MX2008014978A - Moleculas de union humanas que tienen actividad exterminadora contra enterococos y staphylococcus aureus y usos de las mismas. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona moléculas de unión humanas específicamente enlazadas a enterococos y Staphylococcus aureus y tienen actividad exterminadora contra enterococos y Staphylococcus aureus, las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de unión humanas, composiciones que comprenden las moléculas de unión humanas y los métodos para identificar o producir las moléculas de unión humanas. Las moléculas de unión humanas pueden usarse en el diagnóstico, profilaxis y/o tratamiento de una condición resultante de Enterococos.

Description

MOLECULAS DE UNION HUMANAS QUE TIENEN ACTIVIDAD EX EFMINADORA CONTRA ENTEROCOCOS Y STAFHYLCCOCCUS AUREUS Y USOS DE LAS MISMAS CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere a la medicina. En particular la invención se refiere al diagnóstico, profilaxis y/o tratamiento de infección por enterococos. ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los enterococos son bacterias gram positivas, facultativamente bacterias anaeróbicas de la familia Enterococcaceae. Se clasificaron previamente como estreptococos del grupo D. Los enterococos se encuentran en los intestinos de la mayoría de los humanos y se aislan comúnmente de heces, orina y sitios de infección intra-abdominal y de las extremidades inferiores. Las bacterias del género Enterococcus son a menudo consideradas como comensales inofensivos del tracto gastrointestinal, pero dentro de los últimos 10 años se han vuelto una causa importante de infección hospitalaria (adquirida en el hospital) , no debido a que incrementan la virulencia sino a que son resistentes al antibiótico. Se ha estimado en los Estados Unidos de América, que 800,000 casos de infección enterocócica ocurren cada año resultando en costos de alrededor de $500 millones de dólares. Para infectar a los hospederos, los enterococos primeramente colonizan las superficies de las mucosas. Los enterococos son Ref.: 197993 agentes etiológicos de bacteremia, infecciones por heridas quirúrgicas, infecciones del tracto urinario, y endocarditis. También se asocian con anaerobios obligados en infecciones mixtas que resultan en abscesos intra-abdominales . En general, son alrededor de diecisiete especies de enterococos, entre los cuales Enterococcus faecalis y Enterococos faecium aparentan ser los más detectados comúnmente en heces humanas. E. faecalis contribuye a la mayoría de las infecciones enterocócicas de humanos, usualmente representa 80-90% de aislados clínicos. E. faecium se detecta frecuentemente mucho menos pero es sin embargo de importancia debido a una alta incidencia de resistencias múltiples para agentes antibacterianos. Las infecciones enterocócicas se tratan comúnmente con antimicrobianos y hasta hace poco se habían controlado adecuadamente usando estos agentes. Sin embargo, las cepas enterocócicas resistentes al fármaco surgen, y la infección por cepas resistente a todos los antibióticos actualmente disponibles puede volverse un problema serio en un futuro próximo. Algunos enterococos ya tienen resistencia intrínseca adquirida para antibióticos con base en ß-láctamicos (penicilinas) así como muchos aminoglicósidos . En las últimas dos décadas, particularmente las cepas virulentas de Enterococos las cuales aún son resistentes a la vancomicina antibiótica (Enterococo Resistente a Vancomicina, o VRE) han surgido en infecciones hospitalarias de pacientes hospitalizados. A pesar de la necesidad urgente para el desarrollo de nuevos antibióticos, las compañías farmacéuticas principales aparentan tener menos interés en el mercado de los antibióticos. En 2002, solamente 5 de los más de 500 fármacos en desarrollo clínico en fase II o fase III fueron antibióticos nuevos. En los últimos 6 años solamente 10 antibióticos se han registrado y solamente 2 de aquellos no desplieguen actividad cruzada con fármacos existentes (y de esta manera no se someten a los mismos patrones de resistencia al fármaco) . Esta tendencia se ha atribuido a diversos factores: el costo de desarrollo de nuevos fármacos y el retorno sobre la inversión relativamente pequeño que los tratamientos de enfermedades infecciosas producen comparados con los fármacos contra la hipertensión, artritis y fármacos para el estilo de vida, por ejemplo, para impotencia. Otro factor contribuyente es la creciente dificultad de encontrar nuevos objetivos, lo que además incrementa los costos de desarrollo. Por lo tanto, la investigación en las terapias novedosas o medidas preventivas contra infecciones bacterianas (resistentes a fármacos múltiples) es urgentemente necesaria para enfrentar esta crisis que dificulta la asistencia sanitaria . La inmunización activa con vacunas e inmunización pasiva con inmunoglobulinas son promesas alternativas para la terapia de moléculas clásicas pequeñas. Unas cuantas enfermedades bacterianas que una vez provocaron enfermedades extendidas, discapacidad, y muerte pueden ahora prevenirse a través del uso de vacunas. Las vacunas se basan en bacterias debilitadas (atenuadas) o muertas, componentes de la superficie bacteriana o en toxinas inactivadas. La respuesta inmunitaria formulada por una vacuna se dirige principalmente a estructuras inmunogénicas , un número limitado de proteínas o estructuras de azúcar en las bacterias que se procesan activamente por el sistema inmunitario. Ya que estas estructuras inmunogénicas son muy específicas para el organismo, la vacuna necesita comprender los componentes inmunogénicos de todas las variantes de las bacterias contra las cuales la vacuna debe proteger. Como una consecuencia de las mismas, las vacunas son muy complejas, toman tiempo y son caras para su desarrollo. Complicando además el diseño de las vacunas está el fenómeno de 'reemplazo de antígeno' . Esto ocurre cuando las nuevas cepas se vuelven prevalentes que son serológicamente y de esta manera antigénicamente distintas de aquellas cepas cubiertas por las vacunas. El estado inmune de las poblaciones en riesgo para infecciones hospitalarias complica además el diseño de la vacuna. Estos pacientes están inherentemente indispuestos y pueden aún inmunodeprimirse (debido al efecto de fármacos inmunodepresores ) resultando en inmunidad retardada o insuficiente contra los patógenos infectados. Además, excepto en el caso de ciertos procedimientos electivos, puede no ser posible identificar y vacunar a tiempo a los pacientes en riesgo para darles suficiente protección inmune de la infección. La administración directa de las inmunoglobulinas terapéuticas, también se refiere a inmunización pasiva, no requiere una respuesta inmunitaria del paciente y por lo tanto da protección inmediata. Además, la inmunización pasiva puede dirigirse a estructuras bacterianas que no son inmunogénicas y que son menos especificas para el organismo. La inmunización pasiva contra los organismos patogénicos se ha basado en inmunoglobulinas derivadas de suero de donantes humanos o no humanos. Sin embargo, los productos derivados de sangre tienen riesgos para la salud potenciales inherentemente asociados con estos productos. Además, las inmunoglobulinas pueden mostrar variación lote a lote y pueden ser de disponibilidad limitada en caso de exposiciones de masa repentinas. Los anticuerpos producidos recombinantemente no tienen estas desventajas y de esta manera ofrecen una oportunidad para reemplazar las inmunoglobulinas derivadas de sueros. Los anticuerpos monoclonales de murino que se dirigen contra los antigenos enterocócicos se conocen en la técnica (ver O 03/072607) . Sin embargo, los anticuerpos murinos se limitan para su uso in vivo debido a problemas asociados con la administración de anticuerpos de murino a humanos, tales como vida media de suero corto, una incapacidad para provocar ciertas funciones efectoras humanas y provocación de una respuesta inmunitaria dramática indeseada contra el anticuerpo de murino en un humano (HAMA) . La WO 99/18996 se refiere a antigenos y vacunas de enterococos. La WO 99/18996 además describe antisuero de conejo contra antigenos purificados conjugados de enterococos, y actividad opsónica de tal antisuero. Aunque la WO 99/18996 se refiere a anticuerpos humanos como moléculas deseadas, los anticuerpos actualmente descritos y usados en la presente son de origen de conejo, y estos documentos actualmente no describen actualmente ningunos anticuerpos humanos, ni secuencias de los mismos. En vista de su beneficio terapéutico en humanos, todavía existe de esta manera una necesidad para anticuerpos monoclonales humanos contra enterococos. Además, existe una necesidad en la técnica para anticuerpos humanos que puedan exterminar un intervalo más amplio de bacterias, tales como enterococos y estafilococos. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona estos anticuerpos y despliegue que pueden usarse en la medicina, en particular para diagnóstico, prevención y/o tratamiento de infecciones enterocócicas .

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 despliegue datos de un experimento in vivo. En el eje Y se despliegue CFU/ml en sangre de ratones, mientras que en el eje X los anticuerpos respectivos se describen. Los anticuerpos se usaron en una cantidad de 15 mg/kg, con la excepción de CR6016 y CR6241 los cuales se usaron en una cantidad de 7.5 mg/kg. Con la excepción de CR6043 y CR6071 todos los anticuerpos tienen un medio que difiere significativamente con tal del control IgG (P < 0.05 contra IgGl Ctrl.). DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Aquí abajo siguen las definiciones de términos como se usan en la invención. DEFINICIONES Secuencia de aminoácido El término "secuencia de aminoácido" como se usa en la presente se refiere a moléculas que se presentan naturalmentente o sintéticas y a una secuencia de péptidos, oligopéptidos, polipéptidos o proteínas. Molécula de unión Como se usa en la presente el término "molécula de unión" se refiere a una inmunoglobulina intacta incluyendo anticuerpos monoclonales , tales como anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados o humanos, o para un dominio variable y/o enlazado al antígeno que comprende fragmento de una inmunoglobulina que compite con la inmunoglobulina intacta para el unión especifico al compañero de unión de la inmunoglobulina, por ejemplo enterococos. Sin tener en cuenta la estructura, el fragmento enlazado al antigeno se enlaza con el mismo antigeno que se reconoce por la inmunoglobulina intacta. Un fragmento enlazado al antigeno puede comprender un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido de al menos 2 residuos de aminoácido contiguos, al menos 5 residuos de aminoácido contiguos, al menos 10 residuos de aminoácido contiguos, al menos 15 residuos de aminoácido contiguos, al menos 20 residuos de aminoácido contiguos, al menos 25 residuos de aminoácido contiguos, al menos 30 residuos de aminoácido contiguos, al menos 35 residuos de aminoácido contiguos, al menos 40 residuos de aminoácido contiguos, al menos 50 residuos de aminoácido contiguos, al menos 60 residuos de aminoácido contiguos, al menos 70 residuos de aminoácido contiguos, al menos 80 residuos de aminoácido contiguos, al menos 90 residuos de aminoácido contiguos, al menos 100 residuos de aminoácido contiguos, al menos 125 residuos de aminoácido contiguos, al menos 150 residuos de aminoácido contiguos, al menos 175 residuos de aminoácido contiguos, al menos 200 residuos de aminoácido contiguos, o al menos 250 residuos de aminoácido contiguos de la secuencia de aminoácido de la molécula de unión. El término "molécula de unión", como se usa en la presente incluye todas las clases y subclases de inmunoglobulina conocidas en la técnica. Dependiendo de la secuencia de aminoácido del dominio constante de sus cadenas pesadas, las moléculas de unión pueden dividirse en las cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de estos pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgAl, IgA2, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG . Los fragmentos unidos al antigeno incluyen, ínter alia, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, fragmentos de la región determinantes de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), anticuerpos de cadena sencilla (scFv, por sus siglas en inglés), anticuerpos de cadena sencilla bivalente, anticuerpos de fago de cadena sencilla, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos , (poli ) péptidos que contienen al menos un fragmento de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir el unión al antigeno especifico para el (poli ) péptido, etc. Los fragmentos anteriores pueden producirse sintéticamente o por desdoblamiento enzimático o químico de inmunoglobulinas intactas o puede prepararse por ingeniería genética por técnicas de ADN recombinante . Los métodos de producción son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Antibodies: A Laboratory Manual, Editado por: E. Harlow and D, Lañe (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, el cual se incorpora en la presente para referencia. Una molécula de unión o fragmento enlazado al antigeno del mismo puede tener uno o más sitios de unión. Si existe más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos uno con el otro o pueden ser diferentes. La molécula de unión puede ser una molécula de unión descubierta o no conjugada pero también puede ser parte de un inmunoconj ugado . Una molécula de unión descubierta o no conjugada se pretende para referirse a una molécula de unión que no está conjugada, ligada operativamente o de otra manera asociada físicamente o funcionalmente con una porción o etiqueta efectora, tal como inter alia una substancia tóxica, una substancia radioactiva, un liposoma, una enzima. Se entenderá que las moléculas de unión descubiertas o no conjugadas no excluyen moléculas de unión que se han estabilizado, multimerizado, humanizado o en cualquier otra forma manipulado, diferente del unión de una porción o etiqueta efectora. En consecuencia, todas las moléculas de unión descubiertas y no conjugadas modificadas post-traduccionalmente se incluyen con esto, incluyendo donde se hacen las modificaciones en el ambiente celular que produce molécula de unión natural, por una célula que produce molécula de unión, y se introducen por la mano del hombre después de la preparación de la molécula de unión inicial. Por supuesto, el término molécula de unión descubierta o no conjugada no excluye la capacidad de la molécula de unión para formar asociaciones funcionales con células y/o moléculas efectoras después de la administración al cuerpo, ya que algunas de tales interacciones son necesarias con objeto de ejercer un efecto biológico. La carencia del grupo o etiqueta efectora asociada por lo tanto se aplica en la definición para la molécula de unión descubierta o no conjugada in vitro, no in vivo. Despliegue biológica Como se usa en la presente, el término "despliegue biológica" abarca una variedad de tipos de despliegue, incluyendo sangre y otras despliegues liquidas de origen biológico, despliegues de tejido sólido tales como un espécimen de biopsia o cultivos de tejido, o células derivadas de estos y la progenie de los mismos. El término también incluye despliegues que se han manipulado en cualquier forma después de su obtención, tal como por tratamiento con reactivos, solubilización, o enriquecimiento para ciertos compuestos, tales como proteínas o polinucleótidos . El término abarca varios tipos de despliegues clínicas obtenidas de cualesquiera especies, y también incluye células en cultivo, sobrenadantes celulares y lisados celulares. Regiones determinantes de la complementariedad (CDR) El término "regiones determinantes de la complementariedad" como se usa en la presente significa secuencias dentro de las regiones variables de las moléculas de unión, tales como inmunoglobulinas, que usualmente contribuyen a una extensión grande para el sitio enlazado al antigeno que está complementariamente en la distribución de forma y carga para el epitopo reconocido en el antigeno. Las regiones CDR pueden ser especificas para epitopos lineales, epitopos discontinuos, o epitopos conformacionales de proteínas o fragmentos de proteína, ya sea como se presentan en la proteína en su conformación nativa o, en algunos casos, como se presentan en las proteínas como desnaturalizados, por ejemplo, por solubilización en SDS. Los epitopos también pueden consistir de modificaciones post-traduccionales de proteínas . Eliminación El término "eliminación", como se usa en la presente, denota un cambio en cualquier secuencia de aminoácido o nucleótido en la cual uno o más residuos de aminoácido o nucleótido, respectivamente, están ausentes como se compara con el precursor, a menudo se presenta naturalmente, la molécula. Secuencia de ácido nucleico que regula la expresión El término "secuencia de ácido nucleico que regula la expresión" como se usa en la presente se refiere a secuencias de polinucleótido necesarias para y/o afectar la expresión de una secuencia codificadora ligada operablemente en un organismo hospedero particular. Las secuencias de ácido nucleico que regulan la expresión, tales como secuencias de inicio, terminación, promotoras, aumentadoras de transcripción apropiada ir¡ter alia; secuencias represoras o activadoras ; señales de procesamiento de ARN eficientes tales como señales de empalme y poliadenilacion; secuencias que estabilizan el mARN citoplásmico ; secuencias que aumentan la eficiencia de traducción (por ejemplo, sitios unidos a la ribosoma) ; secuencias que aumentan la estabilidad de proteína; y cuando se desea, secuencias que aumentan la secreción de proteínas, pueden ser cualquier secuencia de ácido nucleico que muestre actividad en el organismo hospedero de elección y pueda derivarse de proteínas que codifican genes, las cuales son ya sea homologas o heterólogas para el organismo hospedero. La identificación y empleo de las secuencias que regulan la expresión es de rutina para la persona experimentada en la técnica . Variante funcional El término "variante funcional", como se usa en la presente, se refiere a una molécula de unión que comprende una secuencia de nucleótido y/o aminoácido que se altera por uno o más nucleótidos y/o aminoácidos comparados con las secuencias de nucleótido y/o aminoácido de la molécula de unión progenitora y que es todavía capaz de competir para unirse al compañero de unión, por ejemplo enterococos, con la molécula de unión progenitora. En otras palabras, las modificaciones en la secuencia de aminoácido y/o nucleótido para la molécula de unión progenitora no afecta o altera significativamente las características de unión de la molécula de unión codificada por la secuencia de nucleótido o que contiene la secuencia de aminoácido, es decir la molécula de unión todavía es capaz de reconocer y enlazar su objetivo. La variante funcional puede tener modificaciones de secuencia conservadoras incluyendo substituciones, adiciones y eliminaciones de nucleótido y aminoácido. Estas modificaciones pueden introducirse por técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR aleatorio, y puede comprender nucleótidos y aminoácidos naturales así como no naturales. Las substituciones de aminoácido conservadoras incluyen unas en las cuales el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene propiedades estructurales o químicas similares. Las familias de los residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina, triptofano) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina) , cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano) . Estará claro para el técnico experimentado que otras clasificaciones de las familias de residuo de aminoácido que se usan arriba también pueden emplearse. Además, una variante puede tener substituciones de aminoácido no conservadoras por ejemplo, reemplazo de un aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene propiedades estructurales o químicas diferentes. Las variaciones similares menores también pueden incluir eliminaciones o inserciones de aminoácido, o ambas. La orientación al determinar cuales residuos de aminoácido pueden substituirse, insertarse, o eliminarse sin actividad inmunológica suprimida puede encontrarse usando programas de computadora bien conocidos en la técnica. Una mutación en una secuencia de nucleótidos puede ser una alteración sencilla hecha en un lugar (una mutación de punto) , tales como mutaciones de transición o transversión, o alternativamente, los nucleótidos múltiples pueden insertarse, eliminarse o cambiarse a un lugar sencillo. Además, una o más alteraciones pueden hacerse en cualquier número de lugar dentro de una secuencia de nucleótido. Las mutaciones pueden realizarse por cualquier método adecuado conocido en la técnica . Hospedero El término "hospedero", como se usa en la presente, se pretende para referir a un organismo o una célula en la cual se ha introducido un vector tal como un vector de clonación o un vector de expresión. El organismo o célula puede ser procariótico o eucariótico. Deberá entenderse que este término pretende referirse no solamente al organismo o célula sujeto particular, sino a la progenie de tal organismo o célula también. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones subsiguientes debido a cualesquiera influencias de mutación o ambientales, tal progenie puede de hecho, no ser idéntica, al organismo o célula progenitora, pero todavía se incluyen dentro del alcance del término "hospedero" como se usa en la presente. Humano El término "humano", cuando aplica a moléculas de unión como se define en la presente, se refiere a moléculas que son ya sea directamente derivadas de un humano o con base en una secuencia humana. Cuando una molécula de unión se deriva de o está basada en una secuencia humana y posteriormente modificada, todavía se considera humana como se usa a lo largo de la especificación. En otras palabras, el término humano, cuando aplica a moléculas de unión pretende incluir moléculas de unión que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de linea de germinal humana o con base en regiones variables o constantes que se presentan en un humano o linfocito humano y se modifican de alguna forma. De esta manera, las moléculas de unión humanas pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana, que comprende substituciones y/o eliminaciones (por ejemplo, las mutaciones introducidas por, por ejemplo mutagénesis especificas del sitio o aleatorias in vitro o por mutación somática in vivo) . "Basado en" como se usa en la presente se refiere a la situación de que una secuencia de ácido nucleico puede copiarse exactamente de una plantilla, o con mutaciones menores, tales como por métodos PCR propensos al error, o sintéticamente hechos iguales a la plantilla exactamente o con modificaciones menores. Las moléculas semi-sintét icas basadas en secuencias humanas también se consideran para ser humanas como se usan en la presente. Inserción El término "inserción", también conocido como el término "adición", denota un cambio en una secuencia de aminoácido o nucleótido que resulta en la adición de uno o más residuos de aminoácido o nucleótido, respectivamente, cuando se compara con la secuencia progenitora.

Actividad intrínseca El término "actividad intrínseca", cuando se aplica a moléculas de unión como se definen en la presente, se refiere a moléculas de unión que pueden enlazar ciertos antígenos de proteína o carbohidrato en la superficie de patógenos tales como bacterias y que pueden inhibir la capacidad del patógeno para crecer y dividirse normalmente. Tales moléculas de unión pueden por ejemplo bloquear la entrada de los nutrientes específicos requeridos para el crecimiento o el transporte de elementos de desecho tóxico de las bacterias. A través de la última acción también pueden incrementar la sensibilidad de bacterias para la acción de fármacos antibióticos. Aislado El término "aislado", cuando se aplica a moléculas de unión como se define en la presente, se refiere a moléculas de unión que están substancialmente libres de otras proteínas o polipéptidos , particularmente libres de otras moléculas de unión que tienen especificidades antigénicas diferentes, y también están substancialmente libres de otros químicos y/o material celular. Por ejemplo, cuando las moléculas de unión se producen recombinantemente, preferiblemente están substancialmente libres de medio de cultivo, y cuando las moléculas de unión se producen por síntesis química, preferiblemente están substancialmente libres de precursores químicos u otros químicos, esto es, se separan de precursores químicos u otros químicos los cuales se involucran en la síntesis de la proteína. El término "aislado" cuando se aplica a moléculas de unión que codifican moléculas de ácido nucleico como se define en la presente, pretende referirse a moléculas de ácido nucleico en las cuales las secuencias de nucleótido que codifican las moléculas de unión están libres de otras secuencias de nucleótido, particularmente moléculas de unión que codifican las secuencias de nucleótido que enlazan compañeros de unión diferentes de enterococos. Además, el término "aislado" se refiere a moléculas de ácido nucleico que están substancialmente separadas de otros componentes celulares que acompañan naturalmente a la molécula de ácido nucleico nativa en su hospedero natural, por ejemplo, secuencias de ribosomas, polimerasas, o genómicas con las cuales se asocia naturalmente. Por lo tanto, moléculas de ácido nucleico "aisladas", tales como moléculas de cADN, pueden estar substancialmente libres de otro material celular, o medio de cultivo cuando se producen por técnicas de recombinación, o substancialmente libres de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan químicamente. Anticuerpo monoclonal El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpos de composición molecular sencilla. Un anticuerpo monoclonal despliegue una especificidad y afinidad de unión sencilla para un epitopo particular. En consecuencia, el término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a un anticuerpo que despliegue una especificidad de unión sencilla la cual tiene regiones variables y constantes derivadas de o basadas en secuencias de inmunoglobulinas de linea germinal humana o derivadas de secuencias sintéticas completamente. El método para preparar el anticuerpo monoclonal no es relevante. Se presenta naturalmente El término "se presenta naturalmente" como se usa en la presente cuando se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleót ido que se presenta en un organismo que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y el cual no se ha modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio se presenta naturalmente. Molécula de ácido nucleico El término "molécula de ácido nucleico" como se usa en la presente invención se refiere a una forma polimérica de nucleótidos e incluye tanto hebras de sentido como de antisentido de ARN, cADN, ADN genómico, y formas sintéticas y polímeros mezclados de los anteriores. Un nucleótido se refiere a un ribonucleótido, desoxinucleótido o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término también incluye formas de hebra sencilla y doble de ADN. Además, un polinucleótido puede incluir cualquiera o ambos nucleótidos que se presentan naturalmente o modificados ligados juntos por ligaduras de nucleótido que se presentan naturalmente y/o que no se presentan naturalmente. Las moléculas de ácido nucleico pueden modificarse químicamente o bioquímicamente o pueden contener bases de nucleótido no naturales o derivadas, como se apreciará fácilmente por aquellos de experiencia en la técnica. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, etiquetas, metilación, substitución de uno o más de los nucleótidos que se presentan naturalmente con un análogo, modificaciones internucleótido tales como ligaduras sin carga (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres , fosforamidatos , carbamatos, etc.), ligaduras cargadas (por ejemplo, fosforotioatos , fosforoditioatos , etc.), porciones pendientes (por ejemplo, polipéptidos ) , intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), queladores, alquiladores, y ligaduras modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos anoméricos alfa, etc.). El término anterior también se pretende para incluir cualquier conformación topológica, incluyendo conformaciones de hebra sencilla, hebra doble, parcialmente doble, triple, horquilla, circulares y candado. También se incluyen moléculas sintéticas que imitan a los polinucleótidos imitadores en su capacidad para unirse a una secuencia designada por medio de unión a hidrógeno y otras interacciones químicas. Tales moléculas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, aquellas en las cuales las ligaduras de péptido se substituyen por ligaduras de fosfato en la estructura de la molécula'. Una referencia para una secuencia de ácido nucleico abarca su complemento a menos que se especifique de otra manera. De esta manera, una referencia para una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia particular deberá entenderse para abarcar su hebra complementaria, con su secuencia complementaria. La hebra complementaria también es útil, por ejemplo, para terapia anti-sentido, sondas de hibridación y cebadores PCR. Enlazado operablemente El término "enlazado operablemente" se refiere a dos o más elementos de secuencia de ácido nucleico que se enlazan de manera usual físicamente y están en una relación funcional uno con el otro. Por ejemplo, un promotor se liga operablemente a una secuencia de codificación, si el promotor es capaz de iniciar o regular la transcripción o expresión de una secuencia de codificación, en cuyo caso la secuencia de codificación deberá entenderse como que está "bajo el control del" promotor. Actividad opsónica "Actividad opsónica" se refiere a la capacidad de una opsonina (generalmente cualquier molécula de unión, por ejemplo un anticuerpo, o factores de complemento de suero) para unirse a la superficie de un patógeno ya sea por reconocimiento antigénico especifico (en el caso de anticuerpos) o a través del efecto catalítico de las moléculas de unión a la superficie (por ejemplo la deposición incrementada de C3b como un resultado de anticuerpos unidos a la superficie) . La fagocitosis de patógenos opsonizados se aumenta debido al reconocimiento específico de receptores en el fagocito para la opsonina (el receptor Fe en caso de que los anticuerpos por si mismos son las opsoninas y el receptor complemento en caso de que el complemento es la opsonina) . Ciertas bacterias, especialmente bacterias encapsuladas que resisten la fagocitosis debido a la presencia de la cápsula, se vuelven extremadamente atractivas para los fagocitos tales como neutrófilos y macrófagos cuando se recubren con un anticuerpo opsónico y su velocidad de depuración del torrente sanguíneo y órganos infectados se aumenta sorprendentemente. La actividad opsónica puede medirse en cualquier manera convencional (por ejemplo ensayo de exterminación fagocítica opsónica) . Excipiente farmacéuticamente aceptable Por "excipiente farmacéuticamente aceptable" significa cualquier substancia inerte que se combine con una molécula activa tal como un fármaco, agente, o molécula de unión para preparar una forma de dosificación agradable o conveniente. El "excipiente farmacéuticamente aceptable" es un excipiente que no es tóxico a recipientes en las dosificaciones y concentraciones empleadas, y es compatible con otros ingredientes de la formulación que comprenden el fármaco, agente o molécula de unión. Unión especifica El término "unión especifica", como se usa en la presente, con referencia a la interacción de una molécula de unión, por ejemplo un anticuerpo, y su compañero de unión, por ejemplo un antigeno, significa que la interacción es dependiente de la presencia de una estructura particular, por ejemplo un determinante antigénico o epitopo, en el compañero de unión. En otras palabras, el anticuerpo preferencialmente enlaza o reconoce el compañero de unión aún cuando el compañero de unión se presenta en una mezcla de otras moléculas u organismos. El unión puede mediarse por interacciones covalentes o no covalentes o una combinación de ambos. Aún en otras palabras, el término "unión especifica" significa unión inmunoespecificamente a un antigeno o un fragmento del mismo y sin unión inmunoespeci ficamente a otros antigenos. Una molécula de unión que se enlaza inmunoespecificamente a un antigeno puede unirse a otros péptidos o polipéptidos con afinidad más baja como se determina por, por ejemplo, radioinmunoensayos (RIA, por sus siglas en inglés), ensayos inmunosorbentes ligados a la enzima (ELISA, por sus siglas en inglés), BIACORE, u otros ensayos conocidos en la técnica. Las moléculas de unión o fragmentos de los mismos que se enlazan inmunoespecif icamente a un antigeno pueden ser reactivos cruzados con antigenos relacionados. Preferiblemente, las moléculas de unión o fragmentos de los mismos que se enlazan inmunoespecificamente a un antigeno no son reactivos cruzados con otros antigenos. Substituciones Una "substitución", como se usa en la presente, denota el reemplazo de uno o más aminoácidos o nucleótidos por diferentes aminoácidos o nucleótidos, respectivamente. Cantidad terapéuticamente efectiva El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de la molécula de unión como se define en la presente que es efectiva para prevenir, aliviar y/o tratar una condición que resulta de una infección con Enterococos . Tratamiento El término "tratamiento" se refiere a tratamiento terapéutico asi como mediciones profilácticas o preventivas para curar o detener o al menos retardar el progreso de la enfermedad. Aquellos que necesitan de tratamiento incluyen aquellos fácilmente provocados con una condición que resulta de infección con Enterococos asi como aquellos en los cuales la infección con Enterococos es para prevenirse. Los sujetos parcialmente o totalmente recuperados de la infección con Enterococos pueden también necesitar de tratamiento. La prevención abarca inhibir o reducir la extensión de Enterococos o inhibir o reducir el comienzo, desarrollo o avance de uno o más de los síntomas asociados con la infección con Enterococos . Vector El término "vector" denota una molécula de ácido nucleico en la cual una segunda molécula de ácido nucleico puede insertarse para introducción en un hospedero donde se replicará, y en algunos casos se expresará. En otras palabras, un vector es capaz de transportar una molécula de ácido nucleico a la cual se ha ligado. Los vectores de clonación así como de expresión se contemplan por el término "vector", como se usa en la presente. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC, por sus siglas en inglés) y cromosomas artificiales de levadura (YAC, por sus siglas en inglés) y vectores derivados de bacteriófagos o virus de plantas o animales (incluyendo humanos) . Los vectores comprenden un origen de replicación reconocido por el hospedero propuesto y en el caso de vectores de expresión, el promotor y otras regiones reguladoras se reconocen por el hospedero. Un vector que contiene una segunda molécula de ácido nucleico se introduce en una célula por transformación, transíección, o al hacer uso de mecanismos de entrada víricos. Ciertos vectores pueden replicacion autónoma en un hospedero en el cual se introducen (por ejemplo, vectores que tienen un origen bacteriano de replicacion pueden replicarse en las bacterias) . Otros vectores pueden integrarse en el genoma de un hospedero durante la introducción en el hospedero, y por ello se replican junto con el genoma hospedero. La invención proporciona moléculas de unión humanas capaces de unirse específicamente a los enterococos y mostrar Actividad exterminadora y/o actividad que inhibe el crecimiento contra los enterococos. La invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican al menos la región de unión de las moléculas de unión humanas. La invención se proporciona además para el uso de las moléculas de unión humanas de la invención en la profilaxis y/o tratamiento de un sujeto que tiene, o está en riesgo de desarrollar, una infección por Enterococos . Además de que, la invención se refiere al uso de las moléculas de unión humanas de la invención en el diagnóstico/detección de Enterococos . En un primer aspecto la presente invención abarca moléculas de unión capaces de unirse específicamente a una especie de Enterococos . Preferiblemente, las moléculas de unión son moléculas de unión humanas. Preferiblemente, las moléculas de unión de la invención desplieguen actividad exterminadora contra una especie de Enterococos . En un aspecto adicional las moléculas de unión de la invención pueden unirse específicamente a, y/o tienen actividad exterminadora contra al menos dos especies diferentes de Enterococos . Preferiblemente las moléculas de unión de la invención pueden unirse específicamente a, y/o tienen actividad exterminadora contra al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, al menos trece, al menos catorce, al menos quince, al menos dieciséis, al menos diecisiete especies diferentes de Enterococos . Las especies de Enterococos a las que las moléculas de unión de la invención pueden unirse específicamente, y/o contra las que tienen actividad exterminadora se seleccionan del grupo que consiste de E. asini, E. avium, E. casseliflavus, E. cecorum, E. columbae, E. dispar, E. durans , E. faecalis , E. faecium, E. flavescens , E. gallinarum, E. gilvus, E. haemoperxidus , E. hirae, E. malodoratus , E. moraviensis , E. mundtii, E. pallens, E. porcinus, E. pseudoavium , E. raffinosus, E. ratti, E. saccharolyticus , E. seriolicida , E. solitarius , E. sulfureus, E. villorum, con E. faecalis y E. faecium son especies preferidas. En una modalidad las moléculas de unión de la invención pueden unirse específicamente a y tienen actividad exterminadora contra diferentes cepas dentro de una especie Enterococos. En otra modalidad, las moléculas de unión de la invención pueden aún ser capaces de unirse específicamente y/o tener actividad exterminadora contra al menos otra bacteria Gram positivo y/o bacteria Gram negativo incluyendo, pero no limitado a, estreptococos de grupo A; Streptococcus pyrogenes, estreptococos de grupo B; Streptococcus agalactiae, Streptococcus milleri, Streptococcus pneumoniae, estreptococos Viridans; Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis , Corynebacterium diphtheriae , Corynebacterium ulcerans , Corynebacterium pseudotuberculosis , Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium pseudodiphtheriticum , Bacillus anthracis , Bacillus cereus , histeria monocytogenes , Clostridium perfringens, Clostridium tetani , Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium leprae, Actinomyces israelii , Norcardia asteroides , Norcardia brasiliensis , Escherichia colir Proteus mirabilis , Proteus vulgaris , Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, B y C, Salmonella enteritidis , Salmonella cholerae-suis , Salmonella virchow, Salmonella typhimurium , Shigella dysenteriae, Shigella boydii, Shígella flexneri , Shigella sonnei , Pseudomonas aeruginosa , Pseudomonas mallei, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus , Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus , Campylobacter pylori , Helicobacter pylori, Campylobacter . jejuni, Bacteroides fragilis , Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis , Branhamella catarrhalis , Haemophilus ínfluenzae, Haemophilus ducreyi, Bordetella pertussis , Brucella abortus, Brucella abortus , Brucella melitensis, Legionella pneumophila, Treponema pallidum , Treponema carateum , Leptospira interrogans , Leptospira biflexa, Borrelia recurrentis , Borrelia burgdorferi, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetii, Clamydia trachomatis , Clamydia psittaci, Clamydia pneumoniae . Las moléculas de unión de la invención pueden ser capaces de unirse específicamente a los enterococos y opcionalmente otras bacterias Gram positivas y/o Gram negativas que son viables, vivas y/o infecciosas o que están en forma inactivada/atenuada . Los métodos para bacterias inactivadas/atenuadas son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, tratamiento antibiótico, tratamiento UV, tratamiento con formaldehído, etc. Las moléculas de unión de la invención también pueden ser capaces de unirse específicamente a uno o más fragmentos de los enterococos (y otras bacterias Gram positivas y/o Gram negativas) tales como ínter alia una preparación de una o más proteínas y/o (poli ) péptidos derivados de enterococos o una o más proteínas y/o polipéptidos enterocócicos producidos recombinantemente . Para los métodos de tratamiento y/o prevención de las infecciones enterocócicas las moléculas de unión son capaces preferiblemente de unirse específicamente a proteínas accesibles de superficie de enterococos. Para los propósitos de diagnóstico las moléculas de unión también pueden ser capaces de unirse específicamente a proteínas no presentes en la superficie de enterococos. La secuencia de nucleótido y/o aminoácido de proteínas de varias especies Enterococos y cepas pueden encontrarse en la base de datos del GenBank, base de datos EMBL y/u otras bases. Esto está bien dentro del alcance de la persona experimentada para encontrar tales secuencias en las bases de datos respectivas. Alternativamente, las moléculas de unión de la invención también pueden ser capaces de unirse específicamente a otras moléculas enterocócicas incluyendo, pero no limitado a, factores de superficie que inhiben la sumersión fagocítica; factores que aumentan su sobrevivencia en fagocitos; invasinas que lisan las membranas celulares eucarióticas ; exotoxinas que dañan los tejidos hospederos o de otra manera provocan síntomas de enfermedad; polisacáridos ; otros componentes de la pared celular tales como ácido teicoico, ácido lipoteicoico, ribitol, peptidoglicano, oligopéptido de pentaglicina, N-acetilglucosamina, ácido N-acetilmurámico, ácido N-acetilgalactosaminurónico, N-acetilfucosamina, ácido N-acetilglucosaminurónico, ácido N-acetilmanosaminurónico, 0-acetilo, glucosamina, ácido murámico, ácido galactosaminurónico, fucosamina, ácido glucosaminurónico, ramnosa de ácido manosaminurónico, hexosamina, hexosa, kojibiosa, fosfato de glicerol, fosfato de ribitol y unidades de ligadura entre cualquiera de estos componentes.

En otra modalidad las moléculas de unión de la invención pueden unirse específicamente a un fragmento de las proteínas mencionadas arriba y/u otras moléculas, en donde el fragmentos al menos comprende un determinante antigénico reconocido por las moléculas de unión de la invención. Un "determinante antigénico" como se usa en la presente es una porción que es capaz de unirse a una molécula de unión de la invención con afinidad suficientemente alta para formar un complejo de molécula de unión al antígeno detectable. Las moléculas de unión de la invención pueden ser moléculas de inmunoglobulina intactas tales como anticuerpos policlonales o monoclonales o las moléculas de unión pueden ser fragmentos unidos al antígeno incluyendo, pero no limitado a, Fab, F(ab'), F(ab')2, Ev, dAb, Fd, fragmentos de región determinante complementaria (CDR, por sus siglas en inglés), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla bivalente, anticuerpos de fago de cadena sencilla, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos , y (poli ) péptidos que contienen al menos un fragmento de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir antígeno específico enlazado a enterococos o un fragmento del mismo. En una modalidad preferida las moléculas de unión de la invención son anticuerpos monoclonales humanas. Las moléculas de unión de la invención pueden usarse en forma aislada o no aislada. Además, las moléculas de unión de la invención pueden usarse solas o en una mezcla que comprende al menos una molécula de unión (o variante o fragmento del mismo) de la invención. En otras palabras, las- moléculas de unión pueden usarse en combinación, por ejemplo, como una composición farmacéutica que comprende dos o más moléculas de unión de la invención, variantes o fragmentos de las mismas. Por ejemplo, las moléculas de unión tienen actividades diferentes, pero complementarias pueden combinarse en una terapia sencilla para alcanzar un efecto profiláctico, terapéutico o de diagnóstico, pero alternativamente, las moléculas de unión que tienen actividades idénticas también pueden combinarse en una terapia sencilla para alcanzar un efecto profiláctico, terapéutico o de diagnóstico. Opcionalmente, la mezcla además comprende al menos otro agente terapéutico. Preferiblemente, el agente terapéutico tal como por ejemplo un antibiótico es útil en la profilaxis y/o tratamiento de una infección enterocócica . Típicamente, las moléculas de unión de acuerdo a la invención pueden enlazar a sus compañeros de unión, esto es, enterococos o fragmentos de las mismas, con una constante de afinidad (valor Kd) que es menor que 0.2*10"4 M, 1.0*10~5 M, 1.0*10"6 M, 1.0*10"7 M, preferiblemente menor que 1.0*10"8 M, más preferiblemente menor que 1.0*10~9 M, más preferiblemente menor que 1.0*10~10 M, aún más preferiblemente menor que 1.0*10-11 M, y en particular menor que 1.0*10-12 M. Las constantes de afinidad pueden variar para isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, el unión de afinidad para un isotipo IgM se refiere a una afinidad de unión de al menos alrededor de 1.0*10~7 M. Las constantes de afinidad pueden por ejemplo medirse usando resonancia de plasmón de superficie, por ejemplo usando el sistema BIACORE (Pharmacia Biosensor AB, üppsala, Suecia) . Las moléculas de unión de acuerdo con la invención pueden enlazar a los enterococos o un fragmento de las mismas en forma soluble tales como por ejemplo en una despliegue o en suspensión o pueden unirse a los enterococos o un fragmento de los mismos enlazado o unido a un portador o substrato, por ejemplo, placas de microtitulación, membranas y perlas, etc. Los portadores o substratos pueden hacerse de vidrio, plástico (por ejemplo, poliestireno) , polisacáridos , nylon, nitrocelulosa, o Teflón, etc. La superficie de tales soportes puede ser sólida o porosa y de cualquier forma conveniente. Además, las moléculas de unión pueden unirse a los enterococos en forma purificada/aislada o no purificada/no aislada. Las moléculas de unión de la invención desplieguen actividad exterminadora . La actividad exterminadora como significa aquí incluye, pero no se limita a, actividad opsónica o cualquier otra actividad de fagocitosis incrementada /aumentada / potenciada y/o exterminación fagocitica de bacterias, por ejemplo, enterococos; actividad intrínseca (exterminadora) , por ejemplo reduce o inhibe el crecimiento bacteriano o directamente extermina las bacterias; incrementa la sensibilidad de bacterias para el tratamiento antibiótico; o cualquier combinación de los mismos. La actividad opsónica puede por ejemplo meirse como se describe en la presente. Los ensayos alternativos para medir la actividad opsónica se describen en por ejemplo Manual of Molecular and Clinical Laboratory Immunology, 7a Edición. Los ensayos para medir las otras actividades mencionadas también se conocen. En una modalidad preferida, las moléculas de unión de acuerdo a la invención comprenden al menos una región CDR3, preferiblemente una región CDR3 de cadena pesada, que comprende la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:226, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:256, SEQ ID NO:262, SEQ ID NO:268, SEQ ID NO:274, SEQ ID NO:280, SEQ ID NO:286, SEQ ID NO:292, SEQ ID NO:298, SEQ ID NO:304 , SEQ ID NO:310, SEQ ID NO:316, SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:328, SEQ ID NO:334, SEQ ID NO:340, y SEQ ID NO: 346. Las regiones CDR de las moléculas de unión de la invención se desplieguen en la Tabla 11. Las regiones CDR son de acuerdo a Kabat et al. (1991) como se describe en Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico . En una modalidad las moléculas de unión pueden comprender dos, tres, cuatro, cinco o aún todas las seis regiones CDR de las moléculas de unión de la invención. En aún otra modalidad, las moléculas de unión de acuerdo a la invención comprenden una cadena pesada que comprende la cadena pesada variable de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:211, SEQ ID NO:213, SEQ ID NO:395, SEQ ID NO:397, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:401, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:405, SEQ ID NO:407, SEQ ID NO:409, SEQ ID NO:411, SEQ ID NO:413, SEQ ID NO:415, SEQ ID NO:417, SEQ ID NO:419, SEQ ID NO:421, SEQ ID NO:423, SEQ ID NO:425, SEQ ID NO:427, SEQ ID NO:429, SEQ ID NO:431, SEQ ID NO:433, SEQ ID NO:435, y SEQ ID NO:437. En una modalidad adicional, las moléculas de unión de acuerdo a la invención comprenden una cadena ligera que comprende la cadena ligera variable de la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:439, SEQ ID NO:441, SEQ ID NO:443, SEQ ID NO:445, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:449, SEQ ID NO:451, SEQ ID NO:453, SEQ ID NO:455, SEQ ID NO:457, SEQ ID NO:459, SEQ ID NO:461, SEQ ID NO:463, SEQ ID NO:465, SEQ ID NO:467, SEQ ID NO:469, SEQ ID NO:471, SEQ ID NO:473, SEQ ID NO:475, SEQ ID NO:477, SEQ ID NO:479, y SEQ ID NO:481. La Tabla 12 especifica las regiones variables de cadenas pesadas y ligeras de la molécula de unión de la invención. Otro aspecto de la invención incluye variantes funcionales de las moléculas de unión como se definen en la presente. Las moléculas se consideran para ser variantes funcionales de una molécula de unión de acuerdo a la invención, si las variantes pueden competir para enlazar específicamente a los enterococos (u otras bacterias Gram-positivas y/o Gram-negativas) o un fragmento del mismo con las moléculas de unión humano parental. En otras palabras, cuando las variantes funcionales todavía pueden enlazar a los enterococos o un fragmento del mismo. Preferiblemente, las variantes funcionales pueden competir para enlazar específicamente al menos dos (o más) especies de Enterococos diferentes o fragmentos del mismo que se enlazan específicamente por las moléculas de unión humano parental. Adicionalmente, las moléculas se consideran para ser variantes funcionales de una molécula de unión de acuerdo a la invención, si tienen actividad exterminadora contra enterococos, preferiblemente contra al menos dos (o más) especies de Enterococos contra la cual la molécula de unión progenitora exhibe actividad exterminadora . En otra modalidad las variantes funcionales de una molécula de unión de acuerdo a la invención tienen también actividad exterminadora contra otras bacterias Gram-positivas y/o Gram-negativas . Las variantes funcionales incluyen, pero no se limitan a, derivados que son substancialmente similares derivados similar en la secuencia estructural primaria, pero que contienen por ejemplo, modificaciones in vitro o in vivo, químicas y/o bioquímicas, que no se encuentran en la molécula de unión progenitora. Tales modificaciones incluyen ínter alia acetilación, acilación, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, ligadura cruzada, formación de unión de disulfuro, glicosilación, hidroxilación, metilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, y similares. Alternativamente, las variantes funcionales pueden ser moléculas de unión como se define en la presente invención que comprende una secuencia de aminoácidos que contienen substituciones, inserciones, supresiones o combinaciones de los mismos de uno o más aminoácidos comparados a las secuencias de aminoácidos de las moléculas progenitoras de unión. Adicionalmente, las variantes funcionales pueden comprender truncamientos de la secuencia de aminoácidos en cualquier o ambas terminales de amino o carboxilo. Las variantes funcionales de acuerdo a la invención pueden tener las mismas o diferentes, ya sea más alta o más baja, afinidades de unión comparadas a la molécula de unión progenitora pero son capaces todavía de enlazar a los enterococos o un fragmento del mismo. Por ejemplo, las variantes funcionales de acuerdo a la invención pueden tener incremento o disminución de afinidades de unión para los enterococos o un fragmento del mismo comparado a las moléculas de unión progenitoras . Preferiblemente, las secuencias de aminoácidos de las regiones variables, incluyendo, pero no limitadas a, regiones estructurales, regiones hipervariables , en particular las regiones CDR3, se modifican. Generalmente, las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada comprenden tres regiones hipervariables, que comprenden tres CDR, y más regiones conservadas, las llamadas regiones estructurales (FR). Las regiones hipervariables comprenden residuos de aminoácidos de CDR y residuos de aminoácidos de rizos hipervariables. Las variantes funcionales pretenden caer dentro del alcance de la presente invención para tener al menos alrededor de 50% hasta alrededor de 99%, preferiblemente al menos alrededor de 60% hasta alrededor de 99%, más preferiblemente al menos alrededor de 70% hasta alrededor de 99%, incluso más preferiblemente al menos alrededor de 80% hasta alrededor de 99%, más preferiblemente al menos alrededor de 90% hasta alrededor de 99%, en particular al menos alrededor de 95% hasta alrededor de 99%, y en particular al menos alrededor de 97% hasta alrededor de 99% de secuencia de aminoácidos homologas con las moléculas de unión humano progenitoras como se define en la presente. Los algoritmos computarizados tal como inter alia Gap o Bestfit conocidos por una persona experta en la técnica se pueden usar para secuencias de aminoácidos alineadas óptimamente para compararse y para definir residuos de aminoácidos similares o idénticos. Las variantes funcionales se pueden obtener por alterar las moléculas progenitoras de unión o partes del mismo por métodos biológicos generales o moleculares conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitadas a, PCR propenso al error, mutagénesis dirigida al oligonucleótido, mutagénesis dirigido al sitio y cadena pesado y/o ligera intercalada. En una modalidad las variantes funcionales de la invención tienen actividad exterminadora contra enterococos. La actividad exterminadora puede ya sea ser idéntica, o ser mayor o menor comparada con las moléculas progenitoras de unión. Adicionalmente , las variantes funcionales que tienen actividad exterminadora pueden tener una actividad adicional adecuada en control enterocócico . Otras actividades se mencionan anteriormente. De aqui en adelante, cuando el término molécula de unión (humano) se usa esto también abarca variantes funcionales de la molécula de unión (humano) .

La invención proporciona un panel de anticuerpos monoclonales humanos útiles que tienen actividad exterminadora fagocitica opsónica contra al menos una cepa de cada uno de al menos dos especies Enterococos diferentes y contra al menos una cepa de Staphylococcus aureus. Los anticuerpos de la invención comprenden regiones variables de cualquiera de los anticuerpos CR5140 (SEQ ID NOs 395 + 439), CR5157 (SEQ ID NOs 397 + 441), CR6016 (SEQ ID NOs 88 + 108), CR6043 (SEQ ID NOs 90 + 110), CR6050 (SEQ ID NOs 401 + 445), CR6078 (SEQ ID NOs 96 + 116), CR6087 (SEQ ID NOs 211 + 215), CR6089 (SEQ ID NOs 213 + 217), CR6241 (SEQ ID NOs 98 + 118), CR6252 (SEQ ID NOs 100 + 120), CR6388 (SEQ ID NOs 421 + 465), CR6389 (SEQ ID NOs 423 + 467), CR6396 (SEQ ID NOs 425 + 469), CR6402 (SEQ ID NOs 427 + 471), CR6409 (SEQ ID NOs 429 + 473), CR6415 (SEQ ID NOs 431 + 475), CR6421 (SEQ ID NOs 433 + 477) o CR6429 (SEQ ID NOs 435 + 479) como se describe en la presente, y anticuerpos que comprenden regiones variable con secuencias que son al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, idénticas a esto. Preferiblemente las secuencias de los anticuerpos completos son al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, todavía más preferiblemente al menos 95% idénticos a las secuencias de estos anticuerpos como se describe en la presente. Estos anticuerpos se desplieguen todos para tener actividad exterminadora fagocitica opsónica contra al menos dos especies de Enterococos diferentes (que comprenden E. faecalis y E.faecium). Sorpresivamente, estos anticuerpos son también relativos contra S. aureus (cepa 502, y para algunos anticuerpos (CR6252, CR6415, CR6421) además se mostró que también son reactivos contra la cepa Numan de S. aureus, asi como contra S. epidemidis cepa RP62A) , y asi tener una especificidad amplia y potencia amplia para uso terapéutico. Estos anticuerpos no enlazan al LTA de S. aureus, que es uno de los constituyentes principales de la pared celular de S. aureus. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención por lo tanto no enlazan específicamente al LTA de S. aureus. La invención proporciona también composiciones que comprenden al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, o más, de los anticuerpos monoclonales humanos de la invención. Por supuesto, los mutantes de afinidad más alta o mutantes con otras propiedades ventajosas se pueden preparar de acuerdo a los métodos de rutina, basados en las secuencias de los anticuerpos como se describe en la presente. Tales anticuerpos mejorados se incluyen dentro del alcance de la presente invención, cuando las regiones variables de cadena pesada o ligera son al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, todavía más preferiblemente al menos 95% idénticos a las secuencias de las regiones variables de los anticuerpos descritos en la presente. En aún un aspecto adicional, la invención incluye inmunoconj ugados , es decir moléculas que comprenden al menos una molécula de unión como se define en la presente y además comprende al menos una etiqueta, tal como una porción/agente detectable Inter alia. También contemplado en la presente invención son mezclas de inmunoconjugados de acuerdo a la invención o mezclas de al menos un inmunoconjugado de acuerdo a la invención y otra molécula, tal como un agente terapéutico u otra molécula de unión o inmunoconj ugado . En una modalidad adicional, los inmunoconjugados de la invención pueden comprender más de una etiqueta. Estas etiquetas pueden ser las mismas o distintas de cada una de las otras y se pueden unir/conjugar no covalentemente a las moléculas de unión. Las etiquetas también se pueden unir/conj ugar directamente a las moléculas de unión humano a través de unión covalente. Alternativamente, las etiquetas se pueden unir/conjugar a las moléculas de unión por medios de uno o más compuestos ligados. Las técnicas para etiquetas conjugadas para moléculas de unión son bien conocidas por los técnicos experimentados. Las etiquetas de los inmunoconjugados de la presente invención pueden ser agentes terapéuticos, pero también pueden ser porciones/agentes detectables. Las etiquetas adecuadas en terapia y/o prevención pueden ser toxinas o partes funcionales de los mismos, antibióticos, enzimas, otras moléculas de unión que aumentan la fagocitosis o estimulación inmune. Los inmunoconjugados que comprenden un agente detectable se pueden usar diagnósticamente para, por ejemplo, evaluar si un sujeto ha sido infectado con una especie de Enterococos o monitorear el desarrollo o avance de una infección enterocócica como parte de un procedimiento de prueba clínico para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. Sin embargo, también puede usarse para otras detecciones y/o propósitos analíticos y/o de diagnóstico. Las porciones/agentes detectables incluyen, pero no se limitan a, enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminescentes , materiales bioluminescentes , materiales radioactivos, metales que emiten positrón, y iones de metal paramagnético no radiactivo. Las etiquetas usadas para etiquetar las moléculas de unión para detección y/o propósitos analíticos y/o de diagnóstico depende en las técnicas de detección /análisis / diagnóstico específicas y/o métodos usados tal como ínter alia inmunohistoquímico teñido de despliegues (tejido), detección citométricas de flujo, detección citométrica de láser de escaneo, inmunoensayos fluorescentes, ensayos inmunoabsorbentes ligados a la enzima (ELISA) , radioinmunoensayos (RIA) , bioensayos {por ejemplo, ensayos de fagocitosis), aplicaciones Western blot, etc. Las etiquetas adecuadas para las técnicas de detección /análisis/diagnóstico y/o métodos conocidos en la técnica están bien dentrol alcance del técnico experimentado. Adicionalmente, las moléculas de unión humano o inmunoconj ugados de la invención también se pueden enlazar a soportes sólidos, que son útiles particularmente para inmunoensayos in vitro o purificación de los enterococos o un fragmento del mismo. Tales soportes sólidos pudieran ser porosos o no porosos, plano o no plano. Las moléculas de unión de la presente invención se pueden fusionar para secuencias marcadoras, tal como un péptido para facilitar la purificación. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta hexa-histidina, la etiqueta hemaglutinina (HA) , la etiqueta myc o la etiqueta de bandera. Alternativamente, un anticuerpo se puede conjugar a un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado al anticuerpo. En otro aspecto las moléculas de unión de la invención se pueden conj ugar/enlazar para uno o más antigenos. Preferiblemente, estos antigenos son antigenos que se reconocen por el sistema inmunitario de un sujeto al cual el conjugado de antigeno-molécula de unión se administra. Los antigenos pueden ser idénticos, pero también pueden ser diferentes de cada uno de los otros. Los métodos de conjugación para enlazar los antigenos y moléculas de unión son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, el uso de agentes de ligadura cruzada. Las moléculas de unión de la invención enlazarán a los enterococos y los antigenos unidos a las moléculas de unión iniciarán un ataque de células T poderoso en el conjugado, que eventualmente llevará a la destrucción del Enterococo. Después de producir inmunoconj ugados químicamente por conjugar, directamente o indirectamente, por medio de por ejemplo una ligadura, los inmunoconjugados se pueden producir como proteínas de fusión que comprenden las moléculas de unión de la invención y una etiqueta adecuada. Las proteínas de fusión se pueden producir por métodos conocidos en la técnica tal como, por ejemplo, recombinantemente por construir moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias nucleótidas que codifican las moléculas de unión en marco con secuencias nucleótidas que codifican las etiquetas adecuadas y luego expresan las moléculas del ácido nucleico. Otro aspecto de la presente invención para proporcionar una molécula de ácido nucleico que codifica al menos una molécula de unión, variante funcional o inmunoconj ugado de acuerdo a la invención. Tales moléculas de ácidos nucleicos se pueden usar como intermediarios para propósitos de clonación, por ejemplo en el proceso de maduración de afinidad como se describe anteriormente. En una modalidad preferida, las moléculas del ácido nucleico se aislan o purifican. El hombre experto apreciará que variantes funcionales de estas moléculas de ácidos nucleicos también se pretenden para ser una parte de la presente invención. Las variantes funcionales son secuencias de ácidos nucleicos que se pueden trasladar directamente, usando el código genético estándar, para proporcionar una secuencia de aminoácido idéntica para que se traduzca desde las moléculas de ácidos nucleicos progenitoras . Preferiblemente, las moléculas de ácidos nucleicos codifican moléculas de unión que comprenden una región CDR3, preferiblemente una región CDR3 de cadena pesada, que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID N0:21, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:226, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:256, SEQ ID NO:262, SEQ ID NO:268, SEQ ID NO:274, SEQ ID NO:280, SEQ ID NO:286, SEQ ID NO:292, SEQ ID NO:298, SEQ ID NO:304, SEQ ID NO:310, SEQ ID NO:316, SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:328, SEQ ID NO:334, SEQ ID NO: 340, y SEQ ID NO: 346. En una modalidad adicional las moléculas de ácidos nucleicos codifican moléculas de unión que comprenden dos, tres, cuatro, cinco o incluso todas las seis regiones CDR de las moléculas de unión de la invención. En otra modalidad, las moléculas de ácidos nucleicos codifican moléculas de unión que comprenden una cadena pesada que comprende la cadena pesada variable de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:211, SEQ ID NO:213, SEQ ID NO:395, SEQ ID NO:397, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:401, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:405, SEQ ID NO:407, SEQ ID NO:409, SEQ ID N0:411, SEQ ID NO:413, SEQ ID NO:415, SEQ ID NO:417, SEQ ID NO:419, SEQ ID NO:421, SEQ ID NO:423, SEQ ID NO:425, SEQ ID NO:427, SEQ ID NO:429, SEQ ID NO:431, SEQ ID NO:433, SEQ ID NO:435, y SEQ ID NO: 437. En otra modalidad las moléculas de ácidos nucleicos codifican moléculas de unión que comprenden una cadena ligera que comprende la cadena ligera variable de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 441, SEQ ID NO: 443, SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 449, SEQ ID NO: 451, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 461, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 465, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO:479, y SEQ ID NO:481. Otro aspecto de la invención es proporcionar vectores, es decir constructos de ácido nucleico, que comprenden una o más moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo a la presente invención. Los vectores se pueden derivar de plásmidos tales como Ínter alia F, Rl, RP1, Col, pBR322, TOL, Ti, etc; cosmidos; fagos tales como lambda, lambdoid, M13, Mu, Pl, P22, ?ß, T-even, T-odd, T2, T4, T7, etc; virus de planta. Los vectores se pueden usar para clonar y/o para expresión de las moléculas de unión de la invención e incluso pueden usarse para propósitos de terapia de gen. Los vectores que comprenden una o más moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo a la invención ligados operablemente a una o más moléculas de ácidos nucleicos reguladas por expresión también son cubiertos por la presente invención. La elección del vector seguido es dependiente en los procedimientos recombinantes y se usa el hospedero. La introducción de vectores en células hospederas se puede efectuar por transfeccion de fosfato de calcio ínter alia, infección de virus, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, transfeccion de lipofectamina o electroporación . Los vectores se pueden replicar autónomamente o pueden replicarse junto con el cromosoma en el cual se ha integrado. Preferiblemente, los vectores contienen uno o más marcadores de selección. La elección de los marcadores puede depender de las células hospederas de elección, aunque esta no es critica para la invención como es bien conocido por personas expertas en la técnica. Incluyen, pero no se limitan a, canamicina, neomicina, puromicina, higromicina, zeocina, gen de cinasa de timidina gene del virus simple de Herpes (HSV-TK) , gen de dihidrofolato reductasa del ratón (dhfr) . Los vectores que comprenden una o más moléculas de ácidos nucleicos que codifican las moléculas de unión humano como se describen anteriormente ligadas operablemente a una o más moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas o péptidos que se puede usar para aislar las moléculas de unión humano son también cubiertas por la invención. Estas proteínas o péptidos incluyen, pero no se limitan a, glutationa-S-transferasa, proteína que enlaza maltosa, polihistidina que enlaza metal, proteína fluorescente verde, luciferasa y beta-galactosidasa.

Los hospederos que contienen una o más copias de los vectores anteriormente mencionados son un objetivo adicional de la presente invención. Preferiblemente, los hospederos son células hospederas. Las células hospederas incluyen, pero no se limitan a, células de mamíferos, plantas, insectos, hongos o de origen bacteriano. Las células bacterianas incluyen, pero no se limitan a, células de bacterias Gram-positivas o Gram-negativas tal como varias especies del género Escheríchia , tal como E. coli, y Pseudomonas . En el grupo de células de hongos preferiblemente células de levaduras se usan. La expresión en levadura se puede lograr por usar cepas de levadura tal como ínter alia Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae y Hansenula polymorpha . Adicionalmente, las células de insectos tal como células de Drosophila y Sf9 se puede usar como células hospederas. Además de eso, las células hospederas pueden ser células de plantas tal como células inter alia de plantas de cosecha tal como plantas forestales, o células de plantas que proporcionan alimento y materiales crudo tal como plantas de cereal, o plantas medicinales, o células de ornamentales, o células de cosechas de tubérculos de flores. Las plantas transformadas ( transgénicas ) o células de plantas se producen por métodos conocidos, por ejemplo, Transferencia de gen mediada por agrobacterias, transformación de discos de hojas, transformación de protoplastos por transferencia de ADN inducido por polietileno glicol, electroporación, sonicación, microinyección o transferencia de gen bolistico. Adicionalmente , un sistema de expresión adecuado puede ser un sistema de baculovirus. Los sistemas de expresión usando células de mamíferos tales como células de Ovario de Hámster Chino (CHO) , células COS, células BHK o células de melanoma de Bowes se prefieren en la presente invención. Las células mamíferas proporcionan proteínas expresadas con modificaciones post-traduccionales que son más similares a moléculas naturales de origen mamífero. Ya que la presente invención trata con moléculas que pueden tener que administrarse a humanos, un sistema de expresión completamente humano particularmente se preferiría. Por lo tanto, incluso más preferiblemente, las células hospederas son células humanas. Los ejemplos de células humanas son células Ínter alia HeLa, 911, AT1080, A549, 293 y HEK293T. En modalidades preferidas, las células producidas humanas comprenden al menos una parte funcional de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una región El adenovirus en formato expresable. En incluso más modalidades preferidas, las células hospederas se derivan de una retina humana y se inmortalizan con ácidos nucleicos que comprenden secuencias El adenovirales , tal como células 911 o la linea celular depositada en una Biblioteca Europea de Cultivos Celulares (ECACC) , CAMR, Salisbury, iltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 Febrero 1996 bajo el número 96022940 y distribuido bajo la marca PER.C6® (PER.C6 es una marca registrada de Crucell Holland B. V.). Para los propósitos de esta solicitud "PER.C6" se refiere a células depositadas bajo el número 96022940 o ascendientes, pasajes de corriente ascendente o corriente descendente asi como descendientes de ascendientes de células depositadas, asi como derivados de cualquiera de los anteriores . La producción de proteínas recombinantes en células hospederas se pueden realizar de acuerdo a los métodos bien conocidos en la técnica. El uso de las células distribuido baja la marca PER.C6® como una plataforma de producción para proteínas de interés se ha descrito en O 00/63403 la descripción de los cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. Un método que produce una molécula de unión de acuerdo a la invención es una parte adicional de la invención. El método comprende las etapas de a) cultivar un hospedero de acuerdo a la invención bajo condiciones conductivas a la expresión de la molécula de unión, y b) opcionalmente, recupera la molécula de unión expresada. Las moléculas de enlace expresados o inmunoconj ugados se pueden recuperar del extracto libre de célula, pero preferiblemente se recuperan del medio de cultivo. El método anterior para producir también se puede usar para hacer variantes funcionales de las moléculas de enlace y/o inmunoconjugados de la presente invención. Los métodos para recuperar proteínas, tales como moléculas de unión, de extractos libres de células o medios de cultivos son bien conocidos por las personas expertas en la técnica. Las moléculas de unión, variantes funcionales y/o inmunocon ugados como son obtenibles por el método descrito anteriormente también son una parte de la presente invención. Alternativamente, después de la expresión en hospederos, tal como células hospederas, las moléculas de unión e inmunoconjugados de la invención se pueden . producir sintéticamente por sintetizadores de péptido convencionales o en sistemas de traducción libres de células usando Ácido nucleico de ARN derivado de moléculas de ADN de acuerdo a la invención. Las moléculas de unión e inmunoconjugados como son obtenibles por los métodos de producción sintéticos descritos anteriormente o sistemas de traducción libres de células también son parte de la presente invención. En aún otra modalidad, las moléculas de unión de la presente invención también se pueden producir en mamíferos transgénicos , no humanos, tal como conejos inter alia, cabras o vacas, y secretados en por ejemplo la leche de las mismas.

En aún otra modalidad alternativa, las moléculas de unión de acuerdo a la presente invención, preferiblemente moléculas de unión humanas enlazadas específicamente a los enterococos o un fragmento del mismo, se pueden generar por mamíferos no humanos transgénicos , tal como por ejemplo ratones transgénicos o conejos, que expresan genes de inmunoglobulina humana. Preferiblemente, los mamíferos no humanos transgénicos tienen un genoma que comprenden un trasgen de cadena pesada humano y un transgen de cadena ligera humano que codifica todo o una porción de las moléculas de unión humano como se describe anteriormente. Los mamíferos no humanos transgénicos se pueden inmunizar con una preparación purificada o enriquecida de los enterococos o un fragmento del mismo. Los protocolos para mamíferos no humanos inmunizados son bien establecidos en la técnica. Ver Using Antibodies: A Laboratory Manual, Editado por: E. Harlow, D. Lañe (1998), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York y Current Protocole in Immunology, Editado por: J.E. Coenlazan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober (2001), John Wiley & Sons Inc., New York, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente para referencia. La inmunización de protocolos a menudo incluye inmunizaciones múltiples, ya sea con o sin adyuvantes tal como adyuvantes completos de Freund y adyuvantes incompletos de Freund, pero también pueden incluir inmunizaciones de ADN descubierto. En otra modalidad, las moléculas de unión humano, se producen por células B o células de plasma derivados de los animales transgénicos . En aún otra modalidad, las moléculas de unión humano se producen por hibridomas, que se preparan por fusión de células B obtenidas de los mamíferos no humanos transgénicos descritos anteriormente paira células inmortalizadas. Las células B, células de plasma e hibridomas como son obtenibles de los mamíferos no humanos transgénicos descritos anteriormente y moléculas de unión humano como son obtenibles de los mamíferos no humanos transgénicos descritos anteriormente, células B, células de plasma e hibridomas también son una parte de la presente invención. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para identificar una molécula de unión, tal como una molécula de unión humano, por ejemplo un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, específicamente enlazado a al menos dos organismos bacterianos diferentes o moléculas de ácidos nucleicos que codifican tales moléculas de unión y comprenden las etapas de: (a) contactar una biblioteca de moléculas de unión en la superficie de despliegues genéticos replicables con un primer organismo bacteriano bajo condiciones conductivas para enlazar, (b) seleccionar al menos una vez para un despliegue genético replicable que enlaza al primer organismo bacteriano, (c) opcionalmente, separar el despliegue genético replicable que enlaza al primer organismo bacteriano de los despliegues genéticos replicables que no enlazan al primer organismo bacteriano, contactar el despliegue genético replicable separado con un segundo organismo bacteriano bajo condiciones que conducen a enlazar y seleccionar al menos una vez durante un despliegue genético replicable que enlaza al segundo organismo bacteriano, y (d) separar y recuperar el despliegue genético replicable que enlaza al primero y/o segundo organismo bacteriano de los despliegues genéticos replicables que no enlazan al primer y/o segundo organismo bacteriano. Por supuesto, los métodos anteriores extendidos con selecciones en un tercero y organismos bacterianos adicionales también son parte de la presente invención. Otra parte de la invención es un método para identificar una molécula de unión, tal como una molécula de unión humano, por ejemplo un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, especialmente enlazado a una especie enterocócica o moléculas de ácidos nucleicos que codifican de tal manera a una molécula de unión. Tal método comprende las mismas etapas como el método antes mencionado. Un despliegue genético replicable como se usa en la presente puede ser procariótico o eucariótico e incluye células, esporas, levaduras, bacterias, virus, (bacterio) fago, ribosomas y polisomas. Un despliegue genético replicable preferido es un fago. Las moléculas de Unión, tales como por ejemplo cadenas sencillas Fvs, se desplieguen en el despliegue genético replicable, es decir se enlazan a un grupo o molécula localizada en una superficie exterior del despliegue genético replicable. El despliegue genético replicable es una unidad que puede ser ligada por separación por exclusión o que comprende una molécula de unión pare ser ligada por separación por exclusión a una molécula de ácido nucleico que codifica la molécula de unión. La molécula de ácido nucleico deberá ser replicable ya sea in vivo {por ejemplo, como un vector) o in vitro {por ejemplo, por PCR, transcripción y traducción). La replicación in vivo puede ser autónoma (como por una célula) , con la asistencia de factores hospederos (como por un virus) o con la asistencia de ambos hospederos y virus de ayuda (como por un fagémido) . Los despliegues genéticos replicables que desplieguen una biblioteca de moléculas de unión se forman al introducir moléculas de ácidos nucleicos que codifican moléculas de unión exógenas para mostrarse en los genomas de los despliegues genéticos replicables para formar proteínas de fusión con proteínas endógenas que se expresan normalmente de la superficie exterior de los despliegues genéticos replicables. La expresión de las proteínas de fusión, transporta a la superficie exterior y ensamblan resultados en despliegues de moléculas de unión exógenas de la superficie exterior de los despliegues genéticos replicables. Las etapas de selección en el método de acuerdo con la presente invención se pueden realizar con organismos bacterianos que están vivos y todavía infecciosos o inactivados. La inactivación del organismo bacteriano se puede realizar por métodos de inactivación bacterianos bien conocidos por el técnico experimentado tal como tratamiento ínter alia con pH bajo, es decir pH 4 durante 6 horas hasta 21 días; tratamiento con solvente/detergente orgánico, es decir adición de solventes y detergentes orgánicos (Tritón X-100 o Tween-80) a la bacteria; irradiación UV/ligera; irradiación gamma; y tratamiento con antibióticos importantes. Los métodos para prueba, si un organismo bacteriano está todavía vivo, infectivo y/o viable o parcialmente o completamente inactivado son bien conocidos por la persona experta en la técnica. Los organismos bacterianos usados en el método anterior pueden ser no aislados, por ejemplo presentes en suero y/o sangre de un individuo infectado. Los organismos bacterianos usados también se pueden aislar como colonias discretas después de cultivar durante la noche a 37 °C en un medio adecuado tal como agar en sangre de oveja. En una modalidad el primero y/o segundo organismo bacteriano está en suspensión cuando hace contacto con los despliegues genéticos replicables. Alternativamente, también se pueden acoplar a un portador cuando tiene lugar el contacto. En otra modalidad el primero y segundo organismos bacterianos son de una familia bacteriana diferente, por ejemplo la primera es de una bacteria Gram-negativa y la segunda de una bacteria Gram-positiva . Por este medio, las moléculas de unión capaces de enlazar específicamente a las bacterias Gram-positiva y Gram-negativa se pueden encontrar. Preferiblemente, el primero y segundo organismos bacterianos son ambos bacterias Gram-positivas . El primero y segundo organismos bacterianos ambos pueden ser enterococos. En una modalidad el primero y segundo organismos bacterianos son cepas diferentes de las mismas especies bacterianas, por ejemplo una especie Enterococos tal como E. faecalis o E.faecium. Por este medio, las moléculas de enlace específicas de especies se pueden encontrar que pueden enlazar específicamente a cepas diferentes dentro de una especie. En otra modalidad el primero y segundo organismos bacterianos son cada uno un miembro de un especie de Enterococos diferente, por ejemplo la primera y segunda especie de Enterococos se seleccionan del grupo que consiste de E. faecalis y E. faecium. Por este medio, las moléculas de enlace capaces de enlazar específicamente a especies diferentes dentro de un género bacteriano se pueden encontrar. Alternativamente, la etapa de selección se puede realizar en la presencia de un fragmento de los organismos bacterianos tal como por ejemplo preparaciones de membrana celular, preparaciones de membrana celular que se han tratado enzimáticamente para remover proteínas {por ejemplo con proteasa K) , preparaciones de membrana celular que se han tratado enzimáticamente para remover porciones de carbohidratos {por ejemplo con periodato) , proteínas recombinantes o polisacáridos . En aún otra modalidad, la etapa de selección se puede realizar en la presencia de una o más proteínas o (poli ) péptidos derivados de los organismos bacterianos, proteínas de fusión que comprenden estas proteínas o (poli ) péptidos , y similares. Extracelularmente partes expuestas de estas proteínas también se pueden usar como material de selección,. Los organismos bacterianos vivos o inactivados o fragmentos de los mismos se pueden inmovilizar para un material adecuado antes de usar. Alternativamente, las bacterias vivas o inactivadas en suspensión se usan. En una modalidad la selección se puede realizar en materiales diferentes derivados de organismos bacterianos. Por ejemplo, la primera ronda de selección se puede realizar en organismos bacterianos vivos o inactivados en suspensión, mientras la segunda y tercera ronda de selección se puede realizar en proteínas bacterianas recombinantes y polisacáridos, respectivamente. Por supuesto, otras combinaciones también se contemplan en la presente. Los materiales bacterianos diferentes también se pueden usar durante una etapa de selección/inmunoplaqueteo . En un aspecto adicional la invención proporciona métodos en donde los organismos bacterianos usados en las etapas de selección se derivan de las mismas o diferentes fases de crecimiento de las bacterias, por ejemplo la fase de demora, fase de registro, fase estacionaria o fase de muerte. Por este medio, por ejemplo se pueden encontrar moléculas anti-bacterianas de fase específica. Por ejemplo, el primer organismo bacteriano puede ser un E. faecalis en la fase estacionaria, mientras el segundo organismo bacteriano es un E. faecalis en la fase de registro o el primer organismo bacteriano puede ser un E. faecalis en la fase de demora, mientras el segundo organismo bacteriano es un E.faecium en la fase de registro. Las combinaciones adicionales son buenas dentro de la reacción del técnico experimentado. En aún un aspecto adicional, la invención proporciona un método para obtener una molécula de unión que enlaza específicamente al menos dos diferentes organismos bacterianos o una molécula de ácido nucleico que codifica tal molécula de unión, en donde el método comprende las etapas de a) realizar el método descrito anteriormente de identificar moléculas de unión, y b) aislar del despliegue genético replicable recuperado la molécula de unión y/o la molécula de ácido nucleico que codifica la molécula de unión. La biblioteca de moléculas de unión en la superficie de los despliegues genéticos replicables puede ser una biblioteca de scFvs or Fabs . Una vez un nuevo scFv o Fab se ha establecido o identificado con el método antes mencionado de identificar moléculas de unión o moléculas de ácidos nucleicos que codifican las moléculas de unión, el ADN que codifica el scFv o Fab se puede aislar de las bacterias o fases y combinar con técnicas biológicas moleculares estándar para hacer constructos que codifican scFvs bivalentes o inmunoglobulinas humanas completas de una especificidad deseada (por ejemplo IgG, IgA o IgM) . Estos constructos se pueden transfectar en lineas celulares adecuadas y anticuerpos monoclonales humanos completos se pueden producir (ver Huís et al, 1999; Boel et al, 2000) . Como se menciona anteriormente el despliegue genético replicable preferido es un fago. Los métodos que desplieguen fago para identificar y obtener moléculas de enlace (humana) , por ejemplo anticuerpos monoclonales (humano), son por ahora métodos bien establecidos conocidos por la persona experta en la técnica. Son por ejemplo descritos en Número de Patente E.U.A. 5,696,108; Burton and Barbas, 1994; de Kruif et al, 1995b; y Phage Display: A Laboratory Manual. Editado por: CF Barbas, DR Burton, JK Scott y GJ Silverman (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Todas estas referencias están aquí incorporadas en la presente en su totalidad. Para la construcción de bibliotecas de despliegue de fagos, las colecciones de genes de región variable de cadena pesada y ligera de anticuerpo monoclonal humano se expresa en la superficie de bacteriófago, preferiblemente bacteriófago filamentoso, partículas, en por ejemplo Fv de cadena sencilla (scFv) o en formato Fab (ver de Kruif et al, 1995b) . Grandes bibliotecas de fagos que expresan fragmento del anticuerpo típicamente contienen más de 1.0*109 especificidades del anticuerpo y se pueden ensamblar de las regiones V de inmunoglobulinas expresadas en los linfocitos B de individuos inmunizados o no inmunizados. En una modalidad específica de la invención la biblioteca de fagos de moléculas de unión, preferiblemente biblioteca de fagos scFv, se prepara de ARN aislado de células obtenidas de un sujeto que se ha vacunado contra una bacteria, vacunado recientemente contra un patógeno no relacionado, recientemente sufriendo una infección bacteriana crónica o aguda, por ejemplo infección enterocócica, o de un individuo sano. El ARN se puede aislar de médula ósea ínter alia o sangre de la periferia, preferiblemente linfocitos de sangre de la periferia o en células B aisladas o incluso en subpoblaciones de células B. El sujeto puede ser un animal vacunado contra una bacteria o un animal que tiene o tendrá una infección bacteriana. Preferiblemente, el animal es un sujeto humano que se ha vacunado contra una bacteria o tiene o tendrá una infección x bacteriana crónica o una infección bacteriana aguda. Preferiblemente, el sujeto humano tiene recuperación recientemente de la infección bacteriana. Alternativamente, las bibliotecas que desplieguen fagos se pueden construir de regiones variables de inmunoglobulina que se han ensamblado parcialmente in vitro para introducir diversidad de anticuerpos adicionales en la biblioteca (bibliotecas semi-sintéticas ) . Por ejemplo, las regiones variables ensambladas in vitro contienen tensores producidos sintéticamente, ADN aleatorio o parcialmente aleatorio en aquellas regiones de las moléculas que se importan para especificidad del anticuerpo, por ejemplo regiones CDR. Los anticuerpos de fago específicos para bacterias tales como los enterococos se pueden seleccionar de la biblioteca por exponer las bacterias o material del mismo a una biblioteca de fagos para permitir el unión de fagos que expresan fragmentos de anticuerpos específicos para las bacterias o material del mismo. Los fagos sin unión se remueven por lavar y enlazar fagos eluyendo por infección de bacterias E.coli y propagación subsecuente. Las rondas múltiples de selección y propagación son usualmente requeridas para enriquecer suficientemente para enlazar fagos específicamente a las bacterias o materiales del mismo. Si se desea, antes de exponer la biblioteca de fagos a las bacterias o material del mismo, la primera biblioteca de fagos se puede substraer por exponer la biblioteca de fagos a un material son objetivo tal como bacterias de una familia diferentes, especies y/o cepa o bacterias en una fase de crecimiento diferente o material de estas bacterias. Estas bacterias de subtractor o material del mismo se pueden enlazar a una fase sólida o puede ser en suspensión. Los fagos también se pueden seleccionar para enlazar al antigenos del complejo tal como mezclas del complejo de proteínas bacterianas o (poli) péptidos opcionalmente suplementados con polisacáridos bacterianos u otros materiales bacterianos. Las células hospederas que expresan una o más proteínas o (polipéptidos de bacterias tal como los enterococos también se pueden usar para la selección de propósitos. Un método que despliegue fago usando estas células hospederas se puede extender y mejorar por aglutinantes no relevantes substraídos durante la separación por exclusión por adición de un exceso de células hospederas que comprenden moléculas sin objetivo o moléculas sin objetivo que son , similares, pero no idénticas, al objetivo, y por ello aumentar fuertemente la oportunidad de hallar moléculas de unión importantes. Por supuesto, la substracción se puede realizar antes, durante o después de la separación por exclusión con organismos bacterianos o material del mismo. El proceso es referido como el proceso Mabstract® (Mabstract® es una marca registrada por Crucell Holland B. V., también ver Número de patente E.U.A. 6,265,150 que se incorpora en la presente para referencia) . En aún otro aspecto la invención proporciona un método para obtener una molécula de unión que tiene potencialmente actividad exterminadora contra un organismo bacteriano, preferiblemente al menos dos organismos bacterianos diferentes, en donde el método comprende las etapas de (a) realizar el método para obtener una molécula de unión que enlaza específicamente al menos dos organismos bacterianos diferentes o una molécula de ácido nucleico que codifica tal molécula de unión como se describe anteriormente, y (b) verificar si la molécula de unión aislada tiene actividad exterminadora contra el organismo bacteriano, preferiblemente al menos dos organismos bacterianos diferentes. Los ensayos para verificar si una molécula de unión tiene actividad exterminadora tal como actividad opsónica son bien conocidos en la técnica (ver por ejemplo Manual of Molecular and Clinical Laboratory Immunology, 7a Edición) . En una modalidad adicional la molécula de unión también se prueba por cualquier otra actividad. Otras actividades útiles se mencionan anteriormente . En un aspecto adicional la invención corresponde a una molécula de unión que tiene actividad exterminadora contra al menos dos, preferiblemente al menos tres o más, organismos bacterianos diferentes, tal como por ejemplo enterococos, y son obtenibles por los métodos como se describe anteriormente. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión, la composición farmacéutica que comprende además al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable también es un aspecto de la presente invención. Los excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por la persona experta. La composición farmacéutica de acuerdo a la invención puede comprender además al menos otro agente terapéutico. Los agentes adecuados también son bien conocidos por el técnico experimentado . En aún un aspecto adicional, la invención proporciona composiciones que comprenden al menos una molécula de unión preferiblemente un anticuerpo monoclonal humano de acuerdo a la invención, al menos una variante funcional del mismo, al menos un inmunoconj ugado de acuerdo a la invención o una combinación del mismo. Además de ello, las composiciones pueden comprender moléculas estabilizadoras Inter alia, tal como albúmina o polietilen glicol, o sales. Preferiblemente, las sales usadas son sales que retienen la actividad biológica deseada de las moléculas de unión y no imparten cualquiera de los efectos tóxicos no deseados. Si es necesario, las moléculas de unión humano de la invención se pueden recubrir en o sobre un material para proteger esto de la acción de ácidos u otras condiciones naturales o no naturales que pueden inactivar las moléculas de unión. En aún un aspecto adicional, la invención proporciona composiciones que comprenden al menos una molécula de ácido nucleico como se define en la presente invención. Las composiciones pueden comprender soluciones acuosas tal como soluciones acuosas que contienen sales {por ejemplo, NaCl o sales como se describe anteriormente) , detergentes {por ejemplo, SDS) y/u otros componentes adecuados.

Adicionalmente, la presente invención corresponde a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos una molécula de unión tal como un anticuerpo monoclonal humano de la invención (o fragmento funcional o variante del mismo) , al menos un inmunoconjugado de acuerdo a la invención, al menos una composición de acuerdo a la invención, o combinaciones de los mismos. La composición farmacéutica de la invención comprende además al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable . En una modalidad las composiciones farmacéuticas pueden comprender dos o más moléculas de unión que tienen actividad exterminadora contra un organismo bacteriano, por ejemplo una especie de Enterococos . En una modalidad, las moléculas de unión desplieguen actividad exterminadora sinérgica, cuando se usa en combinación. En otras palabras, las composiciones comprenden al menos dos moléculas de unión que tienen actividad exterminadora, caracterizada en que las moléculas de unión actúan sinérgicamente en exterminio de un organismo bacteriano tal como por ejemplo unas especies de Enterococos . Como se usa en la presente, el término "sinérgico" significa que el efecto combinado de las moléculas de unión cuando se usan en combinación es mayor a sus efectos aditivos cuando se usan individualmente. Las moléculas de unión activadas sinérgicamente pueden enlazar a estructuras diferentes en los mismos o distintos fragmentos del organismo bacteriano. En una modalidad las moléculas de unión que actúan sinérgicamente en exterminio de un organismo bacteriano también pueden ser capaces de exterminar organismos sinérgicamente bacterianos. Un medio de calcular la sinergia es por medio de los índices de combinación. El concepto del índice de combinación (CI) se ha descrito por Chou and Talalay, 1984. Las dos o más moléculas de unión que tienen actividad sinérgica tienen modos distintos de acción. Por ejemplo una primera molécula de unión puede tener actividad opsonizada, mientras la segunda molécula de unión tiene otra actividad de fagocitosis incrementada/aumentada/intensificada o una primera molécula de unión puede tener actividad intrínseca (exterminadora) , por ejemplo reduce o inhibe el crecimiento bacteriano o bacterias directamente exterminadas, mientras la segunda molécula de unión incrementa la sensibilidad de bacterias para tratamiento antibiótico. Se entenderá que otras combinaciones también son contempladas en la presente. Una composición farmacéutica de acuerdo a la invención puede comprender además al menos otro agente terapéutico, profiláctico y/o de diagnóstico. Preferiblemente, la composición ¦ farmacéutica comprende al menos otro agente profiláctico y/o terapéutico. Preferiblemente, los agentes terapéuticos y/o profilácticos adicionales son agentes capaces de prevenir y/o tratar una infección y/o condición bacteriana, por ejemplo enterococal, resultante de tal infección. Los agentes terapéuticos y/o profilácticos incluyen, pero no se limitan a, agentes anti-bacterianos . Tales agentes pueden ser moléculas de unión, moléculas pequeñas, compuestos orgánicos o inorgánicos, enzimas, secuencias polinucleótidas, péptidos anti-microbianos, etc. Otros agentes que se usan actualmente para tratar pacientes infectados con infecciones bacterianas tal como infecciones enterocócicas son antibióticos tales como vancomicina, teicoplanina , combinaciones sinérgicas incluyendo ampicilina o vancomicina y un aminoglicósido o sulbactam, las penicilinas incluyen penicilinas de espectro prolongado, carbapenemos, macrolidos, quinolonas, tetraciclinas , cloramfenicol , daptomicina, linezolid, quinupristin/dalfopristin . Estos se pueden usar en combinación con las moléculas de unión de la invención. Los agentes capaces de prevenir y/o tratar una infección con bacterias y/o una condición resultante de tal infección que están la fase experimental también pudieran usarse como otros agentes terapéuticos y/o profilácticos útiles en la presente invención. Las moléculas de unión o composiciones farmacéuticas de la invención se pueden probar en sistemas de modelos animales adecuados antes de usarse en humanos. Tales sistemas de modelo animal incluyen, pero no se limitan a, sepsis de murino y modelos de peritonitis, sepsis de rata y modelos de endocarditis, y modelos de endocarditis de conejo. Típicamente, las composiciones farmacéuticas deben ser estériles y estables bajo condiciones de fabricación y almacenamiento. Las moléculas de unión, inmunoconjugados, moléculas de ácidos nucleicos o composiciones de la presente invención pueden estar en forma de polvos para la reconstitución en el excipiente farmacéuticamente aceptable apropiado antes o en el tiempo de liberación. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacio y secado por congelado ( liofilización) que proporciona un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución anteriormente filtrada estéril . Alternativamente, las moléculas de unión, inmunoconjugados, moléculas de ácidos nucleicos o composiciones de la presente invención pueden estar en solución y el excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado se puede agregar y/o mezclar antes o en el tiempo de liberación para proporcionar una unidad de dosificación de forma inyectable. Preferiblemente, el excipiente farmacéuticamente aceptable usado en la presente invención es adecuado para concentración del fármaco alta, puede mantener fluidez apropiada y, si es necesario, puede retrasar la absorción . La elección de la ruta óptima de administración de las composiciones farmacéuticas estará influida por varios factores incluyendo las propiedades fisico-quimicas de las moléculas activas dentro de las composiciones, la urgencia de la situación clínica y la relación de las concentraciones de plasma de las moléculas activas para el efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, si es necesario, las moléculas de unión de la invención se pueden preparar con portadores que protegerán contra liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos , y sistemas de suministro microencapsulados. Los polímeros biodegradables, biocompatibles pueden usarse inter alia, tal como acetato de etilen vinilo, polianhidridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres , y ácido poliláctico.

Además, puede ser necesario recubrir las moléculas de unión con o . co-administrar las moléculas de unión con un material o compuesto que previene la inactivación de la molécula de unión humana. Por ejemplo, las moléculas de unión pueden administrarse a un sujeto en un portador apropiado, por ejemplo, liposomas o un diluyente. Las vías de administración pueden dividirse en dos principales categorías, administración oral y parenteral. La vía de administración preferida es intravenosa. Las formas de dosis oral pueden formularse inter alia como comprimidos, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas o aceitosas, polvos dispersables o gránulos, emulsiones, cápsulas duras, cápsulas de gelatina suaves, jarabes o elixires, pildoras, grajeas, líquidos, geles o mezclas espesas. Estas formulaciones pueden contener excipientes farmacéuticos que incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, agentes granulantes o desintegrantes, agentes de unión, agentes lubricantes, conservadores, colorantes, saborizantes o endulzantes, aceites vegetales o minerales, agentes humectantes y agentes espesantes. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden también formularse para administración parenteral. Las formulaciones para la administración parenteral pueden ser ínter alia en la forma de la inyección no tóxica estéril isotónica acuosa o no acuosa o soluciones o suspensiones de infusión. Las soluciones o suspensiones pueden comprender agentes que no son tóxicos para los recipientes en las dosis y concentraciones empleadas tales como 1 , 3-butanodiol , Solución Ringer, solución Hank, solución de cloruro de sodio isotónico, aceites, ácido grasos, agentes anestésicos locales, conservadores, soluciones amortiguadoras, agentes que incrementan la viscosidad o solubilidad, antioxidantes solubles en agua, antioxidantes solubles en aceite y agentes quelantes de metal. En un aspecto adicional, las moléculas de unión tales como los anticuerpos monoclonales humanos (fragmentos funcionales y variantes de los mismos) , inmunoconjugados, composiciones, o composiciones f rmacéuticas de la invención pueden usarse como un medicamento. De este modo, un método para el tratamiento y/o prevención de una infección bacteriana (Gram-positivo y/o Gram-negativo) , por ejemplo, por enterococos, usando las moléculas de unión, inmunoconjugados, composiciones, o composiciones farmacéuticas de la invención es otra parte de la presente invención. Las moléculas mencionadas arriba pueden ser inter alia usadas en el diagnóstico, profilaxis, tratamiento, o combinación de los mismos, de una infección bacteriana. Importantes infecciones clínicas causadas por enterococos incluyen, pero no se limitan a, infecciones del tracto urinario, intra-abdominal , infecciones de tejido suave o pélvico, bacteremia, endocarditis bacteriana, diverticulitis , meningitis, peritonitis, osteomielitis, artritis séptica, abscesos, infecciones de las heridas y neumonía. Son adecuados para el tratamiento de un paciente no tratado que padece una infección bacteriana y pacientes que han sido o son tratados para una infección bacteriana. Estos pueden usarse para los pacientes tales como niños hospitalizados, niños nacidos prematuramente, víctimas de quemaduras, pacientes de edad avanzada, pacientes inmunodeprimidos tales como aquellos que reciben quimioterapia, pacientes inmunodeprimidos tales como aquellos que reciben transplante de órganos, pacientes inmunodeficientes, pacientes sometidos a un procedimiento invasivo, y trabajadores de la salud. Cada administración puede proteger contra la infección adicional por el organismo bacteriano por hasta tres o cuatro semanas y/o retardará el inicio o avance de los síntomas asociados con la infección. Las moléculas de unión de la invención pueden también incrementar la efectividad del tratamiento antibiótico existente por incrementar la sensibilidad de la bacteria al antibiótico, puede estimular el sistema inmunitario para atacar la bacteria en otras maneras a través de la opsonización . Esta activación puede resultar en la protección de larga duración para la infección de la bacteria. Además, las moléculas de unión de la invención pueden inhibir directamente el crecimiento de la bacteria o inhibir los factores de la virulencia requeridos para su supervivencia durante la infección. Las moléculas o composiciones mencionadas arriba pueden emplearse en conjunto con otras moléculas útiles en el diagnóstico, profilaxis y/o tratamiento. Estas pueden usarse in Mitro, ex vivo o in vivo. Por ejemplo, las moléculas de unión tales como anticuerpos monoclonales humanos (o variantes funcionales de los mismos), inmunoconjugados, composiciones o composiciones farmacéuticas de la invención pueden coadministrarse con una vacuna contra el organismo bacteriano (si está disponible). Alternativamente, la vacuna puede también administrarse antes o después de la administración de las moléculas de la invención. En lugar de una vacuna, agentes antibacterianos pueden también emplearse en conjunto con las moléculas de unión de la presente invención. Los agentes antibacterianos adecuados son mencionados arriba. Las moléculas se formulan típicamente en las composiciones- y composiciones farmacéuticas de la invención en una cantidad terapéuticamente o diagnósticamente efectiva. Alternativamente, estas pueden formularse y administrarse separadamente. Por ejemplo, las otras moléculas tales como los agentes anti-bacterianos puede aplicarse sistemicamente, mientras las moléculas de unión de la invención pueden aplicarse intratecalmente o intraventricularmente . Los regímenes de dosis pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica) . Un rango de dosis adecuado puede ser por ejemplo 0.1-100 mg/kg de peso corporal, preferiblemente 0.5-15 mg/kg de peso corporal. Además, por ejemplo, un bolo sencillo puede administrarse, diversas dosis divididas pueden administrarse durante el tiempo o la dosis puede proporcionalmente reducirse o incrementarse como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Las moléculas y composiciones de conformidad a la presente invención son preferiblemente estériles. Los métodos para hacer estas moléculas y composiciones estériles son bien conocidos en la técnica. Las otras moléculas útiles en el diagnóstico, profilaxis y/o tratamiento pueden administrarse en un régimen de dosis similar como el propuesto por las moléculas de unión de la invención. Si otras moléculas se administran separadamente, pueden administrarse a un paciente previo a (por ejemplo, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 7 días, 2 semanas, 4 semanas o 6 semanas antes de) , concomitantemente con o posteriormente a (por ejemplo, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 2 dias, 3 días, 4 días, 5 dias, 7 días, 2 semanas, 4 semanas o 6 semanas después de) la administración de uno o más de las moléculas de unión humanas o composiciones farmacéuticas de la invención. El régimen de dosis exacto se distribuye usualmente durante las pruebas clínicas en pacientes humanos. Las moléculas de unión humanas y composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de unión humanas son particularmente útiles, y se prefieren frecuentemente cuando se administran a humanos como agentes terapéuticos in vivo, ya que la respuesta inmunitaria del recipiente al administrar el anticuerpo frecuentemente será substancialmente menor que la ocasionada por la administración de una moléculas de unión de murina monoclonal, quimérica o humanizada.

En otro aspecto, la invención concierne al uso de las moléculas de unión tales como anticuerpos monoclonales humanos exterminadores (fragmentos funcionales y variantes de los mismos), inmunoconj ugados , moléculas de ácido nucleico, composiciones o composiciones farmacéuticas de conformidad a la invención en la preparación de un medicamento para el diagnóstico, profilaxis, tratamiento, o combinación de los mismos, de una bacteria (Gram-positiva y/o Gram-negativa ) , por ejemplo, infección enterocócica . Posteriormente, los kits comprenden al menos una molécula de unión tal como un anticuerpo monoclonal humano eliminador (fragmentos funcionales y variantes de los mismos), al menos un inmunoconj ugado, al menos una molécula de ácido nucleico, al menos una composición, al menos una composición farmacéutica, al menos un vector, al menos un hospedero de conformidad a la invención o una combinación de los mismos son también parte de la presente invención. Opcionalmente, los componentes descritos arriba de los kits de la invención se empaquetan en recipientes adecuados y se etiquetan por el diagnóstico, profilaxis y/o tratamiento de las condiciones indicadas. Los componentes mencionados arriba pueden almacenarse en recipientes unitarios o de dosis múltiple como una solución acuosa, preferiblemente estéril o como una formulación liofilizada, preferiblemente estéril formulación para la reconstitución. Los recipientes pueden formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico y pueden tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforado por una aguja de inyección hipodérmica) . El kit puede además comprender más recipientes que comprenden la solución amortiguadora farmacéuticamente aceptable. Esta puede además incluir otros materiales deseables de un comercial y punto de vista del usuario incluyendo otras soluciones amortiguadoras, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, medio de cultivo para uno o más de los hospederos adecuados y posiblemente, aun al menos otro agente terapéutico, profiláctico o diagnóstico. Se asocia con los kits que puede ser instrucciones habitualmente incluyendo en despliegues comerciales de los productos terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico, que contiene la información alrededor de, por ejemplo, las indicaciones, uso, dosis, manufactura, administración, contra-indicaciones y/o advertencias que conciernen al uso de tales productos terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico. Las moléculas de unión de la invención pueden también usarse para recubrir los dispositivos médicos o biomateriales poliméricos . La invención además se refiere a un método para detectar un organismo bacteriano (Gram-positivo y/o Gram-negativo) en una despliegue, en donde el método comprende las etapas de (a) poner en contacto una despliegue con una cantidad diagnósticamente efectiva de una molécula de unión (fragmentos funcionales y variantes de los mismos) o un inmunoconj ugado de conformidad a la invención, y (b) determinar si la molécula de unión o inmunoconjugado enlaza específicamente a una molécula de la despliegue. Preferiblemente, el método se usa para detectar un Enterococos en una despliegue. La despliegue puede ser una despliegue biológica que incluye, pero no se limita a sangre, suero, orina, tejido u otro material biológico de (potencialmente ) sujetos infectados, o una despliegue no biológica tal como beber agua, etc. Los sujetos (potencialmente) infectados pueden ser sujetos humanos, pero también animales que se sospechan como portadores de tales organismos bacterianos que podrían probarse para la presencia del organismo usando las moléculas de unión humanas o inmunoconj ugados de la invención. La despliegue puede primero manipularse para ser más adecuada para el método de detección. La manipulación significa tratar ínter alia a la despliegue que se sospecha que contiene y/o que contiene el organismo bacteria en tal manera que el organismo deberá desintegrarse en los componentes antigénicos tales como proteínas, (poli ) péptidos u otros fragmentos antigénicos. Preferiblemente, las moléculas de unión humanas o inmunoconj ugados de la invención se ponen en contacto con la despliegue bajo condiciones las cuales permiten la formación de un complejo inmunologico entre las moléculas de unión humanas y el organismo bacteriano o componentes antigénicos de los mismos que pueden presentarse en la despliegue. La formación de un complejo inmunologico, si es cualquiera indica la presencia del organismo bacteria en la despliegue, luego se detecta y se mide por los medios adecuados. Tales métodos incluyen, inter alia, inmunoensayos de unión homogéneo y heterogéneo, tales como radio inmunoensayos (RIA) , ELISA, inmunofluorescencia, immunohistoquímica , FACS, BIACORE y análisis Western blot. Las técnicas de ensayo preferidas, especialmente para el cribado clínico de gran escala del suero del paciente y sangre y los productos derivados de la sangre son ELISA y técnicas Western blot. Las pruebas ELISA son particularmente preferidas. Para el uso como reactivos en estos ensayos, las moléculas de unión o inmunoconj ugados de la invención se enlazan convenientemente a la superficie interior de los pocilios de microtitulación . Las moléculas de unión o inmunoconj ugados de la invención pueden unirse directamente al pocilio de microtitulación . Sin embargo, el unión máximo de las moléculas de unión o inmunoconj ugados de la invención a los pocilios podría completarse por el pre-tratamiento, los pocilios con polilisina previo a la adición de las moléculas de unión o inmunoconj ugados de la invención.

Además, las moléculas de unión o inmunoconj ugados de la invención pueden unirse convalentemente por los medios conocidos para los pocilios. Generalmente, las moléculas de unión o inmunoconj ugados se usan entre 0.01 hasta 100 yg/ml para recubrirse, aunque superior asi como las cantidades inferiores pueden también usarse. Las despliegues luego se agregan a los pocilios recubiertos con las moléculas de unión o inmunoconj ugados de la invención. Además, las moléculas de enlace de la invención pueden usarse para identificar las estructuras de unión especificas de un organismo bacteriano, por ejemplo, un Enterococos . Las estructuras de unión pueden ser epitopos en las proteínas y/o polipéptidos . Pueden ser lineales, pero también estructurales y/o conformacionales . En una modalidad, las estructuras de unión pueden analizarse por los medios de análisis PEPSCAN (ver Ínter alia WO 84/03564, WO 93/09872, Slootstra et al, 1996) . Alternativamente, una biblioteca de péptido aleatorio comprende los péptidos de una proteína de un organismo bacteriano que puede separarse por exclusión por los péptidos capaces de enlazar a las moléculas de unión de la invención. Las estructuras de unión/péptidos/epítopos encontradas pueden usarse como vacunas y para el diagnóstico de las infecciones bacterianas. En el caso de otros fragmentos de proteínas y/o polipéptidos se enlazan por las estructuras de unión de las moléculas de unión que pueden identificarse por la espectrometría de masa, cromatografía líquida de alta resolución y resonancia magnética nuclear. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para separar por exclusión una molécula de unión (o un fragmento funcional o variante del mismo) para el unión específicos al mismo epítopo de un organismo de bacteria (Gram-positiva y/o Gram-negativa) , por ejemplo, Enterococos, como el epítopo enlazado por una molécula de unión humano de la invención, en donde el método comprende las etapas de (a) poner en contacto una molécula de unión para separarse por exclusión, una molécula de unión de la invención y un organismo de bacteria o fragmento del mismo, (b) medir si la molécula de unión separada por exclusión es capaz de competir para enlazar específicamente al organismo bacteriano o fragmento del mismo con la molécula de unión de la invención. En una etapa adicional puede determinarse, si la molécula de unión de separación por exclusión es capaz de competir por específicamente enlazar al organismo bacteriano o fragmento del mismo que tiene actividad exterminadora, por ejemplo, actividad opsónica. Una molécula de unión que es capaz de competir por enlazar específicamente al organismo bacteriano o un fragmento del mismo con la molécula de unión de la invención es otra parte de la presente invención. En el método de separación por exclusión descrito arriba, "se enlaza específicamente al mismo epítopo" también contempla el unión específico substancialmente o esencialmente al mismo epítopo como el epítopo enlazado por la molécula de unión de la invención. La capacidad para bloquear o competir con, el unión de las moléculas de unión de la invención al organismo bacteriano típicamente indica que una molécula de unión se separa por exclusión para enlazar a un epítopo o sitio de unión en el organismo bacteriano que estructuralmente se sobrepone con el sitio de unión en el organismo bacteria que se reconoce inmunoespecificamente por las moléculas de unión de la invención. Alternativamente, esto puede indicar que una molécula de unión se separa por exclusión para enlazar a un epítopo o sitio de unión el cual se aproxima suficientemente al sitio de unión inmunoespecificamente reconocido por las moléculas de unión de la invención para estéricamente o de otra manera inhibir el unión de las moléculas de unión de la invención al organismo bacteriano. En general, la inhibición competitiva se mide por los medios de un ensayo, en donde una composición del antígeno, esto es, una composición que comprende un organismo bacteriano o fragmentos del mismo, se mezclan con las moléculas de unión de referencia, esto es, las moléculas de unión de la invención y las moléculas de unión para separarse por exclusión. Usualmente, las moléculas de unión para separarse por exclusión se presentan en exceso. Los protocolos basados sobre los ELISA y Western blot son adecuados para el uso en tales estudios de competición simples. Para usar las especies o anticuerpos secundarios del isotipo alguien podrá detectar solamente las moléculas de unión de la referencia de unión, el unión del cual se reducirá por la presencia de una molécula de unión para separarse por exclusión que reconoce substancialmente el mismo epitopo. Al realizar un estudio de competición de la molécula de unión entre una molécula de unión de referencia y cualquier molécula de unión para separar por exclusión (no considerando las especies o isotipos) , alguien primero etiqueta la molécula de unión con una etiqueta detectable, tal como, por ejemplo, biotina, una etiqueta enzimática, radioactiva u otra etiqueta para permitir su identificación posterior. Las moléculas de unión identificadas por estos ensayos de competición ("moléculas de unión competitivas" o "moléculas de unión de reactivo cruzado") incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otros agentes de unión que enlazan a un epitopo o sitio de unión enlazado por la molécula de unión de referencia, esto es, una molécula de unión de la invención, asi como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otros agentes de unión que enlazan a un epitopo o sitio de unión suficientemente próximo a un unión de epitopo por la molécula de unión de referencia para el unión competitivo entre las moléculas de unión para ser separadas por exclusión y la molécula de unión de la referencia para presentarse.

Preferiblemente, las moléculas de unión competitivas de la invención cuando se presentan en exceso, inhibirán el unión especifico de una molécula de unión de referencia a una especie objetivo seleccionada por al menos 10%, preferiblemente por al menos 25%, más preferiblemente por al menos 50%, y más preferiblemente por al menos 75%-90% o aun más. La identificación de una o más moléculas de unión competitivas que se enlazan alrededor de, substancialmente, esencialmente o en el mismo epitopo como las moléculas de unión de la invención es una materia técnica directa. Cuando la identificación de las moléculas de unión competitivas se determina en comparación a una molécula de unión de referencia, esto es, una molécula de unión de la invención, se entenderá que determinar realmente el epitopo al cual se enlazan la molécula de unión de referencia y la molécula de unión competitivo no se requiere de ninguna manera con objeto de identificar una molécula de unión competitiva que unión al mismo o substancialmente al mismo epitopo como la molécula de unión de referencia. EJEMPLOS Para ilustrar la invención, los siguientes ejemplos se proporcionaron. Los ejemplos no se intentan para limitar el alcance de la invención en cualquier manera.

Ejemplo 1 Construcción de bibliotecas de despliegue de fagos scFv usando el ARN extraído de los donantes separados por exclusión por la actividad opsónica Las despliegues de sangre se tomaron de los donantes que reportan una infección de bacteria Gram-positiva reciente asi como adultos sanos entre 25-50 años de edad. Los leucocitos sanguíneos periféricos se aislaron por centrifugación y el suero sanguíneo se guardó y se congeló a -80°C. El suero donado se separó por exclusión para eliminar la actividad usando un ensayo eliminador opsonofagocitico (Huebner et al. 1999) y se comparó al suero de conejo normal. El suero de los donantes tiene mayor actividad fagocítica que el suero normal se eligieron para uso para la generación de las bibliotecas de despliegue de fagos. El ARN total se preparó a partir de los leucocitos sanguíneos periféricos de estos donantes usando la separación de fase orgánica y precipitación de etanol posterior. El ARN obtenido se disolvió en ARNsa libre de agua y la concentración se determinó por la medición del OD 260 nm. Posteriormente, el ARN se diluyó a una concentración de 100 ng/µ?. Posteriormente, 1 g del ARN se convirtió en cADN como sigue: A 10 µ? de ARN total, 13 µ? de Agua ultrapura tratada con DEPC y 1 µ? de hexameros aleatorios (500 ng/µ?) se agregaron y la mezcla obtenida se calentó a 65°C durante 5 minutos y se enfrió rápidamente en hielo. húmedo. Luego, 8 µ? de solución amortiguadora de primera hebra 5X, 2 µ? de dNTP (10 mM cada uno), 2 µ? de DTT (0.1 M) , 2 µ? de inhibidores de ARNsa (40 U/µ?) y 2 µ? de transcriptasa inversa de Superscript™III MMLV (200 U/µ?) se agregaron a la mezcla, se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos y se incubaron durante 1 hora a 50°C. La reacción se terminó por la inactivación del calentamiento, esto es, al incubar la mezcla durante 15 minutos a 75°C. Los productos de cADN obtenidos se diluyeron a un volumen final de 200 µ? con agua ultrapura tratada con DEPC. El OD 260nm de una solución diluida 50 veces (en 10 mM de solución amortiguadora Tris) de la dilución de los productos de cADN obtenidos se usó para determinar la concentración de cADN. Para cada donante 5 hasta 10 µ? de los productos de cADN diluidos se usaron como plantilla para la amplificación PCR de la familiar de cadena pesada gamma de inmunoglobulina y las secuencias de cadena ligera lambda o kappa usando los cebadores oligonucleótidos específicos (ver tablas 1-7) . Además, para un donante, se realizó la amplificación PCR del donante de la familia de cadena pesada mu de inmunoglobulina y las secuencias de cadena ligera lambda o kappa. Las mezcla de reacción PCR que contienen además los productos de cADN diluidos, 25 pmol de cebador sentido y 25 pmol cebador anti-sentido en un volumen final de 50 µ? de 20 mM de Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM de KC1, 1.5 mM de MgCl2, 250 µ? de dNTPs y 1.25 unidades de polimerasa Taq. En un ciclizador térmico de tapa caliente que tiene una temperatura de 96°C, las mezclas obtenidas se fundieron rápidamente durante 2 minutos, seguido por 30 ciclos de: 30 segundos a 96°C, 30 segundos a 55°C o 60°C y 60 segundos a 72°C. Finalmente, las despliegues se incubaron 10 minutos a 72°C y se refrigeraron a 4°C hasta el uso adicional. En una primera ronda de amplificación, cada uno de los dieciocho cebadores sentido de región variable de cadena ligera (doce para la cadena ligera lambda (ver tabla 1; los cebadores sentido HuVLlA-Trasero, HuVLIB-Trasero 5 y HuVLlC-Trasero se mezclaron hasta equimolaridad antes del uso, asi como los cebadores sentido HuVL9-Trasero y HuVLlO-Trasero) y seis para la cadena ligera kappa (ver tabla 2)) se combinaron con un cebador anti-sentido que reconoce la región constante C-kappa llamada HuCK-FOR 5 ' -ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3 ' (ver SEQ ID NO: 121) oregión constante C-lambda HuCL2-FOR 5'-TGAACATTCTGTAGGGGCCACTG-3 ' (ver SEQ ID NO: 122) y HuCL7-FOR 5 ' -AGAGCATTCTGCAGGGGCCACTG-3 ' (ver SEQ ID NO: 123) (los cebadores anti-sentido HuCL2-FOR y HuCL7-F0R se mezclaron hasta equimolaridad antes del uso) , proporcionando 15 productos de alrededor de 650 pares base. Estos productos se purificaron en gel de agarosa y se aislaron del gel usando las columnas de extracción del gel Qiagen. 1/10 de cada uno de los productos aislados se usó en una reacción PCR idéntica como se describe arriba usando dieciocho cebadores sentido, por ello cada cebador sentido de cadena ligera lambda se combinó con uno de los tres cebadores anti-sentido específicos de región Jlambda y cada cebador sentido de cadena ligera kappa se combinó con uno de los cinco cebadores anti-sentido específicos de región Jkappa (ver tabla 3; los cebadores sentido HuVLlA-Trasero-SAL, HuVLlB-Trasero-SAL y HuVLlC-Trasero-SAL se mezclaron hasta equimolaridad antes del uso, así como los cebadores sentido HuVL9-Trasero-SAL y HuVLlO-Trasero-SAL) . Los cebadores sentido usados . en la segunda amplificación fueron los mismos cebadores como se usaron en la primera amplificación, pero se extendieron con los sitios de restricción (ver tabla 3) para permitir la clonación dirigida en el vector que exhibe el fago PDV-C06 (ver SEQ ID NO: 124). Esto resulta en 57 productos de aproximadamente 400 pares base que se agruparon como se despliegue en la tabla 4 para mantener la distribución natural de diferentes segmentos J y familias de cadena ligera dentro de la biblioteca y no se cubren o representan bajo ciertas familias. Los productos agrupados se purificaron usando Las columnas de purificación PCR Qiagen. En la etapa posterior, 3 µ? de los productos agrupados y 100 µ? del vector PDV-C06 se digirieron con Salí y Notl y se purificaron del gel. Posteriormente, una ligación se realizó durante la noche a 16°C como sigue. A 500 ng del vector PDV-C06 ya sea 35, 70 ó 140 ng de los productos agrupados se agregaron en un volumen total de 50 µ? de mezcla de ligación que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM de MgCl2, 10 mM de DTT, 1 mM de ATP, 25 g/ml de BSA y 2.5 µ? de T4 ADN Ligasa (400 U/µ?) . Las mezclas de ligación se purificaron por extracción de fenol/cloroformo, seguido por una extracción de cloroformo y precipitación de etanol, los métodos bien conocidos por aquellos de habilidad en la técnica. El ADN obtenido se disolvió en 50 µ? 10 mM de Tris-HCl pH8.5 y por mezcla de ligación 1 ó 2 µ? se electroporó en 40 µ? de la bacteria E. coli competente TG1 de conformidad al protocolo del fabricante (Stratagene) . Los transformantes se cultivaron durante la noche a 37 °C en 2TY agar suplementado con 50 µg/ml de ampicilina y 4.5% de glucosa. Las colonias se contaron para determinar el vector óptimo para insertar la relación. Para la mezcla de ligación con la relación óptima, las alícuotas múltiples 1 ó 2 µ? se electroporaron como arriba y los transformantes se cultivaron durante la noche a 37 °C, típicamente proporcionando ~107 colonias. Una ( sub) biblioteca de las regiones de cadena ligera variables se obtuvo por raspar los transformantes de las placas de agar. Esta ( sub) biblioteca se usó directamente por la preparación del ADN plasmido usando un kit preparativo Qiagen™ QIAFilter MAXI. Las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada se amplificaron de las mismas preparaciones de cADN en un procedimiento PCR de dos etapas y parámetros de reacción idénticos como se describe arriba para las regiones de cadena ligera con la condición de que los cebadores se detallen en las tablas 5 y 6 se usaron. La primera amplificación se realizo usando un conjunto de ocho cebadores dirigidos sentido (ver tabla 5; los cebadores sentido HuVHlB/7A-Trasero y HuVHIC-Trasero se mezclaron hasta equimolaridad antes del uso) cada uno se combinó con un cebador anti-sentido de región constante especifico IgG llamado HuClgG 5 ' -GTC CAC CTT GGT GTT GCT GGG CTT-3' (SEQ ID NO: 125) proporcionando siete productos de alrededor de 650 pares base. Para un donante un cebador anti-sentido de región constante especifica IgM llamada HuCIgM 5 ' -TGG AAG AGG CAC GTT CTT TTC TTT-3 ' (SEQ ID NO: 126) se usó en lugar del cebador HuClgG. Los productos se purificaron en gel de agarosa y se aislaron del gel usando las columnas de extracción del gel Qiagen. 1/10 de cada uno de los productos aislados se usó en una reacción PCR idéntica como se describe arriba usando ocho cebadores sentido, por ello cada cebador sentido de cadena pesada se combinó con uno de los cuatro cebadores anti-sentido específicos de la región JH (ver tabla 6; cebadores sentido HuVHlB/7A-Trasero-Sfi y HuVHIC-Trasero-Sfi se mezclaron hasta equimolaridad antes del uso) . Los cebadores sentido usados en la segunda etapa fueron los mismos cebadores como se usaron en la primera amplificación, pero se extendieron con los sitios de restricción (ver tabla 6) para permitir la clonación dirigida en el vector de la (sub) biblioteca de cadena ligera. Esto resulta en 28 productos de aproximadamente 400 pares base que se agruparon como se despliegue en la tabla 7 para mantener la distribución natural de diferentes segmentos J y familias de cadenas pesadas dentro de la biblioteca y no se cubren o representan bajo ciertas familias. Los productos agrupados se purificaron usando las columnas de purificación PCR Qiagen. Posteriormente, 3 µg de los productos purificados se digirieron con Sfil y Xhol y se ligaron en el vector de la ( sub ) biblioteca de cadena ligera, luego se cortó con las mismas enzimas de restricción, usando el mismo procedimiento de ligación y volúmenes como se describe arriba para la ( sub) biblioteca de cadena ligera. La purificación de la mezcla de ligación y la transformación posterior de la biblioteca definitiva resultante también se realizo como se describe arriba para la ( sub) biblioteca de cadena ligera. Todas las bacterias, típicamente ~107, se cosecharon en el medio de cultivo 2TY que contiene 50 µ?/??? de ampicilina y 4.5% de glucosa, se mezclaron con glicerol hasta 15% de (v/v) y se congelaron en 1.5 mi de alícuotas a -80°C. El rescate y selección de cada biblioteca se realizó como se describe a continuación. Las diversas bibliotecas se nombraron GPB-05- 01, GPB-05-G01, o GPB-05-G02, GPB-05-G03, GPB-05-G04 y GPB-05-G05. Las otras dos bibliotecas, RAB-03-G01 y RAB-04-G01, se construyeron usando un método similar al procedimiento de arriba, como se describe previamente en la solicitud de patente internacional WO 2005/118644. Ejemplo 2 Construcción de las bibliotecas de despliegue de fagos scFv usando el ARN extraído de las células B de la memoria La sangre periférica se colectó de los donantes normalmente saludables, donantes convalecientes o donantes vacunados por venapuncion usando los tubos de despliegue anticoagulación EDTA. Una despliegue sanguínea (45 mi) se diluyó dos veces con PBS y 30 mi de alícuotas se cubrieron con 10 mi de Ficoll-Hypaque (Pharmacia) y se centrifugaron a 900xg durante 20 minutos a temperatura ambiente sin romperse. El sobrenadante se removió cuidadosamente hasta justo arriba de la capa blanca que contiene la fracción linfocítica y trombocitica . Posteriormente, esta capa se removió cuidadosamente (~10 mi) , se transfiere a un tubo de 50 mi fresco y se lavó tres veces con 40 mi PBS y se giró a 400xg durante 10 minutos a temperatura ambiente para remover los trombocitos. El peletizado obtenido que contiene los linfocitos se volvió a suspender en un medio RPMI que contiene 2% de FBS y el número celular se determinó por el conteo celular. Aproximadamente lxlO8 de los linfocitos se tiñeron por la distribución de la célula fluorescente usando CD24, CD27 y la superficie IgM como se marca para el aislado del cambio y las células B de la memoria IgM. Un conjunto de aparatos de Digital Vantage de Becton Dickinson en el modo de campo se usaron para la distribución y aislado de las células B de la memoria física. Los linfocitos se colaron como la población compacta pequeña de la ventana FSC/SSC. Las células B de la memoria (CD24+/CD27+) se separaron posteriormente de las células B sencillas (CD24+/CD27-) y células T de la memoria (CD24-/CD27+) . En una etapa posterior, las células B de la memoria IgM (IgM+) se separaron de las células B de la memoria de cambio (IgM-) usando la expresión IgM. En esta etapa las células B IgM de la memoria y las células B de la memoria de cambio se distribuyeron en tubos de despliegue separados. Las lxlO5 hasta lxlO6 células de cada población se colectaron en DMEM/50% de FBS y después de que se completa la distribución cada una las células se centrifugaron a 400xg durante 10 minutos. Las células B de la memoria IgM distribuidas luego se usaron como material de partida para la construcción de la biblioteca de conformidad al método descrito en el ejemplo 1, usando el cebador HuCIgM en la primera etapa de la amplificación de las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada. Las diversas bibliotecas se nombraron MEM-05-M01, MEM-05-M02, MEM-05-M03, MEM-05-M04, MEM-05-M05, MEM-05-M06, MEM-05-M07, MEM-05-M08, MEM-05- M09 y MEM-05-M10. Ejemplo 3 Selección de los fagos que llevan fragmentos Fv de cadena sencilla específicamente unidos a enterococos Los fragmentos de los anticuerpos se seleccionan usando la biblioteca que exhibe el anticuerpo fago, tecnología que exhibe el fago general y tecnología Abst ract®, esencialmente como se describe en la patente de E.U.A. número 6,265,150 y en la O 98/15833 (ambas de los cuales se incorporan para referencia en la presente) . Las bibliotecas de fagos del anticuerpo usadas se separan por exclusión de la biblioteca del donante como se describe en el Ejemplo 1 y las bibliotecas de la memoria IgM como se describe en el Ejemplo 2. Los métodos y fagos auxiliares como se describen en la WO 02/103012 (se incorpora para referencia en la presente) se usaron en la presente invención. Para identificar los anticuerpos de fagos que reconocen los enterococos, los experimentos de selección de fago se realizaron usando la bacteria viva en la suspensión o inmovilizando las bacterias en los inmunotubos. Las cepas usadas se describen en la tabla 8. Todos los anticuerpos de fagos se aislaron de las selecciones en donde al menos una etapa E. faecalis 12030 en suspensión se usó. Los anticuerpos fagos llamados SC05-159 y SC05-166 se aislaron originalmente de las selecciones usando el E. faecalis 12030 inmovilizado, pero más tarde fueron también aislados usando E. faecalis 12030 en la suspensión. Las selecciones usando la bacteria en la suspensión se realizaron como sigue. Las bacterias se hicieron crecer durante la noche a 37°C en placas de agar de sangre y se rasparon en PBS que contiene 2% de BSA o 2% de ELK a una concentración de 5xl09 bacteria/ml y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Una alícuota de una biblioteca de fagos (aproximadamente 1013 cfu, se amplificó usando un fago ayudante CT (ver WO 02/103012)) se bloqueó en una solución amortiguadora de bloqueo (2% ELK o 2% BSA en PBS) durante 0.5-2 horas a temperatura ambiente. La biblioteca de fagos de bloqueo se agregó a la suspensión de la bacteria de bloqueo que hace un volumen total de 1 mi y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente en un rotor de extremo a extremo (5 rpm) . La suspensión se centrifugó a 6800xg durante 3 minutos a temperatura ambiente y el sobrenadante se descartó. Las bacterias se lavaron tres hasta ocho veces con solución amortiguadora de bloqueo que contiene 0.05% (v/v) Tween-20, luego tres hasta ocho veces con solución amortiguadora de bloqueo para remover el fago no enlazado. Los fagos unidos se eluyeron del antigeno por incubación con 1 mi de 0.1 M de trietilamina durante 7 minutos a temperatura ambiente en un rotor de extremo a extremo (5 rpm) . La suspensión se centrifugó a 1700xg durante 3 minutos a temperatura ambiente y el sobrenadante luego se mezcló con 0.5 mi de 1 M Tris-HCl pH 7.5 para neutralizar el pH. Esta mezcla se usó para infectar 5 mi de un cultivo de E.coli XLl-azul que se hace crecer a 37°C hasta un OD 600nm de aproximadamente 0.3. Los fagos se dejaron para infectar las bacterias XLl-azul durante 30 minutos a 37°C. Luego, la mezcla se centrifugó durante 10 minutos a 3200xg a temperatura ambiente y el peletizado de la bacteria se volvió a suspender en 0.5 mi del medio de extracto de levadura 2-tripton (2TY) . La suspensión de la bacteria obtenida se dividió sobre dos placas agar 2TY suplementadas con tet raciclina , ampicilina y glucosa. Después de la incubación durante la noche de las placas a 37 °C, las colonias se rasparon de las placas y se usaron para preparar una biblioteca fago enriquecida, esencialmente como se describe por De Kruif et al. (1995a) y WO 02/103012. Brevemente, las bacterias raspadas se usaron para inocular el medio 2TY que contiene ampicilina, tetraciclina y glucosa y se hicieron crecer a una temperatura de 37°C a un OD 600nm de ~0.3. Los fagos ayudantes CT se agregaron y se permitieron para infectar la bacteria después lo cual el medio se cambió a 2TY que contiene ampicilina, tetraciclina y canamicina. La incubación se continuó durante la noche a 30°C. Al día siguiente, las bacterias se removieron del medio 2TY por centrifugación después los fagos en el medio se precipitaron usando polietilen glicol (PEG) 6000/NaCl. Finalmente, los fagos se disolvieron en 2 mi de PBS con 1% de albúmina de suero de bovino (BSA), se esterilizan por filtración y se usan por la siguientes ronda de selección.

Las selecciones que usaran bacterias inmovilizadas en los inmunotubos se realizaron como sigue. Las bacterias se hicieron crecer durante la noche a 37°C en placas de agar sanguíneas y se rasparon en una solución amortiguadora de carbonato a una concentración de 5xl09 bacterias/ml . Dos mí se agregaron a un tubo inmune Nunc MaxiSorp (Nunc) y se incubaron durante la noche a 4°C en un rotor de extremo a extremo (5 rpm) . El tubo se vació y se lavó tres veces con PBS. Tanto el tubo y una alícuota de una biblioteca fago (aproximadamente 1013 cfu, se amplificaron usando un fago ayudante CT (ver O 02/103012)) se bloquearon en una solución amortiguadora de bloqueo (2% de ELK, 2% de BSA o 1% de Protifar en PBS) durante 0.5-2 horas a temperatura ambiente. El tubo se vació, la biblioteca de fagos de bloqueo se agregó y el tubo se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente en un rotor de extremo a extremo (5 rpm) . El tubo se lavó cinco hasta quince veces con PBS que contiene 0.1% (v/v) de Tween-20, luego cinco hasta quince veces con PBS para remover el fago no enlazado. Los fagos unidos se eluyeron del antígeno por incubación con 1.5 mi de 0.1 de trietilamina o 50 m de Glicina-HCl, pH 2.2 durante 10 minutos a temperatura ambiente en un rotor de extremo a extremo (5 rpm) . Los fagos eluidos se mezclaron con 0.5 mi de 1 M Tris-HCl pH 7.5 para neutralizar el pH.

La infección posterior de las bacterias E. coli XLl-azul, se hizo crecer de la bacteria infectada y la preparación de una biblioteca fago enriquecida se realizo como se describe arriba para las selecciones usando la bacteria en suspensión. Típicamente, las dos rondas de las selecciones se realizaron antes del aislado de los anticuerpos fago individuales. La selección podría realizarse dos veces en la misma cepa de la bacteria o diferente cepa que puede usarse secuencialmente . Después de la segunda etapa de la selección, las colonias E.coli individuales se usaron para preparar los anticuerpos fagos monoclonales .

Esencialmente, las colonias individuales se hicieron crecer en la fase larga y se infectaron con los fagos de ayuda CT o VCSM 13 después de la producción del anticuerpo fago se permitió procesar durante la noche. Los anticuerpos fagos producidos fueron el PEG/NaCl-precipitado y se esterilizaron por filtración y se probaron en ELISA para enlazar a los Enterococos preparados como se describe supra. Ejemplo 4 Validación de los anticuerpos de fagos de cadena sencilla específicos de enterococos Los anticuerpos fagos de cadena sencilla seleccionados que se obtienen en la separación por exclusión descrita arriba, se validaron en ELISA por la actividad del unión enterococal especifico, esto es, el unión de una o más cepas enterococal preparadas como se describe supra. Las bacterias 2.5xl08 se recubrieron durante la noche a 4°C por las placas Maxisorp™ ELISA en 50µ1 50 mM de solución amortiguadora de carbonato, pH 9.6. Como controles negativos, los antigeno complejos 2% de ELK y 1% de BSA ambos en PBS (pH 7.4) se recubrieron. Los pocilios se lavaron en PBS que contiene 0.1% (v/v) de Tween-20 y se bloquearon con 300 µ? de PBS que contiene 2% de ELK durante al menos 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos fago de cadena sencilla seleccionados se incubaron durante 15 minutos en un volumen igual de PBS que contiene 2% de ELK para obtener los anticuerpos fago de bloqueo. Las placas se vaciaron y los anticuerpos fago de cadena sencilla de bloqueo se agregaron a los pocilios. La incubación se permitió procesarse durante 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron en PBS que contiene 0.1% de (v/v) Tween-20 y los anticuerpos fago de unión se detectaron usando un anticuerpo anti-M13 conjugado a peroxidasa. La absorbancia a 492 nm se midió usando un espectrofotómetro . Como un control, el procedimiento se realizó simultáneamente sin el anticuerpo fago de cadena sencilla y con un anticuerpo fago de cadena sencilla de control negativo dirigido contra la proteina cubierta con el virus del Nilo Occidental (SC04-374) . Como se despliegue en la tabla 9, los anticuerpos fagos seleccionados llamados SC05-140, SC05-157, SC05-159, SC05-166, SC05-179, SC05-187, SC06-016, SC06-043, SC06-049, SC06-050, SC06-071, SC06-077, SC06-078, SC06-079, SC06-086, SC06-087, SC06-089, SC06-092, SC06-191, SC06-195, SC06-198, SC06-241, SC06-242, SC06-246, SC06-252, SC06-388, SC06-389, SC06-396, SC06-402, SC06-409, SC06-415, SC06-421, SC06-429 y SC06-432 fueron específicamente unidos a la cepa Enterococos faecalis 12030. Con la excepción de SC05-140 y SC06-421 ninguno de los anticuerpos fagos exhibieron algún unión detectable para los antígenos de control negativo ELK y BSA. Ejemplo 5 Caracterización de los scFvs específicos de enterococos Se obtuvo ADN plásmido de los clones del anticuerpo fago de cadena sencilla específica seleccionada (scFv) y las secuencias de nucleótido se determinaron de conformidad a las técnicas estándar. Las secuencias de nucleótidos de los scFvs (incluyendo los sitios de restricción durante la clonación) llamados SC05-140, SC05-157, SC05-159, SC05-166, SC05-179, SC05-187, SC06-016, SC06-043, SC06- 049, SC05-050, SC06-071, SC06-077, SC06-078, SC06-079, SC06-086, SC06-087, SC06- 089, SC06-092, SC06-191, SC06-195, SC06-198, SC06-241, SC06-242, SC06-246, SC06- 252, SC06-388, SC06-389, SC06-396, SC06-402, SC06-409, SC06-415, SC06-421, SC06- 429, y SC06-432 se mostraron en las SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:354, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:356, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:358, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:360, SEQ ID NO:362, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:208, SEQ ID NO:364, SEQ ID NO:366, SEQ ID NO:368, SEQ ID NO:370, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:372, SEQ ID NO:374, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:376, SEQ ID NO:378, SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO:388, SEQ ID NO:390 y SEQ ID NO:392, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de los scFvs se llamaron SC05-140, SC05- 157, SC05- 159, SC05-166, SC05--179, SC05--187, SC06-016, SC06-043, SC06-¦049, SC05-050, SC06--071, SC06--077, SC06-078, SC06-¦079, SC06-¦086, SC06-087, SC06 -089, SC06--092, SC06-191, SC06-¦195, SC06- 198, SC06-241, SC06 -242, SC06--246, SC06-252, SC06-¦388, SC06-¦389, SC06-396, SC06' -402, SC06--409, SC06-415, SC06- 421, SC06-429, y SC06-432 se mostraron en las SEQ ID NO:351, SEQ ID NO:353, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:355, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:357, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:359, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:361, SEQ ID NO:363, SEQ ID NO:207, SEQ ID NO:209, SEQ ID NO:365, SEQ ID NO:367, SEQ ID NO:369, SEQ ID NO:371, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:373, SEQ ID NO:375, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:377, SEQ ID NO:379, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:389, SEQ ID NO: 391 y SEQ ID NO: 393, respectivamente. La identidad del gen VH y VL (ver Tomlinson IM, Williams SC, Ignatovitch O, Corbett SJ, Winter G. V-BASE Sequence Directory. Cambridge United Kingdom: MRC Centre for Protein Engineering (1997)) y las secuencias CDR de los scFvs específicamente unidos a los enterococos se detallan en las tablas 10 y 11, respectivamente . Ejemplo 6 Construcción de las moléculas de inmunoglohulina completamente humanas (anticuerpos anti-enterocócicos monoclonales humanos) de los Fvs de cadena sencilla anti-enterocócicos seleccionados Las regiones variables de la cadena pesada y ligera del scFv se llamaron SC05-140, SC05-157, SC05- 159, SC05-166, SC05-179, SC05-187, SC06-016, SC06-043, SC06-049, SC05-050, SC06- 071, SC06-077, SC06-078, SC06-079, SC06-086, SC06-087, SC06-089, SC06-092, SC06- 191, SC06-195, SC06-198, SC06-241, SC06-242, SC06-246, SC06-252, SC06-388, SC06- 389, SC06-396, SC06-402, SC06-409, SC06-415, SC06-421, SC06-429, y SC06-432 se clonaron directamente por digerir la restricción por la expresión en los vectores de expresión IgG pIg-C911-HCgammal (ver SEQ ID NO: 127), pIg-C909-Ckappa (ver SEQ ID NO: 128) y pIg-C910-Clambda (ver SEQ ID NO: 129) . Las regiones variables de cadena pesada de los scFvs se llamaron SC05-140, SC05-157, SC05-159, SC05-166, SC05-179, SC05-187, SC06-016, SC06-043, SC06-049, SC05-050, SC06-071, SC06-077, SC06-078, SC06-079, SC06-086, SC06-087, SC06- 089, SC06-092, SC06-191, SC06-195, SC06-198, SC06-241, SC06-242, SC06-246, SC06-252, SC06-388, SC06-389, SC06-396, SC06-402, SC06-409, SC06-415, SC06-421, SC06- 429, y SC06-432 se clonaron en el pIg-C911-HCgammal por digerir la restricción usando las enzimas Sfil y Xhol. Las regiones variables de cadena ligera del scFv se llamaron SC06-016, SC06-050, SC06-077, SC06-086, SC06-191, SC06-241, SC06-396, y SC06-429 se clonaron en el vector pIg-C909-Ckappa por digerir la restricción usando las enzimas Salí, Xhol y Notl. Las regiones variables de cadena ligera del scFv se llamaron SC05-140, SC05-157, SC05-159, SC05-166, SC05-179, SC05-187, SC06-043, SC06-049, SC06-071, SC06-078, SC06-079, SC06-087, SC06-089, SC06-092, SC06-195, SC06-198, SC06-242, SC06-246, SC06-252, SC06-388, SC06-389, SC06-402, SC06-409, SC06-415, SC06-421, y SC06-432 se clonaron en el vector pIg-C910-Clambda por digerir la restricción usando las enzimas Salí, Xhol y Notl. Posteriormente las secuencias del nucleótido se verificaron de conformidad a las técnicas estándar conocidas por las personas de habilidad en la técnica. La expresión resultante pgG105-140C911, pgG105-157C911 , pgG105-159C911, pgG105-166C911 , pgG105-179C911 , pgG105-187C911, pgG106-016C911, pgG106-043C911, pgG106-049C911, pgG106-050C911, pgG106-071C911, pgG106-077C911, pgG106-078C911, pgG106-079C911, pgG106-086C911 , pgG106-087C911 , pgG106-089C911, pgG106-092C911, pgG106-191C911 , pgG106-195C911, pgG106-198C911, pgG106-0241C911, pgG106-242C911, pgG106-246C911, pgG106-252C911 , pgGlO 6-388C911 , pgG106-389C911, pgG106-396C911, pgG106-402C911, pgG106-409C911, pgG106-415C911, pgG106-421C911, pgG106-429C911, y pgG106-432C911 que codifican las cadenas pesadas IgGl humanas anti-enterococos y pgG105-140C910 , pgG105-157C910 , pgG105-159C910, pgG105-166C910, pgG105-179C910, pgG105-187C910, pgG106-016C909, pgG106-043C910, pgG106-0 9C910, pgG106-050C909, pgG106-071C910, pgG106-077C909, pgG106-078C910 , pgG106-079C910, pgG106-086C909, pgG106-087C910, pgG106-089C910 , pgG106-092C910, pgGlO 6-191C909 , pgG106-195C910, pgG106-198C910, pgG106-0241C909, pgG106-242C910 , pgG106-246C910, pgG106-252C910, pgG106-388C910, pgGlO 6-389C910 , pgG106-396C909, pgG106-402C910, pgG106-409C910 , pgG106- 15C910 , pgG106-421C910, pgG106-429C909, y pgG106-432C910 que codifican las cadenas ligeras Ig humanas anti-enterococos se expresan transitoriamente en combinación en las células 293T y sobrenadantes que contienen los anticuerpos IgGl humanos se obtienen. Las secuencias de nucleótidos de las cadenas pesadas de los anticuerpos que se llaman CR5140, CR5157, CR5159, CR5166, CR5179, CR5187, CR6016, CR6043, CR6049, CR6050, CR6071, CR6077, CR6078, CR6079, CR6086, CR6087, CR6089, CR6092, CR6191, CR6195, CR6198, CR6241, CR6242, CR6246, CR6252, CR6388, CR6389, CR6396, CR6402, CR6409, CR6415, CR6421, CR6429, y CR6432 se mostraron en las SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO:396, SEQ ID N0:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:398, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID N0:91, SEQ ID NO:400, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:402, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:406, SEQ ID NO:210, SEQ ID NO:212, SEQ ID NO:408, SEQ ID NO:410, SEQ ID NO:412, SEQ ID NO:414, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:416, SEQ ID NO:418, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:420, SEQ ID NO:422, SEQ ID NO:424, SEQ ID NO:426, SEQ ID NO:428, SEQ ID NO:430, SEQ ID NO:432, SEQ ID NO:434, y SEQ ID NO: 436, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas de los anticuerpos se llaman CR5140, CR5157, CR5159, CR5166, CR5179, CR5187, CR6016, CR6043, CR6049, CR6050, CR6071, CR6077, CR6078, CR6079, CR6086, CR6087, CR6089, CR6092, CR6191, CR6195, CR6198, CR6241, CR6242, CR6246, CR6252, CR6388, CR6389, CR6396, CR6402, CR6409, CR6415, CR6421, CR6429, y CR6432, se mostraron en las SEQ ID NO:395, SEQ ID NO:397, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:401, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:405, SEQ ID NO:407, SEQ ID NO:211, SEQ ID NO:213, SEQ ID NO:409, SEQ ID NO:411, SEQ ID NO:413, SEQ ID NO:415, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:417, SEQ ID NO:419, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:421, SEQ ID NO:423, SEQ ID NO:425, SEQ ID NO:427, SEQ ID NO:429, SEQ ID NO:431, SEQ ID NO:433, SEQ ID NO: 35, y SEQ ID NO: 37, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de la cadena ligera de los anticuerpos CR5140, CR5157, CR5159, CR5166, CR5179, CR5187, CR6016, CR6043, CR6049, CR6050, CR6071, CR6077, CR6078, CR6079, CR6086, CR6087, CR6089, CR6092, CR6191, CR6195, CR6198, CR6241, CR6242, CR6246, CR6252, CR6388, CR6389, CR6396, CR6402, CR6409, CR6415, CR6421, CR6429, y CR6432 se mostraron en las SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:442, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO:444, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:450, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:452, SEQ ID NO:454, SEQ ID NO:456, SEQ ID NO:458, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO:460, SEQ ID NO:462, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO:464, SEQ ID NO:466, SEQ ID NO:468, SEQ ID NO:470, SEQ ID NO:472, SEQ ID NO:474, SEQ ID NO:476, SEQ ID NO:478, y SEQ ID NO:480, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de los anticuerpos CR5140, CR5157, CR5159, CR5166, CR5179, CR5187, CR6016, CR6043, CR6049, CR6050, CR6071, CR6077, CR6078, CR6079, CR6086, CR6087, CR6089, CR6092, CR6191, CR6195, CR6198, CR6241, CR6242, CR6246, CR6252, CR6388, CR6389, CR6396, CR6402, CR6409, CR6415, CR6421, CR6429, y CR6432 se mostraron en las SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 441, SEQ ID NO : 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO:443, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO :108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 449, SEQ ID NO :451, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO :455, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO:461, SEQ ID NO:463, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO:465, SEQ ID NO:467, SEQ ID NO:469, SEQ ID NO:471, SEQ ID NO:473, SEQ ID NO:475, SEQ ID NO:477, SEQ ID NO:479, y SEQ ID NO: 81, respectivamente. .Una persona de habilidad en la técnica puede determinar las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos de arriba por seguir a Kabat et al. (1991) como se describe en las secuencias de las proteínas de interés inmunológico . Las regiones variables de los anticuerpos se dan en la tabla 12. Los anticuerpos IgGl anti-enterocócicos humanos se validaron por su habilidad para enlazar enterococos por ELISA esencialmente como se describe por los scFvs arriba; los IgGl se evaluaron en una concentración de 5 g/ml excepto por los siguientes IgGIs: el CR6191 se evaluó a 1.6 g/ml, CR6195 a 3.1 g/mCR6198 a 4.1 g/ml, CR6241 a 2.1 g/ml, CR6246 a 2.6 g/ml y CR6252 a 3.0 g/ml. El control negativo fue un anticuerpo del virus del anti-Nilo Occidental (CR4374). Además, los anticuerpos IgGl anti-enterocócicoses humanos se probaron para su habilidad para enlazar a diferentes aislados clínicos de Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium (ver tabla 13). Un anticuerpo se consideró para enlazar a un aislado, cuando el valor dentro de un experimento individual fue al menos tres veces comparado al valor del control genitivo dentro del experimento individual. El valor del control negativo en la tablal3 es un promedio de 6 experimentos. Todos los anticuerpos excepto CR5157, CR5179, CR6016, CR6043, CR6050, CR6246, CR6388, CR6409 y el anticuerpo de control negativo específicamente enlaza a la cepa Enterococos faecalis 12030 y todos los IgGIs con la excepción de CR5157, CR6016, CR6043, CR6050, CR6241, CR6242, CR6246, CR6388 y CR6409 se enlazan a más de un aislado clínico. Los anticuerpos CR5187, CR6049, CR6396, CR6402 y CR6421 se enlazaron a todas las cepas Enterococos faecalis probadas y las dos cepas Enterococos faecium probadas. Alternativamente, los lotes mayores de 1 mg de cada anticuerpo se produjeron y se purificaron usando los procedimientos estándar. Ejemplo 7 Actividad fagocítica opsonica In vitro de los IgGs específicos enterococales medidos por el ensayo de eliminación opsonofagocitica Un ensayo opsonofagocít ico se realizó para cuantificar la actividad de eliminación del IgGl humano ant i-ent erococos contra el aislado clínico enterocócico 12030. La sangre humana recién extraída (10 hasta 30 mi) se mezcló en un volumen igual es solución amortiguadora de dextrano-heparina (4.5 g de dextran, Sigma Chemical, St. Louis; 28.4 mg de heparina de sodio en 500 mi de agua destilada), y la mezcla se incubó a 37°C durante 1 hora. La capa superior que contiene los leucocitos se colectó por centrifugación, e lisis hipotónica de los eritrocitos restantes se completó por la suspensión del peletizado celular en 1% (p/v) de NH4C1. La población del leucocito se lavó subsecuentemente en RPMI con 15% de suero de bovino fetal. El teñido de azul de tripano y conteo en un hemocit ómet ro se usaron para determinar la concentración de los leucocitos vivos y la concentración del leucocito final se ajustó hasta 2xl07 células/ml. El ensayo de fagocitosis se realizo en duplicado con o sin 1001 de una suspensión de leucocito se agrega a 1001 de la bacteria (concentración ajustada espect rofotomet ricamente hasta 2xl07 por mi y se confirmó por conteo viable), 1001 del IgGl humano ant i-enterococos human diluido en RPMI, y 1001 del complemento de conejo cria. La mezcla de reacción se incubó modulo de rotor a 37°C durante 90 minutos; las despliegues se tomaron en tiempo de 0 y después de 90 minutos, se diluyeron en 1% de peptona proteosa (Difco Laboratories, Detroit, Mich.), y se colocan en placas en placas de agar de soya triptica. La actividad exterminadora (%) de los anticuerpos se calculó como el número medio de los CFU supervivientes en la despliegue que contiene el substrato de leucocitos del número medio de los CFU supervivientes en la despliegue sin leucocitos, se dividen por el último y se amplifican por 100. Cuatro concentraciones del IgGl humano ant i-enterococos se probaron (2500, 250, 25, 2.5 ng/ml) en dos experimentos independientes. El análisis de regresión ordinal aplicado al modelo de conejo se usó para calcula las concentraciones requeridas para el 50% de la eliminación de la bacteria en el ensayo (ver tabla 14) . Ejemplo 8 Actividad In vivo de los IgGs específicos enterococales en un modelo de sepsis murina Un modelo de sepsis murina de enterococo (ver Hufnagel et al. 2004) se usó para cuantificar la actividad del IgGl humano anti-enterococos al depurar el aislado clínico enterocócico 12030 del torrente sanguíneo. Las moléculas IgGl purificadas CR5159, CR5187, CR6016, CR6043, CR6049, CR6071, CR6089, y CR6241 demostraron que tienen actividad exterminadora in Vitro contra el Enterococo y un IgGl de control negativo que tienen actividad exterminadora contra el Enterococo se prepararon como se describe arriba y se inyectaron i.p. (0.5-1 mi en PBS) en los grupos de ratones BALB/c en una dosis de 15 mg/kg, con la excepción de que CR6016 y CR6241 se inyectaron en una dosis de 7.5 mg/kg. Además, un grupo de ratones se inyectó con PBS. Después de 24 horas los animales se inocularon i.v. con 6xl0s CFU de cepa de Enterococos 12030. Cuatro horas después de la prueba inmunogénica los ratones recibieron una segunda inyección i.p. de CR5159, CR5187, CR6016, CR6043, CR6049, CR6071, CR6089, y CR6241 en la misma dosis. Tres días después de la infección sistémica a los animales se les aplicó la eutanasia y ~0.5 mi de la sangre se colectó por punción cardiaca. Las despliegues de sangre se cultivaron cuantitativamente en un medio agar selectivo enterocócico; 1001 de la sangre diluida en 9001 de THB se extiende fuera de las placas en duplicado. Después de incubación durante la noche el número de CFU se leyó completamente de la placa y se multiplicó por 10 para dar el CFU/ml de la sangre. Este valor se relaciona directamente a la cantidad de la bacteria circulante al momento del sacrificio. El punto final primario en este modelo es CFU de Enterococos en la sangre 3 días después de la inoculación. Como se despliegue en la figura 1 todos los animales que recibieron PBS o control IgGl tienen >102 CFU/ml de Enterococos en su sangre después de 3 días y el medio fue ~103 de CFU/ml. En contraste, todos los grupos que recibieron los anticuerpos anti-enterocócicos contienen los animales con <102 de CFU/ml de Enterococos en la sangre. Además, en todos los casos, el CR5187, la media fue un log de bajo de los controles. Un anticuerpo, CR6089, tiene un medio de bajo del nivel de la sensibilidad en el ensayo (10 CFU/ml) y en 6 de 8 animales que no se detectó las bacterias en la sangre. El CR6016 y CR6241 se usaron en una dosis inferior que todavía tienen medios cercanos a 10 CFU/ml de la sangre que indica que son de potencia alta. El análisis no paramétrico de la variación ( ruskal-Wallis ) establece que las diferencias fueron altamente importantes (p < 0.001) . Las comparaciones de los pares se realizaron entre la prueba IgGl y el control negativo IgGl usando la prueba ann-Whitney con la corrección Bonferroni. Los anticuerpos CR5159, CR5187, CR6043, CR6049, CR6089, y CR6241 fueron todos significativamente diferentes (p < 0.05) para controlar el anticuerpo, mientras el medio diferente de los anticuerpos CR6043 y CR6071 no alcanzo importancia cuando se compara al anticuerpo de control. Ejemplo 9 Ensayo de competición IgGl Se desarrolló una competición ELISA para establecer si los anticuerpos en el panel competían para enlazar al mismo objetivo. La cepa enterococal 12030 se formó en franjas en una placa agar de la sangre y se incubó durante la noche a 37°C. Las colonias se rasparon de la placa usando 5 mi de una solución amortiguadora de carbonato (8 volúmenes de 0.2 M de Na2C03, 17 volúmenes de 0.2 de NaHC03 y 75 volúmenes de agua destilada) y se centrifugaron durante 3 minutos a 4000 rpm. El peletizado obtenido se volvió a suspender en 500 µ? de solución amortiguadora de carbonato, se centrifugaron nuevamente y el peletizado se volvió a suspender en 500 µ? de solución amortiguadora de carbonato. La densidad celular se determinó por medir OD600 de una serie de diluciones de la bacteria.

La cepa de enterococos se diluyó en una densidad de 5xl09 células/ml y 100 µ? (5xl0s células) por pocilio se contó durante la noche a 4°C en placas de Nunc-Immuno Maxisorp F96. Después de la incubación, los pocilios se lavaron tres veces con PBS y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con 300 µ? 2% (v/v) ELK en PBS por pocilio. En tubos separados 25 µ? de cada scFv-fago maxiprep (producido como arriba) se diluyó a niveles subsaturados (como se determina por ELISA arriba) se mezcló con 25 µ? de solución amortiguadora de bloqueo (4% de (v/v) ELK en PBS) y 50 µ? del sobrenadante IgGl diluido a 10 g/ml en PBS. La mezcla se incubó durante 20 minutos en hielo. Después de remover la solución de bloqueo de los pocilios, 100 µ? de la mezcla se agregó a cada pocilio y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, los pocilios se lavaron tres veces con PBS/0.01% de (v/v) T een y una vez con PBS. Después del lavado, 100 µ? de anti-M13 HRP (1:5000 en 2% de (v/v) ELK en PBS) se agregó por pocilio y se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente. Los pocilios se lavaron nuevamente y el teñido se visualizó por agregar 100 µ? de una solución en cada pocilio. La reacción de visualización se detuvo después de 5-10 minutos por agregar 50 µ? de 1M H2SO4 a cada pocilio y el OD se midió a 492nm. El experimento se repitió dos veces con el panel completo de anticuerpos y el CR4374 IgGl de control. Los resultados mostraron que los anticuerpos podrían dividirse en diversos, grupos distintos. Un grupo consiste de CR6089 y CR6092; el grupo B consiste de CR5157, CR5187, CR6043, CR6049, CR6388, CR6389, CR6396, CR6402, CR6409, CR6421, y CR6429; y el grupo C consiste de CR5159, CR5166, CR6050, CR6077, CR6078, CR6086, y CR6191 y el resto de los anticuerpos CR5140, CR5179, CR6016, CR6071, CR6079, CR6087, CR6195, CR6198, CR6241, CR6242, CR6246, CR6252, CR6415, y CR6432 no compite con cualquier otro anticuerpo de unión . Ejemplo 10 Actividad fagocítica opsónica in Vitro de Jas moléculas IgGl ant i-enterocócicas contra diferentes cepas de E. faecalis, E. faecium y S. aureus medidas por el ensayo exterminador opsonofagocitico Para determinar la extensión de la actividad exterminadora del panel del anticuerpo monoclonal ant i-enterococal , los lotes purificados de IgGl se hacen como se describe arriba, se prueban por la actividad exterminadora en el ensayo eliminador opsonofagocitico descrito arriba. Una cepa E. faecalis adicional, tipo 2; dos diferentes aislados clínicos E . faecium, 740220 y 838970; y el aislado clínico S. aureus 502 se probaron. Dieciocho anticuerpos se eligieron del panel original de 34 capacidades de unión no competentes y la potencia en el ensayo de eliminación opsonof agoci t ico . Como se despliegue en la tabla 15, el panel elegido mostró la actividad exterminadora contra la cepa E. faecium en dos concentraciones, 2.5 y 0.025 g/ml, aunque la actividad de CR5140, CR6016 y CR6078 fue inferior luego 20% contra la cepa 838970 en una concentración mayor. Todos pero un anticuerpo que actividad medible contra la cepa E. faecalis tipo 2, aunque 11 de 18 anticuerpos tiene menos del 25% de actividad exterminadora en una prueba de concentración alta. Sorprendentemente, todos los anticuerpos del panel tienen actividad exterminadora contra la cepa S. aureus 502, indican que los anticuerpo reconocen ampliamente los objetivos de los reacti os-cruzados. Se prueban si cualquiera de los anticuerpos se enlazan al ácido lipoteichoico (LTA) de S. aureus, y ninguno de estos anticuerpos parece hacerlo. Tres de los anticuerpos (CR6252, CR6415 y CR6421) se probaron para actividad exterminadora fagocitica opsonica contra otra cepa Staphylococcus aureus (Newman) , y contra una cepa Staphyloccoccus epidermidi s (RP62A) , y todos los tres anticuerpos probados mostraron actividad contra estas diferentes especies Staphylococcus y cepas.

Tabla 1: Cebadores de región variable de cadena lambda humana (sentido) .

Nombre del cebador Secuencia del nucleótido cebador SEQ ID NO HuVL l A-Trasero 5 '-CAGTCTGTGCTGACT SEQ ID NO: 130 CAGCCACC-31 HuVLI B-Trasero 5'-CAGTCTGTGYTGACG SEQ ID NO: 131 CAGCCGCC-3' HuVL I C-Trasero 5'-CAGTCTGTCGTGACG SEQ ID NO: 132 CAGCCGCC-3' HuVL2B-Trasero 5 '-CAGTCTGCCCTG ACT SEQ ID NO: 133 CAGCC-3 ' HuVL3A-Trasero 5 '-TCCTATGWGCTGACT SEQ ID NO: 134 CAGCCACC-3' HuVL3B-Trasero 5'-TCTTCTGAGCTGACT SEQ ID NO: 135 CAGGACCC-3' HuVL4B-Trasero 5 '-CAGCYTGTGCTG ACT SEQ ID NO: 136 CAATC-3' HuVL5-Trasero 5'-CAGGCTGTGCTGACT SEQ ID NO: 137 CAGCCGTC-3' HuVL6-Trasero 5'-AATTTTATGCTGACT SEQ ID NO: 138 CAGCCCCA-3' HuVL7/8-Trasero 5'-CAGRCTGTGGTGACY SEQ ID NO: 139 CAGGAGCC-3' HuVL9-Trasero 5'-CWGCCTGTGCTGACT SEQ ID NO: 140 CAGCCMCC-3 ' HuVLl O-Trasero 5 '-CAGGC AGGGCTGACT SEQ ID O: 141 CAG-3' Tabla 2: Cebadores de región variable de cadena kappa humana (sentido) .

Nombre del cebador Secuencia del nucleótido cebador SEQ ID NO HuVKlB- Trasero 5'- SEQ ID NO: 142 GACATCCAGWTGACCC AGTCTCC-3 ' HuVK2-Trasero 5 '-GATGTTGTGATGACT SEQ ID NO: 143 CAGTCTCC-3' HuVK2B2 5 ' -GAT ATTG TG ATG ACC SEQ ID NO: 144 CAGACTCC-3 ' HuVK3B-Trasero 5 '-GAAATTGTGWTGACR SEQ ID NO: 145 CAGTCTCC-3' HuVK5- Trasero 5 ' -G AAACG AC ACTC ACG SEQ ID NO: 146 CAGTCTCC-3' HuVK6-Trasero 5 '-GAAATTGTGCTGACTC SEQ ID NO: 147 AGTCTCC-3' Tabla 3 : Cebadores de región variable de cadena kappa humana ampliados con sitios de restricción Salí (sentido) , cebadores de región J de cadena kappa humana ampliados con sitios de restricción Notl (antisentido) , cebadores de región variable de cadena lambda humana ampliados con sitios de restricción Salí (sentido) y cebadores de región J de cadena lambda humana ampliados con sitios de restricción Notl (anti-sent ido ) .

Nombre del cebador Secuencia del nucleótido cebador SEQ ID NO HuVKlB-Trasero-SAL 5 '-TGAGCACACAGGTCG SEQ ID NO: 148 ACGGACATCCAGWTGACC CAGTCTCC-3' HuVK2-Trasero-SAL 5 '-TGAGCACACAGGTCG SEQ ID NO: 149 ACGGATGTTGTGATGACT CAGTCTCC-3' HuVK2B2-SAL 5 '-TGAGCACACAGGTCG SEQ ID NO: 150 ACGGATATTGTGATGACC CAGACTCC-3 ' HuVK3B-Trasero-SAL 5 '-TGAGCACACAGGTCG SEQ ID NO: 151 ACGGAAATTGTGWTGACR CAGTCTCC-3' HuVKi-Trasero-SAL 5 '-TG AGCACACAGGTCGACG SEQ ID NO: 152 GAAACGACACTCACGCAGTCT CC-3' HuVK6-Trasero-SAL 5 '-TGAGCACACAGGTCG SEQ 1D N0: 153 ACGGAAATTGTGCTGACT CAGTCTCC-3' HuJKl-FOR-NOT 5!-GAGTCATTCTCGACTTGC SEQ ID NO: 154 GGCCGCACGTTTGATTTCCAC CTTGGTCCC-3' HuJK2-FOR-NOT 5 '-GAGTCATTCTCGACT SEQ ID NO: 155 TGCGGCCGCACGTTTGAT CTCCAGCTTGGTCCC-3 ' HuJK3-FOR-NOT 5'-GAGTCATTCTCGACTTGC SEQ ID NO: 156 GGCCGCACGTTTGATATCCAC TTTGGTCCC-3' HuJ 4-FOR-NOT 5 '-GAGTCATTCTCGACT SEQ ID NO: 157 TGCGGCCGACGTTTGAT CTCCACCTTGGTCCC-3 ' HuJK5-FOR-NOT 5 '-GAGTCATTCTCG ACTTGC SEQ ID NO: 158 GGCCGCACGTTTAATCTCCAG TCGTGTCCC-3' HuVL 1 A-Trasero-S AL 5 '-TG AGCACACAGGTCGACG SEQ ID NO: 159 CAGTCTGTGCTGACTCAGCCA CC-3' HuVL l B-Trasero-S AL 5 '-TGAGCAC AC AGGTCGACG SEQ ID NO: 160 CAGTCTGTGYTGACGCAGCCG CC-3' HuVLlC-Trasero-SAL 5 '-TGAGCACAC AGGTCGACG SEQ ID NO: 161 CAGTCTGTCGTGACGCAGCCG CC-3' HuVL2B-Trasero-SAL 5'-TGAGCACACAGGTCGACG SEQ ID NO: 162 CAGTCTGCCCTGACTCAGCC- 3' HuVL3A-Trasero-SAL 5 '-TGAGCACACAGGTCGACG SEQ ID O: 163 TCCTATGWGCTGACTCAGCCA CC-3' HuVL3B-Trasero-SAL 5 '-TGAGCACACAGGTCGACG SEQ ID NO: 164 TCTTCTGAGCTGACTCAGGAC CC-3' HuVL4B-Trasero-SAL 5 '-TGAGCACACAGGTCGACG SEQ ID NO: 165 CAGCYTGTGCTGACTCAATC- 3' HuVL5-Trasero-SAL 5 '-TGAGCACACAGGTCGACG SEQ TD NO: 166 CAGGCTGTGCTG ACTCAGCCG TC-3' HuVL6-Trasero-SAL 5 '-TGAGCACACAGGTCGACG SEQ ID NO: 167 AATTTTATGCTGACTCAGCCC CA-3' HuVL7/8-Trasero-SAL 5 '-TGAGCACACAGGTCGACG SEQ 1D N0:168 CAGRCTGTGGTGACYCAGGAG CC-3' HuVL9-Trasero-SAL 5'-TGAGCACACAGGTCGACG SEQ ID NO: 169 CWGCCTGTGCTGACTCAGCCM CC-3' HuVL10-Trasero-SAL 5 '-TGAGCACACAGGTCGACG SEQ ID NO: 170 CAGGC AGGGCTGACTCAG-3 ' HuJLl-FOR-NOT 5'-GAGTCATTCTCGACTTGC SEQ ID NO:171 GGCCGCACCTAGGACGGTGAC CTTGGTCCC-3' HuJL2/3-FOR-NOT 5'-GAGTCATTCTCGACTTGC SEQ ID NO: 172 GGCCGCACCTAGGACGGTCAG CTTGGTCCC-3' HuJL7-F0R-N0T 5 '-GAGTCATTCTCGACTTGC SEQ 1D 0: 173 GGCCGCACCGAGGACGGTCAG CTGGGTGCC-3' Tabla 4: Porcentaje de los diferentes productos de cadena ligera en la mezcla final, con base en concentraciones determinadas por análisis en gel de agarosa.

Cebador sentido Cebador antisentido Producto Porcentaje Hu VL 1 A-Trasero -SAL + HuJLl -FOR-NOT LUI 4.20% HuVL 1 B-Trasero -S AL + HuJL2/3-FOR-NOT L1J2 8.40% HuVLlC-Trasero-SAL HuJL7-FOR-NOT L1J3 1.40% HuJLl-FOR-NOT L2J1 3.00% HuVL2B-Trasero-SAL HuJL2/3-FOR-NOT L2J2 6.00% HuJL7-FOR-NOT L2J3 1.00% HuJLl-FOR-NOT L3J1 3.00% HuVL3A-Trasero-SAL HuJL2/3-FOR-NOT L3J2 6.00% HuJL7-FOR-NOT L3J3 1.00% HuJLl-FOR-NOT L4J1 0.30% HuVL3B-Trasero-SAL HuJL2/3-FOR-NOT L4J2 0.60% HuJL7-FOR-NOT L4J3 0.10% HuJLl-FOR-NOT L5J1 0.30% HuVL4B-Trasero -SAL HuJL2/3-FOR-NOT L5J2 0.60% HuJL7-FOR-NOT L5J3 0.10% HuJLl-FOR-NOT L6J1 0.30% HuVL5 -Trasero -S AL HuJL2/3-FOR-NOT L6J2 0.60% HuJL7-FOR-NOT L6J3 0.10% HuJLl-FOR-NOT L7J1 0.30% HuVL6-Trasero-SAL HuJL2/3-FOR-NOT L7J2 0.60% HuJL7-FOR-NOT L7J3 0.10% HuJLl-FOR-NOT L8J1 0.30% HuVL7/8-Trasero-SAL HuJL2/3-FOR-NOT L8J2 0.60% HuJL7-FOR-NOT L8J3 0.10% HuVL9- Trasero -SAL + HuJLl-FOR-NOT L9J1 0.30% HuVLlO-Trasero-SAL HuJL2/3-FOR-NOT L9J2 0.60% HU.TL7-FOR-NOT L9J3 0.10% HuJKl-FOR-NOT K1J 1 7.50% HuJK2-FOR-NOT K1 J2 7.50% HuV lB-Trasero-SAL HuJK3-FOR-NOT K1J3 3.00% HuJK4-FOR-NOT 1J4 7.50% HuJK5-FOR-NOT K1J5 4.50% HuJKl-FOR-NOT K2J1 1.00% HuJK2-FOR-NOT K2J2 1.00% HuV 2-Trasero -SAL HuJK3-FOR-NOT 2J3 0.40% HuJK4-FOR-NOT 2J4 1.00% HuJK5-FOR-NOT K2J5 0.60% HuJKl -FOR-NOT K3J1 0.25% HuJ 2-FOR-NOT 3J2 0.25% HuVK2B2-SAL HuJK3-FOR-NOT 3J3 0.10% HuJK4-FOR-NOT K3J4 0.25% HuJK5-FOR-NOT K3J5 0.15% HuJKl -FOR-NOT K4J1 4.75% HuJK2-FOR-NOT K4J2 4.75% Hu VK3B-Trasero -SAL HuJK3-FOR-NOT 4J3 1.90% HuJK4-FOR-NOT K4J4 4.75% HuJK5-FOR-NOT K4J5 2.85% HuJKl -FOR-NOT K5J1 0.25% HuJK2-FOR-NOT 5J2 0.25% HuVK5-Trasero -SAL HuJK3-FOR-NOT K5J3 0.10% HuJK4-F0R-N0T K5J4 0.25% HuJ 5-F0R-N0T K5J5 0.15% HuJKl-FOR-NOT K6J 1 1.25% HuJK2-FOR-NOT 6J2 1.25% HuVK6-Trasero-SAL HuJK3-FOR-NOT K6J3 0.50% HuJK4-FOR-NOT K6J4 1.25% HuJK5-FOR-NOT 6J5 0.75% Tabla 5: Cebadores de región variable de cadena pesada IgG humana (sentido) .

Nombre del cebador Secuencia del nucleótido cebador SEQ ID NO HuVHlB/7 A-Trasero 5'-CAGRTGCAGCTGGTG SEQ ID NO: 174 CARTCTGG-3' HuVHIC-Trasero 5 '-SAGGTCCAGCTGGTR SEQ ID NO: 175 CAGTCTGG-3' HuVH2B-Trasero 5 '-CAGRTCACCTTGAAG SEQ ID NO: 176 GAGTCTGG-3' HuVH3A-Trasero 5 '-GAGGTGCAGCTGGTG SEQ ID NO: 177 GAG-3' HuVH3C-Trasero 5 ' -G AGGTGCAGCTGGTG SEQ ID NO: 178 GAONVCYOG-S' HuVH4B-Trasero 5 ' -C AGG TGC AGCTAC AG SEQ ID NO: 179 CAGTGGGG-3' HuVH4C-Trasero 5 '-CAGSTGCAGCTGCAG SEQ ID NO: 180 GAGTCSGG-3' HuVH6A-Trasero 5 '-CAGGTAC AGCTGC AG SEQ ID NO: 181 CAGTCAGG-3' Tabla 6: Cebadores de región variable de cadena pesada IgG humana ampliados con sitios de restricción Sfil/Ncol (sentido) y cebadores de región J de cadena pesada IgG humana ampliados con sitios de restricción XhoI/BstEII (anti-sentido) . Nombre del cebador Secuencia del nucleótido cebador SEQ ID NO HuVH1B/7A-Trasero-Sfí 5-GTCCTCGCAACTGCG SEQ ID NO:182 GCCCAGCCGGCCATGGCC CAGRTGCAGCTGGTGCAR TCTGG-3' HuVHIC-Trasero-Sfi 5'-GTCCTCGCAACTGCG SEQ ID NO:183 GCCCAGCCGGCCATGGCC SAGGTCCAGCTGGTRCAG TCTGG-3' HuVH2B-Trasero-Sfi 5'-GTCCTCGCAACTGCG SEQ ID NO:184 GCCCAGCCGGCCATGGCC CAGRTCACCTTGAAGGAG TCTGG-3' HuVH3A-Trasero-Sfi 5'-GTCCTCGCAACTGCGGCC SEQ ID NO:185 CAGCCGGCCATGGCCGAGGTG CAGCTGGTGGAG-3' HuVH3C-Trasero-Sfi 5'-GTCCTCGCAACTGCG SEQ ID NO:186 GCCCAGCCGGCCATGGCC GAGGTGCAGCTGGTGGAG WCYGG-3' HuVH4B-Trasero-Sfi 5'-GTCCTCGCAACTGCG SEQ ID NO:187 GCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTGCAGCTACAGCAG TGGGG-3' HuVH4C-Trasero-Sfí 5'-GTCCTCGCAACTGCGGCC SEQ ID NO:188 CAGCCGGCCATGGCCCAGSTG CAGCTGCAGGAGTCSGG-3' HuVH6 A-Trasero -Sfi 5'-GTCCTCGCAACTGCG SEQ ID NO:189 GCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGTACAGCTGCAGCAG TCAGG-3' HuJHl/2-FOR-XhoIB 5 '-GAGTCATTCTCGACTCGA SEQIDNO:190 GACRGTGACCAGGGTGCC-3 ' HuJH3-FOR-Xho 5 '-GAGTCATTCTCGACT SEQ 1DN0:191 CGAGACGGTGACCATTGT CCC-3' HuJH4/5-FOR-Xho 5 '-G AGTCATTCTCGACT SEQ ID NO:192 CGAGACGGTGACCAGGGT TCC-3' HuJH6-FOR-Xho 5 '-GAGTCATTCTCGACTCGA SEQIDNO:193 GACGGTGACCGTGGTCCC-3 ' Porcentaje de los diferentes productos de cade sada en la mezcla final. Cebador sentido Cebador antisentido Producto Porcentaje HuJHl/2-FOR-XholB HU I 2.5% HuVHlB/7 A-Trasero -Sfi HuJH3-FOR-Xho H1.12 2.5% + HuVH lC-Trasero-Sfi HuJH4/5-FOR-Xho H1J3 1 .0% HuJH6-FOR-Xho H1J4 5.0% HuJHl/2-FOR-XhoIB H2J1 0.2% HuVH2B-Trasero-Sfí HuJH3-FOR-Xho H2J2 0.2% HuJH4/5-FOR-Xho H2J3 1.2% HuJH6-FOR-Xho H2J4 0.4% HuJHl/2-FOR-XhoIB H3J 1 2.5% HuVH3A-Trasero-Sfi HuJH3-FOR-Xho H3J2 2.5% HuJH4/5-FOR-Xho H3J3 15.0% HuJH6-FOR-Xho H3J4 5.0% HuJH I /2-FOR-XhoIB H4J1 2.5% HuVH3C- Trasero -Sfi HuJH3-FOR-Xho H4J2 2.5% HuJH4/5-FOR-Xho H4J3 15.0% HuJH6-FOR-Xho H4J4 5.0% HuJH l/2-FOR-XholB H5J1 0.2% HuVH4B-Trasero-Sfi HuJH3-FOR-Xho H5J2 0.2% HuJH4/5-FOR-Xho H5J3 1.2% HuJH6-FOR-Xho H5J4 0.4% HuJHl/2-FOR-XhoIB H6J1 2.0% HuVH4C-Trasero-Sfi HuJH3-FOR-Xho H6J2 2.0% HuJH4/5-FOR-Xho H6J3 12.0% HuJH6-FOR-Xho H6J4 4.0% HuJHl/2-FOR-XhoIB H7J I 0.1 % HuVH6A- Trasero -Sfi HuJH3-FOR-Xho H7J2 0.1 % HuJH4/5-FOR-Xho H7J3 0.6% HuJH6-FOR-Xho H7J4 0.2% Tabla 8 : Cepa s enterocócicas usada s para selección y separación por exclus ión de ant i cuerpos de fago ( sc Fv ) de cadena senc i l la ant i -enterocócicas .

Tabla 9 : Actividad de unión especifico Enterocócico de anticuerpos de fago ( scFv) de cadena sencilla como se mide por ELISA . Antlgenos de control Nombre Cepas Enterococcus (OD492nm) del (OD492nm) anticuerpo de fago 12030 T2 BSA ELK SC05-140 1.094 ND 0.226 0.152 SC05-157 0.787 ND 0.058 0.106 SC05-159 0.612 ND 0.060 0.089 SC05-166 0.954 ND 0.104 0.099 SC05-179 0.804 ND 0.045 0.047 SC05-187 0.835 1.043 0.055 0.055 SC06-016 0.842 ND 0.044 0.041 SC06-043 0.705 ND 0.045 0.042 SC06-049 0.241 ND 0.042 0.043 SC06-050 0.410 ND 0.043 0.043 SC06-071 0.703 0.746 0.043 0.042 SC06-077 0.577 1.005 0.044 0.060 SC06-078 0.596 1.040 0.073 0.044 SC06-079 0.663 0.953 0.048 0.041 SC06-086 0.587 ND 0.062 0.053 SC06-087 0.553 ND 0.044 0.060 SC06-089 0.613 ND 0.042 0.063 SC06-092 0.624 ND 0.047 0.050 SC06-191 0.456 0.498 0.044 0.039 SC06-195 0.661 0.789 0.046 0.043 SC06-198 0.999 1.169 0.049 0.044 SC06-241 1.107 0.122 0.052 0.045 SC06-242 0.814 0.085 0.043 0.043 SC06-246 0.588 0.636 0.042 0.040 SC06-252 0.638 0.304 0.044 0.039 SC06-388 1.006 1.301 ND 0.040 SC06-389 1.337 1.743 ND 0.038 SC06-396 0.689 1.166 ND 0.067 SC06-402 1.538 1.905 ND 0.126 SC06-409 0.876 1.339 0.055 0.051 SC06-415 0.889 1.565 0.044 0.049 SC06-421 3.150 3.270 0.607 0.133 SC06-429 1.101 2.453 0.068 0.043 SC06-432 0.807 2.401 0.059 0.044 Promedio neg. ctrl 0.12 0.15 0.07 0.06 ND significa no determinado Tabla 10: Datos de Fvs de cadena sencilla especifica Enterococos . * se despliegue entre paréntesis los aminoácidos que componen la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena ligera (VL) Tabla 11: Datos de las regiones CDR del Fvs de cadena sencilla especifica Enterococos.

SC06-389 302 303 304 305 306 307 SC06-396 308 309 310 31 1 312 313 SC06-402 314 315 316 317 318 3 19 SC06-409 320 321 322 323 324 325 SC06-415 326 327 328 329 330 33 1 SC06-421 332 333 334 335 336 337 SC06-429 338 339 340 341 342 343 SC06-432 344 345 346 347 348 349 Tabla 12: Datos de los IgG específicos de Enterococos. se despliegue entre paréntesis los aminoácidos que componen la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena ligera (VL) Tabla 13: Actividad de unión especifica contra diferentes cepas de Enterococos faecalis y Enterococos faecium por anticuerpos IgGl humanos como se mide por ELISA. Nombre del Cepas Enterococcal (OD492nm) anticuerpo 12030 T2 6814 B8610A 740220* B210860* CR5140 3.084 0.185 0.121 1.769 0.185 0.123 CR5157 0.225 0.358 0.215 0.282 0.199 0.086 CR5159 0.383 0.441 0.265 0.134 0.114 0.077 CR5166 0.533 1.387 0.444 0.140 0.170 0.101 CR5179 0.250 1.206 0.285 1.546 0.131 0.091 CR5187 0.869 1.267 0.939 1.269 0.725 0.296 CR6016 0.281 0.622 0.243 0.134 0.126 0.084 CR6043 0.232 0.326 0.203 0.274 0.196 0.101 CR6049 0.779 1.258 1.123 0.992 0.509 0.251 CR6050 0.291 0.739 0.218 0.117 0.138 0.092 CR607 I 1.452 0.391 0.699 0.629 0.109 0.081 CR6077 0.739 1.774 0.436 0.137 0.137 0.086 CR6078 0.482 1.457 0.336 0.143 0.114 0.082 CR6079 0.751 0.597 0.293 1.160 0.186 0.114 CR6086 0.583 1.554 0.335 0.118 0.116 0.080 CR6087 1.085 1.414 0.098 0.135 0.182 0.091 CR6089 2.164 0.309 1.127 0.822 0.1 18 0.085 CR6092 2.779 1.204 1.989 1.599 0.1 13 0.088 CR6 I 91 0.868 1.639 0.475 0.100 0.063 0.043 CR61 5 0.304 1.652 0.084 2.219 0.051 0.042 CR6198 1.151 2.854 0.532 2.849 0.071 0.039 CR6241 0.814 0.091 0.043 0.072 0.060 0.037 CR6242 0.356 0.102 0.047 0.075 0.079 0.038 CR6246 0.207 0.290 0.047 0.083 0.131 0.049 CR6252 0.583 0.370 0.045 0.076 0.690 0.052 CR6388 0.165 0.180 0.139 0.157 0.207 0.116 CR6389 0.562 0.197 0.122 0.182 0.168 0.320 CR6396 0.427 0.640 0.342 0.500 0.456 0.312 CR6402 0.428 0.391 0.236 0.447 0.292 0.270 CR6409 0.120 0.155 0.1 13 0.145 0.169 0.124 CR6415 2.284 1.910 0.122 0.108 1.119 0.195 CR6421 0.693 0.803 0.51 1 0.822 0.438 0.368 CR6429 0.302 0.437 0.190 0.403 0.347 0.185 CR6432 0.358 0.364 0.322 0.500 0.216 0.406 Promedio negativo ctrl 0.11 0.13 0.09 0.13 0.12 0.07 Tabla 14: Actividad de eliminación opsonofagocitica In vítro contra cepa Enterococos faecalis 12030 por anticuerpos IgGl humanos .

Nombre del Concentraciones de Anticuerpo (ng/ml) Anticuerpo dando eliminación bacteriana al 50% CR5140 ND CR5157 20.7 CR5159 130 CR5166 27.8 CR5179 312 CR5187 295 CR6016 2.20 CR6043 8.94 CR6049 3794 CR6050 5.82 CR6071 12.4 CR6077 54.7 CR6078 10.5 CR6079 >10000 CR6086 10.8 CR6087 21.2 CR6089 3.67 CR6092 >10000 CR6191 178 CR6195 > 10000 CR6198 4787 CR6241 0.613 CR6242 ND CR6246 >10000 CR6252 29.2 CR6388 0.64 CR6389 0.33 CR6396 4.71 CR6402 1.00 CR6409 36.6 CR6415 ND CR6421 21.6 CR6429 1.2 CR6432 >10000 a no determinado Tabla 15: Actividad exterminadora de anticuerpos IgGl como se mide por ensayo de exterminación opsonofagocitico .

REFERENCIAS Boel E, Verlaan S, Poppelier MJ, esterdaal NA, Van Strijp JA and Logtenberg T (2000), Functional human monoclonal antibodies of all isotypes constructed from phage display library-derived single-chain Fv antibody fragments. J. Immunol. Methods 239:153-166. Burton DR and Barbas CF (1994), Human antibodies from combinatorial librarles. Adv. Immunol. 57:191-280. Chou, TC and P Talalay (1984), Quantitative analysis of dose-effect relationships : the combined effects of múltiple drugs or enzyme inhibitors. Adv. Enzyme Regul. 22:27-55. De Kruif J, Terstappen L, Boel E and Logtenberg T (1995a), Rapid selection of cell subpopulation-specific human monoclonal antibodies from a synthetic phage antibody library. Proc. Nati. Acad. Sci . USA 92:3938. De Kruif J, Boel E and Logtenberg T (1995b), Selection and application of human single-chain Fv antibody fragments from a semi-synthetic phage antibody display library with designed CDR3 regions. J. Mol. Biol. 248:97-105. Huebner J, ang Y, Krueger A, Madoff LC, Martirosian G, Boisot S, Goldmann DA, Kasper DL, Tzianabos AO and Pier GB (1999), Isolation and chemical characterization of a capsular polysaccharide antigen shared by clinical isolates of Enterococos faecalis and vancomycin-resistant Enterococos faecium. Infect. Immun. 67: 1213-1219. Hufnagel M, Koch S, Creti R, Baldassarri L, and Huebner J (2004), A putative sugar-binding transcriptional regulator in a novel gene locus in Enterococos faecalis contributes to production of biofilm and prolonged bacteremia in mice. J. Infect. Dis. 189:420-430. Huís G, Heijnen IJ, Cuomo E, van der Linden J, Boel E, van de Winkel J and Logtenberg T (1999), Antitumor immune effector mechanisms recruited by phage display-derived fully human IgGl and IgAl monoclonal antibodies. Cáncer Res. 59: 5778-578 . Slootstra JW, Puijk WC, Ligtvoet GJ, Langeveld JP, Meloen RH (1996), Structural aspects of antibody-antigen interaction revealed through small random peptide librarles. Mol. Divers . 1:87-96. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un anticuerpo monoclonal humano, caracterizado porque tiene actividad de eliminación fagocitica opsónica contra al menos una cepa de cada una de al menos dos diferentes especies de Enterococos y contra al menos una cepa de Staphylococcus aureus .
2. 2. Un anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es elegido del grupo que consiste de anticuerpos que comprenden las regiones variables de cualquiera de los anticuerpos CR5140, CR5157, CR6016, CR6043, CR6050, CR6078, CR6087, CR6089, CR6241, CR6252, CR6388, CR6389, CR6396, CR6402, CR6409, CR6415, CR6421 o CR6429 como se describe en la presente, y anticuerpos con regiones variables que son al menos 80% idénticas a los mismos .
3. 3. Un anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la especie Enterococos comprende E. faecalis y E. faecium.
4. 4. Un inmunoconj ugado, caracterizado porque comprende un anticuerpo monoclonal humano de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-3, el inmunoconjugado además comprende al menos una etiqueta.
5. 5. Una molécula de ácido nucleico, caracterizada porque codifica un anticuerpo monoclonal humano de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-3.
6. 6. Un vector, caracterizado porque comprende al menos una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 5.
7. 7. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende al menos un vector de conformidad con la reivindicación 6.
8. 8. Un método para producir un anticuerpo monoclonal humano de conformidad con cualesquiera de .las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque comprende las etapas de: a) cultivar una célula hospedera de acuerdo con la reivindicación 7 bajo condiciones propicias para la expresión del anticuerpo monoclonal humano, y opcionalmente, b) recuperar el anticuerpo monoclonal humano expresado o variante funcional.
9. 9. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un anticuerpo monoclonal humano de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-3, o un inmunoconj ugado de acuerdo con la reivindicación 4, la composición farmacéutica además comprende al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
10. 10. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque además comprende al menos otro agente terapéutico.
11. 11. El uso de un anticuerpo monoclonal humano de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-3, un inmunoconj ugado de acuerdo con la reivindicación 4, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, para el diagnóstico, profilaxis, tratamiento, o combinación de los mismos, de una infección por enterococos y/o una infección por estafilococos.