RO123525B1 - Metodă in vitro de inducere selectivă a apoptozei sau de inhibare a proliferării celulelor ţintă care exprimă dr5 şi compoziţie pentru inducerea selectivă a apoptozei cuprinzând o combinaţie de anticorpi - Google Patents

Metodă in vitro de inducere selectivă a apoptozei sau de inhibare a proliferării celulelor ţintă care exprimă dr5 şi compoziţie pentru inducerea selectivă a apoptozei cuprinzând o combinaţie de anticorpi Download PDF

Info

Publication number
RO123525B1
RO123525B1 ROA200400390A RO200400390A RO123525B1 RO 123525 B1 RO123525 B1 RO 123525B1 RO A200400390 A ROA200400390 A RO A200400390A RO 200400390 A RO200400390 A RO 200400390A RO 123525 B1 RO123525 B1 RO 123525B1
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
antibody
cells
tra
trail
apoptosis
Prior art date
Application number
ROA200400390A
Other languages
English (en)
Inventor
Tong Zhou
Kimihisa Ichikawa
P. Robert Kimberly
J. William Koopman
Jun Oshumi
F. Albert Lobuglio
J. Donald Buchsbaum
Original Assignee
Uab Research Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Uab Research Foundation filed Critical Uab Research Foundation
Publication of RO123525B1 publication Critical patent/RO123525B1/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A61P5/44—Glucocorticosteroids; Drugs increasing or potentiating the activity of glucocorticosteroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Abstract

Invenţia se referă la combinaţii de anticorpi selectivi pentru un receptor al unui ligand care induce apoptoza, asociat cu un factor al necrozei tumorale. Un anticorp din prezenta invenţie interacţionează cu DR5 uman sau cu DR4 uman, pentru a produce efecte agoniste sau antagoniste în josul reacţiei cascadă a receptorului, incluzând inhibiţia proliferării celulare şi apoptozei. Metodele şi utilizările anticorpilor, opţional, în combinaţie cu diferiţi agenţi terapeutici, conform invenţiei, sunt utilizate în tratamentul bolilor legate de apoptoză şi în tratamentul creşterii celulare neregulate.

Description

RO 123525 Β1 I nvenţia se referă la metode in vitro de inducere selectivă a apoptozei sau de inhibare a proliferării celulelor ţintă care exprimă DR5 şi la o compoziţie care cuprinde o combinaţie de anticorpi, pentru inducerea selectivă a apoptozei. Invenţia de faţă se referă la un anticorp capabil să lege specific un receptor pentru un ligand (la care se va face referire în continuare ca „TRAIL") inductor al apoptozei, asociat cu un tip singular de factor al necrozei tumorale (la care se va face referire în continuare ca „TNF"), mai specific, la un anticorp monoclonal care induce apoptoza în celule in vivo şi in vitro care exprimă receptorul de tip singular şi la terapii bazate pe acesta. TRAI L este un membru al familiei de proteine TNF, care include de asemenea TNF-a şi ligandul Fas (S. R. Wiley, K. Schooley, P. J. Smolak, W. S. Din, C. P. Huang, J. K. Nicholl, G. R. Sutherland, T. D. Smith, C. Rauch, C. A. Smith, etal., Immunity, 1995, Dec; 3(6):673-82). Aceste proteine sunt inductori eficace ai apoptozei. Au fost identificaţi până acum cinci receptori pentru TRAIL, dintre care doi, DR4 (TRAIL-R1) şi DR5 (TRAIL-R2) (G. Pan, K. O'Rourke, A. M. Chinnaiyan, R. Gentz, R. Ebner, J. Ni, V. M. Dixit, Science, 1997 4 Apr; 276(5309): 111-3; H. Walczak, M. A. Degli-Esposti, R. S. Johnson, P. J. Smolak, J. Y. Waugh, N. Boiani, M. S. Timour, M. J. Gerhart, K. A. Schooley, C. A. Smith, R. G. Goodwin, C. T. Rauch., EMBO J., 1997, 1 Sep; 16(17):5356-97; M. MacFarlane, M. Ahmad, S. M. Srinivasula, T. Femandes-Alnemri, G. M. Cohen, E. S. Alnemri., J. Biol. Chem., 1997,10Oct; 272(41):25417-20; M. A. Degli-Esposti, W. C. Dougall, P. J. Smolak, J. Y. Waugh, C. A. Smith, R. G. Goodwin, Immunity, 1997, Dec; 7(6):813-20; P. M. Chaudhary, M. Eby, A. Tasmin, A. Bookwalter, J. Murray, L. Hood, Immunity, 1997, Dec; 7(6):821-30; P. Schneider, M. Thome, K. Burns, J. L. Bodmer, K. Hofmann, T. Kataoka, N. Holler, J. Tschopp., Immunity, 1997 Dec; 7(6):831-6) sunt capabili de a traduce semnalul de apoptoză, în timp ce ceilalţi trei DcR1 (TRAIL-R3), DcR2 (TRAIL-R4) şi osteoprotegerina (OPG) nu traduc semnalul de apoptoză (M. A. Degli-Esposti, P. J. Smolak, H. Walczak, J. Waugh, C. P. Huang, R. F. DuBose, R. G. Goodwin, C. A. Smith, J. Exp. Med., 1997, Get 6; 186(7):1165-70; J. P. Sheridan, S. A. Marsters, R. M. Pitti, A. Gumey, M. Skubatch, D. Baldwin, L. Ramakrishnan, C. L. Gray, K. Baker, W. I. Wood, A. D. Goddard, P. Godowski, A. Ashkenazi, Science, 1997, 8 Aug.; 277(5327):818-21; G. Pan, J. Ni, Y. F. Wei, G. Yu, R. Gentz, V. M. Dixit, Science, 1997, 8 Aug; 277(5327):815-818; S. A. Marsters, J. P. Sheridan, R. M. Pitti, A. Huang, M. Skubatch, D. Baldwin, J. Yuan, A. Gumey, A. D. Goddard, P. Godowski, A. Ashkenazi., Curr. Biol., 1997,1 Dec; 7(12):1003-6; J. G. Emery, P. McDonnell, Μ. B. Burke, K. C. Deen, S. Lyn, C. Silverman, E. Dul, E. R. Appelbaum, C. Eichman, R. DiPrinzio, R. A. Dodds, I. E. James, M. Rosenberg, J. C. Lee, P. R. Young, J. Biol. Chem., 1998, 5 Iunie; 273(23):14363-7). Toţi cei cinci receptori pentru TRAIL au în comun o omologie semnificativă a domeniilor de legare a ligandului extracelular. Similar cu Fas şi cu receptorul I al TNF (la care se va face referire în continuare ca „TNFRI"), segmentele intracelulare atât ale DR4, cât şi ale DR5, conţin un domeniu al morţii şi traduc un semnal de apoptoză printr-o cale care implică o proteină a domeniului morţii, asociată cu Fas (la care se va face referire în continuare ca „FADD") şi caspaza 8 (P. M. Chaudhary, M. Eby, A. Tasmin, A. Bookwalter, J. Murray, L. Hood, Immunity, 1997 Dec; 7(6):821-30; P. Schneider, M. Thome, K. Burns, J. L. Bodmer, K. Hofmann, T. Kataoka, N. Holler, J. Tschopp, Immunity, 1997, Dec; 7(6):831-6).
Suplimentar faţă de traducerea semnalului apoptozei, receptorii DR4 şi DR5 pot de asemenea să activeze o cale care să implice NFkb (P. M. Chaudhary, M. Eby, A. Tasmin, A. Bookwalter, J. Murray, L. Hood, Immunity, 1997, Dec; 7(6):821-30; P. Schneider, M. Thome, K. Burns, J. L. Bodmer, K. Hofmann, T. Kataoka, N. Holler, J. Tschopp, Immunity, 1997, Dec; 7(6):831-6). 2 RO 123525 Β1
Funcţiile biologice ale TRAI L, care au fost demonstrate, includ capacitatea TRAI L de 1 a induce selectiv apoptoza celulelor tumorale transformate, celulele normale fiind relativ rezistente la apoptoza mediată de TRAIL (H. Walczak, R. E. Miller, K. Ariail, B. Gliniak, T. 3 S. Griffith, M. Kubin, W. Chin, J. Jones, A. Woodward, T. Le, C. Smith, P. Smolak, R. G. Goodwin, C. T. Rauch, J. C. Schuh, D. H. Lynch, Nat. Med., 1999, Feb; 5(2):157-63; Y. 5 Gazitt, Leukemia, 1999, Noiembrie; 13(11): 1817-24; J. Rieger, U. Naumann, T. Glaser, A. Ashkenazi, M. Weller, FEBS Lett., 1998, 1 Mai; 427(1): 124-8). Această selectivitate 7 sugerează faptul că, în contrast cu ligandul Fas, administrarea lui TRAIL se asociază cu niveluri foarte scăzute de toxicitate, după cum s-a demonstrat prin administrarea sistemică 9 a TRAIL pe un model animal, fără a induce o toxicitate semnificativă (H. Walczak, R. E.
Miller, K. Ariail, B. Gliniak, T. S. Griffith, M. Kubin, W. Chin, J. Jones, A. Woodward, T. Le, 11 C. Smith, P. Smolak, R. G. Goodwin, C. T. Rauch, J. C. Schuh, D. H. Lynch, Nat. Med., 1999, Feb; 5(2):157-63). Astfel, TRAIL a fost propus ca agent eficace de inducţie a 13 apoptozei, care ar putea fi un agent terapeutic adecvat pentru tratamentul cancerului şi al altor boli asociate cu proliferarea celulară anormală. TRAIL a fost de asemenea propus ca 15 agent eficace de inducţie a apoptozei, care ar fi adecvat pentru tratamentul bolilor autoimune şi inflamatorii. S-a demonstrat că apoptoza mediată de TRAIL este implicată în moartea 17 celulară indusă prin activarea celulelor T, astfel servind ca mecanism alternativ la ligandul Fas (I. Jeremias, I. Herr, T. Boehler, K. M. Debatin, Eur. J. Imununol., 1998, Ianuarie; 19 28(1):143-52; M. J. Martinez-Lorenzo, M. A. Alava, S. Gamen, K. J. Kim, A. Chuntharapai, A. Pineiro, J. Naval, A. Anei, Eur. J. Immunol., 1998, Sept; 28(9):2714-25). Apoptoza 21 mediată de TRAIL poate de asemenea să funcţioneze în inducţia apoptozei celulelor T şi a altor celule inflamatorii (T. A. Phillips, J. Ni, G. Pan, S. M. Ruben, Y. F. Wei, J. L. Pace, J. 23 S. Hunt., J. Immunol., 1999, 15 Mai; 162(10):6053-9) şi joacă un rol în activitatea ucigaşă a celulelor NK (N. Kayagaki, N. Yamaguchi, M. Nakayama, K. Takeda, H. Akiba, H. Tsutsui, 25 H. Okamura, K. Nakanishi, K. Okumura, H. Yagita, J. Immunol., 1999,15 Aug; 163(4):1906-13; A. C. Johnsen, J. Haux, B. Steinkjer, U. Nonstad, K. Egeberg, A. Sundan, A. Ashkenazi, 27 T. Espevik, Cytokine, 1999, Sept., 11(9):664-72; L. Zamai, M. Ahmad, I. M. Bennett, L.
Azzoni, E. S. Alnemri, B. Perussia, J. Exp. Med., 1998, 21 Dec; 188(12):2375-80), şi în 29 funcţia imunomodulatoare a celulelor dendritice (N. A. Fanger, C. R. Maliszewski, K. Schooley, T. S. Griffith, J. Exp. Med., 1999, 18 Oct; 190(8):1155-64, T. S. Griffith, S. R. 31
Wiley, Μ. Z. Kubin, L. M. Sedger, C. R. Maliszewski, N. A. Fanger, J. Exp. Med., 1999, 19
Apr; 189(8): 1343-54). Astfel, apoptoza mediată de TRAIL poate de asemenea funcţiona în 33 avantajul imunitarşi în supravegherea imunologică.
Sistemul receptorTRAIL este complex, şi include cel puţin doi receptori ai morţii, DR4 35 şi DR5, şi cel puţin doi receptori neapoptotici, DcR1 şi DcR2. Toţi aceşti receptori nu au doar o înaltă omologie a secvenţelor de aminoacizi, ci prezintă de asemenea o afinitate de legare 37 similară la TRAIL (G. Pan, K. O'Rourke, A. M. Chinnaiyan, R. Gentz, R. Ebner, J. Ni, V. M.
Dixit, Science, 1997, 4 Apr; 276(5309): 111-3; H. Walczak, M. A. Degli-Esposti, R. S. 39 Johnson, P. J. Smolak, J. Y. Waugh, N. Boiani, M. S. Timour, M. J. Gerhart, K. A. Schooley, C. A. Smith, R. G. Goodwin, C. T. Rauch., EMBO J., 1997, 1 Sep; 16(17):5356-97; M. 41
MacFarlane, M. Ahmad, S. M. Srinivasula, T. Femandes-Alnemri, G. M. Cohen, E. S. Alnemri, J. Biol. Chem., 1997,10 Oct; 272(41 ):25417-20; M. A. Degli-Esposti, W. C. Dougall, 43 P. J. Smolak, J. Y. Waugh, C. A. Smith, R. G. Goodwin, Immunity, 1997, Dec; 7(6):813-20; P. M. Chaudhary, M. Eby, A. Tasmin, A. Bookwalter, J. Murray, L. Hood, Immunity, 1997, 45
Dec; 7(6):821-30; P. Schneider, M. Thome, K. Burns, J. L. Bodmer, K. Hofmann, T. Kataoka, N. Holler, J. Tschopp, Immunity, 1997, Dec; 7(6):831-6; M. A. Degli-Esposti, P. J. Smolak, 47 H. Walczak, J. Waugh, C. P. Huang, R. F. DuBose, R. G. Goodwin, C. A. Smith, J. Exp. 3 RO 123525 Β1
Med., 1997, Get6; 186(7):1165-70; J. P. Sheridan, S. A. Marsters, R. M. Pitti, A. Gumey, M. Skubatch , D. Baldwin, L. Ramakrishnan, C. L. Gray, K. Baker, W. I. Wood, A. D. Goddard, P. Godowski, A. Ashkenazi, Science, 1997, 8 Aug; 277(5327):818-21; G. Pan, J. Ni, Y. F. Wei, G. Yu, R. Gentz, V. M. Dixit, Science, 1997, 8 Aug; 277(5327):815-818; S. A. Marsters, J. P. Sheridan, R. M. Pitti, A. Huang, M. Skubatch, D. Baldwin, J. Yuan, A. Gumey, A. D. Goddard, P. Godowski, A. Ashkenazi, Curr. Biol., 1997, 1 Dec; 7(12):1003-6; J. G. Emery, P. McDonnell, Μ. B. Burke, K. C. Deen, S. Lyn, C. Silverman, E. Dul, E. R. Appelbaum, C. Eichman, R. DiPrinzio, R. A. Dodds, I. E. James, M. Rosenberg, J. C. Lee, P. R. Young, J. Biol. Chem., 1998, 5 Iunie; 273(23):14363-7). Capacitatea receptorilor DcR1 şi DcR2 de a intra în competiţie pentru TRAIL, fără a induce apoptoza, sugerează că aceştia se pot comporta ca receptori momeală, care blochează sau modulează activitatea ligandului TRAIL. Mai mult, s-a raportat că celulele netransformate exprimă niveluri mai mari ale receptorilor momeală decât o fac celulele transformate. Astfel, s-a propus ca modularea distinctivă a exprimării receptorilor morţii şi momelii să poată reprezenta un mecanism reglator cheie, care să determine susceptibilitatea celulei la apoptoza mediată de TRAIL, doar datorită lipsei de anticorpi receptor-specifici (G. Pan, K. O'Rourke, A. M. Chinnaiyan, R. Gentz, R. Ebner, J. Ni, V. M. Dixit, Science, 1997, 4 Apr; 276(5309): 111-3). Deşi exprimarea şi funcţionarea DR4 şi DR5 a fost studiată pe larg, progresul a fost împiedicat de lipsa anticorpilor monoclonali receptor-specifici. Exprimarea la suprafaţa celulei a DR5 nu a fost documentată. S-a raportat faptul că a fost produs un grup de anticorpi antireceptor TRAIL, care este capabil de a induce apoptoza celulelor de melanom in vitro, dar doar după imobilizarea anticorpilor, pentru a promova legarea încrucişată, şi, în unele cazuri, celulele necesită cultivarea cu actinomicină D (T. S. Griffith, C. T. Rauch, P. J. Smolak, J. Y. Waugh, N. Boiani, D. H. Lynch, C. A. Smith, R. G. Goodwin, Μ. Z. Kubin, J. Immunology, 1999, 162: 2597-2605). Au fost produşi câţiva anticorpi anti-DR5 (T. S. Griffith, C. T. Rauch, P. J. Smolak, J. Y. Waugh, N. Boiani, D. H. Lynch, C. A. Smith, R. G. Goodwin, Μ. Z. Kubin, J. Immunology, 1999, 162: 2597-2605). Cu toate acestea, aceşti anticorpi monoclonali anti-DR5, produşi anterior, au o activitate inductoare a apoptozei scăzută in vitro, chiar şi în condiţiile legării încrucişate (reticulării). Nu a fost raportată nicio activitate in vivo. Aceşti anticorpi nu au fost utilizaţi pentru examinarea exprimării la suprafaţa celulei a receptorilor TRAIL (T. S. Griffith, C. T. Rauch, P. J. Smolak, J. Y. Waugh, N. Boiani, D. H. Lynch, C. A. Smith, R. G. Goodwin, Μ. Z. Kubin, J. Immunology, 1999, 162: 2597-2605). Astfel, există necesitatea unui anticorp monoclonal care să fie selectiv pentru fiecare receptor TRAIL specific, care nu este doar capabil să lege receptorul de pe suprafaţa celulei, ci, de asemenea, de a induce puternic apoptoza a numeroase tipuri de celule anormale, incluzând celulele tumorale, atât in vivo, cât şi in vitro, fără necesitatea legării încrucişate (reticulării) sau a imobilizării. Un asemenea anticorp nu ar asigura doar un potenţial agent terapeutic, ci şi un instrument de diagnostic pentru analiza funcţională a receptorului TRAIL. Există o necesitate specială pentru un anticorp specific împotriva fiecăruia dintre receptorii inductori ai morţii DR4 şi DR5. în dezvoltarea sau progresia multor boli, există adesea cazul în care celulele nu sunt eliminate. în multe boli autoimune şi în multe stări inflamatorii, celulele activate care supravieţuiesc atacă celulele sau ţesuturile normale. în plus, progresia tumorigenezei şi formarea panusului proliferativ al artritei reumatoide sunt caracterizate prin proliferarea necontrolată a celulelor. Astfel, apoptoza insuficientă conduce la dezvoltarea bolii, iar utilizarea ligandului inductor al apoptozei sau a anticorpului monoclonal agonist pentru a îmbunătăţi apoptoza sunt considerate ca o strategie terapeutică potenţială, pentru eliminarea acelor celule nedorite. 4 RO 123525 Β1
De exemplu, artrita reumatoidă (la care se va face referire în continuare ca „RA") este 1 o boală umană, autoimună, comună. Modul curent de înţelegere a fiziopatologiei RA este acela că celulele T autoimune şi celulele B iniţiază un răspuns inflamator în articulaţii, care 3 conduce la hiperproliferarea sinoviocitelor. Ca o consecinţă a hiperproliferării celulelor sinoviale, metaloproteinazele (la care se va face referire în continuare ca „MMP-uri") sunt 5 produse în mod excedentar, ceea ce conduce mai departe la distrugerea erozivă a cartilajului şi a oaselor, ceea ce este caracteristic pentru RA (S. Albani şi D. A. Carson, 1997, Arthntis 7 and allied conditions, a textbook of rheumatology, Ediţia a 13-a, volumul 2,979-992). Astfel, controlul hiperproliferării celulelor inflamatorii sinoviale este o etapă cheie în tratamentul RA. 9
Mecanismele moleculare, care conduc la hiperproliferarea celulelor sinoviale, sunt încă necunoscute. Deşi celulele sinoviale hiperproliferative nu sunt maligne şi nu sunt 11 transformate, multe studii au sugerat faptul că acestea prezintă caracteristici comune cu celulele transformate (U. Miller-Ladner, R. E. Gay şi S. Gay, 1997, Arthntis and allied 13 conditions, a textbook of rheumatology, Ediţia a 13-a, volumul 1, 243-254). Aceste celule, aşa-numitele „sinoviocite care apar transformate", sunt caracterizate printr-un reticul 15 endoplasmatic rugos, dens, numeroşi nudei neregulaţi şi modificări ale scheletului celular, în mod normal în formă de fus. S-a presupus că încorporarea oncogenelor şi a genelor 17 derivate de la virusuri ar putea fi declanşatorii primari ai formei transformate a celulelor sinoviale de RA (U. Miller-Ladner, R. E. Gay şi S. Gay, 1997, Arthritis and allied conditions, 19 a textbook of rheumatology, ediţia a 13-a, volumul 1, 243-254).
Cel puţin două aspecte ale RA sugerează că apoptoza neregulată poate contribui la 21 procesul bolii şi că provocarea terapeutică a apoptozei poate fi un tratament eficace: eşecul eliminării celulelor T activate sugerează faptul că există o moarte celulară defectuoasă, 23 indusă de activarea acestor celule T, care este un proces care implică apoptoza mediată de Fas şi apoptoza mediată de TRAIL, iar natura hiperproliferativă a celulelor sinoviale RA este 25 un factor care contribuie la etapele ulterioare ale fiziopatologiei RA. într-adevăr, s-a demonstrat faptul că administrarea anticorpului anti-Fas, în articulaţiile inflamatoare, inhibă 27 dezvoltarea artritei cronice la şoarecii transgenici tax, care sunt un model animal pentru RA umană (K. Fujisawa, H. Asahara, K. Okamoto, Η. Aono, T. Hasunuma, T. Kobata, Y. 29
Iwakura, S. Yonehara, T. Sumida şi K. J. Nishioka, Clin. Invest. 1996, 98(2): 271-278). Mai mult, transducţia localizată cu gena care codifică pentru ligandul fas, printr-un vector 31 adenoviral, este eficace pentru prevenirea artritei induse de colagen (H. Zhang, Y. Yang, J. L. Horton, E. B. Samoilova, T. A. Judge, L. A. Turka, J. M. Wilson, şi Y. Chen, 1997, J. Clin. 33 Invest., 100(8),1951-1957). Inhibiţia proliferării celulelor inflamatorii sinoviale prin îmbunătăţirea apoptozei mediate de Fas este observată în ambele cazuri. Deşi ligandul Fas 35 este un puternic inductor al apoptozei în celulele sinoviale RA, aplicarea apoptozei mediată de ligandul Fas, ca terapie pentru oameni, a fost limitată de toxicitatea letală asupra ficatului. 37 Astfel, apoptoza indusă de receptorul TRAIL reprezintă o terapie mai sigură şi mai eficace pentru tratamentul RA decât apoptoza indusă de ligandul Fas. 39
Apoptoza indusă de receptorul TRAIL reprezintă de asemenea o terapie mai sigură şi mai eficace pentru tratamentul cancerului decât apoptoza indusă de ligandul Fas. 41 Apoptoza mediată de TRAIL este cunoscută a induce în mod specific apoptoza celulelor tumorale transformate, fără afectarea celulelor normale. S-a arătat că administrarea 43 sistemică a TRAIL solubil trimerizat nu produce toxicitate la animalele experimentale, şi a fost chiar capabil de a induce regresia tumorilor implantate (H. Walczak, R. E. Miller, K. 45 Ariail, B. Gliniak, T. S. Griffith, M. Kubin, W. Chin, J. Jones, A. Woodward, T. Le, C. Smith, P. Smolak, R. G. Goodwin, C. T. Rauch, J. C. Schuh, D. H. Lynch, Nat. Med., 1999, Feb.; 47 5(2): 157-63; W. Roth, S. Isenmann, U. Naumann, S. Kugler, M. Bahr, J. Dichgans, A. 5 RO 123525 Β1
Ashkenazi, M. Weller, Locoregional. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, 19 Nov.; 265(2):479-83). Potenţialul acestuia ca terapie adjuvantă pentru tratamentele tradiţionale a fost subliniat de descoperirea recentă a faptului că exprimarea DR5 şi susceptibilitatea la apoptoza indusă de TRAIL a celulelor de cancer de sân este îmbunătăţită prin iradiere, sugerând faptul că eficienţa TRAIL în terapia cancerului ar fi crescută în combinaţie cu iradierea (A. M. Chinnaiyan, U. Prasad, S. Shankar, D. A. Hamstra, M. Shanaiah, T. L. Chenevert, B. D. Ross, A. Rehemtulla, Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 15 Feb.; 97(4):1754-1759). în plus, gena care codifică receptorul DR5 pentru TRAIL, a fost cartografiată până la cromozomul 8p21-22, loc cu o înaltă frecvenţă a mutaţiilor la unele celule canceroase (T. Arai, Y. Akiyama, S. Okabe, K. Saito, T. Iwai, Y. Yuasa, CancerLeti., 1998, 27 Nov; 133(2): 197-204). S-a raportat faptul că cel puţin două tipuri de celule tumorale, adică cancerul de plămân cu celule mici (S. H. Lee, M. S. Shin, H. S. Kim, Η. K. Lee, W. S. Park, S. Y. Kim, J. H. Lee, S. Y. Han, J. Y. Park, R. R. Oh, J. J. Jang , J. Y. Han, J. Y. Lee, N. J. Yoo, Cancer Res., 1999, 15 Nov; 59(22):5683-5686) şi cancerul capului şi al gâtului (S. I. Pai, G. S. Wu, N. Ozoren, L. Wu, J. Jen, D. Sidransky, W. S. El-Deiry, 1998, Cancer Res., 15 Aug; 58(16):3513-3518) prezintă mutaţii în domeniul morţii genei DR5. Astfel, există necesitatea unui anticorp anti-DR5 în cercetările asupra cancerului, pentru a determina efectul variaţiei determinantului antigenic al receptorului asupra dezvoltării şi progresiei cancerelor. în plus, funcţionalitatea mutaţiilor receptorului TRAIL s-ar dovedi un instrument de diagnostic util, atunci când este utilizată împreună cu alţi biomarkeri, în detectarea timpurie a cancerului şi ca instrument de predicţie a agresivităţii tumorilor.
Un obiect al prezentei invenţii este o metodă in vitro de inducere selectivă a apoptozei în celulele ţintă care exprimă DR5, care cuprinde etapele: a. contactarea celulelor ţintă cu o cantitate terapeutică dintr-un anticorp care se leagă în mod specific la un receptor DR5 TRAIL, în care anticorpul este un anticorp care are aceeaşi specificitate pentru epitop ca TRA-8 al hibridomului şoarece-şoarece, care are numărul de acces ATCC PTA-1428, în care anticorpul respectiv, în forma sa solubilă, are activitate de inducere a apoptozei in vivo şi in vitro, în celulele ţintă care exprimă DR5, şi b. contactarea celulelor ţintă cu o cantitate terapeutică dintr-un anticorp care se leagă în mod specific la un receptor DR4 TRAI L, în care anticorpul este un anticorp care are aceeaşi specificitate pentru epitop ca 2E12 al hibridomului şoarece-şoarece. care are numărul de acces ATCC PTA-3798, în care anticorpul respectiv, în forma sa solubilă, are o activitate de inducere a apoptozei in vivo şi in vitro, în celulele ţintă care exprimă DR4.
Un alt obiect al prezentei invenţii este o metodă in vitro de inhibare a proliferării celulelor ţintă care exprimă DR5, care cuprinde etapele: a. contactarea celulelor ţintă cu o cantitate terapeutică dintr-un anticorp care se leagă în mod specific la un receptor DR5 TRAIL, în care anticorpul este un anticorp care are aceeaşi specificitate pentru epitop ca TRA-8 al hibridomului şoarece-şoarece, care are numărul de acces ATCC PTA-1428, în care anticorpul respectiv, în forma sa solubilă, are activitate de inducere a apoptozei in vivo şi in vitro, în celulele ţintă care exprimă DR5, şi b. contactarea celulelor ţintă cu o cantitate terapeutică dintr-un anticorp care se leagă în mod specific la un receptor DR4 TRAI L, în care anticorpul este un anticorp care are aceeaşi specificitate pentru epitop ca 2E12 al hibridomului şoarece-şoarece, care are numărul de acces ATCC PTA-3798, în care anticorpul respectiv, în forma sa solubilă, are o activitate de inducere a apoptozei in vivo şi in vitro, în celulele ţintă care exprimă DR4.
Invenţia se mai referă la o compoziţie care cuprinde o combinaţie alcătuită din: a. o cantitate terapeutică dintr-un anticorp care se leagă, în mod specific, la un receptor DR5 TRAIL, în care anticorpul este un anticorp cu aceeaşi specificitate pentru 6 RO 123525 Β1 epitop ca TRA-8 al hibridomului şoarece-şoarece, care are numărul de acces ATCC PTA- 1 1428, în care anticorpul respectiv, în forma sa solubilă, are activitate de inducere a apoptozei in vivo şi in vitro, în celulele ţintă care exprimă DR5, 3 Şi b. o cantitate terapeutică dintr-un anticorp care se leagă, în mod specific, la un 5 receptor DR4 TRAIL, în care anticorpul este un anticorp care are aceeaşi specificitate pentru epitop ca 2E12 al hibridomului şoarece-şoarece, care are numărul de acces ATCC PTA- 7 3798, în care anticorpul respectiv, în forma sa solubilă, are o activitate de inducere a apoptozei in vivo şi in vitro, în celulele ţintă care exprimă DR4. 9 într-una dintre concretizări, invenţia se referă la un anticorp care recunoaşte un receptor TRAI L DR5 şi care induce apoptoza într-o celulă care îl exprimă pe DR5 in vivo sau 11 in vitro. Mai departe, este descris un anticorp care recunoaşte DR5, dar nu şi DR4, DcR1 sau DcR2. în mod specific este detaliat un anticorp monoclonal pentru DR5 produs de un 13 hibridom. într-o altă concretizare, invenţia se referă la un anticorp care recunoaşte un receptor 15 TRAIL DR4 şi care induce apoptoza într-o celulă care exprimă DR4 in vivo sau in vitro. Este descris în continuare un anticorp care recunoaşte DR4, dar nu şi DR5, DcR1 sau DcR2. Este 17 descris în mod specific un anticorp monoclonal pentru DR4 produs de un hibridom.
Una dintre metodele furnizate este inducţia apoptozei în celulele ţintă sau inhibiţia 19 proliferării celulelor ţintă prin punerea în contact a celulelor cu o cantitate terapeutică de anticorp capabil de a se lega la DR5 sau DR4. în diferite concretizări ale metodei, apoptoza 21 poate fi indusă sau proliferarea celulelor poate fi inhibată prin punerea în contact a celulelor ţintă cu anticorpi împotriva altor receptori ai morţii. 23
Mai este descrisă o compoziţie farmaceutică care include o cantitate terapeutică de anticorp monoclonal activ împotriva DR5, un transportor farmaceutic acceptabil şi, opţional, 25 un recipient care conţine anticorpul şi transportorul. Este furnizată în continuare de către invenţie utilizarea unui anticorp care să recunoască DR5 sau un anticorp care să recunoască 27 DR4, pentru prepararea unui agent terapeutic pentru apoptoza selectivă a celulelor anormale sau neregulate. 29
Un anticorp din invenţia de faţă interacţionează cu un receptor al unui ligand inductor al apoptozei, asociat cu un factor al necrozei tumorale, cum ar fi DR4, DR5, DrR1, DrR2 şi 31 OPG, care induce apoptoza într-o celulă care exprimă un asemenea receptor. Este descris un anticorp din invenţie, capabil de a lega selectiv un determinant antigenic al unui receptor 33 agonist sau antagonist al unui ligand al unui factor al necrozei tumorale.
Invenţia de faţă furnizează un tratament pentru o boală asociată cu apoptoza, pentru 35 cancer, pentru o boală inflamatorie sau pentru o boală autoimună, printr-o metodă care include punerea în contact a unui ţesut ţintă bolnav cu o cantitate terapeutică de anticorp din 37 invenţie, singur sau în combinaţie cu alţi anticorpi inductori ai apoptozei, şi/sau cu alţi agenţi terapeutici sau tratamente. 39
Este descrisă, în continuare, o proteină de fuziune, care include o secvenţă antigenică a unui aminoacid al unui receptor al TRAIL care are cel puţin zece baze, cuplată 41 la o proteină imunoglobulină sau la un fragment al acesteia, capabilă de a provoca un răspuns imun la un subiect. 43
Invenţia de faţă furnizează o metodă de terapie genică, în care o celulă ţintă este transfectată cu o secvenţă de acid nucleic al unui receptor TRAI L într-un vector de expresie, 45 astfel încât receptorul TRAIL este exprimat pe celula ţintă. Celula ţintă este apoi expusă la un anticorp care leagă selectiv receptorul TRAIL. 47 7 RO 123525 Β1
Sunt furnizate secvenţe de acid nucleic şi secvenţe de aminoacid care codifică imunoglobulinele cu lanţ uşor şi greu ale unui anticorp selectiv pentru DR5. Sunt furnizate, de asemenea, secvenţe ale unui anticorp care leagă selectiv DR4. Sunt de asemenea detaliaţi vectori care includ o secvenţă a unui acid nucleic din invenţie şi celule gazdă transformate cu un vector din invenţie.
Invenţia de faţă furnizează un anticorp DR5 umanizat (de exemplu, TRA-8) şi un DR4 umanizat (de exemplu, 2E12), precum şi o celulă transfectată care produce anticorpul DR5 umanizat şi o celulă transfectată care produce anticorpul DR4 umanizat.
Este descris un procedeu de producere a unui anticorp DR5 umanizat sau a unui anticorp DR4, în care o gazdă este transformată cu secvenţe de acid nucleic care codifică un lanţ uşor de imunoglobulină umanizată şi un lanţgreu de imunoglobulină umanizată, după care gazda transformată este incubată pentru o perioadă de timp predeterminată.
Se mai descrie un procedeu de inducţie a apoptozei în celulele ţintă sau de inhibare a proliferării celulelor, care include punerea în contact a unei celule ţintă cu o cantitate farmaceutic eficace de anticorp DR5 umanizat, de anticorp DR4 umanizat, sau a unei combinaţii de anticorp DR5 şi de anticorp pentru un alt receptor al morţii (de exemplu, un anticorp pentru DR4), în prezenţa sau în absenţa altor agenţi terapeutici sau tratamente.
Se furnizează o trusă comercială pentru inducţia apoptozei, care include un anticorp TRA-8 umanizat, selectiv pentru DR5 sau un anticorp umanizat pentru DR4 (de exemplu, 2E12 umanizat), ambalat într-un recipient adecvat şi, opţional, cu instrucţiuni de utilizare.
Fig. 1. Caracterizarea TRA-8. a. Specificitatea de legare a TRA-8: analiza Western blot (panoul superior): Proteinele de fuziune recombinate ale familiei TNFR examinate cu TRA-8 sau cu IgG antiumană. Linia 1: proteina de fuziune DR5/hlgG1 (imunogen); Linia 2: DR4/hlgG1 (TRAIL-R1); Linia 3: DR5/hlgG1; Linia 4: TRAIL-R3 (DcR-1)/hlgG1; Linia 5: TRAIL-R4 (DcR-2)/hlgG1; Linia 6, CD95/hlgG1; Linia 7: TNFRI solubil. Analiza ELISA (panoul inferior): numărul godeurilorse potriveşte cu cel al Western blot cu excepţia godeului 8 care este o proteină de fuziune DR5/hlgG1 murină. b. Activitatea de legare a TRAIL solubil şi a TRA-8 la DR5 şi DR4: plăcile ELISA au fost acoperite cu DR5/hlgG1 (panoul din stânga) sau cu DR4/hlgG1 (panoul din mijloc) şi apoi au fost incubate cu TRAIL sau cu TRA-8. c. Analiza de citometrie în flux a exprimării de suprafaţă a DR5. Celule Cos-7 transfectate cu vectorul de expresie pcADN3 care conţine cADN-ul lui DR5 cu lungime completă (histograma continuă), cADN-ul lui DR4 (histograma deschisă, linia continuă) sau vectorul gol (histograma deschisă, linia întreruptă). La patruzeci şi opt de ore după transfecţie, celulele au fost colorate cu TRA-8, urmată de lgG1 antişoarece conjugată cu PE. d. Reactivitatea imunohistochimică in situ a DR5: Lamele centrifugate ale celulelor Cos-7 transfectate cu exprimarea DR5 sau vectorul de control au fost colorate cu TRA-8 la 48 h după transfectare. e. Activitatea ucigaşă a TRA-8: celulele Jurkat au fost incubate cu concentraţiile indicate de TRA-8. Viabilitatea celulelor a fost determinată prin analizele ATPLite, MTT, şi de excludere PI, după cultivare peste noapte. Rezultatele analizelor ATPLite şi MTT sunt prezentate ca procent al mediului de control, şi analiza PI este prezentată ca procent de celule PI negative f. Analiza Western blot a activării caspazei: celulele Jurkat au fost incubate cu 500 ng/ml TRA-8 pe perioada indicată. Lizatele de celule au fost separate cu SDS-PAGE15%, colorate şi examinate cu anticorpi anticaspază. Săgeţile indică subunităţile clivate ale fiecărei caspaze. g. Analiza inhibiţiei caspazei: Celulele Jurkat au fost incubate cu TRA-8 50 ng/ml peste noapte în prezenţa a diferite concentraţii de inhibitori ai caspazei indicaţi. Viabilitatea celulelor a fost determinată prin analiza ATPLite.
Fig 2. Exprimarea, la suprafaţa celulei, a DR5 şi susceptibilitatea la apoptoza mediată de DR5. Linii de celule T şi B normale, proaspăt izolate din sânge periferic, celule T (a şi a'), gliom (b şi b'), celule de cancer prostatic (c) şi linii celulare de celule B (d) au fost incubate 8 RO 123525 Β1 cu TRA-8 sau cu anticorp martor izotip lgG1 murin, urmat de lgG1 de capră antişoarece, 1 conjugat cu PE. Histogramele deschise reprezintă martorul anticorp izotopic, în timp ce histogramele continue reprezintă colorarea TRA-8. Apoptoza a fost determinată prin analiza 3 ATPLite, după incubare peste noapte cu TRAIL solubil (cercurile deschise) sau cu TRA-8 (cercurile închise), după cum se arată în a, b' şi d. 5
Fig. 3a'. Linia de celule T U937 a fost incubată cu TRA-8 sau anticorp martor izotip lgG1 murin. Apoptoza a fost determinată prin analiza ATPLite, după incubare peste noapte 7 cu TRAIL solubil (cercurile deschise) sau cu TRA-8 (cercurile închise).
Fig. 3. Linii de celule de gliom (b) şi de cancer de prostată (c) au fost incubate cu 9 TRA-8 sau anticorp martor izotip lgG1 murin. Apoptoza a fost determinată prin analiza ATPLite, după incubare peste noapte cu TRAIL solubil (cercurile deschise) sau cu TRA-8 11 (cercurile închise).
Fig. 4 prezintă o serie de grafice care prezintă viabilitatea celulei pentru celulele 13 Jurkat umane după expunere la concentraţiile indicate de (A) tulpini de anticorpi TRA-1, -8 şi -10, şi (B) TRAIL în prezenţa unei concentraţii fixe de tulpini de anticorp din invenţie 15 descrise în fig. 4A.
Fig. 5. Expresia DR5 în ţesuturile normale şi canceroase: omogenate normale şi 17 canceroase au fost examinate cu TRA-8 şi au fost dezvoltate prin chemiluminescenţă. a.
Analiza Western blot a proteinei DR5 în ţesuturile normale: linia 1: ficat, linia 2: creier, linia 19 3: plămân, linia 4: rinichi, linia 5: splină, linia 6: testicule, linia 7: ovar, linia 8: inimă, linia 9: pancreas, b. Analiza Western blot a proteinei DR5 în ţesuturile canceroase. A fost examinat 21 preparatul de ţesut canceros care conţine cancere de la ovar (linia 1), plămân (linia 2), ficat (linia 3), rect (linia 4), cervix (linia 5), piele (linia 6), testicule (linia 7), tiroidă (linia 8), uter 23 (linia 10), stomac (linia 11), laringofaringe (linia 12) şi pancreas (linia 13). Imunochimia/ns/Yu a ţesuturilor umane normale (c.) şi a ţesuturilor canceroase (d.). Secţiunile îngheţate au fost 25 imunocolorate cu TRA-8.
Fig. 6. Activitatea tumoricidă a TRA-8. Şoareci SCID au fost inoculaţi subcutanat cu 27 celule 1321N1. Şoarecii au fost injectaţi intravenos cu o doză unică de 100 pg TRA-8 în ziua a doua după inocularea tumorii (a.), sau cu trei doze de 100 pg TRA-8, începând la 7 zile 29 după inocularea tumorii (b). Creşterea tumorii a fost determinată prin greutate şi a fost examinată histologic prin colorare H&E. Fotografiile au arătat o creştere tumorală viabilă la 31 şoarecii martor, dar nu şi la şoarecii trataţi cu TRA-8 (a, panoul superior), şi colorarea H&E a tumorii (a, panoul inferior). Şoareci SCID au fost injectaţi intravenos cu 106 celule Jurkat 33 şi au fost trataţi cu o doză unică de TRA-8, în a doua zi după injecţie. Şapte zile mai târziu, celulele splenice au fost recoltate, colorate cu anticorp CD3 antiuman şi au fost analizate prin 35 citometrie în flux (d.) sau prin imunochimie (e).
Fig. 7 prezintă expresia DR5 de la suprafaţa celulei în celulele sinoviale RA (A) şi OA 37 (B). 1 x 106 celule sinoviale primare cultivate au fost colorate cu TRA-8 purificat prin afinitate şi urmat de anticorp lgG1 de capră antişoarece, conjugat cu PE. 10000 celule viabile au fost 39 analizate prin FACSvantage.
Fig. 8 prezintă o serie de grafice prezentând viabilitatea celulei în funcţie de apoptoza 41 indusă de concentraţia TRAIL şi TRA-8 a tulpinilor reprezentative de celule sinoviale RA (A) şi OA (B) cu diferite concentraţii de TRAIL solubil recombinat (cercurile deschise) sau de 43 TRA-8 purificat prin afinitate (cercurile închise). Viabilitatea celulară reprezintă procentajul cpm-ului de celule tratate faţă de cpm-ul de celule netratate. 45
Fig. 9 prezintă o serie de grafice prezentând dependenţa de caspază a apoptozei mediate de DR5, a celulelor sinoviale RA. Celulele sinoviale RA (RA512) sunt incubate cu 47 ligand Fas solubil 50 ng/ml (pătratele deschise), cu anticorp anti-Fas (CH-11) (pătratele 9 RO 123525 Β1 închise), cu TRAIL solubil (cercurile deschise) sau cu anticorp anti-DR5 (TRA-8) (cercurile închise), în prezenţa a diferite concentraţii de inhibitori ai caspazei. După cultivare peste noapte, viabilitatea celulelor este determinată prin ATPLite.
Fig. 10A prezintă o analiză electroforetică de deplasare în gel, care indică activarea NFkb. Celulele RA1016 sunt incubate cu TNF-a 20 ng/ml, cu TRAIL solubil 50 ng/ml sau cu TRA-8 50 ng/ml, pe perioada de timp indicată înainte de a fi supuse electroforezei. Fig. 10B şi C sunt grafice care arată producerea MMP-1 şi MMP-3. 1 x 106/ml celulele sinoviale RA indicate sunt incubate cu concentraţiile indicate de TNF-a (cercurile deschise), TRAIL (triunghiurile deschise) sau cu TRA-8 (cercul închis). După cultivare peste noapte, supernatantele culturilor sunt colectate. Nivelurile MMP-urilorînsupernatantele culturilor sunt determinate prin ELISA.
Fig. 11. TRA-8 nu induce toxicitatea hepatocelulară. a. Ţesuturile de ficat normal nu exprimă DR5. Au fost preparate secţiuni în parafină din două ţesuturi de ficat normal, unul din ţesut de carcinom hepatocelular, şi preparatul de celule centrifugate din celule HepG2 a fost pregătit pentru colorarea H&E şi secţiunile îngheţate corespunzătoare au fost colorate cu TRA-8. b. Analiza citometrică în flux a expresiei la suprafaţa celulei a DR5. Hepatocite izolate din două ţesuturi de ficat normal şi dintr-un caz de ţesut de carcinom hepatocelular şi celule HepG2 au fost colorate cu TRA-8, anticorp anti-Fas (DX2) sau cu un anticorp martor izotip. Histogramele continue indică colorarea TRA-8 sau DX2, iar histogramele deschise sunt martorii izotipici corespunzători.
Fig. 12. TRAIL, nu TRA-8, induce toxicitatea hepatocelulară. Hepatocite umane normale proaspete au fost menţinute în Mediu de Cultură pentru Hepatocite. (a.) Apoptoza hepatocitelor a fost indusă cu 1 pg/ml TRAIL solubil plus agentul de reticulare sau cu TRA-8, la momentele de timp indicate. Viabilitatea celulelor a fost determinată prin ATPLite. Rezultatele sunt prezentate ca procent de celule viabile comparativ cu martorul de mediu. Barele întunecate indică TRAI L, iar barele negre indică TRA-8. (b.) Nucleele condensate ale hepatocitelor au fost colorate cu Hoechst 33352 şi au fost analizate prin citometrie în flux. c. Efectul cicloheximidei asupra apoptozei hepatocitelor. Hepatocitele au fost cultivate în mediul martor sau cu TRAIL 1 pg/ml sau cu TRA-8 în prezenţa (barele închise) sau în absenţa (barele deschise) cicloheximidei 1 pg/ml, timp de 8 h. Viabilitatea celulară a fost determinată prin ATPLite. Rezultatele sunt prezentate sub formă de medie ± EMS a culturilor în triplicat din două experimente, d. O comparaţie a susceptibilităţii hepatocitelor normale la apoptoza mediată de DR5 şi de Fas. Hepatocite proaspăt izolate au fost incubate cu concentraţiile indicate de TRAIL solubil, TRA-8, FasL solubil sau de mAc anti-Fas CH11, timp de 6 h. Viabilitatea celulară a fost determinată prin analiza ATPLite. Rezultatele sunt prezentate ca procent de celule viabile comparativ cu martorul de mediu. Pentru hepatocitele normale, este prezentată media ± EMS a patru indivizi normali. Rezultatele celulelor de carcinom hepatocelular de la un pacient şi celulele HepG2 sunt prezentate sub formă de medie a culturilor în triplicat.
Fig. 13. TRAIL induce hepatita. Şoareci B6 au fost inoculaţi intravenos cu 109 pfu de vector adenoviral, care codifică întreaga lungime a TRAIL uman sub controlul elementului transcripţional „Tet-on". Expresia TRAIL a fost indusă de doza de tetraciclină indicată, a. Analiza Northern blot a exprimării TRAIL uman în ficat. La 24 h după inocularea vectorului şi inducţia cu tetraciclină, ARN total a fost izolat din ficat şi a fost examinat cu cADN al TRAIL uman sau cu β-actină. b. Nivelurile serice ale AST. 24 h după transducţia TRAIL, au fost determinate nivelurile serice ale AST. c. Moartea celulară mediată de TRAIL a hepatocitelor infectate cu vectorul adenoviral: şoareci B6 au fost inoculaţi intravenos cu vector adenoviral inductibil cu tetraciclină. La 48 h după inoculare, hepatocite de la şoarecii martor inoculaţi 10 RO 123525 Β1 şi neinoculaţi au fost izolate şi incubate cu concentraţiile de TRAIL indicate, timp de 8 h 1 (panoul stâng). Viabilitatea celulară a hepatocitelor a fost determinată prin analiza ATPLite. Şoarecii inoculaţi cu vector adenoviral ca mai sus au fost injectaţi intravenos cu 10 pg TRAIL 3 uman solubil, 48 h mai târziu. Nivelurile serice de AST au fost măsurate la 24 h după injectarea TRAIL (panoul din dreapta), (d. şi e.) Analiza histologică a leziunilor ficatului 5 induse de TRAIL. Ficatul a fost colectat la 24 h (d.) sau 7 zile (e.) după transducţia cu TRAIL. Secţiunile parafinice au fost colorate cu H&E şi fotografiate la 100X (panoul superior) 7 şi la 400X (panoul inferior).
Fig. 14 prezintă o serie de grafice, arătând faptul că celulele T activate şi celulele B 9 purificate din PMBC uman exprimă niveluri ridicate de DR5, după cum se determină prin citometrie în flux, pentru celulele rămase (neumplute) şi activate (umbrite). 11
Fig. 15 reprezintă graficele de viabilitate ca funcţie a concentraţiei TRA-8, pentru celulele T şi celulele B purificate descrise în fig. 14, care au fost stimulate timp de 48 h cu 13 anti-CD3 sau cu anti-μ, cu celule activate sau distruse (bolnave), colectate prin densitatea diferită a Ficoll-Paque. Viabilitatea se determină prin analiza ATPLite. 15
Fig. 16 prezintă o histogramă şi graficele de citometrie în flux care prezintă exprimarea CD3 într-o populaţie poartă de limfocite la şoarecii NOD/SCID, lipsiţi de celule 17 NK, injectaţi cu PMBC uman şi cu TRA-8 sau cu IgG (martor).
Fig. 17 prezintă micrograficele celulare colorate cu TUNEL şi CD3 ale ţesutului 19 splenic de şoarece, după cum este detaliat în exemplul 13.
Fig. 18 prezintă punctele de citotoxicitate pentru oamenii cu leucemie limfolitică 21 cronică (CCL) şi pentru cei cu celule B normale în prezenţa TRA-8, BISVIII şi a unor combinaţii ale acestora. 23
Fig. 19. a. Legarea specifică a 2E12 la DR4. Plăcile ELISA au fost acoperite cu forma solubilă a receptorului TRAIL uman-proteine de fuziune Fc lgG1 umane, după cum s-a 25 indicat şi au fost incubate cu concentraţia indicată de mAc2E12, urmată de lgG1 antişoarece conjugată cu HRP. Reacţia a fost dezvoltată cu tampon de substrat TMB şi au fost măsurate 27 valorile DO la 450/650 nM.
Fig. 19. b. 2E12 leagă DR4 de la suprafaţa celulei. Celulele Cos-7 aufosttransfectate 29 cu vectorul care conţine cADN cu lungime integrală pentru DR4 (histograma continuă) sau cu vectorul martor (histograma deschisă). Celulele transfectate au fost colorate cu 2E12 31 10 pg/ml şi cu lgG1 antişoarece, conjugată cu PE. Celulele au fost analizate prin citometrie în flux. 33
Fig. 19. c. Activitatea de inducţie a apoptozei a 2E12. Celule umane Ramos B de limfom au fost incubate peste noapte cu concentraţiile indicate de 2E12, în prezenţa a 2 pg/ml 35 lgG1 antişoarece. Viabilitatea celulară a fost determinată prin analiza ATPLite. d. Activarea caspazei indusă prin 2E12. Celulele Ramos au fost tratate cu 2E12 şi cu anticorp IgG 37 antişoarece, la momentele de timp indicate. Activarea caspazei şi clivajul PARP au fost determinate prin analiza Western blot, utilizând anticorpi specifici anticaspază sau PARP. 39 Fig. 20. Efectul 2E12 şi al Adriamicinei la şoareci nuzi atimici care poartă xenogrefe de cancer de sân. Celule 2LMP (3x107) au fost injectate subcutanat la şoareci nuzi atimici 41 în ziua 0. Două grupe de şoareci au fost injectaţi intraperitoneal cu 200 pg de 2E12, în zilele 7, 10, 14, 17, 21 şi 24. Două grupe de şoareci au primit Adriamicină /. v. (6 mg/kg), în zilele 43 8, 12 şi 16. Un grup de şoareci nu a primit anticorp. Datele sunt exprimate ca modificare medie a mărimii tumorii relativ la mărimea din ziua 7 (n=8 şoareci/grup). 45
Fig. 21. Efectul TRA-8, 2E12 şi al Adriamicinei asupra şoarecilor nuzi atimici care poartă xenogrefe de cancer de sân. Celule 2LMP(3x107) au fost injectate s.c. la şoareci nuzi 47 atimici în ziua 0. Două grupuri de şoareci au fost injectate i.p. cu 200 pg TRA-8 şi 2E12, în 11 RO 123525 Β1 zilele 7, 10, 14, 17, 21 şi 24. Două grupuri de şoareci au primit i. v. Adriamicină (6 mg/kg), în zilele 8, 12 şi 16. Un grup de şoareci nu a primit anticorp. Datele sunt exprimate ca modificare medie a mărimii tumorii relativ la mărimea în ziua 7 (n=8 şoareci/grup).
Fig. 22A prezintă analiza citometrică în flux a exprimării la suprafaţa celulei a DR5 într-un grup de linii de celule umane canceroase de sân. Celulele de cancer de sân au fost recoltate utilizând EDTA şi colorate cu mAb TRA-8 10 Mg/ml. timp de o oră, la 4°C, urmat de lgG1 antişoarece de capră, conjugat cu PE, apoi au fost analizate, utilizând FACScan şi softul CellQuest. Histogramele groase indică colorarea TRA-8 şi histogramele subţiri indică incubarea cu anticorpul martor izotip lgG1 de şoarece.
Fig. 22B prezintă citotoxicitatea TRA-8 asupra liniilor de celule umane de cancer de sân. Celulele au fost tripsinizate şi reînsămânţate la o densitate de 1000 celule/godeu, pe o placă cu 96 de godeuri. Anticorpul TRA-8 a fost adăugat după însămânţarea celulelor şi a fost incubat timp de 24 h, la 37°C. Viabilitatea celulară a fost determinată la 24 h după adăugarea TRA-8, utilizând analiza ATPLite. Nivelurile de ATP se raportează faţă de celulele martor netratate ca medie şi ES din 2-3 experimente independente, fiecare realizat în triplicat.
Fig. 23A prezintă citotoxicitatea tratamentului cu combinaţie de TRA-8 şi Adriamicină asupra liniilor de celule umane de cancer de sân. Celulele (1000/godeu) au fost expuse la diferite concentraţii de Adriamicină, timp de 24 h, la 37°C, începând la 24 h după însămânţarea celulelor. TRA-8 a fost adăugat la 24 h după adăugarea Adriamicinei şi nivelurile de ATP au fost determinate 24 h mai târziu. Valorile reprezintă media şi ES a determinărilor în triplicat de la 2-4 experimente independente, fiecare realizat în triplicat, şi sunt raportate faţă de celulele martor netratate.
Fig. 23B prezintă citotoxicitatea tratamentului cu combinaţie de TRA-8 şi Paclitaxel asupra liniilor de celule umane de cancer de sân. Celulele (1000/godeu) au fost expuse la diferite concentraţii de Paclitaxel, timp de 24 h, la 37°C, începând la 24 h după însămânţarea celulelor. TRA-8 a fost adăugat la 24 h după adăugarea Paclitaxelului şi nivelurile de ATP au fost determinate 24 h mai târziu. Valorile reprezintă media şi ES a determinărilor în triplicat de la 2-4 experimente independente, fiecare realizatîn triplicat, şi sunt raportate faţă de celulele martor netratate.
Fig. 24 prezintă efectul TRA-8 asupra creşterii tumorii la şoareci nuzi atimici care poartă xenogrefe 2LMP stabilizate de cancer uman de sân. Celulele 2LMP (3x107) au fost injecate s.c. în ziua 0. Două grupuri de şoareci au fost injectate i.p. cu 200 ug sau 600 pg de TRA-8, în zilele 7, 10, 14, 17, 21 şi 24. Una dintre grupele de şoareci nu a primit niciun anticorp. Datele reprezintă modificarea medie a mărimii tumorii (produsul a două diametre) faţă de mărimea în ziua a 7-a (n=8 şoareci/grup).
Fig. 25 prezintă efectul TRA-8 şi al Adriamicinei asupra creşterii tumorii la şoarecii nuzi atimici care poartă xenogrefe de cancer uman de sân. Celulele 2LMP (3x107) au fost injectate s.c. la şoareci nuzi atimici în ziua 0. Două grupe de şoareci au fost injectate i.p. cu 200 ug TRA-8 în zilele 7, 10, 14, 17,21 şi 24. Două grupe de şoareci au primit Adriamicină i.v. (6 mg/kg) în zilele 8,12 şi 16. Unul dintre grupurile de şoareci nu a primit niciun anticorp. Datele sunt exprimate ca modificarea medie a mărimii tumorii (produsul a două diametre) faţă de mărimea în ziua a 7-a (n=6-8 şoareci/grupă).
Fig. 26 prezintă efectul TRA-8 şi al Paclitaxelului la şoarecii nuzi atimici care poartă xenogrefe de cancer uman de sân. Celulele 2LMP (3x107) au fost injectate s.c. la şoareci nuzi atimici în ziua 0. Două grupe de şoareci au fost injectate i.p. cu 200 Mg de TRA-8 în zilele 7, 12 RO 123525 Β1 10,14,17,21 şi 24. Două grupe de şoareci au primit Paclitaxel i.v. (20 mg/kg) în zilele 8,12, 1 16, 20 şi 24. Una dintre grupele de şoareci nu a primit niciun anticorp. Datele sunt exprimate ca modificarea medie a mărimii tumorii (produsul a două diametre) faţă de mărimea în ziua 3 a 7-a (n=8 şoareci/grupă).
Fig. 27 prezintă efectul TRA-8, al Adriamicinei şi al radiaţiei 60Co asupra creşterii 5 tumorii la şoareci nuzi atimici care poartă xenogrefe de cancer de sân. Celulele 2LMP (3x107) au fost injectate s.c. la şoareci nuzi atimici în ziua 0. Trei grupe de şoareci au fost 7 injectate /. p. cu 200 ug TRA-8, în zilele 7, 10, 14, 17, 21 şi 24. Două grupe de şoareci au primit Adriamicină i.v. (6 mg/kg) în zilele 8, 12 şi 16. Patru grupe de şoareci au primit 3 Gy 9 de radiaţie de 60Coîn zilele 9 şi 17. Una dintre grupele de şoareci nu a primit niciun anticorp.
Datele sunt exprimate ca modificarea medie a mărimii tumorii (produsul a două diametre) 11 faţă de mărimea în ziua a 7-a (n=8 şoareci/grupă).
Fig. 28 prezintă efectul anticorpilor TRA-8 şi 2E12 administraţi la celule canceroase 13 în aceeaşi compoziţie in vitro. Celulele au fost incubate 24 h cu TRA-8, 2E12 sau 2E12±TRA-8, la doza TRA-8 arătată, apoi s-au determinat nivelurile de ATP. Valorile sunt 15 arătate ca medie şi deviaţie standard (n=4). Eşecul eliminării celulelor este datorat defectelor sistemului inductor al apoptozei, 17 care este asociat cu defectele care includ ilustrativ expresia sau funcţionarea ligandului, receptorului sau a moleculelor reglatoare intracelulare sau efectoare. Invenţia de faţă 19 produce o metodă de corecţie a sistemului deficient de inducţie a apoptozei, precum şi elucidarea defectelor specifice inerente unui sistem defect de inducţie al apoptozei. 21
Invenţia de faţă se referă la o nouă clasă de anticorpi monoclonali, care au o activitate de inducţie a apoptozei selectivă in vivo şi in vitro, împotriva receptorilor TRAIL 23 specifici, incluzând DR5, DR4, DcR1 şi DcR2. Astfel, anticorpii din invenţia de faţă leagă în mod specific unul dintre receptorii TRAIL. Prin „legare selectivă" sau „recunoaştere specifică" 25 înţelegem faptul că anticorpul leagă doar un receptor TRAIL şi prezintă o legare slabă sau nu se leagă deloc de alţi receptori TRAIL, utilizând analiza Western blot tradiţională. Un 27 anticorp DR5 din invenţia de faţă leagă selectiv DR5 şi nu prezintă legare peste 1,5 ori faţă de fond pentru DR4, DcR1 sau DcR2. în mod similar, un anticorp DR4 din invenţia de faţă 29 leagă selectiv DR4 şi nu prezintă legare peste 1,5 ori faţă de fond pentru DR5, DcR1 sau DcR2. Invenţia de faţă prezintă utilitate ca reactiv pentru cercetarea semnalizării apoptozei, 31 precum şi utilitate ca agent terapeutic eficace împotriva celulelor care exprimă receptorii TRAIL, incluzând în mod ilustrativ multe clase de celule canceroase, celule care prezintă 33 nereguli în sistemul de apoptoză, limfocite activate sau alte celule imunitare activate (de exemplu celule limfoide şi celule mieloide), celule infectate viral, şi celule sinoviale care 35 proliferează anormal (de exemplu celulele sinoviale din artrita reumatoidă, incluzând celulele sinoviale inflamatorii, celulele mieloide şi limfoide activate din lichidul sinovial, sinoviocitele 37 asemănătoare macrofagelor, şi sinoviocitele asemănătoare fibroblaştilor) ale bolilor autoimune. Anticorpii conformi cu invenţia de faţă sunt specifici în legarea tipurilor particulare 39 de receptori TRAIL, în ciuda omologiei dintre ei. Anticorpii din invenţie produc o apoptoză ţintită, doar a celulelor care exprimă un receptor TRAIL ţintă sau alternativ, blocând apoptoza 41 TRAIL a celulelor care exprimă un receptor ţintă.
Un anticorp monoclonal DR5 sau un anticorp monoclonal DR4 din invenţia de faţă 43 serveşte ca inductor eficace al apoptozei în celulele care exprimă DR5 sau DR4, respectiv, in vitro, şi ca inhibitor eficace al apoptozei in vivo. Secvenţele CDR fragmentare umanizate, 45 13 RO 123525 Β1 grefate pe catena de bază a anticorpului umanizat şi proteina de fuziune DR5 sau anticorpii DR4, din invenţia de faţă, prezintă proprietăţi apoptotice similare. Până în prezent, nu este disponibil niciun anticorp monoclonal care se leagă la DR5 de la suprafaţa celulei, şi care, chiar şi în concentraţii mici, să inducă apoptoză celulelor care exprimă DR5 atât in vitro, cât şi in vivo, în absenţa unui agent de legare încrucişată (agent de reticulare). Invenţia de faţă include un anticorp DR5 operativ ca agent terapeutic în tratamentul unor multitudini de boli. Deşi TRAIL solubil s-a dovedit a fi eficace în inducţia apoptozei celulelor tumorale in vivo, activitatea ucigaşă pare a fi foarte scăzută în comparaţie cu dozele mari şi repetate, care adesea sunt necesare (H. Walczak, R. E. Miller, K. Ariail, B. Gliniak, T. S. Griffith, M. Kubin, W. Chin, J. Jones, A. Woodward, T. Le, C. Smith, P. Smolak, R. G. Goodwin, C. T. Rauch, J. C. Schuh, D. H. Lynch, Nat. Med., Feb 1999; 5(2):157-63). Invenţia de faţă furnizează un anticorp purificat, care leagă receptorul TRAIL DR5, în care anticorpul menţionat, în forma sa solubilă la concentraţii mici, are o activitate inductoare a apoptozei in vivo şi in vitro, în celulele ţintă care exprimă DR5. într-o concretizare preferată, anticorpul purificat se leagă la receptorul TRAIL DR5, în absenţa legării încrucişate a (reticulării) anticorpului. De preferinţă, anticorpul nu induce apoptoza semnificativă a celulelor fibroblastice normale. De preferinţă, activitatea de inducţie a apoptozei este caracterizată prin mai puţin de 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% viabilitate sau orice procent între acestea, a celulelor ţintă, la concentraţii de anticorp mai mici de aproximativ 0,1, 1, 5, 10 sau 20 pg/ml sau orice concentraţie între acestea. Anticorpul purificat leagă specific receptorul TRAIL DR5 şi nu leagă receptorii TRAIL DR4, DcR1 sau DcR2, conform unei analize Western blot de rutină. într-o concretizare preferată, anticorpul este un anticorp monoclonal, de preferinţă, având aceeaşi specificitate a determinantului antigenic ca şi hibridomul TRA-8 de şoarece-şoarece, care are numărul de acces ATCC PTA-1428. TRA-8, unul dintr-o serie de anticorpi DR5, în conformitate cu invenţia de faţă, este eficace farmaceutic la animale care poartă o transgenă DR5 umană şi are, de asemenea, utilitate, în stabilirea unui model pentru investigarea rolului DR5 şi TRAIL.
Diferite concretizări ale invenţiei furnizează anticorpi care induc apoptoza în prezenţa sau în absenţa legării încrucişate (reticulării). De exemplu, o concretizare preferată a anticorpului DR5 (de exemplu, TRA-8) induce apoptoza în absenţa legării încrucişate (reticulării). „Legarea încrucişată" (“reticularea”) include, de exemplu, legarea încrucişată (reticularea) printr-un anticorp secundar. Alte concretizări furnizează anticorpi care induc apoptoza în prezenţa agenţilor de legare încrucişată (de reticulare), incluzând, de exemplu, o concretizare preferată a anticorpului DR4 (2E12).
Astfel, invenţia furnizează un anticorp purificat care leagă specific un receptor TRAIL DR4, în care anticorpul menţionat, în forma sa solubilă, are o activitate de inducţie a apoptozei in vitro şi in vivo, în celulele ţintă care exprimă DR4. Ca o concretizare, anticorpul este un anticorp monoclonal, care are aceeaşi specificitate a determinantului antigenic ca şi hibridomul 2E12, având numărul de acces ATCC PTA-3798, depozitat în 24 octombrie 2001, având desemnat numele „Clona hibridomului 2E12 împotriva DR4 Uman", cu sprijinul Fundaţiei de Cercetare UAB. 2E12, unul dintr-o serie de anticorpi DR4 din invenţia de faţă este farmaceutic activ în reducerea mărimii tumorilor, comparativ cu animalele de control sau comparativ cu mărimea tumorii înainte de tratament, in vivo, la animale care au cancere care exprimă DR4. 14 RO 123525 Β1
Anticorpii faţă de DR5 sunt eficace sub formă solubilă la doze mici, prin doze mici se 1 înţelege la doze sau la concentraţii mai mici de aproximativ 0,01 până la 1 pg/ml in vitro şi mai mici de aproximativ 1-10 mg/kg in vivo. O caracteristică preferată a anticorpilor din 3 invenţia de faţă este aceea că aceştia induc apoptoza selectiv în celulele care exprimă receptorii DR5, fără a induce apoptoza în hepatocitele, fibrocitele, sinoviocitele etc., normale, 5 neactivate, netransformate. Un anticorp conform cu invenţia de faţă, crescut împotriva unui receptor TRAIL, este recoltat, în conformitate cu invenţia de faţă, de la un animal 7 experimental, dar poate fi făcut prin orice metodă de producere sau de sinteză a anticorpilor cunoscută în domeniu. Prin umanizarea anticorpului în conformitate cu invenţia de faţă, 9 pentru a menţine activitatea de legare a receptorului în paralel, provocând un răspuns imun diminuat şi tolerabil terapeutic la un subiect uman, un anticorp umanizat antireceptor TRAIL, 11 în conformitate cu invenţia de faţă, se utilizează ca agonist terapeutic sau antagonist, pentru un receptor TRAI L dat. Invenţia de faţă este operativă ca agent terapeutic in vivo, deoarece 13 legarea încrucişată (reticularea), secundară, a anticorpului antireceptor TRAIL, opţional, nu este necesară. 15
Invenţia de faţă are o extindere mai mare decât asupra unui singur anticorp antireceptor TRAIL, având efecte apoptotice agoniste sau antagoniste. Mai degrabă, doi sau 17 mai mulţi anticorpi antireceptor TRAI L sunt aduşi în contact cu o cultură de celule in vitro sau cu un ţesut din corp aflat în cercetare in vivo, pentru a crea un tratament îmbunătăţit. Prin 19 „tratament îmbunătăţit", se înţelege orice efect aditiv, sinergie sau de potenţare. De exemplu, linia de celule de gliom U87 şi liniile de celule hematopoietice U937 şi Molt-4 sunt 21 receptive la expunerea sinergică la anticorpii agonişti anti-DR4 şi anti-DR5, în timp ce expunerea numai la anticorpul agonist DR5 demonstrează numai un succes limitat în 23 inducţia apoptozei. în plus, anticorpii agonişti pe receptorii anti-TRAIL au o utilitate particularăîn invenţia 25 de faţă când un anticorp este specific faţă de legarea unuia dintre receptorii momeală DcR1,
DcR2 sau OPG. Blocarea selectivă a unui receptor momeală cu un anticorp conform cu 27 invenţia de faţă are efect în tipurile de celule care exprimă receptorii momeală de deplasare a echilibrului de legare a TRAIL către acei receptori TRAIL capabili de a traduce semnalul 29 de apoptoză. Astfel, într-o altă terapie combinată, conformă cu invenţia de faţă, un anticorp de legare a unui receptor momeală sensibilizează o celulă de expresie faţă de semnalul de 31 apoptoză agonist care traduce legarea receptorului TRAIL. într-o altă concretizare, invenţia de faţă produce o metodă de elucidare a 33 determinanţilor antigenici (epitopi) agonişti şi antagonişti ai unui receptor TRAIL dat. în plus, polimorfismele între indivizi asociaţi cu un receptor TRAIL, dat sunt elucidate în conformitate 35 cu invenţia de faţă prin utilizarea unui grup de anticorpi monoclonali fiecare având o regiune variabilă sau CDR diferită. Un grup caracterizat de anticorpi monoclonali asigură capacitatea 37 de a defini determinanţii antigenici agonişti şi antagonişti şi polimorfismele. Astfel, un grup de anticorpi monoclonali conformi cu invenţia de faţă are utilitate în descoperirea de 39 medicamente şi/sau în screening-ul subiecţilor pentru predispoziţia la boală. O altă concretizare a invenţiei de faţă implică proteine de fuziune care includ un 41 fragment antigenic al unui receptor TRAIL, cuplat cu o proteină imunoglobulină, polipeptidă sau un fragment al acestora. Un fragment de receptor TRAIL este definit ca şi conţinând un 43 număr suficient de baze, pentru a provoca un răspuns imun la un receptor TRAIL nativ, exprimat pe suprafaţa celulei în cauză. Un fragment de fuziune al unui receptor TRAIL include 45 15 RO 123525 Β1 cel puţin zece aminoacizi. O proteină de fuziune imunoglobulină sau un fragment al acesteia este definit aici ca incluzând o proteină nativă sau sintetică, sau un segment polipeptidic având un număr suficient de baze de aminoacid, pentru a activa un răspuns imun, în cascadă, la un subiect. Un imunogen din invenţia de faţă include fuziunea unui fragment de receptor TRAIL, cuplat cu un fragment de imunoglobulină şi prezintă utilitate ca agent terapeutic in vivo, pentru a provoca apariţia unui anticorp antireceptor TRAIL in situ la un subiect. într-o altă concretizare suplimentară, invenţia de faţă este operativă ca terapie genică. Astfel, invenţia furnizează o metodă de inducţie selectivă a apoptozei în celulele ţintă, cuprinzând etapele de transfectare a celulelor ţintă, cu un vector care conţine o secvenţă exprimabilă de acid nucleic al unui receptor TRAIL; exprimarea, pe celulele menţionate, a unui receptor TRAIL, codificat de secvenţa de acid nucleic a receptorului TRAIL, menţionată; şi punerea în contact a celulelor menţionate cu un anticorp inductor al apoptozei, selectiv pentru legarea receptorului TRAIL, menţionat. într-un aspect de terapie genică, al invenţiei de faţă, celulele ţintite sunt transfectate cu un vector care poartă o secvenţă exprimabilă care corespunde unui receptor TRAIL, vectorul fiind convenţional şi ales pe baza susceptibilităţii celulei ţintite la vector. Vectorii de terapie genică includ, ca ilustrare, adenovirusurile, pAdCMV5. După ce celulele ţintite sau ţesutul exprimă receptorul TRAIL transfectat, celulele sau ţesutul sunt expuse la un anticorp conform cu invenţia de faţă, specific pentru legarea receptorului TRAIL transfectat. Se apreciază că anticorpul antireceptor TRAIL este fie agonist fie antagonist faţă de acesta, în acord cu rezultatul terapeutic dorit.
Anticorpii din invenţia de faţă sunt, de asemenea, operativi, împreună cu un sensibili-zator. Un sensibilizator utilizat aici este definit a include orice stimul care induce apoptoza, incluzând lumina ultravioletă, moleculele organice, incluzând în mod specific clasa bisindolmaleimidelor, metalele grele şi speciile de radicali liberi. în contextul terapiei cancerului, TRA-8 este capabil de a induce apoptoza celor mai multe celule tumorale, sensibile la TRAIL, într-un mod dependent de caspaze, în absenţa unei legări transversale (reticulări) secundare. TRA-8 sau 2E12, singuri sau în combinaţie cu alţi anticorpi, prezintă o puternică activitate tumoricidă in vivo. Capacitatea TRA-8 sau a 2E12 de a induce apoptoza celor mai multe celule sensibile la TRAIL confirmă faptul că numai DR5 singur sau numai DR4 singur este suficient pentru a declanşa apoptoza. Majoritatea celulelor tumorale detaliate aici exprimă DR5 de la suprafaţa celulei şi susceptibilitatea acestora faţă de moartea celulară, indusă de TRA-8, pune în paralel susceptibilitatea acestora la TRAIL, indicând faptul că DR5 este un receptor primar al morţii, pentru apoptoza mediată de TRAIL, în majoritatea celulelor tumorale. Rezultate similare au fost obţinute cu anticorpi specifici pentru DR4 (de exemplu, 2E12). Astfel, exprimarea distinctivă a DR5 sau a DR4 de către celule normale şi canceroase este operativă din punct de vedere al selectivităţii apoptozei mediate de TRAIL. TRA-8 scurtcircuitează receptorii momeală, pentru a induce apoptoza mediată de TRAIL. Cu toate acestea, doar o minoritate de celule tumorale rezistente la TRAIL sunt sensibile la TRA-8, indicând faptul că receptorii momeală nu par a juca un rol major în rezistenţa celulelor tumorale la apoptoza mediată de TRAIL.
Deşi studiile anterioare au indicat faptul că administrarea sistemică a formei solubile a TRAIL la animale induce regresia tumorii, fără a cauza toxicitatea (H. Walczak, M. A. Degli-Esposti, R. S. Johnson, P. J. Smolak, J. Y. Waugh, N. Boiani, M. S. Timour, M. J. Gerhart, 16 RO 123525 Β1 K. A. Schooley, C. A. Smith, R. G. Goodwin, C. T. Rauch, MBO J 1 Sep 1997; 16(17):5356- 1 97; M. MacFarlane, M. Ahmad, S. M. Srinivasula, T. Femandes-Alnemri, G. M. Cohen, E. S. Alnemri, J. Biol. Chem., 10 Oct., 1997; 272(41):25417-20; N. A. Fanger, C. R. Maliszewski, 3 K. Schooley, T. S. Griffith, J. Exp. Med., 18 Oct., 1999; 190(8):1155-64), forma legată de membrană a TRAIL uman induce leziuni hepatice la şoareci, după cum este prezentat aici. 5 Cu toate acestea, toxicitatea hepatică a TRAIL este mult mai puţin eficace decât cea a ligandului Fas, după cum s-a demonstrat prin susceptibilitate mai mică a hepatocitelor 7 normale la leziunile induse de TRAIL comparativ cu ligandul Fas şi prin lipsa letalităţii TRAIL in vivo. Astfel, titrarea TRAIL are utilitate în terapia cancerului. 9
După cum s-a detaliat aici, este prezentată absenţa unor niveluri semnificative de expresie a proteinei DR5 de către hepatocitele normale şi este asociată cu rezistenţa 11 hepatocitului la apoptoza indusă de TRA-8. Legarea încrucişată a (reticularea) lui DR5 cu anticorpul monoclonal este insuficientă pentru a organiza formele homopolimere ale 13 receptorului morţii, capabile de a declanşa apoptoza. Experimentele pe saguini nu au indicat vreo probă a toxicităţii hepatice la administrarea TRA-8. Astfel, un anticorp monoclonal DR5 15 agonist este probabil mai selectiv şi mai sigur ca agent terapeutic decât TRAIL solubil. în mod similar, DR4 este exprimat de celulele transformate sau activate şi nu este exprimat în 17 cantităţi apreciabile sau este exprimat, doar în cantităţi mult mai mici de celulele normale, de exemplu, de fibroblaşti. DR4 din invenţia de faţă induce apoptoza anumitor celule ţintă, 19 fără o moarte apreciabilă a celulelor non-ţintă, cum ar fi fibroblaştii etc. După cum se utilizează aici, absenţa unui efect sau lipsa unui efect apreciabil sau semnificativ se referă 21 la, şi include absenţa completă a efectului sau un efect care este mai mic sau egal cu fondul sau cu nivelurile martor şi nu depăşeşte fondul şi nivelurile martor de mai mult de 1,5 ori. 23 Ca analiză screening sau ca instrument de imagistică, invenţia de faţă este adecvată pentru detectarea unor mici grupuri de celule DR4 sau DR5 care mai pot prezenta morfologia 25 celulelor normale. De exemplu, colorarea in situ a secţiunilor de celule canceroase umane, incluzând cancerele de plămân, prostată şi ficat cu anticorpi marcaţi în conformitate cu 27 invenţia de faţă, identifică rapid celulele canceroase. Anticorpii din invenţia de faţă sunt de asemenea utili în screening-ul altor manifestări de boală, incluzând, de exemplu, diferite boli 29 inflamatorii şi autoimune, cum ar fi artrita reumatoidă. Un asemenea screening poate fi util chiar şi înainte de apariţia simptomelor clinice, şi poate fi util pentru screening-ul subiecţilor 31 cu risc de boală, astfel încât tratamentul profilactic poate fi început înainte de manifestarea altor semne sau simptome. în mod specific, se observă că celulele canceroase exprimă 33 niveluri foarte înalte de DR5, comparativ cu celulele normale de acelaşi tip. Astfel, invenţia de faţă are utilitate ca metodă de screening sensibilă pentru malignităţile aflate într-o etapă 35 iniţială în ţesuturi, incluzând cel puţin plămânul, prostata, sângele, cervixul, sânul şi ficatul.
Este detaliat aici un procedeu terapeutic pentru inhibiţia proliferării celulelor anormale 37 asociate cu boli, în mod ilustrativ, cu cancerele maligne şi cu leucemiile limfatice, printre altele. 39
Invenţia de faţă este detaliată aici, în special, referitor la anticorpul monoclonal DR5 antiuman, desemnat ca TRA-8, având numărul de acces ATCC PTA-1428. Se apreciază că 41 tehnicile şi rezultatele detaliate cu privire la anticorpul monoclonal DR5 antiuman TRA-8 sunt complet extrapolabile şi aplicabile la anticorpii antagonişti DR5, la fel ca şi la anticorpii 43 crescuţi împotriva DR4, DcR1 şi DcR2, acţionând atât în mod agonist, cât şi mod antagonist.
Astfel, invenţia de faţă este detaliată aici, în privinţa unui anticorp care induce apoptoza, 45 17 RO 123525 Β1 specific pentru DR4 uman. într-una dintre concretizări, anticorpul are aceeaşi specificitate a determinantului antigenic ca şi hibridomul 2E12, care a fost depozitat în 24 octombrie 2001, pentru a procura un număr de acces în favoarea Fundaţiei de Cercetare UAB, în Colecţia Americană de Tipuri de Culturi, Rockville, Mc. Descrierea materialelor depozitate a fost „Clona Hibridomului 2E12 împotriva DR4 Uman" („2E12 Hybridoma Clone Against Human DR4"), tulpina fiind desemnată 2E12 şi cu numărul de referinţă de etichetă PCT/US01/14151. Nivelurile de expresie a unui receptor al apoptozei, cum ar fi Fas, nu se corelează în mod necesar cu susceptibilitatea celulelor la apoptoză. Pentru apoptoza mediată de TRAIL, s-a sugerat faptul că exprimarea receptorilor momeală pentru TRAIL influenţează susceptibilitatea celulelor. Mai mult, s-a sugerat faptul că DR5 trebuie să fie asociat cu DR4, pentru o traducere eficace a semnalului de apoptoză pe calea FADD şi a caspazei 8. Disponibilitatea anticorpului agonist monoclonal anti-DR5 a permis evaluarea reglării semnalizării DR5 şi rolul relativ al acestuia în apoptoza mediată de TRAIL. Compararea susceptibilităţii celulelor faţă de apoptoza mediată deTRA-8 cu susceptibilitatea acestora la apoptoza mediată de TRAI L oferă o înţelegere a rolului DR5 în apoptoza mediată de TRAI L şi în mecanismele care pot afecta susceptibilitatea. Avantaje similare sunt furnizate de anticorpul DR4.
Acest avantaj se extinde în general asupra anticorpilor DR4 şi DR5 umanizaţi din invenţia de faţă. O clonă moleculară a unui anticorp al DR5, de exemplu, se prepară prin tehnici cunoscute, aşa cum se va detalia în exemplele care urmează. Metodologia ADN-ului recombinat (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning a Laboratory Manual, Cold Sp Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) este operativă aici, pentru a construi secvenţele de acid nucleic, care codifică o moleculă de anticorp monoclonal sau regiunea de legare a antige-nului acestuia.
Invenţia de faţă permite construirea anticorpilor TRAIL umanizaţi, care este improbabil să inducă un răspuns la anticorpul uman antişoarece (la care se va face referire de acum înainte ca „HAMA") (Schroff et al., 1985, Cancer Res., 45, 879-885), şi să aibă în paralel o funcţie eficace a efectorului anticorpului. Anticorpii umani integrali pot fi de asemenea produşi prin imunizarea şoarecilor capabili de a produce un anticorp uman integral (de exemplu, şoarecii modificaţi genetic, pentru a produce anticorpi umani), realizând screening-ul clonelorcare leagă DR5 sau DR4, inducând apoptoza, şi intrând în competiţie pentru determinantul antigenic al TRA-8 sau 2E12. Vezi, de exemplu, Lonberg şi Huszar (1995), Human antibodies from transgenic mice, Int. Rev. Immunol., 13:65-93, care este încorporat aici prin referinţă în întregime, pentru metodele de producere a anticorpilor umani integrali. După cum se utilizează aici, termenii „uman" şi „umanizat", referitor la anticorpi, se referă la orice anticorp care se aşteaptă să provoace un răspuns imunogen slab terapeutic, tolerabil la un subiect uman.
Invenţia de faţă furnizează un anticorp uman DR5, un anticorp umanizat anti-DR5, imunoglobuline TRA-8 cu lanţ greu şi uşor şi imunoglobuline umanizate cu lanţ greu şi uşor. Invenţia mai furnizează un anticorp DR4, un anticorp umanizat DR4, imunoglobuline cu lanţ greu şi uşor ale anticorpului DR4, şi imunoglobuline umanizate cu lanţ greu şi uşor, acizi nucleici care codifică anticorpii şi lanţurile grele şi uşoare, vectori care cuprind aceşti acizi nucleici, şi celule care cuprind vectorii. Anumite fragmente ale acestor proteine sau gene realizează funcţiile de reglare sau enzimatice ale proteinei sau genei cu secvenţă integrală. De exemplu, secvenţele de acid nucleic care le codifică pot fi modificate prin substituţii, adiţii, 18 RO 123525 Β1 suprimări sau exprimări multimerice, care furnizează echivalente funcţionale ale proteinelor 1 sau genelor. Datorită degenerării secvenţelor codificatoare ale acidului nucleic, se pot utiliza, în practica invenţiei de faţă, şi alte secvenţe care codifică aproape aceleaşi secvenţe ale 3 aminoacidului, ca şi cele care apar în mod natural în proteine. Acestea includ, dar nu se limitează la secvenţe de acid nucleic care includ toate porţiunile de acid nucleic care codifică 5 polipeptidele de mai sus, care sunt modificate prin substituţia a diferiţi codoni care codifică un rest de aminoacid echivalent din punct de vedere al funcţiei din secvenţă, producând 7 astfel o modificare silenţioasă. Se apreciază că secvenţa de nucleotide a unei imunoglobuline conforme cu invenţia de faţă tolerează variaţii de omologie a secvenţei până 9 la 25%, după cum se calculează prin metode standard („Current Methods in Sequence Comparison and Analysis", Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods 11 and Applications, pp. 127-149, 1998, Alan R. Liss, Inc.), atât timp cât o asemenea variantă formează un anticorp operativ care recunoaşte un receptor TRAIL DR5. De exemplu, unul 13 sau mai multe resturi din secvenţa polipeptidică pot fi substituite cu alt aminoacid de aceeaşi polaritate, care se comportă ca un echivalent funcţional, având ca rezultat modificări 15 silenţioase. Substituenţii pentru aminoacizii din secvenţă pot fi selectaţi dintre alţi membrii ai clasei din care aminoacidul face parte (adică o substituţie conservativă). De exemplu, 17 aminoacizii nepolari (hidrofobi) includ alanina, leucina, izoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofanul şi metionina. Aminoacizii polari neutri includ glicina, serina, treonina, 19 cisteina, tirozina, asparagina şi glutamina. Aminoacizii încărcaţi pozitiv (bazici) includ arginina, lizina şi histidina. Aminoacizii încărcaţi negativ (acizi) includ acidul aspartic şi acidul 21 glutamic. Sunt de asemenea incluse, în scopul acestei invenţii, proteinele sau fragmente sau derivaţi ai acestora care sunt modificate în mod distinctiv în timpul sau după translaţie, de 23 exemplu, prin glicozilare, clivaj proteolitic, legare la o moleculă de anticorp sau la alţi liganzi celulari etc. în plus, vectorul recombinat, care codifică secvenţele de acid nucleic ale 25 anticorpilor din invenţia de faţă, pot fi supuşi ingineriei, astfel încât să se modifice prelucrarea sau exprimarea unui vector. Se pot face şi alte modificări fie în secvenţa de acid nucleic, fie 27 în cea de aminoacid, fără a reduce sau fără a reduce în mod substanţial activitatea de apoptoză în anticorp. Astfel de modificări pot apărea în regiunile CDR sau non-CDR, 29 utilizând tehnici de rutină din domeniu. Vezi, de exemplu, Yang et al., (1995), J. Moi. Biol. 254:392-403, care este încorporat aici prin referinţă în întregime, pentru metode de 31 mutageneză ambulantă (Ib. engi, walking mutagenesis) a CDR. în plus, un inhibitor care codifică secvenţe de acid nucleic, poate fi supus mutaţiilor 33 in vivo sau in vitro. pentru a crea sau distruge secvenţele de translaţie, iniţiere, şi/sau terminare, sau pentru a crea variaţii în regiunile de codificare şi/sau pentru a forma situsuri 35 pentru endonucleaze de restricţie sau pentru a le distruge pe cele existente, pentru a facilita modificarea in vitro suplimentară. Se poate utiliza orice tehnică de mutageneză cunoscută 37 în domeniu, incluzând, dar nelimitându-se la mutageneză in vitro, direcţionată la situs, J. Biol.
Chem. 253:6551, utilizarea linker-ilor Tab (Pharmacia), şi altele asemenea. 39
Datele de cristalografie cu raze X indică faptul că pliul imunoglobulinei anticorpului formează, în general, o structură cilindrică, lungă, ce cuprinde două straturi antiparalele de 41 foi b, fiecare constând din trei sau patru lanţuri b. în regiunea variabilă, trei bucle din fiecare dintre domeniile V ale lanţurilor H şi L se aglomerează împreună, pentru a forma un situs de 43 legare a antigenului. Fiecare dintre aceste bucle este denumită regiune de determinare complementară (CDR). CDR-urile au cea mai mare variabilitate a secvenţei de aminoacizi 45 19 RO 123525 Β1 din anticorp. Porţiunile regiunii variabile, care nu sunt parte a CDR, se numesc „regiuni schelet" (regiuni „FR") şi joacă în general un rol în menţinerea structurii CDR. De preferinţă, toate CDR-urile dintr-un anticorp dat sunt grefate într-un anticorp acceptor, pentru a păstra regiunea de legare a regiunii determinantului antigenic al receptorului TRAIL. Se apreciază că grefarea unei porţiuni din cantitatea totală a CDR-urilor într-un donor este operativă în cazul de faţă. Se înţelege că grefarea cuprinde, în general, înlocuirea, rest cu rest, a unei regiuni sau a unui aminoacid cu altul/alta. Cu toate acestea, ocazional, în special, prin transferul regiunii, unul sau mai multe resturi pot fi adăugate sau omise sau substituite, după dorinţă, şi astfel de deleţii şi inserţii, la fel ca şi înlocuirile şi inversiunile adecvate sunt apanajul celor cu calificare în domeniu.
Un anticorp din invenţia de faţă se obţine, de exemplu, prin grefarea fiecărei CDR al subunităţii lanţului L şi H, ale unui anticorp monoclonal, al unui receptor anti-TRAIL, într-o regiune CDR corespunzătoare a unui anticorp uman, prin aceasta, umanizând un anticorp monoclonal de şoarece, eficace împotriva unui receptor TRAIL.
Fragmentele de anticorp care conţin idiotipul moleculei sunt de asemenea generate şi sunt operative în cazul de faţă, utilizând tehnici cunoscute. De exemplu, astfel de fragmente includ, ca ilustrare, fragmentul de receptor anti-TRAIL (AB')2 care poate fi produs prin digestia cu pepsină a moleculei de anticorp, fragmentele AB' de receptor TRAIL generate prin reducerea punţilor disulfurice ale fragmentului (AB')2 al receptorului TRAIL, şi ale fragmentului de anticorp care sunt generate prin tratarea moleculei anticorpului cu papaină şi cu un agent reducător.
Anticorpii din invenţia de faţă se pot obţine utilizând numeroase tehnici cunoscute în domeniu. De exemplu, anticorpul monoclonal TRA-8 anti-DR5 poate fi obţinut cultivând un hibridom care, la rândul său, să fie obţinut prin imunizarea unui şoarece cu DR5 uman şi ulterior fuzionând celulele splenice sau celulele de nodul limfatic de la şoarece cu celule de mielom de şoarece.
Prepararea unui anticorp monoclonal, ca ilustrare, implică următoarele etape: a. purificarea unei biomacromolecule de utilizat ca antigen; b. prepararea unor celule producătoare de anticorpi, întâi imunizând un animal, utilizând injecţii cu antigen, exsanghinând animalul şi determinând titrul anticorpului, pentru a determina când să se îndepărteze splina; c. prepararea celulelor de mielom; d. fuzionarea celulelor producătoare de anticorp şi a celulelor de mielom; e. selectarea unui hibridom care produce un anticorp dorit; f. prepararea unei singure clone de celule (donarea); g. opţional, cultivarea celulelor de hibridom sau ale animalelor în creştere în care au fost transplantate celulele de hibridom, pentru prepararea pe scară largă a anticorpului monoclonal; şi h. testarea activităţii biologice şi a specificităţii sau determinarea proprietăţilor de agent marker ale anticorpului monoclonal astfel preparat.
Procedura de preparare a unui anticorp monoclonal este detaliată mai jos, cu referire la etapele descrise mai sus. Această metodă de preparare a unui anticorp din invenţia de faţă se intenţionează să fie numai ilustrativă pentru metodele de preparare, şi nu se limitează la acestea. Pot fi urmate şi alte proceduri sau poate fi modificată metoda care urmează, de exemplu, prin utilizarea, ca celule producătoare de anticorpi, altele decât cele de splină sau de mielom. 20 RO 123525 Β1 a. Prepararea antigenului 1 O proteină recombinată (la care se va face referire de acum înainte ca „DR5 uman recombinat" sau „DR4 uman recombinat"), eficace ca antigen, se obţine prin transfecţia 3 celulelor QBI-293A cu vectorul de exprimare pAdDR5-lgG, pentru o proteină de fuziune care conţine domeniul extracelular al DR5 sau DR4 uman şi regiunea Fc a anticorpului uman lgG1 5 (la care se va face referire de acum înainte ca „IgG"), (cf. PTA-1428), pentru a o exprima prin utilizarea trusei ADENO-Quest (Quantum Biotechnologies Inc., Canada), şi colectând şi 7 purificând parţial produsul de exprimare. Plasmida pAdDR5-lgG este construită prin inserarea unui ADN care codifică un DR5 sau un DR4 uman şi a unei proteine de fuziune 9 umane IgG în pAdCMV5, care este un vector de exprimare pentru celulele animale. Sunt operative în cazul de faţă şi alte materiale, cum ar fi ADN care codifică DR5 sau DR4, 11 vectorul şi gazda. DR5 sau DR4 uman şi proteina de fuziune IgG, produşi în supernatantul de cultură 13 a celulelor QBI-293A, transfectat cu vectorul pAdDR5-lgG, pot fi parţial purificaţi prin cromatografie de afinitate ProteinA-Sepharose sau prin cromatografie de afinitate ProteinG- 15 Sepharose, sau prin cromatografie de schimb ionic, utilizând o coloană Resource Q (denumire comercială; Pharmacia). 17
Ca alternativă, se utilizează, ca antigen DR5 sau DR4 purificaţi, obţinuţi din membranele celulare de linii celulare umane. în plus, deoarece structurile primare ale DR4 19 şi DR5 sunt cunoscute (cf. PTA-1428), o peptidă care să conţină secvenţa de aminoacid SECV ID NR. 1 poate fi sintetizată chimic, printr-o metodă cunoscută, cum ar fi metoda 21 Sânger, şi poate fi utilizată ca antigen. b. Prepararea celulelor producătoare de anticorp 23
Un şoarece se imunizează cu imunogenul produs în etapa a., se amestecă cu un adjuvant, cum ar fi adjuvantul complet sau incomplet al lui Freund sau alaun. Alte animale 25 experimentale includ în mod ilustrativ şobolanii, cobaii, iepurii, câinii, puii, caii, porcii, vacile şi oile. 27 Căile de administrare adecvate pentru a imuniza un animal experimental includ căile de injectare subcutanată, intraperitoneală, intravenoasă, intradermică şi intramusculară, fiind 29 preferate injecţiile subcutanate şi intraperitoneale.
Imunizarea se realizează opţional printr-o doză unică sau prin câteva doze repetate 31 la intervale adecvate (de preferinţă, de la 1 la 5 săptămâni). Animalelor imunizate, li se monitorizează titrul anticorpului în ser şi animalul cu un titru al anticorpului suficient de mare 33 este selectat ca sursă de celule producătoare de anticorp. Selectarea unui animal cu un titru mare face procedeul care urmează mai eficient. Celulele pentru fuziunea ulterioară sunt în 35 general cultivate de la animal, la 3 până la 5 zile după imunizarea finală.
Metodele de determinare a titrului anticorpului includ diferite tehnici bine cunoscute, 37 cum ar fi radioimunoanaliza (la care se va face referire de acum înainte ca „RIA"), imunoanaliza enzimatică în fază solidă (la care se va face referire de acum înainte ca 39 „ELISA"), analiza anticorpului fluorescent şi analiza hemaglutinării pasive, fiind preferate RIA şi ELISA, din motive de sensibilitate de detecţie, rapiditate, acurateţe şi posibilitate de 41 automatizare.
Determinarea titrului anticorpului poate fi realizată, de exemplu, prin ELISA, după cum 43 urmează. întâi, DR5 sau DR4 purificaţi sau DR5 sau DR4 parţial purificaţi se adsorb pe suprafaţa unei faze solide, cum ar fi o placă ELISA cu 96 godeuri, urmată de blocarea oricărei 45 21 RO 123525 Β1 suprafeţe rămase, la care DR5 sau DR4 nu s-au legat, cu o proteină neînrudită cu antigenul, cum ar fi albumina serică bovină (BSA). După spălare, suprafeţele godeurilor sunt puse în contact cu probe diluate serial de ser de şoarece, pentru a permite legarea anticorpului DR5 sau DR4 din probe la antigen. Se adaugă un anticorp marcat antişoarece, ca anticorp secundar, pentru a fi legat de anticorpul de şoarece. Agentul de marcare poate include un agent de marcare enzimatic, un agent de marcare fluorescent sau alţi agenţi de marcare cunoscuţi în domeniu. După spălare, se adaugă substratul enzimei şi titrul anticorpului se estimează, prin determinarea modificării absorbanţei, datorită dezvoltării culorii produse de alterarea substratului sau de altele asemănătoare. c. Prepararea celulelor de mielom
Celule de la linii de celule de şoarece stabilite servesc ca sursă de celule de mielom, incluzând, de exemplu, şoarece rezistent la 8-azaguanină, derivate de la tulpinile de mielom Balb/c: P3X63Ag8U.1 (P3-U1) (D. E. Yelton et al., 1978, Current Topicsin Microbiology and Immunology, 81, 1-7), P3NSI/1-Ag4-1(NS-1) (G. Kohler et al., 1976, European J. Immunology, 6, 511-519). Sp2/0-Agl4 (SP-2) (Shulman, M., et al., 1978, Nature, 276. 269-270), P3X63Ag8.653 (653) (J. F. Kearney et al., 1979, J. Immunology, 123, 1545-1550) şi P3X63Ag8 (X63) (K. Horibata şi A. W. Harris, 1975, Nature, 256, 495-497). Linia de celule selectată este transferată serial într-un mediu adecvat, cum ar fi mediul de 8-azaguanină. Mediul de 8-azaguanină include Mediul Dulbecco modificat, al lui Iscove (la care se va face referire de acum înainte ca „IMDM") sau Mediul Eagle modificat, al lui Dulbecco (la care se va face referire de acum înainte ca „DMEM"). Mediul RPMI-1640 suplimentat cu glutamină, 2-mercaptoetanol, gentamicină, serfetal de viţel (la care se va face referire de acum înainte ca „FCS"), şi 8-azaguanină. Celulele sunt apoi transferate pe un mediu normal, cum ar fi mediul ASF104 (Ajinomoto, K. K.) care conţine FCS 10%, la 3 până la 4 zile înainte de fuziune, pentru a asigura faptul că cel puţin 2x107 celule sunt disponibile în ziua fuziunii. d. Fuziunea celulelor
Limfocitele şi celulele plasmatice obţinute din orice parte adecvată a animalului sunt celule precursoare care produc anticorp. Surse ilustrative de limfocite sau de celule plasmatice includ în mod ilustrativ splina, nodulii limfatici, sângele periferic sau orice combinaţie adecvată a acestora, celulele de splină fiind cea mai comună sursă.
După ultima injecţie, ţesutul în care celulele producătoare de anticorp sunt prezente se îndepărtează de la un şoarece care are titrul predeterminat al anticorpului. Tehnica cea mai bună de fuziune a celulelor de splină cu celulele de mielom preparate în etapa c. utilizează polietilenglicol.
Tehnica de fuziune include spălarea celulelor de splină şi de mielom cu mediu fără ser (cum ar fi RPM11640) sau tampon fosfat salin (la care se va face referire de acum înainte ca „PBS”), astfel încât raportul numeric al celulelor de splină şi al celulelor de mielom să fie aproximativ 5:1 şi 10:1, şi apoi se centrifughează. După evacuarea supernatantului şi eliberarea celulelor din peletă, se adaugă 1 ml mediu fără ser, care conţine 50% (gr/v) polietilenglicol (g.m. de la 1000 la 4000) în picături cu amestecare. Ulterior, 10 ml de mediu fără ser se adaugă încet şi apoi se centrifughează. Supernatantul se aruncă din nou, iar celulele strânse în peletă se suspendă într-o cantitate adecvată de mediu HAT care conţine o soluţie de hipoxantină, aminopterină şi timidină (la care se va face referire de acum înainte ca „HAT") şi interleukină-2 de şoarece (la care se va face referire de acum înainte ca „1L-2). Suspensia este apoi dispersată în godeurile de pe plăcile de cultură (la care se mai face referire 22 RO 123525 Β1 aici simplu ca „plăci") şi se incubă în prezenţa a 5% v/v C02, la 37°C, timp de aproximativ 2 1 săptămâni, adăugând suplimentar mediu HAT, cât este necesar. e. Selectarea hibridoamelor 3 Când tulpina de mielom utilizată este rezistentă la 8-azaguanină, adică, are o deficienţă a enzimei hipoxantin guanin fosforibozil transferază (HGPRT), orice celule de 5 mielom nefuzionate şi orice fuziuni mielom-mielom sunt incapabile de supravieţuire în mediul HAT. Pe de altă parte, fuziuni ale celulelor producătoare de anticorp una cu alta, la fel ca şi 7 a hibrodoamelor de celule producătoare de anticorp cu celule de mielom pot supravieţui, primele având doar o viaţă limitată. în consecinţă, incubarea continuă în mediul HAT are ca 9 rezultat selecţia numai a hibridoamelor dorite.
Hibridoamele rezultate cresc în colonii care sunt transferate în mediul HAT fără 11 aminopterină (mediu HT). După aceea, se îndepărtează alicote de supematant de cultură, pentru a determina titrul anticorpului anti-Fas, de exemplu, prin ELISA. Când proteina de 13 fuziune mai sus-menţionată se utilizează ca antigen ELISA, este de asemenea necesară eliminarea clonelor care produc un anticorp care este legat specific la regiunea Fc a lgG1 15 uman. Prezenţa sau absenţa unei astfel de clone poate fi verificată, de exemplu, prin ELISA, utilizând ca antigen Fas-lgG1 sau lgG1. 17 f. donarea
Hibridoamele care s-a demonstrat că produc anticorpi specifici, utilizând o metodă 19 similară cu cea descrisă în etapa b., pentru a determina titrul anticorpului, sunt apoi transferate pe o altă placă, pentru donare. Metodele de donare adecvate includ: metoda 21 diluţiilor limitate, în care hibridoamele sunt diluate, pentru a conţine o celulă per godeul unei plăci şi apoi se cultivă; metoda agarului moale, în care coloniile sunt recuperate după 23 cultivarea într-un mediu de agar moale; o metodă de utilizare a unui micromanipulator, pentru a separa o singură celulă pentru cultură; şi „sortează - o -clonă", în care celule unice 25 sunt separate de către un sortator de celule.
Procedura de donare conformă cu, de exemplu, metoda diluţiilor limitate, se repetă 27 de 2 până la 4 ori, pentru fiecare godeu, demonstrând un titru de anticorpi, şi clonele care au titre de anticorpi stabile sunt selectate ca hibridoame producătoare de anticorpi 29 monoclonali anti-DR5. Hibridoamele care produc anticorpul DR5 antişoarece sunt selectate printr-o metodă similară, pentru a obţine o linie de celule producătoare de anticorpi 31 monoclonali anti-DR5.
Hibridomul şoarece-şoarece TRA-8, care este baza pentru anticorpii din invenţia de 33 faţă, a fost depozitat în Colecţia Americană de Tipuri de Culturi (American Type Culture Collection), la 1 martie 2000, şi are numărul de acces PTA-1428. Hibridomul 2E12 a fost 35 depozitat în Colecţia Americană de Tipuri de Culturi, la 24 octombrie 2001, după cum a fost descris mai sus şi are numărul de acces ATCC Nr. PTA-3798. în conformitate, când se 37 prepară un anticorp utilizând hibridomul şoarece-şoarece TRA-8 sau orice alt hibridom stabilit, prepararea se poate realiza prin urmarea unei proceduri, începând de la etapa g. în 39 jos, etapele de la a. la f. fiind omise. g. Cultura de hibridom pentru prepararea anticorpului monoclonal 41
Hibridomul obţinut prin donare este apoi cultivat într-un mediu normal, nu în mediul HT. Cultura pe scară largă este realizată prin cultura flacoanelor cilindrice, utilizând flacoane 43 de cultură mari, sau prin cultură rotitoare. Supernatantul de la cultura pe scară largă este apoi recoltat şi purificat printr-o metodă adecvată, cum ar fi gel-filtrarea, care este bine 45 23 RO 123525 Β1 cunoscută persoanelor cu calificare în domeniu, pentru a obţine anticorpul monoclonal DR5 sau DR4, care este o bază pentru anticorpii din invenţia de faţă. Hibridomul mai poate fi, de asemenea, crescut intraperitoneal, la un şoarece singenic, cum ar fi şoarecele Balb/c, sau şoarecele nu/nu, pentru a obţine ascite care conţin un anticorp monoclonal DR5 sau DR4 în cantităţi mari. Trusele de purificare a anticorpilor monoclonali, disponibile în comerţ (de exemplu, trusa MAbTrap Gll; Pharmacia) sunt utilizate în mod convenabil, pentru a purifica anticorpii recoltaţi).
Anticorpii monoclonali preparaţi ca mai sus au o înaltă specificitate pentru DR5 uman sau respectiv DR4 uman. h. Analiza anticorpului monoclonal
Metodele adecvate de identificare a izotopului şi a subclasei anticorpului monoclonal includ metoda Ouchterlony, ELISA şi RIA. De preferinţă, pentru identificare, se utilizează o trusă comercială, cum ar fi o trusă Mouse Typer (denumire comercială BioRad).
Cuantificarea proteinei poate fi realizată prin metoda Folin-Lowry sau prin calcul bazat pe absorbanţa la 280 nm (1,4 (DO280) = imunoglobulină 1 mg/ml).
Identificarea determinantului antigenic pe care anticorpul monoclonal o recunoaşte se realizează după cum urmează. Mai întâi, se prepară diferite structuri parţiale ale moleculei pe care anticorpul monoclonal le recunoaşte. Structurile parţiale se prepară prin metoda în care diferite peptide parţiale ale moleculei se prepară prin sinteză, prin cunoscuta tehnică de sinteză a oligopeptidelor, sau prin metoda în care ADN-ul care codifică polipeptida parţială dorită, este încorporat într-un plasmid de exprimare adecvat, şi se exprimă într-o gazdă adecvată, cum ar fi E. coli, pentru a produce peptidele. în general, ambele metode sunt frecvent utilizate în combinaţie, pentru obiectul de mai sus. De exemplu, o serie de polipeptide având lungimi reduse în mod adecvat, care lucrează de la capătul C sau N terminal al proteinei antigen, se pot prepara prin tehnici de inginerie genetică consacrate. Stabilind care fragment reacţionează cu anticorpul, se obţine o idee aproximativă a locului determinantului antigenic.
Determinantul antigenic este identificat mai îndeaproape prin sinteza unei multitudini de oligopeptide mai mici care îi corespund sau care corespund unor mutanţi ai peptidei, utilizând tehnici consacrate de sinteză a oligopeptidelor, pentru a determina proprietatea de legare a peptidelor la anticorpul monoclonal anti-DR5, de exemplu, ceea ce constituie baza pentru prepararea anticorpului din invenţia de faţă şi o inhibiţie competitivă a legării peptidei la un antigen cu anticorpul monoclonal. Trusele disponibile în comerţ, cum ar fi SPOTs Kit (Genosys Biotechnologies, Inc.) şi o serie de truse (multipin) de sinteză multiplă a peptidelor bazate pe metoda de sinteză multiplă (multipin) (Chiron Corp.) pot fi utilizate în mod convenabil, pentru a obţine o largă varietate de oligopeptide.
Un anticorp din invenţia de faţă posedă diferitele proprietăţi funcţionale de la a. la f., descrise mai jos, fiecare dintre acestea fiind verificată, de exemplu, printr-o metodă descrisă aici mai jos. a. Legarea specifică a TRAS la celule care exprimă DR5 umani O caracteristică unică a acestei invenţii este capacitatea de a lega DR5 de la suprafaţa celulei. Acest lucru se demonstrează prin analiza de citometrie în flux a celulelor care exprimă DR5. Mai întâi, legarea specifică la suprafaţa celulei a DR5 este confirmată prin celulele COS-7 transfectate cu cADN cu lungime integrală care codifică DR5 uman. în mod specific, TRA-8 recunoaşte doar celulele COS-7 transfectate cu DR5 dar nu vectorul de 24 RO 123525 Β1 control gol sau vectorul care codifică DR4. în a doua etapă, sunt testate trei tipuri de celule 1 de tumori maligne de origini diferite: celulele hematopoietice, de gliom şi de cancer de prostată. Majoritatea acestor celule tumorale transformate exprimă niveluri semnificative de 3 DR5 de la suprafaţa celulei, deşi nivelurile de exprimare variază în limite largi. în a treia etapă, se examinează două grupuri de celule fibroblastice sinoviale, primare, de la pacienţi 5 cu RA şi OA. Toate celulele sinoviale RA exprimă niveluri semnificativ mai înalte de DR5 comparativ cu celulele OA. 7 b. Inducţia apoptozei celulelor tumorale maligne in vitro în absenţa reticulării
Capacitatea unui anticorp crescut, conform invenţiei de faţă, de a recunoaşte 9 receptorul TRAIL şi de a induce direct apoptoza celulelor tumorale maligne umane este determinată prin analiza viabilităţii celulare (ATPLite) în timpul culturii in vitro a celulelor cu 11 concentraţii diferite de anticorp, în mod specific TRA-8. Majoritatea celulelor tumorale sunt susceptibile la apoptoza indusă de TRA-8. Pentru unele celule, TRA-8 a prezentat o 13 puternică activitate de inducţie a apoptozei, de exemplu, TRA-8 este capabil de a induce apoptoza celulelor umane Jurkat la niveluri de pg/ml. Ca un lucru important, apoptoza indusă 15 de TRA-8 nu necesită reticulare, şi în cele mai multe celule, TRA-8 a prezentat o activitate de inducţie a apoptozei mai puternică decât TRAIL solubil, recombinat, în prezenţa agentului 17 de îmbunătăţire. c. Activitatea tumoricidă a TRA-8 in vivo 19
Activitatea tumoricidă a TRA-8 este evaluată prin două modele de tumori SCID/umane. Mai întâi, şoarecii SCID sunt inoculaţi intravenos cu celule Jurkat de leucemie 21 umane şi sunt trataţi cu o doză unică (100 pg) de TRA-8. Rezultatele au arătat faptul că majoritatea celulelor Jurkat implantate sunt eliminate din sângele periferic şi din splină prin 23 tratament cu TRA-8, după cum s-a determinat prin analiză citometrică în flux şi prin filtrarea imunohistochimică a celulelor Jurkat. în al doilea rând, celule de astrocitom uman 1321N1 25 sunt inoculate subcutanat la şoareci SCID, iar şoarecii purtători de tumori sunt trataţi cu o doză unică de TRA-8. Creşterea celulelor 1321N1 implantate este inhibată semnificativ la 27 şoarecii trataţi cu TRA-8, după cum s-a determinat prin mărimea tumorii şi prin analiză histologică. 29
d. Identificarea celulelor sinoviale RA de către TRAS
Celulele sinoviale primare, izolate de la 8 pacienţi cu RA şi 4 pacienţi cu OA, sunt 31 testate pentru exprimarea la suprafaţa celulei a DR5. TRA-8 este capabil să coloreze pozitiv toate celulele RA şi să coloreze negativ toate celulele OA. Astfel, RA se disting de OA prin 33 expresia la suprafaţă a DR5, după cum se detectează prin TRA-8. e. Inducţia apoptozei în celulele fibroblastice sinoviale RA de către TRAS 35
Abilitatea lui TRA-8 de a induce apoptoza celulelor sinoviale RA se determină prin analiza viabilităţii celulare în timpul cultivării in vitro, în prezenţa diferitelor concentraţii de 37 TRA-8. Toate celulele RA au prezentat niveluri de la înalte la intermediare ale susceptibilităţii la 100 ng/ml de TRA-8. în contrast, toate celulele OA sunt în mod esenţial rezistente la 39 apoptoza indusă de TRA-8. Ca un fapt important, TRA-8 a prezentat o mai bună activitate de inducţie a apoptozei în celulele sinoviale RA decât TRAIL solubil, împreună cu agentul 41 de îmbunătăţire. Mai mult, comparativ cu anticorpul anti-Fas (CH-11), TRA-8 a prezentat o mai bună selectivitate la celulele sinoviale RA. 43
f. TRAS nu induce producţia de MMP-uri în celulele sinoviale RA
Deoarece TRA-8 este capabil de a induce activarea NF-kb în celulele sinoviale RA 45 ca şi TNF-a, se determină efectul TRA-8 asupra producţiei de MMP1 şi MMP3 ale celulelor 25 RO 123525 Β1 sinoviale. Deoarece TNF-a a indus o creştere doză-dependentă a MMP-urilor, TRA-8 este incapabil de a induce orice producere de MMP-uri, şi în unele concentraţii, TRA-8 a scăzut uşor producţia de MMP-uri în celulele sinoviale RA. g. TRA induce o multiplă activare a caspazei
Deoarece caspazele joacă un rol crucial în inducţia apoptozei, abilitatea TRA-8 de a induce activarea caspazei se determină în celulele umane Jurkat. Când celulele Jurkat sunt incubate cu o doză scăzută (50 ng/ml) de TRA-8, activarea caspazei 8, caspazei 9 şi caspazei 3 se observă la 15 min după incubare, după cum se demonstrează prin analiza Western şi prin analiza de clivaj a caspazei. în termeni de timp, număr şi forţă de activare a caspazei, anticorpii din invenţia de faţă, incluzând anticorpul demonstrativ TRA-8, au prezentat o activitate mult mai bună decât orice alţi anticorpi inductori ai apoptozei, cum ar fi anticorpul Fas antiuman (CH-11).
Anticorpul 2E12 leagă în mod specific DR4 în forma sa solubilă şi are o activitate de inducţie a apoptozei in vivo şi in vitro, în celulele ţintă care exprimă DR4 (incluzând, de exemplu, celulele canceroase, celulele sinoviale de artrită reumatoidă, celule imunitare activate, cum ar fi limfocitele activate şi celulele infectate viral), are o activitate tumoricidă in vivo (de preferinţă, în absenţa toxicităţii la celulele netumorale). De preferinţă, anticorpul DR4 din invenţie are o activitate de inducţie a apoptozei caracterizată prin mai puţin de aproximativ 60%, 50%, 40%, 30%, 20% sau 10% viabilitate a celulelor ţintă, la concentraţii de anticorp de mai puţin de 30 pg/ml, 3 pg/ml, 0,3 pg/ml, sau 0,03 pg/ml, şi o activitate tumoricidă caracterizată prin 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% sau 100% reducere a mărimii tumorii. Astfel, un anticorp aAn din invenţia de faţă este o substanţă având proprietatea de a induce selectiv apoptoza celulelor patogene, după cum se arată în efectul (a) şi (g). în conformitate, acesta este util ca agent profilactic şi terapeutic pentru bolile asociate cu supravieţuirea neadecvată a celulelor sau cu proliferarea inadecvată a celulelor, cum ar fi a celor care pot fi atribuite dereglării sistemelor de apoptoză, incluzând sistemul Fas/ligand Fas.
Abilitatea unui anticorp din invenţia de faţă de a induce apoptoza este confirmată prin cultivarea celulelor, cum ar fi linia Jurkat de celule leucemice umane (Colecţia Americană de Tipuri de Culturi Nr. TIB-152) şi a liniei de celule de astrocitom 1321N1, în mediul în care a fost adăugată proba de test, şi determinarea ratei de supravieţuire, de exemplu, printr-o analiză ATPLite.
Anticorpii din invenţia de faţă, în special, anticorpii DR5 şi DR4, având aproape aceeaşi imunogenicitate la om ca şi cea a anticorpilor umani, este utilizat ca agent pentru profilaxia şi tratamentul bolilor asociate cu supravieţuirea sau cu proliferarea neadecvată ale celulelor, incluzându-le pe cele care pot fi atribuite dereglărilor sistemelor de apoptoză în bolile inflamatorii şi autoimune, incluzând în mod ilustrativ lupusul eritematos sistemic, boala Hashimoto, artrita reumatoidă, boala grefă contra gazdă, sindromul Sjogren, anemia pernicioasă, boala Addison, sclerodermia, sindromul Goodpasture, boala Crohn, anemia hemolitică autoimună, sterilitatea, miastenia gravis, scleroza multiplă, boala Basedow, trombopenia purpura, diabetul zaharat insulinodependent, alergia, astmul, boala atopică, arterioscleroza, miocardita, cardiomiopatia, nefrita glomerulară, anemia hipoplastică, respingerea după transplantul de organ şi numeroasele malignităţi ale ţesuturilor plămânilor, prostatei, ficatului, ovarelor, colonului, cervixului şi sânilor. Anticorpii din invenţia de faţă pot fi utilizaţi pentru a ţinti şi a induce selectiv apoptoza în celulele imunitare activate, incluzând 26 RO 123525 Β1 limfocitele, celulele limfoide, celulele mieloide şi celulele sinoviale reumatoide activate 1 (incluzând sinoviocitele inflamatoare activate, sinoviocitele asemănătoare macrofagelor, sinoviocitele asemănătoare fibroblaştilor) şi în celulele infectate viral (incluzându-le pe cele 3 infectate cu HIV, de exemplu), atât timp cât aceste celule ţintite exprimă sau pot fi făcute să exprime receptorii TRAIL specifici (adică DR4 sau DR5). 5
Un astfel de agent terapeutic sau profilactic se poate administra în diferite forme. Modurile adecvate de administrare includ administrarea orală, cum ar fi prin comprimate, 7 capsule, granule, pulberi şi siropuri, sau administrare parenterală, cum ar fi administrarea prin injecţii sau supozitoare. 9
Anticorpul sau agentul terapeutic se poate administra oral, rectal, intracisternal, intraventricular, intracranian, intratecal, intraarticular, intravaginal, parenteral (intravenos, 11 intramuscular sau subcutanat), local (pudre, unguente sau picături), intraperitoneal, transdermic, prin inhalaţie sau ca spray nazal sau bucal. Cantitatea exactă de anticorp sau 13 de agent terapeutic necesară va varia de la un subiect la alt subiect, dependent de vârstă, greutate şi de starea generală a subiectului, de severitatea bolii care este tratată, de 15 localizarea şi mărimea tumorii, de compuşii particulari utilizaţi, de modul de administrare şi de altele asemenea. O cantitate adecvată poate fi determinată de cineva cu calificare 17 obişnuită în domeniu, utilizând doar experimentarea de rutină, date fiind cunoştinţele de aici.
Dozele unice de anticorp se situează în domeniul de la 0,1...10000 micrograme, de prefe- 19 rinţă, între 1 şi 100 micrograme. Concentraţiile tipice de anticorp într-un transportor variază în domeniul de la 0,2 la 2000 nanograme pe mililitru cedat. Pentru injectare într-o articulaţie, 21 volumele de anticorp şi transportor vor varia dependent de articulaţie, dar vor fi de aproximativ 0,5...10 ml, şi, de preferinţă, de la 1 la 5 ml, care sunt injectaţi într-un genunchi uman, şi, 23 de preferinţă, 1...2 ml într-o gleznă umană. în funcţie de modul de administrare intenţionat, anticorpul sau agentul terapeutic 25 poate exista în compoziţiile farmaceutice în forme de dozare solide, semisolide sau lichide, cum ar fi, de exemplu, comprimate, supozitoare, pilule, capsule, pulberi, lichide sau 27 suspensii, de preferinţă, într-o formă dozată, unitară, adecvată pentru administrarea unică a unei doze exacte. Compoziţiile vor include o cantitate eficace de substrat selectat în 29 combinaţie cu un transportor farmaceutic acceptabil şi, în plus, poate include alţi agenţi medicinali, agenţi farmaceutici, transportori sau diluanţi. Prin „farmaceutic acceptabil", se 31 înţelege un material care nu este indezirabil din punct de vedere biologic sau în alt mod, care poate fi administrat unui individ, împreună cu substratul selectat, fără a produce efecte 33 biologice indezirabile, semnificative, sau fără a interacţiona într-o manieră dăunătoare cu oricare alţi componenţi ai compoziţiei farmaceutice în care acesta este conţinut. 35
Compoziţiile adecvate pentru injecţie parenterală pot cuprinde dispersii, soluţii, suspensii sau emulsii apoase sau neapoase, fiziologic acceptabile, şi pulberi sterile pentru 37 a fi reconstituite în soluţii sau dispersii injectabile sterile. Exemple de transportori, diluanţi, solvenţi sau vehicule, apoşi sau neapoşi, adecvaţi includ apa, etanolul, poliolii 39 (propilenglicolul, polietilenglicolii, glicerolul şi altele asemenea), amestecuri adecvate ale acestora, uleiuri vegetale (cum ar fi uleiul de măsline) şi esteri organici injectabili, cum ar fi 41 oleatul de etil. Poate fi menţinută o fluiditate adecvată, de exemplu, prin utilizarea unui înveliş cum ar fi lecitina, prin menţinerea dimensiunii cerute a particulelor în cazul dispersiilor şi prin 43 utilizarea de surfactanţi. 27 RO 123525 Β1
Aceste compoziţii mai pot de asemenea să conţină adjuvanţi, cum ar fi agenţi de conservare, umectare, emulsifiere şi dispersare. Prevenirea acţiunii microorganismelor poate fi asigurată cu ajutorul diferiţilor agenţi antibacterieni şi antifungici, de exemplu, parabenii, clorbutanol, fenol, acid sorbic şi alţii asemenea. Poate fi de asemenea de dorit includerea agenţilor izotonici, de exemplu, zaharurile, clorura de sodiu şi altele asemenea. Absorbţia prelungită a formei farmaceutice injectabile poate fi obţinută prin utilizarea de agenţi care întârzie absorbţia, de exemplu, monostearatul de aluminiu şi gelatina.
Formele dozate solide pentru administrare orală includ capsulele, comprimatele, pilulele, pulberile şi granulele. în astfel de forme dozate, solide, compusul activ este amestecat cu cel puţin un excipient obişnuit (sau transportor), cum ar fi cifratul de sodiu sau fosfatul dicalcic, sau a. agenţi de umplere sau extindere, cum ar fi. de exemplu, amidonurile, lactoza, sucroza, glucoza, manitolul şi acidul silicic, b. lianţi, cum ar fi. de exemplu, carboximetilceluloza, alginaţii, gelatina, polivinilpirolidona, sucroza şi acacia, c. umectanţi, cum ar fi, de exemplu, glicerolul, d. dezintegranţi, cum ar fi, de exemplu, agar agarul, carbonatul de calciu, amidonul de cartof sau tapioca, acidul alginic, anumiţi silicaţi complexi, şi carbonat de sodiu, e. retardanţi de soluţie, cum ar fi, de exemplu, parafina, f. acceleratori de absorbţie, cum ar fi, de exemplu, compuşii de amoniu cuaternar, g. agenţi de umectare, cum ar fi, de exemplu, alcoolul cetilic şi monostearatul de glicerol, h. adsorbanţi, cum ar fi, de exemplu, caolinul şi bentonita, şi i. lubrifianţi, cum ar fi, de exemplu, talcul, stearatul de calciu, stearatul de magneziu, polietilenglicolii solizi, laurilsulfatul de sodiu sau amestecuri ale acestora. în cazul capsulelor, comprimatelor şi pilulelor, formele dozate mai pot cuprinde, de asemenea, agenţi de tamponare.
Compoziţiile solide de tip similar pot fi de asemenea utilizate ca agenţi de umplere în capsule de gelatină dure sau moi, utilizând excipienţi cum ar fi lactoza sau zahărul din lapte, la fel ca şi polietilenglicolii cu greutate moleculară mare, şi alţii asemenea.
Formele dozate solide, cum ar fi comprimatele, drajeurile, capsulele, pilulele şi granulele, se pot prepara cu învelişuri şi straturi de acoperire, cum ar fi învelişurile enterosolubile şi altele binecunoscute în domeniu. Acestea pot conţine agenţi de opacifiere şi pot avea astfel de compoziţii, încât să cedeze compusul sau compuşii activi într-o anumită parte a tractului intestinal, într-o manieră întârziată. Exemple de compoziţii de aglutinare, care se pot utiliza, sunt substanţele polimerice şi cerurile. Compuşii activi pot fi de asemenea într-o formă microîncapsulată, dacă este adecvat, împreună cu unul sau mai mulţi dintre excipienţii mai sus menţionaţi.
Formele dozate lichide, pentru administrare orală, includ emulsiile, soluţiile, suspensiile, siropurile, şi elixirurile farmaceutic acceptabile. în plus faţă de compuşii activi, formele dozate lichide mai pot conţine diluanţi inerţi, utilizaţi în mod obişnuit în domeniu, cum ar fi apa sau alţi solvenţi, agenţi de solubilizare şi emulgatori, cum ar fi, de exemplu, alcoolul etilic, alcoolul izopropilic, carbonatul de etil, acetatul de etil, alcoolul benzilic, benzoatul de benzii, propilenglicolul, 1,3-butilenglicolul, dimetilformamida, uleiurile, în special, uleiul din seminţe de bumbac, uleiul de arahide, uleiul de germeni de porumb, uleiul de măsline, uleiul de ricin şi uleiul de susan, glicerolul, alcoolul tetrahidrofurfurilic, polietilenglicolii şi esterii de acid gras ai sorbitanului sau amestecuri ale acestor substanţe, şi altele asemenea.
Pe lângă aceşti diluanţi inerţi, compoziţiile mai pot include adjuvanţi, cum ar fi agenţii de umectare, agenţii emulgatori şi de suspendare, agenţi de îndulcire, aromatizare şi parfumare. 28 RO 123525 Β1
Suspensiile, în plus faţă de compuşii activi mai pot conţine agenţi de suspendare, 1 cum ar fi, de exemplu, alcoolii izostearilici etoxilaţi, polioxietilen sorbitolul şi esterii de sorbitan, celuloza microcristalină, metahidroxidul de aluminiu, bentonita, agar agarul şi 3 tragacanta, sau amestecuri ale acestor substanţe, şi altele asemenea.
Compoziţiile pentru administrare rectală sunt, de preferinţă, supozitoare care se pot 5 prepara prin amestecarea compuşilor din invenţia de faţă cu excipienţi sau transportori neiritativi, adecvaţi, cum ar fi untul de cacao, polietilenglicolul sau o ceară de supozitor, care 7 sunt solizi la temperaturile obişnuite, dar lichide la temperatura corpului, şi de aceea, se topesc în cavitatea vaginală sau în rect şi cedează substanţa activă. 9
Formele de dozare pentru administrarea topică a unui compus din această invenţie includ unguentele, pudrele, spray-urile şi inhalantele. Componenta activă este amestecată 11 în condiţii sterile cu un transportor fiziologic acceptabil şi cu conservanţi, tampoane sau propulsori care pot fi necesari. Preparatele oftalmice, unguentele, pudrele şi soluţiile sunt de 13 asemenea considerate ca fiind în scopul acestei invenţii.
Termenul „săruri, esteri, amide şi prodroguri farmaceutic acceptabile", după cum se 15 utilizează aici, se referă la acele săruri carboxilat, săruri de adiţie acidă ale aminoacizilor, esteri, amide şi prodroguri ale compuşilor din invenţia de faţă care sunt adecvate, din punct 17 de vedere medical, pentru utilizare în contact cu ţesuturile pacienţilor, fără a prezenta un grad ridicat de toxicitate, răspuns alergic, iritaţie şi altele asemenea, corelate cu un raport 19 beneficiu/risc adecvat, şi eficace pentru utilizarea intenţionată, la fel ca şi formele amfionice, unde sunt posibile, ale compuşilor din invenţie. Termenul „săruri" se referă la sărurile de 21 adiţie acidă, anorganice şi organice, relativ netoxice, ale compuşilor din invenţia de faţă.
Aceste săruri pot fi preparate in situ în timpul izolării şi purificării finale a compuşilor sau prin 23 reacţia separată a compusului purificat în forma sa de bază liberă cu un acid organic sau anorganic şi izolarea sării astfel formate. Sărurile reprezentative includ bromhidratul, 25 clorhidratul, sulfatul, disulfatul, nitratul, acetatul, oxalatul, valeratul, oleatul, palmitatul, stearatul, lauratul, boratul, benzoatul, lactatul, fosfatul, tosilatul, citratul, maleatul, fumaratul, 27 succinatul, tartratul, naftilat mesilatul, glucoheptonatul, lactobionatul, metansulfonatul şi sărurile laurilsulfonat, şi altele asemănătoare. Acestea pot include cationi pe bază de metale 29 alcaline şi alcalinopământoase, cum ar fi sodiul, litiul, potasiul, calciul, magneziul şi altele semănătoare, la fel ca şi cationi de amoniu, de amoniu cuaternar şi aminici netoxici 31 incluzând, dar nelimitându-se la, amoniu, tetrametilamoniu, tetraetilamoniu, metilamină, dimetilamină, trimetilamină, trietilamină, etilamină şi altele asemănătoare, (vezi, de exemplu, 33 S.M. Barge et al., „Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 1977,66:1-19, care este încorporat aici prin referinţă.) 35
Termenul "prodrog" se referă la compuşi care sunt rapid transformaţi in vivo, pentru a produce compusul părinte cu formula de mai sus, de exemplu, prin hidroliză în sânge. O 37 discuţie pe larg este furnizată în T. Higuchi şi V. Stella, „Pro-drugs as Novei Delivery Systems", voi. 14 din Seriile Simpozionului A.C.S. (A.C.S. Symposium Series), şi în 39 Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, Societatea Farmaceutică Americană (American Pharmaceutical Association) şi Pergamon Press, 1987. 41 O celulă ţintă este o celulă de la un animal, incluzând în mod ilustrativ omul, primatele neumane, pisicile, câinii, şobolanul, şoarecele, cobaiul, iepurele, capra, oaia, vaca, calul, 43 puiul, porcul, maimuţele şi dihorii. 29 RO 123525 Β1 în plus, anticorpul sau agentul terapeutic din invenţia de faţă poate exista atât sub formă nesolvatată, cât şi solvatată, cu solvenţi farmaceutic acceptabili, cum a fi apa, etanolul şi alţii asemenea. în general, formele solvatate sunt considerate echivalente cu formele nesolvatate, pentru scopurile invenţiei de faţă.
Moleculele de anticorp sunt purificate prin tehnici cunoscute, incluzând în mod ilustrativ cromatografia de aminoabsorbţie sau de aminoafinitate, tehnicile cromatografice, cum ar fi cromatografia lichidă la presiune înaltă sau o combinaţie a acestora.
Un alt aspect al invenţiei de faţă include un produs farmaceutic pentru a fi utilizat la cedarea anticorpului receptorului anti-TRAIL biologic activ sau a anticorpului receptorului anti-TRAIL umanizat la un vertebrat. Produsul farmaceutic include o cantitate farmaceutic eficace, de fragment de anticorp al receptorului anti-TRAI L sau un fragment al acestuia, un transportor farmaceutic acceptabil şi un recipient care include transportorul şi anticorpul într-o manieră sterilă. într-o concretizare preferată a invenţiei, o cantitate farmaceutic eficace de anticorp din invenţie inhibă proliferarea celulară sau induce apoptoza în contact cu o celulă ţintă sau cu celule ţintă. O proporţie sau o cantitate farmaceutic eficace, de anticorp care recunoaşte fie DR5 fie DR4 sau un anticorp umanizat care recunoaşte fie DR5, fie DR4, este o proporţie administrată la un individ, suficientă pentru a produce efectul dorit. După cum se utilizează aici, termenii „proporţie farmaceutic eficace" şi „cantitate terapeutică" sunt sinonime. Efectele dorite ale administrării unei cantităţi farmaceutic acceptabile, de anticorpi care recunosc DR5 sau DR4, includ moartea uneia sau a mai multor celule ţintă, inhibiţia creşterii uneia sau a mai multor celule ţintă, stimularea DR5 sau, respectiv, a DR4, legarea la DR5 sau, respectiv, la DR4, şi niveluri sau activităţi crescute de NFkB la o celulă ţintă. O celulă ţintă este o celulă care exprimă DR5 sau DR4 şi pot fi incluse în mod ilustrativ celule care cresc anormal şi celule tumorale, cum ar fi papiloamele şi negii; cancerul de sân, cancerul de colon, hepatoamele, leucemiile, cancerul de plămân, melanomul, mieloamele, osteosarcoamele, cancerul ovarian, cancerul pancreatic, cancerul prostatic, cancerul gâtului şi capului, cancerul tiroidian, cancerul uterin, tumorile creierului, cum ar fi astrocitoamele, celulele imune activate (de exemplu, limfocitele activate, celulele limfoide şi mieloide), celulele inflamatorii, celulele sinoviale de artrită reumatoidă, şi celulele infectate viral. In vivo, celula ţintă este o celulă a unui individ cu o stare patologică, incluzându-i pe cei unde proliferarea celulară este anormală sau neregulată, cum ar fi cancerul malign sau benign şi artrita reumatoidă. într-o altă concretizare preferată, celula ţintă este de asemenea contactată de un agent terapeutic. Astfel, anticorpii şi compoziţiile din invenţia de faţă se pot administra singure sau în combinaţie cu unul sau mai mulţi agenţi terapeutici. Agenţii terapeutici includ, dar nu se limitează la alţi membri ai familiei TNF, agenţi chimioterapeutîci, anticorpi, agenţi antivirali, agenţi antiinflamatori steroidieni şi nesteroidieni, agenţi imunoterapeutici convenţionali, citokine, chemokine, şi/sau factori de creştere. Combinaţiile se pot administra fie concomitent (de exemplu, ca amestec), separat, dar simultan (de exemplu, prin linii intravenoase separate la acelaşi subiect), sau secvenţial (de exemplu, unul dintre compuşi sau agenţi este dat primul, urmat de al doilea). Astfel, termenul „combinaţie" sau „combinat" este utilizat pentru a desemna administrarea fie concomitentă, fie simultană, fie secvenţială a doi sau a mai mulţi agenţi. într-una dintre concretizări, terapia de combinaţie include administrarea membrilor familiei TNF. Moleculele de TNF, cele înrudite cu TNF şi cele asemănătoare cu TNF, care se pot administra cu anticorpul includ, dar nu se limitează la formele solubile ale TNF-a, 30 RO 123525 Β1 limfotoxină-α (LT-α, care mai este cunoscută ca TNF-β), LT-β (care se găseşte în 1 heterotrimerul complex Ι_Τ-α2-β) OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, 4-1BBL, DcR3, 0X40L, TNF-γ (WO 96/14328), TRAIL, ΑΙΜ-II (WO 97/34911), APRIL (J. Exp. Med. 3 188:1185-90, endokina-α (WO 98/07880), TR6 (WO 98/30694), OPG şi factorul de creştere a nervului (NGF), şi formele solubile ale Fas, CD30, CD27, CD40 şi 4-IBB, TR2 5 (WO 96/34095), DR3 (WO 97/33904), DR4 (WO 98/32856), TR5 (WO 98/30693), TRANK, TR9 (WO 98/56892), TRIO (WO 98/54202), 312C2 (WO 98/06842), şi TR12, şi formele 7 solubile ale CD154, CD70 şi CD153. într-o altă concretizare, anticorpul din invenţie se administrează în combinaţie cu 9 liganzi CD40, care aparîn mod natural, sintetici sau manipulaţi genetic (CD40L), incluzând, de exemplu, o formă solubilă a CD40L (de exemplu, AVREND), cu fragmente biologic active, 11 variante sau derivaţi ai CD40L, anticorpi CD40L (de exemplu, anticorpii agonişti sau antagonişti), şi/sau anticorpi CD40 (de exemplu, agonişti sau antagonişti). 13 într-o altă concretizare, anticorpul din invenţie este administratîn combinaţie cu unul, doi, trei, patru, cinci sau mai mulţi dintre următorii: tacrolimus (Fujisawa), talidomidă (de 15 exemplu, Celgene), anti Tac (Fv)-PE40 (de exemplu, Protein Design Labs), inolimomab (Biotest), MAK-195F (Knoll), ASM-981 (Novartis), receptorul interleukinei-1 (de exemplu, 17 Immunex), receptorul interleukinei-4 (de exemplu, Immunex), ICM3 (ICOS), BMS-188667 (Bristol Myers Squibb), Ab anti-TNF (de exemplu Therapeutic Antibodies), CG-1088 19 (Celgene), anticorpul monoclonal anti-B7 (de exemplu, Innogetics), MEDI-507 (BioTransplant), şi ABX-CBL (Abgenix). 21 în conformitate cu invenţia, anticorpul din invenţie se poate administra cu ligandul Fas (Fas-L) sau cu un anticorp Fas care leagă Fas şi traduce semnalul biologic care are ca 23 rezultat apoptoza. De preferinţă, anticorpii Fas utilizaţi în conformitate cu această metodă sunt anticorpi monoclonali. 25 în anumite concretizări, anticorpii din invenţie se administrează în combinaţie cu agenţi antiretrovirali, cu inhibitori nucleozidici ai revers transcriptazei, cu inhibitori 27 nonnucleozidici ai revers transcriptazei, şi/sau cu inhibitori proteazici. Inhibitorii nucleozidici ai revers transcriptazei, care se pot administra în combinaţie cu anticorpii din invenţie, includ, 29 dar nu se limitează la RETROVIR® (zidovudină/AZT) (Glaxo-Wellcome, Research Triangle Park, NC), VIDEX® (didanozină/ddl) (Bristol-Myers Squibb, New York), HMD® 31 (zalcitabină/ddC) (Roche, Nutley, NewJersey), ZERIT® (stavudină) (Bristol-Myers Squibb). Inhibitorii nonnucleozidici ai revers transcriptazei, care se pot administra în combinaţie cu 33 anticorpii din invenţie, includ, dar nu se limitează la VIRAMUNE® (nevirapină) (Boehringer Ingelheim/Roxanne, Columbus, Ohio), RESCRIPTOR® (delavirdină) (Pharmacia & Upjohn 35 Company, Kalamazoo, Michigan), şi SUSTIVA® (evafirenz) (Bristol-Myers Squibb).
Inhibitorii proteazici care se pot administra în combinaţie cu anticorpii din invenţie 37 includ, dar nu se limitează la CRIXIVAN® (indinavir sulfat) (Merck & Company, Whitehouse Station, NJ), NORVIR® (ritonavir) (Abbott Laboratories, Chicago, IL), INVIRASE® 39 (saquinavir) (Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ), şi VIRACEPT® (nelfinavir) (Agouron Pharmaceuticals, SanDiego, CA). într-una din concretizările specifice, agenţii antiretrovirali, 41 inhibitorii nucleozidici ai revers transcriptazei, inhibitorii nonnucleozidici ai revers transcriptazei, şi/sau inhibitorii proteazici se pot utiliza în orice combinaţie cu compoziţii ale 43 invenţiei, pentru a trata SIDA şi/sau pentru a preveni sau trata infecţia cu HIV. 31 RO 123525 Β1 în alte concretizări, anticorpul din invenţie se poate administra în combinaţie cu agenţi de infecţie antioportunişti. Agenţii antioportunişti, care se pot administra în combinaţie cu compoziţiile din invenţie, includ, dar nu se limitează la trimetoprim-pentamidină, sulfametoxazol, DAPSONE® (Jacobus Pharmaceuticals, Princeton, NJ), ATOVAQUONE® (Glaxo Smith Kline, Research Triangle Park, NC), ISONIAZID® (CIBA Pharmaceuticals, Summit, NJ), RIFADIN® (rifampină) (Hoechst-Marrion-Roussel, Kansas City, MO), PYRAZINAMIDE®(Ledelrle, Pearl River, NY), BIAXIN®(claritromicină) (Abbott Laboratories, Chicago, IL), ETHAMBUTOL® (Ledeirle, Peari River, NY), RIFABUTIN® (Pharmacia & Upjohn Company, Kalamazoo, Ml), AZITHROMYCIN® (Pfizer Inc., New York, NY), GANCICLOVIR® (Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ), FOSCARNET® (Astra, Westborough, MA), CIDOFOVIR® (Gilead Sciences, FosterCity, CA), KETOCONAZOLE® (Janssen, Titusville, NJ), FLUCONAZOLE® (Pfizer Inc., New York, NY), ITRACONAZOLE® (Janssen, Titusviile, NJ), ACYCLOVIR® (Glaxo-Welfcome, Research Triangle Park, NC), FAMCICOLCIR® (SmithKline Beecham Pharmaceuticals, Pittsburgh, PA), pirimetamina, leucovorina, NEUPOGEN® (filgrastim/GM-CSF) (Amgen, Thousand Oaks, CA), şi LEUKINE® (sargramostim/GM-CSF) (Immunex, Seattle, WA). într-o concretizare specifică, anticorpul din invenţie se utilizează în orice combinaţie cu trimetoprim-sulfametoxazol şi/sau cu atovaquonă, dapsonă, pentamidină, pentru a trata profilactic şi/sau pentru a preveni o infecţie oportunistă a plămânilor cu Pneumocystis carinii. într-o altă concretizare specifică, anticorpul din invenţie se utilizează în orice combinaţie cu izoniazidă, RIFADIN® (Merrel Dow Pharmaceuticals, Cincinnati, Ohio), pirazinamidă, şi/sau etambutol pentru a trata profilactic şi/sau a preveni o infecţie oportunistă complexă cu Mycobacterium avium. într-o altă concretizare specifică, anticorpul din invenţie se utilizează în orice combinaţie cu rifabutină, claritromicină, şi/sau azitromicină pentru a trata profilactic şi/sau a preveni o infecţie oportunistă cu Mycobacterium tuberculosis. într-o altă concretizare specifică, anticorpul din invenţie se utilizează în orice combinaţie cu ganciclovir, foscarnet şi/sau cidofovir, pentru a trata profilactic şi/sau a preveni o infecţie oportunistă cu citomegalovirus. într-o altă concretizare specifică, anticorpul din invenţie se utilizează în orice combinaţie cu fluconazol, traconazol, şi/sau ketoconazol, pentru a trata profilactic şi/sau pentru a preveni o infecţie oportunistă cu fungi. într-o altă concretizare specifică, anticorpul din invenţie se utilizează în combinaţie cu aciclovir şi/sau famciclovir, pentru a trata profilactic şi/sau pentru a preveni o infecţie oportunistă cu virus herpes simplex de tip I şi/sau de tip II. într-o altă concretizare specifică, anticorpul din invenţie se utilizează în orice combinaţie cu pirimetamină şi/sau cu leucovorină, pentru a trata profilactic şi/sau pentru a preveni o infecţie oportunistă cu Toxoplasma gondii. într-o altă concretizare specifică, anticorpul din invenţie se utilizează în orice combinaţie cu leucovorină şi/sau cu NEUPOGEN® (Amgen, Thousand Oaks, CA), pentru a trata profilactic şi/sau pentru a preveni o infecţie oportunistă bacteriană. într-o concretizare suplimentară, anticorpul din invenţie se administrează în combinaţie cu un agent antiviral. Agenţii antivirali care se pot administra includ, dar nu se limitează la aciclovir, ribavirină, amantadină şi remantidină. într-o concretizare suplimentară, anticorpul din invenţie se administrează în combinaţie cu un agent antibacterian. Agenţii antibacterieni care se pot administra cu compoziţia din invenţie includ, dar nu se limitează la amoxicilină, aminoglicozide, betalactame (glicopeptide), betalactamaze, clindamicină, cloramfenicol, cefalosporine, ciprofloxacină, 32 RO 123525 Β1 eritromicină, flurochinolone, macrolide, metronidazol, peniciline, chinolone, ritempină, 1 streptomicină, sulfonamidă, tetracicline, trimetoprim, trimetoprim-sulfametoxazol şi vancomicină. 3
Agenţii imunosupresivi, nespecifici, convenţionali, care se pot administra în combinaţie cu anticorpul din invenţie includ, dar nu se limitează la steroizi, ciclosporină, 5 analogi de ciclosporină, ciclofosfamidă, metilprednisonă, prednisonă, azatioprină, FK-506 (Fujisawa Pharmaceuticals, Deerfield, IL), 15-deoxispergualină, şi alţi agenţi imunosupresivi 7 care acţionează prin deprimarea funcţiei de răspuns a celulelor imunitare (incluzând, de exemplu, celulele T), direct (de exemplu, prin acţiunea asupra celulei imunitare) sau indirect 9 (prin acţiunea asupra altor celule mediatoare). în concretizări specifice, anticorpul din invenţie se administrează în combinaţie cu 11 agenţi imunodepresivi. Preparatele imunodepresive care se pot administra în combinaţie cu anticorpul din invenţie includ, dar nu se limitează la ORTHOCLONE® (OKT3) (Ortho Biotech, 13 Raritan, NJ), SANDIMMUNE®ORAL(ciclosporină) (Sandoz Pharmaceuticals, Hanover, NJ), PROGRAF® (tacrolimus) (Fujisawa Pharmaceuticals, Deerfield, IL), CELLCEPT® 15 (micofenolat) (Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ), azatioprină, glucosteroizi, şi RAPAMUNE® (sirolimus) (Wyeth, Collegeville, PA). într-o concretizare specifică, imuno- 17 deprimanţii se pot utiliza în combinaţie cu anticorpul pentru a preveni respingerea transplantului de organ sau de măduvă osoasă. 19 într-o concretizare suplimentară, anticorpul din invenţie se administrează singur sau în combinaţie cu unul sau mai multe preparate intravenoase de imunoglobulină. Preparatele 21 intravenoase de imunoglobulină, care se pot administra cu anticorpul din invenţie, includ, dar nu se limitează la GAMMARE® (Centeon, Kankakee, IL), IVEEGAM® (Immuno-US Inc., 23 Rochester, Ml), SANDOGLOBULFN® (Sandoz Pharmaceuticals, Hanover, NJ), GAMMAGARD® (Baxter Healthcare, Glendale, CA), şiGAMIMUNE®(BayerBiological, West 25 Haven, CT). într-o concretizare specifică, anticorpul din invenţie se administrează în combinaţie cu preparate de imunoglobulină intravenoase în terapia de transplant (de 27 exemplu, transplant de măduvă osoasă). într-o concretizare suplimentară, anticorpul din invenţie se administrează singur sau 29 în combinaţie cu un agent antiinflamator. Agenţii antiinflamatori care se pot administra cu compoziţiile din invenţie includ, dar nu se limitează la glucocorticoizi şi agenţi antiinflamatori 31 nesteroidieni, derivaţi de acizi aminoarilcarboxilici, derivaţi de acid arilacetic, derivaţi de acid arilbutiric, acizi arilcarboxilici, derivaţi de acizi arilpropionic, pirazoli, pirazolone, derivaţi de 33 acid salicilic, tiazincarboxamide, acid e-acetamidocaproic, S-adenozilmetionină, acid 3-amino-4-hidroxibutiric, amixetrina, bendazac, benzidiamină, bucolomă, difenpiramidă, ditazol, 35 emorfazonă, guaiazulenă, nabumetonă, nimesulidă, orgoteină, oxaceprol, paranilină, perisoxal, pifoximă, proquazonă, proxazol şi tenidap. 37 într-una dintre concretizări, anticorpul din invenţie se administrează în combinaţie cu o terapie steroidică. Steroizii care se pot administra în combinaţie includ metilprednisolona 39 (de exemplu, IV metilprednisolona). într-o concretizare specifică, anticorpul din invenţie se administrează în combinaţie cu prednisonă. într-o concretizare suplimentară specifică, anti- 41 corpul din invenţie se administrează în combinaţie cu prednisonă şi cu un agent imunodepre-siv. Agenţii imunodepresivi care se pot administra cu prednisonă sunt cei descrişi aici, şi 43 includ, dar nu se limitează la azatioprină, ciclofosfamidă, şi ciclofosfamidă IV. într-o concretizare specifică, anticorpul din invenţie se administrează în combinaţie cu metilprednisolona. 45 33 RO 123525 Β1 într-o concretizare suplimentară specifică, anticorpul din invenţie se administrează în combinaţie cu metilprednisolona şi un agent imunodepresiv. Agenţii imunodepresivi care se pot administra cu metilprednisolona sunt cei descrişi aici, şi includ, dar nu se limitează la azatioprină, ciclofosfamidă, şi ciclofosfamidă IV. într-o altă concretizare, anticorpul din invenţie se administrează în combinaţie cu un antimalaric. Antimalaricii care se pot administra cu compoziţiile din invenţie includ, dar nu se limitează la hidroxiclorochină, clorochină şi/sau chinacrină. într-o altă concretizare suplimentară, anticorpul din invenţie se administrează în combinaţie cu un AINS. Opţional, anticorpul din invenţie se administrează în combinaţie cu unul, două, trei, patru, cinci, zece sau mai multe dintre următoarele medicamente: NRD-101 (Hoechst Marion Roussel, Kansas City, MO), Diclofenac, (Dimethaid, Ontario, CN), Oxaprozin potasic (Monsanto), Mecasermină (Chiron, Emeryville, CA), T-614 (Toyama), Premefrexed disodic (Eli Lilly, Indianapolis, IN), Atreleuton (Abbott, Cicago, IL), Valdecoxib (Monsanto), Eltenac(Byk Gulden, Melville, NY), Campat, AGM-1470 (Takeda, Lincolnshire, IL), CDP-571 (Celltech, Rochester, NY), CM-101 (CarboMed, Nashville, TN), ML-3000 (Merck), CB-2431 (KS Biomedix, Surrey, UK), CBF, BS2 (KS Biomedix, Surrey, UK), terapia cu gena IL-Ira (Valentis, Burligame, CA), JTE-522 (Japan Tobacco, Tokyo, Japonia), Paclitaxel (Angiotech, Vancouver, BC), DW-166HC (Dong Wha, Seul, Coreea), Darbufelonă mesilat (Pfizer Inc., New York, NY), Receptorul TNF solubil 1 (sinergen; Amgen, Thousand Oaks, CA), IPR 6001 (Institutul de Cercetări Farmaceutice, Institute for Pharmaceutical Research), Trocade (Hoffman-La Roche, Nutley, NU), EF5 (Scoţia Pharmaceuticals), BIIL-284(Boehringerlngelheim, Ridgefield, CT), BIIF-1149(Boeringerlngelheim, Ridgefield, CT), LEUKOVAX® (Inflammatics, Malvern, PA), MK-663 (Merck, Whitehouse Station, NJ), ST-1482 (Sigma-Tau, Gaithersburg, MD), şi Propionat de butixocort (Pfizer Inc., New York, NY). într-o altă concretizare, anticorpul din invenţie se administrează în combinaţie cu unul sau mai multe DMARD-uri. Astfel, se pot utiliza unul, două, trei, patru, cinci sau mai multe dintre următoarele medicamente: metotrexat, leflunomidă, edatrexat, epiroprim, iometrexol, piritrexim, trimetrexat, brodimoprim, MX-68, acid N-[4-[3-(2,4-diamino-6,7-dihidro-5H-ciclopenta[d]-pirimidin-5-il)propil]benzoil]-L-glutamic, acid N-[[5-[2-(2-amino-1,4,5,6,7,8-hexahidro-4-oxipirirido[2,3-d]-pirimidin-6-il)etil]-2-tienil]carbonil]-L-glutamic, acid(R)N-[[5-[2-(2-amino-1,4,5,6,7,8-hexahidro-4-oxopirido[2,3-d]-pirimidin-6-il)etil]-2-tienil]-carbonil]L-glutamic, acid N-((2,4-diamino-3,4,5,6,7,8-hexahidropirido[2,3-d]-pirimidin-6-il)etil)-2-tienilcarbonil-L-glutamic, acid (S)-2-[[[4-carboxi-4-[[4-[[2,4-diamino-6-pteridinil)metil]amino]benzoil]-amino]butil]amino]carbonil]benzoic, acid N-[4-[3-(2,4-diamino-1 H-pirolo[2,3-d]pirimidin-5-il)propil]benzoil]-L-glutamic, 2,4-diamino-6-(N-(4-(fenilsulfonil)benzil)metilamino)chinazolină, 2,4-diamino-5-[4-[3-(4-aminofenil-4-sulfonilfenilamino)propoxi]-3,5-dimetoxibenzilpirimidina, acid N-[4-[4-(2,4-diamino-5-pirimidinil)butil]benzoil-L-glutamic, acid N-[4-[3-(2,4-diamino-5-pirimidinil)propil]benzoil-L-glutamic, acid N-[4-[2-(2,4-diamino-6-pteridinil)etil] benzoil-4-metilen-DL-glutamic, şi clorhidratul diamidei N-(1-metiletil-N'[3-(2,4,5-triclorfenoxi)propoxi]-imidocarbonimidice (PS15), sulfasalazina, aurotiomalatul de sodiu, auranofina, ciclosporina, penicilamina, azatioprina, un medicament antimalaric (de exemplu, cum este descris aici), ciclofosfamidă, clorambucilul, aurul, Enbrel (etanercept) (Wyeth-Ayerst Laboratories, Philadelphia, PA), anticorpul anti TNF, şi prednisolona. într-o concretizare mai preferată, anticorpul din invenţie se administrează în combinaţie cu un antimalaric, metotrexat, anti-TNF, Enbrel şi/sau sulfasalazina. 34 RO 123525 Β1 într-o concretizare, anticorpul din invenţie se administrează în combinaţie cu 1 metotrexatul. într-o altă concretizare, anticorpul din invenţie se administrează în combinaţie cu anticorpul anti-TNF. într-o altă concretizare, anticorpul din invenţie se administrează în 3 combinaţie cu metotrexatul şi cu anticorpul anti-TNF sau cu anticorpul anti-Fas. într-o altă concretizare, anticorpul din invenţie se administrează în combinaţie cu sulfasalazina. într-o 5 altă concretizare specifică, anticorpul din invenţie se administrează în combinaţie cu metotrexatul, cu anticorpul anti-TNF, cu anticorpul anti-Fas şi cu sulfasalazina. într-o altă 7 concretizare, anticorpul din invenţie se administrează în combinaţie cu Enbrel. într-o altă concretizare, anticorpul din invenţie se administrează în combinaţie cu Enbrel şi metotrexat. 9 într-o altă concretizare, anticorpul din invenţie se administrează în combinaţie cu Enbrel, metotrexat, sulfasalazina, leflunomidă, etroricoxib, misoprostol/diclofenac sodic, valdecoxib, 11 tiracoxib, rofecoxib, celecoxib, galantamină, darbufelonă mesilat, aceclofenac, ML-3000, anakinra, hialuronat sodic, nimesulid, micofenolat mofetil, diacerein, sivelest sodic, deflazacort, 13 nalmefen clorhidrat, lexidronam de samariu-153 pentasodic, pentostatină, T-614, amipriloză clorhidrat, rocepafant, ampiroxicam, prednisolonă famesilat, meloxicam, diclofenac sodic, 15 lomoxicam, salazosulfapiridină, etodolac, flupirtină maleat, ebselen, tacrolimus hidrat, nabumetonă, cloprednol, piroxicam cinamat, proquazonă, rimexolonă, fenretinidă, imidazol 17 hidroxibenzoat, droxicam, fentiazac, alfacalcidol, diacetat de halopredonă, clorhidrat de gusperimus, inozină pranobex, actarit, indometacin farnesil, mizoribină, acid tolfenamic, 19 diflunisal, piroxicam, oxaprozin, hialuronat sodic, bucilamină, ciclosporină, floctafenină, tenoxicam, palmitat de dexametazonă, amfenac sodic, acemetacină, auranofină, lobenzarit 21 disodic, sau orice combinaţie a acestora. într-o altă concretizare, anticorpul din invenţie este administratîn combinaţie cu Enbrel, 23 metotrexat şi sulfasalazină. în alte concretizări, unul sau mai mulţi agenţi antimalarici sunt combinaţi cu una dintre combinaţiile citate mai sus. într-o concretizare particulară, anticorpul 25 din invenţie se administrează în combinaţie cu un antimalaric (de exemplu, hidroxiclorochină),
Enbrel, metotrexat şi sulfasalazină. într-o altă concretizare specifică, anticorpul din invenţie 27 se administrează în combinaţie cu un antimalaric (de exemplu, hidroxiclorochină), sulfasalazină, anticorp anti-TNF şi metotrexat. 29 într-o altă concretizare, anticorpul din invenţie este administratîn combinaţie cu un agent chemoterapeutic. Agenţii chemoterapeutici care se pot administra cu compoziţiile din 31 invenţie includ, dar nu se limitează la derivaţi antibiotici (de exemplu, doxorubicina, bleomicina, daunorubicina şi dactinomicina); antiestrogeni (de exemplu, tamoxifenul); antimetaboliţi (de 33 exemplu, fluorouracilul, 5-FU, metotrexatul, floxuridina, interferonul alfa-2B, acidul glutamic, plicamicina, mercaptopurinaşi6-tioguanina); agenţi citotoxici (deexemplu, carmustina, BCNU, 35 lomustina, CCNU, citozina arabinozidă, ciclofosfamida, estramustina, hidroxiureea, procarbazina, mitomicina, busulfanul, cisplatinul şi sulfat de vincristină); hormoni (de exemplu, 37 medroxiprogesterona, fosfat sodic de estramustină, etinil estradiolul, estradiolul, acetat de megestrol, metiltestosteronul, difosfatul de dietilstilbestrol, clortrianisenul şi testolactona); 39 derivaţii azotaţi din muştar (de exemplu, mefalen, clorambucil, mecloretamină (azotat din muştar) şi tiotepa); steroizi şi combinaţii (de exemplu, fosfat sodic de betametazonă); şi alţii 41 (de exemplu, dicarbazină, asparaginază, mitotant, sulfat de vincristină, sulfat de vinblastină, şi etoposidă). Alţi agenţi chemoterapeutici includ, de exemplu, CPT-11, deflunomida, 43 cicloheximida, şi mitomicina. 35 RO 123525 Β1 într-o concretizare specifică, anticorpul din invenţie este administratîn combinaţie cu CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina şi prednisonă) sau cu orice combinaţie de componente ale CHOP. într-o altă concretizare, anticorpul din invenţie este administrat în combinaţie cu rituximab. într-o concretizare suplimentară, anticorpul din invenţie este administrat în combinaţie cu rituximab şi CHOP sau cu rituxmab şi orice combinaţie a componentelor CHOP. într-o concretizare suplimentară, anticorpul din invenţie este administratîn combinaţie cu citokine. Citokinele care se pot administra cu compoziţiile din invenţie includ, dar nu se limitează la GM-CSF, G-CSF, IL-lalfa, I L-l beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, anti-CD40, CD40L, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, TNF-alfa, şi TNF-beta. într-o concretizare suplimentară, anticorpul din invenţie este administratîn combinaţie cu factori de creştere hematopoietică. Factorii de creştere hematopoietică care se pot administra cu compoziţiile din invenţie includ, dar nu se limitează la LEUKINE® (sargramostim) şi NEUPOGEN® (filgrast). în concretizări suplimentare, anticorpul din invenţie este administratîn combinaţie cu unul sau mai multe regimuri terapeutice sau profilactice, cum ar fi, de exemplu, terapia cu radiaţii.
După cum se utilizează peste tot, un „agent terapeutic" este un compus sau o compoziţie eficace în ameliorarea unei stări patologice. Exemple ilustrative de agent terapeutic includ un compus anticanceros, membri ai familiei TNF, agenţi antiinflamatori, agenţi antivirali, agenţi antiretrovirali, agenţi antioportunişti, antibiotice, agenţi imuno-depresivi, imunoglobuline, agenţi antimalarici, medicamente antireumatice care modifică boala (DMARD-uri), citokine, chemokine, factori de creştere, şi anticorpi secundari care promovează apoptoza celulelor ţintă.
Un compus anticancerigen sau un agent chemoterapeutic este un compus sau o compoziţie care este eficace în inhibarea sau stoparea creşterii celulelor cu creştere anormală. De aceea, un astfel de agent poate fi utilizat din punct de vedere terapeutic, pentru a trata cancerul, la fel ca şi alte boli caracterizate de creşterea anormală a celulelor. O cantitate farmaceutic eficace de compus anticancerigen este o cantitate administrată la un individ, suficientă pentru a produce inhibiţia sau stoparea creşterii anormale a celulelor. Exemple ilustrative de compuşi anticancerigeni includ: bleomicina, carboplatinul, clorambucilul, cisplatinul, colchicina, ciclofosfamida, daunorubicina, dactinomicina, dietilstilbestrolul, doxorubicina, etoposida, 5-fluoruracilul, floxuridina, melfalanul, metotrexatul, mitomicina, 6-mercaptopurina, teniposida, 6-tioguanina, vincristina şi vinblastina. Exemple suplimentare de compuşi anticancerigeni şi agenţi terapeutici se găsesc în The Merck Manual of Diagnosis and Therapy (Manualul Merck de diagnoză şi terapie), ediţia a 15-a, editori Berkow et al., 1987, Rahway, N. J. şi Sladek et al., Metabolism and Action of Anti-Cancer Drugs (Metabolismul şi acţiunea medicamentelor anticanceroase), 1987, editori Powis et al., Taylorşi Francis, New York, N. Y.
Anticorpii din invenţia de faţă se mai pot combina cu alte terapii, cum ar fi chemoterapia şi/sau radioterapia, în tratamentul malignităţii, şi eficacitatea terapeutică poate fi îmbunătăţită cu ajutorul compuşilor inductori ai apoptozei, cum arfi bisindolilmaleimida VIII (BisVIII) sau alţi agenţi sensibilizatori, cum arfi SN-50 sau LY294002. Astfel, într-una dintre concretizări, anticorpul sau anticorpii din invenţia de faţă se pot combina cu BisVIII sau cu 36 RO 123525 Β1 alt agent sensibilizator şi cu un agent chemoterapeutic (de exemplu, Adriamicina, Etoposida, 1 Topetecanul, Taxoterul sau Paclitaxelul). într-o altă concretizare, anticorpul sau anticorpii din invenţia de faţă se pot combina cu un medicament antiinflamator nesteroidian (de exemplu, 3 sulindac sulfura au alţi inhibitori COX-1 sau COCS-2), cu un agent chemoterapeutic (de exemplu, Adriamicina, Etoposida, Topetecanul, Taxoterul sau Paclitaxelul). în tratamentul 5 altor boli, de exemplu, bolile autoimune şi antiinflamatorii, se mai pot utiliza şi combinaţii de tratamente. De exemplu, un anticorp se poate administra în combinaţie cu alţi agenţi 7 terapeutici, cum arfi afenţii antiinflamatorî, DMARD-uri, agenţi chemoterapeutici, metotrexat, bisindolilmaleimida VIII sau alţi agenţi sensibilizatori şi alţii asemenea. Radioterapia poate 9 fi de asemenea combinată cu alţi agenţi terapeutici în tratamentul bolilor inflamatorii şi autoimune. Cineva cu calificare în domeniu va adapta forma de radioterapie la boala inflamatorie 11 sau autoimună specifică (de exemplu, sinovectomia prin iradiere, în tratamentul artritei).
Terapia care utilizează un anticorp din invenţia de faţă poate fi de asemenea 13 combinată cu terapia care utilizează alt anticorp. De exemplu, anticorpul faţă de DR5 poate fi administrat unui subiect care are nevoie de acesta, împreună cu, înainte de sau consecutiv 15 administrării unui anticorp faţă de DR4, TNF, B7, ligand CD40, CD40, CD20 (de exemplu, rituximab), Fas sau o combinaţie a acestora. O asemenea terapie cu anticorpi combinată 17 poate fi suplimentar combinată cu administrarea unuia sau cu a mai multor agenţi terapeutici (de exemplu, chemoterapeutici, doxorubicină, şi/sau metotrexat), radioterapie sau ambele. 19
Astfel, invenţia furnizează o metodă de inducţie selectivă a apoptozei sau de inhibiţie a proliferării în celulele ţintă care exprimă DR5, cuprinzând etapele de: a. punere în contact 21 a celulelor ţintă cu o cantitate terapeutică de anticorp care leagă specific un receptor DR5 TRAIL, în care anticorpul menţionat, în forma sa solubilă, are activitate de inducţie a 23 apoptozei in vivo şi in vitro, a celulelor ţintă care exprimă DR5, şi b. punerea în contact a celulelor ţintă cu o cantitate terapeutică dintr-unul sau mai mulţi agenţi terapeutici. într-una 25 dintre concretizări, una sau ambele etape de punere în contact se realizează opţional in vivo. într-o altă concretizare, una sau ambele etape de punere în contact se realizează opţional 27 in vitro. Celulele ţintă pot fi selectate din celule care prezintă dereglări ale sistemului de apoptoză, neutrofile, limfocite activate sau alte celule imunitare activate (de exemplu, celule 29 limfoide şi mieloide), celule infectate viral şi celule sinoviale care proliferează anormal (de exemplu, celule sinoviale de poliartrită reumatoidă, incluzând celule inflamatorii sinoviale, 31 celule mieloide şi limfoide activate în sinoviu, sinoviocite asemănătoare macrofagelor, şi sinoviocite asemănătoare cu fibroblaştii) ale bolilor autoimune. Comparativ cu anticorpul anti- 33 DR5 publicat anterior (T. S. Griffith, C. T. Rauch, P. J. Smolak, J. Y. Waugh, N. Boiani, D. H. Lynch, C. A. Smith, R. G. Goodwin, Μ. Z. Kubin, J. Immunology, 1999,162: 2597-2605), 35 activitatea inductoare a apoptozei anticorpului demonstrativ TRA-8 din invenţia de faţă este foarte puternică şi este capabilă de a induce apoptoză celulelor Jurkat, la niveluri de pg/ml 37 in vitro şi demonstrează o activitate tumoricidă in vivo superioară, comparativ cu TRAIL solubil raportat anterior. Administrarea intravenoasă a unei doze unice de TRA-8 este 39 suficientă pentru a inhiba creşterea atât a celulelor de tumori solide, cât şi a celulelor de tumori hematopoietice, în timp ce inducţia regresiei tumorale in vivo cu TRAIL solubil 41 necesită o doză mult mai mare (500 pg în fiecare zi, timp de 10 zile). Anticorpii receptorilor anti-TRAIL din invenţia de faţă apar a fi la fel de siguri ca şi TRAIL solubil, deoarece 43 anticorpul exemplar TRA-8 nu induce apoptoză celulelor fîbroblasfice netransformate. Rezultate similare au fost observate cu anticorpii DR4. 45 37 RO 123525 Β1
Vectorii invenţiei de faţă includ o secvenţă de acid nucleic care codifică o imunoglobulină cu lanţ greu sau uşor, a unui anticorp DR5 sau DR4 care este legat în mod operabil la un element reglator, cum ar fi un promotor sau un amplificator. Termenul „legat în mod operabil·' se referă la un aranjament de secvenţe de nucleotide, configurat astfel încât acestea să îşi realizeze funcţia lor obişnuită. Astfel, un element reglator, legat în mod operabil la o secvenţă de nucleotide care codifică o polipeptidă, este capabil de a direcţiona transcripţia, replicarea şi/sau translaţia polipeptidei. Cei cu calificare în domeniu vor recunoaşte că un vector unic va include opţional secvenţe de codificare atât pentru imunoglobulină cu lanţ greu, cât şi pentru cea cu lanţ uşor ale unui anticorp DR5 sau DR4. într-una dintre concretizări, vectorii codifică imunoglobuline umanizate cu lanţ greu sau uşor.
Exemplele care urmează sunt expuse mai jos, pentru a ilustra metodele şi rezultatele conforme cu invenţia de faţă. Aceste exemple nu se intenţionează să includă toate aspectele invenţiei de faţă, ci mai degrabă să ilustreze metodele şi rezultatele reprezentative. Exemplele nu se intenţionează să excludă echivalentele şi variantele invenţiei de faţă, care sunt uşor de recunoscut pentru cineva cu calificare în domeniu.
Exemplul 1. Prepararea antigenului DR5 1.1. donarea cADN al DR5 ADN-ul care codifică proteina umană DR5, este donat prin următoarea metodă RT-PCR, utilizând: a. Matriţa ARN total din celulele HeLa este extras, utilizând reactivul TRIzol (GIBCO BRL). Matriţa pentru cADN-ul utilizat în reacţia PCR, care se obţine prin utilizarea trusei de sinteză a cADN-ului First-Strand (Amersham Pharmacia Biotech), în conformitate cu manualul de instrucţiuni furnizat cu trusa.
b. Primeri PCR
Se sintetizează pentru PCR următorii primeri oligonucleotidici: 5'-gacgatgcccgatctactttaaggg-3' (DR5p1: SECV. ID. Nr. 1); 5'-ccactgggtgatgttggatggg-3' (DR5p2: SECV. ID. Nr. 2);
Dacă nu se specifică altceva, toate oligonucleotidele din aceste exemple sunt sintetizate de către Lifetechnologies. Toate nucleotidele sunt depozitate la -20°C, după ce au fost dizolvate în apă distilată.
c. Reacţia PCR j
Compoziţia soluţiei de reacţie: - matriţa cADN 5 μΙ din totalul de 33 μΙ al reacţiei; - primerul DR5p1 10 pmoli; - primerul DR5p2 10 pmoli; - tampon PCR concentrat de 10x (furnizat cu trusa) 10 μΙ; - dNTP-uri (fiecare 2,5 mM) 4 μΙ, şi - polimerază Taq (Promega) 5 unităţi.
Se adaugă, la soluţie, apă distilată sterilă, la un volum total de 100 μΙ. Dacă nu se specifică altceva, dNTP-urile sunt un amestec echimolar de dATP, dCTP, dGTP şi dTTP (2,5 mM fiecare). 38 RO 123525 Β1
Reacţia PCR este dirijată după cum urmează. Soluţia este întâi încălzită la 94°C, timp 1 de 2 min, după care un ciclu de încălzire la 94°C, timp de 30 s, la 52°C, timp de 1 min, şi la 72°C, timp de 3 min, se repetă de 40 de ori. După terminarea acestei proceduri, soluţia de 3 reacţie se încălzeşte la 72°C, timp de 10 min.
Fragmentele de ADN amplificate, astfel obţinute, se separă pe un gel de agaroză 1 %, 5 care conţine 0,25 pg/ml bromură de etidiu. Benzile determinate a conţine fragmentele de ADN dorite sunt tăiate, utilizând o lamă de ras, iar ADN-ul este recuperat din acestea, 7 utilizând trusa Gene Clean (BIO101). Fragmentul de ADN este donat, utilizând trusa de donare TA Cloning (Invitrogen, CA). Aceasta se realizează după cum urmează. 9
Fragmentul de ADN recuperat din soluţia reacţiei PCR, împreună cu 50 ng de vedor pCR2.1, care este furnizat cu ajutorul trusei de donare TA Cloning, se amestecă cu 1 μΙ de 11 tampon de reacţie a ligazei 10X (6 mM Tris-HCI (pH 7,5), 6 mM clorură de magneziu, 5 rtiM clorură de sodiu, 7 mM β-mercaptoetanol, 0,1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM spermidină, şi 13 0,1 mg/ml albumină serică bovină), la care au fost adăugate 4 unităţi de ADN ligază T4 (1 μΙ). Volumul total al amestecului este ajustat, la 10 μΙ, cu apă deionizată sterilă, iar soluţia de 15 ligază rezultată este incubată la 14°C, timp de 15 h. După acest timp, 2 μΙ de soluţie din reacţia ligazei se adaugă la 50 μΙ de tulpină TOP1 OF' competentă de E. coli, care este adusă 17 în reacţie cu ajutorul trusei de donare TA, şi este adusă la starea de competenţă în acord cu manualul de instrucţiuni, la care s-au adăugat 2 μΙ de 0,5 M β-mercaptoetanol, iar 19 amestecul rezultat se menţine pe gheaţă, timp de 30 min, apoi la 42°C, timp de 30 s şi din nou pe gheaţă, timp de 5 min. în etapa următoare, se adaugă în cultură 500 μΙ de mediu care 21 conţine 2% v/v triptonă, 0,5/gr/v extract de drojdie, 0,05% gr/v clorură de sodiu, 2,5 mM clorură de potasiu, 1 mM clorură de magneziu, şi 20 mM glucoză (la care se va face referire 23 în continuare ca mediu „SOC"), iar amestecul se incubează timp de o oră la 37°C, cu agitare.
După acest timp, cultura este împrăştiată pe o placă de agar cu bulion L (1% v/v triptonă, 25 0,5% gr/v extract de drojdie, 0,5% gr/v clorură de sodiu, 0,1% gr/v glucoză, şi 0,6% gr/v bacto-agar (Difco)), conţinând 100 pg/ml. Coloniile rezistente la ampicilină, care apar pe 27 placă, sunt selecţionate şi îndepărtate prin răzuire cu o ansă de transfer din platină şi sunt cultivate pe un mediu de bulion L care conţine 100 pg/ml ampicilină la 37°C, peste noapte, 29 agitând la 200 rpm. După incubare, celulele sunt recoltate prin centrifugare, din care se prepară plasmidul ADN, prin metoda alcalină. Fragmentul EcoRI-EcoRI DR5cADN, din 31 plasmida astfel obţinută, este subclonat în plasmida pcADN3 (Invitrogen, CA). întreaga lungime a genei DR5 din pcADN3 este secvenţiată şi se potriveşte cu secvenţa publicată. 33 Plasmida astfel obţinută este desemnată ca plasmida pcADN3-DR5. 1.2. Construirea vectorului de expresie a DR5-lgG 35
Pentru a obţine o formă solubilă a DR5 uman fără domeniul transmembranar, se construieşte un vector plasmidian de expresie. Acest vector este desemnat să codifice o 37 proteină de fuziune care conţine domeniul extracelular al DR5 uman, fuzionat cu ADN Fc lgG1 (J. Chengetal., 1994, Science, 263,1759-1762). ADN-ul care codifică DR5 uman fără 39 domeniul transmembranar, se obţine prin reacţia PCR care urmează. a. Matriţa 41
Matriţa pentru reacţia PCR a utilizat pcADN3-DR5. b. Primeri PCR 43
Se sintetizează pentru PCR următorii primeri de oligonucleotide: 5'-gacgatgcccgatctactttaaggg-3' (DR5p1: SECV ID nr. 1). 45 39 RO 123525 Β1 5'-ggatccgtggacacattcgatgtc-3' (DR5p3: SECV ID nr. 3).
Dacă nu se specifică altceva, toate oligonucleotidele din aceste exemple sunt sintetizate de către Lifetechnologies. Toate nucleotidele sunt depozitate la -20°C, după ce au fost dizolvate în apă distilată.
c. Reacţia PCR
Reacţia PCR are loc. iar ADN-ul amplificat se izolează ca în exemplul 1.1 (c).
Plasmida astfel obţinută este denumită plasmida pCR-ADR5. Fragmentul BamHI-EcoRI, care codifică fragmentul Fc uman care se recuperează din pmFas-hlgGIFc, este subclonatîn situsurile de multiclonare BamHI şi EcoRI ale pcADN3. Plasmida astfel obţinută se denumeşte pcADNFc. Mai departe, fragmentul BamHI- BamHI, care codifică regiunea solubilă a DR5 uman care este recuperat din pCR-ADR5, este subclonat în situsul BamHI al plasmidei pcADNFc. Plasmida astfel obţinută se denumeşte pcDNAADR5-Fc. Fragmentul EcoRI, care codifică regiunea uman solubilă a Fc a IgG DR5 uman care este recuperat din plasmida pcDNAADR5-Fc, este stopat, utilizând fragmentul Klenow al ADN polimerazei (Gl BCO BRL) şi apoi subclonându-l în vectorul vehicul pAdCMV5 (Quantum Biotechnologies Inc., Canada) care este stopat după tăierea cu BamHI. Plasmida astfel obţinută este denumită pAdADR5-Fc. 1.3. Expresia şi purificarea proteinei de fuziune DR5-lgG1 umane
Celulele QBI-293A (furnizate cu trusa ADENO-Quest) sunt cotransfectate cu pAdADR5-Fc şi cu ADN viral QBI (furnizat cu trusa ADENO-Quest), utilizând trusa ADENO-Quest (Quantum Biotechnologies Inc., Canada), în conformitate cu manualul de utilizare. Plăcile cu virus recombinat sunt cultivate şi analizate pentru exprimarea proteinei de fuziune DR5-lgG prin analiza ELISA a supenatantului. Plăcile pozitive sunt amplificate în celulele QBI-293A şi sunt depozitate la -80°C ca stoc de virus. Cincizeci de vase (150 mm) cu celule QBI-293A sunt transfectate cu virusul recombinat pAdADR5-Fc la 10 m.o.i. (multiplicitate a infecţiei). Mediile de cultură sunt recoltate după o transfecţie de 48 h.
Celulele transfectate având gena DR5-lgG sunt crescute la o densitate de celule de 1 x 106 celule/ml, prin incubare în 500 ml de mediu DMEM (GIBCO), care conţine 10% v/v FCS, la 37°C, într-o atmosferă de 5% v/v C02, timp de 2 zile. Cultura este apoi centrifugată (1000 r.p.m., 5 min) şi supernatantul se colectează. Purificarea DR5-lgG din supernatant se realizează, utilizând cromatografia de afinitate ProteinA-Sepharose CL-4B (Pharmacia), în următoarele condiţii: - coloană: coloană ProteinA-Sepharose CL-4B (dimensiunea coloanei 2 ml; Pharmacia); - tampon de eluare: 0,1 M glicină (pH 2,4), 0,15 M NaCI; - tampon de neutralizare: 1M Tris-HCI (pH 8,5).
După ce tot supernatantul este aplicat pe coloană, aceasta se spală de trei ori cu 20 ml PBS şi apoi se adaugă 1 ml tampon de eluţie de 10 ori. Se măsoară densitatea optică a fiecărei fracţii eluate (1 ml). A doua fracţie până la a cincea fracţie (cu DO280>0,1) se colectează şi după adăugarea a 100 μΙ de tampon de neutralizare, eluatele se plasează separat în tuburi de dializă, iar eluatele se dializează faţă de un litru de PBS (pH 7,5) la 4°C, tamponul de analiză fiind schimbat de două ori.
Eluatelor li se analizează apoi exprimarea produsului genă DR5-lgG prin ELISA. Mai întâi, 100 μΙ din fiecare fracţie se plasează separat în godeurile unei plăci cu 96 godeuri (Costar) şi se incubează la 37°C, timp de o oră. După acest timp, soluţia din godeu se 40 RO 123525 Β1 îndepărtează, iar placa se spală de 3 ori cu 100 μΙ/godeu de PBS care conţine 0,1% v/v 1 Tween 20 (la care se va face referire de acum înainte ca „PBS-Tween"). După spălare, PBS care conţine albumină serică bovină 2% gr/v (la care se va face referire de acum înainte ca 3 „BSA") se adaugă în cantităţi de 100 μΙ/godeu, iar placa este apoi incubată la 37°C, timp de o oră. După acest timp, godeurile se spală de încă 3 ori cu PBS-Tween 100 μΙ/godeu, după 5 care, se adaugă, în fiecare godeu, 100 μΙ/godeu de soluţie de anticorp monoclonal lgG1 antiuman, diluat de 1000 de ori cu PBS-Tween, şi placa este din nou incubată la 37°C, timp 7 de o oră. Godeurile sunt apoi spălate de trei ori cu PBS-Tween 100 μΙ/godeu. Se adaugă apoi un sistem de substrat lichid, format din 3,3',5,5'-tetrametil-benzidină (la care se va face 9 referire de acum înainte ca „TMB”) (Sigma), în cantitate de 100 μΙ/godeu şi placa este lăsată să stea la temperatura camerei, timp de 5 min şi apoi reacţia se stopează, prin adăugare de 11 H2S04 0,2 N, 100 μΙ/godeu. Absorbanţa fiecărui godeu se citeşte la 450 nm, pentru a estima concentraţia de anticorp legat, utilizând absorbanţa la 650 nm, ca citire martor. Absorbanţa 13 se măsoară, utilizând un cititor microplacă (Molecular Devices). Producţia de DR5-lgG1 este confirmată, utilizând metoda ELISA. Masa moleculară a proteinei de fuziune DR5-lgG1 15 exprimate este determinată, utilizând analiza Western blot, în care mAc lgG1 antiuman este utilizat pentru a detecta anticorpul pe gel. Masa moleculară a proteinei de fuziune DR5-lgG1 17 exprimată este de aproximativ 50 kDa, puritatea obţinută fiind mai mare de 90%, după cum s-a evaluat prin analiza SDS-PAGE şi prin detecţia proteinei prin colorare cu albastru 19 Coomassie.
Exemplul 2. Generarea anticorpilor monoclonali împotriva DR5 uman 21 2.1. Imunizarea Şoareci femele, Balb/c (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), în vârstă de 6-8 23 săptămâni, se imunizează cu proteină de fuziune DR5/hlgG1 umană, purificată prin afinitate.
Pentru imunizarea iniţială, proteina de fuziune (50 pg) se emulsioneazăîn adjuvantul Freund 25 complet (Difco, Detroit, Ml). Şoarecii sunt apoi revaccinaţi cu patru injecţii de 50 pg de proteină de fuziune, administrată fără adjuvant, din două în două zile. La trei zile după ultima 27 injecţie, limfocite din nodulii limfatici locali sunt fuzionate cu celule de mielom NS-1, iar hibridoamele se cultivă în medii F104, suplimentate cu ser fetal de viţel 10%. Hibridoamele 29 pozitive sunt selectate prin ELISA, în care plăcile sunt acoperite fie cu 1 pg/ml DR5/hlgG1, fie cu aceeaşi cantitate de Fas/hlgG1, ca martor. Izotipul hibridoamelor se determină prin 31 ELISA, utilizând o listă de anticorpi de capră cu izotip IgG specific de şoarece (Southern Biotechnology, Birmingham, AL). Anticorpii monoclonali sunt purificaţi prin cromatografie de 33 afinitate, utilizând lgG1 de şoarece imobilizată sau proteină G (Sigma). 2.2. Fuziunea celulară 35 în a treia zi după vaccinare, nodulii limfatici locali se îndepărtează de la şoarece şi se plasează în 10 ml mediu RPMI 1640, fără ser (GIBCO BRL), conţinând 50 unităţi/ml 37 penicilină, 50 pg/ml streptomicină, şi 300 pg/ml acid L-glutamic, şi sunt dezintegraţi prin trecerea organului printr-o sită (Cell Strainer, Falcon), utilizând o spatulă. Suspensia de 39 celule rezultată este centrifugată, pentru a transforma în peletă celulele de noduli limfatici, care sunt apoi spălate de două ori cu mediu RPMI fără ser. Celulele spălate sunt apoi 41 resuspendate în mediu RPMI fără ser şi sunt numărate. între timp, celule de mielom NS1 (American Type Culture Collection TIB-18) au fost 43 crescute la o densitate celulară care nu depăşeşte 1x108 celule/ml, în mediu ASF104 41 RO 123525 Β1 (Ajinomoto, K.K.) care conţine 10% v/v FCS (Gibco BRL) („mediu ASF cu ser") la 37°C sub 5%v/vC02, şi acestea sunt dezintegrate în acelaşi mod, spălate, resuspendate şi numărate. 0 cantitate de suspensie de celule NS1, calculată pentru a conţine 3x107 celule, se amestecă cu o cantitate de suspensie de celule de splină, calculată pentru a conţine 3x108 celule. Amestecul rezultat este centrifugat, iar supernatantul este aruncat. Sunt efectuate etapele care urmează, menţinând în tot acest timp tubul de plastic care conţine peleta la 37°C, într-un recipient cu apă caldă. 1 ml polietilenglicol 1500 50% (gr/v) (BoeringerManheim) este apoi adăugat încet în tub, agitând mereu peleta, utilizând vârful unei pipete. Ulterior, 1 ml de mediu RPMI fără ser, preîncălzit la 37°C, este adăugat încet, în 2 porţiuni, urmat de adăugarea a încă 7 ml mediu RPMI fără ser. Amestecul rezultat este apoi centrifugat, supernatantul este aruncat şi se adaugă 10 ml mediu HAT, conţinând 10% v/v FCS, agitând uşor cu vârful unei pipete. Se adaugă încă 20 ml mediu HAT, conţinând 10% v/v FCS, iar suspensia se dispersează pe plăci de cultură cu 96 godeuri, la 100 μΙ/godeu şi se incubează la 37°C, într-o atmosferă de 5% v/v C02. După 7 sau 8 zile, 100 μΙ/godeu mediu HAT proaspăt sunt utilizaţi pentru a înlocui mediul din godeurile care prezentau o nuanţă gălbuie. Celulele de fuziune din aceste godeuri sunt donate prin diluţie limitată, după cum este descris mai jos. 2.3. donarea prin diluţie limitativă
Timusuri de la şoareci femele Balb/c (de la Japan SLC, Inc.) de 4 până la 10 săptămâni sunt îndepărtate, dezintegrate pe o sită (Cell Strainer, Falcon), conform descrierii de mai sus, iar celulele dezintegrate se spală de două ori cu mediu HT care conţine 10% v/v FCS. O cantitate de celule de timus, corespunzând celor de la un şoarece, este suspendată în 30 ml de mediu HT, care conţine 10% v/v FCS, pentru a produce o suspensie de celule de hrănire. Preparatul de celule de fuziune obţinut mai sus în exemplul 2.2 este diluat cu această suspensie de celule de hrănire, de la 10 la 100 de ori, şi mai este diluată serial cu suspensia de celule de hrănire, pentru a obţine suspensii având densităţile celulelor de fuziune de 5, 1 şi 0,5 celule/ml. Probele astfel preparate se dispersează în godeurile unor microplăci pentru culturi celulare cu 96 godeuri, într-o cantitate de 100 μΙ/godeu şi se incubează timp de 5 zile, la 37°C, într-o atmosferă de C02 5% v/v. 2.4. Screening-ul
Supernatantele de cultură ale hibridoamelor în creştere sunt analizate prin ELISA, utilizând plăci acoperite fie cu 1 pg/ml DR5/hlgG1, fie cu aceeaşi cantitate de Fas/hlgG1 (J. Cheng et al., 1994, Science, 263, 1759-1762 ) ca martor. Anticorpii legaţi sunt detectaţi, utilizând imunoglobuline antişoarece conjugate cu peroxidază de hrean (HRP) (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) cu TMB (Sigma, St. Louis, Ml) ca substrat. DR5/hlgG1 purificat la o concentraţie de 1 pg/ml sau aceeaşi cantitate de Fas-hlgG1 se introduce în godeurile de pe o placă cu benzi ELISA/RIA cu 96 godeuri (Costar, NY). Placa este menţinută la 4°C, peste noapte, pentru a permite adsorbţia proteinei pe suprafaţa godeurilor. După acest timp, godeurile se descarcă şi fiecare godeu se spală de 3 ori cu PBS-Tween. Apoi, se adaugă 100 μΙ PBS, care conţine 1% (gr/v) albumină serică bovină (A3803; Sigma Chemicals Co.) în fiecare godeu, iar placa este incubată la 37°C, timp de o oră. Godeurile sunt apoi spălate de încă 3 ori cu PBS-Tween şi apoi se adaugă, în fiecare godeu, 50 μΙ din fiecare supernatant de cultură de la hibridoamele în creştere. Placa este apoi incubată la 37°C, timp de o oră, iar godeurile sunt din nou spălate de 4 ori cu PBS-Tween. După spălare, se adaugă, în fiecare godeu, 50 μΙ anticorp imunoglobulină de capră antişoarece, marcat cu 42 RO 123525 Β1 peroxidază de hrean (Southern Biotechnology, Birmingham, AL), diluat de 1000 de ori cu 1 PBS, iar placa este incubată din nou la 37°C, timp de o oră, după care godeurile sunt din nou spălate de 4 ori cu PBS-Tween. Se adaugă apoi sistemul de substrat lichid (Sigma) 3,3',5,5'- 3 tetrametil-benzidină (TMB) într-o cantitate de 100 μΙ/godeu, iar placa este lăsată să stea la temperatura camerei timp de 5 min, iar apoi reacţia este oprită prin adăugarea a 5 100 μΙ/godeu H2S04 0,2N. Absorbanţa fiecărui godeu se măsoară la 450 nm (martor 650 nm), utilizând un cititor microplacă (Molecular Devices), iar celulele de fuziune se 7 selectează din proba care are absorbanţa (450 nm-650 nm, valorile DO > 0,5) în mod clar mai mari decât ale celor în care nu s-a adăugat supernatant de celule de fuziune (valorile 9 DO ~ 0,03). Mai departe, supernatantele de la hibridoamele în creştere sunt de asemenea analizate funcţional, prin măsurarea activităţii de inducţie a apoptozei, utilizând celule Jurkat. 11 50 μΙ de mediu RPMI, conţinând celule Jurkat (1000 celule per godeu), şi 5 μΜ bisindolilmaleimidă VIII (BisVIII, Alexis, San Diego, CA) se adaugă pe plăci cu 96 godeuri, 13 în prezenţa a 50 μΙ de supernatant de cultură de la hibridoamele în creştere. Celulele sunt cultivate într-un incubator umidificat la 37°C peste noapte. Apoptoza se determină prin 15 viabilitatea celulară, utilizând trusa ATPLite, conform instrucţiunilor fabricantului (Packard Instruments), iar probele sunt numărate utilizând un TopCounter (Packard Instruments). 17 2.5. Legarea ELISA a TRAIL şi TRAS la receptori
Plăcile pentru ELISA sunt acoperite cu 2 pg/ml proteină de fuziune DR4-lg sau DR5- 19 Ig peste noapte. După blocare cu BSA 3%, se adaugă TRAIL-FLAG solubil sau TRA-8 în concentraţiile indicate şi se incubează la 37°C, timp de o oră. Legarea TRAIL sau a TRA-8 21 se detectează cu ajutorul anticorpului anti-Flag conjugat cu HRP (Alexis) sau, respectiv, cu lgG1 antimurin, conjugat cu HRP (Southern Biotechnology). Reacţiile se dezvoltă pe tampon 23 de substrat TMB şi se măsoară cu un cititor de referinţă pentru microplăci (Benchmark Microplate Reader) (BioRad). Valorile Kd se estimează cu ajutorul modelului de legare la un 25 situs de regresie neliniară, utilizând programul GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA). Pentru ELISA competitivă, se adaugă 100 ng/ml TRAIL-FLAG şi este incubat 27 în prezenţa a diferite concentraţii de TRA-8. Legarea TRAIL se determină ca mai sus. 2.6. Clonarea 29
Etapele descrise în exemplele 2.3 şi 2.4 de mai sus se repetă de 5 ori pentru celulele selectate în 2.4, prin aceasta permiţând selectarea câtorva clone de hibridom, fiecare dintre 31 acestea producând un singur anticorp care leagă DR5-lgG, dar care nu leagă Fas-lgG. Ca rezultat al acestei proceduri de selecţie, se obţine un hibridom şoarece-şoarece, denumit 33 TRA-8 şi care produce un anticorp care se leagă la DR5-lgG, dar nu se leagă la Fas-lgG.
Acest hibridom, TRA-8, a fost depozitat în American Type Culture Collection (colecţia 35 americană de tipuri de culturi) la data de 1 Martie 2000 şi i s-a fost atribuit numărul de acces Nr. PTA-1428. 37
Subclasa anticorpului produs de către hibridomul şoarece-şoarece TRA-8 (la care se va face referire de acum înainte ca „TRA-8") se demonstrează a fi lgG1, k, după testare cu 39 o trusă de izotopi de anticorpi monoclonali (Pierce).
Utilizând ca imunogen proteina noastră de fuziune DR5-lgG1, sunt obţinute şapte 41 clone de hibridom prin analiza ELISA iniţială, toate acestea fiind puternic pozitive pentru DR5-lgG, dar nu şi pentru proteina de fuziune Fas-lgG, indicând faptul că hibridoamele 43 obţinute produc anticorpi care recunosc porţiunea extracelulară din DR5, dar nu şi porţiunea Fc din lgG1 (date neprezentate). 45 43 RO 123525 Β1 2.7. Analiza Western blot
Sunt achiziţionate filtre pentru analiza Western blot a omogenatelor de ţesuturi umane normale şi canceroase de la Geno Technology (St Louis, MO). Fiecare linie este încărcată cu o cantitate egală de proteine, aşa cum se determină printr-un anticorp anti-β-actină. Preparatele sunt examinate peste noapte cu 1 pg/ml TRA-8 şi urmate de lgG1 de capră antişoarece, conjugată cu HRP (Southern Biotechnology), la temperatura camerei, timp de o oră şi dezvoltate prin chemiluminiscenţă. 2.8. Imunohistochimia in situ Ţesuturile umane sunt obţinute din Centrul de Procurare de Ţesuturi (Tissue ProcurementCenter) al UAB. Secţiunile îngheţate sunt fixate în etanol 70%, blocate cu 10% ser de cal în PBS şi apoi sunt incubate cu 10 pg/ml de TRA-8 purificat prin afinitate la temperatura camerei, timp de 60 min. Se utilizează pentru a vizualiza reactivitatea trusa IgG ABC antişoarece cu diaminobenzidină (Vector, Burlingame, CA), ca şi substrat colorimetric. 2.9. Analiza activării caspazei
Celule Jurkat (1x106/ml) sunt incubate cu 500 ng/ml TRA-8. Alicotele (30 pg de proteine) ale lizatului celular sunt separate pe 15% SDS-PAGE, aşezate pe o membrană de nylon şi preparatele sunt examinate cu anticorpii anticaspază 8,9 şi 3 (BD Pharmingen, San Diego, CA), urmate de anticorpul secundar conjugat cu HRP şi vizualizare, prin chemiluminiscenţă, a produselor clivate. Setul de inhibitori caspazici este achiziţionat de la R&D Systems (Minneapolis, MN). Fiecare inhibitor caspazic este adăugat la cultură la concentraţia indicată.
Exemplul 3. Purificarea anticorpului monoclonal TRA-8
Hibridomul şoarece-şoarece, TRA-8, este crescut la densitatea celulară de 1x106 celule/ml prin incubare în 500 ml de mediu ASF, conţinând 10% v/v FCS, la 37°C, sub 5% v/v C02, timp de 5 zile. Cultura este apoi centrifugată (1000 r.p.m., timp de 5 min) şi supernatantul este colectat. Purificarea TRA-8 din supernatant este realizată utilizând cromatografia de afinitate ProteinG-Sepharose CL-4B (Pharmacia), în următoarele condiţii: - coloană: coloană ProteinG-Sepharose CL-4B (dimensiunea coloanei 2 ml; Pharmacia); - tampon de eluare: 0,1 M Glicină (pH 2,4), 0,15 M NaCI; - tampon de neutralizare: 1 M Tris-HCI (pH 8,5).
După ce este aplicat tot supernatantul pe coloană, 20 ml de PBS sunt spălaţi de trei ori şi apoi tamponul de eluare este adăugatîn volume de 1 ml, de 10 ori. Este măsurată densitatea optică a fiecărei fracţiuni eluate (1 ml). Fracţiunile de la nr. 2 la nr. 5 (>DO280 = 0,1) sunt colectate separat.
După adăugarea de 100 pl de tampon de neutralizare, eluaţii sunt plasaţi separat în tuburi de dializă şi eluaţii sunt dializaţi faţă de un litru de PBS (pH 7,5), la 4°C, tamponul de dializă fiind schimbat de două ori. Acestei probe i-a fost determinată activitatea de anticorp anti-DR5 prin ELISA, utilizând proteina de fuziune DR5-lgG umană, preparată mai sus, utilizând tehnica descrisă mai sus.
Exemplul 4. Prepararea antigenului DR4, a vectorului de exprimare DR4-lgG şi a anticorpului monoclonal anti-DR4
Procedurile din exemplele 1...3 sunt repetate cu cADN-ul matriţă a DR4 şi primerii în locul celor detaliaţi în exemplul 1, pentru a obţine antigenul DR4, care este utilizat ca în exemplele 1.2...3, pentru a obţine un anticorp monoclonal specific faţă de DR4. 44 RO 123525 Β1
Exemplul 5. Anticorpii monoclonali faţă de DcR1 şi DcR2 1
Anticorpii monoclonali sunt crescuţi faţă de receptorii momeală DcR1 şi DcR2 prin substituirea cADN-ului corespunzător şi a primerilor, pentru a crea antigenii respectivi, ca în 3 exemplul 1. Vectorii de expresie pentru fuziunile DcR1 sau DcR2 cu imunoglobulina G şi anticorpii monoclonali purificaţi rezultaţi sunt creaţi ca în exemplele 2 şi 3. 5
Exemplul 6. Specificitatea unui anticorp monoclonal
Deoarece toţi receptorii pentru TRAIL şi alte proteine din familia TNFR au în comun 7 o omologie semnificativă, specificitatea anticorpului exemplificativ TRA-8 pentru DR5 este determinată prin analiza Western blot, utilizând două proteine diferite de fuziune DR5-lgG 9 umane şi forme solubile, recombinate, ale altor proteine înrudite. O primă proteină de fuziune DR5-lg este construită prin fuzionarea cDNA din resturile 1-180 ale porţiunii extracelulare a 11 DR5şicADN, codificând regiunea constantă a lgG1 uman. cADN-ul fuzionat este clonatîntr-un vector adenoviral recombinat (Quantum Biotechnologies, Inc., Montreal, Canada). Proteina 13 de fuziune DR5/hlgG1 exprimată, care are o masă moleculară relativă de 50 kDa, este purificată, utilizând o coloană de afinitate cu IgG antiuman (Sigma, St Louis, MO). Pentru analiza 15 Western blot a specificităţii, o a doua proteină de fuziune DR5/lgG1 umană, recombinată (aa. 52-212), cât şi proteinele de fuziune TRAIL-R1, R3 şi R4, sunt achiziţionate de la Alexis. 17 Formele solubile ale Fas uman şi TNFR1 sunt furnizate prin bunăvoinţa dr. Cari Edwards de la Amgen, Inc., Thousands Oaks, CA, USA. Moleculele umane, recombinate, solubile, de DR4, 19 DcR1, DcR2, TNFR1, R4 şi Fas, utilizate, sunt proteine de fuziune lgG1, umane. 0,5 pg din fiecare proteină sunt separate prin 10% SDS-PAGE şi aşezate pe o membrană de 21 nitroceluloză. Preparatele sunt blocate cu 5% lapte praf în PBS la temperatura camerei, timp de o oră, şi examinate cu 1 pg/ml de anticorp anti-DR5 purificat, monoclonal (dona: TRA-8) 23 sau 0,1 pg/ml de IgG antiumană de capră conjugată cu HRP la 4°C peste noapte. Se utilizează ca anticorp secundar IgG antişoarece de capră, conjugat cu peroxidază de hrean (HRP), pentru 25 a detecta TRA-8 legat. Preparatele sunt dezvoltate prin chemiluminiscenţă.
Celulele Cos-7 transfectate cu vector pcDNA3 (Clontech, Palo Alto, CA), conţinând 27 DR5 sau DR4 cu lungime integrală sau vectorul gol, sunt utilizate pentru analiza citometrică în flux. Trail uman codificat integral cDNA sau ligandul Fas murin este donat în vectorul pTRE 29 în aval faţă de promotorul controlabil prin tetraciclină (Clontech). Fragmentele Xhol-Hindlll de pTRE-hTRAIL sau pTRE-mFasL sunt donate mai departe în vectorul suveică adenoviral 31 pAdBN (Quantum Biotechnologies Inc.). Cele 293 celule gazdă sunt cotransfectate cu TRAIL liniar sau cu Pad-TRE-mFasLşi fragmentul ADN mare al adenovirusului. Exprimarea TRAIL 33 uman funcţional sau ligandului Fas murin din plăcile de virus recombinant este analizată, utilizând o analiză cu eliberare de 51Cr cu Jurkat ca ţinte. 35 TRA-8 a reacţionat puternic cu proteina de fuziune DR5-lgG (~50 kDa), care este utilizată pentru imunizare, aşa cum este prezentatînfig. 1a, DR5, #1, şi slab cu a doua proteină 37 de fuziune DR5-lgG (~60 kDa), aşa cum este prezentatîn fig. 1a, DR5, #2. Nu există o legare semnificativă a TRA-8 la DR4, DcR1, DcR2, Fas (CD95) sau TNFRI. Aceste rezultate indică 39 faptul că TRA-8 recunoaşte determinanţii antigenici care sunt specifici pentru DR5, dar care nu sunt în comun cu ceilalţi membri ai familiei. 41 j TRA-8 nu reacţionează cu alţi membri ai superfamiliei de receptori TNF, cum ar fi Fas (CD95) şi receptorul TNF I, şi nici TRA-8 nu reacţionează încrucişat cu omologul murin al lui 43 DR5, aşa cum se demonstrează prin rapoartele de absorbanţă optică, pentru 450 nm şi 45 RO 123525 Β1 650 nm, în grupul inferior de numere 1-7 (fig. 1 a, coloana 8 a panoului inferior). TRAIL solubil şi TRA-8 se leagă în mod comparabil la DR5 imobilizat (fig. 1 b, panoul din stânga). în contrast, TRAIL se leagă la DR4, dar TRA-8 nu a prezentat nicio activitate de legare la DR4 (fig. 1b, panoul din mijloc). Valorile Kd pentru legarea lui TRAIL şi TRA-8 la DR5 sunt estimate la 59 nM şi, respectiv, 3 nM. Ca un fapt important, TRA-8 a concurat în mod eficient cu TRAIL pentru legare la DR5, dar nu pentru legare la DR4, aşa cum este prezentat în ELISA competitivă (fig. 1 b, panoul din dreapta). Aceste rezultate stabilesc specificitatea TRA-8 pentru DR5 uman. TRA-8 este capabil să detecteze exprimarea la suprafaţa celulei a lui DR5, analiza citometrică în flux indicând o legare specifică la suprafaţa celulei a celulelor Cos-7 transfectate cu DR5 uman cu lungime integrală, dar nu a celulelor Cos-7 transfectate cu DR4 sau vector gol (fig. 1c). în mod similar, imunohistochimia in situ cu TRA-8 a demonstrat o reactivitate a celulelor Cos-7 transfectate cu DR5 ADN cu lungime integrală, dar nu cu acelea transfectate cu vectorul martor (fig. 1d). TRA-8 nu induce apoptoza celulelor Cos-7 netransfectate, şi RT-PCR a ARN din celule Cos-7, utilizând primeri perechi care codifică DR5 uman, nu a prezentat produşi specifici PCR. Analiza funcţională efectuată în continuare, utilizând celule umane Jurkat ca ţinte, a demonstrat faptul că, în absenţa reticulării, TRA-8 induce puternic moartea celulei, fapt demonstrat de trei analize de viabilitate celulară, diferite, incluzând ATPLite, MTT şi excluderea PI (fig. 1e). Sunt ucise mai mult de 50% dintre celulele Jurkat de niveluri de ordinul nanogramelor de TRA-8, aşa cum este demonstrat de analiza ATPLite. Activitatea ucigătoare a TRA-8 este specifică pentru DR5, deşi aceasta ar putea fi blocată de către DR5-lg, dar nu de către proteina de fuziune DR4-lg (datele nu sunt prezentate). Clivajul caspazelor 8, 9 şi 3 poate fi detectat prin analiza Western blot nu mai devreme de 30 min după tratamentul cu TRA-8 a celulelor Jurkat (fig. 1f), şi moartea celulară a celulelor Jurkat este complet inhibată de către inhibitorul general al caspazei (Z-VAD) (fig. 1 g).
Inhibitori caspazici individuali, pentru caspaza 8,3,9 şi 10, au inhibat parţial moartea celulară, indicând mai departe faptul că moartea celulară mediată de TRA-8 este realizată în principal printr-un mecanism apoptotic dependent de caspază.
Exemplul 7. Analiza citometrică în flux a exprimării DR5 de la suprafaţa celulei: un receptor major al morţii pentru multe celule de tumoare, dar nu pentru celule normale
Capacitatea TRA-8 de a se lega la DR5 exprimat la suprafaţa celulei şi specificitatea acestei reacţii este apoi evaluată, utilizând celule COS-7 (American Type Culture Collection Nr. CRL-1651), transfectate cu vectorul de expresie conţinând DR5 uman de lungime integrală sau cADN-ul DR4 sau vectorul gol ca martor.
Se utilizează lgG1 antişoarece, conjugată cu ficoeritrină (PE) (Pharmingen), ca al doilea anticorp, pentru a detecta TRA-8 legat. Fluorescenţa a 1x104 celule este măsurată, utilizând un citometru în flux (FACSVantage), în următoarele condiţii: - lungimea de undă de excitaţie: 488 nm; - lungimea de undă de detecţie: 600 nm.
Analiza citometrică în flux a demonstrat faptul că TRA-8 a colorat aproximativ 30% din celulele COS-7 transfectate cu vectorul DR5, aşa cum este prezentat în histograma solidă din fig. 1 c. Acest procentaj este analog cu eficienţa de transfecţie, aşa cum este determinată prin analiza transfecţiei, utilizând proteină verde fluorescentă (GFP) (datele nu sunt prezentate). TRA-8 nu a coloratîn mod semnificativ celulele transfectate fie cu DR4 (histograma deschisă), fie cu vectorul de control (histograma punctată), indicând faptul că TRA-8 este specific pentru DR5 de la suprafaţa celulei. 46 RO 123525 Β1
Deşi exprimarea DR5 în celule tumorale a fost studiată în mod extensiv la nivelul 1 mRNA (vă rog inseraţi REFERINŢA), exprimarea la suprafaţă a DR5 nu a fost documentată.
Astfel, disponibilitatea anticorpului monoclonal anti-DR5 ne permite să examinăm nivelurile 3 de suprafaţă ale DR5 şi să corelăm exprimarea cu susceptibilitatea celulelor la apoptoza mediată de TRAIL. Următorul grup de celule (1x106) este incubat cu 10 pg/ml de TRA-8 5 purificat prin afinitate la temperatura camerei, timp de 30 de min, şi apoi colorat cu lgG1 antişoarece conjugată cu PE (Pharmingen), pentru încă 30 min. 10000 de celule viabile sunt 7 analizate, utilizând citometrul în flux FACS Vantage, în următoarele condiţii: - lungimea de undă de excitaţie: 488 nm; 9 - lungimea de undă de detecţie: 600 nm.
Cele cinci linii celulare hematopoietice care au fost testate sunt celulele Jurkat, CEM- 11 6, Molt-4, H-9 şi U937. Exprimarea DR5 este detectabilă pe suprafaţa celulelor Jurkat, CEM-6, H-9 şi U937, dar este aproape de nedetectat pe celulele Molt-4, aşa cum se demonstrează 13 în fig. 2a şi 2a'. Deşi niveluri ridicate de exprimare a ARN-ului DR5 au fost descrise anterior (J. P. Sheridan, A. S. Marsters, R. M. Pitti, A. Gurney, M. Skubatch, D. Baldwin, L. 15 Ramakrishnan, C. J. Gray, K. Baker, W. I. Wood, A. D. Goddard, P. Godowski şi A. Ashkenazi, 1997, Science, 277, 818-821), analiza FACs a indicat faptul că aceste celule nu 17 exprimă niveluri înalte de DR5 de suprafaţă. Aceste rezultate indică faptul că exprimarea DR5 de suprafaţă nu se corelează cu exprimarea transcripţională a DR5, ceea ce nu este 19 un lucru neaşteptat pentru un astfel de receptor. Nivelul de expresie de la suprafaţa celulei al DR5 poate fi specific descendenţei celulare, deoarece majoritatea celulelor de origine 21 hematopoietică au exprimat niveluri scăzute, în timp ce majoritatea celulelor de gliomi şi prostatice au exprimat niveluri ridicate de DR5. 23
Anticorpul monoclonal TRA-8 este utilizat pentru a determina rolul DR5 în inducţia apoptozei mediate de TRAI L prin examinarea exprimării acestuia la suprafaţa celulei într-un 25 grup de tipuri diferite de celule tumorale umane, precum şi susceptibilitatea acestor celule la apoptoza mediată atât de TRAI L, cât şi de TRA-8. Celulele T primare din sângele periferic 27 nu au exprimat niveluri semnificative ale DR5 la suprafaţa celulei şi sunt rezistente la apoptoza mediată atât de TRAIL, cât şi de TRA-8 (figurile 2a, 2a' şi 3a'). Deşi toate cele cinci 29 linii de celule T umane de leucemie testate au exprimat niveluri detectabile scăzute ale DR5 de la suprafaţa celulei, două dintre ele (Jurkat şi CEM-6) au o susceptibilitate ridicată faţă 31 de apoptoza mediată atât de TRAIL, cât şi de TRA-8, indicând faptul că DR5 singur este suficient pentru a induce apoptoza acestor celule. Celulele Molt-4 şi U937 sunt parţial 33 susceptibile la apoptoza mediată de TRAIL, dar sunt relativ rezistente la apoptoza mediată de TRA-8, sugerând faptul că receptorii TRAIL pot fi implicaţi în traducerea unui semnal 35 apoptotic. Celulele H-9 sunt rezistente atât la apoptoza mediată de TRAIL, cât şi la cea mediată de TRA-8, implicând un blocaj mediat de către o cale intracelulară antiapoptoză. 37
Grupul de celule a inclus liniile de celule de gliom maligne umane, Hs683, U251 MG, D37MG, D54MG, U373MG, CH235MG, U87 şi astrocite umane normale, care au fost 39 furnizate de către dr. Yancey Gillespie de la Departamentul de Neurochirurgie al Universităţii dinAlabamadelaBirmingham. Liniile de celule canceroase de prostată umană, Du154, PC3 41 şi LnCap, au fost furnizate de către dr. William Grizzle de la Departamentul de Patologie al Universităţii din Alabama de la Birmingham, care a obţinut liniile de celule de la Colecţia 43 Americană de Tipuri de Culturi. Liniile de celule T umane de leucemie, de limfom cu celule B, HepG2 Jurkat (Colecţia Americană de Tipuri de Culturi TIB-152) şi CCRF-CEM CEM-6 45 47 RO 123525 Β1 (Colecţia Americană de Tipuri de Culturi CCL-119), liniile de celule monocite, U937 (Colecţia Americană de Tipuri de Culturi CRL-2367) au fost procurate de la Colecţia Americană de Tipuri de Culturi. Toate liniile de celule de mai sus sunt cultivate în RPM11640 suplimentat cu FCS 10%. Linia de celule deastrocitom uman 1321N1 a fost furnizată prin bunăvoinţa dr. Richard Jope de la Departamentul de Psihiatrie al Universităţii din Alabama de la Birmingham, şi au fost cultivate în DMEM suplimentat cu FCS 5%. TRAIL uman recombinat solubil, procurat de la Alexis Corporation (San Diego, CA), este o proteină de fuziune compusă din domeniul extracelular al TRAIL uman (resturile de aa de la 95 la 281), fuzionat la capătul N-terminal cu un marcaj FLAF şi cu o peptidă de legătură cu 8 aminoacizi. în mod diferit faţă de TRAIL marcat la His, care s-a raportat anterior, doar acest preparat al TRAIL nu induce un răspuns apoptotic puternic în celulele Jurkat şi necesită un anticorp anti-FLAG, ca agent de legare încrucişată, pentru a îmbunătăţi apoptoza. Anticorpul anti-FLAG a fost procurat de la Alexis.
Toate cele 10 celule maligne de gliom uman testate au exprimat niveluri detectabile de DR5 la suprafaţa celulei, majoritatea au exprimat niveluri de DR5 de la intermediare la ridicate, după cum se arată în fig. 2b. Trei linii, D-54MG, U373MG şi CH-235MG, au exprimat niveluri înalte ale DR5, în timp ce şase linii, Hs-683, U251-MG, D37-MG, U87, SMK-1 şi 1321N, 1 au exprimat niveluri intermediare de DR5. Doar o linie de celule, H-465, a exprimat niveluri scăzute de DR5. Toate cele trei linii de celule de cancer de prostată au exprimat niveluri ridicate de DR5, după cum se arată în fig. 2c.
La fel ca şi celulele T primare, celulele B primare nu au exprimat niveluri semnificative de DR5 şi nu au suferit apoptoza după tratamentul fie cu TRAIL, fie cu TRA-8 (fig. 2d). Trei (SKW6.4, EB-3 şi Raji), în afară de a patra dintre liniile de celule B de limfom, au exprimat niveluri relativ ridicate de DR5 şi sunt foarte susceptibile atât la apoptoza mediată de TRAIL, cât şi la cea mediată de TRA-8. A patra linie de celule, Daudi, a exprimat niveluri foarte scăzute de DR5 şi este mult mai puţin susceptibilă atât la apoptoza mediată de TRAIL, cât şi la cea mediată de TRA-8. Deşi astrocitele primare nu au exprimat niveluri detectabile de DR5 de la suprafaţa celulei (fig. 2b'), toate cele patru linii de celule de gliom testate au exprimat niveluri crescute de DR5. Nivelul mai ridicat al DR5 pe celulele de gliom decât cel de pe celulele T şi B nu este însoţit de o susceptibilitate semnificativ mai mare la apoptoza mediată de TRAIL şi de DR5, sugerând faptul că nivelul de exprimare la suprafaţa celulei a DR5 nu este corelat în mod necesar cu nivelul de apoptoză a celulelor tumorale. RT-PCR, efectuată pentru a determina nivelurile mesajului DR4, DR5 şi DCR2, a detectat mesaje în toate celulele testate (tabelul 1). Cu toate acestea, în general, celulele normale primare au exprimat niveluri relativ scăzute de DR5 comparativ cu celulele tumorale transformate.
Tabelul 1
Analiza RT-PCR a exprimării receptorului TRAIL*
Celule DR5 DR4 DcR2 Celule T primare <0,001 <0,001 0,015 Celule Jurkat 0,10 <0,001 0,21 CEM-6 0,50 0,59 0,25 Molt-4 0,10 <0,001 0,05 48 RO 123525 Β1
Tabelul 1 (continuare)
Celule DR5 DR4 DcR2 H-9 0,73 0,61 0,07 Celule B primare <0,001 <0,001 0,024 SKW6.4 0,95 0,66 0,45 EB3 0,40 <0,001 0,35 Raji 0,55 0,11 0,45 Daudi 0,73 0,36 0,63 Astrocite normale 0,05 <0,001 0,12 SH683 0,56 0,96 0,14 U87 0,44 0,56 0,21 D54 1,15 0,46 0,12 1321N1 0,25 0,35 0,05 *ARN total a fost izolat din celule şi RT-PCR a fost efectuată conform descrierii din Metode. Produşii PCR au fost separaţi în gel de agaroză 3% şi au fost analizaţi cu un sistem Multilmager Fluor-S MAX (BioRad). Valorile sunt prezentate ca raport faţă de β-actină.
Exemplul 8. Inducţia apoptozei in vitro în celulele maligne
Pentru a determina dacă TRA-8 induce apoptoza în celulele transformate in vitro, toate celulele tumorale DR5-pozitive sunt examinate pentru susceptibilitatea lor la apoptoza indusă fie de TRA-8, fie de TRAIL.
Celulele ţintă (1x103 per godeu) sunt cultivate pe plăci cu 96 de godeuri, în prezenţa concentraţiilor indicate de TRAI L solubil, plus agent de legare încrucişată (Alexis) sau TRA8, la 37°C, peste noapte. Viabilitatea celulară se determină, utilizând (1) trusa ATPLite în conformitate cu instrucţiunile fabricantului (Packard Instruments, Meriden, CT); (2) trusa de proliferare a celulelor MTT/viabilitate (Sigma); sau (3) colorarea PI a celulelor moarte şi se analizează prin citometrie în flux. La sfârşitul cultivării, celulele sunt colorate cu P110 pg/ml PI şi celulele PI negative sunt raportate ca celule viabile. Pentru analiza nucleelor condensate de hepatocite, celulele se colorează cu Hoechst 33352 10 ng/ml (Molecular Probes) şi se analizează prin citometrie în flux.
Anticorpul TRA-8 este capabil de a induce apoptoza în majoritatea liniilor de celule de gliom uman maligne (9/10), în 2 din 3 linii de celule de cancer de prostată şi în 2 din 5 linii de celule hematopoietice DR5-pozitive. Acesta nu a indus apoptoza în linia de celule Molt-4, care a exprimat niveluri de DR5 aproape nedetectabile la suprafaţa celulară. Cu toate acestea, nivelurile de susceptibilitate a celulelor la apoptoza mediată de TRA-8 au variat considerabil printre liniile de celule.
Variabilitatea susceptibilităţii celulelor faţă de apoptoza indusă de anticorpul TRA-8 sugerează că, deşi este necesar un nivel minim de exprimare a DR5 la suprafaţa celulei, nivelul exprimării la suprafaţa celulei a DR5 nu este în mod necesar determinantul primar al susceptibilităţii, ci şi alţi factori influenţează acest proces. Deşi toate celulele de gliom au 49 RO 123525 Β1 exprimat în general niveluri semnificativ mai mari de DR5 de la suprafaţa celulei decât au făcut-o celulele hematopoietice, susceptibilitatea celulelor de gliom la apoptoza indusă de TRA-8 nu este proporţional crescută comparativ cu celulele hematopoietice. Susceptibilitatea a cinci linii de celule de gliom, D-37MG, D54-MG, U373-MG, CH-235-MG şi 1321N1, la apoptoza indusă de TRA-8, este mare şi este echivalentă cu susceptibilitatea acestora la apoptoza mediată de TRAIL, după cum se arată în fig. 3b. Două dintre liniile de celule de gliom, H-456 şi SMK1, sunt mult mai puţin susceptibile la apoptoza indusă de TRA-8. în cazul celulelor H-456, exprimarea de suprafaţă a DR5 este scăzută, cu toate acestea, exprimarea la suprafaţă a DR5 pe SMK1 este similară cu cea a liniilor de celule mai susceptibile, sugerând că alte mecanisme pot juca un rol în determinarea susceptibilităţii la apoptoza mediată de TRAIL. Deşi toate cele trei linii de cancer de prostată au exprimat niveluri înalte de DR5, celulele Du145 sunt cele mai sensibile la apoptoza indusă de TRA-8, celulele PC3 sunt parţial sensibile, în timp ce LnCAP sunt complet rezistente, după cum se arată în fig. 3c. Printre celulele hematopoietice, s-a descoperit că celulele CEM-6 sunt foarte susceptibile la apoptoza indusă de TRA-8, după cum se arată în fig. 2a, deşi ambele linii de celule au fost găsite a exprima niveluri scăzute de DR5. Deşi DR5 este detectabil pe celulele U937, aceste celule sunt rezistente la apoptoza indusă de TRA-8. în mod similar, deşi celulele H-9 au exprimat niveluri detectabile de DR5, celulele H-9 sunt rezistente la apoptoza indusă de TRA-8. Aceste rezultate au implicat existenţa mecanismelor reglatoare care influenţează apoptoza mediată de DR5.
Anticorpii anti-DR5 de legare de suprafaţă adiţionali sunt produşi ca în procedurile din exemplele 1...3. Doi anticorpi anti-DR5, suplimentari, desemnaţi TRA-1 şi TRA-10, sunt studiaţi, împreună cu TRA-8, pentru a determina comparativ capacitatea de a induce apoptoza şi, prin aceasta, de a acţiona ca agonist sau, din contră, de a bloca apoptoza mediată de TRAIL, prin aceasta acţionând ca antagonist. Celule umane Jurkat se utilizează ca ţintă, pentru a determina activitatea agonistă şi/sau antagonistă a trei anticorpi anti-DR5, denumiţi TRA-1, TRA-8 şi TRA-10. După cum se arată în fig. 4, viabilitatea celulară este aproximativ 90%, 70% şi 20%, pentru TRA-10, TRA-1 şi TRA-8, respectiv, după o incubare peste noapte cu 2,5 pg per ml. TRA-8 a indus un răspuns apoptotic puternic într-o manieră doză-dependentă, în timp ce TRA-1 a indus doar un răspuns apoptotic moderat, iar TRA-10 a indus doar un răspuns slab. De aceea, TRA-8 este clasificat ca anticorp anti-DR5 agonist. în fig. 4, viabilitatea celulelor Jurkat umane este prezentată ca funcţie doză-dependentă a apoptozei induse de TRAIL. TRA-10 a blocat apoptoza celulelor Jurkat umane într-o proporţie semnificativă, într-un studiu al apoptozei induse de TRAIL în doză mică. Astfel, TRA-10 este clasificat ca anticorp anti-DR5 antagonist.
Susceptibilitatea a cinci linii de celule de gliom, D-37MG, D54-MG, U-373-MG, CH235-MG şi 1321N1, la apoptoza indusă de TRA-8, este echivalentă cu susceptibilitatea acestora la apoptoza mediată de TRAIL, după cum se arată în fig. 3b, indicând faptul că apoptoza indusă de TRAIL, în aceste celule, este mediată, în primul rând, prin DR5. Mai mult, două dintre liniile de celule de gliom, Hs683 şi U251-MG, sunt rezistente la apoptoza indusă de TRAIL, dar sunt parţial sensibile la apoptoza indusă de TRA-8, indicând faptul că receptorii momeală funcţionează în aceste celule şi că utilizarea anticorpului TRA-8 scurtcircuitează acest mecanism reglator. în liniile celulare de cancer de prostată, în ciuda sensibilităţii variabile la apoptoza indusă de TRA-8, aceasta a fost analoagă cu sensibilitatea celulelor la apoptoza indusă de TRAIL, sugerând din nou că DR5 joacă un rol major în 50 RO 123525 Β1 apoptoza mediată de TRAIL în celulele de cancer de prostată. Printre celulele 1 hematopoietice, s-a descoperit că Jurkat şi CEM-6 sunt foarte susceptibile atât la apoptoza mediată de TRA-8, cât şi la cea mediată de TRAIL. Nivelul apoptozei induse de TRA-8 este 3 compatibil cu cel indus de TRAIL, după cum se arată în fig. 2a şi 3a’. Doar una dintre liniile de celule de gliom, U87, şi două linii de celule hematopoietice, U937 şi Molt 4, au prezentat 5 sensibilitate la apoptoza indusă de TRAIL, dar sunt mai puţin sensibile sau sunt rezistente la apoptoza indusă de TRA-8. Una dintre liniile de celule, linia de celule H-9, a exprimat 7 niveluri detectabile de DR5, dar este rezistentă la apoptoza indusă fie de TRA-8, fie de TRAI L. Deoarece sunt necesare niveluri minime de expresie, a DR5 pentru apoptoza indusă 9 de TRA-8, nivelul de expresie a DR5 nu prevede în mod necesar susceptibilitatea celulelor la apoptoza mediată de TRA-8; receptorii momeală joacă un rol în modularea apoptozei 11 mediate de TRAIL în unele celule, dar nu pare să joace un rol major în majoritatea celulelor testate; după cum se anticipează, anticorpul TRA-8 scurtcircuitează efectele receptorilor 13 momeală; pot apărea mutaţii funcţionale ale receptorului DR5 în celulele transformate; şi, în final, mecanismele reglatoare intracelulare pot fi la fel de importante sau mai importante 15 decât receptorii momeală, în definirea susceptibilităţii celulelor la apoptoza mediată de TRAIL şi de DR5. 17
Studii anterioare au arătat că mARN pentru DR5 este larg distribuit în ţesuturile normale (P. Schneider, M. Thome, K. Burns, J. L. Bodmer, K. Hofmann, T. Kataoka, N. 19 Holler, J. Tschopp, Immunity, 1997, Dec.; 7(6):831-6). Pentru a evalua exprimarea DR5 la nivel de proteină, este examinat un grup de omogenate de ţesut uman normal (Geno 21 Technology, St. Louis, MO) cu anticorp TRA-8 prin analiza Western blot. Dintre nouă linii de ţesuturi umane normale, ţesutul de creier este slab pozitiv (fig. 5a, linia 2). Proteina DR5 nu 23 este detectabilă de către reactivitatea TRA-8 în ficat (linia 1), plămân (linia 3), rinichi (linia 4), splină (linia 5), testicule (linia 6), ovar (linia 7), inimă (linia 8), sau pancreas (linia 9). în 25 contrast, toate cele treisprezece ţesuturi canceroase umane s-au colorat pozitiv cu TRA-8 (fig, 5b), incluzând cancerele de ovar (linia 1), plămân (linia 2), ficat (linia 3), rect (linia 4), 27 cervix (linia 5), piele (linia 6), testicule (linia 7), tiroidă (linia 8), uter (linia 10), stomac (linia 11), laringofaringe (linia 12) şi pancreas (linia 13). Mai mult, imunochimia in situ a ţesuturilor 29 normale şi canceroase cu TRA-8 a confirmat că, în afară de câteva celule pozitive răspândite în splină, exprimarea DR5 în celulele normale de sân, plămân şi splină nu este detectabilă 31 (fig. 5c). Ţesuturile canceroase corespunzătoare, incluzând carcinomul ductal infiltrant de sân, cancerul de plămân cu celule mici şi limfomul, au reacţionat pozitiv cu TRA-8 (fig. 5d). 33
Dintr-un total de 22 de ţesuturi examinate, 5 din 6 cancere de sân, 2 din 2 cancere de cervix, 4 din 5 cancere de ficat 5 din 8 limfoame, 2 din 2 cancere de plămâni, 2 din două cancere 35 de prostată au reacţionat pozitiv cu TRA-8. Rezultatele concordă cu cele ale analizei citometrice în flux şi indică faptul că ţesuturile canceroase exprimă niveluri mai înalte de 37 proteină DR5 decât o fac ţesuturile normale.
Exemplul 9. Activitatea tumoricidă a TRA-8 in vivo 39
Din diferite motive, mulţi agenţi care au fost promiţători în studiile in vitro nu au arătat eficacitate in vivo. De aceea, este important să se testeze eficacitatea TRA-8 pe un model 41 animal in vivo. Pentru a realiza aceasta, anticorpul DR5 antiuman TRA-8 se administrează la şoareci care poartă xenogrefe umane care exprimă molecula umană DR5. Şoarecii utilizaţi 43 au avut de la 6 la 8 săptămâni, au fost şoareci NOD/SCID (Jackson Laboratory), care au fost 51 RO 123525 Β1 inoculaţi subcutanat cu celule 1321N1 deastrocitom uman (1x107) sau li s-au inoculat celule Jurkat de leucemie umană (1x106). în ziua 2 de la inocularea tumorii, şoarecii sunt inoculaţi intravenos cu TRA-8 (100 pg). La cinci zile după tratamentul cu TRA-8, creşterea tumorii 1321N1 se determină prin mărimea şi greutatea masei tumorale. Creşterea celulelor Jurkat se determină prin greutatea splinei şi procentajul de celule CD3 pozitive umane în splina animalelor inoculate. Biopsiile ţesuturilor tumorale sunt prelevate şi examinate histologic.
Tratamentul timpuriu, cu o singură doză intravenoasă de 100 pg de TRA-8, la o zi după inocularea tumorii, a inhibat complet celulele 1321N1, formând o tumoare solidă (fig. 6a). Tratamentul târziu, cu trei doze de 100 pg de TRA-8, la o săptămână după inocularea tumorii, a redus greutatea tumorii de 4 ori sau mai mult (fig. 6b). Formarea tumorii nu este vizibilă la animalele tratate cu TRA-8 devreme (fig. 6c, panoul superior). Analiza histologică a relevat un ţesut tumoral degenerat în mod dramatic, la animalele tratate cu TRA-8 (fig. 6c, panoul inferior). în mod similar, tratamentul cu TRA-8 a inhibat populaţia de splină de către celulele Jurkat, după cu s-a demonstrat prin insuficienţa celulelor Jurkat din splină (fig. 6d, 6e). Analiza histologică a tumorii implantate a arătat câteva celule tumorale împrăştiate în ţesutul moale, la animalele tratate cu TRA-8, în timp ce martorii au arătat formarea unei tumori solide, după cum s-a arătatîn fig. 6c. Modelul cu celule Jurkat, numărul de celule Jurkat din splinele animalelor tratate cu TRA-8 este mai mic de 2% comparativ cu aproximativ 10% în splina animalelor de control, după cum s-a demonstrat prin analiza citometrică în flux, după cum se arată în fig. 6a şi prin colorarea CD3 in situ din fig. 6c.
Aceste rezultate au confirmat demonstraţia recentă că administrarea sistemică a inhibitorilor TRAIL recombinaţi, legaţi încrucişat, inhibă creşterea tumorii in vivo (H. Walczak, R. E. Miller, K. Ariail, B. Gliniak, T. S. Griffith, M. Kubin, W. Chin, J. Jones, A. Woodward, T. Le , C. Smith, P. Smolak, R. G. Goodwin, C. T. Rauch, J. C. Schuh, D. H. Lynch, Nat. Med., 1999, Feb.; 5(2):157-63). Aceste rezultate au indicat faptul că o singură doză de TRA-8 are o eficacitate înaltă în eliminarea celulelor tumorale in vivo.
Deoarece se utilitează un anticorp antiuman într-un model murin, toxicitatea tratamentului cu TRA-8 nu a putut fi determinată. Cu toate acestea, studiul administrării TRAIL in vivo a indicat că nu se asociază o toxicitate semnificativă cu acest tratament (H. Walczak, R. E. Miller, K. Ariail, B. Gliniak, T. S. Griffith, M. Kubin, W. Chin, J. Jones, A. Woodward, T. Le , C. Smith, P. Smolak, R. G. Goodwin, C. T. Rauch, J. C. Schuh, D. H. Lynch, Nat. Med., 1999, Feb.; 5(2):157-63).
Exemplul 10. Celulele sinoviale RA sunt susceptibile la apoptoza indusă de TRAIL şi TRAS
Majoritatea studiilor din stadiul tehnicii ale apoptozei mediate de TRAIL s-au concentrat asupra celulelor maligne. Apoptoza mediată de TRAIL, în conformitate cu prezenta invenţie, este, de asemenea, terapeutică, în condiţii autoimune şi inflamatoare, cum ar fi RA. 10.1. Analiza citometrică în flux a exprimării lui DR5 de la suprafaţa celulei în celulele RA sinoviale
Exprimarea lui DR5 pe un grup de opt celule sinoviale primare, cultivate de la pacienţi cu RA, este comparată cu aceea de pe opt celule sinoviale, cultivate de la pacienţi cu osteoartrită (la care se va face referire de acum înainte ca „OA"). Cele opt celule umane sinoviale RA primare, cultivate, RA-1014, RA-1016, RA-1021, RA-512, RA-707, RA-811, RA-716 şi RA-929, sunt furnizate prin amabilitatea dr. M. Ohtsuki (Sankyo Co. Ltd., Tokyo, 52 RO 123525 Β1
Japonia) şi cultivate în DMEM suplimentat cu 10% FCS, penicilină, streptomicină şi 1 glutamină. Cele şapte culturi celulare primare de celule sinoviale OA sunt izolate din ţesuturile sinoviale ale pacienţilor cu OA printr-o metodă cu colagenază standard şi cultivate 3 în aceleaşi condiţii. Numărul de trecere al tuturor celulelor primare este sub 10. Exprimarea lui DR5 este determinată prin analiză FACs aşa cum se descrie în exemplul 5. 5
Toate culturile primare de celule RA au exprimat niveluri înalte de DR5 de suprafaţă şi există o variaţie mică a nivelurilor de exprimare printre aceste celule sinoviale, izolate de 7 la pacienţi diferiţi, aşa cum este prezentat în fig. 7a. în contrast, exprimarea lui DR5 de suprafaţă pe suprafaţa celulelor sinoviale izolate de la pacienţii cu OA este foarte scăzută 9 sau nedetectabilă, aşa cum se prezintă în fig. 7b. S-a descoperit că celulele sinoviale transformate SV40 exprimă niveluri înalte de DR5, comparabile cu cele expuse de către 11 celulele RA. în contrast, celulele fibroblastice netransformate au exprimat niveluri scăzute de DR5, comparabile cu cele expuse de celulele OA din fig. 7b. 13
10.2. Susceptibilitatea celulelor sinoviale RA la apoptoza mediată de TRAS şi TRAIL în general, toate celulele sinoviale izolate de la pacienţii cu RA sunt susceptibile atât 15 la apoptoza indusă de TRAIL, cât şi la cea indusă de anticorpul anti-DR5, şi toate celulele OA sunt rezistente la apoptoza indusă de TRAIL şi de anticorpul anti-DR5, aşa cum se 17 prezintă în fig. 8a, b. Aceste studii indică faptul că anticorpul TRA-8 ţinteşte celule modificate, preferenţial faţă de celulele normale. Mai mult, modelul susceptibilităţii sau al 19 rezistenţei la apoptoza indusă de TRAIL este corelat cu cel indus de anticorpul anti-DR5, indicând faptul că celulele sinoviale utilizează, în principal, DR5, pentru a declanşa apoptoza 21 TRAIL. Aşa cum a fost descris în cazul celulelor maligne, susceptibilitatea la apoptoza indusă 23 de TRAIL sau de anticorpul anti-DR5 a variat printre celulele sinoviale RA, deşi a exprimat niveluri similare de DR5. RA-512 şi RA-707 sunt cele mai susceptibile, deoarece peste 80% 25 dintre celule sunt omorâte de concentraţii de TRAIL sau TRA-8 sub 20 ng/ml. RA-1014, RA-811, RA-716 şi RA-929 sunt printre cele cu susceptibilitate intermediară la TRAIL sau la 27 TRA-8, cu aproape 100% moarte celulară, care apare în prezenţa concentraţiilor mari (>50 ng/ml) de TRAIL sau TRA-8. în celulele RA-1016 şi RA-1021, deşi majoritatea celulelor 29 (peste 60%) sunt omorâte de o doză mică de TRAIL sau TRA-8, o porţiune de celule a supravieţuit în prezenţa concentraţiilor ridicate de TRAIL sau TRA-8, indicând faptul că o 31 subpopulaţie de celule este rezistentă la apoptoza mediată de TRAIL. în contrast, toate celulele de OA sunt mult mai puţin susceptibile la apoptoza indusă de TRAIL şi TRA-8. Nu 33 mai mult de 60% dintre celule sunt omorâte în OA52F şi OA69F, chiar şi în prezenţă de concentraţii ridicate de TRAIL sau de TRA-8. Celulele OA72M sunt complet rezistente la 35 apoptoza indusă de TRAIL sau TRA-8. Celulele sinoviale transformate SV40 sunt de asemenea susceptibile la apoptoza indusă de TRAIL şi TRA-8 (datele nu sunt prezentate), 37 în contrast, celulele fibroblastice, netransformate, au prezentat rezistenţă la TRAI L şi TRA-8. S-a demonstrat anterior faptul că DR5 utilizează, pentru a declanşa apoptoza, o cale 39 dependentă de FADD/caspază 8 (P. Schneider, M. Thome , K. Burns, J. L. Bodmer, K. Hofmann, T. Kataoka, N. Holler, J. Tschopp, 1997, Immunity, Dec.;7(6): 831-836). Pentru a 41 determina dependenţa de caspază, a apoptozei mediate de celulele sinoviale de RA, celulele de RA sunt cultivate cu TRAIL sau cu anticorp anti-DR5, în prezenţa inhibitorilor specifici ai 43 caspazei. Dintre opt inhibitori ai caspazei testaţi, inhibitorii caspazelor 6,8 şi 10 sunt capabili 53 RO 123525 Β1 să inhibe apoptoza celulelor sinoviale de RA induse atât de TRAIL, cât şi de DR5, aşa cum este prezentat în fig. 9, indicând faptul că aceste trei caspaze sunt implicate în apoptoza mediată de DR5. 10.3. TRAS sau TRAIL induc activarea NF-Kb în celule sinoviale de RA fără eliberare crescută de MMP-uri
Există o probă considerabilă pentru a sprijini ideea că există legături strânse între semnalizarea apoptozei şi semnalizarea proliferării (N. J. Kennedy, T. Kataoka, J. Tschopp şi R. C. Budd, 1999, J. Exp. Med., 1891-1896). S-a stabilit faptul că DR5 este capabil să activeze o cale NF-Kb în plus faţă de traducerea semnalizării apoptozei, şi că activarea NF-xb poate fi capabilă să traducă un semnal antiapoptoză. De aceea, este efectuată o analiză de deplasare în gel. Celulele sunt stimulate cu 50 ng/ml de TRAIL solubil recombinat, ligand FAS, în prezenţa a 1 mg/ml agent de intensificare, sau 50 ng/ml de TRA-8, pe perioada de timp indicată. Extractele nucleare sunt preparate şi incubate cu o probă de oligo-ADN marcat cu [32P], colorată de două ori. Rezultatele sunt analizate, utilizând fosfaimagerul cu ciclon (TopCount NXT, Packard Instrument Company, CT). După ce celulele sinoviale RA sunt incubate cu TNF-α sau TRAIL, NF-Kb este activat într-o modalitate dependentă de timp. Anticorpul TRA-8 este capabil să activeze puternic NF-Kb. în contrast, ligandul Fas nu este capabil să inducă activarea NF-Kb, aşa cum se prezintă în fig. 10a.
Astfel, deşi TRAIL şi anticorpul TRA-8 induc un răspuns apoptotic puternicîn celulele sinoviale RA, aceştia activează de asemenea NF-Kb, şi activarea NF-Kb s-a crezut că contribuie la rolul proinflamator al TNF-α în RA. Astfel, este posibil ca TRAIL, ca şi TNF-a, să poată servi ca citokină proinflamatoare. Pentru a determina dacă există o consecinţă biologică similară a activării NF-Kb induse de TRAIL şi TNF-α, producţia de MMP-uri este determinată prin ELISA. Celulele sinoviale sunt cultivate în mediu, peste noapte, singure sau cu 50 ng/ml interleukină 1b, 10 ng/ml TNF-a, 50 ng/ml TRAIL, sau 50 ng/ml TRA-8. Nivelurile de MMP-1 şi MMP-3 în supematantele de cultură sunt determinate cu truse ELISA.
Atunci când celulele sinoviale RA sunt incubate cu citokină proinflamatorie, TNF-a sau IL-1 b, producţia de MMP-1,3 şi 13 a crescut în comparaţie cu martorul mediu, aşa cum este prezentat în fig. 10 b, c. în contrast, tratamentul cu TRAIL sau anticorp anti-DR5 nu este asociat cu o eliberare crescută a acestor MMP-uri.
Exemplul 11 A. Eşecul în inducţia toxicităţii hepatocelulare
Pentru analize de viabilitate celulară de 24 h, au fost achiziţionate in vitro, de laTechnology (Baltimore, MD), hepatocite umane, normale, proaspete, în plăci cu 96 de godeuri. Hepatocitele sunt cultivate în mediul de cultură pentru hepatocite, care conţine 1 pg/ml de TRAIL solubil sau TRA-8. Pentru analize de viabilitate de 6 h, sunt izolate, din specimene chirurgicale proaspete, colectate de la UAB Tissue Procurement Center, hepatocite normale sau celule de cancer hepatocelulare. Toţi reactivii pentru izolarea hepatocitelor umane, inclusiv tamponul de perfuzie pentru hepatocite, mediul de digestie, mediul de spălare şi mediul de ataşare, au fost achiziţionate de la Gibco. Feliile de ţesut sunt digerate în mediul de digestie pentru hepatocite, la 37°C, cu agitare (50 rpm), timp de o oră. Hepatocitele izolate sunt recoltate prin centrifugare de viteză mică (50 g, 3 min) şi spălate, cu mediul de spălare pentru hepatocite, de şase ori. Suspensii cu celule singulare de hepatocite sunt cultivate în mediul de ataşare, care conţine 10% FCS, în plăci cu 96 de godeuri Matrigel (BD), timp de şase ore. Hepatocitele neataşate sunt îndepărtate, spălând 54 RO 123525 Β1 de două ori cu mediul de ataşare preîncălzit. Hepatocitele ataşate sunt după aceea incubate 1 cu diferite concentraţii de TRAIL solubil sau FasL, în prezenţa unui agent de legare încrucişată sau TRA-8 sau CH11, timp de 6 h. 3 TRAIL are cel puţin doi receptori (DR4 şi DR5), care sunt capabili să inducă apoptoza. TRA-8 este utilizat pentru a determina dacă legarea încrucişată (reticularea) 5 numai a DR5 este suficientă pentru a induce apoptoza hepatocitelor normale. Exprimarea DR5 la nivelul proteinei este examinată iniţial în cinci ţesuturi de ficat uman normale şi cinci 7 ţesuturi canceroase de ficat prin imunohistochimie in situ, utilizând TRA-8. Secţiunile din ţesuturile de ficat normale au demonstrat arhitecturi şi morfologii celulare normale prin 9 colorare H&E (fig. 11a, panourile din partea stângă superioară) în absenţa unei reactivităţi pozitive cu TRA-8 pentru DR5 (fig. 11a, grupurile din partea stângă inferioară). în contrast, 11 ţesutul de carcinom hepatocelular uman a reacţionat pozitiv cu TRA-8, într-un model potrivit atât cu membrana celulară, cât şi cu prezenţa citoplasmică a DR5 în celulele canceroase. 13 Linia celulară de carcinom hepatocelular uman HepG2 este de asemenea pozitivă pentru DR5. Aceste rezultate sunt consistente între cele cinci ţesuturi de ficat normale şi numai unul 15 (adenomul de ficat) dintre cele cinci ţesuturi canceroase de ficat este DR5 negativ. Aceste rezultate concordă cu datele de analiză Western blot, prezentate în fig. 5a, care demon- 17 strează, la fel ca şi alte ţesuturi normale, faptul că ţesutul normal de ficat uman nu exprimă niveluri semnificative de proteină DR5. Mai mult, analiza Western blot a hepatocitelor umane 19 normale, examinate cu TRA-8 izolate, nu demonstrează niveluri detectabile de DR5.
Exprimarea DR5 de la suprafaţa celulei pe hepatocite umane prin analiză citometrică 21 în flux a demonstrat faptul că hepatocitele normale preparate proaspăt nu au exprimat niveluri detectabile ale DR5 de la suprafaţa celulei (fig. 11b, panourile din partea stângă 23 superioară). Aceasta nu este detectată nici pe hepatocite umane normale care au fost crioconservate sau plasate în cultură pe termen scurt. în contrast, celulele de carcinom 25 hepatocelular, proaspăt izolate, la fel ca şi celulele HepG2, exprimă DR5 de la suprafaţa celulei. Utilizând Fas ca şi comparaţie, hepatocitele normale, celulele de carcinom 27 hepatocelular şi celulele HepG2, toate au exprimat niveluri echivalente de Fas (fig. 11b, panourile inferioare). Aceste rezultate suntîn acord cu cele obţinute utilizând imunohistochimia 29 in situ şi Western blot, şi indică faptul că DR5 de la suprafaţa celulei este bine exprimat în celulele de ficat canceroase, dar nu şi în hepatocitele normale. Prezenţa nivelurilor mARN, 31 pentru DR4, DR5, DcR1 şi DcR2, în hepatocitele umane, demonstrată prin RT-PCR (T. S.
Griffith, S. R. Wiley, Μ. Z. Kubin, L. M. Sedger, C. R. Maliszewski, N. A. Fanger, J. Exp. 33 Med., 19 Apr, 1999; 189(8): 1343-54), sugerează faptul că hepatocitele umane pot exprima niveluri foarte mici de proteină DR5, care sunt sub pragul pentru detecţie prin TRA-8. 35
Pentru a determina dacă TRA-8 induce toxicitate hepatocelulară, se examinează susceptibilitatea hepatocitelor umane normale la apoptoza indusă de TRA-8 şi de TRAIL 37 solubil plus agent de reticulare. Când hepatocitele normale sunt cultivate în prezenţa unei concentraţii mari de TRAIL, se observă o scădere dependentă de timp a viabilităţii celulare, 39 prin analizele ATPLite (fig. 12a) şi MTT. Moartea celulară, mediată de TRAIL, a hepatocitelor normale, poate fi văzută la patru ore după adăugarea TRAIL. La sfârşitul unei culturi de 24 h, 41 mai mult de 80% dintre hepatocite sunt ucise de TRAIL. Prin contrast, în timpul aceleiaşi perioade, TRA-8 nu a indus o moarte celulară semnificativă a hepatocitelor normale. 43 Nucleele condensate colorate cu Hoechst, o caracteristică a apoptozei, sunt crescute în hepatocitele tratate cu TRAIL, dar nu şi în hepatocitele tratate cu TRA-8 (fig. 12). Numărul 45 55 RO 123525 Β1 de hepatocite apoptotice este bine corelat cu viabilitatea celulară scăzută, după cum se determină prin analiza ATPLite, sugerând faptul că moartea celulară indusă de TRAIL este mediată de apoptoză. Aceasta este confirmată prin capacitatea Z-VAD de a inhiba toxicitatea mediată de TRAIL a hepatocitelor. Deoarece cicloheximida este un agent de creştere eficace al apoptozei, este investigat efectul acestui compus asupra hepatocitelor tratate cu TRAIL şi TRA-8. în timpul unei culturi de patru ore, cicloheximida a crescut în mod semnificativ moartea celulară a hepatocitelor indusă de TRAIL, mai mult de 70% dintre hepatocite fiind ucise de TRAIL în prezenţa cicloheximidei (fig. 12c). Cu toate acestea, tratamentul cu cicloheximidă nu este capabil de a creşte moartea celulară mediată de TRA-8 a hepatocitelor. Pentru a compara caracteristicile apoptozei mediate de TRA-8 cu cea indusă de TRAIL în hepatocite, hepatocite normale, precum şi celule canceroase, sunt incubate cu cantităţi variabile de TRAIL solubil cu agent de reticulare sau cu TRA-8. în timpul unei perioade de cultură de 6 h, TRAIL a indus un răspuns apoptotic moderat în hepatocitele normale. Mai mult de 20% dintre hepatocite sunt ucise în prezenţa a 500 ng/ml TRAIL (fig. 12d, în partea superioară stângă). Tratamentul cu TRA-8 al hepatocitelor normale nu a provocat nicio moarte celulară semnificativă de-a lungul aceleiaşi perioade de timp. în contrast cu hepatocitele normale, celulele de carcinom hepatocelular primar (fig. 12d, partea superioară mijloc) şi celulele HepG2 (fig. 12d, partea superioară dreapta) sunt foarte susceptibile la apoptoza mediată fie de TRAIL, fie de TRA-8. Peste 80% dintre celulele de carcinom hepatocelular şi aproape 100% dintre celulele HepG2 sunt ucise în timpul unei perioade de cultură de 8 h. Aceste rezultate au indicat faptul că hepatocitele normale sunt complet rezistente la apoptoza mediată de TRA-8 şi sunt mult mai puţin susceptibile la apoptoza mediată de TRAIL decât sunt celulele de cancer de ficat. Utilizând ligandul Fas şi anticorpul anti-Fas (CH-11), nu există nicio diferenţă semnificativă în ceea ce priveşte susceptibilitatea la apoptoza mediată de Fas între hepatocitele normale, celulele de carcinom hepatocelular, şi celulele HepG2 (fig. 12d, panourile inferioare).
Exemplul comparativ 11B. Inducţia hepatitei de către TRAIL legat de membrană in vivo Şoareci femele B6 de 8...10 săptămâni sunt injectate intravenos cu 109 pfu de Ad/hTRAIL cu numărul egal de Ad/Tet-on. Şoarecii sunt hrăniţi cu concentraţii diferite de tetraciclină în apa de băut a acestora, imediat după inocularea vectorilor adenovirali. Leziunea hepatică este determinată prin nivelurile serice de AST, utilizând o trusă de diagnostic AST (Sigma). Exprimarea TRAIL este determinată prin analiza Northern.
Pentru a determina dacă forma legată de membrană a TRAIL induce o leziune hepatică in vivo, este construit un vector adenoviral recombinat, care codifică lungimea integrală a TRAIL uman (Ad/hTRAIL), a cărui exprimare se află sub controlul promotorului inductibil de către tetraciclină. La douăzeci şi patru de ore după inocularea intravenoasă a şoarecilor B6 cu Ad/hTRAIL, exprimarea indusă de tetraciclină a TRAIL uman este observată în ficat într-o manieră doză-dependentă, după cum se demonstrează prin analiza Northern blot (fig. 13a). Nivelurile de exprimare a TRAIL sunt corelate bine cu leziunile ficatului, după cum se arată prin creşterea dependentă de tetraciclină a transaminazelor, din nou într-o manieră doză-dependentă (fig. 13b). Deoarece inocularea cu vector adenoviral perse poate creşte susceptibilitatea hepatocitelor la apoptoza mediată de TRAIL, sunt izolate hepatocitele de la şoareci inoculaţi cu Ad/TRAIL şi li se testează moartea celulară mediată de TRAIL. Nu 56 RO 123525 Β1 există o moarte celulară semnificativ crescută a hepatocitelor infectate cu Ad/TRAIL 1 comparativ cu cea de la şoarecii martor (fig. 13c, panoul stâng). Mai mult, şoarecii inoculaţi cu Ad/TRAIL nu au prezentat o leziune crescută a ficatului după injecţia intravenoasă a 3 TRAIL uman solubil. Astfel, urmează ca hepatita indusă de Ad/TRAIL să fie mediată de către nivelurile înalte de exprimare a TRAIL în forma sa membranară. Analiza histologică a 5 secţiunilor de ficat a relevat faptul că leziunea hepatocitelor este vizibilă la 24 h după inocularea vectorului (fig. 13d) şi a persistat cel puţin 7 zile (fig. 13e). Aceste modificări 7 patologice ale ficatului sunt de asemenea dependente de tetraciclină şi aparîntr-o manieră doză-dependentă. Faza iniţială, în 24 h de tratament, a leziunii ficatului, indusă de TRAIL, 9 este caracterizată prin focare de necroză. Infiltrarea celulelor inflamatorii nu se observă în acest stadiu, dar hemoragia apare. Din ziua 7 după inoculare, leziuni difuze în ficat apar, 11 împreună cu o dezordine lobulară marcată, o degenerare severă a hepatocitelor, cu o citoplasmă cu aglomerări neregulate şi cu spaţii clare largi şi cu o apoptoză şi o necroză 13 pregnante. Un infiltrat extensiv de celule mononucleare este o caracteristică a acestui stagiu.
Aceste rezultate au indicat faptul că TRAIL uman, sub forma sa legată de membrană, este 15 capabil să inducă leziunea ficatului in vivo. în ciuda înclinaţiei TRAIL uman de a produce hepatite severe la şoareci, acesta nu induce un răspuns letal. în contrast, şoarecii inoculaţi 17 cu vectori similari, controlaţi de tetraciclină, care codifică ligandul Fas, au dezvoltat o hepatită fulminantă, cu o apoptoză masivă şi cu necroza hepatocitelor, însoţită de o hemoragie 19 severă şi de mortalitate, care apare într-o doză dependentă de tetraciclină, la 72 h de la inoculare. Rata mortalităţii a ajuns la 100%, în 48 h, în acele subgrupe care primesc 3 mg/ml 21 tetraciclină. în contrast, toţi şoarecii care au primit Ad/hTRAIL, în ciuda dozei de tetraciclină, sunt încă în viaţă, la patru săptămâni după inoculare. Astfel, rezultă că, in vivo, forma legată 23 de membrană a TRAIL este un inductor mai puţin eficace al leziunilor hepatocelulare decât ligandul Fas. Aceasta sugerează, în continuare, că TRAIL poate induce leziuni hepatice 25 printr-un mecanism care diferă de mecanismele care prezintă toxicitatea ligandului Fas.
Exemplul 12. Celulele T şi B umane activate exprimă niveluri crescute de DR5 27
Pentru a determina dacă DR5 joacă un rol în apoptoza mediată de TRAIL a celulelor T şi B activate, se examinează exprimarea la suprafaţă a DR5, pe celulele T şi B în repaus 29 sau activate, utilizând TRA-8. Celulele T umane, nestimulate în PBMC, nu au exprimat niveluri semnificative de DR5 (fig. 14). La 48 h după stimularea, fie anti-CD3, fie Con-A, 31 exprimarea DR5 de la suprafaţa celulei este crescută semnificativ. în mod similar, celulele B nestimulate au exprimat niveluri foarte joase de DR5. Stimularea cu anti-μ, dar nu cu LPS, 33 a avut ca rezultat o exprimare crescută la suprafaţa celulei a DR5. Aceste rezultate au indicat că ambele celule T şi B activate exprimă niveluri mai mari de DR5 la suprafaţa celulei. 35 Celulele sunt colorate cu 20 pg/ml TRA-8 şi lgG1 antişoarece PE.
Exemplul 13. Celulele T şi B activate devin susceptibile la apoptoza mediată de 37
TRAS
Pentru a determina dacă celulele activate T şi B sunt susceptibile la apoptoza 39 mediată de TRAIL, celulele T şi B de PBMC uman sunt stimulate cu anti-CD3 sau, respectiv, cu anti-μ in vitro, timp de 48 h. Celulele gliale şi celulele bolnave, care proliferează, sunt 41 colectate prin centrifugare în gradient şi sunt incubate cu concentraţii diferite de TRA-8. Celulele T şi B nestimulate nu sunt susceptibile la apoptoza mediată de TRA-8 (fig. 15). 43 57 RO 123525 Β1
Celulele T şi B stimulate total au prezentat o susceptibilitate moderat crescută la apoptoza mediată de TRA-8, 20% dintre celule fiind ucise de TRA-8, după cultivare peste noapte. Celulele T bolnave, cu proliferare înaltă, sunt chiar mai susceptibile la apoptoza mediată de TRA-8. Celulele B bolnave sunt, de asemenea, mai susceptibile la apoptoza mediată de TRA-8, comparativ cu altele. Aceste rezultate au indicat faptul că celulele activate T şi B sunt susceptibile la apoptoza mediată de DR5.
Exemplul 14. TRA-8 produce depleţia celulelor T activate la şoarecii uman/SCID Pentru a determina eficacitatea anticelulă T, in vivo, a TRA-8, şoareci NOD/SCID sunt injectaţi intravenos cu 1x108 PMBC uman. în mod normal, celulele T umane din şoarecii SCI D sunt rapid activate, ca răspuns la stimularea xenogenică. Şoarecii PBMC/SCID umani sunt injectaţi intraperitoneal cu 100 pg TRA-8 sau cu lgG1 martor din ziua transferului, şi se repetă zilnic, timp de 3 zile. La cinci zile după transfer, celulele mononucleare se izolează din splină şi se colorează cu anticorp CD3 antiuman, iar populaţia de limfocite este analizată prin analiză citometrică în flux şi se determină celulele umane T CD3 pozitive. Aproximativ 30% dintre limfocitele splenice sunt celule T umane, după cum se determină prin colorarea CD3 antiuman, la şoarecii martor trataţi. Cu toate acestea, doar câteva celule T umane (mai puţin de 3%) sunt observate printre limfocitele splenice la şoarecii trataţi cu TRA-8 (fig. 16). Studiul histologic in situ a revelat faptul că, în splina şoarecilor martor, celulele T umane sunt repopulate în splină, şi doar câteva celule apoptotice se observă, după cum s-a demonstrat prin colorarea TUNEL. în contrast, repopularea cu celule umane viabile T nu se observă în splina şoarecilor trataţi cu TRA-8, ci mai degrabă se observă mai multe celule (fig. 17). Aceste rezultate demonstrează faptul că TRA-8 are o activitate celulară anti-T in vivo, şi indică utilizarea anticorpilor din invenţie pentru tratamentul bolii GVH.
Exemplul 15. Activitatea terapeutică anticancera TRA-8 15.1. Exprimarea şi DR5, funcţionarea DR5 în ţesuturile şi liniile de celule canceroase umane i. Exprimarea DR5 în ţesuturile canceroase umane prin colorarea in situ cu TRA-8 Pentru a determina dacă celulele şi ţesuturile canceroase exprimă în mod diferenţial niveluri mai înalte de DR5, un grup de ţesuturi canceroase umane, incluzând peste 20 de cancere de sân, 6 cancere ovariene, 5 cancere de colon şi 5 cancere de prostată, se colorează cu TRA-8, pentru imunochimie. Majoritatea acestor ţesuturi canceroase au exprimat DR5 detectabil. Nivelurile de exprimare ale DR5, în aceste ţesuturi canceroase, au fost diferite. în general, ţesuturile canceroase au exprimat niveluri mai înalte de DR5 decât ţesuturile neimplicate. în plus, exprimarea DR5 aparent nu este corelată cu mutaţia p53. ii. Exprimarea şi funcţionarea DR5 în liniile de celule canceroase umane (tabelul 2) La nouă linii de celule de cancer de sân, la trei linii de cancer ovarian, la trei linii de cancer de colon şi la trei linii de cancer de prostată, li s-au examinat exprimarea de suprafaţă a DR5 şi susceptibilitatea la apoptoza indusă de TRA-8 in vitro. 7 din 9 linii de cancere de sân, 3 din 3 linii de cancer de colon şi 3 din 3 linii de cancer de prostată au exprimat niveluri variabile de DR5 de suprafaţă. Dintre 9 linii de cancer de sân, 3 sunt foarte susceptibile, 3i sunt intermediare şi 3 sunt rezistente la apoptoza mediată de TRAIL. Toate liniile de cancer ovarian sunt foarte susceptibile. Una din trei linii de cancer de colon este foarte susceptibilă, în timp ce două au o sensibilitate intermediară. Două din trei linii de cancer de prostată au sensibilitate intermediară şi una este rezistentă. 58 RO 123525 Β1
Tabelul 2
Exprimarea şi funcţionarea DR5 în celulele de cancer umane
Linia de celule Originea Exprimarea1 Susceptibilitatea2 2LMP Sân + ++++ LCC6 Sân +++ ++++ MB468 Sân +++ +++ MB231 Sân ++ +++ ZR-75-1 Sân +++ ++ SKBR3 Sân + ++ MB453 Sân ++ + BT474 Sân + - DY36T2 Sân - - Caov-3 Ovar + ++++ OVCAR-3 Ovar ++ ++++ Skov-3 Ovar + +++ WiDR Colon +++ ++++ HST29 Colon ++ +++ T84 Colon + ++ PC3 Prostată +++ ++ LnCap Prostată +++ + Du-145 Prostată +++ +
Notă: 1 determinată prin citometrie în flux, celulele sunt colorate cu 20 pg/ml TRA-8 şi comparativ cu anticorpul martor.2 determinat prin analiza ATPLite. ++++: peste 80% omorâre, +++ între 60 şi 80%, ++: omorâre între 40 şi 60%, +: omorâre între 20 şi 40%, - fără omorâre. iii. Citotoxicitatea combinată a TRA-8 cu Adriamicină în câteva linii de cancer de sân, se examinează efectul Adriamicinei asupra apoptozei induse de TRA-8. Doze mari de Adriamicină au prezentat un efect aditiv. Cu toate acestea, la unele dintre liniile de celule rezistente la TRA-8, doze mici de Adriamicină cresc sinergie apoptoza indusă de TRA-8. iv. Activitatea de legare in vitro şi in vivo a TRAS la celulele canceroase umane Utilizând TRA-8 marcat cu radioizotopi, activitatea TRA-8 asupra unei linii de cancer de celule este examinată in vitro şi in vivo, la şoarecii SCID la care s-a implantat tumoarea. Activitatea de legare in vitro a celulelor canceroase se estimează ca valoare Kd de 3 nM, care este concordanţă cu previziunile noastre, utilizând ELISA, şi de cel puţin 50 de ori mai mare decât a TRAIL solubil. In vivo, TRA-8 s-a localizat în ţesuturile tumorale implantate. 59 RO 123525 Β1
15.2. Terapia leucemiei cronice limfolitice la şoarecii NOD/SCID cu TRAS
Leucemia limfolitică cronică este o formă comună de malignitate a celulelor B. Cele mai multe celule B maligne în CLL sunt cu fenotip matur şi sunt rezistente la mulţi stimuli apoptotici. Sunt examinate exprimarea şi funcţionarea DR5în celulele B la cinci pacienţi cu CLL. Toţi pacienţii au avut un număr mare de celule B, care s-au dovedit a fi mai mult de 95% celule CD19+B în PBMC. Comparativ cu celulele B primare, celulele B de CLL ale tuturor pacienţilor au avut niveluri mai înalte de DR5 de la suprafaţa celulei şi sunt mai susceptibile la apoptoza indusă de TRA-8 in vivo. Interesant, celulele CLL B sunt de asemenea sensibile la toxicitatea indusă bisindolmaleimidă VIII (BisVIII). Consecutiv tratamentului cu TRA-8 şi BisVIII, aproape 50% dintre celulele B de CLL sunt ucise, în timp ce celulele B normale au rămas fără răspuns (fig. 18). Transferul celulelor B de CLL în şoareci NOD/SCID a avut ca rezultat o repopulare cu celule CD19+B 25...30% a splinei şoarecilor receptori, la cinci zile după transfer. Cu toate acestea, trei doze de tratament cu 100 pg TRA-8 au eliminat complet celulele B de CLL, la patru din cinci pacienţi, în splina şoarecilor SCI D receptori. Astfel, TRA-8 singur sau împreună cu alte substanţe este activ ca agent terapeutic, pentru leucemia limfolitică cronică.
Exemplul 16. Clonarea cADN
1. Determinarea secvenţelor de aminoacid ale capătului N-terminal al lanţurilor greu şi uşor ale TRAS
Pentru a obţine cADN-urile lanţurilor uşor şi greu ale TRA-8, secvenţele de aminoacid ale capătului N-terminal al lanţurilor greu şi uşor ale TRA-8 şi genele donate ale TRA-8 se determină prin tehnicile cunoscute. 10 pg de soluţie care conţine anticorpul antiuman TRA-8 DR5 sunt supuse electroforezei în gel de SDS-poliacrilamidă („SDS-PAGE"), utilizând o concentraţie a gelului de 12% gr/v, 100 V tensiune constantă, timp de 120 min. După elecroforeză, gelul este imersat in tampon de transfer Tris-HCI 25 mM (pH 9,5), 20% metanol, 0,02% vol/vol SDS, timp de 5 min. După acest timp, conţinutul proteic al gelului este transferat pe o membrană de difluorură de poliviniliden („membrană de PVDF"); mărimea porilor 0,45 pm; Milipore, Japonia), îmbibată anterior în tamponul de transfer, utilizând un aparat pentru blotting (KS-8451; Marysol), în condiţii de tensiune constantă de 10 V, 4°C, timp de 14 h.
După acest timp, membrana PVDF este spălată cu tampon de spălare cu NaCI 25 mM, 10 mM tampon borat sodic (pH 8,0), apoi a fost colorată într-o soluţie de colorare (50% vol/vol metanol, 20% vol/vol acid acetic şi 0,05% gr/vol Coomasie Brilliant Blue), timp de 5 min, pentru a localiza benzile proteice. Membrana PVDF este apoi decolorată cu metanol apos 90% vol/vol, iar benzile care corespund lanţului greu, banda cu mobilitate scăzută şi lanţul greu, banda cu mobilitate mare localizată anterior pe membrana PDVF, sunt excizate şi spălate cu apă deionizată.
Secvenţa aminoacizilor de la capătul N-terminal al lanţurilor uşor şi greu este determinată prin metoda automată Edman (Edman, P. etal., (1967), Eur. J. Biochem., 1,80), utilizând un secvenţiator de proteină în fază gazoasă (PPSQ-10; Shimadzu Seisakusyo, K. K.).
Secvenţa aminoacizilor de la capătul N-terminal al benzii corespunzătoare la lanţul greu este determinată ca fiind:
Glu-Val-Met-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Lys-Leu (SECV ID Nr. 4 din lista de secvenţe); 60 RO 123525 Β1 şi cea a benzii corespunzătoare la lanţul uşor este determinată ca fiind: 1
Asp-lle-Val-Met-Thr-GIn-Ser-His-Lys-Phe-Met-Ser-Thr-Ser-Val-Gly-Asp-Arg-Val-Ser (SECV ID Nr. 5 din lista de secvenţe); 3
Compararea acestor secvenţe de aminoacizi cu baza de date a secvenţelor de aminoacizi ai anticorpilor produşi de Kabat et al. (Kabat E. A. et al., 1991, în Sequences of 5 proteins of immunological interest (Secvenţe de proteine de interes imunologic), Voi. II, U. S., Department of Health and Human Services) a revelat faptul că lanţul greu (lanţul γ1) şi 7 lanţul uşor (lanţul k) ale lui TRA-8 aparţin subtipurilor al 3-lea şi, respectiv, primului. 2. donarea cADN 9
Pe baza descoperirilor de mai sus, sunt sintetizaţi primerii oligonucleotidici, care este de aşteptat să hibridizeze cu porţiunile din regiunile 5'-netranslatate şi cu cele chiar de la 11 capătul regiunilor 3'-translatate ale genelor care aparţin subtipurilor şoarece. Apoi, cADN-urile care codifică lanţurile greu şi uşor ale lui TRA-8 sunt donate prin următoarea combinaţie 13 a revers transcripţiei şi PCR (RT-PCR): a. Matrita 15 ) ARN-ul total al hibridomului TRA-8 (ATCC Nr. PTA-1428) este extras, utilizând reactivul TRIzol (GIBCO BRL). Matriţa pentru reacţia PCR a utilizat cADN-ul care este 17 obţinut utilizând trusa de sinteză cADN First-Strand (Amersham Pharmacia Biotech) în conformitate cu manualul de instruire furnizat cu trusa. 19
b. Primerii PCR
Următorii primeri oligonucleotidici se sintetizează pentru PCR: 21 5'-cagcactgaa cacggacccc-3' (H5NCS1: SECV ID Nr. 6 din lista de secvenţe): 5'-aaaggtaatt tattgagaag-3' (H5NCS2: SECV ID Nr. 7 din lista de secvenţe); 23 5'-cctcaccatg aacttcgggc-3' (H5SS1: SECV ID Nr. 8 din lista de secvenţe); 5'-ctgttgtatg cacatgagac-3' (H5SS2: SECV ID Nr. 9 din lista de secvenţe); 25 5'-gaagtgatgc tggtggagtc-3' (H5CS1: SECV ID Nr. 10 din lista de secvenţe); 5'-agtgtgaagt gatgctggtg-3' (H5CS2: SECV ID Nr. 11 din lista de secvenţe); 27 5'-tttaccagga gagtgggaga g-3' (H3CR: SECV ID Nr. 12 din lista de secvenţe); 5'-tgcagagaca gtgaccagag-3' (H3VR: SECV ID Nr. 13 din lista de secvenţe); 29 5'-tgttcaggac cagcatgggc-3' (L5NCS1: SECV ID Nr. 14 din lista de secvenţe); 5'-aagacatttt ggattctaac-3' (L5NCS2: SECV ID Nr. 15 din lista de secvenţe); 31 5'-tatcatgaag tctttgtatg-3' (L5SS1: SECV ID Nr. 16 din lista de secvenţe); 5'-gatggagaca cattctcagg-3' (L5SS2: SECV ID Nr. 17 din lista de secvenţe); 33 5'-gacattgtga tgacccagtc-3' (L5CS: SECV ID Nr. 18 din lista de secvenţe); 5'-ttaacactca ttcctgttga-3' (L3CR: SECV ID Nr. 19 din lista de secvenţe; 35 Şi 5'-gactgggtca tcacaatgtc-3' (LCSR: SECV ID Nr. 20 din lista de secvenţe). 37
Dacă nu este altfel specificat, toate oligonucleotidele din aceste exemple sunt sintetizate de către Pharmacia Biotech. Toate oligonucleotidele sunt depozitate la -20°C, 39 după ce sunt dizolvate în apă distilată. c. Reacţia PCR 41
Compoziţia soluţiei reacţiei PCR: - matriţa cADN 5 μΙ din totalul de 33 μΙ de reacţie; 43 - primerul DR5p1 ........................................... 10pmol; - primerul DR5p2 ........................................... 10pmol; 45 61 RO 123525 Β1 - tamponul concentrat PCR 10 x (furnizat cu trusa) ...................10 μΙ; - dNTP-uri (fiecare 2,5 mM) ....................................4 μΙ; şi - polimeraza Taq (Promega) .................................. 5 unităţi.
Se adaugă apă distilată sterilă, la soluţie, la un volum total de 100 μΙ. Dacă nu este altfel specificat, dNTP-urile sunt un amestec echimolar de dATP, dCTP, dGTP şi dTTP (2,5 mM fiecare).
Reacţia PCR este condusă după cum urmează. Soluţia este mai întâi încălzită la 94°C, timp de 2 min, după care se repetă de 40 de ori un ciclu de încălzite la 94°C, timp de 30 s, la 52°C, timp de 1 min şi la 72°C, timp de 3 min. După efectuarea acestei proceduri, soluţia de reacţie este încălzită la 72°C, timp de 10 min.
Fragmentele de ADN amplificate, astfel obţinute, sunt separate pe gel de agaroză care conţine 0,25 pg/ml bromură de etidiu. Benzile determinate ca conţinând fragmentele de ADN dorite sunt îndepărtate prin tăiere, utilizând o lamă de ras, iar ADN-ul este recuperat de acolo, utilizând o trusă Gene Clean (BIO101). Fragmentul ADN este donat, utilizând vectorul pGEM-T Easy (Promega). Acest lucru este realizat după cum urmează:
Fragmentul de ADN recuperat din soluţia de reacţie PCR, împreună cu 50 ng de vector pGEM-T Easy (furnizat împreună cu trusa), este amestecat cu 1 μΙ de 10 x tampon de reacţie cu ligază (6 mM Tris-HCI (pH 7,5), 6 mM clorură de magneziu, 5 mM clorură de sodiu, 7 mM β-mercaptoetanol, 0,1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM spermidină şi 0,1 mg/ml albumină serică bovină), la care s-au adăugat 4 unităţi deT4 ADN ligază (1 μΙ). Volumul total al amestecului este ajustat la 10 μΙ cu apă deionizată sterilă şi soluţia de ligaze este incubată la 14°C, timp de 15 h . După acest timp, 2 μΙ de soluţie de reacţie cu ligază se adaugă la 50 μΙ de tulpină de E. coli JM109, competentă (furnizată împreună cu trusa şi adusă la competenţă în conformitate cu manualul de utilizare), la care s-au adăugat 2 μΙ β-mercaptoetanol 0,5 M, iar amestecul rezultat este menţinut pe gheaţă, timp de 30 min, apoi la 42°C, timp de 30 s şi din nou pe gheaţă, timp de 5 min. Apoi, se adaugă, la cultură, 500 μΙ de mediu care conţine 2% v/v triptonă, 0,5% gr/v extract de drojdie, 0,05% gr/v clorură de sodiu, clorură de potasiu 2,5 mM, clorură de magneziu 1 mM, şi glucoză 20mM (la care se va face referire de acum înainte ca mediu "SOC"), iar amestecul se incubează timp de o oră, la 37°C, cu agitare. După acest timp, cultura este răspândită pe o placă de agar cu bulion L (conţine 1 % v/v triptonă, 0,5% gr/v extract de drojdie, 0,5% gr/v clorură de sodiu, 0,1% grN glucoză, şi 0,6% gr/v bacto-agar (Difco)), care conţine 100 pg/ml. Coloniile rezistente la ampicilină, care apar pe placă, sunt selectate şi răzuite cu o ansă de transfer din platină şi se cultivă în mediu cu bulion L, care conţine 100 pg/ml ampicilină, la 37°C, peste noapte, agitând la 200 rpm. După incubare, celulele sunt recoltate prin centrifugare, celule din care se prepară ADN plasmidian prin metoda alcalină. Plasmida obţinută este desemnată ca plasmidă pH62 pentru lanţul greu al TRA-8 sau pL28 pentru lanţul uşor al TRA-8. Tulpinile de E. coli transformante, purtătoare ale acestui plasmid, desemnate ca E. coli JM109/pH62 şi E. coli JM109/pL28, au fost depozitate în Organismul Depozitar al Brevetului Internaţional, Institutul Naţional de Ştiinţă şi Tehnologie Industrială Avansată, 1-1, Higashi 1 chome Tsuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia, în 20 aprilie 2001, în conformitate cu Tratatul de la Budapesta pentru Depozitele de Microorganisme, şi au primit numerele de acces FERM BP-7560 şi, respectiv, FERM BP-7561 . Secvenţele de nucleotide, ale acestor ADN-uri care codifică lanţul greu şi lanţul uşor al TRA-8, sunt confirmate prin metoda dideoxi (F. S. Sânger etal., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74:5463-5467), utilizând analizorul 3700 DNA (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia). 62 RO 123525 Β1
Secvenţele de nucleotide ale lanţurilor greu şi uşor ale TRA-8 sunt date ca SECVID 1 nr. 21 şi, respectiv, nr. 22, din Lista de Secvenţe. Secvenţa de aminoacizi a lanţurilor greu şi uşor ale TRA-8 este dată ca SECV ID nr. 23 şi, respectiv, nr. 24, din Lista de Secvenţe. 3 Secvenţele de aminoacid de la capătul N-terminal al lanţurilor greu şi uşor ale TRA-8, stabilite mai sus, se potrivesc perfect. Mai mult, când secvenţele de aminoacizi ale lanţului 5 greu şi uşor se compară cu baza de date a secvenţelor de aminoacizi ale anticorpilor, se stabileşte că, pentru lanţul greu, nucleotidele de la nr. 58 la 414, din SECV ID nr. 21, au 7 constituit regiunea variabilă, în timp ce nucleotidele de la nr. 415 la 1392, din SECV ID nr. 21, au constituit regiunea constantă. Pentru lanţul uşor, nucleotidele de la nr. 64 la 387, din 9 SECV ID nr. 22, au constituit regiunea variabilă, în timp ce nucleotidele de la nr. 388 la 702, din SECV ID nr. 22, au constituit regiunea constantă. Locaţiile şi secvenţele CDR-urilor sunt 11 de asemenea elucidate, comparând omologiile cu baza de date. Secvenţele de aminoacizi ale CDR1, CDR2 şi CDR3 ale lanţului greu al TRA-8 sunt prezentate în SECV ID nr 25, nr. 13 26 şi, respectiv, nr. 27. Secvenţele de aminoacizi ale CDR1, CDR2 şi CDR 3 ale lanţului greu al TRA-8 sunt prezentate în SECV ID nr. 28, nr. 29 şi, respectiv, nr. 30. 15
Exemplul 17. Proiectarea unei versiuni umanizate a anticorpului TRAS 1. Modelarea moleculară a regiunii variabile a TRAS 17
Modelarea moleculară a regiunii variabile a TRA-8 este realizată prin metoda cunoscută în general ca modelare de omologie (Methods in Enzymology, 203, 121-153, 1991). 19
Secvenţele primare ale regiunilor variabile ale imunoglobulinei umane, înregistrate în Banca de Date pentru Proteine (Nuc. Acid. Res., 28, 235-242, 2000), pentru care structurile tridi- 21 mensionale, derivate din analiza cristalografică cu raze X, sunt disponibile, se compară cu regiunile cadru ale TRA-8, determinate mai sus. Ca rezultat, 1NCD şi 1HIL sunt alese ca 23 având cea mai înaltă omologie a secvenţelor cu regiunile cadru ale lanţurilor uşor şi, respectiv, greu, ale TRA-8. Structurile tridimensionale ale regiunilor cadru sunt generate prin 25 combinarea coordonatelor 1NCD şi 1 HIL, care corespund lanţurilor greu şi uşor ale TRA-8, pentru a obţine "modelul cadru". Utilizând clasificarea definită de Clothia et al., CDR-urile 27 TRA-8 se clasifică după cum urmează: CDRL,, CDRL2, CDRH., şi CDRH2 care aparţin claselor canonice 2, 1, 1, respectiv, 3, în timp ce CDRL3 nu aparţine vreunei clase canonice 29 specifice. Buclele CDR ale CDR.,, CDRL2, CDRH1 şi CDRH2 sunt fixate în conformaţiile inerente claselor canonice ale lor şi sunt integrate în modelul cadru. Lui CDRL3 îi este 31 desemnată conformaţia clusterului 8A, în conformitate cu clasificarea lui Thornton et al. (J.
Mol. Biol., 263, 800-815, 1996), şi CDRH3 este clasificată în k(8)C, utilizând regula H3 33 (scrisoarea FEBS 455, 188-197,1999). Apoi conformaţiile reprezentative pentru CDRL3 şi CDRH3 sunt integrate în modelul cadru. 35 în final, se efectuează calcule de energie, pentru a elimina legăturile interatomice nefavorabile, pentru a obţine un model molecular probabil al regiunii variabile a TRA-8 în 37 termeni de energie. Procedura de mai sus se realizează, utilizând sistemul comun de modelare moleculară ABM (Oxford Molecular Limited, Inc). Pentru modelul molecular obţinut, 39 acurateţea structurii este evaluatăîn continuare, utilizând softul PROCHECK (J. Appl. Cryst. (1993),26,283-291). 41 2. Proiectarea secvenţelor de aminoacizi pentru TRAS umanizat
Construcţia anticorpilor TRA-8 umanizaţi se realizează prin metoda cunoscută în 43 general ca grefare CDR (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86, 10029-10033, 1989). Anticorpul 63 RO 123525 Β1 acceptor este ales pe baza omologiei dintre aminoacizii din regiunea cadru. Secvenţele regiunii cadru din Tra-8 se compară cu toate secvenţele de cadru din baza de date Kabat de secvenţe de aminoacizi ale anticorpilor (Nuc. Acid Res., 29, 205-206, 2001). Ca rezultat, anticorpul mAB58'CL este selectat ca acceptor datorită celei mai înalte omologii a secvenţei, 80%, a regiunii cadru. Resturile de aminoacid din regiunea cadru ale mAB58'CL sunt aliniate cu cele pentru TRA-8 şi sunt identificate poziţiile unde se utilizează aminoacizi diferiţi. Locaţia acelor resturi este analizată, utilizând modelul tridimensional al TRA-8, construit mai sus, şi resturile donoare, care ar trebui să fie grefate pe acceptor, sunt alese pe baza criteriului dat de Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86, 10029-10033, 1989). Secvenţele de TRA-8 umanizat sunt construite aşa cum se descrie în următorul exemplu, prin transferarea mai multor resturi donor într-un anticorp acceptor, mAb58'CL.
Exemplul 18. Construcţia unui vector de expresie pentru lanţul greu al anticorpului umanizat 1. Construcţia plasmidei purtătoare a ADN-ului regiunii variabile a lanţului greu al TRA-8 umanizat
Pentru a determina activitatea TRA-8 umanizat, plasmida purtătoare a lanţului greu al TRA-8 umanizat este construită după cum urmează. Cu toate acestea, se apreciază că umanizarea lui TRA-8 nu este limitată la aceste exemple. Aşa cum este prezentat în SECV ID Nr. 31 a listei de secvenţe, umanizarea secvenţelor de aminoacizi ale lanţului greu al anticorpului DR5 antiuman de şoarece TRA-8 a determinat înlocuirea celui de-al 13-lea aminoacid (lizina), celui de-al 19-lea aminoacid (lizina), celui de-al 40-lea aminoacid (treonina), celui de-al 42-lea aminoacid (acidul glutamic), celui de-al 44-lea aminoacid (arginina), celui de-al 84-lea aminoacid (serina), celui de-al 88-lea aminoacid (serina), celui de-al 93-lea aminoacid (metionina), celui de-al 114-lea aminoacid (treonina), celui de-al 115-lea aminoacid (leucina) cu glutamina, arginina, alanina, glicina, glicina, asparagina, alanina, valina, leucina şi respectiv valina.
Plasmida purtătoare a regiunii variabile a lanţului greu al TRA-8 umanizat codificatoare de ADN (SECV ID Nr. 31 a listei de secvenţe) este construită după cum urmează. PCR este utilizată pentru a construi următoarele secvenţe ADN, fiecare dintre acestea cuprinzând cele descrise mai sus.
Sunt sintetizate următoarele 12 oligonucleotide: 5'- ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtgtccac -3' (A; SECV ID Nr. 32); 5'- tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg -3' (B; SECV ID Nr. 33); 5'- attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga gtgggttgca accattagta -3' (C; SECV ID Nr. 34); 5'- gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaccctg -3' (D; SECV ID Nr. 35); 5'- tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3' (E; SECV ID Nr. 36); 5'- ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat cggtc -3' (F; SECV ID Nr. 37); 64 RO 123525 Β1 5'- ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa -3' (G; 1 SECV ID Nr. 38); 5'- tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct 3 gtagctgttg -3' (H; SECV ID Nr. 39); 5'- tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg 5 cacaggagag -3' (I; SECV ID Nr. 40); 5'- ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac tactaatggt 7 tgcaacccac -3' (J; SECV ID Nr. 41); 5'- ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc 9 ttggcattgt -3' (K; SECV ID Nr. 42); 5'- gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta gtccgtcgta 11 atcatagagt cacc -3' (L; SECV ID Nr. 43).
Următorii 2 primeri PCR sunt sintetizaţi aşa cum s-a descris mai sus: 13 5'- ttggataagc ttggcttgac -3' (P1; SECV ID Nr. 44); şi 5'- gaccgatggg cccttggtgg a -3' (P2; SECV ID Nr. 45). 15
Sinteza ADN-ului care codifică un lanţ polipeptidiccare conţine o secvenţă de semnal de secreţie, o regiune variabilă a lanţului greu al TRA-8 umanizat şi cele 8 resturi de amino- 17 acid de la capătul N-terminal al regiunii lgG-CH1 este realizată, utilizând o combinaţie a PCR.
Fragmentul ADN este preparat după cum urmează. 19
Compoziţia soluţiei de reacţie PCR: - oligonucleotida A .......................................... 10pmol; 21 - oligonucleotida B .......................................... 10pmol; - oligonucleotida C .......................................... 10pmol; 23 - oligonucleotida D .......................................... 10pmol; - oligonucleotida E .......................................... 10pmol; 25 - oligonucleotida F .......................................... 10pmol; - oligonucleotida G .......................................... 10pmol; 27 - oligonucleotida H .......................................... 10pmol; - oligonucleotida I ........................................... 10pmol; 29 - oligonucleotida J .......................................... 10pmol; - oligonucleotida K .......................................... 10pmol; 31 - oligonucleotida L .......................................... 10pmol; - oligonucleotida primer P1 ..................................... 2 μΜ; 33 - oligonucleotida primer P2 ..................................... 2 μΜ; - tampon 10 X Pyrobest II ...................................... 10 μΙ; 35 - dNTP mix................................................... 8 μΙ; - ADN polimerază Pyrobest II ..................................0,5 μΙ şi 37 - apă redistilată la un volum final de 50 μΙ.
Reacţia PCR este condusă după cum urmează. Soluţia este mai întâi încălzită la 39 94°C, timp de 5 min, după care un ciclu de încălzire la 98°C, timp de 10 s, la 55°C, timp de 30 s şi la 72°C, timp de un minut, care este repetat de 7 ori. După efectuarea acestei 41 proceduri, soluţia de reacţie este încălzită la 72°Cn timp de 15 min.
Se adaugă un volum egal de fenol-cloroform (50% v/v fenol saturat cu apă, 48% v/v 43 cloroform, 2% v/v alcool izoamilic) la 200 μΙ din fiecare dintre produşii PCR şi se amestecă viguros, timp de un minut. După acest interval de timp, amestecul este centrifugat la 10OOOx g 45 65 RO 123525 Β1 şi stratul apos este recuperat şi amestecat cu un volum egal de cloroform-alcool izoamilic (96% v/v cloroform şi 4% v/v alcool izoamilic), care este din nou amestecat viguros la 10000 x g şi stratul apos este recuperat. Seria de etape expusă în acest paragraf este denumită de acum înainte „extracţia fenolului").
Se efectuează apoi precipitarea din etanol a stratului apos recuperat. Aşa cum este utilizată şi denumită aici, „precipitarea din etanol" constă în adăugarea, cu amestecare, a unei zecimi de volum de acetat de sodiu 3M (pH 5,2) şi a 2,5 volume de 100% etanol la soluţia care trebuie tratată, şi îngheţarea amestecului, utilizând gheaţă uscată. Amestecul rezultat este apoi centrifugat la 10000 X g, pentru a recupera ADN-ul ca precipitat.
După extracţia cu fenol şi precipitarea din etanol, precipitatul de ADN rezultat este uscat în vid, dizolvat într-un minimum de apă redistilată, şi separat prin electroforeză în gel de agaroză 3%. După electroforeză, gelul este colorat cu 1 pg/ml soluţie apoasă de bromură de etidiu, pentru a permite detectarea ADN în lumină UV. Banda ADN corespunzătoare ADN TRA-8 umanizat este tăiată, utilizând o lamă de ras şi este eluată din gel, utilizând trusa Geneclean Spin (BIO 101, CA, SUA). După extracţia cu fenol, ADN-ul eluat este apoi concentrat prin centrifugare la 7500 X g, urmată de precipitare din etanol şi, în final, se dizolvă în 5 pl apă distilată.
Fiecare ADN extras rezultat se donează, utilizând vectorul pGEM-T Easy (Promega), după cum urmează: - fragment de ADN recuperat din reacţia PCR ........................5 μΙ; - tampon Taq polimerază ....................................10X1 μΙ; - amestec dNTP ...............................................1 μΙ; - Taq polimerază (5 unităţi/ml) .................................. 1 μΙ şi - apă redistilată la un volum final de 10 μΙ.
După ce fiecare dintre soluţiile de mai sus reacţionează la 70°C, timp de 30 min, fiecare soluţie de ADN şi vector pGEM-T Easy sunt legate, utilizând trusa DNA Ligation Versiunea 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd), utilizând protocolul fabricantului.
După 4 h de incubare la 15°C, 2 μΙ de soluţie de reacţie incubată se amestecă cu 100 μI de tulpină de E. coli JM109 competentă la densitatea celulară de 1-2 x 109 celule/ml (Takara Shuzo Co., Ltd) şi amestecul este menţinut pe gheaţă, timp de 30 min, apoi la 42°C, timp de 30 s şi din nou pe gheaţă, timp de un minut. Apoi se adaugă la amestec 500 μΙ de mediu SOC (2% v/v triptonă, 0,5% gr/v extract de drojdie, 0,05% gr/v clorură de sodiu, 2,5 mM gr/v clorură de potasiu, clorură de magneziu 1 mM şi glucoză 20 mM), care este incubat timp de încă o oră, agitând. Tulpinile transformante sunt apoi izolate şi se prepară ADN plasmidian din tulpini, după descrierea din Molecular Cloning, a Laborator/ Manual. Secvenţele de nucleotide ale acestor ADN-uri care codifică lanţul greu al TRA-8 umanizat, sunt confirmate prin metoda dideoxi (F. S. Sânger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. SUA, 74:5463-5467), utilizând analizorul 3700 DNA (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).
Plasmidele rezultate se denumesc pHB14 (plasmida care poartă cADN-ul care codifică lanţul greu al TRA-8 umanizat). Tulpina de E. coli transformantă, care poartă această plasmidă, desemnată E. coli JM109/pHB14, a fost depozitată la Organismul Internaţional Depozitar al Brevetelor, Institutul Naţional pentru Ştiinţă şi Tehnologie Avansată, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia, în 20 aprilie 2001, în acord cu Tratatul de la Budapesta pentru Depozitele de Microorganisme, şi i-a fost acordat numărul de acces FERM BP-7556. 66 RO 123525 Β1 2. Construirea plasmidelorde expresie care poartă AND-ul regiunii variabile a lanţului 1 greu al TRAS umanizat
Vectorii de expresie recombinaţi pentru celulele animale sunt construiţi prin inserarea 3 ADN-ului care codifică lanţul greu al TRA-8 umanizat (donat în cele de mai sus), după cum urmează. 5 1 pg de plasmidă pSRHHH3 (cererea de brevet european EP 0-909-816-A1), care poartă regiunea variabilă a lanţului greu al regiunii variabile a anticorpului monoclonal anti- 7 Fas umanizat HFE7A şi ADN-ul genomic al regiunii constante a lgG1 umane, un vector de expresie pentru celulele de mamifer, este digerat cu enzimele de restricţie Hindlll şi Apal, şi 9 se separă prin electroforeză în gel de agaroză 3%. După electroforeză, gelul se colorează cu soluţie apoasă 1 pg/ml bromură de etidiu, pentru a permite detectarea ADN în lumină UV. 11 Benzile de ADN ale vectorului, care conţin ADN-ul genomic al regiunii constante ale lgG1 umane fără regiunea variabilă a lanţului greu al HFE7A umanizat, sunt tăiate, utilizând o 13 lamă de ras şi se eluează din gel, utilizând trusa Geneclean Spin Kit (BIO 101, CA, SUA)).
După extracţia cu fenol, ADN-ul eluat este apoi concentrat prin centrifugare la 7500 X g, 15 urmată de precipitare din etanol şi, în final, dizolvare în 5 μΙ de apă distilată, şi apoi defosforilare, utilizând CIP. Plasmida defosforilată, digerată (100 ng) este legată cu 1 pg de 17 fragment pHB14 de ADN, care conţine ADN-ul care codifică regiunea variabilă a lanţului greu al TRA-8 umanizat, care a fost de asemenea digerată cu Hindlll şi Apal, utilizând o trusă 19 DNA Ligation, versiunea 2.0 (Takara Shuzo Co., Ldt). Amestecul de legare este apoi utilizat pentru a transforma E. coli JM109, care este apoi pusă pe plăci de agar LB, care conţin 21 50 pg/ml ampicilină.
Transformanţii obţinuţi prin această metodă sunt cultivaţi în 2 ml mediu LB lichid, care 23 conţine 50 pg/ml ampicilină la 37°C, peste noapte, iar ADN-ul plasmidian se extrage ulterior, din cultura rezultată, prin metoda alcalină SDS. 25 ADN-ul plasmidian extras este digerat cu Hindlll şi Apal, şi este supus electroforezei în gel de agaroză 3% gr/v, pentru a confirma prezenţa sau absenţa insertului de ADN care 27 codifică regiunea variabilă a lanţului greu al TRA-8 umanizat. Inserţia şi orientarea fragmentului de ADN dorit în vector sunt confirmate prin secvenţierea ADN-ului, utilizând un 29 analizor de secvenţe de gene (analizorul de ADN ABI Prism 3700; Applied Biosystems). Plasmida de expresie, rezultată, care poartă cADN care codifică lanţul greu al TRA-8 31 umanizat, este desemnată pHB14-1.
Exe m p I u I 19. Construcţia unui vector de expresie pentru lanţul uşor al anticorpului 33 umanizat
1. Construirea vectorilor pentru lanţurile uşoare ale versiunilor umanizate ale 35 anticorpului TRAS
După cum se arată în SECVID nr. 46 din Lista de Secvenţe, în umanizarea secvenţei 37 de aminoacizi a lanţului uşor al anticorpului de şoarece DR5 antiuman TRA-8, aminoacidul 8 (histidina), aminoacidul 9 (lizina), aminoacidul 10, (fenilalanina), aminoacidul 11 39 (metionina), aminoacidul 13 (treonina), aminoacidul 20 (serina), aminoacidul 42 (glutamina), aminoacidul 43 (serina), aminoacidul 60 (acidul aspartic), aminoacidul 63 (treonina), 41 aminoacidul 77 (asparagina), aminoacidul 78 (valina), aminoacidul 80 (serina), aminoacidul 83 (leucina), aminoacidul 85 (acidul aspartic), aminoacidul 87 (fenilalanina), şi aminoacidul 43 99 (glicina), aminoacidul 103 (leucina) şi aminoacidul 108 (alanina) de la capătul N-terminal 67 RO 123525 Β1 al secvenţei de aminoacizi a lanţului uşor al TRA-8 sunt înlocuiţi cu prolină, serină, serină, leucină, alanină, treonină, Uzină, alanină, serină, serină, serină, leucină, prolină, fenilalanină, treonină, tirozină, glutamină, valină şi respectiv treonină. Secvenţa rezultată este desemnată LM2.
Plasmidele de expresie, care poartă acest tip de secvenţe de aminoacizi ale lanţului greu umanizat ale anticorpului antiuman DR5 TRA-8. se construiesc după cum urmează. 1. Sinteza primerilor pentru prepararea regiunilor variabile şi constante ale lanţului uşor al TRAS umanizat ADN-ul care codifică lanţul polipeptidic LM2 (SECVID nr. 46 din Lista de Secvenţe), fiecare dintre acestea fiind o fuziune dintre regiunea variabilă a lanţului uşor al anticorpului anti-DR5 umanizat TRA-8 şi regiunea constantă a lanţului uşor al Ig umane (lanţul k) sunt sintetizate prin utilizarea de combinaţii ale PCR.
Suplimentar faţă de 7AL1P (SECV ID Nr, 47) şi 7ALCN (SECV ID Nr. 48), se sintetizează pentru PCR următorii primeri oligonucleotidici: 5' - gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atcacaatgt caccagtgga -3' (HKSPR11; SECVIDNr. 49);
5' - ccaagttctt tgtctgcatc agtaggagac agggtcacca tcacctgc - 3' (HKCDF11; SECV ID
Nr. 50); 5' - agtgtgccgg gtggatgccc agtaaatcag tagtttagga gctttccctg gtttctg -3' (HKCDR12; SECV ID Nr. 51);
5' - tgggcatcca cccggcacac tggggtccca agcaggttta gtggcagt-3' (HKCDF22; SECV ID
Nr. 52); 5' - ataactacta tattgctgac agtaataggt tgcaaaatcc tccggctgca gactagagat ggt -3' (HKCDR22; SECV ID Nr. 53); şi 5'- cagcaatata gcagctatcg gacgttcggt caaggcacca aggtggaaat caaacggact gtg -3' (HKCF12; SECV ID Nr. 54). 2) Construirea plasmidei pCR3.1/M2-1 (donarea lanţului uşor al TRA-8 umanizat)
Fragmentul ADN-LM2, conform definiţiei din SECV ID nr. 55 din Lista de Secvenţe, care codifică secvenţa de aminoacizi conform definiţiei din SECV ID nr. 46, a aceluiaşi, se prepară prin realizarea PCR în 2 etape, se inserează într-un vector plasmidian şi se donează în E. coli.
a. Prima etapă a PCR
Fragmentul LM2-F1-ADN, care codifică o secvenţă de semnal de secreţie şi o porţiune a regiunii FRL,, cu un situs de clivaj al enzimei de restricţie Hind III, adăugat la capătul 5', se prepară în următoarele condiţii: plasmidele matriţă, pHSGHM17 şi pSRPDHH, se obţin urmând descrierea din cererea de brevet european EP 0909816 A1.
Compoziţia soluţiei de reacţie: - ADN-ul plasmidei pHSGHM 17 (cererea de brevet european EP 0909816 A1)..25ng; - primer oligonucleotidic 7AL1P ...............................50 pmoli; - primer oligonucleotidic HKSPR11 .............................50 pmoli; - cocteil de dNTP-uri ............................................5 μΙ; - tampon 10xPCR ..............................................5 μΙ; - ADN polimerază ampliTaq (PerkinElmer) ......................2,5 unităţi. 68 1 RO 123525 Β1
Soluţia de reacţie, având compoziţia de mai sus, este ajustată la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR.
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C,timp de 2 min, după care se încălzeşte într-un ciclu termic, la 94°C, timp de un minut, la 55°C, timp de un minut şi la 72°Cn timp de 2 min, care se repetă de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.
Fragmentul ADN-ului LM2-F2, care codifică o porţiune a FRL,, CDRL,, FRL2 şi CDRL2, se prepară în următoarele condiţii:
Compoziţia soluţiei de reacţie: - ADN plasmidian pL28 ......................................... 25 ng - primer oligonucleotidic HKCDF11 .............................50 pmoli - primer oligonucleotidic HKCDF12 .............................50 pmoli - cocteil de dNTP-uri ........................................... 5 μΙ - tampon 10xPCR ............................................. 5 μΙ - ADN polimerază ampliTaq..................................2,5 unităţi.
Soluţia de reacţie, având compoziţia de mai sus, se ajustează la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR.
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care se încălzeşte într-un ciclu termic, la 94°C, timp de un minut, la 55°C, timp de un minut şi la 72°C, timp de 2 min, care se repetă de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.
Fragmentul ADN-ului LM2-F3, care codifică o porţiune a CDRL2, FRL3 şi o parte a CDRL3, se prepară în următoarele condiţii:
Compoziţia soluţiei de reacţie: -ADN-ul plasmidei pSRPDHH (cererea de brevet european EP 0909816 A1 )..25 ng - primer oligonucleotidic HKCDF22 ............................ 50 pmoli - primer oligonucleotidic HKCDR22 ............................ 50 pmoli - cocteil de dNTP-uri ........................................... 5 μΙ - tampon 10xPCR ............................................. 5 μΙ - ADN polimerază ampliTaq ..................................2,5 unităţi.
Soluţia de reacţie, având compoziţia de mai sus, se ajustează la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR.
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care se încălzeşte într-un ciclu termic, la 94°C, timp de un minut, la 55°C, timp de un minut şi la 72°C, timp de 2 min, care se repetă de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.
Fragmentul ADN-ului LM2-F4, care codifică CDRL3, FRL4 şi regiunea constantă cu un situs de clivaj al enzimei de restricţie EcoRI, adăugat la capătul 3', se prepară în următoarele condiţii:
Compoziţia soluţiei de reacţie: - ADN-ul plasmidului pSRPDHH................................. 25 ng - primer oligonucleotidic HKCDF12 ............................ 50 pmoli - primer oligonucleotidic 7ALCN............................... 50 pmoli - cocteil de dNTP-uri .......................................... 5 μΙ; - tampon 10xPCR.............................................. 5 μΙ; - ADN polimerază ampliTaq ................................. 2,5 unităţi.
Soluţia de reacţie, având compoziţia de mai sus, se ajustează la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR. 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 69 45 RO 123525 Β1
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care se încălzeşte într-un ciclu termic, la 94°C, timp de un minut, la 55°C, timp de un minut şi la 72°C, timp de 2 min, care se repetă de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.
Fragmentele de ADN amplificate după PCR se separă prin electroforeză în gel de poliacrilamidă 5%. Benzile de ADN respective, astfel detectate, sunt excizate cu o lamă de ras.
b. A doua etapă a PCR ADN-ul LM2, în care mai sus descrişii ADN LM2-F1, ADN LM2-F2, ADN LM2-F3 şi ADN LM2-F4 sunt fuzionaţi, se prepară în următoarele condiţii:
Compoziţia soluţiei de reacţie: - fragmentul gel de ADN-LM2-F1 preparat în prima etapă a PCR; - fragmentul gel de ADN-LM2-F2 preparat în prima etapă a PCR; - fragmentul gel de ADN-LM2-F3 preparat în prima etapă a PCR; - fragmentul gel de ADN-LM2-F4 preparat în prima etapă a PCR; - primerul oligonucleotidic 7AL1P...............................50 pmoli; - primerul oligonucleotidic 7ALCN ..............................50 pmoli; - cocteil de dNTP-uri ........................................... 5 μΙ; - tampon 10xPCR.............................................. 5 μΙ; - ADN polimerază ampliTaq................................. 2,5 unităţi.
Soluţia de reacţie, având compoziţia de mai sus, se ajustează la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR.
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care se încălzeşte într-un ciclu termic, la 94°C, timp de un minut, la 55°C, timp de un minut şi la 72°C, timp de 2 min, care se repetă de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.
Fragmentul de ADN-LM2, astfel preparat, se inserează în plasmida pCR3.1DNA, utilizând trusa Eukaryotic TA Cloning (Invitrogen), urmând protocolul fabricantului şi se introduce în E. coli TOP10F' competentă, conţinută în trusă. Secvenţele de nucleotide, ale acestor ADN-uri care codifică lanţul uşor al TRA-8 umanizat, sunt confirmate prin metoda dideoxi (F. S. Sânger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) utilizând analizorul 3700 DNA (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).
Plasmidele rezultate se denumesc pCR3.1/M2-1 (plasmida care poartă cADN-ul care codifică regiunea variabilă a lanţului uşor al TRA-8 umanizat şi o regiune constantă a lanţului uşor al Ig umane).
Plasmida pCR3.1/M2-1, care conţine fragmentul de ADN LM2, este digerată cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I. 1 pg de ADN al plasmidei de donare pHSG399 este digerat cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I şi apoi se defosforilează cu CIP. Fragmentele defosforilate de ADN pHSG399 şi de ADN al LM2, care au fost digerate cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I, se leagă, utilizând trusa DNA Ligation, versiunea 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ldt). Apoi, E. coli DH5a este retransformată cu ADN legat şi este împrăştiată pe un mediu de agar care conţine IPTG 0,1 mM, 0,1% X-Gal şi 50 pg/ml clormafenicol (concentraţii finale). Transformanţii albi, obţinuţi, se cultivă în mediu lichid LB, care conţine 50 pg/ml cloramfenicol, şi ADN-ul plasmidian este extras din cultura rezultată, în conformitate cu metoda alcalin-SDS. ADN-ul plasmidian extras este digerat cu Hind III şi EcoR I, şi apoi este selectată o clonă purtătoare de fragment LM2-ADN, prin electroforeză în gel de agaroză 1 %. 70 RO 123525 Β1
Ca rezultat al procedurii de mai sus, se obţine plasmida pHSG/M2-1-4, purtătoare a 1 unui fragment de fuziune al regiunii variabile a lanţului uşor LM2 TRA-8 umanizat al regiunii constante al lanţului uman Igic. Tulpina transformantă E. coli, care prezintă această plasmidă, 3 denumită E. coli DH5a/pHSG/M2-1-4, a fost depozitată în International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science ADN Technology, 1-1, Higashi 5 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia, la data de 20 Aprilie, 2001, în conformitate cu Tratatul de la Budapesta pentru Depozitarea Microorganismelor, şi i-a fost 7 acordat numărul de acces FERM BP-7563. 3. Construirea plasmidei pSR/M2-1 (plasmida de expresie pentru lanţul uşor LM2 9 TRA-8 umanizat)
Plasmida obţinută pHSG/M2-1-4, purtătoare a unui fragment de fuziune al regiunii 11 variabile a lanţului uşor LM2 TRA-8 umanizat şi al regiunii constante a lanţului uman IgK, este digerată cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I, şi apoi este defosforilată cu CIP. 13 ADN-ul defosforilat, rezultat, pSRPDHH şi fragmentul Hindlll-EcoR I, obţinutdin pHSG/M2-1-4, sunt legate, utilizând trusa de legare a ADN, versiunea 2.0 (DNA Ligation KitVersion2.0) 15 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Apoi E. coli DH5a este transformat cu ADN-ul ligat şi întins pe agar LB. Transformanţii obţinuţi sunt cultivaţi în mediu lichid LB, care conţine 100 pg/ml 17 ampicilină, şi plasmida ADN este extrasă din cultura rezultată, în conformitate cu metoda SDS alcalină. Inserţia şi orientarea fragmentului de ADN dorit, în vectorul pSRPDHH, sunt 19 confirmate prin secvenţierea ADN, utilizând un analizor de secvenţe de gene (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems). 21
Plasmida de exprimare, care poartă cADN-ul care codifică lanţul uşor al TRA-8 umanizat, este desemnată pSR/M2-1. 23
Exemplul 20. Producerea anticorpului umanizat
Transfectarea celulelor COS-7, adică a liniei celulare derivate din rinichi de maimuţă, 25 cu plasmidele de expresie pentru lanţul greu al TRA-8 umanizat şi lanţul uşor al TRA-8 umanizat obţinute mai sus, este realizată prin metodele cu reactiv de transfecţie FUGENE6 27 (Boehringer Manheim Biochemica), în conformitate cu manualul de utilizare furnizat cu trusa.
Celule COS-7 (Colecţia Americană de Tipuri de Culturi nr. CRL-1651) sunt crescute 29 la semiconfluenţă (3x106 celule/vas) într-un vas de cultură (suprafaţa culturii: 57 cm2; Sumitomo Bakelite) care conţine mediu modificat Eagle al lui Dulbecco (la care se va face 31 referire de acum încolo ca "D-MED"; Gibco BRL), suplimentat cu ser fetal de viţel 10% (abreviat aici ca "FCS"; Moregate). 33 între timp, 10 pg/vas (în total 5 vase) cu ADN al plasmidei de exprimare a lanţului greu DR5 umanizat (pHA15-1) şi 10 pg/vas de ADN al plasmidei de exprimare a lanţului uşor 35 DR5 umanizat preparat prin metoda SDS-alcalină şi centrifugare în gradient de densitate de clorură de cesiu se amestecă şi apoi se precipită cu etanol, urmat de suspendare în 5 pl/vas 37 dH20.
După ce 15 pl/vas de reactiv de transfecţie FUGENE6 este amestecat cu 180 pl/vas 39 D-MEM fără FCS, această soluţie FUGENE (185 pl/vas) se amestecă cu 5 pl/vas soluţie de ADN care conţine 10 pg/vas ADN al plasmidei de exprimare a lanţului greu DR5 umanizat 41 şi cu 10 pg/vas ADN al plasmidei de exprimare a lanţului uşor DR5 umanizat. După 15 min de incubare la temperatura camerei, suspensia de plasmidă obţinută (200 pl) se adaugă la 43 plăcile cu COS-7 preparate anterior. După incubare în 5% C02 la 37°C, timp de 24 h, mediul 71 RO 123525 Β1 de cultură este schimbat cu D-MEM fără FCS. După incubare în 5% C02, la 37°C, timp de 72 h, supernatantul de cultură este recuperat, pentru a purifica produsele de exprimare în fluidele supernatante. Prin metoda descrisă mai sus, celulele COS-7 sunt transfectate cu fiecare dintre combinaţiile de plasmide: A. ADN neplasmidian; B. cotransfecţia pHB14-1 şi pSR/M-2-1.
Cultura este apoi centrifugată (1000 rpm, 5 min) şi se colectează supernatantul. Supernatantul se centrifughează din nou (9800 rpm, 15 min) şi se filtrează cu un filtru de 0,45 pm (ADVANTEC TOYO DISMIC-25cs, Cat#25CS045 AS). Purificarea IgG din filtrate se realizează, utilizând cromatografia de afinitate POROS-Proteină G (Applied Biosystems) în următoarele condiţii: - HPLC: BioCAD 700E (Applied Biosystems); - coloană: cartuş senzor ProteinăG-ID (mărimea coloanei: 2,1 mm ID x 30 mm LD, volumul patului: 0,1 ml; Cat #2-1002-00, Applied Biosystems); - tampon de eluţie: 0,1 M glicină-HCI (pH 2,5); - tampon de neutralizare: 1M Tris-HCI (pH 8,5); - detecţie: 280 nm; - viteza de curgere: 1 ml/min; - mărimea fracţiilor: 0,5 ml/0,5 min; - tubul pentru fracţie: microtub de polipropilenă 1,5 ml; - temperatura: 4°C.
După ce toate filtratele se aplică pe coloană, 30 ml PBS (Sigma, Cat # 1000-3), acestea se utilizează pentru a spăla coloana. Când se aplică tamponul de eluţie, porneşte colectorul de fracţii. Fiecare microtub de fracţii a conţinut înainte 55 μΙ de NaCI 1 M, 110 μΙ tampon de neutralizare şi 74 μΙ de albumină serică bovină 2 mg/ml (Sigma, Cat# A-7030) în PBS. Fracţiile de la nr. 8 până la nr. 10 sunt colectate şi dializate faţă de un litru PBS (pH 7,5), la 4°C, timp de o zi, utilizând aparatul Slide-A lyzer (Pierce, Cat # 66450). Tamponul de dializă se schimbă de două ori.
Verificarea exprimării anticorpilor umanizaţi şi determinarea cantitativă a produşilor de expresie în fluidele de supernatant de cultură preparate se realizează prin ELISA faţă de un anticorp IgG antiuman. în fiecare godeu al unei plăci cu 96 godeuri (MaxiSorp, Nune), se adaugă 100 μΙ de anticorp policlonal specific IgG Fc antiuman de capră (Kappel), dizolvat la concentraţia finală de 0,5 pg/ml în tampon de adsorbţie (0,05 M hidrogencarbonat de sodiu, 0,02% azidă de sodiu, pH 9,6), iar placa este incubată la 37°C, timp de 2 h, pentru a produce adsorbţia anticorpului. Apoi, placa se spală cu 350 μΙ PBS(-) conţinând 0,05% Tween-20 (BioRad) (la care se va face referire în continuare ca "PBS-T") de cinci ori. Se adaugă, în godeuri, după spălare, supernatantul de cultură diluat cu D-MEM, care conţine 10% FCS şi se incubează la 37°C, timp de 2 h. După spălare din nou cu PBS-T, se adaugă, în fiecare godeu, 100 μΙ de anticorp policlonal specific IgG Fc antiuman de capră, marcat cu fosfatază alcalină (Jackson Immuno Research Lab.), diluat de 10000 de ori cu PBS-T şi se incubează la 37°C, timp de 2 h. După o nouă spălare cu PBS-T, se adaugă o soluţie de substrat de p-nitrofenil fosfat, obţinută din trusa Alkaline Phosphatase Substrate (BioRad), în conformitate cu manualul de utilizare, furnizat cu trusa. După incubare la 37°C, timp de 0,5 până la o oră, se măsoară absorbanţa la 405 nm. în experimentele de faţă, imunoglobulina G subclasa 1 (lgG1) 72 RO 123525 Β1 din plasmă umană (Biopure AG) diluată cu D-MEM, care conţine 10% FCS în anumite 1 concentraţii, se utilizează ca probă de concentraţie de referinţă, pentru anticorpii DR5 conţinuţi în fluidele de supernatant de cultură. 3
Ca rezultat, produsele de expresie purificate din supernatantul de cultură sunt detectate în mod specific cu anticorp IgG antiuman. Cantitatea de anticorp uman IgG este 5 de 8,96 pg (800 pl).
Exemplul 21. Activitatea de inducţie a apoptozei anticorpului umanizat 7
Se utilizează celule Jurkat (ATCC nr. TIB-152), pentru a examina activitatea de inducţie a anticorpului TRA-8 umanizat. 9
Celule Jurkat, cultivate în mediu RPMI1640, cu 10% FCS (Gibco BRL), la 37°C, timp de 3 zile, în prezenţa a 5% C02, sunt dispersate în fiecare godeu al unei plăci cu 96 godeuri 11 (Sumitomo Bakelite), la 50 μΙ per godeu. TRA-8 umanizat, preparat în exemplul 20, este ajustat, pentru a avea concentraţia produsului final de interes de 100 ng/ml, cu mediu 13 RPM11640, care conţine 10% FCS, prin estimarea concentraţiei acestuia în lichide, în conformitate cu metoda descrisă în exemplul 20. Fiecare dintre soluţiile de produşi de 15 exprimare, astfel ajustate la 100 ng/ml, se utilizează pentru a produce diluţii seriale, prin repetarea unei diluţii seriale de 2-ori cu RPMI1640, care conţine 10% FCS. Fiecare dintre 17 soluţiile de TRA-8 umanizat se adaugă în fiecare godeu la 50 μΙ per godeu. După ce reacţionează la 37°C, timp de 12 h, se adaugă 50 μΙ de PMS 25 μΜ (fenazin metosulfat; 19 Sigma Chemical Co.), care conţine 1 mg/ml XTT (2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil]-2H tetrazolium-5-carboxianiridă sare internă; Sigma Chemical Co.) (concentraţia finală de 21 250 pg/ml pentru XTT şi 5 μΜ pentru PMS). După incubare timp de 3 h , se măsoară absorbanta la 450 nm a fiecărui godeu, pentru a calcula viabilitatea celulară prin utilizarea 23 capacităţii de reducere a mitocondriilor ca indice.
Viabilitatea celulelor din fiecare godeu se calculează în conformitate cu următoarea 25 formulă: 27
Viabilitate (%) = 100 x (a-b)/(c-b) 29 unde "a" este măsurătoarea godeului test, "b" este măsurătoarea unui godeu fără celule şi "c" este măsurătoarea unui godeu fără anticorp adăugat. 31
Ca rezultat, produsul de exprimare preparat în exemplul 20 (anticorpul TRA-8 umanizat) se demonstrează că induce apoptoza în celulele liniei de celule de limfom T care 33 exprimă antigenul DR5 uman.
Exemplul 22. Reactivitatea TRAS faţă de diferite molecule DR5 35
Pentru a determina reactivitatea TRA-8 faţă de diferite molecule DR5, se examinează reactivitatea TRA-8, utilizând limfocite activate, după cum urmează. 37 întâi, se iau probe de sânge periferic de la om (30 ml), saguin (3 ml) şi maimuţă cynomologus(20ml). Probele de sânge au avut adăugaţi ml heparină(Novoheparin; Novo), 39 iar acestea sunt apoi uşor aşezate pe un volum egal de soluţie Ficoll-Paque PLUS (Amersham Pharmacia Biotech.), gravitaţia specifică: 1,077 pentru toate, exceptând maimuţa 41 Cynomologus, care a avut o gravitaţie specifică de 1,072 şi se centrifughează la 1700 rpm timp de 30 min, pentru a obţine o fracţie de celule mononucleare din sânge periferic. Această 43 73 RO 123525 Β1 fracţie celulară mononucleară se spală de două ori cu soluţie de sare Hanks echilibrată şi apoi se suspendă în mediu RPM11640 cu 10% v/v FCS, la o densitate a celulelor de 1x106 celule/ml. Se adaugă fîtohemaglutinină-P (PHA-P, Sigma Chemicals, Co.) la suspensia rezultantă, la o concentraţie finală de 5 pg/ml, iar proba este incubată la 37°C, în 5% v/v C02, timp de 24 h. După acest timp, celulele se recuperează prin centrifugare, se spală şi se resuspendă în mediu RPM11640, care conţine 10% v/v FCS. Apoi, pentru a activa celulele recuperate, se adaugă în suspensie interleukină-2 (Amersham Pharmacia Biotech.), la o concentraţie finală de 10 unităţi/ml şi aceasta este incubată la 37°C, în 5% v/v C02, timp de 72 de h. O cantitate de preparat activat, calculat să conţină 1x106 celule limfocite activate, este plasată într-un tub de test şi se suspendă fie în 50 pl de 0,5, 1,5, 10 pg/ml TRA-8 în PBS, fie în 50 μI de PBS. Suspensia rezultată se lasă să stea pe gheaţă, timp de o oră, după care celulele se spală de trei ori cu alicote de 500 pl de PBS şi apoi se suspendă în 50 μI de anticorp IgG antişoarece marcat cu FITC 20 pg/ml (Bioresource) în PBS. Utilizând celulele suspendate în 500 pl PBS ca martori, se măsoară intensităţile fluorescenţei, utilizând un citometru în flux (FACSCalibur; Becton Dickinson).
Se obţine distribuţia numerelor de celule prin intensitatea fluorescentei şi se calculează raportul numărului de celule colorate din numărul de celule totale. Mai departe, se calculează fiecare valoare Kd, utilizând concentraţia TRA-8 şi raportul dintre numărul de celule colorate şi numărul total de celule. Fiecare frecvenţă a reactivităţii limfocitelor activate de om, saguin şi maimuţă Cynomologus este aproape aceeaşi. în conformitate, TRA-8 este capabil să lege o gamă largă de DR5 de primate, incluzându-l pe cel de om, împotriva cărora TRA-8 a fost preparat la origine.
Exemplul 23. Studiul dozei escaladate a TRA-8 la saguini
Se realizează un studiu de toxicitate preliminară cu doză escaladată de TRA-8, utilizând un saguin mascul şi unul femelă. Au loc trei seturi de dozări intravenoase unice, care sunt separate printr-o perioadă de retragere de 7 zile. Doza de TRA-8 este fixată la 50, 250 şi 1250 pg/corp. La patruzeci şi opt de ore după fiecare tratament, se colectează sânge din vena femurală şi se prepară plasmă. Se măsoară activităţile aspartat aminotransferazei şi alanin aminotransferazei din plasmă, utilizând un analizor (FUJI DRI-CHEM: Fuji Film Medical Co., Ldt.). Tot sângele se ia fără niciun fel de anestezie. Ca rezultat, nu se observă nicio probă a vreunei leziuni hepatice în timpul examinării biochimice a plasmei după fiecare tratament.
Exemplul 24. Studiile farmacologice in vitro şi in vivo ale TRAS împotriva celulelor canceroase
Pentru a determina dacă TRA-8 are eficacitate terapeutică în terapia anticancer, se examinează activitatea terapeutică de ucidere in vitro a TRA-8, utilizând diferite linii de celule canceroase, după cum urmează.
Diferite celule canceroase (2-8x103 celule/50 pl), cultivate în mediu RPM11640 (pentru Jurkat), în mediu DMEM (pentru HCT-116), MEM-R (pentru WiDr) sau DMEM-F12 (pentru COL2-Jck), obţinute de la Gibco BRL, cu 10% FCS (Gibco BRL), la 37°C, în prezenţa a 5% C02, se dispersează în fiecare godeu de pe o microplacă cu 96 godeuri (Sumitomo Bakelite). TRA-8 este ajustat cu mediu conţinând 10% FCS, pentru a avea concentraţia produsului final 74 RO 123525 Β1 de interes de 100 ng/ml. Soluţia de TRA-8 (100 ng/ml) se utilizează pentru a produce diluţii seriale, prin repetarea unei diluţii seriale de două ori, cu mediu care conţine 10% FCS. Fiecare dintre soluţiile diluate de TRA-8 se adaugă, în fiecare godeu, la 50 μΙ per godeu, şi sunt incubate la 37°C. După ce reacţionează la 37°C, timp de 72 h, se adaugă 50 μΙ de PMS 25 μΜ (fenazin metosulfat; Sigma Chemical Co.), care conţine 1 mg/ml XTT (concentraţie finală de 250 μg/ml pentru XTT şi 5 μΜ pentru PMS). După incubare timp de 3 h, se măsoară absorbanta la 450 nm a fiecărui godeu, pentru a calcula viabilitatea celulelor, prin utilizarea capacităţii de reducere a mitocondriilor ca index.
Viabilitatea celulelor din fiecare godeu se calculează în conformitate cu următoarea formulă:
Viabilitate (%) = 100 x (a-b)/(c-b) unde "a" este măsurătoarea godeului test, "b" este măsurătoarea unui godeu fără celule şi "c" este măsurătoarea unui godeu fără anticorp adăugat.
Rezultatele sunt prezentate în tabelul 3 de mai jos.
Tabelul 3
Celule DE50 (ng/ml) Jurkat 0,001...0,01 HCT-116 0,004...0,02 WiDr 0,007...0,03 COL2-Jck 2,28 TRA-8 induce apoptoza foarte puternic la diferite linii de celule în condiţii in vitro.
Mai departe, se determină efectul antitumoral in vitro al TRA-8 la şoareci nuzi cărora li s-au transplantat celule WiDr, deoarece TRA-8 nu reacţionează încrucişat cu DR5 murin.
Anticorpul DR5 antiuman TRA-8 se administrează la şoareci nuzi care poartă xenogrefe umane care exprimă molecula de DR5 uman. Şoarecii utilizaţi au fost şoareci Balb/c nud/nud de şase săptămâni (femele, de la Clea Japan Inc.), cărora li s-au transplantat linii de celule canceroase de colon WiDr (5 mm3). La o zi după transplantul tumorii, aceşti şoareci, cărora li s-a făcut transplant, sunt trataţi zilnic cu injecţii intraarticulare cu TRA-8 (5 pg/corp) de 14 ori. Creşterea tumorii WiDr este determinată zilnic, prin mărimea masei tumorale. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 4 de mai jos.
Tabelul 4 8 zile 11 zile 15 zile 18 zile 22 zile 25 zile Martor (PBS) 196 249 469 584 833 1193 DS ±55 ±77 ±149 ±230 ±274 ±419 TRA-8 158 97 155 195 365 530 DS ±78 + 30 ±60 ±58 ±91 ±135 75 RO 123525 Β1 în acest model, în timp ce toate animalele netratate au prezentat o creştere vizibilă a tumorii, creşterea tumorii este vizibil inhibată la animalele tratate cu TRA-8, după cum se demonstrează prin dimensiunea tumorii. Acest rezultat a indicat faptul că TRA-8 este eficace pentru eliminarea celulelor tumorale in vivo.
Exemplul 25. Studiul de combinare a TRA-8
Se obţine linia de celule de cancer de prostată PC-3 de la American Tissue Culture Collection (ATCC) şi se menţine în amestec nutritiv F-12K (21127-022, Gibco BRL) care conţine ser fetal bovin 10% (FBV, Hyclone, 200 mM L-glutamină 1% (25030-149, Gibco BRL) şi soluţie de streptomicină penicilină 0,5% (P-7539, Sigma). Se utilizează în experimentul care urmează mediul RPMI1640 (MED-008, IWAKI) suplimentat cu FBS 10% şi cu soluţie de penicilină streptomicină 0,5%. Celulele PC-3 cu creştere exponenţială se colectează prin tripsinizare şi se spală de două ori cu mediu proaspăt. Celulele sunt apoi numărate, resuspendate în mediu proaspăt, la o densitate de 5x104 celule/ml şi se distribuie în triplicat pe plăci cu 96 godeuri (3598, Corning-Coster), într-un volum total de 100 μΙ/godeu, la o zi după începerea experimentului. Un medicament anticanceros reprezentativ, Paclitaxel (169-18611, Wako), dizolvat în dimetilsulfoxid (10 mg/ml), este diluat în mediu proaspăt şi apoi se adaugă pe plăci cu 96 godeuri, care conţine celule în cantitate de 50 pl/godeu. Concentraţiile finale de dimetilsulfoxid sunt mai mici de 0,1%. După incubare timp de 24 h, la 37°C, într-o atmosferă de 5% C02, se adaugă, în godeuri, TRA-8 diluat în mediu proaspăt. După incubare timp de încă 24 h, se adaugă, în godeuri, 50 μΙ de mediu Minimum Essential (11095-098, Gibco BRL), care conţine 1 mg/ml XTT şi 25 mM PMS şi plăcile sunt incubate timp de 6 h. Se măsoară apoi DO450 cu SPECTRA MAX 250 (Molecular Devices), iar viabilitatea celulară se calculează după cum urmează:
Viabilitatea (%) = (DO450 pentru godeul care conţine celule tratate cu Taxol şi/sau cu TRA-8 (agent/agenţi - DO450 pentru godeul care nu conţinea nici celule nici agent) x 100/(DO450 pentru godeul care conţine celule fără agent - DO^o pentru godeul care nu conţine nici celule nici agent)
Rezultatul analizei de mai sus al TRA-8 combinat cu un medicament anticanceros reprezentativ, Paclitaxel, este următorul. Paclitaxel a redus viabilitatea celulară a celulelor PC-3, dar mai mult de 40% dintre semnalele care indică celule canceroase viabile a rămas încă la concentraţii de până la 200 nM. Adăugarea a 0,1 ng/ml TRA-8 a scăzut foarte mult viabilitatea celulelor de cancer de sân, cu până la 10%, chiar dacă nu se vede o reducere a viabilităţii celulare, după o singură aplicare a TRA-8, la această concentraţie. Acest rezultat a indicat în mod clar faptul că TRA-8 a prezentat o activitate anticanceroasă sinergică când a fost combinat cu alte medicamente anticancer.
Exemplul 26. Analiza altor tipuri de anticorpi umanizaţi TRAS 1. Proiectarea anticorpilor umanizaţi
Construirea unei versiuni umanizate a TRA-8 se realizează prin metode cunoscute în general ca grefare CDR. Anticorpul mAB58'CL se utilizează ca acceptor, după cum este descris în exemplul de referinţă nr 2 şi regiunile CDR ale anticorpului TRA-8 sunt grefate pe acceptor. în regiunea cadrului, unii aminoacizi sunt grefaţi pe acceptor fie de pe TRA-8, fie 76 RO 123525 Β1 de pe secvenţele umane similare, prin criteriile date de Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 1 USA 86, 10029-10033, 1989), şi secvenţele TRA-8 umanizate sunt construite conform descrierii de mai jos. 3 2. Construirea plasmidei care poartă ADN-ul regiunii variabile a lanţului greu al altor tipuri de TRAS de şoarece sau umanizat 5
După cum se arată în SECV ID nr. 56 din Lista de Secvenţe, umanizarea de tip H1 a secvenţelor de aminoacizi ale lanţului greu al anticorpului DR5 antiuman de şoarece TRA-8 7 a determinatînlocuirea aminoacidului 3 (metionina), aminoacidului 13 (Uzina), aminoacidului 19 (Uzina), aminoacidului 40 (treonina), aminoacidului 42 (acidul glutamic), aminoacidului 44 9 (arginina), aminoacidului 84 (serina), aminoacidului 88 (serina), aminoacidului 93 (metionina), aminoacidului 114 (treonina), aminoacidului 115 (leucina) cu glutamină, 11 glutamină, arginină, alanină, glicină, asparagină, alanină, valină, leucină şi, respectiv ,valină.
După cum se arată în SECV ID nr. 59 din Lista de Secvenţe, umanizarea de tip H3 13 a secvenţelor de aminoacizi ale lanţului greu al anticorpului DR5 antiuman de şoarece TRA-8 a determinatînlocuirea aminoacidului 13 (Uzina), aminoacidului 19 (Uzina), aminoacidului 40 15 (treonina), aminoacidului 42 (acidul glutamic), aminoacidului 44 (arginina), aminoacidului 88 (serina), aminoacidului 93 (metionina), aminoacidului 114 (treonina), aminoacidului 115 17 (leucina) cu glutamină, arginină, alanină, glicină, glicină, alanină, valină, leucină şi respectiv valină. 19
După cum se arată in SECV ID nr. 60 din Lista de Secvenţe, umanizarea de tip H4 a secvenţelor de aminoacizi ale lanţului greu al anticorpului DR5 antiuman de şoarece TRA-8 21 a determinatînlocuirea aminoacidului 13 (lizina), aminoacidului 19 (lizina), aminoacidului 88 (serina), aminoacidului 93 (metionina), aminoacidului 114 (treonina), aminoacidului 115 23 (leucina) cu glutamină, arginina, alanină, alanină, valină, leucină şi, respectiv, valină.
După cum se arată in SECV ID nr. 61 din Lista de Secvenţe, plasmida care poartă 25 ADN-ul regiunii variabile a lanţului greu al TRA-8 imaginar este desemnat "tipul M". în plus, TRA-8 umanizat, descris în exemplele 17 şi 18, este desemnat "tipul H2"). 27
Plasmidele care poartă ADN-ul care codifică secvenţele de ADN care codifică regiunea variabilă a lanţului greu al TRA-8 umanizat sau imaginar se construiesc după cum 29 urmează.
Se utilizează PCR, pentru a construi secvenţele de ADN care urmează, care sunt 31 descrise mai jos:
Sunt sintetizate următoarele 24 oligonucleotide: 33 5'- ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtgtccac -3' (A; SECV ID Nr. 32); 35 5'- tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg-3'(B; SECV ID Nr. 33); 37 5'- tctgaagtac agctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg -3' (B2; SECV ID Nr. 57); 39 5'- tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtaa agcctggagg gtccctgaaa ctctcctgtg cagcctctgg -3' (B3; SECV ID Nr. 66); 41 5'- attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga gtgggttgca accattagta -3' (C; SECV ID Nr. 34); 43 5'- attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag actccagaga agaggctgga gtgggttgca accattagta -3' (C2; SECV ID Nr. 64); 45 77 RO 123525 Β1 5'- gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaccctg -3' (D; SECV ID Nr. 35); 5'- tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3' (E; SECV ID Nr. 36); 5'- tatctgcaaa tgagcagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3' (E2; SECV ID Nr. 62); 5'- tatctgcaaa tgagcagtct gagatctgag gacacggcta tgtattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3' (E3; SECV ID Nr. 67); 5'- ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat cggtc -3' (F; SECV ID Nr. 37); 5'- ggactactgg ggccaaggga ccactctcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat cggtc -3' (F2; SECV ID Nr. 68); 5'- ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa -3' (G; SECV ID Nr. 38); 5'- tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg -3' (H; SECV ID Nr. 39); 5'- tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagct gtacttcaga gtggacacct gtagctgttg -3' (H2; SECV ID Nr. 58); 5'- tttcagggac cctccaggct ttactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg -3' (H3; SECV ID Nr. 69); 5'- tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag -3' (I; SECV ID Nr. 40); 5'- tccagcctct tctctggagt ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag -3' (12; SECV ID Nr. 65); 5'- ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac tactaatggt tgcaacccac -3' (J; SECV ID Nr. 41); 5'- ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt -3' (K; SECV ID Nr. 42); 5'- ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3' (K2; SECV ID Nr. 63); 5'- ccttcttgca cagtaataca tagccgtgtc ctcagatctc agactgctca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3' (K3; SECV ID Nr. 70); 5'- gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cacc -3' (L; SECV ID Nr. 43) şi 5'- gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgaga gtggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cacc -3' (L2; SECV ID Nr. 71).
Următorii doi primeri PCR sunt sintetizaţi aşa cum s-a descris mai sus: 5'- ttggataagc ttggcttgac -3' (P1; SECV ID Nr. 44); şi 5'- gaccgatggg cccttggtgg a -3' (P2; SECV ID Nr. 45).
Sinteza ADN-ului de tip H1, care codifică lanţul polipeptidic care conţine o secvenţă de semnal de secreţie, o regiune variabilă a lanţului greu TRA-8 umanizat şi cele 8 resturi de aminoacid ale capătului N-terminal al regiunii lgG-CH1 este realizată utilizând o combinaţie a PCR.
Fragmentul de ADN de tip H1 este preparat după cum urmează. 78 RO 123525 Β1
Compoziţia soluţiei de reacţie PCR: - oligonucleotida A .......................................... 10pmol; - oligonucleotida B2 ......................................... 10pmol; - oligonucleotida C .......................................... 10pmol; - oligonucleotida D .......................................... 10pmol; - oligonucleotida E .......................................... 10pmol; - oligonucleotida F .......................................... 10pmol; - oligonucleotida G .......................................... 10pmol; - oligonucleotida H2 ......................................... 10pmol; - oligonucleotida I ........................................... 10pmol; - oligonucleotida J .......................................... 10 pmol; - oligonucleotida K .......................................... 10 pmol; - oligonucleotida L .......................................... 10 pmol; - oligonucleotida primer P1 ..................................... 2 μΜ; - oligonucleotida primer P2 ..................................... 2 μΜ; - tampon Pyrobest II ...................................... 10 X 10 pl; - amestec dNTP ............................................... 8 pl; - polimerază ADN Pyrobest ....................................0,5 pl şi - apă redistilată la un volum final de 50 pl.
Reacţia PCR este dirijată după cum urmează. Soluţia este mai întâi încălzită la 94°C, timp de 5 min, după care se repetă de 7 ori un ciclu de încălzire la 98°C, timp de 10 s, la 55°C, timp de 30 s şi la 72°C, timp de un minut. După efectuarea acestei proceduri, soluţia de reacţie este încălzită la 72°C, timp de 15 min.
După extracţia cu fenol şi precipitarea din etanol, precipitatul de ADN rezultat este uscat sub vid, dizolvat într-o cantitate minimă de apă redistilată şi separat prin electroforeză pe gel de agaroză 3%. După electroforeză, gelul este colorat cu 1 pg/ml soluţie apoasă de bromură de etidiu, pentru a permite detecţia ADN-ului sub lumină UV. Benzile ADN, care corespund la ADN tip H1, sunt îndepărtate prin tăiere, utilizând o lamă de ras şi sunt eluate din gel, utilizând trusa Geneclean Spin Kit (BIO 101, CA, USA). După extracţia cu fenol, ADN-ul eluat este apoi concentrat prin centrifugare la 7500 X g, urmată de precipitarea din etanol şi, în final, este dizolvat în 5 pl de apă distilată.
Sinteza ADN-ului de tip H3, care codifică un lanţ polipeptidic care conţine o secvenţă de semnal de secreţie, o regiune variabilă a lanţului greu TRA-8 umanizat şi cele 8 resturi de aminoacid ale capătului N-terminal al regiunii lgG-CH1 este realizată, utilizând o combinaţie a PCR.
Fragmentul de ADN de tip H3 este preparat după cum urmează.
Compoziţia soluţiei de reacţie PCR: - oligonucleotida A .......................................... 10 pmol - oligonucleotida B .......................................... 10 pmol - oligonucleotida C .......................................... 10 pmol - oligonucleotida D .......................................... 10 pmol - oligonucleotida E2 ......................................... 10 pmol - oligonucleotida F .......................................... 10 pmol - oligonucleotida G .......................................... 10 pmol - oligonucleotida H .......................................... 10 pmol 79 RO 123525 Β1 - oligonucleotida I........................................... 10pmol; - oligonucleotida J .......................................... 10 pmol; - oligonucleotida K2......................................... 10 pmol; - oligonucleotida L .......................................... 10 pmol; - oligonucleotida primer P1 ......................................2 μΜ; - oligonucleotida primer P2 ......................................2 μΜ; - tampon Pyrobest II .......................................10 X 10 pl; - amestec dNTP ...............................................8 μΙ; - polimerază ADN Pyrobest................................... 0,5 μΙ şi - apă redistilată la un volum final de 50 μΙ.
Reacţia PCR este dirijată după cum urmează. Soluţia este mai întâi încălzită la 94°C, timp de 5 min, după care se repetă de 7 ori un ciclu de încălzire la 98°C, timp de 10 s, la 55°C, timp de 30 s şi la 72°C, timp de un minut. După efectuarea acestei proceduri, soluţia de reacţie este încălzită la 72°C, timp de 15 min.
După extracţia cu fenol şi precipitarea din etanol, precipitatul de ADN rezultat este uscat sub vid, dizolvat într-o cantitate minimă de apă redistilată şi separat prin electroforeză pe gel de agaroză 3%. După electroforeză, gelul este colorat cu 1 pg/ml soluţie apoasă de bromură de etidiu, pentru a permite detecţia ADN-ului sub lumină UV. Benzile ADN, care corespund la ADN tip H3, sunt îndepărtate prin tăiere, utilizând o lamă de ras şi sunt eluate din gel, utilizând trusa Geneclean Spin Kit. După extracţia cu fenol, ADN-ul eluat este apoi concentrat prin centrifugare la 7500 X g, urmată de precipitarea din etanol şi, în final, este dizolvat în 5 μΙ de apă distilată.
Sinteza ADN-ului de tip H4, care codifică un lanţ polipeptidic care conţine o secvenţă de semnal de secreţie, o regiune variabilă a lanţului greu TRA-8 umanizat şi cele 8 resturi de aminoacid ale capătului N-terminal al regiunii lgG-CH1, este realizată utilizând o combinaţie a PCR.
Fragmentul de ADN de tip H4 este preparat după cum urmează.
Compoziţia soluţiei de reacţie PCR: - oligonucleotida A.......................................... 10 pmol; - oligonucleotida B.......................................... 10 pmol; - oligonucleotida C2......................................... 10 pmol; - oligonucleotida D.......................................... 10 pmol; - oligonucleotida E2......................................... 10 pmol; - oligonucleotida F .......................................... 10 pmol; - oligonucleotida G.......................................... 10 pmol; - oligonucleotida H.......................................... 10 pmol; - oligonucleotida I2.......................................... 10 pmol; - oligonucleotida J .......................................... 10 pmol; - oligonucleotida K2......................................... 10 pmol; - oligonucleotida L .......................................... 10 pmol; - oligonucleotida primer P1 ..................................... 2 μΜ; - oligonucleotida primer P2 ..................................... 2 μΜ; - tampon Pyrobest II ....................................... 10X10 μΙ; - amestec dNTP ...............................................8 μΙ; - polimerază ADN Pyrobest.................................... 0,5 μΙ şi - apă redistilată la un volum final de 50 μΙ. 80 RO 123525 Β1
Reacţia PCR este dirijată după cum urmează. Soluţia este mai întâi încălzită la 94°C, 1 timp de 5 min, după care se repetă de 7 ori un ciclu de încălzire la 98°C, timp de 10 s, la 55°C, timp de 30 s şi la 72°C, timp de un minut. După efectuarea acestei proceduri, soluţia 3 de reacţie este încălzită la 72°C, timp de 15 min.
După extracţia cu fenol şi precipitarea din etanol, precipitatul de ADN rezultat este 5 uscat sub vid, dizolvat într-o cantitate minimă de apă redistilată şi separat prin electroforeză pe gel de agaroză 3%. După electroforeză, gelul este colorat cu 1 pg/ml soluţie apoasă de 7 bromură de etidiu, pentru a permite detecţia ADN-ului sub lumină UV. Benzile ADN care corespund la ADN tip H4 sunt îndepărtate prin tăiere, utilizând o lamă de ras şi sunt eluate 9 din gel, utilizând trusa Geneclean Spin Kit. După extracţia cu fenol, ADN-ul eluat este apoi concentrat prin centrifugare la 7500 X g, urmată de precipitarea din etanol şi, în final, este 11 dizolvat în 5 pl de apă distilată.
Sinteza ADN-ului de tip M, care codifică un lanţ polipeptidic care conţine o secvenţă 13 de semnal de secreţie, o regiune variabilă a lanţului greu TRA-8 himeric şi cele 8 resturi de aminoacid ale capătului N-terminal al regiunii lgG-CH1, este realizată, utilizând o combinaţie 15 a PCR.
Fragmentul de ADN de tip M este preparat după cum urmează: 17
Compoziţia soluţiei de reacţie PCR: - oligonucleotida A .......................................... 10pmol; 19 - oligonucleotida B3 ......................................... 10pmol; - oligonucleotida C2 ......................................... 10pmol; 21 - oligonucleotida D .......................................... 10pmol; - oligonucleotida E3 ......................................... 10pmol; 23 - oligonucleotida F2 ......................................... 10pmol; - oligonucleotida G .......................................... 10pmol; 25 - oligonucleotida H3 ......................................... 10pmol; - oligonucleotida 12.......................................... 10pmol; 27 - oligonucleotida J .......................................... 10 pmol; - oligonucleotida K3 ......................................... 10 pmol; 29 - oligonucleotida L2 ......................................... 10 pmol; - oligonucleotida primer P1 ..................................... 2 μΜ; 31 - oligonucleotida primer P2 ..................................... 2 μΜ; - tampon Pyrobest II ...................................... 10 X 10 μΙ; 33 - amestec dNTP ............................................... 8 μΙ; - polimerază ADN Pyrobest ....................................0,5 μΙ şi 35 - apă redistilată la un volum final de 50 μΙ.
Reacţia PCR este dirijată după cum urmează. Soluţia este mai întâi încălzită la 94°C, 37 timp de 5 min, după care se repetă de 7 ori un ciclu de încălzire la 98°C, timp de 10 s, la 55°C, timp de 30 s şi la 72°C, timp de un minut. După efectuarea acestei proceduri, soluţia 39 de reacţie este încălzită la 72°C, timp de 15 min.
După extracţia cu fenol şi precipitarea din etanol, precipitatul de ADN rezultat este 41 uscat sub vid, dizolvat într-o cantitate minimă de apă redistilată şi separat prin electroforeză pe gel de agaroză 3%. După electroforeză, gelul este colorat cu 1 pg/ml soluţie apoasă de 43 bromură de etidiu, pentru a permite detecţia ADN-ului sub lumină UV. Benzile ADN, care corespund la ADN tip M, sunt îndepărtate prin tăiere, utilizând o lamă de ras şi sunt eluate 45 81 RO 123525 Β1 din gel, utilizând trusa Geneclean Spin Kit. După extracţia cu fenol, ADN-ul eluat este apoi concentrat prin centrifugare la 7500 X g, urmată de precipitarea din etanol şi, în final, este dizolvat în 5 μΙ de apă distilată.
Fiecare ADN extras rezultat (tip H1, tip H3, tip H4, şi tip M) este donat, utilizând vectorul pGem-T Easy (Promega) după cum urmează: - Fragmentul ADN recuperat din reacţia PCR (H1, H3, H4 sau M) ........ 5 μΙ; - Tampon polimerază Taq .................................... 10X1 μΙ; - Amestec dNTP............................................... 1 μΙ; - Polimerază Taq (5 unităţi/ml).................................. 1 μΙ şi - Apă redistilată la volumul final de 10 μΙ.
După ce fiecare dintre soluţiile de mai sus reacţionează la 70°C, timp de 30 min, fiecare soluţie ADN şi vector pGEM-T Easy sunt legate, utilizând o trusă DNA Ligation Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.), utilizând protocolul fabricantului.
După 4 h de incubare la 15°C, 2 μΙ din soluţia de reacţie incubată se amestecă cu 100 μΙ de tulpină de E. coli competentă JM109, la o densitate a celulelor de 1-2x109 celule/ml (Takara Shuzo Co., Ldt), iar amestecul este menţinut pe gheaţă, timp de 30 min, apoi la 42°C, timp de 30 s, şi din nou pe gheaţă, timp de un minut. Apoi, se adaugă, la amestec, 500 μΙ de mediu SOC (2% v/v triptonă, 0,5% extract de drojdie, 0,05% grN clorură de sodiu, 2,5 mM gr/v clorură de potasiu, 1 mM clorură de magneziu, şi 20 mM glucoză), apoi se incubează timp de încă o oră, agitând. Tulpinile transformante sunt apoi izolate şi se prepară ADN plasmidian din tulpini, după descrierea din Molecular Cloning, a Laboratory Manual. Secvenţele de nucleotide, ale acestor ADN-uri care codifică lanţul greu al TRA-8 umanizat, sunt confirmate prin metoda dideoxi (Sânger, F. S. et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. SUA, 74:5463-5467), utilizând analizorul 3700 DNA (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).
Plasmidele rezultate se denumesc pHA15 (plasmida care poartă cADN-ul care codifică lanţul greu de tip H1 al TRA-8 umanizat), pHC10 (plasmida care poartă cADN-ul care codifică lanţul greu de tip H3 al TRA-8 umanizat), pHD21 (plasmida care poartă cADN-ul care codifică lanţul greu de tip H4 al TRA-8 umanizat), şi pM11 (plasmida care poartă cADN-ul care codifică lanţul greu al TRA-8 himeric). Tulpinile de E. coli transformante, care poartă această plasmidă, desemnate E. coli JM109/pHA15, E. coli JM109/pHC10, E. coli JM109/pHD21 şi E. coli JM109/pM11 au fost depozitate la Organismul Internaţional Depozitar al Brevetelor, Institutul Naţional pentru Ştiinţă şi Tehnologie Avansată, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia în 20 aprilie 2001, în acord cu Tratatul de la Budapesta pentru Depozitele de Microorganisme, şi le-a fost acordat numărul de acces FERM BP-7555, FERM BP-7557, FERM BP-7558 şi, respectiv, FERM BP-7559. 3. Construirea plasmidelorde expresie care poartă ADN-ul regiunii variabile a lanţului greu al câtorva tipuri de TRA-8 umanizate sau de şoarece
Vectorii de expresie recombinaţi pentru celulele animale se construiesc prin inserarea ADN-ului care codifică lanţul greu al TRA-8 de tip H1, de tip H3, şi de tip H4 umanizat sau himeric de tip M (donat în cele de mai sus) după cum urmează. 1 pg de plasmidă pSRHHH3 (cererea de brevet european EP 0909816 A1) care poartă regiunea variabilă a lanţului greu al regiunii variabile a anticorpului monoclonal anti-Fas umanizat HFE7A şi ADN-ul genomic al regiunii constante a lgG1 umane, un vector de exprimare pentru celulele de mamifer, este digerat cu enzimele de restricţie Hindlll şi Apal, 82 RO 123525 Β1 şi se separă prin electroforeză în gel de agaroză 3%. După electroforeză, gelul se colorează 1 cu soluţie apoasă 1 pg/ ml bromură de etidiu pentru a permite detectarea ADN în lumină UV.
Benzile de ADN ale vectorului care conţin ADN-ul genomic al regiunii constante ale lgG1 3 umane fără regiunea variabilă a lanţului greu al HFE7A umanizat sunt tăiate, utilizând o lamă de ras şi se eluează din gel, utilizând trusa Geneclean Spin. După extracţia cu fenol, ADN-ul 5 eluat este apoi concentrat prin centrifugare la 7500 X g, urmată de precipitare din etanol şi, în final, dizolvare în 5 μΙ de apă distilată, şi apoi defosforilare, utilizând CIP. Plasmida 7 defosforilată, digerată (100 ng) este legată cu 1 pg de fragment pHA15, pHC10, pHD21, sau pM11 de ADN, care conţine ADN-ul care codifică regiunea variabilă a lanţului greu al TRA-8 9 umanizat sau himeric, care a fost de asemenea digerată cu Hindlll şi Apal, utilizând o trusă DNA Ligation Kit versiunea 2.0 (Takara Shuzo Co., Ldt). Amestecul de legare este apoi 11 utilizat pentru a transforma E. coli JM109, care este apoi pusă pe plăci de agar LB care conţin 50 pg/ml ampicilină. 13
Transformanţii obţinuţi prin această metodă sunt cultivaţi în 2 ml mediu LB lichid care conţin 50 pg/ml ampicilină, la 37°C, peste noapte, iar ADN-ul plasmidian se extrage ulterior 15 din cultura rezultată prin metoda alcalină SDS. ADN-ul plasmidian extras este digerat cu Hindlll şi Apal, şi este supus electroforezei 17 în gel de agaroză 3% gr/v, pentru a conforma prezenţa sau absenţa insertului de ADN care codifică regiunea variabilă a lanţului greu al TRA-8 umanizat sau himeric. Inserţia şi 19 orientarea fragmentului de ADN dorit în vector sunt confirmate prin secvenţierea ADN-ului, utilizând un analizor de secvenţe de gene (analizorul de ADN ABI Prism 3700; Applied 21 Biosystems). Plasmidele de exprimare rezultate care poartă cADN care codifică lanţul greu al TRA-8 umanizat sau himeric sunt desemnate pHA15-1, pHC10-3, pHD21-1, şi respectiv 23 pM 11-1. 4. Construirea vectorilor pentru lanţurile uşoare umanizate 25 4.1. Construirea unui vector de exprimare pentru lanţul uşor al anticorpului umanizat (de tip LM1) 27
După cum se arată în SECV ID nr. 72 din Lista de Secvenţe, umanizarea de tip H1 (tip LM1) a secvenţelor de aminoacizi ale lanţului greu al anticorpului DR5 antiuman de 29 şoarece TRA-8 a determinat înlocuirea aminoacidului 3 (valina), aminoacidului 8 (histidina), aminoacidului 9 (lizina), aminoacidului 10 (fenilalanina), aminoacidului 11 (metionina), 31 aminoacidului 13 (treonina), aminoacidului 20 (serina), aminoacidului 42 (glutamina), aminoacidului 43 (serina), aminoacidului 60 (acidul aspartic), aminoacidului 63 (treonina), 33 aminoacidului 77 (asparagina), aminoacidului 78 (valina), aminoacidului 80 (serina), aminoacidului 83 (leucina), aminoacidului 85 (acidul aspartic), aminoacidului 87 35 (fenilalanina), şi aminoacidului 99 (glicina), aminoacidului 103 (leucina), şi aminoacidului 108 (alanina) de la capătul N-terminal al secvenţei de aminoacizi a lanţului uşor TRA-8 se 37 înlocuiesc cu glutamină, prolină, serină, serină, leucină, alanină, treonină, lizină, alanină, serină, serină, serină, leucină, prolină, fenilalanină, treonină, tirozină, glutamină, valină şi 39 respectiv treonină. Secvenţa rezultată se denumeşte LM1.
Plasmidele de expresie care poartă acest tip de secvenţe de aminoacizi ale lanţului 41 uşor umanizat ale anticorpului antiuman DR5 TRA-8 (de tip LM1, SECV ID nr 72 din lista de secvenţe) se construiesc după cum urmează. 43 83 RO 123525 Β1 1. Sinteza primerilor pentru prepararea regiunilor variabile şi constante ale lanţului uşor al TRAS umanizat (de tip LM1) AND-ul care codifică lanţul polipeptidic LM1 (SECVID nr. 72 din Lista de Secvenţe), fiecare dintre acestea fiind o fuziune dintre regiunea variabilă a lanţului uşor (de tip LM1) al anticorpului anti-DR5 umanizat TRA-8 şi regiunea constantă a lanţului uşor al Ig umane (lanţul k), sunt sintetizate prin utilizarea de combinaţii ale PCR.
Suplimentar faţă de 7AL1P (SECV ID Nr. 47) şi 7ALCN (SECV ID Nr. 48), HKCDF11 (SECV ID nr. 50), HKCDR12 (SECV ID nr. 51), HKCDF22 (SECV ID nr. 52), HKCDR22 (SECV ID nr53), şi HKCF12 (SECV ID nr. 54), se sintetizează pentru PCR următorii primeri oligonucleotidici: 5'-gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atctgaatgt caccagtgga-3' (HKSPR12; SECV ID nr. 77). 2. Construcţia plasmidei pCR3.1/LM1-2 (donarea lanţului uşor al TRAS umanizat de tip LM1)
Fragmentul de ADN-LM1 care codifică secvenţa de aminoacizi care a fost definită în SECV ID nr 72 a aceluiaşi se prepară prin realizarea PCR în 2 etape, se inserează într-un vector plasmidian şi se donează în E. coli.
a. Prima etapă a PCR
Fragmentul LM1-F1-ADN care codifică o secvenţă de semnal de secreţie şi o porţiune a regiunii FRL,, cu un situs de clivaj al enzimei de restricţie Hind III, adăugat la capătul 5', se prepară în următoarele condiţii: plasmidele matriţă, pHSGHM17 şi pSRPDHH, se obţin urmând descrierea din cererea de brevet european EP 0909816 A1.
Compoziţia soluţiei de reacţie: - ADN-ul plasmidei pHSGHM17 ................................. 25 ng; - primeroligonucleotidic7AL1P ...............................50 pmoli; - cocteil de dNTP-uri ........................................... 5 μΙ; - tampon 10xPCR.............................................. 5 μΙ; - ADN polimerază ampliTaq (PerkinElmer) ......................2,5 unităţi.
Soluţia de reacţie, având compoziţia de mai sus, este ajustată la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR.
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care se încălzeşte într-un ciclu termic, la 94°C, timp de un minut, la 55°C, timp de un minut şi la 72°C, timp de 2 min, care se repetă de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.
Fragmentul ADN-ului LM1-F2, care codifică o porţiune a FRL,, CDRL,, FRL2 şi CDRL2, se prepară în următoarele condiţii:
Compoziţia soluţiei de reacţie: - ADN plasmidian pl_28 ........................................ 25 ng; - primer oligonucleotidic HKCDF11 ............................ 50 pmoli; - rimer oligonucleotidic HKCDF12 ............................. 50 pmoli; - cocteil de dNTP-uri ........................................... 5 μΙ; - tampon 10xPCR.............................................. 5 μΙ; ADN polimerază ampliTaq.................................. 2,5 unităţi.
Soluţia de reacţie, având compoziţia de mai sus, se ajustează la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR. 84 RO 123525 Β1
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care se încălzeşte într-un ciclu termic, la 94°C, timp de un minut, la 55°C, timp de un minut şi la 72°C, timp de 2 min, care se repetă de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.
Fragmentul ADN-ului LM1-F3, care codifică CDRL2, FRL3 şi o porţiune din CDRL3, se prepară în următoarele condiţii:
Compoziţia soluţiei de reacţie: - ADN-ul plasmidului pSRPDHH................................. 25 ng; - primer oligonucleotidic HKCDF22 ............................ 50 pmoli; - primer oligonucleotidic HKCDF22 ............................ 50 pmoli; - cocteil de dNTP-uri............................................ 5 μΙ; - tampon 10xPCR............................................. 5 μΙ; - ADN polimerază ampliTaq ................................. 2,5 unităţi.
Soluţia de reacţie, având compoziţia de mai sus, se ajustează la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR.
Condiţii termice PCR: încălzire la 94°C, după care un ciclu termic de 94°C, timp de un minut, 55°C, timp de un minut şi 72°C, timp de 2 min, repetat de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp 10 min.
Fragmentul de ADN al LM1-F4, care codifică CDRL3, FRL4 şi regiunea constantă cu un situs de clivaj pentru enzima de restricţie EcoR I, adăugată la capătul 3' terminal, se prepară în următoarele condiţii:
Compoziţia soluţiei de reacţie: - ADN-ul plasmidei pSRPDHH .................................. 25 ng; - primerul oligonucleotidic HKCF12 .............................50 pmol; - primerul oligonucleotidic 7ALCN ..............................50 pmol; - cocteil de dNTP-uri........................................... 5 μΙ; - tampon PCR ............................................. 10x5 μΙ; ADN polimerază ampliTaq .................................. 2,5 unităţi.
Soluţia de reacţie, care are compoziţia de mai sus, se ajustează la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR.
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care se încălzeşte într-un ciclu termic la 94°C, timp de un minut, la 55°C, timp de un minut şi la 72°C, timp de 2 min, repetat de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.
Fragmentele de ADN amplificate după PCR se separă prin electroforeză în gel de poliacrilamidă 5%. După electroforeză, gelul se colorează cu 1 pg/ml de bromură de etidiu, pentru a detecta ADN-ul produs sub lumină UV. Benzile de ADN respective, astfel detectate, sunt excizate cu o lamă de ras.
b. A doua etapă a PCR ADN-ul LM1, în care fragmentele descrise mai sus ADN LM1-F1, ADN LM1-F2, ADN LM1-F3 şi ADN LM1-F4 sunt fuzionate, se prepară în următoarele condiţii.
Compoziţia soluţiei de reacţie: - fragmentul gel de ADN-LM1-F1 preparat în prima etapă a PCR; - fragmentul gel de ADN-LM1-F2 preparat în prima etapă a PCR; - fragmentul gel de ADN-LM1-F3 preparat în prima etapă a PCR; - fragmentul gel de ADN-LM1-F4 preparat în prima etapă a PCR; RO 123525 Β1 - primerul oligonucleotidic 7AL1P ..............................50 pmoli; - primerul oligonucleotidic 7ALCN ..............................50 pmoli; - cocteil de dNTP-uri .......................................... 5,0 μΙ; - tampon 10x PCR............................................ 5,0 μΙ; - ADN polimerază ampliTaq .................................2,5 unităţi.
Soluţia de reacţie, având compoziţia de mai sus, se ajustează la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR.
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care se încălzeşte într-un ciclu termic, la 94°C, timp de un minut, la 55°C, timp de un minut şi la 72°C, timp de 2 min, repetat de 30 de ori, urmat de încălzire la 72'C, timp de 10 min.
Fragmentul de ADN-LM1 astfel preparat se inserează în plasmida pCR3.1ADN utilizând, trusa EukaryoticTA Cloning Kit (InVitrogen), urmând protocolul fabricantului şi se introduce în E. coli competentă TOP10F' conţinută în trusă. Secvenţele de nucleotide ale acestor ADN-uri, care codifică lanţul uşor al TRA-8 umanizat (tip LM1), sunt confirmate prin metoda dideoxi (F. S. Sânger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467), utilizând analizorul 3700 DNA (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).
Plasmidele rezultate se denumesc pCR3.1/LM1-2 (plasmida care poartă cADN-ul care codifică regiunea variabilă a lanţului uşor al TRA-8 umanizat (tip LM1) şi o regiune constantă a lanţului uşor al Ig umane).
Plasmida pCR3.1/LM1-2, care conţine fragmentul de ADN LM1, este digerată cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I. 1 pg de ADN al plasmidei de donare pHSG399 este digerat cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I, şi apoi se defosforilează cu CIP. Fragmentele rezultate de ADN pHSG399 şi de ADN al LM1 defosforilate, care au fost digerate cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I se leagă, utilizând trusa DNA Ligation, versiunea 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Apoi, E. coli DH5a este transformată cu ADN legat şi este întinsă pe un mediu de agar LB, care conţine IPTG 0,1 mM, 0,1% X-Gal şi 50 pg/ml cloramfenicol (concentraţii finale). Transformanţii albi obţinuţi se cultivă în mediu lichid LB, care conţine 50 pg/ml cloramfenicol, şi ADN-ul plasmidian este extras din cultura rezultată în conformitate cu metoda alcalin-SDS. ADN-ul plasmidian extras este digerat cu Hind III şi EcoR I, şi apoi este selectată o clonă purtătoare de fragment LM1-ADN prin electroforeză în gel de agaroză 1%.
Ca rezultat al procedurii de mai sus, se obţine plasmida pHSG/M 1-2-2 purtătoare a unui fragment de fuziune al regiunii variabile a lanţului uşor LM1 TRA-8 umanizat al regiunii constante a lanţului uman Ig k. Tulpina transformantă E. coli, care prezintă această plasmidă, denumită E. coli DH5a/pHSG/M 1-2-2, a fost depozitată în International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia, la data de 20 Aprilie, 2001, în conformitate cu Tratatul de la Budapesta pentru Depozitarea Microorganismelor, şi i-a fost acordat numărul de acces FERM BP-7562. 3. Construirea plasmidei pSR/LM1-2 (plasmida de expresie pentru lanţul uşor LM1 TRAS umanizat)
Plasmida obţinută pHSG/M1-2 purtătoare a unui fragment de fuziune al regiunii variabile a lanţului uşor LM1 TRA-8 umanizat şi regiunea constantă a lanţului uman Ig κ este digerată cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I. 86 RO 123525 Β1 1 pg al plasmidei de donare ADN pSRPDHH (cererea de brevet european 1 EP 0909816 A1) este digerat cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I, şi apoi este defosforilată cu CIP. ADN-ul defosforilat rezultat pSRPDHH şi fragmentul Hindlll-EcoRI 3 obţinut din pHSG/M 1-2-2 sunt legate, utilizând Trusa de Legare ADN, versiunea 2.0 (DNA Ligation Kit Version 2.0) (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Apoi E. coli DH5a este transformat cu 5 ADN-ul legat şi întinsă pe agar LB. Transformanţii obţinuţi sunt cultivaţi în mediu lichid LB, care conţine 100 pg/ml ampicilină, şi ADN-ul plasmidian se extrage din cultura rezultată, în 7 conformitate cu metoda alcalin-SDS. Inserţia şi orientarea fragmentului de ADN dorit, în vectorul pSRPDHH, sunt confirmate prin secvenţierea ADN, utilizând un analizor de 9 secvenţe de gene.
Plasmida de exprimare, care poartă cADN-ul care codifică lanţul uşor al LM1 TRA-8 11 umanizat, este desemnată pSR/LM1-2. 4.2. Construirea vectorului de exprimare al lanţului uşor al anticorpului umanizat (tip 13 LM3) Aşa cum este prezentat în SECVID Nr. 73 din Lista de Secvenţe, alte umanizări (de 15 tip LM3) ale secvenţelor de aminoacizi ale lanţului uşor al anticorpului şoarece antiuman DR5 TRA-8 au determinat înlocuirea celui de-al 8-lea aminoacid (histidina), al 9-lea aminoacid 17 (Uzina), al 10-lea aminoacid (fenilalanina), al 11-lea aminoacid (metionina), al 13-lea aminoacid (treonina), al 20-lea aminoacid (serina), al 42-lea aminoacid (glutamina), al 43-lea 19 aminoacid (serina), al 77-lea aminoacid (asparagina), al 78-lea aminoacid (valina), al 80-lea aminoacid (serina), al 83-lea aminoacid (leucina), al 85-lea aminoacid (acidul aspartic), al 21 87-lea aminoacid (fenilalanina), al 99-lea aminoacid (glicina), al 103-lea aminoacid (leucina) şi al 108-lea aminoacid (alanina) din capătul N- terminal al secvenţei aminoacid a lanţului 23 uşor TRA-8 cu pralină, serină, leucină, alanină, treonină, lizină, alanină, serină, leucină, pralină, fenilalanină, treonină, tirozină, glutamină, valină şi, respectiv, treonină, Secvenţa 25 rezultată este denumită LM3.
Plasmidele de exprimare, care poartă acest tip de secvenţe de aminoacizi de lanţ 27 uşor umanizate ale anticorpului DR5 antiuman TRA-8 (tip LM3, SECV ID Nr. 73 din Lista de Secvenţe), sunt construite după cum urmează. 29 1. Sinteza primerilor pentru prepararea regiunilor variabile şi constante ale lanţului uşor al LM3 TRA-8 umanizat 31 ADN-ul care codifică lanţul polipeptidic la LM3 (SECV ID Nr. 73 din Lista de Secvenţe), fiecare dintre acestea fiind o fuziune a regiunii variabile a lanţului uşor al 33 anticorpului anti-DR5 TRA-8 umanizat şi regiunea constantă a lanţului uşor uman Ig (lanţul k), sunt sintetizate, utilizând combinaţii de PCR. în continuare, după 7AL1P (SECV ID Nr. 35 47) şi 7ALCN (SECV ID Nr. 48), au fost sintetizaţi următorii primeri oligonucleotidici pentru PCR: 37 5'- atctagttct cagagatgga gacagacaca atcctgctat gggtgctgct gctctgggtt ccagg -3' (MOD1F1; SECVIDNr. 78); 39 5'- cagcacccat agcaggattg tgtctgtctc catctctgag aactagatga gaggatgctt cttaagctt - 3' (MOD1R1; SECVIDNr. 79); 41 5'- ctccactggt gacattgtga tgacccaatc tccaagttct ttgtctgcat ctgtggggga cagggtc-3' (MOD1F22; SECV ID Nr. 80); 43 5'- acttggagat tgggtcatca caatgtcacc agtggagcct ggaacccaga gcag-3' (MOD 1R22; SECV ID Nr. 81); 45 87 RO 123525 Β1 5'-accatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta ccaacagaaa ccaggaa - 3' (MOD1F3; SECV ID Nr. 82); 5'- tacagcagta cccacatcct gactggcctt gcaggtgatg gtgaccctgt cccccacaga tgcagacaaa ga -3' (MOD1R3; SECV ID Nr. 83); 5'- aagcacccaa actcctcatc tattgggcat ccacccggca cactggggtc ccagataggt ttacaggcag t -3' (MOD1F42; SECV ID Nr. 84); 5'- cccagtgtgc cgggtggatg cccaatagat gaggagtttg ggtgcttttc ctggtttctg ttggtaccag gc -3' (MOD1R4; SECV ID Nr. 85); 5'- gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcaacc tat -3' (MOD1F5; SECVIDNr. 86); 5'- actagagatg gtgagggtga agtctgtccc agacccactg cctgtaaacc tatctgggac -3' MOD1R52;SECV. ID. Nr. 87); 5'- tactgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc -3' (MOD1F6; SECV ID Nr. 88); 5'- cgtccgatag ctgctatatt gctgacagta ataggttgca aaatcctccg gctgcac -3' (MOD1R6;SECV ID Nr. 89);
5'- aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga g -3' (MOD1F7; SECV ID
Nr. 90); 5'- gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgccttgacc gaa -3' (M0D1R7; SECV ID Nr. 91); şi 5'- agatttcaac tgctcatcag atggcgggaa (LR17; SECV ID Nr. 101). 2. Construcţia plasmidei pCR3.1/LM3-3-44 (donarea lanţului uşor de tip LM3 umanizat al TRA-8)
Fragmentul ADN-LM3, care codifică secvenţa de aminoacid, aşa cum este definită în SECV ID Nr. 73 a aceluiaşi, se prepară prin efectuarea PCR în două etape, inserţia într-un vector plasmidian şi donând în E. coli. a. Prima etapă a PCR
Fragmentul LM3-F31B-ADN, care codifică o secvenţă de semnal de secreţie cu un situs de clivaj al enzimei de restricţie Hind III, adăugat la capătul 5' FRL, CDRL,, FRL2 şi CDRL2, FRI-3, CDRI_3, FRL4 şi o porţiune a regiunii constante se prepară în următoarele condiţii.
Compoziţia soluţiei de reacţie: - primeroligonucleotidic MOD1F1 ............................... 5 pmol - primer oligonucleotidic MOD1R1............................... 5 pmol - primeroligonucleotidicMOD1F22.............................. 5 pmol - primeroligonucleotidic MOD1R22.............................. 5 pmol - primer oligonucleotidic MOD1F3............................... 5 pmol - primer oligonucleotidic MOD1R3............................... 5 pmol - primer oligonucleotidic MOD1F42.............................. 5 pmol - primer oligonucleotidic MOD1R4............................... 5 pmol - primer oligonucleotidic MOD1F5............................... 5 pmol - primeroligonucleotidic MOD1R52.............................. 5 pmol - primeroligonucleotidic MOD1F6............................... 5 pmol - primeroligonucleotidic MOD1R6............................... 5 pmol - primer oligonucleotidic MOD1F7.............................. 50 pmol 88 RO 123525 Β1 - primer oligonucleotidic MOD1R7 ...............................5 pmol; 1 - primer oligonucleotidic 7AL1P ................................50 pmol; - primer oligonucleotidic LR17 .................................50 pmol; 3 - cocteil de dNTP-uri ..........................................5,0 μΙ; - tampon 10x PCR ............................................. 5 μΙ; 5 - ADN polimerază ampliTaq..................................2,5 unităţi.
Soluţia de reacţie, având compoziţia de mai sus, se ajustează la un volum final de 7 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR.
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care se încălzeşte 9 într-un ciclu termic, la 94°C, timp de un minut, la 55°C, timp de un minut şi la 72°C, timp de 2 min, repetat de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min. 11
Fragmentul LM3-F31C-ADN, care codifică o porţiune a regiunii constante cu un situs de clivaj al enzimei de restricţie Eco R I, adăugat la capătul 3', se prepară în următoarele 13 condiţii.
Plasmidele matriţă, pSRPDHH, se obţin, urmând descrierea din cererea de brevet 15 european EP 0909816 A1.
Compoziţia soluţiei de reacţie: 17 - plasmidă pSRPDHH ADN .................................... 25 ng; - primer oligonucleotidic MOD1F7 .............................. 50 pmol; 19 - primer oligonucleotidic 7ALCN................................ 50 pmol; - cocteil de dNTP-uri............................................ 5 μΙ; 21 - tampon 10x PCR ............................................. 5 μΙ; - ADN polimerază ampliTaq................................. 2,5 unităţi. 23
Soluţia de reacţie, care are compoziţia de mai sus, se ajustează la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR. 25
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care se încălzeşte într-un ciclu termic, la 94°C, timp de un minut, la 55°C, timp de un minut şi la 72°C, timp de 27 2 min, repetat de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.
Fragmentele de ADN amplificate după PCR se separă prin electroforeză în gel de 29 pol i acrii am i dă 5%. După electroforeză, gelul se colorează cu 1 μΙ/ml de bromură de etidiu, pentru a detecta ADN-ul produs sub lumină UV. Benzile de ADN respective astfel detectate 31 sunt excizate cu o lamă de ras. b. A doua etapă a PCR 33 ADN-ul LM3, în care fragmentele descrise mai sus, ADN LM3-F31B, şi ADN LM3-F31C, sunt fuzionate, se prepară în următoarele condiţii. 35
Compoziţia soluţiei de reacţie: - fragmentul gel de ADN-LM3-F31B preparat în prima etapă a PCR; 37 - fragmentul gel de ADN-LM3-F31C preparat în prima etapă a PCR; - primerul oligonucleotidic 7AL1P ..............................50 pmoli; 39 - primerul oligonucleotidic 7ALCN ..............................50 pmol; - cocteil de dNTP-uri ..........................................5,0 μΙ; 41 - tampon 10x PCR ............................................5,0 μΙ; - ADN polimerază ampliTaq..................................2,5 unităţi. 43
Soluţia de reacţie, având compoziţia de mai sus, se ajustează la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR. 45 89 RO 123525 Β1
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care se încălzeşte într-un ciclu termic, la 94°C, timp de un minut, la 55°C, timp de un minut şi la 72°C, timp de 2 min, repetat de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.
Fragmentul de ADN-LM3 astfel preparat se inserează în plasmida pCR3.1ADN, utilizând trusa Eukaryotic TA Cloning Kit (InVitrogen), urmând protocolul fabricantului şi se introduce în E. coli competentă TOP10F' conţinută în trusă. Secvenţele de nucleotide, ale acestor ADN-uri care codifică lanţul uşor al LM3 TRA-8 umanizat, sunt confirmate prin metoda dideoxi (F. S. Sânger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467), utilizând analizorul 3700 DNA Analyzer(ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).
Plasmidele rezultate se denumesc pCR3.1/LM3-3-44 (plasmida care poartă cADN-ul care codifică regiunea variabilă a lanţului uşor al LM3 TRA-8 umanizat şi o regiune constantă a lanţului uşor al Ig umane).
Plasmida pCR3.1/LM3-3-44 obţinută, care conţine fragmentul de ADN LM3, este digerată cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I. 1 pg de ADN al plasmidei de donare pHSG399 este digerat cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I, şi apoi se defosforilează cu CIP. Fragmentele rezultate de ADN pHSG399 şi de ADN al LM3 defosforilate, care au fost digerate cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I, se leagă, utilizând trusa DNA Ligation, versiunea 2.0 (TakaraSyuzo, Co. Ltd.). Apoi, E. coli DH5a este transformată cu ADN-ul legat şi este întinsă pe un mediu de agar LB, care conţine IPTG 0,1 mM, 0,1% X-Gal şi 50 pg/ml cloramfenicol (concentraţii finale). Transformanţii albi obţinuţi se cultivă în mediu lichid LB, care conţine 50 pg/ml cloramfenicol, şi ADN-ul plasmidian este extras din cultura rezultată, în conformitate cu metoda alcalin-SDS. ADN-ul plasmidian extras este digerat cu Hind III şi EcoR I şi apoi este selectată o clonă purtătoare de fragment LM3-ADN prin electroforeză în gel de agaroză 1%.
Ca rezultat al procedurii de mai sus, se obţine plasmida pHSG/M3-3-22 purtătoare a unui fragment de fuziune al regiunii variabile a lanţului uşor LM3 TRA-8 umanizat al regiunii constante al lanţului uman Ig k. Tulpina transformantă E. coli, care prezintă această plasmidă, denumită E. coli DH5a/pHSG/M3-3-22, a fost depozitată în International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia, la data de 20 Aprilie, 2001, în conformitate cu Tratatul de la Budapesta pentru Depozitarea Microorganismelor, şi i-a fost acordat numărul de acces FERM BP-7564. 3. Construirea plasmideipSR/LM3-3-44-10 (plasmida de exprimare pentru lanţul uşor LM3 al TRAS umanizat)
Plasmida obţinută, pHSG/M3-3-22, purtătoare a unui fragment de fuziune al regiunii variabile a lanţului uşor, LM3 al TRA-8, umanizat, şi regiunea constantă a lanţului uman Igic sunt digerate cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I. 1 pg de ADN al plasmidei de donare pSRPDHH (cererea de brevet european EP 0909816 A1) este digerat cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I, şi apoi este defosforilat cu CIP. ADN-ul defosforilat, rezultat, pSRPDHH, şi fragmentul Hindlll-EcoRI, obţinut din pHSG/M3-3-22, sunt legate utilizând Trusa de Legare ADN, versiunea 2,0 (DNA Ligation Kit Version 2.0) (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Apoi E. coli DH5a este transformată cu ADN-ul legat şi întinsă pe agar LB. Transformanţii obţinuţi sunt cultivaţi în mediu lichid LB, care conţine 100 pg/ml ampicilină, şi ADN-ul plasmidian se extrage din cultura rezultată, în 90 RO 123525 Β1 conformitate cu metoda alcalin-SDS. Inserţia şi orientarea fragmentului de ADN dorit, în 1 vectorul pSRPDHH, sunt confirmate prin secvenţierea ADN, utilizând un analizor de secvenţe de gene (ABI Prism 3700 DNA Analyzer, Applied Biosystems). 3
Plasmida de exprimare rezultată, care poartă cADN-ul care codifică lanţul uşor al LM3 TRA-8 umanizat, este desemnată pSR/LM3-3-44-10. 5 4.3. Construirea unui vector de exprimare pentru lanţul uşor al anticorpului umanizat (de tip LM4) 7
După cum se prezintă în SECVID nr. 74 din Lista de Secvenţe, alt tip de umanizare (de tip H4) a secvenţelor de aminoacizi ale lanţului uşor al anticorpului DR5 antiuman de 9 şoarece TRA-8 a determinat înlocuirea aminoacidului 8 (histidina), aminoacidului 9 (lizina), aminoacidului 10 (fenilalanina), aminoacidului 11 (metionina), aminoacidului 13 (treonina), 11 aminoacidului 20 (serina), aminoacidului 42 (glutamina), aminoacidului 43 (serina), aminoacidului 77 (asparagina), aminoacidului 78 (valina), aminoacidului 80 (serina), 13 aminoacidului 83 (leucina), aminoacidului 85 (acidul aspartic), aminoacidului 99 (glicina), aminoacidului 103 (leucina) şi aminoacidului 108 (alanina) de la capătul N-terminal al 15 secvenţei de aminoacizi a lanţului uşor al TRA-8 cu prolină, serină, serină, leucină, alanină, treonină, lizină alanină, serină, leucină, prolină, fenilalanină, treonină, glutamină, valină şi 17 respectiv treonină. Secvenţa rezultată se denumeşte LM4.
Plasmidele de expresie care poartă acest tip de secvenţe de aminoacizi ale lanţului 19 uşor umanizat ale anticorpului antiuman DR5 TRA-8 (de tip LM4) (SECV ID nr. 74 din Lista de Secvenţe) se construiesc după cum urmează. 21 1. Sinteza primerilor pentru prepararea regiunilor variabile şi constante ale lanţului uşor al TRAS LM4 umanizat 23 ADN care codifică lanţul polipeptidic LM4 (SECV ID nr. 74 din Lista de Secvenţe), fiecare dintre ele fiind o fuziune dintre regiunea variabilă a lanţului uşor al anticorpului anti- 25 DR5 umanizat TRA-8 şi regiunea constantă a lanţului uşor al Ig umane (lanţul k), sunt sintetizate prin utilizarea de combinaţii ale PCR. 27
Suplimentar faţă de 7AL1P (SECV ID Nr. 47) şi 7ALCN (SECV ID Nr. 48), MOD1F1 (SECV ID nr. 78), MOD1R1 (SECV ID nr. 79), MOD1F22 (SECV ID nr. 80), MOD1R22 29 (SECV ID nr. 81), MOD1F3 (SECV ID nr. 82), MOD1R3 (SECV ID nr. 83), MOD1F42 (SECV ID nr. 84), MOD1R4 (SECV ID nr. 85), MOD1F5 (SECV ID nr. 86), MOD1R52 (SECV ID nr. 31 87), MOD1F7 (SECV ID nr. 90) şi MOD1R7 (SECV ID nr. 91), LR17 (SECV ID nr. 101), se sintetizează pentru PCR următorii primeri oligonucleotidici: 33 5'-ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc-3' (MOD1F62; SECV ID nr. 92) 35 5'-cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataggttgca aaatcctccg gtcgcag-3' (MOD1R62; SECV ID nr. 93) 37 2. Construirea plasmidei pCR3.1/LM4-5-3 (donarea lanţului uşor al TRAS LM4 umanizat) 39
Fragmentul ADN-LM4, care codifică secvenţa de aminoacizi, conform definiţiei din SECV ID nr. 74, al aceleiaşi, se prepară prin realizarea PCR în 2 etape, se inserează într-un 41 vector plasmidian şi se donează în E. coli. a. Prima etapă a PCR 43
Fragmentul de ADN LM4-F41, care codifică o regiune de secvenţă de semnal de secreţie, cu un situs de clivaj al enzimei de restricţie Hind III, adăugat la capătul 5', FRL,, 45 91 RO 123525 Β1 CDRL,, FRI-2 şi CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4, şi o porţiune a regiunii constante se prepară în următoarele condiţii:
Compoziţia soluţiei de reacţie: - primer oligonucleotidic MOD1F1 ...............................5 pmoli; - primer oligonucleotidic MOD1R1 ..............................5 pmoli; - primer oligonucleotidic MOD1F22..............................5 pmoli; - primer oligonucleotidic MOD1R22 .............................5 pmoli; - primer oligonucleotidic MOD1F3...............................5 pmoli; - primer oligonucleotidic MOD1R3 ..............................5 pmoli; - primer oligonucleotidic MOD1F42 ..............................5 pmoli; - primer oligonucleotidic MOD1R4 ..............................5 pmoli; - primer oligonucleotidic MOD1F5...............................5 pmoli; - primer oligonucleotidic MOD1R52 .............................5 pmoli; - primer oligonucleotidic MOD1F62 ..............................5 pmoli, - primer oligonucleotidic MOD1R62 .............................5 pmoli; - primer oligonucleotidic MOD1F7..............................50 pmoli; - primer oligonucleotidic MOD1R7 ..............................5 pmoli; - primer oligonucleotidic 7AL1P ...............................50 pmoli; - primer oligonucleotidic LR17.................................50 pmoli; - cocteil de dNTP-uri ............................................5 μΙ; - tampon 10xPCR ..............................................5 μΙ; - ADN polimerază ampliTaq .................................2,5 unităţi.
Soluţia de reacţie, având compoziţia de mai sus, este ajustată la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR.
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care se încălzeşte într-un ciclu termic, la 94°C, timp de un minut, la 55°C, timp de un minut şi la 72°C, timp de 2 min, care se repetă de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.
Fragmentul de ADN F41C LM4, care codifică regiunea constantă cu un situs de clivaj al enzimei de restricţie EcoRI, adăugat la capătul 3' terminal, se prepară în următoarele condiţii.
Plasmidele matriţă pSRPDHH se obţin urmând descrierea din cererea de brevet european EP 0909816 A1.
Compoziţia soluţiei de reacţie: - ADN-ul plasmidei pSRPDHH .................................. 25 ng; - primer oligonucleotidic MOD1F17............................ 50 pmoli; - primer oligonucleotidic 7ALCN ...............................50 pmoli; - cocteil de dNTP-uri ............................................5 μΙ; - tampon 10xPCR ..............................................5 μΙ; - ADN polimerază ampliTaq (PerkinElmer) ......................2,5 unităţi.
Soluţia de reacţie, având compoziţia de mai sus, este ajustată la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR.
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care se încălzeşte într-un ciclu termic, la 94°C, timp de un minut, la 55°C, timp de un minut şi la 72°C, timp de 2 min, care se repetă de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min. 92 RO 123525 Β1
Fragmentele de ADN amplificate după PCR se separă prin electroforeză în gel de pol i acrii am i dă 5%. Gelul după electroforeză este colorat cu bromură de etidiu 1 pg/ml, pentru a detecta ADN-ul produs în lumină UV. Benzile de ADN astfel detectate sunt excizate cu o lamă de ras.
b. A doua etapă a PCR ADN-ul LM4, în care mai sus descrisele fragmente ADN LM4-F41B, şi ADN LM4-F41C se fuzionează, se prepară în următoarele condiţii.
Compoziţia soluţiei de reacţie: - fragmentul de gel de ADN-LM4-F41B, preparat în prima etapă a PCR; - fragmentul de gel de ADN-LM4-F41C, preparat în prima etapă a PCR; - primerul oligonucleotidic 7AL1P ..............................50 pmoli; - primerul oligonucleotidic 7ALCN ..............................50 pmoli; - cocteil de dNTP-uri ........................................... 5 pl; - tampon 10xPCR ............................................. 5 μΙ; - ADN polimerază ampliTaq ..................................2,5 unităţi.
Soluţia de reacţie, având compoziţia de mai sus, se ajustează la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR.
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care se încălzeşte într-un ciclu termic, la 94°C, timp de un minut, la 55°C, timp de un minut şi la 72°C, timp de 2 min, care se repetă de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.
Fragmentul de ADN-LM4 astfel preparat se inserează în plasmida pCR3.1DNA, utilizând trusa Eukaryotic TA Cloning (Invitrogen), urmând protocolul fabricantului şi se introduce în E. coli competentă TOP10F' conţinută în trusă. Secvenţele de nucleotide, ale acestor ADN-uri care codifică lanţul uşor al TRA-8 umanizat, sunt confirmate prin metoda dideoxi (F. S. Sânger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467), utilizând analizorul 3700 DNA (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).
Plasmidele rezultate se denumesc pCR3.1/LM4-5-3 (plasmida care poartă cADN-ul care codifică regiunea variabilă a lanţului uşor al TRA-8 umanizat şi o regiune constantă a lanţului uşor al Ig umane).
Plasmida pCR3.1/LM4-5-1, care conţine fragmentul de ADN LM4, este digerată cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I. 1 pg de ADN al plasmidei de donare pHSG399 este digerat cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I, şi apoi se defosforilează cu CIP. Fragmentele de ADN pHSG399 şi de ADN al LM4 defosforilate, care au fost digerate cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I, se leagă, utilizând trusa DNA Ligation, versiunea 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ldt). Apoi, E. coli DH5a este retransformată cu ADN legat şi este împrăştiată pe un mediu de agar care conţine IPTG 0,1 mM, 0,1% X-Gal şi 50 pg/ml clormafenicol (concentraţii finale). Transformanţii albi obţinuţi se cultivă în mediu lichid LB, care conţine 50 pg/ml cloramfenicol, şi ADN-ul plasmidian este extras din cultura rezultată, în conformitate cu metoda alcalin-SDS. ADN-ul plasmidian extras este digerat cu Hind III şi EcoR I, şi apoi este selectată o clonă purtătoare a fragmentului de ADN LM4 prin electroforeză în gel de agaroză 1 %.
Ca rezultat al procedurii de mai sus, se obţine plasmida pHSG/M4-5-3-1 purtătoare a unui fragment de fuziune al regiunii variabile a lanţului uşor LM4 TRA-8 umanizat al regiunii constante a lanţului uman Ig k. Tulpina transformantă E. coli, care poartă această plasmidă, denumită E. coli DH5a/pHSG/M4-5-3-1, a fost depozitată în International Patent Organism 93 RO 123525 Β1
Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia, la data de 20 Aprilie, 2001, în conformitate cu Tratatul de la Budapesta pentru Depozitarea Microorganismelor, şi i-a fost acordat numărul de acces FERM BP-7565. 3. Construirea plasmidei pSR/LM4-5-3-3 (plasmida de expresie pentru lanţul uşor LM4 al TRAS umanizat)
Plasmida obţinută, pHSG/M4-5-3-1, purtătoare a unui fragment de fuziune al regiunii variabile a lanţului uşor LM4 al TRA-8 umanizat şi a regiunii constante a lanţului uman Igic este digerată cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I. 1 pg de ADN al plasmidei de donare pSRPDHH (cererea de brevet european EP 0909816 A1) este digerată cu enzimele de restricţie Hindlll şi EcoR I şi apoi este defosforilată cu CIP. ADN-ul pSRPDHH defosforilat rezultat şi fragmentul de ADN Hindlll-EcoRI obţinut din pHSG/M4-5-3-1 sunt legate, utilizând Trusa de Legare ADN, versiunea 2.0 (DNA Ligation Kit Version 2.0) (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Apoi E. coli DH5a este transformată cu ADN-ul legat şi întinsă pe agar LB. Transformanţii obţinuţi sunt cultivaţi în mediu lichid LB, care conţine 100 pg/ml ampicilină, şi ADN-ul plasmidian este extras din cultura rezultată, în conformitate cu metoda SDS alcalină. Inserţia şi orientarea fragmentului de ADN dorit, în vectorul pSRPDHH, sunt confirmate prin secvenţierea ADN, utilizând un analizor de secvenţe de gene (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).
Plasmida de exprimare rezultată, care poartă cADN-ul care codifică lanţul uşor LM4 al TRA-8 umanizat, este desemnată pSR/LM4-5-3-3. 4.4. Construirea unui vector de expresie pentru lanţul uşor al anticorpului umanizat (de tip LM5)
După cum se arată în SECV ID nr. 75 din Lista de Secvenţe, altă umanizare (de tip LM5) a secvenţelor de aminoacizi ale lanţului uşor al anticorpului DR5 antiuman de şoarece TRA-8 a determinat înlocuirea aminoacidului 8 (histidina), aminoacidului 9 (lizina), aminoacidului 10 (fenilalanina), aminoacidului 11 (metionina), aminoacidului 13 (treonina), aminoacidului 20 (serina), aminoacidului 42 (glutamina), aminoacidului 43 (serina), aminoacidului 77 (asparagina), aminoacidului 78 (valina), aminoacidului 80 (serina), aminoacidului 83 (leucina), aminoacidului 103 (leucina) şi aminoacidului 108 (alanina) de la capătul N-terminal al secvenţei de aminoacizi a TRA-8 cu prolină, serină, serină, leucină, alanină, treonină, lizină, alanină, serină, leucină, prolină, fenilalanină, valină şi, respectiv, treonină. Secvenţa rezultată se denumeşte LM5.
Plasmidele de expresie care poartă acest tip de secvenţe de aminoacizi ale lanţului uşor umanizat ale anticorpului antiuman DR5 TRA-8 (de tip LM5, SECV ID nr75 din lista de secvenţe) se construiesc după cum urmează. 1. Sinteza primerilor pentru prepararea regiunilor variabile şi constante ale lanţului uşor al TRAS umanizat de tip LM5 ADN care codifică lanţul polipeptidic LM5 (SECV ID nr. 75 din Lista de Secvenţe), fiecare dintre acestea fiind o fuziune dintre regiunea variabilă a lanţului uşor al anticorpului anti-DR5 umanizat TRA-8 şi regiunea constantă a lanţului uşor al Ig umane (lanţul k) sunt sintetizate prin utilizarea de combinaţii ale PCR.
Suplimentar faţă de 7AL1P (SECV ID Nr. 47) şi 7ALCN (SECV ID Nr. 48), MOD1F1 (SECV ID Nr. 78), MOD1R1 (SECV ID Nr. 79), MOD1F22 (SECV ID Nr. 80), MOD1R22 (SECV ID Nr. 81), MOD1F3 (SECV ID Nr. 82), MOD1R13 (SECV ID Nr. 83), MOD1F42 94 RO 123525 Β1 (SECV ID Nr. 84), MOD1R4 (SECV ID Nr. 85), MOD1R52 (SECV ID Nr. 87), MOD1F7 1 (SECV ID Nr. 90), şi LR17 (SECV ID Nr. 101) se sintetizează pentru PCR următorii primeri oligonucleotidici: 3 5'-gggtctggga cagacttcac, cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcagat tat -3' (MOD1F52; SECV ID nr. 94) 5 5'-ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtggag gcaccaaggt ggaaatc-3' (MOD1F63; SECV ID nr. 95) 7 5'-cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataatctgca aaatcctccg gctgcag-3' (MOD1 R63;SECV ID nr. 96) 9 5'-gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tcgctccacc gaa-3' (MOD1R72; SECV ID nr. 102) 11 2. Construcţia plasmidei pCR3.1/LM5-3-42 (donarea lanţului uşor al TRAS umanizat de tip LM5) 13
Fragmentul de ADN-LM5, care codifică secvenţa de aminoacizi care a fost definită în SECV ID nr75, al aceluiaşi, se prepară prin realizarea PCR în 2 etape, se inserează într-un 15 vector plasmidian şi se donează în E. coli. a. Prima etapă a PCR 17
Fragmentul LM5-F51B de ADN, care codifică o secvenţă de semnal de secreţie cu un situs de clivaj al enzimei de restricţie Hind III, adăugat la capătul 5', FRL,, CDRL,, FRL2 19 şi CDRL2, FRI-3, CDRI_3, FRL4, şi o porţiune a regiunii constante se prepară în următoarele condiţii. 21
Compoziţia soluţiei de reacţie: - primer oligonucleotidic MOD1F1 ...............................5 pmoli; 23 - primer oligonucleotidic MOD1R1 ...............................5 pmoli; - primer oligonucleotidic MOD1F22 ..............................5 pmoli; 25 - primer oligonucleotidic MOD1R22 ..............................5 pmoli; - primer oligonucleotidic MOD1F3 ...............................5 pmoli; 27 - primer oligonucleotidic MOD1R3 ...............................5 pmoli; - primer oligonucleotidic MOD1F42 ..............................5 pmoli; 29 - primer oligonucleotidic MOD1R4 ...............................5 pmoli; - primer oligonucleotidic MOD1F52 ..............................5 pmoli; 31 - primer oligonucleotidic MOD1R52 ..............................5 pmoli; - primer oligonucleotidic MOD1F63 ..............................5 pmoli; 33 - primer oligonucleotidic MOD1R63 ..............................5 pmoli; - primer oligonucleotidic MOD1F7 ..............................50 pmoli; 35 - primer oligonucleotidic MOD1R72 ..............................5 pmoli; - primer oligonucleotidic 7AL1P ................................50 pmoli; 37 - primer oligonucleotidic LR17 .................................50 pmoli; - cocteil de dNTP-uri ........................................... 5 μΙ; 39 - tampon 10xPCR ............................................. 5 μΙ; - ADN polimerază ampliTaq ..................................2,5 unităţi. 41
Soluţia de reacţie, având compoziţia de mai sus, este ajustată la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR. 43
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care se încălzeşte într-un ciclu termic, la 94°C, timp de un minut, 55°C, timp de un minut şi 72°C, timp de 2 min, 45 care se repetă de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min. 95 RO 123525 Β1
Fragmentul de ADN F51C LM5, care codifică regiunea constantă cu un situs de clivaj al enzimei de restricţie EcoRI, adăugat la capătul 3' terminal, se prepară în următoarele condiţii. Plasmida matriţă pSRPDHH se obţine urmând descrierea din cererea de brevet european EP 0909816 A1.
Compoziţia soluţiei de reacţie: - ADN-ul plasmidei pSRPDHH .................................. 25 ng; - primer oligonucleotidic MOD1F7..............................50 pmoli; - primeroligonucleotidic7ALCN ...............................50 pmoli; - cocteil de dNTP-uri ............................................5 μΙ; - tampon 10xPCR ..............................................5 μΙ; - ADN polimerază ampliTaq .................................2,5 unităţi.
Soluţia de reacţie, având compoziţia de mai sus, este ajustată la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR.
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care se încălzeşte într-un ciclu termic, la 94°C, timp de un minut, 55°C, timp de un minut şi 72°C, timp de 2 min, care se repetă de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.
Fragmentele de ADN amplificate după PCR se separă prin electroforeză în gel de poliacrilamidă 5%. După electoforeză, gelul se colorează cu bromură de etidiu 1 pg/ml, pentru a detecta ADN-ul produs în lumină U V. Benzile de ADN astfel detectate sunt excizate cu o lamă de ras.
b. A doua etapă a PCR ADN-ul LM5, în care mai sus descrisele fragmente ADN LM5-F51B şi ADN LM5-F51C se fuzionează, se prepară în următoarele condiţii.
Compoziţia soluţiei de reacţie: - fragmentul de gel de ADN-LM5-F51B preparat în prima etapă a PCR; - fragmentul de gel de ADN-LM5-F51C preparat în prima etapă a PCR; - primerul oligonucleotidic 7AL1P ..............................50 pmoli; - primerul oligonucleotidic 7ALCN ..............................50 pmoli; - cocteil de dNTP-uri ........................................... 5 μΙ; - tampon 10xPCR ............................................. 5 μΙ; - ADN polimerază ampliTaq .................................2,5 unităţi.
Soluţia de reacţie, având compoziţia de mai sus, se ajustează la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR.
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care se încălzeşte într-un ciclu termic, la 94°C, timp de un minut, la 55°C, timp de un minut şi la 72°C, timp de 2 min, care se repetă de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.
Fragmentul de ADN-LM5 astfel preparat se inserează în plasmida pCR3.1DNA, utilizând trusa Eukaryotic TA Cloning (Invitrogen), urmând protocolul fabricantului şi se introduce în E. coli competentă TOP10F' conţinută în trusă. Secvenţele de nucleotide, ale acestor ADN-uri care codifică lanţul uşor al TRA-8 umanizat, sunt confirmate prin metoda dideoxi (F. S. Sânger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467), utilizând analizorul de ADN.
Plasmidele rezultate se denumesc pCR3.1/LM5-3-42 (plasmida care poartă cADN-ul care codifică regiunea variabilă a lanţului uşor al LM5 TRA-8 umanizat şi o regiune constantă a lanţului uşor al Ig umane). 96 RO 123525 Β1
Plasmida pCR3.1/LM5-3-42 care conţine fragmentul de ADN LM5 este digerată cu 1 enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I. 1 pg de ADN al plasmidei de donare pHSG399 este digerat cu enzimele de restricţie 3 Hind III şi EcoR I, şi apoi se defosforilează cu CIP. Fragmentele de ADN pHSG399 şi de ADN al LM5 defosforilate, care au fost digerate cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I, 5 se leagă, utilizând trusa DNA Ligation, versiunea 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ldt). Apoi, E. coli DH5a este retransformată cu ADN legat şi este împrăştiată pe un mediu de agar care 7 conţine IPTG 0,1 mM, 0,1% X-Gal şi 50 pg/ml clormafenicol (concentraţii finale).
Transformanţii albi obţinuţi se cultivă în mediu lichid LB, care conţine 50 pg/ml cloramfenicol, 9 şi ADN-ul plasmidian este extras din cultura rezultată în conformitate cu metoda SDS alcalină. ADN-ul plasmidian extras este digerat cu Hind III şi EcoR I, şi apoi este selectată 11 o clonă purtătoare de fragment LM5-ADN prin electroforeză în gel de agaroză 1%.
Ca rezultat al procedurii de mai sus, se obţine plasmida pHSG/M5-3-27, purtătoare 13 a unui fragment de fuziune al regiunii variabile a lanţului uşor LM5 TRA-8 umanizat şi al regiunii constante al lanţului uman Ig k. 15 3. Construirea plasmidei pSR/LM5-3-27-1 (plasmida de exprimare a lanţului uşor LM5 al TRA-8 umanizat) 17
Plasmida pHSG/M5-3-27 obţinută, purtătoare a unui fragment de fuziune al regiunii variabile a lanţului uşor LM5 al TRA-8 umanizat şi al regiunii constante al lanţului uman Ig k, 19 este digerată cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I. 1 pg de ADN al plasmidei de donare pSRPDHH (cererea de brevet european 21 EP 0909816 A1) se digeră cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I, şi apoi este defosforilată cu CIP. ADN-ul defosforilat rezultat pSRPDHH şi fragmentul Hindlll-EcoRI 23 obţinut din pHSG/M5-3-27 sunt legate, utilizând Trusa de legare a ADN, versiunea 2.0 (DNA Ligation Kit Version 2.0) (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Apoi E. coli DH5a este transformat cu 25 ADN-ul legat şi este întinsă pe agar LB. Transformanţii obţinuţi sunt cultivaţi în mediu lichid LB, care conţine 100 pg/ml ampicilină, şi ADN-ul plasmidian este extras din cultura rezultată 27 în conformitate cu metoda SDS alcalină. Inserţia şi orientarea fragmentului de ADN dorit, în vectorul pSRPDHH, sunt confirmate prin secvenţierea ADN, utilizând un analizor de 29 secvenţe de gene (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).
Plasmida de expresie, care poartă cADN-ul care codifică lanţul uşor al LM5 TRA-8 31 umanizat, este desemnată pSR/LM5-3-27-1. 4.5. Construirea unui vector de expresie pentru lanţul uşor al anticorpului umanizat 33 (de tip himeră)
Secvenţa prezentată în SECV ID nr. 76 din Lista de Secvenţe, secvenţa de 35 aminoacizi ai lanţului uşor al TRA-8 de tip himeră este desemnată LM6.
Plasmidele de expresie, care poartă acest tip de secvenţe de aminoacizi ale lanţului 37 uşor umanizat ale anticorpului antiuman DR5 TRA-8 (de tip LM6, SECV ID nr 75 din lista de secvenţe), se construiesc după cum urmează. 39 1. Sinteza primerilor pentru prepararea regiunilor variabile şi constante ale lanţului uşor al TRAS umanizat de tip LM6 41 ADN care codifică lanţul polipeptidic LM6 (SECV ID nr. 75 din Lista de Secvenţe), fiecare dintre acestea fiind o fuziune dintre regiunea variabilă a lanţului uşor al anticorpului 43 anti-DR5 umanizat TRA-8 (tip LM6), şi regiunea constantă a lanţului uşor al Ig umane (lanţul k) sunt sintetizate prin utilizarea de combinaţii ale PCR. 45 97 RO 123525 Β1
Suplimentar faţă de 7AL1P (SECV ID Nr. 47) şi 7ALCN (SECV ID Nr. 48), se sintetizează pentru PCR următorii primeri oligonucleotidici:
5'-tgatgtggacatgaatttgtgagactgggtcatcacaatg tcaccagtgg a-3' (HKSPR13; SECV ID nr, 97);
5'-tgggttccag gctccactgg tgacattgtg atgacccagt ctcacaaatt c-3' (MVF11; SECV ID nr. 98); 5'-aagacagatg gtgcagccac agcccgtttg atttccagct tggtgtcctc-3' (MVR11; SECV ID nr. 99), şi 5'-aagctggaaa tcaaacgggc tgtggctgca ccatctgtct tcat-3' (MCF11; SECV ID nr. 100). 2. Construirea plasmidei pCR3.1/M6-1-16 (donarea lanţului uşor al TRAS umanizat de tip LM6)
Fragmentul ADN-LM6, care codifică secvenţa de aminoacizi definită în SECV ID nr. 75, se prepară prin realizarea PCR în 2 etape, se inserează într-un vector plasmidian şi se donează în E. coli.
a. Prima etapă a PCR
Fragmentul LM6-F1 de ADN, care codifică o secvenţă de semnal de secreţie şi o porţiune a regiunii FRL,, cu un situs de clivaj al enzimei de restricţie Hind III, adăugat la capătul 5', se prepară în următoarele condiţii: plasmidele matriţă, pHSGHM17 şi pSRPDHH se obţin urmând descrierea din cererea de brevet european EP 0909816 A1.
Compoziţia soluţiei de reacţie: - ADN-ul plasmidei pHSGHM17 ................................. 25 ng; - primer oligonucleotidic 7AL1P ...............................50 pmoli; - primeroligonucleotidic HKSPR13 .............................50 pmoli; - cocteil de dNTP-uri ............................................5 μΙ; - tampon 10xPCR ..............................................5 μΙ; - ADN polimerază ampliTaq (PerkinElmer) ...................... 2,5 unităţi
Soluţia de reacţie, având compoziţia de mai sus, este ajustată la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR.
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care se încălzeşte într-un ciclu termic, la 94°C, timp de un minut, la 55°C, timp de un minut şi la 72°C, timp de 2 min, care se repetă de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.
Fragmentul ADN-ului LM6-F2, care codifică o porţiune a FRL.,, CDRL,, FRLj, CDRL^, FRL3, CDRI-3, FRL4, şi o porţiune a regiunii constante se prepară în următoarele condiţii.
Compoziţia soluţiei de reacţie: - ADN plasmidian pL28 ........................................ 25 ng; - primer oligonucleotidic MVF11 ...............................50 pmoli; - primeroligonucleotidic MVR12 ...............................50 pmoli; - cocteil de dNTP-uri ............................................5 μΙ; - tampon 10xPCR...............................................5 μΙ; - ADN polimerază ampliTaq .................................2,5 unităţi.
Soluţia de reacţie, având compoziţia de mai sus, se ajustează la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR.
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care se încălzeşte într-un ciclu termic, la 94°C, timp de un minut, la 55°C, timp de un minut şi la 72°C, timp de 2 min, care se repetă de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min. 98 1 RO 123525 Β1
Fragmentul de ADN LM6-F3, care codifică o porţiune a FRL4 şi regiunea constantă, cu un situs de clivaj al enzimei de restricţie EcoR I, adăugat la căpătui 3', se prepară în următoarele condiţii.
Compoziţia soluţiei de reacţie: - ADN-ul plasmidei pSRPDHH ...................................25 ng; - primer oligonucleotidic MCF11 ...............................50 pmoli; - primer oligonucleotidic 7ALCN ...............................50 pmoli; - cocteil de dNTP-uri ........................................... 5 μΙ; - tampon 10xPCR ............................................. 5 μΙ; - ADN polimerază ampliTaq ..................................2,5 unităţi.
Soluţia de reacţie, având compoziţia de mai sus, se ajustează la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR.
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care se încălzeşte într-un ciclu termic, la 94°C timp de un minut, la 55°C, timp de un minut şi la 72°C, timp de 2 min, care se repetă de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.
Fragmentele de ADN amplificate după PCR se separă prin electroforeză în gel de poliacrilamidă 5%. După electroforeză, gelul se colorează cu 1 pg/ml bromură de etidiu, pentru a detecta ADN produs în lumină UV. Benzile de ADN respective astfel detectate sunt excizate cu o lamă de ras.
b. A doua etapă a PCR AND-ul LM6, în care fragmentele de ADN LM6-F1, ADN LM6-F2, ADN LM6-F3 mai sus descrise sunt fuzionate, se prepară în următoarele condiţii.
Compoziţia soluţiei de reacţie: - fragmentul gel de ADN-LM6-F1 preparat în prima etapă a PCR; - fragmentul gel de ADN-LM6-F2 preparat în prima etapă a PCR; - fragmentul gel de ADN-LM6-F3 preparat în prima etapă a PCR; - primerul oligonucleotidic 7AL1P ..............................50 pmoli; - primerul oligonucleotidic 7ALCN ..............................50 pmoli; - cocteil de dNTP-uri ...........................................5 μΙ; - tampon 10xPCR ............................................. 5 μΙ; - ADN polimerază ampliTaq..................................2,5 unităţi.
Soluţia de reacţie, având compoziţia de mai sus, se ajustează la un volum final de 50 μΙ, prin adăugare de apă redistilată şi se utilizează în PCR.
Condiţiile termice ale PCR: încălzire la 94°C, timp de 2 min, după care se încălzeşte într-un ciclu termic, la 94°C, timp de un minut, la 55°C, timp de un minut şi la 72°C, timp de 2 min, care se repetă de 30 de ori, urmat de încălzire la 72°C, timp de 10 min.
Fragmentul de ADN-LM6 astfel preparat se inserează în plasmida pCR3.1DNA, utilizând trusa Eukaryotic TA Cloning (Invitrogen), urmând protocolul fabricantului şi se introduce în E. coli competentă TOP10F' conţinută în trusă. Secvenţele de nucleotide, ale acestor ADN-uri care codifică lanţul uşor al TRA-8 umanizat, sunt confirmate prin metoda dideoxi, utilizând un analizor de ADN.
Plasmidele rezultate se denumesc pCR3.1/LM6-1 -16 (plasmida care poartă cADN-ul care codifică regiunea variabilă a lanţului uşor al TRA-8 de şoarece şi o regiune constantă a lanţului uşor al Ig umane).
Plasmida pCR3.1/M6-1-16 obţinută, care conţine fragmentul de ADN LM6, este digerată cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I. 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 99 45 RO 123525 Β1 1 pg de ADN al plasmidei de donare pHSG399 este digerat cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I, şi apoi se defosforilează cu CIP. Fragmentele de ADN pHSG399 şi de ADN LM6 defosforilate, care au fost digerate cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I se leagă, utilizând trusa DNA Ligation, versiunea 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ldt). Apoi, E. coli DH5a este retransformată cu ADN legat şi este împrăştiată pe un mediu de agar LB, care conţine IPTG 0,1 mM, 0,1% X-Gal şi 50 pg/ml clormafenicol (concentraţii finale). Transformanţii albi obţinuţi se cultivă în mediu lichid LB, care conţine 50 pg/ml cloramfenicol, şi ADN-ul plasmidian este extras din cultura rezultată în conformitate cu metoda SDS alcalină. ADN-ul plasmidian extras este digerat cu Hind III şi EcoR I, şi apoi este selectată o clonă purtătoare de fragment LM6-ADN prin electroforeză în gel de agaroză 1%.
Ca rezultat al procedurii de mai sus, se obţine plasmida pHSG/M6-1-4-1 purtătoare a unui fragment de fuziune a regiunii variabile a lanţului uşor al TRA-8 de şoarece şi a regiunii constante a lanţului uman Igx. Tulpina transformantă E. coli, care prezintă această plasmidă, denumită E. coli DH5a/pHSG/M6-1-4-1, a fost depozitată în International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japonia, la data de 20 Aprilie, 2001, în conformitate cu Tratatul de la Budapesta pentru Depozitarea Microorganismelor, şi i-a fost acordat numărul de acces FERM BP-7566. 3. Construirea plasmidei pSR/LM6-1-4-6 (plasmidă de expresie pentru lanţul uşor LM6 al TRA-8 de tip himeră)
Plasmida obţinută pHSG/LM6-1-4-1, purtătoare a unui fragment de fuziune al regiunii variabile a lanţului uşor al TRA-8 de şoarece şi al regiunii constante a lanţului uman Igx, este digerată cu enzimele de restricţie Hind III şi EcoR I. 1 pg de ADN al plasmidei de donare este digerată cu enzimele de restricţie Hindlll şi EcoR I, şi apoi este defosforilată cu CIP. ADN-ul pSRPDHH defosforilat rezultat şi fragmentul de ADN Hindlll-EcoR I obţinut din pHSG/LM6-1-4-1 sunt legate, utilizând Trusa de Legare ADN, versiunea 2.0 (DNA Ligation Kit Version 2.0) (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Apoi E. coli DH5a este transformată cu ADN-ul legat şi întinsă pe agar LB. Transformanţii obţinuţi sunt cultivaţi în mediu lichid LB, care conţine 100 pg/ml ampicilină, şi plasmida ADN este extrasă din cultura rezultată în conformitate cu metoda SDS alcalină. Inserţia şi orientarea fragmentului de ADN dorit în vector sunt confirmate prin secvenţierea ADN, utilizând un analizor de secvenţe de gene.
Plasmida de exprimare rezultată, care poartă cADN-ul care codifică lanţul uşor al TRA-8 (de tip himeră), este desemnată pSR/LM6-1-4-6. 5. Producerea câtorva tipuri de anticorpi TRA-8 umanizat sau himeric
Transfecţia celulelor COS-7 se realizează prin metodele de transfecţie cu reactiv FUGENE6 (Boehringer Manheim Biochemica), în conformitate cu manualul de utilizare furnizat cu trusa.
Celule COS-7 (Colecţia Americană de Tipuri de Culturi nr. CRL-1651) sunt crescute la semiconfluenţă (3x106 celule/vas) într-un vas de cultură (suprafaţa culturii: 57 cm2, Sumitomo Bakelite) care conţine mediu Eagle modificat al lui Dulbecco (la care se va face referire de acum încolo ca "D-MED"; Gibco BRL), suplimentat cu ser fetal de viţel 10% (abreviat aici ca "FCS"; Moregate). între timp, 10 pg/vas (în total 5 vase) cu ADN al plasmidei de exprimare a lanţului greu DR5 umanizat (pHA15-1) şi 10 pg/vas de ADN al plasmidei de expresie a lanţului uşor 100 RO 123525 Β1 DR5 umanizat preparat prin metoda SDS-alcalină şi centrifugare în gradient de densitate de 1 clorură de cesiu se amestecă şi apoi se precipită cu etanol, urmat de suspendare în 5 pl/vas dH20. 3
După ce 15 μΙ/vas de reactiv de transfecţie FUGENE6 este amestecat cu 180 μΙ/vas D-MEM fără FCS, această soluţie FUGENE (185 μΙ/vas) se amestecă cu 5 μΙ/vas soluţie de 5 ADN care conţine 10 μg/vas ADN al plasmidei de expresie a lanţului greu al DR5 umanizat şi 10 pg/vas ADN al plasmidei de expresie a lanţului uşor al DR5 umanizat. După 15 min de 7 incubare la temperatura camerei, suspensia de plasmidă obţinută (200 μΙ) se adaugă la plăcile cu COS-7 preparate anterior. După incubare în 5% C02, la 37°C, timp de 24 h , 9 mediul de cultură este schimbat cu D-MEM fără FCS. După incubare în 5% C02, la 37'C, timp de 72 h, supernatantul de cultură este recuperat, pentru a purifica produsele de 11 expresie din fluidele supernatante. Prin metoda descrisă mai sus, celulele COS -7 sunt transfectate cu fiecare dintre combinaţiile de plasmide: 13 (A) cotransfecţia lui pHA15-1 şi pSR/LM1-2 (H1L1); (B) cotransfecţia lui pHB14-1 şi pSR/M2-1 (H2L2); 15 (C) cotransfecţia lui pHB14-1 şi pSR/LM3-3-44-10 (H2L3); (D) cotransfecţia lui pHB14-1 şi pSR/LM4-5-3-3 (H2L4); 17 (E) cotransfecţia lui pHC10-3 şi pSR/M2-1 (H3L2); (F) cotransfecţia lui pHC10-3 şi pSR/LM3-3-44-10 (H3L3); 19 (G) cotransfecţia lui pHC10-3 şi pSR/LM4-5-3-3 (H3L4); (H) cotransfecţia lui pHD21-1 şi pSR/LM5-3-27-1 (H4L5); 21 (I) cotransfecţia lui pM11-1 şi pSR/LM6-1-4-6 (himeră).
Cultura este apoi centrifugată (3500 rpm, 15 min) şi se colectează supernatantul. 23 Supernatantul se filtrează cu un filtru de 0,45 pm (ADVANTEC TOYO SISMIC-25cs,
Cat # 25CS045 AS). Purificarea IgG din filtrate se realizează, utilizând cromatografia de 25 afinitate POROS-Proteină G (Applied Biosystems), în următoarele condiţii: - sistemul HPLC: BioCAD 700E (Applied Biosystems); 27 - coloană: cartuş senzor ProteinăG-ID (mărimea coloanei: 2,1 mmID x 30 mm LD, volumul patului: 0,1 ml; Cat # 2-1002-00, Applied Biosystems); 29 - tampon de eluţie: 0,1 M glicină-HCI (pH 2,5); - tampon de neutralizare: 1M Tris-HCI (pH 8,5); 31 - detecţie: 280 nm; - viteza de curgere: 1 ml/min; 33 - mărimea fracţiilor: 0,5 ml/0,5 min; - tubul pentru fracţii: Microtub de polipropilenă 1,5 ml; 35 - temperatura: 4°C.
După ce toate filtratele se aplică pe coloană, 50 ml PBS (Sigma, Cat # 1000-3) se 37 utilizează pentru a spăla coloana. Când se aplică tamponul de eluţie, porneşte colectorul de fracţii. Fiecare microtub de fracţii a conţinut înainte 55 μΙ de NaCI 1M, 110 μΙ tampon de 39 neutralizare şi 74 μΙ de albumină serică bovină 2 mg/ml (Sigma, Cat # A-7030) în PBS). Fracţiile de la nr. 7 până la nr. 8. 41
Verificarea exprimării anticorpilor umanizaţi şi determinarea cantitativă a produşilor de expresie în fluidele de supernatant de cultură preparate se realizează prin ELISA faţă de 43 un anticorp IgG antiuman. 101 RO 123525 Β1 în fiecare godeu al unei plăci cu 96 godeuri (MaxiSorp, Nune), se adaugă 100 pi de anticorp policlonal specific IgG Fc antiuman de capră (Kappel), dizolvat la concentraţia finală de 0,5 pg/ml în tampon de adsorbţie (0,05 M carbonat acid de sodiu, 0,02% azidă de sodiu, pH 9,6), iar placa este incubată la 37°C, timp de 2 h, pentru a produce adsorbţia anticorpului. Apoi, placa se spală cu 350 μΙ PBS(-) conţinând 0,05% Tween-20 (BioRad) (la care se va face referire în continuare ca "PBS-T") de cinci ori. Se adaugă în godeuri, după spălare, supernatantul de cultură diluat cu D-MEM, care conţine 10% FCS, şi se incubează la 37°C, timp de 2 h . După spălare din nou cu PBS-T, se adaugă, în fiecare godeu, 100 μΙ de anticorp policlonal specific IgG Fc antiuman de capră, marcat cu fosfatază alcalină (Jackson Immuno Research Lab.), diluat de 10000 de ori cu PBS-T, şi se incubează la 37°C, timp de 2 h . După o nouă spălare cu PBS-T, se adaugă o soluţie de substrat de p-nitrofenil fosfat, obţinută din trusa Alkaline Phosphatase Substrate (BioRad), în conformitate cu manualul de utilizare, furnizat cu trusa. După incubare la 37°C, timp de 1,5 h, se măsoară absorbanţa la 405 nm. în experimentele de faţă, imunoglobulină G subclasa 1 (lgG1) din plasmă umană (Biopure AG), diluată cu D-MEM, care conţine 10% FCS în anumite concentraţii, se utilizează ca probă de concentraţie de referinţă, pentru anticorpii DR5 conţinuţi în fluidele de supernatant de cultură.
Ca rezultat, produsele de expresie purificate din supernatantul de cultură sunt detectate în mod specific cu anticorp IgG antiuman. Concentraţia de anticorp uman IgG este de44,03 pg/ml (H1L1), 39,8 pg/ml (H2L2), 26,7 pg/ml (H2L3), 41,0 pg/ml (H2L4), 39,3 pg/ml (H3L2), 24,7 pg/ml (H3L3), 21,5 pg/ml (H3L4), 16,7 pg/ml (H4L5) şi, respectiv, 18,3 pg/ml (himeră). 6. Activitatea de inducţie a apoptozei a câtorva tipuri de anticorpi umanizaţi sau himerici
Se utilizează celule Jurkat (ATCC nr. TIB-152), pentru a examina activitatea de inducere a apoptozei a anticorpului TRA-8 umanizat purificat.
Celule Jurkat, cultivate în mediu RPMI1640, cu 10% FCS (Gibco BRL), la 37°C, timp de 3 zile, în prezenţa a 5% C02, sunt dispersate, în fiecare godeu al unei plăci cu 96 godeuri (Sumitomo Bakelite), la 50 pl per godeu. TRA-8 umanizat, preparat în exemplul 20, este ajustat, pentru a avea concentraţia produsului final de interes la 100 ng/ml, cu mediu RPM11640 care conţine 10% FCS, prin estimarea concentraţiei acestuia în lichide, în conformitate cu metoda descrisă în exemplul 26. Fiecare dintre soluţiile de produşi de expresie astfel ajustate la 100 ng/ml se utilizează pentru a produce diluţii seriale, prin repetarea unei diluţii seriale de 2-ori cu RPM 11640 care conţine 10% FCS. Fiecare dintre soluţiile de TRA-8 (H1L1, H2L2, H2L3, H2L4 sau H4L5) se adaugă în fiecare godeu, la 50 pl per godeu. După ce reacţionează la 37°C, timp de 12 h , se adaugă 50 pl de PMS 25 pM, care conţine 1 mg/ml XTT (concentraţia finală de 250 pg/ml pentru XTT şi 5 pM pentru PMS). După incubare timp de 3 h, se măsoară absorbanţa la 450 nm a fiecărui godeu, pentru a calcula viabilitatea celulară, prin utilizarea capacităţii de reducere a mitocondriilor ca indice.
Viabilitatea celulelor din fiecare godeu se calculează în conformitate cu următoarea formulă:
Viabilitate (%) = 100 x (a-b)/(c-b) 102 RO 123525 Β1 unde "a" este măsurătoarea godeului test, "b" este măsurătoarea unui godeu fără celule şi 1 "c" este măsurătoarea unui godeu fără anticorp adăugat.
Ca rezultat, anticorpii umanizaţi testaţi se demonstrează că induc apoptoza în 3 celulele liniei de celule de limfom T care exprimă antigenul DR5 uman.
Mai departe, activitatea de inducţie a apoptozei a TRA-8 umanizat în PC-3 se 5 examinează prin adăugarea de taxol, în conformitate cu metoda descrisă în exemplul 25.
Se obţine linia de celule de cancer de prostată PC-3 (ATCC nr. CRL-1435 de la 7 American Tissue Culture Collection (ATCC) şi se menţine în amestec nutritiv F-12K(21127-022, Gibco BRL) care conţine serfetal bovin 10% (FBS, Hyclone, 200 mM L-glutamină 1% 9 (25030-149, Gibco BRL) şi soluţie de streptomicină penicilină 0,5% (P-7539, Sigma). Se utilizează în experimentul care urmează mediu RPMI1640 (MED-008, IWAKI), suplimentat 11 cu FBS 10% şi cu soluţie de penicilină streptomicină 0,5%. Celulele PC-3 cu creştere exponenţială se colectează prin tripsinizare şi se spală de două ori cu mediu proaspăt. 13 Celulele sunt apoi numărate, resuspendate în mediu proaspăt, la o densitate de 5x104 celule/ml şi se distribuie în triplicat pe plăci cu 96 godeuri (3598, Corning-Coster), într-un 15 volum total de 100 μΙ/godeu, la o zi după începerea experimentului. Un medicament anticanceros reprezentativ, Paclitaxel (169-18611, Wako), dizolvat în dimetilsulfoxid (10 17 mg/ml), este diluat în mediu proaspăt şi apoi se adaugă pe plăci cu 96 godeuri, care conţin celule în cantitate de 50 μΙ/godeu. Concentraţiile finale de dimetilsulfoxid sunt mai mici de 19 0,1%. După incubare timp de 24 h, la 37°C, într-o atmosferă de 5% C02, se adaugă, în godeuri, anticorp TRA-8 umanizat (H1L1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L2, H3L3, H3L4sau H4L5), 21 diluat în mediu proaspăt. După incubare timp de încă 24 h, se adaugă, în godeuri, 50 μΙ de mediu Minimum Essential (11095-098, Gibco BRL), care conţine 1 mg/ml XTT şi 25 mM PMS 23 şi plăcile sunt incubate timp de 6 h. Se măsoară apoi DO^q cu numărătorul multimarcaj ARVO HTS 1420 (Wallac Berthold), iar viabilitatea celulară se calculează după cum 25 urmează: 27
Viabilitatea (%) = (DO450 pentru godeul care conţine celule tratate cu Taxol şi cu TRA-8 (agent/agenţi) - DO^o pentru godeul care nu conţinea nici celule nici agent) x 29 100/(D045o pentru godeul care conţine celule fără agent - DO^q pentru godeul care nu conţine nici celule nici agent) 31
Ca rezultat, anticorpii umanizaţi testaţi se demonstrează că induc apoptoza în liniile 33 de celule de cancer de prostată uman care exprimă antigenul DR5.
Exemplul 27. Producerea anticorpului DR4 35 O proteină de fuziune care conţine domeniul extracelular al DR4 uman (aa de la 1 la 236) şi porţiunea Fc a IgG umane a fost exprimată în celulele Cos-7 transfectate cu un vector 37 adenoviral recombinat. Proteina de fuziune a fost purificată pe o coloană de afinitate cu proteină A. Au fost imunizaţi şoareci Balb/c cu proteina de fuziune purificată, conform descrierii 39 de mai sus. A fost subclonată de trei ori o clonă de hibridom, 2E12 (lgG1 ,κ) cu legare specifică la DR4 şi cu capacitatea de a induce apoptoza celulelor de limfom B umane Ramos. A 41 fost determinată specificitatea de legare a 2E12 prin ELISA şi analiză Western blot, utilizând DR5, DcR1 şi DcR2 umani şi proteina de fuziune lgG1 ca antigeni martor. Legarea 2E12 la 43 103 RO 123525 Β1 DR4 de la suprafaţa celulei a fost determinată prin citometrie în flux a celulelor Cos-7 transfectate cu cADN cu lungime integrală care codifică DR4 uman. Activitatea de inducţie a apoptozei a fost determinată prin incubarea celulelor Ramos cu 1 pg/ml 2E12 în prezenţa lgG1 de capră antişoarece. Viabilitatea celulelor a fost determinată prin analiza ATPLite conform descrierii de mai sus.
Exemplul 28. Caracterizarea anticorpului DR4
Anticorpul monoclonal DR4 (2E12) este specific pentru DR4 uman şi nu se leagă la alţi receptori TRAIL, cum fac DR5, DcR1 şi DcR2 în ELISA (fig. 19a). 2E12 a recunoscut DR4 de la suprafaţa celulei, după cum s-a demonstrat prin analiză de citometrie în flux a celulelor Cos-7 transfectate cu DR4 (fig. 19b). 2E12 a fost capabil de a induce apoptoza celulelor de limfom Ramos în prezenţa unei reticulări a unui al doilea anticorp într-o manieră doză-dependentă (fig. 19c). Tratamentul in vitro al celulelor Ramos cu 2E12 a avut ca rezultat o activare dependentă de timp a caspazelor 8, 9 şi 3, şi clivajul PARP (fig. 19d). Aceste rezultate au indicat faptul că 2E12 este un anticorp anti-DR4 agonist, care induce apoptoza într-o manieră caspazo-dependentă.
Utilizând anti-DR4 (2E12), urmat de anticorp lgG1 antişoarece de capră, conjugat cu PE şi citometria în flux, anticorpul DR4 s-a dovedit că se leagă la celulele unei linii de celule de fibrosarcom (Hs 913T) şi la câteva linii de celule de cancer de sân (2LMP, MDA-MB231, şi MDA-MB453), dara prezentat o legare slabă sau deloc la o linie de celule de fibroblast de piele umană normală (Malme-3).
Exemplul 29. Activitatea tumoricidă a anticorpilor DR4
Activitatea tumoricidă a 2E12 a fost testată, utilizând modele de tumori cancerose de sân. Şoareci nuzi au fost inoculaţi s. c. cu o linie de celule de cancer de sân uman, 2LMP. Tratamentul cu doze I. p. de 200 Mg de 2E12 s-a produs în zilele 7,10,14,17,21 şi 24, după injecţia celulelortumorale. Animalele au primit Adriamicină (Doxorubicină) (6 mg/kg) în zilele 8, 12 şi 16. Tratamentul cu 2E12 şi Adriamicină (fig. 20) a produs o mai mare inhibiţie a creşterii tumorii decât 2E12 sau Adriamicină singure.
Activitatea tumoricidă a TRA-8 în combinaţie cu 2E12 a fost testată, utilizând aceleaşi modele de tumoare canceroasă de sân. Tratamentul cu doze I. p. de 200 pg de TRA-8 şi 2E12 s-a produs în zilele 7,10,14,17, 21 şi 24, după injecţia celulelortumorale. Animalele au primit/, v. Adriamicină (Doxorubicină) (6 mg/kg) în zilele 8,12 şi 16. Tratamentul cu TRA-8 plus 2E12, sau cu TRA-8 plus 2E12 şi Adriamicină a produs o regresie tumorală de 88% sau completă, respectiv, de 100% (fig. 21).
Exemplul 30. Activitatea tumoncidă a anticorpilor DR4/DR5 în combinaţie cu alte terapii 1. Reactivi şi linii de celule
Subclona 2LMP a liniei de cancer de sân uman MDA-MB-231, subclona LCC6 a MDA-MB-435, şi subclona DY36T2 a MDA-MB-361 au fost obţinute de la dr. Marc Lipmann (Universitatea Georgetown, Washington DC), şi au fost menţinute în MEM suplimentat cu FBS10% (Hyclone, Logan, UT). Liniile de celule de cancer uman de sân, MDA-MB-231, MDA-MB-453, MDA-MB-468, BT-474, SK-BR-3 şi ZR-75-1, au fost obţinute de la Colecţia Americană de Tipuri de Culturi (Manassas, VA). Celule MDA-MB-231, MDA-MB-453, şi 104 RO 123525 Β1 MDA-MB-468 au fost crescute în DMEM suplimentat cu vitamine MEM, cu aminoacizi 1 neesenţiali MEM, cu piruvatde sodiu 1mM şi cu 10% FBS. Celulele BT-474 au fost crescute în RPM11640, suplimentat cu 10 pg/ml insulină, 4,5 g/l glucoză, HEPES 10 mM, piruvat de 3 sodiu 1 mM şi FBS 10%. Celulele SK-BR-3 au fost crescute în mediu McCoy cu FBS 15%. Celulele ZR-75-1 au fost crescute în mediu F12K Ham cu FBS 20%. Toate liniile de celule 5 au fost menţinute în mediu fără antibiotic într-o atmosferă de C02 5% şi au fost supuse unei analize de rutină, pentru determinarea contaminării cu micoplasme. 7 A fost produs mAc TRA-8 (lgG1) la UAB şi a fost furnizat, de asemenea, de către Sankyo Co., (Tokyo, Japonia). lgG1 antişoarece de capră, conjugat cu ficoeritrină, şi 9 anticorpul martor lgG1 izotip-specific au fost obţinuţi de la Southern Biotechnology Associates (Birmingham, AL). Adriamicina şi Paclitaxelul au fost achiziţionate de la Sigma 11
Chemicals Co. (St. Louis, MO) şi au fost preparate ca soluţii stoc 10 mM în H20 distilată sau, respectiv, în DMSO. Pentru studiile pe animale, formularea clinică a Paclitaxelului (Bristol- 13 Myers Squibb Co., Princeton, NJ) a fost obţinută de la Universitatea din Alabama, la Farmacia Spitalului Birmingham (Birmingham, AL). Acest preparat a fost diluat 1:5 în PBS, 15 imediat înainte de utilizare. 2. Analiza de imunofluorescenţă indirectă şi analiza de citometrie în flux a expresiei 17 DR5
Celulele aflate în fază de creştere exponenţială au fost spălate o dată cu PBS 19 Dulbecco (cu deficit de Ca2+ şi Mg2+) şi au fost hrănite cu EDTA 4mM/KCI 0,5%, la 37°C. Celulele au fost colectate prin centrifugare la 4°C, timp de 5 min, la 1000 rpm, au fost spălate 21 o dată şi resuspendate în PBS, care conţine BSA 1% şi azidă de sodiu 0,01% (tampon FACS) la 4°C. Celulele au fost incubate cu 10 pg/ml TRA-8 purificat sau cu un anticorp 23 martor specific lgG1, timp de 60 min, la 4°C, spălate o dată cu tampon, apoi incubate cu 10 pg/ml lgG1 antişoarece de capră, conjugat cu PE, timp de 20 min, la 4°C. După colorarea 25 anticorpului, celulele au fost spălate o dată cu tampon FACS şi au fost fixate în para-formaldehidă, timp de 15 min, pe gheaţă. Au fost analizate probe cu un aparat Becton 27 Dickinson FACScan (San Jose, CA) şi datele au fost analizate, utilizând un soft CellQuest. 3. Viabilitatea celulară utilizând ATPLite 29
Celulele au fost tripsinizate şi resuspendate în mediu de cultură complet. O mie de celule per godeu au fost plasate pe plăci negre optic clare cu 96 godeuri (Costar # 3904, 31
Corning, NY) şi au fost incubate peste noapte la 37°C, înainte de a iniţia tratamentele. Medicamentele şi anticorpul au fost diluate în mediul de cultură imediat înainte de utilizare, 33 iar concentraţia finală a DMSO a fost întotdeauna < 0,001%. Viabilitatea celulelor a fost determinată după o expunere de 24 h, doar la TRA-8. Pentru tratamentele combinate cu 35 medicamente citotoxice, celulele au fost pretratate cu medicament cu 24 h înainte de adăugarea anticorpului, şi au fost incubate timp de încă 24 h, înainte de determinarea 37 viabilităţii celulelor prin măsurarea nivelurilor de ATP celular, utilizând o analiză bazată pe luminescenţă ATPLite (Packard Instruments, Meriden, CT). A fost urmat protocolul 39 recomandat de fabricant, cu excepţia faptului că toate volumele de reacţie (mediul de cultură şi reactivii) au fost reduse la jumătate. Toate probele au fost determinate în triplicat şi au fost 41 raportate ca medie ± ES, pentru minimum 3 experimente independente. 4. Studiile de terapie cu TRA-8 singur sau în combinaţie cu chimioterapia sau cu 43 radiaţia la şoareci nuzi atimici care poartă xenogrefe de cancer de sân Şoareci nuzi atimici au fost injectaţi s. c. cu 3 x 107 celule 2LMP. La 7 zile după 45 injecţia cu celule tumorale, au fost administrate 200 sau 600 pg (10 sau 30 mg/kg) TRA-8 105 RO 123525 Β1 /. p., urmat de cinci injecţii suplimentare, în zilele 10,14, 17, 21 şi 24. Creşterea tumorilor a fost supravegheată. în studiile ulterioare, animalele care poartă tumori 2LMP s. c. au fost injectate /. p. cu 200 pg de TRA-8, în zilele 7, 10,14, 17, 21 şi 24, singur sau în combinaţie cu Adriamicină (6 mg/kg I. v., în zilele 8, 12 şi 16) sau cu Paclitaxel (20 mg/kg I. p. în zilele 8, 12, 16, 20 şi 24). Au fost determinate mărimea şi vitezele de regresie a tumorii. în plus, s-a desfăşurat un studiu cu TRA-8 şi Adriamicină, utilizând acelaşi regim descris mai sus, în combinaţie cu iradiere cu 3Gy 60Co a xenogrefelor 2LMP, în zilele 9 şi 17. 5. Analiza apoptozei în xenogrefe Şoareci nuzi atimici au fost injectaţi s. c. cu 3 x 107 celule 2LMP, în ziua 0, apoi au primit 100 pg TRA-8 /. p., în zilele 7 şi 10. Grupuri de 2 şoareci au primit fiecare Adriamicină 3 mg/kg), în zilele 8 şi 11, Paclitaxel (10 mg/kg) în zilele 8 şi 11, sau o combinaţie de TRA-8 şi Adriamicină sau Paclitaxel, după aceeaşi doză şi schemă. Unul dintre grupurile de şoareci a fost netratat. Xenogrefele au fost disecate, pentru studiu, în ziua 14, după injectarea celulelor tumorale. Motivul reducerii substanţiale a intensităţii tratamentului comparativ cu protocolul nostru de tratament standard a fost lăsat să adecveze ţesutul tumoral pentru analiză în ziua 14. Analiza tunel a apoptozei xenogrefelor tumorale a fost realizată după cum urmează. Au fost montate secţiuni de ţesut în parafină de cinci microni pe lame Superfrost/Plus şi au fost încălzite la 58°C, timp de 1 oră. Secţiunile de ţesut au fost deparafinizate de trei ori în xilen şi au fost rehidratate cu etanol absolut, etanol 95% şi cu etanol 70%, fiecare în incremente de 5 min. Apoi secţiunile au fost plasate în soluţie salină tamponată cu Tris (0,5M bază Tris, NaCI 0,15M, 0,0002% Triton X-100, pH 7,6). Nucleele apoptotice au fost detectate, utilizând trusa ApopTagPeroxidase(lntergen, Purchase, N.Y.). A fost adăugată, în fiecare specimen de ţesut, proteinază K (20 pg/ml în apă distilată deionizată), şi s-au incubat la temperatura camerei, timp de 15 min. Peroxidazele endogene au fost inactivate cu o soluţie apoasă de peroxid de hidrogen, timp de 5 min. Secţiunile au fost tratate cu tampon de echilibrare, timp de 30 min şi apoi au fost incubate cu enzimă TdT (diluată în amestecul de reacţie de marcare), timp de o oră, la 37°C, utilizând învelişuri de parafilm. în timpul acestei incubări, enzima TdT se leagă la capetele 3'-OH ale fragmentelor de ADN şi catalizează adiţia dezoxinucleotidelor marcate cu digoxigenină şi nemarcate. Martorii negativi au fost incubaţi cu H20 distilată (diluată în amestec de reacţie de marcare) în locul enzimei TdT. Un tampon de stopare a fost adăugat, timp de 10 min, la temperatura camerei, pentru a termina reacţia de marcare. A fost adăugat, pe fiecare lamelă, un conjugat antidigoxigenină, timp de 30 min. Cromogenul 3,3'DAB a fost utilizat pentru a vizualiza capătul 3ΌΗ al fragmentelor de ADN. Lamelele au fost apoi clătite cu apă deionizată şi au fost uşor contracolorate cu hematoxilină, deshidratate, utilizând alcooli gradaţi şi xilen şi se acoperă, utilizând Permount. La aproximativ 10 câmpuri randomizate, li s-a evaluat procentajul de coloraţie Tunei şi procentajul de corpuri apoptotice intens colorate din întregul ţesut. 6. Analiza statistică A. Analiza interacţiunii TRAS cu citotoxicitatea medicamentului in vitro
Datele de citotoxicitate au fost evaluate pentru a determina dacă combinaţia de efecte citotoxice a fost aditivă, mai puţin decât aditivă (antagonistă) sau mai mare decât aditivă (sinergică). Relaţiile doză-răspuns pentru agenţii singuri şi în combinaţie au fost modelate, utilizând un model de răspuns de suprafaţă de ordinul doi, cu termeni liniari, pătratici şi de interacţiune, pentru fiecare dintre cele 9 linii de celule (Montgomery, D. C., 106 RO 123525 Β1
Design and Analysis of Experimente, New York: Wiley, 2001), după recomandarea lui 1 Gennings (On Testing forDrug/Chemical Interactions: Definitions and Interference, pp. 457-468, 2000). Un termen de interacţiune semnificativ a fost clasificat ca fiind sinergie sau 3 antagonist, depinzând de faptul că termenul de interacţiune a fost negativ, având o citotoxicitate mai mult decât aditivă, sau pozitiv, având o toxicitate mai puţin decât aditivă. 5 Dacă termenul de interacţiune nu a fost semnificativ, atunci relaţia dintre TRA-8 şi Adriamicină sau TRA-8 şi Paclitaxel ar fi considerată aditivă, cu condiţia ca termenii aditivi 7 să fie semnificativi. B. Analiza lui TRA-8, chimioterapie, terapia cu radiaţii şi combinată a experimentelor 9 individuale pe animale
Au fost analizate 6 experimente independente prin experiment individual. 11 Combinaţiile de tratament au fost comparate din punct de vedere al eficacităţii antitumorale, adică inhibiţia creşterii tumorale, care a fost măsurată din trei puncte de vedere: extinderea 13 timpilor de dublare a tumorii, procentajul regresiilor tumorale şi vitezele de creştere în timp. Numărul real de zile în care tumoarea şi-a dublat aria suprafeţei (produsul a două diametre) 15 relativ la linia de bază în ziua 7 după injectarea celulelor tumorale a fsot utilizat în analiza timpului dublat. Testul neparametric Kruskal-Wallis a fost utilizat pentru comparaţiile timpilor 17 medii de dublare a tumorii între tratamente. Testul extractului Fisher a fost utilizat pentru a compara proporţia regresiei tumorii şi regresiile fără recidive în grupele de tratament. Pentru 19 a determina dacă orice terapie combinată produce o inhibiţie sinergică semnificativă a creşterii tumorii, adicămai mult decât aditivă, curbele de creştere din măsurătorile seriale ale 21 suprafeţelor au fost comparate, utilizând o aproximare a modelului amestecat liniar de-a lungul a trei săptămâni după începerea terapiei (Lindsey, J. K., Models for Repeated 23 Measurements, pp. 100-142, Oxford, 1993). Pentru a testa efectele sinergice ale terapiilor combinate, a fost inclus un termen de interacţiune în model. Dacă termenul de interacţiune 25 a fost semnificativ şi efectul a fost o inhibiţie a creşterii cu o viteză mai mare decât aditivă, atunci interacţiunea a fost considerată sinergică. 27 C. Analiza cumulată a efectelor terapiei
Un total de 166 animale, 10 grupe de tratament şi 6 experimente independente au 29 fost incluse în analiza cumulată. Combinaţiile de tratament au fost comparate din punct de vedere al eficacităţii antitumorale in vivo. Timpii medii de dublare a tumorii au fost analizaţi, 31 utilizând testul Kruskal-Wallis şi testul extractului Fisher, pentru a compara proporţiile regresiilor tumorale şi regresiile fără recidive în grupele de tratament. 33
Toate analizele statistice au avut loc, utilizând SAS® (Sas/Stat User's Guide, SAS OnlineDoc, Version 8, Cary NC: SAS Institute Inc., 1999). 35 6. Expresia DR5 şi citotoxicitatea indusă de TRA-8 în liniile de celule de cancer de sân 37
După cum se ilustrează în fig. 22A, toate cele nouă linii de celule canceroase au fost DR5-pozitive, cu diferite grade de expresie, de la puternic pozitiv (LCC6 şi MDA-MB-453) 39 până la slab pozitive (MDA-MB-468 şi SK-BR-3). Fig. 22B ilustrează citotoxicitatea indusă de TRA-8 în cele nouă linii de celule. Patru linii de celule au fost sensibile la citotoxicitatea 41 indusă de TRA-8, cu concentraţiile Cl50 de 17 până la 299 ng/ml (LCC6,2LMP, MDA-MB231, MDA-MB-468), în timp ce altele au fost destul de rezistente (DY36T2, BT-474, MDA-MB- 43 453). Nu a existat o bună corelaţie între expresia DR5 şi gradul de citotoxicitate indusă de TRA-8, după cum a fost ilustrat în cazul liniilor de celule MDA-MB-453 şi MDA-MB-468. 45 107 RO 123525 Β1
Efectele TRA-8 asupra citotoxicităţii induse de chimioterapie au fost apoi examinate cu Adriamicină (fig. 23A) şi Paclitaxel (fig. 23B). Un test de analiză pentru interacţiunea dintre anticorp şi efectele medicamentului este rezumat în tabelul 5. Nu au existat interacţiuni sinergice între TRA-8 şi Paclitaxel, cele mai multe interacţiuni fiind aditive. Patru din nouă linii de celule au îndeplinit criteriile pentru o interacţiune sinergică între TRA-8 şi Adriamicină. Linia de celule 2LMP a demonstrat o bună sensibilitate faţă de TRA-8, precum şi sensibilitate şi la Adriamicină, şi la Paclitaxel. Această linie de celule a fost aleasă pentru a explora eficacitatea in vivo a anticorpului şi/sau a medicamentelor.
Tabelul 5
Efectele interacţiunii in vitro pentru tratamentele combinate TRA-8 + Adriamicină TRA-8 + Paclitaxel Linia de celule Interacţiune Valoarea pa Interacţiune Valoarea pa LCC6 Sinergică <0,001 Aditivă 0,624 MDA-MB-453 Sinergică <0,001 Fără răspuns0 0,615 2LMP Aditivă 0,153 Aditivă 0,937 MDA-MB-231 Aditivă 0,663 Aditivă 0,064 BT-474 Sinergică <0,001 NDb 0,992 ZR-75-1 Sinergică 0,013 Aditivă 0,172 DY36T2 NDb 0,808 NDb 0,798 MDA-MB-468 Aditivă 0,184 Aditivă 0,724 SK-BR-3 Aditivă 0,361 Fără răspuns0 0,871 a Valoarea p se referă la semnificaţia termenului de interacţiune sinergică. Dacă atât TRA-8, cât şi efectele medicamentului, au fost semnificative şi termenul de interacţiune a fost semnificativ, atunci efectele combinaţiei au fost considerate sinergice. Dacă valoarea p de interacţiune nu este <0,05, atunci efectele combinaţiei au fost considerate aditive. b Nu au fost determinate, pentru că efectul TRA-8 nu a fost semnificativ, dar efectul Adriamicină/Paclitaxel a fost semnificativ. c Nu a existat un răspuns semnificativ la doză pentru niciun agent. 7. Efectele antitumorale in vivo ale TRA-8 singur sau în combinaţie cu chimioterapia şi/sau iradierea TRA-8 la doze de 200 pg şi 600 pg, de două ori pe săptămână, a produs o inhibiţie similară a creşterii tumorii pentru tumorile s. c. 2LMP bine stabilite (fig. 24). în trei experimente adiţionale, doza de 200 pg/schemă a produs o inhibiţie statistic semnificativă a creşterii tumorale (p < 0,004, testul Kruskal-Wallis asupra timpilor de dublare a tumorii) comparativ cu martorii netrataţi, şi această doză şi schemă au fost selectate şi pentru studiile ulterioare. Fig. 25 ilustrează efectele TRA-8, Adriamicinei sau ale unei combinaţii de TRA-8 şi Adriamicină asupra eficacităţii antitumorale. Comparativ cu martorii netrataţi, terapia cu TRA-8 singur sau cu TRA-8 plus Adriamicină a produs o inhibiţie semnificativă a creşterii 108 RO 123525 Β1 tumorii (p=0,002 testul Kruskal-Wallis), în timp ce Adriamicina nu a diferit de martori. 1 Combinaţia de TRA-8 plus Adriamicină a produs o mai mare inhibiţie decât fiecare agent singur (p=0,002), precum şi o regresie semnificativ mai completă a tumorilor (patru) decât 3 fiecare agent singur, caz în care nu s-a observat nicio regresie (p<0,001, testul Fisher exact). Sinergismul in vivo dintre TRA-8 şi Adriamicină a fost evaluat, utilizând o analiză de creştere 5 a curbei. Acest termen al interacţiunii a fost semnificativ (p<0,001) şi sinergie. Interacţiunea sinergică a fost coroborată într-un al doilea experiment independent. 7
Efectele TRA-8 şi ale Paclitaxelului au fost studiate, în acest model făcându-se observaţii similare (fig. 26). Comparativ cu martorii netrataţi, TRA-8 şi TRA-8 plus Paclitaxelul 9 au produs o inhibiţie semnificativă a creşterii tumorii (p<0,001, testul Kruskal-Wallis). Creşterea tumorii la animalele tratate cu TRA-8 plus Paclitaxel a fost semnificativ diferită 11 decât în cazul doar al Paclitaxelului (p=0,008) şi a produs o regresie completă 3/8 comparativ cu niciuna, pentru fiecare agent singur. Analiza curbelor de creştere timpurie a 13 tumorii a demonstrat că efectul sinergie a fost aproape semnificativ (p=0,063), în timp ce efectele aditive au fost semnificative (p<0,001). 15 în final, efectele TRA-8, Adriamicinei şi iradierii cu 60Co au fost analizate ca agenţi singulari şi în combinaţii diferite, după cum s-a ilustrat în fig. 27. Au existat diferenţe 17 semnificative peste tot, cu privire la timpii de dublare a tumorii (p<0,001) şi comparaţii multiple au indicat faptul că terapia triplă cu TRA-8, Adriamicină şi 60Co a produs o inhibiţie 19 a creşterii tumorii, care a fost semnificativ diferită decât toate celelalte grupe tratate, în timp ce ambele grupe duale de terapie (Adriamicină plus TRA-8 sau 60Co plus TRA-8 au fost 21 diferite decât un grup cu agent singular (p<0,001). Animalele 60Co tratate doar cu radiaţii nu diferă de martorii netrataţi (p=0,926). Toate combinaţiile de tratamentele pe două căi au avut 23 efecte sinergice semnificative (p<0,001). Regresii complete au fost observate la 6/8 animale care au primit terapie triplă şi 4 animale nu au avut o recurenţă a tumorii de-a lungul a 180 25 de zile de tratament. 8. Analiza cumulativă a efectelor terapiei 27
Studiile antitumorale au cuprins 166 de animale, şi au fost analizaţi timpii de dublare 29 a tumorii şi frecvenţa regresiei complete a tumorii, pentru toate animalele din fiecare grup de tratament (tabelul 6). Analiza ANOVA a timpilor medii de dublare a tumorii a indicat diferenţe 31 semnificative între grupele de tratament (p<0,001), comparaţii multiple arătând că TRA-8 + Paclitaxel, TRA-8 + Adriamicină şi TRA-8 + Adriamicină + 60Co au avut timpi de dublare 33 medii ai tumorii semnificativ mai lungi decât orice grup de tratament fără TRA-8. Adăugarea lui TRA-8, la orice modalitate de tratament, a produs un timp de dublare a tumorii mai 35 îndelungat decât modalitatea singură. în mod similar, testul Kruskal-Wallis asupra timpului median de dublare a tumorii a arătat faptul că medianele au fost semnificativ diferite peste 37 tot (p<0,001). Comparaţia perechilor, utilizând testul speciei semnate Wilcoxin, a produs scheme similare pentru timpul mediu de dublare a tumorii, ca şi comparaţiile multiple 39 ANOVA. Această analiză subestimează inhibiţia creşterii produsă de cele mai eficiente tratamente în acele grupuri care nu ating o dublare a tumorii la sfârşitul experimentului. 41 Tabelul 6 furnizează, de asemenea, frecvenţa regresiei complete a tumorii şi frecvenţa persistenţei acelei regresii la sfârşitul experimentului. Nu au existat regresii complete ale 43 tumorii, văzute la animalele tratate fie cu un regim de chimioterepie, fie cu radiaţii, atribuite creşterii bine stabilite a tumorii şi agresivităţii tumorii. Din testul extractului Fisher, au existat 109 RO 123525 Β1 diferenţe semnificative, privind frecvenţa regresiei complete a tumorii între grupele de tratament (p<0,001). 30 din 166 de animale au realizat o regresie completă, şi 28 dintre acestea au primit doar TRA-8 sau în combinaţie cu alte modalităţi. Regresia completă a avut loc la 1/42 animale martor: 1/54 animale primesc chimioterapie, radiaţii sau o combinaţie; şi 28/68 doar TRA-8 sau regimuri combinate de TRA-8. Grupele tratate cu TRA-8 au avut o frecvenţă semnificativ mai mare (p<0,001) de regresie completă. în mod similar, 14/68 animale care primesc TRA-8 sau combinaţii de TRA-8 nu au avut o recreştere a tumorilor comparativ cu 1/42 martori şi 0/52 animale tratate cu chimioterapie şi/sau radiaţii. Regresiile fără recidive au avut perioade de observare de 99 până la 171 zile (146±24 zile).
Tabelul 6
Rezultatele cumulative ale timpului de dublare şi ale regresiei complete
ale tumorilor 2LMP
Regresii complete T ratament # de animale Timpi de dublare a tumorii (zile) (mediu/median) total (%) Fără recidivă % Perioada medie de observaţie Martori netrataţi 44 (42)a 12/8 1 (2%) 1 (2%) 177 O O o <o 8(7) 14/10 0 0 186 Adriamicină 31 (28) 17/18 0 0 197 Paclitaxel 7(5) 25/20 0 0 Adriamicină + 60Co 8(8) 39/36 1 (13%) 0 197 TRA-8 30 (26) 47/23 6 (20%) 5 (17%) 159 TRA-8 + 60Co 8(8) 65/50 3 (38%) 1 (13%) 186 TRA-8 + Paclitaxel 8(8) 71/62 3 (38%) 1 (13%) 148 TRA-8 + Adriamicină 14 (12) 81/64 10 (71%) 3 (21%) 185 TRA-8 + Adriamicină+60Co 8(6) >140/179 6 (75%) 4 (50%) 192 a Numerele din paranteze sunt numerele de animale necenzurate 9. Apoptoza în tumorile tratate
Inducţia apoptozei la xenogrefele 2LMP, consecutivă tratamentului cu TRA-8, Adriamicină, TRA-8 + Adriamicină, şi TRA-8 + Paclitaxel, a fost analizată, utilizând tehnica Tunel. La animalele netratate, tumorile au avut 4% celule colorate (1% intens), în timp ce tratamentul cu Adriamicină sau Paclitaxel a avut 8% (6% intens) şi 7% (2% intens) celule colorate. Animalele tratate doar cu TRA-8 au avut o apoptoză foarte puternică, cu 25% celule colorate (15% intens). TRA-8 plus Adriamicină a avut 28% (22% intens) şi TRA-8 plus Paclitaxel a avut 26% (12% intens) celule colorate. 110 RO 123525 Β1
Orice scheme sau publicaţii menţionate în descriere sunt indicative pentru nivelul 1 celor cu calificare în domeniu, cărora invenţia li se adresează. Aceste brevete şi publicaţii sunt încorporate aici prin referinţă, în aceeaşi proporţie ca şi cum fiecare publicaţie ar fi 3 indicată în mod specific şi individual ca fiind încorporată prin referinţă.
Invenţia de faţă nu are scopul limitat prin depozitul sau aspectele descrise în 5 exemple, care se intenţionează a fi ilustrative pentru câteva aspecte ale invenţiei, şi orice aspecte care sunt funcţional echivalente intrăîn scopul acestei invenţii. Diferite modificări ale 7 invenţiei, în plus faţă de cele arătate şi descrise aici vor deveni aparente celor cu calificare în domeniu şi se intenţionează să intre în scopul revendicărilor anexate. 9 111 RO 123525 Β1
LISTĂ DE SECVENŢE <110> The UAB Research Foundation Zhou, Tong Ichikawa, Kimihisa Kimberly, Robert P.
Koopman, William J.
Oshumi, Jun LoBuglio, Albert S.
Buchsbaum, Donald J.
<120 COMBINAŢII DE ANTICORPI SELECTIVI PENTRU UN RECEPTOR AL UNUI LIGAND CARE INDUCE APOPTOZA ASOCIAT CU UN FACTOR AL NECROZEI TUMORALE Şl ALŢI AGENŢI TERAPEUTICI <130 21085.0029P3 <150 60/391478 < 151 > 2002-06-24 <150> 60/346402 < 151 > 2001-11-01 <150> PCT/US01/14151 < 151 > 2001-05 <150> 60/201344 <151 >2000-05-02 <160> 102 <170> Patentln versiunea 3.0 <210> 1 <211> 25
<212> ADN <213> construct sintetic «400» 1 gscgatgccc gatctacttt aaggg 25
<210> 2 <211> 22 <212> ADN <213> construct sintetic <400» 2 ccactgggtg atgttggafcg gg 22 112 RO 123525 Β1
<210> 3 <211> 24 <212> ADN <213> construct sintetic <400> 3 ggafcccgtgg acacattcga tgtc 24
<210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> construct sintetic <400> 4
Glu Val Met Leu Val Glu Sex Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu 20
<210> 5 <211 >20 <212> PRT <213> construct sintetic <400> 5
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Hls Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Mg Val Ser 20
<210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> construct sintetic <400> 6 cagcactgaa cacggacccc 20
<210> 7 <211> 20 <212> ADN <213> construct sintetic <400» 7 aaaggtaatt tattgagaag . 20 113 RO 123525 Β1
<210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> construct sintetic <4G0> 8 cctcaccatg aacttcgggc
<210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> construct sintetic <40O> 9 ctgttgtatg cacatgagac
<210> 10 <211> 20 <212> ADN <213> construct sintetic <4Q0> 10 gaagtgatgc tggtggagtc
<210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> construct sintetic <400> n agtgtgaagt gatgctggtg
<210> 12 <211> 21 <212> ADN <213> construct sintetic <400> 12 tttaccagga gagtgggaga g 114 RO 123525 Β1
<210 13 <211> 20 <212> ADN <213> construct sintetic <400> 13 tgcagagacâ gtgaccagag 20
<210> 14 <211> 20 <212> ADN <213> construct sintetic <I00> 14 tgtfccaggac eagcatgggc 20
<210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> construct sintetic <400> 15 aagacatttt ggattetaac 20
<210> 16 <211> 20 <212> ADN <213> construct sintetic <400> 16 tatcatgaag t.ctttgtatg 20
<210> 17 <211 >20 <212> ADN <213> construct sintetic <400> 17 gatggagaca cattctcagg 20
<210> 18 <211> 20 <212> ADN <213> construct sintetic <400> 18 gacattgtga tgacccagtc 20 115 RO 123525 Β1
<210> 19 <211> 20 <212> ADN <213> construct sintetic <4Q0> 19 ttaacactca ttcctgfctga
<210> 20 <211 >20 <212> ADN <213> construct sintetic <400> 20 gactgggtca tcaoaaftffec
<210> 21 <211> 1386 <212> ADN <213> construct sintetic <400? 21 atgaacttcg ggefccagctt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gtgatgctgg tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct tgtgcagcct ctggattcac ttteagtagc tatgtaatgt cttgggttcg gagaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtagtggtg gtagttacac gacagtgtga aggggcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacae caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcaag tctatgatta cgacggacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc acgacacccc catctgtcta tccactggco cctggatctg ctgcccaaac gtgaeectgg gatgcotggt caagggctat ttccctgagc cagtgacagt tctggatccc tgtccagcgg tgtgcacaoc ttcccagctg tcctgcagtc actctgagca gctcagtgac tgtccoctoc agcacctggc ccagcgagac aacgttgccc acccggceag cagcaccaag gtggacaaga aaattgtgcc ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccoa gaagtatcat ctgtcttcat aagcccaagg atgtgctcac cattactcfcg actcotaagg tcaegtgtgt atcagcaagg atgatcccga ggtccagttc agctggtttg tagatgatgt coagtgtgaa gaaactctcc ccagactccg ctactatcca ectgfcacctg acggggggac ctcagccaaa taactccatg gacctggaac tgacctctac cgtcacctgc cagggattgt cttcccccca tgtggtagac ggaggtgcac 116 RO 123525 Β1 aoagcfccaga cgcaaeeccg ggaggagcag ttcaacagoa cttcocatca tgcaceagga ctggctcaat ggcaaggagt gcagctttec etgcccccat cgagaaaacc âtctceaaaa coacaggtgt acaccattcc acctcccaag gagcagatgg acctgcatga taacagactt ettccctgaa gacattactg cagccagcgg agaactacaa gaacactcag cccatcatgg gtctacagca agctcaatgt gcagaagagc aactcggagg tctgtgttac atgagggcct gcacaaccac catactgaga ggtaaa etttcegcte agtcagtgaa 960 1 tcaaatgcag ggtcaacagt 1020 3 ccaaaggcag accgaaggct 1080 5 coaaggataa agtcagtotg 1140 tggagtggca gtggaatggg 1200 7 acacagatgg ctcttacttc 1260 caggaaatac tttcacctgc 1320 9 agagcctctc ccactctcct 1380 11 1386 13 15 17 19 21
<210> 22 <211> 705 <212> ADN <213> construct sintetic
<400> 22 atgaagtctt tgtafcgtgtt agtgtataca cattatctgt ttctgtttgc aggtgttgaa 60 23 ggagacattg tgatgaccea gtcteacaaa ttcatgteca catcagtagg agacagggtc 120 agcatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta tcaacagaaa 180 25 ccagggcaat ctcctaaact actgatttac tgggcatcea cccggcacac tggagtccct 240 27 gatcgettca caggcagtgg atctgggaca gatttcactc teaceattag eaatgtgcag 300 tctgaagact tggcagatta tttctgtcag caatatagca gctatcggac gttcggtgga 360 29 ggcaccaagc tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat ottcccacca 420 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480 31 cccaaagaca tcaatgtcaa gţggaagafct gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540 33 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600 ttgaccaagg acgagtaţga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660 35 tcaacttcac oeattgtcaa gagcttcaaa aggaatgagt gttaa 7 OS 37 39 41
<210> 23 <211 >462 <212> PRT <213> construct sintetic 117 43 RO 123525 Β1 <4QQ> 23 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu lle X 5 Val Gin Cys Glu Val Met Leu Vai 20 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser 35 40 Ser Ser Tyr Val Met Ser Trp Val 50 55 Glu Trp Val Ala Thr lle Ser Ser 65 70 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 85 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser 100 Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Asp 115 120 Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val 130 135 Ser val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly 145 150 Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys 165 Val «l jr**Lr Trp ftsa Ser Gly Ser Leu 180 Ala 'Val Leu Gin Ser Asp Leu Tyr 1 QK 200 Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu 210 215 Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp 225 230 Gly Cys Lys Pro Cys lle Cys Thr 245 lle Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280
Phe Leu 10 Val Leu Val Leu Lys 15 Gly Glu 25 Ser Gly Gly Gly Leu 30 Val Lys Cys Ala Ala Ser Gly 45 Phe Thr Phe Arg Gin Thr Pro Glu 60 Lys Arg Leu Gly Gly Ser 75 Tyr Thr Tyr Tyr Pro 80 lle Ser 90 Arg Asp Asn Ala Lys 95 Asn Leu 105 Arg Ser Glu Asp Thr 110 Ala Met Ser Met lle Thr Thr 125 Asp Tyr Trp Ser Ser Ala Lys Thr 140 Thr Pro Pro Ser Ala Ala 155 Gin Thr Asn Ser Met 160 Gly Tyr no Phe Pro Glu Pro Val 175 Thr Ser 185 Ser Gly Val His Thr 190 Phe Pro Thr Leu Ser Ser Ser 205 Val Thr Val Thr Val Thr Cys Asn 220 Val Ala ais Lys Lys lle 235 Val Pro Arg Asp Cys 240 Val Pro ORO 1fi» ttf Val Ser Ser Val g e c* Zdd UT lia Val 265 Leu Thr lle Thr Leu 270 Thr Pro lle Ser Lys Asp Asp 285 Pro Glu Val 118 1 1 <400> 24 Met Lys Ser Leu 1 Ma Gly Val Glu 20 Ser Thr Ser Val 35 Asp Val Gly Thx 50' Pro lys Leu Leu 65 RO 123525 Β1
Gin, Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val Bis Thr Ala Gin Thr 290 295 300 Gin Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu 305 310 315 320 Leu Pro Ile Met His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys 325 330 335 Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Thr Lys Gly Arcr Pro Lys Ala Pro Gin Val Tyr Thr Ile Pro Pro 355 360 365 Pro Lys Glu Gin Met Ala Lvs Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile 370 375 380 Thr ftsp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gin Trp Asn Gly 385 390 395 400 Gin Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gin Pro Ile Met Asp Thr Asp 405 410 415 Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gin Lys Ser Asn Trp 420 425 430 Glu Ala Gly Asa Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His 435 440 445 Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser Ris Ser Pro Glv Lys 450 455 460
<210> 24 <211 >234 <212> PRT <213> construct sintetic
Tyr Val Leu Val Tyr Thr Bis Tyr Leu Phe Leu Phe 5 10 “ 15
Gly Asp Ile Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met 25 30
Gly Asp Arg val Ser Ii® Thr Cys Lys Ala Ser Sin 40 45
Aia Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 55 60
Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro 70 75 '80 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 119 43 RO 123525 Β1 Aşp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Asn Val Gin Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr 100 105 110 Ser Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Als Αβρ R 3 ^ Λ1 3l Pito Thr ^ÎjÎr 1· Ser Ile Phe Pro Pro Gdx Ser Glu Gin 130 135 14 0 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 Λ £2 tî «L wJD 160 Pro Lys Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gin 165 170 175 Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gin Asp Sex Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Μί» 4** Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys ASp Glu Tyr Glu Arg 195 200 205 His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Aid Thr His Lys Thr Ser TtuT Ser Pro 210 215 220 Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230
<210 25 <211> 5 <212> PRT <213> construct sintetic <400> 25
Ser Tyr Val Met Ser 1 5
<210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> construct sintetic <400> 26
?hr- Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr -Tyr Tyr Pro ftsp Ser Val Lys Gly 1 5 10 ÎS 120 RO 123525 Β1
<210> 27 <211 > 10 <212> PRT <213> construct sintetic <40G> 27
Arg <31y Âsp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr 1 5 10
<210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> construct sintetic <400> 28
Lys Ala Sar Gin Asp Val Gly Thr Ala Val Ala 15 10
<210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> construct sintetic <400> 29
Trp Ala Ser Thr Arg lis Thr 1 S
<210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> construct sintetic <4Q0> 30
Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr 1 5
<210> 31 <211 > 119 <212> PRT <213> construct sintetic 121 RO 123525 Β1 1 <400> 31 3 5 SIu Val Met Leu Vai i 5 Ser Leu Arg Leu Sex 20 Glu Ser Gly Gly Gly Leu 10 Cys Ala Ala Ser Gly Phe 25 Val Gin Pro Thr Phe Ser 30 Gly Gly 15 Ser Tyr 7 Vai Met Ser Trp Val 35 Arg Gin Ala Pro Gly Lys 40 Gly Leu Glu 45 Trp Val 9 Ala Thr Ile Sex Ser 50 Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp 60 Ser Val 11 Lys Giy Arg Phe fhr 65 Ile Ser Arg Asp Asn Ala 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 13 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp Thr 90 Ala Val Tyr Tyr Cys 95 15 Ala Arg Arg Gly Asp 100 Ser Met Ile Thr Thr Asp 105 Tyr Trp Sly 110 Gin Gly 17 Thr Leu Val Thr Val 115 Ser Ser 19 21 <210> 32 <211> 80 23 <212> ADN <213> construct sintetic 25 27 <400> 32 ttggataagc ttggCttgac ctcaccatgg gatggagCtg tât· catcote ttcttggtag 29 caacagctac aggtgtecac <210> 33 31 <211> 80 <212> ADN 33 <213> construct sintetic 35 <4G0> 33 tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga 37 ctetoofcgtg oagcotctgg <210> 34 39 <211> 80 <212> ADN 41 <213> construct sintetic 43 <400> 34 attcactttc agtâgttatg taatgtettg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga 45 gtgggttgca aceattagta 122 RO 123525 Β1 <210> 35 1 <211> 80 <212> ADN 3 <213> construct sintetic 5 <I0D> 35 gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag 60 7 acaatgccaa gaacaccctg 80 9 <210> 36 <211> 80 11 <212> ADN <213> construct sintetic 13 <400> 36 tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg 60 15 ggtgactcta tgattacgac 80 17 19 <210> 37 <211> 64 21 <212> ADN <213> construct sintetic 23 <400> 37 ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctccacca agggccoatc 60 25 ggtc 64 27 <210> 38 29 <211> 60 <212> ADN 31 <213> construct sintetic 33 <400» 38 ctaccaagaa gaggatgata cagotccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa 60 35 <210> 39 37 <211> 80 <212> AND 39 <213> construct sintetic 41 <400» 30 tctcagggac cetccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga 60 43 gtggacacct gtagctgttg 80 45 123 RO 123525 Β1 1 <210 40 <211> 80
3 <212> ADN <213> construct sintetic 5 <40G> 40 ^ tceagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat 60 ccagaggctg cacaggagag 80 9 <210> 41 11 <211> 80
<212> ADN 13 <213> construct sintetic 15 <400> 41 ctctggagat ggtgaatcgg ccettcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac 60 17 tacfcaatggt tgoaacccac 80 19 <210> 42 <211> 80
21 <212> ADN <213> construct sintetic 23 <4GQ> 42 2g ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata 60 cagggtgttc ttggcattgt 80 27 <210> 43 29 <211 >84
<212> ADN 31 <213> construct sintetic 33 <4 0 0> 43 gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta 60 oc gtccgtcgta atcatagagt cacc 84 37 <210> 44 <211 >20
39 <212> ADN <213> construct sintetic 41 <400> 44 43 ttggataagc ttggcttgac ‘ 20 124 RO 123525 Β1 <210 45 1 <211>21 <212> ADN 3 <213> construct sintetic «400» 45 5 gaccgatggg cccttggtgg a 21 7 <210> 46 <211 > 213 9
<212> PRT <213> construct sintetic 11 <400> 46
Asp T le Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu t , Ma Ser Val Gly Λ C 1 5 10 15 1 O Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val G ' Thr Ala 17 20 25 3C Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro siy Lys .^\la Pro Lys Leu Leu Xle 19 35 40 45 Tyr fxp Ăla Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 21 50 55 60 Sex Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 23 Glu Amp Phe Aia Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr 85 90 95 25 Phe Gly Gin Sly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 27 Ser Val Phe Xle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 29 Ăla Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 31 Val Gin Trp Lys Val Asp AS» Ăla Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 145 150 155 160 33 Ser Val Thr Glu Gin A*p Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 35 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ăla Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 37 Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lye Sex Phe 195 200 205 no
Asn Arg Gly 6lu Cys 210 41 125 RO 123525 Β1 1 <210 47
<211> 34 3 <212> ADN <213> construct sintetic 5 <40Q> 47 7 cceaagctta agaagcatcc tctcatctag ttct 34 <210> 48 9 <211> 45
<212> ADN 11 <213> construct sintetic ^2 <400> 48 cccgaattct tactaacact ctcccctgtt gaagctcttt gtgac 45 15 <210> 49 <211> 60
17 <212> ADN <213> construct sintetic 19 <400> 49 qtccocoac.a catgcagaca naganct.tgg aqattgggte atcacaatgt caccagtgga 60 21 23 <210> 50 <211 >48
25 <212> ADN <213> construct sintetic 27 <400> 50 ccaagttctt tgtctgcatc agtaggagac agggtcacca tcacctgc 48 29 <210> 51 31 <211> 57
<212> ADN 33 <213> construct sintetic 35 <4QG> 51 agtgtgccgg gtggatgccc agtaaatcag tagtttagga gctttccctg gtttctg 57 37 <210> 52 39 <211 >48
<212> ADN 41 <213> construct sintetic 43 <400> 52 tgggcatcca cccggcacac tggggtccca agcaggttta gtggcagt 48 126 RO 123525 Β1
<210> 53 <211 >63 <212> ADN <213> construct sintetic <400> 53 ataactacta tattgctgac agtaataggt tgcaaaatcc tccggctgca gactagagat 60 ggt 63
<210> 54 <211 >63 <212> ADN <213> construct sintetic <400> 54 cagcaatata gcagctatcg gacgttcggt caaggcacca aggtggaaat caaacggact 60 gtg 63
<210> 55 <211> 711 <212> ADN <213> construct sintetic <400> 55 atgyagscag 3cscaafcect gctaţgggţg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60 gacattgtga tgacccaatc tccaagttct tţgtctgcat ctgtggggga cagggtcacc 120
atcacctgca aggecagtoa ggatgtgggt actgctgtag cctggtatea acagaaacca IfO gggaaagctc ataaactaafc gatttactgg gcatccaccc ggcacaotgg ggtcccaagc 240 aggtttagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcacccfcca ccatctctag tctgcagccg 300 gaggattttg caacotatta ctgtcagcaa tatagtagtt atcggacgtt cggtcaaggc 360 accaaggtgg aaatcaaacg gactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420 gatgagcagt tgaaafcctgf aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 450 agagaqqcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacccctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt agtaagaatt c 711
<210> 56 <211>119 <212> PRT <213> construct sintetic 127 RO 123525 Β1 <40Q> 56
Glu Val Gin Le» Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Cât* w- a» Le» Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Met Ser Trp 'Val Arg Gin Ăla Pro Gly Lys Gly Leu ,61¾ Trp Val 35 40 45 AX& 'Thr Ile 'hî'W'dB Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pffi Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Iii Ser al y Αβρ Α8Π AX 3 Lye Asn ppţ*| 4A •J» I i i· Leu Tyr 65 70 *7£ I 60 Leu Gin Met Ăsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Al II Val Tyr Tvr Cys 85 90 95 &jLâ Arg Arg Gly Asp Ser Met; Ile Thr Thr Asp j* y «a* Trp Gly Gin Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 57 <211> 80 <212> ADN <213> construct sintetic <400> 57 tctgaagtac agctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcotctgg
<210> 58 <211> 80 <212> ADN <213> construct sintetic <400> 58 tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagct gtacttcaga gtggacacct gtagctgttg
<210> 59 <211> 119 <212> PRT <213> construct sintetic <40Q:> 59
Glu Val Met Leu Val 61» Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 S 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ăla Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lye Gly Le» Glu Trp Val 35 40 45 128 RO 123525 Β1
Ale Thr Ile Ser Ser GlY Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 1 50 55 60 3 Lys Gly Arg Fhe Thr 11« Ser Arg Asp Asm Ala Lys Aan Thr Leu Tvr 65 70 75 80 Leu Gin Met Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thx fila val Tyr Tyr Cys 5 85 so 95* Ala Arg Arg Gly Mp •Sfisy1 W W *» Met IJl9 'Pfo r Thr A*p Tyr 1 A gr Gly Gin Gly 7 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 9 115 11 <210> 60 <211> 119 <212> PRT 13 <213> construct sintetic 15 <40O> 60 17 Glu Val Met Leu Val <31 u Ser Sly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 19 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 21 Val Met Ser Trp val Arg Gin Thr Pro Glu lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 23 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 25 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Aşn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 SC 27 Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Aap Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 29 Ala Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110 31 Thr Leu Val 115 Thr Val Ser Ser 33 35 <210> 61 <211>119 <212> PRT 37 <213> construct sintetic 39 129 1 RO 123525 Β1 <400> 61 3 Gla 1 Val Met Le» Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly Zeu 10 Val Lys Pro Gly 15 Gly 5 Ser Leu Lys Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr 7 Val Met Ser 35 Trp Val Arg Gin Thr 40 Pro Glu Lys Arg Leu 45 Glu Trp Val 9 Ala Thr 50 Ile Ser Ser Gly Gly Ser 55 Tyr Thr Tyr Tyr 60 Pro Asp Ser Val 11 Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ala 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 13 Le» Gin Met Ser Ser 85 Leu Arg Ser Glu Asp Thr 90 Ala Met Tyr Tyr 95 Cys 15 Ala Arg Arg Gly 100 Asp Ser Met Ile Thr 105 Thr Asp Tyr Trp Gly Gin 110 Gly 17 Thr Thr Leu 115 Thr Val Ser Ser 19 <210> 62 <211> 80
21 <212> ADN <213> construct sintetic 23 C00> <:/. 60 80 tatctgcaaa tgagcagtct gagagcagag gacaeggctg tttattactg tgcaagaagg 25 ggtgactcta tgattacgac 27 <210> 63 29 <211 >80
<212> ADN 31 <213> construct sintetic 60 80 ββ <400> 63 ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgte ctetgetete agactgttca tttgeagata ββ cagggtgttc ttggcattgt 37 <210> 64 <211> 80
39 <212> ADN <213> construct sintetic 41 <400> 64 60 80 attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag actccagaga agaggotgga 43 gtgggttgca accattagta 130 RO 123525 Β1 <210> 65 1 <211> 80 <212> ADN 3 <213> construct sintetic <400> 65 5 tocagcctct tctctggagt ctgccgaacc caaqacatta cataactact gaaagtgaat 60 ceagaggci:g ca jya gag 80 ( <210> 66 9 <211> 80 <212> ADN 11 <213> construct sintetic <400> 66 tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtaa agcctggagg gtccctgaaa eo 13 ctctcctgtg cagcctctgg 80 15 <210> 67 17 <211> 80 <212> ADN 19 <213> construct sintetic <400> 67 tatctgcaaa tgagcagtct gagatctgag gacacggcta tgtattactg tgcaagaagg 60 21 ggtqaclcta tgatl'.acgac 80 23 <210> 68 25 <211> 64 <212> ADN 27 <213> construct sintetic <400> 68 ggactactgg ggccaaggga ccactctcac agtctcctca gcctccacca agggcccafcc 60 29 ggtc 64 31 <210> 69 33 <211> 80 <212> ADN 35 <213> construct sintetic <40Q> 69 37 tttcagggac cctccaggct ttactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga 60 gtggacacct gtagctgttg 80 39 <210> 70 41 <211> 80 <212> ADN 43 <213> construct sintetic 131 RO 123525 Β1 <40O> 70 ccttcttgca cagta.ata.ca tagecgtgtc ct.cagat.ctc agactgetea tttgcagata cagggtgt t c ttggcattgt.
<210> 71 <211> 70 <212> ADN <213> construct sintetic <400> 71 gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgaga gtggtccott ggccocagta gtccgtcgta
<210> 72 <211> 212 <212> PRT <213> construct sintetic <400> 72
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val W.â Trp Tyr Gin Gl.fi Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg :;is Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Phe iVl'Ui Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr 85 80 85 Phe 61y Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser val Phe Xle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Lys Ser Gly Thr 115 120 .25 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn ?he Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 - 4 0 Ve Sin Trp Lys Val Aap Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 14 150 155 160· Ser Val Thr Glu. Gjn .Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 1.90 Cys Glu Vai Thr Hls Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205
Asn Arg Gly Glu 210 132 RO 123525 Β1
<210> 73 <211 > 213 <212> PRT <213> construct sintetic <400> 73
Asp Ile 1 Val Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 Asp ârg Val Thr 20 Ile Thr Cys Lys Ala 25 Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala 30 Val Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Leu Leu Ile Tyr Trp 50 Ala Ser Thr Arg His 55 Thr Gly Val Fro Asp Arg Phe 60 Thr Gly Ser 65 Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Gin Pro 80 Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 90 Ser Ser Tyr Arg Thr 95 Phe Gly Gin Gly 100 Thr Lys Val Glu Ile 105 Lys Arg Thr Val Ala 110 Ala Pro Sex Val Phe 115 Ile Phe .Pro· Pro Ser 120 Asp Glu Gin Leu Lys 125 Ser Gly Thr Ala Ser 130 Val Val Cys Leu Leu I jh Asm Asn I?îl€î Tyr Pro 140 Arg Giîu Ala Lys val 145 Gin Trp .Lys Val Asp ISO Asn Ala Leu Gin Ser ·% CC 1^0 Gly Asn Ser Gin Glu 160 0 £& γ* ίΙμ3 Val Thr Glu Gin Asp 165 gor LVS %^>Ε3··Ι*ι· «hJ'V kSf Asp Ser 170 Thr Tyr Ser Leu Ser 175 Ser m i_ __ Leu Thr Leu ISO Cav» 0^5 *> Lys Ala Asp Tyr 185 Glu Lys His Lys Val Tyr 190 A1& Cys Glu Vel 195 Thr His Gin Gly Leu 200 Ser Ser Pro vai. Thr Lys 205 Ser Phe Asm Arg 210 Gly Gl'U fţJlQ
<210> 74 <211> 213 <212> PRT <213> construct sintetic <400> 74
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Sex Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 133 RO 123525 Β1
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala 20 9% 30 Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg iis Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thjr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp 1- he Thr jj©U; Thr Ile Ser ier Leu, Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin :yr Ser Ser Tyr Arg Thr 85 90 95 Fhe Gly Gin ;iy Thr Lys Val Glu ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Sar Val Phe Ί le Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gir» Leu Lys Ser Gly Thx 115 120 125 Ala 'Ci 'gQk Val Val Cys Leu Leu Mam Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 110 Val Gin Trp Lys Val Asp Asii Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gin .Asp Ser Lya Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lye Mie Lys val Tyr Klă 180 '185 • 190 Cy» Glu Val Thr ftis Sin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 ftsn Arg Gly Glu Cys 210
<210 75 <211 > 213 <212> PRT <213> construct sintetic <40Q> 75
Asp île Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr île Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 11« 35 40 45 134 RO 123525 Β1
Tyr Trp Ala Ser ifl-t·, ·ν* Jk X'Ji'jC·' 7K »·« Mie Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 1 50 55 60 3 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 6 5 70 75 00 5 Glu Asp Phe âXa Asp Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr rt C Î5 O 30 95 7 Phe Gly Gly Gly Thr Lyş "Val 0112 1 le Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 9 Ser Vai 'Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 11 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn ΊΖ1 es ψ% m\Să 11 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 X 35 140 13 Val Gin Trp Lys Val ÎtSp Asn Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu i 4 ς «L *s *·^ 150 15 5 160 15 Ser Val Thr Gltt Gin Asp Ser Lys Asp δθΙΓ Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 17 Thr Leu. Thr Leu 180 Ser Lys AIe Asp Tyr 185 Glu. Lys His Lys Val Tyr 190 Ala 19 Cys Glo Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ssjt Pro Val Thr Lys Ser Phe 1 ¢)5 mr 'W 200 205 21 Asn Arg Gly 210 Glu Cys 23 25 <210> 76 <211> 213 <212> PRT 27 <213> construct sintetic 29 31 <4C0> 76 33 Asp Ile Val Mat Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Als Ser Gl» Asp Val Gly Thr Ala 35 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 37 f". Jh 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 39 50 35 60 Ser Gly Ser GfI Thr Asp Phe Thr Leu Thr Xle Ser Asn val Gin Ser 41 65 70 75 00 135 1 RO 123525 Β1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23
Glu Âsp Leu Ala Asp 85 Tyr File Cys Gin Gin Tyr 90 Ser Ser Tyr Arg 95 Thr Phe <31 y <31 y Gly lob Thr lys leu. Glu Ile 105 Lys Arg Ala Val Ala 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile 115 J?he Pro Pro Ser 120 Asp Glu Gin Leu Lys 125 Ser Gly Thr Ala Ser 130 Val Val Cys leu Leu Asn 135 Asn Phe Tyr Pro· 140 7V ^ jnwuy Gin A7 ai 17 vL· 45ţ Lys Val 145 Sin Trp I*ys val Asp 150 Asii Ala heu Gin Ser 155 Gly Asn Şer Gin Glu 160 Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 165 Gly Thr Tyr 170 Ser Leu Ser 175 Ser Thr Leu Thr leu 180 Ser lys Ala Asp Tyr 185 Glu Lys His Lys Val Tyr 190 Cys Glu Val Thr 195 Bis Gin Gly Leu 200 Ser Ser Pro Val Thr 205 Lys Ser Phe Asn Arg 210 Gly Glu Cys
<210> 77 <211 >60 <212> ADN <213> construct sintetic «40G> 77 gtcccocaea gatgcagaoa aagaaettgg agattgggto atctgaatgt caccagtgga 60 27 <210> 78 29 <211 >65
<212> ADN 31 <213> construct sintetic 33 <400 78 atctagttet cagagatggs gacagacaca atcctgctat gggtgctgct gctctgggtt 60 35 ccagg 65 37 <210> 79 <211> 69
39 <212> ADN <213> construct sintetic 41 <400» 79 cagcacceat agcaggattg tgtctgtctc catctctgag aacfcagatga gaggatgctt 60 cttaagctt 69 136 43 RO 123525 Β1 <210 80 1 <211> 67 <212> ADN 3 <213> construct sintetic <400> 80 5
Ct CCâCtggt gâCâttgtga fcgâCCCââtC tOCââgttot ttgtOtgCat Cfc^tggggO^· 60 cagggtc 67 7 <210 81 9 <211> 54 <212> ADN 11 <213> construct sintetic <400> 81 13 acttggagat tgggtcatca caatgtcacc agtggagcct ggaacccaga gcag 54 15 <210> 82 <211 > 67 17
<212> ADN <213> construct sintetic 19 <4QQ> 82 accatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta ccaacagaaa 60 21 ccaggaa 67 23 <210> 83 <211> 72 25
<212> ADN <213> construct sintetic 27 <400> 83 29 tacagcagta cccacatcct gactggcctt gcaggtgatg gtgaccctgt cccccacaga 60 tgeagacaaa ga 72 ^ <210> 84 <211> 71 33
<212> ADN <213> construct sintetic 35 <4QQ> 84 37 aagcacccaa actcctcatc tattgggcat ccacceggca cactggggtc ccagataggt 60 ttacaggcag t 71 39 <210> 85 41 <211> 72 <212> ADN 43 <213> construct sintetic 137 RO 123525 Β1 1 <400> 85 cccagtgtgc cgggr.ggatg cccaatagat gaggagtttg ggtgcttttc ccggtttctg 60 ^ ttggtaccag gc 72 5 <210> 86
<211> 63 7 <212> ADN <213> construct sintetic 9 <400> 86 gggtetggga cagacttcae cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgeaaee 60 ^ tat _ 63 13 <210> 87 <211> 60
15 <212> ADN <213> construct sintetic 17 <400> 87 actagagatg gtgagggtga agtctgtccc agacccactg cctgtaaacc tatctgggac 60 19 21 <210> 88 <211> 57
23 <212> ADN <213> construct sintetic 25 <4Q0> 88 taetgteage satstagcag ctatcggacg ttcggtcaag gqaccaaggt ggaaatc ' 57 27 29 <210> 89 <211> 57
31 <212> ADN <213> construct sintetic 33 <400> 89 cgtccgatag ctgctatatt gctgacagta ataggttgca aaatcctccg gctgcac 57 35 37 <210> 90 <211> 51
39 <212> ADN <213> construct sintetic 41 43 <400> 90 aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga g 51 138 RO 123525 Β1 <210 91 <211> 63 1 <212> ADN 3 <213> construct sintetic 5 <400> 91 gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgccttgaec 60 7 gaa 63 9 <210 92 <211> 57 <212> ADN 11 <213> construct sintetic 13 <400> 92 ttetgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaato 57 15 <210> 93 17 <211> 57 <212> ADN 19 <213> construct sintetic 21 < 4 0 £» 93 cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataggttgca aaatcctccg getgeag 57 23 <210> 94 25 <211> 63 <212> ADN 27 <213> construct sintetic 29 <400> 94 gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcagat 60 31 tat 63 33 <210> 95 <211> 57 <212> ADN 35 <213> construct sintetic 37 <400> 95 ttetgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtggag gcaccaaggt ggaaato 57 39 41 <210 96 <211> 57 <212> ADN 43 <213> construct sintetic 45 139 RO 123525 Β1 <4GG> 96 cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataatctgca aaatcctccg gotgcag
<210> 97 <211> 51 <212> ADN <213> construct sintetic <400> 97 tgatgtggac atgaatttgt gagactgggt catcacaatg tcaccagtgg a
<210> 98 <211> 51 <212> ADN <213> construct sintetic <400> 98 tgggttceag gctccactgg tgacattgtg atgacccagt ctcacaaatt c
<210> 99 <211 >49 <212> AND <213> construct sintetic <40O> 99 aagacaqatq qtqcaqccac agcccgtttg atttccaqct tggtgcctc
<210> 100 <211> 45 <212> ADN <213> construct sintetic <A00> 100 aagctggaaa tcaaacgggc tgtggctgca ccatctgtct tcatc
<210> 101 <211> 30 <212> ADN <213> construct sintetic <4O0> 101 agatttcaac tgctcatcag atggcgggaa 140 RO 123525 Β1 <210> 102 1 <211> 63 <212> ADN 3 <213> construct sintetic 5 <400> 102 gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgcctccacc 60 7 gaa 63 9 141

Claims (19)

  1. RO 123525 Β1 Revendicări 1. Metodă in vitro de inducere selectivă a apoptozei în celulele ţintă care exprimă DR5, care cuprinde etapele de: a. contactare a celulelor ţintă cu o cantitate terapeutică dintr-un anticorp care se leagă în mod specific la un receptor DR5 TRAIL, în care anticorpul este un anticorp care are aceeaşi specificitate pentru epitop ca TRA-8 al hibridomului şoarece-şoarece, care are numărul de acces ATCC PTA-1428, în care anticorpul respectiv, în forma sa solubilă, are activitate de inducere a apoptozei in vivo şi in vitro, în celulele ţintă care exprimă DR5, şi b. contactarea celulelor ţintă cu o cantitate terapeutică dintr-un anticorp care se leagă în mod specific la un receptor DR4 TRAIL, în care anticorpul este un anticorp care are aceeaşi specificitate pentru epitop ca 2E12 al hibridomului şoarece-şoarece, care are numărul de acces ATCC PTA-3798, în care anticorpul respectiv, în forma sa solubilă, are o activitate de inducere a apoptozei in vivo şi in vitro, în celulele ţintă care exprimă DR4.
  2. 2. Metodă in vitro de inhibare a proliferării celulelor ţintă care exprimă DR5, care cuprinde etapele: a. contactarea celulelor ţintă cu o cantitate terapeutică dintr-un anticorp care se leagă în mod specific la un receptor DR5 TRAIL, în care anticorpul este un anticorp care are aceeaşi specificitate pentru epitop ca TRA-8 al hibridomului şoarece-şoarece, care are numărul de acces ATCC PTA-1428, în care anticorpul respectiv, în forma sa solubilă, are activitate de inducere a apoptozei in vivo şi in vitro, în celulele ţintă care exprimă DR5, şi b. contactarea celulelor ţintă cu o cantitate terapeutică dintr-un anticorp care se leagă în mod specific la un receptor DR4 TRAIL, în care anticorpul este un anticorp care are aceeaşi specificitate pentru epitop ca 2E12 al hibridomului şoarece-şoarece, care are numărul de acces ATCC PTA-3798, în care anticorpul respectiv, în forma sa solubilă, are o activitate de inducere a apoptozei in vivo şi in vitro, în celulele ţintă care exprimă DR4.
  3. 3. Compoziţie care cuprinde o combinaţie alcătuită din: a. o cantitate terapeutică dintr-un anticorp care se leagă, în mod specific, la un receptor DR5 TRAIL, în care anticorpul este un anticorp cu aceeaşi specificitate pentru epitop ca TRA-8 al hibridomului şoarece-şoarece, care are numărul de acces ATCC PTA-1428, în care anticorpul respectiv, în forma sa solubilă, are activitate de inducere a apoptozei in vivo şi in vitro, în celulele ţintă care exprimă DR5, Şi b. o cantitate terapeutică dintr- un anticorp care se leagă, în mod specific, la un receptor DR4 TRAIL, în care anticorpul este un anticorp care are aceeaşi specificitate pentru epitop ca 2E12 al hibridomului şoarece-şoarece, care are numărul de acces ATCC PTA-3798, în care anticorpul respectiv, în forma sa solubilă, are o activitate de inducere a apoptozei in vivo şi in vitro, în celulele ţintă care exprimă DR4.
  4. 4. Compoziţie conform revendicării 3, care cuprinde, în plus, unul sau mai mulţi agenţi terapeutici.
  5. 5. Compoziţie conform revendicării 4, în care agentul sau agenţii terapeutici sunt agenţi chimioterapeutici.
  6. 6. Compoziţie conform revendicării 4, în care agentul sau agenţii terapeutici sunt membrii ai familiei TNF.
  7. 7. Compoziţie conform revendicării 4, în care agentul sau agenţii terapeutici sunt agenţi antiinflamatori. 142 RO 123525 Β1
  8. 8. Compoziţie conform revendicării 4, în care agentul sau agenţii terapeutici sunt 1 produşi antivirali.
  9. 9. Compoziţie conform revendicării 4, în care agentul sau agenţii terapeutici sunt 3 produşi antiretrovirali.
  10. 10. Compoziţie conform revendicării 4, în care agentul sau agenţii terapeutici sunt 5 agenţi antioportunişti.
  11. 11. Compoziţie conform revendicării 4, în care agentul sau agenţii terapeutici sunt 7 antibiotice.
  12. 12. Compoziţie conform revendicării 4, în care agentul sau agenţii terapeutici sunt 9 agenţi imnunosupresori.
  13. 13. Compoziţie conform revendicării 4, în care agentul sau agenţii terapeutici sunt 11 imunoglobuline.
  14. 14. Compoziţie conform revendicării 4, în care agentul sau agenţii terapeutici sunt 13 agenţi antimalarici.
  15. 15. Compoziţie conform revendicării 4, în care agentul sau agenţii terapeutici sunt 15 medicamente antireumatice care modifică boala.
  16. 16. Compoziţie conform revendicării 4, în care agentul sau agenţii terapeutici sunt 17 citokine.
  17. 17. Compoziţie conform revendicării 4, în care agentul sau agenţii terapeutici sunt 19 chemokine.
  18. 18. Compoziţie conform revendicării 4, în care agentul sau agenţii terapeutici sunt 21 factori de creştere.
  19. 19. Compoziţie conform revendicării 4, care cuprinde, în plus, un purtător acceptabil 23 farmaceutic. 143
ROA200400390A 2001-11-01 2002-10-25 Metodă in vitro de inducere selectivă a apoptozei sau de inhibare a proliferării celulelor ţintă care exprimă dr5 şi compoziţie pentru inducerea selectivă a apoptozei cuprinzând o combinaţie de anticorpi RO123525B1 (ro)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34640201P 2001-11-01 2001-11-01
US39147802P 2002-06-24 2002-06-24
PCT/US2002/034420 WO2003038043A2 (en) 2001-11-01 2002-10-25 Combinations of dr5 antibody and other therapeutic agents

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RO123525B1 true RO123525B1 (ro) 2013-04-30

Family

ID=26994839

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ROA200400390A RO123525B1 (ro) 2001-11-01 2002-10-25 Metodă in vitro de inducere selectivă a apoptozei sau de inhibare a proliferării celulelor ţintă care exprimă dr5 şi compoziţie pentru inducerea selectivă a apoptozei cuprinzând o combinaţie de anticorpi

Country Status (21)

Country Link
EP (1) EP1506285B1 (ro)
JP (1) JP4663232B2 (ro)
KR (1) KR20040081422A (ro)
CN (1) CN100506277C (ro)
AT (1) ATE491019T1 (ro)
AU (1) AU2002360307B2 (ro)
BR (1) BRPI0213846B8 (ro)
CA (1) CA2465314C (ro)
CO (1) CO5650175A2 (ro)
DE (1) DE60238560D1 (ro)
HK (1) HK1068914A1 (ro)
HU (1) HU230378B1 (ro)
IL (2) IL161686A0 (ro)
MX (1) MXPA04004184A (ro)
NO (1) NO333828B1 (ro)
NZ (2) NZ568727A (ro)
PL (1) PL216750B1 (ro)
RO (1) RO123525B1 (ro)
RU (1) RU2313368C2 (ro)
WO (1) WO2003038043A2 (ro)
ZA (1) ZA200403573B (ro)

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6342369B1 (en) 1997-05-15 2002-01-29 Genentech, Inc. Apo-2-receptor
TWI318983B (en) 2000-05-02 2010-01-01 Uab Research Foundation An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof
AU2003222427B8 (en) 2000-11-17 2010-04-29 Vascular Biogenics Ltd. Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same
US8071740B2 (en) 2000-11-17 2011-12-06 Vascular Biogenics Ltd. Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same for regulation of angiogenesis
KR100932577B1 (ko) 2001-05-18 2009-12-17 기린 홀딩스 가부시키가이샤 항 ｔｒａｉｌ-ｒ 항체
IL159527A0 (en) 2001-07-03 2004-06-01 Genentech Inc Human dr4 antibodies and uses thereof
EP2223932A1 (en) 2001-10-19 2010-09-01 Vascular Biogenics Ltd. Polynucleotide constructs, pharmaceutical compositions and methods for targeted downregulation of angiogenesis and anticancer therapy
AU2008201431B2 (en) * 2002-11-27 2011-11-24 Irm, Llc Methods and compositions for inducing Apoptosis in cancer cells
AU2003297579A1 (en) * 2002-11-27 2004-06-23 Irm Llc Methods and compositions for inducing apoptosis in cancer cells
US20060228331A1 (en) 2003-10-10 2006-10-12 Novo Nordisk A/S IL-21 Derivatives and variants
MXPA06004199A (es) * 2003-10-17 2006-06-28 Novo Nordisk As Terapia en combinacion.
KR20070010046A (ko) * 2004-04-06 2007-01-19 제넨테크, 인크. Ｄｒ5 항체 및 그의 용도
BRPI0513665A (pt) 2004-08-06 2008-05-13 Genentech Inc método de previsão da sensibilidade, métodos de indução da apoptose, método de tratamento de disfunção em mamìferos, método de previsão da sensibilidade e método de tratamento de cáncer do cólon ou colo-retal em mamìferos
ATE508753T1 (de) 2004-08-06 2011-05-15 Genentech Inc Assays und verfahren unter verwendung von biomarkern
BRPI0515615A (pt) * 2004-09-08 2008-07-29 Genentech Inc métodos para tratar células cancerosas e doença imune relacionada
US20090175854A1 (en) * 2004-09-08 2009-07-09 Genentech, Inc. Methods of using death receptor ligands and CD20 antibodies
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
AU2011259844B2 (en) * 2005-02-02 2012-11-01 The Uab Research Foundation Agents and Methods Related to Reducing Resistance to Apoptosis- inducing Death Receptor Agonists
JP5562521B2 (ja) 2005-02-02 2014-07-30 ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション アポトーシス誘導デスレセプターアゴニストに対する抵抗性を低減することに関する薬剤及び方法
US8029783B2 (en) 2005-02-02 2011-10-04 Genentech, Inc. DR5 antibodies and articles of manufacture containing same
JP2006265155A (ja) * 2005-03-23 2006-10-05 Link Genomics Kk 癌の免疫療法
US8901281B2 (en) 2005-06-17 2014-12-02 Merck Sharp & Dohme Corp. ILT3 binding molecules and uses therefor
EP2306200A1 (en) 2005-08-16 2011-04-06 Genentech, Inc. Apoptosis sensitivity to Apo2L/TRAILl by testing for GalNac-T14 expression in cells/tissues
JP5597793B2 (ja) 2006-06-19 2014-10-01 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション Ｉｌｔ３結合分子およびその使用
ES2725023T3 (es) 2006-10-12 2019-09-18 Galera Labs Llc Métodos para el tratamiento de la mucositis oral
CN101157729B (zh) * 2007-10-23 2011-01-12 南京大学 一种肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体及其应用
US9120855B2 (en) 2010-02-10 2015-09-01 Novartis Ag Biologic compounds directed against death receptor 5
NZ610153A (en) 2010-10-29 2014-07-25 Daiichi Sankyo Co Ltd Novel anti-dr5 antibody
TR201808018T4 (tr) 2011-04-25 2018-06-21 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-B7-H3 antikoru.
CA2849456C (en) 2011-09-26 2021-12-07 Galera Therapeutics, Llc Methods for treatment of diseases
LT2907824T (lt) 2012-10-11 2018-06-11 Daiichi Sankyo Company, Limited Antikūno-vaisto konjugatas
ES2782248T3 (es) 2012-10-19 2020-09-11 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugado de anticuerpo y fármaco producido por la unión a través de un enlazador que tiene estructura hidrófila
CN104383520B (zh) * 2013-08-19 2016-09-07 江苏靶标生物医药研究所有限公司 一种抗肿瘤药物组合物
HUE042512T2 (hu) 2013-12-25 2019-07-29 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-trop2 antitest-gyógyszer konjugátum
HRP20211848T1 (hr) 2014-01-31 2022-03-04 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-her2 antitijelo-lijek konjugat
KR102239413B1 (ko) 2014-04-10 2021-04-12 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항her3 항체-약물 콘주게이트
CN107250161A (zh) 2015-01-26 2017-10-13 宏观基因有限公司 包含dr5‑结合结构域的多价分子
CN116059395A (zh) 2015-06-29 2023-05-05 第一三共株式会社 用于选择性制造抗体-药物缀合物的方法
DK3334744T3 (da) 2015-08-11 2020-07-27 Galera Labs Llc Makrocykliske pentaaza-ringkomplekser med oral biotilgængelighed
WO2017028279A1 (en) * 2015-08-19 2017-02-23 Beijing Cotimes Biotech Company Limited Trail receptor-binding agents and uses of same
IL288784B2 (en) 2015-09-24 2023-10-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Antibodies against GARP, nucleotides encoding them, and vectors, cells and preparations containing them, methods for their preparation and uses thereof
JP6797203B2 (ja) * 2015-12-17 2020-12-09 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー デスレセプターアゴニストによる全身性硬化症の改善
TW201828993A (zh) 2016-12-12 2018-08-16 日商第一三共股份有限公司 抗體－藥物結合物與免疫檢查點抑制劑之組合
US11680101B2 (en) 2017-01-27 2023-06-20 Kymab Limited Anti-OPG antibodies
US11246950B2 (en) 2017-04-13 2022-02-15 Galera Labs, Llc Combination cancer immunotherapy with pentaaza macrocyclic ring complex
CN108992671B (zh) * 2017-06-06 2021-02-12 深圳市中科艾深医药有限公司 一种药物组合物及其制备治疗肝损伤的药物中的用途
KR20200027944A (ko) 2017-06-07 2020-03-13 젠맵 비. 브이 돌연변이된 igg 육량체에 기초한 치료 항체
KR101951025B1 (ko) * 2017-08-17 2019-02-21 서울대학교산학협력단 세포사멸 수용체 저해제를 유효성분으로 포함하는 cx3cl1 케모카인 과발현으로 인한 질환 예방 또는 치료용 조성물
TW201919710A (zh) 2017-08-23 2019-06-01 日商第一三共股份有限公司 抗體－藥物結合物之製劑及其冷凍乾燥方法
AU2018327171B2 (en) 2017-08-31 2023-03-09 Daiichi Sankyo Company, Limited Improved method for producing antibody-drug conjugate
JP7248578B2 (ja) 2017-08-31 2023-03-29 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートの新規製造方法
WO2019065964A1 (ja) 2017-09-29 2019-04-04 第一三共株式会社 抗体－ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲート
CN109810193B (zh) * 2017-11-21 2020-11-03 深圳市中科艾深医药有限公司 抗dr5的抗体及其制备方法和应用
CN109810194B (zh) * 2017-11-21 2020-11-03 深圳市中科艾深医药有限公司 抗dr5的抗体及其制备方法和应用
JP7254818B2 (ja) 2018-09-06 2023-04-10 第一三共株式会社 新規環状ジヌクレオチド誘導体及びその抗体薬物コンジュゲート
AU2020246448A1 (en) 2019-03-25 2021-10-14 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-HER2 antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
JPWO2020196474A1 (ro) 2019-03-25 2020-10-01
CN113939318A (zh) 2019-05-29 2022-01-14 第一三共株式会社 抗体-药物缀合物的制剂
WO2021079958A1 (ja) 2019-10-25 2021-04-29 第一三共株式会社 抗ｇａｒｐ抗体と免疫調節剤の組み合わせ
JPWO2021177438A1 (ro) 2020-03-06 2021-09-10
JPWO2021200131A1 (ro) 2020-03-30 2021-10-07
CN117425501A (zh) 2021-01-13 2024-01-19 纪念斯隆凯特琳癌症中心 抗体-吡咯并苯二氮䓬衍生物缀合物
TW202241454A (zh) 2021-02-01 2022-11-01 日商第一三共股份有限公司 抗體－免疫賦活化劑共軛物之新穎製造方法
WO2024052684A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 MyricX Pharma Limited Antibody drug conjugate comprising nmt inhibitor and its use

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6812327B1 (en) * 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
EP1003864A1 (en) * 1997-08-15 2000-05-31 Idun Pharmaceuticals, Inc. Trail receptors, nucleic acids encoding the same, and methods of use thereof
EP1192185B1 (en) * 1999-06-09 2006-06-21 Genentech, Inc. Apo-2L RECEPTOR AGONIST AND CPT-11 SYNERGISM
US6294546B1 (en) * 1999-08-30 2001-09-25 The Broad Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Uses of diterpenoid triepoxides as an anti-proliferative agent
EP1226161A2 (en) * 1999-09-15 2002-07-31 Genentech, Inc. Apo-2 receptor antibodies
IL151853A0 (en) * 2000-04-11 2003-04-10 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses therefor
TWI318983B (en) * 2000-05-02 2010-01-01 Uab Research Foundation An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
HU230378B1 (hu) 2016-03-29
NZ533164A (en) 2008-09-26
DE60238560D1 (de) 2011-01-20
RU2004116476A (ru) 2005-03-27
CN1630516A (zh) 2005-06-22
PL216750B1 (pl) 2014-05-30
NO20042266L (no) 2004-07-23
BRPI0213846B8 (pt) 2021-05-25
KR20040081422A (ko) 2004-09-21
CO5650175A2 (es) 2006-06-30
NZ568727A (en) 2009-08-28
WO2003038043A3 (en) 2004-11-18
IL161686A (en) 2010-12-30
JP2005519871A (ja) 2005-07-07
BR0213846A (pt) 2006-11-21
HUP0600602A3 (en) 2012-09-28
NO333828B1 (no) 2013-09-23
EP1506285B1 (en) 2010-12-08
CA2465314A1 (en) 2003-05-08
EP1506285A4 (en) 2007-09-26
PL374061A1 (en) 2005-09-19
IL161686A0 (en) 2004-09-27
HUP0600602A2 (en) 2006-10-28
CA2465314C (en) 2013-12-10
RU2313368C2 (ru) 2007-12-27
EP1506285A2 (en) 2005-02-16
WO2003038043A2 (en) 2003-05-08
JP4663232B2 (ja) 2011-04-06
CN100506277C (zh) 2009-07-01
BRPI0213846B1 (pt) 2019-10-15
HK1068914A1 (en) 2005-05-06
ATE491019T1 (de) 2010-12-15
AU2002360307B2 (en) 2008-01-17
ZA200403573B (en) 2005-08-31
MXPA04004184A (es) 2005-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2465314C (en) Combinations of antibodies selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and other therapeutic agents
US7981421B2 (en) Combinations of antibodies selective for DR5 and other therapeutic agents
CA2465040C (en) An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof
US20030190687A1 (en) Antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof
AU2002360307A1 (en) Combinations of DR5 antibody and other therapeutic agents
US20090208483A1 (en) Antibody selective for dr4 and uses thereof
AU2002350121A1 (en) An antibody selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and uses thereof