CN115209921A - 包含新型环状二核苷酸衍生物的抗体药物偶联物 - Google Patents

包含新型环状二核苷酸衍生物的抗体药物偶联物 Download PDF

Info

Publication number
CN115209921A
CN115209921A CN202180019047.0A CN202180019047A CN115209921A CN 115209921 A CN115209921 A CN 115209921A CN 202180019047 A CN202180019047 A CN 202180019047A CN 115209921 A CN115209921 A CN 115209921A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
antibody
acid sequence
seq
set forth
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180019047.0A
Other languages
English (en)
Inventor
石崎雅之
铃木督
久德真梨子
雪浦弘志
原香生子
千原正尚
大冢贵文
和田悌司
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Daiichi Sankyo Co Ltd
Original Assignee
Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daiichi Sankyo Co Ltd filed Critical Daiichi Sankyo Co Ltd
Publication of CN115209921A publication Critical patent/CN115209921A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7084—Compounds having two nucleosides or nucleotides, e.g. nicotinamide-adenine dinucleotide, flavine-adenine dinucleotide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells

Abstract

期望开发能够全身给药，且能将STING激动剂特异性地送达至目标细胞、脏器(例如，肿瘤部位)的抗体药物偶联物以及使用该抗体药物偶联物的STING激动剂活性相关的疾病、例如能基于免疫活化而治疗的疾病(例如，癌)的治疗剂和/或治疗方法。本发明提供一种能够全身给药、且在表达抗原的肿瘤中显示抗肿瘤效果的新型抗体CDN衍生物偶联物。

