JP2020522543A - 変異IgG六量体に基づく治療用抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞表面抗原結合後のIgG抗体の六量体化を促進するFc領域における変異を有するIgGアイソタイプの抗体を含む薬学的組成物に関する。本発明はまた、本発明の薬学的組成物を調製するための方法およびそのような組成物の使用に関する。
IgG抗体は、その標的抗原に結合した後に細胞表面で規則正しい六量体に組織化することができる。これらの六量体は補体C1の第1成分に結合し、補体依存性の標的細胞死滅化を誘導する。血液学的腫瘍および固形腫瘍の徴候からの細胞上の様々な標的に対するIgG抗体による六量体形成および補体活性化を増強する変異が同定されている(de Jong et al. 2016 PLoS Biol 14(1): e1002344、WO2013/004842、WO2014/108198)。Fc領域中の特定の位置に変異を有する、IgG骨格、例えばIgG1は、通常の薬物動態および生物薬剤の開発可能性を保持しながらも、細胞株および慢性リンパ球性白血病(CLL)患者の腫瘍細胞の条件付き補体依存性細胞傷害(CDC)を誘導する強力な能力をもたらした。この変異は、アポトーシスを誘導する能力を保持しながらも、補体活性化において効果のないII型CD20抗体のCDCおよび抗体依存性細胞傷害(ADCC)を強力に増強した(de Jong, 上記)。
a. ヒト免疫グロブリンGのFc領域と抗原結合領域とを含む抗体であって、Fc領域が、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置でのアミノ酸の変異を含む、抗体、
b. ヒスチジン緩衝液、ならびに
c. 塩化ナトリウム
を含む薬学的組成物に関し、ここで組成物のpHは5.5〜7.4である。
本発明の1つの態様において、第1および第2のFc領域は、ヒトIgG1におけるEU付番でのS440に対応する位置でのアミノ酸の変異を含み、ただしS440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする。
a) (VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6;
b) (VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6;
c) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14;
d) (VH) SEQ ID NO: 16、17、18および(VL) SEQ ID NO: 21、GAS、22または
e) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記a)〜d)のいずれか1つに定義される(VH) CDR1、CDR2、CDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3
のアミノ酸配列を有する、CDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変重鎖(VH)領域ならびにCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変軽鎖(VL)領域を含む、該抗原結合領域を含む。
・該第1の抗体は以下の6つのCDR配列: (VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含む、または
・該第1の抗体は以下の6つのCDR配列: (VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含む。
本発明の態様を記載する際に、明確化のために特定の専門用語が用いられる。しかしながら、本発明は、そのように選択された特定の用語に限定されることを意図するものではなく、各特定の用語は、同様の目的を達成するために同じような方法で動作する全ての技術的等価物を含むものと理解される。
本明細書において用いられる「免疫グロブリン」という用語は、4つ全てがジスルフィド結合によって潜在的に相互接続された、1対の低分子量軽(L)鎖および1対の重(H)鎖の2対のポリペプチド鎖からなる構造的に関連する糖タンパク質のクラスをいう。免疫グロブリンの構造は、よく特徴付けられている。例えば、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))を参照されたい。簡単に言うと、各重鎖は、典型的には、重鎖可変領域(本明細書においてVHと略記される)および重鎖定常領域から構成される。IgG抗体の重鎖定常領域は、典型的には、3つのドメインCH1、CH2およびCH3から構成される。重鎖は、いわゆる「ヒンジ領域」中のジスルフィド結合を介して相互連結されている。各軽鎖は、典型的には、軽鎖可変領域(本明細書においてVLと略記される)および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、典型的には、1つのドメインCLから構成される。VHおよびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる、より保存されている領域によって隔てられた、相補性決定領域(CDR)とも呼ばれる、超可変性の領域(または配列が超可変でありうるおよび/もしくは構造的に規定されたループの形態でありうる超可変領域)にさらに細分されうる。各VHおよびVLは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順に配列される3つのCDRおよび4つのFRから構成される: FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4 (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901 917 (1987)も参照のこと)。他に明記されていないか、文脈によって矛盾がない限り、本明細書におけるCDR配列はIMGT規則(Brochet X., Nucl Acids Res. 2008;36:W503-508 and Lefranc MP., Nucleic Acids Research 1999;27:209-212; see also internet http address http://www.imgt.org/)に従って同定されるものである。他に明記されていないか、文脈によって矛盾がない限り、本発明の定常領域におけるアミノ酸位置への言及は、EU付番(Edelman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May;63(1):78-85; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. 1991 NIH Publication No. 91-3242)によるものである。本明細書において用いられる「ヒンジ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域をいうように意図される。したがって、例えば、ヒトIgG1抗体のヒンジ領域は、EU付番でのアミノ酸位置216〜230に対応する。
元のアミノ酸 - 位置 - 置換されたアミノ酸;
アミノ酸残基を示すための表記XaaおよびXを含めて、3文字表記または1文字表記が用いられる。したがって、「E345R」または「Glu345Arg」という記法は、変種が、親抗体中の番号345におけるアミノ酸に対応する変種アミノ酸位置にグルタミン酸とアルギニンとの置換を含むことを意味する。
(同一残基×100)/(アライメントの長さ - アライメントにおけるギャップの総数)。
(同一デオキシリボヌクレオチド×100)/(アライメントの長さ - アライメントにおけるギャップの総数)。
上記のように、第1の主要な局面において、本発明は、以下:
a. ヒト免疫グロブリンGのFc領域と抗原結合領域とを含む抗体であって、Fc領域が、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置でのアミノ酸の変異を含む、抗体、
b. ヒスチジン緩衝液、および
c. 塩化ナトリウム
を含み、pHが5.5〜7.4である、薬学的組成物に関する。
a. ヒト免疫グロブリンGのFc領域と抗原結合領域とを含む抗体であって、ここでFc領域が、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置でのアミノ酸の変異を含み、ただしS440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、抗体、
b. ヒスチジン緩衝液、および
c. 塩化ナトリウム
を含み、pHが5.5〜7.4である、薬学的組成物に関する。
上記のように、本発明の薬学的組成物に製剤化される抗体は、ヒト免疫グロブリンGのFc領域と抗原結合領域とを含み、ここでFc領域は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置でのアミノ酸の変異を含み、ただしS440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする。EU付番によるヒトIgG1でのE430、E345およびS440に対応する位置は、Fc領域のCH3ドメインに位置する。
(a) (VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6;
(b) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6;
(c) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14;
(d) (VH) SEQ ID NO:16、17、18およびVL) SEQ ID NO:21、GAS、22; または
(e) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を有する上記(a)〜(d)のいずれかに定義される(VH) CDR1、CDR2、CDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3。すなわち1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、合計で5つまでの変異、例えば置換が許容される。
(a) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6。
(a) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14。
(a) (VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6;
(b) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6;
(c) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14; ならびに
(d) (VH) SEQ ID NO:16、17、18およびVL) SEQ ID NO:21、GAS、22。
(a) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6。
(a) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14。
(a) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6、または
(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14、または
(c) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異を有する上記(a)または(b)のいずれか1つに定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、合計で5つまでの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの変異、例えば置換などの、5つまでの変異、例えば置換がなされ、かつVL領域のCDRにわたり変異がなされない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異、例えば置換がなされないが、しかしVL領域のCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つなどの、5つまでの変異、例えば置換が見出される。
(a) (VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6、または
(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14、または
(c) 該6つのCDR配列にわたり全体で5つまでの変異を有する上記(a)または(b)に定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、合計で5つまでの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの変異、例えば置換などの、5つまでの変異、例えば置換がなされ、かつVL領域の3つのCDRにわたり変異がなされない。他の態様において、VH領域の3つのCDRにわたり変異、例えば置換はなされないが、VL領域の6つのCDRにわたり5つまでの変異、例えば置換がなされ、ここで変異、例えば置換は保存的であるか、または同様の物理的もしくは機能的特性を有するアミノ酸に関するものであり、好ましくはDR5に対する結合親和性を改変しない。
(a) (VH) SEQ ID NO:4および(VL) SEQ ID NO:7;
(b) (VH) SEQ ID NO:9および(VL) SEQ ID NO:7;
(c) (VH) SEQ ID NO:12および(VL) SEQ ID NO:15;
(d) (VH) SEQ ID NO:19および(VL) SEQ ID NO:23; ならびに
(e) (VH) SEQ ID NO:20および(VL) SEQ ID NO:23。
(a) (VH) SEQ ID NO:4および(VL) SEQ ID NO:7;
(b) (VH) SEQ ID NO:9および(VL) SEQ ID NO:7;
(c) (VH) SEQ ID NO:12および(VL) SEQ ID NO:15;
(d) (VH) SEQ ID NO:19および(VL) SEQ ID NO:23;
(e) (VH) SEQ ID NO:20および(VL) SEQ ID NO:23; または
(f) 該(VH)および(VL)配列にわたり全体で1〜10個の変異もしくは置換を有する上記(a)〜(e)のいずれか1つに定義される(VH)および(VL)。すなわち、1つの態様において、VHおよびVL配列により定義されるVHおよびVL領域にわたり、全体で10個までの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VHまたはVL配列にわたり1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個または10個の変異、例えば置換などの、10個までの変異、例えば置換がなされる。本発明の1つの態様において、VH配列において10個までの変異または置換がなされ、かつVL配列において変異はなされない。本発明の1つの態様において、VH配列において変異はなされず、かつVL配列において10個までの変異、例えば置換がなされる。これにより、VHおよびVL配列にわたり10個までの変異、例えば置換を可能にする態様が提供され、ここで変異、例えば置換は保存的であるか、または同様の物理的もしくは機能的特性を有するアミノ酸に関するものであり、それにより抗DR5抗体の結合親和性または機能を改変することなく、VHおよびVL配列内での変異、例えば置換を可能にする。
(a) SEQ ID NO:29;
(b) SEQ ID NO:30;
(c) SEQ ID NO:31;
(d) SEQ ID NO:32; または
(e) 該配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を有していてもよい(a)〜(d)のいずれか1つに定義されるアミノ酸配列。すなわち、1つの態様において、Fc領域にわたり、全体で5つまでの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、Fc領域にわたり1つ、2つ、3つ、4つまたは5つの変異、例えば置換などの、5つまでの変異、例えば置換が許容される。
(a) (HC) SEQ ID NO:33;
(b) (HC) SEQ ID NO:34;
(c) (HC) SEQ ID NO:35;
(d) (HC) SEQ ID NO:36;
(e) (HC) SEQ ID NO:37; および
(f) (HC) SEQ ID NO:38。
(a) (HC) SEQ ID NO:33;
(b) (HC) SEQ ID NO:34;
(c) (HC) SEQ ID NO:35;
(d) (HC) SEQ ID NO:36;
(e) (HC) SEQ ID NO:37; および
(f) (HC) SEQ ID NO:38。
(a) (HC) SEQ ID NO:33;
(b) (HC) SEQ ID NO:34;
(c) (HC) SEQ ID NO:35;
(d) (HC) SEQ ID NO:36;
(e) (HC) SEQ ID NO:37; および
(f) (HC) SEQ ID NO:38; または
(g) 該(HC)配列にわたり全体で1〜10個の変異を有する上記(a)〜(f)のいずれか1つに定義される(HC)。すなわち、1つの態様において、重鎖配列により定義される重鎖にわたり、全体で10個までの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、重鎖配列にわたり1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個または10個の変異、例えば置換などの、10個までの変異、例えば置換がなされる。これにより、重鎖配列にわたり10個までの変異、例えば置換を可能にする態様が提供され、ここで変異、例えば置換は保存的であるか、または同様の物理的もしくは機能的特性を有するアミノ酸に関するものであり、それにより抗DR5抗体の結合親和性または機能を改変することなく、重鎖配列内での変異または置換を可能にする。
(a) (HC) SEQ ID NO:40;
(b) (HC) SEQ ID NO:41; および
(c) (HC) SEQ ID NO:42。
(a) (HC) SEQ ID NO:40;
(b) (HC) SEQ ID NO:41; および
(c) (HC) SEQ ID NO:42。
(a) (HC) SEQ ID NO:40;
(b) (HC) SEQ ID NO:41;
(c) (HC) SEQ ID NO:42; または
(d) 該(HC)配列にわたり全体で1〜10個の変異、例えば置換を有する上記(a)〜(c)のいずれか1つに定義される(HC)。すなわち、1つの態様において、重鎖配列により定義される重鎖にわたり、全体で10個までの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、重鎖配列にわたり1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個または10個の変異、例えば置換などの、10個までの変異、例えば置換がなされる。これにより、重鎖配列にわたり10個までの変異、例えば置換を可能にする態様が提供され、ここで変異、例えば置換は保存的であるか、または同様の物理的もしくは機能的特性を有するアミノ酸に関するものであり、それにより抗DR5抗体の結合親和性または機能を改変することなく、重鎖配列内での変異、例えば置換を可能にする。
別の局面において、本発明の薬学的組成物は、本明細書に記載の、ヒトDR5に結合する少なくとも1つの抗原結合領域を含む二重特異性抗体を含む。
1つの局面において、本発明は、2つまたはそれ以上の抗体を含む薬学的組成物に関し、ここで抗体の少なくとも1つが、ヒト免疫グロブリンGのFc領域と抗原結合領域とを含む抗体であり、ここでFc領域が、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置でのアミノ酸の変異を含む。
a) (VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6
を含み、
該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列:
b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
を含み、
好ましくはここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、ヒトIgG1におけるE430に対応する位置での第1および第2のFc領域における変異を含む。
a) (VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6
を含み、
該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列:
b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
を含み、
ここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、第1および第2のFc領域におけるE430G変異を含む。
a) (VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6
を含み、
該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列、
b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
を含み、
ここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、好ましくは、ヒトIgG1におけるE430に対応する位置での第1および第2のFc領域における変異を含む。
a) (VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6
を含み、
該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列、
b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
を含み、
ここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、第1および第2のFc領域におけるE430G変異を含む。
a) (VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6
を含み、
該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列、
b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
