CN111328335A - 基于突变igg六聚体的治疗性抗体 - Google Patents

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CN111328335A CN201880050867.4A CN201880050867A CN111328335A CN 111328335 A CN111328335 A CN 111328335A CN 201880050867 A CN201880050867 A CN 201880050867A CN 111328335 A CN111328335 A CN 111328335A
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L.S.哈洛夫
A.哈加曼
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Abstract

本发明涉及抗体的配制剂。本发明尤其涉及包含IgG1同种型的抗体分子的药物组合物，所述IgG1同种型的抗体分子在Fc区中具有在细胞表面抗原结合后增强IgG分子的聚簇的突变。

Description

基于突变IGG六聚体的治疗性抗体
发明领域
本发明涉及包含IgG同种型的抗体的药物组合物，所述IgG同种型的抗体在Fc区中具有在细胞表面抗原结合后增强IgG抗体的六聚化的突变。本发明还涉及用于制备本发明的药物组合物的方法以及此类组合物的用途。
发明背景
IgG抗体在结合其靶抗原后可以在细胞表面上组织成有序六聚体。这些六聚体结合补体C1的第一组分，诱导补体依赖性靶细胞杀伤。已鉴定出增强针对来自血液学和实体瘤适应症的细胞上一系列靶标的IgG抗体的六聚体形成和补体激活的突变(de Jong等2016PLoS Biol 14(1):e1002344，WO2013/004842，WO2014/108198)。IgG主链，例如在Fc区中特定位置处具有突变的IgG1表达强大的诱导细胞系和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者肿瘤细胞的条件性补体依赖性细胞毒性(CDC)，而保留正常的药代动力学和生物药物可开发性的能力。突变有效力地增强了对补体激活无效的II型CD20抗体的CDC依赖性和抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)，而保留了其诱导凋亡的能力(de Jong，同上)。
DR5，也称为死亡受体5、肿瘤坏死因子受体超家族成员10B、TNFRSF10B、TNF相关凋亡诱导配体受体2、TRAIL受体2、TRAIL-R2和CD262，是TNF受体超家族的细胞表面受体，其结合肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)并介导凋亡。DR5是具有三个细胞外富含半胱氨酸的域(CRD)、跨膜域(TM)和含有死亡域(DD)的胞质域的单通I型膜蛋白。在不存在配体的情况下，DR5作为单体或通过第一富含半胱氨酸的域相互作用作为两个或三个受体的预组装复合物(也称为配体组装前域(PLAD))存在于细胞膜中(Wassenaar等,Proteins.2008Feb 1；70(2):333-43；Valley等,J Biol Chem.2012 Jun 15；287(25):21265-78；Sessler等,Pharmacol Ther.2013 Nov；140(2):186-99)。与DR5胞外域复合的TRAIL的晶体结构显示，TRAIL在含有三聚体受体和三聚体配体的复合物中与DR5的细胞外域中的CRD2和CRD3结合(Hymowitz等,Mol Cell.1999 Oct；4(4):563-71)。DR5三聚体可以进一步在脂质宏域(macrodomain)(所谓的脂筏)中聚簇成更高阶的受体聚集体(Sessler等,PharmacolTher.2013 Nov；140(2):186-99)。在配体结合的构象中，含细胞质死亡域的衔接物蛋白FADD与寡聚化DR5分子的细胞内DD表面缔合，并接合起始物胱天蛋白酶，胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-10，以形成死亡诱导信号传递复合体(DISC)。
基于癌细胞对TRAIL介导的凋亡的敏感性，开发了许多试剂来激活该途径以选择性地诱导癌细胞中的凋亡。人重组TRAIL(hrTRAIL)正开发为度拉纳明(dulanermin)，并且一系列常规(单特异性，二价)抗DR5抗体已得以开发并在临床进行了测试(综述于Ashkenazi等,Nat Rev Drug Discov.2008 Dec；7(12):1001-12；Trivedi等,FrontOncol.2015 Apr 2；5:69)：DR5抗体包括乐萨妥木单抗(lexatumumab)(HGS-ETR2)、HGS-TR2J、考那妥木单抗(conatumumab)(AMG655)、替加妥珠单抗(tigatuzumab)(CS-1008)、卓齐妥单抗(drozitumab)(Apomab)和LBY-135。用这些化合物进行的临床研究表明，DR5抗体通常具有良好的耐受性，但未能显示出令人信服的显著的临床益处。增强DR5靶向抗体的功效的努力主要集中在(i)通过组合治疗提高癌细胞对DR5激动剂的敏感性，(ii)开发生物标志物用于进行更好的患者分层，和(iii)开发更有效地激活DR5信号传导和诱导凋亡的DR5靶向剂(综述于Lim等,Expert Opin Ther Targets.2015 May 25:1-15；Twomey等,DrugResist Updat.2015 Mar；19:13-21；Reddy等,PLoS One.2015 Sep 17；10(9))。增加DR5激活的不同治疗形式已得以描述且包括合成DR5结合肽的寡聚化、DR5特异性支架的线性融合、rhTRAIL或考那妥木单抗的基于纳米颗粒的递送系统以及基于多价DR5抗体的形式(综述于Holland等、Cytokine Growth Factor Rev.2014Apr；25(2):185-93)。APG880及衍生物存在与人IgG Fc部分融合的两个单链TRAIL受体结合(scTRAIL-RBD)分子(TRAIL模拟物)。每个scTRAIL-RBD具有三个受体结合位点，导致融合蛋白中的六价结合模式(WO 2010/003766 A2)。已经描述了原型scTRAIL-RBD(APG350)在体内诱导不依赖FcγR的抗肿瘤功效(Gieffers等,Mol Cancer Ther,2013.12(12):p.2735-47)。通过融合抗DR5 scFv片段、人血清白蛋白残基和人p53的四聚化域组装而成的四价抗DR5抗体片段衍生的构建体显示比单价构建体更有效力地诱导凋亡(Liu等,Biomed Pharmacother.2015 Mar；70:41-5)。纳米抗体(nanobody)分子是衍生自仅重链的骆驼科抗体的单域抗体片段(VHH)，其类似于scFv，可以经连接以形成多价分子。临床前的体外研究表明，四价抗DR5
Figure BDA0002379913990000031
分子TAS266比TRAIL或交联的DR5抗体LBY-135更有效力，这归因于更快速的胱天蛋白酶激活动力学(Huet等,MAbs.2014；6(6):1560-70)。TAS266在体内也比LBY-135的亲本鼠mAb更有效力。MultYbodyTM分子(MultYmab technology)基于同源多聚化肽与IgG异源二聚体中的一条重链的Fc的融合(突出进入孔(knob into hole))，使MultYbody分子在溶液中本质上是多价的。已显示抗DR5MultYbody在体外诱导有效力的杀伤。双亲和重靶向(DART)分子是基于共价连接的Fv的双价抗体(diabody)。包含针对单个(单表位DART)或两个DR5表位(双表位DART)的四价的DR5靶向性四价Fc DART显示在体外和体内诱导细胞毒性方面比TRAIL和考那妥木单抗变体更有效力(Li等,AACR Annual Meeting Apr 20 2015,Poster abstract#2464)。或者，可以由双特异性DR5xFAP抗体(RG7386)通过与癌细胞上的DR5和肿瘤微环境中成纤维细胞上表达的成纤维细胞活化蛋白(FAP)同时结合介导不依赖FcγR的亲合力驱动的DR5超聚簇(Friess等,AACR Annual Meeting Apr 19 2015,Presentation abstract#952；Wartha等,Proceedings of the 105th Annual Meeting of the AmericanAssociation for Cancer Research；2014 Apr 5-9；San Diego、CA.Philadelphia(PA):AACR；Cancer Res 2014；74(19Suppl):Abstract nr 4573.doi:10.1158/1538-7445.AM2014-4573)。最后，与识别重叠或相似表位的两种抗DR5抗体的组合相比，识别不同表位的两种抗DR5抗体的特定组合在体内和体外显示出增强的激动性功效(WO2014/009358)。
在临床前研究中，上述方法与常规抗DR5抗体相比显示出增强的功效，但是临床数据表明仍然存在改善DR5激动剂的需要。此外，期望基于抗体的形式保留常规IgG的药代动力学(PK)以及其他Fc介导的效应器功能，而基于抗体片段的构建体通常不是这种情况。
PCT/EP2016/079518(通过引用并入本文)提供了包含人IgG的Fc区和与DR5结合的抗原结合区的抗DR5抗体，其中Fc区包含对应于位置E430、E345或S440的氨基酸位置处的突变。发现在抗DR5抗体的Fc区中引入促进在细胞表面抗原结合时的抗体六聚化和不依赖于次级交联的抗原的条件性聚簇的特定点突变导致DR5激活并且显著增强了抗体诱导凋亡和细胞死亡的效力。
需要提供PCT/EP2016/079518中所述的抗体的稳定配制剂，更普遍的是由于对应于根据EU编号的人IgG1中位置E430、E345或S440的氨基酸位置处的突变而更易于六聚化的抗体的稳定配制剂，条件是S440中的突变是S440Y或S440W。
发明概述
出乎意料的是，本发明的发明人发现了提供变体抗体的稳定配制剂的组合物，所述变体抗体由于对应于人IgG1中位置E430、E345或S440的氨基酸位置处的突变而更易于六聚化，条件是S440中的突变是S440Y或S440W。发现两种在其CDR域中具有完全不同序列的此类抗体在本发明的组合物中都是稳定的。
在第一主要方面，本发明涉及药物组合物，其包含
a.抗体，其包含人免疫球蛋白G的Fc区和抗原结合区，其中Fc区包含对应于EU编号的人IgG1中E430、E345或S440的位置处的氨基酸的突变，
b.组氨酸缓冲液，和
c.氯化钠
其中组合物的pH在5.5和7.4之间。
在本发明的一个实施方案中，第一和第二Fc区包含对应于EU编号的人IgG1中S440的位置处的氨基酸的突变，条件是S440中的突变是S440Y或S440W。
发现此类配制剂在应激条件(如加热、冻融循环和搅拌)下提供优异的抗体溶解性和稳定性。观察到最小的大分子聚集体或其他杂质如降解产物的形成。
在进一步的方面，本发明涉及用作药物的本发明的药物组合物，涉及本发明的药物组合物在制备药物中的用途，以及涉及治疗个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本发明的药物组合物。
在更进一步的方面，本发明涉及包含两种或更多种本发明的药物组合物的试剂盒，并且涉及用于制备本发明的药物组合物的方法，所述方法包括将各自包含不同抗体的两种本发明的药物组合物混合的步骤。
在本发明的药物组合物的一个优选的实施方案中，抗体包含与人DR5结合的抗原结合区，优选其中抗原结合区包含包括具有以下氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3域的可变重链(VH)区和包括具有以下氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3域的可变轻链(VL)区：
a)(VH)SEQ ID NO:1、2、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6；
b)(VH)SEQ ID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6；
c)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14；
d)(VH)SEQ ID NO:16、17、18和(VL)SEQ ID NO:21、GAS、22或
e)如以上a)至d)的任一项中所定义的(VH)CDR1、CDR2、CDR3以及(VL)CDR1、CDR2和CDR3，其在所述六个CDR序列中总共具有一至五个突变或取代。
发现此类与DR5结合并且包含对应于(根据EU编号的)人IgG1的位置E430、E345或S440的Fc区中增强六聚体的突变(条件是S440中的突变是S440Y或S440W)的抗体，与不具有上述位置之一的突变的结合DR5的抗体相比在诱导表达DR5的肿瘤细胞中的凋亡方面是优越的。
在一个进一步优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含至少两种抗体，其包含第一抗体和第二抗体，其中
·所述第一抗体包含以下六个CDR序列：(VH)SEQ ID NO:1、2、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6，并且所述第二抗体包含以下六个CDR序列，(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ IDNO:13、RTS、14，或者
·所述第一抗体包含以下六个CDR序列：(VH)SEQ ID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6，并且所述第二抗体包含以下六个CDR序列，(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ IDNO:13、RTS、14。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物包含至少两种抗体，其包含第一抗体和第二抗体，其中所述第一抗体包含以下六个CDR序列：(VH)SEQ ID NO:1、2、3和(VL)SEQ IDNO:5、FAS、6，并且所述第二抗体包含以下六个CDR序列，(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQID NO:13、RTS、14。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物包含至少两种抗体，其包含第一抗体和第二抗体，其中所述第一抗体包含以下六个CDR序列：(VH)SEQ ID NO:1、8、3和(VL)SEQ IDNO:5、FAS、6，并且所述第二抗体包含以下六个CDR序列，(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQID NO:13、RTS、14。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物包含第一抗体，其中所述第一抗体包含以下六个CDR序列：(VH)SEQ ID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物包含第二抗体，其中所述第二抗体包含以下六个CDR序列，(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14。
在体外和体内研究中，发现此类包含两种结合DR5上不同表位的抗DR5抗体的组合物优于包含不具有突变的相同的抗DR5抗体的组合物。也就是说，与包含两种在Fc区中不具有突变的DR5抗体的组合物相比，具有本发明的两种抗体的组合物在诱导表达DR5的肿瘤细胞的凋亡和/或抑制其细胞生长方面是优越的。
附图简述
图1显示四种不同的人IgG1 Fc同种异型的氨基酸比对。IgG1m(f)、IgG1m(z)、IgG1m(a)、IgG1m(x)的Fc序列分别在SEQ ID:29、30、31和32中指定。
图2显示如通过流式细胞术在FACS上测量的人源化(hDR5)和嵌合(DR5)抗DR5抗体与DR5阳性HCT 116人结肠癌细胞的结合。抗gp120抗体IgG1-b12用作阴性对照。结合表示为MFI(平均荧光强度)。误差条表示标准偏差。
图3显示具有和不具有六聚化增强突变E430G或E345K的抗DR5抗体与DR5阳性COLO205细胞的结合。在FACS上通过流式细胞术分析来测试人-小鼠嵌合抗体的变体IgG1-DR5-01-K409R(A)、IgG1-DR5-05-F405L(B)和双特异性抗体IgG1-DR5-01-K409R x IgG1-DR5-05-F405L(BsAb IgG1-DR5-01-K409R x DR5-05-F405L)(C)与COLO 205细胞的结合。结合表示为荧光强度的几何平均值。抗gp120抗体IgG1-b12用作阴性对照。误差条表示标准偏差。
图4显示抗DR5抗体与人和猕猴DR5的结合。在FACS上以流式细胞术分析来测试人-小鼠嵌合抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G与(A)经模拟品转染的CHO细胞，(B)经人DR5转染的CHO细胞和(C)经猕猴DR5转染的CHO细胞的结合。结合表示为荧光强度的几何平均值。误差条表示标准偏差。
图5显示(A)使用EMBOSS Matcher(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_matcher/)对人DR5和小鼠DR5的细胞外域的一部分进行序列比对；(.)类似的氨基酸；(:)相同的氨基酸。(B)经域交换的(domain-swapped)DR5细胞外域的图形表示(白色：人DR5序列；黑色：小鼠DR5序列)。氨基酸数字是指人序列，并且域交换基于图A中所示的比对进行。(C)如通过流式细胞术所评价的IgG1-hDR5-01-F405L和同种型对照抗体IgG1-b12与一组人-小鼠嵌合DR5分子的结合。在每个经域交换的DR5分子中，特定的人氨基酸已由小鼠序列替换，如x轴上所示。误差条表示二重样品的标准偏差。(D)如通过流式细胞术所评价的IgG1-hDR5-05-F405L与一组人-小鼠嵌合DR5分子的结合。在每个经域交换的DR5分子中，特定的人氨基酸已由小鼠序列替换，如x轴上所示。IgG1-b12作为同种型对照抗体包括在内。误差条表示二重样品的标准偏差。
图6显示具有DR5-01和DR5-05抗体的交叉阻断ELISA。图表示如通过ELISA所测量的在存在竞争抗体IgG1-hDR5-01-E430G或IgG1-hDR5-05-E430G的情况下对包被的IgG1-hDR5-01-E430G(A)或IgG1-hDR5-05-E430G(B)与可溶性DR5ECD-FcHisCtag的结合的抑制。抗gp120抗体IgG1-b12(b12)用作阴性对照。DR5-01是IgG1-hDR5-01-E430G；DR5-05是IgG1-hDR5-05-E430G。
图7显示具有DR5-01和DR5-05抗体的变体的存活力测定。E430G六聚化增强突变的引入导致通过单独使用的单一人-小鼠嵌合抗体IgG1-DR5-01-K409R和IgG1-DR5-05-F405L以及通过其组合对DR5阳性COLO 205(A)和HCT 116(B)结肠癌细胞的杀伤的诱导增强。误差条表示标准偏差。
图8显示(A)在IgG1-chTRA8-F405L分别和IgG1-DR5-01-K409R或IgG1-DR5-05-F405L之间的交叉阻断ELISA。如3天存活力测定法中所确定的，将两种非交叉阻断抗DR5抗体IgG1-chTRA8-F405L-E430G和IgG1-DR5-01-K409R-E430G组合(B)导致对HCT 116结肠癌细胞的杀伤的诱导增强(EC50降低)，而将两种交叉阻断抗体IgG1-chTRA8-F405L-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G组合(C)则不会。误差条表示标准偏差。
图9显示引入六聚化增强突变导致通过非交叉阻断抗体IgG1-DR5-05-F405L-E345K+IgG1-CONA-K409R-E430G和BsAb IgG1-DR5-05-F405L-E345K x CONA-K409R-E430G的组合对HCT 116结肠癌细胞的杀伤的诱导增强。(A)用IgG1-CONA-K409R和IgG1-DR5-05-F405L的交叉阻断ELISA。(B)3天存活力测定法。误差条表示标准偏差。RLU：相对发光单位。
图10显示如3天存活力测定法中所确定的，IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合降低了一大组不同的人癌细胞系的存活力。图显示来自二重样品的平均值+/-标准偏差。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001(单向ANOVA与Tukey多重比较检验)。
图11显示如在对BxPC-3和PANC-1胰腺癌细胞系进行的存活力测定法中所测量的，人源化IgG1-hDR5-01-K409R-E430G+IgG1-hDR5-05-F405L-E430G抗体的组合以及嵌合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G抗体的组合的功效。图代表二重(BxPC-3)或三重(PANC-1)样品的平均值+/-标准偏差。
图12显示(A)使用FACS分析的流式细胞术分析，以研究模拟人源化抗体IgG1-hDR5-01-K409R和IgG1-hDR5-05-F405L中的脱酰胺对与HCT 116人结肠癌细胞的结合的影响。引入Asn脱酰胺模拟突变N55D导致IgG1-hDR5-01-K409R的结合减少，但对IgG1-hDR5-05-F405L的结合影响最小。(B)流式细胞术分析以研究防止人源化抗体DR5-01中的脱酰胺对与HCT 116人结肠癌细胞的结合的影响。在IgG1-hDR5-01-E430G中引入氨基酸取代G56T对抗体与HCT 116细胞的结合没有影响。结合表示为荧光强度的几何平均值。(C)如在对BxPC-3胰腺癌细胞进行的存活力测定法中所测量的，人源化抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的组合的效力。图代表二重样品的平均值+/-标准偏差。
图13显示用IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G的排斥和互补变体的存活力测定法。在两种抗体中引入相同的排斥突变(K439E或S440K)导致BxPC-3胰腺癌细胞(A)和HCT-15结肠癌细胞(B)的杀伤的诱导减弱。通过组合两种抗体中的两个突变(K439E和S440K)，可以中和排斥并恢复杀伤。误差条表示标准偏差。
图14：Fc相互作用参与具有六聚化增强突变的抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G诱导细胞表面上的受体聚簇并诱导凋亡的能力。如在对BxPC-3人癌细胞进行的3天存活力测定法中所示，Fc结合肽DCAWHLGELVWCT抑制凋亡的诱导。
图15显示如3天存活力测定法中所确定的，不同比例的IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G(DR5-01:DR5-05)的组合对贴壁的BxPC-3人癌细胞的功效。
图16显示如3天存活力测定法中所确定的，不同比例的IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G(DR5-01:DR5-05)对贴壁的BxPC-3(A)和HCT-15(B)人癌细胞的功效。
图17显示如在对PANC-1(A和B)和BxPC-3(C)胰腺癌细胞进行的存活力测定法中所测量的，通过人源化IgG1-hDR5-01-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G抗体的组合的胱天蛋白酶依赖性程序性细胞死亡。01-E430G是IgG1-hDR5-01-E430G；05-E430G是IgG1-hDR5-05-E430G；ZVAD是泛胱天蛋白酶(pan-caspase)抑制剂Z-Val-Ala-DL-Asp-氟甲基酮(Z-VAD-FMK)。
图18显示在COLO 205结肠癌细胞上抗DR5抗体或抗DR5抗体组合结合后的细胞死亡诱导。将COLO 205细胞与抗体样品温育5小时(A-C)和24小时(D-E)。通过膜联蛋白V/PI双重染色和活性胱天蛋白酶-3染色分析了细胞死亡诱导的不同阶段。图C和D分别显示5和24小时的膜联蛋白V/PI双重染色。误差条表示2个二重样品的标准偏差。01是IgG1-DR5-01-K409R，05是IgG1-DR5-05-F405L，01-E430G是IgG1-DR5-01-K409R-E430G，05-E430G是IgG1-DR5-05-F405L-E430G。
图19显示在COLO 205结肠癌细胞上DR5抗体结合后的胱天蛋白酶-3/7激活的动力学。将COLO 205细胞与抗体温育1、2、5和24小时。在同质发光测定法(homogenousluminescence assay)中分析了胱天蛋白酶-3/7激活。AU，任意单位。误差条表示二重样品的标准偏差。
图20显示在对贴壁的COLO 205结肠癌以及BxPC-3和PANC-1胰腺癌细胞进行的3天存活力测定法中，IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合在存在或不存在通过抗人IgG抗体的F(ab’)2片段的Fc交联的情况下的功效，以及与抗DR5抗体IgG1-DR5-CONA和IgG1-DR5-chTRA8-F405L的比较。非靶物结合抗体IgG1-b12作为阴性对照包括在内。图显示来自二重样品的平均值+/-标准偏差。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001(单向ANOVA与用于多重比较的Bonferroni后检验)。
图21显示如在对BxPC-3胰腺癌细胞进行的存活力测定法中所测量的，人源化IgG1-hDR5-01-K409R-E430G+IgG1-hDR5-05-F405L-E430G抗体的组合和人源化IgG1-DR5-01-E430G+IgG1-DR5-05-E430G抗体的组合的效力。图代表二重样品的平均值+/-标准偏差。
图22显示在对来自COLO 205结肠、BxPC-3胰腺、SNU-5胃、SK-MES-1肺和A375皮肤癌细胞系的贴壁细胞进行的3天存活力测定法中所确定的，嵌合BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G抗体对不同的人癌细胞系的效力。图显示来自二重样品的平均值+/-标准偏差。*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001(单向ANOVA与用于多重比较的Bonferroni后检验)。(01x05)-E430G是BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G。
图23显示在对贴壁的BxPC-3胰腺和COLO 205结肠癌细胞进行的3天存活力测定法中，与抗DR5抗体IgG1-DR5-CONA和IgG1-DR5-chTRA8-F405L相比，嵌合BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G在存在或不存在通过抗人IgG抗体的F(ab’)2片段的Fc交联的情况下的功效。非靶物结合抗体IgG1-b12作为阴性对照包括在内。图显示来自二重样品的平均值+/-标准偏差。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001(单向ANOVA与用于多重比较的Bonferroni后检验)。(01x05)-E430G是BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430Gx IgG1-DR5-05-F405L-E430G。
图24显示在COLO 205结肠癌细胞上双特异性DR5抗体结合后的细胞死亡诱导。将COLO 205细胞与1μg/mL抗体温育5小时(A-C)和24小时(D-E)。通过膜联蛋白V/PI双重染色和活性胱天蛋白酶-3染色分析了细胞死亡诱导的不同阶段。误差条表示2个二重样品的标准偏差。01是IgG1-DR5-01-K409R，05是IgG1-DR5-05-F405L，01-E430G是IgG1-DR5-01-K409R-E430G，05-E430G是IgG1-DR5-05-F405L-E430G，01x05是BsAb IgG1-DR5-01-K409R xDR5-05-F405L，01-E430G x 05-E430G是BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G。
图25显示在具有COLO 205人结肠癌细胞的皮下异种移植模型中对嵌合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G抗体的组合的体内功效的评估。以时间(A)和在第23天(B)显示用所示抗体(5mg/kg)治疗的小鼠中的肿瘤大小(平均值和SEM)。在(C)中，具有小于750mm3的肿瘤大小的小鼠的百分比显示于Kaplan-Meier绘图中。
图26显示在皮下COLO 205结肠癌异种移植物中对不同剂量的IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G抗体组合的体内功效的评估，以及与IgG1-CONA的比较。以时间(A)和在第16天(B)显示用所示抗体剂量治疗的小鼠中的肿瘤大小(平均值和SEM)。在(C)中，具有小于500mm3的肿瘤大小的小鼠的百分比显示于Kaplan-Meier绘图中。*p<0.05，***p<0.001。
图27显示在具有BxPC-3人胰腺癌细胞的皮下异种移植模型中对不同剂量的IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G抗体组合的体内功效的评估，以及与IgG1-CONA-F405L的比较。以时间(A，中位肿瘤大小)和在肿瘤接种后第48天(B，中位肿瘤大小和SEM)显示用所示抗体治疗的小鼠中的肿瘤大小。*p<0.05，**p<0.01(未配对t检验)。在(C)中，具有小于500mm3的肿瘤大小的小鼠的百分比显示于Kaplan-Meier绘图中。
图28显示在具有A375人皮肤癌细胞的皮下异种移植模型中对不同剂量的IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G抗体组合的体内功效的评估，以及与IgG1-CONA-F405L的比较。以时间(A，中位肿瘤大小)和在肿瘤接种后第29天(B，中位肿瘤大小和SEM)显示用所示抗体治疗的小鼠中的肿瘤大小。*p<0.05，**p<0.01(Mann Whitney检验)。
图29显示在具有HCT-15人结肠癌细胞的皮下异种移植模型中对不同剂量的IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G抗体组合的体内功效的评估，以及与IgG1-CONA的比较。以时间(A)和在开始治疗后第17天(B)显示用所示抗体治疗的小鼠中的肿瘤大小(平均值和SEM)。****p<0.001(未配对t检验)。在(C)中，具有小于500mm3的肿瘤大小的小鼠的百分比显示于Kaplan-Meier绘图中。
图30显示在具有SW480人结肠癌细胞的皮下异种移植模型中对不同剂量的IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G抗体组合的体内功效的评估，以及与IgG1-CONA的比较。以时间(A)和在开始治疗后第28天(B)显示用所示抗体治疗的小鼠中的肿瘤大小(平均值和SEM)。*p<0.05，**p<0.01(未配对t检验)。在(C)中，具有小于500mm3的肿瘤大小的小鼠的百分比显示于Kaplan-Meier绘图中。
图31显示在具有SNU-5人胃癌细胞的皮下异种移植模型中对不同剂量的IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G抗体组合的体内功效的评估，以及与IgG1-CONA的比较。以时间(A)和在开始治疗后第23天(B)显示用所示抗体治疗的小鼠中的肿瘤大小(平均值和SEM)。**p<0.01,***p<0.001(Mann Whitney检验)。在(C)中，具有小于500mm3的肿瘤大小的小鼠的百分比显示于Kaplan-Meier绘图中。
图32显示在具有SK-MES-1人肺癌细胞的皮下异种移植模型中对不同剂量的IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G抗体组合的体内功效的评估，以及与IgG1-CONA的比较。以时间(A)和在开始治疗后第14天(B)显示用所示抗体治疗的小鼠中的肿瘤大小(平均值和SEM)。在(C)中，具有小于1.000mm3的肿瘤大小的小鼠的百分比显示于Kaplan-Meier绘图中。
图33显示如通过流式细胞术所测量的，具有和不具有E430G突变的抗DR5抗体IgG1-hDR5-01-G56T和IgG1-hDR5-05与DR5-阳性HCT 116人结肠癌细胞的结合。抗gp120抗体IgG1-b12用作阴性对照。结合表示为几何平均荧光强度(FI)。误差条表示标准偏差。显示了七个实验的代表性实例。
图34显示如通过用直接标记的抗体的流式细胞术所测量的，抗DR5抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G与DR5阳性HCT 116人结肠癌细胞的结合。结合表示为几何平均Alexa 647荧光强度(FI)。误差条表示标准偏差。
图35显示抗DR5抗体与人和食蟹猴DR5的结合。通过流式细胞术测试了抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G与(A)经人DR5转染的CHO细胞和(B)经食蟹猴DR5转染的CHO细胞的结合。结合表示为荧光强度(FI)的几何平均值。误差条表示标准偏差。
图36显示3天存活力测定法，以显示在非交叉阻断抗体IgG1-hDR5-01-G56T和IgG1-hDR5-05中引入E430G突变对COLO 205结肠癌细胞的影响。误差条表示标准偏差。显示了四个实验的代表性实例。
图37显示用DR5抗体对COLO 205人结肠癌细胞的存活力测定。引入六聚化增强突变S440Y导致对通过单一抗体IgG1-hDR5-01-G56T和IgG1-hDR5-05的杀伤的诱导(A)，以及抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T+IgG1-hDR5-05的功效增加(B)。误差条表示标准偏差。
图38显示非交叉阻断抗体IgG1-DR5-CONA-E430G+IgG1-DR5-chTRA8-E430G诱导杀伤BxPC-3人胰腺癌细胞的功效。(A)IgG1-DR5-CONA-K409R(CONA)和IgG1-DR5-chTRA8-F405L(chTRA8)之间的交叉阻断ELISA。(B)如在3天存活力测定法中所确定的，引入E430G六聚化增强突变导致IgG1-DR5-CONA-C49W-E430G+IgG1-DR5-chTRA8-E430G的组合对BxPC-3细胞的杀伤的诱导增强。误差条表示标准偏差。
图39显示用133nM人重组TRAIL或133nM的抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G(E430G)和IgG1-hDR5-01-G56T+IgG1-hDR5-05(WT)对不同的人癌细胞系的3天存活力测定法。图显示来自二重样品的平均值+/-标准偏差。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001(单向ANOVA与Tukey多重比较检验)。
图40显示如在英国Horizon的细胞系组的3天存活力测定筛选中所确定的，(A)抗体(IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G)和(B)TRAIL疗法的抑制百分比。每个数据点代表所示的人癌症指示的单个细胞系。虚线表示设定为将细胞系分类为响应者(≥70％抑制)和非响应者(<70％抑制)的70％最大响应阈值。
图41显示如在3天的存活力测定法中所确定的，组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G(表示为01-E430G:05-E430G)中不同的抗体比例对贴壁的人(A)BxPC-3胰腺和(B)HCT-15结肠癌细胞的功效。分别显示了针对HCT-15和BxPC-3的两个和三个实验的代表性实例。
图42显示如在对BxPC-3胰腺癌细胞进行的存活力测定法中所测量的，通过IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G抗体的组合、不具有E430G突变的亲本WT组合和TRAIL的胱天蛋白酶依赖性程序性细胞死亡。
图43显示与不具有E430G突变的亲本WT组合和TRAIL相比，在BxPC-3胰腺癌细胞上抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G结合后的胱天蛋白酶-3/7激活的动力学。将BxPC-3细胞与抗体温育1、2、4和6小时。在同质发光测定法中分析了胱天蛋白酶-3/7激活。RLU，相对发光单位。显示了四个实验的代表性实例。
图44显示在对贴壁的HCT-15人结肠癌和BxPC-3胰腺癌细胞进行的3天存活力测定法中，IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的组合在存在或不存在通过抗人IgG抗体的F(ab’)2片段的Fc交联的情况下的功效，以及与抗DR5抗体IgG1-DR5-CONA和WT抗体IgG1-hDR5-01-G56T+IgG1-hDR5-05的组合的比较。非靶物结合抗体IgG1-b12作为阴性对照包括在内。图显示来自二重样品的平均值+/-标准偏差。对于两种细胞系，显示了两个实验的代表性实例。
图45显示在用人(A，C)或食蟹猴DR5(B，D)转染的CHO细胞上靶细胞结合后IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G诱导补体激活的分析。(A-B)在存在20％合并的正常人血清的情况下，具有抗体浓度系列的体外CDC测定法。CDC功效表示为由碘化丙啶(PI)阳性细胞百分比确定的裂解百分比。(C-D)在存在C5耗尽的血清(C5-depleted serum)的情况下，抗体结合后补体激活产物的沉积表示为荧光强度的几何平均值。针对HIV gp120的IgG1-b12 mAb用作非结合同种型对照抗体。
图46显示如在对五种不同的结肠癌细胞系进行的存活力测定法中所确定的，将抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G与不同治疗剂组合的影响。显示来自不同治疗剂类别的100种化合物的协同筛选的五个实例。
图47显示在具有COLO 205人结肠癌细胞的皮下异种移植模型中对抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G的体内功效的评估，两者作为单一试剂和作为组合与不具有E430G突变的亲本抗体比较。(A)如以时间显示的用所示抗体(0.5mg/kg)治疗的小鼠中的肿瘤大小(平均值和SEM)。(B)肿瘤进展的Kaplan-Meier绘图，其中截点设定在肿瘤体积>500mm3。
图48显示在具有HCT15人结肠癌细胞的皮下异种移植模型中对具有和不具有六聚化增强突变E430G的抗DR5抗体浓度IgG1-hDR5-01-G56T+IgG1-hDR5-05的体内功效的评估。以时间(A)和在开始治疗后第21天(B)显示用0.5mg/kg抗体治疗的小鼠中的肿瘤大小(平均值和SEM)。**P<0.0011(Mann Whitney检验)。在(C)中，具有小于750mm3的肿瘤大小的小鼠的百分比显示于Kaplan-Meier绘图中。
图49显示在具有SK-MES-1人肺癌细胞的皮下异种移植模型中对与15mg/kg紫杉醇组合的IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-430G抗体的组合的体内功效的评估。(A)以时间显示用所示化合物治疗的小鼠中的肿瘤大小(平均值和SEM)。(B)每治疗组在第16天的肿瘤体积。(C)具有小于500mm3的肿瘤大小的小鼠的百分比显示于Kaplan-Meier绘图中。
图50显示与不具有E430G突变的亲本WT抗体相比，1mg/kg i.v.施用IgG1-hDR5-01-G56T-E430G、IgG1-hDR5-05-E430G或该两种抗体的组合的SCID小鼠中的清除率。(A)通过ELISA测定血清样品中的总人IgG，并以浓度对时间曲线绘图。每个数据点代表四个系列稀释样品的平均值+/-标准偏差。(B)遵循公式D*1.000/AUC确定直至抗体施用后第21天的清除，其中D，注射剂量和AUC，浓度-时间曲线的曲线下面积。
图51显示在附着的COLO 205人结肠癌细胞上用DR5抗体IgG1-DR5-CONA和IgG1-DR5-CONA-E430G的存活力测定法。引入六聚化增强突变E430G导致诱导杀伤。数据表示为从相对于无抗体温育的样品(无杀伤)和与星形孢菌素温育的样品(最大杀伤)的发光计算的％活细胞。误差条表示标准偏差。
发明详述
在描述本发明的实施方案时，为了清楚起见，将采用特定术语。然而，本发明并不旨在限于如此选择的特定术语，并且应理解，每个特定术语包括以类似方式操作以实现类似目的的所有技术等同物。
定义
如本文所用，术语“免疫球蛋白”是指一类结构相关的糖蛋白，由两对多肽链，一对轻(L)低分子量链和一对重(H)链(所有四者潜在通过二硫键相互连接)组成。免疫球蛋白的结构已得到充分表征。参见例如Fundamental Immunology第7章(Paul,W.编,第2版RavenPress,N.Y.(1989))。简言之，每条重链通常由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区构成。IgG抗体的重链恒定区通常由三个域CH1、CH2和CH3构成。重链经由所谓的“铰链区”中的二硫键相互连接。每条轻链通常由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区通常由一个域CL构成。VH和VL区可以进一步细分为高变性区(或高变区，其可以在结构上限定的环的序列和/或形式中是高变的)，也称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(也参见Chothia and LeskJ.Mol.Biol.196,901 917(1987))。除非另有说明或与上下文相矛盾，否则本文的CDR序列根据IMGT规则(Brochet X.,Nucl Acids Res.2008；36:W503-508和Lefranc MP.,NucleicAcids Research 1999；27:209-212；还参见因特网http地址http://www.imgt.org/)鉴定。除非另有说明或与上下文相矛盾，否则本发明中对恒定区中氨基酸位置的提及根据EU编号(Edelman等,Proc Natl Acad Sci U S A.1969 May；63(1):78-85；Kabat等,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第五版.1991 NIH Publication No.91-3242)。如本文所用，术语“铰链区”旨在指免疫球蛋白重链的铰链区。因此，例如，人IgG1抗体的铰链区对应于根据EU编号的氨基酸216-230。
如本文所用，术语“CH2区”或“CH2域”旨在指免疫球蛋白重链的CH2区。因此，例如，人IgG1抗体的CH2区对应于根据EU编号的氨基酸231-340。然而，CH2区也可以是如本文所述的任何其他同种型或同种异型。
如本文所用，术语“CH3区”或“CH3域”旨在意指免疫球蛋白重链的CH3区。因此，例如，人IgG1抗体的CH3区对应于根据EU编号的氨基酸341-447。然而，CH3区也可以是如本文所述的任何其他同种型或同种异型。
术语“片段可结晶区”、“Fc区”、“Fc片段”或“Fc域”可以在本文中可互换地使用，指在从氨基末端到羧基末端排列，至少包含铰链区、CH2域和CH3域的抗体区域。IgG1抗体的Fc区可以例如通过用木瓜蛋白酶消化IgG1抗体来生成。抗体的Fc区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和补体系统的组分，例如C1q，经典补体激活途径中的第一组分。
在本发明的上下文中，术语“Fab片段”是指免疫球蛋白分子的片段，其包含免疫球蛋白的重链和轻链的可变区以及轻链的恒定区和重链的CH1区。“CH1区”是指例如根据EU编号，对应于氨基酸118-215的人IgG1抗体的区域。因此，Fab片段包含免疫球蛋白的结合区。
如本文所用，术语“抗体”(Ab)指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一者的衍生物。本发明的抗体包含免疫球蛋白的Fc区和抗原结合区。Fc区通常含有两个CH2-CH3区和连接区，例如铰链区。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。除非另有说明或与上下文相矛盾，否则如本文所用的术语“抗体”也指多克隆抗体、寡克隆抗体、单克隆抗体(例如人单克隆抗体)、抗体混合物、重组多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。所生成的抗体可以潜在地具有任何类别或同种型。
如本文所用，术语“人抗体”是指具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变、插入或缺失)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中源自另一种物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已经移植到人框架序列上的抗体。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指其中两种链类型，即重链和轻链由于抗体工程而为嵌合的抗体。嵌合链是含有与人源的恒定区连接的外来可变域(源自非人物种，或合成或自任何物种(包括人)工程化)的链。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指其中两种链类型由于抗体工程而人源化的抗体。人源化链通常是下述链，其中可变域的互补决定区(CDR)为外来的(源自除人以外的物种或合成的)，而链的剩余部分是人源的。人源化评价基于所得的氨基酸序列，而不是基于方法本身，其允许使用除移植之外的方案。
如本文所用，术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA1、IgA2、IgE或IgM)。为了产生规范抗体，每个重链同种型将与kappa(κ)或lambda(λ)轻链组合。
如本文所用，术语“同种异型”是指相同物种中一种同种型类别内的氨基酸变异。抗体同种型的主要同种异型在种族个体之间有所不同。重链的IgG1同种型内的已知同种异型变异是由抗体框架中的4个氨基酸取代引起的，如图1中所示。在一个实施方案中，本发明的抗体是如SEQ ID NO 29中定义的IgG1m(f)同种异型。在一个实施方案中，本发明的抗体是如SEQ ID NO 30中定义的IgG1m(z)同种异型、如SEQ ID NO 31中定义的IgG1m(a)同种异型、如SEQ ID NO 32中定义的IgG1m(x)同种异型，或任何同种异型组合，例如IgG1m(z,a)、IgG1m(z,a,x)、IgG1m(f,a)(de lange Exp Clin Immunogenet.1989；6(1):7-17)。
如本文所用，术语“单克隆抗体”、“单克隆Ab”、“单克隆抗体组成”、“mAb”等是指单分子组成的Ab分子的制剂。单克隆抗体组成显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。因此，术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的Ab，其具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。人mAb可以由杂交瘤生成，所述杂交瘤包括从转基因或转染色体非人动物例如转基因小鼠(其具有包含人重链转基因库和人轻链转基因库的基因组)获得的、经重排以产生功能性人抗体并与永生化细胞融合的B细胞。或者，人mAb可以重组生成。
如本文所用，术语“抗体模拟物”是指像抗体一样可以特异性结合抗原但与抗体在结构上不相关的化合物。它们通常是人工肽、蛋白质、核酸或小分子。
术语“双特异性抗体”是指对至少两种不同的，通常是非重叠的表位具有特异性的抗体。此类表位可以在相同或不同的靶标上。包含Fc区的不同类别的双特异性抗体的实例包括但不限于：不对称的双特异性分子，例如具有互补CH3域的IgG样分子和对称双特异性分子，例如重组IgG样双重靶向分子，其中分子的每个抗原结合区结合至少两个不同的表位。
双特异性分子的实例包括但不限于
Figure BDA0002379913990000181
(Trion Pharma/FreseniusBiotech,WO/2002/020039)、突出进入孔(Genentech,WO9850431)、CrossMAb(Roche,WO2009/080251,WO 2009/080252,WO 2009/080253)、静电匹配的Fc-异源二聚体分子(Amgen,EP1870459和WO2009089004；Chugai,US201000155133；Oncomed,WO2010129304)、LUZ-Y(Genentech)、DIG-body、PIG-body和TIG-body(Pharmabcine)、链交换工程化域体(SEEDbody)(EMD Serono,WO2007110205)、双特异性IgG1和IgG2(Pfizer/Rinat,WO11143545)、Azymetric支架(Zymeworks/Merck,WO2012058768)、mAb-Fv(Xencor,WO2011028952)、XmAb(Xencor)、二价双特异性抗体(Roche,WO2009/080254)、双特异性IgG(Eli Lilly)、
Figure BDA0002379913990000182
分子(Genmab A/S,WO 2011/131746)、DuetMab(Medimmune,US2014/0348839)、Biclonics(Merus,WO 2013/157953)、NovImmune(κλBodies,WO 2012/023053)、FcΔAdp(Regeneron,WO 2010/151792)、(DT)-Ig(GSK/Domantis)、二合一抗体或双重作用Fab(Genentech,Adimab)、mAb2(F-Star,WO2008003116)、ZybodiesTM(Zyngenia)、CovX-body(CovX/Pfizer)、FynomAb(Covagen/Janssen Cilag)、DutaMab(Dutalys/Roche)、iMab(MedImmune)、双可变域(DVD)-IgTM(Abbott,US 7,612,18)、双域双头抗体(Unilever；Sanofi Aventis,WO20100226923)、Ts2Ab(MedImmune/AZ)、BsAb(Zymogenetics)、HERCULES(Biogen Idec,US007951918)、scFv-融合物(Genentech/Roche,Novartis,Immunomedics、Changzhou Adam Biotech Inc、CN 102250246)、TvAb(Roche,WO2012025525,WO2012025530)、ScFv/Fc融合物、SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion,Zymogenetics/BMS)、Interceptor(Emergent)、双亲和重靶向技术(Fc-DARTTM)(MacroGenics,WO2008/157379,WO2010/080538)、BEAT(Glenmark)、双-双价抗体(Di-diabody)(Imclone/Eli Lilly)和化学交联的mAb(Karmanos Cancer Center)和共价融合的mAb(AIMM therapeutics)。
当在本文中使用时，术语“全长抗体”是指下述抗体(例如亲本或变体抗体)，其含有与通常在该类别或同种型的野生型抗体中发现的重链和轻链恒定和可变域对应的所有重链和轻链恒定和可变域。
如本文所用，术语“寡聚物”是指与至少原则上由无限数目的单体组成的聚合物形成对比，由超过一个但有限数目的单体单元(例如抗体)组成的分子。示例性的寡聚物是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体。希腊前缀通常用于表示寡聚物中单体单元的数目，例如四聚体由四个单元组成，并且六聚体由六个单元组成。同样地，如本文所用，术语“寡聚化”旨在指将分子转化为有限聚合度的过程。在本文中，观察到包含根据本发明的靶标结合区的抗体和/或其他二聚体蛋白可以在靶标结合后(例如在细胞表面处)经由Fc区的非共价缔合形成寡聚物，例如六聚体。
如本文所用，术语“抗原-结合区”、“抗原结合区”、“结合区”或抗原结合域是指抗体中能够结合抗原的区域。此结合区通常由抗体的VH和VL域定义，所述VH和VL域可以进一步细分为高变性区(或高变区，其可以在结构上限定的环的序列和/或形式中是高变的)，也称为互补决定区(CDR)，散布着更保守的区域，称为框架区(FR)。抗原可以是例如存在于细胞、细菌或病毒体上或溶液中的任何分子，如多肽。除非与上下文矛盾，否则术语“抗原”和“靶标”可以在本发明的上下文中可互换地使用。
如本文所用，术语“靶标”是指与抗体的抗原结合区结合的分子。靶标包括产生的抗体针对的任何抗原。就抗体而言，术语“抗原”和“靶标”可以可互换地使用，并且就本发明的任何方面或实施方案而言构成相同的含义和目的。
术语“表位”意指能够特异性结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由构筑块(building block)如氨基酸、糖侧链或其组合的表面分组(surface groupings)组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于在存在变性溶剂的情况下与前者而非后者的结合丧失。表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基和其他不直接参与结合的氨基酸残基，如由特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基(换句话说，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的足迹内)。
如本文所用，术语“结合”是指抗体与预定抗原或靶标的结合，当使用抗原作为配体且抗体作为分析物或反之亦然，通过例如表面等离子体共振(SPR)技术在BIAcore 3000仪器中测定时，通常具有对应于约10-6M或更小，例如10-7M或更小，如10-8M或更小，如10-9M或更小，约10-10M或更小，或约10-11M或甚至更小的KD的亲和力，并且以对应于比其与预定抗原或密切相关抗原以外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合的亲和力至少低十倍，如至少低100倍，例如至少低1,000倍，如至少低10,000倍，例如至少低100,000倍的KD的亲和力与预定抗原结合。亲和力较低者的量取决于抗体的KD，这样当抗体的KD非常低(即抗体高度特异)时，则对抗原的亲和力低于对非特异性抗原的亲和力的程度可以是至少10,000倍。如本文所用，术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数并且通过将kd除以ka获得。
如本文所用，术语“kd”(sec-1)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值也称为koff值或解离速率(off-rate)。
如本文所用，术语“ka”(M-1x sec-1)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数。所述值也称为kon值或缔合速率(on-rate)。
如本文所用，术语“KA”(M-1)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合平衡常数，并且通过将ka除以kd获得。
如本文所用，术语“亲和力”是一种分子(例如一种抗体)在单一位点处与另一种分子(例如靶标或抗原)的结合强度，例如抗体的单独抗原结合位点对抗原的单价结合。
如本文所用，术语“亲合力”是指两个结构之间的多个结合位点，例如在同时与靶标相互作用的抗体的多个抗原结合位点之间的组合强度。当存在超过一种结合相互作用时，两种结构仅在所有结合位点解离时解离，并因此，解离速率将比对于单独结合位点慢，从而与单独结合位点的结合强度(亲和力)相比提供更大的有效总结合强度(亲合力)。
如本文所用，术语“六聚化增强突变”是指对应于根据EU编号的人IgG1中E430、E345或S440的位置处的氨基酸的突变，条件是S440中的突变是S440Y或S440W。六聚化增强突变加强结合至细胞表面靶标的邻近的IgG抗体之间的Fc-Fc相互作用，导致靶标结合抗体的六聚体形成增强，而抗体分子在溶液中保持单体，如WO2013/004842；WO2014/108198中所述。
如本文所用，术语“聚簇”旨在指通过非共价相互作用使抗体、多肽、抗原或其他蛋白质寡聚化。
如本文所用，术语“排斥突变”或“自我排斥突变”或“六聚化抑制突变”是指人IgG1的氨基酸位置的突变，其可以导致Fc-Fc界面处的氨基酸之间的电荷排斥，从而导致两个相邻的含Fc区的多肽之间的Fc-Fc相互作用减弱，并因此抑制六聚化。人IgG1中此类排斥突变的实例是K439E和S440K。可以通过在与具有第一突变的位置相互作用的氨基酸位置中引入第二突变(互补突变)来中和在排斥突变位置处的两个相邻的含Fc区的多肽之间的Fc-Fc相互作用中的排斥。该第二突变可以存在于相同的抗体或第二抗体中。第一和第二突变的组合导致排斥的中和及Fc-Fc相互作用的恢复，并因此六聚化。此类第一和第二突变的实例是K439E(排斥突变)和S440K(中和通过K439E的排斥)，并且反之亦然S440K(排斥突变)和K439E(中和通过S440K的排斥)。
如本文所用，术语“互补突变”是指与相邻的含Fc区的多肽中的第一突变相关的含Fc区的多肽中的氨基酸位置的突变，所述相邻的含Fc区的多肽由于两个相邻的含Fc区的多肽中的两个突变的组合，优选地与含有互补突变的含Fc区的多肽相互作用。互补突变和相关的第一突变可以存在于相同的抗体(分子内)或第二抗体(分子间)中。分子内互补突变的一个实例是根据WO 2011/131746，介导双特异性抗体中优先异源二聚化的组合K409R和F405L。导致排斥的中和及两个相邻的含Fc区的多肽之间Fc-Fc相互作用的恢复以及因此六聚化的K439E和S440K突变的组合是可以在分子间和分子内应用的互补突变的实例。
