JP2020040954A - 1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1h−ベンゾ[e]インドール二量体抗体 − 薬物コンジュゲート化合物、並びに使用及び処置の方法 - Google Patents
1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1h−ベンゾ[e]インドール二量体抗体 − 薬物コンジュゲート化合物、並びに使用及び処置の方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020040954A JP2020040954A JP2019194288A JP2019194288A JP2020040954A JP 2020040954 A JP2020040954 A JP 2020040954A JP 2019194288 A JP2019194288 A JP 2019194288A JP 2019194288 A JP2019194288 A JP 2019194288A JP 2020040954 A JP2020040954 A JP 2020040954A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- alkylene
- hvr
- seq
- drug conjugate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 0 **c1cc(*(CC2CN)C(CI(*)O)=O)c2c2c1cccc2 Chemical compound **c1cc(*(CC2CN)C(CI(*)O)=O)c2c2c1cccc2 0.000 description 12
- VGTRLUQMNVYIEJ-UHFFFAOYSA-N COC(C=C(C1C2)N=CC(CCC3)N3C1=O)=C2O Chemical compound COC(C=C(C1C2)N=CC(CCC3)N3C1=O)=C2O VGTRLUQMNVYIEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KBXAWEFWZCVFPJ-FFGQRACBSA-N COc(cc(c(N=CC1N2CCC1)c1)C2=O)c1OCCCCCC(N1c2cc(OCc(cc3)ccc3NC(CCCCCN(C(C=C3)=O)C3=O)=O)c(cccc3)c3c2[C@H](CCl)C1)=O Chemical compound COc(cc(c(N=CC1N2CCC1)c1)C2=O)c1OCCCCCC(N1c2cc(OCc(cc3)ccc3NC(CCCCCN(C(C=C3)=O)C3=O)=O)c(cccc3)c3c2[C@H](CCl)C1)=O KBXAWEFWZCVFPJ-FFGQRACBSA-N 0.000 description 1
- WOJKKJKETHYEAC-UHFFFAOYSA-N OC(CCCCCN(C(C=C1)=O)C1=O)=O Chemical compound OC(CCCCCN(C(C=C1)=O)C1=O)=O WOJKKJKETHYEAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
- C07K5/06052—Val-amino acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
- C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D207/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
- C07D207/36—Oxygen or sulfur atoms
- C07D207/40—2,5-Pyrrolidine-diones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07D209/56—Ring systems containing three or more rings
- C07D209/58—[b]- or [c]-condensed
- C07D209/60—Naphtho [b] pyrroles; Hydrogenated naphtho [b] pyrroles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07D209/56—Ring systems containing three or more rings
- C07D209/58—[b]- or [c]-condensed
- C07D209/62—Naphtho [c] pyrroles; Hydrogenated naphtho [c] pyrroles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
- C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
- C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
- C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
- C07D403/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing three or more hetero rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
- C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D471/04—Ortho-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
- C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D487/04—Ortho-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
- C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07F9/572—Five-membered rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
- C07F9/6558—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system
- C07F9/65583—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system each of the hetero rings containing nitrogen as ring hetero atom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
- C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/20—Carbocyclic rings
- C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3061—Blood cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
Abstract
Description
37 CFR§1.53(b)の下に出願されたこの非仮出願は、2013年8月12日に出願された米国仮出願第61/864889号、2013年12月16日に出願された米国仮出願第61/916388号及び2014年3月24日に出願された米国仮出願第61/969499号の35 USC§119(e)の下での利益を主張し、これらの全ては本明細書にその全体が参考として援用される。
本発明は、1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール (CBI) 二量体の薬物部分にコンジュゲートし、治療又は診断用途を有する抗体− 薬物コンジュゲートを形成する抗体に関する。抗体は、CBI二量体薬物 − リンカー中間体とのコンジュゲーションのための反応性の遊離システインアミノ酸により操作されうる。また、本発明は、哺乳動物細胞又は関連する病理学的状態のインビトロ、インサイツ、及びインビボでの診断又は処置のためのCBI二量体抗体 − 薬物コンジュゲート化合物を使用する方法にも関する。
抗体薬物コンジュゲート(ADC)は、抗原を発現する腫瘍細胞に対して強力な細胞毒性薬を標的化し、内在化させ、薬物を放出し、これによりそれらの抗腫瘍活性を増強させることにより、抗体及び細胞毒性薬の両方の特性を組み合わせた標的型化学療法分子である(Carter, P. and Senter, P. (2008) The Cancer Jour. 14(3):154-169)。与えられた標的抗原に対するADC開発の成功は、抗体の選択、リンカーの設計及び安定性、細胞傷害性薬物の効力及び抗体への薬物及びリンカーコンジュゲーションの様式の最適化に依存する(Polakis, P. (2005) Current Opinion in Pharmacology 5:382-387)。
本発明は、治療又は診断用途を有する抗体 − 薬剤コンジュゲート(ADC)化合物を形成するリンカーにより共有結合された1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール(CBI)二量体の薬物部分を含む。
発明の一態様は式:
を有する抗体−薬物コンジュゲート化合物であり、
ここで、
Abは抗体であり;
Lは、式:
を有するリンカーであり;
ここで、Strは抗体に共有結合したストレッチャー単位であり;Pepは2から12個のアミノ酸残基の任意のペプチド単位であり、Spは二量体の薬物部分に共有結合した任意のスペーサー単位であり、m及びnは0及び1から独立に選択され;
pは1から8の整数であり;
Dは式:
を有する二量体薬物部分であり、
ここで
R1は、H,P(O)3H2,C(O)NRaRb,又はLへの結合から選択され;
R2は、H,P(O)3H2,C(O)NRaRb,又はLへの結合から選択され;
Ra及びRbはH及び一以上のFで任意置換されたC1−C6アルキルから独立に選択され,
又はRa及びRbは5又は6員複素環基を形成し;
Tは、C3−C12アルキレン,Y,(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン),(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン),(C2−C6アルケニレン)−Y−(C2−C6アルケニレン)及び(C2−C6アルキニレン)−Y−(C2−C6アルキニレン)から選択されるテザー基であり;
ここで、YはO、S、NR1、アリール、及びヘテロアリールから独立に選択され;
ここで、アルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、F,OH,O(C1−C6アルキル),NH2,NHCH3,N(CH3)2,OP(O)3H2,及びC1−C6アルキルで独立に任意置換され、ここでアルキルは、一以上のFで任意置換され;
又はアルキレン、アルケニレン、アリール及びヘテロアリールは、Lへの結合で独立に任意置換され;
D’は、
から選択される薬物部分であり、
ここで波線はTへの結合部位を示し;
X1及びX2は、O及びNR3から独立に選択され、ここでR3はH及び一以上のFで任意置換されたC1−C6アルキルから選択され;
R4は、H,CO2R、又はLへの結合であり、ここでRはC1−C6アルキル又はベンジルであり;及び
R5は、H又はC1−C6アルキルである。
a)薬学的組成物;及び
b)使用説明書
を含む癌を治療するためのキットである。
から選択されるリンカー薬物中間体であり、
ここで、
Xは、マレイミド、チオール、アミノ、ブロミド、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、p−トルエンスルホン酸塩、ヨウ化物、ヒドロキシル、カルボキシル、ピリジルジスルフィド、及びN−ヒドロキシスクシンイミドから選択される反応性官能基である。
Lは、式:
を有するリンカーであり;
ここで、StrはXに共有結合したストレッチャー単位であり;Pepは2から12個のアミノ酸残基の任意のペプチド単位であり、Spは二量体の薬物部分に共有結合した任意のスペーサー単位であり、m及びnは0及び1から独立に選択され;
Dは式:
を有する二量体薬物部分であり、
ここで
R1は、H,P(O)3H2,C(O)NRaRb,又はLへの結合から選択され;
R2は、H,P(O)3H2,C(O)NRaRb,又はLへの結合から選択され;
Ra及びRbは、H及び一以上のFで任意置換されたC1−C6アルキルから独立に選択され,又はRa及びRbは、5又は6員複素環基を形成し;
Tは、C3−C12アルキレン,Y,(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン),(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン),(C2−C6アルケニレン)−Y−(C2−C6アルケニレン)及び(C2−C6アルキニレン)−Y−(C2−C6アルキニレン)から選択されるテザー基であり;
ここで、YはO、S、NR1、アリール、及びヘテロアリールから独立に選択され;
ここで、アルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、F,OH,O(C1−C6アルキル),NH2,NHCH3,N(CH3)2,OP(O)3H2,及びC1−C6アルキルで独立に任意置換され、ここでアルキルは、一以上のFで任意置換され;
又はアルキレン、アルケニレン、アリール及びヘテロアリールは、Lへの結合で独立に任意置換され;
D’は
から選択される薬物部分であり、
ここで波線はTへの結合部位を示し;
X1及びX2は、O及びNR3から独立に選択され、ここでR3はH及び一以上のFで任意置換されたC1−C6アルキルから選択され;
R4は、H,CO2R、又はLへの結合であり、ここでRはC1−C6アルキル又はベンジルであり;及び
R5は、H又はC1−C6アルキルである。
を有するCBI二量体薬物部分の化合物であり、
ここで
R1は、H,P(O)3H2,C(O)NRaRbから選択され;
R2は、H,P(O)3H2,C(O)NRaRbから選択され;
Ra及びRbは、H及び一以上のFで任意置換されたC1−C6アルキルから独立に選択され、
又はRa及びRbは、5又は6員複素環基を形成し;
Tは、C3−C12アルキレン,Y,(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン),(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン),(C2−C6アルケニレン)−Y−(C2−C6アルケニレン)及び(C2−C6アルキニレン)−Y−(C2−C6アルキニレン)から選択されるテザー基であり;
ここで、YはO、S、NR1、アリール、及びヘテロアリールから独立に選択され;
ここで、アルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、F,OH,O(C1−C6アルキル),NH2,NHCH3,N(CH3)2,OP(O)3H2,及びC1−C6アルキルで独立に任意置換され、ここでアルキルは、一以上のFで任意置換され;
又はアルキレン、アルケニレン、アリール及びヘテロアリールは、Lへの結合で独立に任意置換され;
D’は、
から選択される薬物部分であり、
ここで波線はTへの結合部位を示し;
X1及びX2は、O及びNR3から独立に選択され、ここでR3は、H及び一以上のFで任意置換されたC1−C6アルキルから選択され;
R4は、H,CO2Rであり、ここでRはC1−C6アルキル又はベンジルであり;及び
R5は、H又はC1−C6アルキルである。
本発明の特定の実施態様について詳細に述べられ、その例は、付随する構造と式に示される。本発明は説明される実施態様と併せて説明されるが、それらの実施態様に本発明を限定するものではないことが理解されるであろう。一方、本発明は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替、改変、及び均等物を包含することを意図している。
特に明記しない限り、本明細書で使用する以下の用語と語句は、以下の意味を有することが意図される。
本発明の化合物は、野生型抗体又は親抗体の一以上のアミノ酸が、システインアミノ酸と置換される、システイン操作抗体を含む抗体−薬物コンジュゲートを含む。抗体の任意の形態は、そのように操作、すなわち変異導入されうる。例えば、親Fab抗体断片は、システイン操作Fabを形成するように操作され得、本明細書中で「チオFab(チオFab)」と呼ばれる。同様に、親モノクローナル抗体は、「ThioMab(チオMab)」を形成するように操作され得る。一部位変異は、チオFabにおいて1つの操作システイン残基を生じ、一方、IgG抗体のダイマーの性質に起因して、一部位変異は、ThioMabにおいて2つの操作システイン残基を生じる。置換された(「操作された」)システイン(Cys)残基を有する変異体は、新規に導入された操作チオール基の反応性について評価される。チオール反応性値は、0から1.0の範囲の相対的な数値の項であり、任意のシステイン操作抗体について測定され得る。本発明のシステイン操作抗体のチオール反応性値は、0.6〜1.0;0.7〜1.0;又は0.8〜1.0の範囲内である。
(1)BMPR1B(骨形成タンパク質レセプタータイプIB,Genbank受託番号NM_001203)
ten Dijke,P.,et al Science 264 (5155):101-104(1994),Oncogene 14 (11):1377-1382(1997));国際公開第2004063362号(請求項2);国際公開第2003042661号(請求項12);米国特許出願公開第2003134790−A1号(頁38−39);国際公開第2002102235号(請求項13;頁296);国際公開第2003055443号(頁91−92);国際公開第200299122号(実施例2;頁528−530);国際公開第2003029421号(請求項6);国際公開第2003024392号(請求項2;図112);国際公開第200298358号(請求項1;頁183);国際公開第200254940号(頁100−101);国際公開第200259377号(頁349−350);国際公開第200230268号(請求項27;頁376);国際公開第200148204号(実施例;図4)
NP_001194骨形成タンパク質レセプター,タイプIB/pid=NP_001194.1−
相互参照:MIM:603248;NP_001194.1;AY06599
(2)E16(LAT1,SLC7A5,Genbank受託番号NM_003486)
Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 (6699):288-291 (1998), Gaugitsch, H.W., et al (1992) J. Biol. Chem. 267 (16):11267-11273);国際公開第2004048938号(実施例2);国際公開第2004032842号(実施例IV);国際公開第2003042661号(請求項12);国際公開第2003016475号(請求項1);国際公開第200278524号(実施例2);国際公開第200299074号(請求項19;頁127−129);国際公開第200286443号(請求項27;頁222,393);国際公開第2003003906号(請求項10;頁293);国際公開第200264798号(請求項33;頁93−95);国際公開第200014228号(請求項5;頁133−136);米国特許出願公開第2003224454号(図3);国際公開第2003025138号(請求項12;頁150);
NP_003477溶質担体ファミリー7(カチオン性アミノ酸輸送体,y+
システム),メンバー5/pid=NP_003477.3−ホモサピエンス
相互参照:MIM:600182;NP_003477.3;NM_015923;NM_003486_1
(3)STEAP1(前立腺の6回膜貫通型上皮抗原,Genbank受託番号NM_012449)
Cancer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R.S., et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (25):14523-14528);国際公開第2004065577号(請求項6);国際公開第2004027049号(図1L);欧州特許第1394274号(実施例11);国際公開第2004016225号(請求項2);国際公開第2003042661号(請求項12);米国特許出願公開第2003157089号(実施例5);米国特許出願公開第2003185830号(実施例5);米国特許出願公開第2003064397号(図2);国際公開第200289747号(実施例5;頁618−619);国際公開第2003022995号(実施例9;図13A,実施例53;頁173,実施例2;図2A);
NP_036581 前立腺の6回膜貫通型上皮抗原
相互参照:MIM:604415;NP_036581.1;NM_012449_1
(4)0772P(CA125,MUC16,Genbank受託番号AF361486)
J. Biol. Chem. 276 (29):27371-27375 (2001));国際公開第2004045553号(請求項14);国際公開第200292836号(請求項6;図12);国際公開第200283866号(請求項15;頁116−121);米国特許出願公開第2003124140号(実施例16);相互参照:GI:34501467;AAK74120.3;AF361486_1
(5)MPF(MPF,MSLN,SMR,巨核球増強因子、メソテリン,Genbank受託番号NM_005823)Yamaguchi, N., et al Biol. Chem. 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20):11531-11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (1):136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37):21984-21990 (1995));国際公開第2003101283号(請求項14);(国際公開第2002102235号(請求項13;頁287−288);国際公開第2002101075号(請求項4;頁308−309);国際公開第200271928号(頁320−321);国際公開第9410312号(頁52−57);相互参照:MIM:601051;NP_005814.2;NM_005823_1
(6)Napi3b(NAPI−3B,NPTIIb,SLC34A2,溶質輸送体ファミリー34(リン酸ナトリウム),メンバー2,II型ナトリウム依存性リン酸トランスポーター3b,Genbank受託番号NM_006424)
J. Biol. Chem. 277 (22):19665-19672 (2002), Genomics 62 (2):281-284 (1999), Feild, J.A., et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578-582);国際公開第2004022778号(請求項2);欧州特許第1394274号(実施例11);国際公開第2002102235号(請求項13;頁326);欧州特許第875569号(請求項1;頁17−19);国際公開第200157188号(請求項20;頁329);国際公開第2004032842号(実施例IV);国際公開第200175177号(請求項24;頁139−140);
