KR20200027944A - 돌연변이된 igg 육량체에 기초한 치료 항체 - Google Patents

돌연변이된 igg 육량체에 기초한 치료 항체 Download PDF

Info

Publication number
KR20200027944A
KR20200027944A KR1020207000017A KR20207000017A KR20200027944A KR 20200027944 A KR20200027944 A KR 20200027944A KR 1020207000017 A KR1020207000017 A KR 1020207000017A KR 20207000017 A KR20207000017 A KR 20207000017A KR 20200027944 A KR20200027944 A KR 20200027944A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
seq
pharmaceutical composition
region
igg1
Prior art date
Application number
KR1020207000017A
Other languages
English (en)
Inventor
메테 함부르크 옌센
레네 샨츠 할로우
앤드류 하가르만
케일 할블라이브
Original Assignee
젠맵 비. 브이
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 젠맵 비. 브이 filed Critical 젠맵 비. 브이
Publication of KR20200027944A publication Critical patent/KR20200027944A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 항체 제제에 관한 것이다. 본 발명은 특히 세포-표면 항원 결합 후에 IgG 분자의 클러스터링을 증진시키는 Fc 영역에서의 돌연변이를 갖는 IgG1 이소형의 항체 분자를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

Description

돌연변이된 IGG 육량체에 기초한 치료 항체
본 발명은 세포-표면 항원 결합 후에 IgG 항체의 육량체화를 증진시키는 Fc 영역에서의 돌연변이를 갖는 IgG 이소형의 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 제약 조성물을 제조하는 방법 및 이러한 조성물의 용도에 관한 것이다.
IgG 항체는 그의 표적 항원에 결합한 후 세포 표면 상에서 정렬된 육량체로 조직화될 수 있다. 이들 육량체는 보체의 제1 성분 C1에 결합하여 보체-의존성 표적 세포 사멸을 유도한다. 혈액 및 고형 종양 적응증으로부터의 세포 상의 일련의 표적에 대한 IgG 항체에 의한 육량체 형성 및 보체 활성화를 증진시키는 돌연변이가 확인되었다 (de Jong et al. 2016 PLoS Biol 14(1): e1002344, WO2013/004842, WO2014/108198). Fc 영역 내의 특정 위치에서 돌연변이를 갖는 IgG 백본, 예를 들어 IgG1은 세포주 및 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 환자 종양 세포의 조건부 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 유도하는 강력한 능력을 전달하는 한편, 정규 약동학 및 생물제약 개발가능성은 보유하였다. 돌연변이는 보체 활성화에 효과적이지 않은 유형 II CD20 항체의 CDC- 및 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 강력하게 증진시키는 한편, 아폽토시스를 유도하는 그의 능력은 유지시켰다 (de Jong, 상기 문헌).
사멸 수용체 5, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 10B, TNFRSF10B, TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드 수용체 2, TRAIL 수용체 2, TRAIL-R2 및 CD262로도 공지된 DR5는 종양 괴사 인자-관련 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL)에 결합하여 아폽토시스를 매개하는 TNF 수용체 슈퍼패밀리의 세포 표면 수용체이다. DR5는 3개의 세포외 시스테인-풍부 도메인 (CRD), 막횡단 도메인 (TM), 및 사멸 도메인 (DD)을 함유하는 세포질 도메인을 갖는 단일-통과 유형 I 막 단백질이다. 리간드의 부재 시에, DR5는 단량체로서 또는 2개 또는 3개 수용체의 사전-어셈블리된 복합체로서 프리-리간드 어셈블리 도메인 (PLAD)으로도 공지된 첫번째 시스테인-풍부 도메인의 상호작용을 통해 세포 막에 존재한다 (Wassenaar et al., Proteins. 2008 Feb 1;70(2):333-43; Valley et al., J Biol Chem. 2012 Jun 15;287(25):21265-78; Sessler et al., Pharmacol Ther. 2013 Nov;140(2):186-99). DR5 엑토도메인과의 복합체에서 TRAIL의 결정 구조는, TRAIL이 삼량체 수용체 및 삼량체 리간드를 함유하는 복합체에서 DR5의 세포외 도메인에 있는 CRD2 및 CRD3에 결합한다는 것을 보여준다 (Hymowitz et al., Mol Cell. 1999 Oct;4(4):563-71). DR5 삼량체는 소위 지질 뗏목인 지질 마크로도메인에서 고차원 수용체 응집체로 추가로 클러스터링될 수 있다 (Sessler et al., Pharmacol Ther. 2013 Nov;140(2):186-99). 리간드-결합된 형태에서, 세포질 사멸 도메인-함유 어댑터 단백질 FADD는 올리고머화된 DR5 분자의 세포내 DD 표면과 회합하고, 개시자 카스파제인 카스파제-8 및 카스파제-10과 맞물려서, 사멸-유도 신호전달 복합체 (DISC)를 형성한다.
TRAIL-매개된 아폽토시스에 대한 암 세포의 감수성에 기초하여, 암 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도하기 위해 상기 경로를 활성화시키는 수많은 작용제가 개발되었다. 인간 재조합 TRAIL (hrTRAIL)이 둘라네르민(dulanermin)으로 개발되었고, 일련의 통상적인 (단일특이적, 2가) 항-DR5 항체가 개발되어 임상 시험되었다 (Ashkenazi et al., Nat Rev Drug Discov. 2008 Dec;7(12):1001-12; Trivedi et al., Front Oncol. 2015 Apr 2;5:69에서 검토됨): DR5 항체에는 렉사투무맙 (HGS-ETR2), HGS-TR2J, 코나투무맙 (AMG655), 티가투주맙 (CS-1008), 드로지투맙 (아포맙) 및 LBY-135가 포함된다. 이들 화합물에 대한 임상 연구를 통해, DR5 항체가 전반적으로 널리 용인되지만 확실하고 유의한 임상적 이익을 나타내는 데는 실패하였음이 확인되었다. DR5 표적화 항체의 효능을 증진시키기 위한 노력은 주로 (i) 조합물 치료를 통해 DR5 효능제에 대한 암 세포의 감수성을 개선시키는 것, (ii) 보다 양호한 환자 계층화를 위한 바이오마커를 개발하는 것, 및 (iii) DR5 신호전달 및 아폽토시스-유도를 더욱 효과적으로 활성화시키는 DR5-표적화제를 개발하는 것에 주안을 둔다 (Lim et al., Expert Opin Ther Targets. 2015 May 25:1-15; Twomey et al., Drug Resist Updat. 2015 Mar;19:13-21; Reddy et al., PLoS One. 2015 Sep 17;10(9)에서 검토됨). DR5 활성화를 증가시키기 위한 상이한 치료 포맷이 기재되었고, 그에는 합성 DR5 결합 펩티드의 올리고머화, DR5-특이적 스캐폴드의 선형 융합, rhTRAIL 또는 코나투무맙의 나노입자-기반 전달 시스템, 및 다가 DR5 항체-기반 포맷이 포함된다 (Holland et al., Cytokine Growth Factor Rev. 2014 Apr;25(2):185-93에서 검토됨). 인간 IgG의 Fc 부분에 융합된 2개의 단일 쇄 TRAIL 수용체 결합 (scTRAIL-RBD) 분자 (TRAIL 모방체)인 APG880 및 유도체가 존재한다. 각각의 scTRAIL-RBD는 융합 단백질에서 6가 결합 방식을 유발하는 3개의 수용체 결합 부위를 갖는다 (WO 2010/003766 A2). 프로토타입 scTRAIL-RBD (APG350)는 생체내에서 FcγR-비의존성 항종양 효능을 유도하는 것으로 기재되었다 (Gieffers et al., Mol Cancer Ther, 2013. 12(12): p. 2735-47). 항-DR5 scFv 단편, 인간 혈청 알부민 잔기 및 인간 p53의 사량체화 도메인의 융합에 의해 어셈블리된 4가 항-DR5 항체 단편-유래된 구축물은 1가 구축물에 비해 아폽토시스를 더욱 강력하게 유도하는 것으로 확인되었다 (Liu et al., Biomed Pharmacother. 2015 Mar;70:41-5). 나노바디 분자는 낙타 중쇄-단독 항체로부터 유래된 단일 도메인 항체 단편 (VHH)이며, scFv와 유사하게, 연결되어 다가 분자를 형성할 수 있다. 임상전 시험관내 연구를 통해, 4가 항-DR5 나노바디(Nanobody)® 분자인 TAS266이 TRAIL 또는 가교된 DR5 항체 LBY-135에 비해 더욱 강력하였고, 더욱 신속한 카스파제 활성화 동역학에 기여한 것으로 확인되었다 (Huet et al., MAbs. 2014;6(6):1560-70). TAS266 또한 LBY-135의 모 뮤린 mAb에 비해 생체내에서 더욱 강력하였다. 멀티바디(MultYbody)™ 분자 (멀티맙(MultYmab) 기술)는 동종다량체화 펩티드가 IgG 이종이량체에 있는 1개의 중쇄의 Fc에 융합하는 것에 기초하며 (노브 인투 홀(knob into hole)), 이로써 멀티바디 분자가 용액 중에서 본질적으로 다가가 된다. 항-DR5 멀티바디는 시험관내에서 강력한 사멸을 유도하는 것으로 확인되었다. 이중-친화도 재표적화 (DART) 분자는 공유 연결된 Fv-기반 디아바디이다. 단일 (단일-에피토프 DART) 또는 2개의 DR5 에피토프 (이중-에피토프 DART)에 대해 4가를 포함하는 DR5 표적화 4가 Fc DART는 시험관내 및 생체내에서 세포독성의 유도에 있에서 TRAIL 및 코나투무맙 변이체에 비해 더욱 강력한 것으로 확인되었다 (Li et al., AACR Annual Meeting Apr 20 2015, Poster abstract #2464). 대안적으로, FcγR-비의존성 결합능-유도된 DR5 과다클러스터링은 암 세포 상의 DR5로의 및 종양 미세환경에서 섬유모세포를 발현하는 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP)로의 동시 결합을 통해 이중특이적 DR5xFAP 항체 (RG7386)에 의해 매개될 수 있다 (Friess et al., AACR Annual Meeting Apr 19 2015, Presentation abstract #952; Wartha et al., Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 2014 Apr 5-9; San Diego, CA. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2014;74(19 Suppl):Abstract nr 4573. doi:10.1158/1538-7445.AM2014-4573). 최종적으로, 상이한 에피토프를 인식하는 2가지 항-DR5 항체의 특이적 조합물은 중복되는 또는 유사한 에피토프를 인식하는 2가지 항-DR5 항체의 조합물에 비해 시험관내 및 생체내에서 증진된 효능작용성 효능을 나타내었다 (WO2014/009358).
상기 기재된 접근법들이 임상전 연구에서 통상적인 항-DR5 항체에 비해 증진된 효능을 나타내었지만, 임상 데이터는 DR5 효능제가 여전히 개발될 필요가 있음을 나타낸다. 더욱이, 항체-기반 포맷의 경우 일반 IgG의 약동학 (PK) 뿐만 아니라 다른 Fc-매개된 이펙터 기능을 보존하는 것이 바람직하며, 보통 항체 단편-기반 구축물의 경우에는 그렇지 않다.
본원에 참조로 포함되는 PCT/EP2016/079518은 인간 IgG의 Fc 영역 및 DR5에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 항-DR5 항체를 제공하며, 여기서 Fc 영역은 위치 E430, E345 또는 S440에 상응하는 아미노산 위치에서 돌연변이를 포함한다. 2차 가교와는 무관하게 세포-표면 항원 결합 시 항체의 육량체화 및 항원의 조건부 클러스터링을 용이하게 하는, 항-DR5 항체의 Fc 영역에서의 특이적 점 돌연변이의 도입이 DR5 활성화를 발생시키고 아폽토시스 및 세포 사멸의 유도에 있어서 항체의 능력을 유의하게 증진시키는 것으로 발견되었다.
PCT/EP2016/079518에 기재된 항체, 및 보다 일반적으로는, EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 위치 E430, E345 또는 S440에 상응하는 아미노산 위치에서의 돌연변이로 인해 (단 S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W임) 보다 용이하게 육량체화하는 항체에 대한 안정한 제제를 제공할 필요가 존재한다.
놀랍게도, 본 발명의 본 발명자들은 인간 IgG1의 위치 E430, E345 또는 S440에 상응하는 아미노산 위치에서의 돌연변이로 인해 (단 S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W임) 보다 용이하게 육량체화하는 변이체 항체에 대한 안정한 제제를 제공하는 조성물을 발견하였다. 그의 CDR 도메인에서 완전히 상이한 서열을 갖는 이러한 항체 중 2종은 둘 다 본 발명의 조성물에서 안정한 것으로 발견되었다.
제1 주요 측면에서, 본 발명은
a. 인간 이뮤노글로불린 G의 Fc 영역 및 항원 결합 영역을 포함하는 항체이며, 여기서 Fc 영역은 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430, E345 또는 S440에 상응하는 위치에서 아미노산의 돌연변이를 포함하는 것인 항체,
b. 히스티딘 완충제, 및
c. 염화나트륨
을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이며,
여기서 조성물의 pH는 5.5 내지 7.4이다.
본 발명의 한 실시양태에서 제1 및 제2 Fc 영역은 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 S440에 상응하는 위치에서 아미노산의 돌연변이를 포함하며, 단 S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W이다.
이러한 제제는 스트레스 조건, 예컨대 가열, 동결-해동 사이클 및 교반 하에 탁월한 항체 용해도 및 안정성을 제공하는 것으로 발견되었다. 거대분자 응집체 또는 다른 불순물 예컨대 분해 산물의 최소 형성이 관찰되었다.
추가 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 제약 조성물, 의약의 제조를 위한 본 발명의 제약 조성물의 용도 및 본 발명의 제약 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 2종 이상의 제약 조성물을 포함하는 키트 및 각각 상이한 항체를 포함하는 본 발명의 2종 이상의 제약 조성물을 혼합하는 단계를 포함하는 본 발명의 제약 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제약 조성물의 바람직한 실시양태에서, 항체는 인간 DR5에 결합하는 항원-결합 영역을 포함하며, 바람직하게는 항원 결합 영역은 하기 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함한다:
a) (VH) 서열식별번호(SEQ ID NO): 1, 2, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6;
b) (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6;
c) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14;
d) (VH) 서열식별번호: 16, 17, 18 및 (VL) 서열식별번호: 21, GAS, 22 또는
e) 상기 a) 내지 d) 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 (VH) CDR1, CDR2, CDR3 및 (VL) CDR1, CDR2 및 CDR3 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이 또는 치환을 갖는 상기 6개의 CDR.
DR5에 결합하고 인간 IgG1의 위치 E430, E345 또는 S440 (EU 넘버링에 따름)에 상응하는 Fc 영역에서 육량체화-증진 돌연변이 (단 S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440 W임)를 포함하는 이러한 항체는 상기 언급된 위치 중 하나에서 돌연변이를 갖지 않는 DR5에 결합하는 항체와 비교하여 DR5를 발현하는 종양 세포에서 아폽토시스를 유도하는데 뛰어난 것으로 발견되었다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 제1 항체 및 제2 항체를 포함한 적어도 2종의 항체를 포함하며, 여기서
Figure pct00001
상기 제1 항체는 하기 6개의 CDR 서열: (VH) 서열식별번호: 1, 2, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항체는 하기 6개의 CDR 서열, (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하거나, 또는
Figure pct00002
상기 제1 항체는 하기 6개의 CDR 서열: (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항체는 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 제1 항체 및 제2 항체를 포함한 적어도 2종의 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항체는 하기 6개의 CDR 서열: (VH) 서열식별번호: 1, 2, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항체는 하기 6개의 CDR 서열, (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 제1 항체 및 제2 항체를 포함한 적어도 2종의 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항체는 하기 6개의 CDR 서열: (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항체는 하기 6개의 CDR 서열, (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 제1 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항체는 하기 6개의 CDR 서열: (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 제2 항체를 포함하며, 여기서 상기 제2 항체는 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함한다.
DR5 상의 상이한 에피토프에 결합하는 2종의 항-DR5 항체를 포함하는 이러한 조성물은 시험관내 및 생체내 연구에서 돌연변이를 갖지 않는 동일한 항-DR5 항체를 포함하는 조성물보다 뛰어난 것으로 발견되었다. 즉, 본 발명의 2종의 항체를 갖는 조성물은 Fc 영역에서 돌연변이를 갖지 않는 2종의 DR5 항체를 포함하는 조성물과 비교하여 DR5를 발현하는 종양 세포의 아폽토시스를 유도하고/거나 세포 성장을 억제하는데 뛰어났다.
도 1은 4가지 상이한 인간 IgG1 Fc 동종이형의 아미노산 정렬을 도시한다. IgG1m(f), IgG1m(z), IgG1m(a), IgG1m(x)의 Fc 서열은 각각 서열식별번호: 29, 30, 31 및 32에 명시되어 있다.
도 2는 FACS 상에서 유동 세포측정법에 의해 측정되는 바와 같이 DR5-양성 HCT 116 인간 결장암 세포에 대한 인간화 (hDR5) 및 키메라 (DR5) 항-DR5 항체의 결합을 도시한다. 항-gp120 항체 IgG1-b12는 음성 대조군으로 사용되었다. 결합은 MFI (평균 형광 강도)로 표현된다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 3은 DR5-양성 COLO 205 세포에 대한 육량체화-증진 돌연변이 E430G 또는 E345K를 갖는 및 갖지 않는 항-DR5 항체의 결합을 도시한다. 인간-마우스 키메라 항체 IgG1-DR5-01-K409R (A), IgG1-DR5-05-F405L (B) 및 이중특이적 항체 IgG1-DR5-01-K409R x IgG1-DR5-05-F405L (BsAb IgG1-DR5-01-K409R x DR5-05-F405L) (C)의 변이체를 COLO 205 세포에 대한 결합에 대해 FACS 상에서 유동 세포측정 분석으로 시험하였다. 결합은 형광 강도의 기하 평균으로 표현된다. 항-gp120 항체 IgG1-b12는 음성 대조군으로 사용되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 4는 인간 및 레서스 원숭이 DR5에 대한 항-DR5 항체의 결합을 도시한다. 인간-마우스 키메라 항체 IgG1-DR5-01-K409R-E430G 및 IgG1-DR5-05-F405L-E430G는 (A) 모의-형질감염된 CHO 세포, (B) 인간 DR5-형질감염된 CHO 세포 및 (C) 레서스 마카크 DR5-형질감염된 CHO 세포에 대한 결합에 대해 FACS 상에서 유동 세포측정 분석으로 시험하였다. 결합은 형광 강도의 기하 평균으로 표현된다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 5는 (A) 엠보스 매처 (EMBOSS Matcher, http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_matcher/)를 이용하여 인간 DR5 및 마우스 DR5의 세포외 도메인의 일부의 서열 정렬을 도시한다; (.) 유사한 아미노산; (:) 동일한 아미노산. (B) 도메인-스와핑된 DR5 세포외 도메인의 그래프 표시 (백색: 인간 DR5 서열; 흑색: 마우스 DR5 서열). 아미노산 번호는 인간 서열에 대한 것이고, 도메인 스와핑은 패널 A에 도시된 정렬을 기준으로 이루어졌다. (C) 유동 세포측정법에 의해 평가된, 인간-마우스 키메라 DR5 분자의 패널에 대한 IgG1-hDR5-01-F405L 및 이소형 대조군 항체 IgG1-b12의 결합. 각각의 도메인-스와핑된 DR5 분자에서, x-축 상에 표시된 바와 같이 특이적 인간 아미노산이 마우스 서열로 교체되었다. 오차 막대는 이중 샘플의 표준 편차를 나타낸다. (D) 유동 세포측정법에 의해 평가된, 인간-마우스 키메라 DR5 분자의 패널에 대한 IgG1-hDR5-05-F405L의 결합. 각각의 도메인-스와핑된 DR5 분자에서, x-축 상에 표시된 바와 같이 특이적 인간 아미노산이 마우스 서열로 교체되었다. IgG1-b12는 이소형 대조군 항체에 포함되었다. 오차 막대는 이중 샘플의 표준 편차를 나타낸다.
도 6은 DR5-01 및 DR5-05 항체에 대한 교차차단 ELISA를 도시한다. 그래프는 ELISA에 의해 측정되는 바와 같이 경쟁 항체 IgG1-hDR5-01-E430G 또는 IgG1-hDR5-05-E430G의 존재 하에 가용성 DR5ECD-FcHisC태그에 대한 코팅된 IgG1-hDR5-01-E430G (A) 또는 IgG1-hDR5-05-E430G (B)의 결합의 억제를 도시한다. 항-gp120 항체 IgG1-b12 (b12)는 음성 대조군으로 사용되었다. DR5-01은 IgG1-hDR5-01-E430G이고, DR5-05는 IgG1-hDR5-05-E430G이다.
도 7은 DR5-01 및 DR5-05 항체의 변이체에 대한 생존율 검정을 도시한다. E430G 육량체화-증진 돌연변이의 도입으로 인해, 단일 인간-마우스 키메라 항체 IgG1-DR5-01-K409R 및 IgG1-DR5-05-F405L을 단독으로 및 이들의 조합물로 사용함으로써 DR5-양성 COLO 205 (A) 및 HCT 116 (B) 결장암 세포의 사멸의 유도가 증진되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 8은 (A) IgG1-chTRA8-F405L과 각각 IgG1-DR5-01-K409R 또는 IgG1-DR5-05-F405L 사이의 교차차단 ELISA를 도시한다. 3-일 생존율 검정에 의해 결정되는 바와 같이, 2가지 비-교차차단 항-DR5 항체 IgG1-chTRA8-F405L-E430G 및 IgG1-DR5-01-K409R-E430G의 조합물은 HCT 116 결장암 세포의 사멸의 유도를 증진시킨 반면에 (B) (감소된 EC50), 2가지 교차차단 항체 IgG1-chTRA8-F405L-E430G 및 IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물은 그렇지 않았다 (C). 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 9는 육량체화-증진 돌연변이의 도입이 비-교차차단 항체의 조합물 IgG1-DR5-05-F405L-E345K + IgG1-CONA-K409R-E430G 및 BsAb IgG1-DR5-05-F405L-E345K x CONA-K409R-E430G에 의한 HCT 116 결장암 세포의 사멸의 유도를 증진시킴을 도시한다. (A) IgG1-CONA-K409R 및 IgG1-DR5-05-F405L에 대한 교차차단 ELISA. (B) 3-일 생존율 검정. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. RLU: 상대 발광 단위.
도 10은 3-일 생존율 검정에 의해 결정되는 바와 같이 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물이 상이한 인간 암 세포주의 대형 패널의 생존율을 감소시킴을 도시한다. 그래프는 이중 샘플로부터의 평균 +/- 표준 편차를 도시한다. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001 (터키(Tukey) 다중 비교 검정에 의한 일원 ANOVA).
도 11은 BxPC-3 및 PANC-1 췌장암 세포주에 대한 생존율 검정에서 측정되는 바와 같이 인간화 IgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430G 항체의 조합물 및 키메라 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G 항체의 조합물의 효능을 도시한다. 그래프는 이중 (BxPC-3) 또는 삼중 (PANC-1) 샘플의 평균 값 +/- 표준 편차를 도시한다.
도 12는 (A) HCT 116 인간 결장암 세포에 대한 결합에 대해 인간화 항체 IgG1-hDR5-01-K409R 및 IgG1-hDR5-05-F405L에서의 탈아미드화를 모방하는 효과를 연구하기 위한 FACS 분석을 이용하는 유동 세포측정 분석을 도시한다. Asn 탈아미드화-모방 돌연변이 N55D의 도입은 IgG1-hDR5-01-K409R의 결합을 감소시켰지만, IgG1-hDR5-05-F405L의 결합에 대해서는 최소의 효과를 가졌다. (B) HCT 116 인간 결장암 세포에 대한 결합에 대해 인간화 항체 DR5-01에서의 탈아미드화를 방지하는 효과를 연구하기 위한 유동 세포측정 분석. IgG1-hDR5-01-E430G에서 아미노산 치환 G56T의 도입은 HCT 116 세포에 대한 항체의 결합에 대해 효과가 없었다. 결합은 형광 강도의 기하 평균으로 표현된다. (C) BxPC-3 췌장암 세포에 대한 생존율 검정에서 측정되는 인간화 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 조합물의 효능. 그래프는 이중 샘플의 평균 값 +/- 표준 편차를 나타낸다.
도 13은 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G의 반발성 및 상보성 변이체에 대한 생존율 검정을 도시한다. 항체 둘 다에서 동일한 반발성 돌연변이 (K439E 또는 S440K)의 도입은 BxPC-3 췌장암 세포 (A) 및 HCT-15 결장암 세포 (B)의 사멸의 유도를 감소시켰다. 항체 둘 다에서 2가지 돌연변이 (K439E 및 S440K)를 조합함으로써, 반발성이 중화되고, 사멸이 복구된다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 14: 육량체화-증진 돌연변이를 갖는 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G가 세포 표면 상에서 수용체 클러스터링을 유도하고 아폽토시스를 유도하는 능력에 있어서 Fc 상호작용의 관여. 아폽토시스의 유도는 BxPC-3 인간 암 세포에 대한 3-일 생존율 검정에서 도시된 바와 같이 Fc-결합 펩티드 DCAWHLGELVWCT에 의해 개시된다.
도 15는 3-일 생존율 검정에 의해 결정되는 바와 같이 부착성 BxPC-3 인간 암 세포에 대한 IgG1-DR5-01-K409R-E430G 및 IgG1-DR5-05-F405L-E430G (DR5-01:DR5-05)의 상이한 비의 조합물의 효능을 도시한다.
도 16은 3-일 생존율 검정에 의해 결정되는 바와 같이 부착성 BxPC-3 (A) 및 HCT-15 (B) 인간 암 세포에 대한 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G (DR5-01:DR5-05)의 상이한 비의 조합물의 효능을 도시한다.
도 17은 PANC-1 (A 및 B) 및 BxPC-3 (C) 췌장암 세포에 대한 생존율 검정에서 측정되는 바와 같이 인간화 IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G 항체의 조합물에 의한 카스파제 의존성 프로그램화된 세포 사멸을 도시한다. 01-E430G는 IgG1-hDR5-01-E430G이고, 05-E430G는 IgG1-hDR5-05-E430G이고, ZVAD는 범-카스파제 억제제 Z-Val-Ala-DL-Asp-플루오로메틸케톤 (Z-VAD-FMK)이다.
도 18은 COLO 205 결장암 세포에 대한 항-DR5 항체 또는 항-DR5 항체 조합물의 결합 시 세포 사멸 유도를 도시한다. COLO 205 세포를 5시간 동안 (A-C) 및 24시간 동안 (D-E) 항체 샘플과 함께 인큐베이션하였다. 세포 사멸 유도의 상이한 단계를 아넥신(Annexin) V/PI 이중 염색 및 활성 카스파제-3 염색에 의해 분석하였다. 패널 C 및 D는 각각 5 및 24시간째의 아넥신 V/PI 이중 염색을 도시한다. 오차 막대는 2가지 이중 샘플의 표준 편차를 나타낸다. 01은 IgG1-DR5-01-K409R이고, 05는 IgG1-DR5-05-F405L이고, 01-E430G는 IgG1-DR5-01-K409R-E430G이고, 05-E430G는 IgG1-DR5-05-F405L-E430G이다.
도 19는 COLO 205 결장암 세포에 대한 DR5 항체의 결합 시 카스파제-3/7 활성화의 동역학을 도시한다. COLO 205 세포를 1, 2, 5 및 24시간 동안 항체와 함께 인큐베이션하였다. 카스파제-3/7 활성화를 균질 발광 검정으로 분석하였다. AU, 임의 단위. 오차 막대는 이중 샘플의 표준 편차를 나타낸다.
도 20은 부착성 COLO 205 결장암 및 BxPC-3 및 PANC-1 췌장암 세포에 대한 3-일 생존율 검정에서 항-인간 IgG 항체의 F(ab')2 단편에 의한 Fc 가교의 존재 또는 부재 하에 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물의 효능 및 항-DR5 항체 IgG1-DR5-CONA 및 IgG1-DR5-chTRA8-F405L과의 비교를 도시한다. 비-표적 결합 항체 IgG1-b12는 음성 대조군으로서 포함되었다. 그래프는 이중 샘플로부터의 평균 +/- 표준 편차를 도시한다. * p<0.05, **p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001 (다중 비교를 위해 본페로니(Bonferroni) 사후 검정에 의한 일원 ANOVA).
도 21은 BxPC-3 췌장암 세포에 대한 생존율 검정에 의해 측정되는 바와 같이 인간화 IgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430G 항체의 조합물 및 인간화 IgG1-DR5-01-E430G + IgG1-DR5-05-E430G 항체의 조합물의 효능을 도시한다. 그래프는 이중 샘플의 평균 값 +/- 표준 편차를 나타낸다.
도 22는 COLO 205 결장암, BxPC-3 췌장암, SNU-5 위암, SK-MES-1 폐암, 및 A375 피부암 세포주로부터의 부착성 세포에 대한 3-일 생존율 검정에서 결정되는, 상이한 인간 암 세포주에 대한 키메라 BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G 항체의 효능을 도시한다. 그래프는 이중 샘플로부터의 평균 +/- 표준 편차를 도시한다. * p<0.05, *** p<0.001, **** p<0.0001 (다중 비교를 위해 본페로니 사후 검정에 의한 일원 ANOVA). (01x05)-E430G는 BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G이다.
도 23은 부착성 BxPC-3 췌장암 세포 및 COLO 205 결장암 세포에 대한 3-일 생존율 검정에서 항-인간 IgG 항체의 F(ab')2 단편에 의한 Fc 가교의 존재 또는 부재 하에 키메라 BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G의 효능을 항-DR5 항체 IgG1-DR5-CONA 및 IgG1-DR5-chTRA8-F405L과 비교하여 도시한다. 비-표적 결합 항체 IgG1-b12는 음성 대조군으로서 포함되었다. 그래프는 이중 샘플로부터의 평균 +/- 표준 편차를 도시한다. * p<0.05, **p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001 (다중 비교를 위해 본페로니 사후 검정에 의한 일원 ANOVA). (01x05)-E430G는 BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x IgG1-DR5-05-F405L-E430G이다.
도 24는 COLO 205 결장암 세포에 대한 이중특이적 DR5 항체의 결합 시 세포 사멸 유도를 도시한다. COLO 205 세포를 5시간 동안 (A-C) 및 24시간 동안 (D-E) 1 μg/mL 항체와 함께 인큐베이션하였다. 세포 사멸 유도의 상이한 단계를 아넥신 V/PI 이중 염색 및 활성 카스파제-3 염색에 의해 분석하였다. 오차 막대는 2가지 이중 샘플의 표준 편차를 나타낸다. 01은 IgG1-DR5-01-K409R이고, 05는 IgG1-DR5-05-F405L이고, 01-E430G는 IgG1-DR5-01-K409R-E430G이고, 05-E430G는 IgG1-DR5-05-F405L-E430G이고, 01x05는 BsAb IgG1-DR5-01-K409R x DR5-05-F405L이고, 01-E430G x 05-E430G는 BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G이다.
도 25는 COLO 205 인간 결장암 세포를 갖는 피하 이종이식 모델에서 키메라 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G 항체의 조합물의 생체내 효능의 평가를 도시한다. 지정된 항체 (5 mg/kg)로 처리된 마우스에서 종양 크기 (평균 & SEM)를 시간에 걸쳐 (A) 및 제23일에 (B) 도시한다. (C)에서는 750 mm3보다 작은 종양 크기를 갖는 마우스의 백분율을 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 플롯으로 도시한다.
도 26은 피하 COLO 205 결장암 이종이식에서 상이한 용량의 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G 항체 조합물의 생체내 효능의 평가 및 IgG1-CONA와의 비교를 도시한다. 지정된 항체 용량으로 처리된 마우스에서 종양 크기 (평균 & SEM)를 시간에 걸쳐 (A) 및 제16일에 (B) 도시한다. (C)에서는 500 mm3보다 작은 종양 크기를 갖는 마우스의 백분율을 카플란-마이어 플롯으로 도시한다. * p<0.05, *** p<0.001.
도 27은 BxPC-3 인간 췌장암 세포를 갖는 피하 이종이식 모델에서 상이한 용량의 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G 항체 조합물의 생체내 효능의 평가 및 IgG1-CONA-F405L과의 비교를 도시한다. 지정된 항체로 처리된 마우스에서 종양 크기를 시간에 걸쳐 (A, 중앙 종양 크기) 및 종양 접종 후 제48일에 (B, 평균 종양 크기 & SEM) 도시한다. * p<0.05, ** p<0.01 (독립표본 t-검정). (C)에서는 500 mm3보다 작은 종양 크기를 갖는 마우스의 백분율을 카플란-마이어 플롯으로 도시한다.
도 28은 A375 인간 피부암 세포를 갖는 피하 이종이식 모델에서 상이한 용량의 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G 항체 조합물의 생체내 효능의 평가 및 IgG1-CONA-F405L과의 비교를 도시한다. 지정된 항체로 처리된 마우스에서 종양 크기를 시간에 걸쳐 (A, 중앙 종양 크기) 및 종양 접종 후 제29일에 (B, 평균 종양 크기 & SEM) 도시한다. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 (만 휘트니(Mann Whitney) 검정).
도 29는 HCT-15 인간 결장암 세포를 갖는 피하 이종이식 모델에서 상이한 용량의 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G 항체 조합물의 생체내 효능의 평가 및 IgG1-CONA와의 비교를 도시한다. 지정된 항체로 처리된 마우스에서 종양 크기 (평균 & SEM)를 시간에 걸쳐 (A) 및 치료 시작 후 제17일에 (B) 도시한다. **** p<0.001 (독립표본 t 검정). (C)에서는 500 mm3보다 작은 종양 크기를 갖는 마우스의 백분율을 카플란-마이어 플롯으로 도시한다.
도 30은 SW480 인간 결장암 세포를 갖는 피하 이종이식 모델에서 상이한 용량의 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G 항체 조합물의 생체내 효능의 평가 및 IgG1-CONA와의 비교를 도시한다. 지정된 항체로 처리된 마우스에서 종양 크기 (평균 & SEM)를 시간에 걸쳐 (A) 및 치료 시작 후 제28일에 (B) 도시한다. * p<0.05, ** p<0.01 (독립표본 t-검정). (C)에서는 500 mm3보다 작은 종양 크기를 갖는 마우스의 백분율을 카플란-마이어 플롯으로 도시한다.
도 31은 SNU-5 인간 위암 세포를 갖는 피하 이종이식 모델에서 상이한 용량의 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G 항체 조합물의 생체내 효능의 평가 및 IgG1-CONA와의 비교를 도시한다. 지정된 항체로 처리된 마우스에서 종양 크기 (평균 & SEM)를 시간에 걸쳐 (A) 및 치료 시작 후 제23일에 (B) 도시한다. ** p<0.01, *** p<0.001 (만 휘트니 검정). (C)에서는 500 mm3보다 작은 종양 크기를 갖는 마우스의 백분율을 카플란-마이어 플롯으로 도시한다.
도 32는 SK-MES-1 인간 폐암 세포를 갖는 피하 이종이식 모델에서 상이한 용량의 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G 항체 조합물의 생체내 효능의 평가 및 IgG1-CONA와의 비교를 도시한다. 지정된 항체로 처리된 마우스에서 종양 크기 (평균 & SEM)를 시간에 걸쳐 (A) 및 치료 시작 후 제14일에 (B) 도시한다. (C)에서는 1.000 mm3보다 작은 종양 크기를 갖는 마우스의 백분율을 카플란-마이어 플롯으로 도시한다.
도 33은 유동 세포측정법에 의해 측정되는 바와 같이 E430G 돌연변이를 갖는 및 갖지 않는 항-DR5 항체 IgG1-hDR5-01-G56T 및 IgG1-hDR5-05에 의한 DR5-양성 HCT 116 인간 결장암 세포에 대한 결합을 도시한다. 항-gp120 항체 IgG1-b12는 음성 대조군으로서 사용되었다. 결합은 기하 평균 형광 강도 (FI)로서 표현된다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 7회 실험의 대표적인 예를 도시한다.
도 34는 직접적으로 표지된 항체에 대한 유동 세포측정법에 의해 측정되는 바와 같이 항-DR5 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G에 의한 DR5-양성 HCT 116 인간 결장암 세포에 대한 결합을 도시한다. 결합은 기하 평균 알렉사(Alexa) 647 형광 강도 (FI)로서 표현된다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 35는 인간 및 시노몰구스 원숭이 DR5에 대한 항-DR5 항체의 결합을 도시한다. 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G를 (A) 인간 DR5-형질감염된 CHO 세포 및 (B) 시노몰구스 DR5-형질감염된 CHO 세포에 대한 결합에 대해 유동 세포측정법에 의해 시험하였다. 결합은 형광 강도의 기하 평균 (FI)으로 표현된다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 36은 COLO 205 결장암 세포에 대해 비-교차차단 항체 IgG1-hDR5-01-G56T 및 IgG1-hDR5-05에서 E430G 돌연변이를 도입하는 효과를 도시하기 위한 3-일 생존율 검정을 도시한다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 4회 실험의 대표적인 예를 도시한다.
도 37은 COLO 205 인간 결장암 세포에 대한 DR5 항체에 의한 생존율 검정을 도시한다. 육량체화-증진 돌연변이 S440Y의 도입은 단일 항체 IgG1-hDR5-01-G56T 및 IgG1-hDR5-05에 의한 사멸의 유도 (A) 및 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05의 증가된 효능 (B)을 유발하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 38은 BxPC-3 인간 췌장암 세포의 사멸을 유도하기 위한 비-교차차단 항체 IgG1-DR5-CONA-E430G + IgG1-DR5-chTRA8-E430G의 효능을 도시한다. (A) IgG1-DR5-CONA-K409R (CONA)과 IgG1-DR5-chTRA8-F405L (chTRA8) 사이의 교차차단 ELISA. (B) E430G 육량체화-증진 돌연변이의 도입은 3-일 생존율 검정에서 결정되는 바와 같이 IgG1-DR5-CONA-C49W-E430G + IgG1-DR5-chTRA8-E430G의 조합물에 의한 BxPC-3 세포의 사멸의 유도를 증진시켰다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 39는 상이한 인간 암 세포주에 대한 133 nM의 인간 재조합 TRAIL 또는 133 nM의 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G (E430G) 및 IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05 (WT)에 의한 3-일 생존율 검정을 도시한다. 그래프는 이중 샘플로부터의 평균 +/- 표준 편차를 도시한다. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001 (터키 다중 비교 검정에 의한 일원 ANOVA).
도 40은 영국 호리즌에서 세포주 패널의 3-일 생존율 검정 스크리닝으로 결정되는 바와 같이 (A) 항체 (IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+ IgG1-hDR5-05-E430G) 및 (B) TRAIL 요법에 의한 억제 백분율을 도시한다. 각각의 데이터 점은 지정된 인간 암을 표시하는 개별 세포주를 나타낸다. 점선은 반응자 (≥ 70% 억제) 및 비-반응자 (< 70% 억제)로서 세포주를 분류하기 위해 설정된 70% 최대 반응 역치 값을 나타낸다.
도 41은 3-일 생존율 검정으로 결정되는 바와 같이 부착성 인간 (A) BxPC-3 췌장암 세포 및 (B) HCT-15 결장암 세포에 대한 상이한 항체 비의 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G (01-E430G:05-E430G로 표시함)의 효능을 도시한다. HCT-15 및 BxPC-3에 대해 각각 2회 및 3회 실험의 대표적인 예를 도시한다.
도 42는 BxPC-3 췌장암 세포에 대한 생존율 검정으로 측정되는 바와 같이 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G 항체의 조합물, E430G 돌연변이를 갖지 않는 모 WT 조합물, 및 TRAIL에 의한 카스파제 의존성 프로그램화된 세포 사멸을 도시한다. ZVAD는 범-카스파제 억제제 Z-Val-Ala-DL-Asp-플루오로메틸케톤 (Z-VAD-FMK)이다.
도 43은 BxPC-3 췌장암 세포에 대한 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 결합 시 카스파제-3/7 활성화의 동역학을 E430G 돌연변이를 갖지 않는 모 WT 조합물, 및 TRAIL과 비교하여 도시한다. BxPC-3 세포는 1, 2, 4 및 6시간 동안 항체와 함께 인큐베이션하였다. 카스파제-3/7 활성화를 균질 발광 검정으로 분석하였다. RLU, 상대 발광 단위. 4회 실험의 대표적인 예를 도시한다.
도 44는 부착성 HCT-15 인간 결장암 세포 및 BxPC-3 췌장암 세포에 대한 3-일 생존율 검정에서 항-인간 IgG 항체의 F(ab')2 단편에 의한 Fc 가교의 존재 또는 부재 하에 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 조합물의 효능 및 항-DR5 항체 IgG1-DR5-CONA 및 WT 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05와의 비교를 도시한다. 비-표적 결합 항체 IgG1-b12는 음성 대조군으로서 포함되었다. 그래프는 이중 샘플로부터의 평균 +/- 표준 편차를 도시한다. 세포주 둘 다의 경우, 2회 실험의 대표적인 예를 도시한다.
도 45는 인간 (A, C) 또는 시노몰구스 DR5 (B, D)로 형질감염된 CHO 세포에 대한 표적 세포 결합 시 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G의 보체 활성화 유도의 분석을 도시한다. (A-B) 20% 풀링된 정상 인간 혈청의 존재 하에 항체 농도 시리즈에 의한 시험관내 CDC 검정. CDC 효능은 아이오딘화프로피듐 (PI)-양성 세포 백분율에 의해 결정되는 용해 백분율로서 제시된다. (C-D) C5-고갈된 혈청의 존재 하에 항체 결합 시 보체 활성화 생성물의 침착은 형광 강도의 기하 평균으로 표시된다. HIV gp120에 대한 IgG1-b12 mAb는 비-결합 이소형 대조군 항체로서 사용되었다.
도 46은 5가지 상이한 결장암 세포주에 대한 생존율 검정으로 결정되는 바와 같이 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G와 상이한 치료제의 조합 효과를 도시한다. 상이한 치료제 부류로부터의 100종의 화합물의 상승작용 스크린으로부터 5가지 예를 도시한다.
도 47은 COLO 205 인간 결장암 세포를 갖는 피하 이종이식 모델에서 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G 둘 다 단일 작용제로서 및 조합물로서의 생체내 효능의 평가를 E430G 돌연변이를 갖지 않는 모 항체와 비교하여 도시한다. (A) 지정된 항체 (0.5 mg/kg)로 처리된 마우스에서 종양 크기 (평균 & SEM)를 시간에 따라 도시함. (B) 종양 부피 >500 mm3에서 컷오프 설정을 갖는, 종양 진행의 카플란-마이어 플롯.
도 48은 HCT15 인간 결장암 세포를 갖는 피하 이종이식 모델에서 육량체화-증진 돌연변이 E430G를 갖는 및 갖지 않는 항-DR5 항체 농도 IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05의 생체내 효능의 평가를 도시한다. 0.5 mg/kg 항체로 처리된 마우스에서 종양 크기 (평균 & SEM)를 시간에 걸쳐 (A) 및 치료 시작 후 제21일에 (B) 도시한다. **P < 0.0011 (만 휘트니 검정). (C)에서는 750 mm3보다 작은 종양 크기를 갖는 마우스의 백분율을 카플란-마이어 플롯으로 도시한다.
도 49는 SK-MES-1 인간 폐암 세포를 갖는 피하 이종이식 모델에서 15 mg/kg 파클리탁셀과 조합된 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-430G 항체의 조합물의 생체내 효능의 평가를 도시한다. (A) 지정된 화합물로 처리된 마우스에서 종양 크기 (평균 & SEM)를 시간에 걸쳐 도시한다. (B) 제16일에 처리 그룹에 대한 종양 부피. (C) 500 mm3보다 작은 종양 크기를 갖는 마우스의 백분율을 카플란-마이어 플롯으로 도시한다.
도 50은 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G, IgG1-hDR5-05-E430G 또는 두 항체의 조합물 1 mg/kg을 i.v.로 투여한 SCID 마우스에서 클리어런스율을 E430G 돌연변이를 갖지 않는 모 WT 항체와 비교하여 도시한다. (A) 혈청 샘플 중 총 인간 IgG를 ELISA에 의해 결정하여, 농도 대 시간 곡선으로 플롯팅하였다. 각각의 데이터 점은 4개의 연속 희석된 샘플의 평균 +/- 표준 편차를 나타낸다. (B) 항체 투여 후 제21일까지의 클리어런스를 식 D*1.000/AUC (D, 주사된 용량, 및 AUC, 농도-시간 곡선의 곡선하 면적)에 따라 결정하였다.
도 51은 부착된 COLO 205 인간 결장암 세포에 대한 DR5 항체 IgG1-DR5-CONA 및 IgG1-DR5-CONA-E430G에 의한 생존율 검정을 도시한다. 육량체화-증진 돌연변이 E430G의 도입은 사멸을 유도하였다. 데이터는 항체없이 인큐베이션한 샘플 (사멸 없음) 및 스타우로스포린과 함께 인큐베이션한 샘플 (최대 사멸)에 대한 발광으로부터 계산된 % 생존 세포로서 제시된다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
본 발명의 실시양태를 기재하는데 있어서, 명확성을 위해 특정한 용어가 사용될 것이다. 그러나, 본 발명은 그렇게 선택된 특정한 용어로 제한되는 것으로 의도되지 않고, 각각의 특정한 용어가 유사한 목적을 달성하기 위해 유사한 방식으로 작동하는 모든 기술적 등가물을 포함하는 것으로 이해한다.
정의
본원에 사용된 용어 "이뮤노글로불린"은 2쌍의 폴리펩티드 쇄 (한쌍의 저분자량 경쇄 (L) 및 한쌍의 중쇄 (H), 모든 4개의 쇄는 디술피드 결합에 의해 강력하게 상호 연결됨)로 이루어진 구조적으로 관련된 당단백질의 부류를 지칭한다. 이뮤노글로불린의 구조는 널리 특징분석되어 있다. 예를 들어, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))를 참조한다. 간략히, 각각의 중쇄는 전형적으로 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. IgG 항체의 중쇄 불변 영역은 전형적으로 3개의 도메인, CH1, CH2, 및 CH3으로 구성된다. 중쇄는 소위 "힌지 영역"에서 디술피드 결합을 통해 상호 연결된다. 각각의 경쇄는 전형적으로 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 전형적으로 1개의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로도 지칭되는 더욱 보존된 영역들 사이에 삽입된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 지칭되는 초가변성인 영역 (또는 구조적으로 한정된 루프의 서열 및/또는 형태에서 초가변성일 수 있는 초가변 영역)으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노-말단에서부터 카르복시-말단으로 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다 (또한 Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901 917 (1987) 참조). 달리 명시되지 않거나 문맥상 모순되지 않는 한, 본원의 CDR 서열은 IMGT 규칙에 따라 확인된다 (Brochet X., Nucl Acids Res. 2008;36:W503-508 및 Lefranc MP., Nucleic Acids Research 1999;27:209-212; 또한 인터넷 http 주소 http://www.imgt.org/ 참조). 달리 명시되지 않거나 문맥상 모순되지 않는 한, 본 발명에서 불변 영역의 아미노산 위치에 대한 지칭은 EU-넘버링에 따른 것이다 (Edelman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May;63(1):78-85; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. 1991 NIH Publication No. 91-3242).
본원에 사용된 용어 "힌지 영역"은 이뮤노글로불린 중쇄의 힌지 영역을 지칭하기 위해 의도된다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 힌지 영역은 EU 넘버링에 따라 아미노산 216-230에 상응한다.
본원에 사용된 용어 "CH2 영역" 또는 "CH2 도메인"은 이뮤노글로불린 중쇄의 CH2 영역을 지칭하기 위해 의도된다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH2 영역은 EU 넘버링에 따라 아미노산 231-340에 상응한다. 그러나, CH2 영역은 또한 본원에 기재된 다른 이소형 또는 동종이형 중 임의의 것일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "CH3 영역" 또는 "CH3 도메인"은 이뮤노글로불린 중쇄의 CH3 영역을 지칭하기 위해 의도된다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH3 영역은 EU 넘버링에 따라 아미노산 341-447에 상응한다. 그러나, CH3 영역은 또한 본원에 기재된 다른 이소형 또는 동종이형 중 임의의 것일 수 있다.
용어 "단편 결정화가능한 영역", "Fc 영역", "Fc 단편" 또는 "Fc 도메인"은 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있고, 아미노-말단에서부터 카르복시-말단으로 배열된 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 적어도 포함하는 항체 영역을 지칭한다. IgG1 항체의 Fc 영역은 예를 들어 파파인에 의한 IgG1 항체의 소화에 의해 생성될 수 있다. 항체의 Fc 영역은 면역계의 다양한 세포 (예컨대, 이펙터 세포) 및 보체계의 성분, 예컨대 C1q (보체 활성화의 고전적인 경로에서 첫번째 성분)를 비롯한 숙주 조직 또는 인자로 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 발명의 문맥에서 용어 "Fab 단편"은 이뮤노글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역, 뿐만 아니라 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 CH1 영역을 포함하는, 이뮤노글로불린 분자의 단편을 지칭한다. "CH1 영역"은 예를 들어 EU 넘버링에 따라 아미노산 118-215에 상응하는 인간 IgG1 항체의 영역을 지칭한다. 따라서, Fab 단편은 이뮤노글로불린의 결합 영역을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항체" (Ab)는 이뮤노글로불린 분자, 이뮤노글로불린 분자의 단편, 또는 이들의 유도체를 지칭한다. 본 발명의 항체는 이뮤노글로불린의 Fc-영역 및 항원-결합 영역을 포함한다. Fc 영역은 일반적으로 2개의 CH2-CH3 영역 및 연결 영역, 예를 들어 힌지 영역을 함유한다. 이뮤노글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 또한, 달리 명시되지 않거나 문맥상 모순되지 않는 한, 폴리클로날 항체, 올리고클로날 항체, 모노클로날 항체 (예컨대, 인간 모노클로날 항체), 항체 혼합물, 재조합 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체를 지칭한다. 생성된 항체는 잠재적으로 임의의 부류 또는 이소형을 가질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이, 삽입 또는 결실). 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 그라프팅된 항체는 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항체"는 쇄 유형 둘 다, 즉, 중쇄 및 경쇄가 항체 조작의 결과로서 키메라인 항체를 지칭한다. 키메라 쇄는 인간 기원의 불변 영역에 연결된 외인성 가변 도메인 (비-인간 종으로부터 기원하거나, 또는 인간을 비롯한 임의의 종으로부터 합성되거나 조작됨)을 함유하는 쇄이다.
본원에 사용된 용어 "인간화 항체"는 쇄 유형 둘 다가 항체 조작의 결과로서 인간화된 것인 항체를 지칭한다. 인간화 쇄는 전형적으로 가변 도메인의 상보성 결정 영역 (CDR)이 외인성 (인간 이외의 종으로부터 기원하거나, 또는 합성됨)인 반면에, 나머지 쇄는 인간 기원의 것인 쇄이다. 인간화 평가는 이용된 그라프팅 이외의 프로토콜을 가능하게 하는 방법 자체가 아니라 생성된 아미노산 서열을 기준으로 한다.
본원에 사용된 용어 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩된 이뮤노글로불린 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA1, IgA2, IgE, 또는 IgM)를 지칭한다. 정규 항체를 생성하기 위해, 각각의 중쇄 이소형을 카파 (κ) 또는 람다 (λ) 경쇄와 조합해야 한다.
본원에 사용된 용어 "동종이형"은 동일한 종에서 1가지 이소형 부류 내에서의 아미노산 변형을 지칭한다. 항체 이소형의 우세한 동종이형은 개별 인종에 따라 다르다. 중쇄의 IgG1 이소형 내에서의 공지된 동종이형 변형은 도 1에 도시된 바와 같이 항체 프레임에서 4개 아미노산 치환을 생성한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열식별번호: 29에 정의된 바와 같은 IgG1m(f) 동종이형을 갖는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 30에 정의된 바와 같은 IgG1m(z) 동종이형, 서열식별번호: 31에 정의된 바와 같은 IgG1m(a) 동종이형, 서열식별번호: 32에 정의된 바와 같은 IgG1m(x) 동종이형, 또는 임의의 동종이형 조합, 예컨대 IgG1m(z,a), IgG1m(z,a,x), IgG1m(f,a)을 갖는다 (de lange Exp Clin Immunogenet. 1989;6(1):7-17).
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체", "모노클로날 Ab", "모노클로날 항체 조성물", "mAb" 등은 단일 분자 조성을 갖는 Ab 분자의 제조물을 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 Ab를 지칭한다. 인간 mAb는 기능적 인간 항체를 생성하도록 재배열되고 불멸화 세포에 융합된, 인간 중쇄 트랜스진 레파토리 및 인간 경쇄 트랜스진 레파토리를 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 비-인간 동물, 예컨대 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 인간 mAb는 재조합에 의해 생성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체 모방체"는 항체와 마찬가지로 특이적으로 항원과 결합하지만, 항체와 구조적으로 관련이 없는 화합물을 지칭한다. 이들은 보통 인공 펩티드, 단백질, 핵산 또는 소분자이다.
용어 "이중특이적 항체"는 적어도 2개의 상이한, 전형적으로 중복되지 않는 에피토프에 대해 특이성을 갖는 항체를 지칭한다. 이러한 에피토프는 동일한 또는 상이한 표적 상에 있을 수 있다. Fc 영역을 포함하는 이중특이적 항체의 상이한 부류의 예에는 비대칭 이중특이적 분자, 예를 들어 상보성 CH3 도메인을 갖는 IgG-유사 분자, 및 대칭 이중특이적 분자, 예를 들어 재조합 IgG-유사 이중 표적화 분자가 포함되나 이에 제한되지는 않고, 여기서 상기 분자 각각의 항원-결합 영역은 적어도 2개의 상이한 에피토프에서 결합한다.