如本文所用，术语“凋亡”是指可以发生在细胞中的程序性细胞死亡(PCD)过程。生物化学事件导致特征性细胞改变(形态学)和死亡。这些改变包括起泡、细胞皱缩、磷脂酰丝氨酸暴露、线粒体功能丧失、核碎裂、染色质浓缩、胱天蛋白酶激活和染色体DNA片段化。在一个具体的实施方案中，可以使用方法如例如实施例19、20、25和45中所述的胱天蛋白酶-3/7激活测定法或实施例19和25中所述的磷脂酰丝氨酸暴露确定通过一种或多种激动性抗DR5抗体的凋亡。可以将处于固定浓度(例如1μg/mL)的抗DR5抗体添加至贴壁细胞中，并温育1至24小时。可以通过使用为此目的的专用试剂盒确定胱天蛋白酶-3/7激活，如BDPharmingen的PE活性胱天蛋白酶-3凋亡试剂盒(Cat nr 550914)(实施例19和25)或Promega的胱天蛋白酶-Glo 3/7测定法(Cat nr G8091)(实施例20和45)。可以通过使用为此目的的专用试剂盒确定磷脂酰丝氨酸的暴露和细胞死亡，如来自BD Pharmingen的FITC膜联蛋白V凋亡检测试剂盒I(Cat nr 556547)(实施例19和25)。
如本文所用，术语“程序性细胞死亡”或“PCD”是指细胞内信号传导介导的任何形式的细胞的死亡，例如凋亡、自噬或坏死性凋亡。
如本文所用，术语“膜联蛋白V”是指膜联蛋白组中的蛋白质，其结合细胞表面上的磷脂酰丝氨酸(PS)。
如本文所用，术语“胱天蛋白酶激活”是指通过起始物胱天蛋白酶切割效应胱天蛋白酶的无活性前体形式，导致其转化为效应胱天蛋白酶，其继而切割细胞内的蛋白质底物以触发凋亡。
如本文所用，术语“胱天蛋白酶依赖性程序性细胞死亡”是指由胱天蛋白酶介导的任何形式的程序性细胞死亡。在一个具体的实施方案中，通过一种或多种激动性抗DR5抗体的胱天蛋白酶依赖性程序性细胞死亡可以如实施例18和44中所述，通过比较在存在和不存在泛胱天蛋白酶抑制剂Z-Val-Ala-DL-Asp-氟甲基酮(Z-VAD-FMK)的情况下细胞培养物的存活力来确定。泛胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK(5μM终浓度)可以添加到96孔平底板中的贴壁细胞，并于37℃温育一小时。接下来，可以添加抗体浓度稀释系列(例如，从20,000ng/mL以5倍稀释至0.05ng/mL的最终浓度)，并于37℃温育3天。可以通过使用为此目的的专用试剂盒对细胞存活力进行定量，如Promega的CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法(Cat nrG7571)。
如本文所用，术语“细胞存活力”是指代谢活性细胞的存在。在一个具体的实施方案中，可以如实施例8-18、21-24、38-44、46和48中所述，通过定量存在于细胞中的ATP来确定与一种或多种激动性抗DR5抗体温育后的细胞存活力。可以将浓度稀释系列(例如，从例如20,000ng/mL以5倍稀释至0.05ng/mL的最终浓度)添加到96孔平底板中的细胞，培养基可以用作阴性对照以及5μM星形孢菌素可以用作诱导细胞死亡的阳性对照。温育3天后，可以使用为此目的的专用试剂盒对细胞存活力进行定量，如Promega的CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法(Cat nr G7571)。百分比活细胞可以使用以下公式计算：％活细胞＝[(发光抗体样品-发光星形孢菌素样品)/(发光无抗体样品-发光星形孢菌素样品)]*100。
如本文所用，术语“DR5”是指死亡受体5，也称为CD262和TRAILR2，其是具有三个富含半胱氨酸的细胞外域(CRD)、跨膜域(TM)和含有死亡域(DD)的胞质域的单通I型膜蛋白。在人中，DR5蛋白由编码SEQ ID NO 46中所示的氨基酸序列的核酸序列编码(人DR5蛋白：UniprotKB/Swissprot O14763)。
术语“结合DR5的抗体”、“抗DR5抗体”、“DR5结合抗体”、“DR5特异性抗体”、“DR5抗体”在本文中可以可互换地使用，是指结合DR5的细胞外部分上的表位的任何抗体。
如本文所用，术语“激动剂”是指当与DR5结合时能够在细胞中触发应答的分子，例如抗DR5抗体，其中所述应答可以是程序性细胞死亡。抗DR5抗体是激动性的，应理解为由于抗DR5与DR5结合而导致抗体刺激、激活或聚簇DR5。即，根据本发明的包含Fc区中的氨基酸突变的激动性抗DR5抗体与DR5结合导致与TRAIL结合DR5相同的细胞内信号传导途径的DR5的刺激、聚簇或激活。在一个具体的实施方案中，一种或多种抗体的激动性活性可以通过将靶细胞与抗体浓度稀释系列(例如，从20,000ng/mL以5倍稀释至0.05ng/mL的最终浓度)温育3天来确定。可以在接种细胞时直接添加抗体(如实施例8、9、10、39中所述)，或者在添加抗体样品之前首先允许细胞粘附至96孔平底板(如实施例11、12、13、14、15、16、17、18、21、22、23、24、38、40、41、42、43、44、46、48中所述)。激动性活性，即激动性作用可以通过使用为此目的的专用试剂盒测量活细胞的量来定量，如Promega的CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法(Cat nr G7571)。
如本文所用，术语“DR5阳性”和“表达DR5”是指显示出DR5特异性抗体的结合的组织或细胞系，其可以用例如流式细胞术或免疫组织化学测量。
本发明的“变体”或“抗体变体”是与“亲本”抗体相比包含一个或多个突变的抗体分子。示例性亲本抗体形式包括但不限于野生型抗体、全长抗体或含Fc的抗体片段、双特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或其任何组合。
示例性突变包括亲本氨基酸序列中氨基酸的氨基酸缺失、插入和取代。氨基酸取代可以将存在于野生型蛋白质中的天然氨基酸交换为另一种天然存在的氨基酸，或者非天然存在的氨基酸衍生物。氨基酸取代可以是保守的或非保守的。在本发明的上下文中，保守取代可以根据以下三个表中的一个或多个中反映的氨基酸类别内的取代来定义：
保守取代的氨基酸残基类别
Figure BDA0002379913990000241
备选保守氨基酸残基取代类别
1 A S T
2 D E
3 N Q
4 R K
5 I L M
6 F Y W
氨基酸残基的备选物理和功能分类
Figure BDA0002379913990000242
在本发明的上下文中，变体中的取代表示为：
初始氨基酸-位置-取代的氨基酸；
使用三字母代码或单字母代码，包含代码Xaa和X来表示氨基酸残基。因此，符号“E345R”或“Glu345Arg”意指变体在对应于亲本抗体中位置345中的氨基酸的变体氨基酸位置中包含以精氨酸取代谷氨酸。
在位置本身不存在于抗体中，但变体包含氨基酸的插入的情况下，例如：位置-取代的氨基酸；使用符号，例如“448E”。此类符号就同源多肽或抗体系列中的修饰而言特别相关联。类似地，当取代氨基酸残基的身份无关紧要时：初始氨基酸-位置；或“E345”。对于初始氨基酸和/或取代的氨基酸可以包含超过1个，但非全部氨基酸情况下的修饰，位置345中谷氨酸取代为精氨酸、赖氨酸或色氨酸：“Glu345Arg、Lys、Trp”或“E345R、K、W”或“E345R/K/W”，或“E345至R、K或W”可以在本发明上下文中可互换地使用。此外，术语“取代”囊括取代为其他十九个天然氨基酸的任一个，或取代为其他氨基酸，如非天然氨基酸。例如，位置345中氨基酸E的取代包括以下取代的每一个：345A、345C、345D、345G、345H、345F、345I、345K、345L、345M、345N、345Q、345R、345S、345T、345V、345W和345Y。这相当于名称345X，其中X指任意氨基酸。这些取代也可以称为E345A、E345C等，或E345A、C等或E345A/C/等。这类似适用于本文中提及的每一个位置，本文中具体地包括此类取代的任一个。
为了本发明的目的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)测定两个氨基酸序列之间的序列同一性，如在EMBOSS包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,TrendsGenet.16:276-277)，优选第5.0.0版以上的Needle程序中实施。使用的参数是缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)替代矩阵。标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性，并如下计算：
(相同残基x 100)/(比对长度-比对中的缺口总数)。
为了本发明的目的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，同上)测定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性，如EMBOSS包(EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,同上)，优选第5.0.0版以上的Needle程序中实施。使用的参数是缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)替代矩阵。标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性，并如下计算：
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的缺口总数)。
CDR变体的序列可以通过通常保守、物理或功能性氨基酸取代，在抗体结合区的六个CDR序列中总共至多5个选自保守、物理或功能性氨基酸的突变或取代，如在抗体结合区的六个CDR序列中总共至多4个选自保守、物理或功能性氨基酸的突变或取代，如至多3个选自保守、物理或功能性氨基酸的突变或取代，如至多2个选自保守、物理或功能性氨基酸的突变或取代，如至多1个选自保守、物理或功能性氨基酸的突变或取代而与亲本抗体序列的CDR序列不同。保守、物理或功能性氨基酸选自找到的20种天然氨基酸，即Arg(R)、His(H)、Lys(K)、Asp(D)、Glu(E)、Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)、Gln(Q)、Cys(C)、Gly(G)、Pro(P)、Ala(A)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Trp(W)、Tyr(Y)和Val(V)。
CDR变体的序列可以通过通常保守、物理或功能性氨基酸取代而与亲本抗体序列的CDR序列不同；例如变体中至少约75％、约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多，(例如约75-95％，如约92％、93％或94％)的取代是选自保守、物理或功能性氨基酸残基替换的突变或取代。保守、物理或功能性氨基酸选自找到的20种天然氨基酸，即Arg(R)、His(H)、Lys(K)、Asp(D)、Glu(E)、Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)、Gln(Q)、Cys(C)、Gly(G)、Pro(P)、Ala(A)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Trp(W)、Tyr(Y)和Val(V)。
一个序列中“对应于”另一个序列中的氨基酸或区段的的氨基酸或区段是使用标准序列比对程序如ALIGN、ClustalW或类似的，通常以默认设置与另一氨基酸或区段比对的氨基酸或区段。因此，可以使用标准序列比对程序来鉴定例如免疫球蛋白序列中的哪个氨基酸对应于例如人IgG1中的特定氨基酸。此外，可以使用标准序列比对程序来鉴定序列同一性，例如，与SEQ ID NO:29的序列同一性为至少80％或85％、90％或至少95％。例如，图1中所示的序列比对可以用于鉴定一个IgG1同种异型的Fc区中对应于IgG1 Fc序列的另一个同种异型中的特定氨基酸的任何氨基酸。
如本文所用，术语“载体”是指能够诱导连接到载体中的核酸区段的转录的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其为环状双链DNA环的形式。另一种类型的载体是病毒载体，其中核酸区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以可互换地使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括此类其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们发挥等同的功能。
如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)旨在指其中已引入表达载体的细胞。应当理解，此类术语不仅旨在指特定的受试细胞，还指此类细胞的后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生，所以此类后代事实上可能与亲本细胞不同，但仍包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞包括例如转染瘤，如CHO-S细胞、CHO DG44细胞、HEK-293F细胞、Expi293F细胞、PER.C6、NS0细胞和淋巴细胞，以及原核细胞，如大肠杆菌和其他真核宿主，如植物细胞和真菌，以及原核细胞，如大肠杆菌。
本发明的具体实施方案
如上所述，在第一主要方面中，本发明涉及药物组合物，其包含
a.抗体，其包含人免疫球蛋白G的Fc区和抗原结合区，其中Fc区包含对应于EU编号的人IgG1中E430、E345或S440的位置处的氨基酸的突变，
b.组氨酸缓冲液，和
c.氯化钠
其中组合物的pH在5.5和7.4之间。
在本发明的一个实施方案中涉及药物组合物，其包含
a.抗体，其包含人免疫球蛋白G的Fc区和抗原结合区，其中Fc区包含对应于EU编号的人IgG1中E430、E345或S440的位置处的氨基酸的突变，条件是S440中的突变是S440Y或S440W，
b.组氨酸缓冲液，和
c.氯化钠
其中组合物的pH在5.5和7.4之间。
本发明的药物组合物通常是液体水性溶液。
本发明的药物组合物的一个实施方案中，组合物包含从5mM至100mM的组氨酸，例如，从5mM至75mM，如从10mM至50mM，例如从15mM至45mM，如从20mM至40mM，例如从25至35mM，如从28mM至32mM，例如30mM的组氨酸。
在一个实施方案中，pH为从5.8至7.2，如5.5至6.5，例如5.8至6.2，例如5.9至6.1，如6.0.
在另一个实施方案中，组合物包含从25mM至500mM的氯化钠，例如从25mM至250mM，如从50mM至250mM，例如从100mM至200mM，如从125mM至175mM，例如150mM的氯化钠。
在一个实施方案中，药物组合物包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠和从2mg/ml至40mg/ml的抗体，处于5.5和6.5之间的pH，优选其中组合物包含30mM的组氨酸，150mM的氯化钠和20mg/ml的抗体，处于pH 6.0。
在一个实施方案中，药物组合物包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠和从15mg/ml至25mg/ml的抗体，处于5.5和6.5之间的pH，优选其中组合物包含30mM的组氨酸，150mM的氯化钠和20mg/ml的抗体，处于pH 6.0。
在进一步的实施方案中，药物组合物包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠和从2mg/ml至20mg/ml的抗体，处于5.5和6.5之间的pH，优选其中组合物包含30mM的组氨酸，150mM的氯化钠和10mg/ml的抗体，处于pH 6.0。在另一个实施方案中，药物组合物包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠和从2mg/ml至20mg/ml的抗体，处于5.5和6.5之间的pH，优选其中组合物包含30mM的组氨酸，150mM的氯化钠和20mg/ml的抗体，处于pH 6.0。
在优选的实施方案中，药物组合物包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠和从2mg/ml至40mg/ml的抗体，处于5.5和6.5之间的pH，优选其中组合物包含30mM的组氨酸，150mM的氯化钠和20mg/ml的抗体，处于pH 6.0。
在另一个实施方案中，药物组合物包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠和从2mg/ml至40mg/ml的抗体，处于5.5和6.5之间的pH，优选其中组合物包含30mM的组氨酸，150mM的氯化钠和30mg/ml的抗体，处于pH 6.0。
在进一步的实施方案中，药物组合物包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠和从2mg/ml至40mg/ml的抗体，处于5.5和6.5之间的pH，优选其中组合物包含30mM的组氨酸，150mM的氯化钠和40mg/ml的抗体，处于pH 6.0。
根据常规技术如公开于(Rowe等，Handbook of Pharmaceutical Excipients,2012 June,ISBN 9780857110275)中的那些，可以将药物组合物与另外的药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的佐剂和赋形剂一起配制。此类任选的另外的药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的佐剂和赋形剂应适合于抗体和所选择的施用方式。基于对所选择的本发明的化合物或药物组合物的所期望的生物学特性缺乏明显的负面影响(例如，对抗原结合小于实质性影响(10％或更小的相对抑制，5％或更小的相对抑制))，确定对药物组合物的载体和其他组分的适用性。
药学上可接受的载体包括与组合物的其他成分在生理上相容的任何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂、抗氧化剂和吸收延迟剂等。可以在本发明的药物组合物中采用的合适的水性和非水性载体的其他实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇、右旋糖、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物。本发明的药物组合物可以进一步包括填充剂、盐、缓冲液、洗涤剂(例如非离子洗涤剂，如Tween-20或Tween-80)、稳定剂(例如糖或无蛋白质氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂和/或其他适合包含在药物组合物中的材料。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物不包含表面活性剂。在另一个实施方案中，药物组合物不包含冷冻保护剂。在进一步的实施方案中，除了组氨酸缓冲液和氯化钠外，没有其他赋形剂被添加到抗体制剂中以制备组合物。
可以改变本发明的药物组合物中抗体的实际剂量水平，以便获得对于特定患者、组合物和施用的方式有效实现所期望的治疗应答而对患者无毒的抗体的量。所选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明的特定组合物的活性、施用的途径、施用的时间、所采用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所采用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和既往病史，以及医学领域众所周知的类似因素。用于注射或输注的药物组合物通常必须在生产和储存的条件下是无菌的且稳定的。
在一个实施方案中，药物组合物中的抗体浓度为从0.5mg/ml至250mg/ml，如从1mg/ml至100mg/ml，例如从1mg/ml至50mg/ml，如从2mg/ml至20mg/ml，例如从5ml/ml至15mg/ml，如10mg/ml。
在本发明的优选的实施方案中，药物组合物中的抗体浓度为20mg/ml。在本发明的一个实施方案中，药物组合物中的抗体浓度为从18-20mg/ml。在本发明的一个实施方案中，药物组合物中的抗体浓度为从19-20mg/ml。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物中的抗体浓度为40mg/ml。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物中的抗体浓度为60mg/ml。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物中的抗体浓度为80mg/ml。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物中的抗体浓度为100mg/ml。
在本发明的药物组合物中配制的抗体
如上所述，在本发明的药物组合物中配制的抗体包含人免疫球蛋白G的Fc区和抗原结合区，其中Fc区包含对应于EU编号的人IgG1中E430、E345或S440的位置处的氨基酸的突变，条件是S440中的突变是S440Y或S440W。对应于根据EU编号的人IgG1中E430、E345和S440的位置位于Fc区的CH3域中。
本发明的药物组合物中的抗体包含包括第一和第二重链的Fc区，其中对应于根据EU编号的人IgG1中E430、E345或S440的位置处的突变存在于第一和第二重链两者中，或次优选地仅存在于重链之一中。在本发明的上下文中，术语六聚化增强突变是指对应于根据EU编号的人IgG1中E430、E345或S440的位置处的氨基酸突变，条件是S440中的突变是S440Y或S440W。当结合到细胞表面上的相应靶标时，六聚体增强突变加强包含突变的抗体之间的Fc-Fc相互作用(WO2013/004842；WO2014/108198)。
在一个实施方案中，抗体的Fc区包含对应于EU编号的人IgG1中E430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440Y或S440W的突变。因此抗体包含选自下组的突变：EU编号的人IgG1中E430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440Y和S440W。在此，提供了允许在细胞表面抗原结合后增强抗体的六聚化的实施方案。抗体包含包括第一重链和第二重链的Fc区，其中上述六聚化增强突变之一可以存在于第一和/或第二重链中。
在一个优选的实施方案中，Fc区包含对应于EU编号的人IgG1中E430G或E345K的突变。因此，Fc区包含选自E430G和E345K的突变。
在一个实施方案中，抗体包含对应于根据EU编号的人IgG1中E430的氨基酸位置处的突变，其中突变选自下组：E430G、E430S、E430F和E430T。在一个实施方案中，Fc区包含对应于E430G的突变。因此，在一个实施方案中，Fc区包含E430G突变。
在一个实施方案中，抗体包含对应于根据EU编号的人IgG1中E345的氨基酸位置处的突变，其中突变选自下组：E345K、E345Q、E345R和E345Y。在一个实施方案中，Fc区包含对应于E345K的突变。因此，在一个实施方案中，Fc区包含E345K突变。
在一个实施方案中，抗体包含对应于根据EU编号的人IgG1中S440的氨基酸位置处的突变，其中突变选自下组：S440Y或S440W。在一个实施方案中，Fc区包含对应于S440Y的突变。因此，在一个实施方案中，Fc区包含S440Y突变。
在一个实施方案中，Fc区包含另外的六聚化抑制突变，如EU编号的人IgG1中K439E或S440K。六聚化抑制突变如K439E或S440K防止与包含相同六聚化抑制突变的抗体的Fc-Fc相互作用，但是通过组合具有K439E突变的抗体和具有S440K突变的抗体，抑制作用得以中和并Fc-Fc相互作用得以恢复。在一个实施方案中，抗体包含对应于以下位置之一的氨基酸位置处的另外的突变：EU编号的人IgG1中的S440或K439。在一个实施方案中，Fc区包含对应于S440或K439的位置中的另外的突变，条件是如果六聚化增强突变在S440中，则该另外的突变不在S440位置中。包含根据本发明的对应于E430、E345或S440的位置中的突变以及对应于K439的氨基酸位置处的另外的突变(如K439E突变)的抗体不与在对应于K439的氨基酸位置处包含另外的突变(如K439E突变)的抗体形成寡聚物。然而，包含E430、E345或S440中的六聚体增强突变以及K439中的另外的突变(如K439E突变)的抗体与包含E430或E345中的六聚体增强突变以及S440中的另外的突变(如S440K)的抗体形成寡聚物。包含根据本发明的对应于E430或E345的位置中的突变以及对应于S440的氨基酸位置处的另外的突变(如S440K突变)的抗体不与在对应于S440的氨基酸位置处包含另外的突变(如S440K突变)的抗体形成寡聚物。然而，包含E430或E345中的六聚体增强突变以及S440中的另外的突变(如S440K突变)的抗体与包含E430或E345中的六聚体增强突变以及K439中的另外的突变(如K439E)的抗体形成寡聚物。在一个实施方案中，Fc区包含六聚化增强突变如E430G和六聚化抑制突变如K439E。在一个实施方案中，Fc区包含六聚化增强突变如E345K和六聚化抑制突变如K439E。在另一个实施方案中，Fc区包含六聚化增强突变如E430G和六聚化抑制突变如S440K。在一个实施方案中，Fc区包含六聚化增强突变如E345K和六聚化抑制突变如S440K。在一个实施方案中，Fc区包含六聚化增强突变如S440Y和六聚化抑制突变如K439E。在此，提供了允许在包含K439E突变的抗体和包含S440K突变的抗体的组合之间的排他性六聚化的实施方案。
在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含抗DR5抗体，即包含与DR5结合的抗原结合区的抗体。
在一个实施方案中，药物组合物包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠和从2mg/ml至200mg/ml的抗DR5抗体，处于5.5和6.5之间的pH，优选其中组合物包含30mM的组氨酸，150mM的氯化钠和20mg/ml的抗DR5抗体，处于pH 6.0。在一个实施方案中，药物组合物包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠和从10mg/ml至40mg/ml的抗DR5抗体，处于5.5和6.5之间的pH。在一个实施方案中，药物组合物包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠和从15mg/ml至30mg/ml的抗DR5抗体，处于5.5和6.5之间的pH。
在一个实施方案中，药物组合物包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠和从18mg/ml至25mg/ml的抗DR5抗体，处于5.5和6.5之间的pH，例如处于5.8和6.2之间的pH。
在本发明的一个实施方案中，组合物包含30mM的组氨酸、150mM的氯化钠和10mg/ml抗DR5抗体，处于6.0的pH。在本发明的一个实施方案中，组合物包含30mM的组氨酸、150mM的氯化钠和30mg/ml抗DR5抗体，处于6.0的pH。在本发明的一个实施方案中，组合物包含30mM的组氨酸、150mM的氯化钠和40mg/ml抗DR5抗体，处于6.0的pH。在本发明的一个实施方案中，组合物包含30mM的组氨酸、150mM的氯化钠和50mg/ml抗DR5抗体，处于6.0的pH。在本发明的一个实施方案中，组合物包含30mM的组氨酸、150mM的氯化钠和100mg/ml抗DR5抗体，处于6.0的pH。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一抗DR5抗体以从2-200mg/ml存在于组合物中以及所述第二抗DR5抗体以从2-200mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH，优选其中组合物包含10mg/ml的所述第一抗DR5抗体、10mg/ml的所述第二抗DR5抗体、30mM的组氨酸、150mM的氯化钠，处于pH 6.0。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一抗DR5抗体以从10mg/ml至40mg/ml存在于组合物中以及所述第二抗DR5抗体以从10mg/ml至40mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一抗DR5抗体以从10mg/ml至40mg/ml存在于组合物中以及所述第二抗DR5抗体以从10mg/ml至40mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.8和6.2之间的pH。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一抗DR5抗体以从15mg/ml至30mg/ml存在于组合物中以及所述第二抗DR5抗体以从15mg/ml至30mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一抗DR5抗体以从15mg/ml至30mg/ml存在于组合物中以及所述第二抗DR5抗体以从15mg/ml至30mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.8和6.2之间的pH。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物还可以含有杂质，如蛋白质杂质，例如抗体杂质。蛋白质杂质可以少于0.1mg/ml。在一个实施方案中，药物组合物包含0.1mg/ml的蛋白质杂质，例如抗体杂质。在一个实施方案中，药物组合物包含少于0.1mg/ml的蛋白质杂质，例如抗体杂质。在一个实施方案中，药物组合物包含少于0.09mg/ml的蛋白质杂质，例如抗体杂质。在一个实施方案中，药物组合物包含少于0.07mg/ml的蛋白质杂质，例如抗体杂质。在一个实施方案中，药物组合物包含少于0.05mg/ml的蛋白质杂质，例如抗体杂质。在一个实施方案中，药物组合物包含少于0.03mg/ml的蛋白质杂质，例如抗体杂质。在一个实施方案中，药物组合物包含少于0.001mg/ml的蛋白质杂质，例如抗体杂质。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一抗DR5抗体以从15mg/ml至30mg/ml存在于组合物中以及所述第二抗DR5抗体以从15mg/ml至30mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠和少于0.1mg/ml的蛋白质杂质，例如抗体杂质，处于5.8和6.2之间的pH。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一抗DR5抗体以20mg/ml存在于组合物中以及所述第二抗DR5抗体以20mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH。在本发明的一个实施方案中，组合物包含20mg/ml的第一抗DR5抗体、20mg/ml的第二抗DR5抗体、30mM的组氨酸、150mM的氯化钠，处于pH 6.0。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一抗DR5抗体以40mg/ml存在于组合物中以及所述第二抗DR5抗体以40mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH。在本发明的一个实施方案中，组合物包含40mg/ml的第一抗DR5抗体、40mg/ml的第二抗DR5抗体、30mM的组氨酸、150mM的氯化钠，处于pH 6.0。
人DR5分子(Uniprot O14763)由440个氨基酸组成，其包括前1-55位置处的信号肽，其后是位置56-210处的细胞外域、位置211-231处的跨膜域和位置232-440处的胞质域。细胞外域由155个氨基酸的序列组成。与包含位置56-210处的氨基酸的长型(UniprotO14763)相比，DR5的短同等型(Uniprot O14763-2)从细胞外域缺失了185-213。
在一个实施方案中，抗DR5抗体包含与DR5的细胞外域内的表位结合的抗原结合区。
在一个实施方案中，抗体包含与TRAIL相同的结合位点结合的抗原结合区或与TRAIL的结合位点重叠的结合位点。基于与DR5胞外域复合的TRAIL的晶体结构，TRAIL结合基序位于CRD2和CRD3中(Hymowitz等,Mol Cell.1999 Oct；4(4):563-71)。也就是说，在一个实施方案中，抗体包含与DR5上与TRAIL相同的结合区结合的抗原结合区。因此，在一个实施方案中，DR5抗体结合DR5上的CRD2和/或CRD3。在一个实施方案中，抗体包含阻断TRAIL与DR5结合的抗原结合区。在一个实施方案中，抗体包含与TRAIL竞争结合DR5的抗原结合区。在一个实施方案中，抗体阻断TRAIL诱导的介导的杀伤，如TRAIL诱导的凋亡。
在另一个实施方案中，抗体包含与DR5上不同于TRAIL的结合位点的表位结合的抗原结合区。在一个实施方案中，抗体包含与DR5上与TRAIL不同的结合区结合的抗原结合区。在一个实施方案中，抗体不阻断TRAIL诱导的介导的杀伤，如TRAIL诱导的凋亡。
在本发明的一个实施方案中，抗体包含与DR5上的表位结合的抗原结合区，所述表位包含或需要位于氨基酸残基116-138内的一个或多个氨基酸残基和位于SEQ ID NO:46的氨基酸残基139-166内一个或多个氨基酸残基。也就是说，抗原结合区结合或需要结合DR5位于位置116-138内的一个或多个氨基酸残基和位于位置139-166内一个或多个氨基酸残基。抗原结合区与序列中包含的一个或多个氨基酸结合应理解为抗原结合区与序列内的一个或多个氨基酸接触或直接相互作用。抗原结合区需要序列内的一个或多个氨基酸意味着在抗原结合区与序列中的一个或多个氨基酸之间不需要接触或直接相互作用，但是需要该一个或多个氨基酸来保持表位的三维结构。
可以通过使用如实施例6中所述的经域交换的DR5分子的方法来确定本发明的抗体的人DR5上的细胞外域上的表位或结合区。简言之，经域交换的DR5分子得以在CHO细胞中瞬时表达，通过FACS测定法确定抗体与经域交换的人DR5分子的结合。与经域交换的人DR5分子的结合丧失表明人DR5的经交换的域含有一个或多个涉及与抗体结合的氨基酸。
在另一个优选的实施方案中，抗体包含与DR5上的表位结合的抗原结合区，所述表位包含或需要位于SEQ ID NO:46的氨基酸残基79-138内的一个或多个氨基酸残基。
在一个实施方案中，抗DR5抗体包含抗原结合区，所述抗原结合区包含包括具有以下氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3域的可变重链(VH)区和包括具有以下氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3域的可变轻链(VL)区：
a)(VH)SEQ ID NO:1、2、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6；
b)(VH)SEQ ID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6；
c)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14；
d)(VH)SEQ ID NO:16、17、18和(VL)SEQ ID NO:21、GAS、22或
e)如以上a)至d)的任一项中所定义的(VH)CDR1、CDR2、CDR3以及(VL)CDR1、CDR2和CDR3，其在所述六个CDR序列中总共具有一至五个突变例如取代。
在一个实施方案中，抗DR5抗体包含抗原结合区，所述抗原结合区包含包括具有以下氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3域的可变重链(VH)区和包括具有以下氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3域的可变轻链(VL)区：
a)(VH)SEQ ID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6。
在一个实施方案中，抗DR5抗体包含抗原结合区，所述抗原结合区包含包括具有以下氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3域的可变重链(VH)区和包括具有以下氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3域的可变轻链(VL)区：
a)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14。
也就是说，在一个实施方案中，在构成抗原结合区的六个CDR间允许总共至多五个突变如取代。在本发明的一些实施方案中，在VH区的三个CDR中进行至多五个突变例如取代，如一个、两个、三个、四个或五个突变例如取代，并且在VL区的CDR上不进行突变。在其他实施方案中，在VH区的CDR上不进行突变例如取代，但在VL区的CDR上发现至多五个突变例如取代，如一个、两个、三个、四个或五个。
在一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的抗DR5抗体包含抗原结合区，所述抗原结合区包含包括CDR1、CDR2和CDR3域的可变重链(VH)区和包括CDR1、CDR2和CDR3域的可变轻链(VL)区，其中所述VH区和所述VL区与如选自下组的六个CDR序列中所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性：
a)(VH)SEQ ID NO:1、2、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6；
b)(VH)SEQ ID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6；
c)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14；和
d)(VH)SEQ ID NO:16、17、18和(VL)SEQ ID NO:21、GAS、22。
在一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的抗DR5抗体包含抗原结合区，所述抗原结合区包含包括CDR1、CDR2和CDR3域的可变重链(VH)区和包括CDR1、CDR2和CDR3域的可变轻链(VL)区，其中所述VH区和所述VL区与如选自下组的六个CDR序列中所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性：
a)(VH)SEQ ID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6。
在一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的抗DR5抗体包含抗原结合区，所述抗原结合区包含包括CDR1、CDR2和CDR3域的可变重链(VH)区和包括CDR1、CDR2和CDR3域的可变轻链(VL)区，其中所述VH区和所述VL区与如选自下组的六个CDR序列中所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性：
a)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14。
在一个实施方案中，抗DR5抗体包含包括CDR1、CDR2和CDR3域的可变重链(VH)区和包括CDR1、CDR2和CDR3域的可变轻链(VL)区，所述CDR1、CDR2和CDR3域具有选自下组之一的CDR序列：
a)(VH)SEQ ID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6，或
b)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，或
c)如以上a)或b)的任一项中所定义的(VH)CDR1、CDR2和CDR3以及(VL)CDR1、CDR2和CDR3，其在所述六个CDR序列中总共具有一至五个突变。也就是说，在一个实施方案中，在包含抗原结合区的六个CDR上允许总共至多五个突变如取代。在本发明的一些实施方案中，在VH区的三个CDR上进行至多五个突变例如取代，如一个、两个、三个、四个或五个突变例如取代，并且在VL区的CDR上不进行突变。在其他实施方案中，在VH区的CDR上不进行突变例如取代，但在VL区的CDR上发现至多五个突变例如取代，如一个、两个、三个、四个或五个。
在一个实施方案中，抗DR5抗体包含包括CDR1、CDR2和CDR3域的可变重链(VH)区和包括CDR1、CDR2和CDR3域的可变轻链(VL)区，所述CDR1、CDR2和CDR3域具有选自下组之一的CDR序列：
a)(VH)SEQ ID NO:1、2、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6，或
b)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，或
c)如以上a)或b)中所定义的(VH)CDR1、CDR2和CDR3以及(VL)CDR1、CDR2和CDR3，其在所述六个CDR序列中总共至多五个突变。
也就是说，在一个实施方案中，在包含抗原结合区的六个CDR上允许总共至多五个突变如取代。在本发明的一些实施方案中，在VH区的三个CDR上进行至多五个突变例如取代，如一个、两个、三个、四个或五个突变例如取代，并且在VL区的三个CDR上不进行突变。在其他实施方案中，在VH区的三个CDR上不进行突变例如取代，但在VL区的六个CDR上进行至多五个突变例如取代，其中突变例如取代是保守的或涉及具有相似物理或功能性质的氨基酸，并且优选不改变与DR5的结合亲和力。
在一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的抗DR5抗体包含抗原结合区，所述抗原结合区包含可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区，其中所述VH区和所述VL区与如选自下组的VH和VL序列中所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性：
a)(VH)SEQ ID NO:4和(VL)SEQ ID NO:7；
b)(VH)SEQ ID NO:9和(VL)SEQ ID NO:7；
c)(VH)SEQ ID NO:12和(VL)SEQ ID NO:15；
d)(VH)SEQ ID NO:19和(VL)SEQ ID NO:23；和
e)(VH)SEQ ID NO:20和(VL)SEQ ID NO:23。
在一个实施方案中，抗体包含包括具有以下氨基酸序列的可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区的抗原结合区：
a)(VH)SEQ ID NO:4和(VL)SEQ ID NO:7；
b)(VH)SEQ ID NO:9和(VL)SEQ ID NO:7；
c)(VH)SEQ ID NO:12和(VL)SEQ ID NO:15；
d)(VH)SEQ ID NO:19和(VL)SEQ ID NO:23；
e)(VH)SEQ ID NO:20和(VL)SEQ ID NO:23或
f)如以上a)至e)的任一项中所定义的(VH)和(VL)，其在所述(VH)和(VL)序列上总共具有一至10个突变或取代。
也就是说，在一个实施方案中，在通过VH和VL序列所定义的VH和VL区上允许总共至多10个突变如取代。在本发明的一些实施方案中，在VH或VL序列上进行至多十个突变例如取代，如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个突变例如取代。在本发明的一个实施方案中，在VH序列中进行至多10个突变或取代，并且在VL序列中不进行突变。在本发明的一个实施方案中，在VH序列中不进行突变，并且在VL序列中进行至多十个突变例如取代。在此，提供了允许在VH和VL序列上至多10个突变如取代的实施方案，其中突变如取代是保守的或涉及具有相似物理或功能性质的氨基酸，从而允许VH和VL序列内的突变例如取代而不改变抗DR5抗体的结合亲和力或功能。
在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。在本发明的一个实施方案中，该抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的。在本发明的一个优选的实施方案中，抗体是IgG1抗体。
在一个实施方案中，抗体为IgG1m(f)、IgG1m(z)、IgG1m(a)或IgG1m(x)同种异型或任何同种异型组合，如IgG1m(z,a)、IgG1m(z,a,x)、IgG1m(f,a)。在一个优选的实施方案中，抗体为IgG1m(f)。
在一个实施方案中，轻链是kappa轻链。在一个实施方案中，轻链是Km3同种异型。在一个实施方案中，抗体包含包括选自下组的氨基酸序列的Fc区：
a)SEQ ID NO:29；
b)SEQ ID NO:30；
c)SEQ ID NO:31；
d)SEQ ID NO:32或
e)如以上a)至d)的任一项中所定义的氨基酸序列，其任选地在所述序列上总共具有一至五个突变例如取代。
也就是说，在一个实施方案中，在Fc区上允许至多五个突变例如取代。在本发明的一些实施方案中，在Fc区上允许至多五个突变，例如取代，如一个、两个、三个、四个或五个突变例如取代。
在一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的抗DR5抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，其中LC包含SEQ ID NO:39的序列并且其中HC与如选自下组的HC序列中所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性：
a)(HC)SEQ ID NO:33；
b)(HC)SEQ ID NO:34；
c)(HC)SEQ ID NO:35；
d)(HC)SEQ ID NO:36；
e)(HC)SEQ ID NO:37；和
f)(HC)SEQ ID NO:38。
在一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的抗DR5抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，其中LC包含SEQ ID NO:39的序列并且其中HC与如(HC)SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的抗DR5抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，其中LC与SEQ ID NO:39中所示具有至少75％、80％、85％、90％、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性并且其中HC具有如选自下组的HC序列中所示的氨基酸序列：
a)(HC)SEQ ID NO:33；
b)(HC)SEQ ID NO:34；
c)(HC)SEQ ID NO:35；
d)(HC)SEQ ID NO:36；
e)(HC)SEQ ID NO:37；和
f)(HC)SEQ ID NO:38。
在一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的抗DR5抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，其中LC与SEQ ID NO:39中所示具有至少75％、80％、85％、90％、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性并且其中HC具有如f)(HC)SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，其中LC包含SEQ ID NO:39的序列并且其中HC包含选自下组的序列之一：
a)(HC)SEQ ID NO:33；
b)(HC)SEQ ID NO:34；
c)(HC)SEQ ID NO:35；
d)(HC)SEQ ID NO:36；
e)(HC)SEQ ID NO:37；和
f)(HC)SEQ ID NO:38；或
g)如以上a)至f)的任一项中所定义的(HC)，其在所述(HC)序列上总共具有一至十个突变。
也就是说，在一个实施方案中，在通过重链序列所定义的重链上允许总共至多10个突变如取代。在本发明的一些实施方案中，在重链序列上进行至多十个突变例如取代，如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个突变例如取代。在此，提供了允许在重链序列上至多10个突变如取代的实施方案，其中突变如取代是保守的或涉及具有相似物理或功能性质的氨基酸，从而允许重链序列内的突变或取代而不改变抗DR5抗体的结合亲和力或功能。
在一个实施方案中，抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，其中LC包含SEQ ID NO:39的序列并且其中HC包含SEQ ID NO:38的序列。
在一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的抗DR5抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，其中LC包含SEQ ID NO:43的序列并且其中HC与如选自下组的HC序列中所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性：
a)(HC)SEQ ID NO:40；
b)(HC)SEQ ID NO:41；和
c)(HC)SEQ ID NO:42。
在一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的抗DR5抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，其中LC包含SEQ ID NO:43的序列并且其中HC与如(HC)SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的抗DR5抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，其中LC与SEQ ID NO:43中所示具有至少75％、80％、85％、90％、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性并且其中HC具有如选自下组的HC序列中所示的氨基酸序列：
a)(HC)SEQ ID NO:40；
b)(HC)SEQ ID NO:41；和
c)(HC)SEQ ID NO:42。
在一个实施方案中，如本文公开的任何实施方案中所定义的抗DR5抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，其中LC与SEQ ID NO:43中所示具有至少75％、80％、85％、90％、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性并且其中HC具有如(HC)SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，其中LC包含SEQ ID NO:43的序列并且其中HC包含选自下组的序列之一：
a)(HC)SEQ ID NO:40；
b)(HC)SEQ ID NO:41；
c)(HC)SEQ ID NO:42；或
d)如以上a)至c)的任一项中所定义的(HC)，其在所述(HC)序列上总共具有一至十个突变例如取代。
也就是说，在一个实施方案中，在通过重链序列所定义的重链上允许总共至多10个突变如取代。在本发明的一些实施方案中，在重链序列上进行至多十个突变例如取代，如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个突变例如取代。在此，提供了允许在重链序列上至多10个突变如取代的实施方案，其中突变如取代是保守的或涉及具有相似物理或功能性质的氨基酸，从而允许重链序列内的突变或取代而不改变抗DR5抗体的结合亲和力或功能。
在一个实施方案中，抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，其中LC包含SEQ ID NO:43的序列并且其中HC包含SEQ ID NO:42的序列。
在一个实施方案中，抗体是人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
在一个实施方案中，抗体是抗DR5抗体，并且所述抗DR5抗体是激动性的。抗体是激动性的，应理解为抗体聚簇、刺激或激活DR5。在一个实施方案中，结合至DR5的本发明的激动性抗DR5抗体激活与结合至DR5的TRAIL相同的细胞内途径。一种或多种抗体的激动性活性可以通过将表达DR5的靶细胞如COLO 205细胞(ATCC CCL-222)或HCT 116细胞(ATCCCCL-247)与抗体浓度稀释系列(例如，从20,000ng/mL以5倍稀释至0.05ng/mL的最终浓度)温育3天来确定。可以在接种细胞时直接添加抗体(如实施例8、9、10、39中所述)，或者在添加抗体样品之前首先允许细胞粘附至96孔平底板(如实施例11、12、13、14、15、16、17、18、21、22、23、24、38、40、41、42、43、44、46、48中所述)。激动性活性，即激动性作用可以通过使用为此目的的专用试剂盒测量活细胞的量来定量，如Promega的CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法(Cat nr G7571)。
在一个实施方案中，抗体是抗DR5抗体，并且所述抗DR5抗体具有增强的激动性活性。抗DR5抗体具有活性，应理解为抗体能够聚簇DR5或激活至少与结合至DR5的TRAIL相同的细胞内途径。也就是说，与TRAIL或针对DR5的野生型IgG1抗体相比，具有增强的激动性活性的抗DR5抗体能够在表达DR5的细胞或组织中诱导凋亡或程序性细胞死亡的水平提高。
在一个实施方案中，抗体是抗DR5抗体，并且所述抗DR5抗体诱导靶细胞中的程序性细胞死亡。在本发明的一个实施方案中，抗DR5抗体诱导胱天蛋白酶依赖性细胞死亡。胱天蛋白酶依赖性细胞死亡可以通过激活胱天蛋白酶-3和/或胱天蛋白酶-7来诱导。在本发明的一个实施方案中，抗DR5抗体诱导胱天蛋白酶-3和/或胱天蛋白酶-7依赖性细胞死亡。在本发明的一个实施方案中，抗体诱导凋亡。可以使用方法如例如实施例19、20、25和45中所述的胱天蛋白酶-3/7激活测定法或实施例19和25中所述的磷脂酰丝氨酸暴露确定通过一种或多种激动性抗DR5抗体的凋亡。可以将处于例如1μg/mL的固定浓度的抗DR5抗体添加至贴壁细胞中，并温育1至24小时。可以通过使用为此目的的专用试剂盒确定胱天蛋白酶-3/7激活，如BD Pharmingen的PE活性胱天蛋白酶-3凋亡试剂盒(Cat nr 550914)(实施例19和25)或Promega的胱天蛋白酶-Glo 3/7测定法(Cat nr G8091)(实施例20和45)。可以通过使用为此目的的专用试剂盒确定磷脂酰丝氨酸的暴露和细胞死亡，如来自BD Pharmingen的FITC膜联蛋白V凋亡检测试剂盒I(Cat nr 556547)(实施例19和25)。
在一个实施方案中，抗体是抗DR5抗体，并且所述抗DR5抗体诱导磷脂酰丝氨酸(PS)暴露，其可以通过膜联蛋白V结合来测量。在本发明的一个实施方案中，抗DR5诱导PS易位至靶细胞的细胞表面。因此，膜联蛋白V结合与程序性细胞死亡相关，并且可以用于测量抗DR5抗体诱导导致程序性细胞死亡的细胞事件的能力。
在一个优选的实施方案中，抗体是抗DR5抗体，其在表达DR5的靶细胞如肿瘤细胞中诱导凋亡。
在一个实施方案中，抗体是降低细胞存活力的抗DR5抗体。
在一个实施方案中，抗体是诱导DR5聚簇的抗DR5抗体。抗体可以诱导聚簇甚至增强聚簇导致至少与结合至DR5的TRAIL相同的细胞内信号传导途径的激活。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含抗DR5抗体，并诱导、触发、增加或增强表达DR5的癌细胞或癌细胞组织中的凋亡或细胞死亡。可以通过暴露于本发明的一种或多种抗DR5抗体或用本发明的一种或多种抗DR5抗体处理的细胞上的磷脂酰丝氨酸暴露的增加或增强的水平来测量增加或增强的凋亡或细胞死亡。或者，可以通过测量已经暴露于本发明的一种或多种抗DR5抗体或用本发明的一种或多种抗DR5抗体处理的细胞中的胱天蛋白酶3或胱天蛋白酶7的激活来测量增加或增强的凋亡或细胞死亡。或者，与未经处理的细胞培养物相比，可以通过已经暴露于本发明的一种或多种抗DR5抗体或用本发明的一种或多种抗DR5抗体处理的细胞培养物中存活力的丧失来测量增加或增强的凋亡或细胞死亡。可以通过证实暴露于DR5抗体后胱天蛋白酶抑制剂(例如ZVAD)对存活力丧失的抑制来对胱天蛋白酶介导的凋亡的诱导进行评价。
在本发明的一个实施方案中，本发明的药物组合物中的抗体是抗DR5抗体，其参与表达DR5的靶细胞上抗体的寡聚化如六聚化。寡聚化如六聚化是通过Fc-Fc相互作用介导的。确定其的一种方法是通过抑制表明抗体寡聚化例如六聚化的Fc-Fc相互作用。Fc-Fc相互作用可以通过与参与Fc-Fc相互作用的疏水性斑块(patch)如DCAWHLGELVWCT结合的肽来抑制，如实施例15中所述。
通过引入携带编码抗体链的序列的表达载体，可以在宿主细胞中重组产生待配制在本发明的药物组合物中的抗体。在本发明的上下文中，表达载体可以是任何合适的载体，包括染色体的、非染色体的和合成的核酸载体(包含合适的表达控制元件组的核酸序列)。此类载体的实例包括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，以及病毒核酸(RNA或DNA)载体。在一个实施方案中，编码人源化CD3抗体的核酸包含在裸露的DNA或RNA载体中，所述裸露的DNA或RNA载体包括例如线性表达元件(如例如Sykes and Johnston,Nat Biotech 17,355-59(1997)中所述)、紧密的核酸载体(compacted nucleic acid vector)(如例如US 6,077,835和/或WO 00/70087中所述)、质粒载体如pBR322、pUC 19/18或pUC 118/119，“midge”最小尺寸的核酸载体(如例如Schakowski等,Mol Ther 3,793-800(2001)中所述)，或作为沉淀的核酸载体构建体如CaPO4 -沉淀的构建体(如例如WO 00/46147，Benvenisty and Reshef,PNAS USA 83,9551-55(1986)，Wigler等、Cell 14,725(1978)和Coraro and Pearson,Somatic Cell Genetics7,603(1981)中所述)。此类核酸载体及其用途是本领域众所周知的(参见例如US 5,589,466和US 5,973,972)。
核酸和/或载体还可以包含编码分泌/定位序列的核酸序列，其可以将多肽(如新生多肽链)靶向周质空间或进入细胞培养基。此类序列是本领域已知的，并且包括分泌前导或信号肽、靶向细胞器的序列(例如，核定位序列、ER保留信号、线粒体转运序列、叶绿体转运序列)、膜定位/锚序列(例如，终止转移序列、GPI锚序列)等。
在本发明的表达载体中，编码抗体的核酸以及第一和第二多肽核酸可以包含任何合适的启动子、增强子和其他表达促进元件或与之相关。此类元件的实例包括强表达启动子(例如人CMV IE启动子/增强子以及RSV、SV40、SL3-3、MMTV和HIV LTR启动子)、有效的poly(A)终止序列、大肠杆菌中质粒产物的复制起点、作为选择性标志物的抗生素抗性基因和/或便利的克隆位点(例如，多接头)。核酸还可以包含与组成型启动子如CMV IE相反的诱导型启动子(技术人员将认识到，此类术语实际上是在某些条件下基因表达程度的描述符)。
可以通过使用重组真核或原核宿主细胞来产生抗体。宿主细胞的实例包括酵母、细菌和哺乳动物细胞，如CHO或HEK-293细胞。例如，宿主细胞可以包含稳定整合到细胞基因组中的核酸，所述核酸包含编码用于表达本文所述的抗体的序列。宿主细胞可以包含稳定整合到细胞基因组中的核酸，所述核酸包含编码用于表达本文所述的第一或第二多肽的序列。或者，宿主细胞可以包含非整合核酸，如质粒、粘粒、噬菌粒或线性表达元件，其包含编码用于表达本文所述的抗体的序列。
在本发明的药物组合物中配制的双特异性抗体
另一方面，本发明的药物组合物包含双特异性抗体，其包含至少一个与人DR5结合的抗原结合区，如本文所述。
另一方面，本发明的药物组合物包含双特异性抗体，其包含一个或多个与人DR5结合的抗原结合区，如本文所述。
在本文的一个实施方案中，双特异性抗体包含与人DR5结合的第一抗原结合区和第二抗原结合区，如本文所定义。
在一个此类实施方案中，双特异性抗体包含第一和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区和所述第二抗原结合区结合人DR5上的不同表位。
在另一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第二抗原结合区，其中与人DR5结合的所述第一抗原结合区不阻断与人DR5结合的所述第二抗原结合区的结合。
在一个实施方案中，双特异性抗DR5抗体包含第一和第二Fc区，其中第一和/或第二Fc区包含对应于根据本发明的EU编号的人IgG1中E430、E345或S440的位置处的氨基酸的突变。在一个实施方案中，双特异性抗DR5抗体包含第一和第二Fc区，其中第一和第二Fc区包含对应于EU编号的人IgG1中E430、E345或S440的位置处的氨基酸的突变。在一个实施方案中，双特异性抗DR5抗体包含第一和第二Fc区，其中第一Fc区包含对应于EU编号的人IgG1中E430、E345或S440的位置处的氨基酸的突变。在一个实施方案中，双特异性抗DR5抗体包含第一和第二Fc区，其中第二Fc区包含对应于EU编号的人IgG1中E430、E345或S440的位置处的氨基酸的突变。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含以下六个CDR序列，
a)(VH)SEQ ID NO:1、2、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6，并且所述第二抗原结合区包含以下六个CDR序列，
b)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，或者其中所述第一抗原结合区和所述第二抗原结合区包含，
c)以上(a)或(b)中所定义的六个CDR序列，其分别在所述六个CDR序列中具有总共一至五个突变或取代。
也就是说，抗原结合区的六个CDR序列中的一个或多个突变或取代不改变所述第一或第二抗体的结合特征，如激动性特性、DR5表位结合和/或诱导表达DR5的靶细胞中凋亡的能力。也就是说，在一个实施方案中，在包含抗原结合区的六个CDR上允许总共至多五个突变或取代。在本发明的一些实施方案中，在VH区的三个CDR上进行至多五个突变或取代，如一个、两个、三个、四个或五个突变或取代，并且在VL区的CDR上不进行突变。在其他实施方案中，在VH区的CDR上不进行突变或取代，但在VL区的CDR上发现至多五个突变或取代，如一个、两个、三个、四个或五个。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含以下六个CDR序列，
a)所述第一抗原结合区包含以下六个CDR序列(VH)SEQ ID NO:1、2、3和(VL)SEQID NO:5、FAS、6，并且所述第二抗原结合区包含以下六个CDR序列(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，或者其中所述第一抗原结合区和所述第二抗原结合区包含，b)(a)中所定义的六个CDR序列，其分别在每个第一和第二抗原结合区的所述六个CDR序列中具有总共一至五个突变例如取代。
也就是说，抗原结合区的六个CDR序列中的一个或多个突变例如取代不改变所述第一或第二抗体的结合特征，如激动性特性、DR5表位结合和/或诱导表达DR5的靶细胞中凋亡的能力。也就是说，在一个实施方案中，在包含抗原结合区的六个CDR上允许总共至多五个突变例如取代。在本发明的一些实施方案中，在VH区的三个CDR上进行至多五个突变例如取代，如一个、两个、三个、四个或五个突变或取代，并且在VL区的CDR上不进行突变。在其他实施方案中，在VH区的CDR上不进行突变例如取代，但在VL区的CDR上发现至多五个突变例如取代，如一个、两个、三个、四个或五个。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含以下六个CDR序列，
a)(VH)SEQ ID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6，并且所述第二抗原结合区包含以下六个CDR序列，
b)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，或者其中所述第一抗原结合区和所述第二抗原结合区包含，
c)以上(a)或(b)中所定义的六个CDR序列，其分别在所述六个CDR序列中具有总共一至五个突变或取代。
也就是说，抗原结合区的六个CDR序列中的一个或多个突变或取代不改变所述第一或第二抗体的结合特征，如激动性特性、DR5表位结合和/或诱导表达DR5的靶细胞中凋亡的能力。也就是说，在一个实施方案中，在包含抗原结合区的六个CDR上允许总共至多五个突变或取代。在本发明的一些实施方案中，在VH区的三个CDR上进行至多五个突变或取代，如一个、两个、三个、四个或五个突变或取代，并且在VL区的CDR上不进行突变。在其他实施方案中，在VH区的CDR上不进行突变或取代，但在VL区的CDR上发现至多五个突变或取代，如一个、两个、三个、四个或五个。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第二抗原结合区，其中a)所述第一抗原结合区包含以下六个CDR序列(VH)SEQ ID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6，并且所述第二抗原结合区包含以下六个CDR序列(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，或者其中所述第一抗原结合区和所述第二抗原结合区包含b)(a)中所定义的六个CDR序列，其分别在每个抗原结合区的所述六个CDR序列中具有总共一至五个突变或取代。也就是说，抗原结合区的六个CDR序列中的一个或多个突变例如取代不改变所述第一或第二抗体的结合特征，如激动性特性、DR5表位结合和/或诱导表达DR5的靶细胞中凋亡的能力。也就是说，在一个实施方案中，在包含抗原结合区的六个CDR上允许总共至多五个突变例如取代。在本发明的一些实施方案中，在VH区的三个CDR上进行至多五个突变例如取代，如一个、两个、三个、四个或五个突变例如取代，并且在VL区的CDR上不进行突变。在其他实施方案中，在VH区的CDR上不进行突变或取代，但在VL区的CDR上发现至多五个突变例如取代，如一个、两个、三个、四个或五个。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含以下六个CDR序列，
a)(VH)SEQ ID NO:16、17、18和(VL)SEQ ID NO:21、GAS、6，并且所述第二抗原结合区包含以下六个CDR序列，
b)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，或者其中所述第一抗原结合区和所述第二抗原结合区包含，
c)以上a)或b)中所定义的六个CDR序列，其分别在所述六个CDR序列中具有总共一至五个突变或取代。
也就是说，抗原结合区的六个CDR序列中的一个或多个突变或取代不改变所述第一或第二抗体的结合特征，如激动性特性、DR5表位结合和/或诱导表达DR5的靶细胞中凋亡的能力。也就是说，在一个实施方案中，在包含抗原结合区的六个CDR上允许总共至多五个突变或取代。在本发明的一些实施方案中，在VH区的三个CDR上进行至多五个突变或取代，如一个、两个、三个、四个或五个突变或取代，并且在VL区的CDR上不进行突变。在其他实施方案中，在VH区的CDR上不进行突变或取代，但在VL区的CDR上发现至多五个突变或取代，如一个、两个、三个、四个或五个。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第二抗原结合区，其中，
a)所述第一抗原结合区包含以下六个CDR序列(VH)SEQ ID NO:16、17、18和(VL)SEQ ID NO:21、GAS、6，并且所述第二抗原结合区包含以下六个CDR序列(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，或
b)所述第一抗原结合区和所述第二抗原结合区包含a)中所定义的六个CDR序列，其在每个抗原结合区的所述六个CDR序列中具有总共一至五个突变例如取代。
也就是说，每个抗原结合区的六个CDR序列中的一个或多个突变例如取代不改变所述第一或第二抗体的结合特征，如激动性特性、DR5表位结合和/或诱导表达DR5的靶细胞中凋亡的能力。也就是说，在一个实施方案中，在包含抗原结合区的六个CDR上允许总共至多五个突变例如取代。在本发明的一些实施方案中，在VH区的三个CDR上进行至多五个突变例如取代，如一个、两个、三个、四个或五个突变例如取代，并且在VL区的CDR上不进行突变。在其他实施方案中，在VH区的CDR上不进行突变例如取代，但在VL区的CDR上发现至多五个突变例如取代，如一个、两个、三个、四个或五个。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含以下序列(a)(VH)CDR1 SEQ ID NO 1、CDR2 SEQ ID NO 8、CDR3 SEQ ID NO 3以及(VL)CDR1 SEQ ID NO 5、CDR2 FAS、CDR3SEQ ID NO 6，或b)如以上(a)中所定义的(VH)CDR1、CDR2和CDR3以及(VL)CDR1、CDR2和CDR3，其在所述六个CDR序列中总共具有一至五个突变，并且其中所述第二抗原结合区包含以下序列(c)(VH)CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2 SEQID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 11以及(VL)CDR1 SEQ ID NO 13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO14，或(d)如以上(c)中所定义的(VH)CDR1、CDR2和CDR3以及(VL)CDR1、CDR2和CDR3，其在所述六个CDR序列中具有总共一至五个突变。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第二抗原结合区，其中(a)所述第一抗原结合区包含以下序列(VH)CDR1 SEQ ID NO 1、CDR2 SEQ ID NO 8、CDR3 SEQ ID NO 3以及(VL)CDR1 SEQ ID NO 5、CDR2 FAS、CDR3SEQ ID NO 6，并且所述第二抗原结合区包含以下序列(VH)CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2 SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 11以及(VL)CDR1SEQ ID NO 13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO 14，或b)所述第一抗原结合区或所述第二抗原结合区在每个抗原结合区的所述六个CDR序列中总共包含一至五个突变。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含以下序列(a)(VH)CDR1 SEQ ID NO 1、CDR2 SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 3以及(VL)CDR1 SEQ ID NO 5、CDR2 FAS、CDR3 SEQ ID NO 6，或(b)如以上(a)中所定义的(VH)CDR1、CDR2和CDR3以及(VL)CDR1、CDR2和CDR3，其在所述六个CDR序列中总共具有一至五个突变，并且其中所述第二抗原结合区包含以下序列(c)(VH)CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 11以及(VL)CDR1 SEQ ID NO 13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ IDNO 14，或(d)如以上(c)中所定义的(VH)CDR1、CDR2和CDR3以及(VL)CDR1、CDR2和CDR3，其在所述六个CDR序列中总共具有一至五个突变。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第二抗原结合区，其中(a)所述第一抗原结合区包含以下序列(VH)CDR1 SEQ ID NO 1、CDR2 SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 3以及(VL)CDR1 SEQ ID NO 5、CDR2 FAS、CDR3 SEQ ID NO 6，并且所述第二抗原结合区包含以下序列(VH)CDR1 SEQ ID NO10、CDR2 SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 11以及(VL)CDR1SEQ ID NO 13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO 14，或b)所述第一抗原结合区或所述第二抗原结合区在每个抗原结合区的所述六个CDR序列中总共包含一至五个突变。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含以下序列(a)(VH)CDR1 SEQ ID NO 16、CDR2 SEQ ID NO 17、CDR3 SEQ ID NO18以及(VL)CDR1 SEQ ID NO 21、CDR2 GAS、CDR3 SEQ ID NO 22，或(b)如以上(a)中所定义的(VH)CDR1、CDR2和CDR3以及(VL)CDR1、CDR2和CDR3，其在所述六个CDR序列中总共具有一至五个突变，并且其中所述第二抗原结合区包含以下序列(c)(VH)CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2 SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 11以及(VL)CDR1 SEQ ID NO 13、CDR2 RTS、CDR3 SEQID NO 14，或(d)如以上(c)中所定义的(VH)CDR1、CDR2和CDR3以及(VL)CDR1、CDR2和CDR3，其在所述六个CDR序列中总共具有一至五个突变。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第二抗原结合区，其中(a)所述第一抗原结合区包含以下序列(VH)CDR1 SEQ ID NO 16、CDR2 SEQ ID NO 17、CDR3 SEQ ID NO18以及(VL)CDR1 SEQ ID NO 21、CDR2 GAS、CDR3 SEQ ID NO 22，并且所述第二抗原结合区包含以下序列(VH)CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2 SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 11以及(VL)CDR1 SEQ ID NO 13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO 14，或b)所述第一抗原结合区或所述第二抗原结合区在每个抗原结合区的所述六个CDR序列中总共包含一至五个突变。
如果抗体是包含包括第一和第二重链的Fc区的双特异性抗体，则根据本发明的突变，即对应于EU编号的人IgG1中E430、E345或S440的位置中的突变可以原则上仅存在于重链之一中；即，在第一或第二重链中，尽管在根据本发明的优选实施方案中，突变存在于双特异性抗体的第一和第二重链两者中。
在一个具体的实施方案中，抗体可以是双特异性抗体，如WO 11/131746中所述的异源二聚体蛋白，其在此通过引用并入本文。
在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体，其包含包括免疫球蛋白的第一Fc区和第一抗原结合区的第一重链，以及包括免疫球蛋白的第二Fc区和第二抗原结合区的第二重链，其中第一和第二抗原结合区结合相同抗原上或不同抗原上的不同表位。
在进一步的实施方案中，所述包含第一Fc区的第一重链包含选自对应于人IgG1重链的Fc区中的K409、T366、L368、K370、D399、F405和Y407的位置的位置处的另外的氨基酸取代；并且其中所述包含第二Fc区的第二重链包含选自对应于人IgG1重链的Fc区中的F405、T366、L368、K370、D399、Y407和K409的位置的位置处的另外的氨基酸取代，并且其中所述包含第一Fc区的第一重链中另外的氨基酸取代与所述包含第二Fc区的第二重链中另外的氨基酸取代不同。
在进一步的实施方案中，所述包含第一Fc区的第一重链包含对应于人IgG1重链的Fc区中的K409的位置处的氨基酸取代；并且其中所述包含第二Fc区的第二重链包含对应于人IgG1重链的Fc区中的F405的位置处的氨基酸取代。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含引入第一和第二Fc区，其包含在选自对应于以下的那些氨基酸残基的至少一个氨基酸残基中的突变：人IgG1重链的Fc区中E345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436和K447，条件是S440中的突变是S440Y或S440W。
在进一步的实施方案中，在第一和第二Fc区中的至少一个氨基酸残基中的突变可以位于相同氨基酸残基位置或不同位置，所述氨基酸残基选自对应于人IgG1重链的Fc区中E345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436和K447的那些，条件是S440中的突变是S440Y或S440W。在进一步的实施方案中，它在第一和第二Fc区中相同氨基酸残基位置中可以是相同或不同的突变。
在另一个实施方案中，双特异性抗体包含第一或第二CH2-CH3区，其在至少一个氨基酸残基中包含突变，所述氨基酸残基选自对应于人IgG1重链的Fc区中E345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436和K447的那些，条件是S440中的突变是S440Y或S440W。
在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一和第二重链，其中所述第一重链包含对应于根据EU编号的人IgG1中F405L的突变，并且所述第二重链包含对应于根据EU编号的人IgG1中K409R的突变。
包含两种或更多种抗体的本发明的组合物
一方面，本发明涉及包含两种或更多种抗体的药物组合物，其中至少一种抗体是包含人免疫球蛋白G的Fc区和抗原结合区的抗体，其中Fc区包含对应于EU编号的人IgG1中E430、E345或S440的位置处的氨基酸的突变。
在本发明的一个实施方案中，包含两种或更多种抗体的药物组合物，其中至少一种抗体是包含人免疫球蛋白G的Fc区和抗原结合区的抗体，其中Fc区包含对应于EU编号的人IgG1中E430、E345或S440的位置处的氨基酸的突变，条件是S440中的突变是S440Y或S440W。
在进一步的实施方案中，本发明的药物组合物包含两种不同的抗体，其中两种抗体均包含人免疫球蛋白G的Fc区和抗原结合区，其中Fc区包含对应于EU编号的人IgG1中E430、E345或S440的位置处的氨基酸的突变。
在进一步的实施方案中，本发明的药物组合物包含两种不同的抗体，其中两种抗体均包含人免疫球蛋白G的Fc区和抗原结合区，其中Fc区包含对应于EU编号的人IgG1中E430、E345或S440的位置处的氨基酸的突变，条件是S440中的突变是S440Y或S440W。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含如本文所述的第一抗DR5抗体和第二抗DR5抗体。也就是说，在本发明的一个实施方案中，组合物包含如本文所述的第一抗体和如本文所述的第二抗体，其中第一和第二抗体不相同。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一Fc区并且在第一Fc区中包含对应于EU编号的人IgG1中E430的位置处的突变的第一抗DR5抗体，以及具有第二Fc区并且在第二Fc区中包含对应于EU编号的人IgG1中E430的位置处的突变的第二抗DR5抗体，其中第一和第二抗体结合DR5上的不同表位。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一Fc区并且在第一Fc区中包含对应于EU编号的人IgG1中E430的位置处的突变的第一抗DR5抗体，以及具有第二Fc区并且在第二Fc区中包含对应于EU编号的人IgG1中E430的位置处的突变的第二抗DR5抗体，其中第一抗体不阻断第二抗体与DR5的结合。如实施例7中所述，可以在夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)中确定一种抗DR5抗体对另一种抗DR5抗体的阻断。简言之，抗DR5抗体的交叉阻断可以通过以下步骤确定：a)将2μg/ml的第一抗DR5抗体包被在96孔平底ELISA板上，然后b)用PBSA封闭，并在PBST中洗涤板，然后c)将板与0.2μg/ml DR5EDCD-FcHistag和1μg/ml的第二抗DR5抗体温育，然后d)在PBST中洗涤，并将板与抗His标签抗体温育，然后e)洗涤板，并将板与poly-HRP温育，然后f)将板与2,2’-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)温育，然后g)通过添加2％草酸停止底物反应，然后h)在ELISA读取器上测量405nm处的荧光。一种抗DR5抗体是否阻断另一种抗DR5抗体与DR5的结合可以通过以下公式计算(％抑制＝100–[(存在竞争抗体情况下的结合/不存在竞争抗体情况下的结合)]*100)。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一和第二Fc区的第一和第二抗DR5抗体，其在第一和第二Fc区中包含对应于EU编号的人IgG1中E430的位置处的突变，此类突变可以选自下组：E430G、E430S和E430T。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一Fc区并包含E430G突变的第一抗DR5抗体和具有第二Fc区并包含E430G突变的第二抗DR5抗体，其中所述第一和第二抗体结合DR5上的不同表位。可以通过使用如实施例6中所述的经域交换的DR5分子的方法来确定本发明的抗体的人DR5上的细胞外域上的表位或结合区。简言之，经域交换的DR5分子得以在CHO细胞中瞬时表达，通过FACS测定法确定抗体与经域交换的人DR5分子的结合。与经域交换的人DR5分子的结合丧失表明人DR5的经交换的域含有一个或多个涉及与抗体结合的氨基酸。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一Fc区的第一抗DR5抗体和具有第二Fc区的第二抗DR5抗体，其中第一抗DR5抗体包含以下六个CDR序列：
a)(VH)SEQ ID NO:1、2、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6并且
所述第二抗DR5抗体包含以下六个CDR序列：
b)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，
优选地，其中所述第一抗DR5抗体和所述第二抗DR5抗体在第一和第二Fc区中包含对应于人IgG1中E430的位置处的突变。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一Fc区的第一抗DR5抗体和具有第二Fc区的第二抗DR5抗体，其中第一抗DR5抗体包含以下六个CDR序列：
a)(VH)SEQ ID NO:1、2、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6并且
所述第二抗DR5抗体包含以下六个CDR序列：
b)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，
其中所述第一抗DR5抗体和所述第二抗DR5抗体在第一和第二Fc区中包含E430G突变。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一Fc区的第一抗DR5抗体和具有第二Fc区的第二抗DR5抗体，其中第一抗DR5抗体包含以下六个CDR序列：
a)(VH)SEQ ID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6并且
所述第二抗DR5抗体包含以下六个CDR序列，
b)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，
其中所述第一抗DR5抗体和所述第二抗DR5抗体优选在第一和第二Fc区中包含对应于人IgG1中E430的位置处的的突变。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一Fc区的第一抗DR5抗体和具有第二Fc区的第二抗DR5抗体，其中第一抗DR5抗体包含以下六个CDR序列，
a)(VH)SEQ ID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6并且所述第二抗DR5抗体包含以下六个CDR序列，
b)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，
其中所述第一抗DR5抗体和所述第二抗DR5抗体在第一和第二Fc区中包含E430G突变。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有Fc区并且在Fc区中包含对应于EU编号的人IgG1中E345的位置处的突变的第一抗DR5抗体，以及具有Fc区并且在Fc区中包含对应于EU编号的人IgG1中E345的位置处的突变的第二抗DR5抗体，其中第一和第二抗体结合DR5上的不同表位。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有Fc区并且在Fc区中包含对应于EU编号的人IgG1中E345的位置处的突变的第一抗DR5抗体，以及具有Fc区并且包含对应于EU编号的人IgG1中E345的位置中的突变的第二抗DR5抗体，其中第一抗体不阻断第二抗体与DR5的结合。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一和第二Fc区并且在第一和第二Fc区中包含对应于E345的位置处的突变的第一和第二抗DR5抗体，此类突变可以选自下组：E345K、E345Q、E345R和E345Y。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一Fc区并且包含E345K的第一抗DR5抗体和具有第二Fc区并且包含E345K突变的第二抗DR5抗体，其中第一抗体和第二抗体结合DR5上的不同表位。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一Fc区的第一抗DR5抗体和具有第二Fc区的第二抗DR5抗体，其中第一抗DR5抗体包含以下六个CDR序列，
a)(VH)SEQ ID NO:1、2、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6并且所述第二抗DR5抗体包含以下六个CDR序列，
b)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，并且其中所述第一抗DR5抗体和所述第二抗DR5抗体在第一和第二Fc区中包含对应于人IgG1中E345的位置处的突变。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一Fc区的第一抗DR5抗体和具有第二Fc区的第二抗DR5抗体，其中所述第一抗DR5抗体包含以下六个CDR序列(VH)SEQID NO:1、2、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6并且所述第二抗DR5抗体包含以下六个CDR序列(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，并且其中所述第一抗DR5抗体和所述第二抗DR5抗体在第一和第二Fc区中包含对应于EU编号的人IgG1中E345的位置处的突变。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一Fc区的第一抗DR5抗体和具有第二Fc区的第二抗DR5抗体，其中第一抗DR5抗体包含以下六个CDR序列，
a)(VH)SEQ ID NO:1、2、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6并且所述第二抗DR5抗体包含以下六个CDR序列，
b)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，并且其中所述第一抗DR5抗体和所述第二抗DR5抗体在第一和第二Fc区中包含E345K突变。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一Fc区的第一抗DR5抗体和具有第二Fc区的第二抗DR5抗体，其中所述第一抗DR5抗体包含以下六个CDR序列(VH)SEQID NO:1、2、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6并且所述第二抗DR5抗体包含以下六个CDR序列(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，并且其中所述第一抗DR5抗体和所述第二抗DR5抗体在第一和第二Fc区中包含E345K突变。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一Fc区的第一抗DR5抗体和具有第二Fc区的第二抗DR5抗体，其中第一抗DR5抗体包含以下六个CDR序列，
a)(VH)SEQ ID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6并且所述第二抗DR5抗体包含以下六个CDR序列，
b)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，并且其中所述第一抗DR5抗体和所述第二抗DR5抗体在第一和第二Fc区中包含对应于E345的位置处的突变。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一Fc区的第一抗DR5抗体和具有第二Fc区的第二抗DR5抗体，其中所述第一抗DR5抗体包含以下六个CDR序列(VH)SEQID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6并且所述第二抗DR5抗体包含以下六个CDR序列(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，并且其中所述第一抗DR5抗体和所述第二抗DR5抗体在第一和第二Fc区中包含对应于EU编号的人IgG1中E345的位置处的突变。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一Fc区的第一抗DR5抗体和具有第二Fc区的第二抗DR5抗体，其中第一抗DR5抗体包含以下六个CDR序列，
a)(VH)SEQ ID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6并且所述第二抗DR5抗体包含以下六个CDR序列，
b)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，并且其中所述第一抗DR5抗体和所述第二抗DR5抗体在第一和第二Fc区中包含E345K突变。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一Fc区的第一抗DR5抗体和具有第二Fc区的第二抗DR5抗体，其中所述第一抗DR5抗体包含以下六个CDR序列(VH)SEQID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6并且所述第二抗DR5抗体包含以下六个CDR序列(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，并且其中所述第一抗DR5抗体和所述第二抗DR5抗体在第一和第二Fc区中包含E345K突变。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一和第二Fc区并且在第一和第二Fc区中包含对应于EU编号的人IgG1中S440的位置处的突变的第一和第二抗DR5抗体，此类突变可以选自下组：S440W和S440Y。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一Fc区的第一抗DR5抗体和具有第二Fc区的第二抗DR5抗体，其中所述第一抗DR5抗体包含以下六个CDR序列(VH)SEQID NO:1、2、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6并且所述第二抗DR5抗体包含以下六个CDR序列(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，并且其中所述第一抗DR5抗体和所述第二抗DR5抗体在第一和第二Fc区中包含S440Y突变。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一Fc区的第一抗DR5抗体和具有第二Fc区的第二抗DR5抗体，其中所述第一抗DR5抗体包含以下六个CDR序列(VH)SEQID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6并且所述第二抗DR5抗体包含以下六个CDR序列(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，并且其中所述第一抗DR5抗体和所述第二抗DR5抗体在第一和第二Fc区中包含S440Y突变。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含具有第一Fc区的第一抗DR5抗体和具有第二Fc区的第二抗DR5抗体，其中第一抗体和第二抗体在第一和第二Fc区中包含对应于EU编号的人IgG1中K439E或S440K另外的六聚化抑制突变。在本发明的一个实施方案中，组合物包含具有第一和第二Fc区的第一和第二抗DR5抗体，其中第一和第二抗DR5抗体在第一和第二Fc区包含对应于EU编号的人IgG1中E430、E345或S440的氨基酸位置处的六聚体增强突变，并且其中第一抗体包含对应于K439的位置处的氨基酸中的另外的突变，并且其中第二抗体包含对应于S440的位置处的氨基酸中的另外的突变，条件是另外的突变在S440中时，六聚化增强突变不在S440中。也就是说，在本发明的一个实施方案中，组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中第一抗DR5抗体包含六聚化增强突变如E430G和K439E，并且其中第二抗DR5抗体包含六聚体增强突变如E430G和S440K。也就是说，在本发明的一个实施方案中，组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中第一抗DR5抗体包含六聚化增强突变如E345K和K439E，并且其中第二抗DR5抗体包含六聚化增强突变如E345K和S440K。在此，提供了允许在其中包含K439E突变的抗体和包含S440K突变的抗体的组合之间排他性发生六聚化的组合物的实施方案。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含结合人DR5上不同表位的第一抗DR5抗体和第二抗DR5抗体。在本发明的一个实施方案中，组合物包含第一抗DR5抗体，其包含与DR5上的表位结合的抗原结合区，所述表位包含或需要位于氨基酸残基116-138内的一个或多个氨基酸残基和位于SEQ ID NO:46的氨基酸残基139-166内一个或多个氨基酸残基，以及第二抗DR5抗体，其包含与DR5上的表位结合的抗原结合区，所述表位包含或需要位于SEQID NO:46的氨基酸残基79-138内一个或多个氨基酸残基。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含与DR5结合的所述第一抗DR5抗体，其不阻断所述第二抗DR5抗体与DR5的结合。也就是说，在本发明的一个实施方案中，组合物包含与DR5结合的第一抗DR5抗体和与DR5结合的第二抗DR5抗体，其中第一和第二抗DR5抗体不竞争与DR5的结合。因此，在本发明的上下文中应理解，不阻断第二抗DR5抗体结合的第一抗DR5抗体可以与不与第二抗DR5抗体竞争的第一抗DR5抗体相同。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一抗体包含包括六个CDR序列的VH区和VL区，其中六个CDR序列与如下所示的CDR序列总共具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％或至少99％的氨基酸序列同一性：a)(VH)SEQID NO:1、2、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6；并且所述第二抗体包含包括六个CDR序列的VH区和VL区，其中六个CDR序列与如下所示的CDR序列总共具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％或至少99％的氨基酸序列同一性：b)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14。在其一个实施方案中，所述第一抗体和所述第二抗体的六个CDR序列的序列同一性总共为至少85％、90％、95％、97％或99％。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一抗体包含以下六个CDR序列，
a)(VH)SEQ ID NO:1、2、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6，并且所述第二抗体包含以下六个CDR序列，
b)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，或者其中所述第一抗体和所述第二抗体包含，
c)以上(a)或(b)中所定义的六个CDR序列，其分别在所述六个CDR序列中具有总共一至五个突变或取代。
也就是说，抗原结合区的六个CDR序列中的一个或多个突变或取代不改变所述第一或第二抗体的结合特征，如激动性特性、DR5表位结合和/或诱导表达DR5的靶细胞中凋亡的能力。也就是说，在一个实施方案中，在包含抗原结合区的六个CDR上允许总共至多五个突变或取代。在本发明的一些实施方案中，在VH区的三个CDR上进行至多五个突变或取代，如一个、两个、三个、四个或五个突变或取代，并且在VL区的CDR上不进行突变。在其他实施方案中，在VH区的CDR上不进行突变或取代，但在VL区的CDR上发现至多五个突变或取代，如一个、两个、三个、四个或五个。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中
a)所述第一抗体包含以下六个CDR序列(VH)SEQ ID NO:1、2、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6，并且所述第二抗体包含以下六个CDR序列(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ IDNO:13、RTS、14，或者其中
b)所述第一抗体和所述第二抗体包含(a)中所定义每个抗体的六个CDR序列，或分别在所述六个CDR序列中包含总共一至五个突变例如取代。
也就是说，抗原结合区的六个CDR序列中的一个或多个突变例如取代不改变所述第一或第二抗体的结合特征，如激动性特性、DR5表位结合和/或诱导表达DR5的靶细胞中凋亡的能力。也就是说，在一个实施方案中，在包含抗原结合区的六个CDR上允许总共至多五个突变例如取代。在本发明的一些实施方案中，在VH区的三个CDR上进行至多五个突变例如取代，如一个、两个、三个、四个或五个突变或取代，并且在VL区的CDR上不进行突变。在其他实施方案中，在VH区的CDR上不进行突变例如取代，但在VL区的CDR上发现至多五个突变例如取代，如一个、两个、三个、四个或五个。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一抗体包含包括六个CDR序列的VH区和VL区，其中六个CDR序列与如下所示的CDR序列总共具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％或至少99％的氨基酸序列同一性：a)(VH)SEQID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS；并且所述第二抗体包含包括六个CDR序列的VH区和VL区，其中六个CDR序列与如下所示的CDR序列总共具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％或至少99％的氨基酸序列同一性：b)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14。在其一个实施方案中，所述第一抗体和所述第二抗体的六个CDR序列的序列同一性总共为至少85％、90％、95％、97％或99％。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中
a)所述第一抗体包含以下六个CDR序列，(VH)SEQ ID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6，并且所述第二抗体包含以下六个CDR序列(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ IDNO:13、RTS、14，或者其中
b)所述第一抗体和所述第二抗体包含a)中所定义的六个CDR序列，其分别在所述六个CDR序列中具有总共一至五个突变或取代。
也就是说，抗原结合区的六个CDR序列中的一个或多个突变或取代不改变所述第一或第二抗体的结合特征，如激动性特性、DR5表位结合和/或诱导表达DR5的靶细胞中凋亡的能力。也就是说，在一个实施方案中，在包含抗原结合区的六个CDR上允许总共至多五个突变或取代。在本发明的一些实施方案中，在VH区的三个CDR上进行至多五个突变或取代，如一个、两个、三个、四个或五个突变或取代，并且在VL区的CDR上不进行突变。在其他实施方案中，在VH区的CDR上不进行突变或取代，但在VL区的CDR上发现至多五个突变或取代，如一个、两个、三个、四个或五个。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中
a)所述第一抗体包含以下六个CDR序列(VH)SEQ ID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6，并且所述第二抗体包含以下六个CDR序列(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ IDNO:13、RTS、14，或者其中b)所述第一抗体和所述第二抗体包含(a)中所定义的每个抗体的六个CDR序列，或分别在所述六个CDR序列中包含总共一至五个突变例如取代。也就是说，抗原结合区的六个CDR序列中的一个或多个突变例如取代不改变所述第一或第二抗体的结合特征，如激动性特性、DR5表位结合和/或诱导表达DR5的靶细胞中凋亡的能力。也就是说，在一个实施方案中，在包含抗原结合区的六个CDR上允许总共至多五个突变例如取代。在本发明的一些实施方案中，在VH区的三个CDR上进行至多五个突变例如取代，如一个、两个、三个、四个或五个突变或取代，并且在VL区的CDR上不进行突变。在其他实施方案中，在VH区的CDR上不进行突变例如取代，但在VL区的CDR上发现至多五个突变例如取代，如一个、两个、三个、四个或五个。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一抗体包含包括六个CDR序列的VH区和VL区，其中六个CDR序列与如下所示的CDR序列总共具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％或至少99％的氨基酸序列同一性：a)(VH)SEQID NO:16、17、18和(VL)SEQ ID NO:21、GAS、6；并且所述第二抗体包含包括六个CDR序列的VH区和VL区，其中六个CDR序列与如下所示的CDR序列总共具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％或至少99％的氨基酸序列同一性：b)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14。
在其一个实施方案中，所述第一抗体和所述第二抗体的六个CDR序列的序列同一性总共为至少85％、90％、95％、97％或99％。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中
a)所述第一抗体包含以下六个CDR序列(VH)SEQ ID NO:16、17、18和(VL)SEQ IDNO:21、GAS、6，并且所述第二抗体包含以下六个CDR序列(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQID NO:13、RTS、14，或者其中b)所述第一抗体和所述第二抗体包含(a)中所定义的每个抗体的六个CDR序列，或分别在所述六个CDR序列中包含总共一至五个突变例如取代。也就是说，抗原结合区的六个CDR序列中的一个或多个突变例如取代不改变所述第一或第二抗体的结合特征，如激动性特性、DR5表位结合和/或诱导表达DR5的靶细胞中凋亡的能力。也就是说，在一个实施方案中，在包含抗原结合区的六个CDR上允许总共至多五个突变例如取代。在本发明的一些实施方案中，在VH区的三个CDR上进行至多五个突变例如取代，如一个、两个、三个、四个或五个突变或取代，并且在VL区的CDR上不进行突变。在其他实施方案中，在VH区的CDR上不进行突变例如取代，但在VL区的CDR上发现至多五个突变例如取代，如一个、两个、三个、四个或五个。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含如以上实施方案的任一项中所定义的第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一和第二抗体在Fc区中进一步包含对应于EU编号的人IgG1中位置K439或S440的突变。在本发明的一个实施方案中，组合物包含包括对应于K439的突变如K439E的第一抗体；以及包括对应于S440的突变如S440K的第二抗体。在本发明的一个实施方案中，组合物包含包括对应于S440的突变如S440K的第一抗体；以及包括对应于K439的突变如K439E的第二抗体。在此，提供了其中组合物包含包括至少两个突变如E430G和K439E的第一抗体以及包括至少两个突变如E430G和S440K的第二抗体的实施方案。在本发明的另一个实施方案中，组合物包含包括至少两个突变如E345K和K439E的第一抗体和包括至少两个突变如E345K和S440K的第二抗体。在此，提供了允许具有不同特异性的抗体的六聚化的实施方案。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一抗体包含以下序列(a)(VH)CDR1 SEQ ID NO 1、CDR2 SEQ ID NO 8、CDR3 SEQ ID NO 3以及(VL)CDR1 SEQ ID NO 5、CDR2 FAS、CDR3 SEQ ID NO 6，并且所述第二抗体包含以下序列(b)(VH)CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2 SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 11以及(VL)CDR1 SEQID NO 13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO 14，或(c)如以上(a)或(b)中所定义的(VH)CDR1、CDR2和CDR3以及(VL)CDR1、CDR2和CDR3，其在所述六个CDR序列中具有总共一至五个突变或取代。也就是说，抗原结合区的六个CDR序列中的一个或多个突变或取代不改变所述第一或第二抗体的结合特征，如激动性特性、DR5表位结合和/或诱导表达DR5的靶细胞中凋亡的能力。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一和第二抗体包含以下CDR序列(a)所述第一抗体包含以下CDR序列(VH)CDR1 SEQ ID NO1、CDR2 SEQ ID NO 8、CDR3 SEQ ID NO 3以及(VL)CDR1 SEQ ID NO 5、CDR2 FAS、CDR3 SEQID NO 6，并且所述第二抗体包含以下CDR序列(VH)CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2 SEQ ID NO2、CDR3 SEQ ID NO 11以及(VL)CDR1 SEQ ID NO 13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO 14，或(b)每个抗体的(a)中所述的CDR序列，其在每个抗体的所述六个CDR序列中总共包含一至五个突变例如取代。也就是说，抗原结合区的六个CDR序列中的一个或多个突变例如取代不改变所述第一或第二抗体的结合特征，如激动性特性、DR5表位结合和/或诱导表达DR5的靶细胞中凋亡的能力。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一抗体包含以下序列(a)(VH)CDR1 SEQ ID NO 1、CDR2 2、CDR3 3以及(VL)CDR1 SEQ ID NO5、CDR2 FAS、CDR3 6，并且所述第二抗体包含以下序列(b)(VH)CDR1 SEQ ID NO 10、CDR22、CDR3 11以及(VL)SEQ ID NO CDR1 13、CDR2 RTS、CDR3 14，或(c)如以上(a)或(b)中所定义的(VH)CDR1、CDR2和CDR3以及(VL)CDR1、CDR2和CDR3，其在所述六个CDR序列中总共具有一至五个突变或取代。也就是说，抗原结合区的六个CDR序列中的一个或多个突变或取代不改变所述第一或第二抗体的结合特征，如激动性特性、DR5表位结合和/或诱导表达DR5的靶细胞中凋亡的能力。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一和第二抗体包含以下CDR序列(a)所述第一抗体包含以下CDR序列(VH)CDR1 SEQ ID NO1、CDR2 SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 3以及(VL)CDR1 SEQ ID NO 5、CDR2 FAS、CDR3 SEQID NO 6，并且所述第二抗体包含以下CDR序列(VH)CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2 SEQ ID NO2、CDR3 SEQ ID NO 11以及(VL)CDR1 SEQ ID NO 13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO 14，或(b)每个抗体的(a)中所述的CDR序列，其在每个抗体的所述六个CDR序列中总共包含一至五个突变例如取代。也就是说，抗原结合区的六个CDR序列中的一个或多个突变例如取代不改变所述第一或第二抗体的结合特征，如激动性特性、DR5表位结合和/或诱导表达DR5的靶细胞中凋亡的能力。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一抗体包含以下序列(a)(VH)CDR1 SEQ ID NO 16、CDR2 SEQ ID NO 17、CDR3 SEQ ID NO18以及(VL)CDR1 SEQ ID NO 21、CDR2 GAS、CDR3 SEQ ID NO 22，并且所述第二抗体包含以下序列(b)(VH)CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2 SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 11以及(VL)CDR1SEQ ID NO 13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO 14，或(c)如以上(a)或(b)中所定义的(VH)CDR1、CDR2和CDR3以及(VL)CDR1、CDR2和CDR3，其在所述六个CDR序列中总共具有一至五个突变或取代。也就是说，抗原结合区的六个CDR序列中的一个或多个突变或取代不改变所述第一或第二抗体的结合特征，如激动性特性、DR5表位结合和/或诱导表达DR5的靶细胞中凋亡的能力。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一和第二抗体包含以下CDR序列(a)所述第一抗体包含以下CDR序列(VH)CDR1 SEQ ID NO16、CDR2 SEQ ID NO 17、CDR3 SEQ ID NO 18以及(VL)CDR1 SEQ ID NO 21、CDR2 GAS、CDR3SEQ ID NO 22，并且所述第二抗体包含以下CDR序列(VH)CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2 SEQ IDNO 2、CDR3 SEQ ID NO 11以及(VL)CDR1 SEQ ID NO 13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO 14，或(b)每个抗体的(a)中所述的CDR序列，其在每个抗体的所述六个CDR序列中总共包含一至五个突变例如取代。也就是说，抗原结合区的六个CDR序列中的一个或多个突变例如取代不改变所述第一或第二抗体的结合特征，如激动性特性、DR5表位结合和/或诱导表达DR5的靶细胞中凋亡的能力。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗体，其中两种抗体均包含人免疫球蛋白G的Fc区和抗原结合区，其中Fc区包含对应于EU编号的人IgG1中E430、E345或S440的位置处的氨基酸的突变，其中所述第一抗体和所述第二抗体以1:49至49:1的摩尔比存在于组合物中，如1:1摩尔比、1:2摩尔比、1:3摩尔比、1:4摩尔比、1:5摩尔比、1:6摩尔比、1:7摩尔比、1:8摩尔比、1:9摩尔比、1:10摩尔比、1:15摩尔比、1:20摩尔比、1:25摩尔比、1:30摩尔比、1:35摩尔比、1:40摩尔比、1:45摩尔比、1:50摩尔比、50:1摩尔比、45:1摩尔比、40:1摩尔比、35:1摩尔比、30:1摩尔比、25:1摩尔比、20:1摩尔比、15:1摩尔比、10:1摩尔比、9:1摩尔比、8:1摩尔比、7:1摩尔比、6:1摩尔比、5:1摩尔比、4:1摩尔比、3:1摩尔比、2:1摩尔比。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗体，其中两种抗体均包含人免疫球蛋白G的Fc区和抗原结合区，其中Fc区包含对应于EU编号的人IgG1中E430、E345或S440的位置处的氨基酸的突变，条件是S440中的突变是S440Y或S440W，其中所述第一抗体和所述第二抗体以1:49至49:1的摩尔比存在于组合物中，如约1:1摩尔比、约1:2摩尔比、约1:3摩尔比、约1:4摩尔比、约1:5摩尔比、约1:6摩尔比、约1:7摩尔比、约1:8摩尔比、约1:9摩尔比、约1:10摩尔比、约1:15摩尔比、约1:20摩尔比、约1:25摩尔比、约1:30摩尔比、约1:35摩尔比、约1:40摩尔比、约1:45摩尔比、约1:50摩尔比、约50:1摩尔比、约45:1摩尔比、约40:1摩尔比、约35:1摩尔比、约30:1摩尔比、约25:1摩尔比、约20:1摩尔比、约15:1摩尔比、约10:1摩尔比、约9:1摩尔比、约8:1摩尔比、约7:1摩尔比、约6:1摩尔比、约5:1摩尔比、约4:1摩尔比、约3:1摩尔比、约2:1摩尔比。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体以1:9至9:1摩尔比存在于组合物中。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体以约1:9至9:1摩尔比存在于组合物中。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体以约1:4至4:1的摩尔比存在于组合物中，如约1:3至3:1摩尔比，如约1:2至2:1摩尔比.