相互参照:MIM:604217;NP_006415.1;NM_006424_1
(7)Sema5b(FLJ10372,KIAA1445,Mm.42015,SEMA5B,SEMAG,セマフォリン 5b Hlog,セマドメイン(sema domain),7回トロンボスポンジン反復(1型及び1型様),膜貫通ドメイン(TM)及び短い細胞質ドメイン(セマフォリン)5B,Genbank受託番号AB040878)
Nagase T., et al (2000) DNA Res. 7 (2):143-150);国際公開第2004000997号(請求項1);国際公開第2003003984号(請求項1);国際公開第200206339号(請求項1;頁50);国際公開第200188133号(請求項1;頁41−43,48−58);国際公開第2003054152号(請求項20);国際公開第2003101400号(請求項11);
受託番号:Q9P283;EMBL;AB040878;BAA95969.1.Genew;HGNC:10737;
(8)PSCA hlg(2700050C12Rik,C530008O16Rik,RIKEN cDNA 2700050C12,RIKEN cDNA 2700050C12 遺伝子,Genbank受託番号AY358628);Ross et al (2002) Cancer Res. 62:2546-2553;米国特許出願公開第2003129192号(請求項2);米国特許出願公開第2004044180号(請求項12);米国特許出願公開第2004044179号(請求項11);米国特許出願公開第2003096961号(請求項11);米国特許出願公開第2003232056号(実施例5);国際公開第2003105758号(請求項12);米国特許出願公開第2003206918号(実施例5);欧州特許第1347046号(請求項1);国際公開第2003025148号(請求項20);
相互参照:GI:37182378;AAQ88991.1;AY358628_1
(9)ETBR(エンドセリンタイプBレセプター,Genbank受託番号AY275463);
Nakamuta M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34-39, 1991; Ogawa Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248-255, 1991; Arai H., et al Jpn. Circ. J. 56, 1303-1307, 1992; Arai H., et al J. Biol. Chem. 268, 3463-3470, 1993; Sakamoto A., Yanagisawa M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 656-663, 1991; Elshourbagy N.A., et al J. Biol. Chem. 268, 3873-3879, 1993; Haendler B., et al J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, s1-S4, 1992; Tsutsumi M., et al Gene 228, 43-49, 1999; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; Bourgeois C., et al J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116-3123, 1997; Okamoto Y., et al Biol. Chem. 272, 21589-21596, 1997; Verheij J.B., et al Am. J. Med. Genet. 108, 223-225, 2002; Hofstra R.M.W., et al Eur. J. Hum. Genet. 5, 180-185, 1997; Puffenberger E.G., et al Cell 79, 1257-1266, 1994; Attie T., et al, Hum. Mol. Genet. 4, 2407-2409, 1995; Auricchio A., et al Hum. Mol. Genet. 5:351-354, 1996; Amiel J., et al Hum. Mol. Genet. 5, 355-357, 1996; Hofstra R.M.W., et al Nat. Genet. 12, 445-447, 1996; Svensson P.J., et al Hum. Genet. 103, 145-148, 1998; Fuchs S., et al Mol. Med. 7, 115-124, 2001; Pingault V., et al (2002) Hum. Genet. 111, 198-206;国際公開第2004045516号(請求項1);国際公開第2004048938号(実施例2);国際公開第2004040000号(請求項151);国際公開第2003087768号(請求項1);国際公開第2003016475号(請求項1);国際公開第2003016475号(請求項1);国際公開第200261087号(図1);国際公開第2003016494号(図6);国際公開第2003025138号(請求項12;頁144);国際公開第200198351号(請求項1;頁124−125);欧州特許第522868号(請求項8;図2);国際公開第200177172号(請求項1;頁297−299);米国特許出願公開第2003109676号;米国特許第6518404号(図3);米国特許第5773223号(請求項1a;Col 31−34);国際公開第2004001004号;
(10)MSG783(RNF124,仮想タンパク質 FLJ20315,Genbank受託番号NM_017763);
国際公開第2003104275号(請求項1);国際公開第2004046342号(実施例2);国際公開第2003042661号(請求項12);国際公開第2003083074号(請求項14;頁61);国際公開第2003018621号(請求項1);国際公開第2003024392号(請求項2;図93);国際公開第200166689号(実施例6);
相互参照:遺伝子座番号:54894;NP_060233.2;NM_017763_1
(11)STEAP2(HGNC_8639,IPCA−1,PCANAP1,STAMP1,STEAP2,STMP,前立腺癌関連遺伝子1,前立腺癌関連タンパク質1,前立腺の6回膜貫通型上皮抗原2,6回膜貫通型前立腺タンパク質,Genbank受託番号AF455138)
Lab. Invest. 82 (11):1573-1582 (2002));国際公開第2003087306号;米国特許出願公開第2003064397号(請求項1;図1);国際公開第200272596号(請求項13;頁54−55);国際公開第200172962号(請求項1;図4B);国際公開第2003104270号(請求項11);国際公開第2003104270号(請求項16);米国特許出願公開第2004005598号(請求項22);国際公開第2003042661号(請求項12);米国特許出願公開第2003060612号(請求項12;図10);国際公開第200226822号(請求項23;図2);国際公開第200216429号(請求項12;図10);
相互参照:GI:22655488;AAN04080.1;AF455138_1
(12)TrpM4(BR22450,FLJ20041,TRPM4,TRPM4B,一過性レセプター電位カチオンチャネル,サブファミリーM,メンバー4,Genbank受託番号NM_017636)
Xu, X.Z., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (19):10692-10697 (2001), Cell 109 (3):397-407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33):30813-30820 (2003));米国特許出願公開第2003143557号(請求項4);国際公開第200040614号(請求項14;頁100−103);国際公開第200210382号(請求項1;図9A);国際公開第2003042661号(請求項12);国際公開第200230268号(請求項27;頁391);米国特許出願公開第2003219806号(請求項4);国際公開第200162794号(請求項14;図1A−D);
相互参照:MIM:606936;NP_060106.2;NM_017636_1
(13)CRIPTO(CR,CR1,CRGF,CRIPTO,TDGF1,奇形癌腫由来増殖因子,Genbank受託番号NP_003203又はNM_003212)
Ciccodicola, A., et al EMBO J. 8 (7):1987-1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3):555-565 (1991));米国特許出願公開第2003224411号(請求項1);国際公開第2003083041号(実施例1);国際公開第2003034984号(請求項12);国際公開第200288170号(請求項2;頁52−53);国際公開第2003024392号(請求項2;図58);国際公開第200216413号(請求項1;頁94−95,105);国際公開第200222808号(請求項2;図1);米国特許第5854399号(実施例2;Col 17−18);米国特許第5792616号(図2);
相互参照:MIM:187395;NP_003203.1;NM_003212_1
(14)CD21(CR2(補体レセプター2)又はC3DR(C3d/エブスタインバーウイルスレセプター)又はHs.73792 Genbank受託番号M26004)
Fujisaku et al (1989) J. Biol. Chem. 264 (4):2118-2125); Weis J.J., et al J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988; Moore M., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 9194-9198, 1987; Barel M., et al Mol. Immunol. 35, 1025-1031, 1998; Weis J.J., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639-5643, 1986; Sinha S.K., et al (1993) J. Immunol. 150, 5311-5320;国際公開第2004045520号(実施例4);米国特許出願公開第2004005538号(実施例1);国際公開第2003062401号(請求項9);国際公開第2004045520号(実施例4);国際公開第9102536号(図9.1−9.9);国際公開第2004020595号(請求項1);
受託番号:P20023;Q13866;Q14212;EMBL;M26004;AAA35786.1.
(15)CD79b(CD79B,CD79β,IGb(免疫グロブリン関連β(immunoglobulin−associated beta)),B29,Genbank受託番号NM_000626又は11038674)
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (7):4126-4131, Blood (2002) 100 (9):3068-3076, Muller et al (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6):1621-1625);国際公開第2004016225号(請求項2,図140);国際公開第2003087768号,米国特許出願公開第2004101874号(請求項1,頁102);国際公開第2003062401号(請求項9);国際公開第200278524号(実施例2);米国特許出願公開第2002150573号(請求項5,頁15);米国特許第5644033号;国際公開第2003048202号(請求項1,頁306及び309);国際公開第99/558658号,米国特許第6534482号(請求項13,図17A/B);国際公開第200055351号(請求項11,頁1145−1146);
相互参照:MIM:147245;NP_000617.1;NM_000626_1
(16)FcRH2(IFGP4,IRTA4,SPAP1A(SH2ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質1a),SPAP1B,SPAP1C,Genbank受託番号NM_030764,AY358130)
Genome Res. 13 (10):2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87-95 (2002), Blood 99 (8):2662-2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17):9772-9777 (2001), Xu, M.J., et al (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768-775;国際公開第2004016225号(請求項2);国際公開第2003077836号;国際公開第200138490号(請求項5;図18D−1−18D−2);国際公開第2003097803号(請求項12);国際公開第2003089624号(請求項25);
相互参照:MIM:606509;NP_110391.2;NM_030764_1
(17)HER2(ErbB2,Genbank受託番号M11730)
Coussens L., et al Science (1985) 230(4730):1132-1139); Yamamoto T., et al Nature 319, 230-234, 1986; Semba K., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6497-6501, 1985; Swiercz J.M., et al J. Cell Biol. 165, 869-880, 2004; Kuhns J.J., et al J. Biol. Chem. 274, 36422-36427, 1999; Cho H.-S., et al Nature 421, 756-760, 2003; Ehsani A., et al (1993) Genomics 15, 426-429;国際公開第2004048938号(実施例2);国際公開第2004027049号(図1I);国際公開第2004009622;国際公開第2003081210;国際公開第2003089904号(請求項9);国際公開第2003016475号(請求項1);米国特許出願公開第2003118592号;国際公開第2003008537号(請求項1);国際公開第2003055439号(請求項29;図1A−B);国際公開第2003025228号(請求項37;図5C);国際公開第200222636号(実施例13;頁95−107);国際公開第200212341号(請求項68;図7);国際公開第200213847号(頁71−74);国際公開第200214503号(頁114−117);国際公開第200153463号(請求項2;頁41−46);国際公開第200141787号(頁15);国際公開第200044899号(請求項52;図7);国際公開第200020579号(請求項3;図2);米国特許第5869445号(請求項3;Col 31−38);国際公開第9630514号(請求項2;頁56−61);欧州特許第1439393号(請求項7);国際公開第2004043361号(請求項7);国際公開第2004022709号;国際公開第200100244号(実施例3;図4);
受託番号:P04626;EMBL;M11767;AAA35808.1.EMBL;M11761;AAA35808.1.
(18)NCA(CEACAM6,Genbank受託番号M18728);
Barnett T., et al Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1988; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:16899-16903, 2002;国際公開第2004063709;欧州特許第1439393号(請求項7);国際公開第2004044178号(実施例4);国際公開第2004031238号;国際公開第2003042661号(請求項12);国際公開第200278524号(実施例2);国際公開第200286443号(請求項27;頁427);国際公開第200260317号(請求項2);
受託番号:P40199;Q14920;EMBL;M29541;AAA59915.1.EMBL;M18728;
(19)MDP(DPEP1,Genbank受託番号BC017023)
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26):16899-16903 (2002));国際公開第2003016475号(請求項1);国際公開第200264798号(請求項33;頁85−87);特公平5−003790号公報(図6−8);国際公開第9946284号(図9);
相互参照:MIM:179780;AAH17023.1;BC017023_1
(20)IL20Rα(IL20Ra,ZCYTOR7,Genbank受託番号AF184971);
Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Mungall A.J., et al Nature 425, 805-811, 2003; Blumberg H., et al Cell 104, 9-19, 2001; Dumoutier L., et al J. Immunol. 167, 3545-3549, 2001; Parrish-Novak J., et al J. Biol. Chem. 277, 47517-47523, 2002; Pletnev S., et al (2003) Biochemistry 42:12617-12624; Sheikh F., et al (2004) J. Immunol. 172, 2006-2010;欧州特許第1394274号(実施例11);米国特許出願公開第2004005320号(実施例5);国際公開第2003029262号(頁74−75);国際公開第2003002717号(請求項2;頁63);国際公開第200222153号(頁45−47);米国特許出願公開第2002042366号(頁20−21);国際公開第200146261号(頁57−59);国際公開第200146232号(頁63−65);国際公開第9837193号(請求項1;頁55−59);
受託番号:Q9UHF4;Q6UWA9;Q96SH8;EMBL;AF184971;AAF01320.1.
(21)ブレビカン(BCAN,BEHAB,Genbank受託番号AF229053)
Gary S.C., et al Gene 256, 139-147, 2000; Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002;米国特許出願公開第2003186372号(請求項11);米国特許出願公開第2003186373号(請求項11);米国特許出願公開第2003119131号(請求項1;図52);米国特許出願公開第2003119122号(請求項1;図52);米国特許出願公開第2003119126号(請求項1);米国特許出願公開第2003119121号(請求項1;図52);米国特許出願公開第2003119129号(請求項1);米国特許出願公開第2003119130号(請求項1);米国特許出願公開第2003119128号(請求項1;図52);米国特許出願公開第2003119125号(請求項1);国際公開第2003016475号(請求項1);国際公開第200202634号(請求項1);
(22)EphB2R(DRT,ERK,Hek5,EPHT3,Tyro5,Genbank受託番号NM_004442)
Chan,J. and Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991) Oncogene 10 (5):897-905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196:177-244 (2000));国際公開第2003042661号(請求項12);国際公開第200053216号(請求項1;頁41);国際公開第2004065576号(請求項1);国際公開第2004020583号(請求項9);国際公開第2003004529号(頁128−132);国際公開第200053216号(請求項1;頁42);
相互参照:MIM:600997;NP_004433.2;NM_004442_1
(23)ASLG659(B7h,Genbank受託番号AX092328)
米国特許出願公開第20040101899号(請求項2);国際公開第2003104399号(請求項11);国際公開第2004000221号(図3);米国特許出願公開第2003165504号(請求項1);米国特許出願公開第2003124140号(実施例2);米国特許出願公開第2003065143号(図60);国際公開第2002102235号(請求項13;頁299);米国特許出願公開第2003091580号(実施例2);国際公開第200210187号(請求項6;図10);国際公開第200194641号(請求項12;図7b);国際公開第200202624号(請求項13;図1A−1B);米国特許出願公開第2002034749号(請求項54;頁45−46);国際公開第200206317号(実施例2;頁320−321,請求項34;頁321−322);国際公開第200271928号(頁468−469);国際公開第200202587号(実施例1;図1);国際公開第200140269号(実施例3;頁190−192);国際公開第200036107号(実施例2;頁205−207);国際公開第2004053079号(請求項12);国際公開第2003004989号(請求項1);国際公開第200271928号(頁233−234,452−453);国際公開第0116318号;
(24)PSCA(前立腺幹細胞抗原前駆体,Genbank受託番号AJ297436)
Reiter R.E., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1735-1740, 1998; Gu Z., et al Oncogene 19, 1288-1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275(3):783-788;国際公開第2004022709号;欧州特許第1394274号(実施例11);米国特許出願公開第2004018553号(請求項17);国際公開第2003008537号(請求項1);国際公開第200281646号(請求項1;頁164);国際公開第2003003906号(請求項10;頁288);国際公開第200140309号(実施例1;図17);米国特許出願公開第2001055751号(実施例1;図1b);国際公開第200032752号(請求項18;図1);国際公開第9851805号(請求項17;頁97);国際公開第9851824号(請求項10;頁94);国際公開第9840403号(請求項2;図1B);
受託番号:O43653;EMBL;AF043498;AAC39607.1.
(25)GEDA(Genbank受託番号AY260763);
AAP14954脂肪腫HMGIC融合パートナー様タンパク質(fusion−partner−like protein)/pid=AAP14954.1 − ホモ・サピエンス
種:ホモサピエンス(ヒト)
国際公開第2003054152号(請求項20);国際公開第2003000842号(請求項1);国際公開第2003023013号(実施例3,請求項20);米国特許出願公開第2003194704号(請求項45);
相互参照:GI:30102449;AAP14954.1;AY260763_1
(26)BAFF−R(B細胞活性化因子レセプター,BLySレセプター3,BR3,Genbank受託番号AF116456);BAFFレセプター/pid=NP_443177.1 − ホモサピエンス
Thompson, J.S., et al Science 293 (5537), 2108-2111 (2001);国際公開第2004058309号;国際公開第2004011611;国際公開第2003045422号(実施例;頁32−33);国際公開第2003014294号(請求項35;図6B);国際公開第2003035846号(請求項70;頁615−616);国際公開第200294852号(Col 136−137);国際公開第200238766号(請求項3;頁133);国際公開第200224909号(実施例3;図3);
相互参照:MIM:606269;NP_443177.1;NM_052945_1;AF132600
(27)CD22(B細胞レセプターCD22−Bアイソフォーム,BL−CAM,Lyb−8,Lyb8,SIGLEC−2,FLJ22814,Genbank受託番号AK026467);
Wilson et al (1991) J. Exp. Med. 173:137-146;国際公開第2003072036号(請求項1;図1);
相互参照:MIM:107266;NP_001762.1;NM_001771_1
(28)CD79a(CD79A,CD79α,免疫グロブリン関連アルファ(immunoglobulin−associated alpha),免疫グロブリンベータ(CD79B)と共有結合性に相互作用し、IgM分子と表面上で複合体を形成し、B細胞分化に関与するシグナルを伝達するB細胞特異的タンパク質),等電点:4.84,分子量:25028 TM:2[P]遺伝子染色体:19q13.2,Genbank受託番号NP_001774.10)
国際公開第2003088808号;米国特許出願公開第20030228319号;国際公開第2003062401号(請求項9);米国特許出願公開第2002150573号(請求項4、頁13−14);国際公開第9958658号(請求項13、図16);国際公開第9207574号(図1);米国特許第5644033号; Ha et al (1992) J. Immunol. 148(5):1526-1531; Mueller et al (1992) Eur. J. Biochem. 22:1621-1625; Hashimoto et al (1994) Immunogenetics 40(4):287-295; Preud'homme et al (1992) Clin. Exp. Immunol. 90(1):141-146; Yu et al (1992) J. Immunol. 148(2) 633-637; Sakaguchi et al (1988) EMBO J. 7(11):3457-3464;
(29)CXCR5(バーキットリンパ腫レセプター1は、CXCL13ケモカインによって活性化され、リンパ球遊走及び体液性防御において機能し、HIV−2感染、おそらくエイズ、リンパ腫、骨髄腫、及び白血病の発症において役割を果たす、Gタンパク質共役型レセプター);372アミノ酸,等電点:8.54 分子量:41959 TM:7[P]遺伝子染色体:11q23.3,Genbank受託番号NP_001707.1)
国際公開第2004040000号;国際公開第2004015426号;米国特許出願公開第2003105292号(実施例2);米国特許第6555339号(実施例2);国際公開第200261087号(図1);国際公開第200157188号(請求項20,頁269);国際公開第200172830号(頁12−13);国際公開第200022129号(実施例1,頁152−153,実施例2,頁254−256);国際公開第9928468号(請求項1,頁38);米国特許第5440021号(実施例2,col 49−52);国際公開第9428931号(頁56−58);国際公開第9217497号(請求項7,図5);Dobner et al (1992) Eur. J. Immunol. 22:2795-2799; Barella et al (1995) Biochem. J. 309:773-779;
(30)HLA−DOB(ペプチドを結合しそれらをCD4+Tリンパ球に提示するMHCクラスII分子(Ia抗原)のベータサブユニット);273アミノ酸,等電点:6.56 分子量:30820 TM:1[P]遺伝子染色体:6p21.3,Genbank受託番号NP_002111.1)
Tonnelle et al (1985) EMBO J. 4(11):2839-2847; Jonsson et al (1989) Immunogenetics 29(6):411-413; Beck et al (1992) J. Mol. Biol. 228:433-441; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903; Servenius et al (1987) J. Biol. Chem. 262:8759-8766; Beck et al (1996) J. Mol. Biol. 255:1-13; Naruse et al (2002) Tissue Antigens 59:512-519;国際公開第9958658号(請求項13,図15);米国特許第6153408号(Col 35−38);米国特許第5976551号(col 168−170);米国特許第6011146号(col 145−146);Kasahara et al (1989) Immunogenetics 30(1):66-68; Larhammar et al (1985) J. Biol. Chem. 260(26):14111-14119;
