JP2023501717A - 新規の多重特異性抗体フォーマット - Google Patents

Abstract

本発明は、複数の標的に結合することができる新規の多重特異性抗原結合タンパク質に関する。多重特異性抗原結合タンパク質を含む医薬組成物、及びこれらを生成する方法も開示される。

Description

本発明は、多重特異性抗体、多重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド、及び多重特異性抗体を作製する方法に関する。

本出願は、コンピューター可読形式（ＣＲＦ）、並びに３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．セクション１．８２１（ｃ）及び１．８２１（ｅ）によって要求される紙の複写の双方として適しており、且つその全体が参照により本明細書に組み込まれるＡＳＣＩＩ「ｔｘｔ」準拠の配列表を含有する。２０２０年１１月１８日に作成された「ｔｘｔ」ファイルの名称は、Ａ－２５３６－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ＿２０２０１１１８＿ＳＴ２５であり、３６．１ｋｂのサイズである。

二重特異性抗体及び三重特異性抗体のような多重特異性抗体（同時に複数の標的を標的とする分子）の臨床潜在性は、複合疾患を標的とするのに大いに有望である。しかしながら、所望の活性を発揮する分子の生成は、大きな課題を示す。ここで、発明者らは、２つの抗原結合ドメインを、長さ及び配列が異なるリンカーを介して繋ぐことによって、２つの抗原結合ドメインの結合を細かく調整して、抗原結合を最適化することを可能にする新しいフォーマットを解説する（図１）。

１００を超える二重特異性フォーマットが報告されてきたが、多くの場合、意図される二重特異性バイオロジーを供給できていない。そのような残念な成果は、多くの場合、細胞の表面上のエピトープと各治療標的との空間的位置に関する知識の不足と関連がある。その知識を持って、オンターゲット活性の特定の要件を満たす一方で、オフターゲット活性を最小にするように、当該二重特異性フォーマットを調整することができ、これは、有効且つ安全な治療薬を供給するのに重大な意味を持つ。

一態様において、本発明は：
ａ）第１のヒンジ領域、第１のＣＨ２領域、及び第１のＣＨ３領域を含む抗体Ｆｃ領域を含む第１のポリペプチドと；
ｂ）抗体重鎖構築体を含む第２のポリペプチドであって、抗体重鎖構築体は、
ｉ）ｓｃＦｖであって
１）第１のＶＨ及び第１のＶＬであって、結合して第１の抗原結合ドメインを形成している、第１のＶＨ及び第１のＶＬと、
２）第１のＶＨ及び第１のＶＬを連結している第１のリンカーペプチドと
を含むｓｃＦｖと、
ｉｉ）第２のＶＨ、第２のＣＨ１領域、第２のヒンジ領域、第２のＣＨ２領域、及び第２のＣＨ３領域を含む抗体重鎖と
を含み、
ｓｃＦｖは、そのＣ末端にて、抗体重鎖の第２のＶＨ領域のＮ末端に結合されている、第２のポリペプチドと；
ｃ）第２のＶＬ及びＣＬを含む抗体軽鎖を含む第３のポリペプチド
を含み、
抗体重鎖の第２のＶＨ及び抗体軽鎖の第２のＶＬは結合して、第２の抗原結合ドメインを形成している、多重特異性抗体構築体に関する。

別の態様において、本発明は：
ａ）第１のヒンジ領域、第１のＣＨ２領域、及び第１のＣＨ３領域を含む抗体Ｆｃ領域を含む第１のポリペプチドと；
ｂ）抗体軽鎖構築体を含む第２のポリペプチドであって、抗体軽鎖構築体は、
ｉ）ｓｃＦｖであって
１）第１のＶＨ及び第１のＶＬであって、結合して第１の抗原結合ドメインを形成している、第１のＶＨ及び第１のＶＬと、
２）第１のＶＨ及び第１のＶＬを連結している第１のリンカーペプチドと
を含むｓｃＦｖと、
ｉｉ）第２のＶＬ及びＣＬを含む抗体軽鎖と
を含み、
ｓｃＦｖは、そのＣ末端にて、抗体軽鎖の第２のＶＬ領域のＮ末端に結合されている、第２のポリペプチドと；
ｃ）第２のＶＨ、第２のＣＨ１領域、第２のヒンジ領域、第２のＣＨ２領域、及び第２のＣＨ３領域を含む抗体重鎖を含む第３のポリペプチド
を含み、
抗体重鎖の第２のＶＨ及び抗体軽鎖の第２のＶＬは結合して、第２の抗原結合ドメインを形成している、多重特異性抗体構築体に関する。

一実施形態において、第１のリンカーは：（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_２（配列番号１）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２（配列番号２）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３（配列番号３）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号４）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_４（配列番号５）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４（配列番号６）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_５（配列番号７）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_５（配列番号８）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_６（配列番号９）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_６（配列番号１０）、ＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＧＳ（配列番号１１）、ＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＫＫＤＡＧＳ（配列番号１２）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_２（配列番号１３）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_２（配列番号１４）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_３（配列番号１５）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_３（配列番号１６）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_４（配列番号１７）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_４（配列番号１８）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_５（配列番号１９）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_５（配列番号２０）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_６（配列番号２１）、及び（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_６（配列番号２２）からなる群から選択される配列を含む。

一実施形態において、ｓｃＦｖは、第２のリンカーを介して抗体重鎖に結合されている。一実施形態において、第２のリンカーは：（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_２（配列番号１）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２（配列番号２）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３（配列番号３）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号４）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_４（配列番号５）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４（配列番号６）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_５（配列番号７）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_５（配列番号８）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_６（配列番号９）、及び（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_６（配列番号１０）からなる群から選択される配列を含む。

一実施形態において、ｓｃＦｖは、そのＣ末端にて、第１のリンカーのＮ末端に結合されている第１のＶＨを含み、第１のリンカーは、そのＣ末端にて、第１のＶＬのＮ末端に結合されている。別の実施形態において、ｓｃＦｖは、そのＣ末端にて、第１のリンカーのＮ末端に結合されている第１のＶＬを含み、第１のリンカーは、そのＣ末端にて、第１のＶＨのＮ末端に結合されている。

一実施形態において、第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインは、異なるポリペプチド上のエピトープに結合する。別の実施形態において、第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインは、同じポリペプチド上の異なるエピトープに結合する。一実施形態において、多重特異性抗体構築体は、二重パラトピック抗体構築体である。

一実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、及びＣＨ３領域からなる。

一実施形態において、Ｆｃ領域のＮ末端は、そのＮ末端を介して、第３のリンカーを介して重鎖のＣ末端に連結されている。

一実施形態において、第３のリンカーは：（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_２（配列番号１）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２（配列番号２）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３（配列番号３）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号４）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_４（配列番号５）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４（配列番号６）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_５（配列番号７）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_５（配列番号８）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_６（配列番号９）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_６（配列番号１０）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_２（配列番号１３）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_２（配列番号１４）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_３（配列番号１５）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_３（配列番号１６）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_４（配列番号１７）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_４（配列番号１８）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_５（配列番号１９）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_５（配列番号２０）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_６（配列番号２１）、及び（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_６（配列番号２２）からなる群から選択される配列を含む。

一実施形態において、第１のポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域からなる。

一実施形態において、多重特異性抗体構築体は、二重特異性抗体構築体である。

一実施形態において、一方のＣＨ３ドメインは、Ｆ４０５Ｌ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｄ、Ｆ４０５Ｅ、Ｆ４０５Ｈ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｋ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｎ、Ｆ４０５Ｑ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｖ、Ｆ４０５Ｗ、又はＦ４０５Ｙの変異を含み、他方のＣＨ３ドメインは、Ｋ４０９Ｒ変異を含み、アミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。

別の実施形態において、一方のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｗ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの変異を含み、アミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。

さらに別の実施形態において、一方のＣＨ３ドメインは、Ｋ／Ｒ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄの変異を含み、他方のＣＨ３ドメインは、Ｄ３９９Ｋ変異を含み、アミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。一実施形態において、Ｄ３９９Ｋ変異を含むＣＨ３ドメインはまた、Ｅ３５６Ｋ変異を含み、アミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う。

図１は、同じ標的タンパク質内の２つの異なるドメインに結合した２つのＦａｂの結晶構造を示す。これは、多重特異性の新規のフォーマットを設計するための合理的設計を提供する。 図２は、３つのポリペプチド鎖によって構成される多重特異性分子の概略図を示す。ｓｃＦｖモジュールは、そのＣ－末端ＶＨを介して、Ｆａｂ ＶＨのＮ－末端に、フレキシブルリンカー及び／又はリジッドリンカーによって連結され得る。 図３は、鎖Ａにおいて実行された新規の設計を示す多重特異性分子についての一次構造を示す。 図４は、３つのポリペプチド鎖によって構成される多重特異性分子の概略図を示す。ｓｃＦｖモジュールは、そのＣ－末端ＶＨを介して、Ｆａｂ ＶＬのＮ－末端に、フレキシブルリンカー及び／又はリジッドリンカーによって連結され得る。 図５は、３つのポリペプチド鎖によって構成される多重特異性分子の概略図を示す。ｓｃＦｖモジュールは、そのＣ－末端ＶＨを介して、Ｆａｂ ＶＬのＮ－末端に、フレキシブルリンカー及び／又はリジッドリンカーによって連結され得る。 図６は、多重特異性構築体の発現及び精製を示す。 図７は、多重特異性構築体についての結合アッセイを示す。 図８は、多重特異性分子についての細胞結合アッセイを示す。

本明細書中で使用される用語「抗原結合タンパク質」は、１つ以上の標的抗原に特異的に結合するタンパク質を指す。抗原結合タンパク質には、抗体及びその機能的断片を含めることができる。「機能的抗体断片」とは、完全長の重鎖及び／又は軽鎖に存在するアミノ酸の少なくとも一部を欠くが、それでもなお抗原に特異的に結合することができる抗体の一部である。機能的抗体断片として、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、Ｆｄ断片、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片が挙げられるが、これらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、又はラクダ科の動物等のあらゆる哺乳動物供給源に由来するものとすることができる。機能的抗体断片は、標的抗原の結合について、インタクトな抗体と比肩し得、断片は、インタクトな抗体の修飾（例えば、酵素的又は化学的切断）によって生成されてもよいし、組換えＤＮＡ技術又はペプチド合成を使用して新規に合成されてもよい。

「重」鎖及び「軽」鎖は、ＩｇＧを含む２つのポリペプチドを指す。重鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、以下のドメインに分解することができる：ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３。軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、以下のドメインに分解することができる：ＶＬ及びＣＬ。ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、抗原に結合する機能的高次構造を形成するように相互作用することになる。

また、抗原結合タンパク質には、単一のポリペプチド鎖又は複数のポリペプチド鎖に組み込まれた１つ以上の機能的抗体断片を含むタンパク質を含めることもできる。「多重特異性抗体構築体」は、２以上の異なる抗原に結合する１つ以上の機能的抗体部分を含む１つ以上のポリペプチドである。多重特異性抗体構築体には、抗体重鎖に連結されたか、又は抗体軽鎖に連結されたｓｃＦｖを含むポリペプチドを含めることができる。

特定の態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、２つ以上の異なる抗原に特異的に結合することができることを意味する「多重特異性」である。別の態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、２つの異なる抗原に特異的に結合することができることを意味する「二重特異性」である。

本明細書中で使用される抗原結合タンパク質は、類似の結合アッセイ条件下での他の無関係なタンパク質に対する親和性と比較して、標的抗原に対して有意に高い結合親和性を有し、その結果、その抗原を区別することができる場合に、標的抗原に「特異的に結合する」。抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）が≦１×１０^－６Ｍであり得る。抗原結合タンパク質は、Ｋ_Ｄが≦１×１０^－８Ｍである場合、「高い親和性」で抗原に特異的に結合している。一実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、≦５×１０^－７ＭのＫ_Ｄで標的抗原に結合する。別の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、≦１×１０^－７ＭのＫ_Ｄで標的抗原に結合する

