MXPA04004184A - Combinaciones de anticuerpos selectivos para un receptor de ligando que induce apoptosis relacionada al factor de necrosis tumoral y otros agentes terapeuticos. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo de la invencion interactua con DR5 humano o DR4 humano para producir efectos agonisticos corriente abajo del receptor que incluye la inhibicion de la proliferacion de celulas y apoptosis. Metodos y usos de los anticuerpos, opcionalmente en combinacion con varios agentes terapeuticos, se detallan, incluyendo el tratamiento de la enfermedad relacionada a apoptosis y el tratamiento de crecimiento celular desregulado.

Description

COMBINACIONES OE ANTICUERPOS SELECTIVOS PARA UN RECEPTOR DE LIGANDO QUE INDUCE APOPTOSIS RELACIONADA AL FACTOR DE NECROSIS TÜMORAL Y OTROS AGENTES TERAPEUTICOS Reconocimientos Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional norteamericana número 60/391,478, presentada el 24 de junio del 2002, y la solicitud provisional norteamericana número 60/346,402, presentada el 1 de noviembre del 2001, y reivindica la prioridad de PCT/US01/14151, presentada en mayo del 2001, que está actualmente pendiente. PCT/US01/14151 reivindica el beneficio de la solicitud provisional norteamericana número 60/201,344, presentada el 2 de mayo del 2000. Las solicitudes a las cuales la presente solicitud reivindica el beneficio son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. Esta invención se hizo con el apoyo del gobierno bajo Grant NCI P50 CA 89019-01 concedido por el National Cáncer Institute y bajo NIH R03-AR44982 concedido por el National Institute of Arthritis and Músculoskeletal and Skin Diseases. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención. Campo de la Invención La presente invención se relaciona a un anticuerpo capaz de enlazar especificamente a un solo tipo dé receptor de ligando que induce apoptosis (después referido en la presente como "TRAIL") relacionada con el factor de necrosis tumoral (después referido en la presente como "TNF"), más particularmente, a un anticuerpo monoclonal que induce apoptosis en células in vivo e in vitro que expresan el receptor de un solo tipo y terapias basadas sobre el mismo. Antecedentes de la Invención T AIL es un miembro de la familia de proteinas TNF, que también incluye TNF- y el ligando Fas (1) . Estas proteinas son potentes inductores de apoptosis . Hasta la fecha, cinco receptores para TRAIL han sido identificados, dos de los cuales, DR4 (TRAIL-R1) y DR5 (TRAIL-R2) (2-7), son capaces de transducir la señal de apoptosis mientras que los otros tres DcRl (TRAIL-R3) , DcR2 (TRAIL-R ) y osteoprotegerina (OPG) no transducen la señal de apoptosis (8-12). Todos los cinco receptores para TRAIL comparten homologia significante en sus dominios de enlace de ligando extracelulares. Similar a FAS y el receptor I de TNF (después en la presente referido como "TNFRI") , los segmentos intracelulares de tanto DR4 y DR5 contienen un dominio inductor de muerte, y transducen una señal de apoptosis a través de una ruta que implica la proteina de dominio inductor de muerte asociado con Fas (después en la presente referida como "FADD") y caspasa 8 (6,7). Además de transducir la señal de apoptosis, los receptores DR4 y DR5 también pueden activar una ruta que implica NFKb (6,7). ? 3 Las funciones biológicas del TRAIL que se han demostrado, incluyen la capacidad del TRAIL para inducir selectivamente apoptosis de células de tumor transformadas, con células normales que son relativamente resistentes a la apoptosis mediada por TRAIL (13-15) . Esta selectividad sugiere que, en contraste al ligando Fas, la administración de TRAIL está asociada con niveles muy bajos de toxicidad como es demostrado por la administración sistémica de TRAIL en un modelo animal sin inducir toxicidad significante (13) . Asi, TRAIL se ha propuesto como un potente agente inductor de apoptosis que seria un agente terapéutico adecuado para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades asociadas con la proliferación de células anormal. TRAIL también se ha propuesto que es un potente agente inductor de apoptosis que seria adecuado para el tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Se ha demostrado que la apoptosis mediada por TRAIL está implicada en la muerte celular inducida por activación de las células T, sirviendo de tal manera como un mecanismo alternativo para el ligando Fas (16,17). La apoptosis mediada por TRAIL también puede funcionar en la inducción de la apoptosis de células T y otras células inflamatorias (18), y desempeña una función en la actividad de exterminación de- las células NK (19-21) y en la función inmunoraodulador de las células dendriticas (22,23). Asi, la apoptosis mediada por TRAIL también puede funcionar en el inmunoprivilegio y la inmunovigilancia. El sistema receptor de TRAIL es complejo, e incluye por lo menos dos receptores inductores de muerte, DR4 y DR5, y por lo menos dos receptores no apoptóticos, DcRl y DcR2. Todos estos receptores no solamente comparten una alta homologia de secuencia de aminoácidos, sino también muestran una afinidad de enlace similar a TRAIL (2-12). La habilidad de los receptores DcRl y DcR2 para competir para el enlace del TRAIL sin inducir apoptosis sugiere que ellos pueden actuar como receptores de señuelo que bloquean o modulan la actividad del ligando TRAIL. Además, se ha reportado que las células no transformadas expresan niveles más altos de receptores de señuelo que las células transformadas. Asi, se ha propuesto que la modulación diferencial de la expresión de los receptores de muerte y de señuelo puede representar un mecanismo regulador clave que determina la susceptibilidad de la células a la apoptosis mediada por TRAIL, excepto debido a la falta de anticuerpos específicos del receptor (2) . Aunque la expresión y la función de DR4 y DR5 se han estudiado extensivamente, el progreso se ha impedido por la falta de anticuerpos monoclonales específicos del receptor. La expresión de DR5 de la superficie de la célula no ha sido documentada. Se. ha reportado que un panel de anticuerpos de receptor anti-TRAIL se ha generado, que son capaces de inducir apoptosis de las células de melanoma in vitro pero solamente en la inmovilización de los anticuerpos, para promover la reticulación y, en algunos casos, las células requieren el cultivo con actinomicina D (24). Varios anticuerpos anti-DR5 han sido generados (24). Sin embargo, estos anticuerpos monoclonales anti-DR5 previamente generados tienen baja actividad inductora de apoptosis in vitro, aun bajo las condiciones de reticulación. No se ha reportado actividad in vivo. Estos anticuerpos no se han usado para examinar la expresión de la superficie de la célula de receptores de TRAIL (24) . Asi, aun existe una necesidad por un anticuerpo monoclonal selectivo para cada receptor de TRAIL especifico que no es solamente capaz de enlazar al receptor de la superficie de la célula sino también fuertemente inducir apoptosis de varios tipos de células anormales, incluyendo células de tumor, tanto in vivo como in vitro sin el requerimiento por reticulación o inmobilización. Tal anticuerpo no solamente proporcionarla un agente terapéutico potencial sino también una herramienta de diagnóstico para el análisis funcional del receptor de TRAIL. Aun existe una necesidad particular por un anticuerpo especifico contra cada uno de los receptores inductores de muerte DR4 y DR5. En el desarrollo, o progresión, de muchas enfermedades frecuentemente es el caso que las células no sean suprimidas. En muchas enfermedades autoinmunes y condiciones inflamatorias, las células activadas sobrevivientes atacan los tejidos o células normales. Además, la progresión de la tumorigénesis y la formación inflamatoria proliferativa de la artritis reumatoide son caracterizadas por la proliferación no impedida de células. Asi, la apoptosis insuficiente conduce al desarrollo de enfermedad, y los usos de ligando inductor de apoptosis o anticuerpo monoclonal agonístico para aumentar la apoptosis se consideran como una estrategia terapéutica potencial para eliminar esas- células indeseadas. Por ejemplo, la artritis reumatoide (después en la presente referida como "RA") es una enfermedad autoinmune humana común. El entendimiento actual de la patofisiología de la RA es que las células T y células B autoinmunes inician una respuesta inflamatoria en las articulaciones, que induce la hiperproliferación de los sinoviocitos . Como una consecuencia de la hiperproliferación de células sinoviales, las metaloproteinasas (después en la presente referidas como "MMPs") son sobreproducidas, lo cual además conduce a la destrucción erosiva del cartílago y el hueso que es característico de la RA (25) . Así, el control de la hiperproliferación de células sinoviales inflamatorias es una etapa clave en el tratamiento de, la RA. Los mecanismos moleculares que conducen a la hiperproliferación de células sinoviales todavía son desconocidos. Aunque las células sinoviales hiperproliferativas son no malignas y no transformadas, muchos estudios han sugerido que ellas comparten características comunes con las células transformadas (46) . Estas células, los llamados, "sinoviocitos que aparecen transformados", se caracterizan por un retículo endoplásmico áspero denso, numerosos núcleos irregulares y cambios en el esqueleto de la célula normalmente en forma de espiga. Se ha propuesto que la incorporación de los oncogenes y genes derivados de virus podrían ser los activadores primarios para la aparición transformada de células sinoviales de RA (46) . Por lo menos dos aspectos de la RA sugieren que la apoptosis desrregulada puede contribuir al proceso de enfermedad y que la inducción terapéutica de la apoptosis puede ser un tratamiento efectivo: la deficiencia de la supresión de las células T activadas sugiere que hay una muerte celular inducida por activación defectiva de estas células T, que es un proceso que implica la apoptosis mediada por Fas y la apoptosis mediada por TRAIL, y la naturaleza hiperproliferativa de las células sinoviales de RA es un factor contribuyente en las etapas posteriores de la patofisiologia de la RA. En realidad, se ha mostrado que la administración del anticuerpo anti-FAS en la articulación inflamatoria inhibe el desarrollo de la · artritis crónica en ratones transgénicos tax, que son un modelo de animal para RA humana (26) . Además, la transducción localizada con el gen de ligando fas por un vector adenoviral es efectiva en la prevención de la artritis inducida por colágeno (27) . La inhibición de la proliferación de células sinoviales inflamatorias mediante el aumento de la apoptosis mediada por Fas es observada en ambos casos . Aunque el ligando Fas es un inductor de apoptosis fuerte en las células sinoviales de RA, la aplicación de la apoptosis mediada por el ligando Fas como una terapia para humanos ha sido limitada por la toxicidad del hígado letal, Asi, la apoptosis inducida por el receptor de TRAIL representa un medio terapéutico más seguro y más efectivo para el tratamiento de la RA que la apoptosis inducida por el ligando Fas. La apoptosis inducida por el receptor de TRAIL también representa un medio terapéutico más seguro y más efectivo para el tratamiento del cáncer que la apoptosis inducida por el ligando Fas. La apoptosis mediada por TRAIL se conoce que induce especificamente apoptosis de células de tumor transformadas sin afectar las células normales. Se ha mostrado que la administración sistémica del TRAIL soluble trimerizado no ocasionó toxicidad en los animales experimentales pero fue capaz de inducir regresión de los tumores implantados (13,28). Su potencial como una terapia adjunta para los tratamientos tradicionales se acentuó por el descubrimiento reciente de que la expresión de DR5 y la susceptibilidad a la apoptosis inducida por TRAIL de las células de cáncer de pecho, es aumentada por la radiación, sugiriendo que combinada con la radiación, la eficiencia del TRAIL seria incrementada en la terapia del cáncer (29). Además, el gen que codifica el receptor de TRAIL, DR5, se ha mapeado al cromosoma 8p21-22, sitios con una alta frecuencia de mutación en algunas células de cáncer (30) . Se ha reportado que por lo menos dos clases de células de tumor, cáncer de pulmón pequeño (31) y cáncer de cabeza y cuello (32) muestran mutaciones en el dominio inductor de muerte del gen DR5. Asi, aun existe una necesidad por un anticuerpo anti-DR5 en la investigación del cáncer para determinar el efecto de la variación del epitope receptor sobre el desarrollo y la progresión de los cánceres. Además, la funcionalidad de las mutaciones del receptor de TRAIL resultarla una herramienta de diagnóstico clínica útil cuando se usa en conjunción con otros biomarcadores en la detección temprana de cánceres y como un medio de predicción de la agresividad del tumor. Breve Descripción de la Invención En una modalidad, la invención se relaciona a un anticuerpo que reconoce un receptor de TRAIL, DR5, y que induce apoptosis en una célula que expresa DR5 in vivo o in vitro. Además se describe un anticuerpo que reconoce DR5 pero no DR4, DcRl o DcR2. Específicamente detallado se encuentra un anticuerpo monoclonal a DR5 producido por un hibridoma. En otra modalidad, la invención se relaciona a un anticuerpo que reconoce un receptor de TRAIL, DR4, y que induce apoptosis en una célula que expresa DR4 in vivo o in vitro. Además se describe un anticuerpo que reconoce DR4 pero no DR5, DcRl o DcR2. Específicamente detallado se encuentra un anticuerpo monoclonal DR4 producido por un hibridoma. Un método proporcionado es la inducción de apoptosis en células objetivo o la inhibición de la proliferación de células objetivo al poner en contacto una célula con una cantidad terapéutica de un anticuerpo capaz de enlazar a DR5 o DR4. En varias modalidades del método, la apoptosis puede ser inducida o la proliferación celular inhibida al poner en contacto las células objetivo con anticuerpos contra otros receptores de muerte. También se describe una composición farmacológica que incluye una cantidad terapéutica de anticuerpo monoclonal activo contra un DR5, un portador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, un contenedor que incluye el anticuerpo y el portador. Además, proporcionado por la invención está el uso de un anticuerpo que reconoce DR5 o un anticuerpo que reconoce DR4 para preparar un medio terapéutico para la apoptosis selectiva de células anormales o desrreguladas .

Un anticuerpo de la presente invención interactúa con un receptor de ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis de tumor tales como DR4, DR5, DrRl, DrR2 y OPG, induciendo apoptosis en una célula que expresa tal receptor. Se describe un anticuerpo de la invención capaz de enlazar selectivamente un epitope de receptor de ligando de factor de necrosis de tumor agonístico o antagonístico . La presente invención proporciona un tratamiento para una enfermedad, cáncer, enfermedad inflamatoria o una enfermedad autoinmune relacionada con la apoptosis, mediante un método que incluye poner en contacto un tejido objetivo que tiene la enfermedad con una cantidad terapéutica de un anticuerpo de la invención, individualmente o en combinación con otros anticuerpos inductores de apoptosis, y/o u otros agentes o tratamientos terapéuticos. Además se describe una proteína de fusión que incluye una secuencia de aminoácidos del receptor de TRAIL antigénico que tiene por lo menos diez bases, acoplada a una proteína de inmunoglobulina o fragmento de la misma capaz de producir una respuesta inmune dentro de un sujeto. La presente invención proporciona un método de terapia génica, en el cual una célula objetivo es transfectada con una secuencia de ácido nucleico de receptor de TRAIL en un vector de expresión, de modo que el receptor de TRAIL es expresado sobre la célula objetivo. La célula objetivo luego es expuesta a un anticuerpo que enlaza selectivamente al receptor de TRAIL. Se proporcionan secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos- que codifican las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera para un anticuerpo selectivo para DR5. También se proporcionan secuencias para un anticuerpo que selectivamente enlaza a DR . También se detallan vectores que incluyen una secuencia de ácido nucleico de la invención y células huéspedes transformadas con un vector de la invención. La presente invención proporciona un anticuerpo DR5 humanizado (por ejemplo, TRA-8) y un DR4 humanizado (por ejemplo, 2E12), asi como una célula transfectada que produce el anticuerpo DR5 humanizado y una célula transfectada que produce el anticuerpo DR4 humanizado. Se describe un proceso para producir un anticuerpo DR5 o anticuerpo DR4 humanizado en el cual un huésped es transformado con las secuencias de ácido nucleico que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada y una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, después de lo cual el huésped transformado es incubado durante un periodo de tiempo predeterminado. También se describe un proceso para inducir apoptosis en células objetivo o para inhibir la proliferación celular que incluye poner en contacto uha célula objetivo con una cantidad farmacéuticamente efectiva de un anticuerpo DR5 humanizado, un anticuerpo DR4 humanizado, o una combinación de un anticuerpo DR5 y un anticuerpo para otro receptor de muerte (por ejemplo, un anticuerpo ara DR4), en la presencia o ausencia de otros agentes y tratamientos terapéuticos. Se proporciona un kit comercial para inducir apoptosis que incluye un anticuerpo TRA-8 humanizado selectivo para DR5 o un anticuerpo humanizado para DR4 (por ejemplo, 2E12 humanizado) envasado en un contenedor adecuado, y opcionalmente con instrucciones para uso. Breve Descripción de los Dibujos Figura 1. Caracterización de TRA-8. (a.) Especificidad de enlace de TRA-8: Análisis de manchado de Western (panel superior) : Proteinas de fusión recombinantes de la familia TNFR sondeadas con TRA-8 o IgG anti-humano. Franja 1: Proteina de fusión DR5/hIgGl (inmunógeno)./ Franja 2: DR4/hIgGl (TRAIL-R1) ; Franja 3: DR5/hIgGl Franja 4: TRAIL-R3 (DcR-1) /hlgGl Franja 5: TRAIL-R4 (DcR-2) /hlgGl; Franja 6, CD95/hIgGl; Franja 7: TNFRI soluble. Análisis de ELISA (panel inferior) : Los números de cavidad corresponden a aquellos del manchado de Western excepto la cavidad 8 que es una proteina de fusión DR5/hlgGl de murino. (b.) Actividad de enlace del TRAIL soluble y TRA-8 a DR5 y DR4; placas de ELISA se recubrieron con DR5/hlgGl (panel izquierdo) o DR4/hlgGl (panel de en medio) y luego se incubaron con TRAIL o TRA-8. (c.) Análisis de citometria de flujo de la expresión de DR5 de la superficie. Células Cos-7 transfectadas con el vector de expresión pcDNA3 que contiene el cDNA de DR5 de longitud completa (histograma lleno), cDNA de DR4 (histograma vacio, linea llena) o el vector vacio (histograma vacio, linea de guiones) . Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se mancharon con TRA-8 seguido por el IgGl antiratón conjugado con PE. (d. ) Reactividad de inmunohistoquimica in situ para DR5: Platinas con citospina de células Cos-7 transfectadas con la expresión DR5 o el vector de control se mancharon con TRA-8 a 48 horas después de la transfección, (e.) Actividad de exterminación de TRA-8: Células Jurkat se incubaron con las concentraciones indicadas de TRA-8. La viabilidad de las células se determinó mediante los ensayos de exclusión ATPLite, MTT y PI después del cultivo durante la noche. Los resultados de los ensayos ATPLite y MTT son presentados como el por ciento de medio de control, y el ensayo de PI son presentados como el por ciento de células negativas de PI. (f.) Análisis de manchado de Western de la activación de caspasa. Células Jurkat se incubaron con 500 ng/ml de TRA-8 durante el tiempo indicado. Los lisados de células se separaron mediante SDS-PAGE al 15%, se mancharon y se sondearon con anticuerpos anti-caspasa. Las flechas indican las subunidades segmentadas de cada caspasa. (g.) Ensayo de inhibición de caspasa: Células Jurkat se incubaron con 50 ng/ml de TRA-8 durante la noche en la presencia de varias concentraciones de inhibidores de caspasa indicados. La viabilidad.de las células se determinó mediante el ensayo ATPLite.. Figura 2. Expresión de DR5 de la superficie de la célula y susceptibilidad a la apoptosis mediada por DR5. Células T y B normales, recientemente aisladas de la sangre periférica, las lineas de células . T (a y a' ) , glioma (b y b' ) , células de cáncer de próstata (c) y células B (d) se incubaron con TRA-8 o anticuerpo de control de isotipo IgGl de murino seguido por el IgGl de anti-ratón de cabra conjugado con PE. Los histogramas vacíos representan el control dé anticuerpo de isotipo mientras que los histogramas llenos representan el manchado de TRA-8. La apoptosis se determinó mediante el ensayo ATPLite después de la incubación durante la noche con TRAIL soluble (círculos vacíos) o TRA-8 (círculos llenos) como es mostrado en a, b' y d. Figura 3a' . La línea de células T U937 se incubó con TRA-8 o anticuerpo de un control de isotipo IgGl de murino. La apoptosis se determinó mediante el ensayo de ATPLite después de la incubación durante la noche con TRAIL soluble (círculos vacíos) o TRA-8 (círculos llenos) . Figura 3. Las líneas de células de glioma (b) y cáncer de próstata (c) se incubaron con TRA-8 o anticuerpo de control isotipo de IgGl de murino. La apoptosis se determinó mediante el ensayo ATPLite después de la incubación durante la noche con TRAIL soluble (circuios vacíos) o TRA-8 (círculos llenos) . La Figura 4 es una serie de gráficas que muestran la viabilidad celular para las células Jurkat humanas después de la exposición a concentraciones indicadas de (A) cepas de anticuerpo T A-1, -8 y -10 y (B) TRAIL en la presencia de una concentración fija de las cepas de anticuerpo inventivas representadas en la Figura 4A; Figura 5. Expresión de DR5 en tejidos normales y de cáncer: Homogenados de tejido normal y de cáncer se sondearon con TRA-8 y se revelaron mediante quimioluminiscencia . (a.) Análisis de manchado de Western de la proteína DR5 en tejidos normales: franja 1: hígado, franja 2; cerebro, franja: 3 pulmón, franja 4: riñón, franja 5: bazo, franja 6: testículos, franja 7: ovario, franja 8:corazón, franja 9: páncreas, b. Análisis de manchado de Western de la proteína DR5 en tejidos de cáncer. El manchado de tejido de cáncer que contiene cánceres del ovario (franja 1), pulmón (franja 2), hígado (franja 3), recto (franja 4), cerviz (franja 5), piel (franja 6), testículos (franja 7), tiroides (franja 8), útero (franja 10), estómago (franja 11), laringofaringe (franja 12) y páncreas (franja 13) se sondeó. Inmunohistoquímica in situ de tejidos de humano normales (c.) y de tejidos de cáncer (d.). Secciones congeladas se inmunomancharon con TRA-8. Figura 6. Actividad tumoricida del TRA-8. Ratones SCID se inocularon subcutáneamente con células 1321N1. Los ratones se inyectaron intravenosamente con una sola dosis individual de 100 ]ig de TRA-8 en el segundo día después de la inoculación (a), o con tres dosis de 100 ]ig de TRA-8 comenzando 7 dias después de la inoculación del tumor (b) . El crecimiento del tumor se determinó mediante el peso y se examinó histológicamente con manchado de H&E . Las fotografías muestran crecimiento de tumor viable en ratones de control pero no en ratones tratados con TRA-8 (c, panel superior) y el manchado del tumor con H&E (c, panel inferior). Ratones SCID se inyectaron intravenosamente con 106 células Jurkat y se trataron con una sola dosis de TRA-8 en el segundo dia después de la inyección. Siete dias después, las células del bazo se cosecharon, se mancharon con anticuerpo CD3 antihumano y se analizaron mediante la citometria de flujo (d.), o mediante inmunohistoquimica {e) . La Figura 7 muestra la expresión de DR5 de la superficie de la célula en las células sinoviales de RA (A) y OA (B) . I X 10s células sinoviales cultivadas primarias se mancharo con TRA-8 purificado por afinidad y seguido por el anticuerpo IgGl anti-ratón de cabra conjugado con PE. 10,000 células viables se analizaron por FACSvantage.

La Figura 8 es una serie de gráficas que muestran la viabilidad de las células como una función de la apoptosis inducida por la concentración de TRAIL y de TRA-8 de cepas representativas de células sínoviales de RA (A) y OA (B) con varias concentraciones del TRAIL soluble recombinante (los círculos vacíos) o TRA-8 purificado por afinidad (los círculos llenos) . La viabilidad de las células es el porcentaje del cpm de células tratadas contra el cpm de células no tratadas. La Figura 9 es una serie de gráficas que muestran la dependencia de caspasa de la apoptosis mediada por DR5 de las células sínoviales de RA. Células sínoviales de RA (RA512) son incubadas con 50 ng/ml del ligando Fas soluble (cuadros vacíos), y anticuerpo anti-Fas (CH-11) (cuadros llenos), TRAIL soluble (círculos abiertos), o anticuerpo anti-DR5 (TRA-8) (círculos llenos) en la presencia de concentraciones variables de inhibidores de caspasa. Después del cultivo durante la noche, la viabilidad de las células es determinada por ATPLite. La Figura 10A es un ensayo de desplazamiento de gel electroforético indicando la activación de NFkb. Las células RA1016 son incubadas con 20 ng/ml de TNF-a, 50 ng/ml de TRAIL soluble o 50 ng/ml de TRA-8 para los puntos de tiempo indicados antes de ser sometidos a electroforesis . Las Figuras 10B y C son gráficas que muestran la producción de MMP-1 y MMP-3. 1 X 106/ml de células sinoviales de RA indicadas son incubadas con las concentraciones indicadas de TNF-a (los circuios vacios), RAIL (los triángulos vacíos) o TRA-8 (el circulo lleno) . Después del cultivo durante la noche, son colectados los sobrenadantes de cultivo. Los niveles de MMPs en los sobrenadantes de cultivo son determinados por ELISA. Figura 11. TRA-8 no induce toxicidad hepatocelular. (a.) Tejidos de hígado normal no expresan DR5. Las secciones en parafina de dos tejidos de higado normales, un tejido de carcinoma hepatocelular y la preparación de citospina de las células HepG2 se prepararon para el manchado de H&E, y secciones congeladas correspondientes se mancharon con TRA-8. (b.) Análisis de citometria de flujo de la expresión de DR5 de la superficie de la célula. Hepatocitos, aislados de dos tejidos de higado normales y de un caso de tejido de carcinoma hepatocelular, y células HepG2 se mancharon con TRA-8, anticuerpo anti-Fas (DX2) o un anticuerpo de control de isotipo. Los histogramas llenos indican el manchado con TRA-8 o DX2 y los histogramas vacios son los controles de isotipo correspondientes. Figura 12. TRAIL pero no TRA-8 induce toxicidad hepatocelular. Hepatocitos humanos normales frescos se mantuvieron en el Medio de Cultivo de Hepatocito. (a.) La apoptosis de los hepatocitos se indujo con 1 µg/ml de. TRAIL soluble más agente de reticulación o TRA-8 para los puntos de tiempo indicados. La viabilidad de las células se determinó por ATPLite. Los resultados son presentados como el por ciento de células viables comparadas con el medio de control. Las barras sombreadas indican TRAIL y las barras negras indican TRA-8. (b.) Los núcleos condensados de hepatocitos se mancharon con Hoechst 33352 y se analizaron mediante la citometria de flujo, (c.) Efecto de la cicloheximida sobre la apoptosis de hepatocitos. Los hepatocitos se cultivaron en el medio de control o con 1 µg/ml de TRAIL o TRA-8 en la presencia (barras llenas) o la ausencia (barras vacias) de 1 µg/ml de cicloheximida durante 8 horas. La viabilidad de las células se determinó mediante ATPLite. Los resultados son presentados como el promedio±SEM de cultivos por triplicado de dos experimentos, d. Una comparación de la susceptibilidad de los hepatocitos normales a DR5 y la apoptosis mediada por Fas . Hepatocitos recientemente aislados se incubaron con concentraciones indicadas de TRAIL soluble, TRA-8, FasL soluble o el mAb CH11 anti-Fas por 6 horas. La viabilidad de las células se determinó mediante ATPLite . Los resultados son presentados como el porcentaje de células viables comparados con el medio de .control. Para hepatocitos normales, se presenta el promedio ± SEM de cuatro individuos normales. Los resultados de las células de carcinoma hepatocelulares de un paciente, y las células HepG2 son presentados como el promedio de cultivo por triplicado . Figura 13. TRAIL induce hepatitis. Ratones B6 se inocularon intravenosamente con 109 pfu de vector adenoviral que codifica la longitud completa del TRAIL humano bajo el control del elemento transcripcional "Tet-on". La expresión de TRAIL se indujo mediante la dosis indicada de tetraciclina . (a.) Análisis de manchado de Northern de la expresión de TRAIL humana en el higado. 24 horas después de la inoculación del vector y la inducción con tetraciclina, el RNA total se aisló de los hígados y se sondeó con cDNA de TRAIL humano o ß-actina. (b.) Niveles de suero de AST. 24 horas después de la transducción de TRAIL, se determinaron los niveles de suero de AST. (c.) Muerte celular mediada por TRAIL de los hepatocitos infectados con vector adenoviral: ratones B6 se inocularon intravenosamente con vector adenoviral inducibl'e de tetraciclina. 48 horas después de la inoculación, los hepatocitos de ratones de control inoculados y no inoculados se aislaron y se incubaron con concentraciones indicadas de TRAIL por 8 horas (panel izquierdo) . La viabilidad de las células de los hepatocitos. se determinó por el ensayo ATPLite. Ratones, inoculados con el vector adenoviral como antes, se inyectaron intravenosamente con 10 ]ig de TRAIL humano soluble 48 horas después. Los niveles en el suero de AST se midieron en 24 horas después de la inyección de TRAIL (panel derecho). (d. y e.) Análisis de histología del daño del hígado inducido por TRAIL. Los hígados se colectaron en 24 horas (d. ) o 7 días (e.) después de la transducción con TRAIL. Las secciones en parafina se mancharon con H&E y se fotografiaron a 100X (panel superior) y 400X (panel inferior) . La Figura 14 es una serie de gráficas que muestran que las células T y las células B activadas, purificadas del PBMC humano expresan niveles incrementados de DR5 como es determinado por la citometria de flujo para las células en reposo (no llenadas) y activadas (sombreadas) . La Figura 15 es una gráfica de viabilidad como una función de la concentración de TRA-8 para las células T y células B purificadas, representadas en la Figura 14, que se han estimulado durante 48 horas con anti-CD3 o anti-µ, con las células activadas y descargadas recolectadas por densidad diferente de Ficoll-Paque. La viabilidad es determinada mediante el ensayo ATPLite. La Figura 16 es un histograma y los diagramas de citometria que muestra la expresión de CD3 en una población de linfocitos confinada para ratones NOD/SCID agotados de células K inyectados con PBMC humano y TRA-8 o IgG (control) .

La Figura 17 muestra micrograflas celulares manchadas con CD3 y TUNEL para el tejido de bazo de ratón como es detallado en el Ejemplo 13. La Figura 18 muestra diagramas de citotoxicidad para la leucemia linfolitica crónica (CCL) y células B normales humanas en la presencia de TRA-8, BISVIII, y la combinación de los mismos. Figura 19(a). Enlace especifico de 2E12 a DR4. Las placas de ELISA se recubrieron con la forma soluble del receptor TRAIL humano-proteínas de fusión Fe IgGl como es indicado y se incubaron con la concentración indicada de mAb 2E12, seguido por IgGl anti-ratón conjugado con HRP. La reacción se desarrolló con la solución reguladora de sustrato TMB y los valores OD se midieron a 450/650 nM. Figura 19(b). 2E12 enlaza DR4 de la superficie de la célula. Las células Cos-7 se transfectaron con el vector que contiene el cDNA de longitud completa para DR4 (histograma lleno) o vector de control (histograma vacío) . Las células transfectadas se" mancharon con 10 µg ml de 2E12 e IgGl anti-ratón conjugado con PE. Las células se analizaron mediante citometría de flujo. Figura 19(c). Actividad inductora de apoptosis de 2E12. Las células de linfoma B Ramos, humanas se incubaron durante la noche con las concentraciones indicadas de 2E12 en la presencia de 2 µg/ml de IgGl. anti-ratón. La viabilidad de las células se determinó mediante el ensayo ATPLite. (d) Activación de caspasa inducida por 2E12. Células Ramos se trataron con 2E12 y anticuerpo IgG anti-ratón para los puntos de tiempo indicados . La activación de caspasa y la segmentación de PARP se determinaron mediante el análisis de manchado de Western usando anticaspasa especifica o anticuerpos PARP. Figura 20. El efecto de 2E12 y adriamicina en ratones desnudos atimicos que llevan xenoinjertos de cáncer de pecho. Células 2LMP (3X107) se inyectaron subcutáneamente en ratones desnudos atimicos en el dia 0. Dos grupos de ratones se inyectaron intraperitonealmente con 200 yig de 2E12 en los dias 7, 10, 14, 17, 21 y 24. Dos grupos de ratones recibieron i.v. adriamicina (6 mg/kg) en los dias 8, 12 y 16. Un grupo de ratones no recibió anticuerpo. Los datos son expresados como el cambio promedio en el tamaño de tumor con relación al tamaño en el dia 7 (n=8 ratones/grupo) . Figura 21. El efecto de TRA-8 , 2E12 y adriamicina en ratones desnudos atimicos que llevan xenoinjertos de cáncer de pecho. Células 2LMP (3X107) se inyectaron s.c. en ratones desnudos atimicos en el dia 0. Dos grupos de ratones se inyectaron i. . con 200 µg de TRA-8 y 2E12 en los dias 7, 10, 14, 17, 21 y 24. Dos grupos de ratones recibieron i.v. adriamicina (6 mg/kg) en los dias 8, 12 y 16. Un grupo de ratones no recibió anticuerpo. Los datos son expresados como el cambio promedio en el tamaño de tumor con relación al tamaño en el dia 7 (n=8 ratones/grupo) . Descripción Detallada de la Invención La deficiencia para suprimir células es debido a los defectos en el sistema inductor de apoptosis, que están asociados con los defectos que ilustrativamente incluyen la expresión o función del ligando, el receptor, o las moléculas reguladoras y efectoras intracelulares . La presente invención proporciona un método para corregir un sistema inductor de apoptosis deficiente, asi como para elucidar los defectos específicos inherentes en un sistema inductor de apoptosis defectivo, dado. La presente invención se relaciona a una nueva clase de anticuerpos monoclonales que tienen actividad inductora de apoptosis in vivo e in vitro selectiva, contra los receptores de TRAIL específicos, incluyendo DR5, DR4, DcRl y DcR2. Asi, los anticuerpos de la presente invención específicamente enlazan a uno de los receptores de TRAIL. Por "enlace de manera selectiva" o "reconocimiento de manera especifica" significa que el anticuerpo enlaza solamente a un receptor de TRAIL y muestra poco o nada de enlace a otros tipos de receptores de TRAIL usando el análisis de manchado de Western tradicional. Un anticuerpo DR5 de la presente invención enlaza DR5 selectivamente y no muestra enlace arriba de aproximadamente 1.5 veces del antecedente para DR4, DcRl o DcR2. De manera similar, ~un anticuerpo DR4 de la presente invención enlaza DR4 selectivamente y no muestra enlace arriba de aproximadamente 1.5 veces del antecedente para DR5, DcRl o DcR2. La presente invención tiene utilidad como un reactivo para la investigación de señalización de apoptosis, asi como utilidad como un medio terapéutico efectivo contra las células que expresan receptores de TRAIL, incluyendo ilustrativamente amplias clases de células de cáncer, células que muestran desrregulación del sistema de apoptosis, linfocitos activados u otras células inmunes activadas (por ejemplo, células linfoides y células mieloides), células viralmente infectadas, y células sinoviales anormalmente proliferantes (por ejemplo células sinoviales de artritis reumatoide, incluyendo células sinoviales inflamatorias, células linfoides y mieloides activadas en la sinovia, sinoviocitos similares a macrófagos y sinoviocitos similares a fibroblastos) de enfermedades autoinmunes . Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención son específicos en enlazar tipos particulares de receptores de TRAIL a pesar de la homología entre los mismos. Los anticuerpos inventivos proporcionan la apoptosis dirigida de solamente aquellas células que expresan un receptor de TRAIL objetivo o alternativamente, que bloquean la apoptosis por TRAIL de las células que expresan un receptor objetivo.

Un anticuerpo monoclonal DR5 o un anticuerpo monoclonal DR4 de la presente invención sirve como un potente inductor de apoptosis en células que expresan DR5 o DR4, respectivamente, in vitro y como un potente inductor de apoptosis in vivo. Las. secuencias de COR fragmentarias humanizadas injertadas sobre cadenas principales de anticuerpo humanizadas y los anticuerpos DR5 o DR4 de proteina de fusión de la presente invención muestran propiedades apoptóticas similares. Hasta la fecha, no está disponible anticuerpo monoclonal que enlace a DR5 de la superficie de la célula y que, aún a bajas concentraciones, induzca apoptosis de células que expresan DR5 tanto in vitro como in vivo en la ausencia de un agente de reticulación. La presente invención incluye un anticuerpo DR5 operativo como un agente terapéutico en el tratamiento de una variedad de enfermedades. Aunque el TRAIL soluble se ha mostrado que es efectivo en la inducción de apoptosis de células de tumor in vivo, la actividad de exterminación se presentó que es muy baja con las dosis grandes y repetidas que son frecuentemente requeridas (13) . La presente . invención proporciona, un anticuerpo purificado que enlaza un receptor de TRAIL, DR5; en donde el anticuerpo, en su forma soluble ' a bajas concentraciones, tiene actividad inductora de apoptosis in vivo e in vitro en las células objetivo que expresan DR5. En una modalidad preferida, el anticuerpo purificado enlaza al receptor de TRAIL, DR5, en la ausencia del agente de reticulación de anticuerpo. De preferencia, el anticuerpo no induce apoptosis significante de las células de fibroblasto normales. De preferencia, la actividad inductora de apoptosis es caracterizada por menos de 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% de viabilidad, o cualquier porcentaje en medio, de las células objetivo a concentraciones de anticuerpo de menos de aproximadamente 0.1, 1, 5, 10 o 20 µg/ml o cualquier concentración en medio. El anticuerpo purificado específicamente enlaza al receptor de TRAIL, DR5, y no enlaza a los receptores de TRAIL, DR4, DcRl o DcR2 en el análisis de manchado de Western de rutina. En una modalidad preferida, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, de preferencia que tiene la misma especificidad de epitope como el hibridoma de ratón-ratón TRA-8 que tiene el número de Acceso ATCC PTA-1428. TRA-8, uno de una serie de anticuerpos DR5 de acuerdo con la presente invención, es farmacéuticamente efectivo en animales que llevan un transgen DR5 humano · y también tiene utilidad en establecer un modelo para la investigación dé la función de DR5 y TRAIL. Varias modalidades de la invención proporcionan anticuerpos que inducen apoptosis en la presencia o la ausencia de reticulación. Por ejemplo, una modalidad preferida del anticuerpo DR5 (por ejemplo, TRA-8) induce apoptosis en la ausencia de reticulación. "Reticulación" incluye, por ejemplo, reticulación por un anticuerpo secundario. Otras modalidades proporcionan anticuerpos que inducen apoptosis en la presencia de agentes de reticulación, incluyendo, por ejemplo, una modalidad preferida del anticuerpo DR4 (2E12) . Asi, la invención proporciona un anticuerpo purificado que especificamente enlaza un receptor de TRAIL, DR4, en donde el anticuerpo, en su forma soluble, tiene actividad inductora de apoptosis in vivo e in vitro en células objetivo que expresan DR4. Como una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que tiene la misma especificidad de epitope como el hibridoma 2E12 que tiene el número de acceso, de ATCC PTA-3798, depositado el 24 de Octubre del 2001, que tiene el nombre designado "2E12 Hybridoma Clone Against Human DR4", a nombre de The UAB Research Foundation. 2E12, uno de una serie de anticuerpos DR4 de la presente invención, es farmacéuticamente activo en reducir el tamaño del tumor, como es comparado con los animales de control no tratados o comparado con el tamaño del tumor antes del tratamiento, in vivo en animales con cánceres que expresan DR4.

Los anticuerpos para DR5 son efectivos en la forma soluble a bajas dosis, por bajas dosis se dan a entender dosis o concentraciones de menos de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 1 g/ml in vitro y menos de aproximadamente 1-10 mg/kg in vivo. Un aspecto preferido de los anticuerpos de la presente invención es que inducen apoptosis selectivamente a las células que expresan receptores DR5, sin inducir apoptosis en hepatocitos, fibrocitos, sinoviocitos no transformados, no activados, normales, etc. Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención planteado contra un receptor de TRAIL es cosechado de acuerdo con la presente invención de un animal experimental, pero se puede hacer por cualquiera de los métodos de producción de anticuerpo o síntesis conocidos en la técnica. Al humanizar el anticuerpo de acuerdo con la presente invención para mantener la actividad de enlace del receptor mientras que se produce una respuesta inmune disminuida y terapéuticamente tolerable dentro de un sujeto humano, un anticuerpo de receptor anti-TRAIL humanizado de acuerdo con la presente invención es usado como agonista o antagonista terapéutico para un receptor de TRAIL dado. La presente invención que es operativa como un medio terapéutico in vivo puesto que la reticulación secundaria del anticuerpo de receptor anti-TRAIL, opcionalmente, no es requerida.

La presente invención se extiende más allá de un anticuerpo de receptor anti-TRAIL que tiene efectos apoptóticos agonistas o antagonísticos. Más bien, dos o más anticuerpos de receptor anti-TRAIL son llevados en contacto con un cultivo de células in vitro o un tejido del cuerpo del sujeto in vivo para crear un tratamiento mejorado. Por "tratamiento mejorado" se da a entender cualquier efecto aditivo, sinergístico o de potenciación. Por ejemplo, la línea de células de glioma U87 y las líneas de células hematopoyéticas U937 y Molt-4 son responsivas a una exposición sinergística a los anticuerpos anti-DR4 y anti-DR5 agonísticos mientras que la exposición al anticuerpo anti-DR5 agonístico también muestra solamente éxito limitado en la inducción de apoptosis. Adicionalmente, los anticuerpos de receptor anti- TRAIL antagonísticos tienen utilidad particular en la presente invención cuando un anticuerpo es específico para el enlace de uno de los receptores de señuelo DcRl, DcR2 u OPG. El bloqueo selectivo de un receptor de señuelo con un anticuerpo de acuerdo con la presente invención tiene el efecto en tipos de células que expresan receptores de señuelo para desplazar el equilibrio- de enlace de TRAIL hacia aquellos receptores de TRAIL capaces de transducir la señal de apoptosis. Así, en otra terapia combinada de acuerdo con la presente invención, un anticuerpo de enlace de receptor de señuelo sensibiliza una célula de expresión hacia el enlace del receptor de TRAIL de transducción de señal de apoptosis agonística. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para elucidar los epitopes agonísticos y antagonisticos de un receptor de TRAIL dado. Además, los polimorfismos entre individuos asociados con un receptor de TRAIL dado son elucidados de acuerdo con la presente invención a través del uso de un panel de anticuerpos monoclonales cada uno que tiene una variable diferente o región CDR. Un panel caracterizado de anticuerpos monoclonales proporciona la habilidad para definir epitopes agonísticos y antagonisticos y polimorfismos. Asi, un panel de anticuerpos monoclonales de acuerdo con la presente invención tiene utilidad en el descubrimiento de fármacos y/o la clasificación dé sujetos para la propensión de enfermedad. Todavía otra modalidad de la presente invención implica proteínas de fusión que incluyen un fragmento antigénico de un receptor de TRAIL acoplado a una proteina de inmunoglobulina, polipéptido o fragmento de la misma. Un fragmento de receptor de TRAIL que es definido por contener un número suficiente de bases para producir una respuesta inmunogénica a un receptor de TRAIL nativo expresado en una superficie de la célula del sujeto. Un fragmento de fusión del receptor de TRAIL que incluye por lo menos diez aminoácidos. Una proteina de fusión de inmunoglobulina o fragmento de la misma se define en la presente para incluir una proteina nativa o sintética o segmento de polipéptido que tiene un número suficiente de bases de aminoácido para activar una respuesta de cascada inmunogénica dentro de un sujeto. Un inmunógeno de la presente invención que incluye una fusión de un fragmento de receptor de TRAIL acoplado a un fragmento de inmunoglobulina tiene utilidad como un medio terapéutico in vivo para producir un anticuerpo de receptor anti-TRAIL in situ dentro de un sujeto. Todavía en una modalidad adicional, la presente invención es operativa como una terapia génica. La invención asi proporciona un método para inducir de manera selectiva apoptosis en células objetivo que comprende las etapas de transfectar las células objetivo con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico del receptor de TRAIL expresable; expresar sobre las células un receptor de TRAIL codificado por la secuencia de ácido nucleico del receptor de TRAIL; y poner en contacto las células con un anticuerpo inductor de apoptosis selectivo para el enlace del receptor de TRAIL. En un aspecto de la terapia génica de la presente invención/ las células dirigidas son transfectadas con un vector que lleva una secuencia expresable correspondiente a un receptor de TRAIL, el vector que ' es convencional y escogido sobre la base de la susceptibilidad de la célula dirigida al vector. Los vectores de la terapia génica ilustrativamente incluyen adenovirus, pAdCMV5. En las células o tejido dirigido que expresan el receptor de TRAIL tránsfeatádo, las células o tejidos son expuestas a un anticuerpo de acuerdo a la presente invención especifico para el enlace del receptor de TRAIL transíectado . Es apreciado que el anticuerpo de receptor anti-TRAIL es ya sea agonístico o antagonistico al mismo, consistente con el resultado terapéutico deseado. Los anticuerpos de la presente invención también son operativos en conjunción con un sensibilizador. Un sensibilizador como se utiliza en la presente, se define para incluir cualquier estimulo que induce apoptosis, incluyendo luz ultravioleta, moléculas orgánicas incluyendo específicamente la clase de bisindolmaleimi das, metales pesados y especies de radicales libres. En el contexto de la terapia de cáncer, TRA-8, es capaz de inducir apoptosis de la mayoría de células de tumor sensibles a TRAIL en un aspecto dependiente dé caspasa en ausencia de la reticulación secundaria. TRA-8 o 2E12, solos o en combinació -con otros anticuerpos, muestran una fuerte actividad tumoricida in vivo. La habilidad de TRA-8 o 2E12 para inducir apoptosis de la mayoría de las células sensibles a TRAIL confirma que ya sea DR5 o DR4 solo es suficiente para activar la apoptosis. La mayoría de células de tumor detalladas en la presente expresan DR5 de la superficie de la célula y su susceptibilidad a la muerte celular inducida por TRA-8 en paralelo con su susceptibilidad a TRAIL, indicando que DR5 es un receptor de inducción de muerte primario para la apoptosis mediada por TRAIL en la mayoría de las células de tumor. Resultados similares se obtuvieron con los anticuerpos específicos para DR4 (por ejemplo, 2E12) . Así, la expresión diferencial de DR5 o DR4 por las células normales y de cáncer es operativa en la selectividad de la apoptosis mediada por TRAIL. TRA-8 desvía los receptores de señuelo para inducir la apoptosis mediada por TRAIL. Solamente una minoría de células de tumor resistentes a TRAIL son sensibles a TRA-8, sin embargo, indicando que los receptores de señuelo no aparecen para desempeñar una función mayor en la resistencia de las células de tumor a la apoptosis mediada por TRAIL. Aunque estudios previos han indicado que la administración sistémica de la forma soluble de TRAIL en animales induce la regresión del tumor sin causar toxicidad3'4,22, la forma enlazada a la membrana del TRAIL humano induce daño en el hígado de los ratones como es mostrado en la presente. Sin embargo, la toxicidad hepática de TRAIL es mucho menos potente que aquella del ligando Fas como es demostrado por la menor susceptibilidad de los hepatocitos normales a la lesión inducida por TRAIL comparado con el ligando Fas y por la falta de letalidad de TRAIL in vivo. Asi, la titulación de TRAIL tiene utilidad en la terapia de cáncer. Como es detallado en la presente, se muestra la ausencia de niveles significantes de la expresión de proteina DR5 por los hepatocitos normales y está asociada con la resistencia del hepatocito a la apoptosis inducida por TRA-8. La reticulación de DR5 con el anticuerpo monoclonal es insuficiente para organizar las formas homopoliméricas del receptor inductor de muerte capaz de activar la apoptosis. Los experimentos en titi no indicaron evidencia de toxicidad hepática de la administración de TRA-8. Asi, un anticuerpo de DR5 monoclonal agonístico es probable que sea más selectivo y más seguro que el TRAIL soluble como un agente terapéutico. De manera similar, DR4 es expresado por las células transformadas o activadas y no es expresado en cantidades apreciables o solamente a cantidades mucho menores por las células normales, por ejemplo, fibroblastos. DR4 de la presente invención induce apoptosis de ciertas células objetivo sin muerte celular apreciable en células no objetivo, similares a fibroblastos, etc. Como se utiliza en la presente, la ausencia de un efecto o la falta de un efecto apreciable o significante se refiere a, e incluye, la ausencia completa del efecto o un efecto menor que o igual a los niveles antecedentes o de control y no excede los niveles antecedentes y de control por más de 1.5 veces el nivel antecedente o de control. Como un ensayo de clasificación o herramienta de formación de imagen, la presente invención es bien adecuada para detectar agrupaciones pequeñas de células DR4 o DR5. que aun pueden mostrar morfología de célula normal. Por ejemplo, el manchado de la sección de célula in situ de células de cáncer humano incluyendo cánceres de pulmón, próstata e hígado con anticuerpos marcados de acuerdo con la presente invención fácilmente identifica células cancerosas. Los anticuerpos de la presente invención también son útiles en la clasificación para otras manifestaciones de enfermedad, incluyendo, por ejemplo, varias enfermedades inflamatorias autoinmunes, similar a la artritis reumatoide. Tal clasificación puede ser útil aun antes del inicio de otros síntomas clínicos y podría ser usado para clasificar sujetos en riesgo de enfermedad, de modo que el tratamiento profiláctico puede ser iniciado antes de la manifestación de otros signos o síntomas. Específicamente, las células de cáncer se observan para expresar muy altos niveles de DR5 como es comparado con las células normales del mismo tipo. Así, la presente invención tiene utilidad como un método de clasificación sensible para malignidades de etapa temprana dentro del tejido incluyendo por lo menos pulmón, próstata, colón, sangre, cerviz, pecho e higado. Un proceso terapéutico es detallado en la presente para la inhibición de la proliferación celular anormal asociada con enfermedades, ilustrativamente cánceres malignos y leucemia linfática entre otros. La presente invención es detallada en la presente con particularidad a un anticuerpo monoclonal DR5 anti-humano designado como TRA-8, que tiene el número de acceso de ATCC PTA-1428. Es apreciado que las técnicas y los resultados detallados con respecto al anticuerpo monoclonal DR5 antihumano agonístico TRA-8 son completamente extendibles y aplicables a los anticuerpos DR5 antagonisticos, asi como anticuerpos planteados contra DR4, DcRl y DcR2 que actúan en ambas maneras agonísticas y antagonisticas . Asi, la presente invención es . detallada en la presente con respecto a un anticuerpo inductor de apoptosis especifico para DR4 humano. En una modalidad, el anticuerpo tiene la misma especificidad de epitope como el hibridoma 2E12, que se depositó el 24 de Octubre del 2001, para conseguir un número de acceso a nombre de The UAB Research Foundation, con la Colección Americana de Cultivo Tipo, Rockville, Md. La descripción del material depositado fue "2E12 Hybridoma Clone Against Human DR4", con la designación de cepa 2E12 el número de expediente de referencia como PCT/US01/14151. Los niveles de expresión de un receptor de apoptosis, tal como Fas, no necesariamente se correlacionan con la susceptibilidad de las células a la apoptosis. Para la apoptosis mediada por TRAIL, se ha sugerido que la expresión de los receptores de señuelo para TRAIL influye en la susceptibilidad de las células. Además, se ha sugerido que DR5 debe ser asociado con DR4 para la transducción efectiva de la señal de apoptosis a través de FADD y la ruta de caspasa 8. La disponibilidad del anticuerpo anti-DR5 monoclonal agonístico permitió la evaluación de la regulación de la señalización de DR5 y su función relativa en la apoptosis mediada por TRAIL. La comparación de la susceptibilidad de las células a la apoptosis mediada por TRA-8 con su susceptibilidad a la apoptosis mediada por TRAIL ofrece discernimiento en la función de DR5 en la apoptosis mediada por TRAIL y los mecanismos que pueden afectar la susceptibilidad. Ventajas similares son proporcionadas por el anticuerpo DR4. Esta ventaja generalmente se extiende a los anticuerpos DR5 y DR4 humanizados de la presente invención. Un clon molecular de un anticuerpo a DR-5, por ejemplo, se prepara por técnicas conocidas como es detallado con respecto a los siguientes ejemplos. La metodologia de DNA recombinante (33) es operativa en la presente para construir secuencias de ácido nucleico que codifican una molécula de anticuerpo monoclonal o región de enlace de antigeno de la misma.