を含み、
ここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、ヒトIgG1におけるE345に対応する位置での第1および第2のFc領域における変異を含む。
a) (VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6
を含み、
該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列、
b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
を含み、
ここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、第1および第2のFc領域におけるE345K変異を含む。
a) (VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6
を含み、
該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列、
b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
を含み、
ここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、E345に対応する位置での第1および第2のFc領域における変異を含む。
a) (VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6
を含み、
該第2の抗DR5抗体が以下の6つのCDR配列、
b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
を含み、
ここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、第1および第2のFc領域におけるE345K変異を含む。
(a) 該第1の抗体は以下の6つのCDR配列:
(VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗体は以下の6つのCDR配列:
(VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含み、またはここで
(b) 該第1の抗体および該第2の抗体は、それぞれ該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)に定義される6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異または置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力といった、第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5個までの変異または置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個の変異または置換といった、5個までの変異または置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異または置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個といった、5個までの変異または置換が見出される。
a) (HC) SEQ ID NO:33;
b) (HC) SEQ ID NO:34;
c) (HC) SEQ ID NO:35;
d) (HC) SEQ ID NO:36;
e) (HC) SEQ ID NO:37; または
f) (HC) SEQ ID NO:38、
ここで該抗DR5抗体は組成物中に2 mg/mlから200 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で10 mg/mlの抗DR5抗体、5 mg/mlの第2の抗体、30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムを含む。
a) (HC) SEQ ID NO:40;
b) (HC) SEQ ID NO:41; または
c) (HC) SEQ ID NO:42、
ここで該抗DR5抗体は組成物中に2 mg/mlから200 mg/mlで存在し、かつここで組成物は、pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムをさらに含む。本発明の1つの態様において、組成物は、pH 6.0で10 mg/mlの抗DR5抗体、5 mg/mlの第2の抗体、30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムを含む。
本発明のいずれかの局面または態様による薬学的組成物は、医薬として、すなわち治療用途などの医療用に用いられうる。
DR5のための発現構築物
ヒトの完全長DR5タンパク質(SEQ ID NO 46)、アカゲザルの完全長DR5タンパク質(SEQ ID NO 25)、およびマウスの完全長DR5タンパク質(SEQ ID NO 26)の発現のためのコドン最適化構築物を、利用可能な配列:ヒト(Homo sapiens)DR5(Genbankアクセッション番号NP_003833、UniprotKB/Swiss-Prot O14763-1)、アカゲザル(Macaca mulatta)DR5(Genbankアクセッション番号EHH28346)、マウス(Mus musculus)DR5(UniprotKB/Swiss-Prot Q9QZM4)に基づいて生成した。DR5抗体の結合領域のマッピング(実施例6に記載されている通り)のために、以下のキメラヒト/マウスDR5構築物;それぞれ、対応するマウスDR5配列によって以下の一部が置き換えられたヒトDR5(数字はヒト配列を指す)を作製した:構築物A aa 56〜68、構築物B aa 56〜78、構築物C aa 69〜78、構築物D aa 79〜115、構築物E 79〜138、構築物F aa 97〜138、構築物G aa 139〜166、構築物H aa 139〜182、構築物I aa 167〜182、構築物J 167〜210、構築物K aa 183〜210。機能喪失変異K415Nを、ヒトDR5デスドメイン中に導入した(SEQ ID NO 44)。加えて、C末端Hisタグを有するヒトDR5の細胞外ドメイン(ECD)のためのコドン最適化構築物:DR5ECD-FcHistag(SEQ ID NO 27)およびDR5ECDdelHis(SEQ ID NO 28)を生成した。全ての構築物は、クローニングに適している制限部位および最適コザック(GCCGCCACC)配列を含有していた。構築物を、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.3(Invitrogen)にクローニングした。
抗体発現のために、キメラヒト/マウスDR5抗体DR5-01およびDR5-05(EP2684896A1に基づく)ならびにそれらのヒト化バリアントhDR5-01およびhDR5-05(WO2014/009358に基づく)の、以前に記載されているようなVHおよびVL配列を、関連性のある定常HCおよびLC領域を含有する発現ベクター(pcDNA3.3)にクローニングした。所望の変異を、遺伝子合成または部位特異的変異誘発のいずれかによって導入した。
抗体を、IgG1、κとして発現させた。抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードするプラスミドDNA混合物を、本質的にVink et al. (Vink et al., Methods, 65 (1), 5-10 2014)により記載されているように、293 fectin(Life technologies)を用いてExpi293F細胞(Life technologies, USA)に一過性にトランスフェクトした。
抗体を、固定化プロテインGクロマトグラフィーによって精製した。Hisタグ付加組み換えタンパク質を、固定化金属親和性クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質バッチを、SDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー、およびエンドトキシンレベルの測定を含む複数の生物分析アッセイによって分析した。
二重特異性IgG1抗体を、制御された還元条件下でのFabアーム交換によって生成した。この方法の基礎は、WO2011/131746に記載されているような特定のアッセイ条件下でヘテロダイマーの形成を促進する、相補的CH3ドメインの使用である。F405LおよびK409R(EU付番)変異を、抗DR5 IgG1抗体に導入して、相補的CH3ドメインとの抗体ペアを作製した。F405L変異を、IgG1-DR5-05およびIgG1-DR5-05-E430Gに導入し;K409R変異を、IgG1-DR5-01およびIgG1-DR5-01-E430Gに導入した。二重特異性抗体を生成するために、各々の抗体の最終濃度が0.5 mg/mLの2種類の親相補的抗体を、75 mM 2-メルカプトエチルアミン-HCl(2-MEA)と100μL TEの総体積において31℃で5時間インキュベートした。スピンカラム(Microcon遠心フィルター、30k、Millipore)を用いて製造業者のプロトコルに従い、還元剤2-MEAを除去することによって、還元反応を停止した。このように、二重特異性抗体IgG1-DR5-01-K409R x IgG1-DR5-05-F405L(BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L)およびIgG1-DR5-01-K409R-E430G x IgG1-DR5-05-F405L-E430G(BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G)を生成した。
細胞あたりのDR5密度を、マウスモノクローナル抗体B-K29(Diaclone、カタログ番号854.860.000)と共にQIFIKIT(DAKO、カタログ番号K0078)を用いた間接免疫蛍光によって、様々なヒトがん細胞株について定量した。細胞を、トリプシン処理によって収集し、セルストレーナーを通過させた。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、PBSで洗浄し、2×106細胞/mLの濃度で再懸濁した。次の工程を、4℃で行った。50μLの単一細胞懸濁液(ウェルあたり100,000細胞)を、ポリスチレン96ウェル丸底プレート(Greiner Bio-One、カタログ番号650101)に播種した。細胞を、300×gで3分間の遠心分離によって沈殿させ、10μg/mLの飽和濃度の50μLの抗体試料またはマウスIgG1アイソタイプ対照試料(BD/Pharmingen、カタログ番号555746)に再懸濁した。4℃で30分のインキュベーション後、細胞を沈殿させ、150μL FACS緩衝液(PBS+0.1%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)+0.02%(w/v)アジ化ナトリウム)に再懸濁した。設定ビーズおよび較正ビーズを、製造業者の説明書に従ってプレートに添加した。細胞およびビーズを並行して、150μL FACS緩衝液でさらに2回洗浄し、50μL FITCコンジュゲートヤギ抗マウスIgG(1/50;DAKO、カタログ番号F0479)に再懸濁した。二次抗体を、4℃で30分間、光から保護してインキュベートした。細胞およびビーズを、150μL FACS緩衝液で2回洗浄して、150μL FACS緩衝液に再懸濁した。免疫蛍光を、FACS Canto II(BD Biosciences)上で、生細胞の集団内の10,000イベントを記録することによって測定した。較正ビーズの蛍光強度の幾何平均を使用して、GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)を用いてゼロ強度およびゼロ濃度を通るようにさせた較正曲線を算出した。各細胞株について、形質膜上に発現しているDR5分子の数の推定値である抗体結合能力(ABC)を、較正曲線の方程式に基づいて、DR5抗体染色した細胞の幾何平均蛍光強度を用いて算出した(GraphPad Softwareを用いた、標準曲線からの未知のものの内挿)。概して、DR5細胞表面発現は、ここで評価した細胞株上で低度から中等度であった。これらのデータに基づいて、細胞株を、低いDR5発現(ABC<10,000)および中等度のDR5発現(ABC>10,000)に従って分類した。HCT-15(ATCC, CCL-225)、HT-29(ATCC, HTB-38)およびSW480(ATCC, CCL-228)結腸がん、BxPC-3(ATCC, CRL-1687)、HPAF-II(ATCC, CRL-1997)およびPANC-1(ATCC, CRL-1469)膵臓がん、ならびにA549(ATCC, CCL-185)およびSK-MES-1(ATCC, HTB-58)肺がん細胞株は、低いDR5発現を有することが見出された(QIFIKIT ABC範囲3,081〜8,411)。COLO 205(ATCC CCL-222(商標))およびHCT 116(ATCC CCL-247)結腸がん、A375(ATCC, CRL-1619)皮膚がん、ならびにSNU-5(ATCC, CRL-5973)胃がん細胞株は、中等度のDR5発現を有することが見出された(QIFIKIT ABC範囲10,777〜21,262)。
ヒト化抗体hDR5-01およびhDR5-05は、特許出願WO2014/009398に記載されている。精製したIgG1-hDR5-01-K409RおよびIgG1-hDR5-05-F405LのDR5陽性HCT 116ヒト結腸がん細胞に対する結合を、FACS分析によって分析し、キメラ抗体IgG1-DR5-01-K409RおよびIgG1-DR5-05-F405Lの結合と比較した。単一細胞懸濁液を調製するために、接着性HCT 116細胞を、PBS(B.Braun;カタログ番号3623140)で2回洗浄し、その後、トリプシン1×/EDTA 0.05%と37℃で2分間インキュベートした。10 mLの培地[L-グルタミンおよびHEPESを含むマッコイ5A培地(Lonza;カタログ番号BE12-168F)+10% Donor Bovine Serum with Iron(Life Technologies;カタログ番号10371-029)+100単位ペニシリン/100単位ストレプトマイシン(Lonzaカタログ番号DE17-603E)]を添加し、その後、細胞を、1200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させた。細胞を、10 mL培地に再懸濁し、1200 rpmで5分間の遠心分離によって再び沈殿させ、1.0×106細胞/mLの濃度でFACS緩衝液に再懸濁した。次の工程を、4℃で行った。100μLの細胞懸濁液試料(ウェルあたり100,000細胞)を、ポリスチレン96ウェル丸底プレート(Greiner Bio-One;カタログ番号650101)に播種し、300×gで3分間、4℃での遠心分離によって沈殿させた。細胞を、連続希釈抗体調製物系列(5倍希釈において、0〜10μg/mLの範囲)の100μL試料に再懸濁し、4℃で30分間インキュベートした。細胞を、300×gで3分間、4℃での遠心分離によって沈殿させ、150μL FACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を、50μLの二次抗体R-フィコエリトリン(R-PE)コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2(Jackson ImmunoResearch;カタログ番号109-116-098;1/100)と4℃で30分間、光から保護してインキュベートした。細胞を、150μL FACS緩衝液で2回洗浄し、150μL FACS緩衝液に再懸濁して、抗体結合を、FACS Canto II(BD Biosciences)上で10,000イベントを記録することによって分析した。結合曲線を、GraphPad Prism ソフトウェアを用いた非線形回帰分析(可変の傾きを有するシグモイド用量応答)を用いて分析した。
六量体化増強変異(E430GまたはE345K)を有するおよび有さない、IgG1-DR5-01-K409R、IgG1-DR5-05-F405L、および二重特異性抗体IgG1-DR5-01-K409RxIgG1-DR5-05-F405L(BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L)の精製した抗体バリアントの、ヒト結腸がん細胞COLO 205に対する結合を、FACS分析によって分析した。細胞を、非接着性細胞およびトリプシン処理した接着性COLO 205細胞を含有する培養上清をプールすることによって収集した。細胞を、1,200 rpmで5分間、遠心分離し、10 mLの培養培地[25mM HepesおよびL-グルタミンを含むRPMI 1640(Lonzaカタログ番号BE12-115F)+10% Donor Bovine Serum with Iron(Life Technologiesカタログ番号10371-029)+50単位ペニシリン/50単位ストレプトマイシン(Lonzaカタログ番号DE17-603E)]に再懸濁した。細胞を、計数し、再び遠心分離して、0.3×106細胞/mLの濃度でFACS緩衝液に再懸濁した。次の工程を、4℃で行った。100μLの細胞懸濁液試料(ウェルあたり30,000細胞)を、ポリスチレン96ウェル丸底プレートに播種し、300×gで3分間、4℃での遠心分離によって沈殿させた。細胞を、連続希釈抗体調製物系列(5倍希釈において、0〜10μg/mLの最終濃度の範囲)の50μL試料に再懸濁し、4℃で30分間インキュベートした。プレートを、300×gで3分間、4℃で遠心分離して、細胞を、150μL FACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を、50μLの二次抗体R-PE-コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2(Jackson ImmunoResearch;カタログ番号109-116-098;1/100)と4℃で30分間、光から保護してインキュベートした。細胞を、150μL FACS緩衝液で2回洗浄し、100μL FACS緩衝液に再懸濁して、抗体結合を、FACS Canto II(BD Biosciences)上で5,000イベントを記録することによって分析した。結合曲線を、GraphPad Prism ソフトウェアを用いた非線形回帰分析(可変の傾きを有するシグモイド用量応答)を用いて分析した。
精製したIgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gの、アカゲザルDR5またはヒトDR5を発現するCHO細胞(実施例1に記載)に対する結合を、FACS分析によって分析した。FACS分析の1日前に、CHO細胞に、アカゲザルDR5、ヒトDR5をコードするベクター、または非コードベクター(モック)を一過性にトランスフェクトした。単一細胞懸濁液を調製するために、細胞を、PBSで洗浄し、1.0×106細胞/mLの濃度でFACS緩衝液に再懸濁した。次の工程を、4℃で行った。75μLの細胞懸濁液試料(ウェルあたり75,000細胞)を、ポリスチレン96ウェル丸底プレートに播種し、300×gで3分間、4℃での遠心分離によって沈殿させた。細胞を、連続希釈抗体調製物系列(5倍希釈において、10〜0μg/mLの範囲)の50μL試料に再懸濁し、4℃で30分間インキュベートした。プレートを、300×gで3分間、4℃で遠心分離して、細胞を、150μL FACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を、50μLの二次抗体R-PE-コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2(Jackson ImmunoResearch;カタログ番号109-116-098;1/100)と4℃で30分間、光から保護してインキュベートした。細胞を、150μL FACS緩衝液で2回洗浄し、100μL FACS緩衝液に再懸濁して、抗体結合を、FACS Canto II(BD Biosciences)上で100,000イベントを記録することによって分析した。結合曲線を、GraphPad Prism ソフトウェアを用いた非線形回帰分析(可変の傾きを有するシグモイド用量応答)を用いて分析した。図4は、抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gが、CHO細胞上に発現しているアカゲザルDR5に対して用量依存性結合を示したことを示す。ヒトDR5をトランスフェクトしたCHO細胞およびモックトランスフェクトCHO細胞に対する結合を、それぞれ、陽性対照および陰性対照として試験した。IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gの両方について、ヒトDR5およびアカゲザルDR5に対する結合のEC50値は、同じ範囲であり(それぞれ、[0.014〜0.023μg/mL]および[0.051〜0.066μg/mL])、IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gが、ヒトDR5およびアカゲザルDR5に対して同等の結合を示すことが示された。