親和性は、種々の技術を使用して判定され、その一例として、アフィニティＥＬＩＳＡアッセイがある。種々の実施形態において、親和性は、表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）ベースのアッセイ）によって判定される。この方法論を使用して、結合速度定数（ｋ_ａ単位：Ｍ^－１ｓ^－１）及び解離速度定数（ｋ_ｄ単位：ｓ^－１）を測定することができる。次いで、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ単位：Ｍ）を、運動速度定数の比（ｋ_ｄ／ｋ_ａ）から算出することができる。一部の実施形態において、親和性は、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３７３：５２－６０，２００８に記載されるような結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡ）等の速度論的方法によって判定される。ＫｉｎＥｘＡアッセイを使用して、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ単位：Ｍ）及び結合速度定数（ｋ_ａ単位：Ｍ^－１ｓ^－１）を測定することができる。解離速度定数（ｋ_ｄ単位：ｓ^－１）は、これらの値（Ｋ_Ｄ×ｋ_ａ）から算出することができる。他の実施形態において、親和性は、平衡／解法によって判定される。特定の実施形態において、親和性は、ＦＡＣＳ結合アッセイによって判定される。本発明の特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ ２９３、Ｊｕｒｋａｔ）によって発現された標的抗原に、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３７３：５２－６０，２００８に記載される方法によって行われる結合平衡除外法によって決定される、２０ｎＭ（２．０×１０^－８Ｍ）以下のＫ_Ｄで、１０ｎＭ（１．０×１０^－８Ｍ）以下のＫ_Ｄで、１ｎＭ（１．０×１０^－９Ｍ）以下のＫ_Ｄで、５００ｐＭ（５．０×１０^－１０Ｍ）以下のＫ_Ｄで、２００ｐＭ（２．０×１０^－１０Ｍ）以下のＫ_Ｄで、１５０ｐＭ（１．５０×１０^－１０Ｍ）以下のＫ_Ｄで、１２５ｐＭ（１．２５×１０^－１０Ｍ）以下のＫ_Ｄで、１０５ｐＭ（１．０５×１０^－１０Ｍ）以下のＫ_Ｄで、５０ｐＭ（５．０×１０^－１１Ｍ）以下のＫ_Ｄで、又は２０ｐＭ（２．０×１０^－１１Ｍ）以下のＫ_Ｄで、特異的に結合する。一部の実施形態において、本明細書中に記載される多重特異性抗体構築体は、ｋ_ｄ（解離速度定数）によって測定される、標的抗原に対する結合親和力が、約１０^－２、１０^－３、１０^－４、１０^－５、１０^－６、１０^－７、１０^－８、１０^－９、１０^－１０ｓ^－１以下（値が低いほど結合親和力が高いことを示す）であること、且つ／又はＫ_Ｄ（平衡解離定数）によって測定される、標的抗原に対する結合親和性が、約１０^－９、１０^－１０、１０^－１１、１０^－１２、１０^－１３、１０^－１４、１０^－１５、１０^－１６Ｍ以下（値が低いほど結合親和性が高いことを示す）であること等の所望される特性を示す。

本明細書中で使用される用語、「結合ドメイン」と互換的に使用される「抗原結合ドメイン」は、抗原と相互作用し、且つ抗原に対する特異性及び親和性を抗原結合タンパク質に付与するアミノ酸残基を含有する抗原結合タンパク質の領域を指す。本明細書中で使用される用語「標的抗原」は、例えば、二重特異性分子の第１の標的抗原及び／又は第２の標的抗原を指し、そしてまた、四重特異性分子の第１の標的抗原、第２の標的抗原、第３の標的抗原、及び／又は第４の標的抗原を指す。

本発明の多重特異性抗体構築体の特定の実施形態において、結合ドメインは、抗体又はその機能的断片に由来してもよい。例えば、本発明の多重特異性抗体構築体の結合ドメインは、標的抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域に由来する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでもよい。本明細書中で使用される用語「ＣＤＲ」は、抗体可変配列内の相補性決定領域（「最小認識単位」又は「超可変領域」とも称される）を指す。３つの重鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）及び３つの軽鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）が存在する。本明細書中で使用される用語「ＣＤＲ領域」は、単一の可変領域内に存在する３つのＣＤＲの群（即ち３つの軽鎖ＣＤＲ又は３つの重鎖ＣＤＲ）を指す。２つの鎖の各々におけるＣＤＲは典型的に、フレームワーク領域によってアラインされて、標的タンパク質の特異的エピトープ又はドメインと特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端まで、天然に存在する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は双方とも、典型的に、これらのエレメントの以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４と一致する。

Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）におけるようなＥＵインデックス、及びＡＨｏナンバリングスキーム（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ Ａ．ａｎｄ Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ Ａ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００１ Ｊｕｎ ８；３０９（３）：６５７－７０）の双方を、本発明において使用することができる。所与の抗体のアミノ酸位置、並びに相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）は、いずれの系を使用しても識別され得る。例えば、３９、４４、１８３、３５６、３５７、３７０、３９２、３９９、及び４０９のＥＵ重鎖位置はそれぞれ、ＡＨｏ重鎖位置４６、５１、２３０、４８４、４８５、５０１、５２８、５３５、及び５５１に等しい。同様に、ＥＵ軽鎖位置３８、１００、及び１７６はそれぞれ、ＡＨＯ軽鎖位置４６、１４１、及び２３０に等しい。

抗体をパパインで消化すると、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合性断片（各々が単一の抗原結合部位を有する）及び残部の「Ｆｃ」断片（免疫グロブリン定常領域を含有する）が生成される。Ｆａｂ断片は、可変ドメイン、並びに軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）の全てを含有する。ゆえに、「Ｆａｂ断片」は、１つの免疫グロブリン軽鎖（軽鎖可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ））、並びに１つの免疫グロブリン重鎖のＣＨ１領域及び可変領域（ＶＨ）で構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。Ｆｃ断片は炭水化物を示し、抗体のあるクラスを別のクラスと区別する多くの抗体エフェクタ機能（結合補体及び細胞受容体等）を担う。「Ｆｄ断片」は、免疫グロブリン重鎖由来のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む。Ｆｄ断片は、Ｆａｂ断片の重鎖構成要素を表す。

「Ｆａｂ’断片」は、ＣＨ１ドメインのＣ末端にて、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステイン残基を有するＦａｂ断片である。

「Ｆ（ａｂ’）_２断片」は、重鎖間のジスルフィド架橋によってヒンジ領域にて連結されている、２つのＦａｂ’断片を含む二価の断片である。

「Ｆｖ」断片は、抗体由来の完全抗原認識結合部位を含有する最小の断片である。この断片は、緊密な非共有結合状態にある、１つの免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）及び１つの免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）の二量体からなる。この構成において、各可変領域の３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を定義する。単一の軽鎖又は重鎖の可変領域（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖ断片の半分）は、抗原を認識してこれに結合する能力を有するが、ＶＨ及びＶＬの双方を含む結合部位全体よりも親和性が低い。

本明細書中で、「可変ドメイン」と互換的に使用される「可変領域」（軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））は、抗体の、抗原への結合に直接関与する、免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖のそれぞれにおける領域を指す。先で考察されるように、可変軽鎖領域及び可変重鎖領域は、同じ一般構造を有し、各領域は、４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含み、それらの配列は、広範に保存されており、３つのＣＤＲによって連結されている。フレームワーク領域は、ベータ－シート構造を採用し、ＣＤＲは、ベータ－シート構造を連結するループを形成し得る。各鎖内のＣＤＲは、フレームワーク領域によって三次元構造で保持されて、他方の鎖由来のＣＤＲと一緒になって抗原結合部位を形成する。

「免疫グロブリンドメイン」は、免疫グロブリンのアミノ酸配列と類似したアミノ酸配列を含み、且つ少なくとも２つのシステイン残基を含むおおよそ１００個のアミノ酸残基を含むペプチドを表す。免疫グロブリンドメインの例として、免疫グロブリン重鎖のＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３、並びに免疫グロブリン軽鎖のＶＬ及びＣＬが挙げられる。また、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリン以外のタンパク質中で見出される。免疫グロブリン以外のタンパク質中の免疫グロブリンドメインの例として、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するタンパク質中に含まれる免疫グロブリンドメイン、例えば、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ＣＤ１、Ｂ７、及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が挙げられる。いずれの免疫グロブリンドメインも、本発明の多価抗体用の免疫グロブリンドメインとして使用することができる。

ヒト抗体において、ＣＨ１は、ＥＵインデックスの１１８～２１５位にてアミノ酸配列を有する領域を意味する。「ヒンジ領域」と呼ばれる高度にフレキシブルなアミノ酸領域が、ＣＨ１とＣＨ２との間に存在する。ＣＨ２は、ＥＵインデックスの２３１～３４０位にてアミノ酸配列を有する領域を表し、ＣＨ３は、ＥＵインデックスの３４１～４４６位にてアミノ酸配列を有する領域を表す。

「ＣＬ」は、軽鎖の定常領域を表す。ヒト抗体のκ鎖の場合、ＣＬは、ＥＵインデックスの１０８～２１４位にてアミノ酸配列を有する領域を表す。λ鎖において、ＣＬは、１０８～２１５位にてアミノ酸配列を有する領域を表す。

標的抗原に特異的に結合する結合ドメインは、ａ）当該抗原に対する既知の抗体に、又はｂ）抗原タンパク質若しくはその断片を使用する新規な免疫化法によって、ファージディスプレイによって、若しくは他のルーチンの方法によって得られる新規な抗体若しくは抗体断片に由来するものとすることができる。多重特異性抗体構築体の結合ドメインが由来する抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体とすることができる。特定の実施形態において、結合ドメインが由来する抗体は、モノクローナル抗体である。これらの、又は他の実施形態において、抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体であり、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型、又はＩｇＧ４型のものとすることができる。

本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」（又は「ｍＡｂ」）は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す。即ち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る、可能性のある天然に存在する変異以外は、同一である。モノクローナル抗体は、特異性が高く、様々なエピトープに向けられる様々な抗体を典型的に含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、個別の抗原部位又はエピトープに向けられる。モノクローナル抗体は、当該技術において知られているあらゆる技術を使用して、例えば、免疫化スケジュールの完了後にトランスジェニック動物から収穫した脾臓細胞を不死化することによって、生成されてもよい。脾臓細胞は、当該技術において知られているあらゆる技術を使用して、例えば、脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを生成することによって、不死化することができる。ハイブリドーマを生成する融合手順に使用される骨髄腫細胞は、非抗体産生性であり、融合効率が高く、且つ所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地中での増殖を不能にする酵素欠損がある。マウス融合における使用に適切な細胞株の例として、Ｓｐ－２０、Ｐ３－Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４ １、Ｓｐ２１０－Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ－１１、ＭＰＣ１１－Ｘ４５－ＧＴＧ１．７、及びＳ１９４／５ＸＸＯ Ｂｕｌが挙げられ；ラット融合に使用される細胞株の例として、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３－Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ、及び４Ｂ２１０が挙げられる。細胞融合に有用な他の細胞株として、Ｕ－２６６、ＧＭ１５００－ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ－ＬＯＮ－ＨＭｙ２、及びＵＣ７２９－６がある。

一部の例では、動物（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）を標的抗原免疫原で免疫化して；免疫化した動物から脾臓細胞を収穫して；収穫した脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させることよって、ハイブリドーマ細胞を生成して；ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を確立して；標的抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を識別することによって、ハイブリドーマ細胞株が生成される。

ハイブリドーマ細胞株によって分泌されるモノクローナル抗体は、当該技術において知られているあらゆる技術、例えば、プロテインＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティクロマトグラフィを使用して精製することができる。ハイブリドーマ又はｍＡｂをさらにスクリーニングして、標的抗原を発現している細胞に結合する能力、標的抗原の、そのそれぞれの受容体若しくはリガンドへの結合をブロック若しくは妨害する能力、又は標的抗原のいずれをも機能的にブロックする能力等の特定の性質を有するｍＡｂを識別することができる。