이중특이적 분자의 예에는 트리오맙(Triomab)® (트리온 파마(Trion Pharma)/프레세니우스 바이오텍(Fresenius Biotech), WO/2002/020039), 노브-인투-홀(Knobs-into-Holes) (제넨텍(Genentech), WO9850431), 크로스맙(CrossMAb) (로쉐(Roche), WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253), 정전기적으로 매칭된 Fc-이종이량체 분자 (암젠(Amgen), EP1870459 및 WO2009089004; 츄가이(Chugai), US201000155133; 온코메드(Oncomed), WO2010129304), LUZ-Y (제넨텍), DIG-바디, PIG-바디 및 TIG-바디 (파맙신(Pharmabcine)), 스트랜드 익스체인지 엔지니어드 도메인 바디(Strand Exchange Engineered domain body, SEEDbody) (이엠디 세로노(EMD Serono), WO2007110205), 이중특이적 IgG1 및 IgG2 (화이자(Pfizer)/리나트(Rinat), WO11143545), 아지메트릭 스캐폴드(Azymetric scaffold) (자임웍스(Zymeworks)/머크(Merck), WO2012058768), mAb-Fv (젠코어(Xencor), WO2011028952), XmAb (젠코어), 2가 이중특이적 항체 (로쉐, WO2009/080254), 이중특이적 IgG (일라이 릴리(Eli Lilly)), 듀오바디(DuoBody)® 분자 (젠맵 에이/에스(Genmab A/S), WO 2011/131746), 듀엣맙(DuetMab) (메드이뮨(MedImmune), US2014/0348839), 비클로닉스(Biclonics) (메루스(Merus), WO 2013/157953), 노브이뮨(NovImmune) (κλ바디즈(κλBodies), WO 2012/023053), FcΔAdp (리제너론(Regeneron), WO 2010/151792), (DT)-Ig (GSK/도만티스(Domantis)), 투인원(Two-in-one) 항체 또는 듀얼 액션 Fab(Dual Action Fab) (제넨텍, 아디맙(Adimab)), mAb2 (F-Star(에프-스타), WO2008003116), 자이바디즈(Zybodies)™ (진제니아(Zyngenia)), 코브엑스-바디(CovX-body) (코브엑스(CovX)/화이자), 피노맙(FynomAb) (코바겐(Covagen)/얀센 시래그(Janssen Cilag)), 듀타맙(DutaMab) (듀탈리스(Dutalys)/로쉐), iMab (메드이뮨), 이중 가변 도메인 (Dual Variable Domain, DVD)-Ig™ (애보트(Abbott), US 7,612,18), 이중 도메인 이중 헤드 항체 (유니레버(Unilever); 사노피 아벤티스(Sanofi Aventis), WO20100226923), Ts2Ab (메드이뮨/AZ), BsAb (자이모제네틱스(Zymogenetics)), 허큘레스(HERCULES) (바이오겐 이덱(Biogen Idec), US007951918), scFv-융합 (제넨텍/로쉐, 노바티스(Novartis), 이뮤노메딕스(Immunomedics), 창저우 아담 바이오텍 인크(Changzhou Adam Biotech Inc), CN 102250246), TvAb (로쉐, WO2012025525, WO2012025530), ScFv/Fc 융합, 스콜피온(SCORPION) (이머전트 바이오솔루션즈(Emergent BioSolutions)/트루바이온(Trubion), 자이모제네틱스/BMS), 인터셉터(Interceptor) (이머전트), 이중 친화도 재표적화 기술 (Dual Affinity Retargeting Technology, Fc-DART™) (마크로제닉스((MacroGenics), WO2008/157379, WO2010/080538), BEAT (글렌마크(Glenmark)), 다이-디아바디(Di-Diabody) (임클론(Imclone)/일라이 릴리) 및 화학적으로 가교된 mAb (카르마노스 캔서 센터(Karmanos Cancer Center)), 및 공유적으로 융합된 mAb (아임 테러퓨틱스(AIMM therapeutics))가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "전장 항체"는 해당 부류 또는 이소형의 야생형 항체에서 정상적으로 발견되는 것들에 상응하는 모든 중쇄 및 경쇄 불변 및 가변 도메인을 함유하는 항체 (예를 들어, 모 항체 또는 변이체 항체)를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "올리고머"는 적어도 원칙적으로 개수에 제한이 없는 단량체로 구성된 중합체와는 대조적으로 1개 초과이지만 개수가 제한된 단량체 단위 (예를 들어, 항체)로 구성된 분자를 지칭한다. 예시적인 올리고머는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 및 육량체이다. 올리고머에서 단량체 단위의 개수를 표기하기 위해 그리스어 접두사가 종종 사용되며, 예를 들어 사량체는 4개의 단위로 구성되고, 육량체는 6개의 단위로 구성된다. 마찬가지로, 본원에 사용된 용어 "올리고머화"는 분자를 한정된 중합 정도로 전환시키는 공정을 지칭하는 것으로 의도된다. 여기서, 본 발명에 따른 표적-결합 영역을 포함하는 항체 및/또는 다른 이량체 단백질은 예를 들어 세포 표면에서 표적 결합 후 Fc-영역의 비공유 회합을 통해 올리고머, 예컨대 육량체를 형성할 수 있는 것으로 관찰되었다.
본원에 사용된 용어 "항원-결합 영역", "항원 결합 영역", "결합 영역" 또는 항원 결합 도메인은 항원에 결합할 수 있는 항체의 영역을 지칭한다. 이 결합 영역은 전형적으로 프레임워크 영역 (FR)으로도 지칭되는 더욱 보존된 영역들 사이에 삽입된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 지칭되는 초가변성인 영역 (또는 구조적으로 한정된 루프의 서열 및/또는 형태에서 초가변성일 수 있는 초가변 영역)로 추가로 세분될 수 있는 항체의 VH 및 VL 도메인에 의해 한정된다. 항원은 예를 들어 세포, 박테리아 또는 비리온 상에 또는 용액 중에 존재하는 임의의 분자, 예컨대 폴리펩티드일 수 있다. 문맥상 모순되지 않는 한, 용어 "항원" 및 "표적"은 본 발명의 문맥에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "표적"은 항체의 항원 결합 영역이 결합하는 분자를 지칭한다. 표적은 상승된 항체가 향하는 임의의 항원을 포함한다. 용어 "항원" 및 "표적"은 항체와 관련하여 상호교환적으로 사용될 수 있고, 본 발명의 임의의 측면 또는 실시양태와 관련하여 동일한 의미 및 목적을 구성할 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 의미한다. 에피토프는 보통 빌딩 블록, 예컨대 아미노산, 당 측쇄 또는 이들의 조합물의 표면 그룹으로 구성되며, 보통 특이적인 3차원의 구조적 특징, 뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 갖는다. 구조적 및 비-구조적 에피토프는, 변성 용매의 존재 하에 전자에 대한 결합은 손실되지만 후자에 대한 결합은 손실되지 않는다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에 직접 관여하는 아미노산 잔기 및 결합에 직접 관여하지 않는 다른 아미노산 잔기, 예컨대 특이적 항원 결합 펩티드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기 (달리 말하면, 상기 아미노산 잔기는 특이적 항원 결합 펩티드의 풋프린트 내에 있음)를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "결합"은, 예를 들어 리간드로서 항원 및 피분석물로서 항체를 사용하거나 또는 그 반대로 사용하여 비아코어(BIAcore) 3000 장비에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술에 의해 결정할 때, 전형적으로 약 10-6 M 이하, 예를 들어 10-7 M 이하, 예컨대 약 10-8 M 이하, 예컨대 약 10-9 M 이하, 약 10-10 M 이하, 또는 약 10-11 M 또는 심지어 그 보다 작은 KD에 상응하는 결합 친화도로 항체가 미리 결정된 항원 또는 표적에 결합하고, 미리 결정된 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 비-특이적 항원 (예를 들어, BSA, 카세인)에 대한 그의 결합 친화도에 비해 적어도 10배 적은, 예컨대 적어도 100배 적은, 예를 들어 적어도 1,000배 적은, 예컨대 적어도 10,000배 적은, 예를 들어 적어도 100,000배 적은 KD에 상응하는 친화도로 미리 결정된 항원에 결합하는 것을 지칭한다. 친화도가 낮은 정도는 항체의 KD에 의존하며, 따라서 항체의 KD가 매우 낮으면 (즉, 항체가 매우 특이적이면), 항원에 대한 친화도가 비-특이적 항원에 대한 친화도에 비해 낮은 정도가 적어도 10,000배일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "KD" (M)는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭하고, kd를 ka로 나눔으로써 수득된다.
본원에 사용된 용어 "kd" (sec- 1)는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. 상기 값은 koff 값 또는 오프-속도로도 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "ka" (M-1 x sec- 1)는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합 속도 상수를 지칭한다. 상기 값은 kon 값 또는 온-속도로도 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "KA" (M- 1)는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합 평형 상수를 지칭하고, ka를 kd로 나눔으로써 수득된다.
본원에 사용된 용어 "친화도"는 단일 부위에서, 예컨대 항체의 개별 항원 결합 부위와 항원의 1가 결합에서, 한 분자, 예를 들어 항체가 또 다른 것, 예를 들어 표적 또는 항원에 결합하는 강도이다.
본원에 사용된 용어 "결합능"은 표적과 동시에 상호작용하는 2개의 구조체 사이에서, 예컨대 항체의 다중 항원 결합 부위들 사이에서, 다중 결합 부위들의 조합된 강도를 지칭한다. 1종 초과의 결합 상호작용이 존재하는 경우, 2개의 구조체는 모든 결합 부위가 해리될 때에만 해리될 것이고, 따라서 해리 속도는 개별 결합 부위에 대한 것보다 느릴 것이고, 이로써 개별 결합 부위의 결합 강도 (친화도)보다 더 큰 효과적인 총 결합 강도 (결합능)가 제공될 것이다.
본원에 사용된 용어 "육량체화 증진 돌연변이"는 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430, E345 또는 S440에 상응하는 아미노산 위치에서의 돌연변이를 지칭하며, 단 S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W이다. 육량체화 증진 돌연변이는 세포 표면 표적에 결합된 이웃 IgG 항체들 사이의 Fc-Fc 상호작용을 강화시켜, 표적-결합된 항체의 육량체 형성을 증진시키는 반면에, 항체 분자는 WO2013/004842; WO2014/108198에 기재된 바와 같이 용액 중에서 단량체로 유지된다.
본원에 사용된 용어 "클러스터링"은 비-공유 상호작용을 통한 항체, 폴리펩티드, 항원 또는 다른 단백질의 올리고머화를 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "반발성 돌연변이" 또는 "자체-반발성 돌연변이" 또는 "육량체화-억제 돌연변이"는 Fc-Fc 계면에서 아미노산들 사이의 전하 반발을 일으켜서, 2개의 인접한 Fc 영역 함유 폴리펩티드 사이의 Fc-Fc 상호작용을 약화시켜 육량체화를 억제할 수 있는 인간 IgG1의 아미노산 위치의 돌연변이를 지칭한다. 인간 IgG1에서 이러한 반발성 돌연변이의 예는 K439E 및 S440K이다. 반발성 돌연변이의 위치에서 2개의 인접한 Fc 영역 함유 폴리펩티드 사이의 Fc-Fc 상호작용에서의 반발성은 제1 돌연변이를 보유한 위치와 상호작용하는 아미노산 위치에서 제2 돌연변이 (상보성 돌연변이)의 도입에 의해 중화될 수 있다. 상기 제2 돌연변이는 동일한 항체에 또는 제2 항체에 존재할 수 있다. 제1 및 제2 돌연변이의 조합은 반발성을 중화시키고 Fc-Fc 상호작용을 복구시켜 육량체화를 일으킨다. 이러한 제1 및 제2 돌연변이의 예는 K439E (반발성 돌연변이) 및 S440K (K439E에 의한 반발성 중화), 및 그 반대로 S440K (반발성 돌연변이) 및 K439E (S440K에 의한 반발성 중화)이다.
본원에 사용된 용어 "상보성 돌연변이"는, 2개의 인접한 Fc 영역-함유 폴리펩티드에서 2가지 돌연변이의 조합으로 인해, 바람직하게는 상보성 돌연변이를 함유하는 Fc 영역-함유 폴리펩티드와 상호작용하는 인접한 Fc 영역 함유 폴리펩티드에서의 제1 돌연변이와 관련이 있는 Fc 영역-함유 폴리펩티드에서 아미노산 위치의 돌연변이를 지칭한다. 상보성 돌연변이 및 관련된 제1 돌연변이는 동일한 항체에 (분자내) 또는 제2 항체에 (분자간) 존재할 수 있다. 분자내 상보성 돌연변이의 예는 WO 2011/131746에 따른 이중특이적 항체에서 우선적인 이종이량체화를 매개하는 K409R 및 F405L 조합이다. 2개의 인접한 Fc 영역 함유 폴리펩티드 사이의 반발을 중화시키고 Fc-Fc 상호작용을 복구하여 육량체화를 일으키는 K439E 및 S440K 돌연변이의 조합은 분자간 및 분자내 둘 다에 적용될 수 있는 상보성 돌연변이의 예이다.
본원에 사용된 용어 "아폽토시스"는 세포에서 일어날 수 있는 프로그램화된 세포 사멸 (PCD)의 공정을 지칭한다. 생화학적 사건은 특징적인 세포 변화 (형태학) 및 사멸을 유도한다. 이들 변화에는 기포 형성, 세포 수축, 포스파티딜세린 노출, 미토콘드리아 기능 감소, 핵 단편화, 크로마틴 압축, 카스파제 활성화, 및 염색체 DNA 단편화가 포함된다. 특정한 실시양태에서, 1종 이상의 효능작용성 항-DR5 항체에 의한 아폽토시스는 예를 들어 실시예 19, 20, 25 및 45에 기재된 카스파제-3/7 활성화 검정 또는 실시예 19 및 25에 기재된 포스파티딜세린 노출과 같은 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 예를 들어 1 μg/mL의 고정된 농도의 항-DR5 항체를 부착성 세포에 첨가하여 1 내지 24시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 카스파제-3/7 활성화는 이 목적을 위한 특정한 키트, 예컨대 비디 파밍겐(BD Pharmingen)의 PE 활성 카스파제-3 아폽토시스 키트 (Cat nr 550914) (실시예 19 및 25) 또는 프로메가(Promega)의 카스파제-글로(Caspase-Glo) 3/7 검정 (Cat nr G8091) (실시예 20 및 45)을 이용하여 결정할 수 있다. 포스파티딜세린 노출 및 세포 사멸은 이 목적을 위한 특정한 키트, 예컨대 비디 파밍겐으로부터의 FITC 아넥신 V 아폽토시스 검출 키트 I (Cat nr 556547) (실시예 19 및 25)을 이용하여 결정할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "프로그램화된 세포-사멸" 또는 "PCD"는 세포내 신호전달, 예를 들어 아폽토시스, 자기소모 또는 네크롭토시스에 의해 매개되는 임의의 형태의 세포 사멸을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "아넥신 V"는 세포 표면 상의 포스파티딜세린 (PS)과 결합하는 아넥신 기를 갖는 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "카스파제 활성화"는 개시자 카스파제에 의해 이펙터 카스파제의 비활성 전구 형태를 분할하는 것을 지칭하며, 이로써 상기 형태는 이펙터 카스파제로 전환되고, 이는 세포 내의 단백질 기질을 절단하여 아폽토시스를 촉발시킨다.
본원에 사용된 용어 "카스파제 의존성 프로그램화된 세포 사멸"은 카스파제에 의해 매개되는 임의의 형태의 프로그램화된 세포 사멸을 지칭한다. 특정한 실시양태에서, 1종 이상의 효능작용성 항-DR5 항체에 의한 카스파제 의존성 프로그램화된 세포 사멸은 실시예 18 및 44에 기재된 바와 같이 범-카스파제 억제제 Z-Val-Ala-DL-Asp-플루오로메틸케톤 (Z-VAD-FMK)의 존재 및 부재 하에 세포 배양물의 생존율을 비교함으로써 결정할 수 있다. 범-카스파제 억제제 Z-VAD-FMK (5 μM 최종 농도)를 96-웰 편평 바닥 플레이트에 있는 부착성 세포에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 다음으로, 항체 농도 일련의 희석물 (예를 들어, 5배 희석으로 20,000 ng/mL에서 출발하여 0.05 ng/mL 최종 농도까지)을 첨가하고, 37℃에서 3일 동안 인큐베이션할 수 있다. 세포 생존율은 이 목적을 위한 특정한 키트, 예컨대 프로메가의 셀타이터-글로(CellTiter-Glo) 발광 세포 생존율 검정 (Cat nr G7571)을 이용하여 정량화할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "세포 생존율"은 대사 활성 세포의 존재를 지칭한다. 특정한 실시양태에서, 1종 이상의 효능작용성 항-DR5 항체와 함께 인큐베이션한 후의 세포 생존율은 실시예 8-18, 21-24, 38-44, 46 및 48에 기재된 바와 같이 세포에 존재하는 ATP를 정량화함으로써 결정할 수 있다. 항체 농도 일련의 희석물 (예를 들어, 5배 희석으로 20,000 ng/mL에서 출발하여 0.05 ng/mL 최종 농도까지)을 96-웰 편평 바닥 플레이트에 있는 세포에 첨가할 수 있고, 배지를 음성 대조군으로서 사용할 수 있고, 5 μM 스타우로스포린을 세포 사멸의 유도를 위한 양성 대조군으로서 사용할 수 있다. 인큐베이션 3일 후, 세포 생존율은 이 목적을 위한 특정한 키트, 예컨대 프로메가의 셀타이터-글로 발광 세포 생존율 검정 (Cat nr G7571)을 이용하여 정량화할 수 있다. 생존 세포 백분율은 하기 식을 이용하여 계산할 수 있다: % 생존 세포 = [(항체 샘플의 발광 - 스타우로스포린 샘플의 발광)/(항체가 없는 샘플의 발광 - 스타우로스포린 샘플의 발광)]*100.
본원에 사용된 용어 "DR5"는 CD262 및 TRAILR2로도 공지된 사멸 수용체 5를 지칭하고, 이는 3개의 세포외 시스테인-풍부 도메인 (CRD), 막횡단 도메인 (TM), 및 사멸 도메인 (DD)을 함유하는 세포질 도메인을 갖는 일회 통과 유형 I 막 단백질이다. 인간에서, DR5 단백질은 서열식별번호: 46에 도시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된다 (인간 DR5 단백질: 유니프롯KB(UniprotKB)/스위스프롯(Swissprot) O14763).
본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있는 용어 "DR5에 결합하는 항체", "항-DR5 항체", "DR5-결합 항체", "DR5-특이적 항체", "DR5 항체"는 DR5의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합하는 임의의 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "효능제"는 DR5에 결합 시 세포에서 반응을 촉발시킬 수 있는 항-DR5 항체와 같은 분자를 지칭하며, 여기서 상기 반응은 프로그램화된 세포 사멸일 수 있다. 항-DR5 항체가 효능작용성이라는 것은, 항-DR5가 DR5에 결합한 결과로서 상기 항체가 DR5를 자극하거나, 활성화시키거나, 클러스터링하는 것으로 이해되어야 한다. 즉, DR5에 결합된 본 발명에 따른 Fc 영역에서의 아미노산 돌연변이를 포함하는 효능작용성 항-DR5 항체는 TRAIL이 DR5에 결합함에 따라 동일한 세포내 신호전달 경로의 DR5 자극, 클러스터링 또는 활성화를 유발한다. 특정한 실시양태에서, 1종 이상의 항체의 효능작용성 활성은 표적 세포를 3일 동안 항체 농도 일련의 희석물 (예를 들어, 5배 희석으로 20,000 ng/mL에서 출발하여 0.05 ng/mL 최종 농도로)과 함께 인큐베이션함으로써 결정할 수 있다. 세포를 시딩할 때 항체를 직접 첨가할 수 있거나 (실시예 8, 9, 10, 39에 기재된 바와 같이), 또는 대안적으로 항체 샘플을 첨가하기 전에 먼저 세포를 96-웰 편평 바닥 플레이트에 부착되도록 한다 (실시예 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21, 22, 23, 24, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 48에 기재된 바와 같이). 효능작용성 활성, 즉, 효능작용성 효과는 이 목적을 위한 특정한 키트, 예컨대 프로메가의 셀타이터-글로 발광 세포 생존율 검정 (Cat nr G7571)을 이용하여 생존 세포의 양을 측정함으로써 정량화할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "DR5 양성" 및 "DR5 발현"은 예를 들어 유동 세포측정법 또는 면역조직화학을 이용하여 측정될 수 있는 DR5-특이적 항체의 결합을 나타내는 조직 또는 세포주를 지칭한다.
본 발명의 "변이체" 또는 "항체 변이체"는 "모" 항체와 비교 시 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 항체 분자이다. 예시적인 모 항체 형태에는 야생형 항체, 전장 항체 또는 Fc-함유 항체 단편, 이중특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 이들의 임의의 조합이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
예시적인 돌연변이에는 모 아미노산 서열에서 아미노산의 결실, 삽입 및 치환이 포함된다. 아미노산 치환은 야생형 단백질에 존재하는 원래의 아미노산을 또 다른 천연-발생 아미노산 또는 비-천연-발생 아미노산 유도체로 교체할 수 있다. 아미노산 치환은 보존적 또는 비보존적일 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 보존적 치환은 하기 3개의 표 중 하나 이상에 반영된 아미노산 부류 내에서의 치환으로 정의될 수 있다:
보존적 치환을 위한 아미노산 잔기 부류
Figure pct00003
대안적인 보존적 아미노산 잔기 치환 부류
Figure pct00004
아미노산 잔기의 대안적인 물리적 및 기능적 분류
Figure pct00005
본 발명의 문맥에서, 변이체에서의 치환은 다음과 같이 나타낸다:
원래의 아미노산 - 위치 - 치환된 아미노산;
아미노산 잔기를 나타내기 위해 코드 Xaa 및 X를 비롯한 3개 문자 코드 또는 1개 문자 코드가 사용된다. 따라서, 표기 "E345R" 또는 "Glu345Arg"는, 변이체가 모 항체의 위치 345 아미노산에 상응하는 변이체 아미노산 위치에서 글루탐산의 아르기닌으로의 치환을 포함함을 의미한다. 이러한 위치가 항체에 존재하지 않는 경우, 변이체는 예를 들어 위치 - 치환된 아미노산으로 나타내는 아미노산의 삽입을 포함하고, 예를 들어 표기 "448E"가 사용된다. 이러한 표기는 일련의 상동성 폴리펩티드 또는 항체에서의 변형(들)과 특정한 관련이 있다. 유사하게, 치환 아미노산 잔기(들)의 실체가 없는 경우에는, 원래의 아미노산 - 위치; 또는 "E345"로 나타낸다. 원래의 아미노산(들) 및/또는 치환된 아미노산(들)이 모두는 아니지만 1개 초과의 아미노산(들)을 포함할 수 있는 변형의 경우, 위치 345에서 글루탐산의 아르기닌, 리신 또는 트립토판으로의 치환: "Glu345Arg,Lys,Trp" 또는 "E345R,K,W" 또는 "E345R/K/W" 또는 "E345에서 R, K 또는 W"는 본 발명의 문맥에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 추가로, 용어 "치환"은 다른 19개의 천연 아미노산 중 임의의 하나로의 치환 또는 비천연 아미노산과 같은 다른 아미노산으로의 치환을 포괄한다. 예를 들어, 위치 345에서 아미노산 E의 치환은 하기 각각의 치환을 포함한다: 345A, 345C, 345D, 345G, 345H, 345F, 345I, 345K, 345L, 345M, 345N, 345Q, 345R, 345S, 345T, 345V, 345W, 및 345Y. 이는 명칭 345X와 동등한 것이고, 여기서 X는 임의의 아미노산을 표기한다. 이들 치환은 또한 E345A, E345C 등, 또는 E345A,C,등, 또는 E345A/C/등으로 표기될 수 있다. 이러한 치환 중 임의의 하나를 본원에 구체적으로 포함시키기 위해, 본원에 언급된 각각의 모든 위치에 동일하게 적용된다.
본 발명의 목적을 위해, 2개의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성은 엠보스 팩키지 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), 바람직하게는 버전 5.0.0 또는 후속 버전의 니들(Needle) 프로그램에서 시행된 바와 같이 니들만-운쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)을 이용하여 결정된다. 사용된 파라미터는 10의 갭 개시 패널티, 0.5의 갭 확장 패널티, 및 EBLOSUM62 (BLOSUM62의 엠보스 버전) 치환 매트릭스이다. 니들 표지된 "최장 동일성" (-노브리프 옵션(-nobrief option)을 이용하여 수득됨)의 산출은 % 동일성으로서 사용되고, 다음과 같이 계산된다:
(동일한 잔기 x 100)/(정렬의 길이 - 정렬에서 갭의 총 개수).
본 발명의 목적을 위해, 2개의 데옥시리보뉴클레오티드 서열 사이의 서열 동일성은 엠보스 팩키지 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et a/., 2000, supra), 바람직하게는 버전 5.0.0 또는 후속 버전의 니들 프로그램에서 시행된 바와 같이 니들만-운쉬 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, supra)을 이용하여 결정된다. 사용된 파라미터는 10의 갭 개시 패널티, 0.5의 갭 확장 패널티, 및 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 엠보스 버전) 치환 매트릭스이다. 니들 표지된 "최장 동일성" (-노브리프 옵션을 이용하여 수득됨)의 산출은 % 동일성으로서 사용되고, 다음과 같이 계산된다:
(동일한 데옥시리보뉴클레오티드 x 100)/(정렬의 길이 - 정렬에서 갭의 총 개수).
CDR 변이체의 서열은, 대부분 보존적, 물리적 또는 기능적 아미노산 치환을 통해, 항체 결합 영역의 6개의 CDR 서열에 걸쳐 보존적, 물리적 또는 기능적 아미노산으로부터 선택된 최대 총 5개의 돌연변이 또는 치환, 예컨대 항체 결합 영역의 6개의 CDR 서열에 걸쳐 보존적, 물리적 또는 기능적 아미노산으로부터 선택된 최대 총 4개의 돌연변이 또는 치환, 예컨대 보존적, 물리적 또는 기능적 아미노산으로부터 선택된 최대 3개의 돌연변이 또는 치환, 예컨대 보존적, 물리적 또는 기능적 아미노산 또는 치환으로부터 선택된 최대 2개의 돌연변이, 예컨대 보존적, 물리적 또는 기능적 아미노산으로부터 선택된 최대 1개의 돌연변이 또는 치환이 모 항체 서열의 CDR 서열과 상이할 수 있다. 보존적, 물리적 또는 기능적 아미노산은 20개의 천연 발견 아미노산, 즉, Arg (R), His (H), Lys (K), Asp (D), Glu (E), Ser (S), Thr (T), Asn (N), Gln (Q), Cys (C), Gly (G), Pro (P), Ala (A), Ile (I), Leu (L), Met (M), Phe (F), Trp (W), Tyr (Y) 및 Val (V)로부터 선택된다.
CDR 변이체의 서열은, 대부분 보존적, 물리적 또는 기능적 아미노산 치환을 통해 모 항체 서열의 CDR의 서열과 다를 수 있으며, 예를 들어 변이체에서의 치환 중 적어도 약 75%, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상 (예를 들어, 약 75-95%, 예컨대 약 92%, 93% 또는 94%)이 보존적, 물리적 또는 기능적 아미노산 잔기 대체로부터 선택된 돌연변이 또는 치환이다. 보존적, 물리적 또는 기능적 아미노산은 20개의 천연 발견 아미노산, 즉, Arg (R), His (H), Lys (K), Asp (D), Glu (E), Ser (S), Thr (T), Asn (N), Gln (Q), Cys (C), Gly (G), Pro (P), Ala (A), Ile (I), Leu (L), Met (M), Phe (F), Trp (W), Tyr (Y) 및 Val (V)로부터 선택된다.
또 다른 서열에서의 아미노산 또는 절편에 "상응하는" 한 서열에서의 아미노산 또는 절편은, 표준 서열 정렬 프로그램, 예컨대 ALIGN, ClustalW 또는 전형적으로 디폴트 설정에서 유사한 것을 사용하여 다른 아미노산 또는 절편에 대해 정렬시킨 것이다. 따라서, 표준 서열 정렬 프로그램은, 예를 들어 이뮤노글로불린 서열에서의 아미노산이 예를 들어 인간 IgG1에서의 특이적 아미노산에 상응함을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 추가로, 표준 서열 정렬 프로그램은 서열 동일성, 예를 들어 서열식별번호: 29에 대한 적어도 80%, 또는 85%, 90%, 또는 적어도 95%의 서열 동일성을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 1에 도시된 서열 정렬은 IgG1 Fc 서열의 또 다른 동종이형에서의 특정한 아미노산에 상응하는 한 IgG1 동종이형의 Fc 영역에서의 임의의 아미노산을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 벡터에 라이게이션된 핵산 절편의 전사를 유도할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이며, 이는 원형 이중 가닥 DNA 루프의 형태를 갖는다. 벡터의 또 다른 유형은 바이러스 벡터이며, 핵산 절편이 바이러스 게놈에 라이게이션될 수 있다. 특정한 벡터는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제될 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터, 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터 (예컨대, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포에 도입 시 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 이로써 숙주 게놈을 따라 복제된다. 더욱이, 특정한 벡터는 그들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히 "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용성을 갖는 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태를 갖는다. 플라스미드가 가장 흔히 사용되는 벡터의 형태이기 때문에, 본 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 이러한 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터 (예컨대, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함하는 것으로 의도되며, 이들은 등가물 기능으로 작용한다.
본원에 사용된 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포")는 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 용어가 특정한 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 지칭하는 것으로 의도됨을 이해해야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 특정한 변형이 후세대에서 발생할 수 있기 때문에, 그러한 자손이 모세포와 실제로 동일하지 않을 수 있지만, 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위 내에는 여전히 포함된다. 재조합 숙주 세포에는 예를 들어 트랜스펙토마, 예컨대 CHO-S 세포, CHO DG44 세포, HEK-293F 세포, Expi293F 세포, PER.C6, NS0 세포, 및 림프구 세포, 및 원핵 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 및 다른 진핵 숙주, 예컨대 식물 세포 및 진균, 뿐만 아니라 원핵 세포, 예컨대 이. 콜라이가 포함된다.
본 발명의 구체적 실시양태
상기 기재된 바와 같이, 제1 주요 측면에서, 본 발명은
a. 인간 이뮤노글로불린 G의 Fc 영역 및 항원 결합 영역을 포함하는 항체이며, 여기서 Fc 영역은 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430, E345 또는 S440에 상응하는 위치에서 아미노산의 돌연변이를 포함하는 것인 항체,
b. 히스티딘 완충제, 및
c. 염화나트륨
을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이며,
여기서 조성물의 pH는 5.5 내지 7.4이다.
한 실시양태에서 본 발명은
a. 인간 이뮤노글로불린 G의 Fc 영역 및 항원 결합 영역을 포함하는 항체이며, 여기서 Fc 영역은 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430, E345 또는 S440에 상응하는 위치에서 아미노산의 돌연변이를 포함하고, 단 S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W인 항체,
b. 히스티딘 완충제, 및
c. 염화나트륨
을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이며,
여기서 조성물의 pH는 5.5 내지 7.4이다.
본 발명의 제약 조성물은 전형적으로 액체 수용액이다.
본 발명의 제약 조성물의 한 실시양태에서, 조성물은 5 mM 내지 100 mM 히스티딘, 예를 들어 5 mM 내지 75 mM, 예컨대 10 mM 내지 50 mM, 예를 들어 15 mM 내지 45 mM, 예컨대 20 mM 내지 40 mM, 예를 들어 25 내지 35 mM, 예컨대 28 mM 내지 32 mM, 예를 들어 30 mM 히스티딘을 포함한다.
한 실시양태에서, pH는 5.8 내지 7.2, 예컨대 5.5 내지 6.5, 예를 들어 5.8 내지 6.2, 예를 들어 5.9 내지 6.1, 예컨대 6.0이다.
또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 25 mM 내지 500 mM 염화나트륨, 예를 들어 25 mM 내지 250 mM, 예컨대 50 mM 내지 250 mM, 예를 들어 100 mM 내지 200 mM, 예컨대 125 mM 내지 175 mM, 예를 들어 150 mM 염화나트륨을 포함한다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨 및 2 mg/ml 내지 40 mg/ml 항체, pH 5.5 내지 6.5를 포함하고, 바람직하게는 조성물은 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨 및 20 mg/ml 항체, pH 6을 포함한다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨 및 15 mg/ml 내지 25 mg/ml 항체, pH 5.5 내지 6.5를 포함하고, 바람직하게는 조성물은 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨 및 20 mg/ml 항체, pH 6을 포함한다.
추가 실시양태에서, 제약 조성물은 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨 및 2 mg/ml 내지 20 mg/ml 항체, pH 5.5 내지 6.5를 포함하고, 바람직하게는 조성물은 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨 및 10 mg/ml 항체, pH 6.0을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨 및 2 mg/ml 내지 20 mg/ml 항체, pH 5.5 내지 6.5를 포함하고, 바람직하게는 조성물은 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨 및 20 mg/ml 항체, pH 6.0을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨 및 2 mg/ml 내지 40 mg/ml 항체, pH 5.5 내지 6.5를 포함하고, 바람직하게는 조성물은 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨 및 20 mg/ml 항체, pH 6.0을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨 및 2 mg/ml 내지 40 mg/ml 항체, pH 5.5 내지 6.5를 포함하고, 예컨대 조성물은 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨 및 30 mg/ml 항체, pH 6.0을 포함한다.
추가 실시양태에서, 제약 조성물은 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨 및 2 mg/ml 내지 40 mg/ml 항체, pH 5.5 내지 6.5를 포함하고, 예컨대 조성물은 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨 및 40 mg/ml 항체, pH 6.0을 포함한다.
제약 조성물은 통상적인 기술, 예컨대 문헌 [Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2012 June, ISBN 9780857110275]에 개시된 것에 따라 추가의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제뿐만 아니라 임의의 다른 공지된 아주반트 및 부형제와 함께 제제화될 수 있다. 이러한 임의적인 추가의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제뿐만 아니라 임의의 다른 공지된 아주반트 및 부형제는 항체 및 선택된 투여 방식에 적합하여야 한다. 담체 및 제약 조성물의 다른 성분의 적합성은 본 발명의 선택된 화합물 또는 제약 조성물의 원하는 생물학적 성질에 대한 유의한 부정적인 영향의 결여를 기준으로 결정된다 (예를 들어, 항원 결합 시 실질적인 영향 미만임 (10% 이하의 상대적인 억제, 5% 이하의 상대적인 억제 등)).
제약상 허용되는 담체는 임의의 및 모든 적합한 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제, 항산화제 및 흡수-지연제 및 조성물의 다른 성분과 생리학상 상용성인 것 등을 포함한다. 본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비-수성 담체의 다른 예는 물, 염수, 포스페이트-완충 염수, 에탄올, 덱스트로스, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 그의 적합한 혼합물을 포함한다. 본 발명의 제약 조성물은 추가로 충전제, 염, 완충제, 세제 (예를 들어, 비이온성 세제, 예컨대 트윈-20 또는 트윈-80), 안정화제 (예를 들어, 당 또는 단백질-무함유 아미노산), 보존제, 조직 고정제, 가용화제 및/또는 제약 조성물에 포함되기에 적합한 다른 물질을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 계면활성제를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 동결보호제를 포함하지 않는다. 추가 실시양태에서, 히스티딘 완충제 및 염화나트륨 이외의 다른 부형제는 조성물을 제조하기 위해 항체 제제에 첨가되지 않는다.
본 발명의 제약 조성물 중의 항체의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 아니면서 특정한 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 요구되는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 항체의 양을 수득하도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정한 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정한 화합물의 배출 속도, 치료 지속기간, 사용되는 특정한 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 과거 병력, 및 의학 기술분야에 널리 공지되어 있는 기타 인자를 포함한 다양한 약동학적 인자에 좌우될 것이다. 주사 또는 주입을 위한 제약 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에 멸균되고 안정하여야 한다.
한 실시양태에서, 제약 조성물의 항체 농도는 0.5 mg/ml 내지 250 mg/ml, 예컨대 1 mg/ml 내지 100 mg/ml, 예를 들어 1 mg/ml 내지 50 mg/ml, 예컨대 2 mg/ml 내지 20 mg/ml, 예를 들어 5 ml/ml 내지 15 mg/ml, 예컨대 10 mg/ml이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서 제약 조성물 중 항체 농도는 20 mg/ml이다. 본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물 중 항체 농도는 18-20 mg/ml이다. 본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물의 항체 농도는 19-21 mg/ml이다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물 중 항체 농도는 40 mg/ml이다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물 중 항체 농도는 60 mg/ml이다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물 중 항체 농도는 80 mg/ml이다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물 중 항체 농도는 100 mg/ml이다.
본 발명의 제약 조성물 중에 제제화된 항체
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 제약 조성물 중에 제제화된 항체는 인간 이뮤노글로불린 G의 Fc 영역 및 항원 결합 영역을 포함하며, 여기서 Fc 영역은 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430, E345 또는 S440에 상응하는 위치에서 아미노산의 돌연변이를 포함하며, 단 S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W이다. EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430, E345 또는 S440에 상응하는 위치는 Fc 영역의 CH3 도메인에 위치한다.
본 발명의 제약 조성물 중의 항체는 제1 및 제2 중쇄를 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430, E345 또는 S440에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 제1 및 제2 중쇄 둘 다에 존재하거나, 또는 덜 바람직하게는 중쇄 중 하나에만 존재한다. 본 발명의 문맥에서, 용어 육량체화 증진 돌연변이는 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430, E345 또는 S440에 상응하는 위치에서의 아미노산 돌연변이를 지칭하며, 단 S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W이다. 육량체화 증진 돌연변이는 세포 표면 상의 상응하는 표적에 결합 시 돌연변이를 포함하는 항체 사이의 Fc-Fc 상호작용을 강화한다 (WO2013/004842; WO2014/108198).
한 실시양태에서, 항체의 Fc 영역은 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1에서의 E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y 또는 S440W에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 따라서, 항체는 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1에서의 E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y 및 S440W의 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다. 본원에는 세포-표면 항원 결합 시 항체의 증진된 육량체화를 가능하게 하는 실시양태가 제공된다. 항체는 제1 중쇄 및 제2 중쇄를 포함하는 Fc 영역을 포함하고, 상기 언급된 육량체화 증진 돌연변이 중 하나는 제1 및/또는 제2 중쇄에 존재할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, Fc 영역은 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1에서의 E430G 또는 E345K에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 따라서, Fc 영역은 E430G 및 E345K로부터 선택된 돌연변이를 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1에서의 E430에 상응하는 아미노산 위치에서 돌연변이를 포함하고, 상기 돌연변이는 E430G, E430S, E430F 및 E430T로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, Fc 영역은 E430G에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, Fc 영역은 E430G 돌연변이를 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1에서의 E345에 상응하는 아미노산 위치에서 돌연변이를 포함하고, 상기 돌연변이는 E345K, E345Q, E345R 및 E345Y로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, Fc 영역은 E345K에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, Fc 영역은 E345K 돌연변이를 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 S440에 상응하는 아미노산 위치에서 돌연변이를 포함하고, 상기 돌연변이는 S440W 및 S440Y로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, Fc 영역은 S440Y에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, Fc 영역은 S440Y 돌연변이를 포함한다.
한 실시양태에서, Fc 영역은 추가의 육량체화-억제 돌연변이, 예컨대 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1에서의 K439E 또는 S440K를 포함한다. 육량체화-억제 돌연변이, 예컨대 K439E 또는 S440K는 동일한 육량체화 억제 돌연변이를 포함하는 항체와의 Fc-Fc 상호작용을 방지하지만, K439E 돌연변이를 갖는 항체 및 S440K 돌연변이를 갖는 항체를 조합함으로써 억제 효과가 중화되고 Fc-Fc 상호작용이 복구된다. 한 실시양태에서, 항체는 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1에서의 위치 S440 또는 K439 중 하나에 상응하는 아미노산 위치에서 추가의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, Fc 영역은 S440 또는 K439에 상응하는 위치에서 추가의 돌연변이를 포함하며, 단, 육량체화 증진 돌연변이가 S440인 경우에는 상기 추가의 돌연변이가 위치 S440에 있지 않는다. 본 발명에 따라 E430, E345 또는 S440에 상응하는 위치에서의 돌연변이, 및 K439에 상응하는 아미노산 위치에서의 추가의 돌연변이, 예컨대 K439E 돌연변이를 포함하는 항체는, K439에 상응하는 아미노산 위치에서 추가의 돌연변이, 예컨대 K439E 돌연변이를 포함하는 항체와 올리고머를 형성하지 않는다. 그러나, E430, E345 또는 S440에서 육량체화 증진 돌연변이 및 K439에서 추가의 돌연변이, 예컨대 K439E를 포함하는 항체는, E430 또는 E345에서 육량체화 증진 돌연변이 및 S440에서 추가의 돌연변이, 예컨대 S440K를 포함하는 항체와는 올리고머를 형성한다. 본 발명에 따라 E430 또는 E345에 상응하는 위치에서의 돌연변이, 및 S440에 상응하는 아미노산 위치에서 추가의 돌연변이, 예컨대 S440K 돌연변이를 포함하는 항체는, S440에 상응하는 아미노산 위치에서 추가의 돌연변이, 예컨대 S440K 돌연변이를 포함하는 항체와 올리고머를 형성하지 않는다. 그러나, E430 또는 E345에서 육량체화 증진 돌연변이 및 S440에서 추가의 돌연변이, 예컨대 S440K를 포함하는 항체는, E430 또는 E345에서 육량체화 증진 돌연변이 및 K439에서 추가의 돌연변이, 예컨대 K439E를 포함하는 항체와는 올리고머를 형성한다. 한 실시양태에서, Fc 영역은 육량체화 증진 돌연변이, 예컨대 E430G, 및 육량체화 억제 돌연변이, 예컨대 K439E를 포함한다. 한 실시양태에서, Fc 영역은 육량체화 증진 돌연변이, 예컨대 E345K, 및 육량체화 억제 돌연변이, 예컨대 K439E를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 육량체화 증진 돌연변이, 예컨대 E430G, 및 육량체화 억제 돌연변이, 예컨대 S440K를 포함한다. 한 실시양태에서, Fc 영역은 육량체화 증진 돌연변이, 예컨대 E345K, 및 육량체화 억제 돌연변이, 예컨대 S440K를 포함한다. 한 실시양태에서, Fc 영역은 육량체화 증진 돌연변이, 예컨대 S440Y 및 육량체화 억제 돌연변이, 예컨대 K439E를 포함한다. 본원에는 K439E 돌연변이를 포함하는 항체와 S440K 돌연변이를 포함하는 항체의 조합물 사이에 독점적인 육량체화를 허용하는 실시양태가 제공된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 항-DR5 항체, 즉, DR5에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 항체를 포함한다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨 및 2 mg/ml 내지 200 mg/ml 항-DR5 항체, pH 5.5 내지 6.5를 포함하고, 바람직하게는 조성물은 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨 및 20 mg/ml 항-DR5 항체, pH 6.0을 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨 및 10 mg/ml 내지 40 mg/ml 항-DR5 항체, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨 및 15 mg/ml 내지 30 mg/ml 항-DR5 항체, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨 및 18 mg/ml 내지 25 mg/ml 항-DR5 항체, pH 5.5 내지 6.5, 예를 들어 pH 5.8 내지 6.2를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨 및 10 mg/ml 항-DR5 항체, pH 6.0을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨 및 30 mg/ml 항-DR5 항체, pH 6.0을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨 및 40 mg/ml 항-DR5 항체, pH 6.0을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨 및 50 mg/ml 항-DR5 항체, pH 6.0을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨 및 100 mg/ml 항-DR5 항체, pH 6.0을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체는 조성물 중에 2-200 mg/ml로 존재하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 조성물 중에 2-200 mg/ml로 존재하며, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함하고, 바람직하게는 여기서 조성물은 10 mg/ml의 상기 제1 항-DR5 항체, 10 mg/ml의 상기 제2 항-DR5 항체, 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨, pH 6.0을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체는 조성물 중에 10mg/ml 내지 40mg/ml로 존재하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 조성물 중에 10mg/ml 내지 40mg/ml로 존재하며, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체는 조성물 중에 10mg/ml 내지 40mg/ml로 존재하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 조성물 중에 10mg/ml 내지 40mg/ml로 존재하며, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.8 내지 6.2를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체는 조성물 중에 15mg/ml 내지 30mg/ml로 존재하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 조성물 중에 15mg/ml 내지 30mg/ml로 존재하며, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체는 조성물 중에 15mg/ml 내지 30mg/ml로 존재하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 조성물 중에 15mg/ml 내지 30mg/ml로 존재하며, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.8 내지 6.2를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 또한 불순물, 예컨대 단백질 불순물, 예를 들어 항체 불순물을 함유할 수 있다. 단백질 불순물은 0.1 mg/ml 미만일 수 있다. 한 실시양태에서 제약 조성물은 0.1 mg/ml의 단백질 불순물, 예를 들어 항체 불순물을 포함한다. 한 실시양태에서 제약 조성물은 0.1 mg/ml 미만의 단백질 불순물, 예를 들어 항체 불순물을 포함한다. 한 실시양태에서 제약 조성물은 0.09 mg/ml 미만의 단백질 불순물, 예를 들어 항체 불순물을 포함한다. 한 실시양태에서 제약 조성물은 0.07 mg/ml 미만의 단백질 불순물, 예를 들어 항체 불순물을 포함한다. 한 실시양태에서 제약 조성물은 0.05 mg/ml 미만의 단백질 불순물, 예를 들어 항체 불순물을 포함한다. 한 실시양태에서 제약 조성물은 0.03 mg/ml 미만의 단백질 불순물, 예를 들어 항체 불순물을 포함한다. 한 실시양태에서 제약 조성물은 0.001 mg/ml 미만의 단백질 불순물, 예를 들어 항체 불순물을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체는 조성물 중에 15mg/ml 내지 30mg/ml로 존재하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 조성물 중에 15mg/ml 내지 30mg/ml로 존재하며, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨 및 0.1 mg/ml 미만의 단백질 불순물, 예를 들어 항체 불순물, pH 5.8 내지 6.2를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체는 조성물 중에 20mg/ml로 존재하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 조성물 중에 20mg/ml로 존재하고, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 20 mg/ml의 제1 항-DR5 항체, 20 mg/ml의 제2 항-DR5 항체, 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨, pH 6.0을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체는 조성물 중에 40mg/ml로 존재하고, 상기 제2 항체는 조성물 중에 40mg/ml로 존재하고, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 40 mg/ml의 제1 항-DR5 항체, 40 mg/ml의 제2 항-DR5 항체, 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨, pH 6.0을 포함한다.
인간 DR5 분자 (유니프롯 O14763)는 첫번째 1-55 위치에서 신호전달 펩티드에 이어서, 위치 56-210에서 세포외 도메인, 위치 211-231에서 막횡단 도메인 및 위치 232-440에서 세포질 도메인을 포함하는 440개 아미노산으로 구성된다. 세포외 도메인은 155개 아미노산 서열로 구성된다. DR5의 짧은 이소형 (유니프롯 O14763-2)은 위치 56-210에서 아미노산을 포함하는 긴 버전 (유니프롯 O14763)과 비교하여 세포외 도메인으로부터 185-213이 누락되어 있다.
한 실시양태에서, 항-DR5 항체는 DR5의 세포외 도메인 내에서 에피토프에 결합하는 항원 결합 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 TRAIL과 동일한 결합 부위 또는 TRAIL의 결합 부위와 중복되는 결합 부위에 결합하는 항원 결합 영역을 포함한다. TRAIL 결합 모티프는 DR5 엑토도메인과의 복합체에서 TRAIL의 결정 구조에 기초하여 CRD2 및 CRD3에 위치한다 (Hymowitz et al., Mol Cell. 1999 Oct;4(4):563-71). 즉, 한 실시양태에서, 항체는 TRAIL과 동일한 DR5 상의 결합 영역에 결합하는 항원 결합 영역을 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, DR5 항체는 DR5 상의 CRD2 및/또는 CRD3에 결합한다. 한 실시양태에서, 항체는 DR5에 대한 TRAIL 결합을 차단하는 항원 결합 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 DR5에 대한 TRAIL 결합과 경쟁하는 항원 결합 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 TRAIL 유도된 매개된 사멸, 예컨대 TRAIL 유도된 아폽토시스를 차단한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 TRAIL의 결합 부위와 상이한 DR5 상의 에피토프에 결합하는 항원 결합 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 TRAIL과 상이한 DR5 상의 결합 영역에 결합하는 항원 결합 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 TRAIL 유도된 매개된 사멸, 예컨대 TRAIL 유도된 아폽토시스를 차단하지 않는다.
본 발명의 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 46의 아미노산 잔기 116-138 내에 위치하는 1개 이상의 아미노산 잔기 및 아미노산 잔기 139-166 내에 위치하는 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하거나 또는 그를 필요로 하는 DR5 상의 에피토프에 결합하는 항원 결합 영역을 포함한다. 즉, 항원 결합 영역은 DR5에 결합하기 위해 위치 116-138 내에 위치하는 1개 이상의 아미노산 및 위치 139-166 내에 위치하는 1개 이상의 아미노산에 결합하거나 그를 필요로 한다. 항원 결합 영역이 소정의 서열로 구성된 1개 이상의 아미노산에 결합한다는 것은, 항원 결합 영역이 상기 서열 내의 1개 이상의 아미노산과 접촉하거나 그와 직접 상호작용한다는 것으로 이해해야 한다. 항원 결합 영역이 소정의 서열 내의 1개 이상의 아미노산을 필요로 한다는 것은, 항원 결합 영역과 상기 서열의 1개 이상의 아미노산 사이에 접촉 또는 직접적인 상호작용이 필요하지는 않지만, 에피토프의 3차원 구조를 유지하기 위해 상기 1개 이상의 아미노산이 필요하다는 것을 의미한다.
본 발명의 항체의 인간 DR5 상의 세포외 도메인 상의 에피토프 또는 결합 영역은 실시예 6에 기재된 바와 같이 도메인-스와핑된 DR5 분자의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 간략하게, 도메인-스와핑된 DR5 분자는 CHO 세포에서 일시적으로 발현되고, 도메인-스와핑된 인간 DR5 분자에 대한 항체의 결합은 FACS 검정에 의해 결정된다. 도메인-스와핑된 인간 DR5 분자에 대한 결합의 상실은 인간 DR5의 스와핑된 도메인이 항체에 대한 결합에 수반되는 1개 이상의 아미노산을 함유한다는 것을 나타낸다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 46의 아미노산 잔기 79-138 내에 위치하는 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하거나 또는 그를 필요로 하는 DR5 상의 에피토프에 결합하는 항원 결합 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-DR5 항체는 하기 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항원 결합 영역을 포함한다:
a) (VH) 서열식별번호: 1, 2, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6;
b) (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6;
c) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14;
d) (VH) 서열식별번호: 16, 17, 18 및 VL) 서열식별번호: 21, GAS, 22 또는
e) 상기 a) 내지 d) 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 (VH) CDR1, CDR2, CDR3 및 (VL) CDR1, CDR2 및 CDR3 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환을 갖는 상기 6개의 CDR.
한 실시양태에서, 항-DR5 항체는 하기 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항원 결합 영역을 포함한다:
a) (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6.
한 실시양태에서, 항-DR5 항체는 하기 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항원 결합 영역을 포함한다:
a) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14.
즉, 한 실시양태에서, 항원 결합 영역을 포함하는 6개의 CDR에 걸쳐 최대 총 5개의 돌연변이, 예컨대 치환이 허용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, VH 영역의 3개의 CDR에 걸쳐 최대 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 이루어지고, VL 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 다른 실시양태에서, VH 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이, 예를 들어 치환이 이루어지지 않지만, VL 영역의 CDR에 걸쳐 최대 5개, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 발견된다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 항-DR5 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항원 결합 영역을 포함하며, 여기서 상기 VH 영역 및 상기 VL 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 6개의 CDR 서열에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다:
a) (VH) 서열식별번호: 1, 2, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6;
b) (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6;
c) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14; 및
d) (VH) 서열식별번호: 16, 17, 18 및 VL) 서열식별번호: 21, GAS, 22.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 항-DR5 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항원 결합 영역을 포함하며, 여기서 상기 VH 영역 및 상기 VL 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 6개의 CDR 서열에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다:
a) (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 항-DR5 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항원 결합 영역을 포함하며, 여기서 상기 VH 영역 및 상기 VL 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 6개의 CDR 서열에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다:
a) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14.
한 실시양태에서, 항-DR5 항체는 하기로 이루어진 군의 것으로부터 선택된 CDR 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함한다:
a) (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6 또는
b) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14 또는
c) 상기 (a) 또는 (b) 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 (VH) CDR1, CDR2 및 CDR3 및 (VL) CDR1, CDR2 및 CDR3 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이를 갖는 상기 6개의 CDR. 즉, 한 실시양태에서, 항원 결합 영역을 포함하는 6개의 CDR에 걸쳐 최대 총 5개의 돌연변이, 예컨대 치환이 허용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, VH 영역의 3개의 CDR에 걸쳐 최대 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 이루어지고, VL 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 다른 실시양태에서, VH 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이, 예를 들어 치환이 이루어지지 않지만, VL 영역의 CDR에 걸쳐 최대 5개, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 발견된다.
한 실시양태에서, 항-DR5 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함한다:
a) (VH) 서열식별번호: 1, 2, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6 또는
b) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14 또는
c) 상기 (a) 또는 (b)에 정의된 바와 같은 (VH) CDR1, CDR2 및 CDR3 및 (VL) CDR1, CDR2 및 CDR3 서열에 걸쳐 최대 총 5개의 돌연변이를 갖는 상기 6개의 CDR.
즉, 한 실시양태에서, 항원 결합 영역을 포함하는 6개의 CDR에 걸쳐 최대 총 5개의 돌연변이, 예컨대 치환이 허용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, VH 영역의 3개의 CDR에 걸쳐 최대 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 이루어지고, VL 영역의 3개의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 다른 실시양태에서, VH 영역의 3개의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이, 예를 들어 치환이 이루어지지 않지만, VL 영역의 6개의 CDR에 걸쳐 최대 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 이루어지며, 여기서 상기 돌연변이, 예를 들어 치환은 유사한 물리적 또는 기능적 성질을 갖는 보존적 또는 관심 아미노산이고, 바람직하게는 DR5에 대한 결합 친화도를 변형시키지 않는다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 항-DR5 항체는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항원 결합 영역을 포함하고, 상기 VH 영역 및 상기 VL 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL 서열에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다:
a) (VH) 서열식별번호: 4 및 (VL) 서열식별번호: 7;
b) (VH) 서열식별번호: 9 및 (VL) 서열식별번호: 7;
c) (VH) 서열식별번호: 12 및 (VL) 서열식별번호: 15;
d) (VH) 서열식별번호: 19 및 (VL) 서열식별번호: 23; 및
e) (VH) 서열식별번호: 20 및 (VL) 서열식별번호: 23.
한 실시양태에서, 항체는 하기 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 항원 결합 영역을 포함한다:
a) (VH) 서열식별번호: 4 및 (VL) 서열식별번호: 7;
b) (VH) 서열식별번호: 9 및 (VL) 서열식별번호: 7;
c) (VH) 서열식별번호: 12 및 (VL) 서열식별번호: 15;
d) (VH) 서열식별번호: 19 및 (VL) 서열식별번호: 23;
e) (VH) 서열식별번호: 20 및 (VL) 서열식별번호: 23 또는
f) 상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 (VH) 및 (VL) 서열에 걸쳐 총 1 내지 10개의 돌연변이 또는 치환을 갖는 (VH) 및 (VL). 즉, 한 실시양태에서, VH 및 VL 서열로 정의된 VH 및 VL 영역에 걸쳐 총 10개 이하의 돌연변이, 예컨대 치환이 허용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, VH 또는 VL 서열에 걸쳐 10개 이하의 돌연변이, 예를 들어 치환, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 이루어진다. 본 발명의 한 실시양태에서, VH 서열에서 10개 이하의 돌연변이 또는 치환이 이루어지고, VL 서열에서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 본 발명의 한 실시양태에서, VH 서열에서는 돌연변이가 이루어지지 않고, VL 서열에서 10개 이하의 돌연변이, 예를 들어 치환이 이루어진다. 본원에는 VH 및 VL 서열에 걸쳐 10개 이하의 돌연변이, 예컨대 치환이 허용되는 실시양태가 제공되며, 상기 돌연변이, 예컨대 치환은 유사한 물리적 또는 기능적 성질을 갖는 보존적 또는 관심 아미노산이고, 이로써 항-DR5 항체의 결합 친화도 또는 기능을 변형시키지 않고 VH 및 VL 서열 내에서 돌연변이, 예를 들어 치환을 허용한다.
