BR112016014126B1 - Composto não-peptídico, conjugados de anticorpo-fármaco do mesmo, uso dos ditos conjugados para o tratamento de câncer e composição farmacêutica que compreende os mesmos - Google Patents

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Janet Gunzner-Toste
Thomas Pillow
Brian Safina
Vishal Verma
BinQing Wei
Guiling Zhao
Leanna Staben
Philip Wilson Howard
Luke Masterson
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Abstract

COMPOSTOS PEPTIDOMIMÉTICOS E CONJUGADOS DE ANTICORPO-FÁRMACO DOS MESMOS Esta invenção se refere aos ligadores peptidomiméticos e conjugados de anticorpo- fármaco dos mesmos, às composições farmacêuticas contendo os mesmos e ao seu uso na terapia para a prevenção ou tratamento de câncer.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001]Esta invenção se refere a novos compostos peptidomiméticos que são úteis como ligantes de conjugados de anticorpo-fármaco (ADC). Esta invenção também se refere aos ADCs contendo ligantes peptidomiméticos e pirrolobenzodiazepi- nas (PBD). Esta invenção também se refere aos métodos para tratar doenças em seres humanos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002]O uso de anticorpos monoclonais (mABs) para liberar fármacos anti- câncer diretamente às células de tumor tem atraído muita atenção nos últimos anos. Dois novos conjugados de anticorpo-fármaco foram aprovados pela FDA para o tratamento de câncer. Adcetris® (brentuximabe vedotina) é um conjugado de anticorpo- fármaco dirigido a CD30 (ADC) indicado para o tratamento de linfoma de Hodgkin recidivado ou refratário e linfoma de células grandes anaplásico sistêmico (ALCL). Kadcyla® (ado-trastuzumabe entansina) é uma nova terapia aprovada para pacientes com câncer de mama HER2-positivo, de estágio tardio (metastático). Para obter uma atividade antitumor terapêutica e potente e índice terapêutico aceitável em um ADC, vários aspectos de projeto podem ser otimizados. Particularmente, é bem conhecido que a estrutura química do ligante pode apresentar impacto significante sobre a efi-cácia e a segurança de ADC (Ducry & Stump, Bioconjugate Chem, 2010, 21, 5 a 13). A escolha do ligante correto influencia a liberação de fármaco apropriada ao compartimento celular intencionado das células de câncer. Os ligantes podem ser, em geral, divididos em duas categorias: cliváveis (tais como peptídeo, hidrazona ou dissulfeto) ou não clivável (tal como tioéter). Ligantes de peptídeo, tais como Valina-Citrulina (Val-Cit), que podem ser hidrolisados por enzimas lisossômicas (tais como Catepsi- na B) foram usados para conectar o fármaco ao anticorpo (US 6214345). Eles foram particularmente úteis, devido, em parte, à sua estabilidade relativa na circulação sistêmica e à capacidade de liberar eficazmente o fármaco no tumor. ADCs contendo o ligante Val-Cit foram mostrados relativamente estáveis in vivo (t1/2 para liberação de fármaco ~7 dias (Doronina et al. (2008), Bioconjugate Chem., 19, 1960 a 1963). Entretanto, o espaço químico representado pelos peptídeos naturais é limitado; portanto, é desejável ter uma variedade de ligantes sem peptídeo que atuam como peptí- deos e podem ser eficazmente clivados por proteases lisossômicas. A maior diversidade de estruturas sem peptídeo pode fornecer novas propriedades benéficas que não são fornecidas pelos ligantes de peptídeo. Tipos diferentes de ligantes sem pep- tídeo para ADC que podem ser clivados por enzimas lisossômicas são fornecidos neste relatório.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[003]Esta invenção se refere aos conjugados de anticorpo-fármaco representados pela Fórmula (I)
[004]Ab— (L—D)p,
[005]Ab é um anticorpo;
[006]L é um ligante peptidomimético representado pela seguinte fórmula
[007]—Str—(PM)—Sp—
[008]em que
[009]Str é uma unidade extensora (stretcher) covalentemente ligada a Ab;
[010]Sp é uma ligação ou unidade espaçadora covalentemente ligada a uma porção de fármaco;
[011]PM é uma porção química sem peptídeo selecionada a partir do grupo que consiste de:
Figure img0001
[012]W é -NH-heterocicloalquil- ou heterocicloalquila;
[013]Y é heteroarila, arila, -C(O)alquileno C1-C6, alquenila C1-C6, alquilenila C1-C6 ou -alquileno C1-C6-NH-;
[014]cada R1 é, independentemente, alquila C1-C10, alquenila C1-C10, (alquila C1-C10)NHC(NH)NH2 ou (alquila C1-C10)NHC(O)NH2;
[015]R3 e R2 são, independentemente, H, alquila C1-C10, alquenila C1-C10, ari- lalquila ou heteroarilalquila ou R3 e R2 juntos podem formar um cicloalquila C3-C7;
[016]R4 e R5 são, independentemente, alquila C1-C10, alquenila C1-C10, arilal- quila, heteroarilalquila, (alquila C1-C10)OCH2-, ou R4 e R5 podem formar um anel ci- cloalquila C3-C7;
[017]p é um número inteiro de 1 a 8;
[018]D é uma porção de fármaco da fórmula A ou da fórmula B
Figure img0002
e sais e solvatos dos mesmos, em que: a linha ondulada indica o sítio de ligação covalente ao ligante; as linhas pontilhadas indicam a presença opcional de uma ligação dupla entre C1 e C2 ou C2 e C3;
[019]R22 é, independentemente, selecionado a partir de H, OH, =O, =CH2, CN, Rm, O Rm, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2- Rm, CO2 Rm e CO Rm e, opcionalmente, ainda selecionado a partir de halo ou di-halo, em que RD é, independentemente, selecionado a partir de Rm, CO2 Rm, CO Rm, CHO, CO2H e halo;
[020]R66 e R99 são, independentemente, selecionados a partir de H, Rm, OH, O Rm, SH, S Rm, NH2, NH Rm, N Rm Rp, NO2, Me3Sn e halo;
[021]R77 é, independentemente, selecionado a partir de H, Rm, OH, O Rm, SH, S Rm, NH2, NH Rm, N Rm Rp, NO2, Me3Sn e halo;
[022]Q é, independentemente, selecionado a partir de O, S e NH;
[023]R11 é H ou Rm ou, onde Q é O, SO3M, onde M é um cátion metálico;
[024]Rm e Rp são, independentemente, selecionados a partir de grupos alqui- la C1-C8 opcionalmente substituído, alquenila C2-C8, alquinila C2-C8, cicloalquila C3C8, heterociclila C3-C8 arila C5-C20 e heteroarila C5-20 e, opcionalmente, em relação ao grupo N Rm Rp, Rm e Rp junto com o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados formam um anel heterocíclico de 4, 5, 6 ou 7 membros opcionalmente substituído;
[025]R12, R16, R19, R21 e R17 são definidos para R22, R66, R99, R11 e R77, respectivamente;
[026]R” é um grupo alquileno C3-C12 no qual a cadeia pode ser interrompida por um ou mais heteroátomos, por exemplo, O, S, N(H), NMe e/ou anéis aromáticos, por exemplo, benzeno ou piridina, em que os anéis são opcionalmente substituídos;
[027]X e X’ são, independentemente, selecionados a partir de O, S e N(H); e
[028]RC é um grupo de coroamento.
[029]Esta invenção também se refere às composições farmacêuticas de conjugados de anticorpo-fármaco da fórmula (I).
[030]Esta invenção também se refere a um método para tratar câncer, ao uso de conjugados de anticorpo-fármaco da fórmula (I) em terapia e ao uso de conjugados de anticorpo-fármaco da fórmula (I) na fabricação de um medicamento para tratar câncer.
[031]Esta invenção também se refere ao método para preparar conjugados de anticorpo-fármaco da fórmula (I).
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[032]A Figura 1 mostra a comparação de eficácia de NaPi3b ADCs (NaPi3b PBD ADC1-1 e ADC2-1) em camundongos beges SCID com tumores de ovário humano OVCAR3X2.1.
[033]A Figura 2 mostra a comparação de eficácia de NaPi3b ADCs (NaPi3b PBD ADC1-1 e ADC3-1) em camundongos beges SCID com tumores de ovário humano OVCAR3X2.1.
[034]A Figura 3 mostra a eficácia de CD33 PBD ADC2-2 em várias doses em camundongos SCID com tumores de leucemia mieloide aguda humana EOL-1.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[035]Tipos diferentes de ligantes sem peptídeo para ADC que são cliváveis por enzimas lisossômicas são fornecidos neste relatório. Por exemplo, a ligação amida no meio de um dipeptídeo (por exemplo, Val-Cit) foi substituída por um imitador de amida; e/ou aminoácido total (por exemplo, aminoácido valina no dipeptídeo Val-Cit) foi substituído por uma porção sem aminoácido (por exemplo, estruturas de cicloalquil dicarbonila (por exemplo, tamanho do anel = 4 ou 5)).
[036]Esta invenção se refere aos conjugados de anticorpo da fórmula (I).
[037]Esta invenção também se refere aos conjugados de anticorpo da fórmula (I), em que Y é heteroarila; R4 e R5 juntos formam um anel ciclobutila.
[038]Esta invenção também se refere aos conjugados de anticorpo da fórmula (I), em que Y é uma porção selecionada a partir do grupo que consiste de
Figure img0003
[039]Esta invenção também se refere aos conjugados de anticorpo da fórmu- la (I), em que
[040]Str é uma porção química representada pela seguinte fórmula:
Figure img0004
[041]em que R6 é selecionado a partir do grupo que consiste de alquileno C1C10, alquenila C1-C10, cicloalquila C3-C8, (alquileno C1-C8)O- e alquileno C1- Cio-C(O)N(Ra)-alquileno C2-C6, onde cada alquileno pode ser substituído por um a cinco substituintes selecionados a partir do grupo que consiste de halo, trifluorometi- la, difluorometila, amino, alquilamino, ciano, sulfonila, sulfonamida, sulfóxido, hidróxi, alcóxi, éster, ácido carboxílico, alquiltio arila, cicloalquila C3-C8, heterocicloalquila C4- C7, heteroarilalquila e heteroarila, cada Ra é, independentemente, H ou alquila C1-C6; Sp é —Ar—Rb—, em que Ar é arila ou heteroarila, Rb é (alquileno C1-C10)-C(=O)O-.
[042]Esta invenção também se refere aos conjugados de anticorpo da fórmu- la (I), em que Str apresenta a fórmula:
Figure img0005
[043]em que R7 é selecionado a partir de alquileno C1-C10, alquenila C1-C10, (alquileno Ci-Cio)O-, N(Rc)-(alquileno C2—C6)-N(Rc) e N(Rc)-(alquileno C2-C6); onde cada Rc é, independentemente, H ou alquila C1-C6; Sp é —Ar—Rb—, em que Ar é arila ou heteroarila, Rb é (alquileno C1-C10)-C(=O)O-.
[044]Esta invenção também se refere aos conjugados de anticorpo da fórmula (I), que é representada por: Ab— (L—D)p
[045]em que Ab é um anticorpo; L é uma porção química sem peptídeo representada pela seguinte fórmula
Figure img0006
[046]R1 é alquila C1-C6, alquenila C1-C6, (alquila C1-C6)NHC(NH)NH2 ou (alquila C1-C6)NHC(O)NH2;
[047]R3 e R2 são, independentemente, H, alquila C1-C10.
[048]Esta invenção também se refere aos conjugados de anticorpo da fórmula (I), que é representada por: Ab— (L—D)p
[049]em que Ab é um anticorpo;
[050]L é uma porção química sem peptídeo representada pela seguinte fór- mula
Figure img0007
[051]R1 é alquila C1-C6, (alquila C1-C6)NHC(NH)NH2 ou (alquila C1- C6)NHC(O)NH2;
[052]R4 e R5 juntos formam um anel cicloalquila C3-C7.
[053]Esta invenção também se refere aos conjugados de anticorpo da fórmula (I), que é representada por: Ab— (L—D)p
[054]em que Ab é um anticorpo;
[055]L é uma porção química sem peptídeo representada pela seguinte fórmula
Figure img0008
[056]R1 é alquila C1-C6, (alquila C1-C6)NHC(NH)NH2 ou (alquila C1- C6)NHC(O)NH2.
[057]Esta invenção também se refere aos conjugados de anticorpo da fórmula (I) representada pela seguinte fórmula:
Figure img0009
em que
[058]Str é uma porção química representada pela seguinte fórmula:
Figure img0010
[059]em que R6 é selecionado a partir do grupo que consiste de alquileno C1- Cio, e alquileno Ci-Cio-C(O)N(Ra)-alquileno C2-C6, onde cada alquileno pode ser substituído por um a cinco substituintes selecionados a partir do grupo que consiste de halo, trifluorometila, difluorometila, amino, alquilamino, ciano, sulfonila, sulfonami- da, sulfóxido, hidróxi, alcóxi, éster, ácido carboxílico, alquiltio arila, cicloalquila C3-C8, heterocicloalquila C4-C7, heteroarilalquila e heteroarila, cada Ra é, independentemente, H ou alquila Ci-C6; p é i, 2, 3 ou 4.
[060]Esta invenção também se refere aos conjugados de anticorpo da fórmula (I) representada pela seguinte fórmula:
Figure img0011
em que
[061]Str é uma porção química representada pela seguinte fórmula:
Figure img0012
[062]em que R6 é selecionado a partir do grupo que consiste de alquileno C1- Cio, e alquileno Ci-Cio-C(O)N(Ra)-alquileno C2-C6, onde cada alquileno pode ser substituído por um a cinco substituintes selecionados a partir do grupo que consiste de halo, trifluorometila, difluorometila, amino, alquilamino, ciano, sulfonila, sulfonami- da, sulfóxido, hidróxi, alcóxi, éster, ácido carboxílico, alquiltio arila, cicloalquila C3-C8, heterocicloalquila C4-C7, heteroarilalquila e heteroarila, cada Ra é, independentemente, H ou alquila Ci-C6; p é i, 2, 3 ou 4.
[063]Esta invenção também se refere a qualquer um entre os conjugados de anticorpo acima, em que Y é heteroarila, arila ou alquenila; R6 é alquileno Ci-Cio.
[064]Esta invenção também se refere a qualquer um entre os conjugados de anticorpo acima, em que Y é
Figure img0013
[065]Esta invenção também se refere a qualquer um entre os conjugados de anticorpo acima, em que Y é
Figure img0014
[066]Esta invenção também se refere a qualquer um entre os conjugados de anticorpo acima, em que Y é
Figure img0015
[067]Esta invenção também se refere a qualquer um entre os conjugados de anticorpo acima, em que
[068]Str é uma porção química representada pela seguinte fórmula:
Figure img0016
R6 é alquileno C1-C6;
[069]Sp é —Ar—Rb—, onde Ar é arila, Rb é (alquileno C1-C3)-C(=O)O-.
[070]Esta invenção também se refere a qualquer um entre os conjugados de
Figure img0017
[071]R1 é alquila C1-C6-NH2, (alquila C1-C6)NHC(NH)NH2 ou (alquila C1- C6)NHC(O)NH2 p é 1, 2 ,3 ou 4.
[072]Esta invenção também se refere a qualquer um entre os conjugados de
Figure img0018
em que p é 1, 2, 3 ou 4;
[073]R1 é alquila C1-C6-NH2, (alquila C1-C6)NHC(NH)NH2 ou (alquila C1- C6)NHC(O)NH2;
[074]R4 e R5 são, independentemente, alquila C1-C6, em que o dito alquila é não substituído, ou R4 e R5 podem formar um anel cicloalquila C3-C7.
[075]Esta invenção também se refere aos compostos sem peptídeo da fórmula (IV):
Figure img0019
em que
[076]Str é uma unidade extensora que pode ser covalentemente ligada a um anticorpo;
[077]Sp é uma ligação ou uma unidade espaçadora covalentemente ligada a uma porção de fármaco;
[078]R1 é alquila C1-C10, (alquila C1-C10)NHC(NH)NH2 ou (alquila C1- C10)NHC(O)NH2;
[079]R4 e R5 são, independentemente, alquila C1-C10, arilalquila, heteroarilal- quila, (alquila C1-C10)OCH2-, ou R4 e R5 podem formar um anel cicloalquila C3-C7;
[080]D é uma porção de fármaco da fórmula A ou da fórmula B:
Figure img0020
Figure img0021
e sais e solvatos dos mesmos, em que: a linha ondulada indica o sítio de ligação covalente ao ligante; as linhas pontilhadas indicam a presença opcional de uma ligação dupla entre C1 e C2 ou C2 e C3;
[081]R22 é, independentemente, selecionado a partir de H, OH, =O, =CH2, CN, Rm, O Rm, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2- Rm, CO2 Rm e CO Rm e, opcionalmente, ainda selecionado a partir de halo ou di-halo, em que RD é, independentemente, selecionado a partir de Rm, CO2 Rm, CO Rm, CHO, CO2H e halo;
[082]R66 e R99 são, independentemente, selecionados a partir de H, Rm, OH, O Rm, SH, S Rm, NH2, NH Rm, N Rm Rp, NO2, Me3Sn e halo;
[083]R77 é, independentemente, selecionado a partir de H, Rm, OH, O Rm, SH, S Rm, NH2, NH Rm, N Rm Rp, NO2, Me3Sn e halo;
[084]Q é, independentemente, selecionado a partir de O, S e NH;
[085]R11 é H ou Rm ou, onde Q é O, SO3M, onde M é um cátion metálico;
[086]Rm e Rp são, independentemente, selecionados a partir dos grupos alquila C1-8 opcionalmente substituído, alquenila C2-C8, alquinila C2-C8, cicloalquila C3C8, heterociclila C3-8 arila C5-20 e heteroarila C5-20 e, opcionalmente, em relação ao grupo N Rm Rp, Rm e Rp junto com o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados formam um anel heterocíclico de 4, 5, 6 ou 7 membros opcionalmente substituído;
[087]R12, R16, R19, R21 e R17 são definidos para R22, R66, R99, R11 e R77, respectivamente;
[088]R” é um grupo alquileno C3-C12 no qual a cadeia pode ser interrompida por um ou mais heteroátomos, por exemplo, O, S, N(H), NMe e/ou anéis aromáticos, por exemplo, benzeno ou piridina, em que os anéis são opcionalmente substituídos;
[089]X e X’ são, independentemente, selecionados a partir de O, S e N(H); e RC é um grupo de coroamento.
[090]Esta invenção também se refere aos compostos sem peptídeo representados pela seguinte fórmula
Figure img0022
[091]em que R6 é alquileno C1-C10; R4 e R5 juntos formam um anel cicloalqui- la C3-C7.
[092] Esta invenção também se refere aos compostos sem peptídeo representados pela seguinte fórmula
Figure img0023
[093] Esta invenção também se refere aos compostos sem peptídeo da fórmula:
Figure img0024
em que
[094]Str é uma unidade extensora que pode ser covalentemente ligada a um anticorpo;
[095]Sp é uma unidade espaçadora opcional covalentemente ligada a uma porção de fármaco;
[096]Y é heteroarila, arila, -C(O)alquenila C1-C6, alquenila C1-C6 ou -alquenila C1-C6-NH-;
[097]R1 é alquila C1-C10, (alquila C1-C10)NHC(NH)NH2 ou (alquila C1- C10)NHC(O)NH2;
[098]R3 e R2 são, independentemente, H, alquila C1-C10, arilalquila ou hete- roarilalquila, ou R3 e R2 juntos podem formar um cicloalquila C3-C7;
[099]D é uma porção de fármaco da fórmula A ou da fórmula B:
Figure img0025
e sais e solvatos dos mesmos, em que: a linha ondulada indica o sítio de ligação covalente ao ligante; as linhas pontilhadas indicam a presença opcional de uma ligação dupla entre C1 e C2 ou C2 e C3;
[0100]R22 é, independentemente, selecionado a partir de H, OH, =O, =CH2, CN, Rm, O Rm, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2- Rm, CO2 Rm e CO Rm e, opcionalmente, ainda selecionado a partir de halo ou di-halo, em que RD é, independentemente, selecionado a partir de Rm, CO2 Rm, CO Rm, CHO, CO2H e halo;
[0101]R66 e R99 são, independentemente, selecionados a partir de H, Rm, OH, O Rm, SH, S Rm, NH2, NH Rm, N Rm Rp, NO2, Me3Sn e halo;
[0102]R77 é, independentemente, selecionado a partir de H, Rm, OH, O Rm, SH, S Rm, NH2, NH Rm, N Rm Rp, NO2, Me3Sn e halo;
[0103]Q é, independentemente, selecionado a partir de O, S e NH;
[0104]R11 é H ou Rm ou, onde Q é O, SO3M, onde M é um cátion metálico;
[0105]Rm e Rp são, independentemente, selecionados a partir dos grupos alquila C1-8 opcionalmente substituído, alquenila C2-C8, alquinila C2-C8, cicloalquila C3C8, heterociclila C3-8 arila C5-20 e heteroarila C5-20 e, opcionalmente, em relação ao grupo N Rm Rp, Rm e Rp junto com o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados formam um anel heterocíclico de 4, 5, 6 ou 7 membros opcionalmente substituído;
[0106]R12, R16, R19 e R17 são definidos para R22, R66, R99 e R77, respectivamente;
[0107]R” é um grupo alquileno C3-C12 no qual a cadeia pode ser interrompida por um ou mais heteroátomos, por exemplo, O, S, N(H), NMe e/ou anéis aromáticos, por exemplo, benzeno ou piridina, em que os anéis são opcionalmente substituídos;
[0108]X e X’ são, independentemente, selecionados a partir de O, S e N(H): e RC é um grupo de coroamento.
[0109]Esta invenção também se refere aos compostos sem peptídeo representados pela seguinte fórmula:
Figure img0026
em que R6 é alquileno C1-C10.
[0110]Esta invenção também se refere aos sentados pela seguinte fórmula:
Figure img0027
[0111]Esta invenção também se refere a qualquer um entre os compostos sem peptídeo acima, em que Str apresenta a seguinte fórmula:
Figure img0028
[0112]em que R6 é selecionado a partir do grupo que consiste de alquileno C1-C10, cicloalquila C3-C8, O-(alquileno C1-C8) e alquileno C1- Cio-C(O)N(Ra)-alquileno C2-C6, onde cada alquileno pode ser substituído por um a cinco substituintes selecionados a partir do grupo que consiste de halo, trifluorometi- la, difluorometila, amino, alquilamino, ciano, sulfonila, sulfonamida, sulfóxido, hidróxi, alcóxi, éster, ácido carboxílico, alquiltio arila, cicloalquila C3-C8, heterocicloalquila C4C7 e heteroarila, cada Ra é, independentemente, H ou alquila C1-C6; Sp é —Ar—Rb— , em que Ar é arila ou heteroarila, Rb é (alquileno C1-C10)-C(=O)-O-.
[0113]Esta invenção também se refere aos compostos sem peptídeo, em que R6 é alquileno C1-C10, Sp é —Ar—Rb—, em que Ar é arila, Rb é (alquileno C1- C6)-C(=O)-O-.
[0114]Esta invenção também se refere aos compostos sem peptídeo, onde R6 é -(CH2)q é 1 a 10;
[0115]Esta invenção também se refere aos compostos sem peptídeo, em que Str apresenta a fórmula: o o
Figure img0029
[0116]em que R7 é selecionado a partir de alquileno C1-C10, alquileno C1- C10-O, N(Rc)-(alquileno C2-C6)-N(Rc) e N(Rc)-(alquileno C2-C6); onde cada Rc é, independentemente, H ou alquila C1-C6;
[0117]Sp é —Ar—Rb—, em que Ar é arila ou heteroarila, Rb é (alquileno C1- C10)-C(=O)-O-.
[0118]Esta invenção também se refere aos compostos sem peptídeo, em que R6 é alquileno C1-C10, Sp é —Ar—Rb—, em que Ar é arila Rb é (alquileno C1-C6)- C(=O)-O-. PM
[0119]Conforme descrito acima, PM é uma porção química sem peptídeo se- lecionada a partir do grupo que consiste de:
Figure img0030
[0120]Em cada uma entre PM1, PM2 e PM3, R1 é, independentemente, al- quila C1-C10, alquenila C1-C10, (alquila C1-C10)NHC(NH)NH2 ou (alquila C1- C10)NHC(O)NH2. Em algumas formas de realização, R1 é alquila C1-C6, (alquila C1- C6)NHC(NH)NH2 ou (alquila C1-C6)NHC(O)NH2. Em algumas formas de realização, R1 é C3H6NHC(O)NH2
[0121]Na PM1, W é -NH-heterocicloalquil- ou heterocicloalquila. Em algumas formas de realização, ...
[0122]Na PM2, Y é heteroarila, arila, -C(O)alquileno C1-C6, alquenila C1-C6, alquilenila C1-C6 ou - alquileno C1-C6-NH-. Em algumas formas de realização, Y é heteroarila. Em algumas entre estas formas de realização, Y é
Figure img0031
[0123]Em outras formas de realização, Y é alquilenila C1-C6. Em algumas entre estas formas de realização, Y é
Figure img0032
[0124]Na PM2, R3 e R2 são, independentemente, H, alquila C1-C10, alquenila C1-C10, arilalquila ou heteroarilalquila, ou R3 e R2 juntos podem formar um cicloalquila C3-C7 (com o átomo de carbono ao qual eles são ligados). Em algumas formas de realização, R2 e R3 são, independentemente, H ou alquila C1-10. Em tal forma de realização, R2 é H e R3 é iso-propila.
[0125]Na PM3, R4 e R5 são, independentemente, alquila C1-C10, alquenila C1C10, arilalquila, heteroarilalquila, (alquila C1-C10)OCH2-, ou R4 e R5 podem formar um anel cicloalquila C3-C7 (com o átomo de carbono ao qual eles são ligados). Em algumas entre estas formas de realização, R4 e R5 juntos formam um anel cicloalquila C3-C7 (com o átomo de carbono ao qual eles são ligados). Em particular, eles podem formar um grupo ciclobutila, tal que PM3 é:
Figure img0033
[0126]Em algumas formas de realização, o grupo PM pode ser:
Figure img0034
STR
[0127]Conforme descrito acima, Str é uma unidade extensora covalentemen- te ligada a Ab.
[0128]Em algumas formas de realização, Str é uma porção química representada pela seguinte fórmula:
Figure img0035
[0129]em que R6 é selecionado a partir do grupo que consiste de alquileno C1-C10, alquenila C1-C10, cicloalquila C3-C8, (alquileno C1-C8)O- e alquileno C1- Cio-C(O)N(Ra)-alquileno C2-C6, onde cada alquileno pode ser substituído por um a cinco substituintes selecionados a partir do grupo que consiste de halo, trifluorometi- la, difluorometila, amino, alquilamino, ciano, sulfonila, sulfonamida, sulfóxido, hidróxi, alcóxi, éster, ácido carboxílico, alquiltio arila, cicloalquila C3-C8, heterocicloalquila C4C7, heteroarilalquila e heteroarila, cada Ra é, independentemente, H ou alquila C1-C6; Sp é —Ar—Rb—, em que Ar é arila ou heteroarila, Rb é (alquileno C1-C10)O-.
[0130]Em algumas entre estas formas de realização, R6 é selecionado a partir do grupo que consiste de alquileno C1-C10 e alquileno C1-C10-C(O)N(Ra)-alquileno C2-C6, onde cada alquileno pode ser substituído por um a cinco substituintes selecionados a partir do grupo que consiste de halo, trifluorometila, difluorometila, amino, alquilamino, ciano, sulfonila, sulfonamida, sulfóxido, hidróxi, alcóxi, éster, ácido car- boxílico, alquiltio arila, cicloalquila C3-C8, heterocicloalquila C4-C7, heteroarilalquila e heteroarila, cada Ra é, independentemente, H ou alquila C1-C6.
[0131]Em algumas entre estas formas de realização, R6 é alquileno C1-C10, alquileno C1-6. Em formas de realização particulares, R6 é alquileno C5.
[0132]Em algumas formas de realização, Str apresenta a fórmula:
Figure img0036
[0133]em que R7 é selecionado a partir de alquileno C1-C10, alquenila C1-C10, (alquileno Ci-Cio)O-, N(Rc)-(alquileno C2-C6)-N(Rc) e N(Rc)-(alquileno C2-C6); onde cada Rc é, independentemente, H ou alquila C1-C6.
[0134]Em algumas entre estas formas de realização, R7 é selecionado a partir de alquileno Ci-Cio, alquenila Ci-Cio, (alquileno Ci-Cio)O-, N(Rc)-(alquileno C2- C6)-N(Rc) e N(Rc)-(alquileno C2-C6); onde cada Rc é, independentemente, H ou alquila Ci-C6.
SP
[0135]Sp é uma ligação ou uma unidade espaçadora covalentemente ligada à porção de fármaco.
[0136]Em algumas formas de realização, Sp é —Ar—Rb—, em que Ar é arila ou heteroarila, Rb é (alquileno Ci-Cio)OC(=O)-. Em algumas entre estas formas de realização, Rb é (alquileno Ci-C3)OC(=O)-. Em formas de realização adicionais, Rb é -CH2-OC(=O)-. Em algumas formas de realização, Ar é fenileno e este pode ser:
Figure img0037
[0137]Em algumas formas de realização, -Str-PM-Sp- é selecionada a partir de:
Figure img0038
RC
[0138]O grupo RC é removível da posição N10 da porção PBD para deixar uma ligação imina N10-C11, uma carbinolamina, uma carbinolamina substituída, onde QR11 é OSO3M, um aduto de bissulfito, uma tiocarbinolamina, uma tiocarbinola- mina substituída ou um carbinalamina substituída.
[0139]Em uma forma de realização, RC pode ser um grupo de proteção que é removível para deixar uma ligação imina N10-C11, uma carbinolamina, uma cabi- nolamina substituída ou, onde QR21 é OSO3M, um aduto de bissulfito. Em uma forma de realização, RC é um grupo de proteção que é removível para deixar uma ligação imina N10-C11.
[0140]O grupo Rc é intencionado a ser removível sob as mesmas condições daquelas exigidas para a clivagem do ligante peptidomimético, por exemplo, para produzir uma ligação imina N10-C11, uma carbinolamina e assim por diante. O grupo de coroamento atua como um grupo de proteção para a funcionalidade intencionada na posição N10. O grupo de coroamento não é reativo para o anticorpo, assim, por exemplo, RC não é Str-(PM)-Sp-.
[0141]O grupo de coroamento pode ser referido como um grupo de proteção nitrogênio terapeuticamente removível, conforme definido no WO 00/12507, a definição do qual é incorporada como referência neste relatório.
[0142]Em uma forma de realização, o grupo RC é removível sob as condições que clivam o grupo peptidomimético, PM. Assim, em uma forma de realização, o grupo de coroamento é clivável através da ação de uma enzima.
[0143]O grupo de coroamento pode ser usado como uma máscara para uma ligação imina N10-C11. O grupo de coroamento pode ser removido em um momento que a funcionalidade imina é exigida no composto. O grupo de coroamento também é uma máscara para uma carbinolamina, uma cabinolamina substituída e um aduto de bissulfito, conforme descrito acima.
[0144]Em uma forma de realização, RC é um grupo de proteção carbamato.
[0145]Em uma forma de realização, o grupo de proteção carbamato é selecionado a partir de:
[0146]Alloc, Fmoc, Boc, Troc e Teoc.
[0147]Em uma forma de realização, RC é derivado de um grupo ligante Str- (PM)-Sp- desprovido do grupo funcional para a conexão ao anticorpo.
[0148]Este pedido, particularmente, está envolvido com grupos RC que são carbamatos.
[0149]Em uma forma de realização, RC é um grupo:
Figure img0039
[0150]onde o asterisco indica o ponto de ligação à posição N10, G2 é um grupo de terminação, L3 é uma ligação covalente ou um ligante clivável L1, L2 é uma ligação covalente ou junto com OC(=O) forma um ligante autoimolativo. Alternativamente, L3 pode ser PM e L2 junto com OC(=O) forma Sp.
[0151]Onde L3 e L2 são ligações covalentes, G2 e OC(=O) juntos formam um grupo de proteção carbamato, conforme definido acima. L1 é, preferivelmente, o ligante clivável e pode ser referido como um ativador para a ativação do ligante para clivagem.
[0152]A natureza de L1 e L2, onde presente, pode variar amplamente. Estes grupos são escolhidos na base de suas características de clivagem, que podem ser ditadas pelas condições no sítio ao qual o conjugado é liberado. Aqueles ligantes que são clivados através da ação de enzimas são preferidos, embora os ligantes que são cliváveis através de mudanças no pH (por exemplo, ácido ou base lábil), temperatura ou sob irradiação (por exemplo, fotolábil) também possam ser usados. Os ligantes que são cliváveis sob condições de redução ou oxidação também podem encontrar uso na presente invenção.
[0153]L1 pode compreender uma sequência contígua de aminoácidos. A sequência de aminoácidos pode ser o substrato alvo para a clivagem enzimática, desse modo, permitindo a liberação de R10 a partir da posição N10.
[0154]Em uma forma de realização, L1 é clivável através da ação de uma enzima. Em uma forma de realização, a enzima é uma esterase ou uma peptidase.
[0155]Em uma forma de realização, L2 está presente e junto com -C(=O)O- forma um ligante autoimolativo. Em uma forma de realização, L2 é um substrato para a atividade enzimática, desse modo, permitindo a liberação de R10 a partir da posição N10.
[0156]Em uma forma de realização, onde L1 é clivável através da ação de uma enzima e L2 está presente, a enzima cliva a ligação entre L1 e L2.
[0157]L1 e L2, onde presentes, podem ser conectados através de uma ligação selecionada a partir de: -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH- e -NHC(=O)NH-.
[0158]Um grupo amino de L1 que se conecta ao L2 pode ser o N-terminal de um aminoácido ou pode ser derivado de um grupo amino de uma cadeia lateral de aminoácidos, por exemplo, uma cadeia lateral de aminoácidos lisina.
[0159]Um grupo carboxila de L1 que se conecta ao L2 pode ser o C-terminal de um aminoácido ou pode ser derivado de um grupo carboxila de uma cadeia lateral de aminoácidos, por exemplo, uma cadeia lateral de aminoácidos ácido glutâmi- co.
[0160]Um grupo hidroxila de L1 que se conecta a L2 pode ser derivado de um grupo hidroxila de uma cadeia lateral de aminoácidos, por exemplo uma cadeia lateral de aminoácidos serina.
[0161]O termo “cadeia lateral de aminoácidos” inclui aqueles grupos encontrados em: (i) aminoácidos de ocorrência natural, tais como alanina, arginina, aspa- ragina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleu- cina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tiro- sina e valina; (ii) aminoácidos secundários, tais como ornitina e citrulina; (iii) aminoá- cidos não naturais, beta-aminoácidos, análogos sintéticos e derivados de aminoáci- dos de ocorrência natural; e (iv) todos os enantiômeros, diastereômeros, isomerica- mente enriquecidos, isotopicamente marcados (por exemplo, 2H, 3H, 14C, 15N), formas protegidas e misturas racêmicas dos mesmos.
[0162]Em uma forma de realização, -C(=O)O- e L2 juntos formam o grupo:
Figure img0040
[0163]onde o asterisco indica o ponto de ligação à posição N10, a linha ondulada indica o ponto de ligação ao ligante L1, Y é -N(H)-, -O-, -C(=O)N(H)- ou - C(=O)O- e n é 0 a 3. O anel fenileno é opcionalmente substituído com um, dois ou três substituintes, conforme descrito neste relatório. Em uma forma de realização, o grupo fenileno é opcionalmente substituído com halo, NO2, R ou OR.
[0164]Em uma forma de realização, Y é NH.
[0165]Em uma forma de realização, n é 0 ou 1. Preferivelmente, n é 0.
[0166]Onde Y é NH e n é 0, o ligante autoimolativo pode ser referido como um ligante p-aminobenzilcarbonila (PABC).
[0167]O ligante autoimolativo levará em consideração a liberação do composto protegido quando um sítio remoto é ativado, procedendo ao longo das linhas mostradas abaixo (para n = 0):
Figure img0041
[0168]onde L* é a forma ativada da porção remanescente do ligante. Estes grupos apresentam a vantagem de separar o sítio de ativação a partir do composto que será protegido. Conforme descrito acima, o grupo fenileno pode ser opcional- mente substituído.
[0169]Em uma forma de realização descrita neste relatório, o grupo L* é um ligante L1, conforme descrito neste relatório, que pode incluir um grupo dipeptídeo.
[0170]Em uma outra forma de realização, -C(=O)O- e L2 juntos formam um grupo selecionado a partir de:
Figure img0042
[0171]onde o asterisco, a linha ondulada, Y e n são definidos acima. Cada anel fenileno é opcionalmente substituído com um, dois ou três substituintes, conforme descrito neste relatório. Em uma forma de realização, o anel fenileno que apresenta o substituinte Y é opcionalmente substituído e o anel fenileno que não apresenta o substituinte Y é não substituído. Em uma forma de realização, o anel fenileno que apresenta o substituinte Y é não substituído e o anel fenileno que não apresenta o substituinte Y é opcionalmente substituído.
[0172]Em uma outra forma de realização, -C(=O)O- e L2 juntos formam um grupo selecionado a partir de:
Figure img0043
[0173]onde o asterisco, a linha ondulada, Y e n são definidos acima, E é O, S ou NR, D é N, CH, ou CR, e F é N, CH, ou CR.
[0174]Em uma forma de realização, D é N.
[0175]Em uma forma de realização, D é CH.
[0176]Em uma forma de realização, E é O ou S.
[0177]Em uma forma de realização, F é CH.
[0178]Em uma forma de realização preferida, o ligante é um ligante lábil ca- tepsina.
[0179]Em uma forma de realização, L1 compreende um dipeptídeo. O dipep- tídeo pode ser representado como -NH-X1-X2-CO-, onde -NH- e -CO- representam o N- e o C-terminais dos grupos aminoácido X1 e X2, respectivamente. Os aminoáci- dos no dipeptídeo pode ser qualquer combinação de aminoácidos naturais. Onde o ligante é um ligante lábil catepsina, o dipeptídeo pode ser o sítio de ação para clivagem mediada por catepsina.
[0180]Adicionalmente, para aqueles grupos aminoácidos que apresentam funcionalidade de cadeia lateral carboxila ou amino, por exemplo, Glu e Lys, respectivamente, CO e NH podem representar tal funcionalidade de cadeia lateral.
[0181]Em uma forma de realização, o grupo -X1-X2- no dipeptídeo, -NH-X1- X2-CO-, é selecionado a partir de: -Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, -Val-Cit-, -Phe-Cit-, -Leu-Cit-, -Ile-Cit-, -Phe-Arg-, -Trp-Cit- onde Cit é citrulina.
[0182]Preferivelmente, o grupo -X1-X2- no dipeptídeo, -NH-X1-X2-CO-, é se-lecionado a partir de: -Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, -Val-Cit-.
[0183]Mais preferivelmente, o grupo -X1-X2- no dipeptídeo, -NH-X1-X2-CO-, é -Phe-Lys- ou -Val-Ala-.
[0184]Outras combinações de dipeptídeo podem ser usadas, incluindo aquelas descritas por Dubowchik et al., Bioconjugate Chemistry, 2002, 13,855 a 869, que é incorporado neste relatório como referência.
[0185]Em uma forma de realização, a cadeia lateral de aminoácidos é deri- vatizada, onde apropriado. Por exemplo, um grupo amino ou grupo carbóxi de uma cadeia lateral de aminoácidos pode ser derivatizada.
[0186]Em uma forma de realização, um grupo amino NH2 de um aminoácido de cadeia lateral, tal como lisina, é uma forma derivatizada selecionada a partir do grupo que consiste de NHR e NRR’.
[0187]Em uma forma de realização, um grupo carbóxi COOH de um aminoá- cido de cadeia lateral, tal como ácido aspártico, é uma forma derivatizada selecionada a partir do grupo que consiste de COOR, CONH2, CONHR e CONRR’.
[0188]Em uma forma de realização, a cadeia lateral de aminoácidos é quimicamente protegida, onde apropriado. O grupo de proteção de cadeia lateral pode ser um grupo, conforme debatido abaixo em relação ao grupo RL. Os presentes inventores estabeleceram que as sequências de aminoácidos protegidas são cliváveis por enzimas. Por exemplo, foi estabelecido que uma sequência de dipeptídeos compre- endendo um resíduo Lys protegido em cadeia lateral Boc é clivável por catepsina.
[0189]Os grupos de proteção para as cadeias laterais de aminoácidos são bem conhecidos na técnica e são descritos no Novabiochem Catalog. Estratégias de grupo de proteção adicionais são apresentados em Protective Groups in Organic Synthesis, Greene e Wuts.
[0190]Grupos de proteção de cadeia lateral possíveis são mostrados abaixo para aqueles aminoácidos que apresentam funcionalidade de cadeia lateral reativa: Arg: Z, Mtr, Tos; Asn: Trt, Xan; Asp: Bzl, t-Bu; Cys: Acm, Bzl, Bzl-OMe, Bzl-Me, Trt; Glu: Bzl, t-Bu; Gln: Trt, Xan; His: Boc, Dnp, Tos, Trt; Lys: Boc, Z-Cl, Fmoc, Z, Alloc; Ser: Bzl, TBDMS, TBDPS; Thr: Bz; Trp: Boc; Tyr: Bzl, Z, Z-Br.
[0191]Em uma forma de realização, a proteção de cadeia lateral é selecionado para ser ortogonal a um grupo fornecido como, ou como parte de, um grupo de coroamento, onde presente. Assim, a remoção do grupo de proteção de cadeia lateral não remove o grupo de coroamento ou qualquer funcionalidade de grupo de proteção que é parte do grupo de coroamento.
[0192]Em outras formas de realização da invenção, os aminoácidos selecionados são aqueles que não apresentam funcionalidade de cadeia lateral reativa. Por exemplo, os aminoácidos podem ser selecionados a partir de: Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro e Val.
[0193]Em uma forma de realização, o dipeptídeo é usado em combinação com um ligante autoimolativo. O ligante autoimolativo pode ser conectado a -X2-.
[0194]Onde um ligante autoimolativo está presente, -X2- é diretamente conectado ao ligante autoimolativo. Preferivelmente, o grupo -X2-CO- é conectado a Y, onde Y é NH, desse modo, formando o grupo -X2-CO-NH-.
[0195]-NH-X1- é diretamente conectado a A. A pode compreender a funcionalidade -CO-, desse modo, para formar uma ligação amida com -X1-.
[0196]Em uma forma de realização, L1 e L2 junto com -OC(=O)- compreendem o grupo NH-X1-X2-CO-PABC-. O grupo PABC é diretamente conectado à posição N10. Preferivelmente, o ligante autoimolativo e o dipeptídeo juntos formam o grupo -NH-Phe-Lys-CO-NH-PABC-, que é ilustrado abaixo:
Figure img0044
[0197]onde o asterisco indica o ponto de ligação à posição N10 e a linha ondulada indica o ponto de ligação à porção remanescente do ligante L1 ou o ponto de ligação a A. Preferivelmente, a linha ondulada indica o ponto de ligação a A. A cadeia lateral do Aminoácido Lys pode ser protegida, por exemplo, com Boc, Fmoc ou Alloc, conforme descrito acima.
[0198]Alternativamente, o ligante autoimolativo e o dipeptídeo juntos formam o grupo -NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-, que é ilustrado abaixo:
Figure img0045
[0199]onde o asterisco e a linha ondulada são definidos acima.
[0200]Alternativamente, o ligante autoimolativo e o dipeptídeo juntos formam o grupo -NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-, que é ilustrado abaixo:
Figure img0046
[0201]onde o asterisco e a linha ondulada são definidos acima.
[0202]Vários grupos de terminação são descritos abaixo, incluindo aqueles com base em grupos de proteção bem conhecidos.
[0203]Em uma forma de realização, L3 é um ligante clivável L1 e L2, junto com OC(=O), forma um ligante autoimolativo. Nesta forma de realização, G2 é Ac (acetila) ou Moc ou um grupo de proteção carbamato selecionado a partir de:
[0204]Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz e PNZ.
[0205]Opcionalmente, o grupo de proteção carbamato é ainda selecionado a partir de Moc.
[0206]Em uma outra forma de realização, G2 é um grupo acila -C(=O)G3, onde G3 é selecionado a partir de alquila (incluindo cicloalquila, alquenila e alquinila), heteroalquila, heterociclila e arila (incluindo heteroarila e carboarila). Estes grupos podem ser opcionalmente substituídos. O grupo acila junto com um grupo amino de L3 ou L2, onde apropriado, pode formar uma ligação amida. O grupo acila junto com um grupo hidróxi de L3 ou L2, onde apropriado, pode formar uma ligação éster.
[0207]Em uma forma de realização, G3 é heteroalquila. O grupo heteroalqui- la pode compreender polietilenoglicol. O grupo heteroalquila pode apresentar um heteroátomo, tal como O ou N, adjacente ao grupo acila, desse modo, formando um grupo carbamato ou carbonato, onde apropriado, com um heteroátomo presente no grupo L3 ou L2, onde apropriado.
[0208]Em uma forma de realização, G3 é selecionado a partir de NH2, NHR e NRR’. Preferivelmente, G3 é NRR’.
[0209]Em uma forma de realização, G2 é o grupo:
Figure img0047
[0210]onde o asterisco indica o ponto de ligação a L3, n é 0 a 6 e G4 é selecionado a partir de OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR’, NH2, NHR, NRR’, NO2 e halo. Os grupos OH, SH, NH2 e NHR são protegidos. Em uma forma de realização, n é 1 a 6, e, preferivelmente, n é 5. Em uma forma de realização, G4 é OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR’ e NRR’. Em uma forma de realização, G4 é OR, SR e NRR’. Preferivelmente, G4 é selecionado a partir de OR e NRR’, mais preferivelmente, G4 é OR. Mais preferivelmente, G4 é OMe.
[0211]Em uma forma de realização, o grupo G2 é:
Figure img0048
[0212]onde o asterisco indica o ponto de ligação a L3 e n e G4 são definidos acima.
[0213]Em uma forma de realização, o grupo G2 é:
Figure img0049
[0214]onde o asterisco indica o ponto de ligação a L3, n é 0 ou 1, m é 0 a 50 e G4 é selecionado a partir de OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR’, NH2, NHR, NRR’, NO2 e halo. Em uma forma de realização preferida, n é 1 e m é 0 a 10, 1 a 2, preferivelmente, 4 a 8, e, mais preferivelmente 4 ou 8. Em uma outra forma de realização, n é 1 e m é 10 a 50, preferivelmente, 20 a 40. Os grupos OH, SH, NH2 e NHR são protegidos. Em uma forma de realização, G4 é OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR’ e NRR’. Em uma forma de realização, G4 é OR, SR e NRR’. Pre-ferivelmente, G4 é selecionado a partir de OR e NRR’, mais preferivelmente, G4 é OR. Preferivelmente, G4 é OMe.
[0215]Em uma forma de realização, o grupo G2 é:
Figure img0050
[0216]onde o asterisco indica o ponto de ligação a L3 e n, m e G4 são definidos acima.
[0217]Em uma forma de realização, o grupo G2 é:
Figure img0051
[0218]onde n é 1 a 20, m é 0 a 6 e G4 é selecionado a partir de OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR’, NH2, NHR, NRR’, NO2 e halo. Em uma forma de realização, n é 1 a 10. Em uma outra forma de realização, n é 10 a 50, preferivelmente, 20 a 40. Em uma forma de realização, n é 1. Em uma forma de realização, m é 1. Os grupos OH, SH, NH2 e NHR são protegidos. Em uma forma de realização, G4 é OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR’ e NRR’. Em uma forma de realização, G4 é OR, SR e NRR’. Preferivelmente, G4 é selecionado a partir de OR e NRR’, mais preferivelmente, G4 é OR. Preferivelmente, G4 é OMe.
[0219]Em uma forma de realização, o grupo G2 é:
Figure img0052
[0220]onde o asterisco indica o ponto de ligação a L3 e n, m e G4 são definidos acima.
[0221]Em cada uma entre as formas de realização acima, G4 pode ser OH, SH, NH2 e NHR. Estes grupos são, preferivelmente, protegidos.
[0222]Em uma forma de realização, OH é protegido com Bzl, TBDMS ou TBDPS.
[0223]Em uma forma de realização, SH é protegido com Acm, Bzl, Bzl-OMe, Bzl-Me ou Trt.
[0224]Em uma forma de realização, NH2 ou NHR são protegidos com Boc, Moc, Z-Cl, Fmoc, Z ou Alloc.
[0225]Em uma forma de realização, o grupo G2 está presente em combinação com um grupo L3, o qual é um dipeptídeo.
[0226]O grupo de coroamento não é intencionado para conexão ao agente de ligação celular. Assim, o outro monômero presente no dímero serve como o ponto de conexão ao agente de ligação celular por intermédio de um ligante. Consequentemente, é preferido que a funcionalidade presente no grupo de coroamento não esteja disponível para a reação com um agente de ligação celular. Assim, grupos funcionais reativos, tais como OH, SH, NH2, COOH, são, preferivelmente, evitados. Entretanto, tal funcionalidade pode estar presente no grupo de coroamento, se protegido, conforme descrito acima.
[0227]Em algumas formas de realização da invenção, D é uma porção de fármaco da fórmula A
Figure img0053
e sais e solvatos da mesma, em que: a linha ondulada indica o sítio de ligação covalente ao ligante; as linhas pontilhadas indicam a presença opcional de uma ligação dupla entre C1 e C2 ou C2 e C3;
[0228]R22 é, independentemente, selecionado a partir de H, OH, =O, =CH2, CN, Rm, O Rm, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2- Rm, CO2 Rm e CO Rm e, opcionalmente, ainda selecionado a partir de halo ou di-halo, em que RD é, independentemente, selecionado a partir de Rm, CO2 Rm, CO Rm, CHO, CO2H e halo;
[0229]R66 e R99 são, independentemente, selecionados a partir de H, Rm, OH, O Rm, SH, S Rm, NH2, NH Rm, N Rm Rp, NO2, Me3Sn e halo;
[0230]R77 é, independentemente, selecionado a partir de H, Rm, OH, O Rm, SH, S Rm, NH2, NH Rm, N Rm Rp, NO2, Me3Sn e halo;
[0231]Q é, independentemente, selecionado a partir de O, S e NH;
[0232]R11 é H ou Rm ou, onde Q é O, SO3M, onde M é um cátion metálico;
[0233]Rm e Rp são, independentemente, selecionados a partir dos grupos alquila C1-C8 opcionalmente substituído, heterociclila C3-C8 e arila C5-C20 e, opcionalmente, em relação ao grupo N Rm Rp, Rm e Rp junto com o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados formam um anel heterocíclico de 4, 5, 6 ou 7 membros opcionalmente substituído;
[0234]R12, R16, R19 e R17 são definidos para R22, R66, R99 e R77, respectivamente;
[0235]R” é um grupo alquileno C3-C12, em que a cadeia pode ser interrompida por um ou mais heteroátomos, por exemplo, O, S, N(H), NMe e/ou anéis aromáticos, por exemplo, benzeno ou piridina, em os que anéis são opcionalmente substituídos;
[0236]X e X’ são, independentemente, selecionados a partir de O, S e N(H).
[0237]Esta invenção também se refere a qualquer um entre os conjugados de anticorpo-fármaco acima, em que p é 2.
[0238]Esta invenção também se refere a qualquer um entre os conjugados de anticorpo-fármaco acima, em que o anticorpo se liga a um ou mais entre os poli- peptídeos selecionados a partir do grupo que consiste de: BMPR1B; E16; STEAP1; 0772P; MPF; Napi3b; Sema 5b; PSCA hlg; ETBR; MSG783; STEAP2; TrpM4; CRIPTO; CD21; CD79b; FcRH2; HER2; NCA; MDP; IL20Rα; Brevican; EphB2R; ASLG659; PSCA; GEDA; BAFF-R; CD22; CD79a; CXCR5; HLA-DOB; P2X5; CD72; LY64; FcRH1; IRTA2; TENB2; PMEL17; TMEFF1; GDNF-Ra1; Ly6E; TMEM46; Ly6G6D; LGR5; RET; LY6K; GPR19; GPR54; ASPHD1; Tirosinase; TMEM118; GPR172A; MUC16 e CD33.
[0239]Esta invenção também se refere aos métodos para tratar uma doença em um ser humano em necessidade dos mesmos, compreendendo administrar ao dito humano uma quantidade eficaz de um conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 1.
[0240]Esta invenção também se refere às composições farmacêuticas compreendendo um composto, de acordo com a reivindicação 1, e um portador farma- ceuticamente aceitável do mesmo.
[0241]Esta invenção também se refere a qualquer um entre os conjugados de anticorpo-fármaco acima, em que o anticorpo se liga a um ou mais entre os poli- peptídeos selecionados a partir do grupo que consiste de: STEAP1; Napi3b; STEAP2; TrpM4; CRIPTO; CD21; CD79b; FcRH2; HER2; CD22; CD79a; CD72; LY64; Ly6E; MUC16; e CD33.
[0242]Esta invenção também se refere a qualquer um entre os conjugados de anticorpo-fármaco acima, em que o anticorpo se liga a CD33.
[0243]Esta invenção também se refere a qualquer um entre os conjugados de anticorpo-fármaco acima, em que o anticorpo se liga a CD33 e o anticorpo anti- CD33 compreendem uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 e uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16.
[0244]Esta invenção também se refere a qualquer um entre os conjugados de anticorpo-fármaco acima, em que o anticorpo se liga a CD33 e o anticorpo anti- CD33 compreende um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17 e um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18.
[0245]Em algumas formas de realização, o anticorpo do conjugado de anti- corpo-fármaco se liga a CD33. Em algumas formas de realização, o anticorpo do conjugado de anticorpo-fármaco compreende (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 19; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 20; e (f) HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoáci- dos selecionada a partir da SEQ ID NO: 21.
[0246]Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende um VH como em qualquer uma entre as formas de realização fornecidas acima e um VL como em qualquer uma entre as formas de realização fornecidas acima. Em uma forma de realização, o anticorpo compreende as sequências VL e VH na SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26, respectivamente, incluindo modificações pós-traducionais de tais sequências.
[0247]Esta invenção também se refere a qualquer um entre os conjugados de anticorpo-fármaco acima, em que o anticorpo se liga a NaPi3b.
[0248]Esta invenção também se refere a qualquer um entre os conjugados de anticorpo-fármaco acima, em que o anticorpo se liga a NaPi3b e o anticorpo NaPi3b compreendem uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.
[0249]Esta invenção também se refere a qualquer um entre os conjugados de anticorpo-fármaco acima, em que o anticorpo se liga a NaPi3b e o anticorpo NaPi3b compreende um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8.
[0250]Esta invenção também se refere a qualquer um entre os conjugados de anticorpo-fármaco acima, em que o anticorpo se liga a NaPi3b e o anticorpo NaPi3b compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
DEFINIÇÕES
[0251]A menos que estabelecido de outro modo, os seguintes termos e frases usados neste relatório são intencionados a apresentar os seguintes significados: quando nomes comerciais são usados neste relatório, os requerentes pretendem incluir, independentemente, a formulação de produto de nome comercial, o fármaco genérico e os ingredientes farmacêuticos ativos do produto de nome comercial.
[0252]O termo “peptidomimético” ou PM, conforme usado neste relatório, significa uma porção química sem peptídeo. Os peptídeos são cadeias curtas de monômeros de aminoácidos ligados por ligações peptídicas (amida), as ligações químicas covalentes formadas quando o grupo carboxila de um aminoácido reage com o grupo amino de um outro. Os peptídeos mais curtos são dipeptídeos consistindo de 2 aminoácidos ligados por uma ligação peptídica única, seguido por tripep- tídeos, tetrapeptídeos, etc. Uma porção química peptidomimética inclui porções químicas sem aminoácido. Uma porção química peptidomimética também pode incluir um ou mais aminoácidos que são separados por um ou mais unidades químicas sem aminoácido. Uma porção química peptidomimética não contém em qualquer porção de sua estrutura química dois ou mais aminoácidos adjacentes que são ligados por ligações peptídicas.
[0253]O termo “aminoácido”, conforme usado neste relatório, significa glici- na, alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, tirosina, cisteína, metionina, lisina, arginina, histidina, triptofano, ácido aspártico, ácido glutâ- mico, asparagina, glutamina ou citrulina.
[0254]O termo “anticorpo” neste relatório é usado no sentido mais amplo e, especificamente, cobre os anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, dímeros, multímeros, anticorpos multiespecifícos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpo, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada (Miller et al. (2003) Jour. of Immunology 170:4854 a 4861). Os anticorpos podem ser de murino, humanos, humanizados, quiméricos ou derivados de outra espécie. Um anticorpo é uma proteína gerada pelo sistema imune que é capaz de reconhecer e se ligar a um antígeno específico. (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5a Ed., Garland Publishing, Nova Iorque). Um antígeno alvo, em geral, apresenta diversos sítios de ligação, também chamados epítopos, reconhecidos por CDRs em múltiplos anticorpos. Cada anticorpo que se liga especificamente a um epítopo diferente apresenta uma estrutura diferente. Assim, um antígeno pode apresentar mais do que um anticorpo correspondente. Um anticorpo inclui um molécula de imunoglobulina de comprimento total ou uma porção imunologicamente ativa de uma molécula de imunoglobulina de comprimento total, isto é, uma molécula que contém um sítio de ligação ao antígeno que se liga imunoespecificamente a um antígeno de um alvo de interesse ou parte do mesmo, tais alvos incluindo, mas não limitados às células de câncer ou células que produzem anticorpos autoimunes associados com uma doença autoimune. A imunoglobulina divulgada neste relatório pode ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobu- lina. As imunoglobulinas podem ser derivadas de qualquer espécie. Em um aspecto, entretanto, a imunoglobulina é de origem humana, de murino ou de coelho.
[0255]O termo “fragmentos de anticorpo”, conforme usado neste relatório, compreende uma porção de um anticorpo de comprimento total, em geral, a ligação ao antígeno ou região variável dos mesmos. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; minicor- pos (Olafsen et al. (2004) Protein Eng. Design & Sel. 17(4):315 a 323), fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, anticorpos anti-idiotípicos (anti- Id), CDR (região determinante de complementaridade) e fragmentos de ligação ao epítopo de qualquer um entre aqueles acima que se ligam imunoespecificamente aos antígenos de células de câncer, antígenos virais ou antígenos microbianos, moléculas de anticorpo de cadeia única e anticorpos multiespecifícos formados a partir de fragmentos de anticorpo.
[0256]O termo “anticorpo monoclonal”, conforme usado neste relatório, se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos, exceto para mutações de ocorrência natural possíveis que podem estar presentes em menores quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigida contra um sítio antigênico único. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpo policlonal que incluem anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um determinante único no antígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos pelo fato de que podem ser sintetizados não contaminados por outros anticorpos. O modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo que será obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como exigência de produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais que serão usados, de acordo com a presente invenção, podem ser preparados pelo método de hibridoma descrito primeiro por Kohler et al. (1975) Nature, 256:495 ou podem ser preparados pelos métodos de DNA recombinante (veja, por exemplo: US 4816567; US 5807715). Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados das bibliotecas de anticorpo em fago usando as técnicas descritas em Clackson et al. (1991) Nature, 352:624 a 628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581 a 597; por exemplo.
[0257]Os anticorpos monoclonais neste relatório incluem, especificamente, anticorpos “quiméricos” em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante das cadeia é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma outra espécie ou pertencente a uma outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada (US 4816567; e Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 a 6855). Anticorpos quiméricos de interesse neste relatório incluem anticorpos “primatizados” compreendendo sequências de ligação ao antígeno de domínio variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, Macaco do Velho Mundo, Macaco, etc.) e sequências de região cons- tante humanas.
[0258]O termo “anticorpo intacto”, conforme usado neste relatório, é aquele que compreende domínios VL e VH, assim como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humanos) ou sequência de aminoácidos variante dos mesmos. O anticorpo intacto pode apresentar uma ou mais “funções efe- toras” que se referem àquelas atividades biológicas atribuíveis à região constante Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc variante de sequência de aminoá- cidos) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem ligação de C1q; citotoxicidade dependente do complemento; ligação ao receptor de Fc; cito- toxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC); fagocitose; e in- frarregulação de receptores de superfície celular, tais como receptor de células B e BCR.
[0259]O termo “região Fc”, conforme usado neste relatório, significa uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em uma forma de realização, uma região Fc de cadeia pesada de IgG humana se estende a partir de Cys226 ou a partir de Pro230, ao terminal carboxila da cadeia pesada. Entretanto, a lisina C-terminal (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que de outro modo especificado neste relatório, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração EU, também chamado o índice EU, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
[0260]O termo “estrutura” ou “FR”, conforme usado neste relatório, se refere aos resíduos de domínio variável, exceto resíduos da região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável, em geral, consiste de quatro domínios de FR: FR1, FR2, FR3, e FR4. Consequentemente, as sequências de HVR e FR, em geral, aparecem na seguinte sequência em VH (ou VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
[0261]Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos intactos podem ser determinados para “classes diferentes”. Existem cinco classes principais de anticorpos imunoglobulina intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e vários entre estes podem ser ainda divididos em “subclasses” (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classes diferentes de anticorpos são chamados α, δ, ε, Y e μ, respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de classes diferentes de imunoglobulinas são bem conhecidas. Formas de Ig incluem modificações na dobradiça ou formas sem dobradiça (Roux et al. (1998) J. Immunol. 161:4083 -a 4090; Lund et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267:7246 a 7256; US 2005/0048572; US 2004/0229310).
[0262]O termo “anticorpo humano”, conforme usado neste relatório, se refere a um anticorpo que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um ser humano ou uma célula humana ou derivado de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpo humano ou outras sequências que codificam anticorpo humano. Esta definição de um anticorpo humano, especificamente, exclui um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antígeno não humanos.
[0263]O termo “estrutura consenso humana”, conforme usado neste relatório, se refere a uma estrutura que representa os resíduos de aminoácidos de ocorrência mais comum em uma seleção de sequências de estrutura VL ou VH de imu- noglobulina humanas. Em geral, a seleção de sequências VL ou VH de imunoglobu- lina humanas ocorre a partir de um subgrupo de sequências de domínio variável. Em geral, o subgrupo de sequências é um subgrupo, tal como em Kabat et al., Sequen ces of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Publicação NIH 91 - 3242, Bethesda MD (1991), volumes 1 a 3. Em uma forma de realização, para a VL, o subgrupo é subgrupo capa I, tal como em Kabat et al., supra. Em uma forma de realização, para a VH, o subgrupo é subgrupo III, tal como em Kabat et al., supra.
[0264]O termo “anticorpo humanizado”, conforme usado neste relatório, se refere a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos de aminoácidos a partir de HVRs não humanas e resíduos de aminoácidos a partir de FRs humanas. Em certas formas de realização, um anticorpo humanizado compreenderá, substancialmente, pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis, em que todos ou, substancialmente, todas as HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem àqueles de um anticorpo não humano e todas ou, substancialmente, todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado opcionalmente pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, se refere a um anticorpo que sofreu humanização.
[0265]O termo “região hipervariável” ou “HVR”, conforme usado neste relatório, se refere às regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis na sequência e/ou formam alças estruturalmente definidas (“alças hipervariáveis”). Em geral, anticorpos de quatro cadeias nativos compreendem seis HVRs; três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3). HVRs, em geral, compreendem resíduos de aminoácidos a partir das alças hipervariáveis e/ou a partir das “regiões determinantes de complementaridade” (CDRs), as últimas sendo de variabilidade de sequência mais alta e/ou envolvidas no reconhecimento do antígeno. Alças hipervariáveis exemplares ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2), 91 a 96 (L3), 26 a 32 (H1), 53 a 55 (H2) e 96 a 101 (H3). (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 a 917 (1987).) CDRs exemplares (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24 a 34 de L1, 50 a 56 de L2, 89 a 97 de L3, 31 a 35B de H1, 50 a 65 de H2 e 95 a 102 de H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) Com a exceção de CDR1 em VH, CDRs, em geral, compreendem os resíduos de aminoácidos que formam as alças hipervariáveis. As CDRs também compreendem “resíduos determinantes de especificidade” ou “SDRs”, que são resíduos que contatam o antígeno. SDRs estão contidos dentro das regiões das CDRs chamadas CDRs abreviadas ou a-CDRs. As a- CDRs exemplares (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 e a- CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 31 a 34 de L1, 50 a 55 de L2, 89 a 96 de L3, 31 a 35B de H1, 50 a 58 de H2 e 95 a 102 de H3. (Veja Almagro e Frans- son, Front. Biosci. 13:1619 a 1633 (2008).) A menos que de outro modo indicado, resíduos de HVR e outros resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos de FR) são numerados neste relatório, de acordo com Kabat et al., supra.
[0266]O termo “região variável” ou “domínio variável”, conforme usado neste relatório, se refere ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvida na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo, em geral, apresentam estruturas similares, com cada domínio compreendendo quatro regiões de estrutura conservadas (FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs). (Veja, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman e Co., página 91 (2007).) Um domínio VH ou VL único pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, anticorpos que se ligam a um antígeno particular podem ser isolados usando um domínio VH ou VL a partir de um anticorpo que se liga ao antígeno para triar uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Veja, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880 a 887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624 a 628 (1991).
[0267]O termo “vetor”, conforme usado neste relatório, se refere a uma mo lécula de ácido nucleico capaz de propagar um outro ácido nucleico ao qual ela é ligada. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante, assim como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira em que ele foi introduzido. Certos vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nuclei- cos aos quais eles são operativamente ligados. Tais vetores são referidos neste relatório como “vetores de expressão”.
[0268]O termo “aminoácido cisteína livre”, conforme usado neste relatório, se refere a um resíduo de aminoácido cisteína que foi construído em um anticorpo precursor, apresenta um grupo funcional em tiol (-SH) e não é pareado como uma ponte dissulfeto intramolecular ou intermolecular.
[0269]O termo “Ligante”, “Unidade Ligantea” ou “ligação”, conforme usado neste relatório, significa uma porção química compreendendo uma cadeia de átomos que liga covalentemente uma porção de fármaco a um anticorpo. Em várias formas de realização, um ligante é um radical divalente especificado como L.
[0270]O termo “porção de fármaco”, conforme usado neste relatório, significa uma substância que inibe ou previne uma função celular e/ou causa morte ou destruição celular. Agentes citotóxicos incluem, mas não são limitados a isótopos radioativos (por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu); agentes quimioterápicos ou fármacos (por exemplo, meto- trexato, adriamicina, alcaloides da vinca (vincristina, vinblastina, etoposídeo), doxor- rubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucil, daunorrubicina ou outros agentes intercalantes); agentes inibitórios de crescimento; enzimas e fragmentos das mesmas, tais como enzimas nucleolíticas; e os vários agentes antitumor ou anticâncer divulgados abaixo.
[0271]Conforme usado neste relatório, a menos que definido de outro modo em uma reivindicação, o termo “acila” se refere ao grupo -C(O)R’, onde R’ é alquila, cicloalquila C3-C6 ou heterociclila, conforme cada um é definido neste relatório.
[0272]Conforme usado neste relatório, a menos que definido de outro modo em uma reivindicação, o termo “alcóxi” se refere ao grupo -OR’, onde R’ é alquila C1C4 ou cicloalquila C3-C6, conforme definido acima. Exemplos de “alcóxi” incluem me- tóxi, etóxi, isopropóxi, propóxi, butóxi, t-butóxi, isobutóxi, ciclopropóxi e ciclobutóxi e formas halogenadas dos mesmos, por exemplo, fluorometóxi e difluorometóxi.
[0273]Conforme usado neste relatório, a menos que definido de outro modo em uma reivindicação, o termo “alquila” se refere a um radical hidrocarboneto de cadeia reta ou ramificada, monovalente ou divalente, que apresenta de um a doze (C1-C12) átomo de carbonos, que podem ser não substituídos ou substituídos com múltiplos graus de substituição, por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco ou seis incluídos na presente invenção. Exemplos de substituintes são selecionados a partir do grupo que consiste de halo, trifluorometila, difluorometila, amino, alquilamino, cia- no, sulfonila, sulfonamida, sulfóxido, hidróxi, alcóxi, éster, ácido carboxílico e alquil- tio. Exemplos de “alquila”, conforme usado neste relatório, incluem, mas não são limitados a metila (Me, -CH3), etila (Et, -CH2CH3), 1-propila (n-Pr, n-propila, - CH2CH2CH3), 2-propila (i-Pr, i-propila, -CH(CH3)2), 1-butila (n-Bu, n-butila, - CH2CH2CH2CH3), 2-metil-1-propila (i-Bu, i-butila, -CH2CH(CH3)2), 2-butila (s-Bu, s- butila, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2-propila (t-Bu, t-butila, -C(CH3)3), 1-pentil (n- pentila, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-pentila (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-pentila (- CH(CH2CH3)2), 2-metil-2-butila (-C(CH3)2CH2CH3), 3-metil-2-butila (- CH(CH3)CH(CH3)2), 3-metil-1-butila (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-metil-1-butila (- CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-hexila (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-hexila (- CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-hexila (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-metil-2- pentila (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metil-2-pentila (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4- metil-2-pentila (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentila (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2- metil-3-pentila (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-dimetil-2-butila (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetil-2-butila (-CH(CH3)C(CH3)3, assim como as versões divalentes (“alquile- no”) e substituídas dos mesmos. Exemplos de alquila substituído incluem, mas não são limitados a hidroximetila, difluorometila e trifluorometila.
[0274]Conforme usado neste relatório, a menos que de outro modo definido em uma reivindicação, o termo “alquenila” significa um radical hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada, monovalente ou divalente, de qualquer comprimento a partir de dois a oito átomos de carbono (C2-C10) com pelo menos um sítio de insatura- ção, isto é, uma ligação dupla carbono-carbono, sp2, em que o radical alquenila pode ser opcionalmente substituído, independentemente, por um ou mais substituintes descritos acima na definição de “alquila” e inclui radicais que apresentam orientações “cis” e “trans” ou, alternativamente, orientações “E” e “Z”. Exemplos de alqueni- la incluem, mas não são limitados a etenila ou vinila (-CH=CH2), prop-1-enila (- CH=CHCH3), prop-2-enila (-CH2CH=CH2), 2-metilprop-1-enila, but-1-enila, but-2- enila, but-3-enila, buta-1,3-dienila, 2-metilbuta-1,3-dieno, hex-1-enila, hex-2-enila, hex-3-enila, hex-4-enila, hexa-1,3-dienila, assim como as versões divalente (“alque- nileno”) e substituídas dos mesmos.
[0275]Conforme usado neste relatório, a menos que de outro modo definido em uma reivindicação, o termo “alquinila” se refere a um radical hidrocarboneto linear ou ramificado, monovalente ou divalente, de qualquer comprimento a partir de dois a oito átomos de carbono (C2-C10) com pelo menos um sítio de insaturação, isto é, uma ligação tripla carbono-carbono, sp, em que o radical alquinila pode ser opcionalmente substituído, independentemente, por um ou mais substituintes descritos acima na definição de alquila, exemplos de alquinila incluem, mas não limitados a etinila (-C CH), prop-1-inila (-C CCH3), prop-2-inila (propargila, -CH2C CH), but-1- inila, but-2-inila e but-3-inila, assim como as versões divalentes (“alquinileno”) e substituídas dos mesmos.
[0276]Conforme usado neste relatório, a menos que definido de outro modo em uma reivindicação, o termo “alquilamino” se refere ao grupo -NR’R”, em que R’ é H, alquila C1-C6 ou cicloalquila C3-C6 e R” é alquila C1-C6 ou cicloalquila C3-C6, exemplos de alquilamino incluem, mas não são limitados a metilamino, dimetilamino, eti- lamino, dietilamino, propilamino e ciclopropilamino.
[0277]Conforme usado neste relatório, a menos que definido de outro modo em uma reivindicação, o termo “amida” se refere ao grupo -C(O)NR’R”, em que R’ e R” são, independentemente, H, alquila C1-C6 ou cicloalquila C3-C6; exemplos de ami- da incluem, mas não são limitados a -C(O)NH2, -C(O)NHCH3 e -C(O)N(CH3)2.
[0278]Conforme usado neste relatório, a menos que definido de outro modo em uma reivindicação, o termo “arila” se refere a um sistema de anel de hidrocarbo- neto aromático. O sistema de anel pode ser monocíclico ou policíclico fundido (por exemplo, bicíclico, tricíclico, etc.), substituído ou não substituído. Em várias formas de realização, o anel arila monocíclico é C5-C10, C5-C7 ou C5-C6, onde estes números de carbono se referem ao número de átomos de carbono que formam o sistema de anel. Um sistema de anel C6, isto é, um anel fenila, é um grupo arila. Em várias formas de realização, o anel policíclico é um grupo arila bicíclico, onde exemplos de grupos arila bicíclicos incluem C8-C12 ou C9-C10. Um anel naftila, que apresenta 10 átomos de carbono, é um grupo arila policíclico. Exemplos de substituintes para arila são descritos abaixo na definição de “opcionalmente substituído”.
[0279]Conforme usado neste relatório, a menos que definido de outro modo em uma reivindicação, o termo “ciano” se refere ao grupo -CN.
[0280]Conforme usado neste relatório, a menos que definido de outro modo em uma reivindicação, “cicloalquila” se refere a um grupo de anel hidrocarboneto não aromático, substituído ou não substituído, saturado ou parcialmente insaturado. Exemplos de substituintes são descritos na definição de “opcionalmente substituído”. Em um exemplo, o grupo cicloalquila é 3 a 12 átomos de carbono (C3-C12). Em outro exemplos, cicloalquila é C3-C8, C3-C10 ou C5-C10. Em outros exemplos, o grupo ciclo- alquila, como um monociclo, é C3-C8, C3-C6 ou C5-C6. Em um outro exemplo, o grupo cicloalquila, como um biciclo, é C7-C12. Em um outro exemplo, o grupo cicloalquila, como um sistema espiro, é C5-C12. Exemplos de cicloalquila monocíclico incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, 1-ciclopent-1-enila, 1-ciclopent-2-enila, 1- ciclopent-3-enila, ciclo-hexila, perdeuteriociclo-hexila, 1-ciclo-hex-1-enila, 1-ciclo-hex- 2-enila, 1-ciclo-hex-3-enila, ciclo-hexadienila, ciclo-heptila, ciclo-octila, ciclononila, ciclodecila, cicloundecila e ciclododecila. Arranjos exemplares de cicloalquilas bicícli- cos que apresentam 7 a 12 átomos no anel incluem, mas não são limitados aos sistemas de anel [4,4], [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6]. Cicloalquilas bicíclicos ligados em ponte exemplares incluem, mas não são limitados a biciclo[2,2,1]heptano, bici- clo[2,2,2]octano e biciclo[3,2,2]nonano. Exemplos de espiro cicloalquila incluem, es- piro[2,2]pentano, espiro[2,3]hexano, espiro[2,4]heptano, espiro[2,5]octano e espi- ro[4,5]decano.
[0281]Conforme usado neste relatório, a menos que definido de outro modo em uma reivindicação, o termo “éster” se refere ao grupo -C(O)OR’, onde R’ é alquila C1-C6 ou cicloalquila C3-C6.
[0282]Conforme usado neste relatório, a menos que definido de outro modo em uma reivindicação, o termo “heterociclo” “heterocicloalquila” ou “heterociclila” se refere ao sistema de anel não substituído e substituído mono- ou policíclico não aromático contendo 2 a 12 átomos de carbono no anel e 1 a 3 heteroátomos no anel. Sistemas de anel policíclicos podem ser bi- ou tricíclico fundidos, espiro ou ligados em ponte. Exemplos de heteroátomos incluem N, O e S, incluindo N-óxidos, óxidos de enxofre e dióxidos. Em uma forma de realização, o anel é de três a oito membros e é completamente saturado ou apresenta um ou mais graus de insatura- ção. Múltiplos graus de substituição estão incluídos na presente definição. Exemplos de substituintes são definidos abaixo. Exemplos de grupos “heterocíclicos” incluem, mas não são limitados a tetra-hidrofuranila, piranila, 1,4-dioxanila, 1,3-dioxanila, oxo- lanila, oxetanila, 2-oxa-6-azaespiro[3,3]heptan-6-ila, piperidinila, pirrolidinila, morfoli- nila, azetidinila, piperazinila, pirrolidinonila, piperazinonila, pirazolidinila, imidazolinila, imidazolidinila e seus vários tautômeros.
[0283]Conforme usado neste relatório, a menos que definido de outro modo em uma reivindicação, o termo “heteroarila”, a menos que definido de outro modo em uma reivindicação, se refere a um sistema de anel aromático contendo 1 a 9 carbonos e pelo menos um heteroátomo. Exemplos de heteroátomos incluem N, O e S. Heteroarila pode ser monocíclico ou policíclico, substituído ou não substituído. Um grupo heteroarila monocíclico pode apresentar 2 a 6 átomos de carbono no anel e 1 a 3 heteroátomos no anel, enquanto um heteroarila policíclico pode conter 3 a 9 átomos de carbono no anel e 1 a 5 heteroátomos no anel. Um anel heteroarila poli- cíclico pode conter junções de anel fundido, espiro ou ligado em ponte, por exemplo, heteroarila bicíclico é um heteroarila policíclico. Anéis heteroarila bicíclicos podem conter átomos de 8 a 12 membros. Anéis heteroarila monocíclicos podem conter átomos de 5 a 8 membros (carbonos e heteroátomos). Grupos heteroarila exemplares incluem, mas não são limitados a benzofuranila, benzotiofenila, furanila, imi- dazolila, indolila, azaindolila, azabenzimidazolila, benzoxazolila, benztiazolila, benzo- tiadiazolila, benzotriazolila, benzoimidazolila, tetrazinila, tetrazolila, isotiazolila, oxa- zolila, isoxazolila, pirazinila, pirazolila, piridazinila, piridinila, pirimidinila, pirrolila, qui- nolinila, quinazolinila, quinoxalinila, triazinila, triazolila, tiazolila e tiofenila. Exemplos de substituintes para heteroarila são descritos abaixo na definição de “opcionalmente substituído”.
[0284]Conforme usado neste relatório, a menos que definido de outro modo em uma reivindicação, o termo “heteroarilalquila” significa o grupo (heteroaril)alquila C1-C3.
[0285]Conforme usado neste relatório, a menos que definido de outro modo em uma reivindicação, o termo “arilalquila” significa o grupo (aril)alquila C1-C3.
[0286]Conforme usado neste relatório, a menos que definido de outro modo em uma reivindicação, o termo “ureia” se refere ao grupo -NR’C(O)NR”, em que R’ e R” são, independentemente, H, alquila C1-C6 ou cicloalquila C3-C6.
[0287]Conforme usado neste relatório, a menos que definido de outro modo em uma reivindicação, o termo “opcionalmente” significa que os eventos subsequentemente descritos podem ou não ocorrer e inclui os eventos que ocorrem e os eventos que não ocorrem.
[0288]Conforme usado neste relatório, a menos que definido de outro modo, a frase “opcionalmente substituído”, “substituído” ou variações dos mesmos denota uma substituição opcional, incluindo múltiplos graus de substituição, com um ou mais grupos substituintes, por exemplo, um, dois ou três. A frase não deve ser interpretada como duplicativa das substituições neste relatório descrito e representado. Os grupos substituintes opcionais exemplares incluem acila, alquila C1-C6, sulfonila, amino, sulfonamida, sulfóxido, alcóxi, ciano, halo, ureia, éster, ácido carboxílico, amida, hidróxi, oxo e nitro. Halo: F, Cl, Br e I. Hidróxi: OH.
[0289]Alcóxi: OR, em que R é um grupo alquila, por exemplo, um grupo alquila C1-C8. Exemplos de grupos alcóxi C1-C8 incluem, mas não são limitados a, - OMe (metóxi), -OEt (etóxi), -O(nPr) (n-propóxi), -O(iPr) (isopropóxi), -O(nBu) (n- butóxi), -O(sBu) (sec-butóxi), -O(iBu) (isobutóxi) e -O(tBu) (terc-butóxi). Oxo (ceto, -ona): =O.
[0290]Acila (ceto): -C(=O)R, em que R é um substituinte acila, por exemplo, um grupo alquila C1-C8 (também referido como alquilacila C1-C8 ou alcanoila C1-C8), um grupo alquenila C2-8 (também referido como alquenilacila C2-8), um grupo alquini- la C2-8 (também referido como alquinilacila C2-8), um grupo cicloalquila C3-8 (também referido como cicloalquilacila C3-8), um grupo heterociclila C3-20 (também referido como heterociclilacila C3-20), um grupo arila C5-20 (também referido como arilacila C5- 20) ou um grupo heteroarila C5-20 (também referido como heteroarilacila C5-20), preferivelmente, um grupo alquila C1-C8. Exemplos de grupos acila incluem, mas não são limitados a -C(=O)CH3 (acetila), -C(=O)CH2CH3 (propionila), -C(=O)C(CH3)3 (t- butirila) e -C(=O)Ph (benzoila, fenona).
[0291]Carbóxi (ácido carboxílico): -C(=O)OH.
[0292]Éster (carboxilato, éster do ácido carboxílico, oxicarbonila): -C(=O)OR, em que R é um substituinte éster, por exemplo, um grupo alquila C1-C8, alquenila C2C8, alquinila C2-C8, cicloalquila C3-C8, heterociclila C3-C8 , arila C5-C20 ou heteroarila C5-20, preferivelmente, um grupo alquila C1-C8. Exemplos de grupos éster incluem, mas não são limitados a -C(=O)OCH3, -C(=O)OCH2CH3, -C(=O)OC(CH3)3 e - C(=O)OPh.
[0293]Amino: -NR1R2, em que R1 e R2 são, independentemente, substituin- tes amino, por exemplo, hidrogênio, um grupo alquila C1-C8, alquenila C2-C8, alquinila C2-C8, cicloalquila C3-C8, heterociclila C3-C8, arila C5-C20 ou heteroarila C5-20, preferivelmente, H, ou um grupo alquila C1-C8, ou, no caso de um grupo amino “cíclico”, R1 e R2, tomados juntos com o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados, formam um anel heterocíclico que apresenta de 4 a 8 átomos no anel. Os grupos amino podem ser primários (-NH2), secundários (-NHR1) ou terciários (-NHR1R2) e, na forma catiônica, podem ser quaternários (-+NR1R2R3). Exemplos de grupos amino incluem, mas não são limitados a -NH2, -NHCH3, -NHC(CH3)2, -N(CH3)2, -N(CH2CH3)2 e - NHPh. Exemplos de grupos amino cíclicos incluem, mas não são limitados a aziridi- no, azetidino, pirrolidino, piperidino, piperazino, morfolino e tiomorfolino.
[0294]Amido (carbamoila, carbamila, aminocarbonila, carboxamida): - C(=O)NR1R2, em que R1 e R2 são, independentemente, substituintes amino, conforme definido para os grupos amino. Exemplos de grupos amido incluem, mas não são limitados a -C(=O)NH2, -C(=O)NHCH3, -C(=O)N(CH3)2, -C(=O)NHCH2CH3 e - C(=O)N(CH2CH3)2, assim como grupos amido em que R1 e R2, junto com o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados, formam uma estrutura heterocíclica como, por exemplo, em piperidinocarbonila, morfolinocarbonila, tiomorfolinocarbonila e pipera- zinocarbonila.
[0295]Nitro: -NO2.
[0296]Ciano (nitrila, carbonitrila): -CN.
[0297]Sulfina (sulfinila, sulfóxido): -S(=O)R, em que R é um substituinte sulfina, por exemplo, um grupo alquila C1-C8, alquenila C2-C8, alquinila C2-C8, cicloalqui- la C3-C8, C3-C8 heterociclila, arila C5-C20 ou heteroarila C5-20, preferivelmente, um grupo alquila C1-C8. Exemplos de grupos sulfina incluem, mas não são limitados a - S(=O)CH3 e -S(=O)CH2CH3.
[0298]Sulfona (sulfonila): -S(=O)2R, em que R é um substituinte sulfona, por exemplo, um grupo alquila C1-C8, alquenila C2-C8, alquinila C2-C8, cicloalquila C3-C8, heterociclila C3-C8 , arila C5-C20 ou heteroarila C5-20, preferivelmente, um grupo alquila C1-C8, incluindo, por exemplo, um grupo alquila C1-C8 fluorado ou perfluorado. Exemplos de grupos sulfona incluem, mas não são limitados a -S(=O)2CH3 (meta- nossulfonila, mesila), -S(=O)2CF3 (triflila), -S(=O)2CH2CH3 (esila), -S(=O)2C4F9 (nona- flila), -S(=O)2CH2CF3 (tresila), -S(=O)2CH2CH2NH2 (taurila), -S(=O)2Ph (fenilsulfonila, besila), 4-metilfenilsulfonila (tosila), 4-clorofenilsulfonila (closila), 4- bromofenilsulfonila (brosila), 4-nitrofenila (nosila), 2-naftalenossulfonato (napsila) e 5- dimetilamino-naftalen-1-ilsulfonato (dansila).
[0299]Conforme usado neste relatório, a menos que definido de outro modo em uma reivindicação, o termo “tratamento” se refere ao alívio da condição especificada, eliminação ou redução de um ou mais sintomas da condição, redução ou eliminação da progressão da condição.
[0300]Conforme usado neste relatório, a menos que definido de outro modo em uma reivindicação, o termo “quantidade eficaz” significa a quantidade de um fár- maco ou agente farmacêutico que induzirá a resposta biológica ou médica de um tecido, sistema, animal ou ser humano que será procurada, por exemplo, por um pesquisador ou médico.
[0301]Conforme usado neste relatório, a menos que definido de outro modo em uma reivindicação, o termo “quantidade terapeuticamente eficaz” significa qualquer quantidade que, em comparação a um sujeito correspondente que não recebeu tal quantidade, os resultados no tratamento de uma doença, transtorno ou efeito colateral, ou uma diminuição na taxa de avanço de uma doença ou transtorno. O termo também inclui, dentro de seu escopo, quantidades eficazes para acentuar a função fisiológico normal. Para o uso na terapia, as quantidades terapeuticamente eficazes de um composto da fórmula I, assim como sais do mesmo, podem ser administradas como o produto químico bruto. Adicionalmente, o ingrediente ativo pode ser apresentado como uma composição farmacêutica.
[0302]Esta invenção também se refere a qualquer um entre os exemplos na seção Experimental.
[0303]A frase “sal farmaceuticamente aceitável” usada neste relatório se refere aos sais orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis de um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) ou uma porção de ligante-fármaco. Sais exemplares incluem, mas não são limitados a sais de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, brometo, iodeto, nitrato, bissulfato, fosfato, fosfato de ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato de ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gliconato, glicuronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato, p- toluenossulfonato e pamoato (isto é, 1,1’-metileno-bis -(2-hidróxi-3-naftoato)). Um sal farmaceuticamente aceitável pode envolver a inclusão de uma outra molécula, tal como um íon acetato, um íon succinato ou outro contra-íon. O contra-íon pode ser qualquer porção orgânica ou inorgânica que estabiliza a carga sobre o composto precursor. Além disso, um sal farmaceuticamente aceitável pode apresentar mais do que um átomo carregado em sua estrutura. Exemplos onde múltiplos átomos carregados são parte do sal farmaceuticamente aceitável podem apresentar múltiplos contra-íons. Consequentemente, um sal farmaceuticamente aceitável pode apresentar um ou mais átomos carregados e/ou um ou mais contra-íons.
[0304]Outros sais, que não são farmaceuticamente aceitáveis, podem ser úteis na preparação de compostos desta invenção e estes devem ser considerados para formar um outro aspecto da invenção. Estes sais, tais como oxálico ou trifluoro- acetato, embora não por si só farmaceuticamente aceitáveis, podem ser úteis na preparação de sais úteis como intermediários na obtenção dos compostos da invenção e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
[0305]Os compostos da presente invenção podem existir na forma sólida ou líquida. No estado sólido, eles podem existir na forma cristalina ou não cristalina ou como uma mistura das mesmas. O técnico habilitado avaliará que solvatos farma- ceuticamente aceitáveis podem ser formados para compostos cristalinos ou não cristalinos. Em solvatos cristalinos, moléculas de solvente são incorporadas na rede cristalina durante a cristalização. Os solvatos podem envolver solventes não aquosos, tais como, mas não limitados a etanol, isopropanol, DMSO, ácido acético, eta- nolamina ou acetato de etila ou podem envolver água como o solvente que é incorporado na rede cristalina. Os solvatos em que água é o solvente incorporado na rede cristalina são, tipicamente, referidos como “hidratos”. Os hidratos incluem hidratos estequiométricos, assim como composições contendo quantidades variáveis de água. A invenção inclui todos os tais solvatos.
[0306]O técnico habilitado ainda avaliará que certos compostos da invenção que existem na forma cristalina, incluindo os vários solvatos dos mesmos, podem exibir polimorfismo (isto é, a capacidade de ocorrer em estruturas cristalinas diferentes). Estas formas cristalinas diferentes são, tipicamente, conhecidas como “polimorfos”. A invenção inclui todos os tais polimorfos. Os polimorfos apresentam a mesma composição química, mas diferem no empacotamento, arranjo geométrico e outras propriedades descritivas do estado sólido cristalino. Os polimorfos, portanto, podem apresentar propriedades físicas diferentes, tais como propriedades de forma, densidade, dureza, deformabilidade, estabilidade e dissolução. Os polimorfos, tipicamente, exibem pontos de fusão, espectros IR e padrões de difração de pó de raios X diferentes que podem ser usados para identificação. O técnico habilitado avaliará que polimorfos diferentes podem ser produzidos, por exemplo, através de modificação ou ajuste das condições de reação ou reagentes, usadas na preparação do composto. Por exemplo, mudanças na temperatura, pressão ou solvente podem resultar em polimorfos. Além disso, um polimorfo pode se converter espontaneamente em um outro polimorfo sob certas condições.
[0307]Os compostos da presente invenção ou um sal dos mesmos podem existir nas formas estereoisoméricas (por exemplo, contêm um ou mais átomos de carbono assimétricos). Os estereoisômeros individuais (enantiômeros e diastereô- meros) e misturas destes estão incluídos no escopo da presente invenção. Do mesmo modo, é entendido que um composto ou sal da fórmula (I) pode existir nas formas tautoméricas, exceto aquele mostrado na fórmula e estas também estão incluídas no escopo da presente invenção. Deve ser entendido que a presente invenção inclui todas as combinações e subconjuntos dos grupos particulares definidos neste relatório acima. O escopo da presente invenção inclui misturas de estereoisômeros, assim como enantiômeros purificados ou misturas enantiomericamen- te/diastereomericamente enriquecidos. Deve ser entendido que a presente invenção inclui todas as combinações e subconjuntos dos grupos particulares definidos neste relatório acima.
[0308]A invenção objeto também inclui formas isotopicamente marcadas dos compostos da presente invenção, mas pelo fato de que um ou mais átomos são substituídos por um átomo que apresenta uma massa atômica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa usualmente encontrado na natureza. Exemplos de isótopos que podem ser incorporados nos compostos da invenção e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos incluem isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, fósforo, enxofre, flúor, iodo e cloro, tais como 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F, 36Cl, 123I e 125I.
[0309]Os compostos da presente invenção e sais farmaceuticamente aceitáveis dos ditos compostos que contêm os isótopos anteriormente mencionados e/ou outros isótopos de outros átomos estão no escopo da presente invenção. Os compostos isotopicamente marcados da presente invenção, por exemplo, aqueles em que os isótopos radioativos, tais como 3H, 14C são incorporados, são úteis em ensaios de distribuição de fármaco e/ou tecido de substrato. Isótopos tritiados, isto é, 3H, e carbono-14, isto é, 14C, são comumente usados devido a sua facilidade de preparação e detectabilidade. Os isótopos 11C e 18F são úteis em PET (tomografia de emissão positrônica) e os isótopos 125I são úteis em SPECT (tomografia computadorizada por emissão de fóton único), úteis no imageamento cerebral. Além disso, a substituição com isótopos mais pesados, tais como deutério, isto é, 2H, pode fornecer certas vantagens terapêuticas resultantes de maior estabilidade metabólica, por exemplo, meia-vida in vivo aumentada ou exigências de dosagem reduzidas e, consequentemente, pode ser preferida em algumas circunstâncias. Os compostos isotopicamente marcados da fórmula I e seguintes desta invenção podem, em geral, ser preparados através da realização dos procedimentos divulgados nos esquemas e/ou nos Exemplos abaixo, através da substituição de um reagente isotopicamente marcado e facilmente disponível por um reagente não isotopicamente marcado.
COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE ADCS
[0310]As formulações farmacêuticas de conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) terapêuticos da invenção são, tipicamente, preparadas para administração parenteral, isto é, injeção em bolo, intravenosa, intratumor com um veículo parente- ral farmaceuticamente aceitável e em uma forma injetável de dosagem unitária. Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) que apresenta o grau desejado de pureza é opcionalmente misturado com diluentes, portadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis (Remington’s Pharmaceutical Sciences (1980) 16a edição, Osol, A. Ed.), na forma de uma formulação liofilizada ou uma solução aquosa.
ANTICORPOS CONSTRUÍDOS COM CISTEÍNA
[0311]Os compostos da invenção incluem conjugados de anticorpo-fármaco compreendendo anticorpos construídos com cisteína onde um ou mais aminoácidos de um anticorpo do tipo selvagem ou precursor são substituídos com um aminoácido cisteína. Qualquer forma de anticorpo pode ser construída, isto é, modificada. Por exemplo, um fragmento de anticorpo Fab precursor pode ser construído para formar um Fab construído com cisteína, referido neste relatório como “ThioFab”. Similarmente, um anticorpo monoclonal precursor pode ser construído para formar um “Thi- oMab”. Deve ser observado que uma mutação de sítio única fornece um resíduo de cisteína construído único em um ThioFab, enquanto uma mutação de sítio única fornece dois resíduos de cisteína construídos em um ThioMab, devido à natureza dimé- rica do anticorpo IgG. Os mutantes com resíduos de cisteína (Cys) substituídos (“construídos”) são avaliados quanto à reatividade dos grupos cisteína tiol construídos e recém introduzidos. O valor da reatividade de tiol é um termo numérico relativo na faixa de 0 a 1,0 e pode ser medido para qualquer anticorpo construído com ciste- ína. Os valores da reatividade de tiol de anticorpos construídos com cisteína da in-venção estão nas faixas de 0,6 a 1,0; 0,7 a 1,0; ou 0,8 a 1,0.
[0312]Para preparar um anticorpo construído com cisteína por meio de mu- tagênese, o DNA que codifica uma sequência de aminoácidos variante do polipeptí- deo de partida é preparado por meio de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não são limitados à preparação por mutagêne- se sítio-dirigida (ou mediada por oligonucleotídeo), mutagênese por PCR e mutagê- nese de cassete de um DNA recém preparado que codifica o polipeptídeo. Variantes de anticorpos recombinantes também podem ser construídas por meio de manipulação de fragmento de restrição ou por meio de sobreposição da extensão da PCR com oligonucleotídeos sintéticos. Primers mutagênicos codificam as substituições do códon cisteína. Técnicas de mutagênese padrão podem ser utilizadas para gerar DNA que codifica tais anticorpos construídos com cisteína mutantes. Orientação geral pode ser encontrada em Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; e Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley-Interscience, Nova Iorque, N.Y., 1993.
[0313]Os aminoácidos cisteína podem ser construídos em sítios reativos em um anticorpo e que não forma ligações dissulfeto intracadeia ou intermolecular (Ju- nutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925 a 932; Dornan et al. (2009) Blood 114(13):2721 - 2729; US 7521541; US 7723485; WO 2009/052249, Shen et al. (2012) Nature Biotech., 30(2):184 a 191; Junutula et al. (2008) Jour of Immun. Methods 332:41 a 52). Os cisteína tióis construídos podem reagir com reagentes ligan- tes ou com os intermediários de ligante-fármaco da presente invenção que apresentam grupos eletrofílicos tiol-reativos, tais como maleimida ou alfa-halo amidas para formar ADC com anticorpos construídos com cisteína (ThioMabs) e com a porção de fármaco (D). A localização da porção de fármaco, assim, pode ser projetada, controlada e conhecida. O carregamento de fármaco pode ser controlado, visto que os grupos cisteína tiol construídos, tipicamente, reagem com reagentes ligantes tiol- reativos ou intermediários de ligante-fármaco em alto rendimento. A construção de um anticorpo para introduzir um aminoácido cisteína por meio de substituição em um sítio único na cadeia pesada ou leve fornece duas novas cisteínas no anticorpo simétrico. Um carregamento de fármaco próximo de 2 pode ser obtido e próxima ho- mogeneidade do produto de conjugação ADC.
[0314]Os anticorpos construídos com cisteína da invenção, preferivelmente, conservam a capacidade de ligação ao antígeno de suas contrapartes de anticorpo precursor do tipo selvagem. Assim, os anticorpos construídos com cisteína são capazes de se ligar, preferivelmente, especificamente, aos antígenos. Tais antígenos incluem, por exemplo, antígenos associados ao tumor (TAA), proteínas receptoras de superfície celular e outras moléculas de superfície celular, proteínas transmem- brana, proteínas de sinalização, fatores regulatórios de sobrevivência celular, fatores regulatórios de proliferação celular, moléculas associadas com (por exemplo, para conhecidas ou suspeitas para contribuir funcionalmente a) desenvolvimento ou diferenciação de tecido, linfocinas, citocinas, moléculas envolvidas na regulação do ciclo celular, moléculas envolvidas na vasculogênese e moléculas associadas com (por exemplo, para conhecidas ou suspeitas para contribuir funcionalmente a) angiogê- nese. O antígeno associado ao tumor pode ser um fator de diferenciação de cacho de moléculas (isto é, uma proteína CD). Um antígeno ao qual um anticorpo construído com cisteína é capaz de se ligar pode ser um membro de um subconjunto de uma das categorias mencionadas acima, em que os outros subconjuntos da dita categoria compreendem outras moléculas/antígenos que apresentam uma característica distinta (com respeito ao antígeno de interesse). Os anticorpos construídos com cis- teína são preparados para a conjugação com intermediários de ligante-fármaco por meio da redução e reoxidação de grupos dissulfeto intracadeia.
ANTÍGENOS ASSOCIADOS AO TUMOR
[0315]Os anticorpos, incluindo, mas não limitados aos anticorpos construídos com cisteína, que podem ser úteis nos conjugados de anticorpo-fármaco da invenção no tratamento de câncer incluem, mas não são limitados aos anticorpos contra receptores de superfície celular e antígenos associados ao tumor (TAA). Certos antígenos associados ao tumor são conhecidos na técnica e podem ser preparados para o uso na geração de anticorpos usando métodos e informação que são bem conhecidos na técnica. Nas tentativas de descobrir alvos celulares eficazes para diagnóstico e terapia de câncer, os pesquisadores procuraram identificar polipeptídeos transmembrana ou, de outro modo, associados ao tumor que são especificamente expressados sobre a superfície de um ou mais tipos particulares de células de câncer em comparação àqueles sobre uma ou mais células não cancerosas normais. Frequentemente, tais polipeptídeos associados ao tumor são mais abundantemente expressados sobre a superfície das células de câncer em comparação àqueles sobre a superfície das células não cancerosas. A identificação de tais polipeptídeos de antígeno de superfície celular associados ao tumor deram origem à capacidade de alvejar mais especificamente células de câncer para destruição por intermédio de terapias com base em anticorpo.
[0316]Exemplos de antígenos associados ao tumor TAA incluem, mas não são limitados àqueles listados abaixo. Por conveniência, a informação que se refere a estes antígenos, todos os quais são conhecidos na técnica, é listada abaixo e inclui nomes, nomes alternativos, números de acesso Genbank e referências primárias, seguindo as convenções de identificação de sequência de ácidos nucleicos e proteínas do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Sequências de ácidos nucleicos e proteínas correspondentes aos TAA listados abaixo estão disponíveis nos bancos de dados públicos, tais como GenBank. Os antígenos associados ao tumor alvejados por anticorpos incluem todas as sequências de aminoácidos variantes e isoformas que possuem pelo menos cerca de 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, ou 95 % de identidade de sequência em relação às sequências identificadas nas referências citadas e/ou que exibem substancialmente as mesmas propriedades ou características biológicas de um TAA que apresenta uma sequência encontrada na referências citadas. Por exemplo, um TAA que apresenta um sequência variante, em geral, é capaz de se ligar especificamente a um anticorpo que se liga a especifica- mente ao TAA com a sequência correspondente listada. As sequências e divulgação na referência especificamente citada neste relatório são expressamente incorporadas como referência. (1)BMPR1B (receptor de proteína morfogenética óssea-tipo IB, acesso Genbank no NM_001203)
[0317]ten Dijke,P., et al. Science 264 (5155):101 a 104 (1994), Oncogene 14 (11):1377 - 1382 (1997)); WO 2004063362 (Reivindicação 2); WO 2003042661 (Rei-vindicação 12); US 2003134790-A1 (Página 38 a 39); WO 2002102235 (Reivindicação 13; Página 296); WO 2003055443 (Página 91 a 92); WO 200299122 (Exemplo 2; Página 528 a 530); WO 2003029421 (Reivindicação 6); WO 2003024392 (Reivindicação 2; Fig 112); WO 200298358 (Reivindicação 1; Página 183); WO 200254940 (Página 100 a 101); WO 200259377 (Página 349 a 350); WO 200230268 (Reivindicação 27; Página 376); WO 200148204 (Exemplo; Fig 4)
[0318]NP_001194 receptor de proteína morfogenética óssea, tipo IB/pid=NP_001194,1 - Referências cruzadas: MIM:603248; NP_001194.1; AY065994
[0319](2) E16 (LAT1, SLC7A5, acesso Genbank no NM_003486)
[0320]Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283 a 288 (1999), Nature 395 (6699):288 a 291 (1998), Gaugitsch, H.W., et al. (1992) J. Biol. Chem. 267 (16):11267 a 11273); WO 2004048938 (Exemplo 2); WO 2004032842 (Exemplo IV); WO 2003042661 (Reivindicação 12); WO 2003016475 (Reivindicação 1); WO 200278524 (Exemplo 2); WO 200299074 (Reivindicação 19; Página 127 a 129); WO 200286443 (Reivindicação 27; Páginas 222, 393); WO 2003003906 (Reivindicação 10; Página 293); WO 200264798 (Reivindicação 33; Página 93 a 95); WO 200014228 (Reivindicação 5; Página 133 a 136); US 2003224454 (Fig 3); WO 2003025138 (Reivindicação 12; Página 150);
[0321]NP_003477 família do portador de soluto 7 (transportador de aminoá- cido catiônico, sistema y+), membro 5/pid=NP_003477,3 - Homo sapiens
[0322]Referências cruzadas: MIM:600182; NP_003477.3; NM_015923; NM_003486_1
[0323](3) STEAP1 (antígeno epitelial seis transmembrana da próstata, acesso Genbank no NM_012449)
[0324]Câncer Res. 61 (15), 5857 - 5860 (2001), Hubert, R.S., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (25):14523 a 14528); WO 2004065577 (Reivindicação 6); WO 2004027049 (Fig 1L); EP 1394274 (Exemplo 11); WO 2004016225 (Reivindicação 2); WO 2003042661 (Reivindicação 12); US 2003157089 (Exemplo 5); US 2003185830 (Exemplo 5); US 2003064397 (Fig 2); WO 200289747 (Exemplo 5; Página 618 a 619); WO 2003022995 (Exemplo 9; Fig 13A, Exemplo 53; Página 173, Exemplo 2; Fig 2A); NP_036581 antígeno epitelial seis transmembrana da próstata
[0325]Referências cruzadas: MIM:604415; NP_036581.1; NM_012449_1
[0326](4) 0772P (CA125, MUC16, acesso Genbank no AF361486)
[0327]J. Biol. Chem. 276 (29):27371 a 27375 (2001)); WO 2004045553 (Rei-vindicação 14); WO 200292836 (Reivindicação 6; Fig 12); WO 200283866 (Reivindicação 15; Página 116 a 121); US 2003124140 (Exemplo 16); Referências cruzadas: GI:34501467; AAK74120.3; AF361486_1
[0328](5) MPF (MPF, MSLN, SMR, fator de potenciação de megacariócitos, mesotelina, acesso Genbank no NM_005823) Yamaguchi, N., et al. Biol. Chem. 269 (2), 805 a 808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20):11531 a 11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (1):136 a 140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37):21984 a 21990 (1995)); WO 2003101283 (Reivindicação 14); (WO 2002102235 (Reivindicação 13; Página 287 a 288); WO 2002101075 (Reivindicação 4; Página 308 a 309); WO 200271928 (Página 320 a 321); WO 9410312 (Página 52 a 57); Referências cruzadas: MIM:601051; NP_005814.2; NM_005823_1
[0329](6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, família do portador de soluto 34 (fosfato de sódio), membro 2, transportador de fosfato dependente de sódio tipo II 3b, acesso Genbank no NM_006424)
[0330]J. Biol. Chem. 277 (22):19665 a 19672 (2002), Genomics 62 (2):281 a 284 (1999), Feild, J.A., et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578 a 582); WO 2004022778 (Reivindicação 2); EP 1394274 (Exemplo 11); WO 2002102235 (Reivindicação 13; Página 326); EP 875569 (Reivindicação 1; Página 17 a 19); WO 200157188 (Reivindicação 20; Página 329); WO 2004032842 (Exemplo IV); WO 200175177 (Reivindicação 24; Página 139 a 140);
[0331]Referências cruzadas: MIM:604217; NP_006415.1; NM_006424_1
[0332](7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, domínio sema, sete repetições de thrombospondina (tipo 1 e tipo 1), domínio transmembrana (TM) e domínio citoplasmático curto, (semaforina) 5B, acesso Genbank no AB040878)
[0333]Nagase T., et al. (2000) DNA Res. 7 (2):143 - 150); WO 2004000997 (Reivindicação 1); WO 2003003984 (Reivindicação 1); WO 200206339 (Reivindicação 1; Página 50); WO 200188133 (Reivindicação 1; Página 41 a 43, 48 a 58); WO 2003054152 (Reivindicação 20); WO 2003101400 (Reivindicação 11);
[0334]Acesso: Q9P283; EMBL; AB040878; BAA95969.1. Genew; HGNC:10737;
[0335](8) PSCA hlg (gene 2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12, acesso Genbank no AY358628); Ross et al. (2002) Cancer Res. 62:2546 a 2553; US 2003129192 (Reivindicação 2); US 2004044180 (Reivindicação 12); US 2004044179 (Reivindicação 11); US 2003096961 (Reivindicação 11); US 2003232056 (Exemplo 5); WO 2003105758 (Reivindicação 12); US 2003206918 (Exemplo 5); EP 1347046 (Reivindicação 1); WO 2003025148 (Reivindicação 20);
[0336]Referências cruzadas: GI:37182378; AAQ88991.1; AY358628_1
[0337](9) ETBR (receptor tipo B de endotelina, acesso Genbank no AY275463);
[0338]Nakamuta M., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34 a 39, 1991; Ogawa Y., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248 a 255, 1991; Arai H., et al. Jpn. Circ. J. 56, 1303 - 1307, 1992; Arai H., et al. J. Biol. Chem. 268, 3463 a 3470, 1993; Sakamoto A., Yanagisawa M., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 656 a 663, 1991; Elshourbagy N.A., et al. J. Biol. Chem. 268, 3873 a 3879, 1993; Haendler B., et al. J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, s1-S4, 1992; Tsutsumi M., et al. Gene 228, 43 a 49, 1999; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899 a 16903, 2002; Bourgeois C., et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116 a 3123, 1997; Okamoto Y., et al. Biol. Chem. 272, 21589 a 21596, 1997; Verheij J.B., et al. Am. J. Med. Genet. 108, 223 a 225, 2002; Hofstra R.M.W., et al. Eur. J. Hum. Genet. 5, 180 a 185, 1997; Puffenberger E.G., et al. Cell 79, 1257 a 1266, 1994; At- tie T., et al., Hum. Mol. Genet. 4, 2407 a 2409, 1995; Auricchio A., et al. Hum. Mol. Genet. 5:351 a 354, 1996; Amiel J., et al. Hum. Mol. Genet. 5, 355 a 357, 1996; Hof- stra R.M.W., et al. Nat. Genet. 12, 445 a 447, 1996; Svensson P.J., et al. Hum. Genet. 103, 145 a 148, 1998; Fuchs S., et al. Mol. Med. 7, 115 a 124, 2001; Pingault V., et al. (2002) Hum. Genet. 111, 198 a 206; WO 2004045516 (Reivindicação 1); WO 2004048938 (Exemplo 2); WO 2004040000 (Reivindicação 151); WO 2003087768 (Reivindicação 1); WO 2003016475 (Reivindicação 1); WO 2003016475 (Reivindicação 1); WO 200261087 (Fig 1); WO 2003016494 (Fig 6); WO 2003025138 (Reivindicação 12; Página 144); WO 200198351 (Reivindicação 1; Página 124 a 125); EP 522868 (Reivindicação 8; Fig 2); WO 200177172 (Reivindicação 1; Página 297 a 299); US 2003109676; US 6518404 (Fig 3); US 5773223 (Rei-vindicação 1a; Col 31 a 34); WO 2004001004;
[0339](10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315, acesso Gen bank no NM_017763);
[0340]WO 2003104275 (Reivindicação 1); WO 2004046342 (Exemplo 2); WO 2003042661 (Reivindicação 12); WO 2003083074 (Reivindicação 14; Página 61); WO 2003018621 (Reivindicação 1); WO 2003024392 (Reivindicação 2; Fig 93); WO 200166689 (Exemplo 6);
[0341]Referências cruzadas: LocusID:54894; NP_060233.2; NM_017763_1
[0342](11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gene associado ao câncer de próstata 1, proteína associada ao câncer de próstata 1, antígeno epitelial seis transmembrana da próstata 2, proteína da próstata seis transmembrana, acesso Genbank no AF455138)
[0343]Lab. Invest. 82 (11):1573 a 1582 (2002)); WO 2003087306; US 2003064397 (Reivindicação 1; Fig 1); WO 200272596 (Reivindicação 13; Página 54 a 55); WO 200172962 (Reivindicação 1; Fig 4B); WO 2003104270 (Reivindicação 11); WO 2003104270 (Reivindicação 16); US 2004005598 (Reivindicação 22); WO 2003042661 (Reivindicação 12); US 2003060612 (Reivindicação 12; Fig 10); WO 200226822 (Reivindicação 23; Fig 2); WO 200216429 (Reivindicação 12; Fig 10);
[0344]Referências cruzadas: GI:22655488; AAN04080.1; AF455138_1
[0345](12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal catiônico do receptor de potencial transitório, subfamília M, membro 4, acesso Genbank no NM_017636)
[0346]Xu, X.Z., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (19):10692 a 10697 (2001), Cell 109 (3):397 a 407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33):30813 a 30820 (2003)); US 2003143557 (Reivindicação 4); WO 200040614 (Reivindicação 14; Página 100 a 103); WO 200210382 (Reivindicação 1; Fig 9A); WO 2003042661 (Reivindicação 12); WO 200230268 (Reivindicação 27; Página 391); US 2003219806 (Reivindicação 4); WO 200162794 (Reivindicação 14; Fig 1A a D);
[0347]Referências cruzadas: MIM:606936; NP_060106.2; NM_017636_1
[0348](13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento derivado de teratocarcinoma, acesso Genbank no NP_003203 ou NM_003212)
[0349]Ciccodicola, A., et al. EMBO J. 8 (7):1987 a 1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3):555 a 565 (1991)); US 2003224411 (Reivindicação 1); WO 2003083041 (Exemplo 1); WO 2003034984 (Reivindicação 12); WO 200288170 (Reivindicação 2; Página 52 a 53); WO 2003024392 (Reivindicação 2; Fig 58); WO 200216413 (Reivindicação 1; Página 94 a 95, 105); WO 200222808 (Reivindicação 2; Fig 1); US 5854399 (Exemplo 2; Col 17 a 18); US 5792616 (Fig 2);
[0350]Referências cruzadas: MIM:187395; NP_003203.1; NM_003212_1
[0351](14) CD21 (CR2 (Receptor do complemento 2) ou C3DR (C3d/receptor do vírus Epstein Barr) ou Hs.73792 acesso Genbank no M26004)
[0352]Fujisaku et al. (1989) J. Biol. Chem. 264 (4):2118 a 2125); Weis J.J., et al. J. Exp. Med. 167, 1047 a 1066, 1988; Moore M., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 9194 a 9198, 1987; Barel M., et al. Mol. Immunol. 35, 1025 a 1031, 1998; Weis J.J., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639 a 5643, 1986; Sinha S.K., et al. (1993) J. Immunol. 150, 5311 a 5320; WO 2004045520 (Exemplo 4); US 2004005538 (Exemplo 1); WO 2003062401 (Reivindicação 9); WO 2004045520 (Exemplo 4); WO 9102536 (Fig 9.1 a 9.9); WO 2004020595 (Reivindicação 1);
[0353]Acesso: P20023; Q13866; Q14212; EMBL; M26004; AAA35786.1.
[0354](15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (beta associada à imunoglobulina), B29, acesso Genbank no NM_000626 ou 11038674)
[0355]Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (7):4126 a 4131, Blood (2002) 100 (9):3068 a 3076, Muller et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6):1621 a 1625); WO 2004016225 (reivindicação 2, Fig 140); WO 2003087768, US 2004101874 (reivindicação 1, página 102); WO 2003062401 (reivindicação 9); WO 200278524 (Exemplo 2); US 2002150573 (reivindicação 5, página 15); US 5644033; WO 2003048202 (reivindicação 1, páginas 306 e 309); WO 99/558658, US 6534482 (reivindicação 13, Fig 17A/B); WO 200055351 (reivindicação 11, páginas 1145 a 1146);
[0356]Referências cruzadas: MIM:147245; NP_000617.1; NM_000626_1
[0357](16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (proteína âncora de fosfatase contendo domínio SH2 1a), SPAP1B, SPAP1C, acesso Genbank no NM_030764, AY358130)
[0358]Genome Res. 13 (10):2265 a 2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87 a 95 (2002), Blood 99 (8):2662 a 2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17):9772 a 9777 (2001), Xu, M.J., et al. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768 a 775; WO 2004016225 (Reivindicação 2); WO 2003077836; WO 200138490 (Reivindicação 5; Fig 18D-1 a 18D-2); WO 2003097803 (Reivindicação 12); WO 2003089624 (Reivindicação 25);
[0359]Referências cruzadas: MIM:606509; NP_110391.2; NM_030764_1
[0360](17) HER2 (ErbB2, acesso Genbank no M11730)
[0361]Coussens L., et al. Science (1985) 230(4730):1132 a 1139); Yamamoto T., et al. Nature 319, 230 a 234, 1986; Semba K., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6497 a 6501, 1985; Swiercz J.M., et al. J. Cell Biol. 165, 869 a 880, 2004; Kuhns J.J., et al. J. Biol. Chem. 274, 36422 a 36427, 1999; Cho H.-S., et al. Nature 421, 756 a 760, 2003; Ehsani A., et al. (1993) Genomics 15, 426 a 429; WO 2004048938 (Exemplo 2); WO 2004027049 (Fig 1I); WO 2004009622; WO 2003081210; WO 2003089904 (Reivindicação 9); WO 2003016475 (Reivindicação 1); US 2003118592; WO 2003008537 (Reivindicação 1); WO 2003055439 (Reivindicação 29; Fig 1A a B); WO 2003025228 (Reivindicação 37; Fig 5C); WO 200222636 (Exemplo 13; Página 95 a 107); WO 200212341 (Reivindicação 68; Fig 7); WO 200213847 (Página 71 a 74); WO 200214503 (Página 114 a 117); WO 200153463 (Reivindicação 2; Página 41 a 46); WO 200141787 (Página 15); WO 200044899 (Reivindicação 52; Fig 7); WO 200020579 (Reivindicação 3; Fig 2); US 5869445 (Reivindicação 3; Col 31 a 38); WO 9630514 (Reivindicação 2; Página 56 a 61); EP 1439393 (Reivindicação 7); WO 2004043361 (Reivindicação 7); WO 2004022709; WO 200100244 (Exemplo 3; Fig 4);
[0362]Acesso: P04626; EMBL; M11767; AAA35808.1. EMBL; M11761; AAA35808.1.
[0363](18) NCA (CEACAM6, acesso Genbank no M18728);
[0364]Barnett T., et al. Genomics 3, 59 a 66, 1988; Tawaragi Y., et al. Bio- chem. Biophys. Res. Commun. 150, 89 a 96, 1988; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:16899 a 16903, 2002; WO 2004063709; EP 1439393 (Reivindicação 7); WO 2004044178 (Exemplo 4); WO 2004031238; WO 2003042661 (Reivindicação 12); WO 200278524 (Exemplo 2); WO 200286443 (Reivindicação 27; Página 427); WO 200260317 (Reivindicação 2);
[0365]Acesso: P40199; Q14920; EMBL; M29541; AAA59915.1. EMBL; M18728;
[0366](19) MDP (DPEP1, acesso Genbank no BC017023)
[0367]Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26):16899 a 16903 (2002)); WO 2003016475 (Reivindicação 1); WO 200264798 (Reivindicação 33; Página 85 a 87); JP 05003790 (Fig 6 a 8); WO 9946284 (Fig 9);
[0368]Referências cruzadas: MIM:179780; AAH17023.1; BC017023_1
[0369](20) IL20Rα (IL20Ra, ZCYTOR7, acesso Genbank no AF184971);
[0370]Clark H.F., et al. Genome Res. 13, 2265 a 2270, 2003; Mungall A.J., et al. Nature 425, 805 a 811, 2003; Blumberg H., et al. Cell 104, 9 a 19, 2001; Du- moutier L., et al. J. Immunol. 167, 3545 a 3549, 2001; Parrish-Novak J., et al. J. Biol. Chem. 277, 47517 a 47523, 2002; Pletnev S., et al. (2003) Biochemistry 42:12617 a 12624; Sheikh F., et al. (2004) J. Immunol. 172, 2006 a 2010; EP 1394274 (Exemplo 11); US 2004005320 (Exemplo 5); WO 2003029262 (Página 74 a 75); WO 2003002717 (Reivindicação 2; Página 63); WO 200222153 (Página 45 a 47); US 2002042366 (Página 20 a 21); WO 200146261 (Página 57 a 59); WO 200146232 (Página 63 a 65); WO 9837193 (Reivindicação 1; Página 55 a 59);
[0371]Acesso: Q9UHF4; Q6UWA9; Q96SH8; EMBL; AF184971; AAF01320.1.
[0372](21) Brevican (BCAN, BEHAB, acesso Genbank no AF229053)
[0373]Gary S.C., et al. Gene 256, 139 a 147, 2000; Clark H.F., et al. Genome Res. 13, 2265 a 2270, 2003; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899 a 16903, 2002; US 2003186372 (Reivindicação 11); US 2003186373 (Reivindicação 11); US 2003119131 (Reivindicação 1; Fig 52); US 2003119122 (Reivindicação 1; Fig 52); US 2003119126 (Reivindicação 1); US 2003119121 (Reivindicação 1; Fig 52); US 2003119129 (Reivindicação 1); US 2003119130 (Reivindicação 1); US 2003119128 (Reivindicação 1; Fig 52); US 2003119125 (Reivindicação 1); WO 2003016475 (Reivindicação 1); WO 200202634 (Reivindicação 1);
[0374](22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, acesso Genbank no NM_004442)
[0375]Chan, J. e Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057 a 1061 (1991) Oncogene 10 (5):897 a 905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21:309 a 345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196:177 a 244 (2000)); WO 2003042661 (Reivindicação 12); WO 200053216 (Reivindicação 1; Página 41); WO 2004065576 (Reivindicação 1); WO 2004020583 (Reivindicação 9); WO 2003004529 (Página 128 a 132); WO 200053216 (Reivindicação 1; Página 42);
[0376]Referências cruzadas: MIM:600997; NP_004433.2; NM_004442_1
[0377](23) ASLG659 (B7h, acesso Genbank no AX092328)
[0378]US 20040101899 (Reivindicação 2); WO 2003104399 (Reivindicação 11); WO 2004000221 (Fig. 3); US 2003165504 (Reivindicação 1); US 2003124140 (Exemplo 2); US 2003065143 (Fig 60); WO 2002102235 (Reivindicação 13; Página 299); US 2003091580 (Exemplo 2); WO 200210187 (Reivindicação 6; Fig 10); WO 200194641 (Reivindicação 12; Fig 7b); WO 200202624 (Reivindicação 13; Fig 1A a 1B); US 2002034749 (Reivindicação 54; Página 45 a 46); WO 200206317 (Exemplo 2; Página 320 a 321, Reivindicação 34; Página 321 a 322); WO 200271928 (Página 468 a 469); WO 200202587 (Exemplo 1; Fig 1); WO 200140269 (Exemplo 3; Páginas 190 a 192); WO 200036107 (Exemplo 2; Página 205 a 207); WO 2004053079 (Reivindicação 12); WO 2003004989 (Reivindicação 1); WO 200271928 (Página 233 a 234, 452 a 453); WO 0116318;
[0379](24) PSCA (precursor de antígeno de células tronco da próstata, acesso Genbank no AJ297436)
[0380]Reiter R.E., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1735 a 1740, 1998; Gu Z., et al. Oncogene 19, 1288 a 1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275(3):783 a 788; WO 2004022709; EP 1394274 (Exemplo 11); US 2004018553 (Reivindicação 17); WO 2003008537 (Reivindicação 1); WO 200281646 (Reivindicação 1; Página 164); WO 2003003906 (Reivindicação 10; Página 288); WO 200140309 (Exemplo 1; Fig 17); US 2001055751 (Exemplo 1; Fig 1b); WO 200032752 (Reivindicação 18; Fig 1); WO 9851805 (Reivindicação 17; Página 97); WO 9851824 (Reivindicação 10; Página 94); WO 9840403 (Reivindicação 2; Fig 1B);
[0381]Acesso: O43653; EMBL; AF043498; AAC39607.1.
[0382](25) GEDA (acesso Genbank No AY260763);
[0383]Proteína lipoma HMGIC tipo parceria-fusão AAP14954/pid=AAP14954.1 - Homo sapiens
[0384]Espécie: Homo sapiens (humana)
[0385]WO 2003054152 (Reivindicação 20); WO 2003000842 (Reivindicação 1); WO 2003023013 (Exemplo 3, Reivindicação 20); US 2003194704 (Reivindicação 45);
[0386]Referências cruzadas: GI:30102449; AAP14954.1; AY260763_1
[0387](26) BAFF-R (receptor do fator de ativação de células B, receptor de BLyS 3, BR3, acesso Genbank No AF116456); receptor de BAFF/pid=NP_443177.1 - Homo sapiens
[0388]Thompson, J.S., et al. Science 293 (5537), 2108 a 2111 (2001); WO 2004058309; WO 2004011611; WO 2003045422 (Exemplo; Página 32 a 33); WO 2003014294 (Reivindicação 35; Fig 6B); WO 2003035846 (Reivindicação 70; Página 615 a 616); WO 200294852 (Col 136 a 137); WO 200238766 (Reivindicação 3; Página 133); WO 200224909 (Exemplo 3; Fig 3);
[0389]Referências cruzadas: MIM:606269; NP_443177.1; NM_052945_1; AF132600
[0390](27) CD22 (isoforma CD22-B do receptor de células B, BL-CAM, Lyb- 8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814, acesso Genbank No AK026467);
[0391]Wilson et al. (1991) J. Exp. Med. 173:137 a 146; WO 2003072036 (Reivindicação 1; Fig 1);
[0392]Referências cruzadas: MIM:107266; NP_001762.1; NM_001771_1
[0393](28) CD79a (CD79A, CD79α, alfa associada à imunoglobulina, uma proteína específica de células B que interage covalentemente com Ig beta (CD79B) e forma um complexo sobre a superfície com moléculas de Ig M, transduz um sinal envolvido na diferenciação de células B), pI: 4.84, MW: 25028 TM: 2 [P] Cromossomo do Gene: 19q13.2, acesso Genbank No NP_001774,10)
[0394]WO 2003088808, US 20030228319; WO 2003062401 (reivindicação 9); US 2002150573 (reivindicação 4, páginas 13 a 14); WO 9958658 (reivindicação 13, Fig 16); WO 9207574 (Fig 1); US 5644033; Ha et al. (1992) J. Immunol. 148(5):1526 a 1531; Mueller et al. (1992) Eur. J. Biochem. 22:1621 a 1625; Hashimoto et al. (1994) Immunogenetics 40(4):287 a 295; Preud’homme et al. (1992) Clin. Exp. Immunol. 90(1):141 a 146; Yu et al. (1992) J. Immunol. 148(2) 633 a 637; Sa- kaguchi et al. (1988) EMBO J. 7(11):3457 a 3464;
[0395](29) CXCR5 (receptor do linfoma de Burkitt 1, um receptor ligado à proteína G que é ativado pela quimiocina CXCL13, funciona na migração de linfóci- tos e defesa humoral, desempenha um papel na infecção de HIV-2 e talvez no desenvolvimento de AIDS, linfoma, mieloma e leucemia); 372 aa, pI: 8.54 MW: 41959 TM: 7 [P] Cromossomo do Gene: 11q23.3, acesso Genbank No NP_001707.1)
[0396]WO 2004040000; WO 2004015426; US 2003105292 (Exemplo 2); US 6555339 (Exemplo 2); WO 200261087 (Fig 1); WO 200157188 (Reivindicação 20, página 269); WO 200172830 (páginas 12 a 13); WO 200022129 (Exemplo 1, páginas 152 a 153, Exemplo 2, páginas 254 a 256); WO 9928468 (reivindicação 1, página 38); US 5440021 (Exemplo 2, col 49 a 52); WO 9428931 (páginas 56 a 58); WO 9217497 (reivindicação 7, Fig 5); Dobner et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22:2795 a 2799; Barella et al. (1995) Biochem. J. 309:773 a 779;
[0397](30) HLA-DOB (subunidade beta da molécula MHC classe II (antígeno Ia) que se liga aos peptídeos e apresenta os mesmos aos linfócitos T CD4+); 273 aa, pI: 6.56 MW: 30820 TM: 1 [P] Cromossomo do Gene: 6p21.3, acesso Genbank No NP_002111.1)
[0398]Tonnelle et al. (1985) EMBO J. 4(11):2839 a 2847; Jonsson et al. (1989) Immunogenetics 29(6):411 a 413; Beck et al. (1992) J. Mol. Biol. 228:433 a 441; Strausberg et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899 a 16903; Serveni- us et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:8759 a 8766; Beck et al. (1996) J. Mol. Biol. 255:1 a 13; Naruse et al. (2002) Tissue Antigens 59:512 a 519; WO 9958658 (reivindicação 13, Fig 15); US 6153408 (Col 35 a 38); US 5976551 (col 168 a 170); US 6011146 (col 145 a 146); Kasahara et al. (1989) Immunogenetics 30(1):66 a 68; Larhammar et al. (1985) J. Biol. Chem. 260(26):14111 a 14119;
[0399](31) P2X5 (canal iônico ativado pelo ligante P2X do receptor purinérgi- co 5, um canal iônico ativado por ATP extracelular, pode estar envolvido na transmissão sináptica e neurogênese, a deficiência pode contribuir para a patofisiologia da instabilidade detrusora idiopática); 422 aa), pI: 7.63, MW: 47206 TM: 1 [P] Cro- mossomo do Gene: 17p13.3, acesso Genbank No NP_002552.2)
[0400]Le et al. (1997) FEBS Lett. 418(1 a 2):195 a 199; WO 2004047749; WO 2003072035 (reivindicação 10); Touchman et al. (2000) Genome Res. 10:165 a 173; WO 200222660 (reivindicação 20); WO 2003093444 (reivindicação 1); WO 2003087768 (reivindicação 1); WO 2003029277 (página 82);
[0401](32) CD72 (antígeno de diferenciação de células B CD72, Lyb-2) PROTEIN SEQUENCE Full maeaity...tafrfpd (1..359; 359 aa), pI: 8.66, MW: 40225 TM: 1 [P] Cromossomo do Gene: 9p13.3, acesso Genbank No NP_001773.1)
[0402]WO 2004042346 (reivindicação 65); WO 2003026493 (páginas 51 a 52, 57 a 58); WO 200075655 (páginas 105 a 106); Von Hoegen et al. (1990) J. Immunol. 144(12):4870 a 4877; Strausberg et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899 a 16903;
[0403](33) LY64 (antígeno de linfócito 64 (RP105), proteína de membrana tipo I da família de repetição rica em leucina (LRR), regula a ativação de células B e apoptose, a perda de função está associada com a atividade da doença aumentada em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico); 661 aa, pI: 6.20, MW: 74147 TM: 1 [P] Cromossomo do Gene: 5q12, acesso Genbank No NP_005573.1)
[0404]US 2002193567; WO 9707198 (reivindicação 11, páginas 39 a 42); Miura et al. (1996) Genomics 38(3):299 a 304; Miura et al. (1998) Blood 92:2815 a 2822; WO 2003083047; WO 9744452 (reivindicação 8, páginas 57 a 61); WO 200012130 (páginas 24 a 26);
[0405](34) FcRH1 (Proteína do tipo receptor de Fc 1, um receptor putativo para o domínio Fc de imunoglobulina que contém domínios semelhante à Ig do tipo C2 e ITAM, pode apresentar um papel na diferenciação de linfócitos B); 429 aa, pI: 5.28, MW: 46925 TM: 1 [P] Cromossomo do Gene: 1q21 a 1q22, acesso Genbank No NP_443170.1)
[0406]WO 2003077836; WO 200138490 (reivindicação 6, Fig 18E-1 a 18-E- 2); Davis et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98(17):9772 a 9777; WO 2003089624 (reivindicação 8); EP 1347046 (reivindicação 1); WO 2003089624 (reivindicação 7);
[0407](35) IRTA2 (associado à translocação do receptor da superfamília de imunoglobulina 2, um imunorreceptor putativo com papéis possíveis no desenvolvimento e linfomagênese de células B; a desregulação do gene por meio de translo- cação ocorre em algumas malignidades de células B); 977 aa, pI: 6.88 MW: 106468 TM: 1 [P] Cromossomo do Gene: 1q21, acesso Genbank No Humano: AF343662, AF343663, AF343664, AF343665, AF369794, AF397453, AK090423, AK090475, AL834187, AY358085; Camundongo: AK089756, AY158090, AY506558; NP_112571.1
[0408]WO 2003024392 (reivindicação 2, Fig 97); Nakayama et al. (2000) Bi- ochem. Biophys. Res. Commun. 277(1):124 a 127; WO 2003077836; WO 200138490 (reivindicação 3, Fig 18B-1 a 18B-2);
[0409](36) TENB2 (TMEFF2, tomorregulina, TPEF, HPP1, TR, proteoglicano transmembrana putativo, relacionado à família EGF/heregulina de fatores de crescimento e folistatina); 374 aa, Acesso NCBI: AAD55776, AAF91397, AAG49451, Re- fSeq NCBI: NP_057276; NCBI Gene: 23671; OMIM: 605734; SwissProt Q9UIK5; acesso Genbank No AF179274; AY358907, CAF85723, CQ782436
[0410]WO 2004074320 (SEQ ID NO 810); JP 2004113151 (SEQ ID NOS 2, 4, 8); WO 2003042661 (SEQ ID NO 580); WO 2003009814 (SEQ ID NO 411); EP 1295944 (páginas 69 a 70); WO 200230268 (página 329); WO 200190304 (SEQ ID NO 2706); US 2004249130; US 2004022727; WO 2004063355; US 2004197325; US 2003232350; US 2004005563; US 2003124579; Horie et al. (2000) Genomics 67:146 a 152; Uchida et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:593 a 602; Liang et al. (2000) Cancer Res. 60:4907 a 12; Glynne-Jones et al. (2001) Int J Cancer. Oct 15;94(2):178 a 84;
[0411](37) PMEL17 (homólogo dd prata; SILV; D12S53E; PMEL17; (SI); (SIL); ME20; gp100) BC001414; BT007202; M32295; M77348; NM_006928; McGlinchey, R.P. et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (33), 13731 a 13736; Kummer, M.P. et al. (2009) J. Biol. Chem. 284 (4), 2296 a 2306;
[0412](38) TMEFF1 (proteína transmembrana com domínios do tipo EGF e dois do tipo folistatina 1; Tomorregulina-1; H7365; C9orf2; C9ORF2; U19878; X83961) NM_080655; NM_003692; Harms, P.W. (2003) Genes Dev. 17 (21), 2624 - 2629; Gery, S. et al. (2003) Oncogene 22 (18):2723 - 2727;
[0413](39) GDNF-Ra1 (receptor da família GDNF alfa 1; GFRA1; GDNFR; GDNFRA; RETL1; TRNR1; RET1L; GDNFR-alfa1; GFR-ALFA-1; U95847; BC014962; NM_145793) NM_005264; Kim, M.H. et al. (2009) Mol. Cell. Biol. 29 (8), 2264 - 2277; Treanor, J.J. et al. (1996) Nature 382 (6586):80 a 83;
[0414](40) Ly6E (complexo do antígeno 6 de linfócitos, loco E; Ly67,RIG- E,SCA-2,TSA-1) NP_002337,1; NM_002346,2; de Nooij-van Dalen, A.G. et al. (2003) Int. J. Câncer 103 (6), 768 - 774; Zammit, D.J. et al. (2002) Mol. Cell. Biol. 22 (3):946 a 952;
[0415](41) TMEM46 (homólogo 2 de shisa (Xenopus laevis); SHISA2) NP_001007539.1; NM_001007538.1; Furushima, K. et al. (2007) Dev. Biol. 306 (2), 480 a 492; Clark, H.F. et al. (2003) Genome Res. 13 (10):2265 a 2270;
[0416](42) Ly6G6D (complexo do antígeno 6 de linfócitos, loco G6D; Ly6-D, MEGT1) NP_067079.2; NM_021246.2; Mallya, M. et al. (2002) Genomics 80 (1):113 a 123; Ribas, G. et al. (1999) J. Immunol. 163 (1):278 a 287;
[0417](43) LGR5 (receptor ligado à proteína G contendo repetição rica em leucina 5; GPR49, GPR67) NP_003658.1; NM_003667.2; Salanti, G. et al. (2009) Am. J. Epidemiol. 170 (5):537 a 545; Yamamoto, Y. et al. (2003) Hepatology 37 (3):528 a 533;
[0418](44) RET (proto-oncogene ret; MEN2A; HSCR1; MEN2B; MTC1; (PTC); CDHF12; Hs.168114; RET51; RET-ELE1) NP_066124.1; NM_020975.4; Tsu- kamoto, H. et al. (2009) Cancer Sci. 100 (10):1895 a 1901; Narita, N. et al. (2009) Oncogene 28 (34):3058 a 3068;
[0419](45) LY6K (complexo do antígeno 6 de linfócitos, loco K; LY6K; HSJ001348; FLJ35226) NP_059997.3; NM_017527,3; Ishikawa, N. et al. (2007) Cancer Res. 67 (24):11601 a 11611; de Nooij-van Dalen, A.G. et al. (2003) Int. J. Cancer 103 (6):768 a 774;
[0420](46) GPR19 (receptor ligado à proteína G 19; Mm.4787) NP_006134.1; NM_006143.2; Montpetit, A. e Sinnett, D. (1999) Hum. Genet. 105 (1 a 2):162 a 164; O’Dowd, B.F. et al. (1996) FEBS Lett. 394 (3):325 a 329;
[0421](47) GPR54 (receptor de KISS1; KISS1R; GPR54; HOT7T175; AXOR12) NP_115940.2; NM_032551.4; Navenot, J.M. et al. (2009) Mol. Pharmacol. 75 (6):1300 a 1306; Hata, K. et al. (2009) Anticancer Res. 29 (2):617 a 623;
[0422](48) ASPHD1 (contendo domínio aspartato beta-hidroxilase 1; LOC253982) NP_859069.2; NM_181718.3; Gerhard, D.S. et al. (2004) Genome Res. 14 (10B):2121 a 2127;
[0423](49) Tirosinase (TYR; OCAIA; OCA1A; tirosinase; SHEP3) NP_000363.1; NM_000372.4; Bishop, D.T. et al. (2009) Nat. Genet. 41 (8):920 a 925; Nan, H. et al. (2009) Int. J. Cancer 125 (4):909 a 917;
[0424](50) TMEM118 (proteína ring finger, transmembrana 2; RNFT2; FLJ14627) NP_001103373.1; NM_001109903.1; Clark, H.F. et al. (2003) Genome Res. 13 (10):2265 a 2270; Scherer, S.E. et al. (2006) Nature 440 (7082):346 a 351
[0425](51) GPR172A (receptor ligado à proteína G 172A; GPCR41; FLJ11856; D15Ertd747e) NP_078807.1; NM_024531.3; Ericsson, T.A. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (11):6759 a 6764; Takeda, S. et al. (2002) FEBS Lett. 520 (1 a 3):97 a 101.
[0426]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a um ou mais entre os seguintes polipeptídeos: BMPR1B; E16; STEAP1; 0772P; MPF; Napi3b; Sema 5b; PSCA hlg; ETBR; MSG783; STEAP2; TrpM4; CRIPTO; CD21; CD79b; FcRH2; HER2; NCA; MDP; IL20Rα; Brevican; EphB2R; ASLG659; PSCA; GEDA; BAFF-R; CD22; CD79a; CXCR5; HLA-DOB; P2X5; CD72; LY64; FcRH1; IRTA2; TENB2; PMEL17; TMEFF1; GDNF-Ra1; Ly6E; TMEM46; Ly6G6D; LGR5; RET; LY6K; GPR19; GPR54; ASPHD1; Tirosinase; TMEM118; GPR172A; e CD33.
[0427]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a BMPR1B;
[0428]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a E16;
[0429]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a STEAP1;
[0430]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a 0772P;
[0431]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a MPF;
[0432]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a Napi3b;
[0433]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a Sema 5b;
[0434]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a PSCA hlg;
[0435]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a ETBR;
[0436]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a MSG783;
[0437]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a STEAP2;
[0438]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a TrpM4;
[0439]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a CRIPTO;
[0440]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a CD21;
[0441]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a CD79b;
[0442]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a FcRH2;
[0443]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a HER2;
[0444]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a NCA;
[0445]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a MDP;
[0446]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a IL20Rα;
[0447]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a Brevican;
[0448]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a EphB2R;
[0449]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a ASLG659;
[0450]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a PSCA;
[0451]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a GEDA;
[0452]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a BAFF-R;
[0453]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a CD22;
[0454]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a CD79a;
[0455]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a CXCR5;
[0456]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a HLA-DOB;
[0457]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a P2X5 ;
[0458]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a CD72;
[0459]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a LY64;
[0460]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a FcRH1;
[0461]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a IRTA2;
[0462]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a TENB2;
[0463]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a PMEL17;
[0464]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a TMEFF1;
[0465]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a GDNF-Ra1;
[0466]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a Ly6E;
[0467]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a TMEM46;
[0468]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a Ly6G6D;
[0469]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a LGR5;
[0470]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a RET;
[0471]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a LY6K;
[0472]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a GPR19;
[0473]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a GPR54;
[0474]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a EphB2R; iga a ASLG659;
[0475]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a Tirosinase;
[0476]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a TMEM118;
[0477]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a GPR172A;
[0478]Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a CD33.
[0479]O anticorpo precursor também pode ser uma proteína de fusão compreendendo uma sequência de peptídeo de ligação à albumina (ABP) (Dennis et al. (2002) “Albumina Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins” J Biol Chem. 277:35035 a 35043; WO 01/45746). Os anticorpos da invenção incluem proteínas de fusão com sequências de ABP mostradas por: (i) Dennis et al. (2002) J Biol Chem. 277:35035 a 35043 nas Tabelas III e IV, página 35038; (ii) US 20040001827 em [0076]; e (iii) WO 01/45746 nas páginas 12 a 13, os quais são incorporados neste relatório como referência.
[0480]Os anticorpos podem ser produzidos usando métodos recombinantes e composições, por exemplo, conforme descrito no US 4816567 e conhecido na técnica. Em algumas formas de realização, o anticorpo é produzido em uma célula hospedeira eucariótica (por exemplo, célula hospedeira de mamífero). Em algumas formas de realização, o anticorpo é produzido em uma célula hospedeira procariótica (por exemplo, E. coli).
[0481]Em certas formas de realização, uma ou mais modificações de amino- ácidos podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo fornecido neste relatório, desse modo, gerando uma região Fc variante. A região Fc variante pode compreender uma sequência de região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) compreendendo uma modificação de aminoáci- do (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos.
[0482]Em certas formas de realização, a invenção contempla uma variante de anticorpo que possui algumas, mas nem todas as funções efetoras, que tornam a mesma um candidato desejável para aplicações em que a meia-vida do anticorpo in vivo é importante mesmo que certas funções efetoras (tais como complemento e ADCC) sejam desnecessárias ou deletérias. Ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confirmar a redução/depleção das atividades de CDC e/ou ADCC. Por exemplo, ensaios de ligação ao receptor de Fc (FcR) podem ser conduzidos para garantir que o anticorpo é desprovido de ligação a FCYR (consequentemente, provavelmente desprovido da atividade de ADCC), mas conserva a capacidade de ligação a FcRn.
CARREGAMENTO DE FÁRMACO DE ADC
[0483]O carregamento de fármaco é o número médio de porções de fármaco por anticorpo. O carregamento de fármaco pode variar de 1 a 8 fármacos (D) por anticorpo (Ab), isto é, onde 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 porções de fármaco são covalente- mente ligadas ao anticorpo. As composições de ADC incluem coletas de anticorpos conjugados com uma faixa de fármacos, de 1 a 8. O médio número de fármacos por anticorpo nas preparações de ADC a partir das reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais, tais como espectroscopia de massas, ensaio ELISA, eletroforese e HPLC. A distribuição quantitativa de ADC em termos de p também pode ser determinada. Por meio de ELISA, o valor médio de p em uma preparação particular de ADC pode ser determinado (Hamblett et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063 a 7070; Sanderson et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11:843 a 852). En-tretanto, a distribuição de valores de p (fármaco) não é discernível pela ligação anti- corpo-antígeno e limitação de detecção de ELISA. Além disso, o ensaio ELISA para detecção de conjugados de anticorpo-fármaco não determina onde as porções de fármaco são ligadas ao anticorpo, tais como os fragmentos de cadeia pesada ou cadeia leve ou os resíduos de aminoácidos particulares. Em alguns exemplos, separação, purificação e caracterização de ADC homogêneo onde p é um determinado valor a partir de ADC com outros carregamentos de fármaco podem ser obtidas por meios, tais como HPLC em fase reversa ou eletroforese. Para alguns conjugados de anticorpo-fármaco, p pode ser limitado pelo número de sítios de ligação no anticorpo. Por exemplo, um anticorpo pode apresentar apenas um ou vários grupos cisteína tiol ou pode apresentar apenas um ou vários grupos tiol suficientemente reativos através dos quais um ligante pode ser ligado. Carregamento de fármaco mais alto, por exemplo, p >5, pode causar agregação, insolubilidade, toxicidade ou perda de permeabilidade celular de certos conjugados de anticorpo-fármaco.
[0484]Tipicamente, menos do que o máximo teórico de porções de fármaco é conjugado a um anticorpo durante uma reação de conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, muitos resíduos de lisina que não reagem com o intermediário de ligante-fármaco (X-L-D) ou reagente ligante. Apenas os grupos lisina mais reativos podem reagir com um reagente ligante reativo com amina. Além disso, apenas os grupos cisteína tiol mais reativos podem reagir com um reagente ligante reativo com tiol ou intermediário de ligante-fármaco. Em geral, os anticorpos não contêm muitos, se algum, grupos cisteína tiol livres e reativos que podem ser ligados a uma porção de fármaco. Mais resíduos de cisteína tiol nos anticorpos dos compostos existem como pontes dissulfeto e devem ser reduzido com um agente redutor, tal como ditiotreitol (DTT) ou TCEP, sob condições de redução parciais ou totais. O carregamento (razão fármaco/anticorpo, “DAR”) de um ADC pode ser controlado em várias maneiras diferentes, incluindo: (i) limitação do excesso molar do intermediário de ligante-fármaco ou reagente ligante em relação ao anticorpo, (ii) limitação do tempo ou temperatura da reação de conjugação e (iii) limitação parcial ou das condições redutivas para a modificação de cisteína tiol.
[0485]Onde mais do que um grupo nucleofílico ou eletrofílico do anticorpo reage com um intermediário de ligante-fármaco ou reagente ligante, seguido por reagente da porção de dímero-fármaco, então o produto resultante é uma mistura de conjugado de anticorpo-fármaco com uma distribuição de porções de fármaco ligadas a um anticorpo, por exemplo, 1, 2, 3, etc. Métodos de cromatografia líquida, tais como fase reversa polimérica (PLRP) e interação hidrofóbica (HIC) podem separar compostos na mistura por meio do valor de carregamento de fármaco. As preparações de ADC com um valor de carregamento de fármaco único (p) podem ser isoladas, entretanto, estes ADCs com valor de carregamento único ainda podem ser misturas heterogêneas porque as porções de fármaco podem ser ligadas por intermédio do ligante em sítios diferentes no anticorpo. Assim, as composições de conjugado de anticorpo-fármaco da invenção incluem misturas de compostos de conjugado de an- ticorpo-fármaco onde o anticorpo apresenta uma ou mais porções de fármaco e onde as porções de fármaco podem ser ligadas ao anticorpo em vários resíduos de aminoácidos.
[0486]Assim, a presente invenção também compreende uma coleta de con- jugados onde cada conjugado apresenta a mesma fórmula, exceto para p. PORÇÕES DE FÁRMACO EXEMPLARES
[0487]Componentes de dímero de PBD exemplares não limitantes de ADCs apresentam a fórmula A ou B:
Figure img0054
e sais e solvatos dos mesmos, em que: a linha ondulada indica o sítio de ligação covalente ao ligante; as linhas pontilhadas indicam a presença opcional de uma ligação dupla entre C1 e C2 ou C2 e C3;
[0489]R22 é, independentemente, selecionado a partir de H, OH, =O, =CH2, CN, Rm, O Rm, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2- Rm, CO2 Rm e CO Rm e, opcionalmente, ainda selecionado a partir de halo ou di-halo, em que RD é, independentemente, selecionado a partir de Rm, CO2 Rm, CO Rm, CHO, CO2H e halo;
[0490]R66 e R99 são, independentemente, selecionados a partir de H, Rm, OH, O Rm, SH, S Rm, NH2, NH Rm, N Rm Rp, NO2, Me3Sn e halo;
[0491]R77 é, independentemente, selecionado a partir de H, Rm, OH, O Rm, SH, S Rm, NH2, NH Rm, N Rm Rp, NO2, Me3Sn e halo;
[0492]Q é, independentemente, selecionado a partir de O, S e NH;
[0493]R11 é H ou Rm ou, onde Q é O, SO3M, onde M é um cátion metálico;
[0494]Rm e Rp são, independentemente, selecionados a partir de grupos alquila C1-C8 opcionalmente substituído, alquenila C2-C8, alquinila C2-C8, cicloalquila C3-C8, heterociclila C3-C8, arila C5-C20 e heteroarila C5-C20 e, opcionalmente, em relação ao grupo N Rm Rp, Rm e Rp junto com o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados formam um anel heterocíclico de 4, 5, 6 ou 7 membros opcionalmente substituído;
[0495]R12, R16, R19, R21 e R17 são definidos para R22, R66, R99, R11 e R77, respectivamente;
[0496]R” é um grupo alquileno C3-C12, em que a cadeia pode ser interrompida por um ou mais heteroátomos, por exemplo, O, S, N(H), NMe e/ou anéis aromáticos, por exemplo, benzeno ou piridina, em que os anéis são opcionalmente substituídos; e
[0497]X e X’ são, independentemente, selecionados a partir de O, S e N(H);
[0498]RC é um grupo de coroamento.
[0499]Em algumas formas de realização, R99 e R19 são H.
[0500]Em algumas formas de realização, R66 e R16 são H.
[0501]Em algumas formas de realização, R77 são R17 são OR7A, onde R7A é alquila C1-C4 opcionalmente substituído. Em algumas formas de realização, R7A é Me. Em outras formas de realização, R7A é CH2Ph.
[0502]Em algumas formas de realização, X é O.
[0503]Em algumas formas de realização, R11 é H. Em outras formas de realização, R11 é SO3M, onde M é um cátion metálico. O cátion pode ser Na+.
[0504]Em algumas formas de realização, não existe ligação dupla presente entre C1 e C2 e C2 e C3.
[0505]Em algumas formas de realização, existe uma ligação dupla entre C2 e C3 em cada unidade de monômero.
[0506]Em algumas formas de realização, uma ligação dupla está presente entre C2 e C3 quando R12 e/ou R22 é arila C5-20 ou alquila C1-C8.
[0507]Em algumas formas de realização, existe uma ligação dupla entre C1 e C2, em cada unidade de monômero.
[0508]Em algumas formas de realização, uma ligação dupla está presente entre C1 e C2 quando R12 e/ou R22 é arila C5-20 ou alquila C1-C8.
[0509]Em algumas formas de realização, R22 e R12 são, independentemente, selecionados a partir de H, =O, =CH2, Rm, =CH-RD e =C(RD)2.
[0510]Em algumas formas de realização, R22 e R12 são, independentemente, selecionados a partir de H e Rm.
[0511]Em algumas formas de realização, R22 e R12 são H.
[0512]Em algumas formas de realização, R22 e R12 são, independentemente, Rm. Em algumas formas de realização, R22 e R12 são, independentemente, arila C5C20 opcionalmente substituído. Em algumas formas de realização, R22 e R12 são, independentemente, arila C5-C7 opcionalmente substituído. Em algumas formas de realização, R22 e R12 são, independentemente, arila C8-C10 opcionalmente substituído. Em algumas formas de realização, R22 e R12 são, independentemente, fenila opcionalmente substituído.
[0513]Em algumas formas de realização, R22 e R12, independentemente carregam um a três grupos substituintes, com 1 e 2 sendo mais preferidos, e grupos unicamente substituídos sendo mais preferidos. Os substituintes podem estar em qualquer posição.
[0514]Onde R22 e/ou R12 é um grupo arila C5-C7, um substituinte único é, pre-ferivelmente, em um átomo no anel que não é adjacente à ligação ao restante do composto, isto é, preferivelmente, está β ou Y à ligação ao restante do composto. Portanto, onde o grupo arila C5-7 é fenila, o substituinte está, preferivelmente, nas posições meta ou para e, mais preferivelmente, está na posição para.
[0515]Onde R22 e/ou R12 são um arila C5-C20 opcionalmente substituído, os substituintes podem ser selecionados a partir de: Halo, Hidroxila, Éter, Formila, Acila, Carbóxi, Éster, Acilóxi, Amino, Amido, Acilamido, Aminocarbonilóxi, Ureido, Nitro, Ciano e Tioéter.
[0516]Em algumas formas de realização, R22 e R12 são, independentemente, selecionados a partir de =O, =CH2, =CH-RD e =C(RD)2. Dentro do composto de PBD, o grupo =CH-RD pode apresentar qualquer configuração mostrada abaixo:
Figure img0055
[0517]Em algumas formas de realização, a configuração é a configuração (I).
[0518]Em algumas formas de realização, R22 e R12 são =CH2.
[0519]Em algumas formas de realização, R” é selecionado a partir de um grupo alquileno C3, C5, C7 C9 e C11.
[0520]Em algumas formas de realização, R” é selecionado a partir de um grupo alquileno C3, C5 e C7.
[0521]Em algumas formas de realização, R” é um grupo alquileno C3 ou um grupo alquileno C5.
[0522]Em algumas formas de realização, um componente de dímero de PBD
Figure img0056
[0523]Em algumas formas de realização, um componente de dímero de PBD exemplar de um ADC apresenta a estrutura da Fórmula B(I):
Figure img0057
em que n é 0 ou 1.
[0524]Em algumas formas de realização, um componente de dímero de PBD exemplar de um ADC apresenta a estrutura da Fórmula A(II):
Figure img0058
em que n é 0 ou 1.
[0525]Em algumas formas de realização, um componente de dímero de PBD exemplar de um ADC apresenta a estrutura da Fórmula B(II):
Figure img0059
[0526]Outros componentes de dímero de PBD exemplares não limitantes de
Figure img0060
em que: a linha ondulada indica o sítio de ligação covalente ao ligante; a linha ondulada conectada a OH indica a configuração S ou R;
[0527]RV1 e RV2 são, independentemente, selecionados a partir de H, metila, etila e fenila (em que fenila pode ser opcionalmente substituído com flúor, particularmente, na posição 4) e heterocicloalquila C5-6; e n é 0 ou 1.
[0528]Em algumas formas de realização, RV1 e RV2 são, independentemente, selecionados a partir de H, fenila e 4-fluorofenila.
[0529]Outros componentes de dímero de PBD exemplares não limitantes de ADCs apresentam a Fórmula B(III):
Figure img0061
em que: a linha ondulada indica o sítio de ligação covalente ao ligante; a linha ondulada conectada a OH indica a configuração S ou R;
[0530]RV1 e RV2 são, independentemente, selecionados a partir de H, metila, etila e fenila (em que fenila pode ser opcionalmente substituído com flúor, particularmente, na posição 4) e heterocicloalquila C5-6; e
[0531]n é 0 ou 1.
[0532]Em algumas formas de realização, RV1 e RV2 são, independentemente, selecionados a partir de H, fenila e 4-fluorofenila.
[0533]Em algumas formas de realização, um componente de dímero de PBD
Figure img0062
[0534]em que Ar1 e Ar2 são, independentemente, arila C5-20 opcionalmente substituído ou heteroarila C5-20 e n é 0 ou 1. Ar1 e Ar2 podem ser similares ou dife- rentes.
[0535]Em algumas formas de realização, um componente de dímero de PBD exemplar de um ADC apresenta a estrutura da Fórmula B(IV):
Figure img0063
[0536]em que Ar1 e Ar2 são, independentemente, arila C5-20 opcionalmente substituído ou heteroarila C5-20a e n é 0 ou 1. Ar1 e Ar2 podem ser similares ou dife- rentes.
[0537]Em uma forma de realização, Ar1 e Ar2 em cada uma das formas de realização acima são, independentemente, selecionados a partir de fenila opcionalmente substituído, furanila, tiofenila e piridila.
[0538]Em uma forma de realização, Ar1 e Ar2 em cada uma das formas de realização acima é fenila opcionalmente substituído.
[0539]Em uma forma de realização, Ar1 e Ar2 em cada uma das formas de realização acima é tien-2-ila ou tien-3-ila opcionalmente substituído.
[0540]Em algumas formas de realização, um ligante pode ser ligado em um de vários sítios da porção de fármaco dímero de PBD, incluindo a imina N10 do anel B, a posição endo/exo C-2 do anel C ou a unidade amarrada ligando os anéis A (veja as estruturas C(I) e C(II) abaixo).
[0541]Componentes de dímero de PBD exemplares não limitantes de ADCs incluem as Fórmulas C(I) e C(II):
Figure img0064
[0542]As Fórmulas C(I) e C(II) são mostradas na sua forma imina N10-C11. Porções de fármaco de PBD exemplares também incluem a carbinolamina e as for mas carbinolamina protegidas, conforme mostrado na tabela abaixo:
Figure img0065
em que:
[0543]X é CH2 (n = 1 a 5), N ou O;
[0544]R77 e R17 são, independentemente, selecionados a partir de ORm e NR22b, onde Rm é uma cadeia de alquila primária, secundária ou terciária contendo 1 a 5 átomos de carbono;
[0545]R22a, R12a, R22b e R12b são, independentemente, selecionados a partir de H, grupos alquila C1-C8, alquenila C2-C8, alquinila C2-C8, arila C5-C20 (incluindo arilas substituídos), heteroarila C5-C20, -NH2, -NHMe, -OH e -SH, onde, em algumas formas de realização, as cadeias de alquila, alquenila e alquinila compreendem até 5 átomos de carbono;
[0546]R66 e R16 são, independentemente, selecionados a partir de H, OR, NHR e NR22b, onde R é uma cadeia de alquila primária, secundária ou terciária contendo 1 a 5 átomos de carbono;
[0547]R99 e R19 são, independentemente, selecionados a partir de H, Me e OMe;
[0548]R11a é selecionado a partir de grupos alquila C1-C8, alquenila C2-C8, al- quinila C2-C8, arila C5-20 (incluindo arilas substituídos por halo, nitro, ciano, alcóxi, alquila, heterociclila) e heteroarila C5-C20, onde, em algumas formas de realização, as cadeias de alquila, alquenila e alquinila compreendem até 5 átomos de carbono;
[0549]R11 é H, alquila C1-C8 ou um grupo de proteção (tal como acetila, trifluoroacetila, t-butoxicarbonila (BOC), benziloxicarbonila (CBZ), 9- fluorenilmetilenoxicarbonila (Fmoc) ou uma porção compreendendo uma unidade autoimolativa, tal como valina-citrulina-PAB);
[0550]R11a é H, alquila C1-C8 ou um grupo de proteção;
[0551]em que um hidrogênio de um entre R1, R22a, R12a, R22b , R12b ou R11a ou um hidrogênio do espaçador -OCH2CH2(X)nCH2CH2O- entre os anéis A é substituído com uma ligação conectada ao ligante do ADC.
[0552]Porções de dímero de PDB exemplares de ADC incluem, mas não são limitadas a (a linha ondulada indica o sítio de ligação covalente ao ligante):
Figure img0066
[0553]Formas de realização exemplares não limitantes de ADCs compreendendo dímeros de PBD e ligante peptidomimético incluem as seguintes estruturas:
Figure img0067
Figure img0068
[0554]Os dímeros de PBD e ADC compreendendo os dímeros de PBD podem ser preparados, de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598; WO 2013/055987.
SÍNTESE
[0555]Uma via de síntese possível a um intermediário de dímero da fórmula VIII é mostrada abaixo:
Figure img0069
Figure img0070
Figure img0071
[0556]No esquema acima, RL representa o grupo que se liga ao anticorpo, isto é, L/Str-PM-Sp-, ou um precursor de tal grupo. Em alguns métodos de síntese, o grupo inicial adicionado pode ser uma versão protegida de PM-Sp- a qual o grupo Str é adicionado após a desproteção.
[0557]Os compostos onde a unidade de PBD não ligada apresenta RC na posição N10 podem ser preparados por uma variação do método acima, onde ProtN é substituído por RC (ou um precursor, com transformação subsequente).
[0558]Em geral, dímeros não simétricos, com respeito às suas ligações N10- C11, podem ser preparados através do tratamento dos compostos de bis-amino da fórmula IV com um equivalente de um reagente de cloroformiato, de modo a quebrar a simetria das moléculas. A amina livre remanescente depois pode ser independentemente funcionalizada para introduzir a ligação do grupo precursor (RL). Outra manipulação de grupo funcional para fechar o anel B de PBD e remover os grupos de proteção fornece a molécula alvo.
[0559]Os compostos da fórmula IV são, tipicamente, preparados pela ligação de um fragmento anel C adequadamente funcionalizado (I) a um núcleo de dímero contendo anel A da fórmula II. Os fragmentos do anel C podem ser preparados a partir de conhecido blocos de construção de 4-oxoprolinato de metila protegidos com carbamato. A olefinação sob condições de Wittig ou Horner-Emmons pode ser utilizada para fornecer alcenos endo- ou exo-insaturados. Os fragmentos de anel C e anel A podem ser ligados sob condições padrão na presença de trietilamina, usando derivados de cloreto de ácido dos fragmentos de anel A para fornecer moléculas da fórmula III. A simetria também pode ser quebrada neste estágio através da introdução de anéis C diferentes. Os compostos of tipo III podem ser reduzidos, sem afetar a insaturação endo ou exo do anel C, com zinco em ácido acético ou fórmico para fornecer as moléculas da fórmula IV.
[0560]Alternativamente, um bloco de construção de 4-hidróxi pirrolidina adequado pode ser ligado a um núcleo de dímero da fórmula II. Os grupos hidroxila podem ser oxidados em cetonas e depois convertidos em triflatos de enol. A ligação de Suzuki pode ser usado para introduzir os substituintes pró C2 (por exemplo, arila, alquenila etc). Os grupos nitro depois podem ser reduzidos em aminas, uma amina é protegida deixando a outra livre para carregar o grupo ligante.
[0561]Carbamatos não simétricos do tipo VI podem ser preparados através do tratamento de bis-aminas do tipo IV com um equivalente único de cloroformiatos comercialmente disponíveis (ou facilmente preparados) na presença de piridina ou trietilamina. Cloroformiatos podem ser selecionados para fornecer grupos de proteção nitrogênio com base em carbamato apropriados (ProtN) que são ortogonais àqueles usados no grupo pró-ligante (RL). O carbamato RL pode ser introduzido através da conversão do grupo amino remanescente em um isocianato e extinção do mesmo com o álcool RL. Alternativamente, o álcool RL pode ser convertido em um cloroformiato ou equivalente funcional (fluoroformiato, p-nitrocarbonato, pentafluorocarbonato ou carbonato de hidroxibenzotriazol). Finalmente, o grupo amino rema-nescente pode ser convertido em um p-nitrocarbamato reativo, pentafluorocarbama- to ou carbamato de hidroxibenzotriazol que pode ser deslocado com o álcool RL para fornecer moléculas da fórmula VI.
[0562]As moléculas da fórmula VII podem ser preparadas a partir das moléculas da fórmula VI através da remoção dos grupos de proteção silila, com, por exemplo, ácido acético aquoso. A oxidação com periodinana de Dess-Martin (ou, alternativamente, TPAP/NMO, PDC ou sob condições de Swern) fornece o produto fechado no anel.
[0563]Os conjugados da fórmula V podem ser preparados a partir das moléculas da fórmula VII através da remoção do grupo de proteção nitrogênio com base em carbamato.
COMPOSTO II
[0564]A síntese dos compostos da fórmula (II) é descrita no WO 2006/111759 e também é descrita por Gregson et al. (J. Med. Chem. 2001, 44, 1161 a 1174). A preparação do composto (II), conforme descrito nos mesmos, é, especificamente, incorporada como referência neste relatório.
[0565]Referência também é feita aos métodos conhecidos para sintetizar os dímeros de PBD, incluindo aqueles revisados em Antonow, D. e Thurston, D.E., Chem. Rev. 2011 111 (4), 2815 a 2864.
[0566]Outra divulgação relevante pode ser encontrada no WO 2010/091150. Os compostos intermediários descritos no WO 2010/091150 também podem ser utilizados nos métodos descritos acima. INDICAÇÕES E MÉTODOS DE TRATAMENTO
[0567]É considerado que os conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) da presente invenção podem ser usados para tratar várias doenças ou transtornos, por exemplo, caracterizados pela superexpressão de um antígeno de tumor. Condições exemplares ou transtornos hiperproliferativos incluem tumores sólidos benignos ou malignos e transtornos hematológicos, tais como leucemia e malignidades linfoides. Outros incluem transtornos neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicos, glandulares, macrofágicos, epiteliais, estromais, blastocélicos, inflamatórios, angiogênicos e imu- nologicos, incluindo autoimunes.
[0568]Em certas formas de realização, um ADC da invenção compreendendo um anticorpo anti-NaPi3b, tal como aqueles descritos acima, é usado em um método para tratar tumor sólido, por exemplo, de ovário.
[0569]Em uma outra forma de realização, um ADC da invenção compreendendo um anticorpo anti-CD33, tal como aqueles descritos neste relatório, é usado em um método para tratar malignidades hematológicas, tais como linfoma não- Hodgkin (NHL), linfoma hematopoiético grande difuso, linfoma folicular, linfoma de células do manto, leucemia linfocítica crônica, mieloma múltiplo, leucemia mieloide aguda (AML) e leucemia mielocítica (MCL) e incluindo cânceres relacionados às células B e transtornos proliferativos. Veja: US 8226945; Li et al. (2013) Mol. Cancer. Ther. 12(7):1255 a 1265; Polson et al. (2010) Leukemia 24:1566 a 1573; Polson et al. (2011) Expert Opin. Investig. Drugs 20(1):75 a 85, os conteúdos dos quais são incorporados como referência.
[0570]Em uma outra forma de realização, um ADC da invenção compreendendo um anticorpo anti-MUC16, tal como aqueles descritos neste relatório, é usado em um método para tratar cânceres de ovário, mama e pancreáticos. O câncer pode estar associado com a expressão ou atividade de um polipeptídeo MUC16/CA125/O772P. Veja: WO 2007/001851; US 7989595; US 8449883; US 7723485; Chen et al. (2007) Cancer Res. 67(10): 4924 a 4932; Junutula, et al., (2008) Nature Biotech., 26(8):925 a 932, os conteúdos dos quais são incorporados como referência.
[0571]Em certas formas de realização, um ADC da invenção compreendendo um anticorpo anti-HER2, tal como aqueles descritos acima, é usado em um método para tratar câncer, por exemplo, câncer de mama ou gástrico, mais especificamente, câncer de mama ou gástrico HER2+, em que o método compreende administrar tal ADC a um paciente em necessidade de tal tratamento. Em tal forma de realização, o ADC compreende o anticorpo anti-HER2 trastuzumabe ou pertuzumabe.
[0572]Em geral, a doença ou transtorno que será tratado é uma doença hi- perproliferativa, tal como câncer. Exemplos de câncer que será tratado neste relatório incluem, mas não são limitados a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leu cemia ou malignidades linfoides. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluem câncer de células escamosas (por exemplo, câncer de células escamosas epite- lial), câncer de pulmão, incluindo câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritôneo, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estômago, incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de reto, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândulas salivares, câncer hepático ou renal, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer da tireoide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, assim como câncer de cabeça e pescoço.
[0573]Doenças autoimunes para as quais o conjugado de anticorpo-fármaco pode ser usado no tratamento incluem transtornos reumatológicos (tais como, por exemplo, artrite reumatoide, síndrome de Sjogren, esclerodermia, lúpus, tal como lúpus eritematoso sistêmico (SLE) e nefrite lúpica, polimiosite/dermatomiosite, crio- globulinemia, síndrome do anticorpo antifosfolipídico e artrite psoriática), osteoartrite, transtornos gastrointestinais e hepáticos autoimunes (tais como, por exemplo, doenças inflamatórias intestinais (por exemplo, colite ulcerativa e doença de Crohn), gastrite autoimune e anemia perniciosa, hepatite autoimune, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária e doença celíaca), vasculite (tal como, por exemplo, vasculite associada a ANCA, incluindo vasculite de Churg-Strauss, granulomatose de Wegener e poliarteriite), transtornos neurológicos autoimunes (tais como, por exemplo, esclerose múltipla, síndrome de opsoclonia-mioclonia, miastenia gravis, neuromielite óptica, doença de Parkinson, doença de Alzheimer e polineuropatias autoimunes), transtornos renais (tais como, por exemplo, glomerulonefrite, síndrome de Goodpasture e doença de Berger), transtornos dermatológicos autoimunes (tais como, por exemplo, psoríase, urticária, pênfigo vulgar, penfigoide bolhoso e lúpus eritematoso cutâneo), transtornos hematológicos (tais como, por exemplo, púrpura trombocitopênica, púrpura trombocitopênica trombótica, púrpura pós-transfusão e anemia hemolítica autoimune), aterosclerose, uveíte, doenças auditivas autoimunes (tais como, por exemplo, doença do ouvido interno e perda auditiva), doença de Behcet, síndrome de Raynaud, transplante de órgãos e transtornos endócrinos au- toimunes (tais como, por exemplo, doenças autoimunes diabéticas, tais como diabetes mellitus insulino-dependente (IDDM), doença de Addison e doença da tireoide autoimune (por exemplo, doença de Graves e tireoidite)). Tais doenças mais preferidas incluem, por exemplo, artrite reumatoide, colite ulcerativa, vasculite associada a ANCA, lúpus, esclerose múltipla, síndrome de Sjogren, doença de Graves, IDDM, anemia perniciosa, tireoidite e glomerulonefrite.
[0574]Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de um ADC dependerá do tipo de doença que será tratada, conforme definido acima, da severidade e curso da doença, se a molécula é administrada para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, histórico clínico do paciente e resposta ao anticorpo e critérios do médico. A molécula é adequadamente administrada ao paciente em uma vez ou em uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e severidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 a 20 mg/kg) de molécula é uma dosagem candidata inicial para a administração ao paciente, se, por exemplo, por meio de uma ou mais administrações separadas ou por meio de infusão contí-nua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Uma dosagem exemplar de ADC que será administrada a um paciente está na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg de peso do paciente.
EXPERIMENTOS MÉTODOS EXPERIMENTAIS GERAIS MÉTODO DE HPLC ANALÍTICA
[0575]LC/MS (Shimadzu LCMS-2020) usando uma fase móvel de água (A) (ácido fórmico a 0,1 %) e acetonitrila (B) (ácido fórmico a 0,1 %). Gradiente: composição inicial B a 5 % mantida durante 0,25 minuto, depois aumento de B a 5 % para B a 100 % durante um período de 2 minutos. A composição foi mantida durante 0,50 minuto em B a 100 %, depois retornadas para B a 5 % em 0,05 minuto e manter durante 0,05 minuto. O tempo de condução de gradiente total é igual a 3 minutos. Taxa de fluxo 0,8 mL/min. Faixa de detecção de comprimento de onda: 190 a 800 nm. Temperatura do forno: 50 °C. Coluna: Waters Acquity UPLC BEH Shield RP18 1,7 μm 2,1 x 50 mm.
MÉTODO DE HPLC PREPARATIVA
[0576]A cromatografia líquida de ultra-alto-desempenho em fase reversa (UPLC) foi realizada em uma coluna Phenomenex Gemini NX 5μ C-18 150 x 21,20 mm para trabalho preparativo. Todos os experimentos foram realizados com as condições de gradiente: composição fixada inicial B a 13 % a B a 75 % durante 15 min, mantida durante 2,0 min em B a 75 %, depois B a 75 % a B a 13 % durante 0,10 min mantida em 13 % durante 2,90 min. A duração total de gradiente conduzido foi de 20,00 min. Os eluentes usados foram solvente A (H2O com Ácido fórmico a 0,1 %) e solvente B (CH3CN com Ácido fórmico a 0,1 %). A taxa de fluxo usada foi 20,0 ml/min para HPLC preparativa. A detecção foi em 254 e 280 nm. SÍNTESE DE INTERMEDIÁRIOS a)1-[[(1S)-1-[[4-(Hidroximetil)fenil]carbamoil]-4-ureido- butil]carbamoil]ciclobutancarboxilato de alila (18)
Figure img0072
(i)A uma solução do composto I1 (4,0 g, 10,0 mmols) em mistura de DCM e MeOH (100 mL/50 mL), foram adicionados 4-amino-fenil-metanol (I2) (1,60 g, 13 mmols, 1,3 eq) e EEDQ (3,2 g, 13 mmols, 1,3 eq). Depois que a mistura foi agitada na temperatura ambiente durante 16 horas sob N2, LCMS mostrou que o composto I1 foi consumido. A mistura foi concentrada para fornecer um sólido marrom, e MTBE (200 mL) foi adicionado e a mistura foi agitada a 15 °C durante 2 horas. O sólido foi coletado e lavado com MTBE (50 mL x 2) para fornecer I3 (4,2 g, 84 %) como um sólido laranja. LCMS (ESI, 5 - 95/1,5 min): temperatura ambiente = 0,807 min, M+H+ = 503,0; RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,98 (s, 1 H), 7,89 (d, J = 7,2 Hz, 2 H), 7,73 (d, J = 4,8 Hz, 2 H), 7,70 - 7,65 (m, 1 H), 7,56 (d, J = 8,4 Hz , 2 H), 7,41 (d, J = 7,2 Hz, 2 H), 7,33 - 7,32 (m, 2 H), 7,24 (d, J = 8,4 Hz , 2 H), 5,99 (m, 1 H), 5,42 (s, 2 H), 5,11 - 5,08 (t, J = 5,6 Hz ,1 H), 4,36 (d, J = 5,6 Hz, 2 H), 4,27 (s, 2 H), 4,26 - 4,18 (m, 2 H), 3,33 - 2,94 (m, 2 H), 1,67 - 1,59 (m, 2 H), 1,47 - 1,40 (m, 2 H). (ii)A uma solução agitada do composto I3 (4,2 g, 8,3 mmols) em DMF seco (20 mL), foi adicionada piperidina (1,65 mL, 17 mmols, 2,0 eq) às gotas na temperatura ambiente. A mistura foi agitada na temperatura ambiente durante 30 minutos, e o sólido começou a precipitar. DCM seco (50 mL) foi adicionado, e a mistura tornou- se transparente imediatamente. A mistura foi agitada na temperatura ambiente durante 30 min adicionais, LCMS mostrou que o composto I3 foi consumido. Ele foi concentrado sob pressão reduzida para remover piperidina, e o resíduo foi particionado entre EtOAc e H2O (50 mL/20 mL). A fase aquosa foi lavada com EtOAc (50 mL x 2) e concentrada para fornecer o composto I4 (2,2 g, 94 %) como um óleo (continha pequena quantidade de DMF). RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,95 (s, 1 H), 7,58 (d, J = 8,4 Hz, 2 H), 7,23 (d, J = 8,4 Hz, 2 H), 5,96 - 5,93 (m, 1 H), 5,37 (s, 2 H), 5,15 - 5,05 (m, 1 H), 4,42 (s, 2 H), 3,25 (m, 1 H), 3,0 - 2,9 (m, 2 H), 1,65 - 1,35 (m, 4 H). (iii)A uma solução do composto I5 (8,0 g, 29,7 mmols) em DME (50 mL) foi adicionada uma solução do composto I4 (6,0 g, 21,4 mmols) e NaHCO3 (7,48 g, 89,0 mmols) em água (30 mL). A mistura foi agitada na temperatura ambiente durante 16 horas. A mistura foi concentrada à secura sob pressão reduzida, e o resíduo foi purificado através de cromatografia em coluna (DCM:MeOH = 10:1) para fornecer o composto I6 bruto (6,4 g, 68,7 %) como um sólido branco. LCMS (ESI, 5 - 95/1,5 min): temperatura ambiente = 0,692 min, M+H+ = 435,0. (iv)A uma solução agitada do composto I6 (6,4 g, 14,7 mmols) em THF/MeOH (20 mL/10 mL) foi adicionada uma solução de LiOH-HaO (1,2 g, 28,6 mmols) em H2O (20 mL) na temperatura ambiente. Depois que a mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 16 horas, o solvente foi removido sob pressão reduzida, e o resíduo foi purificado através de pré-HPLC para fornecer o composto I7 (3,5 g, 58,5 %). LCMS (ESI, 5 - 95/1,5 min): temperatura ambiente = 0,575 min, M+H+ = 406,9. RMN de 1H (400 MHz, Metanol-d4) δ 8,86 (d, J = 8,4 Hz, 2 H), 8,51 (d, J = 8,4 Hz, 2 H), 5,88 - 5,86 (m, 2 H), 5,78 (s, 2 H), 4,51- 4,49 (m, 3 H), 4,38 - 4,36 (m, 1 H), 3,86 - 3,84 (m, 1 H), 3,84 - 3,82 (m, 2 H), 3,82 - 3,80 (m, 1 H), 3,30 - 3,06 (m, 3 H), 2,96 - 2,91 (m, 1 H), 2,82 - 2,74 (m, 2 H). (v)A uma mistura do composto I7 (1,30 g, 3,2 mmols) em DMF (10 mL) foi adicionado KF (0,557 g, 9,6 mmols) e Bu4N+HSO-4 (0,101 g, 0,9 mmol). O composto I8 (0,50 mL, excesso) foi adicionado às gotas. A mistura foi agitada a 13 °C durante 2 horas, e LCMS mostrou a formação do composto 18 (86 %) em 254 nm. A mistura foi concentrada e purificada através de cromatografia em coluna (MeOH 10 % - 15 % em DCM) para fornecer o produto como um óleo (1,1 g). O óleo foi dissolvido em água e seco através de liofilização para fornecer 18 como um pó (1,0 g, 70 %). A análise SFC mostrou 89,4 % ee. LCMS (ESI, 5 - 95/1,5 min): temperatura ambiente = 0,721 min, M+H+ = 447,0. RMN de 1H (400 MHz, Metanol-d4) δ 7,58 (d, J = 8,8 Hz, 2 H), 7,31 (d, J = 8,0 Hz, 2 H), 6,01 - 5,93 (m, 1 H), 5,35 (dd, J = 16,8 Hz, 1 H), 5,24 - 5,21 (m, J = 9,6 Hz,1 H), 4,69 - 4,68 (d, J = 5,6 Hz, 1 H), 4,56 - 4,53 (m, 3 H), 3,25 - 3,05 (m, 2 H), 2,70 - 2,50 (m, 4 H), 2,10 - 2,00 (m, 1 H), 2,00 - 1,89 (m, 2 H), 1,76 - 1,58 (m, 1 H), 1,58 - 1,49 (m, 2 H). b)(2S)-2-[4-[(1S)-1-Amino-2-metil-propil]triazol-1-il]-N-[4-(hidroximetil)fenil]-5- ureido-pentanamida (10)
Figure img0073
(i)A solução de NaN3 (20 g, 285,7 mmols) foi dissolvida em H2O destilada (75 mL) e DCM (100 mL) foi adicionado. Ela foi esfriada em um banho de gelo e Tf2O (19,2 mL, 114,28 mmols) foi adicionado lentamente durante 30 min, enquanto a agitação foi continuada durante 3 h. A mistura foi colocada em um funil de separação e a fase de CH2CI2 coletada. A porção aquosa foi extraída com CH2CI2 (50 mL * 2). As frações orgânicas, contendo a triflil azida foram agrupadas e lavadas uma vez com Na2CO3 saturado (150 mL) e usadas sem purificação adicional. O composto I9 (10 g, 57,14 mmols) foi combinado com K2CO3 (11,83 g, 85,7 mmols) e CuSO4^5H2Ü (1,43 g, 5,71 mmols), H2O destilada (50 mL) e MeOH (100 mL). A triflil azida em CH2Cl2 (120 mL) gerado acima foi adicionada e a mistura foi agitada na temperatura ambiente durante a noite. Subsequentemente, os solventes orgânicos foram removidos sob pressão reduzida e a suspensão aquosa foi diluída com H2O (100 mL). Ela foi acidificada ao pH 6 com HCl conc. e diluída com tampão fosfato 0,2 M pH 6,2 (150 mL) e lavada com EtOAC (100 mLx3) para remover subproduto de sulfonami- da. A fase aquosa depois foi acidificada ao pH 2 com HCl conc. Ela foi extraída com EtOAc/MeOH (20:1) (100 mLx4). As extrações de EtOAc/MeOH foram combinadas, secas em Na2SO4 e evaporadas para fornecer o composto I10 sem purificação adicional (10 g, 87 %). (ii)A uma solução do composto I11 (18,00 g, 108,36 mmols) em THF anidro (300 mL) foi adicionado NaH (5,2 g, 130,03 mmols) a 0 oC. A mistura foi agitada a 0 °C durante 1 hora, depois o composto I12 (25,64 g, 130,03 mmols) foi adicionado lentamente na mistura. A mistura de reação foi agitada a 0 °C durante 0,5 hora. A mistura foi filtrada, concentrada, e purificada através de cromatografia em coluna em gel de sílica (PE: EtOAc = 1:1) para fornecer o produto desejado I13 (20 g, 96 %).
[0577]RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 3,84 (s, 3 H), 3,81 (s, 3 H), 2,25 (s, 3 H).
[0578](iii) A uma mistura do composto I14 (20,0 g, 79,59 mmols) em DCM anidro (150 mL) foi adicionado Et3N (24,16 g, 238,77 mmols) e HATU (45,40 g, 119,39 mmols). A mistura foi agitada na temperatura ambiente durante 15 minutos, depois NHMe(OMe) HCl (11,65 g, 119,39 mmols) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi diluída com DCM, lavada com Na2CO3 aq. Saturado (100 mL x 3), ácido cítrico saturado (100 mL x 3) e salmoura (100 mL). A camada orgânica foi seca, concentrada, e purificada através de cromatografia em coluna em gel de sílica (PE: EtOAc = 10: 1) para fornecer o produto desejado I15 (20,0 g, 85,4 %). RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,97 (s, 1 H), 7,73 (d, J = 9,2 Hz, 1 H), 7,36 - 7,29 (m, 5 H), 6,01 (s, 1 H), 5,40 (dd, J = 5,2 Hz, 1 H), 5,08 - 4,99 (m, 2 H), 4,58 (dd, J = 2,8 Hz, 1 H), 2,99 - 2,94 (m, 2 H), 2,21 - 2,02 (m, 4 H), 1,02 - 1,33 (m, 2 H), 0,86 - 0,77 (m, 6 H).
[0579](iv) O composto I15 (12 g, 40,77 mmols) foi dissolvido em DCM anidro (40 mL) e a solução resultante foi esfriada a -78 °C com um banho de gelo se- co/acetona. DIBAL-H (122,3 mL, 122,3 mmols, 1,0 M em tolueno) foi adicionado às gotas e a solução resultante foi agitada a -78 °C durante 4 horas. O excesso de hi- dreto foi interrompido pela adição de MeOH (40 mL) a -78 °C e a solução resultante foi aquecida até a temperatura ambiente. A solução foi evaporada para fornecer o composto I16 (~ 9,2 g, 96 %) sem purificação adicional.
[0580](v) A uma solução do composto I16 (bruto, ~9,2 g, 39,1 mmols) e composto I13 (11,27 g, 58,65 mmols) em MeOH (150 mL) foi adicionado K2CO3 (16,2 g, 117,3 mmols). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi concentrada a vácuo, e purificada através de cromatogra- fia em coluna em gel de sílica (PE: EtOAc = 50:1) para fornecer o produto desejado I17 (4 g, 44 %).
[0581](vi) À solução do composto I17 (4,0 g, 17,29 mmols) e composto I10 (4,17 g, 20,75 mmols) em DMF (15 mL) foi adicionado Cu(CH3CN)4PF6 (1,29 g, 3,46 mmols). A mistura de reação foi agitada a 60 °C durante 2 horas. A mistura foi purificada para fornecer o composto I18 (5,0 g, 66,8 %).
[0582]RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,97 (s, 1 H), 7,73 (d, J = 9,2 Hz, 1 H), 7,36 - 7,29 (m, 5 H), 6,01 (s, 1 H), 5,40 (dd, J = 5,2 Hz, 1 H), 5,08 - 4,99 (m, 2 H), 4,58 (dd, J = 2,8 Hz, 1 H), 2,99 - 2,94 (m, 2 H), 2,21 - 2,02 (m, 4 H), 1,02 - 1,33 (m, 2 H), 0,86 - 0,77 (m, 6 H).
[0583](vii) A uma solução do composto I18 (bruto, ~3,8 g, 8,79 mmols) em DMF (15 mL) foi adicionado EEDQ (4,34 g, 17,58 mmols) e composto I19 (1,62 g, 13,18 mmols) a 0oC. A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente sob N2 durante a noite. A mistura foi purificada através de HPLC prep para fornecer o composto I20 (650 mg, 13,7 %). RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,52 (d, J = 6,8 Hz, 1 H), 8,05 (s, 1 H), 7,72 (d, J = 9,2 Hz, 2 H), 7,33 - 7,23 (m, 7 H), 6,01 (s, 1 H), 5,47 - 5,43 (m, 3 H), 5,04 - 4,96 (m, 2 H), 4,59 - 4,54 (m, 1 H), 4,41 (s, 2 H), 3,04 - 2,94 (m, 3 H), 2,09 - 1,97 (m, 4 H), 1,24 (t, J = 6,4 Hz, 2 H), 0,82 - 0,74 (m, 6 H).
[0584](viii) À reação do composto I20 (650 mg, 1,21 mmol) em MeOH (15 mL) foi adicionado Pd/C (300 mg). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente sob H2 durante 2 horas. A mistura de reação foi filtrada e o filtrado foi concentrado para fornecer 10 (450 mg, 92 %). LCMS (ESI): temperatura ambiente = 0,611 min, M+H+ = 404,0 método = 5 - 95/1,5 min. RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,55 (s, 1 H), 8,03 (d, J = 7,6 Hz, 1 H), 7,51 (d, J = 8,4 Hz, 2 H), 7,23 (d, J = 8,4, 2 H), 6,05 (t, J = 5,6 Hz, 1 H), 5,46 - 5,42 (m, 3 H), 5,14 (s, 1 H), 4,40 (s, 2 H), 3,76 (d, J = 5,2 Hz, 2 H), 3,00 - 2,93 (m, 3 H), 2,09 - 2,04 (m, 2 H), 1,90 - 1,87 (m, 1 H), 1,25 - 1,21 (m, 2 H), 0,82 - 0,77 (m, 6 H). (c) N-[(1S)-1-[1-[(1S)-1-[[4-(Hidroximetil)fenil]carbamoil]-4-ureido-butil]triazol- 4-il]-2-metil-propil]carbamato de alila (2)
Figure img0074
Figure img0075
(i)A uma mistura do composto I21 (20,0 g, 79,59 mmols) em DCM anidro (150 mL) foi adicionado Et3N (24,16 g, 238,77 mmols) e HATU (45,40 g, 119,39 mmols). Depois que a mistura foi agitada na temperatura ambiente durante 15 minutos, NHMe(OMe) HCl (11,65 g, 119,39 mmols) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi diluída com DCM, e lavada com Na2CO3 aq. saturado (100 mL x 3), ácido cítrico saturado (100 mL x 3) e salmoura (100 mL). A camada orgânica foi seca, concentrada, e purificada através de cromatografia em coluna em gel de sílica (PE: EtOAc = 2:1) para fornecer o produto desejado I22 (20,0 g, 85,4 %). (ii)O composto I22 (5,0 g, 16,99 mmols) foi dissolvido em CH2Cl2 anidro (20 mL) e a solução resultante foi esfriada a -78 °C em um banho de gelo seco/acetona. DIBAL-H (51,0 mL, 51,00 mmols, 1,0 M em tolueno) foi adicionado às gotas e a solução resultante foi agitada a -78 °C durante 4 horas. Excesso de hidreto foi interrompido pela adição de MeOH (10 mL) a -78 °C e a solução resultante foi aquecida até a temperatura ambiente. A solução foi evaporada para fornecer o composto I23 (~ 3,2 g, 80 %) sem purificação adicional. (iii)A uma solução do composto I24 (6,00 g, 36,12 mmols) em THF anidro (200 mL) foi adicionado NaH (1,73 g, 43,34 mmols) a 0 oC. A mistura foi agitada a 0 °C durante 1 hora, depois o composto I25 (7,12 g, 36,12 mmols) foi adicionado lentamente. A mistura resultante foi agitada a 0 °C durante 0,5 horas. A mistura foi filtrada, concentrada, e purificada através de cromatografia em coluna em gel de sílica (EtOAc) para fornecer o produto desejado (6,0 g, 86,5 %). RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 3,76 (s, 3 H), 3,73 (s, 3 H), 2,22 (s, 3 H). (iv)A uma solução do composto I23 (bruto, ~3,20 g, 13,60 mmols) e composto I26 (5,23 g, 27,20 mmols) em MeOH (50 mL) foi adicionado K2CO3 (5,64 g, 40,80 mmols). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi concentrada a vácuo, e purificada através de cromatografia em coluna em gel de sílica (PE: EtOAc = 5:1) para fornecer o produto desejado I27 (2,00 g, 63,6 %). RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,77 (d, J = 8,8 Hz, 1 H), 7,39 - 7,30 (m, 5 H), 5,04 (s, 2 H), 4,12 - 4,07 (m, 1 H), 3,19 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 1,83 - 1,74 (m, 1 H), 0,94 (d, J = 6,8 Hz, 3 H), 0,90 (d, J = 6,8 Hz, 3 H). (v)A uma solução do composto I27 (2,90 g, 12,54 mmols) em HOAc (20 mL) foi adicionado solução de HBr aq. (30 mL, 148,31 mmols). Depois que a mistura de reação foi agitada a 40 °C durante 3 horas, ela foi concentrada a vácuo para remover o solvente. O resíduo foi absorvido através de H2O (40 mL), e lavado com EtOAc (20 mL x 3). A camada aquosa foi ajustada ao pH 10 através de uma solução de Na2CO3, e extraída com EtOAc novamente (20 mL x 3). A camada orgânica combinada foi seca em Na2SO4, filtrada, ajustada ao pH 5 através de HCOOH, e concentrada para fornecer o produto desejado I28 como um sal (1,20 g, 66,8 %). RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 3,89 (dd, J = 5,2 Hz, 2,0 Hz, 1 H), 3,59 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 1,83 - 1,74 (m, 1 H), 0,96 (dd, J = 6,4, 4,8 Hz, 6 H). (vi)A uma solução do composto I28 (1,30 g, 9,08 mmols) em THF/H2O (20 mL/4 mL) foi adicionado K2CO3 (3,76 g, 27,24 mmols). Alloc-Cl (1,64 g, 13,62 mmols) foi adicionado às gotas na mistura a 0 oC. A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 0,5 horas. A mistura foi extraída com EtOAc (20 mL x 3) e lavada com H2O (20 mL). A camada orgânica combinada foi seca em Na2SO4, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado através de cromatografia em coluna em gel de sílica (PE: EtOAc = 5:1) para fornecer o composto I29 (1,3 g, 79,0 %). RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,71 (d, J = 8,8 Hz, 1 H), 5,96 - 5,86 (m, 1 H), 5,31 - 5,26 (m, 1 H), 5,20 - 5,16 (m, 1 H), 4,48 (d, J = 5,2 Hz, 2 H), 4,09 - 4,04 (m, 1 H), 3,19 (d, J = 2,0 Hz, 1 H), 1,82 - 1,73 (m, 1 H), 0,94 (d, J = 6,8 Hz, 3 H), 0,89 (d, J = 6,8 Hz, 3 H). (vii)A solução de NaN3 (7,80 g, 119,98 mmols) foi dissolvida em H2O destilada (20 mL) e CH2Cl2 (40 mL) foi adicionado. Ela foi esfriada em um banho de gelo e Tf2O (3,0 mL, 19,65 mmols) foi adicionado lentamente durante 5 min e agitado durante um adicional de 2 horas. A mistura foi colocada em um funil de separação e a fase de CH2Cl2 coletada. A porção aquosa foi extraída com CH2Cl2 (30 mL x 2). As frações orgânicas, contendo a triflil azida foram agrupadas e lavadas uma vez com Na2CO3 saturado (40 mL) e usadas sem purificação adicional. O composto I30 (1,80 g, 10,27 mmols), K2CO3 (2,13 g, 15,41 mmols) e CuSO4«5HaO (257 mg, 1,03 mmol) foi misturado em H2O destilada (40 mL) e MeOH (80 mL). A triflil azida em CH2Cl2 (100 mL) gerado acima foi adicionada e a mistura foi agitada na temperatura ambiente durante a noite. Subsequentemente, os solventes orgânicos foram removidos sob pressão reduzida e a suspensão aquosa foi diluída com H2O (50 mL). Ela foi acidificada ao pH 6 com HCl conc. e diluída com tampão fosfato 0,2 M pH 6,2 (50 mL) e lavada com EtOAc (100 mLx3) para remover subproduto de sulfonamida. A fase aquosa depois foi acidificada ao pH 2 com HCl conc. Ela foi extraída com EtO- Ac/MeOH (20:1) (100 mLx4). Estas extrações de EtOAc/MeOH foram combinadas, secas em Na2SO4 e evaporadas para fornecer o composto I31 sem purificação adicional (1,6 g, 77,4 %). (viii)À solução do composto I31 (1,70 g, 8,45 mmols) e composto I29 (1,23 g, 6,76 mmols) em DMF (10 mL) foi adicionado Cu(CH3CN)4PF6 (315 mg, 0,85 mmol). A mistura de reação foi agitada a 50 °C durante 2 horas, e a mistura foi usada diretamente para a etapa seguinte. (ix)À mistura do composto I32 (bruto, ~2,50 g, 6,54 mmols) em DMF (15 mL) foi adicionado EEDQ (2,42 g, 9,81 mmols) e composto I33 (1,21 g, 9,81 mmols). A mistura de reação foi agitada a 0 °C~r.t sob proteção de N2 durante a noite. A mistura foi purificada através de HPLC prep (FA) para fornecer o produto bruto, depois lavada com MTBE para fornecer o produto puro. Depois da separação de SFC, 2 (1,10 g, 34,5 %) e 2’ (220 mg, 6,9 %) foram obtidos.
[0585]2: LCMS (ESI): temperatura ambiente = 0,973 min, M+H+ = 488,0. método = 10 - 80/2 min. RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,53 (s, 1 H), 8,08 (s, 1 H), 7,66 (d, J = 9,6 Hz, 1 H), 7,54 (dd, J = 6,8, 2,0 Hz, 2 H), 7,26 (d, J = 8,4 Hz, 2 H), 6,02 (t, J = 5,6 Hz, 1 H), 5,94 - 5,87 (m, 1 H), 5,48 (dd, J = 8,8, 6,8 Hz, 1 H), 5,41 (s, 2 H), 5,28 (dd, J = 17,2, 1,6 Hz, 1 H), 5,16 (dd, J = 10,4, 1,2 Hz, 1 H), 5,13 (t, J = 5,6 Hz, 1 H), 4,58 (dd, J = 9,2, 6,8 Hz, 1 H), 4,49 - 4,46 (m, 2 H), 4,44 (d, J = 5,6 Hz, 2 H), 3,04 - 2,97 (m, 2 H), 2,14 - 2,01 (m, 3 H), 1,29 - 1,23 (m, 2 H), 0,85 (d, J = 6,8 Hz, 3 H), 0,78 (d, J = 6,8 Hz, 3 H).
[0586]2’: LCMS (ESI): temperatura ambiente = 0,980 min, M+H+ = 488,0. método = 10 - 80/2 min. RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,52 (s, 1 H), 8,07 (s, 1 H), 7,64 (d, J = 9,2 Hz, 1 H), 7,54 (d, J = 8,4 Hz, 2 H), 7,27 (d, J = 8,8 Hz, 2 H), 6,02 (t, J = 5,6 Hz, 1 H), 5,95 - 5,86 (m, 1 H), 5,47 (dd, J = 8,8, 6,8 Hz, 1 H), 5,42 (s, 2 H), 5,28 (dd, J = 16,8, 1,2 Hz, 1 H), 5,16 (d, J = 11,6 Hz, 1 H), 5,13 (t, J = 6,0 Hz, 1 H), 4,57 (dd, J = 9,2, 7,2 Hz, 1 H), 4,49 - 4,46 (m, 2 H), 4,44 (d, J = 5,6 Hz, 2 H), 3,06 - 2,94 (m, 2 H), 2,16 - 2,02 (m, 3 H), 1,29 - 1,25 (m, 2 H), 0,85 (d, J = 6,8 Hz, 3 H), 0,78 (d, J = 6,8 Hz, 3 H).
[0587]Condição de separação de HPLC (2 e 2’):
[0588]Instrumento: SHIMADZU LC-8A
[0589]Coluna: synergi-10 μm, 250 x 50 mml.D.
[0590]Fase móvel: A para H2O (Adicionar 2% FA, v/v) e B para MeCN
[0591]Gradiente: B 10 a 50 %
[0592]Taxa de fluxo: 80mL/min
[0593]Comprimento de onda monitorado: 220 nm/254 nm
[0594]Comprimento conduzido: 22 min/25 min
[0595]Condição de separação de SFC (2 & 2’):
[0596]Instrumento: Thar SFC 80
[0597]Coluna : Quiral PAK AD, 5 μm, Daicel Chemical Industries, Ltd
[0598]250 x 30mm I.D.
[0599]Fase móvel: A: CO2 supercrítico, B:EtOH(continha NH3H2O a 0,1 %), A:B = 70:30 em 60ml/min
[0600]Temp da Coluna: 38 °C
[0601]Pressão do bico: 100 Bar
[0602]Temp do bico: 60 °C
[0603]Temp do Evaporador: 20 °C
[0604]Temp do Trimer: 25 °C
[0605]Comprimento de onda: 220 nm
[0606]Exemplo 1: Preparação de (6S,6aS)-3-[5-[[(6aS)-2-metóxi-8-metileno- 11-oxo-7,9-di-hidro-6aH-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-3-il]óxi]pentóxi]-6-hidróxi-2- metóxi-8-metileno-11-oxo-6,6a,7,9-tetra-hidropirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepino-5- carboxilato de [4-[[(2S)-2-[4-[(1S)-1-[6-(2,5-dioxopirrol-1-il)hexanoilamino]-2-metil- propil]triazol-1-il]-5-ureido-pentanoil]amino]fenil]metila (PBD-LD2)
Figure img0076
O composto 1 é o composto 6 do WO 2011/130598 (i)(5-((5-(5-(((alilóxi)carbonil)amino)-4-((R)-2-(acetoximetil)-4- metilenepirrolidin-1-carbonil)-2-metoxifenóxi)pentil)óxi)-2-((R)-2-(acetoximetil)-4- metilenpirrolidin-1-carbonil)-4-metoxifenil)carbamato de 4-((S)-2-(4-((S)-1-Amino-2- metilpropil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)-5-ureidopentanamido)benzila (3)
[0607]Trietilamina (0,55 g, 0,76 mL 5,5 mmols, 2,2 eq.) foi adicionada a uma solução agitada da bis-anilina protegida com mono-alloc 1 (1,98 g, 2,5 mmols, 1,0 eq.) e trifosgênio (0,27 g, 0,9 mmol, 0,36 eq.) em THF seco (25 mL) sob uma atmosfera de argônio na temperatura ambiente. A mistura de reação foi aquecida a 40 °C, uma amostra foi tratada com metanol e analisada através de LCMS como carbamato de metila.
[0608]A solução de álcool benzílico 2 (1,58 g, 3,24 mmols, 1,3 eq.) em THF/DMF seco (40 mL/5 mL) foi adicionada às gotas ao isocianato recém preparado. A mistura de reação foi monitorada através de LCMS e foi concluída depois de 4,5 horas a 40 °C. A mistura de reação foi filtrada e o filtrado evaporado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado através de cromatografia instantânea em coluna [eluição por gradiente CHCl3/MeOH 3 % a 6 % em incrementos a 1 %] para fornecer o produto como uma espuma branca (1,83 g, 56 %). Dados Analíticos: temperatura ambiente 1,72 min; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1306 ([M + H]+., 40).
[0609](ii) (5-((5-(5-(((alilóxi)carbonil)amino)-4-((R)-2-(hidroxiimetil)-4- metilenepirrolidin-1-carbonil)-2-metoxifenóxi)pentil)óxi)-2-((R)-2-(hidroximetil)-4- metilenpirrolidin-1-carbonil)-4-metoxifenil)carbamato de 4-((S)-2-(4-((S)-1-Amino-2- metilpropil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)-5-ureidopentanamido)benzila (4)
[0610]A solução de K2CO3 (0,96 g, 7,0 mmols, 5,0 eq.) em H2O (7 mL) foi adicionada a uma solução de acetato 3 (1,82 g, 1,39 mmol, 1,0 eq.) em MeOH (40 mL). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 1 hora. O metanol foi evaporado sob pressão reduzida, o resíduo foi diluído com H2O (100 mL) e acidificado ao pH3 com ácido cítrico 1 M. A mistura foi extraída com DCM (5 x 100 mL). Os extratos combinados foram lavados com salmoura saturada (200 mL), secos (MgSO4) e evaporados sob pressão reduzida para fornecer o produto como uma espuma branca (1,51 g, 88 %). Dados Analíticos: temperatura ambiente 1,57 min; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1222 ([M + H]+., 45).
[0611](iii) (11S,11aS)-8-((5-(((11S,11aS)-10-(((4-((S)-2-(4-((S)-1- (((Alilóxi)carbonil)amino)-2-metilpropil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)-5- ureidopentanamido)benzil)óxi)carbonil)-11-hidróxi-7-metóxi-2-metileno-5-oxo- 2,3,5,10,11,11a-hexahidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)óxi)pentil)óxi)-11- hidróxi-7-metóxi-2-metileno-5-oxo-2,3,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepino-10(5 H)-carboxilato de alila (5)
[0612]Ácido 2-iodoxibenzoico estabilizado 45 % em peso (IBX) (1,78 g, 2,9 mmols, 2,4 eq.) foi adicionado em uma porção a uma solução do bis-álcool 4 (1,46 g, 1,19 mmol, 1,0 eq.) em DMSO seco (90 mL). A solução foi agitada a 30 °C durante 32 horas. A mistura de reação foi adicionada à H2O (500 mL) que foi extraída com DCM (5 x 150 mL). Os extratos combinados foram lavados com solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada (300 mL), H2O (300 mL), salmoura (300 mL) e secos (MgSO4). O solvente foi removido através de evaporação rotativa sob pressão reduzida para fornecer o produto bruto. A purificação através de cromatografia instantânea em coluna [eluição por gradiente CHCl3/MeOH 0 % a 8 % em incrementos a 1 %] forneceu o produto como um sólido branco (0,8 g, 55 %). Dados Analíticos: temperatura ambiente 1,52 min; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1218 ([M + H]+., 100).
[0613](iv) (11S,11aS)-11-hidróxi-7-metóxi-8-((5-(((S)-7-metóxi-2-metileno-5- oxo-2,3,5,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)óxi)pentil)óxi)-2- metileno-5-oxo-2,3,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepino-10(5 H)- carboxilato de 4-((S)-2-(4-((S)-1-Amino-2-metilpropil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)-5- ureidopentanamido)benzila (6)
[0614]Pd(PPh3)4 (14 mg, 12,4 μmols 0,05 eq.) foi adicionado a uma solução do composto de bis-alloc 5 (0,30 g, 0,25 mmol, 1,0 eq.) e pirrolidina (39 mg, 45 μL, 0,86 mmol, 2,2 eq.) em DCM seco (20 mL) sob uma atmosfera de argônio. A solução foi agitada na temperatura ambiente durante 30 min para fornecer uma suspensão turva. O solvente foi evaporado pela metade sob pressão reduzida e depois diluído com éter dietílico. O produto precipitado foi coletado por filtração, lavado com éter dietílico (x 2). Este forneceu o produto como um pó branco que foi usado sem purificação adicional (0,25 g, 100 %). Dados Analíticos: temperatura ambiente 1,15 min; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1032 ([M + H]+., 10).
[0615](v) (11S,11aS)-11-hidróxi-7-metóxi-8-((5-(((S)-7-metóxi-2-metileno-5- oxo-2,3,5,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)óxi)pentil)óxi)-2- metileno-5-oxo-2,3,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepino-10(5 H)- carboxilato de 4-((S)-2-(4-((S)-1-(6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)- 2-metilpropil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)-5-ureidopentanamido)benzila (7)
[0616]EEDQ (12,6 mg, 51 μmols, 1,5 eq.) foi adicionado a uma solução de amina/imina 6 (35 mg, 34 μmols, 1,0 eq.) e ácido maleimida caproico (7,2 mg, 34 μmols, 1,0 eq.) em DCM/MeOH seco (5 mL/1 mL). A solução foi agitada na temperatura ambiente durante 18 horas. Uma porção adicional de EEDQ (12,6 mg, 51 μmols, 1,5 eq.) foi adicionada e a reação foi agitada durante um adicional de 18 horas. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado através de HPLC prep para fornecer o produto como uma espuma branca depois da liofiliza- ção (5,5 mg, 13 %). Dados Analíticos: temperatura ambiente 1,41 min; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1225 ([M + H]+., 60).
Figure img0077
(a)(11S,11aS)-11-hidróxi-7-metóxi-8-((5-(((S)-7-metóxi-2-metileno-5-oxo- 2,3,5,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)óxi)pentil)óxi)-2- metileno-5-oxo-2,3,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepino-10(5 H)- carboxilato de 4-((S)-2-(4-((S)-1-(6-(2-bromoacetamido)hexanamido)-2-metilpropil)- 1H-1,2,3-triazol-1-il)-5-ureidopentanamido)benzila (9a)
[0617]EEDQ (36 mg, 0,15 mmol, 1,5 eq.) foi adicionado a uma solução de amina/imina 6 (101 mg, 98 μmols, 1,0 eq.) e ácido bromoacetamidocaproico 8a (30 mg, 0,12 mmol, 1,2 eq.) em DCM/MeOH seco (6 mL/3 mL). A solução foi agitada na temperatura ambiente durante 5 dias. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo purificado através de HPLC prep para fornecer, em liofilização, o produto como uma espuma branca (25 mg, 20 %). Dados Analíticos: temperatura ambi- ente 1,42 min; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1267 ([M + H]+., 20).
[0618](b) (11S,11aS)-11-hidróxi-7-metóxi-8-((5-(((S)-7-metóxi-2-metileno-5- oxo-2,3,5,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)óxi)pentil)óxi)-2- metileno-5-oxo-2,3,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepino-10(5 H)- carboxilato de 4-((S)-2-(4-((S)-1-(6-(2-bromo-N-metilacetamido)hexanamido)-2- metilpropil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)-5-ureidopentanamido)benzila (9b)
[0619]EEDQ (36 mg, 0,15 mmol, 1,5 eq.) foi adicionado a uma solução de amina/imina 6 (100 mg, 98 μmols, 1,0 eq.) e ácido N metilbromoacetamidocaproico 8b (30 mg, 0,12 mmol, 1,2 eq.) em DCM/MeOH seco (6 mL/3 mL). A solução foi agitada na temperatura ambiente durante 5 dias. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado através de HPLC prep para fornecer, em liofiliza- ção, o produto como uma espuma branca (16 mg, 13 %). Dados Analíticos: temperatura ambiente 1,44 min; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1280 ([M + H]+., 20).
[0620]Exemplo 3: Preparação alternativa de (6S,6aS)-3-[5-[[(6aS)-2-metóxi- 8-metileno-11-oxo-7,9-di-hidro-6aH-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-3-il]óxi]pentóxi]- 6-hidróxi-2-metóxi-8-metileno-11-oxo-6,6a,7,9-tetra-hidropirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepino-5-carboxilato de [4-[[(2S)-2-[4-[(1S)-1-[6-(2,5-dioxopirrol-1- il)hexanoilamino]-2-metil-propil]triazol-1-il]-5-ureido-pentanoil]amino]fenil]metila (PBD-LD2) (a)6-(2,5-Dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-N-((S)-1-(1-((S)-1-((4- (hidroximetil)fenil)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-il)-1H-1,2,3-triazol-4-il)-2- metilpropil)hexanamida (12)
Figure img0078
[0621]Amina 10 (4,37 g, 10,8 mmols, 1,0 eq) e 2,5-dioxopirrolidin-1-il 6-(2,5- dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)hexanoato 11 (3,67 g, 11,9 mmols, 1,1 eq) foram dis- solvidos em DMF anidro (100 mL) com agitação. A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 2 horas. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida para fornecer o produto 12 como um óleo amarelo viscoso (6,0 g, 92 %). Dados Analíticos: temperatura ambiente 1,20 min; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 597 ([M + H]+., 100).
[0622](b) (6S,6aS)-3-[5-[[(6aS)-2-metóxi-8-metileno-11-oxo-7,9-di-hidro-6aH- pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-3-il]óxi]pentóxi]-6-hidróxi-2-metóxi-8-metileno-11- oxo-6,6a,7,9-tetra-hidropirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepino-5-carboxilato de [4-[[(2S)-2- [4-[(1S)-1-[6-(2,5-dioxopirrol-1-il)hexanoilamino]-2-metil-propil]triazol-1-il]-5-ureido- pentanoil]amino]fenil]metila (7, PBD-LD2)
Figure img0079
Resumo (i)trifosgênio, piridina, THF (ii)AcOH, THF, H2O (iii)IBX, DMSO (iv)TFA a 95 %
[0623]O composto 13 é o composto 9 do WO 2013/055987. (i)(5-((5-(5-((terc-butoxicarbonil)amino)-4-((R)-2-(((terc- butildimetilsilil)óxi)metil)-4-metilenpirrolidin-1-carbonil)-2-metoxifenóxi)pentil)óxi)-2- ((R)-2-(((terc-butildimetilsilil)óxi)metil)-4-metilenpirrolidin-1-carbonil)-4- metoxifenil)carbamato de 4-((S)-2-(4-((S)-1-(6-(2,5-Dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanamido)-2-metilpropil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)-5-ureidopentanamido)benzila (14)
[0624]Trietilamina (0,13 g, 0,18 mL, 1,3 mmol, 2,2 eq.) foi adicionado a uma solução agitada da bis-anilina protegida com mono-boc 13 (0,555 g, 0,58 mmol, 1,0 eq.) e trifosgênio (0,062 g, 0,21 mmol, 0,36 eq.) em THF seco (15 mL) sob uma atmosfera de argônio na temperatura ambiente. A mistura de reação foi aquecida a 40 °C, uma amostra foi tratada com metanol e analisada por LCMS como o carbamato de metila.
[0625]A solução de álcool benzílico 12 (0,51 g, 0,85 mmol, 1,45 eq.) em THF/piridina seca (3 mL/3 mL) foi adicionada às gotas ao isocianato recém preparado. A mistura de reação foi monitorada através de LCMS e foi concluída depois de 4 horas a 40 °C. A mistura de reação foi filtrada e o filtrado evaporado sob pressão reduzida. O resíduo foi absorvido em CHCl3 (100 mL) e isto foi lavado com solução de CuSO4 saturada (2 x 150 mL), salmoura saturada (150 mL), seco (MgSO4) e evaporado sob pressão reduzida para fornecer uma espuma amarela. A purificação através de cromatografia instantânea em coluna [eluição por gradiente CHCl3/MeOH a 2 % a MeOH a 5 % em incrementos a 1 %] forneceu o produto como uma espuma branca (0,26 g, 29 %). Dados Analíticos: temperatura ambiente 2,23 min; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1577 ([M + H]+., 100).
[0626](ii) (5-((5-(5-((terc-butoxicarbonil)amino)-4-((R)-2-(hidroximetil)-4- metilenpirrolidin-1-carbonil)-2-metoxifenóxi)pentil)óxi)-2-((R)-2-(hidroximetil)-4- metilenpirrolidin-1-carbonil)-4-metoxifenil)carbamato de 4-((S)-2-(4-((S)-1-(6-(2,5- Dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-2-metilpropil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)-5- ureidopentanamido)benzila (15)
[0627]AcOH/H2O (1,5/1) (42 mL) foi adicionado a uma solução do composto 14 (0,934 g, 0,6 mmol, 1,0 eq) em THF (17 mL) e a solução resultante foi agitada na temperatura ambiente durante 72 horas. A mistura de reação foi basificada ao pH 8 com solução de hidrogenocarbonato de sódio saturada. A mistura foi extraída com DCM (4 x 100 mL) e os extratos combinados foram lavados com solução de hidro- genocarbonato de sódio saturada (300 mL), H2O (200 mL), salmoura saturada (250 mL), secos (MgSO4) e evaporados sob pressão reduzida. A purificação do resíduo através de cromatografia instantânea em coluna [eluição por gradiente CHCl3/MeOH 2 % a 9 % em incrementos a 1 %] forneceu o produto como uma espuma branca (0,573 g, 72 %). Dados Analíticos: temperatura ambiente 1,6 min; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1347 ([M + H]+., 100).
[0628](iii) (11S,11aS)-8-((5-(((11S,11aS)-10-(((4-((S)-2-(4-((S)-1-(6-(2,5- Dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-2-metilpropil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)-5- ureidopentanamido)benzil)óxi)carbonil)-11-hidróxi-7-metóxi-2-metileno-5-oxo- 2,3,5,10,11,11a-hexahidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)óxi)pentil)óxi)-11- hidróxi-7-metóxi-2-metileno-5-oxo-2,3,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepino-10(5 H)-carboxilato de terc-butila (16)
[0629]Ácido 2-iodoxibenzoico estabilizado 45 % em peso (IBX) (0,635 g, 1,02 mmol, 2,4 eq.) foi adicionado em uma porção a uma solução do bis álcool (15) (0,573 g, 0,425 mmol, 1,0 eq.) em DMSO seco (30 mL). A solução foi agitada a 30 °C durante 21 horas. Uma porção adicional de IBX (26 mg, 42,5 μmols, 0,1 eq) foi adicionada e a reação foi continuada durante um adicional de 24 h. A mistura de reação foi adicionada a solução de salmoura (500 mL) que foi extraída com DCM (5 x 100 mL). Os extratos combinados foram lavados com solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada (300 mL), H2O (200 mL), salmoura (300 mL) e secos (MgSO4). O solvente foi removido através de evaporação rotativa sob pressão reduzida para fornecer o produto bruto. A purificação através de cromatografia instantânea em coluna [eluição por gradiente CHCl3/MeOH 0 % a 6 % em incrementos a 1 %] forneceu o produto como um sólido branco (0,35 g, 61 %). Dados Analíticos: temperatura ambiente 1,53 min; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1343 ([M + H]+., 97).
[0630](iv) (11S,11aS)-11-hidróxi-7-metóxi-8-((5-(((S)-7-metóxi-2-metileno-5- oxo-2,3,5,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)óxi)pentil)óxi)-2- metileno-5-oxo-2,3,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepino-10(5 H)- carboxilato de 4-((S)-2-(4-((S)-1-(6-(2,5-Dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanamido)-2-metilpropil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)-5-ureidopentanamido)benzila (7)
[0631]Uma solução fria (banho de gelo) de ácido trifluoroacético a 95 % (16 mL) foi adicionada ao composto 16 que foi esfriado em um banho de gelo. A solução foi agitada a 0 °C durante 15 minutos quando foi mostrada concluída através de LCMS. A mistura de reação foi adicionada às gotas a uma mistura de gelo e solução de hidrogenocarbonato de sódio saturada para neutralizar a solução de ácido trifluo- roacético. A mistura foi extraída com MeOH/CHCl3 10 % (4 x 100 mL) e os extratos combinados foram lavados com salmoura saturada (200 mL), secos (MgSO4) e evaporados sob pressão reduzida para fornecer o produto como um sólido amarelo (0,337 g, 106 %). Dados Analíticos: temperatura ambiente 1,45 min; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1225 ([M + H]+., 100).
[0632]Exemplo 4: Preparação de (6S,6aS)-3-[5-[[(6aS)-2-metóxi-8-metileno- 11-oxo-7,9-di-hidro-6aH-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-3-il]óxi]pentóxi]-6-hidróxi-2- metóxi-8-metileno-11-oxo-6,6a,7,9-tetra-hidropirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepino-5- carboxilato de [4-[[(2S)-2-[[1-[5-(2,5-dioxopirrol-1- il)pentilcarbamoil]ciclobutancarbonil]amino]-5-ureido-pentanoil]amino]fenil]metila (24, PBD-LD3) (a)(5-((5-(5-Amino-4-((S)-2-(((terc-butildimetilsilil)óxi)metil)-4-metilenpirrolidin- 1-carbonil)-2-metoxifenóxi)pentil)óxi)-2-((S)-2-(((terc-butildimetilsilil)óxi)metil)-4- metilenpirrolidin-1-carbonil)-4-metoxifenil)carbamato de alila (17)
Figure img0080
[0633]O composto 17A é o composto 8 do WO 2013/055987.
[0634]Uma solução de cloroformiato de alila 17A (0,38 g, 0,34 mL, 3,2 mmols, 1,0 eq.) em DCM seco (10 mL) foi adicionada às gotas a uma solução da bis- anilina (2,72 g, 3,2 mmols, 1,0 eq.) e piridina seca (0,5 g, 0,52 mL, 6,4 mmols, 2,0 eq.) em DCM seco (30 mL) a -78 °C (gelo seco/acetona) sob uma atmosfera de ar- gônio. A solução resultante foi agitada a -78 °C durante 1 hora depois deixada atingir a temperatura ambiente. A mistura de reação foi diluída com DCM (50 mL) e lavada com solução de sulfato de cobre saturada (2 x 200 mL), água (200 mL), salmoura (200 mL), seca (MgSO4) e evaporada sob pressão reduzida. A purificação através de cromatografia instantânea em coluna [eluição por gradiente n-hexano a 60 %/EtOAc a 40 % a EtOAc a 100 % em incrementos a 10 %] forneceu o produto como uma espuma branca amarelada (1,45 g, 48 %). Dados Analíticos: temperatura ambiente 2,25 min; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 937 ([M + H]+.,100), 959 ([M + Na]+., 60).
[0635](b) (6S,6aS)-3-[5-[[(6aS)-2-metóxi-8-metileno-11-oxo-7,9-di-hidro-6aH- pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-3-il]óxi]pentóxi]-6-hidróxi-2-metóxi-8-metileno-11- oxo-6,6a,7,9-tetra-hidropirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepino-5-carboxilato de [4-[[(2S)-2- [[1-[5-(2,5-Dioxopirrol-1-il)pentilcarbamoil]ciclobutancarbonil]amino]-5-ureido- pentanoil]amino]fenil]metila (24)
Figure img0081
Resumo (i)trifosgênio, piridina, THF (ii)TBAF, THF (iii)IBX, DMSO (iv)Pd(PPh3)4, pirrolidina, CH2Cl2 (v)BOP-Cp, DIEA, DMF
[0636]1-(((S)-1-((4-((((5-((5-(5-(((Alilóxi)carbonil)amino)-4-((S)-2-(((terc- butildimetilsilil)óxi)metil)-4-metilenpirrolidin-1-carbonil)-2-metoxifenóxi)pentil)óxi)-2- ((S)-2-(((terc-butildimetilsilil)óxi)metil)-4-metilenpirrolidin-1-carbonil)-4- metoxifenil)carbamoil)óxi)metil)fenil)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2- il)carbamoil)ciclobutano-1-carboxilato de alila (19)
[0637]Trietilamina (1,85 g, 0,26 mL 1,85 mmol, 2,2 eq.) foi adicionada a uma solução agitada da bis-anilina protegida com mono-alloc 17 (0,79 g, 0,84 mmol, 1,0 eq.) e trifosgênio (90 mg, 0,3 mmol, 0,36 eq.) em THF seco (20 mL) sob uma atmosfera de argônio na temperatura ambiente. A mistura de reação foi aquecida a 40 °C, uma amostra foi tratada com metanol e analisada por LCMS como o carbamato de metila.
[0638]Uma solução de álcool benzílico 18 (0,49 g, 1,1 mmol, 1,3 eq.) em THF seco (20 mL) foi adicionada às gotas ao isocianato recém preparado. A mistura de reação foi monitorada através de LCMS e foi concluída depois de 5 horas a 40 °C. A mistura de reação foi filtrada e o filtrado evaporado sob pressão reduzida. A purificação através de cromatografia instantânea em coluna [eluição por gradiente EtOAc/MeOH a 0 % a MeOH a 6 % em incrementos a 1 %] forneceu o produto como uma espuma branca (0,73 g, 61 %). Dados Analíticos: temperatura ambiente 2,20 min; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1410 ([M + H]+., 50), 1431 ([M + Na]+., 50).
[0639]1-(((S)-1-((4-((((5-((5-(5-(((Alilóxi)carbonil)amino)-4-((S)-2- (hidroximetil)-4-metilenpirrolidin-1-carbonil)-2-metoxifenóxi)pentil)óxi)-2-((S)-2- (hidroximetil)-4-metilenpirrolidin-1-carbonil)-4- metoxifenil)carbamoil)óxi)metil)fenil)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2- il)carbamoil)ciclobutano-1-carboxilato de alila (20)
[0640]Fluoreto de tetra-N-butilamônio (1,0 M em THF, 1,1 mL, 2,2 eq) foi adicionado a uma solução do composto de bis-TBS 19 (0,7 g, 0,5 mmol, 1,0 eq) em THF seco (20 mL) sob uma atmosfera de argônio. A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 15 min. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo re-dissolvido em DCM, lavado com salmoura (x 1), seco (MgSO4) e evaporado para fornecer um óleo amarelo claro. A purificação através de cromato- grafia instantânea em coluna [eluição por gradiente EtOAc/MeOH 5 % a 15 % em incrementos a 2,5 %] forneceu o produto como uma espuma branca (0,46 g, 79 %). Dados Analíticos: temperatura ambiente 1,55 min; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1181 ([M + H]+., 100).
[0641](11S,11aS)-8-((5-(((11S,11aS)-10-(((4-((S)-2-(1- ((Alilóxi)carbonil)ciclobutano-1-carboxamido)-5- ureidopentanamido)benzil)óxi)carbonil)-11-hidróxi-7-metóxi-2-metileno-5-oxo- 2,3,5,10,11,11a-hexahidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)óxi)pentil)óxi)-11- hidróxi-7-metóxi-2-metileno-5-oxo-2,3,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepino-10(5 H)-carboxilato de alila (21)
[0642]ácido 2-iodoxibenzoico estabilizado 45 % em peso (IBX) (0,545 g, 0,88 mmol, 2,4 eq.) foi adicionado em uma porção a uma solução do bis álcool 20 (0,43 g, 0,365 mmol, 1,0 eq.) em DMSO seco (31 mL). A solução foi agitada a 30 °C durante 18 horas. A mistura de reação foi adicionada a solução de salmoura saturada que foi extraída com DCM (5 x 75 mL). Os extratos combinados foram lavados com solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada (200 mL), água (200 mL), salmoura (200 mL) e secos (MgSO4). O solvente foi removido através de evaporação rotativa sob pressão reduzida para fornecer o produto bruto. A purificação através de cromato- grafia instantânea em coluna [eluição por gradiente CHCl3/MeOH 0 % a 6 % em in-crementos a 1 %] forneceu o produto como uma espuma branca (0,21 g, 48 %). Dados Analíticos: temperatura ambiente 1,48 min; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1177 ([M + H]+., 100).
[0643]Ácido 1-(((S)-1-((4-((((11S,11aS)-11-hidróxi-7-metóxi-8-((5-(((S)-7- metóxi-2-metileno-5-oxo-2,3,5,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8- il)óxi)pentil)óxi)-2-metileno-5-oxo-2,3,5,10,11,11a-hexahidro-1H-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepino-10-carbonil)óxi)metil)fenil)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2- il)carbamoil)ciclobutano-1-carboxílico (22)
[0644]Pd(PPh3)4 (6 mg, 5,1 μmols, 0,06 eq.) foi adicionado a uma solução do composto 21 (0,1 g, 85 μmols, 1,0 eq.) e pirrolidina (15 mg, 17 μL, 0,21 mmol, 2,5 eq.) em DCM seco (5 mL) sob uma atmosfera de argônio. A solução foi agitada na temperatura ambiente durante 35 minutos. A mistura de reação foi diluída com éter dietílico (xs) para precipitar o produto que foi coletado por filtração, lavado com éter dietílico (x 2). Este forneceu o produto como um pó branco que foi usado sem purificação adicional. Dados Analíticos: temperatura ambiente 1,34 min; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1035 ([M + H]+., 100).
[0645](11S,11aS)-11-hidróxi-7-metóxi-8-((5-(((S)-7-metóxi-2-metileno-5-oxo- 2,3,5,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)óxi)pentil)óxi)-2- metileno-5-oxo-2,3,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepino-10(5 H)- carboxilato de 4-((S)-2-(1-((5-(2,5-Dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)pentil)carbamoil)ciclobutano-1-carboxamido)-5-ureidopentanamido)benzila (24)
[0646]N,N-Diisopropiletilamina (15 mg, 20 μL, 116 μmols, 3,0 eq) foi adicionado a uma solução de cloreto bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico (12 mg, 46,4 μmols, 1,2 eq) e ácido 22 (40 mg, 39,1 μmols, 1,0 eq) em DMF seco (5 mL) sob uma atmosfera de argônio com agitação. Cloreto de 5-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)pentan-1-amínio 23 (9 mg, 39,1 μmols, 1,0 eq) foi adicionado e a mistura foi agitada durante a noite na temperatura ambiente. A mistura foi interrompida com ácido cítrico e extraída com DCM (3 x 50 mL). Os extratos combinados foram lavados com salmoura saturada (100 mL), secos (MgSO4) e evaporados sob pressão reduzida para fornecer um sólido amarelo purificado por HPLC prep para fornecer o produto como uma espuma branca em liofilização (4,5 mg, 10 %). Dados Analíticos: tempe- ratura ambiente 1,42 min; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1199 ([M + H]+., 60).
MÉTODO PARA PREPARAR ADCS PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS CONSTRUÍDOS COM CISTEÍNA PARA A CONJUGAÇÃO POR MEIO DE REDUÇÃO E REOXIDAÇÃO
[0647]Sob certas condições, os anticorpos construídos com cisteína podem ser feitos reativos para conjugação com intermediários de ligante-fármaco da invenção, tais como aqueles na Tabela 4, por meio de tratamento com um agente redutor, tal como DTT (reagente de Cleland, ditiotreitol) ou TCEP cloridreto de (tris(2- carboxietil)fosfina; Getz et al. (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73 a 80; Soltec Ventures, Beverly, MA). Anticorpos monoclonais construídos com cisteína de comprimento total (ThioMabs) expressados em células CHO (Gomez et al. (2010) Biotechnology e Bioeng. 105(4):748 a 760; Gomez et al. (2010) Biotechnol. Prog. 26:1438 a 1445) foram reduzidos, por exemplo, com cerca de um excesso de 50 vezes de DTT durante a noite na temperatura ambiente para reduzir as ligações dissulfeto que podem ser formadas entre os resíduo de cisteínas recém introduzidos e a cisteína presente no meio de cultura.
[0648]Os aminoácidos de cadeia leve são numerados, de acordo com Kabat (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, (1991) 5a Ed., US Dept of Health and Human Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Os aminoácidos de cadeia pesada são numerados, de acordo com o sistema de numeração EU (Edelman et al. (1969) Proc. Natl. Acad. of Sci. 63(1):78 a 85), exceto onde observado como o sistema de Kabat. As abreviações de aminoácido de letra única são usadas.
[0649]Os anticorpos monoclonais construídos com cisteína de comprimento total (ThioMabs) são expressados em células CHO carregam adutos de cisteína (cistinas) ou glutationilados nas cisteínas construídas, devido às condições de cultura celular. Para liberar os grupos tiol reativos das cisteínas construídas, os ThioMabs são dissolvidos em borato de sódio 500 mM e cloreto de sódio 500 mM em cerca de pH 8,0 e reduzidos com cerca de um excesso de 50 a 100 vezes de TCEP 1 mM cloridreto de (tris(2-carboxietil)fosfina (Getz et al. (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73 a 80; Soltec Ventures, Beverly, MA) durante cerca de 1 a 2 h a 37 °C. Alternativamente, DTT pode ser usado como agente redutor. A formação de ligações dissulfeto in- ter-cadeia foi monitorada por meio de SDS-PAGE não redutora ou por meio de cro- matografia em coluna HPLC PLRP em fase reversa desnaturante. O ThioMab reduzido é diluído e carregado sobre uma coluna HiTrap SP FF em acetato de sódio 10 mM, pH 5, e eluído com PBS contendo cloreto de sódio 0,3M ou Tris-Cl 50 mM, pH 7,5, contendo cloreto de sódio 150 mM.
[0650]Ligações dissulfeto foram reestabelecidas entre resíduos de cisteína presentes no Mab precursor através da realização de reoxidação. O ThioMab reduzido eluído é tratado com ácido desidroascórbico 15X ou 2 mM (dhAA) ao pH 7 durante 3 horas ou durante 3 h em Tris-Cl 50 mM, pH 7,5 ou com sulfato de cobre aquoso 2 mM (CuSO4) na temperatura ambiente durante a noite. Outros oxidantes, isto é, agentes oxidantes e condições oxidantes, que são conhecidos na técnica, podem ser usados. A oxidação ao ar ambiente também pode ser eficaz. Esta etapa de reoxidação suave e parcial forma eficazmente dissulfetos intracadeia com alta fidelidade. O tampão é trocado por eluição em resina Sephadex G25 e eluído com PBS com DTPA 1 mM. O valor de tiol/Ab é verificado através da determinação da concentração do anticorpo reduzido a partir da absorvância em 280 nm da solução e da concentração de tiol por meio da reação com DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) e determinação da absorvância em 412 nm.
[0651]A análise de Cromatografia Líquida/Espectrometria de Massas foi realizada em um espectrômetro de massas quadripolar Triplo TSQ Quantum™ com faixa de massa estendida (Thermo Electron, San Jose Califórnia). As amostras foram cromatografadas em uma coluna de microboro PRLP-S®, 1000 A, (50 mm x 2,1 mm, Polymer Laboratories, Shropshire, UK) aquecidas a 75 °C. Um gradiente linear de B a 30 a 40 % (solvente A: TFA a 0,05 % em água, solvente B: TFA a 0,04 % em ace- tonitrila) foi usado e o eluente foi diretamente ionizado usando a fonte de eletros- pray. Os dados foram coletados pelo sistema de dados Xcalibur® e a deconvolução foi realizada usando ProMass® (Novatia, LLC, Nova Jersey). Antes da análise LC/MS, os anticorpos ou conjugados de fármaco (50 microgramas) foram tratados com PNGase F (2 unidades/ml; PROzyme, San Leandro, CA) durante 2 horas a 37 °C para remover carboidratos N-ligados.
[0652]As amostras de Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC) foram injetadas em uma coluna de Butil HIC NPR (tamanho de partícula 2,5 mícrons, 4,6 mm x 3,5 cm) (Tosoh Bioscience) e eluídas com um gradiente linear de B a 0 a 70 % em 0,8 ml/min (A: sulfato de amônio 1,5 M em fosfato de potássio 50 mM, pH 7, B: fosfato de potássio 50 mM pH 7, isopropanol a 20 %). Um sistema de HPLC série Agilent 1100 equipado com um detector de múltiplos comprimentos de onda e software Chemstation foi usado para resolver e quantificar a espécie de anticorpo com razões diferentes de fármacos por anticorpo. Os anticorpos construídos com cisteína da presente invenção podem ser preparados, de acordo com o método geral descrito acima.
CONJUGAÇÃO DE INTERMEDIÁRIOS DE LIGANTE-FÁRMACO AOS ANTICORPOS (PROCEDIMENTO 1)
[0653]Os anticorpos construídos com cisteína foram bloqueados como dis- sulfetos mistos com glutationa e/ou cisteína, conforme expressado em células CHO. Estas cisteínas foram “desbloqueadas” antes da conjugação.
[0654]O anticorpo desbloqueado (5 a 12 mg/mL) em succinato 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM foi levado a Tris 75 a 100 mM, pH 7,5 a 8 (usando Tris 1 M). O cossolvente (DMSO, DMF ou DMA) foi adicionado à solução de anticorpo, seguido pelo ligante-fármaco (em DMSO ou DMF) para fornecer uma % de solvente orgâni- co final de 10 a 13 % e concentração final de ligante-fármaco 2,5 a 10X em relação à concentração de anticorpo. As reações foram deixadas proceder na temperatura ambiente durante 1 a 12 horas (até que a conjugação máxima foi obtida). As reações de conjugação foram purificadas por intermédio de cromatografia de troca ca- tiônica e/ou filtração em gel usando colunas descartáveis (S maxi ou Zeba, respectivamente). Purificação adicional por meio de filtração em gel preparativa (colunas S200) foi realizada se o conjugado bruto foi significantemente agregado, de acordo com SEC analítica (por exemplo, >10 %). Os conjugados foram subsequentemente trocados em tampão de formulação (His-acetato 20 mM, pH 5,5, sacarose 240 mM) usando filtração em gel ou diálise. Tween-20 foi subsequentemente adicionado ao conjugado purificado para atingir uma concentração final de 0,02 %. As concentrações de conjugado finais variaram de 2,4 a 7,5 mg/mL (% de rendimento: 34 a 81 % a partir do anticorpo desbloqueado). Os conjugados foram analisados por LCMS para obter uma medição da razão fármaco-anticorpo (DAR), que variou de 1,3 a 2,1 (média: 1,8). Os conjugados também foram analisados quanto à presença de agregados de alto peso molecular usando SEC analítica (colunas Zenix ou Shodex); os conjugados finais purificados exibiram agregação variando de 0 a 10 %. Os conjugados também foram avaliados quanto à contaminação de endotoxina, que, em todos os casos, não excedeu a 1,3 EU/mg. O fármaco livre não conjugado não excedeu 1 % do conjugado final.
CONJUGAÇÃO DE INTERMEDIÁRIOS DE LIGANTE-FÁRMACO AOS ANTICORPOS (PROCEDIMENTO 2, PROCEDIMENTO ALTERNATIVO)
[0655]Depois dos procedimentos de redução e reoxidação do exemplo acima, o anticorpo é dissolvido em tampão PBS (solução salina tamponada com fosfato) e resfriado em gelo. Um excesso, de cerca de 1,5 molar a 20 equivalentes de um intermediário de ligante-fármaco com um grupo funcional reativo em tiol, tal como maleimido ou bromo-acetamida, é dissolvido em DMSO, diluído em acetonitrilaa e água e adicionado ao anticorpo reduzido, reoxidado e resfriado em PBS. Depois de cerca de uma hora, um excesso de maleimida é adicionado para extinguir a reação e coroar quaisquer grupos tiol do anticorpo não reagido. A mistura de conjugação pode ser carregada e eluída através de uma coluna HiTrap SP FF para remover o excesso de intermediário de fármaco-ligante e outras impurezas. A mistura de reação é concentrada por meio de ultrafiltração centrífuga e o conjugado de anticorpo construído com cisteína-fármaco é purificado e dessalinizado por eluição através de resina G25 em PBS, filtrado através de filtros de 0,2 μm sob condições estéreis e congelado para armazenagem.
[0656]Os ADCs da presente invenção podem ser preparados, de acordo com o procedimento descrito na seção acima.
ENSAIOS
[0657]Os ligantes selecionados depois foram testados e encontrados ativos em ensaios in vitro e in vivo. Os dados de clivagem são mostrados na tabela abaixo.
ENSAIO DE CLIVAGEM DE CATEPSINA B
[0658]Como ligantes de peptídeo, ligantes sem peptídeo para ADC são esperados como aqueles cliváveis em lisossomo para liberação de fármaco apropriada. Como uma organela digestiva da célula, o lisossomo é enriquecido com algumas proteases que mostram atividade hidrolítica ideal em um pH ácido. Catepsina B é uma protease lisossômica representativa e foi mostrado contribuir para a ativação de ligantes de peptídeo de ADC (ref). Como uma triagem inicial, um ensaio foi desenvolvido usando catepsina B purificada para identificar constructos de fármaco cliváveis por ligante que são adequados para a conjugação com anticorpo. Norfloxacino foi usado para representar o componente de fármaco do ligante-fármaco. A porcentagem de clivagem em relação aos peptídeos controle (tais como Val-Cit) foi medida a um dado ponto no tempo, assim como os parâmetros cinéticos da reação de clivagem (Km e Vmáx). A descrição detalhada do ensaio é mostrada abaixo. A partir des- te ensaio, uma variedade de ligantes proteoliticamente ativos e estruturalmente diversos foi identificada e mais tarde usada na preparação de ADCs.
[0659]A atividade de clivagem de catepsina B usando ligante-fármacos experimentais como substrato foi medida por meio de monitoramento da liberação de Norfloxacino usando LC/MS. Concentrações variadas de ligante-fármaco (diluições em série 3 vezes) foram incubadas em reações de 20 uL contendo Catepsina B 20 nM (EMD Millipore cat. #219364, fígado humano), MES 10 mM pH 6,0, DTT 1 mM, CHAPS a 0,03 % e padrão interno de Norfloxacino-d5 25 nM (Santa Cruz Biotechnology, cat. #sc-301482). As reações foram incubadas durante 1 hora a 37 °C, seguido por adição de 60 uL de ácido fórmico a 2 % para extinguir as reações. As amostras foram analisada por meio de injeção de 2 uL de reações interrompidas em uma coluna de fenila Waters Acquity UPLC BEH (2,1 mm x 50 mm, Waters cat. #186002884). As amostras foram purificadas usando um gradiente de 2 minutos linear (0 % a 80 %) de acetonitrila, ácido fórmico a 0,1 % em uma Water Acquity UPLC. Norfloxacino e padrão interno de Norfloxacino-d5 foram detectados usando um espectrômetro de massas AB Sciex QTrap 5500 quadripolar triplo operando em modo positivo MRM (Norfloxacino 320^233 m/z, Norfloxacino-d5 325 ^233 m/z). O norfloxacino quantificado (normalizado com padrão interno) foi representado grafi-camente contra a concentração de ligante-fármaco e a representação gráfica resultante foi a curva ajustada com um ajuste Michaelis-Menten usando software GraphPad Prism para as constantes cinéticas Km e Vmáx.
ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR IN VITRO
[0660]A eficácia de ADC foi medida por um ensaio de proliferação celular utilizando o seguinte protocolo (Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente CELLTITER GLO™, Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Mendoza et al. (2002) Cancer Res. 62:5485 a 5488): 1 .Uma alíquota de 100 μl de cultura celular contendo cerca de 104 células (SKBR-3, BT474, MCF7 ou MDA-MB-468) no meio foi depositada em cada poço de uma placa de 96 poços com paredes opacas. 2 .Poços controle foram preparado contendo meio e sem células. 3 .ADC foi adicionado aos poços experimentais e incubado durante 3 a 5 dias. 4 .As placas foram equilibradas até a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. 5 .Um volume de Reagente CELLTITER GLO™ igual ao volume do meio de cultura celular presente em cada poço foi adicionado. 6 .Os conteúdos foram misturados durante 2 minutos em um agitador orbital para induzir lise celular. 7 .A placa foi incubada na temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar o sinal de luminescência. 8 .A luminescência foi registrada e relatada em gráficos como RLU = unidades de luminescência relativa.
[0661]Os dados são representados graficamente como a média de luminescência para cada conjunto de réplicas, com barras de erro de desvio padrão. O protocolo é uma modificação do CELLTITER GLO™ Luminescent Cell
[0662]Meio: SK-BR-3 cresce em 50/50/FBS a 10 %/glutamina/250 μg/mL G- 418 OVCAR-3 cresce em RPMI/FBS a 20 %/glutamina ENSAIO IN VIVO 1.A eficácia dos conjugados de anticorpo anti-CD33-fármaco (ADCs) foi investigada em um modelo de xenoenxerto de camundongo de HL-60 ou EOL-1 (leucemia mieloide aguda humana). A linhagem celular HL-60 foi obtida a partir da ATCC (American Type Culture Collection; Manassas, VA) e a linhagem celular EOL- 1 foi originada a partir de DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures; Braunschweig, Alemanha).
[0663]Camundongos SCID C.B-17 fêmeas (Charles River Laboratories; Hollister, CA) foram inoculados subcutaneamente na área do flanco com cinco milhões de células de HL-60 ou EOL-1. Quando os tumores de xenoenxerto atingiram um volume de tumor médio de 100 a 300 mm3 (referido como Dia 0), os animais foram randomizados em grupos de 7 a 10 camundongos e receberam uma injeção intravenosa única dos ADCs. Aproximadamente 4 horas antes da administração de ADCs, os animais foram dosados intraperitonealmente com excesso de quantidade (30 mg/kg) de anticorpo anti-gD controle para bloquear sítios de ligação ao anticorpo não específicos possíveis nas células de tumor. Os tumores e pesos corpóreos de camundongos foram medidos 1 a 2 vezes por semana durante todo o estudo. Os camundongos foram imediatamente submetidos à eutanásia quando a perda de peso corpóreo foi >20 % de seu peso inicial. Todos os animais foram submetidos à eutanásia quando os tumores atingiram 3000 mm3 ou mostraram sinais de ulceração iminente.
[0664]2. A eficácia dos conjugados de anticorpo anti-Napi2B-fármaco (ADCs) foi investigada em um modelo de enxerto de camundongo de OVCAR3-X2.1 (câncer ovariano humano). A OVCAR3 linhagem celular foi obtida a partir de ATCC (American Type Culture Collection; Manassas, VA) e uma sub-linhagem OVCAR3- X2.1 foi gerada em Genentech para crescimento ideal em camundongos.
[0665]Camundongos beges SCID C.B-17 fêmeas (Charles River Laboratories; San Diego, CA) foram inoculados na área de almofada de gordura mamária torácica com dez milhões de células OVCAR3-X2.1. Quando os tumores de xenoenxerto atingiram um volume de tumor médio de 100 a 300 mm3 (referido como Dia 0), os animais foram randomizados em grupos de 7 a 10 camundongos e receberam uma injeção intravenosa única dos ADCs. Os tumores e pesos corpóreos dos camundongos foram medidos 1 a 2 vezes por semana durante todo o estudo. Os camundongos foram imediatamente submetidos à eutanásia quando a perda de peso corpóreo foi >20 % de seu peso inicial. Todos os animais foram submetidos à eutanásia quando os tumores atingiram 3000 mm3 ou mostraram sinais de ulceração iminente.
[0666]3. A eficácia dos conjugados de anticorpo anti-CD22-fármaco (ADCs) é investigada em um modelo de enxerto de camundongo de BJAB-luc (linfoma de Burkitt humano) ou WSU-DLCL2 (linfoma de células B grandes difusas humano). A linhagem celular BJAB é obtida a partir de DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures; Braunschweig, Alemanha) e uma sub-linhagem BJAB-luc é gerada em Genentech para expressar estavelmente o gene da luciferase. A linhagem celular WSU-DLCL2 também é originada a partir de DSMZ.
[0667]Camundongos SCID C.B-17 fêmeas (Charles River Laboratories; Hollister, CA) foram inoculados subcutaneamente na área do flanco com 20 milhões de células de BJAB-luc ou WSU-DLCL2. Quando os tumores de xenoenxerto atingiram um volume de tumor médio de 100 a 300 mm3 (referido como Dia 0), os animais foram randomizados em grupos de 7 a 10 camundongos e receberam uma injeção intravenosa única dos ADCs. Os tumores e pesos corpóreos dos camundongos foram medidos 1 a 2 vezes por semana durante todo o estudo. Os camundongos foram imediatamente submetidos à eutanásia quando a perda de peso corpóreo foi >20 % de seu peso inicial. Todos os animais foram submetidos à eutanásia quando os tumores atingiram 3000 mm3 ou mostraram sinais de ulceração iminente.
[0668]4. A eficácia dos conjugados de anticorpo anti-Her2-fármaco (ADCs) foi investigada em um modelo de aloenxerto camundongo de MMTV-HER2 Founder #5 (tumor mamário de murino). O modelo MMTV-HER2 Founder #5 (Fo5) (desenvolvido em Genentech) é um modelo de camundongo transgênico em que o gene de HER2 humano, sob regulação transcricional do promotor do vírus de tumor mamário de murino (MMTV-HER2), é superexpressado no epitélio mamário. A superexpres- são causa desenvolvimento espontâneo de tumores mamários que superexpressam o receptor de HER2 humano. O tumor mamário a partir de um dos animais do cria- dor (founder #5, Fo5) foi propagado em camundongos FVB (Charles River Laboratories) por meio de transplante em série de fragmentos de tumor.
[0669]Para os estudos de eficácia, o tumor mamário transgênico Fo5 é cirurgicamente transplantado na almofada de gordura mamária torácica de camundongos nu/nu fêmeas (Charles River Laboratories; Hollister, CA) como fragmentos de tumor de aproximadamente 2 mm x 2 mm em tamanho. Quando os tumores de aloenxerto atingiram um volume de tumor médio de 100 a 300 mm3 (referido como Dia 0), os animais foram randomizados em grupos de 7 a 10 camundongos e receberam uma injeção intravenosa única dos ADCs. Os tumores e pesos corpóreos dos camundongos foram medidos 1 a 2 vezes por semana durante todo o estudo. Os camundongos foram imediatamente submetidos à eutanásia quando a perda de peso corpóreo foi >20 % de seu peso inicial. Todos os animais foram submetidos à eutanásia quando os tumores atingiram 3000 mm3 ou mostraram sinais de ulceração iminente. DADOS BIOLÓGICOS
Figure img0082
Figure img0083
PBD-LD1 é o composto 87 do WO 2011/130598.
SEQUÊNCIAS
[0670]Anticorpo humanizado NaPi3b:
[0671]Em uma forma de realização, o anticorpo Napi3b dos ADCs da presente invenção compreende três regiões hipervariáveis de cadeia leve e três regiões hipervariáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 1 a 6), as sequências do qual são mostradas abaixo.
[0672]Em uma forma de realização, o anticorpo Napi3b dos ADCs da presente invenção compreende a sequência de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 7 e a sequência de cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 8.
[0673]Em uma forma de realização, o anticorpo NaPi3b dos ADCs da presente invenção compreende a sequência de cadeia leve da SEQ ID NO: 9 e a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 10.
Figure img0084
Figure img0085
Anticorpo humanizado anti-CD33:
[0674]Em uma forma de realização, o anticorpo anti-CD33 dos ADCs da presente invenção compreende três regiões hipervariáveis de cadeia leve e três regiões hipervariáveis de cadeia pesada, as sequências (SEQ ID NO: 11 a 16) do qual são mostradas abaixo.
[0675]Em uma forma de realização, o anticorpo anti-CD33 dos ADCs da presente invenção compreende a sequência de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 17 e a sequência de cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 18
Figure img0086
Figure img0087
[0676]Em uma forma de realização, o anticorpo anti-CD33 dos ADCs da presente invenção compreende a sequência de cadeia leve da SEQ ID NO: 19 e a sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 20.
[0677]Em uma forma de realização, o anticorpo anti-CD33 dos ADCs da presente invenção compreende três regiões hipervariáveis de cadeia leve e três regiões hipervariáveis de cadeia pesada, as sequências (Seq ID NO: 19 a 24) do qual são mostradas abaixo.
[0678]Em uma forma de realização, o anticorpo anti-CD33 dos ADCs da presente invenção compreende a sequência de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 25 e a sequência de cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 26.
[0679]Em uma forma de realização, o anticorpo anti-CD33 dos ADCs da presente invenção compreende a sequência de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 27 e a sequência de cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 28.
[0680]Em uma forma de realização, o anticorpo anti-CD33 dos ADCs da presente invenção compreende a sequência de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 29 e a sequência de cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 30.
[0681]Em uma forma de realização, o anticorpo anti-CD33 dos ADCs da presente invenção compreende a sequência de cadeia leve variável da SEQ ID NO: 31 e a sequência de cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 32.
Figure img0088
Figure img0089
DADOS IN VITRO DE ADC
[0682]Os seguintes ADCs foram testados em ensaios in vitro descritos acima e foram encontrados ativos. As atividades dos ditos ADCs são ilustradas na tabela abaixo.
Figure img0090
DADOS IN VIVO DE ADC
[0683]Os seguintes ADCs foram testados em ensaios in vivo descritos acima e foram encontrados ativos. As atividades dos ditos ADCs são ilustradas nas Figuras 1 a 3 e na descrição abaixo.
[0684]A Figura 1 mostra a comparação de eficácia de ADCs NaPi3b em camundongos beges SCID com tumores de ovário humano OVCAR3X2.1. ADC1-1 e ADC2-1 NaPi3b PBD mostraram inibição dependente da dose de crescimento de tumor em comparação com o grupo veículo. Os ADCs PBD controle não alvejante gD ou CD33 apresentaram um efeito notável sobre o crescimento do tumor; entretanto, o efeito dos ADCs NaPi3b PBD correspondentes na dose adequada foi superior.
[0685]A Figura 2 mostra a comparação de eficácia de ADCs NaPi3b em camundongos beges SCID com tumores de ovário humano OVCAR3X2.1. ADC1-1 e ADC3-1 NaPi3b PBD mostraram a inibição do crescimento do tumor em comparação com o grupo veículo. O ADC3-2 CD33 PBD controle não alvejante apresentou efeito mínimo sobre o crescimento do tumor.
[0686]A Figura 3 mostra a eficácia de ADC2-2 CD33 PBD em várias doses em camundongos SCID com tumores de leucemia mieloide aguda humana EOL-1. ADC2-2 CD33 PBD demonstrou inibição dependente da dose do crescimento do tumor; levou à estase do tumor na dose do anticorpo de 0,2 mg/kg e remissão do tumor em 0,5 mg/kg ou maior.

Claims (16)

1. Conjugado de anticorpo-fármaco CARACTERIZADO pelo fato de que é representado pela Fórmula (I):
Figure img0091
Ab é um anticorpo; L é um ligante peptidomimético representado pela seguinte fórmula:
Figure img0092
em que, Str é uma unidade extensora covalentemente ligada ao Ab; Sp é uma ligação ou unidade espaçadora covalentemente ligada a uma porção de fármaco; PM é uma porção química não-peptídica selecionada a partir do grupo que consiste em:
Figure img0093
Y é heteroarila, arila, -C(O)alquileno C1-C6, alquenila C1-C6, alquileno C1-C6 ou -alquileno C1-C6-NH-; cada R1 é, independentemente, alquila C1-C10, alquenila C1-C10, (alquila C1- C10)NHC(NH)NH2 ou (alquila C1-C10)NHC(O)NH2; R3 e R2 são cada um, independentemente, H, alquila C1-C10, alquenila C1- C10, arilalquila ou heteroarilalquila, ou R3 e R2 juntos podem formar uma cicloalquila C3-C7; R4 e R5 são cada um, independentemente, alquila C1-C10, alquenila C1-C10, arilalquila, heteroarilalquila, (alquila C1-C10)OCH2-, ou R4 e R5 juntos podem formar um anel cicloalquila C3-C7; p é um número inteiro de 1 a 8; D é uma porção de fármaco da fórmula A:
Figure img0094
ou um sal e/ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: a linha ondulada indica o sítio de ligação covalente ao ligante; as linhas pontilhadas indicam a presença opcional de uma ligação dupla entre C1 e C2 ou C2 e C3; R22 é, independentemente, selecionado a partir de H, OH, =O, =CH2, CN, Rm, O Rm, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2- Rm, CO2 Rm e CO Rm e, opcionalmente, ainda selecionado a partir de halo ou di-halo, em que RD é, independentemente, selecionado a partir de Rm, CO2 Rm, CO Rm, CHO, CO2H e halo; R66 e R99 são, independentemente, selecionados a partir de H, Rm, OH, O Rm, SH, S Rm, NH2, NH Rm, N Rm Rp, NO2, Me3Sn e halo; R77 é, independentemente, selecionado a partir de H, Rm, OH, O Rm, SH, S Rm, NH2, NH Rm, N Rm Rp, NO2, Me3Sn e halo; Q é, independentemente, selecionado a partir de O, S e NH; R11 é H ou Rm ou, onde Q é O, SO3M, onde M é um cátion metálico; Rm e Rp são cada um, independentemente, selecionados a partir de grupos alquila C1-8, alquenila C2-C8, alquinila C2-C8, cicloalila C3-C8, heterociclila C3-C8, arila C5-20 e heteroarila C5-20 opcionalmente substituídos e, opcionalmente, em relação ao grupo N Rm Rp, Rm e Rp juntos com o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados formam um anel heterocíclico de 4, 5, 6 ou 7 membros opcionalmente substituído; R12, R16, R19 e R17 são como definidos para R22, R66, R99, e R77, respectivamente; R” é um grupo alquileno C3-C12, em que a cadeia pode ser interrompida por um ou mais heteroátomos selecionados a partir de O, S, N(H) e NMe e/ou um anel aromático, em que o anel é opcionalmente substituído; X e X’ são, independentemente, selecionados a partir de O, S e N(H).
2. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que Y é heteroarila; e R4 e R5 juntos formam um anel ciclobutila.
3. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que Y é uma porção selecionada a partir do grupo que consiste em:
Figure img0095
4. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que: Str é uma porção química representada pela seguinte fórmula:
Figure img0096
em que R6 é selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno C1-C10, alquenila C1-C10, cicloalquila C3-C8, (alquileno C1-C8)O- e alquileno C1- Cio-C(O)N(Ra)-alquileno C2-C6, onde cada alquileno pode ser substituído por um a cinco substituintes selecionados a partir do grupo que consiste em halo, trifluorometi- la, difluorometila, amino, alquilamino, ciano, sulfonila, sulfonamida, sulfóxido, hidróxi, alcóxi, éster, ácido carboxílico, alquiltio arila, cicloalquila C3-C8, heterocicloalquila C4C7, heteroarilalquila e heteroarila, cada Ra é, independentemente, H ou alquila C1-C6; e Sp é —Ar—Rb—, em que Ar é arila ou heteroarila, e Rb é (alquileno C1-C10)- C(=O)O-.
5. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que Str apresenta a fórmula:
Figure img0097
em que R7 é selecionado a partir de alquileno C1-C10, alquenila C1-C10, (alqui- leno C1-C10)O-, N(Rc)-(alquileno C2-C6)-N(Rc) e N(Rc)-(alquileno C2-C6); onde cada Rc é, independentemente, H ou alquila C1-C6; e Sp é —Ar—Rb—, em que Ar é arila ou heteroarila, Rb é (alquileno C1-C10)- C(=O)O-.
6. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 1 ou 4, CARACTERIZADO pelo fato de que é representado por:
Figure img0098
em que Ab é um anticorpo; L é uma porção química não-peptídica representada pela seguinte fórmula:
Figure img0099
R1 é alquila C1-C6, alquenila C1-C6, (alquila C1-C6)NHC(NH)NH2 ou (alquila C1-C6)NHC(O)NH2; e R3 e R2 são cada um, independentemente, H ou alquila C1-C10.
7. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 1 ou 4, CARACTERIZADO pelo fato de que é representado por:
Figure img0100
em que Ab é um anticorpo; L é uma porção química não-peptídica representada pela seguinte fórmula:
Figure img0101
R1 é alquila C1-C6, (alquila C1-C6)NHC(NH)NH2 ou (alquila C1- C6)NHC(O)NH2; e R4 e R5 juntos formam um anel cicloalquila C3-C7.
8. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 4 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que Y é heteroarila, arila ou al- quenila; e R6 é alquileno C1-C10.
9. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que Y é selecionado a partir de:
Figure img0102
Figure img0103
10. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, CARACTERIZADO pelo fato de que: Str é uma porção química representada pela seguinte fórmula:
Figure img0104
R6 é alquileno C1-C6; e Sp é —Ar—Rb—, onde Ar é arila, e Rb é (alquileno C1-C3)-C(=O)-O-.
11. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 1 ou 4, CARACTERIZADO pelo fato de que é representado pela seguinte fórmula:
Figure img0105
em que: R1 é alquila C1-C6-NH2, (alquila C1-C6)NHC(NH)NH2 ou (alquila C1- C6)NHC(O)NH2; e p é 1, 2, 3 ou 4;
Figure img0106
R1 é alquila C1-C6-NH2, (alquila C1-C6)NHC(NH)NH2 ou (alquila C1- C6)NHC(O)NH2; e R4 e R5 são cada um, independentemente, alquila C1-C6, em que a dita alquila é não substituída ou R4 e R5 podem formar um anel cicloalquila C3-C7.
12. Composto não-peptídico CARACTERIZADO pelo fato de que apresenta a Fórmula (IV) ou Fórmula (V):
Figure img0107
em que: Str é uma unidade extensora que pode ser covalentemente ligada a um anticorpo; Sp é uma ligação ou uma unidade espaçadora covalentemente ligada a uma porção de fármaco; Y é heteroarila, arila, -C(O)alquenila C1-C6, alquenila C1-C6 ou -alquenila C1- C6-NH-; R1 é alquila C1-C10, (alquila C1-C10)NHC(NH)NH2 ou (alquila C1- C10)NHC(O)NH2; R3 e R2 são cada um, independentemente, H, alquila C1-C10, arilalquila ou heteroarilalquila, ou R3 e R2 em conjunto podem formar uma cicloalquila C3-C7; R4 e R5 são cada um, independentemente, alquila C1-C10, arilalquila, hetero- arilalquila, (alquila C1-C10)OCH2-, ou R4 e R5 podem formar um anel cicloalquila C3-C7; D é uma porção de fármaco da fórmula A:
Figure img0108
ou um sal e/ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: a linha ondulada indica o sítio de ligação covalente ao ligante; as linhas pontilhadas indicam a presença opcional de uma ligação dupla entre C1 e C2 ou C2 e C3; R22 é, independentemente, selecionado a partir de H, OH, =O, =CH2, CN, Rm, O Rm, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2- Rm, CO2 Rm e CO Rm e, opcionalmente, ainda selecionado a partir de halo ou di-halo, em que RD é, independentemente, selecionado a partir de Rm, CO2 Rm, CO Rm, CHO, CO2H e halo; R66 e R99 são, independentemente, selecionados a partir de H, Rm, OH, O Rm, SH, S Rm, NH2, NH Rm, N Rm Rp, NO2, Me3Sn e halo; R77 é, independentemente, selecionado a partir de H, Rm, OH, O Rm, SH, S Rm, NH2, NH Rm, N Rm Rp, NO2, Me3Sn e halo; Q é, independentemente, selecionado a partir de O, S e NH; R11 é H ou Rm ou, onde Q é O, SO3M, onde M é um cátion metálico; Rm e Rp são cada um, independentemente, selecionados a partir dos grupos alquila C1-8, alquenila C2-C8, alquinila C2-C8, cicloalila C3-C8, heterociclila C3-C8, arila C5-20 e heteroarila C5-20 opcionalmente substituídos e, opcionalmente, em relação ao grupo N Rm Rp, Rm e Rp junto com o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados formam um anel heterocíclico de 4, 5, 6 ou 7 membros opcionalmente substituído; R12, R16, R19 e R17 são como definidos para R22, R66, R99 e R77, respectiva- mente; R” é um grupo alquileno C3-C12, em que a cadeia pode ser interrompida por um ou mais heteroátomos, selecionados a partir de O, S, N(H), e NMe e/ou um anel aromático, em que o anel é opcionalmente substituído; X e X’ são, independentemente, selecionados a partir de O, S e N(H); e RC é um grupo de coroamento.
13. Composto, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que é representado por uma das seguintes fórmulas: (a)(i):
Figure img0109
em que R6 é alquileno C1-C10; e R4 e R5 juntos formam um anel cicloalquila C3-C7; (a)(ii):
Figure img0110
em que: R6 é alquileno C1-C10;
Figure img0111
14. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo se liga a um ou mais dos polipeptídeos selecionados a partir do grupo que consiste em: BMPR1B; E16; STEAP1; 0772P; MPF; Napi3b; Sema 5b; PSCA hlg; ETBR; MSG783; STEAP2; TrpM4; CRIPTO; CD21; CD79b; FcRH2; HER2; NCA; MDP; IL20Rα; Brevican; EphB2R; ASLG659; PSCA; GEDA; BAFF-R; CD22; CD79a; CXCR5; HLA-DOB; P2X5; CD72; LY64; FcRH1; IRTA2; TENB2; PMEL17; TMEFF1; GDNF-Ra1; Ly6E; TMEM46; Ly6G6D; LGR5; RET; LY6K; GPR19; GPR54; ASPHD1; Tirosinase; TMEM118; GPR172A; MUC16 e CD33.
15. Uso de um conjugado de anticorpo-fármaco, como definido na reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.
16. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um conjugado de anticorpo-fármaco, como definido na reivindicação 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável do mesmo.
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