Description

包含新型环状二核苷酸衍生物的抗体药物偶联物
技术领域
本发明涉及使具有STING激动剂活性的具有新结构的环状二核苷酸衍生物与针对靶细胞的抗体经由连接子结合而成的抗体药物偶联物、含有该抗体药物偶联物的医药组合物等。
背景技术
STING(Stimulator of Interferon Genes：干扰素基因刺激蛋白)是局部存在于内质网的跨膜型衔接蛋白(Adaptor Protein)(非专利文献1)。STING起到哺乳动物的自然免疫活化的中枢分子的功能，负责抵御如细菌、病毒之类的病原体进入的最前线。已知STING的活化是由多个细胞质DNA传感器感知到外因性以及内因性的DNA时的信号引起的。可认为在细胞质DNA传感器中，cGAS(Cyclic GMP－AMP Synthase：环状GMP－AMP合酶)为重要的DNA传感器。当cGAS感知到DNA时，产生环状二核苷酸(2’，3’－cGAMP)，该2’，3’－cGAMP与STING直接结合而使STING活化(非专利文献2)。活化后的STING向高尔基体移动，在那里促进TBK1(Tank－binding kinase 1：Tank结合激酶1)的自磷酸化。进行自磷酸化而活化的TBK1将IRF3(Interferon regulatory factor 3：干扰素调节因子3)转录途径(非专利文献3)以及NFκB转录途径(非专利文献4)两者活化，增加被称为干扰素或细胞因子(I型IFN(Interferon：干扰素)、IL－6(Interleukin－6：白细胞介素－6)、TNF－α(Tumor NecrosisFactor－α：肿瘤坏死因子－α))的炎性蛋白质的产生。这些蛋白质使包含通过复杂的级联(cascade)而破坏病原体或癌细胞的T细胞的获得性免疫系统启动。
根据最近的研究显示：STING不仅仅促进针对微生物的宿主防御，也促进抗肿瘤免疫。例如，在向STING缺损小鼠移植免疫原性肿瘤的情况下，比起野生型小鼠或TRIF(Toll/Interleukin－1(IL－1)receptor domain containing adaptor－inducinginterferon－β：受体域含衔接子诱导干扰素－β)缺损小鼠，肿瘤急速增殖。此外，STING缺损小鼠与TLR(Toll－like receptor：Toll样受体)、MyD88(Myeloid differentiationprimary response 88：髓样分化因子初次应答88)、MAVS(Mitochondrial antiviral－signaling protein：线粒体抗病毒信号蛋白)缺损小鼠不同，对肿瘤的自发性CD8+T细胞的致敏(priming)也消失了。这表明通过细胞质DNA感知而启动的STING途径参与肿瘤增殖的控制(非专利文献5)。在其他的研究中也显示：STING在放射线治疗(非专利文献6)或抗CD47抗体疗法(非专利文献7)的抗肿瘤效果上是必要的。用放射线或抗CD47抗体处置之后的、来自死亡的肿瘤细胞的DNA向树突状细胞的细胞质移动而活化了cGAS－STING途径之后，诱导IFN产生而作为先天性免疫和获得性免疫的中介。该研究表明：通过STING途径活化后的树突状细胞介入的交叉致敏(cross priming)在用于引起对肿瘤的获得性免疫是重要的。
作为血管破坏剂而公知的类黄酮系低分子化合物DMXAA由于诱导巨噬细胞的I型IFN，因此在小鼠肿瘤模型中显示具有强的抗肿瘤活性(非专利文献8)。DMXAA由于在临床前的优异的抗肿瘤效果，因此被期待作为非小细胞肺癌的免疫疗法药，但是在人的临床试验中失败了(非专利文献9)。根据最近的研究清楚表明，DMXAA为针对小鼠的STING的特异性激动剂，对于人的STING因没有物种交叉性而不能结合(非专利文献10)。就结果而言，DMXAA对人是无效的，但是根据小鼠模型的研究表明，低分子药介入STING而有效地致敏CD8+T细胞，能增强抗肿瘤免疫。
作为其他的低分子化合物，环状二核苷酸(Cyclic dinucleotide、CDN)显示：在向荷瘤小鼠给药时，由于STING介入而抗肿瘤免疫应答增强，肿瘤增殖被显著阻碍，可改善小鼠的生存率(非专利文献11)。CDN分为来自细菌的具有标准的两个3’－5’磷酸键的CDN(cyclic－di－GMP，cyclic－di－AMP，3’，3’－cGAMP)和哺乳动物的cGAS所产生的具有非标准的2’－5’磷酸键的混合结合型的CDN(2’，3’－cGAMP)。根据最近的研究显示，比起标准的CDN，混合结合型的CDN更能普遍地活化多样的STING(非专利文献12)。
天然型的CDN因为会像多数的核酸分子那样被血液中的核酸分解酶快速地分解，因此无法以原本的形态给药。因此，开发了在活体内具有STING激动剂活性的合成低分子化合物(例如专利文献1～26)。
当前，作为抗肿瘤剂推进临床试验的STING激动剂的MIW－815(有时也称为ADU－S100、ML RR－S2 CDA或ML－RR－CDA·2Na+)被直接给药至肿瘤内。将STING激动剂直接给药至肿瘤内的方法只能对肿瘤内的限定范围给药药剂，此外，难以向多个远处转移性肿瘤全部直接给药，因此存在可治疗的肿瘤有限的问题。非专利文献13中记载了通过ML RR－S2CDA给药显示出抗肿瘤效果，但是仅为肿瘤内给药，而没有显示通过全身给药(例如，静脉给药)产生的抗肿瘤效果。非专利文献14中记载了将STING激动剂的SB11285向小鼠肿瘤模型静脉给药时显示出抗肿瘤效果，但是SB11285具体是具有怎样的结构的化合物并不清楚。专利文献14中记载了含有免疫刺激化合物、抗体结构物以及连接子的偶联物，但是没有记载作为免疫刺激化合物使用STING激动剂的偶联物的具体例子。专利文献26中记载了经由连接子将具有特定的结构的CDN和抗体结合的偶联物，但是没有记载体内(in vivo)给药偶联物的实施例，没有确认偶联物的抗肿瘤效果。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2014/099824号
专利文献2：国际公开第2014/179335号
专利文献3：国际公开第2014/189805号
专利文献4：国际公开第2014/189806号
专利文献5：国际公开第2015/074145号
专利文献6：国际公开第2015/185565号
专利文献7：国际公开第2016/096714号
专利文献8：国际公开第2016/012305号
专利文献9：国际公开第2016/145102号
专利文献10：国际公开第2017/027646号
专利文献11：国际公开第2017/027645号
专利文献12：国际公开第2017/075477号
专利文献13：国际公开第2017/093933号
专利文献14：国际公开第2017/100305号
专利文献15：国际公开第2017/123669号
专利文献16：国际公开第2017/161349号
专利文献17：国际公开第2017/175147号
专利文献18：国际公开第2017/175156号
专利文献19：国际公开第2018/009466号
专利文献20：国际公开第2018/045204号
专利文献21：国际公开第2018/060323号
专利文献22：国际公开第2018/067423号
专利文献23：国际公开第2018/065360号
专利文献24：国际公开第2014/093936号
专利文献25：国际公开第2018/009648号
专利文献26：国际公开第2018/100558号
非专利文献
非专利文献1：Nature 2008，455，674－678
非专利文献2：Mol.Cell，2013，51，226－235
非专利文献3：Science 2015a，347，aaa2630
非专利文献4：J.Virol.2014，88，5328－5341
非专利文献5：Immunity 2014，41，830－842
非专利文献6：Immunity 2014，41，843－852
非专利文献7：Nat.Med.2015，21，1209－1215
非专利文献8：J.Immunol.1994，153，4684－4693
非专利文献9：J.Clin.Oncol.2011，29，2965－2971
非专利文献10：J.Immunol.2013，190，5216－5225
非专利文献11：Sci.Rep.2016，6，19049
非专利文献12：Mol.Cell，2015，59，891－903
非专利文献13：Cell Rep.2015，11，1018－1030
非专利文献14：AACR Tumor Immunology and Immunotherapy、2017、Poster#A25
发明内容
发明所要解决的问题
期望开发能够全身给药，且能将STING激动剂特异性地送达至目标细胞、脏器(例如，肿瘤部位)的抗体药物偶联物以及使用该抗体药物偶联物的STING激动剂活性相关的疾病、例如能基于免疫活化而治疗的疾病(例如，癌)的治疗剂和/或治疗方法。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述技术问题，发现了将特征在于具有稠合三环性取代基的新型CDN衍生物与特定的抗体经由连接子结合而成的抗体药物偶联物，并发现了若全身给药该抗体药物偶联物，则在表达抗原的肿瘤中显示出抗肿瘤效果，从而完成本发明。
即，本申请发明涉及以下内容，但并不限定于此。
[1]一种抗体药物偶联物，其由下式(II)表示：
Figure BDA0003831863160000051
式中，m1为1～10的范围，Ab表示抗体或该抗体的功能性片段，该抗体的糖链可任选地被重构，在此，抗体表示选自由抗CD70抗体、抗TROP2抗体、以及抗EGFR抗体构成的组中的任意抗体，L表示连接Ab与D的连接子，Ab可任选地从其氨基酸残基直接与L结合，或从Ab的糖链或经重构的糖链与L结合，D表示下式(I)所示的化合物：
Figure BDA0003831863160000061
在此，L与L1中所含的任意的－NH2或羟基结合，L1表示以下的三个结构式中的任一基团：
Figure BDA0003831863160000062
以及
Figure BDA0003831863160000063
在此，波浪线表示取代位置，Q以及Q’分别独立地表示羟基或硫醇基，R21以及R22分别独立地表示羟基或氟原子，W表示－NH－或硫原子。
[2]根据[1]所述的抗体药物偶联物，其中，D由以下的两个结构式中的任一结构式表示：
Figure BDA0003831863160000064
(在此，L1、Q、Q’以及W如前述定义)。
[3]根据[1]或[2]所述的抗体药物偶联物，其中，D由以下的四个结构式中的任一结构式表示：
Figure BDA0003831863160000071
(在此，星号表示与L结合，Q、Q’以及W如前述定义)。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，D由以下的三个结构式中的任一结构式表示：
Figure BDA0003831863160000072
(在此，星号表示与L结合，W如前述定义)。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，D由以下的三个结构式中的任一结构式表示：
Figure BDA0003831863160000081
(在此，星号表示与L结合)。
[6]根据[1]～[4]中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，D由以下的四个结构式中的任一结构式表示：
Figure BDA0003831863160000082
(在此，星号表示与L结合)。
[7]根据[1]～[4]或[6]中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，D由下式表示：
Figure BDA0003831863160000091
(在此，星号表示与L结合)。
[8]根据[1]～[3]中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，D由以下的两个结构式中的任一结构式表示：
Figure BDA0003831863160000092
(在此，星号表示与L结合，W如前述定义)。
[9]根据[1]～[3]或[8]中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，D由以下的四个结构式中的任一结构式表示：
Figure BDA0003831863160000101
(在此，星号表示与L结合)。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，连接子L由－Lb－La－Lp－Lc－*表示，式中，星号表示与药物D结合，Lp表示在靶细胞中能够切断的由氨基酸序列形成的连接子或者不存在，La表示选自以下的组中的任意一个：－C(＝O)－(CH2CH2)n2－C(＝O)－、－C(＝O)－(CH2CH2)n2－CH2－C(＝O)－、－C(＝O)－(CH2CH2)n2－C(＝O)－NH－(CH2CH2)n3－C(＝O)－、－C(＝O)－(CH2CH2)n2－C(＝O)－NH－(CH2CH2)n3－CH2－C(＝O)－、－C(＝O)－(CH2CH2)n2－C(＝O)－NH－(CH2CH2O)n3－CH2－C(＝O)－、－(CH2)n4－O－C(＝O)－、以及、－(CH2)n9－C(＝O)－，在此，n2表示整数1～3，n3表示整数1～5，n4表示整数0～2，n9表示整数2～7，Lb表示将La与Ab的糖链或经重构的糖链结合的间隔子或将La与Ab的半胱氨酸残基结合的间隔子，以及，Lc表示－NH－CH2－、―NH－苯基－CH2－O(C＝O)－或―NH－杂芳基－CH2－O(C＝O)－或不存在。
[11]根据[10]所述的抗体药物偶联物，其中，Lc为－NH－CH2－。
[12]根据[10]或[11]所述的抗体药物偶联物，其中，Lp为－GGFG－、－GGPI－、－GGVA－、－GGFM－、－GGVCit－、－GGFCit－、－GGICit－、－GGPL－、－GGAQ－或－GGPP－中的任意一个。
[13]根据[12]所述的抗体药物偶联物，其中，Lp为－GGFG－或－GGPI－。
[14]根据[10]～[13]中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，La表示选自由以下构成的组中的任意一个：－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－、－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－NH－(CH2CH2O)3－CH2－C(＝O)－、－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－NH－(CH2CH2O)4－CH2－C(＝O)－、以及、－(CH2)5－C(＝O)－。
[15]根据[10]～[14]中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，Lb由以下结构式中的任一结构式表示：
Figure BDA0003831863160000111
(在上述所示的Lb的结构式中，星号表示与La结合，波浪线表示与Ab的糖链或经重构的糖链结合)。
[16]根据[10]～[14]中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，Lb为－(琥珀酰亚胺－3－基－N)－，在此，－(琥珀酰亚胺－3－基－N)－表示以下的结构式：
Figure BDA0003831863160000112
在此，星号表示与La结合，波浪线表示与抗体的半胱氨酸残基的侧链形成硫醚而结合。
[17]根据[10]～[15]中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，连接子L由－Lb－La－Lp－Lc－*表示，式中，星号表示与药物D结合，Lp为－GGFG－、或－GGPI－，La表示－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－，Lb表示下式：
Figure BDA0003831863160000121
(在上述所示的Lb的结构式中，星号表示与La结合，波浪线表示与Ab的糖链或经重构的糖链结合)，Lc表示－NH－CH2－。
[18]根据[1]～[17]中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，抗体药物偶联物中的每一分子抗体的平均药物结合数在1～10个的范围。
[19]根据[18]所述的抗体药物偶联物，其中，抗体药物偶联物中的每一分子抗体的平均药物结合数在1～5个的范围。
[20]根据[19]所述的抗体药物偶联物，其中，抗体药物偶联物中的每一分子抗体的平均药物结合数在3～5个的范围。
[21]根据[1]～[20]中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，抗体从与抗体的Asn297结合的糖链(N297糖链)与L结合。
[22]根据[21]所述的抗体药物偶联物，其中，N297糖链为经重构的糖链。
[23]根据[21]或[22]所述的抗体药物偶联物，其中，N297糖链为具有下式所示的结构的N297－(Fuc)MSG1或N297－(Fuc)SG：
Figure BDA0003831863160000122
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，以及，n5为整数2～5。
Figure BDA0003831863160000131
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧以及1－6链侧两者的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，以及，n5为整数2～5。
[24]根据[21]～[23]中任一项所述的抗体药物偶联物，其由下式表示：
Figure BDA0003831863160000132
式中，m2表示整数1或2，L为连接Ab的N297糖链和D的连接子，如前述定义，Ab表示抗CD70抗体、抗TROP2抗体、或者抗EGFR抗体或这些抗体的功能性片段，Ab的N297糖链表示为具有下式所示的结构的N297－(Fuc)MSG1或N297－(Fuc)SG。
Figure BDA0003831863160000133
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，以及，n5表示整数2～5。
Figure BDA0003831863160000141
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧以及1－6链侧两者的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，以及，n5表示整数2～5，D由以下的四个结构式中的任一结构式表示：
Figure BDA0003831863160000142
在此，式中，星号表示与L结合。
[25]根据[24]所述的抗体药物偶联物，其选自下式：
Figure BDA0003831863160000151
在上述所示的各结构式中，m2表示为整数1或2，Ab表示抗CD70抗体、抗TROP2抗体、或者抗EGFR抗体或这些抗体的功能性片段，Ab的N297糖链表示为具有下式所示的结构的N297－(Fuc)MSG1或N297－(Fuc)SG中的任意一个。
Figure BDA0003831863160000152
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，以及，n5表示整数2～5。
Figure BDA0003831863160000161
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧以及1－6链侧两者的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，以及，n5表示整数2～5。
[26]根据[25]所述的抗体药物偶联物，其选自下式：
Figure BDA0003831863160000162
在上述所示的各结构式中，m2表示为整数1或2，Ab表示抗CD70抗体、抗TROP2抗体、或者抗EGFR抗体或这些抗体的功能性片段，Ab的N297糖链表示为具有下式所示的结构的N297－(Fuc)MSG1或N297－(Fuc)SG中的任意一个。
Figure BDA0003831863160000171
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，以及，n5表示整数2～5。
Figure BDA0003831863160000172
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧以及1－6链侧两者的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，以及，n5表示整数2～5。
[27]根据[1]～[26]中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，抗体为抗CD70抗体。
[28]根据[1]～[26]中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，抗体为抗TROP2抗体。
[29]根据[1]～[26]中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，抗体为抗EGFR抗体。
[30]根据[27]所述的抗体药物偶联物，其中，抗体为包含由序列号1所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号2所述的氨基酸序列形成的重链的抗体、或包含由序列号3所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号4所述的氨基酸序列形成的重链的抗体。
[31]根据[28]所述的抗体药物偶联物，其中，抗体为包含由序列号5所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号6所述的氨基酸序列形成的重链的抗体、或包含由序列号7所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号8所述的氨基酸序列形成的重链的抗体。
[32]根据[29]所述的抗体药物偶联物，其中，抗体为包含由序列号9所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号10所述的氨基酸序列形成的重链的抗体、或包含由序列号11所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号12所述的氨基酸序列形成的重链的抗体。
[33]根据[27]所述的抗体药物偶联物，其中，抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号1的氨基酸编号1～112所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号2的氨基酸编号1～118所述的氨基酸序列形成的重链可变区，或者，抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号3的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号4的氨基酸编号1～118所述的氨基酸序列形成的重链可变区。
[34]根据[28]所述的抗体药物偶联物，其中，抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号5的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号6的氨基酸编号1～121所述的氨基酸序列形成的重链可变区，或者，抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号7的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号8的氨基酸编号1～121所述的氨基酸序列形成的重链可变区。
[35]根据[29]所述的抗体药物偶联物，其中，抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号9的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号10的氨基酸编号1～119所述的氨基酸序列形成的重链可变区，或者，抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号11的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号12的氨基酸编号1～116所述的氨基酸序列形成的重链可变区。
[36]根据[27]所述的抗体药物偶联物，其中，抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号35所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号36所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号37所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号38所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号39所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号40所述的氨基酸序列形成的CDRH3，或者，抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号41所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号42所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号43所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号44所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号45所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号46所述的氨基酸序列形成的CDRH3。
[37]根据[28]所述的抗体药物偶联物，其中，抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号47所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号48所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号49所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号50所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号51所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号52所述的氨基酸序列形成的CDRH3，或者，抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号53所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号54所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号55所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号56所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号57所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号58所述的氨基酸序列形成的CDRH3。
[38]根据[29]所述的抗体药物偶联物，其中，抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号59所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号60所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号61所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号62所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号63所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号64所述的氨基酸序列形成的CDRH3，或者，抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号65所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号66所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号67所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号68所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号69所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号70所述的氨基酸序列形成的CDRH3。
[39]一种抗体药物偶联物，其由下式表示：
Figure BDA0003831863160000201
式中，Ab表示选自以下的组中的任意一个：包含由序列号1所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号2所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；包含由序列号3所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号4所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；包含由序列号5所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号6所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；包含由序列号7所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号8所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；包含由序列号9所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号10所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；包含由序列号11所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号12所述的氨基酸序列形成的重链的抗体，Ab的N297糖链由下式表示：
Figure BDA0003831863160000202
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧以及1－6链侧两者的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，n5为3，以及，m2为2。
[40]一种抗体药物偶联物，其由下式表示：
Figure BDA0003831863160000211
式中，Ab表示选自以下的组中的任意一个：包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号1的氨基酸编号1～112所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号2的氨基酸编号1～118所述的氨基酸序列形成的重链可变区；包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号3的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号4的氨基酸编号1～118所述的氨基酸序列形成的重链可变区；包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号5的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号6的氨基酸编号1～121所述的氨基酸序列形成的重链可变区；包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号7的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号8的氨基酸编号1～121所述的氨基酸序列形成的重链可变区；包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号9的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号10的氨基酸编号1～119所述的氨基酸序列形成的重链可变区；包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号11的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号12的氨基酸编号1～116所述的氨基酸序列形成的重链可变区；Ab的N297糖链由下式表示：
Figure BDA0003831863160000212
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧以及1－6链侧两者的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，n5为3，以及，m2为2。
[41]一种抗体药物偶联物，其由下式表示：
Figure BDA0003831863160000221
式中，Ab表示选自以下的组中的任意一个：包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号35所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号36所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号37所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号38所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号39所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号40所述的氨基酸序列形成的CDRH3；包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号41所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号42所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号43所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号44所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号45所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号46所述的氨基酸序列形成的CDRH3；包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号47所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号48所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号49所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号50所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号51所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号52所述的氨基酸序列形成的CDRH3；包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号53所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号54所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号55所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号56所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号57所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号58所述的氨基酸序列形成的CDRH3；包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号59所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号60所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号61所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号62所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号63所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号64所述的氨基酸序列形成的CDRH3；包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号65所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号66所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号67所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号68所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号69所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号70所述的氨基酸序列形成的CDRH3；Ab的N297糖链由下式表示：
Figure BDA0003831863160000231
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧以及1－6链侧两者的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，n5为3，以及，m2为2。
[42]一种抗体药物偶联物，其由下式表示：
Figure BDA0003831863160000241
式中，Ab表示选自以下的组中的任意一个：包含由序列号1所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号2所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；包含由序列号3所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号4所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；包含由序列号5所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号6所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；包含由序列号7所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号8所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；包含由序列号9所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号10所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；包含由序列号11所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号12所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；Ab的N297糖链由下式表示：
Figure BDA0003831863160000242
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧以及1－6链侧两者的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，n5为3，以及，m2为1。
[43]一种抗体药物偶联物，其由下式表示：
Figure BDA0003831863160000251
式中，Ab表示选自以下的组中的任意一个：包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号1的氨基酸编号1～112所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号2的氨基酸编号1～118所述的氨基酸序列形成的重链可变区；包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号3的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号4的氨基酸编号1～118所述的氨基酸序列形成的重链可变区；包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号5的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号6的氨基酸编号1～121所述的氨基酸序列形成的重链可变区；包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号7的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号8的氨基酸编号1～121所述的氨基酸序列形成的重链可变区；包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号9的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号10的氨基酸编号1～119所述的氨基酸序列形成的重链可变区；包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号11的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号12的氨基酸编号1～116所述的氨基酸序列形成的重链可变区；Ab的N297糖链由下式表示：
Figure BDA0003831863160000252
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧以及1－6链侧两者的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，n5为3，以及，m2为1。
[44]一种抗体药物偶联物，其由下式表示：
Figure BDA0003831863160000261
式中，Ab表示选自以下的组中的任意一个：包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号35所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号36所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号37所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号38所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号39所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号40所述的氨基酸序列形成的CDRH3；包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号41所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号42所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号43所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号44所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号45所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号46所述的氨基酸序列形成的CDRH3；包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号47所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号48所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号49所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号50所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号51所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号52所述的氨基酸序列形成的CDRH3；包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号53所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号54所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号55所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号56所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号57所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号58所述的氨基酸序列形成的CDRH3；包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号59所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号60所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号61所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号62所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号63所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号64所述的氨基酸序列形成的CDRH3；包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号65所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号66所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号67所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号68所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号69所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号70所述的氨基酸序列形成的CDRH3；Ab的N297糖链由下式表示：
Figure BDA0003831863160000271
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧以及1－6链侧两者的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，n5为3，以及，m2为1。
[45]一种STING激动剂，其含有如[1]～[44]中任一项所述的抗体药物偶联物。
[46]一种医药组合物，其含有如[1]～[44]中任一项所述的抗体药物偶联物。
[47]一种抗肿瘤剂，其含有如[1]～[44]中任一项所述的抗体药物偶联物。
[48]根据[47]所述的抗肿瘤剂，其中，肿瘤为肺癌、肾癌、尿路上皮癌、大肠癌、前列腺癌、多形性神经胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、子宫体癌、睾丸癌、宫颈癌、胎盘绒毛膜癌、脑肿瘤、头颈癌、甲状腺癌、间皮瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、胆囊癌、胆管癌、肾上腺癌、鳞状细胞癌、咽癌、舌癌、听觉器官癌、胸腺癌、小肠癌、白血病、恶性淋巴瘤、浆细胞瘤、骨髓瘤或肉瘤。
[49]一种癌的治疗方法，其包括：给药选自由如[1]～[44]中任一项所述的抗体药物偶联物、如[45]所述的STING激动剂、如[46]所述的医药组合物以及如[47]或[48]所述的抗肿瘤剂构成的组中的任意种。
[50]根据[49]所述的方法，其中，癌为肺癌、肾癌、尿路上皮癌、大肠癌、前列腺癌、多形性神经胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、子宫体癌、睾丸癌、宫颈癌、胎盘绒毛膜癌、脑肿瘤、头颈癌、甲状腺癌、间皮瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、胆囊癌、胆管癌、肾上腺癌、鳞状细胞癌、咽癌、舌癌、听觉器官癌、胸腺癌、小肠癌、白血病、恶性淋巴瘤、浆细胞瘤、骨髓瘤或肉瘤。
[51]根据[27]、[30]、[33]或[36]中任一项所述的抗体药物偶联物，其在皮下移植了人肾癌细胞株Caki―1细胞的BALB/c―nu小鼠中发挥了抗体靶点依赖性的抗肿瘤效果。
[52]根据[42]～[44]中任一项所述的抗体药物偶联物，在下述(i)或(ii)所述的动物中发挥比抗体药物偶联物中所含的抗体更强的抗肿瘤效果：(i)皮下移植了小鼠大肠癌细胞株CT26.WT(CRL2638)的BALB/c小鼠，所述小鼠大肠癌细胞株CT26.WT(CRL2638)导入有所述抗体药物偶联物中所含的抗体所结合的抗原上的表位位点被取代为人型而成的人鼠嵌合抗原的基因；(ii)皮下移植了人肾癌细胞株A―498(HTB―44)细胞的BALB/c―nu小鼠。
发明效果
根据本发明，提供一种能够全身给药且在表达抗原的肿瘤中显示抗肿瘤效果的新型抗体CDN衍生物偶联物。
附图说明
图1示意性地表示作为本发明的抗体药物偶联物((II)的分子)的、由SG型糖链重构抗体得到的抗体药物偶联物(图1的A的(II)的分子)以及由MSG型糖链重构抗体得到的抗体药物偶联物(图1的B的(II)的分子)。(a)表示药物D，(b)表示连接子L，(c)表示PEG连接子(L(PEG))，(d)表示N297糖链(在此，白色的圆形表示NeuAc(Sia)、白色的六角形表示Man、黑色的六角形表示GlcNAc、白色的菱形表示Gal以及白色的倒三角形表示Fuc)。白色的五角形表示来自连接子L的炔烃与来自PEG连接子的叠氮基反应而生成的三唑环。Y字型表示抗体Ab。PEG连接子与位于非还原末端的唾液酸的2位羧基经由酰胺键连接。只要没有特别说明，这样的表示方法在本说明书中全部适用。
图2是表示作为本发明的抗体药物偶联物的制造中间体的(Fucα1，6)GlcNAc－抗体(图2的A的(III)的分子)、SG型糖链重构抗体(图2的B的(IV)的分子)、以及MSG型糖链重构抗体(图2的C的(IV)的分子)的结构的示意图。在所有的图中，Y字型与图1同样地表示抗体Ab。在图2的A中，(e)表示包含在Fuc的1位与GlcNAc的6位经α糖苷键合的二糖的N297糖链。在图2的B以及C中，(d)表示与图1同样的N297糖链，(f)为具有叠氮基的PEG连接子，在末端表示提供给与连接子L的结合的叠氮基。具有叠氮基的PEG连接子的结合方式与图1的PEG连接子相同。
图3为由动物细胞中产生的抗体制造SG型糖链重构抗体以及MSG型糖链重构抗体的工序的示意图。图中的分子(III)以及(IV)与图2同样，分别表示(Fucα1，6)GlcNAc－抗体以及SG型糖链重构抗体或MSG型糖链重构抗体。(V)的分子为动物细胞中产生的抗体，是N297糖链不均匀的分子的混合物。图3的A表示通过将(V)的不均匀N297糖链用EndoS之类的水解酶处理而制作均匀的(Fucα1，6)GlcNAc－抗体(III)的工序。图3的B表示对抗体(III)的N297糖链的GlcNAc，使用EndoS D233Q/Q303L变异体之类的糖基转移酶使SG型糖链供体分子进行糖链转移，从而制作(IV)的SG型糖链重构抗体的工序。图3的C与图3的B同样，表示对抗体(III)使MSG型糖链供体分子进行糖链转移而制作(IV)的MSG型糖链重构抗体的工序。在此使用的SG型糖链供体分子以及MSG型糖链供体分子是各自的非还原末端的唾液酸被具有叠氮基的PEG连接子修饰而成的，在制作的SG型N297糖链重构抗体以及MSG型N297糖链重构抗体中，如图2的B以及C所示，非还原末端的唾液酸也进行了同样的修饰。
图4表示抗CD70抗体1的轻链的氨基酸序列(序列号1)以及重链的氨基酸序列(序列号2)(本说明书中，“抗CD70抗体1”也称为“改造抗CD70抗体1”)。
图5表示抗CD70抗体2的轻链的氨基酸序列(序列号3)以及重链的氨基酸序列(序列号4)(本说明书中，“抗CD70抗体2”也称为“改造抗CD70抗体2”)。
图6表示抗TROP2抗体1的轻链的氨基酸序列(序列号5)以及重链的氨基酸序列(序列号6)。
图7表示抗TROP2抗体2的轻链的氨基酸序列(序列号7)以及重链的氨基酸序列(序列号8)(本说明书中，“抗TROP2抗体2”也称为“改造抗TROP2抗体”)。
图8表示抗EGFR抗体1的轻链的氨基酸序列(序列号9)以及重链的氨基酸序列(序列号10)(本说明书中，“抗EGFR抗体1”也称为“改造抗EGFR抗体1”)。
图9表示抗EGFR抗体2的轻链的氨基酸序列(序列号11)以及重链的氨基酸序列(序列号12)(本说明书中，“抗EGFR抗体2”也称为“改造抗EGFR抗体2”)。
图10表示(a)人STING野生型的氨基酸序列(序列号13)、(b)人STING REF变异型(R232H)的氨基酸序列(序列号15)、以及(c)人STING HAQ变异体(R71H、G230A、R293Q)的氨基酸序列(序列号17)。
图11表示抗TROP2抗体2、抗TROP2抗体2―CDN偶联物(1)、抗TROP2抗体2―CDN偶联物(2)以及抗TROP2抗体2―CDN偶联物(3)在TROP2表达细胞中的STING激动剂活性。
图12表示化合物34a、抗CD70抗体1、抗CD70抗体2、抗CD70抗体1―CDN偶联物(1)以及抗CD70抗体2－CDN偶联物(1)在CT26.WT以及CT26.WT―hCD70细胞株与来自小鼠骨髓的树突状细胞的共培养分析系统中的活性。
图13表示基于抗TROP2抗体1以及抗TROP2抗体1－CDN偶联物(1)的静脉给药的抗肿瘤效果。图中的黑四方线表示媒液(vehicle)组，白倒三角线表示使实施例1的化合物6b与参考例5中制作的抗TROP2抗体1偶联而成的抗TROP2抗体1－CDN偶联物(1)给药组，白圆形线表示抗TROP2抗体1给药组。纵轴表示肿瘤体积(mm3)，横轴表示肿瘤移植后的天数。
图14表示基于抗TROP2抗体2以及抗TROP2抗体2－CDN偶联物(1)的静脉给药的抗肿瘤效果。图中的黑四方线表示媒液组，白倒三角线表示使实施例2的化合物34a与参考例6中制作的抗TROP2抗体2偶联而成的抗TROP2抗体2－CDN偶联物(1)给药组，白圆形线表示抗TROP2抗体2给药组。纵轴表示肿瘤体积(mm3)，横轴表示肿瘤移植后的天数。
图15表示基于抗EGFR抗体1、抗EGFR抗体2、抗EGFR抗体―CDN偶联物的静脉给药的抗肿瘤效果。表示基于使实施例2的化合物34a与参考例7中制作的抗EGFR抗体1偶联而成的抗EGFR抗体1－CDN偶联物(1)以及使实施例2的化合物34a与参考例8中制作的抗EGFR抗体2偶联而成的抗EGFR抗体2―CDN偶联物(1)的静脉给药的抗肿瘤效果。图中的黑四方线表示媒液组，白三角线表示抗EGFR抗体1给药组，黑三角线表示抗EGFR抗体1－CDN偶联物(1)给药组，白圆形线表示抗EGFR抗体2给药组，黑圆形线表示抗EGFR抗体2－CDN偶联物(1)给药组。纵轴表示肿瘤体积(mm3)，横轴表示肿瘤移植后的天数。
图16表示抗CD70抗体1的CDRL1的氨基酸序列(序列号35)、CDRL2的氨基酸序列(序列号36)、CDRL3的氨基酸序列(序列号37)、CDRH1的氨基酸序列(序列号38)、CDRH2的氨基酸序列(序列号39)以及CDRH3的氨基酸序列(序列号40)。
图17表示抗CD70抗体2的CDRL1的氨基酸序列(序列号41)、CDRL2的氨基酸序列(序列号42)、CDRL3的氨基酸序列(序列号43)、CDRH1的氨基酸序列(序列号44)、CDRH2的氨基酸序列(序列号45)以及CDRH3的氨基酸序列(序列号46)。
图18表示抗TROP2抗体1的CDRL1的氨基酸序列(序列号47)、CDRL2的氨基酸序列(序列号48)、CDRL3的氨基酸序列(序列号49)、CDRH1的氨基酸序列(序列号50)、CDRH2的氨基酸序列(序列号51)以及CDRH3的氨基酸序列(序列号52)。
图19表示抗TROP2抗体2的CDRL1的氨基酸序列(序列号53)、CDRL2的氨基酸序列(序列号54)、CDRL3的氨基酸序列(序列号55)、CDRH1的氨基酸序列(序列号56)、CDRH2的氨基酸序列(序列号57)以及CDRH3的氨基酸序列(序列号58)。
图20表示抗EGFR抗体1的CDRL1的氨基酸序列(序列号59)、CDRL2的氨基酸序列(序列号60)、CDRL3的氨基酸序列(序列号61)、CDRH1的氨基酸序列(序列号62)、CDRH2的氨基酸序列(序列号63)以及CDRH3的氨基酸序列(序列号64)。
图21表示抗EGFR抗体2的CDRL1的氨基酸序列(序列号65)、CDRL2的氨基酸序列(序列号66)、CDRL3的氨基酸序列(序列号67)、CDRH1的氨基酸序列(序列号68)、CDRH2的氨基酸序列(序列号69)以及CDRH3的氨基酸序列(序列号70)。
图22表示基于抗CD70抗体1、抗CD70抗体1－CDN偶联物(1)以及抗CD70抗体2、抗CD70抗体2－CDN偶联物(1)的静脉给药的抗肿瘤效果。图中的黑四方线表示媒液组，白三角线表示抗CD70抗体1给药组，白倒三角线表示抗CD70抗体2给药组，白菱形线表示抗CD70抗体1－CDN偶联物(1)给药组，白圆形线表示抗CD70抗体2－CDN偶联物(1)给药组。纵轴表示肿瘤体积(mm3)，横轴表示肿瘤移植后的天数。
图23表示基于抗CD70抗体2、抗CD70抗体2－CDN偶联物(2)的静脉给药的抗肿瘤效果。图中的黑四方线表示媒液组，白三角线表示抗CD70抗体2给药组，白倒三角线表示抗CD70抗体2－CDN偶联物(2)给药组。纵轴表示肿瘤体积(mm3)，横轴表示肿瘤移植后的天数。
图24表示基于抗EGFR抗体1、化合物34a、抗EGFR抗体1―CDN偶联物(2)的静脉给药的抗肿瘤效果。图中的黑四方线表示媒液组，白三角线表示抗EGFR抗体1给药组，白菱形线表示化合物34a给药组，白四方线表示抗EGFR抗体1―CDN偶联物(2)给药组。纵轴表示肿瘤体积(mm3)，横轴表示肿瘤移植后的天数。
具体实施方式
本发明涉及包含具有STING激动剂活性的新型CDN衍生物的抗体药物偶联物及其用途。该新型CDN衍生物具有STING激动剂活性，活化免疫细胞而诱导干扰素、细胞因子的产生。此外，该新型CDN衍生物通过该免疫细胞的活化而发挥抗肿瘤效果。本发明的抗体药物偶联物可以通过经由任意的连接子将该CDN衍生物与能够识别并结合靶细胞(例如，肿瘤细胞或免疫细胞)的抗体连接而制作，可进行全身给药。作为全身给药的具体例子，可列举出皮内、肌内、腹腔内、静脉内、以及皮下途径。
STING(Stimulator of Interferon Genes)是指局部存在于内质网的跨膜型的衔接蛋白。已知在STING高频率存在先天的多型(PLoS One、2013Oct、21、8(10)、e77846)。就STING变异型而言，已知有例如，第232位氨基酸从精氨酸(R)变异成组氨酸(H)的R232H变异、第71位精氨酸(R)变异成组氨酸(H)、第230位甘氨酸(G)变异成丙氨酸(A)、第293位精氨酸(R)变异成谷氨酰胺(Q)的HAQ变异。已知这样的STING的多型在通过STING激动剂刺激而被诱导的细胞因子产生量等的响应强度上存在差异(Genes and Immunity、2011、12、263－269)。因此，为了STING激动剂对人稳定地发挥作用，优选对各STING的型具有活性。
在本说明书中，“癌”、“癌症”以及“肿瘤”具有相同的意义。
在本发明中，“免疫活化”是指以任何形式而引起单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、中性粒细胞等参与抗肿瘤免疫的免疫细胞的活化，例如引起细胞因子以及趋化因子的产生、免疫活化标记物的表达上升、免疫抑制性标记物的表达降低、细胞内信号传导系统的磷酸化等变化、基因表达的变化等所有的免疫细胞的结构、功能上的变化。此外，也包含引起肿瘤细胞诱导抗肿瘤免疫的变化，例如是指使免疫细胞活化或诱导游离的细胞因子以及趋化因子的产生、诱导对免疫细胞的敏感性亢进等。
本发明中，“抗肿瘤效果”是指通过药物直接或间接地影响肿瘤细胞，由此诱导肿瘤的减少或萎缩。例如，通过药物直接对肿瘤细胞给予伤害，肿瘤细胞由于受到药物的刺激而使抗肿瘤免疫活化，被送达至肿瘤细胞的药物向细胞外释放等而肿瘤细胞周围的抗肿瘤免疫活化等，而引起肿瘤细胞数的减少以及伤害、或肿瘤的萎缩，将这些称为抗肿瘤效果。
本发明中，“细胞毒性”是指以任何形式对细胞引起病理性变化，不仅是指直接的外伤，也指引起DNA的切断或碱基的二聚物的形成、染色体的切断、细胞分裂装置的损伤、各种酶活性的降低等所有的细胞的结构、功能上的损伤。
本发明中，“细胞”也包含动物个体内的细胞、培养细胞。
＜1.新型CDN衍生物＞
新型CDN衍生物具有下式(I)所示的结构：
Figure BDA0003831863160000341
L1为由以下的三个结构式中的任一结构式表示的基团。
Figure BDA0003831863160000342
Q以及Q’分别独立地表示羟基或硫醇基。优选Q以及Q’均为硫醇基。
R21以及R22分别独立地表示羟基或氟原子。R21优选为羟基。R22优选为氟原子。
W为－NH－或硫原子。W优选为－NH－。
该新型CDN衍生物的制造方法记载于后述的＜3.制造方法＞。
＜2.抗体药物偶联物＞
本发明的抗体药物偶联物能够作为将上述新型CDN衍生物与能够识别并结合靶细胞(例如，肿瘤细胞或免疫细胞)的抗体经由任意的连接子连接而成的抗体药物偶联物进行全身给药。
本发明的抗体药物偶联物由下式(II)表示：
Figure BDA0003831863160000351
m1为1～10的范围，表示抗体药物偶联物中的每一分子抗体的药物结合数。Ab表示抗体或该抗体的功能性片段，L表示将Ab与D连接的连接子，D表示上述的新型CDN衍生物(本说明书中，在新型CDN衍生物作为抗体药物偶联物的一部分使用的情况下，也简称为“药物”)。
药物D是具有活化免疫细胞的活性，具体而言具有STING激动剂活性的化合物。药物D在连接子的一部分或全部在靶细胞(例如，肿瘤细胞或免疫细胞)内被切断时，以原本的结构游离而发挥免疫活化效果。通过靶细胞对免疫细胞的敏感性亢进或经由靶细胞的免疫细胞的活化而发挥目标功能。作为目标功能，只要是与STING激动剂活性相关联的功能就没有特别限定，优选为抗肿瘤活性。即，与以肿瘤作为靶点的抗体(例如，抗CD70抗体、抗TROP2抗体、抗EGFR抗体)经由任意的连接子而连接的药物D被送达至靶细胞或组织，连接子的一部分或全部被切断，通过靶细胞对免疫细胞的敏感性亢进或经由靶细胞的免疫细胞的活化(例如，干扰素、细胞因子的产生)发挥抗肿瘤效果。
结合于本发明的抗体药物偶联物的药物D由下式(I)表示：
Figure BDA0003831863160000352
在此，L1、Q、Q’、R21、R22以及W如上述＜1.新型CDN衍生物＞中所规定。
此外，本发明的抗体药物偶联物中使用的药物D优选由以下的两个结构式表示：
Figure BDA0003831863160000361
在此，L1、Q、Q’以及W如上述＜1.新型CDN衍生物＞中所规定。
此外，本发明的抗体药物偶联物中使用的药物D优选由以下的四个结构式表示：
Figure BDA0003831863160000362
在此，星号表示与L结合，Q、Q’以及W如上述＜1.新型CDN衍生物＞中所规定。
此外，本发明的抗体药物偶联物中使用的药物D优选由以下的三个结构式表示：
Figure BDA0003831863160000371
在此，星号表示与L结合，W如上述＜1.新型CDN衍生物＞中所规定。
此外，本发明的抗体药物偶联物中使用的药物D优选由以下的三个结构式表示：
Figure BDA0003831863160000372
在此，星号表示与L结合。
此外，本发明的抗体药物偶联物中使用的药物D优选由以下的四个结构式表示：
Figure BDA0003831863160000381
在此，星号表示与L结合。
此外，本发明的抗体药物偶联物中使用的药物D更优选由下式表示。
Figure BDA0003831863160000382
此外，本发明的抗体药物偶联物中使用的药物D优选由下式表示。
Figure BDA0003831863160000391
在此，星号表示与L结合，W如上述＜1.新型CDN衍生物＞中所规定。
此外，本发明的抗体药物偶联物中使用的药物D优选由以下的两个结构式表示：
Figure BDA0003831863160000392
在此，星号表示与L结合。
此外，本发明的抗体药物偶联物中使用的药物D优选由下式表示：
Figure BDA0003831863160000393
在此，星号表示与L结合，W如上述＜1.新型CDN衍生物＞中所规定。
此外，本发明的抗体药物偶联物中使用的药物D优选由以下的两个结构式表示：
Figure BDA0003831863160000401
在此，星号表示与L结合。
＜2.1.连接子结构＞
对本发明的抗体药物偶联物中将药物与抗体结合的连接子结构进行说明。本发明的抗体药物偶联物中使用的连接子只要是作为将抗体与药物连接的连接子，本领域技术人员所理解的连接子，就没有特别限定。作为本发明的抗体药物偶联物中使用的连接子，例如可列举出Protein Cell、2018、9(1)：33－46、Pharm Res、2015、32：3526－3540、或Int.J.Mol.Sci.、2016、17、561中记载的连接子，但并不限定于此。连接子可以是在活体内被切断的连接子，也可以是在活体内未被切断的连接子，但优选为在活体内被切断的连接子。
作为本发明的抗体药物偶联物中使用的连接子，例如可列举出将药物与抗体的Fc部分的糖链或经重构的糖链结合(本说明书中，有时称为“糖链偶联(sugar chainconjugation)”)的连接子(例如，记载于WO2018/003983)、或使药物与抗体的任意的氨基酸残基(例如，半胱氨酸残基或赖氨酸残基)结合的连接子(例如，记载于WO2014/057687)，但并不限定于此。作为将药物与抗体的任意的氨基酸残基结合的连接子，优选可列举出与Ab的半胱氨酸的巯基(SH基)进行硫醚键合的情况(本说明书中，有时称为“半胱氨酸偶联”)或与Ab的赖氨酸的氨基(NH2基)进行酰胺键合的情况(本说明书中，有时称为“赖氨酸偶联”)，优选为半胱氨酸偶联。
本发明的抗体药物偶联物中使用的优选的连接子L由下式表示。
－Lb－La－Lp－Lc－*
在此，星号表示与药物D结合。
首先，对Lp进行说明。Lp表示在活体内或靶细胞中能够切断的由氨基酸序列形成的连接子(以下，在本说明书中也称为肽连接子)或者不存在。
Lp通过例如肽酶、酯酶等酶的作用被切断。Lp是由2～7个(优选2～4个)氨基酸构成的肽。Lp在其N末端与后述的La的右端的羰基形成酰胺键，在C末端与Lc的氨基(－NH－)形成酰胺键。通过所述肽酶等酶将Lp的C末端侧的酰胺键切断。
构成Lp的氨基酸没有特别限定，例如为L－或D－氨基酸，优选为L－氨基酸。此外，除了α－氨基酸之外，还可以为β－丙氨酸、ε－氨基己酸、γ－氨基丁酸等结构的氨基酸，进而可以为例如经N－甲基化的氨基酸等非天然型的氨基酸。Lp的氨基酸序列没有特别限定，作为构成的氨基酸，可列举出甘氨酸(Gly；G)、缬氨酸(Val；V)、丙氨酸(Ala；A)、苯丙氨酸(Phe；F)、谷氨酸(Glu；E)、异亮氨酸(Ile；I)、脯氨酸(Pro；P)、瓜氨酸(Cit)、亮氨酸(Leu；L)、蛋氨酸(Met；M)、丝氨酸(Ser；S)、赖氨酸(Lys；K)以及天冬氨酸(Asp；D)等。其中，优选为甘氨酸(Gly；G)、缬氨酸(Val；V)、丙氨酸(Ala；A)、苯丙氨酸(Phe：F)、瓜氨酸(Cit)、异亮氨酸(Ile；I)、脯氨酸(Pro；P)。这些氨基酸可以重复，具有包含任意选择的氨基酸的氨基酸序列。此外，可以根据氨基酸的种类控制药物游离的方式。
作为Lp的具体例，例如可列举出－GGFG－、－GGPI－、－GGVA－、－GGFM－、－GGVCit－、－GGFCit－、－GGICit－、－GGPL－、－GGAQ－、－GGPP－。连接子Lp优选为－GGFG－或－GGPI－，更优选为－GGFG－。
接着，对La进行说明。La表示选自以下构成的组中的任一个：－C(＝O)－(CH2CH2)n2－C(＝O)－、－C(＝O)－(CH2CH2)n2－CH2－C(＝O)－、－C(＝O)－(CH2CH2)n2－C(＝O)－NH－(CH2CH2)n3－C(＝O)－、－C(＝O)－(CH2CH2)n2－C(＝O)－NH－(CH2CH2)n3－CH2－C(＝O)－、－C(＝O)－(CH2CH2)n2－C(＝O)－NH－(CH2CH2O)n3－CH2－C(＝O)－、－(CH2)n4－O－C(＝O)－以及－(CH2)n9－C(＝O)－。
在此，式中，n2表示整数1～3(优选1或2)，n3表示整数1～5(优选整数2～5，更优选3或4)，n4表示整数0～2(优选0或1)，n9表示整数2～7(优选整数2～5，更优选2、3或5)。
La优选表示选自以下构成的组中的任一个：－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－、－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－NH－(CH2CH2O)3－CH2－C(＝O)－、－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－NH－(CH2CH2O)4－CH2－C(＝O)－、－C(＝O)－(CH2CH2)2－C(＝O)－、－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－NH－(CH2CH2)2－C(＝O)－、－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－NH－(CH2CH2)2－CH2－C(＝O)－、－CH2－OC(＝O)－、－OC(＝O)－以及－(CH2)5－C(＝O)－。
La更优选为－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－、－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－NH－(CH2CH2O)3－CH2－C(＝O)－、－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－NH－(CH2CH2O)4－CH2－C(＝O)－、或－(CH2)5－C(＝O)－。
La进一步优选为－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－。
接着，对Lb进行说明。Lb表示糖链偶联的连接子中使用的间隔子(本说明书中也称为“糖链偶联的连接子的间隔子”)、或半胱氨酸偶联的连接子中使用的间隔子(本说明书中也称为“半胱氨酸偶联的连接子的间隔子”)。
＜Lb为“糖链偶联的连接子的间隔子”的情况＞
在Lb为“糖链偶联的连接子的间隔子”的情况下，Lb没有特别限定，例如可列举出下式所示的间隔子。
Figure BDA0003831863160000421
上述所示的各结构式中，星号(*)表示与La的左端的－(C＝O)－、－CH2－或－OC(＝O)－结合，波浪线表示与Ab的糖链或经重构的糖链结合。
在Lb选择Lb－1或Lb－3的情况下，三唑环部位具有几何异构结构，在一个Lb中包含两种结构中的任一种，或包含这些的混合物。本发明的抗体药物偶联物可以使多个药物与一分子抗体结合。在一分子抗体上结合多个药物的情况下，也存在多个Lb(例如，参照后述的＜3.制造方法＞的E法中所示的抗体药物偶联物的示意图(1e))。在Lb选自Lb－1或Lb－3，相对于一分子抗体存在多个该Lb的情况(例如，后述的m2为1或2的情况)下，在各Lb中，三唑环部位具有几何异构结构，在一个Lb中含有两种结构中的任一种，或者包含它们的混合物。
＜Lb为“半胱氨酸偶联的连接子的间隔子”的情况＞
在Lb为“半胱氨酸偶联的连接子的间隔子”的情况下，Lb没有特别限定，例如可列举出－(琥珀酰亚胺－3－基－N)－。本发明中，“－(琥珀酰亚胺－3－基－N)－”具有下式所示的结构。
Figure BDA0003831863160000431
在上述所示的结构式中，星号表示与La结合，波浪线表示与抗体的半胱氨酸残基的侧链形成硫醚而结合。
接着，对Lc进行说明。Lc表示－NH－CH2－、―NH－苯基－CH2－O(C＝O)－或―NH－杂芳基－CH2－O(C＝O)－，或者不存在。在此，作为苯基，优选为1，4－苯基，作为杂芳基，优选为2，5－吡啶基、3，6－吡啶基、2，5－嘧啶基或2，5－噻吩基。Lc优选为－NH－CH2－或不存在。
就本发明的抗体药物偶联物中使用的更优选的连接子L而言，在药物与抗体的结合方式为“糖链偶联”的情况下，连接子L为－ZL1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGFG－、－ZL1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGVA－、－ZL1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGVCit－、－ZL1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGFCit－、－ZL1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGICit－、－ZL1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGFM－、－ZL1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGPI－、－ZL1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGLM－、－ZL1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－FG－、－ZL1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－VA－、－ZL1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGFG－NH－CH2－、－ZL1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGVA－NH－CH2－、－ZL1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGVCit－NH－CH2－、－ZL1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGFCit－NH－CH2－、－ZL1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－NH－(CH2CH2O)3－CH2－C(＝O)－、或－ZL1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－NH－(CH2CH2O)4－CH2－C(＝O)－，在此，ZL1表示上述Lb的以下所示的结构式：
Figure BDA0003831863160000441
或者，在药物与抗体的结合方式为“半胱氨酸偶联”的情况下，连接子L为－ZL2－(CH2)5－C(＝O)－GGFG－、－ZL2－(CH2)5－C(＝O)－GGVA－、－ZL2－(CH2)5－C(＝O)－GGVCit－、－ZL2－(CH2)5－C(＝O)－GGFCit－、－ZL2－(CH2)5－C(＝O)－GGICit－、－ZL2－(CH2)5－C(＝O)－GGFM－、－ZL2－(CH2)5－C(＝O)－GGPI－、－ZL2－(CH2)5－C(＝O)－GGLM－、－ZL2－(CH2)5－C(＝O)－FG－、－ZL2－(CH2)5－C(＝O)－VA－、－ZL2－(CH2)5－C(＝O)－GGFG－NH－CH2－、－ZL2－(CH2)5－C(＝O)－GGVA－NH－CH2－、－ZL2－(CH2)5－C(＝O)－GGVCit－NH－CH2－、－ZL2－(CH2)5－C(＝O)－GGFCit－NH－CH2－、－ZL2－(CH2)5－C(＝O)－NH－(CH2CH2O)3－CH2－C(＝O)－、或－ZL2－(CH2)5－C(＝O)－NH－(CH2CH2O)4－CH2－C(＝O)－，在此，ZL2表示上述Lb的以下所示的结构式所示的－(琥珀酰亚胺－3－基－N)-。
Figure BDA0003831863160000451
就本发明的抗体药物偶联物中使用的进一步优选的连接子L而言，药物与抗体的结合方式为“糖链偶联”，连接子L为－ZL1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGFG－NH－CH2－、或－ZL1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGPI－NH－CH2－，在此，ZL1表示上述Lb的以下所示的结构式：
Figure BDA0003831863160000452
就本发明的抗体药物偶联物中使用的更进一步优选的连接子L而言，药物与抗体的结合方式为“糖链偶联”，连接子L为－ZL1－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－GGFG－NH－CH2－，在此，ZL1表示上述Lb的以下所示的结构式：
Figure BDA0003831863160000453
上述的“优选的连接子L”、“更优选的连接子L”、“进一步优选的连接子L”以及“更进一步优选的连接子L”中的右端与药物D结合。
本发明的抗体药物偶联物中使用的“连接子L－药物D”优选由以下的两个结构式表示：
Figure BDA0003831863160000461
在此，波浪线表示与Ab的糖链或经重构的糖链结合。
本发明的抗体药物偶联物中使用的“连接子L－药物D”更优选由以下的两个结构式表示：
Figure BDA0003831863160000471
在此，波浪线表示与Ab的糖链或经重构的糖链结合。
本发明的抗体药物偶联物中使用的“连接子L－药物D”进一步优选由下式表示：
Figure BDA0003831863160000472
在此，波浪线表示与Ab的糖链或经重构的糖链结合。
＜2.2.抗体及其糖链修饰＞
＜2.2.1抗体＞
本说明书中，“基因”是指包含编码蛋白质的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸或核苷酸序列、或其互补链，例如，作为包含编码蛋白质的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸序列或其互补链的多核苷酸、寡核苷酸、DNA、mRNA、cDNA、RNA等也包含在“基因”的含义中。
本说明书中，“核苷酸”、“多核苷酸”或“核苷酸序列”与“核酸”为同样的含义，例如，DNA、RNA、探针、寡核苷酸、多核苷酸、引物等也包含在“核苷酸”或“核苷酸序列”的含义中。
本说明书中，无区别地使用“多肽”、“肽”、“蛋白质”。
本说明书中，“抗体的功能性片段”也称为“抗体的抗原结合片段”，是指具有与抗原的结合活性的抗体的部分片段，包含Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、diabody(双链抗体)、线状抗体以及由抗体片段形成的多特异性抗体等。此外，将F(ab’)2在还原条件下进行处理后的抗体的可变区的一价片段Fab’也包含在抗体的抗原结合片段中。但是，只要具有与抗原的结合能力，就不限定于这些分子。此外，这些抗原结合片段不仅包含将抗体蛋白质的全长分子用适当的酶处理后的分子，也包含使用经过基因工程改造的抗体基因而在适当的宿主细胞中产生的蛋白质。
本发明的抗体药物偶联物中使用的抗体的功能性片段包含保持受到在IgG重链的Fc区域中良好地保存的N结合型糖链引起的修饰的天冬酰胺(Asn297)及其周围的氨基酸，且具有与抗原的结合能力的功能性片段。
本发明的抗体药物偶联物中使用的抗体是指免疫球蛋白，是含有与抗原免疫特异性结合的抗原结合部位的分子。作为本发明的抗体药物偶联物中使用的抗体，可以是IgG、IgE、IgM、IgD、IgA以及IgY中的任一类，优选IgG。此外，作为亚类(subclass)，可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2中的任一种，优选IgG1、IgG2或IgG4(包含IgG重链的Fc区域中具有影响ADCC以及ADCP活性的变异的抗体)。
在使用IgG1作为本发明的抗体药物偶联物中使用的抗体的同型(isotype)的情况下，可以将恒定区的氨基酸残基的一部分取代而调整效应物(effector)功能(参照WO88/07089、WO94/28027、WO94/29351)。作为IgG1的变异体，例如可列举出IgG1 LALA变异(IgG1－L234A、L235A)。所述L234A、L235A表示由EU index(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America，Vol.63，No.1(May 15，1969)，pp.78－85)确定的234位以及235位的亮氨酸被丙氨酸取代。
已知在抗体的恒定区具有多个同种异型(allotype)。例如关于IgG1重链可列举出G1m17、G1m3、G1m1、G1m2。作为本发明中使用的抗体的恒定区，没有特别限定，优选使用G1m17或G1m3。
已知抗体分子的重链和轻链分别有三处互补决定区(CDR：Complementaritydetermining region)。CDR也被称为高变区(hypervariable region)，在抗体的重链和轻链的可变区内，是一级结构的变异性特别高的部位，在重链和轻链的多肽链的一级结构上分别分离于三处。本说明书中，对于抗体的CDR，从重链氨基酸序列的氨基末端侧起将重链的CDR记为CDRH1、CDRH2、CDRH3，从轻链氨基酸序列的氨基末端侧起将轻链的CDR记为CDRL1、CDRL2、CDRL3。这些部位在立体结构上相互靠近，决定针对要结合的抗原的特异性。
抗体可以来自任意物种，优选可举例示出人、大鼠、小鼠以及兔子。在来自人以外的物种的情况下，优选使用公知的技术进行嵌合化或人源化。本发明的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，优选单克隆抗体。单克隆抗体包括大鼠抗体、小鼠抗体、兔子抗体等来自非人动物的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、它们的功能性片段或它们的修饰体。
抗体优选为以肿瘤细胞或免疫细胞作为靶点的抗体，但并不限定于此。抗体更优选为以肿瘤细胞作为靶点的抗体。
在使用以肿瘤细胞作为靶点的抗体的情况下，作为抗体，优选具备能够识别肿瘤细胞的特性、能够与肿瘤细胞结合的特性、被吞入肿瘤细胞内而内化的特性、以及杀伤肿瘤细胞的特性中的一种或一种以上的特性。本发明的抗体药物偶联物中使用的药物具有STING激动剂活性。该药物使干扰素控制因子3(interferon regulatory factor－3(IRF3))的信号活化而诱导干扰素。因此，在本发明的抗体药物偶联物中使用以肿瘤细胞作为靶点的抗体的情况下，抗体药物偶联物被体内给药后，送达至肿瘤部位，被吞入肿瘤细胞内后连接子部分被肽酶等切断，药物部分游离。可认为游离的药物部分通过STING激动剂活性使肿瘤细胞对免疫细胞的敏感性亢进并且使抗肿瘤免疫活化，从而发挥抗肿瘤效果。或者，也可认为即使聚集于肿瘤细胞的抗体药物偶联物未被内化，肿瘤细胞和/或抗体药物偶联物也因吞噬作用被吞入免疫细胞内，通过STING激动剂活性使抗肿瘤免疫活化，从而发挥抗肿瘤效果。
抗体与肿瘤细胞的结合性可以使用流式细胞仪来确认。抗体向肿瘤细胞内的吞入可以使用下述方式进行确认：(1)使用与治疗抗体结合的二级抗体(荧光标记)通过荧光显微镜将吞入细胞内的抗体可视化的分析(Cell Death and Differentiation(2008)15，751－761)，(2)使用与治疗抗体结合的二级抗体(荧光标记)测定吞入细胞内的荧光量的分析(Molecular Biology of the Cell Vol.15，5268－5282，December 2004)或(3)使用与治疗抗体结合的免疫毒素，当被吞入细胞内时，毒素被释放从而抑制细胞增殖的Mab－ZAP分析(Bio Techniques 28：162－165，January 2000)。作为免疫毒素，也可以使用白喉毒素的催化区域与蛋白G的重组复合蛋白质。
在本发明的抗体药物偶联物使用以肿瘤细胞为靶点的抗体时，优选抗体本身具有抗肿瘤效果，但不是必须的。
药物以及抗体药物偶联物的抗肿瘤活性是指对肿瘤细胞的细胞毒性、抗细胞效果、肿瘤体积的萎缩。可以使用公知的体外(in vitro)或体内(in vivo)的评价系统来确认抗肿瘤活性。
药物以及抗体药物偶联物的作用和免疫活化活性是指肿瘤细胞对免疫细胞的敏感性亢进或通过肿瘤细胞的免疫细胞的活化。可以使用公知的体外(in vitro)或体内(invivo)的评价系统来确认药物以及抗体药物偶联物的作用和免疫活化活性。
作为本发明中能够使用的体外(in vitro)或体内(in vivo)的评价系统，可以举例示出：试验例4记载的CT26.WT以及CT26.WT―hCD70细胞株与来自小鼠骨髓的树突状细胞的共培养分析系统、试验例5记载的皮下移植了将人TROP2基因导入小鼠大肠癌细胞株CT26.WT的CT26.WT－hTROP2细胞的BALB/c小鼠的系统、试验例6记载的皮下移植了将人EGFR基因导入小鼠大肠癌细胞株CT26.WT的CT26.WT－hEGFR细胞的BALB/c小鼠的系统、试验例7记载的皮下移植了人肾癌细胞株Caki―1细胞的BALB/c―nu小鼠的系统、试验例8记载的皮下移植了人肾癌细胞株A―498(HTB―44)细胞的BALB/c―nu小鼠的系统、试验例9记载的皮下移植了将抗体药物偶联物中所含的抗体所结合的抗原上的表位位点被取代为人型而成的人鼠嵌合抗原的基因导入的小鼠大肠癌细胞株CT26.WT(CRL2638)的BALB/c小鼠的系统等，但并不限于此。
作为本发明中使用的抗体，可列举出抗CD70抗体、抗TROP2抗体、或抗EGFR抗体。
本发明中使用的抗体可以通过使用本领域通常实施的方法，使动物免疫成为抗原的多肽，并采集、精制活体内产生的抗体来得到。抗原的来源不限定于人，也可以使动物免疫来自小鼠、大鼠等人以外的动物的抗原。在该情况下，可以通过对与所获得的异种抗原结合的抗体与人抗原的交叉性进行试验来挑选能够用于人的疾病的抗体。
此外，也可以根据公知的方法(例如，Kohler and Milstein，Nature(1975)256，p.495－497、Kennett，R.ed.，Monoclonal Antibodies，p.365－367，Plenum Press，N.Y.(1980))，通过使产生针对抗原的抗体的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合来建立杂交瘤，获得单克隆抗体。
需要说明的是，可以通过基因操作使宿主细胞产生编码抗原蛋白质的基因来得到抗原。
本发明的抗体药物偶联物中使用的抗体可以根据公知的方法(例如，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，6851－6855，(1984)、Nature(1986)321，p.522－525、WO90/07861)来获得。
例如，抗CD70抗体(WO2004/073656、WO2007/038637等)、抗TROP2抗体(WO2015/098099等)、抗EGFR抗体(WO1998/050433、WO2002/092771等)可以使用公知的方法获得。
本发明中使用的抗CD70抗体没有特别限制，优选例如具有以下特性的抗体。
(1)一种抗CD70抗体，其与CD70特异性结合。
(2)如上述(1)所述的抗体，其与人CD70的细胞外结构域结合。
(3)如上述(1)或(2)所述的抗体，所述抗体为单克隆抗体。
(4)如上述(1)～(3)中任一项所述的抗体，其具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
(5)如上述(1)～(4)中任一项所述的抗体，其为小鼠单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
(6)如上述(1)～(3)所述的抗体，其中，重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，包含引起ADCC以及ADCP活性降低的变异。
(7)如上述(5)所述的抗体，其中，重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，由EU INDEX所示的234位以及235位的亮氨酸被丙氨酸取代。
(8)如上述(7)所述的抗体，其为包含由序列号2所述的氨基酸序列形成的重链以及由序列号1所述的氨基酸序列形成的轻链的人源化单克隆抗体。
(9)如上述(7)所述的抗体，其为包含由序列号4所述的氨基酸序列形成的重链以及由序列号3所述的氨基酸序列形成的轻链的人源化单克隆抗体。
(10)如上述(7)所述的抗体，其为包含如下轻链和重链的人源化单克隆抗体，所述轻链包含由序列号35所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号36所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号37所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号38所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号39所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号40所述的氨基酸序列形成的CDRH3。
(11)如上述(7)所述的抗体，其为包含如下轻链和重链的人源化单克隆抗体，所述轻链包含由序列号41所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号42所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号43所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号44所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号45所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号46所述的氨基酸序列形成的CDRH3。
(12)如上述(1)～(11)中任一项所述的抗体，在重链羧基末端缺失一个或两个氨基酸。
(13)一种抗体，其由包括下述工序的该抗体的制造方法而得到：培养通过含有编码上述(1)～(12)中任一项所述的抗体的多核苷酸的表达载体被转化后的宿主细胞的工序；以及从由该工序得到的培养物中采集目标抗体的工序。
作为抗CD70抗体，例如可列举出沃瑟妥珠单抗(vorsetuzumab)、MDX－1115、Cusatuzumab(抗CD70单克隆抗体)，优选可列举出沃瑟妥珠单抗、MDX－1115。
本发明中使用的抗TROP2抗体没有特别限制，优选例如具有以下特性的抗体。
(1)一种抗TROP2抗体，其与TROP2特异性结合。
(2)如上述(1)所述的抗体，其与人TROP2的细胞外结构域结合。
(3)如上述(1)或(2)所述的抗体，所述抗体为单克隆抗体。
(4)如上述(1)～(3)中任一项所述的抗体，其具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
(5)如上述(1)～(4)中任一项所述的抗体，其为小鼠单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
(6)如上述(1)～(3)所述的抗体，其中，重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，包含引起ADCC以及ADCP活性降低的变异。
(7)如上述(1)～(4)中任一项所述的抗体，其为包含由序列号6所述的氨基酸序列形成的重链以及由序列号5所述的氨基酸序列形成的轻链的人源化单克隆抗体。
(8)如上述(5)所述的抗体，其中，重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，由EU INDEX所示的234位以及235位的亮氨酸被丙氨酸取代。
(9)如上述(8)所述的抗体，其为包含由序列号8所述的氨基酸序列形成的重链以及由序列号7所述的氨基酸序列形成的轻链的人源化单克隆抗体。
(10)如上述(8)所述的抗体，其为包含如下轻链和重链的人源化单克隆抗体，所述轻链包含由序列号47所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号48所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号49所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号50所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号51所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号52所述的氨基酸序列形成的CDRH3。
(11)如上述(8)所述的抗体，其为包含如下轻链和重链的人源化单克隆抗体，所述轻链包含由序列号53所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号54所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号55所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号56所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号57所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号58所述的氨基酸序列形成的CDRH3。
(12)如上述(1)～(11)中任一项所述的抗体，在重链羧基末端缺失1个或2个氨基酸。
(13)一种抗体，其由包括下述工序的该抗体的制造方法而得到：培养通过含有编码上述(1)～(12)中任一项所述的抗体的多核苷酸的表达载体被转化后的宿主细胞的工序；以及从由该工序得到的培养物中采集目标抗体的工序。
本发明中使用的抗EGFR抗体没有特别限制，优选例如具有以下特性的抗体。
(1)一种抗EGFR抗体，其与EGFR特异性结合。
(2)如上述(1)所述的抗体，其与人EGFR的细胞外结构域结合。
(3)如上述(1)或(2)所述的抗体，所述抗体为单克隆抗体。
(4)如上述(1)～(3)中任一项所述的抗体，其具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
(5)如上述(1)～(4)中任一项所述的抗体，其为小鼠单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
(6)如上述(1)～(3)所述的抗体，其中，重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，包含引起ADCC以及ADCP活性降低的变异。
(7)如上述(5)所述的抗体，其中，重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，由EU INDEX所示的234位以及235位的亮氨酸被丙氨酸取代。
(8)如上述(7)所述的抗体，其为包含由序列号10所述的氨基酸序列形成的重链以及由序列号9所述的氨基酸序列形成的轻链的人源化单克隆抗体。
(9)如上述(7)所述的抗体，其为包含由序列号12所述的氨基酸序列形成的重链以及由序列号11所述的氨基酸序列形成的轻链的人源化单克隆抗体。
(10)如上述(7)所述的抗体，其为包含如下轻链和重链的人源化单克隆抗体，所述轻链包含由序列号59所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号60所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号61所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号62所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号63所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号64所述的氨基酸序列形成的CDRH3。
(11)如上述(7)所述的抗体，其为包含如下轻链和重链的人源化单克隆抗体，所述轻链包含由序列号65所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号66所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号67所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号68所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号69所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号70所述的氨基酸序列形成的CDRH3。
(12)如上述(1)～(11)中任一项所述的抗体，在重链羧基末端缺失1个或2个氨基酸。
(13)一种抗体，其由包括下述工序的该抗体的制造方法而得到：培养通过含有编码上述(1)～(12)中任一项所述的抗体的多核苷酸的表达载体被转化后的宿主细胞的工序；以及从由该工序得到的培养物中采集目标抗体的工序。
作为抗EGFR抗体，例如可列举出：帕尼单抗(panitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、安美木单抗(ametumumab)(SY－101)、SYN－004、SCT－200、托木妥昔单抗(tomuzotuximab)、GC－1118、GR－1401、迪妥昔珠单抗(depatuxizumab)(ABT－806)，优选可列举出帕尼单抗、ABT806。
本发明中使用的抗体可以是与上述抗体的重链和/或轻链相比具有80％～99％的氨基酸同一性的抗体。在此，“同一性”这一术语具有在本领域中使用的通常定义。同一性的％是指将两个氨基酸序列以氨基酸的一致度成为最大的方式排列(比对：alignment)时的、相同氨基酸数相对于总氨基酸数(包括间隙)的百分比。这样的同一性通常为80％以上的同一性，优选为90％、91％、92％、93％或94％以上的同一性，更优选为95％、96％、97％或98％以上的同一性，进一步优选为99％以上的同一性。此外，通过将在重链和/或轻链的氨基酸序列中取代、缺失和/或添加1～几个氨基酸残基而成的氨基酸序列组合，也可以选择具有与上述各抗体同等的各种作用的抗体。取代、缺失和/或添加的氨基酸残基数通常为10个氨基酸残基以下，优选为5～6个氨基酸残基以下，更优选为2～3个氨基酸残基以下，进一步优选为1个氨基酸残基。
＜2.2.2抗体的糖链重构＞
近年来，报道了通过酶反应重构不均匀的抗体的糖链，均匀地导入具有官能团的糖链的方法(ACS Chem.Biol.2012，7，110－122，ACS Med.Chem.Lett.2016，7，1005－1008)。已经尝试使用该糖链重构技术，部位特异性地导入药物，合成均匀的ADC(Bioconjugate Chem.2015，26，2233－2242，Angew.Chem.Int.Ed.2016，55，2361－2367，US2016361436)。
糖链的重构首先使用水解酶切除添加到蛋白质(抗体等)中的不均匀的糖链而仅留下末端的GlcNAc，制备添加了GlcNAc的均匀的蛋白质部分(以下称为“受体”)。接着，准备另行制备的任意的糖链(以下称为“供体”)，使用糖基转移酶连接该受体和供体。由此可以合成具有任意的糖链结构的均匀的糖蛋白质。
本发明中，“糖链”是指两个以上的单糖通过糖苷键结合而成的结构单元。具体的单糖、糖链有时以缩写形式表示，例如“GlcNAc－”、“SG－”。在结构式中用这些缩写进行记载的情况下，除了具有特别定义的情况以外，还原末端上归属于与其他结构单元的糖苷键的氧原子或氮原子并不包含在表示该糖链的缩写中。
本发明中，除了另有规定的情况以外，为了方便起见，关于成为糖链的基本单元的单糖的记载，在其环结构中与构成环的氧原子键合且与羟基(或归属于糖苷键的氧原子)直接键合的碳原子记为1位(仅唾液酸中为2位)。实施例化合物的名称以化学结构整体来命名，未必适用该规则。
本发明中，在以符号(例如SG、MSG、GlcNAc等)来记载糖链的情况下，除了另有定义的情况以外，连还原末端的碳都包含在该符号中，但归属于N－或O－糖苷键的N或O不包含在该符号中。
本发明的抗体药物偶联物由下式表示：
Figure BDA0003831863160000571
抗体Ab或其功能性片段从其氨基酸残基(例如，半胱氨酸、赖氨酸等)的侧链直接与L结合，或者从Ab的糖链或经重构的糖链与L结合。
本发明的Ab的糖链为N结合型糖链或O结合型糖链，优选N结合型糖链。
N结合型糖链通过N糖苷键与抗体的氨基酸侧链结合，O结合型糖链通过O糖苷键与抗体的氨基酸侧链结合。
本发明的Ab为IgG，优选为IgG1、IgG2或IgG4。
已知IgG在其重链的Fc区域中的第297位天冬酰胺残基(以下称为“Asn297或N297”)中具有高度保守的N结合型糖链(以下称为“Asn297糖链或N297糖链”)，有助于抗体分子的活性、动态等(Eon－Duval，A.et al，Biotechnol.Prog.2012，28，608－622、Sanglier－Cianferani，S.，Anal.Chem.2013，85，715－736)。
IgG的恒定区中的氨基酸序列高度保守，在Edelman等的报告(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，63，78－85，(1969))中，各氨基酸被EU编号(EU INDEX)确定。例如，Fc区域中添加N结合型糖链的Asn297相当于EU编号中的297位，即使在由于分子的片段化、区域缺损而实际的氨基酸位置发生变动的情况下，也可以通过以EU编号表示而唯一地确定氨基酸。
下图表示本发明的抗体药物偶联物从抗体或其功能性片段的所述N297糖链与L结合的情况。
Figure BDA0003831863160000572
需要说明的是，将具有该经重构的糖链的抗体称为糖链重构抗体。
SGP(α2，6－SGP)为Sialylglycopeptide(唾液酸糖肽)的简称，是N结合型糖肽的代表例。可以从鸡蛋的蛋黄中根据例如WO2011/027868所述的方法分离、精制而得到SGP。此外，SGP的精制品由东京化成工业和伏见制药所销售。在本说明书中，将SGP的糖链部分记为SG，将缺少一个SG的还原末端的GlcNAc的糖链记为SG(10)。SG(10)可以例如参照梅川等的报告(Biochim.Biophys.Acta 2010，1800，1203－1209)，通过SGP的酶的水解来制备。此外，SG(10)也可以从东京化成工业和伏见制药所购入。
本说明书中，将仅在SG(10)的β－Man的支链中的任意一方缺失了非还原末端的唾液酸的糖链结构记为MSG(9)，将仅在支链的1－3糖链具有唾液酸的糖链记为MSG1，将仅在支链的1－6糖链具有唾液酸的糖链记为MSG2。
本发明的抗体药物偶联物中使用的经重构的糖链为N297－(Fuc)SG、N297－(Fuc)MSG1、N297－(Fuc)MSG2、或N297－(Fuc)MSG1与N297－(Fuc)MSG2的混合物，优选为N297－(Fuc)SG、N297－(Fuc)MSG1或N297－(Fuc)MSG2，更优选为N297－(Fuc)SG或N297－(Fuc)MSG1。N297－(Fuc)SG由以下的结构式或序列式表示。
Figure BDA0003831863160000581
Figure BDA0003831863160000591
上式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧和1－6链侧两者的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，星号表示与所述连接子L、特别是与连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，其中，n5为整数2～10，优选为整数2～5。
N297－(Fuc)MSG1由以下的结构式或序列式表示。
Figure BDA0003831863160000592
上式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，星号表示与所述连接子L、特别是与连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，其中，n5为整数2～10，优选为整数2～5。
N297－(Fuc)MSG2由以下的结构式或序列式表示。
Figure BDA0003831863160000601
上式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－6链侧的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，星号表示与所述连接子L、特别是与连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，其中，n5为整数2～10，优选为整数2～5。
在本发明的抗体药物偶联物的抗体的N297糖链为N297－(Fuc)SG的情况下，抗体为二聚物，因此抗体药物偶联物为结合了4个连接子L和4个药物D的分子(上述m2＝2)。
在本发明的抗体药物偶联物的抗体的N297糖链为N297－(Fuc)MSG1或者N297－(Fuc)MSG2或它们的混合物的情况下，抗体为二聚物，因此抗体药物偶联物为结合了2个连接子L和2个药物D的分子(上述m2＝1)(参照图1)。
N297糖链优选为N297－(Fuc)SG或者N297－(Fuc)MSG1或N297－(Fuc)MSG2，更优选为N297－(Fuc)SG或N297－(Fuc)MSG1，进一步优选为N297－(Fuc)SG。
在本发明的抗体药物偶联物的抗体的N297糖链为N297－(Fuc)SG或者N297－(Fuc)MSG1或N297－(Fuc)MSG2的情况下，可获得均匀性高的ADC。
＜3.制造方法＞
对包含本发明的新型CDN衍生物的抗体药物偶联物或其制造中间体的代表性制造方法进行说明。需要说明的是，以下为了表示化合物，使用各反应式中所示的化合物的编号。即，称为“式(1)的化合物”、“化合物(1)”等。此外，除此以外的编号的化合物也同样记载。
下述的A法～E法中，取代基L1与上述含义相同。取代基L2表示选自下述(i)或(ii)的基团：(i)与L结合时，L2表示－NHR’、羟基C1－C6烷基或氨基C1－C6烷基，在此，R’表示氢原子、C1－C6烷基、C2－C6烯基、C2－C6炔基或C3－C6环烷基，该C1－C6烷基、C2－C6烯基或C2－C6炔基可以被1～6个卤素原子取代；或(ii)未与L结合时，L2表示氢原子或卤素原子，取代基W1表示－NH－或硫原子。取代基W2表示－CH＝。取代基Z1～Z3一起表示－CH2－CH2－CH2－。取代基R1～R3分别独立地表示氢原子、卤素原子、－OR’、－OC(＝O)R’、－N3、－NHR’、－NR’R”或－NHC(＝O)R’(在此，R’如前述定义，R”表示C1－C6烷基、C2－C6烯基、C2－C6炔基或C3－C6环烷基)。取代基R4表示氢原子。就取代基R5而言，在W1为氮原子时，R5表示氢原子，在W1为氧原子时，R5不存在。取代基Ra、Rc、Re以及Rg表示天然型α－氨基酸的侧链。例如为甲基、异丙基、仲丁基、异丁基、苄基等。PRO1表示伯醇的保护基。优选为4，4’－二甲氧基三苯甲基、4－甲氧基三苯甲基等。PRO2、PRO3、PRO7、PRO8表示仲醇的保护基。优选为叔丁基二甲基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基氧基甲基、苯甲酰基、2－硝基苄基、4－甲氧基四氢吡喃－4－基等。PRO6表示羧酸的保护基。优选为叔丁基、苄基等。PRO5、PRO9表示胺的保护基。PRO5优选为叔丁基氧基羰基、9－芴基甲基氧基羰基、烯丙氧基羰基、2，2，2－三氯乙氧基羰基、苄基氧基羰基等，PRO9优选为9－芴基甲基氧基羰基或2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基。PRO4表示醇或胺的保护基。醇的情况优选叔丁基二甲基甲硅烷基、苯甲酰基等，胺的情况优选2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧基羰基、叔丁基氧基羰基等。Qa表示氧原子或硫原子，Qb表示羟基或硫醇基。Qa’和Qb’分别独立地表示带负电的氧原子(O－)或硫原子(S－)。Rx和Ry分别独立地表示卤素原子或－O－PRO2。n表示整数1～3。
A法
本发明的抗体药物偶联物中使用的(1)所示的CDN衍生物可以根据以下记载的A法来制造。
Figure BDA0003831863160000621
本制造法为用于制造通式(1)所示的化合物的方法。本制造法的A－1工序～A－5工序可以一锅合成(one pot synthesis)，本制造法可以参照Gaffney等的报告(Org.Lett.2010，12，3269－3271)而实施。
Figure BDA0003831863160000631
(A－1工序)
本工序是通过对式(1a)的化合物使用公知的有机化学方法而连续进行水解反应和除去氰基乙基来制造式(2a)的化合物的工序。在溶剂(乙腈、四氢呋喃、N，N－二甲基甲酰胺或它们的混合溶剂)中，在－10℃～反应中使用的溶剂的沸点下，优选在15℃～35℃下通过水以及酸(吡啶三氟乙酸盐、4，5－二氰基咪唑、1H－四唑等)处理化合物(1a)而实施水解反应。相对于化合物(1a)1摩尔，水使用2摩尔～过量摩尔，优选使用2摩尔～10摩尔，酸使用1摩尔～过量摩尔，优选使用1摩尔～5摩尔。反应时间为1分钟～3小时，优选为5分钟～30分钟。接着，在该反应液中添加碱(叔丁胺等)除去氰基乙基。相对于化合物(1a)1摩尔，碱使用过量摩尔，优选使用30摩尔～50摩尔。反应时间为5分钟～6小时，优选为15分钟～1小时。将反应液在减压下浓缩，得到化合物(2a)的粗产物。化合物(2a)的粗产物可以不进行精制而进入下一工序。
(A－2工序)
本工序是对式(2a)的化合物使用公知的有机化学方法除去羟基的保护基来制造式(3a)的化合物的工序。在开始本工序的反应之前，根据需要使用乙腈共沸1～3次，使式(2a)的粗产物干燥。在PRO1为4，4’－二甲氧基三苯甲基的情况下，通过在溶剂(二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷等)中，在－10℃～反应中使用的溶剂的沸点下，优选在15℃～35℃下通过水以及酸(二氯乙酸、三氟乙酸等)处理化合物(2a)，除去4，4’－二甲氧基三苯甲基。相对于化合物(2a)1摩尔，水使用过量摩尔，优选使用10摩尔～20摩尔，利用反应中使用的溶剂将酸稀释至1％～50％(v/v)，优选5％～10％(v/v)，使用该稀释溶液过量摩尔，优选使用5摩尔～15摩尔。反应时间为1分钟～3小时，优选为5分钟～30分钟。在反应液中加入吡啶进行反应停止处理。吡啶使用能够将使用的酸充分中和的量，优选相对于酸1摩尔使用2摩尔～10摩尔的吡啶。将反应液在减压下浓缩，得到化合物(3a)的粗产物。将化合物(3a)的粗产物使用脱水乙腈共沸3～5次。在最后的共沸时乙腈残留，得到化合物(3a)的0.01M～1M的乙腈溶液。将所得到的乙腈溶液直接进入下一工序。
(A－3工序)
本工序是通过对式(3a)的化合物使用公知的有机化学方法而连续进行与式(4a)的化合物的偶联反应以及所得到的偶联体的硫化反应，制造式(5a)的化合物的工序。在开始本工序的反应之前，使用脱水乙腈将化合物(4a)共沸3～5次。在最后的共沸时乙腈残留，制备化合物(4a)的0.01M～1M的乙腈溶液。在该溶液中添加干燥剂(粉末状或团块(pellet)状的分子筛3A或分子筛4A)，在使用溶液之前在氮或氩气氛下保存。通过在化合物(3a)的乙腈溶液中，在5℃～35℃下添加经共沸干燥的化合物(4a)的乙腈溶液来实施偶联反应。反应时间为1分钟～24小时，优选为5分钟～6小时。接着，在该反应液中添加硫化剂(N，N－二甲基－N’－(3－硫酮－3H－1，2，4－二噻唑－5－基)甲脒、3H－1，2－苯并二硫醇－3－酮等)来实施硫化反应。相对于化合物(3a)1摩尔，硫化剂使用1摩尔～5摩尔，优选使用1摩尔～2摩尔。反应时间为5分钟～24小时，优选为30分钟～6小时。将反应液在减压下浓缩，得到化合物(5a)的粗产物。所得到的化合物(5a)的粗产物直接进入下一工序。
(A－4工序)
本工序是对式(5a)的化合物使用公知的有机化学方法除去羟基的保护基，制造式(6a)的化合物的工序。在PRO1为4，4’－二甲氧基三苯甲基的情况下，通过在溶剂(二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷等)中，在－10℃～反应中使用的溶剂的沸点下，优选在15℃～35℃下，利用水和酸(二氯乙酸、三氟乙酸等)处理化合物(5a)的化合物，除去4，4’－二甲氧基三苯甲基。相对于化合物(5a)1摩尔，水使用过量摩尔，优选使用10～20摩尔，利用反应中使用的溶剂将酸稀释至1％～50％(v/v)，优选5％～10％(v/v)，使用该稀释溶液过量摩尔，优选使用5摩尔～15摩尔。反应时间为1分钟～3小时，优选为5分钟～30分钟。在反应液中加入吡啶进行反应停止处理。吡啶使用能够将使用的酸充分中和的量，优选相对于酸1摩尔使用10摩尔～200摩尔的吡啶。将反应液在减压下浓缩，得到化合物(6a)的粗产物。将所得到的化合物(6a)的粗产物直接进入下一工序。
(A－5工序)
本工序是对式(6a)的化合物使用公知的有机化学方法而连续进行环化反应和硫化反应来制造式(7a)的化合物的工序。将化合物(6a)溶于吡啶后，在减压下浓缩，制备0.01M～0.5M的吡啶溶液。通过在该吡啶溶液中，在5℃～35℃下添加脱水缩合剂(2－氯－5，5－二甲基－1，3，2λ5－二氧磷杂环己烷－2－酮等)来实施环化反应。相对于化合物(6a)1摩尔，脱水缩合剂使用1摩尔～过量摩尔，优选使用3摩尔～5摩尔。反应时间为1分钟～6小时，优选为5分钟～1小时。接着，在该反应液中添加水和硫化剂(3H－1，2－苯并二硫醇－3－酮、N，N－二甲基－N’－(3－硫酮－3H－1，2，4－二噻唑－5－基)甲脒等)来实施硫化反应。相对于化合物(6a)1摩尔，水使用过量摩尔，优选使用30摩尔～50摩尔，硫化剂使用1摩尔～5摩尔，优选使用1摩尔～2摩尔。反应时间为5分钟～12小时，优选为30分钟～3小时。将反应液加入碳酸氢钠水溶液(0.1M～1M)中后，搅拌15分钟～24小时进行反应停止处理。将反应液利用有机溶剂(乙酸乙酯、二乙基醚、甲苯或它们的混合溶剂)萃取1～5次后，合并萃取液而利用无水盐(无水硫酸钠或无水硫酸镁)进行干燥。滤去干燥剂将滤液在减压下浓缩。将所得到的残留物用硅胶柱色谱法[二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/甲醇、己烷/乙酸乙酯等]、C18硅胶柱色谱法[缓冲液/乙腈]或将它们组合来进行精制，以两种以上非对映异构体混合物或两种以上纯的非对映异构体的形式得到了化合物(7a)。在本工序中，多数情况下可得到两种非对映异构体，但取决于原料(1a)和(4a)，有时也可进一步得到一种或两种非对映异构体。即使所得到的化合物(7a)为多个非对映异构体混合物，也可以不进行进一步的精制而进入下一工序。
(A－6工序)
本工序是对式(7a)的化合物使用公知的有机化学方法将氰基乙基以及全部的酰基系保护基同时除去，制造式(8a)的化合物的工序。本工序根据需要在高压釜中、或密封管中实施。在PRO4为苯甲酰基的情况下，通过在溶剂(甲醇、乙醇、四氢呋喃或它们的混合溶剂)中在5℃～反应中使用的溶剂的沸点下，用28％(v/v)氨水处理化合物(7a)的化合物来除去氰基乙基和苯甲酰基。相对于化合物(7a)1摩尔，氨使用过量摩尔，优选使用300摩尔～3000摩尔。反应时间为30分钟～96小时，优选为2小时～48小时。根据需要将反应液浓缩，将残留物用制备型HPLC[缓冲液/乙腈、缓冲液/甲醇等]、C18硅胶柱色谱法[缓冲液/乙腈、缓冲液/甲醇等]或它们的组合进行精制，得到化合物(8a)。即使所得到的化合物(8a)为非对映异构体混合物，也可以不进行进一步的精制而进入下一工序。此外，本工序中，也可以不进行精制而直接进入下一工序。
(A－7工序)
本工序是对式(8a)的化合物使用公知的有机化学方法将全部的甲硅烷基系保护基同时除去，制造式(9a)的化合物的工序。在PRO2以及PRO3为叔丁基二甲基甲硅烷基的情况下，通过在5℃～100℃下，优选在35℃～60℃下直接用三乙胺三氢氟酸盐处理化合物(8a)来除去叔丁基二甲基甲硅烷基。相对于化合物(8a)1摩尔，三乙胺三氢氟酸盐使用过量摩尔，优选使用100～200摩尔。反应时间为30分钟～24小时，优选为2小时～12小时。将反应液冷却至室温后，在反应液中逐量注入冰冷的1M碳酸氢三乙铵水溶液和三乙胺的3：1～10：1(v/v)的混合溶液进行反应停止处理。也可以根据需要将反应液注入冰冷的1M碳酸氢三乙铵水溶液和三乙胺的混合溶液中。在该情况下，将反应容器用乙腈和水进行清洗。三乙胺使用足以将反应液的液性变成弱碱性的量，优选相对于三乙胺三氢氟酸盐1摩尔，使用约2摩尔的三乙胺。将反应液的有机溶剂成分在减压下蒸馏除去后，将残留的水溶液用制备型HPLC[缓冲液/乙腈、缓冲液/甲醇等]、C18硅胶柱色谱法[缓冲液/乙腈、缓冲液/甲醇等]或它们的组合进行精制，以单一的非对映异构体的形式得到化合物(9a)。
(A－8工序)
本工序是对式(9a)的化合物使用公知的有机化学方法进行离子交换，制造式(1)的化合物的工序。将阳离子交换树脂(BT AG(注册商标)50W－X2树脂，100－200目，氢型)悬浮于纯水中，填充于空的柱管(column cartridge)中。阳离子交换树脂使用以重量比计为化合物(9a)的10倍～50倍量。使过量的纯水自然流下后，使1M氢氧化钠水溶液自然流下3柱体积，接着，使6柱体积的纯水自然流下。将化合物(9a)溶于约3柱体积的纯水并装填于柱中。在化合物不易溶于纯水的情况下，可以使用与少量的有机溶剂(乙腈、甲醇等)的混合液。分取自然流下的溶液后，进一步用6柱体积的纯水等进行洗脱，分取出组分。合并包含目标物的组分进行冷冻干燥，以单一的非对映异构体的形式得到化合物(1)。
A’法
本发明的抗体药物偶联物中使用的(1’)所示的CDN衍生物可以依照以下记载的A’法进行制造。
Figure BDA0003831863160000671
本制造法是变更A法的一部分而用于制造通式(1’)所示的化合物的方法。具体而言，通式(1’)的化合物可以通过将A法A－5工序变更为以下所示的A’－5工序来制造。此外，在取代基Rx与Ry均为卤素原子的情况下，可以省略A－7工序。
Figure BDA0003831863160000681
(A’－5工序)
本工序是对式(6a’)的化合物使用公知的有机化学方法连续进行环化反应和氧化反应来制造式(7a’)的化合物的工序。将化合物(6a’)溶于吡啶后，在减压下浓缩，制备0.01M～0.5M的吡啶溶液。在该吡啶溶液中，在5℃～35℃下添加脱水缩合剂(2－氯－5，5－二甲基－1，3，2λ5－二氧磷杂环己烷－2－酮等)实施环化反应。相对于化合物(6a’)1摩尔，脱水缩合剂使用1摩尔～过量摩尔，优选使用3摩尔～5摩尔。反应时间为1分钟～6小时，优选为5分钟～1小时。接着，在该反应液中添加水和氧化剂(碘等)实施氧化反应。相对于化合物(6a’)1摩尔，水使用0摩尔～过量摩尔，优选使用30摩尔～50摩尔，氧化剂使用2摩尔～10摩尔，优选使用3摩尔～5摩尔。反应时间为5分钟～12小时，优选为30分钟～3小时。将反应液加入碳酸氢钠水溶液(0.1M～1M)中，搅拌15分钟～24小时进行反应停止处理。将反应液用有机溶剂(乙酸乙酯、二乙基醚、甲苯或它们的混合溶剂)萃取1次～5次后，合并萃取液用无水盐(无水硫酸钠或无水硫酸镁)进行干燥。滤去干燥剂，将滤液在减压下进行浓缩。将所得到的残留物用硅胶柱色谱法[二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/甲醇、己烷/乙酸乙酯等]、C18硅胶柱色谱法[缓冲液/乙腈]或它们的组合进行精制，得到化合物(7a’)。
A”法
本发明的抗体药物偶联物中使用的(1”)所示的CDN衍生物可以依照以下记载的A”法进行制造。
Figure BDA0003831863160000691
本制造法是变更A法的一部分而用于制造通式(1”)所示的化合物的方法。具体而言，通式(1”)的化合物可以通过将A法的A－3工序变更为以下所示的A”－3工序来制造。此外，在取代基Rx与Ry均为卤素原子的情况下，可以省略A－7工序。
Figure BDA0003831863160000692
(A”－3工序)
本工序是对式(3a”)的化合物使用公知的有机化学方法连续进行与式(4a”)的化合物的偶联反应以及所得到的偶联体的氧化反应来制造式(5a”)的化合物的工序。在开始本工序的反应之前，使用脱水乙腈将化合物(4a”)共沸3次～5次。在最后的共沸时乙腈残留，制备化合物(4a”)的0.01M～1M的乙腈溶液。在该溶液中添加干燥剂(粉末状或团块状的分子筛3A或分子筛4A)，在使用溶液之前在氮或氩气氛下保存。通过在化合物(3a”)的乙腈溶液中，在5℃～35℃下添加通过共沸干燥的化合物(4a”)的乙腈溶液来实施偶联反应。反应时间为1分钟～24小时，优选为5分钟～6小时。接着，在该反应液中添加氧化剂(叔丁基过氧化氢等)实施氧化反应。相对于化合物(3a”)1摩尔，氧化剂为1摩尔～5摩尔，优选为2摩尔～3摩尔。反应时间为5分钟～24小时，优选为30分钟～6小时。在反应液中加入饱和硫代硫酸钠水溶液，搅拌10分钟～12小时进行反应停止处理。将反应液用有机溶剂(二氯甲烷与甲醇的混合溶剂等)萃取1次～5次后，合并萃取液用无水盐(无水硫酸钠或无水硫酸镁)进行干燥。滤去干燥剂，将滤液在减压下进行浓缩，得到化合物(5a”)的粗产物。所得到的化合物(5a”)的粗产物直接进入下一工序。
A”’法
本发明的抗体药物偶联物中使用的(1”’)所示的CDN衍生物可以依照以下记载的A”’法进行制造。
Figure BDA0003831863160000701
本制造法是变更A法的一部分而用于制造通式(1”’)所示的化合物的方法。具体而言，通式(1”’)的化合物可以通过将A法的A－3工序变更为A”－3工序、将A－5工序变更为A’－5工序来制造。此外，在取代基Rx与Ry均为卤素原子的情况下，可以省略A－7工序。
Figure BDA0003831863160000711
B法：偶联前体(糖链偶联)
本发明的抗体药物偶联物中使用的(2)所示的偶联前体可以依据以下所述的B法进行制造。
Figure BDA0003831863160000721
本制造法是用于制造在L1的任意位置取代有－NH2的情况的偶联前体(2)的方法。
Figure BDA0003831863160000722
(B－1工序)
本工序是对式(1b)的化合物使用公知的有机化学方法除去保护基来制造式(2b)的化合物的工序。在PRO5为叔丁基氧基羰基的情况下，通过在溶剂(二氯甲烷、二氧杂环己烷、乙腈、乙酸乙酯、四氢呋喃、或它们的混合溶剂)中，在－10℃～反应中使用的溶剂的沸点下，优选在15℃～35℃下用三氟乙酸处理化合物(1b)来除去保护基。相对于化合物(1b)1摩尔，三氟乙酸使用过量摩尔，优选使用20摩尔～50摩尔。反应时间为5分钟～24小时，优选为30分钟～6小时。将反应液在减压下浓缩后，悬浮于甲苯中，再在减压下进行浓缩。该操作反复进行2～5次。加入溶剂(二乙基醚、二异丙基醚、己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯或它们的混合溶剂)制成浆料状后，滤取固体，得到化合物(2b)的粗产物。化合物(2b)的粗产物不进行进一步的精制而进入下一工序。
(B－2工序)
本工序是对式(2b)的化合物使用公知的有机化学方法进行与式(3b)的化合物的酰胺化来制造式(4b)的化合物的工序。通过使化合物(2b)在溶剂(N，N－二甲基甲酰胺、N－甲基吡咯烷酮、N，N－二甲基乙酰胺、乙腈等)中，在5℃～35℃下与碱(三乙胺、N，N－二异丙基乙基胺等)以及化合物(3b)反应来实施酰胺化。相对于化合物(2b)1摩尔，碱使用1摩尔～5摩尔，化合物(3b)使用0.5摩尔～1.5摩尔。反应时间为10分钟～72小时，优选1小时～24小时。将反应液注入有机溶剂(二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇或其混合溶剂)与水或酸性水溶液(0.1～1M的盐酸、柠檬酸水溶液等)这两层，用有机溶剂萃取1～5次。合并萃取液，用饱和食盐水进行清洗后，用无水盐(无水硫酸钠或无水硫酸镁)进行干燥。滤去干燥剂，将滤液在减压下浓缩。需要说明的是，也可以省略上述分液操作，将反应液直接在减压下进行浓缩而进行下一步的硅胶柱精制。将所得到的残留物用硅胶柱色谱法[二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/甲醇等]进行精制，得到化合物(4b)。可以根据需要将所得到的化合物(4b)溶于良溶剂(乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、甲醇或它们的混合溶剂)后，加入不良溶剂(二乙基醚、二异丙基醚、己烷等)进行再沉淀，滤取固体，由此提高纯度。
(B－3工序)
本工序是对式(4b)的化合物使用公知的有机化学方法进行酯化来制造式(5b)的化合物的工序。通过使化合物(4b)在溶剂(N，N－二甲基甲酰胺、N，N－二甲基乙酰胺、N－甲基吡咯烷酮、乙腈等)中，在5℃～35℃下与N－羟基琥珀酰亚胺以及缩合剂(1－乙基－3－(3－二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐等)反应而实施酯化。相对于化合物(4b)1摩尔，N－羟基琥珀酰亚胺以及缩合剂分别使用1摩尔～3摩尔。反应时间为30分钟～72小时，优选为2小时～24小时。将反应液用有机溶剂(二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯或它们的混合溶剂)稀释后，用冰水清洗3～5次。将有机层使用无水盐(无水硫酸钠或无水硫酸镁)进行干燥。滤去干燥剂后，将滤液在减压下浓缩而得到化合物(5b)的粗产物。可以根据需要将所得到的化合物(5b)用C18硅胶柱色谱法[仅乙腈]进行精制。此外，可以将所得到的化合物(5b)溶于良溶剂(乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷或它们的混合溶剂)后，加入不良溶剂(二乙基醚、二异丙基醚、己烷等)进行再沉淀，滤取固体，由此提高纯度。
(B－4工序)
本工序是通过对式(5b)的化合物使用公知的有机化学方法进行与式(6b)的化合物的缩合反应来制造式(2)的化合物的工序。通过使化合物(6b)在溶剂(N，N－二甲基甲酰胺、N，N－二甲基乙酰胺、N－甲基吡咯烷酮、乙腈等)中，在－10℃～100℃下，优选在15℃～35℃下与碱(三乙胺、N，N－二异丙基乙基胺等)以及化合物(5b)反应来实施缩合反应。相对于化合物(6b)1摩尔，碱使用2摩尔～5摩尔，化合物(5b)使用1摩尔～2摩尔。反应时间为5分钟～24小时，优选为1小时～6小时。在反应液中加入苄基胺进行反应停止处理。相对于化合物(6b)1摩尔，苄基胺使用4摩尔～10摩尔。根据需要将反应液在减压下部分浓缩，将残留的溶液用制备型HPLC[缓冲液/乙腈、缓冲液/甲醇等]、C18硅胶柱色谱法[缓冲液/乙腈、缓冲液/甲醇等]或它们的组合进行精制，得到化合物(2)。
B’法：偶联前体(半胱氨酸偶联)
本发明的抗体药物偶联物中使用的(2’)所示的偶联前体可以依据以下所述的B’法进行制造。
Figure BDA0003831863160000741
本制造法是用于制造在L1的任意位置取代有－NH2的情况的偶联前体(2’)的方法。
Figure BDA0003831863160000751
(B－5工序)
本工序是通过对式(2b’)的化合物使用公知的有机化学方法进行与式(7b)的化合物的酰胺化来制造式(8b)的化合物的工序。除了不使用碱以外，依据B法B－2工序记载的方法得到化合物(8b)。
(B－6工序)
本工序是通过对式(8b)的化合物使用公知的有机化学方法除去保护基来制造式(9b)的化合物的工序。在PRO6为叔丁基的情况下，除了在精制操作中使用硅胶柱色谱法[二氯甲烷/甲醇]以外，根据B法B－1工序记载的方法得到化合物(9b)。
(B－7工序)
本工序是通过对式(9b)的化合物使用公知的有机化学方法进行酯化来制造式(10b)的化合物的工序。根据B法B－3工序记载的方法得到化合物(10b)。
(B－8工序)
本工序是通过对式(6b)的化合物使用公知的有机化学方法进行与式(10b)的化合物的缩合反应来制造式(2’)的化合物的工序。根据B法B－4工序记载的方法得到化合物(2’)。
C法
本发明的抗体药物偶联物中使用的(3)所示的偶联前体可以依照以下所述的C法进行制造。
Figure BDA0003831863160000761
本制造法是用于制造在L1的任意位置取代有羟基的情况的偶联前体(3)的方法。
Figure BDA0003831863160000771
(C－1工序)
本工序是通过对式(1c)的化合物使用公知的有机化学方法进行与式(2c)的化合物的酰胺化来制造式(3c)的化合物的工序。根据B法B－2工序记载的方法得到化合物(3c)。
(C－2工序)
本工序是通过对式(3c)的化合物使用公知的有机化学方法进行酯化来制造式(4c)的化合物的工序。根据B法B－3工序记载的方法得到化合物(4c)。
(C－3工序)
本工序是通过对式(5c)的化合物使用公知的有机化学方法连续进行与式(6c)的化合物的偶联反应(氨基亚甲基化)和所得到的偶联体的脱保护来制造式(7c)的化合物的工序。在PRO9为9－芴基甲基氧基羰基的情况下，通过使化合物(5c)在四氢呋喃中在5℃～35℃下与化合物(6c)以及酸(对甲苯磺酸等)反应来实施氨基亚甲基化。相对于化合物(5c)1摩尔，化合物(6c)使用1摩尔～20摩尔，优选使用2摩尔～10摩尔，酸使用0.05摩尔～过量摩尔，优选使用0.1摩尔～3摩尔。反应时间为30分钟～72小时，优选为2小时～24小时。接着，在反应液中加入碱(1，8－二氮杂双环[5.4.0]－7－十一烯等)，实施脱保护。在反应液悬浮的情况下，可以根据需要追加溶剂(N，N－二甲基甲酰胺等)并使其溶解后进行反应。相对于化合物(5c)1摩尔，碱使用过量摩尔，优选使用5摩尔～20摩尔。反应时间为10分钟～24小时，优选为2小时～12小时。在反应液中加入水，直接用C18硅胶柱色谱法[缓冲液/乙腈等]进行精制，得到化合物(7c)。
(C－4工序)
本工序是对式(7c)的化合物使用公知的有机化学方法除去保护基来制造式(8c)的化合物的工序。在PRO7以及PRO8为叔丁基二甲基甲硅烷基的情况下，依据A法A－7工序记载的方法得到化合物(8c)。
(C－5工序)
本工序是通过对式(8c)的化合物使用公知的有机化学方法进行与式(4c)的化合物的缩合反应来制造式(3)的化合物的工序。依照B法B－4工序记载的方法得到化合物(3)。
C’法
本发明的抗体药物偶联物中使用的(3’)所示的偶联前体可以依照以下所述的C’法进行制造。
Figure BDA0003831863160000781
本制造法是用于制造在L1的任意位置取代有羟基的情况的偶联前体(3’)的方法。
Figure BDA0003831863160000791
(C’－1工序)
本工序是通过对式(1c’)的化合物使用公知的有机化学方法连续进行水解反应和氰基乙基的除去来制造式(2c’)的化合物的工序。依照A法A－1工序记载的方法得到化合物(2c’)。
(C’－2工序)
本工序是对式(2c’)的化合物使用公知的有机化学方法除去羟基的保护基来制造式(3c’)的化合物的工序。依照A法A－2工序记载的方法得到化合物(3c’)。
(C’－3工序)
本工序是通过对式(3c’)的化合物使用公知的有机化学方法连续进行与式(4c’)的化合物的偶联反应以及所得到的偶联体的硫化反应或氧化反应来制造式(5c’)的化合物的工序。依照A法A－3工序或A”法A”－3工序记载的方法得到化合物(5c’)。
(C’－4工序)
本工序是对式(5c’)的化合物使用公知的有机化学方法除去羟基的保护基来制造式(6c’)的化合物的工序。依照A法A－4工序记载的方法得到化合物(6c’)。
(C’－5工序)
本工序是对式(6c’)的化合物使用公知的有机化学方法连续进行环化反应和硫化反应或氧化反应来制造式(7c’)的化合物的工序。依照A法A－5工序或A’法A’－5工序记载的方法得到化合物(7c’)。
(C’－6工序)
本工序是对式(7c’)的化合物使用公知的有机化学方法同时除去氰基乙基以及全部的酰基系保护基来制造式(8c’)的化合物的工序。依照A法A－6工序记载的方法得到化合物(8c’)。
(C’－7工序)
本工序是对式(8c’)的化合物使用公知的有机化学方法同时除去全部的甲硅烷基系保护基来制造式(9c’)的化合物的工序。在PRO9为2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基的情况下，在5℃～100℃下，优选在35℃～60℃下用四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液处理化合物(8c’)，由此除去2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基。相对于化合物(8c’)1摩尔，四丁基氟化铵使用过量摩尔，优选使用10～30摩尔。反应时间为1小时～48小时，优选为4小时～24小时。在反应液中加入缓冲液稀释后，根据需要将有机溶剂成分在减压下蒸馏除去。将残留物用制备型HPLC[缓冲液/乙腈、缓冲液/甲醇等]、C18硅胶柱色谱法[缓冲液/乙腈、缓冲液/甲醇等]或它们的组合进行精制，得到化合物(9c’)。
(C’－8工序)
本工序是通过对式(9c’)的化合物使用公知的有机化学方法进行与式(4c)的化合物的缩合反应来制造式(3’)的化合物的工序。依照B法B－4工序记载的方法得到化合物(3’)。
D法：糖链重构抗体的制造
糖链重构抗体可以根据例如WO2018/003983等所述的方法用下式所示的方法进行制造。
Figure BDA0003831863160000811
(D－1工序)
本工序是对目标抗体使用公知的酶反应，利用水解将与抗体的氨基酸序列第297位的天冬酰胺结合的N结合型糖链(N297结合糖链)的还原末端壳二糖结构的GlcNAcβ1－4GlcNAc之间的糖苷键切断，来制造糖链切断抗体的工序。在缓冲液(磷酸缓冲液等)中，在0℃～40℃下，使用野生型EndoS酶等水解酶对目标抗体(1d)(10mg/mL)实施还原末端的壳二糖结构的GlcNAcβ1与4GlcNAc之间的糖苷键的水解反应。反应时间为10分钟～72小时，优选为1小时～6小时。相对于抗体(1d)100mg，野生型EndoS酶使用0.1mg～10mg、优选使用0.1mg～3mg。反应结束后，用亲和色谱(HiTrap rProtein A FF(5ml)(GE HEALTH CARE制))和/或羟基磷灰石柱(Bio－Scale Mini CHT Type I管(5ml)(BIO－RAD制))进行精制，得到(Fucα1，6)GlcNAc抗体(2d)。
(D－2工序)
本工序是使用公知的酶反应，使具有包含叠氮基的PEG连接子的SG型或MSG(MSG1、MSG2)型糖链恶唑啉体(以下称为“叠氮基糖链恶唑啉体”)与D－1工序中得到的(Fucα1，6)GlcNAc抗体(2d)结合，制造糖链重构抗体(3d)的工序。
在缓冲液(磷酸缓冲液等)中，在0℃～40℃下，在EndoS(D233Q/Q303L)等糖基转移酶存在下，使抗体(2d)与叠氮基糖链恶唑啉体反应来实施糖链转移反应。反应时间为10分钟～72小时，优选为1小时～6小时。相对于抗体100mg，EndoS酶(D233Q/Q303L)使用1mg～10mg，优选使用1mg～3mg，叠氮基糖链恶唑啉体使用2当量～过量当量，优选使用4当量～20当量。反应结束后，用亲和色谱(HiTrap rProtein A FF(5ml)(GE HEALTH CARE制))以及羟基磷灰石柱(Bio－Scale Mini CHT Type I管(5ml)(BIO－RAD制))进行精制，得到糖链重构抗体(3d)。
在上述的糖链重构抗体的制备中，抗体水溶液的浓缩、浓度测定、以及缓冲液交换可以依照后述的共通操作A～C来进行。
需要说明的是，SG型的叠氮基糖链恶唑啉体根据WO2018/003983所述的方法进行合成。作为一个例子，将[N3－PEG(3)]2－SG(10)－Ox(WO2018/003983所述的化合物1－10)的合成方法示于下式。
Figure BDA0003831863160000831
MSG型的叠氮基糖链恶唑啉体也根据WO2018/003983所述的方法进行合成。作为一个例子，将[N3－PEG(3)]－MSG1(9)－Ox(WO2018/003983所述的化合物1－11)的合成方法示于下式。
Figure BDA0003831863160000841
E法：抗体与药物的偶联(糖链偶联1)
Figure BDA0003831863160000851
(在此，抗体药物偶联物(1e)的左侧的两个星号(*)表示右侧的星号所示的药物连接子部分。)
本制造法是使D法D－2工序中得到的糖链重构抗体(3d)与B法B－4工序中得到的偶联前体(2)通过SPAAC(应力促进的叠氮-炔烃的环化加成反应strain-promoted azide-alkyne cycloaddition：J.Am.Chem.Soc.2004，126，15046－15047)反应而结合，制造抗体药物偶联物(1e)的方法。
(E－1工序)
通过将糖链重构抗体(3d)的缓冲溶液(磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、硼酸缓冲液等)与在适当的溶剂(二甲基亚砜、N，N－二甲基甲酰胺、N，N－二甲基乙酰胺、N－甲基吡咯烷酮、丙二醇或它们的混合溶剂)中溶解偶联前体(2)而得到的溶液混合，实施SPAAC反应。相对于糖链重构抗体(3d)1摩尔，偶联前体(2)为2摩尔～过量摩尔，优选为4摩尔～30摩尔，相对于抗体的缓冲溶液，有机溶剂的比率优选为1％～200％(v/v)。反应温度为0℃～37℃，优选为15℃～25℃，反应时间为1小时～150小时，优选为6小时～72小时。反应溶液的pH优选为5～9。将反应溶液依照后述的共通操作D所述的方法进行精制，得到抗体药物偶联物(1e)。
E’法：抗体与药物的偶联(半胱氨酸偶联)
具有半胱氨酸偶联的本发明的抗体药物偶联物可以使用根据参考例3等制备的目标抗体与B’法B－8工序中得到的具有马来酰亚胺基的偶联前体(2’)，根据WO2014/057687等所述的方法进行制造。
E”法：抗体与药物的偶联(糖链偶联2)
在E法中，将偶联前体(2)变为C’法C’－8工序中得到的偶联前体(3’)，由此得到下式所示的抗体药物偶联物(1e”)。
Figure BDA0003831863160000861
(在此，抗体药物偶联物(1e”)的左侧的两个星号(*1)表示右侧的星号所示的药物连接子部分。)
对于抗体药物偶联物，可以通过后述的共通操作D～G进行缓冲液交换、精制、抗体浓度的测定以及每一分子抗体的药物平均结合数的测定，进行抗体药物偶联物的鉴定。
共通操作A：抗体水溶液的浓缩
在Amicon(注册商标)Ultra离心式过滤器装置(50000NMWL，Merck MilliporeLtd.)中加入抗体或抗体药物偶联物溶液，通过使用离心机(Allegra X－15R，BeckmanCoulter，Inc.)的离心操作(在2000G～4000G下离心5分钟～20分钟)，对抗体和抗体药物偶联物溶液进行浓缩。
共通操作B：抗体的浓度测定
使用UV测定器(Nanodrop 1000，Thermo Fisher Scientific，Inc.)，根据制造商规定的方法进行抗体浓度的测定。此时，按每种抗体使用不同的280nm吸光系数(1.3mLmg－ 1cm－1～1.8mLmg－1cm－1)。
共通操作C：抗体的缓冲液交换
在抗体水溶液中加入缓冲液(磷酸缓冲生理食盐水(pH6.0)、磷酸缓冲液(pH6.0)等)，依照共通操作A所述的方法进行浓缩。进行几次该操作后，依照共通操作B所述的方法测定抗体浓度。在该抗体缓冲溶液中适当加入缓冲液(磷酸缓冲生理食盐水(pH6.0)、磷酸缓冲液(pH6.0)等)来制备目标浓度(例如，约10mg/mL)的抗体缓冲溶液。
共通操作D：抗体药物偶联物的精制(凝胶过滤色谱)
用乙酸缓冲液(10mM乙酸盐缓冲液，5％山梨糖醇，pH5.5；本说明书中称为ABS)或其他的适当的缓冲液使NAP柱(NAP－5，NAP－10，NAP－25(GE HEALTH CARE制))平衡化。在该NAP柱中装填抗体药物偶联物反应溶液，使制造商规定量的缓冲液自然流下，分取出抗体组分。将该组分再次装填到NAP柱中，使制造商规定量的缓冲液自然流下，分取出抗体组分。反复进行合计2次～3次该操作，由此得到除去了未结合的药物连接子、二甲基亚砜、丙二醇的抗体药物偶联物。根据需要通过共通操作A以及C调节抗体药物偶联物溶液的浓度。
共通操作E：抗体药物偶联物的抗体浓度以及每一分子抗体的药物平均结合数的测定(UV法)
抗体药物偶联物的结合药物浓度可以通过使用吸光光度计(UV/VISSpectrometer Lambda 25，PerkinElmer，Inc.)测定抗体药物偶联物水溶液的280nm以及250nm这两个波长下的吸光度后，进行下述的计算来计算出。某一波长下的总吸光度等于体系内存在的全部的吸收化学物种的吸光度之和(吸光度的加成性)，因此若假定为抗体与药物的偶联前后，抗体以及药物的摩尔吸光系数没有变化，则抗体药物偶联物的抗体浓度以及药物浓度如下述关系式所示。
A280＝AD，280+AA，280＝εD，280CD+εA，280CA 式(I)
A250＝AD，250+AA，250＝εD，250CD+εA，250CA 式(II)
在此，A280表示280nm下的抗体药物偶联物水溶液的吸光度，A250表示250nm下的抗体药物偶联物水溶液的吸光度，AA，280表示280nm下的抗体的吸光度，AA，250表示250nm下的抗体的吸光度，AD，280表示280nm下的偶联物前体的吸光度，AD，250表示250nm下的偶联物前体的吸光度，εA，280表示280nm下的抗体的摩尔吸光系数，εA，250表示250nm下的抗体的摩尔吸光系数，εD，280表示280nm下的偶联物前体的摩尔吸光系数，εD，250表示250nm下的偶联物前体的摩尔吸光系数，CA表示抗体药物偶联物中的抗体浓度，CD表示抗体药物偶联物中的药物浓度。在此，εA，280、εA，250、εD，280、εD，250可以使用事先准备的值(计算推定值或实测值)。例如，εA，280可以由抗体的氨基酸序列通过已知的计算方法(Protein Science，1995，vol.4，2411－2423)推定。εA，250使用由根据抗体的UV测定得到的实测值和εA，280的推定值计算出的值。在实施例中，抗TROP2抗体1的摩尔吸光系数使用εA，280＝223400以及εA，250＝63482。抗TROP2抗体2的摩尔吸光系数使用εA，280＝223400以及εA，250＝69027或71411。抗CD70抗体1的摩尔吸光系数使用εA，280＝226380以及εA，250＝73432。抗CD70抗体2的摩尔吸光系数使用εA，280＝212400以及εA，250＝72355。抗EGFR抗体1的摩尔吸光系数使用εA，280＝203460以及εA，250＝62692。抗EGFR抗体2的摩尔吸光系数使用εA，280＝217440以及εA，250＝75731。εD，280以及εD，250可以通过测定将所使用的偶联物前体溶解成某一摩尔浓度的溶液的吸光度，根据朗伯比尔定律(Lambert－Beerlaw)(吸光度＝摩尔浓度×摩尔吸光系数×单元光程长度)得到。实施例中的偶联物前体的摩尔吸光系数每次都通过UV测定得到。可以测定抗体药物偶联物水溶液的A280以及A250，将这些值代入式(I)以及(II)解开联立方程式，求出CA以及CD。进而可以通过将CD除以CA来求出每一分子抗体的药物平均结合数。
共通操作F：抗体药物偶联物中的抗体浓度以及每一分子抗体的药物平均结合数的测定(反相高效液相色谱法：RP－HPLC)
抗体药物偶联物中的抗体浓度以及每一分子抗体的药物平均结合数除了上述的共通操作E以外，还可以通过使用以下的方法的高效液相色谱分析来求出。
[F－1.HPLC分析用样品的制备(抗体药物偶联物的还原)]
将抗体药物偶联物溶液(约1mg/mL、60μL)与二硫苏糖醇(DTT)水溶液(100mM、15μL)混合。将混合物在37℃下保温(incubate)30分钟，将抗体药物偶联物的L链以及H链之间的二硫键切断。将该反应溶液直接用于HPLC分析。
[F－2.HPLC分析]
代表性的分析条件如下所述。
HPLC系统：Agilent 1290HPLC系统(Agilent Technologies)
检测器：紫外吸光度计(测定波长：280nm)
柱：Acquity BEH Phenyl(2.1×50mm、1.7μm、Waters制)
柱温：75℃
流速：0.8mL/min
样品注入量：10μL
流动相A：0.1％三氟乙酸(TFA)，15％异丙醇水溶液
流动相B：0.075％TFA，15％异丙醇乙腈溶液
梯度程序(流动相B)：14％－36％(0分钟－15分钟)，36％－80％(15－17分钟)，80％－14％(17分钟―17.1分钟)，14％－14％(17.1分钟―23分钟)
[F－3.数据解析]
〔F－3－1〕在SPAAC反应下的糖链偶联的情况下，相对于未结合药物的抗体的L链(L0)以及H链(H0)，结合了药物的H链(结合了一个药物的H链：H1、结合了两个药物的H链：H2)与所结合的药物的数量成比例地疏水性增加，保留时间变长，因此原则上依照L0、H0、H1、H2的顺序被洗脱。通过比较与L0以及H0的保留时间，可将检测峰分配为L0、H0、H1、H2中的任一者。半胱氨酸偶联的情况也同样，结合了药物的L链(结合了一个药物的L链：L1)和结合了药物的H链(结合了一个药物的H链：H1、结合了两个药物的H链：H2、结合了三个药物的H链：H3)与所结合的药物的数量成比例地疏水性增加，保留时间变长，因此原则上依照L0、L1、H0、H1、H2、H3的顺序被洗脱。通过比较与L0以及H0的保留时间，可将检测峰分配为L0、L1、H0、H1、H2、H3中的任一者。
〔F－3－2〕由于药物连接子具有UV吸收，因此在SPAAC反应下的糖链偶联的情况下，根据药物连接子的结合数使用H链以及药物连接子的摩尔吸光系数并依照下式进行峰面积的修正。在L链也结合有药物的半胱氨酸偶联的情况下，对L链也同样地进行峰面积的修正。
Figure BDA0003831863160000901
在此，各抗体的L链以及H链的摩尔吸光系数(280nm)使用由共通操作E记载的已知的计算方法计算出的推定值。在抗TROP2抗体1以及抗TROP2抗体2的情况下，L链的摩尔吸光系数使用27702，H链的摩尔吸光系数使用83998。在抗CD70抗体1的情况下，L链的摩尔吸光系数使用30222，H链的摩尔吸光系数使用82968。在抗CD70抗体2的情况下，L链的摩尔吸光系数使用30222，H链的摩尔吸光系数使用75978。在抗EGFR抗体1的情况下，L链的摩尔吸光系数使用23232，H链的摩尔吸光系数使用78498。在抗EGFR抗体2的情况下，L链的摩尔吸光系数使用30222，H链的摩尔吸光系数使用78498。药物连接子的摩尔吸光系数(280nm)在SPAAC反应下的糖链偶联的情况下，使用偶联前体的实测值，在半胱氨酸偶联的情况下，使用使偶联前体在巯基乙醇或N－乙酰半胱氨酸中反应而将马来酰亚胺基转换为琥珀酰亚胺硫醚而成的化合物的实测值。
〔F－3－3〕依照下式计算相对于峰面积修正值合计的各链峰面积比(％)。
Figure BDA0003831863160000902
〔F－3－4〕依照下式计算抗体－药物偶联物的每一分子抗体的药物平均结合数(DAR)。
Figure BDA0003831863160000903
〔F－3－5〕依照下式计算抗体－药物偶联物中的抗体浓度。
Figure BDA0003831863160000904
在此，抗体药物复合体的吸光度(280nm)使用抗体药物偶联物水溶液的实测值。稀释倍数表示测定吸光度时将抗体药物偶联物水溶液稀释几倍，通常稀释4倍。抗体的摩尔吸光系数(280nm)使用由共通操作E记载的已知的计算方法计算出的推定值。药物平均结合数使用〔F－3－4〕中得到的值。药物连接子的摩尔吸光系数(280nm)在SPAAC反应下的糖链偶联的情况下，使用偶联前体的实测值，在半胱氨酸偶联的情况下，使用使偶联前体在巯基乙醇或N－乙酰半胱氨酸中反应而将马来酰亚胺基转换为琥珀酰亚胺硫醚而成的化合物的实测值。
共通操作G：抗体药物偶联物中的抗体浓度以及每一分子抗体的药物平均结合数的测定(疏水性相互作用－高效液相色谱法：HI－HPLC)
抗体药物偶联物中的抗体浓度以及每一分子抗体的药物平均结合数除了上述共通操作E以及F以外，还可通过使用以下的方法的高效液相色谱分析求出。
[G－1.HPLC分析用样品的制备]
将抗体药物偶联物溶液(约1mg/mL、60μL)直接用于HPLC分析。
[G－2.HPLC分析]
代表性的分析条件如下述两种。
HPLC系统：SHIMADZU CBM－20A(岛津制作所)
检测器：紫外吸光度计(测定波长：280nm)
柱：TSK－gel Butyl－NPR(4.6×100mm，2.5μm，TOSOH制)
柱温：25℃附近的固定温度
流动相A：含有1.5M硫酸铵的25mM磷酸缓冲液(pH＝7.0)
流动相B：25mM磷酸缓冲液(pH＝7.0)/异丙醇混合液(3：1)
流速：0.8mL/min
样品注入量：15μL
梯度程序(流动相B)：10％－15％(0分钟－5分钟)，15％－65％(5分钟－20分钟)
或，HPLC系统：SHIMADZU CBM－20A(岛津制作所)
检测器：紫外吸光度计(测定波长：280nm)
柱：PolyPROPYL A(4.6×100mm，3μm，
Figure BDA0003831863160000923
PolyLC制)
柱温：40℃附近的固定温度
流动相A：含有1.5M硫酸铵的20mM磷酸缓冲液(pH＝7.4)
流动相B：20mM磷酸缓冲液(pH＝7.4)
流速：0.8mL/min
样品注入量：15μL
梯度程序(流动相B)：40％－80％(0分钟－20分钟)
[G－3.数据解析]
〔G－3－1〕与抗体结合的药物的数量成比例地疏水性增加，保留时间变长，因此在SPAAC反应下的糖链偶联的情况下，原则上按照DAR＝0、DAR＝2、DAR＝4的顺序被洗脱。通过比较与DAR＝0的保留时间，可将检测峰分配为DAR＝2以及DAR＝4中的任一者。有时也取决于抗体、药物连接子的种类，而检测出DAR＝1以及DAR＝3的峰。检测峰的DAR也有以HI－HPLC分离出该峰后，测定质谱来推定的情况。
〔G－3－2〕由于药物连接子具有UV吸收，因此根据药物连接子的结合数，使用抗体以及药物连接子的摩尔吸光系数并依照下式进行峰面积值的修正。
Figure BDA0003831863160000921
在此，抗体的摩尔吸光系数(280nm)使用由共通操作E记载的已知的计算方法计算出的推定值。药物连接子的摩尔吸光系数(280nm)使用偶联前体的实测值。
〔G－3－3〕依照下式计算相对于峰面积修正值合计的抗体峰面积比(％)。
Figure BDA0003831863160000922
〔G－3－4〕依照下式计算抗体－药物偶联物的每一分子抗体的药物平均结合数。
Figure BDA0003831863160000931
〔G－3－5〕抗体－药物偶联物中的抗体浓度按照〔F－3－5〕所述的算式计算。此时，药物平均结合数使用〔G－3－4〕中得到的值。
本发明的抗体药物偶联物或其制造中间体有时也存在立体异构体或者来自不对称碳原子的光学异构体、几何异构体、互变异构体或d型、l型、阻转异构体(atropisomer)等光学异构体，这些异构体、光学异构体以及它们的混合物均包含在本发明中。
本发明的抗体药物偶联物中，药物与一分子抗体的结合数是影响其有效性、安全性的重要因素。抗体药物偶联物的制造是规定反应的原料/试剂的使用量等反应条件以使药物的结合数成为固定数量而实施的，但与低分子化合物的化学反应不同，通常得到结合有不同数量的药物的混合物。药物与一分子抗体的结合数可以平均值、即平均药物结合数(DAR)来确定。环状二核苷酸衍生物与抗体分子的结合数可以控制，作为每个抗体的药物平均结合数，可以结合1～10个的范围的环状二核苷酸衍生物，优选1～8个，更优选1～5个。
本发明的抗体药物偶联物中，在抗体Ab从抗体Ab的经重构的糖链与L结合的情况下，抗体药物偶联物的每一分子抗体的药物结合数m2为整数1或2。在该糖链为N297糖链，糖链为N297－(Fuc)SG的情况下，m2为2，DAR为3～5的范围(优选为3.2～4.8的范围，更优选为3.5～4.2的范围)。在N297糖链为N297－(Fuc)MSG1、N297－(Fuc)MSG2或N297－(Fuc)MSG1与N297－(Fuc)MSG2的混合物的情况下，m2为1，DAR为1～3的范围(优选为1.0～2.5的范围，更优选为1.2～2.2的范围)。
需要说明的是，本领域技术人员可以根据本申请实施例的记载来设计使抗体与所需数量的药物结合的反应，可以获得控制了环状二核苷酸衍生物的结合数的抗体。
需要说明的是，本发明的抗体药物偶联物或其制造中间体通过放置于大气中或者进行重结晶，吸收水分，有时会附着吸附水或者形成水合物，这样的含水的化合物和盐也包含在本发明中。
在本发明的抗体药物偶联物或其制造中间体具有氨基等碱性基团的情况下，可以根据需要制成医药上可接受的盐。作为这样的盐，可列举出例如盐酸盐、氢碘酸盐等氢卤酸盐；硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐；甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐等低级烷烃磺酸盐；苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐等芳基磺酸盐；甲酸、乙酸、苹果酸、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等有机酸盐；以及鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐等氨基酸盐。
就本发明的抗体药物偶联物而言，在其结构中包含磷酸基和/或硫代磷酸基，因此通常可以形成碱加成盐。此外，在其制造中间体具有羧基等酸性基团的情况下，通常也可以形成碱加成盐。作为医药上可接受的盐，可列举出例如钠盐、钾盐、锂盐等碱金属盐；钙盐、镁盐等碱土金属盐；铵盐等无机盐；二苄胺盐、吗啉盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N－甲基葡萄糖胺盐、二乙胺盐、三乙胺盐、环己胺盐、二环己胺盐、N，N’－二苄基乙二胺盐、二乙醇胺盐、N－苄基－N－(2－苯基乙氧基)胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、三(羟基甲基)氨基甲烷盐等有机胺盐等。
本发明的抗体药物偶联物及其制造中间体有时通过吸收空气中的水分等而以水合物的形式存在。作为本发明的溶剂合物，只要是医药上可接受的，就没有特别限定，具体而言，优选为水合物、乙醇合物、2－丙醇合物等。此外，在本发明的抗体药物偶联物及其制造中间体中存在氮原子的情况下，可以形成N－氧化物体，这些溶剂合物以及N－氧化物体也包含在本发明的范围内。此外，在本发明的抗体药物偶联物及其制造中间体存在硫原子的情况下，也可形成亚砜体，这些溶剂合物以及亚砜体也包含在本发明的范围内。
此外，本发明也包括被各种放射性或非放射性同位素标记的化合物。构成本发明的抗体药物偶联物及其制造中间体的原子的一个以上也可含有原子同位素的非天然比例。作为原子同位素，例如可列举出氘(2H)、氚(3H)、碘－125(125I)或碳－14(14C)等。此外，本发明化合物也可例如被氚(3H)、碘－125(125I)或碳－14(14C)之类的放射性同位素进行放射性标记。被放射性标记的化合物作为治疗或预防剂、研究试剂(例如分析试剂)、以及诊断剂(例如体内诊断显像剂)是有用的。本发明的抗体药物偶联物的所有同位素变体无论是否为放射性，都包含在本发明的范围内。
＜4.医药＞
本发明的抗体药物偶联物对癌细胞显示出抗肿瘤免疫活性或细胞毒性，因此可用作医药，特别是针对癌症的治疗剂和/或预防剂、或抗肿瘤剂。
作为本发明的抗体药物偶联物适用的癌症的种类，可列举出肺癌(非小细胞肺癌、小细胞肺癌等)、肾癌、尿路上皮癌、大肠癌、前列腺癌、多形性神经胶质母细胞瘤、卵巢癌(表层上皮性肿瘤、间质性肿瘤、生殖细胞肿瘤等)、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、子宫体癌、睾丸癌(精原细胞瘤、非精原细胞瘤)、宫颈癌、胎盘绒毛膜癌、脑肿瘤、头颈癌、甲状腺癌、间皮瘤、胃肠道间质瘤(Gastrointestinal Stromal Tumor，GIST)、胆囊癌、胆管癌、肾上腺癌、咽癌、舌癌、听觉器官癌、胸腺癌、小肠癌、鳞状细胞癌、白血病、恶性淋巴瘤、浆细胞瘤、骨髓瘤、肉瘤等，关于抗体药物偶联物，只要为作为治疗对象的癌细胞中表达抗体药物偶联物中的抗体能够识别的蛋白质的癌细胞，就并不限定于此。
本发明的抗体药物偶联物可对哺乳动物适宜地给药，哺乳动物更优选为人。
作为含有本发明的抗体药物偶联物的医药组合物中使用的物质，在给药量、给药浓度方面，可以从本领域中通常使用的制剂添加物等中适当选择而使用。
本发明的抗体药物偶联物能以包含一种以上的药学相容性成分的医药组合物的形式给药。例如，上述医药组合物代表性地包含一种以上的药学载体(例如，灭菌后的液体(例如包含水和油(源自石油、动物、植物、或合成的油(例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等))))。在上述医药组合物静脉给药的情况下，水是更具有代表性的载体。食盐水溶液、以及葡萄糖水溶液和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别可以用于注射用溶液。适当的药学赋形剂为本领域中公知的。根据需要，上述组合物还可以包含微量的湿润剂或者乳化剂、或pH缓冲剂。适当的药学载体的例子记载于E.W.Martin的“Remington’s PharmaceuticalSciences”中。其处方对应于给药方式。
各种传递系统是公知的，可以用于本发明的抗体药物偶联物的给药。作为导入方法，可列举出皮内、肌内、腹腔内、静脉内、以及皮下途径，但并不限定于此。给药例如可以通过注入或弹丸式注射(bolus injection)进行。在特定的优选的实施方式中，上述抗体药物偶联物的给药通过注入进行。非消化道给药(parenteral administration)是优选的给药途径。
在代表性实施方式中，包含上述抗体药物偶联物的医药组合物根据常规的步骤设计适合于对人静脉给药的医药组合物的处方。代表性地用于静脉给药的组合物为灭菌的等渗性水性缓冲液中的溶液。在必要的情况下，上述医药还可以包含增溶剂和用于缓和注射部位疼痛的局部麻醉剂(例如利多卡因)。通常，上述成分例如以显示活性剂的量的安瓿或药囊(Sachet)等经密封而封口的容器中的干燥冻干粉末或无水浓缩物的形式分开供给，或在单位剂型中一起混合供给。在预定上述医药组合物通过注入给药的情况下，可以通过例如包含灭菌的制药级的水或食盐水的注入瓶来给药。在通过注射给药上述医药的情况下，注射用灭菌水或食盐水的安瓿可以例如可在给药前混合上述成分的方式提供。上述医药组合物有时以溶液的形式提供。
本发明的医药组合物可以为仅包含本发明的抗体药物偶联物的医药组合物，也可以为包含本发明的抗体药物偶联物及其他癌治疗剂的医药组合物。本发明的抗体药物偶联物可以与其他癌治疗剂一起给药或组合给药，由此可增强抗肿瘤效果。出于这样的目的而使用的其他癌治疗剂可以与抗体药物偶联物同时、分开或连续地给药至个体，也可以改变各自的给药间隔进行给药。作为这样的癌治疗剂，可列举出：代谢拮抗剂、烷化剂、微管抑制剂等化学疗法剂(白蛋白结合型紫杉醇(abraxane)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、吉西他滨(gemcitabine)、伊立替康(irinotecan)(CPT－11)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、培美曲塞(pemetrexed)、长春花碱(vinblastine)或国际公开第WO2003/038043号小册子中记载的药剂等)、激素调整药(作为LH－RH类似物的亮丙瑞林等、戈舍瑞林、雌莫司汀、作为雌性激素拮抗药的他莫昔芬、雷洛昔芬等)、芳香化酶抑制剂(阿那曲唑、来曲唑、依西美坦等)、激酶抑制剂、PARP抑制剂、骨破坏抑制剂、骨形成促进剂、转移抑制剂、分子靶点药(抗EGFR抗体、抗VEGF抗体、抗VEGFR抗体等)、免疫检查点抑制剂(作为抗PD―1抗体的纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)等、作为抗PD－L1抗体的阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)等、抗PD－L2抗体、作为抗CTLA4抗体的伊匹单抗(ipilimumab)等、抗A2aR抗体、A2a受体拮抗剂、抗LAG3抗体、抗TIM3抗体等)、抗控制性T细胞药(抗CTLA4抗体、抗CD25抗体、抗GITR抗体、抗GARP抗体、抗TIGIT抗体、抗CCR8抗体等)、免疫活化剂(抗4－1BB抗体、抗OX40抗体、抗CD40抗体、抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL－2类似物、细胞因子、TLR激动剂等)、免疫调节剂(抗CD47抗体、抗SIRPα抗体、抑制性骨髓调整剂等)、具有ADCC(AntibodyDependent Cellular Cytotoxicity)活性、ADCP(Antibody Dependent CellularPhagocytosis)活性或补体活性的抗体医药、BiTE(Bi－specific T－cell engagers)、Antibody－Drug－Conjugate(ADC)(例如，包含Deruxtecan、DM1、Pyrrolobenzodiazepine、MMAF等的药剂偶联物(抗HER2―ADC、抗TROP2―ADC、抗HER3―ADC等))、组合了光动力疗法的ADC等、以及抗肿瘤疫苗、抗肿瘤细胞治疗(CAR－T、TCR－T、树突状细胞、NK细胞等)、抗肿瘤细菌治疗、抗肿瘤病毒治疗等，只要是具有抗肿瘤活性的药剂就没有限定。进而，本发明的抗体药物偶联物也可以与本发明以外的其他抗体药物偶联物一起给药，由此可以增强抗肿瘤效果。此外，本发明的抗体药物偶联物不仅可以通过与药物，还可以通过与带来抗肿瘤效果的治疗，例如放射线、重粒子射线、外科手术、骨髓移植等的并用来增强抗肿瘤效果，只要是具有抗肿瘤效果的治疗就没有限定。
这样的医药组合物制剂成冻干制剂或者液态制剂作为具有所选择的组成和所需的纯度的制剂即可。在制剂成冻干制剂时，可以为包含本领域中使用的适当的制剂添加物的制剂。此外，同样液态制剂可以制剂成包含本领域中使用的各种制剂添加物的液态制剂。
医药组合物的组成以及浓度也根据给药方法而变化，就本发明的医药组合物中所含的抗体药物偶联物而言，在抗体药物偶联物对抗原的亲和性，即对于抗原的解离常数(Kd值)方面，亲和性越高(Kd值越低)，即使是少量的给药量也可以发挥药效。因此，在决定抗体药物偶联物的给药量时，也可以基于抗体药物偶联物与抗原的亲和性状况设定给药量。本发明的抗体药物偶联物对人给药时，例如，将约0.001～100mg/kg一次给药或者以1～180天一次的间隔多次给药即可。
以下通过实施例对本发明进行说明，但本发明并不限定于此。
实施例
以下的实施例中，室温表示15℃～35℃。脱水乙腈使用由关东化学销售的乙腈(脱水)－Super－或由和光纯药工业销售的乙腈(超脱水)。吡啶使用由关东化学销售的吡啶(脱水)－Super－。硅胶色谱使用Biotage SNAP Ultra(Biotage制)、Chromatorex Q－PackSI(富士Silysia制)或Purif－Pack－Ex SI(昭光Science制)来实施。DIOL硅胶柱色谱法使用Chromatorex Q－pack DIOL(富士Silysia制)来实施。C18硅胶柱色谱法使用BiotageSNAP Ultra C18(Biotage制)来实施。柱色谱的洗脱在基于薄层色谱(TLC)的观察下进行。用于洗脱溶剂的0.1％三乙胺是指洗脱溶剂总容量中含有0.1％的三乙胺。制备型HPLC使用SHIMADZU SPD－M10A HPLC系统(岛津制作所)等来实施。制备柱使用Kinetex(5μm，C18，
Figure BDA0003831863160000981
250×30.0mm，Phenomenex制)或Kinetex(5μm，C18，
Figure BDA0003831863160000982
250×21.2mm，Phenomenex制)。
各种光谱数据的测定使用以下的设备。1H－NMR光谱使用JEOL ECS－400(400MHz)、Varian 400－MR(400MHz)或Varian Unity Inova 500(500MHz)进行测定。31P－NMR光谱使用JEOL ECS－400(160MHz)进行测定。质谱使用Agilent 6130Quadrupole LC/MS系统(Agilent Technologies)进行测定。LC/MS的测定在以下的条件下实施[柱：DevelosilCombi－RP，5μm，50×2.0mm(野村化学制)，流动相：0.1％甲酸乙腈溶液/0.1％甲酸水溶液、0.1％甲酸乙腈溶液：2％－100％(0分钟－5分钟或0分钟－10分钟)]。
实施例1：CDN6的合成
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aS，16R)－15，16－二羟基－7－[1－(2－羟基乙基)－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基]－2，10－双(巯基)－14－(6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－二酮
Figure BDA0003831863160000991
[合成路径]
Figure BDA0003831863160000992
Figure BDA0003831863160001001
(工序1)
7－{2－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]－3，5－O－(二叔丁基次甲硅烷基)－β－D－呋喃核糖基}－5－碘基－7H－吡咯并[2，3－d]嘧啶－4－胺
在文献已知(Tetrahedron 2007，63，9850－9861)的5－碘代杀结核菌素(1.0g)的N，N－二甲基甲酰胺(10mL)溶液中，在0℃下缓慢滴加二叔丁基甲硅烷基双(三氟甲磺酸酯)(1.24mL)后，在相同温度下搅拌30分钟。在0℃下加入咪唑(868mg)后，升温至室温搅拌30分钟。在室温下加入叔丁基二甲基氯硅烷，在相同温度下搅拌一整夜。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，停止反应后，用乙酸乙酯进行萃取。将有机层用饱和食盐水进行清洗后，用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯]进行精制，得到标题化合物(910mg)。
MS(ESI)m/z：647(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.25(1H，s)，7.03(1H，s)，6.10(1H，s)，5.63(2H，brs)，4.49－4.44(2H，m)，4.26(1H，dd，J＝9.7，4.8Hz)，4.17(1H，m)，4.00(1H，t，J＝9.7Hz)，1.09(9H，s)，1.04(9H，s)，0.91(9H，s)，0.13(3H，s)，0.11(3H，s).
(工序2)
7－{2－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]－3，5－O－(二叔丁基次甲硅烷基)－β－D－呋喃核糖基}－5－(3，3－二乙氧基丙－1－炔－1－基)－7H－吡咯并[2，3－d]嘧啶－4－胺
在上述工序1所得到的化合物(910mg)的N，N－二甲基甲酰胺(3.0mL)－四氢呋喃(9.0mL)混合溶液中依次加入炔丙醛二甲基缩醛(1.01mL)、三乙胺(0.392mL)、四(三苯基膦)钯(0)(163mg)、以及碘化铜(I)(53.6mg)，在40℃下搅拌18小时。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯，用乙酸乙酯进行萃取。将有机层用饱和食盐水进行清洗后，用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯]进行精制，得到标题化合物(878mg)。
MS(ESI)m/z：647(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.27(1H，s)，7.17(1H，s)，6.09(1H，s)，5.56(2H，brs)，5.50(1H，s)，4.48(1H，dd，J＝9.1，4.9Hz)，4.42(1H，d，J＝4.9Hz)，4.25(1H，dd，J＝9.4，4.6Hz)，4.17(1H，m)，4.00(1H，t，J＝9.7Hz)，3.85－3.77(2H，m)，3.66(2H，m)，1.28(6H，t，J＝7.3Hz)，1.08(9H，s)，1.04(9H，s)，0.91(9H，s)，0.13(3H，s)，0.11(3H，s).
(工序3)
2－{2－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]－3，5－O－(二叔丁基次甲硅烷基)－β－D－呋喃核糖基}－6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁
在上述工序2所得到的化合物(878mg)的乙醇(8.8mL)溶液中加入10％钯碳(M)湿式(500mg)，在氢气氛下，在室温下搅拌9小时。滤去催化剂后，用二氯甲烷进行清洗，将滤液减压浓缩。在残留物的乙酸(8.8mL)溶液中加入10％钯碳(M)湿式(500mg)，在氢气氛下、在40℃下搅拌2天。滤去催化剂后，用二氯甲烷进行清洗，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯/0.1％三乙胺]进行精制，得到标题化合物(603mg)。
MS(ESI)m/z：561(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.47(1H，brs)，8.07(1H，s)，6.70(1H，s)，6.14(1H，s)，4.47－4.43(2H，m)，4.29(1H，dd，J＝9.1，4.8Hz)，4.15(1H，m)，3.99(1H，t，J＝9.7Hz)，3.55(2H，m)，2.89(2H，t，J＝5.4Hz)，2.04(2H，m)，1.09(9H，s)，1.04(9H，s)，0.90(9H，s)，0.10(3H，s)，0.10(3H，s).
(工序4)
6－苯甲酰基－2－{2－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]－3，5－O－(二叔丁基次甲硅烷基)－β－D－呋喃核糖基}－6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁
在上述工序3所得到的化合物(2.17g)的二氯甲烷(21.7mL)溶液中，在室温下依次加入吡啶(1.56mL)、N，N－二甲基氨基吡啶(94.5mg)、以及苯甲酰氯(0.898mL)，在50℃下搅拌15小时。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，使反应停止。用二氯甲烷进行萃取后，将有机层用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯/0.1％三乙胺]进行精制，得到标题化合物(1.91g)。
MS(ESI)m/z：665(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.08(1H，s)，7.37－7.33(3H，m)，7.23(2H，t，J＝7.6Hz)，6.97(1H，s)，6.21(1H，s)，4.50－4.46(2H，m)，4.37－4.30(2H，m)，4.28－4.09(2H，m)，4.02(1H，t，J＝10.0Hz)，3.03(2H，t，J＝6.3Hz)，2.29－2.17(2H，m)，1.10(9H，s)，1.05(9H，s)，0.90(9H，s)，0.10(6H，s).
(工序5)
6－苯甲酰基－2－{5－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]－2－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]－β－D－呋喃核糖基}－6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁
在上述工序4所得到的化合物(1.91g)的二氯甲烷(15mL)溶液中，在0℃下加入所制备的氟化氢－吡啶(0.30mL)与吡啶(1.88mL)的混合液，在0℃下搅拌2小时。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液使反应停止。将反应液用二氯甲烷进行萃取后，将有机层用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物溶于吡啶(15mL)，加入4，4’－二甲氧基三苯甲基氯(1.17g)，在0℃下搅拌12小时。加入甲醇搅拌30分钟后，加入饱和碳酸氢钠水溶液使反应停止。将反应液用二氯甲烷萃取后，将有机层用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯/0.1％三乙胺]进行精制，得到标题化合物(1.98g)。
MS(ESI)m/z：827(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.07(1H，s)，7.47(2H，m)，7.37－7.19(13H，m)，6.84(4H，m)，6.37(1H，d，J＝5.5Hz)，4.75(1H，t，J＝5.2Hz)，4.38－4.20(4H，m)，3.80(6H，s)，3.53(1H，dd，J＝10.7，2.8Hz)，3.40(1H，dd，J＝11.0，3.1Hz)，2.83(1H，d，J＝3.7Hz)，2.78(2H，t，J＝6.4Hz)，2.17(2H，m)，0.81(9H，s)，－0.03(3H，s)，－0.21(3H，s).
(工序6)
6－苯甲酰基－2－(5－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]－2－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]－3－O－{(2－氰基乙氧基)[二(丙烷－2－基)氨基]膦基}－β－D－呋喃核糖基)－6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁
在上述工序5所得到的化合物(1.98g)的二氯甲烷(23.9mL)溶液中加入N，N－二异丙基乙基胺(1.02mL)和2－氰基乙基N，N－二异丙基氯亚磷酰胺(1.07mL)，在室温下搅拌15小时。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液使反应停止。将反应液用二氯甲烷进行萃取后，将有机层用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯]进行精制，得到磷原子上的非对映异构体混合物(非对映异构体比＝7：3)形式的标题化合物(2.06g)。
MS(ESI)m/z：1027(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.06(0.3H，s)，8.04(0.7H，s)，7.50－7.16(15H，m)，6.85－6.79(4H，m)，6.35(0.7H，d，J＝6.7Hz)，6.31(0.3H，d，J＝6.1Hz)，4.84(0.7H，dd，J＝7.0，4.6Hz)，4.78(0.3H，t，J＝5.8Hz)，4.43－4.17(4H，m)，4.04－3.85(1.3H，m)，3.80－3.76(6H，m)，3.69－3.43(3H，m)，3.50(0.7H，dd，J＝10.6，3.3Hz)，3.33－3.26(1H，m)，2.87－2.76(2H，m)，2.74－2.60(1.4H，m)，2.31(0.6H，t，J＝6.7Hz)，2.23－2.11(2H，m)，1.21－1.13(7.8H，m)，1.04(4.2H，d，J＝6.7Hz)，0.73(2.7H，s)，0.72(6.3H，s)，―0.03(0.9H，s)，－0.06(2.1H，s)，－0.24(3H，s).
(工序7)
6－苯甲酰基－2－{2－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]－3－O－[羟基(桥氧基)－λ5－膦基]－β－D－呋喃核糖基}－6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁
在上述工序6所得到的化合物(935mg)的乙腈(4.55mL)溶液中加入水(33μL)和三氟乙酸吡啶盐(229mg)，在室温下搅拌15分钟。在反应液中加入叔丁胺(4.55mL)，在室温下搅拌15分钟。将反应液减压浓缩后，利用乙腈(5mL)将残留物共沸2次。在残留物的二氯甲烷(11.4mL)溶液中加入水(0.164mL)后，加入二氯乙酸(0.651mL)的二氯甲烷(11.4mL)溶液，在室温下搅拌15分钟。加入吡啶(1.25mL)使反应停止后，将反应液减压浓缩。将残留物用脱水乙腈(10mL)共沸3次，最后1次残留5mL左右的乙腈。将所得到的标题化合物的乙腈溶液直接用于下述工序12。
(工序8)
2’，3’，5’－三－O－乙酰基－1－(2－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}乙基)肌苷
在市售(Ark Pharm)的2’，3’，5’－三－O－乙酰基肌苷(10.0g)的四氢呋喃(100mL)悬浮液中，加入2－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}乙烷－1－醇(5.37g)和三苯基膦(7.69g)后，加入二丙烷－2－基(E)－二氮烯－1，2－二羧酸酯(6.10mL)，在室温下搅拌6小时。将反应液减压浓缩后，将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯/二氯甲烷]进行精制，得到与三苯基膦氧化物的混合物(10.6g)形式的标题化合物。
MS(ESI)m/z：553(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.05(1H，s)，7.92(1H，s)，6.12(1H，d，J＝5.4Hz)，5.86(1H，t，J＝5.4Hz)，5.59(1H，dd，J＝5.4，4.2Hz)，4.47－4.41(2H，m)，4.38－4.31(1H，m)，4.22－4.17(2H，m)，3.89(2H，t，J＝4.8Hz)，2.15(3H，s)，2.14(3H，s)，2.08(3H，s)，0.83(9H，s)，－0.06(3H，s)，－0.06(3H，s).
(工序9)
5’－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]－1－(2－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}乙基)肌苷
在上述工序8所得到的化合物(10.6g)的四氢呋喃(30mL)－甲醇(30mL)混合溶液中加入碳酸钾(150mg)，在室温下搅拌3小时。在反应液中加入乙酸(125μL)，进行减压浓缩后，将残留物用吡啶进行共沸。在残留物的吡啶(60mL)溶液中，在0℃下加入4，4’－二甲氧基三苯甲基氯(6.50g)，搅拌30分钟后，在冰箱保管一晚。在反应液中加入甲醇(2mL)，搅拌30分钟后，进行减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯/甲醇/0.1％三乙胺]进行精制，得到与三苯基膦氧化物的混合物(7.21g)形式的标题化合物。
MS(ESI)m/z：729(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.01(1H，s)，7.97(1H，s)，7.35－7.30(2H，m)，7.25－7.17(7H，m)，6.81－6.76(4H，m)，5.95(1H，d，J＝5.4Hz)，5.13(1H，brs)，4.68－4.61(1H，m)，4.43－4.36(2H，m)，4.31－4.23(1H，m)，4.15－4.08(1H，m)，3.89(2H，t，J＝4.5Hz)，3.77(6H，s)，3.42(1H，dd，J＝10.3，3.6Hz)，3.34(1H，dd，J＝10.3，3.6Hz)，3.10(1H，brs)，0.83(9H，s)，－0.06(3H，s)，－0.07(3H，s).
(工序10)
5’－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]－3’－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]－1－(2－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}乙基)肌苷
在上述工序9所得到的化合物(7.21g)的二氯甲烷(36mL)溶液中加入咪唑(1.41g)和叔丁基(氯)二甲基硅烷(1.49g)，在室温下搅拌16小时。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷进行萃取。将有机层用无水硫酸钠进行干燥后，滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯/0.1％三乙胺]进行精制，得到标题化合物(2.17g)和标题化合物的位置异构体即5’－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]－2’－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]－1－(2－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}乙基)肌苷(2.55g)。
MS(ESI)m/z：843(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：7.99(1H，s)，7.97(1H，s)，7.43－7.39(2H，m)，7.33－7.19(7H，m)，6.83－6.77(4H，m)，5.96(1H，d，J＝4.2Hz)，4.56－4.50(2H，m)，4.33－4.25(1H，m)，4.19－4.02(2H，m)，3.89(2H，t，J＝4.8Hz)，3.78(6H，s)，3.45(1H，dd，J＝10.9，4.2Hz)，3.27(1H，dd，J＝10.9，4.2Hz)，3.03(1H，d，J＝6.0Hz)，0.88(9H，s)，0.82(9H，s)，0.07(3H，s)，－0.01(3H，s)，－0.07(3H，s)，－0.07(3H，s).
位置异构体(2’－O－TBS体)
MS(ESI)m/z：843(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：7.98(1H，s)，7.94(1H，s)，7.46－7.42(2H，m)，7.35－7.20(7H，m)，6.85－6.79(4H，m)，5.99(1H，d，J＝5.4Hz)，4.83(1H，t，J＝5.1Hz)，4.33－4.29(1H，m)，4.27－4.24(1H，m)，4.24－4.12(2H，m)，3.90(2H，t，J＝4.5Hz)，3.79(3H，s)，3.78(3H，s)，3.48(1H，dd，J＝10.3，3.0Hz)，3.40(1H，dd，J＝10.3，3.0Hz)，2.71(1H，d，J＝3.6Hz)，0.86(9H，s)，0.83(9H，s)，0.01(3H，s)，－0.07(3H，s)，－0.07(3H，s)，－0.11(3H，s).
(工序11)
5’－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]－3’－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]－1－(2－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}乙基)－2’－O－{(2－氰基乙氧基)[二(丙烷－2－基)氨基]膦基}肌苷
在上述工序10所得到的化合物(2.17g)的二氯甲烷(25.7mL)溶液中加入4，5－二氰基咪唑(334mg)和2－氰基乙基N，N，N’，N’－四异丙基亚磷酰二胺(0.980mL)，在室温下搅拌16小时。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液使反应停止。将反应液用二氯甲烷进行萃取后，将有机层用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用DIOL硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯]进行精制，得到磷原子上的非对映异构体混合物形式的标题化合物(2.65g)。
MS(ESI)m/z：1043(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.03(0.53H，s)，8.01(0.47H，s)，7.97(0.53H，s)，7.93(0.47H，s)，7.45－7.41(2H，m)，7.35－7.19(7H，m)，6.83－6.78(4H，m)，6.17(0.53H，d，J＝4.2Hz)，6.05(0.47H，d，J＝4.2Hz)，4.87－4.80(0.47H，m)，4.64－4.58(0.53H，m)，4.46－4.40(1H，m)，4.30－4.05(3H，m)，3.92－3.87(2H，m)，3.78(6H，s)，3.86－3.40(5H，m)，3.33－3.24(1H，m)，2.54(0.94H，t，J＝6.0Hz)，2.43(1.06H，t，J＝6.7Hz)，1.16－1.09(9H，m)，1.01－0.97(3H，m)，0.83(4.23H，s)，0.83(4.77H，s)，0.82(9H，s)，0.07(1.41H，s)，0.04(1.59H，s)，－0.02(3H，s)，－0.07(1.41H，s)，－0.08(1.59H，s)，－0.08(3H，s).
(工序12)
将上述工序11所得到的化合物(950mg)用脱水乙腈(5mL)共沸3次，最后1次残留3mL左右的乙腈，加入分子筛3A，1/16(团块状的5粒)。在上述工序7中制备的乙腈溶液中加入该乙腈溶液，在氮气氛下、室温下搅拌20分钟。在反应液中加入N，N－二甲基－N’－(3－硫酮－3H－1，2，4－二噻唑－5－基)甲脒(206mg)，在室温下搅拌30分钟后，将反应液减压浓缩。在残留物的二氯甲烷(13.0mL)溶液中加入水(0.164mL)后，加入二氯乙酸(0.822mL)的二氯甲烷(13.0mL)溶液，在室温下搅拌15分钟。在反应液中加入吡啶(9.01mL)使反应停止后，进行减压浓缩。将所得到的粗产物直接用于接下来的反应中。
(工序13)
3－({(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－14－(6－苯甲酰基－6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)－15，16－双{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}－7－[1－(2－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}乙基)－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基]－2－桥氧基－2－巯基－10－硫酮八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－10－基}氧基)丙腈
将上述工序12中得到的粗产物的吡啶(27.1mL)溶液浓缩到20mL左右后，加入2－氯－5，5－二甲基－1，3，2λ5－二氧磷杂环己烷－2－酮(622mg)，在室温下搅拌30分钟。在反应液中加入水(0.57mL)和3H－1，2－苯并二硫醇－3－酮(230mg)，在室温下搅拌15分钟。将反应液注入碳酸氢钠(3.60g)的水溶液(130mL)中，在室温下搅拌30分钟后，用乙酸乙酯进行萃取。将有机层用无水硫酸钠进行干燥后，滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯/甲醇]进行精制，得到磷原子上的非对映异构体混合物形式的标题化合物(494mg)。
MS(ESI)m/z：1274(M+H)+.
(工序14)
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－15，16－双{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}－7－[1－(2－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}乙基)－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基]－2，10－二桥氧基－14－(6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－双(硫醇)双(N，N－二乙基乙铵)
在上述工序13所得到的化合物(494mg)的甲醇(5mL)溶液中加入28％氨水(5mL)，在室温下搅拌15小时。将反应液浓缩后，将残留物用C18硅胶柱色谱法[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈]进行精制，得到标题化合物的非对映异构体1(88.5mg：含有杂质)和非对映异构体2(70.7mg：含有杂质)。
非对映异构体1(低极性)
MS(ESI)m/z：1003(M－C6H15Si+2H)+.
非对映异构体2(高极性)
MS(ESI)m/z：1003(M－C6H15Si+2H)+.
(工序15－1)
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aS，16R)－15，16－二羟基－7－[1－(2－羟基乙基)－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基]－2，10－二桥氧基－14－(6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－双(硫醇)二钠
(非对映异构体1)
在上述工序14所得到的化合物(非对映异构体1)(88.5mg：含有杂质)中加入三乙胺三氢氟酸盐(2.0mL)，在45℃下搅拌3小时。在室温下在反应液中加入冰冷的1M碳酸氢三乙铵水溶液(10mL)和三乙胺(2mL)的混合液。将反应液减压浓缩后，用C18硅胶柱色谱法[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈]和制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈、乙腈：5％－30％(0分钟－40分钟)]进行精制。将所得到的化合物(三乙胺盐)用以下的方法转换为钠盐。
[转换为钠盐]
将BT AG(注册商标)50W－X2树脂(生物技术级(biotechnology grade)，100－200目，氢型(hydrogen form))(500mg)悬浮于纯水中，填充至空柱子中。使过量的纯水自然流下后，依次自然流下1M氢氧化钠水溶液(5mL)和纯水(10mL)。将上述所得到的化合物溶于纯水(5mL)中并装填于柱中。分取自然流下的溶液后，进一步用纯水(10mL)进行洗脱。合并包含目标物的组分并进行冻干，得到标题化合物(25.7mg)。
MS(ESI)m/z：775(M+H)+.
1H－NMR(CD3OD)δ：8.63(1H，s)，8.22(1H，s)，8.02(1H，s)，7.11(1H，s)，6.30－6.24(2H，m)，5.46－5.37(1H，m)，5.23－5.15(1H，m)，4.83－4.79(1H，m)，4.78－4.74(1H，m)，4.53－4.42(2H，m)，4.35－4.16(3H，m)，4.16－3.97(3H，m)，3.83－3.78(2H，m)，3.52－3.47(2H，m)，2.88－2.81(2H，m)，2.03－1.95(2H，m).
31P－NMR(CD3OD)δ：57.8(s)，54.4(s).
(工序15－2)
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aS，16R)－15，16－二羟基－7－[1－(2－羟基乙基)－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基]－2，10－二桥氧基－14－(6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－双(硫醇)二钠
(非对映异构体2)
使用上述工序14所得到的化合物(非对映异构体2)(70.7mg：含有杂质)，以与上述工序15－1同样的方法进行反应后，按照以下的[精制条件]进行精制，得到三乙胺盐形式的标题化合物。
[精制条件]C18硅胶柱色谱法[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈]、制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈、乙腈：5％－25％(0分钟－40分钟)]、以及制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/甲醇、甲醇：15％－70％(0分钟－40分钟)]。
将所得到的三乙胺盐以与上述工序15－1所述的[转换为钠盐]同样的方法进行盐交换，得到标题化合物(17.8mg)。
MS(ESI)m/z：775(M+H)+.
1H－NMR(CD3OD)δ：8.72(1H，s)，8.23(1H，s)，8.02(1H，s)，7.11(1H，s)，6.30(2H，dd，J＝13.6，7.6Hz)，5.48－5.39(2H，m)，4.78(1H，dd，J＝6.7，4.2Hz)，4.51－4.28(5H，m)，4.26－4.13(2H，m)，4.06－4.00(1H，m)，3.93－3.86(1H，m)，3.85－3.80(2H，m)，3.52－3.47(2H，m)，2.94－2.88(2H，m)，2.05－1.97(2H，m).
31P－NMR(CD3OD)δ：62.9(s)，60.0(s).
实施例2：CDN34的合成
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－15－氟－16－羟基－7－[1－(2－羟基乙基)－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基]－2，10－双(巯基)－14－(6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－二酮
Figure BDA0003831863160001111
[合成路径]
Figure BDA0003831863160001112
Figure BDA0003831863160001121
(工序1)
1－[2－(苯甲酰基氧基)乙基]－5’－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]肌苷
在市售(东京化成工业)的肌苷(10.0g)的吡啶(50mL)和N，N－二甲基乙酰胺(50mL)溶液中在0℃下加入4，4’－二甲氧基三苯甲基氯(15.2g)后，在4℃下搅拌64小时。在反应液中加入甲醇(2mL)，搅拌10分钟后，浓缩至50mL左右。在残留物中加入2－溴乙基苯甲酸酯(7.02mL)和2，3，4，6，7，8，9，10－八氢嘧啶并[1，2－a]氮杂卓(azepine)(13.9mL)，在室温下搅拌1天。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液和水，用乙酸乙酯进行萃取。将有机层用饱和食盐水进行清洗后，用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯/甲醇/0.1％三乙胺]进行精制，得到标题化合物(15.2g)。
MS(ESI)m/z：719(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.00(1H，s)，7.98(1H，s)，7.98－7.94(2H，m)，7.62－7.15(12H，m)，6.80－6.75(4H，m)，5.95(1H，d，J＝5.4Hz)，4.82－4.79(1H，m)，4.72－4.64(3H，m)，4.55－4.34(5H，m)，3.77(6H，s)，3.43(1H，dd，J＝10.6，3.9Hz)，3.34(1H，dd，J＝10.6，3.6Hz).
(工序2)
1－[2－(苯甲酰基氧基)乙基]－5’－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]－3’－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]肌苷
使用上述工序1所得到的化合物(3.01g)，以与实施例1工序10同样的方法进行合成，得到标题化合物(1.20g)与标题化合物的位置异构体即1－[2－(苯甲酰基氧基)乙基]－5’－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]－2’－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]肌苷(1.22g)。
MS(ESI)m/z：833(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.03(1H，s)，7.98－7.96(1H，m)，7.96(1H，s)，7.96－7.94(1H，m)，7.59－7.52(1H，m)，7.44－7.38(4H，m)，7.32－7.15(7H，m)，6.83－6.77(4H，m)，5.94(1H，d，J＝4.8Hz)，4.69－4.63(2H，m)，4.59－4.35(4H，m)，4.16(1H，dd，J＝3.8，1.9Hz)，3.77(6H，d，J＝1.8Hz)，3.47(1H，dd，J＝10.9，3.0Hz)，3.27(1H，dd，J＝10.9，4.2Hz)，3.00(1H，d，J＝6.7Hz)，0.87(9H，s)，0.06(3H，s)，－0.01(3H，s).
(2’－O－TBS体)
MS(ESI)m/z：833(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.01(1H，s)，7.97－7.93(2H，m)，7.91(1H，s)，7.59－7.53(1H，m)，7.45－7.38(4H，m)，7.35－7.17(7H，m)，6.83－6.77(4H，m)，5.97(1H，d，J＝6.0Hz)，4.84(1H，t，J＝5.4Hz)，4.71－4.60(2H，m)，4.52－4.37(2H，m)，4.33－4.28(1H，m)，4.28－4.24(1H，m)，3.78(3H，s)，3.77(3H，s)，3.47(1H，dd，J＝10.9，3.0Hz)，3.38(1H，dd，J＝10.9，3.6Hz)，2.71(1H，d，J＝3.0Hz)，0.80(9H，s)，－0.03(3H，s)，－0.19(3H，s).
(工序3)
1－[2－(苯甲酰基氧基)乙基]－5’－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]－3’－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]－2’－O－{(2－氰基乙氧基)[二(丙烷－2－基)氨基]膦基}肌苷
使用上述工序2所得到的化合物(1.20g)，以与实施例1工序11同样的方法进行合成，得到磷原子上的非对映异构体混合物(非对映异构体比＝0.55：0.45)形式的标题化合物(1.41g)。
MS(ESI)m/z：1033(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.05(0.45H，s)，8.04(0.55H，s)，7.99－7.95(2H，m)，7.95(0.55H，s)，7.92(0.45H，s)，7.59－7.53(1H，m)，7.45－7.39(4H，m)，7.35－7.10(7H，m)，6.83－6.78(4H，m)，6.15(0.55H，d，J＝5.4Hz)，6.08(0.45H，d，J＝6.0Hz)，4.86－4.49(3H，m)，4.49－4.35(3H，m)，4.25－4.10(1H，m)，3.78(6H，s)，3.72－3.41(5H，m)，3.35－3.25(1H，m)，2.47(1H，t，J＝6.7Hz)，2.32(1H，t，J＝6.3Hz)，1.33－1.24(6H，m)，1.13－1.03(6H，m)，0.84(4.05H，s)，0.84(4.95H，s)，0.08(1.35H，s)，0.05(1.65H，s)，0.00(1.35H，s)，－0.01(1.65H，s).
(工序4)
6－苯甲酰基－2－{2－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]－β－D－呋喃核糖基}－6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁
在实施例1工序4所得到的化合物(35.80g)的二氯甲烷(322mL)－吡啶(35mL)混合溶液中，在冰冷下历时5分钟加入氟化氢－吡啶(6.33g)的二氯甲烷(36mL)溶液，在相同温度下搅拌3小时。在反应液中依次加入饱和碳酸氢钠水溶液(268mL)和饱和食盐水(143mL)使反应停止，用乙酸乙酯进行萃取。将有机层用无水硫酸钠进行干燥后，滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。在残留物中加入己烷/乙酸乙酯(1：1)(108mL)制成浆料状后，在50℃下搅拌30分钟，追加己烷(161mL)进一步搅拌2小时。滤取析出的固体，用己烷/乙酸乙酯(4：1)(143mL)进行清洗，得到标题化合物(26.81g)。
MS(ESI)m/z：525(M+H)+.
1H－NMR(DMSO－d6)δ：7.98(1H，s)，7.65(1H，s)，7.39(1H，m)，7.26－7.20(4H，m)，6.19(1H，d，J＝6.5Hz)，5.15(1H，t，J＝5.6Hz)，5.00(1H，d，J＝4.8Hz)4.48(1H，t，J＝5.6Hz)，4.27(1H，m)，4.11－4.02(2H，m)，3.97(1H，m)，3.67－3.57(2H，m)，2.99(2H，m)，2.23－2.07(2H，m)，0.68(9H，s)，－0.11(3H，s)，－0.26(3H，s).
(工序5)
6－苯甲酰基－2－{2－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]－3，5－双－O－(四氢吡喃－2－基)－β－D－呋喃核糖基}－6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁
在上述工序4所得到的化合物(19.93g)和3，4－二氢－2H－吡喃(35mL)的N，N－二甲基甲酰胺(200mL)溶液中，在冰冷下加入对甲苯磺酸一水合物(7.25g)，在室温下搅拌3小时。在冰冷下，在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液使反应停止，用乙酸乙酯萃取。将有机层依次用水和饱和食盐水进行清洗，用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯]进行精制，得到标题化合物(24.73g)。
1H－NMR(CDCl3)δ：8.10－8.07(1H，m)，7.59－7.35(1H，m)，7.35－7.27(3H，m)，7.25－7.17(2H，m)，6.44－6.36(1H，m)，4.90－3.36(13H，m)，3.06－2.96(2H，m)，2.31－2.15(2H，m)，2.01－1.43(12H，m)，0.84－0.73(9H，m)，0.04－(－0.35)(6H，m).
(工序6)
6－苯甲酰基－2－[3，5－双－O－(四氢吡喃－2－基)－β－D－呋喃核糖基]－6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁
在上述工序5所得到的化合物(24.73g)和乙酸(3.1mL)的四氢呋喃(250mL)溶液中，在冰冷下加入四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(约1M，55mL)，在室温下搅拌一整夜。将反应液减压浓缩，在残留物中加入乙酸乙酯，依次用水和饱和食盐水进行清洗。将有机层用无水硫酸钠进行干燥后，滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯]进行精制，得到标题化合物(18.74g)。
1H－NMR(CDCl3)δ：8.12－8.09(1H，m)，7.49－7.30(4H，m)，7.28－7.20(2H，m)，6.41－6.30(1H，m)，4.83－4.18(7H，m)，4.12－3.50(7H，m)，3.06－2.97(2H，m)，2.31－2.17(2H，m)，1.96－1.47(12H，m).
(工序7)
6－苯甲酰基－2－[3，5－双－O－(四氢吡喃－2－基)－β－D－阿拉伯呋喃糖基]－6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁
在上述工序6所得到的化合物(18.74g)和吡啶(13.1mL)的二氯甲烷(300mL)溶液中，在冰冷下滴加三氟甲磺酸酐(11mL)，搅拌10分钟。在反应液中加入饱和食盐水使反应停止，用二氯甲烷进行萃取，将有机层用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物溶于四氢呋喃(300mL)中，在冰冷下滴加亚硝酸四丁基铵(28.34g)的四氢呋喃(150mL)溶液，在室温下搅拌一整夜。将反应液减压浓缩，在残留物中加入乙酸乙酯，依次用水和饱和食盐水进行清洗。将有机层用无水硫酸钠进行干燥后，滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯]进行精制，得到标题化合物(10.46g)。
1H－NMR(CDCl3)δ：8.13－8.06(1H，m)，7.63－7.30(4H，m)，7.29－7.18(2H，m)，6.79－6.55(1H，m)，4.93－3.45(14H，m)，3.11－2.95(2H，m)，2.32－2.14(2H，m)，1.98－1.44(12H，m).
(工序8)
6－苯甲酰基－2－[2－脱氧基－2－氟－3，5－双－O－(四氢吡喃－2－基)－β－D－呋喃核糖基]－6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁
在上述工序7所得到的化合物(10.46g)和吡啶(7.3mL)的二氯甲烷(200mL)溶液中，在冰冷下滴加三氟甲磺酸酐(6.1mL)，搅拌10分钟。在反应液中加入饱和食盐水使反应停止，用二氯甲烷进行萃取，将有机层用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物溶于四氢呋喃(200mL)中，在冰冷下加入四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(约1M，150mL)，在相同温度下搅拌3小时。在反应液中加入饱和氯化铵水溶液，用乙酸乙酯进行萃取。将有机层用饱和食盐水进行清洗，用无水硫酸钠进行干燥后，滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯]进行精制，得到标题化合物(7.65g)。
1H－NMR(CDCl3)δ：8.13－8.08(1H，m)，7.53－7.31(4H，m)，7.26－7.22(2H，m)，6.68－6.53(1H，m)，5.42－5.08(1H，m)，4.93－4.18(6H，m)，4.10－3.76(3H，m)，3.71－3.47(3H，m)，3.06－2.96(2H，m)，2.29－2.18(2H，m)，1.96－1.47(12H，m).
(工序9)
6－苯甲酰基－2－(2－脱氧基－2－氟－β－D－呋喃核糖基)－6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁
在上述工序8所得到的化合物(7.65g)的乙醇(150mL)溶液中加入对甲苯磺酸吡啶盐(6.62g)，在50℃下搅拌3小时。将反应液减压浓缩，在残留物中加入乙酸乙酯，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水进行清洗。将有机层用无水硫酸钠进行干燥后，滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯]进行精制，得到标题化合物(3.55g)。
1H－NMR(CDCl3)δ：8.05(1H，s)，7.41－7.35(3H，m)，7.30－7.24(2H，m)，7.06(1H，s)，6.07－6.00(2H，m)，5.85(1H，ddd，J＝52.8，6.7，4.7Hz)，4.66(1H，d，J＝3.9Hz)，4.42－4.31(2H，m)，4.20(1H，m)，3.93(1H，dd，J＝12.9，1.6Hz)，3.74(1H，td，J＝12.3，1.6Hz)，3.12－2.96(2H，m)，2.51(1H，s)，2.33－2.15(2H，m).
(工序10)
6－苯甲酰基－2－{5－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]－2－脱氧基－2－氟－β－D－呋喃核糖基}－6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁
在上述工序9所得到的化合物(3.55g)的脱水吡啶(50mL)溶液中加入4，4’－二甲氧基三苯甲基氯(4.43g)，在氮气氛下、室温下搅拌2小时。在反应液中加入甲醇(1mL)，搅拌10分钟左右后进行减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯/0.1％三乙胺]进行精制，得到标题化合物(5.77g)。
1H－NMR(CDCl3)δ：8.09(1H，s)，7.45－7.41(2H，m)，7.36－7.17(13H，m)，6.85－6.79(4H，m)，6.53(1H，dd，J＝17.2，2.3Hz)，5.40(1H，ddd，J＝53.2，4.8，2.3Hz)，4.83－4.72(1H，m)，4.32－4.21(2H，m)，4.19－4.14(1H，m)，3.79(3H，s)，3.79(3H，s)，3.59(1H，dd，J＝11.0，2.7Hz)，3.45(1H，dd，J＝11.0，3.5Hz)，2.79(2H，t，J＝6.3Hz)，2.45(1H，s)，2.24－2.11(2H，m).
(工序11)
6－苯甲酰基－2－(5－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]－3－O－{(2－氰基乙氧基)[二(丙烷－2－基)氨基]膦基}－2－脱氧基－2－氟－β－D－呋喃核糖基)－6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁使用上述工序10所得到的化合物(5.77g)，以与实施例1工序6同样的方法进行反应，得到磷原子上的非对映异构体混合物(非对映异构体比＝1：1)形式的标题化合物(5.95g)。
1H－NMR(CDCl3)δ：8.10(0.5H，s)，8.09(0.5H，s)，7.45－7.12(15H，m)，6.84－6.75(4H，m)，6.57－6.46(1H，m)，5.61－5.33(1H，m)，5.07－4.83(1H，m)，4.34－4.18(3H，m)，3.93－3.72(7H，m)，3.69－3.49(4H，m)，3.38－3.27(1H，m)，2.87－2.68(2H，m)，2.61(1H，td，J＝6.3，1.6Hz)，2.40(1H，td，J＝6.4，2.1Hz)，2.21－2.12(2H，m)，1.21－1.13(9H，m)，1.03(3H，d，J＝6.7Hz).
(工序12)
使用上述工序11所得到的化合物(1.02g)，以与实施例1工序7同样的方法进行反应，得到6－苯甲酰基－2－{2－脱氧基－2－氟－3－O－[羟基(桥氧基)－λ5－膦基]－β－D－呋喃核糖基}－6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁的乙腈溶液。使用所得到的乙腈溶液和上述工序3所得到的化合物(1.15g)，以与实施例1工序12同样的方法进行反应，将所得到的粗产物直接用于接下来的反应。
(工序13)
2－{9－[(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－14－(6－苯甲酰基－6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)－16－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}－10－(2－氰基乙氧基)－15－氟－2－桥氧基－2－巯基－10－硫酮八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－7－基]－6－桥氧基－6，9－二氢－1H－嘌呤－1－基}乙基苯甲酸酯
使用上述工序12所得到的粗产物，以与实施例1工序13同样的方法进行反应，得到磷原子上的非对映异构体混合物形式的标题化合物(818mg：含有杂质)。
MS(ESI)m/z：1152(M+H)+.
(工序14)
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－16－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}－15－氟－7－[1－(2－羟基乙基)－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基]－2，10－二桥氧基－14－(6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－双(硫醇)双(N，N－二乙基乙铵)
使用上述工序13所得到的化合物(818mg)，以与实施例1工序14同样的方法进行反应，得到标题化合物的非对映异构体1(107mg：含有杂质)和非对映异构体2(101mg：含有杂质)。
非对映异构体1(低极性)
MS(ESI)m/z：891(M+H)+.
非对映异构体2(高极性)
MS(ESI)m/z：891(M+H)+.
(工序15－1)
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－15－氟－16－羟基－7－[1－(2－羟基乙基)－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基]－2，10－二桥氧基－14－(6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－双(硫醇)二钠
(非对映异构体1)
使用上述工序14所得到的化合物(非对映异构体1)(107mg：含有杂质)，以与实施例1工序15－1同样的方法进行反应后，按以下的[精制条件]进行精制，得到三乙胺盐形式的标题化合物。
[精制条件]C18硅胶柱色谱法[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈]以及制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈，乙腈：5％－30％(0分钟－30分钟)].
将所得到的三乙胺盐以与实施例1工序15－1所述的[转换为钠盐]同样的方法进行盐交换，得到标题化合物(29.1mg)。
MS(ESI)m/z：777(M+H)+.
1H－NMR(CD3OD)δ：8.58(1H，m)，8.11(1H，m)，8.03(1H，s)，7.11(1H，s)，6.47(1H，d，J＝17.5Hz)，6.26(1H，d，J＝8.5Hz)，5.53－5.36(2H，m)，5.29－5.17(1H，m)，4.77(1H，d，J＝4.2Hz)，4.54－4.46(1H，m)，4.44－4.38(1H，m)，4.35－4.32(1H，m)，4.30－4.25(2H，m)，4.25－4.16(1H，m)，4.06－3.99(1H，m)，3.96－3.85(1H，m)，3.82－3.71(2H，m)，3.54－3.42(2H，m)，2.77－2.68(1H，m)，2.66－2.55(1H，m)，2.02－1.81(2H，m).
31P－NMR(CD3OD)δ：57.5(s)，53.0(s).
(工序15－2)
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－15－氟－16－羟基－7－[1－(2－羟基乙基)－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基]－2，10－二桥氧基－14－(6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－双(硫醇)二钠
(非对映异构体2)
使用上述工序14所得到的化合物(非对映异构体2)(101mg：含有杂质)，以与实施例1工序15－1同样的方法进行反应后，按以下的[精制条件]进行精制，得到三乙胺盐形式的标题化合物。
[精制条件]C18硅胶柱色谱法[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈]以及制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈，乙腈：5％－20％(0分钟－30分钟)].
将所得到的三乙胺盐以与实施例1工序15－1所述的[转换为钠盐]同样的方法进行盐交换，得到标题化合物(11.2mg)。
MS(ESI)m/z：777(M+H)+.
1H－NMR(CD3OD)δ：8.61(1H，m)，8.16(1H，m)，8.02(1H，m)，7.36(1H，s)，6.49(1H，dd，J＝16.0，2.1Hz)，6.28(1H，d，J＝8.5Hz)，5.56－5.33(3H，m)，4.58－4.49(2H，m)，4.45－4.37(2H，m)，4.31－4.27(1H，m)，4.25－4.16(1H，m)，4.10－3.98(3H，m)，3.80(2H，t，J＝5.1Hz)，3.48(2H，dd，J＝6.7，3.6Hz)，2.90－2.72(2H，m)，2.00－1.90(2H，m).
31P－NMR(CD3OD)δ：59.5(s)，57.7(s).
实施例3：CDN49的合成
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－7－[1－(2－氨基乙基)－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基]－14－(8，9－二氢－6－硫杂－2，3，5－三氮杂苯并[cd]薁－2(7H)－基)－15－氟－16－羟基－2，10－双(巯基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－二酮
Figure BDA0003831863160001221
[合成路径]
Figure BDA0003831863160001222
Figure BDA0003831863160001231
(工序1)
5’－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]－1－[2－(1，3－二桥氧基－1，3－二氢－2H－异吲哚－2－基)乙基]肌苷
在市售(Aamdis Chemical)的5’－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]肌苷(13.0g)的N，N－二甲基乙酰胺(60mL)悬浮液中加入N－(2－溴乙基)邻苯二甲酰亚胺(7.02g)和1，8－二氮杂双环[5.4.0]－7－十一烯(4.1mL)，在室温下搅拌一整夜。追加N－(2－溴乙基)邻苯二甲酰亚胺(1.75g)和1，8－二氮杂双环[5.4.0]－7－十一烯(1.1mL)，进一步搅拌1天。在反应液中加入水使反应停止，用二氯甲烷进行萃取。将有机层用无水硫酸钠进行干燥后，滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[乙酸乙酯/甲醇]进行精制，得到标题化合物(12.4g)。
1H－NMR(CDCl3)δ：7.83(1H，s)，7.76－7.67(4H，m)，7.64(1H，s)，7.35－7.33(2H，m)，7.25－7.11(7H，m)，6.74－6.70(4H，m)，5.93(1H，d，J＝5.1Hz)，5.68(1H，d，J＝3.9Hz)，4.71(1H，q，J＝4.8Hz)，4.43(1H，m)，4.37－4.18(3H，m)，4.10－4.06(2H，m)，3.730(3H，s)，3.728(3H，s)，3.51(1H，m)，3.36(1H，dd，J＝10.6，3.9Hz)，3.32(1H，dd，J＝11.0，5.5Hz).
(工序2)
5’－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]－3’－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]－1－[2－(1，3－二桥氧基－1，3－二氢－2H－异吲哚－2－基)乙基]肌苷
使用上述工序1所得到的化合物(12.4g)，以与实施例1工序10同样的方法进行反应，得到标题化合物(4.18g)和标题化合物的位置异构体即5’－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]－2’－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]－1－[2－(1，3－二桥氧基－1，3－二氢－2H－异吲哚－2－基)乙基]肌苷(6.31g)。
1H－NMR(CDCl3)δ：8.00(1H，s)，7.82－7.77(2H，m)，7.74(1H，s)，7.72－7.67(2H，m)，7.41－7.39(2H，m)，7.32－7.19(7H，m)，6.83－6.78(4H，m)，5.90(1H，d，J＝5.1Hz)，4.53－4.41(3H，m)，4.32－4.25(1H，m)，4.19－4.11(3H，m)，3.79(3H，s)，3.78(3H，s)，3.46(1H，dd，J＝10.6，3.1Hz)，3.24(1H，dd，J＝10.8，4.1Hz)，2.98(1H，d，J＝6.7Hz)，0.85(9H，s)，0.04(3H，s)，－0.03(3H，s).
位置异构体(2’－O－TBS体)
1H－NMR(CDCl3)δ：7.97(1H，s)，7.82－7.78(2H，m)，7.73－7.69(2H，m)，7.66(1H，s)，7.44－7.41(2H，m)，7.33－7.18(7H，m)，6.81(4H，d，J＝7.8Hz)，5.91(1H，d，J＝5.9Hz)，4.82(1H，t，J＝5.5Hz)，4.43(1H，m)，4.34－4.23(3H，m)，4.18－4.08(2H，m)，3.79(6H，s)，3.46(1H，dd，J＝10.6，2.7Hz)，3.36(1H，dd，J＝10.6，3.5Hz)，2.70(1H，d，J＝3.1Hz)，0.83(9H，s)，－0.04(3H，s)，－0.19(3H，s).
(工序3)
5’－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]－3’－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]－2’－O－{(2－氰基乙氧基)[二(丙烷－2－基)氨基]膦基}－1－[2－(1，3－二桥氧基－1，3－二氢－2H－异吲哚－2－基)乙基]肌苷
使用上述工序2所得到的化合物(8.89g)，以与实施例1工序6同样的方法进行反应，得到磷原子上的非对映异构体混合物(非对映异构体比＝1：1)形式的标题化合物(9.45g)。
1H－NMR(CDCl3)δ：8.01(0.5H，s)，8.00(0.5H，s)，7.82－7.77(2H，m)，7.74(0.5H，s)，7.72－7.67(2.5H，m)，7.42(2H，d，J＝7.8Hz)，7.33－7.18(7H，m)，6.81(4H，d，J＝8.6Hz)，6.10(0.5H，d，J＝5.5Hz)，6.04(0.5H，d，J＝5.1Hz)，4.75(0.5H，m)，4.60(0.5H，m)，4.49－4.41(1H，m)，4.38－4.23(2H，m)，4.22－4.05(3H，m)，3.79(6H，s)，3.78－3.65(1H，m)，3.62－3.39(4H，m)，3.33－3.23(1H，m)，2.49(1H，t，J＝6.3Hz)，2.34(1H，t，J＝6.7Hz)，1.12－1.08(9H，m)，0.91(3H，d，J＝7.0Hz)，0.82(9H，s)，0.06(1.5H，s)，0.03(1.5H，s)，－0.03(3H，s).
(工序4)
4－氯－5－碘－7－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－7H－吡咯并[2，3－d]嘧啶
在市售(PharmaBlock)的4－氯－5－碘－7H－吡咯并[2，3－d]嘧啶(73.8g)的N，N－二甲基甲酰胺(10mL)溶液中，在冰冷下加入氢化钠(含有45％矿物油)(13.3g)，一边升温至室温一边搅拌40分钟。再次冰冷却，历时10分钟加入[2－(氯甲氧基)乙基](三甲基)硅烷(51.0mL)后，在相同温度下搅拌30分钟。在大部分固化的反应液中逐量加入水(260mL)使反应停止。滤取固体，用水(1500mL)和己烷(600mL)进行清洗后，在减压、40℃下进行干燥，得到标题化合物(97.63g)。
MS(ESI)m/z：410(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.64(1H，s)，7.54(1H，s)，5.61(2H，s)，3.52(2H，t，J＝8.3Hz)，0.92(2H，t，J＝8.3Hz)，－0.04(9H，s).
(工序5)
4－(苄基氧基)－5－碘－7－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－7H－吡咯并[2，3－d]嘧啶
在苄醇(27mL)的N，N－二甲基甲酰胺(170mL)溶液中，在冰冷下加入氢化钠(含有45％矿物油)(12g)，一边升温至室温一边搅拌40分钟。再次冰冷却，历时40分钟加入上述工序4中所得到的化合物(97.63g)的N，N－二甲基甲酰胺(360mL)悬浮液，在相同温度下搅拌35分钟。在反应液中加入碎冰和饱和氯化铵水溶液，使反应停止。将反应液注入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯这两层中，用乙酸乙酯：甲苯(9：1)进行萃取。将有机层用水和饱和食盐水分别清洗两次后，用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯]进行精制，得到标题化合物(107.7g)。
MS(ESI)m/z：482(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.47(1H，s)，7.61(2H，d，J＝7.3Hz)，7.41(2H，t，J＝7.6Hz)，7.36－7.30(1H，m)，7.30(1H，s)，5.65(2H，s)，5.57(2H，s)，3.52(2H，t，J＝8.3Hz)，0.91(2H，t，J＝8.3Hz)，－0.05(9H，s).
(工序6)
4－(苄基氧基)－5－(3，3－二乙氧基丙－1－炔－1－基)－7－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－7H－吡咯并[2，3－d]嘧啶
在上述工序5所得到的化合物(113.4g)的乙腈(1000mL)－三乙胺(98mL)混合溶液中，在氮气氛下、室温下加入碘化铜(4.49g)、四(三苯基膦)钯(0)(8.17g)、以及3，3－二乙氧基丙－1－炔(104mL)，在相同温度下搅拌4.5小时。将反应液减压浓缩后，在残留物中加入乙酸乙酯和己烷，滤去析出的固体。将固体用乙酸乙酯：己烷(1：1)的混合液进行清洗后，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯]进行精制，得到标题化合物(145.5g：含有杂质)。
MS(ESI)m/z：482(M+H)+.
(工序7)
5－(3，3－二乙氧基丙基)－7－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－7H－吡咯并[2，3－d]嘧啶－4－醇
在上述工序6所得到的化合物(145.5g)的乙醇(900mL)溶液中加入10％钯碳催化剂(M)湿式(50.2g)，在氢气氛下、室温下搅拌5小时。在反应液中加入二氯甲烷(500mL)，用硅藻土滤去催化剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯]精制两次，得到标题化合物(59.6g)。
MS(ESI)m/z：418(M+Na)+，394[M－H]－.
1H－NMR(CDCl3)δ：11.23(1H，brs)，7.85(1H，s)，6.79(1H，s)，5.47(2H，s)，4.58(1H，t，J＝5.9Hz)，3.69(2H，m)，3.57－3.49(4H，m)，2.90(2H，t，J＝7.8Hz)，2.07(2H，m)，1.23(6H，t，J＝7.1Hz)，0.91(2H，t，J＝8.1Hz)，－0.04(9H，s).
(工序8)
5－(3，3－二乙氧基丙基)－7－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－7H－吡咯并[2，3－d]嘧啶－4－硫醇
在上述工序7所得到的化合物(59.6g)的脱水二氯甲烷(300mL)溶液中，在氮气氛下加入2，6－二甲基吡啶(42mL)。在－20℃下历时20分钟滴加三氟甲磺酸酐(31mL)，在相同温度下搅拌20分钟。在冰冷却下加入N，N－二甲基甲酰胺(500mL)和硫化氢钠n水合物(33.5g)，升温至室温后搅拌2.5小时。将反应液减压浓缩，蒸馏除去低沸点成分。将残留物注入乙酸乙酯和冰冷后的饱和氯化铵水溶液这两层中，用乙酸乙酯：甲苯(9：1)的混合液进行萃取。将有机层用饱和氯化铵水溶液清洗一次，用饱和食盐水清洗两次后，用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯]进行精制，得到标题化合物和2，6－二甲基吡啶的混合物。将所得到的混合物注入乙酸乙酯和1N盐酸这两层中，用乙酸乙酯萃取两次。将有机层用饱和食盐水清洗三次后，用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩，得到标题化合物(57.6g)。
MS(ESI)m/z：410[M－H]－.
1H－NMR(CDCl3)δ：11.69(1H，brs)，7.90(1H，s)，6.96(1H，s)，5.49(2H，s)，4.61(1H，t，J＝5.9Hz)，3.71(2H，m)，3.55(2H，m)，3.49(2H，t，J＝8.1Hz)，3.14(2H，t，J＝7.8Hz)，2.08(2H，m)，1.23(6H，t，J＝7.1Hz)，0.90(2H，t，J＝8.3Hz)，－0.04(9H，s).
(工序9)
3－(4－巯基－7－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－7H－吡咯并[2，3－d]嘧啶－5－基)丙烷－1－醇
将上述工序8所得到的化合物(31.62g)溶于80％乙酸水溶液(300mL)，在室温下搅拌30分钟。确认原料消失后，进行冰冷却，小心地逐量加入硼氢化钠(1.45g)，在相同温度下搅拌30分钟。接着，历时15分钟加入三乙酰氧基硼氢化钠(24.4g)，在相同温度下搅拌1.5小时。将反应液减压浓缩至五分之一左右的量。在残留物中小心地加入碳酸氢钠(固体)而中和到某种程度后，用乙酸乙酯进行萃取。将有机层依次用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水进行清洗，用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯]进行精制，得到标题化合物(17.93g)。
MS(ESI)m/z：340[M+H]+.
1H－NMR(CDCl3)δ：11.92(1H，brs)，7.95(1H，s)，7.01(1H，s)，5.51(2H，s)，3.70(2H，t，J＝5.9Hz)，3.50(2H，t，J＝8.1Hz)，3.23(2H，t，J＝7.3Hz)，2.33(1H，brs)，1.99(2H，m)，0.91(2H，t，J＝8.3Hz)，－0.04(9H，s).
(工序10)
2－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}－2，7，8，9－四氢－6－硫杂－2，3，5－三氮杂苯并[cd]薁
在上述工序9所得到的化合物(31.31g)的脱水四氢呋喃(600mL)溶液中在氮气氛下、0℃下加入三苯基膦(25.4g)和偶氮二甲酸二异丙酯(21.8g)，在相同温度下搅拌1小时。将反应液减压浓缩后，将残留物依次用硅胶柱色谱法[二氯甲烷/乙酸乙酯]以及硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯]进行精制，得到标题化合物(35.93g：含有杂质)。
MS(ESI)m/z：322[M+H]+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.57(1H，s)，7.08(1H，s)，5.58(2H，s)，3.52(2H，t，J＝8.3Hz)，3.17(2H，m)，3.06(2H，t，J＝5.6Hz)，2.36(2H，m)，0.92(2H，t，J＝8.3Hz)，－0.05(9H，s).
(工序11)
(8，9－二氢－6－硫杂－2，3，5－三氮杂苯并[cd]薁－2(7H)－基)甲醇
在上述工序10所得到的化合物(35.93g)的二氯甲烷(150mL)溶液中在室温下加入三氟乙酸(150mL)，在相同温度下搅拌1.5小时。将反应液减压浓缩后，用甲苯共沸4次。在残留物中加入二氯甲烷：己烷(1：2)的混合液，滤取析出的固体(固体1)。将滤液减压浓缩后，将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯→乙酸乙酯/甲醇]进行精制，得到固体2。合并固体1和固体2，得到标题化合物(20.13g)。
MS(ESI)m/z：222[M+H]+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.60(1H，s)，7.19(1H，s)，5.71(2H，s)，3.21(2H，m)，3.07(2H，m)，2.38(2H，m).(仅记载了能够观测到的峰)
(工序12)
2，7，8，9－四氢－6－硫杂－2，3，5－三氮杂苯并[cd]薁
在上述工序11所得到的化合物(20.13g)的甲醇(250mL)悬浮液中加入28％氨水溶液(150mL)，在室温下搅拌1.5小时。在减压下将反应液浓缩至一半左右的量。滤取析出的固体，用乙醇进行清洗，得到固体1。将滤液减压浓缩，以同样的操作得到固体2。将滤液涂布于硅胶后，用硅胶柱色谱法[二氯甲烷/甲醇]进行精制。将包含目标物的馏分减压浓缩，用乙醇浆化清洗后，滤取固体(固体3)。合并固体1、固体2以及固体3，得到标题化合物(12.36g)。
MS(ESI)m/z：192[M+H]+.
1H－NMR(CDCl3)δ：10.53(1H，brs)，8.57(1H，s)，7.10(1H，s)，3.18(2H，m)，3.08(2H，t，J＝5.6Hz)，2.37(2H，m).
(工序13)
2－(2，3，5－三－O－苄基－β－D－阿拉伯呋喃糖基)－2，7，8，9－四氢－6－硫杂－2，3，5－三氮杂苯并[cd]薁
在上述工序12所得到的化合物(13.47g)的脱水乙腈(350mL)悬浮液中，在氮气氛下加入粉末状的氢氧化钾(10.3g)和三[2－(2－甲氧基乙氧基)乙基]胺(1.13mL)，在室温下搅拌1.5小时。在冰冷却下逐量地加入文献已知(J.Med.Chem.1976，19，6，814－816)的2，3，5－三－O－苄基－α－D－阿拉伯呋喃糖基氯化物(40.2g)的乙腈(100mL)溶液后，升温至室温，搅拌4小时。过滤除去不溶物，用乙腈进行清洗。将滤液减压浓缩，将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯]进行2次精制，得到标题化合物(26.19g)。
MS(ESI)m/z：594[M+H]+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.51(1H，s)，7.37－7.17(14H，m)，6.86(2H，m)，6.82(1H，d，J＝4.9Hz)，4.68(1H，d，J＝11.7Hz)，4.59(1H，d，J＝11.7Hz)，4.54(1H，d，J＝13.2Hz)，4.52(1H，d，J＝11.7Hz)，4.36－4.33(2H，m)，4.22(1H，d，J＝11.7Hz)，4.14－4.08(2H，m)，3.77(1H，dd，J＝10.7，3.9Hz)，3.72(1H，dd，J＝10.5，4.1Hz)，3.13(2H，m)，2.81(2H，m)，2.27(2H，m).
(工序14)
2－β－D－阿拉伯呋喃糖基－2，7，8，9－四氢－6－硫杂－2，3，5－三氮杂苯并[cd]薁
在上述工序13所得到的化合物(26.19g)的脱水二氯甲烷(300mL)溶液中，在氮气氛下、－78℃下加入三氯化硼的二氯甲烷溶液(1M，200mL)，在相同温度下搅拌2小时后，升温至0℃，进一步搅拌4小时。将反应液再次冷却至－78℃，加入甲醇(80mL)的二氯甲烷(160mL)溶液，一边升温至室温一边搅拌30分钟。将反应液减压浓缩，用乙醇共沸2次。在残留物中加入乙醇(200mL)和二乙基醚(100mL)制成浆料状，滤取固体(固体1)。将滤液减压浓缩，将残留物用硅胶柱色谱法[二氯甲烷/甲醇]进行精制。将包含目标物的馏分减压浓缩后，加入乙醇制成浆料状，滤取固体(固体2)。合并固体1和固体2，得到标题化合物(13.2g)。
MS(ESI)m/z：324[M+H]+.
1H－NMR(CD3OD)δ：8.73(1H，s)，7.96(1H，s)，6.70(1H，d，J＝4.9Hz)，4.32(1H，t，J＝4.6Hz)，4.25(1H，t，J＝4.6Hz)，3.97(1H，m)，3.90(1H，dd，J＝12.0，3.2Hz)，3.85(1H，dd，J＝12.0，4.6Hz)，3.53(2H，m)，3.17(2H，m)，2.43(2H，m).
(工序15)
2－[3，5－双－O－(四氢吡喃－2－基)－β－D－阿拉伯呋喃糖基]－2，7，8，9－四氢－6－硫杂－2，3，5－三氮杂苯并[cd]薁
在上述工序14所得到的化合物(15.35g)的脱水二甲基亚砜(160mL)溶液中，在0℃下加入3，4－二氢－2H－吡喃(17.2mL)和对甲苯磺酸一水合物(9.02g)，在室温下搅拌3小时。追加3，4－二氢－2H－吡喃(8.6mL)，搅拌45分钟后，立即加入三乙胺(13mL)使反应停止。将反应液注入乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水溶液这两层，用乙酸乙酯进行萃取。将有机层用水清洗1次，用饱和食盐水清洗2次后，用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯]进行精制，得到4种非对映异构体混合物形式的标题化合物(10.81g)。
MS(ESI)m/z：492[M+H]+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.548(0.2H，s)，8.546(0.3H，s)，8.54(0.3H，s)，8.53(0.2H，s)，7.54(0.2H，s)，7.53(0.3H，s)，7.51(0.2H，s)，7.44(0.3H，s)，6.75(0.2H，d，J＝5.4Hz)，6.71(0.2H，d，J＝5.9Hz)，6.57(0.3H，d，J＝5.9Hz)，6.56(0.3H，d，J＝5.9Hz)，4.87－4.69(2H，m)，4.55－3.54(10H，m)，3.18－3.12(2H，m)，3.10－2.96(2H，m)，2.40－2.30(2H，m)，1.92－1.51(12H，m).
(工序16)
2－[2－脱氧基－2－氟－3，5－双－O－(四氢吡喃－2－基)－β－D－呋喃核糖基]－2，7，8，9－四氢－6－硫杂－2，3，5－三氮杂苯并[cd]薁
在上述工序15所得到的化合物(10.81g)的脱水二氯甲烷(150mL)溶液中在氮气氛下、0℃下加入吡啶(5.3mL)和三氟甲磺酸酐(5.6mL)，在相同温度下搅拌1小时。在反应液中加入碎冰使反应停止后，将反应液注入乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水溶液这两层，用乙酸乙酯进行萃取。将有机层用饱和食盐水清洗2次后，用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩，得到无定形的三氟甲磺酸酯的粗产物。将所得到的三氟甲磺酸酯的粗产物溶于脱水四氢呋喃(150mL)，在冰冷却下，逐量地加入四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(约1M，154mL)，在相同温度下搅拌一整夜。在反应液中加入饱和氯化铵水溶液使反应停止。将反应液减压浓缩至一半左右的量。将残留物注入乙酸乙酯和饱和氯化铵水溶液这两层，用乙酸乙酯进行萃取。将有机层用饱和氯化铵水溶液清洗1次，用饱和食盐水清洗2次。将水层用乙酸乙酯再次萃取，将萃取液用饱和食盐水进行清洗。合并有机层，用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩，得到标题化合物(40.37g)的粗产物。
MS(ESI)m/z：494[M+H]+.
(工序17)
2－(2－脱氧基－2－氟－β－D－呋喃核糖基)－2，7，8，9－四氢－6－硫杂－2，3，5－三氮杂苯并[cd]薁
在上述工序16所得到的化合物(40.37g)的甲醇(400mL)溶液中加入对甲苯磺酸一水合物(2.09g)，在60℃下搅拌4小时。在反应液中加入三乙胺(16mL)使反应停止。将反应液减压浓缩，将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯→乙酸乙酯/甲醇]进行精制。将包含目标物的馏分减压浓缩至成为浆料状，滤取固体。将所得到的固体用己烷/乙酸乙酯(1：1)进行清洗，得到固体1。将滤液减压浓缩，将残留物用硅胶柱色谱法[二氯甲烷/甲醇]进行精制，得到固体2。合并固体1和固体2，得到标题化合物(5.32g)。
MS(ESI)m/z：326[M+H]+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.51(1H，s)，7.01(1H，s)，6.00(1H，dd，J＝13.7，6.3Hz)，5.95(1H，dd，J＝11.7，2.0Hz)，5.87(1H，ddd，J＝52.7，6.3，4.9Hz)，4.69(1H，m)，4.32(1H，brs)，3.96(1H，d，J＝12.7Hz)，3.77(1H，m)，3.17(2H，m)，3.04(2H，m)，2.41－2.31(3H，m).
(工序18)
2－{5－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]－2－脱氧基－2－氟－β－D－呋喃核糖基}－2，7，8，9－四氢－6－硫杂－2，3，5－三氮杂苯并[cd]薁
使用上述工序17所得到的化合物(5.32g)，使用与实施例2工序10同样的方法进行反应，得到标题化合物(10.1g)。
MS(ESI)m/z：628[M+H]+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.54(1H，s)，7.42(2H，d，J＝7.3Hz)，7.32－7.21(8H，m)，6.81(4H，m)，6.52(1H，dd，J＝17.3，2.2Hz)，5.37(1H，ddd，J＝53.3，4.4，2.4Hz)，4.76(1H，m)，4.16(1H，m)，3.789(3H，s)，3.786(3H，s)，3.59(1H，dd，J＝10.7，2.4Hz)，3.44(1H，dd，J＝10.7，3.4Hz)，3.12(2H，m)，2.76(2H，t，J＝5.6Hz)，2.27(2H，m)，2.18(1H，dd，J＝7.8，2.9Hz).
(工序19)
2－(5－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]－3－O－{(2－氰基乙氧基)[二(丙烷－2－基)氨基]膦基}－2－脱氧基－2－氟－β－D－呋喃核糖基)－2，7，8，9－四氢－6－硫杂－2，3，5－三氮杂苯并[cd]薁
使用上述工序18所得到的化合物(10.1g)，以与实施例1工序6同样的方法进行反应，得到磷原子上的非对映异构体混合物(非对映异构体比＝1：1)形式的标题化合物(12.6g)。
1H－NMR(CDCl3)δ：8.53(1H，s)，7.40(2H，m)，7.34－7.17(8H，m)，6.84－6.74(4H，m)，6.53(0.5H，dd，J＝17.3，2.2Hz)，6.48(0.5H，dd，J＝17.6，1.5Hz)，5.50－5.31(1H，m)，4.99(0.5H，m)，4.85(0.5H，m)，4.31－4.26(1H，m)，3.93－3.76(1H，m)，3.792(1.5H，s)，3.789(1.5H，s)，3.779(1.5H，s)，3.776(1.5H，s)，3.67－3.51(4H，m)，3.34－3.30(1H，m)，3.13－3.10(2H，m)，2.76－2.69(2H，m)，2.61(1H，td，J＝6.3，2.4Hz)，2.39(1H，m)，2.28－2.21(2H，m)，1.19－1.15(9H，m)，1.03(3H，d，J＝6.8Hz).
(工序20)
使用上述工序19所得到的化合物(1.80g)，以与实施例1工序7同样的方法进行反应，得到2－{2－脱氧基－2－氟－3－O－[羟基(桥氧基)－λ5－膦基]－β－D－呋喃核糖基}－2，7，8，9－四氢－6－硫杂－2，3，5－三氮杂苯并[cd]薁的乙腈溶液。使用所得到的乙腈溶液和上述工序3所得到的化合物(2.30g)，以与实施例1工序12同样的方法进行反应，将所得到的粗产物直接用于接下来的反应。
(工序21)
3－{[(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－16－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}－14－(8，9－二氢－6－硫杂－2，3，5－三氮杂苯并[cd]薁－2(7H)－基)－7－{1－[2－(1，3－二桥氧基－1，3－二氢－2H－异吲哚－2－基)乙基]－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基}－15－氟－2－桥氧基－2－巯基－10－硫酮八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－10－基]氧基}丙腈
使用上述工序20中得到的粗产物，以与实施例1工序13同样的方法进行反应，得到磷原子上的非对映异构体混合物形式的标题化合物(1.22g)。
MS(ESI)m/z：1090(M+H)+.
(工序22)
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－7－[1－(2－氨基乙基)－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基]－16－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}－14－(8，9－二氢－6－硫杂－2，3，5－三氮杂苯并[cd]薁－2(7H)－基)－15－氟－2，10－二桥氧八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－双(硫醇)双(N，N－二乙基乙铵)
在上述工序21所得到的化合物(1.22g)的乙醇(10mL)－四氢呋喃(10mL)混合溶液中加入肼一水合物(0.544mL)，在室温下搅拌15小时。将反应液减压浓缩后，将残留物用C18硅胶柱色谱法[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈]进行精制，得到标题化合物的非对映异构体1(108mg：含有杂质)和非对映异构体2(111mg：含有杂质)。
非对映异构体1(低极性)
MS(ESI)m/z：907(M+H)+.
非对映异构体2(高极性)
MS(ESI)m/z：907(M+H)+.
(工序23－1)
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－7－[1－(2－氨基乙基)－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基]－14－(8，9－二氢－6－硫杂－2，3，5－三氮杂苯并[cd]薁－2(7H)－基)－15－氟－16－羟基－2，10－二桥氧八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－双(硫醇)二钠
(非对映异构体1)
使用上述工序22所得到的化合物(非对映异构体1)(108mg：含有杂质)，以与实施例1工序15－1同样的方法进行反应后，按照以下的[精制条件]进行精制，得到三乙胺盐形式的标题化合物。
[精制条件]C18硅胶柱色谱法[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈]以及制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈－甲醇溶液(1：1)，乙腈－甲醇溶液(1：1)：10％－50％(0分钟－40分钟)].
将所得到的三乙胺盐以与实施例1工序15－1所述的[转换为钠盐]同样的方法进行盐交换，得到标题化合物(44.4mg)。
MS(ESI)m/z：793(M+H)+.
1H－NMR(CD3OD)δ：8.50(1H，s)，8.42(1H，s)，7.92(1H，s)，7.56(1H，s)，6.56(1H，d，J＝16.3Hz)，6.21(1H，d，J＝6.0Hz)，5.57－5.40(2H，m)，5.35－5.22(1H，m)，4.73－4.67(1H，m)，4.58－4.49(1H，m)，4.45－4.26(4H，m)，4.24－4.15(1H，m)，4.05－3.96(1H，m)，3.78－3.51(1H，m)，3.26－3.06(4H，m)，2.93－2.82(1H，m)，2.70－2.51(1H，m)，2.29－2.07(2H，m).
31P－NMR(CD3OD)δ：57.5(s)，52.9(s).
(工序23－2)
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－7－[1－(2－氨基乙基)－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基]－14－(8，9－二氢－6－硫杂－2，3，5－三氮杂苯并[cd]薁－2(7H)－基)－15－氟－16－羟基－2，10－二桥氧八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－双(硫醇)二钠
(非对映异构体2)
使用上述工序22所得到的化合物(非对映异构体2)(111mg：含有杂质)，以与实施例1工序15－1同样的方法进行反应后，按照以下的[精制条件]进行精制，得到三乙胺盐形式的标题化合物。
[精制条件]C18硅胶柱色谱法[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈]、制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈，乙腈：5％－25％(0分钟－40分钟)]、以及制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/甲醇，甲醇：20％－60％(0分钟－40分钟)].
将所得到的三乙胺盐以与实施例1工序15－1所述的[转换为钠盐]同样的方法进行盐交换，得到标题化合物(40.6mg)。
MS(ESI)m/z：793(M+H)+.
1H－NMR(CD3OD)δ：8.57(1H，s)，8.41(1H，s)，8.13(1H，s)，7.72(1H，s)，6.59(1H，dd，J＝15.7，1.8Hz)，6.26(1H，d，J＝8.5Hz)，5.61－5.34(3H，m)，4.57－4.48(2H，m)，4.48－4.38(2H，m)，4.38－4.28(2H，m)，4.08－3.98(3H，m)，3.29－3.21(2H，m)，3.20－3.12(2H，m)，3.02－2.92(1H，m)，2.92－2.81(1H，m)，2.29－2.15(2H，m).
31P－NMR(CD3OD)δ：58.7(s)，57.8(s).
实施例4：CDN50的合成
N－(2－{9－[(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－14－(8，9－二氢－6－硫杂－2，3，5－三氮杂苯并[cd]薁－2(7H)－基)－15－氟－16－羟基－2，10－二桥氧基－2，10－双(巯基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－7－基]－6－桥氧基－6，9－二氢－1H－嘌呤－1－基}乙基)－2－羟基乙酰胺
Figure BDA0003831863160001371
[合成路径]
Figure BDA0003831863160001381
(工序1－1)
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－14－(8，9－二氢－6－硫杂－2，3，5－三氮杂苯并[cd]薁－2(7H)－基)－15－氟－16－羟基－7－{1－[2－(2－羟基乙酰胺)乙基]－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基}－2，10－二桥氧八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－双(硫醇)二钠
(非对映异构体1)
在实施例3工序23－1所得到的化合物(20.0mg)的N，N－二甲基甲酰胺(0.5mL)溶液中加入三乙胺(17μL)和1－[(羟基乙酰基)氧基]吡咯烷－2，5－二酮(10.3mg)，在室温下搅拌3小时。将反应液用10mM乙酸三乙铵水溶液进行稀释，用C18硅胶柱色谱法[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈]以及制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈，乙腈：10％－30％(0分钟－40分钟)]进行精制。将所得到的化合物(三乙胺盐)以与实施例1工序15－1所述的[转换为钠盐]同样的方法进行盐交换，得到标题化合物(15.6mg)。
MS(ESI)m/z：851(M+H)+.
1H－NMR(CD3OD)δ：8.43(1H，s)，8.40(1H，brs)，7.66(1H，brs)，7.58(1H，s)，6.53(1H，d，J＝16.3Hz)，6.14(1H，d，J＝8.5Hz)，5.73－5.64(1H，m)，5.59－5.42(1H，m)，5.42－5.29(1H，m)，4.80－4.74(1H，m)，4.53－4.26(5H，m)，4.21－4.12(1H，m)，3.99－3.92(1H，m)，3.83(2H，s)，3.66－3.56(1H，m)，3.43－3.26(2H，m)，3.23－3.06(2H，m)，2.89－2.79(1H，m)，2.49－2.33(1H，m)，2.27－2.15(1H，m)，2.15－2.02(1H，m).
31P－NMR(CD3OD)δ：57.0(s)，52.6(s).
(工序1－2)
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－14－(8，9－二氢－6－硫杂－2，3，5－三氮杂苯并[cd]薁－2(7H)－基)－15－氟－16－羟基－7－{1－[2－(2－羟基乙酰胺)乙基]－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基}－2，10－二桥氧八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－双(硫醇)二钠
(非对映异构体2)
使用实施例3工序23－2所得到的化合物(10.0mg)，以与上述工序1－1同样的方法进行反应后，用C18硅胶柱色谱法[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈]以及制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈，乙腈：7％－25％(0分钟－40分钟)]进行精制。将所得到的化合物(三乙胺盐)以与实施例1工序15－1所述的[转换为钠盐]同样的方法进行盐交换，得到标题化合物(6.6mg)。
MS(ESI)m/z：851(M+H)+.
1H－NMR(CD3OD)δ：8.46(1H，s)，8.42(1H，s)，7.84(1H，s)，7.78(1H，s)，6.59(1H，d，J＝15.1Hz)，6.20(1H，d，J＝7.9Hz)，5.69－5.38(3H，m)，4.60－4.50(2H，m)，4.48－4.38(2H，m)，4.31－4.20(2H，m)，4.10－3.93(2H，m)，3.87(2H，s)，3.73－3.57(2H，m)，3.52－3.41(1H，m)，3.25－3.10(2H，m)，3.01－2.90(1H，m)，2.83－2.71(1H，m)，2.30－2.11(2H，m).
31P－NMR(CD3OD)δ：58.2(s)，57.6(s).
实施例5：药物连接子2的合成
[合成路径]
Figure BDA0003831863160001401
(工序1)
按以下的规模实施与实施例1工序7相同的反应(原料：1.40g)。使用所得到的化合物的乙腈溶液和实施例2工序3所得到的化合物(1.41g)，以与实施例1工序12同样的方法进行反应。将所得到的粗产物直接用于接下来的反应。
(工序2)
2－{9－[(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－14－(6－苯甲酰基－6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)－15，16－双{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}－10－(2－氰基乙氧基)－2－桥氧基－2－巯基－10－硫酮八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－7－基]－6－桥氧基－6，9－二氢－1H－嘌呤－1－基}乙基苯甲酸酯
使用上述工序1中得到的粗产物，以与实施例1工序13同样的方法进行反应，得到磷原子上的非对映异构体混合物形式的标题化合物(778mg)。
MS(ESI)m/z：1264(M+H)+.
(工序3)
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－15，16－双{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}－7－[1－(2－羟基乙基)－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基]－2，10－二桥氧基－14－(6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－双(硫醇)双(N，N－二乙基乙铵)
使用上述工序2所得到的化合物(778mg)，以与实施例1工序14同样的方法进行反应，得到标题化合物的非对映异构体1(255mg)和非对映异构体2(含有杂质)。将非对映异构体2用制备型HPLC[水/含有0.2％三乙胺的乙腈，含有0.2％三乙胺的乙腈：5％－50％(0分钟－40分钟)]再次进行精制，得到标题化合物的非对映异构体2(94.6mg)。
非对映异构体1(低极性)
MS(ESI)m/z：1003(M+H)+.
1H－NMR(CD3OD)δ：8.66(1H，s)，8.21(1H，s)，8.04(1H，s)，7.33(1H，s)，6.27(1H，d，J＝5.1Hz)，6.25(1H，d，J＝3.6Hz)，5.39－5.29(1H，m)，5.18－5.11(1H，m)，4.85－4.81(1H，m)，4.79－4.74(1H，m)，4.71－4.66(1H，m)，4.50－4.42(1H，m)，4.36－4.21(2H，m)，4.09－3.98(2H，m)，3.85－3.78(2H，m)，3.78－3.69(2H，m)，3.55－3.46(2H，m)，3.17(12H，q，J＝7.3Hz)，2.98－2.75(2H，m)，2.05－1.88(2H，m)，1.28(18H，t，J＝7.3Hz)，0.98(9H，s)，0.85(9H，s)，0.31(3H，s)，0.27(3H，s)，0.25(3H，s)，0.09(3H，s).
非对映异构体2(高极性)
MS(ESI)m/z：1003(M+H)+.
1H－NMR(CD3OD)δ：8.50(1H，s)，8.22(1H，s)，8.07(1H，s)，7.20(1H，s)，6.33(1H，d，J＝7.3Hz)，6.26(1H，d，J＝9.1Hz)，5.59－5.44(1H，m)，5.38－5.32(1H，m)，5.21－5.11(1H，m)，4.99－4.89(2H，m)，4.68－4.54(2H，m)，4.25－4.12(3H，m)，4.09－4.03(1H，m)，3.90－3.80(3H，m)，3.59－3.51(2H，m)，3.20(12H，q，J＝7.3Hz)，2.96－2.89(2H，m)，2.07－1.98(2H，m)，1.30(18H，t，J＝7.3Hz)，0.99(9H，s)，0.74(9H，s)，0.27(3H，s)，0.27(3H，s)，0.20(3H，s)，－0.05(3H，s).
(工序4－1)
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－15，16－双{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}－7－(1－{2－[(甘氨酰氨基)甲氧基]乙基}－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基)－2，10－二桥氧基－14－(6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－双(硫醇)双(N，N－二乙基乙铵)
(非对映异构体1)
在上述工序3所得到的化合物(非对映异构体1)(30mg)的四氢呋喃(0.5mL)溶液中加入[(N－{[(9H－芴－9－基)甲氧基]羰基}甘氨酰基)氨基]甲基乙酸酯(91.7mg)和对甲苯磺酸一水合物(11.8mg)，在室温下搅拌6小时。在反应液中加入N，N－二甲基甲酰胺(0.5mL)和1，8－二氮杂双环[5.4.0]－7－十一烯(56μL)，在室温下搅拌3小时。在反应液中加入10mM乙酸三乙铵水溶液，用C18硅胶柱色谱法[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈]进行精制，得到包含作为杂质的原料的标题化合物(25.6mg)。
MS(ESI)m/z：1089(M+H)+.
(工序4－2)
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－15，16－双{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}－7－(1－{2－[(甘氨酰氨基)甲氧基]乙基}－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基)－2，10－二桥氧基－14－(6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－双(硫醇)双(N，N－二乙基乙铵)
(非对映异构体2)
使用上述工序3所得到的化合物(非对映异构体2)(84.6mg)，以与上述工序4－1同样的方法进行反应，得到包含作为杂质的原料的标题化合物(70.9mg)。
MS(ESI)m/z：1089(M+H)+.
(工序5－1)
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aS，16R)－7－(1－{2－[(甘氨酰氨基)甲氧基]乙基}－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基)－15，16－二羟基－2，10－二桥氧基－14－(6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－双(硫醇)双(N，N－二乙基乙铵)
非对映异构体1
在上述工序4－1所得到的化合物(25.6mg)中加入三乙胺三氢氟酸盐(2mL)，在45℃下搅拌3小时。在室温下，在反应液中加入冰冷的1M碳酸氢三乙铵溶液(10mL)和三乙胺(2mL)的混合液。将反应液减压浓缩后，用C18硅胶柱色谱法(10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈)进行精制，得到标题化合物(16.6mg：包含来自工序7－1的原料的杂质)。
MS(ESI)m/z：861(M+H)+.
(工序5－2)
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aS，16R)－7－(1－{2－[(甘氨酰氨基)甲氧基]乙基}－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基)－15，16－二羟基－2，10－二桥氧基－14－(6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－双(硫醇)双(N，N－二乙基乙铵)
(非对映异构体2)
使用上述工序4－2所得到的化合物(70.9mg)，以与上述工序5－1同样的方法进行反应，得到标题化合物(51.7mg：包含来自工序4－2的原料的杂质)。
MS(ESI)m/z：861(M+H)+.
(工序6－1)
N－[4－(11，12－二去氢二苯并[b，f]氮杂环辛四稀－5(6H)－基)－4－桥氧基丁酰基]甘氨酰基甘氨酰基－L－苯基丙氨酰基－N－[(2－{9－[(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aS，16R)－15，16－二羟基－2，10－二桥氧基－2，10－二硫醚－14－(6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－7－基]－6－桥氧基－6，9－二氢－1H－嘌呤－1－基}乙氧基)甲基]甘氨酰胺双(N，N－二乙基乙铵)
(药物连接子2a：非对映异构体1)
在上述工序5－1所得到的化合物(16.6mg)的N，N－二甲基甲酰胺(0.5mL)溶液中加入三乙胺(6μL)和后述的工序8所得到的化合物(15.5mg)，在室温下搅拌3小时。在反应液中加入苄基胺(3μL)，在室温下搅拌1小时。加入10mM乙酸三乙铵水溶液和甲醇，用C18硅胶柱色谱法[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈]和制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈，乙腈：10％－45％(0分钟－30分钟)]进行精制，得到标题化合物(5.1mg)。
MS(ESI)m/z：1409(M+H)+.
1H－NMR(CD3OD)δ：8.66－8.60(1H，m)，8.17(1H，s)，8.02(1H，s)，7.65－7.48(2H，m)，7.43－7.36(3H，m)，7.31－7.13(8H，m)，7.11(1H，s)，6.30－6.21(2H，m)，5.46－5.37(1H，m)，5.23－5.16(1H，m)，5.08－4.99(1H，m)，4.86－4.81(1H，m)，4.80－4.75(1H，m)，4.70－4.40(7H，m)，4.40－4.20(3H，m)，4.10－3.97(3H，m)，3.86－3.58(8H，m)，3.51－3.43(3H，m)，3.18(12H，q，J＝7.3Hz)，3.01－2.93(1H，m)，2.85－2.72(3H，m)，2.37－2.15(2H，m)，2.01－1.93(2H，m)，1.29(18H，t，J＝7.3Hz).(仅记载了能够观测到的峰)
(工序6－2)
N－[4－(11，12－二去氢二苯并[b，f]氮杂环辛四稀－5(6H)－基)－4－桥氧基丁酰基]甘氨酰基甘氨酰基－L－苯基丙氨酰基－N－[(2－{9－[(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aS，16R)－15，16－二羟基－2，10－二桥氧基－2，10－二硫醚－14－(6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－7－基]－6－桥氧基－6，9－二氢－1H－嘌呤－1－基}乙氧基)甲基]甘氨酰胺双(N，N－二乙基乙铵)
(药物连接子2b：非对映异构体2)
使用上述工序5－2所得到的化合物(51.7mg)，以与上述工序6－1同样的方法进行反应后，按照以下的[精制条件]进行精制，得到标题化合物(33.7mg)。
[精制条件]C18硅胶柱色谱法[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈]、制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈，乙腈：10％－50％(0分钟－30分钟)]。
MS(ESI)m/z：1409(M+H)+.
1H－NMR(CD3OD)δ：8.73(1H，d，J＝6.7Hz)，8.19(1H，d，J＝3.0Hz)，8.02(1H，s)，7.66－7.50(2H，m)，7.43－7.37(3H，m)，7.33－7.13(8H，m)，7.11(1H，s)，6.33－6.23(2H，m)，5.51－5.38(2H，m)，5.04(1H，t，J＝13.6Hz)，4.83－4.77(1H，m)，4.64－4.55(2H，m)，4.52－4.26(6H，m)，4.25－3.97(2H，m)，3.93－3.45(13H，m)，3.19(12H，q，J＝7.3Hz)，3.17－3.11(1H，m)，3.02－2.92(1H，m)，2.91－2.73(3H，m)，2.40－2.24(2H，m)，2.07－1.95(3H，m)，1.30(18H，t，J＝7.3Hz).
(工序7)
N－[4－(11，12－二去氢二苯并[b，f]氮杂环辛四稀－5(6H)－基)－4－桥氧基丁酰基]甘氨酰基甘氨酰基－L－苯丙氨酸
在市售(BACHEM)的(2S)－2－[[2－[(2－氨基乙酰基)氨基]乙酰基]氨基]－3－苯基丙烷酸(2.86g)的N，N－二甲基甲酰胺(51.2mL)溶液中加入三乙胺(2.56mL)和市售(Click Chemistry Tools)的1－{[4－(11，12－二去氢二苯并[b，f]氮杂环辛四稀－5(6H)－基)－4－桥氧基丁酰基]氧基}吡咯烷－2，5－二酮(3.69g)，在室温下搅拌24小时。在反应液中加入柠檬酸一水合物(24.0g)的水(500mL)溶液，用乙酸乙酯进行萃取。将有机层用无水硫酸钠进行干燥后，滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物溶于乙酸乙酯/乙腈混合溶液后，用二异丙基醚使其析出并滤取，得到标题化合物(4.30g)。
1H－NMR(DMSO－d6)δ：12.8(1H，brs)，8.15－7.95(3H，m)，7.68－7.17(13H，m)，5.01(1H，d，J＝14.2Hz)，4.41－4.37(1H，m)，3.74－3.57(5H，m)，3.05－3.01(1H，m)，2.87(1H，dd，J＝14.2，9.3Hz)，2.68－2.59(1H，m)，2.32－2.25(1H，m)，2.09－2.03(1H，m)，1.82－1.76(1H，m).
(工序8)
N－[4－(11，12－二去氢二苯并[b，f]氮杂环辛四稀－5(6H)－基)－4－桥氧基丁酰基]甘氨酰基甘氨酰基－L－苯基丙氨酸2，5－二桥氧基吡咯烷－1－基酯
在上述工序7所得到的化合物(2.10g)的N，N－二甲基甲酰胺(75.9mL)溶液中加入N－羟基琥珀酰亚胺(961mg)和1－乙基－3－(3－二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(1.60g)，在氮气氛下、室温下搅拌21小时。将反应液用二氯甲烷进行稀释，用冰水清洗3次后，用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。在残留物中加入甲苯，再次进行减压浓缩。将残留物溶于乙腈中，用C18硅胶柱色谱法[乙腈：100％]进行精制。将包含目标物的馏分减压浓缩后，在残留物中加入二异丙基醚制成浆料状。滤取所得到的固体，得到标题化合物(2.59g)。
1H－NMR(DMSO－d6)δ：8.58－8.51(1H，m)，8.17－8.00(2H，m)，7.66－7.20(13H，m)，5.02－4.98(1H，m)，4.90－4.85(1H，m)，3.78－3.57(5H，m)，3.24－3.19(1H，m)，3.06－3.00(1H，m)，2.82(4H，brs)，2.67－2.58(1H，m)，2.32－2.23(1H，m)，2.09－2.02(1H，m)，1.82－1.75(1H，m).
实施例6：药物连接子17的合成
[合成路径]
Figure BDA0003831863160001481
(工序1)乙酸[(N－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}甘氨酰基)氨基]甲酯
在市售(SUNDIA)的N－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}甘氨酰基甘氨酸(9.32g)的四氢呋喃(100mL)－甲苯(33.3mL)混合液中，在室温下加入吡啶(3.26mL)和四乙酸铅(17.9g)，在65℃下搅拌3小时。滤去不溶物，用四氢呋喃进行清洗后，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯]进行精制，得到标题化合物(8.24g)。
1H－NMR(CDCl3)δ：7.14(1H，brs)，5.27(2H，d，J＝7.3Hz)，5.20(1H，brs)，4.22－4.16(2H，m)，3.88(2H，d，J＝6.0Hz)，2.08(3H，s)，1.04－0.97(2H，m)，0.05(9H，s).
(工序2)
2’，3’，5’－三－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]－1－(2－羟基乙基)肌苷
在文献已知(Chem.Pharm.Bull.1987，35(1)，72－79)的2’，3’，5’－三－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]肌苷(31.3g)的四氢呋喃(75mL)－N，N－二甲基乙酰胺(75mL)混合溶液中加入2－溴乙醇(4.82mL)和1，8－二氮杂双环[5.4.0]－7－十一烯(7.65mL)，在室温下搅拌23小时。在反应液中加入水和乙酸乙酯，用乙酸乙酯进行萃取。将有机层用饱和食盐水进行清洗，用无水硫酸钠进行干燥后，滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯]进行精制，得到标题化合物(29.4g)。
MS(ESI)m/z：655(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.16(1H，s)，7.99(1H，d，J＝2.4Hz)，5.97(1H，d，J＝4.2Hz)，4.40－4.25(3H，m)，4.18－4.06(3H，m)，4.03－3.92(2H，m)，3.79(1H，dd，J＝11.5，2.4Hz)，3.08－2.83(1H，brm)，0.96(9H，s)，0.92(9H，s)，0.82(9H，s)，0.15(3H，s)，0.14(3H，s)，0.09(3H，s)，0.08(3H，s)，－0.02(3H，s)，－0.15(3H，s).
(工序3)
2’，3’，5’－三－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]－1－(2－{[(N－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}甘氨酰基)氨基]甲氧基}乙基)肌苷
在上述工序2所得到的化合物(15.6g)的甲苯(46.8mL)溶液中加入上述工序1所得到的化合物(10.4g)和吡啶(9.63mL)，在110℃下搅拌12小时。在反应液中追加上述工序1所得到的化合物(3.46g)，在110℃下搅拌1天。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液和二氯甲烷，用二氯甲烷进行萃取。将有机层用无水硫酸钠进行干燥后，滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯]进行精制，得到标题化合物(20.6g：含有杂质)。
MS(ESI)m/z：885(M+H)+.
(工序4)
5’－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]－1－(2－{[(N－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}甘氨酰基)氨基]甲氧基}乙基)肌苷
在上述工序3所得到的化合物(20.6g)的四氢呋喃(50mL)溶液中加入三乙胺三氢氟酸盐(10mL)，在室温下搅拌17小时。在冰冷却下、在反应液中缓慢加入1M碳酸氢三乙铵溶液(50mL)和三乙胺(10mL)的混合液后，将反应液减压浓缩。将残留物用C18硅胶柱色谱法[水/乙腈]进行粗精制后，冷冻干燥。将所得到的粗产物用吡啶共沸，在残留物的吡啶(50mL)溶液中，在0℃下加入4，4’－二甲氧基三苯甲基氯(4.73g)，在4℃下搅拌17小时。在反应液中加入甲醇(2mL)，在室温下搅拌15分钟后减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[己烷/乙酸乙酯/甲醇/0.1％三乙胺]进行精制，得到标题化合物(9.18g：含有杂质)。
MS(ESI)m/z：845(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：7.94(1H，s)，7.88(1H，s)，7.65(1H，brs)，7.41－7.36(2H，m)，7.32－7.15(7H，m)，6.83－6.76(4H，m)，5.96(1H，d，J＝6.1Hz)，5.73－5.65(2H，m)，4.87－4.80(1H，m)，4.76－4.61(2H，m)，4.44－4.39(1H，m)，4.35－4.30(1H，m)，4.22－4.05(4H，m)，3.83－3.73(2H，m)，3.77(6H，s)，3.72－3.67(2H，m)，3.48－3.32(3H，m)，0.99－0.91(2H，m)，0.02(9H，s).
(工序5)
5’－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]－3’－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]－1－(2－{[(N－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}甘氨酰基)氨基]甲氧基}乙基)肌苷
使用上述工序4所得到的化合物(5.96g)，以与实施例1工序10同样的方法进行反应，得到标题化合物(2.33g)和标题化合物的位置异构体即5’－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]－2’－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]－1－(2－{[(N－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}甘氨酰基)氨基]甲氧基}乙基)肌苷(2.45g)。
MS(ESI)m/z：959(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：7.99(1H，s)，7.93(1H，s)，7.45－7.39(2H，m)，7.35－7.18(7H，m)，7.05(1H，brs)，6.84－6.77(4H，m)，5.92(1H，d，J＝5.4Hz)，5.46(1H，brs)，4.71－4.61(3H，m)，4.54－4.51(1H，m)，4.22－4.10(5H，m)，3.81－3.76(2H，m)，3.78(3H，s)，3.78(3H，s)，3.74(2H，d，J＝6.0Hz)，3.48(1H，dd，J＝10.9，4.2Hz)，3.26(1H，dd，J＝10.9，4.2Hz)，3.16(1H，d，J＝6.7Hz)，1.00－0.93(2H，m)，0.89(9H，s)，0.09(3H，s)，0.02(9H，s)，0.02(3H，s).
位置异构体(2’－O－TBS体)
MS(ESI)m/z：959(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：7.99(1H，s)，7.91(1H，s)，7.48－7.42(2H，m)，7.37－7.18(8H，m)，6.85－6.78(4H，m)，5.96(1H，d，J＝5.4Hz)，5.63(1H，brs)，4.88(1H，t，J＝5.1Hz)，4.66(2H，d，J＝6.7Hz)，4.36－4.32(1H，m)，4.27－4.19(2H，m)，4.18－4.10(3H，m)，3.81－3.74(4H，m)，3.78(3H，s)，3.78(3H，s)，3.50(1H，dd，J＝10.9，3.6Hz)，3.38(1H，dd，J＝10.9，3.6Hz)，2.73(1H，d，J＝4.2Hz)，0.97－0.90(2H，m)，0.86(9H，s)，0.02(3H，s)，0.01(9H，s)，－0.09(3H，s).
(工序6)
5’－O－[双(4－甲氧基苯基)(苯基)甲基]－3’－O－[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]－2’－O－{(2－氰基乙氧基)[二(丙烷－2－基)氨基]膦基}－1－(2－{[(N－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}甘氨酰基)氨基]甲氧基}乙基)肌苷
使用上述工序5所得到的化合物(2.33g)，以与实施例1工序11同样的方法进行反应，得到磷原子上的非对映异构体混合物(非对映异构体比＝6：4)形式的标题化合物(2.72g)。
MS(ESI)m/z：1159(M+H)+.
1H－NMR(CDCl3)δ：8.03(0.4H，s)，8.02(0.6H，s)，7.95(0.6H，s)，7.92(0.4H，s)，7.46－7.40(2H，m)，7.35－7.17(7H，m)，6.88(1H，brs)，6.84－6.78(4H，m)，6.15(0.6H，d，J＝4.2Hz)，6.10(0.4H，d，J＝4.8Hz)，5.34(1H，brs)，4.86－4.61(3H，m)，4.48－4.42(1H，m)，4.29－4.09(5H，m)，3.83－3.44(9H，m)，3.79(3H，s)，3.78(3H，s)，3.32－3.23(1H，m)，2.58－2.49(1H，m)，2.44－2.38(1H，m)，1.15(3.6H，d，J＝6.7Hz)，1.11(6H，d，J＝6.7Hz)，1.04－0.92(2H，m)，0.97(2.4H，d，J＝6.7Hz)，0.85(3.6H，s)，0.84(5.4H，s)，0.09(1.2H，s)，0.06(1.8H，s)，0.03(9H，s)，0.00(3H，s).
(工序7)
使用实施例2工序11所得到的化合物(2.15g)，以与实施例1工序7同样的方法进行反应，得到6－苯甲酰基－2－{2－脱氧基－2－氟－3－O－[羟基(桥氧基)－λ5－膦基]－β－D－呋喃核糖基}－6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁的乙腈溶液。使用所得到的乙腈溶液和上述工序6所得到的化合物(2.72g)以与实施例1工序12同样的方法进行反应，将所得到的粗产物直接用于接下来的反应。
(工序8)
(2－{[(2－{9－[(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－14－(6－苯甲酰基－6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)－16－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}－10－(2－氰基乙氧基)－15－氟－2－桥氧基－2－巯基－10－硫酮八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－7－基]－6－桥氧基－6，9－二氢－1H－嘌呤－1－基}乙氧基)甲基]氨基}－2－桥氧基乙基)氨基甲酸2－(三甲基甲硅烷基)乙酯
使用上述工序7所得到的粗产物，以与实施例1工序13同样的方法进行反应，得到磷原子上的非对映异构体混合物形式的标题化合物(1.47g：含有杂质)。
MS(ESI)m/z：1278(M+H)+.
(工序9)
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－16－{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}－15－氟－2，10－二桥氧基－7－[6－桥氧基－1－(2－{[(N－{[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}甘氨酰基)氨基]甲氧基}乙基)－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基]－14－(6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－双(硫醇)双(N，N－二乙基乙铵)
在上述工序8所得到的化合物(1.47g)的甲醇(10mL)－四氢呋喃(10mL)混合溶液中加入28％氨水(10mL)，在50℃下搅拌6小时。将反应液减压浓缩后，将残留物用C18硅胶柱色谱法[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈]进行精制，得到标题化合物的非对映异构体1(204mg：含有杂质)和非对映异构体2(205mg：含有杂质)。
非对映异构体1(低极性)
MS(ESI)m/z：1121(M+H)+.
非对映异构体2(高极性)
MS(ESI)m/z：1121(M+H)+.
(工序10－1)
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－15－氟－7－(1－{2－[(甘氨酰氨基)甲氧基]乙基}－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基)－16－羟基－2，10－二桥氧基－14－(6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－双(硫醇)双(N，N－二乙基乙铵)
在上述工序9所得到的化合物(非对映异构体1)(204mg)的四氢呋喃(6mL)溶液中加入四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(约1M，3mL)，在室温下搅拌33小时。在4℃下保存3天后，在反应液中加入10mM乙酸三乙铵水溶液，用C18硅胶柱色谱法[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈]和制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈－甲醇溶液(1：1)，乙腈－甲醇溶液(1：1)：10％－50％(0分钟－40分钟)]进行精制，得到标题化合物(40.7mg：含有杂质)。
MS(ESI)m/z：863(M+H)+.
(工序10－2)
(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－15－氟－7－(1－{2－[(甘氨酰氨基)甲氧基]乙基}－6－桥氧基－1，6－二氢－9H－嘌呤－9－基)－16－羟基－2，10－二桥氧基－14－(6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－2，10－双(硫醇)双(N，N－二乙基乙铵)
使用上述工序9所得到的化合物(非对映异构体2)(205mg)，以与上述工序10－1同样的方法进行反应后，用C18硅胶柱色谱法[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈]和制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈－甲醇溶液(1：1)，乙腈－甲醇溶液(1：1)：10％－50％(0分钟－40分钟)]进行精制，得到标题化合物(50.8mg：含有杂质)。
MS(ESI)m/z：863(M+H)+.
(工序11－1)
N－[4－(11，12－二去氢二苯并[b，f]氮杂环辛四稀－5(6H)－基)－4－桥氧基丁酰基]甘氨酰基甘氨酰基－L－苯基丙氨酰基－N－[(2－{9－[(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－15－氟－16－羟基－2，10－二桥氧基－2，10－二硫醚－14－(6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－7－基]－6－桥氧基－6，9－二氢－1H－嘌呤－1－基}乙氧基)甲基]甘氨酰胺双(N，N－二乙基乙铵)
(药物连接子17a：非对映异构体1)
在上述工序10－1所得到的化合物(40.7mg)的N，N－二甲基甲酰胺(0.5mL)溶液中加入三乙胺(11μL)和实施例5工序8所得到的化合物(25.4mg)，在室温下搅拌2小时。在反应液中加入苄基胺(8μL)，在室温下搅拌1小时。加入10mM乙酸三乙铵水溶液和甲醇，用C18硅胶柱色谱法[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈]、制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈，乙腈：20％－45％(0分钟－40分钟)]、以及制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/甲醇，甲醇：40％－90％(0分钟－40分钟)]进行精制，得到标题化合物(25.1mg)。
MS(ESI)m/z：1411(M+H)+.
1H－NMR(CD3OD)δ：8.58(1H，s)，8.09(1H，s)，8.04(1H，s)，7.57－7.49(2H，m)，7.43－7.34(3H，m)，7.32－7.08(9H，m)，6.47(1H，d，J＝16.9Hz)，6.23(1H，d，J＝7.9Hz)，5.56－5.37(2H，m)，5.31－5.17(1H，m)，5.03(1H，d，J＝13.9Hz)，4.79(1H，d，J＝4.2Hz)，4.64－4.38(6H，m)，4.36－4.21(4H，m)，4.05－3.60(10H，m)，3.53－3.42(3H，m)，3.18(12H，q，J＝7.3Hz)，3.01－2.92(1H，m)，2.86－2.73(1H，m)，2.70－2.54(2H，m)，2.37－2.16(2H，m)，2.06－1.77(3H，m)，1.28(18H，t，J＝7.3Hz).
(工序11－2)
N－[4－(11，12－二去氢二苯并[b，f]氮杂环辛四稀－5(6H)－基)－4－桥氧基丁酰基]甘氨酰基甘氨酰基－L－苯基丙氨酰基－N－[(2－{9－[(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－15－氟－16－羟基－2，10－二桥氧基－2，10－二硫醚－14－(6，7，8，9－四氢－2H－2，3，5，6－四氮杂苯并[cd]薁－2－基)八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－7－基]－6－桥氧基－6，9－二氢－1H－嘌呤－1－基}乙氧基)甲基]甘氨酰胺双(N，N－二乙基乙铵)
(药物连接子17b：非对映异构体2)
使用上述工序10－2所得到的化合物(50.8mg)和实施例5工序8所得到的化合物(31.7mg)，以与上述工序11－1同样的方法进行反应后，用C18硅胶柱色谱法[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈]、制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈，乙腈：25％－45％(0分钟－40分钟)]、以及制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/甲醇，甲醇：45％－90％(0分钟－40分钟)]进行精制，得到标题化合物(23.4mg)。
MS(ESI)m/z：1411(M+H)+.
1H－NMR(CD3OD)δ：8.67(1H，s)，8.14(1H，s)，8.02(1H，s)，7.67－7.50(2H，m)，7.43－7.36(3H，m)，7.34－7.12(9H，m)，6.48(1H，d，J＝15.1Hz)，6.26(1H，t，J＝8.8Hz)，5.60－5.31(3H，m)，5.09－5.00(1H，m)，4.61－4.22(9H，m)，4.11－3.59(13H，m)，3.50－3.44(2H，m)，3.18(12H，q，J＝7.3Hz)，3.04－2.93(1H，m)，2.87－2.74(3H，m)，2.39－2.22(2H，m)，2.06－1.85(3H，m)，1.28(18H，t，J＝7.3Hz).
实施例7：药物连接子20的合成
[合成路径]
Figure BDA0003831863160001561
(工序1)
N－(铵基乙酰基)甘氨酰基－L－苯基丙氨酰基甘氨酸三氟乙酸酯
在市售(BACHEM)的N－(叔丁氧基羰基)甘氨酰基甘氨酰基－L－苯基丙氨酰基甘氨酸(3.00g)的二氯甲烷(30mL)溶液中，在室温下加入三氟乙酸(15mL)，在相同温度下搅拌3小时。将反应液减压浓缩后悬浮于甲苯中，再次进行减压浓缩。进一步重复2次该浓缩操作。将残留物用二乙基醚(100mL)制成浆料状后，滤取而得到标题化合物(3.27g)的粗产物。
MS(ESI)m/z：337(M+H)+.
1H－NMR(DMSO－d6)δ：12.60(1H，brs)，8.48(1H，t，J＝5.6Hz)，8.44(1H，t，J＝5.9Hz)，8.31(1H，d，J＝8.8Hz)，7.97(3H，brs)，7.28－7.16(5H，m)，4.58(1H，m)，3.87(1H，dd，J＝16.8，5.6Hz)，3.78(2H，d，J＝5.9Hz)，3.67(1H，dd，J＝17.1，5.4Hz)，3.56(2H，brd，J＝4.4Hz)，3.05(1H，dd，J＝13.7，3.9Hz)，2.74(1H，dd，J＝13.7，10.3Hz).
(工序2)
N－[4－(11，12－二去氢二苯并[b，f]氮杂环辛四稀－5(6H)－基)－4－桥氧基丁酰基]甘氨酰基甘氨酰基－L－苯基丙氨酰基甘氨酸
在上述工序1所得到的化合物(2.09g)的N，N－二甲基甲酰胺(46.4mL)溶液中加入三乙胺(0.804mL)和1－{[4－(11，12－二去氢二苯并[b，f]氮杂环辛四稀－5(6H)－基)－4－桥氧基丁酰基]氧基}吡咯烷－2，5－二酮(1.87g)，在室温下搅拌21小时。将反应液减压浓缩，将残留物用硅胶柱色谱法[二氯甲烷/甲醇]进行精制。在所得到的化合物的二氯甲烷溶液中加入二乙基醚制成浆料状后，滤取而得到标题化合物(2.10g)。
MS(ESI)m/z：624(M+H)+.
1H－NMR(DMSO－d6)δ：8.20－7.91(4H，m)，7.68－7.13(13H，m)，4.98(1H，dd，J＝13.9，3.2Hz)，4.51－4.46(1H，m)，3.73－3.47(7H，m)，3.00(1H，dd，J＝13.9，4.1Hz)，2.73(1H，t，J＝11.7Hz)，2.67－2.57(1H，m)，2.29－2.22(1H，m)，2.06－2.01(1H，m)，1.80－1.73(1H，m).(仅记载了能观测到的峰)
(工序3)
N－[4－(11，12－二去氢二苯并[b，f]氮杂环辛四稀－5(6H)－基)－4－桥氧基丁酰基]甘氨酰基甘氨酰基－L－苯基丙氨酰基甘氨酸2，5－二桥氧基吡咯烷－1－基酯
在上述工序2所得到的化合物(2.10g)的N，N－二甲基甲酰胺(33.7mL)溶液中加入N－羟基琥珀酰亚胺(426mg)和1－乙基－3－(3－二甲基氨基丙基)－碳二亚胺盐酸盐(710mg)，在氮气氛下，在室温下搅拌16小时。将反应液用二氯甲烷稀释后，用冰水清洗3次，用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。在油状的残留物中加入乙酸乙酯使固体析出。将溶剂在减压下蒸馏除去，在所得到的固体中加入二乙基醚制成浆料状后，滤取而得到标题化合物(2.18g)。
1H－NMR(DMSO－d6)δ：8.74－8.69(1H，m)，8.16－8.08(2H，m)，8.00－7.93(1H，m)，7.71－7.15(13H，m)，5.00(1H，dd，J＝13.9，3.0Hz)，4.55－4.49(1H，m)，4.27(2H，t，J＝6.0Hz)，3.77－3.68(1H，m)，3.64－3.50(4H，m)，3.02(1H，dd，J＝13.9，4.2Hz)，2.82－2.73(5H，m)，2.69－2.58(1H，m)，2.33－2.24(1H，m)，2.10－2.02(1H，m)，1.83－1.75(1H，m).
(工序4)
N－[4－(11，12－二去氢二苯并[b，f]氮杂环辛四稀－5(6H)－基)－4－桥氧基丁酰基]甘氨酰基甘氨酰基－L－苯基丙氨酰基－N－(2－{9－[(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－14－(8，9－二氢－6－硫杂－2，3，5－三氮杂苯并[cd]薁－2(7H)－基)－15－氟－16－羟基－2，10－二桥氧基－2，10－二硫醚八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－7－基]－6－桥氧基－6，9－二氢－1H－嘌呤－1－基}乙基)甘氨酰胺双(N，N－二乙基乙铵)
(药物连接子20)
在实施例3工序23－2所得到的化合物(25.0mg)的N，N－二甲基甲酰胺(0.5mL)溶液中加入三乙胺(8μL)和上述工序3所得到的化合物(25.8mg)，在室温下搅拌2小时。在反应液中加入苄基胺(7μL)，在室温下搅拌1小时。在反应液中加入10mM乙酸三乙铵水溶液和甲醇，用C18硅胶柱色谱法[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈]、制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈，乙腈：30％－50％(0分钟－40分钟)]、以及制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/甲醇，甲醇：50％－90％(0分钟－40分钟)]进行精制，得到标题化合物(33.1mg)。
MS(ESI)m/z：1398(M+H)+.
1H－NMR(CD3OD)δ：8.58(1H，brs)，8.39(1H，d，J＝8.5Hz)，8.00(1H，brs)，7.71(1H，brs)，7.64－7.49(2H，m)，7.44－7.37(3H，m)，7.32－7.10(8H，m)，6.59(1H，d，J＝15.1Hz)，6.23(1H，d，J＝8.5Hz)，5.65－5.36(3H，m)，5.03(1H，dd，J＝16.6，14.2Hz)，4.57－4.38(5H，m)，4.30－4.17(2H，m)，4.07－3.95(2H，m)，3.94－3.50(9H，m)，3.50－3.35(1H，m)，，3.19(12H，q，J＝7.3Hz)，3.18－3.07(3H，m)，3.04－2.73(4H，m)，2.40－2.11(4H，m)，2.05－1.92(1H，m)，1.29(18H，t，J＝7.3Hz).
实施例8：药物连接子21的合成
[合成路径]
Figure BDA0003831863160001601
(工序1)
N－[4－(11，12－二去氢二苯并[b，f]氮杂环辛四稀－5(6H)－基)－4－桥氧基丁酰基]甘氨酰基甘氨酰基－L－苯基丙氨酰基－N－({2－[(2，5－二桥氧基吡咯烷－1－基)氧基]－2－桥氧基乙氧基}甲基)甘氨酰胺
在文献已知(WO2014/057687)的{[(N－{[(9H－芴－9－基)甲氧基]羰基}甘氨酰基)氨基]甲氧基}乙酸(955mg)的N，N－二甲基甲酰胺(8.0mL)溶液中加入1，8－二氮杂双环[5.4.0]－7－十一烯(0.74mL)，在室温下搅拌1小时(反应液A)。在实施例5工序7所得到的化合物(938mg)的N，N－二甲基甲酰胺(8.0mL)溶液中加入N－羟基琥珀酰亚胺(229mg)和1－乙基－3－(3－二甲基氨基丙基)－碳二亚胺盐酸盐(380mg)，在室温下搅拌50分钟(反应液B)。将反应液A加入反应液B中，在室温下搅拌1小时。在反应液中加入二氯甲烷(50mL)和10％柠檬酸水溶液(10mL)，用二氯甲烷进行萃取。将有机层用饱和食盐水进行清洗后，用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[氯仿/(氯仿/甲醇/水＝7：3：1的下层)]进行精制。在所得到的化合物的N，N－二甲基甲酰胺(8.0mL)溶液中加入N－羟基琥珀酰亚胺(229mg)和1－乙基－3－(3－二甲基氨基丙基)－碳二亚胺盐酸盐(380mg)，在室温下搅拌30分钟。在反应液中加入二氯甲烷(100mL)和水(25mL)，用二氯甲烷进行萃取。将有机层用饱和食盐水进行清洗后，用无水硫酸钠进行干燥。滤去干燥剂，将滤液减压浓缩。将残留物用硅胶柱色谱法[氯仿/甲醇]进行精制。将包含目标物的馏分减压浓缩，在残留物中加入二乙基醚制成浆料状。滤取所得到的固体，得到标题化合物(412mg)。
1H－NMR(DMSO－d6)δ：8.72(1H，m)，8.32(1H，m)，8.17－7.96(3H，m)，7.71－7.15(13H，m)，5.01(1H，d，J＝13.9Hz)，4.70－4.48(5H，m)，3.81－3.51(7H，m)，3.05(1H，dd，J＝14.2，3.9Hz)，2.83(4H，s)，2.80(1H，m)，2.64(1H，m)，2.28(1H，m)，2.07(1H，m)，1.79(1H，m).
(工序2)
N－[4－(11，12－二去氢二苯并[b，f]氮杂环辛四稀－5(6H)－基)－4－桥氧基丁酰基]甘氨酰基甘氨酰基－L－苯基丙氨酰基－N－({2－[(2－{9－[(5R，7R，8R，12aR，14R，15R，15aR，16R)－14－(8，9－二氢－6－硫杂－2，3，5－三氮杂苯并[cd]薁－2(7H)－基)－15－氟－16－羟基－2，10－二桥氧基－2，10－二硫醚八氢－2H，10H，12H－5，8－甲桥－2λ5，10λ5－呋喃并[3，2－l][1，3，6，9，11，2，10]五氧杂二膦环十四炔－7－基]－6－桥氧基－6，9－二氢－1H－嘌呤－1－基}乙基)氨基]－2－桥氧基乙氧基}甲基)甘氨酰胺双(N，N－二乙基乙铵)
(药物连接子21)
使用实施例3工序23－2所得到的化合物(15.0mg)和上述工序1所得到的化合物(17.4mg)，以与实施例7工序4同样的方法进行反应后，用C18硅胶柱色谱法[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈]、制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/乙腈，乙腈：25％－50％(0分钟－40分钟)]、以及制备型HPLC[10mM乙酸三乙铵水溶液/甲醇，甲醇：40％－90％(0分钟－40分钟)]进行精制，得到标题化合物(21.8mg)。
MS(ESI)m/z：1485(M+H)+.
1H－NMR(CD3OD)δ：8.61(1H，brs)，8.41－8.34(1H，m)，8.10－8.05(1H，m)，7.72－7.37(6H，m)，7.32－7.12(8H，m)，6.63－6.50(1H，m)，6.27－6.22(1H，m)，5.65－5.31(3H，m)，5.07－4.94(1H，m)，4.68－4.20(10H，m)，4.11－3.53(14H，m)，3.26－3.08(2H，m)，3.19(12H，q，J＝7.3Hz)，3.06－2.67(4H，m)，2.40－2.11(4H，m)，2.05－1.88(1H，m)，1.29(18H，t，J＝7.3Hz).
实施例9：糖链重构抗体1的合成
抗Trop2抗体1－[SG－(N3)2]2的制备
[合成路径]
Figure BDA0003831863160001621
(工序1)
(Fucα1，6)GlcNAc－抗Trop2抗体1的制备
在根据参考例5制备的抗Trop2抗体1的磷酸缓冲生理食盐水溶液(6.0mL，16.55mg/mL，pH6.0)中加入野生型EndoS的磷酸缓冲生理食盐水溶液(0.064mL，7.70mg/mL，pH6.0)，在37℃下震荡2小时。用Experion电泳工作站(BIO－RAD制)确认反应的进度。反应结束后，依照以下的方法进行基于亲和色谱法的精制和基于羟基磷灰石柱色谱的精制。
(1)基于亲和色谱法的精制
精制装置：AKTA avant 25(GE HEALTH CARE制)
柱：HiTrap rProtein A FF(5mL)(GE HEALTH CARE制)
流速：5mL/min(装填时为1.25mL/min)
在与柱结合时，将反应液直接添加至柱中，使结合缓冲液[20mM磷酸缓冲液(pH6.0)]以1.25mL/min流入2CV(Column Volume：柱容积)，进而以5mL/min流入5CV。中间清洗时，使清洗溶液[20mM磷酸缓冲液(pH7.0)，0.5M氯化钠溶液]流入15CV。在洗脱时，使洗脱缓冲液(ImmunoPure IgG Elution buffer、PIERCE制)流入6CV。将洗脱液立即用1M Tris缓冲液(pH9.0)中和。依照共通操作C所述的方法对包含目标物的馏分进行与5mM磷酸缓冲液、50mM 2－吗啉乙磺酸(MES)溶液(pH6.8)的缓冲液交换。依照共通操作B所述的方法测定所得到的缓冲液的抗体浓度，得到粗精制的标题抗体溶液(12.38mg/mL，8mL)。
(2)基于羟基磷灰石色谱法的精制
精制装置：AKTA avant 25(GE HEALTH CARE制)
柱：Bio－Scale Mini CHT Type I管(5mL)(BIO－RAD制)
流速：5mL/min(装填时为1.25mL/min)
将上述(1)中得到的溶液添加到柱中，使A液[5mM磷酸缓冲液，50mM MES溶液(pH6.8)]以1.25mL/min流入2CV，进而以5mL/min流入3CV。之后，使用A液和B液[5mM磷酸缓冲液，50mM MES溶液(pH6.8)、2M氯化钠溶液]进行洗脱。洗脱条件为A液：B液＝100：0～0：100(5CV)。而且，使清洗溶液[500mM磷酸缓冲液(pH6.5)]流入5CV。依照共通操作C所述的方法，对包含目标物的馏分进行与20mM磷酸缓冲液(pH6.0)的缓冲液交换。依照共通操作B所述的方法，测定所得到的缓冲液的抗体浓度，得到标题抗体溶液(12.30mg/mL，8mL)。
(工序2)
抗Trop2抗体1－[SG－(N3)2]2的制备
在上述工序1中得到的抗体的20mM磷酸缓冲液(12.30mg/mL，8mL，pH6.0)中加入[N3－PEG(3)]2－SG(10)Ox(WO2018/003983的化合物1－10)(22.7mg)和EndoS(D233Q/Q303L)的磷酸缓冲生理食盐水溶液(0.339mL，5.8mg/mL，pH6.0)，在30℃下震荡4.5小时。用Experion电泳工作站(BIO－RAD制)确认反应的进度。反应结束后，与上述工序1同样地进行基于亲和色谱法的精制和基于羟基磷灰石色谱法的精制。依照共通操作C所述的方法，对包含目标物的馏分进行与磷酸缓冲生理食盐水(pH6.0)的缓冲液交换。依照共通操作B所述的方法，测定所得到的缓冲液的抗体浓度，得到标题抗体溶液(10.24mg/mL，9mL)。
实施例10：糖链重构抗体2的合成
改造抗Trop2抗体－[SG－(N3)2]2的制备
[合成路径]
Figure BDA0003831863160001641
(工序1)
(Fucα1，6)GlcNAc－改造抗Trop2抗体的制备
使用依照参考例6制备的改造抗Trop2抗体的磷酸缓冲生理食盐水溶液(10mL，16.75mg/mL，pH6.0)，进行与实施例9工序1同样的操作，得到标题抗体的20mM磷酸缓冲液(18.11mg/mL，7.5mL，pH6.0)。
(工序2)
改造抗Trop2抗体－[SG－(N3)2]2的制备
使用上述工序1中得到的抗体的20mM磷酸缓冲液(18.11mg/mL，7.5mL，pH6.0)和[N3－PEG(3)]2－SG(10)Ox(32mg)，进行与实施例9工序2同样的操作，得到标题抗体的磷酸缓冲生理食盐水溶液(11.03mg/mL，10.5mL，pH6.0)。
实施例11：糖链重构抗体3的合成
改造抗CD70抗体1－[SG－(N3)2]2的制备
[合成路径]
Figure BDA0003831863160001651
(工序1)
(Fucα1，6)GlcNAc－改造抗CD70抗体1的制备
使用依照参考例3制备的改造抗CD70抗体1的磷酸缓冲生理食盐水溶液(3.0mL，16.11mg/mL，pH6.0)，进行与实施例9工序1同样的操作，得到标题抗体的20mM磷酸缓冲液(6.41mg/mL，5.5mL，pH6.0)。
(工序2)
改造抗CD70抗体1－[SG－(N3)2]2的制备
使用上述工序1中得到的抗体的20mM磷酸缓冲液(6.41mg/mL，5.5mL，pH6.0)和[N3－PEG(3)]2－SG(10)Ox(10mg)，进行与实施例9工序2同样的操作，得到标题抗体的磷酸缓冲生理食盐水溶液(9.24mg/mL，3.25mL，pH6.0)。
实施例12：糖链重构抗体4的合成
改造抗CD70抗体2－[SG－(N3)2]2的制备
[合成路径]
Figure BDA0003831863160001652
(工序1)
(Fucα1，6)GlcNAc－改造抗CD70抗体2的制备
使用依照参考例4制备的改造抗CD70抗体2的磷酸缓冲生理食盐水溶液(10.0mL，14.00mg/mL，pH6.0)，进行与实施例9工序1同样的操作，得到标题抗体的20mM磷酸缓冲液(18.67mg/mL，6mL，pH6.0)。
(工序2)
改造抗CD70抗体2－[SG－(N3)2]2的制备
使用上述工序1中得到的抗体的20mM磷酸缓冲液(18.67mg/mL，6mL，pH6.0)和[N3－PEG(3)]2－SG(10)Ox(26mg)，进行与实施例9工序2同样的操作，得到标题抗体的磷酸缓冲生理食盐水溶液(11.39mg/mL，7.5mL，pH6.0)。
实施例13：糖链重构抗体5的合成
改造抗EGFR抗体1－[SG－(N3)2]2的制备
[合成路径]
Figure BDA0003831863160001661
(工序1)
(Fucα1，6)GlcNAc－改造抗EGFR抗体1的制备
使用依照参考例7制备的改造抗EGFR抗体1的磷酸缓冲生理食盐水溶液(10.0mL，14.00mg/mL，pH6.0)，进行与实施例9工序1同样的操作，得到标题抗体的20mM磷酸缓冲液(16.70mg/mL，7.5mL，pH6.0)。
(工序2)
改造抗EGFR抗体1－[SG－(N3)2]2的制备
使用上述工序1中得到的抗体的20mM磷酸缓冲液(16.70mg/mL，7.5mL，pH6.0)和[N3－PEG(3)]2－SG(10)Ox(29mg)，进行与实施例9工序2同样的操作，得到标题抗体的磷酸缓冲生理食盐水溶液(10.49mg/mL，10mL，pH6.0)。
实施例14：糖链重构抗体6的合成
改造抗EGFR抗体2－[SG－(N3)2]2的制备
[合成路径]
Figure BDA0003831863160001671
(工序1)
(Fucα1，6)GlcNAc－改造抗EGFR抗体2的制备
使用依照参考例8制备的改造抗EGFR抗体2的磷酸缓冲生理食盐水溶液(10.0mL，14.10mg/mL，pH6.0)，进行与实施例9工序1同样的操作，得到标题抗体的20mM磷酸缓冲液(16.88mg/mL，6mL，pH6.0)。
(工序2)
改造抗EGFR抗体2－[SG－(N3)2]2的制备
使用上述工序1中得到的抗体的20mM磷酸缓冲液(16.88mg/mL，6mL，pH6.0)和[N3－PEG(3)]2－SG(10)Ox(23mg)，进行与实施例9工序2同样的操作，得到标题抗体的磷酸缓冲生理食盐水溶液(8.34mg/mL，6.75mL，pH6.0)。
实施例15：抗体药物偶联物1的合成(抗Trop2抗体1－CDN偶联物(1)的合成)
将糖链重构抗体1的磷酸缓冲生理食盐水(pH6.0)溶液(10.24mg/mL，0.500mL)用丙二醇(0.250mL)进行稀释。在该溶液中加入药物连接子2b的二甲基亚砜溶液(10mM，0.085mL，相对于一分子抗体为24当量)和丙二醇(0.165mL)的混合液，使用试管旋转器(MTR－103，AS ONE株式会社)在室温下反应2天。依照共通操作D所述的方法对反应液进行精制，得到目标抗体药物偶联物的ABS溶液(3.5mL)。
依照共通操作E和G所述的方法进行分析，得到下述结果。
抗体浓度：0.89mg/mL
抗体产量：3.12mg(62％)
药物平均结合数：3.7
实施例16：抗体药物偶联物2的合成(抗Trop2抗体2－CDN偶联物(1)的合成)
将糖链重构抗体2的磷酸缓冲生理食盐水(pH6.0)溶液(11.03mg/mL，1.00mL)用丙二醇(0.500mL)进行稀释。在该溶液中加入药物连接子17a的二甲基亚砜溶液(10mM，0.061mL，相对于一分子抗体为8当量)和丙二醇(0.439mL)的混合液，使用试管旋转器(MTR－103，AS ONE株式会社)在室温下反应2天。依照共通操作D所述的方法对反应液进行精制，得到目标抗体药物偶联物的ABS溶液(6.5mL)。
依照共通操作E和G所述的方法进行分析，得到下述结果。
抗体浓度：1.26mg/mL
抗体产量：8.16mg(74％)
药物平均结合数：3.5
实施例17：抗体药物偶联物3的合成(抗Trop2抗体2－CDN偶联物(2)的合成)
将糖链重构抗体2的磷酸缓冲生理食盐水(pH6.0)溶液(11.03mg/mL，1.00mL)用丙二醇(0.500mL)进行稀释。在该溶液中加入药物连接子20的二甲基亚砜溶液(10mM，0.061mL，相对于一分子抗体为8当量)和丙二醇(0.439mL)的混合液，使用试管旋转器(MTR－103，AS ONE株式会社)在室温下反应2天。依照共通操作D所述的方法对反应液进行精制，得到目标抗体药物偶联物的ABS溶液(6.5mL)。
依照共通操作E和G所述的方法进行分析，得到下述结果。
抗体浓度：1.30mg/mL
抗体产量：8.45mg(77％)
药物平均结合数：3.5
实施例18：抗体药物偶联物4的合成(抗Trop2抗体2－CDN偶联物(3)的合成)
将糖链重构抗体2的磷酸缓冲生理食盐水(pH6.0)溶液(11.03mg/mL，1.00mL)用丙二醇(0.500mL)进行稀释。在该溶液中加入药物连接子21的二甲基亚砜溶液(10mM，0.061mL，相对于一分子抗体为8当量)和丙二醇(0.439mL)的混合液，使用试管旋转器(MTR－103，AS ONE株式会社)在室温下反应2天。依照共通操作D所述的方法对反应液进行精制，得到目标抗体药物偶联物的ABS溶液(6.5mL)。
依照共通操作E和G所述的方法进行分析，得到下述结果。
抗体浓度：1.33mg/mL
抗体产量：8.62mg(78％)
药物平均结合数：3.6
实施例19：抗体药物偶联物5的合成(抗CD70抗体1－CDN偶联物(1)的合成)
将糖链重构抗体3的磷酸缓冲生理食盐水(pH6.0)溶液(9.24mg/mL，1.00mL)用丙二醇(0.500mL)进行稀释。在该溶液中加入药物连接子17a的二甲基亚砜溶液(10mM，0.051mL，相对于一分子抗体为8当量)和丙二醇(0.449mL)的混合液，使用试管旋转器(MTR－103，AS ONE株式会社)在室温下反应2天。依照共通操作D所述的方法对反应液进行精制，得到目标抗体药物偶联物的ABS溶液(6.5mL)。
依照共通操作E和G所述的方法进行分析，得到下述结果。
抗体浓度：1.08mg/mL
抗体产量：7.02mg(76％)
药物平均结合数：3.8
实施例20：抗体药物偶联物6的合成(抗CD70抗体2－CDN偶联物(1)的合成)
将糖链重构抗体4的磷酸缓冲生理食盐水(pH6.0)溶液(11.39mg/mL，1.00mL)用丙二醇(0.500mL)进行稀释。在该溶液中加入药物连接子17a的二甲基亚砜溶液(10mM，0.063mL，相对于一分子抗体为8当量)和丙二醇(0.437mL)的混合液，使用试管旋转器(MTR－103，AS ONE株式会社)在室温下反应2天。依照共通操作D所述的方法对反应液进行精制，得到目标抗体药物偶联物的ABS溶液(6.5mL)。
依照共通操作E和G所述的方法进行分析，得到下述结果。
抗体浓度：1.33mg/mL
抗体产量：8.65mg(76％)
药物平均结合数：3.7
实施例21：抗体药物偶联物7的合成(抗EGFR抗体1－CDN偶联物(1)的合成)
将糖链重构抗体5的磷酸缓冲生理食盐水(pH6.0)溶液(10.49mg/mL，1.00mL)用丙二醇(0.500mL)进行稀释。在该溶液中加入药物连接子17a的二甲基亚砜溶液(10mM，0.058mL，相对于一分子抗体为8当量)和丙二醇(0.442mL)的混合液，使用试管旋转器(MTR－103，AS ONE株式会社)在室温下反应2天。依照共通操作D所述的方法对反应液进行精制，得到目标抗体药物偶联物的ABS溶液(7.0mL)。
依照共通操作E和G所述的方法进行分析，得到下述结果。
抗体浓度：0.69mg/mL
抗体产量：4.84mg(48％)
药物平均结合数：3.6
实施例22：抗体药物偶联物8的合成(抗EGFR抗体2－CDN偶联物(1)的合成)
将糖链重构抗体6的磷酸缓冲生理食盐水(pH6.0)溶液(8.34mg/mL，1.00mL)用丙二醇(0.500mL)进行稀释。在该溶液中加入药物连接子17a的二甲基亚砜溶液(10mM，0.055mL，相对于一分子抗体为9.6当量)和丙二醇(0.445mL)的混合液，使用试管旋转器(MTR－103，AS ONE株式会社)在室温下反应2天。依照共通操作D所述的方法对反应液进行精制，得到目标抗体药物偶联物的ABS溶液(7.0mL)。
依照共通操作E和G所述的方法进行分析，得到下述结果。
抗体浓度：0.52mg/mL
抗体产量：3.62mg(43％)
药物平均结合数：3.8
实施例23：糖链重构抗体7的合成
改造抗Trop2抗体－[MSG1－(N3)]2的制备
[合成路径]
Figure BDA0003831863160001711
(工序1)
(Fucα1，6)GlcNAc－改造抗Trop2抗体的制备
使用改造抗Trop2抗体的磷酸缓冲生理食盐水溶液(5mL，16.75mg/mL，pH6.0)，进行与实施例9工序1同样的操作，得到标题抗体的20mM磷酸缓冲液(9.81mg/mL，7.5mL，pH6.0)。
(工序2)
改造抗Trop2抗体－[MSG1－(N3)]2的制备
使用上述工序1中得到的抗体的20mM磷酸缓冲液(9.81mg/mL，7.5mL，pH6.0)和[N3－PEG(3)]－MSG1(9)Ox(WO2018/003983的化合物1－11)(12mg)，进行与实施例9工序2同样的操作，得到标题抗体的磷酸缓冲生理食盐水溶液(13.22mg/mL，5mL，pH6.0)。
实施例24：糖链重构抗体8的合成
改造抗CD70抗体2－[MSG1－(N3)]2的制备
[合成路径]
Figure BDA0003831863160001721
(工序1)
(Fucα1，6)GlcNAc－改造抗CD70抗体2的制备
使用改造抗CD70抗体2的磷酸缓冲生理食盐水溶液(1.6mL，13.44mg/mL，pH6.0)，进行与实施例9工序1同样的操作，得到标题抗体的20mM磷酸缓冲液(8.96mg/mL，2mL，pH6.0)。
(工序2)
改造抗CD70抗体2－[MSG1－(N3)]2的制备
使用上述工序1中得到的抗体的20mM磷酸缓冲液(8.96mg/mL，2mL，pH6.0)和[N3－PEG(3)]－MSG1(9)Ox(4mg)，进行与实施例9工序2同样的操作，得到标题抗体的磷酸缓冲生理食盐水溶液(12.20mg/mL，1.2mL，pH6.0)。
实施例25：糖链重构抗体9的合成
改造抗EGFR抗体1－[MSG1－(N3)]2的制备
[合成路径]
Figure BDA0003831863160001731
(工序1)
(Fucα1，6)GlcNAc－改造抗EGFR抗体1的制备
使用改造抗EGFR抗体1的磷酸缓冲生理食盐水溶液(10mL，14.00mg/mL，pH6.0)，进行与实施例9工序1同样的操作，得到标题抗体的20mM磷酸缓冲液(14.51mg/mL，7.5mL，pH6.0)。
(工序2)
改造抗EGFR抗体1－[MSG1－(N3)]2的制备
使用上述工序1中得到的抗体的20mM磷酸缓冲液(14.51mg/mL，7.5mL，pH6.0)和[N3－PEG(3)]－MSG1(9)Ox(17.3mg)，进行与实施例9工序2同样的操作，得到标题抗体的磷酸缓冲生理食盐水溶液(13.34mg/mL，7.5mL，pH6.0)。
实施例26：抗体药物偶联物9的合成(抗Trop2抗体2－CDN偶联物(4)的合成)
将糖链重构抗体7的磷酸缓冲生理食盐水(pH6.0)溶液(13.22mg/mL，1.00mL)用丙二醇(0.500mL)进行稀释。在该溶液中加入药物连接子17a的二甲基亚砜溶液(10mM，0.073mL，相对于一分子抗体为8当量)和丙二醇(0.427mL)的混合液，使用试管旋转器在室温下反应2天。依照共通操作D所述的方法对反应液进行精制，得到目标抗体药物偶联物的ABS溶液(6.5mL)。
依照共通操作E和G所述的方法进行分析，得到下述结果。
抗体浓度：1.36mg/mL
抗体产量：8.83mg(67％)
药物平均结合数：1.9
实施例27：抗体药物偶联物10的合成(抗CD70抗体2－CDN偶联物(2)的合成)
将糖链重构抗体8的磷酸缓冲生理食盐水(pH6.0)溶液(12.20mg/mL，1.20mL)用丙二醇(0.600mL)进行稀释。在该溶液中加入药物连接子17a的二甲基亚砜溶液(10mM，0.081mL，相对于一分子抗体为8当量)和丙二醇(0.519mL)的混合液，使用试管旋转器在室温下反应2天。依照共通操作D所述的方法对反应液进行精制，得到目标抗体药物偶联物的ABS溶液(7mL)。
依照共通操作E和G所述的方法进行分析，得到下述结果。
抗体浓度：1.46mg/mL
抗体产量：10.25mg(70％)
药物平均结合数：1.9
实施例28：抗体药物偶联物11的合成(抗EGFR抗体1－CDN偶联物(2)的合成)
将糖链重构抗体9的磷酸缓冲生理食盐水(pH6.0)溶液(13.34mg/mL，1.00mL)用丙二醇(0.500mL)进行稀释。在该溶液中加入药物连接子17a的二甲基亚砜溶液(10mM，0.074mL，相对于一分子抗体为8当量)和丙二醇(0.426mL)的混合液，使用试管旋转器在室温下反应2天。依照共通操作D所述的方法对反应液进行精制，得到目标抗体药物偶联物的ABS溶液(6.5mL)。
依照共通操作E和G所述的方法进行分析，得到下述结果。
抗体浓度：1.68mg/mL
抗体产量：10.91mg(82％)
药物平均结合数：1.9
(参考例1：ML－RR－CDA·2Na+的合成)
本说明书中，作为参照化合物使用的ML－RR－CDA·2Na+是依照专利文献3(WO2014/189805)记载的方法合成的。
(参考例2：2’，3’－cGAMP的合成)
本说明书中，作为参照化合物使用的2’，3’－cGAMP使用cGAS由ATP和GTP在酶的促进下合成。cGAS的制备以及酶反应适当改变文献记载的方法(Immunity，2013，39，1019－1031、Cell Rep.2014，6，421－430)来实施。通过使用弱碱性阴离子交换树脂(DIAIONWA10)以及合成吸附剂(SEPABEADS SP207SS)的柱色谱来实施精制。
(参考例3：抗CD70抗体1的制作)
抗CD70抗体1参照WO2004/073656进行制作。在实施例中使用的抗CD70抗体1的同型为IgG1，具有LALA变异。将在本实施例中使用的抗CD70抗体1的轻链氨基酸序列(序列号1)以及重链氨基酸序列(序列号2)示于图4。将该抗体的CDRL1的氨基酸序列(序列号35)、CDRL2的氨基酸序列(序列号36)、CDRL3的氨基酸序列(序列号37)、CDRH1的氨基酸序列(序列号38)、CDRH2的氨基酸序列(序列号39)、以及CDRH3的氨基酸序列(序列号40)示于图16。
(参考例4：抗CD70抗体2的制作)
抗CD70抗体2参照WO2007/038637进行制作。在本实施例中使用的抗CD70抗体2的同型为IgG1，具有LALA变异。将在本实施例中使用的抗CD70抗体2的轻链氨基酸序列(序列号3)以及重链氨基酸序列(序列号4)示于图5。将该抗体的CDRL1的氨基酸序列(序列号41)、CDRL2的氨基酸序列(序列号42)、CDRL3的氨基酸序列(序列号43)、CDRH1的氨基酸序列(序列号44)、CDRH2的氨基酸序列(序列号45)、以及CDRH3的氨基酸序列(序列号46)示于图17。
(参考例5：抗TROP2抗体1的制作)
抗TROP2抗体1参照WO2015/098099进行制作。在本实施例中使用的抗TROP2抗体1的同型为IgG1。将在本实施例中使用的抗TROP2抗体1的轻链氨基酸序列(序列号5)以及重链氨基酸序列(序列号6)示于图6。将该抗体的CDRL1的氨基酸序列(序列号47)、CDRL2的氨基酸序列(序列号48)、CDRL3的氨基酸序列(序列号49)、CDRH1的氨基酸序列(序列号50)、CDRH2的氨基酸序列(序列号51)、以及CDRH3的氨基酸序列(序列号52)示于图18。
(参考例6：抗TROP2抗体2的制作)
抗TROP2抗体1参照WO2015/098099进行制作。在本实施例中使用的抗TROP2抗体1的同型为IgG1。抗TROP2抗体2将LALA变异导入抗TROP2抗体1。将在本实施例中使用的抗TROP2抗体2的轻链氨基酸序列(序列号7)以及重链氨基酸序列(序列号8)示于图7。将该抗体的CDRL1的氨基酸序列(序列号53)、CDRL2的氨基酸序列(序列号54)、CDRL3的氨基酸序列(序列号55)、CDRH1的氨基酸序列(序列号56)、CDRH2的氨基酸序列(序列号57)、以及CDRH3的氨基酸序列(序列号58)示于图19。
(参考例7：抗EGFR抗体1的制作)
抗EGFR抗体1参照帕尼单抗(Vectibix)点滴静注100mg审查结果报告书(平成22年3月5日医药食品局审查管理课)进行制作。在本实施例中使用的抗EGFR抗体1的同型为IgG1，具有LALA变异。将在本实施例中使用的抗EGFR抗体1的轻链氨基酸序列(序列号9)以及重链氨基酸序列(序列号10)示于图8。将该抗体的CDRL1的氨基酸序列(序列号59)、CDRL2的氨基酸序列(序列号60)、CDRL3的氨基酸序列(序列号61)、CDRH1的氨基酸序列(序列号62)、CDRH2的氨基酸序列(序列号63)、以及CDRH3的氨基酸序列(序列号64)示于图20。CDR序列参照WO1998/050433。
(参考例8：抗EGFR抗体2的制作)
抗EGFR抗体2参照WO2002/092771进行制作。在本实施例中使用的抗EGFR抗体2的同型为IgG1，具有LALA变异。将在本实施例中使用的抗EGFR抗体2的轻链氨基酸序列(序列号11)以及重链氨基酸序列(序列号12)示于图9。将该抗体的CDRL1的氨基酸序列(序列号65)、CDRL2的氨基酸序列(序列号66)、CDRL3的氨基酸序列(序列号67)、CDRH1的氨基酸序列(序列号68)、CDRH2的氨基酸序列(序列号69)、以及CDRH3的氨基酸序列(序列号70)示于图21。
(试验例1)使用报告细胞的STING激动剂活性评价
＜报告基因分析＞
人STING激动剂活性使用可确认位于STING途径的下游的干扰素控制因子3(interferon regulatory factor－3(IRF3))的途径的活化的THP1－DualTM细胞(HAQ变异型)(InvivoGen，CA，US)进行评价。小鼠STING激动剂活性使用RAW－DualTM细胞(InvivoGen)进行评价。
分析通过以下的方式实施。首先，以20μL/孔(well)将用PBS稀释后的实验化合物分注于透明96孔板(Corning，NY，US)。接着，以180μL/孔(1×105cells/孔)添加悬浮于分析缓冲液(包含10％牛血清白蛋白的RPMI1640培养基或DMEM培养基)中的报告细胞，开始刺激。回收了在37℃、5％CO2环境下培养24小时后的离心上清液。将6μL回收的上清液添加到白色384孔板中，向其中添加15μL的QUANTI－Luc(InvivoGen)溶液。充分混合后，使用读板器(PerkinElmer，MA，US)测定了发光。将用1.37～100μM的ML－RR－CDA·2Na+(WO2014/189805中的化合物21)处理的细胞中的最大计数值设为100％，将用PBS处理的细胞中的计数设为0％，使用GraphPad Prism(GraphPad Software，CA，US)计算实验化合物得到50％的计数所需的浓度作为EC50(μM)值。表1中示出人STING激动剂活性试验的结果。
[表1]
Figure BDA0003831863160001771
该结果表明，本发明的抗体药物偶联物中使用的化合物具有对人STING的激动剂活性。此外，对于小鼠STING，也确认了与现有的CDN同等以上的激动剂活性。
(试验例2)使用重组STING C末端结合域蛋白质的蛋白质热位移分析(Proteinthermal shift assay)
(i)各种表达质粒的构建
＜人TMEM173表达质粒的构建＞
人STING(本说明书中，有时也称为人TMEM173)的哺乳动物细胞表达用质粒购入第232位精氨酸(R)变异为组氨酸(H)的(本说明书中也称为H232变异或REF变异)人TMEM173cDNA Clone(Accession NM＿198282.3，H232(REF)变异型STING表达质粒)(GeneCopoeia，MD，US)。将人H232(REF)变异型STING的氨基酸序列示于序列号15，将核苷酸序列示于序列号16。此外，以H232变异型STING表达质粒作为模板，基于Inverse PCR法进行定点突变(site directed mutagenesis)而制作野生型STING以及变异型STING的表达质粒。详细而言，首先使用两种引物(5’－CGTGCTGGCATCAAGGATCGGGTTTAC－3’(H232R(WT)fwd)(序列号25)以及5’－GTCACCGGTCTGCTGGGGCAGTTTATC－3’(H232R(WT)rev))(序列号26)和KOD－Plus－Mutagenesis Kit(SMK－101)(东洋纺)实施PCR，通过DNA测序确认目标野生型(R232)STING表达质粒的构建。将人野生型STING的氨基酸序列示于序列号13，将核苷酸序列示于序列号14。
接着，以与野生型STING表达质粒同样的方法制作HAQ(R71H，G230A以及R293Q)变异型。详细而言，以H232变异型STING表达质粒作为模板，使用两种引物(5’－GCTGACCGTGCTGGCATCAAGGATCGGGTTTAC－3’(H232R/G230A fwd)(序列号27)以及5’－GGTCTGCTGGGGCAGTTTATCCAGG－3’(H232R/G230A rev)(序列号28))和Mutagenesis Kit实施PCR。通过在两处同时导入变异，获得G230A变异型STING质粒。进而，以G230A变异型STING表达质粒作为模板，使用两种引物(5’－CACCACATCCACTCCAGGTACCGG－3’(R71H fwd)(序列号29)以及5’－CAGCTCCTCAGCCAGGCTGCAGAC－3’(R71H rev)(序列号30))和MutagenesisKit实施PCR，获得R71H/G230A变异型STING表达质粒。
接着，以R71H/G230A变异型的STING表达质粒作为模板，使用两种引物(5’－CAGACACTTGAGGACATCCTGGCAG－3’(R293Q fwd)(序列号31)以及5’－GCAGAAGAGTTTGGCCTGCTCAA－3’(R293Q rev)(序列号32))和Mutagenesis Kit实施PCR，获得HAQ(R71H/G230A/R293Q)变异型的表达质粒。将人HAQ变异型STING的氨基酸序列示于序列号17，将核苷酸序列示于序列号18。将人的野生型STING、REF变异型STING、HAQ变异型STING的氨基酸序列示于图10。
＜重组STING C末端结合域蛋白质表达质粒等的构建＞
人STING C末端结合域(aa139－342)蛋白质(UniProt entry Q86WV6)cDNA通过使用两种引物(5’－ACCTGTATTTTCAGGGCCTGGCCCCAGCTGAGATCTCTG－3’(hST Fw_v2)(序列号33)以及5’－CAGAATTCGCAAGCTTTTAAGTAACCTCTTCCTTTTCCTCCTGC－3’(hST Rv＿V3)(序列号34))的PCR，由全长的人TMEM173 cDNA clone表达质粒(野生型、H232变异型以及HAQ变异型)而制作。使用In－Fusion HD Cloning Kit(Takara Bio)，将PCR产物插入至作为大肠杆菌表达用载体的pET15b，使N末端具有由组氨酸6碱基构成的6xHis标签、Avidin(抗生物素蛋白)标签以及TEV蛋白酶切断位点，从而构建pET15b－HisAviTEV－hSTING(139－342)人野生型、pET15b－HisAviTEV－hSTING(139－342)人REF变异型以及pET15b－HisAviTEV－hSTING(139－342)人HAQ变异型的表达质粒。
对于小鼠STING C末端结合域(aa138－341)蛋白质(UniProt entry Q3TBT3)表达用cDNA，使用通过eurofins Genomics人工合成对应小鼠TMEM173 cDNA序列第138号～第341号氨基酸的cDNA的cDNA。将小鼠STING的氨基酸序列示于序列号19，将核苷酸序列示于序列号20。使用In－Fusion HD Cloning Kit，将合成的cDNA插入至作为大肠杆菌表达用载体的pET15b，使N末端具有由组氨酸6碱基构成的6xHis标签、Avidin标签以及TEV蛋白酶切断位点，构建pET15b－HisAviTEV－mSTING(138－341)小鼠野生型的表达质粒。
在pCDF＿Duet－1载体插入人工合成的大肠杆菌BirA(UniProt entry P06709)cDNA，构建pCDF＿Duet－1BirA(1－321)表达质粒。
(ii)STING C末端结合域蛋白质的制备法
所制作的各pET15b－HisAviTEV－hSTING(139－342)(人野生型(Hu－WT)、人REF变异型(Hu－REF)以及人HAQ变异型(Hu－HAQ)的STING C末端结合域蛋白质)表达质粒以及pET15b－HisAviTEV－mSTING(138－341)(小鼠野生型(Ms－WT)的STING C末端结合域蛋白质)表达质粒分别与pCDF＿Duet－1BirA(1－321)表达质粒同时转化为Competent E.coliRosetta 2(DE3)(Merck Millipore，MA，US)，制作各HisAviTEV－STING表达株。将这些表达株添加至包含100μg/mL氨苄西林、50μg/mL链霉素、以及30μg/mL卡那霉素的TB培养基中，在37℃下培养后，用100μM IPTG进行诱导表达，进一步在16℃下培养。
将培养液离心，将所得到的菌体悬浮于50mM HEPES pH8.0，500mM NaCl，20mM咪唑，1mM DTT，5％(w/v)甘油、Complete EDTA free中后，冷冻溶解。添加Lysozyme、DNase I后，通过超声波破碎萃取蛋白质，通过离心回收上清液。将所得到的上清液使用AKTAexpress色谱系统(GE Healthcare，IL，US)以HisTrap FF柱(GE Healthcare)进行精制，通过Superdex200 16/60柱(GE Healthcare)用缓冲液(20mM HEPES pH7.5，120mMNaCl，20％甘油，0.8mM DTT)进行洗脱。用SEC回收包含目标分子量的蛋白质的组分，以His－Avi－TEV－hSTING(139－342)人野生型蛋白质、HisAviTEV－hSTING(139－342)人REF变异型蛋白质、HisAviTEV－hSTING(139－342)人HAQ变异型蛋白质以及His－Avi－TEV－mSTING(138－341)小鼠野生型蛋白质的形式回收。蛋白质浓度使用Nanodrop2000(Thermo Fisher Scientific，MA，US)进行测定，在－80℃下冷冻保存直至使用。
将HisAviTEV－hSTING(139－342)人野生型蛋白质的氨基酸序列示于序列号21，将HisAviTEV－hSTING(139－342)人REF变异型蛋白质的氨基酸序列示于序列号22，将HisAviTEV－hSTING(139－342)人HAQ变异型蛋白质的氨基酸序列示于序列号23，将His－Avi－TEV－mSTING(138－341)小鼠野生型蛋白质的氨基酸序列示于序列号24。
(iii)STING结合试验
化合物与STING C末端结合域蛋白质的结合性通过以蛋白质的热变性温度上升为指标的蛋白质热位移分析Protein thermal shift assay来进行。
详细而言，在384孔的实时PCR板上使用分析缓冲液(20mM Tris－HCl pH7.5，120mM NaCl)，将3μL的实验化合物(最终浓度0.5mM)、3μL的SYPRO橙色蛋白凝胶染色剂(Orange Protein Gel Stain)(Thermo Fisher Scientific)(最终浓度20×浓度)和6μL的STING蛋白质混合，并用平板振荡器混合。通过实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)，以每秒0.03℃的速度将温度从25℃升高到95℃，将SYPRO Orange发出的荧光作为指标测定蛋白质的热变性温度。所得到的测定值使用作为分析软件的Protein Thermal Shift软件(Thermo Fisher Scientific)，求出Tm(the midpoint of the unfolding transition)(℃)作为荧光强度的增加速率显示最大值的温度。通过从各化合物的Tm值中减去未添加化合物的孔的Tm值，将实验化合物的Tm的位移计算为ΔTm(℃)。将对STING蛋白质的结合试验的结果示于表2。
[表2]
Figure BDA0003831863160001811
该结果表明本发明的抗体药物偶联物中使用的化合物对于人的野生型STING以及变异型STING、小鼠的野生型STING具有结合活性。
(试验例3)HCC细胞分析
作为恒定地高度表达TROP2和STING的株，使用从American Type CultureCollection公司购入的人乳腺癌细胞株HCC1954(CRL－2338)细胞，制作使IFIT1启动子报告基因稳定表达的HCC1954－IFIT1报告细胞。详细而言，使用FuGene HD(Promega)，将购入的人IFIT1(ISG－56)启动子报告质粒(GeneCopoeia，HPRM40290－PG04)向HCC1954细胞转染(transfection)。将细胞在添加1.0μg/mL嘌呤霉素(LifeTechnologies)的培养基中传代，制作稳定表达株，进行克隆，获得评价用细胞株。将悬浮于分析缓冲液(包含10％牛血清白蛋白的RPMI1640培养基)的HCC1954－IFIT1报告细胞以90μL/孔(2.5×104cells/孔)分注于384孔板。第二天，试验化合物通过PBS进行稀释，添加10μL并开始刺激。回收了在37℃、5％CO2环境下培养24小时后的离心上清液。将6μL回收的上清液添加到白色384孔板中，向其中添加15μL的QUANTI－Luc(InvivoGen)溶液。充分混合后，使用读板器(PerkinElmer，MA，US)测定了发光。
将结果示于图11。纵轴表示发光计数数量，横轴表示各试验化合物的浓度。图中的白圆形线表示参考例6中制作的抗TROP2抗体2，图中的黑圆形线表示使参考例6中制作的抗TROP2抗体2与实施例2的化合物34a偶联而成的抗TROP2抗体2－CDN偶联物(1)，图中的黑三角线表示使实施例3的化合物49b与抗TROP2抗体2偶联而成的抗TROP2抗体2－CDN偶联物(2)，图中的黑四方线表示使实施例4的化合物50b与抗TROP2抗体2偶联而成的抗TROP2抗体2－CDN偶联物(3)。抗TROP2抗体2没有使发光计数增加，相对于此，抗TROP2抗体2－CDN偶联物(1)、(2)、(3)使计数数量浓度依赖性地上升。以上表明抗TROP2抗体2―CDN偶联物(1)、(2)、(3)具有人STING途径的活化能力。
(试验例4)CT26.WT以及CT26.WT―hCD70细胞株与来自小鼠骨髓的树突状细胞的共培养分析系统
制作在从American Type Culture Collection公司购入的小鼠大肠癌细胞株CT26.WT(CRL2638)中导入了人CD70基因(NP＿001243)的CT26.WT－hCD70细胞。详细而言，制作插入了人CD70基因的pLVSIN慢病毒载体(Takara Bio)，使用Lentiviral High TiterPackaging Mix(Takara Bio)导入Lenti－X293T细胞株(Takara Bio)，回收上清液，使CT26.WT感染。细胞在添加10μg/mL嘌呤霉素(Thermo Fisher Scientific)的培养基中维持。
从5周龄的雌性BALB/c小鼠(BALB/cAnNCrlCrlj)(日本Charles River)的大腿骨采集小鼠骨髓细胞。小鼠骨髓细胞在20μg/mL鼠GM―CSF(PEPROTECH)存在下培养7天，得到来自小鼠骨髓的树突状细胞。对96孔板每孔接种CT26.WT或者CT26.WT―hCD70细胞株1.5×105细胞，接种来自小鼠骨髓的树突状细胞1×105细胞。试验化合物通过RPMI培养基(Invitrogen)进行稀释，添加200μL。培养20小时后，将细胞用FCM缓冲液(HBSS(Wako)、5％FBS(HyClone)、1mM EDTA(THERMO FISHER))进行清洗，使用FCM抗体(抗小鼠CD16/32(Becton Dickinson)、抗小鼠CD45、抗小鼠CD11c、抗小鼠I―A/I―E、抗小鼠CD86(均为BIOLEGEND))进行染色。再次用FCM缓冲液进行清洗后，利用Fortessa(BD Biosciences)进行解析。在CD45+、CD11c+、I―A/I―E+组分中计算CD86的MFI后，计算相对于非添加试验化合物组的比例。将结果示于图12。图中的DC表示来自小鼠骨髓的树突状细胞与各试验化合物的培养结果，图中的DC+CT26.WT表示来自小鼠骨髓的树突状细胞以及CT26.WT与各试验化合物的培养结果，图中的DC+CT26.WT－hCD70表示来自小鼠骨髓的树突状细胞以及CT26.WT―hCD70与各试验化合物的培养结果。纵轴表示相对于非添加组的MFI的比例，横轴表示各试验化合物。图中的抗CD70抗体1－CDN(1)是将实施例2的化合物34a与参考例3的抗CD70抗体1偶联而成的，图中的抗CD70抗体2－CDN(1)是将实施例2的化合物34a与参考例4的抗CD70抗体2偶联而成的。实施例2的化合物34a在全部的条件下使小鼠树突状细胞上的CD86表达上升，抗CD70抗体1以及抗CD70抗体2在所有条件下均未使CD86表达上升。相对于此，抗CD70抗体1―CDN偶联物(1)、以及抗CD70抗体2―CDN偶联物(1)仅在将来自小鼠骨髓的树突状细胞与CT26.WT―hCD70进行培养的情况下，小鼠树突状细胞上的CD86表达增强。综上所述，确认了抗CD70抗体1―CDN偶联物(1)、以及抗CD70抗体2―CDN偶联物(1)的CD70依赖性的树突状细胞活化。
(试验例5)抗肿瘤试验(1)
制作在从American Type Culture Collection公司购入的小鼠大肠癌细胞株CT26.WT(CRL2638)中导入了人TROP2基因(NP＿002344.2)的CT26.WT－hTROP2细胞。详细而言，将pQCIXN载体(Takara Bio)用BamHI和Eco RI切断，用T4 DNA聚合酶切断后使切断末端平滑化，使用Gateway系统(Thermo Fisher Scientific)将人TROP2插入与GatewayReading Frame Cassette A连接(ligation)而制作的pQCIXN－DEN载体中。将人TROP2插入pQCXIN―DEN逆转录病毒载体使用Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific)导入EcoPack2－293细胞株(Takara Bio)中，回收上清液，使CT26.WT感染。细胞在添加250μg/mL遗传霉素(Thermo Fisher Scientific)的培养基中维持。
抗体、以及抗体－CDN偶联物通过乙酸盐缓冲液(10mM乙酸缓冲液，5％山梨糖醇，pH5.5)(Nacalai Tesque)稀释而使用。
将CT26.WT－hTROP2细胞悬浮于生理食盐水中，将2.0×106细胞皮下移植于BALB/c小鼠的右腋窝部(第0天)，7天后实施随机分组。抗TROP2抗体1、以及抗TROP2抗体1－CDN偶联物(1)以30μg/只(相当于1.5mg/kg)的用量，抗TROP2抗体2、以及抗TROP2抗体2－CDN偶联物(1)以3.0mg/kg的用量在第7天共计进行1次尾静脉给药。此外，作为媒液组，设定给药乙酸盐缓冲液的组。各组的小鼠只数为8只。
将抗TROP2抗体1以及抗TROP2抗体1―CDN偶联物(1)的结果示于图13。图中的黑四方线表示媒液组，白圆形线表示参考例5中制作的抗TROP2抗体1给药组，白倒三角线表示使实施例1的化合物6b与抗TROP2抗体1偶联而成的抗TROP2抗体1－CDN偶联物(1)给药组。纵轴表示肿瘤体积(mm3)，横轴表示肿瘤移植后的天数。在媒液组以及抗TROP2抗体1给药组中进行肿瘤的增殖。相对于此，抗TROP2抗体1－CDN偶联物(1)给药组中显著抑制了肿瘤的增殖。
将抗TROP2抗体2以及抗TROP2抗体2―CDN偶联物(1)的结果示于图14。图中的黑四方线表示媒液组，白圆形线表示参考例6中制作的抗TROP2抗体2给药组，白倒三角线表示使实施例2的化合物34a与抗TROP2抗体2偶联而成的抗TROP2抗体2－CDN偶联物(1)给药组。纵轴表示肿瘤体积(mm3)，横轴表示肿瘤移植后的天数。在媒液组以及抗TROP2抗体给药组中进行肿瘤的增殖。相对于此，在抗TROP2抗体2－CDN偶联物(1)给药组中显著抑制了肿瘤的增殖。
综上所述，在抗TROP2抗体没有显示效果的药效模型中确认了基于抗TROP2抗体－CDN偶联物的静脉给药的抗体靶点依赖性的抗肿瘤效果。
(试验例6)抗肿瘤试验(2)
制作了在从American Type Culture Collection公司购入的小鼠大肠癌细胞株CT26.WT(CRL2638)中导入了人EGFR基因(NP＿005219.2)的CT26.WT－hEGFR细胞。详细而言，制作插入了人EGFR基因的pLVSIN慢病毒载体(Takara Bio)，使用Lentiviral HighTiter Packaging Mix(Takara Bio)导入Lenti－X293T细胞株(Takara Bio)中，回收上清液，使CT26.WT感染。细胞在添加10μg/mL嘌呤霉素(Thermo Fisher Scientific)的培养基中维持。
将CT26.WT－hEGFR细胞悬浮于生理食盐水中，将3×106细胞皮下移植于BALB/c小鼠的右腋窝部(第0天)，12天后实施随机分组。抗EGFR抗体1、抗EGFR抗体2、抗EGFR抗体1－CDN偶联物(1)、以及抗EGFR抗体2－CDN偶联物(1)以1.5mg/kg的用量在第12天共计进行1次尾静脉给药。此外，作为媒液组，设定给药乙酸盐缓冲液的组。各组的小鼠只数为8只。
将结果示于图15。图中的黑四方线表示媒液组，白三角线表示参考例7中制作的抗EGFR抗体1给药组，黑三角线表示抗EGFR抗体1－CDN偶联物(1)给药组，白圆形线表示参考例8中制作的抗EGFR抗体2给药组，黑圆形线表示抗EGFR抗体2－CDN偶联物(1)给药组。纵轴表示肿瘤体积(mm3)，横轴表示肿瘤移植后的天数。媒液组进行了肿瘤的增殖。抗EGFR抗体1给药组、以及抗EGFR抗体2给药组没有抑制肿瘤的增殖。相对于此，抗EGFR抗体1－CDN偶联物(1)给药组、以及抗EGFR抗体2－CDN偶联物(1)给药组中显著抑制了肿瘤的增殖。
综上所述，使用抗EGFR抗体没有显示抗肿瘤效果的模型，确认了抗EGFR抗体－CDN偶联物的强抗肿瘤效果。
(试验例7)抗肿瘤试验(3)
抗体、以及抗体－CDN偶联物通过乙酸盐缓冲液(10mM乙酸盐缓冲液，5％山梨糖醇，pH5.5)(Nacalai Tesque)稀释而使用。
将从American Type Culture Collection公司购入的人肾癌细胞株Caki―1(HTB―46)细胞悬浮于用生理食盐水稀释为50％的Matrigel(CORNING)中，将2.5×106细胞皮下移植于BALB/c―nu小鼠的右腋窝部(第0天)，13天后实施随机分组。抗CD70抗体1、抗CD70抗体1－CDN偶联物(1)以及抗CD70抗体2、抗CD70抗体2－CDN偶联物(1)以1.5mg/kg的用量在第13天共计进行1次尾静脉给药。此外，作为媒液组，设定给药乙酸盐缓冲液的组。各组的小鼠只数为8只。
将结果示于图22。图中的抗CD70抗体1－偶联物(1)是将实施例2的化合物34a与参考例3的抗CD70抗体1偶联而成的，图中的抗CD70抗体2－CDN偶联物(1)是将实施例2的化合物34a与参考例4的抗CD70抗体2偶联而成的。图中的黑四方线表示媒液组，白三角线表示抗CD70抗体1给药组，白倒三角线表示抗CD70抗体2给药组，白菱形线表示抗CD70抗体1－CDN偶联物(1)给药组，白圆形线表示抗CD70抗体2－CDN偶联物(1)给药组。纵轴表示肿瘤体积(mm3)，横轴表示肿瘤移植后的天数。媒液组、抗CD70抗体1给药组、抗CD70抗体2给药组中进行了肿瘤的增殖。相对于此，抗CD70抗体1－CDN偶联物(1)给药组以及抗CD70抗体2－CDN偶联物(1)给药组中显著抑制了肿瘤的增殖。
综上所述，在抗CD70抗体没有显示效果的药效模型中，任意抗CD70抗体－CDN偶联物的静脉给药均确认了抗体靶点依赖性的抗肿瘤效果。
(试验例8)抗肿瘤试验(4)
抗体、以及抗体－CDN偶联物通过乙酸盐缓冲液(10mM乙酸盐缓冲液，5％山梨糖醇，pH5.5)(Nacalai Tesque)稀释而使用。
将从American Type Culture Collection公司购入的人肾癌细胞株A―498(HTB―44)细胞悬浮于生理食盐水中，将3.0×106细胞皮下移植于BALB/c―nu小鼠的右腋窝部(第0天)，20天后实施随机分组。抗CD70抗体2以及抗CD70抗体2－CDN偶联物(2)以1.0mg/kg的用量在第20天共计进行1次尾静脉给药。此外，作为媒液组，设定给药乙酸盐缓冲液的组。各组的小鼠只数为6只。
将结果示于图23。图中的抗CD70抗体2－CDN偶联物(2)是使用了药物平均结合数为约2的MSG型糖链重构抗体的抗体－CDN偶联物。图中的黑四方线表示媒液组，白三角线表示抗CD70抗体2给药组，白倒三角线表示抗CD70抗体2－CDN偶联物(2)给药组。纵轴表示肿瘤体积(mm3)，横轴表示肿瘤移植后的天数。媒液组中进行了肿瘤的增殖。抗CD70抗体2给药组没有抑制肿瘤的增殖。相对于此，抗CD70抗体2－CDN偶联物(2)给药组中显著抑制了肿瘤的增殖。
综上所述，在抗CD70抗体没有显示效果的药效模型中确认了抗CD70抗体－CDN偶联物的强抗肿瘤效果。
(试验例9)抗肿瘤试验(5)
制作了在从American Type Culture Collection公司购入的小鼠大肠癌细胞株CT26.WT(CRL2638)中导入了将抗EGFR抗体1的表位位点取代为人型的人鼠嵌合EGFR基因(NP＿005219.2)的CT26.WT－chimeraEGFR细胞。详细而言，制作插入了人鼠嵌合EGFR基因的pLVSIN慢病毒载体(Takara Bio)，使用Lentiviral High Titer Packaging Mix(TakaraBio)导入Lenti－X293T细胞株(Takara Bio)中，回收上清液，使CT26.WT感染。细胞在添加2μg/mL嘌呤霉素(Thermo Fisher Scientific)的培养基中维持。
将CT26.WT－chimeraEGFR细胞悬浮于生理食盐水中，将1×106细胞皮下移植于BALB/c小鼠的右腋窝部(第0天)，7天后实施随机分组。化合物34a以0.01mg/kg的用量、抗EGFR抗体1以0.98mg/kg的用量、抗EGFR抗体1－CDN偶联物(2)以1.0mg/kg的用量在第7天共计进行1次尾静脉给药。化合物编号34a以及抗EGFR抗体1的给药量为构成抗EGFR抗体1－CDN偶联物(2)的各成分的当量。此外，作为媒液组，设定给药乙酸盐缓冲液的组。各组的小鼠只数为8只。
将结果示于图24。图中的抗EGFR抗体1－CDN偶联物(2)是使用了药物平均结合数为约2的MSG型糖链重构抗体的抗体－CDN偶联物。图中的黑四方线表示媒液组，白三角线表示抗EGFR抗体1给药组，白菱形线表示化合物34a给药组，白四方线表示抗EGFR抗体1―CDN偶联物(2)给药组。纵轴表示肿瘤体积(mm3)，横轴表示肿瘤移植后的天数。媒液组中进行了肿瘤的增殖。化合物34a给药组以及抗EGFR抗体1给药组没有抑制肿瘤的增殖。相对于此，抗EGFR抗体1－CDN偶联物(2)给药组中显著抑制了肿瘤的增殖。
综上所述，使用抗EGFR抗体没有显示抗肿瘤效果的模型，确认了抗EGFR抗体－CDN偶联物的强抗肿瘤效果。
产业上的可利用性
根据本发明，可以提供一种包含具有强的STING激动剂活性、显示强的抗肿瘤效果的新型CDN衍生物的抗体药物偶联物。该抗体药物偶联物作为STING激动剂活性所关联的疾病(例如，癌)的治疗剂是有用的。
序列表自由文本
序列号1：抗CD70抗体1的轻链的氨基酸序列
序列号2：抗CD70抗体1的重链的氨基酸序列
序列号3：抗CD70抗体2的轻链的氨基酸序列
序列号4：抗CD70抗体2的重链的氨基酸序列
序列号5：抗TROP2抗体1的轻链的氨基酸序列
序列号6：抗TROP2抗体1的重链的氨基酸序列
序列号7：抗TROP2抗体2的轻链的氨基酸序列
序列号8：抗TROP2抗体2的重链的氨基酸序列
序列号9：抗EGFR抗体1的轻链的氨基酸序列
序列号10：抗EGFR抗体1的重链的氨基酸序列
序列号11：抗EGFR抗体2的轻链的氨基酸序列
序列号12：抗EGFR抗体2的重链的氨基酸序列
序列号13：人野生型STING的氨基酸序列
序列号14：人野生型STING的核苷酸序列
序列号15：人H232(REF)变异型STING的氨基酸序列
序列号16：人H232(REF)变异型STING的核苷酸序列
序列号17：人HAQ变异型STING的氨基酸序列
序列号18：人HAQ变异型STING的核苷酸序列
序列号19：小鼠STING的氨基酸序列
序列号20：小鼠STING的核苷酸序列
序列号21：HisAviTEV－hSTING(139－342)人野生型蛋白质的氨基酸序列
序列号22：HisAviTEV－hSTING(139－342)人REF变异型蛋白质的氨基酸序列
序列号23：HisAviTEV－hSTING(139－342)人HAQ变异型蛋白质的氨基酸序列
序列号24：His－Avi－TEV－mSTING(138－341)小鼠野生型蛋白质的氨基酸序列
序列号25～34：引物的序列
序列号35：抗CD70抗体1的CDRL1的氨基酸序列
序列号36：抗CD70抗体1的CDRL2的氨基酸序列
序列号37：抗CD70抗体1的CDRL3的氨基酸序列
序列号38：抗CD70抗体1的CDRH1的氨基酸序列
序列号39：抗CD70抗体1的CDRH2的氨基酸序列
序列号40：抗CD70抗体1的CDRH3的氨基酸序列
序列号41：抗CD70抗体2的CDRL1的氨基酸序列
序列号42：抗CD70抗体2的CDRL2的氨基酸序列
序列号43：抗CD70抗体2的CDRL3的氨基酸序列
序列号44：抗CD70抗体2的CDRH1的氨基酸序列
序列号45：抗CD70抗体2的CDRH2的氨基酸序列
序列号46：抗CD70抗体2的CDRH3的氨基酸序列
序列号47：抗TROP2抗体1的CDRL1的氨基酸序列
序列号48：抗TROP2抗体1的CDRL2的氨基酸序列
序列号49：抗TROP2抗体1的CDRL3的氨基酸序列
序列号50：抗TROP2抗体1的CDRH1的氨基酸序列
序列号51：抗TROP2抗体1的CDRH2的氨基酸序列
序列号52：抗TROP2抗体1的CDRH3的氨基酸序列
序列号53：抗TROP2抗体2的CDRL1的氨基酸序列
序列号54：抗TROP2抗体2的CDRL2的氨基酸序列
序列号55：抗TROP2抗体2的CDRL3的氨基酸序列
序列号56：抗TROP2抗体2的CDRH1的氨基酸序列
序列号57：抗TROP2抗体2的CDRH2的氨基酸序列
序列号58：抗TROP2抗体2的CDRH3的氨基酸序列
序列号59：抗EGFR抗体1的CDRL1的氨基酸序列
序列号60：抗EGFR抗体1的CDRL2的氨基酸序列
序列号61：抗EGFR抗体1的CDRL3的氨基酸序列
序列号62：抗EGFR抗体1的CDRH1的氨基酸序列
序列号63：抗EGFR抗体1的CDRH2的氨基酸序列
序列号64：抗EGFR抗体1的CDRH3的氨基酸序列
序列号65：抗EGFR抗体2的CDRL1的氨基酸序列
序列号66：抗EGFR抗体2的CDRL2的氨基酸序列
序列号67：抗EGFR抗体2的CDRL3的氨基酸序列
序列号68：抗EGFR抗体2的CDRH1的氨基酸序列
序列号69：抗EGFR抗体2的CDRH2的氨基酸序列
序列号70：抗EGFR抗体2的CDRH3的氨基酸序列。
序列表
<110> 第一三共株式会社
<120> 包含新型环状二核苷酸衍生物的抗体药物偶联物
<130> SAP-865-PCT
<141> 2021-03-05
<150> JP 202038983
<151> 2020-03-06
<160> 70
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 218
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 2
<211> 448
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Ala Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 3
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 4
<211> 448
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Thr Asp Gly Tyr Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 5
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 6
<211> 451
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala
20 25 30
Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 7
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 8
<211> 451
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala
20 25 30
Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 9
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu
85 90 95
Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 10
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 11
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ser Ser Gln Asp Ile Asn Ser Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile
35 40 45
Tyr His Gly Thr Asn Leu Asp Asp Glu Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 12
<211> 446
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ile Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Thr Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 13
<211> 379
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr
20 25 30
Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gly Val Cys
50 55 60
Ser Leu Ala Glu Glu Leu Arg His Ile His Ser Arg Tyr Arg Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Arg Thr Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Leu Arg Arg Gly
85 90 95
Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Leu Pro Asn Ala
100 105 110
Val Gly Pro Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln
115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile
130 135 140
Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala
145 150 155 160
Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln
165 170 175
Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly
180 185 190
Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val
195 200 205
Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys
210 215 220
Leu Pro Gln Gln Thr Gly Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr
225 230 235 240
Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr
245 250 255
Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser
260 265 270
Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala
275 280 285
Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu
290 295 300
Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp
305 310 315 320
Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu
325 330 335
Glu Lys Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Leu Lys Thr Ser Ala Val Pro
340 345 350
Ser Thr Ser Thr Met Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met
355 360 365
Glu Lys Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Phe Ser
370 375
<210> 14
<211> 1140
<212> DNA
<213> 智人
<400> 14
atgccccact ccagcctgca tccatccatc ccgtgtccca ggggtcacgg ggcccagaag 60
gcagccttgg ttctgctgag tgcctgcctg gtgacccttt gggggctagg agagccacca 120
gagcacactc tccggtacct ggtgctccac ctagcctccc tgcagctggg actgctgtta 180
aacggggtct gcagcctggc tgaggagctg cgccacatcc actccaggta ccggggcagc 240
tactggagga ctgtgcgggc ctgcctgggc tgccccctcc gccgtggggc cctgttgctg 300
ctgtccatct atttctacta ctccctccca aatgcggtcg gcccgccctt cacttggatg 360
cttgccctcc tgggcctctc gcaggcactg aacatcctcc tgggcctcaa gggcctggcc 420
ccagctgaga tctctgcagt gtgtgaaaaa gggaatttca acgtggccca tgggctggca 480
tggtcatatt acatcggata tctgcggctg atcctgccag agctccaggc ccggattcga 540
acttacaatc agcattacaa caacctgcta cggggtgcag tgagccagcg gctgtatatt 600
ctcctcccat tggactgtgg ggtgcctgat aacctgagta tggctgaccc caacattcgc 660
ttcctggata aactgcccca gcagaccggt gaccatgctg gcatcaagga tcgggtttac 720
agcaacagca tctatgagct tctggagaac gggcagcggg cgggcacctg tgtcctggag 780
tacgccaccc ccttgcagac tttgtttgcc atgtcacaat acagtcaagc tggctttagc 840
cgggaggata ggcttgagca ggccaaactc ttctgccgga cacttgagga catcctggca 900
gatgcccctg agtctcagaa caactgccgc ctcattgcct accaggaacc tgcagatgac 960
agcagcttct cgctgtccca ggaggttctc cggcacctgc ggcaggagga aaaggaagag 1020
gttactgtgg gcagcttgaa gacctcagcg gtgcccagta cctccacgat gtcccaagag 1080
cctgagctcc tcatcagtgg aatggaaaag cccctccctc tccgcacgga tttctcttag 1140
<210> 15
<211> 379
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr
20 25 30
Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gly Val Cys
50 55 60
Ser Leu Ala Glu Glu Leu Arg His Ile His Ser Arg Tyr Arg Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Arg Thr Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Leu Arg Arg Gly
85 90 95
Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Leu Pro Asn Ala
100 105 110
Val Gly Pro Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln
115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile
130 135 140
Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala
145 150 155 160
Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln
165 170 175
Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly
180 185 190
Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val
195 200 205
Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys
210 215 220
Leu Pro Gln Gln Thr Gly Asp His Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr
225 230 235 240
Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr
245 250 255
Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser
260 265 270
Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala
275 280 285
Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu
290 295 300
Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp
305 310 315 320
Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu
325 330 335
Glu Lys Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Leu Lys Thr Ser Ala Val Pro
340 345 350
Ser Thr Ser Thr Met Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met
355 360 365
Glu Lys Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Phe Ser
370 375
<210> 16
<211> 1140
<212> DNA
<213> 智人
<400> 16
atgccccact ccagcctgca tccatccatc ccgtgtccca ggggtcacgg ggcccagaag 60
gcagccttgg ttctgctgag tgcctgcctg gtgacccttt gggggctagg agagccacca 120
gagcacactc tccggtacct ggtgctccac ctagcctccc tgcagctggg actgctgtta 180
aacggggtct gcagcctggc tgaggagctg cgccacatcc actccaggta ccggggcagc 240
tactggagga ctgtgcgggc ctgcctgggc tgccccctcc gccgtggggc cctgttgctg 300
ctgtccatct atttctacta ctccctccca aatgcggtcg gcccgccctt cacttggatg 360
cttgccctcc tgggcctctc gcaggcactg aacatcctcc tgggcctcaa gggcctggcc 420
ccagctgaga tctctgcagt gtgtgaaaaa gggaatttca acgtggccca tgggctggca 480
tggtcatatt acatcggata tctgcggctg atcctgccag agctccaggc ccggattcga 540
acttacaatc agcattacaa caacctgcta cggggtgcag tgagccagcg gctgtatatt 600
ctcctcccat tggactgtgg ggtgcctgat aacctgagta tggctgaccc caacattcgc 660
ttcctggata aactgcccca gcagaccggt gaccgtgctg gcatcaagga tcgggtttac 720
agcaacagca tctatgagct tctggagaac gggcagcggg cgggcacctg tgtcctggag 780
tacgccaccc ccttgcagac tttgtttgcc atgtcacaat acagtcaagc tggctttagc 840
cgggaggata ggcttgagca ggccaaactc ttctgccgga cacttgagga catcctggca 900
gatgcccctg agtctcagaa caactgccgc ctcattgcct accaggaacc tgcagatgac 960
agcagcttct cgctgtccca ggaggttctc cggcacctgc ggcaggagga aaaggaagag 1020
gttactgtgg gcagcttgaa gacctcagcg gtgcccagta cctccacgat gtcccaagag 1080
cctgagctcc tcatcagtgg aatggaaaag cccctccctc tccgcacgga tttctcttag 1140
<210> 17
<211> 379
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr
20 25 30
Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gly Val Cys
50 55 60
Ser Leu Ala Glu Glu Leu His His Ile His Ser Arg Tyr Arg Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Arg Thr Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Leu Arg Arg Gly
85 90 95
Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Leu Pro Asn Ala
100 105 110
Val Gly Pro Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln
115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile
130 135 140
Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala
145 150 155 160
Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln
165 170 175
Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly
180 185 190
Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val
195 200 205
Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys
210 215 220
Leu Pro Gln Gln Thr Ala Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr
225 230 235 240
Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr
245 250 255
Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser
260 265 270
Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala
275 280 285
Lys Leu Phe Cys Gln Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu
290 295 300
Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp
305 310 315 320
Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu
325 330 335
Glu Lys Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Leu Lys Thr Ser Ala Val Pro
340 345 350
Ser Thr Ser Thr Met Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met
355 360 365
Glu Lys Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Phe Ser
370 375
<210> 18
<211> 1140
<212> DNA
<213> 智人
<400> 18
atgccccact ccagcctgca tccatccatc ccgtgtccca ggggtcacgg ggcccagaag 60
gcagccttgg ttctgctgag tgcctgcctg gtgacccttt gggggctagg agagccacca 120
gagcacactc tccggtacct ggtgctccac ctagcctccc tgcagctggg actgctgtta 180
aacggggtct gcagcctggc tgaggagctg caccacatcc actccaggta ccggggcagc 240
tactggagga ctgtgcgggc ctgcctgggc tgccccctcc gccgtggggc cctgttgctg 300
ctgtccatct atttctacta ctccctccca aatgcggtcg gcccgccctt cacttggatg 360
cttgccctcc tgggcctctc gcaggcactg aacatcctcc tgggcctcaa gggcctggcc 420
ccagctgaga tctctgcagt gtgtgaaaaa gggaatttca acgtggccca tgggctggca 480
tggtcatatt acatcggata tctgcggctg atcctgccag agctccaggc ccggattcga 540
acttacaatc agcattacaa caacctgcta cggggtgcag tgagccagcg gctgtatatt 600
ctcctcccat tggactgtgg ggtgcctgat aacctgagta tggctgaccc caacattcgc 660
ttcctggata aactgcccca gcagaccgct gaccgtgctg gcatcaagga tcgggtttac 720
agcaacagca tctatgagct tctggagaac gggcagcggg cgggcacctg tgtcctggag 780
tacgccaccc ccttgcagac tttgtttgcc atgtcacaat acagtcaagc tggctttagc 840
cgggaggata ggcttgagca ggccaaactc ttctgccaga cacttgagga catcctggca 900
gatgcccctg agtctcagaa caactgccgc ctcattgcct accaggaacc tgcagatgac 960
agcagcttct cgctgtccca ggaggttctc cggcacctgc ggcaggagga aaaggaagag 1020
gttactgtgg gcagcttgaa gacctcagcg gtgcccagta cctccacgat gtcccaagag 1080
cctgagctcc tcatcagtgg aatggaaaag cccctccctc tccgcacgga tttctcttag 1140
<210> 19
<211> 378
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 19
Met Pro Tyr Ser Asn Leu His Pro Ala Ile Pro Arg Pro Arg Gly His
1 5 10 15
Arg Ser Lys Tyr Val Ala Leu Ile Phe Leu Val Ala Ser Leu Met Ile
20 25 30
Leu Trp Val Ala Lys Asp Pro Pro Asn His Thr Leu Lys Tyr Leu Ala
35 40 45
Leu His Leu Ala Ser His Glu Leu Gly Leu Leu Leu Lys Asn Leu Cys
50 55 60
Cys Leu Ala Glu Glu Leu Cys His Val Gln Ser Arg Tyr Gln Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Trp Lys Ala Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Ile His Cys Met
85 90 95
Ala Met Ile Leu Leu Ser Ser Tyr Phe Tyr Phe Leu Gln Asn Thr Ala
100 105 110
Asp Ile Tyr Leu Ser Trp Met Phe Gly Leu Leu Val Leu Tyr Lys Ser
115 120 125
Leu Ser Met Leu Leu Gly Leu Gln Ser Leu Thr Pro Ala Glu Val Ser
130 135 140
Ala Val Cys Glu Glu Lys Lys Leu Asn Val Ala His Gly Leu Ala Trp
145 150 155 160
Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Gly Leu Gln Ala
165 170 175
Arg Ile Arg Met Phe Asn Gln Leu His Asn Asn Met Leu Ser Gly Ala
180 185 190
Gly Ser Arg Arg Leu Tyr Ile Leu Phe Pro Leu Asp Cys Gly Val Pro
195 200 205
Asp Asn Leu Ser Val Val Asp Pro Asn Ile Arg Phe Arg Asp Met Leu
210 215 220
Pro Gln Gln Asn Ile Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asn Arg Val Tyr Ser
225 230 235 240
Asn Ser Val Tyr Glu Ile Leu Glu Asn Gly Gln Pro Ala Gly Val Cys
245 250 255
Ile Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser Gln
260 265 270
Asp Ala Lys Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala Lys
275 280 285
Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Glu Ile Leu Glu Asp Val Pro Glu Ser
290 295 300
Arg Asn Asn Cys Arg Leu Ile Val Tyr Gln Glu Pro Thr Asp Gly Asn
305 310 315 320
Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Ile Arg Gln Glu Glu
325 330 335
Lys Glu Glu Val Thr Met Asn Ala Pro Met Thr Ser Val Ala Pro Pro
340 345 350
Pro Ser Val Leu Ser Gln Glu Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Met Asp
355 360 365
Gln Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Leu Ile
370 375
<210> 20
<211> 1137
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 20
atgccatact ccaacctgca tccagccatc ccacggccca gaggtcaccg ctccaaatat 60
gtagccctca tctttctggt ggccagcctg atgatccttt gggtggcaaa ggatccacca 120
aatcacactc tgaagtacct agcacttcac ctagcctcgc acgaacttgg actactgttg 180
aaaaacctct gctgtctggc tgaagagctg tgccatgtcc agtccaggta ccagggcagc 240
tactggaagg ctgtgcgcgc ctgcctggga tgccccatcc actgtatggc tatgattcta 300
ctatcgtctt atttctattt cctccaaaac actgctgaca tatacctcag ttggatgttt 360
ggccttctgg tcctctataa gtccctaagc atgctcctgg gccttcagag cttgactcca 420
gcggaagtct ctgcagtctg tgaagaaaag aagttaaatg ttgcccacgg gctggcctgg 480
tcatactaca ttgggtactt gcggttgatc ttaccagggc tccaggcccg gatccgaatg 540
ttcaatcagc tacataacaa catgctcagt ggtgcaggga gccgaagact gtacatcctc 600
tttccattgg actgtggggt gcctgacaac ctgagtgtag ttgaccccaa cattcgattc 660
cgagatatgc tgccccagca aaacatcgac cgtgctggca tcaagaatcg ggtttattcc 720
aacagcgtct acgagattct ggagaacgga cagccagcag gcgtctgtat cctggagtac 780
gccaccccct tgcagaccct gtttgccatg tcacaggatg ccaaagctgg cttcagtcgg 840
gaggatcggc ttgagcaggc taaactcttc tgccggacac ttgaggaaat cctggaagat 900
gtccccgagt ctcgaaataa ctgccgcctc attgtctacc aagaacccac agacggaaac 960
agtttctcac tgtctcagga ggtgctccgg cacattcgtc aggaagaaaa ggaggaggtt 1020
accatgaatg cccccatgac ctcagtggca cctcctccct ccgtactgtc ccaagagcca 1080
agactcctca tcagtggtat ggatcagcct ctcccactcc gcactgacct catctga 1137
<210> 21
<211> 243
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Ser Gly Leu
1 5 10 15
Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly Gly Ser
20 25 30
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile Ser Ala Val
35 40 45
Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala Trp Ser Tyr
50 55 60
Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln Ala Arg Ile
65 70 75 80
Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly Ala Val Ser
85 90 95
Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val Pro Asp Asn
100 105 110
Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys Leu Pro Gln
115 120 125
Gln Thr Gly Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr Ser Asn Ser
130 135 140
Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr Cys Val Leu
145 150 155 160
Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser Gln Tyr Ser
165 170 175
Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala Lys Leu Phe
180 185 190
Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu Ser Gln Asn
195 200 205
Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp Ser Ser Phe
210 215 220
Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu Glu Lys Glu
225 230 235 240
Glu Val Thr
<210> 22
<211> 243
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Ser Gly Leu
1 5 10 15
Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly Gly Ser
20 25 30
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile Ser Ala Val
35 40 45
Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala Trp Ser Tyr
50 55 60
Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln Ala Arg Ile
65 70 75 80
Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly Ala Val Ser
85 90 95
Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val Pro Asp Asn
100 105 110
Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys Leu Pro Gln
115 120 125
Gln Thr Gly Asp His Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr Ser Asn Ser
130 135 140
Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr Cys Val Leu
145 150 155 160
Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser Gln Tyr Ser
165 170 175
Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala Lys Leu Phe
180 185 190
Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu Ser Gln Asn
195 200 205
Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp Ser Ser Phe
210 215 220
Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu Glu Lys Glu
225 230 235 240
Glu Val Thr
<210> 23
<211> 243
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Ser Gly Leu
1 5 10 15
Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly Gly Ser
20 25 30
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile Ser Ala Val
35 40 45
Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala Trp Ser Tyr
50 55 60
Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln Ala Arg Ile
65 70 75 80
Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly Ala Val Ser
85 90 95
Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val Pro Asp Asn
100 105 110
Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys Leu Pro Gln
115 120 125
Gln Thr Ala Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr Ser Asn Ser
130 135 140
Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr Cys Val Leu
145 150 155 160
Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser Gln Tyr Ser
165 170 175
Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala Lys Leu Phe
180 185 190
Cys Gln Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu Ser Gln Asn
195 200 205
Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp Ser Ser Phe
210 215 220
Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu Glu Lys Glu
225 230 235 240
Glu Val Thr
<210> 24
<211> 243
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Ser Gly Leu
1 5 10 15
Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly Gly Ser
20 25 30
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Leu Thr Pro Ala Glu Val Ser Ala Val
35 40 45
Cys Glu Glu Lys Lys Leu Asn Val Ala His Gly Leu Ala Trp Ser Tyr
50 55 60
Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Gly Leu Gln Ala Arg Ile
65 70 75 80
Arg Met Phe Asn Gln Leu His Asn Asn Met Leu Ser Gly Ala Gly Ser
85 90 95
Arg Arg Leu Tyr Ile Leu Phe Pro Leu Asp Cys Gly Val Pro Asp Asn
100 105 110
Leu Ser Val Val Asp Pro Asn Ile Arg Phe Arg Asp Met Leu Pro Gln
115 120 125
Gln Asn Ile Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asn Arg Val Tyr Ser Asn Ser
130 135 140
Val Tyr Glu Ile Leu Glu Asn Gly Gln Pro Ala Gly Val Cys Ile Leu
145 150 155 160
Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser Gln Asp Ala
165 170 175
Lys Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala Lys Leu Phe
180 185 190
Cys Arg Thr Leu Glu Glu Ile Leu Glu Asp Val Pro Glu Ser Arg Asn
195 200 205
Asn Cys Arg Leu Ile Val Tyr Gln Glu Pro Thr Asp Gly Asn Ser Phe
210 215 220
Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Ile Arg Gln Glu Glu Lys Glu
225 230 235 240
Glu Val Thr
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
cgtgctggca tcaaggatcg ggtttac 27
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
gtcaccggtc tgctggggca gtttatc 27
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
gctgaccgtg ctggcatcaa ggatcgggtt tac 33
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
ggtctgctgg ggcagtttat ccagg 25
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
caccacatcc actccaggta ccgg 24
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
cagctcctca gccaggctgc agac 24
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
cagacacttg aggacatcct ggcag 25
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
gcagaagagt ttggcctgct caa 23
<210> 33
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
acctgtattt tcagggcctg gccccagctg agatctctg 39
<210> 34
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
cagaattcgc aagcttttaa gtaacctctt ccttttcctc ctgc 44
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Met His
1 5 10 15
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Gln His Ser Arg Glu Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn
1 5 10
<210> 39
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 39
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Ala Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Met Asp Tyr
1 5
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Gln Gln Arg Thr Asn Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Ser Tyr Ile Met His
1 5
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
Asp Thr Asp Gly Tyr Asp Phe Asp Tyr
1 5
<210> 47
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 49
Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 50
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
Thr Ala Gly Met Gln
1 5
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 51
Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 52
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 53
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1 5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Thr Ala Gly Met Gln
1 5
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58
Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 59
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 59
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 60
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 61
Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu Ala
1 5
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 62
Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Thr
1 5
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile
1 5
<210> 65
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 65
His Ser Ser Gln Asp Ile Asn Ser Asn Ile Gly
1 5 10
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 66
His Gly Thr Asn Leu Asp Asp
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 67
Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Trp Thr
1 5
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Phe Ala Trp Asn
1 5 10
<210> 69
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 69
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 70
Val Thr Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr
1 5

Claims (52)

1.一种抗体药物偶联物，其由下式(II)表示：
Figure FDA0003831863150000011
式中，m1为1～10的范围，
Ab表示抗体或该抗体的功能性片段，该抗体的糖链可任选地被重构，
在此，抗体表示选自由抗CD70抗体、抗TROP2抗体以及抗EGFR抗体构成的组中的任意抗体，
L表示连接Ab与D的连接子，
Ab可任选地从其氨基酸残基直接与L结合，或从Ab的糖链或经重构的糖链与L结合，
D表示下式(I)所示的化合物：
Figure FDA0003831863150000012
在此，L与L1中所含的任意的－NH2或羟基结合，
L1表示以下的三个结构式中的任一基团：
Figure FDA0003831863150000013
以及
Figure FDA0003831863150000014
在此，波浪线表示取代位置，
Q以及Q’分别独立地表示羟基或硫醇基，
R21以及R22分别独立地表示羟基或氟原子，
W表示－NH－或硫原子。
2.根据权利要求1所述的抗体药物偶联物，其中，
D由以下的两个结构式中的任一结构式表示：
Figure FDA0003831863150000021
在此，L1、Q、Q’以及W如前述定义。
3.根据权利要求1或2所述的抗体药物偶联物，其中，
D由以下的四个结构式中的任一结构式表示：
Figure FDA0003831863150000022
在此，星号表示与L结合，Q、Q’以及W如前述定义。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
D由以下的三个结构式中的任一结构式表示：
Figure FDA0003831863150000031
在此，星号表示与L结合，W如前述定义。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
D由以下的三个结构式中的任一结构式表示：
Figure FDA0003831863150000032
在此，星号表示与L结合。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
D由以下的四个结构式中的任一结构式表示：
Figure FDA0003831863150000041
在此，星号表示与L结合。
7.根据权利要求1～4或权利要求6中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
D由下式表示：
Figure FDA0003831863150000042
在此，星号表示与L结合。
8.根据权利要求1～3中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
D由以下的两个结构式中的任一结构式表示：
Figure FDA0003831863150000051
在此，星号表示与L结合，W如前述定义。
9.根据权利要求1～3或权利要求8中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
D由以下的四个结构式中的任一结构式表示：
Figure FDA0003831863150000052
在此，星号表示与L结合。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
连接子L由－Lb－La－Lp－Lc－*表示，
式中，星号表示与药物D结合，
Lp表示在靶细胞中能够切断的由氨基酸序列形成的连接子或者不存在，
La表示选自以下的组中的任意一个：
－C(＝O)－(CH2CH2)n2－C(＝O)－、
－C(＝O)－(CH2CH2)n2－CH2－C(＝O)－、
－C(＝O)－(CH2CH2)n2－C(＝O)－NH－(CH2CH2)n3－C(＝O)－、
－C(＝O)－(CH2CH2)n2－C(＝O)－NH－(CH2CH2)n3－CH2－C(＝O)－、
－C(＝O)－(CH2CH2)n2－C(＝O)－NH－(CH2CH2O)n3－CH2－C(＝O)－、
－(CH2)n4－O－C(＝O)－、以及、
－(CH2)n9－C(＝O)－，
在此，n2表示整数1～3，n3表示整数1～5，n4表示整数0～2，n9表示整数2～7，
Lb表示将La与Ab的糖链或经重构的糖链结合的间隔子或将La与Ab的半胱氨酸残基结合的间隔子，以及，
Lc表示－NH－CH2－、―NH－苯基－CH2－O(C＝O)－或―NH－杂芳基－CH2－O(C＝O)－或不存在。
11.根据权利要求10所述的抗体药物偶联物，其中，
Lc为－NH－CH2－。
12.根据权利要求10或11所述的抗体药物偶联物，其中，
Lp为－GGFG－、－GGPI－、－GGVA－、－GGFM－、－GGVCit－、－GGFCit－、－GGICit－、－GGPL－、－GGAQ－或－GGPP－中的任意一个。
13.根据权利要求12所述的抗体药物偶联物，其中，
Lp为－GGFG－或－GGPI－。
14.根据权利要求10～13中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
La表示选自由以下构成的组中的任意一个：
－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－、
－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－NH－(CH2CH2O)3－CH2－C(＝O)－、
－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－NH－(CH2CH2O)4－CH2－C(＝O)－、以及、
－(CH2)5－C(＝O)－。
15.根据权利要求10～14中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
Lb由以下结构式中的任一结构式表示：
Figure FDA0003831863150000071
或者
Figure FDA0003831863150000072
或
Figure FDA0003831863150000073
或者
Figure FDA0003831863150000074
在上述所示的Lb的结构式中，星号表示与La结合，波浪线表示与Ab的糖链或经重构的糖链结合。
16.根据权利要求10～14中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
Lb为－(琥珀酰亚胺－3－基－N)－，
在此，－(琥珀酰亚胺－3－基－N)－表示以下的结构式：
Figure FDA0003831863150000081
在此，星号表示与La结合，波浪线表示与抗体的半胱氨酸残基的侧链形成硫醚而结合。
17.根据权利要求10～15中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
连接子L由－Lb－La－Lp－Lc－*表示，
式中，星号表示与药物D结合，
Lp为－GGFG－、或－GGPI－，
La表示－C(＝O)－CH2CH2－C(＝O)－，
Lb表示下式：
Figure FDA0003831863150000082
或者
Figure FDA0003831863150000083
在上述所示的Lb的结构式中，星号表示与La结合，波浪线表示与Ab的糖链或经重构的糖链结合，
Lc表示－NH－CH2－。
18.根据权利要求1～17中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
抗体药物偶联物中的每一分子抗体的平均药物结合数在1～10个的范围。
19.根据权利要求18所述的抗体药物偶联物，其中，
抗体药物偶联物中的每一分子抗体的平均药物结合数在1～5个的范围。
20.根据权利要求19所述的抗体药物偶联物，其中，
抗体药物偶联物中的每一分子抗体的平均药物结合数在3～5个的范围。
21.根据权利要求1～20中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
抗体从与抗体的Asn297结合的糖链与L结合，所述糖链为N297糖链。
22.根据权利要求21所述的抗体药物偶联物，其中，
N297糖链为经重构的糖链。
23.根据权利要求21或22所述的抗体药物偶联物，其中，
N297糖链为具有下式所示的结构的N297－(Fuc)MSG1或N297－(Fuc)SG：
Figure FDA0003831863150000091
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，
L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，
星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，以及，
n5为整数2～5；
Figure FDA0003831863150000092
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，
L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧以及1－6链侧两者的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，
星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，以及，
n5为整数2～5。
24.根据权利要求21～23中任一项所述的抗体药物偶联物，其由下式表示：
Figure FDA0003831863150000101
式中，m2表示整数1或2，
L为连接Ab的N297糖链和D的连接子，如前述定义，
Ab表示抗CD70抗体、抗TROP2抗体、或者抗EGFR抗体或这些抗体的功能性片段，
Ab的N297糖链表示为具有下式所示的结构的N297－(Fuc)MSG1或N297－(Fuc)SG，
Figure FDA0003831863150000102
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，
L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，
星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，以及，
n5表示整数2～5；
Figure FDA0003831863150000103
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，
L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧以及1－6链侧两者的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，
星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，以及，
n5表示整数2～5，
D由以下的四个结构式中的任一结构式表示，
Figure FDA0003831863150000111
在此，式中，星号表示与L结合。
25.根据权利要求24所述的抗体药物偶联物，其选自下式：
Figure FDA0003831863150000121
在上述所示的各结构式中，m2表示为整数1或2，
Ab表示抗CD70抗体、抗TROP2抗体、或者抗EGFR抗体或这些抗体的功能性片段，
Ab的N297糖链表示为具有下式所示的结构的N297－(Fuc)MSG1或N297－(Fuc)SG中的任意一个，
Figure FDA0003831863150000122
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，
L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，
星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，以及，
n5表示整数2～5；
Figure FDA0003831863150000131
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，
L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧以及1－6链侧两者的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，
星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，以及，
n5表示整数2～5。
26.根据权利要求25所述的抗体药物偶联物，其选自下式：
Figure FDA0003831863150000141
在上述所示的各结构式中，m2表示为整数1或2，
Ab表示抗CD70抗体、抗TROP2抗体、或者抗EGFR抗体或这些抗体的功能性片段，
Ab的N297糖链表示为具有下式所示的结构的N297－(Fuc)MSG1或N297－(Fuc)SG中的任意一个，
Figure FDA0003831863150000142
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，
L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，
星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，以及，
n5表示整数2～5；
Figure FDA0003831863150000151
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，
L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧以及1－6链侧两者的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，
星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，以及，
n5表示整数2～5。
27.根据权利要求1～26中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
抗体为抗CD70抗体。
28.根据权利要求1～26中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
抗体为抗TROP2抗体。
29.根据权利要求1～26中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，
抗体为抗EGFR抗体。
30.根据权利要求27所述的抗体药物偶联物，其中，
抗体为包含由序列号1所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号2所述的氨基酸序列形成的重链的抗体、或包含由序列号3所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号4所述的氨基酸序列形成的重链的抗体。
31.根据权利要求28所述的抗体药物偶联物，其中，
抗体为包含由序列号5所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号6所述的氨基酸序列形成的重链的抗体、或包含由序列号7所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号8所述的氨基酸序列形成的重链的抗体。
32.根据权利要求29所述的抗体药物偶联物，其中，
抗体为包含由序列号9所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号10所述的氨基酸序列形成的重链的抗体、或包含由序列号11所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号12所述的氨基酸序列形成的重链的抗体。
33.根据权利要求27所述的抗体药物偶联物，其中，
抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号1的氨基酸编号1～112所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号2的氨基酸编号1～118所述的氨基酸序列形成的重链可变区，或者，
抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号3的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号4的氨基酸编号1～118所述的氨基酸序列形成的重链可变区。
34.根据权利要求28所述的抗体药物偶联物，其中，
抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号5的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号6的氨基酸编号1～121所述的氨基酸序列形成的重链可变区，或者，
抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号7的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号8的氨基酸编号1～121所述的氨基酸序列形成的重链可变区。
35.根据权利要求29所述的抗体药物偶联物，其中，
抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号9的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号10的氨基酸编号1～119所述的氨基酸序列形成的重链可变区，或者，
抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号11的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号12的氨基酸编号1～116所述的氨基酸序列形成的重链可变区。
36.根据权利要求27所述的抗体药物偶联物，其中，
抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号35所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号36所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号37所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号38所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号39所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号40所述的氨基酸序列形成的CDRH3，或者，
抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号41所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号42所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号43所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号44所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号45所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号46所述的氨基酸序列形成的CDRH3。
37.根据权利要求28所述的抗体药物偶联物，其中，
抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号47所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号48所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号49所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号50所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号51所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号52所述的氨基酸序列形成的CDRH3，或者，
抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号53所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号54所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号55所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号56所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号57所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号58所述的氨基酸序列形成的CDRH3。
38.根据权利要求29所述的抗体药物偶联物，其中，
抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号59所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号60所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号61所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号62所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号63所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号64所述的氨基酸序列形成的CDRH3，或者，
抗体为包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号65所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号66所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号67所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号68所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号69所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号70所述的氨基酸序列形成的CDRH3。
39.一种抗体药物偶联物，其由下式表示：
Figure FDA0003831863150000181
式中，Ab表示选自以下的组中的任意一个：
包含由序列号1所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号2所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；
包含由序列号3所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号4所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；
包含由序列号5所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号6所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；
包含由序列号7所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号8所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；
包含由序列号9所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号10所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；
包含由序列号11所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号12所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；
Ab的N297糖链由下式表示：
Figure FDA0003831863150000191
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，
L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧以及1－6链侧两者的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，
星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，n5为3，以及，m2为2。
40.一种抗体药物偶联物，其由下式表示：
Figure FDA0003831863150000192
式中，Ab表示选自以下的组中的任意一个：
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号1的氨基酸编号1～112所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号2的氨基酸编号1～118所述的氨基酸序列形成的重链可变区；
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号3的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号4的氨基酸编号1～118所述的氨基酸序列形成的重链可变区；
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号5的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号6的氨基酸编号1～121所述的氨基酸序列形成的重链可变区；
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号7的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号8的氨基酸编号1～121所述的氨基酸序列形成的重链可变区；
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号9的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号10的氨基酸编号1～119所述的氨基酸序列形成的重链可变区；
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号11的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号12的氨基酸编号1～116所述的氨基酸序列形成的重链可变区；
Ab的N297糖链由下式表示：
Figure FDA0003831863150000201
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，
L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧以及1－6链侧两者的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，
星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，n5为3，以及，m2为2。
41.一种抗体药物偶联物，其由下式表示：
Figure FDA0003831863150000211
式中，Ab表示选自以下的组中的任意一个：
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号35所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号36所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号37所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号38所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号39所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号40所述的氨基酸序列形成的CDRH3；
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号41所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号42所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号43所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号44所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号45所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号46所述的氨基酸序列形成的CDRH3；
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号47所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号48所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号49所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号50所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号51所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号52所述的氨基酸序列形成的CDRH3；
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号53所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号54所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号55所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号56所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号57所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号58所述的氨基酸序列形成的CDRH3；
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号59所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号60所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号61所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号62所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号63所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号64所述的氨基酸序列形成的CDRH3；
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号65所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号66所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号67所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号68所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号69所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号70所述的氨基酸序列形成的CDRH3；
Ab的N297糖链由下式表示：
Figure FDA0003831863150000221
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，
L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧以及1－6链侧两者的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，
星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，n5为3，以及，m2为2。
42.一种抗体药物偶联物，其由下式表示：
Figure FDA0003831863150000231
式中，Ab表示选自以下的组中的任意一个：
包含由序列号1所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号2所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；
包含由序列号3所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号4所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；
包含由序列号5所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号6所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；
包含由序列号7所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号8所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；
包含由序列号9所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号10所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；
包含由序列号11所述的氨基酸序列形成的轻链以及由序列号12所述的氨基酸序列形成的重链的抗体；
Ab的N297糖链由下式表示：
Figure FDA0003831863150000232
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，
L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧以及1－6链侧两者的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，
星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，n5为3，以及，m2为1。
43.一种抗体药物偶联物，其由下式表示：
Figure FDA0003831863150000241
式中，Ab表示选自以下的组中的任意一个：
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号1的氨基酸编号1～112所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号2的氨基酸编号1～118所述的氨基酸序列形成的重链可变区；
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号3的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号4的氨基酸编号1～118所述的氨基酸序列形成的重链可变区；
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号5的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号6的氨基酸编号1～121所述的氨基酸序列形成的重链可变区；
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号7的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号8的氨基酸编号1～121所述的氨基酸序列形成的重链可变区；
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号9的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号10的氨基酸编号1～119所述的氨基酸序列形成的重链可变区；
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号11的氨基酸编号1～108所述的氨基酸序列形成的轻链可变区，所述重链包含由序列号12的氨基酸编号1～116所述的氨基酸序列形成的重链可变区；
Ab的N297糖链由下式表示：
Figure FDA0003831863150000251
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，
L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧以及1－6链侧两者的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，
星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，n5为3，以及，m2为1。
44.一种抗体药物偶联物，其由下式表示：
Figure FDA0003831863150000252
式中，Ab表示选自以下的组中的任意一个：
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号35所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号36所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号37所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号38所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号39所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号40所述的氨基酸序列形成的CDRH3；
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号41所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号42所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号43所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号44所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号45所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号46所述的氨基酸序列形成的CDRH3；
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号47所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号48所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号49所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号50所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号51所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号52所述的氨基酸序列形成的CDRH3；
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号53所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号54所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号55所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号56所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号57所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号58所述的氨基酸序列形成的CDRH3；
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号59所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号60所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号61所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号62所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号63所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号64所述的氨基酸序列形成的CDRH3；
包含如下轻链和重链的抗体，所述轻链包含由序列号65所述的氨基酸序列形成的CDRL1、由序列号66所述的氨基酸序列形成的CDRL2、以及由序列号67所述的氨基酸序列形成的CDRL3，所述重链包含由序列号68所述的氨基酸序列形成的CDRH1、由序列号69所述的氨基酸序列形成的CDRH2、以及由序列号70所述的氨基酸序列形成的CDRH3；
Ab的N297糖链由下式表示：
Figure FDA0003831863150000271
式中，波浪线表示与抗体的Asn297结合，
L(PEG)表示－(CH2－CH2－O)n5－CH2－CH2－NH－，表示该L(PEG)的右端的氨基与N297糖链的β－Man的支链的1－3链侧以及1－6链侧两者的非还原末端的唾液酸的2位羧基进行酰胺键合，
星号表示与所述连接子L的Lb的1，2，3－三唑环上的1位或3位氮原子结合，n5为3，以及，m2为1。
45.一种STING激动剂，其含有如权利要求1～44中任一项所述的抗体药物偶联物。
46.一种医药组合物，其含有如权利要求1～44中任一项所述的抗体药物偶联物。
47.一种抗肿瘤剂，其含有如权利要求1～44中任一项所述的抗体药物偶联物。
48.根据权利要求47所述的抗肿瘤剂，其中，
肿瘤为肺癌、肾癌、尿路上皮癌、大肠癌、前列腺癌、多形性神经胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、子宫体癌、睾丸癌、宫颈癌、胎盘绒毛膜癌、脑肿瘤、头颈癌、甲状腺癌、间皮瘤、胃肠道间质瘤GIST、胆囊癌、胆管癌、肾上腺癌、鳞状细胞癌、咽癌、舌癌、听觉器官癌、胸腺癌、小肠癌、白血病、恶性淋巴瘤、浆细胞瘤、骨髓瘤或肉瘤。
49.一种癌的治疗方法，其包括：给药选自由如权利要求1～44中任一项所述的抗体药物偶联物、如权利要求45所述的STING激动剂、如权利要求46所述的医药组合物以及如权利要求47或48所述的抗肿瘤剂构成的组中的任意种。
50.根据权利要求49所述的方法，其中，
癌为肺癌、肾癌、尿路上皮癌、大肠癌、前列腺癌、多形性神经胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、子宫体癌、睾丸癌、宫颈癌、胎盘绒毛膜癌、脑肿瘤、头颈癌、甲状腺癌、间皮瘤、胃肠道间质瘤GIST、胆囊癌、胆管癌、肾上腺癌、鳞状细胞癌、咽癌、舌癌、听觉器官癌、胸腺癌、小肠癌、白血病、恶性淋巴瘤、浆细胞瘤、骨髓瘤或肉瘤。
51.根据权利要求27、30、33或36中任一项所述的抗体药物偶联物，其在皮下移植了人肾癌细胞株Caki―1细胞的BALB/c―nu小鼠中发挥了抗体靶点依赖性的抗肿瘤效果。
52.根据权利要求42～44中任一项所述的抗体药物偶联物，其在下述(i)或(ii)所述的动物中发挥比抗体药物偶联物中所含的抗体更强的抗肿瘤效果：
(i)皮下移植了小鼠大肠癌细胞株CT26.WT(CRL2638)的BALB/c小鼠，所述小鼠大肠癌细胞株CT26.WT(CRL2638)导入有所述抗体药物偶联物中所含的抗体所结合的抗原上的表位位点被取代为人型而成的人鼠嵌合抗原的基因；
(ii)皮下移植了人肾癌细胞株A―498(HTB―44)细胞的BALB/c―nu小鼠。
CN202180019047.0A 2020-03-06 2021-03-05 包含新型环状二核苷酸衍生物的抗体药物偶联物 Pending CN115209921A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020038983 2020-03-06
JP2020-038983 2020-03-06
PCT/JP2021/008635 WO2021177438A1 (ja) 2020-03-06 2021-03-05 新規環状ジヌクレオチド誘導体を含む抗体薬物コンジュゲート

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115209921A true CN115209921A (zh) 2022-10-18

Family

ID=77614077

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180019047.0A Pending CN115209921A (zh) 2020-03-06 2021-03-05 包含新型环状二核苷酸衍生物的抗体药物偶联物

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20230330248A1 (zh)
EP (1) EP4115909A1 (zh)
JP (1) JPWO2021177438A1 (zh)
KR (1) KR20220151630A (zh)
CN (1) CN115209921A (zh)
AU (1) AU2021230226A1 (zh)
BR (1) BR112022015283A2 (zh)
CA (1) CA3168368A1 (zh)
CO (1) CO2022013971A2 (zh)
IL (1) IL296124A (zh)
MX (1) MX2022009597A (zh)
TW (1) TW202140044A (zh)
WO (1) WO2021177438A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW202241454A (zh) 2021-02-01 2022-11-01 日商第一三共股份有限公司 抗體－免疫賦活化劑共軛物之新穎製造方法
WO2024024935A1 (ja) * 2022-07-29 2024-02-01 第一三共株式会社 抗腫瘍効果を有する抗体薬物複合体の新規製造方法
WO2024048490A1 (ja) * 2022-08-29 2024-03-07 第一三共株式会社 変異Ｆｃ領域を含む抗体薬物コンジュゲート

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108137641A (zh) * 2015-08-13 2018-06-08 默沙东公司 作为sting激动剂的环状双核苷酸化合物
CN108430503A (zh) * 2015-10-28 2018-08-21 艾杜罗生物科技公司 用于激活“干扰素基因刺激物”依赖性信号传导的组合物和方法
WO2018227023A1 (en) * 2017-06-07 2018-12-13 Silverback Therapeutics, Inc. Antibody construct conjugates
US20190185511A1 (en) * 2016-07-05 2019-06-20 Aduro Biotech, Inc. Locked nucleic acid cyclic dinucleotide compounds and uses thereof
US20190192549A1 (en) * 2016-12-01 2019-06-27 Takeda Pharmaceutical Company Limited Cyclic dinucleotide

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US6235883B1 (en) * 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
WO2002092771A2 (en) 2001-05-11 2002-11-21 Ludwig Institute For Cancer Research Specific binding proteins and uses thereof
BRPI0213846B8 (pt) 2001-11-01 2021-05-25 Uab Research Foundation composição que compreende um anticorpo que liga especificamente uma dr5 do receptor de trail e um ou mais agentes terapêuticos
US7662387B2 (en) * 2003-02-20 2010-02-16 Seattle Genetics Anti-cd70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of cancer and immune disorders
ES2527961T3 (es) 2005-09-26 2015-02-02 Medarex, L.L.C. Anticuerpos monoclonales humanos para CD70
JP5566226B2 (ja) 2009-09-03 2014-08-06 旭化成株式会社 １１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの製造方法
EP3632471A1 (en) 2012-10-11 2020-04-08 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate
WO2014093936A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Aduro Biotech, Inc. Compositions comprising cyclic purine dinucleotides having defined stereochemistries and methods for their preparation and use
CA2895175C (en) 2012-12-19 2021-06-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Pharmaceutical targeting of a mammalian cyclic di-nucleotide signaling pathway
BR112015027327B1 (pt) 2013-04-29 2022-08-02 Rutgers, The State University Of New Jersey Composto, modulador de cgas, composição farmacêutica compreendendo o referido composto ou modulador
JP6400082B2 (ja) 2013-05-18 2018-10-03 アデュロ バイオテック，インコーポレイテッド 「インターフェロン遺伝子の刺激因子」依存性シグナル伝達を抑制するための組成物および方法
JP6453855B2 (ja) 2013-05-18 2019-01-16 アドゥロ バイオテック，インク． 「インターフェロン遺伝子の刺激因子」依存性シグナル伝達を活性化するための組成物及び方法
WO2015074145A1 (en) 2013-11-22 2015-05-28 Brock University Use of fluorinated cyclic dinucleotides as oral vaccine adjuvants
KR102535900B1 (ko) 2013-12-25 2023-05-26 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 trop2 항체-약물 컨쥬게이트
JP6462006B2 (ja) 2014-06-04 2019-01-30 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｓｔｉｎｇのモジュレーターとしての環式ジヌクレオチド
DE102014214408A1 (de) 2014-07-23 2016-01-28 Wacker Chemie Ag Härtbare Organopolysiloxanzusammensetzungen
WO2016096714A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 Henkel Ag & Co. Kgaa Detergent composition comprising subtilase variants
US11559581B2 (en) 2015-01-09 2023-01-24 Oxford University Innovation Limited Antibody conjugates and methods of making the antibody conjugates
KR20170129802A (ko) 2015-03-10 2017-11-27 아두로 바이오테크, 인코포레이티드 ＂인터페론 유전자의 자극인자＂-의존적 신호전달을 활성화하는 조성물 및 방법
MA52157A (fr) 2015-12-03 2021-02-17 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Dinucléotides cycliques de purine utilisés comme modulateurs de sting
CA3007311A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Opi Vi - Ip Holdco Llc Compositions of antibody construct-agonist conjugates and methods of use thereof
CN109451740B (zh) 2016-01-11 2022-09-02 先天肿瘤免疫公司 用于治疗与sting活性相关的病症诸如癌症的环状二核苷酸
IL280430B2 (en) 2016-03-18 2023-11-01 Univ Texas Cyclic dinucleotide compounds and methods of use
EP3440072B1 (en) 2016-04-07 2020-01-29 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd Heterocyclic amides useful as protein modulators
CR20200045A (es) 2016-04-07 2020-03-11 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd AMIDAS HETEROCÍCLICAS ÚTILES COMO MODULADORES DE PROTEÍNAS (Divisional 2018-0472)
EP4159749A3 (en) 2016-07-01 2023-06-14 Daiichi Sankyo Company, Limited A method for producing fc-containing molecule with remodeled sugar chain
EP3481402A4 (en) 2016-07-06 2020-01-22 Sperovie Biosciences, Inc. CONNECTIONS, COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING A DISEASE
WO2018045204A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 Ifm Therapeutics, Inc Cyclic dinucleotide analogs for treating conditions associated with sting (stimulator of interferon genes) activity
US10537590B2 (en) 2016-09-30 2020-01-21 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cyclic dinucleotide compounds
RS62410B1 (sr) 2016-10-04 2021-10-29 Merck Sharp & Dohme Benzo[b]tiofenska jedinjenja kao agonisti sting
US11001605B2 (en) 2016-10-07 2021-05-11 Biolog Life Science Institute Gmbh & Co. Kg Cyclic dinucleotides containing benzimidazole, method for the production of same, and use of same to activate stimulator of interferon genes (sting)-dependent signaling pathways
AR113224A1 (es) * 2017-04-28 2020-02-19 Novartis Ag Conjugados de anticuerpo que comprenden un agonista de sting
AU2019337051B2 (en) * 2018-09-06 2023-11-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Novel cyclic dinucleotide derivative and antibody-drug conjugate thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108137641A (zh) * 2015-08-13 2018-06-08 默沙东公司 作为sting激动剂的环状双核苷酸化合物
CN108430503A (zh) * 2015-10-28 2018-08-21 艾杜罗生物科技公司 用于激活“干扰素基因刺激物”依赖性信号传导的组合物和方法
US20190185511A1 (en) * 2016-07-05 2019-06-20 Aduro Biotech, Inc. Locked nucleic acid cyclic dinucleotide compounds and uses thereof
US20190192549A1 (en) * 2016-12-01 2019-06-27 Takeda Pharmaceutical Company Limited Cyclic dinucleotide
WO2018227023A1 (en) * 2017-06-07 2018-12-13 Silverback Therapeutics, Inc. Antibody construct conjugates

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SENLIN LI等: "The Cyclopeptide Astin C Specifically Inhibits the Innate ImmuneCDN Sensor STING", 《CELL REPORTS》, vol. 25, no. 12, 31 December 2018 (2018-12-31), pages 3405 - 3421, XP055800947, DOI: 10.1016/j.celrep.2018.11.097 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP4115909A1 (en) 2023-01-11
MX2022009597A (es) 2022-09-02
CO2022013971A2 (es) 2022-10-31
JPWO2021177438A1 (zh) 2021-09-10
AU2021230226A1 (en) 2022-09-29
CA3168368A1 (en) 2021-09-10
WO2021177438A1 (ja) 2021-09-10
US20230330248A1 (en) 2023-10-19
BR112022015283A2 (pt) 2022-09-20
IL296124A (en) 2022-11-01
TW202140044A (zh) 2021-11-01
KR20220151630A (ko) 2022-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102567591B1 (ko) 신규 고리형 디뉴클레오티드 유도체 및 그 항체 약물 콘쥬게이트
CN111164208B (zh) 抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物
WO2020196474A1 (ja) 抗体－ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲート
CN115209921A (zh) 包含新型环状二核苷酸衍生物的抗体药物偶联物
US20220168438A1 (en) Combination of antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate and parp inhibitor
WO2020196475A1 (ja) 抗ｈｅｒ２抗体－ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲート
CN117693526A (zh) 抗-c-Met抗体药物缀合物
WO2022163846A1 (ja) 抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの新規製造方法
JP7483975B2 (ja) 新規環状ジヌクレオチド誘導体及びその抗体薬物コンジュゲート
RU2809547C2 (ru) Новое производное циклического динуклеотида и его конъюгат антитело-лекарственное средство
WO2024024935A1 (ja) 抗腫瘍効果を有する抗体薬物複合体の新規製造方法
WO2024048490A1 (ja) 変異Ｆｃ領域を含む抗体薬物コンジュゲート
KR20230154892A (ko) 항-her2 항체-약물 접합체 및 이의 용도
CN116867795A (zh) 抗体－免疫刺激剂偶联物的新型制造方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination