BR112017011325A2 - ?composto de conjugado anticorpo?antibiótico, composição, método de tratamento de uma infecção, método para matar staph aureus, processo para produzir o conjugado, kit para o tratamento de uma infecção, intermediários antibiótico-ligante e ligante-droga? - Google Patents

Abstract

A invenção provê conjugados de anticorpo anti-Staphylococcus aureus - antibiótico rifamicina e métodos de utilização dos mesmos.

Description

1V17T7 “COMPOSTO DE CONJUGADO ANTICORPO-ANTIBIÓTICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMA INFECÇÃO BACTERIANA, MÉTODO PARA MATAR STAPHYLOCOCCUS AUREUS, PROCESSO PARA PRODUZIR O COMPOSTO, KIT PARA O TRATAMENTO DE UMA INFECÇÃO BACTERIANA, INTERMEDIÁRIOS ANTIBIÓTICO-LIGANTE, USO DE UMA QUANTIDADE

TERAPEUTICAMENTE EFICAZ DO COMPOSTO E USO DE UM CONJUGADO ANTI-WTA-ANTIBIÓTICO” REFERÊNCIA CRUZADA PARA Os PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório US 62/087.184, depositado em 3 de dezembro de 2014, cuja divulgação é integralmente incorporada ao presente pela referência para todos os fins.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] O presente pedido contém uma listagem de sequências que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e que está integralmente incorporada ao presente pela referência. A referida cópia ASCII, criada em 20 de novembro de 2015, é nomeada P32433-WO SL.txt e possui 190541 bytes de tamanho.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] A invenção diz respeito aos anticorpos anti-ácido teicoico de parede (“antiWTA”; do inglês anti-Wall Teichoic Acid) conjugados com antibióticos do tipo rifamicina e ao uso do conjugado anticorpo-antibiótico resultante no tratamento de infecções por Staphylococcus.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] O Staphylococcus aureus (S. aureus, SA) é a principal causa de infecções bacterianas em seres humanos em todo o mundo e representa um importante problema de saúde tanto em ambiente hospitalar quanto na comunidade. No entanto, o S. aureus não é exclusivamente um patógeno e comumente coloniza as narinas anteriores e a pele de indivíduos saudáveis. Quando a infecção ocorre, as infecções mais graves, como endocardite, osteomielite, pneumonia necrotizante e sepse, ocorrem após a disseminação das bactérias na corrente sanguínea (Lowy, F.D. (1998) “Staphylococcus aureus infections" N Engl J Med 339, 520-532). Ao longo das últimas décadas, a infecção pelo S. aureus tornou-se cada vez mais difícil de ser tratada devido ao surgimento e a rápida disseminação de S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) que são resistentes a todos os antibióticos beta-lactâmicos conhecidos (Boucher, H.W,., et a/. (2009) “Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America” Clin Infect Dis 48, 1-12). As infecções por MRSA invasivos são difíceis de tratar, com uma taxa de mortalidade de cerca de 20% e são a principal causa de morte por agente infeccioso nos EUA. A vancomicina, linezolida e daptomicina tornaram-se assim os poucos antibióticos de escolha para o tratamento de infecções por MRSA invasivos (Boucher, H., Miller, L.G. & Razonable, R.R. (2010) “Serious infections caused by methicillin- resistant Staphylococcus aureus” Clin Infect Dis 51 Suppl 2, S183-197). No entanto, uma reduzida sensibilidade à vancomicina e resistência cruzada a linezolida e daptomicina já foram relatados em cepas clínicas de MRSA (Nannini, E., Murray, B.E. & Arias, C.A. (2010) “Resistance or decreased susceptibility to glycopeptides, daptomycin, and linezolid in methicillin-resistant Staphylococcus aureus” Curr Opin Pharmacol 10, 516-521). Ao longo do tempo, a dose de vancomicina necessária para superar a resistência aumentou para níveis elevados onde ocorre a nefrotoxicidade. Assim, a mortalidade e a morbidade por infecções invasivas com MRSA permanecem elevadas apesar destes antibióticos.

[0005] Investigações revelaram que o S. aureus é capaz de invadir e sobreviver dentro de células de mamíferos incluindo as células fagocíticas que são responsáveis pela depuração bacteriana (Thwaites, G.E. & Gant, V. (2011) Are bloodstream leukocytes Trojan Horses for the metastasis of Staphylococcus aureus? Nat Rev Microbiol 9, 215-222); Rogers, D.E., Tompsett, R. (1952) “The survival of staphylococci within human leukocytes" J.

Exp.

Med 95, 209-230); Gresham, H.D., et al. (2000) “Survival of Staphylococcus aureus inside neutrophils contributes to infection” J Immunol 164, 3713-3722); Kapral, FA. & Shayegani, M.G. (1959) “Intracellular survival of staphylococci' J Exp Med 110, 123-138; Anwar, S., et al. (2009) “The rise and rise of Staphylococcus aureus: laughing in the face of granulocytes" Clin Exp Immunol 157, 216-224); Fraunholz, M. & Sinha, B. (2012) “Intracellular Staphylococcus aureus: live-in and let die” Front Cell Infect Microbiol 2, 43); Garzoni, C. & Kelley, W.L. (2011) “Return of the Trojan horse: intracellular phenotype switching and immune evasion by Staphylococcus aureus" EMBO Mol Med 3, 115-117). O S. aureus é absorvido por células fagocíticas do hospedeiro, principalmente neutrófilos e macrófagos, poucos minutos após a infecção intravenosa (Rogers, D.E. (1956) “Studies on Bacterimia: Mechanisms Relating to the Persistence of Bacteremia in Rabbits Following the Intravanous Injection of Staphylococci"” JEM 103, 713). Embora a maioria das bactérias sejam efetivamente mortas por estas células, a depuração incompleta do S. aureus dentro dos fagócitos transmitidos pelo sangue pode permitir que estas células infectadas atuem como “cavalos de Tróia" para a disseminação das bactérias à distância do local inicial da infecção.

De fato, os pacientes com contagem normal de neutrófilos podem ser mais propensos à doença disseminada do que aqueles com contagem reduzida de neutrófilos (Thwaites, G.E. & Gant, V. (2011) supra). Uma vez entregue aos tecidos, o S. aureus pode invadir vários tipos de células não fagocíticas e o S. aureus intracelular nos tecidos está associado a infecções crônicas ou recorrentes.

Além disso, a exposição de bactérias intracelulares em concentrações subótimas de antibióticos pode encorajar a emergência de cepas resistentes aos antibióticos,

tornando este problema clínico mais agudo. De acordo com estas observações, o tratamento de pacientes com infecções invasivas por MRSA, tais como bacteremia ou endocardite, com vancomicina ou daptomicina foi associado a taxas de falha superiores a 50% (Kullar, R., Davis, S.L., Levine, D.P. & Rybak, M.J. Impact of vancomycin "exposure on outcomes in patients with methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia: support for consensus guidelines suggested targets. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America 52, 975-981 (2011); Fowler, V.G., Jr. et al. Daptomycin versus standard therapy for bacteremia and endocarditis caused by Staphylococcus aureus. The New England journal of medicine 355, 653-665 (2006); Yoon, Y.K., Kim, J.Y., Park, D.W., Sohn, JW. & Kim, M.J. Predictors of persistent methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteraemia in patients treated with vancomycin. The Joumal of antimicrobial chemotherapy 65:1015-1018 (2010)). Portanto, uma terapia antiestafilocócica bem sucedida deve incluir a eliminação de bactérias intracelulares.

[0006] As ansamicinas são uma classe de antibióticos, incluindo rifamicina, rifampina, rifampicina, rifabutina, rifapentina, rifalazila, ABI-1657 e seus análogos, que inibem a RNA polimerase bacteriana e têm uma potência excepcional contra bactérias Gram-negativas e Gram-positivas seletivas (Rothstein, D.M., et al (2003) Expert Opin. Investir. Drugs 12 (2): 255-271; US 7342011; US 7271165).

[0007] Foram relatadas imunoterapias para prevenir e tratar infecções por S. aureus (incluindo MRSA). A publicação US 2011/0262477 diz respeito ao uso de proteínas de adesão bacterianas Eap, Emp e AdsA como vacinas para estimular a resposta imune contra o MRSA. O documento WO 2000/071585 descreve anticorpos monoclionais isolados específicos reativos para a cepa de S. aureus isolada. O documento US 2011/0059085A1 sugere uma estratégia baseada em anticorpo (Ab) utilizando Abs IgM específicos para um ou mais antígenos capsulares do SA, embora nenhum anticorpo real tenha sido descrito.

[0008] Conjugados anticorpo-droga (ADC), também conhecidos como imunoconjugados, são moléculas quimioterápicas direcionadas que combinam as propriedades ideais de anticorpos e drogas citotóxicas, direcionando potentes fármacos citotóxicos para as células tumorais que expressam antígenos (Teicher, B.A. (2009) Current Cancer Drug Targets 9: 982- 1004), aumentando assim o índice terapêutico através da maximização da eficácia e minimização da toxicidade fora do alvo (Carter, P.J. e Senter P.D. (2008) The Cancer J. 14 (3): 154-169; Chari, R.V. (2008) Acc. Chem. Res. 41: 98-107. O ADC compreende um anticorpo de direcionamento covalentemente ligado através de uma porção de ligação a uma unidade de fármaco citotóxico. Imunoconjugados permitem a distribuição direcionada de uma porção droga a um tumor e o acúmulo intracelular, em que a administração sistêmica de fármacos não conjugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade para as células normais bem como para as células tumorais que devem ser eliminadas (Polakis P. (2005) Current Opinion em Pharmacology 5: 382-387).

[0009] São — descritos — conjugados —não específicos de imunoglobulina-antibiótico que se ligam à superfície das bactérias alvo através do antibiótico para o tratamento da sepse (US 5.545.721; US 6.660.267). São descritos anticorpos conjugados com antibióticos que possuem uma porção de ligação ao antígeno específica para um antígeno bacteriano (tal como o polissacarídeo capsular do SA), mas que não possuem uma região constante que reaja com uma proteína de ligação à Fc bacteriana, por exemplo, proteína estafilocócica A (US 7.569.677).

[0010] Tendo em vista a alarmante taxa de resistência de MRSA aos antibióticos convencionais e a mortalidade e morbidade resultantes de infecções invasivas por MRSA, existe uma elevada necessidade não satisfeita de novas terapêuticas para o tratamento de infecções pelo S. aureus. A presente invenção satisfaz esta necessidade e provê composições e métodos que ultrapassam as limitações das composições terapêuticas atuais, bem como oferece vantagens adicionais que serão evidentes a partir da descrição detalhada abaixo.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0011] A presente invenção provê uma terapêutica única que inclui a eliminação de bactérias intracelulares. A presente invenção demonstra que tal terapêutica é eficaz in vivo onde antibióticos convencionais como a vancomicina falham.

[0012] A invenção provê composições referidas como “conjugado anticorpo-antibiótico” (ou “AAC”) compreendendo um anticorpo conjugado por uma ligação covalente a uma ou mais porções de antibióticos do tipo rifamicina.

[0013] Um aspecto da invenção é um composto de conjugado anticorpo-antibiótico compreendendo um anticorpo anti-ácido teicoico de parede (WTA) covalentemente ligado por um ligante não peptídico, clivável por protease a um antibiótico do tipo rifamicina.

[0014] Uma realização exemplar da invenção é um conjugado anticorpo-antibiótico de acordo com a reivindicação 1, possuindo a fórmula: Ab(PML-abx), em que: Ab é o anticorpo anti-ácido teicoico de parede; PML é um ligante não peptídico, clivável por protease, possuindo a fórmula: —Str-PM—-Y- onde Str é uma unidade extensora (stretcher); PM é uma unidade peptidomimética, e Y é uma unidade espaçadora; abx é o antibiótico do tipo rifamicina; e p é um número inteiro de 1 a 8.

[0015] Os compostos de conjugado anticorpo-antibiótico de

7INT7 qualquer um dos exemplos de realização anteriores podem compreender qualquer um dos anticorpos anti-ácido teicoico de parede (WTA) descritos na presente invenção. Estes anticorpos anti-WTA se ligam ao Staphylococcus aureus. Em um exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpo anti-WTAa monoclonal. Em anticorpos anti-WTAa exemplares, o anticorpo (Ab) é um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia leve (L) e uma cadeia pesada (H), com a cadeia L compreendendo CDR L1, CDR L2 e CDR L3 e a cadeia H compreendendo CDR H1, CDR H2 e CDR H3, em que as CDR L1, CDORL2 e CDR L3 e CDR H1, CDR H2 e CDR H3 compreendem as sequências de aminoácidos das CDR de cada um dos anticorpos (Abs) 4461 (SEQ ID NO: 1-6), 4624 (SEQ ID NO: 7-12), 4399 (SEQ ID NO: 13-18) e 6267 (SEQ ID NO: 19-24), respectivamente, tal como mostrado nas Tabelas 1A e 1B.

[0016] Em alguns exemplos de realização, o anticorpo anti-WTA compreende uma região variável de cadeia pesada (VH), em que VH compreende pelo menos 95% de identidade de sequência ao longo do comprimento da região VH selecionada a partir da sequência VH de SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 dos anticorpos 4461, 4624, 4399 e 6267, respectivamente. Os anticorpos podem compreender ainda uma região variável de cadeia L (VL) em que a VL compreende pelo menos 95% de identidade de sequência ao longo do comprimento da região VL selecionada a partir da sequência VL de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 dos anticorpos 4461, 4624, 4399 e 6267, respectivamente.

[0017] Em outro exemplo de realização, o composto de conjugado anticorpo-antibiótico da invenção compreende um anticorpo monoclonal anti- WTARB. Um anticorpo anti-WTAB exemplar compreende uma cadeia leve (L) e uma cadeia pesada (H), a cadeia L compreendendo CDR L1, CDR L2 e CDR L3 e a cadeia H compreendendo CDR H1, CDR H2 e CDR H3, em que a CDR L1, CDR L2, E CDR L3 e CDR H1, CDR H2 e CDR H3 compreendem as sequências de aminoácidos das CDRs correspondentes de cada um dos anticorpos (Abs) mostrados na Figura 12 (SEQ ID NO: 33-110).

[0018] Outro anticorpo anti-WTAB útil para gerar os AACs da invenção compreende uma região variável de cadeia L (VL) em que a VL compreende pelo menos 95% de identidade de sequência ao longo do comprimento da região VL selecionada a partir da sequência VL correspondente a cada um dos anticorpos 6078, 6263, 4450, 6297, 6239, 6232, 6259, 6292, 4462, 6265, 6253, 4497 e 4487 respectivamente, tal como mostrado nas Figuras 15A-1, 15A-2, 15A-3 nas posições Kabat 1-107. Este anticorpo pode compreender ainda uma região variável de cadeia pesada (VH), em que a VH compreende pelo menos 95% de identidade de sequência ao longo do comprimento da região VH selecionada a partir das sequências VH correspondentes a cada um dos anticorpos 6078, 6263, 4450, 6297, 6239, 6232, 6259, 6292, 4462, 6265, 6253, 4497 e 4487, respectivamente, tal como mostrado nas Figuras 15B-1 a 15B-6 nas posições Kabat 1-113.

[0019] Outro anticorpo anti-WTAB, a VL compreende a sequência de SEQ ID NO: 111 e a VH compreende a sequência de SEQ ID NO: 112, em que Xé QouEeX é M,louV.

[0020] A invenção provê um anti-WTARB útil para gerar um AAC da invenção em que a cadeia leve de anticorpo contém uma cisteína modificada e compreende a sequência de SEQ ID NO: 115 e a cadeia H compreende a SEQ ID NO: 116 em que X é M, l ou V. Em um pareamento alternativo das cadeias L e H, a cadeia leve de anticorpo compreende a sequência de SEQ ID NO: 113 e a cadeia H contém uma cisteína modificada e compreende a SEQ ID NO: 117 em que X é M, l ou V. Uma Cis pode ser manipulada em cada uma das cadeias L e H; em um exemplo de tal anticorpo WTAB a cadeia leve contém uma cisteína modificada e compreende a sequência de SEQ ID NO: 115, e a cadeia H contém uma cisteína modificada e compreende a SEQ ID NO: 117 em que Xé M, | ou

Vv.

[0021] Outro anticorpo anti-WTAB útil para a conjugação compreende uma VH e uma VL, em que a VH compreende pelo menos 95% de identidade de sequência ao longo do comprimento da VH com a SEQ ID NO: 156 e a VL compreende pelo menos 95% de identidade de sequência ao longo do comprimento da VL com a sequência SEQ ID NO: 119. Em um exemplo de realização específico, o anticorpo anti-WTAB compreende uma VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 156 e uma VL compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 119.

[0022] O anticorpo anti-WTARB da invenção pode compreender uma cadeia L compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 121 e uma cadeia H compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 124. O anticorpo anti-WTAB da invenção pode compreender uma cadeia L compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 123 e uma cadeia H compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 124.

[0023] Em outros exemplos de realização, o anticorpo compreende: i) CDRs de cadeia L e cadeia H de SEQ ID NO 99-104 ou CDRs de cadeia L e cadeia H de SEQ ID NOs: 33-38; ou ii) a VL de SEQ ID NO: 119 ou SEQ ID NO: 123 pareada com a VH de SEQ ID NO: 120 ou SEQ ID NO: 156; ou li) a VL de SEQ ID NO: 111 pareada com a VH de SEQ ID NO: 112.

[0024] Em alguns exemplos de realização dos AAC da invenção, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização anteriores.

[0025] O anticorpo de qualquer um dos exemplos de realização anteriores pode ser um fragmento de ligação ao antígeno que não possui uma região Fc. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo é um F(ab) ou F(ab')2. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo compreende ainda uma região constante de cadeia pesada e/ou uma região constante de cadeia leve, em que a região constante de cadeia pesada e/ou a região constante de cadeia leve compreendem um ou mais aminoácidos que são substituídos por resíduos de cisteíina. Em alguns exemplos de realização, a região constante da cadeia pesada compreende a substituição de aminoácidos A118C e/ou S400C, e/ou a região constante da cadeia leve compreende a substituição de aminoácidos V205C, em que o sistema de numeração está de acordo com o sistema de numeração EU.

[0026]Em alguns exemplos de realização de qualquer um dos anticorpos descritos acima, o anticorpo não é do isotipo IgM. Em alguns exemplos de realização de qualquer dos anticorpos descritos acima, o anticorpo é do isotipo IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, I9G4), IgE, I9D ou IgA (por exemplo, IgA: ou IgA>2).

[0027]UM exemplo de realização da invenção é uma composição farmacêutica compreendendo o composto de conjugado anticorpo-antibiótico, e um veículo farmaceuticamente aceitável, deslizante, diluente ou excipiente.

[0028] Os AACs anti-WTA da invenção são úteis como agentes antimicrobianos eficazes para tratar Staphylococci humanos e veterinários, por exemplo, S. aureus, S. saprophyticus e S. simulans bem como Listeria, por exemplo, Listeria monocytogenes. Em um aspecto específico, os AACs da invenção são úteis para tratar infecções por S. aureus. Assim, a invenção também proporciona um método de tratamento de uma infecção por estafiococos em um paciente humano ou veterinário compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado anticorpo-antibiótico de qualquer um dos exemplos de realização descritos anteriormente. Em um exemplo de realização a infecção bacteriana é uma infecção por Staphylococcus aureus. Em alguns exemplos de realização, o paciente foi diagnosticado com uma infecção por S. aureus. Em alguns exemplos de realização, o tratamento da infecção bacteriana compreende a redução da carga bacteriana ou contagens. Em um exemplo de realização, o método de tratamento é administrado a pacientes nos quais a infecção bacteriana incluindo S. aureus culminou na bacteremia. Em exemplos de realização específicos, o método é utilizado para tratar a endocardite estafilocócica ou osteomielite. Em um exemplo de realização, o composto de conjugado anticorpo-antibiótico é administrado ao paciente infectado a uma dose no intervalo de cerca de 50 mg/kg a 100 mg/kg.

[0029] Também é proporcionado um método para matar S. aureus intracelular nas células de um paciente infectado com S. aureus sem matar as células hospedeiras pela administração de um composto de conjugado anti-WTA-antibiótico de qualquer um dos exemplos de realização descritos acima. Outro método é fornecido para matar células bacterianas persistentes de Staphylococcal (por exemplo, S. aureus) in vivo pelo contato da bactéria persistente com um AAC de qualquer um dos exemplos de realização anteriores.

[0030] Em outro exemplo de realização, o método de tratamento compreende ainda a administração de um segundo agente terapêutico. Em outro exemplo de realização, o segundo agente terapêutico é um antibiótico incluindo um antibiótico contra S. aureus em geral ou MRSA em particular.

[0031] Em um exemplo de realização, o segundo antibiótico administrado em combinação com o composto de conjugado anticorpo- antibiótico da invenção é selecionado a partir das classes estruturais: (i) aminoglicosídeos; (ii) beta-lactamas; (ili) macrolídeos/peptídeos cíclicos; (iv) tetraciclinas; (v) fluoroquinolinas/fluoroquinolonas; (vi) e oxazolidinonas.

[0032]EmM um exemplo de realização, o segundo antibiótico administrado em combinação com o composto de conjugado anticorpo- antibiótico da invenção é selecionado a partir de clindamicina, novobiocina, retapamulina, daptomicina, GSK-2140944, CG-400549, sitafloxacina,

teicoplanina, triclosan, naftiridona, radezolida, doxorrubicina, ampicilina, vancomicina, imipenem, doripenem, gemcitabinay dalbavancina e azitromicina.

[0033]Em alguns exemplos de realização, a carga bacteriana no paciente infectado foi reduzida para um nível indetectável após o tratamento. Em um exemplo de realização, a cultura com o sangue do paciente é negativa após o tratamento em comparação com uma cultura de sangue positiva antes do tratamento. Em alguns exemplos de realização, a resistência bacteriana no indivíduo é indetectável ou baixa. Em alguns exemplos de realização, o sujeito não responde ao tratamento com meticilina ou vancomicina.

[0034] Um exemplo de realização exemplar da invenção é um processo para fazer o conjugado anticorpo-antibiótico compreendendo a conjugação de um antibiótico do tipo rifamicina com um anticorpo anti-ácido teicoico de parede (WTA).

[0035] Um exemplo de realização da invenção é um Kkit para tratar uma infecção bacteriana, compreendendo: a) uma composição farmacêutica compreendendo o composto de conjugado anticorpo-antibiótico, e um veículo farmaceuticamente aceitável, deslizante, diluente ou excipiente; e b) instruções para uso.

[0036] Um aspecto da invenção é um intermediário antibiótico- ligante possuindo a Fórmula |l:

Oo Mn, o | O o O OR

SO OH OH X—PML— AR? So HO, Pu, HN o à W em que: as linhas tracejadas indicam uma ligação opcional; R é H, C1-C12 alquila, ou C(O)CHs; R' é OH; Rº? é CH=N-—(heterociclla) em que a heterociclla está opcionalmente substituída por um ou mais grupos independentemente selecionados a partir de C(O)CH3 , alguila Ci-C12, heteroarila Ci-C12, heterociclila C2—=Cao, arila Ce-C20, e carbociclila Ca-C12; ou R' e R? formam uma heteroarila ou heterociclila fusionada possuindo cinco ou seis membross, e opcionalmente, formando um anel de heteroarila, heterociclila, arila, carbociclila de seis membros em espiro ou fusionado, em que anel de heteroarila, heterociclila, arila, carbociclila de seis membros em espiro ou fusionado é opcionalmente substituído por H, F, CI, Br, |, alquila C1-C12, ou OH; PML é um ligante não peptídico, clivável por protease, ligado a R? ou fundido a heteroarila ou heterocíclica formada por R' e R2; possuindo a fórmula: —Str-PM-Y- onde Str é uma unidade extensora (stretcher); PM é uma unidade peptidomimética, e Y é uma unidade espaçadora; e

X é um grupo funcional reativo selecionado a partir da maleimida, tiol, amino, brometo, bromoacetamida, iodoacetamida, p-toluenossulfonato, iodeto, hidroxila, carboxila, bissulfeto de piridila e N-hidroxipucanimida.

[0037] Deve ser compreendido que uma, algumas, ou todas as propriedades dos diversos exemplos de realização descritos na presente invenção podem ser combinadas para formar outros exemplos de realização da presente invenção. Estes e outros aspectos da invenção serão evidentes para os técnicos hábeis no assunto.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0038] Figura 1: depósitos intracelulares de MRSA são protegidos a partir de vancomicina in vivo e in vitro. A Figura 1A ilustra um esquema do desenho experimental para gerar bactérias livres (planctônicas) vs. bactérias intracelulares. Quatro coortes de camundongos foram infectadas por injeção intravenosa com doses aproximadamente equivalentes de bactérias livres viáveis ou bactérias intracelulares e os grupos selecionados foram tratados com vancomicina imediatamente após a infecção e depois uma vez por dia (vide o Exemplo 2). A Figura 1B e a Figura 1C mostram cargas bacterianas no rim e no cérebro, respectivamente, de camundongos infectados 4 dias após a infecção. A linha tracejada indica o limite de detecção para o ensaio. A Figura 1D mostra que o MRSA está protegido da vancomicina quando cultivado em uma monocamada de células infectáveis. (ND = não detectado). A Figura IE E a Figura 1F mostra que o MRSA é capaz de crescer na presença de vancomicina quando cultivada em uma monocamada de células infectáveis. O MRSA (bactérias livres) foi semeado em meio, meio + vancomicina ou meio + vancomiíicina e plaqueado em uma monocamada de osteoblastos MG63 (Figura 1E) ou Células Endoteliais Microvasculares de Cérebro Humano (HBMEC, Figura 1F ). As bactérias extracelulares (bactérias livres) cresceram em meio sozinho, mas foram mortas pela vancomicina. Em poços contendo uma monocamada de células de mamífero (Intracelular + vanco), uma fração das bactérias foi protegida da vancomicina durante as primeiras 8 horas após a infecção e foram capazes de expandir dentro do compartimento intracelular ao longo de 24 horas. As barras de erro mostram o desvio padrão para os poços em triplicatas.

[0039] Figura 2: mostra o conceito de um Conjugado Antibiótico - Antibiótico (AAC). Em um exemplo, o AAC consiste em um anticorpo direcionado contra um epitopo na superfície de S. aureus ligado a um potente antibiótico do tipo rifamicina (por exemplo, Rifalog) através de um ligante que é clivado por proteases lisossômicas.

[0040] Figura 3: mostra um possível mecanismo de ativação de fármacos para conjugados anticorpo-antibiótico (AAC). Os AACs ligam-se às bactérias extracelulares através do domínio de ligação ao antígeno (Fab) do anticorpo e promovem a captação das bactérias opsonizadas através de fagocitose mediada por Fc. O ligante é clivado por proteases lisossômicas, tal como a catepsina B. Após a clivagem do ligante, o ligante é hidrolisado liberando o antibiótico livre dentro do fagolisossoma. O antibiótico livre mata a bactéria opsonizada e fagocitada, juntamente com qualquer bactéria previamente internalizada que resida no mesmo compartimento.

[0041] Figura 4: mostra a parede celular de bactérias Gram- positivas, tal como o S. aureus com uma representação em desenho dos ácidos teicoicos de parede (WTA), ácido Lipo teicoico (LTA) e peptidoglicano (PGN) que estabilizam a membrana celular e fornecem sítio de ligação.

[0042] Figura 5: mostra a estrutura química e modificações de glicosila do Ácido Teicoico de Parede (WTA), descrito em detalhes nas Definições.

[0043] Figuras 6A e 6B: resumem as características dos anticorpos (Abs) a partir do rastreio primário de uma biblioteca de anticorpos monocioanis

(mMAbs) mostrando ligação ELISA-positiva com preparações de parede celular a partir de cepa de S. aureus USA300 ou Wooda486 , tal como descrito no Exemplo

3. Dos Abs que se ligam ao WTA, 4 são específicos para o WTA alfa e 13 se ligam especificamente ao WTA beta.

[0044] Figura 7A: mostra a titulação de anticorpo anti-B-GICNAC WTA marcado com Alexa-488 ou anti-ca-GICNAC WTA marcado com Alexa-448 em MRSA isolado diretamente de rins de camundongo infectados. O anticorpo anti-CMV-gD serviu como um controle de isotipo. A Figura 7B mostra que o anticorpo utilizado para gerar o AAC reconhece um epitopo no Ácido Teicoico de Parede que é mediado pela Glicosiltransferase TarS. A análise por FACS com o anticorpo anti-B-GI-NAC WTA ou com o controle isotípico em Wt USA300, USA300-TarM ou USA300-TarS.

[0045] Figura 8: mostra a seleção de um potente antibiótico do tipo rifamicina (rifalog) dimetilboipbpBOR pela sua capacidade de matar MRSA não replicante.

[0046] Figura 9: Ensaio de inibição do crescimento demonstrando que TAC intacto (uma forma de AAC) não mata as bactérias planctônicas, a menos que o antibiótico seja liberado pelo tratamento com catepsina B. O TAC foi incubado em tampão sozinho (círculos abertos) ou tratado com catepsina B (círculos fechados). O TAC intacto não foi capaz de impedir o crescimento bacteriano após incubação de um dia para o outro. O pré-tratamento do TAC com catepsina B liberou atividade antibiótica suficiente para prevenir o crescimento bacteriano a 0,6 ug/mL de TAC, que se prevê conter 0,006 pug/mL de antibiótico.

[0047] Figura 10: mostra o tratamento de camundongos infectados com S. aureus com anti-WTA-PML AAC reduzidas ou contagens bacterianas erradicadas em órgãos infectados em comparação com anticorpos nus, tal como descrito no Exemplo 10. A Figura 10A é um esquema que mostra a linha do tempo do experimento e os pontos de tempo de injeção conforme descrito no Exemplo 10. A Figura 10B mostra que o tratamento com AAC (DAR2) da Tabela 3 reduziu a carga bacteriana nos rins em aproximadamente 7.000 vezes. Figura 10C mostra que o tratamento com AAC (DAR2) reduziu a carga bacteriana no coração em aproximadamente 500 vezes.

[0048] Figura 11A: fornece um alinhamento de sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve (VL) de quatro anticorpos anti- WTA alfa humanos, 4461, 4624, 4399, 6267 (SEQ ID NOs: 25, 27, 29 e 31, respectivamente, por ordem de aparecimento). As sequências das CDRs; CDRL1, L2 e L3 de acordo com a numeração de Kabat estão sublinhadas. À Figura 11B mostra um alinhamento de sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada (VH) dos quatro anticorpos anti-WTA alfa humanos da Figura 11A. As sequências das CDRs, CDR H1, H2 e H3, de acordo com a numeração de Kabat estão sublinhadas (SEQ ID NOs: 26, 28, 30 e 32, respectivamente, por ordem de aparecimento).

[0049] Figura 12: mostra as sequências CDRs das cadeias L e H de 13 anticorpos anti-WTA beta humanos (SEQ ID NOs: 33-110).

[0050] Figuras 13A-1 e 13A-2: mostram um alinhamento da cadeia L completa (cadeia leve) do Ab anti-WTA beta 6078 (não modificado) e as suas variantes, v2, v3, v4 (SEQ ID NOs: 113, 113, 115, 113, 115, 113, 115 e 115, respectivamente, por ordem de aparecimento). As sequências das CDRs; CDRL1, L2 e L3 de acordo com a numeração de Kabat estão sublinhadas. As caixas mostram os resíduos de contato e os resíduos da CDR de acordo com Kabat e Chothia. As variantes de cadeia L que contêm uma modificação de Cis estão indicadas pelo C na caixa em preto próxima ao fim da região constante (no resíduo EU nº 205 neste caso). A designação variante, por exemplo, v2LC-Cis significa a variante 2 contendo uma modificação de Cis na cadeia L. HCLC-Cis significa que cada uma das cadeias H e L contém uma modificação de Cis. As variantes 2, 3 e 4 têm alterações no início da cadeia H conforme mostrado nas Figuras 13B.

[0051] Figuras 13B-1, 13B-2, 13B-3, 13B4: mostram um alinhamento da cadeia H completa (cadeia pesada) do Ab anti-WTA beta 6078 (não modificado) e as suas variantes, v2, v3, v4 (SEQ ID NOs: 114, 139-144 e 143, respectivamente, por ordem de aparecimento) que têm alterações no início da cadeia H. As variantes de cadeia H que contêm uma modificação de Cis estão indicadas pelo C na caixa em preto próxima ao início da região constante (no resíduo EU nº 118 neste caso).

[0052] Figuras 14A-1 e 14A-2: mostram um alinhamento da cadeia L completa de cadeias L do Ab anti-WTA beta 4497 (não modificado) e das formas modificadas com Cis (SEQ ID NOs: 121, 123, 145 e 145, respectivamente, por ordem de aparecimento). As sequências das CDRs; CDRL1, L2 e L3 de acordo com a numeração de Kabat estão sublinhadas. As caixas mostram os resíduos de contato e os resíduos da CDR de acordo com Kabat e Chothia. As variantes de cadeia L que contêm uma modificação de Cis estão indicadas pelo C na caixa tracejada próxima ao fim da região constante (no resíduo EU nº 205 neste caso).

[0053] Figuras 14B-1, 14B-2, 14B-3: mostram um alinhamento da cadeia H completa do Ab anti-WTA beta 4497 (não modificado) e a sua variante v8 com D alterada para E na posição 96 da CDR H3, com ou sem modificações de Cis (SEQ ID NO: 146-147, 157 e 147, respectivamente, por ordem de aparecimento). As variantes de cadeia H que contêm uma modificação de Cis estão indicadas pelo C na caixa em preto próxima ao início da região constante (no resíduo EU nº 118 neste caso).

[0054] Figuras 15A-1, 15A-2, 15A-3: mostram um alinhamento de sequência de aminoácidos da cadeia leve completa dos treze anticorpos anti- WTA beta humanos (SEQ ID NOs: 113, 158-167, 121 e 168, respectivamente em ordem de aparecimento). A região variável (VL) abrange as posições de aminoácidos seguindo o sistema de numeração de Kabat de 1 a 107. As sequências das CDRs; CDRL1, L2 e L3 de acordo com a numeração de Kabat estão sublinhadas.

[0055] Figuras 15B-1 até 15B-6: mostram um alinhamento de sequências de aminoácidos da cadeia pesada completa dos treze anticorpos anti-WTA beta humanos das Figuras 15A-1, 15A-2, 15A-3 (SEQ ID NOs: 114, 169-176, 133-134, 138 e 127, respectivamente em ordem de aparecimento). À região variável (VH) abrange as posições de aminoácidos de Kabat de 1-113. As sequências das CDRs; CDR H1, H2 e H3, de acordo com a numeração de Kabat estão sublinhadas. A posição EU 118 da cadeia H marcada com um asterisco pode ser alterada para Cis para a conjugação com o fármaco. Os resíduos destacados em preto podem ser substituídos por outros resíduos que não afetam a ligação do antígeno a fim de evitar a desamidação, a isomerização do ácido aspártico, e oxidação ou glicosilação N-ligada.

[0056] Figura 16: mostra uma comparação do Ab 4497 e os seus mutantes nas posições de aminoácidos destacadas e a sua força de ligação relativa ao antígeno testado por ELISA. A Figura 16 revela as SEQ ID NOs: 177, 177, 177, 178, 178, 179, 179, 180, 180 e 180, respectivamente, por ordem de aparecimento.

[0057] Figura 17: mostra que o pré-tratamento com 50 mg/kg de anticorpos livres não é eficaz em um modelo de infecção intravenosa. Os camundongos Balb/c receberam uma dose única de veículo controle (PBS) ou 50 mg/Kg de anticorpos por injeção intravenosa 30 minutos antes da infecção com 2x107 UFC de USA300. Os grupos de tratamento incluíram um anticorpo de controle isotípico que não se liga ao S. aureus (gD), um anticorpo dirigido contra a modificação beta do ácido teicoico de parede (4497) ou um anticorpo dirigido contra a modificação alfa do ácido teicoico de parede (7578). Os camundongos controle foram administrados duas vezes por dia com 110 mg/Kg de vancomicina por injeção intraperitoneal (Vanco).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0058] A referência passará a ser feita em detalhes em determinadas realizações da invenção, cujos exemplos estão ilustrados nas estruturas e fórmulas anexas. Embora a invenção seja descrita em conjunto com os exemplos de realização citados, incluindo métodos, materiais e exemplos, tal descrição não é limitativa e a invenção abrange todas as alternativas, modificações e equivalentes, sejam eles conhecidos ou incorporados ao presente. No caso em que uma ou mais literaturas, patentes e materiais similares incorporados, se diferirem ou contradizerem ao presente pedido, incluindo, mas não se limitado a, definição de termos, uso de termos, técnicas descritas e similares, as definições do presente pedido prevalecerá. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente têm o mesmo significado que é comumente compreendido por um técnico hábil no assunto ao qual esta invenção pertence. Um técnico no assunto reconhecerá que muitos materiais e métodos similares ou equivalentes aos descritos no presente documento, poderiam ser utilizados na prática da presente invenção. À presente invenção não está de forma alguma limitada aos métodos e materiais descritos.

[0059] Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências citadas no presente são incorporados ao presente pela referência em sua totalidade.

| - TÉCNICAS GERAIS

[0060]As técnicas e procedimentos descritos ou mencionados na presente invenção são, em geral, bem compreendidos e comumente empregados pelo uso da metodologia convencional pelos técnicos hábeis no assunto como, por exemplo, as metodologias amplamente utilizadas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); a série Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames e G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow e Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.|. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.|l. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather e P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, e D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley & Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir e C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (JM. Miller e M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et a/., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et a/., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley e Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway e P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd e C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow e D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti e J. D. Capra, eds., Hanwood Academic Publishers, 1995); e Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et a/., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

[0061] A nomenclatura utilizada no presente pedido baseia-se na nomenclatura sistemática da IUPAC, salvo quando indicado de outra forma. A menos que definido de outra forma, os termos técnicos e científicos utilizados no presente têm o mesmo significado que é comumente compreendido por um técnico hábil no assunto ao qual esta invenção pertence, e são consistentes com: Singleton et al., (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2º Ed., J. Wiley & Sons, Nova lorque, NY; e Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5º Ed., Garland Publishing, Nova lorque. Il. DEFINIÇÕES

[0062] “Conjugado Anticorpo Antibiótico” ou AAC é um composto que compreende um anticorpo que está quimicamente ligado a um antibiótico por meio de um ligante. O anticorpo se liga um antígeno ou epítopo em uma superfície bacteriana, por exemplo, um componente de parede celular bacteriana. Conforme utilizado na presente invenção, o ligante é um ligante clivável por protease, não peptídico que é concebido para ser clivado por proteases, incluindo a catepsina B, uma protease lisossômica encontrada na maioria dos tipos celulares de mamífero (Dubowchik et a/., Bioconj. Chem. 13: 855-869). Um diagrama do AAC com seus 3 componentes está ilustrado na Figura 2. O “Conjugado THIOMABTY — Antibiótico” ou “TAC” é uma forma de AAC na qual o anticorpo está quimicamente conjugado a uma unidade ligante- antibiótico através de uma ou mais cisteínas, geralmente uma cisteína que é recombinantemente manipulada no anticorpo em sítios específicos no anticorpo para não interferir com sua função de ligação ao antígeno.

[0063] O termo “ácido teicoico de parede” (WTA) significa glicopolímeros aniônicos que estão covalentemente ligados ao peptidoglicano através de ligação fosfodiéster à hidroxila C6 dos açúcares de ácido N-acetil- muramico. Embora a estrutura química precisa possa variar entre organismos, em um exemplo de realização, o WTA é um ácido teicoico ribitol com unidades repetidas de D-ribitol e éster D-alanílico com ligações 1,5-fosfodiéster na posição 2 e substituintes glicosila na posição 4. Os grupos glicosila podem ser N- acetilglucosaminila a (alfa) ou B (beta) como presentes no S. aureus. As hidroxilas nas repetições alditol/álcool de açúcar fosfato são substituídos por ésteres de D-alanina catiônicos e monossacarídeos, tais como N- acetilglucosamina. Em um aspecto, os substituintes hidroxilo incluem D-alanila e alfa (a) ou beta (B) GIENHAc. Em um aspecto específico, o WTA compreende um composto com a fórmula: no E& o no E& on" no o

[0064] Em que as linhas onduladas indicam unidades de ligação repetidas ou sítios de ligação de Polialditol-P ou o peptidoglicano, em que X é D- alanila ou -H; e Y é a (alfa)-GICNHAc ou 8 (beta)-GICNHAc.

OH à sa o Ro A Núho É GlIcNHAc

[0065] Em S. aureus, o WTA está ligado covalentemente ao 6-OH do ácido N-acetil muramico (MurNAc) através de um dissacarídeo composto por N-acetilglucosamina (GICNAc)-1-P e N-acetilmannoseamina (ManNAc), que é seguido por duas ou três unidades de glicerol-fosfatos. O polímero WTA real é então composto de 11-40 unidades de repetição de ribitol-fosfato (Rbo-P). À síntese por etapas da WTA é iniciada pela enzima chamada TagO, e as cepas de S. aureus sem o gene TagO (por deleção artificial do gene) não produzem qualquer WTA. As unidades de repetição podem ser ainda adaptadas com D- alanina (D-Ala) em C2-OH e/ou com N-acetilglucosamina (GICNAc) na posição C4-OH através de ligações a-(alfa) ou B-(beta) glicosídicas. Dependendo da cepa de S. aureus, ou da fase de crescimento das bactérias, as ligações glicosídicas podem ser a-, B-, ou uma mistura dos dois anômeros.

[0066] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “anticorpo WTA” refere-se a qualquer anticorpo que se liga ao WTA, sendo WTA alfa ou

WTA beta. Os termos “anticorpo anti-ácido teicoico de parede alfa” ou “anticorpo anti-WTA alfa” ou “anticaWTA” ou “anticorpo anti-caGlcNac WTA” são utilizados de maneira indiferente para se referirem a um anticorpo que se liga especificamente ao ácido teicoico de parede (WTA) alfa. Do mesmo modo, os termos “anticorpo anti-ácido teicoico de parede beta” ou “anticorpo anti-WTA beta” ou “anti-=BWTA” ou “anticorpo anti-BGlcNac WTA” são utilizados de maneira indiferente para se referirem a um anticorpo que se liga especificamente ao ácido teicoico de parede (WTA) beta.

[0067] O termo “antibiótico” (abx ou Abx) inclui qualquer molécula que inibe especificamente o crescimento ou que mata micro-organismos, tais como bactérias, mas não é letal para o hospedeiro na concentração e intervalo de dosagem administrada. Em um aspecto específico, um antibiótico é não tóxico para o hospedeiro na concentração administrada e nos intervalos de dosagem. Antibióticos eficazes contra bactérias podem ser amplamente classificados como bactericidas (ou seja, mata diretamente) ou bacteriostáticos (ou seja, previne a divisão). Os antibióticos antibactericidas podem ser ainda subclassificados como de espectro estreito ou amplo espectro. Um antibiótico de amplo espectro é eficaz contra uma ampla gama de bactérias, incluindo bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, em contraste com um antibiótico de espectro estreito, que é eficaz contra uma gama mais pequena de bactérias ou apenas contra determinadas famílias de bactérias. Exemplos de antibióticos incluem: (i) aminoglicosídeos, por exemplo, amicacina, gentamicina, canamicina, neomicina, netilmicina, estreptomicina, tobramicina, paromicina, (ii) ansamicinas, por exemplo, geldanamicina, herbimicina, (ii) carbacefemos, por exemplo, loracarbef, (iv)) carbapenemos, por exemplo, ertapenem, doripenem, imipenem/cilastatina, meropenem, (v) cefalosporinas (primeira geração), por exemplo, cefadroxila, cefazolina, cefalotina, cefalexina, (vi) cefalosporinas (segunda geração), por exemplo, ceflaclor, cefamandol, cefoxitina, cefprozila,

cefuroxima, (vi) cefalosporinas (terceira geração), por exemplo, cefixima, cefdinir, cefditoren, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuten, ceftizoxima, ceftriaxona, (vii) cefalosporinas (quarta geração), por exemplo, cefepima, (viii), cefalosporinas (quinta geração), por exemplo, ceftobiprole, (ix) glicopeptídeos, por exemplo, teicoplanina, vancomicina, (x) macrolídeos, por exemplo, axitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, troleandomicina, telitromicina, espectinomicina, (xi) monobactamas, por exemplo, axtreonam, (xii) penicilinas, por exemplo, amoxicilina, ampicilina, axlocilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, mezlocilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, penicilina, peperacilina, ticarcilina, (xiii) polipeptídeos antibióticos, por exemplo, bacitracina, colistina, polimixina B, (xiv) quinolonas, por exemplo, ciprofloxacina, enoxacina, gatifloxacina, levofloxacina, lemefloxacina,y, moxifloxacina, norfloxacina, orfloxacina, trovafloxacina, (xv) sulfonamidas, por exemplo, mafenida, prontosila, sulfacetamida, — sulfametizol, — sulfanilamida, — sulfasalazina, — sulfisoxazol, trimetoprima, trimetoprima-sulfametoxazol (TMP-SMX), (xvi) tetraciclinas, por exemplo, demeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina e (xvii) outros como arspenamina, cloramfenicol, clindamicina, lincomicina, etambutol, fosfomicina, ácido fusídico, furazolidona, isoniazida, linezolida, metronidazol, = mupirocina, —nitrofurantoina, —platensimicina, pirazinamida, quinupristina/dalfopristina, rifampina/rifampicina ou tinidazol.

[0068] O Staphylococcus aureus também é referido na presente invenção como Staph A ou S. aureus. O termo “Staphylococcus aureus resistente à meticilihpa” (MRSA), alternativamente conhecido como Staphylococcus aureus multirresistente ou Staphylococcus aureus resistente à oxacilina (ORSA), refere-se a qualquer cepa de Staphylococcus aureus que é resistente aos antibióticos beta-lactâmicos, Penicilinas (por exemplo, meticilina, dicloxacilina, nafcilina, oxacilina, etc) e cefalosporinas. O termo “Staphylococcus aureus sensível a meticilihna' (MSSA) refere-se a qualquer cepa de Staphylococcus aureus que é sensível aos antibióticos beta-lactâmicos.

[0069] As expressões “um anticorpo anti-Staph" e “um anticorpo que se liga ao Staph" referem-se a um anticorpo que é capaz de se ligar a um antígeno no Staphylococcus aureus (“S. aureus”) com afinidade suficiente para que o anticorpo se torne útil como um agente diagnóstico e/ou agente terapêutico direcionado ao S. aureus. Em uma realização, a extensão de ligação de um anticorpo anti-Staph a uma proteína não relacionada, não Staph, é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo ao MRSA conforme mensurado, por exemplo, por um teste de radioimunoensaio (RIA). Em certas realizações, um anticorpo que se liga ao Staph tem uma constante de dissociação (Kd) € 1uM, < 100 nM, € 10 AM, , Ss 5 Nm, , S4 NM, , S3nNM,, S2nM,<1nM,<0,1 NM, < 0,01 NM, ou < 0,001 nM (por exemplo, 108 M ou menos, por exemplo, de 108 a 103, por exemplo 10º a 103 M). Em certos exemplos de realização, um anticorpo anti-Staph se liga a um epítopo do Staph que está conservado entre Staphs de diferentes espécies.

[0070] O termo “concentração inibitória mínima” (“MIC”) refere-se à concentração mais baixa de um antimicrobiano que irá inibir o crescimento visível de um micro-organismo após a incubação de um dia para o outro. O ensaio para determinar a MIC é conhecido. Um método está descrito na seção de Exemplos abaixo.

[0071] O termo “anticorpo” é utilizado no presente no sentido mais amplo e abrange especificamente anticorpos monocilonais, anticorpos policlonais, dímeros, multímeros, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos de ligação ao antígeno destes (Miller et a/ (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861). Os anticorpos podem ser murino, humano, humanizado, quimérico ou derivados de outras espécies. Um anticorpo é uma proteína gerada pelo sistema imunitário que é capaz de reconhecer e se ligar a um antígeno específico (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5º Ed., Garland Publishing, Nova lorque). Um antígeno alvo geralmente tem vários sítios de ligação, também denominados de epítopos reconhecidos pelas CDRs em anticorpos múltiplos. Cada anticorpo que se liga especificamente a um epítopo diferente tem uma estrutura diferente. Desse modo, um antígeno pode ser reconhecido e se ligar por mais de um anticorpo correspondente. Um anticorpo inclui uma molécula de imunoglobulina completa (comprimento total) ou uma porção imunologicamente ativa de uma molécula de imunoglobulina de comprimento total, ou seja, uma molécula que contém um sítio de ligação ao antígeno que se liga imuno- especificamente a um antígeno alvo de interesse ou parte deste, e tais alvos incluem, mas não se limitam a, células cancerosas ou células que produzem anticorpos autoimunes associados com uma doença autoimune, uma célula infectada ou um micro-organismo, tal como uma bactéria. A imunoglobulina (lg) divulgada na presente invenção pode ser de qualquer isotipo exceto IgM (por exemplo, IgG, IgE, IgD e IgA ), e subclasse (por exemplo, IgG1, Ig9G2, 1963, IgG, IgA: e IgA2). As imunoglobulinas podem ser derivadas de qualquer espécie. Em um aspecto, a lg é de origem humana, murina ou de coelho. Em um exemplo de realização específico, a Ig é de origem humana.

[0072] A “classe” de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante presente em sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, I9G2, I9G3, IgG, IgA e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados de a, 8, e, 1, e u, respectivamente.

[0073] “Anticorpos — nativos" referem-se a moléculas de imunoglobulinas de ocorrência natural com diferentes estruturas. Por exemplo,

os anticorpos IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de

150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que são ligadas por ligações de bissulfeto. A partir da extremidade N- para a C-terminal, cada cadeia pesada tem uma região variável (VH), também denominada de domínio pesado variável ou domínio variável de cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). Do mesmo modo, a partir da extremidade N- para a C-terminal, cada cadeia leve tem uma região variável (VL), também denominada de domínio leve variável ou domínio variável de cadeia leve, seguido por um domínio constante (CL). À “cadeia leve” de um anticorpo pode ser atribuída a um dentre dois tipos claramente distintos, denominados kappa (k) e lambda (A), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes.

[0074] Os termos “anticorpo completo”, “anticorpo de comprimento total”, “anticorpo intacto” e “anticorpo inteiro” são utilizados na presente invenção de forma alternada para se referirem a um anticorpo possuindo uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura do anticorpo nativo ou possuindo as cadeias pesadas que contem uma região Fc conforme definido no presente.

[0075] Um “fragmento de ligação ao antígeno” de um anticorpo refere-se a uma molécula que não é um anticorpo intacto, que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a Fv, Fab, Fab', Fab-SH, F(ab')2, diacorpos (diabodies), anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única (por exemplo, scFV); e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

[0076] O termo “anticorpo monoclonal” conforme utilizado no presente refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substanciamente — homogênea, ou sejar os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos e/ou se ligam ao(s) mesmo(s)

epíitopo(s), exceto por possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou que podem surgir durante a produção do anticorpo monoclonal (por exemplo, variação natural na glicosilação), tais variantes geralmente estão presentes em pequenas quantidades. Uma variante possível para os anticorpos IgG é a clivagem da lisina C-terminal (K) da região constante da cadeia pesada. Ao contrário das preparações com anticorpo policlonal, que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado a um único determinante sobre um antígeno. Portanto, o adjetivo “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como uma necessidade de se produzir o anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclionais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, mas não se limitando aos métodos de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição por fago, e métodos que utilizam animais transgênicos contendo a totalidade ou parte dos /loci de imunoglobulinas humanas, e tais métodos e outros métodos exemplares para produzir anticorpos monoclonais descritos na presente divulgação. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos na medida em que podem ser sintetizados livres de contaminação por outros anticorpos.

[0077] O termo “anticorpo quimérico” refere-se a um anticorpo no qual uma porção da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma determinada fonte ou espécie, enquanto que o restante da cadeia pesada e/ou leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente.

[0078] Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde ao de um anticorpo produzido por um ser humano ou uma célula humana ou derivado de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências codificantes de anticorpos humanos. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado, que compreende resíduos não humanos de ligação ao antígeno.

[0079] Um “anticorpo humanizado” refere-se a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos de aminoácidos a partir de HVRs não humanas e resíduos de aminoácidos de FRs humanas. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo humanizado compreenderá de substancialmente todos dentre pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode compreender, opcionalmente, pelo menos uma porção de uma região constante do anticorpo derivado de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere- se a um anticorpo que foi submetido à humanização.

[0080] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro arcabouços (frameworks - FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs). (Vide, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6º ed., W.H. Freeman & Co., página 91 (2007)). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um antígeno específico podem ser isolados utilizando um domínio VH ou VL a partir de um anticorpo que se liga ao antígeno para pesquisar uma biblioteca de domínios VL

31VU177 ou VH complementares, respectivamente. Vide, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al, Nature 352:624-628 (1991).

[0081] O termo “região hipervariável”, “HVR” ou “HV” conforme utilizado no presente refere-se às regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis na sequência (“regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs”) e/ou formam alças (loops) estruturalmente definidas (“alças hipervariáveis”) e/ou contêm resíduos de contanto ao antígeno (“contatos ao antígeno”). Geralmente, os anticorpos compreendem seis HVRs; sendo três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). Em anticorpos nativos, H3 e L3 exibem a maior diversidade dentre as seis HVRs e acredita-se que a H3 em particular, desempenha um papel único na conferencia da especificidade fina aos anticorpos. Vide, por exemplo, Xu et al, Immunity 13:37-45 (2000);. Johnson e Wu, em Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed, Human Press, Fairfield, NJ, 2003). De fato, os anticorpos camelídeos de ocorrência natural que consistem apenas em uma cadeia pesada são funcionais e estáveis na ausência da cadeia leve (Hamers-Casterman et a/., (1993) Nature 363:446-448, Sheriff et al., (1996) Nature Struct. Biol. 3:733-736).

[0082] Diversos delineamentos da HVR são utilizados e englobados no presente documento. As regiões determinantes de complementaridade de Kabat (CDRs) são baseadas na variabilidade das sequências e são as mais comumente usadas (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed, National Institute of Health, Bethesda, Md. 1991). Chothia por sua vez refere-se a localização das alças estruturais (Chothia e Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917). Para contatos de antígenos, vide MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996). As HVRs do AbM representam um acordo entre as HVRs de Kabat e as alças (loops) estruturais de Chothia, e são utilizados pelo programa “Oxford Molecular ABM antibody modeling software". O “contato” das HVRs é baseado em uma análise das estruturas de complexo cristalino disponíveis. Os resíduos de cada uma destas HVRs são descritos a seguir.

Alça (Loop) Kabat AbM Chothia Contato L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (numeração de Kabat) H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (numeração de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 Ho6-H101 H9o3-H101

[0083] AS HVRs podem compreender “HVRs estendidas” da seguinte forma: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 ou 89-96 (L3) na VL e 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102, ou 95-102 (H3) na VH. Salvo quando indicado de outra forma, os resíduos HVR, resíduos CDR e outros resíduos do domínio variável (por exemplo, resíduos FR) são numerados na presente invenção de acordo com Kabat et al., Supra.

[0084] As expressões “numeração do resíduo de domínio variável como em Kabat” ou “numeração da posição do aminoácido como em Kabat” e variações destas referem-se ao sistema de numeração utilizado para os domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat et al. supra. Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoácido linear real pode conter menos ou mais aminoácidos, o que corresponde a redução ou inserção em uma FR ou HVR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir um único aminoácido inserido (resíduo 52A, de acordo com Kabat) após o resíduo 52 da H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b, 82c, etc., de acordo com Kabat), após o resíduo 82 da FR de cadeia pesada. À numeração de Kabat dos resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo pelo alinhamento nas regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat “padrão”.

[0085] “Região de arcabouço” ou “região estrutural” ou “FR” (de framework) referem-se aos resíduos de domínios variáveis que não sejam resíduos da região hipervariável (HVR) A FR de um domínio variável consiste geralmente em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Assim, as sequências HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência na VH (ou VL): FR1-H1 (L1)-FR2-H2 (L2)-FR3-H3 (L3)-FRA4.

[0086] Uma “região estrutural aceptora humana” (acceptor human framework) para os propósitos da presente invenção é uma região estrutural ou arcabouço (framework) que compreende a sequência de aminoácidos de uma região estrutural do domínio variável de cadeia leve (V.L) ou uma região estrutural do domínio variável de cadeia pesada (Vn) derivada de uma região estrutural de imunoglobulina humana ou região estrutural de consenso humano, tal como definido abaixo. Uma região estrutural ou região de arcabouço (framework) aceptora humana “derivada de” uma região estrutural de uma imunoglobulina humana ou região estrutural de consenso humano pode compreender a mesma sequência de aminoácido destas ou pode conter alterações na sequência de aminoácidos. Em alguns exemplos de realização, o número de alterações de aminoácidos é de 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos. Em alguns exemplos de realização, a região de arcabouço humana aceptora V. é idêntica em sua sequência com a sequência da região de arcabouço da imunoglobulina humana V.L ou sequência da região estrutural de consenso humano.

[0087] Uma “região de arcabouço (ou estrutural) de consenso humano” é uma região de arcabouço que representa os resíduos de aminoácidos de ocorrência mais comum em uma seleção de sequências da região de arcabouço Vr ou V.L da imunoglobulina humana. De modo geral, a seleção das sequências Vr ou VL da imunoglobulina humana ocorre a partir de um subgrupo de sequências de domínios variáveis. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como o de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. Em um exemplo de realização, para a V1, o subgrupo é subgrupo kappa | como em Kabat et al. supra. Em um exemplo de realização, para a V., o subgrupo é subgrupo Ill como em Kabat et al. supra.

[0088] O termo “região Fc” é utilizado para definir uma região C- terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina. O termo inclui regiões de Fc de sequências nativas e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc da cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc da cadeia pesada da IgG humana é normalmente definida como se estendendo a partir de um resíduo de aminoácidos na posição Cis226, ou a partir da Pro230, até a região carboxi-terminal desta. A lisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração EU - também designado de índice EU, descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou purificação do anticorpo, ou por engenharia recombinante do ácido nucleico que codifica a cadeia pesada do anticorpo. Consequentemente, uma composição de anticorpos intactos podem incluir populações de anticorpos com todos resíduos K447 removidos, populações de anticorpos sem a remoção dos resíduos K447, e populações de anticorpos com uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447. O termo “receptor de Fc" ou “FcR” também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgG maternas para o feto. Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994). Métodos para a medição da ligação ao FcRn são conhecidos (vide, por exemplo, Ghetie e

Ward., Immunol. Today 18(12):592-8 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-40 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et a/.). A ligação ao FcRn in vivo e a meia vida no soro dos polipeptídeos que se ligam a FcRn humano com alta afinidade de ligação podem ser analisadas, por exemplo, em camundongos transgênicos ou transfectados com linhagens de células humanas expressando FcRn humano, ou administrado em primatas aos quais os polipeptídeos possuindo uma região Fc variante são administrados. A publicação WO 2004/42072 (Presta) descreve variantes de anticorpos com ligação aos FcRs melhorada ou diminuída. Vide também, por exemplo, Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).

[0089] Um anticorpo “maturado por afinidade” refere-se a um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões hipervariáveis (HVRs), em comparação com um anticorpo parental que não possui tais alterações, e estas modificações resultam em uma melhoria na afinidade do anticorpo ao antígeno.

[0090] O termo “epítopo” refere-se ao local específico em uma molécula de antígeno ao qual um anticorpo se liga.

[0091] Um “anticorpo que se liga ao mesmo epítopo” como um anticorpo de referência refere-se a um anticorpo que bloqueia em 50% ou mais a ligação do anticorpo de referência ao seu antígeno em um ensaio de competição, e inversamente, os anticorpos de referência bloqueiam a ligação do anticorpo ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais. Um ensaio de competição exemplar é fornecido na presente invenção.

[0092] Um “anticorpo nu” refere-se a um anticorpo não conjugado a uma molécula heteróloga (tal como uma fração citotóxica) ou um radiomarcador. O anticorpo nu pode estar presente em uma formulação farmacêutica.

[0093] “Funções efetoras"” referem-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam de acordo com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: a ligação de C1q e citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação negativa dos receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B), e ativação de células B.

[0094] A “citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo” ou ADCC referem-se a uma forma de citotoxicidade em que a lg secretada ligada aos receptores Fc (FcRs) presentes em certos tipos de células citotóxicas (por exemplo, células Matadoras Naturais (natural killer - NK), neutrófilos e macrófagos) permitem que estas células efetoras citotóxicas se liguem especificamente a um antígeno sobre a célula-alvo e, em seguida, mate a célula-alvo com citotoxinas. Os anticorpos “armam” as células citotóxicas e são necessários para matar a célula alvo por este mecanismo. As células primárias para a mediação de ADCC, as células NK, expressam unicamente FcyRiIl, enquanto monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FecyRIll. A expressão de Fc sobre células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 da página 464 de Ravetch et al., Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse, podem ser realizados ensaios ADCC in vitro, tais como os descritos nas Patentes US 5.500.362 e US 5.821.337. As células efetoras úteis para tais testes incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células Matadoras Naturais (natural killer - NK). Alternativamente ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal conforme descrito em Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998).

[0095] “Fagocitose” refere-se a um processo pelo qual um patógeno é englobado ou internalizado por uma célula hospedeira (por exemplo, um macrófago ou neutrófilo). Os fagócitos medeiam a fagocitose por três vias: (i) receptores da superfície celular diretos (por exemplo, lectinas, integrinas e receptores scavenger); ii) ativado pelo complemento - usando receptores do complemento (incluindo CRI, receptor para C3b, CR3 e CR4) para se ligar e ingerir patógenos opsonizados pelo complemento, e (iii) ativado por anticorpo - utilizando receptores Fc (incluindo FeyRI, FCyRIIA e FeyRIIIA) para liga partículas opsonizadas que depois de internalizadas se fundem com os lisossomos para se tornar fagolisossomos. Na presente invenção, crê-se que a via (iii) desempenha um papel significativo na entrega de terapêuticos AAC anti- MRSA para leucócitos infectados, por exemplo, neutrófilos e macrófagos (Phagocytosis of Microbes: complexity in Action por D. Underhill e A Ozinsky. (2002) Annual Review of Immunology, Vol 20:825).

[0096] “Citotoxicidade dependente de complemento” ou “CDC” refere-se a lise de uma célula alva na presença de complemento. A ativação da via clássica do sistema complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1qg) ao anticorpo (de subclasse apropriada) que está ligado ao seu antígeno cognato. Para avaliar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaio de CDC, conforme descrito, por exemplo, em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

[0097] O carboidrato ligado à região Fc pode ser alterado. Anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos geralmente compreendem um oligossacarídeo ramificado, bianternário que geralmente está ligado por uma ligação N a um Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Vide, por exemplo, Wright et al. 1997 ) TIBTECH 15:26-32. Os oligossacarídeos podem incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetilglicosamina (GICNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GICNAc no “tronco” da estrutura do oligossacarídeo bianternário. Em alguns exemplos de realização, as modificações dos oligossacarídeos em uma IgG podem ser feitas a fim de criar IgGs variantes com certas propriedades melhoradas. Por exemplo, as modificações de anticorpo são fornecidas tendo uma estrutura de carboidrato que carece de fucose anexa (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Essas modificações podem ter a função ADCC melhorada. Vide, por exemplo, as Publicações US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Exemplos de publicações relacionadas com modificações de anticorpos “defucosilados” ou “com deficiência de fucose” (fucose-deficiente) incluem: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WOZ2005/053742; WOZ2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane- Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Exemplos de linhagens de células capazes de produzir anticorpos defucosilados incluem células 13 CHO deficientes da fucosilação de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Pedido de Patente US 2003/0157108 A1, Presta, L; e documento WO 2004/056312 A1, Adams et a/l., Especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares nocautes (knockout), tais como células CHO nocautes para o gene o alfa1 ,6-fucosiltransferase, FUTB8 (vide, por exemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87 : 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); e documento WO2003/085107).

[0098] Um “anticorpo isolado” é aquele que foi identificado e separado a partir de um componente de seu ambiente natural. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo é purificado a mais de 95% ou 99% de pureza, conforme determinado, por exemplo, por métodos eletroforéticos (por exemplo, SDS-PAGE, focalização isoelétrica (IEF), eletroforese capilar) ou por cromatografia (por exemplo, cromatografia de troca iônica ou HPLC de fase inversa). Para uma revisão de métodos para a avaliação da pureza do anticorpo, vide, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

[0099] Um ácido nucleico “isolado” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que foi separada a partir de um componente de seu ambiente natural. Um ácido nucleico isolado inclui uma molécula de ácido nucleico contida nas células que normalmente expressam a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente extracromossomalmente ou está em uma localização cromossômica que é diferente de sua localização cromossômica natural.

[0100] “Ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo anti-WTA” refere-se a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo, incluindo tais moléculas de ácido nucleico em um único vetor ou em vetores separados, e a(s) dita(s) molécula(s) de ácido nucleico estão presentes em pelo menos um ou mais local(ais) de uma célula hospedeira.

[0101] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “se liga especificamente” ou é “específico para” refere-se às interações mensuráveis e reprodutíveis, tais como a ligação entre um alvo e um anticorpo, que é determinante da presença do alvo na presença de uma população heterogénea de moléculas, incluindo moléculas biológicas. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a um alvo (que pode ser um epítopo) é um anticorpo que se liga a este alvo com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a outros alvos. Em um exemplo de realização, a extensão de ligação de um anticorpo a um alvo não relacionado ao WTA-beta é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo ao seu alvo, mensurada, por exemplo, utilizando um teste de radioimunoensaio (RIA). Em determinados exemplos de realização, um anticorpo que se liga especificamente ao WTA-beta tem uma constante de dissociação (Kd) € 1 uM, € 100 nM, < 10 NM, < 1 nM ou < 0,1NM. Em determinados exemplos de realização, um anticorpo se liga especificamente a um epítopo que é conservado entre diferentes espécies. Em outro exemplo de realização, a ligação específica pode incluir, mas não requer ligação exclusiva.

[0102] “Afinidade de ligação” refere-se, em geral, à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (tal como anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A “afinidade de ligação” a menos que indicado de outro modo, refere- se a afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre os membros do par ligante (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade da molécula X para seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida através de métodos conhecidos no estado da técnica, incluindo os métodos descritos na presente invenção. Anticorpos de baixa afinidade ligam de forma fraca o antígeno e tendem a dissociar rapidamente, enquanto os anticorpos de alta afinidade ligam o antígeno de forma mais forte e permanecem ligados por mais tempo. Uma variedade de métodos para mensurar a afinidade de ligação é conhecida no estado da técnica, no qual qualquer um destes métodos pode ser utilizado para os propósitos da presente invenção. Exemplos de realização específicos ilustrativos e exemplares para mensurar a afinidade de ligação são descritos a seguir.

[0103] Em um exemplo de realização, “Kd” ou “valor de Kd “ de acordo com a presente invenção é mensurado por um teste de ligação com antígeno radiomarcado (RIA) realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno como descrito pelo seguinte ensaio. A afinidade de ligação da solução dos Fabs pelos antígenos é mensura equilibrando o Fab com uma mínima concentração de antígeno marcado com 11? na presença de uma titulação seriada de antígeno não marcado e, em seguida, capturando os antígenos ligados com uma placa revestida com anticorpos anti-Fab (vide, por exemplo, Chen et a/., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881). Para estabelecer as condições para o ensaio, placas de microtitulação (Dynex Technologies, Inc.) são revestidas durante a noite com 5 ug/ml de anticorpo anti-Fab (Cappel Labs),

em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9,6) e, em seguida, é feito o bloqueio com albumina bovina 2% (p/v) em PBS por duas a cinco horas à temperatura ambiente (cerca de 23 ºC). Em uma placa não adsorvente (Nunc * 269620), 100 PM ou 26 pM de antígeno—[1125] são misturados com diluições seriadas de um Fab de interesse (por exemplo, coerente com a avaliação do anticorpo anti- VEGF, Fab-12 em Presta et al., Cancer res. 57:4593-4599 (1997)). O Fab de interesse é, em seguida, incubado durante a noite, no entanto, a incubação pode continuar por um longo período (por exemplo, cerca de 65 horas) para garantir que o equilíbrio seja alcançado. Posteriormente, as misturas são transferidas para a placa de captura para a incubação à temperatura ambiente (por exemplo, por uma hora). A solução é então retirada e a placa lavada oito vezes, com 0,1% de Tween-20º em PBS. Após as placas estarem secas, 150 ul/poço de cintilante (MicroScint-20º; Packard) são adicionados, e as placas são submetidas a contagem em um contador TOPCOUNT gamma (Packard) por dez minutos. As concentrações de cada Fab que resultam em uma ligação menor ou igual a 20% da ligação máxima são escolhidas para a utilização em ensaios de ligação competitivos.

[0104] De acordo com outro exemplo de realização, a Kd é mensurada utilizando o ensaio de ressonância plasmônica de superfície utilizando um instrumento BIAcore&-2000 ou BIAcoreG&-3000 (BlAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 ºC com chips CM5 de antígeno imobilizado — 10 Unidades de Resposta (RU) Resumidamente, chips biosensores de dextrano carboximetilados (CM5, BlAcore Inc.) são ativados com cloridrato de N-etil-N'-(3- dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxisucinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, para 5 ug/ml (- 0,2 uM) antes de ser injetado a uma velocidade de fluxo de 5 ul/minuto para atingir aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção do antígeno, etanolamina 1 M é adicionada para bloquear grupos que não reagiram. Para a mediação cinética, diluições seriadas em duplicatas de Fab (0,78 nM e 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% de surfactante Tween-20º (PBST) a 25 ºC em uma velocidade de fluxo de cerca de 25 ul/min. A velocidade de associação (Kon) e a velocidade de dissociação (korr) são calculadas utilizando um modelo de ligação simples um- para-um de Langmuir (BlAcore Evaluation Software version 3.2) pelo ajuste simultâneo de sensogramas de associação e dissociação. A constante de equilíbrio de dissociação (Ka) é calculada como a relação Kor/Kon. Vide, por exemplo., Chen, et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999). Se a taxa de associação exceder 106º M S pelo ensaio de ressonância plasmônica de superfície descrito acima, então a taxa pode ser determinada por uma técnica de inibição (quenching) de fluorescência que mede o aumento ou a diminuição das emissões de intensidade de fluorescência (excitação= 295 nm; emissão = 340 nm, banda de passagem=16 nm) a 25ºC de 20 nM de um anticorpo anti-antígeno (na forma de Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes do antígeno mensurado em espectrômetro, tal como um espectrofotômetro equipado com válvula do tipo stop-flow (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-Aminco série 8000 (ThermoSpectronic), com agitador de cuveta.

[0105] Uma “constante de associação”, “taxa de associação”, “on- rate” ou “Kkon, de acordo a presente invenção também pode ser determinada utilizando o mesmo ensaio de ressonância plasmônica descrito acima usando um sistema BIAcoreTM-2000 ou BIAcoreTM-3000 (BlAcore Inc., Piscataway, NJ).

[0106] Os termos “célula hospedeira”, “linhagem de célula hospedeira” e “cultura de células hospedeiras” são utilizados de maneira alternada e referem-se a células nas quais um ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem

“transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e progênie dela derivada sem levar em conta o número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica quanto a conteúdo de ácido nucleico em relação à célula parental, mas pode conter mutações. À progênie mutante que possui a mesma função ou atividade biológica, conforme triado ou selecionado na célula transformada inicial, é abrangida pela presente invenção.

[0107] O termo “vetor”, da forma utilizada na presente invenção, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar outro ácido nucleico ao qual ele foi ligado. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autoreplicante, bem como o vetor incorporado ao genoma de uma célula hospedeira na qual ele foi introduzido. Determinados vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos aos quais eles estão operacionalmente ligados. Tais vetores são referidos no presente como “vetores de expressão”.

[0108] O “percentual (%) de identidade da sequência de aminoácidos” com relação a uma sequencia polipeptídica é definido no presente como o percentual de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica de referência, após o alinhamento das sequências e introdução de intervalos (gaps), se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de sequências, sem considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidade de sequências. O alinhamento para propósitos da determinação do percentual de identidade de sequências de aminoácidos pode ser obtido de várias formas que estão dentro do conhecimento da técnica, por exemplo, o uso de softwares de computador publicamente disponíveis, tais como os softwares BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos hábeis no assunto podem determinar parâmetros apropriados para o alinhamento de sequências, incluindo qualquer algoritmo necessário para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências que estão sendo comparadas. Para os propósitos da presente invenção, no entanto, os valores da % de identidade da sequência de aminoácido são gerados usando o programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2 é de autoria da Genentech, Inc. e o código fonte foi apresentado com a documentação de usuário no Escritório Norte-Americano de Direitos Autorais, Washington, DC, 20559, onde foi registrado com o nº de Registro de Direitos Autorais Norte- Americano TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível pela Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código-fonte. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, incluindo o UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.

[0109] Em situações onde o ALIGN-2 é empregado para a comparação de sequências de aminoácidos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A, com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (que pode alternativamente ser formulada como uma determinado sequência de aminoácido A que contenha uma certa % de identidade de sequência de aminoácidos com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B ) é calculado da seguinte forma: 100 vezes a fração X/Y, em que X é a quantidade de resíduos de aminoácidos pontuados como correspondentes idênticos pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN- 2 no alinhamento A e B do programa e em que Y é a quantidade total de resíduos de aminoácidos em B. Será compreendido que, quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não for igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, o percentual de identidade de sequências de aminoácidos de À para B não é igual ao percentual de identidade de sequências de aminoácidos de B para A. Exceto se indicado especificamente de outra forma, todas as % de valores de identidade de sequência de aminoácidos utilizadas na presente invenção são obtidas tal como descrito.

[0110] O termo “antibiótico de tipo rifamicina” significa a classe ou grupo de antibióticos possuindo a estrutura, ou uma estrutura semelhante, da rifamicina.

[0111] O termo “antibiótico de tipo rifalazila” significa a classe ou grupo de antibióticos possuindo a estrutura, ou uma estrutura semelhante, da rifalazila.

[0112] Quando indicado o número de substituintes, o termo “um ou mais” refere-se ao intervalo de um substituinte até o maior número possível de substituições, ou seja, a substituição de um hidrogênio até a substituição de todos os hidrogênios pelos substituintes. O termo “substituinte” denota um átomo ou um grupo de átomos que substitui um átomo de hidrogênio na molécula parental. O termo “substituído” indica que um grupo especificado suporta um ou mais substituintes. Quando qualquer grupo pode levar vários substituintes e uma variedade de possíveis substituintes é fornecida, os substituintes são selecionados, independentemente e não precisam ser iguais. O termo “não substituído” significa que o grupo especificado não tem qualquer substituinte. O termo “opcionalmente substituído” significa que o grupo especificado é não substituído ou substituído por um ou mais substituintes, escolhidos independentemente a partir do grupo de possíveis substituintes. Quando indicado o número de substituintes, o termo “um ou mais” significa de um substituinte até o maior número possível de substituições, ou seja, a substituição de um hidrogênio até a substituição de todos os hidrogênios pelos substituintes.

[0113] O termo “alquila” conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um radical hidrocarboneto monovalente saturado linear ou de cadeia ramiíificada de um a doze átomos de carbono (C1-C12), em que o radical alquila pode ser opcionalmente substituído de maneira independente com um ou mais substituintes descrito abaixo. Em outro exemplo de realização, um radical alquila é de um a oito átomos de carbono (C1-Cg), ou de um a seis átomos de carbono (C1-C6). Exemplos de grupos alquila incluem, mas não estão limitados a, metila (Me,-CH;3), etila (Et -CH2CH3), 1-propila (n-Pr, n-—propila, -=CH2CH2CH3), 2— propila (i-Pr, i-propila, =<=CH(CH3)2), 1-butila (n—-Bu, n—butila, <CH2CH2CH2C0Hs3), 2—-metil-1-propila (i-Bu, i-butila, -CH2CH(CH3)2), 2—butila (s-Bu, s-butila, — CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2—propila (t-Bu, t-butila, -C(CH3)3), 1-pentila (n— pentila, -CH2CH2CH2CH2C0Hs3), 2—pentila (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3—pentila (— CH(CH2CH3)2), 2—metil-2—-butila (-C(CH3)2CH2CH3), — 3—metil-2—butila = (— CH(CH3)CH(CH3)2), 3—metil-1-butila (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-metil-1-butila (— CH2CH(CH3)CH2CH3), — 1-hexila (-CH2CH2CH2CH2CH2C0H3), 2-hexila (— CH(CH3)CH2CH2CH2C0H3), 3-hexila (-CH(CH2CH3)(CH2CH2C0H3)), 2-metil-2— pentila (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metil-2—pentila (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CHs), 4—metil-2—pentila (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3—metil-3—pentila [o C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3—pentila (-CH(CH2CH3a)CH(CH3)2), 2,3—-dimetil-2— butila (-C(CH3)-2CH(CH3)2), 3,3—dimetil-2—butila (-CH(CH3)C(CH3)3, 1-heptila, 1-octila, e similares.

[0114] O termo “alquileno” conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um radical hidrocarboneto divalente saturado linear ou de cadeia ramificada de 1-12 átomos de carbono (C1-C12), onde o radical alquileno pode ser opcionalmente substituído de maneira independente com um ou mais substituintes descrito abaixo. Em outro exemplo de realização, um radical alquileno é de um a oito átomos de carbono (C1-Cs), ou de um a seis átomos de carbono (C1-Cs). Exemplos de grupos alquileno incluem, mas não se limitam a, metileno (-CH2-), etileno (-CH2CH2—), propileno (-CH2CH2CH2-), e similares.

[0115] O termo “alquenila” refere-se a um radical hidrocarboneto monovalente de cadeia linear ou ramíificada de dois até oito átomos de carbono (C2-Cs8) com pelo menos um sítio de insaturação, ou seja, uma dupla ligação sp?, carbono-carbono, onde o radical alquenila pode ser opcionalmente substituído de forma independente com um ou mais substituintes descritos no presente, e inclui os radicais possuindo orientações “cis” e “trans” ou, alternativamente, orientações “E” e “Z”. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, etilenila ou vinila (-CH=CH>), alila (-CH2CH=CH>), e similares.

[0116] O termo “alquenileno” refere-se a um radical hidrocarboneto bivalente de cadeia linear ou ramificada de dois até oito átomos de carbono (C2-Cs8) com pelo menos um sítio de insaturação, ou seja, uma dupla ligação sp?, carbono-carbono, onde o radical alquenileno pode ser opcionalmente substituído de forma independente com um ou mais substituintes descritos no presente, e inclui os radicais possuindo orientações “cis" e “trans” ou, alternativamente, orientações “E” e “Z”. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, etilenileno ou vinileno (-CH=CH-), alila (-CH2CH=CH-), e similares.

[0117] O termo “alquinila” refere-se a um radical hidrocarboneto monovalente de cadeia linear ou ramificada de dois a oito átomos de carbono (C2-Cs8) com pelo menos um sítio de insaturação, ou seja, uma ligação tripla sp, carbono-carbono, onde o radical alquinila pode ser opcionalmente substituído de forma independente com um ou mais substituintes descritos no presente. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, etinila (-C=CH), propinila (propargila, -«CH2C=CH), e similares.

[0118] O termo “alquinileno” refere-se a um radical hidrocarboneto bivalente de cadeia linear ou ramificada de dois a oito átomos de carbono (C2-Cs) com pelo menos um sítio de insaturação, ou seja, uma ligação tripla sp, carbono carbono, onde o radical alquinileno pode ser opcionalmente substituído de forma independente com um ou mais substituintes descritos no presente. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, etinileno (-C=C-), propinileno

(propargileno, -CH2C=C-), e similares.

[0119] Os termos “carbociclo”, “carbociclil”, “anel carbocíclico” e “cicloalquila” referem-se a anéis saturados ou parcialmente insaturados, monovalentes não aromáticos de 3 a 12 átomos de carbono (C3-C12) como um anel monocíclico ou 7 a 12 átomos de carbono como um anel bicíclico. Bicíclicos carbocíclicos contendo 7—12 átomos podem ser organizados, por exemplo, como um sistema bicíclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6] e bicíclico carbocíclicos contendo 9 ou 10 átomos no anel podem ser organizados como um sistema bicíclo [5,6] ou [6,6], ou como sistemas de ponte, tal como biciclo [2.2.1] heptano, biciclo [2.2.2] octano e biciclo [3.2.2] nonano. Moléculas espiro também não estão incluídas escopo desta definição. Exemplos de carbocíclicos monocíclicos incluem, mas não estão limitados a, ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil, 1-ciclopento—1-enil, 1— ciclopento—2-enil, I—ciclopento—3-—enil, ciclohexil, I-—ciclohex—1-enil, 1— ciclohex-enil-2, 1—ciclohex—3-enil, ciclohexadienil, cicloheptil, ciclooctil, ciclononil, ciclodecil, cicloundecil, ciclododecil, e similares. Os grupos carbociclila são opcionalmente substituídos de forma independente por um ou mais substituintes descritos no presente.

[0120] “Arila” indica um radical hidrocarboneto — aromático monovalente de 6-20 átomos de carbono (Ce6-C20) derivados da remoção de um átomo de hidrogênio a partir de um único átomo de carbono de um sistema de anel aromático parental. Alguns grupos arila são representados nas estruturas exemplares como “Ar”. Arila inclui radicais biciclo compreendendo um anel aromático fundido a um anel saturado ou parcialmente insaturado, ou anel aromático carbocíclico. Grupos arila típicos incluem, mas não estão limitados a, radicais derivados de benzeno (fenila), benzenos substituídos, naftaleno, antraceno, bifenila, indenila, indanila, 1,2-dihidronaptaleno, 1,2,3,4- tetrahidronaptil, e similares. Os grupos arilas são opcionalmente substituídos de forma independente por um ou mais substituintes descritos no presente.

[0121] “Arileno” indica um radical hidrocarboneto aromático bivalente de 6-20 átomos de carbono (C6-C20) derivados da remoção de dois átomos de hidrogênio a partir de um único átomo de carbono de um sistema de anel aromático parental. Alguns grupos arileno são representados nas estruturas exemplares como “Ar”. Arileno inclui radicais biciclos compreendendo um anel aromático fundido a um anel saturado ou parcialmente insaturado, ou anel aromático carbocíclico. Grupos arilenos típicos incluem, mas não estão limitados a, radicais derivados de benzeno (fenileno), benzenos substituídos, naftaleno, antraceno, bifenileno, indenileno, indanileno, 1,2—dihidronaptaleno, 1,2,3,4- tetrahidronaptil, e similares. Os grupos arilenos são grupos opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes descritos no presente.

[0122] Os termos “heterociclo”, “heterociclil' e “anel heterocíclico” são utilizados no presente de forma intercambiável e referem-se a um radical carbocíclico saturado ou parcialmente insaturado (ou seja, contendo uma ou mais ligações duplas e/ou triplas no anel) de 3 a cerca de 20 átomos no anel, no qual, pelo menos um átomo do anel é um heteroátomo selecionado a partir de hidrogênio, oxigênio, fósforo e enxofre, os átomos restantes do anel são C, no qual um ou mais átomos do anel é (são) opcionalmente substituído(s) de maneira independente por um ou mais dos substituintes descrito abaixo. Um heterociclo pode ser um monociclo contendo de 3 a 7membros no anel (2 a 6 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, O, P e S), ou um bicíclico com 7 a 10 membros no anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 4 heteroátomos selecionados a partir de N, O, Pe S), por exemplo: um sistema biciclo (4,5), (5,5), (5,6) ou (6, 6). Heterociclos são descritos em Paquette, Leo A.; “Principles of Modern Heterocíclicos Chemistry" (WA Benjamin, Nova lorque, 1968), especialmente nos capítulos 1, 3, 4, 6, 7 e 9; “The Chemistry of Heterocyclic Coumpounds, A Series Monography'(John Wiley & Sons, Nova lorque, 1950), em especial nos volumes 13, 14, 16, 19 e 28, e J. Am. Chem. Soc.

(1960) 82:5566. “Heterocíclicos” também incluem radicais em que os radicais heterociclos são fundidos com um anel saturado, parcialmente insaturado ou carbocíclico aromático ou anel heterocíclico. Exemplos de anéis heterocíclicos incluem, mas não estão limitados a, morfolin-d4-ila, piperidin—1-—ila, piperazinila, piperazin-4-il-2-ona, piperazinA4-il-3—ona, pirrolidin-1-ila, tiomorfolin-d4-ila, S—dioxotiomorfolin-4-—ila, azocan-1-ila, azetidin-1-ila, octahidropirido[1,2— alpirazin-2-ila, [1 A]diazepan-1-ila, pirrolidinila, tetrahidrofuranila, dihidrofuranila, tetrahidrotienila, tetrahidropiranila, dihidropiranila, tetrahidrotiopiranila, piperidino, morfolino, tiomorfolino, tioxanila, piperazinila, homopiperazinila, azetidinila, oxetanila, tietanila, homopiperidinila, oxepanila, tiepanila, oxazepinila, diazepinila, tiazepinila, 2—pirrolinila, 3—pirrolinila, indolinila, 2H-piranila, 4H-piranila, dioxanila, 1,3—dioxolanila, pirazolinila, ditianila, ditiolanila, dihidropiranila, dihidrotienila, dihidrofuranila, pirazolidinilimidazolinila, imidazolidinila, 3—azabiciclo[3.1.0]hexanila, 3—azabiciclo[4.1.0]heptanila, azabiciclo[2.2.2]hexanila, 3H-indolil quinolizinila e N—piridil uréias. Moléculas espiro também não estão incluídas escopo desta definição. Exemplos de um grupo heterocíclico onde 2 átomos do anel são substituídos por moléculas oxo (= O) são pirimidinonila e 1,1—dioxo-tiomorfolinila. Os grupos heterciclos no presente são opcionalmente substituídos de forma independente por um ou mais substituintes descritos no presente.

[0123] O termo “heteroarila” refere-se a um radical aromático monovalente, de 5-, 6-, ou 7- membros de anel, e inclui sistemas de anéis fundidos (onde pelo menos um deles é aromático) de 5-20 átomos, contendo um ou mais heteroátomos selecionados independentemente a partir de nitrogênio, oxigênio e enxofre. Exemplos de grupos heteroaril são piridinila (incluindo, por exemplo, 2-hidroxipiridinila), imidazolila, imidazopiridinila, pirimidinila (incluindo, por exemplo, 4-hidroxipirimidinila), pirazolila, triazolila, pirazinila, tetrazolila, furila, tienila, isoxazolila, tiazolila, oxadiazolila, oxazolila, isotiazolila, pirrolila,

quinolinila, isoquinolinila, tetrahidroisoquinolinila, indolila, benzimidazolila, benzofuranila, cinolinila, indazolila, indolizinila, ftalazinila, piridazinila, triazinila, isoindolila, pteridinila, purinila, oxadiazolila, triazolila, tiadiazolila, tiadiazolila, furazanila, benzofurazanila, benzotiofenila, benzotiazolila, benzoxazolila, quinazolinila, quinoxalinila, naftiridinila e furopiridinila. Os grupos heteroarilas são grupos opcionalmente substituídos de forma independente por um ou mais substituintes descritos no presente.

[0124] Os grupos Heterociclo ou heteroarila podem estar acoplados a carbono (ligado ao carbono) ou nitrogênio (ligado ao nitrogênio) sempre quando isso é possível. A título de exemplo, mas não se limitando a, grupos heterociclo ou heteroarila acoplados a carbono são ligados nas posições 2, 3,4, ou 6 de uma piridina, posição 3, 4, 5 ou 6 de uma piridazina, posição 2, 4,5, ou 6 de uma pirimidina, posição 2, 3, 5 ou 6 de uma pirazina, posição 2, 3, 4 ou 5 de um furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol ou tetrahidropirrol, posição 2, 4 ou 5 de um oxazol, imidazol ou tiazol, posição 3, 4 ou 5 de uma isoxazol, pirazol, ou isotiazol, posição 2 ou 3 de uma aziridina, posição 2, 3 ou 4 de uma azetidina, posição 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 de uma quinolína ou posição 1,3, 4, 5, 6, 7 ou 8 de uma isoquinolina.

[0125] A título de exemplo, mas não se limitando, grupos heterociclo ou heteroaril acoplados a nitrogênio estão ligados na posição, 1 de um aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2—pirrolina, 3—pirrolina, imidazólicos, imidazolidina, 2—imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2—pirazolina, 3— pirazolina, piperidina, piperazina, indólicos, indolina, 1H-indazol, posição 2 de uma isoindol, ou isoindolina, posição 4 de uma morfolina, e posição 9 de uma carbazol, ou B-carbolina.

[0126]UmM “metabólito” é um produto produzido através do metabolismo do corpo de um composto específico ou sal deste. Metabólitos de um composto podem ser identificados por meio técnicas rotineiras conhecidas no estado da técnica e sua atividade pode ser determinada utilizando testes como os aqui descritos. Esses produtos podem resultar, por exemplo, da oxidação, redução, hidrólise, amidação, desamidação, esterificação, desesterificação, clivagem enzimática, e processos similares, do composto administrado. Consequentemente, a invenção abrange os metabólitos dos compostos da invenção, incluindo compostos produzidos por um processo que compreende a exposição do composto de Fórmula | da presente invenção a um mamífero por um período de tempo suficiente para produzir um produto metabólico deste.

[0127] O termo “formulação farmacêutica” refere-se a uma preparação que está em uma forma que permite que a atividade biológica do ingrediente ativo contida nela seja eficaz, e que não contenha componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a formulação deveria ser administrada.

[0128] Uma formulação “estéril” é asséptica ou livre de todos os micro-organismos viventes e seus esporos.

[0129] Uma formulação “estável” é aquela em que a proteína que está presente nela retém essencialmente sua estabilidade física e química e integridade quando submetida ao armazenamento. Várias técnicas analíticas para medição de estabilidade da proteína estão disponíveis no estado da técnica e são revistas em, por exemplo: Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nova lorque, Nova lorque Pub. (1991) e Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). A estabilidade pode ser mensurada em uma temperatura selecionada por um período de tempo selecionado. Para rastreio rápido, a formulação pode ser mantida a 40 ºC durante 2 semanas a 1 mês, momento em que a estabilidade é mensurada. Quando a formulação deve ser armazenada a 2-8 ºC, geralmente a formulação deve ser estável a 30 ºC ou 40 ºC durante pelo menos 1 mês e/ou estável a 2-8

ºC durante pelo menos 2 anos. Quando a formulação deve ser armazenada a 30 ºC, geralmente a formulação deve ser estável durante pelo menos 2 anos a 30 ºC e/ou estável a 40 ºC durante pelo menos 6 meses. Por exemplo, a extensão do grau de agregação durante o armazenamento pode ser utilizado como um indicador de estabilidade da proteína. Assim, uma formulação “estável” pode ser aquela em que menos de cerca de 10%, e preferencialmente menos do que cerca de 5%, da proteína está presente como um agregado na formulação. Em outros exemplos de realização, qualquer aumento na formação de agregados durante o armazenamento da formulação pode ser determinado.

[0130]UmMa formulação “isotônica” é aquela que tem essencialmente a mesma pressão osmótica que o sangue humano. A formulação isotônica geralmente terá uma pressão osmótica de aproximadamente 250 a 350 mOsm (miliosmóis). O termo “hipotônico” descreve uma formulação com uma pressão osmótica inferior àquela do sangue humano. De forma correspondente, o termo “hipertônico” é usado para descrever uma formulação com uma pressão osmótica acima daquela encontrada do sangue humano. A isotonicidade pode ser mensurada pelo uso de um osmômetro de pressão de vapor ou do tipo que determina o ponto de congelamento. As formulações da presente invenção são hipertônicas como resultado da adição de sal e/ou tampão.

[0131] Os “veículos” conforme utilizado no presente incluem veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes e/ou estabilizantes, que são atóxicos para as células ou para os mamíferos que são expostos nas mesmas dosagens e concentrações utilizadas. Muitas vezes, o veículo fisiologicamente aceitável é de uma solução aquosa com pH tamponado. Exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões, como o fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos, antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos); proteínas, tal como albumina, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, como polivinilpirrolidona;

aminoácidos como a glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos, incluindo manose, glicose, ou amidos; agentes quelantes, como o EDTA; alcoóis de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sal como sódio; tensoativos e/ou tensoativos não iônicos, como TWEENS, polietileno glicol (PEG), e PLURONICSº.

[0132] Um “veículo farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica que não seja um ingrediente ativo e que não seja tóxico para um sujeito. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a, um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante. Um “ácido farmaceuticamente aceitável” inclui os ácidos inorgânicos e orgânicos que são atóxicos na concentração e maneira pela qual eles são formulados. Por exemplo, ácidos inorgânicos adequados incluem ácido clorídrico sulfúrico, perclórico, bromídrico, iodídrico, nítrico, sulfônico, sulfínico, sulfanílico, fosfórico, carbônico, e etc. Os ácidos orgânicos adequados incluem alquilas, aromáticos, cíclicos, cicloalifáticos, arilalifáticos, heterocíclicos, mono saturados, insaturados, di- e triccarboxílicos, de cadeias lineares e cadeias ramiíficadas incluindo, por exemplo, ácido fórmico, acético, 2-hidroxiacético, trifluoroacético, fenilacético, trimetilacético, t-butil acético, antranílico, propanóico, 2-hidroxipropanóico, 2-0xopropanóico, propandióico, ciclopentanopropiônico, ciclopentano-propiônico, 3-fenilpropiônico, butanóico, butandióico, benzóico, 3-(4-hidroxibenzoil)benzóico, 2-acetoxi-benzóico, ascórbico, cinâmico, lauril sulfúrico, esteárico, mucônico, mandélico, succínico, embônico, fumárico , málico, maleico, hidroximaleico, malônico, láctico, cítrico, glicólico, tartárico, glicônico, glucônico, pirúvico, glioxílico, ácido oxálico, mesílico, succínico, salicílico, ftálico, palmóico, palmeico, tiociânico, metanossulfônico, etanossulfônico, 1,2-etanodissulfônico, 2- hidroxietanossulfônico, benzenossulfônico, 4-clorobenzenosulfônico, naftaleno-

2-sulfônico, p-toluenossulfônico, canforsulfônico, 4-metilbiciclo [2.2.2]-oct-2-eno- 1-carboxílico, glucoheptônico, 4,4'-metilenobis-3- (hidroxi-2-eno-1-carboxílico), hidroxinaftóico.

[0133] “Bases farmaceuticamente aceitáveis” incluem bases inorgânicas e orgânicas que são atóxicas na concentração e maneira na qual elas são formuladas. Por exemplo, bases adequadas incluem os formados a partir de uma base inorgânica que forma metais como lítio, sódio, potássio, magnésio, cálcio, amônio, ferro, zinco, cobre, manganês, alumínio, N- metilglucamina, morfolina, piperidina e bases orgânicas atóxicas, incluindo, aminas primárias, secundárias e terciárias, aminas substituídas, aminas cíclicas e resinas de troca iônica básicas, [por exemplo, N(R')s* (onde R' é independentemente H ou C14 alquila, por exemplo, amônio, Tris)], por exemplo, isopropilamina, — trimetilamina, — dietilamina, — trietilamina, — tripropilamina, etanolamina, 2-dietilaminoetanol, trimetamina, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, etilenodiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, N- etilpiperidina, resinas de poliamina e similares. Particularmente as bases atóxicas orgânicas preferidas são isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetamina, diciclohexilamina, colina e cafeína.

[0134] Os ácidos e bases farmaceuticamente aceitáveis adicionais utilizáveis com a presente invenção incluem aqueles que são derivados a partir de aminoácidos, por exemplo, histidina, glicina, fenilalanina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina e asparagina.

[0135] Tampões e sais “farmaceuticamente aceitáveis” incluem aqueles que são derivados de sais de adição ácida ou básica dos ácidos e bases indicados acima. Tampões e/ou sais específicos incluem succinato e acetato de histidina.

[0136] Um “açúcar farmaceuticamente aceitavel” é uma molécula que, quando combinada com uma proteína de interesse, previne ou reduz significativamente a instabilidade física ou química da proteína após o armazenamento. Quando a formulação se destina a ser liofilizada e em seguida reconstituída, “açúcares farmaceuticamente aceitáveis” também podem ser conhecidos como “lioprotetores”. Exemplos de açúcares e alcoóis de açúcares correspondentes incluem: um aminoácido tal como glutamato de monossódio ou histidina; uma metilamina tal como a betaína, um sal liotrópico, como o sulfato de magnésio, um poliol, como tri-hídricos ou alcoóis de açúcar de peso molecular mais elevado, por exemplo, glicerina, dextrano, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol; propilenoglicol; polietileno-glicol; Pluronicsº, e combinações dos mesmos. Os lioprotetores adicionais exemplares incluem glicerina e gelatina, e os açúcares mellibiose, melezitose, rafinose, mannotriose e estaquiose. Exemplos de açúcares redutores incluem glicose, maltose, lactose, maltulose, isomaltulose e lactulose. Exemplos de açúcares não redutores incluem glicosídeos não redutores de compostos polihidroxila selecionados a partir de alcoóis de açúcar e outros polialcoóis de cadeia linear. Os alcoóis de açúcar preferidos são monoglicosídeos, em especial aqueles compostos obtidos pela redução de dissacarídeos tais como lactose, maltose, lactulose e maltulose. O grupo lateral glicosídico pode ser tanto glicosídico como galactosídico. Outros exemplos de alcoóis de açúcar são glucitol, maltitol, lactitol e isomaltulose. Os açúcares farmaceuticamente aceitáveis preferidos são os açucares não redutores trealose ou sacarose. Os açúcares farmaceuticamente aceitáveis são adicionados à formulação em uma “quantidade de proteção” (por exemplo, pré- liofilização), o que significa que a proteína se mantém essencialmente em sua integridade e estabilidade física ou química durante o armazenamento (por exemplo, após a reconstituição e armazenamento).

[0137] O “diluente” de interesse para a presente invenção é um que seja farmaceuticamente aceitável (seguro e atóxico para a administração a um ser humano), e é útil para a preparação de uma formulação líquida, tal como uma formulação reconstituída após a liofilização. Exemplos de diluentes incluem água estéril, água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução com pH tamponado (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose. Em um exemplo de realização, os diluentes podem incluir soluções aquosas de sais e/ou tampões.

[0138] Um “conservante” é um composto que pode ser adicionado às formulações da presente invenção para reduzir a atividade bacteriana. À adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso (doses múltiplas). Exemplos de conservantes em potencial incluem cloreto octadecildimetilbenzil amônio, cloreto hexametônio, cloreto de benzalcônio (uma mistura de cloretos alquilbenzildimetilamônio em que os grupos alquilas são compostos de cadeia longa), e cloreto de benzetônio. Outros tipos de conservantes incluem alcoóis aromáticos tais como álcool fenolico, butilico e benzílico, alquil parabenos tais como metil- ou propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol e m-cresol. O conservante mais preferido na presente invenção é o álcool benzílico.

[0139] Um “indivíduo”, “sujeito” ou “paciente” é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cachorros e cavalos), primatas (por exemplo, primatas humanos e não humanos tais como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em determinados exemplos de realização, o indivíduo ou sujeito é um ser humano.

[0140] Conforme utilizado no presente, o termo “tratamento” (e variações gramaticais deste termo tal como “tratar” ou “tratando”) refere-se a intervenções clínicas delineadas para alterar o curso natural do indivíduo, tecido ou célula que está sendo tratado durante o curso da patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem, mas não estão limitados a, diminuição na taxa de progressão da doença, melhora ou paliação do estado patológico, e remissão ou prognóstico melhorado, todos mensuráveis por um especialista hábil na técnica, tal como um médico. Em um exemplo de realização, o tratamento pode significar alívio dos sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, diminuição da taxa de progressão da doença infecciosa, melhora ou paliação do estado da doença e remissão ou melhora do prognóstico. Em alguns exemplos de realização, os AACs, TACs da invenção são utilizados para atrasar o desenvolvimento de uma doença ou para retardar a progressão de uma doença infecciosa ou reduzir a carga bacteriana na corrente sanguínea e/ou tecidos e órgãos infectados.

[0141] Conforme utilizado no presente, “em conjunto com” refere- se à administração em uma modalidade de tratamento em adição a outra modalidade de tratamento. Assim, “em conjunto com” refere-se à administração de uma modalidade de tratamento antes, durante, ou após a administração da outra modalidade de tratamento ao indivíduo.

[0142] O termo “bacteremia” refere-se à presença de bactérias na corrente sanguínea que é mais comumente detectada através de uma hemocultura. As bactérias podem entrar na corrente sanguínea como uma complicação grave de infecções (como pneumonia ou meningite), durante a cirurgia (especialmente quando envolvem membranas mucosas, como do trato gastrointestinal), ou devido a cateteres e outros corpos estranhos que entram nas artérias ou veias. A bacteremia pode ter várias consequências. A resposta imune às bactérias pode causar sepse e choque séptico, que tem uma taxa de mortalidade relativamente alta. As bactérias também podem usar o sangue para se espalhar para outras partes do corpo, causando infecções distantes do local original da infecção. Exemplos incluem a endocardite ou osteomielite.

[0143] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” é a concentração mínima necessária para desempenhar uma melhora mensurável de uma doença específica. Uma quantidade terapeuticamente eficaz na presente invenção pode variar de acordo com fatores como estado da doença, idade, sexo e peso do paciente, e a capacidade do anticorpo em suscitar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela em que qualquer efeito tóxico ou prejudicial do anticorpo é superado pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Em um exemplo de realização, uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade eficaz para reduzir a bacteremia em uma infecção in vivo. Em um aspecto, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” é pelo menos a quantidade eficaz para reduzir a carga bacteriana ou unidades formadoras de colônias (UFC) isoladas a partir de uma amostra de paciente, tal como sangue, por pelo menos um log em relação à antes da administração da droga. Em um aspecto mais específico, a redução é de pelo menos 2 logs. Em outro aspecto, a redução é de pelo menos 3, 4, 5 logs. Ainda em outro aspecto, a redução é para níveis abaixo do detectável utilizando ensaios conhecidos na técnica incluindo os ensaios exemplificados na presente invenção. Em outro exemplo de realização, uma quantidade terapeuticamente eficaz é a quantidade de AAC em uma ou mais doses administradas ao longo do período de tratamento, que alcança uma cultura de sangue negativa (ou seja, não desenvolve a bactéria que é alvo do AAC) em comparação com a cultura de sangue positiva anterior ou no início do tratamento do paciente infectado.

[0144] Uma “quantidade profilaticamente eficaz” refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente mas não necessariamente, uma vez que uma dose profilática é utilizada em indivíduos em um estágio precoce da doença ou mesmo antes da exposição às condições em que o risco de infecção é elevado, a quantidade profilaticamente eficaz pode ser inferior à quantidade terapeuticamente eficaz. Em um exemplo de realização, uma quantidade profilaticamente eficaz é pelo menos uma quantidade eficaz para reduzir, prevenir a ocorrência ou propagação de infecção de uma célula para outra.

[0145] A administração “crônica” refere-se à administração do(s) medicamento(s) em um modo contínuo, ao contrário de um modo agudo, de modo a manter o efeito terapêutico inicial (atividade) por um período de tempo prolongado. A administração “intermitente” é o tratamento que não é feito consecutivamente sem interrupção, mas é de natureza cíclica.

[0146] O termo “bula” da forma como é utilizado no presente refere- se a instruções habitualmente incluídas nos recipientes comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, utilização, posologia, administração, terapia combinada, contraindicações e/ou advertências relativas à utilização de tais produtos terapêuticos.

[0147] O termo “quiral” refere-se a moléculas que têm a propriedade de não serem sobreponíveis sobre sua própria imagem, enquanto que o termo “aquiral” refere-se a moléculas que são sobreponíveis sobre sua imagem em espelho.

[0148] O termo “estereoisômeros” refere-se aos compostos que possuem composição química idêntica, mas diferem no que diz respeito ao arranjo dos átomos ou grupos no espaço.

[0149] “Diasterômero” refere-se a um estereoisômero com dois ou mais centros de quiralidade e cujas moléculas não são imagens em espelho uma da outra. Diasterômeros têm diferentes propriedades físicas, por exemplo, ponto de fusão, ponto de ebulição, propriedades espectrais e reatividade. Misturas de diasterôneros podem se separar sob procedimentos analíticos de alta resolução, tais como eletroforese e cromatografia.

[0150] “Enantiômeros”" refere-se a dois estereoisômeros de um composto que não são sobreponíveis sobre a imagem em espelho entre si.

[0151] As definições e as convenções de estereoquímica usadas no presente seguem geralmente S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nova lorque; e Eliel, E. e Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds, John Wiley & Sons, Inc., Nova lorque (1994). Muitos compostos orgânicos existem em formas oticamente ativas, isto é, têm a habilidade de girar o plano do plano de luz polarizada. Na descrição de um composto oticamente ativo, os prefixos D e L, ou Re S, são usados para denotar a configuração absoluta da molécula sobre seus centro(s) quiral(is). Os prefixos d e | ou (+) e (—) são empregados para designar o sinal da rotação do plano de luz polarizada pelo composto, com (—) ou por 1 significando que o composto é levorotatório. Um composto prefixado com (+) ou d é dextrorrotatório. Para uma estrutura química dada, estes esterioisômeros são idênticos exceto por serem uma imagem em espelho entre si. Um estereoisômero específico pode também ser referido como um enantiômero, e uma mistura de tais isômeros é frequentemente denominada de mistura enantiomérica. Uma mistura 50:50 de enantiômeros é referida como a uma mistura racêmica ou racemato, que podem ocorrer onde não houver uma estereoseleção ou estereoespecificidade em uma reação química ou processo. Os termos “mistura racêmica” e “racemato” referem—se a uma mistura equimolar de duas espécies enantioméricas, isentas de atividade ótica.

[0152] O termo “grupo protetor” refere-se a um substituinte que é comumente utilizado para bloquear ou proteger uma determinada funcionalidade enquanto reage com outros grupos funcionais no composto. Por exemplo, um “grupo amino-protetor” é um substituinte acoplado ao grupo amino que bloqueia ou protege a funcionalidade amino no composto. Grupos protetores de amino adequados incluem, mas não se limitam a, grupos acetila, trifluoroacetila, t- butoxicarbonila (BOC), benziloxicarbonila (CBZ) e 9-fluorenilmetilenoxicarbonila (Fmoc). Para uma descrição de grupos protetores e seu uso, vide, T.W. Greene, “Protective Groups in Organic Synthesis" 2º Ed., John Wiley & Sons, Nova lorque, 1991, ou uma edição mais recente.

[0153] O termo “cerca de” utilizado na presente invenção refere-se ao intervalo de erro habitual para o respectivo valor facilmente conhecido pelo especialista neste domínio técnico. A referência para “aproximadamente” ou “cerca de” um valor ou parâmetro no presente inclui (e descreve) exemplos que são direcionados a esse valor ou parâmetro per se.

[0154] Tal como utilizado no presente relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um, uma” e “o, a” abrangem os referentes no plural, a menos que o contexto expresse claramente de outra maneira. Por exemplo, a referência a um “anticorpo” é uma referência de um a muitos anticorpos, tais como quantidades molares, e inclui equivalentes dos mesmos conhecidos pelos especialistas no assunto, e assim por diante.

Ill. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS CONJUGADOS DE ANTICORPO-ANTIBIÓTICO (AAC)

[0155] Os resultados experimentais aqui apresentados são uma forte indicação de que terapias destinadas a eliminar bactérias intracelulares irão melhorar Oo sucesso clínico. Para isso, a presente invenção proporciona um agente terapêutico único que mata seletivamente organismos S. aureus que invadiram compartimentos intracelulares de células hospedeiras. A presente invenção demonstra que tal terapêutica é eficaz em modelos in vivo onde antibióticos convencionais como a vancomicina falham.

[0156] A invenção proporciona uma terapia antibacteriana que visa evitar a fuga de antibióticos pelo direcionamento de populações de bactérias que evitam a terapia antibiótica convencional. A nova terapia antibacteriana é conseguida com um Conjugado Anticorpo Antibiótico (AAC) em que um anticorpo específico para componentes de parede celular encontrado no S. aureus (incluindo o MRSA) é quimicamente ligado a um potente antibiótico (um derivado da rifamicina). O antibiótico é unido ao anticorpo por um ligante clivável por protease, não peptídico que é concebido para ser clivado por proteases, incluindo a catepsina B, uma protease lisossômica encontrada na maioria dos tipos celulares de mamífero (Dubowechik et a/., Bioconj.

Chem. 13: 855-869). Um diagrama do AAC com seus 3 componentes está ilustrado na Figura 2. Sem se limitar por qualquer teoria, um mecanismo de ação do AAC é esquematizado na Figura 3. O AAC atua como um profármaco em que o antibiótico é inativo (devido ao grande tamanho do anticorpo) até que o ligante seja clivado.

Uma vez que uma proporção significativa de S. aureus encontrada em uma infecção natural é absorvida por células hospedeiras, principalmente neutrófilos e macrófagos, em algum momento durante o curso da infecção no hospedeiro, o tempo gasto dentro das células hospedeiras proporciona uma oportunidade significativa para a bactéria evitar a atividade antibiótica.

Os AAC da invenção são concebidos para se ligar ao S. aureus e libertar o antibiótico no interior do fagolisossomo após as bactérias serem absorvidas pelas células hospedeiras.

Através deste mecanismo, a AAC é capaz de concentrar o antibiótico ativo especificamente em um local onde o S. aureus é tratado de forma insatisfatória pelos antibióticos convencionais.

Embora a invenção não seja limitada ou definida por um mecanismo de ação específico, os AACs melhoram a atividade de antibióticos através de três potenciais mecanismos: (1) O AAC fornece o antibiótico dentro das células de mamíferos que absorvem as bactérias, aumentando assim a potência dos antibióticos que difundem mal para os fagolisossomos onde as bactérias são sequestradas. (2) O AAC opsoniza as bactérias, aumentando assim a captação de bactérias livres por células fagocíticas e liberando o antibiótico localmente para matar as bactérias enquanto elas são sequestradas no fagolisossomo.

Como milhares de AACs podem se ligar a uma única bactéria, esta plataforma libera antibióticos suficientes nesses nichos intracelulares para sustentar a morte antimicrobiana máxima.

Além disso, à medida que mais bactérias são liberadas a partir de reservatórios intracelulares pré-existentes, a rápida taxa desta terapia baseada em anticorpos assegura uma “marcação” imediata destas bactérias antes delas poderem escapar para células vizinhas ou distantes, atenuando assim a propagação da infecção. (3) O AAC melhora a meia-vida de antibióticos in vivo (farmacocinética melhorada) pela ligação do antibiótico a um anticorpo, em comparação com antibióticos que são eliminados rapidamente do soro. A farmacocinética melhorada do AAC permite a liberação de antibiótico suficiente em regiões onde S. aureus está concentrado enquanto limita a dose global de antibiótico que necessita ser administrada sistemicamente. Esta propriedade deve permitir a terapia de longo prazo com AAC para direcionar a infecção persistente com mínimos efeitos colaterais do antibiótico.

[0157]JUM composto de conjugado anticorpo-antibiótico compreendendo um anticorpo anti-ácido teicoico de parede (WTA) covalentemente ligado por um ligante não peptídico, clivável por protease a um antibiótico do tipo rifamicina.

[0158]UmM exemplo de realização exemplar é o conjugado anticorpo-antibiótico possuindo a fórmula: Ab(PML-abx), em que: Ab é o anticorpo anti-ácido teicoico de parede; PML é o ligante não peptídico, clivável por protease, possuindo a fórmula: —Str-PM-Y- onde Str é uma unidade extensora (stretcher); PM é uma unidade peptidomimética, e Y é uma unidade espaçadora; abx é o antibiótico do tipo rifamicina; e p é um número inteiro de 1 a 8.

[0159] O antibiótico do tipo rifamicina pode ser um antibiótico do tipo rifalazila.

[0160] O antibiótico do tipo rifamicina pode compreender uma amina quaternária ligada ao ligante não peptídico, clivável por protease.

[0161]UM exemplo de realização do conjugado anticorpo- antibiótico tem a Fórmula |: o "mo | P- o (O e OR SO OH .sOH fra So HO, é, HN o | p

D I em que: as linhas tracejadas indicam uma ligação opcional; R é H, C1-C12 alquila, ou C(O)CHs; R' é OH; R? é CH=N-—(heterociclla)) em que a heterociclla está opcionalmente substituída por um ou mais grupos independentemente selecionados a partir de C(O)JCH3 , C1-C12 alquila, C1-C12 heteroarila, Ca—C20 heterociclila, Ce-C2o arila, e Ca-C12 carbociclila; ou R' e R? formam uma heteroarila ou heterociclila fusionada possuindo cinco ou seis membross, e opcionalmente, formando um anel de heteroarila, heterociclila, arila, carbociclila de seis membros em espiro ou fusionado, em que o anel de heteroarila, heterociclila, arila, carbociclila de seis membros em espiro ou fusionado é opcionalmente substituído por H, F, CI, Br, |, alquila C1-C12, ou OH; PML é o ligante não peptídico, clivável por protease, ligado a R? ou fundido a heteroarila ou heterocíclica formada por R' e R?; e Ab é o anticorpo anti-ácido teicoico de parede (WTA).

[0162] A quantidade de porções de antibiótico que pode ser conjugada por meio de um porção ligante reativa a uma molécula de anticorpo pode estar limitada a quantidade de resíduos de cisteína livres, que são introduzidos pelos métodos descritos na invenção. Exemplos de AAC compreendem anticorpos que possuem 1, 2, 3, ou 4 aminoácidos cisteína modificados (Lyon, R. et al. (2012) Methods in Enzym. 502:123—138).

ANTICORPOS AnTI-ÁCIDO TEICOICO DE PAREDE (WTA)

[0163] Descrevem-se aqui alguns anticorpos anti-WTA e anticorpos anti-WTA conjugados que se ligam ao WTA expresso em diversas bactérias Gm* incluindo o Staphylococcus aureus. Os anticorpos antiWTA podem ser selecionados e produzidos pelos métodos descritos na Patente US 8.283.294; Meijer P.J. et al. (2006) J Mol Biol. 358 (3): 764-72; Lantto J, et al (2011) J Virol. 85 (4): 1820-33 e nos Exemplos 3-4 abaixo.

[0164] A parede celular das bactérias Gram-positivas é composta por uma camada espessa de múltiplas bainhas de peptidoglicano (PGN) que não apenas estabilizam a membrana celular, mas também fornecem muitos sítios aos quais outras moléculas podem ser ligadas (Figura 4). Uma classe principal destas glicoproteínas de superfície celular são os ácidos teicoicos (“TA”), que são moléculas ricas em fosfato encontradas em muitas proteínas de ligação a glicanos (GPB). Os TA vêm em dois tipos: (1) ácido lipo teicoico (“LTA”), que são ancorados à membrana plasmática e se estendem a partir da superfície celular para a camada de peptidoglicano; e (2) TA de parede (“WTA”), que estão covalentemente ligados ao peptidoglicano e se prolongam através e para além da parede celular (Figura 4). O WTA pode representar até 60% da massa total da parede celular em GPB. Como resultado, ele apresenta um antígeno de superfície celular altamente expresso.

[0165] As estruturas químicas de WTAs variam entre os organismos. Em S. aureus, o WTA está ligado covalentemente ao 6-OH do ácido N-acetil muramico (MurNAc) através de um dissacarídeo composto por N- acetilglicosamina (GIcNAc)-1-P e N-acetilmanoseamina (ManNAc), que é seguido por duas ou três unidades de glicerol-fosfatos (Figura 5). O polímero WTA real é então composto de cerca de 11-40 unidades de repetição de ribitol- fosfato (Rbo-P). A síntese por etapas da WTA é iniciada pela enzima chamada TagO, e as cepas de S. aureus sem o gene TagO (por deleção do gene) não produzem qualquer WTA. As unidades de repetição podem ser ainda adaptadas com D-alanina (D-Ala) em C2>-OH e/ou com N-acetilglucosamina (GICNAc) na posição C4-OH através de ligações a-(alfa) ou B-(beta) glicosídicas. Dependendo da cepa de S. aureus, ou da fase de crescimento das bactérias, as ligações glicosídicas podem ser a-, B-, ou uma mistura dos dois anômeros. Estas modificações de açúcar GICNAc são adaptadas por duas glicosiltransferases específicas derivadas de S. aureus (Gtfs): TarM Gtf medeia as ligações a- glicosídicas, enquanto que TarS Gtfs medeia ligações B-(beta) glicosídicas.

[0166] Dada a evidência significativa de que as reservas intracelulares de MRSA são protegidas contra antibióticos, as novas composições terapêuticas da invenção foram desenvolvidas para prevenir este método de evasão aos antibióticos utilizando um anticorpo específico para S. aureus para fixar um antibiótico sobre as bactérias de modo que quando a bactéria é englobada ou de outra forma internalizada por uma célula hospedeira in vivo, ela leva o antibiótico para a célula hospedeira.

[0167] O anticorpo anti-WTA de um AAC da presente invenção pode ser um anticorpo anti-WTAa ou anti-WTAB. Os Abs anti-WTA exemplares fornecidos ao longo do relatório descritivo foram clonados a partir de células B de pacientes infectados com S. aureus (como ensinado nos Exemplos abaixo). Em um exemplo de realização, os anticorpos anti-WTA e Abs anti-Staph aureus são anticorpos monoclonais humanos. O AAC ou TAC da invenção abrangem Abs quimérico e Abs humanizado compreendendo as CDRs dos presentes Abs WTA.

[0168] Para as utilizações terapêuticas desta invenção, os Abs

WTA conjugados com antibióticos para gerar AACs podem ser de qualquer isotipo exceto a IAM. Em um exemplo de realização, os Abs WTA são do isotipo IgG humano. Em exemplos de realização mais específicos, os Abs WTA são IgG: humanas.

[0169] Ao longo do relatório descritivo e das figuras, os Abs designados por um número de 4 dígitos (por exemplo, 4497) também podem ser referidos com um “S” precedente , por exemplo, S4497; ambos os nomes referem-se ao mesmo anticorpo que é a sequência não modificada tipo selvagem (WT) do anticorpo. As variantes do anticorpo são indicadas por um “v” seguindo o nº do anticorpo, por exemplo, 4497v8. A menos que especificado (por exemplo, por um número variante), as sequências de aminoácidos mostradas são as sequências originais, não modificadas/inalteradas. Estes Abs podem ser alterados em um ou mais resíduos, por exemplo, para melhorar o pK, estabilidade, expressão, capacidade de fabricação (por exemplo, como descrito nos Exemplos abaixo), mantendo substancialmente uma afinidade de ligação ao antígeno igual ou melhorada em comparação com o anticorpo não modificado do tipo selvagem. Formas variantes dos anticorpos WTA da invenção que têm substituições conservadoras de aminoácidos estão abrangidas pela invenção. Abaixo, salvo se especificado de outra forma, a numeração CDR é de acordo com Kabat e a numeração de domínio constante é de acordo com a numeração EU.

[0170] Para a conjugação para produzir um composto TAC, os anticorpos anti-WTA da invenção podem compreender modificações de Cis em uma ou ambas as cadeias L e H para a conjugação com o intermediário ligante- antibiótico, conforme ensinado abaixo.

[0171] A Figura 11A e a Figura 11B proporcionam o alinhamento de sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (VL) e da região variável de cadeia pesada (VH), respectivamente, de quatro anticorpos humanos anti-WTA alfa. As sequências das CDRs; CDR L1, L2 e H3 e CDR H1, H2, H3, de acordo com a numeração de Kabat estão sublinhadas. TABELA 1A SEQUÊNCIAS DA CDR DE CADEIA LEVE DO ANTICORPO ANTI-WTAA CDRL1 CDR L2 CDRL3 4461 KSSQSVLSRANNNYYVA WASTREF QQYYTSRRT (SEQ ID NO: 1) (SEQID NO: 2) I(SEQ ID NO: 3) 4624 RSNQNLLSSSNNNYLA WASTRES QQYYANPRT (SEQ ID NO: 7) (SEQIDNO:8) I(SEQIDNO:9) 4399 KSNQNVLASSNDKNYLA — IWASIRES QQYYTNPRT (SEQ ID NO: 13) (SEQ ID NO: 14) |(SEQ ID NO: 15) 6267 KSSQNVLYSSNNKNYLA — IWASTRES QQYYTSPPYT (SEQ ID NO: 19) (SEQ ID NO: 20) |[(SEQ ID NO: 21)

TABELA IB SEQUÊNCIAS DA CDR DE CADEIA PESADA DO ANTICORPO ANTI-WTAA 4461 | DYYMH | WINPKSGGTNYAQRFQOG DCGSGGLRDF (SEQID (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 6) NO: 4) 4624 | DYYVIH | WINPNTGGTYYAQKFRD DCGRGGLRDI (SEQ ID (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 12) NO: 10) 4399 | DYYIH | WINPNTGGTNYAQKFOG DCGNAGLRDI (SEQ ID (SEQ ID NO: 17) (SEQ ID NO: 18) NO: 16) 6267 | SYWIG | IHPGDSKTRYSPSFOG | LYCSGGSCYSDRAFSSLGAGGYYYYGMGV (SEQID (SEQ ID NO: 23) (SEQ ID NO: 24) NO: 22)

[0172] As sequências de cada par de VL e VH são as seguintes:

4461 - REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA LEVE

DIQMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLSRANNNYYVAWYQ

HKPGQPPKLLIYNWASTREFGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYYCQ QYYTSRRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 25) 4461 - REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA

QVALVAOSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTDYYMHWVRQAPG

QGLEWMGWINPKSGGTNYAQRFAGRVTMTGDTSISAAYMDLASLTSDDTAV YYCVKDCGSGGLRDFWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 26) 4624 - REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA LEVE

DIQMTQOSPDSLSVSLGERATINCRSNQNLLSSSNNNYLAWYQQ

KPGQPLKLLIVWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCQQY YANPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 27) 4624 - REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA

QVALQQASRVEVKRPGTSVKVSCKTSGYTFSDYYIHWVRLAPGQ

GLELMGWINPNTGGTYYAQKFRDRVTMTRDTSIATAYLEMSSLTSDDTAVYY CAKDCGRGGLRDIWGPGTMVTVSS (SEQ ID NO: 28) 4399 - REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA LEVE

EIVLTOSPDSLAVSLGERATINCKSNQNVLASSNDKNYLAWFQH

KPGQPLKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLRAEDVAVYYCQQY YTNPRTFGQGTKVEFN (SEQ ID NO: 29) 4399 - REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA

EVOQLVOSGAEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRLAPGQ

GLELMGWINPNTGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSIATAYMELSSLTSDDTAVYY CAKDCGNAGLRDIWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 30) 6267 - REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA LEVE

DIQLTASPDSLAVSLGERATINCKSSQNVLYSSNNKNYLAWYQQ

KPGQPPKLLITYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCQQY YTSPPYTFGQGTKLEIE (SEQ ID NO: 31)

7TVUIT7T 6267 - REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA

EVOQLVOSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGK

GLEWMGIIHPGDSKTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWNSLKASDTAMYYC ARLYCSGGSCYSDRAFSSLGAGGYYYYGMGVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 32)

[0173] Para a produção de um composto AAC, a invenção provê um anticorpo monoclonal isolado que se liga ao ácido teicoico de parede alfa (WTAa) compreendendo uma cadeia leve e uma cadeia H, a cadeia L compreendendo CDR L1, L2, L3 e a cadeia H compreendendo CDR H1, H2, H3 em que as CDRs L1, L2, L3 e H1, H2, H3 compreendem as sequências de aminoácidos das CDRs de cada um dos Abs 4461 (SEQ ID NO: 1-6), 4624 (SEQ ID NO: 7-12) , 4399 (SEQ ID NO: 13-18) e 6267 (SEQ ID NO: 19-24) respectivamente, como mostrado na Tabela 1A e Tabela 1B acima.

[0174] Em outro exemplo de realização, o Ab monoclional isolado que se liga ao WTAa compreende uma região variável de cadeia H (VH) e uma região variável de cadeia L (VL), em que a VH compreende pelo menos 95% de identidade de sequência ao longo do comprimento da sequência da região VH de cada um dos anticorpos 4461, 4624, 4399 e 6267, respectivamente. Ainda em outro aspecto específico, a identidade da sequência é 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[0175]A presente invenção também provê um AAC compreendendo um anticorpo anti-WTA beta a partir da lista de Abs exemplificados na Figura 12. Em um exemplo de realização, o anticorpo monoclonal Ab isolado anti-WTA beta compreende as CDRs L1, L2, L3 e H1, H2, H3 selecionadas a partir do grupo constituído pelas CDRs de cada um dos 13 Abs na Figura 12. Em outro exemplo de realização, a invenção provê um Abs isolado anti-WTA beta compreendendo pelo menos 95% de identidade de sequência ao longo do comprimento dos domínios da região V de cada um dos

13 anticorpos. Ainda em outro aspecto específico, a identidade da sequência é 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[0176] Dos 13 Abs anti-WTA beta, os anticorpos 6078 e 4497 foram modificados para criar variantes i) possuindo uma Cis modificada em uma ou ambas as cadeias L e H para conjugação com intermediários ligantes- antibióticos; e ii) em que o primeiro resíduo Q na cadeia H é alterado para E (v2) ou os dois primeiros resíduos QM foram alterados para El ou EV (v3 e v4).

[0177] As Figuras 13A-1 e 13A-2 fornecem a sequência de aminoácidos da cadeia L completa do Ab anti-WTA beta 6078 (não modificado) e as suas variantes, v2, v3, v4. As variantes de cadeia L que contêm uma modificação de Cis estão indicadas pelo C na caixa em preto no fim da região constante (no resíduo EU nº 205 neste caso). A designação variante, por exemplo, v2LC-Cis significa a variante 2 contendo uma modificação de Cis na cadeia L. HCLC-Cis significa que cada uma das cadeias H e L do anticorpo contém uma Cis modificada. As Figuras 13B-1 a 13B-4 mostram um alinhamento da cadeia H completa do Ab anti-WTA beta 6078 (não modificado) e as suas variantes, v2, v3, v4 que têm alterações nos primeiro ou nos 2 primeiros resíduos da cadeia H. As variantes de cadeia H que contêm uma modificação de Cis estão indicadas pelo C na caixa em preto no fim da região constante (no resíduo EU nº 118).

6078 - REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA LEVE (VL)

DIVMTQSPSILSASVGDRVTITCRASQTISGWLAWYQQKPAEAP

KLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFGIYYCQQYKSYSFNF GQGTKVEIK (SEQ ID NO: 111) 6078 - REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA (VH) XX:QALVAOSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTLTSYDINWVRQATG

QGPEWMGWMNANSGNTGYAQKFQGRVTLTGDTSISTAYMELSSLRSEDTAV YYCARSSILVRGALGRYFDLWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 112) em que X

T3INTT é QouuE;eXt é M,louV 6078 - CADEIA LEVE

DIVMTQSPSILSASVGDRVTITCRASQTISGWLAWYQQKPAEAP KLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFGIYYCQQYKSYSFNF GQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD

NALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOQGLSS PVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 113) 6078 CADEIA LEVE COM MODIFICAÇÃO DE CIS

DIVMTQSPSILSASVGDRVTITCRASQTISGWLAWYQQKPAEAP KLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFGIYYCQQYKSYSFNF GQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD

NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PCTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 115) 6078 - CADEIA PESADA COMPLETA WT

QMQLVASGAEVKKPGASVKVSCEASGYTLTSYDINWVRQATG QGPEWMGWMNANSGNTGYAQKFQGRVTLTGDTSISTAYMELSSLRSEDTAV YYCARSSILVRGALGRYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVWNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT

LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 114) 6078 - CADEIA PESADA COMPLETA VARIANTE (V2, v3 OU V4)

EXQLVAOSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTLTSYDINWVRQATGQ GPEWMGWMNANSGNTGYAQKFQGRVTLTGDTSISTAYMELSSLRSEDTAVY YCARSSILVRGALGRYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA

7TAINT7T

ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVWNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL

PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 116) em que X pode ser H, l ou V. 6078 - CADEIA PESADA COM MODIFICAÇÃO DE CIS VARIANTE (V2, v3 OU V4)

EXQLVOSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTLTSYDINWVRQATGQ GPEWMGWMNANSGNTGYAQKFQGRVTLTGDTSISTAYMELSSLRSEDTAVY YCARSSILVRGALGRYFDLWGRGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVWNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT

LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 117) em que Xé M, l ou V

[0178] EM um exemplo de realização, a invenção provê um anticorpo anti-WTA beta isolado compreendendo uma cadeia pesada e uma leve, em que a cadeia pesada compreende uma VH possuindo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 112. Em um exemplo de realização adicional, este anticorpo compreende ainda uma VL com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 111. 111. Em um exemplo de realização específico, o anticorpo anti-WTA beta compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que a cadeia L compreende uma VL de SEQ ID NO: 111 e a cadeia H compreende uma VH de SEQ ID NO: 112. Em um exemplo de realização ainda mais específico, o anticorpo isolado anti-WTA beta compreende uma cadeia L de SEQ ID NO: 113 e uma cadeia H de SEQ ID NO:

114.

[0179] As variantes de 6078 com cadeias H e L modificadas com Cis podem ser pareadas em qualquer uma das seguintes combinações para formar Abs completos para conjugação com intermediários ligante-Abx para gerar AACs anti-WTA da invenção. A cadeia L não modificada (SEQ ID NO: 113) pode ser pareada com uma variante da cadeia H com modificação de Cis de SEQ ID NO: 117; a variante pode ser uma em que X seja M, | ou V. A cadeia L com Cis modificada de SEQ ID NO: 115 pode ser pareada com: a cadeia H de SEQ ID NO: 14; uma variante de cadeia H de SEQ ID NO: 116; ou uma variante da cadeia H com Cis modificada de SEQ ID NO: 117 (nesta versão, ambas as cadeias H e L são modificadas com Cis) Em um exemplo de realização específico, o anticorpo anti-WTA beta e o AAC anti-WTA beta da invenção compreendem uma cadeia L de SEQ ID NO: 115 e cadeia H de SEQ ID NO: 116.

[0180] As Figuras 14A-1 e 14A-2 fornecem a cadeia L completa do Ab 4497 anti-WTA beta (não modificada) e as suas variantes v8. As variantes de cadeia L que contêm uma modificação de Cis estão indicadas pelo C na caixa em preto na região constante (no resíduo EU nº 205). Figuras 14B-1, 14B-2, 14B- 3: mostram um alinhamento da cadeia H completa do Ab anti-WTA beta 4497 (não modificado) e a sua variante v8 com D alterada para E na posição 96 da CDR H3, com ou sem modificações de Cis. As variantes de cadeia H que contêm uma modificação de Cis estão indicadas pelo C na caixa em preto no início da região constante CH1 (no resíduo EU nº 118 neste caso). A CDR H3 não modificada é GDGGLDD (SEQ ID NO: 104); a CDR H3 4497v8 é GEGGLDD (SEQ ID NO: 118).

4497 - REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA LEVE

DIQLTASPDSLAVSLGERATINCKSSQSIFRTSRNKNLLNWYQQ RPGQPPRLLIHWASTRKSGVPDRFSGSGFGTDFTLTITSLQAEDVAIYYCQAQY

FSPPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 119) 4497 - REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFNSFWMHWVRQVPG

KGLVWISFTNNEGTTTAYADSVRGRFIISRDNAKNTLYLEMNNLRGEDTAVYY CARGDGGLDDWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 120) 4497 .v8 - REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA

EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFNSFWMHWVRQVPG

KGLVWISFTNNEGTTTAYADSVRGRFIISRDNAKNTLYLEMNNLRGEDTAVYY CARGEGGLDDWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 156) 4497 - CADEIA LEVE

DIQLTASPDSLAVSLGERATINCKSSQSIFRTSRNKNLLNWYQQ RPGQPPRLLIHWASTRKSGVPDRFSGSGFGTDFTLTITSLQAEDVAIYYCAQY FSPPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK

VQWKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 121) 4497 v.8 - CADEIA PESADA

EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFNSFWMHWVRQVPG KGLVWISFTNNEGTTTAYADSVRGRFIISRDNAKNTLYLEMNNLRGEDTAVYY CARGEGGLDDWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE

MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 122) 4497 - CADEIA LEVE CIS

DIQLTASPDSLAVSLGERATINCKSSQSIFRTSRNKNLLNWYQQ RPGQPPRLLIHWASTRKSGVPDRFSGSGFGTDFTLTITSLQAEDVAIYYCQAQY

T7INTT

FSPPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK

VQOWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 123) 4497 .v8 - CADEIA PESADA

EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFNSFWMHWVRQVPG KGLVWISFTNNEGTTTAYADSVRGRFIISRDNAKNTLYLEMNNLRGEDTAVYY CARGEGGLDDWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI! SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE

MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 157; o mesmo que SEQ ID NO: 122) 4497 .V8 - CADEIA PESADA CIS

EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFNSFWMHWVRQVPG KGLVWISFTNNEGTTTAYADSVRGRFIISRDNAKNTLYLEMNNLRGEDTAVYY CARGEGGLDDWGQGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM

TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 124)

[0181] Outro anticorpo anti-WTA beta fornecido pela invenção compreende uma cadeia pesada e uma leve, em que a cadeia pesada compreende uma VH possuindo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 120. Em um exemplo de realização adicional, este anticorpo compreende ainda uma VL com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 111. 119. Em um exemplo de realização específico, o anticorpo anti-WTA beta compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que a cadeia L compreende uma VL de SEQ ID NO: 119 e a cadeia H compreende uma VH de SEQ ID NO: 120. Em um exemplo de realização ainda mais específico, o anticorpo isolado anti-WTA beta compreende uma cadeia L de SEQ ID NO: 121 e uma cadeia H de SEQ ID NO: 122.

[0182] As variantes de 4497 com cadeias H e L modificadas com Cis podem ser pareadas em qualquer uma das seguintes combinações para formar Abs completos para conjugação com intermediários ligante-Abx para gerar AACs anti-WTA da invenção. A cadeia L não modificada (SEQ ID NO: 121) pode ser pareada com uma variante da cadeia H com modificação de Cis de SEQ ID NO: 124. A cadeia L com Cis modificada de SEQ ID NO: 123 pode ser pareada com: a cadeia H de SEQ ID NO: 157; uma variante de cadeia H com modificação de Cis de SEQ ID NO: 124 (nesta versão, ambas as cadeias He L são modificadas com Cis). Em um exemplo de realização específico, o anticorpo anti-WTA beta e o AAC anti-WTA beta da invenção compreendem uma cadeia L de SEQ ID NO: 123.

[0183] Outro exemplo de realização é um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que cada um dos anticorpos anti-WTA alfa da Figura 11A e da Figura 11B. Também é fornecido um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que cada um dos Abs anti-WTA beta da Figura 12, Figuras 13A e 13B, e Figuras 14A e 14B se liga.

[0184] A ligação de anticorpos anti-WTA ao WTA é influenciada pela orientação anomérica das modificações de GICNAc-açúcar sobre o WTA. Os WTAs são modificados por modificações de açúcar N-acetilglucosamina (GIcNAc) na posição C4-OH através de ligações a- ou B-glicosídicas, pela TarM glicosiltransferase ou TarS glicosiltransferase, respectivamente.

Consequentemente, as preparações de parede celular a partir de cepas glicosiltransferase mutantes que não possuíam TarM (ATarM), TarS (ATarS) ou ambas TarM e TarS (ATarM/ATarS) foram submetidas à análise de imunotransferência (immunoblotting) com anticorpos contra WTA. O anticorpo WTA (S7574) específico para as modificações de a-GIcNAc no WTA não se liga à preparação de parede celular a partir da cepa ATarM (Meijer, P.J., et al. (2006) “Isolation of human antibody repertoires with preservation of the natural heavy and light chain pairing.” Journal of molecular biology 358, 764-772). Do mesmo modo, um anticorpo WTA (S4462) específico para modificações B-GIcNAc no WTA não se liga à preparação de parede celular a partir da cepa ATarS. Como esperado, estes dois anticorpos não se ligam a preparações de parede celular a partir de uma cepa de deleção que não possui ambas as glicosiltransferases (ATarM/ATarS) e também a cepa que não possui qualquer WTA (ATagoO). De acordo com essa análise, os anticorpos foram caracterizados como mAbs anti- a-GIcNAc WTA, ou como mAbs anti-B-GIcNAc WTA como listado na Tabela nas Figuras 6A e 6B.

[0185] Os aminoácidos cisteina podem ser geneticamente manipulados em sítios reativos em um anticorpo e os quais não formam ligações de bissulfeto intracadeias ou intermoleculares (Junutula, et a/., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7.723.485; WO2009/052249, Shen et al (2012) Nature Biotech., 30(2):184-191; Junutula et a/ (2008) Jour of Immun. Methods 332:41-52). Os tióis de cisteína modificados podem reagir com reagentes ligantes ou intermediários ligante-antibiótico da presente invenção que possuem tiol-reativo, grupos eletrofílicos tal como a maleimida ou alfa-halo amidas para formar AAC com anticorpos modificados com cisteína (THIOMABTY ou ThioMabs) e as porções antibiótico (abx). Desse modo, a localização da porção antibiótico pode ser projetada, controlada e conhecida. O carregamento do antibiótico pode ser controlado uma vez que os grupos tióis de cisteína construídos reagem tipicamente com reagentes ligantes tiol-reativo ou intermediários ligante- antibiótico com alto rendimento. A modificação de um anticorpo anti-WTA para introduzir um aminoácido cisteína pela substituição de um único sítio na cadeia pesada ou leve forma duas novas cisteínas no anticorpo tetrâmero simétrico. Um carregamento de antibiótico próximo de 2 pode ser alcançado e estar próximo da homogeneidade da conjugação do produto AAC.

[0186] EM determinados exemplos de realização, pode ser desejável a criação de anticorpos WTA modificados com cisteína, por exemplo, “thioMAbsS”, no qual um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos de cisteína. Em exemplos de realização específicos, os resíduos substituídos ocorrer em sítios acessíveis do anticorpo. Pela substituição de tais resíduos com cisteína, os grupos tióis reativos são assim posicionados em locais acessíveis do anticorpo e podem ser utilizados para conjugar o anticorpo a outras moléculas, tais como moléculas de antibiótico ou moléculas ligante-antibiótico, para criar um imunoconjugado, conforme descrito na presente invenção. Em determinados exemplos de realização, qualquer um ou mais dos seguintes resíduos podem ser substituídos por cisteína, incluindo V205 (numeração de Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração EU) da cadeia pesada; e S400 (numeração EU) da região Fc da cadeia pesada. São mostrados mutantes exemplificativos não limitantes de cadeia pesada com modificação de Cis A118C (SEQ ID NO: 149) e de cadeia leve V205C (SEQ ID NO: 151) de um anticorpo anti-WTA. Os anticorpos anti-WTA modificados com cisteína podem ser gerados conforme descrito (Junutula et a/., 2008b Nature Biotech., 26 (8): 925-932; US

7.521.541; US-2011/0301334).

[0187] Em outro exemplo de realização, a invenção provê um anticorpo anti-WTA isolado para a conjugação para produzir um AAC, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de região constante de cadeia pesada do tipo selvagem ou uma mutante modificada com cisteína (ThioMab) e a cadeia leve compreende uma sequência de região constante de cadeia leve do tipo selvagem ou uma mutante modificada com cisteína (ThioMab). Em um aspecto, a cadeia pesada tem pelo menos 95% de identidade de sequência com: REGIÃO CONSTANTE DE CADEIA PESADA (IGG1), TIPO SELVAGEM

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:148) REGIÃO CONSTANTE DE CADEIA PESADA (IGG1), A118C “THIOMAB”

CSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:149) e a cadeia leve tem pelo menos 95% de identidade de sequência com: REGIÃO CONSTANTE DE CADEIA LEVE (KAPPA), TIPO SELVAGEM

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS

PVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:150) REGIÃO CONSTANTE DE CADEIA LEVE (KAPPA), V205C “THIOMAB”

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS

PCTKSFNRGEC (SEQ ID NO:151)

[0188] O AAC da invenção inclui anticorpos anti-WTA modificados com cisteína onde um ou mais aminoácidos de um anticorpo anti-WTA tipo- selvagem ou parental (de origem) são substituídos com um aminoácido cisteína. Qualquer forma de anticorpo pode ser desenvolvida ou modificada dessa forma, ou seja, mutada. Por exemplo, um fragmento de anticorpo Fab parental pode ser modificado para formar um Fab modificado com cisteína, referido no presente como “ThioFab”. Da mesma forma, um anticorpo monoclional parental pode ser modificado para formar um “ThioMab”. Note que uma mutação pontual gera um único resíduo de cisteína modificado em um ThioFab, enquanto que uma mutação pontual gera dois resíduos de cisteína modificados em um ThioMab, devido à natureza dimérica do anticorpo IgG. Os mutantes com resíduos de cisteína (Cis) substituídos (“modificados por engenharia genética”) são avaliados quanto à reatividade dos novos grupos tiol de cisteína modificados recém- introduzidos.

[0189] Os anticorpos descritos na presente invenção podem ser produzidos utilizando células hospedeiras em cultura. As células hospedeiras podem ser transformadas com vetores (vetores de expressão ou clonagem) compreendendo um ou mais ácidos nucleicos que codificam os anticorpos aqui descritos. As células podem ser cultivadas sob condições adequadas para produzir os anticorpos e os anticorpos produzidos pela célula podem ser adicionalmente purificados. As células adequadas para produzir anticorpos podem incluir células procariotas, de levedura, ou eucariotas superiores (por exemplo, de mamíferos). Em alguns exemplos de realização, é utilizada uma célula de mamífero (uma célula de mamífero humana ou não humana). Em alguns exemplos de realização, utiliza-se uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO).

[0190] As células de mamífero podem ser cultivadas e a propagação de células de mamífero em cultura (cultura de tecidos) tornou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos podem incluir, sem limitação, a linhagem CV1 de rim de macaco transformada com SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et a/., J. Gen. Virol. 36: 59 (1977)); células de rim de filhote de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células de Sertoli de camundongo (TMA4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macacos (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de rim de rato “buffalo rat” (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de puimão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor da mama de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2). Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem as linhagens de células de mieloma, tais como NSO e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens de células hospedeiras de mamíferos adequadas para a produção de anticorpos, vide, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, Ed., Humana Press, Fairfield, NJ, 2003), págs 255-268.

[0191] Culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja,

petúnia, tomate e lentilha-d'água (Leninaceae), alfafa (M. truncatula) e tabaco também podem ser utilizadas como hospedeiras.

[0192] Células procarióticas apropriadas para este propósito incluem eubactérias, tais como organismos gram-negativos ou gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae como a Escherichia ou, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Enwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, tal como, Salmonella typhimurium, Serratia, tal como a Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacillital como o B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P descrita na DD 266.710 publicada em 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tal como a P. aeruginosa, e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem de E. coli preferido é a E. coli 294 (ATCC 31.446), embora outras cepas sejam apropriadas, tais como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) e E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estes exemplos são ilustrativos e não limitantes.

[0193] Além de procariotos, micróbios eucariotos tais como, fungos filamentosos e leveduras são hospedeiros adequados para a clonagem ou expressão dos vetores que codificam o anticorpo. A Saccharomyces cerevisiae ou fermento comum é o micro-organismo eucarioto mais comumente utilizado dentre os micro-organismos hospedeiros eucariotos inferiores. Entretanto, uma variedade de outros gêneros, espécies e cepas estão comumente disponíveis e são úteis para a presente invenção, tal como, Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces; hospediros como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC

12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K . thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como, por exemplo, Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e Aspergillus, tal como A. nidulans e A. niger.

PORÇÕES DE ANTIBIÓTICO RIFAMICINA

[0194] A porção antibiótico (abx) dos conjugados anticorpo- antibiótico (AAC) da invenção é um antibiótico tipo rifamicina ou grupo que tem um efeito citotóxico ou citostático. As rifamicinas são um grupo de antibióticos que são obtidos naturalmente pela bactéria Nocardia Mediterranei, Ampycolatopsis mediterranei ou artificialmente. Eles são uma subclasse da família Ansamicina maior que inibem a RNA polimerase bacteriana (Fujii et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:1489-1492; Feklistov, et al (2008) Proc Natl Acad Sci USA, 105(39): 14820-5) e têm potência contra bactérias gram- positivas e gram-negativas seletivas. As rifamicinas são particularmente eficazes contra as micobactérias e são, por esse motivo, utilizadas para tratar infecções por tuberculose, hanseníase e complexo Mycobacterium avium (MAC). O grupo tipo rifamicina inclui os fármacos rifamicina “clássicos” assim como rifampicinas derivadas da rifamicina (rifampina, Reg. CA 13292-46-1), rifabutina (Reg. CA 72559-06-9, US 2011/0178001), rifapentina e rifalazila (Reg. CA 129791-92-0, Rothstein et a/. (2003) Expert Opin. Investig. Drugs 12 (2): 255-271; Fuji et al (1994) Antimicrob. Agents Chemother. 38: 1118-1122. Muitos antibióticos do tipo rifamicina partilham a propriedade prejudicial de desenvolvimento de resistência (Wichelhaus et al (2001) J. Antimicrob. Chemother. 47: 153-156). As rifamicinas foram inicialmente isoladas em 1957 a partir de uma cultura de fermentação de Streptomyces mediterranei. Foram descobertas cerca de sete rifamicinas, designadas Rifamicina A, B, C, D, E, S e SV (US

3.150.046). A rifamicina B foi a primeira introduzida comercialmente e foi útil no tratamento da tuberculose resistente aos fármacos na década de 1960. Rifamicinas têm sido utilizadas no tratamento de muitas doenças, sendo a mais importante a Tuberculose associada ao HIV. Devido ao grande número de análogos e derivados disponíveis, as rifamicinas têm sido largamente utilizadas na eliminação de bactérias patogênicas que se tornaram resistentes aos antibióticos comumente utilizados. Por exemplo, a rifampicina é conhecida pelo seu potente efeito e capacidade de prevenir a resistência aos fármacos. Ele mata rapidamente as cepas de bacilos de divisão rápida, bem como as células dormentes ou persistentes “células persisters”, que permanecem biologicamente inativas durante longos períodos de tempo que lhes permitem evadir a atividade antibiótica. Além disso, rifabutina e rifapentina foram ambas utilizadas contra a tuberculose adquirida em pacientes HIV positivos.

[0195] As porções antibiótico (abx) dos conjugados anticorpo- antibiótico de Fórmula | são porções do tipo rifamicina possuindo a estrutura: o Mn, o | O o (À RS OR R& O OHZA, OH R2 So HO, mM HN o s ) em que: as linhas tracejadas indicam uma ligação opcional; R é H, C1-C12 alquila, ou C(O)CHs; R' é OH; R? é CH=N-(heterociclla)) em que a heterociclla está opcionalmente substituída por um ou mais grupos independentemente selecionados a partir de C(O)CH3 , alguila Ci-Ci2, heteroarila C1-C12, heterociclila Co—Cao, arila Cs-C2o, e carbociclila Ca-C12; ou R' e R? formam uma heteroarila ou heterociclila fusionada possuindo cinco ou seis membross, e opcionalmente, formando um anel de heteroarila, heterociclila, arila, carbocíclla de seis membros em espiro ou fusionado, em que o anel de heteroarila, heterociclila, arila, carbociclila de seis membros em espiro ou fusionado é opcionalmente substituído por H, FE, CI, Br, |, alquila C1-C12, ou OH; e em que o ligante não peptídico PML está ligado covalentemente a R?.

[0196] Um exemplo de realização de uma porção do tipo rifamicina é: o Un, o | O gm o | SS OR

D AV (Rd)N Zz o HO,,, Cm HN o Ss em que R3 é independentemente selecionado a partir de H e C1- C12 alquila; Rº é selecionado a partir de H, F, CI, Br, |, C1-C12 alquila e OH; E Z é selecionado a partir de NH, N(alquila C1-C12), O e S; e em que o ligante não peptídico PML está covalentemente ligado ao átomo de nitrogênio de N(R3)2.

[0197] Um exemplo de realização de uma porção do tipo rifampicina é: o Mn, o | O o O W oR

NV Rº O OHZA, noH f OHHO,, A, AN HAN o e. | so A DS em que: Rº é selecionado a partir de H e C1-C12 alquila; e em que o ligante não peptídico PML está covalentemente ligado ao átomo de nitrogênio de NRº.

[0198] Um exemplo de realização de uma porção do tipo rifabutina é: o ZA | o o O vw oR Na oH OH SO) N o HO, Au, HN o

S em que Rº é selecionado a partir de H e C1-C12 alquila; e em que o ligante não peptídico PML está covalentemente ligado ao átomo de nitrogênio de NRº.

[0199]UM exemplo de realização de uma porção do tipo benzoxazinorifamicina é: o 1, o | O ox O | We OR ON o o HO, A, ANA HN o Rº |

W em que R5 é selecionado a partir de H e C1-C12 alquila; e em que o ligante não peptídico PML está covalentemente ligado ao átomo de nitrogênio de NRº.

[0200]UM exemplo de realização de uma porção do tipo benzoxazinorifamicina, aqui referida como pipBOR, é:

o A | o or O | e OR LO o o HO, Pr, (RIN HN o Ss ) em que R3 é independentemente selecionado a partir de H e C1- C12 alquila; e em que o ligante não peptídico PML está covalentemente ligado ao átomo de nitrogênio de N(Rº)2.

[0201] UM exemplo de realização de uma porção do tipo benzoxazinorifamicina, aqui referida como dimetilpipBOR, é: o tm do | o or O We OAc LO o o HO, 777 (CHs)2N No SA) em que o ligante não peptídico PML está ligado covalentemente ao átomo nitrogênio do dimetilamino.

[0202] O derivado semissintético rifamicina S, ou o sal de sódio reduzido, rifamicina SV, pode ser convertido em antibióticos do tipo Rifalazila em várias etapas, em que R é H ou Ac, Rº é independentemente selecionado a partir de entre H e F, CI, Br, |, alquila Ci-C12; Rº é selecionado a partir de H, F, CI, Br, |, alquila Ci-C12 e OH; e Z é selecionado a partir de NH, N(alquila Ci-C12), O e S (vide, por exemplo, as Figuras 23A e B e Figuras 25A e B no documento WO 2014/194247). Podem ser preparadas rifamicinas benzoxazino (Z = O),

benzotiazino (Z = S), benzdiazino (Z = NH, N(alquila C1-C12) (US 7.271.165). Os análogos benzoxazinorifamicina (BOR), benzotiazinorifamicina (BTR) e benzodiazinorifamicina (BDR) que contêm substituintes são numerados de acordo com o esquema de numeração proporcionado na fórmula A na coluna 28 no documento US 7.271.165, que é incorporado ao presente pela referência para este propósito. Por “25-O-desacetila” rifamicina entende-se um análogo da rifamicina em que o grupo acetila na posição 25 foi removido. Os análogos nos quais esta posição é adicionalmente derivada são referidos como “25-O- desacetil-25-(substituinte)rifamicina”, em que a nomenclatura para o grupo derivatizante substitui o “Substituinte” no nome completo do composto.

[0203]Podem ser sintetizadas porções antibióticas do tipo rifamicina por métodos análogos aos revelados nos documentos US

4.610.919; US 4.983.602; US 5.786.349; US 5.981.522; US 4.859.661; US

7.271.165; US 2011/0178001; Seligson, et al. (2001) Anti-Cancer Drugs 12:305-13; Chem. Pharm. Bull., (1993) 41:148, e WO 2014/194247, cada um deles incorporado ao presente pela referência). As porções antibiótico do tipo rifamicina podem ser rastreadas quanto à atividade antimicrobiana medindo a sua concentração inibitória mínima (MIC), utilizando ensaios MIC in vitro convencionais (Tomioka et a/l., (1993) Antimicrob. Agents Chemother. 37:67). o o nn, É o mo Noe- q É ' mo W OR o " ;OAc | | N Nas OH OH OHA, QOH — (RN z 'o HO, A, o HO, A, > BN o HN o | | So

SS rifamicina-S benzoxazinorifamicina

LIGANTES NÃO PEPTÍDICOS CLIVÁVEIS POR PROTEASE

[0204] Um “ligante não peptídico, clivável por protease” (PML) é uma porção bifuncional ou multifuncional que está covalentemente ligada a uma ou mais porções de antibiótico (abx) e uma unidade de anticorpo (Ab) para formar conjugados anticorpo-antibiótico (AAC) de Fórmula |. Os ligantes não peptídicos cliváveis por protease no AAC são substratos para clivagem por proteases intracelulares, incluindo nas condições lisossômicas. As proteases incluem várias catepsinas e caspases. A clivagem do ligante não peptídico de um AAC dentro de uma célula pode liberar o antibiótico do tipo rifamicina com efeitos antibacterianos.

[0205] OS conjugados droga-antibiótico (ANAC) podem ser convenientemente preparados usando um reagente ligante ou intermediário ligante-antibiótico possuindo funcionalidade reativa para ligação ao antibiótico (abx) e ao anticorpo. Em um exemplo de realização, um tiol de cisteína de um anticorpo modificado com cisteína (Ab) pode formar uma ligação com um grupo funcional de um reagente ligante, uma porção antibiótico ou um intermediário antibiótico-ligante.

[0206] A porção PML de um AAC pode compreender um resíduo de aminoácido.

[0207] A unidade PML de um AAC compreende uma unidade peptidomimética.

[0208] Em um aspecto, um reagente ligante ou intermediário ligante-antibiótico tem um sítio reativo que possui um grupo eletrofílico que é reativo a uma cisteína nucleofílica presente em um anticorpo. O tiol de cisteína do anticorpo é reativo com um grupo eletrofílico em um reagente ligante ou antibiótico ligante, formando uma ligação covalente. Os grupos eletrofílicos úteis incluem, mas não estão limitados a, grupos maleimida e haloacetamida.

[0209] Os anticorpos modificados com cisteína podem reagir com reagentes ligantes ou intermediários ligante-antibiótico, com grupos funcionais eletrofílicos, tais como maleimida ou a-halo carbonil, de acordo com o método de conjugação na página 766 de Klussman, et al (2004), Bioconjugate Chemistry (4) :765-773, e de acordo com o protocolo do Exemplo 19.

[0210] Em um exemplo de realização adicional, o grupo reativo de um reagente ligante ou intermediário ligante-antibiótico contém um grupo tiol reativo funcional que pode formar uma ligação com um tiol da cisteína livre de um anticorpo. Exemplos de grupos funcionais de reacção ao tiol incluem, mas não estão limitados a, maleimida, a-haloacetila, ésteres ativados tais como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenila, ésteres de pentafluorofenila, ésteres de tetrafluorofenila, anidridos, ácido clorídrico, cloretos de sulfonila, isocianatos e isotiocianatos.

[0211] Em outro exemplo de realização, um reagente ligante ou intermediário antibiótico-ligante possui um grupo funcional reativo que tem um grupo nucleofílico que é reativo com um grupo eletrofílico presente em um anticorpo. Grupos eletrofílicos úteis em um anticorpo incluem, mas não estão limitados a, grupos bissulfeto de píridila, aldeído e carbonil cetona. O heteroátomo de um grupo nucleofílico de um reagente ligante ou intermediário antibiótico-ligante pode reagir com um grupo eletrofílico em um anticorpo e formar uma ligação covalente para uma unidade de anticorpo. Grupos nucleofílicos úteis em um reagente ligante ou intermediário antibiótico-ligante incluem, mas não estão limitados a, hidrazida, oxima, amino, tiol, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina e arilhidrazida. O grupo eletrofílico em um anticorpo fornece um local conveniente para a fixação a um reagente ligante ou intermediário antibiótico-ligante.

[0212]UmMa porção PML pode compreender um ou mais componentes ligantes. Exemplos componentes ligantes incluem um único aminoácido tal como a cituliha (“cil)) G6-maleimidocaproil (“MC”),

maleimidopropanoil (“MP”), p-aminobenziloxicarbonil (“PAB”), N-Succinimidil 4- (2-piridiltio) pentanoato (“SPP”) e carboxilato de 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 (“MCC”). Diversos componentes ligantes são conhecidos no estado da técnica, sendo alguns deles descritos abaixo.

[0213] Em outro exemplo de realização, o ligante pode ser substituído por grupos que modulam a solubilidade ou reatividade. Por exemplo, um substituinte carregado, tal como o sulfonato (-SO3) ou amônia, pode aumentar a solubilidade à água do reagente e facilitar a reação de acoplamento do reagente ligante com o anticorpo ou a porção antibiótico, ou facilitar a reação de acoplamento do Ab-L (intermediário anticorpo-ligante), com abx, ou abx-L (intermediário antibiótico-ligante) com o Ab, dependendo da via sintética empregada para preparar o AAC.

[0214] Os AAC's da invenção contemplam expressamente, mas não são limitados aqueles preparados com reagentes ligantes: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC e sulfo-SMPB e SVSB (benzoato de succinimidil-(4-vinilsulfona)), e reagentes bis-maleimida: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BM(PEG)>, e BM(PEG)3. Os reagentes bis-maleimida permitem a anexação de um grupo tiol de um anticorpo modificado com cisteína a uma porção antibiótico contendo tiol, marcador ou ligante intermediário, de forma sequencial ou convergente. Outros grupos funcionais, além da maleimida, que são reativos com um grupo tiol de um anticorpo modificado com cisteína, porção antibiótico ou intermediário ligante- antibiótico, incluem a iodoacetamida, bromoacetamida, vinil piridina, bissulfeto, bissulfeto de piridila, isocianato e isotiocianato.

o o q o o Br ETA AAAN, N O N / O o O BM(PEG), BM(PEG);

[0215] Reagentes ligantes úteis também podem ser obtidos através de outras fontes comerciais, como a Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO), ou sintetizados em conformidade com os procedimentos descritos em Toki et al (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch et al (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186; US 6.214.345; WO 02/088172; US 2003130189; US 2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583 e WO 04/032828.

[0216] Em outro exemplo de realização, a porção PML de um AAC compreende um ligante tipo dendrítico para a ligação covalente de mais de uma porção de antibiótico através de uma molécula ligante multifuncional ramificada a um anticorpo (Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761- 1768). Ligantes dendríticos podem aumentar a razão molar de antibiótico por anticorpo, ou seja, a carga que está relacionada com a potência do AAC. Desse modo, quando um anticorpo modificado com cisteína carrega apenas um grupo tiol reativo de cisteína, uma grande variedade de porções antibiótico pode ser acoplada por meio de um ligante dendrítico.

[0217] Em determinados exemplos de realização de realização do AAC de Fórmula |, o ligante não peptídico não clivável por proteases, PML, tem a fórmula: —Str-PM—-Y- onde Str é uma unidade extensora (stretcher); PM é uma unidade peptidomimética, e Y é uma unidade espaçadora;

abx é o antibiótico do tipo rifamicina; e p é um número inteiro de 1 a 8.

[0218] Em um exemplo de realização, uma unidade extensora “Str” tem a fórmula:

O Lo o em que R$ é selecionado a partir do grupo consistindo de alquileno C1-C12, alquileno C1-C12 C(=O), alquileno C1-C12 NH, (CH2CH20)r, (CH2CH20)-- C(=O), (CH2CH20)-CH>, e alquileno C1-C12 NHO(=O)CH2CHí(tiofen-3-il), em que ré um inteiro variando de 1 a 10.

[0219] Exemplos de unidades extensoras são mostrados abaixo (onde a linha ondulada indica sítios de ligação covalente a um anticorpo): Oo

SAND

O o MC o o : A. o MP

O Oo A $ WOA OI NDONO H Oo

O o : ONO Oo o

O

IRINA o

[0220] Em um exemplo de realização, o PM tem a fórmula: Hu RU Rê" o ARC” O o AA em que R? e Rº formam juntos um anel cicloalquila C3- C7, e AA é uma cadeia lateral de aminoácido selecionada a partir de H, —-CH3a —"CHXCsHs)) —CH2CH2CH2CHANHa, — -CH2CH2CHaNHCO(NH)NH>, -CHCH(CH3)CHsa, e -CH2CH2CHaNHC(O)NH>.

[0221] Em um exemplo de realização, a unidade espaçadora Y compreende para-aminobenzila (PAB) ou para-aminobenziloxicarbonila (PABC).

[0222] Uma unidade espaçadora permite a liberação da unidade antibiótica sem uma etapa de hidrólise separada. Uma unidade espaçadora pode ser “autoimolativa"” ou “não autoimolativa”. Em determinados exemplos de realização, uma unidade espaçadora de um ligante compreende uma unidade p- aminobenzila (PAB). Em um exemplo de realização, um álcool! p-aminobenzila é ligado a uma unidade de aminoácido por meio de uma ligação amida, e um carbamato, metilcarbamato ou carbonato entre o grupo p-aminobenzila e a porção antibiótico (Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15: 1087-1103). Em um exemplo de realização, a unidade espaçadora é p- aminobenziloxicarbonila (PAB).

[0223] Em um exemplo de realização, o antibiótico forma uma amina quaternária, tal como o grupo dimetilaminopiperidila, quando ligado à unidade espaçadora PAB do ligante não peptídico PML. Exemplos de tais aminas quaternárias de intermediários ligante-antibiótico (PLA) são PLA-1 a 4 da Tabela 2. O grupo amina quaternária pode modular a clivagem da porção de antibiótico para otimizar os efeitos antibacterianos do AAC. Em outro exemplo de realização, o antibiótico está ligado à unidade espaçadora PABC do ligante não peptídico PML, formando um grupo funcional carbamato no AAC. Tal grupo funcional carbamato pode também otimizar os efeitos antibacterianos do AAC. Exemplos de intermediários de ligante carbamato PABC - antibiótico (PLA) são PLA-S5 e PLA-6 da Tabela 2.

[0224] Outros exemplos de espaçadores autoimolativos incluem, mas não se limitam a, compostos aromáticos que são eletronicamente equivalente ao grupo PAB, tais como os derivados de 2-aminoimidazol-5- metanol (US 7.375.078; Hay et al. 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) e orto- ou para-aminobenzilacetais. Podem ser usados espaçadores que sofrem ciclização sobre a hidrólise da ligação de amida, tais como amidas de ácido 4- aminobutírico substituído e não substituído (Rodrigues et a/. (1995) Chemistry Biology 2:223), sistemas de anéis biciclo (2,2,1) e biciclo (2,2,2) devidamente substituídos (Storm et a/. (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) e amidas de ácido 2-aminofenilpropiônico (Amsberry et al. 1990, J. Org. Chem. 55:5867). À eliminação de drogas contendo aminas que são substituídas na glicina (Kingsbury, et al. (1984) J. Med. Chem. 27:1447) também são exemplos de espaçadores autoimolativos uteis nos AACs.

[0225] A quantidade de antibiótico ativo liberado da clivagem do AAC pode ser mensurada pelo ensaio de libertação da Caspase do Exemplo 8.

INTERMEDIÁRIOS DE LIGANTE-ANTIBIÓTICO ÚTEIS PARA AAC

[0226]Os intermediários ligantes PML-antibióticos (PLA) de Fórmula |l e Tabela 2 foram preparados acoplando uma porção de antibiótico do tipo rifamicina a um reagente ligante, Exemplos 11-21. Os reagentes ligantes foram preparados conforme descrito nos documentos WO 2012/113847; US 7659241; US 7498298; US 20090111756; US 2009/0018086; US 6214345; Dubowchik et a/. (2002) Bioconjugate Chem. 13(4):855-869.

TABELA 2 INTERMEDIÁRIOS LIGANTE PML - ANTIBIÓTICO LA Estrutura No. PLA-1 o 6 Lo o ou o " 2 Ps OS tor A .soH O É o No Ho. e A H no? AN " O L NINA NA ' So

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HN o NH, = o PLA-6 o o o ÍA ( RA DSO NO or ff e IA

HN P no HN Go O OH | o oH 0 2º (AR, T EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO DE CONJUGADOS ANTICORPO-ANTIBIÓTICOS

[0227] Os anticorpos anti-WTA modificados com cisteína foram ligados através do grupo tiol de cisteína livre aos derivados de rifamicina, designados por pipBOR e outros, através de um ligante não peptídico, clivável por protease para formar os compostos de conjugados anticorpo-antibiótico (AAC) na Tabela 3. O ligante é concebido para ser clivado por proteases lisossômicas incluindo catepsinas B, D e outras, a Geração do intermediário ligante-antibiótico que consiste do antibiótico e o ligante PML e outros, é descrita em detalhe nos Exemplos 11-21. O ligante é concebido de tal modo que a clivagem da ligação amida na porção PAB separa o anticorpo do antibiótico em um estado ativo.

[0228] O AAC denominado “dimetilpipbBOR” é idêntico ao AAC “pipBOR” exceto pelo amino dimetilado no antibiótico e o grupo oxicarbonila no ligante.

[0229] A Figura 3 mostra um possível mecanismo de ativação de fármacos para conjugados anticorpo-antibiótico (AAC). O antibiótico ativo (Ab) só é liberado após a internalização do AAC dentro das células de mamíferos. À porção Fab do anticorpo no AAC se liga ao S. aureus enquanto que a porção Fc do AAC aumenta a captação das bactérias pela ligação mediada por receptor Fc nas células fagocíticas incluindo neutrófilos e macrófagos. Após a internalização no fagolisossomo, o ligante pode ser clivado por proteases lisossômicas liberando o antibiótico ativo no interior do fagolisossomo.

[0230] Um exemplo de realização dos compostos de conjugado anticorpo-antibiótico (AAC) da invenção inclui o de Fórmula |: Mn, , | o o O e OR

SO OH OH efe So HO, Pr, ) HN o SS º | em que: as linhas tracejadas indicam uma ligação opcional; R é H, alquila C1-C12, ou C(O)CHs; R' é OH; R? é CH=N-(heterociclla)) em que a heterociclla está opcionalmente substituída por um ou mais grupos independentemente selecionados a partir de C(O)CH3 , alquila Ci-Ci2, heteroarila Ci-C12, heterociclila C2—Cao, arila Ce-C20, e carbociclila Ca-C12; ou R' e R? formam uma heteroarila ou heterociclila fusionada possuindo cinco ou seis membross, e opcionalmente, formando um anel de heteroarila, heterociclila, arila, carbociclila de seis membros em espiro ou fusionado, em que o anel de heteroarila, heterociclila, arila, carbociclila de seis membros em espiro ou fusionado é opcionalmente substituído por H, F, CI, Br, |, alquila C1-C12, ou OH; PML é o ligante não peptídico, clivável por protease, ligado a R? ou fundido a heteroarila ou heterocíclica formada por R' e R?; Ab é o anticorpo anti-ácido teicoico de parede (WTA); e p é um número inteiro de 1 a 8.

[0231] Outro exemplo de realização dos compostos de conjugado anticorpo-antibiótico (AAC) da invenção inclui a Fórmula: o mo | O mo v OR DO OH, OH AbAPML—(R9)N Z o ROMA, HN o | p

W em que: Rº? é independentemente selecionado a partir de H e alquila C1- C12; né 1ou2; Rº é selecionado a partir de H, F, Cl, Br, 1, alquila C1-C12 e OH; e Z é selecionado a partir de NH, N(alquila C1-C12) O e S.

[0232] Outro exemplo de realização dos compostos de conjugado anticorpo-antibiótico (AAC) da invenção inclui a Fórmula: o Un, o | O o v OR

NS R (& CHA, OH f OH HO7,, Arm, N HN o R, 7 RA O) |

AA SS Ab PML p em que: R$ é selecionado a partir de H e alquila C1-C12; e nébloul.

[0233] Outro exemplo de realização dos compostos de conjugado anticorpo-antibiótico (AAC) da invenção inclui a Fórmula: o UA o | O o * OR

NS (Rº% N OH oH A NUA N o HO Aa, b HO o | p

W em que: Rº é selecionado a partir de H e alquila C1-C12; e nébOoul.

[0234] Outro exemplo de realização dos compostos de conjugado anticorpo-antibiótico (AAC) da invenção inclui a Fórmula:

o tm. o | KR or O | WS OR EN º o Pont NU) HN o fa” DS ) p em que: Rº é independentemente selecionado a partir de H e alquila C1— C1i2; e nébloul.

[0235] Outro exemplo de realização dos compostos de conjugado anticorpo-antibiótico (AAC) da invenção inclui a Fórmula: Mn, , | 2 oH O Ww OR LO o o HO, Pu, fumo oo º ) SS p em que: Rº? é independentemente selecionado a partir de H e alquila C1—- Ci; e né 1ou2.

[0236] Outro exemplo de realização dos compostos de conjugado anticorpo-antibiótico (AAC) da invenção inclui a Fórmula:

o Mn, o | O or O | Qu 40Ae

LLC OH OH Ds AV N o o HO, A, o HN o AbA-PML—(CH3)N | W p

[0237] Outro exemplo de realização dos composto de conjugado anticorpo-antibiótico (AAC) da invenção inclui a Fórmula: o

H H abx —N N O Ab Str Oo Oo AA Pp '

[0238] Outro exemplo de realização dos composto de conjugado anticorpo-antibiótico (AAC) da invenção inclui a Fórmula:

KAXKKKKKKKKKKKKKKK KKK KKK KKK KKK KKK KKK KKK KKK KKK KKK KKK KKK KKKKKK

KAXKKKKKKKKKKK KKK KKK KKK KKK KKK KKK KKK KKK KKK H Ho? N N — aAbx AbdosO Ty Oo Oo 7 Ss ,

HN A, |

[0239] Outro exemplo de realização dos composto de conjugado anticorpo-antibiótico (AAC) da invenção inclui a Fórmula: Oo H H q abx NIDA à" Á

Y Ab O o o AA Pp .

[0240] Outro exemplo de realização dos composto de conjugado anticorpo-antibiótico (AAC) da invenção inclui a Fórmula: Oo H H Q abx

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O XY Ab o o O f HN p Ant,

[0241] Outro exemplo de realização dos composto de conjugado anticorpo-antibiótico (AAC) da invenção inclui as Fórmulas: P b: abx

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AKAKXKAKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKAKKKKKKK o o À b:

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[0242] Outro exemplo de realização dos composto de conjugado anticorpo-antibiótico (AAC) da invenção inclui as Fórmulas:

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HN An, HN Go o ow |”%| o oH Oo DO “lon T CARGA DE AnTIBIÓTICO DE AAC

[0243] A carga de antibiótico é representada por p, o número de porções de antibiótico (abx) por anticorpo em uma molécula de Fórmula |. À carga de antibiótico pode variar de 1 a 20 moléculas de antibiótico (D) por anticorpo. Os AACs de Fórmula | incluem coleções de um grupo de anticorpos conjugados com uma faixa de porções de anticorpo, de 1 a 20. O número médio de moléculas de antibiótico por anticorpo em preparações AAC a partir das reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais, tais como espectrometria de massas, ensaios de ELISA e HPLC. A distribuição quantitativa de AAC em termos de p também pode ser determinada. Em alguns casos, a separação, purificação e caracterização do AAC homogêneo onde p é um determinado valor a partir do AAC com outros antibióticos carregados, podem ser alcançadas por meios como o HPLC de fase reversa ou eletroforese.

[0244] Para alguns conjugados anticorpo-antibiótico, p pode ser limitado pelo número de pontos de ligação no anticorpo. Por exemplo, quando a ligação é por um tiol de cisteína, tal como nos exemplos de realização acima, um anticorpo pode ter apenas um ou diversos grupos tióis de cisteína, ou pode ter apenas um ou vários grupos tióis suficientemente reativos através dos quais um ligante pode ser acoplado. Em alguns exemplos de realização, uma carga de antibiótico mais alta, por exemplo, p > 5, pode gerar agregação, insolubilidade, toxicidade ou perda da permeabilidade celular de certos conjugados anticorpo- antibiótico. Em determinados exemplos de realização, a carga de antibiótico para um AAC da invenção varia de 1 a cerca de 8; de cerca de 2 a cerca de 6; de cerca de 2 a cerca de 4; ou entre cerca de 3 e cerca de 5; cerca de 4; ou cerca de 2.

[0245] Em certos exemplos de realização, menos do que o máximo teórico de moléculas de antibiótico são conjugadas a um anticorpo durante uma reação de conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, resíduos de lisina que não reagem com intermediário antibiótico-ligante ou reagente ligante, conforme discutido abaixo. Geralmente, os anticorpos não contêm muitos grupos tiol de cisteína livres e reativos que podem ser ligados a uma porção antibiótico, na verdade a maioria dos resíduos de tiol de cisteína nos anticorpos existe como pontes de dissulfeto. Em certos exemplos de realização, um anticorpo pode ser reduzido com um agente redutor tal como o ditiotreitol (DTT) ou tricarboniletitfosfina (TCEP), sob condições de redução parciais ou totais, para gerar grupos tiol de cisteína reativos. Em certos exemplos de realização, um anticorpo é submetido a condições de desnaturação para revelar grupos nucleófilos reativos, tal como a lisina ou cisteína.

[0246] A carga (proporção de antibiótico/anticorpo, “AAR”) de um AAC, que também pode ser referida na presente invenção como relação droga para anticorpo (DAR), pode ser controlada de diferentes maneiras, por exemplo:

(i) limitando o excesso molar de intermediário antibiótico-ligante ou reagente ligante em relação ao anticorpo, (ii) limitando o tempo ou temperatura da reação de conjugação, e (iii) fornecendo condições redutoras parciais ou limitantes para a modificação do tiol de cisteína.

[0247] Deve-se compreender que quando mais do que um grupo nucleofílico reage com um intermediário antibiótico-ligante ou reagente ligante seguido pelo reagente da porção antibiótico, em seguida, o produto resultante é uma mistura de compostos AAC com uma distribuição de uma ou mais porções antibiótico ligada a um anticorpo. O número médio de antibióticos por anticorpo pode ser calculado a partir da mistura através de um ensaio de anticorpos ELISA duplo, que é específico para o anticorpo e específico para o antibiótico. Moléculas AAC individuais podem ser identificadas na mistura por espectroscopia de massa e separadas por HPLC, por exemplo, cromatografia de interação hidrofóbica (vide, por exemplo, McDonagh et al (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307; Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., et al. “Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate,” Resumo 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, 27-31 de março de 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, maço de 2004; Alley, S.C., et al. “Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates,” resumo nº 627, American Association for Cancer Research, 2004 27-31 de março de 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, março de 2004). Em certos exemplos de realização, um AAC homogêneo, com um valor de carga simples pode ser isolado a partir da mistura de conjugação por eletroforese ou cromatografia. Os anticorpos modificados com cisteína da invenção permitem preparações mais homogêneas uma vez que o sítio reativo no anticorpo está primariamente limitado ao tiol de cisteína modificado. Em um exemplo de realização, o número médio de porções de antibiótico por anticorpo está no intervalo de cerca de 1 a cerca de 20. Em alguns exemplos de realização a intervalo é selecionado e controlado a cerca de 1 a 4. MéTODOS PARA PREPARAR CONJUGADOS ANTICORPO-ANTIBIÓTICO

[0248]UmM AAC de Fórmula | pode ser preparado por diversas rotas, empregando reações, condições e reagentes da química orgânica conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto, incluindo: (1) a reação de um grupo nucleofílico de um anticorpo com um reagente ligante bivalente para formar Ab-L, por meio de uma ligação covalente, seguido pela reação com a porção antibiótico (abx); e (2) reação de um grupo nucleofílico de uma porção antibiótico com um reagente ligante bivalente para formar L-abx, por meio de uma ligação covalente, seguida pela reação com um grupo nucleofílico de um anticorpo. Exemplos de métodos para a preparação de um AAC de Fórmula | por meio desta última rota estão descritos no pedido US 7.498.298, o qual é expressamente incorporado ao presente pela referência.

[0249] Grupos nucleofílicos em anticorpos incluem, mas não estão limitados a: (i) grupos amino N-terminal, (ii) grupos amina da cadeia lateral, por exemplo, lisina, (iii) grupos tióis de cadeia lateral, por exemplo, de cisteína, e (iv) grupos açúcares hidroxila ou amino, em que o anticorpo está glicosilado. Grupos amina, tiol e hidroxila são nucleofílicos e são capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos nas moléculas ligantes e reagentes ligantes, incluindo: (i) ésteres de ativos, tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos e ácidos halogenetos, (ii) haletos de alquila e benzila como haloacetamidas, (iii) aldeídos, cetonas, carboxila e grupos maleimida. Certos anticorpos possuem dissulfetos intercadeias redutíveis, ou seja, pontes de cisteína. Os anticorpos podem ser feitos reativos para a conjugação com reagentes ligantes pelo tratamento com um agente redutor tal como DTT (ditiotreitol) ou tricarboniletilfosfina (TCEP), de tal modo que o anticorpo é completamente ou parcialmente reduzido. Cada ponte de cisteína forma,

teoricamente, dois tióis nucleofílicos reativos. Grupos nucleofílicos adicionais podem ser introduzidos em anticorpos por meio da modificação de resíduos de lisina, por exemplo, pela reação dos resíduos de lisina com 2-iminotiolano (reagente de Traut), resultando na conversão de uma amina em um tiol. Os grupos tióis reativos podem ser introduzidos em um anticorpo pela introdução de um, dois, três, quatro ou mais resíduos de cisteína (por exemplo, pela preparação de anticorpos variantes compreendendo um ou mais resíduos de aminoácido cisteína não nativos).

[0250] Conjugados anticorpo-antibiótico da presente invenção podem também ser produzidos por reação entre um grupo eletrofílico em um anticorpo, tal como um grupo carbonil aldeído ou cetona com um grupo nucleofílico de um reagente ligante ou antibiótico. Grupos nucleofílicos úteis em um reagente ligante incluem, mas não estão limitados a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina e arilhidrazida. Em um exemplo de realização, um anticorpo é modificado para introduzir porções eletrofílicas que são capazes de reagir com substituintes nucleofílicos no reagente ligante ou antibiótico. Em outro exemplo de realização, os açúcares dos anticorpos glicosilados podem ser oxidados, por exemplo, com reagentes periodato oxidantes, para formar grupos aldeído ou cetona que podem reagir com o grupo amina do reagente ligante ou porções de antibiótico. Os grupos de base de Schiff imina resultantes podem formar uma ligação estável, ou podem ser reduzidos, por exemplo, por meio de reagentes borohidreto para formar ligações amina estáveis. Em um exemplo de realização, a reação da porção carboidrato de um anticorpo glicosilado com qualquer galactose oxidase ou meta-periodato de sódio pode resultar em grupos carbonila (aldeído e cetona) no anticorpo que pode reagir com grupos apropriados no antibiótico (Hermanson, Bioconjugate Techniques). Em outro exemplo de realização, anticorpos contendo resíduos de serina ou treonina N-terminais podem reagir com o meta-

periodato de sódio, resultando na produção de um aldeído no lugar do primeiro aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US

5.362.852). Tal aldeído pode reagir com uma porção antibiótico ou ligante nucleofílico.

[0251] Grupos nucleofílicos na porção antibiótico incluem, mas não estão limitados a: grupos amina, tiol, hidroxilay hidrazida, oxima, tiosemicarbazona hidrazina, carboxilato hidrazina, e arilhidrazida capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos na porções ligante e reagentes ligante, incluindo: (i) ésteres de ativos, tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos e ácidos halogenetos, (ii) haletos de alquila e benzila como haloacetamidas, (iii) aldeídos, cetonas, carboxila e grupos maleimida.

[0252] Os conjugados anticorpo-antibiótico (AAC) na Tabela 3 foram preparados por conjugação dos anticorpos anti-WTA descritos e dos intermediários ligante-antibiótico da Tabela 2 e de acordo com os métodos descritos no Exemplo 7. Os AACs foram testados quanto à eficácia por ensaio in vitro em macrófagos (Exemplo 9) e modelo de rim de camundongo in vivo (Exemplo 10).

TABELA3 CONJUGADOS DE ANTICORPO WTA-PML-ANTIBIÓTICO (AAC) pO.0,0,0,0,0,0,0,0,0,4 AAC jFórmuladoAAC ligante-abx JAAR * No. PLA No. 101 tio-S6060-HC-WT/LC-cis-MC-(CBDK-cit)-PAB- [PLA-2 1,9 (dimetilpipBOR) 102 tio-S4497-LC-cis-MC-(CBDK-cit)-PAB- PLA-2 1,8 (dimetilpipBOR) CBDK-cit)-PAB-(dimetilpipBOR)

AAC |FórmuladoAAC ligante-abx JAAR * No. PLA No. CBDK-cit)-PAB-(dimetilpipBOR) CO ea o (piperazBTR) 106 tio-S4497-HC-A118C-MC-(CBDK-cit)-PAB- PLA-2 1,8 (dimetilpipBOR) (PpipBOR) * AAR = Média da relação antibiótico/anticorpo Tipo selvagem (“WT”), Anticorpo mutante modificado com cisteína (“tio”); cadeia leve (“LC”), cadeia pesada (“HC”), 6-maleimidocaproila (“MC”), maleimidopropanoíla (“MP”), , ciclobutildiceto (“CBDK”), citrulina (“cit”), cisteína (“cis”), p-aminobenzila (PAB) e p-aminobenziloxicarbonila (PABC).

MÉTODOS DE TRATAMENTO E PREVENÇÃO DE INFECÇÕES COM CONJUGADOS ANTICORPO-ANTIBIÓTICOS

[0253] Os AACs anti-WTA da invenção são úteis como agentes antimicrobianos eficazes contra Staphylococci humanos e veterinários, por exemplo, S. aureus, S. saprophyticus e S. simulans. Em um aspecto específico, os AACs da invenção são úteis para tratar infecções por S. aureus.

[0254] Após a entrada na corrente sanguínea, o S. aureus pode causar infecção metastática em quase qualquer órgão. Infecções secundárias ocorrem em cerca de um terço dos casos antes do início da terapia (Fowler et al., (2003) Arch. Intern. Med. 163:2066-2072), e mesmo em 10% dos pacientes após o início da terapia (Khatib et a/., (2006) Scand. J. Infect. Dis., 38: 7-14). O marco das infecções são grandes reservatórios de pus, destruição de tecidos e a formação de abcessos (todos os quais contêm grandes quantidades de neutrófilos). Cerca de 40% dos pacientes desenvolvem complicações se a bacteremia persistir além de três dias.

[0255] O mecanismo de ação proposto de um AAC foi descrito acima (sob o subtítulo Conjugados Anticorpo-Antibiótico). Os conjugados anticorpo-anti-WTA-antibiótico (AAC) da invenção têm vantagens terapêuticas significativas para o tratamento de agentes patogênicos intracelulares.

O ligante AAC é clivado por exposição a enzimas fagolisossômicas, libertando um antibiótico ativo.

Devido ao espaço confinado e à concentração local relativamente elevada de antibióticos (cerca de 10º por bactéria), o resultado é que o fagolisossomo não suporta mais a sobrevivência do patógeno intracelular.

Uma vez que o AAC é essencialmente um pró-fármaco inativo, o índice terapêutico do antibiótico pode ser prolongado em relação à forma livre (não conjugada). O anticorpo proporciona um direcionamento específico ao patógeno, enquanto o ligante clivável é clivado sob condições específicas para a localização intracelular do patógeno.

O efeito pode ser tanto diretamente no patógeno opsonizado como em outros patógenos que estão colocalizados no fagolisossomo.

A tolerância aos antibióticos é a capacidade de um patógeno causador de doenças resistir à morte por antibióticos e outros antimicrobianos e é mecanísticamente distinta da resistência a múltiplos fármacos (Lewis K (2007) “Persister cells, dormancy and infectious disease”. Nature Reviews Microbiology (1): 48-56. doi:10.1038/nrmicro 1557). Pelo contrário, esta forma de tolerância é causada por uma pequena subpopulação de células microbianas denominadas persistentes (persisters) (Bigger J.W. (14 de outubro de 1944). “Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilization”. Lancet 244 (6320):497-500). Estas células não são multirresistentes no sentido clássico, mas são células dormentes que são tolerantes ao tratamento com antibióticos que podem matar seus irmãos geneticamente idênticos.

Esta tolerância aos antibióticos é induzida por um estado fisiológico com ausência de divisão ou divisão extremamente lenta.

Quando o tratamento antimicrobiano não consegue erradicar estas células persistentes, elas se tornam um reservatório para infecções crônicas recorrentes. Os conjugados anticorpo-antibiótico da invenção possuem uma propriedade única para matar estas células persistentes e suprimir a emergência de populações bacterianas tolerantes a múltiplos fármacos.

[0256]Em outro exemplo de realização, o AAC anti-WTA da invenção pode ser utilizado para tratar a infecção independentemente do compartimento intracelular no qual o patógeno sobrevive.

[0257] Em outro exemplo de realização, os AACs anti-WTA da invenção também podem ser utilizados para direcionar bactérias Staphylococci em forma planctônica ou de biofilme. As infecções bacterianas tratáveis com conjugados anticorpo-antibiótico (AAC) da invenção incluem o tratamento de infecções pulmonares bacterianas, tais como pneumonia por S. aureus, osteomielite, rinossinusite recorrente, endocardite bacteriana, infecções oculares bacterianas, tais como tracoma e conjuntivite, infecções no coração, cérebro ou pele, infecções do trato gastrointestinal, tais como diarreia de viajantes, colite ulcerativa, síndrome do intestino irritável (IBS), doença de Crohn e IBD (doença inflamatória do intestino) em geral, meningite bacteriana e abscessos em qualquer órgão, tais como músculo, fígado, meninges ou pulmão. As infecções bacterianas podem estar em outras partes do corpo, como o trato urinário, corrente sanguínea, ferida ou local de inserção de um cateter. Os AACs da invenção são úteis para infecções difíceis de tratar que envolvem biofilmes, implantes ou locais santuários (por exemplo, osteomielite e infecções de articulação protética) e infecções de alta mortalidade, tais como pneumonia adquirida em hospital e bacteremia. Grupos de pacientes vulneráveis que podem ser tratados para prevenir a infecção por Staphylococcus aureus incluem pacientes em hemodiálise, pacientes imunocomprometidos, pacientes em unidades de terapia intensiva e alguns pacientes cirúrgicos. Em outro aspecto, a invenção provê um método para matar, tratar ou prevenir uma infecção microbiana em um animal, preferencialmente um mamífero, e mais preferencialmente um ser humano, que inclui a administração ao animal de uma formulação AAC anti-WTA ou farmacêutica de um AAC da invenção. O invenção apresenta ainda o tratamento ou prevenção de doenças associadas ou que resultam oportunisticamente de tais infecções microbianas. Tais métodos de tratamento ou prevenção podem incluir a administração oral, tópica, intravenosa, intramuscular ou subcutânea de uma composição da invenção. Por exemplo, antes da cirurgia ou inserção de um cateter IV, em cuidados em UTI, em medicina de transplante, juntamente ou após a quimioterapia de câncer, ou outras atividades que apresentam um risco elevado de infecção, o AAC da invenção pode ser administrado para prevenir o aparecimento ou a propagação da infecção.

[0258] A infecção bacteriana pode ser causada por bactérias com uma forma ativa e inativa, e o AAC é administrado em uma quantidade e por uma duração suficiente para tratar tanto a forma ativa como a forma inativa, a forma latente da infecção bacteriana, cuja duração é mais longa do que o necessário para tratar a forma ativa da infecção bacteriana.

[0259] Uma análise de várias bactérias Gram* encontrou WTA beta expressa em todos os S. aureus, incluindo cepas MRSA e MSSA, bem como cepas Staph como S. saprophyticus e S. simulans. O WTA alfa (Alfa-GLcNAc ribitol WTA) está presente na maioria, mas não em todos os S. aureus, e também está presente em Listeria monocytogenes. O WTA não está presente em bactérias Gram”. Consequentemente, um aspecto da invenção é um método de tratamento de um paciente infectado com um ou mais S. aureus, S. saprophyticus ou S. simulans pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um AAC anti-WTA beta da invenção. Outro aspecto da invenção é um método de tratamento de um paciente infectado com S. aureus elou Listeria monocytogenes pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um AAC anti-WTA alfa da invenção. A invenção também contempla um método para prevenir infecções causadas por um ou mais bactérias dentre S. aureus ou S. saprophyticus ou S. simulans pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um AAC anti-WTA beta da invenção em ambientes hospitalares tais como cirurgia, pacientes com queimaduras e transplante de órgãos.

[0260] O paciente que necessita de tratamento para uma infecção bacteriana tal como determinado por um médico especializado na técnica pode já ter sido, mas não necessita ser diagnosticado com o tipo de bactéria com a qual está infectado. Uma vez que um paciente com uma infecção bacteriana pode ter uma recaída muito rapidamente, em questão de horas, o paciente no momento da admissão no hospital pode ser administrado os AACs anti-WTA da invenção, juntamente com um ou mais Abx padrão de cuidados, tal como vancomicina ou ciprofloxacina. Quando os resultados de diagnósticos estiverem disponíveis e indicarem a presença de, por exemplo, S. aureus na infecção, o paciente pode continuar com o tratamento com o AAC anti-WTA. Por esse motivo, em um exemplo de realização do método de tratamento de uma infecção bacteriana ou especificamente uma infecção por S. aureus, é administrada ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um AAC anti-WTA beta. Nos métodos de tratamento ou prevenção da presente invenção, um AAC da invenção pode ser administrado como o único agente terapêutico ou em conjunto com outros agentes tais como os descritos abaixo. Os AACs da invenção mostram superioridade à vancomicina no tratamento de MRSA em modelos pré- clínicos. A comparação de AACs com SOC pode ser mensurada, por exemplo, por uma redução na taxa de mortalidade. O paciente a ser tratado seria avaliado quanto à capacidade de resposta ao tratamento com AAC por uma variedade de fatores mensuráveis. Exemplos de sinais e sintomas que os clínicos podem usar para avaliar a melhora em seus pacientes incluem os seguintes: normalização da contagem de glóbulos brancos se elevado no diagnóstico, normalização da temperatura corporal se elevado (febre) no momento do diagnóstico, melhoria visual da ferida, incluindo menos eritema e drenagem de pus, redução dos requisitos do ventilação, como menos oxigênio ou taxa reduzida de ventilação em um paciente que é ventilado, completa saída do pacientes do ventilador se o paciente está sendo ventilado no momento do diagnóstico, uso de menos medicamentos para suportar uma pressão arterial estável se estes medicamentos eram necessários no momento do diagnóstico, normalização de anomalias laboratoriais que sugerem insuficiência de órgãos terminal, tais como creatinina elevada ou testes de função hepática se estavam anormais no momento do diagnóstico, e melhora na imagem radiológica (por exemplo, radiografia de tórax que anteriormente sugeria pneumonia mostrando resolução). Em um paciente na UTI, esses fatores podem ser mensurados pelo menos diariamente. A febre é monitorada de perto, assim como a contagem de glóbulos brancos, incluindo a contagem absoluta de neutrófilos, bem como a evidência de que um “deslocamento para a esquerda” (aparecimento de blastos indicando aumento da produção de neutrófilos em resposta a uma infecção ativa) se resolveu.

[0261] No contexto dos presentes métodos de tratamento da invenção, considera-se que um paciente com uma infecção bacteriana é tratado se houver uma melhora mensurável significativa avaliada pelo médico especialista na técnica, em pelo menos dois ou mais dos fatores precedentes em comparação com os valores, sinais ou sintomas antes ou no início do tratamento ou no momento do diagnóstico. Em alguns exemplos de realização, há melhora mensurável em 3, 4, 5, 6 ou mais dos fatores mencionados acima. Em alguns exemplos de realização, a melhoria nos fatores mensurados é de pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% em comparação com os valores antes do tratamento. Tipicamente, um paciente pode ser considerado completamente tratado da infecção bacteriana (por exemplo, infecção por S. aureus) se as melhoras mensuráveis do paciente incluem o seguinte: i) repetição de hemoculturas ou de culturas de tecido (tipicamente várias) que não crescem a bactéria que foi originalmente identificada; ii) a febre é normalizada; iii) a contagem de glóbulos brancos é normalizada; e iv) há evidência de que a insuficiência de órgãos (coração, pulmões, fígado, rins, colapso vascular) tenha resolvido total ou parcialmente fornecendo as comorbidades pré-existentes que o paciente tinha. DosAGEM

[0262] Em qualquer dos aspectos anteriores, no tratamento de um paciente infectado, a dosagem de um AAC é normalmente de cerca de 0,001 a 1000 mg/kg/dia. Em um exemplo de realização o paciente com uma infecção bacteriana é tratado em uma dose de AAC na faixa de cerca de 1 mg/kg a cerca de 150 mg/kg, tipicamente cerca de 5 mg/kg a cerca de 150 mg/kg, mais especificamente cerca de 25 mg/kg a 125 mg/Kg, 50 mg/kg a 125 mg/kg, ainda mais especificamente a cerca de 50 mg/kg a 100 mg/kg. O AAC pode ser administrado diariamente (por exemplo, em dose única de 5 a 50 mg/kg/dia) ou menos frequentemente (por exemplo, dose única de 5, 10, 25 ou 50 mg/kg/semana). Uma dose pode ser dividida ao longo de 2 dias, por exemplo, mg/kg em um dia e 25 mg/kg no dia seguinte. O paciente pode ser administrado uma vez a cada 3 dias (q3D), uma vez por semana ou a cada quinze dias (qQOW), durante 1-8 semanas. Em um exemplo de realização, o paciente recebe um AAC da invenção por via IV uma vez por semana durante 2- 6 semanas com padrão de cuidados (SOC) para tratar a infecção bacteriana tal como uma infecção por Staph A. A duração do tratamento seria ditada pela condição do paciente ou pela extensão da infecção, por exemplo, uma duração de 2 semanas para a bacteremia não complicada, ou 6 semanas para a bacteremia com endocardite.

[0263] Em um exemplo de realização, um AAC administrado em uma dose inicial de 2,5 a 100 mg/kg durante um a sete dias consecutivos, seguido por uma dose de manutenção de 0,005 a 10 mg/kg uma vez a cada sete dias durante um mês.

VIAS DE ADMINISTRAÇÃO

[0264] Para tratar as infecções bacterianas, os AACs da invenção podem ser administrados em qualquer uma das dosagens anteriores intravenosamente (iv) ou subcutaneamente. Em um exemplo de realização, o WTA-AAC é administrado intravenosamente. Em um exemplo de realização específico, o WTA-AAC administrado via iv. é um AAC WTA-beta, mais especificamente, em que o anticorpo WTA-beta é selecionado dentre o grupo de Abs com as sequências de aminoácidos divulgadas na Figura 12, Figura 13A1 e A2 e Figura 13B1-B4, e Figura 14A1-A2 e Figura 14B1-B3, e Figura 15A1-A3 e Figura 15B1-B6.

TERAPIA COMBINADA

[0265] UM AAC pode ser administrado em conjunto com um ou mais agentes adicionais, por exemplo, um segundo agente terapêutico ou profilático, conforme apropriado como determinado pelo médico que trata o paciente.

[0266] EM um exemplo de realização, o segundo antibiótico administrado em combinação com o composto de conjugado anticorpo- antibiótico da invenção é selecionado a partir das classes estruturais: (i) aminoglicosídeos; (ii) beta-lactamas; (ili) macrolídeos/peptídeos cíclicos; (iv) tetraciclinas; (v) fluoroquinolinas/fluoroquinolonas; (vi) e oxazolidinonas. Vide: Shaw, K. e Barbachyn, M. (2011) Ann. N.Y. Acad. Sci. 1241:48-70; Sutcliffe, J. (2011) Ann. N.Y. Acad. Sci. 1241:122-152.

[0267] EM um exemplo de realização, o segundo antibiótico administrado em combinação com o composto de conjugado anticorpo- antibiótico da invenção é selecionado a partir de clindamicina, novobiocina,

retapamulina, — daptomicina, —“GSK-2140944, CG-400549, sitafloxacina, teicoplanina, triclosan, naftiridona, radezolida, doxorrubicina, ampicilina, vancomicina, imipenem, doripenem, gemcitabina, dalbavancina e azitromicina.

[0268] Exemplos adicionais destes agentes terapêuticos ou profiláticos adicionais são agentes anti-inflamatórios (por exemplo, fármacos anti-inflamatórios não esteroides, NSAIDs; (por exemplo, detoprofeno, diclofenaco, diflunisal, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, meclofenamato, ácido mefenâmico, meloxicam, nabumetona, naproxeno sódico, oxaprozina, piroxicam, sulindaco, tolmetina, celecoxib, rofecoxib, aspirina, salicilato de colina, salsalte, e salicilato de sódio e magnésio) e esteroides (por exemplo, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, — prednisolona, — prednisona, triamcinolona)), — agentes antibacterianos (por exemplo, azitromicina, claritromiícina, eritromicina, gatifloxacina, levofloxacina, amoxicilina, metronidazol, penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, nafcilina, ampicilina, carbenicilina, ticarcilina, mezlocilina, piperacilina, azlocilina, temocilina, cepalotina, cefapirina, cefradina, cefaloridina, cefazolina, cefameol, cefuroxima, cefalexina, cefprozil, cefaclor, loracarbef, cefoxitina, cefmatozol, cefotaxima, ceftizoxima, ceftriaxona, cefoperazona, ceftazidima, cefixima, cefpodoxima, ceftibuteno, cefdinir, cefpiroma, cefepima, BAL5788, BAL9141, imipenem, ertapenem, meropenem, astreonam, clavulanato, sulbactam, tazobactam, estreptomicina, neomicina, canamicina, paromicina, gentamicina, tobramicina, amicacina, netilmicina, espectinomicina, sisomicina, dibekalina, isepamiíicina, tetraciclina, clortetraciclina, — demeclociclina, = minociclina, —oxitetraciclina, —metaciclina, doxiciclina, telitromiícina, ABT-773, lincomicina, clindamicina, vancomicina, oritavancina, dalbavancina, teicoplanina, quinupristina e dalfopristina, sulfanilamida, ácido para-aminobenzóico, sulfadiazina, sulfisoxazol, sulfametoxazol, sulfatalidina, linezolida, ácido nalidixico, ácido oxolinico,

norfloxacina, perfloxacina, enoxacina, ofloxacina, ciprofloxacina, temafloxacina, lomefloxacina, fleroxacina, grepafloxacina, esparfloxacina, trovafloxacina, clinafloxacina, “moxifloxacina, gemifloxacina, sitafloxacina, daptomicina, garenoxacina, ramoplanina, faropenem, polimixina, tigeciclina, AZD2563 ou trimetoprima), anticorpos antibacterianos incluindo anticorpos contra o mesmo antígeno ou com um antígeno diferente do alvo do AAC, inibidores da agregação plaquetária (por exemplo, abciximab, aspirina, cilostazol|, clopidogrel, dipiridamol, eptifibatida, ticlopidina ou tirofiban), anticoagulantes (por exemplo, dalteparina, danaparoide, enoxaparina, heparina, tinzaparina, ou warfarina), antipiréticos (por exemplo, acetaminofeno), agentes de redução de lipídeos (por exemplo, colestiramina, colestipol, ácido nicotínico, gemfibrozil, probucol, ezetimibe, ou estatinas como a atorvastatina, rosuvastatina, lovastatina, simvastatina, pravastatina, cerivastatina, e fluvastatina). Em um exemplo de realização, o AAC da invenção é administrado em combinação com o padrão de cuidados (SOC) para S. aureus (incluindo cepas resistentes à meticilina e sensíveis à meticilina). O MSSA é normalmente tratado com nafcilina ou oxacilihna e o MRSA é tipicamente tratado com vancomicina ou cefazolina.

[0269] Estes agentes adicionais podem ser administrados dentro de 14 dias, 7 dias, 1 dia, 12 horas ou 1 hora da administração de um AAC, ou simultaneamente com o mesmo. Os agentes terapêuticos adicionais podem estar presentes na mesma composição farmacêutica ou em composições farmacêuticas diferentes do AAC. Quando presentes em composições farmacêuticas diferentes, podem ser utilizadas em diferentes vias de administração. Por exemplo, um AAC pode ser administrada por via intravenosa ou subcutânea, enquanto que o segundo agente pode ser administrado por via oral.

FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS

[0270]A presente invenção também provê composições farmacêuticas contendo os WTA-AACs, e métodos de tratamento de uma infecção bacteriana utilizando as composições farmacêuticas contendo o AAC. Tais composições podem compreender ainda excipientes adequados, tais como excipientes farmaceuticamente aceitáveis (veículos) incluindo tampões, ácidos, bases, açúcares, diluentes, agentes deslizantes, conservantes e similares, que são bem conhecidos no estado da técnica e estão descritos na presente invenção. Os presentes métodos e composições podem ser utilizados isoladamente ou em combinações com outros métodos convencionais e/ou agentes para o tratamento de doenças infecciosas. Em alguns exemplos de realização, uma formulação farmacêutica compreende 1) um AAC anti-WTAB da invenção, e 2) um veículo farmaceuticamente aceitável. Em alguns exemplos de realização, uma formulação farmacêutica compreende 1) um AAC da invenção e opcionalmente, 2) pelo menos um agente terapêutico adicional.

[0271] As formulações terapêuticas compreendendo um AAC da invenção são preparadas para o armazenamento misturando o AAC possuindo o grau de pureza desejado com veículos, excipientes ou estabilizantes opcionais fisiológicamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences 16º edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de soluções aquosas, liofiizada ou outras formulações secas. Os veículos, excipientes e estabilizantes aceitáveis são atóxicos aos receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, histidina e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, ácool butílico ou benzilíco; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofíicos tais como polivinilpirrolidona;

aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo a glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açucares tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal tal como sódio; complexos metálicos (tal como, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos tais como TWEENº, PLURONICSº ou polietileno glicol (PEG). As formulações farmacêuticas a serem utilizadas para administração in vivo geralmente são estéreis, o que é facilmente realizado por filtração através de membranas de filtração estéril.

[0272] Os ingredientes ativos também podem ser armazenados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por meio de polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsula de gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nano- partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16º Edição, Osol, A. Ed. (1980).

[0273] Podem ser fabricadas preparações de liberação controlada. Exemplos apropriados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham o anticorpo ou o AAC da presente invenção, em que as matrizes se encontram na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (tais como poli- (metacrilato de 2-hidroxietila) ou álcool poli-(vinílico)), poli-lactídeos (patente US

3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e y L-glutamato de etila, acetato de etilenovinila não degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico e ácido glicólico, tal como LUPRON DEPOTº (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico e ácido glicólico e acetato de leuprolide) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Embora polímeros tais como etilenovinilacetato e ácido láctico-ácido glicólico permitam a liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Quando os anticorpos ou AACs encapsulados permanecem no corpo por um longo período, eles podem desnaturar ou se agregarem como resultado da exposição à umidade a 37 ºC, resultando na perda da atividade biológica e possíveis mudanças na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser concebidas para a estabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se é descoberto que mecanismo de agregação é a formação de pontes S-S intermoleculares através do intercâmbio tio-dissulfeto, a estabilização pode ser obtida pela modificação de resíduos sufidrila, liofilização de soluções ácidas, controlando o conteúdo de umidade, utilizando aditivos adequados e desenvolvendo composições de matriz polimérica específicas.

[0274] Um AAC pode ser formulado em qualquer forma adequada para entrega a uma célula/tecido alvo. Por exemplo, AACs podem ser formulados na forma de lipossomos, uma pequena vesícula composta por vários tipos de lipídeos, fosfolípidos e/ou tensoativos que é útil para entrega de uma droga a um mamífero. Os componentes do lipossoma são comumente arranjados em uma formação de dupla camada, similar ao arranjo lipídico das membranas biológicas. Lipossomos contendo o anticorpo são preparados por meio de métodos conhecidos no estado da técnica, tal como descrito em Epstein et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang et a/l., (1980) Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030; US 4.485.045; US 4.544.545; WO 97/38731; US 5.013.556.

[0275] Os lipossomos particularmente úteis podem ser gerados por meio do método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeos que compreende fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Os lipossomos são extrudados através de filtros com tamanho de poro definido para gerar lipossomas com o diâmetro desejado.

MATERIAIS E MÉTODOS CEPAS BACTERIANAS

[0276]Todos os experimentos foram feitos com a MRSA- USA300 NRS384 obtida a partir do NARSA (http://Www.narsa.net/control/member/repositories), a menos que indicado de outra forma.

DETERMINAÇÕES DA MIC PARA BACTÉRIAS EXTRACELULARES

[0277] A MIC para bactérias extracelulares foi determinada pela preparação de diluições em série de 2 vezes do antibiótico em caldo de soja tríptico. As diluições do antibiótico foram feitas em quadruplicatas em placas de cultura de 96 poços. O MRSA (cepa NRS384 de USA300) foi coletada de uma cultura em crescimento exponencial e diluída 1 x 10º UFC/mL. As bactérias foram cultivadas na presença de antibiótico durante 18-24 horas com agitação a 37 ºC e o crescimento bacteriano foi determinado pela leitura da Densidade Óptica (OD) a 630 nM. A MIC foi determinada como sendo a dose de antibiótico que inibia o crescimento bacteriano em mais de 90%.

DETERMINAÇÕES DA MIC PARA BACTÉRIAS INTRACELULARES

[0278] A MIC intracelular foi determinada em bactérias que foram selecionadas dentro de macrófagos peritoneais de camundongo (vide abaixo para geração de macrófagos peritoneais murinos). Os macrófagos foram colocados em placas de cultura de 24 poços a uma densidade de 4x10º células/mL e infectados com MRSA em uma razão de 10:20 bactérias por macrófago. As culturas de macrófagos foram mantidas em meio de crescimento suplementado com 50 pug/mL de gentamicina (um antibiótico que é ativo apenas em bactérias extracelulares) para inibir o crescimento de bactérias extracelulares e os antibióticos de teste foram adicionados ao meio de crescimento 1 dia após a infecção. A sobrevivência das bactérias intracelulares foi avaliada 24 horas após a adição dos antibióticos. Os macrófagos foram lisados com solução salina tamponada com Hanks suplementada com albumina de soro de bovino a 1% e Triton-X a 1% e foram feitas diluições em série do lisado em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo Tween-20 a 0,05%. O número de bactérias intracelulares sobreviventes foi determinado por plaqueamento em placas de Ágar Tríptico de Soja com 5% de sangue de ovelha desfibrinado.

ISOLAMENTO DE MACRÓFAGOS PERITONEAIS

[0279] Os macrófagos peritoneais foram isolados a partir do peritônio de camundongos Balb/c com 6 a 8 semanas de idade (Charles River Laboratories, Hollister, CA). Para aumentar o rendimento de macrófagos, os camundongos foram pré-tratados por injeção intraperitoneal de 1 mL de meio de tioglicolato (Becton Dickinson). O meio de tioglicolato foi preparado a uma concentração de 4% em água, esterilizado por autoclavagem e envelhecido durante 20 dias a 6 meses antes da utilização. Os macrófagos peritoneais foram coletados 4 dias após o tratamento com tioglicolato lavando a cavidade peritoneal com solução salina tamponada com fosfato fria. Os macrófagos foram plaqueados em meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal e 10 MM de HEPES, sem antibióticos, a uma densidade de 4x 10º células/poço em placas de cultura de 24 poços. Os macrófagos foram cultivados durante a noite para permitir a aderência à placa. Este ensaio também foi utilizado para testar a morte intracelular em tipos de células não fagocíticas. As linhagens de células MG63 (CRL-1427) e AS549 (CCL185) foram obtidas da ATCC e mantidas em meio de cultura de tecidos RPM! 1640 suplementado com Hepes 10 mM e Soro Bovino Fetal a 10% (RPMI-10). As células HUVEC foram obtidas da Lonza e mantidas em meio completo de célula endotelial EGM (Lonza, Walkersville, MD).

INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS COM MRSA OPSONIZADO

[0280] A cepa USA3S00 de MRSA (NRS384) foi obtida a partir do repositório NARSA (Chantilly, Virginia). Alguns experimentos utilizaram a cepa

Newman de S. aureus (ATCC25904). Em todos os experimentos as bactérias foram cultivadas em Caldo de Soja Tríptico.

Para avaliar a morte intracelular com o AAC, a USA300 foi retirada de uma cultura em crescimento exponencial e lavada em HB (Solução Salina Balanceada de Hanks suplementado com HEPES MM e albumina de soro bovino a 0,1%). Os AACs ou anticorpos foram diluídos em HB e incubados com as bactérias durante 1 hora para permitir a ligação do anticorpo às bactérias (opsonização) e as bactérias opsonizadas foram utilizadas para infectar macrófagos em uma proporção de 10:20 bactérias por macrófago (4x10º bactérias em 250 ul de HB por poço). Os macrófagos foram previamente lavados com meio DMEM sem soro imediatamente antes da infecção e infectados por incubação a 37 ºC em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada com 5% de CO> para permitir a fagocitose das bactérias.

Após 2 horas, a mistura de infecção foi removida e substituída por meio de crescimento normal (DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal, 10 MM de HEPES) e gentamicina foi adicionada a 50 ug/ml para evitar o crescimento de bactérias extracelulares.

No final do período de incubação, os macrófagos foram lavados com meio isento de soro e as células foram lisadas em HB suplementado com 0,1% de triton-X (promove a lise os macrófagos sem danificar as bactérias intracelulares). Em alguns experimentos a viabilidade dos macrófagos foi avaliada no final do período de cultura pela detecção da liberação da lactato desidrogenase (LDH) citoplasmática no sobrenadante da cultura utilizando um Kit de Detecção de Citotoxicidade LDH (Produto 11644793001, Roche Diagnostics Corp, Indianapolis, IN). Os sobrenadantes foram coletados e analisados imediatamente de acordo com as instruções do fabricante.

Diluições em série do lisado foram feitas em solução salina tamponada com fosfato suplementada com Tween-20 a 0,05% (para interromper agregados de bactérias) e o número total de bactérias intracelulares sobreviventes foi determinado pelo plaqueamento em Ágar Tríptico de Soja com 5% de sangue de ovelha desfibrinado.

GERAÇÃO DE CÉLULAS PERITONEAIS INFECTADAS COM MRSA

[0281] Foram infectados camundongos A/J fêmeas de 6 a 8 semanas de idade (JAX'" Mice, Jackson Laboratories) com 1x10º UFC da cepa NRS384 de USA300 por injeção peritoneal. A lavagem peritoneal foi coletada 1 dia após a infecção, e as células peritoneais infectadas foram tratadas com 50 uvg/mL de lisostafina diluída em tampão Hepes suplementado com BSA a 0,1% (tampão HB) durante 30 minutos a 37 ºC. As células peritoneais foram então lavadas 2x em tampão HB gelado. As células peritoneais foram diluídas 1x10º células/mlL em meio de cultura de tecidos RPM! 1640 suplementado com Hepes mM e Soro Bovino Fetal a 10% e vancomicina a 5 ug/mlL. MRSA livre a partir da infecção primária foi armazenado durante a noite a 4 ºC em solução salina tamponada com fosfato como controle para bactérias extracelulares que não estavam sujeitas a morte de neutrófilos.

TRANSFERÊNCIA DA INFECÇÃO DAS CÉLULAS PERITONEAIS PARA OSTEOBLASTOS

[0282] A linhagem de células de osteoblasto foi obtida a partir da ATCC (CRL-1427) e mantida em meio de cultura de tecidos RPM! 1640 suplementado com Hepes 10 mM e Soro Bovino Fetal a 10% (RPMI-10). Os osteoblastos foram plaqueados em placas de cultura de tecidos de 24 poços e cultivados para se obter uma camada confluente. No dia do experimento, os osteoblastos foram lavados uma vez em RPM! (sem suplementos). O MRSA ou células peritoneais infectadas foram diluídos em RPMI-10 completo e foram adicionados 5 po/ml de vancomicina imediatamente antes da infecção. As células peritoneais foram adicionadas aos osteoblastos a 1x106 células peritoneais/mL. Uma amostra das células foi lisada com 0,1% de triton-x para determinar a concentração real de bactérias intracelulares vivas no momento da infecção. O título real para todas as infecções foi determinado pelo plaqueamento de diluições em série das bactérias em Ágar Tríptico de Soja com 5% de sangue de ovelha desfibrinado.

[0283] Os osteoblastos G63 foram plaqueados em placas de vidro de 4 cavidades e cultivados em meios de cultura de tecidos RPMI 1640 suplementados com Hepes 10 mM e Soro Bovino Fetal a 10% (RPMI-10) até formarem camadas confluentes. No dia da infecção, os poços foram lavados com meio sem soro e infectados com uma suspensão de células peritoneais infectadas ou com cepas USA300 de MRSA diluída em RPMI-10 completo suplementado com 5 ug/mL de vancomicina. Um dia após a infecção, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e fixadas durante 30 minutos em temperatura ambiente em PBS com paraformaldeído a 2%. Os poços foram lavados 3X em PBS e permeabilizados com PBS com saponina a 0,1% durante 30 minutos em temperatura ambiente.

MODELO DE INFECÇÃO DE TRANSFERÊNCIA IN VIVO

[0284] Foram preparados estoques de USA300 para infecção de culturas ativamente crescentes em caldo de soja tríptico. As bactérias foram lavadas 3X em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e alíquotas foram congeladas a -80 ºC em PBS com 25% de glicerol. Infecções por Bactérias Intracelulares: Camundongos A/J foram escolhidos para estes experimentos porque são facilmente infectados com doses relativamente baixas de MRSA (2x106º UFC/camundongo). Camundongos A/J fêmeas de 7 semanas de idade foram obtidos a partir de Jackson Lab e infectados por injeção peritoneal com 5x107 UFC de USA300. Os camundongos foram sacrificados 1 dia após a infecção e o peritônio foi lavado com 5 mL de PBS frio. Os lavados peritoneais foram centrifugados durante 5 minutos a 1000 rpm a 4 ºC em uma centrífuga de mesa. O sedimento celular contendo células peritoneais foi coletado e as células foram tratadas com 50 ug/mL de lisostafina (Cell Sciences Inc. Canton MA, CRL 309C) durante 20 minutos a 37 ºC para eliminar as bactérias extracelulares contaminantes. As células peritoneais foram lavadas 3x em PBS arrefecido com gelo para remover a lisostafina. As células peritoneais de camundongos doadores foram reunidas e os camundongos receptores foram injetados com células derivadas de 5 doadores para cada receptor por injeção intravenosa na veia caudal. Para determinar o número de UFCs intracelulares vivas, uma amostra das células peritoneais foi lisada em HB (Solução Salina Balanceada de Hanks suplementada com HEPES 10 mM e Albumina de Soro Bovino a 1%) com Triton-X a 1% e diluições em série do lisado foram feitas em PBS com Tween- a 0,05%. Infecções por Bactérias Livres: Os camundongos A/J foram infectados com várias doses de bactérias livres utilizando uma alíquota fresca de estoques em glicerol utilizadas para as injeções peritoneais. As doses de infecção reais foram confirmadas por plaqueamento de UFC. Para os dados mostrados na Figura 1A a dose de infecção efetiva para Bactérias Intracelulares foi de 1,8x10º UFC/camundongo, e a dose de infecção efetiva para Bactérias Livres foi de 2,9x10º UFC/camundongo. Os camundongos selecionados foram tratados com uma dose única de 100 mg/Kg de vancomicina por injeção intravenosa imediatamente após a infecção.

TRANSFERÊNCIA IN VITRO DE INFECÇÃO PARA CÉLULAS NÃO FAGOCÍTICAS

[0285] Geração de células peritoneais infectadas com MRSA: Foram infectados camundongos A/J fêmeas de 6 a 8 semanas de idade (Jackson Laboratories) com 1x10º UFC da cepa NRS384 de USA300 por injeção peritoneal. A lavagem peritoneal foi coletada 1 dia após a infecção, e as células peritoneais infectadas foram tratadas com 50 ug/mL de lisostafina diluída em tampão Hepes suplementado com BSA a 0,1% (tampão HB) durante 30 minutos a 37 ºC. As células peritoneais foram então lavadas 2x em tampão HB gelado. As células peritoneais foram diluídas 1x106 células/ml. em meio de cultura de tecidos RPM! 1640 suplementado com Hepes 10 mM e Soro Bovino Fetal a 10% e vancomicina a 5 ug/ml. O MRSA livre da infecção primária foi armazenado durante a noite a 4 ºC em solução salina tamponada com fosfato como um controle para bactérias extracelulares que não estavam sujeitas a morte de neutrófilos.

[0286] Infecção de osteoblastos ou HBMEC: A linhagem de células MG63 foi obtida a partir da ATCC (CRL-1427) e mantida em meio de cultura de tecidos RPM! 1640 suplementado com Hepes 10 mM e Soro Bovino Fetal a 10% (RPMI-10). As células HBMEC (Catálogo tt 1000) e meios ECM (catálogo tt 1001) foram obtidas da SciencCell Research Labs (Carlsbad, CA). As células foram plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 24 poços e cultivados para se obter uma camada confluente. No dia do experimento, as células foram lavadas uma vez em RPMI (sem suplementos). O MRSA ou células peritoneais infectadas foram diluídos em RPMI-10 completo e foram adicionados 5 ug/mL de vancomicina imediatamente antes da infecção. As células peritoneais foram adicionadas aos osteoblastos a 1x10º células peritoneais/mL. Uma amostra das células foi lisada com 0,1% de triton-x para determinar a concentração real de bactérias intracelulares vivas no momento da infecção. O título real para todas as infecções foi determinado pelo plaqueamento de diluições em série das bactérias em Ágar Tríptico de Soja com 5% de sangue de ovelha desfibrinado.

GERAÇÃO DOS ANTICORPOS ANTI-S. AUREUS

[0287] Os anticorpos IgG humanos contra mAb anti-beta-GIcNAc WTA foram clonados a partir de células B periféricas de pacientes após infecção por S. aureus utilizando uma tecnologia de descoberta de anticorpos monoclonais que conserva o pareamento cognato de cadeias pesadas e leves de anticorpos*º. Os clones de anticorpo individuais foram expressos por transfecção de células de mamífero (Meijer, P.J., Nielsen, L.S., Lantto, J. & Jensen, A.(2009) Human antibody repertoires. Methods Mol Biol 525, 261-277, xiv; Meijer, P.J., et al. (2006) “Isolation of human antibody repertoires with preservation of the natural heavy and light chain pairing.” Journal of molecular biology 358, 764-772). Os sobrenadantes contendo anticorpos IgG1 de comprimento completo foram coletados após sete dias e utilizados para pesquisar a ligação do antígeno por ELISA. Estes anticorpos foram positivos para a ligação a preparações de parede celular a partir da USA300. Os anticorpos foram subsequentemente produzidos em transfecções transitórias de 200 ml e purificados com cromatografia de Proteína A (MabSelet SuRe, GE Life Sciences, Piscataway, NJ) para testes adicionais. O isolamento e o uso desses anticorpos foram aprovados pelo conselho regional de revisão ética. CONJUGAÇÃO DO LIGANTE DROGA - ANTICORPO

[0288] A construção e produção da variante THIOMAB do anticorpo anti-WTA (Ab) foi feita da seguinte forma. Um resíduo de cisteína foi manipulado na posição Val 205 da cadeia leve do Ab Anti-WTA para produzir a variante de anticorpo modificada com cisteina THIOMABTY, Estes Anti-WTA thio foi conjugado aos intermediários Ligante PML - antibiótico da Tabela 2. O anticorpo foi reduzido na presença de DTT em excesso molar de cinquenta vezes durante a noite. O agente redutor e os blocos de cisteína e glutatationa foram purificados utilizando coluna HiTrap SP-HP (GE Healthcare). O anticorpo foi reoxidado na presença de ácido desidroascórbico em excesso molar de quinze vezes (MP Biomedical) durante 2,5 horas. A formação de ligações de bissulfureto entre cadeias foi monitorada por LC/MS. Um excesso molar de três vezes do intermediário ligante PML antibiótico sobre proteína foi incubado com o THIOMAB durante uma hora. O conjugado de anticorpo droga foi purificado por filtração através de um filtro SFCA de 0,2 um (Millipore). O excesso de ligante droga livre foi removido por filtração O conjugado foi trocado por tampão em acetato de histidina a 20 mM pH 5,5/240 mM de sacarose por diálise. O número de antibióticos tipo rifamicina conjugado por mAb foi quantificado por análise LC/MS como a relação antibiótico/anticorpo (AAR). A pureza também foi avaliada por cromatografia de exclusão por tamanho.

ANÁLISE DE ESPECTROMÉTRICA DE MASSA

[0289] A análise de LC/MS foi realizada em um LC/MS por Tempo de Voo quadrupolo (Q-TOF) “6530 Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q- TOF) LC/MS (Agilent Technologies)' (Agilent Technologies). As amostras foram cromatografadas em uma coluna PRLP-S, 1000 A, 8 um (50 mm x 2,1 mm, Agilent Technologies) aquecida a 80 ºC. Um gradiente linear de 30-60% B em 4,3 minutos (solvente A: 0,05% TFA em água, solvente B: 0,04% de TFA em acetonitrila) foi utilizado e o eluente foi ionizado diretamente usando a fonte de electrospray. Os dados foram coletados e deconvoluídos utilizando o software de análise qualitativa Agilent Mass Hunter. Antes da análise por LC/MS, o conjugado droga anticorpo foi tratado com lisila endopeptidase (Wako) durante minutos em uma relação de 1:100 p/p de enzima para anticorpo, pH 8,0, e 37 ºC para produzir o Fab e a porção Fc para facilidade de análise. A relação de antibiótico para anticorpo (AAR) (utilizada indistintamente com o termo razão entre droga e anticorpo (DAR)) foi calculada utilizando a abundância de Fab e Fab+1, calculada pelo software MassHunter.

[0290] Análise de bactérias isoladas a partir de camundongos infectados: Camundongos Balb/c foram infectados com 1x107 UFC de MRSA (USA300) por injeção intravenosa e os rins foram coletados no dia 3 após a infecção. Os rins foram homogeneizados usando um gentleMACS Dissociator em 5 mL de volume para cada 2 rins, utilizando M-tubes e o programa RNAO01.01 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Tampão de homogeneização foi: PBS + 0,1% de Triton-X100, 10 ug/mlL DNAse (de pâncreas bovino grau Il, Roche) e inibidores da protease (coquetel inibidor de protease completo, Roche 11-836-153001). Após a homogeneização as amostras foram incubadas em temperatura ambiente durante 10 minutos e, em seguida, diluídas com PBS gelado e filtrado através de um filtro celular de 40 uM. Os homogenatos de tecido foram lavados 2x em PBS gelado e depois suspensos em um volume de 0,5 mL para cada 2 rins em tampão HB (Solução Salina balanceada de Hanks suplementado com HEPES 10 mM e 0,1% de albumina de Soro Bovino). A suspensão celular foi novamente filtrada e 25 uL da suspensão bacteriana foram separados para cada reação de coloração.

[0291] Citometria de fluxo para comparar a expressão de anticorpos anti-MRSA: Os anticorpos de marcação para a citometria de fluxo de bactérias (1x107 de bactérias cultivadas in vitro, ou 25 ul de homogeneizado de tecido descrito acima) foram suspensos em HB (acima) e bloqueados por incubação com 400 ug/mL (micrograma por mililitro) de IgG de rato (Sigma, 15381) durante 1 hora. Os anticorpos fluorescentemente marcados foram adicionados diretamente à reação de bloqueio e incubadas à temperatura ambiente durante 10-20 minutos. As bactérias foram lavadas 3 vezes em tampão de HB e, em seguida, fixadadas em PBS 2% de paraformaldeído, antes da análise FACS. Anticorpos de teste (anti-BWTA: 4497, anti-caWTA: 7578 ou o isotipo de controle: gD) foram conjugados com Alexa-488 utilizando os reagentes reativos de amina (Invitrogen, succinimidil-ésteres de Alexa Fluor 488, NHS-A488). Os anticorpos em fosfato de sódio 50 MM reagiram com um excesso molar de 5-10 vezes de NHS-A488 no escuro durante 2-3 horas à temperatura ambiente. A mistura de marcação foi aplicada a uma coluna de Sepharose GE S200 equilibrada com PBS para remover o excesso de reagentes a partir do anticorpo conjugado. O número de moléculas de A488/anticorpo foi determinado utilizando o método de UV, tal como descrito pelo fabricante.

[0292] Para a análise de bactérias em homogeneizados de tecidos um anticorpo anti-S. aureus não competidor (rF1- Hazenbos, WL, et a/. (2013) Novel staphylococcal glycosyltransferases SdgA and SdgB mediate immunogenicity and protection of virulence-associated cell wall proteins. PLoS Pathog 9, e 1003653 foi conjugado com Alexa-647 para distinguir o S. aureus a partir de partículas de tamanhos semelhantes. Os anticorpos de teste foram analisados a um intervalo de doses de 80 ng/mL a 50 ug/mL. A citometria de fluxo foi realizada utilizando uma FACS ARIA Beckton Dickson (BD Biosciences,

San Jose CA) e a análise foi realizada utilizando o software de análise - FlowJo (Flow Jo LLC, Ashland OR).

[0293] Tempo de mortes causadas por antibióticos livres em bactérias não replicantes: O S. aureus (USA300) foi coletado a partir de uma cultura em fase estacionária durante a noite, lavado uma vez em tampão fosfato (PBS) e suspenso a 1x107 UFC/mL em PBS com ou sem antibiótico com 1x106 M de antibiótico em um volume de 10 ml em tubos de centrífuga de polipropileno de 50 ml. As bactérias foram incubadas a 37 ºC durante a noite com agitação. Em cada ponto de tempo, três amostras de 1 mL foram removidas de cada cultura e centrifugadas para coletar as bactérias. As bactérias foram lavadas uma vez com PBS para remover o antibiótico e o número total de bactérias sobreviventes foi determinado por plaqueamento de diluições seriadas de bactérias em placas de ágar.

[0294] Eliminação de células persistentes (persisters) por antibióticos livres: O S. aureus (USA300) foi retirado de uma cultura em fase estacionária durante a noite, lavado uma vez em Caldo de Soja Tríptico (TSB) e depois ajustado para uma concentração final de 1x107 UFC/mL em um volume total de 10 mL de TSB ou TSB com ciprofloxicina (0,05 mM). As culturas foram incubadas com agitação a 37 ºC durante 6 horas e depois foi adicionado o segundo antibiótico ou a rifampicina (1 pg/mL) ou outro antibiótico do tipo rifamicina (1 ug/mL). Nos tempos indicados, as amostras foram removidas de cada cultura, lavadas uma vez com PBS para remover o antibiótico e resuspensas em PBS. O número total de bactérias sobreviventes foi determinado por plaqueamento de diluições em série das bactérias em placas de ágar. No ponto final do tempo, o restante de cada cultura foi recoletado e plaqueado.

[0295] Para quantificar a quantidade de antibiótico ativo liberado a partir de AACs após tratamento com catepsina B, os AACs foram diluídos para 200 ug/mL em tampão de catepsina (acetato de sódio 20 mM, EDTA 1 mM, L-

cisteíina 5 MM pH 5). A catepsina B (a partir de baço bovino, SIGMA C7800) foi adicionada a 10 ug/mL e as amostras foram incubadas durante 1 hora a 37 ºC. Como controle, as AACs foram incubadas em tampão sozinho. A reação foi interrompida pela adição de 9 volumes de meio de crescimento bacteriano, Caldo de Soja Tríptico pH 7,4 (TSB). Para estimar a libertação total de antibiótico ativo, foram feitas diluições em série da mistura reacional em quadruplicatas em TSB em placas de 96 poços e foi adicionado MRSA (USA300) a cada poço a uma densidade final de 2x103 UFC/mL. As culturas foram incubadas durante a noite a 37 ºC com agitação e o crescimento bacteriano foi medido pela leitura da absorbância a 630 nM utilizando um leitor de placas. SÍNTESE DO CONJUGADO ANTICORPO S4497 FRET PARA O PROCESSAMENTO

FAGOLISOSSOMAL

[0296] Um peptídeo de maleimida FRET foi sintetizado e conjugado com o anticorpo THIOMAB'TY" manipulado com cisteína S4497. O par FRET empregou tetrametilrhodamina (TAMRA) e fluoresceína (Fischer, R., et al (2010) Bioconjug Chem 21, 64-73). O peptídeo maleimida FRET foi sintetizado por química de fase sólida de Fmoc padrão utilizando um sintetizador de peptídeo PS3 (Protein Technologies, Inc). Resumidamente, utilizou-se 0,1 mmol de resina de amida Rink para gerar carboxamida C- terminal. Utilizou-se Fmoc-Lis(Mtt)- OH nos resíduos N- e C-terminais para remover o grupo Mtt (monometoxitritila) na resina e realizar química na cadeia lateral adicional para ligar TAMRA e fluoresceína. A unidade peptidomimética CBDK-cit foi adicionada entre o par FRET como um espaçador clivável por catepsina. O peptídeo maleimida FRET bruto ou maleimidocaproil-K (TAMRA) -G -CBDK-cit -K (Fluoresceína) clivado a partir da resina foi submetido a purificação adicional por HPLC de fase reversa com uma coluna Jupiter C4 5 um (5 um, 10 mm x 250 mm, Phenomenex). À nossa sonda FRET permite monitorar não só o tráfico intracelular do conjugado de anticorpo, como também o processamento do ligante no fagolisossomo. O conjugado de anticorpo intacto emite fluorescência apenas em vermelho devido à transferência de energia de ressonância de fluorescência a partir do doador. No entanto, após a clivagem do substrato do peptídeo FRET no fagolisossomo, espera-se que a fluorescência verde do doador apareça.

VÍDEO MICROSCOPIA PARA DETECTAR CLIVAGEM DO LIGANTE DENTRO DE MACRÓFAGOS

[0297] Os macrófagos peritoneais murinos foram plaqueados em lâminas de câmara (lbidi, Verona, WI, catálogo 80826) em meio completo conforme descrito para o ensaio de morte intracelular em macrófago. USA300 foi marcado com Cell Tracker Violet (Invitrogen C10094) a 100 pug/mL em PBS, 0,1% BSA por incubação durante 30 minutos a 37 ºC. As bactérias marcadas foram opsonizadas com a sonda 4497-FRET por incubação durante 1 hora em tampão HB. Os macrófagos foram lavados uma vez imediatamente antes da adição das bactérias opsonizadas, e as bactérias foram adicionadas às células a 1 x 107 Bactérias/mL. Para os controles sem fagocitose, os macrófagos foram pré-tratados com 60 nM de Latrunculina A (Calbiochem) durante 30 minutos antes e durante a fagocitose. As lâminas foram colocadas no microscópio imediatamente após a adição das bactérias às células e as gravações foram adquiridas com um microscópio confocal Leica SP5 equipado com uma câmara ambiental com CO, e controladores de temperatura Ludin. As imagens foram capturadas a cada minuto por um tempo total de 30 minutos usando um plano APO CS 40X, N...A: 1.25, lentes para óleo de imersão, e as linhas de laser 488hnm e 543nm para excitar respectivamente o alexa-488 e TAMRA. As imagens de fase foram também gravadas usando laser a 543 nm.

QUANTIFICAÇÃO DO ANTIBIÓTICO LIBERADO NO INTERIOR DE MACRÓFAGOS POR ESPECTROMETRIA DE MASSA

[0298] Os macrófagos peritoneais murinos foram infectados em placas de cultura de tecidos de 24 poços conforme descrito abaixo para o ensaio de morte intracelular com MRSA opsonizado com AAC a 100 ug/mL em HB. Após a fagocitose estar completa, as células foram lavadas e foram adicionados 250 uL de meio completo + gentamicina aos poços e as células foram incubadas durante 1 hora ou 3 horas. Em cada ponto de tempo o sobrenadante e as frações celulares foram coletados e acetonitria (ACN) foi adicionada a uma concentração final de 75% e, em seguida, foram incubadas durante 30 minutos. Os extratos celulares e sobrenadantes foram liofilizados por evaporação sob N2 (TurboVap) e reconstituídos em 100 yuL de ACN 50%, filtrados e analisados no sistema Ab Sciex QTRAP 6500 LC/MS/MS.

ENSAIO DE MORTE INTRACELULAR IN VITRO

[0299] Tipos de células não fogocíticas: As linhagens de células MG63 (CRL-1427) e A5S49 (CCL185) foram obtidas da ATCC e mantidas em meio de cultura de tecidos RPMI 1640 suplementado com Hepes 10 mM e Soro Bovino Fetal a 10% (RPMI-10). As células HUVEC foram obtidas da Lonza e mantidas em meio completo de célula endotelial EGM (Lonza, Walkersville, MD). As células HBMEC (Catálogo ft 1000) e meios ECM (catálogo *%* 1001) foram obtidas da SciencCell Research Labs (Carlsbad, CA).

[0300] Macrófagos murinos: Os macrófagos peritoneais foram isolados a partir do peritônio de camundongos Balb/c com 6 a 8 semanas de idade (Charles River Laboratories, Hollister, CA). Para aumentar o rendimento de macrófagos, os camundongos foram pré-tratados por injeção intraperitoneal de 1 mL de meio de tioglicolato (Becton Dickinson). O meio de tioglicolato foi preparado a uma concentração de 4% em água, esterilizado por autoclavagem e envelhecido durante 20 dias a 6 meses antes da utilização. Os macrófagos peritoneais foram coletados 4 dias após o tratamento com tioglicolato lavando a cavidade peritoneal com solução salina tamponada com fosfato fria. Os macrófagos foram plaqueados em meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal e 10 mM de HEPES, sem antibióticos, a uma densidade de 4x 10º células/poço em placas de cultura de 24 poços. Os macrófagos foram cultivados durante a noite para permitir a aderência à placa.

[0301] Macrófagos humanos M2: Os monócitos CD14* foram purificados a partir de sangue humano normal utilizando o kit de isolamento de monócitos Monocyte Isolation Kit Il (Miltenyi, Cat 130-091-153) e plaqueados a 1,5x105 células/cm? em placas de cultura de tecidos previamente revestidas com soro bovino fetal (SBF) e cultivadas em meio RPMI 1640 com 20% de SBF + 100 ng/mL de rhM-CSF. O meio foi trocado no dia 1 e no dia 7, o meio foi alterado para 5% de soro + 20 ng/mL de IL-4. Os macrófagos foram utilizados 18 horas mais tarde.

[0302] Protocolo de ensaio: Em todos os experimentos as bactérias foram cultivadas em Caldo de Soja Tríptico. Para avaliar a morte intracelular com os Conjugados Anticorpo - Antibiótico (AACs), a USA300 foi retirada de uma cultura em crescimento exponencial e lavada em HB (Solução Salina Balanceada de Hanks suplementado com HEPES 10 mM e albumina de soro bovino a 0,1%). Os AACs ou anticorpos foram diluídos em HB e incubados com as bactérias durante 1 hora para permitir a ligação do anticorpo às bactérias (opsonização) e as bactérias opsonizadas foram utilizadas para infectar macrófagos em uma proporção de 10:20 bactérias por macrófago (4x10º bactérias em 250 ul de HB por poço). Os macrófagos foram previamente lavados com meio DMEM sem soro imediatamente antes da infecção e infectados por incubação a 37 ºC em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada com 5% de CO, para permitir a fagocitose das bactérias. Após 2 horas, a mistura de infecção foi removida e substituída por meio de crescimento normal (DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal, 10 MM de HEPES) e gentamicina foi adicionada a 50 ug/ml para evitar o crescimento de bactérias extracelulares. No final do período de incubação, os macrófagos foram lavados com meio isento de soro e as células foram lisadas em HB suplementado com 0,1% de triton-X (promove a lise os macrófagos sem danificar as bactérias intracelulares). Diluições em série do lisado foram feitas em solução salina tamponada com fosfato suplementada com Tween-20 a 0,05% (para interromper agregados de bactérias) e o número total de bactérias intracelulares sobreviventes foi determinado pelo plaqueamento em Ágar Tríptico de Soja com 5% de sangue de ovelha desfibrinado.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 MRSA INTRACELULARES SÃO PROTEGIDOS CONTRA Os ANTIBIÓTICOS

CONVENCIONAIS

[0303] Para confirmar a hipótese de que as células de mamíferos fornecem um nicho protetor para o S. aureus na presença de terapia com antibióticos, comparou-se a eficácia de três antibióticos principais que são atualmente utilizados como padrão de cuidado (SOC) para infecções invasivas por MRSA (vancomicina, daptomicina e Linezolida) contra bactérias planctônicas extracelulares versus bactérias sequestradas dentro de macrófagos murinos (Tabela 4).

[0304] Para bactérias extracelulares, o MRSA foi cultivado durante a noite em caldo de soja tríptico e determinou-se que a MIC era a dose mínima de antibiótico que impedia o crescimento. Para as bactérias intracelulares, macrófagos peritoneais murinos foram infectados com MRSA e cultivados na presença de gentamicina para matar bactérias extracelulares. Os antibióticos de teste foram adicionados ao meio de cultura um dia após a infecção, e o número total de bactérias intracelulares sobreviventes foi determinado 24 horas mais tarde. As concentrações séricas esperadas para antibióticos clinicamente relevantes foram relatadas em Antimicrobial Agents, Andre Bryskier. ASM Press, Washington DC (2005).

TABELA 4 CONCENTRAÇÕES INIBITÓRIAS MÍNIMAS (MIC) PARA VÁRIOS ANTIBIÓTICOS EM BACTÉRIAS EXTRACELULARES CULTIVADAS EM CULTURA LÍQUIDA VS. BACTÉRIAS

INTRACELULARES SEQUESTRADAS DENTRO DE MACRÓFAGOS MURINOS extracelular intracelular | (vo/mL) g/mL g/mL [Daptomíema — [4 st To

[0305]Esta análise com um MRSA cepa USA300 altamente virulenta adquirido na comunidade revelou que embora o MRSA extracelular seja altamente susceptível à inibição do crescimento por baixas concentrações de vancomicina, daptomicina e linezolida em cultura líquida, todos os três antibióticos não mataram a mesma cepa de MRSA sequestrada dentro de macrófagos expostos a concentrações clinicamente realizáveis dos antibióticos. Mesmo a rifampicina, a qual acreditava-se que era relativamente eficaz na eliminação de agentes patogênicos intracelulares (Vandenbroek, P.V. (1989) Antimicrobial Drugs, Microorganisms, and Phagocytes. Reviews of Infectious Diseases 11 ,213-245), exigiu uma dose 6 000 vezes superior para eliminar o MRSA intracelular em comparação com a dose necessária para inibir o crescimento (MIC) de bactérias planctônicas (Tabela 1), consistente com outros estudos que mostram que a maioria dos antibióticos existentes são ineficientes na destruição de S. aureus intracelular tanto em in vitro como in vivo (Sandberg, A., Hessler, J.H., Skov, R.L., Blom, J. & Frimodt-Moller, N. (2009) “Intracellular activity of antibiotics against Staphylococcus aureus in a mouse peritonitis model” Antimicrob Agents Chemother 53, 1874-1883).

EXEMPLO 2

DISSEMINAÇÃO DA INFECÇÃO COM MRSA INTRACELULAR

[0306] Estes experimentos compararam a virulência de bactérias intracelulares versus uma dose equivalente de bactérias planctônicas livres e determinaram se as bactérias intracelulares são capazes de estabelecer infecção na presença de vancomicina in vivo. Quatro coortes de camundongos foram infectadas por injeção intravenosa com doses aproximadamente equivalentes de bactérias livres viáveis de S. aureu (2,9 x 106) coletadas diretamente a partir de cultura de caldo ou de bactérias intracelulares (1,8 x 10º) sequestradas dentro de macrófagos hospedeiros e neutrófilos que foram gerados por infecção peritoneal de camundongos doadores (Figura 1A) e grupos selecionados foram tratados com vancomicina imediatamente após a infecção e depois uma vez por dia. Os camundongos foram examinados 4 dias após a infecção para colonização bacteriana no rim, um órgão que é consistentemente colonizado por S. aureus em camundongos. Em três experimentos independentes, observou-se carga bacteriana equivalente ou superior nos rins de camundongos infectados com bactérias intracelulares em comparação com os infectados com uma dose equivalente de bactérias planctônicas (Figura 1B). Surpreendentemente, verificou-se que a infecção com bactérias intracelulares resultou em uma colonização mais consistente do cérebro, um órgão que não é eficientemente colonizado após a infecção com bactérias planctônicas neste modelo (Figura 1C). Além disso, as bactérias intracelulares, mas não as bactérias planctônicas, foram capazes de estabelecer infecção em face da terapia com vancomicina neste modelo (Fig. 1B, Fig. 1C).

[0307] Outras análises in vitro abordaram de forma mais quantitativa até que ponto a sobrevivência intracelular facilita a evasão de antibióticos. Para isso, os osteoblastos MG63 foram infectados com MRSA planctônico ou com MRSA intracelular, na presença de vancomicina.

[0308] Infecção de osteoblastos ou HBMEC. A linhagem de células MG63 foi obtida a partir da ATCC (CRL-1427) e mantida em meio de cultura de tecidos RPM! 1640 suplementado com Hepes 10 mM e Soro Bovino Fetal a 10% (RPMI-10). As células HBMEC (Catálogo t 1000) e meios ECM (catálogo * 1001) foram obtidas da SciencCell Research Labs (Carlsbad, CA). As células foram plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 24 poços e cultivados para se obter uma camada confluente. No dia do experimento, as células foram lavadas uma vez em RPMI (sem suplementos). O MRSA ou células peritoneais infectadas foram diluídos em RPMI-10 completo e foram adicionados 5 ug/mL de vancomicina imediatamente antes da infecção. As células peritoneais foram adicionadas aos osteoblastos a 1x106 células peritoneais/mL. Uma amostra das células foi lisada com 0,1% de triton-x para determinar a concentração real de bactérias intracelulares vivas no momento da infecção. O título real para todas as infecções foi determinado pelo plaqueamento de diluições em série das bactérias em Ágar Tríptico de Soja com 5% de sangue de ovelha desfibrinado.

[0309] O MRSA (bactérias livres) foi semeado em meio, meio + vancomicina ou meio + vancomicina e plaqueado em uma monocamada de osteoblastos MG63 (Fig. 1E) ou Células Endoteliais Microvasculares de Cérebro Humano (HBMEC, Fig. 1F). As placas foram centrifugadas para promover o contato das bactérias com a monocamada. Em cada ponto de tempo, o sobrenadante de cultura foi coletado para recuperar bactérias extracelulares ou as células aderentes foram lisadas para libertar bactérias intracelulares.

[0310] As bactérias planctônicas expostas à vancomicina isoladamente foram eficazmente mortas. As bactérias sobreviventes não foram recuperadas após um dia em cultura (Fig. 1D). Quando um número semelhante de bactérias planctônicas foram plaqueadas em osteoblastos MG63, um pequeno número de bactérias sobreviventes (aproximadamente 0,06% de entrada) associado às células MG63 um dia após a infecção, que tinha sido protegido da vancomicina pela invasão dos osteoblastos, foi recuperado.

[0311]Os MRSAs que foram sequestrados dentro de células peritoneais exibiram um aumento dramático na sobrevivência e eficiência da infecção na presença de vancomicina. Cerca de 15% de MRSA intracelular nos leucócitos sobreviveram em condições idênticas em que a vancomicina havia esterilizado as culturas de bactérias planctônicas. As bactérias intracelulares também foram mais capazes de infectar a monocamada de osteoblastos MG63 na presença de vancomicina, resultando em uma duplicação das bactérias recuperadas um dia após a exposição à vancomicina (Figura 1D). Além disso, o S. aureus intracelular foi capaz de aumentar quase 10 vezes ao longo de um período de 24 horas em células MG63 (Figura 1E), células endoteliais primárias de cérebro humano (Fig. 1F) e células epiteliais brônquicas A5S49 (não mostradas) sob exposição constante a uma concentração de vancomicina que matou bactérias vivas livres. Embora protegido contra a morte pelos antibióticos, o crescimento bacteriano não ocorreu em culturas de macrófagos peritoneais infectados e neutrófilos (não ilustrados). Juntos, esses dados sustentam que os reservatórios intracelulares de MRSA em células mieloides podem promover a disseminação da infecção em novos locais, mesmo na presença de tratamento antibiótico ativo, e o crescimento intracelular pode ocorrer em células endoteliais e epiteliais, mesmo sob condições de terapia antibiótica constante.

[0312]Para desenvolver um reagente que mata especificamente o S. aureus intracelular, o anticorpo e os componentes antibióticos foram cuidadosamente escolhidos e otimizados para a máxima eficácia. Os exemplos abaixo mostram experimentos e resultados que levam à escolha dos anticorpos anti-ácido teicoico de parede beta (antiWTAB) e a determinados antibióticos do tipo rifamicina a serem conjugados para formar um AAC.

EXEMPLO 3 SELEÇÃO DE ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-S. AUREUS

[0313] A quantidade de antibiótico administrado por uma AAC e, portanto, a sua eficácia final, é limitada pelo número de locais de ligação de anticorpo na superfície da bactéria. Assim, era essencial selecionar um anticorpo que se ligasse a um antígeno altamente abundante que fosse estavelmente expresso em MRSA durante todas as fases de uma infecção in vivo. Como uma etapa inicial, um painel de mais de 40 anti-S. aureus foi clonado e purificado a partir de células B derivadas de sangue periférico de pacientes que se recuperaram de várias infecções por S. aureus e pesquisados quanto à ligação à MRSAs isolados diretamente a partir dos rins de camundongos infectados.

GERAÇÃO, RASTREIO E SELEÇÃO DE ANTICORPOS

[0314] Abreviações: MRSA (S. aureus resistente à meticilina); MSSA (S. aureus sensível à meticilina); VISA (S. aureus resistente à intermediários de vancomicina); LTA (ácido lipoteicóico); TSB (caldo de soja tríptico); CWP (preparação de parede celular).

[0315] Os anticorpos IgG humanos foram clonados a partir de células B periféricas de pacientes após infecção por S. aureus utilizando a tecnologia Symplex"V (Symphogen, Lyngby, Dinamarca) que conserva o pareamento cognato de cadeias pesadas e leves de anticorpos, tal como descrito na US 8.283.294: “Method for cloning cognate antibodies”; Meijer PJ et al. Journal of Molecular Biology 358:764-772 (2006); e Lantto J et al. J Virol. 85(4):1820-33 (fevereiro de 2011); utilizaram-se células plasmáticas e de memória como fonte genética para os repertórios de IgGs completos recombinantes. Os clones de anticorpo individuais foram expressos por transfecção de células de mamífero conforme descrito em Meijer P.J., et al. Methods in Molecular Biology 525:261-277, xiv. (2009). Os sobrenadantes contendo anticorpos IgG1 de comprimento completo foram coletados após sete dias e utilizados para pesquisar a ligação ao antígeno por ELISA indireto na triagem primária. Foi gerada uma biblioteca de mAbs mostrando ligação ELISA positiva para preparações de parede celular a partir de cepas USA300 ou Wooda46 de S. aureus. Os anticorpos foram subsequentemente produzidos em transfecções transitórias de 200 ml e purificados com cromatografia de Proteína A (MabSelet SuRe, GE Life Sciences, Piscataway, NJ) para testes adicionais. Para a produção de anticorpos em maior escala os anticorpos foram produzidos em células CHO. Vetores que codificam VH e VL foram transfectados em células CHO e as IgGs purificadas a partir de meios de cultura celular por cromatografia de afinidade com proteína A.

TABELAS

LISTA DE ANTÍGENOS UTILIZADOS PARA ISOLAR OS ABS Vendedor/Fonte Ácido Teicóico de Parede (WTA) de Staph A. Cat.No. R84500 (2 mg/vial), lot | Meridian Life WTA | no. 5E14909. Sciences 2 pg/ml! Peptidoglicano a partir de Staphylococcus aureus; Cat no. 77140, PGN |lotno. 1396845 Sigma 2 ug/ml CW CW USA300, RPMI, depletor de ferro. | Genentech, H1 Fase estacionária 100x CW Genentech, H3 CW USA300, TSB. Fase estacionária 500X CW Genentech, H4 CW Wood46, TSB. Fase estacionária 500X CWH1 e CWHA3 foram sempre misturados juntos para fazer o revestimento ELISA:

[0316] A Figura 6 resume o rastreio primário dos anticorpos pelo ensaio ELISA. Todos (exceto o 4569) foram isolados quando rastreados com a mistura de preparação de parede celular USA300 (ferro depletado: TSB em uma proporção de 96:4). Todos mAb GICNAc beta (exceto 6259), SDR e PGN (4479) também foram positivos para PGN e WTA na triagem primária. Todos os GICNAc alfa foram encontrados exclusivamente pelo rastreio para a ligação com a mistura CW USA300. O 4569 (específico para LTA) foi encontrado pelo rastreio em Wood46 CWP.

[0317] O nível mais elevado de ligação de anticorpos foi encontrado com uma IgG1 humana que reconhece modificações de açúcar de GIcNAc O- ligadas no WTA (Tabela 6). Foi conseguida uma menor ligação com anticorpos monoclonais que reconhecem GIcNAc O-ligada; um anticorpo de controle isotípico contra a proteína gD do citomegalovírus (CMV) apresentou alguma reatividade mínima devido à proteína A expressa em S. aureus derivado in vivo (Figura 7A). A especificidade antigênica dos anticorpos foi determinada por meios genéticos, de modo que os anticorpos contra as modificações de açúcares a- ou B-GIcNAcs no WTA fracassaram em se ligar às cepas de S. aureus sem suas respectivas glicosiltransferases (como exemplificado na Figura 7B). Consistente com a extensão da ligação do anticorpo ao MRSA derivado in vivo, os AACs preparados com anticorpos anti-B-GIcNAc WTA apresentaram uma eficácia superior em comparação com os anticorpos anti-a-GIcNAc WTA.

SELEÇÃO DE MAB ANTI-WTA A PARTIR DA BIBLIOTECA UTILIZANDO CITOMETRIA DE FLUXO EX VIVO

[0318] Cada mAb dentro desta biblioteca foi questionado em relação a três critérios de seleção: (1) a intensidade relativa da ligação do mAb à superfície do MRSA, como uma indicação de alta expressão do antígeno cognato correspondente que favoreceria um fornecimento elevado de antibióticos; (2) a consistência da ligação do mAb ao MRSA isolado a partir de uma variedade diversa de tecidos infectados, como uma indicação da expressão estável do antígeno cognato na superfície do MRSA in vivo durante infecções; e (3) a capacidade de ligação do mAb a um painel de cepas clínicas de S. aureus, como uma indicação da conservação da expressão do antígeno de superfície cognato. Para este fim, a citometria de fluxo foi usada para testar todos estes sobrenadantes de cultura pré-selecionados de mAbs em uma biblioteca em relação à reatividade com S. aureus a partir de uma variedade de tecidos infectados e a partir de diferentes cepas de S. aureus.

[0319] Todos os mAbs na biblioteca foram analisados quanto à capacidade para se ligar ao MRSA de rins, baços, fígados e pulmões de camundongos infectados que foram infectados com MRSA USA300; e dentro do coração ou rins de coelhos que foram infectadas com USA300 COL, em um modelo de endocardite do coelho. A capacidade de um anticorpo para reconhecero S. aureus a partir de uma variedade de tecidos infectados aumenta a probabilidade do anticorpo terapêutico ser ativo em uma ampla variedade de infecções clínicas diferentes com o S. aureus. As bactérias foram analisadas imediatamente após coleta de órgãos, ou seja, sem subcultura, para impedir alterações fenotípicas causadas por condições in vitro. Diversos antígenos da superfície de S. aureus enquanto está sendo expresso durante a cultura in vitro perdem de expressão em tecidos infectados. Anticorpos direcionados contra tais antígenos teriam improvável utilidade para o tratamento de infecções. Durante a análise desta biblioteca de mAbs em uma variedade de tecidos infectadas, esta observação foi confirmada para um número significativo de anticorpos, que mostraram ligação significativa à bactéria S. aureus a partir da cultura, mas a ausência de ligação às bactérias a partir de todos os tecidos testados infectados. Alguns anticorpos ligaram às bactérias a partir de alguns, mas não todos os, tecidos testados infectados. Consequentemente, foram selecionados anticorpos que foram capazes de reconhecer bactérias a partir de todas as condições de infecção testadas. Os parâmetros que foram avaliados foram (1) intensidade de fluorescência relativa, como uma medida para a abundância de antígeno; (2) número de órgãos que coraram positivamente, como uma medida para a estabilidade da expressão do antígeno; e (3) capacidade de ligação do mAb a um painel de cepas clínicas de S. aureus como uma indicação da conservação da expressão do antígeno de superfície cognato. A intensidade de fluorescência dos anticorpos de teste foi determinada em relação a um anticorpo de controle de isotipo que era direcionado contra um antígeno não relevante, por exemplo, mAb IgG1 anti-herpes vírus gD: 5237 (referenciado abaixo). Os mAbs contra o WTA-beta não apenas mostraram a maior abundância de antígenos, como também mostraram ligação muito consistente ao MRSA de todos os tecidos infectados testados e especificados acima.

[0320] Adicionalmente, avaliou-se a capacidade destes mAb em se ligar às seguintes cepas de S. aureus e que foram cultivadas in vitro em TSB: USA300 (MRSA), USA400 (MRSA), COL (MRSA), MRSAZ252 (MRSA), Wood46 (MSSA), Rosenbach (MSSA), Newman (MSSA), e Mu50 (VISA). Verificou-se que os mAbs anti-WTA beta mas não os mAbs anti-WTA alfa eram reativos com todas estas cepas. A análise da ligação a diferentes cepas indicou que o WTA beta é mais conservado do que o WTA alfa e, portanto, mais adequado para o AAC.

EXEMPLO 4

CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS COM ESPECIFICIDADE CONTRA ÁCIDO TEICOICO DE PAREDE CONFIRMANDO A ESPECIFICIDADE DOS ABS AO WTA

[0321] As preparações de parede celular (CWP) de uma cepa de S. aureus tipo selvagem (WT) e uma cepa mutante de S. aureus sem WTA (ATagO, cepa WTA-nula) foram geradas incubando 40 mg de cepas de S. aureus sedimentadas com 1 mL de Tris-HCI 10 mM (pH 7,4) suplementado com rafinose a 30%, 100 pg/ml de lisostafina (Cell Sciences, Canton, MA) e coquetel de inibidor de protease sem EDTA (Roche, Pleasanton, CA) durante 30 min a37 ºC. Os lisados foram centrifugados a 11.600 x g durante 5 min, e os sobrenadantes contendo componentes da parede celular foram coletados. Para a análise de imunotransferência (immunoblot), as proteínas foram separadas em um gel de Tris-glicina a 4-12%, e transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Invitrogen, Carlsbad, CA), seguido pela transferência com os anticorpos teste indicados contra WTA ou com anticorpos de controle contra PGN e LTA.

[0322] O immunoblotting mostra que os anticorpos contra WTA se ligam a preparações de parede celular WT a partir da WT de S. aureus, mas não a preparações de parede celular a partir da cepa ATagO sem WTA. Os anticorpos de controle contra peptidoglicano (anti-PGN) e ácido lipoteicóico (anti- LTA) se ligam bem a ambas as preparações de parede celular. Estes dados indicam a especificidade dos anticorpos teste contra o WTA. 1) CITOMETRIA DE FLUXO PARA DETERMINAR A EXTENSÃO DA LIGAÇÃO DO MAB À

SUPERFÍCIE DO MRSA

[0323] A expressão do antígeno de superfície em bactérias inteiras a partir de tecidos infectados foi analisada por citometria de fluxo utilizando o seguinte protocolo. Para a marcação de bactérias a partir de tecidos de camundongo infectados, camundongos C57BI/6 fêmeas com 6 a 8 semanas de idade (Charles River, Wilmington, MA) receberam 10º UFC de USA300 cultivado em fase log em PBS. Os órgãos dos camundongos foram coletados dois dias após a infecção. A endocardite infecciosa em coelho (IE) foi estabelecida como previamente descrito em Tattevin P. et al. Antimicrobial agents and chemotherapy 54: 6610-613 (2010) Os coelhos foram injetados intravenosamente com 5x107 UFC da cepa COL de MRSA cultivado em fase estacionária, e as vegetações cardíacas foram coletadas dezoito horas mais tarde. O tratamento com 30 mg/kg de vancomicina foi administrado por via intravenosa 18 h após a infecção com 7x107 UFC em fase estacionária.

[0324] Para lisar as células de camundongos e coelhos os tecidos foram homogeneizados em tubos M (Miltenyi, Aubum, CA) utilizando um dissociador de células gentleMACS (Miltenyi), seguido de incubação durante 10 minutos à TA em PBS contendo 0,1% de Triton-X100 (Thermo) 10 ug/uml. DNAsel (Roche) e de coquetel inibidor de protease Completo Mini (Roche). As suspensões foram passadas através de um filtro de 40 mícrons (BD) e lavadas com HBSS sem vermelho fenol suplementado com BSA a 0,1% livre de IgG (Sigma) e Hepes 10 mM, pH 7,4 (tampão HB). As suspensões bacterianas foram incubadas com 300 ug/mL de IgG de coelho

(Sigma) em tampão HB durante 1 h à temperatura ambiente (TA) para bloquear a ligação IgG não específica. As bactérias foram coradas com 2 ug/mL de anticorpos primários, incluindo rF1 ou anti-herpesvírus IgG1 de controle de isotipo gD: 5237 (Nakamura GR et al., J Virol 67: 6179-6191 (1993)), e em seguida com anticorpos secundários anti-lgG humana fluorescentes (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA). De modo a permitir a diferenciação de bactérias a partir de detritos de órgãos de camundongo ou de coelho, realizou-se uma dupla coloração usando 20 ug/mL de mAb 702 de camundongo anti-peptídeoglicano de S. aureus (Abcam, Cambridge, MA) e um anticorpo secundário anti-lgG de camundongo marcado com fluorocromo (Jackson Immunoresearch). As bactérias foram lavadas e analisadas por FACSCAalibur (BD). Durante a análise de citometria de fluxo, as bactérias foram classificadas nas janelas de análise (gated) para a coloração positiva com mAb 702 a partir de gráficos de fluorescência dupla. 1) MEDIÇÃO DA AFINIDADE DE LIGAÇÃO AO S. AUREUS E A DENSIDADE DE

ANTÍGENO EM MRSA

[0325]A Tabela 6 mostra a análise de ligação de equilíbrio de anticorpos MRSA ligando-se à cepa Newman-ASPA e a densidade de antígeno na bactéria. TABELA 6 Anticorpo MRSA — JEspecíficidade —|Kpmeéa,nM (n=2) Densidade de Antígeno. avesites/Bactéria as DaWTA 50,000 4462 b-WTA 31 43.000 6263 bWTA 22.000 6297 b-WTA 11 21.000 7578 a-WTA 0.4 16.000 SDR-glico 1600

[0326] A Kp e a densidade de antígeno foram derivadas utilizando um ensaio de ligação de células radioligante sob as seguintes condições de ensaio: DMEM + tampão de ligação a soro de camundongo 2,5%; ligação durante 2 horas à temperatura ambiente (RT); e usando 400.000 bactérias/poço.

[0327] O Ab 6263 é semelhante ao 6078 pelo fato das sequências serem muito semelhantes. Exceto para o segundo resíduo (R contra G) na CDR H3, todas as outras sequências CDRs da cadeia L e H são idênticas.

EXEMPLO 5 MODIFICAÇÕES DE AMINOÁCIDOS DE ANTICORPOS ANTI-WTA

[0328] Em resumo, a região VH de cada um dos Abs anti-WTA beta foi clonada e ligada à região constante de gama1 H humana e VL ligada à região constante kappa para expressar os Abs como IgG1. As sequências tipo selvagem foram alteradas em certas posições para melhorar a estabilidade do anticorpo enquanto mantém a ligação ao antígeno como descrito abaixo. Os Abs modificados com cisteína (ThioMabs, também referidos como THIOMABTY ) foram então gerados.

1. LIGAÇÃO DAS REGIÕES VARIÁVEIS ÀS REGIÕES CONSTANTES

[0329] As regiões VH dos Abs WTA beta identificadas a partir da biblioteca de anticorpo humano acima foram ligadas a regiões constantes y1 humana para produzir Abs IgG1 completos. As cadeias L eram cadeias L kappa.

11. GERAÇÃO DE VARIANTES DE ESTABILIDADE

[0330]Os Abs WTA na Figura 12 (veja em particular as Figuras 13A, 13B, 14A, 14B) foram manipulados para melhorar certas propriedades (para evitar a desamidação, isomerização com ácido aspártico, oxidação ou glicosilação N-ligada) e testados quanto à retenção da ligação ao antígeno, bem como estabilidade química após substituições de aminoácidos. O DNA de fita simples de clones que codificam as cadeias pesada ou leve foi purificado a partir de partículas de fago M13KO7 cultivadas em células CJ236 de E. coli utilizando o kit QlAprep Spin M13 (Qiagen). Oligonucleotídeos sintéticos fosforilados 5' com as sequências: 5-

CCCAGACTGCACCAGCTGGATCTCTGAATGTACTCCAGTTGC- 3' (SEQ ID NO: 152) 5- CCAGACTGCACCAGCTGCACCTCTGAATGTACTCCAGTTGC- 3' (SEQ ID NO: 153) S"'CCAGGGTTCCCTGGCCCCAWTMGTCAAGTCCASCWKCACC TCTTGCACAGTAATAGACAGC- 3' (SEQ ID NO: 154); e 5-

CCTGGCCCCAGTCGTCAAGTCCTCCTTCACCTCTTGCACAGTAATAGACAG C- 3' (SEQ ID NO: 155) (códigos IUPAC) foram utilizados para mutar os clones que codificam os anticorpos por mutagênese sítio-dirigida a oligonucleotídeos, tal como descrito pela mutagênese sítio-específica seguindo a metodologia descrita em Kunkel, T.A. (1985). Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 82(2): 488—

492. O DNA mutagenizado foi utilizado para transformar células E. coli XL1-Blue (Agilent Technologies) que foram plaqueadas em placas de caldo Luria contendo 50 ug/mlL de Carbenicilina. As colônias foram individualmente coletadas e cultivadas em meio Luria líquido contendo 50 pg/ml de Carbenicilina. O DNA Miniprep foi sequenciado para confirmar a presença das mutações.

[0331] Para o Ab 6078, o segundo aminoácido na VH, met (met-2), é propenso a oxidação. Por esse motivo, a met-2 foi mutada para Ile ou Val, para evitar a oxidação do resíduo. Uma vez que a alteração de met-2 pode afetar a afinidade de ligação, os mutantes foram testados quanto à ligação ao Staph CWP por ELISA.

[0332] Os motivos da CDR H3 “DG” ou “DD” revelaram-se propensos a serem transformados em ácido isoaspártico. O Ab 4497 contém DG nas posições 96 e 97 da CDR H3 (vide a Figura 16) e foi alterado por questões de estabilidade. A CDR H3 é geralmente crítica para a ligação ao antígeno, de modo que vários mutantes foram testados quanto à ligação ao antígeno e à estabilidade química. O mutante D96E (v8) retém a ligação ao antígeno de maneira semelhante ao Ab 4497 tipo selvagem (Figura 16), e é estável e não forma ácido isoaspártico.

ELISA PARA STAPH CWP

[0333] Para a análise de mutantes do anticorpo 6078, uma preparação de célula de S. aureus USA300 ASPA tratada com lisostatina (WT) consistindo de 1 x 10º bactérias/mL foi diluída 1/100 em carbonato de sódio 0,05 pH 9,6 e revestida em placas de ELISA de 384 poços (Nunc Neptune, NJ) durante uma incubação durante a noite a 4 ºC. As placas foram lavadas com PBS mais 0,05% de Tween-20 e bloqueadas por uma incubação durante 2 horas com PBS mais 0,5% de albumina bovina (BSA). Esta e todas as incubações subsequentes foram realizadas em temperatura ambiente com suave agitação. Amostras de anticorpo foram diluídas em tampão de diluição de amostra/padrão (PBS, 0,5% de BSA, 15 ppm de Proclin, 0,05% de Tween-20, 0,25% de CHAPS, mM de EDTA , 0,35 M de NaCl, (pH 7,4)), adicionadas às placas e incubadas durante 1,5-2 horas. Anticorpos anti-S. aureus ligados à placa foram detectados durante uma incubação de 1 hora com um fragmento F(ab')2 de cabra anti-lgG humana conjugado com peroxidase (Jackson ImmunoResearch , West Grove, PA) diluído a 40 ng/ml em tampão de ensaio PBS, BSA a 0,5%, Proclin a 15 ppm, Tween 20 a 0,05%). Após uma lavagem final, tetrametilbenzidina (KPL, Gaithersburg, MD) foi adicionada, a cor foi desenvolvida durante 5-10 minutos, e a reação foi interrompida com ácido fosfórico 1 M. As placas foram lidas a 450 nm com uma referência de 620 nm usando um leitor de microplacas.

Ill. GERANDO MUTANTES MODIFCADOS COM CIS (THIOMABS)

[0334] Os ThioMabs completos foram produzidos introduzindo uma Cisteína na cadeia H (em CH1) ou na cadeia L (Ck) em uma posição predeterminada coforme ensinado previamente e descrito abaixo para permitir a conjugação do anticorpo a um intermediário ligante-antibiótico (os aminoácidos cisteína podem ser modificados por engenharia genética em sítios reativos na cadeia pesada (HC) ou cadeia leve (LC) de um anticorpo e que não formam ligações de bissulfeto intracadeias ou intermoleculares (Junutula, et a/., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7.521.541; US 7.723.485; WO 2011/156328; WO2009/052249, Shen et al (2012) Nature Biotech., 30(2):184-191; Junutula et al (2008) Jour of Immun. Methods 332:41-52). As cadeias H e L são então clonadas em plasmídeos separados e os plasmídeos codificantes de H e L são cotransfectados em células 293 onde são expressos e montados em Abs intactos. As cadeias H e L também podem ser clonadas no mesmo plasmídeo de expressão. IgG1 possuindo 2 Cis modificadas, uma em cada uma das cadeias H; ou 2 Cis modificadas, um em cada uma das cadeias L; ou uma combinação de uma Cis modifcada em cada uma das cadeias H e L (HCLCCys) levando a 4 Cis modificadas por tetrâmero de anticorpo, foram geradas pela expressão da combinação desejada de cadeias mutantes cis e cadeias tipo selvagem.

[0335]As Figuras 13A e 13B mostram o 6078 WT e os Abs mutantes com a combinação HC Cis e LC Cis. Os mutantes 6078 também foram testados quanto à capacidade de se ligar ao USA300 Staph A deficiente de proteína A a partir de uma cultura cultivada de um dia para o outro. A partir dos resultados da análise FACS (dados não mostrados), os Abs mutantes se ligaram a USA300 de forma semelhante ao anticorpo 6078 WT (não modificado); as alterações de aminoácidos nos mutantes não prejudicaram a ligação ao Staph A. gD foi utilizado como um anticorpo de controle negativo não específico.

EXEMPLO 6

SELEÇÃO DE ANTIBIÓTICO

[0336]Os antibióticos do tipo rifamicina foram selecionados para atividade de alta potência, atividade bactericida inalterada no baixo pH fagolisossômico, capacidade de suportar insultos intracelulares e a facilidade com que podem ser acoplados a um reagente ligante não peptídico (PML) clivável por protease adequado para a conjugação com um anticorpo anti-WTA. Uma vez que as bactérias intrafagocíticas estavam replicando mais lentamente, a otimização do antibiótico também exigiu que ele fosse capaz de matar MRSA não replicante quando liberado do AAC.

[0337]O MRSA foi coletado a partir de uma cultura em fase estacionária e suspenso em solução salina tamponada com fosfato sem antibiótico ou 1xX10º M de rifampina ou derivado de rifamicina (Rifalog) e incubado a 37 ºC. Nos tempos indicados, uma amostra da cultura foi coletada e centrifugada para remover o antibiótico e o número total de bactérias sobreviventes foi determinado por plaqueamento.

[0338]De modo interessante, a adição do antibiótico rifamicina (rifalog), mas não a rifampicina, resultou em uma diminuição de mais de 1000 vezes no número de bactérias viáveis, mas não replicantes, após a incubação durante a noite em tampão salina fosfato mínimo (PBS) (vide a Figura 8). De forma semelhante, o antibiótico tipo rifamicina foi capaz de matar células persistentes (persisters) classicamente definidas, bactérias que presumivelmente entram em um estado latente para sobreviver ao tratamento com antibióticos (por exemplo, ciprofloxacina) de culturas em crescimento (dados não apresentados). A adição de rifampicina não teve qualquer efeito em suas viabilidade, de acordo com observações anteriores (Conlon, B.P. , et a/ .(2013) Nature 503,365-370). Em contraste, a adição de antibiótico tipo rifamicina (Rifalog) levou à erradicação das células persisters a níveis abaixo do limite de detecção. Estes resultados sugerem que os antibióticos do tipo rifamicina têm uma capacidade notável de matar células dormentes que não se dividem.

EXEMPLO 7 PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS ANTICORPO ANTI-WTA — ANnTIBIÓTICO

[0339] Os conjugados anticorpo anti-ácido teicoico de parede — antibiótico (AAC) da Tabela 3 foram preparados pela conjugação de um anticorpo anticWTA a um Ligante intermediário PML-Antibiótico, incluindo aqueles da Tabela 2. Antes da conjugação, os anticorpos anti-WTA foram parcialmente reduzidos com TCEP utilizando métodos-padrão de acordo com a metodologia descrita no documento WO 2004/010957, cujos ensinamentos são incorporados ao presente pela referência para este fim. Os anticorpos parcialmente reduzidos foram conjugados com o intermediário ligante-antibiótico usando métodos padrão, de acordo com a metodologia descrita em Doronina et al.(2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784 e publicação US 2005/0238649 A1. Resumidamente, os anticorpos parcialmente reduzidos foram combinados com o intermediário ligante-antibiótico para permitir a conjugação do intermediário ligante-antibiótico aos resíduos de cisteína reduzidos do anticorpo. As reações de conjugação foram interrompidas e os AACs foram purificados. A carga de antibiótico (número médio de unidades de antibiótico por anticorpo) para cada AAC foi determinada e estava entre cerca de 1 a cerca de 2 para os anticorpos anti-ácido teicoico de parede manipulados com um único sítio mutante de cisteína.

[0340] Redução/Oxidação de ThioMabs Para Conjugação: Os anticorpos monoclonais completos modificados com cisteína (ThioMabs - Junutula, et a/., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WOZ2009/052249, Shen et al (2012) Nature Biotech., 30(2):184-191; Junutula et al (2008) Jour of Immun. Methods 332:41-52) expressos em células CHO foram reduzidos com um excesso de cerca de 20-40 vezes de TCEP (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina ou DTT (ditiotreitol) em Tris 50 MM pH 7,5 com 2 mM de EDTA durante 3 h a 37

ºC ou durante a noite à temperatura ambiente. (Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA). O ThioMab reduzido foi diluído e carregado em uma coluna HiTrap S em acetato de sódio 10 mM, pH 5, e eluído com PBS contendo 0,3 M de cloreto de sódio. Alternativamente, o anticorpo foi acidificado pela adição de 1/20º volume de ácido acético a 10%, diluído com succinato 10 mM pH 5, carregado na coluna e depois lavado com 10 volumes de coluna de tampão succinato. A coluna foi eluída com Tris 50 mM pH 7,5, EDTA 2 mM.

[0341] O ThioMab reduzido eluído foi tratado com um excesso molar de 15 vezes de DHAA (ácido desidroascórbico) ou sulfato de cobre aquoso 200 nM (CuSO34). A oxidação das ligações de bissulfeto intercadeias foi completa em cerca de três horas ou mais. A oxidação no ar ambiente também foi eficaz. O anticorpo reoxidado foi dialisado em succinato de sódio 20 mM, pH 5, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM e armazenado congelado a -20 ºC.

[0342] Conjugação de Thio-Mabs com intermediários ligante- antibiótico: Os thio-anticorpos desbloqueados, reoxidados (ThioMab) foram reagidos com um excesso molar de 6 a 8 vezes do intermediário ligante- antibiótico da Tabela 2 (a partir de uma reserva de DMSO a uma concentração de 20 mM) em 50 mM de Tris, pH 8, até a reação estar completa (16-24 horas) tal como determinado pela análise LC-MS da mistura da reação.

[0343] Os conjugados anticorpo-antibiótico bruto (AAC) foram então aplicados a uma coluna de troca catiônica após diluição com 20 mM de succinato de sódio, pH 5. A coluna foi lavada com pelo menos 10 volumes de coluna de succinato de sódio 20 MM, pH 5, e o anticorpo foi eluído com PBS. Os AACs foram caracterizados por espectroscopia UV para determinar a concentração de proteína, SEC analítica (cromatografia de exclusão por tamanho) para análise de agregação e LC-MS antes e depois do tratamento com endopeptidase de lisina C.

[0344] A cromatografia de exclusão por tamanhos foi realizada utilizando uma coluna Shodex KW802.5 em 0,2 M de fosfato de potássio pH 6,2 com 0,25 mM de cloreto de potássio e 15% de IPA a uma velocidade de fluxo de 0,75 ml/min. O estado de agregação dos AACs foi determinado por integração da absorbância da área do pico eluído a 280 nm.

[0345] A análise LC-MS foi realizada utilizando um instrumento Agilent QTOF 6520 ESI. Como um exemplo, um AAC gerado utilizando esta química foi tratado com 1:500 p/p de endoproteinase Lis C (Promega) em tampão Tris, pH 7,5, durante 30 min a 37 ºC. Os fragmentos de clivagem resultantes foram carregados em uma coluna 1000A, 8 um PLRP-S aquecida a 80 ºC e eluídos com um gradiente de 30% B até 40% B em 5 minutos. Fase móvel A: H2O com TFA a 0,05%. Fase móvel B: acetonitrila com 0,04% de TFA. Velocidade de fluxo: 0,5 mL/min. A eluição da proteína foi monitorada pela absorbância de detecção UV a 280 nm antes de ionização por eletrospray e análise MS. A resolução cromatográfica do fragmento Fc não conjugado, Fab não conjugado residual e antibiótico-Fab foi alcançada. Os espectros m/z foram deconvoluídos usando o software Massa Hunter'"" (Agilent Technologies) para calcular a massa dos fragmentos de anticorpo.

EXEMPLO 8

CLIVAGEM E LIBERAÇÃO DO ANTIBIÓTICO

[0346] Os antibióticos do tipo rifamicina foram testados para a capacidade de matar diretamente as bactérias extracelulares quando ligados ao mMAb anti-WTA B no formato AAC. O AAC foi incubado apenas em tampão ou tratado com catepsina B. As diluições em série da reação resultante foram adicionadas aos poços contendo MRSA em Caldo de Soja Tríptico e cultivadas durante a noite para identificar poços contendo antibiótico ativo suficiente para prevenir o crescimento.

[0347] Como previsto, o crescimento das bactérias planctônicas não foram prejudicado pela incubação durante a noite com o AAC anti-MRSA intacto a menos que o AAC fosse pré-tratado com catepsina B para liberar o antibiótico ativo (Figura 9). O pré-tratamento do AAC com catepsina B liberou atividade antibiótica suficiente para prevenir o crescimento bacteriano a 0,6 vg/mL de AAC, previsto conter 0,006 pug/mL de antibiótico.

[0348] Para testar se o antibiótico é liberado do AAC somente após a internalização de bactérias opsonizadas com AAC nas células, a clivagem do ligante pode ser examinada com uma sonda baseada na Transferência Ressonante De Energia De Fluorescência (FRET) que consiste do mesmo anticorpo anti-MRSA conjugado com duas moléculas marcadoras, usando o mesmo ligante, como nos AACs. O MRSA é opsonizado com o conjugado FRET e adicionado às culturas de macrófagos. A captação das bactérias e a clivagem da sonda é monitorada por vídeo microscopia. O ligante é clivado dentro de minutos após a absorção das bactérias pelos macrófagos e visualizado pela liberação da sonda A488, análoga à liberação de antibiótico do tipo rifamicina nas AACs. Por outro lado, o ligante permaneceu intacto quando as bactérias não foram internalizadas devido ao tratamento dos macrófagos com latrunculina A, um inibidor da fagocitose. A análise por espectrometria de massa também pode ser utilizada para confirmar que o antibiótico livre está efetivamente liberado dentro de macrófagos após a absorção de MRSA revestido com os AACs.

EXEMPLO 9 POTÊNCIA IN VITRO DO AAC ANTI-WTAB PML

[0349] O AAC anti-WTAB-CBDK mata de forma eficaz o S. aureus quando internalizado pelos macrófagos primários humanos e de camundongo e várias linhagens de células humanas in vitro.

ENSAIO DE MACRÓFAGOS IN VITRO

[0350] O S. aureus (cepa USASO00O NRS384) foi incubado com diversas doses (100 ug/mL, 10 ug/mL, 1 ug/mL ou 0,1 ug/mL) de um anticorpo anti-WTAB 4497, AAC Ab4497-CBDK-dimetilpibpBOR carregado com 2 moléculas de antibiótico por anticorpo (DAR2) ou com AAC anti-WTA-CBDK- dimetilpipbpBOR carregado com 4 moléculas de antibiótico por anticorpo (DAR4) durante 1 hora para permitir a ligação do anticorpo às bactérias. As bactérias opsonizadas resultantes foram incubadas com macrófagos murinos e incubadas a 37 ºC para permitir a fagocitose. Após 2 horas, a mistura de infecção foi removida e substituída por meio de crescimento normal suplementado com 50 Vg/mL de gentamicina para matar quaisquer bactérias extracelulares restantes. O número total de bactérias intracelulares sobreviventes foi determinado 2 dias mais tarde pelo plaqueamento de diluições em série dos lisados de macrófagos em placas de Ágar de Soja Tríptico. EXEMPLO 10 EFICÁCIA IN VivO DE AACS ANTI-WTAB-PML

[0351] O tratamento da infecção pelo S. aureus em camundongos reduz a carga bacteriana em órgãos em várias ordens de grandeza.

[0352] Para determinar se uma terapêutica especificamente direcionada ao S. aureus intracelular teria eficácia durante uma infecção, os AACs WTA-PML foram testados em um modelo de infecção intravenoso de camundongo. Este exemplo demonstra que os AACs WTA-PML foram eficazes na redução ou erradicação das infecções intracelulares de S. aureus em um modelo murino de infecção intravenosa.

[0353] Modelo de Peritonite: Camundongos A/J fêmeas com 7 semanas de idade (Jackson Laboratories) foram infectados por injeção peritoneal com 5x107 UFC de USA300. Os camundongos foram sacrificados 2 dia após a infecção e o peritônio foi lavado com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) frio. Os rins são homogeneizados em 5 mL de PBS como descrito abaixo para o modelo de infecção intravenosa. As lavados peritoneais são centrifugados durante 5 minutos a 1000 rpm a 4 ºC em uma centrífuga de mesa. O sobrenadante é coletado como bactéria extracelular e o sedimento celular contendo células peritoneais é coletado como a fração intracelular. As células são tratadas com 50 ug/mL de lisostafina durante 20 minutos a 37ºC para matar as bactérias extracelulares contaminantes. As células peritoneais são lavadas 3x em PBS gelado para remover a lisostafina antes da análise. Para a contagem do número de UFCs intracelulares vivas, as células peritoneais são lisadas em HB (Solução Salina Balanceada de Hanks suplementada com HEPES 10 mM e Albumina de Soro Bovino (BSA) a 1%) com Triton-X a 0,1% e diluições em série do lisado são feitas em PBS com Tween-20 a 0,05%.

[0354] Modelo murino de infecção intravenosa: Para ser clinicamente relevante, um AAC precisaria ser capaz de eliminar a infecção intracelular já estabelecida. Para avaliar isto, o tratamento foi retardado até 24 horas após o início da bacteremia, tempo em que o tratamento com vancomicina é minimamente eficaz. A infecção intracelular nos neutrófilos é rapidamente estabelecida; em pelo menos um modelo de bacteremia, 95% das bactérias no sangue estão dentro de neutrófilos dentro de 15 minutos', e isto é presumivelmente responsável pela diminuição da eficácia da vancomicina. Nestas condições, o tratamento com uma única dose de AAC foi eficaz e provou ser superior ao tratamento com uma dose equivalente do antibiótico do tipo rifamicina livre.

[0355] O S. aureus é um colonizador comum da pele humana e superfícies mucosas. A análise preliminar de múltiplas fontes de soro humano, incluindo IGIV-GammaGard, uma preparação de imunoglobulina combinada de —- 10.000 seres humanos, demonstrou que o soro humano contém aproximadamente 300 ug/mL de anticorpos anti-S. aureus , dos quais -— 70% são direcionados contra modificações GICNAc de WTA. O soro de camundongo não tem níveis apreciáveis de anticorpo anti-S. aureus. Para determinar se os anticorpos anti-WTA endógenos encontrados no soro humano normal podem competir pela ligação com o AAC, camundongos CB17.SCID (Charles River Laboratories, Hollister, CA) foram reconstituídos com GammaGard S/D IGIV Immune Globulin (ASD Healthcare, Brooks KY) utilizando um regime de dosagem otimizado para atingir níveis séricos constantes de pelo menos 10 mg/mL de IgG humana no soro. O IGIV foi administrado com uma dose intravenosa inicial de 30 mg por camundongo seguida por uma segunda dose de mg/camundongo por injeção intraperitoneal (ip) após 6 horas e subsequentes dosagens diárias de 15 mg por camundongo por injeção intraperitoneal durante 3 dias consecutivos. Estes camundongos foram igualmente suscetíveis à infecção com MRSA em comparação com os controles não tratados.

[0356] Os camundongos (n = 8 para cada anticorpo ou AAC) foram infectados 4 horas após a primeira dose de IGIV com 1 x 107 UFC de MRSA (cepa USAS300 NRS384) diluída em solução salina tamponada com fosfato por injeção intravenosa. Os camundongos infectados foram tratados com 50 mg/Kg de anticorpo nu S4497 ou AAC S4497 da Tabela 3. Aos camundongos receberam uma dose única de AAC 24h após a infecção por injeção intravenosa, e foram sacrificados no dia 4 após a infecção, e os rins e corações foram coletados em 5 mL de solução salina tamponada com fosfato. As amostras de tecido foram homogeneizadas utilizando um dispositivo GentleMACS Dissociator (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). O número total de bactérias recuperadas por órgão foi determinado pelo plaqueamento usando diluições em série do homogenato de tecido em PBS 0,05% de Tween em Ágar de Soja Tríptico com 5% de sangue de ovelha desfibrinado.

[0357] Como mostram os resultados na Figura 10, apesar da presença de anticorpos potencialmente concorrentes, uma única dose de AAC anti-B-GIcNAc WTA (S4497-AAC) reduziu ou erradicou significativamente as contagens bacterianas em órgãos infectados em comparação com o anticorpo nu. A Figura 10B mostra que o tratamento com AAC (DAR2) reduziu a carga bacteriana nos rins em aproximadamente 7.000 vezes. Figura 10C mostra que o tratamento com AAC (DAR2) da Tabela 3 reduziu a carga bacteriana no coração em aproximadamente 500 vezes. O tratamento com antibiótico nu, dimetilpipBOR sozinho (na concentração molar igual ao dimetilpbpipBOR em AAC) no modelo de infecção in vivo não foi eficaz em comparação com o dimetilpipBOR conjugado com anticorpo anti-WTA na forma de AAC.

[0358] Os anticorpos anti-WTA não conjugados (livres) não são eficazes in vivo.

[0359] A Figura 17 mostra que o pré-tratamento com 50 mg/kg de anticorpos livres não é eficaz em um modelo de infecção intravenosa. Os camundongos Balb/c receberam uma dose única de veículo controle (PBS) ou 50 mg/Kg de anticorpos por injeção intravenosa 30 minutos antes da infecção com 2x107 UFC de USA300. Os grupos de tratamento incluíram um anticorpo de controle isotípico que não se liga ao S. aureus (gD), um anticorpo dirigido contra a modificação beta do ácido teicoico de parede (4497) ou um anticorpo dirigido contra a modificação alfa do ácido teicoico de parede (7578). Os camundongos controle foram administrados duas vezes por dia com 110 mg/Kg de vancomicina por injeção intraperitoneal (Vanco).

EXEMPLO 11 PIPERIDIL BENZOXAZINA RIFAMICINA (PIPBOR) 5 oH O Ce, x tie PAG ce HC! —TBS-CI TEA Cx DA EtoH oH DCM, THF 'oH 1 2 ?

o. o. | nf Nor nho Lo-o o CA 40Re TBSOo O E CA o IIS 3 no) oH OH SoH D ” * to HO, Pr, o a Ã. RU HN o í e ) 4 rifamicina-S Pr ns O= O o N Ci " ou EXE SO

HAN OS OH AOH = Q OR OH, Au, MnO, HoN HN O í x

[0360]2-Nitrobenzeno-1,3-diol 1 foi hidrogenado em gás hidrogênio com catalisador paládio/carbono em solvente etanol para formar 2-aminobenzeno-1,3-diol 2, isolado como o sal cloridrato. A mono-proteção de 2 com cloreto de terc-butildimetilsilila e trietilamina em diclorometano/tetrahidrofurano formou 2-amino-3-(terc- butildimetilsililoxi)fenol 3, Rifamicina S (ChemShuttle Inc., Fremont, CA, US 7,342,011; US 7,271,165; US 7,547,692) foi reagida com 3 por condensação oxidativa com óxido de manganês ou gás oxigênio em tolueno à temperatura ambiente para formar benzoxazina rifamicina protegida com TBS 4, LCMS (ESI): M+H* = 915,41, A reação de 4 com piperidin-4-amina e óxido de manganês formou piperidil benzoxazina rifamicina (pipbpBOR) 5, LCMS (ESI): M+H* = 899,40.

EXEMPLO 12 DiIMETIL PIPBOR 6 À ! mnÊo = O LC" ow O | q o >N LS OH OH 4 ! QL DR ToHO, Au, Mno, Di HN o 6 x

[0361] A reação de N N-dimetilpiperidin-4-amina com benzoxazina rifamicina protegida com TBS 4 formou dimetilpiperidil benzoxazina rifamicina (dimetil pipBOR) 6. o. o nn A Nor nmdo Nor o | 40h s | ES AO O: OHAROH o O OH OH 8 (o HO, Ar, O HO, A, ? HNx o HN O | | , nifamicina-S rifamicina SV sódica o o o, l.o- o mho Lo-o q > Ho O x Vs Cr or | Wo oh Ns | ONA, ou >" Ls OH OH F o Ro HO, Pr, — LC DR To HO, A, HN o xy HNÇ O | 9 e 6 D

[0362] Alternativamente, (5-fluoro-2-nitro-1,3- fenileno)bis(oxi)bis(metileno)dibenzeno 7 foi hidrogenado em gás hidrogênio com catalisador paládio/carbono em solvente tetrahidrofurano/metanol para remover os grupos benzila para formar 2-amino-5-fluorobenzeno-1,3-diol 8, LCMS (ESI): M+H* = 144,04, Rifamicina S ou sal sódico de Rifamicina SV comercialmente disponíveis (ChemShuttle Inc., Fremont, CA) foram reagidas com 2-amino-5-fluorobenzeno-1,3-diol 8 por condensação oxidativa em ar ou ferricianeto de potássio em acetato de etila a 60 ºC para formar fluoro benzoxazina rifamicina 9, O deslocamento do flúor com N N-dimetilpiperidin-4- amina formou dimetilpibBOR 6, LCMS (ESI): M+H* = 927,43.

EXEMPLO 13 (S)-N-(5-(2,5-DIOX0-2,5-DIHIDRO-1H-PIRROL-1-I1L)PENTIL)-N-(1-(4- (HIDROXIMETIL)FENILAMINO)-1-0X0-5-UREIDOPENTAN-2-IL)CICLOBUTANO-1,1- DICARBOXAMIDA 10 ETAPA 1: PREPARAÇÃO DE CLORIDRATO DE 1-(5-AMINOPENTIL)-1H-PIRROL-2,5- DIONA 10A o HDD o Q o CO DPPA,TEA Y HOAc, Reflux Y fo] tBuOH o o 9 o CX vt HCI-EtoAc QE He! o DCM o 10a

[0363] Anidro maleico, furan-2,5-diona (150 g, 1,53 mol) foi adicionado a uma solução agitada de ácido 6-aminohexanóico (201 g, 1,53 mol) em HOAc (1000 mL). Após a mistura ser agitada à TA por 2 h, ela foi aquecida até o refluxo durante 8 h. Os solventes orgânicos foram removidos sob pressão reduzida e o resíduo foi extraído com EtOAc (500 mL * 3), lavado com H2O. As camadas orgânicas combinadas foram secas em Na2SO3. e concentradas para formar o produto bruto. Ele foi lavado com éter de petróleo para formar ácido 6- (2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)hexanóico como um sólido branco (250 g, 77,4 %). DPPA (130 g, 473 mmol) e TEA (47,9 g, 473 mmol) foram adicionados a uma solução de ácido 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanóico (100 g, 473 mmol) em t-BuOH (200 mL). A mistura foi aquecida até o refluxo durante 8 h sob N>2, A mistura foi concentrada, e o resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel (PE:EtOAc= 3:1) para formar terc-butil 5-(2,5-dioxo-2,5- dihidro-1H-pirrol-1-il)pentilcarbamato (13 g, 10 %). Em uma solução de terc-butil 5-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)pentilcarbamato (28 g, 992 mmol) em EtOAc anidro (30 mL) foi adicionado HCIVEtOAc (50 mL) gota a gota. Após a mistura ser agitada à TA por 5 h, ela foi filtrada e o sólido foi seco para formar cloridrato de 1-(5-aminopentil)-1H-pirrol-2,5-diona 10a (16 g, 73,7 %). *H NMR (400 MHz, DMSO-ds): ô 8,02 (s, 2H), 6,99 (s, 2H), 3,37-3,34 (m, 2H), 2,71-2,64 (m, 2H), 1,56-1,43 (m, 4H), 1,23-1,20 (m, 2H). ETAPA 2: PREPARAÇÃO DE ÁCIDO (S)-1-(1-(4-(HIDROXIMETIL)FENILAMINO)-1- OXO-5-UREIDOPENTAN-2-ILCARBAMOIL)CICLOBUTANOCARBOXÍLICO 10B o o o oH meo, Fmoern À, “ DO" men LILI ; Fmac-Cl, KCO; ; ? 3 S a f EEDO, DCM, S HN lioxano, HO — Hn MeOH, TA HN oÔ NH) o PÉ n 109 10f 10e o [o] 'oH a Ro mi Tt > 2H o piperidina S ——————67 DMF HN NaHCO:, DME, H;O, TA Pim 10d o OH o oH ARIDI” o RAILT o o. LiOH (2 em) o os" WS MeOH, THF, H,O, rt. WS Pt 10c 10b

[0364] Em uma mistura de ácido (S)-2-amino-5-ureidopentanóico 10g (17,50 g, 0,10 mol) em uma mistura de dioxano e H2O (50 mL / 75 mL) foi adicionado K2COs; (34,55 g, 0,25 mol). Fmoc-Cl (30,96 g, 0,12 mol) foi adicionado vagarosamente a O ºC. A mistura da reação foi aquecida à TA durante 2h. O solvente orgânico foi removido sob pressão reduzida, e a pasta aquosa foi ajustada para pH = 3 com solução de HCI de 6 M, e extraída com EtOAc (100 mL x 3). A camada orgânica foi seca em Na2SO:, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para formar ácido (S)-2-((((9H-fluoren-9- il)metoxi)carbonil)amino)-5-ureidopentanóico 10f (38,0 g, 95,6 %). 10f está comercialmente disponível.

[0365]Em uma solução de 10f (4 g, 10 mmol) uma mistura de DCM e MeOH (100 mL / 50 mL) foram adicionados (4-aminofenil)metano! (1,6 g, 13 mmol, 1,3 eq) e 2-Etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidroquinolina, EEDO, Sigma-Aldrich CAS Reg. No. 16357-59-8 (3,2 g, 13 mmol, 1,3 eq). Após a mistura ser agitada à TA por 16 h sob N>, ela foi concentrada para formar um sólido marrom. MTBE (200 mL) foi adicionado e agitado a 15ºC durante 2 h. O sólido foi coletado por filtração, lavado com MTBE (50 mL x 2) para formar (S)-(9H-fluoren-9-il)]Metil (1-((4-(hidroximetil)fenil)amino)-1- oxo-5-ureidopentan-2-il)carbamato 10e como um sólido laranja (4,2 g, 84%). LCMS (ESI): m/z 503,0 [M+1].

[0366]EmM uma solução agitada de 10e (4,2 g, 8,3 mmol) em DMF seco (20 ml) foi adicionado piperidina (1,65 mL, 17 mmol, 2 eq) gota a gota à TA. A mistura foi agitada à TA por 30 min, e precipitado sólido foi formado. DCM seco (50 mL) foi adicionado, e a mistura se tornou transparente imediatamente. A mistura foi agitada à TA por mais 30 min, e o LCMS mostrou que 10e foi consumido. Ele foi concentrado até a secura sob pressão reduzida (garantindo que não havia piperidina remanecente), e o resíduo foi dividido entre EtOAc e H2O (50 mL / 20 mL). A fase aquosa foi lavada com EtOAc (50 mL x 2) e concentrada para formar (S)-2-amino-N-(4- (hidroximeti!)fenil)-S-ureidopentanamida 10d como um óleo residual (2,2 9, 94%) (continha uma pequena quantidade de DMF).

[0367]O ácido 1,1-ciclobutanodicarboxílico comercialmente disponível, éster de 1,1-dietila (CAS Reg. No. 3779-29-1) foi convertido por saponificação limitada com base aquosa à metade / éster do ácido 1,1-

ciclobutanodicarboxílico, éster de 1-etila (CAS Reg No. 54450-84-9) e ativação com um reagente de acoplamento tal como TBTU tetrafluoroborato de (O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N', N'-tetrametilurônio, tambem denominado de: tetrafluoroborato de N,N,N'N'-Tetrametil-O-(benzotriazol-1-il)urônio, CAS No. 125700-67-6, Sigma-Aldrich B-2903), e N-hidroxisuccinimida ao éster NHS, ciclobutano-1,1-dicarboxilato de 1-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) 1- etila.

[0368]EmM uma solução de ciclobutano-1,1-dicarboxilato de 1- (2,5-dioxopirrolidin-1-il) 1-etila (8 g, 29,7 mmol) em DME (50 mL) foi adicionada uma solução de 10d (6,0 g, 21,4 mmol) e NaHCOs; (7,48 g, 89,0 mmol) em água (30 mL). Após a mistura ser agitada à TA por 16 h, ela foi concentrada até estar seca sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado por cromatografia de coluna (DCM:MeOH = 10:1) para formar (S)-etil 1-((1- (4-(hidroximetil)fenil)-2-0x0-6-ureidohexan-3- il)carbamoil)ciclobutanocarboxilato 10c como um sólido branco (6,4 9, 68,7%). LCMS (ESI): m/z 435,0 [M+1].

[0369]Em uma solução agitada de 10c (6,4 g, 14,7 mmol) em uma mistura de THF e MeOH (20 mL / 10 mL) foi adicionada uma solução de LiOH-H2O (1,2 g, 28,6 mmol) em H2O (20 mL) à TA. Após a mistura da reação ser agitada à TA por 16 h, o solvente foi removido sob pressão reduzida, o resíduo obtido foi purificado por prep-HPLC para formar ácido (S)-1-(1-(4-(hidroximetil)fenilamino)-1-0x0-5-ureidopentan-2- ilcarbamoil)ciclobutanocarboxílico 10b (3,5 g, rendimento: 58,5%). LCMS (ESI): m/z 406,9 [M+1]. *H NMR (400 MHz, Metanol-da) ó 8,86 (d, J=8,4 Hz, 2H), 8,51 (d, J= 8,4 Hz, 2 H), 5,88 - 5,85 (m, 1 H), 5,78 (s, 2 H), 4,54 - 4,49 (m, 3 H), 4,38 - 4,32 (m, 1 H), 3,86 - 3,75 (m, 1 H), 3,84 - 3,80 (m, 2 H), 3,28 - 3,21 (m, 1 H), 3,30 - 3,24 (m, 1 H), 3,00 - 2,80 (m, 1 H), 2,37 - 2,28 (m, 2 H).

ETAPA 3: PREPARAÇÃO DE S)-N-(5-(2,5-DIOX0-2,5-DIHIDRO-1H- PIRROL-1-IL)PENTIL) -N-(1-(4-(HIDROXIMETIL)FENILAMINO)-1-0Xx0-5- UREIDOPENTAN-2-IL)CICLOBUTANO-1,1-DICARBOXAMIDA 10 no O" P ' 4 o O no NÃ, 10a Co A RA, ep? Best EE f DMF Ss HN r—> HN' nt nt 10b 10

[0370] Di-isopropiletilamina, DIPEA (1,59 g, 12,3 mmol) e cloreto de bis(2-0x0-3-oxazolidinil)fosfínico, BOP-CI (CAS Reg. No. 6864 1-49-6, Sigma-Aldrich, 692 mg, 2,71 mmol) foi adicionado a uma solução de ácido (S)-1-(1-(4- (hidroximetil)fenilamino)-1-0x0-5-ureidopentan-2-ilcarbamoil)ciclobutanocarboxílico 10b (1 g, 246 mmol) em DMF (10 mL) à O ºC, seguido por cloridrato de 1-(5- aminopentil)-1H-pirrol-2,5-diona 10a (592 mg, 2,71 mmol). A mistura foi agitada à O ºC durante 0,5h. A reação foi interrompida com solução de ácido cítrico (10 mL), extraída com DCM/MeOH (10:1). A camada orgânica foi seca e concentrada, e o resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel (DCM:MeOH = 10:1) para formar S)-N-(5-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)pentil)- N-(1-(4- (hidroximetil)fenilamino)-1-0x0-5-ureidopentan-2-il)ciclobutano-1,1-dicarboxamida 10 (1,0 g, 71 %), também referido como MC-CBDK-cit-PAB-OH. LCMS (ESI): M+H* = 571,28, *H NMR (400 MHz, DMSO-ds): ô 10,00 (s, 1H), 7,82-7,77 (m, 2H), 7,53 (d, J = 8,4 Hz, 2 H), 7,19 (d, J= 8,4 Hz, 2 H), 6,96 (s, 2H), 5,95 (t, J = 6,4 Hz, 1H), 5,389 (s, 2H), 5,08 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 4,40-4,35 (m, 3H), 4,09 (d, J = 4,8 Hz, 1 H), 3,01 (d J= 3,2 Hz, 2 H), 3,05-2,72 (m, 4H), 2,68-2,58 (m, 3H), 2,40-2,36 (m, 4H), 1,72-1,70 (m, 3H), 1,44-1,42 (m, 1H), 1,40-1,23 (m, 6H), 1,21-1,16 (m, 4H).

EXEMPLO 14 (S)-N-(1-(4-(CLOROMETIL)FENILAMINO)-1-0X0-5-UREIDOPENTAN-2-IL)-N-(5-(2,5- DIOXO-2,5-DIHIDRO-1H-PIRROL-1-IL)PENTIL)CICLOBUTANO-1,1-DICARBOXAMIDA 11 P o Cl

DA RAIO > o os" Wá n o nt,

[0371] Uma solução de (S)-N-(5-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)pentil)-N-(1-(4-(hidroximetil)fenilamino)-1-0x0-5-ureidopentan-2-il)ciclobutano- 1,1-dicarboxamida 10 (2,0 g, 3,5 mmol) em N N-dimetilformamida, DMF ou N- metilpirrolidona, NMP (50 mL) foi tratada com cloreto de tionila, SOCI2 (1,25 9, 10,5 mmol) em porções gota a gota à 0 ºC. A reação permaneceu amarela. À reação foi monitorada por LC/MS indicando >290% de conversão. Após a mistura da reação ter sido agitada a 20 ºC durante 30 min ou por diversas horas, ela foi diluída com água (50 mL) e extraída com EtOAc (50 mL x 3). A camada orgânica foi seca, concentrada e purificada por coluna flash (DCM : MeOH = 20 : 1) para formar 11, também referido como MC-CBDK-cit-PAB-CI como um sólido cinza. LCMS: (5-95, AB, 1,5 min), 0,696 min, m/z = 589,0 [M+1]*.

EXEMPLO 15 CARBONATO DE (S)-4-(2-(1-(5-(2,5-DIOXO0-2,5-DIHIDRO-1H-PIRROL-1- IL)PENTILCARBAMOIL)CICLOBUTANOCARBOXAMIDO)-5-UREIDOPENTANAMIDO)BENZIL A-NITROFENILA 12 o Rs" Cosa 9 o O à Dá nano *

[0372] Em uma solução de (S)-N-(5-(2,5-diox0-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-

iN)pentil)-N-(1-(4-(hidroximetil)fenilamino)-1-0x0-5-ureidopentan-24I)ciclobutano-1,1- dicarboxamida 10 em DMF anidro foi adicionado di-isopropiletilamina (DIEA), seguido por carbonato PNP (bis(4-nitrofenil) carbonato). A solução de reação foi agitada à temperatura ambiente (TA) por 4 horas e a mistura foi purificada por HPLC preparativa para formar 12, LCMS (ESI): M+H* = 736,29.

EXEMPLO 16 PREPARAÇÃO DE MC-(CBDK-ciT)-PAB-(DIMETIL, FLUOROPIPBOR) - PLA-1 o mo | SO Oo or O O S SD Ps Ns. ow AÍSOH Dos QUE —N EN o Í SN | 13

[0373] Seguindo o procedimento para PLA-2, (S)-N-(1-(4- (clorometil)Yfenilamino)-1-0x0-5-ureidopentan-2-il)-N-(5-(2,5-dioxo-2,5-dihidro- 1H-pirrol-1-il)pentil)ciclobutano-1,1-dicarboxamida 11 e o derivado rifamicina fluorinado, dimetilfluoropipBOR 13 (LCMS (ESI): M+H* = 945,43) foram reagidos para formar MC-(CBDK-cit)-PAB-(dimetil, fluoropipBOR) - PLA-1, Tabela 2, LCMS (ESI): M+H* = 1499,7.

EXEMPLO 17 PREPARAÇÃO DE MC-(CBDK-cIT)-PAB-(DIMETILPIPBOR) - PLA-2

[0374] (S)-N-(1-(4-(clorometil)fenilamino)-1-0x0-5-ureidopentan-2- il)-N-(5-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)pentil)ciclobutano-1,1-dicarboxamida 11 (0,035 mmol) em DMF foi resfriado à O ºC e foi adicionado dimetilpipbBOR 6, (10 mg, 0,011 mmol). A mistura foi diluída com mais 0,5 mL de DMF. Agitada em contato com o ar durante 30 minutos. N N-di-isopropiletilamina (DIEA, 10 uL, 0,05 mmol) foi adicionada e a reação agitada de um dia para o outro em contato com o ar. Por LC/MS, foi observado 50% do produto desejado. Mais 0,2 eq de base N N-di-isopropiletilamina foi adicionado em quanto a reação era agiatada em contato com o ar por mais 6 horas até que a reação parasse de progredir. A mistura da reação foi diluída com DMF e purificada em HPLC (20-60% ACN/HCOOH in'H2O0) para formar MC-(CBDK-cit)-PAB-(dimetilpipBOR) - PLA-2, Tabela 2, LCMS (ESI): M+H* = 1481,8, rendimento 31%. EXEMPLO 18 PREPARAÇÃO DE MC-((R)-TIOFEN-3-IL-CBDK-cIT)-PAB-(DIMETILPIPBOR) (PLA-3) o

AA AAA AÇO à o: o os HH

DS DS 14 HaNÍSo

[0375] Seguindo o procedimento para PLA-2, (N-((S)1-(4- (clorometil)Yfenilamino)-1-0x0-5-ureidopentan-2-il)-N-((R)-3-(5-(2,5-dioxo-2,5- dihidro-1H-pirrol-1-il)pentilamino)-3-0x0-1-(tiofen-3-il)propil)ciclobutano-1,1- dicarboxamida 14 (LCMS (ESI): M+H* = 742,3) e dimetilpibBOR 6 foram reagidos para formar MC-((R)-tiofen-3-il-CBDK-cit)-PAB-(dimetilpipBOR) (PLA-3, Tabela 2). LCMS (ESI): M+H* = 1633,9.

EXEMPLO 19 PREPARAÇÃO DE MC-((S)-TIOFEN-3-IL-CBDK-cIT)-PAB-(DIMETILPIPBOR) (PLA-4) o

AA ABRAÇO O O À O O 2H o

HN PN 15 HAN “O

[0376] Seguindo o procedimento para PLA-2, (N-((R)1-(4- (clorometil)fenilamino)-1-0x0-5-ureidopentan-2-il)- N-((R)-3-(5-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-

1H-pirrol-1-i)pentilamino)-3-0x0-1-(tiofen-3-il)propil)ciclobutano-1,1-dicarboxamida (LCMS (ESI): M+H* = 742,3) e dimetilpibBOR 6 reagiram para formar MC-((R)- tiofen-3-il-CBDK-cit)-PAB-(dimetilpipBOR) (PLA, Tabela 2). LCMS (ESI): M+H* = 1633,9.

EXEMPLO 20 PREPARAÇÃO DE MC-(CBDK-ciT)-PABC-(PIPBOR) (PLA-5) [037 7]Piperidil benzoxazina rifamicina (pipBOR) 5 (15 mg, 0,0167 mmol), e em seguida 4-nitrofenil carbonato de (S)-4-(2-(1-(5-(2,5- dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)pentilcarbamoil )Jciclobutanocarboxamido)-5- ureidopentanamido)benzila 12 (12 mg, 0,0167 mmol) foram pesados em um frasco. Dimetilformamida, DMF (0,3 mL) foi adicionada, seguido por di- isopropiletilamina, DIEA (0,006 mL, 0,0334 mmol), e a reação foi agitada à temperatura ambiente por 2 h. A solução de reação fou purificada diretamente por HPLC (30 a 70% MeCN/água + 1% ácido fórmico) para formar MC-(CBDK-cit)-PABC-(pipBOR) (PLA-5, Tabela 2). LCMS (ESI): M+H* = 1496,5. EXEMPLO 21 PREPARAÇÃO DE MC-(CBDK-ciT)-PABC-(PIPERAZBTR) (PLA-6)

O np hoo g & A ow O ; Não Caos ON o UU HN HNL o SN | 16

[0378] Seguindo os procedimentos para PLA-5, a o derivado piperidina rifamicina, piperazBOR 16 (LCMS (ESI): M+H* = 885,4) e 4-nitrofenil carbonato (S)-4-(2-(1-(5-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-

il)pentilcarbamoil)ciclobutanocarboxamido)-5-ureidopentanamido)benzila 12 reagiram para formar MC-(CBDK-cit)-PABC-(piperazBTR) (PLA-6, Tabela 2). LCMS (ESI): M+H* = 1482,5.

[0379] Embora a invenção divulgada acima tenha sido descrita em detalhes por meio de ilustrações e exemplos com o propósito de facilitar o entendimento, as descrições e os exemplos não devem ser interpretados como limitantes do escopo da presente invenção. Todas as patentes, pedidos de patente e referências citadas ao longo do relatório descritivo são expressamente incorporados pela referência.

Claims (37)

REIVINDICAÇÕES

1. “COMPOSTO DE CONJUGADO ANTICORPO- ANTIBIÓTICO, caracterizado por possuir a fórmula: Ab-(PML-abx), em que: Ab é um anticorpo anti-ácido teicoico de parede (WTA); PML é um ligante não peptídico, clivável por protease, possuindo a fórmula: —Str-PM—-Y- onde Str é uma unidade extensora (stretcher); PM é uma unidade peptidomimética, e Y é uma unidade espaçadora; abx é o antibiótico do tipo rifamicina; e p é um número inteiro de 1 a 8, em que PM possui a fórmula:

SN onde R? e Rº formam juntos um anel cicloalquila C3- C7, e AA é uma cadeia lateral de aminoácido selecionada a partir de H, -CH3 ——CH2(CsHs)) —CHICH2CH2CHANHo, — -CH2CH2CHaNHCO(NH)NH>, -CHCH(CH3)CHs3 e -CH2CH2CHaNHC(O)NH:>.

2. "COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo antibiótico do tipo rifamicina ser um antibiótico do tipo rifalazila.

3. — COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo antibiótico do tipo rifamicina compreender uma amina quaternária ligada ao ligante não peptídico, clivável por protease.

4. “COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por possuir a Fórmula |:

Oo Mn, o | O o O « OR Ab—PML— AR? So HO, rm, HN o | p DB ! em que: as linhas tracejadas indicam uma ligação opcional; R é H, alquila C1-C12, ou C(O)CHs; R' é OH; R? é CH=N-(heterociclila), em que a heterociclila é opcionalmente substituída por um ou mais grupos independentemente selecionados a partir de C(O)CH;, alquila C1-C12, heteroarila C1-C12, heterociclila Co—C2o, arila Ce-C2o, e carbociclila Ca-C12; ou R' e R? formam uma heteroarila ou heterocíclila fusionada possuindo cinco ou seis membros, e opcionalmente, formando um anel de heteroarila, heterociclila, arila ou carbociclila de seis membros em espiro ou fusionado, em que o anel de heteroarila, heterociclila, arila ou carbociclila de seis membros em espiro ou fusionado é opcionalmente substituído por H, E, CI, Br, |, alquila C1-C12, ou OH; PML é o ligante não peptídico, clivável por protease, ligado a R? ou a heteroarila ou heterociclila fusionada formada por Re Rº; e Ab é o anticorpo anti-WTA.

5. — COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por possuir a fórmula:

o mo | KR Ro q OR cs J OHA, noH AbAPML—(Rº)N z o On, HN o | p

W em que: R? é independentemente selecionado a partir de H e alquila C1-Ci12; né 1ou2?; Rº é selecionado a partir de H, F, Cl, Br, |, alquila C1-C12 e OH; e Z é selecionado a partir de NH, N(alquila C1-C12), O e S.

6. “COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por possuir a fórmula: o , o | O o W OR Rº O OHA, oH E: RN ONE so |

AA SS Abt+ PML p em que: Rº é selecionado a partir de H e alquila C1-C12; e nébOoul.

7. “COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por possuir a fórmula:

o mo | o o O v OR RI XT OHA, OH

N nl ú HN o mA ) o | p

W em que: R$ é selecionado a partir de H e alquila C1-C12; e nébOoul.

8. —" COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por possuir a fórmula: o mo Ne or O | WS OR NO o 4 o” “mM fa” DS J ] p em que: Rº é independentemente selecionado a partir de H e alquila C1— Ci;e nébloul.

9. “COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por possuir a fórmula:

o nu, o | O or O | WS OR N o o HO, Au, HN o Ab PML—(R?),N | Ds p em que: Rº? é independentemente selecionado a partir de H e alquila C1—- Ci2; e né 1ou2.

10. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por possuir a fórmula: (o) mo | KR oH O | v OAc

OS OH OH N o o HO, A, o HN o AbA PML—(CH3),N | W Pp

11. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Str possuir a fórmula: o Lo o em que Rº é selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno C1-C12, alquileno C1-C12 C(=O), alquileno C1-C12 NH, (CH2CH20O);, (CH2CH20)--C(=O), (CH2CH20)--CH;z, e alquileno C1-C12 NHC(=O)CH2CH(tiofen- 3-il), em que r é um número inteiro variando de 1 a 10.

12. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por Rô ser (CH2)s.

13. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Y compreender para-aminobenzila ou para-aminobenziloxicarbonila.

14. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser selecionado a partir das fórmulas: ) o H H b: í —No . Aço x ) Ab Str Oo o AA p ; ii) H Ho? N N 2 abx Abdo s A O Oo 7 Ss ,

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15. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo monoclonal anti-WTAB.

16. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo anti-WTA compreender uma cadeia leve (L) e uma cadeia pesada (H), em que: a cadeia L compreende CDR L1 que compreende a sequência de KSSQSIFRTSRNKNLLN (SEQ ID NO:99), CDR L2 que compreende a sequência de WASTRKS (SEQ ID NO:100), e CDR L3 que compreende a sequência de QQYFSPPYT (SEQ ID NO:101); e a cadeia H compreende CDR H1 que compreende a sequência de SFWMH (SEQ ID NO:102), CDR H2 que compreende a sequência de FTINNEGTTTAYADSVRG (SEQ ID NO:103), e CDR H3 que compreende a sequência de GEGGLDD (SEQ ID NO:118).

17. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo anti-WTA compreender: a) uma região variável de cadeia pesada (VH), em que a VH compreende uma sequência de aminoácido que possui SEQ ID NO:156; e/ou b) uma região variável de cadeia leve (VL), em que a VL compreende uma sequência de aminoácido que possui SEQ ID NO:119.

18. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo anti-WTA compreender uma cadeia leve (L) e uma cadeia pesada (H), em que: a cadeia L compreende CDR L1 que compreende a sequência de RASQTISGWLA (SEQ ID NO:33), CDR L2 que compreende a sequência de KASTLES (SEQ ID NO:34), e CDR L3 que compreende a sequência de QQYKSYSFN (SEQ ID NO:35); e a cadeia H compreende CDR H1 que compreende a sequência de SYDIN (SEQ ID NO:36), CDR H2 que compreende a sequência de WMNANSGNTGYAQKFQG (SEQ ID NO:37), e CDR H3 que compreende a sequência de SSILVRGALGRYFDL (SEQ ID NO:38).

19. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo anti-WTA compreender: a) uma região variável de cadeia pesada (VH), em que a VH compreende uma sequência de aminoácido que possui SEQ ID NO:112; e/ou b) uma região variável de cadeia leve (VL), em que a VL compreende uma sequência de aminoácido que possui SEQ ID NO:111.

20. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo anti-WTA compreender uma cadeia leve (L) e uma cadeia pesada (H), em que: a) a cadeia L compreende CDR L1 que compreende a sequência de RASQTISGWLA (SEQ ID NO:39), CDR L2 que compreende a sequência de KASTLES (SEQ ID NO:40), e CDR L3 que compreende a sequência de

QQYKSYSFN (SEQ ID NO:41); e a cadeia H compreende CDR H1 que compreende a sequência de SYDIN (SEQ ID NO:42), CDR H2 que compreende a sequência de WMNANSGNTGYAQKFQG (SEQ ID NO:43), e CDR H3 que compreende a sequência de SSILVRGALGRYFDL (SEQ ID NO:44);

b) a cadeia L compreende CDR L1 que compreende a sequência de RASQFVSRTSLA (SEQ ID NO:45), CDR L2 que compreende a sequência de ETSSRAT (SEQ ID NO:46), e CDR L3 que compreende a sequência de HKYGSGPRT (SEQ ID NO:47); e a cadeia H compreende CDR H1 que compreende a sequência de NYDFI (SEQ ID NO:48), CDR H2 que compreende a sequência de WMNPNSYNTGYGQKFQG (SEQ ID NO:49), e CDR H3 que compreende a sequência de AVRGQLLSEY (SEQ ID NO:50);

c) a cadeia L compreende CDR L1 que compreende a sequência de RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO:51), CDR L2 que compreende a sequência de DASSRAT (SEQ ID NO:52), e CDR L3 que compreende a sequência de QKYGSTPRP (SEQ ID NO:53); e a cadeia H compreende CDR H1 que compreende a sequência de SYDIN (SEQ ID NO:54), CDR H2 que compreende a sequência de WMNPNSGNTNYAQRFOQG (SEQ ID NO:55), e CDR H3 que compreende a sequência de ERWSKDTGHYYYYGMDV (SEQ ID NO:56);

d) a cadeia L compreende CDR L1 que compreende a sequência de RASLDITNHLA (SEQ ID NO:57), CDR L2 que compreende a sequência de EASILOS (SEQ ID NO:58), e CDR L3 que compreende a sequência de EKCNSTPRT (SEQ ID NO:59); e a cadeia H compreende CDR H1 que compreende a sequência de NYDIN (SEQ ID NO:60), CDR H2 que compreende a sequência de WMNPSSGRTGYAPKFRG (SEQ ID NO:61), e CDR H3 que compreende a sequência de GGGYYDSSGNYHISGLDV (SEQ ID NO:62);

e) a cadeia L compreende CDR L1 que compreende a sequência de RASQSVGAIYLA (SEQ ID NO:63), CDR L2 que compreende a sequência de GVSNRAT (SEQ ID NO:64), e CDR L3 que compreende a sequência de

QLYTSSRALT (SEQ ID NO:65); e a cadeia H compreende CDR H1 que compreende a sequência de AYAMN (SEQ ID NO:66), CDR H2 que compreende a sequência de SITKNSDSLYYADSVKG (SEQ ID NO:67), e CDR H3 que compreende a sequência de LAARIMATDY (SEQ ID NO:68);

f) a cadeia L compreende CDR L1 que compreende a sequência de RASQGIRNGLG (SEQ ID NO:69), CDR L2 que compreende a sequência de PASTLES (SEQ ID NO:70), e CDR L3 que compreende a sequência de LQDHNYPPT (SEQ ID NO:71); e a cadeia H compreende CDR H1 que compreende a sequência de YYSMI (SEQ ID NO:72), CDR H2 que compreende a sequência de SIDSSSRYLYYADSVKG (SEQ ID NO:73) e CDR H3 compreende a sequência de DGDDILSVYRGSGRPFDY (SEQ ID NO:74);

g) a cadeia L compreende CDR L1 que compreende a sequência de RASQGIRNGLG (SEQ ID NO:75), CDR L2 que compreende a sequência de PASTLES (SEQ ID NO:76), e CDR L3 que compreende a sequência de LQDHNYPPS (SEQ ID NO:77); e a cadeia H compreende CDR H1 que compreende a sequência de YYSMI (SEQ ID NO:78), CDR H2 que compreende a sequência de SIDSSSRYRYYTDSVKG (SEQ ID NO:79), e CDR H3 que compreende a sequência de DGDDILSVYYQGSGRPFDY (SEQ ID NO:80);

h) a cadeia L compreende CDR L1 que compreende a sequência de RASQSVRTNVA (SEQ ID NO:81), CDR L2 que compreende a sequência de GASTRAS (SEQ ID NO:82), e CDR L3 que compreende a sequência de LQOYNTWPRT (SEQ ID NO:83); e a cadeia H compreende CDR H1 que compreende a sequência de TNDMS (SEQ ID NO:84), CDR H2 que compreende a sequência de TIGIDDTTHYADSVRG (SEQ ID NO:85), e CDR H3 que compreende a sequência de NSGIYSF (SEQ ID NO:86);

i) a cadeia L compreende CDR L1 que compreende a sequência de RASQDIGSSLA (SEQ ID NO:87), CDR L2 que compreende a sequência de ATSTLOS (SEQ ID NO:88), e CDR L3 que compreende a sequência de

QQLNNYVHS (SEQ ID NO:89); e a cadeia H compreende CDR H1 que compreende a sequência de DYAMG (SEQ ID NO:90), CDR H2 que compreende a sequência de VVTGHSYRTHYADSVKG (SEQ ID NO:91), e CDR H3 que compreende a sequência de RIWSYGDDSFDV (SEQ ID NO:92); j) a cadeia L compreende CDR L1 que compreende a sequência de RASQSIGDRLA (SEQ ID NO:93), CDR L2 que compreende a sequência de WASNLEG (SEQ ID NO:94), CDR L3 que compreende a sequência de QQYKSQAWS (SEQ ID NO:95); e a cadeia H compreende CDR H1 que compreende a sequência de SYAMN (SEQ ID NO:96), CDR H2 que compreende a sequência de YISSIETIYYADSVKG (SEQ ID NO:97), e CDR H3 que compreende a sequência de DRLVDVPLSSPNS (SEQ ID NO:98); k) a cadeia L compreende CDR L1 que compreende a sequência de RASQFTNHYLN (SEQ ID NO:105), CDR L2 que compreende a sequência de VASNLOS (SEQ ID NO:106), e CDR L3 que compreende a sequência de QQSYRTPYT (SEQ ID NO:107); e a cadeia H compreende CDR H1 que compreende a sequência de SGYYN (SEQ ID NO:108), CDR H2 que compreende a sequência de YILSGAHTDIKASLGS (SEQ ID NO:109), e CDR H3 que compreende a sequência de SGVYSKYSLDV (SEQ ID NO:110).

21. COMPOSTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo anticorpo anti-WTA se ligar ao Staphylococcus aureus.

22. COMPOSTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo anticorpo ser um F(ab) ou F(ab')2.

23. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o composto de conjugado anticorpo-antibiótico, conforme definido na reivindicação 1, e um farmaceuticamente aceitável veículo, deslizante, diluente ou excipiente.

24. MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMA INFECÇÃO

BACTERIANA, caracterizado por ser em um paciente, compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto de conjugado anticorpo-antibiótico, conforme definida na reivindicação

1.

25. MÉTODO PARA MATAR STAPHYLOCOCCUS AUREUS intracelular nas células de um paciente infectado com Staphylococcus aureus sem matar as células hospedeiras, caracterizado por ser pela administração de um composto conjugado anti-WTA-antibiótico, conforme definido na reivindicação 1.

26. PROCESSO PARA PRODUZIR O COMPOSTO de conjugado anticorpo-antibiótico, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por compreender a conjugação de um antibiótico do tipo rifamicina com um anticorpo anti-WTA.

27. KIT PARA O TRATAMENTO DE UMA INFECÇÃO BACTERIANA, caracterizado por compreender: a) a composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 23;e b) instruções para uso.

28. INTERMEDIÁRIO ANTIBIÓTICO-LIGANTE, caracterizado por possuir a Fórmula |l:

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N O OH OH X—PML— AR? o HO, A, HN o

DS U em que: as linhas tracejadas indicam uma ligação opcional; R é H, alquila C1-C12, ou C(O)CHs; R' é OH; R? é CH=N-(heterociclila), em que a heterociclila é opcionalmente substituída por um ou mais grupos independentemente selecionados a partir de C(O)CH;s, alquila C1-C12, heteroarila C1-C12, heterociclila Co—C2o, arila Ce-C2o, e carbociclila Ca-C12; ou R' e R? formam uma heteroarila ou heterociclila de cinco ou seis membros fusionados, e opcionalmente, formando um anel de heteroarila, heterociclila, arila, carbociclila de seis membros em espiro ou fusionado, em que o anel de heteroarila, heterociclila, arila, carbociclila de seis membros em espiro ou fusionado é opcionalmente substituído por H, F, CI, Br, |, alguila C1-C12, ou OH; PML é um ligante não peptídico, clivável por protease, ligado a R? ou a heteroarila ou heterocíclica fusionada formada por R' e R?, e possuindo a fórmula:

—Str-PM-Y- onde Str é uma unidade extensora (stretcher); PM é uma unidade peptidomimética, e Y é uma unidade espaçadora; e X é um grupo funcional reativo selecionado a partir da maleimida, tiol, amino, brometo, bromoacetamida, iodoacetamida, p-toluenossulfonato, iodeto, hidroxila, carboxila, bissulfeto de piridila e N-hidroxisuccinamida, em que PM apresenta a fórmula: “35h onde R? e Rô formam juntos um anel cicloalquila C3- C7, e AA é uma cadeia lateral de aminoácido selecionada a partir de H, -CH3 — "“CHXCsHs)) —"CHrCH2CH2CHANHa, — -CH2CH2CHaNHCO(NH)NH>, -CHCH(CH3)CH3 e -CH2CH2CHaNHC(O)NH2

29. INTERMEDIÁRIO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por X ser JC | e OA N >s o ss eu o :

30. INTERMEDIÁRIO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por possuir a fórmula:

O tm. ho | o mo | W OR X——PML—(R),N Zz o HO, A, HN o

W em que: Rº? é independentemente selecionado a partir de H e alquila C1—- C12; né 1ou2; Rº é selecionado a partir de H, F, Cl, Br, |, alquila C1-C12 e OH; e Z é selecionado a partir de NH, N(alquila C1-C12) O e S.

31. INTERMEDIÁRIO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por possuir a fórmula: Oo 1, o | O or O | WS 4 0Ae N O o HO,,, om o HN o X—PML—(CH3),NH7 |

SS

32. INTERMEDIÁRIO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por ser selecionado a partir das fórmulas:

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33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo paciente estar infectado com uma bactéria do tipo Staphylococcal.

34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo paciente estar infectado com Staphylococcus aureus.

35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo composto de conjugado anticorpo-antibiótico ser administrado ao paciente em uma dose que varia de cerca de 50mg/Kkg a 100mg/Kkg.

36. USO DE UMA QUANTIDADE TERAPEUTICAMENTE EFICAZ DO COMPOSTO de conjugado anticorpo-antibiótico, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratar infecção bacteriana em um paciente.

37. USO DE UM CONJUGADO ANTI-WTA-ANTIBIÓTICO, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para matar Staphylococcus aureus intracelular nas células de um paciente infectado com Staphylococcus aureus sem matar as células hospedeiras.