ヒトDR5およびマウスDR5の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、限定された相同性を示し(図5A)、ヒト化抗体IgG1-hDR5-01-F405LおよびIgG1-hDR5-05-F405Lは、マウスDR5に結合しない(図5C、D)。抗体結合に関与するヒトDR5細胞外ドメイン中のアミノ酸ストレッチを特定する目的で、本発明者らは、図5Bに視覚化されているように、特定のヒトDR5ドメインがマウスアナログによって置き換えられている、11種類のヒト-マウスキメラDR5分子(実施例1に記載されているドメインスワップ型DR5分子)を開発した。ドメインスワップ型DR5バリアントを、CHO細胞上で一過性に発現させた。ドメインスワップ型DR5分子に対するDR5抗体の結合の喪失により、ヒトDR5のスワップされたドメインが、結合にとって非常に重要である1つまたは複数のアミノ酸を含有することが示される。逆に、ドメインスワップ型DR5分子に対するDR5抗体の結合の保持により、ヒトDR5のスワップされたドメインが、結合にとって非常に重要であるアミノ酸を含有しないことが示される。結合アッセイのために、3×106個のトランスフェクト細胞を、洗浄して、3 mL FACS緩衝液に再懸濁した。100μLの細胞懸濁液を、96ウェル丸底プレート(Greiner Bio-one;カタログ番号650101)のウェルあたりに添加した(ウェルあたり100.000細胞)。次の工程を、4℃で行った。細胞を、沈殿させ、50μLのDR5抗体試料に再懸濁して(10μg/mLの最終濃度)、4℃で30分間インキュベートした。細胞を、2回洗浄し、50μLの二次抗体R-PE-コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2(Jackson ImmunoResearch;カタログ番号109-116-098;1/100)において4℃で30分間、光から保護してインキュベートした。細胞を、2回洗浄し、120μL FACS緩衝液に再懸濁して、FACS Canto II(BD Biosciences)上で分析した。生存PE陽性細胞のパーセンテージを、GraphPad Prism ソフトウェアを用いてプロットした。表面発現は、様々なエピトープに対するDR5抗体のパネルを用いて、各ドメインスワップ型DR5分子について確認した(示されていない)。gp120に対する非標的結合抗体IgG1-b12を、結合についての陰性対照として含めた。図5Cは、IgG1-hDR5-01-F405Lが、構築物E(79〜138)、F(97〜138)、G(139〜166)、およびH(139〜182)に対して結合の喪失を示し、他方、構築物A〜D(ヒトDR5配列56〜115をカバーする)およびI〜K(ヒトDR5配列167〜210をカバーする)に対する結合は保持されていたことを示す。合わせて、これらのデータにより、アミノ酸領域116〜138および139〜166は、各々、IgG1-hDR5-01-F405LのヒトDR5に対する結合に必要とされる1つまたは複数のアミノ酸を含有することが示される。図5Dは、IgG1-hDR5-05-F405Lが、構築物D(79〜115)、E(79〜138)、およびF(97〜138)に対して結合の喪失を示し、他方、構築物A〜C(ヒトDR5配列56〜78をカバーする)およびG〜K(ヒトDR5配列139〜210をカバーする)に対する結合は保持されていたことを示す。合わせて、これらのデータにより、アミノ酸領域79〜138は、IgG1-hDR5-05-F405LのヒトDR5に対する結合に必要とされる1つまたは複数のアミノ酸を含有することが示される。
DR5の細胞外ドメインに対する結合についてのヒト化DR5-01抗体とヒト化DR5-05抗体との間の競合を、本実施例に記載されているようなサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)におけるサンドイッチ結合アッセイによって、およびForteBio Octet(登録商標)HTXシステムを用いたバイオレイヤー干渉法(BLI)によって(データは示していない)測定した。ELISAのために、96ウェル平底ELISAプレート(Greiner bio-one;カタログ番号655092)を、100μL PBS中の2μg/mL DR5抗体(IgG1-hDR5-01-E430GまたはIgG1-hDR5-05-E430G)で、4℃で一晩コーティングした。ウェルを、200μL PBSA[PBS/1%ウシ血清アルブミン(BSA;Rocheカタログ番号10735086001)]を添加することによってブロッキングし、室温で1時間インキュベートした。ウェルを、PBST[PBS/0.05% Tween-20(Sigma-Aldrich;カタログ番号63158)]で3回洗浄した。次に、DR5ECD-FcHistag(SEQ ID NO 27)(0.2μg/mLの最終濃度)および競合抗体(1μg/mLの最終濃度)を、100μL PBSTA(PBST/0.2% BSA)の総体積において添加して、室温で1時間、振盪しながらインキュベートした。PBSTで3回洗浄した後、ウェルを、100μLのPBSTA中ビオチニル化抗Hisタグ抗体(R&D Systems;カタログ番号BAM050;1:2.000)と室温で1時間、ELISA振盪機上でインキュベートした。PBSTで3回洗浄した後、ウェルを、PBSTA中のストレプトアビジン標識ポリHRP(Sanquin;カタログ番号M2032;1:10.000)と室温で20分間、ELISA振盪機上でインキュベートした。PBSTで3回洗浄した後、100μLの2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸[ABTS(Roche;カタログ番号11112597001)]とのRTで30分間の、光から保護したインキュベーションを通して、反応を視覚化した。等体積の2%シュウ酸を添加することによって、基質反応を停止した。405 nmでの蛍光を、ELISAリーダー(BioTek ELx808 Absorbance Microplate Reader)上で測定した。図6は、競合抗体の非存在下でのDR5ECD-FcHisCtagの結合と比べた、競合抗体の存在下でのコーティングした抗体に対するDR5ECD-FcHisCtag結合の阻害パーセンテージとして表した、結合競合を示す(阻害%=100−[(競合抗体の存在下での結合/競合抗体の非存在下での結合)]*100)。コーティングしたIgG1-hDR5-01-E430Gに対するDR5ECD-FcHistagの結合は、可溶性IgG1-hDR5-05-E430Gの存在下で阻害されなかった。逆に、コーティングしたIgG1-hDR5-05-E430Gに対するDR5ECD-FcHistagの結合もまた、可溶性IgG1-hDR5-01-E430Gの存在下で阻害されなかった。これらのデータにより、IgG1-hDR5-01-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gは、DR5ECD-FcHisCtagの結合について互いに競合しなかったことが示され、それらが、ヒトDR5の細胞外ドメイン中の別個のエピトープを認識することが示唆された。これらのデータは、古典的なサンドイッチアッセイを用いたBLIによって確認され、そこでは、IgG1-hDR5-01-F405LまたはIgG1-hDR5-05-F405L(10 mM酢酸ナトリウムpH 6.0、ForteBioカタログ番号18-1070中、20μg/ml)を、アミン反応性第2世代バイオセンサー(FoteBioカタログ番号18-5092)上に固定化した。続いて、バイオセンサーを、DR5ECDdelHis(SEQ ID NO 28)(試料希釈液、ForteBioカタログ番号18-1048中、100 nM)とインキュベートして、競合抗体(試料希釈液中、5μg/mL)の結合を分析した(データは示していない)。
ヒト結腸がん細胞COLO 205およびHCT 116を殺傷する抗体の能力に対する、IgG1-DR5-01-K409RおよびIgG1-DR5-05-F405Lにおける六量体化増強変異E430Gの効果を研究するために、生存率アッセイを行った。抗体を、単一作用物質として、ならびに、DR5-01抗体およびDR5-05抗体の組み合わせとして試験した。COLO 205細胞を、非接着性細胞およびトリプシン処理した接着性細胞を含有する培養上清をプールすることによって収集した。HCT 116細胞は、トリプシン処理によって収集した。細胞を、セルストレーナーを通過させ、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、0.5×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。100μLの単一細胞懸濁液(ウェルあたり5,000細胞)を、ポリスチレン96ウェル平底プレート(Greiner Bio-One、カタログ番号655182)に播種した。50μLの連続希釈抗体調製物系列(5倍希釈において、0.05〜20,000 ng/mLの最終濃度の範囲)を添加して、37℃で3日間インキュベートした。2種類の抗体の組み合わせで処置した試料において、アッセイにおける総抗体濃度は、単一抗体で処置した試料におけるものと同じであった。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン(Sigma Aldrich、カタログ番号S6942)とインキュベートした。培養細胞の生存率を、代謝的に活性を有する細胞の指標である、存在するATPを定量する、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイ(Promega、カタログ番号G7571)において決定した。キットから、20μLのルシフェリン溶液試薬をウェルあたりに添加して、500 rpmで2分間、プレートを振盪することによって混合した。次に、プレートを、37℃で1.5時間インキュベートした。100μLの上清を白色OptiPlate-96(Perkin Elmer、カタログ番号6005299)に移して、発光を、EnVision Multilabel Reader(PerkinElmer)上で測定した。データを、GraphPad Prismソフトウェアを用いた非線形回帰(可変の傾きを有するシグモイド用量応答)を用いて分析し、プロットした。図7は、以下の式を用いて算出した際の、生細胞のパーセンテージを示す:生細胞%=[(抗体試料の発光−スタウロスポリン試料の発光)/(抗体なし試料の発光−スタウロスポリン試料の発光)]*100。
実施例8において、六量体化増強変異を有する2種類のクロスブロックしない抗DR5抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gを組み合わせることが、単一抗体の効力と比較して、がん細胞株に対する殺傷の増強を結果としてもたらしたことが示される。ここで、本発明者らは、2種類のクロスブロックしない抗DR5抗体対2種類のクロスブロックする抗DR5抗体の効力を比較する。抗体IgG1-chTRA8-F405L-E430Gの、クロスブロックしない抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430Gまたはクロスブロックする抗体IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのいずれかとの組み合わせの、単一抗体と比較してHCT 116結腸がん細胞の殺傷を誘導する能力を研究するために、生存率アッセイを行った。抗体IgG1-chTRA8-F405LおよびIgG1-DR5-05-F405LについてのクロスブロックELISAを、実施例7に記載されているように行い、Octet(登録商標)HTXシステム上でのサンドイッチ結合アッセイによって確認した(データは示されていない)。HCT 116細胞に対する生存率アッセイを、5倍希釈において、0.00005〜20μg/mLの最終濃度の範囲にわたる連続希釈した抗体系列で、実施例8に記載されているように行った。図8は、HCT 116細胞の殺傷における単一抗体の効力が、2種類のクロスブロックしない抗体IgG1-chTRA8-F405L-E430GおよびIgG1-DR5-01-K409R-E430Gを組み合わせることによって増強され(図8B)、2種類のクロスブロックする抗体IgG1-chTRA8-F405L-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gを組み合わせることによっては増強されなかった(図8C)ことを示す。
2種類のクロスブロックしない抗体の別の組み合わせ(IgG1-CONA-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E345K)およびその二重特異性誘導体BsAb IgG1-CONA-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E345Kの、それぞれ、六量体化増強変異を有さない抗体の組み合わせおよび二重特異性抗体と比較した、HCT 116結腸がん細胞の殺傷を誘導する能力を研究するために、生存率アッセイを行った。抗体IgG1-CONA-K409RおよびIgG1-DR5-05-F405LについてのクロスブロックELISAを、実施例7に記載されているように行い、Octet(登録商標)HTXシステム上でのサンドイッチ結合アッセイによって確認した(データは示していない)。HCT 116細胞に対する生存率アッセイを、5倍希釈において、0.01〜20,000 ng/mLの最終濃度の範囲にわたる連続希釈した抗体系列で、実施例8に記載されているように行った。図9は、六量体化増強変異を有する、クロスブロックしない抗体の組み合わせIgG1-CONA-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E345KおよびBsAb IgG1-CONA-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E345Kが、六量体化増強変異E430GまたはE345Kを有さないこれらの抗体と比較して、HCT 116細胞の殺傷において効力の増強を示したことを示す。
六量体化増強変異E430Gを有するおよび有さない、ヒト-マウスキメラ抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405Lの、COLO 205、HCT-15、HCT 116、HT-29、およびSW480結腸がん、BxPC-3、HPAF-II、およびPANC-1膵臓がん、SNU-5胃がん、A549およびSK-MES-1肺がん、ならびにA375皮膚がん細胞の殺傷を誘導する能力を研究するために、生存率アッセイを行った。接着性細胞を、トリプシン処理によって収集し、セルストレーナーを通過させた。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、0.5×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した[COLO 205、HCT-15、SW480、およびBxPC-3:25mM HepesおよびL-グルタミンを含むRPMI 1640(Lonzaカタログ番号BE12-115F)+10% DBSI(Life Technologiesカタログ番号10371-029)+Pen/Strep(Lonzaカタログ番号DE17-603E);HCT 116およびHT-29: L-グルタミンおよびHepesを含むマッコイ5A培地(Lonza、カタログ番号BE12-168F)+10% DBSI+Pen/Strep;HPAF-IIおよびSK-MES-1:イーグル最小必須培地(EMEM、ATCCカタログ番号30-2003)+10% DBSI+Pen/Strep;PANC-1およびA375:L-Glnを含まず、HEPESを含むDMEM 4.5 g/L グルコース(Lonzaカタログ番号LO BE12-709F)+10% DBSI+1 mM L-グルタミン(Lonzaカタログ番号BE17-605E)+Pen/Strep;SNU-5:IMDM (Lonzaカタログ番号BE12-722F)+10% DBSI+Pen/Strep;A549:F-12K培地(ATCCカタログ番号30-2004)+10% DBSI+1 mM L-グルタミン+Pen/Strep]。100μLの単一細胞懸濁液(ウェルあたり5,000細胞)を、ポリスチレン96ウェル平底プレート(Greiner Bio-One、カタログ番号655182)に播種し、37℃で一晩インキュベートした。接着性細胞の上清を、150μLの抗体試料(最終濃度10μg/mL)によって置き換え、37℃で3日間インキュベートした。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン(Sigma Aldrich、カタログ番号S6942)とインキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。全ての試験した細胞株について、生細胞のパーセンテージは、10μg/mLの抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gとのインキュベーション後に、非標的結合陰性対照抗体IgG1-b12とのインキュベーション後よりも有意に低かった(図10)。試験した細胞株のうちの2種類を除いた全てにおいて、抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの効力は、六量体化増強変異を有さない組み合わせIgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405Lについてよりも有意に高かった。これらのデータにより、六量体化増強変異を有するキメラDR5抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、二次的架橋物質の必要なく、結腸がん、膵臓がん、胃がん、肺がん、および皮膚がんを含む様々な起源のがん標的細胞の殺傷において非常に有効であったことが示される。IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの殺傷効力とDR5標的発現レベル(実施例2に記載)との間には、いかなる相関もなかった。
キメラ抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの、インビトロでBxPC-3およびPANC-1膵臓がん細胞の殺傷を誘導する効能を、ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430Gの効能と比較するために、生存率アッセイを行った。細胞を、トリプシン処理によって収集し、セルストレーナーを通過させた。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、0.5×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。100μLの単一細胞懸濁液(ウェルあたり5,000細胞)を、ポリスチレン96ウェル平底プレート(Greiner Bio-One、カタログ番号655182)に播種し、37℃で一晩インキュベートした。接着性細胞の上清を、連続希釈抗体調製物系列の150μL抗体試料によって置き換え、37℃で3日間インキュベートした。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン(Sigma Aldrich、カタログ番号S6942)とインキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。六量体化増強変異を有するヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430Gは、対応するキメラ抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gと類似した用量応答曲線を示した(図11)。
アミノ酸配列N55-G56を、IgG1-hDR5-01およびIgG1-hDR5-05の重鎖のCDR2領域(SEQ ID NO:2)における潜在的なアスパラギン(Asn)アミド分解モチーフとして特定した。標的結合に対するアミド分解の効果を試験するために、この位置でのアミド分解を、IgG1-hDR5-01-K409RおよびIgG1-hDR5-05-F405LにおけるN55D変異の導入によって模倣した。IgG1-hDR5-01-N55D-K409RおよびIgG1-hDR5-05-N55D-F405Lを、HCT 116細胞に対する結合について、実施例3に記載されているようなFACS分析によって試験した。図12Aは、N55D変異の導入によるアミド分解の模倣が、HCT 116細胞上のIgG1-hDR5-01-K409Rの結合の強い減少を結果としてもたらしたことを示す。対照的に、IgG1-hDR5-05-F405LおよびIgG1-hDR5-05-N55D-F405Lは、同等の結合曲線を示した。DR5-01抗体におけるAsnアミド分解のリスクを低減させるために、G56T変異をIgG1-hDR5-01-E430Gに導入し、この抗体バリアントを、HCT 116細胞に対する結合について、実施例3に記載されているようなFACS分析によって試験した。図12Bは、変異が、HCT 116細胞へのIgG1-hDR5-01-E430Gの結合に対していかなる効果も有さなかったことを示す。
細胞死を誘導するための、IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gによる抗体六量体形成の必要性を解析するために、本発明者らは、自己反発変異K439EおよびS440Kを使用した(Diebolder et al., Science. 2014 Mar 14;343(6176):1260-3)。1つのIgG1抗体における、または抗体の組み合わせにおける、K439EまたはS440Kのいずれかの存在によって導入される抗体間のFc反発は、E345KまたはE430Gなどの六量体化増強変異の存在下でさえも、六量体化の阻害を結果としてもたらす(WO2013/0044842)。K439EおよびS440K変異による反発は、一方またはもう一方の変異を各々保有する2種類の抗体の混合物において両方の変異を組み合わせることによって中和され、Fc:Fc相互作用および六量体化の回復を結果としてもたらす。IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの両方について、K439EまたはS440K変異のいずれかを有するバリアントを生成し、全ての異なる組み合わせで試験した。生存率アッセイを、実施例11に記載されているように、BxPC-3膵臓がん細胞およびHCT-15結腸がん細胞に対して、4倍希釈において0.3〜20,000 ng/mLの総濃度の範囲にわたる連続希釈抗体調製物系列で行った。
抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gによる細胞死の誘導におけるFc-Fc媒介性抗体六量体化の関与を試験するために、本発明者らは、Fc-Fc相互作用に関与する疎水性パッチ中のコアアミノ酸を含有する領域においてFcに結合する(Diebolder et al., Science. 2014 Mar 14;343(6176):1260-3)、13残基ペプチドDCAWHLGELVWCT(DeLano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456):1279-83)を使用した。BxPC-3細胞に対する生存率アッセイを、DCAWHLGELVWCTペプチドの存在下または非存在下で、抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gについて、実施例11に記載されているように行った。簡潔に言うと、細胞の37℃での一晩インキュベーションの後、培養培地を除去して、希釈系列(0〜100μg/mLの範囲)のFc結合DCAWHLGELVWCTペプチド、非特異的対照ペプチドGWTVFQKRLDGSVを含有する、またはペプチドなしの、100μL培養培地によって置き換えた。次に、50μLの抗体試料(833 ng/mLの最終濃度)を添加して、37℃で3日間インキュベートした。抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、BxPC-3細胞の殺傷を誘導する能力は、100μg/mLのFc結合DCAWHLGELVWCTペプチドによって強く阻害された(図14)。これらのデータにより、六量体化増強変異を有する抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、がん細胞の細胞表面上でのDR5クラスター化およびアポトーシスの誘導を誘導する能力における、Fc:Fc相互作用の関与が示される。
抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの、様々な比のIgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gで組み合わせた場合の、BxPC-3膵臓がん細胞の殺傷を誘導する能力を研究するために、生存率アッセイを行った。細胞を、トリプシン処理によって収集し、セルストレーナーを通過させた。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、0.5×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。100μLの単一細胞懸濁液(ウェルあたり5,000細胞)を、ポリスチレン96ウェル平底プレート(Greiner Bio-One、カタログ番号655182)に播種し、37℃で一晩インキュベートした。様々な比のIgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gを有する50μLの抗体試料(5倍希釈において、0.06〜20μg/mLの最終濃度の範囲にわたる連続希釈系列で、100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、および0:100のDR5-01:DR5-05の比として示す)を添加して、37℃で3日間インキュベートした。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン(Sigma Aldrich、カタログ番号S6942)とインキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。20μg/mLおよび4μg/mLの総抗体濃度で、殺傷は、抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gの両方を含有する全ての試験した抗体比で同等に有効であった。0.8μg/mLおよび0.16μg/mLの総抗体濃度で、抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gの両方を含有する全ての試験した抗体比は、殺傷を誘導した(図15)。
抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、様々な抗体比で組み合わせた場合の、BxPC-3膵臓がん細胞およびHCT-15結腸がん細胞の殺傷を誘導する能力を研究するために、生存率アッセイを行った。概して、実験は、実施例16に記載されているように行った。簡潔に言うと、あらかじめ付着させた細胞(ウェルあたり5,000細胞)を、BxPC-3については10μg/mLおよびHCT-15については20μg/mLの最終抗体濃度の、様々な比のIgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430G(100:0、98:2、96:4、94:6、92:8、90:10、50:50、10:90、8:92、6:94、4:96、2:98、および0:100のDR5-01:DR5-05の比として図16に示す)と、ポリスチレン96ウェル平底プレート中150μLにおいて、37℃で3日間インキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。殺傷は、抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの両方を含有する全ての試験した抗体比で同等に有効であった(図16)。
カスパーゼ阻害剤の存在下および非存在下で、ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの細胞傷害を比較するために、生存率アッセイを行った。PANC-1およびBxPC3膵臓がん細胞を、トリプシン処理によって収集し、セルストレーナーを通過させた。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、0.5×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。100μLの単一細胞懸濁液(ウェルあたり5,000細胞)を、ポリスチレン96ウェル平底プレート(Greiner Bio-One、カタログ番号655182)に播種し、37℃で一晩インキュベートした。25μLの汎カスパーゼ阻害剤Z-Val-Ala-DL-Asp-フルオロメチルケトン(Z-VAD-FMK、150μLにおいて5μMの終末濃度、Bachem、カタログ番号4026865.0005)を細胞培養物に添加して、37℃で1時間インキュベートし、その後、連続希釈抗体調製物系列(4倍希釈において、1〜20μg/mLの最終濃度の範囲)の25μL抗体試料を添加して、37℃で3日間、さらにインキュベートした。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン(Sigma Aldrich、カタログ番号S6942)とインキュベートした。組み換えヒトTRAIL/APO-2L(eBioscience、カタログ番号BMS356)を、6μg/mLの最終濃度で使用した。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。六量体化増強変異を有するヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gは、汎カスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMKの存在下で、PANC-1およびBxPC3膵臓がん細胞の生存率を低減させることができず、IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの組み合わせが、カスパーゼ依存性プログラム細胞死を誘導したことが示された(図17)。これはまた、天然のDR5リガンドTRAILについても示された。
細胞死誘導の速度論を、アネキシンV/ヨウ化プロピジウム(PI)二重染色および活性カスパーゼ-3染色によって解析した。アネキシン-Vは、プログラム細胞死の開始後に細胞表面上に露出されるホスファチジルセリンに結合し、これは可逆的プロセスである。PIは、細胞に入った場合に二本鎖DNAおよびRNAの中にインターカレートする色素である。PIは、無傷の形質膜および核膜を通過できないため、生きている細胞を染色することはないが、膜の完全性が低下している瀕死の細胞にのみ入って染色する。これらの特徴のために、アネキシンV/PI二重染色は、開始プログラム細胞死(アネキシンV陽性/PI陰性)と不可逆的プログラム細胞死(アネキシンV陽性/PI陽性)との間を区別するために適用することができる。カスパーゼ-3は、外因性のデス受容体誘導性細胞死経路および内因性のミトコンドリア細胞死経路の両方によって活性化される。したがって、活性カスパーゼ-3はまた、死カスケードの開始についてのマーカーでもある。IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせの結合時の細胞死の誘導を、DR5陽性COLO 205結腸がん細胞において解析した。細胞を、非接着性細胞およびトリプシン処理した接着性細胞を含有する培養上清をプールすることによって収集した。細胞を、セルストレーナーを通過させ、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させて、0.2×106細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。500μLの単一細胞懸濁液(ウェルあたり100,000細胞)を、24ウェル平底培養プレート(Greiner Bio-One、カタログ番号662160)に播種して、37℃で16時間インキュベートした。500μLの抗体試料を添加し(1μgの抗体最終濃度)、37℃で5時間または24時間インキュベートした。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン(Sigma Aldrich、カタログ番号S6942)とインキュベートした。細胞を、250μLの1×PBSで1回洗浄した。接着性細胞を、100μLの0.05%トリプシンと37℃で10分間インキュベートすることによって収集した。200μLの培地を、トリプシン処理した細胞に添加し、細胞を、96ウェル丸底FACSプレート(Greiner Bio-One、カタログ番号650101)に移して、非接着性細胞とプールした。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、200μLの氷冷PBSに再懸濁して、それぞれ、アネキシンV/PI染色および活性カスパーゼ-3染色のために、96ウェル丸底FACSプレートにおいて100μLの2種類の試料に分けた。
実施例19において、キメラDR5抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gとのインキュベーションが、COLO 205結腸がん細胞においてカスパーゼ-3の活性化を誘導したことが記載された。活性カスパーゼ-3陽性細胞のパーセンテージは、抗体の組み合わせとのインキュベーションの24時間後よりも5時間後に、より高かった。本実施例においては、カスパーゼ-3/7認識モチーフDEVDを有する基質が、切断時に、ルシフェラーゼの基質であるアミノルシフェリンを放出する、カスパーゼ-Glo 3/7アッセイ(Promega、カタログ番号G8091)を用いて、カスパーゼ-3/7の活性化を時間において測定した。細胞を、非接着性細胞およびトリプシン処理した接着性COLO 205を含有する培養上清をプールすることによって収集した。細胞を、セルストレーナーを通過させ、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させて、0.8×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。25μLの単一細胞懸濁液(ウェルあたり2,000細胞)を、384ウェル培養プレート(Perkin Elmer、カタログ番号6007680)に播種し、37℃で16時間インキュベートした。25μLの抗体試料を添加し(1μgの抗体最終濃度)、37℃で1、2、5、および24時間インキュベートした。プレートを、インキュベーターから取り出し、室温まで温度を低下させた。細胞を、300 gで3分間の遠心分離によって沈殿させた。25μLの上清を除去し、25μLのカスパーゼ-Glo 3/7基質によって置き換えた。500 rpmで1分間振盪することによって混合した後、プレートを、室温で1時間インキュベートした。発光を、EnVision Multilabel Reader(Perkin Elmer)上で測定した。
二次的抗体架橋剤の非存在下および存在下での抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの、COLO 205大腸がん細胞ならびにBxPC-3およびPANC-1膵臓がん細胞の殺傷を誘導する能力を比較するために、生存率アッセイを行った。比較のために、二次的抗体架橋剤の存在下で殺傷の増強を示すことが公知である2種類のDR5抗体IgG1-CONAおよびIgG1-chTRA8-F405Lを、同じ設定で試験した。細胞を、トリプシン処理によって収集し、セルストレーナーを通過させた。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、0.5×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。100μLの単一細胞懸濁液(ウェルあたり5,000細胞)を、ポリスチレン96ウェル平底プレート(Greiner Bio-One、カタログ番号655182)に播種し、37℃で一晩インキュベートした。接着性細胞の上清を、ヤギ抗ヒトIgG抗体のF(ab')2断片(1/150;Jackson ImmunoResearch;カタログ番号109-006-098)の非存在下または存在下の、150μLの抗体試料(最終濃度10μg/mL)によって置き換え、37℃で3日間インキュベートした。細胞殺傷の陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン(Sigma Aldrich、カタログ番号S6942)とインキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、Fc架橋剤の存在下または非存在下の両方で、COLO 205、BxPC-3、およびPANC-1がん細胞の、陰性対照と比較して有意な殺傷を誘導した(図20)。対照的に、DR5抗体IgG1-DR5-CONAおよびIgG1-DR5-chTRA8-F405Lは、Fc架橋剤の非存在下で標的細胞殺傷を誘導しなかった。Fc架橋は、COLO 205およびBxPC-3細胞において、IgG1-DR5-CONAおよびIgG1-DR5-chTRA8-F405Lによる殺傷を誘導したが、架橋剤の存在下または非存在下での抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gよりも、有意に低い効能であった。これらのデータにより、抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430GによるCOLO 205、BxPC-3、およびPANC-1がん細胞の殺傷は、二次的Fc架橋剤の存在とは無関係であること、ならびに、この架橋剤と無関係の殺傷は、Fc架橋されたIgG1-DR5-CONA およびIgG1-DR5-chTRA8-F405Lについてよりも効率的であることが示される。
本出願に記載されている実験の多くにおいて、抗DR5抗体IgG1-01およびIgG1-05は、IgG Fcドメイン中に、それぞれ、K409RおよびF405L(EU付番インデックス)変異を含有する。これらの変異により、WO2011/131746に記載されているような制御された還元条件下で、IgG1-01-K409RとIgG1-05-F405Lとの間のFabアーム交換反応によるDR5二重特異性抗体の生成が可能になる。Fabアーム交換がないと、K409RおよびF405L変異をもつヒトIgG1抗体は、野生型ヒトIgG1と同じ機能的特徴を示すと考えられている(Labrijn et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Mar 26;110(13):5145-50)。ここで、本発明者らは、K409RまたはF405L変異の存在が、親IgG1-01およびIgG1-05抗体の組み合わせの、インビトロでDR5陽性腫瘍細胞において細胞死を誘導する能力に対していかなる効果も有さないことを示す。ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430Gの、BxPC-3膵臓がん細胞の殺傷を誘導する能力を、ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの能力と比較するために、生存率アッセイを行った。BxPC-3に対する生存率アッセイを、実施例11に記載されているように、4倍希釈において、0.001〜20,000 ng/mLの最終濃度の範囲にわたる連続希釈した抗体系列で行った。BxPC-3膵臓がん細胞株は、ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430Gとのインキュベーション後に、ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gと類似した生存率曲線を示した(図21)。これらのデータにより、K409RおよびF405L変異は、E430G六量体化増強変異を有するヒト化DR5-01およびDR5-05抗体の組み合わせの効能に対していかなる効果も有さなかったことが示される。
2種類の異なるDR5エピトープを標的とする二重特異性抗体を、実施例1に記載されているように、キメラ抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430GとIgG1-DR5-05-F405L-E430Gとの間のFabアーム交換によって生成した。10μg/mLのキメラBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gの、様々な組織起源のがん細胞(COLO 205大腸がん、A375皮膚がん、SK-MES-1肺がん、BxPC-3膵臓がん、およびSNU-5胃がん細胞株)の殺傷を誘導する能力を試験するために、生存率アッセイを、実施例11に記載されているように行った。全ての試験した細胞株について、生細胞のパーセンテージは、10μg/mLのキメラBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G抗体とインキュベートした場合に、非標的結合陰性対照抗体IgG1-b12と比較して有意に低かった(図22)。これらのデータにより、六量体増強変異E430Gを有する二重特異性抗DR5xDR5'抗体は、結腸がん、膵臓がん、胃がん、肺がん、および皮膚がんを含む様々な起源のがん細胞の殺傷を、二次的架橋剤の必要なく誘導したことが示される。
二次的抗体架橋剤の非存在下および存在下でのキメラBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの、BxPC-3膵臓がん細胞およびCOLO 205結腸がん細胞の殺傷を誘導する効能を比較するために、生存率アッセイを、実施例21に記載されているように行った。比較のために、二次的抗体架橋剤の存在下で殺傷の増強を示すことが公知である2種類のDR5抗体IgG1-CONAおよびIgG1-chTRA8-F405Lを、同じ設定で試験した。キメラBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gは、Fc架橋剤の存在下または非存在下の両方で、COLO 205およびBxPC-3がん細胞の、陰性対照と比較して有意な殺傷を示した(図23)。対照的に、DR5抗体IgG1-DR5-CONAおよびIgG1-DR5-chTRA8-F405Lは、Fc架橋剤の存在下で殺傷を誘導しただけであった。
COLO 205細胞に対する1μg/mL BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gによる細胞死誘導の速度論を、実施例19に記載されているように、アネキシンV/ヨウ化プロピジウム(PI)二重染色および活性カスパーゼ-3染色によって解析した。
六量体化増強変異を有する、様々な抗DR5抗体およびDR5-01 + DR5-05抗体の組み合わせのインビボ抗腫瘍効力を、COLO 205ヒト結腸がん細胞での皮下モデルにおいて評定した。0日目に、細胞を、非接着性細胞およびトリプシン処理した接着性細胞を含有する培養上清をプールすることによって収集した。3×106細胞を、6〜11週齢の雌SCIDマウス(C.B-17/IcrHan(登録商標)Hsd-Prkdcscid;Harlan)の側腹部中に、200μL PBSの体積において注射した。全ての実験および動物の取扱いは、地方自治体によって承認され、全ての適用可能な国際的な、国家の、および地方の法律および指針に従って実施した。腫瘍の発生を、少なくとも週に2回、0.52×(長さ)×(幅)2としてカリパス(PLEXX)測定値によってモニターした。腫瘍を、1,500 mm3の終点腫瘍体積まで、腫瘍が潰瘍形成を示すまで、重篤な臨床徴候が観察されるまで、または腫瘍成長がマウスの動きを阻止するまで測定した。6日目に、平均腫瘍体積は約200 mm3であり、マウスを、同等の腫瘍サイズ分散を有する群に選別した(下記の表2)。マウスを、6および13日目に、200μL PBS中の100μg抗体の腹腔内(i.p.)注射によって処置した(用量あたり5 mg/kg)。適正な抗体投与を確認するため、血液試料を、最初の投薬の3日後にIgG血清決定のために取得した。3匹の個々のマウスは、検出可能なヒトIgG血漿レベルを有さず、統計分析から排除した(下記の表2を参照されたい)。他のマウスについて、ヒト抗体血漿濃度は、Vcen=50 mL/kg、Vs=100 mL/kgの2コンパートメントモデルならびに11.6日の排出半減期を仮定した場合に、期待値に従っていた(データは示していない)。腫瘍を、腫瘍接種の16週間後まで測定した。
様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、皮下COLO 205ヒト結腸がん異種移植モデルにおいて評定し、等価投薬のIgG1-CONAと比較した。腫瘍細胞接種、マウスの取扱い、腫瘍増生の測定、および終点決定は、実施例26に記載されているように行った。10日目に、平均腫瘍体積は約400 mm3であり、マウスを、同等の腫瘍サイズ分散を有する群に選別した(下記の表3)。マウスを、10日目に、100μL PBS中の40μg(2 mg/kg)、10μg(0.5 mg/kg)、または2μg(0.1 mg/kg)の抗体の静脈内(i.v.)注射によって処置した。対照群におけるマウスは、40μg(2 mg/kg)IgG1-b12で処置した。腫瘍を、腫瘍接種の17週間後まで測定した。
様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、皮下BxPC-3ヒト膵臓がん異種移植モデルにおいて評定し、等価投薬のIgG1-CONA-F405Lと比較した。0日目に、接着性細胞をトリプシン処理によって収集した。5×106細胞を、6〜11週齢の雌SCIDマウス(C.B-17/IcrHan(登録商標)Hsd-Prkdcscid;Harlan)の側腹部中に、100μL PBSの体積において注射した。マウスの取扱い、腫瘍増生の測定、および終点決定は、実施例26に記載されているように行った。10日目に、平均腫瘍体積は約250 mm3であり、マウスを、同等の腫瘍サイズ分散を有する群に選別した(下記の表4)。マウスを、20および28日目に、200μL PBS中の200μg(10 mg/kg)、40μg(2 mg/kg)、または10μg(0.5 mg/kg)の抗体のi.v.注射によって処置した。対照群におけるマウスは、200μg(10 mg/kg)IgG1-b12で処置した。適正な抗体投与を確認するため、血液試料を、投薬の1週間後にIgG血清決定のために取得した。腫瘍を、腫瘍接種の10週間後まで測定した。
様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、皮下A375ヒト皮膚がん異種移植モデルにおいて評定し、等価投薬のIgG1-CONA-F405Lと比較した。0日目に、接着性細胞をトリプシン処理によって収集した。5×106細胞を、6〜11週齢の雌SCIDマウス(C.B-17/IcrHan(登録商標)Hsd-Prkdcscid;Harlan)の側腹部中に、100μL PBSの体積において注射した。マウスの取扱い、腫瘍増生の測定、および終点決定は、実施例26に記載されているように行った。19日目に、平均腫瘍体積は約250 mm3であり、マウスを、同等の腫瘍サイズ分散を有する群に選別した(下記の表5)。マウスを、19および26日目に、200μL PBS中の200μg(10 mg/kg)、40μg(2 mg/kg)、または10μg(0.5 mg/kg)の抗体のi.v.注射によって処置した。対照群におけるマウスは、200μg(10 mg/kg)IgG1-b12で処置した。適正な抗体投与を確認するため、血液試料を、投薬の1週間後にIgG血清決定のために取得した。腫瘍体積を、腫瘍接種の7週間後まで解析した。
様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、CrownBiosciences, Taicang, Chinaで、皮下HCT-15ヒト結腸がん異種移植モデルにおいて評定し、等価投薬のIgG1-CONAと比較した。細胞を、インビトロで、10%胎児ウシ血清を補給したRPMI-1640培地における単層培養として、37℃で空気中5% CO2の雰囲気において維持した。指数増殖期の接着性細胞を、トリプシン-EDTA処理によって収集した。5×106細胞を、6〜8週齢の雌BALB/cヌードマウス(Shanghai Laboratory Animal Center)の側腹部中に、100μL PBSの体積において注射した。研究中の動物の世話および使用は、Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC)の規則に従って実施した。腫瘍体積を、毎週2回、カリパスを用いて二次元で測定し、体積を、式:V=0.5 a×b2(式中、aおよびbは、それぞれ、腫瘍の長径および短径である)を用いてmm3で表した。腫瘍接種の11日後に、平均腫瘍サイズは186 mm3に達し、マウスを、乱塊法を用いて群に割り当てて、処置を開始した。マウスを、Q7Dレジメンに従って、g体重あたり、10μL PBS中の200μg(10 mg/kg)、40μg(2 mg/kg)、または10μg(0.5 mg/kg)の抗体のi.v.注射によって2回処置した。対照群におけるマウスを、並行して、200μg(10 mg/kg)IgG1-b12で処置した。腫瘍接種後に、動物の福祉を毎日確認し、腫瘍体積を毎週2回測定した。
様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、CrownBiosciences, Taicang, Chinaで、皮下SW480ヒト結腸がん異種移植モデルにおいて評定し、等価投薬のIgG1-CONAと比較した。細胞を、インビトロで、10%胎児ウシ血清を補給したL-15培地における単層培養として、37℃で100%空気において維持した。指数増殖期の接着性細胞を、トリプシン-EDTA処理によって収集した。1×107細胞を、6〜8週齢の雌NOD/SCIDマウス(Beijing HFK Bioscience)の側腹部中に、マトリゲル(1:1)と共に200μL PBSの体積において注射した。マウスの取扱いおよび腫瘍体積の測定は、実施例30に記載されているように行った。腫瘍接種の10日後に、平均腫瘍サイズは175 mm3に達し、マウスを、乱塊法を用いて群に割り当てて、処置を開始した。マウスを、Q7Dレジメンに従って、g体重あたり、10μL PBS中の200μg(10 mg/kg)、40μg(2 mg/kg)、または10μg(0.5 mg/kg)の抗体のi.v.注射によって2回処置した。対照群におけるマウスを、並行して、200μg(10 mg/kg)IgG1-b12で処置した。腫瘍接種後に、動物の福祉を毎日確認し、腫瘍体積を毎週2回測定した。
様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、CrownBiosciences, Taicang, Chinaで、皮下SNU-5ヒト胃がん異種移植モデルにおいて評定し、等価投薬のIgG1-CONAと比較した。細胞を、インビトロで、20%胎児ウシ血清を補給したIMDM培地における浮遊培養として、37℃で空気中5% CO2の雰囲気において維持した。指数増殖期の細胞を収集し、1×107細胞を、6〜8週齢の雌CB17/SCIDマウス(Beijing HFK Bioscience)の側腹部中に、マトリゲル(1:1)と共に200μL PBSの体積において注射した。マウスの取扱いおよび腫瘍体積の測定は、実施例30に記載されているように行った。腫瘍接種の8日後に、平均腫瘍サイズは169 mm3に達し、マウスを、乱塊法を用いて群に割り当てて、処置を開始した。マウスを、Q7Dレジメンに従って、g体重あたり、10μL PBS中の200μg(10 mg/kg)、40μg(2 mg/kg)、または10μg(0.5 mg/kg)の抗体のi.v.注射によって2回処置した。対照群におけるマウスを、並行して、200μg(10 mg/kg)IgG1-b12で処置した。腫瘍接種後に、動物の福祉を毎日確認し、腫瘍体積を毎週2回測定した。
様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、CrownBiosciences, Taicang, Chinaで、皮下SK-MES-1ヒト肺がん異種移植モデルにおいて評定し、等価投薬のIgG1-CONAと比較した。細胞を、インビトロで、10%胎児ウシ血清および0.01 mM NEAAを補給したMEM培地における単層培養として、37℃で空気中5% CO2の雰囲気において維持した。0日目に、指数増殖期の接着性細胞を、トリプシン-EDTA処理によって収集した。5×106細胞を、6〜8週齢の雌BALB/cマウス(Shanghai Laboratory Animal Center)の側腹部中に、100μL PBSの体積において注射した。マウスの取扱いおよび腫瘍体積の測定は、実施例30に記載されているように行った。腫瘍接種の21日後に、平均腫瘍サイズは161 mm3に達し、マウスを、乱塊法を用いて群に割り当てて、処置を開始した。マウスを、Q7Dレジメンに従って、g体重あたり、10μL PBS中の200μg(10 mg/kg)、40μg(2 mg/kg)、または10μg(0.5 mg/kg)の抗体のi.v.注射によって2回処置した。対照群におけるマウスを、並行して、200μg(10 mg/kg)IgG1-b12で処置した。腫瘍接種後に、動物の福祉を毎日確認し、腫瘍体積を毎週2回測定した。
細胞あたりのDR5密度を、実施例2に記載されているように、マウスモノクローナル抗体B-K29と共にQIFIKITを用いた間接免疫蛍光によって、様々なヒトがん細胞株について定量した。細胞株を、低いDR5発現(ABC<10,000)および中等度のDR5発現(ABC>10,000)に従って分類した。ヒトがん細胞株SK-MEL-5(ATCC, HTB-070)悪性黒色腫、Jurkat(ATCC, TIB-152)急性T細胞白血病、およびDaudi(ATCC, CCL-231)バーキットリンパ腫は、低いDR5発現を有することが見出された(QIFIKIT ABC範囲3,500〜6,500)。ヒト大腸がん細胞株SNU-C2B(ATCC, CCL-250)、LS411N(ATCC, CRL-2159)、およびDLD-1(ATCC, CCL-221)は、中等度のDR5発現を有することが見出された(QIFIKIT ABC範囲12,000〜44,500)。
ヒト結腸がん細胞HCT 116に対する結合を、E430G変異を有するおよび有さないIgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05の精製した抗体バリアントについてフローサイトメトリーによって分析した。単一細胞懸濁液を調製して、実施例3に記載されているように、連続希釈抗体調製物系列(4倍希釈において、0.0006〜10μg/mLの最終濃度の範囲)について、結合を分析した。二次抗体とのインキュベーション後に、細胞を2回洗浄し、100μL FACS緩衝液に再懸濁して、抗体結合を、BD LRSFFortessa細胞分析器(BD Biosciences)上で分析した。結合曲線を、GraphPad Prismソフトウェアを用いた非線形回帰分析(可変の傾きを有するシグモイド用量応答)を用いて分析した。
中等度のDR5発現を有するHCT 116ヒトがん細胞に対する抗体結合を、単一作用物質としておよび2種類の抗体の組み合わせとしての両方で、Alexa 647標識IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびAlexa 647標識IgG1-hDR5-05-E430Gの精製した試料についてフローサイトメトリーによって分析した。1 mg/mLのIgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gを、3の標識度に到達するように、0.1 M NaHCO3コンジュゲーション緩衝液において、5モル過剰量のAlexa Fluor(登録商標)647カルボン酸スクシンイミジルエステル(Molecular Probes;カタログ番号A-20006)で1時間、室温で標識した。遊離の過剰量のAlexa 647を、PD 10カラム(Amersham Bioscience、カタログ番号17-0851-01)上で除去した。単一細胞懸濁液を調製して、実施例3に記載されているように、連続希釈抗体調製物系列(5倍希釈において、0.0019〜30μg/mLの最終濃度の範囲)について結合を分析した。抗体インキュベーション後に、細胞を2回洗浄し、100μL FACS緩衝液に再懸濁して、抗体結合を、BD LRSFFortessa細胞分析器(BD Biosciences)上で分析した。結合曲線を、GraphPad Prismソフトウェアを用いた非線形回帰分析(可変の傾きを有するシグモイド用量応答)を用いて分析した。
精製したIgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの、ヒトDR5またはカニクイザルDR5の短いアイソフォームを発現するCHO細胞に対する結合を、フローサイトメトリーによって分析した。デスドメインの機能喪失変異K386Nを有する短いアイソフォームのヒトDR5タンパク質(SEQ ID NO 47、Uniprot番号O14763-2に基づく)、ならびに、アミノ酸185〜213の欠失およびデスドメインの機能喪失変異K420Nを有するカニクイザルDR5タンパク質(SEQ ID NO 50;NCBIアクセッション番号XP_005562887.1に基づく)の発現のためのコドン最適化構築物を、実施例1に記載されているように生成した。DR5トランスフェクトCHO細胞に対する結合を、概して実施例5に記載されているように分析した。トランスフェクト細胞を、液体窒素中に保存し、37℃で素早く融解して、10 mL培地に懸濁した。細胞を、PBSで洗浄し、1.0×106細胞/mLの濃度でFACS緩衝液に再懸濁した。100μLの細胞懸濁液試料(ウェルあたり100,000細胞)を、96ウェルプレートに播種し、300×gで3分間、4℃での遠心分離によって沈殿させた。25μLの連続希釈抗体調製物系列(6倍希釈において、最終濃度0〜20μg/mL)を添加し、4℃で30分間インキュベートした。次に、細胞を、洗浄して、50μLの二次抗体R-PEコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2(Jackson ImmunoResearch;カタログ番号109-116-098;1/100)と4℃で30分間、光から保護してインキュベートした。細胞を、150μL FACS緩衝液で2回洗浄し、50μL FACS緩衝液に再懸濁して、抗体結合を、BD LRSFFortessa細胞分析器(BD Biosciences)上で10,000イベントを記録することによって分析した。結合曲線を、GraphPad Prism ソフトウェアを用いた非線形回帰分析(可変の傾きを有するシグモイド用量応答)を用いて分析した。
ヒト結腸がん細胞COLO 205を殺傷する抗体の能力に対する、IgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05における六量体化増強変異E430Gの効果を研究するために、生存率アッセイを行った。E430G変異を有するおよび有さない抗体を、単一作用物質として、および2種類のクロスブロックしない抗体の組み合わせとして試験した。COLO 205細胞を、実施例8に記載されているように収集した。100μLの単一細胞懸濁液(ウェルあたり5,000細胞)を、ポリスチレン96ウェル平底プレート(Greiner Bio-One、カタログ番号655182)に播種し、37℃で一晩接着させた。続いて、抗体濃度系列(4倍希釈において、0.3〜20,000 ng/mLの最終濃度の範囲)の50μL試料を添加して、37℃で3日間インキュベートした。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン(Sigma Aldrich、カタログ番号S6942)とインキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。
IgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05の単一抗体および組み合わせの、COLO 205ヒト結腸がん細胞を殺傷する能力に対する、六量体化増強変異S440Yの効果を、生存率アッセイにおいて研究した。細胞を収集して、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイを、実施例8に記載されているように行った。簡潔に言うと、100μLの単一細胞懸濁液(ウェルあたり5,000細胞)を96ウェルプレートに播種し、同時に、50μLの連続希釈抗体調製物系列(4倍希釈において、0.0003〜20μg/mLの最終濃度の範囲)を添加して、37℃で3日間インキュベートした。
抗体IgG1-DR5-CONA-K409RおよびIgG1-DR5-chTRA8-F405LについてのクロスブロックELISAを、実施例7に記載されているように行った。K409R変異およびF405L変異は、ここでは関連性がなく、E430G変異を有する抗体の効能に対していかなる効果も有さないことが事前に示された(実施例22)。図38Aは、競合抗体の非存在下でのDR5ECD-FcHisCtagの結合と比べた、競合抗体の存在下でのコーティングした抗体に対するDR5ECD-FcHisCtag結合の阻害パーセンテージとして表した、結合競合を示す(阻害%=100−[(競合抗体の存在下での結合/競合抗体の非存在下での結合)]*100)。コーティングしたIgG1-DR5-CONA-K409Rに対するDR5ECD-FcHisCtagの結合は、可溶性IgG1-DR5-chTRA8-F405Lの存在下で阻害されなかった。逆に、コーティングしたIgG1-DR5-chTRA8-F405Lに対するDR5ECD-FcHistagの結合もまた、可溶性IgG1-DR5-CONA-K409Rの存在下で阻害されなかった。これらのデータにより、IgG1-DR5-CONA-K409RおよびIgG1-DR5-chTRA8-F405Lは、DR5ECD-FcHisCtagの結合について互いに競合しなかったことが示される。次に、クロスブロックしない抗DR5抗体の組み合わせIgG1-DR5-CONA-C49W + IgG1-DR5-chTRA-8の、付着したBxPC-3ヒト膵臓がん細胞を殺傷する能力に対する六量体化増強変異E430Gの効果を、実施例11に記載されているような生存率アッセイにおいて研究した。図38Bは、六量体化増強変異を有する抗体の組み合わせIgG1-DR5-CONA-C49W-E430G + IgG1-DR5-chTRA8-E430Gが、E430G六量体化増強変異を有さない親抗体の組み合わせと比較して、BxPC-3細胞の用量依存性殺傷の増加を示したことを示す。
クロスブロックしない抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、殺傷を誘導する効力を、様々なヒトがん細胞株について解析し、E430G変異を有さない親抗体の組み合わせおよびTRAILと比較した。HCT-15、HCT 116、HT-29、およびSW480結腸がん、BxPC-3、HPAF-II、およびPANC-1膵臓がん、SNU-5胃がん、A549およびSK-MES-1肺がん、ならびにA375皮膚がん細胞に対する生存率アッセイを、本質的に実施例11に記載されているように行った。簡潔に言うと、100μLの単一細胞懸濁液(ウェルあたり5,000細胞)を、96ウェルプレートに播種し、37℃で一晩インキュベートした。50μLの抗体試料(133 nMの最終濃度)またはヒト組み換えTRAIL/APO-2L(eBioscience、カタログ番号BMS356;133 nMの最終濃度)を添加して、37℃で3日間インキュベートした。TRAILおよび抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gは両方とも、様々な適応症を起源とするヒトがん標的細胞株の殺傷を示す(図39)。抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの殺傷は、11種類の試験した細胞株のうち6種類において、対照抗体IgG1-b12と比較して有意であった。これらの応答する細胞株について、生細胞のパーセンテージは、抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gとのインキュベーション後に、E430G変異を有さない抗体の組み合わせとのインキュベーション後よりも有意に低かった。IgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430Gの殺傷効力とDR5標的発現レベル(実施例2に記載)との間には、いかなる相関もなかった。
抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの活性を、14種類の腫瘍系統:腎臓がん、神経組織がん、大腸がん、胃がん、乳がん(主にトリプルネガティブ乳がん(TNBC))、非小細胞肺がん(NSCLC)、膀胱がん、膵臓がん、卵巣がん、黒色腫、肝臓がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、および小細胞肺がん(SCLC)に相当する235細胞株のパネルにおいて試験し、TRAILの活性と比較した。成長阻害解析を伴う72時間ATPliteアッセイ(120時間アッセイを行ったDLD-1およびHCT 116細胞株を除く)を、Horizon Discovery Ltd, UKで、2つの部分において行った。試料は、384ウェルアッセイプレートにおいて四連として試験した。0.072μMの最終濃度から開始した抗体の連続希釈系列を、全ての試験した細胞株について使用した。TRAIL(Invitrogen;カタログ番号PHC1634)については、第1の部分において試験した細胞株については0.01μMの最終濃度、およびスクリーニングの第2の部分において試験した細胞株については0.17μMの最終濃度から開始した連続希釈系列を使用した。阻害パーセンテージは、以下の式を用いて算出した:T≧V(0)の場合、阻害パーセンテージ=100*[1−(T−V(0))/(V−V(0))];T<V(0)の場合、阻害パーセンテージは100%、式中、T=試験試料の発光、V(0)=0日目の培地対照試料の発光、およびV=3日目の培地対照試料の発光。レスポンダー細胞株およびノンレスポンダー細胞株を、70%以上の阻害を示す細胞株をレスポンダーとして、および69%以下の阻害を示す細胞株をノンレスポンダーとして分類する、最大応答閾値によってグループ化した(図40;表11)。抗体(IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G)およびTRAIL単独療法の両方についてのレスポンダー細胞株を、小細胞肺がん(SCLC)を除いて、全ての試験した腫瘍適応症について見出した。
抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、様々な比のIgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gで組み合わせた場合の、BxPC-3膵臓がん細胞およびHCT-15結腸がん細胞の殺傷を誘導する能力を研究するために、生存率アッセイを行った。連続希釈系列(5倍希釈において、0.006〜20μg/mLの最終濃度の範囲にわたる)の、1:0、9:1、3:1、1:1、1:3、1:9、および0:1の抗体比を、実施例16に記載されているようにCellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて試験した。
カスパーゼ阻害剤の存在下および非存在下で、六量体化増強変異E430Gを有するおよび有さないIgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05の抗体バリアントの組み合わせの細胞傷害を比較するために、生存率アッセイを行った。抗体またはTRAIL試料の連続希釈系列(4倍希釈において、0.002〜133 nMの最終濃度の範囲)でのCellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイを、実施例18に記載されているように行った。
カスパーゼ-3/7の活性化を、本質的に実施例20に記載されているように、カスパーゼ-Glo 3/7アッセイを用いて時間において測定した。簡潔に言うと、細胞を、トリプシン処理によって収集し、セルストレーナーを通過させ、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させて、1.6×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。25μLの単一細胞懸濁液(ウェルあたり4,000細胞)を、384ウェル培養プレート(Perkin Elmer、カタログ番号6007680)に播種し、37℃で一晩インキュベートした。25μLの試料を添加し(26.6 nMの最終濃度)、37℃で1、2、4 、および6時間インキュベートした。プレートを、インキュベーターから取り出し、室温まで温度を低下させた。細胞を、300 gで3分間の遠心分離によって沈殿させた。25μLの上清を除去し、25μLのカスパーゼ-Glo 3/7基質によって置き換えた。500 rpmで1分間振盪することによって混合した後、プレートを、室温で1時間インキュベートした。発光を、EnVision Multilabel Reader(Perkin Elmer)上で測定した。
抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、二次的抗体架橋剤の非存在下および存在下でヒトHCT-15結腸がん細胞およびBxPC-3膵臓がん細胞の殺傷を誘導する能力を比較するために、生存率アッセイを行った。二次的抗体架橋剤の存在下で殺傷の増強を示すことが公知であるIgG1-DR5-CONAを、比較のために同じアッセイにおいて試験した。二次的架橋剤の非存在下および存在下での生存率アッセイを、本質的に実施例21に記載されているように行った。簡潔に言うと、100μLの単一細胞懸濁液(ウェルあたり5,000細胞)を、96ウェルプレートに播種し、37℃で一晩インキュベートした。ヤギ抗ヒトIgG抗体のF(ab')2断片の非存在下または存在下の、50μLの抗体試料(最終濃度4μg/mL)と、37℃で3日間インキュベートした。細胞殺傷の陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリンとインキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。
抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの、補体を活性化する能力を解析するために、ヒトDR5またはサルDR5のいずれかの短いアイソフォームを一過性にトランスフェクトしたCHO細胞に対してインビトロ補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイを行い、補体成分C3cの沈着を測定した。DR5構築物は、アゴニスト抗体の結合時のアポトーシスの誘導による殺傷を阻止するために、それらのデスドメイン中にK386N(ヒト)またはK420N(カニクイザル)の変異を保有していた。ヒトDR5またはサル(カニクイザル(Macaca fascicularis))DR5でのCHO細胞の一過性トランスフェクションは、実施例1に記載されているように行った。
抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gと併用して相乗的な阻害効果を提示する臨床的に関連性のある化合物を特定するために、様々な治療的分類に相当する100種類の化合物を、結腸がん細胞株における潜在的な相乗効果についてスクリーニングした。成長阻害分析を伴う、72時間(LS-411N, SNU-C2B、およびSW480について)または120時間(DLD-1およびHCT 116について)のATPliteアッセイを、Horizon Discovery Ltd, UKで、384ウェルアッセイプレートにおいて6×6の最適化された組み合わせマトリックスで行った。全ての試料は、四連で試験した。成長阻害パーセンテージは、以下の式を用いて算出した:T≧V(0)の場合、成長阻害パーセンテージ=100*[1−(T−V(0))/(V−V(0))];T<V(0)の場合、 成長阻害パーセンテージ=100*[1−(T-V(0))/V(0)]、式中、T=試験試料の発光、V(0)=0日目の培地対照試料の発光、およびV=3日目の培地対照試料の発光。相乗効果を特定するために、平均自己クロス活性を、代表的な化合物を用いて各々の治療的分類について決定した。Loewe相加性を超過する併用効果を測定するため、Horizon Discovery Ltdは、相乗効果スコアと呼ばれる相乗的相互作用の強さを特徴決定するためのスカラー測定を考案した。相乗効果スコア方程式は、相加性についてのLoeweモデルを用いた、成分作用物質の活性に数値的に由来するモデル表面を超過する、マトリックスにおける各点での実験的に観察された活性体積を積分する。相乗効果スコア方程式における追加的な用語は、個々の作用物質について使用される種々の希釈係数について正規化するため、および実験全体にわたる相乗効果スコアの比較を可能にするために使用される。陽性阻害ゲーティングまたはIデータ乗数を含めることにより、ゼロ効果レベル近くのノイズを除去し、高い活性レベルで起こる相乗的相互作用についての結果に偏らせる。相乗効果スコア(S)は、以下の式を用いて算出した: S=log fX log fY Σ max(0,Iデータ)(Iデータ−ILoewe)、式中、fx,y =各々の単一作用物質について使用される希釈係数。平均自己クロス+3σよりも大きい相乗効果スコアを、99%信頼レベルで候補相乗効果と考えた。
抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、皮下COLO 205ヒト結腸がん異種移植モデルにおいて、単一抗体および両方の抗体の組み合わせについて評定し、E430G変異を有さない親抗体と比較した。腫瘍細胞接種、マウスの取扱い、腫瘍増生の測定、および終点決定は、本質的に実施例26に記載されているように行った。3×106細胞を、5〜8週齢の雌SCIDマウス(C.B-17/IcrHan(登録商標)Hsd-Prkdcscid;Harlan)の側腹部中に、100μL PBSの体積において注射した。9日目に、平均腫瘍体積を測定し、マウスを、同等の腫瘍サイズ分散を有する群に選別した。マウスを、9日目に、200μL PBS中の10μg(0.5 mg/kg)抗体の静脈内(i.v.)注射によって処置した。対照群におけるマウスは、10μg(0.5 mg/kg)IgG1-b12で処置した。
抗DR5抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、CrownBiosciences, Taicang, Chinaで、皮下HCT15ヒト結腸がん異種移植モデルにおいて、E430G六量体化増強変異を有さないIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05のものと比較した。細胞を、インビトロで、10%胎児ウシ血清を補給したRPMI-1640培地における単層培養として、37℃で空気中5% CO2の雰囲気において維持した。指数増殖期の接着性細胞を、トリプシン-EDTA処理によって収集した。5×106細胞を、7〜9週齢の雌BALB/cヌードマウスの側腹部中に、100μL PBSの体積において注射した。研究中の動物の世話および使用は、Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC)の規則に従って実施した。腫瘍体積を、毎週2回、カリパスを用いて二次元で測定し、体積を、式:V=0.5 a×b2(式中、aおよびbは、それぞれ、腫瘍の長径および短径である)を用いてmm3で表した。平均腫瘍サイズが161 mm3に達した時に、マウスを、乱塊法を用いて群に割り当て、処置を開始した(群あたり8匹のマウス)。マウスを、Q7Dレジメンに従って、0.5 mg/kgの抗体(組み合わせにおいては0.25 mg/kgの各抗体)のi.v.注射によって3回処置した。対照群におけるマウスを、並行して、0.5 mg/kg IgG1-b12で処置した。
IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、CrownBiosciences, Taicang, Chinaで、皮下SK-MES-1ヒト肺がん異種移植モデルにおいてパクリタキセルと併用して評定した。細胞培養、腫瘍細胞接種、マウスの取扱い、腫瘍増生の測定、および終点決定は、実施例33に記載されているように行った。腫瘍接種の21日後に、平均腫瘍サイズは167 mm3に達し、マウスを、乱塊法を用いて群に割り当てて、処置を開始した。表14に示したように、マウスを、Q7Dレジメンに従って、g体重あたり、10μL PBSにおいて両方を投薬した2 mg/kg抗体および15 mg/kgパクリタキセルのi.v.注射によって2回処置した。
IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gのクリアランス速度を、E430G変異を有さない親抗体と比較して、単一化合物についておよび2種類の抗体の組み合わせについて、SCIDマウスにおけるPK実験において研究した。
本研究は、六量体化増強変異E430Gを有する抗DR5抗体IgG1-DR5-CONAの、付着したヒト結腸がん細胞COLO 205を殺傷する能力を例証する。COLO 205細胞を、実施例8に記載されているように収集した。100μLの単一細胞懸濁液(ウェルあたり5,000細胞)を、96ウェル平底プレートに播種し、37℃で一晩インキュベートした。抗体濃度系列(4倍希釈において、0.04〜10μg/mLの最終濃度の範囲)の50μL試料を添加して、37℃で3日間インキュベートした。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリンとインキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。発光を、EnVision Multilabel Reader(PerkinElmer)上で測定した。データを、GraphPad Prismソフトウェアを用いた非線形回帰(可変の傾きを有するシグモイド用量応答)を用いて分析し、プロットした。生細胞パーセンテージは、以下の式を用いて算出した:生細胞%=[(抗体試料の発光−スタウロスポリン試料の発光)/(抗体なし試料の発光−スタウロスポリン試料の発光)]*100。
抗体IgG1-hDR5-05-E430Gは、特に明記しない限り、20 mg/mlで製剤化された。
示差走査熱量測定(DSC)
タンパク質サンプルの融解温度は、MicroCal Capillary DSC装置を用いて決定された。
外観は視覚的評価によって決定された。
pHは、Mettler Toledo SevenMulti pHメーターを用いて測定された。
タンパク質含有量は、Agilent UV/Vis分光光度計(モデル8453)を用いUV/Vis分光法によって決定された。
サイズ排除クロマトグラフィーは、TOSOH, TSK-gel G-3000SWxL (7.8 × 300 mm)カラム(Sigma)を用い、Agilent 100 HPLCシステムにて実施された。
PrinCE Autosamplerを搭載したiCE 3アナライザーを用いて、キャピラリー等電点電気泳動を実施した。
還元および非還元キャピラリー電気泳動は、Beckman Coulter PA800Plusシリーズキャピラリー電気泳動システム(Series Capillary Electrophoresis System)を用いて実施された。サンプルの還元にはベータメルカプトエタノールが用いられた。
動的光散乱は、Wyatt DynaPro Plate Readerを用いて実施された。
1. ベースライン生物物理学的スクリーニング
初期の生物物理学的スクリーニングを実施して緩衝液/pHの組み合わせを選択し、賦形剤スクリーニングに進んだ。表15は初期緩衝液スクリーニングから得られたデータを示し、ここではグルタミン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩およびリン酸塩の緩衝液を試験した。DSCおよびDLSを用いて熱安定性を評価した。DSC分析により、T開始とともに融解温度(Tm1およびTm2)が得られた。DLS分析は、タンパク質の多分散性および流体力学的半径に関する情報を提供した。DSCデータに基づき、グルタミン酸塩pH 5.0、酢酸塩pH 5.5、およびコハク酸塩pH 6.0は、低pHの対応物と比較した場合に高いT開始を有していた。T開始値が高いほど、タンパク質の熱安定性が高いことを示している。pH 5.5、6.0および6.5の全てのヒスチジン製剤は、比較的高いT開始値を示し、これらの値はpHの増加とともにわずかに増加した。それぞれ、pH 6.0および7.0のクエン酸塩緩衝液のT開始は54℃であったが、pH 7.5のリン酸塩のT開始は54℃であった。初期の生物物理学的スクリーニングからのDLSデータの結果は、DSCから得られた製剤結果と強く相関していなかった。具体的には、より高いpHを有する製剤において高度の多分散性が観察され、DSCにおいて観察されたようにより高い熱安定性を示した。例えば、ヒスチジン pH 5.5は、それぞれ10.8および15.6の%Pdを呈したpH 6.0および6.5と比べて、6.3の%Pdを有していた(表15)。リン酸塩およびクエン酸塩製剤は、他の製剤と比べて最も高い%Pdを有していた。DSCおよびDLSから得られたデータに基づき、グルタミン酸塩pH 5.0、酢酸塩pH 5.5、ヒスチジンpH 5.5およびコハク酸塩pH 6.0製剤を、様々な賦形剤の存在下においてさらにスクリーニングした。リン酸塩およびクエン酸塩製剤は、高い%多分散性およびこれらの緩衝液中でのタンパク質の不安定化の潜在的可能性のため選択されなかった。
抗体IgG1-hDR5-05-E430Gを、4つの異なる濃度のNaCl (0、25、50、および100 mM NaCl)の存在下において30 mMヒスチジン pH 5.5中40 mg/mLで製剤化して、溶解度および相分離に及ぼす影響を判定した。サンプルは、予冷却された凍結乾燥機の棚上-5±3℃で24時間貯蔵された。24時間後、サンプルのセットを外観により試験した。調製されたサンプルのいずれでも相分離は観察されなかった。
抗体IgG1-hDR5-05-E430Gを0、0.03、または0.06% w/v Tween-80の存在下において30 mMヒスチジン pH 5.5中で製剤化し、3回の凍結融解サイクルでストレスを加えた。同一のサンプルを48時間撹拌した。サンプルストレス後、サンプルのセットを外観、A280、SEC、還元CE-SDS、および非還元CE-SDSにより試験した。
界面活性剤スクリーニング研究におけるいずれのサンプルでも、サンプル間に視覚的な違いは観察されなかった。全てのサンプルはわずかに黄色の乳白色の液体で、目に見える微粒子はなかった。
UV分析によって得られた抗体濃度は有意差がなく、18.54〜20.73 mg/mLの範囲であった(データは示されていない)。
単量体の純度に有意差はなく、界面活性剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークは観察されなかった。全てのサンプルの純度は98.8〜99.0%であった(データは示されていない)。
純度(LCおよびHC%)に有意差はなく、界面活性剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークは観察されなかった。全てのサンプルの純度は95.6〜96.1%であった(データは示されていない)。
主ピーク純度に有意差はなく、界面活性剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークは観察されなかった。全てのサンプルの純度は90.5%〜92.1%であった(データは示されていない)。
0、0.03、および0.06% PS-80の濃度を含む、ストレスを加えていないサンプルとストレスを加えたサンプルとの間で、外観、タンパク質濃度、または純度の変化は観察されなかった。これらのデータは、界面活性剤がこれらの製剤中の抗体の安定性を向上させないことを示している。
抗凍結剤スクリーニングでは、抗体IgG1-hDR5-05-E430Gを、3つの異なる濃度(0、5、または10% w/v)のスクロースを有する30 mMヒスチジン pH 5.5中で製剤化し、3回の凍結融解サイクルでストレスを加えた。同一のサンプルを48時間撹拌した。サンプルストレス後、サンプルのセットを外観、A280、SEC、還元CE-SDS、および非還元CE-SDSにより試験した。
3回の凍結融解サイクルでストレスを加え、48時間撹拌した0%、5%、または10%スクロースを含有するサンプル間で視覚的な違いは観察されなかった。全てのサンプルはわずかに黄色の乳白色の液体で、目に見える微粒子はなかった。
UV分析によって得られた抗体濃度は有意差がなかった。濃度は19.06〜24.86 mg/mLの範囲であった(データは示されていない)。
単量体の純度に有意差はなく、抗凍結剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークの成長は観察されなかった。全てのサンプルの純度は98.9〜99.1%であった(データは示されていない)。
純度(LCおよびHC%)に有意差はなく、抗凍結剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークの成長は観察されなかった。全てのサンプルの純度は95.3〜95.9%であった(データは示されていない)。
主ピーク純度に有意差はなく、抗凍結剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークの成長は観察されなかった。全てのサンプルの純度は91.5〜92.0%であった(データは示されていない)。
0%、5%および10%スクロースの濃度を含む、ストレスを加えていないサンプルとストレスを加えたサンプルとの間で、外観、タンパク質濃度、または純度の変化は観察されなかった。これらのデータは、抗凍結剤がこれらの製剤中の抗体の安定性を向上させないことを示していた。
DoE試験の製剤デザインを表17に示す。サンプルを5±3℃および40±2℃/75±5% RHで最大4週間貯蔵した。初期サンプルをpH、UV、およびDSCによって試験した。貯蔵後、サンプルのセットを外観、pH、A280、DLS、SEC、icIEF、CE-SDS (還元および非還元)によって試験した。
初期DSCデータを表18に示す。ヒスチジン製剤の場合、より高いpHの製剤の場合に高いT開始値が得られることが観察された。この傾向は、pHの増加に伴ってより高いT開始値が観察された初期ベースラインスクリーニングにおいて得られたデータと相関していた。ヒスチジン製剤pH 6.0は、pH 5.0およびpH 5.5でのヒスチジン製剤と比較して最も高いT開始値を実証した。ヒスチジンpH 6.0製剤のT開始値は50〜53℃の範囲であった。ヒスチジンpH 5.0製剤は43〜46℃の範囲であり、一方ヒスチジンpH 5.5製剤は47〜51℃の範囲であった。スクロースおよびソルビトールからなる製剤の場合に高いT開始値が観察された。製剤F13、F14、F28、およびF29は、スクロースおよびソルビトールを含有する製剤の場合に高いT開始値を示した。酢酸塩製剤の場合に、同様の傾向が観察された。より高いpHでの製剤は、より高い開始値を示した。酢酸塩製剤pH 6.0およびpH 5.5は、NaClおよびアルギニンの存在下および非存在下で高いT開始値を示した。酢酸塩pH 6.0製剤は52〜54℃の範囲であり、一方酢酸塩pH 5.5製剤は51〜54℃の範囲であった。酢酸塩pH 5.0製剤は、45〜49℃という最も低いT開始範囲を示した。
UV A280によるタンパク質含有量の結果は、18.47〜21.95 mg/mLの全サンプルタンパク質濃度を示していた(データは示されていない)。サンプルF8、F24、およびF22は、わずかに低いタンパク質濃度を有しており、これは実験のばらつきによる可能性が高い。全体として、初期の時点で観察されたタンパク質濃度の有意な変化は認められなかった。
5±3℃での4週間時点の全サンプル調製物は透明で、わずかに黄色であった。5±3℃での大部分のサンプル調製物は、生成物に関連しないものと思われる粒子を示さなかった。F5-3、F7、F8、F29、およびF30は少数の粒子を含有していた。40±2℃/75±5% RHでのサンプルは、乳白色のサンプルF20-1およびF23を除き、わずかに黄色かつ透明であった。40±2℃/75±5% RHでの製剤は、粒子なしから多くの粒子を有するまでに及んだ。酢酸塩製剤の場合、製剤F1は粒子を示さなかった。製剤F2、F5、F6、およびF10は粒子をほとんど有していなかったが、製剤F3、F4、F7、F8、F9、F11、F12、F13、F14およびF15は多くの粒子を有していた。ヒスチジン製剤の場合、F17およびF26は多くの粒子を示した。F16、F18、F23、F25、F29、およびF30は、粒子をほとんど示さなかった。残りの製剤F19、F20、F21、F22、F24、F27およびF28は粒子を有していなかった。
製剤の標的pH値を表19に示す。酢酸塩製剤の場合、5±3℃および40±2℃/75±5% RHでの4週間の時点で有意なシフトが観察された。初期時点および5±3℃での酢酸塩製剤のpH差の範囲は0.12〜0.30であった。40±2℃/75±5% RHでストレスを加えたこれらのサンプルにおいて観察されたpHのシフトは0.44〜1.01であった。ヒスチジン製剤の場合、5±3℃および40±2℃/75±5% RHでの4週間の時点で、顕著なpHシフトは観察されなかった。4週間の試験で観察されたヒスチジン製剤のpHの違いは、実験のばらつきに起因しうる。全体として、ヒスチジンpH 6.0製剤は、他の製剤と比べて賦形剤の有無にかかわらずpHの変化を受けなかった。酢酸塩製剤はpHのシフトを受けやすく、そのため酢酸塩は抗体にとってあまり適切でない成分である。大幅なpHシフトもタンパク質の分解を加速させる可能性がある。一方、ヒスチジンpH 6.0製剤は有望な成分であることが証明された。酢酸塩製剤のpHシフトが観察されるため、今後説明される安定性の結果では、ヒスチジン製剤(F16〜F30)に焦点を当てている。
5±3℃サンプルのA280測定値の範囲は19.87〜23.59 mg/mLであったが、40±2℃/75±5% RHのA280測定値の範囲は19.81〜26.38 mg/mLであった(データは示されていない)。A280測定値の有意なシフトは観察されなかった。観察されたUV含有量の範囲は、実験のばらつきによる可能性が高かった。データは、緩衝液濃度、pH、および賦形剤濃度に関するいかなる傾向も示さなかった。
4週間の時点のSECの結果を表20に示す。まずpH 6.0のヒスチジン製剤の場合、荷電賦形剤の存在により製剤の安定性が改善されることが観察された。また、荷電賦形剤の存在下でのpHの上昇により、ヒスチジン製剤の安定性が改善されることが観察された。40±2℃/75±5% RHで、荷電賦形剤の存在下での製剤の総不純物%の減少が観察された。40±2℃/75±5%の製剤F20-1は84.2%の最低の純度を有していた。この中心点の製剤の他の2つの複製物は非常に純粋であるため、これは予期せぬ異常な結果であり、この複製物は外れ値とみなされる。40±2℃/75±5% RHでのヒスチジンpH 5.0製剤F17、F18およびF19の場合、総不純物%は5.0〜5.8%の範囲であった。ヒスチジンpH 5.5製剤F21、F22、およびF23の総不純物%は4.1〜7.3%の範囲であり、一方ヒスチジンpH 6.0製剤F25、F26、およびF27は3.5〜3.8%の範囲の総不純物%を有していた。より高いpHが総不純物%の減少につながり、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤がより高い安定性を示したことは明らかであった。スクロースまたはソルビトールを含有するヒスチジン製剤の場合に、総不純物%の増加が観察された。総不純物%は、賦形剤を有しないpH 6.0製剤の場合に5±3℃で3.8%および40±2℃/75±5% RHで6.9%であった。全体として、荷電賦形剤NaClおよびアルギニンの存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤(製剤F25、F26、およびF27)は、より高い安定性を有していた。
サンプルの電荷不均一性は、5±3℃および40±2℃/75±5% RHにて4週間の時点でicIEFを用いて判定された(表21)。5±3℃および40±2℃/75±5% RHでのサンプルのicIEF結果は、5℃にて4週間の時点でのヒスチジン製剤の酸性変種率が、製剤F16〜F28の場合に56.2〜58.9%の範囲であることを示していた(データは示されていない)。スクロースおよびソルビトールからなった製剤F29およびF30の場合、酸性変種率は、それぞれ60.4%および63.8%であった。これらの違いは、そのプロファイルのF25との比較で見られるように有意であるものと思われる。40±2℃/75±5% RHで、F29およびF30は、45.9%および61.6%の酸性変種率を有していた。スクロースからなる製剤F29の場合、40±2℃/75±5% RHにて32.4%までの塩基性変種の有意な増加が認められた。40±2℃/75±5% RHにて4週間の時点で、全てのヒスチジン製剤は61.6%〜71.6%の範囲の酸性変種率の増加を実証した。製剤F29は、40±2℃/75±5% RHで45.9%の酸性変種率を示した。icIEFデータは、サンプルのpHが電荷不均一性に影響を与えることを示した。pH 5.0のヒスチジン製剤は、pH 5.5および6.0のヒスチジン製剤と比較して、酸性変種の有意な増加を示した。ヒスチジンpH 5.0製剤の場合、40±2℃/75±5% RHの酸性変種率の範囲は71.3〜71.6%であった。40±2℃/75±5% RHで、ヒスチジンpH 5.5の酸性変種率の範囲は63.5〜67.1%であったが、ヒスチジンpH 6.0の酸性変種率の範囲は65.3〜66.1%であった。脱アミド化はより高いpH値で加速されることが知られているため、この結果は脱アミド化によるものではない可能性が高く、ここでは逆の傾向が観察される。全ての製剤にわたり、これらの結果から、ヒスチジンpH 5.5および6.0はヒスチジンpH 5.0製剤よりも優れた製剤であり、スクロースおよびソルビトールからなるヒスチジン製剤では有意な分解が観察されることが示された。
還元CE-SDSの結果を表22に示す。5±3℃にて4週間の時点で、pHに関係なく全てのヒスチジン製剤は同等の純度を示した。40±2℃/75±5% RHにて4週間の時点で、結果から、サンプル調製物の全てについて不純物の増加が示された。より低いpHでの製剤は、40±2℃/75±5% RHでより多くの分解を示すことが観察された。ヒスチジンpH 5.0製剤は、純度率の大幅な低下を示した。純度率の範囲は77.5〜82.8%であった。ヒスチジンpH 5.5製剤の場合、純度率は80.1〜91.2%の範囲であった。ヒスチジンpH 6.0製剤の場合に有意な分解は観察されなかった。ヒスチジンpH 6.0製剤の純度率は、4週間の時点で40±2℃/75±5% RHにて89.7〜91.1%の範囲であった。さらに、ヒスチジンサンプルの% LMWは、低pHでのヒスチジンサンプルで高く、高pHでのヒスチジン製剤でかなり低かった。ヒスチジンpH 5.0製剤の% LMWの範囲は13.7〜18.4%であった。一方、ヒスチジンpH 5.5および6.0製剤は、5.9〜12.9%および5.0〜6.3%の% LMW範囲を示した。ヒスチジンpH 6.0製剤の場合、荷電賦形剤の存在下において純度率が有意に低下しないことも観察された。全ての製剤にわたり、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤は、他のヒスチジン製剤と比べて高い純度を示した。
非還元CE-SDSの結果を表23に示す。酢酸塩製剤(F1〜F15)から得られた結果は、pHシフトがこれらの製剤で観察されるため考慮されない。5±3℃でのアルギニンからなる製剤、すなわち製剤F18、F19、F22、F23、F26およびF27の場合に、有意な高% HMW不純物が観察された。不純物のこの増加は、NaClの存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤(F25)、すなわち製剤F17、F21およびF25の場合に観察されなかった。以前の結果は、荷電賦形剤(NaClおよびアルギニン)の存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤が最適条件であることを示唆していた。非還元CE-SDSデータから得られた結果は、NaClを有するヒスチジンpH 6.0製剤が、アルギニンを有するヒスチジンpH 6.0よりも優れた選択肢であることを裏付けている。
酢酸塩製剤は、pHシフトがこれらの製剤で観察されるため考慮されていない。DLSデータ(示されていない)に基づき、pHが低いとヒスチジン製剤の多分散性が高くなることが観察された。ヒスチジンpH 5.0製剤F17、F18、およびF19は、多分散性の有意な増加を有していた。例えば、5±3℃での製剤F17の%Pdは10.2および7.0であり、40±2℃/75±5% RHで4週間後20.8および18.7に増加した。同様に、ヒスチジンpH 5.5製剤F21、F22、およびF23は、40±2℃/75±5% RHで%Pdの増加を有していた。例えば、製剤F23は5±3℃で6.3および10.4の%Pdを有していた。%Pdは、40±2℃/75±5% RHで17.1および21.7に増加した。荷電賦形剤(NaClおよびアルギニン)の存在下での大部分のヒスチジンpH 6.0製剤は、両方のストレス条件での多分散性の変化に耐性であった。製剤F25、F26、およびF27は、%Pdの有意な増加を示さなかった。例えば、製剤F25は、5±3℃で9.4および8.9の%Pdを示した。40±2℃/75±5% RHでの%Pdは、8.3および10.2であった。さらに、スクロースの存在下での製剤(F19)は、両方の条件で高い多分散性を示した。F29の%Pdは5±3℃で23.7および23.4であったが、40±2℃/75±5% RHでの%Pdは23.2であった。5±3℃条件の%Pdは、この方法では既にかなり高く、既に、高次凝集体の存在を示唆していた。したがって、%Pdが高温でも変化しなかったという事実は、驚くことではない。高い多分散性は、初期ベースライン生物物理学的スクリーニングDLSデータでも観察された。同様に、ソルビトールを有する製剤(F30)の場合に高い%Pdが観察された。興味深いことに、ソルビトールおよびNaClを含有するF28は、高い%Pdを示さなかったが、これは最適な製剤の成分としてNaClが理想的な選択肢であるという概念をさらに支持している。4週間の時点で製剤F28の場合に高い%Pdは観察されなかった。40±2℃/75±5% RHでの製剤F30の%Pdは、15.4および14.2であった。全体として、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤は、多分散性の最小の変化を示した。pH 5.5でスクロースおよびソルビトールを含有する両方のヒスチジン製剤は、両方のストレス条件で高い%Pdを示した。
表17に記載されている様々な製剤中の抗体IgG1-hDR5-05-E430Gの分析試験から得られた結果に基づくと、製剤F25 (30 mMヒスチジン、150 mM NaCl pH 6.0)がこの分子に最適な製剤であった。初期ベースライン生物物理学的スクリーニングの結果から、pH 5.5での酢酸塩およびヒスチジン製剤が最適な緩衝液/pH条件であることが示唆された。さらに、ソルビトールおよびスクロースと比較した場合、アルギニンおよびNaClが賦形剤の優れた選択肢であった。界面活性剤および抗凍結剤の試験により、製剤の安定性を増強するためにPS-80もスクロースも必要とされないことが示された。DoE安定性試験の場合、初期DSCの結果により、30 mMヒスチジンpH 6.0製剤がより高いT開始融解温度値を有することが確認された。全ての30 mM酢酸塩製剤において有意なpHシフトが観察された。ヒスチジンpH 6.0製剤は、5±3℃および40±2℃/75±5% RHで4週間の安定性にわたりpHの有意な変化を示さなかった。SECデータから、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 6.0はIgG1-hDR5-05-E430Gの最大の安定性を付与することが実証された。icIEFの結果から、pH 5.5および6.0のサンプルが電荷不均一性の変化に対してより耐性であることが示された。また、スクロースおよびソルビトールの存在下での製剤が最大の分解を示すことも明らかにされた。DLSデータから、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤が多分散性の最小の変化を有することが示された。還元CE-SDSの結果から、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤は最良の製剤であることが示された。非還元CE-SDSデータから、アルギニンの存在下でのサンプルは、NaClを含有するサンプルには存在しない高%HMW不純物を示すことが明らかにされた。全体として、利用可能なデータの積上げにより、この抗体に対してのヒスチジンおよび塩化ナトリウムを含有する製剤の選択が支持される。
材料、機器および方法
使用した材料、機器および方法は、抗体がIgG1-hDR5-05-E430GではなくIgG1-hDR5-01-G56T-E430Gであることを除いて、実施例54と同じであった。
1. 初期ベースライン生物物理学的スクリーニング
初期の生物物理学的スクリーニングを実施して緩衝液/pHの組み合わせを選択し、賦形剤スクリーニングに進んだ。DSCおよびDLSを用いて熱安定性を評価した。DSC分析により、T開始とともに融解温度(Tm1およびTm2)が得られた。DLS分析は、タンパク質の多分散性および流体力学的半径に関する情報を提供した。全範囲の製剤でDSCデータの傾向が観察された。T開始値は46℃〜55℃の範囲であった(データは示されていない)。T開始値が高いほど熱安定性が高いことを示しているため、最も低いT開始値を有する、極端に低いおよび高いpHの緩衝液(グルタミン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、およびリン酸塩)は最適ではない。コハク酸塩およびヒスチジン緩衝液ならびに酢酸塩pH 5.5のT開始値から、pH 5.5〜6.5のこれら2つの緩衝液がいっそう高い熱安定性を付与することが示唆された。
上記で選択された製剤は、150 mMアルギニン、塩化ナトリウム、スクロースまたはソルビトールの存在下においてスクリーニングされた。データを表24に示す。
抗体を、4つの異なる濃度のNaCl (0、25、50、および100 mM NaCl)を有する基本製剤(30 mMヒスチジン、pH 5.5)中40 mg/mLで製剤化して、溶解度および相分離に及ぼす影響を判定した。サンプルは、予冷却された凍結乾燥機の棚上-5±3℃で24時間貯蔵された。24時間後、サンプルのセットを外観により試験した。調製されたサンプルのいずれでも相分離は観察されなかった。
抗体を0、0.03、または0.06% w/v Tween-80の存在下において30 mMヒスチジン pH 5.5中で製剤化し、3回の凍結融解サイクルでストレスを加えた。同一のサンプルを48時間撹拌した。サンプルストレス後、サンプルのセットを外観、A280、SEC、還元CE-SDS、および非還元CE-SDSにより試験した。
界面活性剤スクリーニング研究におけるいずれのサンプルでも、サンプル間に視覚的な違いは観察されなかった。全てのサンプルはわずかに黄色の乳白色の液体で、目に見える微粒子はなかった。
UV分析によって得られた抗体濃度は、異なる濃度のPS-80を有する、撹拌され凍結融解されたサンプルと対照サンプルとの間で有意差がなく、17.80〜21.32 mg/mLの範囲であった(データは示されていない)。
単量体の純度に有意差はなく、界面活性剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークの成長は観察されなかった。全てのサンプルの純度は98.4〜98.7%であった(データは示されていない)。
純度(軽鎖および重鎖%)に有意差はなく、界面活性剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークは観察されなかった。全てのサンプルの純度は95.4〜95.8%であった(データは示されていない)。
主ピーク純度に有意差はなく、界面活性剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークは観察されなかった。全てのサンプルの純度は91.2%〜91.3%であった(データは示されていない)。
0、0.03、および0.06% PS-80の濃度を含む、ストレスを加えていないサンプルとストレスを加えたサンプルとの間で、外観、タンパク質濃度、または純度の変化は観察されなかった。これらのデータは、界面活性剤が抗体の安定性を向上させないことを示している。
抗凍結剤スクリーニングでは、抗体を、3つの異なる濃度(0、5、または10% w/v)の、スクロースを有する30 mMヒスチジン pH 5.5中で製剤化し、3回の凍結融解サイクルでストレスを加えた。同一のサンプルを48時間撹拌した。サンプルストレス後、サンプルのセットを外観、A280、SEC、還元CE-SDS、および非還元CE-SDSにより試験した。
3回の凍結融解サイクルでストレスを加え、48時間撹拌した0%、5%、または10%スクロースを含有するサンプル間で視覚的な違いは観察されなかった。全てのサンプルはわずかに黄色の乳白色の液体で、目に見える微粒子はなかった。
UV分析によって得られた抗体濃度は有意差がなかった。濃度は19.03〜22.92 mg/mLの範囲であった(データは示されていない)。
単量体の純度に有意差はなく、抗凍結剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークの成長は観察されなかった。全てのサンプルの純度は98.4〜99.0%であった(データは示されていない)。
純度(軽鎖および重鎖%)に有意差はなく、抗凍結剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークの成長は観察されなかった。全てのサンプルの純度は95.1〜95.7%であった(データは示されていない)。
主ピーク純度に有意差はなく、抗凍結剤スクリーニングサンプルのいずれにも新しいピークの成長は観察されなかった。全てのサンプルの純度は90.3〜91.9%であった(データは示されていない)。
0%、5%および10%スクロースの濃度を含む、ストレスを加えていないサンプルとストレスを加えたサンプルとの間で、外観、タンパク質濃度、または純度の有意な変化は観察されなかった。これらのデータは、抗凍結剤が抗体の安定性を向上させないことを示していた。
試験デザインおよび方法論は、実施例54において用いられたものと同一であった。試験中の全ての製剤のリストについては、上記の表17を参照されたい。
初期DSCデータを表25に示す。ヒスチジン製剤の場合、より高いpHの製剤の場合に高いT開始値が得られることが観察された。この傾向は、pHの増加に伴ってより高いT開始値が観察された初期ベースラインスクリーニングにおいて得られたデータと相関していた。ヒスチジン製剤pH 6.0は、pH 5.0およびpH 5.5でのヒスチジン製剤と比較して最も高いT開始値を実証した。ヒスチジンpH 6.0製剤のT開始値は47〜52℃の範囲であった。ヒスチジンpH 5.0製剤は42〜45℃の範囲であり、一方ヒスチジンpH 5.5製剤は46〜50℃の範囲であった。スクロースおよびソルビトールからなる製剤の場合に高いT開始値が観察された。製剤F13、F14、F28、およびF29は、スクロースおよびソルビトールからなる製剤の場合に高いT開始値を示した。これは、折り畳まれた状態のタンパク質に浸透圧調節物質が及ぼす影響のためと予想される。酢酸塩製剤の場合に、同様の傾向が観察された。より高いpHでの製剤は、より高い開始値を示した。酢酸塩製剤pH 6.0およびpH 5.5は、NaClおよびアルギニンの存在下および非存在下で高いT開始値を示した。酢酸塩pH 6.0製剤は52〜54℃の範囲であり、一方酢酸塩pH 5.5製剤は49〜53℃の範囲であった。酢酸塩pH 5.0製剤は、45〜49℃の最も低いT開始範囲を示した。
初期時点のタンパク質濃度の範囲は18.52〜21.86 mg/mLであった(データは示されていない)。全体として、初期時点でタンパク質濃度の有意な変化は観察されなかった。
5±3℃での4週間時点の大部分のサンプル調製物は透明で、わずかに黄色であった。サンプルF28およびF29 (これはソルビトールまたはスクロースのいずれかを含有していた)は、5±3℃で乳白色であった。5±3℃および40±2℃/75±5% RHでの酢酸塩緩衝液およびヒスチジン緩衝液の両方における大部分のサンプル調製物は、少数の粒子を示した。両方の条件でのサンプルは、ヒスチジンで調製された一部のサンプルを除いて、わずかに黄色かつ透明であった。40±2℃/75±5% RH条件の場合、ヒスチジン製剤F20-1、F20-2、F20-3、F24、F28、F29、およびF30は、乳白色であった。これらの製剤は賦形剤を有していないか、またはそれらはスクロースもしくはソルビトールを有する。
酢酸塩製剤の場合、5±3℃および40±2℃/75±5% RHでの4週間の時点で有意なpHシフトが観察された(データは示されていない)。初期時点および5±3℃での酢酸塩製剤のpH差の範囲は0.10〜0.29であった。40±2℃/75±5% RHでストレスを加えたこれらのサンプルにおいて観察されたpHのシフトは0.07〜1.30であった。ヒスチジン製剤の場合、5±3℃および40±2℃/75±5% RHでの4週間の時点で、pHシフトが観察されたが、しかしその変化は酢酸塩サンプルのものよりもはるかに少なかった。初期時点および5±3℃でのヒスチジン製剤のpH差の範囲は0.02〜0.16であった。このタイプの変化は、少量のサンプルに対しての方法のばらつきに起因しうる。40±2℃/75±5% RHでストレスを加えたこれらのサンプルにおいて観察されたpHのシフトは0.02〜0.94であった。
5±3℃サンプルのA280測定値によるタンパク質含有量の測定範囲は、14.66〜21.70 mg/mLであったが、40±2℃/75±5% RHのA280測定値の範囲は18.12〜40.42 mg/mLであった(データは示されていない)。40±2℃/75±5% RHでF20-1、F20-2、F20-3、F24、およびF28の場合にA280測定値に有意なシフトが観察された。これらの同じサンプルは、外観試験において乳白色であることが観察された。観察されたタンパク質濃度の増加により、これらの結果は見かけのUV濃度を増大させる、生成物に関連しないUV吸収剤によるものである可能性が高い。
4週間の時点のSECの結果を表26に示す。ヒスチジン製剤では有意な変化が起こり、タンパク質濃度が高く、外観が乳白色であることが分かった(F20-1、F20-2、F20-3、F24、およびF28、F29、F30)。これらのサンプルの場合、移動相の素通り画分において有意なUV吸収ピークが観察された。これらのSECデータは、既に論じられた他の裏付けとなる分析と同様に、これらの製剤がUV吸収性の非生成物関連成分を含有していたことを示している。高温ストレス条件で、荷電賦形剤を有しないヒスチジン製剤が分解し、このUV吸収成分として作用したという可能性がある。ヒスチジン製剤の場合、荷電賦形剤の存在により製剤の安定性が改善されることが観察された。また、pHの上昇により、ヒスチジン製剤の純度が改善されることが観察された。40±2℃/75±5% RHで、荷電賦形剤の存在下での製剤の総不純物%の減少が観察された。40±2℃/75±5% RHでのヒスチジンpH 5.0製剤F17、F18およびF19の場合、総不純物%は4.2〜4.9%の範囲であった。ヒスチジンpH 5.5製剤F21、F22、およびF23の総不純物%は3.6〜5.6%の範囲であり、一方ヒスチジンpH 6.0製剤F25、F26、およびF27は3.2〜3.4%の範囲の総不純物%を有していた。一般に、より高いpHが総不純物%の減少につながり、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤がより高い安定性を示した。全体として、荷電賦形剤NaClおよびアルギニンの存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤は、より高い安定性を有していた。
抗体サンプルの電荷不均一性は、icIEFを用いて判定された(表27)。データに基づくと、5±3℃での4週間時点のヒスチジン製剤の主ピーク率は、45.6〜47%の範囲であった。40±2℃/75±5% RHで、ソルビトールまたはスクロースからなる製剤F28、F29およびF30は、それぞれ11.2%、19.0%、および11.5%の塩基性変種率の有意な増加を有していた。40±2℃/75±5% RHでの4週間の時点で、全てのヒスチジン製剤が塩基性変種率の増加を実証した。icIEFデータは、サンプルのpHが電荷不均一性に影響を与えることを示した。pH 5.0のヒスチジン製剤は、pH 5.5および6.0のヒスチジン製剤と比較して、塩基性変種のより有意な増加を示した。ヒスチジンpH 5.0製剤の場合、40±2℃/75±5% RHの塩基性変種率の範囲は6.3〜7.2%であった。40±2℃/75±5% RHで、ヒスチジンpH 5.5の塩基性変種率の範囲は5.5〜6.4%であったが、ヒスチジンpH 6.0製剤の塩基性変種率の範囲は4.4〜4.7%であった。脱アミド化はより高いpH値で加速されることが知られているため、この結果は脱アミド化によるものではない可能性が高く、ここでは逆の傾向が観察される。塩基性変種の急増は、HMWまたはLMW種などの他の不純物の形成による可能性がある。全ての製剤にわたり、これらの結果から、ヒスチジンpH 6.0はヒスチジンpH 5.0およびpH 5.5製剤よりも優れた製剤であり、スクロースおよびソルビトールからなるヒスチジン製剤では有意な分解が観察されることが示された。
還元キャピラリー電気泳動の結果を表28に示す。5±3℃にて4週間の時点で、pHに関係なく全てのヒスチジン製剤は同等の純度を示したが、スクロースおよびソルビトールを有する製剤は純度がやや劣っていた。
非還元キャピラリー電気泳動の結果を表29に示す。5±3℃でのヒスチジン製剤の場合、製剤F23およびF29は、他のヒスチジン製剤と比べて3.6%および3.3%の高% HMWを示した。40±2℃/75±5% RHでストレスを加えたヒスチジン製剤の場合、製剤F28、F29およびF30は、それぞれ36.8%、49.3%および37.4%の非常に高い%総不純物を示した。さらに、製剤F20およびF24は、高い%不純物を示した。これらの製剤は、賦形剤を含有しないか、またはスクロースもしくはソルビトールを含有していた。データに基づき、40±2℃/75±5% RHでストレスを加えたサンプルのpH値が高いほど、%総不純物が低くなることが観察された。ヒスチジン製剤pH 5.0の場合、%総不純物は11.8〜15.0%の範囲であった。pH 5.5でのヒスチジン製剤(製剤F21、F22およびF23)の場合、%総不純物は10.7〜12.3%の範囲であり、一方pH 6.0でのヒスチジン製剤(F25、F26およびF27)の%総不純物は9.8〜10.0%の範囲であった。非還元CE-SDSデータから得られた結果により、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤は、他のヒスチジン製剤と比べてさらに高い純度を示したことが確認される。
酢酸塩製剤は、pHシフトがこれらの製剤で観察されるため考慮されていない。ヒスチジン製剤のDLSデータに基づき、製剤F20-2、F24、F28およびF30は5±3℃で高い%Pd値を示した(データは示されていない)。製剤F29は、溶液中のタンパク質粒子の存在を示す%Pdのマルチモーダルとの指定を有していた。以前のデータは、前述の製剤が最適な条件ではないことも示した。スクロースおよびソルビトールからなる製剤は、両方の温度条件で高い%Pdを示した。これは、初期ベースラインスクリーニング試験のDLSデータでも見られた。40±2℃/75±5% RHでのヒスチジン製剤の場合、より低いpHで、%Pdの増加が認められることが観察された。pH 5.0のヒスチジン製剤の場合、40±2℃/75±5% RHでの%Pdは4.7〜18.2%の範囲であった。pH 5.5のヒスチジン製剤(F21、F22、およびF23)の場合、%Pdは7.9〜9.5%の範囲であった。最後に、ヒスチジンpH 6.0製剤(F25、F26、およびF27)の%Pdは7.8〜9.8%の範囲であった。pH 5.5 (F21、F22、およびF23)ならびに6.0 (F25、F26、およびF27)のヒスチジン製剤は、pH 5.0と比べて最も低い%Pd値を示した。ヒスチジンpH 6.0製剤の場合、F25、F26およびF27は、全ての製剤が両方のストレス条件でおよび荷電賦形剤の存在下で低い%Pdを実証したので、有望な候補であった。
表17に記載されている様々な製剤中の抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430Gの分析試験から得られた結果に基づくと、製剤F25 (30 mMヒスチジン、150 mM NaCl pH 6.0)がこの分子に最適な製剤であった。初期ベースライン生物物理学的スクリーニングの結果から、NaClおよびアルギニンの存在下pH 5.5での酢酸塩およびヒスチジン製剤が最適な緩衝液/pH条件であることが示唆された。さらに、ソルビトールおよびスクロースと比較した場合、アルギニンおよびNaClが賦形剤の優れた選択肢であった。界面活性剤および抗凍結剤の試験により、製剤の安定性を増強するためにPS-80もスクロースも必要とされないことが示された。DoE安定性試験の場合、初期DSCの結果により、30 mMヒスチジンpH 6.0製剤が十分に高いT開始融解温度値を有することが確認された。全ての30 mM酢酸塩製剤において有意なpHシフトが観察された。ヒスチジンpH 6.0製剤は、5±3℃および40±2℃/75±5% RHで4週間の安定性にわたりpHの有意な変化を示さなかった。SECデータから、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 6.0はこの抗体の最大の安定性を付与することが実証された。icIEFの結果から、ヒスチジンpH 6.0サンプルが電荷不均一性の変化に対してより耐性であることが示された。また、スクロースおよびソルビトールの存在下での製剤が最大の分解を示すことも明らかにされた。還元および非還元CE-SDSの結果から、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 6.0製剤は最良の製剤であることが示された。DLSデータから、荷電賦形剤の存在下でのヒスチジンpH 5.5および6.0製剤が多分散性の最小の変化を有することが示された。全体として、抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430Gに対する製剤として30 mMヒスチジンおよび150 mM塩化ナトリウムpH 6.0が、利用可能なデータの積上げにより支持される。
各製剤中での混合物の安定性を調べるために、ともに30 mMヒスチジン、150 mM塩化ナトリウムpH 6.0中で製剤化された抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430G (20 mg/mL)およびIgG1-hDR5-05-E430G (20 mg/mL)の1:1混合物を5℃で貯蔵した。サンプルを2、4、8および12週間後ならびに貯蔵6ヶ月後、外観、pHタンパク質含有量、サイズ排除クロマトグラフィー、還元および非還元キャピラリー電気泳動 - ドデシル硫酸ナトリウムならびに画像化キャピラリー等電点電気泳動により、実施例54に記述されている方法を用いて分析した。
試験された特性のいずれにおいても有意な変化は観察されなかった。したがって、抗体混合物は、5℃の貯蔵温度で少なくとも6ヶ月間安定であった。
Claims (57)
- 以下:
a. ヒト免疫グロブリンGのFc領域と抗原結合領域とを含む抗体であって、Fc領域が、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置でのアミノ酸の変異を含む、抗体、
b. ヒスチジン緩衝液、ならびに
c. 塩化ナトリウム
を含み、pHが5.5〜7.4である、薬学的組成物。 - 5 mM〜100 mMのヒスチジン、例えば5 mM〜75 mM、例えば10 mM〜50 mM、例えば 15 mM〜45 mM、例えば20 mM〜40 mM、例えば 25〜35 mM、例えば28 mM〜32 mM、例えば30 mMのヒスチジンを含む、請求項1記載の薬学的組成物。
- pHが5.8〜7.2、例えば5.5〜6.5、例えば5.8〜6.2、例えば5.9〜6.1、例えば6.0である、請求項1または2記載の薬学的組成物。
- 25 mM〜500 mMの塩化ナトリウム、例えば25 mM〜250 mM、例えば50 mM〜250 mM、例えば100 mM〜200 mM、例えば125 mM〜175 mM、例えば150 mMの塩化ナトリウムを含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 抗体濃度が0.5 mg/ml〜250 mg/ml、例えば1 mg/ml〜100 mg/ml、例えば1 mg/ml〜50 mg/ml、例えば2 mg/ml〜20 mg/ml、例えば15 mg/ml〜25 mg/ml、例えば18 mg/ml〜23 mg/ml、例えば19 mg/ml〜21 mg/ml、例えば18 mg/ml〜20 mg/ml、例えば5 mg/ml〜15 mg/ml、例えば10 mg/mlまたは例えば20 mg/mlである、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- pH 5.5〜6.5で10 mM〜50 mMのヒスチジン、50 mM〜250 mMの塩化ナトリウムおよび2 mg/ml〜20 mg/mlの抗体を含み、好ましくは、pH 6.0で30 mMのヒスチジン、150 mMの塩化ナトリウムおよび20 mg/mlの抗体を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 界面活性剤を含まない、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 抗凍結剤を含まない、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- Fc領域が、ヒトIgG1におけるEU付番でのS440に対応する位置でのアミノ酸の変異を含み、ただしS440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- Fc領域が、E430G、E345K、E430S、E430F、E430T、E345Q、E345R、E345Y、S440WおよびS440Yからなる群より選択される変異を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- Fc領域が、E430GまたはE345Kから選択される変異を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- Fc領域がE430G変異を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- Fc領域が、K439EまたはS440Kから選択される変異をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 抗原結合領域がヒトDR5に結合する、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 抗原結合領域が、
SEQ ID NO: 46のアミノ酸残基番号116〜138内に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基およびアミノ酸残基番号139〜166内に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基を含むまたは必要とする、ヒトDR5上のエピトープ
に結合する、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。 - 抗原結合領域が、
SEQ ID NO: 46のアミノ酸残基番号79〜138内に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基を含むまたは必要とする、ヒトDR5上のエピトープ
に結合する、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。 - 抗原結合領域が、以下のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変重鎖(VH)領域ならびに以下のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変軽鎖(VL)領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物:
a) (VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6;
b) (VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6;
c) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14;
d) (VH) SEQ ID NO: 16、17、18および(VL) SEQ ID NO: 21、GAS、22または
e) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記a)〜d)のいずれか1つに定義される(VH) CDR1、CDR2、CDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3。 - 抗原結合領域が、以下のアミノ酸配列を有する可変重鎖(VH)領域および可変軽鎖(VL)領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物:
a) (VH) SEQ ID NO:4および(VL) SEQ ID NO:7;
b) (VH) SEQ ID NO:9および(VL) SEQ ID NO:7;
c) (VH) SEQ ID NO:12および(VL) SEQ ID NO:15;
d) (VH) SEQ ID NO:19および(VL) SEQ ID NO:23;
e) (VH) SEQ ID NO:20および(VL) SEQ ID NO:23または
f) 該(VH)および(VL)配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記a)〜e)のいずれか1つに定義される(VH)および(VL)。 - 抗体がIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 抗体がIgG1アイソタイプである、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 抗体がIgG1m(f)、IgG1m(a)、IgG1m(z)、IgG1m(x)アロタイプまたは混合アロタイプである、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- Fc領域が、以下の群のアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物:
a) SEQ ID NO:29;
b) SEQ ID NO:30;
c) SEQ ID NO:31;
d) SEQ ID NO:32または
e) 該配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記a)〜d)のいずれか1つに定義されるアミノ酸配列。 - 抗体が重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、LCがSEQ ID NO:39の配列を含み、かつHCが以下の配列の1つを含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物:
a) (HC) SEQ ID NO:33;
b) (HC) SEQ ID NO:34;
c) (HC) SEQ ID NO:35;
d) (HC) SEQ ID NO:36;
e) (HC) SEQ ID NO:37;
f) (HC) SEQ ID NO:38; または
g) 該(HC)配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記a)〜f)のいずれか1つに定義される(HC)。 - 抗体が重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、LCがSEQ ID NO:43の配列を含み、かつHCが以下の配列の1つを含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物:
a) (HC) SEQ ID NO:40;
b) (HC) SEQ ID NO:41;
c) (HC) SEQ ID NO:42; または
d) 該(HC)配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記a)〜c)のいずれか1つに定義される(HC)。 - 抗体がモノクローナル抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 抗体が、請求項14〜18のいずれか一項に定義される1つまたは複数の抗原結合領域を含む二重特異性抗体である、請求項1〜24のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 抗体がヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 抗体がアゴニストである、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 抗体が、カスパーゼ依存性細胞死などの、標的細胞におけるプログラム細胞死を誘導する、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 抗体が、DR5を発現する標的細胞においてアポトーシスを誘導する、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 抗体が細胞生存性を低減する、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 2つまたはそれ以上の抗体を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 前記請求項1〜31のいずれか一項に定義される第1の抗体および前記請求項1〜31のいずれか一項に定義される第2の抗体を含む、請求項32記載の薬学的組成物。
- 第1の抗体が第1のFc領域を含み、かつ第2の抗体が第2のFc領域を含む、請求項33記載の薬学的組成物。
- 第1の抗体が、DR5に結合できる第1の抗原結合領域および第1のFc領域を含み、かつ第2の抗体が、DR5に結合できる第2の抗原結合領域および第2のFc領域を含む、請求項33記載の薬学的組成物。
- 第1の抗体および第2の抗体が、ヒトDR5上の異なるエピトープに結合する、請求項33〜35のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- ヒトDR5に結合する第1の抗体が、ヒトDR5への第2の抗体の結合をブロックしない、請求項33〜36のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 第1の抗体が以下の6つのCDR配列:
a) (VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6
を含み、かつ
第2の抗体が以下の6つのCDR配列:
b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
を含む、または
第1の抗体および第2の抗体が
c) それぞれ該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される6つのCDR配列
を含む、
請求項33〜37のいずれか一項記載の薬学的組成物。 - 第1の抗体が以下の6つのCDR配列:
a) (VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6
を含み、かつ
第2の抗体が以下の6つのCDR配列:
b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
を含む、または
第1の抗体および第2の抗体が
c) それぞれ該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される6つのCDR配列
を含む、
請求項33〜37のいずれか一項記載の薬学的組成物。 - 第1の抗体が以下の6つのCDR配列:
a) (VH) SEQ ID NO: 16、17、18および(VL) SEQ ID NO: 21、GAS、6
を含み、かつ
第2の抗体が以下の6つのCDR配列:
b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14
を含む、または
第1の抗体および第2の抗体が
c) それぞれ該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される6つのCDR配列
を含む、
請求項33〜37のいずれか一項記載の薬学的組成物。 - 第1の抗体および第2の抗体が、約1:1のモル比、約1:2のモル比、約1:3のモル比、約1:4のモル比、約1:5のモル比、約1:6のモル比、約1:7のモル比、約1:8のモル比、約1:9のモル比、約1:10のモル比、約1:15のモル比、約1:20のモル比、約1:25のモル比、約1:30のモル比、約1:35のモル比、約1:40のモル比、約1:45のモル比、約1:49のモル比、約49:1のモル比、約45:1のモル比、約40:1のモル比、約35:1のモル比、約30:1のモル比、約25:1のモル比、約20:1のモル比、約15:1のモル比、約10:1のモル比、約9:1のモル比、約8:1のモル比、約7:1のモル比、約6:1のモル比、約5:1のモル比、約4:1のモル比、約3:1のモル比、約2:1のモル比といった、1:49〜49:1のモル比で組成物中に存在する、請求項33〜40のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 第1の抗体および第2の抗体が、約1:9〜9:1のモル比で組成物中に存在する、請求項33〜41のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 第1の抗体および第2の抗体が、約1:1のモル比で組成物中に存在する、請求項33〜42のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 医薬として用いるための、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 感染性疾患、自己免疫疾患または心血管奇形の処置において用いるための、1つまたは複数の抗DR5抗体を含む前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 固形腫瘍および/または血液学的腫瘍の処置において用いるための、1つまたは複数の抗DR5抗体を含む請求項1〜44のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 結腸直腸がん腫および結腸直腸腺がんを含む結腸直腸がん、膀胱がん、骨肉腫、軟骨肉腫、三重陰性乳がんを含む乳がん、神経膠芽腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、神経内分泌腫瘍を含む中枢神経系のがん、子宮頸がん、子宮内膜がん、胃腺がんを含む胃がん、頭頸部がん、腎臓がん、肝細胞がんを含む肝臓がん、NSCLCおよびSCLCを含む肺がん、卵巣がん、膵管がんおよび膵臓腺がんを含む膵臓がん、肉腫、または悪性黒色腫および非黒色腫皮膚がんを含む皮膚がんなどの固形腫瘍の処置において用いるための、1つまたは複数の抗DR5抗体を含む前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 慢性リンパ球性白血病ならびに急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病などの骨髄性白血病を含む白血病、非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群などの血液学的腫瘍の処置において用いるための、1つまたは複数の抗DR5抗体を含む前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- DR5発現腫瘍の増殖の阻害において用いるための、1つまたは複数の抗DR5抗体を含む前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- DR5発現腫瘍におけるアポトーシスの誘導において用いるための、1つまたは複数の抗DR5抗体を含む前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- がんの処置のための医薬の製造のための、1つまたは複数の抗DR5抗体を含む前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物の使用。
- 1つまたは複数の抗DR5抗体を含む前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物の有効量を個体に投与する段階を含む、がんを有する個体を処置する方法。
- さらなる治療剤を投与する段階をさらに含む、請求項52記載の方法。
- さらなる治療剤が、化学療法薬(パクリタキセル、テモゾロミド、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、イリノテカン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、5-フルオロウラシル、ペメトレキセドを含むが、これらに限定されない)、キナーゼ阻害剤(ソラフェニブ、スニチニブまたはエベロリムスを含むが、これらに限定されない)、アポトーシス調節剤(組み換えヒトTRAILまたはビリナパントを含むが、これらに限定されない)、RAS阻害剤、プロテアソーム阻害剤(ボルテゾミブを含むが、これに限定されない)、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤(ボリノスタットを含むが、これに限定されない)、栄養補助食品、サイトカイン(IFN-γを含むが、これに限定されない)、抗体または抗体模倣体(抗EGFR、抗IGF-1R、抗VEGF、抗CD20、抗CD38、抗HER2、抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA4、抗CD40、抗CD137、抗GITR抗体および抗体模倣体を含むが、これらに限定されない)、抗体-薬物コンジュゲートからなる群より選択される1つまたは複数の抗がん剤である、請求項53記載の方法。
- 組成物が治療での同時使用、別使用または逐次使用のためのものである、2つまたはそれ以上の前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物を含む、要素のキット。
- 組成物が治療での同時使用のためのものであり、組成物が使用直前に混合される、請求項55記載の要素のキット。
- 請求項33〜43のいずれか一項記載の薬学的組成物を調製するための方法であって、前記請求項1〜31のいずれか一項に定義される第1の抗体を含む第1の薬学的組成物と前記請求項1〜31のいずれか一項に定義される第2の抗体を含む第2の薬学的組成物とを混合する段階を含む、方法。
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