La presente invención permite la construcción de anticuerpos de receptor de TRAIL humanizado que son improbables para inducir una respuesta de anticuerpo antiratón humano (después en la presente referido como "HAMA") (34), mientras que aun se tiene una función efectora del anticuerpo efectiva. Los anticuerpos completamente humanos también se pueden hacer al inmunizar ratones capaces de hacer un anticuerpo completamente humano (por ejemplo, ratones genéticamente modificados para producir anticuerpos humanos), al clasificar clones que enlazan DR5 o DR4, inducir apoptosis y competir para el epitope TRA-8 o 2E12. Ver, por ejemplo, Lonberg y Huszar (1995) Human antibodies from transgenic mice, Int. Rev. Immunol. 13:65-93, que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad para los métodos de producción de anticuerpos completamente humanos. Como se utiliza en la presente, los términos ""humano" y "humanizado" con relación a anticuerpos, se relacionan a cualquier anticuerpo que se espera que produzca una respuesta inmunogénica débil, terapéuticamente tolerable en un sujeto humano . La presente invención proporciona un anticuerpo DR5, un anticuerpo anti-DR5 humanizado, inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera de TRA-8 e inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera humanizadas. La invención también proporciona un anticuerpo DR4, un anticuerpo DR4 humanizado, inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera del anticuerpo DR4 e inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera humanizadas, ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos y cadenas pesadas y ligeras, vectores que comprenden esos ácidos nucleicos, y células que comprenden los vectores. Ciertos truncamientos de estas proteínas o genes realizan las funciones reguladoras o enzimáticas de la proteina o gen de secuencia completa. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que codifican para las mismas pueden ser alteradas por sustituciones, adiciones, supresiones, o expresión multimérica que proporcionan proteínas o genes funcxonalmente equivalentes . Debido a la degeneración de las secuencias de codificación de ácido nucleico, otras secuencias que codifican sustancialmente las mismas secuencias de aminoácidos como aquellas de las proteínas que surgen de manera natural pueden ser usadas en la práctica de la presente invención. Estas incluyen, pero no están limitadas a, secuencias de ácido nucleico que incluyen todas o porciones de las secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos anteriores, que son alteradas por la sustitución de diferentes codones que codifican un residuo de aminoácidos . funcionalmente equivalente dentro de la secuencia, produciendo de esta manera un cambio silencioso. Es apreciado que la secuencia, de nucleótidos de una inmunoglobulina de acuerdo con la presente invención tolera las variaciones de homología de secuencia de hasta 25% como es calculado por los métodos estándares ("Current Methods in Sequence Comparison and Analysis", Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149, 1998, Alan R. Liss, Inc.) mientras que tal variante forma un anticuerpo operativo que reconoce un receptor de TRAIL, DR5. Por ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos dentro de una secuencia de polipéptido pueden ser sustituidos por otro aminoácido de una polaridad similar que actúa como un equivalente funcional, dando por resultado una alteración silenciosa. Los sustitutos para un aminoácido dentro de la secuencia se pueden seleccionar de otros elementos de la clase a la cual pertenece el aminoácido (es decir, una sustitución conservativa) . Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, feniialanina, triptofano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos positivamente cargados (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos negativamente cargados (acídicos) incluyen ácido aspárticó y ácido glutámico. También incluido dentro del alcance de la presente invención está las proteínas o fragmentos o derivados de las mismas que son diferencialmente modificadas durante o después de la transducción, por ejemplo, mediante glicosilación, segmentación proteolitica, enlace a una molécula de anticuerpo u otros ligandos celulares, etc. Además, el vector recombinante que codifica secuencias de ácido nucleico de los anticuerpos de la presente invención puede ser diseñado para modificar el procesamiento en la expresión de un vector. Otras modificaciones se pueden hacer en ya sea la secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos sin reducir o sin sustancialmente reducir la actividad de apoptosis en el anticuerpo. Tales modificaciones pueden ocurrir en las CDRs o regiones que no son de CDR usando técnicas de rutina en el arte. Ver, por ejemplo, Yang y colaboradores (1995), J. Mol. Biol. 254:392-403, la cual es incorporada por referencia en su totalidad para los métodos de mutagénesis guiada de CDR. Adicionalmente, un inhibidor que codifica la secuencia de ácido nucleico puede ser mutado in vitro o in vivo para crear y/o destruir secuencias de transducción, iniciación y/o terminación o para crear variaciones en las regiones de codificación y/o formar nuevos sitios de endonucleasa de restricción o destruir unos preexistentes, para facilitar la modificación in vitro adicional. Cualquier técnica para la mutagénesis conocida en la técnica puede ser usada, incluyendo, pero no limitada a la mutagénesis dirigida al sitio in vitro, J. Biol. Chem. 253:6551, uso de enlazadores Tab (Pharmacia) y similares.

Los datos de cristalografia de rayos X indican que el pliegue de inmunoglobulina de anticuerpo generalmente forma una estructura cilindrica larga que comprende dos capas de hojas b antiparalelas, cada una que consiste de tres o cuatro cadenas b. En una región variable, tres vueltas de cada uno de los dominios V de las cadenas H y L se amontonan conjuntamente para formar un sitio de enlace de antigeno. Cada una de estas vueltas es llamada una región de determinación de complementariedad (CD ) . Las CDRs tienen la variabilidad más alta en la secuencia de- aminoácidos con el anticuerpo. Las porciones de la región variable que no son parte de una CDR son llamadas "regiones de estructura" (regiones de "FR") y generalmente desempeñan una función en mantener la estructura de CDR. De preferencia, todas las CDRs de un anticuerpo dado son injertadas en un anticuerpo aceptor, para preservar la región de enlace para la región de epitope del receptor de TRAIL. Es apreciado que el injerto de una porción de la cantidad total de CDRs en un donador es operativa en la presente. Se entiende que el injerto generalmente causa el reemplazo, residuo por residuo, de un aminoácido o región, por otro. Sin embargo, de manera ocasional, especialmente con la transferencia de una región, uno o más residuos se pueden adicionar u omitir o sustituir, para los mismos; como sea deseado, y que tales supresiones e inserciones, asi como reemplazos e inversiones apropiadas, están dentro de la habilidad de aquellos expertos en la técnica . Un anticuerpo de la presente invención es obtenido, por ejemplo, al injertar cada CDR de la subunidad de cadena L y cadena H de un anticuerpo monoclonal de receptor anti-TRAIL en una región de CDR correspondiente de un anticuerpo humano, para humanizar de esta manera un anticuerpo monoclonal de ratón efectivo contra un receptor de TRAIL. Los fragmentos de anticuerpo que contienen el idiotipo de la molécula también son generados y operativos en la presente usando técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos ilustrativamente incluyen el fragmento (AB')2 del receptor anti-TRAIL que puede ser producido mediante la digestión de pepsina de la molécula de anticuerpo, los fragmentos AB' de anticuerpo de receptor de TRAIL generados a través de la reducción de los puentes de disulfuro del fragmento (AB')2 del receptor de TRAIL, y el fragmento de anticuerpo que son generados al tratar la molécula de anticuerpo con papaina y un agente reductor. Los anticuerpos de la presente invención se pueden hacer usando numerosas técnicas conocidas en el arte. A manera de ejemplo, el anticuerpo TRA-8 monoclonal anti-DR5 puede ser obtenido aL cultivar un hibridoína que, a su vez, puede ser obtenido al inmunizar un ratón con DR5 humano y subsecuentemente al fusionar las células del bazo o las células del ganglio linfático del ratón con células de mieloraa de ratón. La preparación de un anticuerpo monoclonal ilustrativamente implica las siguientes etapas: a) purificación de una biomacromolécula para el uso como un antigeno; b) preparación de células que producen anticuerpo; después de primero inmunizar un animal usando inyecciones del antigeno, sangrar el animal y analizar el titulo de anticuerpo, para determinar cuando retirar el bazo; c) preparación de células de mieloma; d) fusión de las células que producen anticuerpo y células de mieloma. e) selección de un hibridoma que produce un anticuerpo deseado; f) preparación de un clon de célula individual (clonación) ; g) opcionalmente, cultivo de las células de hibridoma, o cria de animales en los cuales las células de hibridoma han sido transplahtadas, para la preparación a gran escala del anticuerpo monoclonal; y h) prueba de las actividades biológicas y la especificidad, o ensayo de las propiedades del agente marcador, del anticuerpo monoclonal asi preparado . El procedimiento para la preparación de un anticuerpo monoclonal es detallado enseguida con referencia a las etapas descritas en lo anterior. Este método para preparar un anticuerpo de la presente invención se propone solamente para ser ilustrativo de los métodos de preparación y no es limitativo a los mismos. Otros procedimientos conocidos pueden ser seguidos, o el siguiente método modificado, por ejemplo al usar células que producen anticuerpo diferentes a las células de bazo y mieloma. (a) Preparación de antigeno. Una proteina recombinante (después en la presente referida como "DR5 humana recombinante" o "DR4 humana recombinante") efectiva como el antígeno, es obtenida al transfectar células QBI-293A con el vector de expresión pAdDR5-IgG para una proteina de fusión que comprende el dominio extracelular de DR5 o DR4 humano y la región Fe del anticuerpo IgGl humano (después en la presente referido como "IgG"),, (cf. PTA-1428) para expresarla al usar el kit ADENO-Quest (Quantum Biotechnologies Inc., Canadá), y al colectar y parcialmente purificar el producto de expresión. El plásmido pAdDR5-IgG se construye al insertar DNA que codifica un DR5 o DR4 humano y la proteina de fusión IgG humana en pAdCMV5, que es un vector de expresión para células animales. Otros materiales, tal como el DNA que codifica DR5 o DR4, el vector y el huésped, son operativos en la presente. El DR5 o DR4 humano y la proteina de fusión IgG producidas en el sobrenadante de cultivo de las células QBI-293A transfectadas con el vector pAdDR5-IgG pueden ser parcialmente purificados por la cromátografia de afinidad de ProteinA-Sepharose, o la . cromátografia de afinidad de ProteinG-Sepharose o la cromatografía de intercambio iónico usando una columna Resource Q (nombre comercial; Pharmacia) . Alternativamente, DR5 o DR4 purificado obtenido de las membranas de células de las lineas de células humanas es usado como el antigeno. Además, puesto que las estructuras primarias de DR4 y DR5 son conocidas (cf. PTA-1428), un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l, puede ser químicamente sintetizado por un método conocido tal como el método Sanger, y utilizado como el antigeno . (b) Preparación de células que producen anticuerpo. Un ratón es inmunizado con el inmunógeno producido en la etapa (a), mezclado con un adyuvante, tal como un adyuvante completo o incompleto de Freund o alumbre. Otros animales experimentales adecuados ilustrativamente incluyen ratas, cobayos, conejos, perros, pollos, caballos, cerdos, vacas y ovejas.

Las rutas de administración adecuadas para inmunizar un animal experimental incluyen las rutas de inyección subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica e intramuscular, con las inyecciones subcutáneas e intraperitoneales que son preferidas. Las inmunizaciones opcionalmente son realizadas por una sola dosis, o por varias dosis repetidas en intervalos apropiados (de preferencia de 1 a 5 semanas) . Los animales inmunizados son inspeccionados para el titulo de anticuerpo en suero, y un animal con un titulo de anticuerpo suficientemente alto es seleccionado como la fuente de células que producen anticuerpo. La selección de un animal con un titulo alto hace el proceso subsecuente más eficiente . Las células para la fusión subsecuente son generalmente cosechadas del animal de 3 a 5 dias después de la inmunización final. Los métodos para analizar el titulo de anticuerpo incluyen varias técnicas bien conocidas como el radioinmunoensayo (después en la presente, referido como "RIA"), inmunoensayo de enzima en fase sólida (después en la presente, referido como "ELISA"), ensayo de anticuerpo fluorescente y ensayo de hemaglutinación pasiva, con RIA y ELISA preferidos por razones de sensibilidad de detección, rapidez, precisión y potencial para la automatización.

La determinación del titulo de anticuerpo se puede realizar, por ejemplo, por ELISA como sigue. Primero, DR5 o DR4 purificado o parcialmente purificado es absorbido sobre la superficie de una base sólida, tal como una placa de ELISA de 96 cavidades, seguido por el bloqueo de cualquier superficie restante, a la cual DR4 o DR5 no se ha enlazado, una p oteina no relacionada con el antigeno, tal como albúmina de suero bovino (BSA) . Después del lavado, las superficies de la cavidad se ponen en contacto con muestras diluidas en serie de suero de ratón para permitir el enlace del anticuerpo DR5 o DR4 en las muestras al antigeno. Un anticuerpo anti-ratón, marcado, como el anticuerpo secundario es adicionado para ser enlazado al anticuerpo de ratón. La marca puede incluir una marca enzimática, una marca fluorescente u otras marcas conocidas en la técnica. Después del lavado, el sustrato de enzima es adicionado, y el titulo de anticuerpo es estimado al determinar el cambio de absorbencia debido al desarrollo de color ocasionado por la alteración del sustrato o similar. (c) Preparación de células de mieloma Células de lineas de células de ratón establecidas sirven como la fuente de las células de mieloma, incluyendo, por ejemplo ratón resistente a 8-azaguanina, derivado de las cepas de mieloma de BALB/c, P3X63Ag8U.l (P3-U1) (35), P3/NSI/l-Ag4-l(NS-l) (36), Sp2/0-Agl4 (SP-2) (37), P3X63Ag8.653 (653) (38) y P3X63Ag8 (X63) (39) . La linea de células seleccionada es transferida en serie a un medio apropiado, tal como el medio de 8-azaguanina. El medio de 8-azaguaniná incluye el Medio de Dulbeco Modificado de Iscove (después en la presente referido como "IMDM") o Medio de Eagle Modificado de Dulbeco (después en la presente referido como "DMEM"). El medio de RPMI-1640 suplementado con glutamina, 2-mercaptoetanol, gentamicina, suero de bovino fetal (después en la presente referido como "FCS") y 8-azaguanina. Las células luego son transferidas a un medio normal, tal como el medio ASF104 (Ajinomoto, K.K.) que contiene FCS al 10%, 3 a 4 dias antes de la fusión, para asegurar que por lo menos 2xl07 células estén disponibles en el dia de la fusión. (d) Fusión de Células Linfocitos y células de plasma obtenidos de cualquier parte adecuada del animal son células precursoras para producir el anticuerpo. Las fuentes de linfocitos o células de plasma ilustrativamente incluyen el bazo, ganglios linfáticos, sangre periférica o cualquier combinación apropiada de los mismos, con células del bazo que son la fuente más común. Después de la última inyección reforzadora, el tejido en el cual están presentes las células que producen anticuerpo es retirado de un ratón, que tiene el titulo de anticuerpo predeterminado. La técnica actualmente favorecida para la fusión de células de bazo con células de mieloma preparadas en la etapa c) , emplea polietilenglicol. La técnica de fusión incluye el lavado de las células de bazo y de mieloma con medio libre de suero (tal como RPMI 1640) o solución salina regulada de fosfato (después en la presente referida como "PBS") de modo que la relación en número de células de bazo a células de mieloma es aproximadamente entre 5:1 y 10:1, y luego centrifugadas. Después de que el sobrenadante se ha desechado y las células en pelotilla suficientemente desprendidas, 1 mi de medio libre de suero que contiene polietilenglicol al 50% (p/v) (m. . 1,000 a 4,000) se adiciona gota a gota con mezclado. Subsecuentemente, 10 mi de medio libre de suero se adiciona lentamente y luego son centrifugados. El sobrenadante es desechado nuevamente, y las células en pelotillas son suspendidas en una cantidad apropiada de medio HAT que contiene una solución de hipoxantina, aminopterina y timidina (después en la presente referida como "HAT") e interleucina-2 de ratón (después en la presente referido como "IL-2") . La suspensión luego es suministrada en las cavidades de placas de cultivo (también referidas en la presente simplemente como "placas") e incubada en la presencia de CO2 al 5% v/v a 37°C durante aproximadamente 2 semanas, con la adición suplementaria del medio HAT, como sea apropiado.- e) Selección de hibridomas Cuando la cepa de mieloma usada es resistente a 8-azaguanina, es decir, es deficiente en la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT) , cualquiera de las células de mieloma no fusionadas y cualquiera de las fusiones de ioieloma-mieloma son incapaces de sobrevivir en el medio HAT. Por otra parte, las fusiones de células que producen anticuerpo entre si, asi como hibridomas de células que producen anticuerpo con células de mieloma pueden sobrevivir, lo primero que tiene solamente una vida limitada. Por consiguiente, la incubación continua en el medio 'HAT da por resultado la selección de solamente los hibridomas deseados. Los hibridomas resultantes crecen en colonias que luego son transferidos en el medio HAT que carece de aminopterina (medio HT) . Después, alícuotas del sobrenadante de cultivo son retiradas para determinar el titulo de anticuerpo anti-Fas mediante, por ejemplo, ELISA. Cuando la proteina de fusión mencionada en lo anterior es usada como el antigeno de ELISA, también es necesario eliminar los clones que producen un anticuerpo que es específicamente enlazado a la región Fe del IgGl humano. La presencia o ausencia de tal clon puede ser verificada, por ejemplo, mediante ELISA, usando Fas-IgGl o IgGl, como el antigeno. (f) Clonación Hibridomas que se han mostrado que producen anticuerpos específicos, usando un método similar a aquel descrito en la etapa b) para determinar el titulo de anticuerpo, luego son transferidos a otra placa para clonación. Los métodos de clonación adecuados incluyen: el método de dilución limitativo, en el cual los hibridomas son diluidos para contener una célula por cavidad de una placa y luego cultivados; el método de agar blando, en el cual las colonias son recuperadas después del cultivo en el medio de agar blando; un método para usar un micromanipulador para separar una sola célula para cultivo; y "clasificación de un clon", en el cual las células individuales son separadas por un clasificador de células. El procedimiento de clonación de acuerdo con, por ejemplo, el método de dilución limitativo es repetido 2 a .4 veces para cada cavidad demostrando un titulo de anticuerpo, y los clones que tienen títulos de anticuerpo estables son seleccionados como hibridomas que producen anticuerpo monoclonal anti-DR5. Los hibridomas que producen un anticuerpo DRA anti-ratón son seleccionados por un método similar para obtener una linea de células que produce anticuerpo monoclonal anti-DR5. — El hibridoma de ratón-ratón TRA-8 que es una' base para los anticuerpos de la presente invención fue depositado con la Colección Americana de Cultivo Tipo el 1 de marzo del 2000, y tiene el número de acceso PTA-1428. El hibridoma 2E12 se depositó con la Colección Americana de Cultivo Tipo el 24 de octubre del 2001, como es descrito en lo anterior y tiene el número de acceso ATCC No. PTA-3798. Por consiguiente, cuando se prepara un anticuerpo usando el hibridoma de ratón-ratón TRA-8 o cualquier otro hibridoma establecido, la preparación puede ser realizada al seguir el procedimiento iniciando a partir de la etapa (g) enseguida, con las etapas (a) a (f) omitidas. (g) Cultivo de hibridoma para preparar anticuerpo monoclonal . El hibridoma obtenido mediante la clonación luego es cultivado en medio normal, no en medio HT. El cultivo a gran escala es realizado mediante el cultivo en botellas rodantes, usando botellas de cultivo grandes, mediante el cultivo giratorio. El sobrenadante del cultivo a gran escala luego es cosechado y purificado mediante un método adecuado, tal como la filtración en gel, que es bien conocido para aquellos expertos en la técnica, para obtener un anticuerpo monoclonal DR5 o DR4 que es una base para los anticuerpos de la presente invención. El hibridoma también puede ser cultivado intraperitonealmente en un ratón singeneico, tal como un ratón BALB/c o un ratón nu/nu, para obtener ascitis que contiene un anticuerpo monoclonal DR5 o DR4 en grandes cantidades. Los kits de purificación de anticuerpo monoclonal comercialmente disponibles (por ejemplo, MAbTrap Gil Kit; Pharmacia) son convenientemente usados para purificar los anticuerpos cosechados. Los anticuerpos monoclonales preparados como en lo anterior tienen una alta especificidad para DR5 o DR4 humano, respectivamente. (h) Ensayo de anticuerpo monoclonal Los métodos de identificación adecuados del isotipo y la subclase del anticuerpo monoclonal incluyen el método Ouchterlony, ELISA y RIA. De preferencia, un kit comercial es usado para la identificación,, tal como un Kit Mouse Typer (nombre comercial; BioRad) . La cuantificación de la proteina se puede realizar mediante el método Folin-Lowry, o mediante el cálculo basado en la absorbencia .280 nm (1.4 (OD280)=Inmunoglobulina 1 mg/ml) . La identificación del epitope que el anticuerpo monoclonal reconoce es realizada como sigue. Primero, se preparan varias estructuras parciales de la molécula que el anticuerpo monoclonal reconoce. Las estructuras parciales son preparadas por el método en donde varios péptidos parciales de la molécula son sintéticamente preparados por la técnica de sintesis de oligopéptido conocida, o el método en donde el DNA que codifica el polipéptido parcial deseado es incorporado en un plásmido de expresión adecuado, y es expresado en un huésped adecuado, tal como E. coli para producir los péptidos. Generalmente, ambos métodos son frecuentemente usados en combinación para el objeto anterior. Por ejemplo, una serie de polipéptidos que tienen longitudes apropiadamente reducidas, trabajando del C- o N-terminal de la proteina de antigeno, se puede preparar mediante técnicas de ingeniería genética establecidas. Al establecer que fragmentos reaccionan con el anticuerpo, se obtiene una idea aproximada del sitio de epitope. El epitope es más claramente- identificado al sintetizar una variedad de oligopéptidos más pequeños correspondientes a los mismos o mutantes de péptido usando técnicas de síntesis de oligopéptido establecidas para determinar una propiedad de enlace de los péptidos al anticuerpo monoclonal anti-DR5, por ejemplo, que es una base para la preparación del anticuerpo de la presente invención y una inhibición competitiva del enlace del péptido a un antigeno con el anticuerpo monoclonal. Los kits comercialmente disponibles, tal como el kit SPOTs (Genosys Biotechnologies, Inc.) y una serie de kits de síntesis de péptido de multiperno basado en el método de síntesis de multiperno (Chiron Corp.) pueden ser convenientemente usados para obtener una gran variedad de oligopéptidos. Un anticuerpo de la presente invención tiene las diversas propiedades funcionales a) o f) descritas enseguida, cada una de las cuales es verificada mediante, por ejemplo, un método descrito enseguida en la presente. a) Enlace especifico de TRA-8 a células que expresan DR5 humano. Una caracteristica única de la presente invención es la habilidad para enlazar DR5 de la superficie de la célula. Esto es demostrado por el análisis de citometria de flujo de las células que expresan DR5. Primero, el enlace especifico de la superficie de la célula de DR5 es confirmado por las células COS-7 transfectadas con el cDNA de longitud completa que codifica DR5 humano. Específicamente, TRA-8 solamente reconoce las células COS-7 transfectadas con DR5 pero no el vector de control vacio o el vector que codifica DR . Segundo, tres orígenes diferentes: cáncer hematopoyético, glioma y de próstata de células de tumor maligno humano son probadas. La mayoría de estas células de tumor transformadas expresaron niveles significantes de DR5 de la superficie de la célula, aunque los niveles de expresión variaron grandemente. Tercero, dos paneles de células de fibroblasto sinoviales primarias humanas de pacientes. RA y OA son examinadas. Todas las células sinoviales. de RA expresaron niveles significativamente más altos de DR5 comparados con la células de OA. b) Inducción de apoptosis de las células de tumor maligno humano in vitro en la ausencia de reticulación.

La habilidad de un anticuerpo planteado de acuerdo con la presente invención para reconocer el receptor de TRAIL y para inducir directamente apoptosis de las células de tumor humano maligno es determinada por el ensayo de viabilidad de células (ATPLite) durante el cultivo in vitro de células con varias concentraciones de un anticuerpo, específicamente TRA-8. La mayoría de las células de tumor son susceptibles a la apoptosis inducida por TRA-8. Para algunas células TRA-8 mostró una fuerte actividad inductora de apoptosis, por ejemplo, TRA-8 es capaz de inducir apoptosis de células Jurkat humanas dentro de los niveles de pg/ml. De manera importante, la apoptosis inducida por TRA-8 no requirió reticulación, y en la mayoría de las células, TRA-8 mostró una más fuerte actividad inductora de apoptosis que el TRAIL soluble recombinante en la presencia del mejorador. c) Actividad tumoricid¾ de TRA-8 ín vivo. La actividad tumoricida de TRA-8 es evaluada en dos modelos de células de tumor de SCID/humano- Primero, ratones SCID son inoculados intravenosamente con células Jurkat de leucemia humana, y tratados con una sola dosis (100 \ig) de TRA-8. Los resultados muestran que la mayoría de células Jurkat implantadas son eliminadas de la sangre periférica y el bazo mediante el tratamiento con TRA-8, como es determinado mediante el análisis de citometria de flujo y el manchado inmunohistoquímico in si tu de la célula Jurkat.

Segundo, las células de astrocitoma humano, 1321N1, son inoculadas subcutáneamente en ratones SCID, y los ratones que llevan tumor son tratados con una sola dosis de TRA-8. El crecimiento de las células 1321N1 implantadas es significativamente inhibido en los ratones tratados con TRA-8 como es determinado por los tamaños de tumor y el análisis histológico. d) Identificación de células sinoviales de RA mediante TRA-8. Las células sinoviales primarias aisladas de 8 pacientes de RA y 4 pacientes de OA son probadas para la expresión de DR5 en la superficie de la célula. TRA-8 es capaz de manchar positivamente todas las células de RA pero de manchar negativamente todas las células de OA. Asi, RA es diferenciado de OA por la expresión DR5 en la superficie como es detectado por TRA-8. e) Inducción de apoptosis en células de fibroblasto sinoviales de RA mediante TRA-8. La habilidad de TRA-8 para inducir apoptosis de las células sinoviales de RA es determinada mediante el ensayo de viabilidad de células durante el cultivo in vitro en la presencia de varias concentraciones de TRA-8. Todas las células de TRA mostraron niveles altos a intermedios de susceptibilidad a 100 ng/ml de TRA-8. En contraste, todas las células de OA son esencialmente resistentes a la apoptosis inducida por TRA-8. De manera importante, TRA-8 mostró una mejor actividad inductora de apoptosis a las células sinoviales de RA que el TRAIL soluble con el mejorador. Además, comparado con el anticuerpo anti-Fas (CH-11), TRA-8 mostró una mejor selectividad ¾ las células sinoviales de RA. f) TRA-8 no induce producción de MMPs en las células sinoviales de RA. Puesto que TRA-8 es capaz de inducir activación de NF-kb en las células sinoviales de RA como TNF-a, el efecto de TRA-8 en la producción de MMP1 y MMP3 de las células sinoviales es determinado. Mientras que TNF-a indujo una disminución de MMPs dependiente de la dosis, TRA-8 es incapaz de inducir alguna producción de MMPs, y en algunas concentraciones, TRA-8 ligeramente disminuyó la producción de MMPs en las células sinoviales de RA. g) TRA-8 induce la activación de caspasa múltiple. Puesto que las caspasas desempeñan una función crucial en la inducción de apoptosis. La habilidad de TRA-8 para inducir activación de caspasa es determinada en las células Jurkat humanas . Cuando las células Jurkat son incubadas con una baja dosis (50 ng/ml) de TRA-8, la activación de caspas 8, caspasa 9 y caspasa 3 es observada tan temprano como 15 minutos después de la incubación como es demostrado por el análisis de manchado de Western y el análisis de segmentación de caspasa. En término de la sincronización, el número y la intensidad de la activación de caspasa, los anticuerpos de la presente invención incluyendo el anticuerpo TRA-8 demostrativo mostraron una actividad mucho mejor que cualquier de los otros anticuerpos inductores de apoptosis conocidos, tal como el anticuerpo Fas antihumano (CH-11) . El anticuerpo 2E12 específicamente enlaza DR4 en su forma soluble, tiene actividad inductora de apoptosis in vivo o in vitro en células objetivo que expresan DR4 (incluyendo por ejemplo, células de cáncer, células sinoviales de artritis reumatoide, células inmunes activadas similares a los linfocitos activados y células viralmente infectadas (de una actividad tumoricida in vivo) de preferencia en la ausencia de toxicidad en las células que no son de tumor (de preferencia, el anticuerpo DR4 de la invención tiene actividad inductora de apoptosis caracterizada por menos de aproximadamente 60%, 50%, 40%, 30%, 20% o 10% de viabilidad de células objetivo a concentraciones de anticuerpo de menos de 30 µg/ml, 3 µg/mlí .3 µg/ml o .03 µ?/p?? y la actividad tumoricida caracterizada por 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de reducción en el tamaño del tumor. Asi, un anticuerpo de la presente invención es una sustancia que tiene una propiedad para inducir selectivamente apoptosis en células patogénicas como es mostrado en el efecto (a) y (g) . Por consiguiente, es útil como un agente profiláctico y terapéutico para enfermedades asociadas con la supervivencia inapropiada de células o la proliferación apropiada de células, tales como aquellas atribuibles a la disrregulación de sistemas de apoptosis incluyendo el sistema de ligando Fas/Fas. La habilidad de un anticuerpo de la presente invención para inducir apoptosis es confirmada al cultivar células tal como la linea de células de leucemia humana Jurkat (Cultivo Tipo Americano No. TIB-152) y la linea de células de astrocitoma 1321N1 en el medio en el cual la muestra de prueba sé ha adicionado y al determinar la proporción de supervivencia, por ejemplo, mediante un ensayo ATPLite. El anticuerpo de la presente invención, especialmente los anticuerpos DR5 y DR4 que tienen casi la misma inmunogenicidad al humano como aquel de los anticuerpos humanos, es usado como un agente para la profilaxis o tratamiento de enfermedades asociadas con la supervivencia o proliferación inapropiada de células; incluyendo aquellas atribuibles a la disrregulación de los sistemas de apoptosis, enfermedades inflamatorias y antoinmunes que incluyen ilustrativamente lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Hashimoto, artritis reumatoide, enfermedad de injerto contra huésped, sindrome de Sjügren, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, escleroderma, sindrome de Goodpasture, enfermedad de Crohn, anemia hemolitica autoinmune, esterilidad, míastenia grave, esclerosis múltiple, enfermedad de Basedow, trombopenia púrpura, diabetes mellitus independiente de insulina, alergia/ asma, enfermedad atópica; arteriosclerosis; miocarditis; cardiomiopatia, nefritis glomerular, anemia histoplásica; rechazo después del transplante de órgano y numerosas malignidades de tejido de pulmón, próstata, hígado, ovario, colon, cerviz, linfático y pecho. Los anticuerpos de la presente invención se pueden usar para dirigir e inducir selectivamente apoptosis en células inmunes activadas incluyendo linfocitos activados, células linfoides, células mieloides y células sinoviales reumatoides (incluyendo sinoviocitos inflamatorios, sinoviocitos similares a macrófagos, sinoviocitos similares a fibroblastos) y en células viralmente infectadas (incluyendo aquellas infectadas con HIV, por ejemplo) mientras que aquellas células dirigidas expresen o se puedan hacer para expresar los receptores de TRAIL específicos (es decir, DR4 o DR5) . Tal agente profiláctico o terapéutico puede ser administrado en varias formas . Los modos adecuados de administración incluyen la administración oral, tal como mediante tabletas, cápsulas, gránulos, polvos y jarabes, o la administración parenteral, tal como mediante inyección o supositorios.

El anticuerpo o agente terapéutico puede ser administrado oralmente, rectalmente, intracisternalmente, intraventricular, intracraneal, intratecal, intraarticular-mente, intravaginalmente, parenteralmente (intravenosamente, intramuscularmente o subcutáneamente), localmente (polvos, ungüentos o gotas), mediante inyección parenteral, transdérmicamente, mediante inhalación o como un roció bucal o nasal. La cantidad exacta del anticuerpo o agente terapéutico requerida variará de sujeto a sujeto, dependiendo de. la edad, peso y condición general del sujeto, la severidad de la enfermedad que está siendo tratada, la localización y el tamaño del tumor, los compuestos particulares utilizados, el modo de administración y similares. Una cantidad apropiada puede ser determinada por un experto ordinario en la técnica usando solamente experimentación de rutina dadas las enseñanzas en la presente. Las dosificaciones individuales típicas de anticuerpo varian de 0.1-10,000 microgramos, de preferencia de 1 y 100 microgramos. Las concentraciones de anticuerpo típicas en un portador varian de 0.2 a 2000 nanogramos por mililitro suministrado. Para la inyección en una articulación, los volúmenes de anticuerpo y portador variarán dependiendo de la articulación, pero aproximadamente 0.5-10 mi, y de preferencia 1-5 mi, es inyectado en una rodilla humana y aproximadamente 0.1-5 mi, y de preferencia 1-2 mi en el tobillo humano.

Dependiendo del modo propuesto de administración, el anticuerpo o agente terapéutico puede estar en composiciones farmacéuticas en la forma de dosificación sólida, semisólida o liquida, tal como, por ejemplo, tabletas, supositorios, pildoras, cápsulas, polvos, líquidos o suspensiones, de preferencia en forma de dosificación unitaria adecuada para la administración individual de una dosificación precisa. Las composiciones incluirán una cantidad efectiva del sustrato seleccionado en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable y, además puede incluir otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, portadores o diluyentes. Por "farmacéuticamente aceptable" se da a entender un material que no es biológicamente o de otra manera indeseable, que puede se.r administrado a un individuo junto con el sustrato seleccionado sin ocasionar efectos biológicos indeseables significantes o la interacción de una manera nociva con cualquiera de los otros componentes de la composición farmacéutica en la cual está contenida. Las composiciones adecuadas para la inyección parenteral pueden comprender soluciones acuosas o no acuosas, estériles, fisiológicamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones, y polvos estériles para la reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables, estériles. Ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados, diluyentes, solventes o vehículos incluyen agua, etanol, polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol y similares), mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tal como aceite de olivo) y ésteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de surfactantes . Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como agentes de preservación, humectantes, emulsionantes y de suministro. La prevención de la acción de microorganismos puede ser asegurada por varios agentes antibacterianos y antifúngales, por ejemplo, parabehos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede ser originada mediante el uso de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las formas de dosificación sólidas para la administración oral incluyen cápsulas, tabletas, pildoras, polvos y gránulos. En tales formas de dosificación sólidas, el compuesto activo es mezclado con por lo menos un excipiente usual inerte (o portador) tal como citrato de sodio o fosfato de calcio o (a) rellenadores o diluyentes, como por ejemplo, almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, (b) aglomerantes, como por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirro-lidona, sacarosa y acacia, (c) humectantes, como por ejemplo, glicerol, (d) agentes de desintegración, como por ejemplo, agar-agar, carbonato de calcio, almidón de papa o tapioca, ácido alginico, ciertos silicatos complejos y carbonato de sodio, (e) retardantes de la solución, como por ejemplo, parafina, (f) aceleradores de absorción, como por ejemplo, compuestos de amonio cuaternario, (g) agentes humectantes, como por ejemplo, alcohol cetilico y monoestearato de glicerol, (h) absorbentes, como por ejemplo, caolin y bentonita e (i) lubricantes, como por ejemplo, talco,-estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril sulfato de sodio o mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, tabletas, y pildoras, las formas de dosificación también pueden comprender agentes reguladores . Las composiciones sólidas de un tipo similar también pueden ser empleadas como rellenadores en cápsulas de gelatina de relleno blando y duro usando tales excipientes como lactosa o lactina asi como polietilenglicoles de alto peso. molecular, y similares.. Las formas de dosificación sólidas tales como tabletas, grageas, cápsulas, pildoras y gránulos pueden ser preparadas con recubrimientos y cubiertas, tales como recubrimientos entéricos y otros bien conocidos en la técnica. Ellas pueden contener agentes opacificantes, y también pueden ser de tal composición que liberan el compuesto o los compuestos activos en cierta parte del tracto intestinal de una manera retardada. Ejemplos de composiciones de incrustación que pueden ser usadas son sustancias poliméricas y ceras. Los compuestos activos también pueden estar en forma microencapsulada, si es apropiado, con uno o más de los excipientes mencionados en lo anterior. Las formas de dosificación liquidas para la administración oral incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos, las formas de dosificación liquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica, tal como agua u. otros solventes, agentes de solubilización emulsionantes, como por ejemplo, alcohol etílico, alcohol isopropilico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1, 3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites, en particular, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuate, aceite de germen de maiz, aceite de oliva, aceite de ricino y aceite de ajonjolí, glicerol, alcohol tetrahidrofurfurilico, polietilenglicoles y esteres de ácido graso de sorbitán o mezclas de estas sustancias, y similares.

Además de tales diluyentes inertes, la compo ición también puede incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, edulcorantes, saborizantes y agentes perfumantes. Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión, como por ejemplo, alcoholes isoestearilicos, polioxietilen sorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, betonita, agar-agar y tragacanto, o mezclas de estas sustancias, y similares. Las composiciones para las administraciones rectales de preferencia son supositorios que pueden ser preparados al mezclar los compuestos de la presente invención con excipientes o portadores no irritantes, adecuados, tal como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera de supositorio, que son sólidos a temperaturas ordinarios pero líquidos a la temperatura del cuerpo y por lo tanto, se funden en la cavidad del recto o vaginal y liberan el componente activo. Las formas de dosificación para administración tópica de un compuesto de esta invención incluyen ungüentos, polvos, roclos e inhalantes. El componente activo es mezclado bajo condiciones estériles con un portador fisiológicamente aceptable y cualquiera de los conservadores,, soluciones reguladoras o propelentes, como pueda- ser requerido.- Las formulaciones oftálmicas, ungüentos, polvos y soluciones también se contemplan que están dentro del alcance de esta invención. El término "sales, ésteres, amidas y profármacos farmacéuticamente aceptables" como se utiliza en la presente, se refiere a aquellas sales de carboxilato, sales de adición de aminoácido, ésteres, amidas y profármacos de los compuestos de la presente invención que son, dentro del alcance del juicio médico de auscultación, adecuados para el uso en contacto con los tejidos de pacientes sin toxicidad indebida, irritación, respuesta alérgica y similares, en proporción con una relación de beneficio/riesgo razonable, y efectivo para su uso propuesto, asi como las formas switteriónicas, donde es posible, de los compuestos de la invención. El término "sales" se refiere a las sales de adición de ácido inorgánico y orgánico, relativamente no tóxicas, de los compuestos de la presente invención. Estas sales pueden ser preparadas in sítu durante el aislamiento y la purificación final de los compuestos o al hacer reaccionar por separado el compuesto purificado, de base libre con ácido orgánico o inorgánico adecuado y al aislar la sal asi formada. Las sales representativas incluyen el bromhidrato, clorhidrato, sulfato, bisulfato, nitrato, acetato, oxalato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato mesilato, glucoheptonato, lactobionato, metano sulfonato y sales de laurisulfonato y similares. Estas pueden incluir cationes basados en los metales alcalinos y alcalinotérreos, tales como sodio, litio, potasio., calcio, magnesio y similares, asi como cationes de amonio, amonio cuaternario y amina no tóxicos incluyendo, pero no limitados a amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y similares. (Ver, por ejemplo, S.M. Barge y colaboradores, "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 1977, 66:1-19 la cual es incorporada en la presente por referencia) . El término "profármaco" se refiere a compuestos que son rápidamente transformados ín vivo para producir, los compuestos de origen de la fórmula anterior, por ejemplo, mediante la hidrólisis en la sangre. Una discusión completa se proporciona en T. Higuchi y V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems", Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series, y en Sioreversijle Carriers in Drug Desing, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pengamon Press, 1987. Una célula objetivo es una célula de un animal que incluye ilustrativamente humano, primate no humano, gatos, perros, rata, ratón, cobayo, conejo, cabra, oveja, vaca, caballo, pollo, cerdo, titi y hurón.

Además, el anticuerpo o agente terapéutico de la presente invención puede existir en formas no solvatadas asi como en formas solvatadas con solventes farmacéuticamente aceptables tales como agua, etanol y similares. En general, las formas solvatadas se consideran equivalentes a las formas no solvatadas para los propósitos de la presente invención. Las moléculas de anticuerpo son purificadas por técnicas conocidas que incluyen ilustrativamente la absorción de a ino o la cromatografía de afinidad de amino, técnicas cromatográficas tal como la cromatografía liquida de alta presión, o una combinación de las mismas. Otro aspecto de la presente invención incluye un producto farmacéutico para el uso en el suministro de anticuerpo de receptor anti-TRAIL biológicamente activo o anticuerpo de receptor anti-TRAIL humanizado a un vertebrado. El producto farmacéutico incluye una cantidad farmacéuticamente efectiva del anticuerpo receptor anti-TRAIL o fragmento del mismo, un portador farmacéuticamente aceptable, y un contenedor que incluye el portador y el anticuerpo de una manera estéril. En una modalidad preferida de la invención, una cantidad farmacéuticamente efectiva de un anticuerpo de la invención inhibe la proliferación celular o induce la apoptosis mediante el contacto con una célula objetivo o con células objetivo. Un monto o cantidad farmacéuticamente efectiva de un anticuerpo que reconoce ya sea DR5 o DR4 o un anticuerpo humanizado que reconoce ya sea DR5 o DR4 es una cantidad administrada a un individuo suficiente para ocasionar un efecto deseado. Como se utiliza en. la presente, los términos "cantidad farmacéuticamente efectiva" y "cantidad terapéutica" son sinónimos. Los efectos deseados de la administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de anticuerpos que reconocen DR5 o DR4 incluyen la muerte de una o más células objetivo, la inhibición del crecimiento de una o más células objetivo, la estimulación de DR5 o DR4, respectivamente, el enlace a DR5 o DR4 , respectivamente, y niveles de NFkB incrementados o actividad en una célula objetivo. Una célula objetivo es una célula que expresa DR5 o DR4 e ilustrativamente incluye células que crecen anormalmente y células de tumor tales como papiloma y verrugas; cáncer de pecho, cáncer de colon, hepatomas, leucemias, cáncer de pulmón, melanoma, mielomas, osteosarcomas, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de la cabeza y cuello, cáncer de tiroides, cáncer uterino, tumores del cerebro tales como astrocitomas, células inmunes activadas (por ejemplo, linfocitos activados, células linfoides y mieloides), células inflamatorias, células sinoviales de artritis reumatoide, y células viralmente infectadas. In vivo, la célula objetivo es una célula de un individuo con una condición patológica, incluyendo aquella donde la proliferación celular es anormal o disrregulada tal como el cáncer maligno o benigno y la artritis reumatoide. En otra modalidad preferida, la célula objetivo también se pone en contacto mediante un agente terapéutico . Asi, los anticuerpos y composiciones de la presente invención pueden ser administrados solos o en combinación con uno o más agentes terapéuticos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no están limitados a, otros miembros de la familia TNF, agentes quimioterapéuticos, anticuerpos, antivirales, antiinflamatorios esteroidales y no esteroidales, agentes inmunoterapéuticos convencionales, citoquinas, quimioquinas y/o factores de crecimiento. Las combinaciones se pueden administrar ya sea concomatantemente (por ejemplo, como una mezcla), por separado pero simultáneamente (por ejemplo, por medio de lineas intravenosas separadas al mismo sujeto), o secuencialmente (por ejemplo, uno de los compuestos o agentes se da primero seguido por el segundo) . Asi, el término "combinación" o "combinado" se usa para referirse a la administración ya sea concomitante, simultánea o secuencial de dos o más agentes. En una modalidad, la terapia de combinación incluye la administración de miembros de la familia TNF. Las moléculas TNF, relacionadas con TNF o similares a TNF que pueden ser administradas con el anticuerpo de la invención incluyen, pero no están limitadas a, formas solubles de TNF-a, linfotoxina-a (LT-a, también conocida como TNF-ß), LT-ß (encontrada en el heterotrimero complejo LT- 2-p) OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, 4-1BBL, DcR3, OX40L, TNF-y (WO 96/14328), TRAIL, AIM-II (WO 97/34911), APRIL (J. Ex . Med. 188:1185-90), endoquina- (WO 98/07880), TR6 (WO 98/30694), y factor de crecimiento de nervio (HGF), y formas solubles de Fas, CD30, CD27, CD40, y 4-IBB, TR2 (WO 96/34095), DR3 (WO 97/33904), DR4 (WO 98/32856), TR5 (WO 98/30693), TRANK, TR9 (WO 98/56892), TRIO (WO 98/54202), 312C2 (WO 98/06842), y TR12, y formas solubles de CD154, CD70 y CD153. En otra modalidad, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con ligandos CD40 que surgen de manera natural, sintéticos o diseñados (CD40L) , incluyendo, por ejemplo, una forma soluble de CD40L (por ejemplo, AVREND) , fragmentos variantes o derivados biológicamente activos de CD40L, anticuerpos CD40L (por ejemplo, anticuerpos agonisticos o antagonisticos) , y/o anticuerpos CD40L (por ejemplo, agonisticos o antagonisticos) . Todavia en otra modalidad, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con uno, dos, tres, cuatro, cinco, o más los siguientes: tacrolimus (Fujisawa), talidoma (por ejemplo, Celgene), anti Tac (Fv)-PE40 (por ejemplo, Protein Design Labs), inolimomab (Biotest) , MAK-195F ( noll), ASM-981 (Novartis), interleuquina-1 (por ejemplo, Immunex), receptor de interleuquina-4 (por ejemplo, Immunex) , ICM3 (ICOS), BMS-188667 (Bristol Myers Squibb), anti TNF Ab (por ejemplo, Therapeutic Antibodies) , CG-1088 (Celgene), anticuerpo monoclonal anti-B7 (por ejemplo, Innogetics ) , MEDI-507 (BioTransplant) y ABX-CBL (Abgenix) . De acuerdo con la invención, el anticuerpo de la invención se puede administrar con el ligando Fas (Fas-L) o un anticuerpo Fas que enlaza Fas y transduce la señal biológica que resulta en apoptosis. De preferencia, los anticuerpos Fas empleados de acuerdo con esta invención son anticuerpos monoclonales . En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con agentes anti-retrovirales, inhibidores de transcriptasa inversa de nucleósido, inhibidores de transcriptasa inversa que no son de nucleósido, y/o inibidores de proteasa. Los inhibidores de transcriptasa inversa de nucleósido que pueden ser administrados en combinación con los anticuerpos de la invención, incluyen, pero no están limitados a RETROVIR® (zidovudina/AZT) (Glaxo-Wellcome,- Research Triangle Park, NC) , VIDEX® (didanosina/ddl) (Bristol-Myers Squibb, New York) , HIVID® (zalcitabine/ddC) (Roche, Nutley, New Jersey) , ZERIT® (estavudina) (Bristol-Myers. Squibb). Los inhibidores de transcriptasa inversa que no son de nucleósido que pueden ser administrados en combinación con el anticuerpo de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, VIRAMUNE® (nevirapine) (Boehringer Ingelheim/Roxanne, Columbus, Ohio) , RESCRIPTOR® (delavirdine ) (Pharmacia & Up ohn Company, Kalamazoo, Michigan) , y SUSTIVA® (efavirenz) (Bristol-Myers Squibb) . Los inhibidores de proteasa que pueden ser administrados en combinación con los anticuerpos de la invención incluyen, pero no están limitados a, CRIXIVAN® (sulfato de indinavir) (Merck & Company, Whitehouse Station, NJ) , NORVIR® (ritonavir) (Abbott Laboratories, Chicago, IL) , INVIRASE® (saquinavir) (Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ) , y VIRACEPT® (nelfinavir) (Agouron Pharmaceuticals, San Diego, CA) . En una modalidad especifica, los agentes antiretroviarles, inhibidores de transcriptasa inversa de nucleósido, inhibidores de transcriptasa inversa que no son de nucleósido, y/o inhibidores de proteasa se pueden usar en combinación con composiciones de la invención para tratar SIDA y/o prevenir o tratar la infección de HIV. En otras modalidades, el anticuerpo de la invención se puede administrar en combinación con agentes de infección anti-oportunistas. Los agentes anti-oportunistas que pueden ser administrados en, .combinación con las composiciones de la invención incluyen, pero .no están limitados a, trimetoprim-pentamidina, sulfametoxazol, DAPSONE® (Jacobus Pharmaceuticals, Princeton, NJ) , ATOVAQUONE® (GlaxoSMithKline) , Research Triangle Park, NC) , ISONIAZID® (CIBA Pharmaceuticals, Summit, NJ) , RIFADIN® (rifampin) (Hoechst-Marrion-Roussel, Kansas City, O) , PYRA INAMIDE® (Ledelrle, Pearl River, NY) BLAXIN® (claritromicina) (Abbott Laboratories, Chicago, IL) , ETHAMBUTOL® (Ledelrle, Pearl River, NY) , RIFABUTIN® (Pharmacia & Upjohn Company, Kalamzoo, MI), AZITHROMYCIN® (Pfize Inc., New York, NY) , GANCICLOVIR (Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ) , FOSCARNET® (Astra, Westborough, MA) , CIDOFOVIR® (Gilead Sciences, Foster City, CA) , KETOCONAZOLE® (Janssen, Titusville, NJ) , FLUCONAZOLE® (Pfizer Inc., New York, NY) , ITRACONAZOLE® (Janssen, Titusville, NJ) , ACYCLOVIR® (Glaxo-Wellcome, Research Triangle Park, NC) , FAMCICOLCIR® (SmithKline Beecham Pharmaceuticals, Pittsburg, PA) , pirimetamina, leucovorin, NEUPOGEN® (filgrastim/GM-CSF) (Amgen, Thousan Oaks, CA) , y LEUKINE® (sargramostim/GM-CSF) (Immunex, Seattle, WA) . En una modalidad especifica, el anticuerpo de la invención se usa en cualquier combinación con trimetroprim-sulfametoxazol y/o Atovaquone, Dapsone, Pentamidine, para tratar y/o prevenir profilácticamente una infección de neumonía por Pne mocystis carinii oportunista. En otra modalidad especifica, el anticuerpo de la invención se usa en cualquier combinación con Isoniazid, RIFADIN® (Merrell Dow Pharmaceuticals, Cincinnati Ohio) , Pirazinamida, y/o Etambutol para tratar y/o prevenir profilácticamente una infección compleja por Mycobacterium avium oportunista. En otra modalidad especifica, el anticuerpo de la invención se usa en cualquier combinación con Rifabutin, Claritromicina, y/o Azitromicina para tratar y/o prevenir profilácticamente una infección de tuberculosis por Mycobacterium oportunista. En otra modalidad especifica, el anticuerpo de la invención se usa en cualquier combinación con Ganciclovir, Foscarnet, y/o Cidofovir, para tratar y/o prevenir profilácticamente una infección por citomegalovirus oportunista. En otra modalidad especifica el anticuerpo de la invención se usa en cualquier combinación con Fluconazol, Traconazol y/o cetoconazol para tratar y/o prevenir profilácticamente una infección fungal oportunista. En otra modalidad especifica, el anticuerpo de la invención se usa en cualquier combinación con Aciclovir y/o Farmcicolvir para tratar y/o prevenir profilácticamente una infección de virus de herpes simple tipo I y/o tipo II oportunista. En otra modalidad especifica, el anticuerpo de la invención se usa en cualquier combinación con pirimetamina y/o leucovorin para tratar y/o prevenir profilácticamente una infección por Toxoplasma gondii oportunista. En otra modalidad especifica, el anticuerpo de la invención se usa en cualquier combinación con leucovorin y/o NEUPOGEN® (Amgen, Thousand Oaks, CA) para tratar y/o prevenir profilácticamente una infección bacteriana oportunista. En una modalidad adicional, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con un agente antiviral. Los agentes antivirales que pueden ser administrados incluyen, pero no están limitados a, aciclovir, ribavirin, amantadina y remantidina. En una modalidad adicional, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con un agente antibacteriano. Los agentes antibacterianos que pueden ser administrados con las composiciones de la invención incluyen, pero no están limitados a, amoxicilina, aminoglucósido, beta-lactama (glicopéptido) , betalactamasas, clindamicina, clorafenicol, cefalosporinas, ciprofloxacina, eritromicina, fluoroquinolonas, macrólidos, metronidazol, penicilinas, quinolonas, ritampin, estreptomicina, sulfonamida, tetraciclinas, trimetroprim, trimetropim-sulfamtoxazol y vancomicina. Los agentes inmunosupresores no especificos convencionales, que pueden ser administrados en combinación con el anticuerpo de la invención incluyen, pero no están limitados a, esteroides, ciclosporina, análogos de ciclosporina, ciclofosfamida metilprednisona, prednisona, azatioprina, FK-506- (Fuj sawa Pharmaceuticals, Deerfield, IL) , 15 deoxispergualin, y otros agentes inmunosupresores que actúan al suprimir la función de las células inmunes respondientes (incluyendo, por ejemplo, las células T) , directamente (por ejemplo, al actuar en la célula inmune) o indirectamente (al actuar en otras células mediadoras). .En modalidades especificas, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con inmunosupresores . Las preparaciones de inmunosupresores que pueden ser administradas con el anticuerpo de la invención incluyen, pero no están limitadas a, ORTHOCLONE® (0KT3) (Ortho Biotech, Raritan, NJ) , SANDIMMUNE® ORAL (ciclosporina) (Sandoz Pharmaceutical, Hanover, NJ) , PROGRAF® (tacrolimus) (Fujisawa Pharmaceuticals, Deerfield, IL) , CELLCEPT® (micofenolato) (Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ) , azatioprina, glucorticosteroides y RAPAMUNE® (sirolimus) ( yeth, Collegeville, PA) . En una modalidad especifica, los inmunosupresores en combinación con el anticuerpo se pueden usar para prevenir el rechazo del transplante de órgano o médula ósea . En una modalidad adicional, el anticuerpo de la invención se administra solo o en combinación con una o más preparaciones de inmunoglobulina intravenosa. Las preparaciones de inmunoglobulina intravenosas que pueden ser administradas con el anticuerpo de la invención incluyen, pero no están limitadas a, GAMMARE® (centeno, Kankakee, IL) , IVEEGAMS) ( Immuno-US Inc., Rochester, MI), SANDOGLOBULFN® (Sandoz Pharmaceutícals, Hanover, NJ) , GAMMAGARD® (Baxter Healthcare, Glendale, CA) y GAMIMUNE® (Bayer Biological, West Haven, CT) . En una modalidad especifica, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con preparaciones de inmunoglobulina intravenosas en la terapia de transplantes (por ejemplo, transplante de médula ósea) - En una modalidad adicional, el anticuerpo de la invención se administra solo o en combinación con un agente antiinflamatorio. Los agentes intiinflamatorios que pueden ser administrados con las composiciones de la invención incluyen, pero no están limitados a, glucocorticoides y los antiinflamatorios no esteroidales, derivados de ácido aminoarilcarboxilico, derivados de ácido arilacético, derivados de ácido arilbutirico, ácidos arilcarboxílicos, derivados de ácido arilpropionico, pirazoles, pirazolonas, derivados de ácido salicilico, tiazinacarbozamidas, ácido e-acetomidocaproico, S-denosilmetionina, ácido 3-amino-4-hidroxibutirico, amixetrina, bendazac, bencidamina, bucolome, difenpiramida, ditazol, amorfazone, guaiazuleno, nabumetona, ninesulida, orgoteina, oxaceprol, paranilina, perisoxal pifoxime, procuazone, proxazol y tenidap. En una modalidad, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con la terapia de esteroide. Los esteroides que pueden ser administrados en combinación incluyen metilprednisolona (por ejemplo, IV metilprednisolona) . En una modalidad especifica, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con prednisona. En una modalidad especifica adicional, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con prednisona y un agente inmunosupresor . Los agentes inmunosupresores que pueden ser administrados y prednisona son aquellos descritos en la presente, e incluye, pero no están limitados a, azatioprina, ciclosfosfamida y ciclofosfamida IV. En una modalidad especifica, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con metilprednisolona. En una modalidad especifica adicional, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con metilprednisolona y un agente inmunosupresor. Los agentes inmunosupresores que pueden ser administrados con metilprednisolona son aquellos descritos en la presente, e incluyen pero no están limitados a, azatioprina, ciclofosfamida y ciclofosfamida IV. En una modalidad, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con un antimalárico. Los antimaláricos que pueden ser administrados con las composiciones . de.: la invención incluyen, pero no están limitados a, hidroxicloroquina, cloroquin y/o quinacrina. Todavia en. otra modalidad, el anticuerpo- de la invención se administra., en combinación con un NSAID. Opcionalmente, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con uno, dos, tres, cuatro, cinco, diez, o más de los siguientes fármacos: NRD-101 (Hoechst Marrion Roussel, ansas City, MO) , diclofenac (Dimethaid, Ontario, CN) , oxaproxin potasio (Monsanto) , mecasermin (Chiron, Emeryville, CA) , T-614 (Toyama), pemetrexed disódico (Eli Lilly, Indianápolis, IN) , atreleuton (Abbott, Chicago, IL) , valdecoxib (Monsanto) , eltenac (Byk Gulden, Melville, NY) , campact, AGM-1470 (Takeda, Lincolnshire, IL) , CDP-571 (Celltech, Rochester, NY) , CM-101 (CarboMed, Nashville, TN) , ML-3000 (Merck), CB-2431 (KS Biomedix, Surrey, UK) , CBF, BS2 (KS Biomedix, Surrey, UK) ; terapia con gen IL-Ira (Valentis, Burlingame, CA) , JTE-522 (Japón Tobáceo, Tokio, Japón), paclitaxel (Angiotech, Vancouver, BC) , DW-166HC (Don Wha, Seoul, Korea), mesilato de darbufelona (Pfizer Inc., New York, NY) , receptor 1 de TNF soluble (synergen; Amgen, Thousand Oaks, CA) IPR 6001 (Institute for Pharmaceutical Research) , trocade (Hoffman-La Roche, Nutley, NJ) , EF5 (Scotia Parmaceuticals) , BIIL-284 (Boehringer Ingelheim, Ridgefield, CT), BIIF-1149 (Boehringer Ingelheim, Ridgefield, CT), LEUKOVAX® ( Inflammatics, Malvern, PA) , MK-663 (Merck, Whitehouse Station, NJ) , ST-1482 (Sigma-Tau, Gaithersburg, MD) y propionato de butixocort (Pfizer Inc., New York, NY) . Todavía en otra modalidad, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con uno o más DMARDs. Asi, uno, dos, tres> cuatro, cinco o más de los siguientes fármacos pueden ser utilizados: metotrexato, leflunomida, edatrexato, epiroprim, iometrexol, piritrexim, trimetrexato, brodimoprim, MX-68, ácido N- [4- [3- (2, 4-diamino-6, 7-dihidro-5H-ciclopenta [d] -pirimidin-5-il)propil] benzoil] -L-glutáraico, ácido N- [ [5- [2- (2-amino-l, 4,5,6,7, 8-hexahidro-4-oxipirirido-[2.3-d] pirimidin-6-il) etil] -2-tienil] carbonil] -L-glutámico, ácido (R) -N- [ [5- [2- (2-amino-l, , 5, 6, 7, 8-hexahidro-4-oxopiri-do [2, 3-d]pirimidin-6-il) etil] -2-tienil] -carbonil] -L-gutámico, ácido N- ( (2, 4-diamino-3, 4,5,6,7, 8-hexahidropirido [2, 3-d]piri-midin-6-il) etil) -2-tienilcarbonil-L-glutámico, ácido (S)-2-t [ [4-carboxi-4- [ [4- [ [ (2, 4-diamino~6-pteridinil)metil] -amino] benzoil] aiaino] butil] amino] carbonil] -benzoico, ácido N-[4- [3- (2, 4-diamino-l-H-pirrolo [2, 3-d]pirimidin-5-il)propil] -benzoil] -L-glutámico, 2, 4-diamino-6- (N- (4- (fenilsulfonil) -bencil) metilamino) quinazolina, 2, 4-diamino-5- [4- [3- (4-amino-fenil-4-sulfonilfenilamino) propoxi] -3, 5-dimetoxibencil] piri-midina, ácido N- [4-4- (2, 4-diamino-5-pirimidin)butil]benzoil] -L-glutámico, ácido N- [4- (2, 4-diamino-5-pirimidinil) propil] -benzoil] -L-glutámico, ácido N- [4- [2- (2, -diamino-6-pteridinil) etil] benzoil] -4-metilen-DL-glutámico y diamida clorhidrato N- (1-metiletil) -N' [3- (2, 4, 5-triclorofenoxi) -propoxi] imidodicarbonimidico (PS15), sulfasalazine, aurotiomalato sódico, auranofina, ciclosporina penicilamina, azatioprina, un fármaco antimalárico (por ejemplo, como es descrito en la presente) , ciclofosfamida, clorambucil, oro, Enbrel (etanercept) (Wyeth-Ayerst Laboratories, Philadelphia, PA) , anticuerpo anti-TNF, y prednisolona . En una modalidad más preferida, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con un antimalárico, metotrexato, anti-TNF, Enbrel y/o sulfasalazina . En una modalidad, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con metotrexato. En otra modalidad, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con el anticuerpo anti-TNF. En otra modalidad, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con metotrexato y anticuerpo anti-TNF o anticuerpo anti-Fas. En otra modalidad, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con sulfasalazina. En otra modalidad especifica, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con metotrexato, anticuerpo anti-TNF, anticuerpo anti-Fas y sulfasalazina. En otra modalidad, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con Enbrel. En otra modalidad, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con Enbrel y metotrexato. En otra modalidad, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con Enbrel, metotrexato, sulfasalazina, leflunomida, etroricoxib, misoprostol/di-clofenac sódico, valdecoxib, tiracoxib, rofecoxib, celecoxib, galantamina, mesilate de ..darbufelone, aceclofenac, ML-3000, anakinra, hvaluronato sódico, nimesulida, mvcofenolato, diacerein, sivelestst sódico, deflazacort, clorhidrato de nalmefeno, samarium-153 lexidronam pentasódico, pentostatin, T-614, clorhidrato de amiprilosa, rocepafan, ampiroxicam, famesilato de prednisolona, meloxicam, diclofenac sódico, lomoxicam, salazosulfapiridina, etodolac, maleato de flupirtina, . ebselen, tacrolimus hidrato, nabumetcna, cloprednol, cinnamato de piroxicam, proquazona, rimexolona, fenretinida, hidroxibenzoato de imidazol, droxicam, fentiazac, alfacalcidol, diacetato de halopredona, clorhidrato de gusperimus, inosina pranobex, actarit, indometacina fernesil, mizoribina, ácido tolfenamico, diflunisal, piroxicam, oxaprozin, hialuronáto sódico, bucillamina, ciclosporina, floctafenina, tenoxicam, palmitato de dexametasona, amfenac sódico, acemetacin, auranofin, lobenzarit disódico, o cualquier combinación de los mismos. En otra modalidad, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con Enbrel, metotrexato y sulfasalazina. En otras modalidades, uno o más antimaláricos se combinan con una de las combinaciones citadas en lo anterior. En una modalidad especifica, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con un antimalárico (por ejemplo hidroxicloroquina) , Enbrel, metotrexato y sulfasalazina. En otra modalidad especifica, el anticuerpo de la invención se ádministra. en combinación con un antimalárico (por ejemplo, hidroxicloroquina), sulfasalazina, anticuerpo anti-TNF, y metotrexato . . En otra modalidad, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con un agente quimioterapéutico . Los agentes quimioterapéuticos que pueden ser administrados con las composiciones de la invención incluyen, pero no están limitados a, derivados de antibióticos (por ejemplo, doxorrubicina, bleomicina, daunorrubicina y dactinomicina) ; antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifen) ; antimetabolis (por ejemplo, fluorouracilo, 5-FU, methotrexato, floxuridina, interferon alfa-2B, ácido glutámico, plicamicina, mercaptopurina y 6-tioguanina) ; agentes citotóxico (por ejemplo, carmustina, BCNU, lomustine, CCNU, citosina arabinósido, ciclofosfamida, estramustina, hidroxiurea, procarbazina, mitomicina, busulfan, cis-platin y sulfato de vincristine) / hormonas (por ejemplo,, medroxiprogesterona, fosfato de estramustina sódica, etinil estradiol, estradiol, acetato de megestrol, metiltestosterona, difosfato de dietilestilbestrol, clorotrianiseno y testolactona) ; derivados de mostaza de nitrógeno (por ejemplo, mefalen, clorambucilo, mecloretamina (mostaza de nitrógeno) y tiotepa) ; esteroides y combinaciones (por ejemplo, fosfato de betametasona sódico); y otros (por ejemplo, dicarbazina, asparaginasa, mtotan, sulfato de vincristina, sulfato de vinblastina y etopósido) ... Otros quimioterapéuticos incluyen, por ejemplo, CPT-11, deflonimida, cicloheximida y mitomicina.

En una modalidad especifica, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisona) o cualquier combinación de los componentes de CHOP. En otra modalidad, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con Rituximab. En una modalidad adicional, el anticuerpo de la invención se administra con Rituxmab y CHOP, o Rituxmab y cualquier combinación de los componentes de CHOP. En una modalidad adicional, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con citoquinas. Las citoquinas que pueden ser administradas con las composiciones de la invención incluye, pero no están limitadas a, GM-CSF, G-CSF, IL-lalfa, IL-Ibeta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, anti-CD40, CD40L, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, TNF-alfa y TNF-beta. En una modalidad adicional, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con factores de crecimiento hematopoyéticos . Los factores de crecimiento hematopoyéticos que pueden ser administrados con las composiciones de la invención incluyen, pero no están limitados a, LEUKINE® (sargramostim) y NEUPOGEN® (filgrast). En modalidades ..adicionales, el anticuerpo de la invención se administra en combinación con uno o más de otros regímenes terapéuticos o profilácticos, tales · como, por ejemplo, la terapia con radiación. Como se utiliza en toda la presente, un "agente terapéutico" es un compuesto o composición efectiva en mejorar una condición patológica. Ejemplos ilustrativos de un agente terapéutico incluyen un compuesto anticáncer, miembros de la familia TNF, agentes anti-inflamatorios, agentes antivirales, agentes anti-retrovirales, agentes antioportunistas, antibióticos, agentes immunosupresores, inmunoglobulinas, agentes antimaláricos, fármacos antireumáticos modificadores de la enfermedad (DMA Ds), citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento, y segundos anticuerpos que promueven la apoptosis de las células objetivo. Un compuesto anticáncer o agente quimioterapéutico es un compuesto o composición efectiva en inhibir o detener el crecimiento de una célula que crece anormalmente. Asi, tal agente puede ser usado terapéuticamente para tratar cáncer, asi como otras enfermedades marcadas por crecimiento de célula anormal. Una cantidad farmacéuticamente efectiva de un compuesto anti-cáncer es una cantidad administrada a un individuo suficiente para ocasionar inhibición o detención del crecimiento de una célula que crece anormalmente. Ejemplos ilustrativos de compuestos anti-cáncer incluyen: bleomicina, carbopiatin, clorambucilb, cisplátin, colquicina, ciclofosfamida, daunorrubicina, dactinomicina, dietilestilbestrol doxorrubicina, etopósido, 5-fluorouracilo, floxuridina, melfalan, metotrexato, mitomicina, 6-mercaptopurina, tenipósido, 6-tioguanina, vincristina y vinblastina. Ejemplos adicionales de compuestos anti-cáncer y agentes terapéuticos son encontrados en The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow y colaboradors, eds . , 1987, Rahway, N.J. and Sladek y colaboradores. Metabolism and Action of Anti-Cancer Drugs, 1987, Powis y colaboradores, eds., Taylor and Francis, New York, N.Y. El anticuerpo de la presente invención se puede combinar adicionalmente con otras terapias, tal como la quimioterapia y/o la radioterapia en el tratamiento de malignidad, y la eficacia terapéutica puede ser aumentada mediante compuestos inductores de apoptosis, tal como bisindolilmaleimida VIII (BisVIII) y otros agentes sensibilizantes similares a SN-50 o LY294002. Asi, en una modalidad, el anticuerpo o anticuerpos de la presente invención pueden ser combinados con BisVIIÍ u otro agente sensibilizante y un quimioterapéutico (por ejemplo, adriamicina, etopósido, topetecan, taxótero o paclitaxel) . En otra modalidad, el anticuerpo o anticuerpos de la presente invención puedén ser combinados con un fármaco antiinflamatorio no esteroidal (por ejemplo, sulfuro de sulindac u otros inhibidores COX-1 o COX-2) un quimioterapéutico (por ejemplo, adriamicina, etopósido, topetecan, taxótero o paclitaxel) . En el tratamiento de otras enfermedades, por ejemplo, enfermedades autoinmunes e inflamatorias, también se pueden usar combinaciones de tratamientos.. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser administrado en conjunción con otros agentes terapéuticos similares a agentes antiinflamatorios, DMARDs, agentes quimioterapéuticos, metotrexato, bisindolilmaleimida VIII u otros agentes sensibilizantes, y similares. La radioterapia también puede ser combinada con otros agentes terapéuticos en el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes. Un experto en la técnica adaptarla la forma de radioterapia a la enfermedad inflamatoria o autoinmune especifica (por ejemplo, sinovectomia de radiación en el tratamiento de artritis) . La terapia usando un anticuerpo de la presente invención también puede ser combinada con la terapia usando otro anticuerpo de la invención. Por ejemplo, un anticuerpo para DR5 puede ser administrado a un sujeto en necesidad del mismo junto, antes de, o después de la administración de un anticuerpo para DR4, TNF, B7, ligando CD40, CD40, CD20 (por ejemplo rituximab), Fas, o una combinación de los mismos.. Tal terapia de anticuerpo combinada puede ser también combinada con la administración de uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, quimioterapéuticos, doxorrubicina y/o metotrexato), radioterapia o ambos. Asi, la invención proporciona un método para inducir selectivamente apoptosis o inhibir la proliferación en células objetivo que expresan DR5, que comprende las etapas de (a) poner en contacto las células objetivo con una cantidad terapéutica de un anticuerpo que especificamente enlaza un receptor de TRAIL, DR5, en donde el anticuerpo, en su forma soluble, tiene actividad inductora de apoptosis in vivo e in vitro en células objetivo que expresan DR5 y (b) poner en contacto las células objetivo con una cantidad terapéutica de uno o más agentes terapéuticos. En una modalidad, una o ambas de las etapas de contacto opocionalmente se realizan in vivo. En otra modalidad, una o ambas de las etapas de contacto se realizan in vitro. Las células objetivo se pueden seleccionar de células que muestran desrregulación del sistema de apoptosis, neutrófilos, linfocitos activados u otras células inmunes activadas (por ejemplo, células linfoides y células mieloides), células viralmente infectadas y células sinoviales que proliferan anormalmente (por ejemplo, células sinoviales de artritis reumatoide, incluyendo células sinoviales inflamatorias, células linfoides y - mieloides activadas en la sinovia, sinoviocitos similares a macrófagos y sinoviocitos similares a fibroblastos) de enfermedades 93 autoinmunes. Comparado con el anticuerpo anti-DR5 previamente publicado (24), la actividad inductora de apoptosis del anticuerpo TRA-8 demostrativo de. la presente invención es muy fuerte, y es capaz de inducir apoptosis de las células Jurkat con los niveles de pg/ml in vitro y demuestra actividad tumoricida in vivo superior comparado con el TRAIL soluble previamente reportado. La administración intravenosa de una sola dosis de TRA-8 es suficiente para inhibir el crecimiento de tanto tumor sólido como células de tumor hematopoyéticas, mientras que la inducción de la regresión de tumor in vivo con el TRAIL soluble requiere dosis muy altas (500 µg cada dia por 10 dias) . Los anticuerpos del receptor anti-TRAIL de la presente invención se presentan que son tan seguros como el TRAIL soluble, puesto que el anticuerpo ejemplar TRA-8 ño induce apoptosis de las células de fibroblasto no transformadas. Resultados similares se han observado con los anticuerpos DR4. Los vectores de la presente invención incluyen una secuencia de ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina de cadena pesada o ligera de un anticuerpo DR5 o DR4 operablemente . enlazado a un elemento regulador tal como un promotor o me orador. "Operablemente enlazado" se refiere a un arreglo de secuencias de nucleótidos configuradas para realizar su función-.- usual . Asi, un elemento regulador operablemente enlazado a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido es capaz de dirigir la transcripción, replicación y/o traducción del polipéptido. Será reconocido por aquellos expertos en la técnica que un solo vector opcionalmente incluye secuencias de codificación para tanto una inmunoglobulina de cadena pesada o de cadena ligera de un anticuerpo DR5 o DR4. En una modalidad, los vectores codifican inmunoglobulinas dé cadena ligera o pesada humanizadas . Los siguientes ejemplos se exponen enseguida para ilustrar los métodos y resultados de acuerdo con la presente invención. Estos ejemplos no se proponen para ser inclusivos de todos los aspectos de la presente invención, sino más bien para ilustrar métodos y resultados representativos. Estos ejemplos no se proponen para excluir equivalentes y variaciones de la presente invención que son evidentes para un experto en la técnica. Ejemplo 1. Preparación del antigeno DR5 1.1 Clonación de cDNA de DR5 El . DNA que codifica la proteina DR5 humana es clonado mediante el siguiente método RT-PCR usando: a) . Patrón El RNA total de las células HeLa es extraído al usar TRIzol Reagent (GIBCO BRL) . El patrón para la reacción de PCR usó cDNA que es obtenido al usar el kit de síntesis de cDNA de Primera Hebra (Amersham Pharmacia Biotech) de acuerdo con el manual de instrucción proporcionado con el kit. b) Cebadores de PCR Los siguientes cebadores de oligonucleótido son sintetizados por la PCR: 5' -gacgatgcccgatctactttaaggg-3' (DR5pl:SEQ ID N0:1); 5' -ccactgggtgatgttggatggg-3' (DR5p2: SEQ ID NO:2); A menos que se especifique de otra manera, todos los oligonucleótidos en estos Ejemplos son sintetizados por Lifetechnologies . Todos los oligonucleótidos son almacenados a -20°C después de ser disueltos en agua destilada. c) Reacción de PCR Composición de la solución de reacción de PCR: cDNA de patrón, 5 µ? de la reacción de 33 µ? total cebador DR5pl, 10 pmol; cebador DR5p2, 10 pmol; solución reguladora de PCR concentrada 10 x (proporcionada con el kit) , 10 µ?; d TPs (cada uno 2.5 m ) , 4 µ?; y Polimerasa Taq (Promega), 5 unidades. Agua destilada estéril es adicionada a la solución a un volumen total de 100 µ?. A menos que se especifique de otra manera, los dNTPs son una mezcla equimolar de dATP, dCTP, dGTP y dTTP (2.5 m cada uno) . La reacción de PCR es conducida como sigue. La solución primero es calentada a 94 °C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo de calentamiento a 9 °C durante 30 seg, 52 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 3 minutos, es repetido 40 veces. Después de la consumación de este procedimiento, la solución de reacción es calentada a 72°C durante 10 minutos. Los fragmentos de DNA amplificados, asi obtenidos, son separados en un gel de agarosa al 1% que contiene 0.25 g/ml de bromuro dé etidio. Las bandas' determinadas que contienen los fragmentos de DNA deseadas son cortadas usando una hoja de afeitar y el DNA es recuperado de las mismas usando el kit. Gene Clean (BIO101) . El fragmento de DNA es clonado usando el Kit de Clonación TA (Invxtrogen, CA) . Esto es realizado como sigue. El fragmento de DNA recuperado de la solución de reacción de PCR, junto con 50 ng del vector pCR2.1 que es proporcionado con el kit de Clonación TA, es mezclado con 1 µ? de la solución reguladora de reacción de ligasa 10 X (Tris-HCl 6 mM (pH 7.5), cloruro de magnesio 6 mM, cloruro de sodio 5 mM> ß-mercaptoetanol 7 mM, ATP 0.1 mM, DT 2 mM, éspermidina 1 mM> y 0.1 mg/ml de albúmina de suero bovino), al cual se han adicionado 4 unidades- de ligasa de DNA T4 (1 µ?) . El volumen total de la mezcla es ajustado a 10 µ? con agua desionizada estéril, y la solución de ligasa resultante es incubada a 1 °C durante 15 horas. Después de este tiempo, 2 µ? de la solución de reacción de ligasa es adicionado a 50 µ? de la cepa TOP10F' de E. coli competente, que es proporcionada con el kit de clonación TA y llevada a la competencia de acuerdo con el manual de instrucción, al cual se han adicionado 2 µ? de ß-mercaptoetanol 0.5 M, y la mezcla resultante es mantenida sobre hielo durante 30 minutos, luego a 42°C durante 30 segundos, y nuevamente sobre hielo durante 5 minutos. Enseguida, 500 µ? de medio que contiene triptona al 2% v/v, extracto de levadura al 0.5% p/v, cloruro de sodio al 0.05% p/v, cloruro de potasio 2.5 mM, cloruro de magnesio 1 mM, glucosa 20 mM (después en la presente referido como el medio "SOC") es adicionado al cultivo, y la mezcla es incubada durante 1 hora a 37 °C con agitación. Después de este tiempo el cultivo es extendido sobre una placa de agar de L-broth (triptona al 1% v/v, extracto de levadura al 0.5% p/v, cloruro de sodio al 0.05% p/v, glucosa al 0.1% p/v y bacto-agar al 0.6% p/v (Difco)), que contiene 100 µg/ml. Las colonias resistentes a la ampicilina que aparecen en la placa son seleccionadas y removidas raspando con una anilla de transferencia de platino, y cultivadas en el medio L-broth que contiene 100 g/ml de ampicilina a 37 °C, durante la noche, con agitación a 200 r.p.m. Después de la incubación, las células son cosechadas por centrifugación, de las cuales el DNA de plásmido es preparado por el método de álcali . El fragmento EcoRI-EcoRI DR5cDNA del plásmido asi obtenido es subclonado en el plásmido pcDNA3 (Invitrogen, CA) . La longitud completa del gen DR5 en pcDNA3 es secuenciado e igualado con la secuencia publicada. El plásmido asi obtenido es designado como plásmido pcDNA3-DR5. 1.2 Construcción del vector de expresión DR5-IgG Para obtener una forma soluble de DR5 humano que carece del dominio de transmembr na, se construye un vector de plásmido de expresión. Este vector es diseñado para codificar una proteina de fusión que comprende el dominio extracelular del DR5 humano fusionado al IgGl Fe DNA humano (41) . El DNA que codifica el DR5 humano que carece del dominio de transmembrana es obtenido mediante la siguiente reacción de PCR. a) Patró El patrón para la reacción de PCR usado es pcDNA3- DR5. b) Cebadores de PCR Los siguientes cebadores de oligonucleótido son sintetizados por la PCR: 5' -gacgatgcccgatctactttaaggg-3' (DR5pl:SEQ ID NO : 1) ; 5' -ggatccgtggacacattcgatgtc-3' (DR5p3:SEQ ID' NO:3)v A menos que se especifique de otra manera, todos los oligonucleótidos en estos Ejemplos son sintetizados por Lifetechnologies . Todos los oligonucleótidos son almacenados a -20°C después de ser disueltos en agua destilada. c) Reacción de PCR La reacción de PCR es conducida y el DNA amplificado es aislado de acuerdo al Ejemplo 1.1 (c) . El plásmido asi obtenido es designado como plásmido pCR-ADR5. El fragmento BamHI-EcoRI codificado por el fragmento Fe humano que es recuperado del pmFas-hIgGIFc es subclonado en los sitios de multiclonación BamHI y EcoRI del pcDNA3. El plásmido asi obtenido es designado pcDNAFc. Además, el fragmento BamHI-BamHI que codifica la región de DR5 soluble humana que es recuperado de pCR-ADR5 es subclonado en el sitio BamHI del plásmido pcDNAFc. El plásmido asi obtenido es designado como plásmido pcDNAADR5-Fc . El fragmento EcoRI que codifica la región Fe de IgG humano de DR5 soluble humano que es recuperado del plásmido pcDNAADR5-Fc es despuntado en el extremo al usar el fragmento Klenow de polimerasa de DNA (GIBCO BRL) y luego subclonado en el vector de enlace pAdCMVS (Quantum Biotechnologies Inc., Canadá) que es despuntado en el extremo después de cortar mediante BamHI. El plásmido asi obtenido es designado pAdADR5-Fc. . . .. ... .. .... 1.3 Expresión y purificación de la proteina de fusión DR5-IgGl humana Células QBI-293-A (proporcionadas con el Kit ADENO-Quest) son co-transfectadas con pAdADR5-Fc y DNA QBI-Viral (proporcionado con el Kit ADENO-Quest) usando el kit ADENO-Quest (Quantum Biotechnologies Inc., Canadá) de acuerdo con el manual de instrucción. Las placas de virus recombinantes son cultivadas y clasificadas para la expresión de la proteina de fusión DR5-IgG mediante el análisis de ELISA del sobrenadante. Las placas positivas son amplificadas en las células QBI-293-A y almacenadas a -80°C como material de virus. Cincuenta discos (159 mm) de células QBI-293A son transíectados con el virus recombinante pAdADR5-Fc a 10 m.o.i. (Multiplicidad de Infección). Los medios de cultivo son cosechados después de la transfeccion durante 48 horas. Las células transfectadas que tiene el gen DR5-IgG son cultivadas a una densidad de células de 1 x 106 células/ml por incubación en 500 mi de medio DMEM (GIBCO), que contiene FCS al 10% v/v, a 37°C en una atmósfera de C02 al 5% v/v durante 2 dias. El cultivo luego es centrifugado (1,000 r.p.m., 5 minutos) y el sobrenadante . colectado. La purificación de DR5-IgG del sobrenadante es obtenida usando la cromatografía de afinidad de ProteinA-Sepharose CL-4B (Pharmacia) bajo las siguientes condiciones: columna: columna de ProteinA-Sepharose CL-4B (tamaño de la columna 2 mi; Pharmacia); solución reguladora de elución: glicina 0.1 M (pH 2.4), NaCl 0.15 M; solución reguladora de neutralización: Tris-HCl 1M (pH 8.5) . Después de que todo el sobrenadante es aplicado a la columna, ésta es lavada tres veces con 20 mi de PBS y luego 1 mi de solución reguladora de elución es adicionado 10 veces. La densidad óptica de cada fracción eluida (1 mi) es medida. La segunda fracción hasta la quinta fracción (con OD28o=0.1) son colectadas y después de la adición de 100 µ? de solución reguladora de neutralización, los materiales eluidos son colocados por separado en tuberia de diálisis, y los materiales eluidos dializados contra 1 litro de PBS (pH 7.5) a 4°C. La solución reguladora de diálisis que es cambiada dos veces. Los materiales eluidos luego son analizados para la éxpresión del producto de gen DR5-IgG por ELISA. Primero, 100 µ? de cada fracción son colocados por separado en cavidades de una microplaca de 96 cavidades (Costar) e incubados a 37°C durante 1 hora. Después de este tiempo, la solución en las cavidades es retirada, y la placa es lavada 3 veces con 100 µ?/cavidad de PBS que contiene Tween 20 al 0.1% v/v (después en la presente referido como "PBS-Tween" ) . Después del lavado, PBS que contiene albúmina de suero bovino al 2% p/v (después en la presente referido como "BSA") es adicionado en cantidades de 100 µ?/cavidad, y la placa luego es incubada a 37°C durante 1 hora. Después de este tiempo, las cavidades son lavadas 3 veces adicionales con 100 µ?/cavidad de PBS-Tween, después de lo cual 100 µ?/cavidad de una solución de anticuerpo monoclonal IgGl antihumano diluido 1000 veces con PBS-Tween es adicionado a cada cavidad, y la placa es una vez más nuevamente incubada a 37 °C durante 1 hora. Las cavidades luego son lavadas 3 veces con 100 µ?/cavidad de PBS-Tween. El sistema de sustrato liquido (Sigma) de 3, 3' , 5, 5' -Tetrametil-bencidina (después en la presente referida como "TMB") luego se adicionaron a una cantidad de 100 µ?/cavidad y la placa se deja permanecer a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego la reacción se detiene mediante la adición de 100 µ?/cavidad de H2S04 0.2 N. La absorbencia* de cada cavidad es leida a 450 nm para estimar la concentración del anticuerpo enlazado usando la absorbencia a 650 nm como la lectura de control. La absorbencia es medida usando un lector de microplaca (Molecular Devices) . La producción de DR5-IgGl es confirmada usando este método de ELISA. El peso molecular de^ la proteina .de fusión DR5-IgGl expresada es determinada usando análisis de manchado de Western en el cual mAb IgGl antihumano (Sigma) es usado para detectar el anticuerpo sobre' el gel. El peso molecular de l proteina de- fusión DR5-IgGl expresada tiene un peso molecular aproximado de 50 kDa. La pureza obtenida que es más grande que 90% como es evaluada mediante el análisis sobre SDS-PAGE y la detección de la proteina mediante el manchado con azul de Coomassie. Ejemplo 2. Generación de anticuerpos monoclonales contra DR5 humano 2.1 Inmunización Ratones Balb/c hembras (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) de 6-8 semanas de edad, son inmunizados con la proteina de fusión DR5/hIgGl humana purificada por afinidad. Para la inmunización de la planta del pie inicial, la proteina de fusión (50 µg) es emulsificada en el adyuvante completo de Freund (Difco, Detroit, MI) . Los ratones luego son reforzados con cuatro inyecciones de 50 \ig de proteina de fusión administrada sin adyuvante un dia si y otro no. Tres dias después de la última inyección, los linfocitos de los ganglios linfáticos locales son fusionados con las células de mieloma NS-1, y los hibridomas son cultivados en el medio F104 suplementado con suero de ternero fetal al 10%. Los hibridomas positivos son seleccionados por ELISA en la cual las placas son recubiertas ya sea con 1 µg ml de DR5/hIgGl o la misma cantidad de Fas/hIGgl como un control. El isotipo de los hibridomas es determinado mediante ELISA usando un panel de anticuerpo de- cabra específicos de isotipo Ig de ratón (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) . Los anticuerpos monoclonales son purificados mediante la cromatografía de afinidad usando IgGl de ratón inmovilizado o la proteina G (Sigma) . 2.2 Fusión de células Al tercer dia después de la inyección reforzadora, los ganglios linfáticos locales son retirados del ratón y colocados en 10 mi de medio RPMI 1640 libre de suero (GIBCO BRL) que contiene 50 unidades/ml de penicilina, SO µg ml de estreptomicina y 300 g/ml de ácido L-glutámico, y rotos al pasar el órgano a través de una malla (Cell Strainer; Falcon) usando una espátula. La suspensión de célula resultante es centrifugada hasta la formación de pelotilla de células de ganglios linfáticos locales que luego son lavados dos veces con medio RPMI libre de suero. Las células lavadas luego son resuspendidas en el medio RPMI libre de suero y contadas. En el tiempo medio, las células NS1 de mieloma {Colección Americana de Cultivo Tipo TIB-18) se han cultivado a una densidad de células que no excede de 1 x 108 células/ml en el medio ASF104 (Ajinomoto, K.K.) que contiene FCS al 10% v/v (Gibco BRL) ("medio ASF con suero") a 37°C bajo C02 al 5% v/v, y estas son del mismo modo rotas, lavadas, resuspendidas y contadas. Una cantidad de la suspensión de células NS1 calculada para contener 3 x 107 células es mezclada con una cantidad de la suspensión de células del bazo calculada para contener 3 x 108 células. La mezcla resultante es centrifugada y el sobrenadante desechado. Las siguientes etapas de la fusión de células son realizadas mientras que en todos los tiempos se conserva el tubo de plástico que contiene la pelotilla a 37 °C en un vaso de agua caliente. Un mi de polietilenglicol 1, 500 al 50% (p/v) (Boehringer Manheim) luego se adiciona lentamente al tubo, todo mientras que se agita la pelotilla usando la punta de una pipeta. Subsecuentemente, un mililitro de medio RPMI libre de suero, precalentado a 37°C, es adicionado lentamente en 2 porciones, seguido por la adición de 7 mi adicionales de medio RPMI libre de suero. La mezcla resultante luego es centrifugada, el sobrenadante desechado y 10 mi de medio HAT que contiene FCS al 10% v/v son adicionados mientras que se agitan moderadamente con la punta de una pipeta. 20 mi adicionales de medio HAT que contiene FCS al 10% v/v son adicionados, y la suspensión es suministrada a microplacas de cultivo de células de 96 cavidades a 100 µ?/cavidad e incubadas a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5% v/v. Después de 7 u 8 dias, 100 µ?/cavidad del medio HAT fresco son usados para reemplazar el medio en cualquiera de las cavidades que muestran un matiz amarillento. Las células de fusión de estas cavidades son clonadas mediante la dilución limitativa como es descrito enseguida. . . ... 2.3 Clonación mediante dilución limitativa Timos de ratones BALB/c hembras de 4 a 10 semanas de edad (de Japan SLC, Inc.) son retirados, rotos sobre una malla (Cell Strainer, Falcon) como es descrito en lo anterior, y la células rotas son lavadas dos veces con medio HT que contiene FCS al 10% v/v. Una cantidad de células de timo correspondientes a aquellas de un ratón es suspendida en 30 mi de medio HT que contiene FCS al 10% v/v para producir una suspensión de células alimentadora. La preparación de células de fusión obtenida anteriormente en el Ejemplo 2.2 es diluida con esta suspensión de células alimentadoras 10 a 100 veces, y además diluidas en serie con la suspensión de células alimentadora para hacer suspensiones que tienen densidades de células de fusión de 5, 1 y 0.5 células/ml. Las muestras asi preparadas son suministradas en cavidades de microplacas de cultivo de células de 96 cavidades a 100 µ?/cavidad e incubadas durante 5 dias a 37 °C bajo CO2 al 5% v/v. 2.4 Clasificación Los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas en crecimiento son clasificados por ELISA usando placas recubiertas ya sea con 1 µg/Iul de DR5/hIgGl o la misma cantidad de Fas/hlgGl (41) como un control. Los anticuerpos enlazados son . detectados usando - inmunoglobulinas anti-ratón conjugadas con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Southern Biotechnology. Birmingham, AL) con TMB (Sigma, St Louis, MI) como el sustrato. DR5-IgGl purificado en una concentración de 1 µg ml o la misma cantidad de Fas-hlgGl son introducidos a una cavidad de una ELISA/RIA STRIP PLATE de 96 cavidades (Costar, NY) . La mezcla es mantenida vertical a 4°C durante la noche para permitir la absorción de la proteina sobre la superficie de la cavidad. Después de este tiempo, la solución en las cavidades es desechada y cada cavidad es lavada 3 veces con PBS-Tween. Luego, 100 µ? de PBS que contiene albúmina de suero bovino al 1% (p/v) (A3803; Sigma Chemicals Co . ) es adicionado a cada cavidad y la placa es incubada a 37°C durante 1 hora. Las cavidades luego son lavadas 3 veces adicionales con PBS-Tween, y luego 50 µ? de cada sobrenadante de cultivo de los hibridomas en crecimiento es adicionado a cada cavidad. La placa luego es incubada a 37°C durante 1 hora, y las cavidades son lavadas nuevamente 4 veces con PBS-Twenn. Después del lavado, 50 µ? de anticuerpo de inmunoglobulina de anti-ratón de cabra marcada con peroxidasa de rábano picante (Southern Biotechnology, Birmingham, AL), diluido 1000 con PBS, es adicionado por cavidad, y la placa es nuevamente incubada a 3 °C durante 1 hora, después de lo cual las cavidades son lavadas 4 veces con PBS-Tween. El sistema de sustrato liquido (Sigma) de 3, 3' , 5, 5' -Tetrametil-bencidina (TMB) luego es adicionado en una cantidad de 100 µ?/cavidad y la placa se deja permanecer a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego la reacción es detenida mediante la adición de 100 µ?/cavidad de H2S04 0.2N. La absorbencia de cada cavidad a 450 nm (control 650 nm) es medida usando un lector de microplaca (Molecular Devices) y las células de fusión son seleccionadas de la muestra que tiene la absorbencia (450 nm-650 nía, valores OD; >0.5) claramente más alta que aquellas a las cuales no se han adicionado sobrenadante de células de fusión (valores de OD; * 0.03) . Además, los sobrenadantes del cultivo de los hibridomas en crecimiento también son funcionalmente clasificados, al medir la cantidad inductora de apoptosis usando células Jurkat. Cincuenta µ? del medio RPMI que contiene células Jurkat (1000 células por cavidad) y Bisindolilmaleimida VIII 5 uM (Bis VIII, Alexis, San Diego, CA) son adicionados en placas de 96 cavidades en la presencia de 50 µ? de los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas en crecimiento. Las células son cultivadas en una incubadora humidificada a 37 °C durante la noche. La apoptosis es determinada mediante la viabilidad celular usando el kit ATPLite como es instruido por el fabricante (Packard Instruments), y las muestras son contadas usando el TopCounter (Packard Instruments) . 2.5 Enlace de Elisa de TRAIL y TRA-8 a los receptores Placas de ELISA son recubiertas con 2 µg/-r?l de la proteina de fusión DR4-Ig o DR5-Ig durante la noche. Después del bloqueo con BSA al 3%, el TRAIL-FLAG soluble o TRA-8 es adicionado a concentraciones indicadas e incubado a 37 °C durante una hora. El enlace de TRAIL o TRA-8 es detectado mediante el anticuerpo anti-Flag conjugado con HRP (Alexis) o IgGl anti-murino conjugado con HRP (Southern Biotechnology) , respectivamente. Las reacciones son desarrolladas mediante la solución reguladora de sustrato TMB y medidas por el Benchmark Microplate Reader (BioRad) . Los valores de Kd son estimados por el modelo de enlace de un sitio de regresión no lineal usando el software GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA) . Para ELISA competitiva, 100 ng/ml de TRAIL-FLAG son adicionados e incubados en la presencia de concentraciones de TRA-8. El enlace de TRAIL eS determinado como antes. 2.6 Clonación Las etapas descritas en los Ejemplos 2.3 y 2.4 anteriores son repetidas 5 veces para las células seleccionadas en 2.4, para habilitar de esta, manera la selección de varios clones de hibridoma, cada uno de los cuales produjo un solo anticuerpo que enlazó DR5-IgG pero no enlazó Fas-IgG. Como un resultado de este procedimiento ' de selección, un hibridoma de ratón-ratónr -designado TRA-8 y que produce un anticuerpo que enlaza a DR5-IgG, pero no Fas-IgG, es obtenido. Este hibridoma, TRA-8, se depositó con la Colección Americana de Cultivo Tipo el 1 de Marzo del 2000, y se ha asignado con el número de acceso PTA-1428.. La subclase del anticuerpo producido por el hibridoma de ratón-ratón TRA-8 (después en la presente referido simplemente como "TRA-8") es demostrada que es IgGl, k, después de probar con un kit de isotipo de anticuerpo monoclonal (Pierce). Usando las proteinas de fusión DR5-IgGl humanas de los inventores como inmunógeno, siete clones de hibridoma son obtenidos mediante la clasificación de ELISA inicial, todos los cuales son fuertemente positivos para DR5-IgG pero no la proteina de fusión Fas-IgG, indicando que los hibridomas obtenidos producen anticuerpos que reconocen la porción extracelular de DR5 pero no la porción Fe de IgGl (datos no mostrados) . 2.7 Análisis de manchado de Western Filtros para el análisis de manchado de Western de homogenados de tejido de cáncer y humano normales son adquiridos de Geno Technology (St Louis, MO) . Cada franja es cargada con . una cantidad igual de proteina como es determinado, por. un anticuerpo anti-p-actina. Las manchas son sondeadas con 1 µg/ml.. de TRA-8 durante la noche, y seguido por. el IgGl anti-ratón de cabra conjugado con HRP (Southern Biotechnology) a temperatura ambiente durante una hora, y reveladas por quimioluminiscencia . 2.8 Inmunohistoquimica In si u Tejidos humanos son obtenidos del Tissue Procurement Center of UAB. Secciones congeladas son fijadas en etanol al 70%, bloqueadas con suero de caballo al 10% en PBS, y luego incubadas con 10 µg/ml de TRA-8 purificado por afinidad a temperatura ambiente durante 60 minutos. El kit ABC de IgG anti-ratón con diaminobencidina (Vector, Burlingame, CA) como el sustrato colorimétrico es usado para visualidad la reactividad. 2.9 Análisis de la activación de caspasa Células Jurkat (lxloVml) son incubadas con 500 ng/ml de TRA-8. Alícuotas (30 ]ig de proteina) del lisado de células son separadas en SDS-PAGE al 15%, manchadas sobre una membrana de nylon, y las manchas son sondeadas con anticuerpos anti-caspasa 8, 9 y 3 (BD Pharmingen, San Diego, CA) seguido por el anticuerpo secundario conjugado con HRP y la visualización por quimioluminiscencia de productos segmentados . El equipo inhibidor de caspasa es adquirido de R&D Systems (Minneapolis, MN) . Cada inhibidor de caspasa es adicionado al cultivo a concentraciones indicadas . Ejemplo 3. Purificación del Anticuerpo Monoclonal TRA-8 El hibridoma de ratón-ratón, TRA-8, es cultivado a una densidad de células de 1 x 106 células/ml mediante la incubación en 500 mi de medio ASF, que contiene FCS al 10% v/v, a 37 °C bajo C02 al 5% v/v durante 5 dias. El cultivo luego es centrifugado (1,000 r.p.m., 5 minutos) y el sobrenadante colectado. La purificación de TRA-8 del sobrenadante es obtenida usando la cromatografia de afinidad ProteinG-Sepharose CL-4B (Pharmacia) bajo las siguientes condiciones: columna: columna de ProteinG-Sepharose CL-4B (tamaño de columna 2 mi; Farmacia); solución reguladora de elución: Glicina 0.1 M (pH 2.4) , NaCl 0.15 M; solución reguladora de neutralización: Tris-HCl 1M (pH 8.5) .. Después de que todo el sobrenadante es aplicado a la columna, 20 mi de PBS son lavados tres veces y luego la solución reguladora es adicionada en volúmenes de 1 mi durante 10 veces. La densidad óptica de cada fracción eluida (1 mi) es medida. Las fracciones del No. 2 a No. 5 son colectadas por separado. Después de la adición de 100 µ? de solución reguladora de neutralización, los materiales eluidos son colocados en tubería de diálisis por separado, y los materiales eluidos dializados contra un litro de PBS (pH 7.5) a 4°C. La solución reguladora de diálisis es cambiada dos veces . Esta muestra es analizada para la actividad del anticuerpo anti-DR5 de ELI SA usando la proteina de fusión DR5 IgG humana preparada en lo anterior, usando la técnica descrita en lo anterior. Ejemplo 4. Preparación del antigeno DR4, vector de expresión DR4-Ig6 y el anticuerpo monoclonal anti-DR4 Los procedimientos de los E emplos 1-3 son repetidos con el cDNA de patrón DR4 y los cebadores en lugar de aquellos detallados en el Ejemplo 1 para obtener un antigeno DR4 que es utilizado según los Ejemplos 1.2-3 para obtener un anticuerpo monoclonal especifico contra DR4. Ejemplo 5. Anticuerpos monoclonales contra OcRl y DcR2 Los anticuerpos monoclonales son planteados contra los receptores de señuelo DcRl y DcRl al sustituir el cDNA y los cebadores correspondientes para crear los antigenos respectivos según el ejemplo 1. Los vectores de expresión para las fusiones DcRl o DcR2 con inmunoglobulina G y los anticuerpos monoclonales purificados resultantes son creados conforme a los Ejemplos 2 y 3. Ejemplo 6. La especificidad de un anticuerpo monoclonal Como todos los receptores para TRAIL y otras proteínas de la familia TNFR comparten homología significante, la especificidad del anticuerpo ejemplar TRA-8 para DR5 es determinada mediante el análisis de manchado de Western usando dos proteínas de fusión DR5-lgG humanas diferentes y formas recombinantes solubles de otras proteínas relacionadas. Una primera proteína de fusión DR5-IgG es construida al fusionar cDNA de los residuos 1-180 de la porción extracelular de DR5 y cDNA que codifica la región constante de IgG humano. El cDNA fusionado es clonado a un vector adenoviral recombinante . (Quantum Biotechnologies, Inc., Montreal, Canadá). La proteína de fusión DR5/hIgGl expresada, que tuvo un peso molecular relativo de 50 kDa, es purificada usando una columna de afinidad IgG antihumano (Sigma, St. Louis, MO) . Para el análisis de especificidad por manchado de Western, una segunda proteína de fusión DR5/IgGl humana recombinante (aa. 52-212), así como las proteínas de fusión TRAIL-R1, R3 y R4, son adquiridas de Alexis. Las formas solubles de Fas y TNFRl humanas son eordialmente proporcionadas por el Dr. Cari Edwards de Amgen, Inc., Thousands Oaks, Ca, USA. Las moléculas DR4, DcRl, DcR2, TNFRl, R4 y Fas humanas recombinantes solubles, usadas son las proteínas de fusión igGl humanas. 0.05 ug de cada proteína es separada por SDS-PAGE al 10% y manchadas sobre una membrana de nitrocelulosa. Las manchas son bloqueadas con leche seca al 5% en PBS a temperatura ambiente durante una hora, y sondeadas con 1 pg/ml de anticuerpo anti-DR5 monoclonal purificado (clon:TRA-8) o 0.1 ug/ml de IgG antihumano de cabra conjugado con HRP a 4°C durante la noche. IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) es usado como anticuerpo secundario para detectar TRA-8 enlazado. Estas manchas son reveladas por quimioluminiscencia . Las células Cos-7 transíectadas con el vector pcDNA3 (Clontech, Palo Alto, CA) que contienen el DR5 o DR4 de longitud completa o el vector vacio son usadas para el análisis de citometria de flujo. El cDNA de longitud completa que codifica TRAIL humano o el ligando Fas de murino es clonado en el vector pTRE corriente abajo del promotor controlable por tetraciclina (Clontech) . Los fragmentos de Xhol-HindIII de pTRE-hTRAIL o pTRE-mFasL son además clonados en el vector de enlace adenoviral pAdBN (Quantum Biotechnologies, Inc.). Las 293 células huéspedes son cotransfectadas con el pAd-TRE-hTRAIL linealizado o pAd-TRE-mFasL y el DNA de fragmento grande del adenovirus. La expresión del TRAIL humano, funcional o el ligando de Fas de murino de las placas de virus recombinantes es clasificada usando un ensayo de liberación de 51Cr con Jurkat como los objetivos.

TRA-8 reaccionó fuertemente con la proteina de fusión DR5-IgG (-50 kDa) , que es usado para la inmunización como es mostrado en la Figura la, DR5, #1 y débilmente con la segunda proteina de fusión DR5-IgG (-60 kD) como es mostrado en la Figura la, DR5, #2. No hay enlace significante de TRA-8 a DR4, DcRl, DcR2, Fas (CD95) o TNFRI. Estos resultados indican que TRA-8 reconoce los epitopes que son específicos para DR5 pero no compartidos por los otros miembros de la familia. TRA-8 no reacciona con otros miembros de la superfamilia de receptor TNF, tal como Fas (CD95) y el receptor I de TNF, ni TRA-8 reacciona cruzadamente con el homólogo de murino de DR5 como es mostrado por las relaciones de absorbencia ópticas para 450 nm y 650 nm, en donde el panel inferior de número 1-7 (Fig. la, la columna 8 del panel inferior) . TRAIL soluble y TRA-8 se enlazaron comparablemente al DR5 inmovilizado (Fig. Ib, panel izquierdo). En contraste, TRAIL enlazó a DR4, pero TRA-8 no mostró ninguna actividad de enlace a DR4 (Fig. Ib, panel de en medio) . Los valores de Kd para el enlace de TRAIL y TRA-8 a DR5 son estimados a 59 nm y 3 nM, respectivamente. De manera importante, TRA-8 eficientemente compite con TRAIL para el enlace a DR5 pero no para él enlace a DR4,. como, es mostrado en la ELISA competitiva (Fig. Ib, panel derecho). Estos : esultados establecen la especificidad de TRA-8. para DR5. humano TRA-8 es capaz de detectar la expresión de DR5 de la superficie de la célula, con el análisis citométrico de flujo indicando enlace especifico a la superficie de la célula, de las células Cos-7 transfectadas en el DR5 humano de longitud completa pero, no de las células Cos-7 transfectadas con DR4 o el vector vacio (Fig. le) . De manera similar, la inmunohistoquimica in si tu con TRA-8 demostró reactividad con las células Cos-7 transfectadas con el DNA de DR5 de longitud completa pero no con aquellas transfectadas con el vector de control (Fig. Id). TRA-8 no induce apoptosis de las células Cos-7 no transfectadas y la RT-PCR de R A de las células Cos-7 usando cebadores emparejados que codifican DR5 humana mostraron que no son productos de PCR especificos . Además el análisis funcional usando células Jurkat humanas como objetivos mostró que, en la ausencia de reticulación, TRA-8 fuertemente induce muerte celular, demostrado por tres ensayos diferentes para la viabilidad celular incluyendo ATPLite, MTT y la exclusión PI (Fig. le) . Mayor que 50% de células Jurkat son exterminadas por niveles de nanograma de TRA-8 como es mostrado por el ensayo ATPLite. La actividad de exterminación de TRA-8 es especifica para DR5 ya que podria ser bloqueada por DR5-Ig pero no la proteina de fusión DR4-Ig (datos no mostrados) . La segmentación de las caspasas 8, 9 y 3 podria ser detectada por el análisis de manchado de Western tan temprano como 30 minutos después del tratamiento de TRA-8 de las células Jurkat (Fig. lf) , y la muerte celular de las células Jurkat es completamente inhibida por el inhibidor de caspasa general (Z-VAD) (Fig. lg) . Los inhibidores de caspasa individuales para caspasa 8, 3, 9 y 10 parcialmente inhibieron la muerte celular, indicando además que la muerte celular mediada por TRA-8 es principalmente a través de un mecanismo apoptópico dependiente de la caspasa. Ejemplo 7. Análisis citométrico de flujo de la expresión del DR5 de superficie de la célula: Un receptor inductor de muerte mayor en muchas células de tumor pero no en células normales La habilidad de TRA-8 para enlazar DR5 expresado sobre la superficie de la célula y la especificidad de esta reacción luego es estimada usando células COS-7 (Colección Americana de Cultivo Tipo No. CRL-1651) transfectadas con el vector de expresión que contiene el cDNA de DR5 o DR4 humano de longitud completa o el vector vacio como control. IgGl anti-ratón conjugado con ficoeritrina (PE) (Pharmingen) es usado como el segundo anticuerpo para detectar el TRA-8 enlazado. La fluorescencia de 1 x 104 células es medida, usando un citómetro de flujo (FACSVantage) bajo las siguientes condiciones : Longitud de onda de excitación: 488 nm; Longitud de onda de detección: 600 nm.

El análisis de citometria de flujo mostró que TRA-8 manchó aproximadamente 30% de las células COS-7 transfectadas con el vector DR5 como es mostrado en el histograma lleno de la Figura le. Este porcentaje es paralelo con la eficiencia de transfección como es determinado por el análisis de transfección usando protelna fluorescente verde (GFP) (datos no mostrados) . TRA-8 no manchó significativamente células transfectadas con ya sea DR4 (el histograma vacio) o el vector de control (el histograma de guiones), indicando que TRA-8 es especifico para DR5 de la superficie de la célula. Aunque la expresión de DR5 en las células de tumor ha sido estudiada extensivamente en el nivel de mR A (REFERENCIA dispuesta), la expresión de superficie de DR5 no se ha documentado. Asi, la disponibilidad del anticuerpo anti-DR5 monoclonal permite examinar los niveles de superficie del DR5, y correlacionar la expresión con la susceptibilidad de las células a la apoptosis mediada por TRAIL. El siguiente panel de células (1 x 106) es incubado con 10 pg/ml de TRA-8 purificado por afinidad a temperatura ambiente durante 30 min, y luego manchado con IgGl anti-ratón conjugado con PE (Pharmingen) durante otros 30 min. 10,000 células viables son analizadas usando el citómetro de flujo FACS vantage bajo las siguientes condiciones: Longitud de onda de excitación: 488 nm; Longitud de onda de detección: 600 nía.

Las cinco lineas de células hematopoyéticas probadas son células Jurkat, CEM-6, Molt-4, H-9 y U937. La expresión DR5 es detectable sobre la superficie de las células Jurkat, CEM-6, H-9 y U937 pero es casi indetectable en las células Molt-4 como es mostrado en la Figura 2a y 2a' . Aunque niveles altos de la expresión de RNA de DR5 se han descrito previamente (43), el análisis de FACs indicó que estas células no expresan altos niveles del DR5 en la superficie. Estos resultados indican que la expresión de DR5 de la superficie de la célula no se correlaciona con la expresión transcripcional de DR5 que no es inesperada para un receptor de tal clase. El nivel de la expresión de DR5 de . la superficie de la célula puede ser especifico de la clase de la célula, puesto que la mayoría de las células de origen hematopoyético expresaron bajos niveles mientras que la mayoría de las células de glioma y de próstata expresaron altos niveles de DR5. El anticuerpo monoclonal TRA-8 es usado para determinar la función de DR5 en la inducción de la apoptosis mediada por TRAIL al examinar su expresión de la superficie de la célula entre un panel de diferentes tipos de células de tumor humano asi como la susceptibilidad de estas células a la apoptosis mediada tanto por TRAIL como por TRA-8. Las células . T de la sangre periférica primarias no expresaron niveles significantes de DR5 de la superficie de la célula y son resistentes a la apoptosis mediada tanto por TRAIL como por TRA-8 (Figs. 2a, 2a' y 3a') . Aunque todas las cinco de las lineas de células de leucemia T humana expresaron niveles detectables aunque relativamente bajos de DR5 en la superficie de la célula, dos de estas (Jurkat y CEM-6) son altamente susceptibles a la apoptosis mediada tanto por TRAIL como mediada por TRA-8 indicando que DR5 solo es suficiente para inducir apoptosis de estas células. Las células Molt-4 y U937 son parcialmente susceptibles a la apoptosis mediada por TRAIL pero son relativamente resistentes a la apoptosis mediada por TRA-8, sugiriendo que otros receptores de TRAIL podrían estar implicados en la transducción de una señal de apoptosis. Las células H-9 son resistentes a la apoptosis mediada tanto por TRAIL como por TRA-8 implicando un bloqueo mediado por una ruta de anti-apoptosis intracelular . El panel de células incluyó las lineas de células de glioma maligna humano, Hs683, U251MG, D37MG, D54MG, U373MG, CH235 G, U87 y los astrocitos humanos normales, que fueron proporcionados por el Dr. Yancey Gillespie del Neurosurgery Department of the University of Alabama at Birmingham. Las lineas de células de cáncer de próstata humano, Dul54, PC3 y LnCap, fueron proporcionadas por el Dr. William Grizzlé del Pathology Department of the University of Alabama at Birmingham quien ha obtenido las lineas dé células de la Colección Americana de Cultivo Tipo. Las lineas de células T de leucemia humana, linfoma de células B, HepG2 Jurkat (Colección Americana de Cultivo Tipo TIB-152) y CCRF-CEM CEM-6 (Colección Americana de Cultivo Tipo CCL-119); lineas de células de monocito, U937 (Colección Americana de Cultivo Tipo CRL-2367); se adquirieron de la Colección Americana de Cultivo Tipo. Todas las lineas de células anteriores son cultivadas en RPMI 1640 suplementado con FCS al 10%. La linea de célula de astrocitoma humano, 1321N1, fue cordialmente proporcionado por el Dr. Ric ar Jope del Psichiatry Departament of the Unviersity of Alabama at Birmingham, y cultivadas en DMEM suplementado con FCS al 5%. TRAIL humano recombinante soluble, adquirido de Alexis Corporation (San Diego, CA) , es una proteina de fusión comprendida del dominio extracelular de TRAIL humano (residuos aa 95 a 281) fusionado en el N-terminal a un FLAF-tag y un péptido enlazador de 8 aminoácidos. Distinto al TRAIL marcado con His previamente reportado, esta preparación de TRAIL solo, no induce una fuerte respuesta apoptópica en las células Jurkat y requiere un anticuerpo anti-FLAG como un · reticulador para mejorar la apoptosis. El anticuerpo anti-FLAG también se adquirió de Alexis. Todas las 10 células de glioma maligno humano probadas expresaron niveles detectables de DR5 en la superficie de la célula. La mayoría expresaron niveles intermedios a altos de DR5 como es mostrado en la Figura 2b. Tres lineas, D-54MG, U373MG y CH-235MG expresaron altos niveles de DR5 mientras que seis lineas, Hs-683, U251-MG, D37-MG, U87, SMK1 y 1321N1, expresaron niveles intermedios de DR5. Solamente una linea de células, H-465 expresó bajos niveles de DR5. Todas las tres lineas de células de cáncer de próstata expresaron altos niveles de DR5 como es mostrado en la Figura 2c. Similar a las células T primarias normales, las células B primarias no expresaron niveles significantes de DR5 y no se someten a la apoptosis después del tratamiento con ya sea TRAIL o TRA-8 (Fig. 2d) . Tres (SKW6.4, EB-3 y Raji) de cada una de cuatro lineas de células de linfoma B probadas, expresaron niveles relativamente altos de DR5 y son muy susceptibles a la apoptosis mediada tanto por TRAIL como TRA-8. La cuarta linea de células, Daudi, expresó niveles muy bajos de DR5 y es mucho menos susceptible a la apoptosis mediada ya sea por TRAIL o por TRA-8. Aunque los astrocitos primarios no expresaron niveles detectables de DR5 en los niveles de la célula (Fig 2b' ), todas las cuatro lineas de células de glioma probadas expresaron altos niveles de DR5. El nivel más alto de expresión de DR5 en las células de glioma que sobre las células T y. B no está acompañado por una susceptibilidad significativamente más grande, a la apoptosis mediada por TRAIL y por- DR5, sugiriendo que el nivel de la expresión de DR5 en la superficie de la célula no está necesariamente correlacionada con el nivel de apoptosis de las células de tumor. RT-PCR, realizada para determinar niveles de mensaje de DR4, DR5 y DCR2, detectó mensaje en todas las células probadas (Tabla 1). Sin embargo, en general, las células normales primarias expresaron niveles relativamente bajos de DR5 comparado con las células de tumor transformadas. Tabla 1: Análisis de RT-PCR de la expresión de receptor de TRAIL* Células DR5 DR4 DcR2 Células T <0.001 <0.001 0.015 primarias Jurkat 0.10 <0.001 0.21 CE -6 0.50 0.59 0.25 Molt-4 0.10 <0.001 0.05 H-9 0.73 0.61 0.07 Células B <0.001 <0.001 0.024 primarias SKW6.4 0.95 0.66 0.45 EB3 0.40 <0.001 0.35 Raji 0.55 0.11 0.45 Daudi 0.73 0.36 0.63 Astrocitos 0.05 <0.001 0.12 normales SH683 0.56 0.96 0.14 U87 0.44 0.56 0.21 D54 1.15 0.46 0.12 1321N1 0.25 0.35 0.05 * El RNA total se aisló de las células y la RT-PCR se realizó como es descrito en los Métodos. Los productos de PCR se separaron en gel de agarosa al 3% y se analizaron mediante el Fluor-S MAX Multilmager System (BioRAD) . Los valores son presentados como una relación relativa a la ß-actina. Ejemplo 8. Inducción de apoptosis in vitro en células malignas Para determinar si el TRA-8 induce a apoptosis en células transformadas in vitro, todas las células de tumor positivas de DR5 son examinadas para su susceptibilidad a la apoptosis inducida ya sea por TRA-8 o TRAIL. Células objetivo (1 x 103 por cavidad) son cultivadas en placas de 96 cavidades en la presencia de las concentraciones indicadas de TRAIL soluble más agente de reticulación (Alexis) o TRA-8 a 37°C durante la noche. La viabilidad de las células es determinada usando (1) el kit ATPLite de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Packard Instruments, Meriden, CT); (2) el kit de proliferación/viabilidad de Células MTT (Sigma); o (3) manchado de PI de células muertas y analizadas por la citometria de flujo. Al final del cultivo, las células son manchadas con 10 µ?/ml de PI y las células negativas de PI son confinadas como células viables. Para el análisis de núcleos condensados de hepatocitos, las células son manchadas con 10 ng/ml de Hoechst 33352 (Molecular Probes) y analizadas mediante la citometria de flujo. El anticuerpo TRA-8 es capaz de inducir apoptosis en la mayoría de las lineas de células de glioma humano maligno (9/10), en 2 de las 3 lineas de cáncer de próstata y en 2 de las 4 lineas de células hematopoyéticas positivas de DR5. No se indujo apoptosis en la linea de células Molt-4, que expresó niveles de DR5 en la superficie de la célula casi indetectables . Los niveles de susceptibilidad de las células a la apoptosis mediada por TRA-8 sin embargo varió considerablemente entre las lineas de células. La variabilidad de la susceptibilidad de las células a la apoptosis inducida por el anticuerpo TRA-8 sugiere que aunque un nivel miñimo de la expresión de DR5 de la superficie de la célula es requerido, el nivel de la expresión de DR5 de la superficie de la célula no es necesariamente la determinante primaria de susceptibilidad y otros factores influyen en este proceso. Aunque todas las células de . glioma generalmente - expresaron niveles significativamente más altos del DR5 de la superficie que las células hematopoyéticas, la susceptibilidad de las células de glioma a la apoptosis inducida ., po TRA-8 no es proporcionalmente incrementada comparado con las células hematopoyéticas . La susceptibilidad de cinco de las líneas de células de glioma D-37MG, D54-MG, U373-MG, CH235-MG y 1321N1, a la apoptosis inducida por TRA-8 es alta y es equivalente a su susceptibilidad a la apoptosis mediada por TRAIL como es mostrado en la Figura 3b. Dos de las líneas de células de glioma, H-456 y SMK1, son mucho menos susceptibles a la apoptosis inducida por TRA-8. En el caso de las células H-456, la expresión de DR5 de la superficie es baja; sin embargo, la expresión de DR5 de la superficie sobre SMK1 es similar a las líneas de células más susceptibles, sugiriendo que otros mecanismos podrían desempeñar una función en la determinación de la susceptibilidad a la apoptosis mediada por TRAIL. Aunque todas las tres lineas de células de cáncer de próstata expresaron altos niveles de DR5, las células Dul45 son más sensibles a la apoptosis inducida por TRA-8, las células PC3 son parcialmente sensibles, mientras que las células LnCAP son completamente resistentes como es mostrado en la Figura 3c. Entre las células hematopoyéticas, se encuentra que Jurkat y CEM-6 son muy susceptibles a la apoptosis por TRA-8 como es mostrado en la Figura 2a, aunque ambas de estas líneas de células se han encontrado que expresan bajos niveles de DR5. Aunque DR5 es detectable sobre las células- U937, estas células son resistentes a la apoptosis inducida por TRA-8. De manera similar, aunque las células H-9 expresaron niveles detectables de DR5, las células H-9 son resistentes a la apoptosis inducida por TRA-8. Estos resultados implicaron la existencia de mecanismos reguladores que influyen en la apoptosis mediada por DR5. Los anticuerpos anti-DR5 de enlace de la superficie adicionales son producidos según los procedimientos de los Ejemplos 1-3. Dos anticuerpos anti-DR5 adicionales designados TRA-1 y TRA-10 son estudiados junto con TRA-8 para determinar la habilidad comparativa para inducir apoptosis y de esta manera actuar como un agonista o inversamente bloquear la apoptosis mediada por TRAIL, para actuar de esta manera como un antagonista. Las células Jurkat humanas son usadas como un objetivo para determinar la actividad agonística y/o antagonista de los tres anticuerpos anti-DR5 denotados TRA-1, TRA-8 y TRA-10. Como es mostrado en la Figura 4, la viabilidad celular es de aproximadamente 90%, 70% y 20% para TRA-10, TRA-1 y TRA-8, respectivamente en la incubación durante la noche con 2.5 pg por mi. TRA-8 indujo una fuerte respuesta apoptótica en un aspecto dependiente de la dosis mientras que TRA-1 indujo solamente una respuesta apoptótica moderada y TRA-10 solamente indujo una respuesta débil. TRA-8 por lo tanto es clasificado como un anticuerpo anti-DR5 agonista. En la Figura 4, la viabilidad de las células Jurkat humanas es mostrada como una función dependiente de la dosis de la apoptosis inducida por TRAIL. TRA-10 bloqueó la apoptosxs de las células Jurkat . humanas a un grado significante en un estudio de apoptosis inducida por TRAIL a baja dosis. Asi, TRA-10 es clasificado como un anticuerpo anti-DR5 antagonista. La susceptibilidad de cinco de las lineas de células de glioma, D-37MG, D54-MG, U373-MG, CH235-MG y 1321N1 a la apoptosis inducida por TRA-8 es equivalente a su susceptibilidad a la apoptosis mediada por TRAIL como es mostrado en la Figura 3b, indicando que la apoptosis inducida por TRAIL en estas células es mediada principalmente a través de DR5. Además, dos de las lineas.de células de glioma/ Hs683 y U251-MG, son resistentes a la apoptosis inducida por TRAIL pero parcialmente sensibles a la apoptosis inducida por TRA-8 indicando que los receptores de señuelo funcionan en estas células y que el uso del anticuerpo TRA-8 desvió este mecanismo regulador. En las lineas de células de cáncer de próstata, a pesar de la sensibilidad variante a la apoptosis inducida por TRA-8, esto fue pararalelo a la sensibilidad de las células a la apoptosis inducida por TRAIL, nuevamente sugiriendo que DR5 desempeña una función principal de la apoptosis mediada por TRAIL en las células de cáncer de próstata. Entre las células hematopoyéticas, - se encuentra que Jurkat y CEM-ß son muy susceptibles a ^ la apoptosis mediada tanto por TRA-8 como por TRAIL. El nivel de apoptosis inducido por TRA-8 es comparable con- aquel inducido por TRAIL, como es mostrado en las Figuras 2a y 3a' . Solamente una de las lineas de células de glioma, U87, y dos lineas de células hematopoyéticas, U937 y Molt-4, mostraron sensibilidad a la apoptosis inducida por TRAIL pero son menos sensibles o resistentes a la apoptosis inducida por TRA-8. Una linea de células, la linea de células H-9, expresó niveles detectables de DR5 pero son resistentes a la apoptosis inducida ya sea por TRA-8 o TRAIL. Mientras que niveles mínimos de expresión de DR5 son requeridos para la apoptosis inducida por TRA-8, el nivel de expresión de DR5 no necesariamente predice la susceptibilidad de las células a la apoptosis mediada por TRA-8; los receptores de señuelo desempeñan una función en modular la apoptosis mediada por TRAIL en algunas células, pero no aparecen para desempeñar una función principal en la mayoria de las células probadas hasta la fecha; como es anticipado el anticuerpo TRA-^-8 desvia los efectos de los receptores de señuelo; las mutaciones funcionales del receptor DR5 pueden ocurrir en células transformadas; y, finalmente, los mecanismos reguladores intracelulares pueden ser tan importantes, o más importantes que los receptores de señuelo en definir la susceptibilidad de las células a la apoptosis mediada por TRAIL y por DR5. Estudios , previos han mostrado que el mRNA para DR5 es distribuido ampliamente en tejidos. normales7. Para evaluar la -expresión de DR5 al nivel de la proteina, un panel de homogenados de tejido humano normales (Geno Technology, St. Louis, MO) es sondeado con el anticuerpo TRA-8 en el análisis de manchado de Western. Entre nueve tejidos humanos normales, el tejido de cerebro es débilmente positivo (Fig. 5a, franja 2) . La proteína DR5 no es detectabie por la reactividad de TRA-8 en el hígado (franja 1), pulmón (franja 3), riñon (franja 4), bazo (franja 5), testículos (franja 6), ovario (franja 7), corazón (franja 8) o páncreas (franja 9). En contraste, todos los trece tejidos de cáncer humano mancharon positivamente con TRA-8 (Figura 5b) , incluyendo los cánceres del ovario (franja 1), pulmón (franja 2), hígado (franja 3), recto (franja 4), cerviz (franja 5), piel (franja 6), testículos (franja 7), tiroides (franja 8), útero (franja 10), estómago (franja 11), laringofaringe (franja 12) y páncreas (franja 13). Además, la inmunohistoquímica in situ de tejidos normales y de cáncer con TRA-8 confirmó que además de las células positivas un poco dispersadas en el bazo, la expresión de DR5 en los tejidos normales de pecho, pulmón y bazo no es detectabie (Fig. 5c) . Los tejidos de cáncer correspondientes que incluyen carcinoma ductal de infiltración de pecho, cáncer de pulmón de célula pequeña, y linfoma reaccionaron positivamente con TRA-8 (Fig. 5d) . Entre un total de 22 tejidos de cáncer examinados, 5 de 6 cánceres de pecho, 2 de 2 cánceres de la cerviz, 4 de 5 cánceres de hígado, 5 de 8 linfornas, 2 de 2 cánceres de pulmón y 2 de 2 cánceres de próstata reaccionaron positivamente con TRA-8. Estos resultados son consistentes con aquellos del análisis de citometria de flujo e indican que los tejidos cancerosos expresan niveles más altos de proteina DR5 que los tejidos normales . Ejemplo 9. Actividad tuatioricida de TRA-8 ±n vivo Por varias razones, muchos agentes que muestran promesa en los estudios in vitro no muestran eficacia in vivo. Por lo tanto, es importante probar la eficacia de TRA-8 en un modelo de animal in vivo. Para realizar esto, el anticuerpo DR5 antihumano TRA-8 es administrado a ratones que llevan xenoinjertos humanos que expresan la molécula DR5 humana. Los ratones usados son ratones NOD/SCIC de 6 a 8 semanas de edad (Jackson Laboratory), que son inoculados subcutáneamente con las células 1321N1 de astrócitoma humano (lxlO7), o inoculados intravenosamente con células Jurkat de leucemia humana (lxlO6) . En el dia 2 después de la inoculación del tumor, los ratones son inoculados intravenosamente con TRA-8 (100 ]xg) . Cinco dias después del tratamiento con TRA-8, el crecimiento del tumor 1321N1 es determinado por el tamaño y el peso de la masa de tumor. El crecimiento de las células Jurkat es determinado- por el peso del bazo y el porcentaje de células Jurkat positivas de CD3 humanas en el bazo de animales inoculados. Las. biopsias de tejido de tumor son tomadas y examinadas histológicamente.

El tratamiento temprano con una dosis intravenosa individual de 100 de TRA-8 en un dia después de la inoculación del tumor completamente inhibió las células 1321N1 de la formación de . un tumor sólido de (Fig. 6a). El tratamiento tardío con tres dosis de 100 g de TRA-8 en una semana después de la inoculación del tumor redujo el peso del tumor 4 veces o mayor (Fig. 6b) . La formación del tumor no es visible en animales tratados con TRA-8 en un punto de tiempo temprano (Fig. 6c, panel superior) . El análisis histológico reveló tejido de tumor notablemente degenerado en animales tratados con TRA-8 (Fig. 6c panel inferior). De manera similar, el tratamiento con TRA-8 inhibió la población del bazo por las células Jurkat como es demostrado por la escasez de células Jurkat positivas de CD3 en el bazo (Fig. 6d, 6e) . El análisis histológico del tumor implantado mostró unas cuantas células de tumor dispersadas en el tejido blando en los animales tratados con TRA-8, mientras que los controles mostraron la formación de un tumor sólido como es mostrado en la Figura 6c. En el modelo de células Jurkat, el número de células Jurkat en los bazos de los animales tratados con TRA-8 es menor que 2% comparado con casi 10%. en el. bazo de los animales de control como es demostrado por: el análisis ,.de citometria de flujo como es mostrado en la Figura 6a y el manchado de CD3 in situ de la Figura 6c.

Estos resultados confirman la demostración reciente de que la administración sistémica del TRAIL recombinante reticulado inhibe el crecimiento del tumor in vivo (13) . Estos resultados indican que una dosis individual de TRA-8 es altamente efectiva en la eliminación de las células de tumor in vivo. Como un anticuerpo anti-huraano es usado en un modelo murino, la toxicidad del tratamiento con DRA8 no podria ser estimada. Sin embargo, el estudio de la administración de TRAIL in vivo indicó que nada de toxicidad significante está asociada con este tratamiento (13). Ejemplo 10. Células sinoviales de . RA son susceptibles a la apoptosls inducida por TRAIL y por TRA-8 La mayoría de los estudios de la técnica previa de la apoptosis mediada por TRAIL se han enfocado sobre células malignas . La apoptosis mediada por TRAIL de acuerdo con la presente invención también es terapéutica en condiciones autoinmunes e inflamatorias, tal como RA. 10.1 Análisis citamétrico de flujo de la expresión de DR5 de la superficie de la célula en células sxnoviales de RA La expresión de DR5 sobre un panel de ocho células sinoviales cultivadas primarias de pacientes con DRA es comparada con aquella sobre ocho células sinoviales cultivadas primarias de pacientes con osteoartritis (después en la presente referido como "OA") . Los ocho cultivos de células sinoviales de RA primarias humanas RA-1014, RA-1016, RA-1021, RA-512, RA-707, RA-811, RA-716 y RA-929 son cordialmente proporcionados por el Dr. M. Ohtsuki (Sankyo Co. Ltd., Tokyo, Japón) y cultivadas en DMEM suplementado con FCS al 10%, penicilina, estreptomicina y glutamina. Los siete cultivos de células primarias de células sinoviales de OA son aislados de los tejidos sinoviales de pacientes con OA mediante un método de colagenasa estándar y cultivados bajo las mismas condiciones. El número de pasaje de todas las células primarias está debajo de 10. La expresión de DR5 es determinada mediante el análisis FACs como es descrito en el Ejemplo 5. Todos los cultivos primarios de células RA expresaron altos niveles de DR5 de la superficie y hay poca variación en los niveles de expresión entre estas células sinoviales aisladas de diferentes pacientes como es mostrado en la Figura 7a. En contraste, la expresión de DR5 de la superficie, sobre la superficie de las células sinoviales aisladas de los pacientes con OA es muy baja o indetectable según la Figura 7b. Las células sinoviales transformadas con SV40 se encuentran que expresan altos niveles de DR5 comparables con aquellos mostrados por las células RA. En contraste, las células de fibroblasto no transformadas expresaron bajo niveles de DR5 comparables con aquellos mostrados por las células OA en la Figura 7b. 10.2 Susceptibilidad de las células sinov ales de RA a la apoptosis mediada por TRA-8 o TRAIL En general, todas las células sinoviales aisladas de los pacientes de RA son susceptibles a la apoptosis inducida por TRAIL y por el anticuerpo anti-DR5 y todas las células de OA son resistentes a la apoptosis inducida por TRAIL y por el anticuerpo anti-DR5 según las Figuras 8a, b. Estos estudios indican que el anticuerpo TRA-8 se dirige a las células alteradas de preferencia con respecto a las células normales. Además, el patrón de la susceptibilidad o resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL está correlacionado con aquel inducido por el anticuerpo anti-DR5, indicando que . las células sinoviales principalmente utilizan DR5 para activar la apoptosis por TRAIL. Como es descrito para las células malignas, la susceptibilidad a la apoptosis inducida por TRAIL o el anticuerpo anti-DR5 varió entre las células sinoviales de RA aunque expresan niveles similares de DR5. RA-512 y RA-707 son las más susceptibles ya que más de 80% de células son matadas por concentraciones de TRAIL o TRA-8 por debajo de 20 ng/ml. RA-1014, RA-811, RA-716 y RA929 están entre aquellas con la susceptibilidad intermedia a TRAIL o a TRA-8, con casi 100% de muerte celular que ocurre en la presencia de altas concentraciones (>50 ng/ml) de TRAIL o TRA-8. En las células RA-1016 y RA1021, aunque la mayoria (arriba de 60%) de las células son matadas con una baja dosis de TRAIL o TRA-8, una porción de células sobrevivió en la presencia de altas concentraciones de TRAIL o TRA-8, indicando que una subpoblación de células son resistentes a la apoptosis mediada por TRAIL. En contraste, todas las células de OA son - mucho menos susceptibles a la apoptosis inducida por TRAIL y por TRA-8. No mayor que 60% de células son matadas en el OA52F y OA69F aun en la presencia de alta concentración de TRAIL o TRA-8. Las. células OA72M son completamente resistentes a la apoptosis inducida por TRAIL o TRA-8. Las células sinoviales transformadas con SV40 también son susceptibles a la apoptosis inducida por TRAIL y por TRA-8 (datos no mostrados) . En contraste, las células de fibroblasto no transformadas se presentan que son resistentes a TRAIL y TRA-8. Se ha mostrado previamente que DR5 utiliza una ruta dependiente de FADD/caspasa 8 para activar la apoptosis (44) . Para determinar la dependencia de caspasa de la apoptosis mediada por DR5 de las células sinoviales de RA, las células de RA son cultivadas con TRAIL o anticuerpo anti-DR5 en la presencia de inhibidores de caspasa especificos. Entre los ocho inhibidores de caspasa probados, los inhibidores de caspasa 6, 8 y 10 son capaces de inhibir la apoptosis de las células sinoviales de RA inducida tanto por TRAIL como por DR5, como es mostrado en la Figura 9, indicando que estas tres caspasas están involucradas en la apoptosis mediada por DR5. 10.3 TRA-8 o TRAIL induce la activación de NF-kb en células sinoviales de RA sin liberación incrementada de MMPs Hay evidencia considerable para apoyar el concepto de que existen enlaces cercanos entre la señalización de apoptosis y la señalización de proliferación (45) . Se ha establecido que DR5 es capaz de activar una ruta de NF-kb además de la transducción de señalización de apoptosis, y que la activación de NF-kb puede ser capaz de transducir una señal anti-apoptosis . Por lo tanto se lleva a cabo un ensayo de desplazamiento de gél. Las células son estimuladas con 50 ng/ml del TRAIL soluble recombinante, el ligando Fas en la presencia de 1 mg/ml de me orador, o 50 ng/ml de TRA-8 para el tiempo indicado. Los extractos nucleares son preparados e incubados con la sonda oligo-DNA marcada con [32P] doblemente manchada. Los resultados son analizados Usando el fosfa-formador de imagen ciclónico (TopCount NXT, Packard Instrument Company, CT) . Después de que las células sinoviales de RA son incubadas con TNF- o TRAIL, NF-kb es activado en un aspecto dependiente del tiempo. El anticuerpo TRA-8 es capaz de activar fuertemente NF-kb. En contraste, el ligando Fas es incapaz de inducir la activación de NF-kb según la Figura 10a. Asi, aunque TRAIL y el anticuerpo TRA-8 inducen una fuerte respuesta de apoptosis en las células sinoviales de RA, ellos también activan NF-kb, y la activación de Nf-kb se ha creído que contribuye a la función proinflamatoria de TNF- en RA. Asi, es posible que TRAIL, similar a TNF-ot, pueda servir como una citosina pro-inflamatoria. Para determinar si hay una consecuencia biológica similar de la activación de NF-kb inducida por TRAIL y TNF- , la producción de MPs es determinada por ELISA. Las células sinoviales son cultivadas en el medio solo o con 50 ng/ml de interleucina Ib, 10 hg/ml de TNF-a, 50 ng/ml de TRAIL o 50 ng/ml de TRA-8 durante la noche. Los niveles del MMP-1 y MMP-3 en los sobrenadantes de cultivo son determinados por los kits de ELISA. Cuando las células sinoviales de RA son incubadas con una citosina proinflamatoria, TNF- o IL-lb, la producción de MMP-1, 3 y 13 es incrementada comparada con el medio de control como es mostrado en la Figura 10 b, c. En contraste, el tratamiento con TRAIL o el anticuerpo anti-DR5 no está asociado con la liberación incrementada de estas MMPs . Ejemplo 11A. Deficiencia para inducir toxicidad hepatocelular Para ensayos de viabilidad celular de 24 horas, los hepatocitos normales frescos en placas de 96 cavidades se adquirieron de In Vitro Technology (Baltimore, MD) . Los hepatocitos son cultivados en el Medio de Cultivo de Hepatocito que contiene 1 g/ml de ya sea TRAIL soluble o TRA-8. Para ensayos de viabilidad de 6 horas, hapatocitos normales o células de cáncer hepatocelulares son aislados de muestras quirúrgicas frescas colectadas del UAB Tissue Procurement Center. Todos los reactivos para el aislamiento de hepatocitos humanos incluyendo la solución reguladora de perfusión de hepatocitos, el medio de digestión, el medio de lavado y el medio de unión son adquiridos de Gibco. Las platinas de tejido son digeridas en el Medio de Digestión de Hepatocito a 37 °C con agitación (50 rpm) durante una hora. Los hepatocitos aislados son cosechados mediante la centrifugación de baja velocidad (50 g, 3 min) , y lavados con el Medio de Lavado de Hepatocito seis veces . La suspensión de células individual de hepatocitos son cultivados en el Medio de Unión que contiene FCS al 10% en placas Matrigel de 96 cavidades (BD) durante seis horas. Los hepatocitos no unidos son retirados mediante el lavado dos veces con el medio de unión precalentado . Los hepatocitos unidos son adicionalmente incubados con varias concentraciones de TRAIL soluble o FasL en la presencia de agente de reticulación* o TRA-8 o CH11 durante 6 horas.

TRAIL tiene por lo menos dos receptores (DR4 y DR5) que son capaces de inducir apoptosis. TRA-8 es usado para determinar si la reticulación de DR5 solo es suficiente para inducir la apoptosis de hepatocitos normales. La expresión de DR5 al nivel de proteina es examinada inicialmente en cinco tejidos de hígado humano normales y cinco tejidos de cáncer de higado mediante la inmunohistoquímica in situ usando TRA-8. Secciones de los tejidos de hígado normales mostraron arquitectura normal y morfología celular en el manchado de H&E (Fig. lia, páneles superiores izquierdos) en la ausencia de reactividad positiva con TRA-8 para DR5 (Fig. lia, páneles inferiores izquierdos) . En contraste, el tejido de carcinoma hepatocelular humano reaccionó positivamente con TRA-8 en un patrón consistente con tanto la membrana celular en la presencia citoplásmica de DR5 sobre las células cancerosas. La línea de células de carcinoma hepatocelular humano HepG2 también es positiva para DR5. Estos resultados son consistentes entre los cinco tejidos de hígado normales, y solamente uno (adenoma de hígado) de cada cinco tejidos de cáncer de hígado, es negativo a DR5. Estos resultados son consistentes- con los datos de manchado de Western, mostrados en la Figura 5a, que, como con otros tejidos normales, el tejido de hígado humano normal no expresa niveles significantes de proteína DR5. Además, el análisis de manchado de Western de hepatocitos humanos normales, aislados, sondeado con TRA-8 no revela niveles detectables de DR5". La expresión de DR5 de la superficie de la célula sobre hepatocitos humanos mediante el análisis de citometria de flujo demostró que los hepatocitos normales frescamente preparados no expresaron: niveles detectables de DR5 de la superficie de las células (Figura lLb, páneles izquierdos superiores) . Ni es detectado sobre los hepatocitos humanos normales que se han criopreservado o colocado en el cultivo a corto plazo. En contraste, las células de carcinoma hepatocelular frescamente aisladas asi como las células HepG2 expresan DR5 de la superficie celular. Usando Fas como una comparación, los hepatocitos normales de las células de carcinoma hepatocelular de las células HepG2 todos expresaron niveles equivalentes de Fas (Fig. HJ, paneles inferiores) . Estos resultados son consistentes con aquellos obtenidos usando la inmunohistoquimica in situ y el manchado de Western e indican que el DR5 de la superficie de la célula es altamente expresado en las células de higado cancerosas pero no en los hepatocitos normales. La presencia de los niveles de mRNA para DR4, DR5, DcRl y DcR2 en los hepatocitos humanos, demostrada por RT-PCR23, sugiere que los hepatocitos humanos podrian expresar niveles muy bajos de proteina DR5 que están por debajo del umbral para la detección por TRA-8.

Para determinar si TRA-8 induce toxicidad hepatocelular, es examinada la susceptibilidad de los hepatocitos humanos normales a la apoptosis inducida por TRA-8 y por el TRAIL soluble más el agente de reticulación. Cuando los hepatocitos normales SOR cultivados en la presencia de una alta concentración de TRAIL, una disminución dependiente del tiempo y la viabilidad celular es observada por ATPLite (Fig. 12a) y los ensayos de MTT. La muerte celular mediada por TRAIL de hepatocitos normales podría ser observada tan temprano como cuatro horas después de la adición de TRAIL. Al final de µ? cultivo de 24 horas, más de 80% de los hepatocitos son matados por TRAIL. En contraste, durante el mismo periodo de cultivo, TRA-8 no indujo muerte celular significante en los hepatocitos normales. Los núcleos condensados manchados con Hoechst, una característica de apoptosis, son incrementados en hepatocitos tratados con TRAIL pero no en los hepatocitos tratados con TRA-8 (Figura 12b) . El número de hepatocitos apoptóticos está bien correlacionado con la viabilidad celular disminuida como es determinado por el ensayo ATPLite, sugiriendo que la muerte celular inducida por TRAIL de los hepatocitos es mediada por apoptosis. Esto es confirmado por la habilidad de Z-VAD para inhibir la toxicidad mediada por TRAIL de los hepatocitos. Como la cicloheximida es un potente mej orador- de la apoptosis, es investigado el efecto de este compuesto sobre los hepatocitos tratados con TRAIL y con TRA-8. Durante un cultivo de cuatro horas, la cicloheximida significativamente mejoró la muerte celular de los hepatocitos inducida por TRAIL, con mayor que 70% de hepatocitos que son matados por TRAIL en la presencia de cicloheximida (Figura 12c) . Sin embargo, el tratamiento con cicloheximida es capaz de aumentar la muerte celular mediada por TRA-8 en los hepatocitos. Para comparar las caracteristicas de apoptosis inducida por TRA-8 con aquella inducida por TRAIL en hepatocitos, los hepatocitos normales asi como células de cáncer son incubados, con concentraciones variables de TRAIL con agente de reticulación o TRA-8. Durante un periodo de cultivo de seis horas, TRAIL indujo una respuesta apoptótica moderada en los hepatocitos normales. Arriba de 20% de hepatocitos son matados en la presencia de 500 ng/ml de TRAIL (Fig. 12d, parte izquierda superior) . El tratamiento con TRA-8 de los hepatocitos normales no produjo ninguna muerte celular significante durante el mismo periodo de tiempo. En contraste a los hepatocitos normales, las células de carcinoma hepatocelulares primarias (Figura 12d, parte media superior) y las células HepG2 (Figura 12d, parte derecha superior) son altamente susceptibles a la apoptosis mediada por ya sea - TRAIL o TRA-8. Arriba de 80% de células de carcinoma, hepatocelular y casi 100% de- células HepG2 son matadas durante el periodo de cultivo de 8 horas. Estos resultados indican que los hepatocitos normales son completamente resistentes a la apoptosis mediada por TRA-8, y son mucho menos susceptibles a la apoptosis mediada por TRAIL como son las células de cáncer de higado. Usando el ligando Fas y el anticuerpo anti-Fas (CH-11), no hay diferencia significante en la susceptibilidad a la apoptosis mediada por Fas entre los hepatocitos normales, las células de carcinoma hepatocelular y las células HepG2 (Fig. 12d, paneles inferiores) . Ejemplo Comparativo 11B. Inducción de TRAIL enlazado a la membrana humana de la hepatitis in vivo Ratones B6 hembras de 8-10 semanas de edad son inyectados intravenosamente con 109 pfu de Ad/hTRAIL con el número igual de AD/Tet-on. Los ratones son alimentados con diferentes concentraciones de tetraciclina en su agua de beber inmediatamente después de la inoculación de los vectores adenovirales . La lesión del higado es determinada por los niveles en el suero de AST usando un kit de diagnóstico AST (Sigma) . La expresión de TRAIL es determinada mediante el análisis de manchado de Northern. Para determinar si la forma enlazada a la membrana de TRAIL induce daño al higado in vivo, es construido un vector adenoviral recombinante que codifica el TRAIL humano de longitud - completa (Ad/hTRAIL) , la expresión de la cual está bajo el control del promotor inducible de tetraciclina . 24 horas después de la inoculación intravenosa de los ratones B6 con Ad/hTRAIL, la expresión inducida con tetraciclina del TRAIL humano es observada en el higado en un aspecto dependiente de la dosis como es demostrado por el análisis de manchado de Northern (Fig. 13a) . Los niveles de expresión de TRAIL se correlacionaron bien con el daño al higado como es mostrado por un incremento dependiente de la tetraciclina en los niveles en el suero de transaminasas, nuevamente en un aspecto dependiente de la dosis (Fig. 13i») . Como la inoculación, con el vector adenoviral per se podria incrementar la susceptibilidad de los hepatocitos a la apoptosis mediada por TRAIL, los hepatocitos de los ratones inoculados por Ad/TRAIL son aislados y probados para la muerte celular mediada por TRAIL. No hay muerte celular significativamente incrementada de los hepatocitos infectados de Ad/TRAIL comparado con aquellos de los ratones de control (Fig. 13c, panel izquierdo) . Además, los ratones inoculados con Ad/TRAIL no mostraron lesión al higado incrementada después de la inyección intravenosa de TRAIL humano soluble. Asi, se comprende que la hepatitis inducida por Ad/TRAIL es mediada por altos niveles de la expresión de TRAIL en su forma de membrana. El análisis histológico de las secciones de higado revelaron que el daño a los hepatocitos es evidente tan temprano como 24 horas después de la inoculación - del vector (Fig. 13d) y persistió por al menos 7 dias (Fig. 13e) . Estas alteraciones patológicas en el higado también son dependientes de la tetraciclina y ocurrieron de una manera, dependiente de la dosis. La fase temprana, dentro de 24 horas de tratamiento, del daño del higado inducido por TRAIL es caracterizada por focos de necrosis. La infiltración de células inflamatorias no es observada en esta etapa, pero ha ocurrido hemorragia. Por el dia 7 después de la inoculación, el daño del higado difuso es evidente con el desarreglo lobular marcado, degeneración severa de hepatocitós con citoplasma y regularmente amontonado y espacios claros grandes y apoptosis y necrosis prominentes. Un infiltrado extensivo de células mononucleares es un aspecto característico en esta etapa. Estos resultados indican que el TRAIL humano en su forma enlazada a la membrana es capaz de inducir daño al higado in vivo. A pesar de la propensión del TRAIL humano para causar hepatitis severa en los ratones, éste no indujo una respuesta letal. En contraste, los ratones inoculados con los vectores controlados por tetraciclina similares que codifican el ligando Fas, desarrollaron hepatitis fulminante con apoptosis masiva y necrosis de hepatocitos acompañada por severa hemorragia y por mortalidad que ocurre de una manera dependiente de la dosis de tetraciclina dentro de 72 horas de inoculación. La proporción de mortalidad alcanzó 100% dentro de 48 horas en aquellos subgrupos que reciben 3 mg/ml o más de tetraciclina . En contraste, todos los ratones que recibieron Ad/hTRAIL, sin considerar la dosis de tetraciclina, están aun vivos cuatro semanas después de la inoculación. Asi, se comprende que, in vivo, la forma enlazada a la membrana de TRAIL es un inductor menos potente del daño hepatocelular que el ligando Fas. Ellos además sugieren que el TRAIL podria inducir daño al higado a través de un mecanismo que difiere del mecanismo que implica la toxicidad del ligando Fas. Ejsoplo 12. Células T y B humanas activadas expresan niveles incrementados de DR5. Para determinar si DR5 desempeña una función en la apoptosis mediada por TRAIL de las células T y las células B activadas, es examinada la expresión de DR5 de la superficie sobre las células T y B activadas usando TRA-8. Las células T no estimuladas en PBMC no expresan niveles significantes de DR5 (Fig. 14). En 48 horas después de la estimulación con ya sea anti-CD3 o Con-A, la expresión de DR5 de la superficie de la célula es significativamente incrementada. De manera similar, las células B no estimuladas expresaron muy bajos niveles de DR5. La estimulación con anti-µ pero no con LPS dio por resultado la expresión de DR5 de la superficie de la célula incrementada.. Estos resultados indican que las células T y B activadas, expresan, niveles más altos de DR5 de la superficie de la célula. Las células son manchadas con 20 g/ml de TRA-8 e IgGl anti-ratón de PE. Ejemplo 13. Las células T y B activadas pueden ser susceptibles a la apoptosis mediada por TRA-8 Para determinar si las células T y B activadas son susceptibles a la apoptosis mediada por TRA-8, las células T y las células B de PBMC humano son estimuladas con anti-CD3 o anti-µ in vitro durante 48 horas, respectivamente. Las células viables y las células de blastocisto proliferantes con colectadas mediante la centrifugación de gradiente, e incubadas con varias concentraciones de TRA-8. Las células T y las células B no estimuladas no son susceptibles a la apoptosis mediada por TRA-8 (Fig. 15). Las células T y las células B estimuladas totales mostraron una susceptibilidad moderamente incrementada a la apoptosis mediada por TRA-8, con 20% de células que son matadas por TRA-8 después del cultivo durante la noche. Las células T de blastocisto altamente proliferantes son aun más susceptibles a la apoptosis mediada por TRA-8. Más del 70% de las células T de blastocisto podrían ser matadas por TRA-8. Las células B de blastocisto también son más susceptibles a la apoptosis mediada con TRA-8 comparadas con otras. Estos resultados indican que la células T y B activadas son susceptibles a la apoptosis mediada por DR5.

Ejemplo 14. TRA-8 agota las células T activadas en humano/ratones SCIO Para determinar la eficacia anti-célula T in vivo de TRA-8, ratones NOD/SCID son inyectados intravenosamente con lxlO8 PBMC humano. Normalmente, las células T humanas en ratones SCID son rápidamente activadas en respuesta a la estimulación xenogeneica. Los ratones PBMC humano/SCID son intraperitonealmente inyectados con 100 µg de TRA-8 o IgGl de control desde el día de transferencia, repetida diariamente por tres dias. Cinco dias después de la transferencia, las células mononucleares son aisladas del bazo y manchadas con anticuerpo CD3 antihumano, y la población de linfocitos es confinada mediante el análisis de citometria de flujo, y las células T humanas positivas de CD3 son analizadas. Aproximadamente 30% de linfocitos esplénicos son células T humanas, como es determinado por el manchado CD3 antihumano en ratones tratados de control. Sin embargo, unas cuantas células T humanas (menos de 3%) son observadas entre los linfocitos esplénicos en ratones tratados con TRA-8 (Fig. 16) . El estudio histológico in situ reveló que en el bazo de los ratones de control, las células T humanas son repobladas en el bazo con solamente unas cuantas células apoptóticas observadas como es demostrado por el : manchado TUNEL. En contraste, la repoblación con las- células T humanas viables no es observada en el bazo de los ratones tratados con TRA-8, más bien muchas células apoptóticas son observadas (Fig. 17) . Estos resultados demuestran que TRA-8 tiene actividad anticélula T in vivo, e indican la utilidad de los anticuerpos inventivos para el tratamiento en la enfermedad GVH. Ejemplo 15. Actividad terapéutica anti-cáncer de TRA-8 15.1 Exp esión de DR5 y función en los tejidos y líneas de células de cáncer humano i) Expresión de DR5 en los tejidos de cáncer humano mediante el manchado in situ con TRA-8. Para determinar si las células y tejidos de cáncer diferencialmente expresan niveles más altos de DR5, un panel de tejido de cáncer humano incluyendo arriba de 20 cánceres de pecho, 6 cánceres ováricos, 5 cánceres de colon y 5 cánceres de próstata son manchados con TRA-8 para la inmunohistoquimica . La mayoria de estos tejidos de cáncer expresaron DR5 detectable. Los niveles de expresión de DR5 en estos tejidos de cáncer variaron. En general, los tejidos de cáncer expresaron niveles más altos de DR5 que en los tejidos no implicados. Además, la expresión de DR5 está aparentemente no correlacionada con la mutación de p53. ii) Expresión de DR5 y función en líneas de células d cánce humano (Tabla 2) . Nueve lineas de células de cáncer de pecho humano, tres lineas de cáncer ovárico, tres lineas de cáncer de colon y tres lineas de cáncer de próstata son examinadas de la expresión de DR5. de- la superficie de la célula y la susceptibilidad a la apoptosis inducida por TRA-8 in vitro. 7 de 9 lineas de cáncer de pecho, 3 de 3 lineas de cáncer ovárico, 3 de 3 lineas de cáncer de colon y 3 de 3 lineas de cáncer de próstata expresaron niveles variables de DR5 de la superficie de la célula. De 9 lineas de cáncer de pecho, tres son muy susceptibles, tres son intermedias y 3 son resistentes a la apoptosis mediada por TRA-8. Todas las tres lineas de cáncer ovárico son muy susceptibles. Una de las tres lineas de cáncer de colon es muy susceptible, mientras que dos tienen sensibilidad intermedia. Dos de tres lineas de cáncer de próstata tiene sensibilidad intermedia y una es resistente. Tabla 2. Expresión y función de DR5 en las células de cáncer humano. Linea de Origen Expresión1 Susceptibilidad2 células 2LMP pecho + ++++ LCC6 pecho +++ ++++ MB468 pecho +++ +++ MB231 pecho ++ +++ ZR-75-1 pecho +++ ++ SKBR3 pecho + ++ MB453 pecho ++ + BT474 pecho + - DY36T2 pecho - - Caov-3 ovario + ++++ OVCAR-3 ovario ++ ++++ Skov-3 ovario + +++ WiDR colon +++ ++++ HST29 colon ++ +++ T84 colon + ++ PC3 próstata +++ ++ LnCap próstata +++ + Du-145 próstata +++ • + Nota: xdeterminada mediante citometria de flujo, las células son manchadas con 20 pg/ml de TRA-8 y comparadas con el anticuerpo de control. 2determinada mediante el ensayo ATPLite. ++++: arriba de 80% de exterminación, +++: exterminación entre 60-80%, ++: exterminación entre 40-60%, +: exterminación entre 20-40%, - sin exterminación. iii) Citotoxicidad combinada de TRA-8 con adriamicina. En varias lineas de cáncer de pecho., es examinado el efecto de adriamicina sobre la apoptosis inducida por TRA-8. Altas dosis de adriamicina mostraron un efecto aditivo. Sin embargo, en algunas de las lineas resistentes a TRA-8, bajas dosis de adriamicina sinergisticamente mejoran la apoptosis inducida por TRA-8. iv) Actividad de enlace in vitro e in vivo del TRA-8 a las células de cancar humano. Utilización de TRA-8 marcado con radioisótopo. La actividad de enlace del TRA-8 con una linea de cáncer de pecho es examinada in vitro e in vivo en ratones SCID implantados con tumor. La actividad de enlace in vi tro a las células de cáncer es estimada como un valor Kd de 3 nM, que es constante con la estimación previa de los inventores usando ELISA, y por lo menos 50 veces más alta que el TRAIL soluble. In vivo, TRA-8 se localizó a los tejidos de tumor implantados. 15.2 Terapia de leucemia linfolítica crónica en ratones NOD/SCID con TRA-8 La leucemia linfolítica crónica (CLL) es una forma común de malignidad de las células B. La mayoría de las células B malignas en CLL son del fenotipo maduro y son resistentes a muchos estímulos de apoptosis. La expresión DR5 y la función en las células B de cinco pacientes con CLL es examinada. Todos los pacientes tuvieron altas cuentas de células B periféricas, como es mostrado por más de 95% de células B CD19+B en PBMC. Comparado con las células B, primarias normales, las células B de CLL de todos los pacientes tuvieron niveles más altos de DR5 de la superficie de la célula y son más susceptibles a la apoptosis inducida por TRA-8 in .vitro. De manera interesante, las células B de CLL también son sensibles a la citotoxicidad inducida por bisindolmaleimida VIII (Bis VIII). Después: del, tratamiento combinado con TRA-8 y Bis VIII, casi 50% de las células B de CLL son exterminadas mientras que las células B normales permanecen no responsivas (Fig. 18) . La transferencia de las células B de CLL en los ratones NOD/SCID dio por resultado aproximadamente 25% -30% de células B CD19+ repobladas en el bazo de los ratones recipientes en cinco dias después de la transferencia. Sin embargo, tres dosis de 100 µg de tratamiento de TRA-8 completamente eliminaron las células B de CLL de cuatro de cada cinco pacientes en el bazo de los ratones SCID recipientes. Asi, TRA-8 solo o en combinación con otras sustancias es activo como un agente terapéutico para la leucemia linfolitica crónica. Ejemplo 16. Clonación de cDNA (1) Determinación de las secuencias de aminoácidos N-terminales de las cadenas pesada y ligera de TRA-8 Para obtener cDNAs de las cadenas pesada y ligera de TRA-8, las secuencias de aminoácidos N-terminales de las cadenas pesada y ligera de TRA-8 y los genes de TRA-8 clonados son determinados por técnicas conocidas . Diez ]ig de la solución que contiene el anticuerpo DR5 anti-humano TRA-8 es sometido a la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida ("SDS-PAGE") , usando una concentración de gel de 12% p/v, voltaje constante de 100 V, durante 120 minutos. Después de la electroforesis, el gel es sumergido en la solución reguladora de transferencia Tris-HCl 25 mM (pH 9.5), metanol al 20%, SDS al 0.02% v/v durante 5 minutos.

Después de este tiempo, el contenido de proteina del gel es transferido a una membrana de difluoruro de polivinilideno ("membrana de PVDF"; tamaño de poro 0.45 um Millipore, Japón) , preempapada en solución reguladora de transferencia, usando un aparato de manchamiento (KS-8451; Marysol) bajo condiciones de voltaje constante de 1Ü V, 4°C, durante 14 horas. Después de este tiempo, la membrana de PVDF es lavada con solución reguladora de lavado, NaCl 25 mM, solución reguladora de borato de sodio 10 mM (pH 8.0), luego manchada en una solución de manchado (metanol al 50% v/v, ácido acético al 20% v/v y Azul Coomassie Brilliant al 0.05% p/v) durante 5 minutos para localizar las bandas de proteina. La membrana de PDVF luego es desmanchada con metanol acuoso al 90% v/v, y las bandas correspondientes a la cadena pesada, la banda con la menor movilidad, y la cadena ligera, la banda con la más alta movilidad, previamente localizadas sobre la membrana de PDVF son cortadas y lavadas con agua desionizada. La secuencia de aminoácidos N-terminal de las cadenas pesada y ligera son determinadas mediante el método automatizado de Edman (Edman, P., y colaboradores, (1967), Eur. J. Bioc em, 1,80) usando un secuenciador de proteina en fase gas (PPSQ-10; Shimadzu Seisakusyo, K.K.) La secuencia de aminoácidos N-terminal de la banda correspondiente a la cadena pesada se determina que es: Glu-Val-Met-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Lys-Leu (SEQ ID NO:4 del Listado de Secuencias) ; y aquella de la banda correspondiente a la cadena ligera se determina que es: Asp-Ile-Val-Met-Thr-Gln-Ser-His-Lys-Phe-Met-Ser-T r-Ser-Val-Gly-Asp-Arg-Val-Ser (SEQ ID NO: 5 del Listado de Secuencias) . La comparación de estas secuencias de aminoácidos con la base de datos de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos producidos por Kabat y colaboradores (Kabat E.A., y colaboradores, (1991), en "Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol. II", U.S. Department of Health and Human Services) reveló que la cadena pesada (cadena yl) y la cadena ligera (cadena k) de TRA-8 pertenecieron a los subtipos 3d y 1, respectivamente. (2) Clonación de cDNA Basado en los descubrimientos anteriores, se sintetizaron cebadores de oligonucleótido que seria esperado que hibriden con las porciones de las regiones 5 '-no traducidas y los extremos completos de las regiones 3'-traducidas de. los genes que pertenecen a estos subtipos de ratón. Luego, los cDNAs que - codifican las cadenas pesada y ligera de TRA-8 son clonados mediante la siguiente combinación de transcripción inversa y PCR (RT-PCR) . a) Patrón El RNA total del hibridoma de TRA-8 (ATCC No. PTA-1428) es extraído mediante el uso de TRIzol Reagent (GIBCO BRL) . El patrón para la reacción de PCR usó cDNA que es obtenido al usar el kit de sínteis de cDNA de primera hebra (Amersham Pharmacia Biotech) de acuerdo con el manual de instrucción proporcionado con el kit. b) Cebadores de PCR Los siguientes cebadores de oligonucléotido son sintetizados por la PCR: 5' -cagcactgaa cacggacccc-3' (H5NCS1: SEQ ID NO: 6 del Listado de Secuencias); 5'-aaaggtaatt tattgagaag-3' (H5NCS2: SEQ ID NO: 7 del Listado de Secuencias); 5' -cctcaccatg aacttcgggc-3' (H5SS1: SEQ ID NO: 8 del Listado de Secuencias) ; 5'-ctgttgtatg cacatgagac-3' (H5SS2: SEQ ID NO: 9 del Listado de Secuencias) 5' -gaagtgatgc tggtggagtc-3' (H5CS1: SEQ ID NO: 10 del Listado de Secuencias); - 5'-agtgtgaagt gatgctggtg-3' (H5CS2: SEQ ID NO:ll del Listado de Secuencias) ; 5' -tttaccagga gagtgggaga g-3' (H3CR: SEQ ID NO: 12 del Listado de Secuencias) ; 5' -tgcagagaca gtgaccagag-3' (H3VR: SEQ ID N0:13 del Listado de Secuencias); 5' -tgttcaggac cagcatgggc-3' (L5NCS1: SEQ ID N0:14 del Listado de Secuencias); 5' -aagacatttt ggattctaac-3' (L5NCS2: SEQ ID NO: 1.5 del Listado de Secuencias); 5' -tatcatgaag tctttgtatg-3' (L5SS1: SEQ ID NO: 16 del Listado de Secuencias); 5' -gatggagaca cattctcagg-3' (L5SS2: SEQ ID NO: 17 del Listado de Secuencias); 5'-gacattgtga tgacccagtc-3' (L5CS: SEQ ID NO: 18 del Listado de Secuencias); 5' -ttaacactca ttcctgttga-3' (L3CR: SEQ ID NO: 19 del Listado de Secuencias; y 5'-gactgggtca tcacaatgtc-3' (LCSR: SEQ ID NO:20 del Listado de Secuencias) . A menos que se especifique de otra manera, todos los oligonucleótidos en estos Ejemplos son sintetizados por Farmacia Biotech. Todos los oligonucleótidos son almacenados a -20°C después de ser disueltos en agua destilada, c) Reacción de PCR Composición de la solución de reacción de PCR: cDNA patrón, 5 µ? de la reacción de 33 µ? total cebador DR5pl, 10 pmol; cebador DR5p2, 10 pmol; solución reguladora de PCR concentrada 10 x (proporcionada con el kit) , 10 µ?; dNTPs (cada uno 2.5 mM) , 4 µ?; y polimerasa Taq (Promega), 5 unidades Agua destilada estéril es adicionada a la solución a un volumen total de 100 µ?. A menos que se especifique de otra manera, los dNTPs son una mezcla equimolar de dATP, dCTP, dGTP y dTTP (2.5 mM cada uno). La reacción de PCR es conducida como sigue. La solución primero es calentada a 94°C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo de calentamiento a 94 °C durante 30 seg, 52°C durante 1 minuto y 72°C durante 3 minutos, es repetido 40 veces. Después de la consumación de este procedimiento, . la solución de reacción es calentada a 72 °C durante 10 minutos. Los fragmentos de DNA amplificados, asi obtenidos, son separados en un gel de agarosa al 1% que contiene 0.25 ug/ml de bromuro de etidio. Las 'bandas determinadas que contienen los fragmentos de DNA deseados son cortadas usando una hoja de afeitar y el DNA es . recuperado de las mismas usando - el kit Gene Clean (BIO101) . El fragmento de DNA es clonado usando el vector pGEM-T Easy (Promega). Esto se realiza como sigue: El fragmento de DNA recuperado de la solución de reacción de PCR, junto con 50 ng del vector pGEM-T Easy (proporcionado con el kit) , es mezclado con 1 µ? de solución reguladora de reacción de ligasa 10 X (Tris-HCl 6 mM (pH 7.5), cloruro de magnesio 6 mM, cloruro de sodio 5 mM, ß-mercaptoetanol 7 mM, ATP 0.1 mM, DTT 2 mM, espermidina 1 mM y 0.1 mg/ml de albúmina de suero bovino) a lo cual se han adicionado 4 unidades de ligasa de DNA T4 (1 µ?) . El volumen total de la mezcla es ajustado a 10 µ? con agua desionizada estéril, y la solución de ligasa resultante es incubada a 14 °C durante 15 horas. Después de este tiempo, 2 µ? de la solución de reacción de ligasa es adicionado a 50 µ? de la cepa JM109 de E. coli competente (proporcionada con el kit y llevada a la competencia de acuerdo con el manual de instrucción) al cual se han adicionado 2 µ? de ß-raercaptoetanol 0.5 M y la mezcla resultante es mantenida sobre hielo durante 30 minutos, luego a 42° durante 30 segundos, y nuevamente sobre hielo durante 5 minutos. Enseguida, 500 µ? de medio que contiene triptona al 2% v/v, extracto de levadura al 0.5% p/v, cloruro de sodio al 0.05% p/v, cloruro de potasio 2.5 mM, cloruro de magnesio 1 mM y glucosa 20 mM. (después en la presente referido como el medio "SOC") " es adicionado al cultivo, y la mezcla es incubada durante 1 hora a 37°C con agitación. Después de este tiempo, el cultivo es extendido sobre una placa de agar de L-broth (triptona al 1% v/v, extracto de levadura al 0.5% p/v, cloruro de sodio al 0.5% p/v, glucosa al 0.1% p/v y bacto-agar al 0.6% p/v (Difco)), que contiene 100. µ?/ml. Las colonias resistentes a la ampicilina que aparecen sobre la placa son seleccionadas y removidas raspando con una anilla de transferencia de platino, y cultivadas en el medio L-broth que contiene 100 µg/ml de ampicilina a 37°C durante la noche, con agitación a 200 r.p.m. Después de la incubación, las células son cosechadas por centrifugación, de las cuales el DNA de plásmido es preparado mediante el método de álcali. El plásmido obtenido es designado como plásmido pH62 para la cadena pesada de TRA-8 o pL28 para la cadena ligera de TRA-8. Las cepas de E. coli transformantes que albergan este plásmido, designadas como JMl09/pH62 de E. coli y JM109/pL28 de E. coli se depositaron con el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japón el 26 de Abril del 2001, de acuerdo con el Budapest Treaty for the Deposit of Microorganisms, y se asignaron con los números de acceso FERM BP 7560 y FERM BP-7561, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de estos DNAs que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de TRA-8 son confirmadas mediante el método de dideoxi (Sanger, F.S., y colaboradores (1977), Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) usando el Analizador de DNA 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Bíosystems, Japón) . Las secuencias de nucleótidos de las cadenas pesada y ligera de TRA-8 son dadas como SEQ ID No. 21 y No. 22 del Listado de Secuencias, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de TRA-8 son dadas como SEQ ID No. 23 y No. 24 del Listado de Secuencias, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos N-terminales de las cadenas pesada y ligera de TRA-8 se establecieron en lo anterior perfectamente igualadas. Además, cuando las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera son comparadas con las bases de datos de las secuencias de aminoácidos de anticuerpos se establece que, para la cadena pesada, los nucleótidos Nos. 58 a 414 en la SEQ ID NO. 21 constituyeron la región variable, mientras que los nucleótidos Nos. 415 a 1392 en la SEQ ID NO. 21 constituyeron la región constante. Para la cadena ligera, los nucleótidos Nos. 64 a 387 en la SEQ ID NO. 22 constituyeron la región variable, mientras que los nucleótidos Nos. 388 a 702 en la SEQ ID No. 22 constituyeron la región constante. Las localizaciones y las secuencias de las CDRs también son elucidadas al. comparar las homologias con la base de datos. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de TRA-8 son mostradas en la SEQ ID No. 25, No;-26, y No. 27, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de TRA-8 son mostradas en la SEQ ID NO. 28, No. 29 y No. 30, respectivamente. Ejemplo 17. Diseño de una Versión Humanizada del Anticuerpo TRA-8 (1) Modelación molecular de una región variable de TRA-8 La modelación molecular de la región variable de TRA-8 es realizada mediante el método generalmente conocido como modelación de homología (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Las secuencias primarias de las regiones variables de la inmunoglobulina humana registradas en el Banco de Datos de Proteínas (Nuc. Acid Res. 28, 235-242 (2000)), para las cuales las estructuras tridimensionales derivadas de la cristalografía de rayos X están disponibles, son comparadas con las regiones de estructura de TRA-8 determinadas en lo anterior. Como resultado, 1NCD y 1HIL son seleccionados por tener las homologías de secuencia más altas a las regiones de estructura para las cadenas ligera y pesada de TRA-8, respectivamente. Las estructuras tridimensionales de las regiones de estructura son generadas al combinar las coordenadas de 1NCD y 1HIL que corresponden a las cadenas ligera y pesada de TRA-8, para obtener el "modelo de estructura". Usando' la clasificación definida por Chothia y colaboradores, las CDRs de TRA-8 son clasificadas como sigue; CDRLi , CDRL2, CDRHi y CDRH2 que pertenecen a las clases canónicas 2,1,1,3, respectivamente, mientras que CDRL3 no pertenece a ninguna de las clases canónicas especificas. Las vueltas CDR de CDRLi , CDRL2, CDRHi , CDRH2 son fijadas a las conformaciones inherentes a sus clases canónicas respectivas, e integradas en el modelo de estructura. CDRL3 es asignada a la conformación de la agrupación 8a, de acuerdo con la clasificación de Thornton y colaboradores (J. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996)), y CDRH3 es clasificada en k(8)C usando la regla H3 (FEBS letter 455,188-197(1999)). Después las conformaciones representativas para CDRL3 u CDRH3 son integradas en el modelo de estructura. Finalmente, los cálculos de energía son llevados a cabo para eliminar los contactos interatómicos desfavorables, para obtener un modelo molecular probable de la región variable de TRA-8 en términos de energía. El procedimiento anterior es realizado usando el sistema de modelación molecular común, comercialmente disponible ABM (Oxford Molecular Limited, Inc.). Para el modelo molecular obtenido, la precisión de la estructura además es evaluada utilizando el . software,- PROCHECK (J. Appl. Crist. (1993), 26, 283-291). (2) Diseño de las secuencias de aminoácidos para TRA-8 humanizado.- La. construcción de los anticuerpos TRA-8 humanizados es realizada mediante el método generalmente conocido como injerto de CDR (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). El anticuerpo aceptor se elige basado en la homología de aminoácido en la región de estructura. Las secuencias de la región de estructura en TRA-8 son comparadas con todas las secuencias de estructura humanas en la base de datos Kabat de las secuencias de aminoácido de anticuerpos (Nuc. Acid RE } es . 29, 205-206 (2001)). Como un resultado, el anticuerpo mAB58' es seleccionado como un aceptor debido a la homología de secuencia más alta de 80% para la región de estructura. Los residuos de aminoácido en la región de estructura para mAB58'CL son alineados con aquel para TRA-8 y son identificadas las posiciones donde se usan diferentes aminoácidos. Las localizaciones de estos residuos son analizadas usando el modelo tridimensional de TRA-8 construido anteriormente y los residuos de donador que deben ser injertados sobre el aceptor son seleccionados por los criterios dados por Queen y colaboradores (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Las secuencias de TRA-8 humanizadas son construidas como es descrito en el siguiente ejemplo al transferir varios residuos donadores en el anticuerpo aceptor, mAb58'CL. Ejemplo 18. Construcción de un Vector de Expresión de Cadena Pesada del Anticuerpo Humanizado (1) Construcción de plásmido que lleva el DNA de región variable de cadena pesada del TRA-8 Humanizado Para determinar la actividad del TRA-8 humanizado, el plásmido que lleva la cadena pesada del TRA-8 humanizado es construido como sigue. Sin embargo, es apreciado que la humanización del TRA-8 no está limitada a estos ejemplos. Como se muestra en la SEQ ID No. 31. del Listado de Secuencias, la humanización de las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo DR5 anti-humano de ratón TRA-8 ocasionó reemplazar el 13= aminoácido (lisina), el 19-aminoácido (lisina), el 40s aminoácido (treonina), el 422 aminoácido (ácido glutámico), el 442 aminoácido (arginina), el 84- aminoácido (serina), el 882 aminoácido (serina), el 932 aminoácido (metionina) , el 1142 aminoácido (treonina), el 115a aminoácido (leucina) con glutamina, arginina, alanina, glicina, glicina, asparagina, alanina, valina, leucina y valina, respectivamente. Los plásmidos que llevan DNA que codifica la región variable de cadena pesada del TRA-8 humanizado (SEQ ID No. 31 del Listado de Secuencias) se construyen como sigue. La PCR es usada para construir las siguientes secuencias de DNA, cada una de las cuales comprendió lo descrito en lo anterior. Los siguientes 12 · oligonucleótidos " son sintetizados: '- ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtgtccac -3' (A; SEQ ID No. 32); tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg -3\(B; SEQ ID No. 33); '- attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga gtgggttgca accattagta -3 * (C; SEQ ID No. 34); '- gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaccctg -3' (D; SEQ ED No. 35); '- tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac -3' (E; SEQ ID No. 36); '- ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctc cac aagggcccat cggtc - 3' (F; SEQ ID No. 37); '. ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa -3' (G; SEQ ID No. 38); '· tctcagggac cctccaggct gtactaagee tcccccagac tccaccagca ttaetteaga gtggacacct gtagctgttg -3' (H; SEQ ID No. 39); '- tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag -3 * (I; SEQ ID No.40); '· ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac tactaatggt tgcaacccac -3* (J; SEQ ID No. 41); '· ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt -3' (K; SEQ ID No. 42); y '- gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtcectt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cace -3 ' (L; SEQ ID No. 43).

Los - siguientes 2: cebadores de PCR son sintetizados descrito. en lo anterior: - - 5'- ttggataagc ttggcttgac -3' (Pl ; SEQ JD No. 44); y 5 gaccgatggg cccttggtgg a -3 ' (P2; SEQ ID No. 45).

La síntesis de DNA que codifica una cadena de polipéptido que comprende una secuencia de señal de secreción, una región variable de la cadena pesada de TRA-8 humanizado y los 8 residuos de aminoácido en el N-terminal de la región IgG-CHl es realizada usando una combinación de PCR respectivamente. El fragmento de DNA es preparado como sigue. Composición de la solución de reacción de PCR: oligonucleótido A, 10 pmol; oligonucleótido B, 10 pmol; oligonucleótido c, 10 pmol; oligonucleótido D, 10 pmol; oligonucleótido E, 10 pmol; oligonucleótido F, 10 pmol; o1igonuc1eótido G, 10 pmol; oligonucleótido H, 10 pmol; oligonucleótido I, 10 pmol; oligonucleótido J, 10 pmol; oligonucleótido K, 10 pmol; oligonucleótido L, 10 pmol; cebador de oligonucleótido Pl, 2 uM; cebador de oligonucleótido P2, 2 uM; solución reguladora II Pyrobest 10 X, 10 µ?; mezcla de dNTP, 8 µ?; Polimerasa de DNA Pyrobest, 0.5 µ?; y Agua redestilada a un volumen final de 50 µ?. La reacción de PCR es conducida como sigue: La solución primero es calentada a 94°C durante 5 minutos, después de lo cual un ciclo de calentamiento a 98 °C durante 10 segundos, 55°C durante 30 segundos y 72°C durante 1 minuto, es repetido 7 veces. Después de la consumación de este procedimiento, la solución de reacción es calentada a 72 °C durante 15 minutos. Un volumen igual de fenol-cloroformo (50% v/v de fenol saturado con agua, 48% v/v de cloroformo, 2% v/v de alcohol isoamilico) es adicionado a 200 µ? de cada uno de los productos de PCR, y vigorosamente mezclado durante 1 minuto . Después de este tiempo, la mezcla es centrifugada a 10,000 X g, y la capa acuosa es recuperada y mezclada con un volumen igual de cloroformo-alcohol isoamilico (96% v/v de cloroformo y 4% v/ de alcohol isoamilico) , que es nuevamente centrifugado vigorosamente a 10,000 X g y la capa acuosa es recuperada. La serie de etapas mencionada en este párrafo es referida, después en la presente, como "extracción de fenol". La precipitación con etanol luego es realizada sobre la capa acuosa recuperada. Como se utiliza y sé refiere en la presente, "precipitación con etanol" consiste de adicionar, con mezclado, un décimo de volume de acetato de sodio 3M (pH 5.2) y 2.5 volúmenes de etanol al 100% a la solución que es tratada, y congelar la mezcla usando hielo seco. La mezcla resultante luego es centrifugada a 10,000 X g para recuperar el DNA como un precipitado. Después de la extracción con fenol y la precipitación con etanol, el precipitado de DNA resultante es secado al vacio, disuelto en un minimo de agua redestilada, y separado mediante la electroforesis en gel de agarosa al 3%. Después de la electroforesis, el gel es manchado con 1 g/ml de solución acuosa de bromuro de etidio para permitir la detección de DNA bajo luz UV. La banda de DNA correspondiente al DNA de TRA-8 humanizado es cortada usando una hoja de afeitar y eluida del gel usando el Kit Geneclean Spin (BIO 101, CA, USA) . Después de la extracción con fenol, el DNA eluido luego es concentrado mediante centrifugación a 7,500 X g, seguido por la precipitación con etanol, y finalmente disuelto en 5 µ? de agua destilada. El DNA cada uno extraido, resultante es clonado usando el vector pGEM-T Easy (Promega) como sigue-: El fragmento de DNA recuperado de la reacción de PCR, 5 µ?; solución reguladora de polimerasa Taq 10 X, 1 µ?; mezcla de dNTP, 1 µ? polimerasa Taq (5 unidades/mL) , 1 µ?; y agua redestilada a un volumen final de 10 µ?.

Después de lo anterior, cada solución se hace reaccionar a 70°C durante 30 minutos, cada solución de DNA y el vector pGEM-T Easy son ligados usando un Kit de Ligación de DNA Versión 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) usando el protocolo del fabricante. Después de 4 horas de incubación a 15 °C, 2 µ? de la solución de reacción incubada es mezclado con 100 µ? de la cepa JM109 de E. coli competente a una densidad de células de l-2xl09 células/ml (Takara Shuzo Co., Ltd.), y la mezcla es mantenida sobre hielo durante 30 minutos, luego a 42 eC durante 30 segundos y nuevamente en hielo durante 1 minuto. Luego, 500 µ? del medio SOC (triptona ai 2% v/v, extracto de levadura al 0.5% p/v, cloruro de sodio al 0.05% p/v, cloruro de potasio al 2.5 mM p/v, cloruro de magnesio 1 mM y glucosa 20 mM) es adicionado a la mezcla, la cual es incubada durante 1 hora adicional, con agitación. Las cepas transformantes luego son aisladas y el DNA de plásmido es preparado de las cepas como es descrito en "Molecular Cloning A Laboratory Manual". Las secuencias de nucleótidos de estos DNAs que codifican la cadena pesada del TRA-8 humanizado son confirmadas mediante el método de dideoxi (Sanger, F.S., y colaboradores (1977), Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) usando el Analizador de DNA 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, : Japón) .

Los plásmidos resultantes son designados pHB14 (el plásmido que lleva cDNA que codifica la cadena pesada de TRA-8 humanizado) . La cepa de E. coli transformante que alberga este plásmido, designada como JM109/pHB14 de E. coli se depositó con el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japón el 20 de Abril del 2001, de acuerdo con el Budapest Treaty for the Deposit of Microorganisms, y se asignó el número de acceso FERM BP-7556. (2) Construcción de plásmidos de expresión que llevan el DNA de región variable de la cadena pesada del TRA-8 humanizado Vectores de expresión recombinantes para las células animales son construidos al insertar el DNA que codifica la cadena pesada del TRA-8 humanizado (clonado en lo anterior) como sigue. Un µg de plásmido pSRHHH3 (solicitud de patente europea EP 0-909-816-A1) que lleva la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal anti-Fas humanizado HFE7A y el DNA genómico de región constante de IgGl humano, un vector de. expresión para células mamiferas, es digerido con las enzimas de restricción HindIII y Apal, y separado mediante la electroforesis en gel de agarosa al 3%. Después de la electroforesis, el gel es manchado con 1 g/ml de solución acuosa de bromuro de etidio para permitir la detección de DNA bajo luz UV. Las bandas de DNA de vector que contienen el DNA genómico de región constante de IgGl humano sin la región variable de cadena pesada del HFE7A humanizado son cortadas usando una hoja de afeitar y eluidas del gel usando el Kit Geneclean Spin (BIO 101, CA, USA) . Después de la extracción con fenol, el DNA eluido luego es concentrado mediante la centrifugación a 7,500 X g, seguido por la precipitación con etanol, y finalmente disuelto en 5 µ? de agua destilada y luego "desfosforilado usando CIP. El plásmido desfosforilado, digerido, resultante (100 ng) es ligado con 1 \ig del fragmento de DNA de pHB1 que contiene el DNA que codifica la región variable de cadena pesada del TRA-8 humanizado que se ha digerido con HindIII y Apal, usando un Kit de Ligación de DNA Versión 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). La mezcla de ligación luego es usada para transformar JM109 de JE;, coli, que luego es colocado sobre placas de agar LB que contiene 50 ug/ml de ampicilina. Los transformantes obtenidos mediante este método son cultivados en 2 mi de medio LB liquido que contiene 50 µ /?a1 de ampicilina a 37 °C durante la noche y. el DNA de plásmido es subsecuentemente extraído del cultivo resultante mediante el método alcalino-SDS . El DNA de plásmido extraído es digerido con HindIII y Apal, y sometido a la electroforesis en gel de agarosa al 3%~ p/v para confirmar la presencia o ausencia del inserto del DNA que codifica la región variable de cadena pesada del TRA-8 humanizado. La inserción y orientación del fragmento de DNA deseado en el vector es confirmada mediante la secuenciación de DNA usando un analizador de secuencias de gen (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems) . El plásmido de expresión resultante que lleva el cDNA resultante ue codifica la cadena pesada del TRA-8 humanizado es designado pHB14-l. Ejemplo 19. Construcción de un Vector de Expresión para la Cadena Ligera del Anticuerpo Humanizado (1) Construcción da vectores para las cadenas ligeras de versiones humanizadas del anticuerpo TRA-8 Como es mostrado en la SEQ ID No. 46 del Listado de Secuencias, en la humanización de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo DR5 anti-humano de ratón TRA-8, el 8- aminoácido (histidina), 9s aminoácido (lisina) , 10- aminoácido (fenilalanina) , IIs aminoácido (metionina), 132 aminoácido (treonina), 202 aminoácido (serina), 42- aminoácido (glutamina) , 432 (serina), 60- aminoácido (ácido aspártico), 632 aminoácido (treonina), 772 aminoácido (asparagina) , 782 aminoácido, (valina) , 802 aminoácido (serina), 832 aminoácido (leucina), 85= aminoácido (ácido aspártico), 872 aminoácido (fenilalanina) y 992 aminoácido (glicina), 1032 aminoácido (leucina) - 1082 aminoácido (alanina) del N-terminal de la secuencia de aminoácidos , de la cadena ligera de TRA-8 son reemplazados con prolina, serina, serina, leucina, alanina, treonina, lisina, alanina, serina, serina, serina, leucina, prolina, fenilalanina, treonina, tirosina, glutamina, valina y treonina, respectivamente. La secuencia resultante es designada LM2. Los plásmidos de expresión que llevan este tipo de secuencias de aminoácidos de cadena ligera humanizadas del anticuerpo DR5 anti-humano TRA-8 son construidos como sigue. 1) Síntesis de cebadores para preparar las regiones variable y constante de la cadena ligera del TRA-8 humanizado DNA que codifica para la cadena de polipéptido LM2 (SEQ ID No. 46 del Listado de Secuencias) cada una de las cuales es una fusión de la región variable del anticuerpo anti-DR5 humanizado de cadena ligera de TRA-8 y la región constante de la cadena ligera Ig humano (cadena k) , son respectivamente sintetizados al usar combinaciones de PCR. Además de 7AL1P (SEQ ID No. 47) y 7ALCN (SEQ ID No. 48), los siguientes cebadores de oligonucleótido son sintetizados por PCR: 5'- gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atcacaatgt caccagtgga -3* (HKSPR11; SEQ TD No. 49); 5'- ccaagttctt tgtctgcatc agtaggagac agggtcacca tcaccígc -3' (HKCDF11; SEQ ID No. 50); 5'- agtgtgccgg gtggatgccc agtaaateag tagtttagga gctttccctg glttctg -3' (H CDR12; SEQ TD No. 51); 5'- tgggcatcca cccggcacac tggggtccca agcaggttta gtggcagt -3' (HKCDF22; SEQ ID No. 52); 5'- ataactacta tattgctgac agtaataggt tgcaaaatcc tccggctgca gactagaga ggt -3' (HKCDR22; SEQ E> No. 53); y 5 cagcaaíata gcagctateg gacgttcggt caaggcacca aggtggaaat caaacggact gtg -3 ' (HKCF12; SEQ ID No„ 54). 2) Construcción del plásmido pCR3.1 M2-l (clonación de la cadena ligera de TRA-8 humanizado) Fragmento LM2-DNA cómo es definido en la SEQ ID No. 55 del Listado de Secuencias que codifica para la secuencia de aminoácidos como es definida en la SEQ ID No. 46 de la misma, es preparado al realizar la PCR de 2 etapas, insertado en un vector de plásmido y clonado en E. coli. a) PCR de primera etapa El fragmento LM2-F1-DNA que codifica para una secuencia de señal de secreción de una porción de la región FRLi con un sitio de segmentación de enzima de restricción HindIII adicionado en el extremo 5' es preparado bajo las siguientes condiciones. Los plásmidos patrón, pHSGHM17 y pSRPDHH son obtenidos al seguir la descripción en una solicitud de patente europea EP 0 909 816 Al. Composición de la solución de reacción: DNA de plásmido pHSGH l7 (solicitud de .patente europea EP 0 909 816 Al) , 25 ng cebador de oligonucleótido 7AL1P, 50 pmol cebador de oligonucleótido HKSPR11, 50 pmol coctel de dNTPs, 5 µ? solución reguladora de lOxPCR, 5 µ? polimerasa de DNA ampliTaq (PerkinElmer), 2.5 unidades La solución de reacción que tiene la composición anterior es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestilada y usada en PCR . Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94°C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por el calentamiento a 72°C durante 10 minutos. El fragmento LM2-F2-DNA que codifica para una porción de FRLi , CDRLi , FRL2 y CDRL2 y es preparado bajo las siguientes condiciones. Composición de la solución de reacción: DNA de plásmido pL28, 25 ng cebador de oligonucleótido HKCDF11, 50 pmol cebador de oligonucleótido HKCDR12, 50 pmol coctel de dNTPs, 5 µ? solución reguladora de lOxPCR, 5 µ? polimerasa de DNA ampliTaq, 2.5 unidades La solución de reacción que tiene la composición anterior es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestilada y usada en PCR. · Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 9 °C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo térmico de 94 °C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por el calentamiento a 72 °C durante 10 minutos. El fragmento LM2-F3-DNA que codifica para CDRL2, FRL3, y una porción de CDRL3 es preparado bajo las siguientes condiciones . Composición de la solución de reacción: DNA de plásmido pSRPDHH, (solicitud de patente europea EP 0 909 816 Al), 25 ng ' cebador de oligonucleótido HKCDF22, 50 pmol cebador de oligonucleótido HKCDR22, 50 pmol coctel de dNTPs, 5 µ? solución reguladora de lOxPCR, 5 µ? polimerasa de DNA ampliTaq, 2.5 unidades La solución de reacción que tiene la composición anterior es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestilada y usada en PCR. Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94 °C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo térmico de 94 °C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por el calentamiento a 72°C durante 10 minutos. " El fragmento LM2-F4-DNA que codifica para CDRL3, FRL4 y la región constante con un sitio de segmentación de enzima de restricción EcoR I adicionado en el extremo 3' es preparado bajo las siguientes condiciones. Composición de la solución de reacción: DNA de plásmid pSRPDHH, 25 ng cebador de oligonucleótido HKCF12, 50 pmol cebador de oligonucleótido 7ALCN, 50 pmol coctel de dNTPs, 5 µ? solución reguladora de lOxPCR, 5 µ? polimerasa de DNA ampliTaq, 2.5 unidades La solución de reacción que tiene la composición anterior es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestilada y usada en PCR. Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94°C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por el calentamiento a 72 °C durante 10 minutos. Los fragmentos de DNA amplificados después de la PCR son separados mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida al 5%. El gel después de la electroforesis es manchado con 1 µg/ml de bromuro de etidio para detectar el' DNA producido bajo luz W. Las bandas de DNA respectivas asi detectadas son cortadas con una hoja de afeitar. b) PCR de segunda etapa LM2-DNA en la cual son fusionados los fragmentos descritos anteriormente LM2-F1-DNA, LM2-F2-DNA, LM2-F3-DNA y LM2-F4-DNA es preparado bajo las siguientes condiciones: Composición de la solución de reacción: Fragmento de gel de LM2-F1-DNA preparado en la PCR de primera etapa, Fragmento de gel de LM2-F2-DNA preparado en la PCR de primera etapa, Fragmento de gel de LM2-F3-DNA preparado en la PCR de primera etapa, Fragmento de gel de LM2-F4-DNA preparado en la PCR de primera etapa, cebador de oligonucleótido 7ALIP, 50 pmol cebador de oligonucleótido 7ALCN, 50 pmol coctel de d TPs, 5.0 µ? solución reguladora de lOxPCR, 5.0 µ? polimerasa de DNA ampliTaq, 2.5 unidades La solución de reacción que tienen la composición anterior es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestilada y usada en PCR. Condiciones- térmicas de PCR: Calentamiento a 94°C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por el calentamiento a 72°C durante 10 minutos. El fragmento LM2-DNA asi preparado es insertado en el plásmido pCR3.1DNA usando el Kit de clonación TA Eucariótico (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante e introducido en el TOP10F' de E. coli competente contenido en el kit. Las secuencias de nucleótidos de estos DNAs que codifican la cadena ligera del TRA-8 humanizado son confirmadas por el método de dideoxi (Sanger, F.S., y colaboradores, (1977), Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) usando el Analizador de DNA 3700 (ABI PRISM Perkin Elmer Applied Biosystems, Japón) . Los plásmidos resultantes son designados pCR3.1/M2-1 (el plásmido que lleva el cDNA que codifica la región variable de cadena ligera del TRA-8 humanizado y una región constante de cadena ligera de Ig humano) . El plásmido obtenido pCR3.1/M2-l que contiene el fragmento LM2-DNA es digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoRI. Un µg del DNA de plásmido de clonación pHSG399 es digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I, y luego desfosforilado con CIP. El DNA de pHSG399 desfosforilado resultante y el fragmento LM2-DNA, que se ha digerido, con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I, son ligados usando el Kit de Ligación de DNA Versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Luego, DH5 de E. coli es transformado con el DNA ligado y extendido sobre el medio de agar LB que contiene IPTG 0.1 mM, X-Gal al 0.1% y 50 µg/ml de cloranfenicol (concentraciones finales). Los transformantes blancos obtenidos son cultivados en el medio LB liquido que contienen 50 µg/ml de cloranfenicol y el DNA de plásmido es extraído del cultivo resultante de acuerdo con el método alcalino-SDS . El DNA de plásmido extraído es digerido con Hind III y EcoR I, y luego un clon que lleva el fragmento LM2-DNA es seleccionado mediante la electroforesis en gel de agarosa 1%. Como un resultado del procedimiento anterior, el plásmido pHSG/M2-l-4 que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera TRA-8 del LM2 humanizado y la región constante de la cadena Igk humano es obtenido. La cepa de E. coli transformante que alberga este plásmido, designada como DH5a/pHSG/M2-l-4 de E. coli se depositó con el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japón el 20 de Abril de 2001, de acuerdo con el Budapest Treaty for the Deposit of Microorganisms, y se asignó el número de acceso FERM BP-7563. 3) Construcción del plásmido pSR/M2-l (plásmido de expresión para la cadena ligera de TRA-8 de IMZ humanizado) .

El plásraido obtenido pHSG/M2-l-4 que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de TRA-8 de LM2 humanizado y la región constante de la cadena de Igk humano es digerido con las enzimas de restricción Hind II y EcoR I. Un µg de DNA de plásmido de clonación pSRPDHH (solicitud de patente europea EP 0-909-816-A1) es digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I, y luego desfosforilado con CIP. El DNA de pSRPDHH desfosforilado resultante y el fragmento de DNA de HindIII-EcoR I obtenido de pHSG/M2-l-4 son ligados usando el Kit de Ligación de DNA Versión 2.0 (Takara Syuzo, CO. Ltd.)- Luego/ DH5a de E. coli es transformado con el DNA ligado y extendido sobre agar LB. Los transformantes obtenidos son cultivados en el medio LB liquido que contiene 100 ug/ml de ampicilina y el DNA de plásmido es extraído del cultivo resultante de acuerdo con el método alcalino-SDS . La inserción y orientación del fragmento de DNA deseado del vector pSRPDHH es confirmado mediante la secuenciación de DNA usando un analizador de secuencia de gen (ABI Prism 3700 DNA Analyser, Applied Biosystems) . El plásmido de expresión resultante que lleva cDNA que codifica la cadena ligera de TRA-8 humanizado es designado pSR/M2-l. .. .. Ejemplo 20. Producción de Anticuerpo Humanizado La transfección de las células Cos-7, es decir, una linea de células derivada de un riñón de mono, con los plásmidos de expresión para la cadena pesada de cadena TRA-8 humanizado y la cadena ligera de TRA-8 humanizado obtenidas en lo anterior, es conducida mediante los métodos de reactivo de transfección FUGENE6 (Boehringer Mannheim Biochemica) de acuerdo con el manual de instrucción proporcionado con el kit. Células COS-7 (Colección Americana de Cultivo Tipo No. CRL-1651) son cultivadas a las semi-confluencia (3xl06 células/plato) en un plato de cultivo (área de cultivo: 57 cm2; Sumítomo Bakelite) que contiene medio Eagle Modificado de Dulbecco (después en la presente referido como "D-MED", Gibco BRL) suplementado con suero de ternero fetal al 10% (después en la presente abreviado como MFCS"; Moregate) . En el tiempo medio, 10 µg plato (total 5 platos) del DNA de plásmido de expresión de cadena pesada de DR5 humanizado (pHA15-l) y 10 µg/plato del DNA de plásmido de expresión de cadena ligera de DR5 humanizado preparado - . mediante el método alcalino-SDS y la centrifugación con gradiente de densidad de cloruro de cesio son mezclados, y luego precipitados con etanol, seguido por la suspensión en 5 µ?/plato de dH20. .. .

Después de que 15 µ?/plato de reactivo de Transfección FUGENE6 es mezclado con 180 µ?/plato de D-MEM sin FCS, esta solución de FUGENE (185 µ?/plato) es mezclada con 5 µ?/plato de solución de DNA que contiene 10 ^g/plato del DNA de plásmido de expresión de cadena pesada de DR5 humanizado y 10 del DNA de plásmido de expresión de cadena ligera de DR5 humanizado. Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, la suspensión de plásmido obtenido (200 µ?) es adicionada a las placas de COS-7 previamente preparadas. Después de la incubación en CO2 al 5% a 37°C durante 24 horas, el medio de cultivo es cambiado con D-MEM sin FCS. Después de la incubación en CO2 al 5% a 37°C durante 72 horas, el sobrenadante de cultivo es recuperado para purificar los productos de expresión en los fluidos sobrenadantes. Mediante el método como es descrito en lo anterior, las células COS-7 son transfectadas con cada una de las siguientes combinaciones de plásmido. (A) : DNA no de plásmido (B) : cotransfección de pHB14-l y pSR/M2-l El cultivo luego es centrifugado (1,000 r.p.m., 5 minutos) y colectado el sobrenadante. El sobrenadante es centrifugado . nuevamente (9,800 r.p.m., 15 minutos) y filtrado con el filtro de 0.45 um (ADVANTEC TOYO DISMIC-25 es, Cat #25CS045 AS) . La purificación de IgG de los filtrados se obtiene usando la cromatografía de afinidad de Protein G-POROS (Applied Biosystems) bajo las siguientes condiciones: HPLC.BioCAD 700E (Applied Biosystems) columna: cartucho sensor de ProteinG-ID (tamaño de columna: 2.1 mmID x 30 mm LD, volumen del lecho: 0.1 mi; Cat #2-1002-00, Applied Biosystems) solución reguladora de elución: Glicina 0.1 M-HCl (pH 2.5) solución reguladora de neutralización; Tris-HCl 1M (pH 8.5) detección: 280 nm gasto de flujo: 1 ml/min tamaño de fracción: 0.5 ml/0.5 min tubo de fracción: micrptubo de polipropileno 1.5 mi temperatura: 4°C Después de que todos los filtrados son aplicados a la columna, 30 mi de PBS (Sigma, Cat #1000-3) son utilizados para lavar la columna. Cuando la solución reguladora de elución es aplicada, comienza a funcionar el colector de fracciones. Cada microtubo de fracción contuvo 55 µ? de NaCl 1 M, 110 µ? de solución reguladora de neutralización y 74 µ? de 2. mg/ml de albúmina de suero bovino (Sigma, Cat #A-7030) en PBS. Las fracciones del No. 8 hasta el No. 10 son dializadas y colectadas contra 1. litro de PBS (pH 7.5) a 4°C durante 1 dia usando Slide-A lyser (Pierce, Cat #66450) . La solución reguladora de diálisis es cambiada dos veces. La verificación de la expresión de los anticuerpos humanizados y el ensayo cuantitativo de los productos de expresión en los fluidos del sobrenadante de cultivo preparados, es realizada mediante ELISA con un anticuerpo contra IgG anti-humano. A cada cavidad de una placa de 96 cavidades (MaxiSorp, Nunc), 100 µ? de anticuerpo monoclonal especifico de IgG Fe anti-humano de cabra (Kappel) disuelto a la concentración final de 0.5 ]xg/val en solución reguladora de absorción (hidrogenocarbonato de sodio 0.05 M, azida de sodio al 0.02%, pH 9.6) es adicionado y la placa es incubada a 37°C durante 2 horas para ocasionar adsorción del anticuerpo. Luego, la placa es lavada con 350 µ? de PBS(-) que contiene Tween-20 al 0.05% (BioRad) (después en la presente referido como "PBS-T") cinco veces. A las cavidades después del lavado, es adicionado al sobrenadante de cultivo diluido con D-MEM que contiene FCS al 10% e incubado a 37°C durante 2 horas. Después del lavado nuevamente con PBS-T, 100 µ? de anticuerpo policlonal especifico de IgG Fe anti-humano de cabra, marcado con fosfatasa alcalina (Jackson Immuno Research. Lab. ) diluido 10,000 veces con. PBS-T es adicionado a cada cavidad- e incubado a 37°C durante 2 horas. Después del lavado . nuevamente con PBS-T, una, solución de sustrato de fosfato de p-nitrofenilo obtenido del kit del Sustrato de Fosfatasa Alcalina (BioRad) es adicionado de acuerdo con el manual de instrucción proporcionado con el kit. Después de la incubación a 37°C durante 0.5 a 1 hora, es medida la absorbencia a 405 nm. En los presentes experimentos, la inmonoglobulina G de plasma humano subclase 1 (IgGl) (Biopure AG) diluida con D-MEM que contiene FCS al 10% a ciertas concentraciones es usada como muestras de referencia de concentración de los anticuerpos DR5 humanizados contenidos en los fluidos del sobrenadante de cultivo. Como un resultado, los productos de expresión y purificados en el sobrenadante de cultivo son detectaados específicamente con el anticuerpo IgG anti-humano. La cantidad de anticuerpo IgG humano es de 8.96 µg (800 µ?) . Ejemplo 21. Actividad inductora de apoptosis del Act cuerpo Humanizado Células Jurkat (ATCC No. T B-152) , son usadas para examinar la actividad inductora de apoptosis del anticuerpo TRA-8 humanizado purificado. Células Jurkat cultivadas en el medio RPMI1640 con FCS al 10% (Gibco BRL) a 37°C durante 3 dias en la presencia de CO2 al 5% son suministradas en cada cavidad de una microplaca de 96 cavidades (Sumitomo Bakelite) a 50 µ? por cavidad. El TRA-8 humanizado preparado en el Ejemplo 20 es ajustado para tener la concentración del producto final de interés de 100 ng/ml con el medio RPMI1640 que contiene FCS al 10% al estimar sus concentraciones de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 20. Cada una de las soluciones de los productos de expresión así ajustada a 100 ng/ml es usada para producir diluciones en serie al repetir la dilución en serie 2 veces con RPMI1640 que contiene FCS al 10%. Cada una de las soluciones de TRA-8 humanizado diluidas es adicionada a cada cavidad a 50 µ? por cavidad. Después de la reacción a 37 "C durante 12 horas, 50 µ? de PMS 25 uM (metosulfato de fenazina; Sigma Chemical Co.) que contiene 1 mg/ml de XTT (sal interna de 2, 3-bis [2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil] -2H-tetrazolio-5-carboxianirida; Sigma Chemical Co.) es adicionado (concentraciones finales de 250 µg/ml para XTT y 5 uM para PMS) . Después de la incubación durante 3 horas, la absorbencia a 450 nm de cada cavidad es medida para calcular la viabilidad celular al usar la habilidad de reducción de los mitrocondrios como el índice. La viabilidad de las células en cada cavidad es calculada de acuerdo con la siguiente fórmula: Viabilidad (%) = 100 x (a-b)/(c-b) en donde Ma" es la medición de una cavidad de prueba, "b" es la medición de una cavidad sin células y wc" es la medición de una cavidad sin anticuerpo adicionado. Como un resultado, el producto de expresión preparado en el Ejemplo 20 (TRA-8 humanizado) es demostrado para inducir apoptosis en células de la linea de células de linfoma T que expresan antigeno DR5 humano. Ejemplo 22. Reactividad de TRA-8 a varias moléculas DR5 Para determinar la reactividad de TRA-8 a varias moléculas DR5, la reactividad de TRA-8 es examinada usando linfocitos activados como sigue. Primero, muestras de sangre periférica son tomadas de un humano (30 mi), titi (3 mi) y mongo cinomolgus (20 mi). Las muestras de sangre tuvieron 1 mi de heparina (Novoheparin; Novo) adicionado a éstas y las muestras luego se colocaron en capas lentamente sobre un volumen igual de solución Ficoll-Paque PLUS ( (Amersham Pharmacia Biotech.) gravedad especifica: 1.077 para todas excepto la del mono cinomolgus, que tuvo una gravedad especifica de 1.072) y se centrifugaron a 1,700 r.p.m. durante 30 minutos para obtener una fracción de células mononucleares de sangre periférica. Esta fracción de células mononucleares es lavada dos veces con solución de sal equilibrada de Hanks y luego suspendida en el medio RPMI1640 con FCS al 10% v/v a una densidad de células de 1x10s células/ml. Fitohemaglutinina-P (PHA-P, Sigma Chemicals, Co.) es adicionada a la suspensión resultante a una concentración final de 5 pg/ml y la muestra es incubada a 37°C bajo CO2 al 5% v/v durante 24 horas. Después de este tiempo, las células son recuperadas por centrifugación, lavadas y resuspendidas en el medio RPMI 1640 que contiene FCS al 10% v/v. Luego, para activar las células recuperadas, es adiconado interleucin-2 (Amersham Pharmacia Biotech.) a la suspensión a una concentración final de 10 unidades/ml y esta es incubada a 37°C bajo C02 al 5% v/v durante 72 horas. Una cantidad de la preparación activada calculada para contener lxlO6 células de linfocito activadas es colocada en un tubo de prueba y ya sea suspendida en 50 µ? de 0.5, 1, 5, 10 g/ml de TRA-8 en PBS o 50 µ? de PBS solo. La suspensión resultante se deja permanecer sobre hielo durante 1 hora, después de lo cual las células son lavadas 3 veces con alícuotas de 500 µ? de PBS y luego suspendidas en 50 µ? de 20 µg/ml de anticuerpo IgG anti-ratón marcado con FITC (Bioresource) en PBS. Usando las células suspendidas en 500 µ? de PBS como controles, son medidas las intensidades de fluorescencia, usando un citómetro de flujo (FACSCalibur; Becton Dickinson) . Las distribuciones de números de células por intensidad de fluorescencia son obtenidas y las proporciones de los números de las células manchadas a aquellas de las células totales son calculadas. Además, cada valor Kd es calculado usando la concentración de TRA-8 y las proporciones de los números de las células manchadas a aquellas de las células totales . Cada frecuencia de reactividad a los linfocitos activados de humano, titi y mono cinomolgus es casi la misma. Por consiguiente, TRA-8 es capaz de enlazar un amplio rango de DR5 de primate incluyendo humano, contra las cuales TRA-8 es originalmente preparado. Ejemplo 23. Estudio de dosis de escalaclón de TRA-8 en tltis Un estudio de toxicidad preliminar de dosis de escalación de TRA-8 es realizado usando un titi macho y un titi hembra. Tres ajustes de dosificación intravenosa individual, que son separadas por un periodo de retiro de 7 dias, son llevados a cabo. La dosis de TRA-8 es ajustada a 50, 250 y 1250 µg/cue po. Cuarenta y ocho horas después de cada tratamiento, la sangre es recolectada de la vena femoral y el plasma es preparado . Las actividades de aspartato aminotransferasa y alanina aminotransferasa en el plasma son medidas usando un analizador (FUJI DRI-CHEM: Fuji Film Medical Co., Ltd.). Toda la sangre es tomada sin ninguna anestesia. Como resultado, no se observan evidencias que indican lesión hepática en el examen bioquímico del plasma después de cada tratamiento. Ejemplo 24. Estudios farmacológicos in vitro e in vivo del TRA-8 contra células de cáncer Para determinar si TRA-8 tiene la eficacia terapéutica en la terapia anti-cáncer, la actividad de exterminación in vitro del TRA-8 usando varias lineas de células de cáncer es examinada como sigue.

Varias células de cáncer (2-8 x 103 células/50 µ?) cultivadas en el medio RPMI16 0 (para urkat) , medio DMEM (para HCT-116), MEM-R (para iDr) o DMEM-F12 (para COL2-Jck) obtenidos de Gibco BRL con FCS al 10% (Gibco BRL) a 37°C en la presencia de C02 al 5% son suministradas en cada cavidad de microplaca (Sumitomo Bakelité) . Los TRA-8 son ajustados para tener la concentración del producto final de interés de 100 ng/ml con el medio que contiene FCS al 10%. La solución de TRA-8 (100 ng/ml) es usada para producir diluciones en serie al repetir la dilución 2 veces en serie con el medio que contiene FCS al 10%. Cada una de la solución de TRA-8 diluida es adicionada a cada cavidad a 50 µ? por cavidad e incubada a 37°C. Después de la reacción a 37eC durante 72 horas, 50 µ? de PMS 25 µ? (metosulfato de fenazina, Sigma Chemical Co.) que contiene 1 mg/ml de XTT es adicionada (concentraciones finales de 250 µg/l?ll para XTT y 5 µ? para PMS) . Después de la incubación durante 3 horas, la absorbencia a 450 nm de cada cavidad es medida para calcular la viabilidad celular al usar la habilidad de reducción de los mitocondrios como el Índice. La viabilidad de las células en cada cavidad es calculada de acuerdo con la siguiente fórmula: Viabilidad (%) = 100 x (a-b)/(c-b) en donde "a" es la medición de una cavidad de prueba, "b" es la medición de una cavidad sin células y "c" es la medición de una cavidad sin anticuerpo adicionado. Los resultados son mostrados en la Tabla 3, enseguida . Tabla 3 Varias lineas de células de cáncer son fuertemente inducidas en apoptosis por TRA-8 bajo las condiciones in vi tro. Además, es determinado el efecto anti-tumor in vivo del TRA-8 en ratones desnudos transplantados con células WiDR, debido a que el TRA-8 no es reactivo cruzadamente con el DR5 murino. El anticuerpo DR5 anti-humano TRA-8 es administrado a ratones, desnudos que llevan xenoinjertos humanos que expresan la molécula DR5 humana. Los ratones usados fueron ratones desnudos/desnudos BALb/c de 6 semanas de edad (hembras, de Clea Japan Inc.), que se transplantaron con lineas de células de cáncer de colon humano WiDR (5 mm3) . En un dia después del transplante del tumor, estos ratones transplantados son tratados diariamente con la inyección intra-articula de TRA-8 (5 pg/cuerpo) en 14 veces. El crecimiento del tumor iDr es determinado diariamente por el tamaño de la masa del tumor. Los resultados son mostrados en la Tabla 4, enseguida. Tabla 4 8 días 11 días 15 dias 18 dias 22 días 25 días Control (FBS) 196 249 459 584 833 1193 SD ±55 ±77 ±149 ±230 ±274 ±419 RA-8 158 97 155 195 365 530 SD ±78 ±30 ±60 ±58 ±91 ±135 En este modelo, mientras que todos los animales no tratados mostraron crecimiento de tumor visible, el crecimiento del tumor en los animales tratados con TRA-8 es inhibido como es demostrado por el tamaño del tumor. Este resultado indicó que TRA-8 es efectivo en la eliminación de las células de tumor in vivo. Ejemplo 25. Estudio de combinación de TRA-8 La linea de células de cáncer de próstata humano PC-3 es obtenida de la Colección Americana de Cultivo de Tejido (ATCC) y mantenida en la Mezcla de Nutrientes F-12K (21127-022, Gibco BRL) que contiene suero bovino fetal al 10% (FBS, Hyclone), L-Glutamina-200 mM al 1% (25030-149, Gibco RL) y Solución de Penicilina Estreptomicina al 0.5% (P-7539, Sigma) . El medio RPMI1640 (MED-008, IWAKI) suplementado con FBS al 10% y Solución de Penicilina Estreptomicina al 0.5% es usado en el siguiente experimento. Las células PC-3 que crecen exponencialmente son colectadas por tripsinización y lavadas dos veces con el medio fresco. Las células luego son contadas, resuspendidas en medio fresco a una densidad de 5 x 104 células/ml y distribuidas por triplicado en placas de 96 cavidades de fondo plano (3598, Corning-Coster) en un volumen total de 100 µ?/cavidad un dia antes del inicio del experimento. Un fármaco anti-cáncer representativo, Paclitaxel (169-18611, Wako) disuelto en dimetilsulfóxido (10 mg/ml) es diluido en medio fresco y luego adicionado a las placas de 96 cavidades que contienen las células a 50 µ?/cavidad. Las concentraciones finales de dimetilsulfóxido son menores que 0.1%. Después de la incubación durante 24 hr a 37 °C en atmósfera de CO2 al 5%, TRA-8 diluido en medio fresco es adicionado las cavidades. Después de la incubación durante 24 horas adicionales, 50 µ? de Medio Esencial Mínimo (11095-098, Gibco BRL) que contiene 1 mg/mL de XTT y 25 mM de PMS es adicionado a las cavidades y las placas son incubadas durante 6 hr. OD450 luego es medido mediante SPECTRA MAX 250 (Molecular Devices) y la viabilidad celular es calculada como sigue: Viabilidad celular (%)=(OD450 para la cavidad que contiene células tratadas con Taxol y/o TRA-8 (agente (s)) - OD450 para la cavidad que no contiene ni células ni agente) x 100/(OD450 para la cavidad que contiene células sin agente - OD450 para la cavidad que no contiene células ni agente) . El resultado del ensayo anterior para TRA-8 combinado con un fármaco anti-cáncer representativo, Paclitaxel, es seguido. El Paclitaxel redujo la viabilidad celular de células PC-3 pero más de 40% de las señales que indican células de cáncer viables aun permanecieron a concentraciones de hasta 200 nM. Notablemente, la adición de 0.1 ng/ml de TRA-8 grandemente disminuyó la viabilidad celular de las células de cáncer, hasta 10%, aunque nada de reducción en la viabilidad celular se observa después de una sola aplicación de TRA-8 a esta concentración. Este resultado claramente indica que TRA-8 mostró actividad anti-cáncer sinergisticamente cuando es combinado con otros fármacos anti-cáncer. Ejemplo 26. Análisis de Otros Tipos de Anticuerpo Humanizados de TRA-8 (1) Diseño de Anticuerpos Humanizados La construcción de una versión humanizada de TRA-8 es realizada mediante el método generalmente conocido como injerto de CDR. Anticuerpo mAB58'CL es usado como un aceptor como es descrito en el Ejemplo de Referencia 2 y las regiones de CDR del anticuerpo TRA-8 es injertado sobre el aceptor. En la región de estructura, algunos aminoácidos son injertados sobre el aceptor de ya sea TRA-8 o las secuencias consensúales humanas por los criterios dados por Queen y colaboradores (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 10029-10033, (1989)) y las secuencias de TRA-8 humanizado son construidas como es descrito después en la presente. (2) Construcción de Plásxnido que lleva el DNA de Región Variable de Cadena Pesada de Otros Tipos de TRA-8 Humanizado o de Ratón Como es mostrado en la SEQ ID No. 56 del Listado de Secuencias, la humanización de tipo Hl de las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo DR5 antihumano de ratón TRA-8 ocasionó reemplazar el 3— aminoácido (metionina) , el 13- (lisina), el 19- aminoácido (lisina), el 40= aminoácido (treonina), el 422 aminoácido (ácido glutámico) , el 44- aminoácido (arginina), el 84= aminoácido (serina), el 88= aminoácido (serina), el 93= aminoácido (metionina) , el 11 = aminoácido (treonina) , el 115- aminoácido (leucina) con glutamina, glutamina, arginina, alanina, glicina, glicina, asparagina, alanina, valina, leucina y valina, respectivamente. Como es mostrado en la SEQ ID No. 59 del Listado de Secuencias, la humanización de tipo H3 de las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo DR5 antihumano de ratón TRA-8 ocasionó reemplazar el 13= aminoácido (lisina), el 19= aminoácido (lisina), el 40= aminoácido (treonina), el 42= aminoácido (ácido glutá ico), el 44- aminoácido (arginina), el 88£ aminoácido (serina) , el 93- aminoácido (metionina), el 1142 aminoácido (treonina), el 1152 aminoácido (leucina) con glutamina, arginina, alanina, glicina, glicina, alanina, valina, leucina y valina, respectivamente. Como es mostrado en la SEQ ID No. 60 del Listado de Secuencias, la humanización de tipo H4 de las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo DR5 antihumano de ratón TRA-8 ocasionó reemplazar el 132 aminoácido (lisina), el 192 aminoácido (lisina), el 882 aminoácido (serina), el 93- aminoácido (metionina) , el 1142 aminoácido (treonina) , el 1152 aminoácido (leucina) con glutamina, arginina, alanina, valina, leucina y valina, respectivamente. Como es mostrado en la SEQ ID No. 61 del Listado de Secuencias, el plásmido que lleva el DNA de la región variable de cadena pesada del TRA-8 quimérico es designado como "tipo M". Además, el TRA-8 humanizado descrito en el Ejemplo 17 y 18 es designado como "tipo H2". Los plásmidos que llevan DNA que codifica la región variable de cadena pesada del TRA-8 humanizado o quimérico son construidos como sigue. La PCR es usada para construir las siguientes Secuencias de DNA, cada una de las cuales comprendió lo descrito en lo anterior: Los siguientes 24 oligonucleótidos s sintetizados: 5'- ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtgtccac -3" (A; SEQ ID No. 32); 5'- tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg -3' (B; SEQ ID No. 33); 5'- tctgaagtac agctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg -3' (B2; SEQ ID No. 57); 5'- tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtaa agcctggagg gtccctgaaa ctctcctgtg cagcctctgg -3* (B3; SEQ ID No. 66); 5 '- attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga gtgggttgca accattagta -3' (C; SEQ ID No. 34); 5'- attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag actccagaga agaggctgga gtgggttgca accattagta -3 * (C2; SEQ ID No. 64); 5'- gtggtggtag ttacacctac tatccagacá gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaccctg -3' (D; SEQ ID No. 35); 5'- tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac -3' (E; SEQ ID No. 36); 5'- tatctgcaaa tgagcagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac -3' (E2; SEQ ID No. 62); 5'- tatctgcaaa tgagcagtct gagatctgag gacacggcta tgtaüactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac -3' (E3; SEQ ID No. 67); 5'- ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat cggtc - 3' (F; SEQ ID No.37); 5'- ggactactgg ggccaaggga ccactctcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat cggtc - 3* (F2; SEQ ID No. 68); 5'- ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatgg gag gtcaagccaa gcttatccaa -3' (G; SEQ ID No. 38); 5'- tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacticaga gtggacacct gtagctgttg -3' (H; SEQ ?) No. 39); 5'- tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagct gtacttcaga giggacacct gtagctgttg -3* (H2; SEQ ID No. 58); 5'- tttcagggac cctccaggct ttactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg -3 ' (H3; SEQ ID No. 69); '- tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag -3 ' (I; SEQ ID No.40); '- tccagcctct tctctggagt ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag -3 ' (12; SEQ ID No. 65); '- ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac tactaatggt tgcaacccac -3' (J; SEQ ID No. 41); '- ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt -3' ( ; SEQ ID No. 42); '- ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt -3' (K2; SEQ ID No. 63); '- ccttcttgca cagtaataca tagccgtgtc ctcagatctc agactgctca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt -3* ( 3; SEQ ID No. 70); '- gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cace -3' (L; SEQ ID No. 43) y '- gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgag gtggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cace -V (L2; SEQ ID No. 71).

Los siguientes 2 cebadores de PCR son sintetizados descrito e lo anterior: 5'- ttggaíaagc ttggcttgac -3' (Pl ; SEQ ID No. 44); y 5 gaccgatggg cccttggtgg a -3 * (P2; SEQ ID No. 45).

La síntesis del DNA de tipo Hl que codifica una cadena de polipéptido que comprende una secuencia de señal de secreción, una región variable de la cadena pesada de TRA-8 humanizado y los 8 residuos de aminoácidos en el N-terminal de la región IgG-CHl, es realizada usando una combinación de PCR respectivamente. . El fragmento de DNA de tipo Hl es preparado como sigue- Composición de la solución de reacción de PCR: oligonucleótido A, 10 pmol; oligonucleótido B2, 10 pmol; oligonucleótido C, 10 pmol; oligonucleótido D, 10 pmol; oligonucleótido E, 10 pmol; oligonucleótido F, 10 pmol; oligonucleótido G, 10 pmol; oligonucleótido H2, 10 pmol; oligonucleótido I, 10 pmol; oligonucleótido J, 10 pmol; oligonucleótido K, 10 pmol; oligonucleótido L, 10 pmol; cebador de oligonucle.ótido Pl, 2 uM; cebador de oligonucleótido P2, 2 uM; solución reguladora II 10 X Pyrobest, 10 µ?; mezcla de dNTP, 8 µ? polimerasa de DNA Pyrobest, 0.5 µ?; y agua redestilada a un volumen final de 50 µ?. La reacción de PCR es conducida como sigue. La solución primero es calentada a 94 °C durante 5 minutos, después de lo cual un ciclo de calentamiento a 98°C durante 10 segundos, 55°C durante 30 segundos y 72 °C durante 1 minuto, es repetido 7 veces. Después de la consumación de este procedimiento, la solución de reacción es calentada a 72 °C durante 15 minutos. Después de la extracción con fenol y la precipitación con etanol, el precipitado de DNA resultante es secado al vacio, disuelto en un mínimo de agua redestilada, y separado mediante la electroforesis en gel de agarosa al 3%. Después de la electroforesis, el gel es manchado con 1 µ?/ml de solución acuosa de bromuro de etidio, para permitir la detección del DNA bajo luz UV. Las bandas de DNA correspondientes al DNA del tipo Hl son cortadas usando una hoja de afeitar y eluidas del gel usando Geneclean Spin kit (BIO 101, CA, USA) . Después de la extracción con fenol, el DNA éluido luego es concentrado por centrifugación a 7,500 X g, seguido por la precipitación con etanol, y finalmente ' disuelto en 5 µ? de agua destilada. La síntesis del DNA de tipo H3 que codifica una cadena de polipéptido que comprende una secuencia de señal de secreción, una región variable de la cadena pesada de TRA-8 humanizado y los 8 residuos de aminoácidos en el N-terminal de la región IgG-CHl, es realizada usando una combinación de PCR respectivamente. El fragmento de DNA de tipo H3 es preparado como sigue. Composición de la solución de reacción de PCR: oligonucleótido A, 10 pmol; oligonucleótido B, 10 pmol; oligonucleótido C, 10 pmol; oligonucleótido D, 10 pmol; oligonucleótido E2, 10 pmol; oligonucleótido F, 10 pmol; oligonucleótido G, 10 pmol; oligonucleótido H, 10 pmol; oligonucleótido I, 10 pmol; oligonucleótido J, 10 pmol; oligonucleótido K2, 10 pmol; oligonucleótido L, 10 pmol; cebador de oligonucleótido Pl, 2 µ?; cebador de oligonucleótido P2, 2 uM; solución reguladora II 10 X Pyrobest, 10 µ?; mezcla de d TP, 8 µ?;.. polimerasa de DNA Pyrobest,.0.5 µ?; y agua redestilada a un volumen final de 50 µ?. La reacción de PCR es conducida como sigue. La solución primero es calentada a 94 °C durante 5 minutos, después de lo cual un ciclo de calentamiento a 98°C durante 10 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 1 minuto, es repetido 7 veces. Después de la consumación de este procedimiento, la solución de reacción es calentada a 72 °C durante 15 minutos. Después de la extracción con fenol y la precipitación con etanol, el precipitado de DNA resultante es secado al vacio, disuelto en un minimo de agua redestilada, y separado mediante la electroforesis en gel de agarosa al 3%. Después de la electroforesis, el gel es manchado con 1 µ?/ml de solución acuosa de bromuro de etidio, para permitir la detección del DNA bajo luz UV. Las bandas de DNA correspondientes al DNA del tipo H3 son cortadas usando una hoja de afeitar y eluidas del gel usando Geneclean Spin kit. Después de la extracción con fenol, el DNA eluido luego es concentrado por centrifugación a 7,500 X g, seguido por la precipitación con etanol, y finalmente disuelto en 5 µ? de agua destilada. La sintesis del DNA de tipo H4 que codifica una cadena de polipéptido que comprende una secuencia de señal de secreción, una región variable de la cadena pesada de TRA-8 humanizado y los 8 residuos de aminoácidos en el N-terminal de la región IgG-CHl, es realizada usando una combinación de PCR respectivamente. El fragmento de DNA de tipo H4 es preparado como sigue. Composición de la solución de reacción de PCR: oligonucleótido A, 10 pmol; oligonucleótido B, 10 pmol; oligonucleótido C2, 10 pmol; oligonucleótido D, 10 pmol; oligonucleótido E2, 10 pmol; oligonucleótido F, 10 pmol; oligonucleótido G, 10 pmol; oligonucleótido H, 10 pmol; oligonucleótido 12, 10 pmol; oligonucleótido J, 10 pmol; oligonucleótido K2, 10 pmol; oligonucleótido L, 10 pmol; cebador de oligonucleótido Pl, 2 µ?; cebador de oligonucleótido P2, 2 µ?; solución reguladora II 10 X Pyrobest, 10 µ?; mezcla de dNTP, 8 µ?; polimerasa de DNA Pyrobest, 0.5 µ?; y agua redestilada a un volumen final de- 50 µ?. La reacción de, PCR es conducida como sigue. La solución primero es calentada a 94 °C durante 5 minutos,-después de lo cual un ciclo de calentamiento a 98 °C durante 10 segundos, 55°C durante 30 segundos y 72 °C durante 1 minuto, es repetido 7 veces. Después de la consumación de este procedimiento, la solución de reacción es calentada a 72 °C durante 15 minutos. Después de la extracción con fenol y la precipitación con etanol, el precipitado de DNA resultante es secado al vacio, disuelto en un minimo de agua redestilada, y separado mediante la electroforesis en gel de agarosa al 3%. Después de la electroforesis, el gel es manchado con 1 µ?/ml de solución acuosa de bromuro de etidio, para permitir la detección del DNA ba o luz UV. · Las bandas de DNA correspondientes al DNA del tipo H4 son cortadas usando una hoja de afeitar y eluidas del gel usando Geneclean Spin kit. Después de la extracción con fenol, el DNA eluido luego es concentrado por centrifugación a 7,500 X g, seguido por la precipitación con etanol, y finalmente disuelto en 5 µ? de agua destilada. La síntesis del DNA de tipo M que codifica una cadena de polipéptido que comprende una secuencia de señal de secreción, una región variable de la cadena pesada de TRA-8 quimérico y los 8 residuos de aminoácidos en el N-terminal de la región IgG-CHl, es realizada usando una combinación de PCR respectivamente. El fragmento dé DNA de tipo M. es. preparado como sigue. Composición de la solución de reacción de PCR: oligonucleótido A, 10 pmol; oligonucleótido B3, 10 pmol; oligonucleótido C2, 10 pmol; oligonucleótido D, 10 pmol; oligonucleótido E3, 10 pmol; oligonucleótido F2, 10 pmol; oligonucleótido G, 10 pmol; oligonucleótido H3, 10 pmol; oligonucleótido 12, 10 pmol; oligonucleótido J, 10 pmol; oligonucleótido K3, 10 pmol; oligonucleótido L2, 10 pmol; cebador de oligonucleótido Pl, 2 µ?; cebador de oligonucleótido P2, 2 uM; solución reguladora II 10 X Pyrobest, 10 µ?; mezcla de dNTP, 8 µ?; polimerasa de DNA Pyrobest, 0.5 µ?; y agua redestilada a un volumen final de 50 µ?. La reacción de PCR es conducida como sigue. La solución primero es calentada a 94 °C durante 5 minutos, después de lo cual un ciclo de calentamiento a 98 °C durante 10 segundos, 55°C durante 30 segundos y 72eC durante 1 minuto, es repetido 7 veces. Después de la consumación de este procedimiento, la solución de reacción es calentada a 72 °C durante 15 minutos. Después de la extracción con fenol y la precipitación con etanol, el precipitado de DNA resultante es secado al vacio, disuelto en un mínimo de agua redestilada, y separado mediante la electroforesis en gel de agarosa al 3%. Después de la electroforesis, el gel es manchado con 1 µ?/ml de solución acuosa de bromuro de etidio, para permitir la detección del DNA bajo luz UV. Las bandas de DNA correspondientes al DNA del tipo M son cortadas usando una hoja de afeitar y eluidas del gel usando Geneclean Spin kit. Después de la extracción con fenol, el DNA eluido luego es concentrado por centrifugación a 7,500 X g, seguido por la precipitación con etanol, y finalmente disuelto en 5 µ? de agua destilada. El DNA extraído cada uno, resultante (tipo Hl, tipo H3, tipo H4 y tipo ) es clonado usando el vector pGEM-T Easy (Promega) como sigue: El fragmento de DNA recuperado de la reacción de PCR (Hl, H3, H4 o M), 5 µ?; solución reguladora dé polimerasa 10 X Taq, 1 µ?; mezcla de dNTP, 1 µ?; polimerasa Taq (5 unidades/ml) , 1 µ?; y agua redestilada. a un volumen final de 10 µ?. . Después de lo anterior, cada solución se hace reaccionar a 70 °C durante 30 minutos, cada solución de DNA y el vector pGEM-T Easy son ligados usando un kit de ligación de DNA versión 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.), usando el protocolo del fabricante. Después de 4 horas de incubación a 15 °C, 2 µ? de la solución de reacción incubada son mezclados con 100 µ? de la cepa JM109 de E. coli competente a una densidad de células de 1-2 x 103 células/ml (Takara Shuzo Co., Ltd.), y la mezcla es mantenida sobre hielo durante 30 minutos, luego a 42 °C durante 30 segundos, y nuevamente sobre hielo durante 1 minuto. Luego, 500 µ? del medio . SCO (triptona al 2% v/v, extracto de levadura al 0.5% p/v, cloruro de sodio al 0.05% p/v, cloruro de potasio 2.5 mM p/v, cloruro de magnesio 1 m , y glucosa 20 mM) es adicionado a la mezcla, la cual es incubada durante una hora adicional, con agitación. Las cepas transformantes luego son aisladas y el DNA de plásmido es preparado de las cepas como es descrito en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". La secuencia de nucleótidos de este DNA que codifica la cadena pesada de TRA-8 humanizado de ratón es confirmada por el método de dideoxi, respectivamente (Sanger, F. S. y colaboradores, (1977), Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) usando el analizador de DNA 3700 (ABI PRISM; Perkin Elmer. Applied Biosystems, Japón) . El plásmido resultante es designado pHA15 (el plásmido que lleva , cDNA que codifica la cadena pesada de tipo Hl de TRA-8 humanizado), pHClO (el plásmido que lleva cDNA que codifica la cadena pesada de tipo H3 de TRA-8 humanizado), pHD21 (el plásmido que lleva cDNA que codifica la cadena pesada de tipo H4 de TRA-8 humanizado), y pMll (el plásmido que lleva cDNA que codifica la cadena pesada de TRA-8 quimérico). Las cepas de E. coli transformantes que albergan estos plásmidos, designadas como E. coli JM109/pHA15, E. coli JM109/pHC10, E. coli JMl09/pHD21, y E. coli JM109/pMll se depositaron con el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japón el 20 de abril del 2001, de acuerdo con el Budapest Treaty for the Deposit of Microorganisms, y se concedió . el número de acceso FERM BP-7555, FERM BP-7557, FERM BP-7558 y FERM BP-7559, respectivamente. (3) Construcción de Plásmidos de Expresión que Llevan el DNA de Región Variable de Cadena Pesada de TRA-8 Humanizado o de Ratón de Varios Tipos. Los vectores de expresión recombinantes para células de animales son construidos al insertar el DNA que codifica la cadena pesada de TRA-8 quimérico de tipo M o humanizado de tipo Hl, tipo H3 y tipo H4 (clonado en lo anterior) como sigue... Un \iq de plásmido pSRHHH3 (solicitud de patente Europea EP 0 909 816 Al) que lleva la región variable de cadena pesada el anticuerpo monoclonal anti-Fas humanizado HFE7A y el DNA genómico de la región constante IgGl humano, un vector de expresión para las células de mamífero, es digerido con las enzimas de restricción HindIII y Apal, y separado mediante la electroforesis en gel de agarosa al 3%. Después de la electroforesis, el gel es manchado 1 µ?/ml de solución acuosa de bromuro de etidio para permitir la detección de DNA bajo luz UV. Las bandas de DNA de vector que contienen DNA genómico de región constante IgGl humano sin la región variable de cadena pesada de HFE7A humanizado son cortadas usando una hoja de afeitar y eluidas del gel usando Geneclean Spin kit. Después de la extracción con fenol, el DNA eluido luego es concentrado por centrifugación a 7,500 X g, seguido por la precipitación con etanol, y finalmente disuelto en 5 µ? de agua destilada y luego desfosforilado usando CIP. El plásmido desfosforilado, digerido resultante (100 ng) es ligado con 1 ^g del fragmento de DNA de pHA15, pHClO, pHD21 o pMll que contiene el DNA que codifica la región variable de cadena pesada del TRA-8 humanizado quimérico, que también se ha digerido con HindIII y Apal, usando un Kit de Ligación de DNA Versión 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). La mezcla de ligación luego es usada para transformar JM109 de E. .coli, que luego es colocada sobre placas de agar LB que contienen 50 µg ml de ampicilina.

Los transformantes obtenidos por este método son cultivados en 2 mi de medio LB liquido que contiene 50 g/ml de ampicilina a 37°C durante la noche, y el DNA del plásmido es subsecuentemente extraído del cultivo resultante mediante el método alcalino-SDS . El DNA de plásmido extraído es digerido con HindIII y Apal, y sometido a la electroforesis en gel de agarosa al 3% p/v para confirmar la presencia o ausencia del inserto del DNA que codifica la región variable de cadena pesada del TRA-8 humanizado o quimérico. La inserción y orientación del fragmento de DNA deseado en el vector es confirmado mediante la secuenciación de DNA usando un analizador de secuencia de gen (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems) . Los plásmidos de expresión resultantes que llevan cDNA que codifica la cadena pesada de TRA-8 humanizado o quimérico fueron designados pHA15-l, pHClO-3, pHD21-l, y pMll-1, respectivamente. (4) Construcción de Vectores para las Cadenas Ligeras Humanizadas (4.1) Construcción de un Vector de Expresión para la Cadena Ligera del Anticuerpo Humanizado (tipo LM1) . Como es mostrado en la SEQ ID No. 72 del Listado de Secuencias, otra humanización (tipo LM1). de las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera. del anticuerpo DR5 antihumano de ratón TRA-8 ocasionó remplazar... el 3— aminoácido (valina) , 8- aminoácido (histidina) , 9- aminoácido (lisina), 102 aminoácido ( fenilalanina) , 11- aminoácido (metionina) , 132 aminoácido (treonina), 20- aminoácido (serina), 42- aminoácido (glutamina), 432 (serina), 602 aminoácido (ácido aspártico) , 63- aminoácido (treonina), 77- aminoácido (asparagina) , 782 aminoácido (valina) , 802 aminoácido (serina), 832 aminoácido (leucina), 852 aminoácido (ácido aspártico), 872 aminoácido ( fenilalanina) y 992 aminoácido (glicina), 1032 aminoácido (leucina) y 1082 aminoácido (alanina) del N-terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de TRA-8 son reemplazados con glutamina, prolina, serina,. serina, leucina, alanina, treonina, lisina, alanina, serina, serina, serina, leucina, prolina, fenilalanina, treonina, tirosina, glutamina, valina y treonina respectivamente. La secuencia resultante es designada LMl. Los plásmidos de expresión que llevan este tipo de secuencias de aminoácidos de cadena ligera humanizadas del anticuerpo DR5 antihumano TRA-8 (tipo LMl, SEQ ID No. 72 del Listado de Secuencias) son construidos como sigue. 1) Síntesis de cebadores para preparar las reglones variable y constante de la cadena ligera del TRA-8 humanizado (tipo LMl) DNA que codifica para la cadena de polipéptido LMl (SEQ ID No. 72 del Listado de Secuencias), cada una de las cuales es una fusión de la región variable del anticuerpo anti-DR5 humanizado de la cadena ligera de TRA-8 (tipo LM1) y la región constante de la cadena ligera Ig humano (cadena k) , son respectivamente sintetizados al usar combinaciones de PCR. Además de 7AL1P (SEQ ID No. 47), 7ALCN (SEQ ID No. 48), HKCDF11 (SEQ ID No. 50), HKCDR12 (SEQ ID No. 51), HKCDF22 (SEQ ID No. 52), HKCDR22 (SEQ ID No. 53), y HKCF12 (SEQ ID No. 54) . Los siguientes cebadores de oligonucleótido son sintetizados por PCR: 5' -gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atctgaatgt caccagtgga -3' (HKSPR12; SEQ ID No. 77). 2) Construcción del plásmido pCR3.1/I.1-2 (clonación de la cadena ligera de TRA-8 humanizado tipo LM1) El fragmento LMl-DNA que codifica para la secuencia de aminoácidos como es definido en la SEQ ID No. 72 de la misma es preparado al realizar la PCR de 2 etapas, insertado en un vector de plásmido y clonado en E. coli . a) PCR de primera etapa El fragmento LM1-F1-DNA que codifica para una región de secuencia de señal de secreción y una porción de la región FRLi con un sitio de segmentación de enzima de restricción Hind III adicionado en el extremo 5' es preparado bajo las siguientes condiciones. Los plásmidos de patrón, pHSGHM17 y pSRPDHH, son obtenidos al seguir la descripción en una solicitud de patente Europea EP 0 909 816 Al. Composición de la solución de reacción: DNA de plásmido pHSGHM17, 25 ng cebador de oligonucleótido 7AL1P, 50 pmol cebador de oligonucleótido HKSPR12, 50 pmol coctel de dNTPs, 5 µ? solución reguladora lOxPCR, 5 µ? polimerasa de DNA ampliTaq (PerkinElmer) , 2.5 unidades La solución de reacción que tiene la composición anterior es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestilada y usada en PCR. Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94 ° C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo térmico de 9 ° C durante 1 minuto, 55° C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por el calentamiento a 72 ° C durante 10 minutos. El fragmento LM1-F2-DNA que codifica para una porción de FRLi , CDRLi , FRL2 y CDRI2 es preparado bajo las siguientes condiciones. Composición de la solución de reacción: DNA de plásmido pL28, 25 ng cebador de oligonucleótido HKCDFll,. 50 pmol- cebador de oligonucleótido HKCDR12, .50 pmol coctel de dNTPs, 5 µ? solución reguladora lOxPCR, 5 µ? polimerasa de DNA ampliTaq, 2.5 unidades La solución de reacción que tiene la composición anterior es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestilada y usada en PCR. Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94 °C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por calentamiento a 72°C durante 10 minutos . El fragmento LM1-F3-DNA que codifica para CDRL2, FRL3 y una porción de CDRL3 es preparado bajo las siguientes condiciones. Composición de la solución de reacción: DNA de plásmido pSRPDHH, 25 ng cebador de oligonucleótido HKCDF22, 50 praol cebador de oligonucleótido HKCDR22, 50 pmol coctel de dNTPs, 5 µ? solución reguladora lOxPCR, 5 µ? polimerasa de DNA ampliTaq, 2.5 unidades La solución de reacción que tiene la composición anterior es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestilada y usada en PCR. Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94°C durante '2 minutos, después de lo cual un ciclo térmico de 9 °C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por calentamiento a 72°C durante 10 minutos. El fragmento LM1-F4-DNA que codifica para CDRL3, FRL4 y la región constante con un sitio de segmentación de enzima de restricción EcoR I en el extremo 3' es preparado bajo las siguientes condiciones. Composición de la solución de reacción: DNA de plásmido pSRPDHH, 25 ng cebador de oligonucleótido HKCF12, 50 pmol cebador de oligonucleótido 7ALCN, 50 pmol coctel de dNTPs, 5 µ? solución reguladora lOxPCR, 5 µ? polimerasa de DNA ampliTaq, 2.5 unidades La solución de reacción que tiene la composición anterior es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestilada y usada en PCR. Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94°C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo térmico de 9 ?C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por calentamiento a 72°C durante 10 minutos. Los fragmentos de DNA amplificados después de la PCR son separados mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida al- 5%~. El gel después de la electroforesis es manchado con 1 µg/ml de bromuro de etidio para detectar el DNA producido bajo luz UV. Las bandas de DNA respectivas asi detectadas son cortadas con una navaja de afeitar, b) PCR de segunda etapa LM1-DNA en el cual son fusionados los fragmentos descritos anteriormente LM1-F1-DNA, LM1-F2-DNA, LM1-F3-DNA y LM1-F4-DNA, es preparado bajo las siguientes condiciones. Composición de la solución de reacción: Fragmento de gel de LM1-F1-DNA preparado en la PCR de primera etapa. Fragmento de gel de LM1-F2-DNA preparado en la PCR de primera etapa, Fragmento de gel de LM1-F3-DNA preparado en la PCR de primera etapa, Fragmento de gel de LM1-F4-DNA preparado en la PCR de primera etapa, cebador de oligonucleótido 7AL1P, 50 pmol cebador de oligonucleótido 7ALCN, 50 pmol coctel de dNTPs, 5 ul solución reguladora lOxPCR, 5 µ? polimerasa de DNA ampliTaq, 2.5 unidades La solución de reacción que tiene la composición anterior es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestilada y usada en PCR. Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94 °C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por calentamiento a 72°C durante 10 minutos. El fragmento LMl-DNA asi preparado es insertado en el plásmido pCR3.1DNA usando el kit de clonación TA Eucariótico (In Vitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante e introducido en el TOP10F' de E. Coli competente, contenido en el kit. Las secuencias de nucleótidos de estos DNAs que codifican la cadena ligera de TRA-8 humanizado (tipo LM1) son confirmadas mediante el método de dideoxi (Sanger, F. S., y colaboradores, (1977), Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) usando el analizador de DNA 3700 (ABI PRISM; Pekin Elmer Applied Biosystems, Japón) . Los plásmidos resultantes son designados pCR3.1/LM1-2 (el plásmido que lleva el cDNA que codifica la región variable de cadena ligera de TRA-8 humanizado (tipo LM1) y una región constante de cadena ligera de Ig humano) . El plásmido obtenido pCR3.1/LMl-2 que contiene el fragmento LMl-DNA es digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I. Un µg de DNA del plásmido de clonación pHSG399 es digerido con las enzimas de restricció Hind III y EcoR ?, y luego desfosforilado con CIP. El DNA de pHSG399 desfosforilado resultante y el fragmento LMl-DNA, que se ha digerido con las enzimas de restricción Hind III y Eco I, son ligados usando el kit de ligación de DNA Versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Luego DH5a de E. coli. es transformado con el DNA ligado y extendido sobre medio de agar LB que contiene IPTG 0.1 m , X-Gal al 0.1% y 50 ug/ml de cloranfenicol (concentraciones finales) . Los transformantes blancos obtenidos son cultivados en el medio LB liquido que contiene 50 µg/ml de cloranfenicol y el DNA de plásmido es extraído del cultivo resultante de acuerdo con el método alcalino-SDS . El DNA del plásmido extraído es digerido con Hind III y EcoR I, y luego un clon que lleva el fragmento LM1-DNA es seleccionado mediante la electroforesis en gel de agarosa al 1%. Como un resultado del procedimiento anterior, el plásmido pHSG/Ml-2-2 que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de TRA-8 de LM1 humanizado y la región constante de la cadena Igk humana es obtenido. La cepa de E. coli transformante que alberga este plásmido, designada como DH5 /pHSG/Ml-2-2 de E. coli se depositó con el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Hagashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japón el 20 de abril del 2001, de acuerdo con el Budapest Treaty for the.. Deposit of Microorganisms, y se asignó el número de acceso FERM BP-7562. 3) Construcción del plásmido pSR/LMl-2 (plásmido de expresión para la cadena ligera de TRA-8 de LMl humanizado) El plásmido obtenido pHSG/Ml-2- que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de TRA-8 de LMl humanizado y la región constante de la cadena Igk humana es digerida con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I. Un µg de DNA de plásmido de clonación pSRPDHH (solicitud de patente Europea EP 0 909 816 Al) es digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I, y luego desfosforilado con CIP. El DNA de pSRPDHH desfosforilado resultante y el fragmento de DNA de HindIII-EcoRI obtenido de pHSG/Ml-2-2 son ligados usando el kit de ligación de DNA Versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Luego DH5 de E. coli. es transformado con el DNA ligado y extendido sobre agar LB. Los transformantes obtenidos son cultivados en el medio LB liquido que contiene 100 g/ml de ampicilina y el DNA de plásmido es extraído del cultivo resultante de acuerdo con el método alcalino-SDS. La inserción y orientación del fragmento de DNA deseado en el vector pSRPDHH es confirmada mediante la secuenciación de DNA usando un analizador de secuencias de gen. El plásmido de expresión resultante que lleva cDNA que codifica la cadena ligera de TRA-8 de LMl humanizado es designado pSR/LMl-2. (4.2) Construcción de un Vector de Expresión para la Cadena Ligera del Anticuerpo Humanizado (Tipo LM3) Como es mostrado en la SEQ ID No. 73 del Listado de Secuencias, otra humanización (tipo LM3) de las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo DR5 antihumano de ratón TRA-8 ocasionó reemplazar el 82 aminoácido (histidina), 92 aminoácido (lisina), 10- aminoácido ( fenilalanina) , ll2 aminoácido (metionina) , 13- aminoácido (treonina), 20- aminoácido (serina), 42= aminoácido (glutamina), 3= (serina), 77= aminoácido (asparagina) , 18-aminoácido (valina), 80o- aminoácido (serina), 83= aminoácido (leucina), 85= aminoácido (ácido aspártico), 87= aminoácido (fenilalanina), 99- aminoácido (glicina), 1032 aminoácido (leucina) y 108- aminoácido (alanina) del N-terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de TRA-8 son reemplazados con prolina, serina, serina, leucina, alanina, treonina, lisina, alanina, serina, leucina, prolina, fenilalanina, treonina, tirosina, glutamina, valina y treonina, respectivamente. La secuencia resultante es designada LM3. Los plásmidos de expresión que llevan este tipo de secuencias de aminoácidos de cadena ligera humanizadas del anticuerpo DR5 antihumano TRA-8 (tipo L 3, SEQ ID No. 73 del Listado de Secuencias) son- construidos como sigue. 1) Síntesis de cebadores para preparar las reglones- variable y constante de la cadena ligera del TRA-8 de 1M3 humanizado DNA que codifica para la cadena de polipéptido LM3 (SEQ ID No. 73 del Listado de Secuencias), cada una de las cuales es una fusión de la región variable del anticuerpo anti-DR5 humanizado de la cadena ligera de TRA-8 y la región constante de la cadena ligera Ig humano (cadena k) , son respectivamente sintetizados al usar combinaciones de PCR. Además de 7AL1P (SEQ. ID No. 47) y 7ALCN (SEQ ID No. 48), los siguientes cebadores de oligonucleótidos son sintetizados por PCR: 5'- atctagttct cagagaígga gacagacaca atcctgctat gggtgctgct gctctgggtt ccagg -3' (M0D1F1; SEQ ED No. 78); 5'- cagcacccat agcaggattg tgtctgtctc catctctgag aactagaíga gaggatgctt cttaagctt -3' (MOD1R1 ; SEQ ED No.79); 5'- ctccactggt gacattgtga tgacccaatc tccaagttct ttgtctgcat ctgtggggga cagggtc -3' (MOD1F22; SEQ ID No. 80); 5'- acttggagat tgggtcatca caatgtcacc agtggagcct ggaacccaga gcag-3 ' (MOD1R22; SEQ ID No. 81); 5'-accatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta ccaacagaaa ccaggaa -3' (MOD1F3; SEQ ID No. 82); 5 '- tacagcagta cccacatcct gactggcctt gcaggtgatg gígaccctgt cccccacaga tgcagacaaa ga -3* (MOD1R3; SEQ ID No. 83); 5'· aagcacccaa actcctcatc tattgggcat ccacccggca cactggggtc ccagataggt ttacaggcag t -3 ' (MOD1 F42; SEQ ID No. 84); 5'- cccagtgtgc cgggtggatg cccaatagat gaggagtttg ggtgctttt ctggtttctg ttggtaccag ge - 3' (MOD1R4; SEQ ID No. 85); 5 '- gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcaacc tat - 3'(M0D1F5; SEQ ?) No. 86); 5'- actagagatg gtgagggtga agtctgtccc agacccactg cctgtaaacc tatctgggac -3' (MOD1R52; SEQ ED No. 87); 5'- tactgtcagc aatatagcag cta cggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc -3' (MOD1F6; SÉQ ID No. 88); 5'- cgtccgatag ctgctaíatt gctgacagta ataggttgca aaatcctccg gctgcac -3' (MOD1R6; SEQ E) No. 89) 5'- aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga g -3' (MOD1F7; SEQ ID No. 90); 5'- gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgccttgacc gaa -3' (MOD1R7; SEQ ?) No. 91); y 5'- agatttcaac tgctcatcag atggcgggaa (LR17; SEQ ID No. 101). 2) Construcción del plásmido pCR3. l/liM3-3-44 (clonación de la cadena ligera de TRA-8 humanizado tipo LM3) El fragmento LM3-DNA que codifica para la secuencia de aminoácidos como es definido en la SEQ ID No. 73 de la misma, es preparado al realizar la PCR de 2 etapas, insertado en un vector de plásmido y clonado en E. coli . a) PCR de primera etapa El fragmento LM3-F31B-DNA que codifica para una región de secuencia de señal de secreción con un sitio de segmentación de enzima de restricción Hind III adicionado en el extremo 5', FRLi, CDRLi, FRL2 y CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4 y una porción de la región, constante, es preparado bajo las siguientes condiciones.

Composición de la solución de reacción: cebador de oligonucleótido M0D1F1, 5 pmol cebador de oligonucleótido M0D1R1, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1F22, 5 pmol cebador de oligonucleótido OD1R22, 5 pmol cebador de oligonucleótido M0D1F3, 5 pmol cebador de oligonucleótido M0D1R3, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1F42, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1R4, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1F5, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1R52, 5 pmol cebador de oligonucleótido M0D1F6, 5 pmol cebador de oligonucleótido M0D1R6, 5 pmol cebador de oligonucleótido M0D1F7, 50 pmol cebador de oligonucleótido M0D1R7 , 5 pmol cebador de oligonucleótido 7AL1P, 50 pmol cebador de oligonucleótido LR17, 5 pmol coctel de dNTPs, 5 µ? solución reguladora lOx PCR, 5 µ? polxmerasa de DNA ampliTaq, 2.5 unidades La solución de reacción que tiene la composición anterior es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestilada y usada en PCR. Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento., a 94°C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo térmico de 94 °C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por el calentamiento a 72 °C durante 10 minutos. El fragmento LM3-F31C-DNA que codifica para una porción de la región constante con un sitio de segmentación de enzima de restricción Eco R I adicionado en el extremo 3' es preparado bajo las siguientes condiciones. El plásmido de patrón, pSRPDHH, es obtenido al seguir la descripción en una solicitud de patente Europea EP 0 909 816 Al. Composición de la solución de reacción: DNA de plásmido pSRPDHH, 25 ng cebador de oligonucleótido M0D1F7, 50 pmol cebador de oligonucleótido 7ALCN, 50 pmol coctel de dNTPs, 5 µ? solución reguladora lOxPCR, 5 µ? polimerasa de DNA ampliTaq, 2.5 unidades La solución de reacción que tiene la composición anterior es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestilada y usada en PCR. Condiciones térmicas de PCR:. Calentamiento a 94 °C durante 2 minutos, después de lo. cual un ciclo térmico de 94 °C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por calentamiento a 72°C durante 10 minutos.

Los fragmentos de DNA amplificados después de la PCR son separados mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida al 5%. El gel después de la electroforesis es manchado con 1 µg/ml de bromuro de etidio para detectar el DNA producido bajo luz UV. Las bandas de DNA respectivas asi detectadas son cortadas con una navaja de afeitar, b) PCR de segunda etapa LM3-DNA en el cual son fusionados los fragmentos descritos anteriormente LM3-F31B-DNA y LM3-F31C-DNA es preparado bajo las siguientes condiciones. Composición de la solución de reacción: Fragmento de gel de LM3-F31B-DNA preparado en la PCR de primera etapa, Fragmento de gel de LM3-F31C-DNA preparado en la PCR. de primera etapa, cebador de oligonucleótido 7AL1P, 50 pmol cebador de oligonucleótido 7ALCN, 50 pmol coctel de dNTPs, 5.0 µ? solución reguladora lOx PCR, 5.0 µ? polimerasa de DNA ampliTaq, 2.5 unidades La solución de reacción que tiene la composición anterior es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestilada y usada en PCR. Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94 °C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por calentamiento a 72 °C durante 10 minutos. El fragmento LM3-DNA asi preparado es insertado en el plásmido pCR3.1DNA usando el Iit de clonación TA Eucariótico (In Vitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante e introducido en el TOP10F' de E. Coli competente, contenido en el kit. Las secuencias de nucleótidos de estos DNAs que codifican la cadena ligera de TRA-8 de LM3 humanizado son confirmadas mediante el método de dideoxi (Sanger, F. S., y colaboradores, (1977), Proc. Nati- Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) usando el analizador de DNA 3700 (ABI PRISM; PeJcin Elmer Applied Biosystems, Japón) . Los plásmidos resultantes son designados pCR3.1/LM3-3-44 (el plásmido que lleva el cDNA que codifica la región variable de cadena ligera de TRA-8 de LM3 humanizado y una región constante de cadena ligera de Ig humano) . El plásmido obtenido pCR3.1/LM3-3-44 que contiene el fragmento LM3-DNA es digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I . Un ]ig de DNA del plásmido de clonación pHSG399 es digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I, y luego desfosforilado con CIP. El DNA de pHSG399 desfosforilado resultante y el fragmento LM3-DNA, que se ha digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I, son ligados usando el kit de ligación de DNA Versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Luego DH5 de E. coli. es transformado con el DNA ligado y extendido sobre medio de agar LB que contiene IPTG 0.1 mM, X-Gal al 0.1% y 50 µg ml de cloranfenicol (concentraciones finales) . Los transformantes blancos obtenidos son cultivados en el medio LB liquido que contiene 50 µg ml de cloranfenicol y el DNA de plásmido es extraído del cultivo resultante de acuerdo con el método alcalino-SDS . El DNA del plásmido extraído es digerido con Hind III y EcoR I, y luego un clon que lleva el fragmento LM3-DNA es seleccionado mediante la electroforesis en gel de agarosa al 1%. Como un resultado del procedimiento anterior, el plásmido pHSG/M3-3-22 que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de . TRA-8 de LM3 humanizado y la región constante de la cadena Igk humana es obtenido. La cepa de E. coli transformante que alberga este plásmido, designada como ??5µ/??3T/?3-3-22 de E. coli se depositó con el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Hagashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japón el 20 de abril del 2001, de acuerdo con el Budapest Treaty for the.. Deposit of Microorganisms, y se asignó el número de acceso FERM. BP-756 . 3) Construcción del plásmido pSR/LM3-3-44-10 (plásmido de expresión para la cadena ligera de TRA-8 de LM3 humanizado) El plásmido obtenido pHSG/M3-3-22 que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de TRA-8 de L 3 humanizado y la región constante de la cadena Igk humana es digerida con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I. Un µg de DNA de plásmido de clonación pSRPDHH (solicitud de patente Europea EP 0 909 816 Al) es digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I, y luego desfosforilado con CIP. El DNA de pSRPDHH desfosforilado resultante y el fragmento de DNA de HindlII-EcoRl obtenido de pHSG/M3-3-22 son ligados usando el kit de ligación de DNA Versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Luego DH5a de E. coli. es transformado con el DNA ligado y extendido sobre agar LB. Los transformantes obtenidos son cultivados en el medio LB liquido que contiene 100 µg ml de ampicilina y el DNA de plásmido es extraído del cultivo resultante de acuerdo con el método alcalino-SDS . La inserción y orientación del fragmento de DNA deseado en el vector pSRPDHH es confirmada mediante la secuenciación de DNA usando un analizador de secuencias de gen (ABI Prism 3700 DNA Analyzer Applied Biosystems) . El plásmido de expresión resultante que lleva cDNA que codifica la cadena ligera de TRA-8 de LM3 humanizado es designado pSR/LM3-3- 4-10. (4.3) Construcción de un Vector de Expresión para la Cadena Ligera del Anticuerpo Humanizado (Tipo LM4) Como es mostrado en la SEQ ID No. 74 del Listado de Secuencias, otra humanización (tipo LM4) de las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo DR5 antihumano de ratón TRA-8 ocasionó reemplazar el 8- aminoácido (histidina), 92 aminoácido (lisina), 10- aminoácido ( fenilalanina) , 11= aminoácido (metionina) , 13° aminoácido (treonina), 20- aminoácido (serina), 422 aminoácido (glutamina), 43- (serina), 772 aminoácido (asparagina) , 78= aminoácido (valina) , 802 aminoácido (serina), 83= aminoácido (leucina), 852 aminoácido (ácido aspártico), 992 aminoácido (glicina), 103= aminoácido (leucina) y 1082 aminoácido (alanina) del N-terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de TRA-8 son reemplazados con prolina, serina, serina, leucina, alanina, treonina, lisina, alanina, serina, leucina, prolina, fenilalanina, treonina, glutamina, valina y treonina, respectivamente. La secuencia resultante es designada LM4. Los plásmidos de expresión que llevan este tipo de secuencias de aminoácidos de cadena ligera humanizadas del anticuerpo DR5 antihumano TRA-8 (tipo LM4) (SEQ ID No. 74 del Listado de Secuencias) son construidos como sigue. 1) Síntesis de cebadores para preparar las regiones variable y constante de la cadena ligera del TRA-8 de LM4 humanizado DNA que codifica para la cadena de polipéptido LM4 (SEQ ID No. 74 del Listado de Secuencias), cada una de las cuales es una fusión de la región variable del anticuerpo anti-DR5 humanizado de la cadena ligera de TRA-8 y la región constante de la cadena ligera Ig humano (cadena k) , son respectivamente sintetizados al usar combinaciones de PCR. Además de 7AL1P (SEQ ID No. 47), 7ALCN (SEQ ID No. 48)·, MOD1F1 (SEQ ID No. 78), M0D1R1 (SEQ ID No. 79), MOD1F22 (SEQ ID No. 80), MOD1R22 (SEQ ID No. 81), OD1F3 (SEQ ID No. 82), MOD1R3 (SEQ ID No. 83), MOD1F42 (SEQ ID No. 84), MOD1R4 (SEQ ID No. 85), MOD1F5 (SEQ ID No. 86), MOD1R52 (SEQ ID No. 87), MOD1F7 (SEQ ID No. 90) y MOD1R7 (SEQ ID No. 91), LR17 (SEQ ID No. 101), los siguientes cebadores de oligonucleótido son sintetizados por PCR: 5' -ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc -3' (MOD1F62; SEQ ID No. 92) 5' -cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataggttgca aaatcctccg gctgcag -3' (MOD1R62; SEQ ID No. 93) . 2) Construcción del plásmido pCR3.1/LM4-5-3 (clonación de la caden ligera de TRA-8 humanizado tipo IM4) El fragmento LM4-DNA que codifica para la secuencia de aminoácidos como es definido en la SEQ ID No. 74 de; la misma es preparado al realizar la PCR de 2 etapas, ..insertado en un vector de plásmido y. clonado en E. coli. a) PCR de primera etapa El fragmento LM4-F41B-DNA que codifica para una región de secuencia de señal de secreción con un sitio de segmentación de enzima de restricción Hind III adicionado en el extremo 5', FRLX, CDRLi, FRL2 y CDRL2, FRL3; CDRL3, FRL4 y una porción de la región constante, es preparado bajo las siguientes condiciones. Composición de la solución de reacción: cebador de oligonucleótido M0D1F1, 5 pmol cebador de oligonucleótido M0D1R1, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1F22, 5 pmol cebador de oligonucleótido OD1R22, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1F3, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1R3, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1F42, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1R4, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1F5, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1R52, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1F62, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1R62, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1F7, 50 pmol cebador de oligonucleótido MOD1R7, 5 pmol cebador de oligonucleótido 7AL1P, 50 pmol cebador de oligonucleótido LR17, 50 pmol coctel de dNTPs, ..5 µ? solución reguladora lOxPCR, 5 µ? poliraerasa de DNA ampliTaq, 2.5 unidades La solución de reacción que tiene la composición anterior es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestilada y usada en PCR. Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 9 °C durante 2 minutos, después de lo cual ún ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por el calentamiento a 72°C durante 10 minutos. El fragmento LM4-F41C-DNA que codifica para una porción de la región constante con un sitio de segmentación de enzima de restricción EcoR I adicionado en el extremo 3' es preparado bajo las siguientes condiciones. Los plásmidos de patrón, pSRPDHH, son obtenidos al seguir la descripción en una solicitud de patente Europea EP 0 909 816 Al. Composición de la solución de reacción: DNA de plásmido pSRPDHH, 25 ng cebador de oligonucleótido MOD1F7, 50 pmol cebador de oligonucleótido 7ALCN, 50 pmol coctel de dNTPs, 5 µ? solución reguladora lOxPCR, 5 µ? polimerasa de DNA ampliTaq, 2.5 unidades La solución de ..reacción que tiene la composición anterior- es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestilada y usada en PCR. Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 9.4 °C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por calentamiento a 72 °C durante 10 minutos. Los fragmentos de DNA amplificados después de la PCR son separados mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida al 5%. El gel después de la electroforesis es manchado con 1 µg/ml de bromuro de etidio para detectar el DNA producido bajo luz UV. Las bandas de DNA respectivas asi detectadas son cortadas con una navaja de afeitar, b) PCR de segunda etapa LM4-DNA en el cual son fusionados los fragmentos descritos anteriormente LM4-F41B-DNA y LM4-F41C-DNA es preparado bajo las siguientes condiciones. Composición de la solución de reacción: Fragmento de gel de LM4-F41B-DNA preparado en la PCR de primera etapa, Fragmento de gel de LM4-F41C-DNA preparado en la PCR de primera etapa, cebador de oligonucleótido 7AL1P, 50 pmol cebador de oligonucleótido 7ALCN, 50 pmol coctel de dNTPs, ..5 µ? solución reguladora lOxPCR, 5 µ? polimerasa de DNA ampliTaq, 2.5 unidades La solución de reacción que tiene la composición anterior es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestida y usada en PCR. Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 9 °C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por calentamiento a 72 °C durante 10 minutos. El fragmento LM4-DNA asi preparado es insertado en el plásmido pCR3.1DNA usando el kit de clonación TA Eucariótico (In Vitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante e introducido en el TOP10F' de E. Coli competente, contenido en el kit. Las secuencias de nucleótidos de estos DNAs que codifican la cadena ligera de TRA-8 de LM4 humanizado son confirmadas mediante el método de dideoxi (Sanger, F. S., y colaboradores, (1977), Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) usando el analizador de DNA 3700 (ABI PRISM; Pekín Elmer Applied Biosystems, Japón) . Los plásmidos resultantes son designados pCR3.1/LM4-5-3 (el plásmido que lleva, el cDNA que codifica la región variable de cadena- ligera de TRA-8 de LM4 humanizado y una región constante de cadena ligera de Ig humano). El plásmido obtenido pCR3.1/LM4-5-3 que contiene el fragmento LM4-DNA es digerido con las enzimas, de restricción Hind III y EcoR I. Un µg de DNA del plásmido de clonación pHSG399 es digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I, y luego desfosforilado con CIP. El DNA de pHSG399 desfosforilado resultante y el fragmento LM4-DNA, que se ha digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I, son ligados usando el kit de ligación de DNA Versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Luego DH5a de E. coli. es transformado con el DNA ligado y extendido sobre medio de agar LB que contiene IPTG 0.1 mM, X-Gal al 0.1% y 50 µg/ml de cloranfenicol (concentraciones finales) . Los transformantes blancos obtenidos son cultivados en el medio LB liquido que contiene 50 µg ml de cloranfenicol y el DNA de plásmido es extraído del cultivo resultante de acuerdo con el método alcalino-SDS. El DNA del plásmido extraído es digerido con Hind III y EcoR I, y luego un clon que lleva el fragmento LM4-DNA es seleccionado mediante la electroforesis en gel de agarosa al 1%. Como un resultado del procedimiento anterior, el plásmido pHSG/M4-5-3-l que lleva un fragmento de fusión de la región.' variable de la cadena ligera de TRA-8 de LM4 humanizado y la región constante de la cadena Igk humana es obtenido. La cepa de E. coli transformante que alberga este plásmido, designada como ... DH5 /pHSG/M4-5-3-l de E. coli se depositó con el International Pátent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Hagashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japón el 20 de abril del 2001, de acuerdo con el Budapest Treaty for the Deposit of Microorganisms, y se asignó el número de acceso FERM BP-7565. 3) Construcción del plásmido pSR/LM3-5-3-3 (plásmido de expresión paxa la cadena ligera de TRA-8 de LM4 humanizado) El plásmido obtenido pHSG/M4-5-3-l que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de TRA-8 de L 4 humanizado y la región constante de la cadena Igk humana es digerida con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I. Un g de DNA de plásmido de clonación pSRPDHH (solicitud de patente Europea EP 0 909 816 Al) es digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I, y luego desfosforilado con CIP. El DNA de pSRPDHH desfosforilado resultante y el fragmento de DNA de HindlII-EcoRl obtenido de pHSG/M4-5-3-l son ligados usando el kit de ligación de DNA Versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Luego DH5 de E. coli. es transformado con el DNA ligado y extendido sobre agar LB. Los transformantes obtenidos son cultivados en el medio LB liquido que contiene 100 pg/ml de ampicilina y el DNA de plásmido es extraído del cultivo resultante de acuerdo con el método alcalino-SDS . La inserción y orientación del fragmento de DNA deseado en el vector pSRPDHH es confirmada mediante la secuenciación de DNA usando un analizador de secuencias de gen (ABI Prism 3700 DNA Analyzer Applied Biosystems) . El plásmido de expresión resultante que lleva cDNA que codifica la cadena ligera de TRA-8 de LM4 humanizado es designado pSR/LM4-5-3-3. (4.4) Construcción de un Vector de Expresión para la Cadena Ligera del Anticuerpo Humanizado (Tipo LM5) Como es mostrado en la SEQ ID No. 75 del Listado de Secuencias, otra humanización (tipo LM5) de las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo DR5 antihumano de ratón TRA-8 ocasionó reemplazar el 8- aminoácido (histidina) , 9- aminoácido (lisina), 102 aminoácido (fenilalanina), ll2 aminoácido (metionina) , 13= aminoácido (treonina), 20° aminoácido (serina), 42- aminoácido (glutamina), 43= (serina), 77= aminoácido (asparagina) , 782 aminoácido (valina), 802 aminoácido (serina), 835 aminoácido (leucina), 103= aminoácido (leucina) y 1082 aminoácido (alanina) del N-terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de TRA-8 son reemplazados con prolina, serina, serina, leucina, alanina^ treonina, lisina, alanina, serina, leucina, prolina, fenilalanina, valina y treonina respectivamente. La secuencia resultante es designada LM5. Los plásmidos de expresión que llevan, este tipo de secuencias de aminoácidos., de cadena ligera humanizadas del anticuerpo DR5 antihumano TRA-8 (tipo LM5) (SEQ ID No. 75 del Listado de Secuencias) son construidos como sigue. 1) Síntesis de cebadores para preparar las regiones variable y constante de la cadena ligera del TRA-8 de LM5 humanizado DNA que codifica para la cadena de polipéptido LM5 (SEQ ID No. 75 del Listado de Secuencias), cada una de las cuales es una fusión de la región variable del anticuerpo anti-DR5. humanizado de la cadena ligera de TRA-8 y la región constante de la cadena ligera Ig humano (cadena k) , son respectivamente sintetizados al usar combinaciones de PCR. Además de 7AL1P (SEQ ID No. 47), 7ALCN (SEQ ID No. 48), MOD1F1 (SEQ ID No. 78), M0D1R1 (SEQ ID No. 79), MOD1F22 (SEQ ID No. 80), MOD1R22 (SEQ ID No. 81), MOD1F3 (SEQ ID No. 82), MOD1R3 (SEQ ID No. 83), MOD1F42 (SEQ ID No. 84), MOD1R4 (SEQ ID No. 85), MOD1R52 (SEQ ID o. 87), MOD1F7 (SEQ ID No. 90) y LR17 (SEQ ID No. 101), los siguientes cebadores de oligonucleótido son sintetizados por PCR: 5'- gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcaga tai -3' (MOD1F52; SEQ ID No. 94) 5'- ttctgtcagc aataíagcag ctatcggacg ttcggtggag gcaccaaggt ggaaaíc -3' (MOD1F63; SEQ ID No. 95) 5'- cgtccgatag ctgctaíatt gctgacagaa ataatctgca aaatcctccg gctgcag -3' (MOD1R63; SEQ ID No. 96) 5'- gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgcctccacc gaa-3' (MOD1 72; SEQ ID No. 102) 2) Construcción del plásmido pC 3.l/LM5^3-42 (clonación de la cadena ligera de TRA-8 hvnnanizado tipo LM5) El fragmento LM5-DNA que codifica para la secuencia de aminoácidos como es definido en la SEQ ID No. 75 de la misma, es preparado al realizar la PCR de 2 etapas, insertado en un vector de plásmido y clonado en E. coli. a) PCR de primera etapa El fragmento LM5-F51B-DNA. que codifica para una región de secuencia de señal de secreción con un sitio de segmentación de enzima de restricción Hind III adicionado en el extremo 5' , FRLi, CDRLi, FRL2, CDRL2/ FRL3, CDRL3, FRL4 y una porción de la región constante, es preparado bajo las siguientes condiciones . Composición de la solución de reacción: cebador de oligonucleótido MOD1F1, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1R1, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1F22, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1R22, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1F3, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1R3, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1F42, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1R4 , 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1F52, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1R52 , 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1F63, 5 pmol cebador de oligonucleótido MOD1R63, 5 pmol cebador de oligonucleótido M0D1F7, 50 pmol cebador de oligonucleótido MOD1R72, 5 pmol cebador de oligonucleótido 7AL1P, 50 pmol cebador de oligonucleótido LR17, 50 pmol coctel de dNTPs, 5 µ? solución reguladora lOx PCR, 5 µ? polimerasa de DNA ampliTaq, 2.5 unidades La solución de reacción que tiene la composición anterior es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestilada y usada en PCR. Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94 °C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo térmico de 94 °C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por el calentamiento a 72 °C durante 10 minutos. El fragmento LM5-F51C-DNA que codifica para una porción de la región constante con un sitio de segmentación de enzima de restricción Eco R I adicionado en el extremo 3' es preparado bajo las siguientes condiciones. Los plásmidos de patrón, pSRPDHH, son obtenidos al seguir la descripción en una solicitud de patente Europea EP 0 909 816 Al. Composición de la solución de reacción: DNA de plásmido pSRPDHH, 25 ng cebador de oligojiucleótido MOD1F7, 50 pmol cebador de oligonucleótido 7ALCN, 50 pmol coctel de dNTPs, 5 µ? solución reguladora lOxPCR, 5 µ? polimerasa de DNA ampliTaq, 2.5 unidades La solución de reacción que tiene la composición anterior es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestilada y usada en PCR. Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 9 °C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo térmico de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, repetido 30 veces, - seguido por calentamiento a 72°C durante 10 minutos. Los fragmentos de DNA amplificados después de la PCR son separados mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida al 5%. El gel después de la electroforesis es manchado con 1 g ml de bromuro de etidio para detectar el DNA producido bajo luz UV. Las bandas de DNA respectivas asi detectadas son cortadas con una hoja o navaja de afeitar. b) PCR de segunda etapa LM5-DNA en el cual son fusionados los fragmentos descritos anteriormente LM5-F51B-DNA y LM5-F51C-DNA es preparado bajo las siguientes condiciones. Composición, de la solución de reacción: Fragmento de. gel de LM5-F51B-DNA preparado en la PCR de primera etapa, Fragmento, de gel . de LM5-F51C-DNA preparado en la PCR de primera etapa, cebador de oligonucleótido 7AL1P, 50 pmol cebador de oligonucleótido 7ALCN, 50 pmol coctel de dNTPs, 5.0 µ? solución reguladora lOxPCR, 5.0 µ? polimerasa de DNA arapliTaq, 2.5 unidades La solución de reacción que tiene la composición anterior es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestida y usada en PCR. Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94 °C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo térmico de 9 °C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por calentamiento a 72 °C durante 10 minutos. El fragmento LM5-DNA asi preparado es insertado en el plásmido pCR3.1DNA usando el kit de clonación TA Eucariótico (In Vitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante e introducido en el TOP10F' de E. Colí competente, contenido en el kit. Las secuencias de nucleótidos de estos DNAs que codifican la cadena ligera de TRA-8 de LM5 humanizado son confirmadas mediante el método de dideoxi (Sanger, F. S., y colaboradores, (1977), Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) usando el analizador de DNA. Los- plásmidos., resultantes son designados pCR3.1/LM5-3-42 (el plásmido que lleva el cDNA que . codifica la región variable de cadena ligera de TRA-8 de LM5 humanizado y una región constante de cadena ligera de Ig humano) . El plásmido obtenido pCR3.1/LM5-3-42 que contiene el fragmento LM5-DNA es digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I. Un g de DNA de plásmido de clonación pHSG399 es digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I, y luego desfosforilado con CIP. El DNA de pHSG399 desfosforilado resultante y el fragmento LM5-DNA, que se han digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I, son ligados usando el Kit de Ligación de DNA Versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Luego, DH5a de E. coli. es transformado con el DNA ligado y extendido sobre medio de agar LB que contiene IPTG 0.1 mM, X-Gal al 0.1% y 50 g/ml de cloranfenicol (concentraciones finales) . Los transformantes blancos obtenidos son cultivados en el medio LB liquido que contiene 50 g/ml de cloranfenicol y el DNA de plásmido es extraído del cultivo resultante de acuerdo con el método alcalino-SDS. El DNA del plásmido extraído es digerido con Hind III y EcoR I, y luego un clon que lleva el fragmento LM5-DNA es seleccionado mediante la electroforesis en gel de agarosa al 1%. Como un resultado del procedimiento anterior, el plásmido pHSG/M5-3-27 que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de TRA-8 de LM5 humanizado y la región constante de la cadena Igk humana es obtenido . 3) Construcción del plásmido pSR/IM5-3-27-l (plásmido da expresión para la cadena ligera de TRA-8 de IM5 humanizado) El plásmido obtenido pHSG/M5-3-27 que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de TRA-8 de LM5 humanizado y la región constante de la cadena Igk humana es digerida con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I. Un ]ig de DNA de plásmido de clonación pSRPDHH (solicitud de patente Europea EP 0 909 816 Al) es digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I, y luego desfosforilado con CIP. El DNA de pSRPDHH desfosforilado resultante y el fragmento de DNA de Hindi-EcoRl obtenido de pHSG/ 5-3-27 son ligados usando el Kit de Ligación de DNA Versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Luego, DH5a de E. coli. es transformado con el DNA ligado y extendido sobre agar LB. Los transformantes obtenidos son cultivados en el medio LB liquido que contiene 100 µg ml de ampicilina y el DNA de plásmido es extraído del cultivo resultante de acuerdo con el método alcalino-SDS . La inserción y orientación del fragmento de DNA deseado en el vector pSRPDHH es confirmada al secuenciar el DNA usando -un analizador de secuencias de gen (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems) .

El plásmido de expresión resultante que lleva cDNA que codifica la cadena ligera de TRA-8 de LM5 humanizado es designado pSR/LM5-3-27-l . (4.5) Construcción de un Vector de Expresión para la Cadena Ligera del Anticuerpo Humanizado (tipo quimera) La secuencia mostrada en la SEQ ID No. 76 del Listado de Secuencias, la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del TRA-8 de tipo quimera, es designada LM6. Los plásmidos de expresión que llevan este tipo de secuencias de aminoácidos de cadena ligera humanizadas del anticuerpo DR5 antihumano TRA-8 (tipo LM6) (SEQ ID No. 75 del Listado de Secuencias) son construidos como sigue. 1) Síntesis de cebadores para preparar las regiones variable y constante de la cadena ligera del TRA-8 de LM6 humanizado DNA que codifica para la cadena de polipéptido LM6 (SEQ ID No. 75 del Listado de Secuencias), cada una de las cuales es una fusión de la región variable del anticuerpo anti-DR5 de ratón de la cadena ligera de TRA-8 (tipo ML6) y la región constante de la cadena ligera de Ig humano (cadena k) , son respectivamente sintetizados al usar combinaciones de PCR. Además de 7AL1P (SEQ ID No. 47) y 7ALCN (SEQ ID No. 48), los siguientes cebadores de oligonucleótido son sintetizados por PCR: 5'- tgatgtggac a gaatttgt gagactgggt catcacaatg tcaccagtgg a -3' (HKSPRI3; SEQ ID o. 97); 5*- tgggttccag gclccactgg tgacattgtg atgacccagt ctcac&aatt c -3' (MVF11; SEQ ID No. 98); 5'- aagacagatg gtgcagccac agcccgtttg alttccagct tggtgcctc -3' (MVRl 1 ; SEQ ID No. 99) ; y 5*- aagctggaaa tcaaacgggc tgtggctgca ccatctgtct tcatc -3'(MCF11 ; SEQ ID No. 100) . 2) Construcción del plásmido pCR3.1/LM6-1-16 (clonación de la cadena ligera de RA-8 humanizado tipo 1M6) El fragmento LM6-DNA que codifica para la secuencia de aminoácidos como es definido en la SEQ ID No . 75 de la misma, es preparado al realizar la PCR de 2 etapas , insertado en un vector de plásmido y clonado en E. coli . a) PCR de primera etapa El fragmento LM6-F1-DNA que codifica para una región de secuencia de señal de secreción en una porción de la región FRLi con un sitio de segmentación de enzima de restricción Hind III adicionado al extremo 5' , es preparado baj o las siguientes condiciones . Los plásmidos de patrón, pHSGHM17 y pSRPDHH, son obtenidos al seguir la descripción en una solicitud de patente Europea EP 0 909 816 Al . Composición de la solución de reacción : DNA de plásmido pHSGHM17 , 25 ng cebador de oligonucleótido 7AL1P, 50 pmol cebador de oligonucleótido HKSPR13 , 50 pmol coctel de dNTPs, 5 µ? solución, reguladora 10x PCR, 5 µ? polimerasa de DNA ampliTaq ( PerkinElmer) , 2.5 unidades. La solución de reacción que tiene la composición anterior es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestilada y usada en PCR. Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 9 °C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo térmico de 9 °C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por el calentamiento a 72°C durante 10 minutos. El fragmento LM6-F2-DNA que codifica para una porción de FRLi, CDRLi, FRL2, CDRL21 FRL3 , CDRL3 , FRL4 y una porción de la región constante, es preparado bajo las siguientes condiciones. Composición de la solución de reacción: DNA de plásmido pL28, 25 ng cebador de oligonucleótido MVF11, 50 pmol cebador de oligonucleótido VR12, 50 pmol coctel de dNTPs, 5 µ? solución reguladora lOx PCR, 5 µ? polimerasa de DNA ampliTaq, 2.5 unidades. La solución de reacción que tiene la composición anterior es ajustada a un ..volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestilada y usada en PCR.

Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94 °C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo térmico de 9 °C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por calentamiento a 72°C durante 10 minutos . El fragmento LM6-F3-DNA que codifica para una porción FRL4 y la región constante con un sitio de segmentación de enzima de restricción EcoR I adicionado en el extremo 3', es preparado bajo las siguientes condiciones. Composición de la solución de reacción: DNA de plásmido pSRPDHH, 25 ng cebador de oligonucleótido MCF11, 50 pmol cebador de oligonucleótido 7ALCN, 50 pmol coctel de dNTPs, 5 µ? solución reguladora lOxPCR, 5 µ? polimerasa de DNA ampliTaq, 2.5 unidades La solución de reacción que tiene la composición anterior es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua redestilada y usada en PCR. Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94°C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo térmico de 94°C. durante 1 minuto, 55eC durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por calentamiento a 72°C durante 10 minutos. Los fragmentos de DNA amplificados después de la PCR son separados mediante la electroforesis en · gel de poliacrilamida al 5%. El gel después de la electroforesis es manchado con 1 pg/ml de bromuro de etidio para detectar el DNA producido bajo luz UV. Las bandas de DNA respectivas asi detectadas son cortadas con una navaja de afeitar, b) PCR de segunda etapa . LM6-DNA en el cual son fusionados los fragmentos descritos anteriormente L 6-F1-DNA, LM6-F2-DNA y LM6-F3-DNA, es preparado bajo las siguientes condiciones. Composición de la solución de reacción: Fragmento de gel de LM6-F1-DNA preparado en la PCR de primera etapa, Fragmento de gel de LM6-F2-DNA preparado en la PCR de primera etapa, Fragmento de gel de LM6-F3-DNA preparado en la PCR de primera etapa, cebador de oligonucleótido 7AL1P, 50 pmol cebador de oligonucleótido 7ALCN, 50 pmol coctel de dNTPs, 5.0 µ? solución reguladora lOxPCR, 5.0 µ? . polimerasa de DNA ampliTaq, 2.5 unidades La solución de reacción que tiene la composición anterior es ajustada a un volumen final de 50 µ? al adicionar agua - redestida y usada en .PCR. Condiciones térmicas de PCR: Calentamiento a 94 "C durante 2 minutos, después de lo cual un ciclo térmico de 94 °C durante 1 minuto, 55 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos, repetido 30 veces, seguido por calentamiento a 72 °C durante 10 minutos. El f agmento LM6-DNA asi preparado es insertado en el plásmido pCR3.1DNA usando el Kit de Clonación TA Eucariótico (In Vitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante e introducido en el TOP10F' de E. Coli competente contenido en el kit. Las secuencias de nucleótidos de estos DNAs que codifican la cadena ligera de TRA-8 humanizado son confirmadas mediante el método de dldeoxi usando un analizador de DNA. Los plásmidos resultantes son designados pCR3.1/LM6-1-16 (el plásmido que lleva el cDNA que codifica la región variable de cadena ligera de TRA-8 de ratón y una región constante de cadena ligera de Ig humano) . El plásmido obtenido pCR3.1/LM6-1-16 que contiene el fragmento LM6-DNA es digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I. Un µg de DNA de plásmido de clonación pHSG399 es digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I, y luego desfosforilado con · CIP. El DNA de pHSG399 desfosforilado resultante y el fragmento LM6-DNA, que se han digerido con las enzimas .de restricción Hind III y EcoR I, son ligados usando el Kit . de. Ligación- de DNA' Versión. 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Luego, DH5a de E. coli . es transformado con el DNA ligado y extendido sobre medio de agar LB que contiene IPTG 0.1 mM, X-Gal al 0.1% y 50 g/ml de cloranfenicol (concentraciones finales) . Los transformantes blancos obtenidos son cultivados en el medio LB liquido que contiene 50 ug/ml de cloranfenicol y el DNA de plásmido es extraído del cultivo resultante de acuerdo con el método alcalino-SDS . El DNA del plásmido extraído es digerido con Hind III y EcoR I, y luego un clon que lleva el fragmento LM6-DNA es seleccionado mediante la electroforesis en gel de agarosa al 1% . Como un resultado del procedimiento anterior, el plásmido pHSG/M6-l-4-l que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de TRA-8 de ratón y la región constante de la cadena Igk humana es obtenido. La cepa de E. coli transformante que alberga este plásmido, designada como DH5a/pHSG/M6-l-4-l de E. coli se depositó con el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Hagashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japón el 20 de abril- del 2001, de acuerdo con el Budapest Treaty for the Deposit of Microorganisms, y se asignó el número de acceso FERM BP-7566. 3) Construcción del plásmido pSR/LM6-l-4-6 (plásmido de expresión par la cadena- ligera de TRA-8 de LM6 de tipo quimera) El plásmido obtenido pHSG/M6-l-4-l que lleva un fragmento de fusión de la región variable de la cadena ligera de TRA-8 de ratón y la región constante de la cadena Igk humana es digerida con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I. Un µg de DNA de plásmido de clonación pSRPDHH es digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoR I, y luego desfosforilado con CIP. El DNA de pSRPDHH desfosforilado resultante y el fragmento de DNA de Hindlll-EcoRl obtenido de pHSG/M6-l-4-l son ligados usando el Kit de Ligación de DNA Versión 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Luego DH5 de E. coli. es transformado con el DNA ligado y extendido sobre agar LB. Los transformantes obtenidos son cultivados en el medio LB liquido que contiene 100 µg/ml de ampicilina y el DNA de plásmido es extraído del cultivo resultante de acuerdo con el método alcalino-SDS . La inserción y orientación del fragmento de DNA deseado en el vector, es confirmada por la secuenciación de DNA usando un analizador de secuencias de gen. El plásmido de expresión resultante que lleva cDNA que codifica la cadena ligera de TRA-8 (tipo quimera) es designado pSR/LM6-l-4-6. (5) Producción de Varios Tipos de Anticuerpos TRA-8 Humanizado o Quimérico La transfección de las células COS-7 es conducida mediante los métodos de reactivo de transfección FUGENE6 (Boehringer Mannheim Biochemica) de acuerdo con el manual de instrucción proporcionado con el kit. Células COS-7 (Colección Americana de Cultivo Tipo No. CRL-1651) son cultivadas a semi-confluencia (3 x 106 células/plato) en un plato de cultivo (área de cultivo: 57 cm2; Sumitomo Bakelite) que contiene medio de Eagle Modificado de Dulbecco (después en la presente referido como "D-MED"; Gibco BRL) suplementado con suero de becerro fetal al 10% (después en la presente abreviado como "FCS"; Moregate) . En el tiempo medio, 10 µg plato (total de 5 platos) del DNA de plásmido de expresión de cadena pesada DR5 humanizado (pHA15-l) y 10 ug/plato del DNA de plásmido de expresión de cadena ligera de DR5 humanizado preparado mediante el método alcalino-SDS y la centrifugación de gradiente de densidad de cloruro de cesio son mezclados, y luego precipitados con etanol, seguido por las suspensión en 5 ug/plato de dH20. Después 15 ug/plato de reactivo de Transfección FUGENE6 es mezclado con 180 ug/plato de D-MEM sin FCS, esta solución de FUGENE (185 g plato) es mezclada con 5' ug/plato de solución de DNA que., contiene 10 u<j/plato de DNA de plásmido de expresión de cadena pesada de DR5. humanizado y 10 del DNA de plásmido de expresión de cadena ligera de DR5 humanizado. Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, la suspensión de plásmido obtenida (200 µ?) es adicionada a las placas COS-7 previamente preparadas. Después de la incubación en CO2 al 5% a 37 °C durante 24 horas, el medio dé cultivo es cambiado con D-MEM sin FCS. Después de la incubación en CO2 al 5% a 37 °C durante 72 horas, el sobrenadante de cultivo es recuperado para purificar los productos de expresión en los fluidos sobrenadantes. Mediante el método como es descrito en lo anterior, las células COS-7 son transfectadas con cada una de las siguientes combinaciones de plásmido: (A) : cotransfección de pHA15-l y pSR/LMl-2 (H1L1) (B) rcotransfección de pHB14-l y pSR/M2-l (H2L2) (C) : cotransfección de pHB14-l y pSR/LM3-3-44-10 (H2L3) (D) rcotransfección de pHB14-l y pSR/LM4-5-3-3 (H2L4) (E) rcotransfección de pHC10-3 y pSR/M2-l (H3L2) (F) .-cotransfección de pHC10-3 y pSR/LM3-3-44-10 (H3L3) (G) rcotransfección de pHC10-3 y pSR/LM4-5-3-3 (H3L4) (H) cotransfección de pHD21-l y pSR/LM5-3-27-l (H4L5) (I) cotransfección de pMll-1 y pSR/LM6-l-4-6 (Quimera) El cultivo luego es centrifugado (3,500 r.p.m., 15 minutos) y colectado-- el sobrenadante. El . sobrenadante es filtrado con el filtro de,.0.45 um (ADVANTEC TOYO DISMIG-25cs, Cat # 25CS045 AS). La purificación de IgG de los filtrados se obtiene usando la cromatografía de afinidad de Protein G-POROS (Applied Biosystems) bajo las siguientes condiciones: sistema de HPLC: BioCAD 700E (Applied Biosystems) columna: cartucho sensor de ProteinG-ID (tamaño de la columna: 2.1 mmID x 30 mm LD, volumen de lecho: 0.1 mi; Applied Biosystems) solución reguladora de elución: glicina 0.1 M-HCl (pH 2.5) solución reguladora de neutralización: Tis-HCl 1M (pH 8.5) detección: 280 nm gasto de flujo: 1 ml/min tamaño de fracción: 0.5 ml/0.5 min tubo de fracción: microtubo de polipropileno 1.5 mi temperatura: 4°C Después de que todos los filtrados son aplicados a la columna, 50 mi de PBS (Sigma, Cat # 1000-3) son usados para lavar la columna. Cuando es aplicada la solución reguladora de elución, se inició el colector de fracciones . Cada microtubo de fracción previamente contuvo 55 µ? de NaCl 1 M, 110 µ? de solución reguladora de neutralización y 74 µ? de 2 mg/ml de albúmina de suero bovino (Sigma, Cat # A-7030) e PBS. : Las fracciones del No. 7 hasta el No. 8 son colectadas. La verificación de la expresión de los anticuerpos humanizados y el ensayo cuantitativo de los productos de expresión en los fluidos de sobrenadante de cultivo preparados es realizada mediante ELISA con un anticuerpo contra IgG antihumano. A cada cavidad de una placa de 96 cavidades ( axiSorp, Nunc), 100 µ? de anticuerpo policlonal especifico de IgG Fe anti-humano de cabra (Kappel) disuelto a la concentración final de 0.5 g/ml en la solución reguladora de adsorción (hidrógenocarbonato de sodio 0.05 M, azida de sodio al 0.02%, pH 9.6) es adicionado y la placa es incubada a 37°C durante 2 horas para causar la adsorción del anticuerpo. Luego, la placa es lavada con 350 µ? de PBS-T cinco veces. A las cavidades después del lavado, el sobrenadante de cultivo diluido con D-MEM que contiene FCS al 10% es adicionado e incubado a 37 °C durante 2 horas. Después del lavado nuevamente con PBS-T, 100 µ? de anticuerpo policlonal especifico de IgG Fe anti-humano de cabra marcado con fosfatasa alcalina (Jackson Immuno Research Lab.) diluido 10,000 veces con PBS-T es adicionado a cada cavidad e incubado a 37 °C durante 2 horas. Después del lavado nuevamente con PBS-T, una solución de sustrato de fosfato de p-nitrofenilo obtenido del kit de Sustrato de Fosfatasa. Alcalina (Bio Rad) es adicionado de acuerdo con el manual de instrucción proporcionado, con el kit. Después de la incubación a 37 °C durante 0.5 a 1 hora, es medida la absorbencia a 405 nm. En los presentes experimentos, la inmunoglobulina G de plasma humano subclase I (IgGI) (Biopure AG) diluida con D-MEM que contiene FCS al 10% a ciertas concentraciones es usada como muestras de referencia de concentración de los anticuerpos DR5 humanizados contenidos en los fluidos del sobrenadante de cultivo. Como un resultado, los productos de expresión y purificados en el sobrenadante de cultivo son detectados específicamente con . el anticuerpo IgG anti-humano. La concentración final del anticuerpo IgG humano es de 44.03 µg/ml (H1L1), 39.8 g/ml (H2L2), 26.7 g/ml (H2L3) , 41.0 g/ml (H2L4), 39.3 g/ml (H3L2), 24.7 ig/ml (H3L3) , 21.5 µg ml (H3L4), 16.7 g/ml (H4L5) y 18.3 pg/ml (quimera), respectivamente. (6) Actividad Inductora de Apoptosis de varios tipos de Anticuerpos Humanizados o Anticuerpos Quiméricos Células Jurkat (ATCC No. T B-152), son usadas para examinar la actividad inductora de apoptosis del anticuerpo TRA-8 humanizado purificado. Células Jurkat cultivadas en el medio RPMI1640 con FCS al 10% (Gibco BRL) a 37 °C durante 3 dias en la presencia de CO2 al 5% son suministradas en cada cavidad de una microplaca de 96 cavidades. (Sumitomo Bakelite) a 50 ,µ? por cavidad. Los TRA-8. humanizados preparados en este Ejemplo 26 son ajustados para . tener la concentración del. producto, final de interés de 100 ng/ml con el medio RPMII640 que contiene FCS al 10% al estimar sus concentraciones en los fluidos de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 26. Cada una de las soluciones de los productos de expresión asi ajustada a 10Q ng/ml es usada para producir diluciones en serie al repetir la dilución de' 2 veces en serie con RPMI1640 que contiene FCS al 10%. Cada una de la solución diluida de TRA-8 humanizado (H1L1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L3, H3L4 o H4L5) es adicionada a cada cavidad, a 50 µ? por cavidad. Después de la reacción a 37°C durante 12 horas, 50 µ? de PMS 25 µ? que contiene 1 mg/ml de XTT es adicionado (concentraciones finales de 250 µg/ml para XTT y 5 µ? para PMS) . Después de la incubación durante 3 horas, la absorbencia a 450 nm de cada cavidad es medida para calcular la viabilidad de las células al usar la habilidad de reducción de los mitocondrios como el índice. La viabilidad de las células en cada cavidad es calculada de acuerdo con la siguiente fórmula: Viabilidad. (%) = 100 x .(a-b) / (c-b) en donde "a" es la medición de una cavidad de prueba, "b" es la medición de una cavidad sin células, y ,c" es la medición de una cavidad sin anticuerpo adicionado - Como un., resultado, los anticuerpos humanizados probados son demostrados que inducen apoptosis en las células de la línea de células de linforna T que expresan el antígeno DR5 humano. Además, la actividad inductora de apoptosis de TRA-8 humanizado a PC-3 es examinada al adicionar taxol de acuerdo con el método descrito en Ejemplo 25. La linea de células de cáncer de próstata humano PC-3 (ATCC No. CRL-1435) es obtenida de . la Colección Americana de Cultivo de Tejido (ATCC) y mantenida en la mezcla de nutrientes F-12K (21127-022, Gibco BRL) que contiene suero bovino fetal al 10% (FBS, Hyclone), L-Glutamina al l%-200 mM (25030-149, Gibco BRL) y una solución de Penicilina Estreptomicina al 0.5% (P-7539, Sigma) . El medio RPMI1640 (MED-008, IWAKI) suplementado con FBS al 10% y la Solución de Penicilina Estreptomicina al 0.5% es usado en el siguiente experimento. Las células PC-3 que crecen exponencialmente son colectadas por trypsinización y lavado dos veces con el medio fresco. Las células luego son contadas, resuspendidas en el medio fresco a una densidad de 5 x 104 células/ml y distribuidas por triplicado en placas de 96 cavidades de fondo plano (3598, Corning-Coster) en un volumen total de 100 µ?/cavidad un dia antes del inicio del experimento. Un fármaco anti-cáncer representativo, Paclitaxel (169-18611, ako) disuelto en dimetilsulfóxido (10 mg/ml) en diluido en medio fresco y luego adicionado a las placas de 96 cavidades que contiene las células a 50 µ?/cavidad. Las concentraciones finales de dimetilsulfóxido son menores que 0.1%. Después de la incubación durante 24 hr a 37°C en atmósfera de C02 al 5%, el anticuerpo TRA-8 humanizado (H1L1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L2, H3L3, H3L4 o H4L5) diluido en medio fresco es adicionado a las cavidades. Después de la incubación durante 24 hr adicionales, 50 µ? de Medio Esencial Minimo (11095-098, Gibco BRL) que contiene 1 mg/ml de XTT y 25 mM de PMS es adicionado a las cavidades y las placas son incubadas durante 6 hr. OD450 luego es medido mediante el contador de Multimarca ARVO HTS 1420 (Wallac Berthold) y la viabilidad de las células es calculada como sigue. Viabilidad de las células (%) = (OD450 para la cavidad que contiene células tratadas con Taxol y TRA-8 humanizado (agente(s)) - OD450 para la cavidad que no contiene células ni agente) x 100 / (OD450 para la cavidad que contiene células sin agente - OD 50 para la cavidad que no contiene ni células ni agente) . Como un resultado, los anticuerpos - humanizados probados se demuestran que inducen apoptosis en las células de cáncer de próstata humano que expresan antigeno DR5 humano. Ejemplo 27. Producción del Anticuerpo DR4 Una proteina de fusión que : contiene, el dominio extracelular de DR4 humano (a. a. 1-236) y' la: porción Fe. del.

IgGl humano se expresó en las Cos-7 transfectadas con un vector adenoviral recombinante . La proteina de fusión se purificó mediante la columna de afinidad de proteina A. Ratones Balb/c se inmunizaron con la proteina de fusión purificada como es descrito en lo anterior. Un clon de hibridoma, 2E12 (IgGl, Je) con enlace especifico a DR4 y la capacidad de inducir apoptosis de las células de linfoma B humano Ramos se subclonó tres veces. La especificidad de enlace de 2E12 se determinó mediante ELISA y el análisis de manchado de Western usando DR5 humano, DcRl y DcR2 y la proteina de fusión IgGl como antigenos de control. El enlace 2E12 al DR4 de la superficie de las células se determinó mediante el análisis de citómetria de flujo de las células Cos-7 transfectadas con cDNA de longitud completa que codifica el DR4 humano. La actividad inductora de apoptosis se determinó al incubar las células Ramos con 1 µg ml de 2E12 en la presencia de IgGl anti-ratón de cabra. La viabilidad de las células se determinó mediante el ensayo ATPLite como es descrito en lo anterior. Ejemplo 28. Caracterización del Anticuerpo DR4 El anticuerpo monoclonal DR4 (2E12) es especifico para el DR4 humano ya que no enlazó a otros receptores de TRAIL tales como DR5, DcRl y DcR2 en ELISA (Figura 19a). 2E12 reconoció el DR4 de -la - superficie de la célula como es demostrado por el análisis dé citometria de flujo de las células Cos-7 transíectadas con DR4 (Figura 19b). 2E12 fue capaz de inducir apoptosis de las células de linfoma Ramos en la presencia del segundo anticuerpo de reticulación en una manera dependiente de la dosis (Figura 19c) . El tratamiento in vitro de las células Ramos con 2E12 dió por resultado una activación dependiente del tiempo de la caspasa 8, 9 y 3, y la segmentación de PARP (Figura 19d) . Estos resultados indican que 2E12 es un anticuerpo anti-DR4 agonístico, que induce apoptosis en una manera dependiente de la caspasa. Usando anti-DR4 (2E12), seguido por el anticuerpo IgGl anti-ratón de cabra conjugado con PE y la citometria de flujo, el anticuerpo DR4 se mostró que enlaza las células de una linea de células de fibrosarcoma (Hs 913T) y varias lineas de células de cáncer de pecho (2LMP. MDA-MB231 y MDA-MB 453), pero mostró poco o nada de enlace a una linea de células de fibroblasto de piel humana normal (Malme-3) . Ejemplo 29. Actividad tumoricida de los anticuerpos DR4 La actividad tumoricida de 2E12 se probó usando modelos de tumor de cáncer de pecho. Ratones desnudos se inocularon s.c. con la linea de células de cáncer de pecho humano 2LMP. El tratamiento con dosis i.p. de 200 µg de 2E12 ocurrió en los dias 7, 10, 14, 17, 21 y 24 después de la inyección de células de tumor. Los animales recibieron i.v. adriamicina (dexorrubicina) (6 mg/kg) en los dias 8, 12 y 16. El tratamiento con 2E12 y adriamicina (Figura 20) produjo inhibición de crecimiento de tumor más grande que ya sea 2E12 o adriamicina solos . La actividad tumoricida de TRA-8 en combinación con 2E12 se probó usando los mismos modelos de tumor de cáncer de pecho. El tratamiento con dosis í.p. de 200 µg de TRA-8 y 2E12 ocurrió en los dias 7, 10, 14, 17, 21 y 24 después de la inyección dé células de tumor. Los animales recibieron adriamicina i.v. (6 mg/kg) en los dias 8, 12 y 16. El tratamiento con TRA-8 más 2E12, o TRA-8 más 2E12 y adriamicina produjo 88% y 100% de regresión de tumor completo, repectivamente (Figura 21) . Ejemplo 30. Actividad tumoricida de los anticuerpos DR4/DR5 en combinación con otras terapias. (1) Lineas de células y Reactivos El subclón 2LMP de la linea de células de cáncer de pecho humano MDA-MB-231, el subclón LCC6 de MDA-MB- 35 y el subclón DY36T2 de MDA-MB-361 se obtuvieron del Dr. Marc Lipmann (Georgeto n University, Washington, D.C.) y se mantuvieron en MEM mejorado, suplementado con FBS al 10% (Hyclone, Logan, UT) . Las lineas de células de cáncer de pecho humano MDA-MB-231, MDA-MB-453, MDA-MB-468, BT-474, SK-BR-3 y ZR-75-1 se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivo Tipo (Manassas, VA) . Las células MDA-MB-231, MDA-MB-453 y MDA-MB-468 se cultivaron en DMEM suplementado con vitaminas MEM, aminoácidos no esenciales de. MEM, piruv to de sodio 1 mM y FBS al 10%. Células BT-474 se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10 µg/ml de insulina, 4.5 g/1 de glucosa, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM y FBS al 10%. Células SK-BR-3 se cultivaron en medio de McCoy con FBS al 15%. Células ZR-75-1 se cultivaron en el medio F12K de Ham con FBS al 20%. Todas las lineas de células se mantuvieron en el medio libre de antibiótico a 37 °C en una atmósfera de C02 al 5% y se clasificaron rutinariamente para la contaminación de micoplasma. El mAb de TRA-8 (IgGl) purificado se produjo en UAB y también se proporcionó por Sankyo Co., Ltd. (Tokio, Japón). IgGl anti-ratón de cabra conjugado con ficoeritrina y anticuerpo de control igGl especifico de isotipo se obtuvieron de Southern Biotechnology Associates (Birmingham, AL) . Adriamicina y paclitaxel se adquirieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) y se prepararon como soluciones de extracto 10 mM en H20 destilada o DMSO, respectivamente. Para estudios de animales, la formulación clínica de paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Co., Princeton, NJ) se obtuvo de la University de Alabama at Birmingham Hospital Pharmacy (Birmingham, AL). Esta preparación fue diluida 1:5 en PBS inmediatamente antes del uso. (2) Análisis de Inmunofluorescencia Indirecta y Citometria. de Flujo de la Expresión de DR5 Células e fase de crecimiento exponencial se lavaron una vez con PBS de Dulbecco (deficiente de Ca2+ y Mg2+) y se cosecharon con EDTA 4 mM/KCl al 0.5% a 37°C. Las células se colectaron por centrifugación a 4°C durante 5 min a 1,000 rpm, se lavaron una vez y se resuspendieron en PBS que contiene BSA al 1% y azida de sodio 0.01% (solución reguladora FACS) a 4°C. Las células se incubaron con 10 µg/ml de TRA-8 purificado o un anticuerpo de control IgGl especifico de isotipo 60 min a 4°C, se lavaron una vez con solución reguladora, luego se incubaron con 10 g/ml de IgGl anti-ratón de cabra conjugado con PE durante 20 min a 4°C después del manchado del anticuerpo, las células se lavaron una vez con solución reguladora FACS y se fijaron en paraformaldehido al 1% durante 15 min sobre hielo. Las muestras se analizaron sobre un Becton Dickinson FACScan (San José, CA) y los datos se analizaron usando el software CellQuest. (3) Ensayos de Viabilidad de Células Usando ATPLite Las células se tripsinizaron y se resuspendieron en el medio de cultivo completo. Mil células por cavidad se colocaron en placas negras de 96 cavidades ópticamente claras (Costar #3904, Corning, NY) y se incubaron durante la noche a 37 °C antes de iniciar los tratamientos. Los fármacos y el anticuerpo se diluyeron en el medio de cultivo inmediatamente antes, del, uso, la concentración final de DMSO fue siempre <0.001%. La viabilidad de las células se estimó después de 24 h de exposición a TRA-8 solo. Para los tratamientos de combinación con fármacos citotóxicos, las células se pretrataron con. el fármaco durante 24 h antes de la adición del anticuerpo y se incubaron durante 24 h adicionales antes de estimar la viabilidad de las células mediante la medición de los niveles de ATP celulares usando el ensayo basado en luminiscencia de ATPLite (Packard Instruments, Meriden, CT) . El protocolo recomendado por el fabricante fue seguido con la excepción de que todos los volúmenes de reacción (medio de cultivo y reactivo) se redujeron a la mitad. Todas las muestras se analizaron por triplicado y son reportadas como el promedio + SE de un mínimo de 3 experimentos independientes . (4) Estudios de Terapia con TRA-8 Solo o en Combinación con Quimioterapia o Radiación en Ratones Desnudos Atimicos que Llevan Xenoinjertos de Cáncer de Pecho Ratones desnudos atimicos se inyectaron s.c. con 3^ x 107 células 2LMP. En 7 dias después de la inyección de las células de tumor, 200 o 600 ]ig (10 o 30 mg/kg) de TRA-8 se administró i.p. seguido por cinco inyecciones adicionales en los dias 10, 14, 17, 21 y 24. El crecimiento de los tumores se inspeccionó a través del tiempo. En estudios subsecuentes, los animales que llevan tumores s.c. 2LMP se. inyectaron i.p. con 200 ig de TRA-8 en los dias 7, 10, 14, 17, 21 y 24 solo o en combinación con adriamicina (6 mg/kg i.v., dias 8, 12 y 16) o paclitaxel (20 mg/kg i.p., en los dias 8, 12, 16, 20 y 24) . Se determinaron el tamaño de tumor y las proporciones de regresión. Además, un estudio se llevó a cabo con TRA-8 y adriamicina usando el mismo régimen descrito en lo anterior en combinación con 3 Gy de irradiación 60Co de los xenoinjertos 2L P en los dias 9 y 17. (5) Análisis de Apoptosis en Xenoinjertos Ratones desnudos atimicos inyectados s.c. con 3 x 107 células 2LMP en el dia 0 recibieron 100 µg de TRA-8 i.p. en los dias 7 y 10. Grupos de 2 ratones cada uno recibió adriamicina (3 mg/kg) en los dias 8 y 11, paclitaxel (10 mg/kg) en los dias 8, 11, o la combinación de TRA-8 y adriamicina o paclitaxel con la misma dosis y programa. Un grupo de ratones estuvo sin tratar. Los xenoinjertos se disectaron para el estudio de apoptosis en el dia 14 después de la inyección de las células de tumor. La razón para la reducción substancial en la intensidad del tratamiento comparada con el protocolo de tratamiento estándar de los inventores fue permitir adaptar el tejido de tumor para el análisis en el dia 14. El ensayo Túnel para la apoptosis1 en xenoinjertos de tumor se realizó como sigue. Secciones de tejido en parafina dé cinco mieras' se montaron sobre platinas Superfrost/Plus y se calentaron; a 58°C durante 1 h. Secciones de tejido se desparafinizaron en tres cambios de xileno y se rehidrataron con un cambio de etanol puro, etanol al 95% y etanol al 70%, cada uno en incrementos de 5 minutos. Luego, las secciones se colocaron en solución salina Tris-regulada (Tris base 0.5 , NaCl 0.15 M, Tritón X-100 al 0.0002%, pH 7.6). Núcleos apoptóticos se detectaron usando un kit de Apop Tag Preoxidase (Intergan, Purchase, NY) . Proteinasa K (20 µg/ml en H20 desionizada destilada) se adicionó a las muestras de tejido y se incubó a temperatura ambiente durante 15 min. Las peroxidasas endógenas se suprimieron con una solución acuosa de peróxido de hidrógeno al 3% durante 5 min. Las secciones se trataron con una solución reguladora de equilibrio durante 30 min y luego se incubaron con la TdT/enzima (diluida en la mezcla de reacción de marcación) durante 1 h a 37 °C usando cubiertas de parafilm. Durante esta incubación, la enzima TdT enlaza los extremos 3' -OH de los fragmentos de. DNA y cataliza la adición de deoxinucleótidos marcados con digoxigenina y no marcados . Los controles negativos se incubaron con H20 destilada (diluida en la mezcla de reacción de marcación) en lugar de la enzima TdT. Una solución reguladora de detención se adicionó durante 10 min a temperatura ambiente para determinar la reacción de marcación.. Un conjugado, anti-digoxigenina se adicionó a cada platina durante 30 min. El cromágeno 3,3' DAB se usó para visualizar el extremo 3' OH marcado de los fragmentos de DNA.

Las platinas luego se enjuagaron en agua desionizada y se contramancharon ligeramente con hematoxilina, se deshidrataron usando alcoholes graduados y xileno y se cubrieron usando Permount. Aproximadamente 10 campos aleatorios se evaluaron para el porcentaje de Túnel manchado y el porcentaje de cuerpos apoptóticos intensamente manchados por todo el tejido. (6) Análisis Estadístico (A) Análisis de la Interacción de TRA-8 con la Citotoxicidad de Fármaco In Vitro Los datos de citotoxicidad se evaluaron para estimar si . la combinación de efectos citotóxicos fueron aditivos, menor que aditivos (antagonisticos) , o mayor que aditivos (sinergisticos) . Las relaciones de dosis respuesta para los agentes solos o en combinación se modelaron usando un modelo de superficie dé respuesta de segundo orden con términos lineales, cuadráticos y de interacción para cada una de las 9 lineas de células (Montgomery, D.C. Design and Analysis of Experiments, New York: Wiley, 2001), como es recomendado por Gennings (On Testing for Drug/Chemical Interactions : Definitions and Inference, pp. 457-468, 2000). Un término de interacción significante se clasificó ya sea como sinergistico o antagonistico dependiendo si el término de interacción fue negativo con más citotoxicidad aditiva, o positivo con menos citotoxicidad aditiva. Si el término de interacción no fue significante, entonces la relación entre TRA-8 y adriamicina o TRA-8 y paclitaxel seria considerada aditiva, con la condición de los términos aditivos fueran significantes. (B) Análisis de TRA-8 , Quimioterapia, Radiación y Terapia de Combinación de Experimentos en Animales Individuales Datos de 6 experimentos independientes se analizaron mediante el experimento individual. Las combinaciones de tratamiento se compararon con respecto a la eficacia anti-tumor in vivo, es decir la inhibición del crecimiento del tumor, que se midió como tres puntos de extremo: extensión de los tiempos de duplicación de tumor, porcentaje de regresiones de tumor y proporciones de crecimiento a través del tiempo. El número real de dias en el cual el tumor se duplicó en las áreas de superficie (producto de dos diámetros) con relación a la linea de base en el dia 7 después de la inyección de células de tumor se usó en el análisis del tiempo de duplicación. La prueba Kruskal-Wallis no paramétrica se usó para las comparaciones de tiempo de duplicación de tumor promedio entre los tratamientos. La prueba exacta de Fisher se usó para comparar las proporciones de las regresiones de tumor y las regresiones libres de reincidencia a través de. los grupos de tratamiento.. Para determinar si cualquier terapia de combinación produjo inhibición sinergistica significante del crecimiento del tumor, es decir, más que la aditiva, las curvas de crecimiento de las mediciones de área en serie se compararon usando un procedimiento de modelo mezclado lineal sobre las primeras 3 semanas después del inicio de la terapia (Lindsey, J.K. Models for Repeated Measurements, pp. 100-142, Oxford, 1993) . Para probar los efectos sinergisticos de las terapias de combinación, se incluyó un término de interacción en el modelo. Si el término de interacción fue significante y el efecto fue la inhibición del crecimiento a una proporción mayor que el aditivo entonces la interacción se consideró sinergistica. (C) Análisis Agregado de los Efectos de la Terapia Un total de 166 animales, 10 grupos de tratamiento y 6 experimentos independientes se incluyeron en el análisis agregado. Las combinaciones de tratamiento se compararon con respecto a la eficacia anti-tumor in vivo. Los tiempos de duplicación de tumor promedio se analizaron usando la prueba Kruskal-Wallis y la prueba exacta de Fisher se usó para comparar las proporciones de las regresiones de tumor y las regresiones libres de reincidencia a través de los grupos de tratamiento. Todos los análisis estadisticos se condujeron usando SAS® (Sas/Stat User s Guide, SAS OnlineDoc, Versión 8, Cary NC: SAS Institute. Inc. , 1999) . ..-··:·. (6) Expresión DR5 y Citotoxicidad Inducida por TRA-8 en las Lineas de Células de Cáncer de Pecho Como es ilustrado en la Figura 22A, todas las nueve lineas de células de cáncer de pecho fueron positivas de DR5 con grados variables de expresión, de fuertemente positiva (LCC6 y MDA-453) a débilmente positiva (MDA-MB-468 y SK-BR-3) . La Figura 22B ilustra la citotoxicidad inducida por TRA-8 de las nueve lineas de células. Cuatro lineas de células fueron sensibles a la citotoxicidad inducida por TRA-8 con concentraciones IC50 de 17 a 299 ng/ml (LCC6, 2LMP, MDA-MB-231, MDA-MB-468), mientras que otras fueron muy resistentes (DY36T2, BT-474, MDA-MB-453) . No hubo una buena correlación de la expresión DR5 y el grado de citotoxicidad inducido por TRA-8 como es ilustrado por las lineas de células MDA-MB-453 y MDA-MB-468. Los efectos de TRA-8 sobre la citotoxicidad inducida por la quimioterapia luego se examinaron con adriamicina (Figura 23A) y paclitaxel (Figura 23B) . Un análisis para probar la interacción entre los efectos del anticuerpo y el fármaco es resumido en la Tabla 5. No hubieron .¦¦ interacciones sinergisticas significantes entre TRA-8 y paclitaxel, con la mayoría de las interacciones que son aditivas . Cuatro de nueve lineas de células cumplieron con los criterios para una interacción sinergistica entre TRA-8 y adriamicina. La linea de células 2LMP demostró buena sensibilidad a TRA-8, asi como sensibilidad a ya sea adriamicina o paclitaxel. Esta linea de células se eligió para explorar la eficacia in vivo del anticuerpo y/o los fármacos . Tabla 5. Efectos de la Interacción In Vita» para los Tratamientos de Combinación TRA-8 + Adriamicina TRA-8 + Paclitaxel Línea de Células Interacción Valora-p Interacción Valor*-p LCC6 Sinergística <0.001 Aditiva 0.624 MDA-MB-453 Sinergística <0.001 Sin respuesta0 0-615 2LMP Aditiva 0.153 Aditiva 0.937 MDA-MB-231 Aditiva 0.663 Aditiva 0.064 BT-474 Sinergística <0.001 ND" 0.992 ZR-75-1 Sinergística 0.013 Aditiva 0.172 DY36T2 ND" 0.808 ND" 0.798 MDA-MB-468 Aditiva 0.184 Aditiva 0.724 SK-BR-3 Aditiva 0.361 Sin respuest.ac 0.871 a Valor p se refiere al significado del término de interacción sinergística. Si ambos efectos de TRA-8 y el fármaco fueron significantes y el término de interacción fue significante, entonces los efectos de la combinación se consideraron sinergisticos . Si el valor p de interacción no es <0.05 entonces los- efectos de la combinación se consideraron aditivos . b No determinado debido a que el efecto de TRA-8 no fue significante, pero el efecto de adriamicina/paclitaxel fue significante. c No hubo respuesta a la dosis significante para cualquier agente . (7) Efectos Anti-Tumor ln Vivo de TRA-8 Solo o en Combinación con la Quimioterapia y/o la Radiación TRA-8 a dosis de 200 µg y 600 µg dos veces a la semana para 6 dosis produjo una inhibición similar del crecimiento del tumor para los tumores s.c. 2LMP bien establecidos (Figura 24) . En tres experimentos independientes adicionales, la dosis de 200 µg programa produjo inhibición estadísticamente significante del crecimiento del tumor (p<0.004, Kruskal-Wallis en tiempos de duplicación de tumor) comparado con los controles sin tratar y esta dosis y programas se seleccionaron para estudios adicionales. La Figura 25 ilustra el efecto de TRA-8, adriamicina o una combinación de TRA-8 y adriamicina sobre la eficacia antitumor. Como es comparado con los controles sin tratar, la terapia con TRA-8 solo o TRA-8 más adriamicina produjo inhibición insignificante del crecimiento del tumor (p=0.002 prueba Kruskal-Wallis), mientras que la adriamicina. no difirió de los controles. La combinación de TRA-8 más adriamicina produjo, inhibición de crecimiento más grande que cualquier agente solo (p=0.002), asi como regresiones del tumor significativamente más completas (cuatro) que cualquier agente solo donde no se observaron regresiones completas (p<0.001, prueba exacta de Fisher) . El sinergismo de TRA-8 y adriamicina in vivo usando un análisis de curva de crecimiento temprano. El término de interacción fue significante (p<0.001) y sinergistico . La interacción sinergistica fue corroborada en un segundo experimento independiente . Los efectos de TRA-8 y paclitaxel se estudiaron en este mismo modelo con observaciones similares (Figura 26) . Como es comparado con los controles sin tratar TRA-8 y el TRA-8 más paclitaxel produjeron inhibición significante del crecimiento del tumor (p<0.001, prueba de Kruskal- allis) . El crecimiento del tumor en animales tratados con TRA-8 más placlitaxel fue significativamente diferente que el paclitaxel solo (p=0.008) y produjo 3/8 de regresiones completas comparadas con ninguno para cualquier agente solo. El análisis de las curvas de crecimiento de tumor temprano demostraron que él efecto sinergistico fue casi significante (p=0.063) mientras que los efectos aditivos fueron significantes (p<0.001). Finalmente, los efectos de TRA-8, adriamicina y radiación con 60Co se analizaron como agentes individuales y en varias combinaciones como es ilustrado en la Figura 27.

Hubieron diferencias significantes en conjunto con respecto a los tiempos de duplicación de tumor (p<0.001) y comparaciones múltiples indicaron que la terapia triple con TRA-8, adriamicina y 60Co produjeron inhibición de crecimiento del tumor que fue significativamente diferente que los otros grupos tratados, mientras que ambos de los grupos de terapia doble (adriamicina más TRA-8 o 60Co más TRA-8) fueron diferentes que cualquier grupo de agente individual (p < 0.001). Los animales 60Co tratados con radiación sola no difirieron de los controles sin tratar (p=0.926). Todas las combinaciones de tratamiento de dos maneras tuvieron efectos sinergisticos significantes (p=0.001). Regresiones completas se observaron en 6/8 animales que reciben terapia triple y 4 animales no tuvieron recurrencia de tumor durante 180 dias de tratamiento. (8) Análisis Agregado de los Efectos de la Terapia Los estudios anti-tumor in vivo consistieron de 166 animales, y los tiempos de duplicación de tumor y la frecuencia de regresión de tumor completa para todos los animales en cada grupo de tratamiento se analizaron (Tabla 6) . El análisis de A OVA para los tiempos de duplicación de tumor promedio indicaron diferencias significantes entre los grupos de tratamiento (p<0.001), con múltiples compariciones que producen que TRA-8 + paclitaxel, TRA-8 + adriamicina y TRA-8 + adriamicina + 60Co tuvieron tiempos de duplicación de tumor promedio significativamente más largos que cualquier grupo de tratamiento que carece de TRA-8. La adición de TRA-8 a cualquier modalidad de tratamiento produjo un tiempo de duplicación de tumor más largo que aquella modalidad sola. De manera similar, la prueba Kruskal-Wallis e el tiempo promedio para la duplicación de tumor produjo que los promedios fueron significativamente diferentes en conjunto (p<0.001). Las comparaciones por pares usando la prueba de rango asignado Wilcoxin produjeron patrones similares para el tiempo promedio para la duplicación de tumor como las comparaciones múltiples de ANOVA. Este análisis subestima la inhibición de crecimiento producida por los tratamientos más efectivos, en que los grupos que no alcanzaron una duplicación de tumor al final del experimento se asignaron al dia de terminación del experimento. La Tabla 6 también proporciona la frecuencia de regresión completa de tumor y la frecuencia de persistencia de esa retención al final del experimento. No hubo regresiones completas de tumor observadas en los animales tratados con ya sea régimen de quimioterapia o la radiación atestiguando el crecimiento de tumor bien establecido y la agresividad del tumor. De la prueba exacta de Fisher, hubieron diferencias significantes en la frecuencia de regresiones completas de tumor entre los grupos de tratamiento (p<0.001) . Treinta de 166 animales alcanzaron la regresión completa y 28 de estos . recibieron TRA-8 solo o en combinación con otras modalidades. La regresión completa ocurrió en 1/42 animales de control: 1/54 animales que reciben quimioterapia, radiación o una combinación; y 28/68 de TRA-8 solo o regímenes de combinación de TRA-8. Los grupos tratados con TRA-8 tuvieron una frecuencia significativamente más grande (p<0.001) de regresión completa. De manera similar, 14/68 animales que reciben TRA-8 o combinaciones de TRA-8 no tuvieron re-crecimiento de tumor comparado con 1/42 controles y 0/52 animales tratados con quimioterapia y/o radiación. Las regresiones libres de reincidencia tuvieron períodos de observación de 99 a 171 días (146 + 24 días) . Tabla 2. Resultados Agregados del Tiempo de Duplicación y la Regresión Completa de los Tumores 2LMP Regresiones Completas Periodo de Tiempo de Duplicación Sin Observación # de de Tumor (dias) Total relncldenda Promedio Tratamiento Animales (promedio/intermedio) (%) (%) (dias) Controles 44(42)a 12/8 1(2%) 1(2%) 177 sin tratar 60Co 8(7) 14/10 0 0 186 Adriamicina ' 31(28) 17/18 0 0 · 197 Paclitaxel " 7 (5) 25/20 0 0 Adriamicina ' 8(8) 39/36 1 (13%) 0 197 4- 60CO T A 30(26) 47/23 6(20%) 5(17%) 159 TRA 8(8) 65/50 3(38%) 1(13%) 136 60Co TRA-8 + 8(8) 71/62 3(38%) 1(13%) •148 Paclitaxel TRA-8 + 14(12) 81/64 10(71%) 3(21%) 185 Adriamicina TRA-8 +· 8(6) >140/179 6(75%) 4 (50%) 192 Adriamicina + 60Co a Los números entre paréntesis son el número de animales no censurados (9) Apoptosis en Tumores Tratados La inducción de apoptosis en xenoinjertos 2LMP después del tratamiento con TRA-8, adriamicina, paclitaxel, TRA-8 + adriamicina y TRA-8 + paclitaxel se estimó usando la técnica TUNEL. En animales sin tratar, los tumores tuvieron 4% de células manchadas (1% intenso), mientras que el tratamiento con adriamicina o paclitaxel tuvieron 8% (6% intenso) y 7% (2% intenso) de células manchadas. Los animales tratados con TRA-8 solo tuvieron apoptosis sorprendente con 25% (15% intenso) de células manchadas. TRA-8 más adriamicina tuvo 28% (22% intenso) y TRA-8 más paclitaxel tuvo 26% (12% intenso) de células manchadas. Cualquiera de las patentes o publicaciones mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de aquellos expertos en la técnica a la cual la invención pertenece. Estas patentes y publicaciones son incorporadas en la presente por referencia al mismo grado como si cada publicación individual fuera específicamente e individualmente indicada que es incorporada por referencia. La presente invención no está limitada en el alcance por la descripción referida en lo anterior o las modalidades descritas en los ejemplos que se proponen como ilustraciones de unos cuantos aspectos de la invención y cualquiera de las modalidades que son funcionalmente equivalentes, están dentro del alcance de esta invención. Varias modificaciones de la invención, además de aquellas mostradas y descritas en la presente, llegarán a ser evidentes para aquellos expertos en la técnica y se proponen que se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.. Referencias 1. iley SR, Schooley K, Smolak PJ, Din WS, Huang CP, Nicholl JK, Sutherland GR, Smith TD, Rauch C, Smith CA, y colaboradores, Immunity 1995 Dic; 3 ( 6) : 673-82. 2. Pan G, O'Rourke K, Chinnaiyan AM, Gentz R, Ebner R, Ni J, Dixit VM Science 1997 Abril 4; 276 (5309) :lll-3. 3. 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Pan G, Ni J, Wei YF, Yu G, Gentz R, Dixit VM. Science 1997 Agosto 8/277(5327) :815-818. 11. Marsters SA, Sherida JP, Pitti RM, Huang A, Skubatch M, Baldwin D, Yuan J, Gurney A, Goddard AD, Godowski P, Ashkenazi A. Curx Biol 1997 Dic 1/7 (12) :1003-6. 12. Emery- JG, . McDonell P, Burke MB, Deen- KC, . Lyn S,-Silverman C, Dul E, Appelbaum ER, Eichman C, DiPrinzio R, Dodds RA, James IE, Rosenberg M, Lee JC, Young PR. J Biol Chem 1998 Jun. 5; 273 (23) : 14363-7. Walczak H, Miller RE, Ariail K, Gliniak B, Griffth TS, Kubin M, Chin , Jones J, Woodward A, Le T, Smith C, Smolak P, Goodwin RG, Rauch CT, Schuh JC, Lynch DH. Nat Med 1999 Feb; 5 (2) : 157-63. Gazitt Y. Leukemia 1999 Nov; 13 (11) : 1817-2 . Rieger J, Naumann U, Glaser T, Ashkenazi A, Weller M. FEBS Lett 1998 May 1; 427 ( 1 ): 124-8. Jeremías I, Herr I, Boehler T, Debatin KM. Eur J Immunol 1998 Jan;28 (1) :143-52. Martinez-Lorenzo MJ, Alava MA, Gamen S, Kim KJ, Chuntharapai A, Pineiro A, Naval J, Anel A. 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Cheng J y colaboradores, 1994 Science, 263, 1759-1762. Bendele AM y colaboradores, 1999 Clin Exp Rheumatol, 17(5), 553-560. Sheridan JP, Marsters AS, Pitti RM, Gurney A, Skubatch M, Bald in D, Ramakrishnan L, Gray CJ, Baker K, Wood Wl, Goddard AD, Godowski P, y Ashkenazi A. 1997 Science, 277, 818-821. Schneider P, Thome M, Burns K, Bodmer JL, Hofmann , Kataoka T, Holler N, Tschopp J., 1997 Immunity Dic;7 (6) :831-836. Kennedy NJ, Kataoka T, Tschopp J, y Budd RC. 1999 J. Exp. Med. 1891-1896. Miiler-Ladner U, Gay RE, y Gay S, 1997 Arthritis and allied conditions, un libro de reumatologia, 13 edición, Volumen 1,243-254.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para inducir selectivamente apoptosis en células objetivo que expresan DR5, caracterizado porque comprende las etapas de (a) poner en contacto las células objetivo con una cantidad terapéutica de un anticuerpo que específicamente enlaza un receptor de TRAIL, DR5, en donde el anticuerpo, en su forma soluble, tiene actividad que induce apoptosis in vivo e in vitro en células objetivo que expresan DR5 y (b) poner en contacto las células objetivo con una cantidad terapéutica de uno o más agentes terapéuticos. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque por lo menos una etapa de contacto se realiza in vivo. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque por lo menos una etapa de contacto se realiza in vitro. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes quimioterapéuticos . 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el agente o agentes quimioterapéuticos son seleccionados del grupo que consiste de bleomicina, carboplatin, clorambucilo, cisplatin, colquicina, ciclofosfamida, daunorrubicina, actinomicina, dietilestilbestrol, doxorrubicina, etopósido, 5-fluorouracilo, floxuridina, melfalan, metotrexato, mitomicina, 6-mercaptopurina, tenipósido, 6-tioguanina, vincristina y vinblastina. 6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el agente o agentes quimioterapéuticos son seleccionados del grupo que consiste de leflunomida, dactinomicina, tamoxifen, interferona a-2b, ácido glutámico, plicamicina, mércaptopurina, 6-tioguanina, carmustina, BCNU, lomustina, CCNU, citosina arabósido, estramustina, hidroxiurea, procarbazina, busulfan, medroxiprogesterona, fosfato de estramustina sódica, etinil estradiol, estradiol, acetato de megestrol, metiltestosterona, difosfato de dietilestilbestrol, clorotrianiseno, testolactona, mefalen, clorambucilO/ mecloretamina, tiotepa, fosfato de betametasona sódica, dicarbazina, asparaginasa, mitotano, sulfato de vincristina y sulfato de vinblastina. 7. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque los agentes quimioterapéuticos son ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y predisona o un subconjunto de los mismos. 8. El método de conformidad con l reivindicación 7, caracterizado porque además comprende- la administración de rituximab. .. ... 9. El método de conformidad con la- reivindicación 1, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son miembros de la familia TNF. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el miembro o miembros de la familia TNF son ligandos CD40, o fragmentos o derivados de los mismos. 11.. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el miembro o miembros de la familia TNF son ligandos Fas, o fragmentos o derivados de los mismos. 12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes antiinflamatorios. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el agente o agentes antiinflamatorios son agentes antiinflamatorios no esteroidales. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque los agentes antiinflamatorios no esteroidales son inhibidores de COX-1 o inhibidores de COX-2. 15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el agente o agentes antiinflamatorios son agentes antiinflamatorios esteroidales . 16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque eJL agente o agentes terapéuticos son agentes antivirales. 17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes antirretrovilares . 18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes antioportunistas. 19. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son antibióticos. 20. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes inmunosupresores. 21. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son preparaciones de inmunoglobulina . 22. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes antimaláricos. 23. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son fármacos antirreumáticos que modifican la enfermedad. 24. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son citoquinas . 25. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son quimioquinas . 26. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado, porque el agente o agentes terapéuticos son factores de crecimiento. 27. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente terapéutico es un compuesto que induce apoptosis. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el compuesto que induce apoptosis es, bisindolilmaleimida VIII (BisVIII), SN-50 o LY294002. 29. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente terapéutico es un segundo anticuerpo que promueve la apoptosis o bloquea la proliferación de las células objetivo. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el segundo anticuerpo es seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo de DR4, un anticuerpo TNF, un anticuerpo B7, un anticuerpo de ligando CD40, un anticuerpo CD40, un anticuerpo CD20 y un anticuerpo Fas . 31. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son seleccionados del grupo que consiste de agentes quimioterapéuticos, miembros de la familia TNF, agentes antiinflamatorios, agentes antivirales, antirretrovilares, antioportunistas, antibióticos, agentes inmunosupresores, inmunoglobulinas, agentes antimaláricos, agentes de artritis antirreumatoldes, citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento y un segundo anticuerpo que promueve la apoptosis o bloquea la proliferación de las células objetivo. 32. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula objetivo es una célula sinovial que prolifera anormalmente. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la célula sinovial es una célula sinovial de artritis reumatoide. 3 . El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula objetivo es una célula inmune activada. 35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la célula inmune activada es un linfocito activado. 36. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula objetivo es un neutrófxlo. 37. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula objetivo es una célula viralmente infectada. •38.· El método . de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado, porqué además comprende irradiar las células obj eti o . 39. Un método para inhibir la proliferación de células objetivo que expresan DR5, caracterizado porque comprende las etapas de (a) poner en contacto las células objetivo con una cantidad terapéutica de un anticuerpo que específicamente enlaza un receptor de TRAIL, DR5, en donde el anticuerpo, en su forma soluble, tiene actividad que induce apoptosis in vivo e in vitro en células que expresan DR5 y (b) poner en contacto las células objetivo con una cantidad terapéutica de uno o más agentes terapéuticos. 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque por lo menos una etapa de contacto se realiza in vivo. 41. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque por lo menos una etapa de contacto se realiza in vitro. 42. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes quimioterapéuticos . 43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el agente o agentes quimioterapéuticos son seleccionados del grupo que consiste de bleomicina,, carboplatin, clorambucilo, cisplatin, colquicina, ciclofosfamida, daunorrubicina, actinomicina, dietilestilbestrol, doxorrubicina, etopósido, 5-fluorouracilo, floxuridina, melfalan, metotrexato, mitomicina, 6-mercaptopurina, tenipósido, 6-tioguanina, vincristina y vinblastina. 44. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el agente o agentes quimioterapéuticos son seleccionados del grupo que consiste de dactinomicina, tamoxifen, interferona a-2b, ácido glutámico, plicamicina, mercaptopurina, 6-tioguanina, carmustina, BCNU, lomustina, CCNU, citosina arabósido, estramustina, hidroxiurea, procarbazina, busulfan, medroxiprogesterona, fosfato de estramustina sódica, etinil estradiol, estrádiol, acetato de megestrol, metiltestosterona, difosfato de dietilestilbestrol, clorotrianiseno, testolactona, mefalen, clorambucilo, mecloretamina, tiotepa, fosfato de betametasona sódica, dicarbazina, asparaginasa, mitotano, sulfato de vincristina y sulfato de vinblastina. 45. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque los agentes quimioterapéuticos son ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y predisona o un subconjunto de los mismos. 46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque además comprende la administración de rituximab. 47. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son miembros de la familia TNF. 48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el miembro o miembros de la familia TNF son ligandos CD40, o fragmentos o derivados de los mismos. 49. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el miembro o miembros de la familia TNF son ligandos Fas, o fragmentos o derivados de los mismos. 50. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes antiinflamatorios. 51.· El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el agente o agentes antiinflamatorios son agentes antiinflamatorios no esteroidales . 52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque los agentes antiinflamatorios no esteroidales son inhibidores de COX-1 o inhibidores de COX-2. 53. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el agente o agentes antiinflamatorios son agentes antiinflamatorios esteroidales . 54. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes antivirales. - .·.>.-¦ 55. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes antirretrovilares . 56. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes antioportunistas. 57. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son antibióticos . 58. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes inmunosupresores. 59. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son preparaciones de inmunoglobulina . 60. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes antimaláricos. 61. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes de artritis antirreumatoides . 62. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son citoquinas. 63. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son quimioquinas . 64. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son factores de crecimiento. 65. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente terapéutico es un segundo anticuerpo que promueve la apoptosis o bloquea la proliferación de las células objetivo. 66. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el segundo anticuerpo es seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo de DR4, un anticuerpo TNF, un anticuerpo B7, un anticuerpo de ligando CD40, un anticuerpo CD40, un anticuerpo CD20 y un anticuerpo Fas . 67. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente terapéutico es un compuesto que induce apoptosis. 68. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque el compuesto que induce apoptosis es, bisindolilmaleimida VIII (BisVIII), SN-50 o LY294002. 69. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son seleccionados del grupo que consiste de agentes quimioterapéuticos, miembros de la familia TNF, agentes antiinflamatorios, agentes antivirales, antirretrovilares, antioportunistas, antibióticos, agentes inmunosupresores, inmunoglobulinas, agentes antimaláricos, agentes de artritis antirreumatoides, citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento y un segundo anticuerpo que promueve la apoptosis o bloquea la proliferación de las células objetivo. 70. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la célula objetivo es una célula sinovial que prolifera anormalmente. 71. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque la célula sinovial es una célula sinovial de artritis reumatoide. 72. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la célula objetivo es una célula inmune activada. 73. El método de conformidad Con la reivindicación 39, caracterizado porque la célula objetivo es un linfocito activado. 74. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la célula objetivo es un neutrófilo. 75. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la célula objetivo es una célula viralmente infectada. 76. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque además comprende irradiar las células objetivo. 77. Un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad inflamatoria o autoinmune, caracterizado porque comprende (a) administrar al sujeto una cantidad terapéutica de un anticuerpo que específicamente enlaza un receptor de TRAIL, DR5, en donde el anticuerpo, en su forma soluble, tiene actividad que induce apoptosis in vivo e in vitro en células que expresan DR5 y (b) administrar al sujeto una cantidad terapéutica de un agente terapéutico. 78. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes quimioterapéuticos . 79. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque el agente o agentes quimioterapéuticos son seleccionados del grupo que consiste de bleomicina, carboplatin, clorambucilo, cisplatin, colquicina, ciclofosfamida, daunorrubicina, actinomicina, dietilestilbestrol, doxorrubicina, etopósido, 5-fluorouracilo, floxuridina, melfalan, metotrexato, mitomicina, 6-mercaptopurina, tenipósido, 6-tioguanina, vincristina y vinblastina. 80. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque- el agente o. agentes quimioterapéuticos son seleccionados del grupo que. consiste de dactinomicina, tamoxifen> interferona o-2b> ácido glutámico, plicamicina, mercaptopurina, 6-tioguanina, carmustina, BCNU, lomustina, CC U, citosina arabósido, estramustina, hidroxiurea, procarbazina, busulfan, medroxiprogesterona, fosfato de estramustina sódica, etinil estradiol, estradiol, acetato de megestrol, metiltestosterona, difosfato de dietilestilbestrol, clorotrianiseno, testolactona, mefalen, clora bucilo, mecloretamina, tiotepa, fosfato de betametasona sódica, dicarbazina, asparaginasa, mitotano, sulfato de vincristina y sulfato de vinblastina. 81. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque los agentes quimioterapéuticos son ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y predisona o un subconjunto de los mismos. 82. El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque además comprende la administración de rituximab. 83. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son miembros de la familia TNF . 84. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el miembro o miembros de la familia TNF son ligandos CD40, o fragmentos o derivados de los mismos. 85. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el miembro o miembros de la familia TNF son ligandos Fas, o fragmentos o derivados de los mismos. 86. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes antiinflamatorios. 87. El método de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque el agente o agentes antiinflamatorios son agentes antiinflamatorios no esteroidales . 88. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque los agentes antiinflamatorios no esteroidales son inhibidores de COX-1 o inhibidores de COX-2. 89. El método de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque el agente o agentes antiinflamatorios son agentes antiinflamatorios esteroidales. 90. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes antivirales. 91. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes antirretrovilares . 92. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes antioportunistas. ... 93. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son antibióticos. 94. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes inmunosupresores . 95. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son preparaciones de inmunoglobulina . 96. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes antimaláricos. 97. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son agentes de artritis antirreumatoides . 98. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son citoquinas. 99. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son quimioquinas . 100. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son factores de crecimiento. 101. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el agente terapéutico es un segundo anticuerpo que promueve la apoptosis o bloquea la proliferación de las células objetivo. 102. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque el segundo anticuerpo es seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo de DR4, un anticuerpo TNF, un anticuerpo B7, un anticuerpo de ligando CD40, un anticuerpo CD40, un anticuerpo CD20 y un anticuerpo Fas . 103. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente terapéutico es un compuesto que induce apoptosis . 104. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el compuesto que induce apoptosis es, bisindolilmaleimida VIII (BisVIII), SN-50 o LY294002. 105. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el agente o agentes terapéuticos son seleccionados del grupo que consiste de agentes quimioterapéuticos, miembros de la familia TNF, agentes antiinflamatorios, agentes antivirales, antirretrovilares, antioportunistas, antibióticos, agentes inmunosupresores, inmunoglobulinas, agentes antimaláricos, agentes de artritis antirreumatoides, citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento y un segundo anticuerpo que promueve la apoptosis o bloquea la proliferación, de las células objetivo. 106. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque la enfermedad inflamatoria o autoinmune es seleccionada del grupo que consiste de lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Hashimoto, artritis, reumatoide, enfermedad de injerto contra el huésped, síndrome de Sjógren, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, escleroderma, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Crohn, anemia hemolitica autoinmune, esterilidad, miastenia grave, esclerosis múltiple, enfermedad de Basedow, trombocitopenia trombótica, trombopenia púrpura, diabetes mellitus dependiente de insulina, alergia; asma, enfermedad atópica; arteriesclerosis; miocarditis; cardiomiopatia; nefritis glomerular; anemia hipoplásica. 107. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque además comprende la administración al sujeto de terapia de radiación. 108. Una composición, caracterizada porque comprende (a) un anticuerpo que específicamente enlaza un receptor de TRAIL, DR5, en donde el anticuerpo, en su forma soluble, tiene actividad que induce apoptosis in vivo e in vi tro en células que expresan DR5 y (b) uno o más agentes terapéuticos . 109. La composición de conformidad con la reivindicación 108, caracterizada porque el agente o agentes terapéuticos son seleccionados del grupo que consiste de agentes quimioterapéuticos, miembros de la familia TNF, agentes antiinflamatorios, agentes antivirales, antirretrovilares, antioportunistas, antibióticos, agentes inmunosupresores, inmunoglobulinas, agentes antimaláricos, fármaco antirreumático que modifica la enfermedad, citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento y segundos anticuerpos que promueven la apoptosis o bloquean la proliferación de las células objetivo. 110. La composición de conformidad con la reivindicación 108, caracterizada porque además comprende un portador farmacéuticamente aceptable.