифицируя их путем анализа способом комплемент-опосредуемых гемолитических плашек, ^-продуцирующими В-клетками можно манипулировать в пробирке, амплифицируя гены νΗ и Ж, например, способом ЯТ-РСЯ. Гены νΗ и ν4 можно клонировать в вектор экспрессии антитела и трансфицировать в клетки (например, эукариотические или прокариотические) для экспрессии.
Более того, генетические последовательности, пригодные для продукции связывающих молекул настоящего изобретения, можно получить из большого количества разнообразных источников. Например, как широко рассматривалось выше, большое количество генов человеческих антител доступно в публичных хранилищах. Опубликовано множество последовательностей антител и антител-кодирующих генов, и подходящие гены антител можно химически синтезировать из этих последовательностей известными способами, методики синтеза олигонуклеотидов, совместимые с этим аспектом изобретения, хорошо известны специалистам, и их можно выполнить в любом из нескольких коммерчески доступных автоматизированных синтезаторов. Кроме того, последовательности ДНК, кодирующие описанные здесь тяжелые и легкие цепи различных типов, можно получить у коммерческих производителей. Полученный любыми из описанных выше способов генетический материал можно затем изменять с получением полипептидов настоящего изобретения.
Альтернативно, продуцирующие антитела клеточные линии можно выбрать и выращивать способами, хорошо известными квалифицированным специалистам. Такие технологии описаны в большом количестве лабораторных руководств и первичных публикаций. В этом отношении описанные далее подходящие для использования в настоящем изобретении способы приведены в работе СиггегИ Рго1осо1е ίη Iттиηο1οду, Сойдап е1 а1., Ебе., Сгееп РиЬйеЫпд Лееос1а1ее и ^йеу-1п1егес1епсе, 1оЬп ^11еу и 8опе, №те Уогк (1991), которая включена сюда по ссылке во всей своей полноте, включая приложения.
Понятно также, что область настоящего изобретения охватывает стабилизированные связывающие молекулы, включающие аллели, варианты и мутации известных антигенсвязывающих последовательностей ДНК и стабилизированных молекул есЕν изобретения.
Как хорошо известно, РНК могут быть выделены из первоначальных клеток гибридомы или из других трасформированных клеток стандартными способами, такими как экстракция и осаждение гуанидин изотиоцианатом с последующим центрифугированием или хроматографией. При желании, из общей РНК можно выделить мРНК стандартными способами, такими как хроматография на олиго дТ целлюлозе. Соответствующие технологии известны в уровне техники.
В соответствии с одним вариантом осуществления кДНК, кодирующая легкую и тяжелую цепи антитела, можно сделать, одновременно или по отдельности, с использованием обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы в соответствии с хорошо известными способами. ПЦР можно инициировать праймерами консенсусного константной области или более специфичными праймерами, основанными на опубликованных данных о ДНК и аминокислотных последовательностях тяжелых и легких цепей. Как уже рассматривалось выше, ПЦР можно также использовать для выделения клонов ДНК, кодирующих легкие и тяжелые цепи антител. В этом случае библиотеки можно скринировать консенсусными праймерами или более крупными гомологичными зондами, такими как зонды мышиных константных областей.
ДНК, обычно плазмидную ДНК, можно выделить из клеток известными способами, рестрикционно картировать и секвенировать в соответствии со стандартными, хорошо известными методиками, подробно описанными, например, в следующих далее ссылках. Конечно, ДНК можно синтезировать в соответствии с настоящим изобретением в любой момент процесса выделения или последующего анализа. Примеры антител или их фрагментов для использования в связывающих молекулах изобретения включают антитела, распознающие описанные далее мишени.
В соответствии с определенными аспектами антигенсвязывающие фрагменты антител можно продуцировать с помощью хорошо известных технологий.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению может содержать молекулу антитела и стабилизированную молекулу есЕν. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению может содержать фрагмент молекулы антитела и стабилизированную молекулу есЕν.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает фрагмент антитела и стабилизированную молекулу есЕν. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению может содержать антитело без домена и стабилизированную молекулу есЕν. Антитело без домена представляет собой молекулу антитела, в котором один или больше доменов частично или полностью удалены. В соответствии с особо предпочтительными аспектами совместимые стабилизированные связывающие молекулы содержат конструкты без доменов или их варианты, у которых удален весь домен Сн2 (Сн3 конструкты). В соответствии с другими предпочтительными аспектами короткий связывающий пептид можно заместить удаленным доменом, чтобы обеспечить гибкость и свободу перемещения вариабельной области. Специалисты понимают, что такие конструкты особо предпочтительны в связи с регулирующими свойствами Сн3 домена на скорость ката
- 66 015992 болизма антитела.
Конструкты с удаленными доменами можно получить с помощью вектора (например, от ШЕС Р11агтасеи11са1к. 8ап О1едо), кодирующего 1дС 1 человеческий константный домен (см., например, УО 02/060955А2 и УО 02/096948А2). Следует отметить, что эти примеры конструктов были сконструированы, чтобы сплавить Сн3 домен непосредственно с окраинной областью соответствующих полипептидов изобретения. В случае других конструктов может быть желательно ввести пептидный спэйсер между окраинными областями и синтетическими доменами Сн3 и/или Сн3. Например, совместимые конструкты можно экспрессировать, если был удален домен Сн3, а оставшийся Сн3 домен (синтетический или несинтетический) объединен с окраинными областями 5-20 аминокислотным спэйсером. Такой спэйсер можно добавить, например, чтобы гарантировать, что регуляторные элементы константного домена остаются свободными и доступными, или что окраинный область остается гибким. Например, можно использовать конструкт без домена В3Р6 с коротким аминокислотным спэйсером, замещенным доменом Сн3, и нижними окраинными областями (В3Р6.(Сн3 [д1у/кег])). Известны и другие примеры связывающих пептидов (см., например, 1п!егпа!юпа1 РСТ Арр1юа!юп Ыок. УО 2005/000898 и УО 2005/000899). Эти пептиды можно использовать совместно со связывающими молекулами изобретения. Предпочтительно, если связывающий пептид используется с полипептидом, в котором отсутствует домен тяжелой цепи СН2. Предпочтительно, чтобы любой связывающий пептид, совместимый с настоящим изобретением, был относительно не-иммуногенным и не ингибировал нековалентную ассоциацию полипептидов изобретения.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает тяжелую цепь иммуноглобулина с делециями или заменами нескольких или даже одного аминокислотного остатка, если только она разрешает желательную ковалентную или нековалентную ассоциацию между мономерными субъединицами. Например, мутации одного аминокислотного остатка в выбранных областях Сн3 домена может оказаться достаточно, чтобы существенно снизить Рс связывание и, тем самым, увеличить локализацию опухоли. Аналогично, может быть желательно просто удалить ту часть одного или нескольких доменов константных областей, которые контролируют модулируемую эффекторную функцию (например, связывание комплемента).
Такие пространственные делеции константных областей могут улучшить избранные характеристики антитела (период полужизни в сыворотке), оставив интактными другие желательные функции, ассоциированные с доменом константной области. Более того, как показано выше, константные области описываемых антител могут быть синтетическими в связи с мутацией или заменой одной или нескольких аминокислот, которые усиливают профиль полученного конструкта. В этом отношении можно разрушить активность, вносимую консервативным сайтом связывания (например, Рс-связывания), сохраняя конфигурацию и иммуногенный профиль стабилизированной связывающей молекулы. Дополнительные предпочтительные аспекты могут включать добавление одной или нескольких аминокислот к константной области, чтобы усилить желательные характеристики, такие как эффекторную функцию, и получить больше цитотоксинов и углеводов в среде. В соответствии с такими аспектами может быть желательно включить или реплицировать специфичные последовательности, взятые из выбранных доменов константной области.
Известно в уровне техники, что константная область опосредует несколько эффекторных функций. Например, связывание с антителами компонента С1 комплемента активирует комплементарную систему. Активизация комплемента важна для опсонизации и лизиса клеточных патогенов. Активизация комплемента также стимулирует воспалительный ответ и может быть вовлечена в аутоиммунную гиперчувствительность. Более того, антитела связываются с клетками через область Рс, причем Рс-рецепторный сайт области связывается с Рс рецептором (РсК) клетки. Существует множество рецепторов Рс, специфичных для различных классов антител, включая 1дС (гамма рецепторы), 1дЕ (эпсилон рецепторы), 1дА (альфа рецепторы) и 1дМ (мю рецепторы). Связывание антитела с Рс рецепторами на клеточной поверхности запускает множество важных и разнообразных биологических ответов, включая поглощение и разрушение покрытых антителами частиц, очистку иммунных комплексов, лизис покрытых антителами клеток мишеней клетками-киллерами (называемый антителзависимой опосредуемой клетками цитотоксичностью или АОСС), высвобождение медиаторов воспаления, проход через плацентарный барьер и контроль над продукцией иммуноглобулинов.
В соответствии с одним вариантом осуществления эффекторные функции могут быть уничтожены или уменьшены с помощью константной области 1дО4 антитела, которое, как полагают, не может удалить клетки-мишени, или с помощью изготовления Рс вариантов, где остатки в области Рс, критичные для функций эффекторов, мутируются известными технологиями, например, 8. Ра!. № 5585097. Например, делеция или инактивация (посредством точечных мутаций или других средств) домена константной области может уменьшить связывание Рс рецептора циркулирующей стабилизированной связывающей молекулы, увеличивая локализацию опухоли. В других случаях может получиться, что модификации константной области, согласованные с настоящим изобретением, модерируют связывание комплемента и, тем самым, снижают время полужизни в сыворотке и неспецифичную ассоциацию конъюгированного цитотоксина. Другие модификации константной области могут использоваться для модификации ди
- 67 015992 сульфидных связей или молекул олигосахаридов, которые обеспечивают усиленную локализацию благодаря повышенной специфичности к антигену или гибкости антитела. Обобщая, специалисты понимают, что модифицированные описанным здесь способом антитела могут проявлять множество тонких эффектов, которые могут быть или не быть легко заметны. Однако получаемый физиологический профиль, биодоступность и другие биохимические последствия сделанных модификаций, такие как локализация опухоли, биодистрибуция и полужизнь в сыворотке, можно легко измерить и оценить количественно хорошо известными иммунологическими способами без излишнего экспериментирования.
В соответствии с одним вариантом осуществления модифицированные формы антител можно приготовить из целого предшественника или родительского антитела с помощью известных в уровне техники способов. Далее более подробно рассматриваются примеры таких способов.
В. Модифицированные химерные белки.
В соответствии с определенными аспектами стабилизированная связывающая молекула по изобретению представляет собой модифицированный химерный белок. В соответствии с одним примером реализации связывающая молекула по изобретению представляет собой модифицированный химерный белок, включающий стабилизированную молекулу ксРν, связанную с лигандсвязывающим участком рецептора, молекулой адгезии, лигандом или ферментом. В соответствии с другим примером реализации связывающая молекула по изобретению представляет собой химерный белок, включающий стабилизированную молекулу ксРν, связанную с рецепторсвязывающим участком лиганда. Например, связывающая молекула по изобретению представляет собой химерный белок, включающий стабилизированную молекулу ксРт с одной или более следующих молекул.
Цитокины и рецепторы цитокинов.
Цитокины оказывают плейротропные эффекты на пролиферацию, дифференциацию и функциональную активацию лимфоцитов. Различные цитокины и их рецепторсвязывающие участки могут использоваться в химерных белках изобретения. Примеры цитокинов включают интерлейкины (например, Ш-1, Ш-2, Ш-3, Ш-4, Ш-5, Ш-6, Ш-7, Ш-8, Ш-10, Ш-11, Ш-12, Ш-13 и Ш-18), колониестимулирующие факторы (С8Р) (например, гранулоцитарные С8Р(6-С8Р), гранулоцитарно-макрофагальные С8Р(6МС8Р) и моноцитарно макрофагальные С8Р (М-С8Р)), фактор некроза опухолей (ТЫР) альфа и бета, а также интерфероны, такие как интерферон-α, β или γ (патенты США № 4925793 и 4929554).
Рецепторы цитокинов, как правило, состоят из лиганд-специфичной альфа-цепи и общей бета-цепи. Примеры рецепторов цитокинов включают рецепторы 6М-С8Р, Ш-3 (патент США № 5639605), Ш-4 (патент США № 5599905), Ш-5 (патент США № 5453491), ΚΝγ (ЕР0240975) и ΤΝΕ-семейство рецепторов (например, ТЫРа, например, ТЫРЯ-1 (ЕР 417563), ТЫРЯ-2 (ЕР 417014) бета рецептор лимфотоксина).
В соответствии с другим вариантом осуществления молекула ксРт изобретения может связываться с цитокином или цитокиновым рецептором.
Белки адгезии.
Молекулы адгезии представляют собой мембранно-связанные белки, которые позволяют клеткам взаимодействовать друг с другом. В связывающие молекулы изобретения можно включать различные белки адгезии, включая рецепторы лейкоцитов и молекулы клеточной адгезии, или их рецепторсвязывающие комплексы. Рецепторы лейкоцитов экспрессируются на клеточной поверхности лейкоцитов при воспалении и включают а-1 интегрины (например, УЬА-1, 2, 3, 4, 5 и 6), опосредующие связывание с экстраклеточными компонентами матрицы, и в2-интегрины (например, ЬРА-1, ЬРАМ-1, СЯ3 и СЯ4), связывающиеся с молекулами клеточной адгезии (САМ) на эндотелии сосудов. Примеры САМ включают КАМ-1, КАМ-2, УСАМ-1 и МАйСАМ-1. Другие САМ включают представителей семейства селектинов, в том числе Е-селектин, Ь-селектин и Р-селектин.
В соответствии с другим вариантом осуществления молекула ксРт изобретения может связываться с белком адгезии или рецептором белка адгезии.
Хемокины.
Хемокины, хемотактические белки, которые стимулируют миграцию лейкоцитов к сайту инфекции или к их фрагментам, связанным с хемокиновыми рецепторами, также можно включать в связывающие молекулы изобретения. Примеры хемокинов включают макрофагальные воспалительные белки (МГР-1-а и МШ-1-β), хемотактический фактор нейтрофилов и ЯАЫТЕ8 (геди1а!еб оп асОтаОоп погта11у Т-се11 ехргеккей и кесге!ей).
В соответствии с другим вариантом осуществления молекула ксРт изобретения может связываться с хемокинами или их рецепторами.
Факторы роста и рецепторы факторов роста.
Факторы рости или их рецеторы (или их рецепторсвязывающие или лигандсвязывающие фрагменты) или молекулы, с которыми они связываются, также можно включать в связывающие молекулы изобретения. Примеры факторов роста включают ангиобелок, фактор роста сосудов эндотелия (Уакси1аг Епбо1йейа1 Сго\\111 Рас!ог (УЕСР)) и его изоформы (И8 Ра!. № 5194596); факторы роста эпидермиса (Ер1бегта1 Сго\\111 Рас!огк (ЕСРк)); факторы роста фибробластов (Р1ЬгоЬ1ак!ю Сго\\111 Рас!огк (РСР)), включая аРСР и ЬРСР; предсердный натрийуретический фактор (АЫР); факторы роста печени (нСРк;
- 68 015992 патенты США № 5227158 и 6099841); нейротропные факторы, такие как костные нейротропные факторы (ΒΌΝΡ), нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (ΝΓ-3, ΝΓ-4, ΝΓ-5 или ΝΓ-6) или фактор роста нервов, такие как Ν6Ρ-β тромбоцитарный фактор роста (ΡΌ6Ρ) (И8 Ра!. № 4889919, 4845075, 5910574 и 5877016); трансформирующие рост факторы (ТОР), такие как ТСР-альфа и ТСР-бета (УО 90/14359), остеоиндуктивные факторы, включая костный морфогенетический белок (ВМР); инсулин-подобные факторы роста-! и -II (ЮР4 и ЮР-П; патенты США № 6403764 и 6506874); эритропоэтин (ЕРО); фактор стволовых клеток (8СР), тромбопоэтин (с-ΜρI лиганд) и полипептиды Уп! (патент США № 6159462).
Примеры рецепторов факторов роста, которые могут использоваться, включают рецепторы ЕСР (ЕСРК); рецепторы УЕСР (например, Р1! 1 или Р1к1/КЭК), рецепторы РЭСР (УО 90/14425); рецепторы НОР (патенты США № 5648273 и 5686292); рецепторы ЮР (например, ЮРК1 и ЮРК2) и нейротропные рецепторы, включая рецепторы низкого сродства (Ь-ХСРК). также называемые р75№ГК или р75, которые связывают ΝΟΡ, ΒΌΝΡ и ΝΓ-3, а также рецепторы высокого сродства, входящие в состав !гк-семейства рецепторных тирозиновых киназ (например, РкА, !гкВ (ЕР 455460), !гкС (ЕР 522530)). В соответствии с другим вариантом осуществления ЮРК1 и УЕСР являются мишенями. В соответствии с еще одним вариантом осуществления УЪА4 и УЕСР являются мишенями. В соответствии с другим вариантом осуществления ЬРА1 и УЪА4 являются мишенями.
Другие рецепторы клеточной поверхности и/или их лиганды также могут быть мишенями (например, рецепторы семейства ТИР или их лиганды (как здесь описано в больших подробностях)).
В соответствии с другим вариантом осуществления молекула зсРу изобретения может связываться с фактором роста или рецептором фактора роста.
Гормоны.
Примеры гормонов роста или связываемых с ними молекул, которые могут использоваться как агенты мишеней в связывающих молекулах изобретения, включают ренин, гормон роста человека (нСн; патент США № 5834598), Ν-метионил гормона роста человека; бычий гормон роста; фактор высвобождения гормона роста; паратироидный гормон (РТН); тироидстимулирующий гормон (Т8Н); тироксин; проинсулин и инсулин (патенты США № 5157021 и 6576608); фолликулстимулирующий гормон (Р8Н), кальцитонин, лютеинизирующий гормон (ЬН), лептин, глюкагоны; бомбезин; соматропин; муллерианингибирующее вещество; релаксин и прорелаксин; гонадотропин-ассоциированный пептид; пролактин; плацентальный лактоген; белок ОВ; или муллериан-ингибирующее вещество.
В соответствии с другим вариантом осуществления молекула зсРу изобретения может связываться с гормоном или рецептором гормонов.
Факторы свертывания.
Примеры факторов коагулирования крови для использования в качестве агентов мишеней в связывающих молекулах изобретения включают факторы свертывания (например, факторы У, УП, УШ, X, IX, XI, XII и XIII, фактор Фон Виллебрандта); тканевой фактор (И8 Ра!. № 5346991, 5349991, 5726147 и 659684); тромбин и протромбин; фибрин и фибриноген; плазмин и плазминоген; активаторы плазминогена, такие как урокиназа или человеческая моча, или активатор плазминогена тканевого типа (Рззие-!уре р1а8Ш1подеп асРта!ог (ί-РА)).
В соответствии с другим вариантом осуществления молекула зсРу изобретения может связывать фактор свертывания.
В соответствии с другими аспектами стабилизированный связывающий белок изобретения представляет собой модифицированный иммуноадгезин. Как хорошо известно в уровне техники, иммуноадгезин представляет собой химерный белок, который комбинирует мишеньсвязывающую область рецептора, молекулу адгезии, лиганд или фермент с Рс-участком антитела.
Примеры иммуноадгезинов описаны, например, в патентах США № 5116964; 5428130; 5714147 и 6406697, каждый из которых включен сюда по ссылке. В соответствии с одним вариантом осуществления модифицированный иммуноадгезин изобретения формируется путем связывания стабилизированной молекулы зсРу с иммуноадгезином.
Иммуноадгезины, о которых сообщалось ранее, могут быть стабилизированы, как здесь описано, с получением модифицированных иммуноадгезинов настоящего изобретения. Примеры иммуноадгезинов, которые могут использоваться для генерации или получения рассматриваемых модифицированных иммуноадгезинов, включают, но не ограничиваются, абатацепт (Оренсия®, Вг1з!о1-Меуегз 8дшЬЬ, Рппсе!оп. ΝΡ), алефасепт (Атеν^νе®, Вюдеп1бес, СатЬпбде, МА), етанерцепт (ЕпЬге1®, Атдеп. ТРоизапб Оакз, СА), 8МАКТ™ анти-гамма Интерфрон (Рго!е1п Оезщп ЬаЬз, Ргетоп!, СА), 8МАКТ™ анти-Ь-Селектин (Рго!е1 п Оезщп ЬаЬз. Ргетоп!, СА), рилонацепт (Кедепегоп РРаттасеиРсак Шс., Татту!отеп, ΝΥ), регавирумаб (Ή-23, Те1| 1п Атепса, №\ν Υо^к, ΝΥ), К24 (№1Ропа1 Сапсег Р^ббРе (Ве!Резба, МО), Опрелвекин (ХЕСМЕСА®. СепеПсз ШзбШе, СатЬпбде. МА), ОНКОЛИЗИН В, ОНКОЛИЗИН СО6. ОНКОЛИЗИН М и ОНКОЛИЗИН 8 (все от IттипоСеп Рчс.. СатЬпбде, МА, И8А), ОНКОЛИМ™ 131 (ТесРпШопе Согр., ТизРп, СА), IттиΚАIΤ-^^2 Пттипотебюз Шс., Мотз Р1атз, ΝΡ), Ш-4 КА (ΒАΥ 16-9996; Вауег Согр., Вегке1еу, СА), Ш14 ЦСО8 СотрогаРоп, Во!Ре11, УА), СΥΤ-356-Υ-90 (ОХСОКАО®РК. Шоден Согр., Рппсе!оп. ΝΡ), КОТАРА™ (ТесРпШопе Согр., ТизРп, СА), СМВ-401 (Ууе!Р РРаттасеиРса1з, Маб1зоп, ΝΡ),
- 69 015992
АВИЦИДИН® конъюгат (№оВх Согр., 8еай1е, \УЛ) и анти-СИ18 иммуноадгезин (Сепеп!есй 1пс., 8. 8ап Ргапс1ксо, СА).
Другим примером молекул, которые можно включать в состав связывающей молекулы изобретения, является член номер 9 надсемейства иммуноглобулинов (ΙΟ8Ρ9; Сепотюк. 2002. 79:663-70).
С. Специфичность связывания.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению связывается с молекулой мишени, представленной на поверхности клетки, или растворимой.
В соответствии с одним вариантом осуществления по крайней мере одна специфичность связывания связывающей молекулы изобретения является каталитической. Ее можно создать известными способами (см., например, И8 Ра!. № 6590080 и 5658753). Каталитическая специфичность связывания функционирует по различным базовым механизмам, подобным тем, которые реализуются у ферментов для стабилизации переходного состояния, что снижает свободную энергию активации. Например, общие кислотные или основные остатки можно оптимально расположить в каталитическом активном сайте для участия в катализе; можно сформировать ковалентные фермент-субстратные интермедиа™; каталитические антитела также можно разместить в правильной ориентации для реакции и повысить эффективную концентрацию реагентов по крайней мере на семь порядков величины (Регкй!, Л.В., е! а1., Лт. Сйет. 8ос. 90 (1968):5833), что позволяет сильно снизить энтропию химической реакции. Наконец, каталитические антитела могут конвертировать энергию, полученную в результате связывания субстрата, чтобы направить реакцию в направлении структуры, напоминающей переходное состояние.
В соответствии с одним вариантом осуществления в сайт связывания можно включить кислотные или основные остатки, используя комплементарно заряженные молекулы в качестве иммуногена. Такая технология доказала свой успех в индукции антител с гаптеном, включающих положительно заряженный ион аммония (8йока!, е! а1., Сйет. 1п!. Еб. Епд1. 27 (1988):269-271).
В соответствии с другим подходом антитела можно превратить в стабильные соединения, напоминающие по размеру, форме и заряду переходное состояние требуемой реакции (т.е. аналоги переходного состояния). См. и8 Ра!. № 4792446 и 4963355, которые описывают использование аналогов переходного состояния для иммунизации животных и продукции каталитических антител. Оба эти патента включены сюда по ссылке. В соответствии с одним вариантом осуществления такие молекулы можно вводить как часть иммуноконъюгата, например, совместно с иммуногенной молекулой-носителем, такой как КЬН.
Например, каталитическая специфичность связывания может обладать, например, эстеразной активностью (вовлекающее заряженное переходное состояние, электростатические характеристики и характеристики формы которых можно имитировать фосфонатной структурой; 1асоЬк, е! а1., I. Лт. Сйет. 8ос. 109 (1987):2174-2176; ОшТог. е! а1., I. Лт. СКет. 8ос. 110 (1988):8713-8714; Тгатойапо, е! а1., I. Лт. СКет. 8ос. 110 (1988):2282; Ро11аск, е! а1., I. Лт. СКет. 8ос. 111 (1989):5961-5962); пептидазной или амидазной активностью (1апба, е! а1., 8с1епсе 241 (1988): 1188-1191; кегкоп. е! а1., 8с1епсе 243 (1989):11841188; Раи1, е! а1., 8с1епсе 244 (1989): 1158-1162); С1а1кеп геаггапдетеп! (1асккоп, е! а1., I. Лт. СКет. 8ос. 110 (1988):4841-4842; Нйуей, е! а1., Ргос. №ί1. Асаб. 8с1. И8Л 85 (1988):4953-4955; Нйуей, е! а1., I. Лт. СКет. 8ос. 110 (1988):5593-5594); катализировать восстановительные реакции (8йока!, е! а1., Лпдете. СКет. 1п!. Еб. Епд1. 27 (1989):269-271); фотохимическое расщепление тимидинового димера (Сосйгап, е! а1., I. Лт. СКет. 8ос. 110 (1988):7888-7890); стереоспецифичные перегруппировки трансэтерификации (№ррег, е! а1., 8с1епсе 237 (1987):1041-1043); а также синтез бимолекулярных амидов (Вепкоую, е! а1., Ргос. Ν!1. Лсаб. 8с1. И8Л 85 (1988):5355-5358; 1апба, е! а1., 8с1епсе 241 (1988):1188-1191).
В соответствии с другим подходом общую специфичность связывания можно мутировать, чтобы сделать ее каталитической.
Способы скрининга активности каталитического антитела хорошо известны в уровне техники (например, Веутопб, РЬ. 2002. 1оита1 о£ 1ттипо1одюа1 Ме!йобк 269:125; Моига!ои е! а1. 2002. I. о£ 1ттипо1одюа1 Ме!йобк. 269:147). В соответствии с еще одним вариантом осуществления каталитические Вклетки можно выбрать, например, как описано в патенте И8 ра!еп! 6590080, где используется молекула, конструируемая для облегчения селекции каталитических В-клеток.
В соответствии с другим вариантом осуществления каталитическая специфичность связывания может быть создана в двухстадийном процессе. Каталитические антитела выбираются, только если продемонстрированы следующие характеристики связывания: связывание как субстрата, так и реактивной группы таким способом, чтобы две группы находились в реактивном положении друг относительно друга. Во-вторых, отобранные антитела можно сконструировать химически, ковалентно связав реактивную группу с карманом связывания антитела. I. 1ттипо1 Ме!йобк. 2002. 269:81-98.
В соответствии с одним вариантом осуществления каталитическая специфичность связывания специфична для пролекарства. Такая специфичность связывания может использоваться для катализа превращения в лекарство, эффективное ш νίνο. Предпочтительно, если катализируемая реакция не может протекать под действием природных ферментов ш νίνο. Примеры активации пролекарств антителами хорошо известны в уровне техники (см., например, М1уакЫ!а е! а1. 1993. Ргос. №ί1. Лсаб. 8с1. И8Л 90:5337).
- 70 015992
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по крайней мере одну специфичность связывания для клетки мишени и по крайней мере одну специфичность связывания для пролекарства. Например, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению включает по крайней мере одну специфичность связывания для опухолевой клетки и по крайней мере одну специфичность связывания для пролекарства, которое может быть преобразовано в цитотоксическое лекарство. В соответствии с одним примером стабилизированная связывающая молекула по изобретению включает специфичность связывания для пролекарства карбамата 4-|Х№бис(2-хлороэтил)]аминофенил-№[(18-(1,3дикарбокси)пропил] карбамата и генерирует соответствующий цитотоксический азотвключающий препарат (\Уеп1\уог111 е1 а1. 1996. Ргос №111. Асаб. 86. И8А. 93:799).
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула вводится до введения пролекарственной формы, чтобы накопиться в сайте клетки-мишени. Примеры пролекарственных форм хорошо известны в уровне техники. Пролекарственные формы можно также синтезировать, включив в них фрагмент, который должен высвобождаться под действием катализатора, в качестве примера можно привести последовательную реакцию ретро-альдол/ретро-Михаэля, катализируемую антителом с альдолазной активностью (8ПаЬа1 е1 а1. 2001. Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А 98:7428). Такие маскирующие лекарства фрагменты можно получить, например, модификацией гидроксильной и тиоловой группы лекарства.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению полиспецифична, т.е. включает по крайней мере один сайт связывания, который связывается с первой молекулой мишени или эпитопом молекулы мишени, и по крайней мере еще один сайт связывания, который связывается со второй молекулой мишени, отличающейся от первой, или с вторым, отличающимся от первого, эпитопом первой молекулы мишени. В соответствии с определенными аспектами полиспецифичные связывающие молекулы изобретения (например, биспецифичные связывающие молекулы) содержат по крайней мере один сайт связывания из любого из антител, описанных здесь, например, в разделе А.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению биспецифична. Биспецифичные молекулы могут связываться с двумя различными сайтами связывания, например, на одной и той же молекуле мишени или на различных молекулах мишени. Например, в случае антител, биспецифичные молекулы могут связываться с двумя различными эпитопами, например, на одном и том же антигене или на двух различных антигенах. Биспецифичные молекулы могут использоваться, например, в диагностических и терапевтических применениях. Например, с их помощью можно иммобилизировать ферменты в иммуноанализах. Их можно применять также в диагностике и лечении рака, например, если они связываются с молекулой, ассоциированной с опухолью, и с регистрируемым маркером (например, хелатором, тесно связывающимся с радионуклидом).
Биспецифичные молекулы могут использоваться также для лечения людей, например, направляя цитотоксичность на конкретную мишень (например, связываясь с патогеном или опухолевой клеткой и с молекулой, запускающей цитотоксическое действие, такой как рецептор Т-клеток или рецептор Есу). Биспецифичные антитела можно использовать, например, в качестве фибринолитических агентов или адъювантов вакцин.
В соответствии с одним вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения включают по крайней мере одно плечо (т. е. сайт связывания), направленное против молекулы клеточной поверхности, и по крайней мере одно плечо, направленное против растворимой молекулы. В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичное антитело изобретения включает два сайта связывания растворимых молекул. В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичное антитело изобретения включает два сайта связывания молекул клеточной поверхности.
Полиспецифичные связывающие молекулы изобретения могут быть одновалентными для каждой специфичности или поливалентными (многовалентными) для каждой специфичности. В соответствии с одним вариантом осуществления биспецифичная связывающая молекула по изобретению может содержать один сайт связывания, который реагирует с первой молекулой мишени, и один сайт связывания, который реагирует со второй молекулой мишени (например, биспецифичная молекула антитела, химерный белок или мини-тело). В соответствии с другим вариантом осуществления биспецифичная связывающая молекула по изобретению может содержать два сайта связывания, которые реагируют с первой молекулой мишени, и два сайта связывания, которые реагируют со второй молекулой мишени (например, биспецифичное четырехвалентное антитело зсЕу2, четырехвалентное мини-тело или диатело).
В соответствии с определенными аспектами по крайней мере один сайт связывания полиспецифичной связывающей молекулы по изобретению представляет собой антигенсвязывающую область антитела или его антигенсвязывающий фрагмент.
В соответствии с одним вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения представляют собой двухвалентные антитела или их варианты, у которых одно плечо включает по крайней мере одну стабилизированную зсЕу, направленную на первую молекулу мишени, а второе плечо включает по крайней мере одну стабилизированную зсЕу, направленную на вторую молекулу мишени.
- 71 015992
В соответствии с одним вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения содержат по крайней мере одну стабилизированную зсРу (например, 2, 3 или 4 зсРу), связанную с С-концом тяжелой цепи, где молекулы зсРу обладают той же или другой специфичностью связывания. Пример связывающей молекулы этого типа (антитело С-Геркулес) показан на фиг. 20. В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения содержат по крайней мере одну стабилизированную зсРу (например, 2, 3 или 4 зсРу), связанную с Νконцом тяжелой цепи, где молекулы зсРу обладают той же или другой специфичностью связывания. Пример связывающей молекулы этого типа (антитело Ν|ι-Геркулес) показан на фиг. 20. В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения содержат по крайней мере одну стабилизированную зсРу (например, 2, 3 или 4 зсРу), связанную с Ν-концом легкой цепи, где молекулы зсРу обладают той же или другой специфичностью связывания. Пример связывающей молекулы этого типа (антитело Ц.-Геркулес) показан на фиг. 20. В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения содержат по крайней мере одну стабилизированную зсРу (например, 2, 3 или 4 зсРу), связанную с Ν-концом тяжелой или легкой цепи, и по крайней мере одну стабилизированную зсРу (например, 2, 3 или 4 зсРу), связанную с Сконцом тяжелой цепи, где молекулы зсРу обладают той же или другой специфичностью связывания.
В соответствии с одним вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения представляют собой двухвалентные мини-тела, одно плечо которых включает по крайней мере один ксРу фрагмент, направленный на первую молекулу мишени, а второе плечо включает по крайней мере один зсРу фрагмент, направленный на вторую молекулу мишени, где по крайней мере одна из молекул 8сРу стабилизирована. Пример конструкта биспецифичного двухвалентного мини-тела показан на фиг. 57. Сн3 домен фигуры гибридизован со стороны своего Ν-конца со связывающим пептидом, который со стороны своего Ν-конца гибридизован с Ун доменом, который со стороны своего Ν-конца гибридизован с (61у48ег)и гибким линкером, который со стороны своего Ν-конца гибридизован с Уь доменом.
В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения представляют собой зсРу четырехвалентные мини-тела, в которых каждый фрагмент тяжелой цепи включает первый и второй фрагменты зсРу, где по крайней мере одна молекула зсРу стабилизирована. Второй названный фрагмент зсРу может быть связан с Ν-концом первого фрагмента зсРу (например, биспецифичного Ν4 зсРу четырехвалентного мини-тела или биспецифичного Ν, зсРу четырехвалентного мини-тела). Пример биспецифичного Ν зсРу четырехвалентного мини-тела показан на фиг. 58. Альтернативно, второй фрагмент зсРу может быть связан с С-концом указанного фрагмента тяжелой цепи, включающего первый указанный зсРу фрагмент (например, биспецифичные С-зсРу четырехвалентные мини-тела). Пример биспецифичного С-зсРу четырехвалентного мини-тела показан на фиг. 59. В соответствии с одним вариантом осуществления первый и второй фрагменты зсРу могут связываться с молекулами одной или различных мишеней. Если первый и второй фрагменты зсРу участка тяжелой цепи биспецифичного четырехвалентного мини-тела связываются с молекулой одной мишени, то по крайней мере один из двух фрагментов зсРу второго участка тяжелой цепи биспецифичного четырехвалентного мини-тела связывается с другой молекулой мишени.
В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения представляют собой биспецифичные диатела, каждое плечо которых включает тандем фрагментов зсРу, по крайней мере один из которых стабилизирован. В соответствии с одним вариантом осуществления биспецифичное диатело может содержать первое плечо с первой специфичностью связывания и второе плечо со второй специфичностью связывания (см., например, фиг. 60). В соответствии с другим вариантом осуществления каждое плечо диатела может содержать первый зсРу фрагмент с первой специфичностью связывания и второй зсРу фрагмент со второй специфичностью связывания.
В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения представляют собой 8сРу2 четырехвалентные антитела, у которых каждый фрагмент тяжелой цепи включает молекулу зсРу, где по крайней мере одна из молекула зсРу стабилизирована. зсРу фрагменты могут быть связаны с Ν-концом вариабельной области частей тяжелой цепи (например, биспецифичные Νι зсРу2 четырехвалентного антитела или биспецифичных ΝΕ 8сРу2 четырехвалентные антитела). Альтернативно, зсРу фрагменты могут быть связаны с С-концом фрагментов тяжелой цепи четырехвалентного антитела (например, биспецифичных С-зсРу2 четырехвалентного антитела, см., например, фиг. 61). Каждый фрагмент тяжелой цепи 8сРу2 четырехвалентного антитела может содержать вариабельные области и зсРу фрагменты, связывающиеся с той же или другой молекулой мишени. Если зсРу фрагмент и вариабельная область первого участка тяжелой цепи биспецифичного 8сРу2 четырехвалентного антитела связываются с одной и той же молекулой мишени, по крайней мере один из первого или второго фрагментов второго участка тяжелой цепи биспецифичного четырехвалентного антитела связывается с другой молекулой мишени.
В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения представляют собой 8сРу2 четырехвалентные бездоменные антитела, у которых каждый фрагмент тяжелой цепи включает фрагмент зсРу, по крайней мере один из которых стабилизирован. зсРу фрагменты могут быть связаны с Ν-концом вариабельной области частей тяжелой цепи (например, бис
- 72 015992 пецифичные ΝΗ κсРν2 четырехвалентного антитела (см. фиг. 63) или биспецифичные Ν, κсРν2 четырехвалентные антитела (см. фиг. 64)). Альтернативно, κсРν фрагменты могут быть связаны с С-концом фрагментов тяжелой цепи κсРν2 четырехвалентного бездоменного антитела (например, биспецифичные С-κсРν2 четырехвалентные бездоменные антитела, см., например, фиг. 62).
Примеры молекул клеточной поверхности, к которым может присоединяться связывающая молекула по изобретению, включают антигены рецепторов и опухолевых клеток, которые сверхэкспрессируются на поверхности опухолевых или неопластических клеток, а также любой из описанных здесь цитокиновых рецепторов, молекул адгезии или рецепторов факторов роста, например, описанных в разделе В настоящего изобретения. Примеры растворимых молекул включают антиопухолевые агенты (например, токсины, химиотерапевтические препараты и их пролекарства), растворимые ферменты (например, ферменты, конвертирующие пролекарства), цитокины, хемокины, гормоны, факторы роста или факторы тромбообразования, например, описанные здесь в разделе А.
Биспецифичные молекулы, связывающиеся как с антигенами опухолевых клеток, так и с противоопухолевыми агентами или растворимыми ферментами, могут локализовать противоопухолевый агент на клетке опухоли, экспрессирующей указанный антиген, что максимально позволяет увеличить токсические эффекты противораковых лекарств на опухолевую клетку и предельно уменьшить токсический эффект противораковых лекарств на нормальные клетки.
Примеры биспецифичных связывающих молекул по крайней мере с одним сайтом связывания опухолевого антигена и по крайней мере одним сайтом связывания токсина включают анти-сапорин/анти-Ш1, анти-СП22/анти-сапорин, анти-СП7/анти-сапорин, анти-СП38/анти-сапорин, анти-СЕА/анти-рицин А цепи, анти-интерферон-.альфа.(ШН-.альфа.)/анти-гибридомы идиотип, анти-СЕА/анти-винки алкалоид. Примеры биспецифичных связывающих молекул по крайней мере с одним сайтом связывания молекулы клеточной поверхности и по крайней мере одним сайтом связывания фермента, конвертирующего пролекарство, включают, например, анти-СО30/анти-щелочную фосфатазу (которая катализирует превращение пролекарства митомицинфосфата в химиотерапевтический митомициновый спирт).
В соответствии с другими аспектами биспецифичные связывающие молекулы связываются с антигенами опухолевых клеток и диагностическими агентами, тем самым локализуя указанный диагностический агент на опухолевой клетке, экспрессирующей указанный антиген, и облегчая детекцию опухоли ш νίΐτο или 1п νίνο. Примеры биспецифичных связывающих молекул включают анти-СЕА/анти-ЕΟТυΒЕ, анти-СЕА/анти-^ΡТЛ, анти-СЕА/анти-бета-галактозидазу и анти-р185НЕЯ2/анти-гаптен.
В соответствии с другими аспектами биспецифичные связывающие молекулы связываются с растворимыми молекулами (например, растворимыми антигенами) и молекулами клеточной поверхности неопухолевых клеток (например, иммунных клеток). Например, они могут использоваться, чтобы нацелить растворимые иммунные комплексы на рецепторы клеточной поверхности иммунных клеток, что облегчает их вывод из организма по опосредуемым клетками иммунным механизмам. Примеры биспецифичных молекул такого типа включают анти-липобелки низкой плотности (ЬЭЬ)/анти-Ес рецептор (например, Рс.гамма.К!, Рс.гамма.КН или Рс.гамма.КШ)) и биспецифичные связывающие молекулы. применяемые в терапии инфекционных заболеваний (такие как анти-СП3/анти-герпеса симплексный вирус (ΗδΥ), анти-Т-клеточный рецептор:СЭ3 комплекс/анти-грипп, анти-Рс.гамма.К/антиВИЧ)).
В соответствии с другими аспектами биспецифичные связывающие молекулы изобретения могут связываться как с рецепторами клеточной поверхности, так и с растворимыми лигандами. В соответствии с одним вариантом осуществления лиганд представляет собой родственный лиганд рецептора ТИР семейства.
Примерами рецепторов клеточной поверхности, с которыми могут связываться биспецифичные связывающие молекулы, являются антигены опухолевых клеток и рецепторы иммунных клеток. Примеры рецепторов клеточной поверхности включают также рецепторы цитокинов, молекулы адгезии или рецепторы факторов роста, например, как описано здесь, например, в разделе В. Примеры растворимых лигандов включают цитокины, хемокины, гормоны, факторы роста или факторы тромбообразования, например, как описано здесь в разделе В.
Примеры биспецифичных связывающих молекул включают 3434^^4/3434^3^1. антиУ^Л4/анти-УЕΟР, анти-У^Л4/анти-ангиопоэтин, анти-У^Л4/анти-ТNΕα, анти-ЮРШ/анти-УЕОР, антиЮРКТ/анти-ангиопоэтин, анти-ЮРКТ/анти-ЕОРЯ, анти-НОР^Р/анти-УЕОР, анти-НОР^Р/антиангиопоэтин и НОР^Р/любой второй антиген (см., например, Сао е! а1. Ρτοα №И. Лсаб. δα 2001. 98:7443; Ьи е! а1. 2004. 1. Βίο1. Сйет. 279:2856).
В соответствии с другими аспектами биспецифичные связывающие молекулы изобретения включают по крайней мере одно плечо (т.е. сайт связывания), направленное против первой растворимой молекулы (например, растворимого л иганда), и по крайней мере одно плечо, направленное против второй растворимой молекулы (например, растворимого лиганда). Такие биспецифичные связывающие молекулы могут использоваться как средство диагностики (например, анти-кролик IдΟ/анти-ферритин, антипероксидаза из хрена (ΗКΡ)/анти-гормон, анти-соматостатин/анти-вещество Р, анти-ΗКΡ/анти-РIТС (см. Νο13ΐ'ΐ е! з1., кирга)) или фибринолитические агенты (например, анти-фибрин/анти-активатор тканевого плазминогена (ΐΡΑ), анти-фибрин/анти-активатор плазминогена урокиназного типа (υΡΑ)).
- 73 015992
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления растворимая молекула, с которой связывается биспецифичная связывающая молекула по изобретению, - это растворимый лиганд семейства ΤΝΕ. Примеры таких лигандов включают, но не ограничиваются, ЬТА (который связывает ΤΝΕΚ1/ΤΝΕΚ8Ε1 А). ТКЕ (который связывает СП120Ь/ТЫРК8Р1В), ЬТВ (который связывает
ЬТВК/Т№К8Р3), 0Х40Б (который связывает ОХ40/Т№К8Р4), СИ40Ь (который связывает
СП40/Т№К8Р5), (который связывает Рак/Т№К8Р6 и ЭсК3/ТХЕК8Е6В). СИ27Ь (который связывает СП27/Т№К8Р7), СИ30Ь (который связывает СЭ30/ТХЕК8Е8). 4-1-ВВ-Ь (который связывает 4-1ВВ/Т№К8Р9), ТКА1Б (который связывает ТКА1Б-К 1/Т№К8Р 10А, Т1К\1Е-К2/Т\ЕК8Е 10В, ТКА1ЕК3/ТЫРК8Р10С и ТКА1Е-К4/ТХЕК8Е10О). КАХКБ (который связывает ΚАNК/ΤNРΚ8Р11А и Остеопротегин/ΤNΕΚ8РΗВ), АР0-3Ь (который связывает АРО-3/ТХЕК8Р12 и ОК3Е/ТХЕК8Е12Е). АРК1Ь (который связывает ТТАС1/№К8Р13В), ВАРР (который связывает ВАРРК/Т№К8Р13А), БЮИТ (который связывает ИУЕМ/ОТК^РМ), ΝΟΡ-лиганды (которые связывают БХСЕК. например, ΝΟΡ-, Ν6Ρ-2/ΝΓΡ3, ΝΊΡ5, ΕΌΝΕ. 1РКЭ1), С1ТКЬ (который связывает СIΤΚ/ΤNΕΚ8Ρ18), ЕИАК1 и ХЕИАК лиганд, Рп14 лиганд, а также Тгоу/Тгабе лиганд.
В соответствии с другими примерами реализации биспецифичные связывающие молекулы изобретения содержат по крайней мере один сайт связывания для первой молекулы клеточной поверхности и по крайней мере один сайт связывания для второй молекулы клеточной поверхности. В соответствии с одним вариантом осуществления первая и вторая молекулы клеточной поверхности расположены на различных клетках (например, различных типов). Например, биспецифичные молекулы могут содержать по крайней мере одно плечо, направленное против антигена опухолевых клеток, и одно плечо, направленное против рецептора клеточной поверхности на неопухолевой клетке (например, иммунной клетке). Примеры биспецифичных связывающих молекул этого типа включают включающие по крайней мере один сайт связывания для антигена опухолевых клеток и по крайней мере один сайт связывания, направленный против цитотоксической триггерной молекулы иммунной эффекторной клетки (такой как антиРс.гамма.К1/анти-СП15, анти-р185.кир.ΗЕΚ2/Ρс.гамма.ΚШ (СИ16), анти-р185.кир.ΗЕΚ2/анти-VЕСΡ, анти-СП3/анти-злокачественная В-клетка (1Ό10), анти-С^3/анти-р185.кир.ΗЕΚ2, анти-СО3/анти-р97, антиСО3/анти-клетки карциномы почек, анти-СП3/анти-0УСАК-3, анти-СП3/Ь-О1 (анти-карцинома толстого кишечника), анти-СП3/анти-аналог меланоцитстимулирующего гормона, анти-ЕСР-рецептор/анти-СП3, анти-СП3/анти-САМА1, анти-СО3/анти-СО19. анти-СЭ3/МоУ18. анти-молекула адгезии нервных клеток (ХСАМ)/анти-СО3. анти-фолат связывающий белок (РВР)/анти-СИ3 и анти-панкарциномаассоциированный антиген (АМос-31)/анти-СИ3)). Биспецифичные молекулы. связывающиеся с антигенами опухолевых клеток и с молекулой цитотоксического триггера, могут эффективно соединять опухолевые клетки с иммунными эффекторными клетками, тем самым активируя способность эффекторных клеток разрушать опухолевые клетки по опосредуемому клетками иммунному механизму.
В соответствии с другим вариантом осуществления первая и вторая молекулы клеточной поверхности, с которой может связаться биспецифичная связывающая молекула, расположена на той же клетке или типе клеток. Образуя связь между первым и вторым рецепторами на одной и той же клетке, биспецифичные связывающие молекулы изобретения могут ингибировать или усиливать активность (например, активность по трансдукции сигнала), ассоциированную с одним из этих двух рецепторов или с ними обоими. В соответствии с одним направлением реализации первая и вторая молекулы клеточной поверхности относятся к одному типу (например, принадлежат одному семейству молекул). В соответствии с другим направлением реализации указанные первая и вторая молекулы клеточной поверхности относятся к разным типам (например, принадлежат различным семействам молекул). Примеры рецепторов клеточной поверхности, с которыми связываются биспецифичные связывающие молекулы, включают антигены опухолевых клеток или рецепторы иммунных клеток. Примеры рецепторов клеточной поверхности включают также любой из цитокиновых рецепторов, молекул адгезии или рецепторов факторов роста, описанных в разделе В.
В соответствии с одним вариантом осуществления примеры молекул мишеней, с которыми связываются связывающие молекулы изобретения, включают один или более эпитопов, например сульфат гепарина, факторы роста и их рецепторы (например, фактор роста эпидермиса, рецептор инсулинподобного фактора роста, рецептор фактора роста гепатоцитов (ΗΟΡ/8Ρ) (см., например, Сао е! а1. Ргос. №!1. Асаб. 8с1. 2001. 98:7443; Ьи е! а1. 2004. I. Вю1. ('Нет. 279:2856).
В соответствии с примером реализации по крайней мере одна молекула, с которой связывается биспецифичная связывающая молекула по изобретению, является членом семейства Т№-рецепторов (Т№К). В соответствии с другим примером реализации первая и вторая молекулы мишени, с которой связывается биспецифичная связывающая молекула по изобретению, представляют собой члены семейства Т№К В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению связывается с лигандом семейства Т№К В соответствии с еще одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению связывается с лигандом семейства Т№К В соответствии с еще одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению связывается с одним членом семейства Т№К и антигеном, экспрессируемым на поверхности опухолевой клетки, например, предпочтительно экспрессируемым на опухолевой клетке. Ограничивающим фактором при лечении опухолей моноспеци
- 74 015992 фичными ΤΝΡΒ-связывающими молекулами является то, что чувствительно к подобной терапии только подмножество опухолей. Полиспецифичные ΤΝΡΠ связывающие молекулы могут специфично активировать ΤΝΡΠ и усиливать передачу сигнала рецептором, например, приведя ΤΝΡΠ в непосредственную близость. Изобретение относится к способам улучшения биспецифичных ΤΝΡΠ связывающих молекул, которые могут быть направлены на более чем один ΤΝΡΠ или тип ΤΝΡΠ и усиливать передачу сигнала, обеспечивая улучшенный способ лечения рака. В соответствии с одним вариантом осуществления биспецифичная ΤΝΡΠ связывающая молекула повышает силу сигнала, связываясь с двумя или более ΤΝΡΠ одного типа, что повышает количество ΤΝΡΠ, расположенных близко друг к другу. В соответствии с более предпочтительным вариантом осуществления биспецифичная ΤΝΡΠ связывающая молекула способна связываться с двумя различными рецепторами семейства ΤΝΡ.
В соответствии с одним вариантом осуществления по крайней мере один ΤΝΡΠ, с которым связывается биспецифичная ΤΝΡΠ связывающая молекула, включает домен смерти. Термин домен смерти означает цитоплазматическую область рецептора семейства ΤΝΡ, который вовлечен в ΤΝΡопосредуемую клеточную смерть или апоптическую передачу сигнала и индукцию цитотоксичности клеток, опосредуемую этими рецепторами. Регион сопрягает рецептор с активацией каспазы посредством адаптерных белков, что приводит к активации внешнего пути умирания клетки.
Примеры ΤΝΡ-рецепторов, которые содержат домены смерти, включают, но не ограничиваются, ΤΝΡΠ1 (ΤΝΡΠ8Ρ1Α), Ρак (ΤΝΡΠ8Ρ6), ΌΚ-3 (ΤΝΡΒ8Ρ6Β), ΕΝΕΡΠ (ΤΝΡΠ8Ρ16), 2ΉΑΙΡ-Π1 (Τ^^Ρ^), ΤΒΑΙΕ-Κ2 (ΤΝΡΕ8Ρ10β) и ΌΒ6 (ΤΝΡΠ8Ρ21). Передача апоптического сигнала от этих рецепторов модулируется связыванием родственного лиганда и образованием одной из следующих рецептор-лигандных пар: ΝΡΒ1/ΤΝΡα, Ρак/Ρак^, ΌΚ-3/ΏΚ-3Ε6, ΤΗΑΙΡ-Η1/ΤΗΑΙΡ или 2ΉΑΙΡ-Π2/2ΉΑΙΡ.
Биспецифичные ΤΝΡΠ связывающие молекулы, нацеленные на рецепторы семейства ΤΝΡ, включающие домены смерти, полезны при лечении рака, так как ΤΝΡΠ этого типа часто сверхэкспрессируются в раковых клетках, и стимуляция рецептора может активировать апоптоз опухолевых клеток. В соответствии с предпочтительными аспектами домен смерти, включающий ΤΝΡΠ, с которым связывается биспецифичная ΤΝΡΠ связывающая молекула по изобретению, представляет собой ΤΒΑΙΕ-Β2. ΤΒΑΙΕΠ2 предпочтителен при терапии опухоли у человека, так как его активация не запускает апоптоз гепатоцитов и, следовательно, такое лечение характеризуется пониженной токсичностью.
Хотя активация некоторых включающих домен смерти рецепторов, например ΤΝΡΠ1 или Ρак, оказалась токсичной в применении ш νίνΌ, вероятно, привязка этих рецепторов к другим ΤΝΡ-рецепторам может уменьшить токсичность и, тем самым, сделать токсическое антитело менее токсичным.
В соответствии с одним вариантом осуществления биспецифичная ΤΝΡΠ связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один сайт связывания, направленный на ΤΝΡΠ, включающий домен смерти, и по крайней мере один сайт связывания, направленный на ΤΝΡΠ без домена смерти.
В соответствии с демонстративными направлениями реализации изобретения ΤΝΡΠ без домена смерти включают ΤΝΡΠ, принимающие участие в дифференциации тканей. Примеры ΤΝΡΠ рецепторов, вовлеченных в процесс дифференциации тканей, включают ΕΤβΒ ΠΑΝΚ, ΕΌΑΒ1, ΧΕΌΑΒ, ΡΠ14, Шоу/Шабе и Ν6ΡΒ. ΤΝΡΒ, вовлеченные в процесс дифференциации тканей, могут влиять на нее после связывания с родственным лигандом. ΤΝΡΒ связывающие молекулы, направленные на ΤΝΡΒ, вовлеченные в процесс дифференциации тканей, могут влиять на опухоли различными способами. Во-первых, они могут непосредственно замедлить рост опухоли, изменив клеточный цикл. Во-вторых, дифференциация тканей в контексте трансформации опухолевых клеток может привести к конфликту клеточного цикла и апоптозу. В-третьих, такой конфликт может сделать клетки более чувствительными к химиотерапии.
В соответствии с предпочтительными аспектами ΤΝΡΒ, вовлеченные в процесс дифференциации тканей, представляют собой β-рецептор (ΕΤβΒ). ΕΤβΒ участвует в управлении статусом взросления различных специализированных стромальных клеток в иммунной системе и играет критическую роль в ходе развития стромальных элементов бластоциты лимфоузла. Предполагается, что активация программы развития эпителиальных и фибробластоидных клеток в контексте трансформированной клетки отрицательно влияет на ее выживание, и это может объяснить часть противоопухолевой активности активации ΕΤβΒ Эти рецепторы могут также инициировать воспалительные программы, вовлекающие высвобождение хемокинов и стимулирующих иммунологический противоопухолевый ответ. Такое высвобождение может повлиять на воспалительный статус опухоли и/или инициировать инфильтрацию лимфоидных элементов, стимулирующих иммунологическую реакцию в опухоли. Так, биспецифичные ΤΝΡΒ связывающие молекулы, которые связывают ΕΤβΒ по отдельности или совместно с ΤΝΡ-рецепторами, включающими домены смерти (например, ΤΒΑΙΕ-Β2), входят в состав настоящего изобретения.
В соответствии с иллюстративными вариантами осуществления ΤΝΡΒ без домена смерти включают ΤΝΡΒ, вовлеченные в иммунное регулирование. Такие рецепторы включают ΤΝΡΒ2, ΗVΕМ, СЭ27, (2)30, С1)40, 4-1ВВ, ОХ40, 6ΙΤΒ, ΤΑΟ, ΒΑΡΡ-Β, ВСМА и ΠΕΡ2'. Другие рецепторы семейства ΤΝΡ, участвующие в иммунной регуляции, включают ΤΒΑΙΕ-Β3 и ΤΒΑΙΕ-Β4. Другие целевые рецепторы ΤΝΡ семейства, участвующие в образовании опухоли, можно определить с использованием имеющихся баз
- 75 015992 данных РНК экспрессии рецепторов в клетках различных типов, которые дают возможность определить рецепторы ТЫЕ семейства, присутствующие или идеально сверхэкспрессирующиеся в различных опухолях. Более того, существующие базы данных РНК предоставляют дополнительное преимущество в том, что пару рецепторов Т\Е семейства, с которыми связана биспецифичная ТЛЕЯ связывающая молекула по изобретению, можно оптимизировать, идентифицировав пару рецепторов, наиболее уникально экспрессирующихся в типе опухолей или подмножестве опухолей, но не являющихся избыточными для нормальных тканей, особенно, печени и сосудистой системы. В таких случаях идентифицируются рецепторные пары (или больше), способные доставить сильный сигнал опухоли и редким нормальным тканям.
Способы получения полиспецифичных молекул хорошо известны в уровне техники. Например, с использованием рекомбинантной технологии можно создать полиспецифичные молекулы, например, диатела, одноцепочечные диатела, тандемные ксЕу и другие. Примеры способов получения полиспецифичных молекул известны в уровне техники (например, КоШегтапп е1 а1. Ме!йобк т Мо1еси1аг Вю1оду, уо1. 248: Антитело Епдтеегтд: Ме!йобк апб РгоЮсо1к. Р. 227-242, И8 2003/0207346 А1 и процитированные там ссылки). В соответствии с одним вариантом осуществления полимерные полиспецифичные молекулы получают способами, такими как описанные, например, в И8 2003/0207346 А1 или И8 ра1еп1 5821333 или ИЗ 2004/0058400.
В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичная связывающая молекула по изобретению представляет собой полиспецифичный химерный белок. Фраза полиспецифичный химерный белок означает химерные белки (описанные выше), включающие по крайней мере две специфичности связывания (т.е. комбинирующие домены связывания лиганда или рецептора). Полиспецифичный химерный белок можно собрать, например, в виде гетеродимеров, гетеротримеров или гетеротетрамеров, в особенности, как описано в XV0 89/02922 (6 апреля 1989 г.), в ЕР 314317(3 мая 1989 г.) и в патенте США № 5116964, 2 мая, 1992. Предпочтительными полиспецифичными химерными белками являются биспецифичные белки. Примеры биспецифичных химерных белков включают СП4-ксЕу/Т№-рецептор1д6 и СО4-ксЕу/Ь-селектин-1д6. Последний комбинирует функцию связывания с лимфоузлом рецептора лимфоцитов (ЬНЯ, Ь-селектин) и НГУ-связывающую функцию СЭ4, и его потенциальное применение может заключаться в профилактике или лечении ВИЧ-инфекции, родственных состояний или в диагностике.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретение относится к полиспецифичным стабилизированным связывающим молекулам, например биспецифичным связывающим молекулам, например антителам, включающим по крайней мере один сайт связывания, который связывается с известной мишенью, и по крайней мере один сайт связывания, который распознает неизвестную мишень (например, в соответствии с одним вариантом осуществления биспецифичная молекула включает сайты связывания, выбранные из библиотеки дисплея фагов полусинтетических антител) и стабилизированную ксЕу изобретения.
В соответствии с одним направлением реализации изобретения специалист может, начав с одноцепочечного антитела известной специфичности, построить библиотеку ЕаЬ известными в уровне техники способами, или, альтернативно, начав с фрагмента ЕаЬ известной специфичности, построить библиотеку стабилизированных одноцепочечных антител известными в уровне техники способами. Известно, что библиотеки из неиммунизированных источников и полученные синтетической рекомбинацией последовательностей гена У (предпочтительно комбинацией Ун с последовательностями ОН и Ш, а также Уъ с 1Ъ) можно использовать для выделения антител любого антигена. Например, патентная заявка ν0 92/01047 показывает, что фрагменты антител можно изобразить на поверхности бактериофага, и что они будут связывать антиген. Фрагменты антител (например, ЕаЬ, Еу, ксЕу и Ун) можно непосредственно выбрать, используя эту особенность. Другие известные в уровне техники способы включают описанные, например, в патентах И8 5698426; 6291159; 5658727; 5667988 и 5969108.
В соответствии с другим вариантом осуществления ксЕу, распознающую известную мишень, можно димеризовать с помощью ксЕу, выделенной из библиотеки дисплея полусинтетических антител человеческого фага (см., например, КгшГ и ЬодепЬегд 1996. I. Вю1. Сйет. 271:7630).
В соответствии с одним вариантом осуществления рассматриваемая полиспецифичная молекула экспрессируется в системе экспрессии, которая применяется для экспрессии молекул антител, например, клеток млекопитающих, грибков, бактерий, таких как такие как РюсЫа, Е.сой, Васси1оу1гик и т.д. В соответствии с одним вариантом осуществления рассматриваемая полиспецифичная молекула экспрессируется в векторой системе МЕ08РЬА (см., например, патент И8 6159730). Этот вектор включает промотер/усилитель цитомегаловируса, главный промотер мышиного бета глобина, источник репликации ЗУ40, последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста, экзоны 1 и 2 неомицин фосфотрансферазы, ген дигидрофолат редуктазы и ведущую последовательность.
В соответствии с одним вариантом осуществления рассматриваемая полиспецифичная молекула включает синтетический связывающий пептид.
Такие полиспецифичные молекулы содержат один или больше сайтов связывания известной мишени и экспрессируют библиотеку по одному или больше сайтов связывания. Такие полиспецифичные молекулы можно использовать, например, для идентификации молекул в близком соседстве с или связан
- 76 015992 ные с известной мишенью. Например, специалист может проанализировать рассматриваемые полиспецифичные молекулы с целью выбрать такие молекулы, которые индуцируют конкретный ответ, например, апоптоз или активацию клеток, используя хорошо известные способы скрининга. Затем можно идентифицировать биспецифическую молекулу, генерирующую искомый ответ, и определить ее специфичность. Используя указанные способы, можно идентифицировать молекулы в близкой ассоциации с конкретными интересующими мишенями, например, маркеры Т-клеток или другие сигнальные молекулы (такие как СЯГРТОИ, молекулы домена смерти или молекулы, вовлеченные в апоптоз). Близость известной мишени и молекулы, недавно идентифицированной как ближайший сосед, можно подтвердить способами иммунопреципитации или другими технологиями, известными специалистам. Указанные способы позволяют также идентифицировать молекулы как мишени для модулирования конкретного клеточного ответа.
Специфичность связывания, включающая сайты распознавания или целые вариабельные области полиспецифической связывающей молекулы, в частности полиспецифических антител или вариантов антител изобретения, можно определить из анализа одного или нескольких родительских антител. Родительские антитела могут включать природные антитела или их фрагменты, антитела или их фрагменты, адаптированные из природных антител, антитела, сконструированные бе ηονο с использованием последовательностей антител или их фрагментов, о которых известно, что они являются специфическими целевыми молекулами. Последовательности, которые могут быть получены из родительских антител, включают вариабельные области тяжелых и/или легких цепей и/или СОЯ, каркасные области или другие фрагменты.
В соответствии с одним примером реализации изобретения родительские антитело, используемое для конструирования полиспецифической ТИЕЯ связывающей молекулы, представляет собой антиТЕАШ-ЕЗ антитело, например 14А2, и анти-ЬТвЯ антитело, например СВЕ11 или ВНА10. Многовалентные, полиспецифичные антитела могут содержать тяжелую цепь из двух или более вариабельных областей и/или легкую цепь из одного или более вариабельных областей, где по крайней мере две вариабельных области узнают различные эпитопы ЬТвЯ. Полиспецифичные, например, биспецифичные ТИЕЯ связывающие молекулы можно сконструировать различными способами с использованием множества разнообразных последовательностей, производных от родительских анти-ЬТвЯ антител, включая мышиные или гуманизированные ВНА10 (Вготешпд е1 а1., ί. Iттиηο1. 154:33 (1995); Вготешпд е1 а1. ί. Ехр. Меб. 183:867 (1996)), мышиные или гуманизированные СВЕ11 (патент И8 6312691 и \УО 02/30986 соответственно), и/или родительские анти-ТЯΑI^-Я2 мышиные или химерные 14А2. Примеры анти-ЬТвЯ антител, которые могут использоваться для конструирования биспецифических ТИТЯ связывающих молекул изобретения, включают состоящие из ВКА11, СОН10, ВС66, Α6Η1, ВОА8, СВЕ11 и ВНА10 или ВНА10. Следующие далее линии клеток гибридомы, продуцирующие моноклональные анти- ЬТ-в-Я антитела, можно использовать для продукции анти-ЬТвЯ антител, из которых получают последовательности конструктов антител. Эти линии хранятся в американской коллекции культур типов (Атепсап Туре СиЙиге Со11ес1юп (АТСС)) в соответствии с поручением Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры под соответствующими номерами АТСС:
Клеточная Название Номер
линия тАЬ доступа
а) ΑΘ.Η1.5.1 АОН1 НВ 11796
Ь) Βϋ.Αβ.ΑΒΘ ВЭА8 НВ 11798
с) ВС.(36.АРБ ВСС6 В 11794
С) ВН.А10 ВНА10 В 11795
е) ВК.А11.АС10 ВКА11 В 11799
1) СВ.Е11.1 СВЕ11 В 11793
д) СР.Н10.1 СОНЮ В 11797
Другие примеры антител против ТИЕ-рецепторов, которые могут использоваться в полиспецифических ТИЕЯ связывающих молекулах изобретения, включают антитела, направленные против ТИЕрецепторов, включающих домен смерти. Множество антител было сгенерировано для ТИЕ-рецепторов с доменами смерти, они хорошо известны в уровне техники. Такие антитела включают анти-ТИЕ-Я1 моноклональные антитела (Е&Ь системы анти-ТИЕ-Я1; Ти1апк тАЬ № 985, патенты США № 6110690;
- 77 015992
6437113), анти-Рак рецепторы тАЬ Сн-11 (патент США № 6312691; УО 95/10540), анти-ЭК3 антитела (патент США № 5985547; 1ойпкоп, е! а1. (1984), 1ттипоВю1оду о£ нЬА, ей. Энроп1. В.О., 8ргшдег, №\ν Уогк; патенты США № 6462176; 6469166) и анти-ТКАШ-К антитела (патенты США № 5763223; 6072047; 6284236;6521228;6569642;6642358 и 6417328).
Большое количество антител было также продуцировано для ТЫР-рецепторов, участвующих в дифференциации тканей, они хорошо известны в уровне техники. Примеры антител к ТЫР-рецепторам, специфических для ТЫР-рецепторов, включают анти-КАЫК моноклональные антитела (1ттипех - патенты США № 6562948, 6537763, 6528482, 6479635, 6271349, 6017729; Котей - УО 03/080671), антиЕЭАК поликлональные (античеловеческие) и моноклональные (антимышиные) антитела (К&Э 8ук!етк МАВ745, ВАР157; Е1отаа е! а1. (2001), нитап Мо1еси1аг Сепейск. 10:953), анти-ХЕОАК моноклональные и поликлональные антитела (К&Э 8ук1етк- МАВ1093 и АР1093), анти-Рп14 моноклональные антитела (Ыакауата е! а1. (2003), 1. 1ттипо1оду 170:341; 1ТЕМ-1, 1ТЕМ-2 и 1ТЕМ-4 клоны, доступные в еВюкаепсе), анти-ТКОУ антитело (Т3323 йот 81дта-А1ййсй) и анти-ЫСРК (антигрызуны) антитело (Сйетюоп И8А).
Большое количество антител было также выращено для ТЫР-рецепторов, участвующих в иммунорегуляции, они хорошо известны в уровне техники. Примеры антител к ТЫР-рецепторам, специфических для ТЫР-рецепторов, вовлеченных в иммунорегуляцию, включают анти-ИУЕМ антитела (ИС81 УО 03/086301), анти-СО40 антитела (Вюдеп - УО 97/20063; СЫгоп - патенты США № 5677165; 5874082; 6004552; 6056959; 6315998; патентная заявка США № 2002/0106371; патентные заявки США № 2003/0059427; 20030118588А1; 2003/0211100А1; 2002020142358А1; патенты США № 6312693; 6051228; Рапк1ох е! а1. - 5801227), анти-4-1ВВ (международная публикация УО 03/084999; ЕР 0948353; патент США № 6210669; Сепесгай - УО 03/083069) и анти-ВАРР-К антитела (кроличьи поликлональные Рго8с1 са!а1од № 3097), а также большое количество других антител, выращенных для рецепторов, регулирующих иммунитет.
Специалист может разработать большое количество других многовалентных конструктов антител, используя рутинные технологии рекомбинирования ДНК, например, описанные в следующих работах: РСТ 1п!егпайопа1 Арр1ка!юп № РСТ/И886/02269; Еигореап Ра!еп! АррШайоп № 184187; Еигореап Ра!еп! Арр1юа!юп № 171496; Еигореап Ра!еп! АррШайоп № 173494; РСТ 1п!егпа!юпа1 РиЫкайоп № УО 86/01533; И8 Ра!. № 4816567; Еигореап Ра!еп! АррШайоп № 125,023; Вейег е! а1. (1988), 8с1епсе 240:1041-1043; Ыи е! а1. (1987), Ргос. Ыа!1. Асай. 8с1. И8А 84:3439-3443; Ыи е! а1. (1987), 1. 1ттипо1. 139:3521-3526; 8ип е! а1. (1987), Ргос. ЫаЙ Асай. 8с1. И8А 84:214-218; ЫщЫтига е! а1. (1987), Сапсег Кек. 47:999-1005; Уоой е! а1. (1985), Ыа!иге 314:446-449; 81ι;ιν е! а1. (1988), 1. ЫаЙ. Сапсег 1пк!. 80:1553-1559; Моткоп (1985), 8с1епсе 229:1202-1207; О1 е! а1. (1986), ВюТес11пк|иек 4:214; И8 Ра!. № 5225539; 1опек е! а1. (1986), Ыа!иге 321:552-525; УеЛоеуап е! а1. (1988), 8с1епсе 239:1534; Ве1й1ег е! а1. (1988), 1. 1ттипо1. 141:4053-4060; Уш!ег и М11к!ет, Ыа!иге, 349, р. 293-99 (1991). Предпочтительно, если нечеловеческие антитела гуманизируют, связывая нечеловеческий антигенсвязывающий домен с человеческим константным доменом (например, СаЬШу е! а1., И8 Ра!. № 4816567; Моткоп е! а1., Ргос. Ыа!1. Асай. 8с1. И8А, 81, р. 6851-55 (1984)).
Другие способы, которые могут быть использованы для приготовления многовалентных конструктов антител, описаны в следующих публикациях: Сйейе, Майа-Апа е! а1. (2001), В1оой 97:1392-1398; Уо1ГГ. Еййй А. е! а1. (1993), Сапсег Кекеагск 53:2560-2565; Сйейе, Мапа-Апа е! а1. (1997), Ргос. Ыа!1. Асай. 8с1. 94:7509-7514; К1т, ЕС. е! а1. (2002), 1п!. 1. Сапсег 97(4):542-547; Тойогоукка, Апе!а е! а1. (2001), 1ошпа1 о£ 1ттипо1ощса1 Ме!койк 248:47-66; Со1ота М.1. е! а1. (1997), Ыа!иге Вю!есйпо1оду 15:159-163; 2ио, 2кнап§ е! а1. (2000), Рго!еш Епдтеейпд (8ирр1.) 13(5):361-367; 8ап!ок А.О., е! а1. (1999), С11шса1 Сапсег Кекеагск 5:3118к-3123к; Ргек!а, йеопагй С. (2002), Сиггеп! Рйагтасеийса1 Вю!есйпо1оду 3:237-256; уап 8рйе1, Аппет1ек е! а1. (2000), Кег1ех 1ттипо1оду Тойау 21(8):391-397.
XI. Экспрессия связывающих молекул.
После работы с изолированным генетическим материалом для получения полипептидов изобретения, как описано выше, гены, как правило, встраивают в вектор экспрессии для индукции в клеткухозяина, которые, в свою очередь, позволяют получить требуемое количество полипептида, а последний приводит к заявленным связывающим молекулам.
Термин вектор или вектор экспрессии в целях спецификации и формулы изобретения означает векторы, используемые в соответствии с настоящим изобретением в качестве носителя для внедрения в клетку и экспрессии там желаемого гена. Как хорошо известно специалистам, такие векторы можно легко выбрать из группы, состоящей из плазмид, фагов, вирусов и ретровирусов. В общем случае, совместимые с настоящим изобретением векторы содержат маркер выбора, соответствующие сайты рестрикции, облегчающие клонирование желательного гена, а также возможность встраиваться и/или реплицироваться в эукариотических или прокариотических клетках.
В целях настоящего изобретения могут использоваться многочисленные системы экспрессии векторов. Например, один класс векторов использует элементы ДНК, производные от вирусов животных, такие как вирус папилломы быка, вирус полиомы, аденовирус, вирус коровьей оспы, бакуловирус, ретровирусы (К8У, ММТУ или МОМЪУ) или 8У40 вирус. Другие вовлекают использование полицистрон
- 78 015992 ных систем с внутренними сайтами связывания рибосом. Кроме того, клетки, интегрировавшие ДНК в свои хромосомы, можно выбрать для введения одного или больше маркеров, обеспечивающих селекцию трансфицированных клеток-хозяев. Маркеры могут вносить прототропию ауксотропным хозяйским клеткам, резистентность к биоцидом (например, антибиотикам) или тяжелым металлам, таким как медь. Ген выбираемого маркера может либо быть напрямую связан с экспрессируемой последовательностью ДНК, либо вводиться в ту же клетку совместной трансформацией. Для оптимального синтеза мРНК могут потребоваться дополнительные элементы. Эти элементы могут включать сигнальные последовательности, сигналы сплайсинга, а также промотеры, усилители транскрипции и сигналы завершения.
В соответствии с особенно предпочтительными направлениями реализации изобретения клонированные гены вариабельных областей вводят в вектор экспрессии совместно с генами (предпочтительно человеческими) константных областей тяжелых и легких цепей, синтезированными, как описано выше. Предпочтительно на это влияют с помощью коммерческого вектора экспрессии ШЕС, 1пс., называемого ΝεΟδΕ^ (патент υδ 6159730). Этот вектор включает промотер/усилитель цитомегаловируса, главный промотер мышиного бета глобина, источник репликации δν40, последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста, экзоны 1 и 2 неомицинфосфотрансферазы, ген дигидрофолатредуктазы и ведущую последовательность. Как показано в приводимых ниже примерах, обнаружено, что данный вектор приводит к очень высокому уровню экспрессии антител при внедрении генов вариабельных и константных областей, трансфекции в клетках СНО, сопровождаемой селекцией в 0418-включающей среде и амплификацией метотрексата. Векторные системы описаны также в патентах υδ № 5736137 и 5658570, каждый из которых включен сюда по ссылке в своей полноте. Эта система обеспечивает высокие уровни экспрессии, например >30 пг/клетку/день. Другие примеры векторных систем описаны, например, в патенте υδ 6413777.
В соответствии с другими предпочтительными аспектами полипептиды настоящего изобретения можно экспрессировать с использованием полицистронных конструктов, таких как описаны в поданной совместно с данной заявкой американской предварительной патентной заявке № 60/331481, поданной 16 ноября 2001 г. и включенной сюда по ссылке во всей своей полноте. В этих новых системах экспрессии из одного полицистронного конструкта можно получить многочисленные интересующие генные продукты, такие как тяжелые и легкие цепи антител. Такие системы с выгодой используют внутренний сайт ввода рибосом (т!егпа1 пЬокоте еп!гу кйе (ΙΒΉδ)) с получением относительно высокого содержания полипептидов изобретения в эукариотических клетках-хозяевах. Совместимые последовательности IКЕδ описаны в патенте υδ № 6193980, который также включен сюда по ссылке. Специалисты понимают, что такие системы экспрессии можно использовать для эффективного получения полного диапазона полипептидов, описанных в настоящем изобретении.
Обобщая, можно сказать, что, как только вектор или последовательность ДНК, кодирующая мономерную субъединицу связывающей молекулы (например, модифицированное антитело), получен, вектор экспрессии можно ввести в соответствующую клетку-хозяина. Это означает, что клетки-хозяива могут быть трансформированы. Введение плазмиды в хозяйскую клетку может быть выполнено различными способами, хорошо известными специалистам. Эти способы включают, но не ограничиваются, трансфекцию (включая электропорез и электропорацию), гибридизацию протопласта, осаждение фосфатом кальция, гибридизацию клеток с помощью ДНК оболочки, микроинъекцию и инфекцию интактным вирусом. См., например, К1бд^ау, А.А.6. Маттайап Ехргеккюп Уес!огк, Сйар!ег 24, 2, р. 470-472, Уес!огк, Кобпдиех и Оепйагб!, Ебк. (Ви!!ег^ог1йк, Вок!оп, Макк. 1988). Наиболее предпочтительно вводить плазмиду в хозяйскую клетку способом электропорации. Трансформированные клетки выращивают в условиях, соответствующих продукции легких и тяжелых цепей, и анализируют на белковый синтез тяжелых и легких цепей. Примеры способов анализа включают твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА или ЕЬКА), радиоиммуноанализ (К1А) или анализ сортировщиком флуоресцентно-активированных клеток (ΡΛСδ), иммуногистохимию и т.д. Термин трансформация здесь используется в широком смысле, означая введение ДНК в хозяйскую клетку реципиента, которая изменяет генотип и соответственно приводит к изменению клетки реципиента.
Термин клетка-хозяин или хозяйская клетка означает клетки, трансформированные векторами, сконструированными с использованием способов рекомбинантной ДНК и кодирующими по крайней мере один гетерологичный ген. При описании процессов выделения полипептидов из рекомбинантных хозяев термины клетка и клеточная культура используются, заменяя друг друга, чтобы обозначить исходное антитело, если только явным образом не указано по-другому. Иными словами, восстановление полипептида из клетки может означать либо откручивание целых клеток на центрифуге, либо даже всей клеточной культуры, включающей среду и суспендированные клетки.
В соответствии с одним вариантом осуществления линия хозяйских клеток, используемая для экспрессии белка (например, многовалентной связывающей молекулы), взята из млекопитающих; специалисты могут определить конкретные линии хозяйских клеток, которые лучше всего приспособлены для экспрессии в них желательного генного продукта. Примеры хозяйских клеток включают, но не ограничиваются, ЭС44 и ОЬХВ11 (линия клеток яичников китайского хомячка, без ОНРК), НЕЬА (карцинома шейки матки человека), СУ1 (линия почек мартышки), клетки СΟδ (производные СУ1 с антигеном δУ40
- 79 015992
Т), клетки Я1610 (СЫпезе 11ашз1ег ПЬгоЬ1аз1. фибробласты китайского хомячка), клетки ВАБВС/3Т3 (фибробласты мыши), клетки нАК (йатз!ет к1бпеу 1те, линия почек хомячка), клетки 8Р2/0 (миелома мыши), Р3.йтез.63-Ад3653 (мышиная миелома), клетки ВЕА-1с1ВРТ (бычьи эндотелиальные клетки), ЯАЛ (человеческие лимфоциты) и клетки 293 (почка человека). В соответствии с одним направлением реализации можно использовать клетки N80. Клетки СНО особенно предпочтительны. Как правило, линии хозяйских клеток доступны из коммерческих источников, американской коллекции тканей культур или из опубликованной литературы.
Продуцирование ш νίΙΐΌ может быть масштабировано, чтобы получить большое количество требуемых полипептидов. Технологии культивации клеток млекопитающих в культурах тканей известны в уровне техники и включают гомогенизацию культуры суспензии, например, в эрлифтном реакторе или в реакторе с непрерывным перемешиванием, либо иммобилизацию или захват клеточной культуры, например, в полом волокне, микрокапсулах, на агарозных микрошариках или керамических картриджах. Если надо, то растворы полипептидов можно очистить обычными хроматографическими способами, такими как гель-фильтрация, ион-обменная хроматография, хроматография через ЭЕАЕ-целлюлозу или (иммуно-)аффинная хроматография, например, после предпочтительного биосинтеза полипептидов синтетических окраинных областей или до и после хроматографии ШС, описанной в настоящем изобретении. Гены, кодирующие полипептид изобретения, можно также экспрессировать в клетках немлекопитающих, таких как клетки бактерий, дрожжей или растений. В этом отношении надо понимать, что различные одноклеточные микроорганизмы, такие как бактерии, также можно трансформировать, т.е. это касается микроорганизмов, способных к росту в культуре или ферментере. Бактерии, восприимчивые к трансформации, включают члены семейства еп!егоЬас!епасеае, такие как штаммы ЕзсйепсЫа сой или 8а1топе11а; ВасШасеае, такие как ВасШиз зиЫШз; Рпеитососсиз; 81герЮсоссиз и наеторЫ1из тПиепхае. Следует также понимать, что при экспрессии в бактериях полипептиды, как правило, становятся частью телец включения. Полипептиды необходимо выделить, очистить и затем собрать в функциональные молекулы. Если желательна четырехвалентная форма антител, субъединицы затем сами собираются в четырехвалентные антитела (ЭД0 02/096948А2).
Помимо прокариотов можно использовать и эукариотические микробы. Чаще всего среди эукариотических микроорганизмов используют 8ассйаготусез сетеу131ае или обычные пекарские дрожжи, хотя доступно и множество других штаммов.
Для экспрессии в 8ассйаготусез, обычно, используют плазмиду УЯр7 (например, 8Ппс11сотЬ е! а1., №11иге. 282:39 (1979); Кшдзтап е! а1., 6епе, 7:141 (1979); Тзскетрег е! а1., 6епе, 10:157 (1980)). Эта плазмида уже включает ген ТЯР1, который является маркером селекции мутантного штамма дрожжей, не способных расти в триптофане, например, АТСС № 44076 или РЕР4-1 (1опез, 6епе!юз, 85:12 (1977)). Наличие повреждений 1гр1 как характеристики генома хозяйских клеток дрожжей предоставляет эффективное окружение для регистрации трансформации путем роста в отсутствие триптофана.
ΧΙΙ. Мечение и конъюгирование связывающих молекул.
Связывающие молекулы настоящего изобретения могут быть использованы в неконъюгированной форме или быть конъюгированы по крайней мере с одним из множества эффекторов, т.е. функциональных молекул, например, чтобы облегчить детекцию мишени, а также для визуализации или лечения пациента. Полипептиды изобретения можно пометить или конъюгировать как до, так и после очистки, если очистка выполняется. В частности, полипептиды настоящего изобретения можно конъюгировать с цитотоксинами (такими как радиоизотопы, цитотоксические препараты или токсины), цитостатическими агентами, биологическими токсинами, пролекарствами, пептидами, белками, ферментами, вирусами, липидами, модификаторами биологического ответа, фармацевтическими агентами, иммунологически активными лигандами (например, лимфокинами или другими антителами, где полученная молекула связывается с неопластической и эффекторной клеткой, такой как Т-клетка), РЕ6 или или регистрируемыми молекулами, полезными при визуализации. В соответствии с другим вариантом осуществления полипептид изобретения можно конъюгировать с молекулой, которая снижает васкуляризацию опухолей. В соответствии с другими аспектами описываемая композиция может содержать полипептиды изобретения, сопряженные с лекарствами или пролекарствами. Дополнительные аспекты настоящего изобретения включают использование полипептидов изобретения, конъюгированных со специфическими биотоксинами или их цитотоксическими фрагментами, такими как рицин, гелонин, экзотоксин псевдомонас или токсин дифтерии. Выбор конъюгированных и неконъюгированных полипептидов для использования зависит от типа и стадии рака, применения дополнительной терапии (например, химиотерапии или внешнего облучения) и состояния пациента. Следует понимать, что специалист легко сможет сделать такой выбор в свете изложенной здесь информации.
В проведенных ранее исследованиях противоопухолевые антитела, помеченные изотопами, успешно использовались для разрушения клеток солидных опухолей, а также лимфом/лейкемий на животных моделях и иногда на людях. Примеры радиоизотопов включают 90Υ, 125Ι, 131Ι, 123Ι, “Эп, 105Як, 1538т, 67Си, 676а, 166но, 177Ьи, 186Яе и 188Яе. Действие радионуклидов основано на ионизирующем излучении, которое вызывает многочисленные повреждения цепей ДНК, ведущие к гибели клеток. Используемые в терапевтических конъюгатах изотопы, как правило, дают высокоэнергетические а- или β-частицы с коротким
- 80 015992 радиусом действия. Такие радионуклиды убивают клетки, находящиеся поблизости, например, неопластические клетки, к которым прикреплен конъюгат, или в которые он был введен. На расположенные вдалеке клетки изотопы оказывают очень небольшой эффект, или не оказывают его совсем. Как правило, радионуклиды неиммуногенны.
Что касается использования радиоактивно меченых конъюгатов совместно с настоящим изобретением, то полипептиды изобретения можно пометить непосредственно (например, способом иодирования), а можно и косвенно действием хелатирующего агента. Фразы косвенное мечение, непрямое мечение означают, что хелатор ковалентно прикрепляется к связывающей молекуле и с хелатором ассоциирован по крайней мере один радионуклид. Такие хелаторы, как правило, называют бифункциональными, поскольку они связываются с полипептидом и изотопом. Особо предпочтительные хелаторы включают производные 1-изотиоцикмато-бензил-3-метилдиотилен триаминопентауксусной кислоты (МХ-ЭТРА) и циклогексил диэтилентриамин пентауксусной кислоты (СнХ-ЭТРА). Другие хелаторы включают производные Р-Э0ТА и ЕЭТА. Особо предпочтительные для непрямого мечения радионуклиды включают 'Оп и 90Υ.
Здесь фраза прямое мечение означает, что радионуклид ковалентно связан непосредственно с полипептидом (как правило, через аминокислотный остаток). Более конкретно, эти технологии связывания включают мечение случайным образом и сайт-направленное мечение. В последнем случае мечение направлено на специфичные сайты полипептида, такие как ^связанные остатки сахаров, присутствующие только на Рс-участках конъюгатов. Более того, с настоящим изобретением совместимы различные технологии и протоколы прямого мечения. Например, полипептид, меченный технецием-99т, можно приготовить процессом обмена лигандами, восстановлением пертехната (ТсО4-) в растворе двухвалентного олова, хелатированием восстановленного технеция на колонке 8ерЬабех и нанесением на эту колонку полипептидов, а можно с использованием технологий пакетного мечения, например, инкубируя пертехнат, восстановитель, такой как 8пС12, буферный раствор, такой как раствор натрий-калий-фталата, и антитело. В любом случае предпочтительные для прямого мечения антител радионуклиды хорошо известны в уровне техники, а особенно предпочтительным радионуклидом является 131Ι, ковалентно связанный через остатки тирозина. Соответствующие настоящему изобретению полипептиды могут быть получены, например, с использованием радиоактивного иодида натрия и калия и химического окислителя, такого как гипохлорид натрия, хлорамин Т или подобные им, либо ферментативного окислителя, такого как лактопероксидаза, глюкозоксидаза и глюкоза. Однако для целей настоящего изобретения особо предпочтительным является непрямое мечение.
Патенты, относящиеся к хелаторам и их конъюгатам, хорошо известны в уровне техники. Например, патент США № 4831175 автора бапзог направлен на полизамещенные комплексы диэтилентриаминпентауксусной кислоты и включающие их белковые конъюгаты, а также на способы их приготовления. Патенты США № 5099069, 5246692, 5286850, 5434287 и 5124471 от бапзог также относятся к полизамещенным комплексам ЭТРА. Эти патенты включены сюда по всей своей полноте. Другими примерами совместимых хелаторов металлов является этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДПТА), 1,4,8,11-тетраазатетрадекан, 1,4,8,11-тетраазатетрадекан1,4,8,11-тетраукусная кислота, 1-окса-4,7,12,15-тетраазагептадекан-4,7,12,15-тетрауксусная кислота или подобные вещества. Особо предпочтительны циклогексил-ДТПА и СГХ-ДТПА, далее они рассматриваются подробнее. Другие совместимые хелаторы, включая такие, которые еще только предстоит открыть, могут быть легко выбраны опытным специалистом и, очевидно, также входят в область настоящего изобретения.
Совместимые хелаторы, включая специфичные бифункциональные хелаторы, используемые для облегчения хелатирования в поданных совместно с данной заявкой патентных заявках США № 08/475813, 08/475815 и 08/478967, предпочтительно выбираются, чтобы обеспечить высокое сродство с трехвалентными металлами, показывают увеличенный радиус опухоль-не-опухоль и уменьшенное поглощение костной тканью, а также большее удержание радионуклидов ш νί\Ό в целевых сайтах, т.е. в сайтах В-клеточной лимфомы. Однако другие бифункциональные хелаторы, которые могут обладать или не обладать всеми этими характеристиками, также известны в уровне техники и могут с выгодой использоваться в терапии опухолей.
Следует также понимать, что в соответствии с приведенной здесь информацией полипептиды можно конъюгировать с различными радиоактивными метками с диагностическими и терапевтическими целями. В связи с этим упомянутые выше совместно поданные заявки, включенные сюда по ссылкам во всей своей полноте, раскрывают использование радиоактивно меченых терапевтических конъюгатов для диагностического картирования опухолей перед введением терапевтических антител. Конъюгат Iη2В8 включает мышиное моноклональное антитело, 2В8, специфичное для человеческих антигенов СЭ20, которые связаны с 'Оп посредством бифункционального хелатора, т.е. МХ-ДТПА (диэтилентриаминпентауксусной кислоты), который включает смесь 1:1 1-изотиоцианатобензил-3-метил-ОТРА и 1-метил-3изотиоцианатобензил-ОТРА. Чп особо предпочтителен в качестве диагностического радионуклида, потому что приблизительно от 1 до 10 тС1 можно безопасно вводить, не вызывая заметной токсичности, а данные картирования в целом позволяют спрогнозировать последующее распределение Υ-меченых
- 81 015992 антител. Большинство исследований картирования использует 5 тС1 Чп-меченое антитело, потому что эта доза безопасна и характеризуется повышенной эффективностью по сравнению с более низкими дозами, причем оптимальное картирование можно провести в момент времени от трех до шести дней после введения антитела. См., например, Мштау, I. Кис. Меб. 26: 3328 (1985) и СаггадиШо е! а1., I. Кис. Меб. 26: 67 (1985).
Как уже упоминалось, к настоящему изобретению применимо множество радионуклидов, и специалист легко может определить, какой радионуклид наиболее пригоден в различных обстоятельствах. Например, 131Ι предсталяет собой хорошо известный радионуклид, используемый для направленной иммунотерапии. Однако клиническая пригодность 131Ι может быть ограничена несколькими факторами, включая: восьмидневный период полураспада; дегалогенирование иодированного антитела в крови и в сайтах опухолей, а также характеристики эмиссии (например, большой компонент гамма), которая может быть субоптимальна для локализованной депозиции дозы в опухоли. С появлением новых превосходных хелаторов возросли возможности связывания металлических хелатирующих групп с белками, а следовательно, появилась возможность использовать и другие радионуклиды, такие как бп и 90Υ. 90Υ связан с несколькими преимуществами при использовании в радиоиммунотерапевтических приложениях: 64 период полураспада 90 Υ
- это достаточно долго, чтобы обеспечить накопление антитела в опухоли, и, в отличие, например, от 131Ι, 90Υ излучает только бета-лучи высокой энергии без сопровождающего распад гаммаизлучения, при этом оказывается затронутой ткань на расстоянии от 100 до 1000 клеточных диаметров. Более того, минимальное количество проникающей радиации позволяет вводить 9СУ-меченые антитела амбулаторно. Кроме того, для уничтожения клеток не требется интернализация меченого антитела, и локальная эмиссия ионизирующего излучения должна быть летальной для прилегающих клеток опухолевых тканей без молекулы мишени.
Специалисты должны понимать, что эти нерадиоактивные конъюгаты могут также быть собраны различными способами, в зависимости от выбранного для конъюгации агента. Например, конъюгаты с биотином готовят реакцией полипептидов с активированным эфиром биотина, таким как биотин Νгидроксисукцимида эфир. Аналогично, конъюгаты с флуоресцентными маркерами можно приготовить в присутствии агента присоединения, например, приведенного выше, или реакцией с изотиоцианатом, предпочтительно флуоресцин-изотиоцианатом. Конъюгаты полипептидов изобретения с цитостатическими/цитотоксичными веществами и хелаторами металлов готовят аналогично.
У многих эффекторных молекул отсутствуют функциональные группы, с которыми может связаться антитело. В соответствии с одним вариантом осуществления эффекторная молекула, например, лекарство или пролекарство, связывается с антителом посредством связывающей молекулы. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула включает химическую связь, обеспечивающую активацию цитотоксичности в конкретном сайте. Подходящие химические связи хорошо известны в уровне техники и включают дисульфидную связь, кислотные лабильные связи, фотолабильные связи, пептидаз-лабильные связи, тиоэфирные связи, сформированные между сульфгидрильной и малеимидной группами, а также эстеразные лабильные связи. Наиболее предпочтительно связывающая молекула включает дисульфидную связь и тиоэфирную связь. В соответствии с изобретением связывающая молекула предпочтительно включает реактивную химическую группу. Особо предпочтительные реактивные химические группы - это Ν-сукцинимидильные эфиры и Ν-сульфосукцинимидильные эфиры. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления реактивная химическая группа может быть ковалентно связана с эффектором посредством дисульфидной связи между тиоловыми группами. В соответствии с одним направлением реализации молекула эффектора модифицируется так, чтобы содержать тиоловую группу. Специалист понимает, что тиоловая группа включает атом серы, связанный с атомом водорода, и, как правило, называется в уровне техники сульфгидрильной группой, обозначаемой как -811 или В§н.
В соответствии с одним вариантом осуществления соединяющая молекула может использоваться для объединения эффекторной молекулы и связывающей молекулы. Связывающая молекула изобретения может быть отщепляемой и неотщепляемой. В соответствии с одним вариантом осуществления отщепляемая связывающая молекула представляет собой редокс-отщепляемую связывающую молекулу, такую что связывающая молекула отщепляется в окружении с пониженным редокс-потенциалом, таком как цитоплазма и другие области с более высокой концентрацией молекул со свободными сульфгидрильными группами. Примеры соединяющих молекул, которые могут отщепляться при изменении редокспотенциала, включают молекулы, включающие сульфиды. Отщепляющий стимул можно применить при внутриклеточном захвате белка связывания изобретения, где более низкий редокс-потенциал цитоплазмы облегчает отщепление связывающей молекулы. В соответствии с другим вариантом осуществления снижение рН запускает выброс перенесенного груза в клетку-мишень. Снижение рН имеет место во многих физиологических и патологических процессах, таких как перемещения эндосом, рост опухоли, воспаление и миокардиальная ишемия. рН снижается с физиологического значения 7,4 до 5-6 в эндосомах и 4-5 в лизосомах. Примеры чувствительных к закислению соединяющих молекул, которые могут использоваться для действия на лизосомы и эндосомы раковых клеток, включают включающие разрушаемые при закислении связи, такие как бывают в ацеталях, кеталях, ортоэфирах, гидразонах, тритилах, цис
- 82 015992 аконитилах и тиокарбамоилах (см., например, XV Ш пег е! а1. (1993), Вюсопу Сйет., 4: 521-7; И8 Ра!. № 4569789, 4631190, 5306809 и 5665358). Другие примеры чувствительных к закислению соединяющих молекул включают дипептидные последовательности Рйе-Ьук и Уа1-Ьук (Ктд е! а1. (2002), 1. Мей. Сйет., 45: 4336-43). Стимул отщепления может применяться при движении внутри клетки и попадании там в эндосомальные отделы с низким рН (например, в лизосомы). Другие примеры расщепляемых при закислении эндосомальных молекул включают молекулы, включающие две или более разрушаемые при закислении связи, используемые для присоединения двух или более майтансиноидов (тау!апкто1йк (Ктд е! а1. (1999), Вюсопр Сйет., 10: 279-88; У0 98/19705)).
Расщепляемые связывающие молекулы могут быть чувствительны к действию биологических отщепляющих агентов, которые ассоциированы с конкретной клеткой-мишенью, например, лизосомальным или ассоциированным с опухолью ферментам. Примеры соединяющих молекул, которые могут отщепляться ферментативно, включают, но не ограничиваются, пептиды и сложные эфиры. Примеры ферментов, отщепляющих связывающие молекулы, включают те, которые чувствительны к действию опухоль-ассоциированных протеаз, таких как катепсин В или плазмин (ЭпЬо^сЫк е! а1. (1999), Рйагт. Тйеп, 83: 67-123; ЭпЬо^сЫк е! а1. (1998), Вюогд. Мей. Сйет. Ье!!., 8: 3341-52; йе Сгоо! е! а1. (2000), 1. Мей. Сйет., 43: 3093-102; йе Сгоо! е! а1. (1999), 42: 5277-83). Расщепляемые катепсином В сайты включают дипептидные последовательности валин-цитруллин и фенилаланин-лизин (Погошпа е! а1. (2003), Ыа!. Вю!есй., 21(7): 778-84); ОиЬо\\'с1пк е! а1. (2002), Вюсопщд. Сйет., 13: 855-69). Другие примеры ферментативно-расщепляемых сайтов включают образуемые олигопептидными последовательностями из 4-16 аминокислотных остатков (например, 8ис-в-А1а-Ьеи-А1а-Ьеи), которые распознаются протеазами типа йоике рго!еакек, такими как олигопептидаза Тимета (ТЫте! Ойодорерййаке (ТОР)), фермент, предпочтительно выделяемый нейтрофилами, макрофагами и другими гранулоцитами.
В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула образуется при реакции связывающей молекулы по изобретению с соединяющей молекулой формулы
Χ-Υ-Ζ, где X - присоединяемая молекула;
Υ - связывающая молекула (спэйсер) и
Ζ - эффекторная присоединяемая группа.
Термин присоединяемая молекула к связывающей молекуле включает молекулы, дающие возможность ковалентного прикрепления соединяющего пептида к связывающей молекуле изобретения.
Присоединяемая молекула может содержать, например, ковалентную цепь из 1-60 атомов углерода, кислорода, азота, серы, возможно, замещенных атомами водорода и другими заместителями, позволяющая связывающей молекуле выполнять свои функции. Присоединяемая молекула может содержать пептидные, сложноэфирные, алкильные, алкенильные, алкинильные, арильные, эфирные, тиоэфирные и т.д. функциональные группы. Предпочтительно прикрепляющую молекулу выбирают так, чтобы она была способна реагировать с реактивной функциональной группой полипептида, включающей по крайней мере один антигенсвязывающий сайт, с образованием связывающей молекулы изобретения. Примеры прикрепляющих молекул включают, например, амино, карбоксилат и тиолвключающие присоединяемые молекулы.
Аминосодержащие присоединяемые молекулы включают молекулы, реагирующие с аминогруппами полипептида такими, что образуется связывающая молекула по изобретению. Аминосодержащие присоединяемые молекулы известны в уровне техники. Их примеры включают активированные карбамиды (например, которые могут реагировать с аминогруппой на связывающей молекуле с образованием линкерной молекулы, включающей группу мочевины), альдегиды (например, которые могут реагировать с аминогруппой на связывающей молекуле) и активированные изоцианаты (которые могут реагировать с аминогруппой на связывающей молекуле с образованием линкерной молекулы, включающей группу мочевины). Примеры аминосодержащих присоединяемых молекул включают, но не ограничиваются, молекулы Ν-сукцинимидила, Ν-сульфосукцинимидила, Ν-фталимидила, Ν-сульфофталимидила, 2нитрофенила, 4-нитрофенила, 2,4-динитрофенила, 3-сульфонил-4-нитрофенила или 3-карбокси-4нитрофенила.
Карбоксилатсодержащие присоединяемые молекулы включают молекулы, реагирующие с карбоксилатными группами полипептида такими, что образуется связывающая молекула по изобретению. Карбоксилатсодержащие присоединяемые молекулы известны в уровне техники. Их примеры включают, но не ограничиваются, активированные сложноэфирные интермедиаты и активированные карбонильные интермедиаты, которые способны реагировать с группой СООН на связывающей молекуле с образованием линкерной молекулы, включающей сложноэфирную, тиоэфирную или амидную группы.
Тиолсодержащие присоединяемые молекулы включают молекулы, реагирующие с тиоловыми группами полипептида, такими что образуется связывающая молекула по изобретению. Тиолсодержащие присоединяемые молекулы известны в уровне техники. Их примеры включают активированные ацильные группы (которые могут реагировать с сульфгидрилом связывающей молекулы с образованием линкерной молекулы, включающей тиоэфир), активированные алкильные группы (которые могут реагировать с сульфгидрилом связывающей молекулы с образованием линкерной молекулы, включающей тио
- 83 015992 эфир), акцепторы Михаэля, такие как малеинимид или акриловые группы (которые могут реагировать с сульфгидрилом связывающей молекулы с образованием, например, линкерной молекулы, включающей молекулу дисульфида). Другие тиолсодержащие присоединяемые молекулы включают акриламиды, альфа-иодоацетамиды и циклопропан-1,1-дикарбонильные соединения. Кроме того, тиолсодержащие присоединяемые молекулы могут содержать молекулы, модифицирующие тиоловую группу связывающей молекулы с образованием другой реактивной группы, к которой может быть прикреплена линкерная молекула с образованием связывающей молекулы по изобретению.
Спэйсер, молекула Υ, представляет собой ковалентную связь или ковалентную цепочку атомов, которая может содержать один или более аминокислотных остатка. Она может содержать 0-60 атомов углерода, кислорода, серы или азота, необязательно замещенных водородом или другими заместителями, позволяющими образующейся связывающей молекуле выполнять свою функцию. В соответствии с одним вариантом осуществления Υ включает алкин, алкенил, алкинил, сложный или простой эфир, карбонил или амид.
В соответствии с другим вариантом осуществления тиоловая группа на связывающей молекуле конвертируется в реактивную группу, такую как реактивная карбонильная группа, например кетон или альдегид. Затем прикрепляющая молекула реагирует с кетоном или альдегидом с образованием желательных соединений изобретения. Примеры карбонильных реактивных групп включают, но не ограничиваются, гидразины, гидразиды, О-замещенные гидроксиламины, альфа-бета-ненасыщенные кетоны и Η2С=СΗ-СО-NΗ-NΗ2. Другие примеры прикрепляющих молекул и способов идентификации тиоловых молекул, которые могут использоваться для формирования связывающих молекул изобретения, описаны в работах Рга!!, М.Ь. е! а1. й. Ат Сйет 8ос. 2003 Мау 21; 125(20):6149-59; и 8ахои, Е. 8с1еисе. 2000 Маг 17; 287(5460):2007-10.
Линкерная молекула может быть способна реагировать с молекулой-эффектором или ее производной с образованием связывающей молекулы изобретения. Например, эффекторная молекула может быть связана с оставшимся фрагментом (фрагментами) молекулы через дисульфидную связь. В таких случаях линкерная молекула выбирается так, чтобы она могла реагировать с соответствующим производным эффекторной группы, так чтобы эффекторная молекула была бы связана со связывающей молекулой изобретения. Как уже показано выше, линкерная молекула и/или связывающий пептид в целом могут быть выбраны так, чтобы связывающий пептид отщеплялся в соответствующем окружении.
Особо предпочтительные связывающие пептиды включают, например, Ν-сукцинимидил 3-(2пиридилтио)пропионат (8РИР) (см., например, СагИкои е! а1., Вюсйет. й., 173, 723-737 (1978)), Ν-сукцинимидил 4-(2-пиридилтио)бутаноат (8РЭВ) (см., например, патент И8 № 4563304), Ν-сукцинимидил 4-(2-пиридилтио)пентаноат (8РР) (см., например, СА8 Ведкйу иитЬег 341498-08-6), Ν-сукцинимидил 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (8МСС) (см., например, Υо8й^ίаке е! а1., Еиг. й. Вюсйет., 101, 395-399 (1979)) и Ν-сукцинимидил 4-метил-4-[2-(5нитропиридил)дитио]пентаноат (8МНР) (см., например, патент И8 № 4563304). Наиболее предпочтительные связывающие пептидные молекулы, используемые в составе композиций изобретения, - это 8РР, 8МСС и 8РЭВ. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления 8РЭВ используется для соединения эффекторной молекулы и связывающей молекулы изобретения.
Предпочтительные цитотоксические эффекторные молекулы для использования в настоящем изобретении - это цитотоксические препараты, в особенности те, которые применяются при терапии рака. Здесь термин цитотоксин или цитотоксический агент означает любой агент, нарушающий процесс роста и пролиферации клеток и способный снизить, заингибировать или разрушить клетку или злокачественность. Примеры цитотоксинов включают, но не ограничиваются, радионуклиды, биотоксины, ферментативно активные токсины, цитостатики или цитотоксические терапевтические агенты, пролекарства, иммунологически активные лиганды и модификаторы биологического ответа, такие как цитокины. Любой цитотоксин, способный затормозить или замедлить рост иммунореактивных или злокачественных клеток, находится в области настоящего изобретения.
Примеры цитотоксинов включают в целом цитостатические агенты, алкилирующие агенты, антиметаболиты, анти-пролиферативные агенты, тубулин-связывающие агенты, гормоны и антагонисты гормонов и т.д. Примеры цитостатиков, совместимых с настоящим изобретением, включают алкилирующие вещества, такие как мехлорэтамин, триэтиленфосфорамид, циклофосфамид, ифосфамид, хлорамбуцил, бусульфан, мелфалан или триазихинон, а также соединения нитрозомочевины, такие как кармустин, ломустин или семустин.
Особо предпочтительные молекулы для конъюгирования - это майтансиноиды (тауйиктойк). Мэйтансиноиды были первоначально выделены из кустарника в Восточной Африке, принадлежащего роду Мау!еии8, но затем обнаружено, что они являются метаболитами почвенных бактерий, таких как Асйиокуииета ргейокит (см., например, патент И8 № 3896111). Известно, что майтансиноиды включают майтансил, майтансинол, С-3 сложные эфиры майтансинола и другие аналоги и производные майтансинола (см., например, патенты И8 № 5208020 и 6441163). С-3 сложные эфиры могут встречаться в природе, а могут производиться синтетическими способами. Более того, природные и синтетические С-3 майтансинольные эфиры можно классифицировать как С-3 сложные эфиры с простым остатком карбоновой
- 84 015992 кислоты и С-3 сложные эфиры с производным N-метил-^-аланина, причем последний более цитотоксичен, чем первый. Синтетические аналоги майтансиноидов также известны в уровне техники и описаны, например, в работе Кирсйап е1 а1., I. Меб. Сйет., 21, 31-37 (1978). Способы генерации майтансинола и его аналогов или производных описаны, например, в патентной работе И8 № 4151042.
Подходящие майтансиноиды для использования в составе конъюгатов антител можно выделить из природных источников, а также приготовить синтетически или полусинтетически известными способами. Более того, майтансиноиды можно модифицировать любым известным способом, главное, чтобы в готовой молекуле-конъюгате сохранялось достаточно цитотоксичности.
Особо предпочтительные майтансиноиды, включающие соединяющие молекулы с реактивными химическими группами, - это С-3 сложные эфиры майтансинола и его аналогов, где соединяющая молекула включает дисульфидную связь, а прикрепляющая молекула - Н-сукцинимидильный или N-сульфосукцинимидильный эфир. Много положений в майтансиноидах могут служить местами химического прикрепления соединяющей молекулы, например, через эффекторную прикрепляющую молекулу. Например, полезны бывают С-3 позиция с гидроксильной группой, С-14 позиция, модифицированная гидроксиметилом, С-15 позиция, модифицированная гидрокси, и С-20 позиция с гидроксигруппой. Наиболее предпочтительно, если соединяющая молекула связана с С-3 позицией майтансинола. Также предпочтительно, если майтансинол, применяемый совместно с композицией изобретения, представляет собой Ккир.2'-деацетил-М.кир.2'-(-3-меркапто-1-оксопропил)майтансин (ЭМ1) или Ккир.2'-деацетилКкирЛ-^-меркаптоМ-метил-Ьоксопентил^айтансин (ЭМ4).
Соединяющие молекулы с другими химическими связями также могут использоваться в контексте изобретения, равно как и другие майтансиноиды. Специфические примеры других химических связей, которые могут включаться в соединяющие молекулы, это такие описанные выше связи, как, например, кислотные лабильные связи, тиоэфирные связи, фотолабильные связи, пептидаза-лабильные связи и эстераза-лабильные связи. Способы получения майтансиноидов с соединяющими молекулами и/или эффекторными прикрепляющими молекулами описаны, например, в патентных работах И8 № 5208020, 5416064 и 6333410.
Линкерная молекула (и/или эффекторная присоединяемая молекула) майтансиноида, как правило и предпочтительно, входит в состав более длинной связывающей пептидной молекулы, которая применяется для объединения антитела с майтансиноидом. В связи с настоящим изобретением может использоваться любая подходящая связывающая пептидная молекула, если только линкерная молекула обеспечивает снижение токсичности и свойств определения мишени для майтансиноида и антитела соответственно. Линкерная молекула объединяет майтансиноид с антителом посредством химических связей (как описано выше), так что майтансиноид химически сопрягается с антителом (например, связывается ковалентно). Желательно, чтобы линкерная молекула химически присоединялась к майтансиноиду антитела посредством дисульфидных и тиоэфирных связей. Наиболее предпочтительно, если антитело химически сопрягается с майтансиноидом через дисульфидные связи.
Другие предпочтительные классы цитотоксических агентов включают, например, антрациклиновое семейство лекарств, лекарства из растения Утса, митомицины, блеомицины, цитотоксические нуклеозиды, птеридиновое семейство лекарств, диинены и подофиллотоксины. Особо полезные члены этого класса включают, например, адриамицин, карминомицин, даунорубицин (дауномицин), доксорубицин, аминоптерин, метотрексат, метоптерин, митрамицин, стрептонигрин, дихлорометотрексат, митомицин С, актиномицин-Д, порфиромицин, 5-фтороурацил, флоксуридин, фторафур, 6-меркаптопурин, цитарабин, цитозин арабинозид, подофиллотоксин или его производные, такие как етопозид или етопозида фосфат, мелфалан, винбластин, винкристин, лейрозидин, виндезин, лейрозин и подобные им.
Еще одна группа цитотоксинов, совместимая с настоящим изобретением, включает таксол, таксан, цитохалазин В, графицидин Ό, этидиум бромид, еметин, тенопозид, колхицин, дигидрокси антрацин дион, митоксантрон, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуропичин, а также их аналоги и гомологи. С настоящим изобретением совместимы также гормоны и их антагонисты, такие как кортикостероиды, например, преднизон, прогестины, например, гидроксипрогестерон или медропрогестерон, экстрогены, например, диэтилстибестрол, антиэстрогены, например, тамоксифен, андрогены, например, тестостерон, и ингибиторы ароматазы, например, аминоглутетимид. Как уже упоминалось ранее, специалисты легко смогут внести в желаемые соединения химические модификации, чтобы сделать реакции с участием этих соединений более подходящими для целей получения конъюгатов изобретения.
Один пример особенно предпочтительных цитотоксинов включает участников или производные энедиинового семейства протиопухолевых антибиотиков, включая калихеамицин, эсперамицины или динемицины. Эти токсины чрезвычайно эффективны, они действуют, расщепляя ядерную ДНК, что ведет к смерти клеток. В отличие от белковых токсинов, которые могут быть расщеплены ш у1уо с получением множества неактивных, но иммуногенных фрагментов полипептида, токсины, такие как калихеамицин, эсперамицины и другие энедиины, являются маленькими молекулами, которые являются чрезвычайно неиммуногенными. Эти непептидные токсины химически связывают с димерами или тетрамеры с помощью способов, которые ранее использовались, чтобы маркировать моноклональные антитела и другие молекулы. Такие технологии связывания включают сайт-специфичную связь через N-связанные ос
- 85 015992 татки сахаров, присутствующие только на фрагментов конструктов Рс. Такие сайт-направленные способы связывания обладают преимуществом уменьшения возможных эффектов связи на свойства связывания конструктов.
Следует понимать, что помимо прочих цитотоксинов полипептиды могут также быть связаны с биотоксином, таким как подгруппа рицина А, абрин, токсин дифтерии, ботиллинум, циангинозины, сакситоксин, шигатоксин, столбнячный токсин, тетродотоксин, трихотецен, веррикуллоген или токсический фермент. Предпочтительно, такие конструкции будут сделаны с использованием способов генной инженерии, которые учитывают прямую экспрессию конструкта связывающая молекула-токсин. Другие модификаторы биологического ответа, которые могут быть связаны с полипептидами настоящего изобретения, включают цитокины, такие как лимфокины и интерфероны. В свете настоящего описания предполагается, что специалист сможет с легкостью сформировать такие конструкты, используя обычные способы.
Еще один класс совместимых цитотоксинов, которые могут использоваться совместно с описываемыми полипептидами, представляет собой радиосенситизирующие препараты, которые могут быть эффективно направлены к опухоли или иммунореактивным клеткам. Такие препараты увеличивают чувствительность к ионизирующей радиации, тем самым увеличивая эффективность лучевой терапии. Интернализованный опухолевой клеткой конъюгат доставляет радиосенситизатор ближе ядра, где радиосенсибилизация будет максимальна. Полипептиды изобретения, не связанные с радиосенситизатором, быстро выводятся из крови, локализуя остающееся средство радиосенсибилизации в целевой опухоли и обеспечивая минимальное поглощение в нормальных тканях. После быстрого клиренса из крови дополнительная лучевая терапия применяется в одном из трех способов: 1) внешняя радиация, направленная специфично к опухоли, 2) радиоактивность, непосредственно введенная в опухоль, или 3) системная радиоиммунотерапия с той же связывающей молекулой. Потенциально привлекательная вариация этого подхода представляет собой применение терапевтического радиоизотопа к радиосенситизированному иммуноконъюгату, таким образом обеспечивая преимущество введения пациенту единственного лекарственного средства.
В соответствии с одним вариантом осуществления молекула, которая увеличивает стабильность или эффективность полипептида, может быть конъюгирована. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления, чтобы увеличить период полураспада полипептидов изобретения ш νίνο, с ними может быть конъюгирован РЕС. Ьеопд, 8.В., е! а1. 2001. Су!окше 16:106; 2002; Αбν. 1п Эгид Ие1к. Веν. 54:531; или \Уей е! а1. 2002. Вюсйет. 8ос. Тгапкасйопк 30:512.
Как ранее упоминалось, совместимые цитотоксины могут включать пролекарство. Здесь термин пролекарство относится к предшественнику или производной форме фармацевтически активного вещества, которое является менее цитотоксическим к опухолевым клеткам по сравнению с исходным лекарственным средством, и способен к ферментативной активации или превращению в более активную родительскую форму. Пролекарства, совместимые с изобретением, включают, но не ограничиваются, включающие фосфат пролекарства, тиофосфатвключающие пролекарства, сульфатвключающий пролекарства, пептидвключающие пролекарства, β-лактамвключающие пролекарства, возможно, замещенные феноксиацетамидвключающие пролекарства или, возможно, замещенные фенилацетамидвключающие пролекарства, 5-фтороцитозин и другие 5-фтороуридиновые пролекарства, которые могут быть преобразованы к более активному цитотоксическому свободному лекарственному средству. В соответствии с одним вариантом осуществления цитотоксический агент, такой как майтанзионид, вводится как пролекарство, которое высвобождается гидролизом дисульфидных мостиков. Дополнительные примеры цитотоксических препаратов, которые могут быть дериватизированы в форму пролекарства для использования в существующем изобретении, включают химиотерапевтические агенты, описанные выше.
XIII. Введение связывающих молекул.
Способы приготовления и введения связывающих молекул изобретения субъекту хорошо известны специалистам или легко могут быть определены им. Путь введения связывающих молекул изобретения может быть оральным, парентеральным, ингаляцией или топическим. Термин парентеральный здесь включает внутривенное, внутриартериальное, интраперитонеальное, внутримышечное, подкожное, ректальное или влагалищное введение.
Внутривенные, внутриартериальные, подкожные и внутримышечные формы парентерального введения особо предпочтительны. В то время как все эти формы введения явным образом включены в область изобретения, особо предпочтительны внутривенные или внутриартериальные инъекции. Обычно, подходящий фармацевтический состав для инъекции может включить буфер (например, ацетатный, цитратный или фосфатный буфер), сурфактант (например, полисорбат), возможно, стабилизатор (например, человеческий альбумин) и т.д. Однако в других способах, совместимых с приводимой здесь информацией, полипептиды можно ввести непосредственно в сайт больных клеток, таким образом увеличивая экспозицию патологически измененной ткани терапевтическому агенту.
Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примеры неводных растворителей - пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и вводимые в виде инъекций органические эфиры, такие как
- 86 015992 этил олеат. Водные носители включают воду, алкоголь/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологический раствор и забуференную среду.
В настоящем изобретении фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются, 0,01-0,1М и предпочтительно 0,05М фосфатный буфер или 0,8% физиологический раствор. Другие обычные парентеральные носители включают растворы фосфата натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактированный раствор Рингера или фиксированные масла. Внутривенные носители включают жидкие и питательное составы, электролиты, такие как основанные на декстрозе рингера, и подобные им. Консерванты и другие добавки могут также присутствовать, такие как, например, антибактериальные препараты, антиоксиданты, хелаторы, инертные газы и подобные им. Более конкретно, фармацевтические составы, подходящие для введения в виде инъекций, включают стерильные водные растворы (если растворимы в воде), дисперсии или стерильные порошки для немедленного введения стерильных вводимых растворов или дисперсии. В таких случаях состав должен быть стерильным и жидким до степени, обеспечивающей легкое введение. Состав должен быть стабильным в условиях изготовления и хранения и должен быть предпочтительно защищен от действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Носитель может быть растворителем или средой диспергирования, включающей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропилен гликоль, жидкий полиэтилен гликоль и т.д.), а также подходящие смеси всего перечисленного. Надлежащая текучесть может быть обеспечена, например, при помощи покрытия, такого как лецитин, поддержанием необходимого размера частиц в случае дисперсии и при помощи сурфактантов.
Профилактика действия микроорганизмов может быть достигнута различными антибактериальными и противогрибковыми агентами, например парабеном, хлоробутанолом, фенолом, аскорбиновой кислотой, тимерозалом и т.д. Во многих случаях предпочтительно включать изотонические вещества, например, сахар, полиспирты, такие как маннит, сорбитол, хлорид натрия или их композиции. Длительная абсорбция вводимых составов может быть вызвана включением в состав агента, который задерживает поглощение, например моностеарата алюминия и желатина.
В любом случае, стерильные вводимые растворы могут быть подготовлены путем включения активного состава (например, полипептида отдельно или в комбинации с другими активными агентами) в необходимом количестве в соответствующем растворителе с одним или комбинацией компонентов, перечисленных здесь, как требуется, с последующей стерилизацией путем фильтрования. В общем случае, дисперсии делают, включая активный состав в стерильный носитель, который включает основную среду дисперсии и необходимые другие компоненты из числа перечисленных выше. В случае стерильных порошков для подготовки стерильных вводимых растворов предпочтительными способами являются вакуумная и лиофильная сушка, которые приводят к получению порошка, состоящего из активного ингредиента и любого дополнительного желательного компонента из ранее стерильно отфильтрованного раствора. Препараты для инъекций обрабатывают, помещают в контейнеры, такие как ампулы, мешки, бутылки, шприцы или пузырьки и запечатывают при стерильных условиях согласно способам, известным в уровне техники. Далее, препараты могут быть упакованы и проданы в форме наборов, таких как описаны в совместно поданной заявке υ.δ.δ.Ν. 09/259337 и υ.δ.δ.Ν. 09/259338, каждая из которой включена сюда по ссылке. Для таких препаратов предпочтительно делать метки или указания о том, что ассоциированные с ними составы полезны для лечения субъета, страдающего от или предрасположенного к аутоиммунным или неопластическим расстройствам.
Эффективные дозы стабилизированных связывающих молекул настоящего изобретения для лечения вышеупомянутых описанных состояний изменяются в зависимости от множества различных факторов, включая средства введения, целевого сайта, физиологического состояния пациента, является ли пациент человечеком или животным, других принимаемых лекарств и является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно, пациент - человек, но можно также лечить нечеловеческие млекопитающие, включая трансгенные млекопитающие. Дозировки могут титроваться, используя обычные способы, известные специалистам, чтобы оптимизировать безопасность и эффективность.
Для пассивной иммунизации связывающей молекулой изобретения дозировка может находиться в диапазоне, например, от приблизительно 0,0001 до 100 мг/кг, чаще от 0,01 до 5 мг/кг (например, 0,02, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2 мг/кг и т.д.) массы тела хозяина. Например, дозировки могут составлять на 1 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела или в интервале 1-10 мг/кг, предпочтительно по крайней мере 1 мг/кг. Дозы в вышеупомянутых диапазонах также входят в область изобретения.
Субъектам можно вводить такие дозы ежедневно, в альтернативные дни, еженедельно или согласно любому другому списку, определенному эмпирическим анализом. Пример лечения включает введение в многократных дозировках в течение длительного периода, например по крайней мере шесть месяцев. Дополнительные примеры режима лечения предполагают введение раз в каждые две недели или один раз в месяц или раз за каждые 3-6 месяцев. Примеры схем дозировки включают 1-10 мг/кг или 15 мг/кг в последовательные дни, 30 мг/кг через день или 60 мг/кг еженедельно. В некоторых способах два или больше моноклональных антител с различной специфичностью связывания вводят одновременно, в этом случае дозировка каждого вводимого антитела может находиться в пределах обозначенных диапазонов.
Связывающие молекулы изобретения можно вводить многократно. Интервалы между отдельными
- 87 015992 дозировками могут быть, например, ежедневно, еженедельно, ежемесячно или ежегодно. Интервалы могут также быть нерегулярными, на основании данных об уровне в крови пациента полипептида или целевой молекулы. В некоторых способах дозировка настраиваится так, чтобы достигнуть определенной концентрации в плазме связывающей молекулы или токсина, например, 1-1000 мкг/мл или
25-300 мкг/мл. Альтернативно, связывающие молекулы могут быть введены в составе задержанного высвобождения, когда требуется менее частое введение. Дозировка и частота изменяется в зависимости от времени полужизни антитела в пациенте. В целом, гуманизированные антитела демонстрируют самую длинную полужизнь, за ними следуют химерные антитела и нечеловеческие антитела. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения могут быть введены в неконъюгированной форме. В соответствии с другим вариантом осуществления полипептиды изобретения могут быть введены многократно в конъюгированной форме. В соответствии с еще одним вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения могут быть введены в неконъюгированной форме, а затем в конъюгированной форме или наоборот. Частота и дозировка введения может изменяться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. В профилактических применениях составы, включающие настоящее антитело или его коктейль, введены еще здоровому пациенту, чтобы увеличить сопротивляемость. Такое количество называется профилактической эффективной дозой. В этом случае точное количество также зависит от состояния здоровья пациента и общего иммунитета, но в общем случае колеблется от 0,1 до 25 мг за дозу, особенно 0,5 к 2,5 мг за дозу. Относительно низкая дозировка вводится относительно редко в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают лечиться всю оставшуюся жизнь.
Для терапевтического применения иногда требуется относительно высокая дозировка (например, приблизительно от 1-400 мг/кг связывающей молекулы, например, антитела за дозу, с дозировками от 5 до 25 мг, часто используемая для радиоиммуноконъюгатов, и более высокие дозы для конъюгированных молекул цитотоксин-лекарство) за относительно короткие интервалы, пока прогрессия болезни не понижена, или болезнь не прекратилась и предпочтительно пока пациент не показывает частичное или полное ослабление симптомов болезни. После этого пациент может быть переведен на режим профилактического введения препарата.
В соответствии с одним вариантом осуществления субъекта можно лечить нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид изобретения (например, в векторе). Дозы для таких нуклеиновых кислот колеблются приблизительно от 10 нг до 1 г, 100 нг до 100 мг, 1 мкг до 10 мг или 30-300 мкг ДНК для пациента. Дозы для инфекционных вирусных векторов изменяются от 10-100 или больше вирионов на дозу.
Терапевтические вещества могут быть введены парентеральными, топическими, внутривенными, пероральными, подкожными, внутриартериальными, внутричерепными, интраперитонеальными, внутриносовыми или внутримышечными способами для профилактики и/или терапевтического лечения. Внутримышечные инъекции или внутривенные инфузии предпочтительны для введения связывающей молекулы изобретения.
В некоторых способах специфичные терапевтические связывающие молекулы вводятся непосредственно в череп. В некоторых способах связывающие молекулы вводятся как приспособление или устройство задержанного высвобождения, такие как устройство Меб1раб™.
Агенты изобретения могут произвольно быть введены в комбинации с другими агентами, которые эффективны для лечения расстройства или состояния (например, профилактическое или терапевтическое средство). Предпочтительные дополнительные агенты - те, которые признаны в уровне техники и стандартно вводятся для лечения специфических расстройств. Эффективные однократные дозировки лечения (т.е. терапевтически эффективное количество) 9'Л-меченых полипептидов изобретения располагаются приблизительно в диапазоне 5-75 мКи, более предпочтительно приблизительно 10-40 мКи. Эффективные аблативные дозировки при лечении некостного мозга 'Л-мечеными антителами составляют приблизительно 5-70 мКи, более предпочтительно приблизительно 5-40 мКи. Эффективные однократные дозировки аблативного лечения (т.е. может потребовать аутогенной пересадки костного мозга) ’^-мечеными антителами колеблется в диапазоне, приблизительно 30-600 мКи, более предпочтительно, приблизительно 50-500 мКи. В соединении с химерными модифицированными антителами, вследствие более долгой полужизни мышиных антител, эффективные отдельные дозировки аблатива некостного мозга при лечении йода 131 мечеными химерными антителами располагаются приблизительно в диапазоне 5-40 мКи, более предпочтительно менее чем приблизительно 30 мКи. Критерии картирования для, например, меток ''’к, как правило, меньше чем приблизительно 5 мКи.
В то время как большой клинический опыт был получен с 131Ι и 90Υ, в уровне техники известны и другие метки, используемые в подобных целях. Дополнительные радиоизотопы используются и для картирования. Например, дополнительные радиоизотопы, которые совместимы с областью настоящего изобретения, включают, но не ограничены, 123Ι, 125Ι, 32Р, 57Со, 64Си, 67Си, 77Вг, 81ВЬ, 81Кг, 878г, 113 61, 127Сз, 129Сз, 132Ι, 197нё, 203РЬ, 206В1, 177Ьи, 186Ве, 212РЬ, 212В1, 478с, 105ВЙ, 109Рб, 1538т, 188Ве, 199Аи, 225Ас, 211А! и 213В1. В этом отношении альфа, гамма и бета эмиттеры все совместимы с настоящим изобретением. Более того, каждый специалист легко может определить, какие радионуклиды совместимы с выбранным курсом лечения без неуместного экспериментирования. В связи с этим дополнительные радионуклиды, которые
- 88 015992 уже использовались в клиническом диагнозе, включают 125Σ, 123Σ, 99Тс, 43К, 52Ее, 67Са, 68Са, а также и 111Тп. Антитела метились множеством радионуклидов также и для потенциального использования в направленной иммунотерапии (Ре1гегех е1 а1. Iттиηο1. Се11 Вю1. 65: 111-125 (1987)). Эти радионуклиды включают 188Яе и 186Яе, так же как 199Аи и 67Си в меньшей степени, патент США № 5460785 включает дополнительную информацию относительно таких радиоизотопов и включен сюда по ссылке.
Независимо от того, используются ли или нет связывающая молекула изобретения в конъюгированной или неконъюгированной форме, главное преимущество настоящего изобретения - это способность использовать эти полипептиды у миелоподавленных пациентов, особенно тех, кто подвергается или подвергался дополнительным способам лечения, таким как лучевая терапия или химиотерапия. В соответствии с другими предпочтительными вариантами осуществления полипептиды (снова в конъюгированной или неконъюгированной форме) могут вводиться в объединенной терапевтической схеме с химиотерапевтическими агентами. Специалисты понимают, что такие терапевтические режимы могут включить последовательное, одновременное, параллельное введение описываемых антител и одного или более химиотерапевтических агентов, а также введение в течение одинакового времени. Особенно предпочтительные варианты осуществления изобретения будут включать введение токсин-конъюгированной связывающей молекулы, например, конъюгированной к майтансиноидам, таким как Ό4 майтансиноиды.
В то время как связывающие молекулы могут быть введены, как описано выше, нужно подчерк нуть, что в соответствии с другими аспектами конъюгированные и неконъюгированные полипептиды могут быть введены в остальном здоровым пациентам как терапевтический агент первой линии. В таких вариантах осуществления полипептиды могут быть введены пациентам, имеющим нормальные средние запасы красного костного мозга, и/или пациентам, которые не имеют таковых после дополнительных способов лечения, таких как внешняя лучевая или химиотерапия.
Однако как обсуждалось выше, некоторые варианты осуществления изобретения включают введение связывающих молекул пациентам с подавленой функцией костного мозга отдельно или в комбинации или совместно с одним или более дополнительными способами лечения, такие как лучевая терапия или химиотерапия (т.е. объединенная схема лечения). Здесь введение полипептидов в комбинации или совместно с одним или более дополнительными способами лечения означает последовательное, симуль танное, параллельное, сопутствующее введение или одновременное введение, применение терапии и раскрытых здесь связывающих молекул. Квалифицированные специалисты понимают, что введение или применение различных компонентов объединенной схемы лечения может быть рассчитано, чтобы увеличить полную эффективность лечения. Например, химиотерапевтические вещества могли быть введены в стандартных, известных курсах лечения, сопровождаемого в течение нескольких недель радиоиммуноконъюгатами настоящего изобретения. Наоборот, цитотоксин-ассоциированные полипептиды могли быть введены внутривенно, сопровождаться внешним облучением опухоли. В соответствии с другими аспектами полипептид может быть введен одновременно с одним или более отобранными химиотерапевтическими агентами во время отдельного визита. Квалифицированный специалист (например, опытный онколог) легко может различить эффективные комбинированные терапевтические режимы без неуместного экспериментирования, на основании подобранной дополнительной терапии и описания настоящих методик.
В этом отношении следует понимать, что комбинация связывающих молекул (любой конъюгированных или неконъюгированных) и химиотерапевтического вещества может быть назначена в любом порядке и в любой момент времени, который предоставляет терапевтическую пользу пациенту. Таким образом, химиотерапевтическое вещество и полипептид могут быть введены в любом порядке или одновременно. Связывающие молекулы и химиотерапевтические агенты могут быть введены отдельно, или могут быть введены в одном препарате. В отобранных аспектах полипептиды настоящего изобретения будут введены пациентам, которые ранее перенесли химиотерапию. В соответствии с другими аспектами полипептиды и химиотерапевтическое лечение будет проведено по существу одновременно. Например, пациенту можно дать связывающую молекулу во время курса химиотерапии. В соответствии с предпочтительными аспектами связывающая молекула будет введена в течение 1 года после любого химиотерапевтического агента. В соответствии с другими предпочтительными аспектами полипептид вводится в пределах 10, 8, 6, 4 или 2 месяцев после любого химиотерапевтического лечения. В соответствии с остальными предпочтительными аспектами полипептид вводится в пределах 4, 3, 2 или 1 недели после лечения или профилактики любым химиотерапевтическим агентом или лечения. В соответствии с другими аспектами полипептид вводится в пределах 5, 4, 3, 2 или 1 дня после лечения подобранным химиотерапевтическим агентом. Следует понимать, что эти два вещества могут быть введены пациенту в пределах нескольких часов или минуты (т.е. фактически одновременно).
Кроме того, в соответствии с существующим изобретением пациент с подавленной функцией костного мозга означает любого пациента, имеющего пониженные количества форменных элементов крови в анализах. Специалисты понимают, что несколько параметров анализа крови, традиционно используемых как клинические индикаторы подавления функции костного мозга, могут легко измерить степень подавления функции костного мозга у пациента. Примером известного способа измерения подавления функции костного мозга являетя абсолютное количество нейтрофилов (АИС). Такое подавление функции ко
- 89 015992 стного мозга может быть результатом различных биохимических расстройств или болезни или, более вероятно, являться результатом предшествующей лучевой терапии или химиотерапии. В этом отношении, квалифицированные специалисты понимают, что пациенты, которые перенесли традиционную химиотерапию, как правило, демонстрируют уменьшенное количество красного костного мозга. Как обсуждалось выше, таких субъектов часто не удается вылечить оптимальными уровнями цитотоксина (т.е. радионуклидами) из-за недопустимых побочных эффектов, таких как анемия или иммуносупрессия, которые заканчиваются увеличенной летальностью или осложненным течением.
Более конкретно, конъюгированные или неконъюгированные полипептиды настоящего изобретения могут использоваться для эффективного лечения пациентов, имеющих АNС ниже чем 2000/мм3, или количество тромбоцитов ниже чем 150000/мм3. Более предпочтительно полипептиды настоящего изобретения могут использоваться для лечения пациентов, имеющих АNС менее чем 1500/мм3, менее чем 1000/мм3 или еще более предпочтительно менее чем 500/мм3. Аналогично, полипептиды настоящего изобретения могут использоваться для лечения пациентов с количеством тромбоцитов менее чем около 75000/мм3, менее чем 50000/мм3 или даже менее чем 10000/мм3. В более общем смысле, специалисты в данной области легко смогут определить, когда у пациента будет подавлена функция костного мозга, используя принятые правительством руководящие доументы и методики.
Как указано выше, много пациентов с подавленной функцией костного мозга прошли курсы лечения, включая химиотерапию, имплантационную лучевую терапию или внешнюю лучевую терапию. В последнем случае внешний радиационный источник используют для местного облучения злокачественного новообразования. В случае способов имплантации лучевой терапии радиоактивные реактивы хирургически распологают в пределах злокачественного образования, тем самым селективно облучая центр заболевания. В любом случае, описанные полипептиды могут использоваться для лечения расстройства у больных с подавленной функцией костного мозга, независимо от причины.
В этом отношении следует понимать, что полипептиды настоящего изобретения могут использоваться совместно или в комбинации с любым химиотерапевтическим агентом или агентами (например, чтобы обеспечить комбинированный терапевтический режим), которые устраняют, уменьшают или контролируют или ингибируют рост неопластических ячеек ш νί\Ό. Как показано, такие агенты часто приводят к сокращению резервов красного костного мозга. Это сокращение можно возместить, полностью или частично, уменьшая миелотоксичность составов настоящего изобретения, что очень хорошо при агрессивном лечении неоплазий у таких пациентов. В соответствии с другими предпочтительными вариантами осуществления меченный радиоактивным изотопом иммуноконъюгат, раскрытый здесь, может эффективно использоваться с радиосенсибилизаторами, которые увеличивают восприимчивость неопластических клеток к радионуклидам. Например, радиосенсибилизующий состав может быть введен после того, как меченая радиоактивным изотопом связывающая молекулы значительной степени удалена из кровотка, но все еще остается на терапевтически эффективных уровнях на сайте опухоли или в самой опухоли.
Относительно этих аспектов изобретения демонстративные химиотерапевтические агенты, которые совместимы с настоящим изобретением, включают алкилирующие агенты, алкалоиды барвинка (например, винкристин и винбластин), прокарбазин, метотрексат и преднизон. Комбинация МОРР из четырех лекарственных средств (меклетамин (азотный иприт), винкристин (Онковин), прокарбазин и преднизон) очень эффективна в лечении различных типов лимфомы и является предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения. У МОРР-устойчивых пациентов, АВУЭ (например, адриамицин, блеомицин, винбластин и дакарбазин), СЫУРР (хлорамбуцил, винбластин, прокарбазин и преднизон), ТАКСИ (ломустин, доксорубицин, блеомицин и стрептозотоцин), МОРР плюс АВУО, МОРР плюс АВУ (доксорубицин, блеомицин и винбластин) или ВСУРР (кармустин, циклофосфамид, винбластин, прокарбазин и преднизон) могут использоваться совместно. Агпо1б 8. Ргеебтап и Ьее М. №1б1ег. МаИдпап! Ьутрйотаз, т НАКККОЦ^ РК1ХС1РЕЕ8 ОР 1ХТЕ1/ХАЕ МЕО1С1ХЕ 1774-1788 (Кий I. 1ззе1ЬасЕег е! а1., ебз., 13(11 еб. 1994) и У.Т. ЭеУНа е! а1. (1997) и процитированные там ссылки для стандартной дозировки и схемы лечения. Эти способы лечения могут использоваться в соответствии с базовыми рекомендациями, или их можно изменить, как необходимо для конкретного пациента, применяя в комбинации с одним или более полипептидов изобретения, как описано здесь.
Дополнительные режимы, которые пригодны в контексте настоящего изобретения, включают использование отдельных алкилирующих агентов, таких как циклофосфамид или хлорамбуцил, или их комбинаций, таких как ЦВД (циклофосфамид, винкристин и преднизон), СнОР (СУР и доксорубицин), С-МОРР (циклофосфамид, винкристин, преднизон и прокарбазин), БИБОП САР ВОР (СНОР плюс прокарбазин и блеомицин), м-ВАСОЭ (СНОР плюс метотрексат, блеомицин и лейковорин), РгоМАСЕМОРР (преднизон, метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, этопозид и лейковорин плюс стандартный МОРР), РгоМАСЕ-Су(аВОМ (преднизон, доксорубицин, циклофосфамид, этопозид, цитарабин, блеомицин, винкистин, метотрексат и лейковорин) и МАСОР-В (метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, винкристин, фиксированные дозы преднизона, блеомицин и лейковорин). Специалисты легко могут определить стандартные дозировки и схему введения для каждого из этих режимов. СнОР была также объединена с блеомицином, метотрексатом, прокарбазином, горчицей азота, цитозиновым арабинозидом
- 90 015992 и етопозидом. Другие совместимые химиотерапевтические агенты включают, но не ограничены, 2хлордезоксиаденозин (2-С^Α),2'-дезоксикоформицин и флударабин. Для пациентов со средней и высокой степенью НХЛ, для которых не получается добиться ремиссии, используется ургентная терапия. Способы такой терапии используют препараты, такие как цитозиновый арабинозид, цисплатин, этопозид и ифосфамид отдельно или в комбинации. В случае рецидивов или агрессивных форм или в случае определенных неопластических расстройств часто используются следующие протоколы: ГМУР-16 (ифосфамид, метотрексат и этопозид), МГМБ (метил-6Α6, ифосфамид, метотрексат и этопозид), ΌΗΑΡ (дексаметазон, цитарабин в большой дозе и цисплатин), Ε8ΗΑΡ (етопозид, метилпреднизолон, цитарабин ΗΌ, цисплатин), СЕРР (В) (циклофосфамид, этопозид, прокарбазин, преднизон и блезомцин), СΑМР (ломустин, митоксантрон, цитарабин и преднизон) каждый с известными нормами и схемами дозирования.
Количество химиотерапевтического агента, который будет использоваться в комбинации с полипептидами данного изобретения, может измениться в соответствии с уровнем техники, схема введения также может варьироваться. См., например, Вгисе Α СйаЬпег е! а1., Αηί^ηеοр1акΐ^с Αдеηίк, ш 6ΟΟ^МΑN & 6ιΙ1.\1ΑΝ'8 ΤΗΕ РΗΑΒМΑСΟ^Ο6IСΑ^ ΒΑ8I8 ΟΡ ΤΗΕΒΑΡΕυΤΊ€8 1233-1287 (1ое1 6. Шгбтап е! а1., ебк., 9(11 еб. 1996).
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению может быть введена субъекту, который перенес, переносит или перенесет хирургическую операцию, например, по удалению первичной опухоли, метастаза или предзлокачественного роста ткани или в качестве профилактики.
В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению вводится совместно с биопрепаратом. Биопрепараты, пригодные для лечения рака, известны в уровне техники, связывающая молекула по изобретению может быть введена, например, в соединении с такими известными биопрепаратами. Например, ΡΌΑ одобрил следующие биопрепараты для лечения рака молочной железы: Герцептин® (трастузумаб, СепеШесй Шс, Южный Сан-Франциско, Калифорния; гуманизированное моноклональное антитело, с антиопухолевой активностью в ΗΕΚ2-положительном раке молочной железы); Фаслодекс® (фулвестрант, Фармацевтические препараты Αкί^аΖеηеса, ЬР, Уилмингтон, Делавэр; антагонист рецептора эстрогена для лечения рака молочной железы); Аримидекс® (анастрозол, Фармацевтические препараты Αкι^аΖеηеса. ЬР; нестероидный ингибитор ароматазы, который блокируетароматазу, фермент, которые требуется для получения эстрогена); Аромастин® (эксеместан, РПхег Шс, Нью-Йорк, Нью-Йорк; необратимый стероидный инактиватор ароматазы, используемый в лечении рака молочной железы); Фемара® (летрозол, Фармацевтические препараты №уагбк, Восточный Ганновер, Нью-Джерси; нестероидный ингибитор ароматазы, одобренный ΡΌΑ для лечения рака молочной железы); и Нолвадекс® (тамоксифен, Фармацевтические препараты Αкι^аΖеηеса. ЬР; нестероидный антиэстроген, одобренный Р^Α для лечения рака молочной железы). Другие биопрепараты, с которыми могут совместно использоваться связывающие молекулы изобретения, включают: Авастин™ (бевацизумаб, СепегИесй Шс; первая ΡΌΑ-одобренная терапия, разработанная, чтобы ингибировать ангиогенез); Зевалин® (ибритумомаба теуксетан, Вюдеп Шес, Кембридж, Массачусетс; меченое радиоактивным изотопом моноклональное антитело, в настоящее время одобренное для лечения В-лимфоцитарных лимфом).
Кроме того, ΡΌΑ одобрил следующие биопрепараты для лечения колоректального рака: Авастин™; Эрбитукс™ (цитексимаб, ^Сбопе 8ук1етк Шс, Нью-Йорк, Нью-Йорк, ВпкЮ1-Муегк 8ци|ЬЬ, Нью-Йорк, ΝΥ; моноклональное антитело против рецептора эпидермального фактора роста (Ε6ΡΒ)); Гливек® (иматиниба метисилат; ингибитор белоккиназы); Эргамизол® (гидрохлорид левамизола, 1апккеп Рйагтасеибса Ргобиск, ЬР, Τίίυκνί1Β, ΝΕ таикуШе, Нью-Джерси; иммуномодулятор, одобренный ΡΌΑ в 1990 как полезное лечение в комбинации с с 5-фтороурацилами после хирургической резекции у больных рака толстой кишки в стадии Оикек' 8!аде С).
Одобренные способы лечения лимфом не-Ходжкина в настоящее время включают: Бексар® (тозитумомаб и йод Ι-131 тозитумомаб, 61ахо8тййК1те, Парк Шапд^ Рагк, Ν6 многошаговое лечение, вовлекающее моноклональное антитело мыши (тозитумомаб), связанное с радиоактивной молекулой (йод 1-131)); Интрон® (интерферон-альфа-2Ь, 8с11еппд Согрогабоп, Кепбтеойй, ΝΕ тип интерферона, одобренный для лечения фолликулярной лимфомы не-Ходжкина в соединении с содержащей антрациклин химиотерапевтической комбинацией (например, циклофосфамид, доксорубицин, винкристин, преднизон [СΗΟР])); Ритуксан® (ритуксимаб, СепеШесй Шс., 8ои111 8ап Ρ^аηс^ксο, СΑ, и Вюдеп Шес, СатЬббде, МΑ; моноклональное антитело для лечения лимфомы не-Ходжкина; Онтак® (денилейкина дифлитокс, Пдапб Рйагтасеибса1к Шс, Сан-Диего, Калифорния; химерный белок, состоящий из фрагмента токсина дифтерии, генетически гибридизованного с интерлейкином 2); и Зевалин® (тиуксетана ибритумомаб, Вюдеп Шес; радиоактивно меченое моноклональное антитело, одобренное ΡΌΑ для лечения лимфом неХоджкина В-клеток).
Для лечения лейкемии могут использоваться следующие биопрепараты в комбинации со связывающими молекулами изобретения: Гливек®; Кампат®-1Н (алемтузумаб, ЕаЬога!обек, Кгсбтопб, СА; тип моноклонального антитела, используемого в лечении хронического лимфоцитарного лейкоза). Кроме
- 91 015992 того, Генасенс (облимерсен, Оеп!а Согрогабоп, Бегк1еу Не1дй!к, Νί; антисенсорная терапия БСЬ-2 при развитии, может использоваться для лечения лейкоза (например, один или в комбинации с одним или более препаратов химиотерапии, такими как флударабин и циклофосфамид), вещества могут вводиться совместно с указанными связывающими молекулами.
Для лечения рака легкого могут применяться Тарсева™ (ерлотиниб НСЬ, ΟδΙ Ρйз^тасеиΐ^са1κ Шс, Μе1ν^11е, Нью-Йорк; маленькая молекула, направленная против человеческого рецептора эпидермального фактора роста 1 (НЕК1)).
Для лечения множественной миеломы могут использоваться Велкад® (бортезомиб, Μ^11еηη^ит Ρйз^тасеиΐ^са1κ, СатЬпбде ΜΑ; ингибитор протеасом). Дополнительные биопрепараты включают Талидомид® (талидомид, С1едепе Согрогабоп, ^аггеп. Νί; иммуномодулятор, видимо, обладающий и другими механизмами действия, включая способность ингибировать рост и выживание миеломных клеток и антиангиогенез).
Другие примеры биопрепаратов включают МОАВ IΜС-С225, разработанный ТтС1опе δуκΐетκ, Шс, Ыете Уогк, ΝΥ.
Кроме того, заявленные связывающие молекулы могут быть введены совместно с вакцинами или другими агентами (например, цитокины), модулирующими иммунные ответы против рака. Например, Мелацин® (Согрогабоп, δеаΐΐ1е, νΑ) является аллогенной вакциной опухоли, у которой, как сообщалось, проявились многообещающие результаты в лечении резецированной меланомы Т3N0Μ0. ΟΜΚ® ^годешек Ρйз^тасеиΐ^са1, Шс, Таггу1о\уп. Нью-Йорк) является ганглиозным антигеном, введенным как вспомогательный для фазы ΙΙΙ агент у больных с высоким риском рецидива меланомы. Анти-гастрин Терапевтическая вакцина® ^рЫоп Согрогабоп, Μί;·ιιηί. ЕЬ) нейтрализует гормоны О17, находится в третьей фазе клинических испытаний для лечения пациентов с колоректальным и панкреатическим раками и раком желудка. СеаУас® (Тйап Ρйа^тасеиΐ^сз1κ, Шс, δοιιΐΐι δаη Ргзпс1ксо, СЛ) является антигенотипом вакцин антител, исследуемый применительно к колоректальному раку. Наконец, Терапот® (Бютпа Шс. Ебтоп!оп, Л1Ье^ιз. Сапаба), терапевтическая вакцина с синтетическими углеводами, исследуемая на третьей фазе как агент у больных с метастатическим раком молочной железы (Ρйз^тасеи1^са1 Яекеагсй и Μаηиίас1игегк о£ Лте^^сз. 2000).
В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению может быть введена совместно с анти-ангиогенным агентом, например, Эндостатином (эндогенный, полученный из опухоли, эндотелий-специфичный ингибитор, который останавливает капиллярную эндотелиальную продукцию клетки); анти-УЕОЕ антитело; талидомид; ингибиторы металлобелказы матрицы ингибируют синтез и деградацию и базовой мембраны кровеносных сосудов).
Как упоминалось ранее, связывающие молекулы настоящего изобретения, иммунореактивные фрагменты или их рекомбинанты могут быть введены в фармацевтически эффективном количестве для 1п νίνο лечения расстройств у млекопитающих. В этом отношении следует понимать, что описываемая связывающая молекула будет включена в такой состав, чтобы облегчить введение и повысить стабильность активного агента. Предпочтительно фармацевтические составы в соответствии с изобретением включают фармацевтически приемлемый нетоксичный стерильный носитель, такой как физиологический раствор, нетоксичные буферы, консерванты и подобное им. В контексте настоящего изобретения фармацевтически эффективное количество связывающей молекулы изобретения, конъюгированной или неконъюгированной с терапевтическим агентом, означает количество, достаточное для эффективного связывания, например, чтобы уменьшить симптомы болезни или расстройства или чтобы обнаружить вещество или клетку. В случае опухолевых клеток полипептид будет предпочтительно взаимодействовать с отобранными иммунореактивными антигенами на неопластических или иммунореактивных клетках и приводить к усилению гибели этих клеток. Конечно, фармацевтические составы настоящего изобретения могут быть введены однократно или в многократных дозах, достаточных для того, чтобы доставить в организм фармацевтически эффективное количество полипептида.
В рамках объема настоящего изобретения полипептиды изобретения могут быть введены человеку или другому животному в соответствии с вышеупомянутыми способами лечения в количестве, достаточном для того, чтобы оказать терапевтическое или профилактическое действие. Полипептиды изобретения могут быть введены такому человеку или другому животному организму в обычной форме дозировки, приготовленной путем смешивания связывающей молекулы изобретения с обычным фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем согласно известным методикам. Специалисту будет понятно, что форма и особенности фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя определяют количество активного компонента, с которым они должны быть объединены, путь введения и другие известные переменные. Квалифицированные специалисты понимают также, что коктейль, включающий один или более разновидностей полипептидов согласно существующему изобретению, может оказаться особенно эффективным.
- 92 015992
ХГУ. Способы применения.
Молекулы изобретения могут использоваться при состояниях, когда желательно применить стабилизированную молекулу зсЕуз или составы, включающие такую молекулу 8сΡν8, например, в диагностических или терапевтических целях. Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения представляют соединения, составы, композиции и способы диагноза и/или лечения расстройств, при которых введение связывающей молекулы изобретения является эффективным, например, неопластические расстройства у млекопитающего субъекта, нуждающегося в таком лечении. Предпочтительно субъект представляет собой человека.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающие молекулы могут использоваться в пробе, чтобы обнаружить антиген опухоли т уЕго, например, используя пробу ЕЫ8А. Образцовые пробы известны в уровне техники, см., например, заявку на патент США № 20040077025.
В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы могут использоваться для обнаружения клеток с антигеном опухоли, используя технологию формирования изображения. Для таких областей применения может быть желательно конъюгировать связывающую молекулу с поддающейся обнаружению молекулой, например, радиоактивномеченой, как описано ниже.
В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы могут использоваться для снижения концентрации или удаления клеток (например, апоптозом), несущих в себе эпитоп (например, эпитоп Спр1о или эпитоп члена семейства рецептора Т№. ΤΕА[^-Ε2 или ЬТЗК), распознаваемый связывающей молекулой изобретения. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы могут использоваться для снижения концентрации или устранения растворимых целевых молекул из кровообращения.
В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению уменьшает размер опухоли, ингибирует рост опухоли и/или продлевает время жизни онкологически больного субъекта. Соответственно это изобретение также относится к способу лечения опухолей у человека или другого животного организма посредством введения такому человеку или животному организму эффективного, нетоксичного количества полипептида. Специалист сможет обычным экспериментированием определить эффективное, нетоксичное количество полипептида с целью лечения злокачественных образований. Например, терапевтически активное количество полипептида может измениться согласно таким факторам, как стадия болезни (например, стадия Ι против стадии IV), возраст, пол, медицинские осложнения (например, иммуносупрессивные состояния болезни), вес субъекта и способность связывающей молекулы выявить желательную реакцию у субъекта. Режим дозировки может быть отрегулирован, чтобы обеспечить оптимальную терапевтическую реакцию. Например, несколько разделенных доз могут быть введены ежедневно, или доза может быть пропорционально уменьшена в случае соответствующей терапевтической ситуации. В общем случае, однако, эффективная дозировка, вероятно, будет колебаться в диапазоне приблизительно 0,05-100 мг на 1 кг веса тела в день и более предпочтительно от приблизительно 0,5 до 10 мг на 1 кг веса тела в день.
Термин млекопитающее означает любой животный организм, классифицированный как млекопитающее, включая людей, домашних животных фермы и зоопарка и спортивных животных, а также таких животных, как собаки, лошади, кошки, коровы и т.д. Предпочтительно млекопитающее является человеком. Лечение означает как терапевтическое лечение, так и профилактическое средство и/или профилактические меры. К нуждающемся в лечении относятся как субъекты уже с болезнью или расстройством, так и те, у кого болезнь или расстройство следует остановить. Следовательно, млекопитающее может быть диагностировано как имеющее болезнь или расстройство или как предрасположенное или восприимчивое к болезни.
В общем, описываемые составы могут использоваться профилактически или терапевтически. Например, опухоль, включающая маркерный ген, нацеленный связывающей молекулой на раковые клетки, может быть обнаружена или ингибирована (например, уничтожена) с использованием связывающей молекулы изобретения. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения используются, чтобы лечить солидные опухоли. Пример рака включает, но не ограничивается, рак простаты, желудочные раки, такие кактолстой кишки, рак кожи, молочной железы, яичников, легких и поджелудочной железы. В соответствии с другим вариантом осуществления антитела настоящего изобретения могут использоваться для лечения саркомы Капоши, неоплазии С№8 (капиллярной гемангиобластомы, менингиомы и мозговых метастазов), меланомы, желудочно-кишечной почечной саркомы и рабдомиосаркомы, глиобластомы (предпочтительно многоформной глиобластомы), лейомиосаркомы, ретинобластомы, сосочковой цистаденокарциномы яичника, опухоли Вилма или мелкоклеточного рака легкого. Следует понимать, что в свете настоящего описания адекватные полипептиды могут быть получены для молекул опухоли, ассоциированных с каждой из указанных неоплазий без неуместного экспериментирования ввиду наличия настоящего описания.
Примеры гематологических онкологий, которые поддаются лечению настоящим изобретением, включают лимфомы Ходжкинса и не-Ходжкинса, а также лейкозы, включая АЬЬ-Ь3 (лейкоз типа Беркитта), хронический лимфоцитарный лейкоз (СЬЬ) и моноцитарные клеточные лейкозы. Следует понимать, что составы, способы настоящего изобретения особенно эффективны в лечении множества В
- 93 015992 клеточных лимфом, включая лимфому не-Ходжкина (ΝΗΣ) низкой степени/фолликулярную, клеточную лимфому (ЕСС), лимфому МСЬ, диффузную крупноклеточную лимфому (ОБСБ). мелкую лимфоцитарную (ЗБ) ΝΗΣ, умеренную/фолликулярную ΝΉΕ, умеренную диффузную ΝΗΣ, высокую диффузную ΝΉΣ, высокую лимфобластную ΝΉΕ, высокую мелко клеточную ΝΉΕ нерасщепленных клеток, большую ΝΉΕ и макроглобулинимею Валденстрома. Специалисту понятно, что у этих лимфом часто будут различные названия из-за изменяющихся систем классификации и что пациенты с лимфомами под другими названиями могут также получить положительный эффект от комбинированных терапевтических схем настоящего изобретения. В дополнение к вышеупомянутым неопластическим расстройствам следует понимать, что раскрытое изобретение может с успехом использоваться для лечения дополнительных злокачественных образований с молекулами из совместимых опухолей.
В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению способна к специфичному связыванию с антигеном опухолевой клетки и ингибированнию роста опухолевых клеток у пациента. В соответствии с определенными аспектами опухолевые клетки представляют собой опухолевые клетки мозга, головы, шеи, простаты, груди, тестикулярные, толстого кишечника, легкого, яичника, мочевого пузыря, утробные, цервикальные и панкреатические. В соответствии с другими аспектами связывающая молекула по изобретению специфично связывается с антигеном опухолевой клетки и ингибирует рост опухолевых клеток, которые усиленно продуцируют антиген. В соответствии с одним вариантом осуществления опухолевые клетки представляют собой клеточные линии, которые повышенно продуцируют антиген, такие как клеточные линии, полученные из мозга, груди, тестикулярные, толстого кишечника, легкого, яичника, мочевого пузыря, утробные, цервикальные, панкреатического рака и желудка. В соответствии с другими аспектами настоящего изобретения связывающие молекулы изобретения могут использоваться для лечения иммунных расстройств, включающих, но не ограничивающихся следующими: аллергический бронхолегочный аспергиллез, аллергический ринит, аутоиммунную гемолитическую анемию, акантокератодермию, аллергический контактный дерматит, Аддисонову болезнь, атопический дерматит, очаговую алопецию, универсальную алопецию, амилоидную дистрофию, аллергическую пурпуру, анафилактоидную реакцию, апластическую анемию, наследственный ангионевротический отек, идиопатический ангионевротический отек, анкилозирующий спондилоартрит, краниальный артериит, гигантоклеточный артериит, артериит Такаясу, темпоральный артериит, астму, атаксиютелеангиэктазию, аутоиммунный оофорит, аутоиммунный орхит, аутоиммунный полиэндокринный синдром, болезнь Бехчета, болезнь Бергера, болезнь Бюргера, бронхит, буллезный пемфигоид, хронический кандидоз кожи и слизистых, синдром Каплана, посткардиотомный синдром, постперикардиотомный синдром, кардит, нетропическую энтеропатию, болезнь Чагаса, синдром Чедиак-Хигаси, болезнь Черджа-Стросса, синдром Когана, синдром холодовой агглютинации, синдром СКЕЗТ, болезнь Крона, криоглобулинемию, эндогенный фиброзный альвеолит, герпетиформный дерматит, болезнь Вагнера (дерматомиозит), сахарный диабет, синдром Даймонда-Блекфена, синдром Ди Георге, дискоидная красную волчанку, атонический фасциит, эписклерит, ОгуШста с1суаШт бшДпит, ревматоидную эритему, полиморфную эритему, узловатую эритему, семейную средиземноморскую лихорадку, синдром Фелти, фиброз легких, псевдоанафилактический гломерулонефрит, аутоиммунный гломерулонефрит, постстрептококковый гломерулонефрит, посттрансплантационный гломерулонефрит, мембранозную гломерулопатию, синдром Гудпасчера, иммунноопосредованную гранулоцитопению, анулярную гранулему, аллергическую гранулему, гранулематозный миозит, диффузный токсический зоб, аутоиммунный тиреоидит (тиреоидит Хашимото), гемолитическую болезнь новорожденных, идиопатический гемохроматоз, болезнь Шенлейн-Геноха, хронически активный и хронически прогрессивный гепатит, гистоцитоз X, гиперэозинофильный синдром, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, синдром Джоба, ювенильный дерматомиозит, ювенильный ревматоидный артрит (ювенильныйхронический артрит), синдром Кавасаки, кератит, сухой кератоконъюнктивит, синдром Ландри-Гийена-Барре-Строла, лепроматозную лепру, синдром Леффлера, волчанку, синдром Лайелла, вызванное спирохетой ВоггеНа ЬигдйбогГеп заболевание домашних животных и человека, лимфоматозный гранулематоз, системный гепариноцитоз, смешанное заболевание соединительной ткани, множественный мононеврит, синдром Макла-Уэлса, слизисто-кожный лимфоузелковый синдром, многоцентровый ретикулогистиоцитоз, рассеянный склероз, миастению дгау18, грибовидный микоз, системный некротический васкулит, нефротический синдром, синдром <перехлеста>, панникулит, холодовая пароксизмальную гемоглобинурию, ночную пароксизмальную гемоглобинурию, пемфигоид, пемфигус, эритематозный пемфигус, листовидную пузырчатку, обыкновенную пузырчатку, аллергоз голубеводов, гиперчувствительный пневмонит, узелковый полиартериит, ревматическую полимиалгию, болезнь Вагнера (полимиозит), идиопатический полирадикулоневрит, португальскую семейную полиневропатию, преэклампсию/эклампсию, билиарный первичный цирроз печени, генерализованную склеродермию (склеродермию), псориаз, псориатический артрит, легочно-альвеолярный протеиноз, пневмосклероз, феномен/синдром Рейно, тиреоидит Рейдела, болезнь Рейтера, рецидивирующую полихондрию, ревматический полиартрит, ревматоидный артрит, саркоидоз, склерит, склерозирующий холангит, сывороточную болезнь, ретикулярную эритродермию, синдром Шегрена, злокачественную экссудативную эритему, синдром Стилла, лейкоэнцефалит Ван-Богарта, метастатическую офтальмию, системную красную волчанку, отторжение трансплантата, неспецифический
- 94 015992 язвенный колит, недифференцированную диффузную болезнь соединительной ткани, хроническую уртикарию, холодовую крапивницу, увеит, витилиго, болезнь Вебера-Кристиана, синдром Вегенера и синдром Вискотта-Олдрича.
В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения могут использоваться для предварительного применения. Например, те же самые преимущества будут очевидны в предварительном применении для химиотерапевтической доставки лекарства.
Это изобретение ниже иллюстрировано следующими примерами, которые не должны быть рассмотрены как ограничивающие. Содержание всех ссылок, патентов и опубликованных патентных заявок, процитированных в тексте настоящего изобретения, включены в него по ссылке.
Примеры
В примерах использовались следующие материалы и способы, если не указано иначе.
Общие материалы и способы.
Как правило, при выполнении работ в настоящем изобретении использовались, если не указано иное, традиционные методы химии, биофизики, молекулярной биологии, технологии рекомбинантных ДНК, иммунологии (особенно, например, технологии работ с антителами) и стандартные способы электрофореза. В качестве примера можно посмотреть пособие следующих авторов: 8атЬгоок, ЕгйзсП и МатаИз, Мо1еси1аг С1ошпд: Со 16 8рппд нагЬог ЬаЬога!огу Ргезз (1989); АпПЬобу Епдшееттд Рго!осо1з (Ме!ко6з т Мо1еси1аг Вю1оду), 510, Раи1, 8., нитапа Рг (1996); АпПЬобу Епдтеегшд: А Ргасйса1 Арргоаск (Ргасйса1 Арргоаск 8епез, 169), МсСаГГеПу, Е6., Ιτ1 Рг (1996); АпИЬоФез: А ЬаЬога!огу Мапиа1, наг1оте е! а1., С.8.н.Ь Ргезз, РиЬ. (1999) и Сиггеп! Рго!осо1з т Мо1еси1аг Вю1оду, е6з. АизиЬе1 е! а1., До1т ЭДйеу &8опз (1992).
Конструкты экспрессии.
Как правило, если не указано иное, конструкты экспрессии для зсЕуз в приведенных ниже примерах включают в себя ОТконцевой сигнальный пептид 6епе ΙΙΙ, а также С-концевой пептид очистки, включающий в себя маркерные последовательности Мус и Шз, а также участок гидролиза энтерокиназой (Еп!етоктазе). Последовательность ДНК для каждого пептида приведена ниже.
Последовательность ДНК для Мконцевого сигнального пептида 6епе ΙΙΙ:
АТОААААААСТОСТОТТСОСОАПССОСТООТООТОССОТТСТАТАОССАТАОТ (5Е0 Ю N0:25).
Последовательность ДНК для Мконцевого сигнального пептида 6епе ΙΙΙ:
МККЬ1ЕА1Р1.УУРГУ6Н5 (8Е0 Ю N0:26).
Последовательность ДНК для С-концевого пептида очистки:
ОАСОАСОАСОАСААААОСТТТСТАСААСАААААСТСАТСТСАОААОАСОАТСТеААТ
АОСОССОТСОАССАТСАТСАТСАТСАТСАТТОА (ЗЕО Ю N0:27).
Последовательность ДНК для С-концевого пептида очистки:
Антитела.
Антитела ВИВ, использованные в ряде примеров (ВПВ1-ВПВ18), представляют собой коллекцию антител с различной специфичностью. 17 из 18 антител были экспрессированы или в стабильном объеме, или в клонируемых клетках линии СНО, и один тип антител (ВПВ13) был экспрессирован способом временной трансфекции в клетках нЕК293Е. Все 18 типов антител содержат легкие каппа-цепи. Большинство антител являлись человеческими иммуноглобулинами типа Ι§61; однако ВПВ2, ВПВ5 и ВПВ11 являлись человеческими иммуноглобулинами типа Ι§64. Семнадцать из 18 антител были человеческими или гуманизированными. ВИВ 15 были примитизированными® (Макатига е! а1., 2000). Идентичность человеческих зародышевых линий для каждого из антител оценивалась выравниванием с помощью С1из!а1ЭД (С1из!а1ЭД ЭДЭДЭД 8етуюе а! 1ке Еигореап ВютГогтаПсз [пзШШе. Ткотрзоп е! а1., 1994) последовательностей ВИВ Ун или УК против находящихся в свободном доступе человеческих зародышевых линий (Βοήο^: е! а1., 1999).
из 18 общих антител принадлежали к подклассу Ι§61, оставшиеся 3 - к подклассу Ι§64 (ВИВ2, ВИВ5 и ВИВ 11). Последовательности СН1 иммуноглобулинов Ι§61 и Ι§64 имеют 10 аминокислотных различий (6 являются консервативными) и дополнительный дисульфидный мостик с легкой цепью.
Конструкт Ι§61 и Ι§64 с удвоенной Εν областью для исследования эффекта подкласса Ι§6 на стабильность ЕаЬ был коммерчески доступен. Также были созданы два конструкта, включающие Ун область ВИВ7, встроенный в тяжелую цепь константной области или Ι§61, или Ι§64.
Пример 1. Получение обычных белков ВНА10 зсΕν и ЕаЬ.
ВНА10 зсΕν субклонировали из плазмиды рХЭДИ034 способом полимеразной цепной реакции (Ро1утегазе Скат ЯеасИоп (РСЯ)), используя олигонуклеотидные праймеры, приведенные в табл. 2. Прямой праймер ВнА10-01Е включает уникальный сайт рестриктазы 8рк Ι (подчеркнутая последовательность), за которой следует 18 оснований из последовательности, комплементарной Мконцевому вариабельному домену тяжелой цепи гена ВНА10. Обратный праймер, ВнА10-01Я, 24 основания из последовательности, комплементарной С-концевому вариабельному домену легкой цепи гена ВНА10, 15 оснований по
- 95 015992 следовательности, комплементарной участку энтерокиназы (Еп!егоктаке) и прилегающие участки Шпй III и ХЬа I рестриктаз (участки рестрикционных эндонуклеаз подчеркнуты). После амплификации способом ПЦР ПЦР-продукт ожидаемого размера отделяли способом элетрофореза в агарозном геле, вырезали и очищали с помощью набора реагентов для экстракции М1Шроге ШйаГгее-ЭА, пользуясь приложенной к набору методикой (М1Шроге; ВейГогй, МА). Очищенный ПЦР-продукт гидролизовали рестриктазой 8рй I, получили тупой конец с помощью ДНК-полимеразы I в присутствии йКТРк и гидролизовали рестриктазой Шпй III. Полученный ПЦР-продукт лигировали в рК18216, предварительно гидролизованную с помощью 8са [/И1пй III. рК18216 является вектором Е.сой, который обеспечивает экспрессию рекомбинантного белка под контролем индуцибельного ага С промоутера. Частью легирующей смеси обычно трансформировали линию Е.сой ХЬ1-В1ие. Затем скринировали резистентные к ампициллину колонии, и правильность сиквенса конечного конструкта рГЕн003 подтверждалась с помощью анализа ДНК. Сиквенс ДНК и аминокислотный сиквенс ВНА10 ксРт показаны соответственно на фиг. 1 и 2
Таблица 2 Олигонуклеотиды для амплификации способом ПЦР обычного ВНА10 ксРт
Праймер Послед овагельность
ВНА10-01Г (8Ε(}ΙΟΝΟ:1) 5'- САСТАОСАТОСАООТССААСТСОТССАО -3'
ВНА10-02К (8Ε<2ΙΟΝΟ:2) Э'-ОТТСТАОАААССТГТГОТСОТСОТСОТСТГТСАТСТС САССТТООТАСССТС -3'
Для экспрессии ВНА10 ксРт свежевыделенные колонии Е.сой линии ν3110 (АТСС, Мапаккак, Уа. Са!. № 27325), трансформированные плазмидой рШн003, выращивали в среде 8В 4 х 250 мл (Текпота, на1Г Мооп Вау, Са. Са!. № 80140), включающей 50 мкг/мл карбенициллина в конических колбах объемом 1 л до ΟΌ600ξ0,8, индуцировали добавлением к 0,02% арабинозе и культивировали в течение ночи. Бактерии отделяли центрифугированием. Осадки сольюбилизировали и лизировали в 40 мл В-РЕЯ реагента для экстракции белков (Са! № 78243, Р1егсе). Солюбилизированные ксРт наносили на колонку №-ЫТА-8ирегГ1оте объемом 5 мл (Са! № 30410, 01адеп). Связавшийся ксРт промывали 60 мМ имидазолом, рН 8,0 и элюировали 300 мМ имидазолом, рН 8,0. Элюированный ксРт наносили на колонку Рго!еш Ь адагоке объемом 6 мл (Са! № 20510, Р1егсе). Связавшийся белок промывали физиологическим раствором с фосфатным буфером (РВ8) и элюировали 0,1 М глицином, рН 3,0. Очищенные ксРтк диализовали РВ8 и хранили при -20°С. Концентрацию белка определяли по е280пт=2,1 мл-мг-1-см-1.
Для ферментативного получения ВНА10 РаЬ, ВнА10 [дС смешивали с 4 мкл концентрированного сток-раствора папаина (0,3 мг/мл, 30 Иш!к/мг - Са! № 108014, Яосйе) в 8,3 мл раствора, включающего 2,4 мг/мл ВНА10 !дС1, 100 мМ Тпк-нС1, 20 мМ ЕЭТА при рН 7,0. Реакцию проводили при 25°С в течение 90 мин. Полученный раствор разбавили в соотношении 1:5 20 мМ ацетатом, рН 5,0 и нанесли на колонку 8Р-8ерйагоке РР объемом 6 мл, предварительно уравновесив колонку тем же буфером для разбавления. Колонку промывали двумя объемами (по размеру колонки) буфера для разбавления. Сырые фрагменты РаЬ элюировали линейным градиентом №1С1 (0-200 мМ), 30 объемами колонки. Широкий пик, выходящий при концентрации 140 мМ №1С1 (общий объем ~24 мл), содержал основную массу гидролизованного ^С. Собранный элюат концентрировали до объема 2 мл и наносили на препаративную колонку С300 8ν Токойаак 8ЕС (109 мл), уравновешенную РВ8. РаЬ элюировался с колонки в 0,8 объема и собирался в объеме около 15 мл. Очищенный РаЬ концентрировали до 2-11 мг/мл. Концентрации РаЬ определяли, используя е280пт=1,5 мл-мг-1-см-1.
Пример 2. Термостабильность обычной молекулы ВНА10 ксРтк.
Для сравнения стабильности очищенного ВНА10 ксРт и его аналога РаЬ использовался способ дифференциальной сканирующей калоримметрии. Сканирование выполняли на автоматизированном капиллярном дифференциальном сканирующем калориметре (сарО8С, Мюгоса1, ЬЬС). Растворы белков и растворы сравнения автоматически отбирались из 96-луночных планшетов. Перед каждым сканированием белка в ячейке для пробы выполнялось 2 сканирования буфера, и полученная величина в дальнейшем использовалась для вычитания фонового поглощения. После каждого сканирования белков проводилось однократное очищающее сканирование с использованием 5% Ыс.|шпох. После каждого сканирования прибор автоматичеки промывался деионизированной дистиллированной водой (2мл), включающей 0,01% азид натрия, при этом ячейка для образца и ячейка для раствора сравнения промывались трижды. Сканирования выполнялись со скоростью 1°С/мин, с использованием режима тейшт ГеейЬаск тойе для улучшения разрешения прибора. Сканирование проводилось винтервале температур 20-95°С. Все 96луночные планшеты, включающие белок, хранились внутри прибора при температуре 6°С.
На фиг. 3, 4 показаны результаты сканирования способом дифференциальной сканирующей калоримметрии очищенных фрагментов антител ВНА10 РаЬ и ксРт. Температура внутри калоримметра увеличивалась до тех пор, пока не происходило развертывание РаЬ или ксРт. Температура, при которой происходило развертывание белка (а именно величина ТМ), может служить показателем общей стабильности белка. Все четыре домена ВНА10 РаЬ (Ун, Уь, Сн1 и Сь) развертываются одновременно при температуре
- 96 015992
78°С (фиг. 3). ксЕ\' домен. ксЕ\' домен теряет домены СН1 и Сь. Без этого взаимодействия домены ксЕ\' развертываются при гораздо более низкой температуре, чем РаЬ, при этом наблюдается существенное снижение калориметрической энтальпии доменов, указывающее на потерю стабилизирующих взаимодействий.
Уь домен развертывается при температуре ТМ=68°С, в то время как УН домен развертывается при температуре 58°С, что на 20°С ниже, чем температура перехода в денатурированное состояние (ипГо1бтд йапкйюп) для ВНА10 РаЬ (фиг. 4). Кроме этого, величина ТМ зависит от скорости сканирования, из этого следует, что агрегация белка происходит и во время фазы нагрева. Для ксЕ\' показано, что при снижении скорости нагрева ТМ снижается (Ъапсйех-Ешх е! а1., Вюсйеткйу, 27: 1648-1652, 1988). Выявленная низкая стабильность и склонность к агрегации может быть детерминирующим фактором, из-за которого клетки СНО не способны производить существенные количества стабильного, неагрегирующего материала, включающего 8θΓν8, такого как обычные молекулы биспецифических антител Геркулес.
Пример 3. Конструкция молекулы ВНА10 ксΡνк с улучшенной термостабильностью.
На основе того, что домен ВНА10 ксЕ\\ как показано в примере 2, в своей основе нестабилен, было выдвинуто предположение, что модификация ксЕ\' способами генной инженерии с использованием технологии рекомбинантной ДНК, позволит получить модифицированные ксЕ\\ которые будут термодинамически или функционально эквивалентны РаЬ в условиях изменения температуры, что приведет к созданию ксЕ\' домена, который может быть использован для создания биспецифических антител. Также было выдвинуто предположение, что модификация ксЕ\' домена сама по себе придаст какие-нибудь положительные биофизические свойства, которые проявятся, когда он будет частью полностью сформированной биспецифической молекулы. В итоге была начата работа по улучшению биофизической стабильности ВНА10 ксЕ\' домена с использованим экспрессионной системы Е.сой. Стабильность оценивали по измерению связывания термически резистентных ксЕ\' доменов с лигандом и по результатам термического анализа.
Для стабилизации ксЕ\' домена были использованы два способа: 1) введение дисульфидной связи между УН и Уъ доменами ВНА10 ксЕ\' и 2) оптимизация длины (С1у^ег)п линкера, который связывает УН и Уъ домены ВНА10 ксЕ\'.
А. Создание ВНА10 8θΓν8, стабилизированного дисульфидной связью.
В качестве родительского вектора для экспрессии ВНА10 ксЕ\' был использован вектор р1ЕН003. Набор реактивов ОшскСйапде δί^-Όπ^^ Ми!адепек1к Кй ^!га!адепе; Ьа 1о11а, СА) использовали согласно прилагаемой к набору инструкции. С его помощью в цепи УН и Уъ ввели два цистеиновых остатка (по одному в каждую цепь), которые могли использоваться для образования стабилизирующей дисульфидной связи. Чтобы вызвать мутацию остатка С1у (ОСА) на Сук (ТСС) в позиции 44 (по Кэбату) вариабельного домена тяжелой цепи ВНА10, использовали пары праймеров УН44-Р и УН44-К (табл. 3). Продукт мутагенеза гидролизовали с помощью чувствительного к метилированию фермента Орп I в соответствии с методикой, приложенной к набору реактивов для Эрп I, и тансформировали в Е.сой линии ХЙ10СОйО® ^!га!адепе; Ьа 1о11а, СА). Для отбора колоний, включающих заданную мутацию, трансформированные колонии Е.сой, нечувствительные к ампициллину, скринировали путем секвенирования ДНК. Полученная плазмида р1ЕН004 была использована в дальнейшем для создания мутации остатка С1п (САС) в позиции 100 (по Кэбату) на Сук (ТСС) в вариабельном домене легкой цепи ВНА10. Для этого использовались пары праймеров Уь100-Р и Уь100-К (табл. 3). Прямой (УН44-Р) и обратный (УН44-К) праймеры заменяют С1у (ССА) на Сук (ТСС) в позиции 44 УН (ТСС указано подчеркиванием). Прямой (Уь100-Р) и обратный (Уь100-К) праймеры вызывают мутацию С1п (САС) на Сук (ТСС) в позиции 100 Уь (ТСС указано подчеркиванием).
Для отбора колоний, включающих заданную мутацию, трансформированные колонии ХЙ10СОЙЭ® Е.сой, нечувствительные к ампициллину, скринировали путем секвенирования ДНК. Полученная плазмида р1ЕН006 несла двойную цистеиновую мутацию в позициях УН44 и Уъ100. Последовательность ДНК и аминокислотная последовательность для УН44/УЪ100 в стабилизированном дисульфидной связью ВНА10 ксЕ\' показаны соответственно на фиг. 5 и 6.
- 97 015992
Таблица 3
Олигонуклеотиды для конструкции ВΗА10ксΡν, стабилизированного дисульфидной связью между νΗ44/νΕ100
Праймеры Последовательность
УН44-Р (КЕО ГО ΝΟ: 5) 5'- ССАССССССТбаАСАОТОССТТОАОТООАТОООАТО 3'
УН44-К (8ΕΟΙΟΝΟ:6) 5'- САТСССАТССАСТСААСОСАСТОТССАООООССТОС 3'
УЫОО-Р (8ΕΟΠ)ΝΟ:7) 5'- ССТАТССАГГСАСОТТСОССТОСООТАССААООТСЮ АОАТС -3'
УЫ00-К (8ΕΟΙΟΝΟ:8) 5'- ОАТСТССАССТТООТАССОСАОССОААССТОААТСО АТАСЮ-3'
В. Конструкция ВНА10 ксРу с альтернативными линкерами (С1у48ег)п.
Плазмида рIЕΗ003, кодирующая ΙπιβΗΛΗ) ксРу с обычным линкером (С1у48ег)3, была модифицирована способом ПЦР-амплификации с целью получения линкеров (С1у48ег)4 или (С1у48ег)5. Использованные праймеры приведены в табл. 4.
Для получения ВНА10 ксРу (С1у48ег)4 был использован прямой праймер 5'РСК, обозначенный как рХЛИ002-Р1, и обратный праймер 3'РСК, обозначенный как ХЛИ002-К. Праймер 5' νΗ РСК ХЛ002-Р1 включает в себя сайт рестрикционной эндонуклеазы В!д I (подчеркнутая последовательность), локализованный на С-конце ВНА10 νΗ, за которым следует последовательность линкера (61у48ег)4. Праймер 3' Уь РСК ХЛ002-К включает в себя сайт ХЬа I и неполный сайт энтерокиназы (Еп!егоктаке кйе). Неполный ВНА10 Уц+линкер (61у48ег)4+участкн ВНА10 Уь амплифицировали способом ПЦР, используя набор праймеров Х\У002-Е1/Х\У002-К РСК из плазмиды ЭХА рIЕΗ003 (описана в примере 1). Соответствующий ожидаемому размеру фрагмент гена для неполного ВНА10 ксРу-линкера (61у48ег)4 отделяли электрофорезом на агарозном геле, вырезали из геля и очищали с помощью набора реактивов для экстракции Мййроге и1!гаГгее-ЭА в соответствии с приложенными к набору инструкциями (М1Шроге; ВебГогб, МА). Очищенный ПЦР-продукт гидролизовали и клонировали в гидролизованном В!д Ι/ХЬа I векторе рIЕΗ003, получив плазмиду рХЛИ002, кодирующую ВНА10 ксРу, включающий линкер (61у48ег)4. ВΗА10 ксРу, включающий линкер (С1у48ег)5, был получен аналогичным способом, с использованием ПЦР-праймеров ХЛ003-Р и ХЛ002-К для получения плазмиды рХЛИ003. Прямой праймер 5' РСК (ХЛИ003-Р) содержал участок для В!д I (подчеркнутая последовательность), за которым следовала последовательность, кодирующая несколько аминокислот С-конца ВНА10 νΗ, и последовательность, кодирующую неполный линкер (С1у48ег)5. Правильные последовательности были отобраны путем анализа последовательности ДНК. Последовательность ДНК и аминокислотная последовательность для ВНА10 ксРу, включающего линкер (С1у48ег)4, показаны на фиг. 7 и 8 соответственно. Последовательность ДНК и аминокислотная последовательность для ВНА10 ксРу, включающего линкер (С1у48ег)5, показаны на фиг. 9 и 10 соответственно.
Таблица 4 Олигонуклеотиды для конструкции ВНА10 ксРу с линкерами (С1у48ег)4 или (С1у48ег)5
Праймеры Последовательность
ΧΨ002-Ρ1 (ЗЕО ГО N0:11) 5'- ААбОСАССАСООТСАССОТСТССТСАООССОТООАОСОТССО ОТООСООСООАТСТСЮООССООСООАТССООТООТООТбОТАО-З’
ΧΨ002-Κ (8Е<3 ГО N0:12) 5'-ТТГТОТТСТАОААААСТТТТОТСОТСО-З'
ΧΨ003-Ρ (8Е() ГО N0:13) 5'- ААОСОАССАССОТСАССОТСТССТСАСЗОАССбООСООТТСАО ОСООТОСАСООТСССОТООООССООАТСТОООООСОСССОАТС-З'
Пример 4. Характеристика ВНА10 молекулы ксРук с улучшенной термостабильностью.
А. Экспрессия и Вестерн блот анализ сконструированного ВНА10 ксРук.
Для экспрессии сконструированного ВНА10 ксРук, Е.соН линии Л3110 (АТСС, Мапаккак, Уа. Са!. № 27325) трансформировали с помощью плазмид рIЕΗ003, рХЛИ002, рХЛИ003 и рIЕΗ006, отбирали резистентные к ампициллину колонии и выращивали их в 10 мл среды 8В (Текпоуа, Ш11Г Мооп Вау, Са. Са!. № 80140), включающей 50 мкс/г/мл карбенициллина в конической пробирке для центрифугирования объемом 50 мл до ΟΌ600ξ0,8, индуцировали добавлением к 0,02% арабинозе и культивировали в течение ночи. Бактерии отделяли центрифугированием. Осадки ресуспендировали в 1/20 объема ледяного изоосмотического раствора, включающего 50 мМ Тпк-ΗΟ. рΗ 8,0, 1 мМ ЕИТА и 20% сахарозы (вес/объем) и охлаждали на льду. К бактериальной суспензии добавили равный объем 50 мМ Тпк-ΗΟ. рΗ 8,0, 1 мМ ЕИТА и 20% кисгоке (вес/объем), включающий 2 мг/мл Ьуко/уте (81дта), и инкубировали на льду, ино
- 98 015992 гда встряхивая, в течение 10 мин. Затем бактериальную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 8000хд, 4°С и сохраняли периплазматическую фракцию.
Образцы смешивали с нативным буфером для образцов или буфером, включающим восстанавливающий реагент дитиотреитол, и нагревали при 90°С в течение 3 мин. Восстановленные и невостановленные образцы разделяли способом 8Э8-РЛСЕ электрофореза на Τηκ-глицин полиакриламидном геле и переносили электрофоретически на нитрозеллюлозную мембрану ([пубгодеп. БНс Тесбпо1од1ек. Саг1кЬаб, СЛ). Мембрану блокировали РВ8, включающим 5% (вес/объем) обезжиренное молоко и 0,1% Тритон Х100 и инкубировали с античеловеческими антителами каппа (Восбе АррНеб 8с1епсе, НкНапаройк. ΓΝ). Мембрану отмывали и инкубировали с антикроличьими антителами НВР (Лтегкбат Вюкаепсек, Р1кса!а^ау, N1). Образовавшиеся иммунные комплексы идентифицировали способом ЕСБ (ЕСБ \Уек1ет В1о!Нпд Апа1ук1к 8ук!ет) согласно приложенной к набору инструкции (АтегкНат Вюкаепсек, Р1кса!а^ау, N1).
Было показано, что одна из трех протестированных дисульфидных пар, а именно УН44:УЪ100, продуцирует значительные количества белка при экспрессии в Е.соН (фиг. 11, линия 2) (протестированные дисульфиды УН 44:УЪ 105 и УН 106:УЪ43 не продуцируют такого большого количества интактного ксРу). Аналогичным образом, при увеличении длины линкера (С1у48ег)п до п=4 (линия 3) или п=5 (не показано) также происходило увеличение продуцирования белка в Е.соН. Объединение обеих модификаций УН44:УЬ100 и ликера (С1у48ег)4 в ВНА10 ксРу с помощью способов, описанных в примере 3, также давало высокий уровень экспрессии белка (фиг. 11, линия 4). Последовательность ДНК и аминокислотная последовательность для ВНА10 ксРу, включающего обе модификации (УН44:УЪ100 и линкер (С1у48ег)4) показаны на фиг. 12 и 13 соответственно. В обоих случаях, когда ВНА10 ксРу включает мутации Уц44:У|,10. ксРук имеет повышенную подвижность в денатурирующем не-восстанавливающем полиакриламидном геле, мигрируя аналогично ВНА10 ксРу в денатурирующих, восстанавливающих условиях (фиг. 11, линии 2 и 4). Этот анализ позволяет предположить, что в тех случаях, когда ВНА10 ксРу включает УН44;УЪ100, формируются интактные дисульфидные связи и образуется более компактная структура.
В. Измерение термической денатурации.
Активности обычного и сконструированного ВНА10 ксРук сравнивались способом температурного теста (!Негта1 сНа11епде аккау), определяющего температуру, при которой 50% молекул ксРук сохраняет способность связываться с антигеном после выдерживания в условиях повышенной температуры (!Негта1 сНа11епде еуеп!). Величина этой температуры обозначалась как Т50, измерялась в°С. В этом исследовании измерения для ксРук проводились в диапазоне температур, охватывающем температуру перехода для обычного ВНА10 ксРу.
Е.соН линии ^3110 (АТСС, Мапаккак, Уа. Са!. № 27325) трансформировали с помощью плазмид, кодирующих сконструированный и обычный ВНА10 ксРук под контролем индуцибельного промотера ага С промотор. Трансформированные клетки выращивали в течение ночи в среде для экспрессии 8В (Текпоуа, На1б Мооп Вау, Са. Са!. № 80140), включающей 1% глицин, 1% Тритон Х100, 0,02% арабинозу и 50 мкг/мл карбенициллина или при 37°С или при 32°С. Бактерии осаждали центрифугированием, полученный супернатант оставляли для дальнейшей обработки. Включение глицина и Тритона Х-100 в среду позволяет высвободить содержимое периплазмы (нативный белок Е.соН и ксРу) в среду (Υ;·ιΐ'ΐ§ е! а1. АррНеб и Епу1готеп!а1 М1сгоЬю1оду (1998), 64:2869-2874). Присутствие в супернатанте белков Е.соН является существенным для выполнения этого измерения, т.к. термоинактивированные белки действуют как раковина, захватывая случайно развернутые молекулы ксРук в необратимо инактивированные агрегаты.
Каждую библиотеку скринировали на термическую стабильнось дважды. Первый супернатант подвергали воздействию в условиях эксперимента, а второй супернатант оставляли и использовали для сравнения. Измерение термоинактивации для получения данных о термостабильности может быть выполнено при одной температуре или в выбранном диапазоне температур. Для обработки образцов (супернатантов) использовался термоциклер, способный создавать стабильные температурные градиенты (1Сус1ег, Вю-Ваб, СайНегкЬигд, Мб).
Температурное воздействие варьировалось в зависимости от свойств взятого ВНА10 ксРу и обычно было на 2-3 градуса выше, чем экспериментально определенная величина Т50. Замороженные платы Мак!ег размораживали и высевали в лунки на титрационном микропланшете, включающие 250 мкл на лунку среды для экспрессии, и культивировали в течение ночи при 32°С. В качестве контроля использовались культуры, включающие родительскую плазмиду. Их выращивали в тех же условиях и использовали одновременно с библиотекой. Бактерии осаждали и аликвоты объемом 50-100 мкл исследуемого супернатанта помещали или в пробирки для ПЦР (к!пр !иЬек) (АррНеб Вюкук!етк, Рок!ег Сйу, Са, Са!. № N801535), или в 96-луночные платы (АррНеб Вюкук!етк, Рок!ег Сйу, Са, Са!. № N801-560). Образцы нагревали в течение 60-90 мин. Образцы переносили в 96-луночные платы с У-образным дном (Согшпд, Согшпд, ΧΥ, Са!. № 3357) и центрифугировали в охлаждаемой клинической центрифуге (ШС тобе1 8В, ТНегто Е1ес£гоп, ХУабНат. Ма) в течение 30 мин. Затем 100 мкл супернатанта переносили в стандартный титрационный микропланшет (Согшпд, Согшпд, ΧΥ, Са!. № 3357). Аликвоту супернатанта оставляли для
- 99 015992
ОЕЬЕГА. Для большинства библиотек платы, включающие остатки супернатанта, запечатывали (№11де ^μ, Яосйейег, ΧΥ, Са1. № 235205) и помещали в инкубатор с соответствующей термической проверкой (Есйо Тйегт, Тоггеу Ртек Заепййс, Зап Магсок, Са) на 90 мин. Для скрининга, требующего измерений при нескольких температурах проверки (или при температуре выше 75°С) супернатанты помещали в 96луночную плату для ПЦР (Аррйеб ВюкукЮтк, Еок!ег Сйу, Са, Са1. № N801-560) и инкубировали в течение 90 мин при требуемой температуре.
После температурной стимуляции образцы центрифугировали при 2000 ЯРМ для удаления с агрегировавшего материала. Растворимые ВНА10 ксЕу, оставшиеся после обработки в прозрачном супернатанте, отделяли и измеряли связывание с родственным (содпа1е) антигеном ЬТвЯ 1д способом ОЕЬЕГА. 96-луночные платы (Мах1Зогр, №11де N^0, Яосйейег, ΧΥ, Са1. № 437111) покрывали гибридным белком, состоящим из эктодомена рецептора ЬТв (ЬТвЯ), связанного с Ес областью человека (концентрация раствора 1 мкг/мл в 0,1М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5). Платы инкубировали в течение ночи при 4°С и блокировали с помощью буфера для измерения ОЕЬЕГА (ЭЛВ, 10 мМ Тпк НС1, 150 мМ №С1, 20 мкМ ЕОТА, 0,5% ВЗА, 0,02% Т\гееп 20, 0,01% №N3, рН 7,4), инкубируя с ним в течение 1 ч на шейкере при комнатной температуре. Платы отмывали 3 раза ОАВ, не включающим ВЗА (отмывочный буфер), затем добавляли к платам исследуемые образцы, растворенные в ЭАВ в конечном объеме 100 мкл. Платы инкубировали в течение 1 ч на шейкере при комнатной температуре и трижды отмывали отмывочным буфером для удаления несвязавшихся или функционально неактивных молекул ксЕук. Связанный ВНА10 ксЕу определяли добавлением в каждую ячейку 100 мкл ОАВ, включающего 40 нг/мл меченых Ей антиН1к6 антител (Регкт Е1тег, Вок1оп, МА, Са1. № А 00109), и инкубировали на шейкере при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем платы трижды отмывали отмывочным буфером и добавляли в каждую ячейку 100 мкл усиливающего раствора ОЕЬЕГА (Регкт Е1тег, Вок!оп, МА, Са1. № 4001-0010). После инкубации в течение 15 мин платы детектировали, определяя Европий на приборе Ую1ог 2 (Регкт Е1тег, Вок!оп, МА).
Данные измерений обрабатывали с помощью программного обеспечения ЗроШге ОесЫопЗйе (Зро1йге, ЗотегуШе, Ма.) и выражали в виде отношения количества импульсов при температуре проверки к количеству импульсов при исходной температуре для каждого клона. Клоны, воспроизводимо дающие значение этого отношения в два или более раз выше, чем для родительской плазмиды, считались хитами. Плазмидная ДНК для этих клонов была выделена с помощью набора ттНргер (νί/агб Р1ик, Рготеда, Маб1коп, VI) и ретрансфомирована в Е.сой ν3110 для вторичного измерения температурной проверки.
Данные, полученные при градиенте температуры, анализировались с помощью программного обеспечения Рпкт 4 (6гарйРаб Зой^аге, Зап О1едо, Са), с использованием в качестве модели сигмоидальной дозовой зависимости с варьируемой крутизной (варьируемым наклоном). За величину Т50 принимались значения, полученные в средней точке кривой термической денатурации, при этом принималось, что они не эквивалентны биофизически определенной величине ТМ.
Результаты, полученные при анализе температурной проверки, показаны на фиг. 14. Как видно из фиг. 14, все стабилизированные молекулы ксЕук изобретения демонстрируют улучшенную связывающую активность (Т50 >49°С) по сравнению с обычными ксЕу. В частности, величины Т50 для ВНА10 позиции библиотеки Уъ46 ксЕу(З46Ь), позиции библиотеки Ун16 ксЕу (З16Е и 3160) и позиции библиотеки У| 49:У| 50 ксЕу демонстрировали увеличение термической стабильности в диапазоне от 3 до 12°С по сравнению с обычным ВНА10 ксЕу. Кроме этого, величины Т50 для ВНА10 позиция библиотеки Уъ3 ксЕу (ОЛА, О3С, О3З, О3У и Ο3ϋ), позиция библиотеки Ун67 ксЕу (У67Г и У67Ь), позиция библиотеки Ун48 ксЕу (М481 и М486), позиция библиотеки Ун20 ксЕу(У201) и позиция библиотеки Ун101 ксЕу (Р10Ш) демонстрировали увеличение термической стабильности в диапазоне от 4 до 18°С по сравнению с обычным ВНА10 ксЕу. Одна из стабилизирующих мутаций (Уъ К13Е) возникла благодаря ошибке ПЦР. Оказалось, что включение этой стабилизирующей мутации в рГЕН009 дает дополнительное увеличение термической стабильности и даже превышает те, что получены для ВНА10 ЕаЬ в этих условиях. Важно, что нековалентная мутация Уъ46, Ун101 и мутации Ун55, определенные в ходе одного (или более) из подходов (моделирование гомологии области контакта Уь/Ун, согласованные вычисления, компьютерное моделирование и ковариационный анализ), приводят к увеличению термической стабильности ксЕу приблизительно в той же степени, что наблюдается для дисульфидных мутаций, и обосновывают полезность и новизну этих подходов. В частности, Т50 для конструкта рГЕН006, ВНА10 УН44:УЪ100 ксЕу (59°С) отличалась от ВНА10 ЕаЬ (62°С) только на 3°С, в то время как конструкт рГЕН009, ВНА10 ксЕу УН44:Уь100/(61у4Зег)4 линкер, как оказалось, был функционально эквивалентен ВНА10 ЕаЬ при этих условиях. Эти результаты демонстрируют, что стабилизированные ксЕук изобретения имеют улучшенную активность после температурной проверки.
С. Измерение сродства.
Для измерения сродства кЬТЗЯ к ВНА10 ЕаЬ, полученного фементативным гидролизом молекулы ВНА10 1д61, был использован способ изотермического калориметрического титрования (ГТС.) кЬТЗЯ получали по методике, описанной Е1бгебде е1 а1., ВюсйетЦйу (2006). ЕаЬ и кЬТЗЯ концентрировали соответственно до 6,0 и 2,0 мг/мл. Концентрирование проводили способом ультрацентрифугирования, ис
- 100 015992 пользуя оборудование и фильтры Аписон (М\УСО 10,000). Перед калориметрическим титрованием ЦТС) концентрированные сток-растворы одновременно диализовали против РВ8. Калориметрическое титрование [ТС проводили на приборе ЖР-ГТС (М1сгоса1 ЬЬС, ИогШатрЮп, МА) при 30°С. Примерно 500 мкл 7 мкМ раствора еЬТвЯ поместили в ячейку для образца и добавили в ячейку сравнения диализат РВ8. Затем в ячейку для образца порциями добавляли 70 мкМ ВНА10 ЕаЬ (инъекции 7x10 мкл, 12x7 мкл и затем 8x10 мкл, общее количество добавленного ВНА10 ЕаЬ составило 234 мкл). Стехиометрия реакции 1:1. Кривые 1ТС анализировались с помощью пограмммного обеспечения, поставляемого вместе с прибором.
Измерение КО обычного ВНА10 есЕν, а также препаратов ВНА10 (61у48ег)4 есЕν и ВНА10 Жн44:Ж100/(С1у48ег)4 есЕν, описанных в примере 3 и экспрессированных и очищенных способами, приведенными в примере 1, выполняли способом поверхностного плазменного резонанса (8РЯ) на приборе В1асоге 3000 (В1асоге 1пс., Р1еса1атеау, ИТ). Все измерения проводили в буфере НВ8-ЕР, рН 7,4. Биотинилированные антитела РЕИТА-Ше (20 мкг/мл, Са! № 34440, 01адеп) были иммобилизованы на покрытом стрептавидином чипе СМ5 при скорости потока 10 мкл/мин в течение примерно 1 мин. 0,1 мкМ растворы исследуемых есЕνе впрыскивали над чипом при скорости потока 5 мкл/мин в течение 10 мин, при этом есЕνе связывались с поверхностью с помощью иммобилизованных антител РЕИТА-Изе. Для определения связывания между еЬТвЯ и связавшимися есЕν была измерена концентрационная зависимость при концентрациях еЬТвЯ (1, 2, 5, 10, 25, 50, 100 и 200 нМ). еЬТвЯ дважды впрыскивали на поверхность со связанными есЕν при скорости потока 30 мкл/мин. Для вычитания фона из величины, полученной при инъекции образца, вычиталась величина, полученная в тот момент, когда проточная кювета содержала только буфер, и величина, полученная для поверхности с РЕИТА-Ше, когда вслед за инъекцией есЕν вместо еЬТвЯ впрыскивали буфер. Полученные кривые анализировали с помощью программного обеспечения В1аЕгеа1 3,0. Значение КО определяли по кривым ассоциации и диссоциации, используя модель Ленгмюра при связывании в соотношении 1:1. Поверхность чипа регенерировали двумя последовательными инъекциями 0,1 М глицина, рН 3,0.
Табл. 5 показывает результаты измерения сродства способом поверхностного плазменного резонанса. Сродство рекомбинантного ВНА10 есЕν практически такое же, как у ВНА10 ЕаЬ, полученного способом, описанным в примере 1. Кроме этого, введение линкера (С48)4 одного или стабилизирующей дисульфидной связи или их комбинации не приводит к существенной потере сродства к антигену.
Таблица 5 Измерения сродства к ЬТвЯ способом поверхностного плазмонного резонанса
* Измерено способом изотермического калориметрического титрования.
О. Исследования способом дифференциальной сканирующей калориметрии.
Способ дифференциальной сканирующей калориметрии (О8С) применялся для анализа ВНА10 есЕν, ВНА10 (61у48ег)4 есЕν и ВНА10 Жн44:Жъ100/(61у48ег)4 есЕν. Эксперименты проводились, как описано выше, для первоначального сравнения обычного есЕν и полученного ферментативным путем ЕаЬ, за исключением того, что сканирование выполнялось со скоростью 4°С/мин. Термостабильность ВНА10 Жн44:Жъ100/(С1у48ег)4 есЕν была выше, чем термостабильность есЕν дикого типа. В частности, менее стабильный из двух доменов, домен νΗ ВНА10 Жн44:Жь100/(61у48ег)4 есЕν, денатурировал при температуре примерно на 5°С выше, чем обычный ВНА10 есЕν (фиг. 15). Повышение температуры плавления или ТМ могло быть вызвано двумя различными факторами: (ί) увеличением термостабильности равновесной складчатой структуры или (ίί) снижением тенденции к аггрегации. Различие в Δ 5°С между обычным ВНА10 есЕν и ВНА10 Жн44:Жъ100/(61у48ег)4 есЕν практичеки не зависело от скорости сканирования (в интервале между 0,2 и 4,0°С/мин), это позволяет предположить, что наблюдаемые изменения ТМ происходят благодаря стабилизации равновесной складчатой структуры.
Е. Изучение связывания АИ8.
Способность связывать гидрофобный флюоресцентный краситель 1-анилино-8-нафталин сульфонат (АИ8) можно считать показателем взаимодействия между значительными по размеру гидрофобными участками белка в нативном состоянии или в частично раскрывшейся структуре, которая образуется при повышении температуры. В растворителе собственная флюоресценция красителя гаснет, но она значительно повышается при взаимодействии с большой гидрофобной поверхностью белка. Обычный ВНА10
- 101 015992 зсΕν в действительности связывает АН8 в значительно большей степени, чем ВНА10 (С1у48ег)4 зсΕν, или ВНА10 Ун44:Уъ100/(С1у48ег)4 зсΕν, что указывает на наличие на зсΕν доступных гидрофобных областей, существующих благодаря линкеру неадекватного (неподходящего) размера. Введение более длинного линкера, а именно (С1у48ег)4, как оказалось опосредует это эффект. Видимая открытость гидрофобной поверхности обычного ВНА10 зсΕν может приводить к повышенному уровню аггрегации в присутствии других белков или молекул, и даже в чистом растворе самого белка. Нагревание ВНА10 зсΕν выше его ТМ вызывает связывание АН8 и с обычным, и с конструированным ВНА10 зсΕνз. Интересно, что обычный ВНА10 зсΕν показывал значительное увеличение связывания АН8 как функцию от повышающейся температуры, это позволяет предположить, что при температурах ниже ТМ повышается доступность гидрофобных участков, в частности, это может происходить при температурах, используемых при культивировании бактериальных клеток и клеток млекопитающих (т.е. 37°С) (фиг. 16). В противоположность этому, как ВНА10 (С1у48ег)4, так и ВНА10 Ун44:Уь100/(С1у48ег)4 зсΕνз не проявляли такого свойства, это позволяет предположить, что стабилизирующие мутации, описанные в данном изобретении, снижают тенденцию к образованию полу-ассоциатов или ассоциатов с другими белковыми компонентами в культуре благодаря меньшей доступности гидрофобных участков на поверхности белка.
Пример 5. Идентификация стабилизирующих мутаций, обеспечивающих улучшенную внутреннюю стабильность белка.
(ί) Идентификация стабилизирующих мутаций.
Для идентификации стабилизирующих мутаций, обеспечивающих повышенную стабильность представляющим интерес белковым молекулам, были использованы разнообразные способы, основанные на анализе последовательностей (например, подсчет консенсуса, ковариационный анализ, моделирование гомологии области контакта Ун/Уь). Эти стабилизирующие мутации были использованы при создании библиотек экспрессии вариабельного участка антитела.
A. Ковариационный анализ.
Много проектов было разработано для того, чтобы стабилизировать ВНА10 зсΕν Ун и Уъ домены, на основании сильной ковариации, демонстрируемой двумя или более остатками в пределах отдельной последовательности. Анализ ковариаций был выполнен на ВНА10 зсΕν Ун и Уъ доменах с использованием способов, подобных описанным в примере 17, чтобы идентифицировать отсутствующие или разрушающие ковариации таким образом, что стабилизирующие мутации могли быть спрогнозированы и включены в библиотеку экспрессии вариабельных областей антител для экспериментального скрининга.
В первом примере, мутации от 8ег к Ьеи в положении 46 (8466; система нумерация Кэбата) в пределах ВНА10 Уъ показали положительную связь с существующим Туг в остатке 36, который по данным Инструмента Анализа Ковариации сильно коварьирует с 46 леями (см. фиг. 104). Анализ частот остатков также показал, что мутация должны быть стабилизирующей.
В дополнение к 846Ь вторая мутация, стабилизирующая по данным ковариации, была мутацией У55С в пределах Ун ВнА10 домена. В то время как частота остатка указала, что Уа1 нечасто наблюдается в этом положении, это положение включено в СОВ2 и является вариабельным. Поэтому, без дополнительной информации, не предпринималось попыток вносить изменения в этом положении. После анализа ковариации, однако, данные ковариации предположили, что это положение сильно коррелировано по крайней мере с 10 другими аминокислотами, которые уже существуют в пределах Ун ВнА10 домен. Мутация к С1у в положении 55 удовлетворила все 10 ковариаций.
Другим примером эффективно Инструмента Анализа Ковариации было прогнозирование отрицательного эффекта Ун ВнА10 мутации Ο6Ε. Частотный анализ одного остатка предположил, что мутация к намного чаще наблюдаемому С1и в этом положении приведет к увеличению стабильности. Однако Инструмент Анализа Ковариации указал, что отдельная мутация К С1и нарушает несколько существующих настоящих ковариаций в пределах последовательности Ун ВнА10. Чтобы получить улучшение стабильности, нужно заменить несколько аминокислот, которые избирательно стабилизируют С1и в этом положении.
Еще один пример прогностической ценности Инструмента Анализа Ковариации показан на фиг. 105. Ме! 80 был мутирован к Ьеи как часть отдельного проекта библиотеки остатка. Считалось, что эта отдельная мутация будет очень стабилизирующей, поскольку Ьеи - самая частая аминокислота, наблюдаемая в этом положении в базе данных последовательности. Однако исследования ковариации указывают, что две других аминокислоты должны быть мутированы (У67Е и Т708), чтобы достигнуть гармонии ковариации.
B. Подсчет консенсуса.
Оценка консенсуса использовалась как способ идентификации аминокислотных остатков зсΕν Ун и Уь области для мутагенеза, чтобы улучшить стабильность зсΕν. Оценка показывает относительное отклонение от консенсуса Ун и УК последовательностей из-за гиперсоматических мутаций и эволюционных зародышевых изменений. Информация, полученная из этого анализа, использовалась, чтобы проектировать библиотеку для скрининга зсΕν вариантов с улучшенной стабильностью.
Набор сравнения Ун и УК каппа последовательностей млекопитающих использовался для получения консенсусной последовательности для подсчета, и индивидуальные частоты аминокислот в каждом
- 102 015992 положении остатков были собраны, отсортированы и отобраны, как описано ранее (Оетагек!, е! а1., й. Мо1. В1о1. 335, 41-48 (2004); ОетагеЧ. е! а1., Рго!ет Еид. Оек. 8е1. 1и Ргекк (2006). Наборы сравнения млекопитающих были наивно сконструированы, чтобы включать У-гены от различных млекопитающих для достижения разнообразия через эволюционное отклонение между разновидностями. Набор сравнения Ун млекопитающих включает 61 последовательность Ун, прежде всего от NСВI и Т1СВ. представляя в общей сложности 17 различных видов млекопитающих. Набор сравнения УК млекопитающих включает 53 УК последовательностей от 13 различных видов млекопитающих.
Статистический анализ Ун ВнА10 и Уъ был выполнен с использованием пользовательских баз данных 1д6 и модифицированного набора символов РЕВЬ (Оетагек! и др., 2004; ЭетагеЧ и др., 2006). Частота аминокислот каждого остатка в пределах Ун ВнА10 и Уъ была вычислена из пользовательской базы данных. Частота остатка каждой аминокислоты в пределах Ун ВнА10 и Уъ, δί®, для каждого положения 1 в индивидуальной последовательности была вычислена столько раз, что специфичный тип остатка (г=А, С, Ό,... У, V, Υ) наблюдается в пределах набора данных, разделенного на общее количество последовательностей. Фиг. 17, 18 показывают Ун ВнА10 и Уъ частоты остатков, деленное на частоту консенсусных остатков базы данных. Разделив на консенсусную частоту остатка, получен строгий порог для создания библиотек в положениях остатка, где аминокислота ВНА10 нечасто наблюдается среди общего Ун или Уъ последовательности. Положения библиотеки были определены теми остатками, частота которых, разделенная на наибольшую частоту остатка (81(г)/МРВ1(г)), составляла <0,3. Остатки, перечисленные справа от вычислений частоты остатка, обычно находятся в человеческих последовательностях как показано в работе (Сйо!Ыа, и др., й. Молекулярная масса. Вю1. 278, 457-479 (1998)), и могут быть специфично перенаправлены в формат библиотеки, чтобы показать на экране для самой стабилизирующей аминокислоты. СОВ Ун и Уъ ВнА10 не рассматривали для оптимизации стабильности из-за потенциального прерывания взаимодействия с ΕΤβΒ, но могли рассматривать для дизайнов второго поколения.
С. Моделирование гомологии области контакта Ун/Уь.
Как описано в примере 15, анализ дифференциальной сканирующей калориметрии был выполнен на 17 человеческих антителах. Главные кандидаты, В11В1-4 все имели прекрасные (т.е. очень высокие и желательные) свойства стабильности. Эти очень устойчивые антитела могут использоваться как платформа для того, чтобы улучшить стабильность ксРу или доменов антител с низкой собственной стабильностью. В частности, особое внимание уделялось внутренней поверхности между Ун и Уъ, чтобы обеспечить потенциально больший уровень свойств стабильности.
Конверсия ВНА10 РаЬ в ксРу формат приводила к изменению в термограмме ДСК, говорящей о полностью кооперативном событии разворачивания, что видно из одного перехода развертывания при более высокой температуре (РаЬ), по существу, к некооперативному событию развертывания, что видно из двух индивидуальных низкотемпературных переходов развертывания (ксРу). Другими словами, в РаЬ формате, междоменные контакты были достаточно сильны, чтобы захватить все домены в один высокотемпературный переход развертывания. После удаления доменов Сн1 и Съ, Ун и Уь домены ксРу больше не могли вести переход развертывания в кооперативном событии. Постулируется, что стабилизация области контакта может не только стабилизировать оба Ун и Уъ домена одновременно, но также и вызвать прилипание Ун/Уъ области контакта и не допустить агрегации.
Четыре самых устойчивых В11В антитела (В11В1-4) использовались, чтобы спроектировать стабилизирующие мутации в ВНА10 ксРу через двухступенчатую процедуру. Во-первых, кристаллическая структура гуманизированного РаЬ ВнА10 использовалась для структурного анализа. Конкретно, кристаллическая структура использовалась, чтобы идентифицировать все остатки в области контакта между Ун и Уъ, так же как площадь поверхности, которую каждый остаток покрывает в области контакта (использующий программное обеспечение МОЬМОЬ). Остатки, которые в области контакта занимают значительно больше площади поверхности, чем другие, как полагают, являются более критическими для области контакта. В качестве произвольно взятого предела приоритизации, те остатки, которые занимают от 30 и 40 А2, считаются важными. Те, которые занимают > 40 А2, считают критическими. Этим двум категориям уделили самое высокое значение в терминах моделирования гомологии и мутагенеза. Площадь поверхности, которую каждый остаток вводит в толщу тканей в области контакта, представлена в табл. 6. Вовторых, типы аминокислоты в области контакта между Ун и Уъ сравнили с аминокислотами, которые присутствуют в тех же самых положениях в В11В1-4 (т.е. чрезвычайно устойчивого антитела). Этот способ позволил идентифицировать многие выдающиеся мутации для того, чтобы стабилизировать ВНА10 ксРу.
Две мутации, 846Ь в Уъ и Р101Э в Ун, были экспериментально валидированы, как описано в примере 8. Фактически, эти две мутации были отдельными наиболее стабилизирующими мутациями, проверенными в анализе термической проверки (например, см. фиг. 65(А)). Обе мутации стабилизируют Ун и Уь домены одновременно, предполагая, что они помогают построить кооперативность среди доменов.
- 103 015992
Анализ площади поверхности ВНА10 УнУъ
Таблица 6
Положение остатков νΗ/νν области контакта (Кэбат №) Область ΒΗΑ10 ААтип (Кэбат) Занимаемая площадь поверхности (А=) Частота остатка в базе данных млекопитающих Соответствующий ААиз стабильных АЬ (ВИВ)
νΗ35 ΡΑ2 ΗΪ5 16.4 Н1з
νΗ37 ΡΑ2 Уа1 6.5 Уа1
νΗ 39 ΡΡ2 6Ιη 37.4 98% 61п
νΗ44 ΡΑ2 С1у 13.1
νΗ45 ΡΑ2 Ьеи 97.8 97% Ьеи
νΗ47 СРА2 Тгр 78.5 97% Тгр
νΗ50 СОА2 Тгр 24.1
νΗ59 СОА2 ΟΙη 28.8
νΗ51 СОА2 Азп 26.4
νΗ90 РАЗ Туг 37.3 Туг
νΗ 1001 СОАЗ О1и 101.8 Высоко- изменчивые С1у (ΒΙΙΒ1), Туг (ΒΙΙΒ2)
νΗ 10Οΰ сэнз С1у 36.4 А1а, О1у (МСН); Туг (редко); РЬе (ΒΙΙΒ1), А1а (ΒΙΙΒ2)
νΗ 100Κ СОАЗ РЬе 66.7 Ме1 (МСН); РЬе (ЗМСА) РЬе (В11В1); Ме( (ΒΙΙΒ2)
νΗ 101 СОАЗ Рго 43.3 Азр (V. Сопз); А1а (редко) Азр* (ΒΙΙΒ1, ΒΙΙΒ2)
νΗ 103 СОАЗ Тгр 78.9 98% Тгр
νΗ104 ΡΑ4 С1у 6.1
νΗ 108 ΡΒ4 ΟΙη 11.5
- 104 015992
Уь 36 ЕВ2 Туг 44.2 86% Туг (ΒΙΙΒ1, ΒΙΙΒ2)
Уь 38 РН2 ΘΙΠ 34.5 92% ΟΙη (ΒΙΙΒ1, ΒΙΙΒ2)
νι 42 РВ2 Ьуз
уи 43 Н32 А1а 47.7 Зег = 50%; А!а = 35% Рго = 10% А!а (ΒΙ1Β1, ΒΙΙΒ2)
νΕ 44 ЕВ2 Рго 69.7 100% Рго (ΒΙΙΒ1, ΒΙΙΒ2)
Уь 45 ЕВ2 Ьуз 3.5
Уь 46 ГА2 Зег 29.7 Ьеи = 76% Агд = 8% Зег = 8% Ьеи* (ΒΙΙΒ1, ΒΙΙΒ2)
49 РВ2 Зег 14.8 Туг = 88% С1и == 4% Зег = 2% Зег (Β1ΙΒ1)
50 РП2 Зег 9.7 О1у (ΒΙΙΒ1)
УЕ 55 СОК2 Туг 59.6 А1а = 34% С!и = 28% Туг = 6% СНу* (ΒΙΙΒ1)
Уь 87 РАЗ РЬе 35.1 Туг = 84% РЬе = 15% Туг* (ΒΙΙΒ1)
Уь 89 СЭРЗ ΟΙπ 14.7 <3Ιη (ΒΙΙΒ1)
Уи 91 СЭВЗ Туг 36.3 РЬе (ΒΙΙΒ1)
Уь 94 сэвз Туг 68.4 ТЬг = 20% Туг = 12% А1а (ΒΙΙΒ1); Ьеи (ВПВ2);
Уь 95 совз Рго 38.8 Рго = 90% Рго (В11В1); Ьеи (ВПВ2);
Уь 96 РК4 РЬе 76.6 Туг = 12% РЬе = 6% Туг* (ВПВ1); Тгр* (ВПВ2);
Уь 98 РВ4 РНе 102.5 100% РЬе
Уь 99 ЕВ4 С1у 5.4
Уь 105 РВ4 θΐυ 6.2
(Положения остатков, помеченные *, показывают хорошие возможности дизайна стабильности посредством мутаций на остатки ВПВ1,2, 3 или 4).
Б. Компьютерный анализ.
Вычислительные способы использовались, чтобы проанализировать ВНА10 для того, чтобы делать рекомендации по положениям, аминокислотные замены в которых могли бы улучшить стабильность. Эти способы состояли из двух этапов: основанный на последовательности анализ (этап 1) и основанный на структуре анализ (этап 2). Во время первого этапа использовалась база данных последовательностей вариабельных доменов антител. Аминокислоты, представленные в низких частотах в их соответствую
- 105 015992 щих положениях (меньше чем в 10% последовательностей базы данных) или те, которые не соответствовали соответствующим консенсусным аминокислотам, были отобраны для замен на высокочастотные или консенсусные аминокислоты (мутации кандидатуры). На втором этапе использовалась трехмерная структура или модель фрагмента РаЬ антитела. Мутации кандидата были оценены в их структурном контексте и расположены по приоритетам для экспериментального исследования, основанного на структурных свойствах, совместимости с конформациями областей, определяющих комплементарность, роль в упаковке области контакта Уъ/Ун и сворачивание тяжелых и легких цепей.
ВНА10 необычен из-за наличия серина в положении 46 легкой цепи. В базе данных приблизительно 1% Уь (каппа подтип) последовательности обладают 846, тогда как приблизительно у 79% Уъ (каппа подтип) последовательности есть Ь46. Кроме того, у человеческого консенсуса КУ1 есть Ь46. После идентификации как кандидатуры мутации замена 846Ь была оценена в контексте трехмерной модели РаЬ ВнА10. Положение 46 было найдено, так как находилось в области контакта Уъ/Ун в контакте с Υ101 и 103 Ун и Υ36 и Υ55 Уъ. Структурный анализ показал, что замена 846Ь была совместима с целостностью области контакта Уъ/Ун, конформациям СИЯ и Уъ сворачиванием.
Серин - нечастая аминокислота в положении 16 тяжелой цепи. В базе данных приблизительно 5% последовательностей Ун содержат 816, у 25% есть А16, у 21% есть 616, у 11% есть Е16 и приблизительно 10% - 016. Также А16 есть у человеческого консенсуса нУ1. После идентификации как мутации кандидата, 816А, Г, Е и О замены были оценены в контексте трехмерной модели РаЬ ВНА10. Нашли, что положение 16 находится в петле, ближайшей к области контакта Ун/Сн1 и в контакте с К13 и 816 Ун. Структурный анализ показал, что 816А, Г, Е и О замены были совместимы с целостностью области контакта Уь/Ун, конформаций СИЯ и сворачиванием Ун. Также заключили, что предпочтительны длинные гидрофильные боковые цепи Е16 и 016. Соответственно положения Уъ46 и Ун16 были представлены в проекте библиотеки.
Комплементарный подход к вычислительному анализу использовал структурные способы белковой инженерии, такие как описаны в работе Яозейа (КиЫтап В. и др., РNА8 200198 (19): 10687-91) и ИЕЕК (напГ К.1., Р11.Э. Тйезк, МРТ, 2002). Учитывая трехмерную структуру белковой области контакта, эти способы позволяют определить мутации в последовательности аминокислоты, которые приводят к улучшенному ДАГ для Ун и Уъ связывания (различие между связанным и несвязанным состояниями), и/или ААГ для Ун и Уъ свертывания (различие между свернутым и несвернутым состояниями). Использование этих способов показало, что 846Ь - мутация, которая улучшает связывание Ун и Уъ, тогда как 816Е - мутация, которая улучшает сворачивание Ун.
Е. Комбинированные подходы дизайна области контакта и ковариаций.
Анализ ковариаций использовался, чтобы определить сети остатков, важные для обеспечения и поддержки области контакта между Ун и Уъ и для обеспечения сильного сродства между Ун/Уъ, что приводит к увеличению зсРу стабильности. Остатки, непосредственно вовлеченные в область контакта между Ун и Уъ ВнА10 зсРу, были идентифицированы, как описано в примере 5С, и перечислены в табл. 6. Остатки, которые сильно коварьируют с наиболее используемыми остатками, перечисленными в табл. 6, были вычислены, используя способологию ковариации, описанную в секции (а) выше. НММ, используемый для анализа ковариации, не позволяет исследовать остатки в СИЯ2 и СИЯ3 обоих Ун и Уъ доменов, которые заняты в области контакта. Однако предполагается, что никакие сильные ковариации не явились бы результатом этих положений остатка, поскольку они являются очень вариабельными из-за интенсивного селективного давления, которое существует для антител, чтобы они распознавали антигены с высоким сродством. Поэтому остатки, которые использовались для того, чтобы определить, существует ли сеть ковариации, поддерживающая область контакта между обоими Ун и Уъ, были:
νΗ (КэбатТ) Ά (Кэбат№)
У37/137 Υ36
039 038
С44 А43
1.45 Р44
УУ47 646
УУ50 Υ49
Υ91 Υ95
УУЮЗ Р98
Остатки, вид которых в выравнивании последовательности У-класса коррелировал с упомянутыми выше остатками области контакта, были определены с использованием порога значения фи> 0,25. Остаток не рассмотрели как важный элемент для поддержания сильного взаимодействия между Ун и Уъ, если он не коррелировал по крайней мере с двумя из остатков области контакта, перечисленных непосредственно выше. Табл. 7 и 8 перечисляют такие остатки Ун и Уъ доменов соответственно, которые демонст
- 106 015992 рируют две или более корреляций с остатками области контакта. Чем больше количество связей, тем больше воздействие и каждое из этих положений аминокислоты стабилизирует область контакта между Ун и Уъ.
Таблица 7 Остатки с УН с множественными сильными корреляциями к структурным остаткам, наблюдаемым в области контакта кристаллической структуры ВНА10, полученной в результате рентгеновского анализа
КовариацияМ Аминокислота ВЬаЮХгауМ Кэбат№ №Связи
67 47 47 6
48 ν(Ι**) 37 37 5
«1 ь 45 45 5
66 Е 46 46 5
71 I 51 51 5
85 Г 60 59 5
142 7 112 109 5
14 Р 14 14 4
27 О 26 26 4
29 Р 27 27 4
52 А . 40 40 4
61 Ь 45 45 4
102 I 70 69 4
135 106 103 4
31 Р 29 29 3
49 а 38 38 3
60 с 44 44 3
69 σ 49 49 3
78 о 56 55 3
93 ь . 64 63 3
97 о 55 54 3
101 т 69 68 3
106 ϋ 73 72 3'
109 8 75 74 3
115 Υ 80 79 3
120 Т(8‘) 85 82Ь 3
6 Е 8 8 2
43 Υ 32 32 2
50 9 39 39 2
53 Р 41 41 2
92 8 63 62 2
124 А 89 85 2
131 Υ 95 91 2
24 Α,ν,Ο 24 24 3*
89 АЗЧД* 61 60 3*
Выделенные полужирным шрифтом остатки занимают место на области контакта. Выделенные курсивом остатки непосредственно прилегают к первичной последовательности остатков, расположенных в области контакта.
* Свойство, позволяющее различать подклассы.
** Коварьирует с большим количеством таких же остатков, что и первичный остаток, но с меньшим уровнем корреляции из-за меньшей частоты остатков.
- 107 015992
Таблица 8 Остатки с Уъ с множественными сильными корреляциями к структурным остаткам, наблюдаемым в области контакта кристаллической структуры ВНА10, полученной в результате рентгеновского анализа
Ковариэция№ Аминокислота ВЬ*10Хгау№ Кз6ат№ №Свя1и
49 Ω 37 37 7 ’
48 Υ 36 36 6
61 Р 44 44 6
93 Р 59 59 6
91 с 57 57 6
102 о 64 64 6
67 ь 46 46 4
69 / 48 . 48 4
101 8 63 63 4
107 8 67 67 4
108 О 68 68 4
52 К 39 39 3
бб К 45 45 3
85 К 54 54 3
90 8 56 56 3
122 _ 79 79 3
129 ϋ 85 85 3
135 К 98 98 3
68 1 47 47 2
92 V 58 58 2
117 т 74 74 2
120 о 77 77 2
126 Е 83 ' 83 2
133 в 89 89 2
143 ь 104 104 2
Выделенные полужирным шрифтом остатки занимают место в области контакта. Выделенные курсивом остатки непосредственно прилегают к первичной последовательности остатков, расположенных в области контакта.
*Р50,Л89,У135 консервативны в тяжелой и легкой цепях и ковариации, вероятно, не коррелируют с положением в легкой цепи.
Остатки из табл. 7 и 8 были представлены на поверхности Ун ΒΉΑ10 и Уъ соответственно и сопоставлены с фактическими остатками, которые устанавливают прямой контакт в области контакта между двумя доменами (см. фиг. 116-119). Из этого анализа сделано два вывода. Во-первых, ковариации не предоставляют информацию (на данном этапе) о сетях, вовлекающих СИРТ и СИКЗ остатки в области контакта. Во-вторых, ковариации предполагают, что не только остатки, которые устанавливают прямые контакты в пределах области контакта, важны для его обеспечения, но что много других остатков вне прямых остатков с областью контакта важны для его поддержки и поддерживают положения остатков области контакта. Этот вывод проиллюстрирован теми остатками, которые есть на поверхности сети ковариаций, но отсутствуют на поверхности, полученной просто с помощью структур, чтобы вычислить те остатки, которые непосредственно занимают поверхность в области контакта.
Нарушения нескольких из этих сетей ковариации области контакта были обнаружены в ВНА10 или р5Е8 (описанный ниже в примере 21) 5сЕу: Ун или Уъ последовательности. Мутация нативная/неидеальная аминокислоты в этих положениях к идеально поддерживающим кислотным остаткам области контакта, описанным в табл. 7 и 8, оказалась очень стабилизирующей для ВНА10 или р5Е8 5сЕ\ъ: (а) ВНА10 У|. З46Ь и (Ь) Иес152 Ун З49О (Кэбат и рентген №) Ε72Ό (73 для рентгена). Один из этих остатков (З46ЬУь) был непосредственно в области контакта, один (З49ОУН) был непосредственно связан с областью контакта, и каждый был дистальным для области контакта (Е72ЭУН). Однако все три были спрогнозированы на основании Анализа Ковариаций, чтобы стабилизировать область контакта. Стабилизация области контакта может наблюдаться способом ДСК как увеличение теплоустойчивости Ун и Уь.
ίί) Конструирование и скрининг ВНА10 5сЕу библиотек с улучшенной температурной стабильностью.
А) Конструирование библиотек 5сЕу.
Библиотеки проектировали, чтобы они содержали желательные замены аминокислот в обычном ВНА10 5сЕу (рХ^И002), способами, описанными в примерах 4-6. Их создали, используя ОшкС’Напде II ЗИс-Ипсйсй Ми1адепс515 КП, следуя инструкциям изготовителя (З1га!адепе, Ьа Эо11а, Са) с помощью олигонуклеотидов, перечисленных в табл. 9. Последовательность ДНК обычного 5сЕу изображена в фиг. 1, 2.
- 108 015992
Идеальные трансформированные колонии выбраны в глубокие 96-луночные блюда (Согшпд, Согп1пд, ΝΥ, Са!. № 3960), включающие 400 мкл/лунку ЬВ плюс 50 мкг/мл карбенициллина и выращенные в течение ночи при 37°С. Главные планшеты были созданы добавлением равного объема ЬВ, включающего 20%-ный глицерин, к каждому источнику глубоких 96-луночных планшет и передачей 50 мкл аликвот бактерийной взвеси к стерильным пластинам микротитратора (Согшпд, Согшпд, ΝΥ, Са(. № 3359) и заморозке для хранения при -80°С.
Таблица 9
Олигонуклеотиды для конструирования стабильности ΒΗΑ10 ксΡν
Положение в библиотеке ВНА10 Последовательность! Способы) дизайна
Уь49и50 (8ЕО ГО N0:123) 5'-ΟΤΑΟ€ΟΟΤΑΟΟΑΟΟΟΜΝΝΚ КАААТСАОТОАТТТАОО - 3' Консенсус
¥ь46 (8Е<2 ГО N0:124) 5’- ОООААСССТССТАААТТАСТО АТТТССТСООСС - 3' Консенсус, Расчет, У|/Ун интерфейс, ковариация
Ун 16 (8ЕС2 ГО N0:125) 5’аОАСАССТТСАСТОАСВЦССС АООСТТСТТСАС - 3' Консенсус, Расчет
Ун 101 (8Еф ©N0:126) 5'- ОАТССТОООААООТПТОАСТ АСТСССОССАА6СОАС -3' УцУн интерфейс,
Ун 20 (8ЕЦ ©N0:127) 5- СССТССТСАбТОААОтУТКТСС ТОСААСОСТТСТО -3' Консенсус
Ун 48 (8Е<2 ГО N0:128) 5'- САССОАСГГОАОТОСУККССА ТСОАТТТАТССТО -3' Консенсус
Ун 67 (8Е0 ГО N0:129) 5- СААОТТСААСбССАСКйЧУСА СААТСАСТ6САСАС -3' Консенсус
Ун 55 (8Е<2 ©N0:130) 5’-ССАТООАТТТАТССТООААА ТООТСАТОСТСАОТАСААТСАС5 -3' ковариация
У..З (8Е<Э ГО N0:131) 5’-СОТООТАОТОАСАПУ№АТС АСССА6ТСТССТА6С -3' Консенсус
Положения для мутагенеза выделены подчеркиванием. Избыточные основания сокращены следующим образом: \ν=Λ или Т, V=А или С или С, Υ=Ο или Т, 8=С или С, М=А или С, ^А или С или С или Т, К=А или С, К=С или Т, В=С или С или Т (I Вю1 Сйет. 261(1):13-7 (1986)).
В. Анализ температурной стабильности.
Активности обычного и сконструированного ВНА10 ксΡν затем сравнили в анализе термической проверки, который может использоваться, чтобы определить температуру, когда 50% молекул ксΡνк сохраняют антигенсвязывающую активность. Числовая величина, соответствующая этой температуре, называется значение Т50 и измеряется в °С. В этом анализе ксΡνк были подвергнуты диапазону температур, которые охватывают тепловую температуру перехода обычного ВНА10 ксΡν.
Е.сой линии ν3110 (АТСС, Мапаккак, Vа. Са(. № 27325) трансформировали с помощью плазмид, кодирующих сконструированный и обычный ВНА10 ксΡνк под контролем индуцибельного промотера ага С ргошо(ег. Трансформированные клетки выращивали в течение ночи в среде для экспрессии 8В Щекпоуа, Иа1Г Мооп Вау, Са. Са(. № 80140), включающей 1% глицин, 1% Тритон Х100, 0,02% арабинозу и 50 мкг/мл карбенициллина или при 37°С, или при 32°С. Бактерии осаждали центрифугированием, полученный супернатант оставляли для дальнейшей обработки. Включение глицина и Тритона Х-100 в среду позволяет высвободить содержимое периплазмы (нативный белок Е.сой и ксΡν) в среду (Уапд е! а1. Αрр1^еб и Ьпу|готеп1а1 М1сгоЬю1оду (1998), 64:2869-2874). Присутствие в супернатанте белков Е.сой является существенным для выполнения этого измерения, т.к. термоинактивированные белки действуют как раковина, захватывая случайно развернутые молекулы ксΡνк в необратимо инактивированные агрегаты.
Каждую библиотеку скринировали на термическую стабильность дважды. Первый супернатант подвергали воздействию в условиях эксперимента, а второй супернатант оставляли и использовали для сравнения. Измерение термоинактивации для получения данных о термостабильности может быть выполнено при одной температуре или в выбранном диапазоне температур. Для обработки образцов (супернатантов) использовался термоциклер, способный создавать стабильные температурные градиенты
- 109 015992 (1Сус1ег, Вю-Яаб, ОаййегеЬигд, Мб).
Температурное воздействие варьировалось в зависимости от свойств взятого ВНА10 есЕν и обычно было на 2-3° выше, чем экспериментально определенная величина Т50. Замороженные платы Мае1ег размораживали и высевали в лунки на титрационном микропланшете, включающие 250 мкл на лунку среды для экспрессии, и культивировали в течение ночи при 32°С. В качестве контроля использовались культуры, включающие родительскую плазмиду. Их выращивали в тех же условиях и использовали одновременно с библиотекой. Бактерии осаждали в глубоко-луночные планшеты хорошо центрифугированием 2000 об/мин (модель 1ЕС 8Я, ТЬегто Е1ес1гоп, УаИЬат, Ма) в течение 30 мин и 100 мкл супернатанта переносили на стандартные пластины для микротитрования (Согшпд, Согшпд, ИУ, Са! № 3357). Аликвоту супернатанта оставляли Гог (Не геГегепсе ЬЕЬПА. Для большинства библиотек платы, включающие остатки супернатанта, запечатывали (Иа1де Иипс, ЯосЬее1ег, ИУ, Са(. № 235205) и помещали в инкубатор с соответствующей термической проверкой (ЕсЬо ТЬегт, Тоггеу Ртее 8с1епййс, 8ап Магсое, Са) на 90 мин.
Для скрининга, требующего измерений при нескольких сЬаНепде температурах (или при температуре выше 75°С), супернатанты помещали в 96-луночную плату для ПЦР (Аррйеб Вюеуе1ете, Еое1ег Сйу, Са, Са(. № И801-560) и инкубировали в течение 90 мин при требуемой температуре. После температурной стимуляции агрегировавший материал удаляли центрифугированием и растворимые ВНА10 есЕν, оставшиеся после обработки в прозрачном супернатанте, отделяли и измеряли связывание с родственным (содпа(е) антигеном ЬТвЯ 1д способом ЬЕЬПА. 96-луночные платы (Мах18огр, Иа1де Иипс, ЯосЬее1ег, ИУ, Са(. № 437111) покрывали гибридным белком, состоящим из эктодомена рецептора ЬТв (ЬТвЯ), связанного с Ес областью человека (концентрация раствора 1 мкг/мл в 0,1 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5). Платы инкубировали в течение ночи при 4°С и блокировали с помощью буфера для измерения ОЕЬЕГА (ОАВ, 10 мМ Тпе НС1, 150 мМ ИаС1, 20 мкМ ЕОТА, 0,5% В8А, 0,02% Ттеееп 20, 0,01% ИаИ3, рН 7,4), инкубируя с ним в течение 1 ч на шейкере при комнатной температуре. Платы отмывали 3 раза ЬАВ, не включающим В8А (отмывочный буфер), затем добавляли к платам исследуемые образцы, ратворенные в ЬАВ в конечном объеме 100 мкл. Платы инкубировали в течение 1 ч на шейкере при комнатной температуре и трижды отмывали отмывочным буфером для удаления несвязавшихся или функционально неактивных молекул есЕνе. Связанный ВНА10 есЕν определяли добавлением в каждую ячейку 100 мкл ЬАВ включающего 40 нг/мл меченых Ей анти-Н1е6 антител (Регкт Е1тег, Вое1оп, МА, Са(. № АЭ0109) и инкубировали на шейкере при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем платы трижды отмывали отмывочным буфером и добавляли в каждую ячейку 100 мкл усиливающего раствора ЭЕЬРГА (Регкт Е1тег, Вое1оп, МА, Са(. № 4001-0010). После инкубации в течение 15 мин платы детектировали, определяя Европий на приборе Жю1ог 2 (Регкт Е1тег, Вое1оп, МА).
Данные измерений обрабатывали с помощью программного обеспечения 8роШге Оес1еюп8йе (8ро1Пге, Зотег^'Ше, Ма.) и выражали в виде отношения количества импульсов при термической проверке к количеству импульсов при геГегепсе (етрегаШге для каждого клона. Клоны, воспроизводимо дающие значение этого отношения в два или более раз выше, чем для родительской плазмиды, считались хитами. Плазмидная ДНК для этих клонов была выделена с помощью набора тпн-ргер (Χνί/агб Р1ие, Рготеда, Маб1еоп, XVI) и ретрансфомирована в Е.со11 У3110 для вторичного анализа термической проверки.
Данные, полученные при градиенте температуры, анализировались с помощью программного обеспечения Рпет 4 (СгарНРаб 8ойгеаге, 8ап О1едо, Са), с использованием в качестве модели сигмоидальной дозовой зависимости с варьируемой крутизной (варьируемым наклоном). За величину Т50 принимались значения, полученные в средней точке кривой термической денатурации, при этом принималось, что они не эквивалентны биофизически определенной величине ТМ.
Первичные и подтверждающие результаты, полученные при анализе термической проверки, показаны в табл. 10. Некоторые стабилизированные молекулы есЕνе изобретения демонстрируют улучшенную связывающую активность (Т50 >49°С) по сравнению с обычными есЕν. В частности, величины Т50 для ВНА10 позиции библиотеки Ж46 есЕν(846^), позиции библиотеки νΗ16 есЕν (816Е и 8160) и позиции библиотеки Ж49: ν350 есЕν демонстрировали увеличение термической стабильности в диапазоне от 3 до 12°С по сравнению с обычным ВНА10 есЕν. Кроме этого, величины Т50 для ВНА10 позиция библиотеки Ж3 есЕν (О3А, О3С, 038, 03V, и Ο3Ω), позиция библиотеки νΗ67 есЕν (ν67Ι и Ж67Ь), позиция библиотеки νΗ48 есЕν (М481 и М48О), позиция библиотеки νΗ20 есЕν (Ж201) и позиция библиотеки νΗ101 есЕν (Р10Ш) демонстрировали увеличение термической стабильности в диапазоне от 4 до 18°С по сравнению с обычным ВНА10 есЕν. Одна из стабилизирующих мутаций (Ж К13Е) возникла благодара ошибке ПЦР. Оказалось, что включение этой стабилизирующей мутации в р1ЕН009 дает дополнительное увеличение термической стабильности и даже превышает те, что получены для ВНА10 ЕаЬ в этих условиях (фиг. 19). Важно, что нековалентная мутация Ж|,46 и νΗ55, полученная в ходе одного или более из четырех способов дизайна (моделирование гомологии области контакта ЖЖн, расчет консенсуса, вычислительное моделирование, анализ ковариации), заканчивалась улучшением термической стабильности есЕν, почти приближающейся к имеющей место для дисульфидных мутаций и валидирующая пригодность и новизну этих средств проектирования.
- 110 015992
Фиг. 2 показывает аминокислотные последовательности обычного ВНА10 ксЕ\' (ЪЕО ΙΌ ΝΟ: 4), и фиг. 125 (А и В) показывают аминокислотные последовательности стабилизированной ВНА10 ксРУ, включающей δ46Ε (Уь), стабилизирующую мутацию (^ЕО ΙΌ ΝΟ: 137), и У55С(УН), стабилизированную мутацию (^ЕО ΙΌ ΝΟ: 138) соответственно. Последовательность ДНК дикого типа ВНА10 ксЕ\' (ЪЕО ΙΌ ΝΟ: 3) изображена на фиг. 1. Стабилизирующая мутация заключена в рамку. Ведущая последовательность, д1у/кег связывающий пептид и СН1 домен выделены подчеркиванием, полужирным шрифтом и курсивом соответственно.
Таблица 10 ВНА10 УН и Уь библиотечные положения, библиотечный состав и результаты скрининга
положение библиотека НМ 8еч- наблюдаемый дтм ’С
УЬ49и50 49 (Υ или 8) 50 (аИ АА’з) ΥΤ, Υ8, ΥΕ, ΥΟ, 8К, 8К +3-4
УН16 К, Е, К, 97, О, Р, 8, Т, А 816Е 816(2 +8 +4
УЬ46 Ь 8461. +10
УН13 па К.13Е +3
ΥΗ101 па РЮЮ +18
УН20 Р,М,Ь,1 У201 +7
УН48 я, 8, м, ι, ь, ν, о Μ48Ι М48С +3-4
УЬЗ Ν, <2, К, Η, Е, Ц К, ν,Ο,Ρ,δ,Τ,Α (23А, <235, ОЗУ, <23Р, <230, +3-5
УН55 па УНУ55О +12
УН67 Τ, Р, I, Ь,У, А У671 У67Ь +5 +8
па=не применимо.
Табл. 11 показывает результаты всестороннего анализа термоустойчивости различных индивидуальных и комбинированных стабилизирующих мутаций, введенных в обычный ксЕ\'. Эти результаты демонстрируют, что улучшение активности аддитивно, и что способы, описанные в этом изобретении, приводят к улучшению свойств теплоустойчивости ксЕ\' даже превосходя нативные РаЬ. Даже в отсутствие ковалентного дисульфидного мостика в положениях УН44-УЪ100 стабилизирующие мутации показали увеличение теплоустойчивости в пределах от 19 до 33°С относительно обычного ВНА10 ксЕ\'.
- 111 015992
Таблица 11
Характеристики конструктов ВНА10, используемые для изготовления модифицированных белков и значений Т50 по результатам анализа термической проверки
Плазмида Дисульфид Длина линкера Другая мутация («О т«,°с
рЕНООЗ ПО 15 па 49
рЕНООб УН44-УЫ00 15 па 59
рхтеиоо! РаЬ па РаЬ 61
Ρχ\νυοο2 ПО 20 па 51
ρχν/иооз по 25 па 51
рЕН009 УН44-УЫ00 20 па 61
Р1ЕНО29 по 20 УЬ 846Ь 61
рЕНОЗ! УН44-УЫ00 20 УЬ 846Ь 71
ΡΙΕΗ032 по 20 УН816Е 60
ΡΙΕΗ034 по 20 УН 8160 56
ΡΙΕΗ058 по 20 УНРЮЮ 67
рШН059 по 20 УН У201 56
рЕНОбО по 20 УНМ48О 54
рЕН061 по 20 УНМ481 53
рЕН062 по 20 УЬОЗА 53
рЕНОбЗ по 20 УЬО38 53
р1ЕН065 по 20 УЬОЗУ 53
рЕНОбб по 20 УЬОЗЭ 54
рЕН067 по 20 УЬОЗС 54
рЕНОбв по 20 УНУ6Л 55
РЕН069 по 20 УНУ67Ь 58
ΡΙΕΗ070 по 20 УНУ55С 64
РЕН076 по 20 УН 816Е + УЬ 84бЬ 71
рЕН078 по 20 УН 8160 +УЬ 84бЬ 68
рЕН080 УН44-УЫ00 20 УН 816Е + УЬ 846Ь 75
рЕН081 УН44-УЫ00 20 УН 8160 + УЬ 84бЬ 72
рЕН087 по 20 УН 816Е, У55О + УЬ 846Ь 75
рЕН094 ЙО 20 УН 816Е, У55О Р10Ю + УЬ846Ь 82
па=не применимо. аа=аминокислотных остатков.
Резюме.
Три стабилизирующих мутации (УЪ_846Ь, Ун_У55С и Ун_Р10Ш) экспериментально валидировались анализом термической проверки (Т50). Было спрогнозировано, что обе мутации УЪ_846Ь и Ун_У55С стабилизируют индивидуальные Ун и Уъ домены; это сделано на основании данных ковариации, описанных в примере 3 выше. Как показано на фиг. 65(А и В), обе эти мутации привели к значительным увеличениям Т50 ВНА10 зсЕу. В частности, мутация УЪ_846Ь стабилизирует зсЕу на ~7-8°С, в то время как Ун_У55С мутация стабилизирует зсЕу на ~12°С. Обе эти мутации также значительно сокращают промежуток ТМ между Ун и Уь, как определено ДСК (см. фиг. 66-67). Данные ДСК показывают, что обе мутации приводят к значительным увеличениям обоих ТМ (середина температурных переходов развертывания) как для Ун и Уъ доменов, так и в калориметрической энтальпии (т.е. область под кривой) для зсЕу. Увеличение этих значений обеспечивает экспериментальную валидацию, что эти спрогнозированные стабилизирующие мутации фактически стабилизируют зсЕу. Кроме того, так как эти две мутации стабилизируют оба Ун и Уь домена одновременно, они, вероятно, важны в построении кооперативности между Ун и Уь доменами. Соответственно ожидается, что укрепление области контакта между Ун и Уъ может не только способствовать увеличению стабильности, но и уменьшить тенденцию формирования агрегатов.
Было также спрогнозировано, что Уь_846Ь, стабилизирующая мутация и третья стабилизирующая мутация (Ун_Р10Ш) являются стабилизирующими; это сделано на основании моделирования гомологии области контакта Ун/Уь, описанного в примере 4 выше. Ун_Р10Ш стабилизирующая мутация стабилизировала зсЕу ~15°С по данным анализа термической проверки (фиг. 65(С)). Кроме того, ДСК (см. фиг. 68) показывает, что эта стабилизирующая мутация приводит к значительным увеличениям ТМ Ун и Уъ
- 112 015992 доменов и в калориметрическом теплосодержании, указывая, что эта мутация - также, вероятно, кооперативно стабилизируют зсРу в целом через Ун/Уъ область контакта.
Пример 6. Биофизическая характеристика ВНА10 зсРуз, включающего стабилизирующие мутации.
Последовательности для У-участка гена различных плазмид показаны в табл. 11. Они были субклонированы в модифицированный вектор экспрессии Е.сой, чтобы обеспесить экспрессию рекомбинантного белка под контролем индуцибельного ага С промотора. Разновидности ВНА10 зсРуз были экспрессированы и очищены описанными выше способами. Очевидный сайт рестрикции на Ν-конце Уь домена приводил к снижению уровня Уъ в большинстве препаратов зсРу, как это видно из результатов 8Ό8электрофореза (фиг. 69).
Гидродинамические свойства каждого из зсРу исследовались способом эксклюзионной хроматографии нРЬС (Адйеи! Тесйио1од1е8) со статистическим светорассеянием и рефрактометрическими детекторами (М^и^^ΑVN/ΒеX, ννηΙΙ Тесйио1оду). Оказалось, что зсРу в основном были мономерными, однако несколько ксРук, включая зсРу дикого типа (нестабилизированный), содержали небольшое количество димерного материала (табл. 12). Ни один из очищенных зсРуз не содержал заметного (определяемого) уровня олигомеров, больших, чем димер.
Таблица 12
Результаты 8ЕС/светорассеяния зсРуз
Образец Выход экспрессив(мг/Ы* % мономеров % димеров % больших агрегатов
ΨΤ п.4.ь 87 13 0
ез4 0.6±0.1 97 3 0
009(88) пЛ 99 г 0
072 У1. 846Ь 2.0 85 15 0
073 Уь ШЬ + 55 ♦0.15 78 22 0
074 ν„. 816Е 2.4±1.7 94 6 0
075 Ун 51б0 1.1±0.5 96 4 0
076 Уи-БДбЬ + Ун 816Е 1.&Е0.4 80 20 0
077 Ун РЮЮ 2.5 93 7 0
078 Уц_&4бЬ + νΗ 8160 1.0 85 15 0
079 Ун У55О 2.0 92 8 0
080 Уц_846Ь + Ун 816Е + 33 Ό.2Γ 76 24 0
087 У^846Ь + Ун 816Е, У55О 2.8 76 24 0
094 Уь_846Ь + Ун 816Е,У55О,Р10Ю 2.5 79 21 0
а Белки без стандартной ошибки были экспрессированы 1 раз.
Ь и.й., не определяется.
с Эти величины определялись после того, как был выполнен препаративный 8ЕС для уменьшения количества агрегатов.
Конечной целью экспериментов было определить, приведут ли созданные мутации к увеличению стабильности и снижению способности к агрегации. Термостабильность каждого из зсРу оценивалась двумя различными способами. Во первых, развертывание зсРуз под действием температуры анализировалось способом ΩδΟ’ (фиг. 70). Во-вторых, термостабильность каждого зсРу определялась при нагревании с флуоресцентрым гидрофобным красителем 1-анилино-8-сульфонатом (АК8, фиг. 71). А№, как правило, связывается с частично развернутыми белками или белками в компактном неразвернутом состоянии, но денатурировавшими при нагревании. При связывании с гидрофобной поверхностью флюоресценция красителя АК8 возрастает, предположительно из-за того, что снижается гашение флюоресценции растворителем.
Кривые температурной зависимости для флюоресценции были представлены в виде графиков двухэтапного развертывания белка, как описано ниже. В качестве буфера использовался РВ8 и концентрация зсРу в каждом эксперименте составляла 750 нМ. Измерение флюоресценции выполняли на спектрополяриметре с измерением циркулярного дихроизма 1А8СО модели 812, оснащенного термоэлектрическим элементом Пелтье и наружной водяной баней. Флюоресфенцию определяли, используя фотоумножитель, расположенный перпендикулярно световому потоку, и монохроматор, установленный на длину волны 480 нм. Чувствительность была установлена на величине 600 У. Нагревание выполнялось с постоянной скоростью 120°С/мин. Длина волны возбуждения составляла 370 нм.
Развертывание третичной структуры зсРу в данном исследовании приводило к увеличению флюоресценции АК8. Средняя точка термического развертывания (т.е. ТМ) для каждого белкового домена
- 113 015992
8сΡν определялась способом И8С путем подгонки каждого пика развертавания белка к уравнению Гиббса-Геймгольца. Для этого использовалось программное обеспечение 0пдт 7,0 (М1сгоса1, Шс). Значения ТМ определялись по флюоресценции А№ путем включения уравнения Гиббса-Геймгольца в нелинейную кривую в Ка1е1дМа6гарйТМ:
ΔΟυ’ίΤ) = ДНи°(Т) - ΤΔ8ΛΤ). (1) где АС|о(Т) - зависимое от температуры изменение свободной энергии Гиббса при развертывании белка; Ани о(Т) - изменение энтальпии, связанное с развертыванием;
А8ио(Т) - энтропия, связанная с развертыванием.
Уравнение может быть переписано следующим образом:
где ТМ - средняя точка кривой развертывания белка и
АСр° - разность теплоемкостей между свернутым и развернутым состоянием белка.
Это уравнение может быть использовано для вывода температурной зависимости интенсивности флюоресценции А№, если использовать приближение, что интенсивность флюоресценции - это сумма внутренней флюоресценции А№ в присутствии свернутого и развернутого 8сΡν ΐγ(Τ) = ΐρίρ + ίυ^, (3) где 1Т(Т) - зависимая от температуры величина флюоресценции;
ίΡ и ίυ - интенсивности флюоресценции в свернутом и развернутом состоянии соответственно;
ГР и Г · - доли свернутого и развернутого 8сΡν соответственно при данной температуре.
Доля свернутого белка связана с равновесной константой развертывания и свободной энергией развертывания:
Включая Ки(Т) и АСТ(Т) в уравнение (3) и предполагая, что интенсивность флюоресценции А№ в присутствии свернутого и развернутого 8сΡν линейно зависит от температуры (т.е. 1Р=11+12Т и 1и=13+14Т), получим следующее уравнение:
Чтобы получить конечное уравнение, пригодное для подстановки данных, подставляем уравнение (2) для АС| о(Т) в уравнение (5), предполагая, что АСр° не зависит от температуры и пропорциональна разнице доступной для растворителя площади поверхности в свертутом и развернутом состояниях (Иауше & Рпеге, РтоЮпз: 81гис1. Рипе!. Сепе!. 16: 115-140 (1993); Муегз е1 а1., Рто!ет 8с1. 4: 2138-2148 (1995)).
Измерения термостабильности, полученные разными способами (способом И8С и способом измерения флюоресценции А№), для всех 8сΡν дают сравнимые результаты. Развертывание каждого 8сΡν необратимо, следовательно, агрегация влияет на абсолютное значение ТМ, полученное способом И8С или связывания А№. Так как нагревание образца в обоих экспериментах происходит по-разному и с разными скоростями, значения ТМ, полученные в разных экспериментах, не могут быть полностью идентичны (8апс11ех-Яш/ е1 а1., ВюсйетЛзйу, 27:1648-1652 (1988)). Однако тенденция, наблюдаемая для каждой экспериментальной техники, была идентична (см. табл. 13). ДСКэксперименты легко разделили переходы развертывания Ун и Уъ. Эксперименты по А№-связыванию не могли точно дискриминировать 2 перехода (т.е. Ун против Уъ - развертывания); таким образом, только кажуцийся ТМ был предоставлен для экспериментов по А№-связыванию. Очевидный ТМ, наблюдаемый в А№-связывании, казалось, коррелировал хорошо с ТМ развертывания последнего домена либо Ун, либо Уъ, в зависимости от мутации, как определено ДСК. Из-за агрегации развернутого материала в обоих форматах анализа Тм использовалась как руководство по оценке порядка повышения стабильности, предоставленной каждой мутацией без дополнительной интерпретации 8сΡν свободных энергий разворачивания и т.д.
- 114 015992
Таблица 13
Измерения термостабильности каждого зсΕν
Конструкт νΗτΜ (°С ДСК) Ч.тм (°С ДСК) νΗ Тм (°С ΑΝ8) ΒΟΕν Тм (°С ДСК)а 3θΡν Ко (Μ) •10 е (В1асоге )
Дикий тип, (Ο4δ)*3 линкер0 55,4 68,7 65,6 2,7
\М1с14уре, (С43)*4 линкер 57,7 67,4 67,0 2,1
УН_316Е 60,7 68,1 66,76 - 2,0
νΗ_516Ο 59,4 68,4 69е - 1,9
65,6 74,2 71,0 4,0
νΗ_ν55Ο - - 75,4 68,4 2,2
ν^ριοω 71,9 5,2
νΗ_816Ε, Уи_846Ь 71й 74,5й - 72,2 3,4
νΗ_516Ο, νι_346ί 67,9й 74,9й 75,4 - 4,2
νΗ_516Ε, νΗ_ν55Ο, Ук_5461_ 79,3 77,7 3,8
νΗ_516Ε, νΗ_ν55Θ, Ун_Р10Ю, Уи_3461- 84,1 77 81,3 п.с!.
Дикий тип, (С45)*4 линкер νν/νΗ44/νί100 дисульфид 61 68 η.ΰ. 3,3
νΗ_316Ε, У^ЗДбЬ 69 77 η.ό. - 4,0
νΗ_316Ο, 7^8461. η.ΰ. η.ΰ. η.ΰ. η.ΰ. 3,3
а Эти конкретные мутации вели к однократному, кооперативному событию развертывания Ун/УЪ, Ь Все последующие зсΕν были сконструированы с (648)*4 20 аминокислотным линкером.
с Анализ осложнен множественными переходами.
б Невозможно дискриминировать Ун по сравнению с Уь.
Резюме.
Все разработанные отдельные мутации выбрали из библиотечных экранов: Ун 816Е, 8160. У556, Р10ГО и УЪ846Ь значительно стабилизировали Ун домен и в некоторых случаях также Уь домен (фиг. 69). Объяснение, почему на предмет повышения стабильности исследовали эти положения, часто возникали на основании различных форм анализа. Консенсусные способы спрогнозировали, что все мутации Ун 816Е, 8160. У556, Р101Э и Уь 846Ь стабилизируют ВНА10 зсΕν (пример 3). Однако Ун У556 и Р10Ш (случайно оказались две наиболее стабилизирующих мутации) помещены в СЭЯ2 и СЭЯ3 Ун, и соответственно, ранее их не рассматривали для мутагенеза, пока не были получены другие прогностические критерии, позволившие предположить, что мутация в этих двух положениях могла привести к стабилизирующим событиям. Ковариационный анализ также спрогнозировал стабилизирующий характер Ун У556 и Уъ 846Ь. Наконец, стабилизация Ун Р101Э и Уъ 846Ь была спрогнозирована на основании состава области контакта очень устойчивого человеческого антитела (пример 3).
Отдельные мутации в Ун/Уь области контакта увеличили стабильность обоих доменов, в то время
- 115 015992 как мутации УН вне области контакта стабилизировали только непосредственно УН домен. УН 816Е, 8160 и У55С были вне области контакта и увеличили очевидный ТМ УН ВНА10 на 3, 2 и 11°С соответственно. Стабильность Уъ была относительно не затронута этими мутациями. УН мутация У55С, казалось, увеличила стабильность УН, в соответствии с Уъ доменом, не приводя к заметному увеличению стабильности Уъ. Обе мутации в области контакта УН Р101И и Уъ 846Ь значительно увеличили стабильность обоих доменов. Мутация Р101И в особенности привела к полностью совместному разворачиванию УН и Уь доменов, предполагая, что область контакта и кооперативность сворачивания между УН и Уъ была значительно усилена. Таким образом, мутации в УН/Уь области контакта могут обеспечить самые эффективные средства формирования стабилизированной Ρν области, которая и объясняет то, что оно расположило по приоритетам проекты стабильности к УН/Уь области контакта ксРук по дизайнам, направленным на остатки вне области контакта Ρν.
Объединение мутаций УН в конечном счете привело к разъединению между кооперативностью УН/УЪ разветывания (табл. 13). Поскольку ТМ УН поднялась выше 75°С (результат комбинаций мутаций Ун), Тм Уь начал двигаться к более низким температурам. Это позволяет предположить, что гиперстабилизация УН домена без построения компенсационных мутаций в Уъ домене может привести к уменьшенной кооперативности свертывания и ослаблению взаимодействия между двумя доменами. В то время как Тм Ун и Уь доменов (включая ТМ дикого типа ВНА10 ксРу) были часто весьма различны, свидетельство, что мутации в области контакта между двумя доменами могли стабилизировать оба домена, одновременно позволяет предположить, что два домена взаимодействуют на некотором уровне друг с другом - хотя кажущееся сродство между изолированными доменами, как ожидают, не будет чрезвычайно высоко, кроме, возможно, УН Р101И стабилизированного варианта (Вгапб!к & Ып, Биохимия, 29:6927-6940 (1990)).
Увеличение стабильности ксРу привело к уменьшению связывания гидрофобного флуоресцентного красителя А№ при температуре среды (15°С, фиг. 72, 73). Дикий тип ксРу слабо связывается с А№, предполагая, что белок может постоянно или временно подвергать гидрофобную площадь поверхности воздействию растворителя. Стабилизированная ксРу, казалось, полностью потеряла способность связывать А№ в условиях окружающей среды - флюоресценция А№ в присутствии большинства стабилизированных ксРу была не больше чем у одного только А№ в растворителе. Графики УН_ТМ (измеренный ДСК или температурно-зависимым экспериментом по А№ связыванию) против А№ - флюоресценции в присутствии свернутого белка при 15°С демонстрирует, что ксРу-зависимая флюоресценция А№ уменьшается при увеличении стабильности ксРу (фиг. 72, 73). Снижение А№-связывания под действием ксРу стабилизации может указать, что менее гидрофобная площадь поверхности подвергается воздействию растворителя и что у стабилизированной ксРук может быть более низкая склонность к агрегации.
Измерения Кс различных индивидуальных и объединенных стабилизирующих ВНА10 ксРу мутаций были выполнены с использованием поверхностного плазмонного резонанса (8РВ) на устройстве В1асоге 3000. Табл. 13 показывает результаты анализа сродства на В1асоге. Обязательное сродство варианта ВНА10 ксРук колебалось от 1Х-2,5Х родительского ВНА10 ксРу.
Пример 7. Продуцирование стабилизированных биоспецифических антител Геркулес.
Как обычная ВНА10 ксРу, так и стабилизированная ВНА10 ксРу изобретения использовались, чтобы построить группу биспецифических антител, называемых Геркулес. Геркулес биспецифичные антитела включают слияние химерных 14А2 ^С антител, которые связываются с ТВАГЬ В2 рецептором и с ВНА10 ксРу, который связывается с ЬТЗВ. Геркулес антитела были построены оба как N и С-концевые ВНА10 ксРу химеры (см. фиг. 20). ^концевые ксРу химеры могут быть спроектированы как легкая цепь и/или гибридизация тяжелой цепи (Н.-Геркулес или ^-Геркулес соответственно). Решение, какую из аминотерминальных У областей (тяжелой или легкой) отобрать для того, чтобы присоединить к ксРу, прежде всего, определяется тем, какая цепь может распознать первый антиген мишени, не влияя заметно на связывание РаЬ домена к второму антигену мишени.
Можно также с использованием способов изобретения, описанных в этом изобретении, спроектировать четырехвалентное или биспецифичное антитело, состоящее исключительно из стабилизированных ксРу, гибридизованных непосредственно с окраинными областями антител или с СН2 или СН3 доменами, как показано, например, в фиг. 57-64. Указанное антитело может включать области Рс полной длины (см., например, фиг. 61), или СН2-бездоменные области Рс (см., например, фиг. 57). В других примерах осуществления два или более стабилизированных ксРу домена могут быть гибридизованы к тому же самому окончанию тяжелой или легкой цепи (см., например, фиг. 58).
А. Конструирование Н (-Геркулес с ВНА10 обычной (С48)4, УН44:УЪ100 и УН44:Уъ100/(С1у48ег)4 ксРук.
Дизайны четырех анти-ЬТЗВ (ВНА10) х анти-ТВАШ В2(сЫ14А2) биспецифических антител были основаны на добавлении обычного варианта и ВНА10 ксРук к окончанию аминоконца анти-ТВАГЬ В2 тяжелой цепи антитела. ВНА10 ксРук ДНК, описанные в примере 3, использовались, чтобы построить группу N ,-Геркулес биспецифических антител ПЦР амплификацией, используя инициаторы олигонуклеотида, описанные в табл. 14. (С1у48ег)5 линкер использовался, чтобы соединить ВНА10 ксРук со зре
- 116 015992 лым окончанием аминоконца сй114А2 тяжелой цепи. Первые 5' праймеры ПЦР Ун (ксЕуВНА10-Е1) включают М1и I сайт эндонуклеазы рестрикции (подчеркнутая последовательность) для клонирования, сопровождаемого кодированием последовательности, последние три аминокислоты тяжелой цепи сигнализируют пептид и аминоконец Ун ВНА10. Два обратных 3' инициатора ПЦР использовались, чтобы произвести продукты ПЦР с внутренним обратным инициатором, кодирующим Χνυθ05-Κ. карбоксиловый конец ВНА10 Уь, сопровождаемый (61у4Зег)5 линкером, и обратный праймер ксЕуВНА10-Я1, кодирующий частичную анти-ТКАГЬ Я2 область Ун и сайт Вд1 II (подчеркнутая последовательность) для клонирования.
Таблица 14
Олигонуклеотиды для ПЦР-амплификации ^Геркулес с обычными (61у4Зег)4, УН44:УЪ100 и Ун44:Уъ100/(61у4Зег)4 ВНА10 ксЕук
8сГуВНА10-Р1 (8Е<2 ГО N0:134) 5- А6АОАОАСОСОТОТССТСТСССАСОТССААСТОСТ6СА 0-3'
ХЖЛЮ5-К. (ЗЕф ПЭ N0:135) 5’- АОССАССТССССССОАТССАССОСССССТОААССОСССС СТССАОАОСССССТССАССООАСССТССАССОССТТТОА ТСТССАССТТО -3'
зсРуВНА10-К1 (8Е0 ЦЭ ΝΟ: 136) 5'- АОАСАОАОАТСТТОАСТОТСТСТССАООСТТСТТСАОСТ САОСТССАОАСТССАССААСТООАТСТОООАОССАССТ СССССССАТССАС-3'
ВНА10 ксЕу+(61у4Зег)5 линкер+частичные анти-ТЯЛI^ Я2 генные последовательности Ун были амплифицированы в двух последовательных реакциях ПЦР через общее кодирование последовательностей перекрывания, кодирующих (61у4Зег)5 линкер, как представлено в фиг. 21, чтобы приготовить обычный ВНА10 ксЕу от ДНК плазмиды рXVυ034, ВНА10 ксЕу (61у4Зег)4 от плазмиды рXVυ002, ВНА10 ксЕу УН44:УЬ100 от плазмиды рШН006 и ВНА10 ксЕуУН44:Уь100/(61у4Зег)4 от плазмиды рШН009. Продукты ПЦР из группы усиленного ВНА10 ксЕук были очищены электрофорезом агарозного геля, используя М1Шроге Ультрасвободный-ЭА котенок извлечения согласно инструкциям изготовителя (Мййроге; Бедфорд, Массачусетс). Очищенные продукты ПЦР были усвоены с М1и !/Вд1 эндонуклеазами рестрикции и лигированы в М1и !/Вд1 усвоенный р№1<С1 вектор, включающий сйН4А2 !дС1, ранее измененный, чтобы удалить внутренний сайт Вд1 II из сйН4А2 !дС1 кодирующей последовательности. Вектор экспрессии млекопитающих р№1<С1 включает ухудшенный по трансляции, модифицированный (включающий интрон) ген неомицин фосфотрансферазы, чтобы выбрать для транскрипционно активных событий интеграции, и мышиный ген редуктазы дигидрофолата, чтобы разрешить амплификацию с метотрексатом (Вагпей, е! а1., Антитело Ехргеккюп и Епдтеейпд. Дтапака, Π.Υ.ν. а. Т., еб), р. 27-40, 0хйогб Ишуегкйу Ргекк, №\у Уогк, №У (1995)). Полученная группа конструктов формирует химерные белки варианта ВНА10 ксЕук к аминоконцу анти-ТЯЛI^ Я2 антитела Ун домена через 25 аминокислотный (61у4Зег)5 линкер. Гибридизация обычной ВНА10 ксЕу генной последовательности с аминоконцом анти-ТКАГО Я2 антитело генной последовательности тяжелой цепи произвело плазмиду рXVυ005. Гибридизация ВНА10 ксЕу(61у4Зег)4 генных последовательности к аминоконцу анти-ТКАI^ Я2 антитело генная последовательность тяжелой цепи произвело плазмиду рXVυ026. Гибридизация ВНА10 ксЕу УН44:УЬ100 генной последовательности к аминоконцу анти-ТЯАI^ Я2 антитело генная последовательность тяжелой цепи произвело плазмиду рXVυ027.
Гибридизация ВНА10 ксЕу УН44:Уъ100/(61у4Зег)4 генных последовательностей к аминоконцу антиТЯАI^ Я2 антитело генная последовательность тяжелой цепи произвело плазмиду рXVυ028. Смеси лигирования использовались, чтобы преобразовать штамм Е.сой, Т0Р 10 компетентных ячеек (корпорация [пуйгодеп, Карлсбад, Калифорния). Е.сой колонии, преобразованные к лекарственной устойчивости к ампициллину, были скринированы на наличие вставок. Секвенирование ДНК подтвердило правильную последовательность заключительных конструкций. Химерная 14А2 используемая легкая цепь распространена среди всех N и С-Геркулес биспецифических антител, и ДНК (ЗЕО ГО N0: 28), и аминокислотные последовательности (ЗЕО ГО N0: 29) показаны на фиг. 23 и 24. Химерная 14А2 легкая цепь экспрессируется с пептидом сигнала в №конец следующей ДНК последовательности аминокислоты: АТССССТОаАСТССТСТСТТСТТСТТСТТТетТСТТСАТТССТСАСбСТСТТТСТСС ш Ν0. 59).
МАУУТР1.ЕЕ1ТУ1НС805Е5 (ЗЕ() ш 60). ’
ДНК тяжелой цепи (ЗЕО ГО N0: 30) и аминокислотные последовательности (ЗЕО ГО N0: 31) для обычного ВНА10 ксЕу N (-Геркулес показаны на фиг. 25 и 26 соответственно. ДНК тяжелой цепи (ЗЕО ГО N0: 32) и аминокислотные последовательности (ЗЕО ГО N0: 33) для ВНА10 ксЕу (61у4Зег)4 Геркулес показаны на фиг. 27 и 28 соответственно. ДНК тяжелой цепи (ЗЕО ГО N0: 34) и аминокислотные последовательности (ЗЕО ГО N0: 35) для ВНА10 ксЕу УН44:УЬ100 ^Геркулес показаны на фиг. 29 и 30 соответственно. ДНК тяжелой цепи (ЗЕО ГО N0: 36) и аминокислотные последовательности (ЗЕО ГО
- 117 015992
ЫО: 37) для ВНА10 ксРу Ун44:Уь100/(С1у48ег)4 Ν-Геркулес показаны на фиг. 31 и 32 соответственно. Каждая из тяжелых цепей экспрессировалась с пептидом сигнала в Ы-конец, включающий следующие ДНК и аминокислотные последовательности:
АтеесттсеАасстсАтспсстсттссттетсбстсттсстАСбсетстсстбтсс (§Ер ш Ν0.61). МбУгеииЛУАУАТВУ^. (8Е? ГО ЫО: 62). ’
В. Конструкция С-ксРу Геркулес с обычной ВНА10 (С48)4, Ун44:Уь100 и Ун44:Уь100/(С1у48ег)4 ксРу.
Четыре дизайна анти-ЬТвК (ВНА10) х анти-ТКА1Ь К2 (сЫ14А2) биспецифических антител были основаны на добавлении обычного ВНА10 ксРу и его варианта к карбоксиловому концу анти-ТКА1Ь К2 антитело тяжелая цепь. ВНА10 ксРук ДНК, описанные в примере 3, использовались, чтобы построить группу С-Геркулес биспецифических антител амплификацией ПЦР, используя праймеры олигонуклеотида, описанные в табл. 15. 8ег (С1у48ег)3 линкер использовался, чтобы соединить ВНА10 ксРук с карбоксиловым концом сЫ14А2 тяжелой цепи. Прямой 5' праймер ПЦР Ун (ХУИ006-Р1) включают ВатЫ1 сайт эндонуклеазы рестрикции (подчеркнутая последовательность) для клонирования, сопровождаемой последовательности, кодирующей фрагмент 8ег (С1у48ег)3 линкерного пептида и аминоконец Ун ВнА10. Обратный 3' праймер ПЦР Уь (ХУИ006-К1) начинает ВНА10 ксРу легкую цепь и включает терминирующий кодон, сопровождаемый ВатЫ1 сайтом (подчеркнутая последовательность) для клонирования. Прямой 5' внутренний перекрываемый праймер ПЦР (ХУН006-Р2) включает кодирование последовательности (С1у48ег)3 линкер и включает молчащую мутацию, указанную жирным шрифтом. Обратный 3' внутренний праймер ПЦР перекрывания (ХУИ006-К2) включает кодирование последовательности (С1у48ег)3 линкера и включает молчащую мутацию, указанную жирном шрифтом, чтобы удалить сайт ВатЫ1, расположенный в ВНА10 ксРу (С1у48ег)3 области линкера.
Таблица 15
Олигонуклеотиды для ПЦР-амплификации С-Геркулес с обычными ВНА10 сопуепйопа1 (С48)4, Ун44:Уъ100 и Ун44:Уъ100/(С1у48ег)4 ксРу
ХЖЛЮ6-Р1 (5ЕрГОЯО:38) 5'- ОСОООТООАТСССОТОСАОООСОСТССООССОТСССОО СТСССАССТССААСТООТОСАОТСТа -3'
χνυοοΰ-Ρ2 (5ΕΟΠ)ΝΟ:39) 5'- ТООССОСООСООСТССООтаОТСОТОСТАО -3'
χψυοοό-Κ2 (8ΕΟ ГО N0:40) 5’- ТАССАССАССАСССЮАССССССОСССССАО -3’
χνυοοβ-κι (5ΕΟ ГО N0:41) 5'- ОТТААСССАТССТСАТТТСАТСТССАССТТ6О -3'
Как показано на фиг. 22, ВНА10 ксРу генные последовательности Ун были амплифицированы в двух последовательных реакциях ПЦР с использованием 5' УнХУи006-Р1+3' УЬХУИ006-К1 РСК набора праймеров и набора внутренних перекрывающихся ПЦР праймеров (ХУИ006-Р2 и ХУЛ006-К2), разработанных, чтобы устранить ВатШ сайт в ВНА10 ксРу (С1у48ег)3 линкерной области. Эти состояния ПЦР использовались, чтобы приготовить обычный ВНА10 ксРу из плазмиды рХУИ034, ВНА10 ксРу (С1у48ег)4 из плазмиды рХУИ002, ВнА10 ксРу Ун44:Уь100 из плазмиды р1Ен006 и ВНА10 ксРу Ун44:Уь100/(С1у48ег)4 из плазмиды р1Ен009. Продукты ПЦР панели амплифицированного ВНА10 ксРу были очищены электрофорезом на агарозном геле, используя М1Шроге и1!га£гее-ЭА набор экстракции согласно инструкциям изготовителя (М1Шроге; Бедфорд, Массачусетс). Очищенные продукты ПЦР были усвоены с ВатЫ I эндонуклеазами рестрикции, и лигированный в ВатЫ1 сайт рЫ5КС1 вектора, ранее спроектированный, чтобы содержать несколько модификаций. Кратко, вектор рЫ5КС1, включающий сЫ14А2 1дС1, был изменен, чтобы удалить терминирующий кодон в 3' концах гена тяжелой цепи, и ввести нуклеотиды для кодирования последовательности аминокислоты 8ег-С1у-С1у-С1у сопровождаемый Ватн1 сайтом эндонуклеазы рестрикции (кодирующего С1у-8ег) для клонирования. Наконец, внутренний нежелательный ВатШ сайт эндонуклеазы рестрикции в сЫ14А2 Уъ область был также устранен.
Полученная группа конструктов формирует химерные белки варианта ВНА10 ксРук к карбоксиконцу анти-ТКА1Ь К2 антитела тяжелой цепи через 16 аминокислотный 8ег(С1у48ег)3 линкер. Гибридизация обычной ВНА10 ксРу генной последовательности с генной последовательностью карбоксиконца антиТКА1Ь К2 антитела тяжелой цепи привела к плазмиде рХУЫ006. Гибридизация ВНА10 ксРу (С1у48ег)4 генной последовательности с генной последовательностью карбоксиконца анти-ТКАЮ К2 антитела тяжелой цепи привела к плазмиде рХУЫ034. Гибридизация ВНА10 ксРу Ун44:Уь100 генной последовательности с генной последовательностью карбоксиконца анти-ТКАЮ К2 антитела тяжелой цепи привела к плазмиде рХУИ035. Гибридизация ВНА10 ксРу Ун44:Уь100/(С1у48ег)4 генной последовательности с генной последовательностью карбоксиконца анти-ТКА1Ь К2 антитела тяжелой цепи привела к плазмиде рХУИ036.
Смеси лигирования использовались, чтобы преобразовать штамм Е.сой, ТОР 10 компетентных яче
- 118 015992 ек (Корпорация Iην^ΐ^οдеη, Карлсбад, Калифорния). Е.сой колонии, преобразованные к лекарственной устойчивости к ампициллину, были скринированы на наличие вставок. Секвенирование ДНК подтвердило правильную последовательность заключительных конструкций. Химерная 14А2 используемая легкая цепь распространена среди всех Ν- и С-Геркулес биспецифических антител, и ДНК (8ЕО Ю ΝΟ: 28), и аминокислотные последовательности (8ЕО Ш ΝΟ: 29) показаны на фиг. 23 и 24. ДНК тяжелой цепи и аминокислотные последовательности ВНА10 ксРт С-Геркулес показаны на фиг. 33 и 34 соответственно. ДНК тяжелой цепи и аминокислотные последовательности ВНА10 ксРт (С1у48ег)4 С-Геркулес показаны на фиг. 35 и 36 соответственно. ДНК тяжелой цепи и аминокислотные последовательности ВНА10 ксРт Уц44:У|,100 С-Геркулес показаны на фиг. 37 и 38 соответственно. ДНК тяжелой цепи и аминокислотные последовательности ВНА10 ксРт Ун44:Уь100/(С1у48ег)4 С-Геркулес показаны на фиг. 39 и 40 соответственно. Резюме по С-терминальным, биспецифическим конструктам Геркулес включается в табл. 16.
Таблица 16
Интермедиаты и плазмиды экспрессии, кодирующие Геркулес
Вектор Композиция Антитело
ρχ\νυοο2 ρΙΕΗ003 + ΒΗΑ10 8οΡν (¢)48)4 линкер ВНА10 зсРу уяЙ1 (648)4 линкер
ρχνυοο5 ρΝ5Κ61 + ΒΗΑ10 зсРу ΝГеркулес ВНА10 зсРу Ν- Геркулес
ρχν/иооб ρΝ5Κ<31 + ΒΗΑ10 ίεΕν С- Геркулес ВНА10 зсЕу С- Геркулес
Ρχ\νυο26 рХУЛЗООЗ + ((348)4 линкер ВНА10 зсРу (648)4 Ν- Геркулес
ρΧΐνυ027 ρΧ\νυ005 + νΗ44:νι,100 ΒΗΑΙ0 зсРу Ун44:УьЮ0 Ν- Геркулес
ρΧ\νυ028 ΡΧνυ005 + Ун44:У1.100/(01у48ег)4 ВНА10 зсРу Ун44:Уь]00/(01у48ег)4 Ν-Геркулес
ρΧλνυο33 МоФйеарХХУиООб Ват ΗΙ зйе гетоуеб ίη 14А2 Уь о£ С- Геркулес
Ρχν/υο34 рХХУООЗЗ + (648)4 линкер ВНАЮзсГу (648)4 линкер СГеркулес
ρχνυο35 рХТООЗЗ + Уи44:У1Д00 ВНА10 зсРу Ун44:У1.100 СГеркулес
рхч/иозб рХЧШОЗЗ + Ун44У1,100/(01у48ег)4 ВНА10 сру Ун44:У|.100/(61у48ег)4 С- Геркулес
С. Временная экспрессия биспецифических антител в клетках СНО.
ДНК плазмиды рХ№И005, рХ№И026, рХ№И027, рХУЕ'028 и рХ№И006, рХ№И034, рХ№И035 и рХ№И036 (табл. 16) использовались, чтобы преобразовать клетки СнО ЭС44 для переходной продукции белка антитела. Каждые 20 мкг ДНК плазмиды был объединены с 4х106 клеток в объеме 0,4 мл 1ХРВ8. Смесь была добавлена к кювете на 0,4 см (ВюЯай) и помещена в лед на 15 мин. Затем клетки электропорировали в 600 иР и 350 Вт с электропоратором Сепе Ри1кег (ВюЯай). Клетки были помещены в СнО88РМ среду, включающую 100 мкМ гипоксантина и 16 мкМ тимидина, в колбу Т-25 и культивировали при 37° в течение 4 дней.
Супернатанты, включающие белки Геркулес, произведенные этой временной системой экспрессии СНО, были собраны и оценены Вестерн-блоттингом. Фиг. 41 показывает, что Геркулес антитела, включающие Уц44:У|.100 (йк=дисульфид) или Ун44:Уъ100/(С1у48ег)4 линкер-стабилизированную ВНА10 ксРтк, резко улучшали выходы экспрессии, независимо от того, был ли ксРт гибридизован К Νη- или Сконец (плоскости 3, 4, 7, 8). Удивительно, никакой секретированный белок не был обнаружен с диким типом ВНА10 ксРт, как и (С1у48ег)4 линкер ВНА10 ксРт химеры Ν-конца, обозначающего преимущество ксРт стабилизации при экспрессии (плоскости 6 и 7). Кроме того, обычный ВНА10 ксРт и (С1у48ег)4 линкер ВНА10 ксРт химеры С-конца показал значительное количество ~55-60 побочных продуктов молекулярной массы, которых было существенно меньше в стабилизированных конструкциях, что позволяет предположить, что ксРт стабилизация может улучшить качество продукта.
Ό. Анализ ЕЫ8А биспецифического связывания.
Супернатанты были проверены на индивидуальную активность связывания с рекомбинантными ТЯАШ Я2 и ЬТ°Я рецепторами в анализах ЕЫ8А.
В обоих анализах рецептор был иммобилизирован на пластины и исследуемые образцы инкубировали, чтобы они могли связаться с рецептором. Связанные образцы были обнаружены маркированным антителом.
96-луночные планшеты для микротитрования Iтти1οη II (Р1кйег, Са! № 14245-61) были покрыты 100 мкл/лунку 2 мкг/мл ЬТвЯЧд в №ьСО3/№1НСО3 буфере с рН 9,5, при 4°С одну ночь и заблокирован
- 119 015992 ны 200-мкл буфером разбавления (0,5% обезжиренное сухое молоко в ΡΒδ плюс на 0,01% тимерозала) 1 час при 37°С. На следующем этапе 100 мкл индивидуального супернатанта Геркулес или очищенного белка в буфере разбавления были добавлены в лунки в двух повторах и инкубировались 1 ч при 37°С. После промывки водой из-под крана 100 мкл 100 нг/мл ТЯЛI^-К2 Рс 6Х-Н1К теговый химерный белок (Η&Ό δуκ!етκ, Μ^ηηеарο1^κ, ΜΝ) был добавлен к колодцам и инкубировался 1 ч при 37°С. После отмывки 100 мкл разбавленного 1/2000 конъюгата Ρеη!а-Η^κ ΗΚΡ Соп)ида!е (О^ОЕХ Сз1№ 34460) было добавлено к каждой лунке и инкубировалось в течение 1 ч при 37°С. После отмывки 100 мкл/лунку Субстрата ΗΚΡΟ совместно с Субстратом Пероксидазы ТМВ/Раствором Пероксидазы В (кббдззгб и Ρе^^у ЬаЬк, Са!. 50-76-00) было добавлено в систему. Реакция была остановлена 100 мкл 2М Η2δΟ4 через 5-10 мин., ΟΌ измерили при 450 нм и 540 нм с помощью планшетного ридера ΜοΕαιΕίΓ Эеуюек. и кривые связывания были получены. Фиг. 42-45 показывают, что Ν-концевые (фиг. 42 и 44) и С-концевые (фиг. 43 и 45) антитела Геркулес, включающие УН44:УЪ100 (бк=дисульфид) или УН44:Уъ100/(О1у^ег)4 линкер-стабилизированную ВНА10 ксЕу. улучшают связывание с ЬТЗК (фиг. 42, 43) и ^ΑΙΕ К2 (фиг. 44-45) соответственно по сравнению с Геркулес, включающим обычный ΒΗΑ10 ксЕу (по весу).
Е. Стабильная экспрессия биоспецифических антител в клетках СНО, очистка и характеризация антител.
ДНК плазмиды рХ\\'иШ. р.Х\\'Е028 и р.Х\\'Е006. р.Х\\'Е0Л и рХνυ036 (табл. 16) использовались, чтобы преобразовать ЭНЕК-дефицитные клетки СНО ЭО44 для устойчивой продукции белка антитела. Инфицированные вирусом клетки были выращены в альфа минус питательной среде ΜΞΜ, включающей 2 мМ глутамина, с 10% диализованной эмбриональной бычьей сывороткой Цпуйгодеп Согрогабоп) с флуоресцентно-мечеными антителами, с использованием способа реитеративной сортировки флуоресцентно меченых клеток (РЛСδ) (Бге/1пкку. е! а1. ί. Iттиηο1 Μе!йοбκ. 277(1-2):141-55 (2003)). РЛСδ также использовался, чтобы произвести индивидуальные линии клетки. Линии и пулы клеток были приспособлены к бессывороточным состояниям и масштабированы для продукции антител.
Супернатанты от трансфицированных клеточных пулов или линий СНО, экспрессирующие 1) Стерминальный Геркулес с УН44:УЪ100 стабилизированной ВНА10 ксЕу и 2) С-терминальный Геркулес с УН44:Уъ100/(О1у^ег)4 линкер стабилизированной ВНА10 ксЕу. так же как клональные линии клетки СНО, экспрессирующие 3) Ν-концевой Геркулес с УН44:УЪ100 стабилизированной ВНА10 ксЕу и 4) Νконцевой Геркулес с УН44:Уь100/(О1у^ег)4 линкер стабилизированной ВНА10 ксЕу, были собраны и очищены на колонке Ρτο^ω Α δерйз^οκе РР (6 мл), используя буфер ΡΒδ с 10-мМ ЕЭ^. Белки Геркулес были элюированы, используя глицин 0,1 М., рН 3,0 и немедленно нейтрализованны к рН 7,5-8,5 с помощью основания Трис. Кроме того, С-Геркулес, включающий обычный ΒΗΑ10 ксЕу, экспрессировался и, после очистки Белком А, его хроматографировали для сравнения. Элюаты Белка А от С-Геркулес, включающие обычный ВНА10 ксЕу, С-концевой Геркулес с УН44:УЬ100 ВНА10 ксЕу, С-концевой Геркулес с УН44:Уь100/(О1у^ег)4 ΒΗΑ10 ксЕу, был исследован на наличие агрегатов аналитической гельхроматографией (фиг. 46). Профиль хроматограммы С-Геркулес, включающей обычный ВНА10 ксЕу, показал ~40%-ные агрегаты. Напротив, С-концевой Геркулес с УН44:УЬ100 ΒΗΑ10 ксЕу уменьшил уровень агрегатов до 20%-ого, дальнейшая стабилизация была достигнута через С-концевой Геркулес с УН44:Уь100/(О1у48ег)4 ΒΗΑ10 ксЕу, уровень агрегатов снизился до 10%. Уровень агрегации, вероятно, зависит от свойств ксЕу, а не от того, была ли молекула прикреплена к ΝΗ- или С-концу 14А2 ^О (данные не показаны). Элюаты Геркулес были далее очищены диализом в ацетат 0,1 М, рН5,0 и очищены Μοποδ (ОЕ Нез1!йсзге) хроматографией катионного обмена, используя идентичный рабочий буфер как диализат. Белки Геркулес были элюированы, используя поэтапный градиент 0,1 М ацетата рН5,0, 0,5 М №С1. Μοποδ элюаты были собраны и пропущены через препаративную колонку δЕС (ТокоНаак), чтобы удалить агрегаты.
Фиг. 47 и 48 показывают гели δ^δ-ΡЛΟЕ очищенного Т-концевого Геркулес с УН44:УЬ100 стабилизированной ВНА10 ксЕу и Νιι-концевого Геркулес с УН44:Уь100/(О1у^ег)4 линкер-стабилизированной ВНА10 ксЕу и С-концевого Геркулес с УН44:УЬ100 стабилизированная ВНА10 ксЕу и С-концевого Геркулес с УН44:Уъ100/(О1у^ег)4 линкер-стабилизированной ВНА10 ксЕу соответственно. Понижающиеся линии показывают ожидаемые размеры белков тяжелой и легкой цепи. Важно, что нет никакого значительного количества деградировавших или нежелательных побочных продуктов малой молекулярной массы, что часто наблюдался с Геркулес, включающим дикий тип ксЕу доменов.
Фиг. 49 (панели А и С) показывает аналитические профили элюирования δЕС ^-концевого Геркулес с УН44:УЬ100 стабилизированной ВНА10 ксЕу и Νι-концевого Геркулес с УН44:Уь100/(О1у^ег)4 линкер-стабилизированной ВНА10 ксЕу соответственно после первоначального этапа очистки белком А. Фиг. 49 (группы В и Ό) также показывает аналитические профили элюции элюирования δЕС ΝΗконцевого Геркулес с УН44:УЬ100 стабилизированной ВНА10 ксЕу и ^-концевого Геркулес с УН44:Уь100/(О1у48ег)4 линкер-стабилизированная ВНА10 ксЕу соответственно после удаления на препаративной δЕС остаточных немономерных белковых примесей. Аналогично, фиг. 50 (панели А и С) показывает аналитические профили элюирования δЕС С-концевого Геркулес с УН44:УЪ100 стабилизированной ВНА10 ксЕу и С-концевого Геркулес с УН44:Уъ100/(О1у^ег)4 линкер-стабилизированной ВНА10 ксЕу соответственно после первоначального этапа очистки белком А. Фиг. 50 (группы В и Ό) также пока
- 120 015992 зывает аналитические профили элюции элюирования 8ЕС С-концевого Геркулес с УН44:УЪ100 стабилизированной ВНА10 зсРу и С-концевого Геркулес с УН44:Уъ100/(С1у48ег)4 линкер-стабилизированная ВНА10 зсРу соответственно после удаления на препаративной 8ЕС остаточных немономерных белковых примесей. Эти исследования демонстрируют, что стабилизация ВНА10 зсРу дополнением либо УН44:УЪ100 дисульфида, либо УН44:УЪ100 (С1у48ег)4 линкера приводит к препаративным количествами> 98%-ный чистого, мономерного биспецифичного антитела Геркулес, который фактически свободен от разновидностей молекулярной массы более высокого порядка.
ДСК исследования, выполненные при идентичных состояниях, демонстрируют, что С-Геркулес УН44:Уь100/(С1у48ег)4 ВНА10 зсРу является более термостойким, чем С-Геркулес, включающий обычный ВНА10 зсРу (фиг. 51). Профиль денатурации для С-Геркулес, включающего обычный ВНА10 зсРу, начинается с ~5°С более низкой температуры, чем профиль, наблюдаемый для С-Геркулес УН44:Уь100/(С1у48ег)4 ВНА10 зсРу. Эти результаты предполагают, что зсРу может ограничить общую термостойкость молекул Геркулес. Это коррелирует с наблюдаемым увеличением 5°С ТМ для УН44:Уъ100/(С1у48ег)4 ВНА10 зсРу по сравнению с обычными ВНА10 зсРу. Очищенные версии стабилизированных конструктов Геркулес были проверены на биспецифическую активность связывания к рекомбинантно полученным ТКАШ-Ю и Ш^К рецепторам в анализе ЕЫ8А. В этом анализе Ш^К Ц рецептор был иммобилизирован на пластины, на которых были затем инкубированы исследуемые образцы, чтобы обеспечить связывание с рецептором. Несвязанные образцы были удалены отмывкой с последующим вторым этапом инкубации с ТКАШ К2-(Н1з) 6. После этапа отмывки дву-связанные комплексы были детектированы с маркированным анти-(Н1з) 6 антителом. Результаты этого исследования и эффективная концентрация (ЕС50, в мкг/мл) для каждого конструкта изображены на фиг. 52. Фиг. 52 показывает, что оба Ν-терминал и С-терминал Геркулес антитела с УН44:УЬ100 (бз=дисульфид) или УН44:Уь100/(С1у48ег)4 линкер-стабилизированной ВНА10 зсРу демонстрируют четкое биспецифичное связывание с обоими ЬТ(К и ТКАШ К2. Многовалентная (пентамерная) версия ^ΤβΚ-связанных антител (СВЕ11) использовалась как контроль, чтобы продемонстрировать, что одиночное распознавание только ЬТ(К не вызывает сигнал в анализе связывания.
Пример 8. Масштабированное производство стабилизированного биспецифичного Геркулес антитела в клетках СНО.
ИНРК-дефицитные линии клеток СНО, устойчиво трансфицированные ДНК плазмиды рXУυ028 и рXУυ036 (табл. 16) скринировались, чтобы выбрать отдельные клеточные изоляты, которые способны к экспрессии высоких уровней солюбилизированных и свернутых должным образом молекул Геркулес, которые были стабилизированы, используя способы изобретения. В способах клеточного скрининга использовались активизированные флюоресценцией клетки, сортирующие (РАС8) анализ Вгехтку и др. (Вгехтку е! а1., 1. Iттиπо1 Ме(й (2003), 277:141-155). Кратко, флуоресцентные теговые анти-Геркулес антитела использовались, чтобы маркировать клетки СНО, показывающие переходную экспрессию Геркулес антител на их поверхности. Клетки, показывающие интенсивную сигнатуру флюоресценции, затем отбирались, так как сортировочный аппарат был настроен на эти подписи. Отдельные клетки, показывающие высокие уровни производительности, были таким образом отобраны и адаптированы к бессывороточным состояниям, чтобы установить устойчивые линии клетки производителя. Линии клетки производителя были впоследствии масштабированы для продукции и очистки биспецифических антителбелковых комплексов.
л Ν-концевого Геркулес, включающего УН44:Уъ100/(С1у48ег)4 ВНА10 зсРу ^УИ028) супернатант после 11-дневной обработки в биореакторе, были собраны и предочищены ультрафильтрацией. Биспецифичное антитело было захвачено хроматографией с белком А и элюировано в объеме 1218 мл. Белковая фракция была далее очищена в двух отдельных партиях способом анион-обменной хроматографии, сопровождаемой предварительной гель-хроматографией. Первая партия выдавала 825,5 мг при концентрации 4,85 мг/мл в РВ8 с чистотой 98,9% и нагрузкой эндотоксина 0,13 ЕС/мг. Вторая партия выдавала 318 мг при концентрации 10,3 мг/мл с чистотой 99,1% и нагрузкой эндотоксина 2,37 ЕС/мг. В общей сложности, удалось получить 1143,5 мг высокоочищенного, мономерного Ν-концевого Геркулес, включающего УН44:Уъ100/(С1у48ег)4 ВНА10 зсРу.
л С-концевого Геркулес, включающего УН44:Уъ100/(С1у48ег)4 ВНА10 зсРу ^УИ036) супернатант после 11-дневной обработки в биореакторе, были собраны и предочищены ультрафильтрацией. Биспецифичное антитело было очищено в два приема, как описано выше при работе с белком А. Хроматография захваченного неочищенного продукта сопровождалась анион-обменной хроматографией и предварительной гель-хроматографией. Первая партия выдавала 985,5 мг при концентрации 13 мг/мл с чистотой 98,5% и нагрузкой эндотоксина 0,01 ЕИ/мг. Вторая партия выдавала 570 мг при концентрации 11,42 мг/мл с чистотой 99% и нагрузкой эндотоксина 1,91 ЕИ/мг. В общей сложности, удалось получить 1555,5 мг высокоочищенного, мономерного С-концевого Геркулес, включающего УН44:Уъ100/(С1у48ег)4 ВНА10 зсРу.
Линия клетки СНО, производящая XУυ054 биспецифичное антитело, была изолирована и, как оказалась, она производила 21,5 мг/л. Это укладывается в ожидаемый диапазон для исследования неампли
- 121 015992 фицированных линий клетки СНО, и авторы изобретения ожидали бы намного более высокую производительность в случае получения линии клеток.
Эти исследования масштабирования изготовления проводились с неамплифицируемыми линиями клетки СНО, и все же заканчивались выработкой более чем 1 г биофизически устойчивых биспецифических антител высокого качества. По-видимому, стратегия амплификации линии клетки очень увеличила бы клеточную производительность трансфицированных линий клетки СНО, позволяя совершенствовать процессы, подходящие для коммерческого применения. Эти исследования иллюстрируют эффективность способов, описанных в этом изобретении для того, чтобы производить масштабируемую продукцию устойчивых биспецифических антител в линии клеток (например, СНО), подходящую для изготовления.
Пример 9. Биологическая активность биоспецифических антител Геркулес.
Линии опухолевой клетки νίΌτ (АТСС ССБ-218) человеческая линия клетки рака толстой кишки, Ме180 (АТСС НТВ 33) человеческая цервикальная эпителиальная линия клетки рака и ΜΌΑ231 (д-р Ба_)ип Уапд, Университет Мичигана) человеческая линия клетки рака молочной железы культивировались в МЕМ-ЕАКБЕЗ с 10%-ым БСЗ, 2-миллиметровым Б-Глутамин, 1Х несущественные аминокислоты, 0,5миллиметровый пируватнатрия, Пенициллин/стрептомицином. Линии опухолевой клетки были промыты один раз с РВЗ, после чего на них подействовали трипсином. Клетки были собраны центрифугированием, ресуспендированы в полных средах, посчитаны и высеяны в 96-луночные культуральные планшеты в концентрации 5000 клеток/лунку для νίΌτ и Ме 180 и клетка/лунку 1500 для ΜΌΑ231. Человеческий ΙΕΝ γ (Вюдеп Иес, Согр) добавлен к суспензиям клетки, заключительная концентрация цитокина 80 ед./мл для νίΌτ и МЭА231 и 50 ед./мл для Ме180. 50 мкл суспензии опухолевые клетки/ΙΕΝγ были смешаны с 50 мкл 2Х, сконцентрированы 3-кратными серийными разведениями исследуемых антител, приготовленных в полных средах. Конечные концентрации исследуемых антител типично колебались от 5000 рМ до 0,07 рМ. Клетки выращивали в течение 4 дней (νίΌτ & Ме180) или 3 дня (МБА231) при 37°С в 5%-ной СО2-увлажненной камере. Клетки убивали добавлением 20 мкл/лунку Рготеда Се11Т11ег 96 АОиеоик Опе Зо1и1юп Се11 РгоШегайоп Аккау реагент Рготеда Согрогайоп, Майкоп, VI). Пластины были прочитаны в спектрофотометре для чтения планшетов в 490 нм (Зресйотах Р1ик, Мо1еси1аг Беу1сек, Зипиууа1е СА). Данные были представлены в виде графика, используя Мкгокой Ехсе1 (Мкгокой 1пс, VΑ).
Результаты этих исследований показаны на фиг. 53-56. Фиг. 53 показывает, что у 14А2 1§С антител была скромная активность по ингибированию роста опухолевых клеток νίΌτ и в комбинации с 1дС ВНА10 было небольшое увеличение активности анти-опухолевой-клетки по сравнению с одним только 1дС ВНА10. Напротив, оба биспецифических Геркулес антитела показали увеличенную способность к уничтожению опухолевых клеток νίΌτ. Фиг. 54 показывает, что оба 14А2 1§С и ВНА10 1§С антитела имели скромную, если не сказать незначительную, активность в ингибировании роста опухолевых клеток Ме180 как отдельные агенты или в комбинации. Напротив, оба биспецифических Геркулес антител показали способность уничтожать опухолевые клетки Ме180. Фиг. 55 показывает, что у 14А2 1§С и ВНА10 1§С антител была незначительная активность в отношении ингибирования роста опухолевых клеток МЭА231 при применении по отдельности и, возможно, некоторая активность в комбинации. Напротив, биспецифичные Геркулес антитела Χνυ036 (конец С-Геркулес с Ун44:Уъ100/(61у4Зег)4 линкер стабилизированная ВНА10 ксЕу) показал уничтожение опухолевых клеток МЭА231. Фиг. 56 показывает, что ни одно из антител не демонстрирует какой-либо активности по отношению к контролю (эндотелиальные клетки человеческой пупочной вены (НиУЕС)), т.е. цитотоксическая активность биспецифических антител не является повсеместной. НиУЕС показывает положительное окрашивание для БТЗК и ТКА1Б-К2 анализом ЕАСЗ (данные, не показанные) указание наличия рецепторов и что активность биспецифических антител может зависеть от триггера и определенных уникальных компонентов в опухолевых клетках.
Пример 10. Исследования стабильности биспецифических антител Геркулес.
Проводились исследования стабильности в реальном времени образцов Ν- и С-концевых биспецифичных антител Χνυ028 (ВНА10 ксЕу УН44:Уь100/(61у4Зег)4 Ν-Геркулес) и Χνυ036 (ВНА10 ксЕу УН44:УЬ100 /(61у4Зег)4 С-Геркулес) хранящихся при 2-8°С в течение трех месяцев. Качество белка оценили для следующих случаев: (1) агрегация, (2) осаждение, (3) распад полипептида или протеолиз и (4) посттрансляционные модификации, такие как деамидирование или окисление.
Высокая и низкая концентрации Ν- и С-концевых биспецифических антител в образцах, используемых для исследований, были Χνυ028 1,8 мг/мл (низко) и 10,3 мг/мл (высоко) и Χνυ036 в 5,0 мг/мл (низко) и 11,4 мг/мл (высоко). Антитела были приготовлены в РВЗ. Для исследования стабильности проанализировали начальный (Т=0), промежуточный (Т=1 неделя, 2 недели, 1 месяц, 2 месяца) и финальный (Т=3 месяца) моменты времени. Кроме того, начальные (Т=0) образцы были заморожены и сохранялись при -70°С до использования во вторичных исследованиях 3-месячного периода. 1дС ВНА10 (8,7 мг/мл) использовался как контроль и был так же обработан.
- 122 015992
А. Анализ агрегации и преципитации белка.
Агрегацию или осаждение белков определяли, используя аналитическую гель-хроматографию ^ЕС), связанную со встроенными датчиками светорассеяния и показателя преломления (Ууай Тесйпо1офек, М|шОа\уп и гЕХ, соответственно). Анализ δЕС/СВЕТОРАССЕЯНИЯ не позволил получить доказательства агрегации или потери материала, которые могли бы происходить при осаждении. Профили элюирования δЕС в начальный, Т=0, и финальный, Т=3 месяца, моменты времени для ХУИ028, Χ\νυ036 и ВНА10 антител были почти идентичны (фиг. 74, 75 и 76 соответственно). ХУЬ028 и Χ\νυ036 образцы оба накопили ~1% агрегированного материала при завершении исследования; однако детекция этих агрегатов была около низкого предела детекции, определенного для этого способа (табл. 17). Формирование агрегатов происходило независимо от концентрации белка. На основании установленных значений молекулярных масс, используя способы детекции светорассеяния, удалось показать, что низкие уровни агрегации в исследуемых образцах вероятно представляют собой продукт преобразования мономеров в димеры. Ни один из образцов биспецифических антител, ХУИ028 или ХУИ036, не накопил поддающиеся обнаружению уровни агрегатов более высокого порядка, даже при том, что этот тип агрегата должен легко наблюдаться указанными способами. ВНА10 антитело не продемонстрировало увеличения агрегатов в течение 3-месячного курса исследования (табл. 17).
Таблица 17
Процент мономеров, определенный способом хроматографии δЕС
т=о Т=1 неделя Т=2 недели Т=1 месяц Т=2 месяца т=з месяца
5ЕОЮ#49 1_о\м 99,0 98,7 98,4 98,3 98,2 97,9
6ΕΩΙ0Ν-49 Н|дГ1 99,1 99,0 98,9 98,6 98,2 98,1
Ι_ονν 98,8 97,5 97,5 97,4 97,2 96,7
ЗЕОЮ№51 Н|дЬ 98,9 98,8 98,7 98,5 98,1 96,7
ВНА10 1дС 97,4 97,5 97,5 97,5 97,3 97,5
В. Исследование протеолиза и посттрансляционных модификаций.
Протеолиз исследуют, используя жидкостную хроматографию δΌδ-РАСЕ и жидкостную хроматографию/массовую спектроскопию (^^δ) интактного анализа по массе (АдПеп! ΕΠ^δΩ ТОР связанный с 1100 АдПеп! 1100 ЬС через область контакта электрораспыления). Для анализа СТРАНИЦЫ δΌδРАСЕ 5 мкг белка были загружены в полосу. Сниженные образцы были препарированы в 1Х буфере образца Трис-глицин, включающем 5% β-меркаптоэтанол. ХУЬ028 и ХУЬ036 не смогли получить доказательства расщепления белка за 3-месячный период хранения при 2-8°С, как определено невосстанавливающим и восстанавливающим анализом δΌδ-РАСЕ (фиг. 77(А и В)). Точно так же ХУЬ028 и ХУЬ036 не позволил получить доказательства более низкой молекулярной массы протеолитических продуктов за 3-месячный период хранения в 2-8°С, как определено анализом ΓΕ^δ (фиг. 78-79).
Посттрансляционные модификации были исследованы с использованием ^С/Μδ. Т=0, Т=1 мес и Т=3 мес образцы были проанализированы в невосстановленной и восстановленной форме.
Восстановленные образцы были приготовлены обработкой в 50 мм ЭТТ/4М гуанидин гидрохлорида в течение 1 ч при 37°С. Буфер НРЬС А состоит из ТРА 0,03% в воде и НРЬС, буфер В включает ТРА 0,025% в ацетонитриле. Скорость потока сохранялась постоянной в 100 мкл/мин. 7,5 мкг каждого образца (восстановленного и невосстановленного) было нанесено на 2,1 х 50-миллиметровые колонки С4 и проанализированы АдПеп! ЕδI-ТΟР. Способ связывать-и-элюировать использовался для невосстановленных образцов, в то время как способ градиента использовался для сниженных образцов. Спектры были получены, используя Аналитика и пакеты программ МахЕп!1, включенных в комплект поставки. Деконволюированные спектры массы ХУЬ028 и ХУЬ036 (высокие концентрации) в Т=0, Т=1 то и Т=3 то показаны на фиг. 78-79. Ни ХУЕ028, ни ХУЬ036 не продемонстрировали каких-либо поддающихся обнаружению изменений в их масс-спектрах, обозначая отсутствие посттрансляционной модификации, которая могла потенциально неблагоприятно повредить функциям или стабильности биспецифичного антитела.
Вместе указанные данные позволяют предположить, что Ы- и С-концевые биспецифичные антитела, включающие стабилизированные ксРν домены, устойчивы при расширенных состояниях хранения,
- 123 015992 такие как требуемые для биологических лекарственных продуктов. Эти результаты особенно приятны, потому что исследования стабильности проводились с N и С-концевыми биспецифичными антителами в простом буфере (РВ8), и не с растворами, препарированными с оптимальными формулировками.
Пример 11. Ш νί\Ό фармакокинетическая активность и сывороточная стабильность биспецифичных Геркулес антител.
Однократная инъекция 10 мг/кг (1 мг/мл) ^концевого Геркулес (ХУЬ028) или С-концевого Геркулес (ХУи036), разбавленного в забуференном фосфатом РВ8, было введено интраперитонеально самцам мышей СВ17-8сИ. Мышей умерщвляли в 0, 0,5, 2, 6, 24, 48, 72, 96, 168, 240 и 336 ч после инъекции, в каждый момент времени для каждого биспецифичного антитела использовалось по три мыши. Образцы сыворотки были подготовлены к анализу методом ЕЫ8А, чтобы определить количественно уровни биспецифичных антител. Чашки ЕЫ8А были покрыты козьим-античеловеческим Ι§6, заблокированным с РВ8/1%В8А; сыворотка, включающая биспецифичные антитела, была последовательно разбавлена в РВ8/1%В8А и добавлена к чашкам для инкубации. Захваченные антитела были обнаружены с козьимиантичеловеческими каппа нЯР-связанными антителами. Результаты фармакокинетического исследования показаны в табл. 18. У конца ^Геркулес (ХУЬ028) есть период полураспада элимирирования (ΐ1/2) 10,3 дней с пиковой серологической концентрацией 85,67 мкг/мл. У конца С-Геркулес (ХУЬ036) более длинный период полураспада элиминирования (ΐ1/2) 15,1 дней с пиковой серологической концентрацией 105,67 мкг/мл. У обеих молекул есть подобные объемы распределения (Уб), хотя эти значения не были отрегулированы для биопригодности.
Таблица 18
Фармакокинетические параметры
Параметр Единицы Ν-концевой Геркулес (ХШиО28), значение С-концевой Геркулес (хшиозб), значение
Т1/2 ч 247,9386 362,3607
Стах мкг/мл 85,67 105,67
ν<Γ Ь/кг 0,1707 0,1748
сГ мл/мин/кг 0,008 0,0056
Образцы сыворотки были также проанализированы в биспецифичном ЕЫ8А связывании, описанном в примере 7. В этом анализе серологические образцы, включающие конец ^Геркулес (ХУЬ028) или С-конец Геркулес (ХУи036), описанные выше, были исследованы на биспецифичную обязательную активность к рекомбинантно полученным ТЯ^Ь-Я? и ЬТЗЯ рецепторам в анализе ЕЫ8А. Фиг. 80 и 81 показывают, что серологические образцы от мышей, получавших N и С-концевой Геркулес, содержат антитела, которые биспецифично связываются с обоими ΤЯАI^-Я2 и ЬТЗЯ и близко соответствуют профилям элиминирования, наблюдаемым в исследовании РК, указывающем, что биспецифичные антитела остаются интактными при физиологических состояниях для расширенных промежутков времени.
Пример 12. Ιϋ νί\Ό биологическая активность биспецифичных антител Геркулес.
(А) Ш νί\Ό биологическая активность биспецифичных антител Геркулес на модели рака толстой кишки.
Клетки рака толстой кишки человека \УЮг (2х10Е6 клеток на мышь) были внедрены подкожно в 125 атимических голых мышей. Опухоли выращивались до тех пор, пока они не достигли приблизительно 100 мг, в этот момент в общей сложности 70 мышей были отобраны для исследования, разделенного на 7 групп по 10 мышей. Ι₽ лечение было введено, начиная с 13 дня постимплантаций, следующим образом: Группа 1=апирогенный РВ8; Группа 2=СВЕ11, 2 мг/кг, 1х/неделя; Группа 3=НВнА10, 2 мг/кг, 2х/неделя; Группа 4=сН14А2, 2 мг/кг, 2х/неделя; Группа 5=Геркулес-ХУи028, 2 мг/кг, 1х/неделя; Группа 6=Геркулес-ХУи036, 2 мг/кг, 1х/неделя; Группа 7=НВнА10+сЬ14А2, 1 мг/кг каждый, 2х/неделя. Весы тела, размеры опухоли регистрировались каждые две недели. Исследование было закончено, когда средний размер опухоли группы носителя достиг приблизительно 2000 мг. Объем опухоли был вычислен с использованием формулы: (ЬхУ2/2). Временные исследования мышей относились с ХУЬ028 и ХУи036, показал значительную активность анти-опухоли (р<0,001) для обоих биспецифичных антител по сравнению с носителем-контролем РВ8 (фиг. 82).
В случае ХУЬ028 значительные анти-канцерогенные-эффекты (р <0,05) наблюдались по сравнению с ответами на лечение только 11ВИА10 или сН14А2 тАЬ. Для ХУЬ036 значительный антиканцерогенный эффект (р <0,05) наблюдался по сравнению с ответом на действие сН14А2 тАЬ и, в осо
- 124 015992 бенности, наибольший значимый ответ (р <0,01) по сравнению с 11ВНЛ10 тАЬ. Важно, что биспецифичное антитело показало превосходную ш νίνο активность против опухоли, хотя вводилось оно только один раз в неделю. В связи с этим предполагается, что повышение стабильности, описанное в настоящем изобретении, приводит к улучшению свойств антитела и физической стабильности при физиологических состояниях.
(В) Ш νίνο биологическая активность биспецифичных антител Геркулес на опухолевой модели рака молочной железы.
Клетки карциномы молочной железы человека МОА-МВ-231 были введены подкожно в 135 атимических голых мышей (2х10Е6 клетки на мышь). Опухоли были выращены до дня 13, после чего 75 мышам с опухолями среднего размера, приблизительно, 168 мг было назначено лекарство (группа лечения, N=10) и носитель в качестве контроля (N=15). Мыши получали антитела и носитель, начиная с дня 13. Группы показаны следующим образом: Группа 1=апирогенный РВ8; 1х/неделя; Группа 2=11ВНЛ10. 2 мг/кг, 2х/неделя; Группа 3=с1114А2. 2 мг/кг, 2х/неделя; Группа 4=Геркулес-Х^И036, 2 мг/кг, 1х/неделя; Группа 5=11ВНА10+с1114А2. 1 мг/кг каждый, 2х/неделя. Массы тела и размеры опухолей регистрировались каждые две недели. Исследование было закончено, когда средний размер опухоли группы носителя достиг приблизительно 2800 мг. Объем опухоли был вычислен по формуле (Ьх^2/2). Х^И036 продемонстрировал статистически значимую (р<0,001) активность против опухоли по сравнению с любым отдельным 11ВНЛ10 или С1114Л2 тАЬк или со смесью двух антител. Важно, что биспецифичное антитело Х^И036 продемонстрировало хорошую противоопухолевую активность 1п νίνο при введении раз в неделю, схема дозирования предполагала, что усиление стабильности, описанное в этом изобретении, приводило к улучшению свойств антитела и физической стабильности при физиологических состояниях (см. фиг. 115).
Пример 13. Получение стабилизированного биспецифичного антитела Геркулес, включающего нековалентные стабилизирующие мутации ксРу.
ВНА10 ксРук изобретения, включающие одни только нековалентные стабилизирующие мутации, а также совместно с дисульфидным мостиком УН44-УЪ100, использовались, чтобы построить стабилизированные биспецифичные С-Геркулес антитела, включающие гибриды химерных 14А2 ^С антител, которые связывают ТВАГО В2 рецептор с ЬТЗВ. Биспецифичные антитела были построены как С-концевые ВНА10 ксРу химеры, используя способы, как описано в примере 7.
А. Конструирование С-Геркулес биспецифичных антител с ВНА10 УН 816Е+Уь846Ь и УН44Уь100/Ун 816Е+Уъ 846Г ксРук.
ПЦР использовалась, чтобы амплифицировать вариант ВНА10 ксРу фрагмента гена из ДНК плазмиды рШН-050 (родительская плазмида у плазмиды высокой экспрессии рШН076) и рШН-052 (родительская плазмида у плазмиды высокой экспрессии рГЕН080), включающей ВНА10 816Е+Уъ 846Ь и УН44-УЪ100/УН 816Е+Уъ 846Ь ксРук соответственно, используя праймеры олигонуклеотида, описанные в табл. 19. Вариант ВНА10 ксРу генных фрагментов был изолирован на геле. Из-за сайта ВатШ в области линкера плазмиды рШН-050 и рШН-052 генные фрагменты были усвоены с рРиМ I и Крп I эндонуклеазы ограничения и лигированы к модифицированной плазмиде р№КС1, усвоенной с теми же самыми эндонуклеазами ограничения, заканчивающимися продуктом гибридизации стабилизированной анти-ЬТВВ (ВНА10) ксРук к карбоксильному концу анти-ТВА1ЬВ2 (14А2) СН3 домена антитела через 16 аминокислотный (С1у48ег)3 линкер. Правильные последовательности были подтверждены секвенированием ДНК.
Таблица 19
Олигонуклеотиды для амплификации ПЦР ВНА10 УН 816Е+Уъ846Ь и Ун44-Уъ100/Ун 816Е+Уъ846Ь ксРук
ρχχνυοοό-π (8ЕЦ10 N0:56) 5'бСОООТСОАТССООТСОАОООСОСТССбОСООТООСОО ОТСС САОСТССААСТООТОСАОТСТС -3’
χ\νυοο6-κι (8Е(? Ιϋ N0:57) 5’- ОТТААСООАТССТСАТТГОАТСТССАССТТОС -3’
Гибридизация ВНА10 ксРу Ун 816Е+Уъ 846Ь генной последовательности с карбоксильным концом анти-ТВАГБ В2 генной последовательности тяжелой цепи антитела позволила получить плазмиду РХ^И054. Гибридизация ВНА10 ксРу Ун44-Уь100/Ун 816Е+Уь 846Ь генной последовательности с карбоксильным концом анти-ТВАГБ В2 генной последовательности тяжелой цепи антитела позволила получить плазмиду РХ^И055.
Смеси лигирования использовались для трансфицирования 10 самых компетентных клеток штамма Е.со11 (Iπу^!^οдеπ Согрога!юп, Саг1кЬаб, СА). Колонии Е.соН, трансформированные в устойчивые к ампициллину, скринировались на наличие вставок. Секвенирование ДНК подтвердило правильную последовательность заключительных конструкций. Химерные 14А2 ДНК легкой цепи (8ЕО ГО N0: 28 8Е0) последовательности аминокислоты и (8Е0 ГО N0: 29 8Е0) показаны на фиг. 23 и 24. ДНК тяжелой цепи (8Е0 ГО N0: 52 8Е0) последовательности аминокислоты и (8Е0 ГО N0: 53 8Е0) для С-Геркулес ВНА10 ксРу Ун 816Е+Уъ 846Б биспецифичных антител показаны на фиг. 83 и 84 соответственно. ДНК тяжелой
- 125 015992 цепи (8ЕЦ ГО 8ЕЦ ΝΟ: 54), аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО ΝΟ: 55 8ЕЦ) для С-Геркулес ВНА10 ксРу νΗ44-νΣ100/νΗ 816Е+Уъ 846И биспецифичного антитела показана на фиг. 85 и 86 соответственно.
С тяжелыми цепями использовался тот же сигнальный пептид, что и раньше.
В. Стабильная экспрессия биспецифичного антитела в клетках СНО, очистка и характеризация антитела.
ΏΗΡ^ дефицитные линии клетки СНО, устойчиво трансфицированные с ДНКплазмиды рХЛИ054 и рХЛИ055 и приспособленные к бессывороточным условиям, были исследованы на предмет продукции биспецифичного антитела и очищены, как описано в примере 8. Белковые элюаты супернатантов, включающие С-Геркулес с νΗ стабилизированная 816Е+Уь 846Ь ВНА10 ксРу и С-биспецифичным антителом со стабилизированной Уц44-У|.100/Уц 816Е+Уь 846Ь ВНА10 ксРу, были исследованы на наличие агрегатов способом аналитической гель-хроматографии (фиг. 87). Профиль хроматограммы С-Геркулес, включающей обычный ВНА10 ксРу, показал ~40%-ные агрегаты. Напротив, С-концевой Геркулес с νΗ стабилизированным 816Е+Уъ 846Ь ВНА10 ксРу значительно восстанавливал количество агрегатов до уровней, сопоставимых с наблюдаемыми для стандартных ЦС.
Фиг. 88 и 89 показывают гели 808-РАСЕ очищенного С-концевого Геркулес с νΗ 816Е+Уь 846Ь ВНА10 ксРу и С-концевого Геркулес с νΗ44:νΣ100/νΗ 816Е+Уь 846Ь ВНА10 ксРу соответственно. Уменьшенные полоски показывают ожидаемые размеры белков тяжелой и легкой цепей. Важно, что нет никакого значительного содержания нежелательных или деградировавших побочных продуктов меньшей молекулярной массы, которые часто наблюдались с Геркулес, включающей дикий тип ксРу доменов.
Фиг. 90 и 91 показывают аналитические профили элюирования 8ЕС С-концевого Геркулес с νΗ 816Е+Уь846Ь ВΗА10 ксРу и С-концевого Геркулес с νΗ44:νΣ100/νΗ 816Е+Уь 846Ь ВНА10 ксРу, соответственно, следующих за начальным белком этапа очистки белков. Эти исследования демонстрируют, что стабилизация ВНА10 ксРу введением только νΗ 816Е+Уъ 846Ь мутаций и в комбинации с дисульфидными результатами νΗ44:νΕ100 привела к получению в препаративных количествах > 98%-ого чистого, мономерного Геркулес биспецифичного антитела, которое свободно от молекул большего молекулярного веса.
Пример 14. Биологическая активность биспецифичного антитела Геркулес, включающего нековалентные стабилизирующие мутации ксРу.
Ф уйго биологическая активность С-концевого Геркулес с νΗ 816Е+Уь 846Ь ВНА10 ксРу (ХЛИ054) и С-концевого Геркулес с У..44:У 100/ν. 816Е+Уъ 846Ь ВΗА10 ксРу (ХЛИ055) была исследована в анализе пролиферации опухолевой клетки, как описано в примере 7.
Результаты этих исследований представлены на фиг. 92, 93. Фиг. 93 показывает, что у 14А2 ЦС антитела была умеренная активность ингибирования роста опухолевых клеток ЛГОт, и в комбинации с ЦС ВΗА10 оно показало небольшое увеличение противоопухолевой активности по сравнению с одним только ЦС ВΗА10. Напротив, оба биспецифичных антитела Геркулес (ХЛИ054 и ХЛИ055) показали усиленную способность к уничтожению опухолевых клеток ЛГОт, сопоставимую той, что наблюдается для молекулы ХЛИ036 (С-концевой Геркулес с Уц44:Ук100/(С1у.18ег),1 линкер стабилизированная ВНА10 ксРу), описанной в примере 10. Фигура 92 показывает, что у 14А2 ЦС и ВНА10 ЦС антител была незначительная активность в отношении ингибирования роста опухолевых клеток МОА231 в случае использования по отдельности и совместно. Напротив, биспецифичные Геркулес антитела (ХЛИ054 и ХЛИ055) показали усиленное уничтожение опухолевых клеток МОА231, сопоставимое наблюдаемому с молекулой ХЛИ036 (С-концевой Геркулес с Ун44:Уь100/(61у48ег)4 линкер-стабилизированной ВНА10 ксРу), как описано в примере 10.
Пример 15. Использование способа дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) для измерения термической стабильности человеческих или гуманизированных последовательностей антител.
Чтобы оценить диапазон стабильности антител, дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) была выполнена на наборе из 17 ВИВ человеческих или гуманизированных антител.
ВИВ антитела были диализированы против 20 мМ цитрата натрия, 150 мМ буфера хлорида натрия при рН 6,0. Диализаты использовались в ячейке сравнения калориметра, чтобы определить базовую линию каждого сканирования антитела. После диализа концентрации ВИВ1-17 были измерены по поглощению при 280 нм (Расе е! а1., Рто!ет 8с1. 4, 2411-2423, 1995). Растворы антитела, используемые для ДСК, были универсально приготовлены в 1 мг/мл, путем разбавления сконцентрированных стоков с их диализатами.
Сканирования выполняли, используя автоматизированный капиллярный сканирующий калориметр (сарДСК, М1сгоса1, ЬЬС). Белковые растворы и растворы сравнения были проанализированы автоматически в 96-луночных планшетах с помощью автоматизированного приспособления. До начала сканирования белков было выполнено 2 с буфером в клетке образца, они использовались для вычитания фона. Отдельное очищающее сканирование было выполнено после каждого белкового просмотра, используя 5%ный Ыс.|шпох. После каждого просмотра инструмент автоматически промывался клетками сравнения и образца с 3Х-2 мл дистиллированной деионизированной Н2О, включающей азид натрия 0,01%. Сканирование выполнялось со скоростью 1°С/мин в режиме обратной связи для улучшения разрешения пиков.
- 126 015992
Диапазон сканирования был 20-95°С. Все 96-луночные платы с белком хранились на инструменте при температуре 6°С.
Данные сканирования анализировали программным обеспечением Опдт, поставляемым производителем. После фоновой экстракции ненулевые базовые линии были скорректированы с использованием полином третьего порядка. Переходы развертывания для каждого домена 1дС1 были обращены заполнением кривых с несколькими пиками в 3 различных переходах.
Рекомбинантные домены 1дС1 и 1дС4 Есу были использованы для идентификации СН2 и СН3 пиков в каждом переходе. Предполагалось, что оставшиеся переходы соответствуют развертыванию фрагмента ЕаЬ антитела. Большая часть фрагментов ЕаЬ 17 антител развертывалась в процессе кажущихся простых переходов со средними точками термического развертывания (ТМ) в диапазоне 57-82°С, в зависимости от уникальных свойств каждого индивидуального Ρν. Только три антитела, В11В15, В1ГВ16 и В11В17 продемонстрировали 4 перехода. Типичный ДСК след ГдС1 показан на фиг. 94. СРтах (т.е. высота ДСК пика) ЕаЬ фрагментов, в целом, значительно выше, чем у доменов СН2 или СН3. Это разумно, с учетом того, что масса белка ЕаЬ антитела в 4 раза больше, чем у доменов СН2 или СН3, и ЕаЬ-участок антитела также включает заполненную площадь поверхности между четырьмя доменами, в отличие от СН2 и СН3 доменов, где каждый переход вовлекает разрушение только одной гомодимерной области контакта. В целом, переходы, наблюдаемые для СН2 и СН3 доменов каждого антитела 1д61, накладывались друг на друга. То же верно и для СН2 и СН3 доменов 3 1дС4. По этим причинам переходы ЕаЬ для каждой молекулы [дС1 или [дС4 были легко идентифицированы. Одно антитело (В1ГВ18) способом ДСК не изучалось. В11В18 экспрессировал плохо и никогда не приводил к растворимому/неагрегированному веществу. Это антитело было включено в анализ последовательности, описанный в примере 16.
Одно из антител, В11В7, было проанализировано для 1дС1 и 1дС4 человека. Очевидные значения ЕаЬ термостабильности В11В7 в 1дС1 и 1дС4 формате, как измерено по средним точкам их тепловых переходов разворачивания (ТМ), были очень похожи (см. фиг. 95). Вариации в константном подклассе домена не влияло на ЕаЬ ТМ или ЕаЬ калориметрическую энтальпию развертывания.
Наложившиеся переходы, соответствующие СН2 и СН3 доменам 1дС4 Ес, встречаются при значительно более низких температурах, чем таковые у 1дС1, и искусственно делают ЕаЬ переходы на ~1-2°С ниже для [дС4. После полной деконволюции переходов 1дС, ЕаЬ ТМ становятся намного ближе, чем в следах ДСК (ЛТМ <1°С). Факт, что ЕаЬ кривые ДСК В11В7 в [дС1 и [дС4 форматах были очень подобны, предполагает, что термостабильность [§С 1 ЕаЬе и 1дС4 ЕаЬе можно сравнивать непосредственно.
ДСК измерения с 17 гуманизированными В11В антителами показывают, что области Еν сильно влияют на очевидную стабильность их соответствующих ЕаЬ. Например, фиг. 96 демонстрирует совсем другие кривые ДСК, полученные для В11В1, В11В4, В11В6 и В11В16. Все четыре антитела - ГдС1 и единственные различия их последовательностей связаны с областью Еν. Величины и положения СН2 и СН3 ДСК переходов всех 17 антител независимы от ЕаЬ, к которому они присоединены (см. фиг. 96). Диапазон ЕаЬ ТМ для лучших 17 антител в табл. 20 был между 57,2 и 81,6°С (+24,4°С), с В11В1, показывающим самую высокую очевидную ЕаЬ стабильность и для В11В17 самую низкую.
Три антитела с самыми низкими измеряемыми значениями ТМ ЕаЬ, В11В15, В11В16 и В11В17, демонстрируют разъединение между доменом, разворачивающим переходы в пределах ЕаЬ (см. фиг. 96 для В11В16'е ДСК кривая). Ожидаемый пик ЕаЬ был расколот на два отдельных перехода. Более низкие переходы ТМ перечислены в табл. 20, но второй переход, который может представлять разворачивание структурной единицы СН1/СЪ, встречался с ТМ 74, 72 и 70°С для В11В15, В11В16 и В11В17 соответственно. В11В18 был включен в исследование как пример антитела, которое не будет экспрессироваться и последовательность νΗ которого значительно отклонялась от консенсуса (см. пример 16).
Исследования ДСК ясно показали, что уникальные свойства индивидуальных Еν-областей могут сильно ослабить очевидные ТМ всей части ЕаЬ антитела. В крайних случаях В11В15, В11В16 и В11В17, очевидные Еν стабильности были достаточно низки, так что разворачивающиеся переходы доменов в пределах части ЕаЬ отделились друг от друга. Чтобы поддержать очевидный отдельный переход для разворачивания всех четырех домен е ЕаЬ, должен существовать минимальный общий предел ТМ (>70°С для [дС1 при состояниях просмотра, описанных здесь), иначе многократные появляются переходы. Было бы удобно назначить низкую температуру, разворачивающую переходы В11В15, В1ГВ16 и В11В17 к Еν и другие, более высокотемпературные переходы, к СН1/СЪ домену. Однако Етеей и сотрудники показали, что разворачивание νΗ/νΣ домена не всегда сопрягается и может зависеть от подкласса, νΗ/νΣ стабильности и Жц/Ж|. взаимозависимости (Етеей е( а1., ί. Мо1. Вю1. 325: 531-553, 2003). Фактически, очень немногие из Жц/Ж|. есЕν конструкций с полученными из консенсуса каркасами показали совместное разворачивание. Поэтому, вероятно, что, как в случае расщепления переходов, сценарий развертывания может быть более осложненным, чем простой раскол в два перехода, представляющий Еν-область и СН1/Съ-области.
Очевидные стабильности, по данным ДСК для В11В7 [§С 1 и 1дС4 ЕаЬ, были очень подобны даже при том, что есть существенные врожденные различия в последовательности СН1 и дисульфидном сцеплении между этими двумя подклассами. Есть много возможных объяснений этого, такие как (1), биофизические свойства Еν устанавливают потолок термостабильности ЕаЬ В11В7 независимо от того, является
- 127 015992 ли Сн1 1дС1 или 1дС4, (2), очевидная стабильность области Сн1/Съ идентична для 1дС1 и 1дС4 или (3), структурная единица Сн1/Сь не разворачивается в пределах периода эксперимента ДСК. Факт, что РаЬ В11В7, развернутый в отдельном ТМ и с подобным калориметрическим теплосодержанием в обоих форматах 1дС1 и 1дС4. предлагает потенциальную зависимость стабильности от Ру, а не константных областей.
Таблица 20 В11В 1д6 РаЬ ТМ-значения, Ун и УК счета и зародышевые последовательности.
1«С РяЬ Тм со να пфдк ласе νΗ зародышевая последФиательн ость* νΗ счет νΗ подкласса счет печет νκ пфдк ласе V, зародышевая последовятел ьность* νκ счет V* Дсч< подкласса счет
ВИВ1 81 6 УН] Х92340УН1 58 8 70 1-1-/-3 1 +3.7 νκι М64855УК1 78 2 80 3+/-3 5 -2 1
ВПВ2 78 5 УН1 Х92340УН1 72 2 70 1+7-3 1 +2.1 νκι М64855УК1 72 8 80 3+/-3 5 -8 5
впвз 78 2 УН) АВ019438УН1 726 70 1+/-3 1 +2.5 УК2 Х12684УК2 82 4 «5 3+/-2 1 -2 9
ΒΙΙΒ4 77 7 УНЗ М99649УНЗ 961 92 2+/-4 5 +3.9 УК2 ΧΙ2684ΥΚ2 83 9 85 3+/-2 1 -1 4
ΒΙΕΒ5 77 1 УН2 Х56365УН4 69« 68 1+/-5 5 +1.7 νκι Х59316УК1 83 0 80 3+/-3 5 27
ΒΙΙΒ6 76 8 УНЗ М99649УНЗ 97 7 92 2+/-4 5 +5.6 νκι Μ64855νΚΙ 77 4 80 3+/-3 5 -2 9
ВПВ7 75 9 УН1 АВ019438УН1 727 70 Ι+/-3 I +2.6 УКЗ Х72812УКЗ 832 84 Ι+/-2 4 -09
ВПВ8 75 6 УН1 Ζ14300ΥΗΙ 58 0 70 1+/-3 1 +2.9 νκι Χ59316νΚ1 798 80 3+/-3 5 -05
ВПВ9 74 7 УНЗ 212358УНЗ 952 92 2+/-4 5 +3.0 νΚ4 ΖΟΟΟ23\7Κ4 88 8 92 6+/-2 6 -3 8
ВПВ10 74 7 УН4 Х56365УН4 69 3 681+7-5 5 +0Λ νκι Х59316УК1 840 80 3+/-3 5 37
ВПВ11 58 1 УН1 АВ019438УН1 71 3 70 1+7-3 1 +1,2 УК4 Ζ00023νΚ4 94 4 92 6+/-2 6 1 8
ВПВ12 71 2 УН1 АВ019438УН1 67 9 701+7-3 1 -2.2 УК4 Ζ00023νΚ4 92 5 92 6+/-2 6 -0 1
ВПВ13 70 8 УНЗ М99657УНЗ 91 1 92 2+7-4 5 -13 УК4 Ζ00023νΚ4 93 1 92 6+/-2 6 05
ВПВ14 70 6 УН7 Ы0057УН7 651 702+7-3 2 -5.1 νκ- - 56 6 -
ВПВ15 68 5 УНЗ М9966ОУНЗ 924 92 2+7-4 5 +03* νκι М64858УК1 81 6 80 3+/-3 5 1 3
ВИВ 16 68 0 УНЗ М99649УНЗ 95 6 92 2+7-4 5 +33* УКЗ Х72812УКЗ «2 0 84 1+7-2 4 -2 1
ΒΙΙΒ17 57 2 УНЗ 100239УНЗ 89 4 92 2+7-4 5 -3.0 УК2 Х63397УК2 84 8 85 3+/-2 1 -0 5
ВПВ18 _с УНЗ М99400УНЗ 80 0 92 2+7-4 5 -123* УК2 Х63397УК2 84 5 85 3+/-2 1 -0«
а ЬеГгаис е! а1., 1999.
Ь Необычные включения/делеции в 0ΌΒ1 или 0ΌΒ2.
с Не экспрессировали 1.
Пример 16. Использование консенсусного подсчета для идентификации вариабельных областей антител с субоптимальной стабильностью.
Консенсусный подсчет использовался как способ идентификации, какое из В11В антител содержало значительно большие количества неоптимальных аминокислот в пределах их областей Ру. Подсчет оценивает относительное отклонение на основании консенсуса Ун и УК последовательностей из-за гиперсоматических мутаций и эволюционных зародышевых изменений. Измерения ДСК для 17 антител использовались, чтобы квалифицировать способность консенсусного подсчета спрогнозировать слабую стабильность антитела.
Набор сравнения каппа последовательностей Ун и УК млекопитающих использовался для опреде ления последовательности консенсуса для подсчета, и индивидуальные частоты аминокислот в каждом положении остатка были собраны, сортированы и отобраны, как описано ранее (Эетагек! е! а1., й. Мо1. В1о1. 335: 41-48, 2004). Наборы сравнения млекопитающих были наивно построены, чтобы включать Угены от различных млекопитающих, чтобы получить разнообразие через эволюционное отклонение между разновидностями. Ун наборов сравнения млекопитающих включает 61 последовательность Ун прежде всего от NСВI и ТЮВ, представляя в общей сложности 17 различных разновидностей. УК наборов сравнения млекопитающих содержат 53 УК последовательностей от 13 различных видов.
Человеческие Ун и УК последовательности для построения набора сравнения (или для использования как исследуемые последовательности) были собраны из базы данных NСВI, используя критерий поиска антитело вариабельной тяжелой цепи человека разумного и антитело каппа вариабельной легкой цепи человека разумного соответственно. В общей сложности 182 последовательности У-гена человека, 114 Ун и 68 УК, были полурандомизированно отобраны из базы данных NСВI для сравнения с Ун и УК базами данных млекопитающих. Распределение подклассов человеческих Ун и УК последовательностей, полученных полуслучайным выбором из базы данных NСВI, выдавало ожидаемое представление подкласса, основанное на естественном зародышевом Ун или УК (Сшдои и др., 1990), предлагающий небольшой уклон в пути последовательности, выбранных из NСВI.
Затем последовательности категоризировали в их индивидуальные вариабельные подклассы доменов (Ун1-Ун7 и УК1-УК4) выравниванием Ο1υκΙη1ν против консенсусных последовательностей подкласса, полученных из Айо'к Ашахтд А!1ак оГ Антитело Аиа!оту \геЬкйе. Подклассы были дополнительно
- 128 015992 подтверждены выравниванием против общественно доступных человеческих зародышевых последовательностей (ЬеГгапс и др., Нуклеиновые кислоты Вез. 27, 209-212, 1999). Не более чем 5 человеческих последовательностей от любого полипоследовательного элемента NСВI были включены в наборы сравнения, чтобы восстановить потенциальный уклон, созданный более важными наборами или основанный на антигенном использовании У-гена. Сбор последовательности был выполнен наивно; поэтому после группировки подкласса наблюдалось естественное изобилие Ун3 и УК1 последовательностей. Средний счет и стандартное отклонение (описанное ниже и в табл. 20) был вычислен для каждого подкласса, используя 25 Ун1, 3 Ун2, 44 Ун3, 34 Ун4, 5 Ун5, 3 Ун7, 29 УК1, 4 УК2, 19 УК3 и 16 человеческих последовательностей УК4. Только 2 из 18 антител (ВПВ5 и ВИВ14) содержали Ун домены с минимальными группами последовательностей подгруппы (т.е. Ун2, Ун5 или Ун7). Четыре из 18 антител (ВПВ3, ВПВ4, ВПВ17 и ВПВ18) содержали вариабельные домены подкласса УК2, подкласс которого был недостаточно представлен в пространстве последовательностей и точность подсчета которого была плохо определена. Никакие естественные последовательности Ун6 не были найдены в пределах человеческого набора сравнения последовательности Ун. Это не вызывало беспокойства, поскольку ни один из ВИВ антител конструкции не содержал Ун6 домен.
Вариабельные последовательности доменом 18 ВИВ антител и 182 человеческих Ун и УК последовательностей, полученных из NСВI, были подсчитаны против набора сравнения млекопитающих последовательностей антител. Все Ун и УК последовательности был сокращены до СЭВ3 (два остатка после консенсусных остатков ΥΎΟ), чтобы снизить непредсказуемость, вызванную гипервариабельной природой У-(О-) Ι-С объединяющих областей. Частоты остатка (пи®) в каждом положении базы данных млекопитающих были вычислены, суммируя, сколько раз каждая аминокислота (А, С, Ό, ... У, ^, Υ,-) встречается в каждом положении остатка в пределах базы данных, разделенной на общее количество последовательностей. Подсчеты были произведены для каждой человеческой Ун и У исследуемой последовательности, используя следующую формулу:
где с1(г) равняется частоте консенсусных остатков в каждом положении вариабельных баз данных доменов млекопитающих;
й1(г) равняется испытательной частоте остатка каждой аминокислоты человеческой вариабельной исследуемой последовательности домена.
Идеальное консенсусное множество для последовательностей консенсуса млекопитающих баз данных было 104 для Ун и 100 для УК.
A. Случайный подсчет Ун и УК последовательностей с использованием базы данных млекопитающих У-Сепе.
Ун и УК консенсусные последовательности подкласса были подсчитаны против консенсуса базы данных млекопитающих, это показано на фиг. 97(А и С) соответственно. Консенсусный счет Ун3подкласса только на 1 пункт ниже, чем гипотетический идеальный счет консенсуса базы данных млекопитающих, и отличался от него, в общей сложности, тремя остатками.
Таким образом, очевидно, что база данных млекопитающих склоняется к Ун3-подобным последовательностям. Все другие человеческие последовательности консенсуса подкласса Ун подсчитаны также и получили значительно меньший счет. Уклон к последовательностям УК4 наблюдался для баз данных млекопитающих УК (фиг. 97(С)). Человеческие или гуманизированные последовательности ВИВ были проанализированы на основании работы человеческих последовательностей NСВI сопоставимого подкласса. Распределения индивидуального множества последовательностей Ун показано на фиг. 97(В) и распределения счетов индивидуальных последовательностей УК показано на фиг. 97(Ό).
B. Результаты подсчета для ВИВ1-ВИВ18.
Ун и УК счета для всех 18 ВИВ антител были вычислены по сравнению с относительными количествами, полученными из набора сравнения последовательности человека У-депе NСВI (табл. 20). Также в табл. 20 включены различия между счетами У-депе ВИВ и средним счетом подкласса. Это различие между этими счетами использовалось для того, чтобы исследовать потенциальные тенденции стабильности. ВИВ1-18 были маркированы в порядке убывания их взвешенной стабильности ЕаЬ. Подкласс У-депе и ближайшая индивидуальная человеческая зародышевая последовательность для Ун ВИВ и УК генов был определен анализом С1из1а1\У.
Консенсусные счеты были получены для 18 ВИВ антител и сопоставлены с экспериментально определенными ЕаЬ температурными профилями разворачивания. ВИВ антител с самым большим различием между У-депе ВИВ счетом и их средний счетом подкласса (т.е. самым низким счетом последовательностей) были коррелированы с низкими ТМ ЕаЬ, измеренными в примере 15 (табл. 20, фиг. 98). Не было никакой очевидной тенденции, коррелирующей УК множества с ТМ, измеренными ДСК (фиг. 99). Фактически, самый низкий счет УК последовательностей принадлежал ВИВ2, у которого была вторая самая высокая очевидная стабильность ЕаЬ.
Необычные делеции и вставки аминокислот СОВ были найдены в ВИВ15 и ВИВ16, так же как в
- 129 015992
ВПВ18, у которого был худший счет Ун всего ВИВ антител, и никогда не экспрессировался в значительной степени. Счет Ун не предполагал потенциальные проблемы стабильности для ВПВ15 и ВПВ16; однако их ТМ РаЬ были двумя из самых низких проверенных (фиг. 98). ВПВ15 содержал необычно длинный СЭК1 (13 аминокислот в длине и 2 дольше, чем любой Ун3-подобный домен в нашей млекопитающей базе данных млекопитающих, или Ун3 домен в наборе человеческих последовательностей авторов изобретения) и ВПВ16 содержал необычно короткий СЭК2 (15 аминокислот длиной на 1 аминокислота короче большинства других Ун3 СЭК2з в обеих базах данных Ун млекопитающих и набора сравнения человеческого Ун авторов изобретения).
С. Использование небольших баз данных последовательностей млекопитающих для анализа частоты остатков и прогнозирования стабильности ВИВ РаЬ.
Расчет Ун ВИВ доменов против базы данных последовательностей Ун млекопитающих, оказалось, был полезным инструментом для того, чтобы определить избыточность неоптимальных аминокислот каждого Ун домена, который может, в свою очередь, ограничить полную стабильность РаЬ. Счеты были полезны для выбора РаЬ с низкой стабильностью и потенциала для снижения ш νίΙΐΌ долговечности, и увеличения скорости агрегации. На основании уклонов подкласса, наблюдаемых для У-гена баз данных млекопитающих, можно было бы усомниться, не будет ли лучше всего использовать строго базы данных человека У-гена для того, чтобы выполнить консенсусный подсчет, а не на базе данных млекопитающих, используемой здесь. Однако на основании большого количества переменных, определяющих стабильность, которые не отражает счет, такие как точные положения остатка аминокислот неконсенсуса, прочность Ун/Уь взаимодействия, природа У-(О-) 1-С присоединения и уровень гиперсоматических вставок и делеций, трудно предположить, что только человеческая база данных Ун обеспечила бы значительное улучшение. Строго человеческая база данных, используемая для подсчета, может также потребовать, чтобы значительно большее количество последовательностей соответствовало эволюционному разнообразию, наивно включенному в пределах млекопитающей базы данных. Часть данных, которые указывают, что подход млекопитающих работает хорошо, заключается в том, что человеческий консенсус подкласса последовательности Ун отранжирован в порядке возрастания их геномной избыточности и очевидного применения подкласса (Сшдои е! а1., 1990; Теа1е и Мебша, 1992; ТотИпзоп е! а1., 1992). База данных Ун млекопитающих, кажется, правильно взвешивает общие вклады человеческих подклассов Ун. Тот факт, что каждый Ун и УК подкласс консенсусных последовательностей подкласса, в общем случае посчитанных, выше, чем огромное большинство индивидуальных уникальных человеческих последовательностей, и выбранных из NСΒI, предполагает, что база данных млекопитающих захватила консенсусную информацию для всех подклассов, даже при том, что уклон существует к Ун3. Поэтому из-за существования других влияющих на стабильность факторов, которые не включает счет, тенденция, наблюдаемая на фиг. 98, вряд ли улучшится, при тонкой настройке базы данных последовательности Ун, используемой для подсчета.
Необычные вставки и делеции в Ун доменах, кажется, оказывают значительное влияние на стабильность, не отраженную скорингом консенсуса. Необычно длинный (13 аминокислот) СЭК1 ВИВ15 и необычно короткий (15 аминокислот) СЭК2 ВИВ16 - вероятные переносы гуманизации от оригинальной последовательности мыши. Фактически, последовательность Ун ВИВ16 выравнивается очень близко к двум мышиным последовательностям Ун в базе данных млекопитающих у авторов изобретения, которая также содержала 15 аминокислотный СЭК2. Создание необычно маленького СОК для человеческого каркаса, возможно, неблагоприятно повлияет на стабильность этого антитела. ВИВ18 не только показал самый низкий счет Ун всех последовательностей ВИВ, но также и содержал необычно длинный СЭК2 (22 остатка по сравнению с обычными 19 аминокислот). Таким образом, при рассмотрении многократных возможных проблем, связанных с последовательностями ВИВ18, не приходится удивляться, что они никогда не достигнут уровней экспрессии, допускающих что-нибудь другое, кроме чрезвычайно сырых биологических проб с неочищенными супернатантами. Результаты для ВИВ15, ВИВ16 и ВИВ18 предполагают, что необычные вставки Ун или делеции могут иметь больший эффект на термостабильность антитела, чем большинство отдельных точечных мутаций. Исключительно слабое поведение ВИВ 18 не было спрогнозировано с первого взгляда на его последовательность, поскольку его Ру содержал все существенные аминокислоты, строго сохраненные в пределах У-гена складок. Возможность отбраковки проблемных антител является реальным полезным следствием подхода подсчета.
Никакие тенденции не были очевидны, если сравнивать измеренные РаЬ стабильности с УК счетами. Объединение УК счетов со счетами Ун просто снижало тренд, наблюдаемый для одних только счетов Ун. В отличие от результатов подсчета Ун человеческий УК консенсусный счет не соответствовал естественной избыточности УК зародышевых линий и использованию генов (Сшдои е! а1., 1990; Мешб1 е! а1., 1990; Сох е! а1., 1994); даже при том, что консенсусные счеты работают лучше, чем их индивидуальные человеческие последовательности подкласса каппа (фиг. 99). Есть предположение, что эти отклонения от ожидаемого порядка консенсусных счетов УК могут удержать способность баз данных млекопитающих точно спрогнозировать низкую стабильность УК доменов. Кроме того, последовательностей УК2 было недостаточно для того, чтобы определить счет среднего числа подкласса УК2. После того как распределения подкласса были определены для УК последовательностей 68 человек, только 4 оказались последо
- 130 015992 вательностями УК2 (что вполне прилично отражает использование УК2). Даже с этими недостатками УК все еще предполагают, что большее разнообразие последовательности генов Ун может, чаще чем не может, делать Ун домены определяющими стабильность компонентов ЕаЬ (Оетагез! и др., 2006); хотя в литературе доступны примеры противоположного (ЯоШПзЬегдег и др., 2006).
Ό. Зависимость стабильности от Ун или Уъ зародышевых линий и пар Ун/Уь.
Многие из 18 антител содержали перекрывающиеся зародышевые У-гены, чьи СОЯ и гиперсоматические мутации варьируются, и чьи Ун или УК были одинаковыми или различными. Это позволяло сравнить стабильности ЕаЬ антител против индивидуальных зародышевых линий, из которых они были получены. У двух самых устойчивых ЕаЬ, ВПВ1 и ВПВ2, есть те же самые Ун1 и УК1 зародышевые комбинации. Ун и УК соединения, кажется, не имеют ясных свойственных им уклонов, на основании исследовании ЭДш!ег с сотрудниками, но, как полагают, являются рецептор-управляемым (6е ЭД116! и др., 1999Ь). ВПВ1 и ВПВ2 связывают относительно несхожие антигены, ССЬ2 и УъА4; поэтому комбинация либо встречалась случайным образом, или была результатом гуманизации. Наблюдалось ясное изобилие неоптимальных аминокислот в пределах Ун доменов наименее устойчивых ЕаЬ, ВПВ17 и ВП18 (т.е. низкие счеты последовательности и ВПВ18 содержали необычную вставку). Оба этих антитела также содержали те же самые зародышевые УК2, потенциально предлагающие проблемы стабильности белка легкой цепи как основу проблем Ун, определенных подсчетом. Будущее исследование должно определить, был ли этот специфичный УК2 компонентом слабого биофизического поведения этих двух антител. Подкласс УК2 в общем не был связан с плохой стабильностью ЕаЬ, поскольку ВПВ3 и ВПВ4 также содержат ген подкласса УК2. Зародышевое АВ019438Ун1 (ЬеГгапс и др., 1999) неожиданно возникало четыре раза. Значения ТМ для этих ЕаЬ (ВПВ12, ВПВ11, ВПВ7 и ВПВ3) колебались от 71,2 до 78,2. Интересно, их счеты последовательности Ун коррелировали с их кажущимися стабильностями ЕаЬ (ВПВ12<ВПВ11 +ВПВ7-ВПВ3). Положительная корреляция подсчета Ун была также обнаружена в ВПВ1 и ВПВ2 антителах, описанных выше, с той же самой зародышевой Ун1. Очевидная неточность подсчета Ун, однако, была подчеркнута отрицательной корреляцией стабильности, наблюдаемой для ВПВ4 и ВПВ6, оба из которых содержали зародышевое М99649Ун3. В то время как использование Ун зародышевых семейств у взрослых кажется довольно случайным, семейство Ун3 включает большинство представителей у людей. Ун3 или Ун3-подобные гены стохастически чаще появлялись в человеческом наборе сравнения и базе данных млекопитающих. Е\\гег1 и Р1иск!кип'з получили результаты, которые продемонстрировали, что полученная из консенсуса человеческая последовательность Ун3 была самой устойчивой из полученных из консенсуса Ун доменов (Έ\\όγΙ и Р1иск!кип, 2003). Этот результат, возможно, не был полностью неожиданным, так как у подкласса Ун3 есть больше зародышевых последовательностей, чтобы поспособствовать созданию оптимального консенсуса по сравнению с другими подклассами. Полученные данные стабильности показывают, что Ι§6, включающие Ун3 зародышевые линии, в целом, не демонстрируют более высоких значений ТМ ЕаЬ. Ун3 и Ун1 Гены подкласса Ун3 и Ун1 существуют в верхней и нижней частях списка стабильности. В то время как много других факторов способствуют полной стабильности ЕаЬ, особенно свойства УК копий в пределах Εν, можно было бы ожидать тенденцию к более высоким стабильностям ЕаЬ, которые содержат подкласс Ун3 зародышевых линий, если бы Ун3 домены в общем были более устойчивыми, чем другие подклассы. Это, кажется, не является верным, на основании ограниченного количества представленных здесь исследований стабильности.
Пример 17. Анализ ковариаций укладки Ι§ полипептидов.
А. Сбор и фильтрация структур ^-укладки.
Структуры белков ^-укладки или доменов Ιβ-укладки из полидоменных белков были собраны из базы данных А8ТЯАБ, которая включает структуры доменов, соответствующие иерархии 8С0Р. Иммуноглобулин специфичные Ι^-домены были найдены согласно следующим классификациям в пределах иерархии 8С0Р: Все белки бета Подобный иммуноглобулину бета-сэндвич^Иммуноглобулин. Под иммуноглобулином были доступны четыре набора структур: У набор, набор С1, набор С2 и набор Ι. Четырьмя таможенными подлинниками загрузки отдельно управляли, чтобы получить рбЬ файлы классов У-класс, С1-класс, 1-класс и С2-класс, было запущено четыре пользовательских скрипта загрузки.
Как только файлы структуры для каждого подсемейства были загружены, было выполнено некоторое фильтрование, чтобы удалить ошибочно категоризированные, неполные, избыточные или доменобменные структуры (Ьш Υ, е! а1., Рго!ет 8с1. (2002), 1285-1299). Было 4 главных этапа фильтрования, они описаны ниже.
Этап 1. Удаление последовательностей с разрывами.
Структуры от каждого подкласса были визуально осмотрены, используя просмотровую программу 8\\зззРОВ. на предмет разрывов в последовательности (любые неразрешенные удельные веса или отсутствующие секции из-за обмена между доменами). Файлы РОВ дефектных структур были вручную удалены из наборов данных структуры У-, С1-, С2-, Ι-класса.
- 131 015992
Этап 2. Удаление 100% идентичных последовательностей.
Структуры формата РЭВ были преобразованы в аминокислотные последовательности формата ЕАЗТА и отфильтрованы, чтобы удалить любые последовательности, которые были на 100% идентичны оставшимся подпоследовательностям.
Этап 3. Удаление последовательностей неправильной длины.
Структуры РЭВ с ошибочно длинными или короткими последовательностями аминокислот были удалены из наборов данных структуры. Критерии сокращения длины были определены на основании гистограммы всех длин последовательности (фиг. 101). Гистограммы предствалялись соответствующими нормальному распределению. Последовательности за пределами двух допустимых отклонений от среднего были удалены из каждого набора данных подсемейства. Полное среднее количество остатков для суперсемейства иммуноглобулина было 106,10 и допустимое отклонение было 12,19. Следовательно, общие используемые сокращения были <81 и >131 остаток. Распад средних длин допустимых отклонений показан в табл. 21.
Таблица 21
Критерии длин последовательностей наборов структурных данных
Подкласс Средняя длина Стандартное отклонение
С1 99,44 8,79
С2 88,07 15,14
I 95,5 4,94
V 11,95 10,62
Общее 106,10 12,19
Этап 4. Удаление неверно свернутых последовательностей.
Структуры были визуально осмотрены, используя ЗитккРЭВ, на предмет поиска неверного свертывания. Отказались от любых структур, которые не соответствовали двум бета-листовым топологиям бутерброда. Только начиная с пяти С2-классов, домены были получены из ЗСОР, и после этого 1д-сгибы С2-подкласса более не преследовались. После этого С1-классы стали называться С-классом.
B. Получение выравнивания последовательностей на основании структурного выравнивания.
Для каждого отдельного класса структуры 1д-укладки были наложены друг на друга, используя принцип соответствия вторичных структур (ЗЗМ) в пределах ЗеТгосНпдег к1гис1айдп пакета (см. главную документацию программы ЗеТгосНпдег для инструкций относительно создания суперпозиций). Суперпозиции были выполнены на все ко всем или все к одному основанию. Каждый алгоритм привел к подобным качественным выравниваниям, таким образом все к одному были выбраны для суперположений. Некоторые суперналожения были исправлены, чтобы гарантировать, что основные области каждой структуры были добавлены вместо петель. Суперналожения тогда использовались, чтобы произвести основанные на структуре выравнивания последовательности всего У-класса, Ι-класса, последовательностей С-класса и в пределах каждого структурного выравнивания. Выравнивание каждой последовательности на другой было выполнено с использованием пакета ЗеТгосНпдег, соответствуя аминокислотам от одной последовательности до той из второй последовательности, основанной на самом коротком расстоянии между α-углеродом полипептидной цепи.
C. Конструирование исправленной базы данных последовательностей 1д-укладки.
Некоторые этапы были созданы, чтобы получить исправленную базу данных укладок 1д для того, чтобы вычислить правильную статистику ковариации:
Этап 1. Конструирование профилей НММ.
Три профиля Скрытой Модели Маркова (НММ) были построены, каждый на основании структуры выравнивания последовательности для одного из трех классов 1д-укладки. Профили были созданы пакетом программ НММЕК (версия 1,8), используя команды ИттЬшкГ и ИттеаИЬгаЮ со стандартными выборами. Эти НММ тогда использовались, чтобы обнаружить и выравнять дополнительные последовательности 1д-Ео1й в НОМЕРЕ базы данных, поддержанной в NСΒI.
Этап 2. Поиск ΝΚ с помощью новых У-, I- и С-класса НММ профилей.
Три специфичных для класса НММ использовались, чтобы искать подобные последовательности в местном ΝΚ базы данных. ΝΚ базы данных является большим файлом, включающим ~3 миллиона безызбыточных белковых последовательностей. Для каждого из У-, I, С-классов НММ, НММЕК команда йтткеагей использовалась, чтобы искать ΝΚ. Каждый выход оценил ΝΚ последовательностей их счетами относительно ΝΚ используемый и предоставил информацию о количестве областей, пораженных ΝΚ и положения областей хита в пределах каждого ΝΚ последовательности. Для каждой ^-укладки специфичной для класса НММ ищут ΝΚ последовательностей выше рекомендуемого порога счета критерия
- 132 015992 как кандидаты в члены класса Iд-укладки, чей НММ использовался. Для тех областей хита, которые были подпоследовательностями ΝΚ последовательности, точный ΝΚ хита подпоследовательности был извлечен из полного ΝΚ последовательности, используя пользовательскую программу.
Этап 3. Валидация Iд-укладки с помощью ΡРΑΜ.
ΡРΛΜ - белковое семейство и домен инструмента классификации, созданный и поддержанный \е11соте Тгик! δαι^Γ Ш^йШе (Рш, е! а1., Ыис. Αα6κ. Кек. (2006), 34: Ό247-Ό251), который может быть применен к индивидуальным белковым последовательностям. Инструмент ΡГзт рГаттепГу был применен к каждой последовательности кандидата ^-РоН. полученной на этапе 2 выше, чтобы подтвердить, что оно было правильно классифицировано специфичной для класса ^-укладки НММ, созданным на основании структуры выравниваний последовательности, Iд-клан ΡРΛΜ ХМ представляет У-, Ι, С1-, С2- и менее специфичный ΗΜΜκ, были загружены от веб-сайта ΡРЛΜ. Каждая последовательность из ΝΚ была выиграна ^-кланом НММ, показывая, какхорошо каждая последовательность соответствует каждому ΡРΑΜ ХМ. Последовательности, счеты которых лежат ниже рекомендуемых сокращений (ТС1 - определенный в веб-сайте ΡРΑΜ) для У-, -Ι- или С-классы или были удалены из соответствующих наборов последовательности. Таким образом, кандидатный класс специфичных последовательностей ^укладок, найденный на этапе 2, был сохранен, только если его счета ΡРЛΜ подтверждали свои установки для класса ^-укладки.
Этап 4. Выравнивание новых последовательностей ^-укладок.
Последовательности Iд-укладки, которые перешли от этапа ΝΚ к НММ поискам и которые прошли приведенный выше этап 3, затем были выровнены относительно пользовательского НММ назначенного класса. Так как эти НММ были основаны на тщательных структурных выравниваниях, этот процесс застраховал управляемое структурой выравнивание новых последовательностей. Пакет ΗΜΜΉΚ использовался, чтобы произвести тарз11 выравнивания в Гак!а формате выхода, использовавшемся в Инструменте Ковариации Последовательности, описанном ниже. Выравнивания были также выведены в Стокгольмском формате выхода и осмотрены для неверных и невыровненных последовательностей или которые были упущены. Заканчивающиеся выравнивания, состоящие из оригинальных структурно выровненных последовательностей с добавленными НММ-выровненными последовательности из ΝΚ, содержали следующие количества последовательностей: ~50 000 У-классов; ~10 000 С-классов; ~10 000 Ιклассов.
Этап 5. Удаление избыточных и похожих последовательностей.
Ожидалось, что эти выравнивания будут смещаться к часто наблюдаемым последовательностям, со снижением частоты появления редких последовательностей и последовательным снижением разнообразия последовательности. Например, ожидался большой уклон в У-классе выравнивания последовательности Iд-укладки к мышиной человеческой переменной иммуноглобулина и доменов. Так как сверхпредставление специфичных типов последовательности ограничивает полноценность исследований ковариации, был создан инструмент фильтрования, он снижал избыточность выравнивания. Инструмент использовал новый эвристический алгоритм, чтобы найти последовательности с >80%-ной идентичностью к друг другу, и удалял их из выравниваний, т.е. проценты тождественности были вычислены для всех пар последовательности. Значения идентичности были тогда сгруппированы в группы процента идентичности (т.е. 99%-й бин, 98%-й бин, 97%-й бин и т.д.). Во время сокращения каждого бина последовательности каждого мусорного ведра оценивались, уменьшая счет остатка непромежутка, и тогда их весом последовательности НешкоГГ (НешкоГГ δ и НешкоГГ 1О, ί. Молекулярная масса. Βίο1. (1994), 243: 184-199). После этого этапа остающееся количество последовательностей в каждом выравнивании было: 2 786 Уклассов; 1 587 Ι-классов; и 518 С-классов.
Этап 6. Удаление пробелов и создание окончательного выравнивания.
В окончательных выравниваниях столбцы, которые не соответствовали состояниям НММ профиля, были удалены. Поэтому в то время как многие из последовательностей содержали больше аминокислот, чем заключительная длина выравнивания, длины были сокращены, чтобы избежать вычислений на менее информативных областях промежутка выравнивания. Заключительные количества остатков (включая промежутки) в пределах выравниваний были 144 для У-класса, 60 для Ι-класса и 111 для С-класса.
Ό. Общее описание заключительного выравнивания.
а) У-Класс.
После того как был наложен заключительный 80%-ный фильтр, 2786 последовательностей У-класса могли быть разделены на три категории: (1) вариабельный генный класс мммуноглобулина, 49%, которые включают оба УН и Уъ домена разнообразных иммуноглобулинов; (2) Т-лимфоцитарные гены Укласса Рецептора, 16%, которые содержали гипервариабельный домен; и (3) Другие гены У-класса, 35%. Гены У-класса иммуноглобулина берутся из огромного разнообразия разновидностей в пределах от хрящевой рыбы к приматам. Был уклон к человеческим последовательностям У-класса (537 из 1272 последовательностей). Однако другие позвоночные разновидности были только минимально представлены: мышь (33), корова (5), верблюд (23), лама (31), макака (17), цыпленок (6) и т.д. Т-лимфоцитарный набор рецептора последовательностей был почти как разнообразный в пределах от рыбы примату и не содержал уклон к человеческим последовательностям. Другая категория включала большое количество раз
- 133 015992 нообразных последовательностей без реальных подкатегорий, включающих более чем 1-2% остающихся последовательностей. Другая категория содержала еще более широкое множество разновидностей, включая хордовых животных (прежде всего), хрящевую рыбу, цефалоидов и насекомых.
b) С-Класс.
После того как был наложен заключительный 80%-ный фильтр, 2786 последовательностей У-класса могли быть разделены на три категории: (1) вариабельный генный класс иммуноглобулина, 49%, которые включают оба Ун и Уъ домена разнообразных иммуноглобулинов; (2) Т-лимфоцитарные гены Укласса рецептора, 16%, которые содержали гипервариабельные домены; и (3) Другие гены У-класса, 35%. Гены У-класса иммуноглобулина берутся из огромного разнообразия разновидностей в пределах от хрящевой рыбы к приматам. На подкатегорию иммуноглобулина С-класса не оказал влияние примат или даже млекопитающие последовательности (только 3 человеческих последовательности оставались нефильтрованными: 1дЕ-Сн4, СЬ каппы и СЬ лямбды). Подкатегория МнС также колебалась от хрящевой рыбы приматам, и также показал, что немного склоняет к одной эволюционной группе. Другая категория С-класса содержала много неизвестных белков, очень маленькую подкатегорию различного бета-2пнсгоЦоЬиКпк. и много других белков, которые не наблюдались с частотой, заслуженной подкатегории.
c) 1-Класс.
У 1-класса не было никаких ясных подкатегорий. Титан или подобные титану молекулы обычно неожиданно возникали также, как и адгезия клеток или молекул.
Е. Расчет статистики ковариаций.
Сила корреляции (в терминах φ-значение) и значение (в терминах %2-значения) ковариаций между всеми возможными парами аминокислот в выравниваниях было вычислено на основании признанных в уровне техники способов, но включало следующие изменения: 1) промежутки были включены как различный тип остатка; (2) взвешивание схемы по Хеникову не было выполнено; (3) тождества среднего числа последовательности (8А1) не использовались, чтобы отфильтровать коварьирующие пары; (4) χ2 значения были вычислены, используя основанный на событиях счет (количество возникновений), а не частоты; и (5) о коварьирующих парах не сообщали в соответствии с программой, если они не наблюдались минимальное количество раз. Две группы статистики были созданы, первое (меньший набор) с сокращением случаев до 10 и второй (намного больший набор) с сокращением числа случаев до 6 событий. Способность вычислить эти параметры на любом данном выравнивании последовательности была закодирована в на 1ауа и проверена на 1ауа Кипйте Епдте (ДКЕ) уегкюп 1.4.2.
На основании количества положений в пределах выравнивания и в общей сложности 23 возможных остатка в каждом положении (включая промежутки, В и Ζ неоднозначные остатки), было 2,4 млн корреляций, вычисленных для С-класса, 700 тыс., вычисленных для 1-класса, и 4,1 млн вычислены для Укласса. Фиг. 126 показывает значения φ для У-класса с высокими χ2 значениями, φ оценивает диапазон от -1 до+1. Поскольку положительные значения χ перемещаются от 0 (т.е. к+1), прочность корреляции (т.е. ковариация) между двумя аминокислотами в определенных положениях в пределах увеличений выравниваний. Отрицательные корреляции (т. е. наличие одной аминокислоты на одном сайте в выравнивании, вызывающем отсутствие другой специфичной аминокислоты на втором сайте) увеличиваются по мере перемещения φ в сторону -1. Сокращения для того, что является реальной ковариацией, несколько произвольны, но ковариации со значением χ> 0,5 сильно коррелированы друг с другом. Таким образом, согласно фиг. 126, только 370 из возможных 2,4 миллионов корреляций в пределах С-класса сильны. Однако сообщалось, что корреляции выше 0,3 также важны и увеличивают число положительных корреляций, наблюдаемых для всех трех классов, приблизительно в 10 раз. Эти корреляции представляют очень маленькую, но важную часть набора данных, который используется для дальнейших исследований, генерации белковых проектов или прогнозирования функциональных положений остатка.
Ρ. Валидация статистики ковариаций.
Для валидации сильных ковариаций используется несколько критериев, которые были получены из базы данных 1д-Ро1й, они значительны и значимы, даже если не считать статистической силы, основанной на вычислениях. Первый критерий должен проанализировать, был ли тренд между остатками, которые коварьировали друг с другом и их близостью в 1д-укладках известной структуры. Предыдущие исследования продемонстрировали, что корреляция между коварьированием остатков и их близостью к друг другу действительно существует - хотя они очень слабы - в согласии с нашими результатами. Второй критерий - генерировали ли вычисления ковариации 1д-укладки известные связи между положениями аминокислот, которые, как уже сообщали, существовали в пределах известных субпопуляций 1дукладки. Один четкий пример связан с Ν-концом человеческих/мышиных укладок вариабельной тяжелой цепи 1дС (часть У-класса). Остатки 6-10, как известно, принимают очень специфичные конформации, основанные на сохранении коварьирования пар аминокислот (Έ\\όγΙ 8. и др., Ме11юйк (2004), 24: 184-199). Две из трех пар, о которых сообщают, что коварьирования аминокислот были найдены, характеризуются φ выше 0,3 - много больше очевидного фона набора данных.
- 134 015992
Пример 18. Получение РΚIМΑΤIΖΕ^® р5Е8 четырехвалентного антитела, включающего обычный р5Е8 χΡν.
РΚIМΑΤIΖΕ^® р5Ε8С1 является химерным макака/человек (РΚIМΑΤIΖΕ^®) моноклональным антителом, включающим тяжелые и легкие вариабельные области макаки, гибридизованные с человеческой гамма 1 и константной областью каппы соответственно. РΚIМΑΤIΖΕ^® р5Ε8С1 связывается с человеческим СЭ23, рецептором низкого сродства для ΙβΕίΈχΠΙΙ) (Мауготабк и Сйекоп. 2003. I. С1т. Опсо1. 21:1874; и8 Ра(еп( Αрр1^саΐ^οη 20030059424).
Четырехвалентное РΚIМΑΤIΖΕ^® р5Е8 антитело было построено с использованием подобной стратегии, как это описало в примерах 1-8. РΚIМΑΤIΖΕ^® р5Ε8 χΡν, используемый для того, чтобы строить четырехвалентное антитело, состоит из р5Е8 νΐ, и последовательности области νΗ, привязанных коротким линкером к УЕ^(С1у48ег)3 линкерхориентация νΗ, и описан подробно в примере 19. Правильные последовательности были подтверждены секвенированием ДНК. ДНК плазмиды использовалась, чтобы преобразовать клетки СНО ЭС44 для устойчивой продукции белка антитело. Фиг. 106 показывает последовательность ДНК С-конца тяжелой цепи четырехвалентного РΚIМΑΤIΖΕ^® р5Ε8 антитела с включением обычного χΡν. Фиг. 107 показывает последовательность аминокислоты С-конца тяжелой цепи четырехвалентного РΚIМΑΤIΖΕ^® р5Ε8 антитела с включением обычного χΡν. Фиг. 108 показывает последовательность ДНК РΚIМΑΤIΖΕ^® р5Ε8 легкой цепи. Фиг. 109 показывает последовательность аминокислот РΚIМΑΤIΖΕ^® р5Ε8 легкая цепь.
Пример 19. Получение примитизированных белков р5Е8 χΡν и ΡаЬ.
РΚIМΑΤIΖΕ^® р5Ε8 χΡιέ в обеих ориентациях (Уь линкер (С1у48ег)3 Π νΗ (Уь/Ун) и νΗ линкер (С1у48ег)3 Уъ (νΗ/νΕ)) были субклонированы способом ПЦР-амплификации с использованием плазмид, описанных в и8 патентной заявке 20050163782. Олигонуклеотиды, использованные в конструкции, показаны в табл. 22.
Приматизированные р5Е8 χΡν (Уь/УЩ были получены способом ПЦР с использованием прямого праймера Р5Ε8-V^01Ρ, включающего 29 оснований, кодирующих часть лидерной последовательности дрШ, за которой следуют 15 оснований последовательности, комплементарной гену Ν-конца легкого вариабельного домена р5Е8, и обратный праймер, Р5Ε8-VΗ01Κ, который включает 15 оснований последовательности, комплементарной гену р5Е8 С-конца вариабельного домена тяжелой цепи, за которым следует уникальный смежный сайт рестрикции эндонуклеазы 8а1 Ι (сайт рестрикции эндонуклеазы подчеркнут). Точно так же РΚIМΑΤIΖΕ^ р5Ε8 χΡιέ (УЩУь) был построен способом ПЦР, используя прямой праймер Р5Ε8-VΗ01Ρ, который включает 29 оснований, кодирующих часть дрШ ведущей последовательности, сопровождаемый 18 основаниями последовательности, комплементарной гену р5Е8 вариабельного Ν-концевого тяжелого домена, и обратный праймер, Р5Ε8-V^01Κ, который включает 12 оснований последовательности, дополнительной к р5Е8 вариабльному С-концевому легкому домену, сопровождаемой уникальным смежным 8а1 Ι сайтом эндонуклеазы (сайт эндонуклеазы подчеркнут).
Таблица 22
Олигонуклеотиды для ПЦР амплификации обычного РΚIМΑΤIΖΕ^® р5Ε8 χΡν
Праймеры Последовательность
Р5Е8-УЬ01Р (8Е<2 ГО N0:71) 5’- С0СТ00Т00Т0СС0ТГСТАТА6ССАТА0Т0АС АТССАОАТ6АСС -3’
Р5Е8-УЬ01й (8Е<3 ГО N0:72) 5'- ОТСОТСОАСТГТОАПТССАС -3'
Ρ5Ε8ΎΗΟ1Ρ (8Е<Э П> N0:73) 5’- СОСТОСТСОТОССОГГСТАТАОССАТАОТОАСС ТССАОСТССТаОАО -3'
Р5Е8-УН01К (8Е() ΙΟ N0:74) 5’- ОТСОТСОАСТОАССАОАСОСТОАС -3’
Р5Е8-Ьеа<1егО1 (8ΕρΐΟΝΟ:75) 5'- ООСАТАТОААААААСТ6СТОТТСОСОАТТССОСТО ОТОСТ6ССС7ТСТАТАО -3'
После амплификации ПЦР праймер Р5Н8-Ееабег()1 был добавлен к обеим реакциям для второй реакции ПЦР. Праймер Р5Н8-Ееабег()1 включает уникальный № сайт эндонуклеазы, сопровождаемый 25 основаниями, кодирующими часть Ν-конца дрШ последовательности лидера, сопровождаемой 22 основаниями, комплементарными 5' концам Р5Б8-У, 01Ρ и Р5Ε8-VΗ01Ρ и ПЦР амплифицировали опять. Продукты ПЦР, соответствующие ожидаемым размерам, были растворены электрофорезом агарозного геля, иссечены и очищены с использованием Мййроге ийгаГгее-ΌΑ ехбасбоп кй согласно инструкциям изготовителя (М1Шроге; Бедфорд, Массачусетс). Очищенные продукты ПЦР были впоследствии усвоены с Ме Ι и 8а1 Ι и клонированы в Ме К8а1 Ι сайты модифицированного Е.сой вектора экспрессии, разработанного, чтобы делать рекомбинантную белковую экспрессию под контролем индуцибельного ага С промотора.
- 135 015992
Вектор экспрессии содержал модификацию, кодирующую уникальный Ыбе I, перекрывающую стартовый кодон ВНА10 ксРν. Индивидуальные реакции лигирования были выполнены с каждым из очищенных продуктов ПЦР геля и усвоенным вектором экспрессии, и часть каждой из смесей лигирования использовалась, чтобы преобразовать Е.сой ХЬ1-синее напряжение. Устойчивые к ампициллину колонии скринировались, и анализ сиквенса ДНК подтвердил правильную последовательность конца р5Е8 (УН/УЬ) кодирование р1ЕН-162 и р5Е8 (УЪ/УН) кодирование р1ЕН-163 конструкции. ДНК последовательности аминокислоты и р5Е8 (УЪ/УН) ксРν показаны на фиг. 110 и 111 соответственно. ДНК последовательности аминокислоты и р5Е8 (УН/УЪ) ксРν показаны на фиг. 112 и 113 соответственно.
Для экспрессии обычного р5Е8 ^ν, недавно изолированные колонии штамма Е.сой У3110 (АТСС, Мапаккак, Уа. Са!. № 27325), трансформированного плазмидами р1ЕН-162 и р1ЕН-163, были выращены и любые супернатанты культуры или экстракты периплазмы были препарированы, как описано в примере 4.
РШМАТЕЕО® р5Е8 РаЬ был приготовлен ферментативным усвоением РШМАТЕЕО® р5Е8 1дС после применения способов, описанных в примере 1. Очищенный РаЬ был сконцентрирован к диапазону 2-11 мг/мл. Концентрации РаЬ были определены, используя ε280 нм=мг на 1,5 мл-1-см-1.
Пример 20. Термическая стабильность обычных антител р5Е8 ксРν.
Поскольку была получена очень хорошая корреляция между значениями Т50, полученными способом термической проверки, описанным в примерах 4 и 5, и значениями Т50, расчитанными способом ΩδΟ (г2=0,93). Для определения относительной термической стабильности р5Е8 (УЪ/УН) и р5Е8 (УН/УЪ) ксРу был использован способ термической проверки. Способ термической проверки применялся, как описано в примерах 4 и 5, за искличением того, что для покрытия плат был использован растворимый антиген СЭ23 в концентрации 1 мкг/мл, и концентрация меченых европием антител (Еи-1аЬе11еб ап!1-6 Н1к ап!1Ьобу (Регкш Е1тег, Вок!оп, МА, Са!. № А00109)) была увеличена до 250 нг/мл. Согласно полученным результатам величина Т50 для р5Е8 (УЬ/УН) составляет 38°С, а для р5Е8 (УН/УЬ) немного ниже и составляет 34°С (фиг. 114). Поскольку оба ксРу имели заметно низкие величины Т50, а р5Е8 (УЬ/УН) был немного более термостабилен, именно он был выбран для дальнейшей модификации.
Пример 21. Конструкция молекул р5Е8 ксРν с улучшенной термической стабильностью.
Индивидуальные варианты и библиотеки, включающие требуемые аминокислотные замены в обычном р5Е8 (УЪ/УН) ксРν по методикам, приведенным в примерах 3 и 5, были созданы, как это было ранее описано, с помощью олигонуклеотидов, приведенных в табл. 23.
В табл. 23 вместе с каждым названием олигонуклеотиндов дана ссылка на соответствующую замену аминокислоты в УН или У|, с номером позиции согласно системе нумерации Кэбата. В графе Обоснование дана ссылка на использованный способ. Упомянутые способы детально описаны в примере 5 кирга. Мутагенные остатки обозначены заглавными буквами. Пары олигонуклеотидов для создания дисульфидной связи УН/Уь помещены в рамку. Использованы следующие сокращения: СОМР - компьютерный анализ, СΟУАК - ковариационный анализ, 'ΌΟΝ8 - консенсусный счет, ГЫТЕК-УН/УЬ - дизайн Интерфейса, δδ - УН/УЬ дисульфидная связь и ТВЭ - следует определить.
- 136 015992
Таблица 23
Олигонуклеотиды и обоснования для конструкции разновидностей р5Е8 (Уъ/Ун) §СРу
Олмго_назван не Обосвовавие Последовательность1 8БО ГО N0;
УН Ё60 СОМР даддЪдсадсЪддЪдСадЪсХдддддсддсЪх.д 76
УН И1800 СОМР дадВсВдддддсддсККСдсааадссВдддддд 77
УН.А12УК.К1 ЗОЕК соуак дЪсЕдддддсддаиЪдННСМАбссЪдддддд'ЬсссЪд 78
УН N328 ΟΟΝ3 д^^саддЫсассЪСсАОСаас'Ьас^.асаЪддас 79
УН озбьнзы ПУТЕЙ сааНаасСасСасаЪдМКСъдддССсдссаддсЬс 80
УН О43КК СОУАК сдссаддсЪссадддАКСдддсЪддад^дддЪс 81
УН 8496А СОУАК дддс1ддадгддд1.с63Ссд£а1Хад£ад1;адЬд 82
УН Ι51Μ СОМР дад1ддд^сЬсасд1:а1:6ад^ад'С.ад(:дд1:да^с 83
VI О37А СОМР ддЪа^аЪИаааНддЪаЪСССсадааассаддаааад 84
ун Цйэез СОМЗ д£а£Хад1:ад1:ад1;дд£ЯССсссаеа±дд1:асдсад 85
УН Р568ТО СО№ д-ВадВадСддВдаВКУСасаВддВасдсадас 86
УН ΙΛ/58ΥΝ ПУТЕЙ дСддЪда£сссасаИАС1асдсадас1:ссд£д 87
УН Ε72ΟΝ СОУАК чаЬСсассаСсСссадаНАСаасдссаадаасасас 8В
УН А743 СОУАК саЬс^ссадададаасАССаадаасасасЬдИСс 69
УН Р79У8У СОУАК дссаадаасаеас£дКНСс1Лсааа£даасадс 90
УН О81Е СОМР даасасасСдСССсВВеаааСдаасадссЪдадад 91
УН АВ4О СОМР саааВдаасадссСдадаббСдаддасасддсСдЪс 92
УН У89АОТ СОМР дадс£даддасасддс1В5С1;а1Лас1:д1дсд 93
УН 394КК ΟΟΝ8 д£с£ак1:ас±д£дсдАЯ31:£дас1:асаддд£с£д 94
УН У107Т СОУАК твп
УН МОВАОЗ СОМР ТВО
УН Т110УЗ СОУАК ΤΒϋ .
VI. 1.110 СОУАК саде с В сса ϊ οϊ ΐ с сВОС С сВдса С сС д С аддд 95
νί νΐ5Α<38 СОМР сссВдВсВдсаВсВКЗСддддасададВсасс 96
УЬ νΐ9ί СОУАК сВдВаддддасадаСТСассаВсасВВдсадд 97
У1.121Ь СОУАК ддддасадад1.сассСТСас£1дсадддеаа,д 98
У1 Т223 СОМР дасададСсасса^сАСССдсадддсаадЬсад 99
νί ϋ283Ο СО№ дсадддсаадВсадЕССаВВаддВавВаВВЧаааввд 100
УЪ^НЗОЗ!. СО№ дсаадъсаддасаъ£МКСка1Ха1;1Лааа£Хдд 101
VI Κ39Α СОУАК ааВВддВаВсадсадбССссаддаааадсВсс 102
Ά. Κ45ΕΗ ΙΝΤΕΚ ссаддаааадсьссВЗКСсСссВдаВсВаВдВВд 103
VI. У50П ΙΝΤΕΚ сВаадсВссВдаВсВаВННКдсаВссадВВВдсааад 104
νί. ί54Κ СОМЗ сВаВдВВдсаВссадВСОСсааадВддддВссс 105
УЦУ588 СОУАК садВВСдсааадбдддТССссавсааддВВсадс 106
- 137 015992
VI. Е70Ц СОУАЙ садЪддаЬсЪдддасаСАССЬсасЪСЕсассдЪс 107
VI. У751 СОМР дадЁбсасЁсбсассАТСадсадссЁдсадсс 108
VI.. РВОАЗ СОМР садсадссбдсадКОСдаадаЁЁЁЁдсдас 109
У1..Е83А03Т СОМР сбдсадссёдаадаЁКЗСдсдасёЁаЁ6ас.д 110
уь.твбО СОУАК сс'Едаада^^ЪдедСАСЪаЪ ^ас^д^с^асад 111
VI. ЬВЭАО ΙΜ1ΈΚ дсдасЪ иа'Ь’ЬасЪд^ЗМНсадд^^’Ьа'Ьад'С.асс 112
VI. Р96Ь¥ ΙΝΤΕΒ дЁЁЁаЁадбассссЕМНАасдЁЁсддссааддд 113
νΐ- (Эдч ΙΝΤΕΚ д’Ьасссс^сддасдТвСЗддссаадддассаад 114
VI Ι106ΑΘ8 СОМР ТВР
.......
УН (-45С 38 дсЁЁсадддсаддддТССдадбдддЁсЕсасд 115
Ά Р98С 88 д ё а с сс сё сдда сдТССддссаа дддасса ад 116
УН С101С 38 сьъдас*асадддесЬТбСЪссЪддддсеадддад 117
νί Ё46С 55 ддаааадсЁссЁаадтессЁдаЁСЁабдбЁдс 118
УН 8102С 88 дасЬасадддксЬдасЮСХддддсоадддадБс 110
И 146С 33 ддаааадсЪсс^аадТССс^да!: сЛаЪд'Ыдс 120
УН 344С 88 саддс^ссадддсадТССсБддад*: дддтс^сас 121
У1 СИ00С 38 сс^сддасдбЬсддсТССдддассааддгддаааБс 122
I Позиции, являющиеся мишенями для мутагенеза, указаны подчеркиванием. Неопределенные строго основания обозначены следующим образом: V=А или Т; У=А, или С, или 6; Υ=Ο или Т; З=С или 6; М=А или С; ^А, или С, или 6, или Т; Я=А или 6; К=6 или Т; В=С, или 6, или Т (I. Вю1 Сйет. 261(1):13-7 (1986)).
Трансформированные индивидуальные колонии были отобраны в 96-луночные платы и после культивирования проскринированы согласно способам, детально описанным в примере 5. Трансформированные культуры выращивали в течение ночи в среде для экспрессии, на основе ЗВ (Текпоуа, Най Мооп Вау, Са. Сак № З0140), включающей 0,6% глицин, 0,6% Тритон Х100, 0,02% арабинозу и 50 мкг/мл карбенициллина при 37 или 32°С.
После термической проверки агрегировавший материал удаляли центрифугированием и измеряли в растворимом ΟΌ23 ^Е^ЕIА, как описано в примере 3. Данные измерений были обработаны с помощью программного обеспечения ЗроШге ОесйкюпЗйе койгаге (Зроййе, ЗотегуШе, Ма) и выражены в виде отношения значений ПЕЙЕ^, наблюдаемых при термической проверке к начальной температуре для каждого клона. Клоны, воспроизводимо дающие отношение, не менее чем в 2 раза большее, чем наблюдаемое для родительской плазмиды, считались хитами. Плазмидная ДНК этих позитивных клонов была выделена способом тйш-ргер (νί/агб Р1ик, Рготеда, Мабйкоп, VI) и снова ретрансформирована в Е.сой ν3110 для повторного измерения способом термической проверки, а также для определения последовательности ДНК.
Результаты первоначальных и повторных измерений приведены в табл. 24. Некоторые из стабилизированных молекул ксЕу изобретения имели улучшенную связывающую активность (Т50>38°С) по сравнению с обычным р5Е8 ксЕу. В частности, значения Т50 для р5Е8 с позицией в библиотеке Ун6 (Е6О), с позицией в библиотеке Ун49 (З496 и З49А), с позицией в библиотеке Ун43 (О43К), с позициями в библиотеке Ун72 (Е72Э и Е72Ц) и с позицией в библиотеке Ун79 (Е79З) демонстрируют увеличение термической стабильности на величину от 4 до 5°С относительно обычного р5Е8 ксЕу. Значения Т50 для р5Е8 с позицией в библиотеке Уь50 (У50Й и У50З), с позицией в библиотеке Уь75 (У75Е), с позицией в библиотеке Уь80 (Р80З) и с позициями в библиотеке Уь83 (Е83А, Е836, Е83З и Е83Т) демонстрируют увеличение термической стабильности на величину от 3 до 7°С по сравнению с обычным р5Е8 ксЕу.
Кроме этого, значения Т50 для р5Е8 с позицией в библиотеке Ун32 (N323) и позицией в библиотеке Ун79 (Γ79Υ) демонстрируют увеличение термической стабильности на величину +2°С по сравнению с обычным р5Е8 ксЕу.
Стабилизирующие мутации были идентифицированы с помощью ряда способов, описанных в примере 5 - мутации Ун6 (Е60), Уъ75 ^75^, Уъ80 (Р80З) и Уъ83 (Е83А, Е836, Е83З и Е83Т) были выведены способом компьютерного анализа, мутация Ун32 (N323) была выведена способом консенсусного счета, четыре мутации Ун49 (З496 и З49А), Ун43 (043К), Ун72 (Е72О и Е72N), Ун79 (Е79З и Е79Υ) были выведены способом ковариационного анализа, мутации У|.50 (У50Й и У50З) были выведены способом Ун/Уь анализом области контакта, что обосновывает полезность и новизну этих способов. Комбинация мутаций Уц43О и УН32З со стабилизирующими мутациями Ун496, УН72О, или УН49А повышала термостабильность (Т50) для р5Е8 до 53°С, что на 15°С больше, чем эта же величина для обычного р5Е8 ксЕу.
- 138 015992
Таблица 24 р5Е8 Ун и Уъ позиции библиотеки, состав библиотеки и результаты скрининга
Позиция Библиотека ΗΪΙ 8ец. Наблюдаемый ДТя>°С
УН6 О Еб<Э +4
УН32 8 N328 +2
УН49 8, А 8490,849А +5,+5
УН43 К, К. О43К. +4
УН72 О, N Е72О, Ε72Ν +5+ +4
УН79 δ,ν,γ Р798, Ρ79Υ +4,+2
УЕ50 а11 аишю аск!з У50Ц, У508 +4,+3
УЬ75 I У751 +5
УЕ80 8,0 Р808 +4
УЕ83 8, А, О, Т Р838, Р83А, Р83О, Р83Т +4, +6, +7,+«
Табл. 25 показывает результаты всестороннего анализа термической стабильности различных индивидуальных стабилизирующих мутаций и их комбинаций, введенных в обычный ксРт. Для стабилизирующих мутаций было показано, что в комбинации они дают увеличение термической стабильности в диапазоне от 10 до 15°С по сравнению с обычным р5Е8 ксРт. Эти результаты, аналогично приведенным в примере 5, показывают, что улучшения в активности являются аддитивными и способы, описанные в этом изобретении, могут улучшать термическую стабильность второго исследуемого ксРт, что демонстрирует общую пригодность этих способов.
Таблица 25 Характеристики конструктов р5Е8, использованных для получения различных вариантов белка, и значения Т50, полученные способом термической проверки
Плазмида Дисульфид Длина линкер* (на) Другие мутация Тя’С
р1ЕН162 по 15 па 34
ΡΙΕΗΚ53 по 15 па 38
ΡΙΕΗ164 по 20 па 37
ΡΙΕΗ165 по 20 па -
рШН171 ПО 15 УНЕ60 42
ΡΙΕΗ172 ПО 15 УН N328 40
ΡΙΕΗ173 по 15 УН 8490 43
ΡΙΕΗ174 по 15 УН Е72О 43
РШН175 по 15 ΫΗΟ43Κ 42
рШН17б по 15 УН849А 45
ΡΙΕΗ177 по 15 ΫΗΕ72Ν
РЕН178 По 15 УНР798 42
ΡΙΕΗ179 по 15 ΥΗΡ79Υ 40
ΡΙΕΗ187 по 15 УЬ У751 43
Р1ЕН188 по 15 УЪР808 42
ΡΙΕΗ189 15 УЬ Е838 42
ΡΙΕΗ190 по 15 УЦР83А 44
ΡΪΕΗ191 по 15 УЬГ83О 45
ΡΙΕΗ192 по 15 УЬР83Т 44
Р1ЕИ182 \'Н45-УЬ98 15 ’ па ГВО
ΡΙΕΗ183 УН101-У146 15 па ГВО
ΡΙΕΗ184 УН102-УЬ46 15 па ТВЦ
ΡΙΕΗ193 УН44-УЫ00 15 па ТВЦ
ΡΙΕΗ195 по 15 УЬУ50О 43
ΡΙΕΗ196 по 15 УЬУ508 41
ΡΙΕΗ197 по 15 УНЕ60,8490 51
р!ЕН198 по 15 УН Е60, N328,8490 53
ΡΪΕΗ199 по 15 УНЕ60, Ε72Ν 48
ρΙΕΗ-200 по 15 УН Е60, N328, Ε72Ν 50
рШН-201 по 15 УН Е60, N328, Е72Н 50
р1ЕН-202 по 15 УН Е60,Е72О 48
ρΙΕΗ-203 по 15 νΗΕ6Ο,Ν328,849А 51
ρΙΕΗ-204 по 15 УНЕ60,849А 48
па=неприменимы;
аа=аминокислота;
ТВЭ=следует определить.
- 139 015992
Пример 22. Продукция стабилизированных четырехвалентных антител р5Е8.
Стабилизированные р5Е8 ксРу изобретения использованы для создания тетравалентных антител, гибридизованных на Ν-конце и С-конце и имеющих конфигурацию, аналогичную показанной на фиг. 20.
A. Конструкция тетравалентных антител ΝΗ^5Ε8.
Для конструкции тетравалентных антител NΗ-р5Е8, аналогичных тем, что описаны в примере 7 кирга, использованы ДНК р5Е8 ксРу, описанные в примере 21. Чтобы связать р5Е8 ксРу с Ν-концом сформированной тяжелой цепи приматизированного® р5Е8 ЦС. использован линкер (С1у48ег)5. Конструкция молекулы следующая: р5Е8 ксРу - линкер (С1у48ег)5 - тяжелая цепь приматизированного® р5Е8 ЦС. Эта молекула соединяется с легкой цепью и образует тетравалентное антитело. Правильность последовательности ДНК может быть подтверждена путем ее анализа. Конструкт мог быть использован для трансфекции клеток СНО, как это описано в примере 8 для продукции больших количеств тетравалентных антител ΝΗ- р5Е8. Трансфицированные клетки СНО могут быть проскринированы на связывание с иммобильзованным антигеном СЭ23 способом ОБЬЕИ. 96-луночные платы, например (Мах18огр, №11де Мшс. Косйек!ег, ΝΥ, Са!. № 437111) можно покрыть растворимым антигеном СЭ23 в концентрации 1 мкг/мл, растворенным в 0,1 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5. Платы покрывают в течение ночи при 4°С и блокируют в течение 1 ч при комнатной температуре буфером для измерения ЭЕкНА (ОАВ, 10 мМ Тпк 11С1. 150 мМ №С1, 20 мМ НОТА. 0,5% В8А, 0,02% Ттеееп 20, 0,01% №Ν3, рН 7,4). Платы отмывают 3 раза ОАВ, не включающим В8А (отмывочный буфер), затем добавляют в платы исследуемые образцы, растворенные в ОАВ, в конечном объеме 100 мкл. Платы инкубируют в течение 1 ч на шейкере при комнатной температуре и затем отмывают 3 раза отмывочным буфером, чтобы удалить несвязавшийся материал. Связавшиеся антитела определяют, добавляя в ячейку 100 мкл ОАВ, включающего 250 нг/мл меченых Ей античеловеческих антител (Регкт Е1тег, Вок!оп, МА, Са!. № 1244-330), и инкубируют при комнатной температуре на шейкере в течение 1 ч. Платы трижды отмывают отмывочным буфером и добавляют в каждую ячейку 100 мкл усиливающего раствора ОЕЬРЛ (Регкт Е1тег, Вок!оп, МА, Са!. № 4001-0010). Затем инкубируют в течение 15 мин и определяют Ей по методике на приборе для считывания плат У1с!ог 2 р1а!е геабег (Регкт Е1тег, Вок!оп, МА).
B. Конструирование С-р5Е8 четырехвалентного антитела.
Молекулы р5Е8 ксРу ДНК, описанные в примере 21 выше, используются, чтобы построить С-р5Е8 четырехвалентное антитело, как описано в примере 7 выше. Сер (С1у48ег)3 пептидный линкер используется, чтобы соединить р5Е8 ксРу с карбоксильной конечной группой РШМАТЕЕО® р5Е8 ЦС тяжелой цепи. Структура молекулы - РШМАТЕЕО® р5Е8 ЦС тяжелая цепь - Сер (С1у48ег)3 линкер-р5Е8 ксРу. Эта молекула объединяется с легкой цепью, чтобы сформировать четырехвалентное антитело. Правильная последовательность была бы подтверждена анализом последовательности ДНК. Конструкция могла использоваться для трансфицирования ячеек СНО, как описано в примере 8, для увеличенного производства С-р5Е8 четырехвалентного антитела. Ячейки Тгапкас!еб ί'ΉΟ могут быть показаны на экране, как описано выше.
Эквиваленты.
Специалисты понимают или смогут путем рутинного экспериментирования установить множество эквивалентов приведенным выше вариантам осуществления настоящего изобретения. Такие эквиваленты также охватываются объемом нижеприведенной формулы изобретения.
- 140 015992
Перечень последовательностей < 110> Байоджен Айдек Эмэй Инк.
<120> СТАБИЛИЗИРОВАННАЯ СВЯЗЫВАЮЩАЯ МОЛЕКУЛА НА ОСНОВЕ СТАБИЛИЗИРОВАННОЙ МОЛЕКУЛЫ веру (ВАРИАНТЫ) И ВАРИАНТЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВЫШЕНАЗВАННЫХ СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ МОЛЕКУЛ.
<130> ВСгТЧ-А242РС <140> РСТ/1182007/006883 <141> 2007-03-19 <150> 11/725,970 <151> 2007-03-19 <150> 60/783,622 <151> 2006-03-17 < 150> 60/812,688 <151> 2006-06-09 <150> 60/873,502 <151> 2006-12-08 <150> 60/873,996 <151> 2006-12-08 <160> 161 <170> Ра1еп11п версия 3.3 <210> 1 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности:
Синтетический праймер <400> 1 садЬадсард саддЬссаас ЬддЬдсад 28
- 141 015992 <210>2 <211> 52 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 2 дССсСадааа дсССССдбсд СсдбсдСсСС СдаСсСссас сССддЪассс Сд 52 <210>3 <211> 714 <2|2> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности:Синтетический конструкт <400> 3
саддЬссаас ЬддСдсадбс СддадсСдад дСдаадаадс сСдддСссбс адСдааддбд 60
бссбдсаадд сССсбддсСа сасССЛсаса ассСас^аСС ЪдсасСдддС даддсаддсс 12С
ссСддасадд дасССдадСд даСдддаСдд ассъабсссд даааедСбса бдсбсадсас 180
аабдадаадЬ Ссаадддсад ддбсасааЬс асЬдсадаса ааСссассад сасадссСас 240
аСддадсЬса дсадссСдад дСсСдаадаС асСдсддСсЬ аССасСдСдс аадаСссЬдд 300
дааддСХБСс сесассдддд ссаадддасс асддСсассд СсСссСсадд Сдддддсдда 360
СсЬдддддсд дсддаСссдд ьддьддьздь адСдасаССс адабдассса дСсСссСадс 420
СсссЬдЬссд ссСсадСадд адасадддСс ассаЪсассЬ дсааддссад ЬсадааСдЬд 480
дд-еассаайд СадссСдд^а Ссаасадааа ссадддаадд сссссааабс ассдассссс 540
СсддссЬссх ассддбасад СддадСсссЪ СссадаССса дсддсадЪдд абсСдддаса 600
даеьСсасСс СсассаЦсад садссЪссад ссСдаадасС СсдсаассЬа СССсЬдЬсад 660
сааЬаЬдаса ссЬаЬссаЬС сасдССсддс садддЬасса аддкддадаь сааа 714
<210> 4 <211> 238
- 142 015992 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности;Синтетический конструкт <400>4
О1п Уа1 С1П Ьеи Уа1 СЬп Зег СЬу АЬа С1и Уа1 ьуз Ьуз РГО СЬу Зег
1 5 10 15
Зег УаЬ Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз АЬа Зег СЬу Туг ТНг РНе ТЬг ТЬг Туг
20 25 30
Туг Ьеи Н±3 Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу СЬп СЬу Ьеи СЬи Тгр Мес
35 40 45
О1у Тгр Не Туг Рго <31у Азп Уа1 НЬз АЬа С1п Туг Азп СЬи Ьуз РНе
50 55 60
Ьуз СЬу Агд УаЬ ТНг 11е ТНг АЬа Азр Ьуз Зег ТНг Зег ТНг АЬа Туг
65 70 75 80
МеС СЬи Ьеи Зег Бег Ьеи Агд Зег СЬи Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
АЬа Агд Зег Тгр СЬи СЬу РНе Рго Туг Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг ТЬг УаЬ
100 105 110
ТЬг УаЬ Зег Зег СЬу СЬу С1у СЬу Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу СЬу
115 120 125
<Э1у С1у Зег Азр 11е СЬп мес ТНг СЬп Зег РГО Зег Зег Ьеи Зег АЬа
13 0 135 14 0
Зег УаЬ СЬу Азр Агд УаЬ ТНг 11е ТНг Суз Ьуз АЬа Зег СЬп Азп Уа1
145 150 155 160
С1у Не Азп УаЬ А1а Тгр Туг СЬп СЬп Ьув Рго С1у Ьуз АЬа Рго Ьуз
165 170 Ь75
Зег Ьеи 11е Зег Зег А1а Зег Туг Агд Туг Зег СЬу Уа1 Рго Зег Агд
180 185 190
РНе Зег СЬу Зег СЬу Зег СЬу ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг 11е Зег Зег
195 200 205
Ьеи С1п Рго СЬи Азр РНе А1а ТНг Туг РНе Суз СЬп СЬп Туг Авр ТЬг
210 215 220
- 143 015992
Туг Рго РЬе ТЬг РЬе е1у С1п С1у ТЬг Ьуз 7а1 С1и Не Ьуз
225 230 235 <210> 5 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 5 дсаддссссС ддасадСдсс СЬдадСддаС дддаСд 36 <210> 6 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 6 саСсссаСсс асСсааддса сСдСссаддд дссСдс 36 <210> 7 <211> 41 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 7 ссЪаСссаСЬ сасдСЬсддс СдсддСасса аддЬддадаЬ с 41
- 144 015992 <210> 8 <21 »41 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 8 даСсСссасс ЬСддСассдс адссдаасдС дааСддаСад д 41 <210> 9 <211> 714 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 9
саддЬссаас СддСдсадСс СддадсСдад дСдаадаадс сСдддСссЬс адЬдааддЪд 60
ЬссЬдсаадд сСЬсСддсСа сасЬЬСсаса ассСасСаСС ЬдсасЬдддС даддсаддсс 120
ссСддасадЬ дссЬСдадЬд даСдддаСдд аСССаЬссСд даааСдЬЬса СдсСсадЬас 180
ааСдадаадс Ссаадддсад ддЬсасааЬс асСдсадаса ааСссассад сасадссЬас 240
аСддадсСса дсадссСдад дЬсСдаадаЪ асСдсддСсС аСЬасСдСдс аадаЪссСдд 300
дааддЪСССс сЪСасСдддд ссаадддасс асддСсассд СсСссСсадд ьдддддсдда 360
СсСдддддсд дсддаСссдд ЪддЬддСддЪ адСдаоаССс адаЬдассса дЪсЕссЪадс 420
СсссЪдСссд ссЬсадЕадд адасадддЬс ассаСсассС дсааддссад ЬсадааЬдСд 480
ддСаССааСд ЬадссЬддЬа Ъсаасадааа ссадддаадд сЬссЬаааЪс асСдаСХЕсс 540
СсддссСссЬ ассддЕасад СддадСсссС ЬссадаЬЬса дсддсадЬдд аСсЬдддаса 600
даЬСЪсасСс ЬсассаЬсад садссЕссад сс1;даадась СсдсаассЪа ЬЬЪсСдЪсад 660
сааСаСдаса ссЬаЪссаЬС. сасдССсддс СдсддЬасса аддЬддадаС сааа 714
<210> 10
- 145 015992 <211> 238 <212> ПРТ < 213 > И скусственная поел ед овательностъ <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 10
С1п 1 Уа1 С1п Ьеи Уа1 5 О1п Зег С1у А1а С1и 10 Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у 15 Зег
Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг ТЬг Туг
20 25 30
Туг Ьеи ΗΪ3 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у <Э1п Суз Ьеи О1и Тгр мес
35 40 45
С1у Тгр Не Туг Рго С1у Азп Уа1 Н1з А1а С1п Туг Азп С1и Ьуз РЬе
50 55 60
Т ГХ1 1Ζ '' — Л ат-гг Ча1 ТЬг Не тЬг д 1а Д 4ΤΊ Τ ιΆΖ«ϊ “2 “ Звзг ТЬг Збг ТЪ г- А1а Т\лт ~ 2 ~
65 70 75 80
МеС С1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег С1и Азр ТЬг А1а ν81 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Зег Тгр С1и С1у РЬе Рго Туг Тгр СЯу О1п О1у ТЬг ТЬг Уа1
100 105 но
ТНг Уа1 Зег Зег СЯу С1у О1у е1у Зег СЯу С1у С1у О1у Зег С1у 61у
115 120 125
С1у О1у Зег АЗр Не <31п МеС ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а
130 135 140
Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Ьуз А1а Зег С1п Азп Уа1
14 5 150 155 160
<Э1у Не Азп Уа1 А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго СЯу Ьуз А1а Рго Ьуз
165 170 175
Зег Ьеи Не Зег Зег А1а Зег Туг Агд Туг Зег С1у ν31 Рго Зег Агд
180 185 190
РЬе Зег С1у Зег <31у Зег <31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег
- 146 015992
195 200 205
Иби С1п Рго С1и Азр РНе А1а 215 ТНг Туг РНе Суз 01П О1п Туг Азр ТНг 220
210
Туг Рго РЬе ТНг РНе 61у Суз С1у ТНг Ьуз Уа1 01и Не Ьуз
225 230 235 <210> 11 <211> 85 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> И аадддассас ддСсассдкс СссНсаддсд дбддадддкс сддСдддддс ддаесСдддд 60 дсддсддаНс сддЬддНддС ддНад 85 <210> 12 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 12
СССНдЬИсНа даааасккЪЬ дСсдЪсд 27 <210> 13 <211> 85 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 147 015992 <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 13 аадддассас ддЬсассдСс СссСсаддад ддддсддССс аддсддЕдда дддСссддСд 60 ддддсддаСс Сдддддсддс ддаЕС 35 <210> 14 <211> 729 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 14
саддЕссаас ЬйЗЬдсадСс СддадсСдад дЬдаадаадс с-ЬдддСссСс адСдааддСд 60
СссСдсаадд осСсСддсьа сасСЬСсаса ассСасСаСС СдсасСдддЕ даддсаддсс 120
ссСддасадд дасЬЬдадСд даЪдддаСдд аССДаСссЬд даааЬдЪСса СдсЬсадЬас 130
ааСдадаадС Ссаадддсад ддСеасаасс асСдсадаса ааСссассад сасадссСас 240
аСддадоСса дсадсссдад дСсСдаадаП асСдсддСсЬ аСЪасСдЬдс аадаСссСдд 300
дааддЬСССс сССасЬдддд ссаадддасс асддСсассд СсСссСсадд сддСддаддд 360
СссддЬдддд дсддаСсьдд оддсддссда Ьссддеддсд дСддЕадСда саССсадаСд 420
асссадьаес сЕадсСсссС дСссдссЕса дСаддадаса дддСсасса-Ь сассСдсаад 480
дссадЕсада аСдСдддСаС ЬааСдСадсс ЬддСаЬсааС адааассадд дааддсЕссС 540
аааСсасСда ЪЬСссСсддс ссссьассдд СасадСддад СсссЬСссад аЬСсадсддс 600
адЪддаьссд ддасадаССЬ сасСсЕсасс аСсадсадсс СссадссСда адасССсдса 660
ассЪаСЕЕсс дЬсадсааСа ЬдасассСаС ссаССсасдС Ссддссаддд СассааддСд 720
дадаСсааа 729 <210> 15 <211> 243 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 148 015992 <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 15
(31п Уа1 (31п Ьеи Уа1 31п Зег <51у А1а (31и Уа1 Ьуз Ьуз Рго 01у Зег
1 5 10 15
Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг ТЬг Туг
20 25 30
Туг Ьеи Н1з Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго СИу СИп С1у Ьеи С1и Тгр мес
35 40 45
51у Тгр Не Туг Рго СИу Азп Уа1 Н13 А1а С1п Туг Азп С1и Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз С1у Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг А1а Азр Ьуз Зег ТЬг Зег ТЬг А1а туг
65 70 75 80
мес С1и Ьеи Зет Зег Ьеи Агд Зег С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Зег Тгр О1и СИу РЬе Рго Туг Тгр С1у 31 п 01у ТЬг ТЬг Уа1
100 105 но
ТЬг ναΐ Зег зег О1у (31у О1у С1у зег □1у 01у С1у <31у зег 01у □1у
115 120 125
О1у 61у Зег О1у 01у СИу <31у Зег Азр 11е 01п Мес ТЬг 61п Зег Рго
130 135 14 0
Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 <31у Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Ьуз
145 150 155 160
А1а Зег О1п Азп Уа1 СИу 11е АЗП Уа1 А1а Тгр Туг 31п 01η Ьуз Рго
165 170 175
СИу Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи 11е Зег Зег А1а Зег Туг Агд Туг Зег
130 185 190
С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Авр РЬе ТЬг
195 200 205
Ъеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи 61п Рго <31и Азр РЬе А1а ТЬг Туг РЬе Суз
210 215 220
- 149 015992
Οίη С1п Туг Аар ТЬг Туг Рго РЬе ТЬг РЬе С1у <31п (31у ТЬг Ьуз Уа1
225 230 235 240
С1и 11е Ьуз <210> 16 <211> 744 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 16
саддСссаас СддСдсадЬс СддадсСдад дСдаадаадс сЬдддСссСс адСдааддСд 60
СссЬдсаадд сССсСддсЬа сасСССсаса ассйасСаЫ; СдсасСдддС даддсаддсс 120
ссбддасадд дасСЬдадСд дасдддабдд абЛСаСссХд дааабдСЬса ЬдсСсадбас 180
ааЬдадаадС Ьсаадддсад ддСсасааСс асСдсадаса ааЪссассад сасадссЬас 240
аСддадсСса дсадссЬдад дЬсЬдаадаЬ асЬдсддЬсЬ аССасСдСдс аадаЬссСдд 300
дааддСЬЬСС сЬЪасСдддд ссаадддасс асддЬсассд ЬсСссСсадд адддддсддр 360
СсаддсддСд дадддЬссдд Ьдддддсдда СсЬдддддсд дсддаЬссдд ЬддЬддЬддС 420
адЬдасаССс адаСдассса дСсЬссСадс СсссЬдЕссд ссрсадСадд адасадддЬс 480
ассаСсассС дсааддссад СсадааСдСд ддсассаасд Ьадсссддса Ссаасадааа 540
ссадддаадд сЬссЬаааСс асСдаЬССсс СсддссЬссЬ ассддСасад ЬддадСссср 600
СссадаЬЕ-са дсддсадедд арсрдддаса даьъссассс СсассаЬсад садссСссад 660
ссрдаадасС ЬсдсаассСа РССсСдЬсад сааСаСдаса сссаессаье сасдССсддс 720
садддеасса аддЬддадаЬ сааа 744
<210> 17 <211> 248 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт
- 150 015992 <400> 17
СЬп УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬп Зег С1у АЬа СЬи УаЬ Ьуз Ьуз РГО СЬу Зег
1 5 10 15
Зег УаЬ Ьуз УаЬ Зег Суз Ьуз АЬа Зег СЬу Туг ТЬг рЬе ТЬг Т11Г Туг
20 25 30
Туг Ьеи НЬз Тгр УаЬ Агд СЬП АЬа Рго СЬу СЬп СЬу Ьеи СЬи Тгр МеЬ
35 40 45
СЬу Тгр 1Ье Туг Рго СЬу Азп УаЬ НЬз АЬа СЬп Туг Азп С1и Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз СЬу Агд УаЬ ТЬг ТЬе ТЬг АЬа Азр Ьуз Зег ТЬг Зег ТЬг АЬа Туг
65 70 75 80
МеИ СЬи Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег СЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг Туг Суз
85 90 95
АЬа Агд Зег Тгр СЬи СЬу РЬе Рго Туг Тхр СЬу СЬп СЬу ТЬг ТЬг УаЬ
100 105 110
ТЬг УаЬ Зег Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу СЬу
115 120 125
СЬу СЬу Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег Азр ТЬе СЬп
130 135 14 0
МеЪ ТЬг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу Азр Агд УаЬ
145 150 155 160
ТЬГ Не ТЬг Суз Ьуз АЬа Зег СЬп Азп УаЬ СЬу Не Азп УаЬ АЬа Тгр
165 170 175
Гуг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа РГО ьуз Зег Ьеи 1Ье Зег Зег АЬа
180 185 190
Зег Туг Агд туг Зег СЬу УаЬ Рго зег Агд РЬе зег СЬу Зег СЬу Зег
195 200 205
СЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг ТЬе Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи Азр РЬе
210 2Ь5 220
АЬа ТЬг Туг РЬе Суз СЬп СЬп Туг Азр ТЬг Туг Рго РЬе ТЬг РЬе СЬу
225 230 235 240
СЬп СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи ЬЬе Ьуз
245
- 151 015992 <210> 18 <211> 729 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 18
саддЕссаас ЕддЕдсадЕс ЕддадсЕдад дЕдаадаадс сЕдддЕссЕс адЕдааддЕд 60
ЕссЕдсаадд сЕЕсЕддсЕа сасЕЕЕсаса ассЕасЕаЕЕ ЕдсасЕдддЕ даддсаддсс 120
ссЕддасадЕ дссЕЕдадЕд даЬдддаЕдд аЕЕЕаЕссЕд даааЕдЕЕса ЕдсЕсадЕас 1В0
ааЕдадаадЕ Есаадддсад ддЕсасааЕс асЕдсадаса ааЕссассад сасадссЕас 240
аЕддадсЕса дсадссЕдад дЕсЕдаадаЕ асЕдсддЕсЕ аЕЕасЕдЕдс аадаЕссЕдд 300
дааддЕЕЕЕс сЕЕасЕдддд ссаадддасс асддЕсассд ЕсЕссЕсадд сддЕддаддд 360
ЕссддЕдддд дсддаЕсЕдд дддсддсдда ЕссддЕддйд дЕддЕадЕда саЕЕсадаЕд 420
асссадЕсЕс сЕадсЕсссЕ дЕссдссЕса дЕаддадаса дддЕсассаЕ сассЕдсаад 480
дссадЕсада аЕдЕдддЕаЕ ЕааЕдЕадсс ЕддЕаЕсаас адааассадд дааддсЕссЕ 540
аааЕсасЕда ЕЕЕссЕсддс сЕссЕассдд ЕасадЕддад ЕсссЕЕссад аЕЕсадсддс 600
адЕддаЕсЕд ддасадаЕЕЕ сасЕсЕсасс аЕсадсадсс ЕссадссЕда адасЕЕсдса 660
ассЕаЕЕЕсЕ дЕсадсааЕа ЕдасассЕаЕ ссаЕЕсасдЕ ЕсддсЕдсдд ЕассааддЕд 720
дадаЕсааа 729 <210> 19 <211> 243 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 19
- 152 015992
С1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 01п Зег С1у А1а 01и Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у Зег
1 5 10 15
Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег 01у Туг ТЬг РЬе ТЬг ТЬг Туг
20 25 30
Туг Ьеи Н13 Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго С1у Э1п Суз Ьеи 01и Тгр Мек
35 40 45
01у Тгр Не Туг Рго С1у Азп Уа1 Н1э А1а 31п Туг Азп С1и Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз С1у Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг А1а Азр Ьуз Зег ТЬг Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
Мек С1и Ьеи Зег Зег- Ьеи Агд Зег С1и Азр Ткг А1а Уа1 Туг Туг Сув
85 90 95
А1а Агд Зег Тгр 01и С1у РЬе Рго Туг Тгр 01у 01П 01у ТЬг ТЫ Уа1
100 105 110
ТЬг Уа1 Зег Бег 01/ 01у <31у С1у Зег 01у 31у (31у 31у Зег 01у О1у
115 120 125
01у О1у Зег О1у □ 1у С1у 01у Зег Азр Не 01п Мек ТЬг С1п Зег Рго
130 135 140
Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 01у Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Ьуз
145 150 155 160
А1а Зег С1п Азп Уа1 С1у Не Азп Уа1 А1а Тгр Туг 01п С1п Ьуз Рго
165 170 175
С1у Ьуз А1а Рго Ьув Зег Ьеи Не Зег Зег А1а Зег Туг Агд Туг Зег
180 185 190
С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег 01у Зег 01у Зег С1у ТЬг Авр РЬе ТЬг
195 200 205
Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи 01п Рго С1и Авр РЬе А1а ТЬг Туг РЬе Суз
210 215 220
О1п С1П Туг Азр ТЬг Туг Рго РЬе ТЬг РЬе 01у Суз 01у ТЬг Ьуз Уа1
225 230 235 240
С1и Не Ьув <210> 20 <211> 20
- 153 015992 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический петлиц <400> 20 (31у <31у <31у <31у Зег С1у <31у С1у С1у Зег <31у О1у <31у С1у Зег <31у
10 15 (31у <31у С1у Зег <210> 21 <211> 15 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 21 <31у О1у <31 у (31у Зег <31у С1у <31у С1у Зег <31у С1у <31у (31у Зег
10 15 <210> 22 <211> 6 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический тэг 6хН18 <400> 22
ΗΪΒ Н±э ΗΪ8 Н1е ΗΪ8 ΗίΒ
Б
- 154 015992 <210> 23 <211> 25 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 23
С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у 61у С1у Зег С1у <Яу 61у С1у Зег О1у
10 15 □ 1у <Э1у С1у Зег С1у С1у С1у А1а Зег
25 <210> 24 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 24
С51у О1у С1у С1у Зег
5 <210> 25 <211> 54 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
- 155 015992 <400> 25 аЪдаааааас ьдсСдССсдс даьсссдсед дьддсдссдс ссъасадсса Саде 54 <210> 26 <211> 18 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 26
МеЬ Ьуз Ьуз Ьеи Ьеи РИе А1а Не Рго Ьеи ¥а1 Та1 Рго РЬе Туг Зег
10 15
Н1з Зег <210> 27 <211> 90 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 27 дасдасдасд асаааадсСС СсСадаасаа ааасЬсаСсС: садаададда СсЬдааСадс 60 дссдСсдасс аЪсаЬсаЬса СсаСсаЬСда 90 <210> 28 <211> 669 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
- 156 015992 конструкт <400> 28
саасЕСдЬдс ЬсасЪсадЬс аЬсЬЬсадЪс ЬсСЬСсСссс СдддадссЬс адсаааасСс 60
асдЬдсассЬ ЬдадЬадСса дсасадСасд СасассаЬСд ааЬддЬаСса дсаасадссс 12 0
сЬсаадссСс сЕаадЬаЬдЬ даСддадсех аадааадаСд даадссасад сасаддСдаЬ 180
дддаЬССсЬд аЬсдсЬЬсЬс ЪддаЬссадс СсСддСдсед аСсдсгассс ЕадсаСсссе 240
аасаСссадс сЬдаадаЬда адсааСаСас аСсСдСддСд СдддСдаЬао ааСЕааддаа 300
сааСССдедЬ аедССССсдд сддЬддаасс ааддЬсдааа есааасдСас ддСддсСдса зео
ссаСсЬдЬсС СсаСсСЬссс дссаСсСдаС дадсадСЕда ааесхддаас СдссСсСдЬС 420
дРдСдссЬдс ЬдааСаасЬЬ. сСаСсссада даддссааад СасадЪддаа ддЕддаЬаас 480
дсссСссааС сдддЕаасЪс ссаддададЬ дЬсасададс аддасадсаа ддасадсасс 540
СасадссСса дсадсасссе дасдсЬдадс ааадсадасЪ асдадаааса сааадСсСас 600
дссЬдсдаад ЬсасссаЬса дддссСдадс СсдсссдСса сааададсСС саасадддда 660
дадЕдЬСда 669 <210> 29 <211> 222 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 29
С1п Ьеи Уа1 Ьеи ТЬг· 01η. Зег Зег Зег Уа1 Зег РЬе Зег Ьеи С1у А1а
1 5 10 15
Зег А1а Ьуз Ьеи ТЬг Суз ТЬг Ьеи Зег Зег 01п Нгз Зег ТЬг Туг ТЬг
20 25 30
Не <31и Тгр Туг θΐη 51п 61п Рго Ьеи Ьуз Рго Рго Ьуз Туг Уа1 МеЬ
35 40 45
С1и Ьеи Ьуз Ьуз Азр С1у Зег Ηί з Зег ТЬг С1у Азр С1у Не Рго Азр
50 35 60
Агд ?Ье 8ег С1у Зег Зег Зег О1у А1а Азр Агд Туг Ьеи Зег 11е Зег
65 70 75 80
- 157 015992
Аги 11е С1п Рго С1и Азр С1и А1а Не Туг 11е Суз С1у Уа1 С1у 95 Азр
85 90
ТЬг 11е Ьуз С1и С1п РЬе ν&1 Туг Уа1 РЬе <31у С1у <31у ТЬг Ьуз Уа1
100 105 110
е1и 11е Ьуз Агд ТЬг Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РЬе Не РЬе Рго Рго
115 120 12 5
Зег Азр С1и С1п Ьеи Ьуз Зег 61у ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи
130 135 140
Азп Азп РЬе Туг Рго Агд С1и А1а Ьуз Уа1 01п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп
14 5 150 155 160
А1а Ьеи С1п Зег <31у Азп Зег С1п С1и Зег Уа1 ТЬг С1и С1п Азр Зег
165 170 175
Туе Азр Зег ТЬг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз А1а
180 185 190
Азр Туг С1и Ьуз ΗΪ3 Ьуз Уа1 Туг А1а Суз <Э1и Уа1 ТЬг Н1з Й1п <31у
195 200 205
Ьеи Зег Зег Рго Уа1 ТЬг Ьуз Зег РЬе Азп Агд е1у <Э1и Суз
210 215 220 <210> 30 <211> 2139 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 30
саддЬссаас СддрдсадЬс рддадсЬдад дрдаадаадс срдддрссСс адс.даадд£д 60
ЬссСдсаадд сСЬсЬддсЬа сасРЬСсаса ассСасЬаСЬ ЬдсасЬдддс даддсаддсс 120
ссЬддасадд дасЬсдадЬд даьдддаъдд аьььапссрд даааЬдРЬса СдсЬсадЬас 180
аасдадаадЬ (зсаадддсад ддСсасааьс асЬдсадаса ааЬссассад сасадссЬас 240
аЬддадсЬса дсадссЬдад дЬсСдаадаС асЬдсддЬсЬ аСЬасСдЬдс аадаСссЬдд 300
дааддЬЕЬЕс сРЬасРдддд ссаадддасс асддСсассд ЬсбссЬсадд Ьдддддсдда 360
- 158 015992
ЁсЬдддддсд дсддаЬссдд ЁддЁддЁддЁ адЁдасаЁЁс адаЁдассса дЁсЁссЁадс 420
ЪссскдЕссд ссксад+адд адасадддЁс ассаЁсассЁ дсааддссад ЁсадааЁдЁд 480
ддкасиааьд СадссСддСа Ёсаасадааа ссадддаадд сЁссЁаааЁс асЁдаЕЁЕсс 540
ЁсддссЕССЁ ассддьасад ЁддадЁсссЁ ЁСсадаЁЁса дсддсадЕдд аЕсЕдддаса 600
даЬЬЬсасЬс ЬсассаЬсад садссЁссад ссЁдаадасЁ ЁсдсаассЕа ЕЕЕсЕдЕсад 660
сааЪаЬдаса ссЬакссаЕЬ сасдЁЁсддс садддЁасса аддЁддадаЁ саааддсддЁ 720
сдадддСссд дкддаддддд сЁсъддаддд ддсддЁЁсад ддддсддьдд аЕсдддддда 780
ддС.ддсЬссс адаЕссадЁС. ддЁдсадЁсЁ ддассЁдадс Ёдаадаадсс Еддададаса 840
дЬсаадакск ссЁдсааддс ЁЁсЪддЁЁЁЁ ассЁЁсасад асЪаЁЁсааЁ асасЕдддЕд 900
ааасаддсЪс саддаааддд ЁЁЁааадЁдд аЁдддсЁдда ЁааасасЁда дасЕддЕдад 960
ссаасаЬаЪа садаЁдасЁЁ саадддасда ЁЁЁдССЁЁСЁ сЁЁЁддЁдас сЁсЕдссасс 1020
ас+дсскаЁР ЬдсадаЬсаа саассЪсаас ааЁдаддаса сддсЁасаЁЁ ЁЁЁСЁдЁдсЁ 1080
адаыгсаесь аЁдаЁссЁЁа ЁЁдддддЁЁЁ дсЁЁасЁддд дссаддддас ЕсЕддЕсасЕ 1140
дЪсЬссдсад скадсассаа дддсссаЬсд дЁсЁЁссссс ЁддсасссЁс сЕссаададс 1200
ассЕсСдддд дсасадсддс ссЁдддсЁдс сЁддЁсаадд асЕасЁЁссс сдаассддЕд 1260
асддСдСсдЬ ддаасЁсадд сдсссЁдасс адсддсдЬдс асассЁЁссс ддсЕдЁссЕа 1320
садЬссЬсад дасЁсЁасЁс ссЁсадсадс дЁддЁдассд ЕдсссЁссад садсЕЕдддс 1380
асссадассЬ асаЁсЁдсаа сдЁдааЁсас аадсссадса асассааддЬ ддасаадааа 1440
дС-Едадссса ааЁсЁЁдЁда саааасЁсас асаЕдсссас сдЕдсссадс ассЕдаасЕс 1500
сСддддддас одЁсадЁСЁЁ ССЁСЁЁСССС ссаааассса аддасасссЕ саЕдаЕсЕсс 1560
сддасссскд аддЁсасаЁд сдЁддЁддЁд дасдЁдадсс асдаадассс ЕдаддЕсаад 1620
ЬЁсаасЬддЁ асдЬддасдд сдЁддаддЁд саЁааЕдсса адасааадас дсдддаддад 1680
садкасааса дсасдьассд Ьдьддссадс дЁссЁсассд ЁссЕдсасса ддасЕддсЕд 1740
аакддсаадд адъасаад+д сааддЕсЁсс аасааадссс Ёсссадсссс саЕсдадааа 1800
ассаЬсЁсса аадссааадд дсадссссда даассасадд ЁдсасасссЁ дсссссаЕсс 1860
сддда^дадс Ёдассаадаа ссаддЁсадс сЁдассЁдсс ЁддЁсааадд сЕЁсЕаЕссс 1920
адсдасаксд ссдЬддадЁд ддададсааЁ дддсадссдд адаасаасЁа саадассасд 1980
ссСсссдСдс ЁддасЕссда сддсСссЬСс ЕЁссЁсЁаса дсаадсЁсас сдЕддасаад 2040
адсаддрддс адсаддддаа сдЁсЁЁсЁса ЁдсЕссдЁда ЁдсаЁдаддс ЕсЕдсасаас 2100
сасЬасасдс адаададссЁ сЁсссЁдЁсЁ ссдддЁЁда 2139
<210> 31 <211> 712 <212> ПРТ
- 159 015992 <213> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400 31
С1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1п Зег 01у А1а 61и Уа1 Ьуз Ьуз Рго О1у Зег
1 5 10 15
Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг ТЬг Туг
20 25 30
Туг Ьеи Н1з Тгр Уа1 Агд 01п А1а Рго С1у <31п <31у Ьеи С1и Тгр мее
35 40 45
<31у Тгр 11е Туг Рго С1у Азп Уа1 Н1з А1а 01п Туг Азп С1и Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз <31у Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг А1а Азр Ьуз Зег ТЬг Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
Мее С1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Зег Тгр (31и <31у РЬе Рго Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1
100 105 но
ТЬг Уа1 Зег Зег <31у О1у <31у С1у Зег С1у С1у С1у (Ну Зег С1у С1у
115 120 125
С1у С1у Зег Азр Не <31п мее ТЬг θΐη Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а
130 135 140
Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Ьуз А1а Зег С1п Азп Уа1
145 150 155 160
С1у Не Азп Уа1 А1а Тгр Туг О1п 01п Ьуз Рго <31у Ьуз А1а Рго Ьуз
165 170 175
Зег Ьеи Не Зег Зег А1а Зег Туг Агд Туг Зег <Э1у Уа1 Рго Зег Агд
180 185 190
Рбе Зег О1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег
195 200 205
Ьеи □1п Рго <Э1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг РЬе Суз С1п С1п Туг Азр ТЬг
210 215 220
- 160 015992
Туг Рго РЬе ТЬг РЬе 61у С1п 01у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз С1у С1у
225 230 235 240
С1у 01у Зег О1у <Э1у С1у <31у Зег (31у С1у <31у С1у Зег С1у С1у 01у
245 250 255
<Э1у Зег <31у С1у С1у 61у Зег С1п 11е С1п Ьеи Уа1 (31п Зег 01у Рго
260 265 270
01и Ьеи Ьуз Ьуз Рго б1у 61и ТЬг Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а Зег
275 280 285
С1у РЬе ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг Зег Не Н13 Тгр Уа1 Ьуз О1п А1а Рго
290 295 300
С1у Ьуз С1у Ьеи Ьуз Тгр МеЬ С1у Тгр Не Азп ТЬг С1и ТЬг С1у О1и
305 310 315 320
Рго ТЬг Туг ТЬг Азр Азр РЬе Ьуз С1у Агд РЬе А1а РЬе Зег Ьеи νβΐ
325 330 335
ТЬг Зег А1а ТЬг ТЬг А1а Туг Ьеи С1п Не Азп Азп Ьеи Азп Азп С1и
340 345 350
Азр ТЬг А1а ТЬг РЬе РЬе Суз А1а Агд РЬе Не Туг Азр Рго Туг Тгр
355 360 365
01у РЬе А1а Туг тгр 01у 01п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег А1а А1а
370 375 380
Зег ТЬг Ьуз <31у Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег
385 390 395 400
ТЬг Зег С1у (31у ТЬг А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе
405 410 415
Рго О1и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег (31у А1а Ьеи ТЬг Зег 01у
420 425 430
Уа1 Низ ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Ьеи 01п Зег Зег 01у Ьеи Туг Зег Ьеи
435 440 445
Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЬг С1п ТЬг Туг
450 455 460
Не Суз Азп Уа1 Азп Низ Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз
465 470 475 480
Уа1 О1и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Низ ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго
485 490 495
- 161 015992
А1а Рго С1и Ьеи 500 Ьеи О1у С1у Рго Зег 505 Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго 510 Рго Ьуз
рго ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ Не Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1
515 520 525
Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег ΗΪ3 51и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг
530 535 540
Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Н13 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и
545 550 555 560
С1П Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Ηίθ
565 570 575
С1п Азр Тгр Ьеи Азп <31у Ьуз (31и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз
580 585 590
А1а Ьеи Рго А1а Рго Не (31и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз С1у СЯп
595 600 605
Рго Агд С1и Рго Θΐπ Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр О1и Ьеи
510 615 620
ТЬг Ьуз Азп <31п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз ьеи Уа1 ьуз (31у РЬе Туг Рго
625 630 635 640
Зег Азр Не А1а Уа1 01и Тгр О1и Зег Азп СЭ1у αΐη Рго (31и Азп Азп
645 650 655
Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр <31у Зег РЬе РЬе Ьеи
660 665 670
Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр (31п О1п С1у Азп Уа1
675 680 685
РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеЬ Н1з О1и А1а Ьеи Н13 Азп ΗΪ3 Туг ТЬг <31п
690 695 700
Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
705 710
<210> 32 <211> 2154 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 162 015992 <223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 32
саддЬссаас СддЕдсадСс ЬддадсСдад дЬдаадаадс сЪдддССсЬс адСдааддЪд 60
СссСдсаадд сЪСсСддсСа сасЬССсаса ассЬасСаЬС ЕдсасСдддС даддсаддсс 120
ссЬддасадд дасЬЬдадЬд даьддда^дд аСССаСссСд дзааСдССса СдсЪсадСас 180
ааЬдадаадС Ссаадддсад ддЬсасааЬс асСдсадаса ааСссассад сасадссЬас 240
аСддадсСса дсадссСдад дСсЬдаадаС асСдсддСсС аЪСасСдСдс аадаСссСдд 300
дааддесьес сЕЕаседддд ссаадддасс асддесассд ьссссесадд сддЪддаддд 360
СссддСдддд дсддаСсСдд дддсддсдда СссддСддСд дЬддЪадСда саГЬсадаСд 420
асссад^сЕс сСадсСссаС дЬссдссЪса дЬаддадаса дддСсассаЪ сассСдсаад 480
дссадСсада аСдСдддСаС ЬааЬдСадсс СддСаСсаас адааассадд дааддсСссС 540
аааЕсасСда ьрСссЬсддс сСссСассдд СасадСддад СсссСЬссад арьсадсддс 600
адСддарсСд ддасадаЬСС сасрсссасс аСсадсадсс СссадссСда адасССсдса 660
ассСаЕССсС дьсадсааСа СдасассСаС ссаЪСсасдС есддссаддд СассааддСд 720
дадаЬсааад дсддСддадд дСссддСдда дддддсьсйд дадддддсдд СЬсадддддс 780
ддЕддаСсдд ддддаддедд сЬсссадаСс садСЕддСдс адСсСддасс ЬдадсЬдаад 840
аадссЪддад адасадСсаа даСсСссСдс ааддсСЕсСд дЬеьСассСЪ сасадасЕаС 900
ЬсааСасасЬ дддЪдаааса ддсСссадда аадддСЬ'Ьаа адСддаСддд сЬддаЬааас 960
асЬдадасЪд дСдадссаас аеаСасадаЬ дасССсаадд дасдаСЪСдс СЪСсСсЪСГд 1020
дСдассСсСд ссассасСдс сЕаСЛСдсад абсаасаасс СсаасааСда ддасасддсС 1080
асаСССССсЬ дЬдсЬадаСС сассСаедаь ссцеаеСддд ддССЪдсССа седдддссад 1140
дддасСсСдд СсасСдЬсСс сдсадсЬадс ассаадддсс саСсддЪсСЬ сссссСддса 1200
ссс&ссСсса ададсассЬс Ьдддддсаса даддсссЬдд дсСдссЪддЬ сааддасСас 1260
РСссссдаас сддСдасддС дСсдСддаас Ссаддсдссс Сдассадсдд сдСдсасасс 1320
СЬсссддсСд СссеасадЬс сСсаддасрс СасСсссрса дсадсдъдде дассдрдссс 1380
СссадсадсС Сдддсассса дассРасаСс СдсаасдСда аСсасаадсс садсаасасс 1440
ааддСддаса адааадССда дсссаааЬсС едедасаааа сСсасасаСд сссассдсдс 1500
ссадсассСд аасСссЪддд дддассдЕса дьссессесь ессссссааа асссааддас 1560
асссесаеда есЬсссддас сссСдаддЕс асаСдсдЕдд ЪддЬддасдС дадссасдаа 1620
дасссСдадд есаадЬСсаа сЬддСасдСд дасддсдСдд аддЪдсаСаа Сдссаадаса 1680
аадссдсддд аддадсадЬа саасадсасд СассдСдъдд ЬсадсдЬссЬ сассдессед 1740
сассаддасЪ ддсЕдааЬдд сааддадСас аадСдсаадд СсСссаасаа адсссЬссса 1800
- 163 015992
дсссссаСсд адаааассаС сСссааадсс ааадддсадс сссдадаасс асаддСдСас 1850
аассСдсссс саСсссддда СдадсСдасс аадааасадд СсадссСдас сСдссСддьс 1920
аааддсСС.с'С аСсссадсда саСсдссдСд дадСдддада дсааСдддса дссддадаас 1980
аасСасаада ссасдссесс сдСдсЬддас СссдасддсС ссессссссь сСасадсаад 2040
сЬсассдСдд асаададсад дЬддсадсад дддаасдСсС СсСсаЬдсСс сдСдаСдсаС 2100
даддсСсСдс асаассасСа сасдсадаад адссСсСссс СдЬсСссддд седа 2154
<210> 33 <211> 717 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 33
<31п Уа1 С1п ьеи Уа1 Й1п Зег 31у А1а <31и Уа1 Ьуз Ьуз Рго 31у зег
1 5 10 15
Зег Уа1 Ьуз иа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг ТЬг Туг
20 25 30
Туг Ьеи ΗΪ3 Тгр Уа1 Агд σΐη А1а Рго С1у 31п 61у Ьеи 31и Тгр МеС
35 40 45
31у Тгр 11е Туг Рго С1у Азп Уа1 Ηίθ А1а Θΐη Туг Азп О1и Ьуз РНе
50 55 60
Ьуз С1у Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг А1а Азр Ьуз Зег ТНг Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
МеЬ Е1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Зег Тгр С1и 61у РЬе Рго Туг Тгр 31у <31п С1у ТИг ТИг ν&1
100 105 110
ТЬг Уа1 Зег Зег <31у С1у <31у С1у Зег <31у <31у С1у С1у Зег С1у С1у
115 120 125
<31у Н1у Зег С1у С1у <31у <31у Зег Азр Не <31п МеС ТЬг 61п Зег Рго
130 135 140
- 164 015992
Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу Азр Агд УаЬ ТЬг ТЬе ТЬг Суз Ьуз
145 150 155 160
АЬа Зег СЬп Азп УаЬ СЬу ТЬе Азп УаЬ АЬа Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго
165 Ь70 175
СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Зег Ьеи ТЬе Зег Зег АЬа Зег Туг Агд Туг Зег
180 185 190
СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег СЬу ТЬг Азр РЬе ТНг
195 200 205
Ьеи ТЬг ТЬе Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи Азр РЬе АЬа ТЬг Туг РЬе Суд
210 215 220
СЬп СЬп Туг Азр ТЬг Туг Рго РЬе ТЬг РЬе СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьуз УаЬ
225 230 235 240
СЬи ТЬе Ьуз СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу СЬу СЬу
245 250 255
СЬу Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬп ЬЬе СЬп Ьеи
260 265 270
УаЬ СЬп Зег СЬу РГО СЬи Ьеи Ьуз Ьуз РГО СЬу СЬи ТЬг УаЬ ьуз Ые
275 280 285
Зег Суз Ьуз АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг Зег ЬЬе ΗΪ3 Тгр
290 295 300
УаЬ Ьуз СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи Ьуз Тгр Мек СЬу Тгр ЬЬе Азп
305 310 ЗЬ5 320
ТЬг СЬи ТЬг СЬу СЬи Рго ТЬг Туг ТЬг Азр Азр РЬе Ьуз СЬу Агд РЬе
325 330 335
А1а РЬе Зег Ьеи УаЬ ТЬг Зег АЬа ТЬг ТЬг АЬа Туг Ьеи СЬп Ые Азп
340 345 350
Азп Ьеи Азп Азп СЬи Азр ТЬг АЬа ТЬг РЬе РЬе Сув АЬа Агд РЬе Ые
355 360 365
Туг Азр Рго Туг Тгр СЬу РЬе АЬа Туг тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьеи УаЬ
370 375 380
ТЬг УаЬ Зег АЬа А1а Зег ТЬг Ьуз СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Рго Ьеи АЬа
385 390 395 400
Рго Зег Зег Ьуз Зег Ткг Зег СЬу СЬу ТЬг АЬа АЬа Ьеи СЬу Суз Ьеи
405 410 415
- 165 015992
Уа1 Ьуз Азр Туг 420 РЬе Рго СНи Рго Уа1 425 ТИг Уа1 Зег Тгр Азп 430 Зег О1у
А1а Ьеи ТЬг Зег 01у Уа1 Нтз ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Ьеи 01п Зег Зег
435 440 445
О1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи
450 455 460
С1у ТЬг С1п ТЬг Туг Т1е Суз Азп Уа1 Азп Н13 Ьуз РГО Зег Азп ТЬг
465 470 475 480
Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз Уа1 С1и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Нтз ТЬг
485 490 495
Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи αίγ С1у Рго Зег Уа1 РЬе
500 505 510
Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мек 11е Зег Агд ТЬг Рго
515 520 525
01и ν31 ТЬг Суз \7а1 Уа1 νθΐ Азр Уа1 Зег Нтз СЛи Азр Рго 01и Уа1
530 535 540
ьуз РЬе АЗП тгр туг Уа1 Азр С1у Уа1 01и Уа1 Н1з АЗП А1а Ьуз ТЬг
545 550 555 560
Ьуз Рго Агд 01и СНи 01п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1
565 570 575
Ьеи ТЬг йа1 Ьеи Нтз С1п Азр Тгр Ьеи Азп 01у Ьуз (Ни Туг Ьуз Суз
580 585 590
Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е □1и Ьуз ТЬг 11е Зег
595 600 605
Ьуз А1а Ьуз С1у 01п Рго Агд СИи Рго 01п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго
610 615 620
Зег Агд Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1
625 630 635 640
Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр СНи Зег Азп 01у
64 5 650 655
С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр
660 665 670
С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр
575 580 685
- 166 015992
<31п <31 η <31у Авп Уа1 РЬе Зег Сув Зег Уа1 695 МеС ΗΪ3 С1и А1а Ьеи Нтз 700
690
Ав η Н13 Туг ТЬг С1п Ьув Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 61у
705 710 715
<210> 34 <211> 1773 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 34
саддЬссаас Ьддедсадес ЬддадсЬдад дедаадаадс седддессес адедааддед 60
ЬссЬдсаадд сеесСддсеа сасЬЬесаса ассеасеаее едсаседдде даддсаддсс 120
сседдасаде дссеедадед даедддаедд аъееаессед даааедееса едсесадеас 180
ааЬдадааде Ьсаадддсад ддЬсасааЬс асЬдсадаса ааессассад сасадссеас 240
аЬддадсЬса дсадссЬдад дЬсЬдаадае асЬдсддЬсе аЬеасЬдЪдс аадаЬссЬдд 300
дааддееЬЬс сЬЬасЬдддд ссаадддасс асддЬсассд ЬсессЬсадд едддддсдда 360
есЬдддддсд дсддаЬссдд ЬддЬддеддЬ адЪдасаЬЬс адаЬдассса дЬсессЬадс 420
ЬсссЬдессд ссЬсадЬадд адасадддес ассаЬсассЬ дсааддссад есадааедЬд 480
ддеаСЬааед еадсседдЬа есаасадааа ссадддаадд сессЬаааес аседаееесс 540
есддссессе ассддъасад еддадесссе ессадаееса дсддсадедд аеседддаса 600
даееесасес Ьсассаесад садссессад сседаадасе есдсаассеа сееседесад 660
сааеаЪдаса ссьаессаее сасдеесддс ЬдсддСасса аддСддадае саааддсддС 720
ддадддессд деддаддддд сеседдаддд ддсддеесад ддддсддедд аесдддддда 780
ддЬддсЬссс адаЬссадее ддЬдсадЬсЬ ддассЬдадс едаадаадсс Сддададаса 840
дСсаадаЪсС ссЬдсааддс ееседдееее ассеесасад асСаЬЬсаае асасЬдддЬд 900
ааасаддсЬс саддаааддд еееааадедд аСдддсЬдда еааасасЬда даседдедад 960
ссаасаЬаЬа садаЬдасеЬ саадддасда ееедссеьсе сеЬЬддедас сЬсЬдссасс 1020
аседссеаЬе едсадаЪсаа саассесаас ааЬдаддаса сддсЬасаее еееседедсе 1080
адаЬЬсаесЬ аЬдаЬссЬеа еЬдддддЬее дсЬЬасЬддд дссаддддас ЬседдСсасЬ 1140
дЬсессдсад сЬадсассаа дддсссаЬсд дЬсеессссс ЬддсасссЬс сессаададс 1200
- 167 015992
ассесьдддд дсасадсддс ссСдддсЬдс сСддСсаадд асСасСЪссс сдаассддЬд 1260
асддСдСсдС ддаасСсадд сдсссЬдасс адсддсдЬдс асассЬСссс ддсСдСссба 1320
садбссСсад дасСсСасЬс ссъсадсадс дСддЬдассд ЬдсссСссад садсССдддс 1380
асссадассС асабсЬдсаа сдбдааСсас аадсссадса асассаадде ддасаадааа 1440
дТЬдадссса ааСоъсдЬда саааасЬсас асаЬдсссас сдСдсссадс ассСдаасЬс 1500
сбддддддас сдСсадСсЪС ССЪСЬЧСССС ссаааассса аддасасссь саЬдаЬсСсс 1560
сддассссЬд аддссасаЬд сдЬддСддбд дасдСдадсс асдаадассс СдаддСсаад 1620
ЬЬсаасСддС асдЬддасдд сдсддаддсд саСааСдсса адасааадсс дсдддаддад 1680
садСасааса дсасдьассд СдЬддЬсадс дСссСсассд СссСдсасса ддасСддсСд 1740
аабддсаадд адСасаадЬд сааддбсСсс аас 1773
<210> 35 <211> 712 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 35
С1П Уа1 С1П Ьеи Уа1 С1П Зег 61у А1а СЛи Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у Зег
1 5 10 15
Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег <31у Туг ТЬг РЬе ТЬг ТЬг Туг
20 25 30
Туг Ьеи ΗΪΒ Тгр Уа1 Агд 61П А1а Рго 01у Θΐη Суз Ьеи С1и Тгр МеС
35 40 45
01у Тгр Не Туг Рго О1у Азп Уа1 Н1я А1а <Э1п Туг Азп С1и Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз <31у Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг А1а Азр Ьуз Зег ТЬг Зег ТЬг АЬа Туг
65 70 75 80
МеС С1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег С1и Азр ТЬг АЬа Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Зег Тгр СЬи С1у РЬе Рго Туг Тгр <31у <Э1п <31у ТНг ТЬг Уа1
100 105 110
- 168 015992
ТЬг УаЬ Зег 115 Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег 120 СЬу СЬу СЬу СЬу 125 Зег СЬу СЬу
01у СЬу Зег Азр Не СЬп МеЬ ТЬг СЬп Зег Рго Зег- Зег Ьеи Зег АЬа
130 135 140
Зег УаЬ ЕЬу Азр Агд УаЬ ТЬг Не ТЬг Суз Ьуз АЬа Зег СЬп Азп УаЬ
145 Ь50 155 Ь60
СЬу Не Азп УаЬ АЬа Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго ьуз
165 170 175
Зег Ьеи ЬЬе Зег Зег АЬа Зег Туг Агд Туг Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд
180 185 190
РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег
195 200 205
Ьеи СЬп Рго СЬи Азр РЬе А1а ТЬг Туг РЬе Суз СЬп СЬп Туг Азр ТЬг
210 215 220
Туг Рго РЬе ТЬг РЬе СЬу Суз С1у ТЬг Ьуз Уа1 СЬи не Ьуз СЬу СЬу
225 230 235 240
СЬу СЬу Зег СЬу СЬу СЬу С1у Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу СЬу СЬу
245 250 255
СЬу Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬп ЬЬе СЬп Ьеи УаЬ СЬп Зег СЬу Рго
260 265 270
СЬи Ьеи Ьуз Ьуз Рго СЬу СЬи ТЬг УаЬ Ьуз Не Зег Суз Ьуз АЬа Зег
275 290 285
СЬу РЬе тъг РЬе ТЬг Азр Туг Зег Не ΗΪ3 Тгр УаЬ Ьуз СЬп АЬа РГО
290 295 300
СЬу Ьуз СЬу Ьеи Ьуз тгр МеЬ СЬу Тгр Не Азп ТЬг СЬи ТЬг СЬу СЬи
305 310 315 320
Рго ТЬг Туг ТЬг Азр Азр РЬе Ьуз СЬу Агд РЬе АЬа РЬе Зег Ьеи УаЬ
325 330 335
ТЬг Зег А1а ТЬг ТЬг АЬа Туг Ьеи СЬп Не Азп Азп Ьеи Азп Азп СЬи
340 345 350
Азр ТЬг А1а ТЬг РЬе РЬе Суз АЬа Агд РЬе Пе Туг Азр Рго Туг Тгр
355 360 365
СЬу РЬе АЬа Туг Тгр СЬу С1п СЬу ТЬг Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег АЬа АЬа
370 375 330
- 169 015992
Зег 335 ТЬг Ьуз 01. у Рго Зег Уа1 390 РЬе Рго Ьеи А1а 395 Рго Зег Зег Ьув Зег 400
ТЬг Зег С1у О1у ТЬг А1а А1а Ьеи 01у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе
405 410 415
Рго С1и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег 01у А1а Ьеи ТЬг Зег 01у
420 425 430
Уа1 ΗΪ8 ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Ьеи 01П Зег Зег 01у Ьеи Туг Зег Ьеи
435 440 445
Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго зег Зег Зег Ьеи С1у ТЬг 01п ТЬг Туг
450 455 460
11е Суз Азп Уа1 Азп Нхз Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз
465 470 475 480
Уа1 С1и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Н1з ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго
485 490 495
А1а Рго 01и Ьеи Ьеи <31у 01у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз
500 505 510
Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мек Не Зег Агд ТЬг РХО О1и Уа1 ТЬг Суз Уа1
515 520 525
Уа1 Уа1 Аар Уа1 Зег Ыз О1и Азр Рго О1и Уа1 Ьув РЬе Азп Тгр Туг
530 535 540
Уа1 Азр 01у Уа1 <31и Уа1 Ηίδ Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и 01и
545 550 555 560
О1п туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Н1з
565 570 575
С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз
530 585 590
А1а Ьеи Рго А1а Рго Не (Ни Ьуз ТЫ Не Зег Ьуз А1а Ьуз 01у 01-1
595 600 605
Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ты Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи
610 615 620
ТЬг Ьуз Азп 01п Уа1 Зег Ьеи ТЬГ Суз Ьеи Уа1 Ьуз <31у РЬе Туг Рго
625 630 635 640
Зег Азр 11е А1а Уа1 01и Тгр С1и Зег Азп 31у 01п Рго 01и АЗП АЗП
645 550 655
- 170 015992
Туг Ьуз ТЬг ТЬг 660 Рго Рго Уа1 Ьеи Азр 665 Зег Авр <31у Зег РЬе 670 РЬе Ьеи
Туг Зег Ьуз ьеи ТЬг Уа1 Азр ьуз Зег Агд Тгр С1п Θΐη С1у Азп Уа1
675 680 685
РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеЬ Η1Ξ (31и А1а Ьеи ΗΪΞ АЗП Н1з Туг ТЬг О1П
690 695 700
Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго Э1у
70Б 710
<210> 36 <211> 2154 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 36
саддессаас СддЬдсадСс СддадсЬдад дрдаадаадс сЬдддСссСс адЬдааддСд 60
ЬссЬдсаадд сЬЬссддсЬа сасЬЬЬсаса ассСасЬаЬЬ СдсасЕдддЬ даддсаддсс 120
ссСддасадь дссеедадЬд дасдддасдд аьссасссьд даааСдССса идсьсадсас 180
ааСдадаадС Ьсаадддсад ддСсасааСс асСдсадаса ааСссассад сасадссСас 240
аЬддадсСса дсадссЬдад дЕсСдаадаЬ асЕдсддЬсС аССасСд-Ьдс аадаЬссСдд 300
дааддьсесс сСЛасЬдддд ссаадддасс асддьсассд СсСссЬсадд сддеддаддд 360
ьсаддТдддд дсддаСсьдд дддсддсдда ЬссддСддрд дСддЬадСда саССсадаСд 420
асссадьсьс срадсссссс дСссдссСса дСаддадаса дддСсассаЬ сассСдсаад 480
дссадЬсада аЬдСдддСаЬ СааЬдЬадсс СддСаЬсаас адааассадд дааддсЬссЬ 540
аааСсасСда СССссСсддс сЬссСассдд СасадСддад ЬсссСЬссад аСЬсадсддс 600
адеддаСоСд ддасадаСЬС сасСсСсасс аесадсадсс ЬссадссСда адасСЪсдса 660
ассСаССЪсС дСсадсааСа СдасассьаС ссасьсасдс Ссддсрдсдд Ьассааддсд 720
дадаЬсааад дсддЬддадд дЬссддЬдда дддддсссьд дадддддсдд ЬСсадддддс 780
ддЬддаесдд ддддаддЬдд сЬсссадаЕс садЬЪддСдс адСсСддасс СдадсСдаад 840
аадссЕддад адасадСсаа даСсЬссЬдс ааддсСЬсЬд дССССассСС сасадасЬаЬ 900
СсааЕасасЬ дддЬдаааса ддсЬссадда аадддЬСЬаа адЬддаЬддд сЬддаСааас 960
- 171 015992
асЕдадасЕд дЬдадссаас аЕаЕасадаЕ дасЕЕсаадд дасдаЕЕЕдс сЕЕсЕсЕЕЕд 1020
дЕдассЕсЕд ссассасЕдс сЕаЕЕЕдсад аЕсаасаасс ЕсаасааЕда ддасасддсЕ 1080
асаЕЕЕЕЕсЕ дЕдсЕадаЫ саЕсЕаЕдаЕ ссЕЕаЕЕддд ддЕЕЕдсЕЕа сЕддддссад 1140
дддасЕсЕдд ЕсасЕдЕсЕс сдсадсЕадс ассаадддсс саЕсддЕсЕЕ сссссЕддса 1200
сссЕссЕсса ададсассЕс Едддддсаса дсддсссЕдд дсЕдссЕддЕ сааддасЕас 1260
ЕЕссссдаас сддЕдасддЕ дЕсдЕддаас Есаддсдссс Едассадсдд сдЕдсасасс 1320
ЕЕсссддсЕд ЕссЕасадЕс сЕсаддасЕс ЕасЕссоЕса дсадсдЕддЕ дассдЕдссс 1330
ЕссадсадсЕ Едддсассса дассЕасаЕс ЕдсаасдЕда аЕсасаадсс садсаасасс 1440
ааддЕддаса адааадЕЕда дсссаааЕсЕ ЕдЕдасаааа сЕсасасаЕд сссассдЕдс 1500
ссадсассЕд аасЕссЕддд дддассдЕса дЕСЕЕссЕсЕ Ессссссааа асссааддас 1560
асссЕсаЕда ЕсЕсссддас сссЕдаддЕс асаЕдсдЕдд ЕддЕддасдЕ дадссасдаа 1620
дасссЕдадд ЕсаадЕЕсаа сЕддЕасдсд дасддсдЕдд аддЕдсаЕаа Едссаадаса 1680
аадссдсддд аддадсадЕа саасадсасд ЕассдъдЕдд ЕсадсдЕссЕ сассдЕссЕд 1740
сассаддасЕ ддсЕдааЕдд сааддадЕас аадЪдсаадд ЕсЕссаасаа адсссЕссса 1800
дсссссаЕсд адаааассаС. сЕссааадсс ааадддсадс сссдадаасс асаддСдЕас 1860
асссЕдсссс саЕсссддда ЕдадсЕдасс аадаассадд ЕсадссЕдас сЕдссЕддЕс 1920
аааддсЕЕсЕ аЕсссадсда саЕсдссдЕд дадедддада дсааЕдддса дссддадаас 1980
аасЕасаада ссасдссьсс сдЕдсЕддас ЕссдасддсЕ ссЕЕсЕЕссЕ сЕасадсаад 2040
сЕсассдЕдд асаададсад дЕддсадсад дддаасдЕсЕ ЕсЕсаЕдсЕс сдЕдаЕдсаЕ 2100
даддсЕсЕдс асаассасЕа сасдсадаад адссЕсЕссс ЕдЕсЕссддд ЕЕда 2154
<210> 37 <211> 717 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 37
Е1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1п Зег С1у А1а С1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у Зег
1 5 10 15
Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг ТЬг Туг
20 25 30
172 015992
туг Ьеи ΗΪ3 35 Тгр Уа1 Агд О1п А1а 40 Рго С1у С1п Суз Ьеи 45 (31и Тгр МеЬ
С1у Тгр Не Туг Рго С1у Азп Уа1 ΗΪ3 А1а С1п Туг Азп С1и Ьуз РЬе
50 55 60
Ьуз С1у Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг А1а Авр Ьуз Зег ТЬг Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
МеТ О1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Зег Тгр С1и С1у РЬе Рго Туг Тгр СЯу С1п <31у ТЬг ТЬг Уа1
100 105 110
ТЬг Уа1 Зег Зег С1у С1у С1у С1у Зег СЯу С1у С1у <31у Зег СЯу С1у
115 120 125
<Э1у С1у Зег 01у С1у 61у С1у Зег Азр 11е С1п Мер ТЬг 61п Зег Рго
130 135 140
Зег 8ег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз ьуз
145 150 155 160
А1а Зег СЯл Азп Уа1 С1у 11е Азп Уа1 А1а Тхр Туг <31п <31п Ьуз Рго
165 170 175
С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи Не Зег Зег А1а Зег Туг Агд Туг Зег
180 185 190
<31у Уа1 Его Зег Агд РЬе Зег <31у Зег <31у Зег <Э1у ТЬг Азр РЬе ТЬг
195 200 205
Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи (31п Рго <Э1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг РЬе Суз
210 215 220
01 η С1п Туг Азр ТЬг Туг Рго РЬе ТЬг РЬе С1у Суз С1у ТЬг Ьуз Уа1
225 230 235 240
О1и Не Ьуз <Э1у С1у С1у О1у Зег О1у С1у 61у С1у Зег <31у 01у С1у
245 250 255
О1у Зег О1у С1у О1у С1у Зег С1у О1у С1у С1у Зег О1П Не 01П Ьеи
260 265 270
Уа1 С1п Зег 01у Рго 61и Ьеи Ьуз Ъуз Рго СЯу С1и ТЬг Уа1 Ъуз Не
275 280 285
Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг Зег Не Н1з Тгр
290 295 300
- 173 015992
УаЬ Ьуз С1п АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи ьуз Тгр мес СЬу Тгр ЬЬе Азп
305 310 315 320
ТЬг СЬи ТЬг СЬу СЬи Рго ТЬг Туг ТЬг Азр Азр РЬе Ьуз СЬу Агд Рйе
325 330 335
АЬа РЬе Зег Ьеи УаЬ ТЬг Зег АЬа ТЬг ТЬг АЬа Туг Ьеи СЬп Ые Азп
340 345 350
Азп Ьеи Азп Азп СЬи Азр ТЬг АЬа ТЬг РЬе РЬе Суз АЬа Агд РЬе ЬЬе
355 360 365
Туг Азр Рго Туг Тгр СЬу РЬе АЬа Туг Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьеи УаЬ
370 375 380
ТЬг УаЬ Зег АЬа АЬа Зег ТЬг Ьуз СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Рго Ьеи АЬа
385 390 395 400
Рго Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Зег СЬу СЬу ТЬг АЬа АЬа Ьеи СЬу Суз Ьеи
405 410 415
УаЬ Ьуз Азр Туг РЬе Рго СЬи Рго УаЬ ТЬг УаЬ Зег Тгр Азп Зег СЬу
420 425 430
АЬа Ьеи ТЬг Зег СЬу УаЬ НЬз ТЬг РЬе РГО АЬа УаЬ ьеи СЬп Зег Зег
435 440 445
СЬу Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег УаЬ УаЬ ТЬг УаЬ Рго Зег Зег Зег Ьеи
450 455 460
СЬу ТЬг СЬп ТЬг Туг ЬЬе Суз Азп УаЬ Азп НЬз Ьуз Рго Зег Азп ТЬг
465 470 475 480
Ьуз УаЬ Азр Ьуз Ьуз УаЬ СЬи Рго Ьуз зег Суз Азр Ьуз ТЙГ НЬз ТЙГ
485 490 495
Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго СЬи Ьеи Ьеи СЬу СЬу Рго Зег УаЬ Рйе
500 505 510
Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Ней ЬЬе Зег Агд ТЬг Рго
515 520 525
СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег НЬз СЬи Азр Рго СЬи УаЬ
530 535 54 0
Ьуз РЬе Азп Тгр Туг УаЬ Аэр СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп А1а Ьуз Тйг
545 550 555 560
Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд УаЬ УаЬ Зег УаЬ
565 570 575
- 174 015992
ьеи ТНг Уа1 Ьеи 580 ΗΪ3 <31п Азр Тгр Ьеи Азп <31у Ьуз <Э1и Туг Ьуз Суз
585 590
Ьуз νβΐ Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго Не С1и Ьуз ТИг Не Зег
5Э5 600 605
Ьуз А1а ьуз <з1у С1п Рго Агд <31и Рго (31п Уа1 туг ТНг Ьеи Рго Рго
610 615 620
8ег Агд Азр О1и Ьеи ТНг Ьуз Азп ат νβΐ Зег Ьеи ТИг Суз Ьеи Уа1
625 630 635 640
Ьуз О1у РЬе Туг РГО Зег Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр <31и Зег Азп С1у
645 650 655
О1П РГО С1и Азп АЗП Туг Ьуз ТЬг ТНг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр
660 665 670
С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр
675 680 685
<31п (31п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеЬ Нгз С1и А1а Ьеи ΗΪΞ
690 695 700
Азп Н13 Туг ТЬг <31п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
705 710 715
<210> 38 <211> 64 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 38 дддддЬддаЬ ссддЬддадд дддсЬссддс ддНддсдддЬ сссадднсса асъддТдсад 60
ЪсЬд 64 <210> 39 <211> 30 <212> ДНК
- 175 015992 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 39 ^99333с99с дзЗ^ссддУд З^ЗЗ^ЗЗ^аЗ 30 <210> 40 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид · <400> 40
Ьассассасс ассддасссд ссдсссссад 30 <210> 41 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 41 дЪЪаасддаС ссЪсаЕССда СсСссассГС дд 32 <210> 42 <211> 48 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 176 015992 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 42
Ессддсдддд дЕддаЕссдд Еддадддддс ЕссддсддЕд дсдддЕсс 48 <210> 43 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 43
Зег С1у (31у О1у С1у Зег (31у 31у <31у <31у Зег С1у (31у С1у б1у Зег
10 15 <210> 44 <211> 2115 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 44
садаЕссадЕ ЕддЕдсадЕс ЕддассЕдад сЕдаадаадс сЕддададас адЕсаадаЕс 60
ЕссЕдсаадд сЕЕСЕддЕЕЕ ЕассЕЕсаса дасЕаЕЕсаа ЕасасЕдддЕ дааасаддсЕ 120
ссаддааадд дЕЕЕааадЕд даЬдддсЕдд аЕааасасЕд адасЕддЕда дссаасаЕаС 180
асадаЕдасЕ Есаадддасд аЕЕЕдссЕЕс ЕсЕЕЕддЕда ссЕаЕдссас сасЕдссЕаЕ 240
ЕЕдаадаЕса асаассЕсаа сааЕдаддас асддсЕасаЕ ЕЕЕЕсЕдЕдс ЕадаЕЕсаЕс 300
ЕаЕдаЕссЕЕ аЕЕдддддЕЕ ЕдсЕЕасЕдд ддссадддда сЕсЕддЕсас ЕдЕсЕссдса 360
дсЕадсасса адддсссаЕс ддЕсЕЕсссс сЕддсасссЕ ссЕссаадад сассЕсЕддд 420
- 177 015992
ддсасадсдд сссЬдддсЕд ссЬддЕсаад дасЬасЪЪсс ссдаассддЬ дасддЬдЬсд 480
ЬддаасЬсад дсдсссЬдас садсддсдЬд сасассЬЬсс сддсЬд^ссЬ асадГссЪса 540
ддасСсСасЪ сссгсадсад сдсддСдасс дЪдсссссса дсадсЪЬддд сасссадасс 600
СасаесСдса асдсдааСса саадсссадс аасассаадд Сддасаадаа адСЕдадссс 660
аааГсьсдсд асаааасьса сасасдссса ссдЪдсссад сассЬдаасЬ ссЬдддддда 720
ссдЬсадСсС ЪссСс-еъсас сссаааассс ааддасассс ЬсаСдаГсПс ссддассссЬ 780
даддВсасаП дсдПддСддЪ ддасдЪдадс сасдаадасс сЬдаддТсаа дЪЕсаасЪдд 840
ЬасдЬддасд дсдСддаддЬ дсаЬааЕдсс аадасааадс сдсдддадда дсадЪасаас 900
адсасдЪасс Э^дЬддЪсад сдЬссТсасс дЪссОдсасс аддасЪддсС дааЪддсаад 960
дадЪасаадЬ дсаадд^сГс саасааадсс сесссадссс ссаесдадаа аассаГсГсс 1020
ааадссааад ддсадссссд адаассасад дъдгасассс СдсссссаПс ссдддаЪдад 1080
спдассаада ассаддСсад ссГдассСдс сЬддЪсааад дсССсьаГсс садсдасаСс 1140
дссдСддадС дддададсаа Ьдддсадссд дадаасаасС асаадассас дссСсссдПд 1200
сЪддасПссд асддсСссСЬ адсаадсСса ссдСддасаа дадсаддЬдд 1260
садсадддда асдЬсЬЪскс аСдсЬссдЬд аЬдсаЪдадд сЪсСдсасаа ссасЬасасд 1320
садаададсс ЬсЬсссПдЪс ЬссдддСааа Ъссддсдддд дЬддаЬссдд Ьддадддддс 1380
СссддсддСд дсдддСссса ддСссаасСд дСдсадГсСд дадсСдаддС даадаадссС 1440
дддГссЬсад СдааддСдСс сСдсааддсС СсСддсСаса сСССсасаас ссассаспсд 1500
сасСдддВда ддсаддсссс Сддасаддда сгСдадЪдда ЪдддаЪддаС ЪСаСссГдда 1560
ааСдЬСсаЬд сСсад^асаа СдадаадССс аадддсаддд СсасааСсас Сдсадасааа 1620
Ьссассадса садссЬасаЪ ддадсГсадс адссТдаддС сСдаадаЪас СдсддЪсЬаЬ 1680
ЕасЬдЬдсаа даСссЪддда аддЬЪЬЪссЬ СасЬддддсс аадддассас ддЬсассдСс 1740
ЬссЪсаддГд ддддсддаСс ьдддддсддс дддСссддЬд дЬддьддьад ЕдасаГЪсад 1800
аЬдасссадС. сЬссСадсСс ссЬд'Ьссдсс ЕсадГаддад асаддд1:сас саГсассСдс 1860
ааддссадсс адаа^дъддд ъаъсааъд^а дссиддсаъс аасадааасс адддааддсЬ 1920
ссГаааВсас СдаПСЬссСс ддссЪссВас сддеасадСд дадСсссЪСс садаССсадс 1980
ддсадЬддаС сСдддасада ъепсасъсгс ассаСсадса дссЬссадсс ЬдаадасЪЪс 2040
дсаассСаСЬ ЬсСдЬсадса аЬаСдасасс ЬаЬссаЫса сдЬЬсддсса дддЬассаад 2100
д^здадаьса ааЬда 2115
<210> 45 <211> 704 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 178 015992 <220 >
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 45
31п Ые С1п Ьеи Уа1 С1п Зег С1у Рго <31и Ьеи Ьуз Ьуз Рго С1у 31и
1 5 10 15
ТИг Уа1 Ьуз Ые Бег Суз Ьуз А1а Зег □1у РЬе ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг
20 25 30
Зег Не Н1з Тгр иа1 Ьуз <31п А1а Рго О1у Ьуз <31у Ьеи Ьуз Тгр Мес
35 40 45
С1у Тгр Ые Азп ТЬГ <31и ТЬг <31у С1и РГО ТЬг Туг ТЬг Азр АЗр РЬе
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе А1а РЬе зег Ьеи Уа1 ТЬг зег А1а ТЬг ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Ые Азп Азп Ьеи Азп Азп Б1и Азр ТЬг А1а ТЬг РЬе РЬе Суз
85 90 95
А1а Агд ₽Ье Ые Туг Азр Рго Туг Тгр С1у РЬе А1а Туг Тгр О1у Θΐη
100 105 110
61у ТИг ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Бег А1а А1а зег ТЬг Ьуз (31у Рго Бег ν&1
115 120 125
РНе РГО ьеи А1а Рго Зег Зег ьуз зег ТЬг Зег О1у 61у ТЬг А1а А1а
130 135 14 0
Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз АЗр Туг РЬе Рго С1и РГО Уа1 ТЬг Уа1 Бег
145 150 155 160
тгр АЗП Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Бег С1у νβΐ Н13 ТЬг РЬе Рго А1а Уа1
165 170 175
Ьеи С1п Бег Бег С1у ьеи туг Бег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 РГО
180 185 190
Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЬг С1п ТЬг туг Ые Суз Азп Уа1 Азп ΗΪ3 Ьуз
195 200 205
Рго Бег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз Уа1 С1и Рго Ьуз Бег Суз Азр
210 215 220
- 179 015992
Ьуз ТЬг НЬз ТЬг Сув Рго Рго Суз Рго АЬа Рго СЬи Ьеи Ьеи СЬу СЬу
225 230 235 240
Рго Зег УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Авр ТЬг Ьеи МеЕ Не
245 250 255
Зег Агд ТНг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег Н13 СЬи
260 265 270
Азр Рго СЬи УаЬ Ьуз РЬе Азп Тгр туг Уа1 Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ Н1е
275 280 285
Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп Туг Азп Зег ТЙГ Туг Агд
290 295 300
УаЬ Уа1 Зег УаЬ Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи НЬз СЬп Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз
305 310 315 320
СЬи Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз АЬа Ьеи Рго А1а Рго Не СЬи
325 330 335
Ьуз Тйг Не Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ туг
340 345 350
ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр СЬи Ьеи ТЬг Ьуз АВП СЬп Уа1 Зег Ьеи
355 360 365
Тйг Суз Ьеи УаЬ Ьуз СЬу РЬе Туг Рго Зег Авр Не АЬа УаЬ СЬи Тгр
370 375 380
С1и Зег Азп СЬу СЬп Рго СЬи Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго УаЬ
385 390 395 400
Ьеи Азр Зег Азр СЬу Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр
405 410 415
Ьуз Зег Агд Тгр С1п СЬп СЬу Азп УаЬ РЬе Зег Суз Зег УаЬ МеЕ ΗΪ5
420 425 430
С1и АЬа Ьеи НЬз Азп нхз Туг Тйг <31п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго
435 440 445
СЬу Ьуз Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу С1у СЬу
450 455 460
СЬу Зег С1п Уа1 СЬп Ьеи УаЬ СЬп Зег СЬу АЬа СЬи УаЬ Ьуз Ьуз Рго
465 470 475 480
С1у Зег Зег УаЬ Ьуз УаЬ Зег Суз Ьуз А1а Зег СЬу Туг ТЬг Рйе тйг
485 490 495
- 180 015992
ТЬг Туг Туг Ьеи НЬз 500 Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа 505 Рго СЬу СЬп СЬу 510 Ьеи СЬи
Тгр МеЬ □Ьу Тгр 1Ье Туг Рго СЬу Азп УаЬ НЬз АЬа СЬп Туг Азп СЬи
5Ь5 520 525
Ьуз РЬе Ьуз □Ьу Агд УаЬ ТЬг 1Ье ТЬг АЬа Азр Ьуз Зег ТЬг Зег ТЬг
530 535 540
АЬа Туг МеЬ СЬи Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег СЬи Авр ТЬг АЬа УаЬ Туг
545 550 555 560
Туг Суз АЬа Агд Зег Тгр СЬи СЬу РЬе Рго Туг Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг
565 570 575
ТЬг УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег СЬу СЬу СЬу □Ьу Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег
580 585 590
СЬу СЬу СЬу СЬу Зег Азр ЬЬе СЬп МеЬ ТЬг СЬп Зег Рго Зег Бег Ьеи
595 600 605
Бег АЬа Зег УаЬ СЬу Азр Агд УаЬ ТЬг 1Ье ТЬг Суз ьуз АЬа Зег СЬп
610 615 520
Азп УаЬ СЬу ЬЬе Азп УаЬ АЬа Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз РГО СЬу Ьуз АЬа
625 630 635 640
Рго Ьуз Зег Ьеи ЬЬе Бег Зег А1а Зег Туг Агд Туг Зег СЬу УаЬ РГО
645 650 655
Зег Агд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег СЬу ТЬг Азр РЬе ТЫ Ьеи ТЬг ЬЬе
660 665 670
Зег Зег Ьеи С1п Рго СЬи Азр РЬе АЬа ТЬг Туг РЬе Суз СЬп СЬп Туг
675 680 685
Азр ТЬг Туг Рго РЬе ТЬг РЬе СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи ЬЬе Ьув
590 695 700 <210> 46 <211> 2130 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
- 181 015992 конструкт <400> 46
садакссадк кддкдсадкс кддасскдад скдаадаадс скддададас адксаадакс 60
ксскдсаадд сккскддккк касскксаса даскакксаа касаскдддк дааасаддск 120
ссаддааадд дкккааадкд дакдддскдд акааасаскд адаскддкда дссаасакак 180
асадакдаск ксаадддасд акккдссккс кскккддкда сскскдссас саскдсскак 240
ккдсадакса асаассксаа саакдаддас асддскасак ккккскдкдс кадакксакс 300
какдаксскк аккдддддкк кдсккаскдд ддссадддда скскддксас кдкскссдса 360
дскадсасса адддсссакс ддкскксссс скддсассск сскссаадад сасскскддд 420
ддсасадсдд ссскдддскд сскддксаад даскаскксс ссдаассддк дасддкдксд 480
кддаасксад дсдссскдас садсддсдкд сасасскксс сддскдксск асадксскса 540
ддаскскаск сссксадсад сдкддкдасс дкдсссксса дсадсккддд сасссадасс 600
Сасакскдса асдкдаакса саадсссадс аасассаадд кддасаадаа адккдадссс 660
аааксккдкд асааааскса сасакдссса ссдкдсссад сасскдааск сскдддддда 720
ссдксадкск ксскаккссс сссаааассс ааддасасас ксакдакскс ссддасссск 780
даддксасак дсдкддкддк ддасдкдадс сасдаадасс скдаддксаа дкксааскдд 840
касдкддасд дсдкддаддк дсакаакдсс аадасааадс сдсдддадда дсадкасаас 900
адсасдкасс дкдкддксад сдкссксасс дксскдсасс аддаскддск даакддсаад 960
дадкасаадк дсааддкскс саасааадсс сксссадссс ссаксдадаа аассаксксс 1020
ааадссааад ддсадссссд адаассасад дкдкасассс кдсссссакс ссдддакдад 1080
скдассаада ассаддксад сскдасскдс скддксааад дсккскаксс садсдасакс 1140
дссдкддадк дддададсаа кдддсадссд дадаасааск асаадассас дссксссдкд 1200
скддаскссд асддсксскк скксскскас адсаадскса ссдкддасаа дадсаддкдд 1260
садсадддда асдСсккскс акдскссдкд акдсакдадд скскдсасаа ссаскасасд 1320
садаададсс кскссскдкс кссдддкааа кссддсдддд дкддакссдд -ддадддддс 1380
кссддсддкд дсдддкссса ддкссааскд дкдсадкскд дадскдаддк даадаадсск 1440
дддкссксад кдааддкдкс скдсааддск кскддскаса сккксасаас скаскакккд 1500
саскдддкда ддсаддсссс кддасаддда сккдадкдда бдддакддак ккаксскдда 1560
аакдкксакд сксадкасаа кдадаадккс аадддсаддд ксасааксас кдсадасааа 1620
кссассадса садсскасак ддадсксадс адсскдаддк скдаадакас Сдсддкскак 1680
каскдкдсаа даксскддда аддкккксск каскддддсс аадддассас ддксассдка 1740
кссксаддсд дкддадддкс сддкдддддс ддакскдддд дсддсдддкс 1800
ддЬадкдаса кксадакдас ссадксксск адскссскдк ссдссксадк аддадасадд 1860
- 182 015992
дЪсассаЬса сс^дсааддс садСсадааС дбдддЬаЬСа аЬдЬадссбд дбаЬсаасад 1920
ааассаддда аддсСссСаа аЬсасЪдаСС СссЬсддссС. ссбассддСа садСддадЬс 1980
ссььссадат бсадсддсад ЬддаЬс+ддд асадаСЛЬса сСсЬсассаЬ садсадссЬа 2040
садссЪдаад асСЬсдсаас сЬаЬЬЬсЬдЬ садсааСаСд асассбаЬсс аЬЬсасдЬЬс 2100
ддссадддЬа ссааддЬдда даЪсаааЬда 2130
<210> 47 <211> 709 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 47
СЬп Не СЬп Ьеи Уа1 СЬп Зег СЬу Рго СЬи Ьеи Ьуз Ьуз Рго СЬу СЬи
1 5 ЬО 15
ТЬг Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг
20 25 30
Зег Не Н13 Тгр Уа1 Ьуз СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи Ьуз Тгр МеЬ
35 40 45
СЬу Тгр Не АЗП ТЬг СЬи ТЬг СЬу СЬи Рго ТЬг туг ТЬг Азр Азр РЬе
50 55 60
Ьуз СЬу Агд РЬе А1а РЬе Зег Ьеи Уа1 ТЬг Зег А1а ТЬг ТЬг АЬа Туг
65 70 75 80
Ьеи СЬп Не Азп Азп Ьеи Азп Азп СЬи Азр ТЬГ АЬа ТЬг РЬе РЬе Суз
85 90 95
А1а Агд РЬе Не Туг Азр Рго Туг Тгр СЬу РЬе АЬа Туг Тгр СЬу СЬп
100 105 110
СЬу ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг УаЬ Зег АЬа АЬа Зег ТЬг Ьуз С1у Рго Зег ν»ι
115 120 125
РЬе Рго Ьеи АЬа Рго Зег Зег ьуз Зег ТЬг Зег СЬу С1у ТЬг А1а А1а
130 135 140
- 183 015992
Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 ьуз АВр Туг РЬе РГО 31и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег
145 150 155 160
Тгр Авп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег <31у νβΐ ΗΪ8 ТЬг РЬе Рго А1а Уа1
165 170 175
Ьеи Θΐη Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго
180 185 190
Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЬг С1п ТЬг Туг Не Суз Азп Уа1 Азп Н1з Ьуз
195 200 205
Рго Зег Авп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз Уа1 <31и Рго Ьуз Зег Суз Азр
210 215 220
Ьув ТЫ Н1в ТЬг Су в Рго Рго Сув Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи <31у <31у
225 230 235 240
Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ 11е
245 250 255
зег Агд ТЬг Рго 61и Уа1 ТЬг Суз Уа1 νβΐ Уа1 Азр Уа1 Зег Н13 С1и
260 265 270
Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Аер С1у Уа1 (31и Уа1 Н1з
275 280 285
Азп А1а Ьуз ТНг Ьуз Рго Агд 01и С1и <31п Туг Азп Зег ТЫ Туг Агд
290 295 300
Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Ηί3 б1п АВр Тгр ьеи Азп 61у ьуз
305 310 315 320
<31и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьув А1а Ьеи Рго А1а Рго Не С1и
325 330 335
Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз СЯу <31п Рго Агд 31и Рго <31п Уа1 Туг
340 345 350
ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр <31и Ьеи ТЬг Ьуз Азп <31п Уа1 Зег Ьеи
355 360 365
ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз <31у РЬе Туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1 С1и Тгр
370 375 380
О1и Зег Азп С1у <31п Рго <Э1и АЗП Азп Туг Ьуз ТЫ ТЬг Рго Рго Уа1
385 390 395 400
Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр
405 410 415
- 184 015992
Ьуз Зег Агд Тгр С1п 420 01п 01у Азп Уа1 425 РЬе Зег Суз Зег Уа1 430 МеЕ Ηίε
О1и А1а Ьеи Н1з Азп Низ Туг ТЬг 01п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго
435 440 445
С1у Ьуз Зег О1у <Э1у 01у С1у Зег С1у О1у С1у С1у Зег С1у О1у С1у
450 455 460
01у Зег Θΐη ^7а1 <31п Ьеи Уа1 01п Зег 01у А1а О1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго
465 470 475 480
61у Зег Зег νθΐ Ьуз νβΐ Зег Суз Ьуз А1а Зег 01у Туг ТНг РЬе ТЫ
485 490 495
ТЬг Туг туг Ьеи Н1а Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у С1п С1у Ьеи 01и
500 505 510
Тгр МеЕ 01у Тгр 11е Туг Рго С1у Азп Уа1 ΗΪ8 А1а С1п Туг Азп 01и
515 520 525
Ьуз РЬе Ьуз (31у Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг А1а Азр Ьуз Зег ТЬг Зег ТЬг
530 535 540
А1а Туг МеЕ О1и Ьеи Зег Зег ьеи Агд Зег 01и Азр Ткг А1а Уа1 Туг
545 550 555 560
Туг Суз А1а Агд Зег Тгр 01и 01у РЬе Рго Туг Тгр С1у е1п О1у ТЬг
565 570 575
ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 01у 01у 01у О1у Зег О1у 01у С1у 01у Зег
580 585 590
С1у С1у С1у С1у Зег 01у О1у 01у 01у Зег Азр Не 01п МеЕ ТЫ 01п
595 600 605
Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг
610 615 620
Суз Ьуз А1а Зег С1п Азп Уа1 С1у 11е Азп Уа1 А1а Тгр Туг С1п 01п
625 630 635 640
Ьуз Рго 01у Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи 11е Зег Зег А1а Зег Туг Агд
645 650 655
Туг Зег 01у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег 01у Зег 01у ТЬг Азр
660 665 670
РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи 01п Рго О1и Авр РЬе А1а ТЬг Туг
675 680 685
- 185 015992
РЬе Суз 01п <31п Туг Аар ТЬг Туг Рго РЬе ТЬг РЬе (51у 31п 01у ТЬг
690 695 700
Ьуз Уа1 <Э1и Х1е Ьуз
705 <210> 48 <211> 2115 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 48
садаСссадС РддСдсадСс ЦддассСдад сСдаадаадс сСддададас адСсаадаСс 60
Ьсседсаадд ссьссддсъе ЕасаССсаса дасЬаЬСсаа еасасСддде дааасаддсС 120
ссаддааадд дССЬааадСд даСдддсСдд аСааасасСд адасСддЬда дссаасаСаС 180
асадаСдасС Ссаадддасд аСССдссССс С с ΐ: ьСддСда ссисСдссас сасСдссСаС 240
ецдсадасса аааасессаа сааьдаддас асддсЕасаС СССИсСдСдс ЬадаССсаСс 300
СаСдаСссСО аССдддддер СдсЪСасСдд ддссадддда сЬоСддСсас СдСсСссдса 360
дсСадсасса адддсссаСс дд-СсССсссс сСддсасссС ссСссаадад сассьседдд 420
ддсасадсдд сссСдддсСд ссСддСсаад дасСасССсс ссдаассддС дасддСдЬсд 480
СддаасЬсад дсдсссЕдас садсддсдСд сасассЕЬсс сддсСдСссе асадСссСса 540
ддасЪсЪасС сссесадсад сдСддСдасс дЬдсссСсса дсадсСЪддд сасссадасс 600
ЕасаСсрдса асдСдааЬса саадсссадс аасассаадд Сддасаадаа адССдадссс 660
аааЬсССдСд асаааасеса сасаСдссса ссдСдсссад сассСдааср ссСдддддда 720
ссдЬсадСсС сссрсесссс сссаааассс ааддасассс СсаСдаСсСс ссддассссъ 780
даддСсасаС дсдСддСддЬ ддасдЬдадс сасдаадасс седаддьсаа дССсаасСдд 840
сасдСддасд дсдСддаддС дсаСааЬдсс аадасааадс сдсдддадда дсадСасаас 900
адсасдЬасс дСдСддСсад сдьссесасс дСсседсасс аддасСддсС дааеддсаад 960
дадСасаадС дсааддЬсСс саасааадсс сСсссадссс ссаСсдадаа аассаСсСсс 1020
ааадссааад ддсадссссд адаассасад дСдЬасассс СдсссссаСс ссдддаЬдад 1080
сЬдассаада ассаддьсад ссСдассрдс седдгсааад дсЕС сСаС.сс садсдасаЬс 1140
дссдСддадЬ дддададсаа Сдддсадссд дадаасаась асаадасаас дссСсссдСд 1200
- 186 015992
сйддасЬссд асддсЬссЫ ссъссЬсЬас адсаадсйса ссдЬддасаа дадсаддЬдд 1260
садсадддда асдСсЬЬсЬс аЬдсЬссдСд аСдсаСдадд сСсЬдсасаа ссасЬасасд 1320
садаададсс ЬсЬсссСдЬс ЬссдддЁааа Сссддсдддд дЬддаСссдд сддадддддс 1380
ЬсаддсддЬд дсдддЬссса ддбссаасЬд дЬдсадЬсЬд дадсЬдаддЬ даадаадссЬ 1440
дддСссЬсад ^дааддбдЬс сЬдсааддсг ЬсСддсЬаса сЫЬсасаас сЬасЬаЬЪЬд 1500
сасйдддьда ддсаддсссс ЬддасадЪдс сыдадЬдда ЬдддаЬддаЬ ЫаЬссбдда 1560
аабдЬЪсаЪд сЬсадЬасаа ЬдадаадЬЬс аадддсаддд ЬаасааЬсас Ьдсадасааа 1620
Ьссассадса садссЬасаЬ ддадсСсадс адссЬдаддЬ сЬдаадаЬас ЬдсддСсСай 1680
еасйдсдсаа дассссддда аддЫЫссЬ СасЬддддсс аадддассас ддтсассдьс 1740
ЬсабсаддЬд ддддсддаЪс Ьдддддсддс дддЪссддСд дйддЬддЬад ЪдасаЬЬсад 1800
аСдасссадЬ сЬссйадсЫ ссЬдЬссдсс СсадЪаддад асадддЬсас саЪсассЬдс 1860
ааддссадьс адаасдьддд ЪаЫааСдЬа дссЬддЬаЬс аасадааасс адддааддсЪ 1920
ссйаааЬсас ЬдаЬЫссЪс ддссЬссСас сддЪасадЬд дадСассЬЪс садаСЪсаде 1980
ддсадЬддаС сЬдддасада ЪЬЬсасСсЬс ассабсадса дссЬссадсс ЬдаадасЬЬс 2040
дсаассеаЫ ЕсЁдСсадса айаСдасасс ьаъссаеьса едььсддссд сддрассаад 2100
дЬддадаЪса ааЪда 2115
<210> 49 <211> 704 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический коиструкт <400> 49
СЬп Не СЬп Ьеи УаЬ СЬп Зег <31у Рго СЬи Ьеи Ьуз Ьуз Рго СЬу СЬи
1 5 10 15
ТЬг УаЬ Ьуз Не Зег Суз Ьуз АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг
20 25 30
зег Не НЬз Тгр УаЬ Ьуз СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи Ьуз Тгр МеЬ
35 40 45
СЬу Тгр Не Азп ТЬг СЬи ТЬг СЬу СЬи Рго ТЫ Туг ТЬг Азр Азр РЬе
50 55 60
- 187 015992
Ьуз С1у Агд РЬе А1а РНе Зег Ьеи Уа1 ТЬг Зег А1а ТНг ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п 11е Азп Азп Ьеи Азп Азп С1и Азр ТЬг А1а ТЬг РЬе РЬе Суз
85 90 95
А1а Агд РНе 11е Туг Азр Рго Туг Тгр С1у РЬе А1а Туг Тгр С1у С1п
100 105 110
С1У ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег А1а А1а Зег ТЬг Ьуз С1у Рго Зег Уа1
115 120 12 5
РЬе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Зег С1у С1у ТНг А1а А1а
13 0 135 14 0
Ьеи 61у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго <31и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег
145 150 155 160
Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег С1у Уа1 Η13 ТЬг РЬе Рго А1а Уа1
165 170 175
Ьеи σΐη Зег Зег (31у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго
180 185 190
Зег Зег Зег Ьеи 01у ТЬг С1п ТЬг Туг Не Суз Азп Уа1 Азп Н13 Ьуз
195 200 205
Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз Уа1 (31и Рго Ьуз Зег Суз Азр
210 215 220
Ьуз ТЬг Н±з ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи <31у С1у
225 23 0 235 240
Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ 11е
245 250 255
Зег Агд ТЬг Рго С1и ν31 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр νβΐ Зег Н13 С1и
260 265 270
Азр Рго (31и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 (31и Уа1 Н13
275 280 285
Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуе Рго Агд (31и С1и Θΐπ Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд
290 295 300
Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Н1з С1п Азр Тгр Ьеи Азп О1у Ьуз
305 310 315 320
С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а РГО 11е 01и
325 330 335
- 188 015992
Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз СЯу С1п Рго Агд С1и Рго С1п 350 Уа1 Туг
340 345
ТЬг ьеи Рго Рго Зег Агд Азр СЯи Ьеи ТЬг Ьуз Азп 61п Уа1 Зег Ьеи
355 360 365
ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 01и Тгр
370 375 380
С1и Зег Азп е1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1
385 390 395 400
Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр
405 410 415
Ьуз Зег Агд тгр 61 п 51п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 Мее Н1з
420 425 430
С1и А1а Ьеи Шз АЗП ΗΪ3 Туг ТЬг Θΐη ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго
435 440 445
О1у Ьуз Зег <31у С1у О1у С1у Зег <Э1у СЯу С1у 61у Зег 61у СЯу 61у
450 455 460
С1у Зег Θΐη Уа1 <31п Ьеи Уа1 61п Зег (31у А1а 61и Уа1 Ьуз Ьуз Рго
465 470 475 480
С1у Зег Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег 61у Туг ТЬг РЬе ТЬг
485 490 495
ТЬг Туг Туг Ьеи Н13 Тгр Уа1 Агд <31п А1а Рго 61у С1п Суз Ьеи О1и
500 505 510
Тгр Мее (Э1у Тгр 11е Туг Рго С1у Азп Уа1 Ηί3 А1а С1п Туг Азп 61и
515 520 525
Ьуз РЬе ьуз С1у Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг А1а Азр Ьуз Зег ТЬг Зег ТЬг
530 535 54 0
А1а Туг Мее С1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег б1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг
545 550 555 560
Туг Суз А1а Агд Зег Тгр 61и □1у РЬе Рго Туг Тгр <Иу 61п 61у ТЬг
565 570 575
ТНг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег О1у 01у 61у <31у Зег (31у 61у С1у <31у Зег
580 585 590
С1у С1у О1у 31у Зег Азр 11е С1п Мее ТЬг 61 п зег Рго Зег зег Ьеи
595 600 605
- 189 015992
Зег АЬа 610 Зег УаЬ СЬу Азр Агд УаЬ 615 ТЬг Ые ТЬг Суз 620 ьуз А1а Зег СЬп
Азп УаЬ СЬу Ые Азп Уа1 АЬа Тгр Туг О1п СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа
625 630 635 640
Рго Ьуз Зег Ьеи Ые Зег Зег А1а Зег Туг Агд Туг Зег СЬу УаЬ Рго
645 650 655
Зег Агд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег 61у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Ые
660 665 670
Зег Зег Ьеи СЬп Рго <Э1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг РЬе Суз С1п С1п Туг
675 680 685
Айр ТЬг Туг Рго РЬе ТЬг РЬе С1у Суз С1у ТЬг Ьуз УаЬ СЬи Ые Ьуз
690 695 700 <210> 50 <211> 2130 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 50
садаЬссадЬ ЬддЬдсадЬс ЬддассЬдад сЬдаадаадс сСддададас адЬсаадаЬс 60
СссРдсаадд сССсЬддСЬЬ ЬассСЬсаса дасЬаЬЬсаа Ьасас’ЬдддЬ дааасаддсЬ 120
ссаддааадд дЕЬСааадЬд даЬдддсСдд аСааасасЬд адасЬддбда дссаасаСаь 160
асадабдась Ьсаадддасд аьссдосЫс Ссььсддьда ссьсьдссас сасСдссСаС 240
ССдсадаСса асаассСсаа сааСдаддас асддсЬасас ССССсьдьдс СадаССсаСс 300
ЬаЬдаЬссСС аЬСдддддСС ЬдсЫ-асЬдд ддссадддда сЬсЬддЬсас ЬдЬсЬссдса 360
дсЬадсаоса адддсссаСс ддЬсЬЪсссс сСддсасссС ссЬссаадад сассСсбддд 420
ддсасадсдд сссЬдддсЬд ссЬддбсаад дасСасЬЬсс ссдаассддС дасддЬдСсд 480
СддаасЬсад дсдсссСдас садсддсдСд сасассЬЬсс сддссдрссь асадЬссбса 540
ддасЪсЬасС сссСсадсад сдСддЬдасс дСдсссСсса дсадсСЬддд сасссадасс 600
СасаЬоСдса асдСдаабса саадсссадс аасассаадд Сддасаадаа адьсдадссс 660
аааЬсСЬдЬд асаааасбса сасаЬдссса ссдЬдсссад сассСдаасС ссЬдддддда 720
- 190 015992
ссдЕсадЕсЕ ёссёсёёссс сссаааассс ааддасассс ЕсаЕдаЕсЕс ссддассссЕ 780
даддЕсасаЕ дсдЁддЕддЕ ддасдЕдадс сасдаадасс сЕдаддЕсаа дЕЕсаасЕдд 840
ЕасдЕддасд дсдЕддаддЕ дсаЕааЕдсс аадасааадс сдсдддадда дсадЕасаас 900
адсасдЕасс дйдЁддЕсад сдЕссЕсасс дЕссЕдсасс аддасЕддсЕ дааЕддсаад 960
дадЕасаадЕ дсааддЕсЕс саасааадсс сЕсссадссс ссаЕсдадаа аассаЕсЕсс 1020
ааадссааад ддсадссссд адаассасад дЕдЕасассс ЕдсссссаЕс асдддаЕдад 1080
СЕдассаада ассаддЕсад ссЕдассЕдс сЕддЕсааад дсЕЕсЕаЕсс садсдасаЕс 1140
дссдЕддадЕ дддададсаа Едддсадссд дадаасаасЕ асаадассас дссЕсссдЕд 1200
сЕддасЕссд асддсЕссЕЕ сЕЕссЕОЕас адсаадсЕса ссдЕддасаа дадсаддЕдд 1260
садсадддда асдЕсЕЕсЕс аЕдсЕссдЕд аЕдсаЕдадд сЕсЕдсасаа ссасЕасасд 1320
садаададсс ЕсЁсссЕдЕс ЕссдддЕааа Ессддсдддд дЕддаЕссдд Еддадддддс 1380
ЕасддсддЕд дсдддЕсаса ддЕссаасЕд дЕдсадЕсЕд дадсЕдаддЕ даадаадссЕ 1440
дддЕссЕсад ЕдааддЕдЕс сЕдсааддсЕ ЕсЕддсЕаса сЕЕЕсасаас сЕасЕаЕЕЕд 1500
сасЕдддЕда ддсаддсасс ЕддасадЕдс сЕЕдадЕдда ЕдддаЕддаЕ ЕЕаЕссЕдда 1560
ааЕдЕЕсаЕд сЕсадЕасаа ЕдадаадЕЕс аадддсаддд ЕсасааЕсас Едсадасааа 1620
Ессассадса садссЕасаЕ ддадсЕсадс адссЕдаддЕ сЕдаадаЕас ЕдсддЕсЕаЕ 1680
ЁасЕдЁдсаа даЕссЕддда аддЕЕЕЕссЕ ЕасЕддддсс аадддассас ддЕсассдЕс 1740
ЕссЕсаддсд дЕддадддЕс сддЬдддддс ддаЕсЕдддд дсддсдддЕс сддеддЪддЪ 1800
ддЕадЕдаса ЕЕсадаЕдас асадЕсЕссЕ адсЕсссЕдЕ ссдссЕсадЕ аддадасадд 1860
дЕаассаЕса ссЕдсааддс садЕсадааЕ дЕдддЕаЕЕа аЕдЕадссЕд дЕаЕсаасад 1920
ааассаддда аддсЕссЕаа айсасЕдаЕЕ ЕссЕсддссЕ ссЕассддЕа садЕддадЕс 1980
ссЁЕссадаЁ Есадсддсад ЕддаЕсЕддд асадаЕЕЕса сЕсЕсассаЕ садсадссЕс 2040
садссЕдаад асЕЕсдсаас СЕаЕЕЕсЕдЕ садсааЕаЕд асассЕаЕсс аЕЕсасдЕЕс 2100
ддсЁдсддЁа ссааддЕдда даЕсаааЕда 2130
<210> 51 <211> 709 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <22О>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 51
- 191 015992
01η 11е С1П Ьеи Уа1 01п Зег 01у Рго С1и Ьеи ьув Ьув Рго С1у 01и
1 5 10 15
ТЬг Уа1 Ьув Не Зег Суз Ьуз А1а Зег 01у РЬе ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг
20 25 30
8ег Не Ηίε Тгр Уа1 Ьуз □1п А1а Рго С1у Ьув 01у Ьеи Ьув Тгр Мек
35 40 45
01 у Тгр Не АВП ТЬг С1и ТЬг 31у О1и Рго ТЬг Туг ТЬг Азр Азр РЬе
50 55 60
Ьув О1у Агд РЬе А1а РЬе Зег Ьеи Уа1 ТЫ Зег А1а ТЫ ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
Ьеи 01 η Не Азп Азп Ьеи Азп Азп □1и Азр ТЫ А1а ТЫ РЬе РЬе Сув
85 90 95
А1а Агд РЬе Не Туг Азр Рго Туг Тгр С1у РЬе А1а Туг Тгр 01у С1п
100 105 110
01у тЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег А1а А1а Зег ТЬг Ьув 01у Рго Зег Уа1
115 120 125
РЬе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Бег ТЫ Зег С1у 01у ТЬг А1а А1а
130 135 14 0
Ьеи 01у Су в Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго 01и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег
145 150 155 160
Тгр Ави Зег С1у А1а Ьеи ТЫ Зег С1у Уа1 Нхз ТЫ РЬе Рго А1а Уа1
165 170 175
Ьеи 01п Зег Зег 01у Ьеи туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго
180 1Θ5 190
Зег Зег Зег Ьеи О1у ТЬг 01п ТЫ Туг Не Сув Авп Уа1 Азп Нхз Ьуз
195 200 205
Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз Уа1 01и Рго Ьув Зег суз Азр
210 215 220
Ьув ТЬг Н1в ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго 01и Ьеи Ьеи 01у 01у
225 230 235 240
Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мек Не
245 250 255
Зег Агд ТЬг Рго 01и Уа1 ТЫ Суз Υ31 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Нхз 01и
260 265 270
- 192 015992
Азр Рго С1и 275 уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр О1у Уа1 С1и Уа1 Н13
280 285
Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и 01и 01п Туг А8П Зег ТЬг Туг Агд
290 295 300
Уа1 уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Нхз 01п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьув
305 310 315 32 0
01и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго Не 01и
325 330 335
Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз □1у С1п Рго Агд 01и Рго 01п Уа1 Туг
340 345 350
ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи
355 360 365
ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз 01у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 01и Тгр
370 375 380
61и Зег Азп С1у С1п Рго 61и Азп Азп Туг ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1
385 390 395 400
Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр
405 410 415
Ьуз Зег Агд Тгр 01п С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеЬ Нхз
420 425 430
<31и А1а Ьеи Нх8 Азп Нхз Туг ТЬг 01п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго
435 440 445
О1у Ьуз Зег 01у О1у 01у 01у Зег 01у 01у <Э1у С1у Зег С1у О1у О1у
450 455 460
С1у Зег 01п Уа1 01п Ьеи Уа1 01п Зег 01у А1а 01и Уа1 ьуз Ьуз Рго
465 470 475 480
С1у Зег Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег 01у Туг ТЬг РЬе ТЬг
485 490 495
ТЬг Туг Туг Ьеи ΗΪ3 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго 01у О1п Суз Ьеи С1и
500 505 510
Тгр МеЬ 01у Тгр 11е Туг Рго 01у Азп Уа1 ΗΪ3 А1а С1п Туг Азп 01и
515 520 525
Ьуз РЬе Ьуз С1у Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг А1а Азр Ьуз Зег ТЬг Зег ТЬг
530 535 540
- 193 015992
А1а Туг Меб СЬи Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег СЬи Азр ТЬг А1а УаЬ Туг
545 550 555 560
туг суз АЬа Агд Зег Тгр 01и 01у РЬе Рго Туг Тгр СЬу 01п ОЬу ТЬг
565 570 575
ТЬг νβΐ ТЬг Уа1 Зег Зег С1у СЬу ОЬу СЬу Зег СЬу СЬу СЬу ОЬу Зег
580 585 590
СЬу СЬу СЬу СХу Зег СЬу 01у СЬу СЬу Зег Азр Не СЬп Меб ТЬг СЬп
595 600 605
Вег Рго Зег Зег ьеи Зег АЬа Зег УаЬ ОЬу Азр Агд νβΐ ТЬг Не ТЬг
610 615 620
суз ьуз АЬа Зег СХп Азп Уа1 СЬу 1Ье АЗП Уа1 АЬа Тгр Туг СЬп ЗЬп
625 630 635 640
Ьуз Рго СХу Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи 1Ье Зег Зег АЬа Зег ТуГ Агд
645 650 655
Туг Зег СЬу УаХ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег СЬу ТЬг Азр
660 665 670
РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи Азр РЬе АЬа ТЬг Туг
675 680 685
РЬе Суз СЬп <31п туг Азр ТЬг Туг Рго РЬе ТЬг РЬе СЬу Суз СЬу ТЬг
690 695 700
Ьуз УаЬ 01и 11е Ьуз
705 <210> 52 <211> 2130 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 52 садабссадб бддбдсадбс Ъддаоссдад сбдаадаадс сбддададас адбсаадабс 60
СссСдсаадд сСХсбддббб бассббсаса дасбаССсаа басасбдддб дааасаддсС 120
- 194 015992
ссаддааадд дЬСЬааадЬд дасдддсьдд аЪааасасЪд адасЬддбда дссаасаСаЪ 180
асадасдасг Есаадддасд аСССдссИС-с Ьссхсддсда ссбсГдссас сасхдссьае. 240
ЬЪдсадаСса асаассСсаа сааГдаддас асддсЪасаЬ СЫЬсСдЬдс ЬадаЬЬсаЬс 300
ЬаддаЪссЬЬ. аЬЕдддддЫ; ЪдскЬасЬдд ддссадддда сЕсЬддксас ЪдЬсЕссдса 360
дсСадсасса адддсссаСс ддСсЬСсссс сСддсасссб ссбссаадад сассбс'Ьддд 420
ддсасадсдд сссЬдддсЬд сссддЪсаад дасЪасГСсс ссдаассддЪ дасддЬдксд 480
СддаасЬсад дсдсссСдас садсддсдЕд сасассССсс сддсбдЬссС асадСссСса 540
ддасСсгасс сссгсадсад сдЪддСдасс дЬдсссСсса дсадсСЕддд сасссадасс 600
СасаСсСдса асдСдааЪса саадсссадс аасассаадд Сддасаадаа адЦ.дадссс 660
аааЬсССдСд асаааасЪса сасаСдссса ссдС-дсссад сассЕдаасЪ ссЬдддддда 720
ссдбсадесь гсс^съьссс сссаааассс ааддасассс СсаСдаСсИс ссддассссб 78С
даддбсасаС дсдСддСддС ддасдСдадс сасдаадасс сСдаддЪсаа дССсаасСдд 840
ЬасдСддасд дсдГддаддк дсаСааСдсс аадасааадс сдсдддадда дсадСасаас 900
адсасдсасс дСдСддЬсад сдГссбсасс дСссбдсасс аддасСддсЬ дааСддсаад 960
дадЬасаадС дсааддЬсСс саасааадсс сЬсссадссс ссаЬсдадаа аассаЬсксс 1020
ааадссааад ддсадссссд адаассасад дЬдСасассс ЬдсссссаСс ссдддаСдад 1080
сЬдассаада ассаддСсад ссбдассСдс сСддСсааад дсССсСаЬсс садсдасаЬс 1140
дссдЬддадЬ дддададсаа Сдддсадссд дадаасаасЬ асаадассас дссСсссдЬд 1200
сПддасСссд асддсбссЬЬ сЬЬссЪсЬас адсаадсЬса ссдЪддасаа дадсаддЪдд 1260
садсадддда асдСсССс^с аедсЬссдСд аСдсаОдадд сЬсЬдсасаа ссасГасасд 1320
садаададсс СсСсссСдЬс СссдддЬааа Сссддсдддд дСддаЬссдд Сддадддддс 1380
СссддсддСд дсдддЬссса ддСссаасбд дбдсадЪсЪд дадсСдаддС даадаадссС 1440
ддддадссад СдааддбдСс сьдсааддсс СсСддсСаса ссебсасаас сЕассасссд 1500
сасСдддГда ддсаддсссс Сддасаддда сьъдадСдда ЬдддаЬддаЪ ССа-иссСдда 1560
ааСдЪЪсаСд сСсадЪасаа СдадаадССс аадддсаддд Ссасааьсас Ъдсадасааа 1620
Сссассадса садссСасаС ддадсСсадс адссСдаддС сСдаадаЬас СдсддЬсСае 1680
ЪасддЬдсаа даЬссГддда аддтЬссС СасЬддддсс аадддассас ддЬсассдЬс 1740
ЪссЪсаддсд дЬддадддЬс сддсдддддс дда^сЪдддд дсддсдддьс сддЪддкддк 1800
ддбадСдаса СЬсадаСдас ссадЬсСссС адсСсссЬдЬ ссдссЬсадС аддадасадд 1Б60
дЬсассаЪса ссЬдсааддс садбсадааЬ дИдддСаСЬа аСдЬадссЬд дЬаСсаасад 1920
ааассаддда аддсСссЬаа аЪЕасЪдаЬЪ ЪсаЪсддссС ссЬассддЬа садЪддадЪс 1980
ссЬСссадак Ссадсддсад ЬддаЬсЬддд асадаЬСЬса сСсЬсассаЕ садсадссЬс 2040
садссЬдаад асГСсдсаас сСаСПсСдС садсааСаСд асассЪаЬсс аЬЪсасдГЬс 2100
ддссадддСа ссааддСдда даЪсаааСда 2130
- 195 015992 <210> 53 <211> 709 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 53
С1п 11е С1п Ьеи Уа1 С1п Зег С1у Рго <31и Ьеи Ьуз Ьуз Рго <31у 61и
1 5 10 15
ТЬг Уа1 Ьуз 11е Зег Суз Ьуз А1а Зег 61у РЬе ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг
20 25 30
Зег 11е Н13 Тгр Уа1 Ьуз С1п А1а РГО (31у ьуз О1у Ьеи Ьуз Тгр меь
35 40 45
61у тгр 11е Азп ТЬГ <31и ТЬг <Э1у (31и РГО тЬг Туг ТЬг АЗр Азр РЬе
50 55 60
Ьуз 61у Агд РЬе А1а РЬе Зег Ьеи Уа1 ТЬг Зег А1а ТЬг ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п 11е Азп Азп Ьеи Азп Азп О1и Азр ТЬг А1а ТЬг РЬе РЬе Суз
85 90 95
А1а Агд РЬе 11е туг Азр Рго Туг Тгр С1у РЬе А1а Туг Тгр С1у С1п
100 105 110
С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег А1а А1а Зег ТИг Ьуз О1у Рго Зег Уа1
115 120 125
РЬе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Зег <31у С1у ТЬг А1а А1а
130 135 140
Ьеи <31у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Абр Туг РЬе Рго С1и Рго νβΐ ТЬг Уа1 Зет
145 150 155 160
Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег <31у Уа1 Н13 ТЬг РЬе Рго А1а Уа1
165 170 175
Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго
180 185 190
- 196 015992
Зег Зег Зег 195 Ьеи О1у ТЬг С1п тЬг туг 200 11е Суз Азп Уа1 205 АЗП Н13 ьуз
Рго Зег Авп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз Уа1 б1и Рго Ьуз Зег Суз Азр
210 215 220
Ьуз ТЬг Нтз ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у 01у
225 230 235 240
Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеП Не
245 250 255
Зег Агд ТЬг Рго б1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Нгз 61и
260 265 270
Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр <31у Уа1 СЯи Уа1 Н1з
275 280 285
АЗП А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд <31и 01и 61п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд
290 295 300
νβΐ Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Н1з 01п Азр Тгр Ьеи Азп □1у Ьуз
305 310 315 320
С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е <31и
325 330 335
Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз 01у <31п Рго Агд 01и Рго <31п Уа1 Туг
340 345 350
ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр 61и Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи
355 360 365
ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 <31и Тгр
370 375 380
<31и Зег Азп С1у С1п Рго 61и АЗП Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1
385 390 395 400
Ьеи Азр Зег Азр (31у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр
405 410 415
Ьуз Зег Агд Тгр 01п <31п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеЬ Нгз
420 425 430
О1и А1а Ьеи Н13 Азп ΗΪΒ Туг ТЬг 01п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго
435 440 445
О1у Ьуз Зег О1у С1у С1у С1у Зег 01у <31у <31у 01у Зег <31у <31у □ 1у
450 455 450
- 197 015992
61у Зег Θΐη 465 Уа1 СЯп Ьеи 470 Уа1 С1п Зег СЯу А1а 475 СЯи Уа1 Ьуз Ьуз Рго 480
С1у С1и Зег Уа1 ьуз Уа1 Зег Суз ьуз А1а Зег СЯу Туг ТЬг РЬе ТЬг
485 490 495
ТЬг Туг Туг Ьеи Нхз Тгр Уа1 Агд СЯп А1а Рго СЯу <51п СЯу Ьеи С1и
500 505 510
тгр Мек 61у тгр Не Туг Рго СЯу Азп Уа1 Нхз А1а 61п Туг Азп СЯи
515 520 525
Ьуз РЬе Ьуз СЯу Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг А1а Азр Ьуз Зег ТЬг Зег ТЬг
530 535 54 0
А1а Туг Мее СЯи Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег СЯи Азр ТЬг А1а Уа1 Туг
545 550 555 560
Туг Суз А1а Агд Зег Тгр О1и СЯу РЬе Рго Туг Тгр СЯу СЯп О1у ТЬг
565 570 575
ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег СЯу СЯу СЯу СЯу Зег С1у СЯу (31у СЯу Зег
580 585 590
С1у 61у 61у С1у Зег СЯу СЯу СЯу С1у Зег Азр Не СЯп Мее ТЬг СЯп
595 600 605
Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 (Иу Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг
610 615 620
Суз ьуз А1а Зег С1п Азп Уа1 СЯу Не Азп Уа1 А1а Тгр Туг СЯп С1п
625 630 635 640
Ьуз Рго СЯу Ьуз А1а Рго Ьуя Ьеи Ьеи Не Зег Зег А1а Зег Туг Агд
645 650 655
Туг Зег СЯу Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег СЯу Зег О1у Зег С1у ТЬг АЗр
660 665 670
РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Т1е Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг
675 680 685
Рке Суя СЯп 61п Туг Азр ТЬг Туг Рго РИе ТЬг РЬе СЯу СЯп СЯу ТЬг
690 695 700
Ьуз Уа! 31и Не Ьуз
705 <210> 54
- 198 015992 <211> 2130 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 54
сада+ссадГ ЬддЬдсадСс ТддассГдад сЬдаадаадс седдададас адЬсаада+с 60
ЕссЬдсаадд с^сссддпъп еассГСсаса дасЬаЪПсаа ЕасастдддЕ дааасаддсЬ 120
ссаддааадд дЪЬЬааадЬд даСдддсЬдд а£ааасас£д адасГддЬда дссаасаЬаЕ 180
асадаПдасЪ Ъсаадддасд аьсьдсспьс иссЬЬддИда ссСсЬдссас сасПдасЬаЕ 240
ССдсадаГса асаассСсаа сааЬдаддас асддсЬасаЬ ССССсЬдГдс ЬадаГСсаГс 300
сасдасссьп ассдддддъс СдсСГасЬдд ддссадддда с+сьддтсас сдесгссдса 360
дсЬадсасса адддсссаЪс ддЬсЬЪсссс сСддсасссТ ссЬссаадад сассЬсЕддд 420
ддсасадсдд ссседддсед сседдссаад дасЬасиссс ссдаассддь дасддЬдгсд 480
еддаасесад дсдссседас садсддсдед сасассессс сддсодьссс асадессгса 540
ддасСсПасС сссЬсадсад сдЬддГдасс дЬдсссЬсса дсадсЬПддд сасссадасс 600
ЬасаСсЬдса асдЬдааСса саадсссадс аасассаадд Сддасаадаа адГЬдадссс 660
аааЬсЬСдСд асаааасСса саса+дссса ссдЬдсссад сассСдаасС. ссЬдддддда 720
ссдЬсадСсС ЬссЬсУСссс сссаааассс ааддасассс СсаСдаЬсГс ссддассссг 780
даддСсасаС дсдЬддЬддЬ ддасдСдадс сасдаадасс сЬдаддЬсаа дЬЬсаасПдд 840
СасдСддасд дсдЬддадде дсаЬааЪдсс аадасааадс сдсдддадда дсадЪасаас 900
адсасдСасс дЪдЬддЪсад сдСссСсасс дЬссЪдсасс аддасЬддсС дааЬддсаад 960
дадЬасаадЬ дсааддСсПс саасааадсс сЬсссадссс ссаЪсдадаа аассаЬсЪсс 1020
ааадссааад ддсадссссд адаассасад дЬдГасассс ЪдсссссаСс ссддда'Ьдад 1080
сСдассаада ассаддГсад ссЬдассЬдс сЪддЬсааад дсЬЬсЪаЕсс садсдасаСс 1140
дссдСддадС дддададсаа Сдддсадссд дадаасаасЬ асаадассас дссЪсссдЬд 1200
сСддасЪссд асддсЬссСЬ сСЕссЬсеас адсаадсьса ссдСддасаа дадсаддЬдд 1260
садсадддда асдЬсЬЕсЬс асдсТссдЬд аСдсаедадд сТсЬдсасаа ссасЕасасд 1320
садаададсс ГсссссСдСс ЬссдддСааа Сссддсдддд дСддаЬссдд Сддадддддс 1380
ТссддсддЪд дсдддСссса ддЬссаасСд дЬдсадСсед дадсЬдаддС даадаадсст 1440
ддддадЬсад СдааддЬдЪс сГдсааддсЪ ГсЬддсЬаса сЬГЬсасаас сГасЕаЬЫд 1500
- 199 015992
саскдддкда ддсаддсссс кддасадкдс сккдадкдда кдддакддак ккаксскдда 1560
аакдкксакд сксадкасаа кдадаадккс аадддсаддд ксасааксас кдсадасааа 1620
кссассадса садсскасак ддадсксадс адсскдаддк скдаадакас кдсддкскак 1680
каскдкдсаа даксскддда аддкккксск каскддддсс аадддассас ддксассдкс 1740
кссксаддсд дкддадддкс сддгдддддс.· ддакскдддд дсддсдддкс сддьддсдд1; 1800
ддкадкдаса кксадакдас ссадксксск адскссскдк ссдссксадк аддадасадд 1860
дксассакса сскдсааддс садксадаак д^дддианка акдкадсскд дкаксаасад 1920
ааассаддда аддсксскаа аккаскдакк кссксддсск сскассддка садкддадкс 1980
ссккссадак ксадсддсад кддакскддд асадакккса сксксассак садсадсскс 2040
садсскдаад аскксдсаас скакккскдк садсаакакд асасскаксс акксасдккс 2100
ддскдсддка ссааддкдда даксааакда 2130
<210> 55 <211> 709 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 55
О1п 11е С1п Ьеи Уа1 <31п Зег С1у Рго О1и Ьеи Ьуз Ъуз Рго <31у 01и
1 5 10 15
ТНг Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а Зег (31у РНе ТИг РНе ТЬг Азр Туг
20 25 30
Зег Не ΗΪ3 Тгр Уа1 Ьув С1п А1а Рго <31у Ьуз б1у Ьеи Ьуз Тгр Мек
35 40 45
(31у Тгр Не Азп ТИг С1и ТИг О1у Й1и Рго ТИг Туг ТИг Азр Азр РИе
50 55 60
Ьуз 51у Агд РИе А1а РНе Зег Ьеи Уа1 ТИг Зег А1а ТИг ТИг А1а Туг
65 70 75 80
Ьеи <31п Не Азп Азп Ьеи Азп Азп С1и Азр ТНг А1а ТЬг РЬе РЬе Суз
90 95
- 200 015992
А1а Агд РЬе Не Туг Азр Рго Туг Тгр С1у РЬе А1а Туг Тгр С1у С1п
100 105 но
С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг V»! Зег А1а А1а Зег ТЬг Ьуз □ 1у Рго Зег Уа1
115 120 125
РЬе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Бег □1у (31у ТЬг А1а А1а
130 135 140
Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго νβΐ ТЬг νπΐ Зег
145 150 155 160
Тгр Азп Зег б1у А1а Ьеи ТЬг Зег С1у Уа1 ΗΪ3 ТЬг РЬе Рго А1а Уа1
165 170 175
Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 νπΐ ТЬг Уа1 Рго
180 185 190
Зег Зег Зег Ьеи Й1у ТЬг Й1п ТЬг Туг Не Суз Азп Уа1 Азп Н1з Ьуз
195 200 205
Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз Уа1 С1и Рго Ьуз Зег Суз Азр
210 215 220
Ьуз ТЬг Шз ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи <Э1у С1у
225 230 235 240
Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи мек Не
245 250 255
Зег Агд ТЬг Рго <31и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег ΗΪ3 (31и
260 265 270
Азр Рго С1и Уа1 ьуз РЬе АЗП Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Н±з
275 280 2В5
Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и 31и С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд
290 295 300
Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 ьеи ΗΪ3 αΐη Азр тгр Ьеи АЗП С1у Ьуз
305 310 315 320
О1и Туг Ьуз Суз Ьуз νβΐ Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е <31и
325 330 335
Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд <31и Рго <31п Уа1 Туг
340 345 350
ТНг Ьеи РГО Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп □1п Уа1 Зег Ьеи
355 360 365
- 201 015992
ТЫ Суз Ьеи УаЬ Ьуз СЬу РЬе Туг 375 Рго Зег Азр 11е 380 АЬа УаЬ С1и тгр
370
СЬи Зег Авп СЬу СЬп Рго СЬи Азп Азп Туг Ьуз ТЫ ТНг Рго Рго УаЬ
385 390 395 400
Ьеи Авр Зег Азр СЬу Зег РЬе РНе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг УаЬ Авр
405 410 415
Ьуз Зег Агд Тгр СЬп СЬп СЬу Азп УаЬ РЬе Зег Суз Зег УаЬ МеЬ Н13
420 425 430
СЬи АЬа Ьеи ΗΪΒ Азп НЬз Туг ТЬг СЬп Ьуз Зег ьеи Зег Ьеи Зег Рго
435 440 445
СЬу Ьуз Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу СЬу СЬу
450 455 460
СЬу Зег СЬп УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬп Зег СЬу АЬа СЬи УаЬ Ьуз Ьуз Рго
465 470 475 480
СЬу СЬи Зег УаЬ Ьуз УаЬ Зег Суз Ьуз АЬа Зег СЬу Туг ТЬг РЬе ТЬг
485 490 4 95
ТЬг Туг Туг Ьеи НЬз Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу СЬп Суз Ьеи СЬи
500 505 510
Тгр Мек СЬу Тгр Ые Туг Рго СЬу Авп УаЬ НЬз АЬа СЬп Туг Азп СЬи
515 520 525
Ьуз РЬе Ьуз СЬу Агд УаЬ ТЬг Ые ТЫ АЬа Азр Ьуз Зег ТЬг Зег ТЬг
530 535 540
АЬа Туг МеЬ СЬи Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег СЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг
545 550 555 560
Туг Суз АЬа Агд Зег Тгр СЬи СЬу РНе РГО Туг Тгр СЬу СЬп СЬу ТЫ
565 570 575
ТЬг УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег
580 585 590
СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег Азр 11е СЬп мее ТЬг СЬп
595 600 605
Бег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу Авр Агд УаЬ ТЬг Ые ТЬг
6Ь0 615 620
Суз Ьуз АЬа Зег СЬп Азп УаЬ СЬу ЬЬе Азп УаЬ АЬа Тгр Туг СЬп СЬп
625 630 635 640
- 202 015992
Ьуз Рго 31у Ьуз А1а 645 РГО ьуз Ьеи Ьеи Не 650 Зег Зег А1а Зег Туг Агд 655
Туг Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег (31у Зег <Э1у Зег 31у ТЬг Азр
660 665 670
РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1л Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг
675 680 685
РЬе Суз <51п С1п Туг Азр Таг Туг Рго РЬе ТЬг РЬе 61у Суа е1у ТЫ
690 695 700
Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
705 <210> 56 <211> 64 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Сшттетический олигонуклеотид <400> 56 дддддЕддаЕ ссддЕддадд дддсЕссддс ддТддсдддЬ сссаддЬсса асЕддсдсад 60
ЕсЕд 64 <210> 57 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 57 дЬЕаасддаЬ ссЕсаЬЕЕда ЕсЕссассЕЕ дд 32 <210> 58
- 203 015992 <211> 29 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 58
Азр Азр Азр Азр Ьуз Зег РЬе Ьеи О1и <31п Ьуз Ьеи Не Зег С1и Е1и
10 15
Азр Ьеи Азп Зег А1а Уа1 Азр Н1з Ηίβ Н13 Н1з Ηίβ Н13
25 <210> 59 <211> 57 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 59 аЬддссЬдда сСссСсСсСЬ сСЪсСЕссЬЬ. дССсССсаЬС. дсЬсадддЬс ЪЬСсЬсс 57 <210> 60 <211> 19 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 60
- 204 015992
Меб А1а Τιρ ТНг Рго Ьеи. РЬе РЬе РЬе РЬе УаЬ Ьеи НЬз Суз Зег СЬу
10 15
Зег РНе Зег <210> 61 <211> 57 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 61 абдддббдда дссбсабсбб дабсббасбб дбсдсбдббд сбаедсдбдб есбдбсс 57 <210> 62 <211> 19 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 62
Меб СЬу Тгр Зег Ьеи 1Ье Ьеи Ьеи РЬе Ьеи УаЬ АЬа Уа! А1а ТЬг Агд
10 15
УаЬ Ьеи Зег <210> 63 <211> 2115 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 205 015992 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 63
даддкдсадс ЬддЕддадЕс кдддддсддс ЕЕддсааадс скддддддьс ссЕдадасЕс 60
ЕссЕдсдсад ссЕссдддЕЕ саддЕЕсасс ЕЕсааЕаасЕ асЕасаЕдда сЕдддЕссдс 12 0
саддсЕссад ддсаддддсЕ ддадЕдддЕс ЕсасдЕаЕЕа дЕадЕадЕдд ЕдаЕсссаса 180
ЕддЕасдсад асЕссдЕдаа дддсадаЕЕс ассаЕсЕсса дададаасдс саадаасаса 240
сЕдЕЕЕсЕЕс аааЕдаасад ссЕдададсЕ даддасасдд сЕдЕсЕаЕЕа сЕдЕдсдадс 300
ЕЕдасЕасад ддксЕдасЕс сЕддддссад ддадЕссЕдд ЕсассдЕсЕС сЕсадсЕадс 360
ассаадддсс саЕсддЕсЕЕ сссссЕддеа сссЕссЕсса ададсассЕс ^нэдддсаса 420
дсддсссЕдд дсЕдссЕддЕ сааддасЕас ЕЕссссдаас сддЕдасддЕ дЕсдЕддаас 480
Есаддсдссс Едассадсдд сдЕдсасасс ЕЕсссддсид ЕссЕасадЕс сЕсаддасЕс 540
ЕасЕсссЕса дсадсдЕддЕ дассдЕдссс ЕссадсадсЕ Едддсассса дассЕасаЕс 600
ЕдсаасдЕда аЕсасаадсс садсаасасс ааддЕддаса адааадЕЕда дсссаааЕсЕ 660
ЕдЕдасаааа сЕсасасаЕд сссаасдЕдс ссадсассЕд аасЕссЕддд дддассдЕса 720
дЕсЕЕссЕсЕ Ессссссааа асссааддас асссЕсаЕда ЕсЕсссддас сссЕдаддЕс 780
асаЕдсдЕдд ЕддЕддасдЕ дадссасдаа дасссЕдадд ЕсаадЕЕсаа сЕддЕасдЕд 840
дасддсдЕдд аддЕдсаЕаа Едссаадаса аадссдсддд аддадсадЕа саасадсасд 900
ЕассдЕдЕдд ЕсадсдЕссЕ сассдЕссЕд сассаддасЕ ддсЕдааЕдд сааддадЕас 960
аадЕдсаадд ЕсЕссаасаа адсссЕссса дсссссаЕсд адаааассаЕ сЕссааадсс 1020
ааадддсадс сссдадаасс асаддЕдЕас асссЕдсссс саЕсссддда ЕдадсЕдасс 1080
аадаассадд ЕсадссЕдас сЕдссЕддЕс аааддсЕЕсЕ аЕсссадсда саЕсдссдЕд 1140
дадЕдддада дсааЕдддса дссддадаас аасЕасаада ссасдссЕсс сдЕдсЕддас 1200
ЕссдасддсЕ ссЕЕсЕЕссЕ сЕасадсаад сЕсассдЕдд асаададсад дЕддсадсад 1260
дддаасдЕсЕ ЕсЕсаЕдсЕс сдЕдаЕдсаЕ даддсЕсЕдс асаассасЕа сасдсадаад 1320
адссЕсЕссс ЕдЕсЕссддд ЕаааЕссддс дддддЕддас ссддЕддадд дддскссддс 1380
ддкддсдддЪ ссдасаЕсса даЕдасссад ЕсЕссаЕсЕЕ сссЕдЕсЕдс аЕсЕдЕаддд 1440
дасададЕса ссаЕсасЕЕд садддсаадЕ саддасаЕЕа ддЕаЕЕаЕЕЕ аааЕЕддЕаЕ 1500
садсадааас саддаааадс ЕссЕаадсЕс сЕдаЕсЕаЕд ЕЕдсаЕссад ЕЕЕдсааадЕ 1560
ддддЕсссаЕ сааддЕЕсад сддсадЕдда ЕсЕдддасад адЕЕсасЕсЕ сассдЕсадс 1620
адссЕдсадс сЕдаадаЕЕЕ ЕдсдасЕЕаЕ ЕасЕдЕсЕас аддЕЕЕаЕад ЕассссЕсдд 1680
асдЕЕсддсс аадддассаа ддЕддаааЕс аааддЕдддд дсддаЕсЕдд дддсддсддд 1740
- 206 015992
СссддСддСд дсддсадсда ддСдсадсСд дсддадйссд ддддсддсы ддсааадссС 1800
зддзздьссс СдадасЬсЬс сСдсдсадсс ЬссдддССса ддСЬсассЬЬ сааСаасйас 1860
Сасасддасс дддС.ссдсса ддсьссаддд саддддсСдд адС-дддСсЬс асдСаССадС 1920
адСадСддСд аСсссасаСд дйасдсадас СссдСдаадд дсадаССсас саСсСссада 1980
дадаасдсса адаасасасЬ дикПхаа аЬдаасадсс СдададсСда ддасасддсЬ 2040
дьсСаеСасС дСдсдадсСС дасСасаддд СсСдасСссС ддддссаддд адСссСддЬс 2100
ассдЪсСссС. сабда 2115
<210> 64 <211> 704 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 64
СЬи УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬи Зег СЬу СЬу СЬу Ьеи АЬа Ьуз Рго СЬу СЬу
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу Рйе Агд Рйе ТЬг Рйе АЗП
20 25 30
Азп Туг Туг МеС Азр Тгр УаЬ Агд С1П АЬа Рго СЬу СЬп СЬу Ьеи СЬи
35 40 45
Тгр УаЬ Зег Агд 11е Зег Зег Зег СЬу Азр Рго Тйг Тгр Туг АЬа Азр
50 55 60
Зег УаЬ Ьуз СЬу Агд РЬе ТЙГ ЬЬе Зег Агд С1и Азп АЬа Ьуз АЗП ТЙГ
65 70 75 80
Ьеи РЬе Ьеи СЬп Мес АЗП Зег Ьеи Агд АЬа СЬи Азр Тйг АЬа УаЬ туг
85 90 95
Туг Суз А1а Зег Ьеи ТЬг ТЙГ СЬу Зег Авр Зег Тгр СЬу СЬп СЬу УаЬ
100 105 110
Ьеи Уа1 ТЬг УаЬ Зег Зег АЬа Зег ТЙГ Ьуз СЬу Рго Зег УаЬ Рйе Рго
115 120 125
- 207 015992
Ьеи АЬа Рго Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Зег СЬу СЬу ТЬг АЬа А1а Ьеи СЬу
130 135 140
Суз Ьеи УаЬ Ьуэ Аэр Туг РЬе Рго СЬи Рго УаЬ ТЬг УаЬ Зег Тгр Авп
14 5 150 155 160
Зет СЬу А1а Ьеи ТЬг Зег СПу УаЬ НЬз ТЬг РЬе Рго АЬа УаЬ Ьеи СЬп
165 170 175
Зег Зег СЬу Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зет УаЬ Уа1 ТЬг УаЬ Рго Зег Бет
180 185 190
Зег ьеи СЬу ТЬг СЬп ТЬг Туг Не Сув Азп УаЬ Азп НЬз ьуз Рго Зег
195 200 205
Азп Тйг Ьуз УаЬ Азр Ьуз Ьув уаь СЬи РГО Ьуз Зег Сув Азр Ьуз ТЙГ
210 215 220
НЬз ТИг Сув РГО Рго Суз Рго А1а Рго СЬи Ьеи Ьеи СЬу СЬу РГО Зег
225 230 235 240
УаЬ РЬе ьеи РЬе Рго РГО ьуз РГО ьуз Авр ТЬг Ьеи меь 1Ье Зег Агд
245 250 255
Тйг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег нЬэ СЬи Азр Рго
260 265 270
СЬи УаЬ Ьуз РЬе АЗП Тгр Туг УаЬ Авр СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп АЬа
275 280 285
Ьуз ТЬг Ьув Рго Агд СЬи СЬи СЬп Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд УаЬ УаЬ
290 295 300
Зег УаЬ Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи ΗΪ8 СЬп Азр Тгр Ьеи Авп СЬу Ьуз СЬи Туг
3 05 310 315 320
Ьув Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз АЬа Ьеи Рго АЬа Рго Не СЬи Ьуэ ТЙГ
325 330 335
ЬЬе Зег Ьуз А1а Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг Ьеи
340 345 350
Рго Рго Зег Агд Азр СЬи Ьеи ТЬг Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи ТНг Сув
355 360 365
Ьеи УаЬ Ьув (31у РЬе Туг Рго Зег Азр Не АЬа УаЬ СЬи Тгр СЬи Бег
370 375 380
Азп СЬу СЬп Рго СЬи Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго УаЬ Ьеи Авр
335 390 395 400
- 208 015992
Зег Азр <31у Зег РЬе РЬе Ьеи 405 Туг Зег Ьуз 410 Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз 415 Зег
Агд Тгр 61п 61п 61у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеС Нхз 61и А1а
420 425 430
Ьеи ΗΪ3 Азп Н1з Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег РГО <31у Ьуз
435 440 445
Зег 61у С1у С1у <31у Зег <31у С1у 61у 61у Зех 61у 61у <Э1у 61у Зег
450 455 460
Азр Не С1п МеЬ ТЬг 61п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Бег Уа1 <Э1у
465 470 475 480
Авр Агд Уа1 ТЫ Не ТЬг Суз Агд А1а Зег 61п Азр Не Агд Туг Туг
485 490 495
Ьеи Азп Тгр Туг <31п 6111 Ьуз Рго 61у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи. Не
500 505 510
Туг Уа1 А1а Зег Зег Ьеи 01п Зег 61у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег 61у
515 520 525
Зег 61у Зег 61у ТЬг 61и РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Зег Зег Ьеи 61п Рго
530 535 540
<31и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз Ьеи 61п Уа1 Туг Зег ТЫ Рго Агд
545 550 555 560
ТЬг РЬе С1у □1п О1у ТЬг Ьуз 7а1 61и Не Ьуз 61у 61у <31у 61у Бег
565 570 575
61у 61у <Э1у <31у Зег 61у С1у 61у О1у Бег 61и Уа1 С1п Ьеи Уа1 61и
580 5В5 590
Зег 61у 61у 61у Ьеи А1а Ьуз Рго О1у 61у Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз
595 600 605
А1а А1а Зег 61у РЬе Агд РЬе ТЬг РЬе АЗП Азп Туг Туг Мес Азр Тгр
610 615 620
Уа1 Агд <31п А1а Рго 61у С1п 61у Ьеи 61и Тгр Уа1 Зег Агд Не Зег
625 630 635 640
Зег Зег С1у Азр Рго ТЬг Тгр Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз 61у Агд РЬе
645 650 655
ТЬг Не Зег Агд С1и Азп А1а Ьуз Азп ТЬг Ьеи РЬе Ьеи 61п МеС Азп
660 665 670
- 209 015992
Зег Ьеи Агд А1а С1и Аар ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а Зег Ьеи ТЬг
675 600 605
ТЬг О1у Зег Аар Зег Тгр <Э1у <Э1п 31у Уа1 Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
690 695 700
<210> 65 <211> 645 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400 > 65
дасаЬссада СдасссадЬс Сссаьсьссс сьдсссдсаь сСдСадддда сададЬсасс 60
аЬсасСЬдса дддсаадЕса ддасаСЬадд ЬаЬСаСЕЕаа аЬЬддЬаЬса дсадааасса 120
ддаааадсЬс сЬаадсЬссЬ даЬсСаЬдЬЬ дсаЬссадЪЬ ЬдсааадЬдд ддСсссаСса 180
аддььсадсд дсадЬддаЬс Сдддасадад ЬЬсасЬсЬса ссдЕсадсад ссЬдсадссс. 240
даадаЬСССд сдасЬСаССа сЬдЬсСасад дЬЬЬаСадса ссссьсддас дЬСсддссаа 300
дддассаадд ьддаааьсаа асдСасддЬд дсЬдсассаЬ сСдСсЬСсаС сСЬсссдсса 360
СсЬдаЬдадс адЬЬдаааСс СддаасСдсс СсЬдЬЬдЬдЬ дссЕдсЬдаа Ъаас-еьсЬаЕ 420
сссадададд ссааадСаса дЕддааддСд даЬаасдссс ЬссааЬсддд ЬаасЬсссад 480
дададЬдЬса сададсадда садса.адда.с адсассЬаса дссСсадсад сасссЬдасд 540
сЬдадсааад садасьасда дааасасааа дьсЬасдссь дсдаадьсас ссаЬсадддс 600
седадсьсдс ссдСсасааа дадсЪЁсаас аддддададр дССда 645
<210> 66 <211> 214 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт
- 210 015992 <400 66
Азр 1 1Ье СЬп Меб ТЬг 5 СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи 10 Зег АЬа Зег Уа1 15 □Ьу
Азр Агд УаЬ ТЬг 11е ТЬг Суз Агд АЬа Бег СЬп Азр Не Агд Туг Туг
20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг УаЬ АЬа Бег Зег Ьеи СЬп Бег □ьу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Бег СЬу
50 55 60
Бег СЬу Зег СЬу ТЬг □Ьи РЬе ТЫ Ьеи ТЬг УаЬ Зег Бег Ьеи СЬп Рго
65 70 75 80
СЬи Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз Ьеи СЬп УаЬ Туг Зег ТЫ Рго Агд
85 90 95
ТЬг РЬе СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьуз УаЬ □ Ьи Не Ьуз Агд ТЬг УаЬ АЬа АЬа
100 105 110
Рго Зег УаЬ РЬе 1Ье РЬе РГО Рго Зег Азр СЬи СЬп ьеи Ьуз Зег СЬу
115 120 125
ТЬг АЬа Зег УаЬ УаЬ Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе Туг Рго Агд СЬи АЬа
130 135 140
Ьуз УаЬ СЬп Тгр Ьуз УаЬ Азр Азп АЬа Ьеи □Ьп Зег □Ьу Азп Зег □Ьп
145 150 155 160
СЬи Зег УаЬ ТЬг СЬи СЬп Азр Зег Ьуз Азр Бег ТЬг Туг Бег Ьеи Зег
165 170 175
Зег ТЬг Ьеи ТЫ Ьеи Зег Ьуз АЬа Авр Туг □Ьи Ьуз Н1з Ьуз УаЬ Туг
180 185 190
АЬа Суз СЬи УаЬ ТЬг ΗΪ3 СЬп □Ьу Ьеи Бег Бег Рго УаЬ ТЬг Ьуз Зег
195 200 205
РЬе Азп Агд СЬу СЬи Суз
210 <210> 67 <211> 723 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 211 015992 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 67
дасаСссада СдасссадСс СссаСсССсс сСдесСдсар сСдСадддда сададисасс 60
арсасехдса дддсаадсса ддасаееадд с а ср ах С саа аьсддсасса дсадааасса 120
ддаааадсСс сЬаадсСссЬ даЬсСаЬдСС дсаЪссадСС ЬдсааадСдд ддСссааСса 180
аддхссадсд дсадСддаЕс сдддасадад еьсасхсСса ссдесадсад осСдсадссе 240
даадаССЬСд сдасЬЬаЕЬа сСдСсСасад дСССарадСа ссссСсддас дььсддссаа 300
дддассаадд сддааарсаа аддсддСддс дддСссддед ддддрддссс сдддддсддб 360
ддсЬссдадд ЬдсадсрддС ддадСсЬддд ддсддсЬСдд сааадссЬдд ддддСсссСд 420
адасСсрссС дсдсадссСс сдддССсадд ССсассеСса аСаасСасСа саЬддасСдд 480
дСссдссадд сСссадддса ддддсСддад ЕдддСсСсас дСаСЪадСад СадСддСдаС 540
сссасаСддС асдсадасСс сдСдаадддс адаССсасса СсСссадада даасдссаад 600
аасасасСдЬ ЬЪсСЬсаааЬ даасадссСд ададсЬдадд асасддсСдС сСаСЬасЬдС 660
дсдадсССда сСасадддЪс СдасЬссСдд ддссадддад ЪссЬддЬсас сдЪссссСса 720
Сда 723 <2Ю> 68 <211> 240 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 68
АЗр Не С1п Мер ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
АЗр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег 01п Азр Не Агд туг туг
20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг С1п αΐπ Ьуз Рго О1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
- 212 015992
Туг Уа1 А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег СЯу Уа1 Рго Зег 60 Агд РЬе Зег С1у
50 55
Зег С1у Зег 61у ТЬг СЯи РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Зег Зег Ьеи СНп РГО
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суд Ьеи СЯп Уа1 Туг Зег ТЬг Рго Агд
85 90 95
ТЬг РЬе 61у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 61и Не Ьуз СЯу 61у 61у СЯу Зег
100 105 но
61у <Э1у С1у СЯу Зег С1у С1у СЯу С1у Зег 61и Уа1 СЯп ьеи Уа1 СЯи
115 120 12 5
Зег 61у СЯу СЯу Ьеи А1а Ьуз Рго СЯу (31у Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз
130 135 140
А1а А1а Зег СЯу РЬе Агд РЬе ТЬг РЬе АЗП Азп Туг Туг МеЬ Азр Тгр
145 150 155 160
νβΐ Агд О1П А1а Рго СЯу 31п СЯу Ьеи 61и Тгр Уа1 Зег Агд Не Зег
165 170 175
Зег Зег О1у Азр Рго ТЬг Тгр Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз <31у Агд РЬе
180 185 190
ТЬг Не Зег Агд СЯи Азп А1а Ьуз Азп ТЬг Ьеи РЬе Ьеи <Э1п МеЬ Азп
195 200 205
Зег Ьеи Агд А1а 61и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а Зег Ьеи ТЬг
210 215 220
ТЬг 61у Зег Азр Зег Тгр С31у СЯп СЯу Уа1 Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Бег Зег
225 230 235 240
<2Ι0> 69 <211> 723 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 69
- 213 015992
даддЕдсадс ^ЗЗ^ддадЕс Едддддсддс ЕЕддсааадс сЕддддддЕс ссЕдадасЕс 60
ЕссЕдсдсад ссЕссдддЕЕ саддЕЕсасс ЕЕсааЕаасЕ асЕасаЕдда сЕдддЕссдс 12 0
саддсЕссад ддсаддддсЕ ддадЕдддЕс ЕсасдЕаЕЕа дЕадьадЕдд ЕдаЕсссаса 180
ЕддЕасдсад асЕссдЕдаа дддсадаЕЕс ассаЕсЕсса дададаасдс саадаасаса 240
сЕдЕЕЕсЕЕс аааЕдаасад ссЕдададсЕ даддасасдд сЕдЕсЕаЕЕа сЕдЕдсдадс 300
ЕЕдасЕасад ддЕсЕдасЕс сЕддддссад ддадЕссЕдд ЕсассдЕсЕс сЕсаддсддЕ 360
ддсдддЕссд ЛдддддЕдд сЕссдддддс ддЕддсЕссд асаЕссадаЕ дасссадЕсЕ 420
ссаЕсЕЕссс ЕдЕсЕдсаЕс ЕдЕаддддас ададЕсасса ЕсасЕЕдсад ддсаадЕсад 480
дасаЕЕаддЕ аЕЕаЕЕЕааа ЕЕддЕаЕсад садааассад даааадсЕсс ЕаадсЕссЕд 540
аЕсЕаЕдЕЕд саЕссадЕЕЕ дсааадЕддд дЕсссаЕсаа ддЕЕсадсдд садЕддаЕсЕ 600
дддасададЕ ЕсасЕсЕсас сдЕсадсадс сЕдсадссЕд аадаЕЕЕЕдс дасЕЕаЕЕас 660
ЕдЕсЕасадд ЕЕЕаЕадЕас сссЕсддасд ЕЕсддссаад ддассааддЕ ддаааЕсааа 720
Еда 723 <210> 70 <211> 240 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 70 '
С1и Уа1 О1П ьеи Уа1 (31и Зег С1у (31у 61у Ьеи А1а Ьуз РГО С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе Агд РЬе ТЪг РЬе Азп
20 25 30
Азп Туг Туг МеЕ Азр Тгр Уа1 Агд <31п А1а Рго <31у 61п С1у Ьеи <31и
35 40 45
Тгр Уа1 Зег Агд Не Зег Зег Зег <Э1у Азр Рго ТЬг Тгр Туг А1а Азр
50 55 60
Зег Уа1 Ьуз В1у Агд РЬе ТЬг Не зег Агд О1и Азп А1а Ьуз Азп Т11Г
65 70 75 80
- 214 015992
Ьеи РЬе Ьеи С1п МеЪ 85 Азп зег Ьеи Агд А1а 90 С1и Азр ТЬг А1а Уа1 95 Туг
Туг Суз А1а Зег Ьеи ТЬг ТЬг 01у Зег Азр Зег Тгр СЬу С1п С1у Уа1
100 105 110
Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег СЬу С1у С1у СЬу Зег СЬу СЬу СЬу С1у Зег
115 12 0 125
СЬу СЬу СЬу СЬу Зег Азр Не С1П МеЬ ТЬг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи
130 135 140
Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд УаЬ ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п
145 150 155 160
Азр 11е Агд туг Туг Ьеи Азп Тгр туг <31п СЬп Ьуз Рго С1у Ьуз А1а
165 170 175
Рго ьуз Ьеи Ьеи 11е Туг Уа1 А1а Зег Зег Ьеи СЬп Зег СЬу Уа1 Рго
180 185 190
Зег Агд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег С1у ТЬг СЬи РЬе ТЬг Ьеи ТЬг УаЬ
195 200 205
Зег Зег Ьеи <Э±п Рго Схи Азр Рпе Аха Таг Туг Туг Суе Ьеи Охи Уах
210 215 220
ТуГ Зег ТКг ΡΧΌ Агд ТЬг РЬе О1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не ьуз
225 230 235 240
<210> 71 <211> 44 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400 71 сдсЬддЬддЬ дссдЬЪсЬаЬ адссаЬадЬд асаЬссадаЬ даос 44 <210> 72 <211> 21
- 215 015992 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 72 дьддьсдаск НСдаСССсса с 21 <210> 73 <211> 47 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 73 сдскддСддС дссдСЬскак адссаЬадкд аддЬдсадск ддкддад 47 <210> 74 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 74 дкддссдасо даддадасдд Сдас 24 <210> 75 <211> 52 <212> ДНК
- 216 015992 <213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400> 75 ддсаСаСдаа аааасЬдсСд ССсдсдаЬЪс сдсСддСддС дссдЬСсСаЬ ад 52 <210> 76 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 76
ЬддЪдсадЕс Сдддддсддс СЪд 33 <210> 77 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 77 дадСсЬдддд дсддсггсдс ааадссСддд ддд 33 <210> 78 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 217 015992 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 78 дСсйдддддс ддсССдгйдт адссСддддд дСсссСд 37 <210> 79 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 79 дССсаддССс ассСЬсадса асСасйасаС ддас 34 <210> 80 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 80 саараасСас РасаСдтгсС дддйссдсса ддсСс 35 <210> 81 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 218 015992 <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 81 сдссаддсЪс садддагддд дсЕддадкдд дкс 33 <210> 82 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 82 дддскддадС дддксдзссд каССадкадк адкд 34 <210> 83 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 83 дадкдддкск сасдкакдад кадкадкддк даЬс 34 <210> 84 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
- 219 015992 олигонуклеотид <400> 84 ддСаббаССС аааССд-дСаб дсссадааас саддаааад 39 <210 85 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <22 3> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонукле отид <400> 85 дбаббадбад бадбддбгдс сссасабддб асдсад 36 <210 86 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонукле отид <400> 86 дбадбадбдд бдабгусаса бддбасдсад ас 32 <210 87 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид
- 220 015992 <400> 87 дЕддЕдаЬсс сасаиасЕас дсадасЕссд Ед 32 <210> 88 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 88 даЕЁсассаЕ сЕссадагас аасдссаада асасас 36 <210> 89 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 89 сассЕсаада дадаасадса адаасасасъ дЕЕЕс 35 <210> 90 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олиго!гукле отид <400> 90 дссаадааоа сасЕдкйссЕ тсаааьдаас аде 33
- 221 015992 <210> 91 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 91 даасасасСд ьссссьдааа СдаасадссС дадад 35 <210> 92 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 92 саааСдааса дссьдададд сдаддасасд дсЬдЬс 35 <210> 93 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 93 дадседадда сасддсЬгзс саЬЬасЬдЬд сд 32 <210> 94
- 222 015992 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 94 дСсЬаССасЬ дбдсдагдСС дасбасаддд ТсСд 34 <210> 95 <211> 33 .
<212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 95 садСсСссаб сЬСссддсЬс СдсаСсСдЬа ддд 33 <210> 96 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 96 ссссдтсьдс аСссгзсддд дасададсса сс 32 <210> 97 <211> 32
- 223 015992 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 97 сЬдЬадддда садасЕдасс аЬсасЪЬдса дд 32 <210> 98 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 98 ддддасадад ЪсасссЪдас еедсадддса ад 32 <210> 99 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 99 дасададЬса ссаЬсадсЬд садддсаадС сад 33 <210> 100 <211> 37 <212> ДНК
- 224 015992 <213> Искусственная последовательность <220 >
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 100 дсадддсаад СсадгдсаСС аддСаССаСС СаааЪСд 37 <210> 101 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 10!
дсаадСсадд асагстксга ссасссааас Сдд 33 <210> 102 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 102 ааССддСаСс адсаддсссс аддаааадсе сс 32 <210> 103 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 225 015992 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 103 сс১аааа§ стсскгсс! сс1§а1сШ 34 <210> 104 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <22О>
<221> тоб1Йес1_Ьа8е <222> (18)..(19) <223> а, с, ё ог I <400> 104 сЬаадсСссЬ даЬсСаСппк дсаЪссадСЬ Ъдсааад 37 <210> 105 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 105 сЬаЬд-ЬСдса ЬссадСсдсс ааадСддддС ссс 33 <210> 106
- 226 015992 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 106 садСЫдсаа адбдддТссс саЫааддГ® саде 34 <210> 107 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 107 садрддаесъ дддасадасС СсасСсСсас сдес 34 <210> 108 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 108 дадЫсасес СсассаСсад садссрдсад сс 32 <210> 109 <211> 30
- 227 015992 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 109 садсадссЬд садгдсдаад аСЕЬЕдсдас 30 <210> 110 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 110 сЕдсадссЕд аадасгасдс дассьассас Ед 32 <210> 111 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 111 ссСдаадаЬЕ ЕЕдсддасСа ЕЕасЕдЕска сад 33 <210> 112 <211> 33 <212> ДНК
- 228 015992 <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 112 дсдасССаСС аскдхзтгса ддсссасадб асе 33 <210> 113 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 113 дкккаЬадСа ссссСпмаас дкксддссаа ддд 33 <210> 114 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 114 дкассссЬсд дасдЬддддс саадддасса ад 32 <210> 115 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 229 015992 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400 115 дсбссадддс аддддбдсда дбдддбсбса сд 32 <210> 116 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400 116 дСассссбсд дасдбдсддс саадддасса ад 32 <210 117 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонукле отид <400 117 сбСдасбаса дддбсббдсб ссбддддсса дддад 35 <210> 118 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220
- 230 015992 <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400 118 ддаааадсСс сЬаадСдссЬ даЪсЬаСдСЬ дс 32 <210> 119 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 119 дасЪасаддд ЪсСдасСдсС ддддссаддд адСс 34 <210 120 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400 120 ддаааадсСс ссаадСдссс дасссасдсс дс 32 <210> 121 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический
- 231 015992 олигонуклеотид <400> 121 саддсСссад ддсадСдссС ддадбдддсс есас 34 <210 122 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400 122 ссСсддасдС СсддсСдсдд дассааддСд даааСс 3 6 <210> 123 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221> тобИ1е{1_Ьазе <222> (17)..(18) <223> а, с, β ог I <400> 123 дЪассддСад даддстппгк аааСсадЬда ЬССадд 36 <210> 124 <211> 33 <212> ДНК
- 232 015992 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический о лигонукле отцц <400> 124 дддааддсСс сСаааССасб даСССссСсд дсс 33 <210> 125 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический о лигонукле отид <220 <221> тобШсб_Ьазс <222> (18) <223> а, с, § ог I <400> 125 ддасассЬСс асйдасЬпсс саддсССсьС сас 33 <2Ю> 126 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 126 даСссЬддда аддСТСХдас сасбддддсс аадддас 37
- 233 015992 <210> 127 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 127 дддЕссЕсад ЕдаадиЕгЕс сЕдсааддсЕ ЕсЕд 34 <210> 128 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 128 садддасЕЕд адЕддуккдд аЕддаЕЕЕаЕ ссЕд 34 <210> 129 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221 > тобШеб_Ьазе <222> (17)
- 234 015992 <223> а, с, § ог 1 <400> 129 даадЬЬсаад ддсаддпуса сааЬсасЬдс адас 34 <210> 130 <211> 42 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 130 ддаСддаЬЬе аЬссЬддааа СддЬсаЬдсЪ садЪасааЬд ад 42 <210> 131 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <220>
<221 > тосИГ1ед_Ьазе <222> (17) <223> а, с, β ог ί <400> 131 ддЬддЬадЪд асаЬЬлтзаЬ дасссадСсЬ ссЬадс 36 <210> 132 <211> 75 <212> ДНК
- 235 015992 <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 132 ддсддбддад ддЬссддбдд адддддсСсС ддадддддсд дЬЪсаддддд сддЬддаЬсд 60 дддддаддьд дсьсс 75 <210> 133 <211> 25 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 133
С1у С1у С1у С1у Зег С1у <31у С1у С1у Зег С1у С1у <31у О1у Зег С1у
10 15
С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у 51у Зег
25 <210> 134 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 134 адададасдс дЬдЬссЬдбс сааддбссаа сВддЬдсад 39 <210> 135
- 236 015992 <211> 89 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 135 адссассЬсс ссссдаСсса ссдсссссЬд аассдссссс ьссададссс ссьссассдд 60 асссСссасс дссСССдаСс ЬссассСЬд 89 <210> 136 <211> 90 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <400> 136 ададададаЪ сЬСдасСдСс СсСссаддсЪ СсССсадсСс аддСссадас СдсассаасЪ 60 ддаСсСддда дссаессссс сссдасссае 90 <210> 137 <211> 290 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 137 мес ьуз Ьуз Ьеи Ьеи РЬе А1а Ые Рго Ьеи Уа1 Уа1 Рго РЬе туг Зег
10 15
- 237 015992
Ηίβ Зег СЯп Уа1 20 (31п Ьеи Уа1 СЯп Зег 25 61у А1а С1и Уа1 Ьуз 30 Ьуз Рго
(31у Бег Зег νβΐ Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег СЯу Туг ТЬг РЬе ТЬг
35 40 45
ТИг Туг Туг Ьеи Н1з Тгр Уа1 Агд СЯп А1а Рго СЯу 61п СЯу Ьеи 61и
50 55 60
Тгр МеЬ СЯу Тгр Не Туг Рго (31у Азп Уа1 Н13 А1а 61п Туг Азп СЯи
65 70 75 80
Ьуз РЬе Ьуз СЯу Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг А1а Азр Ьуз Зег ТЬг Зег ТЬг
85 90 95
А1а Туг МеО (Ни Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег (Яи Азр ТЬг А1а νβΐ Туг
100 105 но
Туг Суз А1а Агд Бег Тгр СЯи (31у РЬе Рго Туг Тгр О1у 01п СЯу ТЬг
115 120 125
ТЬг ν&1 ТЬг Уа1 Зег Зег (31у С1у СЯу С1у Зег СЯу С1у 01у СЯу Зег
130 135 140
61у 61у <31у 61у Зег СЯу О1у С1у 61у Зег Азр Не С1п Мек ТЬг СЯп
145 150 155 160
Бег РГО зег Бег Ьеи Бег А1а Зег Уа1 СЯу АЗр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг
165 170 175
Суз Ьуз А1а Бег αΐη Азп Уа1 61у Не АЗП Уа1 А1а Тгр Туг О1п Θΐη
180 185 190
Ьуз Рго СЯу Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи 11е Бег Зег А1а Зег Туг Агд
195 200 205
Туг Зег 61у Уа1 Рго Бег Агд РЬе Зег СЯу Зег 61у Бег СЯу ТЬг Азр
210 215 220
РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег зет Ьеи СЯп Рго (Яи Азр РЬе А1а ТЬг Туг
225 230 235 240
РЬе Суз СЯп <31п Туг Азр ТЬг Туг Рго РИе ТЬг РЬе 61у СЯп СЯу ТЬг
245 250 255
Ьуз Уа1 С1и Х1е Ьуз Азр Азр Азр Азр Ьуз Бег РЬе Ьеи С1и <31п Ьуз
260 265 270
Ьеи Не Зег 61и С1и Азр Ьеи Азп Бег А1а Уа1 Азр Нхз ΗΪ3 Нхз НХЗ
275 280 285
- 238 015992
ΗΪ3 Н13
290 <210> 138 <211> 290 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический конструкт <400> 138
МеЬ Ьуз Ьуз Ьеи Ьеи РЬе АЬа ЬЬе Рго Ьеи УаЬ УаЬ Рго РЬе Туг Зег
1 5 ЬО 15
Ηΐε Зег СЬп УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬп Зег СЬу АЬа СЬи УаЬ Ьуз Ьуз Рго
20 25 30
СЬу Зег Зег УаЬ Ьуз УаЬ Зег Суз Ьуз АЬа Зег СЬу Туг ТЬг РЬе ТЬг
35 40 45
ТЬг Туг Туг Ьеи Ηί3 Тгр УаЬ Агд СЬп А1а Рго СЬу СЬп СЬу Ьеи СЬи
50 55 60
Тгр МеС СЬу Тгр Не Туг Рго СЬу Азп СЬу НЬз АЬа СЬп Туг Азп СЬи
65 70 75 80
Ьуз РЬе Ьуз СЬу Агд УаЬ ТЬг Не ТЬг АЬа Азр Ьуз Зег ТЬг Зег ТЬг
85 90 95
АЬа Тук МеС СЬи Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег СЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг
100 105 110
Туг Суз АЬа Агд Зег Тгр СЬи СЬу РЬе Рго Туг Тгр СЬу СЬп ОЬу ТЬг
115 120 125
ТЬг УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег ОЬу СЬу ОЬу СЬу Зег
ЬЗО 135 14 0
аьу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег Азр Не СЬп Мей ТЬг СЬп
145 150 155 160
Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу Азр Агд УаЬ ТЬг Не ТЬг
165 170 175
- 239 015992
Суз Ьуз АЬа Зег СЬп 180 Азп УаЬ СЬу 11е Азп УаЬ 185 АЬа Тгр Туг 190 СЬп СЬп
Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Зег Ьеи Не Зег Зет АЬа Зег Туг Агд
195 200 205
туг Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег СЬу ТНг Авр
210 215 220
РЬе ТЬг Ьеи ты 1Ье Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи Азр РЬе АЬа ТЬг Туг
225 230 235 240
РНе Суз СЬп СЬп Туг Азр ТЫ Туг РГО РЬе ТЬг РЬе СЬу СЬп СЬу ТЬг
245 250 255
Ьуз УаЬ СЬи Не Ьуз Азр Азр Азр Азр Ьуз Зег РЬе Ьеи СЬи СЬп Ьуз
260 265 270
ьеи 11е Зег СЬи СЬи Азр Ьеи Азп Зег АЬа УаЬ Азр НЬз НЬз НЬз НЬз
275 280 285
НхЗ НЬз
290 <210> 139 <211> 33 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 139
УаЬ Ьуз Ьеи ТЫ УаЬ Зег СЬп СЬу СЬп Рго УаЬ Ьуз Ьеи Азп Суз Зег
1 5 10 15
УаЬ СЬи СЬу СЬи СЬи Рго Азр 1Ье СЬп Тгр УаЬ Ьуз Азр СЬу АЬа УаЬ
25 30
УаЬ <210> 140 <211> 44
- 240 015992 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 140
СЬп УаЬ 1 Ьеи СЬп Зег УаЬ 5 АЬа СЬу СЬп ТИг Ьеи Тйг УаЬ Агд Суз С1п
10 15
Туг Рго Рго Тйг СЬу Зег Ьеи Туг С1и Ьуз Ьуз СЬу Тгр Суз Ьуз СЬи
20 25 30
АЬа Зег АЬа Ьеи УаЬ Суз ЬЬе Агд Ьеи УаЬ ТИг Зег
35 40
<210> 141 <211> 42 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 141
Ьеи Ьуз 1 ЬЬе СЬп АЬа 5 Туг Рйе Азп СЬи ТЙГ 10 АЬа Азр Ьеи Рго Суз 15 С1п
АЬа Азп Зег СЬп Азп СЬп Зег Ьеи Зег СЬи Ьеи УаЬ УаЬ Рйе Тгр □Ьп
20 25 30
Азр СЬп СЬи АЗП Ьеи УаЬ Ьеи Азп СЬи УаЬ
35 49
<210> 142 <211> 51 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 241 015992 <220>
<22 3> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 142
Уа1 Уа1 Агд Уа1 Рго ТЬг А1а ТЬг Ьеи Уа1 Агд Уа1 Уа1 С1у ТЬг С1и
1 5 10 15
Ьеи Уа1 11е Рго Суз Азп Уа! Зег Азр Туг Азр О1у Рго Зег <31и (31п
20 25 30
Азп РЬе Азр Тгр Зег РЬе Зег Зег Ьеи б!у Зег Зег РЬе Уа! С1и Ьеи
40 45
А1а Зег тЬг <210> 143 <211> 44 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 143
А1а Ьеи ТЬг С1п С1п Азр С1у С1у Мек Зег Уа1 А1а О1и С1у С1п А! а
1 5 10 15
Ьеи Ьеи Ьеи Рго Суз <31у А1а ТЬг Ьеи 01у <3!у Рго Азп Ьеи Зег Уа!
20 25 30
Уа! Тгр Уа! Зег Рго Агд (31п 31и Азр Ьеи Уа! А!а
40 <210> 144 <211> 45 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 242 015992 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 144
Зег Ъеи Агд 1 ναΙ Зег 5 Рго Ъуз Азп Рго Агд Уа1 10 Рго Ъуз Зег ΗΪ3 15 ТЬг
Ъеи С1и Ъеи Н13 Суз (31и Зег θΐη Суз Азр Зег ΗΪ3 Ъеи Ъуз Туг Зег
20 25 30
Ъеи Ьуз Ъеи Зег Тгр Зег Ъуз Азр <31у С1и А1а РЬе <31и
35 40 45
<210> 145 <211> 44 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 145
Уа1 Уа1 Рго ТЬг Уа1 Н1з Агд Азп νβΐ ТЫ Уа1 Зег Агд 61у (31и Рго
1 5 10 15
Уа1 ТЬг Ъеи Азп Суз Зег Не Азп Меб ТЬг Азп 11е ТЬг С1п 11е Зег
20 25 30
Тгр Агд Ьуз Азр ТИг Ъеи 11е РЬе Уа1 Туг Ьеи А1а
35 40
<210> 146 <211> 39 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
- 243 015992 пептид <400> 146
Н13 <31п С1п С1п Не С1у Уа1 С1и С1у Ьуз С1и Уа1 Не Ьеи Азп Суз
1 5 10 15
Ьуз ТНг Нхз Азр Ьуз Азр Уа1 ТЬг Тгр Ьуз Туг Ьуз Туг Азр ТЬг <31у
20 25 30
Зег А1а Не Не Не Не О1п
35
<210> 147 <211> 51 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 147
Уа1 А1а Зег С1п <21у С1у Н1з Уа1 С1и Зег Уа1 Туг Ьеи Туг С1у ТЬг
1 5 10 15
Уа1 С1и Ьеи Рго Суз О1и РЬе Рго РЬе Уа1 ТЬг О1у Рго О1п Азр Ьеи
20 25 30
Уа1 МеЬ ТЬг Тгр Ьеи Ьуз Уа1 Уа1 (51п Азр Зег <31и Азп Уа1 Уа1 Уа1
35 40 45
Н1з Зег Туг <210> 148 <211> 51 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
- 244 015992 пептид <400> 148
ТЬг Не ТЬг А1а Рго Ьуз Азр Ьеи Туг Уа1 Уа1 С1и Туг (31у Зег Азп
1 5 10 15
!7а1 ТЬг МеЬ О1и Суз Агд РЬе Рго Уа1 С1и Агд С1и Азр Ьеи Ьеи А1а
20 25 30
Ьеи Уа1 Уа1 Туг Тгр С1и Ьуз (31и Азр <31и О1п Уа1 Не С1п РЬе Уа1
35 40 45
А1а О1у С1и <210> 149 <211> 50 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 149
Ьуз Не (Э1и А1а Рго Уа1 Азп Уа1 Не Уа1 С1п Агд С1у Ьеи Суз Уа1
1 5 10 15
Ьеи Не Рго Суз Азп РЬе ТЬг Уа1 (31у Рго Ьуз Туг Азп Ьеи ТЬг Ьуз
20 25 30
Азр А1а Не С1у Не Тгр Туг Ьуз С1у Ηί8 Рго Азп Азр Рго νπΐ А1а
35 40 45
А1а Зег <210> 150 <211> 49 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 245 015992 <223 > Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 150
01п О1у А1а Уа1 Рго О1и 01и Ьеи ΗΪ3 Ьуз Низ Рго 01у <31п ТЬг Ьеи
1 5 10 15
Ьеи Ьеи С1п Суз С31п Туг Зег Рго Ьуз Агд С1у Рго Туг 01п Рго Ьуз
20 25 30
Зег Тгр Суз 01п 01п ТЬг Зег Рго Зег Агд Суз ТЬг Ьеи Ьеи Уа1 ТЬг
40 45
Зег <210> 151 <211> 46 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности; Синтетический пептид <400> 151
Зег Ьеи Зег Азр Зег Уа1 Зег Зег А1а Уа1 Ьеи 01у Зег Зег А1а Ьуз
1 5 10 15
Ьеи Не Суз О1п РЬе ТЬг Рго Уа1 Уа1 Азр А1а Ьуз Азп νβΐ 01и 11е
20 25 30
Агд Тгр РЬе ТЬг Агд Зег РЬе Агд Рго Туг Уа1 Низ О1п Туг
35 40 45
<210> 152 <211> 49 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 246 015992 <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 152
Уа1 С1у ТЬг С1п Агд Рго Не С1и Ьеи ΗΪ8 Ьеи С1у С1и Ьеи Агд С1у
1 5 10 15
Зег Не ТЬг Не Рго СУз Рго Рго е1у АЗр Зег Тгр О1у 01у ТЬг Агд
20 25 30
Агд Ьеи Тгр Суз Агд Уа1 С1у Агд Зег Агд Суз Не Ьеи Не А1а Азр
35 40 45
ТЬг <210> 153 <211> 39 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 153
61п Ьеи Уа1 Рго Уа1 Рго Азп Уа1 ТЬг Уа1 Зег Рго О1у С1и ТЬг А1а
1 5 10 15
Не Ьеи Зег Суз Ьеи Уа1 Ьеи Зег С1и А1а Рго Туг Азп Ьеи ТЬг Тгр
20 25 30
Уа1 Аид Азр Тгр Агд Уа1 Ьеи
35
<210> 154 <211> 47 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
- 247 015992 пептид <400> 154
Меб Уа1 О1и С1п МеС Азр АЗП Ьуз ТЬг Ча1 Уа1 Зег 01у ьуз Рго Уа1
1 5 10 15
ТЬг РЬе Ьеи Суз Азп туг Не Ьеи Зег Мес Агд Уа1 Агд С1П ν«1 Ьеи
20 25 30
Тгр Ьуз Ьуз ТЬг А1а С1и О1п Н1у Азр ТЬг А1а 11е Уа1 А1а Зег
35 40 45
<210> 155 <211> 42 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 155
Зег <31п МеЬ Уа1 Зег 61и РГО (31у Ьуз Азп 11е ТЬг Ьеи ТЬг Суз С31и
1 5 10 15
Рго Агд О1и Азп. Н13 Ьеи Ьеи С1и С1и νδΐ зег тгр <Э1и Ьуз 11е (31п
20 25 30
Рго (31п С1п 11е Азр Ьеи Ьеи 11е Зег Суз
35 40
<210> 156 <211> 30 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <220>
- 248 015992 <221> Μ0Ό-ΚΕ8 <222> (6)..(10) <223 > Участок может присутствовать или отсутствовать <220>
<221> ΜΟϋ_ΚΕ8 <222> (11)..(15) <223> Участок может присутствовать или отсутствовать <220>
<221> ΜΟΌ_ΚΕ5 <222> (16)..(20) <223 > Участок может присутствовать или отсутствовать <220>
<221> ΜΟΌ ΚΕ8 <222> (21)..(25) <223> Участок может присутствовать или отсутствовать <220>
<221> ΜΟϋ ΚΕδ <222> (26),.(30) <223> Участок может присутствовать или отсутствовать, <400> 156
С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у О1у С1у Зег С1у
1015
С1у <Э1у 01у Зег С1у <Э1у 01у 01у Зег О1у С1у <31у С1у Зег
2530 <210> 157 <211> 31 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 249 015992 <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <220>
<221> ΜΟϋ_ΚΕ5 <222> (7)..(11) <223> Участок может присутствовать или отсутствовать <220>
<221> М0ЩКЕ8 <222> (12)..(16) <223> Участок может присутствовать или отсутствовать <220>
<221> МОО_КЕ8 <222> (17),.(21) <223> Участок может присутствовать или отсутствовать <220>
<221> ΜΟϋ КЕ8 <222> (22),.(26) <223> Участок может присутствовать или отсутствовать <220>
<221> МОЦ КЕ8 <222> (27)..(31) <223> Участок может присутствовать или отсутствовать <400> 157
Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег
10 15
СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу С1у С1у С1у Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег
25 30 <210> 158
- 250 015992 <2Π> 4 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический <220>
<221> ΜΟϋ_ΚΕ5 <222> (1) <223> 8ис-Ье1а-А1а <400> 158
А1а Ьеи А1а Ьеи <210> 159 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический тэг 5хНк <400> 159
Η13 Н1Э Н13 ΗΪΞ Η13
5 <210> 160 <211> 25 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <220>
<221> ΜΟϋ„ΚΕ5
- 251 015992 <222> (16)..(20) <223> Участок может присутствовать или отсутствовать <220>
<221> МОЭ_КЕ8 <222> (21)..(25) <223> Участок может присутствовать или отсутствовать <400> 160
СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу СЬу СЬу С1у Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу
10 15
СЬу СЬу СЬу Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег
25 <210> 161 <211> 4 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 161
Зег СЬу СЬу СЬу

Claims (37)

1. Способ получения стабилизированного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с улучшенными биофизическими свойствами, которые содержат стабилизированный Ун домен и стабилизированный Уь домен, полученные из Ун и Уь доменов антитела-кандидата, в котором выравнивают исправленный исходный набор аминокислотных последовательностей, которые относятся к надсемейству иммуноглобулинов (1д), с получением набора выравнивания, затем определяют ковариацию между по меньшей мере двумя позициями аминокислотных остатков с получением набора ковариаций, идентифицируют нековарьирующие аминокислотные остатки в Ун или Уъ доменах антителакандидата, причем нековарьирующими аминокислотными остатками являются те, которые не соответствуют ни одной ковариации в наборе ковариаций, после этого заменяют по меньшей мере один нековарьирующий аминокислотный остаток в Ун или Уь доменах антитела-кандидата аминокислотным остатком в соответствующем положении набора выравнивания, который соответствует по меньшей мере одной ковариации в наборе ковариаций, с получением стабилизированного антитела или его фрагмента.
2. Способ по п.1, в котором биофизическое свойство выбрано из группы, включающей термическую стабильность, профиль рН развертывания, стабильное удаление гликозилирования, растворимость, биохимическую функцию и их комбинации.
3. Способ по п.1, в котором стабилизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из группы, включающей доменное антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело, нечеловеческое моноклональное антитело, химерное антитело, биспецифичное антитело, 8сЕу антитело, ксЕу-содержащее антитело, антитело с удаленным доменом и комбинации любых фрагментов указанных антител.
4. Способ по п.1, в котором аминокислотные остатки в наборе ковариаций представляют собой часть структурного признака, выбранного из группы, включающей дисульфидный мостик, солевой мостик, фрагмент лигандсвязывающего кармана или поверхности, Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия, водородные связи и/или заряд-зарядное взаимодействие.
5. Способ по п.1, в котором аминокислотные последовательности в наборе выравнивания обладают менее чем 95% идентичностью по отношению друг к другу.
6. Способ по п.1, в котором получение исправленного исходного набора включает создание набора трехмерных структур 1д-укладки, причем указанные структуры 1д-укладки выбраны из группы, включающей укладку У-класса, 1-класса, С1-класса и С2-класса и комбинации указанных классов 1д-укладки, фильтрование указанного набора структур 1д-укладки исключением структур 1д-укладки, которые содержат последовательности с разрывами, 100% идентичностью, аберрантной длиной или показывающие неправильную укладку, проведение структурного выравнивания между структурами 1д-укладки внутри отфильтрованного набора структур, проведение выравниваний последовательностей из структурных выравниваний, при котором аминокислоты из последовательности одной структуры выравнивают с аминокислотами из последовательности второй структуры на основе кратчайшего расстояния между α-углеродами полипептидных каркасов, построение скрытых марковских моделей (НММ), основанных на структурных выравниваниях последовательностей для одного из классов 1д-укладки, проведение поиска в базе данных белковых последовательностей с использованием по меньшей мере одной НММ, специфичной для класса 1д-укладки, при котором извлекаются записи о хранящихся в базе данных белковых последовательностях, совпадающих по НММ, и валидацию отнесения класса 1д-укладки белковых последовательностей, записи о которых извлечены в результате проведения поиска с использованием по меньшей мере одной НММ, при помощи аннотированной базы данных белковых доменов, где указанные извлеченные записи о последовательностяхкандидатах 1д-укладки белка сохраняются только в том случае, если их отнесение к классу 1д-укладки в аннотированной базе данных белковых доменов является статистически значимым.
7. Способ по п.1, в котором выравнивание дополнительно включает удаление лишних или имеющих высокую степень сходства аминокислотных последовательностей из набора выравнивания и удаление столбцов в выравнивании, которые не совпадают в НММ-профиле.
8. Способ по п.1, в котором определение ковариации включает по меньшей мере одну стадию, выбранную из группы, включающей идентификацию разрывов как признаков аминокислот различного типа, определение веса аминокислот, причем указанное определение отлично от определения веса уникальности по Хеникову, фильтрацию коварьирующих пар, в которой не используются средние идентичности последовательностей (8ΆΙ), отсечение по событию, при котором коварьирующие пары не регист
- 253 015992 рируются, если только они не наблюдались некоторое минимальное количество раз, и при котором отсечение по событию происходит по меньшей мере примерно 2 раза, и комбинацию двух или более указанных стадий.
9. Способ по п.1, в котором определение ковариации включает определение статистической значимости вариации с использованием '//-анализа.
10. Способ по п.9, в котором значения /2 определяют при помощи формулы, основанной на событиях.
11. Способ по п.10, в котором указанная формула имеет следующий вид:
л _ ~ (р(Т) рЦ) · ЦО)!1 где ρ(ί) и ρ(ί) представляют собой частоты встречаемости аминокислотных остатков любых двух интересующих типов в положениях ί и _) соответственно в выровненном наборе последовательностей;
с(1, _)) представляет собой количество случаев присутствия ρ(ί) и ρ(ί) в одной и той же последовательности;
с(!) представляет собой общее количество последовательностей в выровненном наборе последовательностей, при этом частоты встречаемости аминокислотных остатков представляют собой количество случаев присутствия аминокислотного остатка определенного типа в определенном положении в выровненном наборе последовательностей, разделенное на общее количество последовательностей в выровненном наборе.
12. Способ по п.1, в котором определение ковариации включает определение коэффициента корреляции (φ) по формуле +а^) *(^ϊ/ +αίΛ;) +¾¾) *(ар +а^) где а 1Ь; - количество случаев присутствия аминокислотных остатков типа а или Ь в одной и той же последовательности в положениях ί и _) соответственно;
- количество случаев отсутствия аминокислотных остатков обоих типов в одной и той же последовательности;
- количество случаев присутствия аминокислотного остатка типа а при отсутствии аминокислотного остатка типа Ь;
аА
7 - количество случаев отсутствия аминокислотного остатка типа а при наличии аминокислотного остатка типа Ь, при этом коэффициент корреляции (φ) определяет статистическую достоверность ковариации.
13. Способ по п.1, в котором определение ковариации включает в себя определение ковариационных счетов только для тех ковариаций, которые удовлетворяют пороговому значению статистической достоверности.
14. Способ по п.13, в котором ковариационные счета определяют только для тех ковариаций, которые обладают значением выше или ниже порогового значения / 2 или значения φ.
15. Способ по п.14, в котором положениям аминокислотных остатков последовательностикандидата присваивают положительные специфические ковариационные счета для положительных ковариаций, коэффициент корреляции φ которых составляет от примерно +0,25 до примерно +1,0.
16. Способ по п.14, в котором положениям аминокислотных остатков последовательностикандидата присваивают отрицательные специфические ковариационные счета для отрицательных ковариаций, коэффициент корреляции φ которых составляет от примерно -0,25 до примерно -1,0.
17. Способ по п.1, который дополнительно включает получение структурных моделей доменов Ун или Уъ образца антител и доменов Ун или У|, антитела-кандидата, идентификацию аминокислотных остатков области белок-белкового взаимодействия в домене Ун или Уъ образца антитела, которые важны для стабилизации указанной области, идентификацию каркасных аминокислотных остатков, которые коварьируют с идентифицированными аминокислотными остатками области контакта, и замещение по меньшей мере одного соответствующего остатка области контакта или каркасной области домена Ун или Уь антитела-кандидата на соответствующие идентифицированные аминокислотные остатки указанных областей.
18. Способ по п.17, в котором Ун домен или Уъ домен образца антитела обладает укладкой надсемейства 1д.
19. Способ по п.17, в котором аминокислотные остатки области контакта расположены в области контакта Ун/Уь доменов Ун домена или Уъ домена антитела-кандидата.
20. Способ по п.1, который дополнительно включает определение консенсусного счета по меньшей мере для одного положения аминокислотного остатка доменов Ун или У|, антитела-кандидата, комбинирование консенсусных счетов с данными набора ковариации и выбор замен аминокислотных остатков,
- 254 015992 предсказанных для стабилизации νΗ домена или У|. домена антитела-кандидата, причем выбор основан на комбинации консенсусных счетов с данными ковариации.
21. Способ по п.20, в котором определение консенсусного счета включает получение исправленного исходного набора полипептидных последовательностей, принадлежащих к надсемейству 1д, выравнивание последовательностей исходного набора с получением набора выравнивания и определение частоты встречаемости исследуемого аминокислотного остатка для каждого положения внутри νΗ домена или ν3 домена антитела-кандидата, при котором частота определяется путем суммирования количества случаев наличия указанного аминокислотного остатка в соответствующем положении среди последовательностей выровненного набора и деления полученного значения на общее количество последовательностей в исходном наборе.
22. Способ по п.21, который включает определение консенсусной последовательности, в которой аминокислотный остаток в каждом положении последовательности соответствует наиболее распространенному аминокислотному остатку для данного положения в выровненном наборе, определение частоты встречаемости консенсусной аминокислоты для каждого аминокислотного положения внутри консенсусной полипептидной последовательности, при котором частота определяется путем суммирования количества случаев наличия указанного аминокислотного остатка в соответствующем положении среди последовательностей выровненного набора и деления полученного значения на общее количество последовательностей в исходном наборе, и деление частоты исследуемого аминокислотного остатка на частоту консенсусного аминокислотного остатка с получением консенсусного счета.
23. Стабилизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные способом по любому из пп.1-22, которые включают стабилизированные домены νΗ и VI, и по меньшей мере одну замену нековарьирующего аминокислотного остатка коварьирующим в соответствующем положении.
24. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.23, термическая стабильность которых, измеренная как Т50, по меньшей мере на 10°С выше, чем термическая стабильность соответствующего антитела-кандидата.
25. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.23, термическая стабильность которых, измеренная как Т50, превышает 67°С по результатам анализа термической проверки.
26. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.23, которые имеют домены νΗ и ν со стабилизированной областью контакта между ними и по меньшей мере одну стабилизирующую замену по сравнению с антителом-кандидатом в аминокислотном положении непосредственно в области контакта.
27. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.23, которые являются молекулами 5сГу. включающими линкер, соединяющий между собой домены νΗ и
28. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.27, в которых линкер содержит 8ЕС ГО N0: 21 или 8Ер ГО N0: 20.
29. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.23-28, термическая стабильность которых измеряется методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), спектроскопии кругового дихроизма (КД), флуоресцентной эмиссионной спектроскопии, спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или посредством анализа термической проверки.
30. Многовалентная антигенсвязывающая молекула, которая включает стабилизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.23-29, которые генетически гибридизованы со вторым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом.
31. Полинуклеотид, кодирующий стабилизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.23-29 или молекулу по п.30.
32. Вектор, содержащий полинуклеотид по п.31.
33. Изолированная клетка-хозяин, которая содержит вектор по п.32.
34. Способ продуцирования стабилизированной связывающей молекулы, в котором выращивают клетку-хозяин по п.33 в культуральной среде и очищают стабилизированную связывающую молекулу.
35. Способ продуцирования стабилизированной молекулы в условиях крупномасштабного производственного процесса, в котором выращивают клетку-хозяин по п.34 в условиях, пригодных для крупномасштабного производства и сбора популяции стабилизированных молекул.
36. Применение стабилизированного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.23-29 или многовалентной антигенсвязывающей молекулы по п.30 в качестве средства при лечении субъекта, при котором лечение с помощью указанных стабилизированных молекул способно облегчить состояние субъекта.
37. Применение по п.36, в котором указанный субъект страдает от заболевания или расстройства, выбранного из группы, включающей рак, аутоиммунное расстройство или заболевание и неврологическое расстройство или заболевание.
EA200802005A 2006-03-17 2007-03-19 Стабилизированное антитело и многовалентная антигенсвязывающая молекула на его основе, способы получения и использования вышеназванного стабилизированного антитела EA015992B1 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US78362206P 2006-03-17 2006-03-17
US81268806P 2006-06-09 2006-06-09
US87399606P 2006-12-08 2006-12-08
US87380206P 2006-12-08 2006-12-08
PCT/US2007/006883 WO2007109254A2 (en) 2006-03-17 2007-03-19 Stabilized polypeptide compositions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200802005A1 EA200802005A1 (ru) 2009-06-30
EA015992B1 true EA015992B1 (ru) 2012-01-30

Family

ID=38523044

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200802005A EA015992B1 (ru) 2006-03-17 2007-03-19 Стабилизированное антитело и многовалентная антигенсвязывающая молекула на его основе, способы получения и использования вышеназванного стабилизированного антитела

Country Status (16)

Country Link
US (3) US7951918B2 (ru)
EP (1) EP2024392A2 (ru)
JP (2) JP5374359B2 (ru)
KR (1) KR101516823B1 (ru)
CN (1) CN103073639A (ru)
AU (1) AU2007227292B2 (ru)
BR (1) BRPI0709598A8 (ru)
CA (1) CA2646508A1 (ru)
EA (1) EA015992B1 (ru)
GE (1) GEP20135917B (ru)
IL (1) IL194120A (ru)
MX (1) MX2008011874A (ru)
NO (1) NO20084339L (ru)
NZ (1) NZ591252A (ru)
SG (1) SG170750A1 (ru)
WO (1) WO2007109254A2 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2723131C2 (ru) * 2015-01-08 2020-06-08 Генмаб А/С Связывающиеся с рецепторами агонисты tnf
RU2725812C2 (ru) * 2014-06-25 2020-07-06 Юсб Биофарма Спрл Конструкции полиспецифических антител

Families Citing this family (376)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
RS52036B (en) 2004-12-21 2012-04-30 Medimmune Limited ANGIOPOETIN-2 ANTIBODIES AND ITS USES
NZ568015A (en) 2005-12-08 2012-03-30 Medarex Inc Human monoclonal antibodies to O8E
JP5374359B2 (ja) * 2006-03-17 2013-12-25 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 安定化されたポリペプチド化合物
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
CA2963138C (en) * 2007-01-30 2019-05-14 Epivax, Inc. Regulatory t cell epitopes, compositions and uses thereof
CA2697032C (en) 2007-08-22 2021-09-14 The Regents Of The University Of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
WO2009032782A2 (en) * 2007-08-28 2009-03-12 Biogen Idec Ma Inc. Compositions that bind multiple epitopes of igf-1r
CN101874042B9 (zh) 2007-09-26 2019-01-01 中外制药株式会社 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法
EP2195341B1 (en) 2007-09-26 2017-03-22 UCB Biopharma SPRL Dual specificity antibody fusions
WO2009043051A2 (en) * 2007-09-27 2009-04-02 Biogen Idec Ma Inc. Cd23 binding molecules and methods of use thereof
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
MX2010008025A (es) * 2008-01-22 2010-08-04 Biogen Idec Inc Anticuerpos ron y usos de los mismos.
CA2712000A1 (en) * 2008-01-28 2009-08-06 Medimmune Limited Stabilized angiopoietin-2 antibodies and uses thereof
WO2009114591A1 (en) * 2008-03-11 2009-09-17 Smithkline Beecham Corporation Method and apparatus for screening drugs for predictors of quantitatively measured events
LT2708559T (lt) 2008-04-11 2018-06-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigeną surišanti molekulė, galinti pakartotinai prisijungti prie dviejų ar daugiau antigeno molekulių
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
CA2722466A1 (en) * 2008-04-29 2009-11-05 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY31861A (es) * 2008-06-03 2010-01-05 Abbott Lab Inmunoglobulina con dominio variable dual y usos de la misma
EP2297209A4 (en) * 2008-06-03 2012-08-01 Abbott Lab IMMUNOGLOBULINS WITH TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF
WO2010006060A2 (en) * 2008-07-08 2010-01-14 Abbott Laboratories Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP2011528035A (ja) * 2008-07-14 2011-11-10 ユーシカゴ アルゴン， エルエルシー タンパク質の安定性を体系的に制御するための方法
EP2324061B1 (en) * 2008-09-03 2017-04-12 F. Hoffmann-La Roche AG Multispecific antibodies
EA201100527A1 (ru) * 2008-09-26 2011-10-31 Юсб Фарма С.А. Биологические продукты
CA2737035A1 (en) * 2008-09-30 2010-04-08 Abbott Laboratories Improved method of rna display
EP2344540B1 (en) 2008-10-02 2017-11-29 Aptevo Research and Development LLC Cd86 antagonist multi-target binding proteins
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
CN102482347B (zh) 2009-01-12 2017-04-26 希托马克斯医疗有限责任公司 修饰抗体组合物及其制备和使用方法
US8399219B2 (en) 2009-02-23 2013-03-19 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease activatable interferon alpha proprotein
MX2011009798A (es) 2009-03-20 2011-12-08 Amgen Inc Inmunoglobulinas portadoras y usos de las mismas.
WO2010110838A2 (en) * 2009-03-25 2010-09-30 Vet Therapeutics Inc. Antibody constant domain regions and uses thereof
US9325661B2 (en) * 2009-03-30 2016-04-26 Avaya Inc. System and method for managing a contact center with a graphical call connection metaphor
WO2010112194A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen-binding polypeptides and multispecific antibodies comprising them
RU2598248C2 (ru) 2009-04-02 2016-09-20 Роше Гликарт Аг Полиспецифичные антитела, включающие антитела полной длины и одноцепочечные фрагменты fab
KR20110124369A (ko) 2009-04-07 2011-11-16 로슈 글리카트 아게 이중특이적 항­ｅｒｂｂ­3／항­ｃ­ｍｅｔ 항체
PL2417156T3 (pl) 2009-04-07 2015-07-31 Roche Glycart Ag Trójwartościowe, bispecyficzne przeciwciała
WO2010115553A1 (en) 2009-04-07 2010-10-14 Roche Glycart Ag Bispecific anti-erbb-2/anti-c-met antibodies
CA2761233A1 (en) 2009-05-27 2010-12-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
EP2435478A1 (en) * 2009-05-28 2012-04-04 Glaxo Group Limited Antigen-binding proteins
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
TW201109438A (en) * 2009-07-29 2011-03-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
NZ598929A (en) * 2009-09-01 2014-05-30 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
CA2781519A1 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Genentech, Inc. Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
GB201005063D0 (en) * 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
JP2013507926A (ja) 2009-10-14 2013-03-07 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド ＩＧＦ−１Ｒ及びＥｒｂＢ３シグナル伝達を標的とする二重特異的結合剤及びその使用
TW201119676A (en) * 2009-10-15 2011-06-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
EP2501407A1 (en) 2009-11-20 2012-09-26 Amgen Inc. Anti-orai1 antigen binding proteins and uses thereof
ME02505B (me) * 2009-12-29 2017-02-20 Aptevo Res & Development Llc Heterodimerni vezujući proteini i njihove upotrebe
CN105001334A (zh) 2010-02-10 2015-10-28 伊缪诺金公司 Cd20抗体及其用途
US9616120B2 (en) * 2010-03-04 2017-04-11 Vet Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies directed to CD20
BR112012022342A2 (pt) * 2010-03-04 2017-02-14 Vet Therapeutics Inc anticorpos monoclonais dirigidos a cd52
GB201005064D0 (en) 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
AR080794A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
US20120010388A1 (en) * 2010-04-16 2012-01-12 Gottfried Himmler LeY SPECIFIC BIOTHERAPEUTIC
EP2560992A2 (en) * 2010-04-21 2013-02-27 Glaxo Group Limited Binding domains
AU2011249782B2 (en) 2010-05-06 2014-10-02 Novartis Ag Compositions and methods of use for therapeutic low density lipoprotein - related protein 6 (LRP6) multivalent antibodies
CN103038258B (zh) 2010-05-06 2017-02-15 诺华股份有限公司 用于治疗低密度脂蛋白相关蛋白质6(lrp6)的抗体的组合物及使用方法
WO2011141926A2 (en) * 2010-05-10 2011-11-17 Intas Biopharmaceuticals Limited Liquid formulation of polypeptides containing an fc domain of an immunoglobulin
CA2800173C (en) 2010-05-21 2019-05-14 Ulrik Nielsen Bi-specific fusion proteins
WO2012006635A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Biogen Idec Hemophilia Inc. Processable single chain molecules and polypeptides made using same
AU2011283694B2 (en) 2010-07-29 2017-04-13 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
JP2013537415A (ja) 2010-08-03 2013-10-03 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
WO2012019061A2 (en) 2010-08-05 2012-02-09 Stem Centrx, Inc. Novel effectors and methods of use
WO2012021475A2 (en) * 2010-08-12 2012-02-16 Eli Lilly And Company ANTI-N3pGlu AMYLOID BETA PEPTIDE ANTIBODIES AND USES THEREOF
BR112013002167A2 (pt) 2010-08-24 2016-05-31 Roche Glycart Ag anticorpo biespecífico, composição farmacêutica, uso, método de tratamento de um paciente que sofre de câncer e de um paciente que sofre de inflamação
MX340558B (es) 2010-08-24 2016-07-14 F Hoffmann-La Roche Ag * Anticuerpos biespecificos que comprenden fragmento fv estabilizado con disulfuro.
AU2011293253B2 (en) 2010-08-26 2014-12-11 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2608807A1 (en) 2010-08-27 2013-07-03 Stem Centrx, Inc. Notum protein modulators and methods of use
TW201302793A (zh) 2010-09-03 2013-01-16 Glaxo Group Ltd 新穎之抗原結合蛋白
NZ608814A (en) 2010-09-03 2015-06-26 Stem Centrx Inc Novel modulators and methods of use
SG188591A1 (en) 2010-09-22 2013-04-30 Amgen Inc Carrier immunoglobulins and uses thereof
AR083495A1 (es) 2010-10-22 2013-02-27 Esbatech Alcon Biomed Res Unit Anticuerpos estables y solubles
RS59589B1 (sr) 2010-11-05 2019-12-31 Zymeworks Inc Dizajniranje stabilnog heterodimernog antitela sa mutacijama u fc domenu
EP2647706B1 (en) 2010-11-30 2023-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
SG10201601792UA (en) 2010-12-08 2016-04-28 Stemcentrx Inc Novel modulators and methods of use
JP5766296B2 (ja) 2010-12-23 2015-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用
SA112330278B1 (ar) 2011-02-18 2015-10-09 ستيم سينتركس، انك. مواد ضابطة جديدة وطرق للاستخدام
KR101638224B1 (ko) 2011-02-28 2016-07-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 항원 결합 단백질
CN103403025B (zh) 2011-02-28 2016-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单价抗原结合蛋白
AU2012229251A1 (en) * 2011-03-11 2013-09-12 Amgen Inc. Method of correlated mutational analysis to improve therapeutic antibodies
EP2502934B1 (en) * 2011-03-24 2018-01-17 Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Single chain antigen recognizing constructs (scARCs) stabilized by the introduction of novel disulfide bonds
KR101517320B1 (ko) 2011-04-19 2015-05-28 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 단일특이적 및 이중특이적 항-igf-1r 및 항 erbb3 항체
WO2012170969A2 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Biogen Idec Ma Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
JP6120848B2 (ja) 2011-08-15 2017-04-26 メディミューン，エルエルシー 抗ｂ７−ｈ４抗体およびその使用
JP2015527869A (ja) 2011-08-26 2015-09-24 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド タンデムＦｃ二重特異性抗体
US20130058947A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc Novel Modulators and Methods of Use
MX2014002996A (es) 2011-09-23 2014-05-28 Roche Glycart Ag Anticuerpos anti - egfr/anti - igf-1r bisespecificos.
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
SG11201401562RA (en) * 2011-10-18 2014-09-26 Coherus Biosciences Inc Etanercept formulations stabilized with sodium chloride
US10485869B2 (en) 2011-10-18 2019-11-26 Coherus Biosciences, Inc. Etanercept formulations stabilized with meglumine
RU2018112861A (ru) * 2011-10-20 2019-03-04 ИЭсБиЭйТЕК - Э НОВАРТИС КОМПАНИ ЭлЭлСи Стабильные антитела, связывающиеся с несколькими антигенами
CN104039830A (zh) * 2011-11-04 2014-09-10 诺华股份有限公司 低密度脂蛋白相关蛋白6(lrp6)-半寿期延长物构建体
JP6326371B2 (ja) 2011-11-04 2018-05-16 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｆｃドメインにおける変異を有する安定なヘテロ二量体抗体デザイン
HUE033245T2 (hu) * 2011-12-19 2017-11-28 Synimmune Gmbh Bispecifikus ellenanyag molekula
CA2861610A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against il-13 and/or il-17
JP6226752B2 (ja) * 2012-02-09 2017-11-08 中外製薬株式会社 抗体のＦｃ領域改変体
KR20140127854A (ko) 2012-02-10 2014-11-04 제넨테크, 인크. 단일-쇄 항체 및 다른 이종다량체
JP6007310B2 (ja) 2012-04-05 2016-10-12 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ヒトｔｗｅａｋ及びヒトｉｌ１７に対する二重特異性抗体並びにその使用
US9499634B2 (en) 2012-06-25 2016-11-22 Zymeworks Inc. Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells
WO2014001325A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
RU2639287C2 (ru) 2012-06-27 2017-12-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ отбора и получения высокоселективных и мультиспецифичных нацеливающих групп с заданными свойствами, включающих по меньшей мере две различные связывающие группировки, и их применения
WO2014006124A1 (en) 2012-07-04 2014-01-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked antigen-antibody conjugates
EP3339328A1 (en) 2012-07-04 2018-06-27 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-biotin antibodies and methods of use
MX353951B (es) 2012-07-04 2018-02-07 Hoffmann La Roche Anticuerpos de anti-teofilina y metodos de uso.
EP3632462A1 (en) 2012-07-06 2020-04-08 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
SG11201408646VA (en) 2012-07-06 2015-01-29 Genmab Bv Dimeric protein with triple mutations
CN104661651A (zh) 2012-07-09 2015-05-27 科荣生生物科学公司 表现出不溶性微粒显著减少的依那西普制剂
PE20150361A1 (es) 2012-07-13 2015-03-14 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-vegf/anti-ang-2 y su utilizacion en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares
US11236168B2 (en) 2012-08-24 2022-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Mouse FcγammaRII-specific Fc antibody
ES2657377T3 (es) 2012-09-11 2018-03-05 Coherus Biosciences, Inc. Etanercept plegado correctamente con alta pureza y excelente rendimiento
US9771573B2 (en) 2012-10-03 2017-09-26 Zymeworks Inc. Methods of quantitating heavy and light chain polypeptide pairs
NZ707641A (en) 2012-11-01 2016-09-30 Abbvie Inc Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US9914785B2 (en) * 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
CA3206122A1 (en) 2012-11-28 2014-06-05 Zymeworks Bc Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
JP2016509582A (ja) 2012-12-19 2016-03-31 アンプリミューン， インコーポレイテッド 抗ヒトｂ７−ｈ４抗体およびその使用
WO2014108198A1 (en) 2013-01-10 2014-07-17 Genmab B.V. Human igg1 fc region variants and uses thereof
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10738132B2 (en) 2013-01-14 2020-08-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
WO2014113510A1 (en) 2013-01-15 2014-07-24 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
US10047163B2 (en) 2013-02-08 2018-08-14 Abbvie Stemcentrx Llc Multispecific constructs
WO2014138449A1 (en) 2013-03-06 2014-09-12 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Anti-c-met tandem fc bispecific antibodies
HUE042020T2 (hu) 2013-03-11 2019-06-28 Genzyme Corp Génmódosított anti-TGF-béta ellenanyagok és antigénkötõ fragmensek
TWI683666B (zh) 2013-03-15 2020-02-01 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ｉｘ多肽調配物
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP3421495A3 (en) 2013-03-15 2019-05-15 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
WO2014150973A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Eli Lilly And Company Methods for producing fabs and bi-specific antibodies
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
TW201512219A (zh) 2013-03-15 2015-04-01 Abbvie Inc 針對ＩＬ－１β及／或ＩＬ－１７之雙特異性結合蛋白
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
KR102049991B1 (ko) 2013-03-28 2019-12-02 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 Her2 이중 특이 항체
KR102074421B1 (ko) 2013-03-29 2020-02-10 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체
AU2014250434B2 (en) 2013-04-02 2019-08-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant
RU2670748C9 (ru) 2013-06-24 2018-12-13 Аблбио Конъюгаты антител с лекарственными агентами, обладающие улучшенной стабильностью, и их применение
CN113248615A (zh) 2013-07-05 2021-08-13 根马布股份公司 人源化或嵌合cd3抗体
EP3024851B1 (en) 2013-07-25 2018-05-09 CytomX Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same
CN104341504B (zh) 2013-08-06 2017-10-24 百奥泰生物科技(广州)有限公司 双特异性抗体
EP3042205B1 (en) * 2013-09-06 2019-12-25 F. Hoffmann-La Roche AG Method for improving antibody stability
JP6422956B2 (ja) 2013-10-11 2018-11-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性ドメイン交換共通可変軽鎖抗体
EP3065769A4 (en) 2013-11-08 2017-05-31 Biogen MA Inc. Procoagulant fusion compound
RU2737882C2 (ru) 2013-11-27 2020-12-04 Займворкс Инк. Биспецифические антигенсвязывающие конструкции против her2
WO2015085179A1 (en) * 2013-12-06 2015-06-11 The Regents Of The University Of California Alpha-v beta-6 integrin-binding antibody fragments
BR112016013562A2 (pt) 2013-12-20 2017-10-03 Hoffmann La Roche Anticorpos anti-tau(ps422) humanizados, seus usos, e formulações farmacêuticas
BR112016014945A2 (pt) 2014-01-03 2018-01-23 F. Hoffmann-La Roche Ag conjugado, formulação farmacêutica e uso
CA2933384A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-hapten/anti-blood brain barrier receptor antibodies, complexes thereof and their use as blood brain barrier shuttles
CA2930154A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked helicar-anti-helicar antibody conjugates and uses thereof
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
CU24481B1 (es) 2014-03-14 2020-03-04 Immutep Sas Moléculas de anticuerpo que se unen a lag-3
EP3593812A3 (en) 2014-03-15 2020-05-27 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
BR112016022385A2 (pt) 2014-03-28 2018-06-19 Xencor, Inc anticorpos específicos que se ligam a cd38 e cd3
BR112016027888A2 (pt) 2014-05-28 2017-10-24 Zymeworks Inc construto de polipeptídeo de ligação ao antígeno isolado, polinucleotídeo isolado ou um conjunto de polinucleotídeos isolados, vetor ou conjunto de vetores, célula isolada, composição farmacêutica, uso do construto, método para tratar um sujeito com uma doença ou distúrbio, método para obter um construto, método para preparar um construto, meio de armazenamento legível por computador, método para produzir um construto de polipeptídeo de ligação com antígeno bi-específico e método para preparar um construto de polipeptídeo de ligação com antígeno isolado
AR100978A1 (es) 2014-06-26 2016-11-16 Hoffmann La Roche LANZADERAS CEREBRALES DE ANTICUERPO HUMANIZADO ANTI-Tau(pS422) Y USOS DE LAS MISMAS
CA2954934C (en) 2014-06-30 2023-09-26 Glykos Finland Oy Drug derivative and conjugates
AU2015283704A1 (en) 2014-07-01 2016-12-15 Pfizer Inc. Bispecific heterodimeric diabodies and uses thereof
CN107074948B (zh) 2014-07-11 2022-01-28 根马布股份公司 结合axl的抗体
EP3193915A1 (en) 2014-07-21 2017-07-26 Novartis AG Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
MY181834A (en) 2014-07-21 2021-01-08 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
WO2016014576A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor
CN107108738A (zh) 2014-07-25 2017-08-29 西托姆克斯治疗公司 抗cd3抗体、可活化抗cd3抗体、多特异性抗cd3抗体、多特异性可活化抗cd3抗体及其使用方法
EP4205749A1 (en) 2014-07-31 2023-07-05 Novartis AG Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing cells
JP6919118B2 (ja) 2014-08-14 2021-08-18 ノバルティス アーゲー ＧＦＲα−４キメラ抗原受容体を用いる癌の治療
RU2724999C2 (ru) 2014-08-19 2020-06-29 Новартис Аг Химерный антигенный рецептор (car) против cd123 для использования в лечении злокачественных опухолей
UY36302A (es) 2014-09-15 2016-04-29 Amgen Inc Proteína de unión a antígenos, bi-específicos del receptor anti-cgrp/receptor pac1 y usos de las mismas
WO2016044605A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Beatty, Gregory Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
MA41044A (fr) 2014-10-08 2017-08-15 Novartis Ag Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer
CR20170143A (es) 2014-10-14 2017-06-19 Dana Farber Cancer Inst Inc Moléculas de anticuerpo que se unen a pd-l1 y usos de las mismas
US11033637B2 (en) 2014-11-21 2021-06-15 University Of Maryland, Baltimore Targeted structure-specific particulate delivery systems
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
CN110894240B (zh) 2014-11-26 2022-04-15 森科股份有限公司 结合cd3和肿瘤抗原的异二聚体抗体
AU2015353416C1 (en) 2014-11-26 2022-01-27 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CD38
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
US20180334490A1 (en) 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
SG11201700841QA (en) 2014-12-19 2017-03-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant fc regions, and methods of use
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
MA41375A (fr) 2015-01-22 2017-11-28 Lilly Co Eli Anticorps igg bispécifiques et leurs procédés de préparation
KR102605798B1 (ko) 2015-02-05 2023-11-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용
TWI726870B (zh) 2015-03-04 2021-05-11 美商健臻公司 具有高親和性、結合性及專一性之結合轉形生長因子-β１的ｓｃＦｖ-Ｆｃ二聚體
TWI733661B (zh) 2015-03-04 2021-07-21 美商健臻公司 以高親合性、結合性及特異性結合轉化生長因子－β１的經修飾ＩｇＧ抗體
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
JP2018511346A (ja) * 2015-03-31 2018-04-26 ブイエイチスクエアード リミテッド ポリペプチド
DK3280729T3 (da) 2015-04-08 2022-07-25 Novartis Ag Cd20-behandlinger, cd22-behandlinger og kombinationsbehandlinger med en cd19-kimær antigenreceptor (car)-udtrykkende celle
US20180298068A1 (en) 2015-04-23 2018-10-18 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
US9862763B2 (en) 2015-06-24 2018-01-09 Hoffmann-La Roche Inc. Humanized anti-tau(pS422) antibodies and methods of use
PT3319993T (pt) 2015-07-10 2020-04-22 Genmab As Conjugados de anticorpo-fármaco específicos de axl para tratamento de cancro
PT3317301T (pt) 2015-07-29 2021-07-09 Novartis Ag Terapias de associação compreendendo moléculas de anticorpo contra lag-3
WO2017019896A1 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to pd-1
US20180207273A1 (en) 2015-07-29 2018-07-26 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
AU2016323440B2 (en) 2015-09-15 2023-07-13 Amgen Inc. Tetravalent bispecific and tetraspecific antigen binding proteins and uses thereof
CN115960249A (zh) 2015-10-02 2023-04-14 银溪制药股份有限公司 用于组织修复的双特异性治疗性蛋白质
EP3359576A4 (en) 2015-10-08 2019-08-28 Zymeworks Inc. ANTIGENBINDING POLYPEPTIDE CONSTRUCTS WITH KAPPA AND LAMBDA LIGHT CHAINS AND USES THEREOF
JP7058219B2 (ja) 2015-12-07 2022-04-21 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｐｓｍａに結合するヘテロ二量体抗体
WO2017106578A1 (en) 2015-12-15 2017-06-22 Amgen Inc. Pacap antibodies and uses thereof
AU2016369537B2 (en) 2015-12-17 2024-03-14 Novartis Ag Antibody molecules to PD-1 and uses thereof
AU2016369623A1 (en) 2015-12-17 2018-06-28 Novartis Ag Combination of c-Met inhibitor with antibody molecule to PD-1 and uses thereof
US11359009B2 (en) 2015-12-25 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
US20210198368A1 (en) 2016-01-21 2021-07-01 Novartis Ag Multispecific molecules targeting cll-1
KR20180118175A (ko) 2016-03-04 2018-10-30 노파르티스 아게 다중 키메라 항원 수용체 (car) 분자를 발현하는 세포 및 그에 따른 용도
EP3432924A1 (en) 2016-03-23 2019-01-30 Novartis AG Cell secreted minibodies and uses thereof
EP4219721A3 (en) 2016-04-15 2023-09-06 Novartis AG Compositions and methods for selective protein expression
CN109415441B (zh) * 2016-05-24 2023-04-07 英斯梅德股份有限公司 抗体及其制备方法
EP3464375A2 (en) 2016-06-02 2019-04-10 Novartis AG Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells
CA3026151A1 (en) 2016-06-14 2017-12-21 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
EP3475889A4 (en) * 2016-06-23 2020-01-08 Capital One Services, LLC NEURONAL NETWORKING SYSTEMS AND METHOD FOR GENERATING DISTRIBUTED PRESENTATIONS OF ELECTRONIC TRANSACTION INFORMATION
EP3475304B1 (en) 2016-06-28 2022-03-23 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
BR112019000512A2 (pt) 2016-07-14 2019-04-24 Genmab A/S anticorpo, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, composição, métodos de tratamento de uma doença, para produzir um anticorpo biespecífico e para detectar se a reticulação entre as células que expressam cd40 e cd137 ocorre em uma amostra, uso de um anticorpo multiespecífico, e, kit
AU2017295886C1 (en) 2016-07-15 2024-05-16 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
CN118021943A (zh) 2016-07-28 2024-05-14 诺华股份有限公司 嵌合抗原受体和pd-1抑制剂的组合疗法
US20190161542A1 (en) 2016-08-01 2019-05-30 Novartis Ag Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
MX2019001448A (es) 2016-08-05 2019-09-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion para profilaxis o tratamiento de enfermedades relacionadas con interleucina 8 (il-8).
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
TW202340473A (zh) 2016-10-07 2023-10-16 瑞士商諾華公司 利用嵌合抗原受體之癌症治療
PE20191034A1 (es) 2016-10-14 2019-08-05 Xencor Inc Proteinas de fusion heterodimericas biespecificas que contienen proteinas de fusion fc il-15/il-15r y fragmentos de anticuerpo pd-1
BR112019008702A2 (pt) 2016-11-01 2019-07-16 Genmab B.V. polipeptídeo, método de diminuição de uma função fc efetora de um polipeptídeo, composição, método de tratamento, kit de partes, e, uso de um polipeptídeo ou composição.
US20230137351A1 (en) 2016-11-14 2023-05-04 Amgen Inc. Bispecific or biparatopic antigen binding proteins and uses thereof
US20180230218A1 (en) 2017-01-04 2018-08-16 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
ES2912408T3 (es) 2017-01-26 2022-05-25 Novartis Ag Composiciones de CD28 y métodos para terapia con receptores quiméricos para antígenos
SG11201906961UA (en) 2017-02-10 2019-08-27 Genmab Bv Polypeptide variants and uses thereof
EP3589647A1 (en) 2017-02-28 2020-01-08 Novartis AG Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
CA3055127A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Genmab A/S Antibodies against pd-l1
NZ757603A (en) 2017-03-31 2024-05-31 Genmab Holding B V Bispecific anti-cd37 antibodies, monoclonal anti-cd37 antibodies and methods of use thereof
JOP20190248A1 (ar) 2017-04-21 2019-10-20 Amgen Inc بروتينات ربط مولد ضد trem2 واستخداماته
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
EP3615068A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
CN111328335A (zh) 2017-06-07 2020-06-23 根马布私人有限公司 基于突变igg六聚体的治疗性抗体
SG11201912473PA (en) 2017-06-22 2020-01-30 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
WO2019006007A1 (en) 2017-06-27 2019-01-03 Novartis Ag POSOLOGICAL REGIMES FOR ANTI-TIM3 ANTIBODIES AND USES THEREOF
AU2018291497A1 (en) 2017-06-30 2020-01-16 Xencor, Inc. Targeted heterodimeric Fc fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra and antigen binding domains
CA3068634A1 (en) * 2017-06-30 2019-01-03 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Compositions and methods for adoptive cell therapy for cancer
RU2019142330A (ru) 2017-06-30 2021-07-30 Займворкс, Инк. Стабилизированные химерные fab
CN111212849A (zh) * 2017-06-30 2020-05-29 纪念斯隆-凯特林癌症中心 用于癌症的过继性细胞疗法的组合物和方法
MX2020000342A (es) 2017-07-11 2020-08-17 Compass Therapeutics Llc Anticuerpos agonistas que se unen a cd137 humano y sus usos.
US20200172617A1 (en) 2017-07-20 2020-06-04 Novartis Ag Dosage regimens of anti-lag-3 antibodies and uses thereof
JP7117088B2 (ja) * 2017-08-04 2022-08-12 シスメックス株式会社 抗体及びその製造方法、並びに抗体の熱安定性を向上させる方法
WO2019025545A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Genmab A/S BINDING AGENTS BINDING TO PD-L1 AND CD137 AND THEIR USE
UA128472C2 (uk) 2017-08-25 2024-07-24 Файв Прайм Терапеутікс Інк. B7-h4 антитіла і методи їх використання
EP3684801A1 (en) * 2017-09-22 2020-07-29 H. Hoffnabb-La Roche Ag Multivalent mono- or bispecific recombinant antibodies for analytic purpose
AU2018347521A1 (en) * 2017-10-12 2020-05-07 Immunowake Inc. VEGFR-antibody light chain fusion protein
JP7438106B2 (ja) 2017-10-14 2024-02-26 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 抗体、活性化可能抗体、二重特異性抗体、および二重特異性活性化可能抗体ならびにその使用方法
WO2019089753A2 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Compass Therapeutics Llc Cd137 antibodies and pd-1 antagonists and uses thereof
WO2019089798A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
EP3706793A1 (en) 2017-11-08 2020-09-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
CN111655288A (zh) 2017-11-16 2020-09-11 诺华股份有限公司 组合疗法
US11851497B2 (en) 2017-11-20 2023-12-26 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
JP2021506291A (ja) 2017-12-19 2021-02-22 ゼンコア インコーポレイテッド 改変されたｉｌ−２ ｆｃ融合タンパク質
JP7339262B2 (ja) 2018-01-12 2023-09-05 アムジェン インコーポレイテッド Ｐａｃ１抗体及びその使用
WO2019145455A1 (en) 2018-01-24 2019-08-01 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
AU2019215031A1 (en) 2018-01-31 2020-08-20 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
CA3092097A1 (en) * 2018-02-26 2019-08-29 Just Biotherapeutics, Inc. Determining impact on properties of proteins based on amino acid sequence modifications
KR20200144094A (ko) 2018-03-02 2020-12-28 파이브 프라임 테라퓨틱스, 인크. B7-h4 항체 및 이의 사용 방법
EP3765493A2 (en) 2018-03-12 2021-01-20 Genmab A/S Antibodies
MX2020009296A (es) 2018-03-15 2020-11-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos anti-virus del dengue que tienen reactividad cruzada con el virus zika y metodos de uso.
CA3096052A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
US20210147547A1 (en) 2018-04-13 2021-05-20 Novartis Ag Dosage Regimens For Anti-Pd-L1 Antibodies And Uses Thereof
CA3097741A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains
US11524991B2 (en) 2018-04-18 2022-12-13 Xencor, Inc. PD-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra Fc-fusion proteins and PD-1 antigen binding domains and uses thereof
WO2019210153A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
MX2020011552A (es) 2018-05-03 2020-11-24 Genmab Bv Combinaciones de variantes de anticuerpos y usos de las mismas.
WO2019226658A1 (en) 2018-05-21 2019-11-28 Compass Therapeutics Llc Multispecific antigen-binding compositions and methods of use
CA3099308A1 (en) 2018-05-21 2019-11-28 Compass Therapeutics Llc Compositions and methods for enhancing the killing of target cells by nk cells
US20210213063A1 (en) 2018-05-25 2021-07-15 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
US20210214459A1 (en) 2018-05-31 2021-07-15 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
CN112867394B (zh) 2018-06-04 2024-09-13 马萨诸塞州渤健公司 具有降低的效应功能的抗vla-4抗体
TW202016139A (zh) 2018-06-13 2020-05-01 瑞士商諾華公司 Bcma 嵌合抗原受體及其用途
CN112654394A (zh) 2018-06-19 2021-04-13 阿塔盖有限责任公司 针对补体成分5的抗体分子和其用途
CN110021348A (zh) * 2018-06-19 2019-07-16 上海交通大学医学院附属瑞金医院 基于RNA-seq数据的肿瘤基因突变检测方法及系统
WO2019243636A1 (en) 2018-06-22 2019-12-26 Genmab Holding B.V. Anti-cd37 antibodies and anti-cd20 antibodies, compositions and methods of use thereof
CN108961364A (zh) * 2018-07-10 2018-12-07 麒麟合盛网络技术股份有限公司 一种图片处理方法和装置
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
WO2020014306A1 (en) 2018-07-10 2020-01-16 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
GB201811368D0 (en) 2018-07-11 2018-08-29 Ucb Biopharma Sprl Antibody
TW202019518A (zh) 2018-07-13 2020-06-01 丹麥商珍美寶股份有限公司 Ｃｄ３８抗體之變體及其用途
US20240254252A1 (en) 2018-07-13 2024-08-01 Genmab A/S Trogocytosis-mediated therapy using cd38 antibodies
WO2020021465A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Advanced Accelerator Applications (Italy) S.R.L. Method of treatment of neuroendocrine tumors
SG11202103192RA (en) 2018-10-03 2021-04-29 Xencor Inc Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
US20240252635A1 (en) 2018-10-04 2024-08-01 Genmab Holding B.V. Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-cd37 antibodies
WO2020094744A1 (en) 2018-11-06 2020-05-14 Genmab A/S Antibody formulation
EP3880716A4 (en) 2018-11-13 2022-08-03 Compass Therapeutics LLC MULTISPECIFIC BINDING CONSTRUCTS DIRECTED AGAINST CHECKPOINT MOLECULES AND ASSOCIATED USES
KR20210106484A (ko) 2018-12-20 2021-08-30 노파르티스 아게 Hdm2-p53 상호작용 억제제와 bcl2 억제제의 조합 및 암 치료를 위한 이의 용도
KR20210106437A (ko) 2018-12-20 2021-08-30 노파르티스 아게 3-(1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체를 포함하는 투약 요법 및 약학적 조합물
US10871640B2 (en) 2019-02-15 2020-12-22 Perkinelmer Cellular Technologies Germany Gmbh Methods and systems for automated imaging of three-dimensional objects
CN113490528A (zh) 2019-02-15 2021-10-08 诺华股份有限公司 3-(1-氧代-5-(哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物及其用途
EP3924055B1 (en) 2019-02-15 2024-04-03 Novartis AG Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
US20220088075A1 (en) 2019-02-22 2022-03-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors
JP2022523946A (ja) 2019-03-01 2022-04-27 ゼンコア インコーポレイテッド Ｅｎｐｐ３およびｃｄ３に結合するヘテロ二量体抗体
CN113950355A (zh) 2019-03-29 2022-01-18 阿塔盖有限责任公司 Fgf23的抗体分子和其用途
CN110164506B (zh) * 2019-04-19 2021-02-26 浙江工业大学 一种基于域间残基接触的多域蛋白结构组装方法
JP7387760B2 (ja) * 2019-05-02 2023-11-28 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 合成タンパク質の安定性を高めるためのシステムおよび方法
JP2022531894A (ja) 2019-05-09 2022-07-12 ゲンマブ ビー．ブイ． がんの処置において使用するための抗ｄｒ５抗体の組み合わせの投与レジメン
TW202110877A (zh) 2019-05-30 2021-03-16 美商安進公司 工程改造鉸鏈區以驅動抗體二聚化
EP3990493A1 (en) 2019-06-28 2022-05-04 Amgen Inc. Anti-cgrp receptor/anti-pac1 receptor bispecific antigen binding proteins
EP3767628B1 (de) * 2019-07-18 2024-03-27 Bayer Aktiengesellschaft Selektion von antikörpern / antikörperfragmenten
AU2020370832A1 (en) 2019-10-21 2022-05-19 Novartis Ag TIM-3 inhibitors and uses thereof
KR20220103947A (ko) 2019-10-21 2022-07-25 노파르티스 아게 베네토클락스 및 tim-3 억제제를 사용한 조합 요법
EP4055046A1 (en) 2019-11-06 2022-09-14 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
AU2020380379A1 (en) 2019-11-08 2022-05-26 Amgen Inc. Engineering charge pair mutations for pairing of hetero-IgG molecules
JP2023501717A (ja) 2019-11-19 2023-01-18 アムジエン・インコーポレーテツド 新規の多重特異性抗体フォーマット
IL293215A (en) 2019-11-26 2022-07-01 Novartis Ag Chimeric antigen receptors that bind bcma and cd19 and their uses
MX2022007759A (es) 2019-12-20 2022-07-19 Novartis Ag Combinacion del anticuerpo anti tim-3 mbg453 y anticuerpo anti tgf-beta nis793, con o sin decitabina o el anticuerpo anti pd-1 spartalizumab, para el tratamiento de mielofibrosis y sindrome mielodisplasico.
GB201919061D0 (en) 2019-12-20 2020-02-05 Ucb Biopharma Sprl Multi-specific antibody
GB201919062D0 (en) 2019-12-20 2020-02-05 Ucb Biopharma Sprl Antibody
IL293640A (en) 2019-12-20 2022-08-01 Amgen Inc CD40 antagonistic mesothelin-targeted multispecific antibody constructs for the treatment of solid tumors
WO2021144457A1 (en) 2020-01-16 2021-07-22 Genmab A/S Formulations of cd38 antibodies and uses thereof
KR20220128389A (ko) 2020-01-17 2022-09-20 노파르티스 아게 골수이형성 증후군 또는 만성 골수단핵구성 백혈병을 치료하는데 사용하기 위한 tim-3 억제제 및 저메틸화제를 포함하는 조합물
CN115298322A (zh) 2020-01-17 2022-11-04 贝克顿迪金森公司 用于单细胞分泌组学的方法和组合物
GB202001447D0 (en) 2020-02-03 2020-03-18 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
WO2021155916A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 BioNTech SE Treatment involving antigen vaccination and binding agents binding to pd-l1 and cd137
IL295878A (en) 2020-02-27 2022-10-01 Novartis Ag Methods for producing cells expressing a chimeric antigen receptor
AR121599A1 (es) 2020-03-18 2022-06-22 Genmab As Anticuerpos
US20230236199A1 (en) * 2020-04-23 2023-07-27 Eli Lilly And Company Subcutaneous absorption and bioavailability of antibodies
JP7314859B2 (ja) * 2020-04-30 2023-07-26 株式会社島津製作所 分析支援装置、分析支援方法および分析支援プログラム
WO2021226351A1 (en) * 2020-05-08 2021-11-11 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods and systems for stabilizing proteins using intelligent automation
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
CN115916199A (zh) 2020-06-23 2023-04-04 诺华股份有限公司 包含3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物的给药方案
UY39324A (es) 2020-07-16 2022-02-25 Novartis Ag Anticuerpos anti-betacelulina, sus fragmentos, moléculas de unión multiespecíficas, casetes de expresión, composiciones y métodos de tratamiento.
JP2023534726A (ja) 2020-07-23 2023-08-10 ジェンマブ ビー．ブイ． 多発性骨髄腫の治療に使用するための抗ｄｒ５抗体と免疫調節イミド薬との併用
WO2022026592A2 (en) 2020-07-28 2022-02-03 Celltas Bio, Inc. Antibody molecules to coronavirus and uses thereof
EP4188549A1 (en) 2020-08-03 2023-06-07 Novartis AG Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
US20230287088A1 (en) 2020-08-06 2023-09-14 BioNTech SE Binding agents for coronavirus s protein
JP2023538891A (ja) 2020-08-19 2023-09-12 ゼンコア インコーポレイテッド 抗ｃｄ２８組成物
MX2023002125A (es) 2020-08-20 2023-04-26 Amgen Inc Proteínas de unión a antígenos con disulfuro no canónico en la región fab.
WO2022043557A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
WO2022043558A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
IL300835A (en) 2020-09-02 2023-04-01 Genmab As Antibody therapy
IL301085A (en) 2020-09-10 2023-05-01 Genmab As A bispecific antibody against CD3 and CD20 in combination therapy for the treatment of diffuse large B-cell lymphoma
CN116437956A (zh) 2020-09-10 2023-07-14 健玛保 用于治疗慢性淋巴细胞白血病的针对cd3和cd20的双特异性抗体
US20230365714A1 (en) 2020-10-02 2023-11-16 Genmab A/S Antibodies capable of binding to ror2 and bispecific antibodies binding to ror2 and cd3
AU2021358033A1 (en) 2020-10-07 2023-05-04 Amgen Inc. Rational selection of building blocks for the assembly of multispecific antibodies
JP2023546229A (ja) * 2020-10-21 2023-11-01 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 眼の疾患の処置のためのアゴニスト性ＴｒｋＢ結合分子
US20240002509A1 (en) 2020-11-06 2024-01-04 Novartis Ag ANTIBODY Fc VARIANTS
TW202233663A (zh) 2020-11-10 2022-09-01 美商安進公司 多特異性抗原結合結構域之新穎的連接子
WO2022104061A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Novartis Ag Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells
IL303295A (en) 2020-12-07 2023-07-01 UCB Biopharma SRL Multispecific antibodies and antibody combinations
JP2023551983A (ja) 2020-12-07 2023-12-13 ユーシービー バイオファルマ エスアールエル インターロイキン－２２に対する抗体
EP4284510A1 (en) 2021-01-29 2023-12-06 Novartis AG Dosage regimes for anti-cd73 and anti-entpd2 antibodies and uses thereof
AU2022232375A1 (en) 2021-03-09 2023-09-21 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
KR20230154311A (ko) 2021-03-10 2023-11-07 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 gpc3에 결합하는 이종이량체 항체
CA3210971A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Bart-Jan DE KREUK Non-activating antibody variants
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
CN117651714A (zh) 2021-04-20 2024-03-05 美国安进公司 多特异性和单价IgG分子组装中链配对的静电转向中的平衡电荷分布
JP2024516305A (ja) 2021-05-03 2024-04-12 ユーシービー バイオファルマ エスアールエル 抗体
MX2023012351A (es) 2021-05-07 2023-10-31 Genmab As Composiciones farmaceuticas que comprenden anticuerpos biespecificos que se unen al inhibidor de la activacion de celulas t que contiene un dominio v-set 1 (b7h4) y cumulo de diferenciacion 3 (cd3).
AR125874A1 (es) 2021-05-18 2023-08-23 Novartis Ag Terapias de combinación
BR112023027006A2 (pt) 2021-06-21 2024-03-12 BioNTech SE Método para reduzir ou prevenir a progressão de um tumor ou tratar um câncer em um sujeito, e, agente de ligação
GB202111905D0 (en) 2021-08-19 2021-10-06 UCB Biopharma SRL Antibodies
KR20240051280A (ko) 2021-09-06 2024-04-19 젠맵 에이/에스 Cd27과 결합할 수 있는 항체, 그의 변이체 및 그의 용도
EP4405396A2 (en) 2021-09-20 2024-07-31 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
AR127298A1 (es) 2021-10-08 2024-01-10 Genmab As Anticuerpos que se unen a cd30 y cd3
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
WO2023150778A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Visterra, Inc. Anti-idiotype antibody molecules and uses thereof
WO2023174521A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Genmab A/S Binding agents binding to epcam and cd137
WO2023183288A2 (en) * 2022-03-22 2023-09-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Monoclonal antibodies for targeting the cardiac conduction system
US20230368861A1 (en) * 2022-05-10 2023-11-16 Amgen Inc. Machine learning techniques for predicting thermostability
WO2023218051A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
WO2023218046A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
WO2023220695A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2024030976A2 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for crossing the blood brain barrier
WO2024035761A1 (en) * 2022-08-09 2024-02-15 Board Of Trustees Of Michigan State University Predicting function from sequence using information decomposition
WO2024081938A2 (en) * 2022-10-14 2024-04-18 Aikium Inc. Protein scaffolds for disordered regions
WO2024094660A1 (en) 2022-10-31 2024-05-10 Genmab A/S Cd38 antibodies and uses thereof
WO2024168061A2 (en) 2023-02-07 2024-08-15 Ayan Therapeutics Inc. Antibody molecules binding to sars-cov-2
WO2024208898A1 (en) 2023-04-05 2024-10-10 Genmab A/S Pharmaceutical compositions comprising antibodies binding to cd30 and cd3

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003025018A2 (en) * 2001-09-14 2003-03-27 Affimed Therapeutics Ag Dimeric and multimeric antigen binding structure
WO2005121177A2 (en) * 2004-06-09 2005-12-22 Wyeth Anti-il-13 antibodies, crystals of anti-il-13 antibodies and complexes comprising them

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3785186T2 (de) 1986-09-02 1993-07-15 Enzon Lab Inc Bindungsmolekuele mit einzelpolypeptidkette.
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US20050038609A1 (en) 1992-03-25 2005-02-17 Benner Steven Albert Evolution-based functional genomics
US5958784A (en) 1992-03-25 1999-09-28 Benner; Steven Albert Predicting folded structures of proteins
US6377893B1 (en) 1992-03-25 2002-04-23 Steven Albert Benner Application of protein structure predictions
AU5670194A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
US6482919B2 (en) 1993-02-01 2002-11-19 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5747654A (en) 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
DE4425115A1 (de) 1994-07-15 1996-01-18 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur Modifizierung der Stabilität von Antikörpern
US5656730A (en) 1995-04-07 1997-08-12 Enzon, Inc. Stabilized monomeric protein compositions
US6262238B1 (en) 1997-01-14 2001-07-17 Roche Diagnostic, Gmbh Process for modifying the stability of antibodies
CA2284665C (en) 1997-03-20 2010-08-17 David Fitzgerald Recombinant antibodies and immunoconjugates targeted to cd-22 bearing cells and tumors
US20020129889A1 (en) * 2001-03-15 2002-09-19 Anderson Norman G. Method and apparatus for making fibers for sectioned arrays
DK2278509T3 (en) 2002-03-01 2014-12-15 Codexis Mayflower Holdings Llc Methods, systems and software for identification of functional biomolecules
CN1672160B (zh) * 2002-05-20 2010-06-09 埃博马可西斯公司 基于前导抗体的结构构建抗体文库的方法
EP1583503A4 (en) 2002-12-20 2006-08-09 Biogen Idec Inc POLYVALENT LYMPHOTOXIN BETA RECEPTOR AGONISTS AND THERAPEUTIC USE THEREOF
WO2005000898A2 (en) 2003-06-27 2005-01-06 Biogen Idec Ma Inc. Use of hydrophobic-interaction-chromatography or hinge-region modifications for the production of homogeneous antibody-solutions
AU2005227322A1 (en) * 2004-03-23 2005-10-06 Biogen Idec Ma Inc. Receptor coupling agents and therapeutic uses thereof
WO2006074399A2 (en) * 2005-01-05 2006-07-13 Biogen Idec Ma Inc. Multispecific binding molecules comprising connecting peptides
JP5374359B2 (ja) * 2006-03-17 2013-12-25 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 安定化されたポリペプチド化合物
WO2009032782A2 (en) * 2007-08-28 2009-03-12 Biogen Idec Ma Inc. Compositions that bind multiple epitopes of igf-1r
WO2009043051A2 (en) * 2007-09-27 2009-04-02 Biogen Idec Ma Inc. Cd23 binding molecules and methods of use thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003025018A2 (en) * 2001-09-14 2003-03-27 Affimed Therapeutics Ag Dimeric and multimeric antigen binding structure
WO2005121177A2 (en) * 2004-06-09 2005-12-22 Wyeth Anti-il-13 antibodies, crystals of anti-il-13 antibodies and complexes comprising them

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CARONTI V. et al. Anti-beta 2-glycoprotein I antibodies bind to central nervous system. J. Neurol Sci, 1998 Apr 1; 156(2):211-9, referat [on-layn] [naydeno 2009-01-21]. Naydeno iz bazy dannykh PubMed *
HALABY D.M. et al. The immunoglobulin fold family:sequence analysis and 3D structure comparisons, Protein Engineering, vol. 12, no. 7, p. 563-571, 1999, referat, s. 566, fig. 2 *
HARRISON A. et al. Recognizing the fold of a protein structure. Bioinformatics, 2003 Sep 22; 19(14): 1748-59, referat [on-layn] [naydeno 2009-01-21]. Naydeno iz bazy dannykh PubMed *
JUNG S. et al. Selection for improved protein stability by phage display. J. Mol Biol, 1999 Nov 19; 294(1):163-80, referat [on-layn] [naydeno 2009-01-21]. Naydeno iz bazy dannykh PubMed *
LU D. et al. Acquired antagonistic activity of a bispecific diabody directed against two different epitopes on vascular endothelial growth factor receptor 2. J. Immunol Methods, 1999 Nov 19; 230(1-2):159-71, referat [on-layn] [naydeno 2009-01-21]. Naydeno iz bazy dannykh PubMed *
MOK Y.K. et al. Dramatic stabilization of an SH3 domain by a singl substitution: roles of the folded and unfolded states. J. Mol Biol, 2001 Mar 30; 307(3):913-28, referat [on-layn] [naydeno 2009-01-21]. Naydeno iz bazy dannykh PubMed *
ROGUSKA A. MICHAEL et al. Humanization of murine monoclonal antibodies through variable domain resurfacing, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 91, p. 969-973, February 1994, Biochemistry, s. 970, pravaya kolonka, abzatsy 1, 2, referat *
SONG L.P. et al. A new model of trispecific antibody resulting the cytotoxicity directed against tumor cells. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghal), 2003 Jun; 35(6):503-10, referat [on-layn] [naydeno 2009-01-21]. Naydeno iz bazy dannykh PubMed *
TSE E. et al. Intracellular antibody capture technology: application to selection of intracellular antibodies recognising the BCR-ABL oncogenic protein. J. Mol Biol, 2002 Mar 15; 317(1):85-94, referat, [on-layn] [naydeno 2009-01-21]. Naydeno iz bazy dannykh PubMed *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2725812C2 (ru) * 2014-06-25 2020-07-06 Юсб Биофарма Спрл Конструкции полиспецифических антител
US11345760B2 (en) 2014-06-25 2022-05-31 UCB Biopharma SRL Multispecific antibody constructs
RU2723131C2 (ru) * 2015-01-08 2020-06-08 Генмаб А/С Связывающиеся с рецепторами агонисты tnf

Also Published As

Publication number Publication date
WO2007109254A2 (en) 2007-09-27
NO20084339L (no) 2008-12-16
US20090048122A1 (en) 2009-02-19
US8892364B2 (en) 2014-11-18
MX2008011874A (es) 2009-01-07
SG170750A1 (en) 2011-05-30
EA200802005A1 (ru) 2009-06-30
JP2013176394A (ja) 2013-09-09
US7951918B2 (en) 2011-05-31
AU2007227292A1 (en) 2007-09-27
IL194120A (en) 2015-03-31
NZ591252A (en) 2012-06-29
IL194120A0 (en) 2011-08-01
CN103073639A (zh) 2013-05-01
KR20080113241A (ko) 2008-12-29
KR101516823B1 (ko) 2015-05-07
EP2024392A2 (en) 2009-02-18
US20080050370A1 (en) 2008-02-28
US20110301331A1 (en) 2011-12-08
US7960142B2 (en) 2011-06-14
JP5374359B2 (ja) 2013-12-25
GEP20135917B (en) 2013-09-10
CA2646508A1 (en) 2007-09-27
BRPI0709598A8 (pt) 2019-01-08
JP2009531028A (ja) 2009-09-03
WO2007109254A3 (en) 2008-10-23
AU2007227292B2 (en) 2012-04-12
BRPI0709598A2 (pt) 2011-07-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA015992B1 (ru) Стабилизированное антитело и многовалентная антигенсвязывающая молекула на его основе, способы получения и использования вышеназванного стабилизированного антитела
Dübel et al. Handbook of therapeutic antibodies
ES2687270T3 (es) Fijación como objetivo de ABCB5 para la terapia del cáncer
US20150191543A1 (en) Engineered antibody fragments for targeting and imaging cd8 expression in vivo
EA030182B1 (ru) Антитела, специфические для кадгерина-17
EA030436B1 (ru) АНТИТЕЛА К IL-23p19 ИЛИ ИХ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ ФРАГМЕНТЫ, ИХ ПРИМЕНЕНИЕ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ЭТИ АНТИТЕЛА, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ, ЭКСПРЕССИОННЫЕ ВЕКТОРЫ И КЛЕТКИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ
CN107922471A (zh) 靶向ny‑eso‑1肽/mhc复合物的构建体及其用途
EA018301B1 (ru) Фармацевтические композиции, содержащие антагонистическое моноклональное антитело к cd40, и их применение
CN101171263A (zh) 通过合理修饰互补决定区残基使免疫球蛋白可变区人源化的方法
CN101087807A (zh) 治疗血管炎的方法
CN103347894A (zh) 抗gd2抗体
CN102753578A (zh) 增加肌肉生长的组合物和方法
EA021644B1 (ru) Человеческое моноклональное антитело против cd20 и его применение
EA028899B1 (ru) АНТИ-C5a-АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ АНТИТЕЛ
EA030437B1 (ru) Антитела к cd48 и их применение
JP2008504002A (ja) 新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）結合ポリペプチド改変体、ダイマーＦｃ結合タンパク質、およびそれらに関連する方法
EA019344B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против лиганда-1 запрограммированной гибели клеток (pd-l1) и их применения
EA028336B1 (ru) Полностью человеческие антитела, специфические в отношении cadm1
CN103153331A (zh) 靶向于钙粘着蛋白-11的ec1结构域的人源化抗体及相关组合物和方法
US20180193456A1 (en) Anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 (vegfr2) antibodies
CN114401744A (zh) 用于治疗癌症的抗cd33抗体
CN101448853A (zh) 稳定的多肽组合物
CN114502584A (zh) Cd33抗体和使用所述抗体治疗癌症的方法
CN114341176A (zh) Cd19抗体及其使用方法
WO2023057583A1 (en) Humanized hh1

Legal Events

Date Code Title Description
TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU