CN117425501A - 抗体-吡咯并苯二氮䓬衍生物缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新型抗DLL3抗体‑吡咯并二氮杂衍生物和一种使用其的新型抗DLL3抗体‑吡咯并二氮杂

Description

抗体-吡咯并苯二氮䓬衍生物缀合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年1月13日提交的美国临时申请号63/136,928的优先权，将其公开内容通过引用以其整体特此并入。
序列表
本申请含有以ASCII格式电子提交并且通过引用以其整体特此并入的序列表。在2022年1月12日创建的所述ASCII副本命名为098065-0303_SL.txt并且大小为153,716字节。
技术领域
本发明涉及可用作抗肿瘤药物的抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物具有经由接头结构部分彼此缀合的能够靶向肿瘤细胞的抗体和吡咯并苯二氮衍生物。
背景技术
下文提供对本发明技术背景的说明仅仅是为了帮助理解本发明技术，并且不承认所述说明描述或构成针对本发明技术的现有技术。
抗体-药物缀合物(ADC)具有与结合癌细胞表面上表达的抗原的抗体缀合的具有细胞毒性活性的药物，并且能够通过结合发生抗原的细胞内化。ADC可以将药物有效递送至癌细胞，并且因此预期引起癌细胞内的药物积累并且杀伤细胞。
例如，ADC Adcetris(TM)(维布妥昔单抗(brentuximab vedotin))具有与抗CD30单克隆抗体缀合的一甲基澳瑞他汀E(monomethyl auristatin E)，已被批准作为用于霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤的治疗药物。Kadcyla(TM)(恩美曲妥珠单抗(trastuzumabemtansine))具有与抗HER2单克隆抗体缀合的恩美(emtansine)，用于治疗HER2阳性晚期和复发的乳腺癌。
用于ADC的有待缀合的药物的可用例子是吡咯并苯二氮(PBD)。PBD例如通过与DNA小沟中的PuGPu序列结合展现出细胞毒性。安曲霉素(一种天然存在的PBD)在1965年被首次发现，并且自从该发现以来已发现了多种天然存在的PBD及其PBD类似物(参见Mantaj等人,Angewandte Chemie,Internationl Edition 2016,55,2-29；Antonow.等人,Chemical Reviews,2010,111,2815-2864；In Antibiotics III.Springer Verlag,NewYork,第3-11页；以及Accounts of Chemical Research,1986,19,230)。
PBD的一般结构式由下式表示：
[式1]
已知的是A和C环部分中取代基的数量、类型和位点不同的PBD以及B和C环部分的不饱和度不同的那些。
已知PBD通过形成二聚体结构而具有大幅增强的细胞毒性(参见Journal of theAmerican Chemical Society,1992,114,4939；Journal of Organic Chemistry,1996,61,8141)，并且已报告了多种具有二聚体PBD的ADC(参见WO 2013/173496、WO 2014/130879、WO2017/004330、WO 2017/004025、WO 2017/020972、WO 2016/036804、WO 2015/095124、WO2015/052322、WO 2015/052534、WO 2016/115191、WO 2015/052321、WO 2015/031693、WO2011/130613和WO 2019/065964)。
二聚体结构PBD用于一些已知的ADC。例如，报告了这样的ADC，其中二聚体结构PBD与靶向DLL3的抗体缀合(参见WO 2013/126746和Saunders等人,Sci TranslationalMedicine 7(302):302ra136(2015))。
DLL3(即，δ样配体3或δ样蛋白3)是单跨越I型跨膜蛋白，并且是Notch配体之一(参见Owen等人J Hematol Oncol 12,61(2019))。DLL3在高级别肺神经内分泌肿瘤(包括SCLC和LCNEC)中选择性表达。在SCLC和LCNEC患者源性异种移植肿瘤中观察到DLL3的表达增加，并且在原发性肿瘤中也得到证实。参见Saunders等人,Sci Translational Medicine 7(302):302ra136(2015)。在肺外神经内分泌癌(包括前列腺神经内分泌癌)中也观察到DLL3的表达增加(Puca等人,Sci Transl Med 11(484):pii:eaav0891(2019))。虽然DLL3在此类肿瘤细胞的表面上表达，但其在成人正常组织中的表达受到限制。
已知含有抗DLL3抗体作为活性成分的多种药物组合物。参见Giffin等人,ClinCancer Res 2021；27:1526-37，WO 2011/093097和WO 2013/126746。但是迄今为止，没有靶向DLL3的药物被批准用作药学药剂。
本领域中需要用于治疗多种类型的癌症的高效且有效的靶向治疗剂(诸如ADC)。本申请满足了该需求并且包括利用PBD的ADC。
发明内容
通过本发明有待解决的问题：本发明提供了一种新型抗DLL-3抗体-吡咯并苯二氮(PBD)衍生物缀合物。另外，本发明提供了一种含有所述抗DLL-3抗体-PBD衍生物缀合物的药物组合物。此外，本发明提供了一种用于通过使用所述抗DLL3抗体-PBD衍生物缀合物抗治疗癌症的方法。
解决问题的手段：本发明诸位发明人勤奋调查发现，新型抗DLL-3抗体-吡咯并苯二氮(PBD)衍生物缀合物具有出乎意料强的抗肿瘤活性，从而完成了本发明。本发明包括以下方面和本发明的实施方案：
[1]在一方面，本公开文本提供了一种由下式表示的抗体-药物缀合物：
其中
m1表示1至2的整数；
D表示由下式之一表示的药物：
其中星号表示与L键合；
L是连接Ab的N297聚糖与D的接头；
N297聚糖是任选地经改造的；
Ab表示与DLL-3特异性结合的抗DLL3抗体。
[2]在根据[1]的一些实施方案中，所述抗DLL3抗体包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中(a)所述VH包含选自以下的VH-CDR1序列、VH-CDR2序列和VH-CDR3序列：
(i)分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；
(ii)分别为SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15；
(iii)分别为SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；以及
(iv)分别为SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35；和/或
(b)所述VL包含选自以下的VL-CDR1序列、VL-CDR2序列和VL-CDR3序列：
(i)分别为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；
(ii)分别为SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；
(iii)分别为SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；以及
(iv)分别为SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。
[3]在根据[1]或[2]的一些实施方案中，所述抗DLL3抗体包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中(a)包含VH-CDR1序列、VH-CDR2序列和VH-CDR3序列的所述VH与(b)包含VL-CDR1序列、VL-CDR2序列和VL-CDR3序列的所述VL的组合选自：
(i)分别为(a)SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5与(b)SEQ ID NO:8、SEQID NO:9和SEQ ID NO:10；
(ii)分别为(a)SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15与(b)SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；
(iii)分别为(a)SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25与(b)SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；以及
(iv)分别为(a)SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35与(b)SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。
[4]在根据[1]或[2]的一些实施方案中，所述抗DLL3抗体包含以下特征中的一个或多个：
(a)与SEQ ID NO:7、17、27、37、62、66或70中的任一个中存在的轻链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的轻链免疫球蛋白可变结构域序列；和/或
(b)与SEQ ID NO:2、12、22、32、59、60、61、63、64、65、67、68或69中的任一个中存在的重链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的重链免疫球蛋白可变结构域序列。
[5]在根据[1]-[4]中任一项的一些实施方案中，所述抗DLL3抗体包含以下特征中的一个或多个：
(a)与SEQ ID NO:17、27或37中的任一个中存在的轻链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的轻链免疫球蛋白可变结构域序列；和
(b)与SEQ ID NO:12、22或32中的任一个中存在的重链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的重链免疫球蛋白可变结构域序列。
[6]在根据[1]-[5]中任一项的一些实施方案中，所述抗DLL3抗体包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中：(a)所述VH包含选自SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:32的氨基酸序列；和/或(b)所述VL包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
[7]在根据[1]-[6]中任一项的一些实施方案中，所述抗DLL3抗体包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中：(a)所述VH包含选自SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:32的氨基酸序列，并且(b)所述VL包含选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
[8]在根据[6]的一些实施方案中，所述VH氨基酸序列和所述VL氨基酸序列选自：分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:7(7-I1-B)；分别为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:17(2-C8-A)；分别为SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:27(10-O18-A)；以及分别为SEQ ID NO:32和SEQ IDNO:37(6-G23-F)。
[9]在根据[1]-[8]中任一项的一些实施方案中，在所述抗DLL3抗体与细胞表面(例如，肿瘤细胞表面)上表达的DLL3多肽结合时，所述抗体-药物缀合物经历细胞内内化。
[10]在根据[1]-[9]中任一项的一些实施方案中，所述抗DLL3包含选自IgG1或其变体、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE的同种型的Fc结构域。
[11]在根据[1]-[10]中任一项的一些实施方案中，所述抗DLL3包含SEQ ID NO:42、57或58的重链恒定区。
[12]在根据[1]-[11]中任一项的一些实施方案中，所述抗DLL3抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或双特异性抗体。
[13]在根据[1]-[12]中任一项的一些实施方案中，所述抗体包含：
(a)含有SEQ ID NO:59至61中的任一个的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:62中的任一个的氨基酸序列的轻链；
(b)含有SEQ ID NO:63至65中的任一个的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:66中的任一个的氨基酸序列的轻链；和/或
(c)含有SEQ ID NO:67至69中的任一个的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:70中的任一个的氨基酸序列的轻链。
[14]在根据[1]-[13]中任一项的一些实施方案中，所述抗体包含：
(a)含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链；
(b)含有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链；或
(c)含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链。
[15]在根据权利要求1的一些实施方案中，所述抗DLL-3抗体与根据权利要求9或权利要求V的抗体竞争与DLL-3的结合。
[16]在根据[1]-[15]中任一项的一些实施方案中，所述抗DLL3抗体与DLL3上的表位结合，所述表位是构象表位或非构象表位。
[17]在根据[1]-[16]中任一项的一些实施方案中，所述抗DLL3抗体与哺乳动物DLL3多肽结合，所述哺乳动物DLL3多肽具有包含SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51的氨基酸残基27-492的氨基酸序列。
[18]在根据[1]-[17]中任一项的一些实施方案中，所述抗体的重链或轻链具有选自以下的一个或两个或更多个修饰或氨基酸残基集：N-连接的糖基化、O-连接的糖基化、N末端加工、C末端加工、脱酰胺、天冬氨酸的异构化、甲硫氨酸的氧化、添加甲硫氨酸残基到N末端、脯氨酸残基的酰胺化、在所述重链的234和235(EU编号)位置处两个亮氨酸(L)残基被取代为丙氨酸(A)(LALA)、所述重链的356位置处的Glu(E)和358(EU编号)位置处的Met(M)的氨基酸残基集、所述重链的356位置处的Asp(D)和358(EU编号)位置处的亮氨酸(L)的氨基酸残基集或其任何组合、N末端谷氨酰胺或N末端谷氨酸转化为焦谷氨酸、以及从羧基末端缺失一个或两个氨基酸。
[19]在根据[18]的一些实施方案中，从其重链的羧基末端缺失一个或两个氨基酸。
[20]在根据[19]的一些实施方案中，从其两条重链的每个羧基末端缺失一个氨基酸。
[21]在根据[18]-[20]中任一项的一些实施方案中，其重链的羧基末端的脯氨酸残基被进一步酰胺化。
[22]在根据[1]-[21]中任一项的一些实施方案中，所述抗DLL3抗体包含经调节以便增强抗体依赖性细胞毒性活性的糖链修饰。
[23]在根据[1]-[22]中任一项的一些实施方案中，D是：
[24]在根据[1]-[22]中任一项的一些实施方案中，D是：
[25]在根据[1]-[22]中任一项的一些实施方案中，D是：
[26]在根据[1]-[22]中任一项的一些实施方案中，D是：
[27]在根据[23]-[26]中任一项的一些实施方案中，-OH在11’位置处。
[28]在根据[1]-[27]中任一项的一些实施方案中，
L由-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C＝O)-*表示，星号表示与D键合；
B表示苯基或杂芳基；
Lp表示由在靶细胞中可切割的氨基酸序列组成的接头；
La表示选自以下的任一个：
-C(＝O)-(CH2CH2)n2-C(＝O)-、
-C(＝O)-(CH2CH2)n2-C(＝O)-NH-(CH2CH2)n3-C(＝O)-、
-C(＝O)-(CH2CH2)n2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(＝O)-、
-C(＝O)-(CH2CH2)n2-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)n3-CH2CH2-C(＝O)-和
-(CH2)n4-O-C(＝O)-；
n2表示1至3的整数，n3表示1至5的整数，并且n4表示0至2的整数；并且Lb表示将La与Ab的聚糖或改造聚糖键合的间隔子。
[29]在根据[28]的一些实施方案中，B是选自以下的任一个：1,4-苯基、2,5-吡啶基、3,6-吡啶基、2,5-嘧啶基和2,5-噻吩基。
[30]在根据[29]的一些实施方案中，B是1,4-苯基。
[31]在根据[28]-[30]中任一项的一些实施方案中，Lp是由二至七个氨基酸构成的氨基酸残基。
[32]在根据[28]-[31]中任一项的一些实施方案中，Lp是由选自以下的氨基酸组成的氨基酸残基：甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、瓜氨酸、亮氨酸、丝氨酸、赖氨酸和天冬氨酸。
[33]在根据[28]-[32]中任一项的一些实施方案中，Lp选自下组：-GGVA-(SEQ IDNO:85)、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-(SEQ ID NO:86)、-GGPI-(SEQ ID NO:87)、-GGVCit-(SEQ ID NO:88)、-GGVK-(SEQ ID NO:89)、-GG(D-)PI-和-GGPL-(SEQ ID NO:90)。
[34]在根据[28]-[33]中任一项的一些实施方案中，La选自下组：
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-、-C(＝O)-(CH2CH2)2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2)2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(＝O)-、
-CH2-OC(＝O)-和-OC(＝O)-。
[35]在根据[28]-[34]中任一项的一些实施方案中，Lb由下式表示：
其中，在以上示出的Lb的每个结构式中，
每个星号表示与La键合，并且每条波浪线表示与Ab的聚糖或改造聚糖键合。
[36]在根据[28]-[35]中任一项的一些实施方案中，
L由-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C＝O)-*表示，其中
B是1,4-苯基；
Lp表示选自下组的任一个：-GGVA-(SEQ ID NO:85)、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-(SEQ ID NO:86)、-GGPI-(SEQ ID NO:87)、-GGVCit-(SEQ ID NO:88)、-GGVK-(SEQ ID NO:89)和-GGPL-(SEQ ID NO:90)；
La表示选自下组的任一个：
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-、-C(＝O)-(CH2CH2)2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2)2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(＝O)-、
-CH2-OC(＝O)-和-OC(＝O)-；并且
Lb由下式表示：
其中，在以上示出的Lb的每个结构式中，
每个星号表示与La键合，并且每条波浪线表示与Ab的聚糖或改造聚糖键合。
[37]在根据[28]-[36]中任一项的一些实施方案中，
L选自下组：
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-(CH2CH2)2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:87所公开的“GGPI”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:86所公开的“GGFG”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:88所公开的“GGVCit”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:89所公开的“GGVK”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:90所公开的“GGPL”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2)2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z2-OC(＝O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)以及
-Z3-CH2-OC(＝O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)，其中
Z1表示以下结构式：
Z2表示以下结构式：
并且
Z3表示以下结构式：
其中，在Z1、Z2和Z3的每个结构式中，
每个星号表示与La键合，每条波浪线表示与Ab的聚糖或改造聚糖键合；并且
B表示1,4-苯基。
[38]在根据[37]的一些实施方案中，
L选自下组：
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-(CH2CH2)2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(＝O)-、-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2)2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:88所公开的“GGVCit”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-和
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-，其中
B是1,4-苯基，并且Z1表示以下结构式：
其中，在Z1的结构式中，
每个星号表示与邻接Z1的C(＝O)键合，并且每条波浪线表示与Ab的聚糖或改造聚糖键合。
[39]在根据[1]-[38]中任一项的一些实施方案中，
L由-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C＝O)-*表示，其中
星号表示与D键合；
B表示1,4-苯基；
Lp表示-GGVA-(SEQ ID NO:85)或-VA；
La表示-(CH2)n9-C(＝O)-或-(CH2CH2)n10-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)n11-CH2CH2-C(＝O)-，其中n9表示2至7的整数，n10表示1至3的整数，并且n11表示6至10的整数；并且Lb是-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-。
[40]在根据[39]的一些实施方案中，
L表示选自下组的任一个：
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH2)5-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH2)5-C(＝O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(＝O)-)-(如SEQ IDNO:85所公开的“GGVA”)和
-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-，其中B是1,4-苯基。
[41]在根据[1]-[40]中任一项的一些实施方案中，所述抗体是IgG。
[42]在根据[41]的一些实施方案中，所述抗体是IgG1或其变体、IgG2或IgG4。
[43]在根据[1]-[42]中任一项的一些实施方案中，所述抗体与肿瘤细胞结合，并且被掺入且内化在肿瘤细胞中。
[44]在根据[43]的一些实施方案中，所述抗体进一步具有抗肿瘤作用。
[45]在根据[1]-[44]中任一项的一些实施方案中，所述N297聚糖是改造聚糖。
[46]在根据[45]的一些实施方案中，所述N297聚糖是N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或其混合物，或者N297-(Fuc)SG，其中N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2和N297-(Fuc)SG具有由下式表示的结构：
其中
波浪线表示与所述抗体的Asn297键合；
L(PEG)表示-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-，其中在右端的氨基经由酰胺键与所述N297聚糖中的β-Man的1-3支链的非还原末端的唾液酸的2位置处的羧酸结合；
星号表示与接头L键合；并且
n5表示2至10的整数，
其中
波浪线表示与所述抗体的Asn297键合；
L(PEG)表示-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-，其中在右端的氨基经由酰胺键与所述N297聚糖中的β-Man的1-6支链的非还原末端的唾液酸的2位置处的羧酸结合；
星号表示与接头L键合；并且
n5表示2至10的整数，并且
其中
波浪线表示与所述抗体的Asn297键合；
L(PEG)表示-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-，其中在右端的氨基经由酰胺键与所述N297聚糖中的β-Man的1-3和1-6支链中的每一条的非还原末端的唾液酸的2位置处的羧酸结合；
星号表示与接头L键合；并且
n5表示2至10的整数。
[47]在根据[46]的一些实施方案中，n5是2至5的整数。
[48]在根据[1]-[47]中任一项的一些实施方案中，
m2表示1或2的整数；
L选自下组：
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-(CH2CH2)2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:88所公开的“GGVCit”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2)2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-和-Z1-C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-，其中B是1,4-苯基，并且Z1表示以下结构式：
其中，在Z1的结构式中，
每个星号表示与邻接Z1的C(＝O)键合，并且每条波浪线表示与Ab的所述N297聚糖键合；
Ab表示IgG抗体；
Ab的所述N297聚糖表示N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2及其混合物和N297-(Fuc)SG中的任一个，其中N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2和N297-(Fuc)SG具有由下式表示的结构：
其中
每条波浪线表示与所述抗体的Asn297键合；
所述N297聚糖中的L(PEG)表示-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)n5-*，其中
n5表示2至5的整数，在左端的氨基经由酰胺键与所述N297聚糖中的β-Man的1-3和1-6支链中的每一条或任一条的非还原末端的唾液酸的2位置处的羧酸结合，并且每个星号表示与接头L中的Z1的三唑环的1或3位置处的氮原子键合。
[49]在另一方面，本公开文本提供了一种选自下组的抗体-药物缀合物：
/>
/>
其中，在以上示出的每个结构式中，
m2表示1或2的整数；
Ab表示抗DLL3 IgG抗体或所述抗体的功能片段；
Ab的所述N297聚糖表示N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2及其混合物和N297-(Fuc)SG中的任一个，其中N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2和N297-(Fuc)SG具有由下式表示的结构：
其中
每条波浪线表示与所述抗体的Asn297键合；
所述N297聚糖中的L(PEG)表示-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*，其中
在左端的氨基经由酰胺键与所述N297聚糖中的β-Man的1-3和1-6支链中的每一条或任一条的非还原末端的唾液酸的2位置处的羧酸结合，并且每个星号表示与对应结构式中的三唑环的1或3位置处的氮原子键合。
[50]在根据[49]的一些实施方案中，所述抗体包含人IgG1或其变体、人IgG2或人IgG4的重链恒定区。
[51]在根据[49]的一些实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:42、57或58的重链恒定区。
[52]在根据[48]-[51]中任一项的一些实施方案中，所述抗DLL3抗体包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中(a)所述VH包含选自以下的VH-CDR1序列、VH-CDR2序列和VH-CDR3序列：
(i)分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；
(ii)分别为SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15；
(iii)分别为SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；以及
(iv)分别为SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35；和/或
(b)所述VL包含选自以下的VL-CDR1序列、VL-CDR2序列和VL-CDR3序列：
(i)分别为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；
(ii)分别为SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；
(iii)分别为SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；以及
(iv)分别为SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。
[53]在根据[52]的一些实施方案中，所述抗DLL3抗体包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中(a)包含VH-CDR1序列、VH-CDR2序列和VH-CDR3序列的所述VH与(b)包含VL-CDR1序列、VL-CDR2序列和VL-CDR3序列的所述VL的组合选自：
(i)分别为(a)SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5与(b)SEQ ID NO:8、SEQID NO:9和SEQ ID NO:10；
(ii)分别为(a)SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15与(b)SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；
(iii)分别为(a)SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25与(b)SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；以及
(iv)分别为(a)SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35与(b)SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。
[54]在根据[49]-[53]中任一项的一些实施方案中，所述抗体是包含以选自以下组合(1)至(4)的任一个组合的轻链与重链的抗体或所述抗体的功能片段：
(1)包含SEQ ID NO:7的可变结构域序列的轻链和包含SEQ ID NO:2的可变结构域序列的重链，
(2)包含SEQ ID NO:17的可变结构域序列的轻链和包含SEQ ID NO:12的可变结构域序列的重链，
(3)包含SEQ ID NO:27的可变结构域序列的轻链和包含SEQ ID NO:22的可变结构域序列的重链，以及
(4)包含SEQ ID NO:37的可变结构域序列的轻链和包含SEQ ID NO:32的可变结构域序列的重链。
[55]在根据[54]的一些实施方案中，所述抗体是包含含有SEQ ID NO:17的可变结构域序列的轻链和含有SEQ ID NO:12的可变结构域序列的重链的抗体。
[56]在根据[54]的一些实施方案中，所述抗体是包含含有SEQ ID NO:27的可变结构域序列的轻链和含有SEQ ID NO:22的可变结构域序列的重链的抗体。
[57]在根据[54]的一些实施方案中，所述抗体是包含含有SEQ ID NO:37的可变结构域序列的轻链和含有SEQ ID NO:32的可变结构域序列的重链的抗体。
[58]在根据[54]的一些实施方案中，其中所述抗体是包含含有SEQ ID NO:7的可变结构域序列的轻链和含有SEQ ID NO:2的可变结构域序列的重链的抗体。
[59]在根据[49]-[58]中任一项的一些实施方案中，所述抗体包含：
(a)含有SEQ ID NO:59至61中的任一个的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链；
(b)含有SEQ ID NO:63至65中的任一个的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链；或
(c)含有SEQ ID NO:67至69中的任一个的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链。
[60]在根据[49]-[59]中任一项的一些实施方案中，所述抗体包含：
(a)含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链；
(b)含有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链；或
(c)含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链。
[61]在根据[49]-[60]中任一项的一些实施方案中，所述重链或所述轻链具有选自以下的一个或两个或更多个修饰或氨基酸残基集：N-连接的糖基化、O-连接的糖基化、N末端加工、C末端加工、脱酰胺、天冬氨酸的异构化、甲硫氨酸的氧化、添加甲硫氨酸残基到N末端、脯氨酸残基的酰胺化、在所述重链的234和235(根据EU索引)位置处两个亮氨酸(L)残基被取代为丙氨酸(A)(LALA)、所述重链的356位置处的Glu(E)和358(根据EU索引)位置处的Met(M)的氨基酸残基集、所述重链的356位置处的Asp(D)和358(根据EU索引)位置处的亮氨酸(L)的氨基酸残基集或其任何组合、N末端谷氨酰胺或N末端谷氨酸转化为焦谷氨酸、以及从羧基末端缺失一个或两个氨基酸。
[62]在另一方面，本公开文本提供了一种由下式表示的抗体-药物缀合物：
其中，
m2表示1或2的整数；
Ab表示抗DLL3 IgG抗体，所述抗DLL3 IgG抗体包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链；
Ab的所述N297聚糖表示N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2及其混合物和N297-(Fuc)SG中的任一个，其中N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2和N297-(Fuc)SG具有由下式表示的结构：
其中
每条波浪线表示与所述抗体的Asn297键合；
所述N297聚糖中的L(PEG)表示-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*，其中
在左端的氨基经由酰胺键与所述N297聚糖中的β-Man的1-3和1-6支链中的每一条或任一条的非还原末端的唾液酸的2位置处的羧酸结合，并且每个星号表示与对应结构式中的三唑环的1或3位置处的氮原子键合。
[63]在另一方面，本公开文本提供了一种由下式表示的抗体-药物缀合物：
其中，
m2表示1或2的整数；
Ab表示抗DLL3 IgG抗体，所述抗DLL3 IgG抗体包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链；
Ab的所述N297聚糖表示N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2及其混合物和N297-(Fuc)SG中的任一个，其中N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2和N297-(Fuc)SG具有由下式表示的结构：
其中
每条波浪线表示与所述抗体的Asn297键合；
所述N297聚糖中的L(PEG)表示-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*，其中
在左端的氨基经由酰胺键与所述N297聚糖中的β-Man的1-3和1-6支链中的每一条或任一条的非还原末端的唾液酸的2位置处的羧酸结合，并且每个星号表示与对应结构式中的三唑环的1或3位置处的氮原子键合。
[64]在另一方面，本公开文本提供了一种由下式表示的抗体-药物缀合物：
其中，
m2表示1或2的整数；
Ab表示抗DLL3 IgG抗体，所述抗DLL3 IgG抗体包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链；
Ab的所述N297聚糖表示N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2及其混合物和N297-(Fuc)SG中的任一个，其中N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2和N297-(Fuc)SG具有由下式表示的结构：
其中
每条波浪线表示与所述抗体的Asn297键合；
所述N297聚糖中的L(PEG)表示-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*，其中
在左端的氨基经由酰胺键与所述N297聚糖中的β-Man的1-3和1-6支链中的每一条或任一条的非还原末端的唾液酸的2位置处的羧酸结合，并且每个星号表示与对应结构式中的三唑环的1或3位置处的氮原子键合。
[65]在另一方面，本公开文本提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含根据[1]-[64]中任一项所述的抗体-药物缀合物、其盐、或所述缀合物或所述盐的水合物。
[66]在根据[65]的一些实施方案中，所述药物组合物是抗肿瘤药物。
[67]在根据[65]或[66]的一些实施方案中，所述药物组合物用于治疗肿瘤，其中所述肿瘤是表达DLL3的肿瘤。
[68]在根据[66]或[67]的一些实施方案中，所述肿瘤是小细胞肺癌(SCLC)；大细胞神经内分泌癌(LCNEC)；包括肾脏、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、宫颈和子宫内膜)、胃肠道(胃、结肠)、甲状腺(甲状腺髓样癌)、胰腺和肺在内的多种组织的神经内分泌肿瘤；神经胶质瘤或假性神经内分泌肿瘤(pNET)。
[69]在另一方面，本公开文本提供了一种用于产生聚糖经改造的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
i)培养包含编码抗DLL3抗体的核酸的宿主细胞并且从获得的培养物中收集靶抗体；
ii)用水解酶处理步骤i)中获得的抗体以产生(Fucα1,6)GlcNAc-抗体；以及iii)-1使聚糖供体分子与所述(Fucα1,6)GlcNAc-抗体在转糖苷酶的存在下反应，所述聚糖供体分子通过以下方式获得：将具有叠氮基团的PEG接头引入MSG(9)或SG(10)中的唾液酸的2位置处的羧酸的羰基并且将还原末端噁唑啉化，或
iii)-2使所述(Fucα1,6)GlcNAc-抗体与聚糖供体分子在转糖苷酶的存在下反应，所述聚糖供体分子通过以下方式获得：将具有叠氮基团的PEG接头引入具有任选地受保护的α-氨基的(MSG-)Asn或(SG-)Asn中的唾液酸的2位置处的羧酸的羰基以及引入所述Asn中的羧酸的羰基，引起水解酶的作用，然后将还原末端噁唑啉化。
[70]在根据[69]的一些实施方案中，所述方法进一步包括通过用羟基磷灰石柱纯化步骤ii)中的反应溶液来纯化所述(Fucα1,6)GlcNAc-抗体的步骤。
[71]在另一方面，本公开文本提供了一种用于产生根据[1]-[64]中任一项所述的抗体-药物缀合物形式的方法，所述方法包括以下步骤：
i)通过使用根据[69]或[70]所述的方法产生聚糖经改造的抗体；以及ii)使具有DBCO的药物-接头与步骤i)中制备的聚糖经改造的抗体的聚糖中的叠氮基团反应。
[72]在另一方面，本公开文本提供了一种通过使用根据[69]或[70]所述的方法获得的聚糖经改造的抗体。
[73]在另一方面，本公开文本提供了一种通过使用根据[71]所述的方法获得的抗体-药物缀合物。
[74]在另一方面，本公开文本提供了一种用于治疗肿瘤的方法，所述方法包括向患有肿瘤的个体施用根据[1]-[64]中任一项所述的抗体-药物缀合物、所述抗体-药物缀合物的盐、或所述抗体-药物缀合物或所述盐的水合物。
[75]在另一方面，本公开文本提供了一种用于治疗肿瘤的方法，所述方法包括向个体同时、单独或连续地施用药物组合物和至少一种抗肿瘤药物，所述药物组合物包含选自根据[1]-[64]中任一项所述的抗体-药物缀合物、其盐和所述缀合物或所述盐的水合物的至少一种组分。
[76]在根据[74]或[75]的一些实施方案中，所述肿瘤是表达DLL3的肿瘤。
[77]在根据[74]-[76]中任一项的一些实施方案中，所述肿瘤是小细胞肺癌(SCLC)；大细胞神经内分泌癌(LCNEC)；包括肾脏、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、宫颈和子宫内膜)、胃肠道(胃、结肠)、甲状腺(甲状腺髓样癌)、胰腺和肺在内的多种组织的神经内分泌肿瘤；神经胶质瘤或假性神经内分泌肿瘤(pNET)。
本发明的有利效果：由本发明提供的新型抗DLL-3抗体-吡咯并苯二氮(PBD)衍生物缀合物在抗肿瘤活性和安全性方面优越，并且因此可用作抗肿瘤剂。
附图说明
图1(Fig.1)是本发明的药物缀合物形式((I)的分子)的示意图。(a)指示药物D，(b)指示接头L，(c)指示N3-L(PEG)-，并且(d)指示N297聚糖(空心椭圆形：NeuAc(Sia)，空心六边形：Man，实心六边形：GlcNAc，空心菱形：Gal，空心倒三角形：Fuc)。通过(c)的叠氮基团(实心泪滴形状)与(b)的间隔子(空心半圆形)之间的反应，(b)和(c)组合在一起以形成三唑环。Y形图形表示抗体Ab。为了方便起见，在该示意图中，将N297聚糖指示为N297-(Fuc)MSG，并且该图示出了这样的实施方案，其中每个N297聚糖中的两条支链中的任一条具有与具有叠氮基团的PEG接头(N3-L(PEG)-)键合的唾液酸，而另一条支链在非还原末端没有唾液酸(即，N297-(Fuc)MSG)；然而，还可接受另一个实施方案，其中N297聚糖的两条支链中的每条在非还原末端具有与具有叠氮基团的PEG接头键合的唾液酸(即，N297-(Fuc)SG)。除非另有说明，否则在整个本说明书中皆应用此类说明方式。
图2(Fig.2)是展示了(Fucα1,6)GlcNAc-抗体(图2的(II)中A的分子)(其是本发明药物缀合物形式的生产中间体)和MSG型的聚糖经改造的抗体(图2的B中的(III)的分子)的结构的示意图。在每个示意图中，Y形图表示如图1中的抗体Ab。在图2中的A中，(e)指示仅由GlcNAc组成的N297聚糖，所述GlcNAc在6位置处经由α糖苷键与Fuc的1位置连接。在图2中的B中，(d)指示与图1中相同的N297聚糖，并且(f)指示PEG接头部分的结构，所述PEG接头部分具有叠氮基团，具体是在末端有待与接头L键合的叠氮基团。具有叠氮基团的PEG接头的键合方式如对图1所描述。
图3(Fig.3)是由动物细胞中产生的抗体产生MSG型的聚糖经改造的抗体的步骤的示意图。如图2中，该图中的分子(II)和(III)分别表示(Fucα1,6)GlcNAc-抗体和MSG型的聚糖经改造的抗体。分子(IV)是动物细胞中产生的抗体，并且是具有异质N297聚糖部分的分子的混合物。图3A展示了通过用诸如EndoS的水解酶处理(IV)的异质N297聚糖部分而产生同质(Fucα1,6)GlcNAc-抗体(II)的步骤。图3B展示了通过使抗体(II)中的N297聚糖的GlcNAc经受诸如EndoSD233Q/Q303L变体的转糖苷酶以使MSG型聚糖供体分子的聚糖发生转糖基化来产生(III)的MSG型的聚糖经改造的抗体的步骤。此处使用的MSG型聚糖供体分子在用具有叠氮基团的PEG接头修饰的MSG的非还原末端具有唾液酸。因此，所得的MSG型的N297聚糖经改造的抗体在以如图2B所描述的相同方式修饰的非还原末端也具有唾液酸。为了方便起见，图3B示出了作为供体分子的MSG。然而，其中具有叠氮基团的接头分子与N297聚糖的各非还原末端键合的聚糖经改造的抗体还可以通过使用SG(10)作为聚糖供体合成为(III)的改造抗体。
图4(Fig.4)：图4A示出了智人(Homo sapiens)δ样典型Notch配体3(DLL3)亚型1的核苷酸序列和氨基酸序列，分别表示为SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:50。图4B示出了智人δ样典型Notch配体3(DLL3)亚型2的核苷酸序列和氨基酸序列，分别表示为SEQ ID NO:56和SEQID NO:51。
图5(Fig.5)：图5A示出了抗体7-I1-B的VH结构域的核苷酸序列和氨基酸序列，分别表示为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。VH CDR1(SEQ ID NO:3)以粗体字体示出，VH CDR2(SEQ ID NO:4)加下划线，并且VH CDR3(SEQ ID NO:5)以斜体、下划线字体指示。图5B示出了抗体7-I1-B的VL结构域的核苷酸序列和氨基酸序列，分别表示为SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7。VL CDR1(SEQ ID NO:8)以粗体字示出，VL CDR2(SEQ ID NO:9)加下划线，并且VL CDR3(SEQ ID NO:10)以斜体、下划线字体指示。
图6(Fig.6)：图6A示出了抗体2-C8-A的VH结构域的核苷酸序列和氨基酸序列，分别表示为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。VH CDR1(SEQ ID NO:13)以粗体字体示出，VH CDR2(SEQ ID NO:14)加下划线，并且VH CDR3(SEQ ID NO:15)以斜体、下划线字体指示。图6B示出了抗体2-C8-A的VL结构域的核苷酸序列和氨基酸序列，分别表示为SEQ ID NO:16和SEQID NO:17。VL CDR1(SEQ ID NO:18)以粗体字示出，VL CDR2(SEQ ID NO:19)加下划线，并且VL CDR3(SEQ ID NO:20)以斜体、下划线字体指示。
图7(Fig.7)：图7A示出了抗体10-O18-A的VH结构域的核苷酸序列和氨基酸序列，分别表示为SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。VH CDR1(SEQ ID NO:23)以粗体字体示出，VHCDR2(SEQ ID NO:24)加下划线，并且VH CDR3(SEQ ID NO:25)以斜体、下划线字体指示。图7B示出了抗体10-O18-A的VL结构域的核苷酸序列和氨基酸序列，分别表示为SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27。VL CDR1(SEQ ID NO:28)以粗体字示出，VL CDR2(SEQ ID NO:29)加下划线，并且VL CDR3(SEQ ID NO:30)以斜体、下划线字体指示。
图8(Fig.8)：图8A示出了抗体6-G23-F的VH结构域的核苷酸序列和氨基酸序列，分别表示为SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32。VH CDR1(SEQ ID NO:33)以粗体字体示出，VH CDR2(SEQ ID NO:34)加下划线，并且VH CDR3(SEQ ID NO:35)以斜体、下划线字体指示。图8B示出了抗体6-G23-F的VL结构域的核苷酸序列和氨基酸序列，分别表示为SEQ ID NO:36和SEQID NO:37。VL CDR1(SEQ ID NO:38)以粗体字示出，VL CDR2(SEQ ID NO:39)加下划线，并且VL CDR3(SEQ ID NO:40)以斜体、下划线字体指示。
图9(Fig.9)示出了进行Fab ZAP测定(基于细胞毒性的内化测定)以测定通过指定抗体内化DLL3的结果。将参考DLL3单克隆抗体SC16用作阳性对照。参见WO 2015127407。所有测试的抗DLL3抗体均展现出与参考单克隆抗体可比较的杀伤活性。在较高浓度的抗DLL3抗体下观察到钩状效应，因为游离的抗DLL3与细胞结合的抗DLL3竞争Fab ZAP。
图10(Fig.10)：图10A-图10D示出了抗体7-I1-B(图10A)、6-G23-F(图10B)、10-O18-A(图10C)和2-C8-A(图10D)的结合曲线，如经由Octet HTX在25℃下使用PBS 0.1％BSA 0.02％ Tween 20作为结合缓冲液和10mM甘氨酸(pH 1.7)作为再生缓冲液测量的。将单克隆抗体(各5μg/mL)加载到抗小鼠Fc传感器上，并且将加载的传感器浸入以200nM起始浓度采用7个连续1:3稀释度的重组人DLL3蛋白(氨基酸Ala27-Ala479，目录号9749-DL，R&DSystems)的指定稀释液中。对于每个DLL3稀释液，示出了实际测量值和曲线拟合。图10E示出了本文所述的四种单克隆抗体(6-G23-F、2-C8-A、7-I1-B和10-O18-A)的解离常数(KD)值，所述值是使用图2A-图2D中示出的结合曲线并且应用单价(1:1)结合模型计算的。
图11(Fig.11)示出了6-G23-F、10-O18-A和2-C8-A单克隆抗体(mAb)选择性结合DLL3，但不结合DLL1或DLL4。7-I1-B mAb结合DLL3和DLL4二者，但是不结合DLL1。
图12(Fig.12)示出了“方案R：抗体的制备”的反应方案，其描述在以下第VI(E)部分中。
图13(Fig.13)示出了H2-C8-A的聚糖改造方案。
图14(Fig.14)示出了H6-G23-F的聚糖改造方案。
图15(Fig.15)示出了H10-O18-A的聚糖改造方案。
图16(Fig.16)示出了用于制备H2-C8-A ADC的合成步骤。
图17(Fig.17)示出了用于制备H6-G23-F ADC的合成步骤。
图18(Fig.18)示出了用于制备H10-O18-A ADC的合成步骤。
图19(Fig.19)示出了三种人抗DLL3药物抗体-药物缀合物(H2-C8-A缀合物、H6-G23-F缀合物、H10-O18-A缀合物)或抗LPS抗体缀合物的体内抗肿瘤作用。使用动物模型进行评价，其中将DLL3阳性人小细胞肺癌细胞系NCI-H209接种在免疫缺陷小鼠中。横坐标描绘了接种后的天数，并且纵坐标描绘了估计的肿瘤体积。误差范围描绘了标准误差(SE)值。箭头指示施用日期。
图20(Fig.20)示出了三种人抗DLL3抗体-药物缀合物(H2-C8-A缀合物、H6-G23-F缀合物、H10-O18-A缀合物)或抗LPS抗体缀合物的体内抗肿瘤作用。使用动物模型进行评价，其中将DLL3阳性人小细胞肺癌细胞系NCI-H524接种在免疫缺陷小鼠中。横坐标描绘了接种后的天数，并且纵坐标描绘了估计的肿瘤体积。误差范围描绘了标准误差(SE)值。箭头指示施用日期。
图21(Fig.21)示出了三种人抗DLL3抗体-药物缀合物(H2-C8-A缀合物、H6-G23-F缀合物、H10-O18-A缀合物)或抗DLL3抗体-药物缀合物(SC16LD6.5)的体内抗肿瘤作用。使用动物模型进行评价，其中将DLL3阳性人小细胞肺癌细胞系NCI-H510A接种在免疫缺陷小鼠中。横坐标描绘了接种后的天数，并且纵坐标描绘了估计的肿瘤体积。误差范围描绘了标准误差(SE)值。箭头指示施用日期。
图22(Fig.22)示出了H2-C8-A-3的聚糖改造方案。
图23(Fig.23)示出了H10-O18-A-3的聚糖改造方案。
图24(Fig.24)示出了用于制备H2-C8-A-3ADC的合成步骤。
图25(Fig.25)示出了用于制备H10-O18-A-3ADC的合成步骤。
图26(Fig.26)示出了两种人抗DLL3抗体-药物缀合物(H2-C8-A-3缀合物、H10-O18-A-3缀合物)、抗DLL3抗体-药物缀合物(SC16LD6.5)或抗LPS抗体缀合物的体内抗肿瘤作用。使用动物模型进行评价，其中将DLL3阳性人小细胞肺癌细胞系NCI-H510A接种在免疫缺陷小鼠中。横坐标描绘了施用后的天数，并且纵坐标描绘了估计的肿瘤体积。误差范围描绘了标准误差(SE)值。
图27(Fig.27)示出了两种人抗DLL3抗体-药物缀合物(H2-C8-A-3缀合物、H10-O18-A-3缀合物)的体内抗肿瘤作用。使用动物模型进行评价，其中将DLL3阳性人小细胞肺癌细胞系NCI-H209接种在免疫缺陷小鼠中。横坐标描绘了施用后的天数，并且纵坐标描绘了估计的肿瘤体积。误差范围描绘了标准误差(SE)值。
图28(Fig.28)示出了两种人抗DLL3抗体-药物缀合物(H2-C8-A-3缀合物、H10-O18-A-3缀合物)、抗DLL3抗体-药物缀合物(SC16LD6.5)或抗LPS抗体缀合物的体内抗肿瘤作用。使用动物模型进行评价，其中将DLL3阳性人小细胞肺癌细胞系NCI-H82接种在免疫缺陷小鼠中。横坐标描绘了施用后的天数，并且纵坐标描绘了估计的肿瘤体积。误差范围描绘了标准误差(SE)值。
具体实施方式
本发明的抗体-药物缀合物是具有经由接头结构部分与能够识别或结合肿瘤细胞的抗体缀合的抗肿瘤化合物的抗肿瘤药物。
应当理解，为了提供对本发明技术的实质性理解，在各个细节层次上描述了本发明技术的某些方面、模式、实施方案、变型和特征。
在实践本发明技术时，使用了分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组DNA中的许多常规技术。参见例如，Sambrook和Russell编辑(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版；丛书Ausubel等人编辑(2007)CurrentProtocols in Molecular Biology；丛书Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.,纽约州)；MacPherson等人(1991)PCR 1:A Practical Approach(IRL Press at OxfordUniversity Press)；MacPherson等人(1995)PCR 2:A Practical Approach；Harlow和Lane编辑(1999)Antibodies,A Laboratory Manual；Freshney(2005)Culture of AnimalCells:A Manual of Basic Technique,第5版；Gait编辑(1984)OligonucleotideSynthesis；美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编辑(1984)Nucleic AcidHybridization；Anderson(1999)Nucleic Acid Hybridization；Hames和Higgins编辑(1984)Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press(1986))；Perbal(1984)A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller和Calos编辑(1987)Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Cold Spring HarborLaboratory)；Makrides编辑(2003)Gene Transfer and Expression in MammalianCells；Mayer和Walker编辑(1987)Immunochemical Methods in Cell and MolecularBiology(Academic Press,London)；以及Herzenberg等人编辑(1996)Weir’s Handbook ofExperimental Immunology。检测和测量多肽基因表达产物水平(即，基因翻译水平)的方法是本领域熟知的，并且包括使用多肽检测方法，诸如抗体检测和量化技术。(还参见，Strachan和Read,Human Molecular Genetics,第二版(John Wiley and Sons,Inc.,NY,1999))。
在下文中，将参考附图来描述用于执行本发明的优选实施方案。应注意以下描述的实施方案仅仅说明了本发明的代表性实施方案，并且本发明的范围不应当由于这些例子进行狭隘地解释。
I.定义
在本说明书中，术语“癌症”用于具有与术语“肿瘤”的含义相同的含义。
在本说明书中，术语“基因”不仅用于包括DNA还包括其mRNA和cDNA及其cRNA。
在本说明书中，术语“多核苷酸”或“核苷酸”用于具有与核酸的含义相同的含义，并且还包括DNA、RNA、探针、寡核苷酸和引物。在本说明书中，除非另有说明，术语“多核苷酸”和“核苷酸”可以彼此互换使用。
在本说明书中，术语“多肽”和“蛋白质”可以彼此互换使用。
在本说明书中，术语“细胞”包括个体动物中的细胞和培养的细胞。
在本说明书中，术语“DLL3”可以用于具有与DLL3蛋白的含义相同的含义。在本说明书中，人DLL3还被称为“hDLL3”。
在本说明书中，术语“细胞毒性活性”用于意指以任何给定方式引起细胞的病理变化。术语不仅意指直接的创伤，而且还意指对细胞引起的所有类型的结构或功能性损害，诸如DNA裂解、碱基二聚体的形成、染色体裂解、对细胞有丝分裂器的损害、和多种类型酶的活性的降低。
在本说明书中，短语“在细胞中施加毒性”用于意指以任何给定方式在细胞中展现出毒性。术语不仅意指直接的创伤，而且还意指对细胞引起的所有类型的结构、功能或代谢性影响，诸如DNA裂解、碱基二聚体的形成、染色体裂解、对细胞有丝分裂器的损害、多种类型酶的活性的降低、和细胞生长因子作用的抑制。
在本说明书中，术语“抗体的功能性片段”还称为“抗体的抗原结合片段”用于意指具有针对抗原的结合活性的抗体的部分片段，并且包括Fab、F(ab')2、scFv、双抗、线性抗体和形成自抗体片段的多特异性抗体等。Fab'是通过在还原条件下处理F(ab')2而获得的抗体可变区的单价片段，也包括在抗体的抗原结合片段中。然而，抗体的抗原结合片段不限于这些分子，只要抗原结合片段具有抗原结合能力即可。这些抗原结合片段不仅包括通过用适当的酶处理抗体蛋白的全长分子而获得的抗原结合片段，还包括使用基因工程化的抗体基因在适当的宿主细胞中产生的蛋白质。
在本说明书中，术语“表位”用于意指特定抗DLL3抗体所结合的DLL3的部分肽或部分三维结构。此类表位是上述DLL3的部分肽，可以通过本领域技术人员熟知的方法(诸如免疫测定)来确定。首先，产生抗原的多种部分结构。关于此类部分结构的生产，可以应用已知的寡肽合成技术。例如，通过本领域技术人员熟知的遗传重组技术产生一系列多肽，其中DLL3已经从其C末端或N末端以适当的长度相继截短。之后，研究抗体对此类多肽的反应性，并且大致确定识别位点。之后，合成进一步更短的肽，然后可以研究其与这些肽的反应性，以便确定表位。当与具有多个细胞外结构域的膜蛋白结合的抗体涉及作为表位的由多个结构域构成的三维结构时，抗体结合的结构域可以通过修饰特定细胞外结构域的氨基酸序列并且从而修饰三维结构来确定。表位是抗原的与特定抗体结合的部分三维结构，还可以通过X射线结构分析指定抗原的与抗体相邻的氨基酸残基来确定。
在本说明书中，“人源化抗体”是指包含至少一条链的抗体，所述链包含来自人抗体链的可变区框架残基和来自非人抗体(例如，小鼠)的至少一个互补决定区(CDR)。
如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有源自人免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中衍生自另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)的CDR序列已经被移植到人框架序列上的抗体。
在本说明书中，短语“与相同表位结合的抗体”用于意指与共同表位结合的抗体。如果第二抗体与第一抗体所结合的部分肽或部分三维结构结合，则可以确定第一抗体和第二抗体与相同的表位结合。可替代地，通过确认第二抗体与第一抗体竞争第一抗体与抗原的结合(即，第二抗体干扰第一抗体与抗原的结合)，可以确定第一抗体和第二抗体与相同的表位结合，即使尚未确定表位的特定序列或结构。在本说明书中，短语“与相同表位结合”是指通过这些确定方法中的任何一种或两种确定第一抗体和第二抗体与共同表位结合的情况。当第一抗体和第二抗体与相同表位结合，并且进一步地，第一抗体具有诸如抗肿瘤活性或内化活性的特殊作用时，可以预期第二抗体具有与第一抗体的活性相同的活性。
在本说明书中，术语“CDR”用于意指互补决定区。已知抗体分子的重链和轻链各自具有三个CDR。此类CDR也被称为高变区，并且位于抗体的重链和轻链的可变区中。这些区具有特别高度可变的一级结构并且被分为重链和轻链各自中的多肽链的一级结构上的三个位点。在本说明书中，关于抗体的CDR，重链的CDR从重链的氨基酸序列的氨基末端侧起分别被称为CDRH1、CDRH2和CDRH3，而轻链的CDR从轻链的氨基酸序列的氨基末端侧起分别被称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。这些位点在三维结构上位置彼此靠近，并且决定抗体与所述抗体所结合的抗原的特异性。
如本文所用，术语“CDR移植抗体”意指这样的抗体，在所述抗体中“受体”抗体的至少一个CDR被来自“供体”抗体的具有所需抗原特异性的CDR“移植物”替代。
如本文所用，术语“个体”、“患者”或“受试者”可以是单独的生物体、脊椎动物、哺乳动物或人。在一些实施方案中，个体、患者或受试者是人。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌化合物和抗真菌化合物、等渗化合物和吸收延迟化合物等。药学上可接受的载体及其配制品是本领域技术人员已知的，并且描述于例如Remington'sPharmaceutical Sciences(第20版,编辑A.Gennaro,2000,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA.)中。
如本文所用的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”涵盖对受试者(诸如人)的本文所述的疾病或障碍的治疗，并且包括：(i)抑制疾病或障碍，即阻止其发展；(ii)缓解疾病或障碍，即使障碍消退；(iii)减缓障碍的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或障碍的一种或多种症状的进展。在一些实施方案中，治疗意指使与疾病相关的症状例如被缓和、减轻、治愈或处于缓解状态。
如本文所用，“特异性结合”是指分子(例如，抗体或其抗原结合片段)识别并结合另一个分子(例如，抗原)，但是基本上不识别并结合其他分子。如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性地结合”或“特异于”特定分子(例如，多肽或多肽上的表位)可以例如通过一种分子对于其所结合的分子具有约10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10- 12M的KD来展现。术语“特异性地结合”也可以指这样的结合，其中分子(例如，抗体或其抗原结合片段)与特定多肽(例如，DLL3多肽)或特定多肽上的表位结合，而基本上不与任何其他多肽或多肽表位结合。
在本说明书中，将术语“一至几个”用于意指1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、或1或2。
在本发明中，“卤素原子”的例子可以包括但不限于氟原子、氯原子、溴原子和碘原子。
在本发明中，“C1至C6烷基”是指具有一至六个碳原子的直链或支链烷基。“C1至C6烷基”的例子可以包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和正己基。
在本发明中，“C1至C6烷氧基”是指具有直链或支链烷基的烷氧基，所述烷基具有一至六个碳原子。“C1至C6烷氧基”的例子可以包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基和正己氧基。
在本发明中，“C1至C6烷硫基”是指具有直链或支链烷基的烷硫基，所述烷基具有一至六个碳原子。“C1至C6烷硫基”的例子可以包括但不限于甲硫基、乙硫基、正丙硫基、异丙硫基、正丁硫基、异丁硫基、正丁硫基、叔丁硫基、正戊硫基和正己硫基。
在本发明中，“三至五元饱和烃环”是指具有三至五个碳原子的饱和环状烃基团。“三至五元饱和烃环”的例子可以包括但不限于环丙基、环丁基和环戊基。
在本发明中，“C3至C5环烷氧基”是指具有饱和环状烃基团的环烷氧基，所述饱和环状烃基团具有三至五个碳原子。“C3至C5环烷氧基”的例子可以包括但不限于环丙氧基、环丁氧基和环戊氧基。
在本发明中，“三至五元饱和杂环”可以包括但不限于1,3-环氧丙烷、氮杂环丁烷、硫杂环丁烷、四氢呋喃和吡咯烷。
在本发明中，“芳基”的例子可以包括但不限于苯基、苄基、茚基、萘基、芴基、蒽基和菲基。
在本发明中，“杂芳基”的例子可以包括但不限于噻吩基、吡咯基、吡唑基、三唑基、噁唑基、噁二唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、喹啉基、喹喔啉基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并三唑基和苯并呋喃基。
在本发明中，“六元杂环基”可以包括但不限于吡啶环、嘧啶环和哒嗪环。
在本发明中，“螺键合的(spiro-bonded)”是指其中(如实施例中所例示的)A与A键合的吡咯烷或者E与E键合的吡咯烷形成螺环。
II.δ样配体3(DLL3)
DLL3(即，δ样配体3或δ样蛋白3)在包括SCLC和LCNEC的高级别肺神经内分泌肿瘤中选择性表达。在SCLC和LCNEC患者源性异种移植肿瘤中观察到DLL3的表达增加，并且在原发性肿瘤中也得到证实。参见Saunders等人,Sci Translational Medicine7(302):302ra136(2015)。在肺外神经内分泌癌(包括前列腺神经内分泌癌)中也观察到DLL3的表达增加(Puca等人,Sci Transl Med 11(484):pii:eaav0891(2019))。虽然DLL3在此类肿瘤细胞表面表达，但是它在正常组织中不表达。本公开文本提供了免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或其抗原结合片段)，其在与肿瘤细胞上的DLL3结合时内化，并且因此可用于将毒性有效载荷递送至这些肿瘤细胞。本发明技术的免疫球蛋白相关组合物可用于检测或治疗有需要的受试者的DLL3相关癌症的方法中。因此，本发明方法的各个方面涉及抗DLL3抗体的制备、表征和操纵。本发明技术的免疫球蛋白相关组合物可以单独使用或与用于治疗癌症的另外的治疗剂组合使用。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白相关组合物是人源化抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。
在果蝇(Drosophila)中，Notch信号传导主要由Notch受体介导。δ是激活相邻细胞中的信号传导的果蝇Notch配体之一。人类具有四种已知的Notch受体(NOTCH1至NOTCH4)和δ的三种同源物，称为δ样配体：DLL1、DLL3和DLL4。据报道，与DLL1和DLL4不同，DLL3抑制Notch信号传导而不是激活它。
DLL3(也称为δ样3或SCDO1)是Notch DSL配体的δ样家族的成员。代表性DLL3蛋白质直系同源物包括但不限于：
人(登录号NP_058637：
MVSPRMSGLLSQTVILALIFLPQTRPAGVFELQIHSFGPGPGPGAPRSPCSARLPCRLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALGAALSARGPVYTEQPGAPAPDLPLPDGLLQVPFRDAWPGTFSFIIETWREELGDQIGGPAWSLLARVAGRRRLAAGGPWARDIQRAGAWELRFSYRARCEPPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECEAPLVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLSPRGPSSATTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECTCPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDCRERADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCEFPVHPDGASALPAAPPGLRPGDPQRYLLPPALGLLVAAGVAGAALLLVHVRRRGHSQDAGSRLLAGTPEPSVHALPDALNNLRTQEGSGDGPSSSVDWNRPEDVDPQGIYVISAPSIYAREVATPLFPPLHTGRAGQRQHLLFPYPSSILSVK(SEQ ID NO:50)
和NP_982353：
MVSPRMSGLLSQTVILALIFLPQTRPAGVFELQIHSFGPGPGPGAPRSPCSARLPCRLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALGAALSARGPVYTEQPGAPAPDLPLPDGLLQVPFRDAWPGTFSFIIETWREELGDQIGGPAWSLLARVAGRRRLAAGGPWARDIQRAGAWELRFSYRARCEPPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECEAPLVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLSPRGPSSATTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECTCPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDCRERADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCEFPVHPDGASALPAAPPGLRPGDPQRYLLPPALGLLVAAGVAGAALLLVHVRRRGHSQDAGSRLLAGTPEPSVHALPDALNNLRTQEGSGDGPSSSVDWNRPEDVDPQGIYVISAPSIYAREA(SEQ ID NO:51))；
黑猩猩(登录号XP_003316395：
MVSPRMSRLLSQTVILALIFLPQTRPAGVFELQIHSFGPGPGPGAPRSPCSARVPCRLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALGAALSARGPVYTEQPGAPAPDLPLPDGLLQVPFRDAWPGTFSFIIETWREELGDQIGGPAWSLLARVAGRRRLAAGGTWARDIQRAGAWELRFSYRARCEPPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECEAPPVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLSPRGPSSATTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPGSFECACPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDCRERADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCEFPVHPDGASALPAAPPGLRPGDPQRYLLPPALGLLVAAGVAGAALLLVHVRRRGHAQDAGARLLAGTPEPSVHALPDALNNLRTQEGAGDGPSSSVDWNRPEDVDPRGIYVISAPSIYAREA(SEQ ID NO:52))；
小鼠(登录号NP_031892：
MVSLQVSPLSQTLILAFLLPQALPAGVFELQIHSFGPGPGLGTPRSPCNARGPCRLFFRVCLKPGVSQEATESLCALGAALSTSVPVYTEHPGESAAALPLPDGLVRVPFRDAWPGTFSLVIETWREQLGEHAGGPAWNLLARVVGRRRLAAGGPWARDVQRTGTWELHFSYRARCEPPAVGAACARLCRSRSAPSRCGPGLRPCTPFPDECEAPSVCRPGCSPEHGYCEEPDECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLNSRVPGPASTGCLLPGPGPCDGNPCANGGSCSETSGSFECACPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGEDPDSAYVCHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCQNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGSRRCSCALGFGGRDCRERADPCASRPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGVRCEFAVRPDGADAVPAAPRGLRQADPQRFLLPPALGLLVAAGLAGAALLVIHVRRRGPGQDTGTRLLSGTREPSVHTLPDALNNLRLQDGAGDGPSSSADWNHPEDGDSRSIYVIPAPSIYAREA(SEQ ID NO:53))，
和大鼠(登录号NP_446118：
MVSLQVSSLPQTLILAFLLPQALPAGVFELQIHSFGPGPGPGTPRSPCNARGPCRLFFRVCLKPGVSQEAAESLCALGAALSTSGPVYTEQPGVPAAALSLPDGLVRVPFLDAWPGTFSLIIETWREQLGERAAGPAWNLLARVAGRRRLAAGAPWARDVQRTGAWELHFSYRARCEPPAVGAACARLCRSRSAPSRCGPGLRPCTPFPDECEAPRESLTVCRAGCSPEHGYCEEPDECHCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLNSRVSGPAGTGCLLPGPGPCDGNPCANGGSCSETPGSFECACPRGFYGPRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGEDPDSAYVCHCPPAFQGSNCERRVDRCSLQPCQNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGARRCSCALGFGGRDCRERADPCASRPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGVRCEFAVRPDGADAVPAAPRGLRQADSQRFLLPPALGLLAAAALAGAALLLIHVRRRGPGRDTGTRLLSGTREPSVHTLPDALNNLRLQDGAGDGPTSSADWNHPEDGDSRSIYVIPAPSIYAREA(SEQ ID NO:54))。
在人类中，DLL3基因由8个外显子组成，跨越9.5kBp，位于染色体19q13上。最后一个外显子内的选择性剪接产生2389bp转录物(登录号NM_016941(SEQ ID NO:55))和2052bp转录物(登录号NM_203486(SEQ ID NO:56))。前一种转录物编码长度为618个氨基酸的蛋白质(登录号NP_058637(SEQ ID NO:50))，而后者编码长度为587个氨基酸的蛋白质(登录号NP_982353(SEQ ID NO:51))。参见图4A-图4B。DLL3的这两种蛋白质亚型在其细胞外结构域和跨膜结构域之间具有100％的总体同一性，不同之处仅在于较长的亚型含有一个延伸的胞质尾区，其在蛋白质的羧基末端处含有32个另外的残基。
两种亚型都可以在肿瘤细胞中检测到。事实上，异常的DLL3表达(基因型和/或表型)与多种致瘤细胞亚群(诸如癌症干细胞和肿瘤起始细胞)相关。因此，本公开文本提供了可以特别用于靶向此类细胞(例如，癌症干细胞、肿瘤起始细胞和癌症，例如，小细胞肺癌、大细胞神经内分泌癌、肺神经内分泌癌、肺外神经内分泌癌和黑色素瘤)的DLL3抗体，从而促进肿瘤障碍的治疗、管理或预防。
用于本发明的DLL3蛋白可以直接从人或非人哺乳动物(例如，大鼠、小鼠或猴)的表达DLL3的细胞中纯化，然后可以使用，或者可以制备上述细胞的细胞膜部分并且可以用作DLL3蛋白。可替代地，DLL3还可以通过体外合成或者通过允许通过基因操纵使宿主细胞产生DLL3来获得。根据此类基因操纵，具体地可以通过以下方式获得DLL3蛋白：将DLL3cDNA掺入能够表达DLL3 cDNA的载体中，然后在含有酶、底物以及转录和翻译所需的能量材料的溶液中合成DLL3；或者转化其他原核生物或真核生物的宿主细胞，从而使它们表达DLL3。此外，基于上述基因操纵的表达DLL3的细胞或表达DLL3的细胞系可以用于呈现DLL3蛋白。可替代地，可以向待免疫的动物直接施用已掺入DLL3cDNA的表达载体，并且DLL3可以在由此免疫的动物体内表达。
此外，在上述DLL3氨基酸序列中，由包含一个或几个氨基酸的取代、缺失和/或增加的氨基酸序列组成并且具有与DLL3蛋白的生物活性相当的生物活性的蛋白质也包括在术语“DLL3”中。
III.抗DLL3抗体
本发明技术描述了用于产生和使用抗DLL3免疫球蛋白相关组合物(例如，抗DLL3抗体或其抗原结合片段)的方法和组合物。本公开文本的抗DLL3免疫球蛋白相关组合物可用于诊断或治疗DLL3相关癌症(例如，小细胞肺癌、大细胞神经内分泌癌、肺神经内分泌癌、肺外神经内分泌癌和黑色素瘤)。在本发明技术的范围内的抗DLL3免疫球蛋白相关组合物包括例如但不限于特异性结合靶多肽、其同源物、衍生物或片段的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、双特异性抗体和双抗体。本公开文本还提供本文公开的任何抗DLL3抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、F(ab)'2、Fab'、scFv和Fv。
本发明技术公开了可以促进DLL3抗体复合物内化并且因此可用于将有毒有效载荷递送至肿瘤细胞的抗DLL3抗体。
图5-图8提供了本文公开的抗体的VH和VL的核苷酸和氨基酸序列以及CDR序列(SEQ ID NO:1-40)。下表还提供了本文公开的抗体的VH和VL的氨基酸序列以及CDR序列。
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在一方面，本公开文本提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中(a)所述VH包含选自以下的VH-CDR1序列、VH-CDR2序列和VH-CDR3序列：(i)分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；(ii)分别为SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15；(iii)分别为SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；以及(iv)分别为SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35；和/或(b)所述VL包含选自以下的VL-CDR1序列、VL-CDR2序列和VL-CDR3序列：(i)分别为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；(ii)分别为SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；(iii)分别为SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；以及(iv)分别为SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中(a)包含VH-CDR1序列、VH-CDR2序列和VH-CDR3序列的所述VH与(b)包含VL-CDR1序列、VL-CDR2序列和VL-CDR3序列的所述VL的组合选自：(i)分别为(a)SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5与(b)SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；(ii)分别为(a)SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15与(b)SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；(iii)分别为(a)SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25与(b)SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ IDNO:30；以及(iv)分别为(a)SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35与(b)SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含任何同种型的Fc结构域，所述同种型例如但不限于IgG(包括IgG1和变体(SEQ ID NO:42、57和58)、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD、IgE或IgM和IgY。在一些实施方案中，所述抗体包含以下的重链恒定区：SEQ ID NO:42、57或58、优选SEQ ID NO:57或58、更优选SEQ ID NO:58。恒定区序列的非限制性例子包括：
人IgD恒定区，Uniprot：P01880(SEQ ID NO:41)
APTKAPDVFPIISGCRHPKDNSPVVLACLITGYHPTSVTVTWYMGTQSQPQRTFPEIQRRDSYYMTSSQLSTPLQQWRQGEYKCVVQHTASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK
人IgG1恒定区，Uniprot：P01857(SEQ ID NO:42)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG1变体恒定区(SEQ ID NO:57)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG1变体恒定区(SEQ ID NO:58)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2恒定区，Uniprot：P01859(SEQ ID NO:43)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG3恒定区，Uniprot：P01860(SEQ ID NO:44)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
人IgM恒定区，Uniprot：P01871(SEQ ID NO:45)
GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
人IgG4恒定区，Uniprot：P01861(SEQ ID NO:46)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
人IgA1恒定区，Uniprot：P01876(SEQ ID NO:47)
ASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
人IgA2恒定区，Uniprot：P01877(SEQ ID NO:48)
ASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNVVVACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQNVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCPDGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRMAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
人Igκ恒定区，Uniprot：P01834(SEQ ID NO:49)
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一些实施方案中，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物包含与SEQ ID NO:41-48、57、58至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的重链恒定区。另外地或可替代地，在一些实施方案中，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物包含与SEQID NO:49至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的轻链恒定区。在一些实施方案中，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物与DLL3的细胞外结构域结合。在一些实施方案中，所述表位是构象表位。
在另一方面，本公开文本提供了分离的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或其抗原结合片段)，所述分离的免疫球蛋白相关组合物包含含有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:32的重链免疫球蛋白可变结构域(VH)氨基酸序列或它们的具有一个或多个保守氨基酸取代的变体，或者含有SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68或SEQ IDNO:69的重链氨基酸序列或它们的具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物包含含有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:37的轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)氨基酸序列或它们的具有一个或多个保守氨基酸取代的变体，或者含有SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:70的轻链氨基酸序列或它们的具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。
在一些实施方案中，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物包含选自以下的重链免疫球蛋白可变结构域(VH)或重链氨基酸序列和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)或轻链氨基酸序列：分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:7(7-I1-B)；分别为SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:17(2-C8-A)；分别为SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:62(H2-C8-A)；分别为SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:62(H2-C8-A-2)；分别为SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62(H2-C8-A-3)；分别为SEQID NO:22和SEQ ID NO:27(10-O18-A)；分别为SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:70(H10-O18-A)；分别为SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:70(H10-O18-A-2)；SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70(H10-O18-A-3)；分别为SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:37(6-G23-F)。
在免疫球蛋白相关组合物的上述实施方案中的任一个中，HC和LC免疫球蛋白可变结构域序列形成与DLL3的细胞外结构域结合的抗原结合位点。在免疫球蛋白相关组合物的上述实施方案中的任一个中，HC和LC免疫球蛋白可变结构域序列形成与DLL3结合的抗原结合位点并且促进所述免疫球蛋白相关组合物的内化。在一些实施方案中，所述表位是构象表位。
在一些实施方案中，所述HC和LC免疫球蛋白可变结构域序列是同一多肽链的组分。在其他实施方案中，所述HC和LC免疫球蛋白可变结构域序列是不同多肽链的组分。在某些实施方案中，所述抗体是全长抗体。
在一些实施方案中，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物与至少一种DLL3多肽特异性地结合。在一些实施方案中，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物以约10-3M、10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M的解离常数(KD)结合至少一种DLL3多肽。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白相关组合物是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或双特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含人抗体框架区。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白相关组合物包括以下特征中的一个或多个：(a)轻链免疫球蛋白可变结构域序列，其与SEQ ID NO:7、17、27、37、62、66或70中的任一个中存在的轻链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同；和/或(b)重链免疫球蛋白可变结构域序列，其与SEQ ID NO:2、12、22、32、59、60、61、63、64、65、67、68或69中的任一个中存在的重链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同。在另一方面，本文提供的免疫球蛋白相关组合物中的一个或多个氨基酸残基被另一氨基酸取代。所述取代可以是如本文所定义的“保守取代”。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白相关组合物含有IgG1恒定区，所述IgG1恒定区包含选自以下的一个或多个氨基酸取代或氨基酸残基集：N297A和K322A、在所述重链的234和235(根据EU索引)位置处两个亮氨酸(L)残基被取代为丙氨酸(A)(LALA)、所述重链的356位置处的Glu(E)和358(根据EU索引)位置处的Met(M)的氨基酸残基集、或所述重链的356位置处的Asp(D)和358(根据EU索引)位置处的亮氨酸(L)的氨基酸残基集或其任何组合。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述免疫球蛋白相关组合物含有包含S228P突变的IgG4恒定区。包含上述LALA取代的工程化抗体显示出抗肿瘤作用，而没有由Fc介导的效应子免疫功能引起的毒性、PK特征和稳定性受损的任何不良影响(PharmacolTher.2019；200:110-125)。
在一些方面，本文所述的抗DLL3免疫球蛋白相关组合物含有结构修饰以促进快速结合和细胞吸收和/或缓慢释放。在一些方面，本发明技术的抗DLL3免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体)可以在CH2恒定重链区中含有缺失以促进快速结合和细胞吸收和/或缓慢释放。在一些方面，Fab片段用于促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，F(ab)'2片段用于促进快速结合和细胞吸收和/或缓慢释放。
考虑了本文描述的抗DLL3抗体的一种或多种氨基酸序列修饰。例如，可能希望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。通过将适当的核苷酸变化引入抗体核酸中或通过肽合成来制备抗DLL3抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基缺失和/或插入和/或取代。只要获得的抗体具有所需的特性，就可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得目的抗体。修饰还包括蛋白质糖基化模式的变化。进行取代诱变的最感兴趣的位点包括高变区，但是也考虑了FR改变。“保守取代”在下表中示出。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体的一个或多个高变区残基。用于生成此类取代变体的一种便利方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。特别地，使数个高变区位点(例如，6-7个位点)突变，以在每个位点产生所有可能的氨基酸取代。将如此产生的抗体变体从丝状噬菌体颗粒以单价方式展示为与包装在每个颗粒中的M13的基因III产物的融合物。然后针对其生物活性(例如，结合亲和力)筛选噬菌体展示的变体，如本文所公开。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。可替代地或另外地，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。根据本文详述的技术，此类接触残基及邻近残基是取代的候选物。一旦产生了此类变体，就对这组变体进行如本文所述的筛选，并且可以选择在一种或多种相关测定中具有相似或更优特性的抗体进行进一步开发。
在一个方面，本发明技术提供一种编码本文所述的任何免疫球蛋白相关组合物的核酸序列。本文中还公开编码本文所述的任何抗体的重组核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸序列选自SEQ ID NO:1、6、11、16、21、26、31和36。
在另一个方面，本发明技术提供了一种宿主细胞或表达载体，所述宿主细胞或表达载体表达编码本文所述的免疫球蛋白相关组合物中的任一种的任何核酸序列。
本发明技术的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗DLL3抗体)可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或具有更大的多特异性。多特异性抗体可以对一种或多种DLL3多肽的不同表位具有特异性，或者可以对一种或多种DLL3多肽以及对异源组合物(诸如异源多肽或固体支持物材料)两者均具有特异性。参见例如，WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等人,J.Immunol.147:60-69(1991)；美国专利号5,573,920、4,474,893、5,601,819、4,714,681、4,925,648；6,106,835；Kostelny等人,J.Immunol.148:1547-1553(1992)。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白相关组合物是嵌合的。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白相关组合物是人源化的。
本发明技术的免疫球蛋白相关组合物可以进一步在N末端或C末端与异源多肽重组融合，或者与多肽或其他组合物化学缀合(包括共价和非共价缀合)。例如，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物可以与可用作检测测定中的标记的分子和效应分子(诸如异源多肽、药物或毒素)重组融合或缀合。参见例如，WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利号5,314,995；并且EP 0 396 387。
在本发明技术的免疫球蛋白相关组合物的任何上文实施方案中，所述抗体或抗原结合片段可以任选地与选自以下的药剂缀合：同位素、染料、色原、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或其任何组合。在一些实施方案中，本发明技术的抗体或抗原结合片段可以与药学上可接受的载体组合。对于化学键或物理结合，免疫球蛋白相关组合物上的官能团典型地与药剂上的官能团缔合。可替代地，药剂上的官能团与免疫球蛋白相关组合物上的官能团缔合。
药剂上的官能团和免疫球蛋白相关组合物上的官能团可以直接缔合。例如，药剂上的官能团(例如，巯基)可以与免疫球蛋白相关组合物上的官能团(例如，巯基)缔合以形成二硫键。可替代地，官能团可以通过交联剂(即，接头)缔合。交联剂的一些例子描述如下。交联剂可以附接至药剂或免疫球蛋白相关组合物。缀合物中的药剂或免疫球蛋白相关组合物的数量也受到对方上存在的官能团数量的限制。例如，与缀合物缔合的药剂的最大数量取决于免疫球蛋白相关组合物上存在的官能团的数量。可替代地，与药剂缔合的免疫球蛋白相关组合物的最大数量取决于药剂上存在的官能团的数量。
在又另一个实施方案中，缀合物包含与一种药剂缔合的一种免疫球蛋白相关组合物。在一个实施方案中，缀合物包含与至少一种免疫球蛋白相关组合物化学键合(例如，缀合)的至少一种药剂。可以通过本领域技术人员已知的任何方法将药剂与免疫球蛋白相关组合物化学键合。例如，药剂上的官能团可以直接附接至免疫球蛋白相关组合物上的官能团。合适的官能团的一些例子包括例如氨基、羧基、巯基、马来酰亚胺、异氰酸酯、异硫氰酸酯和羟基。
也可以通过交联剂(诸如二醛、碳二亚胺、二马来酰亚胺等)将药剂与免疫球蛋白相关组合物化学键合。交联剂可以例如从伊利诺伊州罗克福德的Pierce Biotechnology,Inc.获得。Pierce Biotechnology,Inc.网站可以提供帮助。另外的交联剂包括以下文献中描述的铂交联剂：荷兰阿姆斯特丹的Kreatech Biotechnology,B.V.的美国专利号5,580,990；5,985,566；和6,133,038。
可替代地，药剂和免疫球蛋白相关组合物上的官能团可以是相同的。同双官能交联剂典型地用于交联相同的官能团。同双官能交联剂的例子包括EGS(即，乙二醇双[琥珀酰亚胺基琥珀酸酯])、DSS(即，辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、DMA(即，己二亚胺酸二甲酯.2HCl)、DTSSP(即，3,3'-二硫代双[磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯])、DPDPB(即，1,4-二-[3'-(2'-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]丁烷)和BMH(即，双马来酰亚胺基己烷)。此类同双官能交联剂也可从Pierce Biotechnology,Inc.获得。
在其他情况下，从免疫球蛋白相关组合物切割药剂可能是有益的。上述PierceBiotechnology,Inc.的网站还可以为本领域技术人员在选择合适的交联剂方面提供帮助，所述交联剂可以通过例如细胞中的酶切割。由此，可以将药剂与免疫球蛋白相关组合物分离。可切割接头的例子包括SMPT(即，4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-甲基-a-[2-吡啶基二硫代]甲苯)、磺基-LC-SPDP(即，磺基琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)、LC-SPDP(即，琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)、磺基-LC-SPDP(即，磺基琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)、SPDP(即，N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基己酸酯)和AEDP(即，3-[(2-氨基乙基)二硫代]丙酸HCl)。
在另一个实施方案中，缀合物包含与至少一种与免疫球蛋白相关组合物物理键合的至少一种药剂。可以采用本领域技术人员已知的任何方法将药剂与免疫球蛋白相关组合物物理键合。例如，可以通过本领域技术人员已知的任何方法将免疫球蛋白相关组合物和药剂混合。混合的顺序并不重要。例如，可以通过本领域技术人员已知的任何方法将药剂与免疫球蛋白相关组合物物理混合。例如，可以将免疫球蛋白相关组合物和药剂放置在容器中，并且通过例如摇动容器进行搅拌，以混合免疫球蛋白相关组合物和药剂。
免疫球蛋白相关组合物可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行修饰。例如，如上所述，可以通过交联剂或官能团来修饰免疫球蛋白相关组合物。
本发明的抗体还包括抗体的修饰。修饰用于意指化学或生物修饰的本发明抗体。此类化学修饰的例子包括化学部分与氨基酸骨架的结合，以及N-连接或O-连接的碳水化合物链的化学修饰。此类生物修饰的例子包括经过翻译后修饰(例如，N-连接的或O-连接的糖基化、N末端或C末端加工、脱酰胺、天冬氨酸的异构化、甲硫氨酸的氧化、和N末端谷氨酰胺或N末端谷氨酸转化为焦谷氨酸)的抗体；和作为已允许使用原核宿主细胞表达的结果而添加甲硫氨酸残基到N末端的抗体。此外，此类修饰还意味着包括用于能够检测或分离本发明抗体或抗原的标记抗体，例如酶标记抗体、荧光标记抗体和亲和标记抗体。本发明抗体的此类修饰可用于改善抗体在血液中的稳定性和保留；降低抗原性；检测或分离抗体或抗原等。
此外，通过调节与本发明抗体结合的糖链修饰(糖基化、去岩藻糖基化等)，可以增强抗体依赖性细胞毒性活性。作为调节抗体的糖链修饰的技术，国际公开号WO 1999/54342、WO 2000/61739和WO 2002/31140、WO 2007/133855等中描述的那些是已知的，但技术不限于此。本发明的抗体还包括关于上述哪种糖链修饰已被调节的抗体。
一旦分离出抗体基因，可以使用宿主和表达载体的适当组合将所述基因引入适当的宿主中以产生抗体。抗体基因的具体例子可以是编码本说明书中所述抗体的重链序列的基因和编码其中所述抗体的轻链序列的基因的组合。在宿主细胞转化时，此类重链序列基因和轻链序列基因可以插入单个表达载体中，或者这些基因反而可以分别插入不同的表达载体中。
当使用真核细胞作为宿主时，可以使用动物细胞、植物细胞或真核微生物。特别地，动物细胞的例子可以包括哺乳动物细胞，诸如是猴细胞的COS细胞(Gluzman,Y.,Cell(1981)23,第175-182页,ATCC CRL-1650)、小鼠成纤维细胞NIH3T3(ATCC号CRL-1658)、中国仓鼠卵巢细胞的二氢叶酸还原酶缺陷细胞系(CHO细胞，ATCC CCL-61)(Urlaub,G.和Chasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77,第4126-4220页)，以及FreeStyle293F细胞(Invitrogen Corp.)。
当使用原核细胞作为宿主时，例如可以使用大肠杆菌(Escherichia coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
将目的抗体基因引入这些细胞中用于转化，然后将转化的细胞体外培养以获得抗体。在上述培养物中，存在产率根据抗体的序列而不同的情况，并且因此，可以使用产率作为指标，从具有等同结合活性的抗体中选择容易作为药剂产生的抗体。因此，本发明的抗体还包括通过上述用于产生抗体的方法获得的抗体，所述方法包括培养转化的宿主细胞的步骤和从上述步骤中获得的培养物中收集目的抗体或所述抗体的功能片段的步骤。
已知在培养的哺乳动物细胞中产生的抗体的重链的羧基末端的赖氨酸残基缺失(Journal of Chromatography A,705:129-134(1995))，并且还已知在重链羧基末端的两个氨基酸残基(甘氨酸和赖氨酸)缺失，并且将新定位在羧基末端的脯氨酸残基酰胺化(Analytical Biochemistry,360:75-83(2007))。然而，这些重链序列的此类缺失和修饰对抗体的抗原结合活性和效应子功能(补体的激活、抗体依赖性细胞毒性等)没有影响。因此，根据本发明的抗体还包括经过上述修饰的抗体和所述抗体的功能片段，并且此类抗体的具体例子包括在重链羧基末端包含1或2个氨基酸的缺失的缺失突变体，和通过对上述缺失突变体进行酰胺化而形成的缺失突变体(例如，其中羧基末端位点的脯氨酸残基被酰胺化的重链)。然而，涉及根据本发明的抗体的重链的羧基末端的缺失的缺失突变体不限于上述缺失突变体，只要他们保留抗原结合活性和效应子功能即可。构成根据本发明的抗体的两条重链可以是选自全长抗体和上述缺失突变体的任一类型的重链，或者可以是选自上述组的任何两种类型的组合。单独缺失突变体的比率可以受产生根据本发明的抗体的培养的哺乳动物细胞的类型和培养条件的影响。根据本发明的抗体的主要成分的例子可以包括抗体，其中在两条重链的每个羧基末端处缺失一个氨基酸残基。
抗体的生物活性的例子通常可以包括抗原结合活性、通过与抗原结合而内化到表达抗原的细胞中的活性、中和抗原活性的活性、增强抗原活性的活性、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性、补体依赖性细胞毒性(CDC)活性和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。根据本发明的抗体的功能是针对DLL3的结合活性，并且优选是通过与DLL3结合而内化到表达DLL3的细胞中的活性。此外，本发明的抗体可以具有ADCC活性、CDC活性和/或ADCP活性以及细胞内化活性。
IV.抗DLL3抗体的产生
本发明的抗DLL3抗体可以源自任何物种。优选的物种的例子包括人、猴、大鼠、小鼠和兔。在本发明的抗DLL3抗体源自除人以外的物种时，优选通过已知技术嵌合或人源化抗DLL3抗体。本发明的抗体可以是多克隆抗体，或者可以是单克隆抗体，并且优选单克隆抗体。
本发明的抗DLL3抗体是能够靶向肿瘤细胞的抗体。具体地，本发明的抗DLL3抗体拥有能够识别肿瘤细胞的特性、能够与肿瘤细胞结合的特性和/或通过细胞摄取被内化到肿瘤细胞中的特性等。因此，本发明的抗DLL3抗体可以经由接头与具有抗肿瘤活性的化合物缀合以制备抗体-药物缀合物。
抗体针对肿瘤细胞的结合活性可以通过流式细胞术确认。可以通过以下方式确认抗体到肿瘤细胞中的摄取：(1)在荧光显微镜下使用与所述抗体结合的二抗(荧光标记的)可视化细胞吸纳抗体的测定(Cell Death and Differentiation,2008,15,751-761)，(2)使用与所述抗体结合的二抗(荧光标记的)测量细胞吸纳荧光的量的测定(MolecularBiology of the Cell第15卷,5268-5282,2004年12月)，或(3)使用与所述抗体结合的免疫毒素的Mab-ZAP测定，其中所述毒素在细胞摄取后释放，以便抑制细胞生长(BioTechniques 28:162-165,2000年1月)。白喉毒素的催化区和蛋白G的重组缀合蛋白可以用作免疫毒素。
在本说明书中，术语“高内化能力”用于意指已施用上述抗体和皂草素标记的抗大鼠IgG抗体的表达DLL3的细胞的存活率(其由相对于没有抗体添加的细胞存活率(定义为100％)的比率表示)优选70％或更低并且更优选60％或更低。
本发明的抗肿瘤抗体-药物缀合物包含施加抗肿瘤作用的缀合化合物。因此，优选但不必需的是，抗体本身应具有抗肿瘤作用。为了特异性和/或选择性地在肿瘤细胞中施加抗肿瘤化合物的细胞毒性的目的，重要并且优选的是，所述抗体应具有内化并且转移到肿瘤细胞中的特性。
可以通过本领域中通常进行的方法用用作抗原的多肽免疫动物，然后收集并且纯化在其活体中产生的抗体来获得抗DLL3抗体。优选使用保留三维结构的DLL3作为抗原。此类方法的例子可以包括DNA免疫方法。
抗原的来源不限于人，并且因此，还可以用源自非人动物(诸如小鼠或大鼠)的抗原来免疫动物。在这种情况下，可以通过检查获得的与异源抗原结合的抗体与人抗原的交叉反应性来选择适用于人类疾病的抗体。
此外，产生针对抗原的抗体的产生抗体的细胞可以根据已知方法与骨髓瘤细胞融合(例如，Kohler和Milstein,Nature(1975)256,495-497；并且Kennet,R.编辑,MonoclonalAntibodies,365-367,Plenum Press,N.Y.(1980))以建立杂交瘤，以便获得单克隆抗体。
在下文中，将具体描述用于获得针对DLL3的抗体的方法。
总体概述.首先，选择靶多肽，可以产生针对所述靶多肽的本发明技术的抗体。例如，可以针对全长DLL3蛋白或DLL3蛋白的胞外结构域的一部分产生抗体。用于生成针对此类靶多肽的抗体的技术是本领域技术人员熟知的。此类技术的例子例如包括但不限于涉及展示文库、异种或人小鼠、杂交瘤等的那些技术。在本发明技术范围内的靶多肽包括能够引发免疫应答的源自含有胞外结构域的DLL3蛋白的任何多肽。
应当理解，针对DLL3蛋白及其片段的重组工程化抗体和抗体片段(例如，抗体相关多肽)适合于根据本公开文本使用。
可以经受本文所阐述的技术的抗DLL3抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，以及抗体片段，诸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、scFv、双抗体、抗体轻链、抗体重链和/或抗体片段。已经描述了可用于高产率产生含抗体Fv的多肽(例如，Fab'和F(ab')2抗体片段)的方法。参见美国专利号5,648,237。
通常，抗体是从起源物种获得的。更具体地，获得对靶多肽抗原具有特异性的起源物种抗体的轻链、重链或两者的可变部分的核酸或氨基酸序列。起源物种是可用于产生本发明技术的抗体或抗体文库的任何物种，例如大鼠、小鼠、兔子、鸡、猴、人等。
噬菌体或噬菌粒展示技术是可用于衍生本发明技术的抗体的技术。用于产生和克隆单克隆抗体的技术是本领域技术人员熟知的。编码本发明技术的抗体的序列的表达可以在大肠杆菌(E.coli)中进行。
由于核酸编码序列的简并性，编码与天然存在的蛋白质的那些氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的其他序列可用于本发明技术的实践中。这些序列包括但不限于包括编码上述多肽的全部或部分核酸序列在内的核酸序列，所述核酸序列通过编码序列内功能等同氨基酸残基的不同密码子的取代而发生改变，从而产生沉默变化。应当理解，根据本发明技术的免疫球蛋白的核苷酸序列容忍如通过标准方法计算的高达25％的序列同源性变异(“Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,”MacromoleculeSequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications,第127-149页,1998,Alan R.Liss,Inc.)，只要此类变体形成识别DLL3蛋白的有效抗体即可。例如，多肽序列内的一个或多个氨基酸残基可以被具有相似极性的另一个氨基酸取代，所述另一个氨基酸充当功能等同物，从而导致沉默改变。序列内氨基酸的取代基可以选自所述氨基酸所属的类别的其他成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。在本发明技术范围内还包括蛋白质或其片段或衍生物，所述蛋白质或其片段或衍生物在翻译过程中或翻译后进行差异性修饰，例如通过糖基化、蛋白水解切割、与抗体分子或其他细胞配体的连接等来进行。另外，可以使编码免疫球蛋白的核酸序列在体外或体内突变，以产生和/或破坏序列的翻译、起始和/或终止，或者在编码区产生变异和/或形成新的限制性核酸内切酶位点或破坏先前存在的所述位点，以促进进一步的体外修饰。可以使用本领域中已知的任何诱变技术，包括但不限于体外定点诱变(J.Biol.Chem.253:6551)、使用Tab接头(Pharmacia)等。
多克隆抗血清和免疫原的制备.产生本发明技术的抗体或抗体片段的方法典型地包括用纯化的DLL3蛋白或其片段或用表达DLL3蛋白或其片段的细胞对受试者(通常是非人受试者，诸如小鼠或兔)进行免疫。适当的免疫原性制剂可以含有例如重组表达的DLL3蛋白或化学合成的DLL3肽。使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术，可以将DLL3蛋白的细胞外结构域或其部分或片段用作免疫原以产生与DLL3蛋白或其部分或片段结合的抗DLL3抗体。
全长DLL3蛋白或其片段可作为片段用作免疫原。在一些实施方案中，DLL3片段包含DLL3的细胞外结构域，使得针对所述肽产生的抗体与DLL3蛋白形成特异性免疫复合物。
DLL3的细胞外结构域的长度为466个氨基酸，跨越全长DLL3蛋白的氨基酸27-492。在一些实施方案中，所述抗原性DLL3肽包含至少5、8、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸残基。取决于用途和根据本领域技术人员熟知的方法，有时需要较长的抗原肽而不是较短的抗原肽。给定表位的多聚体有时比单体更有效。
如果需要，可以通过与载体蛋白诸如钥孔戚血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA)融合或缀合来增加DLL3蛋白(或其片段)的免疫原性。许多这样的载体蛋白是本领域中已知的。还可以将DLL3蛋白与常规佐剂(诸如弗氏完全或不完全佐剂)组合，以增强受试者对所述多肽的免疫反应。用于提高免疫应答的多种佐剂包括但不限于弗氏(完全和不完全)、矿物凝胶(例如，氢氧化铝)、表面活性物质(例如，溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、二硝基苯酚等)、人用佐剂(诸如卡介苗(Bacille Calmette-Guerin)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum))或类似的免疫刺激化合物。这些技术在本领域中是标准的。
在描述本发明技术时，免疫应答可以被描述为“初级”或“次级”免疫应答。初级免疫应答，也称为“保护性”免疫应答，是指由于初始暴露(例如，初始“免疫”)于特定抗原(例如，DLL3蛋白)而在个体中产生的免疫应答。在一些实施方案中，可以通过用含有抗原的疫苗对个体进行疫苗接种来进行免疫。例如，所述疫苗可以是包含一种或多种DLL3蛋白来源的抗原的DLL3疫苗。随着时间的推移，初级免疫应答可能削弱或减弱，甚至可能消失或至少变得减弱到无法检测到。因此，本发明技术还涉及“次级”免疫应答，在此也称为“记忆免疫应答”。术语次级免疫应答是指在已经产生初级免疫应答之后在个体中引发的免疫应答。
因此，可以引发次级免疫应答，例如以增强已经削弱或减弱的现有免疫应答，或者重新产生已经消失或无法再被检测到的先前免疫应答。次级或记忆免疫应答可以是体液(抗体)应答或细胞应答。在对首次呈递抗原时产生的记忆B细胞进行刺激后发生次级或记忆体液应答。迟发型超敏(DTH)反应是CD4+T细胞介导的细胞次级或记忆免疫应答的类型。首次暴露于抗原启动免疫系统，并且另外的一次或多次暴露导致DTH。
适当的免疫后，可以从受试者的血清制备抗DLL3抗体。如果需要，可以从哺乳动物(例如，从血液)分离针对DLL3蛋白的抗体分子，并且通过熟知的技术诸如多肽A色谱进一步纯化以获得IgG级分。
单克隆抗体.在本发明技术的一个实施方案中，所述抗体是抗DLL3单克隆抗体。例如，在一些实施方案中，所述抗DLL3单克隆抗体可以是人或小鼠抗DLL3单克隆抗体。为了制备针对DLL3蛋白或其衍生物、片段、类似物或同源物的单克隆抗体，可以使用通过连续细胞系培养产生抗体分子的任何技术。此类技术包括但不限于杂交瘤技术(参见例如Kohler和Milstein,1975.Nature 256:495-497)；三源杂交瘤技术；人B细胞杂交瘤技术(参见例如Kozbor等人,1983.Immunol.Today 4:72)和EBV杂交瘤技术来产生人单克隆抗体(Cole等人,1985.In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,第77-96页)。人单克隆抗体可以用于本发明技术的实践中，并且可以通过使用人杂交瘤(参见例如，Cote等人,1983.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026-2030)或通过在体外用埃伯斯坦-巴尔(Epstein Barr)病毒转化人B细胞(参见例如，Cole等人,1985.In:MONOCLONAL ANTIBODIESAND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,第77-96页)。例如，可以分离编码抗体区域的核酸群。将利用源自编码抗体保守区的序列的引物的PCR用于从所述群扩增编码抗体部分的序列，然后从扩增的序列重建编码抗体或其片段(诸如可变结构域)的DNA。此类扩增的序列也可以与编码其他蛋白质-(例如，噬菌体外壳或细菌细胞表面蛋白)-的DNA融合，用于融合多肽在噬菌体或细菌上的表达和展示。然后可以表达扩增的序列，并且基于例如表达的抗体或其片段对存在于DLL3蛋白上的抗原或表位的亲和力来进行进一步选择或分离。可替代地，可以通过对受试者进行免疫，然后使用常规方法从受试者的脾脏分离杂交瘤来制备表达抗DLL3单克隆抗体的杂交瘤。参见例如Milstein等人,(Galfre和Milstein,MethodsEnzymol(1981)73:3-46)。使用标准方法筛选杂交瘤将产生具有不同特异性(即，针对不同表位)和亲和力的单克隆抗体。具有所需特性(例如，DLL3结合)的所选单克隆抗体可以如杂交瘤表达地使用，可以将其与分子(诸如聚乙二醇(PEG))结合以改变其特性，或者可以将编码所述单克隆抗体的cDNA以多种方式进行分离、测序和操纵。可以将合成的树型体(dendromeric)树添加到反应性氨基酸侧链例如赖氨酸，以增强DLL3蛋白的免疫原性特性。另外，CPG-二核苷酸技术可以用于增强DLL3蛋白的免疫原性特性。其他操纵包括将促进抗体在储存过程中或在施用至受试者后的不稳定性的特定氨基酰基残基取代或缺失，以及亲和力成熟技术以改善DLL3蛋白的抗体的亲和力。
杂交瘤技术.在一些实施方案中，本发明技术的抗体是由杂交瘤产生的抗DLL3单克隆抗体，所述杂交瘤包括获自转基因非人动物(例如，转基因小鼠)的B细胞，所述转基因非人动物具有包含与永生化细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。杂交瘤技术包括本领域已知的并且在以下文献中传授的那些：Harlow等人,Antibodies:ALaboratoryManual Cold Spring Harbor Laboratory,纽约州冷泉港,349(1988)；Hammerling等人,Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas,563-681(1981)。用于产生杂交瘤和单克隆抗体的其他方法是本领域技术人员熟知的。
噬菌体展示技术.如上所指出，可以通过应用重组DNA技术和噬菌体展示技术来产生本发明技术的抗体。例如，可以使用本领域已知的多种噬菌体展示方法来制备抗DLL3抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在噬菌体颗粒的表面上，所述噬菌体颗粒携带编码所述功能性抗体结构域的多核苷酸序列。通过直接用抗原(典型地是结合或捕获到固体表面或珠上的抗原)选择，从库或组合抗体文库(例如，人或鼠)选择具有所需结合特性的噬菌体。这些方法中使用的噬菌体典型地是丝状噬菌体，其包括具有Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域的fd和M13，所述结构域与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合。此外，方法适于Fab表达文库的构建(参见例如，Huse等人,Science246:1275-1281,1989)，以快速有效地鉴定对DLL3多肽具有所需特异性的单克隆Fab片段，例如多肽或其衍生物、片段、类似物或同源物。可以用于制造本发明技术的抗体的噬菌体展示方法的其他例子包括以下文献中所披露的那些：Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,85:5879-5883,1988；Chaudhary等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,87:1066-1070,1990；Brinkman等人,J.Immunol.Methods 182:41-50,1995；Ames等人,J.Immunol.Methods 184:177-186,1995；Kettleborough等人,Eur.J.Immunol.24:952-958,1994；Persic等人,Gene 187:9-18,1997；Burton等人,Advances in Immunology 57:191-280,1994；PCT/GB91/01134；WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；WO 96/06213；WO 92/01047(医学研究委员会(Medical Research Council)等人)；WO 97/08320(Morphosys)；WO 92/01047(CAT/MRC)；WO 91/17271(Affymax)；以及美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727和5,733,743。Lohning的美国专利号6,753,136已经描述了用于通过经由二硫键附接多肽而在噬菌体粒子表面上展示多肽的方法。如上述参考文献中所述，在噬菌体选择后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区，并且将其用于产生完整抗体(包括人抗体)或任何其他所需的抗原结合片段，并且在任何所需宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中表达。例如，重组产生Fab、Fab'和F(ab')2片段的技术也可以使用本领域已知的方法来利用，所述方法诸如以下文献中披露的那些：WO 92/22324；Mullinax等人,BioTechniques 12:864-869,1992；和Sawai等人,AJRI 34:26-34,1995；和Better等人,Science240:1041-1043,1988。
通常，可以针对适当抗原选择克隆到展示载体中的杂合抗体或杂合抗体片段，以鉴定保持良好结合活性的变体，因为所述抗体或抗体片段将存在于噬菌体或噬菌粒颗粒的表面上。参见例如，Barbas III等人,Phage Display,A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press,纽约州冷泉港,2001)。然而，其他载体形式可以用于此过程，诸如将抗体片段文库克隆到裂解性噬菌体载体(修饰的T7或Lambda Zap系统)中进行选择和/或筛选。
重组抗DLL3抗体的表达.如上所述，可以通过应用重组DNA技术来产生本发明技术的抗体。编码本发明技术的抗DLL3抗体的重组多核苷酸构建体典型地包括与抗DLL3抗体链的编码序列可操作地连接的表达控制序列，所述表达控制序列包括天然缔合的或异源的启动子区域。因此，本发明技术的另一个方面包括含有编码本发明技术的抗DLL3抗体的一种或多种核酸序列的载体。对于一种或多种本发明技术的多肽的重组表达，通过本领域中熟知和如下详述的重组DNA技术将含有编码抗DLL3抗体的核苷酸序列的全部或一部分的核酸插入合适的克隆载体或表达载体(即，含有用于插入的多肽编码序列的转录和翻译的必要元件的载体)中。Lerner等人的美国专利号6,291,160和6,680,192已经描述了用于产生多种载体群体的方法。
一般而言，可用于重组DNA技术中的表达载体通常呈质粒形式。在本公开文本中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明技术旨在包括在技术上不是质粒的、发挥同等功能的此类其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷性逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。此类病毒载体允许感染受试者并且在该受试者中表达构建体。在一些实施方案中，表达控制序列是在能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦将载体掺入合适的宿主中，就将宿主维持在适合于高水平表达编码抗DLL3抗体的核苷酸序列以及收集和纯化抗DLL3抗体(例如，交叉反应的抗DLL3抗体)的条件下。一般参见，U.S.2002/0199213。这些表达载体典型地可作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分在宿主生物中复制。通常，表达载体含有选择标记物，例如氨苄青霉素抗性或潮霉素抗性，以允许检测那些用所需DNA序列转化的细胞。载体还可以编码可用于引导胞外抗体片段的分泌的信号肽，例如果胶裂解酶。参见美国专利号5,576,195。
本发明技术的重组表达载体包含编码具有DLL3结合特性的蛋白质的核酸，所述重组表达载体呈适合于所述核酸在宿主细胞中表达的形式，这意味着所述重组表达载体包括根据用于表达的宿主细胞选择的一种或多种调节序列，所述一种或多种调节序列与待表达的核酸序列可操作地连接。在重组表达载体中，“可操作地连接”旨在意指，目的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中或当将载体引入宿主细胞中时在宿主细胞中)的方式与一个或多个调节序列连接。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。此类调节序列描述于例如以下文献中：Goeddel,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中引导核苷酸序列组成型表达的那些和仅在某些宿主细胞中引导核苷酸序列表达的那些(例如，组织特异性调节序列)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可以取决于如以下等因素：待转化的宿主细胞的选择、所需多肽的表达水平等。可用作重组多肽(例如，抗DLL3抗体)表达的启动子的典型调节序列包括例如但不限于3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶的启动子。诱导型酵母启动子尤其包括来自以下的启动子：醇脱氢酶、异细胞色素C、以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。在一个实施方案中，编码本发明技术的抗DLL3抗体的多核苷酸与ara B启动子可操作地连接并且在宿主细胞中是可表达的。参见美国专利5,028,530。可以将本发明技术的表达载体引入宿主细胞中，从而产生由本文所述的核酸编码的多肽或肽，包括融合多肽(例如，抗DLL3抗体等)。
本发明技术的另一个方面涉及表达抗DLL3抗体的宿主细胞，其含有编码一种或多种抗DLL3抗体的核酸。本发明技术的重组表达载体可以被设计用于在原核或真核细胞中表达抗DLL3抗体。例如，抗DLL3抗体可以在细菌细胞(诸如大肠杆菌)、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、真菌细胞(例如，酵母、酵母细胞)或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞进一步论述于以下文献中：Goeddel,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY185,Academic Press,加利福尼亚州圣地亚哥(1990)。可替代地，可以例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶在体外转录和翻译重组表达载体。先前已经描述了可用于经由表达随机产生的多核苷酸序列来制备并且筛选具有预定特性的多肽(例如，抗DLL3抗体)的方法。参见美国专利号5,763,192；5,723,323；5,814,476；5,817,483；5,824,514；5,976,862；6,492,107；6,569,641。
多肽在原核生物中的表达最常在大肠杆菌中用含有引导融合或非融合多肽表达的组成型或诱导型启动子的载体进行。融合载体将许多氨基酸添加至其中编码的多肽，通常添加至重组多肽的氨基末端。此类融合载体典型地具有三个目的：(i)增加重组多肽的表达；(ii)增加重组多肽的溶解度；以及(iii)通过充当亲和纯化中的配体来帮助重组多肽的纯化。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组多肽的连接处引入蛋白水解切割位点，以使得在纯化融合多肽之后能够从融合部分分离重组多肽。此类酶及其同源识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith和Johnson,1988.Gene 67:31-40)、pMAL(New England Biolabs，马萨诸塞州贝弗利)和pRIT5(Pharmacia，新泽西州皮斯卡塔韦)，它们分别使谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合多肽或多肽A与靶重组多肽融合。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的例子包括pTrc(Amrann等人,(1988)Gene 69:301-315)和pET 11d(Studier等人,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS INENZYMOLOGY 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)60-89)。Pack等人的美国专利号6,294,353；6,692,935已经描述了用于经由多肽融合来靶向组装不同活性肽或蛋白质结构域以产生多功能多肽的方法。一种最大化大肠杆菌中的重组多肽(例如，抗DLL3抗体)表达的策略是在以蛋白水解方式切割重组多肽的能力受损的宿主细菌中表达所述多肽。参见例如，Gottesman,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,AcademicPress,加利福尼亚州圣地亚哥(1990)119-128。另一种策略是改变有待插入表达载体中的核酸的核酸序列，使得每个氨基酸的单独密码子是表达宿主(例如，大肠杆菌)中优先使用的那些密码子(参见例如Wada等人,1992.Nucl.Acids Res.20:2111-2118)。本发明技术的核酸序列的此类改变可以通过标准DNA合成技术来进行。
在另一个实施方案中，抗DLL3抗体表达载体是酵母表达载体。用于在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达的载体的例子包括pYepSec1(Baldari等人,1987.EMBO J.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz,Cell 30:933-943,1982)、pJRY88(Schultz等人,Gene 54:113-123,1987)、pYES2(Invitrogen Corporation,圣地亚哥，加利福尼亚州)和picZ(Invitrogen Corp,圣地亚哥，加利福尼亚州)。可替代地，可以使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达抗DLL3抗体。可用于在培养的昆虫细胞(例如，SF9细胞)中表达多肽(例如，抗DLL3抗体)的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人,Mol.Cell.Biol.3:2156-2165,1983)和pVL系列(Lucklow和Summers,1989.Virology 170:31-39)。
在又另一个实施方案中，使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达编码本发明技术的抗DLL3抗体的核酸。哺乳动物表达载体的例子包括例如但不限于pCDM8(Seed,Nature 329:840,1987)和pMT2PC(Kaufman等人,EMBO J.6:187-195,1987)。当用于哺乳动物细胞时，表达载体的控制功能通常由病毒调节元件提供。例如，常用的启动子源自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。关于可用于表达本发明技术的抗DLL3抗体的原核和真核细胞两者的其他合适的表达系统，参见例如Sambrook等人,MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL.第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press,纽约州冷泉港,1989的第16和17章节。
在另一个实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够引导核酸在特定细胞类型中的表达(例如，组织特异性调节元件)。组织特异性调节元件是本领域已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性例子包括白蛋白启动子(肝脏特异性；Pinkert等人,Genes Dev.1:268-277,1987)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton,Adv.Immunol.43:235-275,1988)、T细胞受体(Winoto和Baltimore,EMBO J.8:729-733,1989)和免疫球蛋白(Banerji等人,1983.Cell 33:729-740；Queen和Baltimore,Cell 33:741-748,1983.)的启动子、神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne和Ruddle,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473-5477,1989)、胰腺特异性启动子(Edlund等人,1985.Science 230:912-916)，以及乳腺特异性启动子(例如，奶乳清启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。还涵盖发育调节的启动子，例如鼠hox启动子(Kessel和Gruss,Science 249:374-379,1990)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman,Genes Dev.3:537-546,1989)。
本发明方法的另一个方面涉及宿主细胞，其中已经引入了本发明技术的重组表达载体。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应当理解，此类术语不仅是指特定的受试者细胞，而且还指此类细胞的子代或潜在子代。因为在后代中由于突变或环境影响可能发生某些修饰，此类子代可能在事实上与亲代细胞不同，但是仍然包括在如本文使用的所述术语的范围内。
宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，抗DLL3抗体可以在细菌细胞(诸如大肠杆菌)、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞中表达。哺乳动物细胞是适合于表达编码免疫球蛋白或其片段的核苷酸区段的宿主。参见Winnacker,From Genes To Clones(VCHPublishers,纽约州,1987)。在本领域中已经开发了许多能够分泌完整异源蛋白的合适的宿主细胞系，并且所述合适的宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、多种COS细胞系、HeLa细胞、L细胞和骨髓瘤细胞系。在一些实施方案中，所述细胞是非人的。这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列，诸如复制起点、启动子、增强子，以及必要的加工信息位点，诸如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止子序列。Queen等人,Immunol.Rev.89:49,1986。说明性表达控制序列是源自内源基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。Co等人,J Immunol.148:1149,1992。其他合适的宿主细胞为本领域技术人员所已知。
可以经由常规转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。如本文所用，术语“转化”和“转染”旨在是指用于将外源核酸(例如，DNA)引入宿主细胞中的各种本领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染、电穿孔、基因枪或基于病毒的转染。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(一般参见Sambrook等人,Molecular Cloning)。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以在以下文献中找到：Sambrook等人(MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL.第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press,纽约州冷泉港,1989)和其他实验室手册。取决于细胞宿主的类型，可以通过熟知的方法将含有目的DNA区段的载体转移到宿主细胞中。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知根据所用的表达载体和转染技术，只有小部分细胞可以将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，通常将编码可选择标记物(例如，对抗生素的抗性)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。多种可选择标记物包括赋予对药物(诸如G418、潮霉素和甲氨蝶呤)的抗性的那些可选择标记物。可以将编码可选择标记物的核酸在与编码抗DLL3抗体的载体相同的载体上引入宿主细胞中，或者可以在单独的载体上引入。可以通过药物选择来鉴定被引入的核酸稳定转染的细胞(例如，已掺入可选择标记基因的细胞将存活，而其他细胞死亡)。
包括本发明技术的抗DLL3抗体的宿主细胞(诸如培养中的原核或真核宿主细胞)可以用于产生(即，表达)重组抗DLL3抗体。在一个实施方案中，所述方法包括在合适的培养基中培养宿主细胞(已经向其中引入了编码抗DLL3抗体的重组表达载体)，从而产生抗DLL3抗体。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括从培养基或宿主细胞分离抗DLL3抗体的步骤。一旦表达，就从培养基和宿主细胞纯化抗DLL3抗体，例如，抗DLL3抗体或抗DLL3抗体相关多肽的收集物。可以根据本领域的标准程序(包括HPLC纯化、柱色谱、凝胶电泳等)纯化抗DLL3抗体。在一个实施方案中，通过Boss等人的美国专利号4,816,397的方法在宿主生物体中产生抗DLL3抗体。通常，抗DLL3抗体链与信号序列一起表达，并且因此被释放到培养基中。然而，如果抗DLL3抗体链不是由宿主细胞自然分泌的，则可以通过用温和的洗涤剂处理来释放抗DLL3抗体链。重组多肽的纯化是本领域熟知的，并且包括硫酸铵沉淀、亲和色谱纯化技术、柱色谱、离子交换纯化技术、凝胶电泳等(一般参见Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,纽约州,1982))。
可以将编码抗DLL3抗体的多核苷酸例如抗DLL3抗体的编码序列掺入转基因中，以供引入转基因动物的基因组中并且随后在转基因动物的乳汁中表达。参见例如，美国专利号5,741,957、5,304,489和5,849,992。合适的转基因包括与来自乳腺特异性基因(诸如酪蛋白或β-乳球蛋白)的启动子和增强子可操作连接的轻链和/或重链的编码序列。对于转基因动物的产生，可以将转基因显微注射到受精的卵母细胞中，或者可以将转基因掺入胚胎干细胞的基因组中，并且将此类细胞的核转移到无核的卵母细胞中。
单链抗体.在一个实施方案中，本发明技术的抗DLL3抗体是单链抗DLL3抗体。根据本发明技术，技术可以适于产生对DLL3蛋白具有特异性的单链抗体(参见例如美国专利号4,946,778)。可以用于产生本发明技术的单链Fv和抗体的技术的例子包括描述于以下文献中的那些：美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等人,Methods in Enzymology,203:46-88,1991；Shu,L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7995-7999,1993；以及Skerra等人,Science 240:1038-1040,1988。
嵌合和人源化抗体.在一个实施方案中，本发明技术的抗DLL3抗体是嵌合抗DLL3抗体。在一个实施方案中，本发明技术的抗DLL3抗体是人源化抗DLL3抗体。在本发明技术的一个实施方案中，供体抗体和受体抗体是来自不同物种的单克隆抗体。例如，受体抗体是人抗体(以使其在人中的抗原性最小化)，在这种情况下所得的CDR移植抗体称为“人源化”抗体。
包含人和非人部分的重组抗DLL3抗体(诸如嵌合单克隆抗体和人源化单克隆抗体)可以使用标准重组DNA技术来制备，并且在本发明技术范围内。对于某些用途，包括本发明技术的抗DLL3抗体的体内用途以及这些药剂在体外检测测定中的用途，可以使用嵌合或人源化抗DLL3抗体。此类嵌合单克隆抗体和人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生。此类有用的方法包括例如但不限于描述于以下文献中的方法：国际申请号PCT/US86/02269；美国专利号5,225,539；欧洲专利号184187；欧洲专利号171496；欧洲专利号173494；PCT国际公开号WO 86/01533；美国专利号4,816,567；5,225,539；欧洲专利号125023；Better等人,1988.Science 240:1041-1043；Liu等人,1987.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443；Liu等人,1987.J.Immunol.139:3521-3526；Sun等人,1987.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218；Nishimura等人,1987.CancerRes.47:999-1005；Wood等人,1985.Nature 314:446-449；Shaw等人,1988.J.Natl.CancerInst.80:1553-1559；Morrison(1985)Science 229:1202-1207；Oi等人(1986)BioTechniques 4:214；Jones等人,1986.Nature 321:552-525；Verhoeyan等人,1988.Science 239:1534；Morrison,Science 229:1202,1985；Oi等人,BioTechniques 4:214,1986；Gillies等人,J.Immunol.Methods,125:191-202,1989；美国专利号5,807,715；以及Beidler等人,1988.J.Immunol.141:4053-4060。例如，可以使用多种技术将抗体人源化，所述技术包括CDR移植(EP 0 239 400；WO 91/09967；美国专利号5,530,101；5,585,089；5,859,205；6,248,516；EP460167)、镶面或表面重修(EP 0 592 106；EP 0 519 596；Padlan E.A.,Molecular Immunology,28:489-498,1991；Studnicka等人,ProteinEngineering 7:805-814,1994；Roguska等人,PNAS 91:969-973,1994)和链改组(美国专利号5,565,332)。在一个实施方案中，用特异性选择的限制性内切酶消化编码鼠抗DLL3单克隆抗体的cDNA，以除去编码Fc恒定区的序列，并且取代编码人Fc恒定区的cDNA的等效部分(参见Robinson等人,PCT/US86/02269；Akira等人,欧洲专利申请184,187；Taniguchi,欧洲专利申请171,496；Morrison等人,欧洲专利申请173,494；Neuberger等人,WO 86/01533；Cabilly等人美国专利号4,816,567；Cabilly等人,欧洲专利申请125,023；Better等人(1988)Science 240:1041-1043；Liu等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443；Liu等人(1987)J Immunol 139:3521-3526；Sun等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218；Nishimura等人(1987)Cancer Res47:999-1005；Wood等人(1985)Nature 314:446-449；以及Shaw等人(1988)J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559；美国专利号6,180,370；美国专利号6,300,064；6,696,248；6,706,484；6,828,422。
在一个实施方案中，本发明技术提供人源化抗DLL3抗体的构建，所述人源化抗DLL3抗体不太可能诱导人抗小鼠抗体(下文称为“HAMA”)应答，同时仍然具有有效的抗体效应子功能。如本文所用，关于抗体的术语“人”和“人源化”涉及预期在人受试者中引发治疗上可耐受的弱免疫原性应答的任何抗体。在一个实施方案中，本发明技术提供人源化抗DLL3抗体、重链和轻链免疫球蛋白。
CDR移植抗体.在一些实施方案中，本发明技术的抗DLL3抗体是抗DLL3CDR移植抗体。通常，用于产生抗DLL3 CDR抗体的供体和受体抗体是来自不同物种的单克隆抗体；典型地，受体抗体是人抗体(以使其在人中的抗原性最小化)，在这种情况下所得CDR移植抗体称为“人源化”抗体。详细地说，“人源化抗体”是指包含至少一条链的抗体，所述链包含来自人抗体链的可变区框架残基和来自非人抗体(例如，小鼠)的至少一个互补决定区(CDR)。如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有源自人免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中衍生自另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)的CDR序列已经被移植到人框架序列上的抗体。移植物可以具有受体抗体的单个VH或VL内的单个CDR(或甚至单个CDR的一部分)，或者可以具有VH和VL中的一个或两个内的多个CDR(或其部分)。通常，受体抗体的所有可变结构域中的所有三个CDR都将被相应的供体CDR替代，但只需要尽可能多的替代，以使所得的CDR移植抗体与DLL3蛋白充分结合。以下文献中传授了用于产生CDR移植和人源化抗体的方法：Queen等人的美国专利号5,585,089；美国专利号5,693,761；美国专利号5,693,762；和Winter的U.S.5,225,539；和EP 0682040。以下文献中传授了可用于制备VH和VL多肽的方法：Winter等人,美国专利号4,816,397；6,291,158；6,291,159；6,291,161；6,545,142；EP 0368684；EP 0451216；和EP 0120694。
选择来自相同家族和/或相同家族成员的合适的框架区候选物后，重链和轻链可变区中的一个或两个是通过将来自起源物种的CDR移植到杂合框架区中而产生的。可以使用本领域技术人员已知的常规方法来完成关于以上任一方面的具有杂合可变链区的杂合抗体或杂合抗体片段的组装。例如，可以通过寡核苷酸合成和/或PCR来产生编码本文所述的杂合可变结构域(即，基于靶物种的框架和来自起源物种的CDR)的DNA序列。也可以使用合适的限制性内切酶从起源物种抗体分离编码CDR区的核酸，并且通过用合适的连接酶连接而连接到靶物种框架中。可替代地，可以通过定点诱变来改变起源物种抗体的可变链的框架区。
因为杂合体是从对应于每个框架区的多个候选物之间的选择构建的，存在适合于根据本文所述原理构建的许多序列组合。因此，可以组装杂合体的文库，其成员具有单独框架区的不同组合。此类文库可以是序列的电子数据库集合或杂合体的物理集合。
此过程典型地不会改变移植CDR侧翼的受体抗体的FR。然而，本领域技术人员有时可以通过替代给定FR的某些残基以使FR与供体抗体的相应FR更相似，来提高所得抗DLL3CDR移植抗体的抗原结合亲和力。合适的取代位置包括与CDR相邻的氨基酸残基，或能够与CDR相互作用的氨基酸残基(参见例如，US 5,585,089，尤其是第12-16栏)。或者本领域技术人员可以从供体FR开始并对其进行修饰以使其与受体FR或人共有FR更相似。用于进行这些修饰的技术是本领域已知的。特别是如果所得的FR符合该位置的人共有FR或者与此类共有FR至少90％或更多相同，则与具有完全人FR的相同抗体相比，这样做可能不会显著增加所得经修饰的抗DLL3 CDR移植抗体的抗原性。
双特异性抗体(BsAb).双特异性抗体是可以同时与具有不同结构的两个靶标(例如，两个不同的靶抗原、同一靶抗原上的两个不同表位)结合的抗体。BsAb可以例如通过组合识别相同或不同抗原的不同表位的重链和/或轻链来制备。在一些实施方案中，通过分子功能，双特异性结合剂在其两个结合臂中的一个结合臂(一个VH/VL对)上结合一个抗原(或表位)，并在其第二个臂(不同的VH/VL对)上结合不同的抗原(或表位)。依据此定义，双特异性结合剂具有两个不同的抗原结合臂(特异性和CDR序列两者均不同)，并且对于其结合的每种抗原是单价的。
本发明技术的双特异性抗体(BsAb)和双特异性抗体片段(BsFab)具有与例如DLL3特异性结合的至少一个臂和与第二靶抗原特异性结合的至少一个其他臂。在某些实施方案中，BsAb能够与在细胞表面上表达DLL3抗原的肿瘤细胞结合。
使用分子工程化可以产生多种双特异性融合蛋白。例如，已经构建了BsAb，其利用完整的免疫球蛋白框架(例如，IgG)、单链可变片段(scFv)或其组合。在一些实施方案中，双特异性融合蛋白是二价的，其包含例如具有针对一种抗原的单一结合位点的scFv和具有针对第二抗原的单一结合位点的Fab片段。在一些实施方案中，双特异性融合蛋白是二价的，其包含例如具有针对一种抗原的单一结合位点的scFv和具有针对第二抗原的单一结合位点的另一种scFv片段。在其他实施方案中，双特异性融合蛋白是四价的，其包含例如具有针对一种抗原的两个结合位点的免疫球蛋白(例如，IgG)和针对第二抗原的两个相同scFv。已经显示由两个串联的scFv单元构成的BsAb是临床上成功的双特异性抗体形式。在一些实施方案中，BsAb包含两个串联的单链可变片段(scFv)，其被设计成使得结合肿瘤抗原(例如，DLL3)的scFv与结合不同靶抗原的scFv连接。
用于产生BsAb的最新方法包括工程化重组单克隆抗体，其具有另外的半胱氨酸残基，使得它们比更常见的免疫球蛋白同种型更牢固地交联。参见例如，FitzGerald等人,Protein Eng.10(10):1221-1225(1997)。另一种方法是工程化重组融合蛋白，其连接具有所需的双重特异性的两种或更多种不同的单链抗体或抗体片段区段。参见例如，Coloma等人,Nature Biotech.15:159-163(1997)。使用分子工程化可以产生多种双特异性融合蛋白。
连接两种或更多种不同单链抗体或抗体片段的双特异性融合蛋白以类似的方式产生。重组方法可以用于产生多种融合蛋白。在一些特定的实施方案中，根据本发明技术的BsAb包含含有重链和轻链的免疫球蛋白以及scFv。在一些特定的实施方案中，scFv与本文公开的任何DLL3免疫球蛋白的重链的C末端连接。在一些特定的实施方案中，scFv与本文公开的任何DLL3免疫球蛋白的轻链的C末端连接。在各种实施方案中，scFv经由接头序列与重链或轻链连接。通过PCR反应，将重链Fd与scFv进行框内连接所必需的适当接头序列引入VL和Vκ结构域中。然后将编码scFv的DNA片段连接至含有编码CH1结构域的DNA序列的支架(staging)载体中。切下所得的scFv-CH1构建体，并且将其连接至含有编码DLL3抗体的VH区的DNA序列的载体中。所得载体可用于转染适当的宿主细胞(诸如哺乳动物细胞)，以表达双特异性融合蛋白。
在一些实施方案中，接头的长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，接头的特征在于其倾向于不采用刚性三维结构，而是为多肽提供灵活性(例如，第一和/或第二抗原结合位点)。在一些实施方案中，基于赋予BsAb的特定的特性，例如像稳定性增加，在本文所述的BsAb中采用接头。在一些实施方案中，本发明技术的BsAb包含G4S接头(SEQ ID NO:82)。在一些特定的实施方案中，本发明技术的BsAb包含(G4S)n接头，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多(SEQ ID NO:83)。
Fc修饰.在一些实施方案中，本发明技术的抗DLL3抗体包含变体Fc区，其中所述变体Fc区包含相对于野生型Fc区(或亲本Fc区)的至少一个氨基酸修饰，使得所述分子对Fc受体(例如，FcγR)的亲和力发生了改变，条件是基于Fc-Fc受体相互作用的晶体学和结构分析(诸如Sondermann等人,Nature,406:267-273(2000)所披露的那些)，所述变体Fc区在与Fc受体直接接触的位置没有取代。Fc区内与Fc受体(诸如FcγR)直接接触的位置的例子包括氨基酸234-239(铰链区)、氨基酸265-269(B/C环)、氨基酸297-299(C7E环)和氨基酸327-332(F/G)环。
在一些实施方案中，本发明技术的抗DLL3抗体对激活和/或抑制性受体具有改变的亲和力，其中变体Fc区具有一个或多个氨基酸修饰，其中所述一个或多个氨基酸修饰是N297被取代为丙氨酸或K322被取代为丙氨酸。
糖基化修饰.在一些实施方案中，本发明技术的抗DLL3抗体具有Fc区，所述Fc区与亲本Fc区相比含有变体糖基化。在一些实施方案中，变体糖基化包括岩藻糖的不存在；在一些实施方案中，变体糖基化是由于在GnT1缺陷性CHO细胞中表达所致。
在一些实施方案中，相对于与目的抗原(例如，DLL3)结合的适当参考抗体，本发明技术的抗体可以具有经修饰的糖基化位点，而不改变抗体的功能性，例如与抗原的结合活性。如本文所用，“糖基化位点”包括抗体中将与寡糖(即，含有连接在一起的两个或更多个单糖的碳水化合物)特异性和共价附接的任何特定氨基酸序列。
寡糖侧链典型地经由N连接或O连接与抗体的骨架连接。N-连接的糖基化是指寡糖部分与天冬酰胺残基的侧链附接。O-连接的糖基化指寡糖部分附接至羟基氨基酸，例如丝氨酸、苏氨酸。例如，缺乏某些寡糖(包括岩藻糖)和末端N-乙酰葡糖胺的Fc-糖型(hDLL3-IgGln)可以在特殊的CHO细胞中产生，并且展现出增强的ADCC效应子功能。
在一些实施方案中，通过添加或缺失糖基化位点来修饰本文公开的免疫球蛋白相关组合物的碳水化合物含量。修饰抗体的碳水化合物含量的方法是本领域中熟知的并且包括在本发明技术中，参见例如美国专利号6,218,149；EP 0359096B1；美国专利公开号US2002/0028486；国际专利申请公开WO 03/035835；美国专利公开号2003/0115614；美国专利号6,218,149；美国专利号6,472,511；上述专利都是通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，通过使抗体的一个或多个内源碳水化合物部分缺失来修改抗体(或其相关部分或组分)的碳水化合物含量。在一些特定的实施方案中，本发明技术包括通过将位置297的天冬酰胺修饰为丙氨酸来使抗体Fc区的糖基化位点缺失。
工程化糖型可用于多种目的，包括但不限于增强或减弱效应子功能。工程化的糖型可以通过本领域技术人员已知的任何方法来产生，例如通过使用工程化的或变体表达毒株，通过与一种或多种酶(例如，N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII))共表达，通过在多种生物体或来自多种生物体的细胞系中表达包含Fc区的分子，或者通过在已经表达包含Fc区的分子后修饰一种或多种碳水化合物。用于产生工程化糖型的方法是本领域已知的，并且包括但不限于描述于以下文献中的那些：Umana等人,1999,Nat.Biotechnol.17:176-180；Davies等人,2001,Biotechnol.Bioeng.74:288-294；Shields等人,2002,J.Biol.Chem.277:26733-26740；Shinkawa等人,2003,J.Biol.Chem.278:3466-3473；美国专利号6,602,684；美国专利申请序列号10/277,370；美国专利申请序列号10/113,929；国际专利申请公开WO 00/61739A1；WO 01/292246A1；WO 02/311140A1；WO 02/30954A1；POTILLEGENTTM技术(Biowa,Inc.，新泽西州普林斯顿)；GLYCOMABTM糖基化工程技术(GLYCART biotechnology AG，瑞士苏黎士)；这些文献各自通过引用以其整体并入本文。参见例如国际专利申请公开WO 00/061739；美国专利申请公开号2003/0115614；Okazaki等人,2004,JMB,336:1239-49。
融合蛋白.在一个实施方案中，本发明技术的抗DLL3抗体是融合蛋白。当与第二蛋白质融合时，本发明技术的抗DLL3抗体可以用作抗原标签。可以与多肽融合的结构域的例子不仅包括异源信号序列，还包括其他异源功能区。融合不一定是直接的，而可以是通过接头序列进行。此外，本发明技术的融合蛋白也可以工程化以改善抗DLL3抗体的特征。例如，可以将另外的氨基酸(特别是带电荷的氨基酸)的区域添加至抗DLL3抗体的N末端以改善在从宿主细胞纯化或随后的处理和储存过程中的稳定性和持久性。另外，可以将肽部分添加到抗DLL3抗体以促进纯化。可以在最终制备抗DLL3抗体之前去除此类区域。添加肽部分以促进多肽的处理是本领域熟知的常规技术。可以将本发明技术的抗DLL3抗体与标记序列(诸如促进融合多肽的纯化的肽)融合。在选择的实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽(SEQ ID NO:84)，诸如在pQE载体(QIAGEN，Inc.，查茨沃斯(Chatsworth)，加利福尼亚州)中提供的标签以及其他，其中许多是可商购的。如在Gentz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824,1989中描述的，例如六组氨酸(SEQ ID NO:84)提供了方便的融合蛋白纯化。另一个可用于纯化的肽标签即“HA”标签对应于源自流感血凝素蛋白的表位。Wilson等人,Cell 37:767,1984。
因此，任何这些上述融合蛋白可以使用本发明技术的多核苷酸或多肽进行工程化。另外，在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白显示增加的体内半衰期。
与单独的单体分泌的蛋白质或蛋白质片段相比，具有二硫键连接的二聚体结构(由于IgG)的融合蛋白可以更高效地结合和中和其他分子。Fountoulakis等人,J.Biochem.270:3958-3964,1995。
类似地，EP-A-O 464 533(加拿大对应案2045869)公开了融合蛋白，其包含免疫球蛋白分子恒定区的各个部分以及另一种人蛋白或其片段。在许多情况下，融合蛋白中的Fc部分在治疗和诊断中是有益的，因此可以导致例如改善的药代动力学特性。参见EP-A 0232262。可替代地，可能需要在表达、检测和纯化融合蛋白后缺失或修饰Fc部分。例如，如果使用融合蛋白作为抗原用于免疫，则Fc部分可能妨碍治疗和诊断。在药物发现中，例如人蛋白(诸如hIL-5)已经与Fc部分融合，以用于高通量筛选测定以鉴定hIL-5的拮抗剂的目的。Bennett等人,J.Molecular Recognition 8:52-58,1995；Johanson等人,J.Biol.Chem.,270:9459-9471,1995。
抗原的制备：通过允许根据基因操纵使宿主细胞产生编码抗原蛋白的基因来获得DLL3抗原。具体地，产生能够表达抗原基因的载体，然后将所述载体引入宿主细胞中，使得所述基因在其中表达，并且之后，可以纯化所表达的抗原。还可以通过用基于上述基因操纵的表达抗原的细胞或表达抗原的细胞系免疫动物的方法来获得抗体。
可替代地，还可以在不使用抗原蛋白的情况下通过以下方式获得抗体：将抗原蛋白的cDNA掺入表达载体中，然后向待免疫的动物施用所述表达载体，并且在由此免疫的动物体内表达所述抗原蛋白，使得在其中产生针对所述抗原蛋白的抗体。
本发明中使用的抗DLL3抗体没有特别限制。例如，可以适当地使用由本申请的序列表中所示出的氨基酸序列指定的抗体。用于本发明的抗DLL3抗体理想地是具有以下特性的抗体：
(1)具有以下特性的抗体：
(a)与DLL3特异性结合，以及
(b)具有通过与DLL3结合内化到表达DLL3的细胞中的活性；或
(2)根据以上(1)所述的抗体，其中所述DLL3是人DLL3。
用于获得本发明的针对DLL3的抗体的方法没有特别限制，只要可以获得抗DLL3抗体即可。优选使用保留DLL3构象的DLL3作为抗原。
用于获得抗体的方法的一个例子可以包括DNA免疫方法。DNA免疫方法是涉及用抗原表达质粒转染动物(例如，小鼠或大鼠)个体，然后在个体中表达抗原以诱导针对抗原的免疫力的方法。转染方法包括将质粒直接注射到肌肉的方法、将转染试剂(诸如脂质体或聚乙烯亚胺)注射到静脉的方法、使用病毒载体的方法、使用基因枪注射附接到质粒的金颗粒的方法、快速将大量质粒溶液注入静脉的流体动力学方法等。关于将表达质粒注射到肌肉的转染方法，称作体内电穿孔的技术(其涉及将电穿孔应用到质粒的肌内注射位点)已知为提高表达水平的方法(Aihara H,Miyazaki J.Nat Biotechnol.1998年9月；16(9):867-70，或Mir LM,Bureau MF,Gehl J,Rangara R,Rouy D,Caillaud JM,Delaere P,Branellec D,Schwartz B,Scherman D.Proc Natl Acad Sci U S A.1999年4月13日；96(8):4262-7)。该方法通过在肌内注射质粒前用透明质酸酶处理肌肉来进一步提高表达水平(McMahon JM1,Signori E,Wells KE,Fazio VM,Wells DJ.,Gene Ther.2001年8月；8(16):1264-70)。此外，杂交瘤生产可以通过已知方法进行，并且还可以使用例如Hybrimune杂交瘤生产系统(Cyto Pulse Sciences,Inc.)进行。
获得单克隆抗体的具体例子可以包括以下程序：
(a)可以通过将DLL3 cDNA掺入表达载体(例如，pcDNA3.1；Thermo FisherScientific Inc.)中来诱导免疫反应，并且通过诸如电穿孔或基因枪的方法向要免疫的动物(例如，大鼠或小鼠)直接施用所述载体，以便在动物的身体中表达DLL3。可以通过电穿孔等进行一次或多次(如果需要的话，优选多次)载体施用以提高抗体滴度；
(b)从上述动物(其中已诱导免疫反应)中收集含有产生抗体的细胞的组织(例如，淋巴结)；
(c)骨髓瘤细胞(在下文中，称为“骨髓瘤”)(例如，小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14细胞)的制备；
(d)在产生抗体的细胞与骨髓瘤之间的细胞融合；
(e)产生目的抗体的杂交瘤组的选择；
(f)分裂成单细胞克隆(克隆)；
(g)任选地，培养用于大量生产单克隆抗体的杂交瘤，或培育接种杂交瘤的动物；和/或
(h)研究由此产生的单克隆抗体的生理活性(内化活性)和结合特异性，或检查抗体作为标记试剂的特性。
本文中所用的用于测量抗体滴度的方法的例子可以包括但不限于流式细胞术和细胞-ELISA。
本发明的抗体还包括为了降低对人的异种抗原性的目的而经人工修饰的基因重组抗体(诸如嵌合抗体、人源化抗体和人抗体，以及上述针对DLL3的单克隆抗体)。这些抗体可以通过已知的方法产生。
嵌合抗体的例子可以包括其中可变区和恒定区彼此异源的抗体，诸如通过将小鼠源性或大鼠源性抗体的可变区与人源性恒定区缀合而形成的嵌合抗体(参见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855,(1984))。
人源化抗体的例子可以包括通过仅将互补决定区(CDR)掺入人源性抗体中形成的抗体(参见Nature(1986)321,第522-525页)、通过将来自一些框架以及CDR序列的氨基酸残基根据CDR移植方法掺入人抗体中而形成的抗体(国际公开号WO 90/07861)、和通过在保持抗原结合能力的同时修饰一些CDR的氨基酸序列而形成的抗体。
本发明的抗体的进一步例子可以包括与DLL3结合的人抗体。抗DLL3人抗体意指仅具有源自人染色体的抗体的基因序列的人抗体。抗DLL3人抗体可以通过使用具有包含人抗体的重链和轻链基因的人染色体片段的产生人抗体的小鼠的方法获得(参见Tomizuka,K.等人,Nature Genetics(1997)16,第133-143页；Kuroiwa,Y.等人,Nucl.Acids Res.(1998)26,第3447-3448页；Yoshida,H.等人,Animal Cell Technology:Basic and AppliedAspects第10卷,第69-73页(Kitagawa,Y.,Matsuda,T.和Iijima,S.编辑)，KluwerAcademic Publishers,1999；Tomizuka,K.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97,第722-727页；等)。
可以通过以下方式特异性产生此类产生人抗体的小鼠：使用经基因修饰的动物(其内源性免疫球蛋白重链和轻链的基因座被破坏，并且取而代之的是使用酵母人工染色体(YAC)载体等引入了人免疫球蛋白重链和轻链的基因座)，然后由此类经基因修饰的动物产生出敲除动物和转基因动物，然后使此类动物彼此繁殖。
另外，抗DLL3人抗体还可以通过以下方式获得：根据基因重组技术，用编码此类人抗体的重链和轻链中的每一个的cDNA或者优选用包含所述cDNA的载体转化真核细胞，然后培养产生经基因修饰的人单克隆抗体的转化细胞，使得可以从培养上清液中获得抗体。
在此上下文中，真核细胞并且优选哺乳动物细胞(诸如CHO细胞、淋巴细胞或骨髓瘤)可以例如用作宿主。
此外，获得噬菌体展示源性人抗体的方法也是已知的，所述人抗体选自人抗体文库(参见Wormstone,I.M.等人,Investigative Ophthalmology&Visual Science.(2002)43(7),第2301-2308页；Carmen,S.等人,Briefings in Functional Genomics andProteomics(2002),1(2),第189-203页；Siriwardena,D.等人,Ophthalmology(2002)109(3),第427-431页；等)。
例如，可以应用噬菌体展示方法，所述方法包括允许人抗体的可变区在噬菌体表面上表达为单链抗体(scFv)，然后选择与抗原结合的噬菌体(Nature Biotechnology(2005),23,(9),第1105-1116页)。
通过分析由于其与抗原的结合能力而被选择的噬菌体基因，可以确定编码与抗原结合的人抗体的可变区的DNA序列。
一旦确定与抗原结合的scFv的DNA序列，就产生具有上述序列的表达载体，然后将产生的表达载体引入适当的宿主中，并且可以允许在其中表达，从而获得人抗体(国际公开号WO 92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438和WO95/15388，Annu.Rev.Immunol(1994)12,第433-455页,Nature Biotechnology(2005)23(9),第1105-1116页)。
本说明书中的氨基酸取代优选是保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是在与某些氨基酸侧链相关的氨基酸基团内发生的取代。优选的氨基酸基团如下：酸性基团＝天冬氨酸和谷氨酸；碱性基团＝赖氨酸、精氨酸和组氨酸；非极性基团＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；以及不带电荷的极性家族＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。其他优选的氨基酸基团如下：脂肪族羟基＝丝氨酸和苏氨酸；含酰胺基团＝天冬酰胺和谷氨酰胺；脂肪族基团＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；和芳族基团＝苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。此类氨基酸取代优选在不损害具有原始氨基酸序列的物质的特性的情况下进行。V.抗DLL3抗体的鉴定和表征
用于鉴定和/或筛选本发明技术的抗DLL3抗体的方法。用于在针对DLL3多肽的抗体中鉴定和筛选对DLL3蛋白具有所需特异性的抗体(例如，与DLL3的细胞外结构域结合的那些)的方法包括本领域中已知的任何免疫介导的技术。可以通过本领域普通技术人员熟知的多种方法在体外检测免疫应答的组分。例如，(1)可以将细胞毒性T淋巴细胞与放射性标记的靶细胞一起孵育，并通过放射性的释放来检测这些靶细胞的裂解；(2)可以将辅助T淋巴细胞与抗原和抗原呈递细胞一起孵育，并通过标准方法测量细胞因子的合成和分泌(Windhagen A等人,Immunity,2:373-80,1995)；(3)可以将抗原呈递细胞与全蛋白抗原一起孵育，并且通过T淋巴细胞激活测定或生物物理学方法检测该抗原在MHC上的呈递(Harding等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,86:4230-4,1989)；(4)可以将肥大细胞与交联其Fc-ε受体的试剂一起孵育，并且通过酶免疫测定来测量组胺释放(Siraganian等人,TIPS,4:432-437,1983)；以及(5)酶联免疫吸附测定(ELISA)。
类似地，也可以通过本领域普通技术人员熟知的多种方法来检测模型生物体(例如，小鼠)或人受试者中免疫应答的产物。例如，(1)可以通过目前用于临床实验室中的标准方法例如ELISA容易地检测响应于疫苗接种的抗体的产生；(2)可以通过刮伤皮肤表面并放置无菌容器以捕获刮痕部位上的迁移细胞来检测免疫细胞向炎症部位的迁移(Peters等人,Blood,72:1310-5,1988)；(3)可以使用3H-胸苷测量外周血单个核细胞(PBMC)响应于有丝分裂原或混合淋巴细胞反应的增殖；(4)可以通过将PBMC与标记的颗粒一起置于孔中来测量粒细胞、巨噬细胞和其他吞噬细胞在PBMC中的吞噬能力(Peters等人,Blood,72:1310-5,1988)；和(5)可以通过用针对CD分子(诸如CD4和CD8)的抗体标记PBMC并且测量表达这些标记物的PBMC的分数来测量免疫系统细胞的分化。
在一个实施方案中，利用DLL3肽在可复制的遗传包装的表面上的展示来选择本发明技术的抗DLL3抗体。参见例如，美国专利号5,514,548；5,837,500；5,871,907；5,885,793；5,969,108；6,225,447；6,291,650；6,492,160；EP 585 287；EP 605522；EP 616640；EP1024191；EP 589 877；EP 774 511；EP 844 306。已经描述了可用于产生/选择丝状噬菌体颗粒的方法，所述丝状噬菌体颗粒含有编码具有所需特异性的结合分子的噬菌粒基因组。参见例如，EP 774 511；US 5871907；US 5969108；US 6225447；US 6291650；US 6492160。
在一些实施方案中，利用DLL3肽在酵母宿主细胞的表面上的展示来选择本发明技术的抗DLL3抗体。可用于通过酵母表面展示分离scFv多肽的方法已经由Kieke等人,Protein Eng.1997Nov；10(11):1303-10描述。
在一些实施方案中，使用核糖体展示选择本发明技术的抗DLL3抗体。可用于使用核糖体展示来鉴定肽文库中配体的方法已经由Mattheakis等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:9022-26,1994；和Hanes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4937-42,1997。
在某些实施方案中，使用DLL3肽的tRNA展示来选择本发明技术的抗DLL3抗体。可用于使用tRNA展示进行配体的体外选择的方法已经由Merryman等人,Chem.Biol.,9:741-46,2002描述。
在一个实施方案中，使用RNA展示选择本发明技术的抗DLL3抗体。可用于使用RNA展示文库选择肽和蛋白质的方法已经由Roberts等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:12297-302,1997；和Nemoto等人,FEBS Lett.,414:405-8,1997描述。可用于使用非天然RNA展示文库选择肽和蛋白质的方法已经由Frankel等人,Curr.Opin.Struct.Biol.,13:506-12,2003。
在一些实施方案中，将本发明技术的抗DLL3抗体在革兰氏阴性细菌的周质中表达，并且与标记的DLL3蛋白混合。参见WO 02/34886。在表达对DLL3蛋白具有亲和力的重组多肽的克隆中，与抗DLL3抗体结合的标记的DLL3蛋白的浓度增加，并且允许细胞与文库的其余部分分离，如在Harvey等人,Proc.Natl.Acad.Sci.22:9193-98 2004和美国专利公开号2004/0058403中所描述的。
在选择所需的抗DLL3抗体之后，预期可以通过本领域技术人员已知的任何技术(例如，原核或真核细胞表达等)大量生产所述抗体。抗DLL3抗体(它们是例如但不限于抗DLL3杂合抗体或片段)可以通过以下方式来产生：使用常规技术构建编码抗体重链的表达载体，在所述抗体重链中保留起源物种抗体结合特异性所需的CDR和(如果需要)可变区框架的最小部分(如根据本文所述的技术工程化)源自起源物种抗体，并且抗体的剩余部分源自可以如本文所述操纵的靶物种免疫球蛋白，从而产生用于表达杂合抗体重链的载体。
DLL3结合的测量。在一些实施方案中，DLL3结合测定指一种测定形式，其中DLL3蛋白和抗DLL3抗体在适合于DLL3蛋白与抗DLL3抗体之间结合和评估DLL3蛋白与抗DLL3抗体之间的结合量的条件下混合。将结合量与合适的对照进行比较，所述对照可以是在不存在DLL3蛋白的情况下的结合量、在存在非特异性免疫球蛋白组合物的情况下的结合量或二者。结合量可以通过任何合适的方法来评估。结合测定法包括例如ELISA、放射免疫测定、临近闪烁测定、荧光能量转移测定、液相色谱、膜过滤测定等。用于直接测量与抗DLL3抗体结合的DLL3蛋白的生物物理学测定是例如核磁共振、荧光、荧光偏振、表面等离子体共振(BIACORE芯片)、生物膜层干涉法等。通过本领域已知的标准测定来测定特异性结合，所述标准测定是例如放射性配体结合测定、ELISA、FRET、免疫沉淀、SPR、NMR(2D-NMR)、质谱法等。如果候选抗DLL3抗体的特异性结合比在不存在候选抗DLL3抗体的情况下观察到的结合高至少1％，则所述候选抗DLL3抗体可用作抗本发明技术的抗DLL3抗体。
通过将显示与上述重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列的高同一性的序列组合在一起，有可能选择具有与每个上述抗体的生物学活性相当的生物学活性的抗体。此类同一性通常是以下的同一性：80％或更多、优选90％或更多、更优选95％或更多并且最优选99％或更多。此外，还通过结合包含相对于重链或轻链的氨基酸序列的一个或几个其氨基酸残基的取代、缺失或添加的重链与轻链的氨基酸序列，可以选择具有与每种上述抗体的生物学活性相当的生物学活性的抗体。
可以通过使用Clustal W版本2(Larkin MA,Blackshields G,Brown NP,ChennaR,McGettigan PA,McWilliam H,Valentin F,Wallace IM,Wilm A,Lopez R,Thompson JD,Gibson TJ and Higgins DG(2007),“Clustal W and Clustal X version 2.0”,Bioinformatics.23(21):2947-2948)的默认参数比对序列来确定两种类型的氨基酸序列之间的同一性。
如果新产生的人抗体与本说明书中描述的任一种大鼠抗人DLL3抗体、嵌合抗人DLL3抗体或人源化抗人DLL3抗体所结合的部分肽或部分三维结构结合，可以确定人抗体与所述大鼠抗人DLL3抗体、嵌合抗人DLL3抗体或人源化抗人DLL3抗体结合的相同表位结合。可替代地，通过证实人抗体与本说明书中描述的大鼠抗人DLL3抗体、嵌合抗人DLL3抗体或人源化抗人DLL3抗体竞争所述抗体与DLL3的结合，可以确定人抗体结合与本说明书中描述的大鼠抗人DLL3抗体、嵌合抗人DLL3抗体或人源化抗人DLL3抗体所结合的表位相同的表位，即使尚未确定表位的特定序列或结构也是如此。在本说明书中，当通过这些确定方法中的至少一种确定人抗体“结合相同的表位”时，结论是新制备的人抗体与本说明书中所描述的大鼠抗人DLL3抗体、嵌合抗人DLL3抗体或人源化抗人DLL3抗体“结合相同的表位”。当确认人抗体与同一表位结合时，则预期所述人抗体应具有与大鼠抗人DLL3抗体、嵌合抗人DLL3抗体或人源化抗人DLL3抗体的生物学活性相当的生物学活性。
根据已知方法等评估通过上述方法获得的嵌合抗体、人源化抗体或人抗体的针对抗原的结合活性，使得可以选择优选的抗体。
用于比较抗体的特性的另一指标的一个例子可以包括抗体的稳定性。差示扫描量热仪(DSC)是能够迅速且准确地测量热变性中点(Tm)的装置，所述热变性中点(Tm)用作蛋白质相对结构稳定性的良好指标。通过使用DSC测量Tm值并且对所获得的值进行比较，可以比较热稳定性的差异。已知抗体的保存稳定性与抗体的热稳定性具有一定的相关性(LoriBurton等人,Pharmaceutical Development and Technology(2007)12,第265-273页)，并且因此，可以使用热稳定性作为指标来选择优选的抗体。用于选择抗体的指标的其他例子可以包括在合适的宿主细胞中的高产率和在水溶液中的低凝集。例如，因为具有最高产率的抗体并不总是展现出最高的热稳定性，因此有必要通过基于上述指标对其全面确定来选择最适合于向人施用的抗体。
所获得的抗体可以纯化至同质状态。为了分离和纯化抗体，可以使用用于普通蛋白质的分离和纯化方法。例如，适当选择柱色谱法、过滤、超滤、盐析、透析、制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦并且相互组合，使得可以分离并且纯化抗体(Strategies forProtein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual,DanielR.Marshak等人编辑,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；和Antibodies:ALaboratory Manual.编辑Harlow和David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但分离和纯化方法的例子不限于此。
色谱的例子可以包括亲和色谱、离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱和吸收色谱。
这些色谱技术可以使用液相色谱法(诸如HPLC或FPLC)进行。
亲和色谱中使用的柱的例子可以包括蛋白A柱和蛋白G柱。涉及使用蛋白A的柱的例子可以包括Hyper D、POROS和琼脂糖凝胶F.F.(Pharmacia)。
而且，使用固定化抗原的载体，可以通过利用抗体与抗原的结合活性来纯化抗体。
VI.抗DLL3抗体-药物缀合物(ADC)
可以将本文所述的抗DLL3抗体(例如，2-C8-A、6-G23-F和10-O18-A或人抗体：H2-C8-A、H2-C8-A-2、H2-C8-A-3、H6-G23-F、H6-G23-F-2、H6-G23-F-3、H10-O18-A、H10-O18-A-2和H10-O18-A-3)经由接头结构部分与药物缀合，以制备抗DLL3抗体-药物缀合物(ADC)。所述药物没有特别限制，只要它具有可以连接到接头结构的取代基或部分结构即可。抗DLL3抗体-药物缀合物(ADC)可以根据所缀合的药物用于多种目的。此类药物的例子可以包括具有抗肿瘤活性的物质、对血液疾病有效的物质、对自身免疫疾病有效的物质、抗炎物质、抗微生物物质、抗真菌物质、抗寄生虫物质、抗病毒物质和抗麻醉物质。
本发明的抗体-药物缀合物由下式表示：
[式36]
m1表示抗体-药物缀合物中每个抗体分子缀合的药物分子的数量，Ab表示抗体或抗体的功能片段，L表示连接Ab与D的接头，并且D表示药物。
A.药物
本文中描述了本发明的抗体-药物缀合物中缀合的药物D。本发明的药物D优选是抗肿瘤化合物。当接头的一部分或全部在肿瘤细胞中被切割并且抗肿瘤化合物部分被释放时，抗肿瘤化合物产生抗肿瘤作用。当接头与药物在键合部分被切割分离时，释放呈原始结构的抗肿瘤化合物并且发挥原始抗肿瘤作用。
本发明的抗体-药物缀合物中的抗肿瘤化合物是由以下通式(V)表示的吡咯并苯二氮衍生物(PBD衍生物)：
[式37]
下面更详细描述了所述式的可变基团。
星号表示与接头L键合。
n1表示2至8的整数，并且优选2至6的整数，并且更优选3至5的整数。
下标n1为2至8的整数、优选2至6的整数并且更优选3至5的整数的烷基链可以包含双键。
A表示螺键合的三至五元饱和烃环或三至五元饱和杂环，并且优选三至五元饱和烃环(环丙烷、环丁烷或环戊烷)、更优选环丙烷或环丁烷，并且最优选环丙烷。
螺键合的三至五元饱和烃环可以被一至四个卤素原子取代，并且可以优选被一或两个氟原子取代(例如，2,2-二氟环丙烷)。
R1和R2各自独立地表示C1至C6烷氧基、C1至C6烷基、氢原子、羟基、硫醇基团、C1至C6烷硫基、卤素原子或-NR'R”，并且各自优选是C1至C6烷氧基、C1至C6烷基或羟基、更优选C1至C3烷氧基并且最优选甲氧基。
R3、R4和R5如以下(i)至(iii)中的任一个所描述的。
i.化合物实施方案一
如果R3和R4与R3和R4所结合的碳原子组合在一起以形成双键，如以下所示：
[式38]
其中R5表示任选地具有一个或多个选自组1的取代基的芳基或杂芳基，或任选地具有一个或多个选自组2的取代基的C1至C6烷基，并且优选任选地具有一个或多个选自组1的取代基的芳基。
R5的“任选地具有一个或多个选自组1的取代基的芳基或杂芳基”中的“芳基”优选是苯基或萘基并且更优选苯基。
R5的“任选地具有一个或多个选自组1的取代基的芳基或杂芳基”中的“杂芳基”优选是噻吩基、吡啶基、嘧啶基、喹啉基、喹喔啉基或苯并噻吩基，更优选2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基，并且甚至更优选3-吡啶基或3-噻吩基。
R5的芳基或杂芳基的取代基的例子可以包括但不限于以下a)至j)：
a)任选地被一至三个卤素原子取代的C1至C6烷氧基，
b)任选地被选自一至三个卤素原子、羟基、-OCOR'、-NR'R”、-C(＝NR')-NR”R”'和-NHC(＝NR')-NR”R”'的任一个取代的C1至C6烷基，
c)卤素原子，
d)C3至C5环烷氧基，
e)C1至C6烷硫基，
f)-NR'R”，
g)-C(＝NR')-NR”R”'，
h)-NHC(＝NR')-NR”R”'，
i)-NHCOR'和
j)羟基。
在此，b)和f)至i)中的R'、R”和R”'各自独立地表示氢原子或C1至C6烷基，并且各自独立地优选是氢原子或C1至C3烷基。
a)至j)优选如下：
a)任选地被一至三个卤素原子取代的C1至C3烷氧基，更优选甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基或三氟甲氧基，甚至更优选甲氧基、乙氧基或三氟甲氧基，并且最优选甲氧基；
b)任选地被一至三个卤素原子、羟基、-OCOR'、-C(＝NR')-NR”R”'或-NHC(＝NR')-NR”R”'取代的C1至C3烷基，其中R'、R”和R”'各自独立地是氢原子或C1至C3烷基；更优选任选地被选自一至三个卤素原子、羟基、-OCOR'、-C(＝NR')-NR”R”'和-NHC(＝NR')-NR”R”'的任一个取代的C1至C3烷基，其中R'、R”和R”’各自独立地是氢原子或甲基；甚至更优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、羟甲基、-CH2OCOMe、-CH2-NHC(＝NH)-NH2或-CH2-NHC(＝NMe)-NH2；
c)卤素原子，优选氟原子或氯原子；
d)C3至C5环烷氧基，更优选环丙氧基；
e)C1至C3烷硫基，更优选甲硫基或乙硫基；
f)-NR'R”，其中R'和R”各自独立地是氢原子或C1至C3烷基，更优选-NH2、-NHMe、-NMe2、-NHEt或-NEt2；
g)-C(＝NR')-NR”R”'，其中R'、R”和R”'各自独立地是氢原子或C1至C3烷基，更优选-C(＝NH)-NH2或-C(＝NMe)-NH2；
h)-NHC(＝NR')-NR”R”'，其中R'、R”和R”'各自独立地是氢原子或C1至C3烷基，更优选-NHC(＝NH)-NH2或-NHC(＝NMe)-NH2；
i)-NHCOR'，其中R'是氢原子或C1至C3烷基，更优选-NHCOMe或-NHCOEt；和j)羟基。
R5的芳基(优选苯基)或杂芳基(优选吡啶基)可以具有至少一个在任何位置的取代基。如果存在多个取代基，则取代基可以是相同的或不同的。
如果R5是芳基，则每个取代基优选是a)、b)、d)、g)、h)或j)，并且更优选a)、b)、d)或j)。
如果R5是苯基，则R5可以具有在任何位置的取代基并且可以具有多个取代基，并且优选一个或两个取代基存在于3位置处和/或4位置处，并且更优选一个取代基存在于4位置处。如果R5是萘基，则R5可以具有在任何位置的取代基并且可以具有多个取代基，并且优选一个取代基存在于6位置处。
如果R5是苯基，则R5更优选是苯基、4-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-乙氧基苯基、4-(正丙氧基)-苯基、4-(异丙氧基)-苯基、4-环丙氧基-苯基、4-三氟甲基苯基、4-羟甲基-苯基、4-乙酰氧基甲基-苯基或4-胍基甲基-苯基，并且甚至更优选苯基、4-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-环丙氧基-苯基、4-羟甲基-苯基、4-乙酰氧基甲基-苯基、4-胍基甲基-苯基或4-三氟甲基苯基。
如果R5是萘基，则R5更优选是萘基或6-甲氧基-2-萘基。
最优选是4-甲氧基苯基。
如果R5是杂芳基，则每个取代基优选是a)、b)、d)、g)、h)或j)，并且更优选a)或b)。
如果R5是杂芳基，则R5可以具有至少一个在任何位置的取代基。如果R5是3-吡啶基，则其一个或多个取代基优选存在于6位置和/或5位置处。如果R5是2-吡啶基，则其一个或多个取代基优选存在于5位置和/或4位置处或5位置和/或6位置处。如果R5是4-吡啶基，则其一个或多个取代基优选存在于2位置和/或6位置处。
如果R5是杂芳基，则R5可以具有多个取代基，并且优选具有一个或两个取代基，并且优选具有一个取代基。
如果R5是吡啶基，则R5优选是6-甲氧基-3-吡啶基或6-甲基-3-吡啶基。
如果R5是3-噻吩基或6-喹喔啉基，则R5优选是未经取代的。
R5的“任选地具有一个或多个选自组2的取代基的C1至C6烷基”中的“C1至C6烷基”优选是C1至C3烷基，并且更优选甲基或乙基。
R5的“任选地具有一个或多个选自组2的取代基的C1至C6烷基”中的取代基各自是卤素原子、羟基或C1至C6烷氧基(优选，C1至C3烷氧基)，优选羟基、甲氧基或乙氧基，并且更优选羟基。
ii.化合物实施方案二
如果R3表示氢原子，则R4和R5组合，与R4和R5所结合的碳原子一起形成三至五元饱和烃环或三至五元饱和杂环或CH2＝，如下所示：
[式39]
或
[式49]
/>
三至五元饱和烃环可以被一至四个卤素原子取代，并且可以优选被一个或两个氟原子取代。
R4和R5优选组合以形成三至五元饱和烃环或CH2＝，更优选形成环丙烷、环丁烷或CH2＝(环外亚甲基)，并且甚至更优选形成环丙烷。
如果R4和R5结合以形成三至五元饱和烃环或三至五元饱和杂环，则所述三至五元饱和烃环或三至五元饱和杂环优选与A相同。更优选地，A是三至五元饱和烃环并且R4和R5组合以形成三至五元饱和烃环，并且甚至更优选地，A是环丙烷环并且R4和R5组合以形成环丙烷环。
iii.化合物实施方案三
R3、R4和R5组合，与R3所结合的碳原子以及R4和R5所结合的碳原子一起形成任选地具有一个或多个选自组3的取代基的苯环或六元杂环。
下式显示了这样的情况，其中R3和R4组合以形成任选地具有一个或多个取代基的苯环：
[式41]
苯环或杂环可以具有至少一个在任何位置的取代基。如果存在多个取代基，则取代基可以是相同的或不同的。
苯环或杂环的每个取代基是卤素原子、任选地被一至三个卤素原子取代的C1至C6烷基、或C1至C6烷氧基，优选卤素原子、任选地被一至三个卤素原子取代的C1至C3烷基、或C1至C3烷氧基，并且更优选卤素原子、甲基或甲氧基。
“任选地具有一个或多个取代基的苯环或六元杂环”优选是未经取代的苯环。
R3、R4和R5最优选满足来自小节(i)“化合物实施方案一”的以上所述。
R6和R7各自表示氢原子，或R6和R7组合以表示亚胺键(C＝N)。
R8是羟基或C1至C3烷氧基，优选羟基或甲氧基，并且更优选羟基。R8可以是亚硫酸氢根加合物(OSO3M，其中M是金属阳离子)。
由于R8与不对称碳原子键合，因此提供了由以下部分结构(Va)或(Vb)表示的空间构型。通式(V)中的每条波浪线表示与Y键合，并且每个星号表示与L键合。
[式42]
X和Y各自独立地是氧原子、氮原子或硫原子，并且优选氧原子。
本发明的药物D优选是选自下组的任一种化合物：
[式43]
[式44]
[式45]
其中每个星号表示药物与接头结构(L)键合之处。
在一些实施方案中，-OH在11’位置处。
B.接头结构
将描述本发明抗体-药物缀合物中将抗肿瘤药物与抗体键合的接头结构。
接头L由下式表示：
-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C＝O)-*
其中星号表示与药物D的N10'位置处的氮原子键合，Lb表示其中连接La与Ab的聚糖或改造聚糖的间隔子。
B表示苯基或杂芳基，并且优选1,4-苯基、2,5-吡啶基、3,6-吡啶基、2,5-嘧啶基或2,5-噻吩基，并且更优选1,4-苯基。
Lp表示由在体内或靶细胞中可切割的氨基酸序列组成的接头。例如通过诸如酯酶和肽酶的酶的作用切割Lp。
Lp是由二至七个(优选二至四个)氨基酸构成的肽残基。即，Lp由寡肽残基构成，所述寡肽残基中二至七个氨基酸经由肽键连接。
Lp在N末端与Lb-La-中的La的羰基结合，并且在C末端与接头的-NH-B-CH2-O(C＝O)-部分的氨基(-NH-)形成酰胺键。通过诸如酯酶的酶切割Lp的C末端与-NH-之间的键。
构成Lp的氨基酸不限于特定氨基酸，并且例如是L-或D-氨基酸，并且优选L-氨基酸。氨基酸不仅可以是α-氨基酸，还可以包括具有例如β-丙氨酸、ε-氨基己酸或γ-氨基丁酸结构的氨基酸，并且可以进一步包括非天然氨基酸(诸如N-甲基化氨基酸)。
Lp的氨基酸序列不限于特定氨基酸序列，并且构成Lp的氨基酸的例子可以包括但不限于甘氨酸(Gly；G)、缬氨酸(Val；V)、丙氨酸(Ala；A)、苯丙氨酸(Phe；F)、谷氨酸(Glu；E)、异亮氨酸(Ile；I)、脯氨酸(Pro；P)、瓜氨酸(Cit)、亮氨酸(Leu；L)、丝氨酸(Ser；S)、赖氨酸(Lys；K)和天冬氨酸(Asp；D)。其中优选的是甘氨酸(Gly；G)、缬氨酸(Val；V)、丙氨酸(Ala；A)和瓜氨酸(Cit)。
这些氨基酸中的任一个可以出现多次，并且Lp具有包括任意选定的氨基酸的氨基酸序列。可以经由氨基酸类型控制药物释放方式。
特定接头Lp可以包括但不限于-GGVA-(SEQ ID NO:85)、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-(SEQ ID NO:86)、-GGPI-(SEQ ID NO:87)、-GGVCit-(SEQ ID NO:88)、-GGVK-(SEQ IDNO:89)、-GG(D-)PI-、-GGPL-(SEQ ID NO:90)、-EGGVA(SEQ ID NO:91)、-PI-、-GGF-、DGGF-(SEQ ID NO:92)、(D-)D-GGF-、-EGGF-(SEQ ID NO:93)、-SGGF-(SEQ ID NO:94)、-KGGF-(SEQ ID NO:95)、-DGGFG-(SEQ ID NO:96)、-GGFGG-(SEQ ID NO:97)、-DDGGFG-(SEQ IDNO:98)、-KDGGFG-(SEQ ID NO:99)和-GGFGGGF-(SEQ ID NO:100)。
在此，“(D-)V”指示D-缬氨酸，“(D)-P”指示D-脯氨酸，并且“(D-)D”指示D-天冬氨酸。
接头Lp优选是以下中的任一个：
-GGVA-(SEQ ID NO:85)、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-(SEQ ID NO:86)、-GGPI-(SEQID NO:87)、-GGVCit-(SEQ ID NO:88)、-GGVK-(SEQ ID NO:89)、-GG(D-)PI-和-GGPL-(SEQID NO:90)。
接头Lp更优选是以下中的任一个：
-GGVA-(SEQ ID NO:85)、-GGVCit-(SEQ ID NO:88)和-VA-。
Lb表示：连接La与Ab的聚糖或改造聚糖的间隔子。在一些实施方案中，Lb表示选自下组的任一个：
-C(＝O)-(CH2CH2)n2-C(＝O)-、-C(＝O)-(CH2CH2)n2-C(＝O)-NH-(CH2CH2)n3-C(＝O)-、
-C(＝O)-(CH2CH2)n2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(＝O)-、
-C(＝O)-(CH2CH2)n2-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)n3-CH2CH2-C(＝O)-、-(CH2)n4-O-C(＝O)-
其中，n2表示1至3(优选1或2)的整数，n3表示1至5的整数(优选2至4的整数，更优选2或4)，并且n4表示0至2的整数(优选0或1)。
在一些实施方案中，La优选表示选自下组的任一个：
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-、-C(＝O)-(CH2CH2)2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2)2-C(＝O)-
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(＝O)-、
-CH2-OC(＝O)-和-OC(＝O)-，并且
La更优选是-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-或-C(＝O)-(CH2CH2)2-C(＝O)-。
间隔子Lb不限于特定间隔子，并且其例子可以包括但不限于由下式表示的间隔子。
[式46]
[式47]
[式48]
在以上示出的Lb的结构式中，每个星号表示与在La的左端的-(C＝O)或-(CH2)n4键合，并且每条波浪线表示与Ab的聚糖或改造聚糖键合。
在以上示出的Lb(Lb-1、Lb-2或Lb-3)的每个结构式中，通过叠氮基团和DBCO的点击反应形成的三唑环位点提供了几何异构体的结构，并且Lb的分子作为两个结构的任一个或作为它们两者的混合物存在。本发明的抗体-药物缀合物的每个分子存在m1个“-L-D”部分，并且两个结构中的任一个或它们两者在m1个“-L-D”部分中的每个的L中作为Lb(Lb-1、Lb-2或Lb-3)存在或共存在。
在一些实施方案中，L优选由-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C＝O)-*表示，其中：
B是1,4-苯基，
Lp表示选自下组的任一个：
-GGVA-(SEQ ID NO:85)、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-(SEQ ID NO:86)、-GGPI-(SEQID NO:87)、-GGVCit-(SEQ ID NO:88)、-GGVK-(SEQ ID NO:89)、-GG(D-)PI-和-GGPL-(SEQID NO:90)，
La表示选自下组的任一个：
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-、-C(＝O)-(CH2CH2)2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2)2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(＝O)-、-CH2-OC(＝O)-、-OC(＝O)-，并且
Lb表示Lb的以上结构式中的任一个。
在一些实施方案中，L更优选选自下组的任一个：
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-(CH2CH2)2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:87所公开的“GGPI”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:86所公开的“GGFG”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:88所公开的“GGVCit”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:89所公开的“GGVK”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:90所公开的“GGPL”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2)2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z2-OC(＝O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)、
-Z3-CH2-OC(＝O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)；
其中Z1表示如对Lb所描述的以下结构式：
[式49]
Z2表示如对Lb所描述的以下结构式：
[式50]
/>
Z3表示如对Lb所描述的以下结构式：
[式51]
，并且B是1,4-苯基。
L最优选是以下中的任一个：
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-(CH2CH2)2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:88所公开的“GGVCit”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2)2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-，和-Z1-C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-，其中B是1,4-苯基，并且Z1表示如对Lb描述的以下结构式：
[式52]
推断本发明的抗体-药物缀合物通过这样的过程展现出抗肿瘤活性，其中大多数抗体-药物缀合物分子迁移到肿瘤细胞中，然后通过酶等切割接头蛋白(例如，Lp)以激活抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物释放药物D的部分(在下文中称为游离药物(稍后描述))。
因此，优选本发明的抗体-药物缀合物在肿瘤细胞之外是稳定的。
C.抗体
所公开的抗体-药物缀合物(ADC)中有待使用的抗体是抗DLL3抗体(例如，2-C8-A、6-G23-F和10-O18-A，或人抗体H2-C8-A、H6-G23-F、H10-O18-A、H2-C8-A-3和H10-O18-A-3)。可以掺入所公开的ADC中的所公开的抗体详细描述于以上第III部分“抗DLL3抗体”中。
简言之，在一些实施方案中，所述ADC的抗DLL3抗体可以包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中(a)VH包含选自以下的VH-CDR1序列、VH-CDR2序列和VH-CDR3序列：(i)分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；(ii)分别为SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15；(iii)分别为SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24和SEQ ID NO:25；以及(iv)分别为SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35；和/或(b)VL包含选自以下的VL-CDR1序列、VL-CDR2序列和VL-CDR3序列：(i)分别为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；(ii)分别为SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；(iii)分别为SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；以及(iv)分别为SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。
在一些实施方案中，所述ADC的抗DLL3抗体可以包含以下特征中的一个或多个：(a)轻链免疫球蛋白可变结构域序列，其与SEQ ID NO:7、17、27、37、62、66或70中的任一个中存在的轻链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同；和/或(b)重链免疫球蛋白可变结构域序列，其与SEQ ID NO:2、12、22、32、59、60、61、63、64、65、67、68或69中的任一个中存在的重链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同。
在一些实施方案中，所述ADC的抗DLL3抗体可以包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)或重链和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)或轻链，其中：(a)VH或重链包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69；和/或(b)VL或轻链包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO 62、SEQ ID NO:66和SEQ IDNO:70。在一些实施方案中，VH或重链氨基酸序列和VL或轻链氨基酸序列选自：分别为SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:7(7-I1-B)；分别为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:17(2-C8-A)；分别为SEQID NO:59和SEQ ID NO:62(H2-C8-A)；分别为SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:62(H2-C8-A-2)；分别为SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62(H2-C8-A-3)；分别为SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:27(10-O18-A)；分别为SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:70(H10-O18-A)；分别为SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:70(H10-O18-A-2)；SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70(H10-O18-A-3)；分别为SEQID NO:32和SEQ ID NO:37(6-G23-F)；分别为SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:66(H6-G23-F)；分别为SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:66(H6-G23-F-2)；以及分别为SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66(H6-G23-F-3)。
在一些实施方案中，所述ADC的抗DLL3抗体可以是改造聚糖或修饰聚糖，如下面更详细讨论的。
本发明的功能片段包括这样的功能片段，其在IgG重链Fc区中具有非常保守的有待用N-连接聚糖修饰的天冬酰胺(Asn297)和在Asn297周围的氨基酸，同时保留与抗原的结合活性。
i.所公开的抗DLL3抗体的聚糖改造：
最近报告了用于通过酶促反应等对抗体的异质糖蛋白进行改造以同质地引入具有官能团的聚糖的方法(ACS Chemical Biology 2012,7,110,ACS Medicinal ChemistryLetters 2016,7,1005)。已使用该聚糖改造技术尝试了位点特异性地引入药物以合成同质ADC(Bioconjugate Chemistry 2015,26,2233,Angew.Chem.Int.Ed.2016,55,2361-2367,US2016361436)。
在本发明的聚糖改造中，使用水解酶将添加到蛋白质(例如，抗体)的异质聚糖切割，以在每个末端仅留下GlcNAc，从而产生具有GlcNAc的同质蛋白部分(在下文中称为“受体”)。随后，提供单独制备的任意聚糖(在下文中称为“供体”)，并且通过使用转糖苷酶将受体和供体连接在一起。因此，可以合成具有任意聚糖结构的同质糖蛋白。
在本发明中，“聚糖”是指经由糖苷键键合在一起的两个或更多个单糖的结构单元。特定单糖和聚糖有时缩写为例如“GlcNAc-”、“MSG-”等。当在结构式中使用这些缩写中的任一个时，显示所述缩写的意图是，除非特别定义，否则在还原末端处与另一个结构单元连接的糖苷键中涉及的氧原子或氮原子不包括在指示聚糖的缩写中。
在本发明中，为了方便起见指示了作为聚糖的基本单元的单糖，使得在环结构中，除非另有说明，否则将与构成环的氧原子键合并且与羟基(或参与糖苷键的氧原子)直接键合的碳原子的位置定义为1位置(2位置仅用于唾液酸)。鉴于作为整体的化学结构来各自提供实施例中的化合物的名称，并且不一定应用该规则。
当聚糖在本发明中以标志(例如，GLY、SG、MSG、GlcNAc)指示时，除非另有定义，否则所述标志旨在包括范围到还原末端的碳原子并且不包括N-糖苷键或O-糖苷键中涉及的N或O。
在本发明中，除非特别说明，否则当聚糖与氨基酸的侧链连接时，部分结构以这样的方式指示使得侧链部分指示在括号中，例如“(SG-)Asn”。
D.抗体-药物缀合物(ADC)
在一些实施方案中，本发明的抗DLL3抗体-药物缀合物由下式表示：
[式53]
其中抗体Ab或所述抗体的功能片段可以从其氨基酸残基(例如，半胱氨酸、赖氨酸)的侧链直接与L键合，或经由Ab的聚糖或改造聚糖与L键合，并且优选经由Ab的聚糖与改造聚糖与L键合，并且更优选经由Ab的改造聚糖与L键合。
本发明的Ab中的聚糖是N-连接的聚糖或O-连接的聚糖，并且优选为N-连接的聚糖。N-连接的聚糖和O-连接的聚糖分别经由N-糖苷键和O-糖苷键与抗体的氨基酸侧链键合。
在一些实施方案中，本发明的抗体(Ab)是IgG，并且优选IgG1、IgG2或IgG4。在一些实施方案中，所述抗体(Ab)是2-C8-A、6-G23-F、10-O18-A、H2-C8-A、H2-C8-A-2、H2-C8-A-3、H6-G23-F、H6-G23-F-2、H6-G23-F-3、H10-O18-A、H10-O18-A-2或H10-O18-A-3。
IgG在重链的Fc区的297位置处的天冬酰胺残基(在下文中称为“Asn297或N297”)处具有非常保守的N连接聚糖，并且已知N连接聚糖有助于抗体分子的活性和动力学。(Biotechnol.Prog.,2012,28,608-622,Sanglier-Cianferani,S.,Anal.Chem.,2013,85,715-736)
IgG的恒定区中的氨基酸序列是非常保守的，并且每个氨基酸通过Edelman等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第63卷,第1期(1969年5月15日),第78-85页)中的Eu索引编号明确指定。例如，在Fc区中添加N-连接的聚糖的Asn297对应于Eu索引编号中的297位置，并且每个氨基酸由Eu索引编号唯一指定，即使氨基酸的实际位置以分子断裂或区域缺失而变化。
在本发明抗体-药物缀合物的一些实施方案中，所述抗体或所述抗体的功能片段可以经由与其Asn297的侧链键合的聚糖(在下文中称为“N297聚糖”)与L键合，并且所述抗体或所述抗体的功能片段甚至更优选经由所述N297聚糖与L键合，其中所述N297聚糖是改造聚糖。
下式说明了本发明的抗体-药物缀合物或抗体的功能片段经由N297聚糖与L键合的情况。
[式54]
将具有改造聚糖的抗体称为聚糖经改造的抗体。
SGP(唾液酸基糖肽的缩写)是代表性N-连接的复合聚糖。SGP可以例如通过使用WO2011/0278681中描述的方法从母鸡蛋的蛋黄中分离/纯化。SGP的纯化产品是可商购的(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.，FUSHIMIPharmaceutical Co.,Ltd.)，并且可以购买。例如，二唾液酸八糖(disialooctasaccharide)(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.)是一种通过在SG的聚糖部分(在下文中称为“SG(10)”)中的还原末端处缺失一个GlcNAc而形成的聚糖，是可商购的。
在本发明中，通过仅在SG(10)中的β-Man的任一条支链的非还原末端处缺失唾液酸而形成的聚糖结构是指MSG(9)，并且将仅在1-3条支链中具有唾液酸的结构称为MSG1，并且将仅在1-6条支链中具有唾液酸的结构称为MSG2。
本发明的改造聚糖是N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或者N297-(Fuc)MSG1与N297-(Fuc)MSG2的混合物，或N297-(Fuc)SG，并且优选N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或N297-(Fuc)SG，并且更优选N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)MSG2。
N297-(Fuc)MSG1由以下结构式或序列式表示：
[式55]
[式56]
在上式中：
每条波浪线表示与所述抗体的Asn297键合；
L(PEG)表示-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-，其中在右端的氨基表示经酰胺与在N297聚糖中的β-Man的1-3支链的非还原末端的唾液酸的2位置处的羧酸键合，
每个星号表示与接头L、具体是接头L中Lb的1,2,3-三唑环的1位置或3位置处的氮原子键合，并且
n5是2至10的整数，并且优选2至5的整数。
N297-(Fuc)MSG2由以下结构式或序列式表示：
[式57]
[式58]
在上式中：
每条波浪线表示与所述抗体的Asn297键合；
L(PEG)表示-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-，其中在右端的氨基表示与在N297聚糖中的β-Man的1-6支链的非还原末端的唾液酸的2位置处的羧酸的经酰胺键合，
每个星号表示与接头L、具体是接头L中Lb的1,2,3-三唑环的1位置或3位置处的氮原子键合，并且
n5是2至10的整数，并且优选2至5的整数。
N297-(Fuc)SG由以下结构式或序列式表示：
[式59]
[式60]
在上式中：
每条波浪线表示与所述抗体的Asn297键合；
L(PEG)表示-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-，其中在右端的氨基经由酰胺键表示经酰胺与N297聚糖中的β-Man的1-3和1-6支链中的每一条的非还原末端的唾液酸的2位置处的羧酸结合，
每个星号表示与接头L、具体是接头L中Lb的1,2,3-三唑环的1位置或3位置处的氮原子键合，并且
n5是2至10的整数，并且优选2至5的整数。
如果本发明的抗体-药物缀合物中的抗体的N297聚糖是N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或它们的混合物，因为抗体是二聚体(参见图1)，因此抗体-药物缀合物是两个接头L分子和两个药物D分子已缀合的分子(m2＝1)。
如果本发明的抗体-药物缀合物中的抗体的N297聚糖是N297-(Fuc)SG，抗体-药物缀合物是四个接头L分子和四个药物D分子已缀合的分子(m2＝2)。N297聚糖优选是N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或N297-(Fuc)SG，并且更优选N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)MSG2。
如果本发明的抗体-药物缀合物中的抗体的N297聚糖是N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或N297-(Fuc)SG，则可以获得同质ADC。
本发明的抗体-药物缀合物最优选是一种选自下组的抗体-药物缀合物：
[式61]
[式62]
[式63]
[式64]
[式65]
[式66]
[式67]
[式68]
[式69]
[式70]
[式71]
[式72]
在以上的每种结构式中，
m2表示1或2(优选m2是1)，
抗体Ab是抗DLL3 IgG抗体(优选IgG1、IgG2或IgG4，更优选IgG1)或抗体的功能片段，N297聚糖表示N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2和它们的混合物，以及N297-(Fuc)SG(优选N297-(Fuc)MSG1)中的任一个，
L(PEG)表示-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*，其中在左端的氨基表示经酰胺与N297聚糖中的β-Man的1-3和1-6支链(优选1-3支链)中的每一条或任一条的非还原末端的唾液酸的2位置处的羧酸键合，并且星号表示与接头L中Lb的三唑环的1位置处或3位置处的氮原子键合。在一些实施方案中，所述抗DLL3抗体是例如2-C8-A、6-G23-F、10-O18-A、H2-C8-A、H2-C8-A-2、H2-C8-A-3、H6-G23-F、H6-G23-F-2、H6-G23-F-3、H10-O18-A、H10-O18-A-2或H10-O18-A-3。
尽管具有二或四个“-(N297聚糖)-L-D”单元(m2＝1或2)(在所述二或四个单元的每个中N297聚糖与一个缀合物分子(“(N297聚糖)-(N1Lb)L-D”)中的L中的Lb的三唑环的1位置处的氮原子键合)的结构或具有二或四个“-(N297聚糖)-L-D”单元(m2＝1或2)(在所述二或四个单元的每个中N297聚糖与一个缀合物分子(“(N297聚糖)-(N3Lb)L-D”)中的L中的Lb的三唑环的3位置处的氮原子键合)的结构为方便起见被展示为最优选抗体-药物缀合物，但还包括在一个缀合物分子中具有“(N297聚糖)-(N1Lb)L-D”(如果m2＝1，那么一个单元，如果m2＝2，那么一、二或三个单元)和“(N297聚糖)-(N3Lb)L-D”(如果m2＝1，那么一个单元，如果m2＝2，那么三、二或一个单元)两者的抗体-药物缀合物。换言之，“(N297聚糖)-(N1Lb)L-D”和“(N297聚糖)-(N3Lb)L-D”中的任一个存在于或它们两者共存于一个缀合物分子中。
本发明的抗体-药物缀合物和本发明的抗DLL3抗体-药物缀合物展现出强肿瘤活性(体内抗肿瘤活性、体外抗细胞活性)和令人满意的体内动力学和物理特性，并且具有高安全性，并且因此可用作药物。
可能存在用于本发明抗体-药物缀合物的立体异构体、由于不对称碳原子而产生的光学异构体、几何异构体、互变异构体、或光学异构体(诸如d型、l型和阻转异构体)，以及游离药物或抗体-药物缀合物的生产中间体，并且这些异构体、光学异构体以及它们的混合物全部包括在本发明中。本发明的PBD衍生物(V)或(VI)在11'位置处具有不对称碳，并且因此存在光学异构体。在本文中，这些异构体和这些异构体的混合物全部由单一的式表示，即通式(V)或(VI)。相应地，(V)或(VI)包括所有光学异构体和任意比例的光学异构体的混合物。(V)或(VI)的11'位置处的绝对空间构型可以通过X射线晶体结构分析或NMR(诸如Mosher方法)确定其结晶产物或中间体或其衍生物。然后，绝对空间构型可以通过使用用具有空间构型已知的不对称中心的试剂衍生的结晶产物或中间体来确定。根据需要，根据本发明的合成化合物的立体异构体可以通过用普通的光学分辨方法或分离方法分离而获得。
每个抗体分子缀合的药物分子的数量是影响本发明抗体-药物缀合物的功效和安全性的重要因素。抗体-药物缀合物以为得到恒定数量的缀合药物分子而指定的反应条件(诸如有待反应的原材料和试剂的量)产生，但与低分子量化合物的化学反应相反，典型地获得具有不同数量的缀合药物分子的混合物。将每个抗体分子缀合的药物分子的数量指定为平均值，即缀合的药物分子的平均数量(DAR：药物与抗体的比率)。与抗体分子缀合的吡咯并苯二氮衍生物分子的数量是可控的，并且可以缀合1至10个吡咯并苯二氮/>衍生物分子作为每个抗体分子缀合的药物分子的平均数量(DAR)，但优选数量是一至八并且更优选一至五。
如果在本发明抗体-药物缀合物中的抗体经由抗体的改造聚糖与L键合，则抗体-药物缀合物中每个抗体分子缀合的药物分子的数量m2是1或2的整数。如果聚糖是N297聚糖并且聚糖是N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2，或者N297-(Fuc)MSG1与N297-(Fuc)MSG2的混合物，则m2是1，并且DAR在1至3的范围(优选在1.0至2.5的范围，更优选在1.2至2.2的范围)内。如果N297聚糖是N297-(Fuc)SG，则m2是2，并且DAR在3至5的范围(优选在3.2至4.8的范围，更优选在3.5至4.2的范围)内。
在任一个前述实施方案中，抗DLL3抗体(即，“抗体”或“Ab”)可以选自2-C8-A、6-G23-F、10-O18-A、H2-C8-A、H2-C8-A-2、H2-C8-A-3、H6-G23-F、H6-G23-F-2、H6-G23-F-3、H10-O18-A、H10-O18-A-2或H10-O18-A-3。在一些实施方案中，所述ADC的抗DLL3抗体可以包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中(a)VH包含选自以下的VH-CDR1序列、VH-CDR2序列和VH-CDR3序列：(i)分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；(ii)分别为SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15；(iii)分别为SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；以及(iv)分别为SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35；和/或(b)VL包含选自以下的VL-CDR1序列、VL-CDR2序列和VL-CDR3序列：(i)分别为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；(ii)分别为SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19和SEQ ID NO:20；(iii)分别为SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；以及(iv)分别为SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。在一些实施方案中，所述ADC的抗DLL3抗体可以包含以下特征中的一个或多个：(a)轻链免疫球蛋白可变结构域序列，其与SEQ ID NO:7、17、27、37、62、66或70中的任一个中存在的轻链免疫球蛋白可变结构域序列或轻链序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同；和/或(b)重链免疫球蛋白可变结构域序列，其与SEQ ID NO:2、12、22中的任一个中存在的重链免疫球蛋白可变结构域序列或重链序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同，在一些实施方案中，所述ADC的抗DLL3抗体可以包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)或重链和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)或轻链，其中：(a)VH或重链包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69；和/或(b)VL包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO 62、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:70。在一些实施方案中，VH或重链氨基酸序列和VL或轻链氨基酸序列选自：分别为SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:7(7-I1-B)；分别为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:17(2-C8-A)；分别为SEQ ID NO:59和SEQID NO:62(H2-C8-A)；分别为SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:62(H2-C8-A-2)；分别为SEQ IDNO:61和SEQ ID NO:62(H2-C8-A-3)；分别为SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:27(10-O18-A)；分别为SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:70(H10-O18-A)；分别为SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:70(H10-O18-A-2)；SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70(H10-O18-A-3)；分别为SEQ ID NO:32和SEQID NO:37(6-G23-F)；分别为SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:66(H6-G23-F)；分别为SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:66(H6-G23-F-2)；以及分别为SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66(H6-G23-F-3)。
本领域技术人员可以基于本文实施例中的描述工程化反应方法以使所需数量的药物分子与每个抗体分子缀合，并且获得具有受控数量的缀合的吡咯并苯二氮衍生物分子的抗体。
本发明的抗体-药物缀合物、游离药物或生产中间体可以吸附水分，允许所吸附的水的粘附，或当在大气中静置或再结晶时变成水合物，并且此类化合物和含水的盐也包括在本发明中。
如果具有诸如氨基的碱性基团，本发明的抗体-药物缀合物、游离药物或生产中间体可以根据需要转化为药学上可接受的盐。此类盐的例子可以包括但不限于卤化氢盐(诸如盐酸盐和氢碘酸盐)；无机酸盐(诸如硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐和磷酸盐)；低级链烷磺酸盐(诸如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐和乙磺酸盐)；芳基磺酸盐(诸如苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐)；有机酸盐(诸如甲酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐和马来酸盐)；和氨基酸盐(诸如鸟氨酸盐、谷氨酸盐和天冬氨酸盐)。
如果本发明的抗体-药物缀合物、游离药物或生产中间体具有诸如羧基的酸性基团，则通常可以形成碱加成盐。药学上可接受的盐的例子可以包括但不限于：碱金属盐(诸如钠盐、钾盐和锂盐)；碱土金属盐(诸如钙盐和镁盐)；无机盐(诸如铵盐)；和有机胺盐(诸如二苄胺盐、吗啉盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基谷氨酸盐、二乙胺盐、三乙胺盐、环己胺盐、二环己胺盐、N,N'-二苄基乙二胺盐、二乙醇胺盐、N-苄基-N-(2-苯基乙氧基)胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐和三(羟甲基)氨基甲烷盐)。
本发明的抗体-药物缀合物、游离药物或生产中间体可以例如通过吸收空气中的水分作为水合物存在。本发明的溶剂化物不限于特定的溶剂化物并且可以是任何药学上可接受的溶剂化物，并且具体地，优选水合物、乙醇溶剂化物、2-丙醇溶剂化物等。如果本发明的抗体-药物缀合物、游离药物或生产中间体中存在氮原子，则本发明的抗体-药物缀合物、游离药物或生产中间体可以是其N-氧化物形式，并且这些溶剂化物和N-氧化物形式包括在本发明的范围内。
本发明包括用各种放射性或非放射性同位素标记的化合物。本发明的抗体-药物缀合物、游离药物或生产中间体可以含有具有非天然比率的原子同位素的一种或多种组成原子。原子同位素的例子可以包括但不限于氘(2H)、氚(3H)、碘-125(125I)和碳-14(14C)。本发明的化合物可以用诸如氚(3H)、碘-125(125I)和碳-14(14C)的放射性同位素进行放射性标记。放射性标记的化合物可用作治疗剂或预防剂、用于研究的试剂(诸如测定试剂和诊断剂(诸如用于体内成像的诊断剂))。本发明的抗体-药物缀合物的同位素变体不论它们是否具有放射性全部包括在本发明的范围内。
E.产生方法
本文公开了用于产生本发明抗体-药物缀合物的代表性方法并且将描述游离药物或其生产中间体。在以下中，反应式中所示的化合物数量用于相互鉴定化合物。具体地，将引用呈“式(1)的化合物”、“化合物(1)”等形式。具有其他数字的化合物将以相同的方式指示。
方案R：抗体的制备
可以通过使用如图3中展示的方法(例如，根据WO 2013/120066中描述的方法)产生聚糖经改造的抗体。关于图12和以下方案进行合成的步骤R1和R2的以下描述。
步骤R-1：在还原末端的几丁二糖结构的GlcNAcβ1-4GlcNAc的糖苷键的水解
所述步骤是通过使用已知的酶促反应切割与靶抗体的氨基酸序列的297位置处的天冬酰胺键合的N-连接的聚糖(N297连接的聚糖)来制备聚糖经截短的抗体的步骤。
在0℃至40℃下使用水解酶(诸如酶EndoS)使在缓冲溶液(例如，50mM磷酸盐缓冲液溶液)中的靶抗体(20mg/mL)经受在还原末端的几丁二糖结构中GlcNAcβ1与4GlcNAc之间的糖苷键的水解反应。反应时间为10分钟至72小时，并且优选1小时至6小时。要对100mg抗体使用的野生型酶EndoS的量为0.1至10mg，优选0.1至3mg。反应完成后，进行亲和色谱纯化和/或用羟基磷灰石柱纯化(各自稍后描述)，以产生聚糖在GlcNAcβ1与4GlcNAc之间水解的(Fucα1,6)GlcNAc抗体。
步骤R-2：转糖基化反应
所述步骤是通过使用酶促反应将(Fucα1,6)GlcNAc抗体与具有包含叠氮基团的PEG接头的MSG型(MSG1型、MSG2型)或SG型聚糖噁唑啉形式(在下文中称为“叠氮化物聚糖噁唑啉形式”)键合以产生聚糖经改造的抗体的步骤。
在缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲液溶液)中的聚糖经截短的抗体通过在催化量的转糖苷酶(诸如EndoS(D233Q/Q303L))的存在下在0℃至40℃下与叠氮化物聚糖噁唑啉形式反应而经受转糖基化反应。反应时间为10分钟至72小时，并且优选1小时至6小时。对于100mg抗体有待使用的酶EndoS(D233Q/Q303L)的量为1至10mg，优选1至3mg，并且有待使用的叠氮化物聚糖噁唑啉形式的量为2当量至过量当量，优选2当量至20当量。
反应完成后，进行亲和色谱纯化和羟基磷灰石柱纯化，以得到经纯化的聚糖改造的抗体。
叠氮化物聚糖噁唑啉(实施例[N3-PEG(3)]-MSG1-Ox，WO 19065964中的实施例56)形式可以根据WO 19065964中的实施例55至57中所述的方法制备。通过使用合成有机化学的领域中已知的反应(例如，缩合反应)，可以将N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2(包含叠氮基团的PEG接头(N3-L(PEG)))引入MSG(MSG1、MSG2)或二唾液酸八糖(Tokyo Chemical IndustryCo.,Ltd.)中。具体地，在唾液酸的2位置处的羧酸和在N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2的右端的氨基经历缩合反应以形成酰胺键。
缩合反应中使用的缩合剂的例子可以包括但不限于N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI)、羰基二咪唑(CDI)、2-(2H-苯并三唑-2-基)-4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯酚(BOP)、1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基磷鎓六氟磷酸盐(PyBOP)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)，并且用于反应的溶剂的例子可以包括但不限于二氯甲烷、DMF、THF、乙酸乙酯及其混合溶剂。
反应温度典型地为-20℃至100℃或溶剂的沸点，并且优选在-5℃至50℃的范围内。根据需要，可以添加诸如三乙胺、二异丙基乙胺、N-甲基吗啉和4-二甲基氨基吡啶的有机碱或诸如碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾和碳酸氢钠的无机碱。此外，例如，可以添加1-羟基苯并三唑或N-羟基琥珀酰亚胺作为反应促进剂。
MSG、MSG1或MSG2可以通过用水解酶(诸如EndoM)水解(MSG-)Asn或分离/纯化(MSG1-)Asn或(MSG2-)Asn来获得。
根据已知的文章(J.Org Chem.,2009,74(5),2210-2212.Helv.Chim.Acta,2012,95,1928-1936.)，噁唑啉化可以由在MSG型(MSG1型、MSG2型)或SG型聚糖的还原末端的GlcNAc制备。
步骤R-3：转糖基化反应
代替步骤R-2，可以应用以下步骤来产生上述聚糖经改造的抗体，以及使用WO2018/003983中描述的两种酶的方法。将由步骤R-1得到的(Fucα1,6)GlcNAc抗体应用于在两种糖基转移酶(酶A和酶B)的存在下与(SG-)Asn、(MSG-)Asn等其唾液酸中引入叠氮基团的聚糖供体分子反应，以合成唾液酸中引入叠氮基团的含有SG型聚糖经改造的Fc的分子。酶A的例子可以包括EndoM、EndoOm和EndoCC，以及展现出降低的水解活性的EndoM突变体、EndoOm突变体和EndoCC突变体。酶A优选为EndoM N175Q、EndoCC N180H或EndoOm N194Q。酶B的例子可以包括EndoS和EndoS2(EndoS49)，以及展现出降低的水解活性的EndoS突变体和EndoS2(EndoS49)突变体。酶B优选为EndoSD233Q、EndoSD233Q/Q303L、EndoSD233Q/E350A、EndoSD233Q/E350Q、EndoSD233Q/E350D、EndoSD233Q/E350N、EndoSD233Q/D405A、EndoS2D184M、EndoS2 T138Q等。在制备聚糖经改造的抗体时，抗体水溶液的浓缩、浓度的测量和缓冲液交换可以根据以下常用操作A至C进行。
i.常用操作A：抗体水溶液的浓缩
将抗体或抗体-药物缀合物的溶液置于Amicon Ultra(30,000至50,000MWCO，Millipore Corporation)的容器中，并且使用离心机(Allegra X-15R，Beckman Coulter,Inc)将抗体或抗体-药物缀合物的溶液(对其稍后描述)通过离心操作(以2000G至4000G离心5至20分钟)浓缩。
ii.常用操作B：抗体浓度的测量
根据由制造商指定的方法，通过使用UV测量装置(Nanodrop 1000，Thermo FisherScientific Inc.)进行抗体浓度的测量。然后，使用抗体之间不同的280nm吸收系数(1.3mLmg-1cm-1至1.8mL mg-1cm-1)。
iii.常用操作C：抗体的缓冲液交换
将缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水(pH 6.0)、磷酸盐缓冲液(pH 6.0))添加到抗体水溶液中，根据常用操作A将抗体浓缩。进行该操作多次，然后通过使用常用操作B测量抗体浓度，并且用缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水(pH 6.0)、磷酸盐缓冲液(pH 6.0))调节至10-20mg/mL。
方案S：缀合
生产方法是用于通过将上述聚糖经改造的抗体与生产中间体(2)通过SPAAC(应变促进的炔烃叠氮化物环化加成(strain-promoted alkyne azide cycloaddition):J.AM.CHEM.SOC.2004,126,15046-15047)反应缀合来产生抗体-药物缀合物的方法。在式中，Ab表示聚糖经改造的抗体。
[式73]
通过将抗体Ab的缓冲溶液(乙酸钠溶液、磷酸钠、硼酸钠溶液等或其混合物)与在适当的溶剂(二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2-吡啶酮(NMP)、丙二醇(PG)等或其混合物)中溶解化合物(2)的溶液混合来进行SPAAC反应。
每摩尔抗体有待使用的化合物(2)的摩尔量为2mol至过量摩尔，优选1mol至30mol，并且有机溶剂与抗体缓冲液的比率优选为1％至200％v/v。反应温度为0℃至37℃并且优选10℃至25℃，并且反应时间为1至150小时并且优选6小时至100小时。反应中的pH优选为5至9。
抗体-药物缀合物化合物(ADC)可以根据上述常用操作A至C和稍后描述的常用操作D至F通过缓冲液交换、纯化、以及测量抗体浓度和每个抗体分子缀合的药物分子的平均数量来彼此鉴定。
iv.常用操作D：抗体-药物缀合物的纯化
用含有可商购的山梨糖醇(5％)的乙酸缓冲溶液(10mM，pH 5.5；本文中称为ABS)平衡NAP-25柱(GE Healthcare)。向该NAP-25柱应加抗体-药物缀合物的水性反应溶液(约1.5至2.5mL)，并且用由制造商指定的量的缓冲液洗脱以分离并且收集抗体级分。将分离并且收集的级分再次应用于NAP-25柱，并且将用缓冲液洗脱的凝胶过滤纯化操作总共重复两次或三次以得到未结合的药物-接头、二甲基亚砜和丙二醇被去除的抗体-药物缀合物。根据需要，通过常用操作A至C调节抗体-药物缀合物溶液的浓度。
v.常用操作E：抗体-药物缀合物的抗体浓度的测量
抗体-药物缀合物中缀合药物的浓度可以通过使用以下示出的朗伯-比尔定律(Lambert-Beer's law)来计算。使用朗伯-比尔定律的表达式(I)如下。
[表达式I]
在此，A280表示抗体-药物缀合物水溶液在280nm处的吸光度，ε280表示抗体-药物缀合物在280nm处的摩尔吸光系数，并且C(mol·L-1)表示抗体-药物缀合物的摩尔浓度。根据表达式(I)，抗体-药物缀合物的摩尔浓度C(mol·L-1)可以通过使用以下表达式(II)来确定。
[表达式II]
此外，将两侧乘以抗体-药物缀合物的摩尔质量MW(g·mol-1)以确定抗体-药物缀合物的重量浓度C'(mg·mL-1)(表达式(III))。
[表达式III]
将描述用于表达式并且应用于实施例的值。
所用的吸光度A280是抗体-药物缀合物水溶液在280nm处的UV吸光度的测量值。对于摩尔质量MW(g·mol-1)，由抗体的氨基酸序列计算抗体的分子量的估计值，并且将所述估计值用作抗体-药物缀合物的摩尔质量的近似值。测量中使用的光程长度l(cm)为1cm。
抗体-药物缀合物的摩尔吸光系数ε280可以通过使用以下表达式(IV)来确定。
[表达式IV]
在此，εAb,280表示抗体在280nm处的摩尔吸光系数，并且εDL,280表示药物在280nm处的摩尔吸光系数。
通过使用已知的计算方法(Protein Science,1995,第4卷,2411-2423)，εAb,280可以由抗体的氨基酸序列进行估计。在实施例中，所用DLL3抗体(H2-C8-A)的摩尔吸光系数为εAb,280＝220378(计算的估计值)，所用DLL3抗体(H6-G23-F)的摩尔吸光系数为εAb,280＝215353(计算的估计值)，所用DLL3抗体(H10-O18-A)的摩尔吸光系数为εAb,280＝215424(计算的估计值)，所用LPS抗体的摩尔吸光系数为εAb,280＝230280(计算的估计值)，所用DLL3抗体(H2-C8-A-3)的摩尔吸光系数为εAb,280＝220420(计算的估计值)，并且所用DLL3抗体(H10-O18-A-3)的摩尔吸光系数为εAb,280＝215380(计算的估计值)。
由每次UV测量中获得的测量值计算εDL,280，备用。具体地，测量溶解一定摩尔浓度的缀合物前体(药物)的溶液的吸光度，并且对其应用表达(I)(朗伯-比尔定律)，并且使用所得值。
vi.常用操作F：抗体-药物缀合物中每个抗体分子缀合的药物分子的平均数量的测量
抗体-药物缀合物中每个抗体分子缀合的药物分子的平均数量可以用以下方法通过高效液相色谱(HPLC)确定。
[F-1.用于HPLC分析的样品的制备(抗体-药物缀合物的还原)]
将抗体-药物缀合物溶液(约1mg/mL，60μL)与二硫苏糖醇(DTT)水溶液(100mM，15μL)混合。将混合物在37℃下孵育30分钟以制备样品，其中抗体-药物缀合物的L链与H链之间的二硫键被切割，并且将该样品用于HPLC分析。
[F-2.HPLC分析]
在以下条件下进行HPLC分析。
HPLC系统：Agilent 1290HPLC系统(Agilent Technologies)
检测器：紫外吸收光谱仪(测量波长：280nm，329nm)
柱：BEH Phenyl(2.1×50mm，1.7μm，Waters Acquity)
柱温：75℃
流动相A：0.1％三氟乙酸(TFA)-15％异丙醇水溶液
流动相B：0.075％ TFA-15％异丙醇乙腈溶液
梯度程序1：14％-36％(0min至15min)、36％-80％(15min至17min)、80％-14％(17min至17.1min)、14％-14％(17.1min至23min)
梯度程序2：14％-50％(0min至15min)、50％-80％(15min至17min)、80％-14％(17min至17.1min)、14％-14％(17.1min至23min)
样品进样体积：5μL
[F-3.数据分析]
[F-3-1]与没有任何缀合药物分子的抗体的L链(L0)和H链(H0)相比，具有缀合药物分子的L链(具有一个缀合药物分子的L链：L1)和具有一个或多个缀合药物分子的H链(具有一个缀合药物分子的H链：H1，具有两个缀合药物分子的H链：H2，具有三个缀合药物分子的H链：H3)具有与缀合药物分子的数量成比例增加的疏水性并且具有更长的保留时间，并且因此L0、L1、H0、H1、H2和H3以出现的顺序洗脱。虽然L1和H0的顺序在一些情况下是颠倒的，但H0(其没有缀合药物分子)不吸收药物特征性的329nm波长。因此，L1和H0可以通过检查329nm波长的吸收来区分。通过比较L0与H0之间的保留时间，检测到的每个峰可以分配到L0、L1、H0、H1、H2或H3。
[F-3-2]因为每个药物-接头吸收UV，根据缀合的药物-接头分子的数量，通过使用具有L链、H链和药物-接头的摩尔吸光系数的以下表达式来校正峰面积值。
[表达式V]
/>
在此，对于每个抗体的L链和H链的摩尔吸光系数(280nm)，可以使用通过使用已知的计算方法(Protein Science,1995,第4卷,2411-2423)由抗体的L链和H链的氨基酸序列估计的值。在DLL3抗体(H2-C8-A)的情况下，将26123用作由氨基酸序列估计的L链的摩尔吸光系数，并且将84150用作由氨基酸序列估计的H链的摩尔吸光系数。在DLL3抗体(H6-G23-F)的情况下，将30105用作由氨基酸序列估计的L链的摩尔吸光系数，并且将77423用作由氨基酸序列估计的H链的摩尔吸光系数。在DLL3抗体(H10-O18-A)的情况下，将26166用作由氨基酸序列估计的L链的摩尔吸光系数，并且将81340用作由氨基酸序列估计的H链的摩尔吸光系数。在DLL3抗体(H2-C8-A-3)的情况下，将26212用作由氨基酸序列估计的L链的摩尔吸光系数，并且将83993用作由氨基酸序列估计的H链的摩尔吸光系数。在DLL3抗体(H10-O18-A-3)的情况下，将26212用作由氨基酸序列估计的L链的摩尔吸光系数，并且将81478用作由氨基酸序列估计的H链的摩尔吸光系数。
[F-3-3]通过使用以下表达式来计算每条链与校正峰面积总和的峰面积比率(％)。
[表达式VI]
ALi，AHi：Li1Hi相应的校正峰面积
[F-3-4]通过使用以下表达式来计算抗体-药物缀合物中每个抗体分子缀合的药物分子的平均数量。
缀合的药物分子的平均数＝(L0峰面积比×0+L0峰面积比×1+H0峰面积比×0+H1峰面积比×1+H2峰面积比×2+H3峰面积比×3)/100×2。
VII.游离药物和生产中间体
本发明抗体-药物缀合物的中间体和游离药物由下式表示：
[式74]
将在以下对此进行描述。
本发明的游离药物是通过使抗体-药物缀合物迁移到肿瘤细胞中，然后切割抗体-药物缀合物中的接头L部分的方法产生的。
本发明的抗体-药物缀合物通过使用生产中间体产生。
用于本发明抗体-药物缀合物的游离药物对应于(a)R16与R17组合以形成亚胺键(N＝C)的情况。
用于本发明抗体-药物缀合物的生产中间体对应于(b)R16由J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C＝O)-*表示的情况。
相应地，式中的l与n1、E与A、R9与R1、R10与R2、R11与R3、R12与R4、R13与R5、R14与R6、R15与R7、V与X、W与Y、组7与组1、组8与组2、组9与组3、组10与组4、组11与组5以及组12与组6分别是同义的。
l表示2至8的整数，并且优选2至6的整数，并且更优选3至5的整数。l为2至8的整数、优选2至6的整数并且更优选3至5的整数的烷基链可以包含双键。
E表示螺键合的三至五元饱和烃环或三至五元饱和杂环，并且优选三至五元饱和烃环(环丙烷、环丁烷或环戊烷)、更优选环丙烷或环丁烷，并且最优选环丙烷。螺键合的三至五元饱和烃环可以被一至四个卤素原子取代，并且可以优选被一或两个氟原子取代(例如，2,2-二氟环丙烷)。
R9和R10各自独立地表示C1至C6烷氧基、C1至C6烷基、氢原子、羟基、硫醇基团、C1至C6烷硫基、卤素原子或-NR'R”，并且各自优选是C1至C6烷氧基、C1至C6烷基或羟基、更优选C1至C3烷氧基并且最优选甲氧基。
R11、R12和R13如以下(i)至(iii)中的任一个所描述的。
A.化合物实施方案一
如果R11和R12与R3和R4所结合的碳原子组合在一起以形成双键，R13表示任选地具有一个或多个选自组7的取代基的芳基或杂芳基，或任选地具有一个或多个选自组8的取代基的C1至C6烷基，并且优选任选地具有一个或多个选自组7的取代基的芳基。
R13的“任选地具有一个或多个选自组7的取代基的芳基或杂芳基”中的“芳基”优选是苯基或萘基并且更优选苯基。
R13的“任选地具有一个或多个选自组7的取代基的芳基或杂芳基”中的“杂芳基”优选是噻吩基、吡啶基、嘧啶基、喹啉基、喹喔啉基或苯并噻吩基，更优选2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基，并且甚至更优选3-吡啶基或3-噻吩基。
R13的芳基或杂芳基的取代基的例子可以包括但不限于以下a)至j)：
a)任选地被一至三个卤素原子取代的C1至C6烷氧基，
b)任选地被选自一至三个卤素原子、羟基、-OCOR'、-NR'R”、-C(＝NR')-NR”R”'和-NHC(＝NR')-NR”R”'的任一个取代的C1至C6烷基，
c)卤素原子，
d)C3至C5环烷氧基，
e)C1至C6烷硫基，
f)-NR'R”，
g)-C(＝NR')-NR”R”'，
h)-NHC(＝NR')-NR”R”'，
i)-NHCOR'和
j)羟基。
在此，b)和f)至i)中的R'、R”和R”'各自独立地表示氢原子或C1至C6烷基，并且各自独立地优选是氢原子或C1至C3烷基。
a)至j)优选如下：
a)任选地被一至三个卤素原子取代的C1至C3烷氧基，更优选甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基或三氟甲氧基，甚至更优选甲氧基、乙氧基或三氟甲氧基，最优选甲氧基；
b)任选地被选自一至三个卤素原子、羟基、-OCOR'、-C(＝NR')-NR”R”’和-NHC(＝NR')-NR”R”'的任一个取代的C1至C3烷基，其中R'、R”和R”'各自独立地是氢原子或C1至C3烷基；更优选任选地被选自一至三个卤素原子、羟基、-OCOR'、-C(＝NR')-NR”R”'和-NHC(＝NR')-NR”R”'的任一个取代的C1至C3烷基，其中R'、R”和R”’各自独立地是氢原子或甲基；甚至更优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、羟甲基、-CH2OCOMe、-CH2-NHC(＝NH)-NH2或-CH2-NHC(＝NMe)-NH2；
c)卤素原子，优选氟原子或氯原子；
d)C3至C5环烷氧基，更优选环丙氧基；
e)C1至C3烷硫基，更优选甲硫基或乙硫基；
f)-NR'R”，其中R'和R”各自独立地是氢原子或C1至C3烷基，更优选-NH2、-NHMe、-NMe2、-NHEt或-NEt2；
g)-C(＝NR')-NR”R”'，其中R'、R”和R”'各自独立地是氢原子或C1至C3烷基，更优选-C(＝NH)-NH2或-C(＝NMe)-NH2；
h)-NHC(＝NR')-NR”R”'，其中R'、R”和R”'各自独立地是氢原子或C1至C3烷基，更优选-NHC(＝NH)-NH2或-NHC(＝NMe)-NH2；
i)-NHCOR'，其中R'是氢原子或C1至C3烷基，更优选-NHCOMe或-NHCOEt；和j)羟基。
R13的芳基(优选苯基)或杂芳基(优选吡啶基)可以具有至少一个在任何位置的取代基。如果存在多个取代基，则取代基可以是相同的或不同的。
如果R13是芳基，则每个取代基优选是a)、b)、d)、g)、h)或j)，并且更优选a)、b)、d)或j)。
如果R13是苯基，则R13可以具有在任何位置的取代基并且可以具有多个取代基，并且优选一个或两个取代基存在于3位置处和/或4位置处，并且更优选一个取代基存在于4位置处。
如果R5是萘基，则R5可以具有在任何位置的取代基并且可以具有多个取代基，并且优选一个取代基存在于6位置处。
如果R13是苯基，则R13更优选是苯基、4-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-乙氧基苯基、4-(正丙氧基)-苯基、4-(异丙氧基)-苯基、4-环丙氧基-苯基、4-三氟甲基苯基、4-羟甲基-苯基、4-乙酰氧基甲基-苯基或4-胍基甲基-苯基，并且甚至更优选苯基、4-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-环丙氧基-苯基、4-羟甲基-苯基、4-乙酰氧基甲基-苯基、4-胍基甲基-苯基或4-三氟甲基苯基。
如果R13是萘基，则R13更优选是萘基或6-甲氧基-2-萘基。最优选是4-甲氧基苯基。
如果R13是杂芳基，则每个取代基优选是a)、b)、d)、g)、h)或j)，并且更优选a)或b)。
如果R13是杂芳基，则R13可以具有至少一个在任何位置的取代基。如果R13是3-吡啶基，则其一个或多个取代基优选存在于6位置和/或5位置处。如果R13是2-吡啶基，则其一个或多个取代基优选存在于5位置和/或4位置处或5位置和/或6位置处。如果R13是4-吡啶基，则其取代基优选存在于2位置和/或6位置处。
如果R13是杂芳基，则R13可以具有多个取代基，并且优选具有一个或两个取代基，并且优选具有一个取代基。
如果R13是吡啶基，则R13优选是6-甲氧基-3-吡啶基或6-甲基-3-吡啶基。
如果R13是3-噻吩基或6-喹喔啉基，则R13优选是未经取代的。
R13的“任选地具有一个或多个选自组8的取代基的C1至C6烷基”中的“C1至C6烷基”优选是C1至C3烷基，并且更优选甲基或乙基。
R13的“任选地具有一个或多个选自组8的取代基的C1至C6烷基”中的取代基各自是卤素原子、羟基或C1至C6烷氧基(优选，C1至C3烷氧基)，优选羟基、甲氧基或乙氧基，并且更优选羟基。
B.化合物实施方案二
如果R11表示氢原子，则R12和R13组合，与R12和R13所结合的碳原子一起形成三至五元饱和烃环或三至五元饱和杂环或CH2＝。
三至五元饱和烃环可以被一至四个卤素原子取代，并且可以优选被一个或两个氟原子取代。
R12和R13优选组合以形成三至五元饱和烃环或CH2＝，更优选形成环丙烷、环丁烷或CH2＝(环外亚甲基)，并且甚至更优选形成环丙烷。
如果R12和R13结合以形成三至五元饱和烃环或三至五元饱和杂环，则所述三至五元饱和烃环或三至五元饱和杂环优选与E相同。更优选地，E是三至五元饱和烃环并且R12和R13组合以形成三至五元饱和烃环，并且甚至更优选地，E是环丙烷环并且R12和R13组合以形成环丙烷环。
C.化合物实施方案三
R11、R12和R13组合，与R11所结合的碳原子以及R12和R13所结合的碳原子一起形成任选地具有一个或多个选自组9的取代基的苯环或六元杂环。
苯环或杂环可以具有至少一个在任何位置的取代基。如果存在多个取代基，则取代基可以是相同的或不同的。
苯环或杂环的每个取代基是卤素原子、任选地被一至三个卤素原子取代的C1至C6烷基、或C1至C6烷氧基，优选卤素原子、任选地被一至三个卤素原子取代的C1至C3烷基、或C1至C3烷氧基，并且更优选卤素原子、甲基或甲氧基。
“任选地具有一个或多个取代基的苯环或六元杂环”优选是未经取代的苯环。
R11、R12和R13最优选满足上述(i)。
D.其他可变基团和实施方案
R14和R15各自表示氢原子，或R14和R15组合以表示亚胺键(C＝N)。
V和W各自独立地是氧原子、氮原子或硫原子，并且优选氧原子。
R16和R17使得：
(a)R16和R17组合以形成亚胺键(N＝C)；或
(b)R16表示J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C＝O)-*并且R17表示羟基或C1至C3烷氧基。
在(b)R16是J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C＝O)-*的情况下，式中的星号表示与由上式表示的吡咯并苯二氮环的N10'-位置键合。/>
B’表示苯基或杂芳基，并且优选1,4-苯基、2,5-吡啶基、3,6-吡啶基、2,5-嘧啶基或2,5-噻吩基，并且更优选1,4-苯基。
Lp’表示由在体内或靶细胞中可切割的氨基酸序列组成的接头。例如通过诸如酯酶和肽酶的酶的作用切割Lp。
接头Lp’的具体例子可以包括但不限于-GGVA-(SEQ ID NO:85)、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-(SEQ ID NO:86)、-GGPI-(SEQ ID NO:87)、-GGVCit-(SEQ ID NO:88)、-GGVK-(SEQ ID NO:89)、-GG(D-)PI-、-GGPL-(SEQ ID NO:90)、-EGGVA(SEQ ID NO:91)、-PI-、-GGF-、DGGF-(SEQ ID NO:92)、(D-)D-GGF-、-EGGF-(SEQ ID NO:93)、-SGGF-(SEQ ID NO:94)、-KGGF-(SEQ ID NO:95)、-DGGFG-(SEQ ID NO:96)、-GGFGG-(SEQ ID NO:97)、-DDGGFG-(SEQ ID NO:98)、-KDGGFG-(SEQ ID NO:99)和-GGFGGGF-(SEQ ID NO:100)。
在此，“(D-)V”指示D-缬氨酸，“(D)-P”指示D-脯氨酸，并且“(D-)D”指示D-天冬氨酸。
接头Lp'优选如下：
-GGVA-(SEQ ID NO:85)、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-(SEQ ID NO:86)、-GGPI-(SEQID NO:87)、-GGVCit-(SEQ ID NO:88)、-GGVK-(SEQ ID NO:89)、-GG(D-)PI-或-GGPL-(SEQID NO:90)。
更优选的例子是-GGVA-(SEQ ID NO:85)、-GGVCit-(SEQ ID NO:88)和-VA-。
La'表示选自下组的任一个：
-C(＝O)-(CH2CH2)n6-C(＝O)-、-C(＝O)-(CH2CH2)n6-C(＝O)-NH-(CH2CH2)n7-C(＝O)-、
-C(＝O)-(CH2CH2)n6-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)n7-CH2-C(＝O)-、
-C(＝O)-(CH2CH2)n6-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)n7-CH2CH2-C(＝O)-、-(CH2)n8-O-C(＝O)-、
-(CH2)n12-C(＝O)-和-(CH2CH2)n13-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)n14-CH2CH2-C(＝O)-。
在式中，n6表示1至3的整数(优选1或2)，n7表示1至5的整数(优选2至4的整数，更优选2或4)，n8表示0至2的整数(优选0或1)，n12表示2至7的整数(优选2至5的整数，更优选2或5)，n13表示1至3的整数(优选1)，并且n14表示6至10的整数(优选8)。
La'优选表示选自下组的任一个：
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-、-C(＝O)-(CH2CH2)2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2)2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(＝O)-、-CH2-OC(＝O)-、-OC(＝O)-、
-(CH2)2-C(＝O)-、-(CH2)5-C(＝O)-和-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(＝O)-。
La'更优选-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-、-C(＝O)-(CH2CH2)2-C(＝O)-或-(CH2)5-C(＝O)-。
J不限于特定结构，并且可以是包含与叠氮基团反应形成1,2,3-三唑环的炔烃结构的任何环状结构，并且其例子可以包括但不限于由下式表示的化合物：
[式75]
在以上示出的J的结构式中，每个星号表示与在La'的左端处的-(C＝O)或-(CH2)n8键合。
可替代地，J可以是与抗体Ab的氨基酸残基(例如，半胱氨酸或赖氨酸)的侧链或卤素原子键合的化合物，并且J的例子可以包括但不限于由下式表示的马来酰亚胺基：
[式76]
在以上示出的马来酰亚胺基中，星号表示与在La'的左端的-(CH2)n12或-(CH2CH2)n13键合。
R16优选由J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C＝O)-*表示，其中
B'是1,4-苯基；
Lp'表示选自下组的任一个：
-GGVA-(SEQ ID NO:85)、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-(SEQ ID NO:86)、-GGPI-(SEQID NO:87)、-GGVCit-(SEQ ID NO:88)、-GGVK-(SEQ ID NO:89)、-GG(D-)PI-和-GGPL-(SEQID NO:90)；
La'表示选自下组的任一个：
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-、-C(＝O)-(CH2CH2)2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2)2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-CH2-OC(＝O)-、
-(CH2)5-C(＝O)-和-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(＝O)-；并且J表示以下结构式中的任一个：
[式77]
其中，在J的结构式中，
每个星号表示与La'键合。
R16更优选是选自下组的任一个：
J1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)、
J1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GG-(D-)VA-NH-B'-CH2-OC(＝O)-、
J1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B'-CH2-OC(＝O)-、
J1-C(＝O)-(CH2CH2)2-C(＝O)-VA-NH-B'-CH2-OC(＝O)-、
J1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGPI-NH-B'-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:87所公开的“GGPI”)、
J1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGFG-NH-B'-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:86所公开的“GGFG”)、
J1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVCit-NH-B'-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:88所公开的“GGVCit”)、
J1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVK-NH-B'-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:89所公开的“GGVK”)、
J1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGPL-NH-B'-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:90所公开的“GGPL”)、
J1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2)2-C(＝O)-VA-NH-B'-CH2-OC(＝O)-、
J1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(＝O)-VA-NH-B'-CH2-OC(＝O)-、
J1-C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B'-CH2-OC(＝O)-、
J2-OC(＝O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)、J3-CH2-OC(＝O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)、
J4-(CH2)5-C(＝O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)、
J4-(CH2)5-C(＝O)-VA-NH-B'-CH2-OC(＝O)-和
J4-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B'-CH2-OC(＝O)-
其中J1、J2、J3和J4表示由以下表示的结构式：
[式78]
其中，在J1、J2、J3和J4的结构式中，
每个星号表示与邻接J1、J2、J3或J4的基团键合，并且
B'是1,4-苯基。
R16最优选以下中的任一个：
J1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)、
J1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B'-CH2-OC(＝O)-、
J1-C(＝O)-(CH2CH2)2-C(＝O)-VA-NH-B'-CH2-OC(＝O)-、
J1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVCit-NH-B'-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:88所公开的“GGVCit”)、
J1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2)2-C(＝O)-VA-NH-B'-CH2-OC(＝O)-、
J1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(＝O)-VA-NH-B'-CH2-OC(＝O)-、
J1-C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B'-CH2-OC(＝O)-、
J4-(CH2)5-C(＝O)-VA-NH-B'-CH2-OC(＝O)-
其中
B'是1,4-苯基，并且
J1和J4由以下J的结构式表示：
[式79]
其中，在J1和J4的结构式中，
每个星号表示与邻接J1或J4的基团键合。
R17是羟基或C1至C3烷氧基，并且优选羟基或甲氧基。R17可以是亚硫酸氢根加合物(OSO3M，其中M是金属阳离子)。由于R17与不对称碳原子键合，因此提供了由以下部分结构(VIa)或(VIb)表示的空间构型。每条波浪线表示与由通式(VI)表示的中间体和游离药物中的W键合。
[式80]
游离药物优选选自以下组的一种化合物：
[式81]
在一些情况下，游离药物伴随键合的接头L的一部分被释放在肿瘤细胞中，但即使在这种状态下，也是发挥了优越的抗肿瘤作用的优良药物。在迁移到肿瘤细胞后，游离药物在一些情况下被进一步氧化以引起R16和R17的脱氢，但即使在这种状态下也发挥了优异的抗肿瘤作用。
产物中间体还可以是选自以下组的一种化合物：
[式82]
[式83]
产物中间体还可以是选自以下组的一种化合物：[式84]
[式85]
[式86]
[式87]
VIII.药剂
本发明的抗体-药物缀合物展现出对癌细胞的细胞毒性活性，并且因此可以用作用于癌症的药物、特别是治疗剂和/或预防剂。在一些实施方案中，所述癌症表达DLL3或过表达DLL3。
应用本发明抗体-药物缀合物的癌症的例子可以包括小细胞肺癌(SCLC)；大细胞神经内分泌癌(LCNEC)；包括肾脏、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、宫颈和子宫内膜)、胃肠道(胃、结肠)、甲状腺(甲状腺髓样癌)、胰腺和肺在内的多种组织的神经内分泌肿瘤；神经胶质瘤或假性神经内分泌肿瘤(pNET)，但不限于此，只要作为治疗靶标的癌细胞表达抗体-药物缀合物中的抗体可识别的蛋白质即可。
本发明的抗体-药物缀合物可以优选向哺乳动物施用，并且更优选向人施用。
鉴于施用的剂量或浓度，可以从本领域中通常使用的配制添加剂等中适当地选择并且应用在含有本发明抗体-药物缀合物的药物组合物中使用的物质。
本发明的抗体-药物缀合物可以作为含有一种或多种药学上适用的组分的药物组合物施用。例如，药物组合物典型地含有一种或多种药物载体(例如，灭菌液体(包括水和油(石油和动物来源、植物来源或合成来源的油(诸如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油))))。在将上述药物组合物静脉内施用时，水是更典型的载体。盐水溶液、水性右旋糖溶液和水性甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物媒介物是本领域已知的。如果需要，上述组合物还可以含有痕量的保湿剂、乳化剂或pH缓冲剂。合适的药物载体的例子披露于E.W.Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中。配制品对应于施用方式。
应用本发明抗DLL3抗体-药物缀合物的癌症的类型没有特别限制，只要所述癌症在待治疗的癌细胞中表达DLL3即可。其例子可以包括小细胞肺癌(SCLC)；大细胞神经内分泌癌(LCNEC)；包括肾脏、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、宫颈和子宫内膜)、胃肠道(胃、结肠)、甲状腺(甲状腺髓样癌)、胰腺和肺在内的多种组织的神经内分泌肿瘤；神经胶质瘤或假性神经内分泌肿瘤(pNET)。然而癌症不限于此，只要癌症表达DLL3即可。癌症的更优选例子可以包括小细胞肺癌(SCLC)、大细胞神经内分泌癌(LCNEC)和多种组织的神经内分泌肿瘤。
本发明的抗DLL3抗体-药物缀合物可以优选向哺乳动物施用，并且更优选向人施用。
已知多种递送系统，并且它们可以用于施用本发明的抗体-药物缀合物。施用途径的例子可以包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下途径。例如，可以通过注射或团注进行施用。根据具体优选的实施方案，上述配体-药物缀合物形式的施用通过注射完成。肠胃外施用是优选的施用途径。
根据代表性的实施方案，所述药物组合物根据常规程序被规定为适合于向人静脉内施用的药物组合物。用于静脉内施用的组合物典型地是在无菌和等渗水性缓冲液中的溶液。如果需要，所述药物可以含有增溶剂和局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛(例如，利多卡因)。通常，上述成分作为包含在每个容器中的干燥的冻干粉或无水浓缩物单独提供，所述容器通过密封在指示活性剂的量的安瓿或小药囊中获得；或作为单位剂型的混合物提供。当药物组合物要通过注射施用时，它可以从含有无菌制药级水或盐水的注射瓶施用。当通过注射施用药物时，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿，使得在施用前将上述成分相互混合。
本发明的药物组合物可以是仅含有本发明抗体-药物缀合物的药物组合物，或含有抗体-药物缀合物和除所述抗体-药物缀合物以外的至少一种癌症治疗剂的药物组合物。本发明的抗体-药物缀合物可以与其他癌症治疗剂组合施用，并且从而可以增强抗癌效果。用于这种目的的其他抗癌剂可以与抗体-药物缀合物同时、单独或在其之后向个体施用，并且可以在改变各自的施用间隔的同时施用。此类癌症治疗剂的例子可以包括白蛋白结合型紫杉醇(abraxane)，卡铂，顺铂，吉西他滨，伊立替康(CPT-11)，紫杉醇，培美曲塞，索拉非尼，长春花碱，国际公开号WO 2003/038043中描述的药剂，LH-RH类似物(例如，亮丙瑞林、戈舍瑞林)，雌莫司汀磷酸盐，雌激素拮抗剂(例如，他莫昔芬、雷洛昔芬)和芳香化酶抑制剂(例如，阿那曲唑、来曲唑、依西美坦)，但不限于此，只要它们是具有抗肿瘤活性的药剂即可。
可以将药物组合物配制为冻干配制品或液体配制品作为具有选定组成和所需纯度的配制品。当配制为冻干配制品时，它可以是含有本领域中所用的合适配制品添加剂的配制品。此外对于液体配制品，可以将它配制为含有本领域中所用的各种配制品添加剂的液体配制品。
药物组合物的组成和浓度可以根据施用方法而变化。然而，当抗体-药物缀合物具有对抗原的高亲和力(即，就对抗原的解离常数(Kd值)而言更高的亲和力(更低的Kd值))时，本发明药物组合物中含有的抗体-药物缀合物即使在小剂量下也可以展现出药物作用。因此，为了确定抗体-药物缀合物的剂量，可以鉴于关于抗体-药物缀合物对抗原的亲和力的情况设定剂量。当本发明的抗体-药物缀合物向人施用时，例如，可以一次施用约0.001至100mg/kg或以1至180天的间隔以多个部分施用。
总之，所公开的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或其抗原结合片段，诸如2-C8-A、6-G23-F、10-O18-A、H2-C8-A、H6-G23-F或H10-O18-A)及其抗体-药物缀合物可用于治疗DLL3相关癌症。此类治疗可以用于被鉴定为具有病理上高水平的DLL3的患者(例如，通过本文所述的方法诊断的患者)或被诊断患有已知与此类病理水平相关的疾病的患者。在一个方面，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者的DLL3相关癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明技术的抗体(或其抗原结合片段)。通过本发明技术的抗体治疗的癌症的例子包括但不限于：小细胞肺癌(SCLC)；大细胞神经内分泌癌(LCNEC)；包括肾脏、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、宫颈和子宫内膜)、胃肠道(胃、结肠)、甲状腺(甲状腺髓样癌)、胰腺和肺在内的多种组织的神经内分泌肿瘤；神经胶质瘤或假性神经内分泌肿瘤(pNET)。本发明技术的组合物可以任选地以单次推注的形式施用至有需要的受试者。可替代地，给药方案可以包括在肿瘤出现后的不同时间进行的多次施用。施用可以通过任何合适的途径进行，所述合适的途径包括口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌内、腹膜内或皮下)、直肠、颅内、瘤内、鞘内或局部。施用包括自我施用和由另一人施用。还应理解，如所描述的医学病症的多种治疗方式旨在意指“基本上的”，其包括完全治疗以及不到完全治疗，并且其中实现了一些生物学或医学上相关的结果。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明技术，所述实施例不应当被解释为以任何方式进行限制。以下实施例展示了本发明技术的说明性抗DLL3抗体和抗体-药物缀合物(ADC)的制备、表征和用途。然而，这些实施例不旨在限制本发明的范围。此外，不应以任何手段以有限的方式解释这些实施例。要注意的是，以下实施例中，除非另有说明，否则已经根据“Molecular Cloning”(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,由Cold SpringHarbor Laboratory在1989年出版)或本领域技术人员使用的实验手册中描述的其他方法进行了关于基因操纵的单独操作，或当已经使用可商购的试剂或试剂盒时，已经根据可商购产品中包括的说明书进行实施例。在本说明书中，除非另有说明，否则试剂、溶剂和起始材料可从可商购的来源容易获得。
实施例1-单克隆抗体的产生
将在稳定表达全长DLL3的HEK293T细胞中产生的对应于具有C-末端6×His标签(SEQ ID NO:84)的氨基酸Ala27-Ala479的DLL3(GenBank登录号Q9NY J7-1)的细胞外结构域(ECD)用作免疫原。根据标准免疫技术，在3周的时间段内将携带人免疫球蛋白库的Ablexis AlivaMAbκ小鼠(Ablexis，加利福尼亚州圣地亚哥)用可溶性DLL3-ECD或稳定细胞进行免疫。收获来自对DLL3具有特异性的具有高血清滴度的小鼠的脾细胞和引流淋巴结细胞，并且使用电融合与小鼠骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。然后筛选这些杂交瘤以通过ELISA鉴定特异性结合可溶性DLL3-ECD的抗体和通过流式细胞术稳定表达293细胞与亲本293细胞的全长DLL3蛋白的抗体的存在。通过在流式细胞术中对293DLL3转染子的染色强度排序以及如下所述进行4℃/37℃染色，选择用于进一步研究的杂交瘤。
实施例2-用单克隆抗体6-G23-F、2-C8-A、7-I1-B和10-O18-A的4/37内化测定
通过比较在4℃下和在37℃下的染色，比较四种单克隆抗体(6-G23-F、2-C8-A、7-I1-B和10-O18-A)内化DLL3的能力。将参考单克隆抗体SC16(已知经由DLL3内化并具有ADC活性，并且先前在文献中报道过)用作内化的阳性对照。将指数生长的NCI-H82细胞用胰蛋白酶/EDTA收获，在含有10％胎牛血清(FCS)的RPMI中洗涤一次，并且以2×107个细胞/ml重悬于补充有10％ FCS的DMEM中。将100μl(2×106个细胞)添加到U底96孔板中。将测试单克隆抗体(6-G23-F、2-C8-A、7-I1-B或10-O18-A)或参考单克隆抗体添加到单独的孔中，以在重复的板中得到10μg/ml的终浓度。将两个板均在4℃下保持30分钟，然后将两个板均用补充有10％ FCS的冷RPMI洗涤2次，并且重悬于补充有10％FCS的RPMI中。将一个板在4℃下保持(对照板)，并且将另一个板在37℃下在CO2培养箱中孵育(实验板)。将实验板在37℃下在CO2培养箱中孵育并且将对照板在4℃下孵育4小时后，将细胞在4℃下用冷洗涤缓冲液(含有0.5％ BSA的PBS)洗涤3次。然后将样品以在洗涤缓冲液中7μg/ml的终浓度重悬于冷洗涤缓冲液+R-藻红蛋白-AffiniPure F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG(Jackson 115-116-071)中。在4℃下孵育30分钟后，将细胞在冷洗涤缓冲液中洗涤三次，并且固定在PBS 0.5％多聚甲醛中，并且在48小时内通过流式细胞术分析。将通过对照板(其在4℃下与抗体一起孵育)获得的MFI除以从实验板(其在37℃下与抗体一起孵育)获得的相应MFI计算的平均荧光强度(MFI)比率作为内化的相对量度。高的值指示更大的内化。如下表所示，所有的单克隆抗体(6-G23-F、2-C8-A、7-I1-B和10-O18-A)都能够内化结合DLL3，但是不能达到参考单克隆抗体的程度。
克隆 MFI比率
6-G23-F 1.67
2-C8-A 1.76
7-I1-B 1.68
10-O18-A 1.56
参考单克隆抗体 2.66
小鼠IgG1 1.28
这些结果证明本发明技术的免疫球蛋白相关组合物经由与DLL3结合而经历内化。因此，本文公开的免疫球蛋白相关组合物可用于将治疗剂递送至DLL3阳性癌细胞。
实施例3-单克隆抗体6-G23-F、2-C8-A、7-I1-B和10-O18-A的淬灭内化测定
为了关于内化对单克隆抗体进行排序，使用淬灭内化测定。此方法反映了内化和进入内体/溶酶体途径。将山羊抗小鼠IgG1 F(ab)(Jackson Immunoresearch 115-007-185)用Dy light Dy650 NHS酯(Thermofisher 02206)和LICOR IRDye QC1 NHS酯(LICOR929-7030)进行双重标记(所述双重标记抗体在本文称为“F(ab)Dy650-QC1”)。此测定的原理如下：F(ab)Dy650-QC1不发荧光，因为Dy light Dy650荧光被IRDye QC1淬灭。然而，在内化后，F(ab)Dy650-QC1经由内体/溶酶体途径降解，并且由此引起的IRDye QC1释放使得可观察到Dy light Dy650的荧光。因此，将Dy light Dy650荧光信号用作经由溶酶体内化的量度。简言之，将指数生长的NCI-H82细胞用胰蛋白酶/EDTA收获，在补充有10％FCS的生长培养基RPMI中洗涤一次，并且重悬于生长培养基中，并且每孔添加1.25x 106个细胞(80μl)。将浓度为200μg/ml的单克隆DLL3抗体与200μg/ml的山羊抗小鼠IgG1Dy650 QC1在室温下混合20分钟，并且将20μl的混合物添加到细胞中。在4℃下孵育30分钟后，将细胞用生长培养基洗涤两次，重悬于生长培养基中并且转移至37℃的CO2培养箱中持续4小时以允许内化。然后将细胞用含有0.5％ BSA的冰冷的PBS洗涤2次，并且通过流式细胞术进行分析，并且确定平均荧光强度。将对照参考单克隆的平均荧光强度设置为100％内化。如下表所示，所有四种单克隆抗体均展示出内化和进入内体/溶酶体途径。
克隆 Dy light Dy658荧光(对照参考单克隆抗体的％)
6-G23-F(10μg/ml) 76.5
7-I1-B(10μg/ml) 70.1
2-C8-A(10μg/ml) 62.9
10-O18-A(10μg/ml) 62.2
同种型对照 20
这些结果证明本发明技术的免疫球蛋白相关组合物经由与DLL3结合经历内化，并且进入细胞的吞噬体/溶酶体区室。因此，本文公开的免疫球蛋白相关组合物可用于将治疗剂递送至DLL3阳性癌细胞。
实施例4-抗DLL3单克隆抗体的Fab ZAP测定
Fab ZAP测定被用作测量内化的另一种方法。Fab ZAP测定经由抗DLL3单克隆抗体的内化来测量毒素向细胞的递送。Fab ZAP测定使用皂草素毒素缀合的F(ab)抗小鼠重链和轻链来标记带有毒素的单克隆抗体。使用来自Advanced Targeting Systems的试剂盒，并且根据Fab ZAP测定方案表征抗DLL3单克隆抗体组。简言之，将指数生长的NCI-H82细胞用胰蛋白酶/EDTA收获，用补充有10％ FCS的RMPI洗涤一次，并且在补充有10％ FCS的100μlRPMI中在96孔白色固体板上以5000个细胞/孔铺板。第二天，以10μg/ml的起始浓度添加25μl纯化单克隆抗体(G23-F、2-C8-A、7-I1-B或10-O18-A)或参考单克隆单克隆抗体，并且进行连续三个倍数稀释。在25μl中添加皂苷缀合的F(ab)抗小鼠Ig HL(Fab ZAP)以得到4.4nM的终浓度。3-4天后，将相同体积的Cell Titre Glow(Promega G7571)添加到板上，将其在定轨摇床上摇动2分钟，并且在室温下再摇动10分钟后，使用读板仪读取发光。所有单克隆抗体都被测试为完全滴定，以否定前带效应。如图9和下表所示，所有单克隆抗体都展现出与参考单克隆抗体可比较的细胞毒性活性。在这些单克隆抗体的其他实验中，小鼠IgG1对照单克隆抗体没有展现出细胞毒性活性。因此，这些结果证明通过识别DLL3而不是通过FcR来介导细胞毒性活性。
这些结果证明本发明技术的免疫球蛋白相关组合物可以将治疗剂递送至在其细胞表面上表达DLL3的肿瘤。因此，本文公开的免疫球蛋白相关组合物可用于将治疗剂递送至DLL3阳性癌细胞。
实施例5-抗DLL3抗体的表位结合
在阵列表面等离子体共振(SPR)测定平台(/>Inc.，犹他州盐湖城)上使纯化抗DLL3单克隆抗体和参考单克隆抗体经受成对表位分箱，其中针对捕获组氨酸标记的DLL3抗原(DLL3-His)以及针对与组中的每一种其他抗体竞争结合DLL3-His测试每种单克隆抗体。通过打印阵列方法通过标准胺偶联技术将抗体固定在HC200M芯片(配体)上。然后在每个循环中，在整个阵列中注射抗原，接着注射单个抗体(分析物)。在每个循环结束时，将表面再生以去除抗原和分析物，然后开始新的循环。如下表所示，鉴定三种不同的箱元，其中具有7-I1-B和2-C8-A的组映射为箱元2，而6-G23-F在箱元3中，并且10-O18-A在箱元1中。
这些结果证明本发明技术的免疫球蛋白相关组合物结合DLL3蛋白中存在的三种不同表位。因此，本文公开的免疫球蛋白相关组合物可以彼此组合使用，以用于将多种治疗剂递送至表达DLL3的肿瘤细胞。
实施例6-亲和力测量。
使用PBS 0.1％ BSA 0.02％ Tween 20作为结合缓冲液和10mM甘氨酸(pH 1.7)作为再生缓冲液，在25℃下使用Octet HTX仪器通过生物膜层干涉法(BLI)确定四种单克隆抗体(6-G23-F、2-C8-A、7-I1-B和10-O18-A)的结合亲和力。将四种纯化的单克隆抗体(各5μg/mL)加载到抗小鼠Fc传感器上。将加载的传感器浸入以200nM起始浓度采用7个连续1:3稀释度的重组人DLL3蛋白(氨基酸Ala27-Ala479，目录号9749-DL，R&DSystems)的系列稀释液中。如图10A-图10D中所示，结合是浓度依赖性的。使用单价(1:1)结合模型计算解离常数(KD)。如图10E所示，所有单克隆抗体的亲和力都在亚纳摩尔范围内。图11示出了6-G23-F、10-O18-A和2-C8-A单克隆抗体(mAb)选择性结合DLL3，但不结合DLL1或DLL4。7-I1-B mAb结合DLL3和DLL4二者，但是不结合DLL1。
这些结果证明本发明技术的免疫球蛋白相关组合物以高亲和力特异性结合DLL3。因此，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物可用于检测生物样品中的DLL3蛋白的方法中。
实施例7-单克隆抗体与转染细胞和原代细胞的结合。
通过流式细胞术测试四种单克隆抗体(6-G23-F、2-C8-A、7-I1-B和10-O18-A)与小鼠和食蟹猴DLL3以及内源性人DLL3结合的能力。为此，将HEK293细胞用编码全长人、小鼠或食蟹猴DLL3的质粒DNA转染并且用于实验。简言之，将在FACS缓冲液PBS 0.5％BSA中的106个转染的HEK293细胞或NCI-H82原代细胞添加到96孔U底板的孔中，并且以10μg/ml添加纯化的单克隆。在4℃下孵育30分钟后，将细胞在FACS缓冲液中洗涤3次，并且与PE标记的F(ab)2抗小鼠IgG H和L第2阶段一起孵育。在4℃下孵育另外的30分钟后，将细胞在FACS缓冲液中洗涤三次，并且在流式细胞仪上进行分析。数据以单克隆的平均荧光强度除以第2阶段的背景染色的比率呈现。如下表所示，将所有的单克隆抗体都与食蟹猴DLL3交叉反应，并且在NCI H82细胞上检测到内源性DLL3，但是只有6-G23-F和7-I1-B与小鼠DLL3结合。
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这些结果证明本发明技术的免疫球蛋白相关组合物可用于检测生物样品中的DLL3蛋白的方法中。
实施例8-测序
通过RACE(快速扩增cDNA末端)从7-I1-B、6-G23-F、2-C8-A和10-O18-A的相应杂交瘤中分离四种单克隆抗体的可变重链和可变轻链。使用RNAEasy试剂盒(Qiagen)从裂解的杂交瘤分离RNA。分离mRNA用于cDNA合成，并且使用RACE试剂盒生成PCR产物。然后将PCR产物克隆到TOPO载体中，进行PCR扩增，并且随后凝胶分离用于测序。重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的核苷酸和氨基酸序列示出于下表和图5A-图5D(7-I1-B)、图6A-图6D(2-C8-A)、图7A-图7D(10-O18-A)和图8A-图8D(6-G23-F)中。
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实施例8-1重组抗DLL3抗体H2-C8-A、H2-C8-A-2和H2-C8-A-3的产生
重链的构建：通过将实施例8中获得的可变区(SEQ ID NO:12)与IgG1的人γ链恒定区(SEQ ID:42)连接来构建抗DLL3抗体H2-C8-A(SEQ ID NO:59)的重链。还通过将实施例8中获得的可变区(SEQ ID NO:12)与IgG1变体的人γ链恒定区(SEQ ID NO:57和58)连接来构建抗DLL3抗体H2-C8-A-2(SEQ ID NO:60)和H2-C8-A-3(SEQ ID NO:61)的重链。
EVQLVESGGGLVQPGGSQRLSCAASGFTFSSYWMNWVRQAPGKGLEWVANIKEDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPGWAPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:59)
EVQLVESGGGLVQPGGSQRLSCAASGFTFSSYWMNWVRQAPGKGLEWVANIKEDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPGWAPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:60)
EVQLVESGGGLVQPGGSQRLSCAASGFTFSSYWMNWVRQAPGKGLEWVANIKEDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPGWAPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:61)
轻链的构建：构建抗DLL3抗体H2-C8-A的轻链，并且可以通过将实施例8中获得的可变区与IgG1的人κ链恒定区(SEQ ID NO:17和49)连接来构建抗DLL3抗体H2-C8-A-2和H2-C8-A-3的轻链(SEQ ID NO:62)。
DIQMSQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQSGVPSKFSGSGSGTDFTLAISSLQPEDFATYYCQQYNSFPYTFGQGTTLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:62)
表达载体pCMA-G1的构建：专利申请号WO 2017/051888中描述了包含人重链信号序列和编码人γ链恒定区的DNA序列的表达载体pCMA-G1的构建。
表达载体pCMA-LK的构建：专利申请号WO 2017/051888中描述了包含人轻链信号序列和编码人κ链恒定区的DNA序列的表达载体pCMA-LK的构建。
表达载体pCMA-G1-1的构建：合成DNA片段(SEQ ID No:75)(Eurofins Genomics，人工基因合成服务)。将DNA片段用限制性内切酶XbaI和PmeI消化。将所得的1.1kb片段通过琼脂糖凝胶电泳分离并且用纯化Wizard SV Gel和PCR Clean-Up系统(Promega)纯化。还将pCMA-G1的表达载体用限制性内切酶XbaI和PmeI消化以通过琼脂糖凝胶电泳去除人重链信号序列和编码人γ链恒定区的DNA序列。还将所得的3.4kb pCMA-G1的XbaI/PmeI片段用Wizard SV Gel和PCR Clean-Up系统纯化。将纯化的1.1kb和3.4kb XbaI/PmeI片段与Ligation High(Toyobo)连接，以构建表达载体pCMA-G1-1。
GGGTCTAGAGCCACCATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTGCTGAGCCAGGTGCAATTGTGCAGGCGGTTAGCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAAGCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCCGTGACCGTGAGCTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCCTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGCAAATGAGATATCGGGCCCGTTTAAACGGG(SEQ ID NO:75)
抗DLL3抗体H2-C8-A-2重链的表达载体的构建：合成(GENEART，人工基因合成服务)DNA片段，所述DNA片段由在核苷酸58至405位置处(在SEQ ID NO:76中)的核苷酸与在5’-位点(AGCTCCCAGATGGGTGCTGAGC；SEQ ID NO:76的核苷酸36-57)和在3’-位点(AGCTCAGCCTCCACCAAGGGCCC；SEQ ID NO:76的核苷酸406-428)两处的用于融合反应(In-Fusion reaction)的侧翼重组位点组成。使用融合HD PCR克隆试剂盒(Takara Bio USA)，将合成的DNA片段插入用限制性内切酶BIpI切割的pCMA-G1-1的位点，从而构建抗DLL3抗体H2-C8-A-2重链的表达载体。
ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTGCTGAGCGAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCAGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGGTCGCCAACATCAAAGAGGACGGCAGCGAGAAGTACTACGTGGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCG
CCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCCTGGCTGGGCCCCTTTCGATTATTGGGGCCAG
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GCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTG
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ACAAAACTCACACATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCCTC
AGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG
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GCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGAC
TGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCC
CCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCACAGGTGTA
CACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGC
CTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCC
AGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC
TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTCT
TCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGCAAA(SEQ ID NO:76)
抗DLL3抗体H2-C8-A-3重链的表达载体的构建：合成(GENEART，人工基因合成服务)DNA片段，所述DNA片段由在核苷酸1至1401位置处(在SEQ ID NO:77中)的核苷酸与在SEQ ID NO:77之外的5’-位点(CCAGCCTCCGGACTCTAGAGCCACC；SEQ ID NO:101)和在SEQ IDNO:77之外的3’-位点(TGAGTTTAAACGGGGGAGGCTAACT；SEQ ID NO:102)两处的用于融合反应的侧翼重组位点组成。使用融合HD PCR克隆试剂盒，将扩增的DNA片段插入用限制性内切酶XbaI/PmeI切割的pCMA-LK的位点，导致构建抗DLL3抗体H2-C8-A-3重链的表达载体。ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCTAGATGGGTGCTGTCTGAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCAGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACTGGATGAACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGGTCGCCAACATCAAAGAGGACGGCAGCGAGAAGTACTACGTGGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGCGCCGAAGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCCTGGCTGGGCCCCTTTCGATTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCATCTGCCTCCACCAAGGGCCCAAGCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCCGTGACCGTGAGCTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGGACCCTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGCAAA(SEQ ID NO:77)
抗DLL3抗体H2-C8-A-2和H2-C8-A-3轻链的表达载体的构建：合成(GENEART，人工基因合成服务)DNA片段，所述DNA片段由在核苷酸61至381位置处(在SEQ ID NO:80中)的核苷酸与在5’-位点(CTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGC；SEQ ID NO:80的核苷酸37-60)和在3’-位点(CGTACGGTGGCCGCCCCCTCC；SEQ ID NO:80的核苷酸382-402)两处的用于融合反应的侧翼重组位点组成。使用融合HD PCR克隆试剂盒(Takara Bio USA)，将合成的DNA片段插入用限制性内切酶BsiWI切割的pCMA-LK的位点，从而构建抗DLL3抗体H2-C8-A-2和H2-C8-A-3轻链的表达载体。
ATGGTGCTGCAGACCCAGGTGTTCATCTCCCTGCTGCTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGCGACATCCAGATGTCTCAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCAGCAACTACCTGGCCTGGTTCCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGAGCCTGATCTATGCCGCTAGCTCTCTGCAGTCTGGCGTGCCCTCTAAGTTTAGCGGCTCTGGCAGCGGCACCGATTTCACACTGGCCATATCTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAACAGCTTCCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCACACTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCTCCGTGTTCATCTTCCCCCCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGGAACTCCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGAGCTCCCCCGTCACCAAGAGCTTCAACAGGGGGGAGTGT(SEQ ID NO:80)
表达和纯化：构建(转染级质粒，Genscript)编码H2-C8-A的重链和轻链的对应DNA序列的表达载体并且将其转染到HEK293细胞(HD 293F，Genscript)中。然后培养并且收获，通过蛋白A亲和色谱从所获得的上清液中纯化出抗体。
可替代地，关于H2-C8-A-3，根据使用手册培养并且传代FreeStyle 293F细胞(Thermo Fisher Scientific)。将在对数生长期的FreeStyle 293F细胞接种在3L锥形瓶(CORNING)上，并且用FreeStyle293表达培养基(Thermo Fisher Scientific)以2.0-2.4×106个细胞/mL稀释至总体积580mL。同时，将300μg H2-C8-A-3的重链表达载体、300μgH2-C8-A-3的轻链表达载体和1.8mg聚乙烯亚胺(Polyscience)添加到20mL Opti-Pro SFM培养基(Thermo Fisher Scientific)中，并且轻缓地搅拌所获得的混合物。在孵育5分钟后，将混合物添加到FreeStyle 293F细胞中。将细胞在培养箱(37℃，8％ CO2)中在95rpm下振荡的情况下孵育4小时，并且之后，将480mL包含4mM GlutaMAX补充物I(Thermo FisherScientific)的BalanCD(R)HEK293(FUJIFILM Irvine Scientific)和120mL包含4mMGlutaMAX补充物I的BalanCD(R)HEK293 Feed(FUJIFILM Irvine Scientific)添加到培养物中。将细胞进一步在培养箱(37℃，8％ CO2)中在95rpm下振荡的情况下孵育6天。将培养物上清液收获并且用500mL过滤器系统(Thermo Fisher Scientific)过滤。
另一方面，关于H2-C8-A-2，根据使用手册，将FreeStyle 293F细胞在带有中型生物反应器BCP(Biott)的旋转瓶(spinner flask)中在37℃，8％ CO2下培养并且传代。用WAVE BIOREACTOR(GE healthcare)进行FreeStyle 293F细胞的转染和培养。将2.5L在对数生长期的FreeStyle 293F细胞以2.0-2.4×106个细胞/mL接种在WAVE CELLBAG10L(Cytiva)上。同时，将1.25mg H2-C8-A-2的重链表达载体、1.25mg H2-C8-A-2的轻链表达载体和7.5mg聚乙烯亚胺(Polyscience)添加到160mL的Opti-Pro SFM培养基(Thermo FisherScientific)中，并且轻缓地搅拌获得的混合物。在孵育5分钟后，将混合物添加到在WAVECELLBAG10L中的FreeStyle 293F细胞中。将细胞在WAVE CELLBAG10L(37℃，8％ CO2)中在摇摆下培养4小时，并且之后，将1.92L包含4mM GlutaMAX补充物I的BalanCD(R)HEK293和480mL包含4mM GlutaMAX补充物I的BalanCD(R)HEK293 Feed添加到培养物中。将细胞进一步在WAVE CELLBAG10L(37℃，8％CO2)中在摇摆下培养6天。收获培养的上清液，将其离心并且用胶囊筒式过滤器(CAPSULE CARTRIDGE FILTER)(孔径：0.45μm，ADVANTEC)过滤。
抗DLL3抗体的纯化：将过滤的培养物上清液通过rProtein A亲和色谱和羟基磷灰石陶瓷的两步方法纯化。纯化方法的细节描述在专利申请号WO 2020/013170中。
实施例8-2-重组抗DLL3抗体H6-G23-F、H6-G23-F-2和H6-G23-F-3的MAB2产生
重链的构建：通过将实施例8中获得的可变区(SEQ ID NO:32)与IgG1的人γ链恒定区(SEQ ID:42)连接来构建抗DLL3抗体H6-G23-F(SEQ ID NO:63)的重链。还通过将实施例8中获得的可变区(SEQ ID NO:32)与IgG1变体的人γ链恒定区(SEQ ID NO:57和58)连接来构建抗DLL3抗体H6-G23-F-2和H6-G23-F-3(分别为SEQ ID NO:64和65)的重链。
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWMGIIDPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDREYNYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:63)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWMGIIDPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDREYNYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:64)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWMGIIDPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDREYNYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:65)
轻链的构建：通过将实施例8中获得的可变区与IgG1的人κ链恒定区(SEQ ID NO:37和49)连接来构建抗DLL3抗体H6-G23-F的轻链并且可以构建抗DLL3抗体H6-G23-F-2和H6-G23-F-3的轻链(SEQ ID NO:66)。
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVYRDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFRGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:66)
表达和纯化：制备(转染级质粒，Genscript)编码上述H6-G23-F的重链和轻链的对应DNA序列的表达载体并且将其转染到HEK293细胞(HD 293F，Genscript)中。然后培养并且收获，通过蛋白A亲和色谱从所获得的上清液中纯化出抗体。
实施例8-3-重组抗DLL3抗体H10-O18-A、H10-O18-A-2和H10-O18-A-3的MAB3产生
重链的构建：通过将实施例8中获得的可变区(SEQ ID NO:22)与IgG1的人γ链恒定区(SEQ ID NO:42)连接来构建抗DLL3抗体H10-O18-A的重链(SEQ ID NO:67)。可以通过将实施例8中获得的可变区(SEQ ID NO:22)与IgG1变体的人γ链恒定区(SEQ ID NO:57和58)连接来构建抗DLL3抗体H10-O18-A-2和H10-O18-A-3(分别为SEQ ID NO：68和69)的重链。
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIFYSGITNYNPSLKSRVTISLDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARIGVAGFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:67)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIFYSGITNYNPSLKSRVTISLDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARIGVAGFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:68)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIFYSGITNYNPSLKSRVTISLDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARIGVAGFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:69)
轻链的构建：构建抗DLL3抗体H10-O18-A的轻链，并且可以通过将实施例8中获得的可变区与IgG1的人κ链恒定区(SEQ ID NO:27和49)连接来构建抗DLL3抗体H10-O18-A-2和H10-O18-A-3的轻链(SEQ ID NO:70)。
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGTSPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:70)
抗DLL3抗体H10-O18-A-2重链的表达载体的构建：合成(GENEART，人工基因合成服务)DNA片段，所述DNA片段由在核苷酸58至405位置处(在SEQ ID NO:78中)的核苷酸与在5’-位点(AGCTCCCAGATGGGTGCTGAGC；SEQ ID NO:78的核苷酸36-57)和在3’-位点(AGCTCAGCCTCCACCAAGGGCCC；SEQ ID NO:78的核苷酸406-428)两处的用于融合反应(In-Fusion reaction)的侧翼重组位点组成。使用融合HD PCR克隆试剂盒(Takara Bio USA)，将合成的DNA片段插入用限制性内切酶BIpI切割的pCMA-G1-1的位点，从而构建抗DLL3抗体H10-O18-A-2重链的表达载体。
ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTGCTGAGCCAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTAGCGAAACACTGAGCCTGACCTGTACCGTGTCTGGCGGCAGCATCAACAGCTACTACTGGTCCTGGATCCGGCAGCCTCCTGGCAAAGGACTGGAATGGATCGGCTACATCTTCTACAGCGGCATCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGAGTGACCATCAGCCTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACAGCCGTGTACTACTGTGCCAGAATCGGCGTGGCCGGCTTCTACTTCGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTTAGCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAAGCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCCGTGACCGTGAGCTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCCTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGCAAA(SEQ ID NO:78)
抗DLL3抗体H10-O18-A-3重链的表达载体的构建：合成(GENEART，人工基因合成服务)DNA片段，所述DNA片段由在核苷酸1至1401位置处(在SEQ ID NO:79中)的核苷酸与在SEQ ID NO:79之外的5’-位点(CCAGCCTCCGGACTCTAGAGCCACC；SEQ ID NO:101)和在SEQ IDNO:79之外的3’-位点(TGAGTTTAAACGGGGGAGGCTAACT；SEQ ID NO:102)两处的用于融合反应的侧翼重组位点组成。使用融合HD PCR克隆试剂盒，将扩增的DNA片段插入用限制性内切酶PmeI/XbaI切割的pCMA-LK的位点，导致构建抗DLL3抗体H10-O18-A-3重链的表达载体。
ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCTAGATGGGTGCTGTCTCAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTAGCGAAACACTGAGCCTGACCTGTACCGTGTCTGGCGGCAGCATCAACAGCTACTACTGGTCCTGGATCCGGCAGCCTCCTGGCAAAGGACTGGAATGGATCGGCTACATCTTCTACAGCGGCATCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGAGTGACCATCAGCCTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACAGCCGTGTACTACTGTGCCAGAATCGGCGTGGCCGGCTTCTACTTCGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTTTCTTCTGCCTCCACCAAGGGCCCAAGCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCCGTGACCGTGAGCTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGGACCCTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGCAAA(SEQ ID NO:79)
抗DLL3抗体H10-O18-A-2和H10-O18-A-3轻链的表达载体的构建：合成(GENEART，人工基因合成服务)DNA片段，所述DNA片段由在核苷酸61至384位置处(在SEQ ID NO:81中)的核苷酸与在5’-位点(CTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGC；SEQ ID NO:81的核苷酸37-60)和在3’-位点(CGTACGGTGGCCGCCCCCTCC；SEQ ID NO:81的核苷酸385-405)两处的用于融合反应的侧翼重组位点组成。使用融合HD PCR克隆试剂盒(Takara Bio USA)，将合成的DNA片段插入用限制性内切酶BsiWI切割的pCMA-LK的位点，从而构建抗DLL3抗体H10-O18-A-2和H10-O18-A-3轻链的表达载体。
ATGGTGCTGCAGACCCAGGTGTTCATCTCCCTGCTGCTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGCGAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGGCACACTGTCACTGTCTCCAGGCGAAAGAGCCACACTGAGCTGTAGAGCCAGCCAGAGCGTGTCCAGCTCTTACCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCCGGACAGGCTCCCAGACTGCTGATCTATGGCGCCTCTTCTAGAGCCACAGGCATCCCCGATAGATTCAGCGGCTCTGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACAATCAGCAGACTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGTCAGCAGTACGGCACAAGCCCTCTGACCTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCTCCGTGTTCATCTTCCCCCCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGGAACTCCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGAGCTCCCCCGTCACCAAGAGCTTCAACAGGGGGGAGTGT(SEQ ID NO:81)
表达和纯化：构建(转染级质粒，Genscript)编码H10-O18-A的重链和轻链的对应DNA序列的表达载体并且将其转染到HEK293细胞(HD 293F，Genscript)中。然后培养并且收获，通过蛋白A亲和色谱从所获得的上清液中纯化出抗体。
可替代地，关于H10-O18-A-3，根据使用手册培养并且传代FreeStyle 293F细胞(Thermo Fisher Scientific)。将在对数生长期的FreeStyle 293F细胞接种在3L锥形瓶(CORNING)上，并且用FreeStyle293表达培养基(Thermo Fisher Scientific)以2.0-2.4×106个细胞/mL稀释至总体积580mL。同时，将300μg H10-O18-A-3的重链表达载体、300μgH10-O18-A-3的轻链表达载体和1.8mg聚乙烯亚胺(Polyscience)添加到20mL Opti-ProSFM培养基(Thermo Fisher Scientific)中，并且轻缓地搅拌所获得的混合物。在孵育5分钟后，将混合物添加到FreeStyle 293F细胞中。将细胞在培养箱(37℃，8％ CO2)中在95rpm下振荡的情况下孵育4小时，并且之后，将480mL包含4mM GlutaMAX补充物I(Thermo FisherScientific)的BalanCD(R)HEK293(FUJIFILM Irvine Scientific)和120mL包含4mMGlutaMAX补充物I的BalanCD(R)HEK293 Feed(FUJIFILM Irvine Scientific)添加到培养物中。将细胞进一步在培养箱(37℃，8％ CO2)中在95rpm下振荡的情况下孵育6天。将培养物上清液收获并且用500mL过滤器系统(Thermo Fisher Scientific)过滤。
另一方面，关于H10-O18-A-2，根据使用手册，将FreeStyle 293F细胞在带有中型生物反应器BCP(Biott)的旋转瓶(spinner flask)中在37℃，8％ CO2下培养并且传代。用WAVE BIOREACTOR(GE healthcare)进行FreeStyle 293F细胞的转染和培养。将2.5L在对数生长期的FreeStyle 293F细胞以2.0-2.4×106个细胞/mL接种在WAVE CELLBAG10L(Cytiva)上。同时，将1.25mg H10-O18-A-2的重链表达载体、1.25mg H10-O18-A-2的轻链表达载体和7.5mg聚乙烯亚胺(Polyscience)添加到160mL的Opti-Pro SFM培养基(ThermoFisher Scientific)中，并且轻缓地搅拌获得的混合物。在孵育5分钟后，将混合物添加到在WAVE CELLBAG10L中的FreeStyle 293F细胞中。将细胞在WAVE CELLBAG10L(37℃，8％CO2)中在摇摆下培养4小时，并且之后，将1.92L包含4mM GlutaMAX补充物I的BalanCD(R)HEK293和480mL包含4mM GlutaMAX补充物I的BalanCD(R)HEK293 Feed添加到培养物中。将细胞进一步在WAVE CELLBAG10L(37℃，8％ CO2)中在摇摆下培养6天。收获培养的上清液，将其离心并且用胶囊筒式过滤器(孔径：0.45μm，ADVANTEC)过滤。
抗DLL3抗体的纯化：将过滤的培养物上清液通过rProtein A亲和色谱和羟基磷灰石陶瓷的两步方法纯化。纯化方法的细节描述在专利申请号WO 2020/013170中。
实施例9-聚糖改造(H2-C8-A抗体-[MSG1-N3]2)
进行抗DLL3抗体H2-C8-A的聚糖改造，如图13中的方案所示。该图示出了接头结构的方案，在接头结构中已将叠氮基团引入MSG1型N297聚糖的非还原末端的唾液酸。通过将叠氮基团引入N297聚糖而形成的中间体的接头结构与由所述式表示的结构完全相同。
步骤1：(Fucα1,6)GlcNAc-H2-C8-A抗体的制备
根据常用操作C使H2-C8-A抗体溶液(8.02mg/mL在PBS(pH 7.2)中，12.0mL)经受缓冲液交换至50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)。向所得的H2-C8-A抗体溶液(20.2mg/mL在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中，2.50mL)中添加0.0335mL野生型EndoS溶液(7.52mg/mL在PBS中)，并且将溶液在37℃下孵育4小时。通过微芯片电泳系统(Bioanalyzer2100，Agilent)检查反应的进展。反应完成后，根据以下程序进行通过亲和色谱的纯化和用羟基磷灰石柱的纯化。
(1)纯化装置：AKTA pure150(由GE Healthcare生产)
柱：HiTrap rProtein A FF(5mL)(由GE Healthcare生产)
流速：5mL/min(1.25mL/min进料)
使3CV的结合缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0))以1.25mL/min流过并且使5CV的结合缓冲液进一步以5mL/min流过。在中间体洗涤中，使15CV的洗涤溶液(20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，0.5M氯化钠溶液)流过。在洗脱中，使6CV的洗脱缓冲液(ImmunoPure IgG洗脱缓冲液，由Pierce生产)流过。将洗出液立即用1M Tris缓冲液(pH 9.0)中和。通过使用常用操作C使含有所需化合物的级分经受缓冲液交换至5mM磷酸盐缓冲液/50mM 2-吗啉代乙烷磺酸(MES)溶液(pH 6.8)。
(2)通过羟基磷灰石色谱的纯化
纯化装置：AKTA avant25(由GE Healthcare生产)
柱：Bio-Scale Mini CHT I型柱筒(5mL)(由Bio-Rad Laboratories,Inc.生产)
流速：5mL/min(1.25mL/min进料)
将步骤1中获得的溶液添加到柱的上部部分，并且使3CV的溶液(5mM磷酸盐缓冲液、50mM 2-吗啉代乙烷磺酸(MES)溶液(pH 6.8))以1.25mL/min流过并且使3CV的溶液进一步以5mL/min流过。此后，用溶液A和溶液B(5mM磷酸盐缓冲液/50mM2-吗啉代乙烷磺酸(MES)溶液(pH 6.8)、2M氯化钠溶液)进行洗脱。洗脱条件是溶液A:溶液B＝100:0至0:100(15CV)。此外，使5CV的洗涤溶液(500mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5))流过。通过使用常用操作C使含有所需化合物的级分经受缓冲液交换以得到(Fucα1,6)GlcNAc-H2-C8-A抗体溶液(19.4mg/mL在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中，2.10mL)。
步骤2：H2-C8-A抗体-[MSG1-N3]2的制备
向步骤1中获得的(Fucα1,6)GlcNAc-H2-C8-A抗体溶液(19.4mg/mL在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中，2.10mL)中添加噁唑啉(6.46mg)、[N3-PEG(3)]-MSG1-Ox(WO 19065964中的实施例56)在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)(0.129mL)中的溶液和0.170mL EndoSD233Q/Q303L溶液(4.80mg/mL在PBS中)，并且将混合物在30℃下孵育4.5小时。通过微芯片电泳系统(Bioanalyzer2100，Agilent)检查反应的进展。反应完成后，如步骤1中那样进行通过亲和色谱的纯化和通过羟基磷灰石色谱的纯化，然后通过使用常用操作C使含有所需化合物的级分经受缓冲液交换至10mM乙酸盐缓冲液(5％山梨糖醇)(pH 5.5)，以得到H2-C8-A抗体-[MSG1-N3]2溶液(11.1mg/mL在10mM乙酸盐缓冲液(5％山梨糖醇)(pH 5.5)中，3.00mL)。
实施例10-聚糖改造(H6-G23-F抗体-[MSG1-N3]2)
进行抗DLL3抗体H6-G23-F的聚糖改造，如图14中的方案所示。该图示出了接头结构的方案，在接头结构中已将叠氮基团引入MSG1型N297聚糖的非还原末端的唾液酸。通过将叠氮基团引入N297聚糖而形成的中间体的接头结构与由所述式表示的结构完全相同。
步骤1：(Fucα1,6)GlcNAc-H6-G23-F抗体的制备
根据常用操作C使H6-G23-F抗体溶液(6.22mg/mL在PBS(pH 7.2)中，16.5mL)经受缓冲液交换至50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)。使用所得的H6-G23-F抗体溶液(19.9mg/mL在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中，2.50mL)，进行与实施例9的步骤1中相同的操作以得到(Fucα1,6)GlucNAc-H6-G23-F抗体溶液(19.9mg/mL在PB(pH 6.0)中，2.00mL)。
步骤2：H6-G23-F抗体-[MSG1-N3]2的制备
使用以上步骤1中获得的(Fuca1,6)GlucNAc-H6-G23-F抗体溶液(19.9mg/mL在PB(pH 6.0)中，2.00mL)进行与实施例9的步骤2中相同的操作以得到H6-G23-F抗体-[MSG1-N3]2溶液(9.24mg/mL在10mM乙酸盐缓冲液(5％山梨糖醇)(pH 5.5)中，3.50mL)。
实施例11-聚糖改造(H10-O18-A抗体-[MSG1-N3]2)
进行抗DLL3抗体H10-O18-A的聚糖改造，如图15中的方案所示。该图示出了接头结构的方案，在接头结构中已将叠氮基团引入MSG1型N297聚糖的非还原末端的唾液酸。通过将叠氮基团引入N297聚糖而形成的中间体的接头结构与由所述式表示的结构完全相同。
步骤1：(Fucα1,6)GlcNAc-H10-O18-A抗体的制备
根据常用操作C，使H10-O18-A抗体溶液(6.87mg/mL在PBS(pH 7.2)中，16.0mL)经受缓冲液交换至50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)。使用所得的H10-O18-A抗体溶液(20.1mg/mL在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中，2.50mL)，进行与实施例9的步骤1中相同的操作以得到(Fucα1,6)GlucNAc-H10-O18-A抗体溶液(21.0mg/mL在PB(pH 6.0)中，2.00mL)。
步骤2：H10-O18-A抗体-[MSG1-N3]2的制备
使用步骤1中获得的(Fucα1,6)GlucNAc-H10-O18-A抗体溶液(21.0mg/mL在PB(pH6.0)中，2.00mL)进行与实施例9的步骤2中相同的操作以得到H10-O18-A抗体-[MSG1-N3]2溶液(10.7mg/mL在10mM乙酸盐缓冲液(5％山梨糖醇)(pH 5.5)中，3.50mL)。
实施例12-H2-C8-A缀合物的合成
如以下反应式中所说明的，通过将实施例9的步骤2中获得的抗体与根据WO 2019/065964合成的药物-接头缀合来合成ADC。合成的第一个步骤示出于图16中。步骤1中有待形成的三唑环具有几何异构化，并且步骤1中获得的化合物具有作为如图16中的R所示的两种结构的混合物的接头。
步骤1：抗体H2-C8-A-[MSG1-N3]2和药物-接头的缀合
在室温下向实施例9的步骤2中获得的H2-C8-A抗体-(MSG1-N3)2的10mM乙酸盐缓冲液(5％山梨糖醇)(pH 5.5)溶液(11.1mg/mL，1.5mL)中添加1,2-丙二醇(1.43mL)和根据WO2019/065964中的实施例3的程序制备的N-[4-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-基)-4-氧代丁酰基]甘氨酰甘氨酰基-L-缬氨酰基-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮-8-基]氧基}戊基)氧基]-5'-氧代-11',11'a-二氢-1'H,3'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮/>]-10'(5'H)-羰基]氧基}甲基)苯基]-L-氨基丙酰胺(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)的10mM二甲基亚砜溶液(0.0690mL；每个抗体分子6当量)，并且将所产生物使用管旋转器(MTR-103，AS ONE Corporation)在室温下反应48小时。
纯化操作：通过使用常用操作D纯化溶液以得到7.0mL所需化合物的溶液。
表征：通过使用常用操作E(使用εA，280＝220378，εA，329＝0，εD，280＝23155并且εD，329＝19492)和F(梯度程序1)获得以下特征值。
抗体浓度：1.77mg/mL，抗体产率：12.4mg(74％)，每个抗体分子缀合的药物分子的平均数量(n)：1.8。
实施例13-H6-G23-F缀合物的合成
如以下反应式中所说明的，通过将实施例10的步骤2中获得的抗体与根据WO2019/065964中的实施例3的程序制备的N-[4-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-基)-4-氧代丁酰基]甘氨酰甘氨酰基-L-缬氨酰基-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮-8-基]氧基}戊基)氧基]-5'-氧代-11',11'a-二氢-1'H,3'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮/>]-10'(5'H)-羰基]氧基}甲基)苯基]-L-氨基丙酰胺(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)缀合来合成ADC。合成的第一个步骤示出于图17中。步骤1中有待形成的三唑环具有几何异构化，并且步骤1中获得的化合物具有作为如图17中的R所示的两种结构的混合物的接头。
步骤1：抗体H6-G23-F-[MSG1-N3]2与药物-接头的缀合物
使用H6-G23-F-[MSG1-N3]2溶液(9.24mg/mL在10mM乙酸盐缓冲液(5％山梨糖醇)(pH 5.5)中，1.1mL)进行与实施例12相同的操作。作为结果，获得H6-G23-F ADC溶液(6.0mL)。
表征：通过使用常用操作E(使用εA,280＝215353，εA,329＝0，εD，280＝23155并且εD,329＝19492)和F(梯度程序1)获得以下特征值。
抗体浓度：1.38mg/mL，抗体产率：8.30mg(82％)，每个抗体分子缀合的药物分子的平均数量(n)：1.8。
实施例14-H10-O18-A缀合物的合成
如以下反应式中所说明的，通过将实施例11的步骤2中获得的抗体与根据WO2019/065964中的实施例3的程序制备的N-[4-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-基)-4-氧代丁酰基]甘氨酰甘氨酰基-L-缬氨酰基-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮-8-基]氧基}戊基)氧基]-5'-氧代-11',11'a-二氢-1'H,3'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮/>]-10'(5'H)-羰基]氧基}甲基)苯基]-L-氨基丙酰胺(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)缀合来合成ADC。合成的第一个步骤示出于图18中。步骤1中有待形成的三唑环具有几何异构化，并且步骤1中获得的化合物具有作为如图18中的R所示的两种结构的混合物的接头。
步骤1：抗体H10-O18-A-[MSG1-N3]2和药物-接头的缀合
使用H10-O18-A-[MSG1-N3]2溶液(10.7mg/mL在10mM乙酸盐缓冲液(5％山梨糖醇)(pH 5.5)中，1.0mL)进行与实施例12相同的操作。作为结果，获得H10-O18-AADC溶液(5.0mL)。
表征：通过使用常用操作E(使用εA，280＝215424，εA，329＝0，εD，280＝23155并且εD，329＝19492)和F(梯度程序2)获得以下特征值。
抗体浓度：1.68mg/mL，抗体产率：8.41mg(79％)，每个抗体分子缀合的药物分子的平均数量(n)：1.8。
实施例15-抗LPS ADC(抗LPS抗体缀合物)的合成
抗LPS抗体缀合物是从识别与DLL3无关的抗原的人IgG产生的抗体-药物缀合物，并且用作阴性对照。
参考如国际公开号WO 2015/046505中描述的h#1G5-H1L1的以下SEQ ID NO:73和74(其对应于国际公开号WO 2015/046505中的SEQ ID NO:57和NO:67)中所示出的重链全长和轻链全长氨基酸序列来产生抗LPS抗体。参考WO 2019/065964中的实施例21和36，进行聚糖改造和缀合反应以得到抗LPS ADC(抗LPS抗体缀合物)。
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWINWVRQAPGQGLEWMGNIYPGSSSINYNEKFKSRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARTIYNYGSSGYNYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(LPS_重链；SEQ ID NO:73)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASENVGNSVSWYQQKPGQPPKLLIYGASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCGQSYSYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(LPS_轻链；SEQ ID NO:74)。
实施例16-抗DLL3 ADC(SC16LD6.5)的产生
通过以下步骤制备抗DLL3 ADC(SC16LD6.5)；参考WO 2017/031458 A2产生抗DLL3抗体(hSC16.56)。hSC16.56(SC16)的轻链和重链的氨基酸序列表示为以下SEQ ID NO:71和72(其对应于国际公开号WO 2017/031458中的SEQ ID NO:7和NO:8)。根据先前报告的程序(Med.Chem.Lett.2016,7,983-987)合成药物接头(SG3249)。根据所报告的程序(WO 2014/130879 A2中的实施例7(a)马来酰亚胺缀合物)将hSC16.56(SC16)与SG3249缀合以得到SC16LD6.5(ADC1)。
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARIGDSSPSDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:71)
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVSNDVVWYQQKPGQAPRLLIYYASNRYTGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQDYTSPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:72)
实施例17-抗体-药物缀合物的体内抗肿瘤作用
通过接种DLL3阳性人肿瘤细胞系，使用源自免疫缺陷小鼠的动物模型评价抗体-药物缀合物的抗肿瘤作用。在实验中使用前，将4周龄至5周龄的BALB/c裸小鼠(CAnN.Cg-Foxnl[nu]/CrlCrlj[Foxnlnu/Foxnlnu],Charles River Laboratories Japan Inc.)在SPF条件下适应环境3天或更久。将小鼠用无菌固体饮食(FR-2，Funabashi Farms Co.,Ltd)和给定的无菌自来水(其已通过将5至15ppm次氯酸钠溶液添加至自来水中制备)喂养。使用电子数显卡尺(CD-15CX，Mitutoyo Corp.)一周两次测量接种的肿瘤的长径和短径，然后根据以下表达式计算肿瘤的体积。
肿瘤体积(mm3＝1/2x长径(mm)x[短径(mm)]2
将抗体-药物缀合物各自用ABS缓冲液(10mM乙酸盐缓冲液(5％山梨糖醇)，pH5.5)(Nacalai Tesque,Inc.)稀释，并且将稀释液以每个研究中示出的剂量静脉内施用至每只小鼠的尾部。将ABS缓冲液以与以上相同的方式施用至对照组(媒介物组)。每组六只小鼠用于实验中。将具有超过3000mm3估计肿瘤体积的组在此时安乐死。
17)-1抗肿瘤作用-(1)
将DLL3阳性人小细胞肺癌细胞系NCI-H209(ATCC)悬浮在基质胶(Corning Inc.)中，并且将细胞悬浮液以4x 106个细胞的剂量皮下接种至每只雌性裸小鼠的右侧区域(第0天)。在第11天，将小鼠随机分组。在分组当天，将3种抗体-药物缀合物(H2-C8-A缀合物、H6-G23-F缀合物、H10-O18-A缀合物)中的每种或抗LPS抗体缀合物以0.4mg/kg的剂量静脉内施用至每只小鼠的尾部。结果示出于图19中。横坐标描绘了接种后的天数，并且纵坐标描绘了估计的肿瘤体积。误差范围描绘了SE值。箭头指示施用日期。
抗LPS抗体缀合物在该肿瘤模型中展现出无意义的抗肿瘤作用。所有3种抗体-药物缀合物(H2-C8-A缀合物、H6-G23-F缀合物、H10-O18-A缀合物)在施用后减小了肿瘤体积，产生显著的肿瘤消退，并且在施用后维持肿瘤消退效果28天(图19)。此外，用每种抗体-药物缀合物治疗的小鼠没有显示出显著的体重减轻体征，表明3种抗体-药物缀合物(H2-C8-A缀合物、H6-G23-F缀合物、H10-O18-A缀合物)是低毒性并且安全的。在所述组至少一只小鼠的估计肿瘤体积超过3000mm3时，将媒介物组和抗LPS抗体缀合物组安乐死。
17)-2抗肿瘤作用-(2)
将DLL3阳性人小细胞肺癌细胞系NCI-H524(ATCC)悬浮在基质胶(Corning Inc.)中，并且将细胞悬浮液以2.5x 106个细胞的剂量皮下接种至每只雌性裸小鼠的右侧区域(第0天)。在第13天，将小鼠随机分组。在分组当天，将3种抗体-药物缀合物(H2-C8-A缀合物、H6-G23-F缀合物、H10-O18-A缀合物)中的每种或抗LPS抗体缀合物以0.4mg/kg的剂量静脉内施用至每只小鼠的尾部。结果示出于图20中。横坐标描绘了接种后的天数，并且纵坐标描绘了估计的肿瘤体积。误差范围描绘了SE值。箭头指示施用日期。
抗LPS抗体缀合物在该肿瘤模型中展现出抗肿瘤作用。所有3种抗体-药物缀合物(H2-C8-A缀合物、H6-G23-F缀合物、H10-O18-A缀合物)在施用后减小了肿瘤体积，产生肿瘤消退，并且H2-C8-A缀合物和H10-O18-A缀合物在施用后维持肿瘤消退效果29天(图20)。此外，用每种抗体-药物缀合物治疗的小鼠没有显示出显著的体重减轻体征，表明3种抗体-药物缀合物(H2-C8-A缀合物、H6-G23-F缀合物、H10-O18-A缀合物)是低毒性并且安全的。在所述组至少一只小鼠的估计肿瘤体积超过3000mm3时，将媒介物组和抗LPS抗体缀合物组安乐死。
17)-3抗肿瘤作用-(3)
将DLL3阳性人小细胞肺癌细胞系NCI-H510A(ATCC)悬浮在基质胶(Corning Inc.)中，并且将细胞悬浮液以2.5x 106个细胞的剂量皮下接种至每只雌性裸小鼠的右侧区域(第0天)。在第15天，将小鼠随机分组。在分组当天，将3种抗体-药物缀合物(H2-C8-A缀合物、H6-G23-F缀合物、H10-O18-A缀合物)中的每种或参考抗DLL3抗体缀合物(SC16LD6.5)以0.2mg/kg的剂量静脉内施用至每只小鼠的尾部。结果示出于图21中。横坐标描绘了接种后的天数，并且纵坐标描绘了估计的肿瘤体积。误差范围描绘了SE值。箭头指示施用日期。
参考抗DLL3-药物缀合物(SC16LD6.5)在该肿瘤模型中展现出一些肿瘤生长抑制而没有肿瘤消退效果。另一方面，H2-C8-A缀合物和H10-O18-A缀合物在施用后减小肿瘤体积，产生肿瘤消退，并且在施用后维持肿瘤消退效果27天。H2-C8-A缀合物和H10-O18-A缀合物比SC16LD6.5进一步减小肿瘤体积。因此，与SC16LD6.5抗体药物缀合物相比，两种本发明抗体-药物缀合物(H2-C8-A缀合物、H10-O18-A缀合物)作为充当抗肿瘤剂的抗体-药物缀合物是更优的。(图21)。此外，用每种抗体-药物缀合物治疗的小鼠没有显示出显著的体重减轻体征，表明三种抗体-药物缀合物(H2-C8-A缀合物、H6-G23-F缀合物、H10-O18-A缀合物)是低毒性并且安全的。
实施例18-聚糖改造(H2-C8-A-3抗体-[MSG1-N3]2)
进行抗DLL3抗体H2-C8-A-3的聚糖改造，如图22中的方案所示。该图示出了接头结构的方案，在接头结构中已将叠氮基团引入MSG1型N297聚糖的非还原末端的唾液酸。通过将叠氮基团引入N297聚糖而形成的中间体的接头结构与由所述式表示的结构完全相同。
步骤1：(Fucα1,6)GlcNAc-H2-C8-A-3抗体的制备
根据常用操作C使H2-C8-A-3抗体溶液(30.0mg/mL在HBSor(组氨酸缓冲液山梨糖醇)中，3.43mL)经受缓冲液交换至50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)。使用所得的H2-C8-A-3抗体溶液(20.0mg/mL在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中，5.00mL)，进行与实施例9的步骤1中相同的操作以得到(Fucα1,6)GlcNAc-H2-C8-A-3抗体溶液(19.8mg/mL在PB(pH 6.0)中，4.95mL)。
步骤2：H2-C8-A-3抗体-[MSG1-N3]2的制备
使用以上步骤1中获得的(Fuca1,6)GlucNAc-H2-C8-A-3抗体溶液(19.8mg/mL在PB(pH 6.0)中，4.95mL)进行与实施例9的步骤2中相同的操作以得到H2-C8-A-3抗体-[MSG1-N3]2溶液(9.88mg/mL在10mM乙酸盐缓冲液(5％山梨糖醇)(pH 5.5)中，9.30mL)。
实施例19-聚糖改造(H10-O18-A-3抗体-[MSG1-N3]2)
进行抗DLL3抗体H10-O18-A-3的聚糖改造，如图23中的方案所示。该图示出了接头结构的方案，在接头结构中已将叠氮基团引入MSG1型N297聚糖的非还原末端的唾液酸。通过将叠氮基团引入N297聚糖而形成的中间体的接头结构与由所述式表示的结构完全相同。
步骤1：(Fucα1,6)GlcNAc-H10-O18-A-3抗体的制备
根据常用操作C使H10-O18-A-3抗体溶液(37.8mg/mL在HBSor中，2.20mL)经受缓冲液交换至50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)。使用所得的H10-O18-A-3抗体溶液(20.0mg/mL在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中，3.86mL)，进行与实施例9的步骤1中相同的操作以得到(Fucα1,6)GlucNAc-H10-O18-A-3抗体溶液(19.5mg/mL在PB(pH 6.0)中，3.77mL)。
步骤2：H10-O18-A-3抗体-[MSG1-N3]2的制备
使用步骤1中获得的(Fucα1,6)GlucNAc-H10-O18-A-3抗体溶液(19.5mg/mL在PB(pH 6.0)中，3.77mL)进行与实施例9的步骤2中相同的操作以得到H10-O18-A-3抗体-[MSG1-N3]2溶液(10.6mg/mL在10mM乙酸盐缓冲液(5％山梨糖醇)(pH 5.5)中，6.50mL)。
实施例20-H2-C8-A-3缀合物的合成
如以下反应式中所说明的，通过将实施例18的步骤2中获得的抗体与根据WO2019/065964中的实施例3的程序制备的N-[4-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-基)-4-氧代丁酰基]甘氨酰甘氨酰基-L-缬氨酰基-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮-8-基]氧基}戊基)氧基]-5'-氧代-11',11'a-二氢-1'H,3'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮/>]-10'(5'H)-羰基]氧基}甲基)苯基]-L-氨基丙酰胺(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)缀合来合成ADC。合成的第一个步骤示出于图24中。步骤1中有待形成的三唑环具有几何异构化，并且步骤1中获得的化合物具有作为如图24中的R所示的两种结构的混合物的接头。
步骤1：抗体H2-C8-A-3-[MSG1-N3]2与药物-接头的缀合物
使用H2-C8-A-3-[MSG1-N3]2溶液(9.88mg/mL在10mM乙酸盐缓冲液(5％山梨糖醇)(pH 5.5)中，3.50mL)进行与实施例12相同的操作。作为结果，获得H2-C8-A-3ADC溶液(17.5mL)并且随时间进一步稳定。
表征：通过使用常用操作E(使用εA，280＝220420，εA，329＝0，εD，280＝23155并且εD，329＝19492)和F(梯度程序1)获得以下特征值。
抗体浓度：1.65mg/mL，抗体产率：29.0mg(84％)，每个抗体分子缀合的药物分子的平均数量(n)：1.9。
实施例21-H10-O18-A-3缀合物的合成
如以下反应式中所说明的，通过将实施例19的步骤2中获得的抗体与根据WO2019/065964中的实施例3的程序制备的N-[4-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-基)-4-氧代丁酰基]甘氨酰甘氨酰基-L-缬氨酰基-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮-8-基]氧基}戊基)氧基]-5'-氧代-11',11'a-二氢-1'H,3'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮/>]-10'(5'H)-羰基]氧基}甲基)苯基]-L-氨基丙酰胺(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)缀合来合成ADC。合成的第一个步骤示出于图25中。步骤1中有待形成的三唑环具有几何异构化，并且步骤1中获得的化合物具有作为如图25中的R所示的两种结构的混合物的接头。
步骤1：抗体H10-O18-A-3-[MSG1-N3]2和药物-接头的缀合
使用H10-O18-A-3-[MSG1-N3]2溶液(10.6mg/mL在10mM乙酸盐缓冲液(5％山梨糖醇)(pH 5.5)中，3.50mL)进行与实施例12相同的操作。作为结果，获得H10-O18-A-3ADC溶液(17.5mL)并且随时间进一步稳定。
表征：通过使用常用操作E(使用εA，280＝215380，εA，329＝0，εD，280＝23155并且εD，329＝19492)和F(梯度程序2)获得以下特征值。
抗体浓度：1.79mg/mL，抗体产率：31.3mg(84％)，每个抗体分子缀合的药物分子的平均数量(n)：1.9。
实施例22-抗体-药物缀合物的体内抗肿瘤作用
使用与实施例17中基本上相同的方案。
22)-1抗肿瘤作用-(1)
将DLL3阳性人小细胞肺癌细胞系NCI-H510A(ATCC)悬浮在基质胶(Corning Inc.)中，并且将细胞悬浮液以2.3x 106个细胞的剂量皮下接种至每只雌性裸小鼠的右侧区域。在建立肿瘤后，将小鼠随机分组(每组6只小鼠)。在分组当天，将2种抗体-药物缀合物(H2-C8-A-3缀合物、H10-O18-A-3缀合物)中的每种、参考抗DLL3抗体缀合物(SC16LD6.5)或抗LPS抗体缀合物以0.2mg/kg的剂量静脉内施用至每只小鼠的尾部。结果示出于图26中。横坐标描绘了施用后的天数，并且纵坐标描绘了估计的肿瘤体积。误差范围描绘了SE值。
抗LPS抗体缀合物在该肿瘤模型中展现出无意义的抗肿瘤作用。参考抗DLL3-药物缀合物(SC16LD6.5)在该肿瘤模型中展现出一些肿瘤生长抑制而没有肿瘤消退效果。另一方面，2种抗体-药物缀合物(H2-C8-A-3缀合物、H10-O18-A-3缀合物)两者都减小了肿瘤体积，并且这些组中的所有肿瘤在施用后28天比它们的初始体积更小。H2-C8-A-3缀合物和H10-O18-A-3缀合物比SC16LD6.5进一步减小了肿瘤体积。因此，与SC16LD6.5抗体药物缀合物相比，两种本发明的抗体-药物缀合物(H2-C8-A-3缀合物、H10-O18-A-3缀合物)作为充当抗肿瘤剂的抗体-药物缀合物是更优良的(图26)。此外，用每种抗体-药物缀合物治疗的小鼠显示不值得考虑的体重减轻或无体重减轻，表明这些抗体-药物缀合物(H2-C8-A-3缀合物、H10-O18-A-3缀合物)皆是低毒性并且安全的。在组中的至少一只小鼠的估计肿瘤体积超过3000mm3或组中的至少一只小鼠的肿瘤的长径超过20mm时，将媒介物组和抗LPS抗体缀合物组安乐死。
22)-2抗肿瘤作用-(2)
将DLL3阳性人小细胞肺癌细胞系NCI-H209(ATCC)悬浮在基质胶(Corning Inc.)中，并且将细胞悬浮液以4x 106个细胞的剂量皮下接种至每只雌性裸小鼠的右侧区域。在建立肿瘤后，将小鼠随机分组(每组5只小鼠)。在分组的当天，将2种抗体-药物缀合物(H2-C8-A-3缀合物、H10-O18-A-3缀合物)中的每种以0.4mg/kg的剂量静脉内施用至每只小鼠的尾部。结果示出于图27中。横坐标描绘了施用后的天数，并且纵坐标描绘了估计的肿瘤体积。误差范围描绘了SE值。
2种抗体-药物缀合物(H2-C8-A-3缀合物、H10-O18-A-3缀合物)两者都减小了肿瘤体积，并且这些组中的所有肿瘤在施用后28天比它们的初始体积更小。此外，用每种抗体-药物缀合物治疗的小鼠显示不值得考虑的体重减轻或无体重减轻，表明2种抗体-药物缀合物(H2-C8-A-3缀合物、H10-O18-A-3缀合物)皆是低毒性并且安全的。
22)-3抗肿瘤作用-(3)
将DLL3阳性人小细胞肺癌细胞系NCI-H82(ATCC)悬浮在基质胶(Corning Inc.)中，并且将细胞悬浮液以1x 106个细胞的剂量皮下接种至每只雌性裸小鼠的右侧区域。在建立肿瘤后，将小鼠随机分组(每组6只小鼠)。在分组当天，将2种抗体-药物缀合物(H2-C8-A-3缀合物、H10-O18-A-3缀合物)中的每种、参考抗DLL3抗体缀合物(SC16LD6.5)或抗LPS抗体缀合物以0.4mg/kg的剂量静脉内施用至每只小鼠的尾部。结果示出于图28中。横坐标描绘了施用后的天数，并且纵坐标描绘了估计的肿瘤体积。误差范围描绘了SE值。
抗LPS抗体缀合物在该肿瘤模型中展现出无意义的抗肿瘤作用。参考抗DLL3-药物缀合物(SC16LD6.5)在该肿瘤模型中展现出一些肿瘤生长抑制而没有肿瘤消退效果。另一方面，2种抗体-药物缀合物(H2-C8-A-3缀合物、H10-O18-A-3缀合物)两者都减小了肿瘤体积，并且这些组中的所有肿瘤在施用后28天比它们的初始体积更小。H2-C8-A-3缀合物和H10-O18-A-3缀合物比SC16LD6.5进一步减小了肿瘤体积。因此，与SC16LD6.5抗体药物缀合物相比，两种本发明抗体-药物缀合物(H2-C8-A-3缀合物、H10-O18-A-3缀合物)作为充当抗肿瘤剂的抗体-药物缀合物是更优的。此外，用每种抗体-药物缀合物治疗的小鼠显示不值得考虑的体重减轻或无体重减轻，表明2种抗体-药物缀合物(H2-C8-A-3缀合物、H10-O18-A-3缀合物)皆是低毒性并且安全的。在所述组至少一只小鼠的估计肿瘤体积超过3000mm3时，将抗LPS抗体缀合物组安乐死。
实施例23-抗体-药物缀合物在ICR小鼠中的毒性或耐受剂量
23)-1在ICR小鼠中的耐受剂量-(1)
将5周龄的Crl:CD1(ICR)雄性小鼠(Charles River Laboratories Japan,Inc.)随机分组(每组5只小鼠)。在分组的当天，将2种抗体-药物缀合物(H2-C8-A-3缀合物或H10-O18-A-3缀合物)中的每种以3、6或10mg/kg的剂量静脉内施用至每只小鼠的尾部。一周几次观察小鼠的死亡率，并且在施用后测量体重持续41天。
在该实验期间，用H2-C8-A-3缀合物治疗的小鼠全部活着。在该实验期间，用H2-C8-A-3缀合物治疗的小鼠在任何测试剂量(3、6、10mg/kg)下显示出不值得考虑的体重减轻或无体重减轻。在该实验期间，用H10-O18-A-3缀合物治疗的小鼠全部活着。在该实验期间，用H10-O18-A-3缀合物治疗的小鼠在任何测试剂量(3、6、10mg/kg)下显示出不值得考虑的体重减轻或无体重减轻。
23)-2在ICR小鼠中的耐受剂量-(2)
将5周龄的Crl:CD1(ICR)雌性小鼠(Charles River Laboratories Japan,Inc.)随机分组(每组5只小鼠)。在分组的当天，将2种抗体-药物缀合物(H2-C8-A-3缀合物或H10-O18-A-3缀合物)中的每种以3、6或10mg/kg的剂量静脉内施用至每只小鼠的尾部。一周几次观察小鼠的死亡率，并且在施用后测量体重持续41天。
在该实验期间，用H2-C8-A-3缀合物治疗的小鼠全部活着。在该实验期间，用H2-C8-A-3缀合物治疗的小鼠在任何测试剂量(3、6、10mg/kg)下显示出无体重减轻或不值得考虑的体重减轻。在该实验期间，用H10-O18-A-3缀合物治疗的小鼠全部活着。在该实验期间，用H10-O18-A-3缀合物治疗的小鼠在任何测试剂量(3、6、10mg/kg)下显示出不值得考虑的体重减轻或无体重减轻。
*****
工业实用性：本发明提供了一种具有内化活性的抗DLL3抗体和包含所述抗体的抗体-药物缀合物。所述抗体-药物缀合物可以用作癌症等的治疗药物。实际上，前述实施例和公开内容证明了本发明技术的ADC组合物可用于治疗患有DLL3相关癌症(例如，小细胞肺癌(SCLC)；大细胞神经内分泌癌(LCNEC)；包括肾脏、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、宫颈和子宫内膜)、胃肠道(胃、结肠)、甲状腺(甲状腺髓样癌)、胰腺和肺在内的多种组织的神经内分泌肿瘤；神经胶质瘤或假性神经内分泌肿瘤(pNET))的受试者的方法中。
序列表
<110> 纪念斯隆凯特琳癌症中心
　　　三院治疗研究所
　　　第一三共株式会社
<120> 抗体-吡咯并苯二氮䓬衍生物缀合物
<130> 098065-0303
<140>
<141>
<150> 63/136,928
<151> 2021-01-13
<160> 102
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 1
gaggtgcagc tggtggagtc tggggggggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aacacctgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt attaaaagca aatctgatgg tgggacaaca 180
gactacgctg cacccgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240
ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtacccag 300
tattattgga actcctttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 2
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Ser Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Gln Tyr Tyr Trp Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 3
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr Trp
1 5
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 4
Ile Lys Ser Lys Ser Asp Gly Gly Thr Thr
1 5 10
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 5
Thr Gln Tyr Tyr Trp Asn Ser Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 6
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatattg caacatatta ctgtcaacag tatgataatc tcccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 8
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 9
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 10
Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 11
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 11
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc ccagagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaaggaag atggaagtga gaaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatccg 300
ggctgggctc cctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 12
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Glu Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Gly Trp Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 13
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 14
Lys Glu Asp Gly Ser Glu
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 15
Asp Pro Gly Trp Ala Pro Phe Asp Tyr
1 5
<210> 16
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 16
gacatccaga tgtcccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggcattagc aattatttag cctggtttca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aagttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctcg ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt tcccgtacac ttttggccag 300
gggaccacgc tggagatcaa a 321
<210> 17
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 17
Asp Ile Gln Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 18
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 19
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 20
Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 21
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 21
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcaat agttactact ggagctggat ccggcagccc 120
ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atcttttaca gtgggatcac caactacaac 180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca ttagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aatcggcgtg 300
gctggttttt actttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 22
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 22
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ile Gly Val Ala Gly Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 23
Gly Gly Ser Ile Asn Ser Tyr
1 5
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 24
Phe Tyr Ser Gly Ile
1 5
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 25
Ile Gly Val Ala Gly Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 26
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 26
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta cctcaccgct cactttcggc 300
ggagggacca aggtggagat caaa 324
<210> 27
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 27
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 28
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 29
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 30
Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 31
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 31
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tacactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcgacccaa gtgatggtag cacaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatcgg 300
gaatataact actacggttt ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
<210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Glu Tyr Asn Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 33
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
1 5
<210> 34
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 34
Asp Pro Ser Asp Gly Ser
1 5
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 35
Asp Arg Glu Tyr Asn Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
1 5 10
<210> 36
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 36
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta taccgtgatg gaaacaccta cttgaattgg 120
tttcagcaga ggccaggcca atctccaagg cgcctaattt ataaggtttc taaccgggac 180
tctggggtcc cagacagatt ccgcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240
agccgggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaggtac acactggcct 300
ccgacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336
<210> 37
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 37
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Arg
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 38
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 38
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Arg Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 39
Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 40
Met Gln Gly Thr His Trp Pro Pro Thr
1 5
<210> 41
<211> 384
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 41
Ala Pro Thr Lys Ala Pro Asp Val Phe Pro Ile Ile Ser Gly Cys Arg
1 5 10 15
His Pro Lys Asp Asn Ser Pro Val Val Leu Ala Cys Leu Ile Thr Gly
20 25 30
Tyr His Pro Thr Ser Val Thr Val Thr Trp Tyr Met Gly Thr Gln Ser
35 40 45
Gln Pro Gln Arg Thr Phe Pro Glu Ile Gln Arg Arg Asp Ser Tyr Tyr
50 55 60
Met Thr Ser Ser Gln Leu Ser Thr Pro Leu Gln Gln Trp Arg Gln Gly
65 70 75 80
Glu Tyr Lys Cys Val Val Gln His Thr Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu
85 90 95
Ile Phe Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro
100 105 110
Thr Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala
115 120 125
Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys
130 135 140
Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu
145 150 155 160
Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala
165 170 175
Val Gln Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val
180 185 190
Val Gly Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly
195 200 205
Lys Val Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser
210 215 220
Asn Gly Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu
225 230 235 240
Trp Asn Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu
245 250 255
Pro Pro Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro
260 265 270
Val Lys Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala
275 280 285
Ala Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile
290 295 300
Leu Leu Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe
305 310 315 320
Ala Pro Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala
325 330 335
Trp Ser Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr
340 345 350
Tyr Thr Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala
355 360 365
Ser Arg Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His Gly Pro Met Lys
370 375 380
<210> 42
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 42
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 43
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 43
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 44
<211> 377
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 44
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 45
<211> 452
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 45
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
1 5 10 15
Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
20 25 30
Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Leu Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser
35 40 45
Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln
65 70 75 80
Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn
85 90 95
Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys
100 105 110
Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg
115 120 125
Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile
130 135 140
Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr
145 150 155 160
Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr
165 170 175
Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Gly Gln
180 185 190
Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln
195 200 205
Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val
210 215 220
Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr
225 230 235 240
Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr
245 250 255
Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn
260 265 270
Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala
275 280 285
Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr
290 295 300
Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg
305 310 315 320
Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro
325 330 335
Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu
340 345 350
Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg
355 360 365
Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro
370 375 380
Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val
385 390 395 400
Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Ala His
405 410 415
Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr
420 425 430
Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala
435 440 445
Gly Thr Cys Tyr
450
<210> 46
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 46
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 47
<211> 353
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 47
Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr
1 5 10 15
Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe
20 25 30
Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val
35 40 45
Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr
50 55 60
Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly
65 70 75 80
Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp
85 90 95
Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro
100 105 110
Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser
115 120 125
Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn
130 135 140
Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe
145 150 155 160
Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu
165 170 175
Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys
180 185 190
Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr
195 200 205
Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn
210 215 220
Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu
225 230 235 240
Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser
245 250 255
Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro
260 265 270
Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly
275 280 285
Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp
290 295 300
Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu
305 310 315 320
Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro
325 330 335
Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys
340 345 350
Tyr
<210> 48
<211> 340
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 48
Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr
1 5 10 15
Pro Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe
20 25 30
Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Asn Val
35 40 45
Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr
50 55 60
Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro Asp Gly
65 70 75 80
Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp
85 90 95
Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro
100 105 110
Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser
115 120 125
Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly
130 135 140
Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly
145 150 155 160
Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu
165 170 175
Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr
180 185 190
Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Asn Ile Thr Lys
195 200 205
Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser
210 215 220
Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg
225 230 235 240
Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln
245 250 255
Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro
260 265 270
Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala
275 280 285
Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His
290 295 300
Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Met Ala
305 310 315 320
Gly Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp
325 330 335
Gly Thr Cys Tyr
340
<210> 49
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 49
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 50
<211> 618
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 50
Met Val Ser Pro Arg Met Ser Gly Leu Leu Ser Gln Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ala Leu Ile Phe Leu Pro Gln Thr Arg Pro Ala Gly Val Phe Glu Leu
20 25 30
Gln Ile His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ala Pro Arg Ser
35 40 45
Pro Cys Ser Ala Arg Leu Pro Cys Arg Leu Phe Phe Arg Val Cys Leu
50 55 60
Lys Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Glu Ser Pro Cys Ala Leu Gly
65 70 75 80
Ala Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro Val Tyr Thr Glu Gln Pro Gly Ala
85 90 95
Pro Ala Pro Asp Leu Pro Leu Pro Asp Gly Leu Leu Gln Val Pro Phe
100 105 110
Arg Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Phe Ile Ile Glu Thr Trp Arg
115 120 125
Glu Glu Leu Gly Asp Gln Ile Gly Gly Pro Ala Trp Ser Leu Leu Ala
130 135 140
Arg Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Arg
145 150 155 160
Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp Glu Leu Arg Phe Ser Tyr Arg Ala
165 170 175
Arg Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Ala Cys Thr Arg Leu Cys Arg
180 185 190
Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Ala
195 200 205
Pro Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala Pro Leu Val Cys Arg Ala Gly Cys
210 215 220
Ser Pro Glu His Gly Phe Cys Glu Gln Pro Gly Glu Cys Arg Cys Leu
225 230 235 240
Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val Pro Val Ser Thr Ser Ser
245 250 255
Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser Ser Ala Thr Thr Gly Cys Leu Val
260 265 270
Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser
275 280 285
Cys Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe
290 295 300
Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro
305 310 315 320
Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala
325 330 335
Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu Lys
340 345 350
Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys
355 360 365
Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala
370 375 380
Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys
385 390 395 400
Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser
405 410 415
Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys Arg Glu Arg Ala Asp Pro
420 425 430
Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe
435 440 445
Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met Gly Ala Arg Cys
450 455 460
Glu Phe Pro Val His Pro Asp Gly Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Pro
465 470 475 480
Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Leu Pro Pro Ala
485 490 495
Leu Gly Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Leu Leu Leu
500 505 510
Val His Val Arg Arg Arg Gly His Ser Gln Asp Ala Gly Ser Arg Leu
515 520 525
Leu Ala Gly Thr Pro Glu Pro Ser Val His Ala Leu Pro Asp Ala Leu
530 535 540
Asn Asn Leu Arg Thr Gln Glu Gly Ser Gly Asp Gly Pro Ser Ser Ser
545 550 555 560
Val Asp Trp Asn Arg Pro Glu Asp Val Asp Pro Gln Gly Ile Tyr Val
565 570 575
Ile Ser Ala Pro Ser Ile Tyr Ala Arg Glu Val Ala Thr Pro Leu Phe
580 585 590
Pro Pro Leu His Thr Gly Arg Ala Gly Gln Arg Gln His Leu Leu Phe
595 600 605
Pro Tyr Pro Ser Ser Ile Leu Ser Val Lys
610 615
<210> 51
<211> 587
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 51
Met Val Ser Pro Arg Met Ser Gly Leu Leu Ser Gln Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ala Leu Ile Phe Leu Pro Gln Thr Arg Pro Ala Gly Val Phe Glu Leu
20 25 30
Gln Ile His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ala Pro Arg Ser
35 40 45
Pro Cys Ser Ala Arg Leu Pro Cys Arg Leu Phe Phe Arg Val Cys Leu
50 55 60
Lys Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Glu Ser Pro Cys Ala Leu Gly
65 70 75 80
Ala Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro Val Tyr Thr Glu Gln Pro Gly Ala
85 90 95
Pro Ala Pro Asp Leu Pro Leu Pro Asp Gly Leu Leu Gln Val Pro Phe
100 105 110
Arg Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Phe Ile Ile Glu Thr Trp Arg
115 120 125
Glu Glu Leu Gly Asp Gln Ile Gly Gly Pro Ala Trp Ser Leu Leu Ala
130 135 140
Arg Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Arg
145 150 155 160
Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp Glu Leu Arg Phe Ser Tyr Arg Ala
165 170 175
Arg Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Ala Cys Thr Arg Leu Cys Arg
180 185 190
Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Ala
195 200 205
Pro Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala Pro Leu Val Cys Arg Ala Gly Cys
210 215 220
Ser Pro Glu His Gly Phe Cys Glu Gln Pro Gly Glu Cys Arg Cys Leu
225 230 235 240
Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val Pro Val Ser Thr Ser Ser
245 250 255
Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser Ser Ala Thr Thr Gly Cys Leu Val
260 265 270
Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser
275 280 285
Cys Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe
290 295 300
Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro
305 310 315 320
Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala
325 330 335
Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu Lys
340 345 350
Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys
355 360 365
Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala
370 375 380
Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys
385 390 395 400
Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser
405 410 415
Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys Arg Glu Arg Ala Asp Pro
420 425 430
Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe
435 440 445
Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met Gly Ala Arg Cys
450 455 460
Glu Phe Pro Val His Pro Asp Gly Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Pro
465 470 475 480
Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Leu Pro Pro Ala
485 490 495
Leu Gly Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Leu Leu Leu
500 505 510
Val His Val Arg Arg Arg Gly His Ser Gln Asp Ala Gly Ser Arg Leu
515 520 525
Leu Ala Gly Thr Pro Glu Pro Ser Val His Ala Leu Pro Asp Ala Leu
530 535 540
Asn Asn Leu Arg Thr Gln Glu Gly Ser Gly Asp Gly Pro Ser Ser Ser
545 550 555 560
Val Asp Trp Asn Arg Pro Glu Asp Val Asp Pro Gln Gly Ile Tyr Val
565 570 575
Ile Ser Ala Pro Ser Ile Tyr Ala Arg Glu Ala
580 585
<210> 52
<211> 587
<212> PRT
<213> 黑猩猩 (Pan troglodytes)
<400> 52
Met Val Ser Pro Arg Met Ser Arg Leu Leu Ser Gln Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ala Leu Ile Phe Leu Pro Gln Thr Arg Pro Ala Gly Val Phe Glu Leu
20 25 30
Gln Ile His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ala Pro Arg Ser
35 40 45
Pro Cys Ser Ala Arg Val Pro Cys Arg Leu Phe Phe Arg Val Cys Leu
50 55 60
Lys Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Glu Ser Pro Cys Ala Leu Gly
65 70 75 80
Ala Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro Val Tyr Thr Glu Gln Pro Gly Ala
85 90 95
Pro Ala Pro Asp Leu Pro Leu Pro Asp Gly Leu Leu Gln Val Pro Phe
100 105 110
Arg Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Phe Ile Ile Glu Thr Trp Arg
115 120 125
Glu Glu Leu Gly Asp Gln Ile Gly Gly Pro Ala Trp Ser Leu Leu Ala
130 135 140
Arg Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala Gly Gly Thr Trp Ala Arg
145 150 155 160
Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp Glu Leu Arg Phe Ser Tyr Arg Ala
165 170 175
Arg Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Ala Cys Thr Arg Leu Cys Arg
180 185 190
Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Ala
195 200 205
Pro Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala Pro Pro Val Cys Arg Ala Gly Cys
210 215 220
Ser Pro Glu His Gly Phe Cys Glu Gln Pro Gly Glu Cys Arg Cys Leu
225 230 235 240
Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val Pro Val Ser Thr Ser Ser
245 250 255
Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser Ser Ala Thr Thr Gly Cys Leu Val
260 265 270
Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser
275 280 285
Cys Ser Glu Thr Pro Gly Ser Phe Glu Cys Ala Cys Pro Arg Gly Phe
290 295 300
Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro
305 310 315 320
Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala
325 330 335
Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu Lys
340 345 350
Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys
355 360 365
Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala
370 375 380
Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys
385 390 395 400
Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser
405 410 415
Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys Arg Glu Arg Ala Asp Pro
420 425 430
Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe
435 440 445
Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met Gly Ala Arg Cys
450 455 460
Glu Phe Pro Val His Pro Asp Gly Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Pro
465 470 475 480
Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Leu Pro Pro Ala
485 490 495
Leu Gly Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Leu Leu Leu
500 505 510
Val His Val Arg Arg Arg Gly His Ala Gln Asp Ala Gly Ala Arg Leu
515 520 525
Leu Ala Gly Thr Pro Glu Pro Ser Val His Ala Leu Pro Asp Ala Leu
530 535 540
Asn Asn Leu Arg Thr Gln Glu Gly Ala Gly Asp Gly Pro Ser Ser Ser
545 550 555 560
Val Asp Trp Asn Arg Pro Glu Asp Val Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Val
565 570 575
Ile Ser Ala Pro Ser Ile Tyr Ala Arg Glu Ala
580 585
<210> 53
<211> 585
<212> PRT
<213> 小家鼠 (Mus musculus)
<400> 53
Met Val Ser Leu Gln Val Ser Pro Leu Ser Gln Thr Leu Ile Leu Ala
1 5 10 15
Phe Leu Leu Pro Gln Ala Leu Pro Ala Gly Val Phe Glu Leu Gln Ile
20 25 30
His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly Leu Gly Thr Pro Arg Ser Pro Cys
35 40 45
Asn Ala Arg Gly Pro Cys Arg Leu Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Val Ser Gln Glu Ala Thr Glu Ser Leu Cys Ala Leu Gly Ala Ala
65 70 75 80
Leu Ser Thr Ser Val Pro Val Tyr Thr Glu His Pro Gly Glu Ser Ala
85 90 95
Ala Ala Leu Pro Leu Pro Asp Gly Leu Val Arg Val Pro Phe Arg Asp
100 105 110
Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu Val Ile Glu Thr Trp Arg Glu Gln
115 120 125
Leu Gly Glu His Ala Gly Gly Pro Ala Trp Asn Leu Leu Ala Arg Val
130 135 140
Val Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Arg Asp Val
145 150 155 160
Gln Arg Thr Gly Thr Trp Glu Leu His Phe Ser Tyr Arg Ala Arg Cys
165 170 175
Glu Pro Pro Ala Val Gly Ala Ala Cys Ala Arg Leu Cys Arg Ser Arg
180 185 190
Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Thr Pro Phe
195 200 205
Pro Asp Glu Cys Glu Ala Pro Ser Val Cys Arg Pro Gly Cys Ser Pro
210 215 220
Glu His Gly Tyr Cys Glu Glu Pro Asp Glu Cys Arg Cys Leu Glu Gly
225 230 235 240
Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val Pro Val Ser Thr Ser Ser Cys Leu
245 250 255
Asn Ser Arg Val Pro Gly Pro Ala Ser Thr Gly Cys Leu Leu Pro Gly
260 265 270
Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys Ser
275 280 285
Glu Thr Ser Gly Ser Phe Glu Cys Ala Cys Pro Arg Gly Phe Tyr Gly
290 295 300
Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe
305 310 315 320
Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Glu Asp Pro Asp Ser Ala Tyr Val
325 330 335
Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu Lys Arg Val
340 345 350
Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Gln Asn Gly Gly Leu Cys Leu Asp
355 360 365
Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala Gly Pro
370 375 380
Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys Ala Asn
385 390 395 400
Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly Gly Ser Arg Arg Cys Ser Cys Ala
405 410 415
Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys Arg Glu Arg Ala Asp Pro Cys Ala
420 425 430
Ser Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe Ser Gly
435 440 445
Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met Gly Val Arg Cys Glu Phe
450 455 460
Ala Val Arg Pro Asp Gly Ala Asp Ala Val Pro Ala Ala Pro Arg Gly
465 470 475 480
Leu Arg Gln Ala Asp Pro Gln Arg Phe Leu Leu Pro Pro Ala Leu Gly
485 490 495
Leu Leu Val Ala Ala Gly Leu Ala Gly Ala Ala Leu Leu Val Ile His
500 505 510
Val Arg Arg Arg Gly Pro Gly Gln Asp Thr Gly Thr Arg Leu Leu Ser
515 520 525
Gly Thr Arg Glu Pro Ser Val His Thr Leu Pro Asp Ala Leu Asn Asn
530 535 540
Leu Arg Leu Gln Asp Gly Ala Gly Asp Gly Pro Ser Ser Ser Ala Asp
545 550 555 560
Trp Asn His Pro Glu Asp Gly Asp Ser Arg Ser Ile Tyr Val Ile Pro
565 570 575
Ala Pro Ser Ile Tyr Ala Arg Glu Ala
580 585
<210> 54
<211> 589
<212> PRT
<213> 褐家鼠 (Rattus norvegicus)
<400> 54
Met Val Ser Leu Gln Val Ser Ser Leu Pro Gln Thr Leu Ile Leu Ala
1 5 10 15
Phe Leu Leu Pro Gln Ala Leu Pro Ala Gly Val Phe Glu Leu Gln Ile
20 25 30
His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Thr Pro Arg Ser Pro Cys
35 40 45
Asn Ala Arg Gly Pro Cys Arg Leu Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Val Ser Gln Glu Ala Ala Glu Ser Leu Cys Ala Leu Gly Ala Ala
65 70 75 80
Leu Ser Thr Ser Gly Pro Val Tyr Thr Glu Gln Pro Gly Val Pro Ala
85 90 95
Ala Ala Leu Ser Leu Pro Asp Gly Leu Val Arg Val Pro Phe Leu Asp
100 105 110
Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Thr Trp Arg Glu Gln
115 120 125
Leu Gly Glu Arg Ala Ala Gly Pro Ala Trp Asn Leu Leu Ala Arg Val
130 135 140
Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala Gly Ala Pro Trp Ala Arg Asp Val
145 150 155 160
Gln Arg Thr Gly Ala Trp Glu Leu His Phe Ser Tyr Arg Ala Arg Cys
165 170 175
Glu Pro Pro Ala Val Gly Ala Ala Cys Ala Arg Leu Cys Arg Ser Arg
180 185 190
Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Thr Pro Phe
195 200 205
Pro Asp Glu Cys Glu Ala Pro Arg Glu Ser Leu Thr Val Cys Arg Ala
210 215 220
Gly Cys Ser Pro Glu His Gly Tyr Cys Glu Glu Pro Asp Glu Cys His
225 230 235 240
Cys Leu Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val Pro Val Ser Thr
245 250 255
Ser Ser Cys Leu Asn Ser Arg Val Ser Gly Pro Ala Gly Thr Gly Cys
260 265 270
Leu Leu Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly
275 280 285
Gly Ser Cys Ser Glu Thr Pro Gly Ser Phe Glu Cys Ala Cys Pro Arg
290 295 300
Gly Phe Tyr Gly Pro Arg Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp
305 310 315 320
Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Glu Asp Pro Asp
325 330 335
Ser Ala Tyr Val Cys His Cys Pro Pro Ala Phe Gln Gly Ser Asn Cys
340 345 350
Glu Arg Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Gln Asn Gly Gly
355 360 365
Leu Cys Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly
370 375 380
Phe Ala Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg
385 390 395 400
Ala Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly Gly Ala Arg Arg
405 410 415
Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys Arg Glu Arg Ala
420 425 430
Asp Pro Cys Ala Ser Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys Tyr Ala
435 440 445
His Phe Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met Gly Val
450 455 460
Arg Cys Glu Phe Ala Val Arg Pro Asp Gly Ala Asp Ala Val Pro Ala
465 470 475 480
Ala Pro Arg Gly Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Arg Phe Leu Leu Pro
485 490 495
Pro Ala Leu Gly Leu Leu Ala Ala Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ala Leu
500 505 510
Leu Leu Ile His Val Arg Arg Arg Gly Pro Gly Arg Asp Thr Gly Thr
515 520 525
Arg Leu Leu Ser Gly Thr Arg Glu Pro Ser Val His Thr Leu Pro Asp
530 535 540
Ala Leu Asn Asn Leu Arg Leu Gln Asp Gly Ala Gly Asp Gly Pro Thr
545 550 555 560
Ser Ser Ala Asp Trp Asn His Pro Glu Asp Gly Asp Ser Arg Ser Ile
565 570 575
Tyr Val Ile Pro Ala Pro Ser Ile Tyr Ala Arg Glu Ala
580 585
<210> 55
<211> 2341
<212> DNA
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 55
actcccgaga cccccccacc agaaggccat ggtctcccca cggatgtccg ggctcctctc 60
ccagactgtg atcctagcgc tcattttcct cccccagaca cggcccgctg gcgtcttcga 120
gctgcagatc cactctttcg ggccgggtcc aggccctggg gccccgcggt ccccctgcag 180
cgcccggctc ccctgccgcc tcttcttcag agtctgcctg aagcctgggc tctcagagga 240
ggccgccgag tccccgtgcg ccctgggcgc ggcgctgagt gcgcgcggac cggtctacac 300
cgagcagccc ggagcgcccg cgcctgatct cccactgccc gacggcctct tgcaggtgcc 360
cttccgggac gcctggcctg gcaccttctc tttcatcatc gaaacctgga gagaggagtt 420
aggagaccag attggagggc ccgcctggag cctgctggcg cgcgtggctg gcaggcggcg 480
cttggcagcc ggaggcccgt gggcccggga cattcagcgc gcaggcgcct gggagctgcg 540
cttctcgtac cgcgcgcgct gcgagccgcc tgccgtcggg accgcgtgca cgcgcctctg 600
ccgtccgcgc agcgccccct cgcggtgcgg tccgggactg cgcccctgcg caccgctcga 660
ggacgaatgt gaggcgccgc tggtgtgccg agcaggctgc agccctgagc atggcttctg 720
tgaacagccc ggtgaatgcc gatgcctaga gggctggact ggacccctct gcacggtccc 780
tgtctccacc agcagctgcc tcagccccag gggcccgtcc tctgctacca ccggatgcct 840
tgtccctggg cctgggccct gtgacgggaa cccgtgtgcc aatggaggca gctgtagtga 900
gacacccagg tcctttgaat gcacctgccc gcgtgggttc tacgggctgc ggtgtgaggt 960
gagcggggtg acatgtgcag atggaccctg cttcaacggc ggcttgtgtg tcgggggtgc 1020
agaccctgac tctgcctaca tctgccactg cccacccggt ttccaaggct ccaactgtga 1080
gaagagggtg gaccggtgca gcctgcagcc atgccgcaat ggcggactct gcctggacct 1140
gggccacgcc ctgcgctgcc gctgccgcgc cggcttcgcg ggtcctcgct gcgagcacga 1200
cctggacgac tgcgcgggcc gcgcctgcgc taacggcggc acgtgtgtgg agggcggcgg 1260
cgcgcaccgc tgctcctgcg cgctgggctt cggcggccgc gactgccgcg agcgcgcgga 1320
cccgtgcgcc gcgcgcccct gtgctcacgg cggccgctgc tacgcccact tctccggcct 1380
cgtctgcgct tgcgctcccg gctacatggg agcgcggtgt gagttcccag tgcaccccga 1440
cggcgcaagc gccttgcccg cggccccgcc gggcctcagg cccggggacc ctcagcgcta 1500
ccttttgcct ccggctctgg gactgctcgt ggccgcgggc gtggccggcg ctgcgctctt 1560
gctggtccac gtgcgccgcc gtggccactc ccaggatgct gggtctcgct tgctggctgg 1620
gaccccggag ccgtcagtcc acgcactccc ggatgcactc aacaacctaa ggacgcagga 1680
gggttccggg gatggtccga gctcgtccgt agattggaat cgccctgaag atgtagaccc 1740
tcaagggatt tatgtcatat ctgctccttc catctacgct cgggaggtag cgacgcccct 1800
tttccccccg ctacacactg ggcgcgctgg gcagaggcag cacctgcttt ttccctaccc 1860
ttcctcgatt ctgtccgtga aatgaattgg gtagagtctc tggaaggttt taagcccatt 1920
ttcagttcta acttactttc atcctatttt gcatccctct tatcgttttg agctacctgc 1980
catcttctct ttgaaaaacc tatgggcttg aggaggtcac gatgccgact ccgccagagc 2040
ttttccactg attgtactca gcggggaggc aggggaggca gaggggcagc ctctctaatg 2100
cttcctactc attttgtttc taggcctgac gcgtctcctc catccgcacc tggagtcaga 2160
gcgtggattt ttgtatttgc tcggtggtgc ccagtctctg ccccagaggc tttggagttc 2220
aatcttgaag gggtgtctgg gggaacttta ctgttgcaag ttgtaaataa tggttattta 2280
tatcctattt tttctcaccc catctctcta gaaacaccta taaaggctat tattgtgatc 2340
a 2341
<210> 56
<211> 2004
<212> DNA
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 56
actcccgaga cccccccacc agaaggccat ggtctcccca cggatgtccg ggctcctctc 60
ccagactgtg atcctagcgc tcattttcct cccccagaca cggcccgctg gcgtcttcga 120
gctgcagatc cactctttcg ggccgggtcc aggccctggg gccccgcggt ccccctgcag 180
cgcccggctc ccctgccgcc tcttcttcag agtctgcctg aagcctgggc tctcagagga 240
ggccgccgag tccccgtgcg ccctgggcgc ggcgctgagt gcgcgcggac cggtctacac 300
cgagcagccc ggagcgcccg cgcctgatct cccactgccc gacggcctct tgcaggtgcc 360
cttccgggac gcctggcctg gcaccttctc tttcatcatc gaaacctgga gagaggagtt 420
aggagaccag attggagggc ccgcctggag cctgctggcg cgcgtggctg gcaggcggcg 480
cttggcagcc ggaggcccgt gggcccggga cattcagcgc gcaggcgcct gggagctgcg 540
cttctcgtac cgcgcgcgct gcgagccgcc tgccgtcggg accgcgtgca cgcgcctctg 600
ccgtccgcgc agcgccccct cgcggtgcgg tccgggactg cgcccctgcg caccgctcga 660
ggacgaatgt gaggcgccgc tggtgtgccg agcaggctgc agccctgagc atggcttctg 720
tgaacagccc ggtgaatgcc gatgcctaga gggctggact ggacccctct gcacggtccc 780
tgtctccacc agcagctgcc tcagccccag gggcccgtcc tctgctacca ccggatgcct 840
tgtccctggg cctgggccct gtgacgggaa cccgtgtgcc aatggaggca gctgtagtga 900
gacacccagg tcctttgaat gcacctgccc gcgtgggttc tacgggctgc ggtgtgaggt 960
gagcggggtg acatgtgcag atggaccctg cttcaacggc ggcttgtgtg tcgggggtgc 1020
agaccctgac tctgcctaca tctgccactg cccacccggt ttccaaggct ccaactgtga 1080
gaagagggtg gaccggtgca gcctgcagcc atgccgcaat ggcggactct gcctggacct 1140
gggccacgcc ctgcgctgcc gctgccgcgc cggcttcgcg ggtcctcgct gcgagcacga 1200
cctggacgac tgcgcgggcc gcgcctgcgc taacggcggc acgtgtgtgg agggcggcgg 1260
cgcgcaccgc tgctcctgcg cgctgggctt cggcggccgc gactgccgcg agcgcgcgga 1320
cccgtgcgcc gcgcgcccct gtgctcacgg cggccgctgc tacgcccact tctccggcct 1380
cgtctgcgct tgcgctcccg gctacatggg agcgcggtgt gagttcccag tgcaccccga 1440
cggcgcaagc gccttgcccg cggccccgcc gggcctcagg cccggggacc ctcagcgcta 1500
ccttttgcct ccggctctgg gactgctcgt ggccgcgggc gtggccggcg ctgcgctctt 1560
gctggtccac gtgcgccgcc gtggccactc ccaggatgct gggtctcgct tgctggctgg 1620
gaccccggag ccgtcagtcc acgcactccc ggatgcactc aacaacctaa ggacgcagga 1680
gggttccggg gatggtccga gctcgtccgt agattggaat cgccctgaag atgtagaccc 1740
tcaagggatt tatgtcatat ctgctccttc catctacgct cgggaggcct gacgcgtctc 1800
ctccatccgc acctggagtc agagcgtgga tttttgtatt tgctcggtgg tgcccagtct 1860
ctgccccaga ggctttggag ttcaatcttg aaggggtgtc tgggggaact ttactgttgc 1920
aagttgtaaa taatggttat ttatatccta ttttttctca ccccatctct ctagaaacac 1980
ctataaaggc tattattgtg atca 2004
<210> 57
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 57
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 58
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 58
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 59
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Glu Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Gly Trp Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 60
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Glu Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Gly Trp Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 61
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Glu Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Gly Trp Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 62
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 62
Asp Ile Gln Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 63
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Glu Tyr Asn Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 64
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 64
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Glu Tyr Asn Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 65
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 65
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Glu Tyr Asn Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 66
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 66
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Arg
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 67
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 67
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ile Gly Val Ala Gly Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 68
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 68
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ile Gly Val Ala Gly Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 69
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 69
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ile Gly Val Ala Gly Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 70
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 70
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 71
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 71
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Gly Asp Ser Ser Pro Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
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His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 72
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 72
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Trp
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 73
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 73
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
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Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
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Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325 330 335
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
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355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 74
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 74
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Asn Ser
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 75
<211> 1117
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 75
gggtctagag ccaccatgaa acacctgtgg ttcttcctcc tgctggtggc agctcccaga 60
tgggtgctga gccaggtgca attgtgcagg cggttagctc agcctccacc aagggcccaa 120
gcgtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg cggcacagcc gccctgggct 180
gcctggtcaa ggactacttc cccgaacccg tgaccgtgag ctggaactca ggcgccctga 240
ccagcggcgt gcacaccttc cccgctgtcc tgcagtcctc aggactctac tccctcagca 300
gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc 360
acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggttgagcc caaatcttgt gacaaaactc 420
acacatgccc accctgccca gcacctgaac tcctgggggg accctcagtc ttcctcttcc 480
ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg 540
tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg 600
tgcataatgc caagacaaag ccccgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgggtggtca 660
gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct 720
ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa ggccagcccc 780
gggaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca 840
gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca 900
atggccagcc cgagaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggactcc gacggctcct 960
tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc aacgtcttct 1020
catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac ccagaagagc ctctccctgt 1080
ctcccggcaa atgagatatc gggcccgttt aaacggg 1117
<210> 76
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 76
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgag 60
gtgcagctgg ttgaatctgg cggaggactg gttcagcctg gcggatctca gagactgtct 120
tgtgccgcca gcggcttcac cttcagcagc tactggatga actgggtccg acaggcccct 180
ggcaaaggcc ttgaatgggt cgccaacatc aaagaggacg gcagcgagaa gtactacgtg 240
gacagcgtga agggcagatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacag cctgtacctg 300
cagatgaact ccctgagagc cgaggacacc gccgtgtact actgtgccag agatcctggc 360
tgggcccctt tcgattattg gggccagggc acactggtca ccgttagctc agcctccacc 420
aagggcccaa gcgtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg cggcacagcc 480
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaacccg tgaccgtgag ctggaactca 540
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc cccgctgtcc tgcagtcctc aggactctac 600
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggttgagcc caaatcttgt 720
gacaaaactc acacatgccc accctgccca gcacctgaac tcctgggggg accctcagtc 780
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccccgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960
cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080
ggccagcccc gggaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200
tgggagagca atggccagcc cgagaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggactcc 1260
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc 1320
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac ccagaagagc 1380
ctctccctgt ctcccggcaa a 1401
<210> 77
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 77
atgaagcacc tgtggttctt tctgctgctg gtggccgctc ctagatgggt gctgtctgaa 60
gtgcagctgg tggaatctgg cggaggactg gttcaacctg gcggctctca gagactgtct 120
tgtgccgcca gcggcttcac cttcagcagc tactggatga actgggtccg acaggcccct 180
ggcaaaggcc ttgaatgggt cgccaacatc aaagaggacg gcagcgagaa gtactacgtg 240
gacagcgtga agggcagatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacag cctgtacctg 300
cagatgaact ccctgcgcgc cgaagatacc gccgtgtact actgtgccag agatcctggc 360
tgggcccctt tcgattattg gggccaggga accctggtca ccgtgtcatc tgcctccacc 420
aagggcccaa gcgtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg cggcacagcc 480
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaacccg tgaccgtgag ctggaactca 540
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc cccgctgtcc tgcagtcctc aggactctac 600
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggttgagcc caaatcttgt 720
gacaaaactc acacatgccc accctgccca gcacctgaag ccgcgggggg accctcagtc 780
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccccgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960
cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080
ggccagcccc gggaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200
tgggagagca atggccagcc cgagaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggactcc 1260
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc 1320
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac ccagaagagc 1380
ctctccctgt ctcccggcaa a 1401
<210> 78
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 78
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60
gttcagctgc aagagtctgg ccctggcctg gtcaagccta gcgaaacact gagcctgacc 120
tgtaccgtgt ctggcggcag catcaacagc tactactggt cctggatccg gcagcctcct 180
ggcaaaggac tggaatggat cggctacatc ttctacagcg gcatcaccaa ctacaacccc 240
agcctgaagt ccagagtgac catcagcctg gacaccagca agaaccagtt ctccctgaag 300
ctgagcagcg tgacagccgc cgatacagcc gtgtactact gtgccagaat cggcgtggcc 360
ggcttctact tcgattattg gggccagggc accctggtca cagttagctc agcctccacc 420
aagggcccaa gcgtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg cggcacagcc 480
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaacccg tgaccgtgag ctggaactca 540
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc cccgctgtcc tgcagtcctc aggactctac 600
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggttgagcc caaatcttgt 720
gacaaaactc acacatgccc accctgccca gcacctgaac tcctgggggg accctcagtc 780
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccccgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960
cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080
ggccagcccc gggaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200
tgggagagca atggccagcc cgagaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggactcc 1260
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc 1320
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac ccagaagagc 1380
ctctccctgt ctcccggcaa a 1401
<210> 79
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 79
atgaagcacc tgtggttctt tctgctgctg gtggccgctc ctagatgggt gctgtctcag 60
gttcagctgc aagagtctgg ccctggcctg gtcaagccta gcgaaacact gagcctgacc 120
tgtaccgtgt ctggcggcag catcaacagc tactactggt cctggatccg gcagcctcct 180
ggcaaaggac tggaatggat cggctacatc ttctacagcg gcatcaccaa ctacaacccc 240
agcctgaagt ccagagtgac catcagcctg gacaccagca agaaccagtt ctccctgaag 300
ctgagcagcg tgacagccgc cgatacagcc gtgtactact gtgccagaat cggcgtggcc 360
ggcttctact tcgattattg gggccagggc accctggtca ccgtttcttc tgcctccacc 420
aagggcccaa gcgtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg cggcacagcc 480
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaacccg tgaccgtgag ctggaactca 540
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc cccgctgtcc tgcagtcctc aggactctac 600
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggttgagcc caaatcttgt 720
gacaaaactc acacatgccc accctgccca gcacctgaag ccgcgggggg accctcagtc 780
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccccgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960
cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080
ggccagcccc gggaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200
tgggagagca atggccagcc cgagaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggactcc 1260
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc 1320
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac ccagaagagc 1380
ctctccctgt ctcccggcaa a 1401
<210> 80
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 80
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60
gacatccaga tgtctcagag ccctagcagc ctgtctgcca gcgtgggaga cagagtgacc 120
atcacctgta gagccagcca gggcatcagc aactacctgg cctggttcca gcagaagcct 180
ggcaaggccc ctaagagcct gatctatgcc gctagctctc tgcagtctgg cgtgccctct 240
aagtttagcg gctctggcag cggcaccgat ttcacactgg ccatatctag cctgcagcct 300
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacagct tcccctacac cttcggccag 360
ggcaccacac tggaaatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480
cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600
ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660
ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702
<210> 81
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 81
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60
gagatcgtgc tgacacagag ccctggcaca ctgtcactgt ctccaggcga aagagccaca 120
ctgagctgta gagccagcca gagcgtgtcc agctcttacc tggcttggta tcagcagaag 180
cccggacagg ctcccagact gctgatctat ggcgcctctt ctagagccac aggcatcccc 240
gatagattca gcggctctgg cagcggcacc gatttcaccc tgacaatcag cagactggaa 300
cccgaggact tcgccgtgta ctactgtcag cagtacggca caagccctct gacctttggc 360
ggcggaacaa aggtggaaat caagcgtacg gtggccgccc cctccgtgtt catcttcccc 420
ccctccgacg agcagctgaa gtccggcacc gcctccgtgg tgtgcctgct gaataacttc 480
taccccagag aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagtc cgggaactcc 540
caggagagcg tgaccgagca ggacagcaag gacagcacct acagcctgag cagcaccctg 600
accctgagca aagccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaggt gacccaccag 660
ggcctgagct cccccgtcac caagagcttc aacagggggg agtgt 705
<210> 82
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 82
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 83
<211> 75
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(75)
<223> 此序列可以涵盖1-15个"Gly Gly Gly Gly Ser"
重复单元
<220>
<223> 对于取代和优选实施方案的详细描述，
参见提交的说明书
<400> 83
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75
<210> 84
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
6xHis标签
<400> 84
His His His His His His
1 5
<210> 85
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 85
Gly Gly Val Ala
1
<210> 86
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 86
Gly Gly Phe Gly
1
<210> 87
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 87
Gly Gly Pro Ile
1
<210> 88
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 瓜氨酸
<400> 88
Gly Gly Val Xaa
1
<210> 89
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 89
Gly Gly Val Lys
1
<210> 90
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 90
Gly Gly Pro Leu
1
<210> 91
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 91
Glu Gly Gly Val Ala
1 5
<210> 92
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 92
Asp Gly Gly Phe
1
<210> 93
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 93
Glu Gly Gly Phe
1
<210> 94
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 94
Ser Gly Gly Phe
1
<210> 95
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 95
Lys Gly Gly Phe
1
<210> 96
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 96
Asp Gly Gly Phe Gly
1 5
<210> 97
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 97
Gly Gly Phe Gly Gly
1 5
<210> 98
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 98
Asp Asp Gly Gly Phe Gly
1 5
<210> 99
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 99
Lys Asp Gly Gly Phe Gly
1 5
<210> 100
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 100
Gly Gly Phe Gly Gly Gly Phe
1 5
<210> 101
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 101
ccagcctccg gactctagag ccacc 25
<210> 102
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 102
tgagtttaaa cgggggaggc taact 25

Claims (75)

1.一种由下式表示的抗体-药物缀合物：
其中
m1表示1至2的整数；
D表示由下式之一表示的药物：
其中星号表示与L键合；
L是连接Ab的N297聚糖与D的接头；
N297聚糖是任选地经改造的；
Ab表示与DLL-3特异性结合的抗DLL3抗体或所述抗体的功能片段。
2.根据权利要求1所述的抗体药物缀合物，其中所述抗DLL3抗体包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中(a)所述VH包含选自以下的VH-CDR1序列、VH-CDR2序列和VH-CDR3序列：
(i)分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；
(ii)分别为SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15；
(iii)分别为SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；以及
(iv)分别为SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35；和/或
(b)所述VL包含选自以下的VL-CDR1序列、VL-CDR2序列和VL-CDR3序列：
(i)分别为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；
(ii)分别为SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；
(iii)分别为SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；以及
(iv)分别为SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。
3.根据权利要求1或2所述的抗体药物缀合物，其中所述抗DLL3抗体包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中(a)包含VH-CDR1序列、VH-CDR2序列和VH-CDR3序列的所述VH与(b)包含VL-CDR1序列、VL-CDR2序列和VL-CDR3序列的所述VL的组合选自：
(i)分别为(a)SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5与(b)SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10；
(ii)分别为(a)SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15与(b)SEQ ID NO:18、SEQID NO:19和SEQ ID NO:20；
(iii)分别为(a)SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25与(b)SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；以及
(iv)分别为(a)SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35与(b)SEQ ID NO:38、SEQID NO:39和SEQ ID NO:40。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体药物缀合物，其中所述抗DLL3抗体包含以下特征中的一个或多个：
(a)与SEQ ID NO:7、17、27或37中的任一个中存在的轻链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的轻链免疫球蛋白可变结构域序列；和/或
(b)与SEQ ID NO:2、12、22或32中的任一个中存在的重链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的重链免疫球蛋白可变结构域序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体药物缀合物，其中所述抗DLL3抗体包含以下特征中的一个或多个：
(a)与SEQ ID NO:17、27或37中的任一个中存在的轻链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的轻链免疫球蛋白可变结构域序列；和
(b)与SEQ ID NO:12、22或32中的任一个中存在的重链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的重链免疫球蛋白可变结构域序列。
6.根据1-5中任一项所述的抗体药物缀合物，其中所述抗DLL3抗体包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中：(a)所述VH包含选自SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:32的氨基酸序列；和/或(b)所述VL包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体药物缀合物，其中所述抗DLL3抗体包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中：(a)所述VH包含选自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:32的氨基酸序列，并且(b)所述VL包含选自SEQID NO:17、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
8.根据权利要求6所述的抗体药物缀合物，其中所述VH氨基酸序列和所述VL氨基酸序列选自：分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:7(7-I1-B)；分别为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:17(2-C8-A)；分别为SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:27(10-O18-A)；以及分别为SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:37(6-G23-F)。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中在所述抗DLL3抗体与细胞表面(例如，肿瘤细胞表面)上表达的DLL3多肽结合时，所述抗体-药物缀合物经历细胞内内化。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗DLL3包含选自IgG1或其变体、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE的同种型的Fc结构域。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗DLL3包含SEQ IDNO:42、57或58的重链恒定区。
12.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗DLL3抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或双特异性抗体。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体包含：
(a)含有SEQ ID NO:59至61中的任一个的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链；
(b)含有SEQ ID NO:63至65中的任一个的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链；或
(c)含有SEQ ID NO:67至69中的任一个的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体包含：
(a)含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链；
(b)含有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链；或
(c)含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链。
15.根据权利要求1所述的抗体药物缀合物，其中所述抗DLL-3抗体与根据权利要求9或权利要求V的抗体竞争与DLL-3的结合。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗DLL3抗体与DLL3上的表位结合，所述表位是构象表位或非构象表位。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗DLL3抗体与哺乳动物DLL3多肽结合，所述哺乳动物DLL3多肽具有包含SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51的氨基酸残基27-492的氨基酸序列。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体的重链或轻链具有选自以下的一个或两个或更多个修饰或氨基酸残基集：N-连接的糖基化、O-连接的糖基化、N末端加工、C末端加工、脱酰胺、天冬氨酸的异构化、甲硫氨酸的氧化、添加甲硫氨酸残基到N末端、脯氨酸残基的酰胺化、在所述重链的234和235(EU编号)位置处两个亮氨酸(L)残基被取代为丙氨酸(A)(LALA)、所述重链的356位置处的Glu(E)和358(EU编号)位置处的Met(M)的氨基酸残基集、所述重链的356位置处的Asp(D)和358(EU编号)位置处的亮氨酸(L)的氨基酸残基集或其任何组合、N末端谷氨酰胺或N末端谷氨酸转化为焦谷氨酸、以及从羧基末端缺失一个或两个氨基酸。
19.根据权利要求18所述的抗体-药物缀合物，其中从其重链的羧基末端缺失一个或两个氨基酸。
20.根据权利要求19所述的抗体-药物缀合物，其中从其两条重链的每个羧基末端缺失一个氨基酸。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中其重链的羧基末端的脯氨酸残基被进一步酰胺化。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗DLL3抗体包含经调节以便增强抗体依赖性细胞毒性活性的糖链修饰。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中D是：
24.根据权利要求1-22中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中D是：
25.根据权利要求1-22中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中D是：
26.根据权利要求1-22中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中D是：
27.根据权利要求23-26中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中-OH在11’位置处。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中
L由-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C＝O)-*表示，星号表示与D键合；
B表示苯基或杂芳基；
Lp表示由在靶细胞中可切割的氨基酸序列组成的接头；
La表示选自以下的任一个：
-C(＝O)-(CH2CH2)n2-C(＝O)-、
-C(＝O)-(CH2CH2)n2-C(＝O)-NH-(CH2CH2)n3-C(＝O)-、
-C(＝O)-(CH2CH2)n2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(＝O)-、
-C(＝O)-(CH2CH2)n2-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)n3-CH2CH2-C(＝O)-和
-(CH2)n4-O-C(＝O)-；
n2表示1至3的整数，n3表示1至5的整数，并且n4表示0至2的整数；并且
Lb表示将La与Ab的聚糖或改造聚糖键合的间隔子。
29.根据权利要求28所述的抗体-药物缀合物，其中B是选自以下的任一个：1,4-苯基、2,5-吡啶基、3,6-吡啶基、2,5-嘧啶基和2,5-噻吩基。
30.根据权利要求29所述的抗体-药物缀合物，其中B是1,4-苯基。
31.根据权利要求28-30中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中Lp是由二至七个氨基酸构成的氨基酸残基。
32.根据权利要求28-31中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中Lp是由选自以下的氨基酸组成的氨基酸残基：甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、瓜氨酸、亮氨酸、丝氨酸、赖氨酸和天冬氨酸。
33.根据权利要求28-32中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中Lp选自下组：-GGVA-(SEQ ID NO:85)、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-(SEQ ID NO:86)、-GGPI-(SEQ ID NO:87)、-GGVCit-(SEQ ID NO:88)、-GGVK-(SEQ ID NO:89)、-GG(D-)PI-和-GGPL-(SEQ ID NO:90)。
34.根据权利要求28-33中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中La选自下组：
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-、-C(＝O)-(CH2CH2)2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2)2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(＝O)-、
-CH2-OC(＝O)-和-OC(＝O)-。
35.根据权利要求28-34中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中Lb由下式表示：
其中，在以上示出的Lb的每个结构式中，
每个星号表示与La键合，并且每条波浪线表示与Ab的聚糖或改造聚糖键合。
36.根据权利要求28-35中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中L由-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C＝O)-*表示，其中
B是1,4-苯基；
Lp表示选自下组的任一个：-GGVA-(SEQ ID NO:85)、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-(SEQID NO:86)、-GGPI-(SEQ ID NO:87)、-GGVCit-(SEQ ID NO:88)、-GGVK-(SEQ ID NO:89)和-GGPL-(SEQ ID NO:90)；
La表示选自下组的任一个：
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-、-C(＝O)-(CH2CH2)2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2)2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(＝O)-、
-C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(＝O)-、
-CH2-OC(＝O)-和-OC(＝O)-；并且
Lb由下式表示：
其中，在以上示出的Lb的每个结构式中，
每个星号表示与La键合，并且每条波浪线表示与Ab的聚糖或改造聚糖键合。
37.根据权利要求28-36中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中
L选自下组：
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-(CH2CH2)2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:87所公开的“GGPI”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:86所公开的“GGFG”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:88所公开的“GGVCit”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:89所公开的“GGVK”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:90所公开的“GGPL”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2)2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z2-OC(＝O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)以及
-Z3-CH2-OC(＝O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)，其中
Z1表示以下结构式：
Z2表示以下结构式：
并且
Z3表示以下结构式：
其中，在Z1、Z2和Z3的每个结构式中，
每个星号表示与La键合，每条波浪线表示与Ab的聚糖或改造聚糖键合；并且
B表示1,4-苯基。
38.根据权利要求37所述的抗体-药物缀合物，其中
L选自下组：
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-(CH2CH2)2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:88所公开的“GGVCit”)、-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2)2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-和
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-，其中
B是1,4-苯基，并且Z1表示以下结构式：
其中，在Z1的结构式中，
每个星号表示与邻接Z1的C(＝O)键合，并且每条波浪线表示与Ab的聚糖或改造聚糖键合。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体是IgG。
40.根据权利要求39所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体是IgG1或其变体、IgG2或IgG4。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体与肿瘤细胞结合，并且被掺入且内化在所述肿瘤细胞中。
42.根据权利要求41所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体进一步具有抗肿瘤作用。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述N297聚糖是改造聚糖。
44.根据权利要求43所述的抗体-药物缀合物，其中所述N297聚糖是N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或其混合物，或者N297-(Fuc)SG，其中N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2和N297-(Fuc)SG具有由下式表示的结构：
其中
波浪线表示与所述抗体的Asn297键合；
L(PEG)表示-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-，其中在右端的氨基经由酰胺键与所述N297聚糖中的β-Man的1-3支链的非还原末端的唾液酸的2位置处的羧酸结合；
星号表示与接头L键合；并且
n5表示2至10的整数，
其中
波浪线表示与所述抗体的Asn297键合；
L(PEG)表示-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-，其中在右端的氨基经由酰胺键与所述N297聚糖中的β-Man的1-6支链的非还原末端的唾液酸的2位置处的羧酸结合；
星号表示与接头L键合；并且
n5表示2至10的整数，并且
其中
波浪线表示与所述抗体的Asn297键合；
L(PEG)表示-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-，其中在右端的氨基经由酰胺键与所述N297聚糖中的β-Man的1-3和1-6支链中的每一条的非还原末端的唾液酸的2位置处的羧酸结合；
星号表示与接头L键合；并且
n5表示2至10的整数。
45.根据权利要求44所述的抗体-药物缀合物，其中n5是2至5的整数。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中
m2表示1或2的整数；
L选自下组：
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:85所公开的“GGVA”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-(CH2CH2)2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(＝O)-(如SEQ ID NO:88所公开的“GGVCit”)、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2)2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-、
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-C(＝O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-和
-Z1-C(＝O)-CH2CH2-NH-C(＝O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(＝O)-VA-NH-B-CH2-OC(＝O)-，其中B是1,4-苯基，并且Z1表示以下结构式：
其中，在Z1的结构式中，
每个星号表示与邻接Z1的C(＝O)键合，并且每条波浪线表示与Ab的所述N297聚糖键合；
Ab表示IgG抗体；
Ab的所述N297聚糖表示N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2及其混合物和N297-(Fuc)SG中的任一个，其中N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2和N297-(Fuc)SG具有由下式表示的结构：
其中
每条波浪线表示与所述抗体的Asn297键合；
所述N297聚糖中的L(PEG)表示-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)n5-*，其中
n5表示2至5的整数，在左端的氨基经由酰胺键与所述N297聚糖中的β-Man的1-3和1-6支链中的每一条或任一条的非还原末端的唾液酸的2位置处的羧酸结合，并且每个星号表示与接头L中的Z1的三唑环的1或3位置处的氮原子键合。
47.一种选自下组的抗体-药物缀合物：
/>
其中，在以上示出的每个结构式中，
m2表示1或2的整数；
Ab表示抗DLL3 IgG抗体或所述抗体的功能片段；
Ab的所述N297聚糖表示N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2及其混合物和N297-(Fuc)SG中的任一个，其中N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2和N297-(Fuc)SG具有由下式表示的结构：
其中
每条波浪线表示与所述抗体的Asn297键合；
所述N297聚糖中的L(PEG)表示-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*，其中
在左端的氨基经由酰胺键与所述N297聚糖中的β-Man的1-3和1-6支链中的每一条或任一条的非还原末端的唾液酸的2位置处的羧酸结合，并且每个星号表示与对应结构式中的三唑环的1或3位置处的氮原子键合。
48.根据权利要求47所述的抗体药物缀合物，其中所述抗体包含人IgG1或其变体、人IgG2或人IgG4的重链恒定区。
49.根据权利要求47或48所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体包含SEQ ID NO:42、57或58的重链恒定区。
50.根据权利要求46-49中任一项所述的抗体药物缀合物，其中所述抗DLL3抗体包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中(a)所述VH包含选自以下的VH-CDR1序列、VH-CDR2序列和VH-CDR3序列：
(i)分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；
(ii)分别为SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15；
(iii)分别为SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；以及
(iv)分别为SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35；和/或
(b)所述VL包含选自以下的VL-CDR1序列、VL-CDR2序列和VL-CDR3序列：
(i)分别为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；
(ii)分别为SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；
(iii)分别为SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；以及
(iv)分别为SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。
51.根据权利要求50所述的抗体药物缀合物，其中所述抗DLL3抗体包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中(a)包含VH-CDR1序列、VH-CDR2序列和VH-CDR3序列的所述VH与(b)包含VL-CDR1序列、VL-CDR2序列和VL-CDR3序列的所述VL的组合选自：
(i)分别为(a)SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5与(b)SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10；
(ii)分别为(a)SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15与(b)SEQ ID NO:18、SEQID NO:19和SEQ ID NO:20；
(iii)分别为(a)SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25与(b)SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；以及
(iv)分别为(a)SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35与(b)SEQ ID NO:38、SEQID NO:39和SEQ ID NO:40。
52.根据权利要求47-51中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体是包含以选自以下组合(1)至(4)的任一个组合的轻链与重链的抗体或所述抗体的功能片段：
(1)包含SEQ ID NO:7的可变结构域序列的轻链和包含SEQ ID NO:2的可变结构域序列的重链，
(2)包含SEQ ID NO:17的可变结构域序列的轻链和包含SEQ ID NO:12的可变结构域序列的重链，
(3)包含SEQ ID NO:27的可变结构域序列的轻链和包含SEQ ID NO:22的可变结构域序列的重链，以及
(4)包含SEQ ID NO:37的可变结构域序列的轻链和包含SEQ ID NO:32的可变结构域序列的重链。
53.根据权利要求52所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体是包含含有SEQ ID NO:17的可变结构域序列的轻链和含有SEQ ID NO:12的可变结构域序列的重链的抗体。
54.根据权利要求52所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体是包含含有SEQ ID NO:27的可变结构域序列的轻链和含有SEQ ID NO:22的可变结构域序列的重链的抗体。
55.根据权利要求52所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体是包含含有SEQ ID NO:37的可变结构域序列的轻链和含有SEQ ID NO:32的可变结构域序列的重链的抗体。
56.根据权利要求52所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体是包含含有SEQ ID NO:7的可变结构域序列的轻链和含有SEQ ID NO:2的可变结构域序列的重链的抗体。
57.根据权利要求47-56中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体包含：
(a)含有SEQ ID NO:59至61中的任一个的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链；
(b)含有SEQ ID NO:63至65中的任一个的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链；或
(c)含有SEQ ID NO:67至69中的任一个的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链。
58.根据权利要求47-57中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体包含：
(a)含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链；
(b)含有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链；或
(c)含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链。
59.根据权利要求47-58中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述重链或所述轻链具有选自以下的一个或两个或更多个修饰或氨基酸残基集：N-连接的糖基化、O-连接的糖基化、N末端加工、C末端加工、脱酰胺、天冬氨酸的异构化、甲硫氨酸的氧化、添加甲硫氨酸残基到N末端、脯氨酸残基的酰胺化、在所述重链的234和235(根据EU索引)位置处两个亮氨酸(L)残基被取代为丙氨酸(A)(LALA)、所述重链的356位置处的Glu(E)和358(根据EU索引)位置处的Met(M)的氨基酸残基集、所述重链的356位置处的Asp(D)和358(根据EU索引)位置处的亮氨酸(L)的氨基酸残基集或其任何组合、N末端谷氨酰胺或N末端谷氨酸转化为焦谷氨酸、以及从羧基末端缺失一个或两个氨基酸。
60.一种由下式表示的抗体-药物缀合物：
其中，
m2表示1或2的整数；
Ab表示抗DLL3 IgG抗体，所述抗DLL3 IgG抗体包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链；
Ab的所述N297聚糖表示N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2及其混合物和N297-(Fuc)SG中的任一个，其中N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2和N297-(Fuc)SG具有由下式表示的结构：
其中
每条波浪线表示与所述抗体的Asn297键合；
所述N297聚糖中的L(PEG)表示-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*，其中
在左端的氨基经由酰胺键与所述N297聚糖中的β-Man的1-3和1-6支链中的每一条或任一条的非还原末端的唾液酸的2位置处的羧酸结合，并且每个星号表示与对应结构式中的三唑环的1或3位置处的氮原子键合。
61.一种由下式表示的抗体-药物缀合物：
其中，
m2表示1或2的整数；
Ab表示抗DLL3 IgG抗体，所述抗DLL3 IgG抗体包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链；
Ab的所述N297聚糖表示N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2及其混合物和N297-(Fuc)SG中的任一个，其中N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2和N297-(Fuc)SG具有由下式表示的结构：
其中
每条波浪线表示与所述抗体的Asn297键合；
所述N297聚糖中的L(PEG)表示-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*，其中
在左端的氨基经由酰胺键与所述N297聚糖中的β-Man的1-3和1-6支链中的每一条或任一条的非还原末端的唾液酸的2位置处的羧酸结合，并且每个星号表示与对应结构式中的三唑环的1或3位置处的氮原子键合。
62.一种由下式表示的抗体-药物缀合物：
其中，
m2表示1或2的整数；
Ab表示抗DLL3 IgG抗体，所述抗DLL3 IgG抗体包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链；
Ab的所述N297聚糖表示N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2及其混合物和N297-(Fuc)SG中的任一个，其中N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2和N297-(Fuc)SG具有由下式表示的结构：
其中
每条波浪线表示与所述抗体的Asn297键合；
所述N297聚糖中的L(PEG)表示-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*，其中
在左端的氨基经由酰胺键与所述N297聚糖中的β-Man的1-3和1-6支链中的每一条或任一条的非还原末端的唾液酸的2位置处的羧酸结合，并且每个星号表示与对应结构式中的三唑环的1或3位置处的氮原子键合。
63.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-62中任一项所述的抗体-药物缀合物、其盐、或所述缀合物或所述盐的水合物。
64.根据权利要求63所述的药物组合物，所述药物组合物是抗肿瘤药物。
65.根据权利要求63或64所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗肿瘤，其中所述肿瘤是表达DLL3的肿瘤。
66.根据权利要求64或65所述的药物组合物，其中所述肿瘤是小细胞肺癌(SCLC)；大细胞神经内分泌癌(LCNEC)；包括肾脏、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、宫颈和子宫内膜)、胃肠道(胃、结肠)、甲状腺(甲状腺髓样癌)、胰腺和肺在内的多种组织的神经内分泌肿瘤；神经胶质瘤或假性神经内分泌肿瘤(pNET)。
67.一种用于产生聚糖经改造的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
i)培养包含编码抗DLL3抗体的核酸的宿主细胞并且从获得的培养物中收集靶抗体；
ii)用水解酶处理步骤i)中获得的抗体以产生(Fucα1,6)GlcNAc-抗体；以及
iii)-1使聚糖供体分子与所述(Fucα1,6)GlcNAc-抗体在转糖苷酶的存在下反应，所述聚糖供体分子通过以下方式获得：将具有叠氮基团的PEG接头引入MSG(9)或SG(10)中的唾液酸的2位置处的羧酸的羰基并且将还原末端噁唑啉化，或
iii)-2使所述(Fucα1,6)GlcNAc-抗体与聚糖供体分子在转糖苷酶的存在下反应，所述聚糖供体分子通过以下方式获得：将具有叠氮基团的PEG接头引入具有任选地受保护的α-氨基的(MSG-)Asn或(SG-)Asn中的唾液酸的2位置处的羧酸的羰基以及引入所述Asn中的羧酸的羰基，引起水解酶的作用，然后将还原末端噁唑啉化，或
iii)-3使所述(Fucα1,6)GlcNAc-抗体与聚糖供体分子在两种糖基转移酶的存在下反应，其中所述聚糖供体分子是具有引入其唾液酸中的叠氮基团的(SG-)Asn或(MSG-)Asn。
68.根据权利要求67所述的方法，所述方法进一步包括通过用羟基磷灰石柱纯化步骤ii)中的反应溶液来纯化所述(Fucα1,6)GlcNAc-抗体的步骤。
69.一种用于产生根据权利要求1-62中任一项所述的抗体-药物缀合物形式的方法，所述方法包括以下步骤：
i)通过使用根据权利要求56或57所述的方法产生聚糖经改造的抗体；以及
ii)使具有DBCO的药物-接头与步骤i)中制备的聚糖经改造的抗体的聚糖中的叠氮基团反应。
70.一种聚糖经改造的抗体，所述聚糖经改造的抗体通过使用根据权利要求67或68所述的方法获得。
71.一种抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物通过使用根据权利要求69所述的方法获得。
72.一种用于治疗肿瘤的方法，所述方法包括向患有肿瘤的个体施用根据权利要求1至62中任一项所述的抗体-药物缀合物、所述抗体-药物缀合物的盐、或所述抗体-药物缀合物或所述盐的水合物。
73.一种用于治疗肿瘤的方法，所述方法包括向个体同时、单独或连续地施用药物组合物和至少一种抗肿瘤药物，所述药物组合物包含选自根据权利要求1至62中任一项所述的抗体-药物缀合物、其盐和所述缀合物或所述盐的水合物的至少一种组分。
74.根据权利要求72或73所述的方法，其中所述肿瘤是表达DLL3的肿瘤。
75.根据权利要求72-74中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是小细胞肺癌(SCLC)；大细胞神经内分泌癌(LCNEC)；包括肾脏、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、宫颈和子宫内膜)、胃肠道(胃、结肠)、甲状腺(甲状腺髓样癌)、胰腺和肺在内的多种组织的神经内分泌肿瘤；神经胶质瘤或假性神经内分泌肿瘤(pNET)。
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