JP2020522543A - 変異ＩｇＧ六量体に基づく治療用抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、抗体の製剤化に関する。本発明は、特に、細胞表面抗原結合後のIgG分子のクラスター化を増強するFc領域における変異を有するIgG1アイソタイプの抗体分子を含む薬学的組成物に関する。

Description

発明の分野
本発明は、細胞表面抗原結合後のIgG抗体の六量体化を促進するFc領域における変異を有するIgGアイソタイプの抗体を含む薬学的組成物に関する。本発明はまた、本発明の薬学的組成物を調製するための方法およびそのような組成物の使用に関する。
発明の背景
IgG抗体は、その標的抗原に結合した後に細胞表面で規則正しい六量体に組織化することができる。これらの六量体は補体C1の第1成分に結合し、補体依存性の標的細胞死滅化を誘導する。血液学的腫瘍および固形腫瘍の徴候からの細胞上の様々な標的に対するIgG抗体による六量体形成および補体活性化を増強する変異が同定されている(de Jong et al. 2016 PLoS Biol 14(1): e1002344、WO2013/004842、WO2014/108198)。Fc領域中の特定の位置に変異を有する、IgG骨格、例えばIgG1は、通常の薬物動態および生物薬剤の開発可能性を保持しながらも、細胞株および慢性リンパ球性白血病(CLL)患者の腫瘍細胞の条件付き補体依存性細胞傷害(CDC)を誘導する強力な能力をもたらした。この変異は、アポトーシスを誘導する能力を保持しながらも、補体活性化において効果のないII型CD20抗体のCDCおよび抗体依存性細胞傷害(ADCC)を強力に増強した(de Jong, 上記)。
デス受容体5、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー10B、TNFRSF10B、TNF関連アポトーシス誘導リガンド受容体2、TRAIL受容体2、TRAIL-R2およびCD262としても知られているDR5は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)に結合し、アポトーシスを媒介する、TNF受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体である。DR5は、3つの細胞外システインリッチドメイン(CRD)、膜貫通ドメイン(TM)およびデスドメイン(DD)を含む細胞質ドメインを有する、1回貫通I型膜タンパク質である。リガンドが存在しない場合、DR5は単量体として、またはプレリガンドアセンブリドメイン(PLAD)としても知られる、第1のシステインリッチドメインの相互作用を通して2つまたは3つの受容体のプレアセンブリされた複合体として、細胞膜に存在する(Wassenaar et al., Proteins. 2008 Feb 1;70(2):333-43; Valley et al., J Biol Chem. 2012 Jun 15;287(25):21265-78; Sessler et al., Pharmacol Ther. 2013 Nov;140(2):186-99)。DR5細胞外ドメインと複合したTRAILの結晶構造から、TRAILが、三量体受容体および三量体リガンドを含む複合体においてDR5の細胞外ドメイン中のCRD2およびCRD3に結合することが示された(Hymowitz et al., Mol Cell. 1999 Oct;4(4):563-71)。DR5三量体は、脂質マクロドメイン、いわゆる脂質ラフト中の高次受容体凝集体へとさらにクラスター化することができる(Sessler et al., Pharmacol Ther. 2013 Nov;140(2):186-99)。リガンド結合立体配座において、細胞質デスドメイン含有アダプタータンパク質FADDは、オリゴマー化されたDR5分子の細胞内DD表面と結合し、イニシエーターカスパーゼであるカスパーゼ-8およびカスパーゼ-10と会合して、細胞死誘導シグナル伝達複合体(DISC)を形成する。
TRAIL媒介アポトーシスに対するがん細胞の感受性に基づき、この経路を活性化してがん細胞において選択的にアポトーシスを誘導するための多数の薬剤が開発された。ヒト組み換えTRAIL (hrTRAIL)はドゥラネルミンとして開発されており、一連の従来の(単一特異性、二価)抗DR5抗体が臨床で開発され、試験されている(Ashkenazi et al., Nat Rev Drug Discov. 2008 Dec;7(12):1001-12; Trivedi et al., Front Oncol. 2015 Apr 2;5:69において概説されている): DR5抗体にはレキサツムマブ(HGS-ETR2)、HGS-TR2J、コナツムマブ(AMG655)、チガツズマブ(CS-1008)、ドロジツマブ(Apomab)およびLBY-135が含まれる。これらの化合物を用いた臨床研究から、DR5抗体が一般的に耐容性は良好であるが、説得力のある有意な臨床的利点を示せないことが実証された。DR5を標的とする抗体の有効性を高める努力は、(i) 併用処置を通してDR5アゴニストに対するがん細胞の感受性を改善すること、(ii) より良好な患者の層別化のためのバイオマーカーを開発すること、および(iii) DR5シグナル伝達およびアポトーシス誘導をより効果的に活性化するDR5標的指向性剤の開発に主に焦点を当てている(Lim et al., Expert Opin Ther Targets. 2015 May 25:1-15; Twomey et al., Drug Resist Updat. 2015 Mar;19:13-21; Reddy et al., PLoS One. 2015 Sep 17;10(9)において概説されている)。DR5活性化を増加させるための様々な治療形式が記載されており、合成DR5結合ペプチドのオリゴマー化、DR5特異的足場の線状融合、rhTRAILまたはコナツムマブのナノ粒子に基づく送達系および多価DR5抗体に基づく形式を含む(Holland et al., Cytokine Growth Factor Rev. 2014 Apr;25(2):185-93において概説されている)。APG880および誘導体は、ヒトIgGのFc部分に融合された2つの一本鎖TRAIL受容体結合(scTRAIL-RBD)分子(TRAIL模倣体)で存在する。各scTRAIL-RBDは3つの受容体結合部位を有し、融合タンパク質において6価結合様式を生じる(WO 2010/003766 A2)。プロトタイプのscTRAIL-RBD (APG350)は、インビボでFcγR非依存性抗腫瘍効力を誘導することが記載されている(Gieffers et al., Mol Cancer Ther, 2013. 12(12): p. 2735-47)。抗DR5 scFv断片、ヒト血清アルブミン残留物(residue)およびヒトp53の四量体化ドメインの融合によってアセンブルされた4価抗DR5抗体断片由来構築物は、一価構築物よりも強力にアポトーシスを誘導することが示されている(Liu et al., Biomed Pharmacother. 2015 Mar;70:41-5)。ナノボディ分子は、scFvと同様に、多価分子を形成するために連結することができるラクダ科(camelid)重鎖のみの抗体に由来する単一ドメイン抗体断片(VHH)である。前臨床インビトロ試験により、4価抗DR5 Nanobody(登録商標)分子であるTAS266は、より迅速なカスパーゼ活性化動態に起因して、TRAILまたは架橋DR5抗体LBY-135よりも強力であることが示された(Huet et al., MAbs. 2014;6(6):1560-70)。TAS266はまた、LBY-135の親マウスmAbよりインビボで強力であった。MultYbody(商標)分子(MultYmab技術)は、ホモ多量体化ペプチドとIgGヘテロ二量体(ノブ・イントゥ・ホール)における1つの重鎖のFcとの融合に基づいており、MultYbody分子を溶液中で本質的に多価にする。抗DR5 MultYbodyはインビトロで強力な死滅化を誘導することが示された。二重親和性再標的指向性(DART)分子は、共有結合したFvに基づくダイアボディである。単一のDR5エピトープ(単エピトープDART)または2つのDR5エピトープ(二エピトープDART)に対する4価性を含む4価DR5標的指向性Fc DARTは、インビトロおよびインビボで細胞傷害性を誘導する際にTRAILおよびコナツムマブ変種よりも強力であることが示された(Li et al., AACR Annual Meeting Apr 20 2015, Poster abstract #2464)。あるいは、FcγR非依存性のアビディティー駆動DR5超クラスター化は、がん細胞上のDR5へのおよび腫瘍微小環境中の線維芽細胞上に発現される線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)への同時結合を通して二重特異性DR5xFAP抗体(RG7386)により媒介されうる(Friess et al., AACR Annual Meeting Apr 19 2015, Presentation abstract #952; Wartha et al., Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 2014 Apr 5-9; San Diego, CA. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2014;74(19 Suppl):Abstract nr 4573. doi:10.1158/1538-7445.AM2014-4573)。最後に、異なるエピトープを認識する2つの抗DR5抗体の特異的組み合わせは、重複エピトープまたは類似エピトープを認識する2つの抗DR5抗体の組み合わせと比較してインビトロおよびインビボでアゴニスト効力の増強を示した(WO 2014/009358)。
上記のアプローチは、前臨床試験における従来の抗DR5抗体と比べて効力の増強を示すが、しかし臨床データから、DR5アゴニストの改善が依然として必要であることが示される。さらに、抗体断片に基づく構築物の場合は通常あてはまらないが、抗体に基づく形式では、正規のIgGの薬物動態(PK)および他のFc媒介エフェクター機能を保存することが望ましい。
参照により本明細書に組み入れられるPCT/EP2016/079518は、ヒトIgGのFc領域とDR5に結合する抗原結合領域とを含む抗DR5抗体を提供し、ここでFc領域は、E430、E345またはS440位に対応するアミノ酸位置に変異を含む。細胞表面抗原結合に対する抗体の六量体化および二次架橋結合に非依存的な抗原の条件付きクラスター化を容易にする抗DR5抗体のFc領域における特定の点突然変異の導入により、DR5活性化が引き起こされ、アポトーシスおよび細胞死の誘導においての抗体の効力が増強されることが分かった。
PCT/EP2016/079518に記述されている抗体、より一般的には、EU付番によるヒトIgG1での位置E430、E345またはS440に対応するアミノ酸位置での変異、ただしS440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とするものによりさらに容易に六量体化する抗体の、安定した製剤を提供する必要がある。
驚くべきことに、本発明の発明者らは、ヒトIgG1における位置E430、E345またはS440に対応するアミノ酸位置での変異、ただしS440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とするものにより、さらに容易に六量体化する変種抗体の、安定な製剤を提供する組成物を見出した。CDRドメインにおいて全く異なる配列を有するそのような抗体のうちの2つは、両方とも本発明の組成物中で安定であることが見出された。
第1の主要な局面において、本発明は、以下:
a. ヒト免疫グロブリンGのFc領域と抗原結合領域とを含む抗体であって、Fc領域が、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置でのアミノ酸の変異を含む、抗体、
b. ヒスチジン緩衝液、ならびに
c. 塩化ナトリウム
を含む薬学的組成物に関し、ここで組成物のpHは5.5〜7.4である。
本発明の1つの態様において、第1および第2のFc領域は、ヒトIgG1におけるEU付番でのS440に対応する位置でのアミノ酸の変異を含み、ただしS440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする。
そのような製剤は、加熱、凍結融解サイクルおよび撹拌などのストレス条件の下で優れた抗体溶解性および安定性を提供することが分かった。高分子凝集体または分解産物などの他の不純物の形成が最小限であることが観察された。
さらなる局面において、本発明は、医薬として用いるための本発明の薬学的組成物に関し、医薬の製造のための本発明の薬学的組成物の使用に関し、および本発明の薬学的組成物の有効量を個体に投与する段階を含む個体を処置する方法に関する。
さらなる局面において、本発明は、本発明の2つまたはそれ以上の薬学的組成物を含むキットに関し、および異なる抗体を各々が含む本発明の2つの薬学的組成物を混合する段階を含む本発明の薬学的組成物を調製するための方法に関する。
本発明の薬学的組成物の好ましい態様において、抗体は、ヒトDR5に結合する抗原結合領域であって、好ましくは
a) (VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6;
b) (VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6;
c) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14;
d) (VH) SEQ ID NO: 16、17、18および(VL) SEQ ID NO: 21、GAS、22または
e) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記a)〜d)のいずれか1つに定義される(VH) CDR1、CDR2、CDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3
のアミノ酸配列を有する、CDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変重鎖(VH)領域ならびにCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変軽鎖(VL)領域を含む、該抗原結合領域を含む。
DR5に結合し、かつS440における変異がS440YまたはS440Wであるという条件で、ヒトIgG1の位置E430、E345またはS440 (EU付番による)に対応するFc領域における六量体化増強変異を含むそのような抗体は、上記位置の1つにおける変異のないDR5に結合する抗体と比較して、DR5を発現する腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導において優れていることが分かった。
さらに好ましい態様において、本発明の薬学的組成物は、第1の抗体および第2の抗体を含む少なくとも2つの抗体を含み、ここで
・該第1の抗体は以下の6つのCDR配列: (VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含む、または
・該第1の抗体は以下の6つのCDR配列: (VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含む。
1つの態様において、本発明の薬学的組成物は、第1の抗体および第2の抗体を含む少なくとも2つの抗体を含み、ここで該第1の抗体は以下の6つのCDR配列: (VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含み、該第2の抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含む。
1つの態様において、本発明の薬学的組成物は、第1の抗体および第2の抗体を含む少なくとも2つの抗体を含み、ここで該第1の抗体は以下の6つのCDR配列: (VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含み、該第2の抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含む。
1つの態様において、本発明の薬学的組成物は第1の抗体を含み、ここで該第1の抗体は以下の6つのCDR配列: (VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含む。
1つの態様において、本発明の薬学的組成物は第2の抗体を含み、ここで該第2の抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含む。
DR5の異なる2つのエピトープに結合する2つの抗DR5抗体を含むそのような組成物は、変異のない同じ抗DR5抗体を含む組成物よりもインビトロおよびインビボ研究において優れていることが分かった。すなわち、本発明の2つの抗体を有する組成物は、Fc領域における変異のない2つのDR5抗体を含む組成物と比べて、DR5を発現する腫瘍細胞のアポトーシスの誘導および/または細胞増殖の抑制において優れていた。
4種類の異なるヒトIgG1 Fcアロタイプのアミノ酸アラインメントを示す。IgG1m(f)、IgG1m(z)、IgG1m(a)、IgG1m(x)のFc配列は、それぞれ、SEQ ID NO:29、30、31、および32に明記されている。 FACS上のフローサイトメトリーによって測定した際の、DR5陽性HCT 116ヒト結腸がん細胞に対するヒト化（hDR5）およびキメラ化（DR5）抗DR5抗体の結合を示す。抗gp120抗体IgG1-b12を、陰性対照として使用した。結合を、MFI（平均蛍光強度）として表す。エラーバーは標準偏差を示す。 DR5陽性COLO 205細胞に対する、六量体化増強変異のE430GまたはE345Kを有するおよび有さない抗DR5抗体の結合を示す。ヒト-マウスキメラ抗体のバリアントのIgG1-DR5-01-K409R（A）、IgG1-DR5-05-F405L（B）、および二重特異性抗体IgG1-DR5-01-K409R x IgG1-DR5-05-F405L（BsAb IgG1-DR5-01-K409R x DR5-05-F405L）（C）を、COLO 205細胞に対する結合について、FACS上のフローサイトメトリー分析で試験した。結合を、蛍光強度の幾何平均として表す。抗gp120抗体IgG1-b12を、陰性対照として使用した。エラーバーは標準偏差を示す。 ヒトDR5およびアカゲザルDR5に対する抗DR5抗体の結合を示す。ヒト-マウスキメラ抗体のIgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gを、（A）モックトランスフェクトCHO細胞、（B）ヒトDR5トランスフェクトCHO細胞、および（C）アカゲザル（Rhesus macaque）DR5トランスフェクトCHO細胞に対する結合について、FACS上のフローサイトメトリー分析において試験した。結合を、蛍光強度の幾何平均として表す。エラーバーは標準偏差を示す。 （A）EMBOSS Matcher（http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_matcher/）；(.) 類似アミノ酸；(:) 同一アミノ酸を用いた、ヒトDR5およびマウスDR5の細胞外ドメインの一部の配列アラインメントを示す。（B）ドメインスワップ型DR5細胞外ドメインのグラフ表示（白色：ヒトDR5配列；黒色：マウスDR5配列）を示す。アミノ酸番号はヒト配列を指し、ドメインスワップは、パネルAに示されたアラインメントに基づいて行った。（C）フローサイトメトリーによって評価した際の、ヒト-マウスキメラDR5分子のパネルに対するIgG1-hDR5-01-F405Lおよびアイソタイプ対照抗体IgG1-b12の結合を示す。各々のドメインスワップ型DR5分子において、x軸上に示されるように、特定のヒトアミノ酸がマウス配列によって置き換えられている。エラーバーは、二連の試料の標準偏差を示す。（D）フローサイトメトリーによって評価した際の、ヒト-マウスキメラDR5分子のパネルに対するIgG1-hDR5-05-F405Lの結合を示す。各々のドメインスワップ型DR5分子において、x軸上に示されるように、特定のヒトアミノ酸がマウス配列によって置き換えられている。IgG1-b12を、アイソタイプ対照抗体に含めた。エラーバーは、二連の試料の標準偏差を示す。 DR5-01抗体およびDR5-05抗体でのクロスブロックELISAを示す。グラフは、ELISAによって測定した際の、競合抗体IgG1-hDR5-01-E430GまたはIgG1-hDR5-05-E430Gの存在下での可溶性DR5ECD-FcHisCtagに対する、コーティングしたIgG1-hDR5-01-E430G（A）またはIgG1-hDR5-05-E430G（B）の結合の阻害を表示する。抗gp120抗体IgG1-b12（b12）を、陰性対照として使用した。DR5-01はIgG1-hDR5-01-E430Gであり；DR5-05はIgG1-hDR5-05-E430Gである。 DR5-01抗体およびDR5-05抗体のバリアントでの生存率アッセイを示す。E430G六量体化増強変異の導入は、単独で使用された単一のヒト-マウスキメラ抗体IgG1-DR5-01-K409RおよびIgG1-DR5-05-F405Lによる、ならびにそれらの組み合わせによる、DR5陽性COLO 205（A）およびHCT 116（B）結腸がん細胞の殺傷の誘導の増強を結果としてもたらす。エラーバーは標準偏差を示す。 （A）それぞれ、IgG1-chTRA8-F405LとIgG1-DR5-01-K409RまたはIgG1-DR5-05-F405Lとの間のクロスブロックELISAを示す。3日生存率アッセイにおいて判定した際に、2種類のクロスブロックしない抗DR5抗体IgG1-chTRA8-F405L-E430GとIgG1-DR5-01-K409R-E430Gとの組み合わせ（B）は、HCT 116結腸がん細胞の殺傷の誘導の増強（EC50の低下）を結果としてもたらし、他方、2種類のクロスブロックする抗体IgG1-chTRA8-F405L-E430GとIgG1-DR5-05-F405L-E430Gとの組み合わせ（C）は、もたらさなかった。エラーバーは標準偏差を示す。 六量体化増強変異の導入が、クロスブロックしない抗体の組み合わせIgG1-DR5-05-F405L-E345K + IgG1-CONA-K409R-E430GおよびBsAb IgG1-DR5-05-F405L-E345K x CONA-K409R-E430Gの組み合わせによるHCT 116結腸がん細胞の殺傷の誘導の増強を結果としてもたらすことを示す。（A）IgG1-CONA-K409RおよびIgG1-DR5-05-F405LでのクロスブロックELISA。（B）3日生存率アッセイ。エラーバーは標準偏差を示す。RLU：相対発光単位。 IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせが、3日生存率アッセイにおいて判定した際に、様々なヒトがん細胞株の大きなパネルの生存率を低減させることを示す。グラフは、二連の試料由来の平均+/-標準偏差を示す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001、＊＊＊＊p＜0.0001（チューキーの多重比較検定での一元配置分散分析）。 BxPC-3およびPANC-1膵臓がん細胞株に対する生存率アッセイにおいて測定した際の、ヒト化IgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430G抗体の組み合わせおよびキメラIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G抗体の組み合わせの効能を示す。グラフは、二連（BxPC-3）または三連（PANC-1）の試料の平均値+/-標準偏差を表示する。 （A）HCT 116ヒト結腸がん細胞への結合に対する、ヒト化抗体IgG1-hDR5-01-K409RおよびIgG1-hDR5-05-F405Lにおいてアミド分解を模倣する効果を研究するための、FACS分析を用いたフローサイトメトリー分析を示す。Asnアミド分解を模倣する変異N55Dの導入は、IgG1-hDR5-01-K409Rの結合の低下を結果としてもたらしたが、IgG1-hDR5-05-F405Lの結合に対しては最小の効果を有していた。（B）HCT 116ヒト結腸がん細胞への結合に対する、ヒト化抗体DR5-01においてアミド分解を阻止する効果を研究するための、フローサイトメトリー分析を示す。IgG1-hDR5-01-E430Gにおけるアミノ酸置換G56Tの導入は、HCT 116細胞への抗体の結合に対していかなる効果も有さなかった。結合を、蛍光強度の幾何平均として表す。（C）BxPC-3膵臓がん細胞に対する生存率アッセイにおいて測定した際の、ヒト抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの効能を示す。グラフは、二連の試料の平均値+/-標準偏差を表示する。 IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの反発的および相補的なバリアントでの生存率アッセイを示す。両方の抗体における同じ反発変異（K439EまたはS440K）の導入は、BxPC-3膵臓がん細胞（A）およびHCT-15結腸がん細胞（B）の殺傷の誘導の減少を結果としてもたらす。両方の抗体において2種類の変異（K439EおよびS440K）を組み合わせることによって、反発が中和され、殺傷が回復される。エラーバーは標準偏差を示す。 六量体化増強変異を有する抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、細胞表面上での受容体クラスター化およびアポトーシスの誘導を誘導する能力における、Fc相互作用の関与。BxPC-3ヒトがん細胞に対する3日生存率アッセイにおいて示されるように、アポトーシスの誘導は、Fc結合ペプチドDCAWHLGELVWCTによって阻害される。 3日生存率アッセイにおいて判定した際の、接着性BxPC-3ヒトがん細胞に対する、様々な比のIgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせ（DR5-01：DR5-05）の効力を示す。 3日生存率アッセイにおいて判定した際の、接着性BxPC-3（A）およびHCT-15（B）ヒトがん細胞に対する、様々な比のIgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430G（DR5-01：DR5-05）の効力を示す。 PANC-1（AおよびB）ならびにBxPC-3（C）膵臓がん細胞に対する生存率アッセイにおいて測定した際の、ヒト化IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G抗体の組み合わせによる、カスパーゼ依存性プログラム細胞死を示す。01-E430GはIgG1-hDR5-01-E430Gであり；05-E430GはIgG1-hDR5-05-E430Gであり；ZVAD は汎カスパーゼ阻害剤Z-Val-Ala-DL-Asp-フルオロメチルケトン（Z-VAD-FMK）である。 COLO 205結腸がん細胞に対する抗DR5抗体または抗DR5抗体の組み合わせの結合時の、細胞死誘導を示す。COLO 205細胞を抗体試料と、5時間（A〜C）および24時間（D〜E）インキュベートした。様々な段階の細胞死誘導を、アネキシンV/PI二重染色および活性カスパーゼ-3染色によって解析した。パネルCおよびDは、それぞれ、5時間および24時間でのアネキシンV/PI二重染色を示す。エラーバーは、2種類の二連試料の標準偏差を示す。01はIgG1-DR5-01-K409Rであり、05はIgG1-DR5-05-F405Lであり、01-E430GはIgG1-DR5-01-K409R-E430Gであり、05-E430GはIgG1-DR5-05-F405L-E430Gである。 COLO 205結腸がん細胞に対するDR5抗体の結合時の、カスパーゼ-3/7活性化の速度論を示す。COLO 205細胞を抗体と、1、2、5、および24時間インキュベートした。カスパーゼ-3/7活性化を、ホモジニアス発光アッセイにおいて解析した。AU、任意の単位、エラーバーは、二連の試料の標準偏差を示す。 接着性COLO 205結腸がん細胞ならびにBxPC-3およびPANC-1膵臓がん細胞に対する3日生存率アッセイにおける、抗ヒトIgG抗体のF(ab')2断片によるFc架橋の存在下または非存在下でのIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせの効力、ならびに、抗DR5抗体IgG1-DR5-CONAおよびIgG1-DR5-chTRA8-F405Lに対する比較を示す。非標的結合抗体IgG1-b12を、陰性対照として含めた。グラフは、二連の試料由来の平均+/-標準偏差を示す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001、＊＊＊＊p＜0.0001（多重比較のためのボンフェローニ事後検定での一元配置分散分析）。 BxPC-3膵臓がん細胞に対する生存率アッセイにおいて測定した際の、ヒト化IgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430G抗体の組み合わせおよびヒト化IgG1-DR5-01-E430G + IgG1-DR5-05-E430G抗体の組み合わせの効能を示す。グラフは、二連の試料の平均値+/-標準偏差を表示する。 COLO 205結腸がん細胞株、BxPC-3膵臓がん細胞株、SNU-5胃がん細胞株、SK-MES-1肺がん細胞株、およびA375皮膚がん細胞株由来の接着性細胞に対する3日生存率アッセイにおいて判定した、様々なヒトがん細胞株に対するキメラBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G抗体の効能を示す。グラフは、二連の試料由来の平均+/-標準偏差を示す。＊p＜0.05、＊＊＊p＜0.001、＊＊＊＊p＜0.0001（多重比較のためのボンフェローニ事後検定での一元配置分散分析）。(01x05)-E430Gは、BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gである。 接着性BxPC-3膵臓がん細胞およびCOLO 205結腸がん細胞に対する3日生存率アッセイにおける、抗DR5抗体IgG1-DR5-CONAおよびIgG1-DR5-chTRA8-F405Lと比較した、抗ヒトIgG抗体のF(ab')2断片によるFc架橋の存在下または非存在下でのキメラBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gの効力を示す。非標的結合抗体IgG1-b12を、陰性対照として含めた。グラフは、二連の試料由来の平均+/-標準偏差を示す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001、＊＊＊＊p＜0.0001（多重比較のためのボンフェローニ事後検定での一元配置分散分析）。(01x05)-E430Gは、BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x IgG1-DR5-05-F405L-E430Gである。 COLO 205結腸がん細胞に対する二重特異性DR5抗体の結合時の、細胞死誘導を示す。COLO 205細胞を1μg/mLの抗体と、5時間（A〜C）および24時間（D〜E）インキュベートした。様々な段階の細胞死誘導を、アネキシンV/PI二重染色および活性カスパーゼ-3染色によって解析した。エラーバーは、2種類の二連試料の標準偏差を示す。01はIgG1-DR5-01-K409Rであり、05はIgG1-DR5-05-F405Lであり、01-E430GはIgG1-DR5-01-K409R-E430Gであり、05-E430GはIgG1-DR5-05-F405L-E430Gであり、01x05はBsAb IgG1-DR5-01-K409R x DR5-05-F405Lであり、01-E430G x 05-E430GはBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gである。 COLO 205ヒト結腸がん細胞での皮下異種移植モデルにおける、キメラIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G抗体の組み合わせのインビボ効力の評定を示す。示した抗体（5 mg/kg）で処置したマウスにおける腫瘍サイズ（平均およびSEM）を、時間において（A）および23日目に（B）示す。（C）には、750 mm3よりも小さい腫瘍サイズを有するマウスのパーセンテージを、カプラン・マイヤープロットにおいて示す。 皮下COLO 205結腸がん異種移植における、様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの抗体の組み合わせのインビボ効力の評定、およびIgG1-CONAに対する比較を示す。示した抗体用量で処置したマウスにおける腫瘍サイズ（平均およびSEM）を、時間において（A）および16日目に（B）示す。（C）には、500 mm3よりも小さい腫瘍サイズを有するマウスのパーセンテージを、カプラン・マイヤープロットにおいて示す。＊p＜0.05、＊＊＊p＜0.001。 BxPC-3ヒト膵臓がん細胞での皮下異種移植モデルにおける、様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの抗体の組み合わせのインビボ効力の評定、およびIgG1-CONA-F405Lに対する比較を示す。示した抗体で処置したマウスにおける腫瘍サイズを、時間において（A、中央腫瘍サイズ）および腫瘍接種後48日目に（B、平均腫瘍サイズおよびSEM）示す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01（独立t-検定）。（C）には、500 mm3よりも小さい腫瘍サイズを有するマウスのパーセンテージを、カプラン・マイヤープロットにおいて示す。 A375ヒト皮膚がん細胞での皮下異種移植モデルにおける、様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの抗体の組み合わせのインビボ効力の評定、およびIgG1-CONA-F405Lに対する比較を示す。示した抗体で処置したマウスにおける腫瘍サイズを、時間において（A、中央腫瘍サイズ）および腫瘍接種後29日目に（B、平均腫瘍サイズおよびSEM）示す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001（マン・ホイットニー検定）。 HCT-15ヒト結腸がん細胞での皮下異種移植モデルにおける、様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの抗体の組み合わせのインビボ効力の評定、およびIgG1-CONAに対する比較を示す。示した抗体で処置したマウスにおける腫瘍サイズ（平均およびSEM）を、時間において（A）および処置開始後17日目に（B）示す。＊＊＊＊p＜0.001（独立t検定）。（C）には、500 mm3よりも小さい腫瘍サイズを有するマウスのパーセンテージを、カプラン・マイヤープロットにおいて示す。 SW480ヒト結腸がん細胞での皮下異種移植モデルにおける、様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの抗体の組み合わせのインビボ効力の評定、およびIgG1-CONAに対する比較を示す。示した抗体で処置したマウスにおける腫瘍サイズ（平均およびSEM）を、時間において（A）および処置開始後28日目に（B）示す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01（独立t-検定）。（C）には、500 mm3よりも小さい腫瘍サイズを有するマウスのパーセンテージを、カプラン・マイヤープロットにおいて示す。 SNU-5ヒト胃がん細胞での皮下異種移植モデルにおける、様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの抗体の組み合わせのインビボ効力の評定、およびIgG1-CONAに対する比較を示す。示した抗体で処置したマウスにおける腫瘍サイズ（平均およびSEM）を、時間において（A）および処置開始後23日目に（B）示す。＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001（マン・ホイットニー検定）。（C）には、500 mm3よりも小さい腫瘍サイズを有するマウスのパーセンテージを、カプラン・マイヤープロットにおいて示す。 SK-MES-1ヒト肺がん細胞での皮下異種移植モデルにおける、様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの抗体の組み合わせのインビボ効力の評定、およびIgG1-CONAに対する比較を示す。示した抗体で処置したマウスにおける腫瘍サイズ（平均およびSEM）を、時間において（A）および処置開始後14日目に（B）示す。（C）には、1.000 mm3よりも小さい腫瘍サイズを有するマウスのパーセンテージを、カプラン・マイヤープロットにおいて示す。 フローサイトメトリーによって測定した際の、E430G変異を有するおよび有さない抗DR5抗体IgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05による、DR5陽性HCT 116ヒト結腸がん細胞に対する結合を示す。抗gp120抗体IgG1-b12を、陰性対照として使用した。結合を、幾何平均蛍光強度（FI）として表す。エラーバーは標準偏差を示す。7回の実験のうちの代表的な例を示す。 直接標識抗体でのフローサイトメトリーによって測定した際の、抗DR5抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gによる、DR5陽性HCT 116ヒト結腸がん細胞に対する結合を示す。結合を、幾何平均Alexa 647蛍光強度（FI）として表す。エラーバーは標準偏差を示す。 ヒトDR5およびカニクイザルDR5に対する抗DR5抗体の結合を示す。抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gを、（A）ヒトDR5トランスフェクトCHO細胞および（B）カニクイザルDR5トランスフェクトCHO細胞に対する結合について、フローサイトメトリーによって試験した。結合を、蛍光強度（FI）の幾何平均として表す。エラーバーは標準偏差を示す。 COLO 205結腸がん細胞に対する、クロスブロックしない抗体IgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05においてE430G変異を導入する効果を示すための、3日生存率アッセイを示す。エラーバーは標準偏差を示す。4回の実験のうちの代表的な例を示す。 COLO 205ヒト結腸がん細胞に対する、DR5抗体での生存率アッセイを示す。六量体化増強変異S440Yの導入は、単一抗体IgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05による殺傷の誘導（A）、ならびに抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05の効力の増大（B）を結果としてもたらした。エラーバーは標準偏差を示す。 BxPC-3ヒト膵臓がん細胞の殺傷を誘導する、クロスブロックしない抗体IgG1-DR5-CONA-E430G + IgG1-DR5-chTRA8-E430Gの効力を示す。（A）IgG1-DR5-CONA-K409R（CONA）とIgG1-DR5-chTRA8-F405L（chTRA8）との間のクロスブロックELISA。（B）E430G六量体化増強変異の導入は、3日生存率アッセイにおいて判定した際、IgG1-DR5-CONA-C49W-E430G + IgG1-DR5-chTRA8-E430Gの組み合わせによるBxPC-3細胞の殺傷の誘導の増強を、結果としてもたらした。エラーバーは標準偏差を示す。 様々なヒトがん細胞株に対する、133 nMのヒト組み換えTRAILまたは133 nMの抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G（E430G）およびIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05（WT）での3日生存率アッセイを示す。グラフは、二連の試料由来の平均+/-標準偏差を示す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001、＊＊＊＊p＜0.0001（チューキーの多重比較検定での一元配置分散分析）。 Horizon, UKの細胞株パネルの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した、（A）抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）および（B）TRAIL療法による阻害のパーセンテージを示す。各々のデータ点は、示したヒトがん適応症の個々の細胞株を表示する。点線は、レスポンダー（70％以上の阻害）およびノンレスポンダー（70％未満の阻害）として細胞株を分類するために設定した70％最大応答閾値を示す。 3日生存率アッセイにおいて判定した際の、接着性ヒト（A）BxPC-3膵臓がん細胞および（B）HCT-15結腸がん細胞に対する、組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gにおける様々な抗体比（01-E430G：05-E430Gとして示す）の効力を示す。2回および3回の実験のうちの代表的な例を、それぞれ、HCT-15およびBxPC-3について示す。 BxPC-3膵臓がん細胞に対する生存率アッセイにおいて測定した際の、IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G抗体の組み合わせ、E430G変異を有さない親WTの組み合わせ、およびTRAILによる、カスパーゼ依存性プログラム細胞死を示す。ZVADは、汎カスパーゼ阻害剤Z-Val-Ala-DL-Asp-フルオロメチルケトン（Z-VAD-FMK）である。 E430G変異を有さない親WTの組み合わせ、およびTRAILと比較した、BxPC-3膵臓がん細胞に対する抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの結合時の、カスパーゼ-3/7活性化の速度論を示す。BxPC-3細胞を抗体と、1、2、4、および6時間インキュベートした。カスパーゼ-3/7活性化を、ホモジニアス発光アッセイにおいて解析した。RLU、相対発光単位。4回の実験のうちの代表的な例を示す。 接着性HCT-15ヒト結腸がん細胞およびBxPC-3膵臓がん細胞に対する3日生存率アッセイにおける、抗ヒトIgG抗体のF(ab')2断片によるFc架橋の存在下または非存在下でのIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの組み合わせの効力、ならびに、抗DR5抗体IgG1-DR5-CONAおよびWT抗体IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05の組み合わせに対する比較を示す。非標的結合抗体IgG1-b12を、陰性対照として含めた。グラフは、二連の試料由来の平均+/-標準偏差を示す。両方の細胞株について、2回の実験のうちの代表的な例を示す。 ヒトDR5（A、C）またはカニクイザルDR5（B、D）をトランスフェクトしたCHO細胞に対する標的細胞結合時に補体活性化を誘導する、IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの解析を示す。（A〜B）20％のプールした正常ヒト血清の存在下での、抗体濃度系列でのインビトロCDCアッセイ。CDCの効力を、ヨウ化プロピジウム（PI）陽性細胞のパーセンテージによって決定した溶解パーセンテージとして提示する。（C〜D）C5枯渇血清の存在下での抗体結合時の補体活性化産物の沈着を、蛍光強度の幾何平均として表す。HIV gp120に対するIgG1-b12 mAbを、非結合アイソタイプ対照抗体として使用した。 5種類の異なる結腸がん細胞株に対する生存率アッセイにおいて判定した際の、抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gを様々な治療物質と併用する効果を示す。様々な治療的分類由来の100種類の化合物の相乗効果スクリーニングから、5種類の例を示す。 COLO 205ヒト結腸がん細胞での皮下異種移植モデルにおける、単一作用物質および組み合わせの両方としての、抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gのインビボ効力の評定を、E430G変異を有さない親抗体と比較して示す。（A）時間において示した際の、示した抗体（0.5 mg/kg）で処置したマウスにおける腫瘍サイズ（平均およびSEM）。（B）500 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロット。 HCT15ヒト結腸がん細胞での皮下異種移植モデルにおける、六量体化増強変異E430Gを有するおよび有さない、抗DR5抗体濃度IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05のインビボ効力の評定を示す。0.5 mg/kgの抗体で処置したマウスにおける腫瘍サイズ（平均およびSEM）を、時間において（A）および処置開始後21日目に（B）示す。＊＊p＜0.0011（マン・ホイットニー検定）。（C）には、750 mm3よりも小さい腫瘍サイズを有するマウスのパーセンテージを、カプラン・マイヤープロットにおいて示す。 SK-MES-1ヒト肺がん細胞での皮下異種移植モデルにおける、15 mg/kgパクリタキセルと併用したIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-430G抗体の組み合わせのインビボ効力の評定を示す。（A）示した化合物で処置したマウスにおける腫瘍サイズ（平均およびSEM）を、時間において示す。（B）16日目の処置群あたりの腫瘍体積。（C）500 mm3よりも小さい腫瘍サイズを有するマウスのパーセンテージを、カプラン・マイヤープロットにおいて示す。 IgG1-hDR5-01-G56T-E430G、IgG1-hDR5-05-E430G、または2種類の抗体の組み合わせを1 mg/kgでi.v.投与したSCIDマウスにおけるクリアランス速度を、E430G変異を有さない親WT抗体と比較して示す。（A）血清試料中の総ヒトIgGを、ELISAによって決定し、濃度対時間曲線においてプロットした。各データ点は、4種類の連続希釈した試料の平均+/-標準偏差を表示する。（B）抗体の投与後21日までのクリアランスを、式D*1.000/AUC（Dは注射した用量であり、AUCは濃度-時間曲線の曲線下の面積）に従って決定した。 付着したCOLO 205ヒト結腸がん細胞に対する、DR5抗体IgG1-DR5-CONAおよびIgG1-DR5-CONA-E430Gでの生存率アッセイを示す。六量体化増強変異E430Gの導入は、殺傷の誘導を結果としてもたらした。データを、抗体なしでインキュベートした試料（殺傷なし）およびスタウロスポリンとインキュベートした試料（最大殺傷）と比べた発光から算出した、生細胞％として提示する。エラーバーは標準偏差を示す。
発明の詳細な説明
本発明の態様を記載する際に、明確化のために特定の専門用語が用いられる。しかしながら、本発明は、そのように選択された特定の用語に限定されることを意図するものではなく、各特定の用語は、同様の目的を達成するために同じような方法で動作する全ての技術的等価物を含むものと理解される。
定義
本明細書において用いられる「免疫グロブリン」という用語は、4つ全てがジスルフィド結合によって潜在的に相互接続された、1対の低分子量軽(L)鎖および1対の重(H)鎖の2対のポリペプチド鎖からなる構造的に関連する糖タンパク質のクラスをいう。免疫グロブリンの構造は、よく特徴付けられている。例えば、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))を参照されたい。簡単に言うと、各重鎖は、典型的には、重鎖可変領域(本明細書においてVHと略記される)および重鎖定常領域から構成される。IgG抗体の重鎖定常領域は、典型的には、3つのドメインCH1、CH2およびCH3から構成される。重鎖は、いわゆる「ヒンジ領域」中のジスルフィド結合を介して相互連結されている。各軽鎖は、典型的には、軽鎖可変領域(本明細書においてVLと略記される)および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、典型的には、1つのドメインCLから構成される。VHおよびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる、より保存されている領域によって隔てられた、相補性決定領域(CDR)とも呼ばれる、超可変性の領域(または配列が超可変でありうるおよび/もしくは構造的に規定されたループの形態でありうる超可変領域)にさらに細分されうる。各VHおよびVLは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順に配列される3つのCDRおよび4つのFRから構成される: FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4 (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901 917 (1987)も参照のこと)。他に明記されていないか、文脈によって矛盾がない限り、本明細書におけるCDR配列はIMGT規則(Brochet X., Nucl Acids Res. 2008;36:W503-508 and Lefranc MP., Nucleic Acids Research 1999;27:209-212; see also internet http address http://www.imgt.org/)に従って同定されるものである。他に明記されていないか、文脈によって矛盾がない限り、本発明の定常領域におけるアミノ酸位置への言及は、EU付番(Edelman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May;63(1):78-85; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. 1991 NIH Publication No. 91-3242)によるものである。本明細書において用いられる「ヒンジ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域をいうように意図される。したがって、例えば、ヒトIgG1抗体のヒンジ領域は、EU付番でのアミノ酸位置216〜230に対応する。
本明細書において用いられる「CH2領域」または「CH2ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のCH2領域をいうように意図される。したがって、例えば、ヒトIgG1抗体のCH2領域は、EU付番でのアミノ酸位置231〜340に対応する。しかしながら、CH2領域はまた、本明細書に記載の他のアイソタイプまたはアロタイプのいずれかでありうる。
本明細書において用いられる「CH3領域」または「CH3ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のCH3領域をいうように意図される。したがって、例えば、ヒトIgG1抗体のCH3領域は、EU付番でのアミノ酸位置341〜447に対応する。しかしながら、CH3領域はまた、本明細書に記載の他のアイソタイプまたはアロタイプのいずれかでありうる。
本明細書において互換的に用いられうる、「断片結晶化可能領域」、「Fc領域」、「Fc断片」または「Fcドメイン」という用語は、アミノ末端からカルボキシ末端に配列された、少なくともヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含む抗体領域をいう。IgG1抗体のFc領域は、例えば、パパインを用いたIgG1抗体の消化によって作出することができる。抗体のFc領域は、免疫系の様々な細胞(エフェクター細胞などの)および補体活性化の古典経路における第1成分である、C1qなどの補体系の成分を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介しうる。
本発明の文脈における「Fab断片」という用語は、重鎖および軽鎖の可変領域ならびに軽鎖の定常領域および免疫グロブリンの重鎖のCH1領域を含む、免疫グロブリン分子の断片をいう。「CH1領域」は、例えば、EU付番でのアミノ酸位置118〜215に対応するヒトIgG1抗体の領域をいう。したがって、Fab断片は、免疫グロブリンの結合領域を含む。
本明細書において用いられる「抗体」(Ab)という用語は、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の断片、またはそのいずれかの誘導体をいう。本発明の抗体は、免疫グロブリンのFc領域と抗原結合領域とを含む。Fc領域は一般に、2つのCH2-CH3領域および接続領域、例えばヒンジ領域を含む。免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。本明細書において用いられる「抗体」という用語はまた、他に明記されていないか、文脈によって矛盾がない限り、ポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体、モノクローナル抗体(ヒトモノクローナル抗体などの)、抗体混合物、組み換えポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体をいう。作出される抗体は、任意のクラスまたはアイソタイプを潜在的に保有することができる。
本明細書において用いられる「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体をいう。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基(例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異、挿入または欠失)を含みうる。しかしながら、本明細書において用いられる「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの、別の種の生殖細胞系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含むように意図されない。
本明細書において用いられる「キメラ抗体」という用語は、抗体工学の結果として、両方の鎖タイプ、すなわち重鎖および軽鎖がキメラである抗体をいう。キメラ鎖は、ヒト由来の定常領域に連結された外来可変ドメイン(非ヒト種に由来するか、またはヒトを含む任意の種から合成もしくは操作された)を含む鎖である。
本明細書において用いられる「ヒト化抗体」という用語は、両方の鎖タイプが抗体工学の結果としてヒト化されている抗体をいう。ヒト化鎖は、典型的には、可変ドメインの相補性決定領域(CDR)が外来(ヒト以外の種に由来するか、または合成)であり、鎖の残部がヒト由来である鎖である。ヒト化の評価は、得られたアミノ酸配列に基づいており、それ自体が方法論に基づくものではなく、それによって移植以外のプロトコルを用いることが可能とされる。
本明細書において用いられる「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる免疫グロブリンクラス(例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA1、IgA2、IgEまたはIgM)をいう。標準的な抗体を産生するために、各重鎖アイソタイプは、カッパ(κ)またはラムダ(λ)軽鎖のいずれかと組み合わせるべきである。
本明細書において用いられる「アロタイプ」という用語は、同じ種における1つのアイソタイプクラス内のアミノ酸変異をいう。抗体アイソタイプの主たるアロタイプは、民族個体間で異なる。重鎖のIgG1アイソタイプ内の既知のアロタイプ変異は、図1に示すように抗体フレーム中の4アミノ酸置換に起因する。1つの態様において、本発明の抗体は、SEQ ID NO 29に定義されるIgG1m(f)アロタイプのものである。本発明の1つの態様において、抗体は、SEQ ID NO 30に定義されるIgG1m(z)アロタイプ、SEQ ID NO 31に定義されるIgG1m(a)アロタイプ、SEQ ID NO 32に定義されるIgG1m(x)アロタイプ、またはIgG1m(z,a)、IgG1m(z,a,x)、IgG1m(f,a)などの、任意のアロタイプの組み合わせのものである(de lange Exp Clin Immunogenet. 1989;6(1):7-17)。
本明細書において用いられる「モノクローナル抗体」、「モノクローナルAb」、「モノクローナル抗体組成物」、「mAb」などの用語は、単一分子組成のAb分子の調製物をいう。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する単一の結合特異性を示すAbをいう。ヒトmAbは、機能的なヒト抗体を産生するように再編成され、かつ不死化細胞に融合された、ヒト重鎖導入遺伝子レパートリーおよびヒト軽鎖導入遺伝子レパートリーを含むゲノムを有する、トランスジェニックマウスなどの、トランスジェニックまたは染色体導入非ヒト動物から得られたB細胞を含むハイブリドーマによって作出されうる。あるいは、ヒトmAbは組み換えによって作出されうる。
本明細書において用いられる「抗体模倣体」という用語は、抗体と同様に、抗原に特異的に結合できるが、抗体と構造的に関連しない化合物をいう。それらは、通常、人工ペプチド、タンパク質、核酸または小分子である。
「二重特異性抗体」という用語は、少なくとも2つの異なる、典型的には重複しないエピトープに対する特異性を有する抗体をいう。そのようなエピトープは、同じまたは異なる標的上にありうる。Fc領域を含む異なるクラスの二重特異性抗体の例としては、分子の各抗原結合領域が少なくとも2つの異なるエピトープに結合する、非対称二重特異性分子、例えば相補的CH3ドメインを有するIgG様分子および対称二重特異性分子、例えば組み換えIgG様二重標的分子が挙げられるが、これらに限定されることはない。
二重特異性分子の例としては、トリオマブ(登録商標) (Trion Pharma/Fresenius Biotech, WO/2002/020039)、ノブ・イントゥ・ホール(Knobs-into-Holes) (Genentech, WO9850431)、CrossMAbs (Roche, WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253)、静電的に適合したFcヘテロ二量体分子(Amgen, EP1870459およびWO2009089004; Chugai, US201000155133; Oncomed, WO2010129304)、LUZ-Y (Genentech)、DIG-body、PIG-bodyおよびTIG-body (Pharmabcine)、鎖交換組み換えドメインボディ(Strand Exchange Engineered Domain body) (SEEDbody) (EMD Serono, WO2007110205)、二重特異性IgG1およびIgG2 (Pfizer/Rinat, WO11143545)、Azymetric足場(Zymeworks/Merck, WO2012058768)、mAb-Fv (Xencor, WO2011028952)、XmAb (Xencor)、二価二重特異性抗体(Roche, WO2009/080254)、二重特異性IgG (Eli Lilly)、DuoBody(登録商標)分子(Genmab A/S, WO 2011/131746)、DuetMab (Medimmune, US2014/0348839)、Biclonics (Merus, WO 2013/157953)、NovImmune (κλBodies, WO 2012/023053)、FcΔAdp (Regeneron, WO 2010/151792)、(DT)-Ig (GSK/Domantis)、ツー・イン・ワン(Two-in-one)抗体または二重作用(Dual Action) Fabs (Genentech, Adimab)、mAb2 (F-Star, WO2008003116)、Zybodies(商標) (Zyngenia)、CovX-body (CovX/Pfizer)、FynomAbs (Covagen/Janssen Cilag)、DutaMab (Dutalys/Roche)、iMab (MedImmune)、二重可変ドメイン(Dual Variable Domain) (DVD)-Ig(商標) (Abbott, US 7,612,18)、二重ドメインダブルヘッド抗体(Unilever; Sanofi Aventis, WO20100226923)、Ts2Ab (MedImmune/AZ), BsAb (Zymogenetics)、HERCULES (Biogen Idec, US007951918)、scFv-融合体(Genentech/Roche, Novartis, Immunomedics, Changzhou Adam Biotech Inc, CN 102250246)、TvAb (Roche, WO2012025525, WO2012025530)、ScFv/Fc融合体, SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS)、インターセプター(Interceptor) (Emergent)、二重親和性再標的技術(Dual Affinity Retargeting Technology) (Fc-DART(商標)) (MacroGenics, WO2008/157379, WO2010/080538)、BEAT (Glenmark)、Di-Diabody (Imclone/Eli Lilly)および化学的に架橋されたmAbs (Karmanos Cancer Center)、ならびに共有結合的に融合されたmAbs (AIMM therapeutics)が挙げられるが、これらに限定されることはない。
本明細書において用いられる場合、「全長抗体」という用語は、そのクラスまたはアイソタイプの野生型抗体に通常見出されるものに対応する全ての重鎖および軽鎖の定常ドメインおよび可変ドメインを含む抗体(例えば、親抗体または変種抗体)をいう。
本明細書において用いられる「オリゴマー」という用語は、少なくとも原則的には、無制限の数の単量体からなる重合体とは対照的に、2以上であるが限られた数の単量体単位(例えば、抗体)からなる分子をいう。例示的なオリゴマーは、二量体、三量体、四量体、五量体および六量体である。ギリシャ語の接頭語は、オリゴマー中の単量体単位の数を指定するために用いられることが多く、例えば四量体は4単位から構成され、六量体は6単位から構成される。同様に、本明細書において用いられる「オリゴマー化」という用語は、分子を有限の重合度に変換するプロセスをいうように意図される。本明細書において、本発明による標的結合領域を含む抗体および/または他の二量体タンパク質は、例えば細胞表面での、標的結合後のFc領域の非共有結合によって、六量体などの、オリゴマーを形成できることが認められる。
本明細書において用いられる「抗原結合領域」、「抗原結合領域」、「結合領域」または抗原結合ドメインという用語は、抗原に結合することができる抗体の領域をいう。この結合領域は、典型的には、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる、より保存されている領域によって隔てられた、相補性決定領域(CDR)とも呼ばれる、超可変性の領域(または配列が超可変でありうるおよび/もしくは構造的に規定されたループの形態でありうる超可変領域)にさらに細分されうる抗体のVHおよびVLドメインにより規定される。抗原は、例えば細胞、細菌もしくはビリオン上または溶液中に存在する、ポリペプチドなどの、任意の分子であることができる。「抗原」および「標的」という用語は、文脈によって矛盾がない限り、本発明の文脈において互換的に用いられうる。
本明細書において用いられる「標的」という用語は、抗体の抗原結合領域が結合する分子をいう。標的は、産生された抗体が向けられる任意の抗原を含む。「抗原」および「標的」という用語は、抗体に関して、互換的に用いられ、本発明の任意の局面または態様に関して同じ意味および目的を構成しうる。
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、表面分子群、例えばアミノ酸または糖側鎖からなり、かつ通常、特異的な三次元構造的特徴および特異的な電荷的特徴を有する。立体構造エピトープおよび非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合は失われるが後者への結合は失われないという点で区別される。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基および結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば特異的抗原結合ペプチドによって効果的にブロックされるアミノ酸残基(言い換えると、アミノ酸残基は特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にある)を含みうる。
本明細書において用いられる「結合」という用語は、典型的には、例えばBIAcore 3000機器においてリガンドとして抗原および分析物として抗体またはその逆を用い表面プラズモン共鳴(SPR)技術によって決定される場合、約10-6 Mもしくはそれ以下、例えば10-7 Mもしくはそれ以下、例えば約10-8 Mもしくはそれ以下、例えば約10-9 Mもしくはそれ以下、約10-10 Mもしくはそれ以下、または約10-11 Mもしくはさらにそれ以下のKDに相当する結合親和性での、所定の抗原または標的への抗体の結合をいい、所定の抗原または密接に関連している抗原以外の非特異的抗原(例えば、BSA、カゼイン)への結合に対するその親和性よりも少なくとも10倍低い、例えば少なくとも100倍低い、例えば少なくとも1,000倍低い、例えば少なくとも10,000倍低い、例えば少なくとも100,000倍低いKDに相当する親和性で所定の抗原に結合する。親和性がより低い量は、抗体のKDに依存するので、抗体のKDが非常に低い(すなわち、抗体が非常に特異的である)場合、抗原に対する親和性の程度は、非特異的抗原に対する親和性よりも低く、少なくとも10,000倍低い可能性がある。本明細書において用いられる「KD」(M)という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の解離平衡定数をいい、kdをkaで除して得られる。
本明細書において用いられる「kd」(秒-1)という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度定数をいう。この値は、Koff値または解離速度(off-rate)ともいわれる。
本明細書において用いられる「ka」(M-1×秒-1)という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の会合速度定数をいう。この値は、kon値または結合速度(on-rate)ともいわれる。
本明細書において用いられる「KA」(M-1)という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の会合平衡定数をいい、kaをkdで除して得られる。
本明細書において用いられる場合、「親和性」という用語は、抗体の個々の抗原結合部位の抗原への一価結合などの、単一部位での、ある分子、例えば抗体の、別の分子、例えば標的または抗原への結合の強度である。
本明細書において用いられる場合、「アビディティー」という用語は、標的と同時に相互作用する抗体の複数の抗原結合部位の間などの、2つの構造間の複数の結合部位の複合強度をいう。2つ以上の結合相互作用が存在する場合、2つの構造は、全ての結合部位が解離した場合にのみ解離するため、解離速度は個々の結合部位の場合よりも遅くなり、それによって個々の結合部位の結合の強度(親和性)と比べて高い有効な全結合強度(アビディティー)をもたらすであろう。
本明細書において用いられる「六量体化増強変異」という用語は、EU付番にしたがってヒトIgG1中のE430、E345またはS440に対応する位置におけるアミノ酸の変異をいい、ただしS440の変異はS440YまたはS440Wである。六量体化増強変異は、WO2013/004842; WO2014/108198に記載されているように、抗体分子が溶液中で単量体のままである間に、細胞表面標的に結合した隣接するIgG抗体間のFc-Fc相互作用を強化し、標的結合抗体の六量体形成の増強を引き起こす。
本明細書において用いられる「クラスター化」という用語は、非共有結合相互作用による抗体、ペプチド、抗原、またはその他のタンパク質のオリゴマー化をいう。
本明細書において用いられる「反発変異」または「自己反発変異」または「六量体化阻害変異」という用語は、Fc-Fc界面でのアミノ酸間の電荷反発を引き起こし、結果的に隣接する2つのFc領域含有ポリペプチド間のFc-Fc相互作用の弱化を引き起こし、かくして六量体化を阻害しうるヒトIgG1のアミノ酸位置の変異をいう。ヒトIgG1におけるそのような反発変異の例は、K439EおよびS440Kである。反発変異の位置での2つの隣接するFc領域含有ポリペプチド間のFc-Fc相互作用における反発は、第1の変異を有する位置と相互作用するアミノ酸位置に第2の変異(相補的変異)を導入することによって中和することができる。この第2の変異は、同じ抗体または第2の抗体のいずれかに存在することができる。第1および第2の変異の組み合わせは、Fc-Fc相互作用、したがって六量体化の反発および回復の中和を引き起こす。そのような第1および第2の変異の例は、K439E (反発変異)およびS440K (K439Eにより反発を中和)であり、逆の場合も同じくS440K (反発変異)およびK439E (S440Kにより反発を中和)である。
本明細書において用いられる「相補的変異」という用語は、2つの隣接Fc領域含有ポリペプチドにおける2つの変異の組み合わせに起因する、相補的変異を含むFc領域含有ポリペプチドと好ましくは相互作用する隣接Fc領域含有ポリペプチドにおける第1の変異に関連したFc領域含有ポリペプチドにおけるアミノ酸位置の変異をいう。相補的変異および関連した第1の変異は、同じ抗体中(分子内)または第2の抗体中(分子間)のいずれかに存在することができる。分子内相補的変異の例は、WO 2011/131746による二重特異性抗体における選択的ヘテロ二量体化を媒介するK409RおよびF405Lの組み合わせである。2つの隣接するFc領域含有ポリペプチド間のFc-Fc相互作用したがって六量体化の反発および回復の中和を引き起こすK439EおよびS440K変異の組み合わせは、分子間にも分子内にもともに適用できる相補的変異の例である。
本明細書において用いられる「アポトーシス」という用語は、細胞内で起こりうるプログラム細胞死(PCD)のプロセスをいう。生化学的事象は、特徴的な細胞変化(形態学)および死に至る。これらの変化には、小疱形成、細胞収縮、ホスファチジルセリンの露出、ミトコンドリア機能の喪失、核断片化、クロマチン凝縮、カスパーゼ活性化、および染色体DNA断片化が含まれる。特定の態様において、1つまたは複数のアゴニスト抗DR5抗体によるアポトーシスは、例えば、実施例19、20、25および45に記載のカスパーゼ-3/7活性化アッセイ法または実施例19および25に記載のホスファチジルセリンの露出などの方法を用いて判定することができる。例えば1 μg/mLの一定濃度の抗DR5抗体が接着細胞に添加され、1〜24時間インキュベートされうる。BD PharmingenのPE活性カスパーゼ-3アポトーシスキット(PE Active Caspase-3 Apoptosis Kit) (カタログ番号550914) (実施例19および25)またはPromegaのカスパーゼ-Glo 3/7 (Caspase-Glo 3/7)アッセイ(カタログ番号G8091) (実施例20および45)などの、この目的のための特別なキットを用いることによって、カスパーゼ-3/7活性化を判定することができる。BD PharmingenのFITCアネキシンVアポトーシス検出キットI (FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I) (カタログ番号556547) (実施例19および25)などの、この目的のための特別なキットを用いることによって、ホスファチジルセリンの露出および細胞死を判定することができる。
本明細書において用いられる「プログラム細胞死」または「PCD」という用語は、細胞内シグナル伝達によって媒介される任意の形態での細胞の死、例えばアポトーシス、自食作用またはネクロトーシスをいう。
本明細書において用いられる「アネキシンV」という用語は、細胞表面上のホスファチジルセリン(PS)に結合するアネキシン群のタンパク質をいう。
本明細書において用いられる「カスパーゼ活性化」という用語は、エフェクターカスパーゼへのその変換に至る、イニシエーターカスパーゼによるエフェクターカスパーゼの不活性プロ型の切断をいい、これによって今度は、細胞内のタンパク質基質が切断されてアポトーシスを引き起こす。
本明細書において用いられる「カスパーゼ依存性プログラム細胞死」という用語は、カスパーゼによって媒介されるプログラム細胞死の任意の形態をいう。特定の態様において、1つまたは複数のアゴニスト抗DR5抗体によるカスパーゼ依存性プログラム細胞死は、実施例18および44に記載されているようにパン-カスパーゼ阻害剤Z-Val-Ala-DL-Asp-フルオロメチルケトン(Z-VAD-FMK)の存在下および非存在下において細胞培養物の生存性を比較することにより判定することができる。パン-カスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMK (5 μMの終濃度)が96ウェル平底プレート中の接着細胞に添加され、37℃で1時間インキュベートされうる。次に、抗体濃度希釈系列(例えば20,000 ng/mLから始めて5倍希釈で0.05 ng/mLの終濃度まで)が添加され、37℃で3日間インキュベートされうる。PromegaのCellTiter-Glo発光細胞生存性アッセイ(カタログ番号G7571)などの、この目的のための特別なキットを用いて細胞生存性を定量化することができる。
本明細書において用いられる「細胞生存性」という用語は、代謝的に活性な細胞の存在をいう。特定の態様において、1つまたは複数のアゴニスト抗DR5抗体とのインキュベーション後の細胞生存性は、実施例8〜18、21〜24、38〜44、46および48に記載されるように、細胞中に存在するATPを定量化することによって判定することができる。抗体濃度希釈系列(例えば20,000 ng/mLから始めて5倍希釈で0.05 ng/mLの終濃度まで)が96ウェル平底プレート中の細胞に添加され、培地が陰性対照として用いられ、5 μMのスタウロスポリンが細胞死の誘導のための陽性対照として用いられうる。3日間のインキュベーション後、PromegaのCellTiter-Glo発光細胞生存性アッセイ(カタログ番号G7571)などの、この目的のための特別なキットを用いて細胞生存性が定量化されうる。生存細胞の割合は、以下の式を用いて計算することができる: %生存細胞 = [(発光 抗体サンプル - 発光 スタウロスポリンサンプル)/(発光 抗体なしサンプル - 発光 スタウロスポリンサンプル)]＊100。
本明細書において用いられる「DR5」という用語は、3つの細胞外システインリッチドメイン(CRD's)、膜貫通ドメイン(TM)およびデスドメイン(DD)を含む細胞質ドメインを有する1回貫通I型膜タンパク質である、CD262およびTRAILR2としても知られる、デス受容体5をいう。ヒトでは、DR5タンパク質は、SEQ ID NO:46 (ヒトDR5タンパク質: UniprotKB/Swissprot O14763)に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされる。
本明細書において互換的に用いられうる「抗体結合DR5」、「抗DR5抗体」、「DR5結合抗体」、「DR5特異的抗体」、「DR5抗体」という用語は、DR5の細胞外部分のエピトープに結合する任意の抗体をいう。
本明細書において用いられる「アゴニスト」という用語は、DR5に結合した場合に細胞内で、プログラム細胞死でありうる応答を引き起こすことができる抗DR5抗体などの分子をいう。抗DR5抗体がアゴニストであるということは、抗体がDR5への抗DR5結合の結果としてDR5を刺激、活性化またはクラスター化することと理解されるべきである。つまり、DR5に結合した本発明によるFc領域のアミノ酸変異を含むアゴニスト抗DR5抗体は、DR5に結合したTRAILと同じ細胞内シグナル伝達経路のDR5刺激、クラスター化または活性化をもたらす。特定の態様において、抗体濃度希釈系列(例えば20,000 ng/mLから5倍希釈で0.05 ng/mLの終濃度まで)と共に3日間、標的細胞をインキュベートすることによって、1つまたは複数の抗体のアゴニスト活性を判定することができる。抗体は細胞を播種する際に直接添加されてもよく(実施例8、9、10、39に記載)、またあるいは、抗体サンプルを添加する前に細胞をまず初めに、96ウェル平底プレートに接着させる(実施例11、12、13、14、15、16、17、18、21、22、23、24、38、40、41、42、43、44、46、48に記載)。アゴニスト活性、すなわちアゴニスト効果は、PromegaのCellTiter-Glo発光細胞生存性アッセイ(カタログ番号G7571)などの、この目的のための特別なキットを用いて生存細胞の量を測定することにより定量化することができる。
本明細書において用いられる「DR5陽性」および「DR5発現」という用語は、例えばフローサイトメトリーまたは免疫組織化学で、測定できるDR5特異的抗体の結合を示す組織または細胞株をいう。
本発明の「変種」または「抗体変種」は、「親」抗体と比較して1つまたは複数の変異を含む抗体分子である。例示的な親抗体の形式には、非限定的に、野生型抗体、全長抗体もしくはFc含有抗体断片、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
例示的な変異には、アミノ酸の欠失、挿入、および親アミノ酸配列におけるアミノ酸の置換が含まれる。アミノ酸置換は、野生型タンパク質中に存在する天然アミノ酸を別の天然に存在するアミノ酸に、または天然に存在しないアミノ酸誘導体に交換しうる。アミノ酸置換は、保存的または非保存的でありうる。本発明の文脈において、保存的置換は、以下の3つの表のうちの1つまたは複数において反映されるアミノ酸のクラス内での置換によって定義されうる。
保存的置換のためのアミノ酸残基クラス
Figure 2020522543
代替的な保存的アミノ酸残基置換クラス
Figure 2020522543
代替的なアミノ酸残基の物理的および機能的分類
Figure 2020522543
本発明の文脈において、変種における置換は、以下のように示される:
元のアミノ酸 - 位置 - 置換されたアミノ酸;
アミノ酸残基を示すための表記XaaおよびXを含めて、3文字表記または1文字表記が用いられる。したがって、「E345R」または「Glu345Arg」という記法は、変種が、親抗体中の番号345におけるアミノ酸に対応する変種アミノ酸位置にグルタミン酸とアルギニンとの置換を含むことを意味する。
抗体にそのような位置が存在しないが、しかし変種がアミノ酸の挿入を含む場合、例えば: 位置 - 置換されたアミノ酸; 記法、例えば「448E」が用いられる。そのような記法は、一連の相同なポリペプチドまたは抗体の改変に関して特に関連する。同様に、置換アミノ酸残基の同一性が重要でない場合: 元のアミノ酸 - 位置; または「E345」。元のアミノ酸および/または置換されたアミノ酸が、全てではないが2つ以上のアミノ酸を含みうる修飾の場合、位置345におけるアルギニン、リジンまたはトリプトファンに向けてのグルタミン酸の置換: 「Glu345Arg、Lys、Trp」または「E345R、K、W」または「E345R/K/W」または「E345→R、 KもしくはW」が本発明の文脈において互換的に用いられうる。さらに、「置換」という用語は、他の19種の天然アミノ酸のいずれか1つへの、または非天然アミノ酸などの、他のアミノ酸への置換を包含する。例えば、位置345におけるアミノ酸Eの置換には、以下の置換の各々が含まれる: 345A、345C、345D、345G、345H、345F、345I、345K、345L、345M、345N、345Q、345R、345S、345T、345V、345W、および345Y。それは、ところで、345Xという指定と等価であり、ここでXは任意のアミノ酸を指定する。これらの置換は、E345A、E345Cなど、またはE345A, Cなど、またはE345A/C/などと指定することもできる。同じことが、本明細書において言及されたありとあらゆる位置への類推のため、そのような置換のいずれか1つを具体的に含むように適用される。
本発明の目的のため、2つのアミノ酸配列間の配列同一性は、EMBOSSパッケージ(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), 好ましくはバージョン5.0.0またはそれ以降のNeedleプログラムにおいて実施されるNeedleman-Wunschアルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)を用いて判定される。使用されるパラメータは、ギャップオープンペナルティ10、ギャップ伸長ペナルティ0.5、およびEBLOSUM62 (BLOSUM62のEMBOSSバージョン)置換マトリックスである。「最長同一性」とラベル付けされたNeedleの出力(-nobriefオプションを用いて取得される)は、%同一性として用いられ、以下のように計算される:
(同一残基×100)/(アライメントの長さ - アライメントにおけるギャップの総数)。
本発明の目的のため、2つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性は、EMBOSSパッケージ(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et a/., 2000, 前記), 好ましくはバージョン5.0.0またはそれ以降のNeedleプログラムにおいて実施されるNeedleman-Wunschアルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970, 前記)を用いて判定される。使用されるパラメータは、ギャップオープンペナルティ10、ギャップ伸長ペナルティ0.5、およびEDNAFULL (NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン)置換マトリックスである。「最長同一性」とラベル付けされたNeedleの出力(-nobriefオプションを用いて取得される)は、%同一性として用いられ、以下のように計算される:
(同一デオキシリボヌクレオチド×100)/(アライメントの長さ - アライメントにおけるギャップの総数)。
CDR変種の配列は、抗体結合領域の6つのCDR配列にわたって合計で保存的、物理的または機能的アミノ酸から選択される多くとも5つの変異または置換、例えば抗体結合領域の6つのCDR配列にわたって合計で保存的、物理的または機能的アミノ酸から選択される多くとも4つの変異または置換、例えば抗体結合領域の6つのCDR配列にわたって合計で保存的、物理的または機能的アミノ酸から選択される多くとも3つの変異または置換、例えば抗体結合領域の6つのCDR配列にわたって合計で保存的、物理的または機能的アミノ酸から選択される多くとも2つの変異、例えば抗体結合領域の6つのCDR配列にわたって合計で保存的、物理的または機能的アミノ酸から選択される多くとも1つの変異または置換で大部分は保存的、物理的または機能的アミノ酸置換を通じて親抗体配列のCDRの配列とは異なりうる。保存的、物理的または機能的アミノ酸は、見つかった20種の天然アミノ酸、すなわちArg (R)、His (H)、Lys (K)、Asp (D)、Glu (E)、Ser (S)、Thr (T)、Asn (N)、Gln (Q)、Cys (C)、Gly (G)、Pro (P)、Ala (A)、Ile (I)、Leu (L)、Met (M)、Phe (F)、Trp (W)、Tyr (Y)およびVal (V)から選択される。
CDR変種の配列は、大部分は保存的、物理的または機能的アミノ酸置換を通じて親抗体配列のCDRの配列とは異なりうる; 例えば変種における置換の少なくとも約75%、約80%またはそれ以上、約85%またはそれ以上、約90%またはそれ以上(例えば、約92%、93%または94%などの、約75〜95%)は保存的、物理的または機能的アミノ酸残基置換から選択される変異または置換である。保存的、物理的または機能的アミノ酸は、見つかった20種の天然アミノ酸、すなわちArg (R)、His (H)、Lys (K)、Asp (D)、Glu (E)、Ser (S)、Thr (T)、Asn (N)、Gln (Q)、Cys (C)、Gly (G)、Pro (P)、Ala (A)、Ile (I)、Leu (L)、Met (M)、Phe (F)、Trp (W)、Tyr (Y)およびVal (V)から選択される。
別の配列中のアミノ酸またはセグメントに「対応する」1つの配列中のアミノ酸またはセグメントは、典型的にはデフォルト設定で、ALIGN、ClustalWまたは同様のものなどの標準的な配列アライメントプログラムを用いて他のアミノ酸またはセグメントと整列するアミノ酸またはセグメントである。ゆえに、標準的な配列アライメントプログラムを用いて、例えば免疫グロブリン配列中のどのアミノ酸が、例えばヒトIgG1中の特定のアミノ酸に対応するかを同定することができる。さらに、標準的な配列アライメントプログラムを用いて、配列同一性、例えば少なくとも80%、もしくは85%、90%、または少なくとも95%のSEQ ID NO:29に対する配列同一性を同定することができる。例えば、図1に示す配列アライメントを用いて、IgG1 Fc配列の別のアロタイプにおける特定のアミノ酸に対応する1つのIgG1アロタイプのFc領域における任意のアミノ酸を同定することができる。
本明細書において用いられる「ベクター」という用語は、ベクターにライゲーションされた核酸セグメントの転写を誘導することができる核酸分子をいう。1つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは環状の二本鎖DNAループの形態にある。別のタイプのベクターは、核酸セグメントがウイルスゲノムにライゲーションされうるウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的複製が可能である(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(非エピソーム性哺乳動物ベクターなどの)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムとともに複製されうる。さらに、ある種のベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を指令することができる。そのようなベクターは、本明細書において「組み換え発現ベクター」(または単に「発現ベクター」)といわれる。一般に、組み換えDNA技法において有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態にある。本明細書において、プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形態であるため、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に用いられうる。しかしながら、本発明は、等価な機能を果たすウイルスベクター(複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなど)などの、他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。
本明細書において用いられる「組み換え宿主細胞」(または単に「宿主細胞」)という用語は、発現ベクターが導入された細胞をいうように意図される。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫もいうように意図されるものと理解されるべきである。変異または環境の影響のために後に続く世代ではある種の改変が起こりうるので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではないかもしれないが、それでも本明細書において用いられる「宿主細胞」という用語の範囲に含まれる。組み換え宿主細胞には、例えば、CHO-S細胞、CHO DG44細胞、HEK-293F細胞、Expi293F細胞、PER.C6、NS0細胞およびリンパ球細胞などの、トランスフェクトーマや、大腸菌(E. coli)などの原核細胞ならびに植物細胞および菌類などの他の真核生物宿主も、大腸菌などの原核細胞も含まれる。
本発明の特定の態様
上記のように、第1の主要な局面において、本発明は、以下:
a. ヒト免疫グロブリンGのFc領域と抗原結合領域とを含む抗体であって、Fc領域が、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置でのアミノ酸の変異を含む、抗体、
b. ヒスチジン緩衝液、および
c. 塩化ナトリウム
を含み、pHが5.5〜7.4である、薬学的組成物に関する。
本発明の1つの態様において、
a. ヒト免疫グロブリンGのFc領域と抗原結合領域とを含む抗体であって、ここでFc領域が、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置でのアミノ酸の変異を含み、ただしS440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、抗体、
b. ヒスチジン緩衝液、および
c. 塩化ナトリウム
を含み、pHが5.5〜7.4である、薬学的組成物に関する。
本発明の薬学的組成物は、典型的には、液体水溶液である。
本発明の薬学的組成物の1つの態様において、組成物は、5 mM〜100 mMのヒスチジン、例えば5 mM〜75 mM、例えば10 mM〜50 mM、例えば 15 mM〜45 mM、例えば20 mM〜40 mM、例えば 25〜35 mM、例えば28 mM〜32 mM、例えば30 mMのヒスチジンを含む。
1つの態様において、pHは5.8〜7.2、例えば5.5〜6.5、例えば5.8〜6.2、例えば5.9〜6.1、例えば6.0である。
別の態様において、薬学的組成物は、25 mM〜500 mMの塩化ナトリウム、例えば25 mM〜250 mM、例えば50 mM〜250 mM、例えば100 mM〜200 mM、例えば125 mM〜175 mM、例えば150 mMの塩化ナトリウムを含む。
1つの態様において、薬学的組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムおよび2 mg/ml〜40 mg/mlの抗体を含み、好ましくは組成物は、pH 6で30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムおよび20 mg/mlの抗体を含む。
1つの態様において、薬学的組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムおよび15 mg/ml〜25 mg/mlの抗体を含み、好ましくは組成物は、pH 6で30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムおよび20 mg/mlの抗体を含む。
さらなる態様において、薬学的組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムおよび2 mg/ml〜20 mg/mlの抗体を含み、好ましくは組成物は、pH 6.0で30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムおよび10 mg/mlの抗体を含む。
別の態様において、薬学的組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムおよび2 mg/ml〜20 mg/mlの抗体を含み、好ましくは組成物は、pH 6.0で30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムおよび20 mg/mlの抗体を含む。
好ましい態様において、薬学的組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムおよび2 mg/ml〜40 mg/mlの抗体を含み、好ましくは組成物は、pH 6.0で30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムおよび20 mg/mlの抗体を含む。
別の態様において、薬学的組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムおよび2 mg/ml〜40 mg/mlの抗体を含み、例えば組成物は、pH 6.0で30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムおよび30 mg/mlの抗体を含む。
さらなる態様において、薬学的組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムおよび2 mg/ml〜40 mg/mlの抗体を含み、例えば組成物は、pH 6.0で30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムおよび40 mg/mlの抗体を含む。
薬学的組成物は、(Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2012 June, ISBN 9780857110275)に開示されているものなどの従来の技法にしたがって、さらなる薬学的に許容される担体または希釈剤ならびに任意の他の既知の補助剤および賦形剤とともに製剤化されうる。そのような任意のさらなる薬学的に許容される担体または希釈剤ならびに任意の他の既知の補助剤および賦形剤は、抗体および選択された投与様式に適したものであるべきである。薬学的組成物の担体および他の構成要素に対する適合性を、本発明の選択された化合物または薬学的組成物の所望の生物学的特性に及ぼす顕著な負の影響の欠如(例えば、抗原結合に及ぼす影響が実質的な影響に満たない(10%またはそれ以下の相対阻害、5％またはそれ以下の相対阻害など))に基づいて決定する。
薬学的に許容される担体は、組成物の他の構成要素と生理学的に適合する任意のおよび全ての適切な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤(isotonicity agent)、酸化防止剤ならびに吸収遅延剤などを含む。本発明の薬学的組成物において利用されうる適切な水性および非水性の担体の他の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、エタノール、デキストロース、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、およびその適切な混合物が挙げられる。本発明の薬学的組成物は、充填剤、塩、緩衝液、界面活性剤(例えば、Tween-20もしくはTween-80といった、非イオン性界面活性剤)、安定化剤(例えば、糖もしくは無タンパク質アミノ酸)、防腐剤、組織固定剤、可溶化剤、および/または薬学的組成物に含めるのに適した他の材料をさらに含みうる。
1つの態様において、本発明の薬学的組成物は界面活性剤を含まない。別の態様において、薬学的組成物は抗凍結剤を含まない。さらなる態様において、組成物を調製するために、ヒスチジン緩衝液および塩化ナトリウム以外の他の賦形剤は抗体調製物に添加されない。
本発明の薬学的組成物中の抗体の実際の投薬レベルは、患者にとって毒性がない状態で、特定の患者、組成物、および投与の様式について所望の治療応答を達成するのに有効である抗体の量を得るように変えられうる。選択される投薬レベルは、利用される本発明の特定の組成物、投与の経路、投与の時間、利用されている特定の化合物の排出の速度、処置の継続期間、利用される特定の組成物と組み合わせて用いられるその他の薬物、化合物、および/または材料、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康および以前の病歴、ならびに医療技術分野において周知の同様の因子を含む、種々の薬物動態学的因子に依存するであろう。注射または注入用の薬学的組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。
1つの態様において、薬学的組成物中の抗体濃度は0.5 mg/ml〜250 mg/ml、例えば1 mg/ml〜100 mg/ml、例えば1 mg/ml〜50 mg/ml、例えば2 mg/ml〜20 mg/ml、例えば5 ml/ml〜15 mg/ml、例えば10 mg/mlである。
本発明の好ましい態様において、薬学的組成物中の抗体濃度は20 mg/mlである。本発明の1つの態様において、薬学的組成物中の抗体濃度は18〜20 mg/mlである。本発明の1つの態様において、薬学的組成物中の抗体濃度は19〜21 mg/mlである。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物中の抗体濃度は40 mg/mlである。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物中の抗体濃度は60 mg/mlである。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物中の抗体濃度は80 mg/mlである。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物中の抗体濃度は100 mg/mlである。
本発明の薬学的組成物に製剤化される抗体
上記のように、本発明の薬学的組成物に製剤化される抗体は、ヒト免疫グロブリンGのFc領域と抗原結合領域とを含み、ここでFc領域は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置でのアミノ酸の変異を含み、ただしS440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする。EU付番によるヒトIgG1でのE430、E345およびS440に対応する位置は、Fc領域のCH3ドメインに位置する。
本発明の薬学的組成物中の抗体は、第1および第2の重鎖を含むFc領域を含み、ここでヒトIgGにおけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置の変異が第1および第2の重鎖の両方に存在するか、またはあまり好ましくないが重鎖の1つにのみ存在する。本発明の文脈において、六量体化増強変異という用語は、ヒトIgGにおけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置でのアミノ酸変異をいい、ただし、S440における変異は、S440YまたはS440Wである。六量体化増強変異は、細胞表面上の対応する標的に結合した場合に、変異を含む抗体間のFc-Fc相互作用を強化する。(WO2013/004842; WO2014/108198)。
1つの態様において、抗体のFc領域は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YまたはS440Wに対応する変異を含む。したがって、抗体は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wの群から選択される変異を含む。これにより、細胞表面抗原結合の際に抗体の六量体化の増強を可能にする態様が提供される。抗体は、第1の重鎖および第2の重鎖を含むFc領域を含み、ここで上記の六量体化増強変異の1つが第1および/または第2の重鎖に存在しうる。
好ましい態様において、Fc領域は、ヒトIgGにおけるEU付番でのE430GまたはE345Kに対応する変異を含む。したがって、Fc領域は、E430GおよびE345Kから選択される変異を含む。
1つの態様において、抗体は、ヒトIgGにおけるEU付番でのE430に対応するアミノ酸位置に変異を含み、ここで変異は、E430G、E430S、E430FおよびE430Tからなる群より選択される。1つの態様において、Fc領域は、E430Gに対応する変異を含む。したがって、1つの態様において、Fc領域はE430G変異を含む。
1つの態様において、抗体は、ヒトIgGにおけるEU付番でのE345に対応するアミノ酸位置に変異を含み、ここで変異は、E345K、E345Q、E345RおよびE345Yからなる群より選択される。1つの態様において、Fc領域は、E345Kに対応する変異を含む。したがって、1つの態様において、Fc領域はE345K変異を含む。
1つの態様において、抗体は、ヒトIgGにおけるEU付番でのS440に対応するアミノ酸位置に変異を含み、ここで変異は、S440WおよびS440Yからなる群より選択される。1つの態様において、Fc領域は、S440Yに対応する変異を含む。したがって、1つの態様において、Fc領域はS440Y変異を含む。
1つの態様において、Fc領域は、ヒトIgG1におけるEU付番でのK439EまたはS440Kなどの、さらなる六量体化阻害変異を含む。K439EまたはS440Kなどの六量体化阻害変異は、同じ六量体化阻害変異を含む抗体とのFc-Fc相互作用を妨げるが、K439E変異を有する抗体およびS440K変異を有する抗体を組み合わせることによって阻害効果が中和され、Fc-Fc相互作用が回復する。1つの態様において、抗体は、ヒトIgG1におけるEU付番での以下の位置S440またはK439の1つに対応するアミノ酸位置にさらなる変異を含む。1つの態様において、Fc領域は、S440またはK439に対応する位置にさらなる変異を含むが、ただし、六量体化増強変異がS440にある場合、さらなる変異が位置S440にないことを条件とする。本発明によるE430、E345またはS440に対応する位置における変異およびK439E変異などのK439に対応するアミノ酸位置でのさらなる変異を含む抗体は、K439E変異などのK439に対応するアミノ酸位置にさらなる変異を含む抗体とオリゴマーを形成しない。しかしながら、E430、E345またはS440における六量体化増強変異およびK439EなどのK439におけるさらなる変異を含む抗体は、E430またはE345における六量体化増強変異およびS440KなどのS440におけるさらなる変異を含む抗体とオリゴマーを形成する。本発明によるE430またはE345に対応する位置における変異およびS440K変異などのS440に対応するアミノ酸位置でのさらなる変異を含む抗体は、S440K変異などのS440に対応するアミノ酸位置にさらなる変異を含む抗体とオリゴマーを形成しない。しかしながら、E430またはE345における六量体化増強変異およびS440KなどのS440におけるさらなる変異を含む抗体は、E430またはE345における六量体化増強変異およびK439EなどのK439におけるさらなる変異を含む抗体とオリゴマーを形成する。1つの態様において、Fc領域は、E430Gなどの六量体化増強変異およびK439Eなどの六量体化阻害変異を含む。1つの態様において、Fc領域は、E345Kなどの六量体化増強変異およびK439Eなどの六量体化阻害変異を含む。別の態様において、Fc領域は、E430Gなどの六量体化増強変異およびS440Kなどの六量体化阻害変異を含む。1つの態様において、Fc領域は、E345Kなどの六量体化増強変異およびS440Kなどの六量体化阻害変異を含む。1つの態様において、Fc領域は、S440Yなどの六量体化増強変異およびK439Eなどの六量体化阻害変異を含む。これにより、K439E変異を含む抗体およびS440K変異を含む抗体の組み合わせの間で排他的な六量体化を可能にする態様が提供される。
好ましい態様において、本発明の薬学的組成物は抗DR5抗体、すなわちDR5に結合する抗原結合領域を含む抗体を含む。
1つの態様において、薬学的組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムおよび2 mg/ml〜200 mg/mlの抗DR5抗体を含み、好ましくはここで組成物は、pH 6.0で30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムおよび20 mg/mlの抗DR5抗体を含む。1つの態様において、薬学的組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムおよび10 mg/ml〜40 mg/mlの抗DR5抗体を含む。1つの態様において、薬学的組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムおよび15 mg/ml〜30 mg/mlの抗DR5抗体を含む。
1つの態様において、薬学的組成物は、pH 5.5〜6.5で、例えばpH 5.8〜6.2で、10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムおよび18 mg/ml〜25 mg/mlの抗DR5抗体を含む。
本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムおよび10 mg/mlの抗DR5抗体を含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムおよび30 mg/mlの抗DR5抗体を含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムおよび40 mg/mlの抗DR5抗体を含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムおよび50 mg/mlの抗DR5抗体を含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムおよび100 mg/mlの抗DR5抗体を含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体は組成物中に2から200 mg/mlで存在し、該第2の抗DR5抗体は組成物中に2から200 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含み、好ましくはここで組成物は、pH 6.0で10 mg/mlの該第1の抗DR5抗体、10 mg/mlの該第2の抗DR5抗体、30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムを含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体は組成物中に10 mg/mlから40 mg/mlで存在し、該第2の抗DR5抗体は組成物中に10 mg/mlから40 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体は組成物中に10 mg/mlから40 mg/mlで存在し、該第2の抗DR5抗体は組成物中に10 mg/mlから40 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.8〜6.2で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体は組成物中に15 mg/mlから30 mg/mlで存在し、該第2の抗DR5抗体は組成物中に15 mg/mlから30 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体は組成物中に15 mg/mlから30 mg/mlで存在し、該第2の抗DR5抗体は組成物中に15 mg/mlから30 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.8〜6.2で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物はまた、タンパク質不純物、例えば抗体不純物などの、不純物を含有しうる。タンパク質不純物は、0.1 mg/ml未満でありうる。1つの態様において、薬学的組成物は0.1 mg/mlのタンパク質不純物、例えば抗体不純物を含む。1つの態様において、薬学的組成物は0.1 mg/ml未満のタンパク質不純物、例えば抗体不純物を含む。1つの態様において、薬学的組成物は0.09 mg/ml未満のタンパク質不純物、例えば抗体不純物を含む。1つの態様において、薬学的組成物は0.07 mg/ml未満のタンパク質不純物、例えば抗体不純物を含む。1つの態様において、薬学的組成物は0.05 mg/ml未満のタンパク質不純物、例えば抗体不純物を含む。1つの態様において、薬学的組成物は0.03 mg/ml未満のタンパク質不純物、例えば抗体不純物を含む。1つの態様において、薬学的組成物は0.001 mg/ml未満のタンパク質不純物、例えば抗体不純物を含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体は組成物中に15 mg/mlから30 mg/mlで存在し、該第2の抗DR5抗体は組成物中に15 mg/mlから30 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.8〜6.2で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムおよび0.1 mg/ml未満のタンパク質不純物、例えば抗体不純物をさらに含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体は組成物中に20 mg/mlで存在し、該第2の抗DR5抗体は組成物中に20 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で20 mg/mlの第1の抗DR5抗体、20 mg/mlの第2の抗DR5抗体、30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムを含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体は組成物中に40 mg/mlで存在し、該第2の抗体は組成物中に40 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で40 mg/mlの第1の抗DR5抗体、40 mg/mlの第2の抗DR5抗体、30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムを含む。
ヒトDR5分子(Uniprot O14763)は、最初の1〜55位のシグナル伝達ペプチド、それに続く56〜210位の細胞外ドメイン、211〜231位の膜貫通ドメインおよび232〜440位の細胞質ドメインを含む440個のアミノ酸から構成される。細胞外ドメインは155個のアミノ酸の配列から構成される。DR5の短いアイソフォーム(Uniprot O14763-2)は、56〜210位のアミノ酸を含む長いバージョン(Uniprot O14763)と比較して、細胞外ドメインから185〜213を失っている。
1つの態様において、抗DR5抗体は、DR5の細胞外ドメイン内のエピトープに結合する抗原結合領域を含む。
1つの態様において、抗体は、TRAILと同じ結合部位に結合する抗原結合領域またはTRAILの結合部位と重複する結合部位を含む。TRAIL結合モチーフは、DR5外部ドメインと複合体を形成するTRAILの結晶構造に基づいてCRD2およびCRD3に位置する(Hymowitz et al., Mol Cell. 1999 Oct;4(4):563-71)。すなわち、1つの態様において、抗体は、TRAILと同じDR5上の結合領域に結合する抗原結合領域を含む。したがって、1つの態様において、DR5抗体はDR5上のCRD2および/またはCRD3に結合する。1つの態様において、抗体は、DR5へのTRAIL結合をブロックする抗原結合領域を含む。1つの態様において、抗体は、DR5へのTRAIL結合と競合する抗原結合領域を含む。1つの態様において、抗体は、TRAIL誘導アポトーシスなどのTRAIL誘導を介した死滅化をブロックする。
別の態様において、抗体は、TRAILの結合部位とは異なるDR5上のエピトープに結合する抗原結合領域を含む。1つの態様において、抗体は、TRAILとは異なるDR5上の結合領域に結合する抗原結合領域を含む。1つの態様において、抗体は、TRAIL誘導アポトーシスなどのTRAIL誘導を介した死滅化をブロックしない。
本発明の態様において、抗体は、SEQ ID NO:46のアミノ酸残基116〜138内に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基およびアミノ酸残基139〜166内に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基を含むまたは必要とするDR5上のエピトープに結合する抗原結合領域を含む。すなわち、抗原結合領域は、DR5への結合のため、位置116〜138内に位置する1つまたは複数のアミノ酸および位置139〜166内に位置する1つまたは複数のアミノ酸に結合するまたはそれを必要とする。抗原結合領域が配列中に含まれる1つまたは複数のアミノ酸に結合するということは、抗原結合領域が配列内の1つまたは複数のアミノ酸と接触しているかまたは直接相互作用していると理解されるべきである。抗原結合領域が配列内の1つまたは複数のアミノ酸を必要とするということは、抗原結合領域と配列中の1つまたは複数のアミノ酸との間の接触または直接的相互作用は必要とされないが、1つまたは複数のアミノ酸が、エピトープの三次元構造を保つために必要とされることを意味する。
本発明の抗体の、ヒトDR5の細胞外ドメイン上のエピトープまたは結合領域は、実施例6に記述されているようにドメインスワップDR5分子の方法の使用によって判定されうる。手短には、ドメインスワップDR5分子をCHO細胞において一過性に発現させ、ドメインスワップヒトDR5分子への抗体の結合をFACSアッセイ法によって判定する。ドメインスワップヒトDR5分子への結合の喪失は、ヒトDR5のスワップドメインが、抗体への結合に関与する1つまたは複数のアミノ酸を含むことを示している。
別の好ましい態様において、抗体は、SEQ ID NO:46のアミノ酸残基79〜138内に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基を含むまたは必要とするDR5上のエピトープに結合する抗原結合領域を含む。
1つの態様において、抗DR5抗体は、以下のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変重鎖(VH)領域ならびに以下のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変軽鎖(VL)領域を含む抗原結合領域を含む:
(a) (VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6;
(b) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6;
(c) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14;
(d) (VH) SEQ ID NO:16、17、18およびVL) SEQ ID NO:21、GAS、22; または
(e) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を有する上記(a)〜(d)のいずれかに定義される(VH) CDR1、CDR2、CDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3。すなわち1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、合計で5つまでの変異、例えば置換が許容される。
1つの態様において、抗DR5抗体は、以下のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変重鎖(VH)領域ならびに以下のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変軽鎖(VL)領域を含む抗原結合領域を含む:
(a) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6。
1つの態様において、抗DR5抗体は、以下のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変重鎖(VH)領域ならびに以下のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変軽鎖(VL)領域を含む抗原結合領域を含む:
(a) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14。
すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDR配列にわたり全体で5つまでの変異、例えば置換が可能である。いくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの変異、例えば置換などの、5つまでの変異、例えば置換がなされ、かつVL領域のCDRにわたり変異がなされない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異、例えば置換がなされないが、しかしVL領域のCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つなどの、5つまでの変異、例えば置換が見出される。
1つの態様において、本明細書において開示される態様のいずれかにおいて定義される抗DR5抗体は、CDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変重鎖(VH)領域ならびにCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変軽鎖(VL)領域を含む抗原結合領域を含み、ここで該VH領域および該VL領域は、以下からなる群より選択される6つのCDR配列に記載されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する:
(a) (VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6;
(b) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6;
(c) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14; ならびに
(d) (VH) SEQ ID NO:16、17、18およびVL) SEQ ID NO:21、GAS、22。
1つの態様において、本明細書において開示される態様のいずれかにおいて定義される抗DR5抗体は、CDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変重鎖(VH)領域ならびにCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変軽鎖(VL)領域を含む抗原結合領域を含み、ここで該VH領域および該VL領域は、以下からなる群より選択される6つのCDR配列に記載されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する:
(a) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6。
1つの態様において、本明細書において開示される態様のいずれかにおいて定義される抗DR5抗体は、CDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変重鎖(VH)領域ならびにCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変軽鎖(VL)領域を含む抗原結合領域を含み、ここで該VH領域および該VL領域は、以下からなる群より選択される6つのCDR配列に記載されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する:
(a) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14。
1つの態様において、抗DR5抗体は、以下からなる群の1つより選択されるCDR配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変重鎖(VH)領域ならびにCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変軽鎖(VL)領域を含む:
(a) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6、または
(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14、または
(c) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異を有する上記(a)または(b)のいずれか1つに定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、合計で5つまでの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの変異、例えば置換などの、5つまでの変異、例えば置換がなされ、かつVL領域のCDRにわたり変異がなされない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異、例えば置換がなされないが、しかしVL領域のCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つなどの、5つまでの変異、例えば置換が見出される。
1つの態様において、抗DR5抗体は、以下からなる群の1つより選択されるCDR配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変重鎖(VH)領域ならびにCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変軽鎖(VL)領域を含む:
(a) (VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6、または
(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14、または
(c) 該6つのCDR配列にわたり全体で5つまでの変異を有する上記(a)または(b)に定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、合計で5つまでの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの変異、例えば置換などの、5つまでの変異、例えば置換がなされ、かつVL領域の3つのCDRにわたり変異がなされない。他の態様において、VH領域の3つのCDRにわたり変異、例えば置換はなされないが、VL領域の6つのCDRにわたり5つまでの変異、例えば置換がなされ、ここで変異、例えば置換は保存的であるか、または同様の物理的もしくは機能的特性を有するアミノ酸に関するものであり、好ましくはDR5に対する結合親和性を改変しない。
1つの態様において、本明細書において開示される態様のいずれかに定義される抗DR5抗体は、可変重鎖(VH)領域および可変軽鎖(VL)領域を含む抗原結合領域を含み、ここで該VH領域および該VL領域は、以下からなる群より選択されるVHおよびVL配列に記載されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する:
(a) (VH) SEQ ID NO:4および(VL) SEQ ID NO:7;
(b) (VH) SEQ ID NO:9および(VL) SEQ ID NO:7;
(c) (VH) SEQ ID NO:12および(VL) SEQ ID NO:15;
(d) (VH) SEQ ID NO:19および(VL) SEQ ID NO:23; ならびに
(e) (VH) SEQ ID NO:20および(VL) SEQ ID NO:23。
1つの態様において、抗体は、以下のアミノ酸配列を有する可変重鎖(VH)領域および可変軽鎖(VL)領域を含む抗原結合領域を含む:
(a) (VH) SEQ ID NO:4および(VL) SEQ ID NO:7;
(b) (VH) SEQ ID NO:9および(VL) SEQ ID NO:7;
(c) (VH) SEQ ID NO:12および(VL) SEQ ID NO:15;
(d) (VH) SEQ ID NO:19および(VL) SEQ ID NO:23;
(e) (VH) SEQ ID NO:20および(VL) SEQ ID NO:23; または
(f) 該(VH)および(VL)配列にわたり全体で1〜10個の変異もしくは置換を有する上記(a)〜(e)のいずれか1つに定義される(VH)および(VL)。すなわち、1つの態様において、VHおよびVL配列により定義されるVHおよびVL領域にわたり、全体で10個までの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VHまたはVL配列にわたり1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個または10個の変異、例えば置換などの、10個までの変異、例えば置換がなされる。本発明の1つの態様において、VH配列において10個までの変異または置換がなされ、かつVL配列において変異はなされない。本発明の1つの態様において、VH配列において変異はなされず、かつVL配列において10個までの変異、例えば置換がなされる。これにより、VHおよびVL配列にわたり10個までの変異、例えば置換を可能にする態様が提供され、ここで変異、例えば置換は保存的であるか、または同様の物理的もしくは機能的特性を有するアミノ酸に関するものであり、それにより抗DR5抗体の結合親和性または機能を改変することなく、VHおよびVL配列内での変異、例えば置換を可能にする。
1つの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。本発明の1つの態様において、抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4アイソタイプのものである。好ましい態様において、抗体はIgG1抗体である。
1つの態様において、抗体は、IgG1m(f)、IgG1m(z)、IgG1m(a)もしくはIgG1m(x)アロタイプ、またはIgG1m(z,a)、IgG1m(z,a,x)、IgG1m(f,a)などの、任意のアロタイプの組み合わせである。好ましい態様において、抗体はIgG1m(f)である。
1つの態様において、軽鎖はカッパ軽鎖である。1つの態様において、軽鎖はKm3アロタイプである。
1つの態様において、抗体は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むFc領域を含む:
(a) SEQ ID NO:29;
(b) SEQ ID NO:30;
(c) SEQ ID NO:31;
(d) SEQ ID NO:32; または
(e) 該配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を有していてもよい(a)〜(d)のいずれか1つに定義されるアミノ酸配列。すなわち、1つの態様において、Fc領域にわたり、全体で5つまでの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、Fc領域にわたり1つ、2つ、3つ、4つまたは5つの変異、例えば置換などの、5つまでの変異、例えば置換が許容される。
1つの態様において、本明細書において開示される態様のいずれかに定義される抗DR5抗体は、重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、ここでLCはSEQ ID NO:39の配列を含み、かつここでHCは、以下からなる群より選択されるHC配列に記載されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する:
(a) (HC) SEQ ID NO:33;
(b) (HC) SEQ ID NO:34;
(c) (HC) SEQ ID NO:35;
(d) (HC) SEQ ID NO:36;
(e) (HC) SEQ ID NO:37; および
(f) (HC) SEQ ID NO:38。
1つの態様において、本明細書において開示される態様のいずれかに定義される抗DR5抗体は、重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、ここでLCはSEQ ID NO:39の配列を含み、かつここでHCは、(HC)SEQ ID NO:38の配列に記載されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する。
1つの態様において、本明細書において開示される態様のいずれかに定義される抗DR5抗体は、重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、ここでLCはSEQ ID NO:39に記載される少なくとも75%、80%、85%、90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有し、かつここでHCは、以下からなる群より選択されるHC配列に記載されるアミノ酸配列を有する:
(a) (HC) SEQ ID NO:33;
(b) (HC) SEQ ID NO:34;
(c) (HC) SEQ ID NO:35;
(d) (HC) SEQ ID NO:36;
(e) (HC) SEQ ID NO:37; および
(f) (HC) SEQ ID NO:38。
1つの態様において、本明細書において開示される態様のいずれかに定義される抗DR5抗体は、重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、ここでLCはSEQ ID NO:39に記載される少なくとも75%、80%、85%、90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有し、かつここでHCは、(f) (HC)SEQ ID NO:38に記載されるアミノ酸配列を有する。
1つの態様において、抗体は重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、ここでLCはSEQ ID NO:39の配列を含み、かつここでHCは、以下からなる群より選択される配列の1つを含む:
(a) (HC) SEQ ID NO:33;
(b) (HC) SEQ ID NO:34;
(c) (HC) SEQ ID NO:35;
(d) (HC) SEQ ID NO:36;
(e) (HC) SEQ ID NO:37; および
(f) (HC) SEQ ID NO:38; または
(g) 該(HC)配列にわたり全体で1〜10個の変異を有する上記(a)〜(f)のいずれか1つに定義される(HC)。すなわち、1つの態様において、重鎖配列により定義される重鎖にわたり、全体で10個までの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、重鎖配列にわたり1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個または10個の変異、例えば置換などの、10個までの変異、例えば置換がなされる。これにより、重鎖配列にわたり10個までの変異、例えば置換を可能にする態様が提供され、ここで変異、例えば置換は保存的であるか、または同様の物理的もしくは機能的特性を有するアミノ酸に関するものであり、それにより抗DR5抗体の結合親和性または機能を改変することなく、重鎖配列内での変異または置換を可能にする。
1つの態様において、抗体は重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、ここでLCはSEQ ID NO:39の配列を含み、HCはSEQ ID NO:38の配列を含む。
1つの態様において、本明細書において開示される態様のいずれかに定義される抗DR5抗体は、重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、ここでLCはSEQ ID NO:43の配列を含み、かつここでHCは、以下からなる群より選択されるHC配列に記載されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する:
(a) (HC) SEQ ID NO:40;
(b) (HC) SEQ ID NO:41; および
(c) (HC) SEQ ID NO:42。
1つの態様において、本明細書において開示される態様のいずれかに定義される抗DR5抗体は、重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、ここでLCはSEQ ID NO:43の配列を含み、かつここでHCは、(HC) SEQ ID NO:42に記載されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する。
1つの態様において、本明細書において開示される態様のいずれかに定義される抗DR5抗体は、重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、ここでLCはSEQ ID NO:43に記載される少なくとも75%、80%、85%、90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有し、かつここでHCは、以下からなる群より選択されるHC配列に記載されるアミノ酸配列を有する:
(a) (HC) SEQ ID NO:40;
(b) (HC) SEQ ID NO:41; および
(c) (HC) SEQ ID NO:42。
1つの態様において、本明細書において開示される態様のいずれかに定義される抗DR5抗体は、重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、ここでLCはSEQ ID NO:43に記載される少なくとも75%、80%、85%、90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有し、かつここでHCは、(HC) SEQ ID NO:42に記載されるアミノ酸配列を有する。
1つの態様において、抗体は重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、ここでLCはSEQ ID NO:43の配列を含み、かつここでHCは、以下からなる群より選択される配列の1つを含む:
(a) (HC) SEQ ID NO:40;
(b) (HC) SEQ ID NO:41;
(c) (HC) SEQ ID NO:42; または
(d) 該(HC)配列にわたり全体で1〜10個の変異、例えば置換を有する上記(a)〜(c)のいずれか1つに定義される(HC)。すなわち、1つの態様において、重鎖配列により定義される重鎖にわたり、全体で10個までの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、重鎖配列にわたり1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個または10個の変異、例えば置換などの、10個までの変異、例えば置換がなされる。これにより、重鎖配列にわたり10個までの変異、例えば置換を可能にする態様が提供され、ここで変異、例えば置換は保存的であるか、または同様の物理的もしくは機能的特性を有するアミノ酸に関するものであり、それにより抗DR5抗体の結合親和性または機能を改変することなく、重鎖配列内での変異、例えば置換を可能にする。
1つの態様において、抗体は重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、ここでLCはSEQ ID NO:43の配列を含み、HCはSEQ ID NO:42の配列を含む。
1つの態様において、抗体はヒト抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。
1つの態様において、抗体は抗DR5抗体であり、該抗DR5抗体はアゴニストである。抗体がアゴニストであるということは、抗体がDR5をクラスター化、刺激または活性化することと理解されるべきである。1つの態様において、DR5に結合した本発明のアゴニスト抗DR5抗体は、DR5に結合したTRAILと同じ細胞内経路を活性化する。抗体濃度希釈系列(例えば20,000 ng/mLから5倍希釈で0.05 ng/mLの終濃度まで)とともに3日間、DR5を発現する標的細胞、例えばCOLO 205細胞(ATCC CCL-222)またはHCT 116細胞(ATCC CCL-247)をインキュベートすることによって、1つまたは複数の抗体のアゴニスト活性を判定することができる。抗体は細胞を播種する際に直接添加されてもよく(実施例8、9、10、39に記載)、またあるいは、抗体サンプルを添加する前に細胞をまず初めに、96ウェル平底プレートに接着させる(実施例11、12、13、14、15、16、17、18、21、22、23、24、38、40、41、42、43、44、46、48に記載)。アゴニスト活性、すなわちアゴニスト効果は、PromegaのCellTiter-Glo発光細胞生存性アッセイ(カタログ番号G7571)などの、この目的のための特別なキットを用いて生存細胞の量を測定することにより定量化することができる。
1つの態様において、抗体は抗DR5抗体であり、該抗DR5抗体は増強されたアゴニスト活性を有する。抗DR5抗体が活性を有することは、抗体がDR5をクラスター化できるか、またはDR5に結合したTRAILと少なくとも同じ細胞内経路を活性化できると理解されるべきである。すなわち、増強されたアゴニスト活性を有する抗DR5抗体は、TRAILまたはDR5に対する野生型IgG1抗体と比較して、DR5を発現する細胞または組織において増加したレベルのアポトーシスまたはプログラム細胞死を誘導することができる。
1つの態様において、抗体は抗DR5抗体であり、該抗DR5抗体は、標的細胞においてプログラム細胞死を誘導する。本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は、カスパーゼ依存性細胞死を誘導する。カスパーゼ依存性細胞死は、カスパーゼ-3および/またはカスパーゼ-7の活性化によって誘導されうる。本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は、カスパーゼ-3および/またはカスパーゼ-7依存性細胞死を誘導する。本発明の1つの態様において、抗体はアポトーシスを誘導する。1つまたは複数のアゴニスト抗DR5抗体によるアポトーシスは、例えば、実施例19、20、25および45に記載のカスパーゼ-3/7活性化アッセイ法または実施例19および25に記載のホスファチジルセリンの露出などの方法を用いて判定することができる。例えば1 μg/mLの一定濃度の抗DR5抗体が接着細胞に添加され、1〜24時間インキュベートされうる。BD PharmingenのPE活性カスパーゼ-3アポトーシスキット(PE Active Caspase-3 Apoptosis Kit) (カタログ番号550914) (実施例19および25)またはPromegaのカスパーゼ-Glo 3/7 (Caspase-Glo 3/7)アッセイ(カタログ番号G8091) (実施例20および45)などの、この目的のための特別なキットを用いることによって、カスパーゼ-3/7活性化を判定することができる。BD PharmingenのFITCアネキシンVアポトーシス検出キットI (FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I) (カタログ番号556547) (実施例19および25)などの、この目的のための特別なキットを用いることによって、ホスファチジルセリンの露出および細胞死を判定することができる。
1つの態様において、抗体は抗DR5抗体であり、該抗DR5抗体は、アネキシン-V結合によって測定できるホスファチジルセリン(PS)の露出を誘導する。本発明の1つの態様において、抗DR5は、標的細胞の細胞表面へのPSの転位置を誘導する。それゆえ、アネキシン-V結合は、プログラム細胞死と相関し、プログラム細胞死に至る細胞事象を誘導する抗DR5抗体の能力を測定するために用いることができる。
好ましい態様において、抗体は、腫瘍細胞などの、DR5を発現する標的細胞においてアポトーシスを誘導する抗DR5抗体である。
1つの態様において、抗体は、細胞生存性を低減する抗DR5抗体である。
1つの態様において、抗体は、DR5クラスター化を誘導する抗DR5抗体である。抗体がクラスター化を誘導し、クラスター化をさらに増強しうるということは、DR5に結合したTRAILと少なくとも同じ細胞内シグナル伝達経路の活性化に至る。
1つの態様において、本発明の組成物は抗DR5抗体を含み、DR5を発現するがん細胞またはがん組織におけるアポトーシスまたは細胞死を誘導、誘発、増大または増強する。増大または増強されたアポトーシスまたは細胞死は、本発明の1つもしくは複数の抗DR5抗体に曝露された、または本発明の1つもしくは複数の抗DR5抗体で処理された細胞におけるホスファチジルセリンの露出の増大または増強されたレベルによって測定することができる。あるいは、増大または増強されたアポトーシスまたは細胞死は、本発明の1つもしくは複数の抗DR5抗体に曝露された、または本発明の1つもしくは複数の抗DR5抗体で処理された細胞におけるカスパーゼ3またはカスパーゼ7の活性化を測定することによって測定することができる。あるいは、増大または増強されたアポトーシスまたは細胞死は、未処理の細胞培養物と比較して、本発明の1つもしくは複数の抗DR5抗体に曝露されたまたは本発明の1つもしくは複数の抗DR5抗体で処理された細胞培養物における生存性の喪失によって測定することができる。カスパーゼ媒介アポトーシスの誘導は、カスパーゼ阻害剤、例えばZVADによるDR5抗体への曝露後の生存性の喪失の阻害を実証することによって評価することができる。
本発明の1つの態様において、本発明の薬学的組成物中の抗体は、DR5を発現する標的細胞上での抗体の六量体化などのオリゴマー化に関与する抗DR5抗体である。六量体化などのオリゴマー化は、Fc-Fc相互作用を通じて媒介される。これを判定するための1つの方法は、抗体がオリゴマー化する、例えば六量体化することを示すFc-Fc相互作用を阻害することによるものである。Fc-Fc相互作用は、実施例15に記載されるようにDCAWHLGELVWCTなどのFc-Fc相互作用に関与する疎水性パッチに結合するペプチドによって阻害することができる。
本発明の薬学的組成物に製剤化される抗体は、抗体鎖をコードする配列を運ぶ発現ベクターを導入することで、宿主細胞中で組み換えにより生産されてもよい。本発明の文脈における発現ベクターは、染色体ベクター、非染色体ベクター、および合成核酸ベクター(適切な発現制御要素のセットを含む核酸配列)を含む、任意の適切なベクターでありうる。そのようなベクターの例としては、SV40の誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージDNAの組み合わせ由来のベクター、ならびにウイルス核酸(RNAまたはDNA)ベクターが挙げられる。1つの態様において、ヒト化CD3抗体をコードする核酸は、例えば線状発現要素(例えばSykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355 59 (1997)に記述されているような)、コンパクト核酸ベクター(例えばUS 6,077,835および/もしくはWO 00/70087に記述されているような)、pBR322、pUC 19/18、もしくはpUC 118/119などのプラスミドベクター、「midge」最小サイズ核酸ベクター(例えばSchakowski et al., Mol Ther 3, 793 800 (2001)に記述されているような)を含め、裸のDNAもしくはRNAベクター中に、またはCaPO4 -沈殿された構築物などの、沈殿された核酸ベクター構築物(例えばWO 00/46147、Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551 55 (1986)、Wigler et al., Cell 14, 725 (1978)、およびCoraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)に記述されているような)として含まれる。そのような核酸ベクターおよびその使用法は、当技術分野において周知である(例えばUS 5,589,466およびUS 5,973,972を参照のこと)。
核酸および/またはベクターはまた、新生ポリペプチド鎖などのポリペプチドをペリプラズム空間へまたは細胞培地中へ向けることができる分泌/局在化配列をコードする核酸配列を含みうる。そのような配列は当技術分野において公知であり、分泌リーダーまたはシグナルペプチド、オルガネラ標的指向性配列(例えば、核局在化配列、ER保持シグナル、ミトコンドリア輸送配列、葉緑体輸送配列)、膜局在化/アンカー配列(例えば、輸送停止配列、GPIアンカー配列)などを含む。
本発明の発現ベクターにおいて、抗DR5抗体をコードする核酸ならびに第1および第2のポリペプチド核酸は、任意の適切なプロモーター、エンハンサー、および他の発現促進要素を含みまたは伴いうる。そのような要素の例としては、強力な発現プロモーター(例えば、ヒトCMV IEプロモーター/エンハンサーならびにRSV、SV40、SL3-3、MMTVおよびHIV LTRプロモーター)、有効なポリ(A)終結配列、大腸菌におけるプラスミド産物のための複製起点、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子、および/または好都合なクローニング部位(例えば、ポリリンカー)が挙げられる。核酸はまた、CMV IEなどの構成性プロモーターとは対照的に誘導性プロモーターを含みうる(当業者は、そのような用語が実際には、ある種の条件下でのある程度の遺伝子発現の記述子であることを認識するであろう)。
抗体は、抗体を産生する組み換え真核または原核宿主細胞の使用によって生産されてもよい。宿主細胞の例としては、CHOまたはHEK-293細胞などの、酵母、細菌および哺乳動物の細胞が挙げられる。例えば、宿主細胞は、本明細書において記述される抗体の発現をコードする配列を含む、細胞ゲノムへ安定に組み込まれた核酸を含んでもよい。宿主細胞は、本明細書において記述される第1または第2のポリペプチドの発現をコードする配列を含む、細胞ゲノムへ安定に組み込まれた核酸を含んでもよい。あるいは、宿主細胞は、本明細書において記述される抗体の発現をコードする配列を含む、プラスミド、コスミド、ファージミド、または線状発現要素などの、非組み込み核酸を含んでもよい。
本発明の薬学的組成物に製剤化される二重特異性抗体
別の局面において、本発明の薬学的組成物は、本明細書に記載の、ヒトDR5に結合する少なくとも1つの抗原結合領域を含む二重特異性抗体を含む。
別の局面において、本発明の薬学的組成物は、本明細書に記載の、ヒトDR5に結合する1つまたは複数の抗原結合領域を含む二重特異性抗体を含む。
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、本明細書において定義される、ヒトDR5に結合する第1の抗原結合領域および第2の抗原結合領域を含む。
1つのこのような態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで該第1の抗原結合領域および該第2の抗原結合領域は、ヒトDR5上の異なるエピトープに結合する。
別の態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここでヒトDR5に結合する該第1の抗原結合領域はヒトDR5に結合する該第2の抗原結合領域の結合をブロックしない。
1つの態様において、二重特異性抗DR5抗体は、第1および第2のFc領域を含み、ここで第1および/または第2のFc領域は、本発明によるヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置におけるアミノ酸の変異を含む。1つの態様において、二重特異性抗DR5抗体は、第1および第2のFc領域を含み、ここで第1および第2のFc領域は、ヒトIgG1,におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置におけるアミノ酸の変異を含む。1つの態様において、二重特異性抗DR5抗体は、第1および第2のFc領域を含み、ここで第1のFc領域は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置におけるアミノ酸の変異を含む。1つの態様において、二重特異性抗DR5抗体は、第1および第2のFc領域を含み、ここで第2のFc領域は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置におけるアミノ酸位置の変異を含む。
1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで該第1の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(a) (VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含む、またはここで該第1の抗原結合領域および該第2の抗原結合領域は、(c) 該6つのCDR配列それぞれにわたり全体で1〜5個の変異または置換を有する上記(a)または(b)に定義される6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異または置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力などの第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5個までの変異または置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個の変異または置換などの5個までの変異または置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異または置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個などの、5個までの変異または置換が見出される。
1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで該第1の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列を含み、(a) 該第1の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含む、またはここで該第1の抗原結合領域および該第2の抗原結合領域は、(b) それぞれ各第1および第2の抗原結合領域の該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を含む(a)に定義される6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異、例えば置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力などの第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5個までの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個の変異または置換などの5個までの変異、例えば置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異、例えば置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個などの、5個までの変異、例えば置換が見出される。
1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで該第1の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(a) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含む、またはここで該第1の抗原結合領域および該第2の抗原結合領域は、(c) 該6つのCDR配列それぞれにわたり全体で1〜5個の変異または置換を有する上記(a)または(b)に定義される6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異または置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力などの第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5個までの変異または置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個の変異または置換などの5個までの変異または置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異または置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個などの、5個までの変異または置換が見出される。
1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで(a) 該第1の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含む、またはここで該第1の抗原結合領域および該第2の抗原結合領域は、(b) それぞれ各抗原結合領域の該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異または置換を有する(a)に定義される6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異、例えば置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力などの第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5つまでの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つまたは5つの変異、例えば置換などの、5つまでの変異、例えば置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異または置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つまたは5つなどの、5つまでの変異、例えば置換が見出される。
1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで該第1の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(a) (VH) SEQ ID NO:16、17、18および(VL) SEQ ID NO:21、GAS、6を含み、かつ該第2の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含む、またはここで該第1の抗原結合領域および該第2の抗原結合領域は、(c) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異または置換を有する上記(a)または(b)に定義される6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異または置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力などの第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5つまでの変異または置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つまたは5つの変異または置換などの5つまでの変異または置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異または置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つまたは5つなどの、5つまでの変異または置換が見出される。
1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで、(a) 該第1の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:16、17、18および(VL) SEQ ID NO:21、GAS、6を含み、かつ該第2の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含む、または(b) 該第1の抗原結合領域および該第2の抗原結合領域は、各抗原結合領域の該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を含む(a)に定義される6つのCDR配列を含む。すなわち、各抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異、例えば置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力などの第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5個までの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つまたは5つの変異、例えば置換などの、5つまでの変異、例えば置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異、例えば置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つまたは5つなどの、5つまでの変異、例えば置換が見出される。
1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで該第1の抗原結合領域は以下の配列:(a) (VH) CDR1 SEQ ID NO:1、CDR2 SEQ ID NO:8、CDR3 SEQ ID NO:3および(VL) CDR1 SEQ ID NO:5、CDR2 FAS、CDR3 SEQ ID NO:6、または（b) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異を有する上記(a)に定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3を含み、かつここで該第2の抗原結合領域は以下の配列:(c) (VH) CDR1 SEQ ID NO:10、CDR2 SEQ ID NO:2、CDR3 SEQ ID NO:11および(VL) CDR1 SEQ ID NO:13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO:14または(d) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異を有する上記(c)に定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3を含む。
1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで(a) 該第1の抗原結合領域は以下の配列:(VH) CDR1 SEQ ID NO:1、CDR2 SEQ ID NO:8、CDR3 SEQ ID NO:3および(VL) CDR1 SEQ ID NO:5、CDR2 FAS、CDR3 SEQ ID NO:6を含み、かつ該第2の抗原結合領域は以下の配列:(VH) CDR1 SEQ ID NO:10、CDR2 SEQ ID NO:2、CDR3 SEQ ID NO:11および(VL) CDR1 SEQ ID NO:13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO:14を含み、または（b) 該第1の抗原結合領域もしくは該第2の抗原結合領域は、各抗原結合領域の該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異を含む。
1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで該第1の抗原結合領域は以下の配列:(a) (VH) CDR1 SEQ ID NO:1、CDR2 SEQ ID NO:2、CDR3 SEQ ID NO:3および(VL) CDR1 SEQ ID NO:5、CDR2 FAS、CDR3 SEQ ID NO:6または(b) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異を有する上記(a)に定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3を含み、かつここで該第2の抗原結合領域は以下の配列:(c) (VH) CDR1 SEQ ID NO:10、CDR2 SEQ ID NO:2、CDR3 SEQ ID NO:11および(VL) CDR1 SEQ ID NO:13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO:14または(d) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異を有する上記(c)に定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3を含む。
1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで(a) 該第1の抗原結合領域は以下の配列:(VH) CDR1 SEQ ID NO:1、CDR2 SEQ ID NO:2、CDR3 SEQ ID NO:3および(VL) CDR1 SEQ ID NO:5、CDR2 FAS、CDR3 SEQ ID NO:6を含み、かつ該第2の抗原結合領域は以下の配列:(VH) CDR1 SEQ ID NO:10、CDR2 SEQ ID NO:2、CDR3 SEQ ID NO:11および(VL) CDR1 SEQ ID NO:13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO:14を含み、または(b) 該第1の抗原結合領域もしくは該第2の抗原結合領域は、各抗原結合領域の該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異を含む。
1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで該第1の抗原結合領域は以下の配列:(a) (VH) CDR1 SEQ ID NO:16、CDR2 SEQ ID NO:17、CDR3 SEQ ID NO:18および(VL) CDR1 SEQ ID NO:21、CDR2 GAS、CDR3 SEQ ID NO:22または(b) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異を有する上記(a)に定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3を含み、かつここで該第2の抗原結合領域は以下の配列:(c) (VH) CDR1 SEQ ID NO:10、CDR2 SEQ ID NO:2、CDR3 SEQ ID NO:11および(VL) CDR1 SEQ ID NO:13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO:14または(d) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異を有する上記(c)に定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3を含む。
1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで(a) 該第1の抗原結合領域は以下の配列:(VH) CDR1 SEQ ID NO:16、CDR2 SEQ ID NO:17、CDR3 SEQ ID NO:18および(VL) CDR1 SEQ ID NO:21、CDR2 GAS、CDR3 SEQ ID NO:22を含み、かつ該第2の抗原結合領域は以下の配列:(VH) CDR1 SEQ ID NO:10、CDR2 SEQ ID NO:2、CDR3 SEQ ID NO:11および(VL) CDR1 SEQ ID NO:13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO:14を含み、または(b) 該第1の抗原結合領域もしくは該第2の抗原結合領域は、各抗原結合領域の該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異を含む。
抗体が、第1および第2の重鎖を含むFc領域を含む二重特異性抗体である場合、本発明による変異、すなわちIgG1のEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置における変異は原則として、重鎖の1つにのみ; すなわち第1または第2の重鎖のいずれかに存在しうるが、本発明による好ましい態様において、変異は二重特異性抗体の第1および第2の重鎖の両方に存在する。
特定の態様において、抗体は、参照により本明細書に組み入れられるWO 11/131746に記載されたヘテロ二量体タンパク質などの二重特異性抗体でありうる。
1つの態様において、抗体は、免疫グロブリンの第1のFc領域と第1の抗原結合領域とを含む第1の重鎖、および免疫グロブリンの第2のFc領域と第2の抗原結合領域とを含む第2の重鎖を含む二重特異性抗体であり、ここで第1および第2の抗原結合領域は、同じ抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープに結合する。
さらなる態様において、第1のFc領域を含む第1の重鎖は、ヒトIgG1重鎖のFc領域でのK409、T366、L368、K370、D399、F405およびY407に対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含み; かつここで第2のFc領域を含む第2の重鎖は、ヒトIgG1重鎖のFc領域でのF405、T366、L368、K370、D399、Y407およびK409に対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含み、かつここで第1のFc領域を含む第1の重鎖における該さらなるアミノ酸置換は、第2のFc領域を含む第2の重鎖における該さらなるアミノ酸置換とは異なる。
さらなる態様において、第1のFc領域を含む第1の重鎖は、ヒトIgG1重鎖のFc領域でのK409に対応する位置にアミノ酸置換を含み; かつ第2のFc領域を含む第2の重鎖は、ヒトIgG1重鎖のFc領域でのF405に対応する位置にアミノ酸置換を含む。
1つの態様において、二重特異性抗体は、ヒトIgG1重鎖のFc領域においてE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436、およびK447に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基での変異を含む第1および第2のFc領域を導入することを含み、ただしS440における変異はS440YまたはS440Wであることを条件とする。
さらなる態様において、S440における変異はS440YまたはS440Wであることを条件とする、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436、およびK447に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基での第1および第2のFc領域における変異は、同じアミノ酸残基の位置または異なる位置にありうる。さらなる態様において、それは第1および第2のFc領域における同じアミノ酸残基の位置での同じまたは異なる変異でありうる。
別の態様において、二重特異性抗体は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436、およびK447に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基での変異を含む第1または第2のCH2-CH3領域を含み、ただしS440における変異はS440YまたはS440Wであることを条件とする。
1つの態様において、二重特異性抗体は第1および第2の重鎖を含み、ここで該第1の重鎖は、EU付番でのヒトIgG1におけるF405Lに対応する変異を含み、かつ該第2の重鎖は、EU付番でのIgG1におけるK409Rに対応する変異を含む。
2つまたはそれ以上の抗体を含む本発明の組成物
1つの局面において、本発明は、2つまたはそれ以上の抗体を含む薬学的組成物に関し、ここで抗体の少なくとも1つが、ヒト免疫グロブリンGのFc領域と抗原結合領域とを含む抗体であり、ここでFc領域が、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置でのアミノ酸の変異を含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は2つまたはそれ以上の抗体を含み、ここで抗体の少なくとも1つが、ヒト免疫グロブリンGのFc領域と抗原結合領域とを含む抗体であり、ここでFc領域が、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置でのアミノ酸の変異を含み、ただしS440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする。
さらなる態様において、本発明の薬学的組成物は2つの異なる抗体を含み、ここで両方の抗体が、ヒト免疫グロブリンGのFc領域と抗原結合領域とを含み、ここでFc領域が、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置でのアミノ酸の変異を含む。
さらなる態様において、本発明の薬学的組成物は2つの異なる抗体を含み、ここで両方の抗体が、ヒト免疫グロブリンGのFc領域と抗原結合領域とを含み、ここでFc領域が、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置でのアミノ酸の変異を含み、ただしS440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、本明細書において記述される第1の抗DR5抗体と第2の抗DR5抗体とを含む。すなわち、本発明の1つの態様において、組成物は、本明細書において記述される第1の抗体と、本明細書において記述される第2の抗体とを含み、ここで第1および第2の抗体は同一ではない。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、第1のFc領域を有しかつヒトIgG1におけるEU付番でのE430に対応する位置での第1のFc領域における変異を含む第1の抗DR5抗体と、第2のFc領域を有しかつヒトIgG1におけるEU付番でのE430に対応する位置での第2のFc領域における変異を含む第2の抗DR5抗体とを含み、ここで第1および第2の抗体がDR5上の異なるエピトープに結合する。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、第1のFc領域を有しかつヒトIgG1におけるEU付番でのE430に対応する位置での第1のFc領域における変異を含む第1の抗DR5抗体と、第2のFc領域を有しかつヒトIgG1におけるEU付番でのE430に対応する位置での第2のFc領域における変異を含む第2の抗DR5抗体とを含み、ここで第1の抗体は、DR5への第2の抗体の結合をブロックしない。別の抗DR5抗体による1つの抗DR5抗体のブロックは、実施例7に記述されるようにサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)において判定されうる。手短には、抗DR5抗体による交差ブロックは、以下の段階、a) 2 μg/mlの第1の抗DR5抗体を96ウェル平底ELISAプレートにコーティングし、その後にb) PBSAでブロッキングしおよびPBST中でプレートを洗浄し、その後にc) 0.2 μg/mlのDR5EDCD-FcHisタグおよび1 μg/mlの第2の抗DR5抗体とともにプレートをインキュベートし、その後にd) PBST中で洗浄しおよび抗Hisタグ抗体とともにプレートをインキュベートし、その後にe) プレートを洗浄しおよびポリ-HRPとともにプレートをインキュベートし、その後にf) 2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)とともにプレートをインキュベートし、その後にg) 2%シュウ酸を加えることにより基質反応を停止させ、その後にh) ELISAリーダー上にて405 nmでの蛍光を測定することによって判定されうる。1つの抗DR5抗体が、別の抗DR5抗体によるDR5への結合をブロックするかどうかは、以下の式によって計算されうる(%阻害 = 100 - [(競合抗体の存在下での結合/競合抗体の非存在下での結合)]＊100)。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430に対応する位置での第1および第2のFc領域における変異を含む第1および第2のFc領域を有する第1および第2の抗DR5抗体を含み、そのような変異は、E430G、E430SおよびE430Tからなる群より選択されうる。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、第1のFc領域を有しかつE430G変異を含む第1の抗DR5抗体と、第2のFc領域を有しかつE430G変異を含む第2の抗DR5抗体とを含み、ここで第1および第2の抗体がDR5上の異なるエピトープに結合する。本発明の抗体の、ヒトDR5の細胞外ドメイン上のエピトープまたは結合領域は、実施例6に記述されているようにドメインスワップDR5分子の方法の使用によって判定されうる。手短には、ドメインスワップDR5分子をCHO細胞において一過性に発現させ、ドメインスワップヒトDR5分子への抗体の結合をFACSアッセイ法によって判定する。ドメインスワップヒトDR5分子への結合の喪失は、ヒトDR5のスワップドメインが、抗体への結合に関与する1つまたは複数のアミノ酸を含むことを示している。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、第1のFc領域を有する第1の抗DR5抗体と、第2のFc領域を有する第2の抗DR5抗体とを含み、ここで第1の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列:
a) (VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6
を含み、
該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列:
b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
を含み、
好ましくはここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、ヒトIgG1におけるE430に対応する位置での第1および第2のFc領域における変異を含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、第1のFc領域を有する第1の抗DR5抗体と、第2のFc領域を有する第2の抗DR5抗体とを含み、ここで第1の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列:
a) (VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6
を含み、
該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列:
b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
を含み、
ここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、第1および第2のFc領域におけるE430G変異を含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、第1のFc領域を有する第1の抗DR5抗体と、第2のFc領域を有する第2の抗DR5抗体とを含み、ここで第1の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列:
a) (VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6
を含み、
該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列、
b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
を含み、
ここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、好ましくは、ヒトIgG1におけるE430に対応する位置での第1および第2のFc領域における変異を含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、第1のFc領域を有する第1の抗DR5抗体と、第2のFc領域を有する第2の抗DR5抗体とを含み、ここで第1の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列:
a) (VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6
を含み、
該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列、
b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
を含み、
ここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、第1および第2のFc領域におけるE430G変異を含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、Fc領域を有しかつヒトIgG1におけるEU付番でのE345に対応する位置でのFc領域における変異を含む第1の抗DR5抗体と、Fc領域を有しかつヒトIgG1におけるEU付番でのE345に対応する位置でのFc領域における変異を含む第2の抗DR5抗体とを含み、ここで第1および第2の抗体がDR5上の異なるエピトープに結合する。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、Fc領域を有しかつヒトIgG1におけるEU付番でのE345に対応する位置でのFc領域における変異を含む第1の抗DR5抗体と、Fc領域を有しかつヒトIgG1におけるEU付番でのE345に対応する位置での変異を含む第2の抗DR5抗体とを含み、ここで第1の抗体がDR5への第2の抗体の結合をブロックしない。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、第1および第2のFc領域を有しかつE345に対応する位置での第1および第2のFc領域における変異を含む第1および第2の抗DR5抗体を含み、そのような変異は、E345K、E345Q、E345RおよびE345Yからなる群より選択されうる。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、第1のFc領域を有しかつE345Kを含む第1の抗DR5抗体と、第2のFc領域を有しかつE345K変異を含む第2の抗DR5抗体とを含み、ここで第1および第2の抗体がDR5上の異なるエピトープに結合する。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、第1のFc領域を有する第1の抗DR5抗体と、第2のFc領域を有する第2の抗DR5抗体とを含み、ここで第1の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列、
a) (VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6
を含み、
該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列、
b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
を含み、
ここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、ヒトIgG1におけるE345に対応する位置での第1および第2のFc領域における変異を含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、第1のFc領域を有する第1の抗DR5抗体と、第2のFc領域を有する第2の抗DR5抗体とを含み、ここで該第1の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含み、該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含み、ここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE345に対応する位置での第1および第2のFc領域における変異を含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、第1のFc領域を有する第1の抗DR5抗体と、第2のFc領域を有する第2の抗DR5抗体とを含み、ここで第1の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列、
a) (VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6
を含み、
該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列、
b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
を含み、
ここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、第1および第2のFc領域におけるE345K変異を含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、第1のFc領域を有する第1の抗DR5抗体と、第2のFc領域を有する第2の抗DR5抗体とを含み、ここで該第1の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含み、該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含み、ここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、第1および第2のFc領域におけるE345K変異を含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、第1のFc領域を有する第1の抗DR5抗体と、第2のFc領域を有する第2の抗DR5抗体とを含み、ここで第1の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列、
a) (VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6
を含み、
該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列、
b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
を含み、
ここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、E345に対応する位置での第1および第2のFc領域における変異を含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、第1のFc領域を有する第1の抗DR5抗体と、第2のFc領域を有する第2の抗DR5抗体とを含み、ここで該第1の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含み、該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含み、ここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE345に対応する位置での第1および第2のFc領域における変異を含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、第1のFc領域を有する第1の抗DR5抗体と、第2のFc領域を有する第2の抗DR5抗体とを含み、ここで第1の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列、
a) (VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6
を含み、
該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列、
b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
を含み、
ここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、第1および第2のFc領域におけるE345K変異を含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、第1のFc領域を有する第1の抗DR5抗体と、第2のFc領域を有する第2の抗DR5抗体とを含み、ここで該第1の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含み、該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含み、ここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、第1および第2のFc領域におけるE345K変異を含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、第1および第2のFc領域を有し、かつヒトIgG1におけるEU付番でのS440に対応する位置での第1および第2のFc領域における変異を含む第1および第2の抗DR5抗体を含み、そのような変異は、S440WおよびS440Yからなる群より選択されうる。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、第1のFc領域を有する第1の抗DR5抗体と、第2のFc領域を有する第2の抗DR5抗体とを含み、ここで該第1の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含み、該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含み、ここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、第1および第2のFc領域におけるS440Y変異を含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、第1のFc領域を有する第1の抗DR5抗体と、第2のFc領域を有する第2の抗DR5抗体とを含み、ここで該第1の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含み、該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含み、ここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、第1および第2のFc領域におけるS440Y変異を含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、第1のFc領域を有する第1の抗DR5抗体と、第2のFc領域を有する第2の抗DR5抗体とを含み、ここで第1および第2の抗体はヒトIgG1 EU付番でのK439EまたはS440Kに対応する第1および第2のFc領域におけるさらなる六量体化阻害変異を含む。本発明の1つの態様において、組成物は、第1および第2のFc領域を有する第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1および第2の抗DR5抗体はヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345もしくはS440に対応するアミノ酸位置での第1および第2のFc領域における六量体化増強変異を含み、かつここで第1の抗体が、K439に対応する位置でのアミノ酸のさらなる変異を含み、かつここで第2の抗体が、S440に対応する位置でのアミノ酸のさらなる変異を含み、ただしさらなる変異がS440にある場合には六量体化増強変異はS440にないことを条件とする。すなわち、本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1の抗DR5抗体はE430GおよびK439Eなどの六量体化増強変異を含み、かつここで第2の抗DR5抗体はE430GおよびS440Kなどの六量体化増強変異を含む。すなわち、本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1の抗DR5抗体はE345KおよびK439Eなどの六量体化増強変異を含み、かつここで第2の抗DR5抗体はE345KおよびS440Kなどの六量体化増強変異を含む。これにより、K439E変異を含む抗体およびS440K変異を含む抗体の組み合わせの間で六量体化が排他的に行われる組成物を可能にする態様が提供される。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、ヒトDR5上の異なるエピトープに結合する第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含む。本発明の1つの態様において、組成物は、SEQ ID NO 46のアミノ酸残基番号116〜138内に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基およびアミノ酸残基番号139〜166内に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基を含むまたは必要とするDR5上のエピトープに結合する抗原結合領域を含む第1の抗DR5抗体ならびにSEQ ID NO 46のアミノ酸残基番号79〜138内に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基を含むまたは必要とするDR5上のエピトープに結合する抗原結合領域を含む第2の抗DR5抗体を含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、DR5への第2の抗DR5抗体の結合をブロックしないDR5に結合する第1の抗DR5抗体を含む。すなわち、本発明の1つの態様において、組成物は、第1および第2の抗DR5抗体がDR5への結合について競合しない、DR5に結合する第1の抗DR5抗体およびDR5に結合する第2の抗DR5抗体を含む。したがって、本発明の文脈において、第2の抗DR5抗体の結合をブロックしない第1の抗DR5抗体は、第2の抗DR5抗体と競合しない第1の抗DR5抗体と同じものでありうることが理解されるべきである。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗体は、6つのCDR配列を含むVH領域およびVL領域を含み、ここで全体で6つのCDR配列が、以下に記載されるCDR配列: (a) (VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有し; かつ該第2の抗体は、6つのCDR配列を含むVH領域およびVL領域を含み、ここで全体で6つのCDR配列が、以下に記載されるCDR配列: (b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する。
その1つの態様において、第1の抗体および第2の抗体の全体で6つのCDR配列の配列同一性は、少なくとも85%、90%、95%、97%、または99%である。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗体は以下の6つのCDR配列:(a) (VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗体は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含み、またはここで該第1の抗体および該第2の抗体は(c) それぞれ該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異または置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力といった、第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5個までの変異または置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個の変異または置換といった、5個までの変異または置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異または置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個といった、5個までの変異または置換が見出される。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで(a) 該第1の抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含み、またはここで(b) 該第1の抗体および該第2の抗体は、それぞれ該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を含む(a)に定義される各抗体の6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異、例えば置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力といった、第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5個までの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個の変異または置換といった、5個までの変異、例えば置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異、例えば置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個といった、5個までの変異、例えば置換が見出される。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗体は、6つのCDR配列を含むVH領域およびVL領域を含み、ここで全体で6つのCDR配列が、以下に記載されるCDR配列: (a) (VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FASと少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有し; かつ該第2の抗体は、6つのCDR配列を含むVH領域およびVL領域を含み、ここで全体で6つのCDR配列が、以下に記載されるCDR配列: (b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する。その1つの態様において、第1の抗体および第2の抗体の全体で6つのCDR配列の配列同一性は、少なくとも85%、90%、95%、97%、または99%である。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで
(a) 該第1の抗体は以下の6つのCDR配列:
(VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗体は以下の6つのCDR配列:
(VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含み、またはここで
(b) 該第1の抗体および該第2の抗体は、それぞれ該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)に定義される6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異または置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力といった、第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5個までの変異または置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個の変異または置換といった、5個までの変異または置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異または置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個といった、5個までの変異または置換が見出される。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで(a) 該第1の抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含み、またはここで(b) 該第1の抗体および該第2の抗体は、それぞれ該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を含む(a)に定義される各抗体の6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異、例えば置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力といった、第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5個までの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個の変異または置換といった、5個までの変異、例えば置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異、例えば置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個といった、5個までの変異、例えば置換が見出される。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗体は、6つのCDR配列を含むVH領域およびVL領域を含み、ここで全体で6つのCDR配列が、以下に記載されるCDR配列: (a) (VH) SEQ ID NO: 16、17、18および(VL) SEQ ID NO: 21、GAS、6と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有し; かつ該第2の抗体は、6つのCDR配列を含むVH領域およびVL領域を含み、ここで全体で6つのCDR配列が、以下に記載されるCDR配列: (b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する。
本発明の1つの態様において、第1の抗体および第2の抗体の全体で6つのCDR配列の配列同一性は、少なくとも85%、90%、95%、97%、または99%である。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで(a) 該第1の抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 16、17、18および(VL) SEQ ID NO: 21、GAS、6を含み、かつ該第2の抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含み、またはここで(b) 該第1の抗体および該第2の抗体は、それぞれ該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を含む(a)に定義される各抗体の6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異、例えば置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力といった、第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5個までの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個の変異または置換といった、5個までの変異、例えば置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異、例えば置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個といった、5個までの変異、例えば置換が見出される。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、上記態様のいずれかに定義される第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1および第2の抗体は、ヒトIgG1におけるEU付番でのK439またはS440位に対応するFc領域における変異をさらに含む。本発明の1つの態様において、組成物は、K439EなどのK439に対応する変異を含む第1の抗体およびS440KなどのS440に対応する変異を含む第2の抗体を含む。本発明の1つの態様において、組成物は、S440KなどのS440に対応する変異を含む第1の抗体およびK439EなどのK439に対応する変異を含む第2の抗体を含む。これにより、組成物が、E430GおよびK439Eなどの少なくとも2つの変異を含む第1の抗体ならびにE430GおよびS440Kなどの少なくとも2つの変異を含む第2の抗体を含む態様が提供される。本発明の別の態様において、組成物は、E345KおよびK439Eなどの少なくとも2つの変異を含む第1の抗体ならびにE345KおよびS440Kなどの少なくとも2つの変異を含む第2の抗体を含む。これにより、異なる特異性を有する抗体の六量体化を可能にする態様が提供される。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗体は以下の配列(a) (VH) CDR1 SEQ ID NO 1、CDR2 SEQ ID NO 8、CDR3 SEQ ID NO 3および(VL) CDR1 SEQ ID NO 5, CDR2 FAS, CDR3 SEQ ID NO 6を含み、かつ該第2の抗体は以下の配列(b) (VH) CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2 SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 11および(VL) CDR1 SEQ ID NO 13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO 14または(c) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異または置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力といった、第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1および第2の抗体は以下のCDR配列を含み、(a) 該第1の抗体は以下のCDR配列:(VH) CDR1 SEQ ID NO 1、CDR2 SEQ ID NO 8、CDR3 SEQ ID NO 3および(VL) CDR1 SEQ ID NO 5、CDR2 FAS、CDR3 SEQ ID NO 6を含み、かつ該第2の抗体は以下のCDR配列:(VH) CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2 SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 11および(VL) CDR1 SEQ ID NO 13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO 14または(b) 各抗体について該CDR配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を含む各抗体について(a)に記述されるCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異、例えば置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力といった、第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗体は以下の配列(a) (VH) CDR1 SEQ ID NO 1、CDR2 2、CDR3 3および(VL) CDR1 SEQ ID NO 5、CDR2 FAS、CDR3 6を含み、かつ該第2の抗体は以下の配列(b) (VH) CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2 2、CDR3 11および(VL) SEQ ID NO CDR1 13、CDR2 RTS、CDR3 14または(c) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異または置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力といった、第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1および第2の抗体は以下のCDR配列を含み、(a) 該第1の抗体は以下のCDR配列:(VH) CDR1 SEQ ID NO 1、CDR2 SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 3および(VL) CDR1 SEQ ID NO 5、CDR2 FAS、CDR3 SEQ ID NO 6を含み、かつ該第2の抗体は以下のCDR配列:(VH) CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2 SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 11および(VL) CDR1 SEQ ID NO 13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO 14または(b) 各抗体について該CDR配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を含む各抗体について(a)に記述されるCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異、例えば置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力といった、第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗体は以下の配列(a) (VH) CDR1 SEQ ID NO 16、CDR2 SEQ ID NO 17、CDR3 SEQ ID NO 18および(VL) CDR1 SEQ ID NO 21、CDR2 GAS、CDR3 SEQ ID NO 22を含み、かつ該第2の抗体は以下の配列(b) (VH) CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2 SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 11および(VL) CDR1 SEQ ID NO 13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO 14または(c) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異または置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力といった、第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1および第2の抗体は以下のCDR配列を含み、(a) 該第1の抗体は以下のCDR配列:(VH) CDR1 SEQ ID NO 16、CDR2 SEQ ID NO 17、CDR3 SEQ ID NO 18および(VL) CDR1 SEQ ID NO 21、CDR2 GAS、CDR3 SEQ ID NO 22を含み、かつ該第2の抗体は以下のCDR配列:(VH) CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2 SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 11および(VL) CDR1 SEQ ID NO 13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO 14または(b) 各抗体について該CDR配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を含む各抗体について(a)に記述されるCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異、例えば置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力といった、第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗体を含み、ここで両方の抗体が、ヒト免疫グロブリンGのFc領域と抗原結合領域とを含み、ここでFc領域が、EU付番によるヒトIgG1でのE430、E345またはS440に対応する位置でのアミノ酸の変異を含み、ここで該第1の抗体および該第2の抗体が1:1のモル比、1:2のモル比、1:3のモル比、1:4のモル比、1:5のモル比、1:6のモル比、1:7のモル比、1:8のモル比、1:9のモル比、1:10のモル比、1:15のモル比、1:20のモル比、1:25のモル比、1:30のモル比、1:35のモル比、1:40のモル比、1:45のモル比 1:50のモル比、50:1のモル比、45:1のモル比、40:1のモル比、35:1のモル比、30:1のモル比 25:1のモル比、20:1のモル比、15:1のモル比、10:1のモル比、9:1のモル比、8:1のモル比、7:1のモル比、6:1のモル比、5:1のモル比、4:1のモル比、3:1のモル比、2:1のモル比といった、1:49〜49:1のモル比で組成物中に存在する。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗体を含み、ここで両方の抗体が、ヒト免疫グロブリンGのFc領域と抗原結合領域とを含み、ここでFc領域が、EU付番によるヒトIgG1でのE430、E345またはS440に対応する位置でのアミノ酸の変異を含み、ただしS440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とし、ここで該第1の抗体および該第2の抗体が約1:1のモル比、約1:2のモル比、約1:3のモル比、約1:4のモル比、約1:5のモル比、約1:6のモル比、約1:7のモル比、約1:8のモル比、約1:9のモル比、約1:10のモル比、約1:15のモル比、約1:20のモル比、約1:25のモル比、約1:30のモル比、約1:35のモル比、約1:40のモル比、約1:45のモル比、約1:50のモル比、約50:1のモル比、約45:1のモル比、約40:1のモル比、約35:1のモル比、約30:1のモル比、約25:1のモル比、約20:1のモル比、約15:1のモル比、約10:1のモル比、約9:1のモル比、約8:1のモル比、約7:1のモル比、約6:1のモル比、約5:1のモル比、約4:1のモル比、約3:1のモル比、約2:1のモル比といった、1:49〜49:1のモル比で組成物中に存在する。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗体を含み、ここで該第1の抗体および該第2の抗体は1:9〜9:1のモル比で組成物中に存在する。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗体を含み、ここで該第1の抗体および該第2の抗体は約1:9〜9:1のモル比で組成物中に存在する。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗体を含み、ここで該第1の抗体および該第2の抗体は約1:4〜4:1のモル比で、例えば約1:3〜3:1のモル比で、例えば約1:2〜2:1のモル比で組成物中に存在する。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗体を含み、ここで該第1の抗体および該第2の抗体はおよそ1:1のモル比で組成物中に存在する。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗体を含み、ここで該第1の抗体および該第2の抗体は1:1のモル比で組成物中に存在する。
本発明の好ましい態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗体を含み、ここで該第1の抗体および該第2の抗体ならびに/または任意のさらなる抗体は、等モル比で組成物中に存在する。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗体を含み、ここで該第1の抗体は組成物中に5 mg/mlで存在し、該第2の抗体は組成物中に5 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で5 mg/mlの第1の抗体、5 mg/mlの第2の抗体、30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムを含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗体を含み、ここで該第1の抗体は組成物中に10 mg/mlで存在し、該第2の抗体は組成物中に10 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含み、好ましくはここで組成物は、pH 6.0で10 mg/mlの該第1の抗体、10 mg/mlの該第2の抗体、30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムを含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗体を含み、ここで該第1の抗体は組成物中に15 mg/mlで存在し、該第2の抗体は組成物中に15 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で15 mg/mlの第1の抗体、15 mg/mlの第2の抗体、30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムを含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗体を含み、ここで該第1の抗体は組成物中に20 mg/mlで存在し、該第2の抗体は組成物中に20 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で20 mg/mlの第1の抗体、20 mg/mlの第2の抗体、30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムを含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗体を含み、ここで該第1の抗体は組成物中に30 mg/mlで存在し、該第2の抗体は組成物中に30 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で30 mg/mlの第1の抗体、30 mg/mlの第2の抗体、30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムを含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗体を含み、ここで該第1の抗体は組成物中に40 mg/mlで存在し、該第2の抗体は組成物中に40 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で40 mg/mlの第1の抗体、40 mg/mlの第2の抗体、30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムを含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗体を含み、ここで該第1の抗体は組成物中に50 mg/mlで存在し、該第2の抗体は組成物中に50 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で50 mg/mlの第1の抗体、50 mg/mlの第2の抗体、30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムを含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗体を含み、ここで該第1および第2の抗体は10 mg/ml抗体の総抗体濃度で組成物中に存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で10 mg/mlの抗体の総抗体濃度での第1および第2の抗体、30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムを含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗体を含み、ここで該第1および第2の抗体は20 mg/ml抗体の総抗体濃度で組成物中に存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で20 mg/mlの抗体の総抗体濃度での第1および第2の抗体、30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムを含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗体を含み、ここで該第1および第2の抗体は30 mg/ml抗体の総抗体濃度で組成物中に存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で30 mg/mlの抗体の総抗体濃度での第1および第2の抗体、30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムを含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗体を含み、ここで該第1および第2の抗体は40 mg/ml抗体の総抗体濃度で組成物中に存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で40 mg/mlの抗体の総抗体濃度での第1および第2の抗体、30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムを含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗体を含み、ここで該第1および第2の抗体は50 mg/ml抗体の総抗体濃度で組成物中に存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で50 mg/mlの抗体の総抗体濃度での第1および第2の抗体、30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムを含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は抗DR5抗体を含み、抗DR5抗体は重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、ここでLCはSEQ ID NO:39の配列を含み、かつここでHCは、以下からなる群より選択される配列の1つを含み:
a) (HC) SEQ ID NO:33;
b) (HC) SEQ ID NO:34;
c) (HC) SEQ ID NO:35;
d) (HC) SEQ ID NO:36;
e) (HC) SEQ ID NO:37; または
f) (HC) SEQ ID NO:38、
ここで該抗DR5抗体は組成物中に2 mg/mlから200 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で10 mg/mlの抗DR5抗体、5 mg/mlの第2の抗体、30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムを含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は抗DR5抗体を含み、抗DR5抗体は重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、ここでLCはSEQ ID NO:43の配列を含み、かつここでHCは、以下からなる群より選択される配列の1つを含み:
a) (HC) SEQ ID NO:40;
b) (HC) SEQ ID NO:41; または
c) (HC) SEQ ID NO:42、
ここで該抗DR5抗体は組成物中に2 mg/mlから200 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で10 mg/mlの抗DR5抗体、5 mg/mlの第2の抗体、30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムを含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体は、a) SEQ ID NO:33; b) SEQ ID NO:34; c) SEQ ID NO:35; d) SEQ ID NO:36; e) SEQ ID NO:37; またはf) SEQ ID NO:38からなる群より選択されるHC配列、およびSEQ ID NO: 39のLC配列を含み、該第2の抗DR5抗体は、g) SEQ ID NO:40; H) SEQ ID NO:41; またはi) SEQ ID NO:42からなる群より選択されるHC配列およびSEQ ID NO: 43のLC配列を含み、該第1の抗DR5抗体は組成物中に2 mg/mlから200 mg/mlで存在し、該第2の抗DR5抗体は組成物中に2 mg/mlから200 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で10 mg/mlの第1の抗DR5抗体、10 mg/mlの第2の抗DR5抗体、30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムを含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体はSEQ ID NO: 38のHC配列およびSEQ ID NO: 39のLC配列を含み、該第2の抗DR5抗体はSEQ ID NO: 42のHC配列およびSEQ ID NO: 43のLC配列を含み、該第1の抗DR5抗体は組成物中に2 mg/mlから200 mg/mlで存在し、該第2の抗DR5抗体は組成物中に2 mg/mlから200 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で10 mg/mlの第1の抗DR5抗体、10 mg/mlの第2の抗DR5抗体、30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムを含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体はHC SEQ ID NO: 38およびLC SEQ ID NO: 39を含み、該第2の抗DR5抗体はHC SEQ ID NO: 42およびLC SEQ ID NO:43を含み、該第1の抗DR5抗体は組成物中に10 mg/mlから20 mg/mlで存在し、該第2の抗DR5抗体は組成物中に10 mg/mlから20 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体はHC SEQ ID NO: 38およびLC SEQ ID NO: 39を含み、該第2の抗DR5抗体はHC SEQ ID NO: 42およびLC SEQ ID NO:43を含み、該第1の抗DR5抗体は組成物中に10 mg/mlで存在し、該第2の抗DR5抗体は組成物中に10 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体はHC SEQ ID NO: 38およびLC SEQ ID NO: 39を含み、該第2の抗DR5抗体はHC SEQ ID NO: 42およびLC SEQ ID NO:43を含み、該第1の抗DR5抗体は組成物中に10 mg/mlで存在し、かつ該第2の抗DR5抗体は組成物中に10 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 6で30 mMヒスチジン、150 mM塩化ナトリウムをさらに含む。
さらなる局面において、本発明は、前記請求項のいずれか一項記載の2つまたはそれ以上の薬学的組成物を含む要素のキットに関し、ここで組成物は治療における同時使用、別使用または逐次使用のためのものである。1つの態様において、組成物は治療での同時使用のためのものであり、ここで組成物は使用直前に混合される。
さらなる局面において、本発明は、本発明により薬学的組成物を調製するための方法であって、本明細書において定義される第1の抗体を含む第1の薬学的組成物と、本明細書において定義される第2の抗体を含む第2の薬学的組成物とを混合する段階を含む該方法に関する。
治療用途
本発明のいずれかの局面または態様による薬学的組成物は、医薬として、すなわち治療用途などの医療用に用いられうる。
したがって、1つの局面において、本発明は、医薬において用いるための本発明による薬学的組成物に関する。
別の局面において、本発明は、がんなどの障害を処置または予防するための方法を提供し、この方法は、本発明の薬学的組成物の治療的有効量を、それを必要とする対象へ投与することを含む。
薬学的組成物は任意の適切な経路および様式によって投与されうる。インビボおよびインビトロで本発明の化合物を投与する適切な経路は、当技術分野において周知であり、かつ当業者によって選択されうる。
1つの態様において、本発明の薬学的組成物は、非経口的に投与される。本明細書において用いられる「非経口投与」および「非経口的に投与される」という用語は、通常は注射による、腸内および局所への投与以外の投与の様式をいい、上皮、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心腔内、皮内、腹腔内、腱内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、硬膜外、および胸骨内の注射および注入を含む。
1つの態様において、本発明の薬学的組成物は静脈内または皮下の注射または注入によって投与される。
1つまたは複数の抗DR5抗体を含む本発明による薬学的組成物は、DR5を発現する細胞に関連する障害の処置または予防において用いることができる。例えば、抗体は、DR5発現細胞に関わる障害を処置または予防するために、ヒト対象に、例えばインビボで、投与されうる。本明細書において用いられる場合、「対象」という用語は、典型的には、抗DR5抗体または二重特異性抗体が投与されるヒトである。対象は、例えば、DR5機能を調節することにより、またはDR5発現細胞を直接的もしくは間接的に死滅させることにより、是正または改善されうる障害を有するヒト患者を含みうる。
1つの態様において、本発明は、感染性疾患、自己免疫疾患または心血管奇形の処置において用いるための、1つまたは複数の抗DR5抗体を含む本発明による薬学的組成物に関する。
1つの態様において、本発明は、がんおよび/または腫瘍の処置において用いるための1つまたは複数の抗DR5抗体を含む本発明による薬学的組成物に関する。「がん」という用語は、典型的には制御されない増殖によって特徴付けられるヒトなどの哺乳動物における生理学的状態をいい、または記述する。大部分のがんは、2つのより大きな群のがん、すなわち固形腫瘍および血液学的腫瘍のうちの1つに属する。
特定の態様において、薬学的組成物は、がんを発症するリスクを低減させ、がん進行における事象の発症を遅延させ、またはがんが寛解したおよび/もしくは原発腫瘍が外科的に除去された場合に再発のリスクを低減させるために、予防的に投与される。後者の場合、薬学的組成物は、例えば、手術に関連して(すなわち、手術前、手術中または手術後に)投与されうる。予防的投与は、他の生物学的要因のために存在すると考えられる腫瘍の位置を特定することが困難な患者においても有用でありうる。
1つの態様において、本発明は、固形腫瘍および/または血液学的腫瘍の処置において用いるための1つまたは複数の抗DR5抗体を含む本発明による薬学的組成物に関する。
1つの態様において、本発明は、結腸直腸がん腫および結腸直腸腺がんを含む結腸直腸がん、膀胱がん、骨肉腫、軟骨肉腫、三重陰性乳がんを含む乳がん、神経膠芽腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、神経内分泌腫瘍を含む中枢神経系のがん、子宮頸がん、子宮内膜がん、胃腺がんを含む胃がん、頭頸部がん、腎臓がん、肝細胞がんを含む肝臓がん、非小細胞肺がん(NSCLC)および小細胞肺がん(SCLC)を含む肺がん、卵巣がん、膵管がんおよび膵臓腺がんを含む膵臓がん、肉腫または悪性黒色腫および非黒色腫皮膚がんを含む皮膚がんなどの固形腫瘍の処置において用いるための1つまたは複数の抗DR5抗体を含む本発明による薬学的組成物に関する。
1つの態様において、本発明は、慢性リンパ球性白血病ならびに急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病などの骨髄性白血病を含む白血病、非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群などの、血液学的腫瘍の処置において用いるための、1つまたは複数の抗DR5抗体を含む本発明による薬学的組成物に関する。
1つの態様において、本発明は、以下のがん群から選択されるがんの処置において用いるための1つまたは複数の抗DR5抗体を含む本発明による薬学的組成物に関する; 膀胱がん、骨がん、結腸直腸がん、肉腫、子宮内膜がん、線維芽細胞がん、胃がん、頭頸部がん、腎臓がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、筋肉がん、神経組織がん、卵巣がん、膵臓がんおよび皮膚がん。
1つの態様において、本発明は、DR5陽性またはDR5発現腫瘍またはがんの増殖の阻害において用いるための1つまたは複数の抗DR5抗体を含む本発明による薬学的組成物に関する。
本発明において、DR5陽性腫瘍またはがんは、細胞表面上にDR5を発現する腫瘍細胞および/またはがん細胞と理解されるべきである。そのようなDR5発現は、免疫組織化学、フローサイトメトリー、画像化または他の適切な診断方法によって検出されうる。DR5の異種発現を示す腫瘍およびがん組織も、DR5陽性腫瘍およびがんとみなされる。
腫瘍および/またはがんは、DR5発現を示すいくつかの腫瘍および/またはがん細胞および/または組織においてDR5を発現することがあり、いくつかの腫瘍および/またはがんは、DR5の過剰発現または異常発現を示すことがあり、その一方で他の腫瘍および/またはがんはDR5の異種発現を示す。そのような腫瘍および/またはがんは全て、抗DR5抗体、二重特異性抗体および本発明によるそのような抗体を含む組成物を用いた処置に適した標的でありうる。
1つの態様において、本発明は、DR5発現腫瘍におけるアポトーシスの誘導において用いるための1つまたは複数の抗DR5抗体を含む本発明による薬学的組成物に関する。
本発明の1つの態様において、本発明による薬学的組成物の有効量を個体に投与する段階を含む、がんを有する個体を処置する方法または使用は、該個体にさらなる治療剤を投与する段階をさらに含む。
本発明の1つの態様において、さらなる治療剤は、化学療法薬(パクリタキセル、テモゾロミド、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、イリノテカン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、5-フルオロウラシル、ペメトレキセドを含むが、これらに限定されない)、キナーゼ阻害剤(ソラフェニブ、スニチニブまたはエベロリムスを含むが、これらに限定されない)、アポトーシス調節剤(組み換えヒトTRAILまたはビリナパントを含むが、これらに限定されない)、RAS阻害剤、プロテアソーム阻害剤(ボルテゾミブを含むが、これに限定されない)、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤(ボリノスタットを含むが、これに限定されない)、栄養補助食品、サイトカイン(IFN-γを含むが、これに限定されない)、抗体または抗体模倣体(抗TF、抗AXL、抗EGFR、抗IGF-1R、抗VEGF、抗CD20、抗CD38、抗HER2、抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA4、抗CD40、抗CD137、抗GITR、抗VISTA (もしくは他の免疫調節標的)抗体および抗体模倣体を含むが、これらに限定されない)、ならびにブレンツキシマブベドチン、トラスツズマブエムタンシン、HuMax-TF-ADCまたはHuMax-AXL-ADCなどの抗体-薬物コンジュゲートの群より選択される単一の薬剤または薬剤もしくはレジメンを含む薬剤の組み合わせである。
本発明の態様を記述する際に、全ての可能な態様の組み合わせおよび入れ替えは明示的に記述されていない。それにも関わらず、ある種の手段が相互に異なる従属請求項に記載されているか、または異なる態様に記述されているという単なる事実は、これらの手段の組み合わせを有利に使用できないことを示すものではない。本発明は、記述された態様の全ての可能な組み合わせおよび入れ替えを想定する。
配列の表1
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実施例1：抗体構築物および抗原構築物
DR5のための発現構築物
ヒトの完全長DR5タンパク質（SEQ ID NO 46）、アカゲザルの完全長DR5タンパク質（SEQ ID NO 25）、およびマウスの完全長DR5タンパク質（SEQ ID NO 26）の発現のためのコドン最適化構築物を、利用可能な配列：ヒト（Homo sapiens）DR5（Genbankアクセッション番号NP_003833、UniprotKB/Swiss-Prot O14763-1）、アカゲザル（Macaca mulatta）DR5（Genbankアクセッション番号EHH28346）、マウス（Mus musculus）DR5（UniprotKB/Swiss-Prot Q9QZM4）に基づいて生成した。DR5抗体の結合領域のマッピング（実施例6に記載されている通り）のために、以下のキメラヒト／マウスDR5構築物；それぞれ、対応するマウスDR5配列によって以下の一部が置き換えられたヒトDR5（数字はヒト配列を指す）を作製した：構築物A aa 56〜68、構築物B aa 56〜78、構築物C aa 69〜78、構築物D aa 79〜115、構築物E 79〜138、構築物F aa 97〜138、構築物G aa 139〜166、構築物H aa 139〜182、構築物I aa 167〜182、構築物J 167〜210、構築物K aa 183〜210。機能喪失変異K415Nを、ヒトDR5デスドメイン中に導入した（SEQ ID NO 44）。加えて、C末端Hisタグを有するヒトDR5の細胞外ドメイン（ECD）のためのコドン最適化構築物：DR5ECD-FcHistag（SEQ ID NO 27）およびDR5ECDdelHis（SEQ ID NO 28）を生成した。全ての構築物は、クローニングに適している制限部位および最適コザック（GCCGCCACC）配列を含有していた。構築物を、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.3（Invitrogen）にクローニングした。
抗体のための発現構築物
抗体発現のために、キメラヒト／マウスDR5抗体DR5-01およびDR5-05（EP2684896A1に基づく）ならびにそれらのヒト化バリアントhDR5-01およびhDR5-05（WO2014/009358に基づく）の、以前に記載されているようなVHおよびVL配列を、関連性のある定常HCおよびLC領域を含有する発現ベクター（pcDNA3.3）にクローニングした。所望の変異を、遺伝子合成または部位特異的変異誘発のいずれかによって導入した。
実施例のいくつかにおいて、事前に記載されている、DR5に対する参照抗体を使用した。IgG1-CONA（US7521048 B2およびWO2010/138725に基づく）ならびにIgG1-chTRA8（EP1506285B1およびUS7244429B2に基づく）を、上記のような関連性のある抗体発現ベクターにクローニングした。
実施例のいくつかにおいて、gp120特異的抗体であるヒトIgG1抗体IgG1-b12を、陰性対照として使用した（Barbas et al., J Mol Biol. 1993 Apr 5;230(3):812-23）。
一過性発現
抗体を、IgG1、κとして発現させた。抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードするプラスミドDNA混合物を、本質的にVink et al. (Vink et al., Methods, 65 (1), 5-10 2014)により記載されているように、293 fectin（Life technologies）を用いてExpi293F細胞（Life technologies, USA）に一過性にトランスフェクトした。
膜タンパク質を、freestyle Max試薬を用いて、製造業者により記載されているように、Freestyle CHO-S細胞（Life technologies）において発現させた。
タンパク質の精製および分析
抗体を、固定化プロテインGクロマトグラフィーによって精製した。Hisタグ付加組み換えタンパク質を、固定化金属親和性クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質バッチを、SDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー、およびエンドトキシンレベルの測定を含む複数の生物分析アッセイによって分析した。
二重特異性抗体の生成
二重特異性IgG1抗体を、制御された還元条件下でのFabアーム交換によって生成した。この方法の基礎は、WO2011/131746に記載されているような特定のアッセイ条件下でヘテロダイマーの形成を促進する、相補的CH3ドメインの使用である。F405LおよびK409R（EU付番）変異を、抗DR5 IgG1抗体に導入して、相補的CH3ドメインとの抗体ペアを作製した。F405L変異を、IgG1-DR5-05およびIgG1-DR5-05-E430Gに導入し；K409R変異を、IgG1-DR5-01およびIgG1-DR5-01-E430Gに導入した。二重特異性抗体を生成するために、各々の抗体の最終濃度が0.5 mg/mLの2種類の親相補的抗体を、75 mM 2-メルカプトエチルアミン-HCl（2-MEA）と100μL TEの総体積において31℃で5時間インキュベートした。スピンカラム（Microcon遠心フィルター、30k、Millipore）を用いて製造業者のプロトコルに従い、還元剤2-MEAを除去することによって、還元反応を停止した。このように、二重特異性抗体IgG1-DR5-01-K409R x IgG1-DR5-05-F405L（BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L）およびIgG1-DR5-01-K409R-E430G x IgG1-DR5-05-F405L-E430G（BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G）を生成した。
K409R変異および／またはF405L変異は、抗体の対応する抗原への結合に対していかなる効果も有さない。すなわち、K409R変異および／またはF405L変異は、抗DR5抗体のDR5への結合についていかなる効果も有さない。
実施例2：様々なヒトがん細胞株上のDR5発現レベル
細胞あたりのDR5密度を、マウスモノクローナル抗体B-K29（Diaclone、カタログ番号854.860.000）と共にQIFIKIT（DAKO、カタログ番号K0078）を用いた間接免疫蛍光によって、様々なヒトがん細胞株について定量した。細胞を、トリプシン処理によって収集し、セルストレーナーを通過させた。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、PBSで洗浄し、2×106細胞/mLの濃度で再懸濁した。次の工程を、4℃で行った。50μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり100,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル丸底プレート（Greiner Bio-One、カタログ番号650101）に播種した。細胞を、300×gで3分間の遠心分離によって沈殿させ、10μg/mLの飽和濃度の50μLの抗体試料またはマウスIgG1アイソタイプ対照試料（BD/Pharmingen、カタログ番号555746）に再懸濁した。4℃で30分のインキュベーション後、細胞を沈殿させ、150μL FACS緩衝液（PBS＋0.1％（w/v）ウシ血清アルブミン（BSA）＋0.02％（w/v）アジ化ナトリウム）に再懸濁した。設定ビーズおよび較正ビーズを、製造業者の説明書に従ってプレートに添加した。細胞およびビーズを並行して、150μL FACS緩衝液でさらに2回洗浄し、50μL FITCコンジュゲートヤギ抗マウスIgG（1/50；DAKO、カタログ番号F0479）に再懸濁した。二次抗体を、4℃で30分間、光から保護してインキュベートした。細胞およびビーズを、150μL FACS緩衝液で2回洗浄して、150μL FACS緩衝液に再懸濁した。免疫蛍光を、FACS Canto II（BD Biosciences）上で、生細胞の集団内の10,000イベントを記録することによって測定した。較正ビーズの蛍光強度の幾何平均を使用して、GraphPad Prismソフトウェア（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を用いてゼロ強度およびゼロ濃度を通るようにさせた較正曲線を算出した。各細胞株について、形質膜上に発現しているDR5分子の数の推定値である抗体結合能力（ABC）を、較正曲線の方程式に基づいて、DR5抗体染色した細胞の幾何平均蛍光強度を用いて算出した（GraphPad Softwareを用いた、標準曲線からの未知のものの内挿）。概して、DR5細胞表面発現は、ここで評価した細胞株上で低度から中等度であった。これらのデータに基づいて、細胞株を、低いDR5発現（ABC＜10,000）および中等度のDR5発現（ABC＞10,000）に従って分類した。HCT-15（ATCC, CCL-225）、HT-29（ATCC, HTB-38）およびSW480（ATCC, CCL-228）結腸がん、BxPC-3（ATCC, CRL-1687）、HPAF-II（ATCC, CRL-1997）およびPANC-1（ATCC, CRL-1469）膵臓がん、ならびにA549（ATCC, CCL-185）およびSK-MES-1（ATCC, HTB-58）肺がん細胞株は、低いDR5発現を有することが見出された（QIFIKIT ABC範囲3,081〜8,411）。COLO 205（ATCC CCL-222（商標））およびHCT 116（ATCC CCL-247）結腸がん、A375（ATCC, CRL-1619）皮膚がん、ならびにSNU-5（ATCC, CRL-5973）胃がん細胞株は、中等度のDR5発現を有することが見出された（QIFIKIT ABC範囲10,777〜21,262）。
実施例3：ヒト化DR5-01およびDR5-05抗体のHCT 116細胞に対する結合
ヒト化抗体hDR5-01およびhDR5-05は、特許出願WO2014/009398に記載されている。精製したIgG1-hDR5-01-K409RおよびIgG1-hDR5-05-F405LのDR5陽性HCT 116ヒト結腸がん細胞に対する結合を、FACS分析によって分析し、キメラ抗体IgG1-DR5-01-K409RおよびIgG1-DR5-05-F405Lの結合と比較した。単一細胞懸濁液を調製するために、接着性HCT 116細胞を、PBS（B.Braun；カタログ番号3623140）で2回洗浄し、その後、トリプシン1×/EDTA 0.05％と37℃で2分間インキュベートした。10 mLの培地［L-グルタミンおよびHEPESを含むマッコイ5A培地（Lonza；カタログ番号BE12-168F）＋10％ Donor Bovine Serum with Iron（Life Technologies；カタログ番号10371-029）＋100単位ペニシリン/100単位ストレプトマイシン（Lonzaカタログ番号DE17-603E）］を添加し、その後、細胞を、1200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させた。細胞を、10 mL培地に再懸濁し、1200 rpmで5分間の遠心分離によって再び沈殿させ、1.0×106細胞/mLの濃度でFACS緩衝液に再懸濁した。次の工程を、4℃で行った。100μLの細胞懸濁液試料（ウェルあたり100,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル丸底プレート（Greiner Bio-One；カタログ番号650101）に播種し、300×gで3分間、4℃での遠心分離によって沈殿させた。細胞を、連続希釈抗体調製物系列（5倍希釈において、0〜10μg/mLの範囲）の100μL試料に再懸濁し、4℃で30分間インキュベートした。細胞を、300×gで3分間、4℃での遠心分離によって沈殿させ、150μL FACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を、50μLの二次抗体R-フィコエリトリン（R-PE）コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2（Jackson ImmunoResearch；カタログ番号109-116-098；1/100）と4℃で30分間、光から保護してインキュベートした。細胞を、150μL FACS緩衝液で2回洗浄し、150μL FACS緩衝液に再懸濁して、抗体結合を、FACS Canto II（BD Biosciences）上で10,000イベントを記録することによって分析した。結合曲線を、GraphPad Prism ソフトウェアを用いた非線形回帰分析（可変の傾きを有するシグモイド用量応答）を用いて分析した。
図2は、ヒト化抗体IgG1-hDR5-01-K409RおよびIgG1-hDR5-05-F405Lが、それぞれ、その対応するキメラ抗体IgG1-DR5-01-K409RまたはIgG1-DR5-05-F405Lと類似した結合曲線を示したことを示す。ヒト化は、DR5抗体の結合に対していかなる効果も有さなかった。
実施例4：六量体化増強変異の導入は、キメラDR5-01およびDR5-05抗体ならびに二重特異性抗体DR5-01xDR5-05のDR5陽性ヒト結腸がん細胞に対する結合に影響を及ぼさない
六量体化増強変異（E430GまたはE345K）を有するおよび有さない、IgG1-DR5-01-K409R、IgG1-DR5-05-F405L、および二重特異性抗体IgG1-DR5-01-K409RxIgG1-DR5-05-F405L（BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L）の精製した抗体バリアントの、ヒト結腸がん細胞COLO 205に対する結合を、FACS分析によって分析した。細胞を、非接着性細胞およびトリプシン処理した接着性COLO 205細胞を含有する培養上清をプールすることによって収集した。細胞を、1,200 rpmで5分間、遠心分離し、10 mLの培養培地［25mM HepesおよびL-グルタミンを含むRPMI 1640（Lonzaカタログ番号BE12-115F）＋10％ Donor Bovine Serum with Iron（Life Technologiesカタログ番号10371-029）＋50単位ペニシリン/50単位ストレプトマイシン（Lonzaカタログ番号DE17-603E）］に再懸濁した。細胞を、計数し、再び遠心分離して、0.3×106細胞/mLの濃度でFACS緩衝液に再懸濁した。次の工程を、4℃で行った。100μLの細胞懸濁液試料（ウェルあたり30,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル丸底プレートに播種し、300×gで3分間、4℃での遠心分離によって沈殿させた。細胞を、連続希釈抗体調製物系列（5倍希釈において、0〜10μg/mLの最終濃度の範囲）の50μL試料に再懸濁し、4℃で30分間インキュベートした。プレートを、300×gで3分間、4℃で遠心分離して、細胞を、150μL FACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を、50μLの二次抗体R-PE-コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2（Jackson ImmunoResearch；カタログ番号109-116-098；1/100）と4℃で30分間、光から保護してインキュベートした。細胞を、150μL FACS緩衝液で2回洗浄し、100μL FACS緩衝液に再懸濁して、抗体結合を、FACS Canto II（BD Biosciences）上で5,000イベントを記録することによって分析した。結合曲線を、GraphPad Prism ソフトウェアを用いた非線形回帰分析（可変の傾きを有するシグモイド用量応答）を用いて分析した。
図3Aは、抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-01-K409R-E345Kが、IgG1-DR5-01-K409Rと類似した、ヒト結腸がん細胞COLO 205に対する用量依存性結合を示したことを示す。図3Bは、抗体IgG1-DR5-05-F405L-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E345Kが、IgG1-DR5-05-F405Lと類似した、COLO 205細胞に対する用量依存性結合を示したことを示す。図3Cは、BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430GおよびBsAb DR5-01-K409R-E345K x DR5-05-F405L-E345Kが、BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405Lと類似した、COLO 205細胞に対する用量依存性結合を示したことを示す。これらのデータにより、六量体化増強変異E430GまたはE345Kの導入は、IgG1-DR5-01-K409R、IgG1-DR5-05-F405L、およびBsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405LのDR5陽性COLO 205細胞に対する結合に影響を及ぼさなかったことが示される。
実施例5：キメラDR5-01およびDR5-05抗体のアカゲザルDR5に対する結合
精製したIgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gの、アカゲザルDR5またはヒトDR5を発現するCHO細胞（実施例1に記載）に対する結合を、FACS分析によって分析した。FACS分析の1日前に、CHO細胞に、アカゲザルDR5、ヒトDR5をコードするベクター、または非コードベクター（モック）を一過性にトランスフェクトした。単一細胞懸濁液を調製するために、細胞を、PBSで洗浄し、1.0×106細胞/mLの濃度でFACS緩衝液に再懸濁した。次の工程を、4℃で行った。75μLの細胞懸濁液試料（ウェルあたり75,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル丸底プレートに播種し、300×gで3分間、4℃での遠心分離によって沈殿させた。細胞を、連続希釈抗体調製物系列（5倍希釈において、10〜0μg/mLの範囲）の50μL試料に再懸濁し、4℃で30分間インキュベートした。プレートを、300×gで3分間、4℃で遠心分離して、細胞を、150μL FACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を、50μLの二次抗体R-PE-コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2（Jackson ImmunoResearch；カタログ番号109-116-098；1/100）と4℃で30分間、光から保護してインキュベートした。細胞を、150μL FACS緩衝液で2回洗浄し、100μL FACS緩衝液に再懸濁して、抗体結合を、FACS Canto II（BD Biosciences）上で100,000イベントを記録することによって分析した。結合曲線を、GraphPad Prism ソフトウェアを用いた非線形回帰分析（可変の傾きを有するシグモイド用量応答）を用いて分析した。図4は、抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gが、CHO細胞上に発現しているアカゲザルDR5に対して用量依存性結合を示したことを示す。ヒトDR5をトランスフェクトしたCHO細胞およびモックトランスフェクトCHO細胞に対する結合を、それぞれ、陽性対照および陰性対照として試験した。IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gの両方について、ヒトDR5およびアカゲザルDR5に対する結合のEC50値は、同じ範囲であり（それぞれ、［0.014〜0.023μg/mL］および［0.051〜0.066μg/mL］）、IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gが、ヒトDR5およびアカゲザルDR5に対して同等の結合を示すことが示された。
実施例6：ドメインスワップ型DR5分子を用いた、ヒトDR5上のDR5-01およびDR5-05抗体の結合領域のマッピング
ヒトDR5およびマウスDR5の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、限定された相同性を示し（図5A）、ヒト化抗体IgG1-hDR5-01-F405LおよびIgG1-hDR5-05-F405Lは、マウスDR5に結合しない（図5C、D）。抗体結合に関与するヒトDR5細胞外ドメイン中のアミノ酸ストレッチを特定する目的で、本発明者らは、図5Bに視覚化されているように、特定のヒトDR5ドメインがマウスアナログによって置き換えられている、11種類のヒト-マウスキメラDR5分子（実施例1に記載されているドメインスワップ型DR5分子）を開発した。ドメインスワップ型DR5バリアントを、CHO細胞上で一過性に発現させた。ドメインスワップ型DR5分子に対するDR5抗体の結合の喪失により、ヒトDR5のスワップされたドメインが、結合にとって非常に重要である1つまたは複数のアミノ酸を含有することが示される。逆に、ドメインスワップ型DR5分子に対するDR5抗体の結合の保持により、ヒトDR5のスワップされたドメインが、結合にとって非常に重要であるアミノ酸を含有しないことが示される。結合アッセイのために、3×106個のトランスフェクト細胞を、洗浄して、3 mL FACS緩衝液に再懸濁した。100μLの細胞懸濁液を、96ウェル丸底プレート（Greiner Bio-one；カタログ番号650101）のウェルあたりに添加した（ウェルあたり100.000細胞）。次の工程を、4℃で行った。細胞を、沈殿させ、50μLのDR5抗体試料に再懸濁して（10μg/mLの最終濃度）、4℃で30分間インキュベートした。細胞を、2回洗浄し、50μLの二次抗体R-PE-コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2（Jackson ImmunoResearch；カタログ番号109-116-098；1/100）において4℃で30分間、光から保護してインキュベートした。細胞を、2回洗浄し、120μL FACS緩衝液に再懸濁して、FACS Canto II（BD Biosciences）上で分析した。生存PE陽性細胞のパーセンテージを、GraphPad Prism ソフトウェアを用いてプロットした。表面発現は、様々なエピトープに対するDR5抗体のパネルを用いて、各ドメインスワップ型DR5分子について確認した（示されていない）。gp120に対する非標的結合抗体IgG1-b12を、結合についての陰性対照として含めた。図5Cは、IgG1-hDR5-01-F405Lが、構築物E（79〜138）、F（97〜138）、G（139〜166）、およびH（139〜182）に対して結合の喪失を示し、他方、構築物A〜D（ヒトDR5配列56〜115をカバーする）およびI〜K（ヒトDR5配列167〜210をカバーする）に対する結合は保持されていたことを示す。合わせて、これらのデータにより、アミノ酸領域116〜138および139〜166は、各々、IgG1-hDR5-01-F405LのヒトDR5に対する結合に必要とされる1つまたは複数のアミノ酸を含有することが示される。図5Dは、IgG1-hDR5-05-F405Lが、構築物D（79〜115）、E（79〜138）、およびF（97〜138）に対して結合の喪失を示し、他方、構築物A〜C（ヒトDR5配列56〜78をカバーする）およびG〜K（ヒトDR5配列139〜210をカバーする）に対する結合は保持されていたことを示す。合わせて、これらのデータにより、アミノ酸領域79〜138は、IgG1-hDR5-05-F405LのヒトDR5に対する結合に必要とされる1つまたは複数のアミノ酸を含有することが示される。
実施例7：DR5-01抗体およびDR5-05抗体でのクロスブロックELISA
DR5の細胞外ドメインに対する結合についてのヒト化DR5-01抗体とヒト化DR5-05抗体との間の競合を、本実施例に記載されているようなサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）におけるサンドイッチ結合アッセイによって、およびForteBio Octet（登録商標）HTXシステムを用いたバイオレイヤー干渉法（BLI）によって（データは示していない）測定した。ELISAのために、96ウェル平底ELISAプレート（Greiner bio-one；カタログ番号655092）を、100μL PBS中の2μg/mL DR5抗体（IgG1-hDR5-01-E430GまたはIgG1-hDR5-05-E430G）で、4℃で一晩コーティングした。ウェルを、200μL PBSA［PBS/1％ウシ血清アルブミン（BSA；Rocheカタログ番号10735086001）］を添加することによってブロッキングし、室温で1時間インキュベートした。ウェルを、PBST［PBS/0.05％ Tween-20（Sigma-Aldrich；カタログ番号63158）］で3回洗浄した。次に、DR5ECD-FcHistag（SEQ ID NO 27）（0.2μg/mLの最終濃度）および競合抗体（1μg/mLの最終濃度）を、100μL PBSTA（PBST/0.2％ BSA）の総体積において添加して、室温で1時間、振盪しながらインキュベートした。PBSTで3回洗浄した後、ウェルを、100μLのPBSTA中ビオチニル化抗Hisタグ抗体（R&D Systems；カタログ番号BAM050；1:2.000）と室温で1時間、ELISA振盪機上でインキュベートした。PBSTで3回洗浄した後、ウェルを、PBSTA中のストレプトアビジン標識ポリHRP（Sanquin；カタログ番号M2032；1:10.000）と室温で20分間、ELISA振盪機上でインキュベートした。PBSTで3回洗浄した後、100μLの2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸［ABTS（Roche；カタログ番号11112597001）］とのRTで30分間の、光から保護したインキュベーションを通して、反応を視覚化した。等体積の2％シュウ酸を添加することによって、基質反応を停止した。405 nmでの蛍光を、ELISAリーダー（BioTek ELx808 Absorbance Microplate Reader）上で測定した。図6は、競合抗体の非存在下でのDR5ECD-FcHisCtagの結合と比べた、競合抗体の存在下でのコーティングした抗体に対するDR5ECD-FcHisCtag結合の阻害パーセンテージとして表した、結合競合を示す（阻害％＝100−［（競合抗体の存在下での結合／競合抗体の非存在下での結合）］*100）。コーティングしたIgG1-hDR5-01-E430Gに対するDR5ECD-FcHistagの結合は、可溶性IgG1-hDR5-05-E430Gの存在下で阻害されなかった。逆に、コーティングしたIgG1-hDR5-05-E430Gに対するDR5ECD-FcHistagの結合もまた、可溶性IgG1-hDR5-01-E430Gの存在下で阻害されなかった。これらのデータにより、IgG1-hDR5-01-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gは、DR5ECD-FcHisCtagの結合について互いに競合しなかったことが示され、それらが、ヒトDR5の細胞外ドメイン中の別個のエピトープを認識することが示唆された。これらのデータは、古典的なサンドイッチアッセイを用いたBLIによって確認され、そこでは、IgG1-hDR5-01-F405LまたはIgG1-hDR5-05-F405L（10 mM酢酸ナトリウムpH 6.0、ForteBioカタログ番号18-1070中、20μg/ml）を、アミン反応性第2世代バイオセンサー（FoteBioカタログ番号18-5092）上に固定化した。続いて、バイオセンサーを、DR5ECDdelHis（SEQ ID NO 28）（試料希釈液、ForteBioカタログ番号18-1048中、100 nM）とインキュベートして、競合抗体（試料希釈液中、5μg/mL）の結合を分析した（データは示していない）。
実施例8：六量体化増強変異の導入は、DR5-01抗体およびDR5-05抗体ならびにそれらの組み合わせによる細胞死誘導の効力を改善する
ヒト結腸がん細胞COLO 205およびHCT 116を殺傷する抗体の能力に対する、IgG1-DR5-01-K409RおよびIgG1-DR5-05-F405Lにおける六量体化増強変異E430Gの効果を研究するために、生存率アッセイを行った。抗体を、単一作用物質として、ならびに、DR5-01抗体およびDR5-05抗体の組み合わせとして試験した。COLO 205細胞を、非接着性細胞およびトリプシン処理した接着性細胞を含有する培養上清をプールすることによって収集した。HCT 116細胞は、トリプシン処理によって収集した。細胞を、セルストレーナーを通過させ、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、0.5×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル平底プレート（Greiner Bio-One、カタログ番号655182）に播種した。50μLの連続希釈抗体調製物系列（5倍希釈において、0.05〜20,000 ng/mLの最終濃度の範囲）を添加して、37℃で3日間インキュベートした。2種類の抗体の組み合わせで処置した試料において、アッセイにおける総抗体濃度は、単一抗体で処置した試料におけるものと同じであった。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン（Sigma Aldrich、カタログ番号S6942）とインキュベートした。培養細胞の生存率を、代謝的に活性を有する細胞の指標である、存在するATPを定量する、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイ（Promega、カタログ番号G7571）において決定した。キットから、20μLのルシフェリン溶液試薬をウェルあたりに添加して、500 rpmで2分間、プレートを振盪することによって混合した。次に、プレートを、37℃で1.5時間インキュベートした。100μLの上清を白色OptiPlate-96（Perkin Elmer、カタログ番号6005299）に移して、発光を、EnVision Multilabel Reader（PerkinElmer）上で測定した。データを、GraphPad Prismソフトウェアを用いた非線形回帰（可変の傾きを有するシグモイド用量応答）を用いて分析し、プロットした。図7は、以下の式を用いて算出した際の、生細胞のパーセンテージを示す：生細胞％＝［（抗体試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）／（抗体なし試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）］*100。
図7は、E430G変異の導入が、COLO 205（A）およびHCT 116（B）細胞の両方において、キメラ抗体IgG1-DR5-01-K409RおよびIgG1-DR5-05-F405Lの効能を増強したことを示す。IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせは、いずれかの抗体単独よりも強力であり、かつ、E430G変異を有さない抗体の組み合わせよりも強力であった。IgG1-DR5-01-K409RおよびIgG1-DR5-05-F405Lの組み合わせは、いずれかの抗体単独よりも強力であった。これらのデータにより、六量体化増強変異E430Gの導入は、単一抗体としておよび組み合わせでの両方で、キメラDR5抗体01および05の結合時の細胞殺傷の誘導の増強を結果としてもたらし、組み合わせがより強力であったことが示される。
実施例9：六量体化増強変異を有する2種類のクロスブロックしないDR5抗体を組み合わせることは、標的細胞殺傷の増強を結果としてもたらす
実施例8において、六量体化増強変異を有する2種類のクロスブロックしない抗DR5抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gを組み合わせることが、単一抗体の効力と比較して、がん細胞株に対する殺傷の増強を結果としてもたらしたことが示される。ここで、本発明者らは、2種類のクロスブロックしない抗DR5抗体対2種類のクロスブロックする抗DR5抗体の効力を比較する。抗体IgG1-chTRA8-F405L-E430Gの、クロスブロックしない抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430Gまたはクロスブロックする抗体IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのいずれかとの組み合わせの、単一抗体と比較してHCT 116結腸がん細胞の殺傷を誘導する能力を研究するために、生存率アッセイを行った。抗体IgG1-chTRA8-F405LおよびIgG1-DR5-05-F405LについてのクロスブロックELISAを、実施例7に記載されているように行い、Octet（登録商標）HTXシステム上でのサンドイッチ結合アッセイによって確認した（データは示されていない）。HCT 116細胞に対する生存率アッセイを、5倍希釈において、0.00005〜20μg/mLの最終濃度の範囲にわたる連続希釈した抗体系列で、実施例8に記載されているように行った。図8は、HCT 116細胞の殺傷における単一抗体の効力が、2種類のクロスブロックしない抗体IgG1-chTRA8-F405L-E430GおよびIgG1-DR5-01-K409R-E430Gを組み合わせることによって増強され（図8B）、2種類のクロスブロックする抗体IgG1-chTRA8-F405L-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gを組み合わせることによっては増強されなかった（図8C）ことを示す。
実施例10：六量体化増強変異を有する、クロスブロックしない抗体の組み合わせDR5-05 + CONAおよび二重特異性抗体DR5-05xCONAの、標的細胞殺傷を誘導する能力
2種類のクロスブロックしない抗体の別の組み合わせ（IgG1-CONA-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E345K）およびその二重特異性誘導体BsAb IgG1-CONA-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E345Kの、それぞれ、六量体化増強変異を有さない抗体の組み合わせおよび二重特異性抗体と比較した、HCT 116結腸がん細胞の殺傷を誘導する能力を研究するために、生存率アッセイを行った。抗体IgG1-CONA-K409RおよびIgG1-DR5-05-F405LについてのクロスブロックELISAを、実施例7に記載されているように行い、Octet（登録商標）HTXシステム上でのサンドイッチ結合アッセイによって確認した（データは示していない）。HCT 116細胞に対する生存率アッセイを、5倍希釈において、0.01〜20,000 ng/mLの最終濃度の範囲にわたる連続希釈した抗体系列で、実施例8に記載されているように行った。図9は、六量体化増強変異を有する、クロスブロックしない抗体の組み合わせIgG1-CONA-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E345KおよびBsAb IgG1-CONA-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E345Kが、六量体化増強変異E430GまたはE345Kを有さないこれらの抗体と比較して、HCT 116細胞の殺傷において効力の増強を示したことを示す。
実施例11：E430G六量体化増強変異を有するDR5-01 + DR5-05抗体の組み合わせの、様々ながん細胞株において標的細胞殺傷を誘導する能力
六量体化増強変異E430Gを有するおよび有さない、ヒト-マウスキメラ抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405Lの、COLO 205、HCT-15、HCT 116、HT-29、およびSW480結腸がん、BxPC-3、HPAF-II、およびPANC-1膵臓がん、SNU-5胃がん、A549およびSK-MES-1肺がん、ならびにA375皮膚がん細胞の殺傷を誘導する能力を研究するために、生存率アッセイを行った。接着性細胞を、トリプシン処理によって収集し、セルストレーナーを通過させた。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、0.5×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した［COLO 205、HCT-15、SW480、およびBxPC-3：25mM HepesおよびL-グルタミンを含むRPMI 1640（Lonzaカタログ番号BE12-115F）＋10％ DBSI（Life Technologiesカタログ番号10371-029）＋Pen/Strep（Lonzaカタログ番号DE17-603E）；HCT 116およびHT-29： L-グルタミンおよびHepesを含むマッコイ5A培地（Lonza、カタログ番号BE12-168F）＋10％ DBSI＋Pen/Strep；HPAF-IIおよびSK-MES-1：イーグル最小必須培地（EMEM、ATCCカタログ番号30-2003）＋10％ DBSI＋Pen/Strep；PANC-1およびA375：L-Glnを含まず、HEPESを含むDMEM 4.5 g/L グルコース（Lonzaカタログ番号LO BE12-709F）＋10％ DBSI＋1 mM L-グルタミン（Lonzaカタログ番号BE17-605E）＋Pen/Strep；SNU-5：IMDM (Lonzaカタログ番号BE12-722F)＋10％ DBSI＋Pen/Strep；A549：F-12K培地（ATCCカタログ番号30-2004）＋10％ DBSI＋1 mM L-グルタミン＋Pen/Strep］。100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル平底プレート（Greiner Bio-One、カタログ番号655182）に播種し、37℃で一晩インキュベートした。接着性細胞の上清を、150μLの抗体試料（最終濃度10μg/mL）によって置き換え、37℃で3日間インキュベートした。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン（Sigma Aldrich、カタログ番号S6942）とインキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。全ての試験した細胞株について、生細胞のパーセンテージは、10μg/mLの抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gとのインキュベーション後に、非標的結合陰性対照抗体IgG1-b12とのインキュベーション後よりも有意に低かった（図10）。試験した細胞株のうちの2種類を除いた全てにおいて、抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの効力は、六量体化増強変異を有さない組み合わせIgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405Lについてよりも有意に高かった。これらのデータにより、六量体化増強変異を有するキメラDR5抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、二次的架橋物質の必要なく、結腸がん、膵臓がん、胃がん、肺がん、および皮膚がんを含む様々な起源のがん標的細胞の殺傷において非常に有効であったことが示される。IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの殺傷効力とDR5標的発現レベル（実施例2に記載）との間には、いかなる相関もなかった。
実施例12：E430G六量体化増強変異を有するヒト化DR5-01 + DR5-05抗体の組み合わせの、標的細胞殺傷を誘導する能力
キメラ抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの、インビトロでBxPC-3およびPANC-1膵臓がん細胞の殺傷を誘導する効能を、ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430Gの効能と比較するために、生存率アッセイを行った。細胞を、トリプシン処理によって収集し、セルストレーナーを通過させた。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、0.5×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル平底プレート（Greiner Bio-One、カタログ番号655182）に播種し、37℃で一晩インキュベートした。接着性細胞の上清を、連続希釈抗体調製物系列の150μL抗体試料によって置き換え、37℃で3日間インキュベートした。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン（Sigma Aldrich、カタログ番号S6942）とインキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。六量体化増強変異を有するヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430Gは、対応するキメラ抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gと類似した用量応答曲線を示した（図11）。
実施例13：抗体IgG1-hDR5-01-E430Gの最適化
アミノ酸配列N55-G56を、IgG1-hDR5-01およびIgG1-hDR5-05の重鎖のCDR2領域（SEQ ID NO:2）における潜在的なアスパラギン（Asn）アミド分解モチーフとして特定した。標的結合に対するアミド分解の効果を試験するために、この位置でのアミド分解を、IgG1-hDR5-01-K409RおよびIgG1-hDR5-05-F405LにおけるN55D変異の導入によって模倣した。IgG1-hDR5-01-N55D-K409RおよびIgG1-hDR5-05-N55D-F405Lを、HCT 116細胞に対する結合について、実施例3に記載されているようなFACS分析によって試験した。図12Aは、N55D変異の導入によるアミド分解の模倣が、HCT 116細胞上のIgG1-hDR5-01-K409Rの結合の強い減少を結果としてもたらしたことを示す。対照的に、IgG1-hDR5-05-F405LおよびIgG1-hDR5-05-N55D-F405Lは、同等の結合曲線を示した。DR5-01抗体におけるAsnアミド分解のリスクを低減させるために、G56T変異をIgG1-hDR5-01-E430Gに導入し、この抗体バリアントを、HCT 116細胞に対する結合について、実施例3に記載されているようなFACS分析によって試験した。図12Bは、変異が、HCT 116細胞へのIgG1-hDR5-01-E430Gの結合に対していかなる効果も有さなかったことを示す。
ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、BxPC-3膵臓がん細胞の殺傷を誘導する能力を、ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの能力と比較するために、生存率アッセイを行った。生存率を、実施例11に記載されているように、ウェルあたり1,000細胞、および、200μLの総体積における、4倍希釈において0.0001〜10,000 ng/mLの最終濃度の範囲にわたる抗体濃度系列で評価した。図12Cは、IgG1-hDR5-01-E430GにおけるG56T変異の導入が、IgG1-hDR5-05-E430Gとの組み合わせでの抗体の殺傷効力に対していかなる効果も有さなかったことを示す。
実施例14：ヒト化抗体の組み合わせhDR5-01-G56T-E430GおよびhDR5-05-E430Gによる細胞死誘導は、六量体を形成するためのFc：Fc相互作用を必要とする
細胞死を誘導するための、IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gによる抗体六量体形成の必要性を解析するために、本発明者らは、自己反発変異K439EおよびS440Kを使用した（Diebolder et al., Science. 2014 Mar 14;343(6176):1260-3）。1つのIgG1抗体における、または抗体の組み合わせにおける、K439EまたはS440Kのいずれかの存在によって導入される抗体間のFc反発は、E345KまたはE430Gなどの六量体化増強変異の存在下でさえも、六量体化の阻害を結果としてもたらす（WO2013/0044842）。K439EおよびS440K変異による反発は、一方またはもう一方の変異を各々保有する2種類の抗体の混合物において両方の変異を組み合わせることによって中和され、Fc：Fc相互作用および六量体化の回復を結果としてもたらす。IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの両方について、K439EまたはS440K変異のいずれかを有するバリアントを生成し、全ての異なる組み合わせで試験した。生存率アッセイを、実施例11に記載されているように、BxPC-3膵臓がん細胞およびHCT-15結腸がん細胞に対して、4倍希釈において0.3〜20,000 ng/mLの総濃度の範囲にわたる連続希釈抗体調製物系列で行った。
図13は、同じ反発変異（K439EまたはS440K）を両方が保有するIgG1-hDR5-01-G56T-E430GバリアントおよびIgG1-hDR5-05-E430Gバリアントの組み合わせが、BxPC-3細胞（A）およびHCT-15細胞（B）において強く減少した殺傷効力を示したことを示す。殺傷効力は、相補的な変異K439EまたはS440Kのうちの1つを各々有する2種類の抗体を組み合わせることによって反発が中和された場合に、回復された。これらのデータにより、Fc-Fc相互作用による六量体化が、IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gによる細胞死の誘導のために必要とされることが示される。
実施例15：抗体Fc-Fc相互作用は、六量体化増強変異を有する抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430GによるDR5クラスター化およびアポトーシスの誘導に関与している
抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gによる細胞死の誘導におけるFc-Fc媒介性抗体六量体化の関与を試験するために、本発明者らは、Fc-Fc相互作用に関与する疎水性パッチ中のコアアミノ酸を含有する領域においてFcに結合する（Diebolder et al., Science. 2014 Mar 14;343(6176):1260-3）、13残基ペプチドDCAWHLGELVWCT（DeLano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456):1279-83）を使用した。BxPC-3細胞に対する生存率アッセイを、DCAWHLGELVWCTペプチドの存在下または非存在下で、抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gについて、実施例11に記載されているように行った。簡潔に言うと、細胞の37℃での一晩インキュベーションの後、培養培地を除去して、希釈系列（0〜100μg/mLの範囲）のFc結合DCAWHLGELVWCTペプチド、非特異的対照ペプチドGWTVFQKRLDGSVを含有する、またはペプチドなしの、100μL培養培地によって置き換えた。次に、50μLの抗体試料（833 ng/mLの最終濃度）を添加して、37℃で3日間インキュベートした。抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、BxPC-3細胞の殺傷を誘導する能力は、100μg/mLのFc結合DCAWHLGELVWCTペプチドによって強く阻害された（図14）。これらのデータにより、六量体化増強変異を有する抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、がん細胞の細胞表面上でのDR5クラスター化およびアポトーシスの誘導を誘導する能力における、Fc：Fc相互作用の関与が示される。
実施例16：E430G六量体化増強変異を有するキメラ抗体の組み合わせDR5-01およびDR5-05抗体の、様々な組み合わせ比でがん細胞殺傷を誘導する能力
抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの、様々な比のIgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gで組み合わせた場合の、BxPC-3膵臓がん細胞の殺傷を誘導する能力を研究するために、生存率アッセイを行った。細胞を、トリプシン処理によって収集し、セルストレーナーを通過させた。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、0.5×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル平底プレート（Greiner Bio-One、カタログ番号655182）に播種し、37℃で一晩インキュベートした。様々な比のIgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gを有する50μLの抗体試料（5倍希釈において、0.06〜20μg/mLの最終濃度の範囲にわたる連続希釈系列で、100：0、90：10、80：20、70：30、60：40、50：50、40：60、30：70、20：80、10：90、および0：100のDR5-01：DR5-05の比として示す）を添加して、37℃で3日間インキュベートした。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン（Sigma Aldrich、カタログ番号S6942）とインキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。20μg/mLおよび4μg/mLの総抗体濃度で、殺傷は、抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gの両方を含有する全ての試験した抗体比で同等に有効であった。0.8μg/mLおよび0.16μg/mLの総抗体濃度で、抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gの両方を含有する全ての試験した抗体比は、殺傷を誘導した（図15）。
実施例17：E430G六量体化増強変異を有するヒト化抗体DR5-01およびDR5-05抗体の組み合わせの、様々な組み合わせ比での、がん細胞殺傷を誘導する能力
抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、様々な抗体比で組み合わせた場合の、BxPC-3膵臓がん細胞およびHCT-15結腸がん細胞の殺傷を誘導する能力を研究するために、生存率アッセイを行った。概して、実験は、実施例16に記載されているように行った。簡潔に言うと、あらかじめ付着させた細胞（ウェルあたり5,000細胞）を、BxPC-3については10μg/mLおよびHCT-15については20μg/mLの最終抗体濃度の、様々な比のIgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430G（100：0、98：2、96：4、94：6、92：8、90：10、50：50、10：90、8：92、6：94、4：96、2：98、および0：100のDR5-01：DR5-05の比として図16に示す）と、ポリスチレン96ウェル平底プレート中150μLにおいて、37℃で3日間インキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。殺傷は、抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの両方を含有する全ての試験した抗体比で同等に有効であった（図16）。
実施例18：E430G六量体化増強変異を有するヒト化DR5-01 + DR5-05抗体の組み合わせは、カスパーゼ依存性細胞傷害を誘導する
カスパーゼ阻害剤の存在下および非存在下で、ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの細胞傷害を比較するために、生存率アッセイを行った。PANC-1およびBxPC3膵臓がん細胞を、トリプシン処理によって収集し、セルストレーナーを通過させた。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、0.5×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル平底プレート（Greiner Bio-One、カタログ番号655182）に播種し、37℃で一晩インキュベートした。25μLの汎カスパーゼ阻害剤Z-Val-Ala-DL-Asp-フルオロメチルケトン（Z-VAD-FMK、150μLにおいて5μMの終末濃度、Bachem、カタログ番号4026865.0005）を細胞培養物に添加して、37℃で1時間インキュベートし、その後、連続希釈抗体調製物系列（4倍希釈において、1〜20μg/mLの最終濃度の範囲）の25μL抗体試料を添加して、37℃で3日間、さらにインキュベートした。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン（Sigma Aldrich、カタログ番号S6942）とインキュベートした。組み換えヒトTRAIL/APO-2L（eBioscience、カタログ番号BMS356）を、6μg/mLの最終濃度で使用した。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。六量体化増強変異を有するヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gは、汎カスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMKの存在下で、PANC-1およびBxPC3膵臓がん細胞の生存率を低減させることができず、IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの組み合わせが、カスパーゼ依存性プログラム細胞死を誘導したことが示された（図17）。これはまた、天然のDR5リガンドTRAILについても示された。
実施例19：アネキシンV/ヨウ化プロピジウムおよび活性カスパーゼ-3染色によって評価した際の、COLO 205結腸がん細胞に対するキメラDR5-01およびDR5-05抗体の組み合わせの結合時の細胞死誘導
細胞死誘導の速度論を、アネキシンV/ヨウ化プロピジウム（PI）二重染色および活性カスパーゼ-3染色によって解析した。アネキシン-Vは、プログラム細胞死の開始後に細胞表面上に露出されるホスファチジルセリンに結合し、これは可逆的プロセスである。PIは、細胞に入った場合に二本鎖DNAおよびRNAの中にインターカレートする色素である。PIは、無傷の形質膜および核膜を通過できないため、生きている細胞を染色することはないが、膜の完全性が低下している瀕死の細胞にのみ入って染色する。これらの特徴のために、アネキシンV/PI二重染色は、開始プログラム細胞死（アネキシンV陽性/PI陰性）と不可逆的プログラム細胞死（アネキシンV陽性/PI陽性）との間を区別するために適用することができる。カスパーゼ-3は、外因性のデス受容体誘導性細胞死経路および内因性のミトコンドリア細胞死経路の両方によって活性化される。したがって、活性カスパーゼ-3はまた、死カスケードの開始についてのマーカーでもある。IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせの結合時の細胞死の誘導を、DR5陽性COLO 205結腸がん細胞において解析した。細胞を、非接着性細胞およびトリプシン処理した接着性細胞を含有する培養上清をプールすることによって収集した。細胞を、セルストレーナーを通過させ、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させて、0.2×106細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。500μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり100,000細胞）を、24ウェル平底培養プレート（Greiner Bio-One、カタログ番号662160）に播種して、37℃で16時間インキュベートした。500μLの抗体試料を添加し（1μgの抗体最終濃度）、37℃で5時間または24時間インキュベートした。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン（Sigma Aldrich、カタログ番号S6942）とインキュベートした。細胞を、250μLの1×PBSで1回洗浄した。接着性細胞を、100μLの0.05％トリプシンと37℃で10分間インキュベートすることによって収集した。200μLの培地を、トリプシン処理した細胞に添加し、細胞を、96ウェル丸底FACSプレート（Greiner Bio-One、カタログ番号650101）に移して、非接着性細胞とプールした。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、200μLの氷冷PBSに再懸濁して、それぞれ、アネキシンV/PI染色および活性カスパーゼ-3染色のために、96ウェル丸底FACSプレートにおいて100μLの2種類の試料に分けた。
アネキシンV/PI二重染色は、FITCアネキシンVアポトーシス染色キットI（BD Pharmingen、カタログ番号556547）を用いて行った。細胞を、氷冷PBSで1回洗浄し、50μLのアネキシンV/PI染色溶液（アネキシンV-FITC 1：00およびPI 1：25）において4℃で15分間インキュベートした。細胞を、100μLの結合緩衝液で洗浄し、20μLの結合緩衝液に再懸濁して、1時間以内にiQue Screener（IntelliCyt）上で蛍光を測定した。データを、GraphPad Prismソフトウェアを用いて分析し、プロットした。
活性カスパーゼ-3染色は、PE活性カスパーゼ-3アポトーシスキット（BD Pharmingen、カタログ番号550914）を用いて行った。細胞を、氷冷PBSで1回洗浄し、100μLのCytofix/Cytoperm固定化および透過処理溶液に再懸濁して、氷上で20分間インキュベートした。細胞を、室温で沈殿させ、100μLの1×透過処理（Perm）/洗浄緩衝液で2回洗浄し、室温で30分のインキュベーションのために、100μLのPEウサギ抗活性カスパーゼ-3（1：10）に再懸濁した。細胞を、室温で沈殿させ、100μLの1×透過処理/洗浄緩衝液で1回洗浄し、20μLの1×透過処理/洗浄緩衝液に再懸濁した。蛍光を、iQue Screener上で測定した。データを、GraphPad Prismソフトウェアを用いて分析し、プロットした。
図18は、5時間のインキュベーション後に、キメラ抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gが、アネキシンV陽性/PI陰性（A）および活性カスパーゼ-3陽性細胞（B）のパーセンテージの増加によって示されるように、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して効率的に細胞死の初期段階を誘導したことを示す。アネキシンV陽性/PI陰性および活性カスパーゼ-3陽性細胞のパーセンテージは、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせで処置した細胞において、E430G変異を有さないDR5抗体の組み合わせ（IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405L）または単一抗体のいずれかと比較して、より高かった。5時間の時点で、アネキシンV/PI二重陽性細胞のパーセンテージは、全ての試料においてバックグラウンドレベルと同様であった（C）。
24時間のインキュベーション後に、アネキシンV/PI二重陽性細胞のパーセンテージ（D）は、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gで処置した試料において増強されており、細胞が細胞死の不可逆的段階に入ったことが示された。また、この段階で、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせの効果は、E430G変異を有さないDR5抗体の組み合わせ（IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405L）または単一抗体のいずれかで処置した試料においてよりも強かった（アネキシンV/PI二重陽性細胞のパーセンテージがより大きく増加（E））。同じ時点で、活性カスパーゼ3陽性細胞のパーセンテージは、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gで処置した細胞において最も高かった。
これらのデータにより、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせは、COLO 205結腸がん細胞において細胞死の初期段階および後期段階の両方を誘導し、E430G六量体化増強変異を有さない抗体の組み合わせよりも有効に、そのようにすることが示される。
実施例20：六量体化増強変異を有するキメラDR5-01およびDR5-05抗体の組み合わせのCOLO 205結腸がん細胞に対する結合時の、カスパーゼ-3およびカスパーゼ-7の活性化
実施例19において、キメラDR5抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gとのインキュベーションが、COLO 205結腸がん細胞においてカスパーゼ-3の活性化を誘導したことが記載された。活性カスパーゼ-3陽性細胞のパーセンテージは、抗体の組み合わせとのインキュベーションの24時間後よりも5時間後に、より高かった。本実施例においては、カスパーゼ-3/7認識モチーフDEVDを有する基質が、切断時に、ルシフェラーゼの基質であるアミノルシフェリンを放出する、カスパーゼ-Glo 3/7アッセイ（Promega、カタログ番号G8091）を用いて、カスパーゼ-3/7の活性化を時間において測定した。細胞を、非接着性細胞およびトリプシン処理した接着性COLO 205を含有する培養上清をプールすることによって収集した。細胞を、セルストレーナーを通過させ、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させて、0.8×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。25μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり2,000細胞）を、384ウェル培養プレート（Perkin Elmer、カタログ番号6007680）に播種し、37℃で16時間インキュベートした。25μLの抗体試料を添加し（1μgの抗体最終濃度）、37℃で1、2、5、および24時間インキュベートした。プレートを、インキュベーターから取り出し、室温まで温度を低下させた。細胞を、300 gで3分間の遠心分離によって沈殿させた。25μLの上清を除去し、25μLのカスパーゼ-Glo 3/7基質によって置き換えた。500 rpmで1分間振盪することによって混合した後、プレートを、室温で1時間インキュベートした。発光を、EnVision Multilabel Reader（Perkin Elmer）上で測定した。
図19は、1、2〜5時間の時間経過において、カスパーゼ-3/7の活性化が、抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430GおよびIgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405Lによって、ならびに二重特異性DR5抗体BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gについて誘導されたことを示す。24時間後に、カスパーゼ-3/7の活性化は、全ての試験したDR5抗体についてほぼベースラインレベルに低減した。1時間後、カスパーゼ-3/7の活性化は、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gで処置していた細胞において既に観察され、他方、六量体化増強変異を有さないIgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405Lの組み合わせで処置していた細胞においては、いかなるカスパーゼ-3/7活性化も観察されなかった。同様に、2時間および5時間で、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gによって誘導されたカスパーゼ-3/7の活性化は、IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405Lの組み合わせについてよりも強かった。これらのデータにより、六量体化増強変異を有するキメラDR5抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、六量体化増強変異を有さない抗体の組み合わせよりも迅速な、かつより強力なカスパーゼ-3/7の活性化を誘導したことが示される。
実施例21：E430G六量体化増強変異を有するキメラDR5-01およびDR5-05の抗体の組み合わせの効能は、二次的Fc架橋剤の存在とは無関係である
二次的抗体架橋剤の非存在下および存在下での抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの、COLO 205大腸がん細胞ならびにBxPC-3およびPANC-1膵臓がん細胞の殺傷を誘導する能力を比較するために、生存率アッセイを行った。比較のために、二次的抗体架橋剤の存在下で殺傷の増強を示すことが公知である2種類のDR5抗体IgG1-CONAおよびIgG1-chTRA8-F405Lを、同じ設定で試験した。細胞を、トリプシン処理によって収集し、セルストレーナーを通過させた。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、0.5×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル平底プレート（Greiner Bio-One、カタログ番号655182）に播種し、37℃で一晩インキュベートした。接着性細胞の上清を、ヤギ抗ヒトIgG抗体のF(ab')2断片（1/150；Jackson ImmunoResearch；カタログ番号109-006-098）の非存在下または存在下の、150μLの抗体試料（最終濃度10μg/mL）によって置き換え、37℃で3日間インキュベートした。細胞殺傷の陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン（Sigma Aldrich、カタログ番号S6942）とインキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、Fc架橋剤の存在下または非存在下の両方で、COLO 205、BxPC-3、およびPANC-1がん細胞の、陰性対照と比較して有意な殺傷を誘導した（図20）。対照的に、DR5抗体IgG1-DR5-CONAおよびIgG1-DR5-chTRA8-F405Lは、Fc架橋剤の非存在下で標的細胞殺傷を誘導しなかった。Fc架橋は、COLO 205およびBxPC-3細胞において、IgG1-DR5-CONAおよびIgG1-DR5-chTRA8-F405Lによる殺傷を誘導したが、架橋剤の存在下または非存在下での抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gよりも、有意に低い効能であった。これらのデータにより、抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430GによるCOLO 205、BxPC-3、およびPANC-1がん細胞の殺傷は、二次的Fc架橋剤の存在とは無関係であること、ならびに、この架橋剤と無関係の殺傷は、Fc架橋されたIgG1-DR5-CONA およびIgG1-DR5-chTRA8-F405Lについてよりも効率的であることが示される。
実施例22：IgG1-hDR5-01-430GにおけるK409R変異の導入およびIgG1-hDR5-05-E430GにおけるF405L変異の導入は、ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの効能に対していかなる効果も有さない
本出願に記載されている実験の多くにおいて、抗DR5抗体IgG1-01およびIgG1-05は、IgG Fcドメイン中に、それぞれ、K409RおよびF405L（EU付番インデックス）変異を含有する。これらの変異により、WO2011/131746に記載されているような制御された還元条件下で、IgG1-01-K409RとIgG1-05-F405Lとの間のFabアーム交換反応によるDR5二重特異性抗体の生成が可能になる。Fabアーム交換がないと、K409RおよびF405L変異をもつヒトIgG1抗体は、野生型ヒトIgG1と同じ機能的特徴を示すと考えられている（Labrijn et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Mar 26;110(13):5145-50）。ここで、本発明者らは、K409RまたはF405L変異の存在が、親IgG1-01およびIgG1-05抗体の組み合わせの、インビトロでDR5陽性腫瘍細胞において細胞死を誘導する能力に対していかなる効果も有さないことを示す。ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430Gの、BxPC-3膵臓がん細胞の殺傷を誘導する能力を、ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの能力と比較するために、生存率アッセイを行った。BxPC-3に対する生存率アッセイを、実施例11に記載されているように、4倍希釈において、0.001〜20,000 ng/mLの最終濃度の範囲にわたる連続希釈した抗体系列で行った。BxPC-3膵臓がん細胞株は、ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430Gとのインキュベーション後に、ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gと類似した生存率曲線を示した（図21）。これらのデータにより、K409RおよびF405L変異は、E430G六量体化増強変異を有するヒト化DR5-01およびDR5-05抗体の組み合わせの効能に対していかなる効果も有さなかったことが示される。
実施例23：キメラ二重特異性抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gは、DR5陽性腫瘍細胞の殺傷を誘導する
2種類の異なるDR5エピトープを標的とする二重特異性抗体を、実施例1に記載されているように、キメラ抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430GとIgG1-DR5-05-F405L-E430Gとの間のFabアーム交換によって生成した。10μg/mLのキメラBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gの、様々な組織起源のがん細胞（COLO 205大腸がん、A375皮膚がん、SK-MES-1肺がん、BxPC-3膵臓がん、およびSNU-5胃がん細胞株）の殺傷を誘導する能力を試験するために、生存率アッセイを、実施例11に記載されているように行った。全ての試験した細胞株について、生細胞のパーセンテージは、10μg/mLのキメラBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G抗体とインキュベートした場合に、非標的結合陰性対照抗体IgG1-b12と比較して有意に低かった（図22）。これらのデータにより、六量体増強変異E430Gを有する二重特異性抗DR5xDR5'抗体は、結腸がん、膵臓がん、胃がん、肺がん、および皮膚がんを含む様々な起源のがん細胞の殺傷を、二次的架橋剤の必要なく誘導したことが示される。
実施例24：キメラBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gの効能は、二次的Fc架橋剤の存在とは無関係である
二次的抗体架橋剤の非存在下および存在下でのキメラBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの、BxPC-3膵臓がん細胞およびCOLO 205結腸がん細胞の殺傷を誘導する効能を比較するために、生存率アッセイを、実施例21に記載されているように行った。比較のために、二次的抗体架橋剤の存在下で殺傷の増強を示すことが公知である2種類のDR5抗体IgG1-CONAおよびIgG1-chTRA8-F405Lを、同じ設定で試験した。キメラBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gは、Fc架橋剤の存在下または非存在下の両方で、COLO 205およびBxPC-3がん細胞の、陰性対照と比較して有意な殺傷を示した（図23）。対照的に、DR5抗体IgG1-DR5-CONAおよびIgG1-DR5-chTRA8-F405Lは、Fc架橋剤の存在下で殺傷を誘導しただけであった。
実施例25：アネキシンV/ヨウ化プロピジウムおよび活性カスパーゼ-3染色によって評価した際の、COLO 205結腸がん細胞に対するBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gの結合時の細胞死誘導
COLO 205細胞に対する1μg/mL BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gによる細胞死誘導の速度論を、実施例19に記載されているように、アネキシンV/ヨウ化プロピジウム（PI）二重染色および活性カスパーゼ-3染色によって解析した。
図24は、5時間のインキュベーション後に、BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430GxDR5-05-F405L-E430Gが、アネキシンV陽性/PI陰性（A）および活性カスパーゼ-3陽性細胞（B）のパーセンテージの増加によって示されるように、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して効率的に細胞死の初期段階を誘導したことを示す。アネキシンV陽性/PI陰性および活性カスパーゼ-3陽性細胞のパーセンテージは、BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430GxDR5-05-F405L-E430Gで処置していた細胞において、E430G変異を有さない二重特異性抗体（BsAb IgG1-DR5-01-K409RxDR5-05-F405L）または単一特異性抗体のいずれかと比較して、より高かった。5時間の時点で、アネキシンV/PI二重陽性細胞のパーセンテージは、全ての試料においてバックグラウンドレベルと同等であった（C）。24時間のインキュベーション後に、アネキシンV/PI二重陽性細胞のパーセンテージ（D）は、BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430GxDR5-05-F405L-E430Gで処置した試料において増強されており、細胞が細胞死の不可逆的段階に入ったことが示された。また、この段階で、BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430GxDR5-05-F405L-E430Gの効果は、E430G変異を有さない二重特異性抗体（BsAb IgG1-DR5-01-K409R x DR5-05-F405L）で処置した試料においてよりも強かった（アネキシンV/PI二重陽性細胞のパーセンテージがより大きく増加（E））。同じ時点で、活性カスパーゼ3陽性細胞のパーセンテージは、BsAB IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gで処置した細胞において最も高かった。
これらのデータにより、BsAB IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gは、COLO 205結腸がん細胞において細胞死の初期段階および後期段階の両方を誘導し、E430G六量体化増強変異を有さない二重特異性抗体よりも有効に、そのようにすることが示される。
実施例26：皮下COLO 205結腸がん異種移植モデルにおける、六量体化増強変異を有するおよび有さないDR5-01およびDR5-05抗体バリアンドのインビボ効力
六量体化増強変異を有する、様々な抗DR5抗体およびDR5-01 + DR5-05抗体の組み合わせのインビボ抗腫瘍効力を、COLO 205ヒト結腸がん細胞での皮下モデルにおいて評定した。0日目に、細胞を、非接着性細胞およびトリプシン処理した接着性細胞を含有する培養上清をプールすることによって収集した。3×106細胞を、6〜11週齢の雌SCIDマウス（C.B-17/IcrHan（登録商標）Hsd-Prkdcscid；Harlan）の側腹部中に、200μL PBSの体積において注射した。全ての実験および動物の取扱いは、地方自治体によって承認され、全ての適用可能な国際的な、国家の、および地方の法律および指針に従って実施した。腫瘍の発生を、少なくとも週に2回、0.52×（長さ）×（幅）2としてカリパス（PLEXX）測定値によってモニターした。腫瘍を、1,500 mm3の終点腫瘍体積まで、腫瘍が潰瘍形成を示すまで、重篤な臨床徴候が観察されるまで、または腫瘍成長がマウスの動きを阻止するまで測定した。6日目に、平均腫瘍体積は約200 mm3であり、マウスを、同等の腫瘍サイズ分散を有する群に選別した（下記の表2）。マウスを、6および13日目に、200μL PBS中の100μg抗体の腹腔内（i.p.）注射によって処置した（用量あたり5 mg/kg）。適正な抗体投与を確認するため、血液試料を、最初の投薬の3日後にIgG血清決定のために取得した。3匹の個々のマウスは、検出可能なヒトIgG血漿レベルを有さず、統計分析から排除した（下記の表2を参照されたい）。他のマウスについて、ヒト抗体血漿濃度は、Vcen＝50 mL/kg、Vs＝100 mL/kgの2コンパートメントモデルならびに11.6日の排出半減期を仮定した場合に、期待値に従っていた（データは示していない）。腫瘍を、腫瘍接種の16週間後まで測定した。
（表２）処置群および投薬
Figure 2020522543
図25Aは、時間における処置群あたりの平均腫瘍体積を示す。図25Bは、全ての群がまだ無傷であった時である腫瘍接種後23日目の、平均腫瘍体積を表示する。全ての抗DR5抗体試料は、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して、腫瘍成長を有意に阻害した（23日目の、ノンパラメトリック分散分析の解析（クラスカル・ワリス）およびその後のダンの多重比較検定：p＜0.0001）。完全な腫瘍の抑止が、六量体化増強変異を有するDR5-01 + DR5-05抗体の組み合わせ（IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G）について、六量体化増強変異を有するおよび有さない二重特異性抗体（BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405LおよびBsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G）について、ならびに六量体化増強変異を有する抗DR5抗体（IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430G）について観察された。六量体化増強変異を有さないIgG1-CONAおよびIgG1-DR5-05-F405Lは、IgG1-b12と比較して腫瘍成長を強く阻害したが、完全な腫瘍の抑止は結果としてもたらさなかった。
図25Cは、750 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロットを示す。陰性対照抗体IgG1-b12で処置したマウスと比較して、腫瘍増生は、抗DR5抗体で処置した全ての群において有意に遅延していた（腫瘍サイズカットオフ750 mm3でのマンテル・コックス分析：p＜0.001）。研究の終末（112日目）に、六量体化増強変異を有するDR5-01 + DR5-05抗体の組み合わせ（IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G）で処置したマウスの群は、コナツムマブ群よりも有意に少ない、腫瘍増生を伴うマウスを示した（フィッシャーの正確偶然性検定p＜0.01）。
これらのデータにより、IgG1-DR5-05-F405LにおけるE430G六量体化増強変異の導入は、六量体化増強変異を有さないIgG1-DR5-05-F405Lと比較して、皮下COLO 205結腸がん腫瘍モデルにおいて腫瘍阻害の増強を結果としてもたらしたことが示される。六量体化増強変異を有するDR5-01抗体およびDR5-05抗体の両方（IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430G）、六量体化増強変異を有するおよび有さない二重特異性抗体（BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405LおよびBsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G）、ならびに六量体化増強変異を有する抗体の組み合わせ（IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G）は、六量体化増強変異を有さないIgG1-CONAおよびIgG1-DR5-05-F405Lよりも良好な腫瘍阻害を示した。
実施例27：皮下COLO 205結腸がん異種移植モデルにおける、様々な用量の抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ効力
様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、皮下COLO 205ヒト結腸がん異種移植モデルにおいて評定し、等価投薬のIgG1-CONAと比較した。腫瘍細胞接種、マウスの取扱い、腫瘍増生の測定、および終点決定は、実施例26に記載されているように行った。10日目に、平均腫瘍体積は約400 mm3であり、マウスを、同等の腫瘍サイズ分散を有する群に選別した（下記の表3）。マウスを、10日目に、100μL PBS中の40μg（2 mg/kg）、10μg（0.5 mg/kg）、または2μg（0.1 mg/kg）の抗体の静脈内（i.v.）注射によって処置した。対照群におけるマウスは、40μg（2 mg/kg）IgG1-b12で処置した。腫瘍を、腫瘍接種の17週間後まで測定した。
（表３）処置群および投薬
Figure 2020522543
図26Aは、処置群あたりの平均腫瘍体積を示す。単一用量の0.5 mg/kgまたは2 mg/kgの抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gでの処置は、研究を126日目にやめるまで、完全な腫瘍退縮を結果としてもたらした。0.5 mg/kgおよび2 mg/kgのIgG1-CONAでの処置もまた、腫瘍退縮を誘導したが、退縮は不完全であり、腫瘍増生の再発が、それぞれ、全てのマウスまたはほぼ全て（7/8）のマウスにおいてあった。0.1 mg/kgでは、IgG1-CONAも、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせも、抗腫瘍活性を示さなかった。図26Bは、腫瘍接種後16日目に、2 mg/kgおよび0.5 mg/kgのIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gによる腫瘍阻害が、等価用量のIgG1-CONAと比較して有意に良好であったことを示す（独立t検定）。
図26Cは、500 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロットを示す。0.5 mg/kgおよび2 mg/kgの用量で、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430GおよびIgG1-CONAは、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して、腫瘍成長進行を有意に阻害した（p＜0.001の、腫瘍サイズカットオフ500 mm3でのマンテル・コックス分析）。0.5 mg/kgの用量で、腫瘍成長進行の阻害は、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gについて、等価用量のIgG1-CONAに対して有意に良好であった。
これらのデータにより、2 mg/kgで投薬された組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、IgG1-CONAと比較して16日目に腫瘍負荷を有意に低減させ、0.5 mg/kgでは、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせが、IgG1-CONAと比較して、16日目に腫瘍負荷を有意に低減させ、かつ進行のない生存時間を延長させた（腫瘍サイズカットオフ500 mm3）ため、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gが、IgG1-CONAと比較してより強い抗腫瘍効力を有していたことが示される。
実施例28：皮下BxPC-3膵臓がん異種移植モデルにおける、様々な用量の抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ効力
様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、皮下BxPC-3ヒト膵臓がん異種移植モデルにおいて評定し、等価投薬のIgG1-CONA-F405Lと比較した。0日目に、接着性細胞をトリプシン処理によって収集した。5×106細胞を、6〜11週齢の雌SCIDマウス（C.B-17/IcrHan（登録商標）Hsd-Prkdcscid；Harlan）の側腹部中に、100μL PBSの体積において注射した。マウスの取扱い、腫瘍増生の測定、および終点決定は、実施例26に記載されているように行った。10日目に、平均腫瘍体積は約250 mm3であり、マウスを、同等の腫瘍サイズ分散を有する群に選別した（下記の表4）。マウスを、20および28日目に、200μL PBS中の200μg（10 mg/kg）、40μg（2 mg/kg）、または10μg（0.5 mg/kg）の抗体のi.v.注射によって処置した。対照群におけるマウスは、200μg（10 mg/kg）IgG1-b12で処置した。適正な抗体投与を確認するため、血液試料を、投薬の1週間後にIgG血清決定のために取得した。腫瘍を、腫瘍接種の10週間後まで測定した。
（表４）処置群および投薬
Figure 2020522543
図27Aは、処置群あたりの中央腫瘍体積を示す。抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの全ての試験した用量は、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して腫瘍成長を阻害し、他方、IgG1-CONA-F405L処置群は阻害しなかった。図27Bは、腫瘍接種後48日目に、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせによる腫瘍成長阻害が、等価用量のIgG1-CONA-F405Lよりも有意に良好であったことを示す（独立t検定、p＜0.05）。
図27Cは、500 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロットを示す。組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して、およびIgG1-CONA-F405Lと比較して、腫瘍成長進行を有意に阻害した（腫瘍サイズカットオフ500 mm3でのマンテル・コックス分析：p＜0.001）。
これらのデータにより、インビボBxPC-3ヒト膵臓がん異種移植モデルにおいて、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、様々な用量（0.5 mg/kg、2 mg/kg、および10 mg/kg）で腫瘍成長を阻害したこと、および、抗腫瘍効力は、等価用量のIgG1-CONA-F405Lについてよりも有意に高かったことが示される。
実施例29：皮下A375皮膚がん異種移植モデルにおける、様々な用量の抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ効力
様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、皮下A375ヒト皮膚がん異種移植モデルにおいて評定し、等価投薬のIgG1-CONA-F405Lと比較した。0日目に、接着性細胞をトリプシン処理によって収集した。5×106細胞を、6〜11週齢の雌SCIDマウス（C.B-17/IcrHan（登録商標）Hsd-Prkdcscid；Harlan）の側腹部中に、100μL PBSの体積において注射した。マウスの取扱い、腫瘍増生の測定、および終点決定は、実施例26に記載されているように行った。19日目に、平均腫瘍体積は約250 mm3であり、マウスを、同等の腫瘍サイズ分散を有する群に選別した（下記の表5）。マウスを、19および26日目に、200μL PBS中の200μg（10 mg/kg）、40μg（2 mg/kg）、または10μg（0.5 mg/kg）の抗体のi.v.注射によって処置した。対照群におけるマウスは、200μg（10 mg/kg）IgG1-b12で処置した。適正な抗体投与を確認するため、血液試料を、投薬の1週間後にIgG血清決定のために取得した。腫瘍体積を、腫瘍接種の7週間後まで解析した。
（表５）処置群および投薬
Figure 2020522543
図28Aは、処置群あたりの中央腫瘍体積を示す。抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの全ての試験した用量は、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して腫瘍成長を阻害し、他方、IgG1-CONA-F405L処置群は阻害しなかった。図28Bは、腫瘍接種後29日目に、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせで処置したマウスにおける平均腫瘍サイズが、IgG1-b12で処置したマウスにおいてよりも小さかった（全ての用量レベルについてp＜0.05、多重比較のためのダネット補正を伴う一元配置分散分析）こと、および、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせが、等価用量でIgG1-CONA-F405Lよりも有意に強力であった（マン・ホイットニー検定、p＜0.05）ことを示す。
これらのデータにより、インビボA375ヒト皮膚がん異種移植モデルにおいて、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、様々な用量（0.5 mg/kg、2 mg/kg、および10 mg/kg）で腫瘍成長を阻害したこと、および、抗腫瘍効力は、等価用量のIgG1-CONA-F405Lについてよりも有意に高かったことが示される。
実施例30：皮下HCT-15結腸がん異種移植モデルにおける、様々な用量の抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ効力
様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、CrownBiosciences, Taicang, Chinaで、皮下HCT-15ヒト結腸がん異種移植モデルにおいて評定し、等価投薬のIgG1-CONAと比較した。細胞を、インビトロで、10％胎児ウシ血清を補給したRPMI-1640培地における単層培養として、37℃で空気中5％ CO2の雰囲気において維持した。指数増殖期の接着性細胞を、トリプシン-EDTA処理によって収集した。5×106細胞を、6〜8週齢の雌BALB/cヌードマウス（Shanghai Laboratory Animal Center）の側腹部中に、100μL PBSの体積において注射した。研究中の動物の世話および使用は、Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care（AAALAC）の規則に従って実施した。腫瘍体積を、毎週2回、カリパスを用いて二次元で測定し、体積を、式：V＝0.5 a×b2（式中、aおよびbは、それぞれ、腫瘍の長径および短径である）を用いてmm3で表した。腫瘍接種の11日後に、平均腫瘍サイズは186 mm3に達し、マウスを、乱塊法を用いて群に割り当てて、処置を開始した。マウスを、Q7Dレジメンに従って、g体重あたり、10μL PBS中の200μg（10 mg/kg）、40μg（2 mg/kg）、または10μg（0.5 mg/kg）の抗体のi.v.注射によって2回処置した。対照群におけるマウスを、並行して、200μg（10 mg/kg）IgG1-b12で処置した。腫瘍接種後に、動物の福祉を毎日確認し、腫瘍体積を毎週2回測定した。
（表６）処置群および投薬、実施例30
Figure 2020522543
図29Aは、処置群あたりの平均腫瘍体積を示す。抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの全ての試験した用量は、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して腫瘍成長を阻害し、他方、IgG1-CONAは阻害しなかった。図29Bは、処置の開始後17日目に、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせによる腫瘍成長阻害が、等価用量のIgG1-CONAよりも有意に良好であったことを示す（独立t検定、p＜0.05）。
図29Cは、500 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロットを示す。組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して、および等価用量のIgG1-CONAと比較して、腫瘍成長進行を有意に阻害した（腫瘍サイズカットオフ500 mm3でのマンテル・コックス分析：p＜0.001）。
これらのデータにより、HCT-15ヒト結腸がん細胞でのインビボ異種移植モデルにおいて、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、様々な用量（0.5 mg/kg、2 mg/kg、および10 mg/kg）で腫瘍成長を阻害したこと、および、抗腫瘍効力は、等価用量のIgG1-CONAについてよりも有意に高かったことが示される。
実施例31：皮下SW480結腸がん異種移植モデルにおける、様々な用量の抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ効力
様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、CrownBiosciences, Taicang, Chinaで、皮下SW480ヒト結腸がん異種移植モデルにおいて評定し、等価投薬のIgG1-CONAと比較した。細胞を、インビトロで、10％胎児ウシ血清を補給したL-15培地における単層培養として、37℃で100％空気において維持した。指数増殖期の接着性細胞を、トリプシン-EDTA処理によって収集した。1×107細胞を、6〜8週齢の雌NOD/SCIDマウス（Beijing HFK Bioscience）の側腹部中に、マトリゲル（1：1）と共に200μL PBSの体積において注射した。マウスの取扱いおよび腫瘍体積の測定は、実施例30に記載されているように行った。腫瘍接種の10日後に、平均腫瘍サイズは175 mm3に達し、マウスを、乱塊法を用いて群に割り当てて、処置を開始した。マウスを、Q7Dレジメンに従って、g体重あたり、10μL PBS中の200μg（10 mg/kg）、40μg（2 mg/kg）、または10μg（0.5 mg/kg）の抗体のi.v.注射によって2回処置した。対照群におけるマウスを、並行して、200μg（10 mg/kg）IgG1-b12で処置した。腫瘍接種後に、動物の福祉を毎日確認し、腫瘍体積を毎週2回測定した。
（表７）処置群および投薬、実施例31
Figure 2020522543
図30Aは、処置群あたりの平均腫瘍体積を示す。抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの全ての試験した用量は、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して腫瘍成長を阻害した（10 mg/kg p＜0.0001；2 mg/kg p＜0.001；0.5 mg/kg p＜0.05）。IgG1-CONA処置群は、最高の用量でIgG1-b12よりも良好であっただけであった（10 mg/kgおよび2 mg/kg p＜0.01）が、0.5 mg/kgでは良好でなかった。図30Bは、処置開始後28日目に、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせによる腫瘍成長阻害が、10 mg/kgおよび0.5 mg/kgで等価用量のIgG1-CONAよりも有意に良好であったことを示す（独立t検定、p＜0.05）。
図30Cは、500 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロットを示す。10 mg/kgで投薬した組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して、および等価用量のIgG1-CONAと比較して、腫瘍成長進行を有意に阻害した（腫瘍サイズカットオフ500 mm3でのマンテル・コックス分析：p＜0.001）。
これらのデータにより、インビボSW480ヒト結腸がん異種移植モデルにおいて、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、様々な用量（0.5 mg/kg、2 mg/kg、および10 mg/kg）で腫瘍成長を阻害したこと、ならびに、10 mg/kgおよび0.5 mg/kgの用量についての抗腫瘍効力は、等価用量のIgG1-CONAについてよりも有意に高かったことが示される。
実施例32：皮下SNU-5胃がん異種移植モデルにおける、様々な用量の抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ効力
様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、CrownBiosciences, Taicang, Chinaで、皮下SNU-5ヒト胃がん異種移植モデルにおいて評定し、等価投薬のIgG1-CONAと比較した。細胞を、インビトロで、20％胎児ウシ血清を補給したIMDM培地における浮遊培養として、37℃で空気中5％ CO2の雰囲気において維持した。指数増殖期の細胞を収集し、1×107細胞を、6〜8週齢の雌CB17/SCIDマウス（Beijing HFK Bioscience）の側腹部中に、マトリゲル（1：1）と共に200μL PBSの体積において注射した。マウスの取扱いおよび腫瘍体積の測定は、実施例30に記載されているように行った。腫瘍接種の8日後に、平均腫瘍サイズは169 mm3に達し、マウスを、乱塊法を用いて群に割り当てて、処置を開始した。マウスを、Q7Dレジメンに従って、g体重あたり、10μL PBS中の200μg（10 mg/kg）、40μg（2 mg/kg）、または10μg（0.5 mg/kg）の抗体のi.v.注射によって2回処置した。対照群におけるマウスを、並行して、200μg（10 mg/kg）IgG1-b12で処置した。腫瘍接種後に、動物の福祉を毎日確認し、腫瘍体積を毎週2回測定した。
（表８）処置群および投薬、実施例32
Figure 2020522543
図31Aは、処置群あたりの平均腫瘍体積を示す。抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの全ての試験した用量は、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して腫瘍成長を阻害した。2 mg/kgおよび10 mg/kgの用量で、抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、完全な研究時間（処置開始後7週間）にわたって続いた完全な腫瘍退縮を結果としてもたらした。図31Bは、処置開始後23日目に、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせによる腫瘍成長阻害が、等価用量のIgG1-CONAよりも有意に良好であったことを示す（マン・ホイットニー検定、p＜0.05）。
図31Cは、500 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロットを示す。組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して、および等価用量のIgG1-CONAと比較して、腫瘍成長進行を有意に阻害した（腫瘍サイズカットオフ500 mm3でのマンテル・コックス分析：p＜0.05）。
これらのデータにより、インビボSNU-5ヒト胃がん異種移植モデルにおいて、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、様々な用量（0.5 mg/kg、2 mg/kg、および10 mg/kg）で腫瘍成長を阻害したこと、および、抗腫瘍効力は、等価用量のIgG1-CONAについてよりも有意に高かったことが示される。
実施例33：皮下SK-MES-1肺がん異種移植モデルにおける、様々な用量の抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ効力
様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、CrownBiosciences, Taicang, Chinaで、皮下SK-MES-1ヒト肺がん異種移植モデルにおいて評定し、等価投薬のIgG1-CONAと比較した。細胞を、インビトロで、10％胎児ウシ血清および0.01 mM NEAAを補給したMEM培地における単層培養として、37℃で空気中5％ CO2の雰囲気において維持した。0日目に、指数増殖期の接着性細胞を、トリプシン-EDTA処理によって収集した。5×106細胞を、6〜8週齢の雌BALB/cマウス（Shanghai Laboratory Animal Center）の側腹部中に、100μL PBSの体積において注射した。マウスの取扱いおよび腫瘍体積の測定は、実施例30に記載されているように行った。腫瘍接種の21日後に、平均腫瘍サイズは161 mm3に達し、マウスを、乱塊法を用いて群に割り当てて、処置を開始した。マウスを、Q7Dレジメンに従って、g体重あたり、10μL PBS中の200μg（10 mg/kg）、40μg（2 mg/kg）、または10μg（0.5 mg/kg）の抗体のi.v.注射によって2回処置した。対照群におけるマウスを、並行して、200μg（10 mg/kg）IgG1-b12で処置した。腫瘍接種後に、動物の福祉を毎日確認し、腫瘍体積を毎週2回測定した。
（表９）処置群および投薬、実施例33
Figure 2020522543
図32Aは、処置群あたりの平均腫瘍体積を示す。抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの全ての試験した用量は、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して腫瘍成長を有意に阻害し（p＜0.0001）、他方、IgG1-CONAは、10 mg/kg（p＜0.01）および2 mg/kg（p＜0.05）でIgG1-b12と比較して有意な効果を有しただけであったが、0.5 mg/kgでは効果を有さなかった（一元配置分散分析およびその後のダネットの多重比較検定）。図32Bは、処置開始後14日目に、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせによる腫瘍成長阻害が、2 mg/kgおよび0.5 mg/kgで等価用量のIgG1-CONAよりも有意に良好であったことを示す（独立t検定、それぞれ、p＜0.05およびp＜0.01）。
図32Cは、1.000 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロットを示す。組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して（腫瘍サイズカットオフ1.000 mm3でのマンテル・コックス分析：p≦0.001）、ならびに2 mg/kgおよび0.5 mg/kgで等価用量IgG1-CONAと比較して（腫瘍サイズカットオフ1.000 mm3でのマンテル・コックス分析：p＜0.05）、腫瘍成長進行を有意に阻害した。
これらのデータにより、インビボSK-MES-1ヒト肺がん異種移植モデルにおいて、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、様々な用量（0.5 mg/kg、2 mg/kg、および10 mg/kg）で腫瘍成長を阻害したこと、ならびに、抗腫瘍効力は、0.5 mg/kgおよび2 mg/kgで、等価用量のIgG1-CONAについてよりも有意に高かったことが示される。
実施例34：様々なヒトがん細胞株上のDR5発現レベル
細胞あたりのDR5密度を、実施例2に記載されているように、マウスモノクローナル抗体B-K29と共にQIFIKITを用いた間接免疫蛍光によって、様々なヒトがん細胞株について定量した。細胞株を、低いDR5発現（ABC＜10,000）および中等度のDR5発現（ABC＞10,000）に従って分類した。ヒトがん細胞株SK-MEL-5（ATCC, HTB-070）悪性黒色腫、Jurkat（ATCC, TIB-152）急性T細胞白血病、およびDaudi（ATCC, CCL-231）バーキットリンパ腫は、低いDR5発現を有することが見出された（QIFIKIT ABC範囲3,500〜6,500）。ヒト大腸がん細胞株SNU-C2B（ATCC, CCL-250）、LS411N（ATCC, CRL-2159）、およびDLD-1（ATCC, CCL-221）は、中等度のDR5発現を有することが見出された（QIFIKIT ABC範囲12,000〜44,500）。
実施例35：六量体化増強変異の導入は、IgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05抗体のDR5陽性ヒト結腸がん細胞に対する結合に影響を及ぼさない
ヒト結腸がん細胞HCT 116に対する結合を、E430G変異を有するおよび有さないIgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05の精製した抗体バリアントについてフローサイトメトリーによって分析した。単一細胞懸濁液を調製して、実施例3に記載されているように、連続希釈抗体調製物系列（4倍希釈において、0.0006〜10μg/mLの最終濃度の範囲）について、結合を分析した。二次抗体とのインキュベーション後に、細胞を2回洗浄し、100μL FACS緩衝液に再懸濁して、抗体結合を、BD LRSFFortessa細胞分析器（BD Biosciences）上で分析した。結合曲線を、GraphPad Prismソフトウェアを用いた非線形回帰分析（可変の傾きを有するシグモイド用量応答）を用いて分析した。
図33は、抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gが、E430G変異を有さないそれらの対応する抗体と類似した、HCT 116細胞に対する用量依存性結合を示したことを示す。E430G変異の導入は、DR5抗体の結合に対していかなる効果も有さなかった。EC50値は、6回の反復実験から、IgG1-hDR5-01-G56T-E430Gについて74.4 (+/- 58.4) ng/mL、およびIgG1-hDR5-05-E430Gについて101.2 (+/- 52.6) ng/mLと算出された。
実施例36：単一抗体としておよび組み合わせとしてのIgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの、DR5陽性ヒトがん細胞に対する結合
中等度のDR5発現を有するHCT 116ヒトがん細胞に対する抗体結合を、単一作用物質としておよび2種類の抗体の組み合わせとしての両方で、Alexa 647標識IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびAlexa 647標識IgG1-hDR5-05-E430Gの精製した試料についてフローサイトメトリーによって分析した。1 mg/mLのIgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gを、3の標識度に到達するように、0.1 M NaHCO3コンジュゲーション緩衝液において、5モル過剰量のAlexa Fluor（登録商標）647カルボン酸スクシンイミジルエステル（Molecular Probes；カタログ番号A-20006）で1時間、室温で標識した。遊離の過剰量のAlexa 647を、PD 10カラム（Amersham Bioscience、カタログ番号17-0851-01）上で除去した。単一細胞懸濁液を調製して、実施例3に記載されているように、連続希釈抗体調製物系列（5倍希釈において、0.0019〜30μg/mLの最終濃度の範囲）について結合を分析した。抗体インキュベーション後に、細胞を2回洗浄し、100μL FACS緩衝液に再懸濁して、抗体結合を、BD LRSFFortessa細胞分析器（BD Biosciences）上で分析した。結合曲線を、GraphPad Prismソフトウェアを用いた非線形回帰分析（可変の傾きを有するシグモイド用量応答）を用いて分析した。
図34は、クロスブロックしない抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの単一抗体および組み合わせの両方が、HCT 116ヒトがん細胞に対して用量依存性結合を示したことを示す。
実施例37：抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430GのカニクイザルDR5に対する結合
精製したIgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの、ヒトDR5またはカニクイザルDR5の短いアイソフォームを発現するCHO細胞に対する結合を、フローサイトメトリーによって分析した。デスドメインの機能喪失変異K386Nを有する短いアイソフォームのヒトDR5タンパク質（SEQ ID NO 47、Uniprot番号O14763-2に基づく）、ならびに、アミノ酸185〜213の欠失およびデスドメインの機能喪失変異K420Nを有するカニクイザルDR5タンパク質（SEQ ID NO 50；NCBIアクセッション番号XP_005562887.1に基づく）の発現のためのコドン最適化構築物を、実施例1に記載されているように生成した。DR5トランスフェクトCHO細胞に対する結合を、概して実施例5に記載されているように分析した。トランスフェクト細胞を、液体窒素中に保存し、37℃で素早く融解して、10 mL培地に懸濁した。細胞を、PBSで洗浄し、1.0×106細胞/mLの濃度でFACS緩衝液に再懸濁した。100μLの細胞懸濁液試料（ウェルあたり100,000細胞）を、96ウェルプレートに播種し、300×gで3分間、4℃での遠心分離によって沈殿させた。25μLの連続希釈抗体調製物系列（6倍希釈において、最終濃度0〜20μg/mL）を添加し、4℃で30分間インキュベートした。次に、細胞を、洗浄して、50μLの二次抗体R-PEコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2（Jackson ImmunoResearch；カタログ番号109-116-098；1/100）と4℃で30分間、光から保護してインキュベートした。細胞を、150μL FACS緩衝液で2回洗浄し、50μL FACS緩衝液に再懸濁して、抗体結合を、BD LRSFFortessa細胞分析器（BD Biosciences）上で10,000イベントを記録することによって分析した。結合曲線を、GraphPad Prism ソフトウェアを用いた非線形回帰分析（可変の傾きを有するシグモイド用量応答）を用いて分析した。
図35は、抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gが、CHO細胞上に発現しているヒトDR5およびカニクイザルDR5に対して用量依存性結合を示したことを示す。IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの両方について、ヒトDR5およびカニクイザルDR5に対する結合のEC50値は、4回の反復実験に基づいて同じ範囲にあった（表10）。
（表１０）ヒトDR5およびカニクイザルDR5に対するIgG1-hDR5-01-G56T-E430G およびIgG1-hDR5-05-E430Gの結合のEC50値。4回の実験に基づく。
Figure 2020522543
実施例38：E430G変異の導入は、クロスブロックしない抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05による細胞死誘導の効力を改善する
ヒト結腸がん細胞COLO 205を殺傷する抗体の能力に対する、IgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05における六量体化増強変異E430Gの効果を研究するために、生存率アッセイを行った。E430G変異を有するおよび有さない抗体を、単一作用物質として、および2種類のクロスブロックしない抗体の組み合わせとして試験した。COLO 205細胞を、実施例8に記載されているように収集した。100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル平底プレート（Greiner Bio-One、カタログ番号655182）に播種し、37℃で一晩接着させた。続いて、抗体濃度系列（4倍希釈において、0.3〜20,000 ng/mLの最終濃度の範囲）の50μL試料を添加して、37℃で3日間インキュベートした。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン（Sigma Aldrich、カタログ番号S6942）とインキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。
図36は、IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの組み合わせが、いずれかの抗体単独よりも強力であり、かつ、E430G変異を有さない抗体の組み合わせよりも強力であったことを示す。これらのデータにより、六量体化増強変異E430G変異の導入は、クロスブロックしない抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの接着性COLO 205結腸がん細胞に対する結合時に、細胞殺傷の誘導の増強を結果としてもたらしたことが示される。細胞を播種した時に抗体を直接添加した実験設定（実施例8）と対照的に、単一抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gは、試料を添加する前に細胞を96ウェル平底プレートに最初に接着させたこの実験において、COLO 205細胞に対する効力を示さなかった。
実施例39：六量体化増強変異S440Yの導入は、ヒト結腸がん細胞に対して細胞死を誘導する抗DR5抗体の効力を改善する
IgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05の単一抗体および組み合わせの、COLO 205ヒト結腸がん細胞を殺傷する能力に対する、六量体化増強変異S440Yの効果を、生存率アッセイにおいて研究した。細胞を収集して、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイを、実施例8に記載されているように行った。簡潔に言うと、100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を96ウェルプレートに播種し、同時に、50μLの連続希釈抗体調製物系列（4倍希釈において、0.0003〜20μg/mLの最終濃度の範囲）を添加して、37℃で3日間インキュベートした。
図37Aは、細胞を播種した時に抗体を直接添加した実験設定において、六量体化増強変異S440Yの導入は、単一抗体IgG1-hDR5-01-G56T-S440YおよびIgG1-hDR5-05-S440Yによる用量依存性殺傷を結果としてもたらし、他方、親の野生型抗体IgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05は、COLO 205結腸がん細胞を殺傷できなかったことを示す。また、IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05の組み合わせの効力も、両方の抗体においてS440Y変異の導入によって改善され、EC50の低下によって表示された（図37B）。
実施例40：六量体化増強変異E430Gの導入は、抗DR5抗体の組み合わせIgG1-DR5-CONA + IgG1-DR5-chTRA8による細胞死誘導の効力を改善する
抗体IgG1-DR5-CONA-K409RおよびIgG1-DR5-chTRA8-F405LについてのクロスブロックELISAを、実施例7に記載されているように行った。K409R変異およびF405L変異は、ここでは関連性がなく、E430G変異を有する抗体の効能に対していかなる効果も有さないことが事前に示された（実施例22）。図38Aは、競合抗体の非存在下でのDR5ECD-FcHisCtagの結合と比べた、競合抗体の存在下でのコーティングした抗体に対するDR5ECD-FcHisCtag結合の阻害パーセンテージとして表した、結合競合を示す（阻害％＝100−［(競合抗体の存在下での結合／競合抗体の非存在下での結合)］*100）。コーティングしたIgG1-DR5-CONA-K409Rに対するDR5ECD-FcHisCtagの結合は、可溶性IgG1-DR5-chTRA8-F405Lの存在下で阻害されなかった。逆に、コーティングしたIgG1-DR5-chTRA8-F405Lに対するDR5ECD-FcHistagの結合もまた、可溶性IgG1-DR5-CONA-K409Rの存在下で阻害されなかった。これらのデータにより、IgG1-DR5-CONA-K409RおよびIgG1-DR5-chTRA8-F405Lは、DR5ECD-FcHisCtagの結合について互いに競合しなかったことが示される。次に、クロスブロックしない抗DR5抗体の組み合わせIgG1-DR5-CONA-C49W + IgG1-DR5-chTRA-8の、付着したBxPC-3ヒト膵臓がん細胞を殺傷する能力に対する六量体化増強変異E430Gの効果を、実施例11に記載されているような生存率アッセイにおいて研究した。図38Bは、六量体化増強変異を有する抗体の組み合わせIgG1-DR5-CONA-C49W-E430G + IgG1-DR5-chTRA8-E430Gが、E430G六量体化増強変異を有さない親抗体の組み合わせと比較して、BxPC-3細胞の用量依存性殺傷の増加を示したことを示す。
実施例41：抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの、様々ながん細胞株において標的細胞殺傷を誘導する能力
クロスブロックしない抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、殺傷を誘導する効力を、様々なヒトがん細胞株について解析し、E430G変異を有さない親抗体の組み合わせおよびTRAILと比較した。HCT-15、HCT 116、HT-29、およびSW480結腸がん、BxPC-3、HPAF-II、およびPANC-1膵臓がん、SNU-5胃がん、A549およびSK-MES-1肺がん、ならびにA375皮膚がん細胞に対する生存率アッセイを、本質的に実施例11に記載されているように行った。簡潔に言うと、100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を、96ウェルプレートに播種し、37℃で一晩インキュベートした。50μLの抗体試料（133 nMの最終濃度）またはヒト組み換えTRAIL/APO-2L（eBioscience、カタログ番号BMS356；133 nMの最終濃度）を添加して、37℃で3日間インキュベートした。TRAILおよび抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gは両方とも、様々な適応症を起源とするヒトがん標的細胞株の殺傷を示す（図39）。抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの殺傷は、11種類の試験した細胞株のうち6種類において、対照抗体IgG1-b12と比較して有意であった。これらの応答する細胞株について、生細胞のパーセンテージは、抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gとのインキュベーション後に、E430G変異を有さない抗体の組み合わせとのインキュベーション後よりも有意に低かった。IgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430Gの殺傷効力とDR5標的発現レベル（実施例2に記載）との間には、いかなる相関もなかった。
実施例42：抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの細胞傷害効力についてのヒトがん細胞株パネルのスクリーニング
抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの活性を、14種類の腫瘍系統：腎臓がん、神経組織がん、大腸がん、胃がん、乳がん（主にトリプルネガティブ乳がん（TNBC））、非小細胞肺がん（NSCLC）、膀胱がん、膵臓がん、卵巣がん、黒色腫、肝臓がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、および小細胞肺がん（SCLC）に相当する235細胞株のパネルにおいて試験し、TRAILの活性と比較した。成長阻害解析を伴う72時間ATPliteアッセイ（120時間アッセイを行ったDLD-1およびHCT 116細胞株を除く）を、Horizon Discovery Ltd, UKで、2つの部分において行った。試料は、384ウェルアッセイプレートにおいて四連として試験した。0.072μMの最終濃度から開始した抗体の連続希釈系列を、全ての試験した細胞株について使用した。TRAIL（Invitrogen；カタログ番号PHC1634）については、第1の部分において試験した細胞株については0.01μMの最終濃度、およびスクリーニングの第2の部分において試験した細胞株については0.17μMの最終濃度から開始した連続希釈系列を使用した。阻害パーセンテージは、以下の式を用いて算出した：T≧V(0)の場合、阻害パーセンテージ＝100*［1−（T−V(0)）／（V−V(0)）］；T＜V(0)の場合、阻害パーセンテージは100％、式中、T＝試験試料の発光、V(0)＝0日目の培地対照試料の発光、およびV＝3日目の培地対照試料の発光。レスポンダー細胞株およびノンレスポンダー細胞株を、70％以上の阻害を示す細胞株をレスポンダーとして、および69％以下の阻害を示す細胞株をノンレスポンダーとして分類する、最大応答閾値によってグループ化した（図40；表11）。抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL単独療法の両方についてのレスポンダー細胞株を、小細胞肺がん（SCLC）を除いて、全ての試験した腫瘍適応症について見出した。
表１１：様々なヒトがん適応症：腎臓がん（A）、神経組織がん（B）、大腸がん（C）、胃がん（D）、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）（E）、非小細胞肺がん（NSCLC）（F）、膀胱がん（G）、膵臓がん（H）、卵巣がん（I）、黒色腫（J）、肝臓がん（K）、子宮内膜がん（L）、頭頸部がん（M）、および小細胞肺がん（SCLC）（N）に相当する細胞株のパネルについて、Horizon Discovery Ltd, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL単独療法の結果。IC50値および最大阻害のパーセンテージを表にしている。
（表１１Ａ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の腎臓がん細胞株スクリーニングの結果
Figure 2020522543
（表１１Ｂ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の神経組織がん細胞株スクリーニングの結果
Figure 2020522543
（表１１Ｃ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の大腸がん細胞株スクリーニングの結果
Figure 2020522543
（表１１Ｄ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の胃がん細胞株スクリーニングの結果
Figure 2020522543
（表１１Ｅ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の乳がん細胞株スクリーニングの結果
Figure 2020522543
（表１１Ｆ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の非小細胞肺がん（NSCLC）細胞株スクリーニングの結果
Figure 2020522543
（表１１Ｇ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の膀胱がん細胞株スクリーニングの結果
Figure 2020522543
（表１１Ｈ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の膵臓がん細胞株スクリーニングの結果
Figure 2020522543
（表１１Ｉ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の卵巣がん細胞株スクリーニングの結果
Figure 2020522543
（表１１Ｊ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の黒色腫細胞株スクリーニングの結果
Figure 2020522543
（表１１Ｋ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の肝臓がん細胞株スクリーニングの結果
Figure 2020522543
（表１１Ｌ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の子宮内膜がん細胞株スクリーニングの結果
Figure 2020522543
（表１１Ｍ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の頭頸部がん細胞株スクリーニングの結果
Figure 2020522543
（表１１Ｎ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の小細胞肺がん（SCLC）がん細胞株スクリーニングの結果
Figure 2020522543
実施例43：抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、様々な組み合わせ比でがん細胞殺傷を誘導する能力
抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、様々な比のIgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gで組み合わせた場合の、BxPC-3膵臓がん細胞およびHCT-15結腸がん細胞の殺傷を誘導する能力を研究するために、生存率アッセイを行った。連続希釈系列（5倍希釈において、0.006〜20μg/mLの最終濃度の範囲にわたる）の、1：0、9：1、3：1、1：1、1：3、1：9、および0：1の抗体比を、実施例16に記載されているようにCellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて試験した。
20μg/mL、4μg/mL、および0.8μg/mLの総抗体濃度で、BxPC-3（図41A）およびHCT-15（図41B）細胞の殺傷は、抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの両方を含有する全ての試験した抗体比で同等に有効であった。対照的に、単一抗体（1：0および0：1の比）は、殺傷を誘導しなかった。0.16μg/mLの総抗体濃度で、試験したIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの組み合わせは、より高い抗体濃度よりも小さい程度であったが、殺傷を誘導し、効力は、使用する様々な比によって影響を受ける。
実施例44：抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gは、カスパーゼ依存性プログラム細胞死を誘導する
カスパーゼ阻害剤の存在下および非存在下で、六量体化増強変異E430Gを有するおよび有さないIgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05の抗体バリアントの組み合わせの細胞傷害を比較するために、生存率アッセイを行った。抗体またはTRAIL試料の連続希釈系列（4倍希釈において、0.002〜133 nMの最終濃度の範囲）でのCellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイを、実施例18に記載されているように行った。
BxPC-3細胞の殺傷は、TRAILならびに抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05およびIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gについて、汎カスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMKの存在下で阻害された（図42）。これらのデータにより、TRAILと同様に、抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05およびIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gは、カスパーゼ依存性プログラム細胞死を誘導したことが示される。
実施例45：ヒトがん細胞に対する抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの結合時の、カスパーゼ-3およびカスパーゼ-7の活性化
カスパーゼ-3/7の活性化を、本質的に実施例20に記載されているように、カスパーゼ-Glo 3/7アッセイを用いて時間において測定した。簡潔に言うと、細胞を、トリプシン処理によって収集し、セルストレーナーを通過させ、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させて、1.6×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。25μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり4,000細胞）を、384ウェル培養プレート（Perkin Elmer、カタログ番号6007680）に播種し、37℃で一晩インキュベートした。25μLの試料を添加し（26.6 nMの最終濃度）、37℃で1、2、4 、および6時間インキュベートした。プレートを、インキュベーターから取り出し、室温まで温度を低下させた。細胞を、300 gで3分間の遠心分離によって沈殿させた。25μLの上清を除去し、25μLのカスパーゼ-Glo 3/7基質によって置き換えた。500 rpmで1分間振盪することによって混合した後、プレートを、室温で1時間インキュベートした。発光を、EnVision Multilabel Reader（Perkin Elmer）上で測定した。
1、2、4〜6時間の時間経過において、TRAILおよび抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gは両方とも、六量体化増強変異を有さないWT抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05と比較して、BxPC-3細胞に対してより迅速な、かつより強力なカスパーゼ-3/7の活性化を誘導した（図43）。
実施例46：抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gのインビトロの効能は、二次的Fc架橋剤の存在を必要としない
抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、二次的抗体架橋剤の非存在下および存在下でヒトHCT-15結腸がん細胞およびBxPC-3膵臓がん細胞の殺傷を誘導する能力を比較するために、生存率アッセイを行った。二次的抗体架橋剤の存在下で殺傷の増強を示すことが公知であるIgG1-DR5-CONAを、比較のために同じアッセイにおいて試験した。二次的架橋剤の非存在下および存在下での生存率アッセイを、本質的に実施例21に記載されているように行った。簡潔に言うと、100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を、96ウェルプレートに播種し、37℃で一晩インキュベートした。ヤギ抗ヒトIgG抗体のF(ab')2断片の非存在下または存在下の、50μLの抗体試料（最終濃度4μg/mL）と、37℃で3日間インキュベートした。細胞殺傷の陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリンとインキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。
組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gは、BxPC-3およびHCT15細胞において強力な殺傷を誘導し、細胞傷害は、二次的架橋剤の存在下でさらには増強されなかった（図44）。対照的に、IgG1-DR5-CONAおよび野生型抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05の効力は、BxPC-3およびHCT15の両方において、二次的架橋剤の存在によって増強された。これらのデータにより、抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430GによるBxPC-3およびHCT15がん細胞の殺傷は、二次的Fc架橋剤の存在とは無関係であることが示される。
実施例47：ヒトDR5またはカニクイザルDR5のいずれかを一過性にトランスフェクトしたCHO細胞に対するIgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの結合時の、補体活性化
抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの、補体を活性化する能力を解析するために、ヒトDR5またはサルDR5のいずれかの短いアイソフォームを一過性にトランスフェクトしたCHO細胞に対してインビトロ補体依存性細胞傷害（CDC）アッセイを行い、補体成分C3cの沈着を測定した。DR5構築物は、アゴニスト抗体の結合時のアポトーシスの誘導による殺傷を阻止するために、それらのデスドメイン中にK386N（ヒト）またはK420N（カニクイザル）の変異を保有していた。ヒトDR5またはサル（カニクイザル（Macaca fascicularis））DR5でのCHO細胞の一過性トランスフェクションは、実施例1に記載されているように行った。
CDCアッセイのために、0.1×106細胞を、ポリスチレン丸底96ウェルプレート（Greiner bio-one、カタログ番号650101）において精製抗体の濃度系列と、80μLの総体積中で15分間、振盪機上、RTでプレインキュベートした。次に、20μLの正常ヒト血清（NHS；カタログ番号M0008 Sanquin, Amsterdam, The Netherlands）を、補体の供給源として添加し、37℃インキュベーターにおいて45分間インキュベートした（20％の最終NHS濃度；3倍希釈において、0.003〜10.0μg/mLの最終抗体濃度）。プレートを氷上に置くことによって反応を停止し、その後、遠心分離によって細胞を沈殿させて、上清を30μLの2μg/mLヨウ化プロピジウム溶液（PI；Sigma Aldrich, Zwijnaarde, The Netherlands）によって置き換えた。PI陽性細胞のパーセンテージを、Intellicyt iQue（商標）スクリーナー（Westburg）上でフローサイトメトリーによって決定した。データを、GraphPad PRISM 5において対数変換された濃度を用いた非線形用量応答適合の最良適合値を用いて分析した。
C3b沈着の解析のために、0.1×106細胞を、丸底96ウェルプレートにおいて精製抗体の濃度系列（3倍希釈において、0.003〜10.0μg/mLの最終抗体濃度）と、80μLの総体積中で15分間、振盪機上、RTでプレインキュベートした。次に、20μLのC5枯渇血清（Quidel；カタログ番号A501）を、補体の供給源として添加し、37℃インキュベーターにおいて45分間インキュベートした（20％の最終NHS濃度）。細胞を沈殿させ、続いて、50μLのFITC標識ポリクローナルウサギ抗ヒトC3c補体（Dako；カタログ番号F0201；2μg/mL）とFACS緩衝液において30分間、4℃でインキュベートした。細胞を、FACS緩衝液で2回洗浄し、30μL FACS緩衝液に再懸濁した。細胞上へのC3b沈着を、Intellicyt iQue（商標）スクリーナー（Westburg）上でフローサイトメトリーによって決定した。データを、GraphPad PRISM 5において対数変換された濃度を用いた非線形用量応答適合の最良適合値を用いて分析した。
DR5トランスフェクトCHO細胞に対する補体依存性殺傷（図45A〜B）およびC3b沈着（図45C〜D）の両方が、IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gについて、両方の単一抗体および組み合わせについて用量応用曲線で観察された。これらのデータにより、IgG1抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの、細胞表面上の標的結合時に補体活性化を誘導する内因性能力が、両方の単一抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430G、ならびに組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gについて保存されていたことが示される。
実施例48：ヒト結腸がん細胞株に対する、化合物のパネルでの抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの効力増強についての、薬物併用スクリーニング解析
抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gと併用して相乗的な阻害効果を提示する臨床的に関連性のある化合物を特定するために、様々な治療的分類に相当する100種類の化合物を、結腸がん細胞株における潜在的な相乗効果についてスクリーニングした。成長阻害分析を伴う、72時間（LS-411N, SNU-C2B、およびSW480について）または120時間（DLD-1およびHCT 116について）のATPliteアッセイを、Horizon Discovery Ltd, UKで、384ウェルアッセイプレートにおいて6×6の最適化された組み合わせマトリックスで行った。全ての試料は、四連で試験した。成長阻害パーセンテージは、以下の式を用いて算出した：T≧V(0)の場合、成長阻害パーセンテージ＝100*［1−（T−V(0)）／（V−V(0)）］；T＜V(0)の場合、 成長阻害パーセンテージ＝100*［1−（T-V(0)）／V(0)］、式中、T＝試験試料の発光、V(0)＝0日目の培地対照試料の発光、およびV＝3日目の培地対照試料の発光。相乗効果を特定するために、平均自己クロス活性を、代表的な化合物を用いて各々の治療的分類について決定した。Loewe相加性を超過する併用効果を測定するため、Horizon Discovery Ltdは、相乗効果スコアと呼ばれる相乗的相互作用の強さを特徴決定するためのスカラー測定を考案した。相乗効果スコア方程式は、相加性についてのLoeweモデルを用いた、成分作用物質の活性に数値的に由来するモデル表面を超過する、マトリックスにおける各点での実験的に観察された活性体積を積分する。相乗効果スコア方程式における追加的な用語は、個々の作用物質について使用される種々の希釈係数について正規化するため、および実験全体にわたる相乗効果スコアの比較を可能にするために使用される。陽性阻害ゲーティングまたはIデータ乗数を含めることにより、ゼロ効果レベル近くのノイズを除去し、高い活性レベルで起こる相乗的相互作用についての結果に偏らせる。相乗効果スコア（S）は、以下の式を用いて算出した： S＝log fX log fY Σ max（0,Iデータ）（Iデータ−ILoewe）、式中、fx,y ＝各々の単一作用物質について使用される希釈係数。平均自己クロス＋3σよりも大きい相乗効果スコアを、99％信頼レベルで候補相乗効果と考えた。
表12は、100種類の試験した化合物全てについての相乗効果スコアを示す。抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gとの相乗効果は、化学療法剤（細胞骨格調節因子およびDNA/RNA損傷物質を含む）、キナーゼ阻害剤、PI3K経路阻害剤、RAS阻害剤、アポトーシス調節剤、プロテアソーム阻害剤、エピジェネティック修飾因子（HDAC阻害剤を含む）、および他のものを含む、様々な治療的分類由来の化合物で、1つまたは複数の細胞株について観察された。図46は、抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gと併用した試験化合物の成長阻害効果の、5種類の例を示す。ビリナパント（図46C）、オキサリプラチン（図46A）、イリノテカン（図46B）、およびパクリタキセル（図46E）は、IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの効果を増強した例であり、他方、バリシチニブ（図46D）は、IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの活性に対していかなる効果も示さなかった例である。
（表１２）結腸がん細胞株LS-411N、SNU-C2B、SW480、DLD-1、およびHCT 116に対する生存率アッセイにおいてIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gと併用して試験した、様々な治療的分類の100種類の化合物についての相乗効果スコア。相乗効果（相乗効果スコア＞平均自己クロス＋3σ）を灰色で示す。
Figure 2020522543
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実施例49：皮下COLO 205結腸がん異種移植モデルにおける、抗DR5抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gのインビボ効力
抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、皮下COLO 205ヒト結腸がん異種移植モデルにおいて、単一抗体および両方の抗体の組み合わせについて評定し、E430G変異を有さない親抗体と比較した。腫瘍細胞接種、マウスの取扱い、腫瘍増生の測定、および終点決定は、本質的に実施例26に記載されているように行った。3×106細胞を、5〜8週齢の雌SCIDマウス（C.B-17/IcrHan（登録商標）Hsd-Prkdcscid；Harlan）の側腹部中に、100μL PBSの体積において注射した。9日目に、平均腫瘍体積を測定し、マウスを、同等の腫瘍サイズ分散を有する群に選別した。マウスを、9日目に、200μL PBS中の10μg（0.5 mg/kg）抗体の静脈内（i.v.）注射によって処置した。対照群におけるマウスは、10μg（0.5 mg/kg）IgG1-b12で処置した。
（表１３）処置群および投薬
Figure 2020522543
図47Aは、時間における処置群あたりの平均腫瘍体積を示す。単一抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430GにおけるE430G変異の導入は、E430G変異を有さない親抗体と比較して、腫瘍成長の阻害の増強を結果としてもたらした。抗体の組み合わせでの処置は、IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430GおよびE430G変異を有さない親抗体の組み合わせの両方について、完全な腫瘍退縮を誘導した。19日目に、DR5抗体で処置した全ての群における平均腫瘍サイズは、陰性対照抗体IgG1-b12で処置した動物におけるものよりも有意に小さかった（マン・ホイットニー検定（P＜0.001））（データは示していない）。図47Bは、500 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロットを示す。陰性対照抗体IgG1-b12で処置したマウスと比較して、腫瘍増生は、抗DR5抗体で処置した全ての群において有意に遅延していた（腫瘍サイズカットオフ500 mm3でのマンテル・コックス分析：p＜0.0001）。六量体化増強変異E430Gを有さない単一抗体IgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05で処置したマウスは、他の試験した抗DR5抗体で処置したマウスと比較して有意に早期に、腫瘍増生を示した（腫瘍サイズカットオフ500 mm3でのマンテル・コックス分析：p＜0.0001）。
実施例50：皮下HCT15結腸がん異種移植モデルにおける抗DR5抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05のインビボ効力に対する、六量体化増強変異の効果
抗DR5抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、CrownBiosciences, Taicang, Chinaで、皮下HCT15ヒト結腸がん異種移植モデルにおいて、E430G六量体化増強変異を有さないIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05のものと比較した。細胞を、インビトロで、10％胎児ウシ血清を補給したRPMI-1640培地における単層培養として、37℃で空気中5％ CO2の雰囲気において維持した。指数増殖期の接着性細胞を、トリプシン-EDTA処理によって収集した。5×106細胞を、7〜9週齢の雌BALB/cヌードマウスの側腹部中に、100μL PBSの体積において注射した。研究中の動物の世話および使用は、Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care（AAALAC）の規則に従って実施した。腫瘍体積を、毎週2回、カリパスを用いて二次元で測定し、体積を、式：V＝0.5 a×b2（式中、aおよびbは、それぞれ、腫瘍の長径および短径である）を用いてmm3で表した。平均腫瘍サイズが161 mm3に達した時に、マウスを、乱塊法を用いて群に割り当て、処置を開始した（群あたり8匹のマウス）。マウスを、Q7Dレジメンに従って、0.5 mg/kgの抗体（組み合わせにおいては0.25 mg/kgの各抗体）のi.v.注射によって3回処置した。対照群におけるマウスを、並行して、0.5 mg/kg IgG1-b12で処置した。
図48Aは、処置群あたりの平均腫瘍体積を示す。抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gは、IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05よりも良好な腫瘍成長阻害を示した。21日目に、組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gで処置したマウスにおける平均腫瘍サイズは、等価用量のIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05で処置したマウスにおいてよりも有意に小さかった（マン・ホイットニー検定：P＜0.0011）（図48B）。図48Cは、750 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロットを示す。組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gで処置したマウスにおける腫瘍増生は、等価用量のIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05で処置したマウスにおいてよりも有意に後であった。
これらのデータにより、抗DR5抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430GにおけるE430G六量体化増強変異の導入は、HCT15ヒト結腸がん細胞でのインビボ異種移植モデルにおいて、腫瘍成長阻害の増強を結果としてもたらしたことが示される。
実施例51：皮下SK-MES-1ヒト肺がん異種移植モデルにおける、パクリタキセルと併用したIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gのインビボ効力
IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、CrownBiosciences, Taicang, Chinaで、皮下SK-MES-1ヒト肺がん異種移植モデルにおいてパクリタキセルと併用して評定した。細胞培養、腫瘍細胞接種、マウスの取扱い、腫瘍増生の測定、および終点決定は、実施例33に記載されているように行った。腫瘍接種の21日後に、平均腫瘍サイズは167 mm3に達し、マウスを、乱塊法を用いて群に割り当てて、処置を開始した。表14に示したように、マウスを、Q7Dレジメンに従って、g体重あたり、10μL PBSにおいて両方を投薬した2 mg/kg抗体および15 mg/kgパクリタキセルのi.v.注射によって2回処置した。
（表１４）処置群および投薬、実施例53
Figure 2020522543
図49Aは、処置群あたりの平均腫瘍体積を示す。抗体処置単独（2 mg/kg IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）、または15 mg/kgパクリタキセルと併用した2 mg/kg抗体処置、または15 mg/kgパクリタキセル単独は全て、IgG1-b12と比較して抗腫瘍効力を実証した。図49Bは、16日目の処置群あたりの腫瘍体積を示す。全ての処置群において、腫瘍負荷は、IgG1-b12と比較して有意に低かった（マン・ホイットニー検定、p＜0.01）。図49Cは、500 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロットを示す。15 mg/kgパクリタキセルと2 mg/kg IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G抗体との併用は、パクリタキセルまたは抗体単独と比較して、進行のない生存を有意に延長させた（ゲーハン・ブレスロー・ウィルコクソン検定、腫瘍サイズカットオフ500 mm3：p＜0.05）。
実施例52：IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの薬物動態（PK）解析
IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gのクリアランス速度を、E430G変異を有さない親抗体と比較して、単一化合物についておよび2種類の抗体の組み合わせについて、SCIDマウスにおけるPK実験において研究した。
7〜10週齢の雌SCID（C.B-17/IcrHan@Hsd-Prkdc<scid, Harlan）マウス（群あたり3匹のマウス）に、200μLの注射体積において20μgの抗体（1 mg/kg）を静脈内注射した。50〜100μLの血液試料を、抗体投与後10分、4時間、1日、2日、7日、14日、および21日に、伏在静脈から採集した。血液を、ヘパリン含有バイアル中に採集し、10,000 gで5分間、遠心分離した。血漿試料を、4種類の最初の時点については1：20（285μL PBSA（0.2％ウシ血清アルブミン（BSA）を補給したPBS）中、15μL試料）で、最後の2種類の時点については1：10（270μL PBSA中、30μL試料）で希釈して、抗体濃度の決定まで-20℃で保存した。
総ヒトIgG濃度を、サンドイッチELISAを用いて決定した。マウス抗ヒトIgG-κmAbクローンMH16（CLB Sanquin、カタログ番号M1268）を、捕捉抗体として使用し、100μLにおいて4℃で一晩、96ウェルMicrolon ELISAプレート（Greiner, Germany）にPBS中2μg/mLの濃度でコーティングした。プレートを、プレート振盪機上で1時間、RTでPBSAとインキュベートすることによってブロッキングした。洗浄後、100μLの連続希釈した血漿試料（3倍希釈において、0.037〜1μg/mLの範囲）を添加して、プレート振盪機上で1時間、RTでインキュベートした。プレートを、300μL PBST（0.05％ Tween 20を補給したPBS）で3回洗浄し、続いて、プレート振盪機上で1時間、RTで100μLのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG免疫グロブリン（番号109-035-098, Jackson, West Grace, PA；0.2％ BSAを補給したPBSTにおいて1：10.000）とインキュベートした。プレートを再び、300μL PBSTで3回洗浄し、その後、15分間、RTでの100μLの基質2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸)［ABTS；Roche、カタログ番号11112 422001；50 mL ABTS緩衝液（Roche、カタログ番号11112 597001)中、1錠］と、光から保護してインキュベートした。100μLの2％シュウ酸の添加およびRTで10分間のインキュベーションによって、反応を停止した。吸光度を、マイクロプレートリーダー（Biotek, Winooski, VT）において405 nmで測定した。参照曲線として注入した物質を用いることによって、濃度を算出した。プレート対照として、精製ヒトIgG1（The binding site、カタログ番号BP078）を含めた。ヒトIgG濃度（μg/mLにおける）をプロットし（図50A）、曲線下の面積（AUC）を、Graphpad prism 6.0を用いて算出した。血液試料採取の最後の日（21日目）までのクリアランスを、式D*1.000/AUC（式中、Dは注射の用量（1 mg/kg）である）によって決定した（図50B）。
IgG1-hDR5-01-G56T-E430GまたはIgG1-hDR5-05-E430Gと、E430G変異を有さないそれらの親抗体との間には、単一作用物質として注射した時またはそれらの組み合わせとして注射した時の両方で、血漿クリアランス速度においていかなる差も観察されなかった（図50）。
実施例53：六量体化増強変異E430Gを有する抗DR5抗体IgG1-DR5-CONAは、ヒト結腸がん細胞を殺傷することができる
本研究は、六量体化増強変異E430Gを有する抗DR5抗体IgG1-DR5-CONAの、付着したヒト結腸がん細胞COLO 205を殺傷する能力を例証する。COLO 205細胞を、実施例8に記載されているように収集した。100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を、96ウェル平底プレートに播種し、37℃で一晩インキュベートした。抗体濃度系列（4倍希釈において、0.04〜10μg/mLの最終濃度の範囲）の50μL試料を添加して、37℃で3日間インキュベートした。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリンとインキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。発光を、EnVision Multilabel Reader（PerkinElmer）上で測定した。データを、GraphPad Prismソフトウェアを用いた非線形回帰（可変の傾きを有するシグモイド用量応答）を用いて分析し、プロットした。生細胞パーセンテージは、以下の式を用いて算出した：生細胞％＝［（抗体試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）／（抗体なし試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）］*100。
図51は、六量体化増強変異E430Gの導入が、IgG1-DR5-CONA-E430Gによる用量依存性殺傷を結果としてもたらし、他方、親の野生型抗体 IgG1-DR5-CONAは、付着したCOLO 205結腸がん細胞を殺傷できなかったことを示す。
実施例54: 抗体IgG1-hDR5-05-E430Gの製剤開発
使用される略語:
Figure 2020522543
材料:
抗体IgG1-hDR5-05-E430Gは、特に明記しない限り、20 mg/mlで製剤化された。
方法
示差走査熱量測定(DSC)
タンパク質サンプルの融解温度は、MicroCal Capillary DSC装置を用いて決定された。
外観
外観は視覚的評価によって決定された。
pH
pHは、Mettler Toledo SevenMulti pHメーターを用いて測定された。
UV A280によるタンパク質含有量
タンパク質含有量は、Agilent UV/Vis分光光度計(モデル8453)を用いUV/Vis分光法によって決定された。
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)
サイズ排除クロマトグラフィーは、TOSOH, TSK-gel G-3000SWxL (7.8 × 300 mm)カラム(Sigma)を用い、Agilent 100 HPLCシステムにて実施された。
画像化キャピラリー等電点電気泳動(icIEF)
PrinCE Autosamplerを搭載したiCE 3アナライザーを用いて、キャピラリー等電点電気泳動を実施した。
キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム(CE-SDS)
還元および非還元キャピラリー電気泳動は、Beckman Coulter PA800Plusシリーズキャピラリー電気泳動システム(Series Capillary Electrophoresis System)を用いて実施された。サンプルの還元にはベータメルカプトエタノールが用いられた。
動的光散乱(DLS)
動的光散乱は、Wyatt DynaPro Plate Readerを用いて実施された。
結果
1. ベースライン生物物理学的スクリーニング
初期の生物物理学的スクリーニングを実施して緩衝液/pHの組み合わせを選択し、賦形剤スクリーニングに進んだ。表15は初期緩衝液スクリーニングから得られたデータを示し、ここではグルタミン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩およびリン酸塩の緩衝液を試験した。DSCおよびDLSを用いて熱安定性を評価した。DSC分析により、T開始とともに融解温度(Tm1およびTm2)が得られた。DLS分析は、タンパク質の多分散性および流体力学的半径に関する情報を提供した。DSCデータに基づき、グルタミン酸塩pH 5.0、酢酸塩pH 5.5、およびコハク酸塩pH 6.0は、低pHの対応物と比較した場合に高いT開始を有していた。T開始値が高いほど、タンパク質の熱安定性が高いことを示している。pH 5.5、6.0および6.5の全てのヒスチジン製剤は、比較的高いT開始値を示し、これらの値はpHの増加とともにわずかに増加した。それぞれ、pH 6.0および7.0のクエン酸塩緩衝液のT開始は54℃であったが、pH 7.5のリン酸塩のT開始は54℃であった。初期の生物物理学的スクリーニングからのDLSデータの結果は、DSCから得られた製剤結果と強く相関していなかった。具体的には、より高いpHを有する製剤において高度の多分散性が観察され、DSCにおいて観察されたようにより高い熱安定性を示した。例えば、ヒスチジン pH 5.5は、それぞれ10.8および15.6の%Pdを呈したpH 6.0および6.5と比べて、6.3の%Pdを有していた(表15)。リン酸塩およびクエン酸塩製剤は、他の製剤と比べて最も高い%Pdを有していた。DSCおよびDLSから得られたデータに基づき、グルタミン酸塩pH 5.0、酢酸塩pH 5.5、ヒスチジンpH 5.5およびコハク酸塩pH 6.0製剤を、様々な賦形剤の存在下においてさらにスクリーニングした。リン酸塩およびクエン酸塩製剤は、高い%多分散性およびこれらの緩衝液中でのタンパク質の不安定化の潜在的可能性のため選択されなかった。
（表１５）初期ベースラインスクリーンからの融解温度 DSC(上)、DLS(下)
Figure 2020522543
上記で選択された製剤を、150 mMアルギニン、塩化ナトリウム、スクロースおよびソルビトールの存在下においてスクリーニングした。ベースライン生物物理学的スクリーニングのこの部分のデータを表16に示す。グルタミン酸塩pH 5.0は、安定化賦形剤ソルビトールおよびスクロースの存在下でさえも、おそらくは低pHのゆえに、賦形剤の存在下において最も低いT開始を有していた。表16に示されたデータに基づき、酢酸塩製剤の場合、スクロースの存在下においてT開始が上昇することが観察された。ヒスチジン製剤の場合、スクロースおよびソルビトールの存在下においてT開始の上昇が観察された。コハク酸塩製剤の場合、スクロースを含有するものにおいて唯一、T開始の上昇が観察された。酢酸塩サンプルの場合、NaClおよびアルギニンからなる製剤は、それぞれ51℃および52℃のT開始値を有していた。NaClを含有するヒスチジン製剤は、アルギニンの存在下での製剤と比較して高いT開始値を示した。アルギニンを有するヒスチジン製剤のT開始値は47℃であったが、NaClの存在下でのヒスチジン製剤のT開始値は51℃であった。荷電賦形剤を含有するコハク酸塩製剤のT開始値は同等であった(54℃)。開始値は他の3つの緩衝液のタイプと比べて、荷電賦形剤を含有するコハク酸塩緩衝液の場合に全体として最高であったが、ヒスチジンおよびコハク酸塩緩衝液は、ソルビトールおよびスクロースの存在下においてグルタミン酸塩および酢酸塩緩衝液よりも高い開始値を示した。
（表１６）賦形剤を有するベースライン緩衝液からの融解温度 DSC(上)、DLS(下)
Figure 2020522543
Figure 2020522543
DLSの結果(表16)に基づき、スクロースおよびソルビトールからなる全ての製剤は、高分子凝集体の形成を示すマルチモーダルかつ高い流体力学的半径の%Pdを示した。また、DLSデータから、荷電賦形剤である塩化ナトリウムおよびアルギニンの存在下でのこれらの製剤が低い%Pdを有することが実証された。
全体として、DSCとDLSの両方から得られたデータにより、NaClの存在下でのpH 5.5の25 mM酢酸塩ならびに塩化ナトリウムの存在下でのpH 5.5のアルギニンおよびヒスチジン製剤が、さらなる製剤開発に向けていっそう優れた候補であることが示唆された。
2. NaClスクリーニング
抗体IgG1-hDR5-05-E430Gを、4つの異なる濃度のNaCl (0、25、50、および100 mM NaCl)の存在下において30 mMヒスチジン pH 5.5中40 mg/mLで製剤化して、溶解度および相分離に及ぼす影響を判定した。サンプルは、予冷却された凍結乾燥機の棚上-5±3℃で24時間貯蔵された。24時間後、サンプルのセットを外観により試験した。調製されたサンプルのいずれでも相分離は観察されなかった。
3. 界面活性剤スクリーニング
抗体IgG1-hDR5-05-E430Gを0、0.03、または0.06% w/v Tween-80の存在下において30 mMヒスチジン pH 5.5中で製剤化し、3回の凍結融解サイクルでストレスを加えた。同一のサンプルを48時間撹拌した。サンプルストレス後、サンプルのセットを外観、A280、SEC、還元CE-SDS、および非還元CE-SDSにより試験した。
3.1 外観
界面活性剤スクリーニング研究におけるいずれのサンプルでも、サンプル間に視覚的な違いは観察されなかった。全てのサンプルはわずかに黄色の乳白色の液体で、目に見える微粒子はなかった。
3.2 UV A280によるタンパク質含有量
UV分析によって得られた抗体濃度は有意差がなく、18.54〜20.73 mg/mLの範囲であった(データは示されていない)。
3.3 SEC
単量体の純度に有意差はなく、界面活性剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークは観察されなかった。全てのサンプルの純度は98.8〜99.0%であった(データは示されていない)。
3.4 還元CE-SDS
純度(LCおよびHC%)に有意差はなく、界面活性剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークは観察されなかった。全てのサンプルの純度は95.6〜96.1%であった(データは示されていない)。
3.5 非還元CE-SDS
主ピーク純度に有意差はなく、界面活性剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークは観察されなかった。全てのサンプルの純度は90.5%〜92.1%であった(データは示されていない)。
3.6 界面活性剤スクリーニングからの結論
0、0.03、および0.06% PS-80の濃度を含む、ストレスを加えていないサンプルとストレスを加えたサンプルとの間で、外観、タンパク質濃度、または純度の変化は観察されなかった。これらのデータは、界面活性剤がこれらの製剤中の抗体の安定性を向上させないことを示している。
4. 抗凍結剤スクリーニング
抗凍結剤スクリーニングでは、抗体IgG1-hDR5-05-E430Gを、3つの異なる濃度(0、5、または10% w/v)のスクロースを有する30 mMヒスチジン pH 5.5中で製剤化し、3回の凍結融解サイクルでストレスを加えた。同一のサンプルを48時間撹拌した。サンプルストレス後、サンプルのセットを外観、A280、SEC、還元CE-SDS、および非還元CE-SDSにより試験した。
4.1 外観
3回の凍結融解サイクルでストレスを加え、48時間撹拌した0%、5%、または10%スクロースを含有するサンプル間で視覚的な違いは観察されなかった。全てのサンプルはわずかに黄色の乳白色の液体で、目に見える微粒子はなかった。
4.2 UV A280によるタンパク質含有量
UV分析によって得られた抗体濃度は有意差がなかった。濃度は19.06〜24.86 mg/mLの範囲であった(データは示されていない)。
4.3 SEC
単量体の純度に有意差はなく、抗凍結剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークの成長は観察されなかった。全てのサンプルの純度は98.9〜99.1%であった(データは示されていない)。
4.4 還元CE-SDS
純度(LCおよびHC%)に有意差はなく、抗凍結剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークの成長は観察されなかった。全てのサンプルの純度は95.3〜95.9%であった(データは示されていない)。
4.5 非還元CE-SDS
主ピーク純度に有意差はなく、抗凍結剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークの成長は観察されなかった。全てのサンプルの純度は91.5〜92.0%であった(データは示されていない)。
4.6 抗凍結剤スクリーニングからの結論
0%、5%および10%スクロースの濃度を含む、ストレスを加えていないサンプルとストレスを加えたサンプルとの間で、外観、タンパク質濃度、または純度の変化は観察されなかった。これらのデータは、抗凍結剤がこれらの製剤中の抗体の安定性を向上させないことを示していた。
5. DoE安定性試験
DoE試験の製剤デザインを表17に示す。サンプルを5±3℃および40±2℃/75±5% RHで最大4週間貯蔵した。初期サンプルをpH、UV、およびDSCによって試験した。貯蔵後、サンプルのセットを外観、pH、A280、DLS、SEC、icIEF、CE-SDS (還元および非還元)によって試験した。
（表１７）抗体IgG1-hDR5-05-E430G DoE試験のための製剤の指定
Figure 2020522543
＊-三つ組で調製されたサンプル
5.1 DSC (初期)
初期DSCデータを表18に示す。ヒスチジン製剤の場合、より高いpHの製剤の場合に高いT開始値が得られることが観察された。この傾向は、pHの増加に伴ってより高いT開始値が観察された初期ベースラインスクリーニングにおいて得られたデータと相関していた。ヒスチジン製剤pH 6.0は、pH 5.0およびpH 5.5でのヒスチジン製剤と比較して最も高いT開始値を実証した。ヒスチジンpH 6.0製剤のT開始値は50〜53℃の範囲であった。ヒスチジンpH 5.0製剤は43〜46℃の範囲であり、一方ヒスチジンpH 5.5製剤は47〜51℃の範囲であった。スクロースおよびソルビトールからなる製剤の場合に高いT開始値が観察された。製剤F13、F14、F28、およびF29は、スクロースおよびソルビトールを含有する製剤の場合に高いT開始値を示した。酢酸塩製剤の場合に、同様の傾向が観察された。より高いpHでの製剤は、より高い開始値を示した。酢酸塩製剤pH 6.0およびpH 5.5は、NaClおよびアルギニンの存在下および非存在下で高いT開始値を示した。酢酸塩pH 6.0製剤は52〜54℃の範囲であり、一方酢酸塩pH 5.5製剤は51〜54℃の範囲であった。酢酸塩pH 5.0製剤は、45〜49℃という最も低いT開始範囲を示した。
（表１８）初期DSC結果
Figure 2020522543
5.2 UV A280によるタンパク質含有量
UV A280によるタンパク質含有量の結果は、18.47〜21.95 mg/mLの全サンプルタンパク質濃度を示していた(データは示されていない)。サンプルF8、F24、およびF22は、わずかに低いタンパク質濃度を有しており、これは実験のばらつきによる可能性が高い。全体として、初期の時点で観察されたタンパク質濃度の有意な変化は認められなかった。
5.3 外観
5±3℃での4週間時点の全サンプル調製物は透明で、わずかに黄色であった。5±3℃での大部分のサンプル調製物は、生成物に関連しないものと思われる粒子を示さなかった。F5-3、F7、F8、F29、およびF30は少数の粒子を含有していた。40±2℃/75±5% RHでのサンプルは、乳白色のサンプルF20-1およびF23を除き、わずかに黄色かつ透明であった。40±2℃/75±5% RHでの製剤は、粒子なしから多くの粒子を有するまでに及んだ。酢酸塩製剤の場合、製剤F1は粒子を示さなかった。製剤F2、F5、F6、およびF10は粒子をほとんど有していなかったが、製剤F3、F4、F7、F8、F9、F11、F12、F13、F14およびF15は多くの粒子を有していた。ヒスチジン製剤の場合、F17およびF26は多くの粒子を示した。F16、F18、F23、F25、F29、およびF30は、粒子をほとんど示さなかった。残りの製剤F19、F20、F21、F22、F24、F27およびF28は粒子を有していなかった。
5.4 pH
製剤の標的pH値を表19に示す。酢酸塩製剤の場合、5±3℃および40±2℃/75±5% RHでの4週間の時点で有意なシフトが観察された。初期時点および5±3℃での酢酸塩製剤のpH差の範囲は0.12〜0.30であった。40±2℃/75±5% RHでストレスを加えたこれらのサンプルにおいて観察されたpHのシフトは0.44〜1.01であった。ヒスチジン製剤の場合、5±3℃および40±2℃/75±5% RHでの4週間の時点で、顕著なpHシフトは観察されなかった。4週間の試験で観察されたヒスチジン製剤のpHの違いは、実験のばらつきに起因しうる。全体として、ヒスチジンpH 6.0製剤は、他の製剤と比べて賦形剤の有無にかかわらずpHの変化を受けなかった。酢酸塩製剤はpHのシフトを受けやすく、そのため酢酸塩は抗体にとってあまり適切でない成分である。大幅なpHシフトもタンパク質の分解を加速させる可能性がある。一方、ヒスチジンpH 6.0製剤は有望な成分であることが証明された。酢酸塩製剤のpHシフトが観察されるため、今後説明される安定性の結果では、ヒスチジン製剤(F16〜F30)に焦点を当てている。
（表１９）抗体IgG1-hDR5-05-E430G DoE試験のためのpHの結果
Figure 2020522543
5.5 UV A280によるタンパク質含有量
5±3℃サンプルのA280測定値の範囲は19.87〜23.59 mg/mLであったが、40±2℃/75±5% RHのA280測定値の範囲は19.81〜26.38 mg/mLであった(データは示されていない)。A280測定値の有意なシフトは観察されなかった。観察されたUV含有量の範囲は、実験のばらつきによる可能性が高かった。データは、緩衝液濃度、pH、および賦形剤濃度に関するいかなる傾向も示さなかった。
5.6 SEC
4週間の時点のSECの結果を表20に示す。まずpH 6.0のヒスチジン製剤の場合、荷電賦形剤の存在により製剤の安定性が改善されることが観察された。また、荷電賦形剤の存在下でのpHの上昇により、ヒスチジン製剤の安定性が改善されることが観察された。40±2℃/75±5% RHで、荷電賦形剤の存在下での製剤の総不純物%の減少が観察された。40±2℃/75±5%の製剤F20-1は84.2%の最低の純度を有していた。この中心点の製剤の他の2つの複製物は非常に純粋であるため、これは予期せぬ異常な結果であり、この複製物は外れ値とみなされる。40±2℃/75±5% RHでのヒスチジンpH 5.0製剤F17、F18およびF19の場合、総不純物%は5.0〜5.8%の範囲であった。ヒスチジンpH 5.5製剤F21、F22、およびF23の総不純物%は4.1〜7.3%の範囲であり、一方ヒスチジンpH 6.0製剤F25、F26、およびF27は3.5〜3.8％の範囲の総不純物%を有していた。より高いpHが総不純物%の減少につながり、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤がより高い安定性を示したことは明らかであった。スクロースまたはソルビトールを含有するヒスチジン製剤の場合に、総不純物%の増加が観察された。総不純物%は、賦形剤を有しないpH 6.0製剤の場合に5±3℃で3.8％および40±2℃/75±5% RHで6.9%であった。全体として、荷電賦形剤NaClおよびアルギニンの存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤(製剤F25、F26、およびF27)は、より高い安定性を有していた。
（表２０）SEC結果(F16〜F30)
Figure 2020522543
5.7 icIEF
サンプルの電荷不均一性は、5±3℃および40±2℃/75±5% RHにて4週間の時点でicIEFを用いて判定された(表21)。5±3℃および40±2℃/75±5% RHでのサンプルのicIEF結果は、5℃にて4週間の時点でのヒスチジン製剤の酸性変種率が、製剤F16〜F28の場合に56.2〜58.9%の範囲であることを示していた(データは示されていない)。スクロースおよびソルビトールからなった製剤F29およびF30の場合、酸性変種率は、それぞれ60.4%および63.8%であった。これらの違いは、そのプロファイルのF25との比較で見られるように有意であるものと思われる。40±2℃/75±5% RHで、F29およびF30は、45.9%および61.6%の酸性変種率を有していた。スクロースからなる製剤F29の場合、40±2℃/75±5% RHにて32.4%までの塩基性変種の有意な増加が認められた。40±2℃/75±5% RHにて4週間の時点で、全てのヒスチジン製剤は61.6%〜71.6%の範囲の酸性変種率の増加を実証した。製剤F29は、40±2℃/75±5% RHで45.9%の酸性変種率を示した。icIEFデータは、サンプルのpHが電荷不均一性に影響を与えることを示した。pH 5.0のヒスチジン製剤は、pH 5.5および6.0のヒスチジン製剤と比較して、酸性変種の有意な増加を示した。ヒスチジンpH 5.0製剤の場合、40±2℃/75±5% RHの酸性変種率の範囲は71.3〜71.6%であった。40±2℃/75±5% RHで、ヒスチジンpH 5.5の酸性変種率の範囲は63.5〜67.1%であったが、ヒスチジンpH 6.0の酸性変種率の範囲は65.3〜66.1%であった。脱アミド化はより高いpH値で加速されることが知られているため、この結果は脱アミド化によるものではない可能性が高く、ここでは逆の傾向が観察される。全ての製剤にわたり、これらの結果から、ヒスチジンpH 5.5および6.0はヒスチジンpH 5.0製剤よりも優れた製剤であり、スクロースおよびソルビトールからなるヒスチジン製剤では有意な分解が観察されることが示された。
（表２１）icIEF DoE試験による電荷不均一性の結果(F16〜F30)
Figure 2020522543
Figure 2020522543
5.8 還元CE-SDS
還元CE-SDSの結果を表22に示す。5±3℃にて4週間の時点で、pHに関係なく全てのヒスチジン製剤は同等の純度を示した。40±2℃/75±5% RHにて4週間の時点で、結果から、サンプル調製物の全てについて不純物の増加が示された。より低いpHでの製剤は、40±2℃/75±5% RHでより多くの分解を示すことが観察された。ヒスチジンpH 5.0製剤は、純度率の大幅な低下を示した。純度率の範囲は77.5〜82.8%であった。ヒスチジンpH 5.5製剤の場合、純度率は80.1〜91.2%の範囲であった。ヒスチジンpH 6.0製剤の場合に有意な分解は観察されなかった。ヒスチジンpH 6.0製剤の純度率は、4週間の時点で40±2℃/75±5% RHにて89.7〜91.1%の範囲であった。さらに、ヒスチジンサンプルの% LMWは、低pHでのヒスチジンサンプルで高く、高pHでのヒスチジン製剤でかなり低かった。ヒスチジンpH 5.0製剤の% LMWの範囲は13.7〜18.4%であった。一方、ヒスチジンpH 5.5および6.0製剤は、5.9〜12.9%および5.0〜6.3%の% LMW範囲を示した。ヒスチジンpH 6.0製剤の場合、荷電賦形剤の存在下において純度率が有意に低下しないことも観察された。全ての製剤にわたり、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤は、他のヒスチジン製剤と比べて高い純度を示した。
（表２２）還元キャピラリー電気泳動の結果(F16〜F30)
Figure 2020522543
5.9 非還元CE-SDS
非還元CE-SDSの結果を表23に示す。酢酸塩製剤(F1〜F15)から得られた結果は、pHシフトがこれらの製剤で観察されるため考慮されない。5±3℃でのアルギニンからなる製剤、すなわち製剤F18、F19、F22、F23、F26およびF27の場合に、有意な高% HMW不純物が観察された。不純物のこの増加は、NaClの存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤(F25)、すなわち製剤F17、F21およびF25の場合に観察されなかった。以前の結果は、荷電賦形剤(NaClおよびアルギニン)の存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤が最適条件であることを示唆していた。非還元CE-SDSデータから得られた結果は、NaClを有するヒスチジンpH 6.0製剤が、アルギニンを有するヒスチジンpH 6.0よりも優れた選択肢であることを裏付けている。
（表２３）非還元CE-SDSの結果(F16〜F30)
Figure 2020522543
5.10 DLS
酢酸塩製剤は、pHシフトがこれらの製剤で観察されるため考慮されていない。DLSデータ(示されていない)に基づき、pHが低いとヒスチジン製剤の多分散性が高くなることが観察された。ヒスチジンpH 5.0製剤F17、F18、およびF19は、多分散性の有意な増加を有していた。例えば、5±3℃での製剤F17の%Pdは10.2および7.0であり、40±2℃/75±5% RHで4週間後20.8および18.7に増加した。同様に、ヒスチジンpH 5.5製剤F21、F22、およびF23は、40±2℃/75±5% RHで%Pdの増加を有していた。例えば、製剤F23は5±3℃で6.3および10.4の%Pdを有していた。%Pdは、40±2℃/75±5% RHで17.1および21.7に増加した。荷電賦形剤(NaClおよびアルギニン)の存在下での大部分のヒスチジンpH 6.0製剤は、両方のストレス条件での多分散性の変化に耐性であった。製剤F25、F26、およびF27は、%Pdの有意な増加を示さなかった。例えば、製剤F25は、5±3℃で9.4および8.9の%Pdを示した。40±2℃/75±5% RHでの%Pdは、8.3および10.2であった。さらに、スクロースの存在下での製剤(F19)は、両方の条件で高い多分散性を示した。F29の%Pdは5±3℃で23.7および23.4であったが、40±2℃/75±5% RHでの%Pdは23.2であった。5±3℃条件の%Pdは、この方法では既にかなり高く、既に、高次凝集体の存在を示唆していた。したがって、%Pdが高温でも変化しなかったという事実は、驚くことではない。高い多分散性は、初期ベースライン生物物理学的スクリーニングDLSデータでも観察された。同様に、ソルビトールを有する製剤(F30)の場合に高い%Pdが観察された。興味深いことに、ソルビトールおよびNaClを含有するF28は、高い%Pdを示さなかったが、これは最適な製剤の成分としてNaClが理想的な選択肢であるという概念をさらに支持している。4週間の時点で製剤F28の場合に高い%Pdは観察されなかった。40±2℃/75±5% RHでの製剤F30の%Pdは、15.4および14.2であった。全体として、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤は、多分散性の最小の変化を示した。pH 5.5でスクロースおよびソルビトールを含有する両方のヒスチジン製剤は、両方のストレス条件で高い%Pdを示した。
6. 結論
表17に記載されている様々な製剤中の抗体IgG1-hDR5-05-E430Gの分析試験から得られた結果に基づくと、製剤F25 (30 mMヒスチジン、150 mM NaCl pH 6.0)がこの分子に最適な製剤であった。初期ベースライン生物物理学的スクリーニングの結果から、pH 5.5での酢酸塩およびヒスチジン製剤が最適な緩衝液/pH条件であることが示唆された。さらに、ソルビトールおよびスクロースと比較した場合、アルギニンおよびNaClが賦形剤の優れた選択肢であった。界面活性剤および抗凍結剤の試験により、製剤の安定性を増強するためにPS-80もスクロースも必要とされないことが示された。DoE安定性試験の場合、初期DSCの結果により、30 mMヒスチジンpH 6.0製剤がより高いT開始融解温度値を有することが確認された。全ての30 mM酢酸塩製剤において有意なpHシフトが観察された。ヒスチジンpH 6.0製剤は、5±3℃および40±2℃/75±5% RHで4週間の安定性にわたりpHの有意な変化を示さなかった。SECデータから、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 6.0はIgG1-hDR5-05-E430Gの最大の安定性を付与することが実証された。icIEFの結果から、pH 5.5および6.0のサンプルが電荷不均一性の変化に対してより耐性であることが示された。また、スクロースおよびソルビトールの存在下での製剤が最大の分解を示すことも明らかにされた。DLSデータから、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤が多分散性の最小の変化を有することが示された。還元CE-SDSの結果から、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤は最良の製剤であることが示された。非還元CE-SDSデータから、アルギニンの存在下でのサンプルは、NaClを含有するサンプルには存在しない高%HMW不純物を示すことが明らかにされた。全体として、利用可能なデータの積上げにより、この抗体に対してのヒスチジンおよび塩化ナトリウムを含有する製剤の選択が支持される。
実施例55: 抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430Gの製剤開発
材料、機器および方法
使用した材料、機器および方法は、抗体がIgG1-hDR5-05-E430GではなくIgG1-hDR5-01-G56T-E430Gであることを除いて、実施例54と同じであった。
結果
1. 初期ベースライン生物物理学的スクリーニング
初期の生物物理学的スクリーニングを実施して緩衝液/pHの組み合わせを選択し、賦形剤スクリーニングに進んだ。DSCおよびDLSを用いて熱安定性を評価した。DSC分析により、T開始とともに融解温度(Tm1およびTm2)が得られた。DLS分析は、タンパク質の多分散性および流体力学的半径に関する情報を提供した。全範囲の製剤でDSCデータの傾向が観察された。T開始値は46℃〜55℃の範囲であった(データは示されていない)。T開始値が高いほど熱安定性が高いことを示しているため、最も低いT開始値を有する、極端に低いおよび高いpHの緩衝液(グルタミン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、およびリン酸塩)は最適ではない。コハク酸塩およびヒスチジン緩衝液ならびに酢酸塩pH 5.5のT開始値から、pH 5.5〜6.5のこれら2つの緩衝液がいっそう高い熱安定性を付与することが示唆された。
DLSデータのpHを増加させる一連の緩衝液にわたり傾向が観察された(データは示されていない)。一般に、緩衝液の全範囲にわたって、pHを増加させるといっそう高いレベルの多分散性が観察され、より高いpHの緩衝液ではより高いレベルの凝集が示された。その各pHレベルの両方でのグルタミン酸塩および酢酸塩緩衝液は、最も低いレベルの多分散性(3.5%〜7.6%の%Pd)を有していた。25 mMヒスチジンpH 5.5 (6.9% %Pd)を除いて、残りの緩衝液は、13.8%〜23.3%の範囲に及ぶいっそう高いレベルの多分散性を有していた。
初期の生物物理学的スクリーニングからのDLSデータの結果は、いくつかの製剤についてDSCから得られた製剤ランキング結果と強く相関していた。リン酸塩およびクエン酸塩緩衝液は、高度の%Pd (14.1%〜18.9%)および比較的低いT開始値(48℃〜51℃)を示した。凝集および熱不安定性の証拠により、これら2つの製剤はさらなる試験から除外された。他の製剤(グルタミン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、ヒスチジン)は、DSCデータとDLSデータの間に強い相関関係を有していなかった。例えば、25 mMヒスチジンpH 6.0および6.5は、それぞれ、18.5%および23.3%の%Pdを有していたが、これら2つの緩衝液はそれぞれ最高のT開始値53℃および55℃を示した。グルタミン酸塩および酢酸塩pH 4.5緩衝液の両方とも46℃〜50℃というやや低いT開始値を有していたが、最も低い%Pd値(3.5%〜7.6%)を有していた。最後に、pH 5.5および6.0でのコハク酸塩緩衝液は、それぞれ50℃および54℃の、より高いT開始値を示したが、高レベルの多分散性(それぞれ13.8%および14.7%)を有することが観察された。前述の緩衝液製剤の結果は決定的でないため、全4つの緩衝液(グルタミン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、およびヒスチジン)を、さらなる試験に向けて賦形剤を用いた生物物理学的スクリーニングにおいて用いた。
2. 賦形剤を用いた生物物理学的スクリーニング
上記で選択された製剤は、150 mMアルギニン、塩化ナトリウム、スクロースまたはソルビトールの存在下においてスクリーニングされた。データを表24に示す。
DSCおよび賦形剤での抗体の生物物理学的スクリーニングのデータにおいて傾向が明らかであった。概して、荷電賦形剤を有する製剤は、スクロースまたはソルビトールを有する製剤よりも低いT開始値を有していた。全範囲の緩衝液において、pHが増加すると、DSCにてT開始値(46℃〜55℃に及ぶ範囲)の一般的な増加も認められ、緩衝液pHの増加が抗体に大きな熱安定性を付与したことを示していた。
DLSデータ全体で一般的な傾向も観察された。これらのデータによれば、荷電賦形剤(アルギニンおよびNaCl)を含有する製剤は、糖(ソルビトールおよびスクロース)を含有する製剤と比べて、多分散性のレベルが低いため、見かけの凝集レベルが低いことが分かった。糖を含有するこれらの製剤は、高いレベルの多分散性を有するだけでなく、場合によっては、ソルビトールを含有する酢酸塩緩衝液ならびにソルビトールおよびスクロースを含有するヒスチジン緩衝液について、マルチモーダルとの指定で示されるように、2つの異なるタンパク質集団を含んでもいた。この傾向の例外は、25 mMコハク酸塩の全ての製剤において見られ、この全てが荷電賦形剤または糖賦形剤の存在に関係なく高レベルの多分散性を示した。
低pHでのグルタミン酸塩のT開始値が著しく低いこと、およびタンパク質骨格の低pH酸加水分解の可能性のため、グルタミン酸塩緩衝液はさらなる試験から除外された。さらに、コハク酸塩緩衝液は、荷電賦形剤を有する製剤を含めて、その全ての製剤間で高レベルの多分散性があるため、さらなる試験から除外された。それゆえ、生物物理学的スクリーニングデータは、塩化ナトリウムおよびアルギニンの存在下のpH 5.5の25 mM酢酸塩およびヒスチジン製剤が、さらなる製剤開発のためのさらに優れた候補であったことを示唆している。
（表２４）賦形剤でのベースライン緩衝液スクリーニングからの結果(DSCおよびDLS)
Figure 2020522543
Figure 2020522543
3. 溶解度試験
抗体を、4つの異なる濃度のNaCl (0、25、50、および100 mM NaCl)を有する基本製剤(30 mMヒスチジン、pH 5.5)中40 mg/mLで製剤化して、溶解度および相分離に及ぼす影響を判定した。サンプルは、予冷却された凍結乾燥機の棚上-5±3℃で24時間貯蔵された。24時間後、サンプルのセットを外観により試験した。調製されたサンプルのいずれでも相分離は観察されなかった。
4. 界面活性剤スクリーニング
抗体を0、0.03、または0.06% w/v Tween-80の存在下において30 mMヒスチジン pH 5.5中で製剤化し、3回の凍結融解サイクルでストレスを加えた。同一のサンプルを48時間撹拌した。サンプルストレス後、サンプルのセットを外観、A280、SEC、還元CE-SDS、および非還元CE-SDSにより試験した。
4.1 外観
界面活性剤スクリーニング研究におけるいずれのサンプルでも、サンプル間に視覚的な違いは観察されなかった。全てのサンプルはわずかに黄色の乳白色の液体で、目に見える微粒子はなかった。
4.2 A280によるタンパク質含有量
UV分析によって得られた抗体濃度は、異なる濃度のPS-80を有する、撹拌され凍結融解されたサンプルと対照サンプルとの間で有意差がなく、17.80〜21.32 mg/mLの範囲であった(データは示されていない)。
4.3 サイズ排除クロマトグラフィー
単量体の純度に有意差はなく、界面活性剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークの成長は観察されなかった。全てのサンプルの純度は98.4〜98.7%であった(データは示されていない)。
4.4 還元キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム
純度(軽鎖および重鎖%)に有意差はなく、界面活性剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークは観察されなかった。全てのサンプルの純度は95.4〜95.8%であった(データは示されていない)。
4.5 非還元キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム
主ピーク純度に有意差はなく、界面活性剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークは観察されなかった。全てのサンプルの純度は91.2%〜91.3%であった(データは示されていない)。
4.6 界面活性剤スクリーニングからの結論
0、0.03、および0.06% PS-80の濃度を含む、ストレスを加えていないサンプルとストレスを加えたサンプルとの間で、外観、タンパク質濃度、または純度の変化は観察されなかった。これらのデータは、界面活性剤が抗体の安定性を向上させないことを示している。
5. 抗凍結剤スクリーニング
抗凍結剤スクリーニングでは、抗体を、3つの異なる濃度(0、5、または10% w/v)の、スクロースを有する30 mMヒスチジン pH 5.5中で製剤化し、3回の凍結融解サイクルでストレスを加えた。同一のサンプルを48時間撹拌した。サンプルストレス後、サンプルのセットを外観、A280、SEC、還元CE-SDS、および非還元CE-SDSにより試験した。
5.1 外観
3回の凍結融解サイクルでストレスを加え、48時間撹拌した0%、5%、または10%スクロースを含有するサンプル間で視覚的な違いは観察されなかった。全てのサンプルはわずかに黄色の乳白色の液体で、目に見える微粒子はなかった。
5.2 A280によるタンパク質含有量
UV分析によって得られた抗体濃度は有意差がなかった。濃度は19.03〜22.92 mg/mLの範囲であった(データは示されていない)。
5.3 サイズ排除クロマトグラフィー
単量体の純度に有意差はなく、抗凍結剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークの成長は観察されなかった。全てのサンプルの純度は98.4〜99.0%であった(データは示されていない)。
5.4 還元キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム
純度(軽鎖および重鎖%)に有意差はなく、抗凍結剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークの成長は観察されなかった。全てのサンプルの純度は95.1〜95.7%であった(データは示されていない)。
5.5 非還元キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム
主ピーク純度に有意差はなく、抗凍結剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークの成長は観察されなかった。全てのサンプルの純度は90.3〜91.9%であった(データは示されていない)。
5.6 抗凍結剤スクリーニングからの結論
0%、5%および10%スクロースの濃度を含む、ストレスを加えていないサンプルとストレスを加えたサンプルとの間で、外観、タンパク質濃度、または純度の有意な変化は観察されなかった。これらのデータは、抗凍結剤が抗体の安定性を向上させないことを示していた。
6. DoE安定性試験
試験デザインおよび方法論は、実施例54において用いられたものと同一であった。試験中の全ての製剤のリストについては、上記の表17を参照されたい。
6.1 DSC (初期)
初期DSCデータを表25に示す。ヒスチジン製剤の場合、より高いpHの製剤の場合に高いT開始値が得られることが観察された。この傾向は、pHの増加に伴ってより高いT開始値が観察された初期ベースラインスクリーニングにおいて得られたデータと相関していた。ヒスチジン製剤pH 6.0は、pH 5.0およびpH 5.5でのヒスチジン製剤と比較して最も高いT開始値を実証した。ヒスチジンpH 6.0製剤のT開始値は47〜52℃の範囲であった。ヒスチジンpH 5.0製剤は42〜45℃の範囲であり、一方ヒスチジンpH 5.5製剤は46〜50℃の範囲であった。スクロースおよびソルビトールからなる製剤の場合に高いT開始値が観察された。製剤F13、F14、F28、およびF29は、スクロースおよびソルビトールからなる製剤の場合に高いT開始値を示した。これは、折り畳まれた状態のタンパク質に浸透圧調節物質が及ぼす影響のためと予想される。酢酸塩製剤の場合に、同様の傾向が観察された。より高いpHでの製剤は、より高い開始値を示した。酢酸塩製剤pH 6.0およびpH 5.5は、NaClおよびアルギニンの存在下および非存在下で高いT開始値を示した。酢酸塩pH 6.0製剤は52〜54℃の範囲であり、一方酢酸塩pH 5.5製剤は49〜53℃の範囲であった。酢酸塩pH 5.0製剤は、45〜49℃の最も低いT開始範囲を示した。
（表２５）初期DSC結果 DOE試験用抗体サンプル
Figure 2020522543
6.2. UV (初期)
初期時点のタンパク質濃度の範囲は18.52〜21.86 mg/mLであった(データは示されていない)。全体として、初期時点でタンパク質濃度の有意な変化は観察されなかった。
6.3 外観
5±3℃での4週間時点の大部分のサンプル調製物は透明で、わずかに黄色であった。サンプルF28およびF29 (これはソルビトールまたはスクロースのいずれかを含有していた)は、5±3℃で乳白色であった。5±3℃および40±2℃/75±5% RHでの酢酸塩緩衝液およびヒスチジン緩衝液の両方における大部分のサンプル調製物は、少数の粒子を示した。両方の条件でのサンプルは、ヒスチジンで調製された一部のサンプルを除いて、わずかに黄色かつ透明であった。40±2℃/75±5% RH条件の場合、ヒスチジン製剤F20-1、F20-2、F20-3、F24、F28、F29、およびF30は、乳白色であった。これらの製剤は賦形剤を有していないか、またはそれらはスクロースもしくはソルビトールを有する。
6.4 pH
酢酸塩製剤の場合、5±3℃および40±2℃/75±5% RHでの4週間の時点で有意なpHシフトが観察された(データは示されていない)。初期時点および5±3℃での酢酸塩製剤のpH差の範囲は0.10〜0.29であった。40±2℃/75±5% RHでストレスを加えたこれらのサンプルにおいて観察されたpHのシフトは0.07〜1.30であった。ヒスチジン製剤の場合、5±3℃および40±2℃/75±5% RHでの4週間の時点で、pHシフトが観察されたが、しかしその変化は酢酸塩サンプルのものよりもはるかに少なかった。初期時点および5±3℃でのヒスチジン製剤のpH差の範囲は0.02〜0.16であった。このタイプの変化は、少量のサンプルに対しての方法のばらつきに起因しうる。40±2℃/75±5% RHでストレスを加えたこれらのサンプルにおいて観察されたpHのシフトは0.02〜0.94であった。
大幅なpHシフトもタンパク質の分解を加速させる可能性がある。酢酸塩製剤は、ヒスチジン製剤と比べてはるかに高いレベルでpHのシフトを受けやすく、このことが酢酸塩をこの抗体に不適切な成分にしている。酢酸塩製剤のpHシフトが観察されるため、今後説明される安定性の結果では、ヒスチジン製剤(F16〜F30)に焦点を当てている。
6.5 UV A280によるタンパク質含有量
5±3℃サンプルのA280測定値によるタンパク質含有量の測定範囲は、14.66〜21.70 mg/mLであったが、40±2℃/75±5% RHのA280測定値の範囲は18.12〜40.42 mg/mLであった(データは示されていない)。40±2℃/75±5% RHでF20-1、F20-2、F20-3、F24、およびF28の場合にA280測定値に有意なシフトが観察された。これらの同じサンプルは、外観試験において乳白色であることが観察された。観察されたタンパク質濃度の増加により、これらの結果は見かけのUV濃度を増大させる、生成物に関連しないUV吸収剤によるものである可能性が高い。
6.6 サイズ排除クロマトグラフィー
4週間の時点のSECの結果を表26に示す。ヒスチジン製剤では有意な変化が起こり、タンパク質濃度が高く、外観が乳白色であることが分かった(F20-1、F20-2、F20-3、F24、およびF28、F29、F30)。これらのサンプルの場合、移動相の素通り画分において有意なUV吸収ピークが観察された。これらのSECデータは、既に論じられた他の裏付けとなる分析と同様に、これらの製剤がUV吸収性の非生成物関連成分を含有していたことを示している。高温ストレス条件で、荷電賦形剤を有しないヒスチジン製剤が分解し、このUV吸収成分として作用したという可能性がある。ヒスチジン製剤の場合、荷電賦形剤の存在により製剤の安定性が改善されることが観察された。また、pHの上昇により、ヒスチジン製剤の純度が改善されることが観察された。40±2℃/75±5% RHで、荷電賦形剤の存在下での製剤の総不純物%の減少が観察された。40±2℃/75±5% RHでのヒスチジンpH 5.0製剤F17、F18およびF19の場合、総不純物%は4.2〜4.9%の範囲であった。ヒスチジンpH 5.5製剤F21、F22、およびF23の総不純物%は3.6〜5.6%の範囲であり、一方ヒスチジンpH 6.0製剤F25、F26、およびF27は3.2〜3.4％の範囲の総不純物%を有していた。一般に、より高いpHが総不純物%の減少につながり、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤がより高い安定性を示した。全体として、荷電賦形剤NaClおよびアルギニンの存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤は、より高い安定性を有していた。
（表２６）SECトレンディング結果DoE試験 -5±3℃(F16〜F30)
Figure 2020522543
（表２６）（続き）40±2℃/75±5% RH (F16〜F30)
Figure 2020522543
6.7 画像化キャピラリー等電点電気泳動
抗体サンプルの電荷不均一性は、icIEFを用いて判定された(表27)。データに基づくと、5±3℃での4週間時点のヒスチジン製剤の主ピーク率は、45.6〜47%の範囲であった。40±2℃/75±5% RHで、ソルビトールまたはスクロースからなる製剤F28、F29およびF30は、それぞれ11.2%、19.0%、および11.5%の塩基性変種率の有意な増加を有していた。40±2℃/75±5% RHでの4週間の時点で、全てのヒスチジン製剤が塩基性変種率の増加を実証した。icIEFデータは、サンプルのpHが電荷不均一性に影響を与えることを示した。pH 5.0のヒスチジン製剤は、pH 5.5および6.0のヒスチジン製剤と比較して、塩基性変種のより有意な増加を示した。ヒスチジンpH 5.0製剤の場合、40±2℃/75±5% RHの塩基性変種率の範囲は6.3〜7.2%であった。40±2℃/75±5% RHで、ヒスチジンpH 5.5の塩基性変種率の範囲は5.5〜6.4%であったが、ヒスチジンpH 6.0製剤の塩基性変種率の範囲は4.4〜4.7%であった。脱アミド化はより高いpH値で加速されることが知られているため、この結果は脱アミド化によるものではない可能性が高く、ここでは逆の傾向が観察される。塩基性変種の急増は、HMWまたはLMW種などの他の不純物の形成による可能性がある。全ての製剤にわたり、これらの結果から、ヒスチジンpH 6.0はヒスチジンpH 5.0およびpH 5.5製剤よりも優れた製剤であり、スクロースおよびソルビトールからなるヒスチジン製剤では有意な分解が観察されることが示された。
（表２７）電荷不均一性の結果-DoE試験(F16〜F30)
Figure 2020522543
6.8 還元キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム
還元キャピラリー電気泳動の結果を表28に示す。5±3℃にて4週間の時点で、pHに関係なく全てのヒスチジン製剤は同等の純度を示したが、スクロースおよびソルビトールを有する製剤は純度がやや劣っていた。
40±2℃/75±5% RHにて4週間の時点で、結果から、サンプル調製物の全てについて不純物の増加が示された。より低いpHでの製剤は、40±2℃/75±5% RHでより多くの分解を示すことが観察された。ヒスチジンpH 5.0製剤は、純度率の大幅な低下を示した。純度率の範囲は86.3〜88.9%であった。ヒスチジンpH 5.5製剤の場合、純度率は85.0〜92.3%の範囲であった。ヒスチジンpH 6.0製剤の場合、分解が有意に少ないことが観察された。ヒスチジンpH 6.0製剤の純度率は、4週間の時点で40±2℃/75±5% RHにて90.1〜93.1%の範囲であった。さらに、ヒスチジンサンプルの% LMWは、低pHでのヒスチジンサンプルで高く、高pHでのヒスチジン製剤でかなり低かった。ヒスチジンpH 5.0製剤の% LMWの範囲は8.3〜11.0%であったが、ヒスチジンpH 5.5および6.0製剤は、5.4〜12.1%および4.0〜6.6%の% LMW範囲を示した。ヒスチジンpH 6.0製剤の場合、荷電賦形剤の存在下において純度率が有意に低下しないことも観察された。全ての製剤にわたり、荷電賦形剤NaClおよびアルギニンの存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤は、他のヒスチジン製剤と比べて高い純度を示した。
（表２８）還元キャピラリー電気泳動の結果 - DoE試験(F16〜F30)
Figure 2020522543
（表２８）（続き）40±2℃/75±5% RH
Figure 2020522543
6.9 非還元キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム
非還元キャピラリー電気泳動の結果を表29に示す。5±3℃でのヒスチジン製剤の場合、製剤F23およびF29は、他のヒスチジン製剤と比べて3.6%および3.3%の高% HMWを示した。40±2℃/75±5% RHでストレスを加えたヒスチジン製剤の場合、製剤F28、F29およびF30は、それぞれ36.8%、49.3%および37.4%の非常に高い%総不純物を示した。さらに、製剤F20およびF24は、高い%不純物を示した。これらの製剤は、賦形剤を含有しないか、またはスクロースもしくはソルビトールを含有していた。データに基づき、40±2℃/75±5% RHでストレスを加えたサンプルのpH値が高いほど、%総不純物が低くなることが観察された。ヒスチジン製剤pH 5.0の場合、%総不純物は11.8〜15.0%の範囲であった。pH 5.5でのヒスチジン製剤(製剤F21、F22およびF23)の場合、%総不純物は10.7〜12.3%の範囲であり、一方pH 6.0でのヒスチジン製剤(F25、F26およびF27)の%総不純物は9.8〜10.0%の範囲であった。非還元CE-SDSデータから得られた結果により、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤は、他のヒスチジン製剤と比べてさらに高い純度を示したことが確認される。
（表２９）非還元キャピラリー電気泳動の結果 - DoE試験(F16〜F30)
Figure 2020522543
（表２９）（続き）40±2℃/75±5% RH
Figure 2020522543
6.10 動的光散乱
酢酸塩製剤は、pHシフトがこれらの製剤で観察されるため考慮されていない。ヒスチジン製剤のDLSデータに基づき、製剤F20-2、F24、F28およびF30は5±3℃で高い%Pd値を示した(データは示されていない)。製剤F29は、溶液中のタンパク質粒子の存在を示す%Pdのマルチモーダルとの指定を有していた。以前のデータは、前述の製剤が最適な条件ではないことも示した。スクロースおよびソルビトールからなる製剤は、両方の温度条件で高い%Pdを示した。これは、初期ベースラインスクリーニング試験のDLSデータでも見られた。40±2℃/75±5% RHでのヒスチジン製剤の場合、より低いpHで、%Pdの増加が認められることが観察された。pH 5.0のヒスチジン製剤の場合、40±2℃/75±5% RHでの%Pdは4.7〜18.2%の範囲であった。pH 5.5のヒスチジン製剤(F21、F22、およびF23)の場合、%Pdは7.9〜9.5%の範囲であった。最後に、ヒスチジンpH 6.0製剤(F25、F26、およびF27)の%Pdは7.8〜9.8%の範囲であった。pH 5.5 (F21、F22、およびF23)ならびに6.0 (F25、F26、およびF27)のヒスチジン製剤は、pH 5.0と比べて最も低い%Pd値を示した。ヒスチジンpH 6.0製剤の場合、F25、F26およびF27は、全ての製剤が両方のストレス条件でおよび荷電賦形剤の存在下で低い%Pdを実証したので、有望な候補であった。
7. 結論
表17に記載されている様々な製剤中の抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430Gの分析試験から得られた結果に基づくと、製剤F25 (30 mMヒスチジン、150 mM NaCl pH 6.0)がこの分子に最適な製剤であった。初期ベースライン生物物理学的スクリーニングの結果から、NaClおよびアルギニンの存在下pH 5.5での酢酸塩およびヒスチジン製剤が最適な緩衝液/pH条件であることが示唆された。さらに、ソルビトールおよびスクロースと比較した場合、アルギニンおよびNaClが賦形剤の優れた選択肢であった。界面活性剤および抗凍結剤の試験により、製剤の安定性を増強するためにPS-80もスクロースも必要とされないことが示された。DoE安定性試験の場合、初期DSCの結果により、30 mMヒスチジンpH 6.0製剤が十分に高いT開始融解温度値を有することが確認された。全ての30 mM酢酸塩製剤において有意なpHシフトが観察された。ヒスチジンpH 6.0製剤は、5±3℃および40±2℃/75±5% RHで4週間の安定性にわたりpHの有意な変化を示さなかった。SECデータから、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 6.0はこの抗体の最大の安定性を付与することが実証された。icIEFの結果から、ヒスチジンpH 6.0サンプルが電荷不均一性の変化に対してより耐性であることが示された。また、スクロースおよびソルビトールの存在下での製剤が最大の分解を示すことも明らかにされた。還元および非還元CE-SDSの結果から、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤は最良の製剤であることが示された。DLSデータから、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 5.5および6.0製剤が多分散性の最小の変化を有することが示された。全体として、抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430Gに対する製剤として30 mMヒスチジンおよび150 mM塩化ナトリウムpH 6.0が、利用可能なデータの積上げにより支持される。
実施例56: 抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430Gおよび抗体IgG1-hDR5-05-E430G製剤の混合物
各製剤中での混合物の安定性を調べるために、ともに30 mMヒスチジン、150 mM塩化ナトリウムpH 6.0中で製剤化された抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G (20 mg/mL)およびIgG1-hDR5-05-E430G (20 mg/mL)の1:1混合物を5℃で貯蔵した。サンプルを2、4、8および12週間後ならびに貯蔵6ヶ月後、外観、pHタンパク質含有量、サイズ排除クロマトグラフィー、還元および非還元キャピラリー電気泳動 - ドデシル硫酸ナトリウムならびに画像化キャピラリー等電点電気泳動により、実施例54に記述されている方法を用いて分析した。
結果
試験された特性のいずれにおいても有意な変化は観察されなかった。したがって、抗体混合物は、5℃の貯蔵温度で少なくとも6ヶ月間安定であった。

Claims (57)

  1. 以下:
    a. ヒト免疫グロブリンGのFc領域と抗原結合領域とを含む抗体であって、Fc領域が、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置でのアミノ酸の変異を含む、抗体、
    b. ヒスチジン緩衝液、ならびに
    c. 塩化ナトリウム
    を含み、pHが5.5〜7.4である、薬学的組成物。
  2. 5 mM〜100 mMのヒスチジン、例えば5 mM〜75 mM、例えば10 mM〜50 mM、例えば 15 mM〜45 mM、例えば20 mM〜40 mM、例えば 25〜35 mM、例えば28 mM〜32 mM、例えば30 mMのヒスチジンを含む、請求項1記載の薬学的組成物。
  3. pHが5.8〜7.2、例えば5.5〜6.5、例えば5.8〜6.2、例えば5.9〜6.1、例えば6.0である、請求項1または2記載の薬学的組成物。
  4. 25 mM〜500 mMの塩化ナトリウム、例えば25 mM〜250 mM、例えば50 mM〜250 mM、例えば100 mM〜200 mM、例えば125 mM〜175 mM、例えば150 mMの塩化ナトリウムを含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  5. 抗体濃度が0.5 mg/ml〜250 mg/ml、例えば1 mg/ml〜100 mg/ml、例えば1 mg/ml〜50 mg/ml、例えば2 mg/ml〜20 mg/ml、例えば15 mg/ml〜25 mg/ml、例えば18 mg/ml〜23 mg/ml、例えば19 mg/ml〜21 mg/ml、例えば18 mg/ml〜20 mg/ml、例えば5 mg/ml〜15 mg/ml、例えば10 mg/mlまたは例えば20 mg/mlである、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  6. pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムおよび2 mg/ml〜20 mg/mlの抗体を含み、好ましくは、pH 6.0で30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムおよび20 mg/mlの抗体を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  7. 界面活性剤を含まない、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  8. 抗凍結剤を含まない、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  9. Fc領域が、ヒトIgG1におけるEU付番でのS440に対応する位置でのアミノ酸の変異を含み、ただしS440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  10. Fc領域が、E430G、E345K、E430S、E430F、E430T、E345Q、E345R、E345Y、S440WおよびS440Yからなる群より選択される変異を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  11. Fc領域が、E430GまたはE345Kから選択される変異を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  12. Fc領域がE430G変異を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  13. Fc領域が、K439EまたはS440Kから選択される変異をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  14. 抗原結合領域がヒトDR5に結合する、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  15. 抗原結合領域が、
    SEQ ID NO: 46のアミノ酸残基番号116〜138内に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基およびアミノ酸残基番号139〜166内に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基を含むまたは必要とする、ヒトDR5上のエピトープ
    に結合する、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  16. 抗原結合領域が、
    SEQ ID NO: 46のアミノ酸残基番号79〜138内に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基を含むまたは必要とする、ヒトDR5上のエピトープ
    に結合する、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  17. 抗原結合領域が、以下のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変重鎖(VH)領域ならびに以下のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変軽鎖(VL)領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物:
    a) (VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6;
    b) (VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6;
    c) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14;
    d) (VH) SEQ ID NO: 16、17、18および(VL) SEQ ID NO: 21、GAS、22または
    e) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記a)〜d)のいずれか1つに定義される(VH) CDR1、CDR2、CDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3。
  18. 抗原結合領域が、以下のアミノ酸配列を有する可変重鎖(VH)領域および可変軽鎖(VL)領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物:
    a) (VH) SEQ ID NO:4および(VL) SEQ ID NO:7;
    b) (VH) SEQ ID NO:9および(VL) SEQ ID NO:7;
    c) (VH) SEQ ID NO:12および(VL) SEQ ID NO:15;
    d) (VH) SEQ ID NO:19および(VL) SEQ ID NO:23;
    e) (VH) SEQ ID NO:20および(VL) SEQ ID NO:23または
    f) 該(VH)および(VL)配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記a)〜e)のいずれか1つに定義される(VH)および(VL)。
  19. 抗体がIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  20. 抗体がIgG1アイソタイプである、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  21. 抗体がIgG1m(f)、IgG1m(a)、IgG1m(z)、IgG1m(x)アロタイプまたは混合アロタイプである、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  22. Fc領域が、以下の群のアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物:
    a) SEQ ID NO:29;
    b) SEQ ID NO:30;
    c) SEQ ID NO:31;
    d) SEQ ID NO:32または
    e) 該配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記a)〜d)のいずれか1つに定義されるアミノ酸配列。
  23. 抗体が重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、LCがSEQ ID NO:39の配列を含み、かつHCが以下の配列の1つを含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物:
    a) (HC) SEQ ID NO:33;
    b) (HC) SEQ ID NO:34;
    c) (HC) SEQ ID NO:35;
    d) (HC) SEQ ID NO:36;
    e) (HC) SEQ ID NO:37;
    f) (HC) SEQ ID NO:38; または
    g) 該(HC)配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記a)〜f)のいずれか1つに定義される(HC)。
  24. 抗体が重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、LCがSEQ ID NO:43の配列を含み、かつHCが以下の配列の1つを含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物:
    a) (HC) SEQ ID NO:40;
    b) (HC) SEQ ID NO:41;
    c) (HC) SEQ ID NO:42; または
    d) 該(HC)配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記a)〜c)のいずれか1つに定義される(HC)。
  25. 抗体がモノクローナル抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  26. 抗体が、請求項14〜18のいずれか一項に定義される1つまたは複数の抗原結合領域を含む二重特異性抗体である、請求項1〜24のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  27. 抗体がヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  28. 抗体がアゴニストである、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  29. 抗体が、カスパーゼ依存性細胞死などの、標的細胞におけるプログラム細胞死を誘導する、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  30. 抗体が、DR5を発現する標的細胞においてアポトーシスを誘導する、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  31. 抗体が細胞生存性を低減する、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  32. 2つまたはそれ以上の抗体を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  33. 前記請求項1〜31のいずれか一項に定義される第1の抗体および前記請求項1〜31のいずれか一項に定義される第2の抗体を含む、請求項32記載の薬学的組成物。
  34. 第1の抗体が第1のFc領域を含み、かつ第2の抗体が第2のFc領域を含む、請求項33記載の薬学的組成物。
  35. 第1の抗体が、DR5に結合できる第1の抗原結合領域および第1のFc領域を含み、かつ第2の抗体が、DR5に結合できる第2の抗原結合領域および第2のFc領域を含む、請求項33記載の薬学的組成物。
  36. 第1の抗体および第2の抗体が、ヒトDR5上の異なるエピトープに結合する、請求項33〜35のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  37. ヒトDR5に結合する第1の抗体が、ヒトDR5への第2の抗体の結合をブロックしない、請求項33〜36のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  38. 第1の抗体が以下の6つのCDR配列:
    a) (VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6
    を含み、かつ
    第2の抗体が以下の6つのCDR配列:
    b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
    を含む、または
    第1の抗体および第2の抗体が
    c) それぞれ該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される6つのCDR配列
    を含む、
    請求項33〜37のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  39. 第1の抗体が以下の6つのCDR配列:
    a) (VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6
    を含み、かつ
    第2の抗体が以下の6つのCDR配列:
    b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
    を含む、または
    第1の抗体および第2の抗体が
    c) それぞれ該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される6つのCDR配列
    を含む、
    請求項33〜37のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  40. 第1の抗体が以下の6つのCDR配列:
    a) (VH) SEQ ID NO: 16、17、18および(VL) SEQ ID NO: 21、GAS、6
    を含み、かつ
    第2の抗体が以下の6つのCDR配列:
    b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
    を含む、または
    第1の抗体および第2の抗体が
    c) それぞれ該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される6つのCDR配列
    を含む、
    請求項33〜37のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  41. 第1の抗体および第2の抗体が、約1:1のモル比、約1:2のモル比、約1:3のモル比、約1:4のモル比、約1:5のモル比、約1:6のモル比、約1:7のモル比、約1:8のモル比、約1:9のモル比、約1:10のモル比、約1:15のモル比、約1:20のモル比、約1:25のモル比、約1:30のモル比、約1:35のモル比、約1:40のモル比、約1:45のモル比、約1:49のモル比、約49:1のモル比、約45:1のモル比、約40:1のモル比、約35:1のモル比、約30:1のモル比、約25:1のモル比、約20:1のモル比、約15:1のモル比、約10:1のモル比、約9:1のモル比、約8:1のモル比、約7:1のモル比、約6:1のモル比、約5:1のモル比、約4:1のモル比、約3:1のモル比、約2:1のモル比といった、1:49〜49:1のモル比で組成物中に存在する、請求項33〜40のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  42. 第1の抗体および第2の抗体が、約1:9〜9:1のモル比で組成物中に存在する、請求項33〜41のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  43. 第1の抗体および第2の抗体が、約1:1のモル比で組成物中に存在する、請求項33〜42のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  44. 医薬として用いるための、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  45. 感染性疾患、自己免疫疾患または心血管奇形の処置において用いるための、1つまたは複数の抗DR5抗体を含む前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  46. 固形腫瘍および/または血液学的腫瘍の処置において用いるための、1つまたは複数の抗DR5抗体を含む請求項1〜44のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  47. 結腸直腸がん腫および結腸直腸腺がんを含む結腸直腸がん、膀胱がん、骨肉腫、軟骨肉腫、三重陰性乳がんを含む乳がん、神経膠芽腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、神経内分泌腫瘍を含む中枢神経系のがん、子宮頸がん、子宮内膜がん、胃腺がんを含む胃がん、頭頸部がん、腎臓がん、肝細胞がんを含む肝臓がん、NSCLCおよびSCLCを含む肺がん、卵巣がん、膵管がんおよび膵臓腺がんを含む膵臓がん、肉腫、または悪性黒色腫および非黒色腫皮膚がんを含む皮膚がんなどの固形腫瘍の処置において用いるための、1つまたは複数の抗DR5抗体を含む前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  48. 慢性リンパ球性白血病ならびに急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病などの骨髄性白血病を含む白血病、非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群などの血液学的腫瘍の処置において用いるための、1つまたは複数の抗DR5抗体を含む前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  49. DR5発現腫瘍の増殖の阻害において用いるための、1つまたは複数の抗DR5抗体を含む前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  50. DR5発現腫瘍におけるアポトーシスの誘導において用いるための、1つまたは複数の抗DR5抗体を含む前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  51. がんの処置のための医薬の製造のための、1つまたは複数の抗DR5抗体を含む前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物の使用。
  52. 1つまたは複数の抗DR5抗体を含む前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物の有効量を個体に投与する段階を含む、がんを有する個体を処置する方法。
  53. さらなる治療剤を投与する段階をさらに含む、請求項52記載の方法。
  54. さらなる治療剤が、化学療法薬(パクリタキセル、テモゾロミド、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、イリノテカン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、5-フルオロウラシル、ペメトレキセドを含むが、これらに限定されない)、キナーゼ阻害剤(ソラフェニブ、スニチニブまたはエベロリムスを含むが、これらに限定されない)、アポトーシス調節剤(組み換えヒトTRAILまたはビリナパントを含むが、これらに限定されない)、RAS阻害剤、プロテアソーム阻害剤(ボルテゾミブを含むが、これに限定されない)、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤(ボリノスタットを含むが、これに限定されない)、栄養補助食品、サイトカイン(IFN-γを含むが、これに限定されない)、抗体または抗体模倣体(抗EGFR、抗IGF-1R、抗VEGF、抗CD20、抗CD38、抗HER2、抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA4、抗CD40、抗CD137、抗GITR抗体および抗体模倣体を含むが、これらに限定されない)、抗体-薬物コンジュゲートからなる群より選択される1つまたは複数の抗がん剤である、請求項53記載の方法。
  55. 組成物が治療での同時使用、別使用または逐次使用のためのものである、2つまたはそれ以上の前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物を含む、要素のキット。
  56. 組成物が治療での同時使用のためのものであり、組成物が使用直前に混合される、請求項55記載の要素のキット。
  57. 請求項33〜43のいずれか一項記載の薬学的組成物を調製するための方法であって、前記請求項1〜31のいずれか一項に定義される第1の抗体を含む第1の薬学的組成物と前記請求項1〜31のいずれか一項に定義される第2の抗体を含む第2の薬学的組成物とを混合する段階を含む、方法。
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