一部の実施形態において、本発明の多重特異性抗体構築体の結合ドメインは、標的抗原に対するヒト化抗体に由来してもよい。「ヒト化抗体」は、領域（例えばフレームワーク領域）が、ヒト免疫グロブリン由来の対応する領域を含むように修飾されている抗体を指す。一般に、ヒト化抗体は、最初に非ヒト動物において作られたモノクローナル抗体から生成することができる。典型的には抗体の非抗原認識部分に由来する、このモノクローナル抗体内のある特定のアミノ酸残基が、対応するアイソタイプのヒト抗体内の対応する残基と相同となるように修飾されている。ヒト化は、例えば、齧歯類可変領域の少なくとも一部を、ヒト抗体の対応する領域に置換することによる種々の方法を使用して実行することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書及び米国特許第５，６９３，７６２号明細書、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２１：５２２－５２５，１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３３２：３２３－２７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３９：１５３４－１５３６，１９８８参照）。別の種において生成された抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のＣＤＲは、コンセンサスヒトＦＲにグラフト化することができる。コンセンサスヒトＦＲを作出するために、幾つかのヒト重鎖アミノ酸配列又はヒト軽鎖アミノ酸配列由来のＦＲをアラインして、コンセンサスアミノ酸配列を同定してもよい。

本発明の多重特異性抗体構築体の結合ドメインが由来し得る標的抗原に対して生成される新規な抗体を、完全ヒト抗体とすることができる。「完全ヒト抗体」は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を含む抗体である。完全ヒト抗体の生成を実施するために提供される具体的な一手段として、マウス体液性免疫系の「ヒト化」がある。内因性のＩｇ遺伝子が不活化されたマウス中への、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の導入は、所望のあらゆる抗原で免疫化することができる動物であるマウスにおいて完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成する一手段である。完全ヒト抗体を使用すると、マウスのｍＡｂ又はマウス由来のｍＡｂを治療剤としてヒトに投与することによって生じることがあり得る免疫原性及びアレルギー性の応答を最小化することができる。

完全ヒト抗体は、内因性の免疫グロブリンの産生の不在下で、ヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（通常はマウス）を免疫化することによって生成することができる。この目的のための抗原は、典型的に、６つ以上の連続アミノ酸を有し、そして場合によっては、ハプテン等の担体にコンジュゲートされている。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１－２５５５、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５－２５８及びＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３参照。そのような方法の一例では、トランスジェニック動物は、マウスの免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖をコードする内因性のマウス免疫グロブリン遺伝子座を無能化し、且つヒト重鎖タンパク質及び軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含有するヒトゲノムＤＮＡの大型断片をマウスゲノム中に挿入することによって生成される。次いで、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の完全補体よりも少ない補体を有する部分的に修飾された動物を交雑して、所望の免疫系修飾を全て有する動物が得られる。免疫原が投与されると、当該トランスジェニック動物は、その免疫原に免疫特異性があるが、可変領域を含めて、マウスのアミノ酸配列ではなく、ヒトのアミノ酸配列を有する抗体を産生する。そのような方法の更なる詳細については、例えば、国際公開第９６／３３７３５号パンフレット及び国際公開第９４／０２６０２号パンフレット参照。ヒト抗体を作製するためのトランスジェニックマウスに関連する更なる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、米国特許第６，７１３，６１０号明細書、米国特許第６，６７３，９８６号明細書、米国特許第６，１６２，９６３号明細書、米国特許第５，９３９，５９８号明細書、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、米国特許第６，３００，１２９号明細書、米国特許第６，２５５，４５８号明細書、米国特許第５，８７７，３９７号明細書、米国特許第５，８７４，２９９号明細書、及び米国特許第５，５４５，８０６号明細書、ＰＣＴ公報の国際公開第９１／１０７４１号パンフレット、国際公開第９０／０４０３６号パンフレット、国際公開第９４／０２６０２号パンフレット、国際公開第９６／３０４９８号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、並びに欧州特許第５４６０７３Ｂ１号明細書及び欧州特許出願公開第５４６０７３Ａ１号明細書に記載されている。

本明細書中で「ＨｕＭａｂ」マウスと称される上記のトランスジェニックマウスは、内因性のミュー及びカッパ鎖遺伝子座を不活化する標的変異と共に、再配列されていないヒト重鎖（ミュー及びガンマ）及びカッパ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含有する（Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９）。従って、マウスは、マウスＩｇＭ又はカッパの発現の引下げを示し、且つ免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチ及び体細胞変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧカッパモノクローナル抗体を生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，前掲；Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３；Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６－５４６）。ＨｕＭａｂマウスの調製は、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６２８７－６２９５；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７－６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２－２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９－１０１；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５７９－５９１；Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３；Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６－５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５－８５１に詳細に記載されており、これらの文献は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，５６９，８２５号明細書、米国特許第５，６２５，１２６号明細書、米国特許第５，６３３，４２５号明細書、米国特許第５，７８９，６５０号明細書、米国特許第５，８７７，３９７号明細書、米国特許第５，６６１，０１６号明細書、米国特許第５，８１４，３１８号明細書、米国特許第５，８７４，２９９号明細書、及び米国特許第５，７７０，４２９号明細書、並びに米国特許第５，５４５，８０７号明細書、国際公開第９３／１２２７号パンフレット、国際公開第９２／２２６４６号パンフレット、及び国際公開第９２／０３９１８号パンフレット参照（これらの全ての開示は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。こうした遺伝子導入マウスにおけるヒト抗体の生成に利用される技術は、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット及びＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６においても開示されており、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。

また、ヒト由来抗体は、ファージディスプレイ技術を使用して生成することもできる。ファージディスプレイは、例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９１／１７２７１号パンフレット、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、及びＣａｔｏｎ ａｎｄ Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０－６４５４（１９９０）に記載されており、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ファージ技術によって生成される抗体は、通常、細菌において、抗原結合断片、例えばＦｖ又はＦａｂ断片として生成されるので、エフェクタ機能を欠いている。エフェクタ機能を、２つの戦略のうち１つによって導入することができる。断片を操作して、必要に応じて、哺乳動物細胞内で発現する完全な抗体にすることも、エフェクタ機能をトリガーすることができる第２の結合部位を有する多重特異性抗体断片にすることもできる。典型的には、抗体のＦｄ断片（ＶＨ－ＣＨ１）及び軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）が、ＰＣＲによって別々にクローニングされて、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリ内でランダムに組み換えられてから、特定の抗原への結合について選択され得る。抗体断片は、ファージ表面上に発現されて、Ｆｖ又はＦａｂの、抗原結合による選択（従って、抗体断片をコードするＤＮＡを含有するファージ）は、パニングと称される手順である抗原結合及び再増幅を数ラウンド行うことによって達成される。抗原に特異的な抗体断片が富化されて、最終的に単離される。また、ファージディスプレイ技術を、「ガイデッドセレクション（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる、齧歯類モノクローナル抗体のヒト化のためのアプローチに使用することができる（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２，８９９－９０３（１９９４）参照）。これについては、マウスモノクローナル抗体のＦｄ断片を、ヒト軽鎖ライブラリと組み合わせて提示することができ、そして生じたハイブリッドＦａｂライブラリを次に、抗原により選択することができる。これにより、マウスＦｄ断片は、選択をガイドするテンプレートを提供する。続いて、選択されたヒト軽鎖は、ヒトＦｄ断片ライブラリと組み合わされる。生じたライブラリの選択により、完全なヒトＦａｂが得られる。

本明細書中で使用される用語「同一性」は、配列をアラインして比較することによって判定される、２つ以上のポリペプチド分子又は２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。本明細書中で使用される「同一性パーセント」は、比較する分子中のアミノ酸又はヌクレオチド間の同一残基のパーセントを意味し、比較することになる分子の最小のサイズに基づいて算出される。当該算出のために、アラインメントにおけるギャップ（存在する場合）に、特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム（即ち「アルゴリズム」）によって対処しなければならない。アラインした核酸又はポリペプチドの同一性を算出するのに使用され得る方法として、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；及びＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記載されるものが挙げられる。例えば、配列同一性を、２つのポリペプチドのアミノ酸の位置の類似性を比較するのに一般に使用されている標準的な方法によって判定することができる。ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡ等のコンピュータプログラムを使用して、２つのポリペプチド又は２つのポリヌクレオチド配列を、それらのそれぞれの残基が最適にマッチするようにアラインする（一方若しくは双方の配列の全長に沿って、又は一方若しくは双方の配列の所定の部分に沿って）。プログラムは、デフォルトのオープニングペナルティ及びデフォルトのギャップペナルティを与える。ＰＡＭ ２５０（標準スコアリングマトリックス；Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐ．３（１９７８）を参照）等のスコアリングマトリックスを、コンピュータプログラムと共に使用することができる。次いで、例えば、同一性パーセントを次のように算出することができる：完全マッチの総数に１００を掛けてから、マッチしたスパン内のより長い配列の長さと、２つの配列をアラインするために、より長い配列中に導入されたギャップの数との合計で割る。同一性パーセントの算出では、比較されることになる配列は、配列間のマッチを最大化するようにアラインされる。

ＧＣＧプログラムパッケージは、同一性パーセントを判定するのに使用することができるコンピュータプログラムであり、当該パッケージはＧＡＰを含む（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。コンピュータアルゴリズムＧＡＰは、配列同一性パーセントを判定しようとする２つのポリペプチド又は２つのポリヌクレオチドをアラインするのに使用される。配列は、そのそれぞれのアミノ酸又はヌクレオチドの最適なマッチングが得られるようにアラインされる（アルゴリズムによって決定される「マッチドスパン（ｍａｔｃｈｅｄ ｓｐａｎ）」）。ギャップオープニングペナルティ（３×平均対角（ａｖｅｒａｇｅ ｄｉａｇｏｎａｌ）として算出され、「平均対角」は、使用されることになる比較マトリックスの対角の平均であり；「対角」は、特定の比較マトリックスによってそれぞれの完全アミノ酸マッチに割り当てられるスコア又は数である）及びギャップエクステンションペナルティ（通常、ギャップオープニングペナルティの１／１０倍である）、並びにＰＡＭ ２５０又はＢＬＯＳＵＭ ６２等の比較マトリックスが、アルゴリズムと共に使用される。特定の実施形態において、標準比較マトリックス（ＰＡＭ ２５０比較マトリックスについては、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：３４５－３５２参照；ＢＬＯＳＵＭ ６２比較マトリックスについては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５－１０９１９参照）もまた、アルゴリズムによって使用される。

ＧＡＰプログラムを使用してポリペプチド又はヌクレオチド配列の同一性パーセントを判定するのに推奨されるパラメータとして、以下が挙げられる：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３；
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２、前掲のＢＬＯＳＵＭ ６２；
ギャップペナルティ：１２（但し、エンドギャップに対するペナルティなし）
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０

２つのアミノ酸配列をアラインするための特定のアラインメントスキームが、２つの配列の短い領域のみのマッチングをもたらし得、このアラインされた小さい領域は、２つの全長配列間に有意な関係がないにも拘わらず、非常に高い配列同一性を有し得る。従って、選択したアラインメント方法（ＧＡＰプログラム）を、必要に応じて調節して、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続するアミノ酸にわたるアラインメントをもたらすことができる。

本明細書中で使用される用語「抗体」は、２つの軽鎖ポリペプチド（それぞれ約２５ｋＤａ）及び２つの重鎖ポリペプチド（それぞれ約５０～７０ｋＤａ）を含む四量体免疫グロブリンタンパク質を指す。用語「軽鎖」又は「免疫グロブリン軽鎖」は、アミノ末端からカルボキシル末端までに、単一の免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）及び単一の免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むポリペプチドを指す。免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、カッパ（κ）又はラムダ（λ）とすることができる。用語「重鎖」又は「免疫グロブリン重鎖」は、アミノ末端からカルボキシル末端までに、単一の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）、及び場合によっては免疫グロブリン重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）を含むポリペプチドを指す。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、及びイプシロン（ε）として分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥと定義する。ＩｇＧクラス抗体及びＩｇＡクラス抗体はさらに、サブクラス、即ち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、並びにＩｇＡ１及びＩｇＡ２にそれぞれ分けられる。ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、及びＩｇＤ抗体の重鎖は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有し、ＩｇＭ抗体及びＩｇＥ抗体の重鎖は、４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４）を有する。免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、サブタイプが挙げられるあらゆる免疫グロブリンアイソタイプに由来するものとすることができる。抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間（即ち、軽鎖と重鎖との間）の、そして抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介して連結されている。

多重特異性抗体構築体は、あらゆる免疫グロブリン定常領域を含むことができる。本明細書中で使用される用語「定常領域」は、可変領域以外の抗体の全てのドメインを指す。定常領域は、抗原の結合に直接には関与しないが、種々のエフェクタ機能を発揮する。上記のように、抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、特定のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）及びサブタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）に分けられる。軽鎖定常領域は、例えば、カッパ型又はラムダ型の軽鎖定常領域、例えば、５つの抗体アイソタイプ全てにおいて見出されるヒトのカッパ型又はラムダ型の軽鎖定常領域とすることができる。ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列の例を、以下の表に示す。

多重特異性抗体構築体の重鎖定常領域は、例えば、アルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、又はミュー型の重鎖定常領域、例えば、ヒトのアルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、又はミュー型の重鎖定常領域とすることができる。一部の実施形態において、多重特異性抗体構築体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。一実施形態において、多重特異性抗体構築体は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。別の実施形態において、多重特異性抗体構築体は、ヒトＩｇＧ２免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ２重鎖定常領域配列の例を、以下の表５に示す。

可変領域が、先の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域に結合されて、それぞれ完全な抗体軽鎖及び抗体重鎖が形成されてもよい。さらに、このようにして生成された重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの各々が組み合わされて、多重特異性抗体構築体が形成されてもよい。本明細書中で提供される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、先で列挙された例示的な配列と異なる配列を有する他の定常ドメインにも結合され得ることが理解されるべきである。

本発明の特定の実施形態において、２つの異なるＦｃドメインが使用されて、本発明のヘテロ二量体分子が形成されている。多重特異性抗体構築体へのＦｃ鎖及び重鎖のアセンブリを促進するために、多重特異性抗体構築体のＦｃ含有ポリペプチドの各々由来のＦｃドメイン及び重鎖のＦｃドメインを操作して、ミス塩基対形成分子の形成を減少させることができる。例えば、ホモダイマーＦｃ形成に対してヘテロダイマーＦｃ形成を促進する一アプローチが、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」法であり、これは、接触インターフェイスにて２つの異なる抗体重鎖Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン中に変異を導入することを含む。具体的には、一方の抗体重鎖Ｆｃ領域内の１つ以上のかさ高い（ｂｕｌｋｙ）アミノ酸が、短い側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン又はトレオニン）で置換されて「ホール」が生じる一方、大きな側鎖を有する１つ以上のアミノ酸（例えば、チロシン又はトリプトファン）が、他方の重鎖中に導入されて「ノブ」が生じる。修飾重鎖Ｆｃ領域が共発現される場合、ホモダイマー（ホール－ホール又はノブ－ノブ）と比較してより大きなパーセンテージのヘテロダイマー（ノブ－ホール）が形成される。「ノブ・イントゥ・ホール」方法論は、国際公開第９６／０２７０１１号パンフレット；Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，Ｖｏｌ．９：６１７－６２１，１９９６；及びＭｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６：６７７－６８１，１９９８に詳述されており、これらは全て、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

ホモダイマー形成を除外する、ヘテロダイマー形成を促進する別のアプローチは、静電ステアリング機構を利用することを伴う（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８５：１９６３７－１９６４６，２０１０参照、この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。このアプローチは、２つの異なるＦｃ領域が、静電引力を引き起こす反対荷電を介して関連するように、各Ｆｃ領域内のＣＨ３ドメイン内の荷電残基を導入又は利用することを含む。同一のＦｃ領域のホモ二量体化は不都合である。なぜなら、同一のＦｃ領域は、同じ荷電を有することで反発するからである。静電ステアリング技術、並びにヘテロダイマー及び正確な軽鎖／重鎖対形成を促進するのに適切な荷電対変異が、国際公開第２００９０８９００４号パンフレット及び国際公開第２０１４０８１９５５号パンフレットに記載されており、これらは双方とも、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

特定の実施形態において、３７０、３９２、及び４０９（ＥＵナンバリング系）から選択される一方のＣＨ３ドメインの１つ以上の位置のアミノ酸（例えばリシン）が、負荷電アミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）で置換されており、他方のＣＨ３ドメインの３５６、３５７、及び３９９（ＥＵナンバリング系）から選択される１つ以上の位置のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）が、正荷電アミノ酸（例えば、リシン、ヒスチジン、及びアルギニン）で置換されている。

特定の実施形態において、多重特異性抗体構築体は、３９２位及び４０９位に負荷電アミノ酸（例えば、Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄの置換）を含む第１のＣＨ３含有ポリペプチド（重鎖又はＦｃドメイン）、及び３５６位及び３９９位に正荷電アミノ酸（例えば、Ｅ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋの置換）を含む第２のＣＨ３含有ポリペプチドを含む。他の特定の実施形態において、多重特異性抗体構築体は、３９２位、４０９位、及び３７０位に負荷電アミノ酸（例えば、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ、及びＫ３７０Ｄの置換）を含む第１のＣＨ３含有ポリペプチド、並びに３５６位、３９９位及び３５７位に正荷電アミノ酸（例えば、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３９９Ｋ、及びＥ３５７Ｋの置換）を含む第２のＣＨ３含有ポリペプチドを含む。

一実施形態において、ミス塩基対形成の問題は、Ｆｃドメインを重鎖にリンカーを介して連結することによって回避される。そのような例において、重鎖及びＦｃドメインは、単鎖Ｆｃ（ｓｃＦｃ）を形成することができる。

定常ドメインのいずれも、多重特異性抗体構築体の正確なアセンブリを促進するために、上述の荷電対変異の１つ以上を含有するように修飾することができる。

また、本発明の多重特異性抗体構築体は、重鎖及び／又は軽鎖を含む抗体を包含し、重鎖及び軽鎖のいずれか１つに関して、例えば、抗体が発現される宿主細胞のタイプから生じる翻訳後修飾に起因して、１、２、３、４、又は５つのアミノ酸残基が、Ｎ末端若しくはＣ末端、又は双方から欠けている。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、抗体重鎖からＣ末端リシンを高頻度で切断する。

本明細書中で使用される用語「Ｆｃ領域」は、インタクトな抗体のパパイン消化によって生成され得る免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメイン、即ちＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、そして場合によってはヒンジドメインを含む。特定の実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４免疫グロブリン由来のＦｃ領域である。一部の実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ２免疫グロブリン由来のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃ領域は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及びファゴサイトーシス等のエフェクタ機能を保持し得る。他の実施形態において、Ｆｃ領域は、本明細書中にさらに詳細に記載されるように、エフェクタ機能を引き下げるか、又は排除するように修飾される場合がある。

本発明の多重特異性抗体構築体の特定の実施形態において、Ｆｃ領域のアミノ末端に配置された結合ドメイン（即ちアミノ末端結合ドメイン）は、Ｆｃ領域のアミノ末端に、本明細書中に記載されるペプチドリンカーを介して、又は免疫グロブリンヒンジ領域を介して融合したＦａｂフラグメントである。「免疫グロブリンヒンジ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを連結するアミノ酸配列を指す。ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域は、通常、約Ｇｌｕ２１６又は約Ｃｙｓ２２６から、約Ｐｒｏ２３０までのアミノ酸配列と定義される。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、同じ位置において重鎖間ジスルフィド結合を形成するように最初と最後のシステイン残基を配置することによって、ＩｇＧ１配列とアラインすることができ、当業者であれば決定可能である。一部の実施形態において、アミノ末端結合ドメインは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域を介してＦｃ領域のアミノ末端に結合される。他の実施形態において、アミノ末端結合ドメインは、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域を介してＦｃ領域のアミノ末端に結合される。一実施形態において、アミノ末端結合ドメイン（例えばＦａｂフラグメント）は、Ｆｃ領域に、ＦａｂのＣＨ１領域のカルボキシル末端を介して融合している。

本明細書中で使用される用語「修飾された重鎖」は、免疫グロブリン重鎖、特にヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ２重鎖、及び機能的抗体断片（例えばｓｃＦｖ）を含む融合タンパク質を指し、その断片又は部分は、重鎖のＮ末端又はＣ末端に、場合によってはペプチドリンカーを介して、融合している。

本明細書中で使用される用語「修飾された軽鎖」は、免疫グロブリン軽鎖及び機能的抗体断片（例えばｓｃＦｖ）を含む融合タンパク質を指し、その断片又は部分は、軽鎖のＮ末端又はＣ末端に、場合によってはペプチドリンカーを介して、融合している。

本明細書中に記載される多重特異性抗体構築体の重鎖定常領域又はＦｃ領域は、抗原結合タンパク質のグリコシル化及び／又はエフェクタ機能に影響する１つ以上のアミノ酸置換を含んでもよい。免疫グロブリンのＦｃ領域の機能の１つが、免疫グロブリンがその標的に結合している場合に免疫系に伝達することである。これは、一般に「エフェクタ機能」と称される。伝達は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に至る。ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰは、免疫系の細胞の表面上のＦｃ受容体へのＦｃ領域の結合を介して媒介される。ＣＤＣは、補体系のタンパク質、例えばＣ１ｑとのＦｃの結合を介して媒介される。一部の実施形態において、本発明の多重特異性抗体構築体は、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＰ活性が挙げられるエフェクタ機能、及び／又は抗原結合タンパク質のクリアランス若しくは半減期を増強するような１つ以上のアミノ酸置換を定常領域内に含む。エフェクタ機能を増強することができる例示的なアミノ酸置換（ＥＵナンバリング）として、以下に限定されないが、Ｅ２３３Ｌ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３５Ｓ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｖ、Ｐ２４７Ｉ、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｙ、Ｒ２９２Ｐ、Ｅ２９４Ｌ、Ｙ２９６Ｗ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｔ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｑ３１１Ｍ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３２６Ｗ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｍ、Ａ３３０Ｆ、Ｉ３３２Ｅ、Ｄ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｖ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ、又は上記のあらゆる組合せが挙げられる。

他の実施形態において、本発明の多重特異性抗体構築体は、エフェクタ機能を引き下げるような１つ以上のアミノ酸置換を定常領域内に含む。エフェクタ機能を引き下げることができる例示的なアミノ酸置換（ＥＵナンバリング）として、以下に限定されないが、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、又は上記のあらゆる組合せが挙げられる。

グリコシル化が、抗体、特にＩｇＧ１抗体のエフェクタ機能に寄与し得る。ゆえに、一部の実施形態において、本発明の多重特異性抗体構築体は、結合タンパク質のグリコシル化のレベル又はタイプに影響を及ぼす１つ以上のアミノ酸置換を含んでいてもよい。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的に、Ｎ結合型又はＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－トレオニン（Ｘは、プロリン以外のあらゆるアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。ゆえに、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作り出される。Ｏ結合型グリコシル化は、糖であるＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースのうち１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はトレオニンへの結合を指すが、５－ヒドロキシプロリン又は５－ヒドロキシリシンを使用することもできる。

特定の実施形態において、本明細書中に記載される多重特異性抗体構築体のグリコシル化は、１つ以上のグリコシル化部位を、例えば結合タンパク質のＦｃ領域に付加することによって、増大される。抗原結合タンパク質へのグリコシル化部位の付加は、上記のトリペプチド配列のうち１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって、簡便に達成することができる（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）。また、改変は、開始配列への１つ以上のセリン残基若しくはトレオニン残基の付加、又はこれらによる置換によってなされてもよい（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）。容易にするために、抗原結合タンパク質アミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変化によって、特に、所望のアミノ酸に翻訳されることになるコドンが生成されるように、予め選択された塩基にて、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることによって、改変されてもよい。

本発明はまた、炭水化物構造が改変されて、結果としてエフェクタ活性が改変されている二重特異性抗原結合タンパク質分子、例えば、フコシル化がないか又は減少して、ＡＤＣＣ活性の向上を示す抗原結合タンパク質の生成も包含する。フコシル化を減少させるか、又は排除する種々の方法が、当該技術において知られている。例えば、ＡＤＣＣエフェクタ活性は、抗体分子の、ＦｃγＲＩＩＩ受容体への結合によって媒介され、これは、ＣＨ２ドメインのＮ２９７残基でのＮ結合型グリコシル化の炭水化物構造に依存することが示されている。非フコシル化抗体は、高い親和性でこの受容体に結合して、ＦｃγＲＩＩＩ媒介性エフェクタ機能を、天然のフコシル化抗体よりも効率的にトリガーする。例えば、アルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ酵素がノックアウトされているＣＨＯ細胞における非フコシル化抗体の組換え生成により、ＡＤＣＣ活性が１００倍増大した抗体が生じる（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．８７（５）：６１４－２２，２００４参照）。同様の効果は、フコシル化経路におけるアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ酵素又は他の酵素の活性を低下させることによって、例えば、ｓｉＲＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡ処理、酵素をノックアウトするような細胞株の操作、又は選択的グリコシル化阻害剤を用いる培養によって、達成することができる（Ｒｏｔｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１２）：１１１３－２３，１９８９参照）。一部の宿主細胞株、例えばＬｅｃ１３又はラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞株は、フコシル化レベルがより低い抗体を天然に産生する（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７（３０）：２６７３３－４０，２００２及びＳｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３４６６－７３，２００３参照）。また、例えば、ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞において抗体を組換え生成することによる、二分された糖鎖レベルの増大により、ＡＤＣＣ活性が増大することが判明している（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６－８０，１９９９参照）。

他の実施形態において、本明細書中に記載される多重特異性抗体構築体のグリコシル化は、例えば結合タンパク質のＦｃ領域から、１つ以上のグリコシル化部位を除去することによって、低減又は排除される。Ｎ結合型グリコシル化部位を排除又は改変するアミノ酸置換により、抗原結合タンパク質のＮ結合型グリコシル化を減少させるか、又は排除することができる。特定の実施形態において、本明細書中に記載される多重特異性抗体構築体は、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ａ、又はＮ２９７Ｇ等のＮ２９７位（ＥＵナンバリング）での変異を含む。特定の一実施形態において、本発明の多重特異性抗体構築体は、Ｎ２９７Ｇ変異を有する、ヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。Ｎ２９７変異を含む分子の安定性を向上させるために、分子のＦｃ領域はさらに操作されてもよい。例えば、一部の実施形態において、Ｆｃ領域内の１つ以上のアミノ酸は、二量体状態でのジスルフィド結合形成を促進するように、システインで置換されている。ゆえに、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＶ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３、又はＩ３３２（ＥＵナンバリング）に対応する残基が、システインで置換されていてもよい。一実施形態において、残基の特定の対が、互いにジスルフィド結合を優先的に形成するようにシステインで置換されることで、ジスルフィド結合スクランブリングを制限又は防止している。特定の実施形態において、対として、Ａ２８７Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ、並びにＶ３２３Ｃ及びＩ３３２Ｃが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書中に記載される多重特異性抗体構築体は、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃの変異を有する、ヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。そのような実施形態において、Ｆｃ領域はまた、Ｎ２９７Ｇ変異を含んでもよい。特定の実施形態において、本明細書中に記載される多重特異性抗体構築体は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの変異を有する、ヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。特定の実施形態において、本明細書中に記載される多重特異性抗体構築体は、Ｎ２９７Ｇ、Ｒ２９２Ｃ、Ｖ３０２Ｃ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａの変異を有する、ヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。

また、例えば、サルベージ受容体（ｓａｌｖａｇｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）結合エピトープの組込み若しくは付加による（例えば、適切な領域の変異による、又はエピトープをペプチドタグに組み込み、続いてこれを、例えばＤＮＡ若しくはペプチド合成によって、いずれかの末端又は中央にて抗原結合タンパク質に融合させることによる；例えば、国際公開第９６／３２４７８号パンフレット参照）、又は多糖ポリマーが挙げられるＰＥＧ若しくは他の水溶性ポリマー等の分子の付加による、血清半減期を延長するような本発明の多重特異性抗体構築体の修飾が所望される場合もある。サルベージ受容体結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃ領域の１つ又は２つのループ由来のいずれか１つ以上のアミノ酸残基が、抗原結合タンパク質中の類似の位置に移される領域を構成する。一実施形態において、Ｆｃ領域の１つ又は２つのループ由来の３つ以上の残基が移される。一実施形態において、エピトープは、Ｆｃ領域（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ領域）のＣＨ２ドメインからとられて、抗原結合タンパク質のＣＨ１、ＣＨ３、若しくはＶＨ領域、又は複数のそのような領域に移される。これ以外にも、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインからとられて、抗原結合タンパク質のＣＬ領域若しくはＶＬ領域、又は双方に移される。Ｆｃ変異体及びその、サルベージ受容体との相互作用の説明については、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット及び国際公開第９６／３２４７８号パンフレット参照。

本発明は、本明細書中に記載される多重特異性抗体構築体及びその構成要素をコードする、１つ以上の単離核酸を含む。本発明の核酸分子として、一本鎖及び二本鎖の双方の形態のＤＮＡ及びＲＮＡ、並びに対応する相補的配列が挙げられる。ＤＮＡの例として、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組合せが挙げられる。本発明の核酸分子として、完全長遺伝子又はｃＤＮＡ分子、並びにそれらの断片の組合せが挙げられる。一実施形態において、本発明の核酸は、ヒト供給源に由来するが、本発明には、非ヒト種に由来するものも含まれる。

免疫グロブリン又はその領域（例えば、可変領域、Ｆｃ領域等）又は注目するポリペプチド由来の関連するアミノ酸配列は、直接的タンパク質配列決定によって決定することができ、適切なコードヌクレオチド配列を、普遍コドン表に従って設計することができる。これ以外にも、本発明の多重特異性抗体構築体の結合ドメインが由来し得るモノクローナル抗体をコードするゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、そのような抗体を産生する細胞から単離して配列決定することができる。

本明細書中で「単離ポリヌクレオチド」と互換的に使用される「単離核酸」は、天然に存在する供給源から単離された核酸の場合、核酸が単離された生物のゲノム中に存在する隣接遺伝子配列から分離された核酸である。例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチド等、鋳型から酵素的に、又は化学的に合成される核酸の場合、そのようなプロセスに由来する核酸は、単離核酸であると理解される。単離核酸分子は、別個の断片の形態の核酸分子、又はより大きな核酸構築体の構成要素としての核酸分子を指す。一実施形態において、核酸は、夾雑する内因性物質を実質的に含まない。核酸分子は、実質的に純粋な形態で、且つ標準的な生化学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に概説されているもの）によって、その構成要素ヌクレオチド配列の識別、操作、及び回収を可能にする量又は濃度で、少なくとも１回単離されたＤＮＡ又はＲＮＡに由来した。そのような配列は、典型的には真核生物遺伝子内に存在する内部非翻訳配列又はイントロンによって中断されていないオープンリーディングフレームの形態で提供且つ／又は構築される。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’側又は３’側に存在することができ、この場所で当該配列は、コード領域の操作又は発現を妨害しない。特に明記しない限り、本明細書中で考察されるあらゆる単鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端が５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向が５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写産物の５’から３’への産生の方向は、転写方向と称され、ＲＮＡ転写産物の５’末端の５’側にあるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と称され、ＲＮＡ転写産物の３’末端の３’側にあるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。

本発明はまた、中程度にストリンジェントな条件下、高度にストリンジェントな条件下で、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする核酸も含む。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響する基本パラメータ、及び適切な条件を考案するためのガイダンスは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ ９ ａｎｄ １１；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．１０ ａｎｄ ６．３－６．４）によって示されており、例えば、ＤＮＡの長さ及び／又は塩基組成に基づいて当業者が容易に決定することができる。中程度にストリンジェントな条件を達成する一方法が、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する予洗溶液、約５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーションバッファ、約５５℃のハイブリダイゼーション温度（又は他の類似のハイブリダイゼーション溶液、例えば、約４２℃のハイブリダイゼーション温度による、約５０％ホルムアミドを含有するもの）、及び０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の約６０℃の洗浄条件の使用を含む。一般に、高度にストリンジェントな条件は、およそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄すること以外は、上記のようなハイブリダイゼーション条件として定義される。ＳＳＰＥ（ｌ×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、及び１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を、ハイブリダイゼーションバッファ及び洗浄バッファ中のＳＳＣ（ｌ×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）に置換することができ、ハイブリダイゼーションが完了した後に、１５分間の洗浄が実行される。勿論、所望の程度のストリンジェンシーを達成する必要に応じて、当業者に知られており、且つ以下にさらに説明されるように、ハイブリダイゼーション反応及び二重鎖安定性を決定する基本原理を適用することによって、洗浄温度及び洗浄塩濃度を調節することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９参照）。核酸を未知の配列の標的核酸へとハイブリダイズする場合、ハイブリッド長は、ハイブリダイズする当該核酸の長さであると仮定する。既知の配列の核酸がハイブリダイズされる場合、ハイブリッド長は、当該核酸の配列をアラインして、最適な配列相補性の領域を識別することによって決定することができる。５０塩基対長未満であると予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５～１０℃低くなければならず、ここで、Ｔｍは、以下の式に従って求められる。１８塩基対長未満のハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ塩基＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ塩基＋Ｃ塩基の数）である。１８塩基対長を超えるハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－（６００／Ｎ）であり、式中、Ｎはハイブリッドにおける塩基の数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーションバッファ中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。一実施形態において、そのようなハイブリダイズする核酸は各々が、少なくとも１５ヌクレオチド（又は少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、若しくは少なくとも５０ヌクレオチド）の長さ、又はこれがハイブリダイズする本発明の核酸の長さの少なくとも２５％（又は少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、若しくは少なくとも８０％）である長さを有し、且つこれがハイブリダイズする本発明の核酸と、少なくとも６０％の配列同一性（又は少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは少なくとも９９．５％）を有する。ここで、配列同一性は、先でより詳細に記載されるように、重複及び同一性が最大となる一方で、配列ギャップが最小になるようにアラインしたときの、ハイブリダイズする核酸の配列を比較することによって判定される。

本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の変異体は、ポリペプチドをコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的な変異誘発によって、カセット若しくはＰＣＲ変異誘発、又は当該技術において周知の他の技術を使用して、変異体をコードするＤＮＡを生成し、その後、本明細書に概説するように、細胞培養物中で組換えＤＮＡを発現させることによって調製することができる。しかしながら、最大約１００～１５０個の残基を有する変異体ＣＤＲを含む抗原結合タンパク質を、確立された技術を使用してインビトロ合成によって調製してもよい。変異体は、典型的に、天然に存在する類似体と同じ定性的生物学的活性、例えば抗原への結合を示す。そのような変異体は、例えば、抗原結合タンパク質のアミノ酸配列内に、残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換のあらゆる組合せを行って、最終構築体に至るのであるが、最終構築体は所望の特性を保持することを条件とする。また、アミノ酸の変化は、グリコシル化部位の数又は位置を変化させる等、抗原結合タンパク質の翻訳後プロセスを改変する場合もある。特定の実施形態において、抗原結合タンパク質変異体は、エピトープ結合に直接関与するアミノ酸残基を修飾する目的で調製される。他の実施形態において、本明細書中で考察される目的のため、エピトープ結合に直接関与しない残基、又はエピトープ結合に何ら関与しない残基の修飾が所望される。あらゆるＣＤＲ領域及び／又はフレームワーク領域内に、変異誘発が企図される。抗原結合タンパク質のアミノ酸配列における有用な修飾を設計するために、当業者は共分散分析技術を使用することができる。例えば、Ｃｈｏｕｌｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ４１：４７５－４８４，２０００；Ｄｅｍａｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：４１－４８，２００４；Ｈｕｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １６（５）：３８１－８６，２００３；Ａｕｒｏｒａ ｅｔ ａｌ．、米国特許出願公開第２００８／０３１８２０７Ａ１号明細書；Ｇｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許出願公開第２００９／００４８１２２Ａ１号明細書；Ｕｒｅｃｈ ｅｔ ａｌ．、国際公開第２００８／１１０３４８Ａ１号パンフレット；Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．、国際公開第２００９／００００９９Ａ２号パンフレット参照。共分散分析によって決定されるそのような修飾は、抗原結合タンパク質の効力、薬物動態学的特性、薬力学的特性、及び／又は製造可能性の特性を向上させることができる。

本発明の核酸配列。当業者に理解されるように、遺伝コードの縮重に起因して、極めて多数の核酸が作製され得、それらは全て、本発明のＣＤＲ（並びに本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の重鎖及び軽鎖、又は他の構成要素）をコードする。ゆえに、特定のアミノ酸配列を同定したら、当業者であれば、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化させない方法で１つ以上のコドンの配列を単に修飾することによって、あらゆる数の異なる核酸を作製し得るであろう。

本発明はまた、本発明の多重特異性抗体構築体の１つ以上の構成要素（例えば、可変領域、軽鎖、重鎖、修飾された重鎖、及びＦｄ断片）をコードする１つ以上の核酸を含むベクターを含む。用語「ベクター」は、タンパク質コード情報を宿主細胞に移すために使用されるあらゆる分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ、又はウイルス）を指す。ベクターの例として、以下に限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター、及び発現ベクター、例えば組換え発現ベクターが挙げられる。本明細書中で使用される用語「発現ベクター」又は「発現構築体」は、所望のコード配列、及び作動可能に連結された当該コード配列の、特定の宿主細胞における発現に必要な適切な核酸制御配列を含有する組換えＤＮＡ分子を指す。発現ベクターは、転写、翻訳に影響を及ぼすか、又はそれらを制御する配列、及びイントロンが存在するならば、これに作動可能に連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列を含み得るが、これらに限定されない。原核生物での発現に必要な核酸配列として、プロモータ、場合によってはオペレーター配列、リボソーム結合部位、及びことによると他の配列が挙げられる。真核細胞は、プロモータ、エンハンサ、並びに終結シグナル及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。分泌シグナルペプチド配列が、場合によっては、注目するコード配列に作動可能に連結された発現ベクターによってコードされることも可能であり、これにより、必要に応じて、注目するポリペプチドが細胞からより容易に単離されるように、組換え宿主細胞によって発現ポリペプチドを分泌させることができる。例えば、一部の実施形態において、シグナルペプチド配列は、本発明のポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に付加され得／融合し得る。特定の実施形態において、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ（配列番号３２）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドが、本発明のポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に融合している。他の実施形態において、ＭＡＷＡＬＬＬＬＴＬＬＴＱＧＴＧＳＷＡ（配列番号３３）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドが、本発明のポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に融合している。さらに他の実施形態において、ＭＴＣＳＰＬＬＬＴＬＬＩＨＣＴＧＳＷＡ（配列番号３４）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドが、本発明のポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に融合している。本明細書中に記載されるポリペプチド配列のアミノ末端に融合し得る他の適切なシグナルペプチド配列として、ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号３５）、ＭＥＷＴＷＲＶＬＦＬＶＡＡＡＴＧＡＨＳ（配列番号３６）、ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号３７）、ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ（配列番号３８）、及びＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号３９）が挙げられる。他のシグナルペプチドが当業者に知られており、例えば、特定の宿主細胞における発現を促進又は最適化するために、本発明のポリペプチド鎖のいずれかに融合していてもよい。

典型的には、本発明の二重特異性抗原タンパク質を生成するのに宿主細胞中で使用される発現ベクターは、プラスミド維持のための配列、並びに二重特異性抗原結合タンパク質の構成要素をコードする外因性ヌクレオチド配列のクローニング及び発現のための配列を含有することになる。集合的に「フランキング配列」と称されるそのような配列は、特定の実施形態において、典型的には、以下のヌクレオチド配列：プロモータ、１つ以上のエンハンサ配列、複製起点、転写終結配列、ドナー及びアクセプタスプライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されることになるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、並びに選択マーカーエレメントのうち１つ以上を含むことになる。これらの配列の各々を、以下で考察する。

場合によっては、ベクターは、「タグ」コード配列、即ち、ポリペプチドコード配列の５’末端又は３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含有してもよく、当該オリゴヌクレオチドタグ配列は、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓ等）、ＦＬＡＧ、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）、ｍｙｃ、又は市販の抗体が存在する別の「タグ」分子をコードする。当該タグは、典型的に、ポリペプチドが発現すると、ポリペプチドに融合して、宿主細胞からのポリペプチドのアフィニティ精製又は検出のための手段として機能し得る。アフィニティ精製は、例えば、タグに対する抗体をアフィニティマトリックスとして使用するカラムクロマトグラフィによって達成することができる。場合によっては、その後、特定の切断用ペプチダーゼを使用する等の種々の手段によって、精製されたポリペプチドからタグを除去することができる。

フランキング配列は、同種性（即ち、宿主細胞と同じ種及び／又は株に由来する）、異種性（即ち、宿主細胞の種又は株以外の種に由来する）、ハイブリッド（即ち、複数の供給源に由来するフランキング配列の組合せ）、合成、又は天然のものとすることができる。従って、フランキング配列の供給源は、あらゆる原核生物若しくは真核生物、あらゆる脊椎生物若しくは無脊椎生物、又はあらゆる植物であってよいが、フランキング配列は、宿主細胞機構において機能的であり、且つ当該機構によって活性化され得ることを条件とする。

本発明のベクターにおいて有用なフランキング配列は、当該技術において周知の幾つかの方法のいずれかによって得ることができる。典型的には、本明細書において有用なフランキング配列は、マッピング及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されていることになるため、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、適切な組織供給源から単離することができる。場合により、フランキング配列の全ヌクレオチド配列が知られている場合がある。ここで、フランキング配列は、核酸合成又はクローニングの常法を使用して合成することができる。

フランキング配列の全てが既知であるか、又はその一部のみが既知であるかを問わず、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を使用して、且つ／又は同じ若しくは別の種に由来するオリゴヌクレオチド及び／若しくはフランキング配列断片等の適切なプローブを使用してゲノムライブラリをスクリーニングすることによって、フランキング配列を得ることができる。フランキング配列が不明である場合、フランキング配列を含有するＤＮＡの断片を、例えば、コード配列を、又は別の遺伝子さえをも含有し得るより大きなＤＮＡ片から単離することができる。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適切なＤＮＡ断片を生成し、続いてアガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）、又は当業者に知られている他の方法を使用して単離することによって達成することができる。この目的を達成するのに適切な酵素の選択は、当業者であれば容易に明らかとなろう。

複製起点は典型的に、市販の原核生物発現ベクターの一部であり、当該起点は、宿主細胞内でのベクターの増幅を補助する。選択したベクターが複製起点部位を含有していなければ、知られている配列に基づいて当該部位を化学的に合成して、ベクター中にライゲートしてもよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に由来する複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適しており、種々のウイルス起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、又はパピローマウイルス、例えばＨＰＶ若しくはＢＰＶ）が、哺乳動物細胞におけるベクターのクローニングに有用である。一般に、複製起点構成要素は、哺乳動物発現ベクターには必要でない（例えば、ＳＶ４０起点は、ウイルス初期プロモータも含有するという理由でのみ、使用されることが多い）。

転写終結配列は典型的に、ポリペプチドコード領域の末端に対して３’側に位置しており、転写を終結させるように機能する。通常、原核細胞における転写終結配列は、Ｇ－Ｃリッチ断片とそれに続くポリＴ配列である。当該配列は、ライブラリから容易にクローニングされるか、又はベクターの一部として商業的に購入される場合すらあるが、既知の核酸合成方法を使用して容易に合成することもできる。

選択マーカー遺伝子は、選択培養培地中で増殖させた宿主細胞の生存及び増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に、抗生物質若しくは他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、若しくはカナマイシンに対する耐性を付与し；（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補完し；又は（ｃ）複合培地若しくは規定培地からは利用不能の重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。特異的選択マーカーとして、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、及びテトラサイクリン耐性遺伝子がある。有利には、ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞及び真核生物宿主細胞の双方における選択に使用することができる。

他の選択遺伝子を使用して、発現されることになる遺伝子を増幅してもよい。増幅は、増殖又は細胞生存にとって重要なタンパク質の産生に必要とされる遺伝子が、継続する世代の組換え細胞の染色体内でタンデムに繰り返されるプロセスである。哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの例として、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子及びプロモータレスチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体を、当該形質転換体のみが唯一、ベクター中に存在する選択遺伝子によって生存するように適合されている選択圧下に置く。形質転換された細胞を、培地中の選択剤の濃度が連続的に増大する条件下で培養することによって選択圧が課されることによって、選択可能な遺伝子と、本明細書中に記載される多重特異性抗体構築体の１つ以上の構成要素等の別の遺伝子をコードするＤＮＡとの双方の増幅が導かれる。その結果、増幅されたＤＮＡから多量のポリペプチドが合成される。

リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、シャイン・ダルガーノ配列（原核生物）又はコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、典型的に、プロモータの３’側、及び発現されることになるポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。特定の実施形態において、１つ以上のコード領域が、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結されていてよく、これにより単一のＲＮＡ転写産物から２つのオープンリーディングフレームの翻訳が可能となる。

真核生物宿主細胞発現系においてグリコシル化が所望される等の場合には、グリコシル化又は収率を向上させるために、種々のプレ配列又はプロ配列を操作してもよい。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を改変してもよいし、プロ配列を付加してもよく、これらもグリコシル化に影響し得る。最終タンパク質産物は、－１位（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）に、発現に付随する１つ以上の追加のアミノ酸を有する場合があり、これは、完全には除去されていなくてもよい。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合した、ペプチダーゼ切断部位において見出される１つ又は２つのアミノ酸残基を有し得る。これ以外にも、幾つかの酵素切断部位を使用すると、酵素が成熟ポリペプチド内のそのような領域にて切断するならば、所望のポリペプチドの僅かに切断された形態が生じ得る。

本発明の発現ベクター及びクローニングベクターは、典型的に、宿主生物によって認識され、且つポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されたプロモータを含有する。本明細書中で使用される用語「作動可能に連結された」は、所与の遺伝子の転写及び／又は所望のタンパク質分子の合成を指示することができる核酸分子が生成されるように、２つ以上の核酸配列が連結されていることを指す。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結された」ベクター中の制御配列は、タンパク質コード配列の発現が制御配列の転写活性と適合する条件下で達成されるように、タンパク質コード配列にライゲートされている。より詳細には、プロモータ及び／又はエンハンサ配列（シス作用性転写制御エレメントのあらゆる組合せを含む）は、適切な宿主細胞又は他の発現系においてコード配列の転写を刺激又は調節するならば、コード配列に作動可能に連結されている。

プロモータは、構造遺伝子の開始コドンの上流（即ち５’側）に位置し（一般に、約１００～１０００ｂｐ以内）、構造遺伝子の転写を制御する非転写配列である。従来、プロモータは、２つのクラス：誘導性プロモータ及び構成的プロモータの１つにグループ化される。誘導性プロモータは、栄養素の有無、又は温度の変化等の培養条件の何らかの変化に応じて、その制御下で、ＤＮＡからの転写レベルの増大を開始する。一方、構成的プロモータは、それが作動可能に連結されている遺伝子を均一に、即ち遺伝子発現に対する制御をほとんど又は全く行わずに、転写する。種々の潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモータが周知である。供給源ＤＮＡから制限酵素消化によってプロモータを除去して、所望のプロモータ配列をベクター中に挿入することによって、適切なプロモータが、本発明の多重特異性抗体構築体の、例えば、重鎖、軽鎖、修飾された重鎖、又は他の構成要素をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。

酵母宿主に使用するのに適切なプロモータもまた、当該技術において周知である。有利には、酵母エンハンサが、酵母プロモータと共に使用される。哺乳動物宿主細胞と共に使用するのに適切なプロモータが周知であり、以下に限定されないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２型等）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから得られるものが挙げられる。他の適切な哺乳動物プロモータとして、異種哺乳動物プロモータ、例えば、熱ショックプロモータ及びアクチンプロモータが挙げられる。

注目され得る更なるプロモータとして、以下に限定されないが：ＳＶ４０初期プロモータ（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４－３１０）；ＣＭＶプロモータ（Ｔｈｏｒｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９－６６３）；ラウス肉腫ウイルスの３’側の長い末端反復内に含有されるプロモータ（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８０、Ｃｅｌｌ２２：７８７－７９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４－１４４５）；メタロチオニン遺伝子由来のプロモータ及び調節配列（Ｐｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９－４２）；並びにベータ－ラクタマーゼプロモータ等の原核生物プロモータ（Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７－３７３１）；又はｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１－２５）が挙げられる。また、注目されるのは、組織特異性を示し、且つトランスジェニック動物において利用されてきた以下の動物転写制御領域である：膵腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９－６４６；Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９－４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５－５１５）；膵ベータ細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５－１２２）；リンパ細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７－６５８；Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３－５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６－１４４４）；精巣、乳房、リンパ球、及び肥満細胞において活性であるマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５－４９５）；肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８－２７６）；肝臓において活性であるアルファ－フェト－タンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９－１６４８；Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：５３－５８）；肝臓において活性であるアルファ１－アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１－１７１）；骨髄細胞において活性であるベータ－グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８－３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９－９４）；脳内のオリゴデンドロサイト細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３－７１２）；骨格筋において活性であるミオシン軽鎖－２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３－２８６）；並びに視床下部において活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２－１３７８）。

エンハンサ配列がベクター中に挿入されて、多重特異性抗体構築体の構成要素（例えば、軽鎖、重鎖、修飾された重鎖、Ｆｄ断片）をコードするＤＮＡの転写が、高等真核生物によって増大し得る。エンハンサは、プロモータに作用して転写を増大させる、通常約１０～３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサは、方向及び位置に比較的依存せず、転写単位に対して５’側及び３’側の双方の位置にて見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能な幾つかのエンハンサ配列が知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ－フェト－タンパク質、及びインスリン）。しかしながら、典型的には、ウイルス由来のエンハンサが使用される。当該技術において知られているＳＶ４０エンハンサ、サイトメガロウイルス初期プロモータエンハンサ、ポリオーマエンハンサ、及びアデノウイルスエンハンサは、真核生物プロモータの活性化のための例示的な増強エレメントである。エンハンサは、ベクターにおいて、コード配列の５’側又は３’側のいずれに位置してもよいが、典型的には、プロモータから５’側の部位に位置決めされる。適切な天然又は異種性のシグナル配列（リーダー配列又はシグナルペプチド）をコードする配列を、発現ベクター中に組み込んで、抗体の細胞外分泌を促進することができる。シグナルペプチド又はリーダーの選択は、抗体が産生されることになる宿主細胞の型に依存し、異種性のシグナル配列が、天然のシグナル配列に取って代わることができる。シグナルペプチドの例が、先に記載されている。哺乳動物宿主細胞において機能する他のシグナルペプチドとして、米国特許第４，９６５，１９５号明細書に記載されるインターロイキン－７（ＩＬ－７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８に記載されるインターロイキン－２受容体のシグナル配列；欧州特許第０３６７ ５６６号明細書に記載されるインターロイキン－４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号明細書に記載されるＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチド；欧州特許第０ ４６０ ８４６号明細書に記載されるＩＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチドが挙げられる。

提供される発現ベクターは、市販のベクター等の出発ベクターから構築されてもよい。そのようなベクターは、所望のフランキング配列の全てを含有していてもしていなくてもよい。本明細書中に記載されるフランキング配列の１つ以上がベクター内に最初から存在していない場合、それらを個々に得てベクター中にライゲートしてもよい。フランキング配列の各々を得るために使用される方法が、当業者に周知である。発現ベクターを宿主細胞中に導入することによって、本明細書中に記載される核酸によってコードされる、融合タンパク質が挙げられるタンパク質を生成することができる。

特定の実施形態において、本発明の多重特異性抗体構築体の異なる構成要素をコードする核酸を、同じ発現ベクター中に挿入してもよい。例えば、第１の抗標的抗原軽鎖をコードする核酸は、第１の抗標的抗原重鎖をコードする核酸と同じベクター中にクローニングすることができる。そのような実施形態において、軽鎖及び重鎖が、同じｍＲＮＡ転写産物から発現されるように、単一のプロモータの制御下で、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって２つの核酸が分離されていてもよい。これ以外にも、２つの核酸は、軽鎖及び重鎖が、２つの別個のｍＲＮＡ転写産物から発現されるように、２つの別個のプロモータの制御下にあってもよい。一部の実施形態において、第１の抗標的抗原軽鎖及び重鎖をコードする核酸が、１つの発現ベクター中にクローニングされて、第２の抗標的抗原軽鎖及び重鎖をコードする核酸が、第２の発現ベクター中にクローニングされている。

ベクターが構築されて、本明細書中に記載される多重特異性抗体構築体の構成要素をコードする１つ以上の核酸分子が、ベクターの適当な部位中に挿入された後に、完成したベクターは、増幅及び／又はポリペプチド発現に適切な宿主細胞中に挿入されてもよい。ゆえに、本発明は、二重特異性抗原結合タンパク質の構成要素をコードする１つ以上の発現ベクターを含む単離宿主細胞を包含する。本明細書中で使用される用語「宿主細胞」は、核酸で形質転換されているか、又は形質転換されることが可能であり、これによって注目の遺伝子を発現する細胞を指す。当該用語には、注目する遺伝子が存在する限り、元の親細胞と形態又は遺伝的構造が同一であるか否かに拘わらず、親細胞の後代が含まれる。少なくとも１つの発現制御配列（例えば、プロモータ又はエンハンサ）に作動可能に連結された一実施形態において、本発明の単離核酸を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」である。

抗原結合タンパク質の発現ベクターの、選択された宿主細胞中への形質転換は、形質移入、感染、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介形質移入、又は他の既知の技術が挙げられる周知の方法によって達成することができる。選択される方法は、ある程度、使用されることになる宿主細胞の型に応じることになる。こうした方法及び他の適切な方法は、当業者に周知であり、例えば、前掲のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１に示されている。

宿主細胞は、適切な条件下で培養されると、抗原結合タンパク質を合成し、抗原結合タンパク質はその後、（これを宿主細胞が培地中に分泌するならば）培養培地から、又は（分泌されなければ）産生宿主細胞から直接的に収集することができる。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に所望されるか、又は必要であるポリペプチド修飾（グリコシル化又はリン酸化等）、及び生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さ等の種々の要因に依存することになる。

例示的な宿主細胞として、原核生物細胞、酵母細胞、又は高等真核生物細胞が挙げられる。原核生物の宿主細胞として、グラム陰性生物又はグラム陽性生物等の真正細菌、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えば、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、例えばネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、例えばセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、及びシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、並びにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、並びにストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられる。真核生物の微生物、例えば糸状菌又は酵母が、組換えポリペプチドに適切なクローニング宿主又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又は一般的なパン酵母が、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。しかしながら、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、例えばＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、トリコデルマ・レーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、例えばシュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、並びに糸状菌、例えば、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）属、並びにアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属宿主、例えば、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）等の幾つかの他の属、種、及び株が、本明細書中で一般に利用可能であり、且つ有用である。

グリコシル化された抗原結合タンパク質の発現のための宿主細胞は、多細胞生物由来とすることができる。無脊椎動物細胞の例として、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。幾つかのバキュロウイルスの株及び変異体、並びにツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）等の宿主由来の、対応する昆虫の許容宿主細胞が同定されている。そのような細胞の形質移入のための種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ－１変異体、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ－５株が公に入手可能である。

脊椎動物宿主細胞もまた適切な宿主であり、そのような細胞からの抗原結合タンパク質の組換え生成は常法となっている。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術において周知であり、以下に限定されないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株、例えば、以下に限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えば、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６，１９８０）；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３細胞又は懸濁培養での増殖用にサブクローニングされた２９３細胞、（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１，１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８，１９８２）；ＭＲＣ ５細胞又はＦＳ４細胞；哺乳動物骨髄腫細胞、及び幾つかの他の細胞株が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の多重特異性抗体構築体をどの細胞株が高レベルで発現して恒常的に産生するかを判定することによって、細胞株を選択してよい。別の実施形態において、それ自体の抗体は作製しないが、異種性抗体を作製且つ分泌する能力を有するＢ細胞系統由来の細胞株を選択することができる。一部の実施形態において、ＣＨＯ細胞が、本発明の多重特異性抗体構築体を発現するための宿主細胞である。

多重特異性抗体構築体の生成のための宿主細胞は、上記の核酸又はベクターで形質転換又は形質移入されて、プロモータの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変された従来の栄養培地中で培養される。加えて、選択マーカーによって分離された転写単位の複数のコピーを有する新規なベクター及び形質移入された細胞株が、抗原結合タンパク質の発現に特に有用である。ゆえに、本発明はまた、本明細書中に記載される二重特異性抗原結合タンパク質を調製する方法であって、本明細書中に記載される１つ以上の発現ベクターを含む宿主細胞を、当該１つ以上の発現ベクターによってコードされる二重特異性抗原結合タンパク質の発現を可能にする条件下の培養培地中で培養することと、培養培地から二重特異性抗原結合タンパク質を回収することとを含む方法も提供する。

本発明の抗原結合タンパク質を生成するのに使用される宿主細胞は、種々の培地中で培養することができる。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）等の市販の培地が、宿主細胞を培養するのに適している。また、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４，１９７９；Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５，１９８０；米国特許第４，７６７，７０４号明細書；米国特許第４，６５７，８６６号明細書；米国特許第４，９２７，７６２号明細書；米国特許第４，５６０，６５５号明細書；若しくは米国特許第５，１２２，４６９号明細書；国際公開第９０１０３４３０号パンフレット；国際公開第８７／００１９５号パンフレット；又は米国再発行特許第３０，９８５号明細書に記載されているいずれの培地も、宿主細胞の培養培地として使用することができる。これらの培地はいずれも、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、又は上皮増殖因子等）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩等）、バッファ（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジン等）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）薬物等）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度にて存在する無機化合物として定義される）、並びにグルコース又は等価のエネルギー源を補充することができる。他に必要なあらゆる栄養補助物質もまた、当業者に知られている適切な濃度にて含めてもよい。温度及びｐＨ等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。

宿主細胞を培養すると、二重特異性抗原結合タンパク質が、細胞内、細胞膜周辺腔内で産生され得、又は培地中に直接分泌され得る。抗原結合タンパク質が細胞内で産生されれば、第１のステップとして、粒状の破片である宿主細胞又は溶解した断片を、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去する。二重特異性抗原結合タンパク質は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、陽イオン又は陰イオン交換クロマトグラフィ、或いは親和性リガンドとして注目する抗原又はプロテインＡ若しくはプロテインＧを使用するアフィニティクロマトグラフィを使用して精製することができる。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づくポリペプチドを含むタンパク質を精製するのに使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１３，１９８３）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５，１９８６）。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定なマトリックスは、アガロースを使用して達成され得るよりも流速を速くし、且つ処理時間を短くすることが可能である。タンパク質がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。回収されるべき特定の二重特異性抗原結合タンパク質に応じて、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿等のタンパク質精製のための他の技術もまた可能である。

シス作用機序及びトランス作用機構の双方で広く使用され得る二重特異性の新規のフォーマットの合理的設計を、同じ標的受容体分子内の２つの異なるドメインに結合する２つのＦａｂとの三元複合体の結晶構造の決定により行った。これにより、それらの２つの分子を連結して、単一細胞内での組換え発現時に単一分子にするリンカーを概念化するための鋳型を提供した（図１）。これらの２つの弾頭（ｗａｒｈｅａｄ）を連結するこのリンカーの使用は、特定の治療的プロジェクトの特定の必要に合わせて調整することができる特定の結合モードを実施するのに重要である。

ｓｃＦｖモジュールをＦａｂに結合するために、複数の反復を有する３つのフレキシブルＧ４リンカー、及び長さが異なる２つの半固定（ｓｅｍｉ－ｒｉｇｉｄ）ヘリカルリンカー（図２）を操作した。分子の半減期を延長するために、Ｆａｂ ＣＨ１ドメイン（図２及び図３）のＣ末端にＦＣ領域を挿入して、３つのポリペプチド鎖を有する分子を生じさせた。

これ以外にも、同様に、ｓｃＦｖを、Ｆａｂ内の軽鎖のＮ末端に連結させることもできる。これにより、必要とされる結合モードの特定の必要を満たす分子設計が可能となり、そしてまた、分子を含むポリペプチド鎖の長さのバランスをとることができる（図３）。

分子を、ＨＥＫ ２９３ ６Ｅ細胞内で発現させて、ＰｒｏＡについて精製した。総収量は約７５ｍｇ／Ｌであった（図６）。

続いて、分子を、双方の弾頭からの同じ受容体への結合を厳密に実施する結合アッセイについて試験した。ＦＧ１１は、設計目標を満たし、２つの異なる受容体分子内のエピトープを認識しなかった／に結合しなかった（図７）。

これらの二重特異性分子が、細胞の表面上の標的に結合しながらも機能的であることを確認するために、ヒト標的タンパク質を発現する細胞ベースのアッセイを実行した。この場合、全ての二重特異性分子が結合を示した（図８）。

本明細書において考察し、且つ引用してきた全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それらの全体が参照により本明細書により組み込まれる。開示した本発明は、記載される特定の方法論、プロトコル、及び材料に限定されず、これらは変化し得ることが理解される。また、本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲を限定することは意図されないことも理解される。

当業者であれば、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、単なる日常的な実験を使用して認識するか、又は確認可能であろう。そのような等価物は、続く特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

Claims (31)

1. ａ）第１のヒンジ領域、第１のＣＨ２領域、及び第１のＣＨ３領域を含む抗体Ｆｃ領域を含む第１のポリペプチドと；
   ｂ）抗体重鎖構築体を含む第２のポリペプチドであって、前記抗体重鎖構築体は、
   ｉ）ｓｃＦｖであって
   １）第１のＶＨ及び第１のＶＬであって、結合して第１の抗原結合ドメインを形成している、第１のＶＨ及び第１のＶＬと、
   ２）前記第１のＶＨ及び前記第１のＶＬを連結している第１のリンカーペプチド；
   を含むｓｃＦｖと、
   ｉｉ）抗体重鎖であって、第２のＶＨ、第２のＣＨ１領域、第２のヒンジ領域、第２のＣＨ２領域、及び第２のＣＨ３領域を含む抗体重鎖と；
   を含み、
   前記ｓｃＦｖは、そのＣ末端にて、前記抗体重鎖の前記第２のＶＨ領域のＮ末端に結合されている、第２のポリペプチドと；
   ｃ）第２のＶＬ及びＣＬを含む抗体軽鎖を含む第３のポリペプチドと
   を含み、
   前記抗体重鎖の前記第２のＶＨ及び前記抗体軽鎖の前記第２のＶＬは結合して、第２の抗原結合ドメインを形成している、多重特異性抗体構築体。
2. 前記ｓｃＦｖは、第２のリンカーを介して前記抗体重鎖に結合されている、請求項１に記載の多重特異性抗体構築体。
3. 前記第２のリンカーは、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_２（配列番号１）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２（配列番号２）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３（配列番号３）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号４）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_４（配列番号５）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４（配列番号６）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_５（配列番号７）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_５（配列番号８）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_６（配列番号９）、及び（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_６（配列番号１０）からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の多重特異性抗体構築体。
4. 前記第１のリンカーは、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_２（配列番号１）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２（配列番号２）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３（配列番号３）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号４）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_４（配列番号５）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４（配列番号６）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_５（配列番号７）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_５（配列番号８）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_６（配列番号９）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_６（配列番号１０）、ＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＧＳ（配列番号１１）、ＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＫＫＤＡＧＳ（配列番号１２）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_２（配列番号１３）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_２（配列番号１４）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_３（配列番号１５）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_３（配列番号１６）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_４（配列番号１７）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_４（配列番号１８）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_５（配列番号１９）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_５（配列番号２０）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_６（配列番号２１）、及び（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_６（配列番号２２）からなる群から選択される配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体構築体。
5. 前記ｓｃＦｖは、そのＣ末端にて、前記第１のリンカーのＮ末端に結合されている前記第１のＶＨを含み、前記第１のリンカーは、そのＣ末端にて、前記第１のＶＬのＮ末端に結合されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体構築体。
6. 前記ｓｃＦｖは、そのＣ末端にて、前記第１のリンカーのＮ末端に結合されている前記第１のＶＬを含み、前記第１のリンカーは、そのＣ末端にて、前記第１のＶＨのＮ末端に結合されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体構築体。
7. 前記第１の抗原結合ドメイン及び前記第２の抗原結合ドメインは、異なるポリペプチド上のエピトープに結合する、請求項１～６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体構築体。
8. 前記第１の抗原結合ドメイン及び前記第２の抗原結合ドメインは、同じポリペプチド上の異なるエピトープに結合する、請求項１～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体構築体。
9. 二重パラトピック抗体構築体である、請求項８に記載の多重特異性抗体構築体。
10. 前記Ｆｃ領域は、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、及びＣＨ３領域からなる、請求項１～９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体構築体。
11. 前記Ｆｃ領域のＮ末端は、そのＮ末端を介して、第３のリンカーを介して前記重鎖のＣ末端に連結されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体構築体。
12. 前記第３のリンカーは、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_２（配列番号１）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２（配列番号２）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３（配列番号３）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号４）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_４（配列番号５）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４（配列番号６）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_５（配列番号７）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_５（配列番号８）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_６（配列番号９）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_６（配列番号１０）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_２（配列番号１３）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_２（配列番号１４）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_３（配列番号１５）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_３（配列番号１６）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_４（配列番号１７）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_４（配列番号１８）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_５（配列番号１９）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_５（配列番号２０）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_６（配列番号２１）、及び（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_６（配列番号２２）からなる群から選択される配列を含む、請求項１１に記載の多重特異性抗体構築体。
13. 前記第１のポリペプチドは、前記抗体Ｆｃ領域からなる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体構築体。
14. ａ）第１のヒンジ領域、第１のＣＨ２領域、及び第１のＣＨ３領域を含む抗体Ｆｃ領域を含む第１のポリペプチドと；
    ｂ）抗体軽鎖構築体を含む第２のポリペプチドであって、前記抗体軽鎖構築体は、
    ｉ）ｓｃＦｖであって
    １）第１のＶＨ及び第１のＶＬであって、結合して第１の抗原結合ドメインを形成している、第１のＶＨ及び第１のＶＬと、
    ２）前記第１のＶＨ及び前記第１のＶＬを連結している第１のリンカーペプチドと；
    を含むｓｃＦｖと、
    ｉｉ）第２のＶＬ及びＣＬを含む抗体軽鎖と；
    を含み、
    前記ｓｃＦｖは、そのＣ末端にて、前記抗体軽鎖の前記第２のＶＬ領域のＮ末端に結合されている、第２のポリペプチドと；
    ｃ）第２のＶＨ、第２のＣＨ１領域、第２のヒンジ領域、第２のＣＨ２領域、及び第２のＣＨ３領域を含む抗体重鎖を含む第３のポリペプチドと
    を含み、
    前記抗体重鎖の前記第２のＶＨ及び前記抗体軽鎖の前記第２のＶＬは結合して、第２の抗原結合ドメインを形成している、多重特異性抗体構築体。
15. 前記ｓｃＦｖは、第２のリンカーを介して前記抗体軽鎖に結合されている、請求項１４に記載の多重特異性抗体構築体。
16. 前記第２のリンカーは、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_２（配列番号１）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２（配列番号２）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３（配列番号３）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号４）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_４（配列番号５）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４（配列番号６）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_５（配列番号７）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_５（配列番号８）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_６（配列番号９）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_６（配列番号１０）、ＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＧＳ（配列番号１１）、ＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＫＫＤＡＧＳ（配列番号１２）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_２（配列番号１３）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_２（配列番号１４）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_３（配列番号１５）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_３（配列番号１６）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_４（配列番号１７）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_４（配列番号１８）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_５（配列番号１９）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_５（配列番号２０）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_６（配列番号２１）、及び（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_６（配列番号２２）からなる群から選択される配列を含む、請求項１５に記載の多重特異性抗体構築体。
17. 前記第１のリンカーは、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_２（配列番号１）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２（配列番号２）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３（配列番号３）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号４）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_４（配列番号５）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４（配列番号６）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_５（配列番号７）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_５（配列番号８）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_６（配列番号９）、及び（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_６（配列番号１０）からなる群から選択される配列を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体構築体。
18. 前記ｓｃＦｖは、そのＣ末端にて、前記第１のリンカーのＮ末端に結合されている前記第１のＶＨを含み、前記第１のリンカーは、そのＣ末端にて、前記第１のＶＬのＮ末端に結合されている、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体構築体。
19. 前記ｓｃＦｖは、そのＣ末端にて、前記第１のリンカーのＮ末端に結合されている前記第１のＶＬを含み、前記第１のリンカーは、そのＣ末端にて、前記第１のＶＨのＮ末端に結合されている、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体構築体。
20. 前記第１の抗原結合ドメイン及び前記第２の抗原結合ドメインは、異なるポリペプチド上のエピトープに結合する、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体構築体。
21. 前記第１の抗原結合ドメイン及び前記第２の抗原結合ドメインは、同じポリペプチド上の異なるエピトープに結合する、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体構築体。
22. 二重パラトピック抗体構築体である、請求項２１に記載の多重特異性抗体構築体。
23. 前記Ｆｃ領域は、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、及びＣＨ３領域からなる、請求項１４～２２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体構築体。
24. 前記Ｆｃ領域のＮ末端は、そのＮ末端を介して、第３のリンカーを介して前記重鎖のＣ末端に連結されている、請求項１４～２３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体構築体。
25. 前記第３のリンカーは、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_２（配列番号１）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２（配列番号２）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３（配列番号３）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号４）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_４（配列番号５）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４（配列番号６）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_５（配列番号７）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_５（配列番号８）、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_６（配列番号９）、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_６（配列番号１０）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_２（配列番号１３）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_２（配列番号１４）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_３（配列番号１５）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_３（配列番号１６）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_４（配列番号１７）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_４（配列番号１８）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_５（配列番号１９）、（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_５（配列番号２０）、（Ｇｌｙ_３Ｇｌｎ）_６（配列番号２１）、及び（Ｇｌｙ_４Ｇｌｎ）_６（配列番号２２）からなる群から選択される配列を含む、請求項２４に記載の多重特異性抗体構築体。
26. 前記第１のポリペプチドは、前記抗体Ｆｃ領域からなる、請求項１４～２３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体構築体。
27. 前記多重特異性抗体構築体は、二重特異性抗体構築体である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体構築体。
28. 一方のＣＨ３ドメインが、Ｆ４０５Ｌ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｄ、Ｆ４０５Ｅ、Ｆ４０５Ｈ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｋ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｎ、Ｆ４０５Ｑ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｖ、Ｆ４０５Ｗ、又はＦ４０５Ｙの変異を含み、他方のＣＨ３ドメインが、Ｋ４０９Ｒ変異を含み、アミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、請求項１～２７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体構築体。
29. 一方のＣＨ３ドメインが、Ｔ３６６Ｗ変異を含み、他方のＣＨ３ドメインが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの変異を含み、アミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、請求項１～２８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体構築体。
30. 一方のＣＨ３ドメインが、Ｋ／Ｒ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄの変異を含み、他方のＣＨ３ドメインが、Ｄ３９９Ｋ変異を含み、アミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、請求項１～２８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体構築体。
31. Ｄ３９９Ｋ変異を含むＣＨ３ドメインは、Ｅ３５６Ｋ変異をも含み、アミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔに記載されているＥＵインデックスに従う、請求項３０に記載の多重特異性抗体構築体。

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