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体以大约1:1的摩尔比存在于组合物中。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗体，其中所述第一抗体和所述第二抗体以1:1的摩尔比存在于组合物中。
在本发明的一个优选实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗体，其中所述第一抗体和第二抗体和/或任何另外的抗体以等摩尔比存在于组合物中。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗体，其中所述第一抗体以5mg/ml存在于组合物中以及所述第二抗体以5mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH。在本发明的一个实施方案中，组合物包含5mg/ml的第一抗体、5mg/ml的第二抗体、30mM的组氨酸、150mM的氯化钠，处于pH 6.0。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗体，其中所述第一抗体以10mg/ml存在于组合物中以及所述第二抗体以10mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH，优选其中组合物包含10mg/ml的所述第一抗体、10mg/ml的所述第二抗体、30mM的组氨酸、150mM的氯化钠，处于pH 6.0。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗体，其中所述第一抗体以15mg/ml存在于组合物中以及所述第二抗体以15mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH。在本发明的一个实施方案中，组合物包含15mg/ml的第一抗体、15mg/ml的第二抗体、30mM的组氨酸、150mM的氯化钠，处于pH 6.0。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗体，其中所述第一抗体以20mg/ml存在于组合物中以及所述第二抗体以20mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH。在本发明的一个实施方案中，组合物包含20mg/ml的第一抗体、20mg/ml的第二抗体、30mM的组氨酸、150mM的氯化钠，处于pH 6.0。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗体，其中所述第一抗体以30mg/ml存在于组合物中以及所述第二抗体以30mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH。在本发明的一个实施方案中，组合物包含30mg/ml的第一抗体、30mg/ml的第二抗体、30mM的组氨酸、150mM的氯化钠，处于pH 6.0。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗体，其中所述第一抗体以40mg/ml存在于组合物中以及所述第二抗体以40mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH。在本发明的一个实施方案中，组合物包含40mg/ml的第一抗体、40mg/ml的第二抗体、30mM的组氨酸、150mM的氯化钠，处于pH 6.0。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗体，其中所述第一抗体以50mg/ml存在于组合物中以及所述第二抗体以50mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH。在本发明的一个实施方案中，组合物包含50mg/ml的第一抗体、50mg/ml的第二抗体、30mM的组氨酸、150mM的氯化钠，处于pH 6.0。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗体，其中所述第一和第二抗体以10mg/ml抗体的总抗体浓度存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH。在本发明的一个实施方案中，组合物包含处于10mg/ml的抗体的总抗体浓度的第一和第二抗体、30mM的组氨酸、150mM的氯化钠，处于pH 6.0。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗体，其中所述第一和第二抗体以20mg/ml抗体的总抗体浓度存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH。在本发明的一个实施方案中，组合物包含处于20mg/ml的抗体的总抗体浓度的第一和第二抗体、30mM的组氨酸、150mM的氯化钠，处于pH 6.0。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗体，其中所述第一和第二抗体以30mg/ml抗体的总抗体浓度存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH。在本发明的一个实施方案中，组合物包含处于30mg/ml的抗体的总抗体浓度的第一和第二抗体、30mM的组氨酸、150mM的氯化钠，处于pH 6.0。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗体，其中所述第一和第二抗体以40mg/ml抗体的总抗体浓度存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH。在本发明的一个实施方案中，组合物包含处于40mg/ml的抗体的总抗体浓度的第一和第二抗体、30mM的组氨酸、150mM的氯化钠，处于pH 6.0。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗体，其中所述第一和第二抗体以50mg/ml抗体的总抗体浓度存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH。在本发明的一个实施方案中，组合物包含处于50mg/ml的抗体的总抗体浓度的第一和第二抗体、30mM的组氨酸、150mM的氯化钠，处于pH 6.0。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含抗DR5抗体，抗DR5抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，其中LC包含SEQ ID NO:39的序列并且其中HC包含选自下组的序列之一：
a)(HC)SEQ ID NO:33；
b)(HC)SEQ ID NO:34；
c)(HC)SEQ ID NO:35；
d)(HC)SEQ ID NO:36；
e)(HC)SEQ ID NO:37；或
f)(HC)SEQ ID NO:38，
其中所述抗DR5抗体以从2mg/ml至200mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH。在本发明的一个实施方案中，组合物包含10mg/ml的抗DR5抗体、5mg/ml的第二抗体、30mM的组氨酸、150mM的氯化钠，处于pH 6.0。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含抗DR5抗体，抗DR5抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，其中LC包含SEQ ID NO:43的序列并且其中HC包含选自下组的序列之一：
a)(HC)SEQ ID NO:40；
b)(HC)SEQ ID NO:41；或
c)(HC)SEQ ID NO:42，
其中所述抗DR5抗体以从2mg/ml至200mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH。在本发明的一个实施方案中，组合物包含10mg/ml的抗DR5抗体、5mg/ml的第二抗体、30mM的组氨酸、150mM的氯化钠，处于pH 6.0。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一抗DR5抗体包含选自下组的HC序列：a)SEQ ID NO:33；b)SEQ ID NO:34；c)SEQ ID NO:35；d)SEQ ID NO:36；e)SEQ ID NO:37；或f)SEQ ID NO:38以及LC序列ID NO:39，所述第二抗DR5抗体包含选自下组的HC序列：g)SEQ ID NO:40；H)SEQ ID NO:41；或i)SEQ ID NO:42以及LC序列ID NO:43，所述第一抗DR5抗体以从2mg/ml至200mg/ml存在于组合物中，并且所述第二抗DR5抗体以从2mg/ml至200mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH。在本发明的一个实施方案中，组合物包含10mg/ml的第一抗DR5抗体、10mg/ml的第二抗DR5抗体、30mM的组氨酸、150mM的氯化钠，处于pH 6.0。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一抗DR5抗体包含HC序列ID NO:38以及LC序列ID NO:39，所述第二抗DR5抗体包含HC序列IDNO:42以及LC序列ID NO:43，所述第一抗DR5抗体以从2mg/ml至200mg/ml存在于组合物中，并且所述第二抗DR5抗体以从2mg/ml至200mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH。在本发明的一个实施方案中，组合物包含10mg/ml的第一抗DR5抗体、10mg/ml的第二抗DR5抗体、30mM的组氨酸、150mM的氯化钠，处于pH 6.0。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一抗DR5抗体包含HC SEQ ID NO:38以及LC SEQ ID NO:39，所述第二抗DR5抗体包含HC SEQID NO:42以及LC SEQ ID NO:43，所述第一抗DR5抗体以从10mg/ml至20mg/ml存在于组合物中，并且所述第二抗DR5抗体以从10mg/ml至20mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一抗DR5抗体包含HC SEQ ID NO:38以及LC SEQ ID NO:39，所述第二抗DR5抗体包含HC SEQID NO:42以及LC SEQ ID NO:43，所述第一抗DR5抗体以10mg/ml存在于组合物中，并且所述第二抗DR5抗体以10mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于5.5和6.5之间的pH。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含第一和第二抗DR5抗体，其中所述第一抗DR5抗体包含HC SEQ ID NO:38以及LC SEQ ID NO:39，所述第二抗DR5抗体包含HC SEQID NO:42以及LC SEQ ID NO:43，所述第一抗DR5抗体以10mg/ml存在于组合物中，并且所述第二抗DR5抗体以10mg/ml存在于组合物中，并且其中组合物进一步包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠，处于pH 6。
在进一步的方面，本发明涉及试剂盒，其包含根据前述权利要求中任一项的两种或更多种药物组合物，其中组合物用于在疗法中同时、分开或相继使用。在一个实施方案中，组合物用于在疗法中同时使用，其中组合物在使用前立即混合。
在进一步的方面，本发明涉及用于制备根据本发明的药物组合物的方法，所述方法包括将包含如本文所定义的第一抗体的第一药物组合物与包含如本文所定义的第二抗体的第二药物组合物混合。
治疗应用
根据本发明的任何方面或实施方案的药物组合物可以用作药物，即用于医学，如治疗应用。
因此，一方面，本发明涉及根据本发明的药物组合物，其用作药物。
另一方面，本发明提供了用于治疗或预防病症如癌症的方法，该方法包括将治疗有效量的本发明的药物组合物施用于有此需要的受试者。
药物组合物可以通过任何合适的途径和方式施用。在体内和体外施用本发明的化合物的合适途径是本领域众所周知的，并且可以由本领域普通技术人员选择。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物肠胃外施用。如本文所用，术语“肠胃外的施用”和“肠胃外地施用”是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，并且包括表皮、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、腱内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、颅内、胸腔内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物通过静脉内或皮下注射或输注施用。
包含一种或多种抗DR5抗体的根据本发明的药物组合物可以用于治疗或预防涉及表达DR5的细胞的病症。例如，可以将抗体例如在体内施用于人受试者，以治疗或预防涉及表达DR5的细胞的病症。如本文所用，术语“受试者”通常是向其施用抗DR5抗体或双特异性抗体的人。受试者可以例如包括患有可以通过直接或间接地调控DR5功能或通过杀伤表达DR5的细胞来纠正或改善的病症的人类患者。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的包含一种或多种抗DR5抗体的药物组合物，其用于治疗传染病、自身免疫性疾病或心血管异常。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的包含一种或多种抗DR5抗体的药物组合物，其用于治疗癌症和/或肿瘤。术语“癌症”是指或描述通常以不受控制的生长为特征的诸如人的哺乳动物中的生理状况。大多数癌症属于两大组癌症，即实体瘤和血液学肿瘤之一。
在一个具体的实施方案中，预防性地施用药物组合物以降低癌症发展的风险，延迟癌症进展中事件的发作或者当癌症缓解和/或已通过手术切除原发肿瘤时降低复发的风险。在后一种情况下，药物组合物可以例如与手术相关联地(即，在手术之前、期间或之后)施用。预防性施用在因其他生物学因素而难以定位据信存在的肿瘤的患者中也可能有用。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的包含一种或多种抗DR5抗体的药物组合物，其用于治疗实体瘤和/或血液学肿瘤。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的包含一种或多种抗DR5抗体的药物组合物，其用于治疗实体瘤，如结肠直肠癌(colorectal cancer)，包括结肠直肠癌瘤(colorectal carcinoma)和结肠直肠腺癌，膀胱癌，骨肉瘤，软骨肉瘤，乳腺癌，包括三阴性乳腺癌，中枢神经系统的癌症，包括胶质母细胞瘤，星形细胞瘤，神经母细胞瘤，神经纤维肉瘤，神经内分泌肿瘤，宫颈癌，子宫内膜癌，胃癌，包括胃腺癌，头颈癌，肾癌，肝癌，包括肝细胞癌，肺癌，包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)，卵巢癌，胰腺癌，包括胰腺导管癌和胰腺腺癌，肉瘤或皮肤癌，包括恶性黑色素瘤和非黑色素瘤皮肤癌。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的包含一种或多种抗DR5抗体的药物组合物，其用于治疗血液学肿瘤，如白血病，包括慢性淋巴细胞性白血病和髓样白血病，包括急性髓样白血病和慢性髓样白血病，淋巴瘤，包括非霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤，包括霍奇金淋巴瘤或包括骨髓增生异常综合征。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的包含一种或多种抗DR5抗体的药物组合物，其用于治疗选自以下癌症组的癌症；膀胱癌、骨癌、结肠直肠癌、肉瘤、子宫内膜癌、成纤维细胞癌、胃癌、头颈癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、肌肉癌、神经组织癌、卵巢癌、胰腺癌和皮肤癌。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的包含一种或多种抗DR5抗体的药物组合物，其用于抑制DR5阳性或表达DR5的肿瘤或癌症的生长。
在本发明中，DR5阳性肿瘤或癌症应理解为在细胞表面上表达DR5的肿瘤细胞和/或癌细胞。此类DR5表达可以通过免疫组织化学、流式细胞术、成像或其他合适的诊断方法来检测。显示DR5异源表达的肿瘤和癌组织也被视为DR5阳性肿瘤和癌症。
肿瘤和/或癌症可以在显示DR5表达的一些肿瘤和/或癌细胞和/或组织上表达DR5，一些肿瘤和/或癌症可以显示DR5的过表达或异常表达，而其他肿瘤和/或癌症则显示DR5的异源表达。此类肿瘤和/或癌症都可以是对用根据本发明的抗DR5抗体、双特异性抗体和包含此类抗体的组合物治疗的合适靶标。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的包含一种或多种抗DR5抗体的药物组合物，其用于诱导表达DR5的肿瘤中的凋亡。
在本发明的一个实施方案中，治疗患有癌症的个体的用途或方法包括向所述个体施用有效量的根据本发明的药物组合物，其进一步包括向所述个体施用另外的治疗剂。
在本发明的一个实施方案中，另外的治疗剂是单一试剂或试剂的组合，其包含选自下组的试剂或方案：化学治疗剂(包括但不限于紫杉醇、替莫唑胺(temozolomide)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、伊立替康(irinotecan)、多柔比星(doxorubicin)、吉西他滨(gemcitabine)、5-氟尿嘧啶、培美曲塞(pemetrexed))、激酶抑制剂(包括但不限于索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)或依维莫司(everolimus))、凋亡调控剂(包括但不限于重组人TRAIL或比利那潘(birinapant))、RAS抑制剂、蛋白酶体抑制剂(包括但不限于硼替佐米(bortezomib))、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(包括但不限于伏立诺他(vorinostat))、营养制品、细胞因子(包括但不限于IFN-γ))、抗体或抗体模拟物(包括但不限于抗TF、抗AXL、抗EGFR、抗IGF-1R、抗VEGF、抗CD20、抗CD38、抗HER2、抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA4、抗CD40、抗CD137、抗GITR、抗VISTA(或其他免疫调节靶标)抗体和抗体模拟物)以及抗体-药物缀合物如维汀-布仑妥昔单抗(brentuximab vedotin)、恩星-曲妥珠单抗(trastuzumab emtansine)、HuMax-TF-ADC或HuMax-AXL-ADC。
当描述本发明的实施例时，没有明确描述所有可能的实施方案的组合和排列。然而，某些措施在互不相同的从属权利要求中进行叙述或在不同的实施方案中进行描述的事实并不表示不能有利地使用这些措施的组合。本发明设想了所描述的实施方案的所有可能的组合和排列。
序列表1
Figure BDA0002379913990000731
Figure BDA0002379913990000741
Figure BDA0002379913990000751
Figure BDA0002379913990000761
Figure BDA0002379913990000771
Figure BDA0002379913990000781
Figure BDA0002379913990000791
Figure BDA0002379913990000801
Figure BDA0002379913990000811
Figure BDA0002379913990000821
Figure BDA0002379913990000831
Figure BDA0002379913990000841
Figure BDA0002379913990000851
Figure BDA0002379913990000861
实施例
实施例1：抗体和抗原构建体
DR5的表达构建体
基于以下可获得的序列生成用于表达人(SEQ ID NO 46)、猕猴(SEQ ID NO 25)和小鼠(SEQ ID NO 26)的全长DR5蛋白的密码子优化构建体：人(Homo sapiens)DR5(Genbank登录号NP_003833,UniprotKB/Swiss-Prot O14763-1)、猕猴(恒河猴(Macaca mulatta)DR5(Genbank登录号EHH28346)、鼠(小家鼠(Mus musculus))DR5(UniprotKB/Swiss-ProtQ9QZM4)。为了绘制(mapping)DR5抗体的结合区(如实施例6中所述)，制备了以下嵌合的人/小鼠DR5构建体；人DR5，其中以下部分分别被相应的小鼠DR5序列替换(数字是指人序列)，构建体A aa 56-68、构建体B aa 56-78、构建体C aa 69-78、构建体D aa 79-115、构建体E79-138、构建体F aa 97-138、构建体G aa 139-166、构建体H aa 139-182、构建体I aa167-182、构建体J167-210、构建体K aa 183-210。将功能丧失突变K415N引入人DR5死亡域(SEQ ID NO 44)中。另外，生成了具有C末端His标签的人DR5的细胞外域(ECD)的密码子优化的构建体：DR5ECD-FcHistag(SEQ ID NO 27)和DR5ECDdelHis(SEQ ID NO 28)。所有构建体均包含适合克隆的限制性位点和最佳Kozak(GCCGCCACC)序列。将构建体克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.3(Invitrogen)中。
抗体的表达构建体
对于抗体表达，将嵌合人/小鼠DR5抗体DR5-01和DR5-05(基于EP2684896A1)及其人源化变体hDR5-01和hDR5-05(基于WO2014/009358)的如先前所述的VH和VL序列克隆到含有相关的恒定HC和LC区的表达载体(pcDNA3.3)中。通过基因合成或定点诱变引入所期望的突变。
在一些实施例中，使用了先前已经描述的针对DR5的参照抗体。将IgG1-CONA(基于US7521048 B2和WO2010/138725)和IgG1-chTRA8(基于EP1506285B1和US7244429B2)克隆到如上的相关抗体表达载体中。
在一些实施例中，人IgG1抗体IgG1-b12(gp120特异性抗体)用作阴性对照(Barbas等,J Mol Biol.1993 Apr 5；230(3):812-23)。
瞬时表达
抗体以IgG1,κ表达。使用293fectin(Life technologies)在Expi293T细胞(Lifetechnologies,USA)中瞬时转染编码抗体的重链和轻链两者的质粒DNA混合物，基本上如Vink等人(Vink等,Methods,65(1),5-10 2014)所述。
使用Freestyle Max试剂在Freestyle CHO-S细胞(Life technologies)中如制造商所述表达膜蛋白。
蛋白质的纯化和分析
通过固定化的蛋白G层析法纯化抗体。通过固定化的金属亲和层析法纯化加有His标签的重组蛋白。通过许多生物分析测定法对蛋白质批次进行分析，包括SDS-PAGE、尺寸排阻层析法和内毒素水平的测量。
双特异性抗体的生成
在受控还原条件下通过Fab臂交换生成双特异性IgG1抗体。该方法的基础是使用互补的CH3域，其促进在如WO2011/131746中所述的特定测定条件下的异源二聚体的形成。将F405L和K409R(EU编号)突变引入抗DR5 IgG1抗体中以创建具有互补CH3域的抗体对。将F405L突变引入IgG1-DR5-05和IgG1-DR5-05-E430G中；将K409R突变引入IgG1-DR5-01和IgG1-DR5-01-E430G中。为了生成双特异性抗体，将两种亲本互补抗体(每种抗体处于0.5mg/mL的最终浓度)与75mM 2-巯基乙胺-HCl(2-MEA)在总体积100μL的TE中于31℃温育5小时。通过使用旋转柱(Microcon离心滤器，30k，Millipore)根据制造商的方案除去还原剂2-MEA来终止还原反应。以此方式，生成双特异性抗体IgG1-DR5-01-K409R x IgG1-DR5-05-F405L(BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L)和IgG1-DR5-01-K409R-E430G x IgG1-DR5-05-F405L-E430G(BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G)。
K409R突变和/或F405L突变对抗体与相应抗原的结合没有影响。也就是说，K409R突变和/或F405L突变对抗DR5抗体与DR5的结合没有影响。
实施例2：不同人癌细胞系上的DR5表达水平
通过使用QIFIKIT(DAKO,Cat nr K0078)与小鼠单克隆抗体B-K29(Diaclone,Catnr 854.860.000)的间接免疫荧光，对于不同人癌细胞系对每细胞DR5密度进行定量。通过胰蛋白酶处理收获细胞，并使其通过细胞过滤器。通过以1200rpm离心5分钟使细胞沉淀，用PBS洗涤并以2x106个细胞/mL的浓度重悬。接下来的步骤于4℃进行。将50μL的单细胞悬液(每孔100,000个细胞)接种到聚苯乙烯96孔圆底板(Greiner Bio-One,Cat nr 650101)中。通过以300xg离心3分钟使细胞沉淀，并以10μg/mL饱和浓度重悬于50μL抗体样品或小鼠IgG1同种型对照样品(BD/Pharmingen,Cat nr 555746)中。于4℃温育30分钟后，将细胞沉淀并重悬于150μL FACS缓冲液(PBS+0.1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)+0.02％(w/v)叠氮化钠)中。根据制造商的说明，将设置珠和校准珠添加到板上。将细胞和珠平行地用150μLFACS缓冲液再洗涤两次并重悬于50μL FITC缀合的山羊抗小鼠IgG(1/50；DAKO,Cat nrF0479)中。将二抗于4℃避光温育30分钟。将细胞和珠用150μL FACS缓冲液洗涤两次并重悬于150μL FACS缓冲液中。在FACS Canto ll(BD Biosciences)上通过记录活细胞群内的10,000个事件来测量免疫荧光。校准珠的荧光强度的几何平均值用于计算校准曲线，使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)使其强制通过零强度和零浓度。对于每种细胞系，基于校准曲线的方程式(使用GraphPad软件从标准曲线中插入未知数)，使用DR5抗体染色的细胞的几何平均荧光强度计算抗体结合能力(ABC)，即对质膜上表达的DR5分子的数量的估计。通常，在此处评价的细胞系上，DR5细胞表面表达为低至中等。基于这些数据，根据低DR5表达(ABC<10,000)和中等DR5表达(ABC>10,000)对细胞系进行分类。发现HCT-15(ATCC,CCL-225)、HT-29(ATCC,HTB-38)和SW480(ATCC,CCL-228)结肠癌，BxPC-3(ATCC,CRL-1687)、HPAF-II(ATCC,CRL-1997)和PANC-1(ATCC,CRL-1469)胰腺癌，以及A549(ATCC,CCL-185)和SK-MES-1(ATCC,HTB-58)肺癌细胞系具有DR5低表达(QIFIKITABC范围3,081-8,411)。发现COLO 205(ATCC CCL-222TM)和HCT 116(ATCC CCL-247)结肠癌，A375(ATCC,CRL-1619)皮肤癌以及SNU-5(ATCC,CRL-5973)胃癌细胞系具有中等DR5表达(QIFIKIT ABC范围10,777-21,262)。
实施例3：人源化DR5-01和DR5-05抗体与HCT 116细胞的结合
人源化抗体hDR5-01和hDR5-05描述于专利申请WO2014/009358中。通过FACS分析对纯化的IgG1-hDR5-01-K409R和IgG1-hDR5-05-F405L与DR5阳性HCT 116人结肠癌细胞的结合进行分析并将其与嵌合抗体IgG1-DR5-01-K409R和IgG1-DR5-05-F405L的结合进行比较。为了制备单细胞悬液，将贴壁的HCT 116细胞用PBS(B.Braun；Cat nr 3623140)洗涤两次，然后与胰蛋白酶1x/EDTA 0.05％于37℃温育2分钟。添加10mL培养基[含L-谷氨酰胺和HEPES的McCoy's 5A培养基(Lonza；Cat nr BE12-168F)+10％含铁的供体牛血清(LifeTechnologies；Cat nr 10371-029)+100单位青霉素/100单位链霉素(Lonza Cat nr DE17-603E)]，然后以1200rpm离心5分钟使细胞沉淀。将细胞重悬于10mL培养基中，通过以1200rpm离心5分钟再次沉淀，并以1.0x106个细胞/mL的浓度重悬于FACS缓冲液中。接下来的步骤于4℃进行。将100μL细胞悬液样品(每孔100,000个细胞)接种到聚苯乙烯96孔圆底板(Greiner Bio-One；Cat nr 650101)中，并通过于4℃以300x g离心3分钟将其沉淀。将细胞重悬于系列稀释抗体制剂系列的100μL样品中(范围为0至10μg/mL，以5倍稀释)，并于4℃温育30分钟。通过于4℃以300x g离心3分钟使细胞沉淀，并用150μL FACS缓冲液洗涤两次。将细胞与50μL二抗R-藻红蛋白(R-PE)缀合的山羊抗人IgG F(ab’)2(JacksonImmunoResearch；Cat nr 109-116-098；1/100)于4℃避光温育30分钟。将细胞用150μLFACS缓冲液洗涤两次，重悬于150μL FACS缓冲液中，并在FACS Canto ll(BD Biosciences)上通过记录10,000个事件分析抗体结合。使用GraphPad Prism软件用非线性回归分析(具有可变斜率的S形剂量反应)分析结合曲线。
从图2可以看出，人源化抗体IgG1-hDR5-01-K409R和IgG1-hDR5-05-F405L分别显示与其相应的嵌合抗体IgG1-DR5-01-K409R或IgG1-DR5-05-F405L相似的结合曲线。人源化对DR5抗体的结合没有影响。
实施例4：引入六聚化增强突变不影响嵌合DR5-01和DR5-05抗体以及双特异性抗体DR5-01xDR5-05与DR5阳性人结肠癌细胞的结合。
通过FACS分析对纯化的具有和不具有六聚化增强突变(E430G或E345K)的IgG1-DR5-01-K409R、IgG1-DR5-05-F405L和双特异性抗体IgG1-DR5-01-K409RxIgG1-DR5-05-F405L(BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L)的抗体变体与人结肠癌细胞COLO 205的结合进行分析。通过合并含有非贴壁细胞的培养上清液和经胰蛋白酶处理的贴壁COLO 205细胞来收获细胞。将细胞以1200rpm离心5分钟，并重悬于10mL培养基[含25mM Hepes和L-谷氨酰胺的RPMI 1640(Lonza Cat nr BE12-115F)+10％含铁的供体牛血清(Life Technologies；Cat nr 10371-029)+50单位青霉素/50单位链霉素(Lonza Cat nr DE17-603E)]中。对细胞进行计数，再次离心并以0.3x106个细胞/mL的浓度重悬于FACS缓冲液中。接下来的步骤于4℃进行。将100μL细胞悬液样品(每孔30,000个细胞)接种到聚苯乙烯96孔圆底板中，并通过于4℃以300x g离心3分钟将其沉淀。将细胞重悬于系列稀释抗体制剂系列的50μL样品中(最终浓度范围为0至10μg/mL，以5倍稀释)，并于4℃温育30分钟。将板以300x g于4℃离心3分钟，并将细胞用150μL FACS缓冲液洗涤两次。将细胞与50μL二抗R-PE缀合的山羊抗人IgGF(ab’)2(Jackson ImmunoResearch；Cat nr 109-116-098；1/100)于4℃避光温育30分钟。将细胞用150μL FACS缓冲液洗涤两次，重悬于100μL FACS缓冲液中，并在FACS Canto ll(BD Biosciences)上通过记录5,000个事件分析抗体结合。使用GraphPad Prism软件用非线性回归分析(具有可变斜率的S形剂量反应)分析结合曲线。
图3A显示，抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-01-K409R-E345K显示出与IgG1-DR5-01-K409R相似的与人结肠癌细胞COLO 205的剂量依赖性结合。图3B显示，抗体IgG1-DR5-05-F405L-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E345K显示出与IgG1-DR5-05-F405L相似的与COLO 205细胞的剂量依赖性结合。图3C显示，BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G和BsAb DR5-01-K409R-E345K x DR5-05-F405L-E345K显示出与BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L相似的与COLO 205细胞的剂量依赖性结合。这些数据表明引入六聚化增强突变E430G或E345K不影响DR5阳性COLO205细胞上抗体IgG1-DR5-01-K409R、IgG1-DR5-05-F405L和BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L的结合。
实施例5：嵌合DR5-01和DR5-05抗体与猕猴DR5的结合。
通过FACS分析对纯化的IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G与表达猕猴DR5或人DR5的CHO细胞(描述于实施例1中)的结合进行分析。在FACS分析前一天，用编码猕猴DR5、人DR5或非编码载体(模拟品)的载体瞬时转染CHO细胞。为了制备单细胞悬液，将细胞用PBS洗涤并以1.0x106个细胞/mL的浓度重悬浮于FACS缓冲液中。接下来的步骤于4℃进行。将75μL细胞悬液样品(每孔75,000个细胞)接种到聚苯乙烯96孔圆底板中，并通过于4℃以300xg离心3分钟将其沉淀。将细胞重悬于系列稀释抗体制剂系列的50μL样品中(范围为10至0μg/mL，以5倍稀释)，并于4℃温育30分钟。将板以300xg于4℃离心3分钟，并将细胞用150μL FACS缓冲液洗涤两次。将细胞与50μL二抗R-PE缀合的山羊抗人IgG F(ab’)2(Jackson ImmunoResearch；Cat nr 109-116-098；1/100)于4℃避光温育30分钟。将细胞用150μL FACS缓冲液洗涤两次，重悬于100μL FACS缓冲液中，并在FACS Canto ll(BDBiosciences)上通过记录100,000个事件分析抗体结合。使用GraphPad Prism软件用非线性回归分析(具有可变斜率的S形剂量反应)分析结合曲线。
图4显示，抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G显示出与CHO细胞上表达的猕猴DR5的剂量依赖性结合。与用人DR5转染的CHO细胞和经模拟品转染的CHO细胞的结合分别作为阳性和阴性对照进行测试。对于IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G两者，与人DR5和猕猴DR5结合的EC50值都在相同的范围中(分别为[0.014-0.023μg/mL]和[0.051-0.066μg/mL])，表明IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G显示出相当的与人和猕猴DR5的结合。
实施例6：使用经域交换的DR5分子绘制人DR5上DR5-01和DR5-05抗体的结合区。
人和鼠DR5的细胞外域的氨基酸序列显示出有限的同源性(图5A)，并且人源化抗体IgG1-hDR5-01-F405L和IgG1-hDR5-05-F405L不结合鼠DR5(图5C，D)。为了鉴定涉及抗体结合的人DR5细胞外域中的氨基酸段，我们开发了11种人-小鼠嵌合DR5分子，其中特定的人DR5域已被小鼠类似物替换(经域交换的DR5分子描述于实施例1中)，如在图5B中所见。经域交换的DR5变体在CHO细胞上瞬时表达。DR5抗体与经域交换的DR5分子的结合丧失，表明人DR5的经交换的域含有一个或多个对结合至关重要的氨基酸。反之亦然，DR5抗体与经域交换的DR5分子的结合的保留表明人DR5的经交换的域不含有对于结合至关重要的氨基酸。对于结合测定，对3x106个经转染的细胞进行洗涤，并重悬于3mL FACS缓冲液中。在96孔圆底板(Greiner Bio-one；Cat nr 650101)的每孔添加100μL细胞悬液(每孔100.000个细胞)。接下来的步骤于4℃进行。将细胞沉淀，重悬于50μL DR5抗体样品中(最终浓度10μg/mL)，并于4℃温育30分钟。将细胞洗涤两次，并在50μL二抗R-PE缀合的山羊抗人IgG F(ab’)2(Jackson ImmunoResearch；Cat nr 109-116-098；1/100)中于4℃避光温育30分钟。将细胞洗涤两次，重悬于120μL FACS缓冲液中，并在FACS Canto ll(BD Biosciences)上进行分析。使用GraphPad Prism软件对活PE阳性细胞的百分比进行绘图。使用针对不同表位的一组DR5抗体证实了每个经域交换的DR5分子的表面表达(未显示)。针对gp120的非靶标结合抗体IgG1-b12作为结合的阴性对照包括在内。图5C显示，IgG1-hDR5-01-F405L显示出与构建体E(79-138)、F(97-138)、G(139-166)和H(139-182)的结合丧失，而与构建体A-D(覆盖人DR5序列56-115)和I-K(覆盖人DR5序列167-210)的结合得到保留。这些数据一起表明氨基酸区域116-138和139-166各自含有一个或多个对于IgG1-hDR5-01-F405L与人DR5结合所需的氨基酸。图5D显示，IgG1-hDR5-05-F405L显示出与构建体D(79-115)、E(79-138)和F(97-138)的结合丧失，而与构建体A-C(覆盖人DR5序列56-78)和G-K(覆盖人DR5序列139-210)的结合得到保留。这些数据一起表明氨基酸区域79-138含有一个或多个对于IgG1-hDR5-05-F405L与人DR5结合所需的氨基酸。
实施例7：使用DR5-01和DR5-05抗体的交叉阻断ELISA。
通过如本实施例中所述的夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)中的夹心结合测定法和通过使用ForteBio
Figure BDA0002379913990000931
HTX系统的生物层(Bio-Layer)干涉法(BLI)对人源化DR5-01和DR5-05抗体之间竞争与DR5的细胞外域结合进行测量(数据未显示)。对于ELISA，将96孔平底ELISA板(Greiner bio-one；Cat nr 655092)用2μg/mL DR5抗体(IgG1-hDR5-01-E430G或IgG1-hDR5-05-E430G)在100μL PBS中于4℃包被过夜。通过添加200μL PBSA[PBS/1％牛血清白蛋白(BSA；Roche Cat#10735086001)]封闭孔并于室温温育1小时。用PBST[PBS/0.05％Tween-20(Sigma-Aldrich；Cat nr 63158)]洗涤孔3次。接下来，将DR5ECD-FcHistag(SEQ ID 27)(0.2μg/mL最终浓度)和竞争抗体(1μg/mL最终浓度)添加到总体积100μL的PBSTA(PBST/0.2％BSA)中，摇动下于室温温育1小时。用PBST洗涤3次后，将孔在ELISA摇床上与100μL生物素化的抗His标签抗体(R&D Systems；Cat nr BAM050；1:2.000)在PBSTA中于室温温育1小时。用PBST洗涤3次后，将孔在ELISA摇床上与链霉亲合素标记的Poly-HRP(Sanquin；Cat nr M2032；1:10.000)在PBSTA中于室温温育20分钟。用PBST洗涤3次后，通过与100μL 2,2’-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[ABTS(Roche；Cat nr11112597001)]于室温避光温育30分钟使反应可视化。通过添加等体积的2％草酸终止底物反应，在ELISA读取器(BioTek ELx808 Absorbance Microplate Reader)上测量405nm处的荧光。图6显示结合竞争，表示为DR5ECD-FcHisCtag在存在竞争抗体的情况下与包被抗体的结合相对于DR5ECD-FcHisCtag在不存在竞争抗体的情况下的结合的百分比抑制(％抑制＝100-[(存在竞争抗体的情况下的结合/不存在竞争抗体的情况下的结合)]*100)。在存在可溶性IgG1-hDR5-05-E430G的情况下，DR5ECD-FcHistag与包被的IgG1-hDR5-01-E430G的结合不受抑制。反之亦然，在存在可溶性IgG1-hDR5-01-E430G的情况下DR5ECD-FcHistag与包被的IgG1-hDR5-05-E430G的结合也不受抑制。这些数据表明，IgG1-hDR5-01-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G不相互竞争DR5ECD-FcHisCtag的结合，表明它们识别人DR5的细胞外域中不同的表位。这些数据通过使用经典夹心测定法的BLI得到了证实，其中IgG1-hDR5-01-F405L或IgG1-hDR5-05-F405L(10mM乙酸钠中20μg/ml，pH 6.0，ForteBio Cat nr 18-1070)固定化在胺反应性第二代生物传感器上(ForteBio Cat nr 18-5092)。随后，将生物传感器与DR5ECDdelHis(SEQ ID 28)(样品稀释液中100nM，ForteBio cat nr 18-1048)温育，并分析竞争抗体的结合(样品稀释液中5μg/mL)(数据未显示)。
实施例8：六聚化增强突变的引入改进了DR5-01和DR5-05抗体及其组合诱导细胞死亡的功效。
进行了存活力测定法以研究IgG1-DR5-01-K409R和IgG1-DR5-05-F405L中六聚化增强突变E430G对抗体杀伤人结肠癌细胞COLO 205和HCT 116的能力的影响。抗体作为单一试剂以及DR5-01和DR5-05抗体的组合得以测试。通过合并含有非贴壁细胞的培养上清液和经胰蛋白酶处理的贴壁细胞收获COLO 205细胞。通过胰蛋白酶处理收获HCT 116细胞。使细胞通过细胞过滤器，通过以1200rpm离心5分钟沉淀，并以0.5x105个细胞/mL的浓度重悬于培养基中。将100μL单细胞悬液(每孔5,000个细胞)接种到聚苯乙烯96孔平底板(GreinerBio-One,Cat nr 655182)中。添加50μL的系列稀释抗体制剂系列(范围为0.05至20,000ng/mL最终浓度，以5倍稀释)并于37℃温育3天。在用两种抗体的组合处理的样品中，测定中的总抗体浓度与用单一抗体处理的样品相同。作为阳性对照，将细胞与5μM星形孢菌素(SigmaAldrich,Cat nr S6942)温育。培养的细胞的存活力在CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法(Promega,Cat nr G7571)中确定，该测定法定量存在的ATP，其是代谢活性细胞的指标。每孔添加来自试剂盒的20μL萤光素溶液试剂，并通过以500rpm摇动板2分钟进行混合。接下来，将板于37℃温育1.5小时。将100μL上清液转移至白色的OptiPlate-96(Perkin Elmer,Cat nr 6005299)，并在EnVision多标记读取器(EnVision Multilabel Reader)(PerkinElmer)上测量发光。使用GraphPad Prism软件用非线性回归(具有可变斜率的S形剂量反应)对数据进行分析和绘图。图7显示了如使用以下公式所计算的百分比活细胞：％活细胞＝[(发光抗体样品-发光星形孢菌素样品)/(发光无抗体样品-发光星形孢菌素样品)]*100。
图7显示，在COLO 205(A)和HCT 116(B)两种细胞中，引入E430G突变增强嵌合抗体IgG1-DR5-01-K409R和IgG1-DR5-05-F405L的效力。IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合比单独任一种抗体更有效力，并且比不具有E430G突变的抗体的组合更有效力。IgG1-DR5-01-K409R和IgG1-DR5-05-F405L的组合比单独任一种抗体更有效力。这些数据显示，引入六聚化增强突变E430G在作为单一抗体和组合的嵌合DR5抗体01和05结合后导致对细胞杀伤的诱导增强，其中组合是最有效力的。
实施例9：将两种非交叉阻断DR5抗体与六聚化增强突变组合导致靶细胞杀伤力增强
在实施例8中，显示与单一抗体的功效相比，将两种具有六聚化增强突变的非交叉阻断抗DR5抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G组合导致对癌细胞系的杀伤增强。在此，我们比较了两种非交叉阻断抗DR5抗体相对于两种交叉阻断抗DR5抗体的功效。进行了存活力测定法以研究与单一抗体相比，抗体IgG1-chTRA8-F405L-E430G与非交叉阻断抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G或交叉阻断抗体IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合诱导HCT 116结肠癌细胞杀伤的能力。如实施例7中所述进行针对抗体IgG1-chTRA8-F405L和IgG1-DR5-05-F405L的交叉阻断ELISA，并通过
Figure BDA0002379913990000951
HTX系统上的夹心结合测定法进行证实(数据未显示)。如实施例8中所述对HCT 116细胞进行存活力测定法，其中系列稀释抗体系列范围为0.00005至20μg/mL最终浓度，以5倍稀释。图8显示通过组合两种非交叉阻断抗体IgG1-chTRA8-F405L-E430G和IgG1-DR5-01-K409R-E430G，单一抗体杀伤HCT116细胞的功效得以增强(图8B)而通过组合两种交叉阻断抗体IgG1-chTRA8-F405L-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G未得以增强(图8C)。
实施例10：具有六聚化增强突变的非交叉阻断抗体DR5-05+CONA的组合和双特异性抗体DR5-05xCONA诱导靶细胞杀伤的能力
进行了存活力测定法以研究与不具有六聚化增强突变的抗体组合和双特异性抗体相比，两种非交叉阻断抗体(IgG1-CONA-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E345K)的另一种组合及其双特异性衍生物BsAb IgG1-CONA-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E345K分别诱导HCT 116结肠癌细胞的杀伤的能力。如实施例7中所述进行针对抗体IgG1-CONA-K409R和IgG1-DR5-05-F405L的交叉阻断ELISA，并通过
Figure BDA0002379913990000961
HTX系统上的夹心结合测定法进行证实(数据未显示)。如实施例8中所述对HCT 116细胞进行存活力测定法，其中系列稀释抗体系列范围为0.01至20,000ng/mL最终浓度，以5倍稀释。图9显示具有六聚化增强突变的非交叉阻断抗体IgG1-CONA-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E345K的组合和BsAb IgG1-CONA-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E345K与不具有六聚化增强突变E430G或E345K的这些抗体相比显示出增强的杀伤HCT116细胞的功效。
实施例11：具有E430G六聚化增强突变的DR5-01+DR5-05抗体组合在不同癌细胞系中诱导靶细胞杀伤的能力
进行了存活力测定法以研究具有和不具有六聚化增强突变E430G的人-小鼠嵌合抗体IgG1-DR5-01-K409R+IgG1-DR5-05-F405L的组合诱导杀伤COLO 205、HCT-15、HCT 116、HT-29和SW480结肠癌，BxPC-3、HPAF-II和PANC-1胰腺癌，SNU-5胃癌，A549和SK-MES-1肺癌以及A375皮肤癌细胞的能力。通过胰蛋白酶处理收获贴壁细胞，并使其通过细胞过滤器。通过以1,200rpm离心5分钟沉淀细胞，并以0.5x105个细胞/mL的浓度重悬于培养基中[COLO205、HCT-15、SW480和BxPC-3：含25mM Hepes和L-谷氨酰胺的RPMI 1640(Lonza Cat nrBE12-115F)+10％DBSI(Life Technologies Cat nr 10371-029)+青霉素/链霉素(LonzaCat nr DE17-603E)；HCT116和HT-29：含L-谷氨酰胺和Hepes的McCoy’s5A培养基(Lonza,Cat nr BE12-168F)+10％DBSI+青霉素/链霉素；HPAF-II和SK-MES-1：Eagle最低必需培养基(EMEM,ATCC Cat nr 30-2003)+10％DBSI+青霉素/链霉素；PANC-1和A375：DMEM 4.5g/L葡萄糖，不含L-Gln，含HEPES(Lonza Cat nr LO BE12-709F)+10％DBSI+1mM L-谷氨酰胺(Lonza Cat nr BE17-605E)+青霉素/链霉素；SNU-5：IMDM(Lonza Cat nr BE12-722F)+10％DBSI+青霉素/链霉素；A549：F-12K培养基(ATCC Cat nr 30-2004)+10％DBSI+1mM L-谷氨酰胺+青霉素/链霉素]。将100μL的单细胞悬液(每孔5,000个细胞)接种到聚苯乙烯96孔平底板(Greiner Bio-One,Cat nr 655182)中，并于37℃温育过夜。用150μL抗体样品(最终浓度10μg/mL)替换贴壁细胞的上清液，并于37℃温育3天。作为阳性对照，将细胞与5μM星形孢菌素(Sigma Aldrich,Cat nr S6942)温育。如实施例8中所述，在CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法中确定细胞培养物的存活力。对于所有测试的细胞系，百分比活细胞在与10μg/mL的抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G温育后比与非靶标结合阴性对照抗体IgG1-b12温育后显著更低(图10)。在除了两个经测试的细胞系之外的所有细胞系中，抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的功效显著优于不具有六聚化增强突变的组合IgG1-DR5-01-K409R+IgG1-DR5-05-F405L。这些数据表明，具有六聚化增强突变的嵌合DR5抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合对杀伤不同来源的癌靶细胞，包括结肠、胰腺、胃、肺和皮肤癌非常有效，无需次级交联剂。IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的杀伤功效与DR5靶标表达水平之间没有相关性(描述于实施例2中)。
实施例12：具有E430G六聚化增强突变的人源化DR5-01+DR5-05抗体组合诱导靶细胞杀伤的能力。
进行了存活力测定法以将嵌合抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合在体外诱导杀伤BxPC-3和PANC-1胰腺癌细胞的效力与人源化抗体IgG1-hDR5-01-K409R-E430G+IgG1-hDR5-05-F405L-E430G组合的效力进行比较。通过胰蛋白酶处理收获细胞，并使其通过细胞过滤器。通过以1,200rpm离心5分钟沉淀细胞，并以0.5x105个细胞/mL的浓度重悬于培养基中。将100μL的单细胞悬液(每孔5,000个细胞)接种到聚苯乙烯96孔平底板(Greiner Bio-One,Cat nr 655182)中，并于37℃温育过夜。用150μL系列稀释抗体制剂系列的抗体样品替换贴壁细胞的上清液，并于37℃温育3天。作为阳性对照，将细胞与5μM星形孢菌素(Sigma Aldrich,Cat nr S6942)温育。如实施例8中所述，在CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法中确定细胞培养物的存活力。具有六聚化增强突变的人源化抗体的组合IgG1-hDR5-01-K409R-E430G+IgG1-hDR5-05-F405L-E430G显示出与相应嵌合抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合相似的剂量反应曲线(图11)。
实施例13：抗体IgG1-hDR5-01-E430G的优化
氨基酸序列N55-G56被鉴定为IgG1-hDR5-01和IgG1-hDR5-05重链(SEQ ID NO:2)的CDR2区中潜在的天冬酰胺(Asn)脱酰胺基序。通过在IgG1-hDR5-01-K409R和IgG1-hDR5-05-F405L中引入N55D突变来模拟该位置处的脱酰胺，以测试脱酰胺对靶标结合的影响。如实施例3中所述，通过FACS分析测试了IgG1-hDR5-01-N55D-K409R和IgG1-hDR5-05-N55D-F405L与HCT 116细胞的结合。图12A显示，通过引入N55D突变来模拟脱酰胺导致HCT 116细胞上IgG1-hDR5-01-K409R的结合大大降低。相反，IgG1-hDR5-05-F405L和IgG1-hDR5-05-N55D-F405L显示出相当的结合曲线。为了降低DR5-01抗体中Asn脱酰胺的风险，将G56T突变引入IgG1-hDR5-01-E430G中，并如实施例3中所述通过FACS分析测试该抗体变体与HCT 116细胞的结合。图12B显示突变对IgG1-hDR5-01-E430G与HCT116细胞的结合没有影响。
进行存活力测定法以将人源化抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的组合诱导杀伤BxPC-3胰腺癌细胞的能力与人源化抗体IgG1-hDR5-01-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G组合的能力进行比较。如实施例11中所述对存活力进行评价，其中每孔1,000个细胞，并且抗体浓度系列的范围为从0.0001至10,000ng/mL最终浓度，以四倍稀释，总体积为200μL。图12C显示在IgG1-hDR5-01-E430G中引入G56T突变对与IgG1-hDR5-05-E430G组合的抗体的杀伤功效没有影响。
实施例14：通过人源化抗体hDR5-01-G56T-E430G和hDR5-05-E430G的组合诱导细胞死亡需要Fc:Fc相互作用以形成六聚体
为了分析IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G形成抗体六聚体以诱导细胞死亡的需求，我们利用了自排斥突变K439E和S440K(Diebolder等,Science.2014Mar 14；343(6176):1260-3)。在一种IgG1抗体中或在抗体组合中通过K439E或S440K的存在而引入的抗体之间的Fc排斥即使在存在六聚化增强突变(如E345K或E430G)的情况下也导致六聚化的抑制(WO2013/0044842)。通过将两种突变在两种各自具有一种或另一种突变的抗体的混合物中组合，从而导致Fc:Fc相互作用和六聚化的恢复来中和通过K439E和S440K突变产生的排斥。
对于IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G两者，生成了具有K439E或S440K突变的变体，并以所有不同组合进行测试。如实施例11中所述，在BxPC-3胰腺癌细胞和HCT-15结肠癌细胞上进行存活力测定法，其中系列稀释抗体制剂系列的范围为0.3至20,000ng/mL总浓度，以4倍稀释。
图13显示均具有相同排斥突变(K439E或S440K)的IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G变体的组合在BxPC-3(A)和HCT-15细胞(B)中显示出极大降低的杀伤功效。当通过将各自具有互补突变K439E或S440K之一的两种抗体组合来中和排斥时，杀伤功效得以恢复。这些数据表明，通过IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G诱导细胞死亡需要通过Fc-Fc相互作用进行六聚化。
实施例15：抗体Fc-Fc相互作用参与具有六聚化增强突变的抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的DR5聚簇和凋亡诱导。
为了测试Fc-Fc介导的抗体六聚化在通过抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G诱导细胞死亡中的参与，我们利用了13个残基的肽DCAWHLGELVWCT(DeLano等,Science 2000Feb18；287(5456):1279-83)，其在含有疏水性斑块中涉及Fc-Fc相互作用的核心氨基酸的区域中结合Fc(Diebolder等,Science.2014 Mar 14；343(6176):1260-3)。如实施例11中所述，在存在或不存在DCAWHLGELVWCT肽的情况下，针对抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G在BxPC-3细胞上进行了存活力测定法。简言之，将细胞于37℃温育过夜后，将培养基去除并替换为100μL培养基，其含有Fc结合DCAWHLGELVWCT肽、非特异性对照肽GWTVFQKRLDGSV的稀释系列(范围为0-100μg/mL)，或没有肽。接下来，添加50μL抗体样品(833ng/mL最终浓度)，并于37℃温育3天。100μg/mL Fc结合DCAWHLGELVWCT肽大大抑制了抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G诱导BxPC-3细胞杀伤的能力(图14)。这些数据表明Fc:Fc相互作用参与了具有六聚化增强突变的抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G诱导癌细胞的细胞表面上DR5聚簇和诱导凋亡的能力。
实施例16：具有E430G六聚化增强突变的嵌合抗体组合DR5-01和DR5-05抗体在不同的组合比例时诱导癌细胞杀伤的能力
进行存活力测定法以研究抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G当以不同比例的IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G组合时诱导杀伤BxPC-3胰腺癌细胞的能力。通过胰蛋白酶处理收获细胞，并使其通过细胞过滤器。通过以1,200rpm离心5分钟沉淀细胞，并以0.5x105个细胞/mL的浓度重悬于培养基中。将100μL的单细胞悬液(每孔5,000个细胞)接种到聚苯乙烯96孔平底板(Greiner Bio-One,Cat nr 655182)中，并于37℃温育过夜。添加50μL具有不同比例的IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G的抗体样品(在以5倍稀释的范围为从0.06至20μg/mL最终浓度的系列稀释系列中表示为100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90和0:100的比例DR5-01:DR5-05)，并于37℃温育3天。作为阳性对照，将细胞与5μM星形孢菌素(Sigma Aldrich,Cat nr S6942)温育。如实施例8中所述，在CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法中确定细胞培养物的存活力。在20μg/mL和4μg/mL的总抗体浓度下，在所有测试的含有抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G两者的抗体比例下，杀伤同等有效。在0.8μg/mL和0.16μg/mL的总抗体浓度下，所有测试的含有抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G两者的抗体比例均诱导杀伤(图15)。
实施例17：具有E430G六聚化增强突变的人源化抗体DR5-01和DR5-05抗体的组合在不同的组合比例时诱导癌细胞杀伤的能力
进行存活力测定法以研究抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G当以不同比例组合时诱导杀伤BxPC-3胰腺和HCT-15结肠癌细胞的能力。通常，如实施例16中所述进行实验。简言之，将聚苯乙烯96孔平底板中150μL中预贴壁的细胞(每孔5,000个细胞)与不同比例的IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G(在图16中表示为100:0、98:2、96:4、94:6、92:8、90:10、50:50、10:90、8:92、6:94、4:96、2:98和0:100的比例DR5-01:DR5-05)于37℃温育3天，对于BxPC-3最终抗体浓度为10μg/mL，而对于HCT-15则为20μg/mL。如实施例8中所述，在CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法中确定细胞培养物的存活力。在所有测试的含有抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G两者的抗体比例下，杀伤同等有效(图16)。
实施例18：具有E430G六聚化增强突变的人源化DR5-01+DR5-05抗体的组合诱导胱天蛋白酶依赖性细胞毒性
进行存活力测定法以比较在存在和不存在胱天蛋白酶抑制剂的情况下，人源化抗体IgG1-hDR5-01-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的组合的细胞毒性。通过胰蛋白酶处理收获PANC-1和BxPC3胰腺癌细胞，并使其通过细胞过滤器。通过以1,200rpm离心5分钟沉淀细胞，并以0.5x105个细胞/mL的浓度重悬于培养基中。将100μL的单细胞悬液(每孔5,000个细胞)接种到聚苯乙烯96孔平底板(Greiner Bio-One,Cat nr 655182)中，并于37℃温育过夜。将25μL泛胱天蛋白酶抑制剂Z-Val-Ala-DL-Asp-氟甲基酮(Z-VAD-FMK，150μL中5μM终浓度，Bachem,Cat nr 4026865.0005)添加到细胞培养物中并于37℃温育一小时，然后添加25μL系列稀释抗体制剂系列的抗体样品(范围为1至20μg/mL最终浓度，以4倍稀释)并进一步于37℃温育3天。作为阳性对照，将细胞与5μM星形孢菌素(Sigma Aldrich,Cat nr S6942)温育。以6μg/mL使用重组人TRAIL/APO-2L(eBioscience,Cat nr BMS356)。如实施例8中所述，在CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法中确定细胞培养物的存活力。具有六聚化增强突变的人源化抗体IgG1-hDR5-01-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的组合在存在泛胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK的情况下未能降低PANC-1和BxPC3胰腺癌细胞的存活力，表明IgG1-hDR5-01-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的组合诱导了胱天蛋白酶依赖性程序性细胞死亡(图17)。对于天然DR5配体TRAIL也显示了这一点。
实施例19：如通过膜联蛋白V/碘化丙啶和活性胱天蛋白酶-3染色所评价的，嵌合DR5-01和DR5-05抗体的组合在COLO 205结肠癌细胞上结合后的细胞死亡诱导
通过膜联蛋白V/碘化丙啶(PI)双重染色和活性胱天蛋白酶-3染色分析了细胞死亡诱导的动力学。膜联蛋白-V结合在程序性细胞死亡起始后在细胞表面上暴露的磷脂酰丝氨酸，其是可逆的过程。PI是一种染料，当其进入细胞后插入到双链DNA和RNA中。因为PI无法通过完整的质膜和核膜，所以它不染色活细胞，而只进入并染色具有降低的膜完整性的死细胞。由于这些特性，膜联蛋白V/PI双重染色可以应用于区分起始(膜联蛋白V阳性/PI阴性)和不可逆的(膜联蛋白V阳性/PI阳性)程序性细胞死亡。胱天蛋白酶-3被外在死亡受体诱导的和内在的线粒体细胞死亡途径两者激活。因此，活性胱天蛋白酶-3也是起始死亡级联的标志物。在DR5阳性的COLO 205结肠癌细胞中分析了IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合结合后细胞死亡的诱导。通过汇合含有非贴壁细胞的培养上清液和经胰蛋白酶处理的贴壁细胞收获细胞。使细胞通过细胞过滤器，通过以1,200rpm离心5分钟沉淀，并以0.2x106个细胞/mL的浓度重悬于培养基中。将500μL的单细胞悬液(每孔100,000个细胞)接种到24孔平底培养板(Greiner Bio-One,Cat nr 662160)中并于37℃温育16小时。添加500μL抗体样品(1μg抗体最终浓度)并于37℃温育5小时或24小时。作为阳性对照，将细胞与5μM星形孢菌素(Sigma Aldrich,Cat nr S6942)温育。细胞用250μL 1x PBS洗涤一次。通过与100μL 0.05％胰蛋白酶于37℃温育10分钟来收获贴壁细胞。将200μL培养基添加到经胰蛋白酶处理的细胞中，并且将细胞转移到96孔圆底FACS板(Greiner Bio-One,Cat nr 650101)中，并与非贴壁细胞汇合。通过以1,200rpm离心5分钟沉淀细胞，重悬于200μL冰冷的PBS中，并在96孔圆底FACS板中分为100μL的两个样品分别进行膜联蛋白V/PI和活性胱天蛋白酶-3染色。
使用FITC膜联蛋白V凋亡检测试剂盒I(BD Pharmingen,Cat nr 556547)进行膜联蛋白V/PI双重染色。将细胞用冰冷的PBS洗涤一次，并在50μL膜联蛋白V/PI染色溶液(膜联蛋白V-FITC 1:00和PI 1:25)中于4℃温育15分钟。用100μL结合缓冲液洗涤细胞，重悬于20μL结合缓冲液中，并在1小时内在iQue Screener(IntelliCyt)上测量荧光。使用GraphPadPrism软件分析数据并绘图。
使用PE活性胱天蛋白酶-3凋亡试剂盒(BD Pharmingen,Cat nr 550914)进行活性胱天蛋白酶-3染色。用冰冷的PBS洗涤细胞一次，重悬于100μL Cytofix/Cytoperm固定和通透溶液中，并在冰上温育20分钟。于室温沉淀细胞，用100μL 1x通透/洗涤(Perm/Wash)缓冲液洗涤两次，并重悬于100μL PE兔抗活性胱天蛋白酶-3(1:10)中，于室温温育30分钟。于室温沉淀细胞，用100μL 1x通透/洗涤缓冲液洗涤一次并重悬于20μL 1x通透/洗涤缓冲液。在iQue Screener上测量荧光。使用GraphPad Prism软件分析数据并绘图。
图18显示，温育5小时后，嵌合抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合有效诱导了细胞死亡的早期阶段，如通过与阴性对照抗体IgG1-b12相比，膜联蛋白V阳性/PI阴性(A)和活性胱天蛋白酶-3阳性细胞(B)的百分比增加所示。与不具有E430G突变的DR5抗体的组合(IgG1-DR5-01-K409R+IgG1-DR5-05-F405L)或任何单一抗体相比，在用IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合处理的细胞中膜联蛋白V阳性/PI阴性和活性胱天蛋白酶-3阳性细胞的百分比更高。在5小时时间点，膜联蛋白V/PI双阳性细胞的百分比在所有样品中与背景水平相当(C)。
24小时温育后，用IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G处理的样品中膜联蛋白V/PI双阳性细胞(D)的百分比增加，表明细胞已进入细胞死亡的不可逆阶段。同样在此阶段，IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合的作用比用不具有E430G突变的DR5抗体的组合(IgG1-DR5-01-K409R+IgG1-DR5-05-F405L)或任何单一抗体处理的样品中更强(膜联蛋白V/PI双阳性细胞(E)的百分比增加更大)。在相同时间点，在用IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G处理的细胞中，活性胱天蛋白酶3阳性细胞的百分比最高。
这些数据表明IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合诱导COLO 205结肠癌细胞中的早期和晚期阶段两者的细胞死亡，并且比不具有E430G六聚化增强突变的抗体的组合更有效。
实施例20：具有六聚化增强突变的嵌合DR5-01和DR5-05抗体的组合在COLO 205结肠癌细胞上结合后的胱天蛋白酶-3和-7激活
在实施例19中，描述了与嵌合DR5抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合温育诱导了COLO 205结肠癌细胞中的胱天蛋白酶-3激活。与抗体组合温育5小时后的活性胱天蛋白酶-3阳性细胞的百分比高于24小时后。在该实施例中，使用胱天蛋白酶-Glo 3/7测定法(Promega,Cat nr G8091)以时间测量胱天蛋白酶-3/7激活，其中具有胱天蛋白酶-3/7识别基序DEVD的底物在切割后释放氨基萤光素，即萤光素酶的底物。通过汇合含有非贴壁细胞的培养上清液和经胰蛋白酶处理的贴壁COLO 205收获细胞。使细胞通过细胞过滤器，通过以1,200rpm离心5分钟沉淀，并以0.8x105个细胞/mL的浓度重悬于培养基中。将25μL的单细胞悬液(每孔2,000个细胞)接种到384孔培养板(Perkin Elmer,Cat nr 6007680)中并于37℃温育16小时。添加25μL抗体样品(1μg抗体最终浓度)并于37℃温育1、2、5和24小时。从培养箱中移出板以使温度降低至室温。通过以300g离心3分钟沉淀细胞。除去25μL上清液，并用25μL胱天蛋白酶-Glo 3/7底物替换。通过以500rpm摇动1分钟进行混合后，将板于室温温育一小时。在EnVision多标记读取器(PerkinElmer)上测量发光。
图19显示，在1、2至5小时的时间进程中，抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G和IgG1-DR5-01-K409R+IgG1-DR5-05-F405L，以及对于双特异性DR5抗体BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G诱导了胱天蛋白酶-3/7激活。24小时后，对于所有测试的DR5抗体，胱天蛋白酶-3/7激活几乎都降至基线水平。1小时后，在已用组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G处理的细胞中已经观察到胱天蛋白酶-3/7激活，而在已用不具有六聚化增强突变的IgG1-DR5-01-K409R+IgG1-DR5-05-F405L的组合处理的细胞中未观察到胱天蛋白酶-3/7激活。类似地，在2和5小时，由组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G诱导的胱天蛋白酶-3/7激活比IgG1-DR5-01-K409R+IgG1-DR5-05-F405L的组合更强。这些数据表明，具有六聚化增强突变的嵌合DR5抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合比不具有六聚化增强突变的抗体的组合诱导更快速且更有效力的胱天蛋白酶-3/7激活。
实施例21：具有E430G六聚化增强突变的嵌合DR5-01和DR5-05的抗体组合的效力不依赖于次级Fc交联剂的存在
进行存活力测定法以比较在不存在和存在次级抗体交联剂的情况下，抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G诱导杀伤COLO 205结肠直肠以及BxPC-3和PANC-1胰腺癌细胞的能力。为了进行比较，在相同设置下测试了两种已知在存在次级抗体交联剂的情况下显示出增强杀伤的DR5抗体，即IgG1-CONA和IgG1-chTRA8-F405L。通过胰蛋白酶处理收获细胞，并使其通过细胞过滤器。通过以1,200rpm离心5分钟沉淀细胞，并以0.5x105个细胞/mL的浓度重悬于培养基中。将100μL的单细胞悬液(每孔5,000个细胞)接种到聚苯乙烯96孔平底板(Greiner Bio-One,Cat nr 655182)中，并于37℃温育过夜。在不存在或存在山羊抗人IgG抗体(1/150；Jackson ImmunoResearch；Cat nr 109-006-098)的F(ab’)2片段的情况下用150μL抗体样品(最终浓度10μg/mL)替换贴壁细胞的上清液，并于37℃温育3天。作为细胞杀伤的阳性对照，将细胞与5μM星形孢菌素(SigmaAldrich,Cat nr S6942)温育。如实施例8中所述，在CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法中确定细胞培养物的存活力。在存在或不存在Fc交联剂的两种情况下，与COLO 205、BxPC-3和PANC-1癌细胞的阴性对照相比，抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G诱导了显著的杀伤(图20)。相反，在不存在Fc交联剂的情况下，DR5抗体IgG1-DR5-CONA和IgG1-DR5-chTRA8-F405L不诱导靶细胞杀伤。Fc交联诱导在COLO 205和BxPC-3细胞中通过IgG1-DR5-CONA和IgG1-DR5-chTRA8-F405L杀伤，尽管其效力在存在或不存在交联剂的情况下显著低于抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G。这些数据表明，抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G对COLO205、BxPC-3和PANC-1癌细胞的杀伤不依赖于次级Fc交联剂的存在，并且这种不依赖于交联剂的杀伤比Fc交联的IgG1-DR5-CONA和IgG1-DR5-chTRA8-F405L更有效。
实施例22：在IgG1-hDR5-01-430G中引入K409R突变和在IgG1-hDR5-05-E430G中引入F405L突变对人源化抗体IgG1-hDR5-01-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的组合的效力没有影响
在本申请中描述的许多实验中，抗DR5抗体IgG1-01和IgG1-05在IgG Fc域中分别含有K409R和F405L(EU编号索引)突变。这些突变使得能够通过如WO2011/131746中所述的在受控还原条件下通过IgG1-01-K409R和IgG1-05-F405L之间的Fab臂交换反应来生成DR5双特异性抗体。不进行Fab臂交换，则认为带有K409R和F405L突变的人IgG1抗体显示与野生型人IgG1相同的功能型特征(Labrijn等,Proc Natl Acad Sci U S A.2013 Mar 26；110(13):5145-50)。在此，我们显示K409R或F405L突变的存在对亲本IgG1-01和IgG1-05抗体的组合诱导体外DR5阳性肿瘤细胞中细胞死亡的能力没有影响。进行存活力测定法以将人源化抗体IgG1-hDR5-01-K409R-E430G+IgG1-hDR5-05-F405L-E430G的组合诱导杀伤BxPC-3胰腺癌细胞的能力与人源化抗体IgG1-hDR5-01-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的组合的能力进行比较。如实施例11中所述对BxPC-3进行存活力测定法，其中系列稀释抗体系列范围为0.001至20,000ng/mL最终浓度，以4倍稀释。与人源化抗体IgG1-hDR5-01-K409R-E430G+IgG1-hDR5-05-F405L-E430G的组合温育后，BxPC-3胰腺癌细胞系显示出与和人源化抗体IgG1-hDR5-01-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的组合温育后相似的存活力曲线(图21)。这些数据表明，K409R和F405L突变对具有E430G六聚化增强突变的人源化DR5-01和DR5-05抗体的组合的效力没有影响。
实施例23：嵌合双特异性抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G诱导DR5阳性肿瘤细胞的杀伤
如实施例1中所述，通过嵌合抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G之间的Fab臂交换生成靶向两个不同DR5表位的双特异性抗体。如实施例11中所述进行存活力测定法以测试10μg/mL的嵌合BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G诱导杀伤不同组织来源的癌细胞(COLO 205结肠直肠癌、A375皮肤癌、SK-MES-1肺癌、BxPC-3胰腺癌和SNU-5胃癌细胞系)的能力。对于所有测试的细胞系，与非靶标结合阴性对照抗体IgG1-b12相比，与10μg/mL的嵌合BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G抗体温育时百分比活细胞显著更低(图22)。这些数据表明，具有六聚化增强突变E430G的双特异性抗DR5xDR5’抗体诱导杀伤不同来源的癌细胞，包括结肠、胰腺、胃、肺和皮肤癌，而无需次级交联剂。
实施例24：嵌合BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430Gx DR5-05-F405L-E430G的效力不依赖于次级Fc交联剂的存在
如实施例21中所述进行存活力测定法以比较在不存在和存在次级抗体交联剂的情况下，嵌合BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x IgG1-DR5-05-F405L-E430G诱导杀伤BxPC-3胰腺和COLO 205结肠癌细胞的效力。为了进行比较，在相同设置下测试了两种已知在存在次级抗体交联剂的情况下显示出增强杀伤的DR5抗体，即IgG1-CONA和IgG1-chTRA8-F405L。在存在或不存在Fc交联剂的两种情况下，与COLO 205和BxPC-3癌细胞的阴性对照相比，嵌合BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G显示出显著的杀伤(图23)。相反，在存在Fc交联剂的情况下，DR5抗体IgG1-DR5-CONA和IgG1-DR5-chTRA8-F405L仅诱导杀伤。
实施例25：如通过膜联蛋白V/碘化丙啶和活性胱天蛋白酶-3染色所评价的，BsAbIgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G在COLO 205结肠癌细胞上结合后的细胞死亡诱导
如实施例19中所述通过膜联蛋白V/碘化丙啶(PI)双重染色和活性胱天蛋白酶-3染色分析了1μg/mL BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G对COLO 205细胞诱导的细胞死亡的动力学。
图24显示，温育5小时后，BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430GxDR5-05-F405L-E430G有效诱导了细胞死亡的早期阶段，如通过与阴性对照抗体IgG1-b12相比，膜联蛋白V阳性/PI阴性(A)和活性胱天蛋白酶-3阳性细胞(B)的百分比增加所示。与不具有E430G突变的双特异性抗体(BsAb IgG1-DR5-01-K409RxDR5-05-F405L)或任何单特异性抗体相比，在已用BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430GxDR5-05-F405L-E430G处理的细胞中膜联蛋白V阳性/PI阴性和活性胱天蛋白酶-3阳性细胞的百分比更高。在5小时时间点，膜联蛋白V/PI双阳性细胞的百分比在所有样品中与背景水平相当(C)。24小时温育后，用BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430GxDR5-05-F405L-E430G处理的样品中膜联蛋白V/PI双阳性细胞(D)的百分比增加，表明细胞已进入细胞死亡的不可逆阶段。同样在此阶段，BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430GxDR5-05-F405L-E430G的作用比用不具有E430G突变的双特异性抗体(BsAb IgG1-DR5-01-K409R x DR5-05-F405L)或任何单特异性抗体处理的样品中更强(膜联蛋白V/PI双阳性细胞(E)的百分比增加更大)。在相同时间点，在用BsAB IgG1-DR5-01-K409R-E430G xDR5-05-F405L-E430G处理的细胞中，活性胱天蛋白酶3阳性细胞的百分比最高。
这些数据表明BsAB IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G诱导COLO205结肠癌细胞中的早期和晚期阶段两者的细胞死亡，并且比不具有E430G六聚化增强突变的双特异性抗体更有效。
实施例26：在皮下COLO 205结肠癌异种移植模型中具有和不具有六聚化增强突变的DR5-01和DR5-05抗体变体的体内功效
在具有COLO 205人结肠癌细胞的皮下模型中评估了不同抗DR5抗体以及具有六聚化增强突变的DR5-01+DR5-05抗体的组合的体内抗肿瘤功效。在第0天，通过汇合含有非贴壁细胞的培养上清液和经胰蛋白酶处理的贴壁细胞来收获细胞。将3x106个细胞以200μLPBS的体积注射到6-11周龄的雌性SCID小鼠(C.B-
Figure BDA0002379913990001071
Hsd-Prkdcscid；Harlan)的腹侧中。所有实验和动物处理均已获得地方当局的批准，并根据所有适用的国际、国家和地方法律和指南进行。通过每周至少两次卡尺(PLEXX)测量为0.52x(长)x(宽)2来监测肿瘤发展。测量肿瘤直至1,500mm3的终点肿瘤体积，直至肿瘤显示出溃疡，直至观察到严重的临床体征，或者直至肿瘤生长阻止了小鼠的运动为止。在第6天，平均肿瘤体积为～200mm3，并且将小鼠分为具有相同肿瘤大小差异的组(下表2)。在第6天和第13天通过腹膜内(i.p.)注射在200μL PBS中的100μg抗体对小鼠进行治疗(每剂5mg/kg)。为了检查正确的抗体施用，在第一剂后三天获得血液样品用于IgG血清测定。三只单独的小鼠没有可检测的人IgG血浆水平，并被排除在统计分析之外(参见下表2)。对于其他小鼠，当假设其2室模型中Vcen＝50mL/kg，Vs＝100mL/kg以及消除半衰期为11.6天时，人抗体血浆浓度符合预期(数据未显示)。测量肿瘤直至肿瘤接种后16周。
表2：治疗组和给药
Figure BDA0002379913990001081
图25A显示每治疗组以时间的平均肿瘤体积。图25B表示在肿瘤接种后第23天，当所有组仍然完整时的平均肿瘤体积。与阴性对照抗体IgG1-b12相比，所有抗DR5抗体样品均显著抑制肿瘤生长(非参数单向方差分析(Kruskal-Wallis)，然后在第23天进行Dunn多重比较检验：p<0.0001)。对于具有六聚化增强突变的DR5-01+DR5-05抗体的组合(IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G)，对于具有和不具有六聚化增强突变的双特异性抗体(BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L和BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G)，以及具有六聚化增强突变的抗DR5抗体(IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G)观察到完全肿瘤消除。与IgG1-b12相比，不具有六聚化增强突变的IgG1-CONA和IgG1-DR5-05-F405L大大抑制了肿瘤生长，但并未导致完全肿瘤消除。
图25C显示肿瘤进展的Kaplan-Meier绘图，其中截点设定在肿瘤体积>750mm3。与用阴性对照抗体IgG1-b12治疗的小鼠相比，在用抗DR5抗体治疗的所有组中，肿瘤长出(tumor outgrowth)都显著延迟了(在肿瘤大小截点的750mm3的Mantel-Cox分析：p<0.001)。在研究结束时(第112天)，用具有六聚化增强突变的DR5-01+DR5-05抗体的组合(IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G)治疗的小鼠的组具有肿瘤长出的小鼠显著少于考那妥木单抗组(Fisher精确列联检验(Fisher’s exact contingencytest)p<0.01)。
这些数据表明，与不具有六聚化增强突变的IgG1-DR5-05-F405L相比，在IgG1-DR5-05-F405L中引入E430G六聚化增强突变导致皮下COLO 205结肠癌肿瘤模型中的肿瘤抑制增强。具有六聚化增强突变的DR5-01和DR5-05抗体(IgG1-DR5-01-K409R-E430G和IgG1-DR5-05-F405L-E430G)两者，具有和不具有六聚化增强突变的双特异性抗体(BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L和BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G)以及具有六聚化增强突变的抗体的组合(IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G)显示出比不具有六聚化增强突变的IgG1-CONA和IgG1-DR5-05-F405L更好的肿瘤抑制。
实施例27：在皮下COLO 205结肠癌异种移植模型中不同剂量的抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的体内功效
在皮下COLO 205人结肠癌异种移植模型中评估了不同剂量IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的体内抗肿瘤功效，并将其与等同剂量的IgG1-CONA进行比较。如实施例26中所述进行肿瘤细胞接种、小鼠处理、肿瘤长出测量和终点确定。在第10天，平均肿瘤体积为～400mm3，并且将小鼠分为具有相同肿瘤大小差异的组(下表3)。在第10天通过静脉内(i.v.)注射在100μL PBS中的40μg(2mg/kg)、10μg(0.5mg/kg)或2μg(0.1mg/kg)抗体对小鼠进行治疗。用40μg(2mg/kg)IgG1-b12治疗对照组中的小鼠。测量肿瘤直至肿瘤接种后17周。
表3：治疗组和给药
Figure BDA0002379913990001101
图26A显示每治疗组的平均肿瘤体积。用0.5mg/kg或2mg/kg单剂量的抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G进行治疗导致完全肿瘤消退，直至第126天研究停止。用0.5mg/kg和2mg/kg IgG1-CONA进行治疗也诱导肿瘤消退，但消退并不完全，其中复发的肿瘤长出分别在所有小鼠或几乎所有(7/8)小鼠中。在0.1mg/kg时，IgG1-CONA和IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合均未显示抗肿瘤活性。图26B显示，在肿瘤接种后第16天，与等同剂量IgG1-CONA相比，通过2mg/kg和0.5mg/kgIgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的肿瘤抑制显著更好(未配对t检验)。
图26C显示肿瘤进展的Kaplan-Meier绘图，其中截点设定在肿瘤体积>500mm3。与阴性对照抗体IgG1-b12相比，在0.5mg/kg和2mg/kg的剂量下，组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G和IgG1-CONA显著抑制肿瘤生长进展(p<0.001在肿瘤大小截点500mm3的Mantel-Cox分析)。在0.5mg/kg的剂量下，对于组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G，肿瘤生长进展的抑制明显优于等同剂量IgG1-CONA。
这些数据表明，与IgG1-CONA相比，IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G组合具有更强的抗肿瘤功效，因为以2mg/kg给药时，在第16天与IgG1-CONA比较，组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G显著降低了肿瘤负荷，而以0.5mg/kg，在第16天与IgG1-CONA比较，IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G组合显著降低了肿瘤负荷，并延长了无进展生存时间(肿瘤大小截点500mm3)。
实施例28：在皮下BxPC-3胰腺癌异种移植模型中不同剂量的抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的体内功效
在皮下BxPC-3人胰腺癌异种移植模型中评估了不同剂量IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的体内抗肿瘤功效，并将其与等同剂量的IgG1-CONA-F405L进行比较。如实施例26中所述进行小鼠处理、肿瘤长出测量和终点确定。在第10天，平均肿瘤体积为～250mm3，并且将小鼠分为具有相同肿瘤大小差异的组(下表4)。在第20和28天通过i.v.注射在200μL PBS中的200μg(10mg/kg)、40μg(2mg/kg)或10μg(0.5mg/kg)抗体对小鼠进行治疗。用200μg(10mg/kg)IgG1-b12治疗对照组中的小鼠。为了检查正确的抗体施用，在给药后一周获得血液样品用于IgG血清测定。测量肿瘤直至肿瘤接种后10周。
表4：治疗组和给药
Figure BDA0002379913990001111
图27A显示每治疗组的中位肿瘤体积。与阴性对照抗体IgG1-b12相比，所有测试剂量的抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G均抑制肿瘤生长，而IgG1-CONA-F405L治疗组未抑制。图27B显示，在肿瘤接种后第48天，IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合对肿瘤生长抑制显著优于等同剂量的IgG1-CONA-F405L(未配对t检验，p<0.05)。
图27C显示肿瘤进展的Kaplan-Meier绘图，其中截点设定在肿瘤体积>500mm3。与阴性对照抗体IgG1-b12相比以及与IgG1-CONA-F405L相比，组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G显著抑制肿瘤生长进展(在肿瘤大小截点500mm3的Mantel-Cox分析：p<0.001)。
这些数据表明处于不同剂量(0.5mg/kg、2mg/kg和10mg/kg)的组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G抑制肿瘤生长，并且在体内BxPC-3人胰腺癌异种移植模型中，抗肿瘤功效显著优于等同剂量的IgG1-CONA-F405L。
实施例29：在皮下A375皮肤癌异种移植模型中不同剂量的抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的体内功效
在皮下A375人皮肤癌异种移植模型中评估了不同剂量IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的体内抗肿瘤功效，并将其与等同剂量的IgG1-CONA-F405L进行比较。在第0天，通过胰蛋白酶处理收获贴壁细胞。将5x106个细胞以100μL PBS的体积注射到6-11周龄的雌性SCID小鼠(C.B-
Figure BDA0002379913990001122
Hsd-Prkdcscid；Harlan)的腹侧中。如实施例26中所述进行小鼠处理、肿瘤长出测量和终点确定。在第19天，平均肿瘤体积为～250mm3，并且将小鼠分为具有相同肿瘤大小差异的组(下表5)。在第19和26天通过i.v.注射在200μL PBS中的200μg(10mg/kg)、40μg(2mg/kg)或10μg(0.5mg/kg)抗体对小鼠进行治疗。用200μg(10mg/kg)IgG1-b12治疗对照组中的小鼠。为了检查正确的抗体施用，在给药后一周获得血液样品用于IgG血清测定。分析肿瘤直至肿瘤接种后7周。
表5：治疗组和给药
Figure BDA0002379913990001121
Figure BDA0002379913990001131
图28A显示每治疗组的中位肿瘤体积。与阴性对照抗体IgG1-b12相比，所有测试剂量的抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G均抑制肿瘤生长，而IgG1-CONA-F405L治疗组未抑制。图28B显示，在肿瘤接种后第29天，用IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合治疗的小鼠中平均肿瘤大小小于用IgG1-b12治疗的小鼠(对于所有剂量水平，p<0.05，具有用于多重比较的Dunnet校正的单向方差分析)，并且在等同剂量，IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合比IgG1-CONA-F405L显著更有效力(Mann Whitney检验，p<0.05)。
这些数据表明处于不同剂量(0.5mg/kg、2mg/kg和10mg/kg)的组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G抑制肿瘤生长，并且在体内A375人皮肤癌异种移植模型中，抗肿瘤功效显著优于等同剂量的IgG1-CONA-F405L。
实施例30：在皮下HCT-15结肠癌异种移植模型中不同剂量的抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的体内功效
于CrownBiosciences,Taicang,China，在皮下HCT-15人结肠癌异种移植模型中评估了不同剂量IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的体内抗肿瘤功效，并将其与等同剂量的IgG1-CONA进行比较。将细胞作为单层培养物在补充有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中于37℃在空气中5％CO2的气氛中进行体外维持。通过胰蛋白酶-EDTA处理收获指数生长期的贴壁细胞。将5x106个细胞以100μL PBS的体积注射到6-8周龄雌性BALB/c裸鼠(上海实验动物中心)的腹侧中。根据实验动物护理评估和鉴定协会(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC)的规定，在研究期间对动物进行护理和使用。使用卡尺每周两次在两个维度测量肿瘤体积，并且使用以下公式以mm3表示体积：V＝0.5a x b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。肿瘤接种后11天，平均肿瘤大小达到186mm3，并使用随机区组设计将小鼠分组，并开始治疗。根据Q7D方案通过i.v.注射每g体重10μL PBS中的200μg(10mg/kg)、40μg(2mg/kg)或10μg(0.5mg/kg)抗体对小鼠进行两次治疗。用200μg(10mg/kg)IgG1-b12平行地治疗对照组中的小鼠。肿瘤接种后，每天检查动物的福利，并每周两次测量肿瘤体积。
表6：治疗组和给药，实施例30
Figure BDA0002379913990001141
图29A显示每治疗组的平均肿瘤体积。与阴性对照抗体IgG1-b12相比，所有测试剂量的抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G均抑制肿瘤生长，而IgG1-CONA未抑制。图29B显示，在开始治疗后第17天，IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合对肿瘤生长抑制显著优于等同剂量IgG1-CONA(未配对t检验，p<0.05)。
图29C显示肿瘤进展的Kaplan-Meier绘图，其中截点设定在肿瘤体积>500mm3。与阴性对照抗体IgG1-b12相比以及与等同剂量IgG1-CONA相比，组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G显著抑制肿瘤生长进展(在肿瘤大小截点500mm3的Mantel-Cox分析：p<0.001)。
这些数据表明处于不同剂量(0.5mg/kg、2mg/kg和10mg/kg)的组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G抑制肿瘤生长，并且在具有HCT-15人结肠癌细胞的体内异种移植模型中，抗肿瘤功效显著优于等同剂量的IgG1-CONA。
实施例31：在皮下SW480结肠癌异种移植模型中不同剂量的抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的体内功效
于CrownBiosciences,Taicang,China，在皮下SW480人结肠癌异种移植模型中评估了不同剂量IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的体内抗肿瘤功效，并将其与等同剂量的IgG1-CONA进行比较。将细胞作为单层培养物在补充有10％胎牛血清的L-15培养基中于37℃在100％空气中进行体外维持。通过胰蛋白酶-EDTA处理收获指数生长期的贴壁细胞。将1x107个细胞在200μL PBS的体积中与Matrigel(1:1)一起注射到6-8周龄雌性NOD/SCID小鼠(Beijing HFK Bioscience)的腹侧中。如实施例30中所述进行小鼠处理和肿瘤体积测量。肿瘤接种后十天，平均肿瘤大小达到175mm3，并使用随机区组设计将小鼠分组，并开始治疗。根据Q7D方案通过i.v.注射每g体重10μL PBS中的200μg(10mg/kg)、40μg(2mg/kg)或10μg(0.5mg/kg)抗体对小鼠进行两次治疗。用200μg(10mg/kg)IgG1-b12平行地治疗对照组中的小鼠。肿瘤接种后，每天检查动物的福利，并每周两次测量肿瘤体积。
表7：治疗组和给药，实施例31
Figure BDA0002379913990001151
Figure BDA0002379913990001161
图30A显示每治疗组的平均肿瘤体积。与阴性对照抗体IgG1-b12相比，所有测试剂量的抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G均抑制肿瘤生长(10mg/kg p<0.0001；2mg/kg p<0.001；0.5mg/kg p<0.05)。IgG1-CONA治疗组在最高剂量(10mg/kg和2mg/kg，p<0.01)下仅优于IgG1-b12，但在0.5mg/kg没有。图30B显示，在开始治疗后第28天，处于10mg/kg和0.5mg/kg的IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合对肿瘤生长抑制显著优于等同剂量IgG1-CONA(未配对t检验，p<0.05)。
图30C显示肿瘤进展的Kaplan-Meier绘图，其中截点设定在肿瘤体积>500mm3。与阴性对照抗体IgG1-b12相比以及与等同剂量IgG1-CONA相比，以10mg/kg给药的组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G显著抑制肿瘤生长进展(在肿瘤大小截点500mm3的Mantel-Cox分析：p<0.001)。
这些数据表明处于不同剂量(0.5mg/kg、2mg/kg和10mg/kg)的组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G抑制肿瘤生长，并且在体内SW480人结肠癌异种移植模型中，10mg/kg和0.5mg/kg的剂量的抗肿瘤功效显著优于等同剂量的IgG1-CONA。
实施例32：在皮下SNU-5胃癌异种移植模型中不同剂量的抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的体内功效
于CrownBiosciences,Taicang,China，在皮下SNU-5人胃癌异种移植模型中评估了不同剂量IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的体内抗肿瘤功效，并将其与等同剂量的IgG1-CONA进行比较。将细胞作为悬浮培养物在补充有20％胎牛血清的IMDM培养基中于37℃在空气中5％CO2的气氛中进行体外维持。收获指数生长期的细胞，并将1x107个细胞在200μL PBS的体积中与Matrigel(1:1)一起注射到6-8周龄雌性CB17/SCID小鼠(Beijing HFK Bioscience)的腹侧中。如实施例30中所述进行小鼠处理和肿瘤体积测量。肿瘤接种后八天，平均肿瘤大小达到169mm3，并使用随机区组设计将小鼠分组，并开始治疗。根据Q7D方案通过i.v.注射每g体重10μL PBS中的200μg(10mg/kg)、40μg(2mg/kg)或10μg(0.5mg/kg)抗体对小鼠进行两次治疗。用200μg(10mg/kg)IgG1-b12平行地治疗对照组中的小鼠。肿瘤接种后，每天检查动物的福利，并每周两次测量肿瘤体积。
表8：治疗组和给药，实施例32
Figure BDA0002379913990001171
图31A显示每治疗组的平均肿瘤体积。与阴性对照抗体IgG1-b12相比，所有测试剂量的抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G均抑制肿瘤生长。在2mg/kg和10mg/kg剂量下，抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G导致持续整个研究时间的完全肿瘤消退(开始治疗后7周)。图31B显示，在开始治疗后第23天，IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合对肿瘤生长抑制显著优于等同剂量IgG1-CONA(Mann Whitney检验，p<0.05)。
图31C显示肿瘤进展的Kaplan-Meier绘图，其中截点设定在肿瘤体积>500mm3。与阴性对照抗体IgG1-b12相比以及与等同剂量IgG1-CONA相比，组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G显著抑制肿瘤生长进展(在肿瘤大小截点500mm3的Mantel-Cox分析：p<0.05)。
这些数据表明处于不同剂量(0.5mg/kg、2mg/kg和10mg/kg)的组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G抑制肿瘤生长，并且在体内SNU-5人胃癌异种移植模型中，抗肿瘤功效显著优于等同剂量的IgG1-CONA。
实施例33：在皮下SK-MES-1肺癌异种移植模型中不同剂量的抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的体内功效
于CrownBiosciences,Taicang,China，在皮下SK-MES-1人肺癌异种移植模型中评估了不同剂量IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的体内抗肿瘤功效，并将其与等同剂量的IgG1-CONA进行比较。将细胞作为单层培养物在补充有10％胎牛血清和0.01mM NEAA的MEM培养基中于37℃在空气中5％CO2的气氛中进行体外维持。在第0天，通过胰蛋白酶-EDTA处理收获指数生长期的贴壁细胞。将5x106个细胞以100μL PBS的体积注射到6-8周龄雌性BALB/c小鼠(上海实验动物中心)的腹侧中。如实施例30中所述进行小鼠处理和肿瘤体积测量。肿瘤接种后二十一天，平均肿瘤大小达到161mm3，并使用随机区组设计将小鼠分组，并开始治疗。根据Q7D方案通过i.v.注射每g体重10μL PBS中的200μg(10mg/kg)、40μg(2mg/kg)或10μg(0.5mg/kg)抗体对小鼠进行两次治疗。用200μg(10mg/kg)IgG1-b12平行地治疗对照组中的小鼠。肿瘤接种后，每天检查动物的福利，并每周两次测量肿瘤体积。
表9：治疗组和给药，实施例33
Figure BDA0002379913990001181
Figure BDA0002379913990001191
图32A显示每治疗组的平均肿瘤体积。与阴性对照抗体IgG1-b12相比，所有测试剂量的抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G均显著抑制肿瘤生长(p<0.0001)，而IgG1-CONA仅在处于10mg/kg(p<0.01)和2mg/kg(p<0.05)的情况下与IgG1-b12相比具有显著的作用，但处于0.5mg/kg时则没有(单向方差分析，随后是Dunnett多重比较检验)。图32B显示，在开始治疗后第14天，处于2mg/kg和0.5mg/kg的IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G的组合对肿瘤生长抑制显著优于等同剂量IgG1-CONA(未配对t检验，分别为p<0.05和p<0.01)。
图32C显示肿瘤进展的Kaplan-Meier绘图，其中截点设定在肿瘤体积>1.000mm3。与阴性对照抗体IgG1-b12相比(在肿瘤大小截点1.000mm3的Mantel-Cox分析：p≤0.001)以及与等同剂量IgG1-CONA相比(在肿瘤大小截点1.000mm3的Mantel-Cox分析：p<0.05)，处于2mg/kg和0.5mg/kg的组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G显著抑制肿瘤生长进展。
这些数据表明处于不同剂量(0.5mg/kg、2mg/kg和10mg/kg)的组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G抑制肿瘤生长，并且在体内SK-MES-1人肺癌异种移植模型中，处于0.5mg/kg和2mg/kg的抗肿瘤功效显著优于等同剂量的IgG1-CONA。
实施例34：不同人癌细胞系上的DR5表达水平
如实施例2中所述，通过使用QIFIKIT与小鼠单克隆抗体B-K29的间接免疫荧光法，对不同人癌细胞系的每细胞DR5密度进行了定量。根据低DR5表达(ABC<10,000)和中等DR5表达(ABC>10,000)对细胞系进行分类。发现人癌细胞系SK-MEL-5(ATCC，HTB-070)恶性黑色素瘤、Jurkat(ATCC，TIB-152)急性T细胞白血病和Daudi(ATCC，CCL-231)伯基特淋巴瘤具有低DR5表达(QIFIKIT ABC范围为3,500-6,500)。发现人结肠直肠癌细胞系SNU-C2B(ATCC，CCL-250)、LS411N(ATCC，CRL-2159)和DLD-1(ATCC，CCL-221)具有中等DR5表达(QIFIKITABC范围为12,000-44,500)。
实施例35：六聚化增强突变的引入不影响IgG1-hDR5-01-G56T和IgG1-hDR5-05抗体与DR5阳性人结肠癌细胞的结合。
通过流式细胞术分析了经纯化的具有和不具有E430G突变的IgG1-hDR5-01-G56T和IgG1-hDR5-05的抗体变体与人结肠癌细胞HCT 116的结合。如实施例3中所述制备单细胞悬液并分析系列稀释抗体制剂系列(范围为0.0006至10μg/mL最终浓度，以4倍稀释)的结合。与二抗温育后，将细胞洗涤两次，重悬于100μL FACS缓冲液中，并在BD LRSFFortessa细胞分析仪(BD Biosciences)上分析抗体结合。使用GraphPad Prism软件用非线性回归分析(具有可变斜率的S形剂量反应)分析结合曲线。
图33显示，抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G显示出与其对应的不具有E430G突变的抗体相似的与HCT 116细胞的剂量依赖性结合。E430G突变的引入对DR5抗体的结合没有影响。从六个重复实验计算出EC50值，对于IgG1-hDR5-01-G56T-E430G为74.4(+/-58.4)ng/mL，对于IgG1-hDR5-05-E430G为101.2(+/-52.6)ng/mL。
实施例36：IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G作为单一抗体和作为组合与DR5阳性人癌细胞的结合。
通过流式细胞术分析了经纯化的Alexa 647标记的IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和Alexa 647标记的IgG1-hDR5-05-E430G的样品(作为单一试剂和作为两种抗体的组合两者)与具有中等DR5表达的HCT 116人癌细胞的抗体结合。将1mg/mL IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G于室温用0.1M NaHCO3缀合缓冲液中5摩尔过量的Alexa
Figure BDA0002379913990001201
647、羧酸、琥珀酰亚胺酯(Molecular Probes；Cat#A-20006)标记以达到3标记程度。在PD 10柱(Amersham Bioscience,Cat#17-0851-01)上除去游离的过量Alexa 647。如实施例3中所述制备单细胞悬液并分析系列稀释抗体制剂系列(范围为0.0019至30μg/mL最终浓度，以5倍稀释)的结合。抗体温育后，将细胞洗涤两次，重悬于100μL FACS缓冲液中，并在BDLRSFFortessa细胞分析仪(BD Biosciences)上分析抗体结合。使用GraphPad Prism软件用非线性回归分析(具有可变斜率的S形剂量反应)分析结合曲线。
图34显示，非交叉阻断抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G的单一抗体和组合两者均显示出对HCT 116人癌细胞的剂量依赖性结合。
实施例37：抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G与食蟹猴DR5的结合。
通过流式细胞术分析经纯化的IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G与表达人DR5或食蟹猴DR5的短同等型的CHO细胞的结合。如实施例1中所述生成用于表达同等型具有死亡域功能丧失突变K386N的短人DR5蛋白(基于Uniprot编号O14763-2的SEQ IDNO 47)以及具有氨基酸185-213的缺失和死亡域功能丧失突变K420N的食蟹猴DR5蛋白(SEQID NO 50；基于NCBI登录号XP_005562887.1)的密码子优化的构建体。通常如实施例5中所述分析与经DR5转染的CHO细胞的结合。经转染的细胞储存在液氮中，并于37℃快速融化，并悬浮在10mL培养基中。用PBS洗涤细胞，并以1.0x106个细胞/mL的浓度重悬于FACS缓冲液中。将100μL细胞悬液样品(每孔100,000个细胞)接种到96孔板中，并通过于4℃以300xg离心3分钟沉淀。添加25μL的系列稀释抗体制剂系列(最终浓度0至20μg/mL，以6倍稀释)，并于4℃温育30分钟。接下来，洗涤细胞并与50μL二抗R-PE缀合的山羊抗人IgG F(ab’)2(Jackson ImmunoResearch；Cat nr 109-116-098；1/100)于4℃避光温育30分钟。将细胞用150μL FACS缓冲液洗涤两次，重悬于50μL FACS缓冲液中，并通过在BD LRSFFortessa细胞分析仪(BD Biosciences)上记录10,000个事件分析抗体结合。使用GraphPad Prism软件用非线性回归分析(具有可变斜率的S形剂量反应)分析结合曲线。
图35显示，抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G显示出与CHO细胞上表达的人和食蟹猴DR5的剂量依赖性结合。基于四个重复实验，对于IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G两者，与人DR5和食蟹猴DR5结合的EC50值均在相同范围内(表10)。
表10：IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G与人和食蟹猴DR5结合的EC50值。基于四个实验。
Figure BDA0002379913990001211
实施例38：E430G突变的引入改进了非交叉阻断抗体IgG1-hDR5-01-G56T+IgG1-hDR5-05的组合对细胞死亡诱导的功效。
进行存活力测定法以研究IgG1-hDR5-01-G56T和IgG1-hDR5-05中六聚化增强突变E430G对抗体杀伤人结肠癌细胞COLO 205的能力的影响。将具有和不具有E430G突变的抗体作为单一试剂以及作为两种非交叉阻断抗体的组合进行测试。如实施例8中所述收获COLO205细胞。将100μL的单细胞悬液(每孔5,000个细胞)接种到聚苯乙烯96孔平底板(GreinerBio-One,Cat nr 655182)中，并允许其于37℃粘附过夜。随后，添加50μL抗体浓度系列的样品(范围为0.3-20,000ng/mL最终浓度，以4倍稀释)，并于37℃温育3天。作为阳性对照，将细胞与5μM星形孢菌素(Sigma Aldrich,Cat nr S6942)温育。如实施例8中所述，在CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法中确定细胞培养物的存活力。
图36显示，IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的组合比单独任一抗体更有效力，并且比不具有E430G突变的抗体的组合更有效力。这些数据表明，在非交叉阻断抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的组合与贴壁COLO 205结肠癌细胞结合后，引入六聚化增强突变E430G导致细胞杀伤的诱导增强。与其中在接种细胞时直接添加抗体的实验设置相反(实施例8)，单一抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G在该实验中未显示对COLO 205细胞的功效，所述实验中首先允许细胞粘附到96孔平底板，然后添加样品。
实施例39：六聚化增强突变S440Y的引入改进了抗DR5抗体在人结肠癌细胞上诱导细胞死亡的功效。
在存活力测定法中研究了六聚化增强突变S440Y对单一抗体以及IgG1-hDR5-01-G56T和IgG1-hDR5-05的组合杀伤COLO 205人结肠癌细胞的能力的影响。如实施例8中所述收获细胞并进行CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法。简言之，将100μL的单细胞悬液(每孔5,000个细胞)接种到96孔板中，并同时添加50μL的系列稀释抗体制剂系列(范围为0.0003至20μg/mL最终浓度，以4倍稀释)，并于37℃温育3天。
图37A显示，在其中接种细胞时直接添加抗体的实验设置中，引入六聚化增强突变S440Y导致单一抗体IgG1-hDR5-01-G56T-S440Y和IgG1-hDR5-05-S440Y的剂量依赖性杀伤，而亲本野生型抗体IgG1-hDR5-01-G56T和IgG1-hDR5-05不能杀伤COLO 205结肠癌细胞。通过降低的EC50所示，IgG1-hDR5-01-G56T+IgG1-hDR5-05的组合的功效也通过在两种抗体中引入S440Y突变而得到改进(图37B)。
实施例40：六聚化增强突变E430G的引入改进了抗DR5抗体IgG1-DR5-CONA+IgG1-DR5-chTRA8的组合对细胞死亡诱导的功效。
如实施例7中所述进行针对抗体IgG1-DR5-CONA-K409R和IgG1-DR5-chTRA8-F405L的交叉阻断ELISA。K409R和F405L突变在此处无关，并且先前已显示对具有E430G突变的抗体的效力没有影响(实施例22)。图38A显示了结合竞争，其表示为在存在竞争抗体的情况下DR5ECD-FcHisCtag与包被抗体的结合的百分比抑制，相对于在不存在竞争抗体的情况下DR5ECD-FcHisCtag的结合(％抑制＝100–[(存在竞争抗体的情况下的结合/不存在竞争抗体的情况下的结合)]*100)。在存在可溶性IgG1-DR5-chTRA8-F405L的情况下，DR5ECD-FcHisCtag与包被的IgG1-DR5-CONA-K409R的结合不受抑制。反之亦然，在存在可溶性IgG1-DR5-CONA-K409R的情况下，DR5ECD-FcHistag与包被的IgG1-DR5-chTRA8-F405L的结合也不受抑制。这些数据表明，IgG1-DR5-CONA-K409R和IgG1-DR5-chTRA8-F405L不相互竞争结合DR5ECD-FcHisCtag。接下来，如实施例11中所述在存活力测定法中研究六聚化增强突变E430G对非交叉阻断抗DR5抗体IgG1-DR5-CONA-C49W+IgG1-DR5-chTRA-8的组合杀伤附着的BxPC-3人胰腺癌细胞的能力的影响。图38B显示，与不具有E430G六聚化增强突变的亲本抗体的组合相比，具有六聚化增强突变的抗体组合IgG1-DR5-CONA-C49W-E430G+IgG1-DR5-chTRA8-E430G显示出对BxPC-3细胞的剂量依赖性杀伤增加。
实施例41：抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G诱导不同癌细胞系中靶细胞杀伤的能力。
在不同的人癌细胞系上分析了非交叉阻断抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的组合诱导杀伤的功效，并将其与不具有E430G突变的亲本抗体组合和TRAIL进行比较。基本上如实施例11中所述进行对HCT-15、HCT 116、HT-29和SW480结肠癌，BxPC-3、HPAF-II和PANC-1胰腺癌，SNU-5胃癌，A549和SK-MES-1肺癌以及A375皮肤癌细胞的存活力测定法。简言之，将100μL单细胞悬液(每孔5,000个细胞)接种在96孔板中并于37℃温育过夜。添加50μL的抗体样品(133nM最终浓度)或人重组TRAIL/APO-2L(eBioscience,Cat nr BMS356；133nM最终浓度)，并于37℃温育3天。TRAIL和抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G两者均显示出源自不同适应症的人癌症靶细胞系的杀伤(图39)。在11个测试细胞系的6个中，与对照抗体IgG1-b12相比，抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的杀伤显著。对于这些应答细胞系，与抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G温育后的百分比活细胞显著低于与不具有E430G突变的抗体组合温育后。IgG1-hDR5-01-K409R-E430G+IgG1-hDR5-05-F405L-E430G的杀伤效力与DR5靶标表达水平之间没有相关性(描述于实施例2中)。
实施例42：对人癌细胞系组筛选抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的细胞毒性功效。
测试了抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的活性，并将其在一组235个细胞系中与TRAIL的活性进行比较，所述组代表14种肿瘤谱系：肾、神经组织、结肠直肠、胃、乳腺癌(主要是三阴性乳腺癌(TNBC))、非小细胞肺癌(NSCLC)、膀胱、胰腺、卵巢、黑色素瘤、肝、子宫内膜、头颈和小细胞肺癌(SCLC)。在Horizon Discovery Ltd,UK分两部分进行了72小时ATPlite测定法(DLD-1和HCT116细胞系除外，对其进行了120小时测定法)与生长抑制分析。样品在384孔测定板中一式四份进行测试。从0.072μM最终浓度开始的抗体的系列稀释系列用于所有测试的细胞系。对于TRAIL(Invitrogen；Cat#PHC1634)，在筛选的第一部分对测试的细胞系使用从0.01μM最终浓度开始的系列稀释系列，而在第二部分对测试的细胞系使用0.17μM最终浓度。使用以下公式计算百分比抑制：如果T≥V(0)，则百分比抑制＝100*[1-(T-V(0))/(V-V(0))]；如果T<V(0)，则百分比抑制＝100％，其中T＝测试样品的发光，V(0)＝在第0天培养基对照样品的发光，而V＝在第3天培养基对照样品的发光。将响应者和非响应者细胞系通过最大响应阈值分组，将显示出≥70％抑制的细胞系分类为响应者，将显示出≤69％抑制的细胞系分类为非响应者(图40；表11)。对于所有测试的肿瘤适应症，除了小细胞肺癌(SCLC)以外，抗体(IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G)和TRAIL单一疗法两者的响应细胞系均得以发现。表11：如在Horizon DiscoveryLtd,UK进行的针对一组细胞系的3天存活力测定法筛选中所确定的抗体(IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G)和TRAIL单一疗法的结果，所述组代表不同的人癌症适应症：肾(A)、神经组织(B)、结肠直肠(C)、胃(D)、三阴性乳腺癌(TNBC)(E)、非小细胞肺癌(NSCLC)(F)、膀胱(G)、胰腺(H)、卵巢(I)、黑色素瘤(J)、肝(K)、子宫内膜(L)、头颈(M)和小细胞肺癌(SCLC)(N)。表中列出了IC50值和百分比最大抑制。表11A：如在3天存活力测定法筛选中确定的针对抗体(IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G)和TRAIL疗法的肾癌细胞系筛选结果
Figure BDA0002379913990001251
表11B：针对抗体(IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G)和TRAIL疗法的神经组织癌细胞系筛选结果，如在3天存活力测定法中确定的
Figure BDA0002379913990001252
表11续
表11C：针对抗体(IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G)和TRAIL疗法的结肠直肠癌细胞系筛选结果，如在Horizon,UK的3天存活力测定法筛选中确定的
Figure BDA0002379913990001261
Figure BDA0002379913990001271
表11续
表11D：针对抗体(IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G)和TRAIL疗法的胃癌细胞系筛选结果，如在Horizon,UK的3天存活力测定法筛选中确定的
Figure BDA0002379913990001272
表11E：针对抗体(IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G)和TRAIL疗法的乳腺癌细胞系筛选结果，如在Horizon,UK的3天存活力测定法筛选中确定的
Figure BDA0002379913990001273
Figure BDA0002379913990001281
表11续
表11F：针对抗体(IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G)和TRAIL疗法的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系筛选结果，如在Horizon,UK的3天存活力测定法筛选中确定的
Figure BDA0002379913990001282
Figure BDA0002379913990001291
表11G：针对抗体(IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G)和TRAIL疗法的膀胱癌细胞系筛选结果，如在Horizon,UK的3天存活力测定法筛选中确定的
Figure BDA0002379913990001292
表11续
表11H：针对抗体(IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G)和TRAIL疗法的胰腺癌细胞系筛选结果，如在Horizon,UK的3天存活力测定法筛选中确定的
Figure BDA0002379913990001293
Figure BDA0002379913990001301
表11I：针对抗体(IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G)和TRAIL疗法的卵巢癌细胞系筛选结果，如在Horizon,UK的3天存活力测定法筛选中确定的
Figure BDA0002379913990001302
表11续
表11J：针对抗体(IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G)和TRAIL疗法的黑色素瘤细胞系筛选结果，如在Horizon,UK的3天存活力测定法筛选中确定的
Figure BDA0002379913990001303
Figure BDA0002379913990001311
表11K：针对抗体(IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G)和TRAIL疗法的肝癌细胞系筛选结果，如在Horizon,UK的3天存活力测定法筛选中确定的
Figure BDA0002379913990001312
表11续
表11L：针对抗体(IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G)和TRAIL疗法的子宫内膜癌细胞系筛选结果，如在Horizon,UK的3天存活力测定法筛选中确定的
Figure BDA0002379913990001313
Figure BDA0002379913990001321
表11续
表11M：针对抗体(IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G)和TRAIL疗法的头颈癌细胞系筛选结果，如在Horizon,UK的3天存活力测定法筛选中确定的
Figure BDA0002379913990001322
表11N：针对抗体(IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G)和TRAIL疗法的小细胞肺癌(SCLC)细胞系筛选结果，如在Horizon,UK的3天存活力测定法筛选中确定的
Figure BDA0002379913990001331
实施例43：处于不同组合比例的抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G诱导癌细胞杀伤的能力。
进行存活力测定法以研究抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G当以不同比例的IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G组合时诱导杀伤BxPC-3胰腺癌细胞和HCT-15结肠癌细胞的能力。如实施例16中所述CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法中测试在系列稀释系列(范围从0.006至20μg/mL最终浓度，以5倍稀释)中1:0、9:1、3:1、1:1、1:3、1:9和0:1的抗体比例。
在20μg/mL、4μg/mL和0.8μg/mL总抗体浓度下，在含有抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G两者的所有测试的抗体比例下对BxPC-3(图41A)和HCT-15(图41B)细胞的杀伤等同有效。相反，单一抗体(比例1:0和0:1)没有诱导杀伤。在0.16μg/mL总抗体浓度下，测试的IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的组合诱导杀伤，尽管其程度比较高的抗体浓度小并且功效受到使用不同的比例的影响。
实施例44：抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G诱导胱天蛋白酶依赖性程序性细胞死亡。
在存在和不存在胱天蛋白酶抑制剂的情况下，进行存活力测定法以比较具有和不具有六聚化增强突变E430G的IgG1-hDR5-01-G56T和IgG1-hDR5-05的抗体变体的组合的细胞毒性。如实施例18中所述，用抗体或TRAIL样品的系列稀释系列(范围为0.002至133nM最终浓度，以4倍稀释)进行CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法。
对于TRAIL以及抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T+IgG1-hDR5-05和IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G，在存在泛胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK的情况下，对BxPC-3细胞的杀伤受到抑制(图42)。这些数据表明，与TRAIL一样，抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T+IgG1-hDR5-05和IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G诱导胱天蛋白酶依赖性程序性细胞死亡。
实施例45：抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G在人癌细胞上结合后的胱天蛋白酶-3和-7激活
基本上如实施例20中所述，使用胱天蛋白酶-Glo 3/7测定法以时间测量胱天蛋白酶-3/7激活。简言之，通过胰蛋白酶处理收获细胞，使其通过细胞过滤器，通过以1,200rpm离心5分钟沉淀，并以1.6x105个细胞/mL的浓度重悬于培养基中。将25μL的单细胞悬液(每孔4,000个细胞)接种到384孔培养板(Perkin Elmer,Cat nr 6007680)中并于37℃温育过夜。添加25μL抗体样品(26.6nM最终浓度)并于37℃温育1、2、4和6小时。从培养箱中移出板以使温度降低至室温。通过以300g离心三分钟沉淀细胞。除去25μL上清液，并用25μL胱天蛋白酶-Glo 3/7底物替换。通过以500rpm摇动1分钟进行混合后，将板于室温温育一小时。在EnVision多标记读取器(PerkinElmer)上测量发光。
在1、2、4至6小时的时间进程中，与不具有六聚化增强突变的WT抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T+IgG1-hDR5-05相比，TRAIL和抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G两者针对BxPC-3细胞诱导更快速且更有效力的胱天蛋白酶-3/7激活(图43)。
实施例46：抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的体外效力不需要次级Fc交联剂的存在。
进行存活力测定法以比较在不存在和存在次级抗体交联剂的情况下，抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G诱导杀伤人HCT-15结肠癌细胞和BxPC-3胰腺癌细胞的能力。为了进行比较，在相同测定法测试了已知在存在次级抗体交联剂的情况下显示出增强杀伤的IgG1-DR5-CONA。基本上如实施例21中所述，在不存在和存在次级交联剂的情况下进行存活力测定法。简言之，将100μL的单细胞悬液(每孔5,000个细胞)接种到96孔板中，并于37℃温育过夜。在不存在或存在山羊抗人IgG抗体的F(ab’)2片段的情况下，50μL抗体样品(最终浓度4μg/mL)，并于37℃温育3天。作为细胞杀伤的阳性对照，将细胞与5μM星形孢菌素温育。如实施例8中所述，在CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法中确定细胞培养物的存活力。
在存在次级交联剂的情况下，组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G在BxPC-3和HCT15细胞中诱导有效力的杀伤，并且细胞毒性并未进一步增强(图44)。相反，BxPC-3和HCT15两者中次级交联剂的存在均增强了IgG1-DR5-CONA和野生型抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T+IgG1-hDR5-05的功效。这些数据表明，抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G对BxPC-3和HCT15癌细胞的杀伤不依赖于次级Fc交联剂的存在。
实施例47：在IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G与用人或食蟹猴DR5瞬时转染的CHO细胞结合后的补体激活。
为了分析抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G激活补体的能力，在用缺少人或猴DR5的同等型瞬时转染的CHO细胞上测量了体外补体依赖性细胞毒性(CDC)测定法和补体成分C3c的沉积。DR5构建体在其死亡域中具有K386N(人)或K420N(食蟹猴)突变，以防止通过结合激动性抗体后诱导凋亡的杀伤。如实施例1中所述进行用人或猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))DR5对CHO细胞的瞬时转染。
对于CDC测定法，将0.1x 106个细胞在聚苯乙烯圆底96孔板(Greiner bio-oneCat#650101)中与经纯化抗体的浓度系列以80μL的总体积在摇床上于RT预温育15分钟。接下来，添加20μL正常人血清(NHS；Cat#M0008 Sanquin,Amsterdam,The Netherlands)作为补体的来源，并在37℃的培养箱中温育45分钟(20％最终NHS浓度；0.003-10.0μg/mL最终抗体浓度，以3倍稀释)。通过将板置于冰上来终止反应，然后通过离心沉淀细胞，并用30μL的2μg/mL碘化丙啶溶液(PI；Sigma Aldrich,Zwijnaarde,The Netherlands)替换上清液。在Intellicyt iQueTM筛选器(Westburg)上通过流式细胞术测定PI阳性细胞的百分比。在GraphPad PRISM 5中使用对数转换的浓度，用非线性剂量响应拟合的最佳拟合值对数据进行分析。
为了分析C3b沉积，将0.1x 106个细胞在圆底96孔板中与经纯化抗体的浓度系列(0.003-10.0μg/mL最终抗体浓度，以3倍稀释)以80μL的总体积在摇床上于RT预温育15分钟。接下来，添加20μL C5耗尽的血清(Quidel；Cat#A501)作为补体的来源，并在37℃的培养箱中温育45分钟(20％最终NHS浓度)。沉淀细胞，并随后与FACS缓冲液中的50μL FITC标记的多克隆兔抗人C3c补体(Dako；Cat#F0201；2μg/mL)于4℃温育30分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，并重悬于30μL FACS缓冲液中。在Intellicyt iQueTM筛选器(Westburg)上通过流式细胞术测定细胞上的C3b沉积。在GraphPad PRISM 5中使用对数转换的浓度，用非线性剂量响应拟合的最佳拟合值对数据进行分析。
对于IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G观察到在经DR5转染的CHO细胞上补体依赖性杀伤(图45A-B)和C3b沉积(图45C-D)两者，对于单一抗体和对于组合两者具有剂量反应曲线。这些数据表明，对于单一抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G以及组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G两者，IgG1抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G在靶标结合到细胞表面上时诱导补体激活的内在能力得以保留。
实施例48：对于抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G与一组化合物在人结肠癌细胞系上的功效增强的药物组合筛选分析。
为了鉴定与抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G组合显示出协同抑制作用的临床相关化合物，针对结肠癌细胞系中潜在的协同作用对代表不同治疗类别的100种化合物进行筛选。在Horizon Discovery Ltd,UK，在384孔测定板中的6x6优化组合矩阵中，进行了具有生长抑制分析的72小时(对于LS-411N、SNU-C2B和SW480)或120小时(对于DLD-1和HCT 116)ATPlite测定法。所有样品均一式四份进行测试。使用以下公式计算百分比生长抑制：如果T≥V(0)，则百分比生长抑制＝100*[1-(T-V(0))/(V-V(0))]；如果T<V(0)，则百分比生长抑制＝100*[1-(T-V(0))/V(0)]，其中T＝测试样品的发光，V(0)＝在第0天培养基对照样品的发光，而V＝在第3天培养基对照样品的发光。为了鉴定协同作用，使用代表性化合物确定每种治疗类别的平均自交叉活性。为了衡量超过Loewe可加性的组合效应，Horizon Discovery Ltd设计了一种标量方法来表征称为“协同得分(SynergyScore)”的协同相互作用的强度。协同得分方程对超出使用可加性的Loewe模型从组分试剂的活性数值性衍生的模型表面的矩阵中每个点的实验观察活性体积进行积分。协同得分方程中的另外的术语用于标准化用于各个试剂的各种稀释因子，并用于允许在整个实验中比较协同得分。包括正抑制门控或Idata乘法器去除零效应水平附近的噪音，并偏向于高活性水平下发生的协同相互作用的结果。使用以下公式计算协同得分(S)：S＝log fX log fYΣmax(0,Idata)(Idata–ILoewe)，其中fx,y＝用于每种单一试剂的稀释因子。在99％置信水平下，大于平均自交叉加3σ的协同得分被认为是候选协同。
表12显示了所有100种测试的化合物的协同得分。对于一个或多个细胞系与来自不同治疗类别的化合物，观察到与抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的协同，所述化合物包括化学治疗药物(包括细胞骨架调节剂和DNA/RNA损伤剂)、激酶抑制剂、PI3K途径抑制剂、RAS抑制剂、凋亡调节剂、蛋白酶体抑制剂、表观遗传调控剂(包括HDAC抑制剂)等。图46显示了与抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G组合的测试的化合物的生长抑制作用的五个实例。比利那潘(图46C)、奥沙利铂(图46A)、伊立替康(图46B)和紫杉醇(图46E)是增强IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的作用的实例，而巴西替尼(baricitinib)(图46D)是显示对IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的活性没有影响的实例。
Figure BDA0002379913990001381
Figure BDA0002379913990001391
Figure BDA0002379913990001401
Figure BDA0002379913990001411
实施例49：在皮下COLO 205结肠癌异种移植模型中抗DR5抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G的体内功效
在皮下COLO 205人结肠癌异种移植模型中评估了抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G(单一抗体和两种抗体的组合)的体内抗肿瘤功效，并将其与不具有E430G突变的亲本抗体进行比较。基本上如实施例26中所述进行肿瘤细胞接种、小鼠处理、肿瘤长出测量和终点确定。将3x106个细胞以100μL PBS的体积注射到5-8周龄的雌性SCID小鼠(C.B-
Figure BDA0002379913990001421
Hsd-Prkdcscid；Harlan)的腹侧中。在第9天，测量平均肿瘤体积，并将小鼠分为具有相同肿瘤大小差异的组。在第9天通过静脉内(i.v.)注射在200μL PBS中的10μg(0.5mg/kg)抗体对小鼠进行治疗。用10μg(0.5mg/kg)IgG1-b12治疗对照组中的小鼠。
表13：治疗组和给药
Figure BDA0002379913990001422
图47A显示每治疗组以时间的平均肿瘤体积。与不具有E430G突变的亲本抗体相比，在单一抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G中引入E430G突变导致对肿瘤生长的抑制增强。对于IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G和对于不具有E430G突变的亲本抗体的组合两者，用抗体组合进行治疗均诱导完全肿瘤消退。在第19天，用DR5抗体治疗的所有组中平均肿瘤大小均显著小于用阴性对照抗体IgG1-b12治疗的动物(Mann Whitney检验(P<0.001))(数据未显示)。图47B显示肿瘤进展的Kaplan-Meier绘图，其中截点设定在肿瘤体积>500mm3。与阴性对照抗体IgG1-b12相比，用抗DR5抗体治疗的所有组中的肿瘤长出均显著延迟(在肿瘤大小截点500mm3的Mantel-Cox分析：p<0.0001)。与用其他测试的抗DR5抗体治疗的小鼠相比，用不具有六聚化增强突变E430G的单一抗体IgG1-hDR5-01-G56T和IgG1-hDR5-05治疗的小鼠显示出显著更早的肿瘤长出(在肿瘤大小截点500mm3的Mantel-Cox分析：p<0.0001)。
实施例50：在皮下HCT15结肠癌异种移植模型中六聚化增强突变对抗DR5抗体IgG1-hDR5-01-G56T+IgG1-hDR5-05的组合的体内功效的影响
于CrownBiosciences,Taicang,China，在皮下HCT15人结肠癌异种移植模型中将抗DR5抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的体内抗肿瘤功效与不具有E430G六聚化增强突变的IgG1-hDR5-01-G56T+IgG1-hDR5-05进行比较。将细胞作为单层培养物在补充有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中于37℃在空气中5％CO2的气氛中进行体外维持。通过胰蛋白酶-EDTA处理收获指数生长期的贴壁细胞。将5x106个细胞以100μLPBS的体积注射到7-9周龄雌性BALB/c裸鼠的腹侧中。根据实验动物护理评估和鉴定协会(AAALAC)的规定，在研究期间对动物进行护理和使用。使用卡尺每周两次在两个维度测量肿瘤体积，并且使用以下公式以mm3表示体积：V＝0.5a x b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。当平均肿瘤大小达到161mm3时，使用随机区组设计将小鼠分组，并开始治疗(每组8只小鼠)。根据Q7D方案通过i.v.注射0.5mg/kg抗体(组合中每种抗体0.25mg/kg)对小鼠进行三次治疗。用0.5mg/kg IgG1-b12平行地治疗对照组中的小鼠。
图48A显示每治疗组的平均肿瘤体积。抗体组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G显示优于IgG1-hDR5-01-G56T+IgG1-hDR5-05的肿瘤生长抑制。在第21天，用组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G治疗的小鼠中的平均肿瘤大小显著小于用等同剂量IgG1-hDR5-01-G56T+IgG1-hDR5-05治疗的小鼠(Mann Whitney检验：P<0.0011)(图48B)。图48C显示肿瘤进展的Kaplan-Meier绘图，其中截点设定在肿瘤体积>750mm3。用组合IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G治疗的小鼠中的肿瘤长出显著迟于用等同剂量IgG1-hDR5-01-G56T+IgG1-hDR5-05治疗的小鼠。
这些数据表明在抗DR5抗体组合IgG1-DR5-01-K409R-E430G+IgG1-DR5-05-F405L-E430G中引入E430G六聚化增强突变导致具有HCT15人结肠癌细胞的体内异种移植模型中肿瘤生长抑制增强。
实施例51：在皮下SK-MES-1人肺癌异种移植模型中与紫杉醇组合的IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的体内功效。
于CrownBiosciences,Taicang,China，在皮下SK-MES-1人肺癌异种移植模型中评估了与紫杉醇组合的IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G的体内抗肿瘤功效。如实施例33中所述进行细胞培养、肿瘤细胞接种、小鼠处理、肿瘤长出测量和终点确定。肿瘤接种后21天，平均肿瘤大小达到167mm3，并使用随机区组设计将小鼠分组，并开始治疗。根据Q7D方案通过i.v.注射2mg/kg抗体和15mg/kg紫杉醇(两者均以每g体重10μL PBS给药)对小鼠进行两次治疗，如表14中所示。
表14：治疗组和给药，实施例53
Figure BDA0002379913990001441
图49A显示每治疗组的平均肿瘤体积。与IgG1-b12相比，单独的抗体治疗(2mg/kgIgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G)或与15mg/kg紫杉醇组合的2mg/kg抗体治疗或单独的15mg/kg紫杉醇均显示出抗肿瘤功效。图49B显示在第16天每治疗组的肿瘤体积。在所有治疗组中，与IgG1-b12相比，肿瘤负荷均显著较低(Mann-Whitney检验，p<0.01)。图49C显示肿瘤进展的Kaplan-Meier绘图，其中截点设定在肿瘤体积>500mm3。与单独的紫杉醇或抗体相比，15mg/kg紫杉醇与2mg/kg IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+IgG1-hDR5-05-E430G抗体的组合显著延长无进展生存(Gehan-Breslow-Wilcoxon检验，肿瘤大小截点500mm3：p<0.05)。
实施例52：IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G的药代动力学(PK)分析
与不具有E430G突变的亲本抗体相比，在SCID小鼠中的PK实验中，研究了IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和IgG1-hDR5-05-E430G(单一化合物和两种抗体的组合)的清除率。
向7-10周龄的雌性SCID(C.B-17/IcrHan@Hsd-Prkdc<scid,Harlan)小鼠(每组3只小鼠)静脉内注射200μL注射体积中的20μg抗体(1mg/kg)。在抗体施用后10分钟、4小时、1天、2天、7天、14天和21天从隐静脉收集50-100μL血液样品。将血液收集到含肝素的小瓶中，并以10,000g离心5分钟。在前四个时间点将血浆样品以1:20稀释(285μL PBSA(补充有0.2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS)中15μL样品)，在最后两个时间点以1:10稀释(270μL PBSA中30μL样品)，并保存在-20℃直至确定抗体浓度。
使用夹心ELISA测定人总IgG浓度。小鼠抗人IgG-kappa mAb克隆MH16(CLBSanquin,Cat##M1268)用作捕获抗体，并以PBS中2μg/mL的浓度在100μL中于4℃过夜包被到96孔Microlon ELISA板(Greiner,Germany)。通过在板摇床上与PBSA于RT温育1小时来封闭板。洗涤后，添加100μL的系列稀释的血浆样品(范围为0.037-1μg/mL，以3倍稀释)，并在板摇床上于RT温育1小时。将板用300μL PBST(补充有0.05％Tween 20的PBS)洗涤3次，并随后在板摇床上与100μL过氧化物酶标记的山羊抗人IgG免疫球蛋白(#109-035-098,Jackson,West Grace,PA；在补充有0.2％BSA的PBST中1:10.000)于RT温育1小时。将板再次用300μLPBST洗涤3次，然后与100μL底物2,2’-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[ABTS；Roche,Cat#11112 422001；50mL ABTS缓冲液(Roche,Cat#11112 597001)中1片]于室温避光温育15分钟。通过添加100μL 2％草酸并于室温温育10分钟终止反应。在酶标仪(microplatereader)(Biotek,Winooski,VT)中测量405nm处的吸光度。通过使用注射的材料作为参考曲线来计算浓度。作为板对照，经纯化的人IgG1(结合位点，Cat#BP078)包括在内。绘制人IgG浓度(以μg/mL)(图50A)，并使用Graphpad prism 6.0计算曲线下面积(AUC)。通过公式D*1.000/AUC确定直至血液采样的最后一天(第21天)的清除，其中D是注射的剂量(1mg/kg)(图50B)。
IgG1-hDR5-01-G56T-E430G或IgG1-hDR5-05-E430G与其不具有E430G突变的亲本抗体之间的血浆清除率均未观察到差异，无论是作为单一试剂还是作为它们的组合注射(图50)。
实施例53：具有六聚化增强突变E430G的抗DR5抗体IgG1-DR5-CONA能够杀伤人结肠癌细胞。
本研究说明了具有六聚化增强突变E430G的抗DR5抗体IgG1-DR5-CONA杀伤附着的人结肠癌细胞COLO 205的能力。如实施例8中所述收获COLO 205细胞。将100μL的单细胞悬液(每孔5,000个细胞)接种到96孔平底板中，于37℃温育过夜。添加50μL的抗体浓度系列的样品(范围为0.04至10μg/mL最终浓度，以4倍稀释)并于37℃温育3天。作为阳性对照，将细胞与5μM星形孢菌素温育。如实施例8中所述在CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法中确定细胞培养物的存活力。在EnVision多标记读取器(PerkinElmer)上测量发光。使用GraphPad Prism软件用非线性回归(具有可变斜率的S形剂量反应)对数据进行分析和绘图。使用以下公式计算百分比活细胞：％活细胞＝[(发光抗体样品-发光星形孢菌素样品)/(发光无抗体样品-发光星形孢菌素样品)]*100。
图51显示，引入六聚化增强突变E430G导致IgG1-DR5-CONA-E430G的剂量依赖性杀伤，而亲本野生型抗体IgG1-DR5-CONA不能杀伤附着的COLO 205结肠癌细胞。
实施例54：抗体IgG1-hDR5-05-E430G的配制剂开发
使用的缩写：
缩写/术语 定义
A<sub>280</sub> 280nm处的吸光度
API 活性药物成分
CE 毛细管电泳
DSC 差示扫描量热法
DLS 动态光散射
DoE 实验设计
HC 重链
HMW 高分子量
HPLC 高效液相层析
icIEF 成像毛细管等电聚焦
LC 轻链
LMW 低分子量
NaCl 氯化钠
PS-80 聚山梨酯80
RH 相对湿度
％Pd 百分比多分散性
SDS 十二烷基硫酸钠
SEC 尺寸排阻层析
T<sub>起始</sub> 熔化温度的起始
UV 紫外
材料：
除非另有说明，否则抗体IgG1-hDR5-05-E430G以20mg/ml配制。
方法差示扫描量热法(DSC)
使用MicroCal毛细管DSC设备确定蛋白质样品的熔化温度。
外观
通过视觉评估确定外观。
pH
使用Mettler Toledo SevenMulti pH计测量pH。
通过UV A280得到的蛋白质含量
使用Agilent UV/Vis分光光度计(8453型)通过UV/Vis光谱法测定蛋白质含量
尺寸排阻层析(SEC)
使用TOSOH,TSK-gel G-3000SWxL(7.8×300mm)柱(Sigma)在Agilent 100 HPLC系统上进行尺寸排阻层析。
成像毛细管等电聚焦(icIEF)
使用配备有PrinCE自动进样器的iCE 3分析仪进行成像毛细管等电聚焦。
毛细管电泳–十二烷基硫酸钠(CE-SDS)
使用Beckman Coulter PA800Plus系列毛细管电泳系统进行还原和非还原性毛细管电泳。Beta巯基乙醇用于还原性样品。
动态光散射(DLS)
使用Wyatt DynaPro读板器进行动态光散射。
结果
1.基线生物物理筛选
进行了初始生物物理筛选，以选择缓冲液/pH组合以进入赋形剂筛选。表15显示从初始缓冲液筛选获得的数据，其中测试了谷氨酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液。DSC和DLS用于评价热稳定性。DSC分析提供了熔化温度(Tm1和Tm2)以及T起始。DLS分析提供了有关蛋白质的多分散性和流体动力学半径的信息。
基于DSC数据，与其处于较低pH的对应物相比，谷氨酸盐pH 5.0，乙酸盐pH 5.5和琥珀酸盐pH 6.0具有较高的T起始值。较高的T起始值表明蛋白质的更好的热稳定性。在pH 5.5、6.0和6.5时，所有组氨酸配制剂均显示出相对较高的T起始值，这些值随pH的增加而略有增加。处于pH 6.0和7.0的柠檬酸盐缓冲液的T起始为54℃，而处于pH 7.5的磷酸盐的T起始为54℃。来自初始生物物理筛选的DLS数据的结果与从DSC获得的配制剂结果没有强烈关联。具体地，在具有较高pH的配制剂中观察到高度的多分散性，如在DSC中所观察到的，其具有更好的热稳定性。例如，pH 5.5的组氨酸具有6.3的％Pd，与之相比pH 6.0和6.5分别显示出10.8和15.6的％Pd(表15)。与其余配制剂相比，磷酸盐和柠檬酸盐配制剂具有最高的％Pd。基于从DSC和DLS获得的数据，在存在各种赋形剂的情况下进一步筛选谷氨酸盐pH 5.0、乙酸盐pH 5.5、组氨酸pH 5.5和琥珀酸盐pH 6.0配制剂。由于高％多分散性以及这些缓冲液中蛋白质的去稳定化的潜在可能性，因此未选择磷酸盐和柠檬酸盐配制剂。
表15.来自初始基线筛选DSC(顶部)、DLS(底部)的熔化温度
DSC
Figure BDA0002379913990001481
DLS
Figure BDA0002379913990001482
Figure BDA0002379913990001491
在存在150mM精氨酸、氯化钠、蔗糖和山梨糖醇的情况下筛选以上选择的配制剂。来自基线生物物理筛选的该部分数据显示于表16中。即使在存在稳定化的赋形剂山梨糖醇和蔗糖的情况下，在存在赋形剂的情况下由于低pH，谷氨酸盐pH 5.0具有最低的T起始。基于表16中所示的数据，观察到对于乙酸盐配制剂，在存在蔗糖的情况下T起始增加。在存在蔗糖和山梨糖醇的情况下，观察到组氨酸配制剂的T起始增加。仅在含有蔗糖的琥珀酸盐配制剂中观察到T起始增加。对于乙酸盐样品，由NaCl和精氨酸组成的配制剂分别具有51℃和52℃的T起始值。与存在精氨酸的配制剂相比时，含有NaCl的组氨酸配制剂显示出更高的起始值。具有精氨酸的组氨酸配制剂的T起始值为47℃，而存在NaCl的组氨酸配制剂的T起始值为51℃。含有带电荷的赋形剂的琥珀酸盐配制剂的T起始值是等同的(54℃)。与其他三种缓冲液类型相比，含有带电荷的赋形剂的琥珀酸盐缓冲液的起始值总体上最高，而在存在山梨糖醇和蔗糖的情况下，组氨酸和琥珀酸盐缓冲液显示出高于谷氨酸盐和乙酸盐缓冲液的起始值。
表16.来自具有赋形剂的基线缓冲液DSC(顶部)、DLS(底部)的熔化温度
DSC
Figure BDA0002379913990001492
Figure BDA0002379913990001501
DLS
Figure BDA0002379913990001502
基于DLS结果(表16)，由蔗糖和山梨糖醇组成的所有配制剂均显示出多峰的％Pd和高流体动力学半径，其指示大分子聚集体的形成。DLS数据还证明，在存在带电荷的赋形剂氯化钠和精氨酸的情况下，这些配制剂具有低％Pd。
总的来说，从DSC和DLS两者获得的数据表明，在存在NaCl和精氨酸的情况下处于pH 5.5的25mM乙酸盐和在存在氯化钠的情况下处于pH 5.5的组氨酸配制剂是用于进一步配制剂开发的更好的候选者。
2.NaCl筛选
在存在四种不同浓度的NaCl(0、25、50和100mM NaCl)的情况下，在30mM组氨酸，pH5.5中以40mg/mL配制抗体IgG1-hDR5-05-E430G，以确定对溶解度和相分离的影响。将样品在预冷的冻干架上于-5±3℃储存24小时。24小时后，通过外观测试该组样品。在任何制备的样品中均未观察到相分离。
3.表面活性剂筛选
在存在0、0.03或0.06％w/v Tween-80的情况下，在30mM组氨酸，pH 5.5中配制抗体IgG1-hDR5-05-E430G，并通过三个冻融循环对其施加压力。将相同的样品搅动48小时的时段。样品应激后，通过外观、A280、SEC、还原性CE-SDS和非还原性CE-SDS对该组样品进行测试。
3.1外观
在表面活性剂筛选研究中，任何样品之间均未观察到视觉差异。所有样品均为淡黄色液体，乳白色(opalescent)且无可见颗粒。
3.2通过UV A280的蛋白质含量
通过UV分析获得的抗体浓度没有显著差异，并且范围在18.54和20.73mg/mL之间(数据未显示)。
3.3 SEC
单体纯度没有显著差异，并且任何表面活性剂筛选样品均未观察到新的峰。所有样品的纯度在98.8–99.0％之间(数据未显示)。
3.4还原性CE-SDS
纯度(LC和HC％)没有显著差异，并且任何表面活性剂筛选样品均未观察到新的峰。所有样品的纯度为95.6-96.1％(数据未显示)。
3.5非还原性CE-SDS
主峰纯度没有显著差异，并且任何表面活性剂筛选样品均未观察到新峰。所有样品的纯度在90.5％和92.1％之间(数据未显示)。
3.6表面活性剂筛选的结论
在含有0、0.03和0.06％浓度PS-80的未应激和应激样品之间未观察到外观、蛋白质浓度或纯度的变化。这些数据表明表面活性剂在这些配制剂中不增强抗体的稳定性。
4.冷冻保护剂筛选
在冷冻保护剂筛选中，在具有三种不同浓度(0、5或10％w/v)的蔗糖的30mM组氨酸，pH 5.5中配制抗体IgG1-hDR5-05-E430G，并通过三个冻融循环对其施加压力。将相同的样品搅动48小时的时段。样品应激后，通过外观、A280、SEC、还原性CE-SDS和非还原性CE-SDS对该组样品进行测试。
4.1外观
在用三个冻融循环施加压力并搅动48小时的时段的含有0％、5％或10％蔗糖的样品之间未观察到视觉差异。所有样品均为淡黄色液体，乳白色且无可见颗粒。
4.2通过UV A280的蛋白质含量
通过UV分析获得的抗体浓度没有显著差异。浓度范围在19.06和24.86mg/mL之间(数据未显示)。
4.3 SEC
单体纯度没有显著差异，并且任何冷冻保护剂筛选样品均未观察到新峰的增长。所有样品的纯度在98.9–99.1％之间(数据未显示)。
4.4还原性CE-SDS
纯度(LC和HC％)没有显著差异，并且任何冷冻保护剂筛选样品均未观察到新峰的增长。所有样品的纯度为95.3–95.9％之间(数据未显示)。
4.5非还原性CE-SDS
主峰纯度没有显著差异，并且任何冷冻保护剂筛选样品均未观察到新峰的增长。所有样品的纯度为91.5–92.0％之间(数据未显示)。
4.6冷冻保护剂筛选的结论
在含有0％、5％和10％蔗糖的浓度的未应激和应激样品之间未观察到外观、蛋白质浓度或纯度的变化。这些数据表明冷冻保护剂在这些配制剂中不增强抗体的稳定性。
5.DoE稳定性研究
DoE研究的配制剂设计显示于表17中。将样品于5±3℃和40±2℃/75±5％RH储存至多4周。初始样品通过pH、UV和DSC进行测试。储存后，通过外观、pH、A280、DLS、SEC、icIEF、CE-SDS(还原和非还原)对该组样品进行测试。
表17.抗体IgG1-hDR5-05-E430G DoE研究的配制剂名称
配制剂缩写 缓冲液 pH NaCl 精氨酸 山梨糖醇 蔗糖
F1 30mM乙酸盐 5.0 0 0 0 0
F2 30mM乙酸盐 5.0 150 0 0 0
F3 30mM乙酸盐 5.0 0 150 0 0
F4 30mM乙酸盐 5.0 100 50 0 0
*F5 30mM乙酸盐 5.5 0 0 0 0
F6 30mM乙酸盐 5.5 150 0 0 0
F7 30mM乙酸盐 5.5 0 150 0 0
F8 30mM乙酸盐 5.5 100 50 0 0
F9 30mM乙酸盐 6.0 0 0 0 0
F10 30mM乙酸盐 6.0 150 0 0 0
F11 30mM乙酸盐 6.0 0 150 0 0
F12 30mM乙酸盐 6.0 100 50 0 0
F13 30mM乙酸盐 5.5 0 0 150 0
F14 30mM乙酸盐 5.5 0 0 0 150
F15 30mM乙酸盐 5.5 100 0 50 0
F16 30mM组氨酸 5.0 0 0 0 0
F17 30mM组氨酸 5.0 150 0 0 0
F18 30mM组氨酸 5.0 0 150 0 0
F19 30mM组氨酸 5.0 100 50 0 0
*F20 30mM组氨酸 5.5 0 0 0 0
F21 30mM组氨酸 5.5 150 0 0 0
F22 30mM组氨酸 5.5 0 150 0 0
F23 30mM组氨酸 5.5 100 50 0 0
F24 30mM组氨酸 6.0 0 0 0 0
F25 30mM组氨酸 6.0 150 0 0 0
F26 30mM组氨酸 6.0 0 150 0 0
F27 30mM组氨酸 6.0 100 50 0 0
F28 30mM组氨酸 6.0 0 0 225 0
F29 30mM组氨酸 5.5 0 0 0 150
F30 30mM组氨酸 5.5 100 0 50 0
*–样品一式三份制备
5.1 DSC(初始)
初始DSC数据显示于表18中。对于组氨酸配制剂，观察到处于较高pH的配制剂获得了高T起始值。该趋势与在初始基线筛选中获得的数据相关，在初始基线筛选中，随着pH值增加，观察到更高的T起始值。当与处于pH 5.0和pH 5.5的组氨酸配制剂相比时，组氨酸配制剂pH 6.0显示出最高的T起始值。对于组氨酸pH 6.0配制剂，T起始值范围为从50-53℃。组氨酸pH5.0配制剂的范围为从43-46℃，而组氨酸pH 5.5配制剂的范围为从47-51℃。对于由蔗糖和山梨糖醇组成的配制剂，观察到高T起始值。对于含有蔗糖和山梨糖醇的配制剂，配制剂F13、F14、F28和F29显示出高T起始值。对于乙酸盐配制剂，观察到类似的趋势。处于较高pH的配制剂显示较高的起始值。乙酸盐配制剂pH 6.0和pH 5.5在存在和不存在NaCl和精氨酸的情况下均显示出高T起始值。乙酸盐pH 6.0配制剂的范围为从52-54℃，而乙酸盐pH 5.5配制剂的范围为从51-54℃。乙酸盐pH 5.0配制剂显示出45-49℃的最低T起始范围。
表18.初始DSC结果
Figure BDA0002379913990001541
Figure BDA0002379913990001551
5.2通过UV A280的蛋白质含量
通过UV A280的蛋白质含量结果显示，所有样品蛋白质浓度在18.47-21.95mg/mL之间(数据未显示)。样品F8、F24和F22具有略低的蛋白质浓度，这很可能是由于实验变异性所致。总体而言，在初始时间点未观察到蛋白质浓度的显著变化。
5.3外观
在四周时间点于5±3℃，所有样品制剂均透明且颜色为浅黄。处于5±3℃的大多数样品制剂没有表现出与产品无关的颗粒。F5-3、F7、F8、F29和F30含有一些颗粒。处于40±2℃/75±5％RH的样品颜色浅黄色且透明，除了乳白色的样品F20-1和F23。处于40±2℃/75±5％RH的配制剂范围为从无颗粒到许多颗粒。对于乙酸盐配制剂，配制剂F1没有显示出颗粒。配制剂F2、F5、F6和F10具有很少的颗粒，而配制剂F3、F4、F7、F8、F9、F11、F12、F13、F14和F15具有许多颗粒。对于组氨酸配制剂，F17和F26显示出许多颗粒。F16、F18、F23、F25、F29和F30显示很少的颗粒。其余配制剂F19、F20、F21、F22、F24、F27和F28没有颗粒。
5.4 pH
配制剂的目标pH值显示于表19中。对于乙酸盐配制剂，在四周时间点于5±3℃和40±2℃/75±5％RH观察到显著改变。在初始时间点和5±3℃，乙酸盐配制剂的pH差异的范围为0.12-0.30。在处于40±2℃/75±5％RH应激的这些样品中观察到的pH的改变为0.44-1.01。对于组氨酸配制剂，在四周时间点于5±3℃和40±2℃/75±5％RH未观察到明显的pH改变。在四周测试中观察到的组氨酸配制剂的pH差异可以归因于实验变异性。总体而言，与其余配制剂相比，具有和不具有赋形剂的组氨酸pH 6.0配制剂的pH均未经历任何变化。乙酸盐配制剂易受pH改变的影响，这使乙酸盐成为不太适合抗体的组分。显著的pH改变也可以导致蛋白质的加速降解。另一方面，组氨酸pH 6.0配制剂得以证明是有前途的组分。由于观察到的乙酸盐配制剂的pH改变，因此解释的稳定性结果将集中在组氨酸配制剂(F16-F30)上。
表19.抗体IgG1-hDR5-05-E430G DoE研究的pH结果
Figure BDA0002379913990001552
Figure BDA0002379913990001561
5.5通过UV A280的蛋白质含量
5±3℃样品的A280读数的范围为19.87-23.59mg/mL，而40±2℃/75±5％RH的A280读数的范围为19.81-26.38mg/mL(数据未显示)。没有观察到A280读数的显著改变。观察到的UV含量的范围可能是由于实验变异性。数据未显示出有关缓冲液浓度、pH和赋形剂浓度的任何趋势。
5.6 SEC
四周时间点的SEC结果显示于表20中。对于主要处于pH 6.0的组氨酸配制剂，观察到带电荷的赋形剂的存在改进了配制剂的稳定性。还观察到在存在带电荷的赋形剂的情况下pH的增加改进了组氨酸配制剂的稳定性。于40±2℃/75±5％RH，观察到在存在带电荷的赋形剂的情况下配制剂的％总杂质降低。处于40±2℃/75±5％的配制剂F20-1具有84.2％的最低纯度。这是一个意外和反常的结果，因为此中心点配制剂的其他两个重复纯净得多，因此该重复被认为是异常值。对于处于40±2℃/75±5％RH的组氨酸pH 5.0配制剂F17、F18和F19，％总杂质的范围为从5.0-5.8％。组氨酸pH 5.5配制剂F21、F22和F23的％总杂质的范围为4.1-7.3％，而组氨酸pH 6.0配制剂F25、F26和F27具有范围为从3.5-3.8％的％总杂质。显然，较高的pH导致％总杂质降低，并且在存在带电荷的赋形剂的情况下，组氨酸pH6.0配制剂显示出更好的稳定性。对于含有蔗糖或山梨糖醇的组氨酸配制剂，观察到％总杂质的增加。对于不具有赋形剂的pH 6.0配制剂，％总杂质百分含量于5±3℃为3.8％，于40±2℃/75±5％RH为6.9％。总的来说，在存在带电荷的赋形剂NaCl和精氨酸的情况下，组氨酸pH 6.0配制剂(配制剂F25、F26和F27)具有更好的稳定性。
表20.SEC结果(F16至F30)
Figure BDA0002379913990001571
Figure BDA0002379913990001581
5.7 icIEF
使用icIEF在四周于5±3℃和40±2℃/75±5％RH确定样品的电荷异质性(表21)。处于5±3℃和40±2℃/75±5％RH的样品的icIEF结果显示，对于配制剂F16-F28，在四周时间点处于5℃的组氨酸配制剂的百分比酸性变体的范围为从56.2–58.9％(数据未显示)。对于由蔗糖和山梨糖醇组成的配制剂F29和F30，百分比酸性变体分别为60.4％和63.8％。从将其概况与F25进行比较可以看出，这些差异似乎很显著。处于40±2℃/75±5％RH，F29和F30具有45.9％和61.6％的百分比酸性变体。对于由蔗糖组成的配制剂F29，处于40±2℃/75±5％RH，碱性变体显著增加至32.4％。在四周时间点于40±2℃/75±5％RH，所有组氨酸配制剂显示出范围为61.6％-71.6％之间的百分比酸性变体的增加。处于40±2℃/75±5％RH的配制剂F29显示45.9％的百分比酸性变体。icIEF数据显示样品的pH影响电荷异质性。与组氨酸配制剂pH 5.5和6.0相比，处于pH 5.0的组氨酸配制剂在酸性变体中显示出更显著的增加。对于组氨酸pH 5.0配制剂，于40±2℃/75±5％RH的百分比酸性变体的范围为71.3-71.6％。于40±2℃/75±5％RH，组氨酸pH 5.5的百分比酸性变体的范围为63.5-67.1％，而组氨酸pH 6.0的百分比酸性变体的范围为65.3-66.1％。该结果可能不是由于脱酰胺引起的，因为已知脱酰胺在较高的pH值下加速，而在此观察到相反的趋势。在所有配制剂中，结果表明组氨酸pH 5.5和6.0是比组氨酸pH 5.0配制剂更好的配制剂，并且在由蔗糖和山梨糖醇组成的组氨酸配制剂中观察到显著降解。
表21.通过icIEF DoE研究的电荷异质性结果(F16至F30)
5±3℃
样品名称 ％酸性 ％主要 ％碱性
F16 56.4 40.3 3.3
F17 56.6 41.3 2.1
F18 57.0 41.1 1.9
F19 56.6 41.9 1.5
F20-1 57.8 40.3 1.9
F20-2 57.9 40.1 2.0
F20-3 57.5 40.4 2.1
F21 58.9 39.0 2.1
F22 57.0 40.0 2.9
F23 57.9 39.6 2.5
F24 56.2 41.5 2.4
F25 57.0 41.1 1.8
F26 57.1 40.9 2.0
F27 57.7 40.7 1.6
F28 57.0 40.3 2.7
F29 60.4 20.7 18.9
F30 63.8 32.6 3.7
40±2℃/75±5％RH
样品名称 ％酸性 ％主要 ％碱性
F16 71.5 25.4 3.1
F17 71.5 25.4 3.1
F18 71.6 24.9 3.5
F19 71.3 25.6 3.1
F20-1 66.4 30.5 3.1
F20-2 67.1 30.3 2.5
F20-3 67.0 30.4 2.6
F21 65.7 30.2 4.1
F22 68.0 29.0 3.1
F23 63.5 31.7 4.8
F24 65.6 32.0 2.4
F25 66.1 31.0 2.9
F26 65.3 31.9 2.8
F27 66.0 31.4 2.6
F28 65.4 31.6 3.0
F29 45.9 21.7 32.4
F30 61.6 29.5 8.9
5.8还原性CE-SDS
还原性CE-SDS的结果显示于表22中。在四周时间点于5±3℃，所有组氨酸配制剂，不论pH均显示出相当的纯度。
在四周时间点于40±2℃/75±5％RH，结果表明所有样品制剂中的杂质均增加。观察到处于较低pH的配制剂于40±2℃/75±5％RH显示出更多降解。组氨酸pH 5.0配制剂显示百分比纯度的显著降低。百分比纯度的范围为77.5-82.8％。对于组氨酸pH 5.5配制剂，百分比纯度的范围为80.1-91.2％。对于组氨酸pH 6.0配制剂未观察到显著降解。处于40±2℃/75±5％RH四周时间点的组氨酸pH 6.0配制剂的百分比纯度的范围为从89.7-91.1％。此外，组氨酸样品的％LMW对于处于较低pH的组氨酸样品较高，而对于处于较高pH的组氨酸配制剂则低得多。对于组氨酸pH 5.0配制剂，％LMW的范围为13.7-18.4％。而组氨酸pH 5.5和6.0配制剂显示出5.9–12.9％和5.0–6.3％的％LMW范围。对于组氨酸pH 6.0配制剂，还观察到在存在带电荷的赋形剂的情况下百分比纯度未显著降低。在所有配制剂中，与其他组氨酸配制剂相比，在存在带电荷的赋形剂的情况下的组氨酸pH 6.0配制剂显示出更好的纯度。
表22.还原性毛细管电泳结果(F16至F30)
Figure BDA0002379913990001601
Figure BDA0002379913990001611
5.9非还原性CE-SDS
非还原性CE-SDS的结果显示于表23中。由于这些配制剂中观察到的pH改变，因此不考虑从乙酸盐配制剂(F1至F15)获得的结果。于5±3℃，对于由精氨酸组成的配制剂(即配制剂F18、F19、F22、F23、F26和F27)，观察到显著高％HMW杂质。在存在NaCl(F25)的情况下，对于组氨酸pH 6.0配制剂(即制剂F17、F21和F25)未观察到该杂质的增加。先前的结果表明，在存在带电荷的赋形剂(NaCl和精氨酸)的情况下，组氨酸pH 6.0配制剂是最佳条件。从非还原性CE-SDS数据获得的结果证实，具有NaCl的组氨酸pH 6.0配制剂是比具有精氨酸的组氨酸pH 6.0更好的选择。
表23.非还原性CE-SDS结果(F16至F30)
Figure BDA0002379913990001612
Figure BDA0002379913990001621
5.10 DLS
由于在这些配制剂中观察到pH改变，因此不考虑乙酸盐配制剂。基于DLS数据(未显示)，观察到较低的pH导致组氨酸配制剂中的高多分散性。组氨酸pH 5.0配制剂F17、F18和F19多分散性显著增加。例如，配制剂F17于5±3℃下的％Pd为10.2和7.0，并且在处于40±2℃/75±5％RH四周后增加至20.8和18.7。类似地，组氨酸pH 5.5配制剂F21、F22和F23于40±2℃/75±5％RH具有增加的％Pd。例如，配制剂F23于5±3℃具有6.3和10.4的％Pd。于40±2℃/75±5％RH，％Pd增加至17.1和21.7。在存在带电荷的赋形剂(NaCl和精氨酸)的情况下，大多数组氨酸pH 6.0配制剂在两种压力条件下均抵抗多分散性的变化。配制剂F25、F26和F27未显示出％Pd的显著增加。例如，配制剂F25于5±3℃显示9.4和8.9的％Pd。处于40±2℃/75±5％RH的％Pd为8.3和10.2。另外，在两种条件下存在蔗糖的配制剂(F19)显示出高多分散性。F29于5±3℃的％Pd为23.7和23.4，而处于40±2℃/75±5％RH的％Pd为23.2。对于此方法在5±3℃条件下的％Pd已经相当高，表明已经存在高阶聚集体。因此，％Pd在较高温度下没有变化的事实不足为奇。在初始基线生物物理筛选DLS数据中也观察到了高多分散性。类似地，对于具有山梨糖醇的配制剂(F30)观察到高％Pd。有趣的是，含有山梨糖醇和NaCl的F28的未显示出高％Pd，这进一步支持了NaCl是作为最佳配制剂的组分的理想选择的观点。在四周时间点未观察到配制剂F28的高％Pd。配制剂F30于40±2℃/75±5％RH的％Pd为15.4和14.2。总体而言，在存在带电荷的赋形剂的情况下，组氨酸pH 6.0配制剂显示多分散性变化最小。处于pH 5.5的含有蔗糖和山梨糖醇的两种组氨酸配制剂在两种压力条件下均显示出高的％Pd。
6.结论
基于从对表17中列出的各种配制剂中的抗体IgG1-hDR5-05-E430G进行分析测试获得的结果，配制剂F25(30mM组氨酸，150mM NaCl pH 6.0)是该分子的最佳配制剂。
初始基线生物物理筛选结果表明，处于pH 5.5的乙酸盐和组氨酸配制剂是最佳缓冲液/pH条件。此外，与山梨糖醇和蔗糖相比，精氨酸和氯化钠是更好的赋形剂的选择。表面活性剂和冷冻保护剂研究表明，不需要PS-80或蔗糖来增强配制剂的稳定性。对于DoE稳定性研究，初始DSC结果证实30mM组氨酸pH 6.0配制剂具有较高的T起始熔化温度值。在所有30mM乙酸盐配制剂中均观察到显著pH改变。组氨酸pH 6.0配制剂于5±3℃和40±2℃/75±5％RH在四周稳定性内未显示出pH的任何显著变化。SEC数据表明，在存在带电荷的赋形剂的情况下，组氨酸pH 6.0赋予IgG1-hDR5-05-E430G最大的稳定性。来自icIEF的结果表明，pH 5.5和6.0样品对电荷异质性的变化更具抵抗力。还显示在存在蔗糖和山梨糖醇的情况下的配制剂表现出最大的降解。DLS数据表明，在存在带电荷的赋形剂的情况下，组氨酸pH6.0配制剂的多分散性变化最小。还原性CE-SDS的结果表明，在存在带电荷的赋形剂的情况下，组氨酸pH 6.0配制剂是最佳配制剂。非还原性CE-SDS数据显示，在存在精氨酸的情况下的样品显示出高％HMW杂质，而这些杂质在含有NaCl的样品中不存在。总体而言，对于该抗体，可用数据的总和支持选择含有组氨酸和氯化钠的配制剂。
实施例55：抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G的配制剂开发
材料、设备和方法
使用的材料、设备和方法与实施例54相同，除了抗体是IgG1-hDR5-01-G56T-E430G而不是IgG1-hDR5-05-E430G。
结果
1.初始基线生物物理筛选
进行了初始生物物理筛选，以选择缓冲液/pH组合以进入赋形剂筛选。DSC和DLS用于评价热稳定性。DSC分析提供了熔化温度(Tm1和Tm2)以及T起始。DLS分析提供了有关蛋白质的多分散性和流体动力学半径的信息。
在配制剂的范围内观察到DSC数据的趋势。T起始值范围在46℃和55℃之间(数据未显示)。较高的T起始值表示较高的热稳定性，因此，具有最低T起始值的极低和极高pH的缓冲液(谷氨酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐)不是最佳的。琥珀酸盐和组氨酸缓冲液以及乙酸盐pH 5.5的T起始值表明，这两种pH 5.5和6.5之间的缓冲液赋予更高的热稳定性。
对于DLS数据，在一定范围的pH增加的缓冲液中观察到了趋势(数据未显示)。通常，随着pH在缓冲液的范围内增加观察到较高水平的多分散性，表明较高pH的缓冲液的聚集水平较高。处于其各自pH水平的谷氨酸盐和乙酸盐缓冲液具有最低水平的多分散性(％Pd在3.5％–7.6％之间)。除25mM组氨酸pH 5.5(6.9％％Pd)外，其余缓冲液具有较高水平的多分散性，范围在13.8％-23.3％之间。
来自初始生物物理筛选的DLS数据的结果与从一些配制剂的DSC获得的配制剂排名结果密切相关。磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液显示出高度的％Pd(14.1％-18.9％)，以及相对较低的T起始值(48℃–51℃)。由于聚集和热不稳定性的证据，这两种配制剂已从进一步研究中剔除。其他配制剂(谷氨酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、组氨酸)在DSC和DLS数据之间没有强相关性。例如，25mM组氨酸pH 6.0和6.5分别具有18.5％和23.3％的％Pd，但是，这两种相同的缓冲液分别表现出一些最高的T起始值，分别为53℃和55℃。谷氨酸盐和乙酸盐pH 4.5缓冲液两者具有稍微较低的T起始值，在46℃和50℃之间，但具有最低的％Pd值(在3.5％-7.6％之间)。最后，处于pH 5.5和6.0的琥珀酸盐缓冲液分别显示较高的T起始值，分别为50℃和54℃，但观察到具有高水平的多分散性(分别为13.8％和14.7％)。由于上述缓冲液配制剂的非决定性结果，所有四种缓冲液(谷氨酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐和组氨酸)均用于具有赋形剂的生物物理筛选，以进行进一步检查。
2.具有赋形剂的生物物理筛选
在存在150mM精氨酸、氯化钠、蔗糖或山梨糖醇的情况下筛选以上选择的配制剂。数据显示于表24中。
在DSC和用于具有赋形剂的抗体的生物物理筛选的数据中，趋势是明显的。通常，具有带电荷的赋形剂的配制剂的T起始值低于具有蔗糖或山梨糖醇的配制剂。随着pH在缓冲液的范围内增加，DSC中的T起始值也普遍增加(范围在46℃和55℃之间)，表明增加的缓冲液pH赋予抗体更大的热稳定性。
DLS数据内也观察到总体趋势。根据这些数据，与含有糖(山梨糖醇和蔗糖)的配制剂相比，发现含有带电荷的赋形剂(精氨酸和NaCl)的配制剂具有较低的多分散性水平，因此具有较低的表观聚集水平。这些含有糖的配制剂不仅具有较高的多分散性水平，而且在一些情况下，如多峰名称所示，含有两个不同的蛋白质群体，即含有山梨糖醇的乙酸盐缓冲液以及含有山梨糖醇和蔗糖的组氨酸缓冲液。在所有25mM琥珀酸盐配制剂中均发现了这种趋势的例外情况，即无论是否存在带电荷的或糖赋形剂，它们均显示出高水平的多分散性。
由于处于较低pH的谷氨酸盐的T起始值显著较低，以及蛋白质主链的低pH酸水解的潜力，因此谷氨酸盐缓冲液排除在进一步研究之外。另外，由于琥珀酸盐缓冲剂在其所有配制剂中(包括具有带电荷的赋形剂的配制剂中)高水平的多分散性，因此排除在进一步检查之外。因此，生物物理筛选数据表明，在存在氯化钠和精氨酸的情况下，处于pH 5.5的25mM乙酸盐和组氨酸配制剂是用于进一步配制剂开发的更好的候选者。
表24.具有赋形剂的基线缓冲液筛选的结果(DSC和DLS)
DSC
Figure BDA0002379913990001651
Figure BDA0002379913990001661
DLS
Figure BDA0002379913990001662
3.溶解度研究
将抗体以40mg/mL在其基础配制剂(30mM组氨酸，pH 5.5)中与四种不同浓度的NaCl(0、25、50和100mM NaCl)一起配制，以确定对溶解度和相分离的影响。将样品在预冷的冻干架上于-5±3℃储存24小时。24小时后，通过外观测试该组样品。在任何制备的样品中均未观察到相分离。
4.表面活性剂筛选
在存在0、0.03或0.06％w/v Tween-80的情况下，在30mM组氨酸，pH 5.5中配制抗体，并通过三个冻融循环对其施加压力。将相同的样品搅动48小时的时段。样品应激后，通过外观、A280、SEC、还原性CE-SDS和非还原性CE-SDS对该组样品进行测试。
4.1外观
在表面活性剂筛选研究中，任何样品之间均未观察到视觉差异。所有样品均为淡黄色液体，乳白色且无可见颗粒。
4.2通过UV A280的蛋白质含量
通过UV分析获得的抗体浓度在具有不同浓度的PS-80的搅动、冻融和对照样品之间没有显着差异，并且范围在17.80和21.32mg/mL之间(数据未显示)。
4.3尺寸排阻层析
单体纯度没有显著差异，并且任何表面活性剂筛选样品均未观察到到新峰的增长。所有样品的纯度在98.4–98.7％之间(数据未显示)。
4.4还原性毛细管电泳-十二烷基硫酸钠
纯度(轻链和重链％)没有显著差异，并且任何表面活性剂筛选样品均未观察到新的峰。所有样品的纯度为95.4–95.8％(数据未显示)。
4.5非还原性毛细管电泳-十二烷基硫酸钠
主峰纯度没有显著差异，并且任何表面活性剂筛选样品均未观察到新峰。所有样品的纯度在91.2％和91.3％之间(数据未显示)。
4.6表面活性剂筛选的结论
在含有0、0.03和0.06％浓度PS-80的未应激和应激样品之间未观察到外观、蛋白质浓度或纯度的变化。这些数据表明表面活性剂不增强抗体的稳定性。
5.冷冻保护剂筛选
在冷冻保护剂筛选中，在具有三种不同浓度(0、5或10％w/v)的蔗糖的30mM组氨酸，pH 5.5中配制抗体，并通过三个冻融循环对其施加压力。将相同的样品搅动48小时的时段。样品应激后，通过外观、A280、SEC、还原性CE-SDS和非还原性CE-SDS对该组样品进行测试。
5.1外观
在用三个冻融循环施加压力并搅动48小时的时段的含有0％、5％或10％蔗糖的样品之间未观察到视觉差异。所有样品均为淡黄色液体，乳白色且无可见颗粒。
5.2通过A280的蛋白质浓度
通过UV分析获得的抗体浓度没有显著差异。浓度范围在19.03和22.92mg/mL之间(数据未显示)。
5.3尺寸排阻层析
单体纯度没有显著差异，并且任何冷冻保护剂筛选样品均未观察到新峰的增长。所有样品的纯度在98.4–99.0％之间(数据未显示)。
5.4还原性毛细管电泳-十二烷基硫酸钠
纯度(轻链和重链％)没有显著差异，并且任何冷冻保护剂筛选样品均未观察到新峰的增长。所有样品的纯度为95.1–95.7％之间(数据未显示)。
5.5非还原性毛细管电泳-十二烷基硫酸钠
主峰纯度没有显著差异，并且任何冷冻保护剂筛选样品均未观察到新峰的增长。所有样品的纯度为90.3–91.9％之间(数据未显示)。
5.6冷冻保护剂筛选的结论
在含有0％、5％和10％蔗糖的浓度的未应激和应激样品之间未观察到外观、蛋白质浓度或纯度的显著变化。这些数据表明冷冻保护剂不增强抗体的稳定性。
6.DoE稳定性研究
研究设计和方法学与实施例54中使用的相同。有关所检查的所有配制剂的列表，请参见上面的表17。
6.1 DSC(初始)
初始DSC数据显示于表25中。对于组氨酸配制剂，观察到处于较高pH的配制剂获得了高T起始值。该趋势与在初始基线筛选中获得的数据相关，在初始基线筛选中，随着pH值增加，观察到更高的T起始值。当与处于pH 5.0和pH 5.5的组氨酸配制剂相比时，处于pH 6.0的组氨酸配制剂显示出更高的T起始值。对于组氨酸pH 6.0配制剂，T起始值范围为从47-52℃。组氨酸pH 5.0配制剂的范围为从42-45℃，而组氨酸pH 5.5配制剂的范围为从46-50℃。对于由蔗糖和山梨糖醇组成的配制剂，观察到高T起始值。对于由蔗糖和山梨糖醇组成的配制剂，配制剂F13、F14、F28和F29显示出高T起始值。由于渗透剂(osmolyte)对蛋白质的折叠状态有影响，因此这可以预期。对于乙酸盐配制剂，观察到类似的趋势。处于较高pH的配制剂显示较高的起始值。乙酸盐配制剂pH 6.0和pH 5.5在存在和不存在NaCl和精氨酸的情况下均显示出高T起始值。乙酸盐pH 6.0配制剂的范围为从52-54℃，而乙酸盐pH 5.5配制剂的范围为从49-53℃。乙酸盐pH 5.0配制剂显示出45-49℃的最低T起始范围。
表25.DOE研究的抗体样品的初始DSC结果
Figure BDA0002379913990001691
Figure BDA0002379913990001701
6.2 UV(初始)
初始时间点的蛋白质浓度的范围为18.52-21.86mg/mL(数据未显示)。总体而言，在初始时间点未观察到蛋白质浓度的显著变化。
6.3外观
在四周时间点于5±3℃，大多数样品制剂均透明且颜色为浅黄。样品F28和F29(其包含山梨糖醇或蔗糖)于5±3℃呈乳白色。在乙酸盐和组氨酸缓冲液两者中，于5±3℃和40±2℃/75±5％RH，大多数样品制剂均显示出很少的颗粒。处于两种条件下的样品均为淡黄色且透明，除了一些在组氨酸中制备的样品。对于40±2℃/75±5％RH条件，组氨酸配制剂F20-1、F20-2、F20-3、F24、F28、F29和F30为乳白色。这些配制剂不具有赋形剂，或者其具有蔗糖或山梨糖醇。
6.4 pH
对于乙酸盐配制剂，在四周时间点于5±3℃和40±2℃/75±5％RH观察到显著pH改变(数据未显示)。在初始时间点和5±3℃，乙酸盐配制剂的pH差异的范围为0.10-0.29。在处于40±2℃/75±5％RH应激的这些样品中观察到的pH的改变为0.07-1.30。对于组氨酸配制剂，在四周时间点于5±3℃和40±2℃/75±5％RH观察到了pH改变，但该变化远小于乙酸盐样品的变化。在初始时间点和5±3℃，组氨酸配制剂的pH差异的范围为0.02-0.16。可以将这种类型的变化归于小体积样品的方法变异性。在处于40±2℃/75±5％RH应激的这些样品中观察到的pH的改变为0.02-0.94。
显著的pH改变也可以导致蛋白质加速降解。与组氨酸配制剂相比，乙酸盐配制剂易于以高得多的水平受pH改变的影响，这使乙酸盐成为该抗体的不合适的组分。由于观察到的乙酸盐配制剂的pH改变，因此接着解释的稳定性结果将集中在组氨酸配制剂(F16-F30)上。
6.5通过UV A280的蛋白质含量
通过5±3℃样品的A280读数测定的蛋白质含量的范围为14.66–21.70mg/mL，而40±2℃/75±5％RH的A280读数的范围为18.12–40.42mg/mL(数据未显示)。于40±2℃/75±5％RH，对于F20-1、F20-2、F20-3、F24和F28，观察到A280读数的显著改变。在外观测试中观察到这些相同的样品是乳白色的。由于观察到的蛋白质浓度增加，这些结果很可能是由于非产品相关的UV吸收物，使表观UV浓度膨胀所致。
6.6尺寸排阻层析
四周时间点的SEC结果显示于表26中。发现其具有高蛋白质浓度且外观为乳白色的组氨酸配制剂(F20-1、F20-2、F20-3、F24和F28、F29、F30)发生了显著变化。对于这些样品，在流动相流通中观察到明显的UV吸收峰。这些SEC数据以及已经讨论的其他支持分析表明，这些配制剂含有与吸收UV的与产品无关的组分。在高温应激条件下，不具有带电荷的赋形剂的组氨酸配制剂可能降解并充当该UV吸收组分。对于组氨酸配制剂，观察到带电荷的赋形剂的存在改进了配制剂的稳定性。还观察到pH的增加改进了组氨酸配制剂的纯度。于40±2℃/75±5％RH，在存在带电荷的赋形剂的情况下，观察到配制剂的％总杂质降低。对于处于40±2℃/75±5％RH的组氨酸pH 5.0配制剂F17、F18和F19，％总杂质的范围为从4.2-4.9％。组氨酸pH 5.5配制剂F21、F22和F23的％总杂质3.6–5.6％，而组氨酸pH 6.0配制剂F25、F26和F27具有范围为从3.2–3.4％的％总杂质。通常，较高的pH导致％总杂质降低，并且在存在带电荷的赋形剂的情况下，组氨酸pH 6.0配制剂显示出更好的稳定性。总的来说，在存在带电荷的赋形剂NaCl和精氨酸的情况下，组氨酸pH 6.0配制剂具有更好的稳定性。
表26.SEC趋势结果DoE研究-5±3℃(F16至F30)
样品 ％主峰 总％聚集体 总％后单体 总％杂质
F16 98.2 ND 1.8 1.8
F17 97.8 ND 2.2 2.2
F18 97.8 ND 2.2 2.2
F19 97.8 ND 2.2 2.2
F20-1 95.7 ND 4.3 4.3
F20-2 95.9 ND 4.2 4.2
F20-3 95.8 ND 4.2 4.2
F21 97.6 ND 2.4 2.4
F22 97.8 ND 2.2 2.2
F23 97.8 ND 2.2 2.2
F24 97.9 ND 2.1 2.1
F25 97.9 ND 2.1 2.1
F26 97.8 ND 2.2 2.2
F27 97.6 ND 2.4 2.4
F28 90.9 ND 9.1 9.1
F29 95.7 ND 4.3 4.3
F30 97.9 ND 2.1 2.1
表26.(续)40±2℃/75±5％RH(F16至F30)
样品 ％主峰 总％聚集体 总％后单体 总％杂质
F16 95.9 0.3 3.8 4.1
F17 95.8 ND 4.2 4.2
F18 95.1 0.4 4.5 4.9
F19 95.3 0.5 4.2 4.7
F20-1 57.2 0.4 42.4 42.8
F20-2 59.6 0.3 43.6 44.0
F20-3 56.0 0.4 43.6 44.0
F21 96.2 1.1 2.6 3.7
F22 96.4 0.9 2.6 3.6
F23 94.4 1.0 4.6 5.6
F24 62.6 0.6 36.8 37.4
F25 96.7 0.9 2.4 3.3
F26 96.8 0.7 2.5 3.2
F27 96.6 0.8 2.6 3.4
F28 40.7 0.2 59.1 59.3
F29 37.0 0.1 62.9 63.0
F30 62.7 0.3 36.9 37.3
6.7成像毛细管等电聚焦
使用icIEF确定抗体样品的电荷异质性(表27)。基于数据，在四周时间点于5±3℃，组氨酸配制剂的百分比主峰的范围为45.6–47％。处于40±2℃/75±5％RH，由山梨糖醇或蔗糖组成的配制剂F28、F29和F30的百分比碱性变体显著增加，分别为11.2％、19.0％和11.5％。在四周时间点于40±2℃/75±5％RH，所有组氨酸配制剂均显示出百分比碱性变体的增加。icIEF数据显示样品的pH显著影响电荷的异质性。当与组氨酸配制剂pH 5.5和6.0相比时，处于pH 5.0的组氨酸配制剂在碱性变体中显示出更显著的增加。对于组氨酸pH5.0配制剂，处于40±2℃/75±5％RH的百分比碱性变体的范围为6.3–7.2％。处于40±2℃/75±5％RH，组氨酸pH 5.5的百分比碱性变体的范围为5.5–6.4％，而组氨酸pH 6.0的百分比碱性变体的范围为4.4–4.7％。该结果可能不是由于脱酰胺引起的，因为已知脱酰胺在较高的pH值下加速，而在此观察到相反的趋势。碱性变体的增殖可能是由于其他杂质，如HMW或LMW物质形成。在所有配制剂中，结果表明，组氨酸pH 6.0是比组氨酸pH 5.0和pH 5.5配制剂更好的配制剂，并且在由蔗糖和山梨糖醇组成的组氨酸配制剂中观察到显著降解。
表27.电荷异质性结果–DoE研究(F16至F30)
5±3℃
样品名称 ％酸性 ％主要 ％碱性
F16 51.2658 45.7214 3.0129
F17 50.7337 46.3536 2.9128
F18 49.6343 47.2554 3.1103
F19 51.0018 46.0089 2.9892
F20-1 50.2246 46.6850 3.0903
F20-2 50.7704 46.4691 2.7605
F20-3 50.5080 46.5530 2.9389
F21 50.5807 46.5006 2.9188
F22 51.3396 45.5742 3.0860
F23 50.6815 46.3329 2.9856
F24 50.5549 46.4321 3.0129
F25 51.1597 46.0433 2.7969
F26 50.7182 46.2823 2.9996
F27 50.1041 46.9935 2.9024
F28 50.4796 46.7715 2.7489
F29 50.7420 46.5580 2.7000
F30 50.6776 46.1046 3.2178
40±2℃/75±5％RH
样品名称 ％酸性 ％主要 ％碱性
F16 60.7833 32.8678 6.3489
F17 61.4471 32.0916 6.4613
F18 60.7822 32.1308 7.0869
F19 60.9821 31.8441 7.1738
F20-1 58.4109 35.2051 6.3840
F20-2 57.4696 36.9132 5.6171
F20-3 57.7045 36.2584 6.0370
F21 59.6823 34.7816 5.5361
F22 59.0513 35.3566 5.5921
F23 58.8688 35.7943 5.3369
F24 59.7325 35.8236 4.4438
F25 59.4254 35.9883 4.5862
F26 58.3393 36.9718 4.6889
F27 58.5474 37.0873 4.3652
F28 58.2504 30.5135 11.2363
F29 53.1306 27.8952 18.9743
F30 55.7556 32.7219 11.5222
6.8还原性毛细管电泳–十二烷基硫酸钠
还原性毛细管电泳的结果显示于表28中。在四周时间点于5±3℃，所有组氨酸配制剂，不论pH均显示出相当的纯度，然而具有蔗糖和山梨糖醇的配制剂的纯度稍差。
在四周时间点于40±2℃/75±5％RH，结果表明所有样品制剂中的杂质均增加。观察到处于较低pH的配制剂于40±2℃/75±5％RH显示出更多降解。组氨酸pH 5.0配制剂显示百分比纯度的显著降低。百分比纯度的范围为86.3-88.9％。对于组氨酸pH 5.5配制剂，百分比纯度的范围为85.0-92.3％。对于组氨酸pH 6.0配制剂观察到显著较少的降解。处于40±2℃/75±5％RH四周时间点的组氨酸pH 6.0配制剂的百分比纯度的范围为从90.1-93.1％。此外，组氨酸样品的％LMW对于处于较低pH的组氨酸样品较高，而对于处于较高pH的组氨酸配制剂则低得多。对于组氨酸pH 5.0配制剂，％LMW的范围为8.3-11.0％。而组氨酸pH 5.5和6.0配制剂显示出5.4–12.1％和4.0–6.6％的％LMW范围。对于组氨酸pH 6.0配制剂，还观察到在存在带电荷的赋形剂的情况下百分比纯度未显著降低。在所有配制剂中，与其他组氨酸配制剂相比，在存在带电荷的赋形剂NaCl和精氨酸的情况下的组氨酸pH 6.0配制剂显示出更好的纯度。
表28.还原性毛细管电泳结果–DoE研究(F16至F30)
5±3℃
样品名称 ％LC ％HC ％NGHC ％纯度 ％总LMW ％总HMW
F16 32.4 63.1 0.8 95.5 2.1 2.5
F17 31.6 64.0 0.8 95.6 2.0 2.4
F18 31.4 63.8 0.8 95.2 2.3 2.5
F19 31.5 63.5 0.8 95.0 2.4 2.6
F20 rep 1 31.9 63.4 0.8 95.3 2.2 2.5
F20 rep 2 32.5 63.4 0.7 95.9 1.8 2.3
F20 rep 3 32.5 63.5 0.7 96.0 1.8 2.3
F21 31.9 64.1 0.7 96.0 1.7 2.3
F22 31.8 64.2 0.7 95.9 1.8 2.2
F23 31.9 64.0 0.7 95.9 1.9 2.2
F24 32.8 62.8 0.7 95.6 1.9 2.5
F25 32.0 63.7 0.7 95.7 1.9 2.4
F26 31.8 64.0 0.7 95.7 1.9 2.4
F27 31.7 63.8 0.8 95.5 2.1 2.4
F28 32.5 62.8 0.8 95.3 2.2 2.5
F29 32.3 62.6 0.8 94.9 2.7 2.5
F30 31.8 63.2 0.7 95.0 2.1 3.0
表28.(续)40±2℃/75±5％RH
Figure BDA0002379913990001741
Figure BDA0002379913990001751
6.9非还原性毛细管电泳–十二烷基硫酸钠
非还原性毛细管电泳的结果显示于表29中。对于处于5±3℃的组氨酸配制剂，与其余组氨酸配制剂相比，配制剂F23和F29显示出3.6％和3.3％的高％HMW。对于在40±2℃/75±5％RH下应激的组氨酸配制剂，配制剂F28、F29和F30分别显示36.8％、49.3％和37.4％的极高的％总杂质百分比。另外，配制剂F20和F24显示出高％杂质。这些配制剂不含有赋形剂或者含有蔗糖或山梨糖醇。基于数据，观察到对于在40±2℃/75±5％RH下应激的样品，在较高的pH值下％总杂质较低。对于组氨酸配制剂pH 5.0，％总杂质的范围为11.8–15.0％。对于处于pH 5.5的组氨酸配制剂(配制剂F21、F22和F23)，％总杂质的范围为从10.7-12.3％，而对于处于pH 6.0的组氨酸配制剂(F25、F26和F27)，％总杂质的范围为从9.8-10.0％。从非还原性CE-SDS数据获得的结果证实，与其他组氨酸配制剂相比，在存在带电荷的赋形剂的情况下的组氨酸pH 6.0配制剂显示出更好的纯度。
表29.非还原性毛细管电泳结果–DoE研究(F16至F30)
5±3℃
Figure BDA0002379913990001752
Figure BDA0002379913990001761
表29.(续)40±2℃/75±5％RH
样品 ％LMW ％主峰 ％HMW ％总杂质
F16 10.8 88.2 1.0 11.8
F17 11.5 87.2 1.3 12.8
F18 12.5 86.5 1.0 13.5
F19 11.6 85.0 3.4 15.0
F20-1 21.5 77.9 0.6 22.1
F20-2 21.7 77.7 0.6 22.3
F20-3 23.0 76.2 0.7 23.8
F21 11.0 87.7 1.3 12.3
F22 10.0 89.3 0.8 10.7
F23 9.9 89.1 0.9 10.9
F24 13.2 85.8 1.0 14.2
F25 8.9 90.0 1.1 10.0
F26 9.1 90.1 0.8 9.9
F27 8.9 90.2 0.8 9.8
F28 36.4 63.2 0.4 36.8
F29 48.8 50.7 0.5 49.3
F30 36.7 62.6 0.8 37.4
6.10动态光散射
由于在这些配制剂中观察到pH改变，因此不考虑乙酸盐配制剂。基于组氨酸配制剂的DLS数据，配制剂F20-2、F24、F28和F30于5±3℃显示高％Pd值(数据未显示)。配制剂F29具有％Pd的多峰名称，表明溶液中存在蛋白质颗粒。先前的数据还表明上述配制剂不是最佳条件。由蔗糖和山梨糖醇组成的配制剂在两种温度条件下均显示出高％Pd。在来自初始基线筛选研究的DLS数据中也可以看出这一点。对于处于40±2℃/75±5％RH的组氨酸配制剂，观察到在较低的pH值下％Pd增加。对于处于pH 5.0的组氨酸配制剂，处于40±2℃/75±5％RH的％Pd的范围为4.7–18.2％。对于处于pH 5.5的组氨酸配制剂(F21、F22和F23)，％Pd的范围为7.9-9.5％。最后，组氨酸pH 6.0配制剂(F25、F26和F27)的％Pd的范围为7.8–9.8％。与pH 5.0相比，处于pH 5.5(F21、F22和F23)和6.0(F25、F26和F27)的组氨酸配制剂显示出最低的％Pd值。对于组氨酸pH 6.0配制剂，F25、F26和F27是有前途的候选者，因为所有配制剂在两种应激条件和在存在带电荷的赋形剂的情况下均显示出低％Pd。
7.结论
基于从对表17中列出的各种配制剂中的抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G进行分析测试获得的结果，配制剂F25(30mM组氨酸，150mM NaCl pH 6.0)是该分子的最佳配制剂。
初始基线生物物理筛选结果表明，在存在NaCl和精氨酸的情况下，处于pH 5.5的乙酸盐和组氨酸配制剂是最佳缓冲液/pH条件。此外，与山梨糖醇和蔗糖相比，精氨酸和NaCl是更好的赋形剂的选择。表面活性剂和冷冻保护剂研究表明，不需要PS-80或蔗糖来增强配制剂的稳定性。对于DoE稳定性研究，初始DSC结果证实30mM组氨酸pH 6.0配制剂具有足够高的T起始熔化温度值。在所有30mM乙酸盐配制剂中均观察到显著pH改变。组氨酸pH 6.0配制剂于5±3℃和40±2℃/75±5％RH在四周稳定性内未显示出pH的任何显著变化。SEC数据表明，在存在带电荷的赋形剂的情况下，组氨酸pH 6.0赋予该抗体最大的稳定性。来自icIEF的结果表明，组氨酸pH 6.0样品对电荷异质性的变化更具抵抗力。还显示在存在蔗糖和山梨糖醇的情况下的配制剂表现出最大的降解。还原和非还原性CE-SDS的结果表明，在存在带电荷的赋形剂的情况下，组氨酸pH 6.0配制剂是最佳配制剂。DLS数据表明，在存在带电荷的赋形剂的情况下，组氨酸pH 5.5和6.0配制剂的多分散性变化最小。总体而言，可用数据的总和支持30mM组氨酸，150mM氯化钠pH 6.0作为抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G的配制剂。
实施例56：抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G和抗体IgG1-hDR5-05-E430G配制剂的混合物
将两者均在30mM组氨酸，150mM氯化钠pH 6.0中配制的IgG1-hDR5-01-G56T-E430G(20mg/mL)和IgG1-hDR5-05-E430G(20mg/mL)的1:1混合物储存于5°以研究混合物在各自配制剂中的稳定性。在储存2、4、8、12周后以及6个月后，使用实施例54中所述的方法，通过外观、pH、蛋白质含量、尺寸排阻层析，还原和非还原性毛细管电泳–十二烷基硫酸钠和成像毛细管等电聚焦对样品进行分析。
结果
在任何经测试的特性中均未观察到显著变化。因此，抗体混合物在5℃储存温度下稳定至少6个月。
序列表
<110> 根马布私人有限公司
<120> 基于突变IGG六聚体的治疗性抗体
<130> P/0117-WO
<160> 68
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 1
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Phe
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 2
Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 3
Val Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr
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<210> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 4
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1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Phe Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 7
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Trp Pro Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 10
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr His
1 5
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 11
Ala Arg Trp Gly Thr Asn Val Tyr Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 12
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Glu Tyr Asp Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Gly Thr Asn Val Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 13
Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 14
Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro Thr
1 5
<210> 15
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 15
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 16
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Asp Tyr Phe
1 5 10
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 17
Ile His Asn Ser Gly Thr Thr
1 5
<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 18
Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 19
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 19
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Cys Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 20
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 21
Gln Gly Ile Ser Arg Ser Tyr
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 22
Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 23
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 23
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 439
<212> PRT
<213> 人
<400> 24
Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys
1 5 10 15
Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu
35 40 45
Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln
50 55 60
Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu
65 70 75 80
Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser
85 90 95
Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe
100 105 110
Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro
115 120 125
Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe
130 135 140
Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys
145 150 155 160
Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile
165 170 175
Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Thr Lys His Ser Gly Glu Val Pro
180 185 190
Ala Val Glu Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Pro
195 200 205
Cys Ser Leu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala Ala Val Val
210 215 220
Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys Val
225 230 235 240
Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp Pro Glu
245 250 255
Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp Asn Val Leu
260 265 270
Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val Pro Glu Gln Glu
275 280 285
Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Val Asn Met Leu Ser
290 295 300
Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala Glu Arg Ser
305 310 315 320
Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Glu Gly Asp Pro Thr Glu
325 330 335
Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Asp Leu Val Pro Phe Asp
340 345 350
Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly Leu Met Asp Asn Glu Ile
355 360 365
Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr Leu Tyr Thr
370 375 380
Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala Ser Val His
385 390 395 400
Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu Ala Lys Lys
405 410 415
Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu Gly
420 425 430
Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser
435
<210> 25
<211> 440
<212> PRT
<213> 恒河猴
<400> 25
Met Gly Gln Leu Arg Gln Ser Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys
1 5 10 15
Gly Arg Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Leu
20 25 30
Arg Val Leu Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Ala Arg Val Leu
35 40 45
Val Ser Ala Asp Cys Ala Pro Ile Thr Arg Gln Ser Leu Asp Pro Gln
50 55 60
Arg Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Thr Glu Gly Leu
65 70 75 80
Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Ser Arg Asp Cys Ile Ser
85 90 95
Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Phe Leu Phe
100 105 110
Cys Leu Arg Cys Thr Lys Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Val Asn Ser
115 120 125
Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe
130 135 140
Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Ile Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys
145 150 155 160
Pro Arg Gly Met Val Lys Val Lys Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile
165 170 175
Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Thr Lys His Thr Gly Glu Val Pro
180 185 190
Ala Val Glu Lys Thr Val Thr Thr Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Pro
195 200 205
Cys Ser Leu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Ile Val Phe Val Val Ile
210 215 220
Val Val Val Ala Val Ile Val Trp Lys Thr Ser Leu Trp Lys Lys Val
225 230 235 240
Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Val Cys Ser Gly Asp Gly Gly Asp Pro Glu
245 250 255
Arg Val Asp Ser Ser Pro Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp Asn Ala Leu
260 265 270
Asn Glu Ile Val Ser Ile Val Gln Pro Ser Gln Val Pro Glu Gln Glu
275 280 285
Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Gln Thr Asp Val Asn Thr Leu Ser
290 295 300
Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Lys Ala Glu Gly Pro
305 310 315 320
Gln Arg Arg Gly Gln Leu Val Pro Val Asn Glu Asn Asp Pro Thr Glu
325 330 335
Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Ala Ile Val Pro Phe Asp
340 345 350
Ala Trp Glu Pro Leu Val Arg Gln Leu Gly Leu Thr Asn Asn Glu Ile
355 360 365
Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Ser Ser Arg Asp Thr Leu Tyr Val
370 375 380
Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg Ala Ala Ser Val Asn
385 390 395 400
Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Glu Glu Arg Leu Ala Lys Gln
405 410 415
Lys Ile Gln Asp Arg Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu
420 425 430
Asp Asn Ala Asp Ser Ala Thr Ser
435 440
<210> 26
<211> 381
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 26
Met Glu Pro Pro Gly Pro Ser Thr Pro Thr Ala Ser Ala Ala Ala Arg
1 5 10 15
Ala Asp His Tyr Thr Pro Gly Leu Arg Pro Leu Pro Lys Arg Arg Leu
20 25 30
Leu Tyr Ser Phe Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Ala Val Phe Val
35 40 45
Pro Val Thr Ala Asn Pro Ala His Asn Arg Pro Ala Gly Leu Gln Arg
50 55 60
Pro Glu Glu Ser Pro Ser Arg Gly Pro Cys Leu Ala Gly Gln Tyr Leu
65 70 75 80
Ser Glu Gly Asn Cys Lys Pro Cys Arg Glu Gly Ile Asp Tyr Thr Ser
85 90 95
His Ser Asn His Ser Leu Asp Ser Cys Ile Leu Cys Thr Val Cys Lys
100 105 110
Glu Asp Lys Val Val Glu Thr Arg Cys Asn Ile Thr Thr Asn Thr Val
115 120 125
Cys Arg Cys Lys Pro Gly Thr Phe Glu Asp Lys Asp Ser Pro Glu Ile
130 135 140
Cys Gln Ser Cys Ser Asn Cys Thr Asp Gly Glu Glu Glu Leu Thr Ser
145 150 155 160
Cys Thr Pro Arg Glu Asn Arg Lys Cys Val Ser Lys Thr Ala Trp Ala
165 170 175
Ser Trp His Lys Leu Gly Leu Trp Ile Gly Leu Leu Val Pro Val Val
180 185 190
Leu Leu Ile Gly Ala Leu Leu Val Trp Lys Thr Gly Ala Trp Arg Gln
195 200 205
Trp Leu Leu Cys Ile Lys Arg Gly Cys Glu Arg Asp Pro Glu Ser Ala
210 215 220
Asn Ser Val His Ser Ser Leu Leu Asp Arg Gln Thr Ser Ser Thr Thr
225 230 235 240
Asn Asp Ser Asn His Asn Thr Glu Pro Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly
245 250 255
Lys Lys Leu Leu Val Pro Val Asn Gly Asn Asp Ser Ala Asp Asp Leu
260 265 270
Lys Phe Ile Phe Glu Tyr Cys Ser Asp Ile Val Pro Phe Asp Ser Trp
275 280 285
Asn Arg Leu Met Arg Gln Leu Gly Leu Thr Asp Asn Gln Ile Gln Met
290 295 300
Val Lys Ala Glu Thr Leu Val Thr Arg Glu Ala Leu Tyr Gln Met Leu
305 310 315 320
Leu Lys Trp Arg His Gln Thr Gly Arg Ser Ala Ser Ile Asn His Leu
325 330 335
Leu Asp Ala Leu Glu Ala Val Glu Glu Arg Asp Ala Met Glu Lys Ile
340 345 350
Glu Asp Tyr Ala Val Lys Ser Gly Arg Phe Thr Tyr Gln Asn Ala Ala
355 360 365
Ala Gln Pro Glu Thr Gly Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val
370 375 380
<210> 27
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 27
Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys
1 5 10 15
Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Leu
20 25 30
Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu
35 40 45
Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln
50 55 60
Gln Arg Val Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu
65 70 75 80
Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser
85 90 95
Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe
100 105 110
Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro
115 120 125
Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe
130 135 140
Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys
145 150 155 160
Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile
165 170 175
Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Thr Lys His Ser Gly Glu Ala Pro
180 185 190
Ala Val Glu Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Pro
195 200 205
Cys Ser Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Ala Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys His His His His His His His
435 440 445
His Glu Pro Glu Ala
450
<210> 28
<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 28
Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys
1 5 10 15
Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu
35 40 45
Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln
50 55 60
Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu
65 70 75 80
Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser
85 90 95
Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe
100 105 110
Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro
115 120 125
Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe
130 135 140
Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys
145 150 155 160
Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile
165 170 175
Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly His His His His His His His His
180 185 190
<210> 29
<211> 329
<212> PRT
<213> 人
<400> 29
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 30
<211> 329
<212> PRT
<213> 人
<400> 30
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 31
<211> 329
<212> PRT
<213> 人
<400> 31
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
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435 440 445
<210> 41
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 41
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Glu Tyr Asp Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Trp Gly Thr Asn Val Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
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Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
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His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
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<211> 448
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<213> 人工序列
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<223> N/A
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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65 70 75 80
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His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
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Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
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Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
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Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
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Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
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Asn Arg Gly Glu Cys
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<213> 人
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Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys
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Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Pro
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Cys Ser Leu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala Ala Val Val
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Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys Val
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Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp Pro Glu
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Lys Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu
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Gly Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser
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<213> 人
<400> 45
Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys
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Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Leu
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Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys Val
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Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp Pro Glu
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435 440
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<211> 440
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<213> 人
<400> 46
Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys
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Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Pro
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Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu
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Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser
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Cys Ser Leu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala Ala Val Val
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Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys Val
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Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp Pro Glu
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Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Glu Gly Asp Pro Thr Glu
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Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu Ala Lys Gln
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Lys Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu
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Gly Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser
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<213> 人
<400> 47
Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys
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Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Pro
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Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu
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Ala Val Val Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp
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Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala
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<213> 食蟹猴
<400> 48
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Val Ile Val Val Val Ala Val Ile Val Trp Lys Thr Ser Leu Trp Lys
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Lys Val Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Val Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp
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260 265 270
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<213> 食蟹猴
<400> 49
Met Gly Gln Leu Arg Gln Ser Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys
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Gly Arg Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Leu
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Lys Val Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Val Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp
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Val Pro Glu Gln Glu Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Gln Thr Asp
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<213> 食蟹猴
<400> 50
Met Gly Gln Leu Arg Gln Ser Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys
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Leu Ser Val Ser Ala Asp Cys Ala Pro Ile Thr Arg Gln Ser Leu Asp
50 55 60
Pro Gln Arg Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Thr Glu
65 70 75 80
Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Ser Arg Glu Cys
85 90 95
Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Phe
100 105 110
Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Lys Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Val
115 120 125
Asn Ser Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly
130 135 140
Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Ile Cys Arg Lys Cys Arg Thr
145 150 155 160
Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val Lys Asp Cys Thr Pro Trp Ser
165 170 175
Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Ile
180 185 190
Val Leu Val Val Ile Val Val Val Ala Val Ile Val Trp Lys Thr Ser
195 200 205
Leu Trp Lys Lys Val Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Val Cys Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Asp Pro Glu Arg Val Asp Ser Ser Ser His Ser Pro Gln Arg
225 230 235 240
Pro Gly Ala Glu Asp Asn Ala Leu Asn Glu Ile Val Ser Ile Val Gln
245 250 255
Pro Ser Gln Val Pro Glu Gln Glu Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu
260 265 270
Gln Thr Asp Val Asn Thr Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu
275 280 285
Glu Pro Ala Lys Ala Glu Gly Pro Gln Arg Arg Gly Gln Leu Val Pro
290 295 300
Val Asn Glu Asn Asp Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp
305 310 315 320
Phe Ala Ala Ile Val Pro Phe Asp Ala Trp Glu Pro Leu Val Arg Gln
325 330 335
Leu Gly Leu Thr Asn Asn Glu Ile Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala
340 345 350
Ser Ser Arg Asp Thr Leu Tyr Val Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys
355 360 365
Thr Gly Arg Ala Ala Ser Val Asn Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr
370 375 380
Leu Glu Glu Arg Leu Ala Asn Gln Lys Ile Gln Asp Arg Leu Leu Ser
385 390 395 400
Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu Asp Asn Ala Asp Ser Ala Thr Ser
405 410 415
<210> 51
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 51
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Val
1 5
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 52
Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr
1 5
<210> 53
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 53
Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr
1 5 10
<210> 54
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 54
Gln Asp Val Gly Thr Ala
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 55
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr
1 5
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<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 56
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
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<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 57
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
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Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
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Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
85 90 95
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100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 59
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 59
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Lys Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 60
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 60
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
85 90 95
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Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
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130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
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Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Tyr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 61
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 61
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
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100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 62
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 62
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
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100 105 110
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115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
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Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
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Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
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260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
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Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Lys Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 63
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 63
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
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Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
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65 70 75 80
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165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 64
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 64
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
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Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
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Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
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Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
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65 70 75 80
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305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
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<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 65
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
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35 40 45
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Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
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210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 66
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 66
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 67
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 67
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Lys Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 68
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N/A
<400> 68
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325

Claims (57)

1.药物组合物，其包含
a.抗体，其包含人免疫球蛋白G的Fc区和抗原结合区，其中所述Fc区包含对应于EU编号的人IgG1中E430、E345或S440的位置处的氨基酸的突变，
b.组氨酸缓冲液，和
c.氯化钠
其中所述组合物的pH在5.5和7.4之间。
2.根据权利要求1的药物组合物，其中所述组合物包含从5mM至100mM的组氨酸，例如，从5mM至75mM，如从10mM至50mM，例如从15mM至45mM，如从20mM至40mM，例如从25至35mM，如从28mM至32mM，例如30mM的组氨酸。
3.根据权利要求1或2的药物组合物，其中所述pH为从5.8至7.2，如5.5至6.5，例如5.8至6.2，例如5.9至6.1，如6.0。
4.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述组合物包含从25mM至500mM的氯化钠，例如从25mM至250mM，如从50mM至250mM，例如从100mM至200mM，如从125mM至175mM，例如150mM的氯化钠。
5.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述抗体浓度为从0.5mg/ml至250mg/ml，如从1mg/ml至100mg/ml，例如从1mg/ml至50mg/ml，如从2mg/ml至20mg/ml，如从15mg/ml至25mg/ml，如从18mg/ml至23mg/ml，如从19mg/ml至21mg/ml，如从18mg/ml至20mg/ml，如从5mg/ml至15mg/ml，如10mg/ml或如20mg/ml。
6.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述组合物包含从10mM至50mM的组氨酸、从50mM至250mM的氯化钠和从2mg/ml至20mg/ml的抗体，处于5.5和6.5之间的pH，优选其中所述组合物包含30mM的组氨酸，150mM的氯化钠和20mg/ml的抗体，处于pH 6.0。
7.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述组合物不包含表面活性剂。
8.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述组合物不包含冷冻保护剂。
9.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述Fc区包含对应于EU编号的人IgG1中S440的位置处的氨基酸的突变，条件是所述S440中的突变是S440Y或S440W。
10.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述Fc区包含选自下组的突变：E430G、E345K、E430S、E430F、E430T、E345Q、E345R、E345Y、S440W和S440Y。
11.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述Fc区包含选自E430G或E345K的突变。
12.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述Fc区包含E430G突变。
13.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述Fc区进一步包含选自K439E或S440K的突变。
14.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述抗原结合区与人DR5结合。
15.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述抗原结合区与人DR5上的表位结合，所述表位包含或需要位于SEQ ID NO:46的氨基酸残基116-138内的一个或多个氨基酸残基和氨基酸残基139-166内的一个或多个氨基酸残基。
16.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述抗原结合区与人DR5上的表位结合，所述表位包含或需要位于SEQ ID NO:46的氨基酸残基79-138内的一个或多个氨基酸残基。
17.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述抗原结合区包含包括具有以下氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3域的可变重链(VH)区和包括具有以下氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3域的可变轻链(VL)区：
a)(VH)SEQ ID NO:1、2、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6；
b)(VH)SEQ ID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6；
c)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14；
d)(VH)SEQ ID NO:16、17、18和(VL)SEQ ID NO:21、GAS、22或
e)如以上a)至d)的任一项中所定义的(VH)CDR1、CDR2、CDR3以及(VL)CDR1、CDR2和CDR3，其在所述六个CDR序列中总共具有一至五个突变或取代。
18.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述抗原结合区包含具有以下氨基酸序列的可变重链(VH)区和具有以下氨基酸序列的可变轻链(VL)区：
a)(VH)SEQ ID NO:4和(VL)SEQ ID NO:7；
b)(VH)SEQ ID NO:9和(VL)SEQ ID NO:7；
c)(VH)SEQ ID NO:12和(VL)SEQ ID NO:15；
d)(VH)SEQ ID NO:19和(VL)SEQ ID NO:23；
e)(VH)SEQ ID NO:20和(VL)SEQ ID NO:23或
f)如以上a)至e)的任一项中所定义的(VH)和(VL)，其在所述(VH)和(VL)序列中总共具有一至五个突变或取代。
19.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
20.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述抗体为IgG1同种型。
21.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述抗体为IgG1m(f)、IgG1m(a)、IgG1m(z)、IgG1m(x)同种异型或混合同种异型。
22.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述Fc区包含下组的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:29；
b)SEQ ID NO:30；
c)SEQ ID NO:31；
d)SEQ ID NO:32或
e)如以上a)至d)的任一项中所定义的氨基酸序列，其在所述序列中总共具有一至五个突变或取代。
23.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，其中所述LC包含SEQ ID NO:39的序列并且其中所述HC包含以下序列之一：
a)(HC)SEQ ID NO:33；
b)(HC)SEQ ID NO:34；
c)(HC)SEQ ID NO:35；
d)(HC)SEQ ID NO:36；
e)(HC)SEQ ID NO:37；
f)(HC)SEQ ID NO:38；或
g)如以上a)至f)的任一项中所定义的(HC)，其在所述(HC)序列中总共具有一至五个突变或取代。
24.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，其中所述LC包含SEQ ID NO:43的序列并且其中所述HC包含以下序列之一：
a)(HC)SEQ ID NO:40；
b)(HC)SEQ ID NO:41；
c)(HC)SEQ ID NO:42；或
d)如以上a)至c)的任一项中所定义的(HC)，其在所述(HC)序列中总共具有一至五个突变或取代。
25.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
26.根据权利要求1至24中任一项的药物组合物，其中所述抗体是双特异性抗体，其包含一个或多个如权利要求14至18的任一项中所定义的抗原结合区。
27.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述抗体是人的、人源化的或嵌合的。
28.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述抗体是激动性的。
29.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述抗体诱导靶细胞中的程序性细胞死亡，如胱天蛋白酶依赖性细胞死亡。
30.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述抗体诱导表达DR5的靶细胞中的凋亡。
31.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述抗体降低细胞存活力。
32.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其包含两种或更多种抗体。
33.根据权利要求32的药物组合物，其包含如前述权利要求1-31的任一项中所定义的第一抗体和如前述权利要求1-31的任一项中所定义的第二抗体。
34.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述第一抗体包含第一Fc区，并且所述第二抗体包含第二Fc区。
35.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述第一抗体包含能够与DR5结合的第一抗原结合区和第一Fc区，并且所述第二抗体包含能够与DR5结合的第二抗原结合区和第二Fc区。
36.根据权利要求33至35中任一项的药物组合物，其中所述第一抗体和所述第二抗体与人DR5上的不同表位结合。
37.根据权利要求33至36中任一项的药物组合物，其中所述第一抗体与人DR5的结合不阻断所述第二抗体与人DR5的结合。
38.根据权利要求33至37中任一项的药物组合物，其中所述第一抗体包含以下六个CDR序列，
a)(VH)SEQ ID NO:1、2、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6，并且所述第二抗体包含以下六个CDR序列，
b)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，或者其中所述第一抗体和所述第二抗体包含，
c)以上(a)或(b)中所定义的六个CDR序列，其分别在所述六个CDR序列中具有总共一至五个突变或取代。
39.根据权利要求33至37中任一项的药物组合物，其中所述第一抗体包含以下六个CDR序列，
a)(VH)SEQ ID NO:1、8、3和(VL)SEQ ID NO:5、FAS、6，并且所述第二抗体包含以下六个CDR序列，
b)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，或者其中所述第一抗体和所述第二抗体包含，
c)以上(a)或(b)中所定义的六个CDR序列，其分别在所述六个CDR序列中具有总共一至五个突变或取代。
40.根据权利要求33至37中任一项的药物组合物，其中所述第一抗体包含以下六个CDR序列，
a)(VH)SEQ ID NO:16、17、18和(VL)SEQ ID NO:21、GAS、6，并且所述第二抗体包含以下六个CDR序列，
b)(VH)SEQ ID NO:10、2、11和(VL)SEQ ID NO:13、RTS、14，或者其中所述第一抗体和所述第二抗体包含，
c)以上(a)或(b)中所定义的六个CDR序列，其分别在所述六个CDR序列中具有总共一至五个突变或取代。
41.根据权利要求33至40中任一项的药物组合物，其中所述第一抗体和所述第二抗体以1:49至49:1的摩尔比存在于所述组合物中，如约1:1摩尔比、约1:2摩尔比、约1:3摩尔比、约1:4摩尔比、约1:5摩尔比、约1:6摩尔比、约1:7摩尔比、约1:8摩尔比、约1:9摩尔比、约1:10摩尔比、约1:15摩尔比、约1:20摩尔比、约1:25摩尔比、约1:30摩尔比、约1:35摩尔比、约1:40摩尔比、约1:45摩尔比、约1:49摩尔比、约49:1摩尔比、约45:1摩尔比、约40:1摩尔比、约35:1摩尔比、约30:1摩尔比、约25:1摩尔比、约20:1摩尔比、约15:1摩尔比、约10:1摩尔比、约9:1摩尔比、约8:1摩尔比、约7:1摩尔比、约6:1摩尔比、约5:1摩尔比、约4:1摩尔比、约3:1摩尔比、约2:1摩尔比。
42.根据权利要求33至41中任一项的药物组合物，其中所述第一抗体和所述第二抗体以约1:9至9:1的摩尔比存在于所述组合物中。
43.根据权利要求33至42中任一项的药物组合物，其中所述第一抗体和所述第二抗体以约1:1的摩尔比存在于所述组合物中。
44.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其用作药物。
45.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述组合物包含一种或多种抗DR5抗体，其用于治疗传染病、自身免疫性疾病或心血管异常。
46.根据权利要求1至44中任一项的药物组合物，其中所述组合物包含一种或多种抗DR5抗体，其用于治疗实体瘤和/或血液学肿瘤。
47.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述组合物包含一种或多种抗DR5抗体，其用于治疗实体瘤，如结肠直肠癌，包括结肠直肠癌瘤(colorectal carcinoma)和结肠直肠腺癌，膀胱癌，骨肉瘤，软骨肉瘤，乳腺癌，包括三阴性乳腺癌，中枢神经系统的癌症，包括胶质母细胞瘤，星形细胞瘤，神经母细胞瘤，神经纤维肉瘤，神经内分泌肿瘤，宫颈癌，子宫内膜癌，胃癌，包括胃腺癌，头颈癌，肾癌，肝癌，包括肝细胞癌，肺癌，包括NSCLC和SCLC，卵巢癌，胰腺癌，包括胰腺导管癌和胰腺腺癌，肉瘤或皮肤癌，包括恶性黑色素瘤和非黑色素瘤皮肤癌。
48.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述组合物包含一种或多种抗DR5抗体，其用于治疗血液学肿瘤，如白血病，包括慢性淋巴细胞性白血病和髓样白血病，包括急性髓样白血病和慢性髓样白血病，淋巴瘤，包括非霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤，包括霍奇金淋巴瘤或包括骨髓增生异常综合征。
49.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述组合物包含一种或多种抗DR5抗体，其用于抑制表达DR5的肿瘤的生长。
50.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述组合物包含一种或多种抗DR5抗体，其用于诱导表达DR5的肿瘤中的凋亡。
51.根据前述权利要求中任一项的包含一种或多种抗DR5抗体的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
52.治疗患有癌症的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述组合物包含一种或多种抗DR5抗体。
53.根据权利要求52的方法，其进一步包括施用另外的治疗剂。
54.根据权利要求53的方法，其中所述另外的治疗剂是选自下组的一种或多种抗癌剂：化学治疗剂(包括但不限于紫杉醇、替莫唑胺(temozolomide)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、伊立替康(irinotecan)、多柔比星(doxorubicin)、吉西他滨(gemcitabine)、5-氟尿嘧啶、培美曲塞(pemetrexed))、激酶抑制剂(包括但不限于索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)或依维莫司(everolimus))、凋亡调控剂(包括但不限于重组人TRAIL或比利那潘(birinapant))、RAS抑制剂、蛋白酶体抑制剂(包括但不限于硼替佐米(bortezomib))、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(包括但不限于伏立诺他(vorinostat))、营养制品、细胞因子(包括但不限于IFN-γ))、抗体或抗体模拟物(包括但不限于抗EGFR、抗IGF-1R、抗VEGF、抗CD20、抗CD38、抗HER2、抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA4、抗CD40、抗CD137、抗GITR抗体和抗体模拟物)、抗体-药物缀合物。
55.试剂盒，其包含两种或更多种根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述组合物用于在疗法中同时、分开或相继使用。
56.根据权利要求55的试剂盒，其中所述组合物用于在疗法中同时使用，其中所述组合物在使用前立即混合。
57.用于制备根据权利要求33至43中任一项的药物组合物的方法，所述方法包括将包含如前述权利要求1-31的任一项中所定义的第一抗体的第一药物组合物与包含如前述权利要求1-31的任一项中所定义的第二抗体的第二药物组合物混合。
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