한 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형의 것이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 항체는 IgG1 항체이다.
한 실시양태에서, 항체는 IgG1m(f), IgG1m(z), IgG1m(a) 또는 IgG1m(x) 동종이형, 또는 임의의 동종이형 조합물, 예컨대 IgG1m(z,a), IgG1m(z,a,x), IgG1m(f,a)이다. 바람직한 실시양태에서 항체는 IgG1m(f)이다.
한 실시양태에서 경쇄는 카파 경쇄이다. 한 실시양태에서 경쇄는 Km3 동종이형이다. 한 실시양태에서 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역을 포함한다:
a) 서열식별번호: 29;
b) 서열식별번호: 30;
c) 서열식별번호: 31;
d) 서열식별번호: 32 또는
e) 임의로 a) 내지 d) 중 어느 하나에 정의된 아미노산 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환을 갖는 상기 아미노산 서열.
즉, 한 실시양태에서, Fc 영역에 걸쳐 최대 총 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 허용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, Fc 영역에 걸쳐 최대 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 허용된다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 항-DR5 항체는 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하며, 상기 LC는 서열식별번호: 39의 서열을 포함하고, 상기 HC는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 HC 서열에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다:
a) (HC) 서열식별번호: 33;
b) (HC) 서열식별번호: 34;
c) (HC) 서열식별번호: 35;
d) (HC) 서열식별번호: 36;
e) (HC) 서열식별번호: 37; 및
f) (HC) 서열식별번호: 38.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 항-DR5 항체는 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하며, 여기서 LC는 서열식별번호: 39의 서열을 포함하고, 여기서 HC는 (HC) 서열식별번호: 38에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 항-DR5 항체는 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하며, 여기서 LC는 서열식별번호: 39에 제시된 것과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 여기서 HC는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 HC 서열에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다:
a) (HC) 서열식별번호: 33;
b) (HC) 서열식별번호: 34;
c) (HC) 서열식별번호: 35;
d) (HC) 서열식별번호: 36;
e) (HC) 서열식별번호: 37; 및
f) (HC) 서열식별번호: 38.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 항-DR5 항체는 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하며, 여기서 LC는 서열식별번호: 39에 제시된 것과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 여기서 HC는 f) (HC) 서열식별번호: 38에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
한 실시양태에서, 항체는 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하며, 여기서 LC는 서열식별번호: 39의 서열을 포함하고, 여기서 HC는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 1개를 포함한다:
a) (HC) 서열식별번호: 33;
b) (HC) 서열식별번호: 34;
c) (HC) 서열식별번호: 35;
d) (HC) 서열식별번호: 36;
e) (HC) 서열식별번호: 37; 및
f) (HC) 서열식별번호: 38; 또는
g) 상기 a) 내지 f) 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 (HC) 서열에 걸쳐 총 1 내지 10개의 돌연변이를 갖는 상기 (HC).
즉, 한 실시양태에서, 중쇄 서열에 의해 정의된 중쇄에 걸쳐 총 10개 이하의 돌연변이, 예컨대 치환이 허용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 중쇄 서열에 걸쳐 10개 이하의 돌연변이, 예를 들어 치환, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 이루어진다. 본원에는 중쇄 서열에 걸쳐 10개 이하의 돌연변이, 예컨대 치환이 허용되는 실시양태가 제공되며, 상기 돌연변이, 예컨대 치환은 유사한 물리적 또는 기능적 성질을 갖는 보존적 또는 관심 아미노산이고, 이로써 항-DR5 항체의 결합 친화도 또는 기능을 변형시키지 않고 중쇄 서열 내에서 돌연변이 또는 치환을 허용한다.
한 실시양태에서, 항체는 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하며, 여기서 LC는 서열식별번호: 39의 서열을 포함하고, 여기서 HC는 서열식별번호: 38의 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 항-DR5 항체는 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하며, 여기서 LC는 서열식별번호: 43의 서열을 포함하고, 여기서 HC는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 HC 서열에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다:
a) (HC) 서열식별번호: 40;
b) (HC) 서열식별번호: 41; 및
c) (HC) 서열식별번호: 42.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 항-DR5 항체는 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하며, 여기서 LC는 서열식별번호: 43의 서열을 포함하고, 여기서 HC는 (HC) 서열식별번호: 42에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 항-DR5 항체는 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하며, 여기서 LC는 서열식별번호: 43에 제시된 것과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 여기서 HC는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 HC 서열에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다:
a) (HC) 서열식별번호: 40;
b) (HC) 서열식별번호: 41; 및
c) (HC) 서열식별번호: 42.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 항-DR5 항체는 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하며, 여기서 LC는 서열식별번호: 43에 제시된 것과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 여기서 HC는 (HC) 서열식별번호: 42에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
한 실시양태에서, 항체는 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하며, 여기서 LC는 서열식별번호: 43의 서열을 포함하고, 여기서 HC는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 1개를 포함한다:
a) (HC) 서열식별번호: 40;
b) (HC) 서열식별번호: 41;
c) (HC) 서열식별번호: 42; 또는
d) 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 (HC) 서열에 걸쳐 총 1 내지 10개의 돌연변이, 예를 들어 치환을 갖는 상기 (HC).
즉, 한 실시양태에서, 중쇄 서열에 의해 정의된 중쇄에 걸쳐 총 10개 이하의 돌연변이, 예컨대 치환이 허용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 중쇄 서열에 걸쳐 10개 이하의 돌연변이, 예를 들어 치환, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 이루어진다. 본원에는 중쇄 서열에 걸쳐 10개 이하의 돌연변이, 예컨대 치환이 허용되는 실시양태가 제공되며, 상기 돌연변이, 예컨대 치환은 유사한 물리적 또는 기능적 성질을 갖는 보존적 또는 관심 아미노산이고, 이로써 항-DR5 항체의 결합 친화도 또는 기능을 변형시키지 않고 중쇄 서열 내에서 돌연변이, 예컨대 치환을 허용한다.
한 실시양태에서 항체는 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하며, 여기서 LC는 서열식별번호: 43의 서열을 포함하고, 여기서 HC는 서열식별번호: 42의 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 인간 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체이다.
한 실시양태에서 항체는 항-DR5 항체이고, 상기 항-DR5 항체는 효능작용성이다. 항체가 효능작용성이라는 것은, 항체가 DR5를 클러스터링하거나 자극하거나 활성화시킨다는 것으로 이해해야 한다. 한 실시양태에서, DR5에 결합된 본 발명의 효능작용성 항-DR5 항체는 DR5에 결합된 TRAIL과 동일한 세포내 경로를 활성화시킨다. 1종 이상의 항체의 효능작용성 활성은 DR5를 발현하는 표적 세포, 예컨대 COLO 205 세포 (ATCC CCL-222) 또는 HCT 116 세포 (ATCC CCL-247)를 항체 농도 일련의 희석물 (예를 들어, 5배 희석으로 20,000 ng/mL에서 0.05 ng/mL 최종 농도까지)과 함께 3일 동안 인큐베이션함으로써 결정할 수 있다. 세포를 시딩할 때 항체를 직접 첨가할 수 있거나 (실시예 8, 9, 10, 39에 기재됨), 또는 대안적으로 항체 샘플을 첨가하기 전에 먼저 세포를 96-웰 편평 바닥 플레이트에 부착되도록 한다 (실시예 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21, 22, 23, 24, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 48에 기재됨). 효능작용성 활성, 즉, 효능작용성 효과는 이 목적을 위한 특정한 키트, 예컨대 프로메가의 셀타이터-글로 발광 세포 생존율 검정 (Cat nr G7571)을 사용하여 생존 세포의 양을 측정함으로써 정량화할 수 있다.
한 실시양태에서, 항체는 항-DR5 항체이고, 상기 항-DR5 항체는 증진된 효능작용성 활성을 갖는다. 항-DR5 항체가 활성을 갖는다는 것은, 상기 항체가 DR5를 클러스터링시킬 수 있거나 또는 적어도 DR5에 결합된 TRAIL과 동일한 세포내 경로를 활성화시킬 수 있다는 것으로 이해해야 한다. 즉, 증진된 효능작용성 활성을 갖는 항-DR5 항체는 DR5를 발현하는 세포 또는 조직에서 TRAIL 또는 DR5에 대한 야생형 IgG1 항체에 비해 아폽토시스 또는 프로그램화된 세포 사멸의 증가된 수준을 유도할 수 있다.
한 실시양태에서, 항체는 항-DR5 항체이고, 상기 항-DR5 항체는 표적 세포에서 프로그램화된 세포 사멸을 유도한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항-DR5 항체는 카스파제 의존성 세포 사멸을 유도한다. 카스파제 의존성 세포 사멸은 카스파제-3 및/또는 카스파제-7의 활성화에 의해 유도될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항-DR5 항체는 카스파제-3 및/또는 카스파제-7 의존성 세포 사멸을 유도한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항체는 아폽토시스를 유도한다. 1종 이상의 효능작용성 항-DR5 항체에 의한 아폽토시스는 예를 들어 실시예 19, 20, 25 및 45에 기재된 카스파제-3/7 활성화 검정 또는 실시예 19 및 25에 기재된 포스파티딜세린 노출과 같은 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 예를 들어 1 μg/mL의 고정된 농도의 항-DR5 항체를 부착성 세포에 첨가하고, 1 내지 24시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 카스파제-3/7 활성화는 이 목적을 위한 특정한 키트, 예컨대 비디 파밍겐의 PE 활성 카스파제-3 아폽토시스 키트 (Cat nr 550914) (실시예 19 및 25) 또는 프로메가의 카스파제-글로 3/7 검정 (Cat nr G8091) (실시예 20 및 45)을 이용하여 결정할 수 있다. 포스파티딜세린 노출 및 세포 사멸은 이 목적을 위한 특정한 키트, 예컨대 비디 파밍겐으로부터의 FITC 아넥신 V 아폽토시스 검출 키트 I (Cat nr 556547) (실시예 19 및 25)를 이용하여 결정할 수 있다.
한 실시양태에서 항체는 항-DR5 항체이고, 상기 항-DR5 항체는 아넥신-V 결합에 의해 측정될 수 있는 포스파티딜세린 (PS) 노출을 유도한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항-DR5는 표적 세포의 세포 표면으로 PS의 전위를 유도한다. 따라서, 아넥신-V 결합은 프로그램화된 세포 사멸과 상관관계가 있고, 이를 이용하여 프로그램화된 세포 사멸을 초래하는 세포 사건을 유도하는 항-DR5 항체의 능력을 측정할 수 있다.
바람직한 실시양태에서 항체는 DR5를 발현하는 표적 세포, 예컨대 종양 세포에서 아폽토시스를 유도하는 항-DR5 항체이다.
한 실시양태에서 항체는 세포 생존율을 감소시키는 항-DR5 항체이다.
한 실시양태에서 항체는 DR5 클러스터링을 유도하는 항-DR5 항체이다. 항체가 클러스터링을 유도할 수 있고 심지어 클러스터링을 증진시킬 수 있다는 것은, DR5에 결합된 TRAIL과 적어도 동일한 세포내 신호전달 경로의 활성화를 초래한다는 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 항-DR5 항체를 포함하고, DR5를 발현하는 암 세포 또는 암 조직에서 아폽토시스 또는 세포 사멸을 유도하거나, 촉발시키거나, 증가시키거나, 증진시킨다. 아폽토시스 또는 세포 사멸의 증가 또는 증진은, 본 발명의 1종 이상의 항-DR5 항체에 노출되거나 그로 처리된 세포 상에서 포스파티딜세린 노출 수준의 증가 또는 증진에 의해 측정될 수 있다. 대안적으로, 아폽토시스 또는 세포 사멸의 증가 또는 증진은, 본 발명의 1종 이상의 항-DR5 항체에 노출되었거나 그로 처리되었던 세포에서 카스파제 3 또는 카스파제 7의 활성화를 측정함으로써 측정할 수 있다. 대안적으로, 아폽토시스 또는 세포 사멸의 증가 또는 증진은, 비처리 세포 배양물에 비해 본 발명의 1종 이상의 항-DR5 항체에 노출되었거나 그로 처리되었던 세포 배양물에서 생존율의 상실에 의해 측정될 수 있다. 카스파제-매개된 아폽토시스의 유도는 카스파제-억제제, 예를 들어 ZVAD에 의해 DR5 항체에 노출된 후에 생존율 상실의 억제를 입증함으로써 평가할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물 중의 항체는 DR5를 발현하는 표적 세포 상에서 항체의 올리고머화, 예컨대 육량체화에 관여하는 항-DR5 항체이다. 올리고머화, 예컨대 육량체화는 Fc-Fc 상호작용을 통해 매개된다. 이를 측정하기 위한 한 방법은, 항체가 올리고머화, 예를 들어 육량체화함을 나타내는 Fc-Fc 상호작용을 억제하는 것이다. Fc-Fc 상호작용은 실시예 15에 기재된 바와 같이 Fc-Fc 상호작용과 관련된 소수성 패치, 예컨대 DCAWHLGELVWCT에 결합하는 펩티드에 의해 억제될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물 중에 제제화되는 항체는 숙주 세포에서 항체 쇄를 코딩하는 서열을 운반하는 발현 벡터를 도입하는 것에 의해 재조합적으로 생산될 수 있다. 본 발명의 문맥에서 발현 벡터는 임의의 적합한 벡터, 예컨대 염색체성, 비-염색체성 및 합성 핵산 벡터 (발현 제어 요소의 적합한 세트를 포함하는 핵산 서열)일 수 있다. 이러한 벡터의 예에는 SV40의 유도체, 박테리아 플라스미드, 파지 DNA, 바큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드 및 파지 DNA의 조합물로부터 유래된 벡터, 및 바이러스 핵산 (RNA 또는 DNA) 벡터가 포함된다. 한 실시양태에서, 인간화 CD3 항체-코딩 핵산은 네이키드 DNA 또는 RNA 벡터, 예를 들어 선형 발현 요소 (예를 들어, Sykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)에 기재됨), 압축 핵산 벡터 (예를 들어, US 6,077, 835 및/또는 WO 00/70087에 기재됨), 플라스미드 벡터, 예컨대 pBR322, pUC 19/18, 또는 pUC 118/119, "미지(midge)" 최소 크기 핵산 벡터 (예를 들어, Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)에 기재됨), 또는 침전된 핵산 벡터 구축물, 예컨대 CaPO4 --침전된 구축물 (예를 들어, WO 00/46147, Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978), 및 Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)에 기재됨)로 구성된다. 이러한 핵산 벡터 및 이들의 용법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, US 5,589,466 및 US 5,973,972 참조).
핵산 및/또는 벡터는 또한 폴리펩티드, 예컨대 신생 폴리펩티드 쇄를 원형질막 주위 공간으로 또는 세포 배양 배지 내로 표적화할 수 있는, 분비/국재화 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 분비 리더 또는 신호 펩티드, 소기관-표적화 서열 (예를 들어, 핵 국재화 서열, ER 보유 신호, 미토콘드리아 수송 서열, 엽록체 수송 서열), 막 국재화/앵커 서열 (예를 들어, 이동 종결 서열, GPI 앵커 서열) 등을 포함한다.
본 발명의 발현 벡터에서, 항체-코딩 핵산 및 제1 및 제2 폴리펩티드 핵산은 임의의 적합한 프로모터, 인핸서, 및 다른 발현-촉진 요소를 포함하거나 이들과 회합될 수 있다. 이러한 요소의 예에는 강력한 발현 프로모터 (예를 들어, 인간 CMV IE 프로모터/인핸서 뿐만 아니라 RSV, SV40, SL3-3, MMTV, 및 HIV LTR 프로모터), 효과적인 폴리 (A) 종결 서열, 이. 콜라이에서 플라스미드 생성물에 대한 복제 기점, 선택가능한 마커로서 항생제 내성 유전자, 및/또는 편리한 클로닝 부위 (예를 들어, 폴리링커)가 포함된다. 핵산은 또한 구성적 프로모터와는 대조적인 유도성 프로모터, 예컨대 CMV IE를 포함할 수 있다 (통상의 기술자라면 이러한 용어가 특정 조건 하에 유전자 발현의 정도를 실제로 기술하는 것임을 인식할 것임).///
항체는 재조합 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 사용하여 생산될 수 있다. 숙주 세포의 예는 효모, 박테리아 및 포유동물 세포, 예컨대 CHO 또는 HEK-293 세포를 포함한다. 예를 들어, 숙주 세포는 본원에 기재된 항체의 발현을 코딩하는 서열을 포함하는 세포 게놈 내로 안정하게 통합된 핵산을 포함할 수 있다. 숙주 세포는 본원에 기재된 제1 또는 제2 폴리펩티드의 발현을 코딩하는 서열을 포함하는 세포 게놈 내로 안정하게 통합된 핵산을 포함할 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 본원에 기재된 항체의 발현을 코딩하는 서열을 포함하는 비-통합된 핵산, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 또는 선형 발현 요소를 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물 중에 제제화된 이중특이적 항체
또 다른 측면에서, 본 발명의 제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 인간 DR5에 결합하는 적어도 1개의 항원 결합 영역을 포함하는 이중특이적 항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 인간 DR5에 결합하는 1개 이상의 항원 결합 영역을 포함하는 이중특이적 항체를 포함한다.
그의 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 본원에 기재된 바와 같은 인간 DR5에 결합하는 제1 항원 결합 영역 및 제2 항원 결합 영역을 포함한다.
하나의 이러한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 제1 및 제2 항원 결합 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 항원 결합 영역 및 상기 제2 항원 결합 영역은 인간 DR5 상의 상이한 에피토프에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 이중특이적 항체는 제1 및 제2 항원 결합 영역을 포함하고, 여기서 상기 인간 DR5에 결합하는 제1 항원 결합 영역은 상기 인간 DR5에 결합하는 제2 항원 결합 영역의 결합을 차단하지 않는다.
한 실시양태에서, 이중특이적 항-DR5 항체는 제1 및 제2 Fc 영역을 포함하고, 여기서 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 본 발명에 따라 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430, E345 또는 S440에 상응하는 위치에서 아미노산의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항-DR5 항체는 제1 및 제2 Fc 영역을 포함하고, 여기서 제1 및 제2 Fc 영역은 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430, E345 또는 S440에 상응하는 위치에서 아미노산의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항-DR5 항체는 제1 및 제2 Fc 영역을 포함하고, 제1 Fc 영역은 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430, E345 또는 S440에 상응하는 위치에서 아미노산의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항-DR5 항체는 제1 및 제2 Fc 영역을 포함하고, 제2 Fc 영역은 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430, E345 또는 S440에 상응하는 위치에서 아미노산의 돌연변이를 포함한다.
한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 제1 및 제2 항원 결합 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 항원 결합 영역은 하기 6개의 CDR 서열
a) (VH) 서열식별번호: 1, 2, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 영역은 하기 6개의 CDR 서열
b) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하거나, 또는 여기서 상기 제1 항원 결합 영역 및 상기 제2 항원 결합 영역은 c) 각각 상기 (a) 또는 (b)에 정의된 6개의 CDR 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이 또는 치환을 갖는 상기 6개의 CDR 서열을 포함한다.
즉, 항원 결합 영역의 6개의 CDR 서열에 걸쳐 1개 이상의 돌연변이 또는 치환은 상기 제1 또는 제2 항체의 결합 특징, 예컨대 효능작용성 성질, DR5 에피토프 결합, 및/또는 DR5를 발현하는 표적 세포에서 아폽토시스를 유도하는 능력을 변화시키지 않는다. 즉, 한 실시양태에서, 항원 결합 영역을 포함하는 6개의 CDR에 걸쳐 최대 총 5개의 돌연변이 또는 치환이 허용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, VH 영역의 3개의 CDR에 걸쳐 최대 5개의 돌연변이 또는 치환, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이 또는 치환이 이루어지고, VL 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 다른 실시양태에서, VH 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이 또는 치환이 이루어지지 않지만, VL 영역의 CDR에 걸쳐 최대 5개, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이 또는 치환이 발견된다.
한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 제1 및 제2 항원 결합 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 항원 결합 영역은 하기 6개의 CDR 서열
a) (VH) 서열식별번호: 1, 2, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 영역은 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하거나, 또는 여기서 상기 제1 항원 결합 영역 및 상기 제2 항원 결합 영역은 b) 각각, 각각의 제1 및 제2 항원 결합 영역의 (a)에 정의된 6개의 CDR 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환을 포함하는 상기 6개의 CDR 서열을 포함한다.
즉, 항원 결합 영역의 6개의 CDR 서열에 걸쳐 1개 이상의 돌연변이, 예를 들어 치환은 상기 제1 또는 제2 항체의 결합 특징, 예컨대 효능작용성 성질, DR5 에피토프 결합, 및/또는 DR5를 발현하는 표적 세포에서 아폽토시스를 유도하는 능력을 변화시키지 않는다. 즉, 한 실시양태에서, 항원 결합 영역을 포함하는 6개의 CDR에 걸쳐 최대 총 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 허용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, VH 영역의 3개의 CDR에 걸쳐 최대 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이 또는 치환이 이루어지고, VL 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 다른 실시양태에서, VH 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이, 예를 들어 치환이 이루어지지 않지만, VL 영역의 CDR에 걸쳐 최대 5개, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 발견된다.
한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 제1 및 제2 항원 결합 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 항원 결합 영역은 하기 6개의 CDR 서열
a) (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 영역은 하기 6개의 CDR 서열
b) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하거나, 또는 여기서 상기 제1 항원 결합 영역 및 상기 제2 항원 결합 영역은 c) 각각 상기 (a) 또는 (b)에 정의된 6개의 CDR 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이 또는 치환을 갖는 상기 6개의 CDR 서열을 포함한다.
즉, 항원 결합 영역의 6개의 CDR 서열에 걸쳐 1개 이상의 돌연변이 또는 치환은 상기 제1 또는 제2 항체의 결합 특징, 예컨대 효능작용성 성질, DR5 에피토프 결합, 및/또는 DR5를 발현하는 표적 세포에서 아폽토시스를 유도하는 능력을 변화시키지 않는다. 즉, 한 실시양태에서, 항원 결합 영역을 포함하는 6개의 CDR에 걸쳐 최대 총 5개의 돌연변이 또는 치환이 허용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, VH 영역의 3개의 CDR에 걸쳐 최대 5개의 돌연변이 또는 치환, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이 또는 치환이 이루어지고, VL 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 다른 실시양태에서, VH 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이 또는 치환이 이루어지지 않지만, VL 영역의 CDR에 걸쳐 최대 5개, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이 또는 치환이 발견된다.
한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 제1 및 제2 항원 결합 영역을 포함하고, 여기서 a) 상기 제1 항원 결합 영역은 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 영역은 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하거나, 또는 여기서 상기 제1 항원 결합 영역 및 상기 제2 항원 결합 영역은 b) 각각, 각각의 항원 결합 영역의 a)에 정의된 6개의 CDR 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이 또는 치환을 갖는 상기 6개의 CDR 서열을 포함한다. 즉, 항원 결합 영역의 6개의 CDR 서열에 걸쳐 1개 이상의 돌연변이, 예를 들어 치환은 상기 제1 또는 제2 항체의 결합 특징, 예컨대 효능작용성 성질, DR5 에피토프 결합, 및/또는 DR5를 발현하는 표적 세포에서 아폽토시스를 유도하는 능력을 변화시키지 않는다. 즉, 한 실시양태에서, 항원 결합 영역을 포함하는 6개의 CDR에 걸쳐 최대 총 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 허용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, VH 영역의 3개의 CDR에 걸쳐 최대 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 이루어지고, VL 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 다른 실시양태에서, VH 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이 또는 치환이 이루어지지 않지만, VL 영역의 CDR에 걸쳐 최대 5개, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 발견된다.
한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 제1 및 제2 항원 결합 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 항원 결합 영역은 하기 6개의 CDR 서열
a) (VH) 서열식별번호: 16, 17, 18 및 (VL) 서열식별번호: 21, GAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 영역은 하기 6개의 CDR 서열
b) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하거나, 또는 여기서 상기 제1 항원 결합 영역 및 상기 제2 항원 결합 영역은
c) 상기 a) 또는 (b)에 정의된 6개의 CDR 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이 또는 치환을 갖는 상기 6개의 CDR을 포함한다.
즉, 항원 결합 영역의 6개의 CDR 서열에 걸쳐 1개 이상의 돌연변이 또는 치환은 상기 제1 또는 제2 항체의 결합 특징, 예컨대 효능작용성 성질, DR5 에피토프 결합, 및/또는 DR5를 발현하는 표적 세포에서 아폽토시스를 유도하는 능력을 변화시키지 않는다. 즉, 한 실시양태에서, 항원 결합 영역을 포함하는 6개의 CDR에 걸쳐 최대 총 5개의 돌연변이 또는 치환이 허용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, VH 영역의 3개의 CDR에 걸쳐 최대 5개의 돌연변이 또는 치환, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이 또는 치환이 이루어지고, VL 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 다른 실시양태에서, VH 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이 또는 치환이 이루어지지 않지만, VL 영역의 CDR에 걸쳐 최대 5개, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이 또는 치환이 발견된다.
한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 제1 및 제2 항원 결합 영역을 포함하며, 여기서
a) 상기 제1 항원 결합 영역은 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 16, 17, 18 및 (VL) 서열식별번호: 21, GAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 영역은 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하거나, 또는
b) 상기 제1 항원 결합 영역 및 상기 제2 항원 결합 영역은 각각의 항원 결합 영역의 a)에 정의된 6개의 CDR 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환을 포함하는 상기 6개의 CDR을 포함한다.
즉, 각각의 항원 결합 영역의 6개의 CDR 서열에 걸쳐 1개 이상의 돌연변이, 예를 들어 치환은 상기 제1 또는 제2 항체의 결합 특징, 예컨대 효능작용성 성질, DR5 에피토프 결합, 및/또는 DR5를 발현하는 표적 세포에서 아폽토시스를 유도하는 능력을 변화시키지 않는다. 즉, 한 실시양태에서, 항원 결합 영역을 포함하는 6개의 CDR에 걸쳐 최대 총 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 허용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, VH 영역의 3개의 CDR에 걸쳐 최대 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 이루어지고, VL 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 다른 실시양태에서, VH 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이, 예를 들어 치환이 이루어지지 않지만, VL 영역의 CDR에 걸쳐 최대 5개, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 발견된다.
한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 제1 및 제2 항원 결합 영역을 포함하고, 상기 제1 항원 결합 영역은 하기 서열: (a) (VH) CDR1 서열식별번호: 1, CDR2 서열식별번호: 8, CDR3 서열식별번호: 3 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 5, CDR2 FAS, CDR3 서열식별번호: 6, 또는 b) 상기 (a)에 정의된 바와 같은 (VH) CDR1, CDR2 및 CDR3 및 (VL) CDR1, CDR2 및 CDR3 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이를 갖는 상기 6개의 CDR을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 영역은 하기 서열: (c) (VH) CDR1 서열식별번호: 10, CDR2 서열식별번호: 2, CDR3 서열식별번호: 11 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 13, CDR2 RTS, CDR3 서열식별번호: 14, 또는 (d) 상기 (c)에 정의된 바와 같은 (VH) CDR1, CDR2 및 CDR3 및 (VL) CDR1, CDR2 및 CDR3에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이를 갖는 상기 6개의 CDR 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 제1 및 제2 항원 결합 영역을 포함하고, (a) 상기 제1 항원 결합 영역은 하기 서열: (VH) CDR1 서열식별번호: 1, CDR2 서열식별번호: 8, CDR3 서열식별번호: 3 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 5, CDR2 FAS, CDR3 서열식별번호: 6을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 영역은 하기 서열: (VH) CDR1 서열식별번호: 10, CDR2 서열식별번호: 2, CDR3 서열식별번호: 11 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 13, CDR2 RTS, CDR3 서열식별번호: 14를 포함하거나, 또는 b) 상기 제1 항원 결합 영역 또는 상기 제2 항원 결합 영역은 각각의 항원 결합 영역의 상기 6개의 CDR 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이를 포함한다.
한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 제1 및 제2 항원 결합 영역을 포함하고, 상기 제1 항원 결합 영역은 하기 서열: (a) (VH) CDR1 서열식별번호: 1, CDR2 서열식별번호: 2, CDR3 서열식별번호: 3 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 5, CDR2 FAS, CDR3 서열식별번호: 6, 또는 (b) 상기 (a)에 정의된 바와 같은 (VH) CDR1, CDR2 및 CDR3 및 (VL) CDR1, CDR2 및 CDR3에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이를 갖는 상기 6개의 CDR 서열을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 영역은 하기 서열: (c) (VH) CDR1 서열식별번호: 10, CDR2 서열식별번호: 2, CDR3 서열식별번호: 11 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 13, CDR2 RTS, CDR3 서열식별번호: 14, 또는 (d) 상기 (c)에 정의된 바와 같은 (VH) CDR1, CDR2 및 CDR3 및 (VL) CDR1, CDR2 및 CDR3에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이를 갖는 상기 6개의 CDR 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 제1 및 제2 항원 결합 영역을 포함하고, (a) 상기 제1 항원 결합 영역은 하기 서열: (VH) CDR1 서열식별번호: 1, CDR2 서열식별번호: 2, CDR3 서열식별번호: 3 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 5, CDR2 FAS, CDR3 서열식별번호: 6을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 영역은 하기 서열: (VH) CDR1 서열식별번호: 10, CDR2 서열식별번호: 2, CDR3 서열식별번호: 11 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 13, CDR2 RTS, CDR3 서열식별번호: 14를 포함하거나, 또는 b) 상기 제1 항원 결합 영역 또는 상기 제2 항원 결합 영역은 각각의 항원 결합 영역의 상기 6개의 CDR 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이를 포함한다.
한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 제1 및 제2 항원 결합 영역을 포함하고, 상기 제1 항원 결합 영역은 하기 서열: (a) (VH) CDR1 서열식별번호: 16, CDR2 서열식별번호: 17, CDR3 서열식별번호: 18 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 21, CDR2 GAS, CDR3 서열식별번호: 22, 또는 (b) 상기 (a)에 정의된 바와 같은 (VH) CDR1, CDR2 및 CDR3 및 (VL) CDR1, CDR2 및 CDR3에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이를 갖는 상기 6개의 CDR 서열을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 영역은 하기 서열: (c) (VH) CDR1 서열식별번호: 10, CDR2 서열식별번호: 2, CDR3 서열식별번호: 11 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 13, CDR2 RTS, CDR3 서열식별번호: 14, 또는 (d) 상기 (c)에 정의된 바와 같은 (VH) CDR1, CDR2 및 CDR3 및 (VL) CDR1, CDR2 및 CDR3에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이를 갖는 상기 6개의 CDR 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 제1 및 제2 항원 결합 영역을 포함하고, (a) 상기 제1 항원 결합 영역은 하기 서열: (VH) CDR1 서열식별번호: 16, CDR2 서열식별번호: 17, CDR3 서열식별번호: 18 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 21, CDR2 GAS, CDR3 서열식별번호: 22를 포함하고, 상기 제2 항원 결합 영역은 하기 서열: (VH) CDR1 서열식별번호: 10, CDR2 서열식별번호: 2, CDR3 서열식별번호: 11 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 13, CDR2 RTS, CDR3 서열식별번호: 14를 포함하거나, 또는 b) 상기 제1 항원 결합 영역 또는 상기 제2 항원 결합 영역은 각각의 항원 결합 영역의 상기 6개의 CDR 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이를 포함한다.
항체가 제1 및 제2 중쇄를 포함하는 Fc 영역을 포함하는 이중특이적 항체인 경우, 본 발명에 따른 돌연변이, 즉 EU 넘버링에 따라 IgG1에서의 E430, E345 또는 S440에 상응하는 위치에 있는 돌연변이는 원칙적으로 중쇄들 중 1개에만, 즉, 제1 또는 제2 중쇄에 존재할 수 있지만, 본 발명에 따른 바람직한 실시양태에서는, 상기 돌연변이가 이중특이적 항체의 제1 및 제2 중쇄 둘 다에 존재한다.
특정한 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체, 예컨대 WO 11/131746 (본원에 참조로 포함됨)에 기재된 이종이량체 단백질일 수 있다.
한 실시양태에서, 항체는 이뮤노글로불린의 제1 Fc 영역 및 제1 항원-결합 영역을 포함하는 제1 중쇄, 및 이뮤노글로불린의 제2 Fc 영역 및 제2 항원-결합 영역을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 이중특이적 항체이며, 상기 제1 및 제2 항원-결합 영역은 동일한 항원 상의 또는 상이한 항원 상의 상이한 에피토프에 결합한다.
추가의 실시양태에서, 제1 Fc 영역을 포함하는 상기 제1 중쇄는 인간 IgG1 중쇄의 Fc 영역에서의 K409, T366, L368, K370, D399, F405 및 Y407에 상응하는 것으로부터 선택된 위치에서 추가의 아미노산 치환을 포함하고; 제2 Fc 영역을 포함하는 상기 제2 중쇄는 인간 IgG1 중쇄의 Fc 영역에서의 F405, T366, L368, K370, D399, Y407 및 K409에 상응하는 것으로부터 선택된 위치에서 추가의 아미노산 치환을 포함하며, 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 중쇄에서의 상기 추가의 아미노산 치환은 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 중쇄에서의 상기 추가의 아미노산 치환과는 상이하다.
추가의 실시양태에서, 제1 Fc 영역을 포함하는 상기 제1 중쇄는 인간 IgG1 중쇄의 Fc-영역에서의 K409에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하고, 제2 Fc 영역을 포함하는 상기 제2 중쇄는 인간 IgG1 중쇄의 Fc-영역에서의 F405에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.
한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간 IgG1 중쇄의 Fc-영역에서의 E345, E430, S440, Q386, P247, I253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 및 K447에 상응하는 것으로부터 선택된 적어도 1개의 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하는 제1 및 제2 Fc 영역을 도입하는 것을 포함하며, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W이다.
추가의 실시양태에서, 인간 IgG1 중쇄의 Fc-영역에서의 E345, E430, S440, Q386, P247, I253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 및 K447에 상응하는 것으로부터 선택된 적어도 1개의 아미노산 잔기에 있는 제1 및 제2 Fc 영역에서의 돌연변이 (단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W임)는 동일한 아미노산 잔기 위치 또는 상이한 위치에 있을 수 있다. 추가의 실시양태에서, 이는 제1 및 제2 Fc 영역에서 동일한 아미노산 잔기 위치에서 동일한 또는 상이한 돌연변이일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간 IgG1 중쇄의 Fc-영역에서의 E345, E430, S440, Q386, P247, I253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 및 K447에 상응하는 것으로부터 선택된 적어도 1개의 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하는 제1 또는 제2 CH2-CH3 영역을 포함하며, 단, S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W이다.
한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 제1 및 제2 중쇄를 포함하고, 상기 제1 중쇄는 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1에서의 F405L에 상응하는 돌연변이를 포함하고, 상기 제2 중쇄는 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1에서의 K409R에 상응하는 돌연변이를 포함한다.
2종 이상의 항체를 포함하는 본 발명의 조성물
한 측면에서, 본 발명은 2종 이상의 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이며, 여기서 항체 중 적어도 1종은 인간 이뮤노글로불린 G의 Fc 영역 및 항원 결합 영역을 포함하는 항체이고, 여기서 Fc 영역은 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430, E345 또는 S440에 상응하는 위치에서 아미노산의 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 2종 이상의 항체를 포함하며, 여기서 항체 중 적어도 1종은 인간 이뮤노글로불린 G의 Fc 영역 및 항원 결합 영역을 포함하는 항체이고, 여기서 Fc 영역은 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430, E345 또는 S440에 상응하는 위치에서 아미노산의 돌연변이를 포함하고, 단 S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W이다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 2종의 상이한 항체를 포함하며, 여기서 둘 다의 항체는 인간 이뮤노글로불린 G의 Fc 영역 및 항원 결합 영역을 포함하고, 여기서 Fc 영역은 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430, E345 또는 S440에 상응하는 위치에서 아미노산의 돌연변이를 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 2종의 상이한 항체를 포함하며, 여기서 둘 다의 항체는 인간 이뮤노글로불린 G의 Fc 영역 및 항원 결합 영역을 포함하고, 여기서 Fc 영역은 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430, E345 또는 S440에 상응하는 위치에서 아미노산의 돌연변이를 포함하고, 단 S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W이다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 제1 항-DR5 항체 및 제2 항-DR5 항체를 포함한다. 즉, 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 제1 항체 및 본원에 기재된 바와 같은 제2 항체를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 항체는 동일하지 않다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 Fc 영역을 갖고 제1 Fc 영역에서 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하는 제1 항-DR5 항체 및 제2 Fc 영역을 갖고 제2 Fc 영역에서 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 항체는 DR5 상의 상이한 에피토프에 결합한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 Fc 영역을 갖고 제1 Fc 영역에서 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하는 제1 항-DR5 항체 및 제2 Fc 영역을 갖고 제2 Fc 영역에서 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 제1 항체는 DR5에 대한 제2 항체의 결합을 차단하지 않는다. 또 다른 항-DR5 항체에 의한 하나의 항-DR5 항체의 차단은 실시예 7에 기재된 바와 같이 샌드위치 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에서 결정될 수 있다. 간략하게 항-DR5 항체에 의한 교차차단은 하기 단계, a) 2μg/ml의 제1 항-DR5 항체를 96-웰 편평 바닥 ELISA 플레이트에 코팅하는 단계, 이어서 b) PBSA로 차단하고 플레이트를 PBST 중에서 세척하는 단계, 이어서 c) 플레이트를 0.2 μg/ml DR5EDCD-FcHis태그 및 1 μg/ml의 제2 항-DR5 항체와 인큐베이션하는 단계, 이어서 d) PBST 중에서 세척하고, 플레이트를 항-His 태그 항체와 함께 인큐베이션하는 단계, 이어서 e) 플레이트를 세척하고, 플레이트를 폴리-HRP와 함께 인큐베이션하는 단계, 이어서 f) 플레이트를 2,2'-아지노-비스 (3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)와 함께 인큐베이션하는 단계, 이어서 g) 2% 옥살산을 첨가하여 기질 반응을 정지시키는 단계, 이어서 h) ELISA 판독기 상에서 405 nm에서의 형광을 측정하는 단계에 의해 결정될 수 있다. 하나의 항-DR5 항체가 또 다른 항-DR5 항체에 의한 DR5에의 결합을 차단하는지 여부는 하기 식 (% 억제 = 100 -[(경쟁 항체의 존재 하에서의 결합/경쟁 항체의 부재 하에서의 결합)]*100)에 의해 계산될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 Fc 영역에서 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하는, 제1 및 제2 Fc 영역을 갖는 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 이러한 돌연변이는 E430G, E430S 및 E430T로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 Fc 영역을 갖고 E430G 돌연변이를 포함하는 제1 항-DR5 항체 및 제2 Fc 영역을 갖고 E430G 돌연변이를 포함하는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 항체는 DR5 상의 상이한 에피토프에 결합한다. 본 발명의 항체의 인간 DR5 상의 세포외 도메인 상의 에피토프 또는 결합 영역은 실시예 6에 기재된 바와 같이 도메인-스와핑된 DR5 분자의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 간략하게, 도메인-스와핑된 DR5 분자는 CHO 세포에서 일시적으로 발현되고, 도메인-스와핑된 인간 DR5 분자에 대한 항체의 결합은 FACS 검정에 의해 결정된다. 도메인-스와핑된 인간 DR5 분자에 대한 결합의 상실은 인간 DR5의 스와핑된 도메인이 항체에 대한 결합에 수반되는 1개 이상의 아미노산을 함유한다는 것을 나타낸다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 Fc 영역을 갖는 제1 항-DR5 항체 및 제2 Fc 영역을 갖는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 제1 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열:
a) (VH) 서열식별번호: 1, 2, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고,
상기 제2 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열:
b) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하고,
바람직하게는 여기서 상기 제1 항-DR5 항체 및 상기 제2 항-DR5 항체는 제1 및 제2 Fc 영역에서 인간 IgG1의 E430에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 Fc 영역을 갖는 제1 항-DR5 항체 및 제2 Fc 영역을 갖는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 제1 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열:
a) (VH) 서열식별번호: 1, 2, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고,
상기 제2 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열:
b) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하고,
여기서 상기 제1 항-DR5 항체 및 상기 제2 항-DR5 항체는 제1 및 제2 Fc 영역에서 E430G 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 Fc 영역을 갖는 제1 항-DR5 항체 및 제2 Fc 영역을 갖는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 제1 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열:
a) (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고,
상기 제2 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열,
b) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하고,
여기서 상기 제1 항-DR5 항체 및 상기 제2 항-DR5 항체는 바람직하게는 제1 및 제2 Fc 영역에서 인간 IgG1의 E430에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 Fc 영역을 갖는 제1 항-DR5 항체 및 제2 Fc 영역을 갖는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 제1 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열
a) (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열
b) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하고,
여기서 상기 제1 항-DR5 항체 및 상기 제2 항-DR5 항체는 제1 및 제2 Fc 영역에서 E430G 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 Fc 영역을 갖고 Fc 영역에서 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E345에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하는 제1 항-DR5 항체 및 Fc 영역을 갖고 Fc 영역에서 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E345에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 항체는 DR5 상의 상이한 에피토프에 결합한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 Fc 영역을 갖고 Fc 영역에서 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E345에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하는 제1 항-DR5 항체 및 Fc 영역을 갖고 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E345에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 제1 항체는 DR5에 대한 제2 항체의 결합을 차단하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 Fc 영역을 갖고 제1 및 제2 Fc 영역에서 E345에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하는 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 이러한 돌연변이는 E345K, E345Q, E345R 및 E345Y로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 Fc 영역을 갖고 E345K를 포함하는 제1 항-DR5 항체 및 제2 Fc 영역을 갖고 E345K 돌연변이를 포함하는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 항체는 DR5 상의 상이한 에피토프에 결합한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 Fc 영역을 갖는 제1 항-DR5 항체 및 제2 Fc 영역을 갖는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 제1 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열,
a) (VH) 서열식별번호: 1, 2, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열,
b) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하고, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체 및 상기 제2 항-DR5 항체는 제1 및 제2 Fc 영역에서 인간 IgG1의 E345에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 Fc 영역을 갖는 제1 항-DR5 항체 및 제2 Fc 영역을 갖는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 1, 2, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하고, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체 및 상기 제2 항-DR5 항체는 제1 및 제2 Fc 영역에서 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E345에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 Fc 영역을 갖는 제1 항-DR5 항체 및 제2 Fc 영역을 갖는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 제1 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열,
a) (VH) 서열식별번호: 1, 2, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열,
b) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하고, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체 및 상기 제2 항-DR5 항체는 제1 및 제2 Fc 영역에서 E345K 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 Fc 영역을 갖는 제1 항-DR5 항체 및 제2 Fc 영역을 갖는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 1, 2, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하고, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체 및 상기 제2 항-DR5 항체는 제1 및 제2 Fc 영역에서 E345K 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 Fc 영역을 갖는 제1 항-DR5 항체 및 제2 Fc 영역을 갖는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 제1 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열,
a) (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열,
b) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하고, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체 및 상기 제2 항-DR5 항체는 제1 및 제2 Fc 영역에서 E345에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 Fc 영역을 갖는 제1 항-DR5 항체 및 제2 Fc 영역을 갖는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하고, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체 및 상기 제2 항-DR5 항체는 제1 및 제2 Fc 영역에서 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E345에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 Fc 영역을 갖는 제1 항-DR5 항체 및 제2 Fc 영역을 갖는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 제1 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열,
a) (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열,
b) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하고, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체 및 상기 제2 항-DR5 항체는 제1 및 제2 Fc 영역에서 E345K 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 Fc 영역을 갖는 제1 항-DR5 항체 및 제2 Fc 영역을 갖는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하고, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체 및 상기 제2 항-DR5 항체는 제1 및 제2 Fc 영역에서 E345K 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 Fc 영역을 갖고 제1 및 제2 Fc 영역에서 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 S440에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하는 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 이러한 돌연변이는 S440W 및 S440Y로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 Fc 영역을 갖는 제1 항-DR5 항체 및 제2 Fc 영역을 갖는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 1, 2, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하고, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체 및 상기 제2 항-DR5 항체는 제1 및 제2 Fc 영역에서 S440Y 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 Fc 영역을 갖는 제1 항-DR5 항체 및 제2 Fc 영역을 갖는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하고, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체 및 상기 제2 항-DR5 항체는 제1 및 제2 Fc 영역에서 S440Y 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 Fc 영역을 갖는 제1 항-DR5 항체 및 제2 Fc 영역을 갖는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 항체는 제1 및 제2 Fc 영역에서 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 K439E 또는 S440K에 상응하는 추가의 육량체화-억제 돌연변이를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 및 제2 Fc 영역을 갖는 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 항-DR5 항체는 제1 및 제2 Fc 영역에서 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430, E345 또는 S440에 상응하는 아미노산 위치에서 육량체화 증진 돌연변이를 포함하고, 여기서 제1 항체는 K439에 상응하는 위치의 아미노산에서 추가의 돌연변이를 포함하고, 여기서 제2 항체는 S440에 상응하는 위치의 아미노산에서 추가의 돌연변이를 포함하며, 단, 추가의 돌연변이가 S440에 있을 때에는, 육량체화 증진 돌연변이가 S440에 있지 않는다. 즉, 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 제1 항-DR5 항체는 육량체화 증진 돌연변이, 예컨대 E430G 및 K439E를 포함하고, 제2 항-DR5 항체는 육량체화 증진 돌연변이, 예컨대 E430G 및 S440K를 포함한다. 즉, 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 제1 항-DR5 항체는 육량체화 증진 돌연변이, 예컨대 E345K 및 K439E를 포함하고, 제2 항-DR5 항체는 육량체화 증진 돌연변이, 예컨대 E345K 및 S440K를 포함한다. 본원에는 K439E 돌연변이를 포함하는 항체 및 S440K 돌연변이를 포함하는 항체의 조합물 사이에서 독점적으로 육량체화가 일어나는 조성물을 허용하는 실시양태가 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 인간 DR5 상의 상이한 에피토프에 결합하는 제1 항-DR5 항체 및 제2 항-DR5 항체를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 46의 아미노산 잔기 116-138 내에 위치하는 1개 이상의 아미노산 잔기 및 아미노산 잔기 139-166 내에 위치하는 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하거나 필요로 하는 DR5 상의 에피토프에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 제1 항-DR5 항체, 및 서열식별번호: 46의 아미노산 잔기 79-138 내에 위치하는 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하거나 필요로 하는 DR5 상의 에피토프에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 제2 항-DR5 항체를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 DR5에 결합하는 상기 제1 항-DR5 항체를 포함하며, 상기 항체는 DR5에 대한 상기 제2 항-DR5 항체의 결합을 차단하지 않는다. 즉, 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 DR5에 결합하는 제1 항-DR5 항체 및 DR5에 결합하는 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 제1 및 제2 항-DR5 항체는 DR5에 대한 결합에 대해 경쟁하지 않는다. 따라서, 본 발명의 문맥에서, 제2 항-DR5 항체의 결합을 차단하지 않는 제1 항-DR5 항체는 제2 항-DR5 항체와 경쟁하지 않는 제1 항-DR5 항체와 동일할 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 상기 제1 항체는 6개의 CDR 서열을 포함하는 VH 영역 및 VL 영역을 포함하고, 상기 총 6개의 CDR 서열은 하기 제시된 CDR 서열: a) (VH) 서열식별번호: 1, 2, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 상기 제2 항체는 6개의 CDR 서열을 포함하는 VH 영역 및 VL 영역을 포함하고, 상기 총 6개의 CDR 서열은 하기 제시된 CDR 서열: b) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 그의 한 실시양태에서, 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체의 총 6개의 CDR 서열의 서열 동일성은 적어도 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99%이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항체는 하기 6개의 CDR 서열,
a) (VH) 서열식별번호: 1, 2, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항체는 하기 6개의 CDR 서열,
b) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하거나, 또는 여기서 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체는
c) 각각 상기 (a) 또는 (b)에 정의된 6개의 CDR 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이 또는 치환을 갖는 상기 6개의 CDR 서열을 포함한다.
즉, 항원 결합 영역의 6개의 CDR 서열에 걸쳐 1개 이상의 돌연변이 또는 치환은 상기 제1 또는 제2 항체의 결합 특징, 예컨대 효능작용성 성질, DR5 에피토프 결합, 및/또는 DR5를 발현하는 표적 세포에서 아폽토시스를 유도하는 능력을 변화시키지 않는다. 즉, 한 실시양태에서, 항원 결합 영역을 포함하는 6개의 CDR에 걸쳐 최대 총 5개의 돌연변이 또는 치환이 허용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, VH 영역의 3개의 CDR에 걸쳐 최대 5개의 돌연변이 또는 치환, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이 또는 치환이 이루어지고, VL 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 다른 실시양태에서, VH 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이 또는 치환이 이루어지지 않지만, VL 영역의 CDR에 걸쳐 최대 5개, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이 또는 치환이 발견된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서
a) 상기 제1 항체는 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 1, 2, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항체는 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하거나, 또는 여기서
b) 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체는 각각 a)에 정의된 각각의 항체의 6개의 CDR 서열을 포함하거나 또는 상기 6개의 CDR 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환을 포함한다.
즉, 항원 결합 영역의 6개의 CDR 서열에 걸쳐 1개 이상의 돌연변이, 예를 들어 치환은 상기 제1 또는 제2 항체의 결합 특징, 예컨대 효능작용성 성질, DR5 에피토프 결합, 및/또는 DR5를 발현하는 표적 세포에서 아폽토시스를 유도하는 능력을 변화시키지 않는다. 즉, 한 실시양태에서, 항원 결합 영역을 포함하는 6개의 CDR에 걸쳐 최대 총 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 허용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, VH 영역의 3개의 CDR에 걸쳐 최대 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이 또는 치환이 이루어지고, VL 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 다른 실시양태에서, VH 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이, 예를 들어 치환이 이루어지지 않지만, VL 영역의 CDR에 걸쳐 최대 5개, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 발견된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항체는 6개의 CDR 서열을 포함하는 VH 영역 및 VL 영역을 포함하고, 여기서 총 6개의 CDR 서열은 하기 제시된 CDR 서열: a) (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖고; 상기 제2 항체는 6개의 CDR 서열을 포함하는 VH 영역 및 VL 영역을 포함하고, 여기서 총 6개의 CDR 서열은 하기 제시된 CDR 서열; b) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
그의 한 실시양태에서, 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체의 총 6개의 CDR 서열의 서열 동일성은 적어도 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99%이다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서
a) 상기 제1 항체는 하기 6개의 CDR 서열, (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항체는 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하거나, 또는 여기서
b) 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체는 각각 상기 a)에 정의된 6개의 CDR 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이 또는 치환을 갖는 상기 6개의 CDR 서열을 포함한다.
즉, 항원 결합 영역의 6개의 CDR 서열에 걸쳐 1개 이상의 돌연변이 또는 치환은 상기 제1 또는 제2 항체의 결합 특징, 예컨대 효능작용성 성질, DR5 에피토프 결합, 및/또는 DR5를 발현하는 표적 세포에서 아폽토시스를 유도하는 능력을 변화시키지 않는다. 즉, 한 실시양태에서, 항원 결합 영역을 포함하는 6개의 CDR에 걸쳐 최대 총 5개의 돌연변이 또는 치환이 허용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, VH 영역의 3개의 CDR에 걸쳐 최대 5개의 돌연변이 또는 치환, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이 또는 치환이 이루어지고, VL 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 다른 실시양태에서, VH 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이 또는 치환이 이루어지지 않지만, VL 영역의 CDR에 걸쳐 최대 5개, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이 또는 치환이 발견된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서
a) 상기 제1 항체는 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항체는 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하거나, 또는 여기서 b) 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체는 각각 (a)에 정의된 각각의 항체의 6개의 CDR 서열을 포함하거나 또는 상기 6개의 CDR 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환을 포함한다. 즉, 항원 결합 영역의 6개의 CDR 서열에 걸쳐 1개 이상의 돌연변이, 예를 들어 치환은 상기 제1 또는 제2 항체의 결합 특징, 예컨대 효능작용성 성질, DR5 에피토프 결합, 및/또는 DR5를 발현하는 표적 세포에서 아폽토시스를 유도하는 능력을 변화시키지 않는다. 즉, 한 실시양태에서, 항원 결합 영역을 포함하는 6개의 CDR에 걸쳐 최대 총 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 허용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, VH 영역의 3개의 CDR에 걸쳐 최대 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이 또는 치환이 이루어지고, VL 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 다른 실시양태에서, VH 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이, 예를 들어 치환이 이루어지지 않지만, VL 영역의 CDR에 걸쳐 최대 5개, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 발견된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하고, 상기 제1 항체는 6개의 CDR 서열을 포함하는 VH 영역 및 VL 영역을 포함하고, 상기 총 6개의 CDR 서열은 하기 제시된 CDR 서열: a) (VH) 서열식별번호: 16, 17, 18 및 (VL) 서열식별번호: 21, GAS, 6과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 상기 제2 항체는 6개의 CDR 서열을 포함하는 VH 영역 및 VL 영역을 포함하고, 상기 총 6개의 CDR 서열은 하기 제시된 CDR 서열: b) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
그의 한 실시양태에서, 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체의 총 6개의 CDR 서열의 서열 동일성은 적어도 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99%이다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서
a) 상기 제1 항체는 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 16, 17, 18 및 (VL) 서열식별번호: 21, GAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항체는 하기 6개의 CDR 서열 (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하거나, 또는 여기서 b) 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체는 각각 (a)에 정의된 각각의 항체의 6개의 CDR 서열을 포함하거나 또는 상기 6개의 CDR 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환을 포함한다. 즉, 항원 결합 영역의 6개의 CDR 서열에 걸쳐 1개 이상의 돌연변이, 예를 들어 치환은 상기 제1 또는 제2 항체의 결합 특징, 예컨대 효능작용성 성질, DR5 에피토프 결합, 및/또는 DR5를 발현하는 표적 세포에서 아폽토시스를 유도하는 능력을 변화시키지 않는다. 즉, 한 실시양태에서, 항원 결합 영역을 포함하는 6개의 CDR에 걸쳐 최대 총 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 허용된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, VH 영역의 3개의 CDR에 걸쳐 최대 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이 또는 치환이 이루어지고, VL 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이가 이루어지지 않는다. 다른 실시양태에서, VH 영역의 CDR에 걸쳐서는 돌연변이, 예를 들어 치환이 이루어지지 않지만, VL 영역의 CDR에 걸쳐 최대 5개, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환이 발견된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 상기 임의의 실시양태에 정의된 바와 같은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 상기 제1 및 제2 항체는 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1에서의 위치 K439 또는 S440에 상응하는 Fc 영역에서 돌연변이를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 K439에 상응하는 돌연변이, 예컨대 K439E를 포함하는 제1 항체, 및 S440에 상응하는 돌연변이, 예컨대 S440K를 포함하는 제2 항체를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 S440에 상응하는 돌연변이, 예컨대 S440K를 포함하는 제1 항체, 및 K439에 상응하는 돌연변이, 예컨대 K439E를 포함하는 제2 항체를 포함한다. 본원에는 조성물이 적어도 2개의 돌연변이, 예컨대 E430G 및 K439E를 포함하는 제1 항체, 및 적어도 2개의 돌연변이, 예컨대 E430G 및 S440K를 포함하는 제2 항체를 포함하는 것인 실시양태가 제공된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 조성물은 적어도 2개의 돌연변이, 예컨대 E345K 및 K439E를 포함하는 제1 항체, 및 적어도 2개의 돌연변이, 예컨대 E345K 및 S440K를 포함하는 제2 항체를 포함한다. 본원에는 상이한 특이성을 갖는 항체의 육량체화를 가능하게 하는 실시양태가 제공된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 상기 제1 항체는 하기 서열: (a) (VH) CDR1 서열식별번호: 1, CDR2 서열식별번호: 8, CDR3 서열식별번호: 3 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 5, CDR2 FAS, CDR3 서열식별번호: 6을 포함하고, 상기 제2 항체는 하기 서열: (b) (VH) CDR1 서열식별번호: 10, CDR2 서열식별번호: 2, CDR3 서열식별번호: 11 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 13, CDR2 RTS, CDR3 서열식별번호: 14를 포함하거나, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b)에 정의된 바와 같은 (VH) CDR1, CDR2 및 CDR3 및 (VL) CDR1, CDR2 및 CDR3 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이 또는 치환을 갖는 상기 6개의 CDR을 포함한다. 즉, 항원 결합 영역의 6개의 CDR 서열에 걸쳐 1개 이상의 돌연변이 또는 치환은 상기 제1 또는 제2 항체의 결합 특징, 예컨대 효능작용성 성질, DR5 에피토프 결합, 및/또는 DR5를 발현하는 표적 세포에서 아폽토시스를 유도하는 능력을 변화시키지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 상기 제1 및 제2 항체는 하기 CDR 서열: (a) 상기 제1 항체는 하기 CDR 서열: (VH) CDR1 서열식별번호: 1, CDR2 서열식별번호: 8, CDR3 서열식별번호: 3 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 5, CDR2 FAS, CDR3 서열식별번호: 6을 포함하고, 상기 제2 항체는 하기 CDR 서열: (VH) CDR1 서열식별번호: 10, CDR2 서열식별번호: 2, CDR3 서열식별번호: 11 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 13, CDR2 RTS, CDR3 서열식별번호: 14를 포함하거나, 또는 (b) 각각의 항체에 대한 상기 CDR 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환을 포함하는, 각각의 항체에 대해 (a)에 기재된 CDR 서열을 포함한다. 즉, 항원 결합 영역의 6개의 CDR 서열에 걸쳐 1개 이상의 돌연변이, 예를 들어 치환은 상기 제1 또는 제2 항체의 결합 특징, 예컨대 효능작용성 성질, DR5 에피토프 결합, 및/또는 DR5를 발현하는 표적 세포에서 아폽토시스를 유도하는 능력을 변화시키지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 상기 제1 항체는 하기 서열: (a) (VH) CDR1 서열식별번호: 1, CDR2 2, CDR3 3 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 5, CDR2 FAS, CDR3 6을 포함하고, 상기 제2 항체는 하기 서열: (b) (VH) CDR1 서열식별번호: 10, CDR2 2, CDR3 11 및 (VL) 서열식별번호: CDR1 13, CDR2 RTS, CDR3 14를 포함하거나, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b)에 정의된 바와 같은 (VH) CDR1, CDR2 및 CDR3 및 (VL) CDR1, CDR2 및 CDR3에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이 또는 치환을 갖는 상기 6개의 CDR 서열을 포함한다. 즉, 항원 결합 영역의 6개의 CDR 서열에 걸쳐 1개 이상의 돌연변이 또는 치환은 상기 제1 또는 제2 항체의 결합 특징, 예컨대 효능작용성 성질, DR5 에피토프 결합, 및/또는 DR5를 발현하는 표적 세포에서 아폽토시스를 유도하는 능력을 변화시키지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 상기 제1 및 제2 항체는 하기 CDR 서열: (a) 상기 제1 항체는 하기 CDR 서열: (VH) CDR1 서열식별번호: 1, CDR2 서열식별번호: 2, CDR3 서열식별번호: 3 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 5, CDR2 FAS, CDR3 서열식별번호: 6을 포함하고, 상기 제2 항체는 하기 CDR 서열: (VH) CDR1 서열식별번호: 10, CDR2 서열식별번호: 2, CDR3 서열식별번호: 11 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 13, CDR2 RTS, CDR3 서열식별번호: 14를 포함하거나, 또는 (b) 각각의 항체에 대해 (a)에 기재된 CDR 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환을 포함하는 각각의 항체에 대한 상기 CDR 서열을 포함한다. 즉, 항원 결합 영역의 6개의 CDR 서열에 걸쳐 1개 이상의 돌연변이, 예를 들어 치환은 상기 제1 또는 제2 항체의 결합 특징, 예컨대 효능작용성 성질, DR5 에피토프 결합, 및/또는 DR5를 발현하는 표적 세포에서 아폽토시스를 유도하는 능력을 변화시키지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 상기 제1 항체는 하기 서열: (a) (VH) CDR1 서열식별번호: 16, CDR2 서열식별번호: 17, CDR3 서열식별번호: 18 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 21, CDR2 GAS, CDR3 서열식별번호: 22를 포함하고, 상기 제2 항체는 하기 서열: (b) (VH) CDR1 서열식별번호: 10, CDR2 서열식별번호: 2, CDR3 서열식별번호: 11 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 13, CDR2 RTS, CDR3 서열식별번호: 14를 포함하거나, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b)에 정의된 바와 같은 (VH) CDR1, CDR2 및 CDR3 및 (VL) CDR1, CDR2 및 CDR3에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이 또는 치환을 갖는 상기 6개의 CDR 서열을 포함한다. 즉, 항원 결합 영역의 6개의 CDR 서열에 걸쳐 1개 이상의 돌연변이 또는 치환은 상기 제1 또는 제2 항체의 결합 특징, 예컨대 효능작용성 성질, DR5 에피토프 결합, 및/또는 DR5를 발현하는 표적 세포에서 아폽토시스를 유도하는 능력을 변화시키지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 상기 제1 및 제2 항체는 하기 CDR 서열: (a) 상기 제1 항체는 하기 CDR 서열: (VH) CDR1 서열식별번호: 16, CDR2 서열식별번호: 17, CDR3 서열식별번호: 18 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 21, CDR2 GAS, CDR3 서열식별번호: 22를 포함하고, 상기 제2 항체는 하기 CDR 서열: (VH) CDR1 서열식별번호: 10, CDR2 서열식별번호: 2, CDR3 서열식별번호: 11 및 (VL) CDR1 서열식별번호: 13, CDR2 RTS, CDR3 서열식별번호: 14를 포함하거나, 또는 (b) 각각의 항체에 대해 (a)에 기재된 CDR 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이, 예를 들어 치환을 포함하는 상기 각각의 항체에 대한 상기 CDR 서열을 포함한다. 즉, 항원 결합 영역의 6개의 CDR 서열에 걸쳐 1개 이상의 돌연변이, 예를 들어 치환은 상기 제1 또는 제2 항체의 결합 특징, 예컨대 효능작용성 성질, DR5 에피토프 결합, 및/또는 DR5를 발현하는 표적 세포에서 아폽토시스를 유도하는 능력을 변화시키지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 제1 및 제2 항체를 포함하며, 여기서 둘 다의 항체는 인간 이뮤노글로불린 G의 Fc 영역 및 항원 결합 영역을 포함하며, 여기서 Fc 영역은 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430, E345 또는 S440에 상응하는 위치에서 아미노산의 돌연변이를 포함하고, 여기서 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체는 조성물 중에 1:49 내지 49:1 몰비, 예컨대 1:1 몰비, 1:2 몰비, 1:3 몰비, 1:4 몰비, 1:5 몰비, 1:6 몰비, 1:7 몰비, 1:8 몰비, 1:9 몰비, 1:10 몰비, 1:15 몰비, 1:20 몰비, 1:25 몰비, 1:30 몰비, 1:35 몰비, 1:40 몰비, 1:45 몰비, 1:50 몰비, 50:1 몰비, 45:1 몰비, 40:1 몰비, 35:1 몰비, 30:1 몰비, 25:1 몰비, 20:1 몰비, 15:1 몰비, 10:1 몰비, 9:1 몰비, 8:1 몰비, 7:1 몰비, 6:1 몰비, 5:1 몰비, 4:1 몰비, 3:1 몰비, 2:1 몰비로 존재한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 제1 및 제2 항체를 포함하며, 여기서 둘 다의 항체는 인간 이뮤노글로불린 G의 Fc 영역 및 항원 결합 영역을 포함하며, 여기서 Fc 영역은 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430, E345 또는 S440에 상응하는 위치에서 아미노산의 돌연변이를 포함하고, 단 S440에서의 돌연변이는 S440Y 또는 S440W이며, 여기서 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체는 조성물 중에 1:49 내지 49:1 몰비, 예컨대 약 1:1 몰비, 약 1:2 몰비, 약 1:3 몰비, 약 1:4 몰비, 약 1:5 몰비, 약 1:6 몰비, 약 1:7 몰비, 약 1:8 몰비, 약 1:9 몰비, 약 1:10 몰비, 약 1:15 몰비, 약 1:20 몰비, 약 1:25 몰비, 약 1:30 몰비, 약 1:35 몰비, 약 1:40 몰비, 약 1:45 몰비, 약 1:50 몰비, 약 50:1 몰비, 약 45:1 몰비, 약 40:1 몰비, 약 35:1 몰비, 약 30:1 몰비, 약 25:1 몰비, 약 20:1 몰비, 약 15:1 몰비, 약 10:1 몰비, 약 9:1 몰비, 약 8:1 몰비, 약 7:1 몰비, 약 6:1 몰비, 약 5:1 몰비, 약 4:1 몰비, 약 3:1 몰비, 약 2:1 몰비로 존재한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체는 조성물 중에 1:9 내지 9:1 몰비로 존재한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체는 조성물 중에 약 1:9 내지 9:1 몰비로 존재한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체는 조성물 중에 약 1:4 내지 4:1 몰비, 예컨대 약 1:3 내지 3:1 몰비, 예컨대 약 1:2 내지 2:1 몰비로 존재한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체는 조성물 중에 대략 1:1 몰비로 존재한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체는 조성물 중에 1:1 몰비로 존재한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항체 및 제2 항체 및/또는 임의의 추가의 항체는 조성물 중에 등몰비로 존재한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항체는 조성물 중에 5mg/ml로 존재하고, 상기 제2 항체는 조성물 중에 5mg/ml로 존재하고, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 5 mg/ml의 제1 항체, 5 mg/ml의 제2 항체, 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨, pH 6.0을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항체는 조성물 중에 10mg/ml로 존재하고, 상기 제2 항체는 조성물 중에 10mg/ml로 존재하고, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함하고, 바람직하게는 여기서 조성물은 10 mg/ml의 상기 제1 항체, 10 mg/ml의 상기 제2 항체, 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨, pH 6.0을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항체는 조성물 중에 15mg/ml로 존재하고, 상기 제2 항체는 조성물 중에 15mg/ml로 존재하고, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 15 mg/ml의 제1 항체, 15 mg/ml의 제2 항체, 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨, pH 6.0을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항체는 조성물 중에 20mg/ml로 존재하고, 상기 제2 항체는 조성물 중에 20mg/ml로 존재하고, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 20 mg/ml의 제1 항체, 20 mg/ml의 제2 항체, 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨, pH 6.0을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항체는 조성물 중에 30mg/ml로 존재하고, 상기 제2 항체는 조성물 중에 30mg/ml로 존재하고, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 30 mg/ml의 제1 항체, 30 mg/ml의 제2 항체, 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨, pH 6.0을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항체는 조성물 중에 40mg/ml로 존재하고, 상기 제2 항체는 조성물 중에 40mg/ml로 존재하고, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 40 mg/ml의 제1 항체, 40 mg/ml의 제2 항체, 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨, pH 6.0을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항체는 조성물 중에 50mg/ml로 존재하고, 상기 제2 항체는 조성물 중에 50 mg/ml로 존재하고, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 50 mg/ml의 제1 항체, 50 mg/ml의 제2 항체, 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨, pH 6.0을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 및 제2 항체는 조성물 중에 10 mg/ml 항체의 총 항체 농도로 존재하고, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 10 mg/ml 항체의 총 항체 농도의 제1 및 제2 항체, 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨, pH 6.0을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 및 제2 항체는 조성물 중에 20 mg/ml 항체의 총 항체 농도로 존재하고, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 20 mg/ml 항체의 총 항체 농도의 제1 및 제2 항체, 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨, pH 6.0을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 및 제2 항체는 조성물 중에 30 mg/ml 항체의 총 항체 농도로 존재하고, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 30 mg/ml 항체의 총 항체 농도의 제1 및 제2 항체, 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨, pH 6.0을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 및 제2 항체는 조성물 중에 40 mg/ml 항체의 총 항체 농도로 존재하고, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 40 mg/ml 항체의 총 항체 농도의 제1 및 제2 항체, 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨, pH 6.0을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 및 제2 항체는 조성물 중에 50mg/ml 항체의 총 항체 농도로 존재하고, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 50 mg/ml 항체의 총 항체 농도의 제1 및 제2 항체, 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨, pH 6.0을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하는 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 LC는 서열식별번호: 39의 서열을 포함하고, 여기서 HC는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 1개를 포함하고:
a) (HC) 서열식별번호: 33;
b) (HC) 서열식별번호: 34;
c) (HC) 서열식별번호: 35;
d) (HC) 서열식별번호: 36;
e) (HC) 서열식별번호: 37; 또는
f) (HC) 서열식별번호: 38,
여기서 상기 항-DR5 항체는 조성물 중에 2mg/ml 내지 200mg/ml로 존재하며, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 10 mg/ml of 항-DR5 항체, 5 mg/ml의 제2 항체, 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨, pH 6.0을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하는 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 LC는 서열식별번호: 43의 서열을 포함하고, 여기서 HC는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 1개를 포함하고:
a) (HC) 서열식별번호: 40;
b) (HC) 서열식별번호: 41; 또는
c) (HC) 서열식별번호: 42,
여기서 상기 항-DR5 항체는 조성물 중에 2mg/ml 내지 200mg/ml로 존재하며, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 10 mg/ml of 항-DR5 항체, 5 mg/ml의 제2 항체, 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨, pH 6.0을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체는 a) 서열식별번호: 33; b) 서열식별번호: 34; c) 서열식별번호: 35; d) 서열식별번호: 36; e) 서열식별번호: 37; 또는 f) 서열식별번호: 38로 이루어진 군으로부터 선택된 HC 서열 및 LC 서열식별번호: 39를 포함하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 g) 서열식별번호: 40; H) 서열식별번호: 41; 또는 i) 서열식별번호: 42로 이루어진 군으로부터 선택된 HC 서열 및 LC 서열식별번호: 43을 포함하고, 상기 제1 항-DR5 항체는 조성물 중에 2 mg/ml 내지 200 mg/ml로 존재하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 조성물 중에 2 mg/ml 내지 200 mg/ml로 존재하고, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 10 mg/ml의 제1 항-DR5 항체, 10 mg/ml of 제2 항-DR5 항체, 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨, pH 6.0을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체는 HC 서열식별번호: 38 및 LC 서열식별번호: 39를 포함하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 HC 서열식별번호: 42 및 LC 서열식별번호: 43을 포함하고, 상기 제1 항-DR5 항체는 조성물 중에 2 mg/ml 내지 200 mg/ml로 존재하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 조성물 중에 2 mg/ml 내지 200 mg/ml로 존재하고, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 조성물은 10 mg/ml의 제1 항-DR5 항체, 10 mg/ml of 제2 항-DR5 항체, 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨, pH 6.0을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체는 HC 서열식별번호: 38 및 LC 서열식별번호: 39를 포함하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 HC 서열식별번호: 42 및 LC 서열식별번호: 43을 포함하고, 상기 제1 항-DR5 항체는 조성물 중에 10 mg/ml 내지 20 mg/ml로 존재하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 조성물 중에 10 mg/ml 내지 20 mg/ml로 존재하고, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체는 HC 서열식별번호: 38 및 LC 서열식별번호: 39를 포함하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 HC 서열식별번호: 42 및 LC 서열식별번호: 43을 포함하고, 상기 제1 항-DR5 항체는 조성물 중에 10 mg/ml로 존재하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 조성물 중에 10 mg/ml로 존재하고, 여기서 조성물은 추가로 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨, pH 5.5 내지 6.5를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서 제약 조성물은 제1 및 제2 항-DR5 항체를 포함하며, 여기서 상기 제1 항-DR5 항체는 HC 서열식별번호: 38 및 LC 서열식별번호: 39를 포함하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 HC 서열식별번호: 42 및 LC 서열식별번호: 43을 포함하고, 상기 제1 항-DR5 항체는 조성물 중에 10 mg/ml로 존재하고, 상기 제2 항-DR5 항체는 조성물 중에 10 mg/ml로 존재하고, 여기서 조성물은 추가로 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨, pH 6을 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 이전항 중 어느 한 항에 따른 2종 이상의 제약 조성물을 포함하는 부분들의 키트에 관한 것이며, 여기서 조성물은 요법에서 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 것이다. 한 실시양태에서, 조성물은 요법에서 동시 사용을 위한 것이며, 조성물은 사용 직전에 혼합된다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 제1 항체를 포함하는 제1 제약 조성물을 본원에 정의된 바와 같은 제2 항체를 포함하는 제2 제약 조성물과 혼합하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 제약 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
치료 용도
본 발명의 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 제약 조성물은 의약으로서, 즉 의학적, 예컨대 치료 용도로 사용될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 제약 조성물에 관한 것이다 .
또 다른 측면에서, 본 발명은 장애, 예컨대 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 장애, 예컨대 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
제약 조성물은 임의의 적합한 경로 및 방식으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물의 적합한 생체내 및 시험관내 경로는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 비경구로 투여된다. 본원에 사용된 용어 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여되는"은 경장 및 국소 투여 이외의, 일반적으로 주사에 의한 투여 방식을 지칭하며, 그에는 표피, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 건내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 두개내, 흉곽내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입이 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 정맥내 또는 피하 주사 또는 주입에 의해 투여된다.
1종 이상의 항-DR5 항체를 포함하는 본 발명에 따른 제약 조성물은 DR5를 발현하는 세포와 관련된 장애의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체를 인간 대상체에게, 예를 들어 생체내로 투여하여, DR5-발현 세포와 관련된 장애를 치료 또는 예방할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 전형적으로 항-DR5 항체 또는 이중특이적 항체가 투여되는 인간이다. 예를 들어 대상체에는 DR5 기능을 조절함으로써 또는 DR5-발현 세포를 사멸시킴으로써 직접적으로 또는 간접적으로 고쳐지거나 개선될 수 있는 장애를 가진 인간 환자가 포함될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 감염성 질환, 자가면역 질환 또는 심혈관 이상의 치료에 사용하기 위한 1종 이상의 항-DR5 항체를 포함하는 본 발명에 따른 제약 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 암 및/또는 종양의 치료에 사용하기 위한 1종 이상의 항-DR5 항체를 포함하는 본 발명에 따른 제약 조성물에 관한 것이다. 용어 "암"은 전형적으로 조절되지 않는 성장을 특징으로 하는 포유류, 예컨대 인간에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재한다. 대부분의 암은 2가지 큰 그룹의 암, 즉, 고형 종양 및 혈액 종양 중 하나에 속한다.
특정한 실시양태에서, 제약 조성물은 암의 발병 위험을 감소시키거나, 암 진행에서 소정의 사건 발생을 지연시키거나, 또는 암이 관해 상태이고/거나 원발성 종양이 수술에 의해 제거되었을 때 재발의 위험을 감소시키기 위해 예방적으로 투여된다. 후자의 경우에는, 제약 조성물이 예를 들어 수술과 함께 (즉, 수술 이전, 동안 또는 이후) 투여될 수 있다. 예방적 투여는 또한 다른 생물학적 인자로 인해 존재하는 것으로 믿어지는 종양의 존재를 찾아내는 것이 어려운 경우의 환자에게 유용할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 고형 종양 및/또는 혈액 종양의 치료에 사용하기 위한 1종 이상의 항-DR5 항체를 포함하는 본 발명에 따른 제약 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 고형 종양, 예컨대 결장직장암, 예컨대 결장직장 암종 및 결장직장 선암종, 방광암, 골육종, 연골육종, 유방암, 예컨대 삼중-음성 유방암, 중추신경계암, 예컨대 교모세포종, 성상세포종, 신경모세포종, 신경 섬유육종, 신경내분비 종양, 자궁경부암, 자궁내막암, 위암, 예컨대 위 선암종, 두경부암, 신장암, 간암, 예컨대 간세포성 암종, 폐암, 예컨대 비소세포 폐암 (NSCLC) 및 소세포 폐암 (SCLC), 난소암, 췌장암, 예컨대 췌장관 암종 및 췌장 선암종, 육종 또는 피부암, 예컨대 악성 흑색종 및 비-흑색종 피부암의 치료에 사용하기 위한 1종 이상의 항-DR5 항체를 포함하는 본 발명에 따른 제약 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 혈액 종양 예컨대, 백혈병, 예컨대 만성 림프구성 백혈병 및 골수성 백혈병, 예컨대 급성 골수성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병, 림프종, 예컨대 비-호지킨 림프종 또는 다발성 골수종, 예컨대 호지킨 림프종, 및 예컨대 골수이형성 증후군의 치료에 사용하기 위한 1종 이상의 항-DR5 항체를 포함하는 본 발명에 따른 제약 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 군의 암; 방광암, 골암, 결장직장암, 육종, 자궁내막암, 섬유모세포암, 위암, 두경부암, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 근육암, 신경 조직암, 난소암, 췌장암 및 피부암으로부터 선택된 암의 치료에 사용하기 위한 1종 이상의 항-DR5 항체를 포함하는 본 발명에 따른 제약 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 DR5 양성 또는 DR5 발현 종양 또는 암의 성장을 억제하는데 사용하기 위한 1종 이상의 항-DR5 항체를 포함하는 본 발명에 따른 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, DR5 양성 종양 또는 암은 세포 표면 상에서 DR5를 발현하는 종양 세포 및/또는 암 세포인 것으로 이해해야 한다. 이러한 DR5 발현은 면역조직화학, 유동 세포측정법, 영상화 또는 다른 적합한 진단 방법에 의해 검출될 수 있다. DR5의 이질적인 발현을 나타내는 종양 및 암 조직 또한 DR5 양성 종양 및 암으로서 고려된다.
종양 및/또는 암은 DR5 발현을 나타내는 일부 종양 및/또는 암 세포 및/또는 조직 상에서 DR5를 발현할 수 있고, 일부 종양 및/또는 암은 DR5의 과다발현 또는 비정상 발현을 나타낼 수 있는 반면에, 다른 종양 및/또는 암은 DR5의 이질적인 발현을 나타낸다. 이러한 종양 및/또는 암은 모두 본 발명에 따른 항-DR5 항체, 이중특이적 항체, 및 이러한 항체를 포함하는 조성물에 의한 치료에 적합한 표적일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 DR5 발현 종양에서의 아폽토시스의 유도에 사용하기 위한 1종 이상의 항-DR5 항체를 포함하는 본 발명에 따른 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 제약 조성물의 유효량을 암을 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 상기 개체를 치료하는 용도 또는 방법은, 상기 개체에게 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 추가의 치료제는 화학요법제 (파클리탁셀, 테모졸로미드, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 이리노테칸, 독소루비신, 겜시타빈, 5-플루오로우라실, 페메트렉세드를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 키나제 억제제 (소라페닙, 수니티닙 또는 에베롤리무스를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 아폽토시스-조정제 (재조합 인간 TRAIL 또는 비리나판트를 포함하나 이에 제한되지는 않음), RAS 억제제, 프로테아솜 억제제 (보르테조밉을 포함하나 이에 제한되지는 않음), 히스톤 데아세틸라제 억제제 (보리노스타트를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 기능식품, 시토카인 (IFN-γ를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 항체 또는 항체 모방체 (항-TF, 항-AXL, 항-EGFR, 항-IGF-1R, 항-VEGF, 항-CD20, 항-CD38, 항-HER2, 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-CTLA4, 항-CD40, 항-CD137, 항-GITR, 항-VISTA (또는 다른 면역조정 표적) 항체 및 항체 모방체를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 및 항체-약물 접합체, 예컨대 브렌툭시맙 베도틴, 트라스투주맙 엠탄신, HuMax-TF-ADC 또는 HuMax-AXL-ADC의 군으로부터 선택된 작용제 또는 요법제를 포함하는 단일 작용제 또는 작용제들의 조합물이다.
본 발명의 실시양태를 기재할 때, 모든 가능한 실시양태의 조합 및 치환이 명시적으로 기재되지는 않았다. 그럼에도 불구하고, 특정한 수단이 서로 상이한 종속항에 인용되거나 상이한 실시양태에 기재되었다는 단순한 사실만으로, 이들 수단의 조합이 유리하게 사용될 수 없음을 나타내는 것은 아니다. 본 발명은 기재된 실시양태의 모든 가능한 조합 및 치환을 예상한다.
서열 표 1
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
실시예
실시예 1: 항체 및 항원 구축물
DR5를 위한 발현 구축물
인간 (서열식별번호: 46), 레서스 원숭이 (서열식별번호: 25) 및 마우스 (서열식별번호: 26)의 전장 DR5 단백질의 발현을 위한 코돈-최적화된 구축물은 입수가능한 서열: 인간 (호모 사피엔스(Homo sapiens)) DR5 (진뱅크(Genbank) 수탁 번호 NP_003833, 유니프롯KB/스위스-프롯 O14763-1), 레서스 원숭이 (마카카 물라타(Macaca mulatta)) DR5 (진뱅크 수탁 번호 EHH28346), 뮤린 (무스 무스쿨루스(Mus musculus)) DR5 (유니프롯KB/스위스-프롯 Q9QZM4)에 기초하여 생성하였다. DR5 항체의 결합 영역을 맵핑하기 위해 (실시예 6에 기재된 바와 같이), 하기 키메라 인간/마우스 DR5 구축물을 제조하였다; 인간 DR5에서 각각 하기 부분이 상응하는 마우스 DR5 서열 (숫자는 인간 서열에 대한 것임)로 교체되었다: 구축물 A aa 56-68, 구축물 B aa 56-78, 구축물 C aa 69-78, 구축물 D aa 79-115, 구축물 E 79-138, 구축물 F aa 97-138, 구축물 G aa 139-166, 구축물 H aa 139-182, 구축물 I aa 167-182, 구축물 J 167-210, 구축물 K aa 183-210. 기능 상실 돌연변이 K415N을 인간 DR5 사멸 도메인 (서열식별번호: 44)에 도입하였다. 또한, C-말단 His 태그를 갖는 인간 DR5의 세포외 도메인 (ECD)을 위한 코돈-최적화된 구축물을 생성하였다: DR5ECD-FcHis태그 (서열식별번호: 27) 및 DR5ECDdelHis (서열식별번호: 28). 모든 구축물은 클로닝에 적합한 제한 부위 및 최적의 코작(Kozak) (GCCGCCACC) 서열을 함유하였다. 구축물을 포유류 발현 벡터 pcDNA3.3 (인비트로젠(Invitrogen))에 클로닝하였다.
항체를 위한 발현 구축물
항체 발현을 위해, 키메라 인간/마우스 DR5 항체 DR5-01 및 DR5-05 (EP2684896A1에 기초함) 및 그의 인간화 변이체 hDR5-01 및 hDR5-05 (WO2014/009358에 기초함)의 이전에 기재된 VH 및 VL 서열을 관련 불변 HC 및 LC 영역을 함유하는 발현 벡터 (pcDNA3.3)에 클로닝하였다. 원하는 돌연변이를 유전자 합성 또는 부위 지정 돌연변이유발에 의해 도입하였다.
일부 실시예에서, 이전에 기재되었던 DR5에 대한 기준 항체를 사용하였다. IgG1-CONA (US7521048 B2 및 WO2010/138725에 기초함) 및 IgG1-chTRA8 (EP1506285B1 및 US7244429B2에 기초함)을 상기에 기재된 관련 항체 발현 벡터에 클로닝하였다.
일부 실시예에서, 인간 IgG1 항체 IgG1-b12, gp120-특이적 항체가 음성 대조군으로서 사용되었다 (Barbas et al., J Mol Biol. 1993 Apr 5;230(3):812-23).
일시적인 발현
항체를 IgG1,κ로서 발현시켰다. 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 플라스미드 DNA 혼합물을 빈크(Vink) 등 (Vink et al., Methods, 65 (1), 5-10 2014)에 의해 기재된 바와 같이 본질적으로 293펙틴(293fectin) (라이프 테크놀로지즈(Life technologies))을 사용하여 Expi293F 세포 (라이프 테크놀로지즈, USA)에 일시적으로 형질감염시켰다.
막 단백질을 프리스타일 맥스(Freestyle Max) 시약을 사용하여 제조자에 의해 기재된 바와 같이 프리스타일 CHO-S 세포 (라이프 테크놀로지즈)에서 발현시켰다.
단백질의 정제 및 분석
항체를 고정된 단백질 G 크로마토그래피에 의해 정제하였다. His-태그부착된 재조합 단백질을 고정된 금속 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 단백질 배치를 수많은 생물분석 검정, 예컨대 SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피, 및 외독소 수준의 측정에 의해 분석하였다.
이중특이적 항체의 생성
이중특이적 IgG1 항체는 제어된 환원 조건 하에 Fab-아암-교환에 의해 생성하였다. 이 방법을 위한 기초는 WO2011/131746에 기재된 바와 같은 구체적인 검정 조건 하에 이종이량체의 형성을 촉진시키는 상보성 CH3 도메인을 사용하는 것이다. F405L 및 K409R (EU 넘버링) 돌연변이를 항-DR5 IgG1 항체에 도입하여, 상보성 CH3 도메인과의 항체 쌍을 생성하였다. F405L 돌연변이를 IgG1-DR5-05 및 IgG1-DR5-05-E430G에 도입하였고; K409R 돌연변이를 IgG1-DR5-01 및 IgG1-DR5-01-E430G에 도입하였다. 이중특이적 항체를 생성하기 위해, 2개의 모 상보성 항체 (최종 농도 0.5 mg/mL의 각각의 항체)를 총 부피 100 μL의 TE 중에서 75 mM 2-머캅토에틸아민-HCl (2-MEA)과 함께 31℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 스핀 컬럼 (마이크로콘(Microcon) 원심분리 여과기, 30k, 밀리포어(Millipore))을 사용하여 환원제 2-MEA를 제거함으로써 환원 반응을 중단시켰다. 이러한 방식으로, 이중특이적 항체 IgG1-DR5-01-K409R x IgG1-DR5-05-F405L (BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L) 및 IgG1-DR5-01-K409R-E430G x IgG1-DR5-05-F405L-E430G (BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G)를 생성하였다.
K409R 돌연변이 및/또는 F405L 돌연변이는 상응하는 항원에 대한 항체의 결합에 대해 효과가 없었다. 즉, K409R 돌연변이 및/또는 F405L 돌연변이는 DR5에 대한 항-DR5 항체의 결합에 대해 효과가 없었다.
실시예 2: 상이한 인간 암 세포주에 대한 DR5 발현 수준
세포당 DR5 밀도를 마우스 모노클로날 항체 B-K29 (디아클론(Diaclone), Cat nr 854.860.000)를 사용하는 퀴피키트(QIFIKIT) (다코(DAKO), Cat nr K0078)를 이용하여 간접적인 면역형광에 의해 상이한 인간 암 세포주에 대해 정량화하였다. 세포를 트립신 처리에 의해 수확하고, 세포 스트레이너에 통과시켰다. 세포를 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하고, PBS로 세척하고, 2x106 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 다음 단계는 4℃에서 수행하였다. 50 μL의 단일 세포 현탁액 (100,000 세포/웰)을 폴리스티렌 96-웰 둥근 바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원(Greiner Bio-One), Cat nr 650101)에 시딩하였다. 세포를 300xg에서 3분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하고, 10 μg/mL 포화 농도에서 50 μL 항체 샘플 또는 마우스 IgG1 이소형 대조군 샘플 (비디/파밍겐(BD/Pharmingen), Cat nr 555746) 중에 재현탁시켰다. 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 펠릿화하고 150 μL FACS 완충제 (PBS + 0.1% (w/v) 소 혈청 알부민 (BSA) + 0.02% (w/v) 아지드화나트륨) 중에 재현탁시켰다. 셋업 및 보정 비드를 제조자의 지침에 따라 플레이트에 첨가하였다. 동시에 세포 및 비드를 150 μL FACS 완충제로 2회 더 세척하고, 50 μL FITC-접합된 염소-항-마우스 IgG (1/50; 다코, Cat nr F0479) 중에 재현탁시켰다. 이차 항체를 빛으로부터 보호하면서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포 및 비드를 150 μL FACS 완충제로 2회 세척하고, 150 μL FACS 완충제 중에 재현탁시켰다. 면역형광을 생존 세포의 집단 내에서 10,000 사건을 기록함으로써 FACS 칸토(Canto) ll (비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences)) 상에서 측정하였다. 보정 비드의 형광 강도의 기하 평균을 이용하여, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software), 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 제로 강도 및 제로 농도를 통과하도록 강제된 보정 곡선을 계산하였다. 각각의 세포주에 대해, 항체 결합 용량 (ABC) (혈장 막 상에 발현된 DR5 분자의 개수에 대한 추정치)은 보정 곡선의 방정식에 기초하여 (그래프패드 소프트웨어를 사용하여 표준 곡선으로부터 미지수를 내삽함) DR5-항체-염색된 세포의 기하 평균 형광 강도를 사용하여 계산하였다. 일반적으로, DR5 세포 표면 발현은 여기서 평가된 세포주에 대해 낮은 내지 중간이었다. 이들 데이터에 기초하여, 세포주를 낮은 DR5 발현 (ABC < 10,000) 및 중간 DR5 발현 (ABC > 10,000)에 따라 분류하였다. HCT-15 (ATCC, CCL-225), HT-29 (ATCC, HTB-38) 및 SW480 (ATCC, CCL-228) 결장암, BxPC-3 (ATCC, CRL-1687), HPAF-II (ATCC, CRL-1997) 및 PANC-1 (ATCC, CRL-1469) 췌장암, 및 A549 (ATCC, CCL-185) 및 SK-MES-1 (ATCC, HTB-58) 폐암 세포주는 낮은 DR5 발현 (퀴피키트 ABC 범위 3,081-8,411)을 갖는 것으로 확인되었다. COLO 205 (ATCC CCL-222™) 및 HCT 116 (ATCC CCL-247) 결장암, A375 (ATCC, CRL-1619) 피부암 및 SNU-5 (ATCC, CRL-5973) 위암 세포주는 중간 DR5 발현 (퀴피키트 ABC 범위 10,777-21,262)을 갖는 것으로 확인되었다.
실시예 3: HCT 116 세포에 대한 인간화 DR5-01 및 DR5-05 항체의 결합
인간화 항체 hDR5-01 및 hDR5-05는 특허 출원 WO2014/009358에 기재되어 있다. 정제된 IgG1-hDR5-01-K409R 및 IgG1-hDR5-05-F405L과 DR5-양성 HCT 116 인간 결장암 세포의 결합을 FACS 분석에 의해 분석하고, 키메라 항체 IgG1-DR5-01-K409R 및 IgG1-DR5-05-F405L의 결합과 비교하였다. 단일 세포 현탁액을 제조하기 위해, 트립신 1x/EDTA 0.05%와 함께 37℃에서 2분 동안 인큐베이션하기 전에, 부착성 HCT 116 세포를 PBS (비.브라운(B.Braun); Cat nr 3623140)로 2회 세척하였다. 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 세포를 펠릿화하기 전에, 10 mL 배지 [L-글루타민 및 HEPES (론자(Lonza); Cat nr BE12-168F) + 10% 철 함유 공여자 소 혈청 (라이프 테크놀로지즈; Cat nr 10371-029) + 100 유닛 페니실린 / 100 유닛 스트렙토마이신 (론자 Cat nr DE17-603E)을 갖는 맥코이(McCoy) 5A 배지]를 첨가하였다. 세포를 10 mL 배지 중에 재현탁시키고, 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 다시 펠릿화하고, FACS 완충제 중에 1.0x106 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 다음 단계는 4℃에서 수행하였다. 100 μL 세포 현탁액 샘플 (100,000 세포/웰)을 폴리스티렌 96-웰 둥근 바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원; Cat nr 650101)에 시딩하고, 300x g에서 4℃에서 3분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 세포를 연속 희석 항체 제제 시리즈 (5배 희석으로 0 내지 10 μg/mL의 범위)의 100 μL 샘플 중에 재현탁시키고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 300x g에서 4℃에서 3분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하고, 150 μL FACS 완충제로 2회 세척하였다. 세포를 빛으로부터 보호하면서 50 μL 이차 항체 R-피코에리트린 (R-PE)-접합된 염소-항-인간 IgG F(ab')2 (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch); Cat nr 109-116-098; 1/100)와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 150 μL FACS 완충제로 2회 세척하고, 150 μL FACS 완충제 중에 재현탁시키고, 항체 결합을 10,000 사건을 기록함으로써 FACS 칸토 ll (비디 바이오사이언시즈) 상에서 분석하였다. 결합 곡선은 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀 분석 (가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응)을 이용하여 분석하였다.
도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 인간화 항체 IgG1-hDR5-01-K409R 및 IgG1-hDR5-05-F405L이 각각 그들의 상응하는 키메라 항체 IgG1-DR5-01-K409R 또는 IgG1-DR5-05-F405L과 유사한 결합 곡선을 나타내었다. 인간화는 DR5 항체의 결합에 대해 효과가 없었다.
실시예 4: 육량체화-증진 돌연변이의 도입은 키메라 DR5-01 및 DR5-05 항체 및 이중특이적 항체 DR5-01xDR5-05와 DR5-양성 인간 결장암 세포의 결합에 영향을 미치지 않는다.
육량체화-증진 돌연변이 (E430G 또는 E345K)를 갖는 및 갖지 않는, IgG1-DR5-01-K409R, IgG1-DR5-05-F405L 및 이중특이적 항체 IgG1-DR5-01-K409RxIgG1-DR5-05-F405L (BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L)의 정제된 항체 변이체와 인간 결장암 세포 COLO 205의 결합을 FACS 분석에 의해 분석하였다. 비부착성 세포 및 트립신 처리된 부착성 COLO 205 세포를 함유하는 배양물 상청액을 풀링함으로써 세포를 수확하였다. 세포를 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 10 mL 배양물 배지 [25mM Hepes 및 L-글루타민 (론자 Cat nr BE12-115F) + 10% 철 함유 공여자 소 혈청 (라이프 테크놀로지즈 Cat nr 10371-029) + 50 유닛 페니실린 / 50 유닛 스트렙토마이신 (론자 Cat nr DE17-603E)을 갖는 RPMI 1640] 중에 재현탁시켰다. 세포를 카운트하고, 다시 원심분리하고, FACS 완충제 중에 0.3x106 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 다음 단계는 4℃에서 수행하였다. 100 μL 세포 현탁액 샘플 (30,000 세포/웰)을 폴리스티렌 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 시딩하고, 300xg에서 4℃에서 3분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 세포를 연속 희석 항체 제제 시리즈 (5배 희석으로 0 내지 10 μg/mL 범위의 최종 농도)의 50 μL 샘플 중에 재현탁시키고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 300xg에서 4℃에서 3분 동안 원심분리하고, 세포를 150 μL FACS 완충제로 2회 세척하였다. 세포를 빛으로부터 보호하면서 4℃에서 30분 동안 50 μL 이차 항체 R-PE-접합된 염소-항-인간 IgG F(ab')2 (잭슨 이뮤노리서치; Cat nr 109-116-098; 1/100)와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 150 μL FACS 완충제로 2회 세척하고, 100 μL FACS 완충제 중에 재현탁시키고, 항체 결합을 5,000 사건을 기록함으로써 FACS 칸토 ll (비디 바이오사이언시즈) 상에서 분석하였다. 결합 곡선은 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀 분석 (가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응)을 이용하여 분석하였다.
도 3A는 항체 IgG1-DR5-01-K409R-E430G 및 IgG1-DR5-01-K409R-E345K가 인간 결장암 세포 COLO 205에 대해 IgG1-DR5-01-K409R과 유사한 용량-의존성 결합을 나타내었음을 도시한다. 도 3B는 항체 IgG1-DR5-05-F405L-E430G 및 IgG1-DR5-05-F405L-E345K가 COLO 205 세포에 대해 IgG1-DR5-05-F405L과 유사한 용량-의존성 결합을 나타내었음을 도시한다. 도 3C는 BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G 및 BsAb DR5-01-K409R-E345K x DR5-05-F405L-E345K가 COLO 205 세포에 대해 BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L과 유사한 용량-의존성 결합을 나타내었음을 도시한다. 이들 데이터는, 육량체화-증진 돌연변이 E430G 또는 E345K의 도입이 DR5-양성 COLO 205 세포에 대한 항체 IgG1-DR5-01-K409R, IgG1-DR5-05-F405L 및 BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L의 결합에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다.
실시예 5: 레서스 마카크 DR5에 대한 키메라 DR5-01 및 DR5-05 항체의 결합.
정제된 IgG1-DR5-01-K409R-E430G 및 IgG1-DR5-05-F405L-E430G와 레서스 마카크 DR5 또는 인간 DR5를 발현하는 CHO 세포 (실시예 1에 기재됨)의 결합을 FACS 분석에 의해 분석하였다. FACS 분석 하루 전에, CHO 세포를 레서스 마카크 DR5, 인간 DR5를 코딩하는 벡터, 또는 비코딩 벡터 (모의)로 일시적으로 형질감염시켰다. 단일 세포 현탁액을 제조하기 위해, 세포를 PBS로 세척하고, FACS 완충제 중에 1.0x106 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 다음 단계는 4℃에서 수행하였다. 75 μL 세포 현탁액 샘플 (75,000 세포/웰)을 폴리스티렌 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 시딩하고, 300xg에서 4℃에서 3분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 세포를 연속 희석 항체 제제 시리즈 (5배 희석으로 10 내지 0 μg/mL의 범위)의 50 μL 샘플 중에 재현탁시키고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 300xg에서 4℃에서 3분 동안 원심분리하고, 세포를 150 μL FACS 완충제로 2회 세척하였다. 세포를 빛으로부터 보호하면서 4℃에서 30분 동안 50 μL 이차 항체 R-PE-접합된 염소-항-인간 IgG F(ab')2 (잭슨 이뮤노리서치; Cat nr 109-116-098; 1/100)와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 150 μL FACS 완충제로 2회 세척하고, 100 μL FACS 완충제 중에 재현탁시키고, 항체 결합을 100,000 사건을 기록함으로써 FACS 칸토 ll (비디 바이오사이언시즈) 상에서 분석하였다. 결합 곡선은 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀 분석 (가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응)을 이용하여 분석하였다.
도 4는 항체 IgG1-DR5-01-K409R-E430G 및 IgG1-DR5-05-F405L-E430G가 CHO 세포 상에서 발현된 레서스 마카크 DR5에 대한 용량-의존성 결합을 나타내었음을 도시한다. 인간 DR5로 형질감염된 CHO 세포 및 모의-형질감염된 CHO 세포에 대한 결합은 각각 양성 및 음성 대조군으로서 시험하였다. IgG1-DR5-01-K409R-E430G 및 IgG1-DR5-05-F405L-E430G 둘 다의 경우, 인간 DR5 및 레서스 마카크 DR5에 대한 결합에 대한 EC50 값이 동일한 범위 내에 있었고 (각각 [0.014-0.023 μg/mL] 및 [0.051-0.066 μg/mL]), 이는 IgG1-DR5-01-K409R-E430G 및 IgG1-DR5-05-F405L-E430G가 인간 및 레서스 마카크 DR5에 대해 필적할만한 결합을 나타냄을 시사한다.
실시예 6: 도메인-스와핑된 DR5 분자를 사용하여 인간 DR5에 대한 DR5-01 및 DR5-05 항체의 결합 영역의 맵핑.
인간 및 뮤린 DR5의 세포외 도메인의 아미노산 서열은 제한된 상동성을 나타내고 (도 5A), 인간화 항체 IgG1-hDR5-01-F405L 및 IgG1-hDR5-05-F405L은 뮤린 DR5에 결합하지 않는다 (도 5C, D). 항체 결합에 관여하는 인간 DR5 세포외 도메인에서 아미노산 스트레치를 식별하기 위한 목적으로, 본 발명자들은 도 5B에 가시화된 바와 같이 특이적 인간 DR5 도메인이 마우스 유사체로 교체된 11종의 인간-마우스 키메라 DR5 분자를 개발하였다 (실시예 1에 기재된 도메인-스와핑된 DR5 분자). 도메인-스와핑된 DR5 변이체를 CHO 세포 상에서 일시적으로 발현시켰다. 도메인-스와핑된 DR5 분자에 대한 DR5 항체 결합의 상실은, 인간 DR5의 스와핑된 도메인이 결합에 결정적인 1개 이상의 아미노산을 함유함을 나타낸다. 그 반대로, 도메인-스와핑된 DR5 분자에 대한 DR5 항체 결합의 유지는, 인간 DR5의 스와핑된 도메인이 결합에 결정적인 아미노산을 함유하지 않음을 나타낸다. 결합 검정을 위해, 3x106 형질감염된 세포를 세척하고, 3 mL FACS 완충제 중에 재현탁시켰다. 100 μL 세포 현탁액을 96-웰 둥근 바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원; Cat nr 650101)의 웰마다 첨가하였다 (100.000 세포/웰). 다음 단계는 4℃에서 수행하였다. 세포를 펠릿화하고, 50 μL DR5 항체 샘플 중에 재현탁시키고 (10 μg/mL 최종 농도), 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고, 빛으로부터 보호하면서 4℃에서 30분 동안 50 μL 이차 항체 R-PE-접합된 염소-항-인간 IgG F(ab')2 (잭슨 이뮤노리서치; Cat nr 109-116-098; 1/100)와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고, 120 μL FACS 완충제 중에 재현탁시키고, FACS 칸토 ll (비디 바이오사이언시즈) 상에서 분석하였다. 생존 PE-양성 세포의 백분율은 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 플롯팅하였다. 각각의 도메인-스와핑된 DR5 분자에 대한 표면 발현을 상이한 에피토프에 대한 DR5 항체의 패널을 사용하여 확인하였다 (제시되지 않음). gp120에 대한 비-표적 결합 항체 IgG1-b12는 결합에 대한 음성 대조군으로 사용되었다. 도 5C는 IgG1-hDR5-01-F405L이 구축물 E (79-138), F (97-138), G (139-166) 및 H (139-182)에 대한 결합을 상실한 반면에, 구축물 A-D (인간 DR5 서열 56-115를 커버함) 및 I-K (인간 DR5 서열 167-210을 커버함)에 대한 결합은 유지하였음을 도시한다. 그와 함께, 이들 데이터는, 아미노산 영역 116-138 및 139-166 각각이 인간 DR5로의 IgG1-hDR5-01-F405L의 결합에 필요한 1개 이상의 아미노산을 함유함을 나타낸다. 도 5D는 IgG1-hDR5-05-F405L이 구축물 D (79-115), E (79-138) 및 F (97-138)에 대한 결합을 상실한 반면에, 구축물 A-C (인간 DR5 서열 56-78을 커버함) 및 G-K (인간 DR5 서열 139-210을 커버함)에 대한 결합은 유지하였음을 도시한다. 그와 함께, 이들 데이터는, 아미노산 영역 79-138이 인간 DR5로의 IgG1-hDR5-05-F405L의 결합에 필요한 1개 이상의 아미노산을 함유함을 나타낸다.
실시예 7: DR5-01 및 DR5-05 항체에 대한 교차차단 ELISA.
DR5의 세포외 도메인에의 결합에 대한 인간화 DR5-01 및 DR5-05 항체 사이의 경쟁을 이 실시예에 기재된 바와 같이 샌드위치 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)에서 샌드위치 결합 검정에 의해 및 포르테바이오(ForteBio) 옥텟(Octet)® HTX 시스템을 사용하여 바이오층 간섭법 (Bio-Layer interferometry, BLI)에 의해 측정하였다 (데이터는 제시되지 않음). ELISA의 경우, 96-웰 편평 바닥 ELISA 플레이트 (그라이너 바이오-원; Cat nr 655092)를 4℃에서 밤새 100 μL PBS 중 2 μg/mL DR5 항체 (IgG1-hDR5-01-E430G 또는 IgG1-hDR5-05-E430G)로 코팅하였다. 200 μL PBSA [PBS/ 1% 소 혈청 알부민 (BSA; 로쉐 Cat # 10735086001)]를 첨가하여 웰을 차단하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBST [PBS/ 0.05% 트윈-20 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich); Cat nr 63158)]으로 3회 세척하였다. 다음으로, DR5ECD-FcHis태그 (서열식별번호: 27) (0.2 μg/mL 최종 농도) 및 경쟁 항체 (1 μg/mL 최종 농도)를 총 부피 100 μL의 PBSTA (PBST/ 0.2% BSA)에 첨가하고, 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBST로 3회 세척한 후, 웰을 ELISA 진탕기 상에서 실온에서 1시간 동안 PBSTA 중 100 μL 비오티닐화 항-His 태그 항체 (알앤디 시스템즈(R&D Systems); Cat nr BAM050; 1:2.000)와 함께 인큐베이션하였다. PBST로 3회 세척한 후, 웰을 ELISA 진탕기 상에서 실온에서 20분 동안 PBSTA 중 스트렙타비딘-표지된 폴리-HRP(Poly-HRP) (산퀸(Sanquin); Cat nr M2032; 1:10.000)와 함께 인큐베이션하였다. PBST로 3회 세척한 후, 빛으로부터 보호하면서 RT에서 30분 동안 100 μL의 2,2'-아지노-비스 (3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산 [ABTS (로쉐; Cat nr 11112597001)]과 함께 인큐베이션함으로써 반응을 가시화하였다. 기질 반응은 동등한 부피의 2% 옥살산을 첨가함으로써 중단시켰다. 405 nm에서의 형광을 ELISA 판독기 (바이오텍(BioTek) ELx808 흡광도 미세플레이트 판독기) 상에서 측정하였다. 도 6은 경쟁 항체의 부재 하의 DR5ECD-FcHisC태그의 결합에 대한 경쟁 항체의 존재 하의 코팅된 항체로의 DR5ECD-FcHisC태그 결합의 억제 백분율로서 표현되는 결합 경쟁을 도시한다 (% 억제 = 100 -[(경쟁 항체 존재 하의 결합/경쟁 항체 부재 하의 결합)]*100). 코팅된 IgG1-hDR5-01-E430G로의 DR5ECD-FcHis태그의 결합은 가용성 IgG1-hDR5-05-E430G의 존재 하에 억제되지 않았다. 그와 반대로, 코팅된 IgG1-hDR5-05-E430G로의 DR5ECD-FcHis태그의 결합 또한 가용성 IgG1-hDR5-01-E430G의 존재 하에 억제되지 않았다. 이들 데이터는, IgG1-hDR5-01-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G가 DR5ECD-FcHisC태그의 결합에 대해 서로 경쟁하지 않았음을 나타내고, 이는 이들이 인간 DR5의 세포외 도메인에서 구별되는 에피토프를 인식함을 시사한다. 이들 데이터는, IgG1-hDR5-01-F405L 또는 IgG1-hDR5-05-F405L (10 mM 아세트산나트륨 중 20 μg/ml, pH 6.0, 포르테바이오 Cat nr 18-1070)이 아민-반응성 차세대 바이오센서 (포르테바이오 Cat nr 18-5092) 상에 고정된 전형적인 샌드위치 검정을 이용하는 BLI에 의해 확인되었다. 후속적으로, 바이오센서를 DR5ECDdelHis (서열식별번호: 28) (샘플 희석제 중 100 nM, 포르테바이오 cat nr 18-1048)와 함께 인큐베이션하였고, 경쟁 항체 (샘플 희석제 중 5 μg/mL)의 결합을 분석하였다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 8: 육량체화-증진 돌연변이의 도입은 DR5-01 및 DR5-05 항체 및 이들의 조합물에 의한 세포 사멸 유도의 효능을 개선시킨다.
항체가 인간 결장암 세포 COLO 205 및 HCT 116을 사멸시키는 능력에 대한 IgG1-DR5-01-K409R 및 IgG1-DR5-05-F405L에서의 육량체화-증진 돌연변이 E430G의 효과를 연구하기 위해 생존율 검정을 수행하였다. 항체를 DR5-01 및 DR5-05 항체의 단일 작용제로서 및 조합물로서 시험하였다. 비부착성 세포 및 트립신 처리된 부착성 세포를 함유하는 배양물 상청액을 풀링함으로써 COLO 205 세포를 수확하였다. HCT 116 세포를 트립신 처리에 의해 수확하였다. 세포를 세포 스트레이너에 통과시키고, 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하고, 배양물 배지 중에 0.5x105 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 100 μL의 단일 세포 현탁액 (5,000 세포/웰)을 폴리스티렌 96-웰 편평 바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원, Cat nr 655182)에 시딩하였다. 50 μL의 연속 희석 항체 제제 시리즈 (5배 희석으로 0.05 내지 20,000 ng/mL 범위의 최종 농도)를 첨가하고, 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 두 항체의 조합물로 처리한 샘플에 대한 검정에서의 총 항체 농도는 단일 항체로 처리한 샘플에 대한 것과 동일하였다. 양성 대조군으로서, 세포를 5 μM 스타우로스포린 (시그마 알드리치, Cat nr S6942)과 함께 인큐베이션하였다. 배양된 세포의 생존율은 대사 활성 세포의 지표인 ATP의 존재를 정량화하는 셀타이터-글로 발광 세포 생존율 검정 (프로메가, Cat nr G7571)으로 결정하였다. 상기 키트로부터, 20 μL 루시페린 용액 시약을 웰마다 첨가하고, 500 rpm에서 2분 동안 플레이트를 진탕시킴으로써 혼합하였다. 다음으로, 플레이트를 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 100 μL 상청액을 백색 옵티플레이트(OptiPlate)-96 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), Cat nr 6005299)으로 옮기고, 발광을 엔비젼 멀티라벨(EnVision Multilabel) 판독기 (퍼킨엘머) 상에서 측정하였다. 데이터는 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀 (가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응)를 이용하여 분석하고 플롯팅하였다. 도 7은 하기 식을 이용하여 계산되는 생존 세포 백분율을 도시한다: % 생존 세포 = [(항체 샘플의 발광 - 스타우로스포린 샘플의 발광)/(항체가 없는 샘플의 발광 - 스타우로스포린 샘플의 발광)]*100.
도 7은 E430G 돌연변이의 도입이 COLO 205 (A) 및 HCT 116 (B) 세포 둘 다에서 키메라 항체 IgG1-DR5-01-K409R 및 IgG1-DR5-05-F405L의 효능을 증진시켰음을 도시한다. IgG1-DR5-01-K409R-E430G 및 IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물이 항체 단독에 비해 더 강력하였고, E430G 돌연변이를 갖지 않는 항체의 조합물에 비해 더 강력하였다. IgG1-DR5-01-K409R 및 IgG1-DR5-05-F405L의 조합물은 항체 단독에 비해 더 강력하였다. 이들 데이터는, 육량체화-증진 돌연변이 E430G의 도입이 키메라 DR5 항체 01 및 05 둘 다 단일 항체로서 및 조합물로서의 결합 시 세포 사멸의 유도를 증진시켰고, 조합물이 가장 강력하였음을 나타낸다.
실시예 9: 육량체화-증진 돌연변이를 갖는 2가지 비-교차차단 DR5 항체의 조합물은 증진된 표적 세포 사멸을 유발한다.
실시예 8에서, 육량체화 증진 돌연변이를 갖는 2가지 비-교차차단 항-DR5 항체 IgG1-DR5-01-K409R-E430G 및 IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물이 단일 항체의 효능에 비해 암 세포주에 대해 증진된 사멸을 유발하였음이 확인되었다. 여기서, 본 발명자들은 2가지 비-교차차단 대 2가지 교차차단 항-DR5 항체의 효능을 비교하였다. 단일 항체와 비교하여, 항체 IgG1-chTRA8-F405L-E430G와 비-교차차단 항체 IgG1-DR5-01-K409R-E430G 또는 교차차단 항체 IgG1-DR5-05-F405L-E430G 중 하나의 조합물이 HCT 116 결장암 세포의 사멸을 유도하는 능력을 연구하기 위해 생존율 검정을 수행하였다. 항체 IgG1-chTRA8-F405L 및 IgG1-DR5-05-F405L에 대한 교차차단 ELISA를 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행하였고, 옥텟® HTX 시스템 상에서 샌드위치 결합 검정에 의해 확인하였다 (데이터는 제시되지 않음). HCT 116 세포에 대한 생존율 검정은 연속 희석된 항체 시리즈 (5배 희석으로 0.00005 내지 20 μg/mL 범위의 최종 농도)를 사용하여 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 8은 HCT116 세포의 사멸에 있어서 단일 항체의 효능이 2가지 비-교차차단 항체 IgG1-chTRA8-F405L-E430G 및 IgG1-DR5-01-K409R-E430G의 조합에 의해 증진되었고 (도 8B), 2가지 교차차단 항체 IgG1-chTRA8-F405L-E430G 및 IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합에 의해서는 개선되지 않았음을 도시한다 (도 8C).
실시예 10: 육량체화-증진 돌연변이를 갖는 비-교차차단 항체 DR5-05 + CONA의 조합물 및 이중특이적 항체 DR5-05xCONA가 표적 세포 사멸을 유도하는 능력
육량체화-증진 돌연변이를 갖지 않는 항체의 조합물 및 이중특이적 항체 각각과 비교하여, 2가지 비-교차차단 항체 (IgG1-CONA-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E345K)의 또 다른 조합물 및 그의 이중특이적 유도체 BsAb IgG1-CONA-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E345K가 HCT 116 결장암 세포의 사멸을 유도하는 능력을 연구하기 위해 생존율 검정을 수행하였다. 항체 IgG1-CONA-K409R 및 IgG1-DR5-05-F405L에 대한 교차차단 ELISA를 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행하였고, 옥텟® HTX 시스템 상에서 샌드위치 결합 검정에 의해 확인하였다 (데이터는 제시되지 않음). HCT 116 세포에 대한 생존율 검정은 연속 희석된 항체 시리즈 (5배 희석으로 0.01 내지 20,000 ng/mL 범위의 최종 농도)를 사용하여 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 9는 육량체화-증진 돌연변이를 갖는 비-교차차단 항체 IgG1-CONA-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E345K의 조합물 및 BsAb IgG1-CONA-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E345K가 육량체화-증진 돌연변이 E430G 또는 E345K를 갖지 않는 이들 항체에 비해 HCT116 세포의 사멸에서 증진된 효능을 나타내었음을 도시한다.
실시예 11: E430G 육량체화-증진 돌연변이를 갖는 DR5-01 + DR5-05 항체 조합물이 상이한 암 세포주에서 표적 세포 사멸을 유도하는 능력
육량체화-증진 돌연변이 E430G를 갖는 및 갖지 않는 인간-마우스 키메라 항체 IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405L의 조합물이 COLO 205, HCT-15, HCT 116, HT-29 및 SW480 결장암, BxPC-3, HPAF-II 및 PANC-1 췌장암, SNU-5 위암, A549 및 SK-MES-1 폐암, 및 A375 피부암 세포의 사멸을 유도하는 능력을 연구하기 위해 생존율 검정을 수행하였다. 부착성 세포를 트립신 처리에 의해 수확하고, 세포 스트레이너에 통과시켰다. 세포를 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하고, 0.5x105 세포/mL의 농도로 배양물 배지 중에 재현탁시켰다 [COLO 205, HCT-15, SW480 및 BxPC-3: 25mM Hepes 및 L-글루타민 (론자 Cat nr BE12-115F) + 10% DBSI (라이프 테크놀로지즈 Cat nr 10371-029) + Pen/Strep (론자 Cat nr DE17-603E)을 함유하는 RPMI 1640; HCT116 및 HT-29: L-글루타민 및 Hepes (론자, Cat nr BE12-168F) + 10% DBSI + Pen/Strep을 함유하는 맥코이 5A 배지; HPAF-II 및 SK-MES-1: 이글(Eagle) 최소 필수 배지 (EMEM, ATCC Cat nr 30-2003) + 10% DBSI + Pen/Strep; PANC-1 및 A375: L-Gln을 함유하지 않고 HEPES (론자 Cat nr LO BE12-709F) + 10% DBSI + 1 mM L-글루타민 (론자 Cat nr BE17-605E) + Pen/Strep을 함유하는 DMEM 4.5 g/L 글루코스; SNU-5: IMDM (론자 Cat nr BE12-722F) + 10% DBSI + Pen/Strep; A549: F-12K 배지 (ATCC Cat nr 30-2004) + 10% DBSI + 1 mM L-글루타민 + Pen/Strep]. 100 μL의 단일 세포 현탁액 (5,000 세포/웰)을 폴리스티렌 96-웰 편평 바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원, Cat nr 655182)에 시딩하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 부착성 세포의 상청액을 150 μL 항체 샘플 (최종 농도 10 μg/mL)로 교체하고, 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로서, 세포를 5 μM 스타우로스포린 (시그마 알드리치, Cat nr S6942)과 함께 인큐베이션하였다. 세포 배양물의 생존율은 실시예 8에 기재된 바와 같이 셀타이터-글로 발광 세포 생존율 검정으로 결정하였다. 모든 시험된 세포주에 대해, 생존 세포 백분율은 비-표적 결합 음성 대조군 항체 IgG1-b12와 함께 인큐베이션한 후에 비해 10 μg/mL의 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G와 함께 인큐베이션한 후에 유의하게 더 낮았다 (도 10). 2개를 제외한 시험된 모든 세포주에서, 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 효능이 육량체화-증진 돌연변이를 갖지 않는 조합물 IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405L에 비해 유의하게 양호하였다. 이들 데이터는, 육량체화-증진 돌연변이를 갖는 키메라 DR5 항체 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물이 이차 교차-결합제를 필요로 하지 않고 결장암, 췌장암, 위암, 폐암 및 피부암을 비롯한 상이한 기원의 암 표적 세포의 사멸에서 매우 효과적이었음을 나타낸다. IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 사멸 효능 및 DR5 표적 발현 수준 사이에 상관관계는 없었다 (실시예 2에 기재됨).
실시예 12: E430G 육량체화-증진 돌연변이를 갖는 인간화 DR5-01 + DR5-05 항체 조합물이 표적 세포 사멸을 유도하는 능력.
시험관내에서 BxPC-3 및 PANC-1 췌장암 세포의 사멸을 유도하는데 있어서 키메라 항체 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물의 효능과 인간화 항체 IgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430G의 조합물의 효능을 비교하기 위해 생존율 검정을 수행하였다. 세포를 트립신 처리에 의해 수확하고, 세포 스트레이너에 통과시켰다. 세포를 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하고, 0.5x105 세포/mL의 농도로 배양물 배지 중에 재현탁시켰다. 100 μL의 단일 세포 현탁액 (5,000 세포/웰)을 폴리스티렌 96-웰 편평 바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원, Cat nr 655182)에 시딩하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 부착성 세포의 상청액을 연속 희석 항체 제제 시리즈의 항체 샘플 150 μL로 교체하고, 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로서, 세포를 5 μM 스타우로스포린 (시그마 알드리치, Cat nr S6942)과 함께 인큐베이션하였다. 세포 배양물의 생존율은 실시예 8에 기재된 바와 같이 셀타이터-글로 발광 세포 생존율 검정으로 결정하였다. 육량체화-증진 돌연변이를 갖는 인간화 항체 IgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430G의 조합물은 상응하는 키메라 항체 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물과 유사한 용량-반응 곡선을 나타내었다 (도 11).
실시예 13: 항체 IgG1-hDR5-01-E430G의 최적화
아미노산 서열 N55-G56은 IgG1-hDR5-01 및 IgG1-hDR5-05 중쇄 (서열식별번호: 2)의 CDR2 영역에 있는 잠재적인 아스파라긴 (Asn) 탈아미드화 모티프로서 확인되었다. 이 위치에서의 탈아미드화를 IgG1-hDR5-01-K409R 및 IgG1-hDR5-05-F405L에서 N55D 돌연변이의 도입에 의해 모방하여, 표적 결합에 대한 탈아미드화의 효과를 시험하였다. 실시예 3에 기재된 바와 같이 FACS 분석에 의해 IgG1-hDR5-01-N55D-K409R 및 IgG1-hDR5-05-N55D-F405L을 HCT 116 세포에 대한 결합에 대해 시험하였다. 도 12A는 N55D 돌연변이의 도입에 의한 탈아미드화의 모방이 HCT 116 세포에 대한 IgG1-hDR5-01-K409R의 강력하게 감소된 결합을 유발하였음을 도시한다. 대조적으로, IgG1-hDR5-05-F405L 및 IgG1-hDR5-05-N55D-F405L은 필적할만한 결합 곡선을 나타내었다. DR5-01 항체에서 Asn 탈아미드화의 위험을 감소시키기 위해, G56T 돌연변이를 IgG1-hDR5-01-E430G에 도입하였고, 실시예 3에 기재된 바와 같이 FACS 분석에 의해 상기 항체 변이체를 HCT 116 세포에 대한 결합에 대해 시험하였다. 도 12B는 상기 돌연변이가 HCT 116 세포에 대한 IgG1-hDR5-01-E430G의 결합에 효과가 없었음을 도시한다.
BxPC-3 췌장암 세포의 사멸을 유도하는 인간화 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 조합물의 능력과 인간화 항체 IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 조합물의 능력을 비교하기 위해 생존율 검정을 수행하였다. 생존율은 1,000 세포/웰 및 항체 농도 시리즈 (4배 희석으로 0.0001 내지 10,000 ng/mL 범위의 최종 농도, 200 μL의 총 부피)를 사용하여 실시예 11에 기재된 바와 같이 평가하였다. 도 12C는 IgG1-hDR5-01-E430G에서 G56T 돌연변이의 도입이 IgG1-hDR5-05-E430G와 조합된 항체의 사멸 효능에 대해 효과가 없었음을 도시한다.
실시예 14: 인간화 항체 hDR5-01-G56T-E430G 및 hDR5-05-E430G의 조합물에 의한 세포 사멸 유도는 육량체를 형성하는 Fc:Fc 상호작용을 필요로 한다.
세포 사멸을 유도하는데 있어서 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G에 의한 항체 육량체 형성의 필요를 분석하기 위해, 본 발명자들은 자체-반발성 돌연변이 K439E 및 S440K를 이용하였다 (Diebolder et al., Science. 2014 Mar 14;343(6176):1260-3). 한 IgG1 항체에서 또는 항체의 조합물에서 K439E 또는 S440K의 존재에 의해 유도된 항체들 사이의 Fc 반발성은 육량체화 증진 돌연변이, 예컨대 E345K 또는 E430G의 존재 하에서도 육량체화를 억제하였다 (WO2013/0044842). K439E 및 S440K 돌연변이에 의한 반발성은 하나의 또는 다른 돌연변이를 각각 보유하는 2개의 항체의 혼합물에서 돌연변이 둘 다를 조합함으로써 중화되며, 이로써 Fc:Fc 상호작용 및 육량체화가 복구된다.
IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G 둘 다에 대해, K439E 또는 S440K 돌연변이를 갖는 변이체를 생성하여 모든 상이한 조합물에서 시험하였다. 생존율 검정은 실시예 11에 기재된 바와 같이 BxPC-3 췌장암 세포 및 HCT-15 결장암 세포에 대해 연속 희석 항체 제제 시리즈 (4배 희석으로 0.3 내지 20,000 ng/mL 범위의 총 농도)를 사용하여 수행하였다.
도 13은 둘 다 동일한 반발성 돌연변이 (K439E 또는 S440K)를 보유하는 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G 변이체의 조합물이 BxPC-3 (A) 및 HCT-15 세포 (B)에서 강력하게 감소된 사멸 효능을 나타내었음을 도시한다. 각각 상보성 돌연변이 K439E 또는 S440K를 갖는 2개의 항체를 조합함으로써 반발성이 중화되었을 때 사멸 효능이 복구되었다. 이들 데이터는, Fc-Fc 상호작용에 의한 육량체화가 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G에 의한 세포 사멸의 유도를 위해 필요함을 나타낸다.
실시예 15: 항체 Fc-Fc 상호작용은 육량체화 증진 돌연변이를 갖는 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G에 의한 DR5 클러스터링 및 아폽토시스의 유도에 관여한다.
항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G에 의한 세포 사멸의 유도에서 Fc-Fc-매개된 항체 육량체화의 관여를 시험하기 위해, 본 발명자들은 Fc-Fc 상호작용과 관련있는 소수성 패치에서 코어 아미노산을 함유하는 영역에 있는 Fc와 결합하는 13-잔기 펩티드 DCAWHLGELVWCT (DeLano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456):1279-83)를 사용하였다 (Diebolder et al., Science. 2014 Mar 14;343(6176):1260-3). BxPC-3 세포에 대한 생존율 검정은 DCAWHLGELVWCT 펩티드의 존재 또는 부재 하에 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G에 대해 실시예 11에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략히, 세포를 밤새 37℃에서 인큐베이션한 후, 배양물 배지를 제거하고, Fc-결합 DCAWHLGELVWCT 펩티드, 비-특이적 대조군 펩티드 GWTVFQKRLDGSV, 또는 펩티드 없음의 희석 시리즈 (0-100 μg/mL의 범위)를 함유하는 100 μL 배양물 배지로 교체하였다. 다음으로, 50 μL 항체 샘플 (833 ng/mL 최종 농도)을 첨가하고, 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G가 BxPC-3 세포의 사멸을 유도하는 능력은 100 μg/mL Fc-결합 DCAWHLGELVWCT 펩티드에 의해 강력하게 억제되었다 (도 14). 이들 데이터는, 육량체화-증진 돌연변이를 갖는 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G가 암 세포의 세포 표면 상에서 DR5 클러스터링을 유도하고 아폽토시스를 유도하는 능력에 있어서 Fc:Fc 상호작용의 관여를 나타낸다.
실시예 16: E430G 육량체화 증진 돌연변이를 갖는 키메라 항체 조합물 DR5-01 및 DR5-05 항체가 상이한 조합 비에서 암 세포 사멸을 유도하는 능력
IgG1-DR5-01-K409R-E430G 및 IgG1-DR5-05-F405L-E430G를 상이한 비로 조합할 때, 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G가 BxPC-3 췌장암 세포의 사멸을 유도하는 능력을 연구하기 위해 생존율 검정을 수행하였다. 세포를 트립신 처리에 의해 수확하고, 세포 스트레이너에 통과시켰다. 세포를 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하고, 0.5x105 세포/mL의 농도로 배양물 배지 중에 재현탁시켰다. 100 μL의 단일 세포 현탁액 (5,000 세포/웰)을 폴리스티렌 96-웰 편평 바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원, Cat nr 655182)에 시딩하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 상이한 비의 IgG1-DR5-01-K409R-E430G 및 IgG1-DR5-05-F405L-E430G (5배 희석으로 0.06 내지 20 μg/mL 범위의 최종 농도를 갖는 연속 희석 시리즈 중에서 100:0, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90 및 0:100의 DR5-01:DR5-05 비로 나타냄)를 갖는 50 μL 항체 샘플을 첨가하고, 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로서, 세포를 5 μM 스타우로스포린 (시그마 알드리치, Cat nr S6942)과 함께 인큐베이션하였다. 세포 배양물의 생존율은 실시예 8에 기재된 바와 같이 셀타이터-글로 발광 세포 생존율 검정으로 결정하였다. 20 μg/mL 및 4 μg/mL 총 항체 농도에서, 항체 IgG1-DR5-01-K409R-E430G 및 IgG1-DR5-05-F405L-E430G 둘 다를 함유하는 모든 시험된 항체 비에서 사멸은 동등하게 효과적이었다. 0.8 μg/mL 및 0.16 μg/mL의 총 항체 농도에서, 항체 IgG1-DR5-01-K409R-E430G 및 IgG1-DR5-05-F405L-E430G 둘 다를 함유하는 모든 시험된 항체 비는 사멸을 유도하였다 (도 15).
실시예 17: E430G 육량체화 증진 돌연변이를 갖는 인간화 항체 DR5-01 및 DR5-05 항체의 조합물이 상이한 조합 비에서 암 세포 사멸을 유도하는 능력
상이한 항체 비로 조합하였을 때 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G가 BxPC-3 췌장암 세포 및 HCT-15 결장암 세포의 사멸을 유도하는 능력을 연구하기 위해 생존율 검정을 수행하였다. 일반적으로, 실시예 16에 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다. 간략히, BxPC-3의 경우 10 μg/mL 및 HCT-15의 경우 20 μg/mL의 최종 항체 농도에서 상이한 비의 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G (도 16에 100:0, 98:2, 96:4, 94:6, 92:8, 90:10, 50:50, 10:90, 8:92, 6:94, 4:96, 2:98 및 0:100의 DR5-01:DR5-05 비로 나타냄)를 갖는 폴리스티렌 96-웰 편평 바닥 플레이트 중에서 150 μL로 미리 부착된 세포 (5,000 세포/웰)를 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 세포 배양물의 생존율은 실시예 8에 기재된 바와 같이 셀타이터-글로 발광 세포 생존율 검정으로 결정하였다. 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G 둘 다를 함유하는 모든 시험된 항체 비에서 사멸은 동등하게 효과적이었다 (도 16).
실시예 18: E430G 육량체화-증진 돌연변이를 갖는 인간화 DR5-01 + DR5-05 항체의 조합물은 카스파제 의존성 세포독성을 유도한다.
카스파제 억제제의 존재 및 부재 하에 인간화 항체 IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 조합물의 세포독성을 비교하기 위해 생존율 검정을 수행하였다. PANC-1 및 BxPC3 췌장암 세포를 트립신 처리에 의해 수확하고, 세포 스트레이너에 통과시켰다. 세포를 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하고, 0.5x105 세포/mL의 농도로 배양물 배지 중에 재현탁시켰다. 100 μL의 단일 세포 현탁액 (5,000 세포/웰)을 폴리스티렌 96-웰 편평 바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원, Cat nr 655182)에 시딩하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 25 μL 범-카스파제 억제제 Z-Val-Ala-DL-Asp-플루오로메틸케톤 (Z-VAD-FMK, 150 μL 중 5 μM 최종 농도, 바켐(Bachem), Cat nr 4026865.0005)을 세포 배양물에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 연속 희석 항체 제제 시리즈 (4배 희석으로 1 내지 20 μg/mL 범위의 최종 농도)의 25 μL 항체 샘플을 첨가하고, 37℃에서 3일 동안 추가로 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로서, 세포를 5 μM 스타우로스포린 (시그마 알드리치, Cat nr S6942)과 함께 인큐베이션하였다. 재조합 인간 TRAIL/APO-2L (이바이오사이언스(eBioscience), Cat nr BMS356)을 6 μg/mL 최종 농도에서 사용하였다. 세포 배양물의 생존율은 실시예 8에 기재된 바와 같이 셀타이터-글로 발광 세포 생존율 검정으로 결정하였다. 육량체화-증진 돌연변이를 갖는 인간화 항체의 조합물 IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G는 범-카스파제 억제제 Z-VAD-FMK의 존재 하에 PANC-1 및 BxPC3 췌장암 세포의 생존율을 감소시킬 수 없었고, 이는 IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 조합물이 카스파제 의존성 프로그램화된 세포 사멸을 유도하였음을 나타낸다 (도 17). 이는 또한 천연 DR5 리간드 TRAIL의 경우에도 나타났다.
실시예 19: 아넥신 V/아이오딘화프로피듐 및 활성 카스파제-3 염색에 의해 평가되는 바와 같이, COLO 205 결장암 세포에 대한 키메라 DR5-01 및 DR5-05 항체의 조합물의 결합 시 세포 사멸 유도
세포 사멸 유도의 동역학을 아넥신 V / 아이오딘화프로피듐 (PI) 이중 염색 및 활성 카스파제-3 염색에 의해 분석하였다. 아넥신-V는 가역적인 공정으로서 프로그램화된 세포 사멸의 개시 후에 세포 표면 상에 노출되는 포스파티딜세린에 결합한다. PI는 세포에 들어갔을 때 이중 가닥 DNA 및 RNA에 개재되는 염료이다. PI가 무손상 혈장 및 핵막을 통과할 수 없기 때문에, 이는 살아있는 세포를 염색하지 않을 것이지만, 막 일체성이 감소된 죽은 세포는 염색할 것이다. 이들 특징으로 인해, 아넥신 V/PI 이중 염색은 개시 (아넥신 V-양성 / PI-음성) 및 비가역적인 (아넥신 V-양성 / PI-양성) 프로그램화된 세포 사멸을 구별하기 위해 적용될 수 있다. 카스파제-3은 외인성 사멸 수용체-유도된 및 내인성 미토콘드리아 세포 사멸 경로 둘 다에 의해 활성화된다. 따라서, 활성 카스파제-3은 또한 사멸 케스케이드의 개시에 대한 마커이다. IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물의 결합 시 세포 사멸의 유도를 DR5-양성 COLO 205 결장암 세포에서 분석하였다. 비부착성 세포 및 트립신 처리된 부착성 세포를 함유하는 배양물 상청액을 풀링함으로써 세포를 수확하였다. 세포를 세포 스트레이너에 통과시키고, 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하고, 0.2x106 세포/mL의 농도로 배양물 배지 중에 재현탁시켰다. 500 μL의 단일 세포 현탁액 (100,000 세포/웰)을 24-웰 편평 바닥 배양물 플레이트 (그라이너 바이오-원, Cat nr 662160)에 시딩하고, 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 500 μL 항체 샘플을 첨가하고 (1 μg 항체 최종 농도), 37℃에서 5시간 또는 24시간 동안 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로서, 세포를 5 μM 스타우로스포린 (시그마 알드리치, Cat nr S6942)과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 250 μL 1x PBS로 1회 세척하였다. 37℃에서 10분 동안 100 μL 0.05% 트립신과 함께 인큐베이션함으로써 부착성 세포를 수확하였다. 200 μL 배지를 트립신 처리된 세포에 첨가하고, 세포를 96-웰 둥근 바닥 FACS 플레이트 (그라이너 바이오-원, Cat nr 650101)에 옮기고, 비부착성 세포와 함께 풀링하였다. 세포를 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하고, 200 μL 빙저온 PBS 중에 재현탁시키고, 각각 아넥신 V/PI 및 활성 카스파제-3 염색을 위해 96-웰 둥근 바닥 FACS 플레이트에서 100 μL의 샘플 2개로 나누었다.
아넥신 V / PI 이중 염색은 FITC 아넥신 V 아폽토시스 검출 키트 I (비디 파밍겐, Cat nr 556547)을 사용하여 수행하였다. 세포를 빙저온 PBS로 1회 세척하고, 50 μL 아넥신 V/PI 염색 용액 (아넥신 V-FITC 1:00 및 PI 1:25) 중에서 4℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 100 μL 결합 완충제로 세척하고, 20 μL 결합 완충제 중에 재현탁시키고, 1시간 내에 아이큐 스크리너(iQue Screener) (인텔리사이트(IntelliCyt)) 상에서 형광을 측정하였다. 데이터는 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 분석하고 플롯팅하였다.
활성 카스파제-3 염색은 PE 활성 카스파제-3 아폽토시스 키트 (비디 파밍겐, Cat nr 550914)를 사용하여 수행하였다. 세포를 빙저온 PBS로 1회 세척하고, 100 μL 사이토픽스/사이토펌(Cytofix/Cytoperm) 고정화 및 투과화 용액 중에 재현탁시키고, 얼음 상에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 실온에서 펠릿화하고, 100 μL 1x 펌/워시(Perm/Wash) 완충제로 2회 세척하고, 실온에서 30분 인큐베이션을 위해 100 μL PE 토끼 항-활성 카스파제-3 (1:10) 중에 재현탁시켰다. 세포를 실온에서 펠릿화하고, 100 μL 1x 펌/워시 완충제로 1회 세척하고, 20 μL 1x 펌/워시 완충제 중에 재현탁시켰다. 아이큐 스크리너 상에서 형광을 측정하였다. 데이터는 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 분석하고 플롯팅하였다.
도 18은, 아넥신 V-양성/ PI-음성 (A) 및 활성 카스파제-3-양성 세포 (B)의 백분율에서의 증가에 의해 나타나는 바와 같이, 5시간의 인큐베이션 후에, 키메라 항체 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물이 음성 대조군 항체 IgG1-b12에 비해 세포 사멸의 초기 단계를 효과적으로 유도하였음을 도시한다. 아넥신 V-양성/PI-음성 및 활성 카스파제-3 양성 세포의 백분율은 E430G 돌연변이를 갖지 않는 DR5 항체의 조합물 (IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405L) 또는 임의의 단일 항체에 비해 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물로 처리된 세포에서 더 높았다. 5시간 시점에서, 아넥신V/PI 이중-양성 세포의 백분율은 모든 샘플에서 백그라운드 수준에 필적할만한 하였다 (C).
24시간 인큐베이션 후에, 아넥신 V/PI 이중-양성 세포의 백분율 (D)은 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G로 처리된 샘플에서 증진되었으며, 이는 상기 세포가 세포 사멸의 비가역적인 단계에 들어갔음을 나타낸다. 또한, 이 단계에서, IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물의 효과는 E430G 돌연변이를 갖지 않는 DR5 항체의 조합물 (IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405L) 또는 임의의 단일 항체로 처리된 샘플에서에 비해 강력하였다 (아넥신 V/PI 이중-양성 세포의 백분율에서 더 많은 증가가 있음 (E)). 동일한 시점에서, 활성 카스파제 3 양성 세포의 백분율은 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G로 처리된 세포에서 가장 높았다.
이들 데이터는, IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물이 COLO 205 결장암 세포에서 세포 사멸의 초기 및 후기 단계 둘 다를 유도하고, E430G 육량체화 증진 돌연변이를 갖지 않는 항체의 조합물에 비해 더욱 효과적임을 나타낸다.
실시예 20: COLO 205 결장암 세포에 대한 육량체화-증진 돌연변이를 갖는 키메라 DR5-01 및 DR5-05 항체의 조합물의 결합 시 카스파제-3 및 -7 활성화
실시예 19에서, 키메라 DR5 항체 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물과 함께 인큐베이션하여 COLO 205 결장암 세포에서 카스파제-3 활성화가 유도되었음이 기재되었다. 활성 카스파제-3-양성 세포의 백분율은 항체 조합물과 함께 인큐베이션한지 24시간 후보다 5시간 후에 더 높았다. 이 실시예에서, 카스파제-3/7 활성화는 카스파제-글로 3/7 검정 (프로메가, Cat nr G8091)을 이용하여 시간에 따라 측정하였고, 여기서 카스파제-3/7 인식 모티프 DEVD를 갖는 기질은 절단 시 루시페라제의 기질인 아미노루시페린을 방출한다. 비부착성 세포 및 트립신 처리된 부착성 COLO 205를 함유하는 배양물 상청액을 풀링함으로써 세포를 수확하였다. 세포를 세포 스트레이너에 통과시키고, 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하고, 0.8x105 세포/mL의 농도로 배양물 배지 중에 재현탁시켰다. 25 μL의 단일 세포 현탁액 (2,000 세포/웰)을 384-웰 배양물 플레이트 (퍼킨 엘머, Cat nr 6007680)에 시딩하고, 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 25 μL 항체 샘플을 첨가하고 (1 μg 항체 최종 농도), 37℃에서 1, 2, 5 및 24시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 인큐베이터로부터 꺼내거나 또는 실온이 될 때까지 온도가 감소하게 두었다. 세포를 300 g에서 3분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 25 μL 상청액을 제거하고, 25 μL 카스파제-글로 3/7 기질로 교체하였다. 500 rpm에서 1분 동안 진탕에 의해 혼합한 후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 엔비젼 멀티라벨 판독기 (퍼킨엘머) 상에서 발광을 측정하였다.
도 19는 1, 2 내지 5시간의 시간 경과에서, 카스파제-3/7 활성화가 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G 및 IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405L, 및 이중특이적 DR5 항체 BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G에 의해 유도되었음을 도시한다. 24시간 후, 카스파제-3/7 활성화는 모든 시험된 DR5 항체에 대해 기준선 수준으로 거의 감소되었다. 1시간 후, 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G로 처리된 세포에서 카스파제-3/7 활성화가 이미 관찰된 반면에, 육량체화-증진 돌연변이를 갖지 않는 IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405L의 조합물로 처리된 세포에서는 카스파제-3/7 활성화가 관찰되지 않았다. 유사하게, 2 및 5시간에서, 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G에 의해 유도된 카스파제-3/7 활성화가 IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405L의 조합물에 의한 것보다 더 강력하였다. 이들 데이터는, 육량체화 증진 돌연변이를 갖는 키메라 DR5 항체의 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G가 육량체화 증진 돌연변이를 갖지 않는 항체의 조합물에 비해 더욱 신속하고 더욱 강력한 카스파제-3/7 활성화를 유도하였음을 나타낸다.
실시예 21: E430G 육량체화-증진 돌연변이를 갖는 키메라 DR5-01 및 DR5-05의 항체 조합물의 효능은 이차 Fc 가교제의 존재와 무관하다.
이차 항체 가교제의 부재 및 존재 하에 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G가 COLO 205 결장직장암 및 BxPC-3 및 PANC-1 췌장암 세포의 사멸을 유도하는 능력을 비교하기 위해 생존율 검정을 수행하였다. 비교를 위해, 이차 항체 가교제의 존재 하에 증진된 사멸을 나타내는 것으로 공지된 2종의 DR5 항체, IgG1-CONA 및 IgG1-chTRA8-F405L을 동일한 설정에서 시험하였다. 세포를 트립신 처리에 의해 수확하고, 세포 스트레이너에 통과시켰다. 세포를 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하고, 0.5x105 세포/mL의 농도로 배양물 배지 중에 재현탁시켰다. 100 μL의 단일 세포 현탁액 (5,000 세포/웰)을 폴리스티렌 96-웰 편평 바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원, Cat nr 655182)에 시딩하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 부착성 세포의 상청액을 염소-항-인간 IgG 항체의 F(ab')2 단편 (1/150; 잭슨 이뮤노리서치; Cat nr 109-006-098)의 부재 또는 존재 하에 150 μL 항체 샘플 (최종 농도 10 μg/mL)로 교체하고, 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 세포 사멸을 위한 양성 대조군으로서, 세포를 5 μM 스타우로스포린 (시그마 알드리치, Cat nr S6942)과 함께 인큐베이션하였다. 세포 배양물의 생존율은 실시예 8에 기재된 바와 같이 셀타이터-글로 발광 세포 생존율 검정으로 결정하였다. 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G는 COLO 205, BxPC-3 및 PANC-1 암 세포의 음성 대조군에 비해 Fc 가교제의 존재 또는 부재 둘 다 하에 유의한 사멸을 유도하였다 (도 20). 대조적으로, DR5 항체 IgG1-DR5-CONA 및 IgG1-DR5-chTRA8-F405L은 Fc 가교제의 부재 하에서는 표적 세포 사멸을 유도하지 않았다. Fc 가교는 COLO 205 및 BxPC-3 세포에서 IgG1-DR5-CONA 및 IgG1-DR5-chTRA8-F405L에 의한 사멸을 유도하였지만, 가교제의 존재 또는 부재 하에 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G에 비해 유의하게 더 낮은 효능을 나타내었다. 이들 데이터는, 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G에 의한 COLO 205, BxPC-3 및 PANC-1 암 세포의 사멸이 이차 Fc 가교제의 존재와는 무관하고, 이러한 가교제-비의존성 사멸이 Fc-가교된 IgG1-DR5-CONA 및 IgG1-DR5-chTRA8-F405L에 비해 더욱 효과적임을 나타낸다.
실시예 22: IgG1-hDR5-01-430G에서 K409R 돌연변이의 도입 및 IgG1-hDR5-05-E430G에서 F405L 돌연변이의 도입은 인간화 항체 IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 조합물의 효능에 대해 효과가 없다.
본 출원에 기재된 여러 실험에서, 항-DR5 항체 IgG1-01 및 IgG1-05는 각각 IgG Fc 도메인에서 K409R 및 F405L (EU 넘버링 인덱스) 돌연변이를 함유한다. 이들 돌연변이는 WO2011/131746에 기재된 바와 같이 제어된 환원 조건 하에 IgG1-01-K409R과 IgG1-05-F405L 사이의 Fab-아암-교환 반응에 의한 DR5 이중특이적 항체의 생성을 가능하게 한다. Fab-아암 교환없이, K409R 및 F405L 돌연변이를 보유하는 인간 IgG1 항체는 야생형 인간 IgG1과 동일한 기능적 특징을 나타내는 것으로 생각된다 (Labrijn et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Mar 26;110(13):5145-50). 여기서, 본 발명자들은, K409R 또는 F405L 돌연변이의 존재가 시험관내에서 DR5-양성 종양 세포에서 세포 사멸을 유도하는 모 IgG1-01 및 IgG1-05 항체의 조합물의 능력에 대해 효과가 없음을 보여준다. BxPC-3 췌장암 세포의 사멸을 유도하는데 있어서 인간화 항체 IgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430G의 조합물의 능력과 인간화 항체 IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 조합물의 능력을 비교하기 위해 생존율 검정을 수행하였다. BxPC-3에 대한 생존율 검정은 연속 희석된 항체 시리즈 (4배 희석으로 0.001 내지 20,000 ng/mL 범위의 최종 농도)를 사용하여 실시예 11에 기재된 바와 같이 수행하였다. BxPC-3 췌장암 세포주는 인간화 항체 IgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430G의 조합물과의 인큐베이션 후에 인간화 항체 IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 조합물과 유사한 생존율 곡선을 나타낸다 (도 21). 이들 데이터는, K409R 및 F405L 돌연변이가 E430G 육량체화 증진 돌연변이를 갖는 인간화 DR5-01 및 DR5-05 항체의 조합물의 효능에 대해 효과가 없었음을 나타낸다.
실시예 23: 키메라 이중특이적 항체 IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G는 DR5-양성 종양 세포의 사멸을 유도한다.
2가지 상이한 DR5 에피토프를 표적화하는 이중특이적 항체를 실시예 1에 기재된 바와 같이 키메라 항체 IgG1-DR5-01-K409R-E430G 및 IgG1-DR5-05-F405L-E430G 사이의 Fab-아암 교환에 의해 생성하였다. 10 μg/mL 용량의 키메라 BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G가 상이한 조직 기원의 암 세포 (COLO 205 결장직장암, A375 피부암, SK-MES-1 폐암, BxPC-3 췌장암 및 SNU-5 위암 세포주)의 사멸을 유도하는 것을 시험하기 위해 생존율 검정을 실시예 11에 기재된 바와 같이 수행하였다. 시험된 모든 세포주의 경우, 생존 세포 백분율은 비-표적 결합 음성 대조군 항체 IgG1-b12에 비해 10 μg/mL의 키메라 BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G 항체와 함께 인큐베이션하였을 때 유의하게 더 낮았다 (도 22). 이들 데이터는, 육량체화-증진 돌연변이 E430G를 갖는 이중특이적 항-DR5xDR5' 항체가 이차 가교제의 필요없이 결장암, 췌장암, 위암, 폐암 및 피부암을 비롯한 상이한 기원의 암 세포의 사멸을 유도하였음을 나타낸다.
실시예 24: 키메라 BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G의 효능은 이차 Fc 가교제의 존재와 무관하다.
이차 항체 가교제의 부재 및 존재 하에 키메라 BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x IgG1-DR5-05-F405L-E430G가 BxPC-3 췌장암 세포 및 COLO 205 결장암 세포의 사멸을 유도하는 능력을 비교하기 위해 생존율 검정을 실시예 21에 기재된 바와 같이 수행하였다. 비교를 위해, 이차 항체 가교제의 존재 하에 증진된 사멸을 나타내는 것으로 공지된 2가지 DR5 항체, IgG1-CONA 및 IgG1-chTRA8-F405L을 동일한 설정에서 시험하였다. 키메라 BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G는 Fc 가교제의 부재 또는 존재 둘 다에서 COLO 205 및 BxPC-3 암 세포의 음성 대조군에 비해 유의한 사멸을 나타내었다 (도 23). 대조적으로, DR5 항체 IgG1-DR5-CONA 및 IgG1-DR5-chTRA8-F405L은 Fc 가교제의 존재 하에서만 사멸을 유도하였다.
실시예 25: 아넥신 V/아이오딘화프로피듐 및 활성 카스파제-3 염색에 의해 평가되는, COLO 205 결장암 세포에 대한 BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G의 결합 시 세포 사멸 유도
COLO 205 세포에 대한 1 μg/mL BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G에 의한 세포 사멸 유도의 동역학은 실시예 19에 기재된 바와 같이 아넥신 V / 아이오딘화프로피듐 (PI) 이중 염색 및 활성 카스파제-3 염색에 의해 분석하였다.
도 24는, 5시간의 인큐베이션 후에, 아넥신 V-양성/ PI-음성 (A) 및 활성 카스파제-3-양성 세포 (B)의 백분율에서의 증가에 의해 나타나는 바와 같이, BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430GxDR5-05-F405L-E430G가 음성 대조군 항체 IgG1-b12에 비해 세포 사멸의 초기 단계를 효과적으로 유도하였음을 도시한다. 아넥신 V-양성/PI-음성 및 활성 카스파제-3 양성 세포의 백분율은 E430G 돌연변이를 갖지 않는 이중특이적 항체 (BsAb IgG1-DR5-01-K409RxDR5-05-F405L) 또는 임의의 단일특이적 항체에 비해 BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430GxDR5-05-F405L-E430G로 처리되었던 세포에서 더 높았다. 5시간 시점에서, 아넥신V/PI 이중 양성 세포의 백분율은 모든 샘플에서 백그라운드 수준에 필적할만한 하였다 (C).
24시간 인큐베이션 후에, 아넥신 V/PI 이중-양성 세포의 백분율 (D)은 BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430GxDR5-05-F405L-E430G로 처리된 샘플에서 증진되었고, 이는 상기 세포가 세포 사멸의 비가역적인 단계에 들어갔음을 나타낸다. 또한, 이 단계에서, BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430GxDR5-05-F405L-E430G의 효과는 E430G 돌연변이를 갖지 않는 이중특이적 항체 (BsAb IgG1-DR5-01-K409R x DR5-05-F405L) 또는 임의의 단일특이적 항체로 처리된 샘플에서에 비해 더 강력하였다 (아넥신 V/PI 이중-양성 세포의 백분율에서 더 많은 증가가 있음) (E). 동일한 시점에서, 활성 카스파제 3 양성 세포의 백분율은 BsAB IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G로 처리된 세포에서 가장 높았다.
이들 데이터는, BsAB IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G가 COLO 205 결장암 세포에서 세포 사멸의 초기 및 후기 단계 둘 다를 유도하고, E430G 육량체화 증진 돌연변이를 갖지 않는 이중특이적 항체에 비해 더욱 효과적임을 나타낸다.
실시예 26: 피하 COLO 205 결장암 이종이식 모델에서 육량체화-증진 돌연변이를 갖는 및 갖지 않는 DR5-01 및 DR5-05 항체 변이체의 생체내 효능
육량체화 증진 돌연변이를 갖는 상이한 항-DR5 항체 및 DR5-01 + DR5-05 항체 조합물의 생체내 항-종양 효능을 COLO 205 인간 결장암 세포를 가진 피하 모델에서 평가하였다. 제0일에, 비부착성 세포 및 트립신 처리된 부착성 세포를 함유하는 배양물 상청액을 풀링함으로써 세포를 수확하였다. 3x106 세포를 200 μL PBS의 부피로 6-11 주령 암컷 SCID 마우스 (C.B-17/IcrHan®Hsd-Prkdcscid; 하를란(Harlan))의 옆구리에 주사하였다. 모든 실험 및 동물 취급은 지방 당국에 의해 승인되었고, 모든 적용가능한 국제, 국가 및 지방 법률 및 지침에 따라 수행되었다. 종양 발달은 0.52 x (길이) x (너비)2로서 캘리퍼스 (PLEXX) 측정에 의해 적어도 1주에 2회 모니터링하였다. 1,500 mm3의 종점 종양 부피에 도달할 때까지, 종양이 궤양화를 나타낼 때까지, 중증의 임상 징후가 관찰될 때까지, 또는 종양 성장이 마우스의 움직임을 차단할 때까지 종양을 측정하였다. 제6일에, 평균 종양 부피는 ~200 mm3이었고, 마우스를 동등한 종양 크기 변화를 갖는 그룹으로 분류하였다 (하기 표 2). 마우스를 제6일 및 제13일에 200 μL PBS 중 100 μg 항체의 복강내 (i.p.) 주사에 의해 처리하였다 (투여당 5 mg/kg). 정확한 항체 투여를 체크하기 위해, IgG 혈청 측정을 위한 혈액 샘플을 제1 투여 3일 후에 수득하였다. 3 마리의 개별 마우스는 검출가능한 인간 IgG 혈장 수준을 갖지 않았고, 통계 분석으로부터 배제되었다 (하기 표 2 참조). 다른 마우스의 경우, 인간 항체 혈장 농도는 Vcen = 50 mL/kg, Vs = 100 mL/kg, 및 11.6일의 제거 반감기를 갖는 2-구획 모델을 가정할 때 예상한 바에 따랐다 (데이터는 제시되지 않음). 종양 접종 후 16주까지 종양을 측정하였다.
표 2: 처리 그룹 및 투여
Figure pct00019
도 25A는 시간에 따른 처리 그룹당 평균 종양 부피를 도시한다. 도 25B는 종양 접종 후 제23일의 평균 종양 부피를 나타내고, 이 때 모든 그룹이 여전히 무손상이었다. 모든 항-DR5 항체 샘플은 음성 대조군 항체 IgG1-b12에 비해 종양 성장을 유의하게 억제하였다 (제23일에 비모수 ANOVA 분석 (크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis))에 이어, 던(Dunn) 다중 비교 검정: p< 0.0001). 육량체화-증진 돌연변이를 갖는 DR5-01 + DR5-05 항체의 조합물 (IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G), 육량체화-증진 돌연변이를 갖는 및 갖지 않는 이중특이적 항체 (BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L 및 BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G), 및 육량체화-증진 돌연변이를 갖는 항-DR5 항체 (IgG1-DR5-01-K409R-E430G 및 IgG1-DR5-05-F405L-E430G)의 경우에 완전한 종양 소멸이 관찰되었다. 육량체화-증진 돌연변이를 갖지 않는 IgG1-CONA 및 IgG1-DR5-05-F405L은 IgG1-b12에 비해 종양 성장을 강력하게 억제하였지만, 완전한 종양 소멸을 유발하지는 않았다.
도 25C는 종양 부피 >750 mm3에서 컷오프 설정을 갖는, 종양 진행의 카플란-마이어 플롯을 도시한다. 음성 대조군 항체 IgG1-b12로 처리된 마우스와 비교시, 종양 증식은 항-DR5 항체로 처리된 모든 그룹에서 유의하게 지연되었다 (종양 크기 컷-오프 750 mm3에서 만텔-콕스(Mantel-Cox) 분석: p< 0.001). 연구 종료 시 (제112일), 육량체화 증진 돌연변이를 갖는 DR5-01 + DR5-05 항체의 조합물 (IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G)로 처리된 마우스의 그룹은 코나투무맙 그룹에 비해 종양 증식을 갖는 마우스를 유의하게 적게 나타내었다 (피셔 정확 분할표 검정(Fisher's exact contingency test) p<0.01).
이들 데이터는, IgG1-DR5-05-F405L에서 E430G 육량체화-증진 돌연변이의 도입이 육량체화-증진 돌연변이를 갖지 않는 IgG1-DR5-05-F405L에 비해 피하 COLO 205 결장암 종양 모델에서 증진된 종양 억제를 제공하였음을 나타낸다. 육량체화 증진 돌연변이를 갖는 DR5-01 및 DR5-05 항체 둘 다 (IgG1-DR5-01-K409R-E430G 및 IgG1-DR5-05-F405L-E430G), 육량체화 증진 돌연변이를 갖는 및 갖지 않는 이중특이적 항체 (BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L 및 BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G) 및 육량체화-증진 돌연변이를 갖는 항체의 조합물 (IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G)은 육량체화-증진 돌연변이를 갖지 않는 IgG1-CONA 및 IgG1-DR5-05-F405L에 비해 양호한 종양 억제를 나타내었다.
실시예 27: 피하 COLO 205 결장암 이종이식 모델에서 상이한 용량의 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 생체내 효능
상이한 용량의 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 생체내 항-종양 효능을 평가하여, 피하 COLO 205 인간 결장암 이종이식 모델에서 동등한 용량의 IgG1-CONA와 비교하였다. 종양 세포 접종, 마우스 취급, 종양 증식 측정 및 종점 결정을 실시예 26에 기재된 바와 같이 수행하였다. 제10일에, 평균 종양 부피는 ~400 mm3이었고, 마우스를 동등한 종양 크기 변화를 갖는 그룹으로 분류하였다 (하기 표 3). 마우스를 제10일에 100 μL PBS 중 40 μg (2 mg/kg), 10 μg (0.5 mg/kg) 또는 2 μg (0.1 mg/kg) 항체의 정맥내 (i.v.) 주사에 의해 처리하였다. 대조군 그룹의 마우스는 40 μg (2 mg/kg) IgG1-b12로 처리하였다. 종양 접종 후 17주까지 종양을 측정하였다.
표 3: 처리 그룹 및 투여
Figure pct00020
도 26A는 처리 그룹당 평균 종양 부피를 도시한다. 0.5 mg/kg 또는 2 mg/kg 단일 용량의 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G로의 처리는 제126일에 연구를 중단할 때까지 완전한 종양 관해를 유발하였다. 0.5 mg/kg 및 2 mg/kg IgG1-CONA로의 처리 또한 종양 관해를 유도하였지만, 각각 모든 마우스에서 또는 거의 모든 (7/8) 마우스에서 종양 증식이 재발하여 관해가 불완전하였다. 0.1 mg/kg에서는, IgG1-CONA 뿐만 아니라 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물 모두 항-종양 활성을 나타내지 않았다. 도 26B는, 종양 접종 후 제16일에, 2 mg/kg 및 0.5 mg/kg IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G에 의한 종양 억제가 동등한 용량의 IgG1-CONA에 비해 유의하게 양호하였음을 도시한다 (독립표본 t-검정).
도 26C는 종양 부피 >500 mm3에서 컷오프 설정을 갖는, 종양 진행의 카플란-마이어 플롯을 도시한다. 0.5 mg/kg 및 2 mg/kg의 용량에서, 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G 및 IgG1-CONA는 음성 대조군 항체 IgG1-b12에 비해 종양 성장 진행을 유의하게 억제하였다 (p<0.001, 종양 크기 컷-오프 500 mm3에서 만텔-콕스 분석). 0.5 mg/kg의 용량에서, 종양 성장 진행의 억제는 동등한 용량의 IgG1-CONA에 비해 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G에서 유의하게 양호하였다.
이들 데이터는, 2 mg/kg에서 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G가 IgG1-CONA에 비해 제16일에 종양 부하를 유의하게 감소시켰고, 0.5 mg/kg에서 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G 조합물이 IgG1-CONA에 비해 제16일에 종양 부하를 유의하게 감소시켰고 진행이 없는 생존 시간을 연장시켰기 때문에 (종양 크기 컷-오프 500 mm3), 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G가 IgG1-CONA에 비해 강력한 항-종양 효능을 가졌음을 나타낸다.
실시예 28: 피하 BxPC-3 췌장암 이종이식 모델에서 상이한 용량의 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 생체내 효능
상이한 용량의 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 생체내 항-종양 효능을 평가하여, 피하 BxPC-3 인간 췌장암 이종이식 모델에서 동등한 용량의 IgG1-CONA-F405L과 비교하였다. 제0일에, 부착성 세포를 트립신 처리에 의해 수확하였다. 5x106 세포를 100 μL PBS의 부피로 6-11 주령 암컷 SCID 마우스 (C.B-17/IcrHan®Hsd-Prkdcscid; 하를란)의 옆구리에 주사하였다. 마우스 취급, 종양 증식 측정 및 종점 결정을 실시예 26에 기재된 바와 같이 수행하였다. 제10일에, 평균 종양 부피는 ~250 mm3이었고, 마우스를 동등한 종양 크기 변화를 갖는 그룹으로 분류하였다 (하기 표 4). 마우스를 제20일 및 제28일에 200 μL PBS 중 200 μg (10 mg/kg), 40 μg (2 mg/kg) 또는 10 μg (0.5 mg/kg) 항체의 i.v. 주사에 의해 처리하였다. 대조군 그룹의 마우스는 200 μg (10 mg/kg) IgG1-b12로 처리하였다. 정확한 항체 투여를 체크하기 위해, IgG 혈청 측정을 위한 혈액 샘플을 투여 1주일 후에 수득하였다. 종양 접종 후 10주까지 종양을 측정하였다.
표 4: 처리 그룹 및 투여
Figure pct00021
도 27A는 처리 그룹당 중앙 종양 부피를 도시한다. 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 모든 시험된 용량은 음성 대조군 항체 IgG1-b12에 비해 종양 성장을 억제한 반면에, IgG1-CONA-F405L 처리 그룹은 그렇지 않았다. 도 27B는, 종양 접종 후 제48일에, IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물에 의한 종양 성장 억제가 동등한 용량의 IgG1-CONA-F405L에 비해 유의하게 양호하였음을 도시한다 (독립표본 t-검정, p <0.05).
도 27C는 종양 부피 >500 mm3에서 컷오프 설정을 갖는, 종양 진행의 카플란-마이어 플롯을 도시한다. 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G는 음성 대조군 항체 IgG1-b12에 비해 및 IgG1-CONA-F405L에 비해 종양 성장 진행을 유의하게 억제하였다 (종양 크기 컷오프 500 mm3에서 만텔-콕스 분석: p<0.001).
이들 데이터는, 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G가 상이한 용량 (0.5 mg/kg, 2 mg/kg 및 10 mg/kg)에서 종양 성장을 억제하였고, 생체내 BxPC-3 인간 췌장암 이종이식 모델에서 항-종양 효능이 동등한 용량의 IgG1-CONA-F405L에 비해 유의하게 양호하였음을 나타낸다.
실시예 29: 피하 A375 피부암 이종이식 모델에서 상이한 용량의 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 생체내 효능
상이한 용량의 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 생체내 항-종양 효능을 평가하여, 피하 A375 인간 피부암 이종이식 모델에서 동등한 용량의 IgG1-CONA-F405L과 비교하였다. 제0일에, 부착성 세포를 트립신 처리에 의해 수확하였다. 5x106 세포를 100 μL PBS의 부피로 6-11 주령 암컷 SCID 마우스 (C.B-17/IcrHan®Hsd-Prkdcscid; 하를란)의 옆구리에 주사하였다. 마우스 취급, 종양 증식 측정 및 종점 결정을 실시예 26에 기재된 바와 같이 수행하였다. 제19일에, 평균 종양 부피는 ~250 mm3이었고, 마우스를 동등한 종양 크기 변화를 갖는 그룹으로 분류하였다 (하기 표 5). 마우스를 제19일 및 제26일에 200 μL PBS 중 200 μg (10 mg/kg), 40 μg (2 mg/kg) 또는 10 μg (0.5 mg/kg) 항체의 i.v. 주사에 의해 처리하였다. 대조군 그룹의 마우스는 200 μg (10 mg/kg) IgG1-b12로 처리하였다. 정확한 항체 투여를 체크하기 위해, IgG 혈청 측정을 위한 혈액 샘플을 투여 1주일 후에 수득하였다. 종양 접종 후 7주까지 종양 부피를 분석하였다.
표 5: 처리 그룹 및 투여
Figure pct00022
도 28A는 처리 그룹당 중앙 종양 부피를 도시한다. 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 모든 시험된 용량은 음성 대조군 항체 IgG1-b12에 비해 종양 성장을 억제한 반면에, IgG1-CONA-F405L 처리 그룹은 그렇지 않았다. 도 28B는, 종양 접종 후 제29일에, IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물로 처리된 마우스에서 평균 종양 크기가 IgG1-b12로 처리된 마우스에 비해 작았고 (모든 용량 수준의 경우 p<0.05, 다중 비교를 위한 던넷(Dunnet) 보정에 의한 일원 ANOVA), IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물이 동등한 용량에서 IgG1-CONA-F405L에 비해 유의하게 더욱 강력하였음을 (만 휘트니 검정, p <0.05) 도시한다.
이들 데이터는, 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G가 상이한 용량 (0.5 mg/kg, 2 mg/kg 및 10 mg/kg)에서 종양 성장을 억제하였고, 생체내 A375 인간 피부암 이종이식 모델에서 항-종양 효능이 동등한 용량의 IgG1-CONA-F405L에 비해 유의하게 양호하였음을 나타낸다.
실시예 30: 피하 HCT-15 결장암 이종이식 모델에서 상이한 용량의 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 생체내 효능
상이한 용량의 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 생체내 항-종양 효능을 평가하여, 피하 HCT-15 인간 결장암 이종이식 모델 (크라운바이오사이언시즈(CrownBiosciences), 중국 타이창)에서 동등한 용량의 IgG1-CONA와 비교하였다. 세포를 37℃에서 공기 중 5% CO2의 분위기 하에 10% 태아 소 혈청으로 보충된 RPMI-1640 배지 중 단일층 배양물로서 시험관내에서 유지하였다. 지수 성장기에 있는 부착성 세포를 트립신-EDTA 처리에 의해 수확하였다. 5x106 세포를 100 μL PBS의 부피로 6-8 주령 암컷 BALB/c 누드 마우스 (상하이 래버러토리 애니멀 센터(Shanghai Laboratory Animal Center))의 옆구리에 주사하였다. 연구하는 동안 동물의 관리 및 이용은 실험 동물 관리의 평가 및 인증을 위한 협회 (Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, AAALAC)의 규정에 따라 수행하였다. 종양 부피는 캘리퍼스를 사용하여 1주에 2회 이차원으로 측정하였고, 부피는 하기 식을 이용하여 mm3으로 표현하였다: V = 0.5 a x b2 (여기서, a 및 b는 각각 종양의 긴 직경 및 짧은 직경임). 종양 접종 11일 후, 평균 종양 크기는 186 mm3에 이르렀고, 마우스를 무작위화 차단 설계를 이용하여 그룹으로 분류하고, 처리를 시작하였다. 마우스를 체중 g당 10 μL PBS 중 200 μg (10 mg/kg), 40 μg (2 mg/kg) 또는 10 μg (0.5 mg/kg) 항체의 i.v. 주사에 의해 Q7D 투약 방식에 따라 2회 처리하였다. 동시에 대조군 그룹의 마우스는 200 μg (10 mg/kg) IgG1-b12로 처리하였다. 종양 접종 후, 동물의 복지를 매일 체크하고, 종양 부피를 1주에 2회 측정하였다.
표 6: 처리 그룹 및 투여, 실시예 30
Figure pct00023
도 29A는 처리 그룹당 평균 종양 부피를 도시한다. 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 모든 시험된 용량은 음성 대조군 항체 IgG1-b12에 비해 종양 성장을 억제한 반면에, IgG1-CONA는 그렇지 않았다. 도 29B는, 치료 시작 후 제17일에, IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물에 의한 종양 성장 억제가 동등한 용량의 IgG1-CONA에 비해 유의하게 양호하였음을 도시한다 (독립표본 t 검정, p <0.05).
도 29C는 종양 부피 >500 mm3에서 컷오프 설정을 갖는, 종양 진행의 카플란-마이어 플롯을 도시한다. 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G는 음성 대조군 항체 IgG1-b12에 비해 및 동등한 용량의 IgG1-CONA에 비해 종양 성장 진행을 유의하게 억제하였다 (종양 크기 컷오프 500 mm3에서 만텔-콕스 분석: p<0.001).
이들 데이터는, 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G가 상이한 용량 (0.5 mg/kg, 2 mg/kg 및 10 mg/kg)에서 종양 성장을 억제하였고, HCT-15 인간 결장암 세포를 갖는 생체내 이종이식 모델에서 항-종양 효능이 동등한 용량의 IgG1-CONA에 비해 유의하게 양호하였음을 나타낸다.
실시예 31: 피하 SW480 결장암 이종이식 모델에서 상이한 용량의 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 생체내 효능
상이한 용량의 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 생체내 항-종양 효능을 평가하여, 피하 SW480 인간 결장암 이종이식 모델 (크라운바이오사이언시즈, 중국 타이창)에서 동등한 용량의 IgG1-CONA와 비교하였다. 세포를 37℃에서 100% 공기 하에 10% 태아 소 혈청으로 보충된 L-15 배지 중 단일층 배양물로서 시험관내에서 유지하였다. 지수 성장기에 있는 부착성 세포를 트립신-EDTA 처리에 의해 수확하였다. 1x107 세포를 마트리겔 (1:1)과 함께 200 μL PBS의 부피로 6-8 주령 암컷 NOD/ SCID 마우스 (베이징 에이치에프케이 바이오사이언스(Beijing HFK Bioscience))의 옆구리에 주사하였다. 마우스 취급 및 종양 부피 측정은 실시예 30에 기재된 바와 같이 수행하였다. 종양 접종 10일 후, 평균 종양 크기가 175 mm3에 이르렀고, 마우스를 무작위화 차단 설계를 이용하여 그룹으로 분류하고, 처리를 시작하였다. 마우스를 체중 g당 10 μL PBS 중 200 μg (10 mg/kg), 40 μg (2 mg/kg) 또는 10 μg (0.5 mg/kg) 항체의 i.v. 주사에 의해 Q7D 투약 방식에 따라 2회 처리하였다. 동시에 대조군 그룹의 마우스는 200 μg (10 mg/kg) IgG1-b12로 처리하였다. 종양 접종 후, 동물의 복지를 매일 체크하고, 종양 부피를 1주에 2회 측정하였다.
표 7: 처리 그룹 및 투여, 실시예 31
Figure pct00024
도 30A는 처리 그룹당 평균 종양 부피를 도시한다. 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 모든 시험된 용량은 음성 대조군 항체 IgG1-b12에 비해 종양 성장을 억제하였다 (10 mg/kg p<0.0001; 2 mg/kg p<0.001; 0.5 mg/kg p<0.05). IgG1-CONA 처리 그룹은 최고 용량에서만 (10 mg/kg 및 2 mg/kg p<0.01) IgG1-b12에 비해 양호하였고, 0.5 mg/kg에서는 그렇지 않았다. 도 30B는, 치료 시작 후 제28일에, IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물에 의한 종양 성장 억제가 10 mg/kg 및 0.5 mg/kg에서 동등한 용량의 IgG1-CONA에 비해 유의하게 양호하였음을 도시한다 (독립표본 t 검정, p <0.05).
도 30C는 종양 부피 >500 mm3에서 컷오프 설정을 갖는, 종양 진행의 카플란-마이어 플롯을 도시한다. 10 mg/kg으로 투여된 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G는 음성 대조군 항체 IgG1-b12에 비해 및 동등한 용량의 IgG1-CONA에 비해 종양 성장 진행을 유의하게 억제하였다 (종양 크기 컷오프 500 mm3에서 만텔-콕스 분석: p<0.001).
이들 데이터는, 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G가 상이한 용량 (0.5 mg/kg, 2 mg/kg 및 10 mg/kg)에서 종양 성장을 억제하였고, 생체내 SW480 인간 결장암 이종이식 모델에서 10 mg/kg 및 0.5 mg/kg의 용량에 대한 항-종양 효능이 동등한 용량의 IgG1-CONA에 비해 유의하게 양호하였음을 나타낸다.
실시예 32: 피하 SNU-5 위암 이종이식 모델에서 상이한 용량의 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 생체내 효능
상이한 용량의 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 생체내 항-종양 효능을 평가하여, 피하 SNU-5 인간 위암 이종이식 모델 (크라운바이오사이언시즈, 중국 타이창)에서 동등한 용량의 IgG1-CONA와 비교하였다. 세포를 37℃에서 공기 중 5% CO2의 분위기 하에 20% 태아 소 혈청으로 보충된 IMDM 배지 중 현탁액 배양물로서 시험관내에서 유지하였다. 지수 성장기에 있는 세포를 수확하고, 1x107 세포를 마트리겔 (1:1)과 함께 200 μL PBS의 부피로 6-8 주령 암컷 CB17/SCID 마우스 (베이징 에이치에프케이 바이오사이언스)의 옆구리에 주사하였다. 마우스 취급 및 종양 부피 측정은 실시예 30에 기재된 바와 같이 수행하였다. 종양 접종 8일 후, 평균 종양 크기가 169 mm3에 이르렀고, 마우스를 무작위화 차단 설계를 이용하여 그룹으로 분류하고, 처리를 시작하였다. 마우스를 체중 g당 10 μL PBS 중 200 μg (10 mg/kg), 40 μg (2 mg/kg) 또는 10 μg (0.5 mg/kg) 항체의 i.v. 주사에 의해 Q7D 투약 방식에 따라 2회 처리하였다. 동시에 대조군 그룹의 마우스는 200 μg (10 mg/kg) IgG1-b12로 처리하였다. 종양 접종 후, 동물의 복지를 매일 체크하고, 종양 부피를 1주에 2회 측정하였다.
표 8: 처리 그룹 및 투여, 실시예 32
Figure pct00025
도 31A는 처리 그룹당 평균 종양 부피를 도시한다. 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 모든 시험된 용량은 음성 대조군 항체 IgG1-b12에 비해 종양 성장을 억제하였다. 2 mg/kg 및 10 mg/kg 용량에서, 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G는 전체 연구 시간 (치료 시작 후 7주)에 걸쳐 지속되는 완전한 종양 관해를 유발하였다. 도 31B는, 치료 시작 후 제23일에, IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물에 의한 종양 성장 억제가 동등한 용량의 IgG1-CONA에 비해 유의하게 양호하였음을 도시한다 (만 휘트니 검정, p<0.05).
도 31C는 종양 부피 >500 mm3에서 컷오프 설정을 갖는, 종양 진행의 카플란-마이어 플롯을 도시한다. 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G는 음성 대조군 항체 IgG1-b12에 비해 및 동등한 용량의 IgG1-CONA에 비해 종양 성장 진행을 유의하게 억제하였다 (종양 크기 컷오프 500 mm3에서 만텔-콕스 분석: p<0.05).
이들 데이터는, 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G가 상이한 용량 (0.5 mg/kg, 2 mg/kg 및 10 mg/kg)에서 종양 성장을 억제하였고, 생체내 SNU-5 인간 위암 이종이식 모델에서 항-종양 효능이 동등한 용량의 IgG1-CONA에 비해 유의하게 양호하였음을 나타낸다.
실시예 33: 피하 SK-MES-1 폐암 이종이식 모델에서 상이한 용량의 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 생체내 효능
상이한 용량의 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 생체내 항-종양 효능을 평가하여, 피하 SK-MES-1 인간 폐암 이종이식 모델 (크라운바이오사이언시즈, 중국 타이창)에서 동등한 용량의 IgG1-CONA와 비교하였다. 세포를 37℃에서 공기 중 5% CO2의 분위기 하에 10% 태아 소 혈청 및 0.01 mM NEAA로 보충된 MEM 배지 중에서 단일층 배양물로서 시험관내에서 유지하였다. 제0일에, 지수 성장기에 있는 부착성 세포를 트립신-EDTA 처리에 의해 수확하였다. 5x106 세포를 100 μL PBS의 부피로 6-8 주령 암컷 BALB/ c 마우스 (상하이 래버러토리 애니멀 센터)의 옆구리에 주사하였다. 마우스 취급 및 종양 부피 측정은 실시예 30에 기재된 바와 같이 수행하였다. 종양 접종 21일 후, 평균 종양 크기가 161 mm3에 이르러고, 마우스를 무작위화 차단 설계를 이용하여 그룹으로 분류하고, 처리를 시작하였다. 마우스를 체중 g당 10 μL PBS 중 200 μg (10 mg/kg), 40 μg (2 mg/kg) 또는 10 μg (0.5 mg/kg) 항체의 i.v. 주사에 의해 Q7D 투약 방식에 따라 2회 처리하였다. 동시에 대조군 그룹의 마우스는 200 μg (10 mg/kg) IgG1-b12로 처리하였다. 종양 접종 후, 동물의 복지를 매일 체크하고, 종양 부피를 1주에 2회 측정하였다.
표 9: 처리 그룹 및 투여, 실시예 33
Figure pct00026
도 32A는 처리 그룹당 평균 종양 부피를 도시한다. 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 모든 시험된 용량은 음성 대조군 항체 IgG1-b12에 비해 종양 성장을 유의하게 억제한 반면에 (p<0.0001), IgG1-CONA는 10 mg/kg (p<0.01) 및 2 mg/kg (p<0.05)에서만 IgG1-b12에 비해 유의한 효과를 가졌고, 0.5 mg/kg에서는 그렇지 않았다 (일원 ANOVA에 이어, 던넷(Dunnett) 다중 비교 검정). 도 32B는, 치료 시작 후 제14일에, IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G의 조합물에 의한 종양 성장 억제가 2 mg/kg 및 0.5 mg/kg에서 동등한 용량의 IgG1-CONA에 비해 유의하게 양호하였음을 도시한다 (독립표본 t-검정, 각각 p<0.05 및 p<0.01).
도 32C는 종양 부피 >1.000 mm3에서 컷오프 설정을 갖는, 종양 진행의 카플란-마이어 플롯을 도시한다. 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G는 음성 대조군 항체 IgG1-b12에 비해 (종양 크기 컷오프 1.000 mm3에서 만텔-콕스 분석: p≤0.001) 및 2 mg/kg 및 0.5 mg/kg에서 동등한 용량의 IgG1-CONA에 비해 (종양 크기 컷오프 1.000 mm3에서 만텔-콕스 분석: p<0.05) 종양 성장 진행을 유의하게 억제하였다.
이들 데이터는, 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G가 상이한 용량 (0.5 mg/kg, 2 mg/kg 및 10 mg/kg)에서 종양 성장을 억제하였고, 생체내 SK-MES-1 인간 폐암 이종이식 모델에서 항-종양 효능이 0.5 mg/kg 및 2 mg/kg에서 동등한 용량의 IgG1-CONA에 비해 유의하게 양호하였음을 나타낸다.
실시예 34: 상이한 인간 암 세포주에 대한 DR5 발현 수준
세포당 DR5 밀도는 실시예 2에 기재된 바와 같이 마우스 모노클로날 항체 B-K29를 사용하는 퀴피키트를 이용하여 간접적인 면역형광에 의해 상이한 인간 암 세포주에 대해 정량화하였다. 세포주를 낮은 DR5 발현 (ABC < 10,000) 및 중간 DR5 발현 (ABC > 10,000)에 따라 분류하였다. 인간 암 세포주 SK-MEL-5 (ATCC, HTB-070) 악성 흑색종, 주르카트(Jurkat) (ATCC, TIB-152) 급성 T 세포 백혈병 및 다우디(Daudi) (ATCC, CCL-231) 버킷(Burkitt) 림프종은 낮은 DR5 발현 (퀴피키트 ABC 범위 3,500-6,500)을 갖는 것으로 확인되었다. 인간 결장직장 암종 세포주 SNU-C2B (ATCC, CCL-250), LS411N (ATCC, CRL-2159) 및 DLD-1 (ATCC, CCL-221)은 중간 DR5 발현 (퀴피키트 ABC 범위 12,000-44,500)을 갖는 것으로 확인되었다.
실시예 35: 육량체화-증진 돌연변이의 도입은 DR5-양성 인간 결장암 세포로 IgG1-hDR5-01-G56T 및 IgG1-hDR5-05 항체의 결합에 영향을 미치지 않는다.
E430G 돌연변이를 갖는 및 갖지 않는 IgG1-hDR5-01-G56T 및 IgG1-hDR5-05의 정제된 항체 변이체에 대한 인간 결장암 세포 HCT 116에 대한 결합을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 단일 세포 현탁액을 제조하였고, 실시예 3에 기재된 바와 같이 연속 희석 항체 제제 시리즈 (4배 희석으로 0.0006 내지 10 μg/mL 범위의 최종 농도)에 대해 결합을 분석하였다. 이차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 세포를 2회 세척하고, 100 μL FACS 완충제 중에 재현탁시키고, 항체 결합을 BD LRSF포스테사(BD LRSFFortessa) 세포 분석기 (비디 바이오사이언시즈) 상에서 분석하였다. 결합 곡선은 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀 분석 (가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응)을 이용하여 분석하였다.
도 33은, 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G가 E430G 돌연변이를 갖지 않는 그들의 상응하는 항체와 유사한 HCT 116 세포에 대한 용량-의존성 결합을 나타내었음을 도시한다. E430G 돌연변이의 도입은 DR5 항체의 결합에 대해 효과가 없었다. 6회 반복 실험으로부터의 EC50 값은 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G의 경우 74.4 (+/- 58.4) ng/mL 및 IgG1-hDR5-05-E430G의 경우 101.2 (+/- 52.6) ng/mL로서 계산되었다.
실시예 36: 단일 항체로서 및 조합물로서 DR5-양성 인간 암 세포에 대한 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G의 결합.
중간 DR5 발현을 갖는 HCT 116 인간 암 세포에 대한 항체 결합을 알렉사 647-표지된 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 알렉사 647-표지된 IgG1-hDR5-05-E430G의 정제된 샘플 (둘 다 단일 작용제로서 및 두 항체의 조합물로서)에 대해 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 1 mg/mL IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G를 실온에서 1시간 동안 0.1 M NaHCO3 공액 완충제 중 5 몰 과량의 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 647 카르복실산, 숙신이미딜 에스테르 (몰레큘라 프로브즈(Molecular Probes); Cat # A-20006)로 표지하여, 3가지가 소정의 표지 정도에 도달하게 하였다. 과량의 유리 알렉사 647을 PD 10 컬럼 (아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Bioscience), Cat # 17-0851-01) 상에서 제거하였다. 실시예 3에 기재된 바와 같이, 단일 세포 현탁액을 제조하고 연속 희석 항체 제제 시리즈 (5배 희석으로 0.0019 내지 30 μg/mL 범위의 최종 농도)에 대해 결합을 분석하였다. 항체를 인큐베이션한 후, 세포를 2회 세척하고, 100 μL FACS 완충제 중에 재현탁시키고, 항체 결합을 BD LRSF포르테사 세포 분석기 (비디 바이오사이언시즈) 상에서 분석하였다. 결합 곡선은 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀 분석 (가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응)을 이용하여 분석하였다.
도 34는, 비-교차차단 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G의 단일 항체 및 조합물 둘 다 HCT 116 인간 암 세포에 대해 용량-의존성 결합을 나타내었음을 도시한다.
실시예 37: 시노몰구스 원숭이 DR5에 대한 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G의 결합.
인간 DR5 또는 시노몰구스 원숭이 DR5의 짧은 이소형을 발현하는 CHO 세포에 대한 정제된 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G의 결합을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 사멸 도메인 기능 상실 돌연변이 K386N을 갖는 짧은 이소형 인간 DR5 단백질 (서열식별번호: 47, 유니프롯 번호 O14763-2에 기초함) 및 아미노산 185-213의 결실 및 사멸 도메인 기능 상실 돌연변이 K420N을 갖는 시노몰구스 원숭이 DR5 단백질 (서열식별번호: 50; NCBI 수탁 번호 XP_005562887.1에 기초함)의 발현에 코돈-최적화된 구축물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성하였다. DR5-형질감염된 CHO 세포에 대한 결합을 일반적으로 실시예 5에 기재된 바와 같이 분석하였다. 형질감염된 세포를 액체 질소에 보관하고, 37℃에서 신속히 해동하고, 10 mL 배지에 현탁시켰다. 세포를 PBS로 세척하고, FACS 완충제 중에 1.0x106 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 100 μL 세포 현탁액 샘플 (100,000 세포/웰)을 96-웰 플레이트에 시딩하고, 300xg에서 4℃에서 3분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 25 μL의 연속 희석 항체 제제 시리즈 (6배 희석으로 0 내지 20 μg/mL의 최종 농도)를 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 세포를 세척하고, 빛으로부터 보호하면서 50 μL 이차 항체 R-PE-접합된 염소-항-인간 IgG F(ab')2 (잭슨 이뮤노리서치; Cat nr 109-116-098; 1/100)와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 150 μL FACS 완충제로 2회 세척하고, 50 μL FACS 완충제 중에 재현탁시키고, 10,000 사건을 기록함으로써 BD LRSF포르테사 세포 분석기 (비디 바이오사이언시즈) 상에서 항체 결합을 분석하였다. 결합 곡선은 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀 분석 (가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응)을 이용하여 분석하였다.
도 35는, 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G가 CHO 세포 상에서 발현된 인간 및 시노몰구스 DR5에 대해 용량-의존성 결합을 나타내었음을 도시한다. IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G 둘 다의 경우, 인간 DR5 및 시노몰구스 DR5에 대한 결합에 대한 EC50 값이 4회 반복 실험을 기준으로 동일한 범위 내에 있었다 (표 10).
표 10: 인간 및 시노몰구스 DR5로의 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G의 결합에 대한 EC50 값. 4회 실험 기준.
Figure pct00027
실시예 38: E430G 돌연변이의 도입은 비-교차차단 항체 IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05의 조합물에 의한 세포 사멸 유도의 효능을 개선시킨다.
항체가 인간 결장암 세포 COLO 205를 사멸시키는 능력에 대한 IgG1-hDR5-01-G56T 및 IgG1-hDR5-05에서의 육량체화-증진 돌연변이 E430G의 효과를 연구하기 위해 생존율 검정을 수행하였다. E430G 돌연변이를 갖는 및 갖지 않는 항체를 2가지 비-교차차단 항체의 단일 작용제로서 및 이들의 조합물로서 시험하였다. COLO 205 세포를 실시예 8에 기재된 바와 같이 수확하였다. 100 μL의 단일 세포 현탁액 (5,000 세포/웰)을 폴리스티렌 96-웰 편평 바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원, Cat nr 655182)에 시딩하고, 밤새 37℃에서 부착되도록 하였다. 후속적으로, 항체 농도 시리즈 (4배 희석으로 0.3-20,000 ng/mL 범위의 최종 농도)의 50 μL 샘플을 첨가하고, 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로서, 세포를 5 μM 스타우로스포린 (시그마 알드리치, Cat nr S6942)과 함께 인큐베이션하였다. 세포 배양물의 생존율을 실시예 8에 기재된 바와 같이 셀타이터-글로 발광 세포 생존율 검정으로 결정하였다.
도 36은, IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 조합물이 항체 단독에 비해 더욱 강력하였고, E430G 돌연변이를 갖지 않는 항체의 조합물에 비해 더욱 강력하였음을 도시한다. 이들 데이터는, 육량체화-증진 돌연변이 E430G의 도입이 부착성 COLO 205 결장암 세포로 비-교차차단 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 조합물의 결합 시 세포 사멸의 유도를 증진시켰음을 나타낸다. 세포를 시딩할 때 항체를 직접 첨가하는 실험 설정과는 대조적으로 (실시예 8), 샘플을 첨가하기 전에 세포를 96-웰 편평 바닥 플레이트에 먼저 부착되도록 한 이 실험에서는 단일 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G가 COLO 205 세포에 대한 효능을 나타내지 않았다.
실시예 39: 육량체화-증진 돌연변이 S440Y의 도입은 항-DR5 항체가 인간 결장암 세포에 대한 세포 사멸을 유도하는 효능을 개선시킨다.
IgG1-hDR5-01-G56T 및 IgG1-hDR5-05의 단일 항체 및 조합물이 COLO 205 인간 결장암 세포를 사멸시키는 능력에 대한 육량체화-증진 돌연변이 S440Y의 효과를 생존율 검정으로 연구하였다. 세포를 수확하고, 셀타이터-글로 발광 세포 생존율 검정을 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략히, 100 μL의 단일 세포 현탁액 (5,000 세포/웰)을 96-웰 플레이트에 시딩하고, 동시에 50 μL의 연속 희석 항체 제제 시리즈 (4배 희석으로 0.0003 내지 20 μg/mL 범위의 최종 농도)를 첨가하고, 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다.
도 37A는, 세포를 시딩할 때 항체를 직접 첨가한 실험 설정에서, 육량체화-증진 돌연변이 S440Y의 도입이 단일 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-S440Y 및 IgG1-hDR5-05-S440Y에 의한 용량-의존성 사멸을 유발한 반면에, 모 야생형 항체 IgG1-hDR5-01-G56T 및 IgG1-hDR5-05는 COLO 205 결장암 세포를 사멸시킬 수 없었음을 도시한다. 또한, 감소된 EC50에 의해 나타나는 바와 같이, IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05의 조합물의 효능은 항체 둘 다에서 S440Y 돌연변이의 도입에 의해 개선되었다 (도 37B).
실시예 40: 육량체화-증진 돌연변이 E430G의 도입은 항-DR5 항체 IgG1-DR5-CONA + IgG1-DR5-chTRA8의 조합물에 의한 세포 사멸 유도의 효능을 개선시킨다.
항체 IgG1-DR5-CONA-K409R 및 IgG1-DR5-chTRA8-F405L에 대한 교차차단 ELISA를 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행하였다. K409R 및 F405L 돌연변이는 관련이 없으며, E430G 돌연변이를 갖는 항체의 능력에 대해 효과가 없었다 (실시예 22). 도 38A는 경쟁 항체의 부재 하의 DR5ECD-FcHisC태그의 결합에 대한 경쟁 항체의 존재 하의 코팅된 항체로의 DR5ECD-FcHisC태그 결합의 억제 백분율로서 표현되는 결합 경쟁을 도시한다 (% 억제 = 100 -[(경쟁 항체 존재 하의 결합/경쟁 항체 부재 하의 결합)]*100). 코팅된 IgG1-DR5-CONA-K409R로 DR5ECD-FcHisC태그의 결합은 가용성 IgG1-DR5-chTRA8-F405L의 존재 하에 억제되지 않았다. 그 반대로, 코팅된 IgG1-DR5-chTRA8-F405L로 DR5ECD-FcHis태그의 결합 또한 가용성 IgG1-DR5-CONA-K409R의 존재 하에 억제되지 않았다. 이들 데이터는, IgG1-DR5-CONA-K409R 및 IgG1-DR5-chTRA8-F405L이 DR5ECD-FcHisC태그의 결합에 대해 서로 경쟁하지 않았음을 나타낸다.
다음으로, 비-교차차단 항-DR5 항체 IgG1-DR5-CONA-C49W + IgG1-DR5-chTRA-8의 조합물이 부착된 BxPC-3 인간 췌장암 세포를 사멸시키는 능력에 대한 육량체화-증진 돌연변이 E430G의 효과를 실시예 11에 기재된 바와 같이 생존율 검정으로 연구하였다. 도 38B는, 육량체화-증진 돌연변이를 갖는 항체 조합물 IgG1-DR5-CONA-C49W-E430G + IgG1-DR5-chTRA8-E430G가 E430G 육량체화-증진 돌연변이가 없는 모 항체의 조합물에 비해 BxPC-3 세포의 증가된 용량-의존성 사멸을 나타내었음을 도시한다.
실시예 41: 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G가 상이한 암 세포주에서 표적 세포 사멸을 유도하는 능력.
비-교차차단 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 조합물이 사멸을 유도하는 효능을 상이한 인간 암 세포주에 대해 분석하여, E430G 돌연변이를 갖지 않는 모 항체 조합물, 및 TRAIL과 비교하였다. HCT-15, HCT 116, HT-29 및 SW480 결장암, BxPC-3, HPAF-II 및 PANC-1 췌장암, SNU-5 위암, A549 및 SK-MES-1 폐암, 및 A375 피부암 세포에 대한 생존율 검정을 본질적으로 실시예 11에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략히, 100 μL의 단일 세포 현탁액 (5,000 세포/웰)을 96-웰 플레이트에 시딩하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 μL의 항체 샘플 (133 nM 최종 농도) 또는 인간 재조합 TRAIL/APO-2L (이바이오사이언스, Cat nr BMS356; 133 nM 최종 농도)을 첨가하고, 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다.
TRAIL 및 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G 둘 다는 상이한 징후로부터 기원한 인간 암 표적 세포주의 사멸을 나타내었다 (도 39). 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 사멸은 11가지 시험된 세포주 중 6가지에서 대조군 항체 IgG1-b12에 비해 유의하였다. 이들 반응 세포주의 경우, 생존 세포 백분율은 E430G 돌연변이를 갖지 않는 항체 조합물과 함께 인큐베이션한 후에 비해 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G와 함께 인큐베이션한 후에 유의하게 더 낮았다. IgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430G의 사멸 효능과 DR5 표적 발현 수준 사이에는 상관관계가 없었다 (실시예 2에 기재됨).
실시예 42: 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 세포독성 효능에 대한 인간 암 세포주 패널의 스크리닝.
항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 활성을 시험하여, 14가지 종양 계통을 나타내는 235 세포주의 패널에서 TRAIL의 활성과 비교하였다: 신장암, 신경 조직암, 결장직장암, 위암, 유방암 (우세하게는 삼중 음성 유방암 (TNBC)), 비소세포 폐암 (NSCLC), 방광암, 췌장암, 난소암, 흑색종, 간암, 자궁내막암, 두경부암 및 소세포 폐암 (SCLC). 성장 억제 분석을 이용하는 72시간 에이티피라이트(ATPlite) 검정 (DLD-1 및 HCT116 세포주의 경우에는 제외, 이 경우에는 120시간 검정을 수행하였음)을 호리즌 디스커버리 리미티드(Horizon Discovery Ltd, 영국)에서 2 파트로 수행하였다. 샘플을 384-웰 검정 플레이트에서 사중으로 시험하였다. 0.072 μM 최종 농도에서 출발하는 항체의 연속 희석 시리즈를 모든 시험된 세포주에 대해 사용하였다. TRAIL (인비트로젠; Cat # PHC1634)의 경우에는, 제1 파트에서 시험된 세포주에 대해 0.01 μM 최종 농도에서 출발하는 및 스크리닝의 제2 파트에서 시험된 세포주에 대해 0.17 μM 최종 농도에서 출발하는 연속 희석 시리즈를 사용하였다. 억제 백분율은 하기 식을 이용하여 계산하였다: T≥V(0)인 경우, 억제 백분율 = 100*[1-(T-V(0))/(V-V(0))]; T<V(0)인 경우, 억제 백분율 = 100%, T = 시험 샘플의 발광, V(0) = 제0일에 배지 대조군 샘플의 발광, 및 V = 제3일에 배지 대조군 샘플의 발광. 반응자 및 비-반응자 세포주를 반응자로서 ≥ 70% 억제를 나타내는 세포주 및 비-반응자로서 ≤ 69% 억제를 나타내는 세포주를 분류하는 최대 반응 역치 값에 의해 그룹화하였다 (도 40; 표 11). 항체 (IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G) 및 TRAIL 단일요법 둘 다에 대한 반응자 세포주는 소세포 폐암 (SCLC)을 제외한 모든 시험된 종양 징후에 대해 확인되었다.
표 11: 상이한 인간 암 징후를 나타내는 세포주의 패널에 대해 호리즌 디스커버리 리미티드 (영국)에서 3-일 생존율 검정 스크리닝으로 결정되는 항체 (IgG1-hDR5-01-G56T-E430G+ IgG1-hDR5-05-E430G) 및 TRAIL 단일요법에 대한 결과: 신장암 (A), 신경 조직암 (B), 결장직장암 (C), 위암 (D), 삼중 음성 유방암 (TNBC) (E), 비소세포 폐암 (NSCLC) (F), 방광암 (G), 췌장암 (H), 난소암 (I), 흑색종 (J), 간암 (K), 자궁내막암 (L), 두경부암 (M) 및 소세포 폐암 (SCLC) (N). IC50 값 및 최대 억제 백분율을 표에 나타내었다.
표 11A: 3-일 생존율 검정 스크리닝으로 결정된 바와 같은 항체 (IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G) 및 TRAIL 요법에 대한 신장암 세포주 스크리닝 결과.
Figure pct00028
표 11B: 3-일 생존율 검정으로 결정된 바와 같은 항체 (IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G) 및 TRAIL 요법에 대한 신경 조직 암 세포주 스크리닝 결과.
Figure pct00029
표 11C: 호리즌 (영국)에서 3-일 생존율 검정 스크리닝으로 결정된 바와 같은 항체 (IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G) 및 TRAIL 요법에 대한 결장직장 암 세포주 스크리닝 결과.
Figure pct00030
표 11D: 호리즌 (영국)에서 3-일 생존율 검정 스크리닝으로 결정된 바와 같은 항체 (IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G) 및 TRAIL 요법에 대한 위암 세포주 스크리닝 결과.
Figure pct00031
표 11E: 호리즌 (영국)에서 3-일 생존율 검정 스크리닝으로 결정된 바와 같은 항체 (IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G) 및 TRAIL 요법에 대한 유방암 세포주 스크리닝 결과.
Figure pct00032
*TNBC
표 11F: 호리즌 (영국)에서 3-일 생존율 검정 스크리닝으로 결정된 바와 같은 항체 (IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G) 및 TRAIL 요법에 대한 비소세포 폐암 (NSCLC) 세포주 스크리닝 결과.
Figure pct00033
표 11G: 호리즌 (영국)에서 3-일 생존율 검정 스크리닝으로 결정된 바와 같은 항체 (IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G) 및 TRAIL 요법에 대한 방광암 세포주 스크리닝 결과.
Figure pct00034
표 11H: 호리즌 (영국)에서 3-일 생존율 검정 스크리닝으로 결정된 바와 같은 항체 (IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G) 및 TRAIL 요법에 대한 췌장암 세포주 스크리닝 결과.
Figure pct00035
표 11I: 호리즌 (영국)에서 3-일 생존율 검정 스크리닝으로 결정된 바와 같은 항체 (IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G) 및 TRAIL 요법에 대한 난소암 세포주 스크리닝 결과.
Figure pct00036
표 11J: 호리즌 (영국)에서 3-일 생존율 검정 스크리닝으로 결정된 바와 같은 항체 (IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G) 및 TRAIL 요법에 대한 흑색종 세포주 스크리닝 결과.
Figure pct00037
표 11K: 호리즌 (영국)에서 3-일 생존율 검정 스크리닝으로 결정된 바와 같은 항체 (IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G) 및 TRAIL 요법에 대한 간암 세포주 스크리닝 결과.
Figure pct00038
표 11L: 호리즌 (영국)에서 3-일 생존율 검정 스크리닝으로 결정된 바와 같은 항체 (IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G) 및 TRAIL 요법에 대한 자궁내막암 세포주 스크리닝 결과.
Figure pct00039
표 11M: 호리즌 (영국)에서 3-일 생존율 검정 스크리닝으로 결정된 바와 같은 항체 (IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G) 및 TRAIL 요법에 대한 두경부암 세포주 스크리닝 결과.
Figure pct00040
표 11N: 호리즌 (영국)에서 3-일 생존율 검정 스크리닝으로 결정된 바와 같은 항체 (IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G) 및 TRAIL 요법에 대한 소세포 폐암 (SCLC) 암 세포주 스크리닝 결과.
Figure pct00041
실시예 43: 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G가 상이한 조합 비에서 암 세포 사멸을 유도하는 능력.
IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G를 상이한 비로 조합할 때, 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G가 BxPC-3 췌장암 세포 및 HCT-15 결장암 세포의 사멸을 유도하는 능력을 연구하기 위해 생존율 검정을 수행하였다. 연속 희석 시리즈 (5배 희석으로 0.006 내지 20 μg/mL 범위의 최종 농도) 중 1:0, 9:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:9 및 0:1의 항체 비를 실시예 16에 기재된 바와 같이 셀타이터-글로 발광 세포 생존율 검정으로 시험하였다.
20 μg/mL, 4 μg/mL 및 0.8 μg/mL의 총 항체 농도에서, BxPC-3 (도 41A) 및 HCT-15 (도 41B) 세포의 사멸은 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G 둘 다를 함유하는 모든 시험된 항체 비에서 동등하게 효과적이었다. 대조적으로, 단일 항체 (1:0 및 0:1의 비)는 사멸을 유도하지 않았다. 0.16 μg/mL의 총 항체 농도에서, IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 시험된 조합물은 사멸을 유도하였지만, 보다 높은 항체 농도에 비해 더 적은 정도였으며, 상이한 비의 사용에 의해 효능이 영향을 받는다.
실시예 44: 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G는 카스파제 의존성 프로그램화된 세포 사멸을 유도한다.
카스파제 억제제의 존재 및 부재 하에 육량체화-증진 돌연변이 E430G를 갖는 및 갖지 않는 IgG1-hDR5-01-G56T 및 IgG1-hDR5-05의 항체 변이체의 조합물의 세포독성을 비교하기 위해 생존율 검정을 수행하였다. 항체 또는 TRAIL 샘플의 연속 희석 시리즈 (4배 희석으로 0.002 내지 133 nM 범위의 최종 농도)를 사용하여 셀타이터-글로 발광 세포 생존율 검정을 실시예 18에 기재된 바와 같이 수행하였다.
TRAIL 및 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05 및 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 경우 BxPC-3 세포의 사멸이 범-카스파제 억제제 Z-VAD-FMK의 존재 하에 억제되었다 (도 42). 이들 데이터는, TRAIL과 마찬가지로, 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05 및 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G가 카스파제 의존성 프로그램화된 세포 사멸을 유도하였음을 나타낸다.
실시예 45: 인간 암 세포에 대한 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 결합 시 카스파제-3 및 -7 활성화.
카스파제-3/7 활성화를 본질적으로 실시예 20에 기재된 바와 같이 카스파제-글로 3/7 검정을 이용하여 시간에 걸쳐 측정하였다. 간략히, 세포를 트립신 처리에 의해 수확하고, 세포 스트레이너에 통과시키고, 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하고, 1.6x105 세포/mL의 농도로 배양물 배지 중에 재현탁시켰다. 25 μL의 단일 세포 현탁액 (4,000 세포/웰)을 384-웰 배양물 플레이트 (퍼킨 엘머, Cat nr 6007680)에 시딩하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 25 μL 샘플을 첨가하고 (26.6 nM 최종 농도), 37℃에서 1, 2, 4 및 6시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 인큐베이터로부터 꺼내어 실온이 될 때까지 온도가 감소하게 두었다. 세포를 300 g에서 3분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 25 μL 상청액을 제거하고, 25 μL 카스파제-글로 3/7 기질로 교체하였다. 500 rpm에서 1분 동안 진탕시킴으로써 혼합한 후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 엔비젼 멀티라벨 판독기 (퍼킨엘머) 상에서 발광을 측정하였다.
1, 2, 4 내지 6시간의 시간 과정에 걸쳐, TRAIL 및 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G 둘 다 육량체화 증진 돌연변이를 갖지 않는 WT 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05에 비해 BxPC-3 세포에 대해 더욱 신속하고 더욱 강력한 카스파제-3/7 활성화를 유도하였다 (도 43).
실시예 46: 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 시험관내 효능은 이차 Fc 가교제의 존재를 필요로 하지 않는다.
이차 항체 가교제의 부재 및 존재 하에 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G가 인간 HCT-15 결장암 세포 및 BxPC-3 췌장암 세포의 사멸을 유도하는 능력을 비교하기 위해 생존율 검정을 수행하였다. 비교를 위해, 이차 항체 가교제의 존재 하에 증진된 사멸을 나타내는 것으로 공지된 IgG1-DR5-CONA를 동일한 검정으로 시험하였다. 이차 가교제의 부재 및 존재 하에 생존율 검정을 본질적으로 실시예 21에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략히, 100 μL의 단일 세포 현탁액 (5,000 세포/웰)을 96-웰 플레이트에 시딩하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 염소-항-인간 IgG 항체의 F(ab')2 단편의 부재 또는 존재 하에 50 μL 항체 샘플 (최종 농도 4 μg/mL)을 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 세포 사멸에 대한 양성 대조군으로서, 세포를 5 μM 스타우로스포린과 함께 인큐베이션하였다. 세포 배양물의 생존율을 실시예 8에 기재된 바와 같이 셀타이터-글로 발광 세포 생존율 검정으로 결정하였다.
조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G는 BxPC-3 및 HCT15 세포에서 강력한 사멸을 유도하였고, 이차 가교제의 존재 하에 세포독성은 추가로 증진되지 않았다 (도 44). 대조적으로, IgG1-DR5-CONA 및 야생형 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05의 효능은 BxPC-3 및 HCT15 둘 다에서 이차 가교제의 존재에 의해 증진되었다. 이들 데이터는, 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G에 의한 BxPC-3 및 HCT15 암 세포의 사멸이 이차 Fc 가교제의 존재와는 무관하다는 것을 나타낸다.
실시예 47: 인간 또는 시노몰구스 DR5로 일시적으로 형질감염된 CHO 세포에 대한 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G의 결합 시 보체 활성화.
항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G가 보체를 활성화시키는 능력을 분석하기 위해, 시험관내 보체-의존성 세포독성 (CDC) 검정 및 보체 성분 C3c의 침착을 인간 또는 원숭이 DR5의 짧은 이소형으로 일시적으로 형질감염된 CHO 세포에 대해 측정하였다. DR5 구축물은 그들의 사멸 도메인에 K386N (인간) 또는 K420N (시노몰구스 원숭이) 돌연변이를 보유하여, 효능작용성 항체의 결합 시 아폽토시스의 유도에 의한 사멸을 방지하였다. 인간 또는 원숭이 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)) DR5에 의한 CHO 세포의 일시적인 형질감염을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다.
CDC 검정의 경우, 0.1 x 106 세포를 진탕기 상에서 RT에서 15분 동안 총 부피 80 μL의 정제된 항체의 농도 시리즈와 함께 폴리스티렌 둥근 바닥 96-웰 플레이트 (그라이너 바이오-원 Cat # 650101)에서 사전 인큐베이션하였다. 다음으로, 20 μL 정상 인간 혈청 (NHS; Cat # M0008 산퀸, 네덜란드 암스테르담)을 보체 공급원으로서 첨가하고, 37℃ 인큐베이터에서 45분 동안 인큐베이션하였다 (20% 최종 NHS 농도; 3배 희석으로 0.003-10.0 μg/mL 최종 항체 농도). 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고 상청액을 30 μL의 2 μg/mL 아이오딘화프로피듐 용액 (PI; 시그마 알드리치, 네덜란드 쯔비냐르데)으로 교체하기 전에, 플레이트를 얼음 상에 놓아 반응을 중단시켜다. PI-양성 세포의 백분율을 인텔리사이트 아이큐™ 스크리너 (웨스트버그) 상에서 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 그래프패드 프리즘 5에서 로그-변환 농도를 사용하는 비선형 용량-반응 대입의 최상-대입 값을 사용하여 데이터를 분석하였다.
C3b 침착의 분석의 경우, 0.1 x 106 세포를 진탕기 상에서 RT에서 15분 동안 총 부피 80 μL의 정제된 항체의 농도 시리즈 (3배 희석으로 0.003-10.0 μg/mL 최종 항체 농도)와 함께 둥근 바닥 96-웰 플레이트에서 사전 인큐베이션하였다. 다음으로, 20 μL C5-고갈된 혈청 (퀴델(Quidel); Cat # A501)을 보체 공급원으로서 첨가하고, 37℃ 인큐베이터에서 45분 동안 인큐베이션하였다 (20% 최종 NHS 농도). 세포를 펠릿화하고, 후속적으로 FACS 완충제 중 50 μL FITC-표지된 폴리클로날 토끼-항-인간 C3c 보체 (다코(Dako); Cat # F0201; 2 μg/mL)와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충제로 2회 세척하고, 30 μL FACS 완충제 중에 재현탁시켰다. 세포 상의 C3b-침착을 인텔리사이트 아이큐™ 스크리너 (웨스트버그) 상에서 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 그래프패드 프리즘 5에서 로그-변환 농도를 사용하는 비선형 용량-반응 대입의 최상-대입 값을 사용하여 데이터를 분석하였다.
IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G의 경우 DR5-형질감염된 CHO 세포에 대한 보체-의존성 사멸 (도 45A-B) 및 C3b 침착 (도 45C-D) 둘 다가 단일 항체 및 조합물 둘 다에 대한 용량-반응 곡선으로 관찰되었다. 이들 데이터는, IgG1 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G가 세포 표면 상에 표적 결합 시 보체 활성화를 유도하는 고유의 능력이 단일 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G 및 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G 둘 다에 대해 보존되었음을 나타낸다.
실시예 48: 인간 결장암 세포주에 대한 화합물의 패널을 이용하여 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 효능 증진에 대한 약물 조합물 스크린 분석.
항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G와 조합 시 상승작용적 억제 효과를 나타내는 관련 화합물을 임상적으로 확인하기 위해, 상이한 치료제 분류에 해당하는 100종의 화합물을 결장암 세포주에서 잠재적인 상승작용에 대해 스크리닝하였다. 성장 억제 분석을 이용하는 72시간 (LS-411N, SNU-C2B 및 SW480의 경우) 또는 120시간 (DLD-1 및 HCT 116의 경우) 에이티피라이트 검정을 호리즌 디스커버리 리미티드 (영국)에서 384-웰 검정 플레이트 중 6x6 최적화된 조합물 매트릭스에서 수행하였다. 모든 샘플은 사중으로 시험하였다. 성장 억제 백분율은 하기 식을 이용하여 계산하였다: T≥V(0)인 경우, 성장 억제 백분율 = 100*[1-(T-V(0))/(V-V(0))]; T<V(0)인 경우, 성장 억제 백분율 = 100*[1-(T-V(0))/V(0)], T = 시험 샘플의 발광, V(0) = 제0일에 배지 대조군 샘플의 발광, 및 V = 제3일에 배지 대조군 샘플의 발광. 상승작용적 효과를 확인하기 위해, 대표적인 화합물을 사용하여 각각의 치료제 부류에 대한 평균 자체-교차 활성을 결정하였다. 로에베 가산성(Loewe additivity)을 능가하는 조합물 효과를 측정하기 위해, 호리즌 디스커버리 리미티드는 상승작용 점수(Synergy Score)로 지칭되는 상승작용적 상호작용의 강도를 특징화하는 스칼라 척도를 고안하였다. 상승작용 점수 방정식은, 가산성에 대한 로에베 모델을 이용하여 개별 작용제에 대한 활성으로부터 수치적으로 유래된 모델 표면을 능가하는 행렬에서 각각의 시점에서 실험적으로 관찰된 활성 부피를 통합한다. 상승작용 점수 방정식에 대한 추가적인 용어는 개별 작용제에 대해 사용되는 다양한 희석 인자를 정규화하기 위해 및 전체 실험에 걸쳐 상승작용 점수의 비교를 허용하기 위해 사용된다. 양성 억제 게이팅 또는 아이데이터 멀티플라이어(Idata multiplier)의 포함은 제로 효과 수준 근처의 노이즈를 제거하고, 높은 활성 수준에서 발생하는 상승작용적 상호작용의 결과를 편향시킨다. 상승작용 점수 (S)는 하기 식을 이용하여 계산하였다: S = log fX log fY Σ max(0,I데이터)(I데이터 - I로에베) (fx,y = 각각의 단일 작용제에 대해 사용된 희석 인자). 평균 자체-교차 + 3σ보다 높은 상승작용 점수는 99% 신뢰 수준에서 후보 상승작용으로 고려되었다.
표 12는 모든 100종의 시험된 화합물에 대한 상승작용 점수를 도시한다. 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G와의 상승작용을 화학요법제 (예컨대, 세포골격 조절제 및 DNA/RNA 손상제), 키나제 억제제, PI3K 경로 억제제, RAS 억제제, 아폽토시스-조정제, 프로테아솜 억제제, 후성적 조정제 (예컨대, HDAC 억제제) 등을 비롯한 상이한 치료제 부류로부터의 화합물과 함께 1종 이상의 세포주에 대해 관찰하였다. 도 46은 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G와 조합된 시험된 화합물의 성장 억제 효과의 5가지 예를 도시한다. 비리나판트 (도 46C), 옥살리플라틴 (도 46A), 이리노테칸 (도 46B) 및 파클리탁셀 (도 46E)은 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 효과를 증진시킨 예인 반면에, 바리시티닙 (도 46D)은 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 활성에 대한 효과를 나타내지 않은 예이다.
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
표 12: 결장암 세포주 LS-411N, SNU-C2B, SW480, DLD-1 및 HCT 116에 대한 생존율 검정에서 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G와 조합하여 시험한 상이한 치료제 부류의 100종의 화합물에 대한 상승작용 점수. 상승작용적 효과 (상승작용 점수 > 평균 자체-교차 + 3σ)는 회색으로 표시하였다.
실시예 49: 피하 COLO 205 결장암 이종이식 모델에서 항-DR5 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G의 생체내 효능.
항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G의 생체내 항-종양 효능을 단일 항체 및 항체 둘 다의 조합물에 대해 평가하여, 피하 COLO 205 인간 결장암 이종이식 모델에서 E430G 돌연변이를 갖지 않는 모 항체와 비교하였다. 종양 세포 접종, 마우스 취급, 종양 증식 측정 및 종점 결정을 본질적으로 실시예 26에 기재된 바와 같이 수행하였다. 3x106 세포를 100 μL PBS의 부피로 5-8 주령 암컷 SCID 마우스 (C.B-17/IcrHan®Hsd-Prkdcscid; 하를란)의 옆구리에 주사하였다. 제9일에, 평균 종양 부피를 측정하였고, 마우스를 동등한 종양 크기 변화를 갖는 그룹으로 분류하였다. 마우스를 제9일에 200 μL PBS 중 10 μg (0.5 mg/kg) 항체의 정맥내 (i.v.) 주사에 의해 처리하였다. 대조군 그룹의 마우스는 10 μg (0.5 mg/kg) IgG1-b12로 처리하였다.
표 13: 처리 그룹 및 투여
Figure pct00046
도 47A는 시간에 따른 처리 그룹당 평균 종양 부피를 도시한다. 단일 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G에서 E430G 돌연변이의 도입은 E430G 돌연변이를 갖지 않는 모 항체에 비해 종양 성장의 억제를 증진시켰다. 항체 조합물로의 처리는 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G에 대해 및 E430G 돌연변이를 갖지 않는 모 항체의 조합물에 대해 둘 다 완전한 종양 관해를 유도하였다. 제19일에, DR5-항체로 처리한 모든 그룹에서 평균 종양 크기는 음성 대조군 항체 IgG1-b12로 처리한 동물에서에 비해 유의하게 작았다 (만 휘트니 검정 (P < 0.001))(데이터는 제시되지 않음). 도 47B는 종양 부피 >500 mm3에서 컷오프 설정을 갖는, 종양 진행의 카플란-마이어 플롯을 도시한다. 음성 대조군 항체 IgG1-b12로 처리한 마우스에 비해, 항-DR5 항체로 처리한 모든 그룹에서 종양 증식이 유의하게 지연되었다 (종양 크기 컷-오프 500 mm3에서 만텔-콕스 분석: p< 0.0001). 육량체화-증진 돌연변이 E430G를 갖지 않는 단일 항체 IgG1-hDR5-01-G56T 및 IgG1-hDR5-05로 처리한 마우스는 다른 시험된 항-DR5 항체로 처리한 마우스에 비해 유의하게 더 이른 종양 증식을 나타내었다 (종양 크기 컷-오프 500 mm3에서 만텔-콕스 분석: p< 0.0001).
실시예 50: 피하 HCT15 결장암 이종이식 모델에서 항-DR5 항체 IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05의 조합물의 생체내 효능에 대한 육량체화-증진 돌연변이의 효과.
항-DR5 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 생체내 항-종양 효능을 피하 HCT15 인간 결장암 이종이식 모델 (크라운바이오사이언시즈, 중국 타이창)에서 E430G 육량체화-증진 돌연변이를 갖지 않는 IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05와 비교하였다. 세포를 37℃에서 공기 중 5% CO2의 분위기 하에 10% 태아 소 혈청으로 보충된 RPMI-1640 배지 중 단일층 배양물로서 시험관내에서 유지하였다. 지수 성장기에 있는 부착성 세포를 트립신-EDTA 처리에 의해 수확하였다. 5x106 세포를 100 μL PBS의 부피로 7-9 주령 암컷 BALB/c 누드 마우스의 옆구리에 주사하였다. 연구하는 동안 동물의 관리 및 이용은 실험 동물 관리의 평가 및 인증을 위한 협회 (AAALAC)의 규정에 따라 수행하였다. 종양 부피는 캘리퍼스를 사용하여 1주에 2회 이차원으로 측정하였고, 부피는 하기 식을 이용하여 mm3으로 표현하였다: V = 0.5 a x b2 (여기서, a 및 b는 각각 종양의 긴 직경 및 짧은 직경임). 평균 종양 크기가 161 mm3에 이르렀을 때, 마우스를 무작위화 차단 설계를 이용하여 그룹으로 분류하고, 처리를 시작하였다 (그룹당 8 마리의 마우스). 마우스를 0.5 mg/kg 항체 (조합물 중 0.25 mg/kg의 각각의 항체)의 i.v. 주사에 의해 Q7D 투약 방식에 따라 3회 처리하였다. 동시에 대조군 그룹의 마우스는 0.5 mg/kg IgG1-b12로 처리하였다.
도 48A는 처리 그룹당 평균 종양 부피를 도시한다. 항체 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G는 IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05에 비해 더 양호한 종양 성장 억제를 나타내었다. 제21일에, 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G로 처리한 마우스에서 평균 종양 크기는 동등한 용량의 IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05로 처리한 마우스에 비해 유의하게 더 작았다 (만 휘트니 검정: P < 0.0011) (도 48B). 도 48C는 종양 부피 >750 mm3에서 컷오프 설정을 갖는, 종양 진행의 카플란-마이어 플롯을 도시한다. 조합물 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G로 처리한 마우스에서 종양 증식은 동등한 용량의 IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05로 처리한 마우스에 비해 유의하게 더 늦었다.
이들 데이터는, 항-DR5 항체 조합물 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G에서 E430G 육량체화-증진 돌연변이의 도입이 HCT15 인간 결장암 세포를 갖는 생체내 이종이식 모델에서 종양 성장 억제를 증진시켰음을 나타낸다.
실시예 51: 피하 SK-MES-1 인간 폐암 이종이식 모델에서 파클리탁셀과 조합된 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 생체내 효능.
IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G의 생체내 항-종양 효능을 피하 SK-MES-1 인간 폐암 이종이식 모델 (크라운바이오사이언시즈, 중국 타이창)에서 파클리탁셀과 조합하여 평가하였다. 세포 배양, 종양 세포 접종, 마우스 취급, 종양 증식 측정 및 종점 결정을 실시예 33에 기재된 바와 같이 수행하였다. 종양 접종 21일 후, 평균 종양 크기는 167 mm3에 이르렀고, 마우스를 무작위화 차단 설계를 이용하여 그룹으로 분류하고, 처리를 시작하였다. 마우스를 표 14에 나타낸 바와 같이 둘 다 체중 g당 10 μL PBS 중 2 mg/kg 항체 및 15 mg/kg 파클리탁셀 용량의 i.v. 주사에 의해 Q7D 투약 방식에 따라 2회 처리하였다.
표 14: 처리 그룹 및 투여, 실시예 53
Figure pct00047
도 49A는 처리 그룹당 평균 종양 부피를 도시한다. 항체 처리 단독 (2 mg/kg IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G), 또는 15 mg/kg 파클리탁셀과 조합된 2 mg/kg 항체 처리, 또는 15 mg/kg 파클리탁셀 단독 모두 IgG1-b12에 비해 항-종양 효능을 입증하였다. 도 49B는 제16일에 처리 그룹당 종양 부피를 도시한다. 모든 처리 그룹에서, 종양 부하가 IgG1-b12에 비해 유의하게 낮았다 (만-휘트니 검정, p<0.01). 도 49C는 종양 부피 > 500 mm3에서 컷오프 설정을 갖는, 종양 진행의 카플란-마이어 플롯을 도시한다. 15 mg/kg 파클리탁셀과 2 mg/kg IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G 항체의 조합물은 파클리탁셀 또는 항체 단독에 비해 진행이 없는 생존을 유의하게 연장시켰다 (게한-브레슬로우-윌콕슨(Gehan-Breslow-Wilcoxon) 검정, 종양 크기 컷-오프 500 mm3: p<0.05).
실시예 52: IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G의 약동학 (PK) 분석
E430G 돌연변이를 갖지 않는 모 항체와 비교하여 단일 화합물에 대해 및 두 항체의 조합물에 대해 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 IgG1-hDR5-05-E430G의 클리어런스율을 SCID 마우스에서 PK 실험으로 연구하였다.
7-10 주령 암컷 SCID (C.B-17/IcrHan@Hsd-Prkdc<scid, 하를란) 마우스 (그룹당 3 마리의 마우스)에게 200 μL 주사 부피로 20 μg 항체 (1 mg/kg)를 정맥내로 주사하였다. 항체 투여 후 10분, 4시간, 1일, 2일, 7일, 14일 및 21일째에 복재 정맥으로부터 50-100 μL 혈액 샘플을 수집하였다. 혈액을 헤파린-함유 바이알에 수집하고, 10,000 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 혈장 샘플을 처음 4회 시점의 경우에는 1:20으로 희석하고 (285 μL PBSA (0.2% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 보충된 PBS) 중 15 μL 샘플), 마지막 2회 시점의 경우에는 1:10으로 희석하고 (270 μL PBSA 중 30 μL 샘플), 항체 농도를 측정할 때까지 -20℃에서 보관하였다.
총 인간 IgG 농도를 샌드위치 ELISA를 이용하여 결정하였다. 마우스 항-인간 IgG-kappa mAb 클론 MH16 (CLB 산퀸, Cat # #M1268)을 포획 항체로 사용하였고, 4℃에서 밤새 PBS 중 2 μg/mL의 농도에서 96-웰 마이크롤론(Microlon) ELISA 플레이트 (그라이너(Greiner), 독일)에 100 μL로 코팅하였다. 플레이트 진탕기 상에서 RT에서 1시간 동안 PBSA와 함께 인큐베이션함으로써 플레이트를 차단하였다. 세척한 후, 100 μL의 연속 희석된 혈장 샘플 (3배 희석으로 0.037 - 1 μg/mL 범위)을 첨가하고, 플레이트 진탕기 상에서 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 300 μL PBST (0.05% 트윈 20으로 보충된 PBS)로 3회 세척하고, 후속적으로 플레이트 진탕기 상에서 RT에서 1시간 동안 100 μL 퍼옥시다제-표지된 염소 항-인간 IgG 이뮤노글로불린 (#109-035-098, 잭슨(Jackson), 펜실베니아주 웨스트 그레이스; 0.2% BSA로 보충된 PBST 중 1:10.000)과 함께 인큐베이션하였다. 빛으로부터 보호하면서 RT에서 15분 동안 100 μL 기질 2,2'-아지노-비스 (3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산) [ABTS; 로쉐, Cat # 11112 422001; 50 mL ABTS 완충제 중 1개 정제 (로쉐, Cat # 11112 597001)]과 함께 인큐베이션하기 전에, 플레이트를 다시 300 μL PBST로 3회 세척하였다. 100 μL 2% 옥살산을 첨가하여 반응을 중단시키고, RT에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 마이크로플레이트 판독기 (바이오텍, 버몬트주 위누스키)에서 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 기준 곡선으로서 주사된 물질을 사용하여 농도를 계산하였다. 플레이트 대조군으로서, 정제된 인간 IgG1 (결합 부위, Cat # BP078)을 포함시켰다. 인간 IgG 농도 (μg/mL)를 플롯팅하고 (도 50A), 곡선하 면적 (AUC)을 그래프패드 프리즘 6.0을 이용하여 계산하였다. 혈액 샘플링 마지막 날까지 (제21일) 클리어런스를 하기 식에 의해 결정하였다: D*1.000/AUC (여기서, D는 주사 용량임 (1 mg/kg)) (도 50B).
단일 작용제로서 또는 이들의 조합물로서 주사하였을 때 둘 다의 경우에, IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 또는 IgG1-hDR5-05-E430G와 E430G 돌연변이를 갖지 않는 그들의 모 항체 사이에 혈장 클리어런스율에서의 차이가 관찰되지 않았다 (도 50).
실시예 53: 육량체화-증진 돌연변이 E430G를 갖는 항-DR5 항체 IgG1-DR5-CONA는 인간 결장암 세포를 사멸시킬 수 있다.
본 연구는 육량체화-증진 돌연변이 E430G를 갖는 항-DR5 항체 IgG1-DR5-CONA가 부착된 인간 결장암 세포 COLO 205를 사멸시키는 능력을 설명한다. COLO 205 세포를 실시예 8에 기재된 바와 같이 수확하였다. 100 μL의 단일 세포 현탁액 (5,000 세포/웰)을 96-웰 편평 바닥 플레이트에 시딩하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 항체 농도 시리즈 (4배 희석으로 0.04 내지 10 μg/mL 범위의 최종 농도)의 50 μL 샘플을 첨가하고, 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로서, 세포를 5 μM 스타우로스포린과 함께 인큐베이션하였다. 세포 배양물의 생존율은 실시예 8에 기재된 바와 같이 셀타이터-글로 발광 세포 생존율 검정으로 결정하였다. 엔비젼 멀티라벨 판독기 (퍼킨엘머) 상에서 발광을 측정하였다. 데이터를 분석하고, 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하는 비선형 회귀 (가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응)를 이용하여 플롯팅하였다. 생존 세포 백분율은 하기 식을 이용하여 계산하였다: % 생존 세포 = [(항체 샘플의 발광 - 스타우로스포린 샘플의 발광)/(항체가 없는 샘플의 발광 - 스타우로스포린 샘플의 발광)]*100.
도 51은, 육량체화-증진 돌연변이 E430G의 도입이 IgG1-DR5-CONA-E430G에 의한 용량-의존성 사멸을 유발한 반면에, 모 야생형 항체 IgG1-DR5-CONA는 부착된 COLO 205 결장암 세포를 사멸시킬 수 없었음을 도시한다.
실시예 54: 항체 IgG1-hDR5-05-E430G의 제제 개발
사용된 약어:
Figure pct00048
물질:
항체 IgG1-hDR5-05-E430G는, 달리 언급되지 않는 한, 20 mg/ml로 제제화하였다.
방법
시차 주사 열량측정 (DSC)
단백질 샘플의 용융 온도는 마이크로칼 모세관 DSC 장비를 사용하여 결정하였다.
외관
외관은 시각적 평가에 의해 결정하였다.
pH
pH는 메틀러 톨레도 세븐멀티(Mettler Toledo SevenMulti) pH 미터를 사용하여 측정하였다.
UV A280에 의한 단백질 함량
단백질 함량은 애질런트(Agilent) UV/Vis 분광광도계 (모델 8453)를 사용하여 UV/Vis 분광분석법에 의해 결정하였다.
크기 배제 크로마토그래피 (SEC)
크기 배제 크로마토그래피는 애질런트 100 HPLC 시스템 상에서 도소(TOSOH), TSK-겔 G-3000SWxL (7.8 x 300 mm) 칼럼 (시그마)을 사용하여 수행하였다.
영상화 모세관 등전 포커싱 (icIEF)
영상화 모세관 등전 포커싱은 PrinCE 오토샘플러가 구비된 iCE 3 분석기를 사용하여 수행하였다.
모세관 전기영동 - 소듐 도데실 술페이트 (CE-SDS)
환원 및 비-환원 모세관 전기영동은 베크만 쿨터(Beckman Coulter) PA800플러스 시리즈 모세관 전기영동 시스템을 사용하여 수행하였다. 베타 메르캅토에탄올을 환원 샘플로 사용하였다.
동적 광 산란 (DLS)
동적 광 산란은 와이어트 디나프로(Wyatt DynaPro) 플레이트 판독기를 사용하여 수행하였다.
결과
1. 기준선 생물물리학적 스크리닝
초기 생물물리학적 스크리닝을 수행하여, 부형제 스크리닝으로 이동하기 위해 완충제/pH 조합을 선택하였다. 표 15는 초기 완충제 스크린으로부터 수득된 데이터를 나타내며, 여기서 글루타메이트, 아세테이트, 숙시네이트, 히스티딘, 시트레이트 및 포스페이트 완충제를 시험하였다. DSC 및 DLS를 사용하여 열 안정성을 평가하였다. DSC 분석은 T개시와 함께 용융 온도 (Tm1 및 Tm2)를 제공하였다. DLS 분석은 단백질의 다분산도 및 유체역학 반경에 대한 정보를 제공하였다.
DSC 데이터에 기초하면, 글루타메이트 pH 5.0, 아세테이트 pH 5.5, 및 숙시네이트 pH 6.0은 보다 낮은 pH에서의 그의 대응물과 비교했을 때 보다 높은 T개시 값을 가졌다. 보다 높은 T개시 값은 단백질의 보다 우수한 열 안정성을 나타낸다. pH 5.5, 6.0 및 6.5에서의 모든 히스티딘 제제는 비교적 높은 T개시 값을 나타내었고, 이들 값은 pH가 증가함에 따라 약간 증가하였다. 각각 pH 6.0 및 7.0에서의 시트레이트 완충제의 경우 T개시는 54℃인 반면, pH 7.5에서의 포스페이트의 T개시는 54℃였다. 초기 생물물리학적 스크리닝으로부터의 DLS 데이터로부터의 결과는 DSC로부터 수득한 제제 결과와 강하게 상관되지 않았다. 구체적으로, DSC에서 관찰된 바와 같은 보다 우수한 열 안정성을 나타낸 보다 높은 pH를 갖는 제제에서 높은 정도의 다분산도가 관찰되었다. 예를 들어, 히스티딘, pH 5.5는, 각각 10.8 및 15.6의 %Pd를 나타낸 pH 6.0 및 6.5와 비교하여, 6.3의 %Pd를 가졌다 (표 15). 포스페이트 및 시트레이트 제제는 나머지 제제와 비교하여 가장 높은 %Pd를 가졌다. DSC 및 DLS로부터 수득된 데이터에 기초하여, 다양한 부형제의 존재 하에 글루타메이트 pH 5.0, 아세테이트 pH 5.5, 히스티딘 pH 5.5 및 숙시네이트 pH 6.0 제제를 추가로 스크리닝하였다. 포스페이트 및 시트레이트 제제는 높은 % 다분산도 및 이들 완충제 중에서 단백질이 탈안정화될 잠재적인 가능성으로 인해 선택되지 않았다.
표 15. 초기 기준선 스크린으로부터의 용융 온도 DSC (상부), DLS (하부)
DSC
Figure pct00049
DLS
Figure pct00050
상기 선택된 제제를 150mM 아르기닌, 염화나트륨, 수크로스 및 소르비톨의 존재 하에 스크리닝하였다. 기준선 생물물리학적 스크리닝의 이러한 부분으로부터의 데이터를 표 16에 제시한다. 글루타메이트 pH 5.0은 부형제의 존재 하에 가장 낮은 T개시를 가졌고, 낮은 pH로 인해 심지어 안정화 부형제 소르비톨 및 수크로스의 존재 하에서도 그러할 가능성이 크다. 표 16에 제시된 데이터에 기초하면, 아세테이트 제제의 경우, 수크로스의 존재 하에 T개시가 증가되었음이 관찰되었다. 히스티딘 제제의 경우 수크로스 및 소르비톨의 존재 하에 T개시의 증가가 관찰되었다. 증가된 T개시는 수크로스를 함유하는 숙시네이트 제제의 경우에만 관찰되었다. 아세테이트 샘플의 경우, NaCl 및 아르기닌으로 이루어진 제제는 각각 51℃ and 52℃의 T개시 값을 가졌다. NaCl을 함유하는 히스티딘 제제는 아르기닌의 존재 하의 제제와 비교하여 보다 높은 개시 값을 나타내었다. 아르기닌을 갖는 히스티딘 제제의 경우 T개시 값은 47℃인 반면, NaCl의 존재 하의 히스티딘 제제의 경우 T개시 값은 51℃였다. 하전된 부형제를 함유하는 숙시네이트 제제의 경우 T개시 값은 동등하였다 (54℃). 개시 값은 다른 3종의 완충제 유형과 비교하여 하전된 부형제를 함유하는 숙시네이트 완충제의 경우에 전반적으로 가장 높았고, 한편 히스티딘 및 숙시네이트 완충제는 소르비톨 및 수크로스의 존재 하의 글루타메이트 및 아세테이트 완충제보다 더 높은 개시 값을 나타내었다.
표 16. 부형제를 갖는 기준선 완충제로부터의 용융 온도 DSC (상부), DLS (하부)
DSC
Figure pct00051
DLS
Figure pct00052
DLS 결과에 기초하면 (표 16), 수크로스 및 소르비톨로 이루어진 모든 제제는 거대분자 응집체의 형성을 나타내는 다중모드 및 높은 유체역학 반경인 %Pd를 나타내었다. DLS 데이터는 또한, 하전된 부형제인 염화나트륨 및 아르기닌의 존재 하에 이들 제제가 낮은 %Pd를 가졌음을 입증하였다.
전체적으로, DSC 및 DLS 둘 다로부터 수득된 데이터는 NaCl의 존재 하의 pH 5.5의 25mM 아세테이트 및 염화나트륨의 존재 하의 pH 5.5의 아르기닌 및 히스티딘 제제가 추가의 제제 개발을 위한 보다 우수한 후보라는 것을 시사하였다.
2. NaCl 스크리닝
항체 IgG1-hDR5-05-E430G를 4종의 상이한 농도의 NaCl (0, 25, 50, 및 100 mM NaCl)의 존재 하의 30mM 히스티딘, pH 5.5 중에 40 mg/mL로 제제화하여 용해도 및 상 분리에 대한 효과를 결정하였다. 샘플을 사전냉각된 동결건조기 선반 상에서 -5±3℃에서 24시간 동안 저장하였다. 24시간 후, 샘플 세트를 외관에 의해 시험하였다. 상 분리는 제조된 샘플 중 어느 것에서도 관찰되지 않았다.
3. 계면활성제 스크리닝
항체 IgG1-hDR5-05-E430G를 0, 0.03, 또는 0.06% w/v 트윈-80의 존재 하에 30mM 히스티딘, pH 5.5 중에 제제화하고, 3회의 동결-해동 사이클로 스트레스를 가하였다. 동일한 샘플을 48시간 동안 교반하였다. 샘플 스트레스 후에, 샘플 세트를 외관, A280, SEC, 환원 CE-SDS, 및 비-환원 CE-SDS에 의해 시험하였다.
3.1 외관
계면활성제 스크리닝 연구에서 샘플 중 어떠한 샘플 사이에서도 시각적 차이가 관찰되지 않았다. 모든 샘플은 미황색 액체였고, 유백색이었고, 가시적인 미립자가 존재하지 않았다.
3.2 UV A280에 의한 단백질 함량
UV 분석에 의해 수득된 항체 농도는 유의하게 상이하지 않았고, 18.54 내지 20.73 mg/mL 사이의 범위였다 (데이터는 제시되지 않음).
3.3 SEC
계면활성제 스크리닝 샘플 중 어떠한 것에 대해서도 단량체 순도는 유의하게 상이하지 않았고, 새로운 피크는 관찰되지 않았다. 모든 샘플의 순도는 98.8 - 99.0%였다 (데이터는 제시되지 않음).
3.4 환원 CE-SDS
계면활성제 스크리닝 샘플 중 어떠한 것에 대해서도 순도 (LC 및 HC %)는 유의하게 상이하지 않았고, 새로운 피크는 관찰되지 않았다. 모든 샘플의 순도는 95.6 - 96.1%였다 (데이터는 제시되지 않음).
3.5 비-환원 CE-SDS
계면활성제 스크리닝 샘플 중 어떠한 것에 대해서도 주요 피크 순도는 유의하게 상이하지 않았고, 새로운 피크는 관찰되지 않았다. 모든 샘플의 순도는 90.5% 내지 92.1%였다 (데이터는 제시되지 않음).
3.6 계면활성제 스크리닝으로부터의 결론
0, 0.03, 및 0.06% PS-80의 농도를 함유하는 비스트레스 샘플 및 스트레스 샘플 사이에, 외관, 단백질 농도, 또는 순도에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 계면활성제가 이들 제제에서 항체의 안정성을 증진시키지 않는다는 것을 나타낸다.
4. 동결보호제 스크리닝
동결보호제 스크린에서, 항체 IgG1-hDR5-05-E430G를 3종의 상이한 농도 (0, 5, 또는 10% w/v)의 수크로스의 존재 하의 30mM 히스티딘, pH 5.5 중에 제제화하고, 3회의 동결-해동 사이클로 스트레스를 가하였다. 동일한 샘플을 48시간 동안 교반하였다. 샘플 스트레스 후에, 샘플 세트를 외관, A280, SEC, 환원 CE-SDS, 및 비-환원 CE-SDS에 의해 시험하였다.
4.1 외관
3회의 동결-해동 사이클로 스트레스를 가하고 48시간 동안 교반한 0%, 5%, 또는 10% 수크로스를 함유하는 샘플 사이에서 어떠한 시각적 차이도 관찰되지 않았다. 모든 샘플은 미황색 액체였고, 유백색이었고, 가시적인 미립자는 존재하지 않았다.
4.2 UV A280에 의한 단백질 함량
UV 분석에 의해 수득된 항체 농도는 유의하게 상이하지 않았다. 농도는 19.06 내지 24.86 mg/mL 범위였다 (데이터는 제시되지 않음).
4.3 SEC
동결보호제 스크리닝 샘플 중 어떠한 것에 대해서도 단량체 순도는 유의하게 상이하지 않았고, 새로운 피크의 성장은 관찰되지 않았다. 모든 샘플의 순도는 98.9 - 99.1%였다 (데이터는 제시되지 않음).
4.4 환원 CE-SDS
동결보호제 스크리닝 샘플 중 어떠한 것에 대해서도 순도 (LC 및 HC %)는 유의하게 상이하지 않았고, 새로운 피크의 성장은 관찰되지 않았다. 모든 샘플의 순도는 95.3 - 95.9%였다 (데이터는 제시되지 않음).
4.5 비-환원 CE-SDS
동결보호제 스크리닝 샘플 중 어떠한 것에 대해서도 주요 피크 순도는 유의하게 상이하지 않았고, 새로운 피크의 성장은 관찰되지 않았다. 모든 샘플의 순도는 91.5 - 92.0%였다 (데이터는 제시되지 않음).
4.6 동결보호제 스크리닝으로부터의 결론
0%, 5% 및 10% 수크로스 농도를 함유하는 비스트레스 샘플 및 스트레스 샘플 사이에, 외관, 단백질 농도, 또는 순도에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 동결보호제가 이들 제제에서 항체의 안정성을 증진시키지 않는다는 것을 나타낸다.
5. DoE 안정성 연구
DoE 연구를 위한 제제 설계를 표 17에 제시한다. 샘플을 5±3℃ 및 40±2℃/75±5% RH에서 최대 4주 동안 저장하였다. 초기 샘플을 pH, UV, 및 DSC에 의해 시험하였다. 저장 후, 샘플 세트를 외관, pH, A280, DLS, SEC, icIEF, CE-SDS (환원 및 비-환원)에 의해 시험하였다.
표 17. 항체 IgG1-hDR5-05-E430G DoE 연구에 대한 제제 명칭
Figure pct00053
* - 3중으로 제조된 샘플
5.1 DSC (초기)
초기 DSC 데이터를 표 18에 제시한다. 히스티딘 제제의 경우, 보다 높은 pH의 제제에 대해 높은 T개시 값이 수득된 것으로 관찰되었다. 이러한 경향은 pH가 증가함에 따라 보다 높은 T개시 값이 관찰된 초기 기준선 스크린에서 수득된 데이터와 상관되었다. 히스티딘 제제 pH 6.0은 pH 5.0 및 pH 5.5의 히스티딘 제제와 비교하여 가장 높은 T개시 값을 입증하였다. T개시 값은 히스티딘 pH 6.0 제제의 경우 50 - 53℃ 범위였다. 히스티딘 pH 5.0 제제는 43 - 46℃ 범위인 반면, 히스티딘 pH 5.5 제제는 47 - 51℃ 범위였다. 수크로스 및 소르비톨로 이루어진 제제의 경우 높은 T개시 값이 관찰되었다. 제제 F13, F14, F28, 및 F29는 수크로스 및 소르비톨을 함유하는 제제의 경우 높은 T개시 값을 나타내었다. 아세테이트 제제의 경우, 유사한 경향이 관찰되었다. 보다 높은 pH의 제제는 보다 높은 개시 값을 나타내었다. 아세테이트 제제 pH 6.0 및 pH 5.5는 NaCl 및 아르기닌의 존재 및 부재 하에서 높은 T개시 값을 나타내었다. 아세테이트 pH 6.0 제제는 52 - 54℃의 범위인 반면, 아세테이트 pH 5.5 제제는 51 - 54℃의 범위였다. 아세테이트 pH 5.0 제제는 45 - 49℃의 최저 T개시 범위를 나타내었다.
표 18. 초기 DSC 결과
Figure pct00054
5.2 UV A280에 의한 단백질 함량
UV A280 결과에 의한 단백질 함량은 모든 샘플 단백질 농도에 대해 18.47 - 21.95 mg/mL로 나타났다 (데이터는 제시되지 않음). 샘플 F8, F24, 및 F22는, 아마도 실험적 가변성으로 인해, 약간 더 낮은 단백질 농도를 가졌다. 전체적으로, 초기 시점에 관찰된 단백질 농도에서 유의한 변화가 없었다.
5.3 외관
4주 시점에 5±3℃에서 모든 샘플 제제는 투명하고 미황색이었다. 5±3℃에서 대부분의 샘플 제제는 비-생성물 관련된 것으로 보이는 어떠한 입자도 나타내지 않았다. F5-3, F7, F8, F29, 및 F30은 약간의 입자를 함유하였다. 40±2℃/75±5% RH에서 샘플은, 유백색인 샘플 F20-1 및 F23을 제외하고, 미황색이고 투명하였다. 40±2℃/75±5% RH의 제제는 입자를 갖지 않는 것으로부터 많은 입자를 갖는 것까지의 범위였다. 아세테이트 제제의 경우, 제제 F1은 어떠한 입자도 나타내지 않았다. 제제 F2, F5, F6, 및 F10은 거의 입자를 갖지 않는 반면, 제제 F3, F4, F7, F8, F9, F11, F12, F13, F14 및 F15는 많은 입자를 가졌다. 히스티딘 제제의 경우, F17 및 F26은 많은 입자를 나타내었다. F16, F18, F23, F25, F29 및 F30은 거의 입자를 나타내지 않았다. 나머지 제제 F19, F20, F21, F22, F24, F27 및 F28은 어떠한 입자도 갖지 않았다.
5.4 pH
제제에 대한 목표 pH 값을 표 19에 제시하였다. 아세테이트 제제의 경우, 5±3℃ 및 40±2℃/75±5% RH에서 4주 시점에 유의한 이동이 관찰되었다. 초기 시점 및 5±3℃에서 아세테이트 제제의 경우 pH에서의 차이 범위는 0.12 - 0.30이었다. 40±2℃/75±5% RH에서 스트레스를 가한 이들 샘플에서 관찰된 pH의 이동은 0.44 - 1.01이었다. 히스티딘 제제의 경우 5±3℃ 및 40±2℃/75±5% RH에서 4주 시점에 유의한 pH 이동이 관찰되지 않았다. 4주 시험에서 관찰된 히스티딘 제제의 pH에서의 차이는 실험적 가변성에 기인할 수 있다. 전체적으로, 히스티딘 pH 6.0 제제는 나머지 제제와 비교하여 부형제의 존재 및 부재 하에 pH에서 어떠한 변화도 겪지 않았다. 아세테이트 제제는 pH에서의 이동에 감수성이었고, 이는 아세테이트가 항체에 대해 덜 적합한 성분이게 하였다. 유의한 pH 이동은 또한 단백질의 가속화된 분해로 이어질 수 있다. 다른 한편으로 히스티딘 pH 6.0 제제는 유망한 성분인 것으로 입증되었다. 앞으로 설명할 안정성 결과는 아세테이트 제제에 대해 관찰된 pH 이동으로 인해 히스티딘 제제 (F16-F30)에 초점을 맞출 것이다.
표 19. 항체 IgG1-hDR5-05-E430G DoE 연구에 대한 pH 결과
Figure pct00055
5.5 UV A280에 의한 단백질 함량
5±3℃ 샘플에 대한 A280 판독 범위는 19.87 - 23.59 mg/mL인 반면, 40±2℃/75±5% RH에 대한 A280 판독의 범위는 19.81 - 26.38 mg/mL였다 (데이터는 제시되지 않음). A280 판독에서 유의한 이동은 관찰되지 않았다. UV 함량에서 관찰된 범위는 아마도 실험적 가변성으로 인한 것이었다. 데이터는 완충제 농도, pH, 및 부형제 농도와 관련하여 어떠한 경향도 나타내지 않았다.
5.6 SEC
4주 시점에 대한 SEC 결과를 표 20에 제시하였다. 히스티딘 제제의 경우 주로 pH 6.0에서, 하전된 부형제의 존재가 제제의 안정성을 개선시킨다는 것이 관찰되었다. 또한, 하전된 부형제의 존재 하에서의 pH의 증가는 히스티딘 제제의 안정성을 개선시킨다는 것이 관찰되었다. 하전된 부형제의 존재 하에서의 제제에 대한 총 불순물 %의 감소는 40±2℃/75±5% RH에서 관찰되었다. 40±2℃/75±5%에서 제제 F20-1은 84.2%의 최저 순도를 가졌다. 이는 이러한 중심점 제제에 대한 다른 2개의 복제물이 매우 더 순수하여 이러한 복제물이 이상치로 간주되기 때문에 예상외의 이상 결과였다. 히스티딘 pH 5.0 제제 F17, F18 및 F19의 경우 40±2℃/75±5% RH에서, 총 불순물 %는 5.0 - 5.8% 범위였다. 히스티딘 pH 5.5 제제 F21, F22 및 F23에 대한 총 불순물 %는 4.1 - 7.3% 범위인 반면, 히스티딘 pH 6.0 제제 F25, F26, 및 F27은 총 불순물 %가 3.5 - 3.8% 범위였다. 보다 높은 pH는 총 불순물 %를 감소시키고, 하전된 부형제의 존재 하의 히스티딘 pH 6.0 제제는 보다 우수한 안정성을 나타내는 것이 명백하였다. 총 불순물 %의 증가는 수크로스 또는 소르비톨을 함유하는 히스티딘 제제에 대해 관찰되었다. 총 불순물 %는 부형제의 부재 하의 pH 6.0 제제의 경우 5±3℃에서 3.8%였고, 40±2℃/75±5% RH에서 6.9%였다. 전체적으로, 하전된 부형제 NaCl 및 아르기닌의 존재 하의 히스티딘 pH 6.0 제제 (제제 F25, F26, 및 F27)가 보다 우수한 안정성을 가졌다.
표 20. SEC 결과 (F16 내지 F30)
Figure pct00056
5.7 icIEF
샘플의 전하 이종성을 5±3℃ 및 40±2℃/75±5% RH에서 4주째에 icIEF를 사용하여 결정하였다 (표 21). 5±3℃ 및 40±2℃/75±5% RH에서의 샘플에 대한 icIEF 결과는, 5℃에서 4주 시점에 히스티딘 제제의 퍼센트 산성 변이체가 제제 F16 - F28의 경우 56.2 - 58.9% 범위임을 보여주었다 (데이터는 제시되지 않음). 수크로스 및 소르비톨로 이루어진 제제 F29 및 F30의 경우, 퍼센트 산성 변이체는 각각 60.4% 및 63.8%였다. F25를 사용한 그의 프로파일의 비교에서 관찰된 바와 같이 이들 차이는 유의한 것으로 보였다. 40±2℃/75±5% RH에서, F29 및 F30은 45.9% 및 61.6%의 퍼센트 산성 변이체를 가졌다. 수크로스로 이루어진 제제 F29의 경우, 40±2℃/75±5% RH에서 염기성 변이체의 32.4%까지의 유의한 증가가 존재하였다. 40±2℃/75±5% RH에서 4주 시점에, 모든 히스티딘 제제는 퍼센트 산성 변이체에서 61.6% - 71.6% 범위의 증가를 입증하였다. 제제 F29는 40±2℃/75±5% RH에서 45.9%의 퍼센트 산성 변이체를 나타내었다. icIEF 데이터는 샘플의 pH가 전하 이종성에 영향을 미친다는 것을 보여주었다. pH 5.0의 히스티딘 제제는 히스티딘 제제 pH 5.5 및 6.0과 비교하여 산성 변이체에서 보다 유의한 증가를 나타내었다. 히스티딘 pH 5.0 제제의 경우, 40±2℃/75±5% RH에서 퍼센트 산성 변이체의 범위는 71.3 - 71.6%였다. 40±2℃/75±5% RH에서, 히스티딘 pH 5.5의 경우 퍼센트 산성 변이체의 범위는 63.5 - 67.1%인 반면, 히스티딘 pH 6.0의 경우 퍼센트 산성 변이체의 범위는 65.3 - 66.1%였다. 탈아미드화가 보다 높은 pH 값에서 가속화되는 것으로 공지되어 있기 때문에, 이러한 결과는 탈아미드화로 인한 것 같지 않고, 여기서는 반대의 경향이 관찰된다. 모든 제제에 걸쳐, 결과는 히스티딘 pH 5.5 및 6.0이 히스티딘 pH 5.0 제제보다 더 우수한 제제이고, 수크로스 및 소르비톨로 이루어진 히스티딘 제제에서 유의한 분해가 관찰되었음을 보여주었다.
표 21. icIEF DoE 연구에 의한 전하 이종성 결과 (F16 내지 F30)
5±3℃
Figure pct00057
40±2℃/75±5% RH
Figure pct00058
5.8 환원 CE-SDS
환원 CE-SDS에 대한 결과를 표 22에 제시하였다. 5±3℃에서 4주 시점에, 모든 히스티딘 제제는 pH에 관계없이 대등한 순도를 나타내었다.
40±2℃/75±5% RH에서 4주 시점에, 결과는 모든 샘플 제제에 대한 불순물에서의 증가를 나타내었다. 보다 낮은 pH에서 제제는 40±2℃/75±5% RH에서 보다 많은 분해를 나타낸 것으로 관찰되었다. 히스티딘 pH 5.0 제제는 퍼센트 순도에서 상당한 감소를 나타내었다. 퍼센트 순도에 대한 범위는 77.5 - 82.8%였다. 히스티딘 pH 5.5 제제의 경우, 퍼센트 순도는 80.1 - 91.2% 범위였다. 히스티딘 pH 6.0 제제의 경우 유의한 분해는 관찰되지 않았다. 히스티딘 pH 6.0 제제에 대한 퍼센트 순도는 40±2℃/75±5% RH에서 4주 시점에 89.7 - 91.1% 범위였다. 또한, 히스티딘 샘플에 대한 % LMW는 히스티딘 샘플의 경우 보다 낮은 pH에서 더 높았고, 히스티딘 제제의 경우 보다 높은 pH에서 상당히 더 낮았다. 히스티딘 pH 5.0 제제의 경우 % LMW 범위는 13.7 - 18.4%였다. 반면에 히스티딘 pH 5.5 및 6.0 제제는 5.9 - 12.9% 및 5.0 - 6.3%의 % LMW 범위를 나타내었다. 히스티딘 pH 6.0 제제의 경우, 퍼센트 순도는 하전된 부형제의 존재 하에 유의하게 감소되지 않은 것으로 또한 관찰되었다. 모든 제제에 걸쳐, 하전된 부형제의 존재 하의 히스티딘 pH 6.0 제제는 나머지 히스티딘 제제와 비교하여 보다 우수한 순도를 나타내었다.
표 22. 환원 모세관 전기영동 결과 (F16 내지 F30)
Figure pct00059
5.9 비-환원 CE-SDS
비-환원 CE-SDS에 대한 결과를 표 23에 제시하였다. 아세테이트 제제 (F1 내지 F15)로부터 수득된 결과는 이들 제제에 대해 관찰된 pH 이동으로 인해 고려되지 않을 것이다. 5±3℃에서 아르기닌으로 이루어진 제제, 즉, 제제 F18, F19, F22, F23, F26 및 F27에 대해 유의하게 높은 % HMW 불순물이 관찰되었다. 불순물의 이러한 증가는 NaCl의 존재 하의 히스티딘 pH 6.0 제제 (F25), 즉 제제 F17, F21 및 F25에 대해서는 관찰되지 않았다. 이전 결과는 하전된 부형제 (NaCl 및 아르기닌)의 존재 하의 히스티딘 pH 6.0 제제가 최적 조건임을 시사하였다. 비-환원 CE-SDS 데이터로부터 수득된 결과는 NaCl의 존재 하의 히스티딘 pH 6.0 제제가 아르기닌의 존재 하의 히스티딘 pH 6.0보다 더 우수한 선택임을 확인시켜 주었다.
표 23. 비-환원 CE-SDS 결과 (F16 내지 F30)
Figure pct00060
5.10 DLS
아세테이트 제제는 이들 제제에서 관찰된 pH 이동으로 인해 고려되지 않는다. DLS 데이터 (제시되지 않음)에 기초하여, 히스티딘 제제에서 보다 낮은 pH가 높은 다분산도로 이어지는 것으로 관찰되었다. 히스티딘 pH 5.0 제제 F17, F18 및 F19는 다분산도에서 유의한 증가를 가졌다. 예를 들어, 5±3℃에서 제제 F17의 %Pd는 10.2 및 7.0이었고, 40±2℃/75±5% RH에서 4주 후에는 20.8 및 18.7로 증가하였다. 유사하게, 히스티딘 pH 5.5 제제 F21, F22, 및 F23은 40±2℃/75±5% RH에서 증가된 %Pd를 가졌다. 예를 들어, 제제 F23은 5±3℃에서 6.3 및 10.4의 %Pd를 가졌다. %Pd는 40±2℃/75±5% RH에서 17.1 및 21.7로 증가하였다. 하전된 부형제 (NaCl 및 아르기닌)의 존재 하에 대부분의 히스티딘 pH 6.0 제제는 둘 다의 스트레스 조건에서 다분산도의 변화에 대해 저항성을 나타내었다. 제제 F25, F26, 및 F27은 %Pd에서 유의한 증가를 나타내지 않았다. 예를 들어 제제 F25는 5±3℃에서 9.4 및 8.9의 %Pd를 나타내었다. 40±2℃/75±5% RH에서의 % Pd는 8.3 및 10.2였다. 추가적으로, 수크로스의 존재 하의 제제 (F19)는 둘 다의 조건에서 높은 다분산도를 나타내었다. F29에 대한 %Pd는 5±3℃에서 23.7 및 23.4인 반면, 40±2℃/75±5% RH에서 %Pd는 23.2였다. 5±3℃ 조건의 경우 % Pd는 이러한 방법에서 이미 상당히 높았으며, 이는 이미 고차 응집체의 존재를 나타낸다. 따라서, %Pd가 더 높은 온도에서 변화되지 않는다는 사실은 놀라운 것이 아니다. 또한 초기 기준선 생물물리학적 스크린 DLS 데이터에서 높은 다분산도가 관찰되었다. 유사하게, 높은 %Pd가 소르비톨의 존재 하의 제제 (F30)에 대해 관찰되었다. 흥미롭게도, 소르비톨 및 NaCl을 함유하는 F28은 높은 %Pd를 나타내지 않았고, 이는 NaCl이 최적의 제제를 위한 성분으로서 이상적인 선택이라는 개념을 추가로 지지한다. 제제 F28의 경우 4주 시점에 높은 % Pd가 관찰되지 않았다. 40±2℃/75±5% RH에서 제제 F30에 대한 %Pd는 15.4 및 14.2였다. 전체적으로, 히스티딘 pH 6.0 제제는 하전된 부형제의 존재 하에 다분산도에서 최소 변화를 나타내었다. pH 5.5의 수크로스 및 소르비톨을 함유하는 둘 다의 히스티딘 제제는 둘 다의 스트레스 조건에서 높은 %Pd를 나타내었다.
6. 결론
표 17에 열거된 다양한 제제에서 항체 IgG1-hDR5-05-E430G의 분석 시험으로부터 수득된 결과에 기초하면, 제제 F25 (30 mM 히스티딘, 150mM NaCl pH6.0)는 이러한 분자에 대한 최적 제제였다.
초기 기준선 생물물리학적 스크리닝 결과는 pH 5.5의 아세테이트 및 히스티딘 제제가 최적의 완충제/pH 조건임을 시사하였다. 추가적으로, 아르기닌 및 NaCl은 소르비톨 및 수크로스와 비교하여 부형제의 보다 우수한 선택이었다. 계면활성제 및 동결보호제 연구는 제제의 안정성을 증진시키기 위해 PS-80도 수크로스도 필요하지 않음을 나타내었다. DoE 안정성 연구의 경우, 초기 DSC 결과는 30mM 히스티딘 pH 6.0 제제가 보다 높은 T개시 용융 온도 값을 가졌음을 확인시켜 주었다. 유의한 pH 이동은 모든 30mM 아세테이트 제제에서 관찰되었다. 히스티딘 pH 6.0 제제는 5±3℃ 및 40±2℃/75±5% RH에서 4주 안정성에 걸쳐 pH에서 어떠한 유의한 변화도 나타내지 않았다. SEC 데이터는 하전된 부형제의 존재 하의 히스티딘 pH 6.0이 IgG1-hDR5-05-E430G에 대해 가장 큰 안정성을 부여한다는 것을 입증하였다. icIEF로부터의 결과는 pH 5.5 및 6.0 샘플이 전하 이종성의 변화에 대해 보다 저항성이라는 것을 보여주었다. 이는 또한 수크로스 및 소르비톨의 존재 하의 제제가 가장 많은 분해를 나타낸다는 것을 보여주었다. DLS 데이터는 하전된 부형제의 존재 하의 히스티딘 pH 6.0 제제가 다분산도에서 최소의 변화를 갖는다는 것을 보여주었다. 환원 CE-SDS에 대한 결과는 하전된 부형제의 존재 하의 히스티딘 pH 6.0 제제가 최상의 제제임을 보여주었다. 비-환원 CE-SDS 데이터는 아르기닌의 존재 하의 샘플이 NaCl을 함유하는 샘플에 존재하지 않는 높은 % HMW 불순물을 나타낸다는 것을 보여주었다. 전체적으로, 이용가능한 데이터를 종합한 것은 이러한 항체에 대한 히스티딘 및 염화나트륨을 함유하는 제제의 선택을 지지한다.
실시예 55: 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G의 제제 개발
물질, 장비 및 방법
항체가 IgG1-hDR5-05- E430G 대신 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G인 것을 제외하고는, 사용된 물질, 장비 및 방법은 실시예 54에서와 동일하였다.
결과
1. 초기 기준선 생물물리학적 스크리닝
초기 생물물리학적 스크리닝을 수행하여, 부형제 스크리닝으로 이동하기 위해 완충제/pH 조합을 선택하였다. DSC 및 DLS를 사용하여 열 안정성을 평가하였다. DSC 분석은 T개시와 함께 용융 온도 (Tm1 및 Tm2)를 제공하였다. DLS 분석은 단백질의 다분산도 및 유체역학 반경에 대한 정보를 제공하였다.
DSC 데이터에서의 경향을 제제의 범위에 걸쳐 관찰하였다. T개시 값은 46℃ 내지 55℃의 범위였다 (데이터는 제시되지 않음). 보다 높은 T개시 값은 보다 큰 열 안정성을 나타내며, 따라서 최저 T개시 값을 갖는 극히 낮은 pH 및 높은 pH의 완충제 (글루타메이트, 아세테이트, 시트레이트, 및 포스페이트)는 최적이 아니다. 숙시네이트 및 히스티딘 완충제뿐만 아니라 아세테이트 pH 5.5의 T개시 값은 pH 5.5 내지 6.5의 이들 2종의 완충제가 보다 큰 열 안정성을 부여한다는 것을 나타내었다.
DLS 데이터의 경우 증가하는 pH의 완충제 범위에 걸쳐 경향이 관찰되었다 (데이터는 제시되지 않음). 일반적으로, 완충제의 범위에 걸쳐 pH 증가에 따라 보다 높은 수준의 다분산도가 관찰되었고, 이는 보다 높은 pH의 완충제의 경우 보다 높은 수준의 응집체를 나타낸다. 글루타메이트 및 아세테이트 완충제는 그들 각각의 pH 수준 둘 다에서 가장 낮은 수준의 다분산도 (3.5% - 7.6%의 %Pd)를 가졌다. 25 mM 히스티딘 pH 5.5 (6.9% %Pd)를 제외한 나머지 완충제는 13.8% - 23.3% 범위의 보다 높은 수준의 다분산도를 가졌다.
초기 생물물리학적 스크리닝으로부터의 DLS 데이터로부터의 결과는 일부 제제에 대해 DSC로부터 수득된 제제 순위화 결과와 강하게 상관되었다. 포스페이트 및 시트레이트 완충제는 높은 정도의 %Pd (14.1% - 18.9%), 뿐만 아니라 상대적으로 보다 낮은 T개시 값 (48℃ - 51℃)을 나타내었다. 응집 및 열 불안정성의 증거로 인해, 이들 2가지 제제는 추가의 연구로부터 제외하였다. 다른 제제 (글루타메이트, 아세테이트, 숙시네이트, 히스티딘)는 DSC와 DLS 데이터 사이에 강한 상관관계를 갖지 않았다. 예를 들어, 25 mM 히스티딘 pH 6.0 및 6.5는 각각 18.5% 및 23.3%의 %Pd를 가졌지만, 이들 동일한 2가지 완충제는 가장 높은 T개시 값 중 일부인 각각 53℃ 및 55℃를 나타내었다. 글루타메이트 및 아세테이트 pH 4.5 완충제 둘 다는 46℃ 내지 50℃의 다소 낮은 T개시 값을 가졌지만, 가장 낮은 %Pd 값 (3.5% - 7.6%)을 가졌다. 마지막으로, pH 5.5 및 6.0의 숙시네이트 완충제는 각각 50℃ 및 54℃의 보다 높은 T개시 값을 나타내었지만, 높은 수준의 다분산도 (각각 13.8% 및 14.7%)를 갖는 것으로 관찰되었다. 상기 언급된 완충제 제제에서 결론나지 않은 결과로 인해, 모든 4종의 완충제 (글루타메이트, 아세테이트, 숙시네이트, 및 히스티딘)를 추가의 조사를 위해 부형제의 존재 하의 생물물리학적 스크리닝에 사용하였다.
2. 부형제의 존재 하의 생물물리학적 스크리닝
상기 선택된 제제를 150mM 아르기닌, 염화나트륨, 수크로스 또는 소르비톨의 존재 하에 스크리닝하였다. 데이터를 표 24에 제시하였다.
부형제의 존재 하의 항체의 DSC 및 생물물리학적 스크리닝에 대한 데이터에서 경향은 분명하였다. 일반적으로, 하전된 부형제의 존재 하의 제제는 수크로스 또는 소르비톨의 존재 하의 제제보다 더 낮은 T개시 값을 가졌다. 또한, 완충제의 범위에 걸쳐 pH가 증가함에 따라 DSC에서 T개시 값이 일반적으로 증가하였고 (46℃ 내지 55℃ 범위), 이는 증가된 완충제 pH가 항체에 대해 보다 큰 열 안정성을 부여한다는 것을 시사한다.
뿐만 아니라 DLS 데이터에 걸쳐서도 일반적 경향이 관찰되었다. 이들 데이터에 따르면, 하전된 부형제 (아르기닌 및 NaCl)를 함유하는 제제는 당 (소르비톨 및 수크로스)을 함유하는 제제와 비교하여 보다 낮은 수준의 다분산성을 갖고, 따라서 보다 낮은 수준의 겉보기 응집을 갖는 것으로 발견되었다. 당을 함유하는 이들 제제는 보다 높은 수준의 다분산도를 가질 뿐만 아니라, 일부 경우에 소르비톨을 함유하는 아세테이트 완충제 및 소르비톨 및 수크로스를 함유하는 히스티딘 완충제에 대해 다중모드 명칭에 의해 표시된 바와 같은 2종의 별개의 단백질성 집단을 함유하였다. 이러한 경향에 대한 예외는 25 mM 숙시네이트의 모든 제제에서 발견되었고, 이는 모두 하전된 부형제 또는 당 부형제의 존재와 관계없이 높은 수준의 다분산도를 나타내었다.
글루타메이트의 경우 보다 낮은 pH에서의 유의하게 더 낮은 T개시 값, 뿐만 아니라 단백질 백본의 낮은 pH 산 가수분해에 대한 잠재력으로 인해, 글루타메이트 완충제는 추가 연구로부터 제외되었다. 또한, 숙시네이트 완충제는 하전된 부형제의 존재 하의 것을 포함하여 그의 모든 제제 사이에서의 높은 수준의 다분산도로 인해 추가의 검사로부터 제외되었다. 따라서, 생물물리학적 스크리닝 데이터는 염화나트륨 및 아르기닌의 존재 하의 pH 5.5의 25mM 아세테이트 및 히스티딘 제제가 추가의 제제 개발을 위한 보다 우수한 후보임을 시사하였다.
표 24. 부형제의 존재 하의 기준선 완충제 스크리닝으로부터의 결과 (DSC 및 DLS)
DSC
Figure pct00061
DLS
Figure pct00062
3. 용해도 연구
항체를 4종의 상이한 농도의 NaCl (0, 25, 50, 및 100 mM NaCl)의 존재 하의 그의 기본 제제 (30 mM 히스티딘, pH 5.5) 중에 40 mg/mL로 제제화하여 용해도 및 상 분리에 대한 효과를 결정하였다. 샘플을 사전냉각된 동결건조기 선반 상에서 -5±3℃에서 24시간 동안 저장하였다. 24시간 후, 샘플 세트를 외관에 의해 시험하였다. 상 분리는 제조된 샘플 중 어느 것에서도 관찰되지 않았다.
4. 계면활성제 스크리닝
항체를 0, 0.03, 또는 0.06% w/v 트윈-80의 존재 하에 30 mM 히스티딘, pH 5.5 중에 제제화하고, 3회의 동결-해동 사이클로 스트레스를 가하였다. 동일한 샘플을 48시간 동안 교반하였다. 샘플 스트레스 후에, 샘플 세트를 외관, A280, SEC, 환원 CE-SDS, 및 비-환원 CE-SDS에 의해 시험하였다.
4.1 외관
계면활성제 스크리닝 연구에서 샘플 중 어떠한 샘플 사이에서도 시각적 차이가 관찰되지 않았다. 모든 샘플은 미황색 액체였고, 유백색이었고, 가시적인 미립자는 존재하지 않았다.
4.2 A280에 의한 단백질 농도
UV 분석에 의해 수득된 항체 농도는 상이한 농도의 PS-80을 갖는 교반, 동결-해동 및 대조군 샘플 사이에서 유의하게 상이하지 않았고, 17.80 내지 21.32 mg/mL 범위였다 (데이터는 제시되지 않음).
4.3 크기 배제 크로마토그래피
계면활성제 스크리닝 샘플 중 어떠한 것에 대해서도 단량체 순도는 유의하게 상이하지 않았고, 새로운 피크의 성장은 관찰되지 않았다. 모든 샘플의 순도는 98.4 - 98.7%였다 (데이터는 제시되지 않음).
4.4 환원 모세관 전기영동-소듐 도데실 술페이트
계면활성제 스크리닝 샘플 중 어떠한 것에 대해서도 순도 (경쇄 및 중쇄 %)는 유의하게 상이하지 않았고, 새로운 피크는 관찰되지 않았다. 모든 샘플의 순도는 95.4 - 95.8%였다 (데이터는 제시되지 않음).
4.5 비-환원 모세관 전기영동-소듐 도데실 술페이트
계면활성제 스크리닝 샘플 중 어떠한 것에 대해서도 주요 피크 순도는 유의하게 상이하지 않았고, 새로운 피크는 관찰되지 않았다. 모든 샘플의 순도는 91.2% 내지 91.3%였다 (데이터는 제시되지 않음).
4.6 계면활성제 스크리닝으로부터의 결론
0, 0.03, 및 0.06% PS-80의 농도를 함유하는 비스트레스 샘플 및 스트레스 샘플 사이에, 외관, 단백질 농도, 또는 순도에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 계면활성제가 항체의 안정성을 증진시키지 않는다는 것을 나타낸다.
5. 동결보호제 스크리닝
동결보호제 스크린에서, 항체를 3종의 상이한 농도 (0, 5, 또는 10% w/v)의 수크로스의 존재 하의 30 mM 히스티딘, pH 5.5 중에 제제화하고, 3회의 동결-해동 사이클로 스트레스를 가하였다. 동일한 샘플을 48시간 동안 교반하였다. 샘플 스트레스 후에, 샘플 세트를 외관, A280, SEC, 환원 CE-SDS, 및 비-환원 CE-SDS에 의해 시험하였다.
5.1 외관
3회의 동결-해동 사이클로 스트레스를 가하고 48시간 동안 교반한 0%, 5%, 또는 10% 수크로스를 함유하는 샘플 사이에서 어떠한 시각적 차이도 관찰되지 않았다. 모든 샘플은 미황색 액체였고, 유백색이었고, 가시적인 미립자는 존재하지 않았다.
5.2 A280에 의한 단백질 농도
UV 분석에 의해 수득된 항체 농도는 유의하게 상이하지 않았다. 농도는 19.03 내지 22.92 mg/mL 범위였다 (데이터는 제시되지 않음).
5.3 크기 배제 크로마토그래피
동결보호제 스크리닝 샘플 중 어떠한 것에 대해서도 단량체 순도는 유의하게 상이하지 않았고, 새로운 피크의 성장은 관찰되지 않았다. 모든 샘플의 순도는 98.4 - 99.0%였다 (데이터는 제시되지 않음).
5.4 환원 모세관 전기영동-소듐 도데실 술페이트
동결보호제 스크리닝 샘플 중 어떠한 것에 대해서도 순도 (경쇄 및 중쇄 %)는 유의하게 상이하지 않았고, 새로운 피크의 성장은 관찰되지 않았다. 모든 샘플의 순도는 95.1 - 95.7%였다 (데이터는 제시되지 않음).
5.5 비 환원 모세관 전기영동-소듐 도데실 술페이트
동결보호제 스크리닝 샘플 중 어떠한 것에 대해서도 주요 피크 순도는 유의하게 상이하지 않았고, 새로운 피크의 성장은 관찰되지 않았다. 모든 샘플의 순도는 90.3 - 91.9%였다 (데이터는 제시되지 않음).
5.6 동결보호제 스크리닝으로부터의 결론
0%, 5% 및 10% 수크로스 농도를 함유하는 비스트레스 샘플 및 스트레스 샘플 사이에, 외관, 단백질 농도, 또는 순도에서 어떠한 유의한 변화도 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 동결보호제가 항체의 안정성을 증진시키지 않는다는 것을 나타내었다.
6. DOE 안정성 연구
연구 설계 및 방법론은 실시예 54에서 사용된 것과 동일하였다. 조사 하의 모든 제제의 목록에 대해서는 상기 표 17을 참조한다.
6.1 DSC (초기)
초기 DSC 데이터를 표 25에 제시한다. 히스티딘 제제의 경우, 보다 높은 pH의 제제에 대해 높은 T개시 값이 수득된 것으로 관찰되었다. 이러한 경향은 pH가 증가함에 따라 보다 높은 T개시 값이 관찰된 초기 기준선 스크린에서 수득된 데이터와 상관되었다. 히스티딘 제제 pH 6.0은 pH 5.0 및 pH 5.5의 히스티딘 제제와 비교하여 보다 높은 T개시 값을 입증하였다. T개시 값은 히스티딘 pH 6.0 제제의 경우 47 - 52℃ 범위였다. 히스티딘 pH 5.0 제제는 42 - 45℃ 범위인 반면, 히스티딘 pH 5.5 제제는 46 - 50℃ 범위였다. 수크로스 및 소르비톨로 이루어진 제제의 경우 높은 T개시 값이 관찰되었다. 제제 F13, F14, F28, 및 F29는 수크로스 및 소르비톨로 이루어진 제제의 경우 높은 T개시 값을 나타내었다. 이는 삼투물질이 단백질의 폴딩된 상태에 미치는 효과로 인해 예상되었다. 아세테이트 제제의 경우, 유사한 경향이 관찰되었다. 보다 높은 pH의 제제는 보다 높은 개시 값을 나타내었다. 아세테이트 제제 pH 6.0 및 pH 5.5는 NaCl 및 아르기닌의 존재 및 부재 하에서 높은 T개시 값을 나타내었다. 아세테이트 pH 6.0 제제는 52 - 54℃의 범위인 반면, 아세테이트 pH 5.5 제제는 49 - 53℃의 범위였다. 아세테이트 pH 5.0 제제는 45 - 49℃의 최저 T개시 범위를 나타내었다.
표 25. DOE 연구에 대한 초기 DSC 결과 항체 샘플
Figure pct00063
6.2 UV (초기)
초기 시점에 단백질 농도의 범위는 18.52 - 21.86 mg/mL였다 (데이터는 제시되지 않음). 전체적으로, 초기 시점에 관찰된 단백질 농도에서 유의한 변화가 없었다.
6.3 외관
4주 시점에 5±3℃에서 대부분의 샘플 제제는 투명하고 미황색이었다. 샘플 F28 및 F29 (소르비톨 또는 수크로스를 함유함)는 5±3℃에서 유백색이었다. 5±3℃ 및 40±2℃/75±5% RH에서 아세테이트 및 히스티딘 완충제 둘 다 중의 대부분의 샘플 제제는 거의 입자를 나타내지 않았다. 히스티딘 중에 제조된 일부 샘플을 제외하고, 둘 다의 조건에서 샘플은 미황색이고 투명하였다. 40±2℃/75±5% RH 조건의 경우, 히스티딘 제제 F20-1, F20-2, F20-3, F24, F28, F29, 및 F30은 유백색이었다. 이들 제제는 부형제를 갖지 않았거나, 또는 수크로스 또는 소르비톨을 가졌다.
6.4 pH
아세테이트 제제의 경우, 5±3℃ 및 40±2℃/75±5% RH에서 4주 시점에 유의한 pH 이동이 관찰되었다 (데이터는 제시되지 않음). 초기 시점 및 5±3℃에서 아세테이트 제제의 경우 pH에서의 차이 범위는 0.10 - 0.29였다. 40±2℃/75±5% RH에서 스트레스를 가한 이들 샘플에서 관찰된 pH의 이동은 0.07 - 1.30이었다. 히스티딘 제제의 경우 5±3℃ 및 40±2℃/75±5% RH에서 4주 시점에 pH 이동이 관찰되었지만, 변화는 아세테이트 샘플의 것보다 훨씬 더 적었다. 초기 시점 및 5±3℃에서 히스티딘 제제의 경우 pH에서의 차이 범위는 0.02 - 0.16이었다. 이러한 유형의 변화는 작은 부피 샘플에 대한 방법 가변성에 기인할 수 있다. 40±2℃/75±5% RH에서 스트레스를 가한 이들 샘플에서 관찰된 pH의 변화는 0.02 - 0.94였다.
유의한 pH 이동은 또한 단백질의 가속화된 분해로 이어질 수 있다. 아세테이트 제제는 히스티딘 제제와 비교하여 pH에서의 이동에 대해 훨씬 더 높은 수준에서 감수성이었고, 이는 아세테이트가 이러한 항체에 대해 부적합한 성분이게 하였다. 앞으로 설명할 안정성 결과는 아세테이트 제제에 대해 관찰된 pH 이동으로 인해 히스티딘 제제 (F16 내지 F30)에 초점을 맞출 것이다.
6.5 UV A280에 의한 단백질 함량
5±3℃ 샘플에 대한 A280 판독에 의한 단백질 함량 결정 범위는 14.66 - 21.70 mg/mL인 반면, 40±2℃/75±5% RH에 대한 A280 판독의 범위는 18.12 - 40.42 mg/mL였다 (데이터는 제시되지 않음). 40±2℃/75±5% RH에서 F20-1, F20-2, F20-3, F24, 및 F28에 대해 A280 판독치에서의 유의한 이동이 관찰되었다. 이들 동일한 샘플은 외관 시험에서 유백색인 것으로 관찰되었다. 관찰된 단백질 농도에서의 증가로 인해, 이들 결과는 겉보기 UV 농도를 부풀리는 비-생성물 관련 UV 흡수물로 인한 것일 가능성이 있다.
6.6 크기 배제 크로마토그래피
4주 시점에 대한 SEC 결과를 표 26에 제시하였다. 높은 단백질 농도를 갖고 외관상 유백색인 것으로 밝혀진 히스티딘 제제에서 유의한 변화가 발생하였다 (F20-1, F20-2, F20-3, F24, 및 F28, F29, F30). 이들 샘플의 경우, 이동상 통과물에서 유의한 UV 흡수 피크가 관찰되었다. 이들 SEC 데이터 뿐만 아니라 이미 논의된 다른 지지 분석은 이들 제제가 UV 흡수 비-생성물 관련 성분을 함유한다는 것을 나타낸다. 고온 스트레스 조건에서, 하전된 부형제의 부재 하의 히스티딘 제제가 분해되어 이러한 UV 흡수 성분으로서 작용하는 것이 가능하다. 히스티딘 제제의 경우, 하전된 부형제의 존재는 제제의 안정성을 개선시키는 것으로 관찰되었다. 또한, pH의 증가가 히스티딘 제제의 순도를 개선시키는 것으로 관찰되었다. 하전된 부형제의 존재 하에서의 제제에 대한 총 불순물 %의 감소는 40±2℃/75±5% RH에서 관찰되었다. 히스티딘 pH 5.0 제제 F17, F18 및 F19의 경우 40±2℃/75±5% RH에서, 총 불순물 %는 4.2 - 4.9% 범위였다. 히스티딘 pH 5.5 제제 F21, F22 및 F23에 대한 총 불순물 %는 3.6 - 5.6% 범위인 반면, 히스티딘 pH 6.0 제제 F25, F26, 및 F27은 총 불순물 %가 3.2 - 3.4% 범위였다. 일반적으로, 보다 높은 pH는 총 불순물 %를 감소시키고, 하전된 부형제의 존재 하의 히스티딘 pH 6.0 제제는 보다 우수한 안정성을 나타내었다. 전체적으로, 하전된 부형제 NaCl 및 아르기닌의 존재 하의 히스티딘 pH 6.0 제제가 보다 우수한 안정성을 가졌다.
표 26. SEC 경향 결과 DoE 연구 - 5±3℃ (F16 내지 F30)
Figure pct00064
표 26. (계속) 40±2℃/75±5% RH (F16 내지 F30)
Figure pct00065
6.7 영상화 모세관 등전 포커싱
항체 샘플의 전하 이종성을 icIEF를 사용하여 결정하였다 (표 27). 데이터에 기초하면, 5±3℃에서 4주 시점의 히스티딘 제제의 퍼센트 주요 피크는 45.6 - 47% 범위였다. 40±2℃/75±5% RH에서, 소르비톨 또는 수크로스로 이루어진 제제 F28, F29 및 F30은 퍼센트 염기성 변이체에서 각각 11.2%, 19.0%, 및 11.5%의 유의한 증가를 가졌다. 40±2℃/75±5% RH에서 4주 시점에, 모든 히스티딘 제제는 퍼센트 염기성 변이체에서 증가를 입증하였다. icIEF 데이터는 샘플의 pH가 전하 이종성에 유의하게 영향을 미친다는 것을 보여주었다. pH 5.0의 히스티딘 제제는 히스티딘 제제 pH 5.5 및 6.0과 비교하여 염기성 변이체에서 보다 유의한 증가를 나타내었다. 히스티딘 pH 5.0 제제의 경우, 40±2℃/75±5% RH에서 퍼센트 염기성 변이체의 범위는 6.3 - 7.2%였다. 40±2℃/75±5% RH에서, 히스티딘 pH 5.5의 경우 퍼센트 염기성 변이체의 범위는 5.5 - 6.4%인 반면, 히스티딘 pH 6.0 제제의 경우 퍼센트 염기성 변이체의 범위는 4.4 - 4.7%였다. 탈아미드화가 보다 높은 pH 값에서 가속화되는 것으로 공지되어 있기 때문에, 이러한 결과는 탈아미드화로 인한 것 같지 않고, 여기서는 반대의 경향이 관찰된다. 염기성 변이체의 증식은 HMW 또는 LMW 종 형성과 같은 다른 불순물로 인한 것일 수 있다. 모든 제제에 걸쳐, 결과는 히스티딘 pH 6.0이 히스티딘 pH 5.0 및 pH 5.5 제제보다 더 우수한 제제이고, 수크로스 및 소르비톨로 이루어진 히스티딘 제제에서 유의한 분해가 관찰되었음을 보여주었다.
표 27. 전하 이종성 결과 - DoE 연구 (F16 내지 F30)
5±3℃
Figure pct00066
40±2℃/75±5% RH
Figure pct00067
6.8 환원 모세관 전기영동 - 소듐 도데실 술페이트
환원 모세관 전기영동에 대한 결과를 표 28에 제시하였다. 5±3℃에서 4주 시점에, 모든 히스티딘 제제는 pH에 관계없이 대등한 순도를 나타내었지만, 수크로스 및 소르비톨의 존재 하의 제제는 다소 덜 순수하였다.
40±2℃/75±5% RH에서 4주 시점에, 결과는 모든 샘플 제제에 대한 불순물에서의 증가를 나타내었다. 보다 낮은 pH에서 제제는 40±2℃/75±5% RH에서 보다 많은 분해를 나타낸 것으로 관찰되었다. 히스티딘 pH 5.0 제제는 퍼센트 순도에서 상당한 감소를 나타내었다. 퍼센트 순도에 대한 범위는 86.3 - 88.9%였다. 히스티딘 pH 5.5 제제의 경우, 퍼센트 순도는 85.0 - 92.3% 범위였다. 히스티딘 pH 6.0 제제의 경우 유의하게 더 적은 분해가 관찰되었다. 히스티딘 pH 6.0 제제에 대한 퍼센트 순도는 40±2℃/75±5% RH에서 4주 시점에 90.1 - 93.1% 범위였다. 또한, 히스티딘 샘플에 대한 % LMW는 히스티딘 샘플의 경우 보다 낮은 pH에서 더 높았고, 히스티딘 제제의 경우 보다 높은 pH에서 상당히 더 낮았다. 히스티딘 pH 5.0 제제의 경우 % LMW 범위는 8.3 - 11.0%인 반면, 히스티딘 pH 5.5 및 6.0 제제는 5.4 - 12.1% 및 4.0 - 6.6%의 % LMW 범위를 나타내었다. 히스티딘 pH 6.0 제제의 경우, 퍼센트 순도는 하전된 부형제의 존재 하에 유의하게 감소되지 않은 것으로 또한 관찰되었다. 모든 제제에 걸쳐, 하전된 부형제 NaCl 및 아르기닌의 존재 하의 히스티딘 pH 6.0 제제는 나머지 히스티딘 제제와 비교하여 보다 우수한 순도를 나타내었다.
표 28. 환원 모세관 전기영동 결과 - DoE 연구 (F16 내지 F30)
5±3℃
Figure pct00068
표 28. (계속) 40±2℃/75±5% RH
Figure pct00069
6.9 비-환원 모세관 전기영동 - 소듐 도데실 술페이트
비-환원 모세관 전기영동에 대한 결과를 표 29에 제시하였다. 히스티딘 제제의 경우 5±3℃에서, 제제 F23 및 F29는 나머지 히스티딘 제제와 비교하여 3.6% 및 3.3%의 높은 % HMW를 나타내었다. 40±2℃/75±5% RH에서 스트레스를 가한 히스티딘 제제의 경우, 제제 F28, F29 및 F30은 각각 36.8%, 49.3% 및 37.4%의 극도로 높은 총 불순물 %를 나타내었다. 추가적으로, 제제 F20 및 F24는 높은 불순물 %를 나타내었다. 이들 제제는 부형제를 함유하지 않았거나, 또는 수크로스 또는 소르비톨을 함유하였다. 데이터에 기초하면, 40±2℃/75±5% RH에서 스트레스를 가한 샘플의 경우 보다 높은 pH 값에서 총 불순물 %가 더 낮다는 것이 관찰되었다. 히스티딘 제제 pH 5.0의 경우, 총 불순물 %는 11.8 - 15.0% 범위였다. pH 5.5의 히스티딘 제제 (제제 F21, F22 및 F23)의 경우, 총 불순물 %는 10.7 - 12.3% 범위인 반면, pH 6.0의 히스티딘 제제 (F25, F26 및 F27)의 총 불순물 %는 9.8 - 10.0% 범위였다. 비-환원 CE-SDS 데이터로부터 수득된 결과는 하전된 부형제의 존재 하의 히스티딘 pH 6.0 제제가 나머지 히스티딘 제제와 비교하여 보다 우수한 순도를 나타낸다는 것을 확인시켜 주었다.
표 29. 비-환원 모세관 전기영동 결과 - DoE 연구 (F16 내지 F30)
5±3℃
Figure pct00070
표 29. (계속) 40±2℃/75±5% RH
Figure pct00071
6.10 동적 광 산란
아세테이트 제제는 이들 제제에서 관찰된 pH 이동으로 인해 고려되지 않는다. 히스티딘 제제에 대한 DLS 데이터에 기초하여, 제제 F20-2, F24, F28 및 F30은 5±3℃에서 높은 %Pd 값을 나타내었다 (데이터는 제시되지 않음). 제제 F29는 % Pd에 대해 다중모드 명칭을 가졌고, 이는 용액 중 단백질성 입자의 존재를 나타낸다. 이전의 데이터는 또한 상기 언급된 제제가 최적의 조건이 아니라는 것을 나타내었다. 수크로스 및 소르비톨로 이루어진 제제는 둘 다의 온도 조건에서 높은 %Pd를 나타내었다. 이는 또한 초기 기준선 스크리닝 연구로부터의 DLS 데이터에서 관찰되었다. 40±2℃/75±5% RH에서 히스티딘 제제의 경우, 보다 낮은 pH에서 % Pd의 증가가 존재하는 것이 관찰되었다. pH 5.0의 히스티딘 제제의 경우, 40±2℃/75±5% RH에서 % Pd는 4.7 - 18.2% 범위였다. pH 5.5의 히스티딘 제제 (F21, F22, 및 F23)의 경우, % Pd는 7.9 - 9.5% 범위였다. 마지막으로, 히스티딘 pH 6.0 제제 (F25, F26, 및 F27)에 대한 % Pd는 7.8 - 9.8% 범위였다. pH 5.5 (F21, F22, 및 F23) 및 6.0 (F25, F26, 및 F27)의 히스티딘 제제는 pH 5.0의 것과 비교하여 가장 낮은 % Pd 값을 나타내었다. 히스티딘 pH 6.0 제제의 경우, F25, F26 및 F27은 모든 제제가 둘 다의 스트레스 조건에서 하전된 부형제의 존재 하에 낮은 % Pd를 입증하였으므로, 유망한 후보였다.
7. 결론
표 17에 열거된 다양한 제제에서 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G의 분석 시험으로부터 수득된 결과에 기초하면, 제제 F25 (30 mM 히스티딘, 150mM NaCl pH6.0)는 이러한 분자에 대한 최적 제제였다. 초기 기준선 생물물리학적 스크리닝 결과는 NaCl 및 아르기닌의 존재 하의 pH 5.5의 아세테이트 및 히스티딘 제제가 최적의 완충제/pH 조건임을 시사하였다. 추가적으로, 아르기닌 및 NaCl은 소르비톨 및 수크로스와 비교하여 부형제의 보다 우수한 선택이었다. 계면활성제 및 동결보호제 연구는 제제의 안정성을 증진시키기 위해 PS-80도 수크로스도 필요하지 않음을 나타내었다. DoE 안정성 연구의 경우, 초기 DSC 결과는 30mM 히스티딘 pH 6.0 제제가 유의하게 높은 T개시 용융 온도 값을 가졌음을 확인시켜 주었다. 유의한 pH 이동은 모든 30mM 아세테이트 제제에서 관찰되었다. 히스티딘 pH 6.0 제제는 5±3℃ 및 40±2℃/75±5% RH에서 4주 안정성에 걸쳐 pH에서 어떠한 유의한 변화도 나타내지 않았다. SEC 데이터는 하전된 부형제의 존재 하의 히스티딘 pH 6.0이 이러한 항체에 대해 가장 큰 안정성을 부여한다는 것을 입증하였다. icIEF로부터의 결과는 히스티딘 pH 6.0 샘플이 전하 이종성의 변화에 대해 보다 저항성이라는 것을 보여주었다. 이는 또한 수크로스 및 소르비톨의 존재 하의 제제가 가장 많은 분해를 나타낸다는 것을 보여주었다. 환원 CE-SDS 및 비 환원 CE-SDS에 대한 결과는 하전된 부형제의 존재 하의 히스티딘 pH 6.0 제제가 최상의 제제임을 보여주었다. DLS 데이터는 하전된 부형제의 존재 하의 히스티딘 pH 5.5 및 6.0 제제가 다분산도에서 최소의 변화를 갖는다는 것을 보여주었다. 전체적으로, 이용가능한 데이터를 종합한 것은 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G에 대한 제제로서 30 mM 히스티딘, 150mM 염화나트륨 pH 6.0을 지지한다.
실시예 56: 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G 및 항체 IgG1-hDR5-05-E430G 제제의 혼합물
둘 다 30 mM 히스티딘, 150mM 염화나트륨 pH 6.0 중에 제제화한 항체 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G (20 mg/mL) 및 IgG1-hDR5-05-E430G (20 mg/mL)의 1:1 혼합물을, 각각의 제제에서의 혼합물의 안정성을 조사하기 위해 5℃에서 저장하였다. 실시예 54에 기재된 방법을 사용하여, 저장 2, 4, 8 및 12주 후, 뿐만 아니라 6개월 후에, 외관, pH 단백질 함량, 크기 배제 크로마토그래피, 환원 및 비-환원 모세관 전기영동 - 소듐 도데실 술페이트 및 영상화 모세관 등전 포커싱에 의해 샘플을 분석하였다.
결과
시험된 특성 중 어떠한 것에서도 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 따라서, 항체 혼합물은 5℃ 저장 온도에서 적어도 6개월 동안 안정하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Genmab B.V. <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF <130> P/0117-WO <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 1 Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Phe 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 2 Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 3 Val Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 4 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Phe Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 5 Gln Ser Ile Ser Asn Asn 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 6 Gln Gln Gly Asn Ser Trp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 7 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 8 Ile Asp Pro Ala Asn Thr Asn Thr 1 5 <210> 9 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 9 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Phe Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Thr Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 10 Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr His 1 5 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 11 Ala Arg Trp Gly Thr Asn Val Tyr Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 12 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Glu Tyr Asp Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Thr Asn Val Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 13 Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 14 Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5 <210> 15 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 15 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 16 Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Asp Tyr Phe 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 17 Ile His Asn Ser Gly Thr Thr 1 5 <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 18 Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 19 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 19 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Cys Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 20 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 21 Gln Gly Ile Ser Arg Ser Tyr 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 22 Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 23 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 23 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 24 <211> 439 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 24 Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys 1 5 10 15 Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Pro 20 25 30 Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu 35 40 45 Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln 50 55 60 Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu 65 70 75 80 Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser 85 90 95 Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe 100 105 110 Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro 115 120 125 Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe 130 135 140 Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys 145 150 155 160 Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile 165 170 175 Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Thr Lys His Ser Gly Glu Val Pro 180 185 190 Ala Val Glu Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Pro 195 200 205 Cys Ser Leu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala Ala Val Val 210 215 220 Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys Val 225 230 235 240 Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp Pro Glu 245 250 255 Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp Asn Val Leu 260 265 270 Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val Pro Glu Gln Glu 275 280 285 Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Val Asn Met Leu Ser 290 295 300 Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala Glu Arg Ser 305 310 315 320 Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Glu Gly Asp Pro Thr Glu 325 330 335 Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Asp Leu Val Pro Phe Asp 340 345 350 Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly Leu Met Asp Asn Glu Ile 355 360 365 Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr Leu Tyr Thr 370 375 380 Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala Ser Val His 385 390 395 400 Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu Ala Lys Lys 405 410 415 Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu Gly 420 425 430 Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser 435 <210> 25 <211> 440 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 25 Met Gly Gln Leu Arg Gln Ser Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys 1 5 10 15 Gly Arg Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Leu 20 25 30 Arg Val Leu Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Ala Arg Val Leu 35 40 45 Val Ser Ala Asp Cys Ala Pro Ile Thr Arg Gln Ser Leu Asp Pro Gln 50 55 60 Arg Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Thr Glu Gly Leu 65 70 75 80 Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Ser Arg Asp Cys Ile Ser 85 90 95 Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Phe Leu Phe 100 105 110 Cys Leu Arg Cys Thr Lys Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Val Asn Ser 115 120 125 Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe 130 135 140 Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Ile Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys 145 150 155 160 Pro Arg Gly Met Val Lys Val Lys Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile 165 170 175 Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Thr Lys His Thr Gly Glu Val Pro 180 185 190 Ala Val Glu Lys Thr Val Thr Thr Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Pro 195 200 205 Cys Ser Leu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Ile Val Phe Val Val Ile 210 215 220 Val Val Val Ala Val Ile Val Trp Lys Thr Ser Leu Trp Lys Lys Val 225 230 235 240 Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Val Cys Ser Gly Asp Gly Gly Asp Pro Glu 245 250 255 Arg Val Asp Ser Ser Pro Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp Asn Ala Leu 260 265 270 Asn Glu Ile Val Ser Ile Val Gln Pro Ser Gln Val Pro Glu Gln Glu 275 280 285 Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Gln Thr Asp Val Asn Thr Leu Ser 290 295 300 Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Lys Ala Glu Gly Pro 305 310 315 320 Gln Arg Arg Gly Gln Leu Val Pro Val Asn Glu Asn Asp Pro Thr Glu 325 330 335 Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Ala Ile Val Pro Phe Asp 340 345 350 Ala Trp Glu Pro Leu Val Arg Gln Leu Gly Leu Thr Asn Asn Glu Ile 355 360 365 Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Ser Ser Arg Asp Thr Leu Tyr Val 370 375 380 Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg Ala Ala Ser Val Asn 385 390 395 400 Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Glu Glu Arg Leu Ala Lys Gln 405 410 415 Lys Ile Gln Asp Arg Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu 420 425 430 Asp Asn Ala Asp Ser Ala Thr Ser 435 440 <210> 26 <211> 381 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 26 Met Glu Pro Pro Gly Pro Ser Thr Pro Thr Ala Ser Ala Ala Ala Arg 1 5 10 15 Ala Asp His Tyr Thr Pro Gly Leu Arg Pro Leu Pro Lys Arg Arg Leu 20 25 30 Leu Tyr Ser Phe Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Ala Val Phe Val 35 40 45 Pro Val Thr Ala Asn Pro Ala His Asn Arg Pro Ala Gly Leu Gln Arg 50 55 60 Pro Glu Glu Ser Pro Ser Arg Gly Pro Cys Leu Ala Gly Gln Tyr Leu 65 70 75 80 Ser Glu Gly Asn Cys Lys Pro Cys Arg Glu Gly Ile Asp Tyr Thr Ser 85 90 95 His Ser Asn His Ser Leu Asp Ser Cys Ile Leu Cys Thr Val Cys Lys 100 105 110 Glu Asp Lys Val Val Glu Thr Arg Cys Asn Ile Thr Thr Asn Thr Val 115 120 125 Cys Arg Cys Lys Pro Gly Thr Phe Glu Asp Lys Asp Ser Pro Glu Ile 130 135 140 Cys Gln Ser Cys Ser Asn Cys Thr Asp Gly Glu Glu Glu Leu Thr Ser 145 150 155 160 Cys Thr Pro Arg Glu Asn Arg Lys Cys Val Ser Lys Thr Ala Trp Ala 165 170 175 Ser Trp His Lys Leu Gly Leu Trp Ile Gly Leu Leu Val Pro Val Val 180 185 190 Leu Leu Ile Gly Ala Leu Leu Val Trp Lys Thr Gly Ala Trp Arg Gln 195 200 205 Trp Leu Leu Cys Ile Lys Arg Gly Cys Glu Arg Asp Pro Glu Ser Ala 210 215 220 Asn Ser Val His Ser Ser Leu Leu Asp Arg Gln Thr Ser Ser Thr Thr 225 230 235 240 Asn Asp Ser Asn His Asn Thr Glu Pro Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly 245 250 255 Lys Lys Leu Leu Val Pro Val Asn Gly Asn Asp Ser Ala Asp Asp Leu 260 265 270 Lys Phe Ile Phe Glu Tyr Cys Ser Asp Ile Val Pro Phe Asp Ser Trp 275 280 285 Asn Arg Leu Met Arg Gln Leu Gly Leu Thr Asp Asn Gln Ile Gln Met 290 295 300 Val Lys Ala Glu Thr Leu Val Thr Arg Glu Ala Leu Tyr Gln Met Leu 305 310 315 320 Leu Lys Trp Arg His Gln Thr Gly Arg Ser Ala Ser Ile Asn His Leu 325 330 335 Leu Asp Ala Leu Glu Ala Val Glu Glu Arg Asp Ala Met Glu Lys Ile 340 345 350 Glu Asp Tyr Ala Val Lys Ser Gly Arg Phe Thr Tyr Gln Asn Ala Ala 355 360 365 Ala Gln Pro Glu Thr Gly Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val 370 375 380 <210> 27 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 27 Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys 1 5 10 15 Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Leu 20 25 30 Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu 35 40 45 Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln 50 55 60 Gln Arg Val Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu 65 70 75 80 Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser 85 90 95 Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe 100 105 110 Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro 115 120 125 Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe 130 135 140 Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys 145 150 155 160 Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile 165 170 175 Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Thr Lys His Ser Gly Glu Ala Pro 180 185 190 Ala Val Glu Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Pro 195 200 205 Cys Ser Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 225 230 235 240 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 245 250 255 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 260 265 270 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 275 280 285 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 290 295 300 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 305 310 315 320 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 325 330 335 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 340 345 350 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 355 360 365 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 370 375 380 Tyr Lys Thr Ala Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 385 390 395 400 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 405 410 415 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 420 425 430 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys His His His His His His His 435 440 445 His Glu Pro Glu Ala 450 <210> 28 <211> 192 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 28 Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys 1 5 10 15 Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Pro 20 25 30 Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu 35 40 45 Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln 50 55 60 Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu 65 70 75 80 Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser 85 90 95 Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe 100 105 110 Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro 115 120 125 Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe 130 135 140 Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys 145 150 155 160 Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile 165 170 175 Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly His His His His His His His His 180 185 190 <210> 29 <211> 329 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 29 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 20 25 30 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 35 40 45 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 50 55 60 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 85 90 95 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 30 <211> 329 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 30 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 20 25 30 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 35 40 45 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 50 55 60 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 31 <211> 329 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 31 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 20 25 30 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 35 40 45 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 50 55 60 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro 85 90 95 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 32 <211> 329 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 32 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 20 25 30 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 35 40 45 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 50 55 60 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro 85 90 95 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 33 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 33 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Phe Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 34 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 34 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Phe Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Lys Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 35 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 35 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Phe Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 36 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 36 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Phe Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Thr Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 37 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 37 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Phe Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Thr Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Lys Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 38 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 38 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Phe Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Thr Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 39 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 39 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 40 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 40 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Glu Tyr Asp Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Thr Asn Val Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 41 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 41 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Glu Tyr Asp Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Thr Asn Val Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Lys Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 42 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 42 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Glu Tyr Asp Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Thr Asn Val Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 43 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 43 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 44 <211> 440 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 44 Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys 1 5 10 15 Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Pro 20 25 30 Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu 35 40 45 Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln 50 55 60 Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu 65 70 75 80 Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser 85 90 95 Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe 100 105 110 Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro 115 120 125 Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe 130 135 140 Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys 145 150 155 160 Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile 165 170 175 Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Thr Lys His Ser Gly Glu Val Pro 180 185 190 Ala Val Glu Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Pro 195 200 205 Cys Ser Leu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala Ala Val Val 210 215 220 Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys Val 225 230 235 240 Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp Pro Glu 245 250 255 Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp Asn Val Leu 260 265 270 Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val Pro Glu Gln Glu 275 280 285 Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Val Asn Met Leu Ser 290 295 300 Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala Glu Arg Ser 305 310 315 320 Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Glu Gly Asp Pro Thr Glu 325 330 335 Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Asp Leu Val Pro Phe Asp 340 345 350 Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly Leu Met Asp Asn Glu Ile 355 360 365 Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr Leu Tyr Thr 370 375 380 Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala Ser Val His 385 390 395 400 Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu Ala Asn Gln 405 410 415 Lys Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu 420 425 430 Gly Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser 435 440 <210> 45 <211> 440 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 45 Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys 1 5 10 15 Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Leu 20 25 30 Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu 35 40 45 Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln 50 55 60 Gln Arg Val Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu 65 70 75 80 Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser 85 90 95 Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe 100 105 110 Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro 115 120 125 Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe 130 135 140 Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys 145 150 155 160 Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile 165 170 175 Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Thr Lys His Ser Gly Glu Ala Pro 180 185 190 Ala Val Glu Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Pro 195 200 205 Cys Ser Leu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala Ala Val Val 210 215 220 Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys Val 225 230 235 240 Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp Pro Glu 245 250 255 Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp Asn Val Leu 260 265 270 Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val Pro Glu Gln Glu 275 280 285 Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Val Asn Met Leu Ser 290 295 300 Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala Glu Arg Ser 305 310 315 320 Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Glu Gly Asp Pro Thr Glu 325 330 335 Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Asp Leu Val Pro Phe Asp 340 345 350 Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly Leu Met Asp Asn Glu Ile 355 360 365 Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr Leu Tyr Thr 370 375 380 Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala Ser Val His 385 390 395 400 Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu Ala Lys Gln 405 410 415 Lys Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu 420 425 430 Gly Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser 435 440 <210> 46 <211> 440 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 46 Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys 1 5 10 15 Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Pro 20 25 30 Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu 35 40 45 Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln 50 55 60 Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu 65 70 75 80 Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser 85 90 95 Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe 100 105 110 Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro 115 120 125 Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe 130 135 140 Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys 145 150 155 160 Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile 165 170 175 Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Thr Lys His Ser Gly Glu Val Pro 180 185 190 Ala Val Glu Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Pro 195 200 205 Cys Ser Leu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala Ala Val Val 210 215 220 Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys Val 225 230 235 240 Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp Pro Glu 245 250 255 Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp Asn Val Leu 260 265 270 Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val Pro Glu Gln Glu 275 280 285 Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Val Asn Met Leu Ser 290 295 300 Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala Glu Arg Ser 305 310 315 320 Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Glu Gly Asp Pro Thr Glu 325 330 335 Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Asp Leu Val Pro Phe Asp 340 345 350 Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly Leu Met Asp Asn Glu Ile 355 360 365 Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr Leu Tyr Thr 370 375 380 Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala Ser Val His 385 390 395 400 Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu Ala Lys Gln 405 410 415 Lys Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu 420 425 430 Gly Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser 435 440 <210> 47 <211> 411 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 47 Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys 1 5 10 15 Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Pro 20 25 30 Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu 35 40 45 Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln 50 55 60 Gln Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu 65 70 75 80 Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser 85 90 95 Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe 100 105 110 Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro 115 120 125 Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe 130 135 140 Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys 145 150 155 160 Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile 165 170 175 Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala 180 185 190 Ala Val Val Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp 195 200 205 Lys Lys Val Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Asp Pro Glu Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp 225 230 235 240 Asn Val Leu Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val Pro 245 250 255 Glu Gln Glu Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Val Asn 260 265 270 Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala 275 280 285 Glu Arg Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Glu Gly Asp 290 295 300 Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Asp Leu Val 305 310 315 320 Pro Phe Asp Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly Leu Met Asp 325 330 335 Asn Glu Ile Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr 340 345 350 Leu Tyr Thr Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala 355 360 365 Ser Val His Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu 370 375 380 Ala Asn Gln Lys Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met 385 390 395 400 Tyr Leu Glu Gly Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser 405 410 <210> 48 <211> 445 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 48 Met Gly Gln Leu Arg Gln Ser Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys 1 5 10 15 Gly Arg Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Leu 20 25 30 Arg Val Leu Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Ala Arg Val Leu 35 40 45 Leu Ser Val Ser Ala Asp Cys Ala Pro Ile Thr Arg Gln Ser Leu Asp 50 55 60 Pro Gln Arg Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Thr Glu 65 70 75 80 Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Ser Arg Glu Cys 85 90 95 Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Phe 100 105 110 Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Lys Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Val 115 120 125 Asn Ser Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly 130 135 140 Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Ile Cys Arg Lys Cys Arg Thr 145 150 155 160 Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val Lys Asp Cys Thr Pro Trp Ser 165 170 175 Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Thr Lys His Thr Gly Glu 180 185 190 Val Pro Ala Val Glu Lys Thr Val Thr Thr Ser Pro Gly Thr Pro Ala 195 200 205 Ser Pro Cys Ser Leu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Ile Val Leu Val 210 215 220 Val Ile Val Val Val Ala Val Ile Val Trp Lys Thr Ser Leu Trp Lys 225 230 235 240 Lys Val Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Val Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp 245 250 255 Pro Glu Arg Val Asp Ser Ser Ser His Ser Pro Gln Arg Pro Gly Ala 260 265 270 Glu Asp Asn Ala Leu Asn Glu Ile Val Ser Ile Val Gln Pro Ser Gln 275 280 285 Val Pro Glu Gln Glu Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Gln Thr Asp 290 295 300 Val Asn Thr Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala 305 310 315 320 Lys Ala Glu Gly Pro Gln Arg Arg Gly Gln Leu Val Pro Val Asn Glu 325 330 335 Asn Asp Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Ala 340 345 350 Ile Val Pro Phe Asp Ala Trp Glu Pro Leu Val Arg Gln Leu Gly Leu 355 360 365 Thr Asn Asn Glu Ile Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Ser Ser Arg 370 375 380 Asp Thr Leu Tyr Val Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg 385 390 395 400 Ala Ala Ser Val Asn Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Glu Glu 405 410 415 Arg Leu Ala Lys Gln Lys Ile Gln Asp Arg Leu Leu Ser Ser Gly Lys 420 425 430 Phe Met Tyr Leu Glu Asp Asn Ala Asp Ser Ala Thr Ser 435 440 445 <210> 49 <211> 445 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 49 Met Gly Gln Leu Arg Gln Ser Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys 1 5 10 15 Gly Arg Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Leu 20 25 30 Arg Val Leu Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Ala Arg Val Leu 35 40 45 Leu Ser Val Ser Ala Asp Cys Ala Pro Ile Thr Arg Gln Ser Leu Asp 50 55 60 Pro Gln Arg Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Thr Glu 65 70 75 80 Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Ser Arg Glu Cys 85 90 95 Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Phe 100 105 110 Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Lys Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Val 115 120 125 Asn Ser Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly 130 135 140 Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Ile Cys Arg Lys Cys Arg Thr 145 150 155 160 Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val Lys Asp Cys Thr Pro Trp Ser 165 170 175 Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Thr Lys His Thr Gly Glu 180 185 190 Val Pro Ala Val Glu Lys Thr Val Thr Thr Ser Pro Gly Thr Pro Ala 195 200 205 Ser Pro Cys Ser Leu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Ile Val Leu Val 210 215 220 Val Ile Val Val Val Ala Val Ile Val Trp Lys Thr Ser Leu Trp Lys 225 230 235 240 Lys Val Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Val Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp 245 250 255 Pro Glu Arg Val Asp Ser Ser Ser His Ser Pro Gln Arg Pro Gly Ala 260 265 270 Glu Asp Asn Ala Leu Asn Glu Ile Val Ser Ile Val Gln Pro Ser Gln 275 280 285 Val Pro Glu Gln Glu Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Gln Thr Asp 290 295 300 Val Asn Thr Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala 305 310 315 320 Lys Ala Glu Gly Pro Gln Arg Arg Gly Gln Leu Val Pro Val Asn Glu 325 330 335 Asn Asp Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Ala 340 345 350 Ile Val Pro Phe Asp Ala Trp Glu Pro Leu Val Arg Gln Leu Gly Leu 355 360 365 Thr Asn Asn Glu Ile Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Ser Ser Arg 370 375 380 Asp Thr Leu Tyr Val Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg 385 390 395 400 Ala Ala Ser Val Asn Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Glu Glu 405 410 415 Arg Leu Ala Asn Gln Lys Ile Gln Asp Arg Leu Leu Ser Ser Gly Lys 420 425 430 Phe Met Tyr Leu Glu Asp Asn Ala Asp Ser Ala Thr Ser 435 440 445 <210> 50 <211> 416 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 50 Met Gly Gln Leu Arg Gln Ser Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys 1 5 10 15 Gly Arg Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Leu 20 25 30 Arg Val Leu Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Ala Arg Val Leu 35 40 45 Leu Ser Val Ser Ala Asp Cys Ala Pro Ile Thr Arg Gln Ser Leu Asp 50 55 60 Pro Gln Arg Arg Ala Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Thr Glu 65 70 75 80 Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Ser Arg Glu Cys 85 90 95 Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Phe 100 105 110 Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Lys Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Val 115 120 125 Asn Ser Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly 130 135 140 Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Ile Cys Arg Lys Cys Arg Thr 145 150 155 160 Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val Lys Asp Cys Thr Pro Trp Ser 165 170 175 Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Ile 180 185 190 Val Leu Val Val Ile Val Val Val Ala Val Ile Val Trp Lys Thr Ser 195 200 205 Leu Trp Lys Lys Val Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Val Cys Ser Gly Gly 210 215 220 Gly Gly Asp Pro Glu Arg Val Asp Ser Ser Ser His Ser Pro Gln Arg 225 230 235 240 Pro Gly Ala Glu Asp Asn Ala Leu Asn Glu Ile Val Ser Ile Val Gln 245 250 255 Pro Ser Gln Val Pro Glu Gln Glu Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu 260 265 270 Gln Thr Asp Val Asn Thr Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu 275 280 285 Glu Pro Ala Lys Ala Glu Gly Pro Gln Arg Arg Gly Gln Leu Val Pro 290 295 300 Val Asn Glu Asn Asp Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp 305 310 315 320 Phe Ala Ala Ile Val Pro Phe Asp Ala Trp Glu Pro Leu Val Arg Gln 325 330 335 Leu Gly Leu Thr Asn Asn Glu Ile Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala 340 345 350 Ser Ser Arg Asp Thr Leu Tyr Val Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys 355 360 365 Thr Gly Arg Ala Ala Ser Val Asn Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr 370 375 380 Leu Glu Glu Arg Leu Ala Asn Gln Lys Ile Gln Asp Arg Leu Leu Ser 385 390 395 400 Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu Asp Asn Ala Asp Ser Ala Thr Ser 405 410 415 <210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 51 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Val 1 5 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 52 Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr 1 5 <210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 53 Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr 1 5 10 <210> 54 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 54 Gln Asp Val Gly Thr Ala 1 5 <210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 55 Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr 1 5 <210> 56 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 56 Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 57 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 57 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 58 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 58 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 20 25 30 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 35 40 45 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 50 55 60 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 85 90 95 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 59 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 59 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 20 25 30 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 35 40 45 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 50 55 60 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 85 90 95 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Lys Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 60 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 60 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 20 25 30 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 35 40 45 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 50 55 60 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 85 90 95 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Tyr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 61 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 61 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 20 25 30 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 35 40 45 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 50 55 60 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 85 90 95 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 62 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 62 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 20 25 30 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 35 40 45 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 50 55 60 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 85 90 95 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Lys Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 63 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 63 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 20 25 30 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 35 40 45 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 50 55 60 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 85 90 95 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 64 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 64 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 20 25 30 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 35 40 45 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 50 55 60 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 85 90 95 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Lys Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 65 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 65 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 20 25 30 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 35 40 45 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 50 55 60 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 85 90 95 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 66 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 66 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 20 25 30 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 35 40 45 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 50 55 60 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 85 90 95 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 67 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 67 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 20 25 30 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 35 40 45 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 50 55 60 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 85 90 95 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Lys Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 68 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N/A <400> 68 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 20 25 30 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 35 40 45 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 50 55 60 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 85 90 95 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325

Claims (57)

  1. a. 인간 이뮤노글로불린 G의 Fc 영역 및 항원 결합 영역을 포함하는 항체이며, 여기서 Fc 영역은 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 E430, E345 또는 S440에 상응하는 위치에서 아미노산의 돌연변이를 포함하는 것인 항체,
    b. 히스티딘 완충제, 및
    c. 염화나트륨
    을 포함하는 제약 조성물이며,
    여기서 조성물의 pH는 5.5 내지 7.4인 제약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 5 mM 내지 100 mM 히스티딘, 예를 들어 5 mM 내지 75 mM, 예컨대 10 mM 내지 50 mM, 예를 들어 15 mM 내지 45 mM, 예컨대 20 mM 내지 40 mM, 예를 들어 25 내지 35 mM, 예컨대 28 mM 내지 32 mM, 예를 들어 30 mM 히스티딘을 포함하는 제약 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, pH가 5.8 내지 7.2, 예컨대 5.5 내지 6.5, 예를 들어 5.8 내지 6.2, 예를 들어 5.9 내지 6.1, 예컨대 6.0인 제약 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 25 mM 내지 500 mM 염화나트륨, 예를 들어 25 mM 내지 250 mM, 예컨대 50 mM 내지 250 mM, 예를 들어 100 mM 내지 200 mM, 예컨대 125 mM 내지 175 mM, 예를 들어 150 mM 염화나트륨을 포함하는 제약 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 농도가 0.5 mg/ml 내지 250 mg/ml, 예컨대 1 mg/ml 내지 100 mg/ml, 예를 들어 1 mg/ml 내지 50 mg/ml, 예컨대 2 mg/ml 내지 20 mg/ml, 예컨대 15mg/ml 내지 25 mg/ml, 예컨대 18 mg/ml 내지 23 mg/ml, 예컨대 19mg/ml 내지 21 mg/ml, 예컨대 18mg/ml 내지 20mg/ml, 예컨대 5 mg/ml 내지 15 mg/ml, 예컨대 10 mg/ml 또는 예컨대 20 mg/ml인 제약 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 10 mM 내지 50 mM 히스티딘, 50 mM 내지 250 mM 염화나트륨 및 2 mg/ml 내지 20 mg/ml 항체, pH 5.5 내지 6.5를 포함하고, 바람직하게는 30 mM 히스티딘, 150 mM 염화나트륨 및 20 mg/ml 항체, pH 6.0을 포함하는 제약 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제를 포함하지 않는 제약 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 동결보호제를 포함하지 않는 제약 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역이 EU 넘버링에 따라 인간 IgG1의 S440에 상응하는 위치에서 아미노산의 돌연변이를 포함하며, 단 S440에서의 돌연변이가 S440Y 또는 S440W인 제약 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역이 E430G, E345K, E430S, E430F, E430T, E345Q, E345R, E345Y, S440W 및 S440Y로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는 것인 제약 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역이 E430G 또는 E345K로부터 선택된 돌연변이를 포함하는 것인 제약 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역이 E430G 돌연변이를 포함하는 것인 제약 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역이 K439E 또는 S440K로부터 선택된 돌연변이를 추가로 포함하는 것인 제약 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 영역이 인간 DR5에 결합하는 것인 제약 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 영역이 서열식별번호: 46의 아미노산 잔기 116-138 내에 위치한 1개 이상의 아미노산 잔기 및 아미노산 잔기 139-166 내에 위치한 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하거나 또는 이를 필요로 하는 인간 DR5 상의 에피토프에 결합하는 것인 제약 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 영역이 서열식별번호: 46의 아미노산 잔기 79-138 내에 위치한 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하거나 또는 이를 필요로 하는 인간 DR5 상의 에피토프에 결합하는 것인 제약 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 영역이 하기 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 것인 제약 조성물:
    a) (VH) 서열식별번호: 1, 2, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6;
    b) (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6;
    c) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14;
    d) (VH) 서열식별번호: 16, 17, 18 및 (VL) 서열식별번호: 21, GAS, 22 또는
    e) 상기 a) 내지 d) 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 (VH) CDR1, CDR2, CDR3 및 (VL) CDR1, CDR2 및 CDR3 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이 또는 치환을 갖는 상기 6개의 CDR.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 영역이 하기 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 (VH) 영역 및 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 것인 제약 조성물:
    a) (VH) 서열식별번호: 4 및 (VL) 서열식별번호: 7;
    b) (VH) 서열식별번호: 9 및 (VL) 서열식별번호: 7;
    c) (VH) 서열식별번호: 12 및 (VL) 서열식별번호: 15;
    d) (VH) 서열식별번호: 19 및 (VL) 서열식별번호: 23;
    e) (VH) 서열식별번호: 20 및 (VL) 서열식별번호: 23 또는
    f) 상기 a) 내지 e) 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 (VH) 및 (VL) 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이 또는 치환을 갖는 상기 (VH) 및 (VL).
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 제약 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgG1 이소형인 제약 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgG1m(f), IgG1m(a), IgG1m(z), IgG1m(x) 동종이형 또는 혼합된 동종이형인 제약 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역이 하기 군의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제약 조성물:
    a) 서열식별번호: 29;
    b) 서열식별번호: 30;
    c) 서열식별번호: 31;
    d) 서열식별번호: 32 또는
    e) 상기 a) 내지 d) 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 아미노산 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이 또는 치환을 갖는 상기 서열.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하며, 여기서 LC는 서열식별번호: 39의 서열을 포함하고, 여기서 HC는 하기 서열 중 1개를 포함하는 것인 제약 조성물:
    a) (HC) 서열식별번호: 33;
    b) (HC) 서열식별번호: 34;
    c) (HC) 서열식별번호: 35;
    d) (HC) 서열식별번호: 36;
    e) (HC) 서열식별번호: 37;
    f) (HC) 서열식별번호: 38; 또는
    g) 상기 a) 내지 f) 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 (HC) 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이 또는 치환을 갖는 상기 (HC).
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하며, 여기서 LC는 서열식별번호: 43의 서열을 포함하고, 여기서 HC는 하기 서열 중 1개를 포함하는 것인 제약 조성물:
    a) (HC) 서열식별번호: 40;
    b) (HC) 서열식별번호: 41;
    c) (HC) 서열식별번호: 42; 또는
    d) 상기 a) 내지 c) 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 (HC) 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이 또는 치환을 갖는 상기 (HC).
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 제약 조성물.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 1개 이상의 항원 결합 영역을 포함하는 이중특이적 항체인 제약 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간, 인간화 또는 키메라 항체인 제약 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 효능작용성 항체인 제약 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 표적 세포에서 프로그램화된 세포 사멸, 예컨대 카스파제 의존성 세포 사멸을 유도하는 것인 제약 조성물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 DR5를 발현하는 표적 세포에서 아폽토시스를 유도하는 것인 제약 조성물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 세포 생존율을 감소시키는 것인 제약 조성물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 2종 이상의 항체를 포함하는 제약 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제1 항체 및 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제2 항체를 포함하는 제약 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 제1 항체가 제1 Fc 영역을 포함하고, 제2 항체가 제2 Fc 영역을 포함하는 것인 제약 조성물.
  35. 제33항에 있어서, 제1 항체가 DR5에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 영역 및 제1 Fc 영역을 포함하고, 제2 항체가 DR5에 결합할 수 있는 제2 항원 결합 영역 및 제2 Fc 영역을 포함하는 것인 제약 조성물.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체가 인간 DR5 상의 상이한 에피토프에 결합하는 것인 제약 조성물.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 DR5에 결합하는 상기 제1 항체가 인간 DR5에 대한 상기 제2 항체의 결합을 차단하지 않는 것인 제약 조성물.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체가 하기 6개의 CDR 서열
    a) (VH) 서열식별번호: 1, 2, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항체가 하기 6개의 CDR 서열
    b) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하거나, 또는 여기서 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체가
    c) 각각 상기 (a) 또는 (b)에 정의된 6개의 CDR 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이 또는 치환을 갖는 상기 6개의 CDR 서열을 포함하는 것인
    제약 조성물.
  39. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체가 하기 6개의 CDR 서열
    a) (VH) 서열식별번호: 1, 8, 3 및 (VL) 서열식별번호: 5, FAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항체가 하기 6개의 CDR 서열
    b) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하거나, 또는 여기서 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체가
    c) 각각 상기 (a) 또는 (b)에 정의된 6개의 CDR 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이 또는 치환을 갖는 상기 6개의 CDR 서열을 포함하는 것인
    제약 조성물.
  40. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체가 하기 6개의 CDR 서열
    a) (VH) 서열식별번호: 16, 17, 18 및 (VL) 서열식별번호: 21, GAS, 6을 포함하고, 상기 제2 항체가 하기 6개의 CDR 서열
    b) (VH) 서열식별번호: 10, 2, 11 및 (VL) 서열식별번호: 13, RTS, 14를 포함하거나, 또는 여기서 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체가
    c) 각각 상기 (a) 또는 (b)에 정의된 6개의 CDR 서열에 걸쳐 총 1 내지 5개의 돌연변이 또는 치환을 갖는 상기 6개의 CDR 서열을 포함하는 것인
    제약 조성물.
  41. 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체가 조성물 중에 1:49 내지 49:1 몰비, 예컨대 약 1:1 몰비, 약 1:2 몰비, 약 1:3 몰비, 약 1:4 몰비, 약 1:5 몰비, 약 1:6 몰비, 약 1:7 몰비, 약 1:8 몰비, 약 1:9 몰비, 약 1:10 몰비, 약 1:15 몰비, 약 1:20 몰비, 약 1:25 몰비, 약 1:30 몰비, 약 1:35 몰비, 약 1:40 몰비, 약 1:45 몰비, 약 1:49 몰비, 약 49:1 몰비, 약 45:1 몰비, 약 40:1 몰비, 약 35:1 몰비, 약 30:1 몰비, 약 25:1 몰비, 약 20:1 몰비, 약 15:1 몰비, 약 10:1 몰비, 약 9:1 몰비, 약 8:1 몰비, 약 7:1 몰비, 약 6:1 몰비, 약 5:1 몰비, 약 4:1 몰비, 약 3:1 몰비, 약 2:1 몰비로 존재하는 것인 제약 조성물.
  42. 제33항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체가 조성물 중에 약 1:9 내지 9:1 몰비로 존재하는 것인 제약 조성물.
  43. 제33항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체가 조성물 중에 약 1:1 몰비로 존재하는 것인 제약 조성물.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 제약 조성물.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 감염성 질환, 자가면역 질환 또는 심혈관 이상의 치료에 사용하기 위한 1종 이상의 항-DR5 항체를 포함하는 제약 조성물.
  46. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 종양 및/또는 혈액 종양의 치료에 사용하기 위한 1종 이상의 항-DR5 항체를 포함하는 제약 조성물.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 종양, 예컨대 결장직장암, 예컨대 결장직장 암종 및 결장직장 선암종, 방광암, 골육종, 연골육종, 유방암, 예컨대 삼중-음성 유방암, 중추신경계암, 예컨대 교모세포종, 성상세포종, 신경모세포종, 신경 섬유육종, 신경내분비 종양, 자궁경부암, 자궁내막암, 위암, 예컨대 위 선암종, 두경부암, 신장암, 간암, 예컨대 간세포성 암종, 폐암, 예컨대 NSCLC 및 SCLC, 난소암, 췌장암, 예컨대 췌장관 암종 및 췌장 선암종, 육종 또는 피부암, 예컨대 악성 흑색종 및 비-흑색종 피부암의 치료에 사용하기 위한 1종 이상의 항-DR5 항체를 포함하는 제약 조성물.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 종양 예컨대, 백혈병, 예컨대 만성 림프구성 백혈병 및 골수성 백혈병, 예컨대 급성 골수성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병, 림프종, 예컨대 비-호지킨 림프종 또는 다발성 골수종, 예컨대 호지킨 림프종 또는 예컨대 골수이형성 증후군의 치료에 사용하기 위한 1종 이상의 항-DR5 항체를 포함하는 제약 조성물.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, DR5 발현 종양의 성장을 억제하는데 사용하기 위한 1종 이상의 항-DR5 항체를 포함하는 제약 조성물.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, DR5 발현 종양에서 아폽토시스를 유도하는데 사용하기 위한 1종 이상의 항-DR5 항체를 포함하는 제약 조성물.
  51. 암의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 1종 이상의 항-DR5 항체를 포함하는 제약 조성물의 용도.
  52. 1종 이상의 항-DR5 항체를 포함하는 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물의 유효량을 암을 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 암을 갖는 개체를 치료하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 추가의 치료제가 화학요법제 (파클리탁셀, 테모졸로미드, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 이리노테칸, 독소루비신, 겜시타빈, 5-플루오로우라실, 페메트렉세드를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 키나제 억제제 (소라페닙, 수니티닙 또는 에베롤리무스를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 아폽토시스-조정제 (재조합 인간 TRAIL 또는 비리나판트를 포함하나 이에 제한되지는 않음), RAS 억제제, 프로테아솜 억제제 (보르테조밉을 포함하나 이에 제한되지는 않음), 히스톤 데아세틸라제 억제제 (보리노스타트를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 기능식품, 시토카인 (IFN-γ를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 항체 또는 항체 모방체 (항-EGFR, 항-IGF-1R, 항-VEGF, 항-CD20, 항-CD38, 항-HER2, 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-CTLA4, 항-CD40, 항-CD137, 항-GITR 항체 및 항체 모방체를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 항체-약물 접합체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 항암제(들)인 방법.
  55. 요법에서 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한, 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 2종 이상의 제약 조성물을 포함하는 부분들의 키트.
  56. 제55항에 있어서, 조성물이 요법에서 동시 사용을 위한 것이고, 조성물이 사용 직전에 혼합되는 것인 키트.
  57. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제1 항체를 포함하는 제1 제약 조성물을 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제2 항체를 포함하는 제2 제약 조성물과 혼합하는 것을 포함하는, 제33항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물을 제조하는 방법.
KR1020207000017A 2017-06-07 2018-06-07 돌연변이된 igg 육량체에 기초한 치료 항체 KR20200027944A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762516489P 2017-06-07 2017-06-07
US62/516,489 2017-06-07
US201862614801P 2018-01-08 2018-01-08
US62/614,801 2018-01-08
PCT/EP2018/065071 WO2018224609A1 (en) 2017-06-07 2018-06-07 Therapeutic antibodies based on mutated igg hexamers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200027944A true KR20200027944A (ko) 2020-03-13

Family

ID=62636167

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207000017A KR20200027944A (ko) 2017-06-07 2018-06-07 돌연변이된 igg 육량체에 기초한 치료 항체

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20200247897A1 (ko)
EP (1) EP3635005A1 (ko)
JP (2) JP2020522543A (ko)
KR (1) KR20200027944A (ko)
CN (1) CN111328335A (ko)
BR (1) BR112019025328A2 (ko)
MA (1) MA49259A (ko)
MX (1) MX2019014407A (ko)
TW (1) TW201919692A (ko)
WO (1) WO2018224609A1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220315661A1 (en) * 2019-05-09 2022-10-06 Genmab B.V. Dosage regimens for a combination of anti-dr5 antibodies for use in treating cancer
TW202140553A (zh) 2020-01-13 2021-11-01 美商威特拉公司 C5ar1抗體分子及其用途
JP2023534726A (ja) * 2020-07-23 2023-08-10 ジェンマブ ビー．ブイ． 多発性骨髄腫の治療に使用するための抗ｄｒ５抗体と免疫調節イミド薬との併用
CA3173944A1 (en) 2021-01-13 2022-07-21 Visterra, Inc. Humanized complement 5a receptor 1 antibodies and methods of use thereof

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
WO1998050431A2 (en) 1997-05-02 1998-11-12 Genentech, Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
CA2361421A1 (en) 1999-02-03 2000-08-10 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
TWI318983B (en) 2000-05-02 2010-01-01 Uab Research Foundation An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof
DE10043437A1 (de) 2000-09-04 2002-03-28 Horst Lindhofer Verwendung von trifunktionellen bispezifischen und trispezifischen Antikörpern zur Behandlung von malignem Aszites
BRPI0213846B8 (pt) 2001-11-01 2021-05-25 Uab Research Foundation composição que compreende um anticorpo que liga especificamente uma dr5 do receptor de trail e um ou mais agentes terapêuticos
ES2592271T3 (es) 2005-03-31 2016-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Métodos de producción de polipéptidos mediante la regulación de la asociación de los polipéptidos
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
PE20071101A1 (es) 2005-08-31 2007-12-21 Amgen Inc Polipeptidos y anticuerpos
NZ591252A (en) 2006-03-17 2012-06-29 Biogen Idec Inc Methods of designing antibody or antigen binding fragments thereof with substituted non-covarying amino acids
DK1999154T3 (da) 2006-03-24 2012-12-03 Merck Patent Gmbh Fremstillede heterodimere proteindomæner
AT503902B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
CA2691434C (en) 2007-06-21 2020-07-21 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
ES2524553T3 (es) 2008-06-17 2014-12-10 Apogenix Gmbh Receptores multiméricos de TNF
SG10201407908VA (en) 2008-12-19 2015-01-29 Macrogenics Inc Covalent diabodies and uses thereof
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
US20120070432A1 (en) 2009-05-28 2012-03-22 Amgen Inc. Treatment of pancreatic cancer using a dr5 agonist in combination with gemcitabine
CA2766220C (en) 2009-06-26 2021-02-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
EA201201435A1 (ru) 2010-04-20 2013-04-30 Генмаб А/С ГЕТЕРОДИМЕРНЫЕ АНТИТЕЛО-Fc-СОДЕРЖАЩИЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
EP2569337A1 (en) 2010-05-14 2013-03-20 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
JP5997154B2 (ja) 2010-08-16 2016-09-28 ノビミューン エスアー 多重特異性多価抗体の生成方法
CA2807269A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 Roche Glycart Ag Activatable bispecific antibodies
BR112013001847A2 (pt) 2010-08-24 2016-05-31 Hoffmann La Roche anticorpo biespecífico, método de preparação do anticorpo biespecífico, do anticorpo biespecífico trivalente, métodos e composição farmacêutica
MX352929B (es) 2010-11-05 2017-12-13 Zymeworks Inc DISEÑO DE ANTICUERPOS HETERODIMÉRICOS ESTABLES CON MUTACIONES EN EL DOMINIO Fc.
CN102250246A (zh) 2011-06-10 2011-11-23 常州亚当生物技术有限公司 抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体及其应用
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
CN102654260B (zh) 2011-09-29 2014-09-03 北京京东方光电科技有限公司 一种背光源和液晶显示器
SI2794905T1 (sl) 2011-12-20 2020-08-31 Medimmune, Llc Modificirani polipeptidi za ogrodja bispecifičnega protitelesa
KR102171431B1 (ko) 2012-04-20 2020-10-30 메뤼스 엔.페. Ig-유사 분자의 제조방법 및 제조수단
US11180572B2 (en) * 2012-07-06 2021-11-23 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
EP2684896A1 (en) 2012-07-09 2014-01-15 International-Drug-Development-Biotech Anti-DR5 family antibodies, bispecific or multivalent anti-DR5 family antibodies and methods of use thereof
EA201500741A1 (ru) 2013-01-10 2016-01-29 Генмаб Б.В. ВАРИАНТЫ Fc-ОБЛАСТИ IGG1 ЧЕЛОВЕКА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
CN109476737A (zh) * 2015-12-01 2019-03-15 根马布有限公司 抗dr5抗体及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3635005A1 (en) 2020-04-15
CN111328335A (zh) 2020-06-23
US20200247897A1 (en) 2020-08-06
TW201919692A (zh) 2019-06-01
WO2018224609A1 (en) 2018-12-13
JP2023145720A (ja) 2023-10-11
MX2019014407A (es) 2020-02-05
BR112019025328A2 (pt) 2020-06-23
JP2020522543A (ja) 2020-07-30
MA49259A (fr) 2020-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10882913B2 (en) Anti-DR5 antibodies and methods of use thereof
ES2963157T3 (es) Anticuerpos anti-SIRP-alfa y métodos relacionados
KR102426765B1 (ko) Cd137에 대한 신규한 이중특이성 폴리펩타이드
JP7397055B2 (ja) Ｃｄ１３７及びｏｘ４０に結合する抗体分子
JP2023145720A (ja) 変異ＩｇＧ六量体に基づく治療用抗体
US20230227572A1 (en) Anti-pvrig protein antibody or antibody fragment and use thereof
US20220315661A1 (en) Dosage regimens for a combination of anti-dr5 antibodies for use in treating cancer
US20230293680A1 (en) A composition of anti-dr5 antibodies and an immunomodulatory imide drug for use in treating multiple myeloma
US20230365714A1 (en) Antibodies capable of binding to ror2 and bispecific antibodies binding to ror2 and cd3
IL293117A (en) Methods for treating cancer by anti-oxo40 antibodies in combination with anti-tim3 antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application