(31)P2X5(プリンレセプターP2Xリガンド開口型イオンチャネル5は、細胞外ATPにより開閉されるイオンチャネルであり、シナプス伝達及び神経発生に関与する可能性があり、欠乏は、特発性排尿筋不安定性の病態生理の一因となり得る;422アミノ酸),等電点:7.63,分子量:47206 TM:1[P]遺伝子染色体:17p13.3,Genbank受託番号NP_002552.2)
Le et al (1997) FEBS Lett. 418(1-2):195-199;国際公開第2004047749号;国際公開第2003072035号(請求項10);Touchman et al (2000) Genome Res. 10:165-173;国際公開第200222660号(請求項20);国際公開第2003093444号(請求項1);国際公開第2003087768号(請求項1);国際公開第2003029277号(頁82);
(32)CD72(B細胞分化抗原CD72,Lyb−2)PROTEIN SEQUENCE Full maeaity...tafrfpd(1..359;359アミノ酸),等電点:8.66,分子量:40225 TM:1[P]遺伝子染色体:9p13.3,Genbank受託番号NP_001773.1)
国際公開第2004042346号(請求項65);国際公開第2003026493号(頁51−52,57−58);国際公開第200075655号(頁105−106);Von Hoegen et al (1990) J. Immunol. 144(12):4870-4877; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903;
(33)LY64(リンパ球抗原64(RP105),ロイシンリッチリピート(LRR)ファミリーのI型膜タンパク質であり、B細胞の活性化及びアポトーシスを制御し、機能喪失は全身性エリテマトーデスの患者における疾患活性の上昇に関連する);661アミノ酸,等電点:6.20,分子量:74147 TM:1[P]遺伝子染色体:5q12,Genbank受託番号NP_005573.1)
米国特許出願公開第2002193567号;国際公開第9707198号(請求項11,頁39−42);Miura et al (1996) Genomics 38(3):299-304; Miura et al (1998) Blood 92:2815-2822;国際公開第2003083047号;国際公開第9744452号(請求項8,頁57−61);国際公開第200012130号(頁24−26);
(34)FcRH1(Fcレセプター様タンパク質1,C2タイプIg様ドメイン及びITAMドメインを含む免疫グロブリンFcドメインについての推定上のレセプターであり、B−リンパ球分化において役割を有し得る);429アミノ酸,等電点:5.28,分子量:46925 TM:1[P]遺伝子染色体:1q21−1q22,Genbank受託番号NP_443170.1)
国際公開第2003077836号;国際公開第200138490号(請求項6,図18E−1−18−E−2);Davis et al (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98(17):9772-9777;国際公開第2003089624号(請求項8);欧州特許第1347046号(請求項1);国際公開第2003089624号(請求項7);
(35)IRTA2(免疫グロブリンスーパーファミリーレセプタートランスロケーション関連2(Immunoglobulin superfamily receptor translocation associated 2)、B細胞発生及びリンパ腫形成において役割を有し得る推定上の免疫レセプター;一部のB細胞悪性腫瘍においてトランスロケーションによる遺伝子の調節解除が発生する);977アミノ酸,等電点:6.88 分子量:106468 TM:1[P]遺伝子染色体:1q21,Genbank受託番号ヒト:AF343662,AF343663,AF343664,AF343665,AF369794,AF397453,AK090423,AK090475,AL834187,AY358085;マウス:AK089756,AY158090,AY506558;NP_112571.1
国際公開第2003024392号(請求項2,図97); Nakayama et al (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277(1):124-127;国際公開第2003077836号;国際公開第200138490号(請求項3,図18B−1−18B−2);
(36)TENB2(TMEFF2,tomoregulin,TPEF,HPP1,TR,増殖因子のEGF/ヘレグリンファミリー及びフォリスタチンに関連する推定上の膜貫通型プロテオグリカン);374アミノ酸,NCBI受託番号:AAD55776,AAF91397,AAG49451,NCBI RefSeq:NP_057276;NCBI Gene:23671;OMIM:605734;SwissProt Q9UIK5;Genbank受託番号AF179274;AY358907,CAF85723,CQ782436
国際公開第2004074320号(配列番号810);特開2004−113151号公報(配列番号2,4,8);国際公開第2003042661号(配列番号580);国際公開第2003009814号(配列番号411);欧州特許第1295944号(頁69−70);国際公開第200230268号(頁329);国際公開第200190304号(配列番号2706);米国特許出願公開第2004249130号;米国特許出願公開第2004022727号;国際公開第2004063355号;米国特許出願公開第2004197325号;米国特許出願公開第2003232350号;米国特許出願公開第2004005563号;米国特許出願公開第2003124579号;Horie et al (2000) Genomics 67:146-152; Uchida et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:593-602; Liang et al (2000) Cancer Res. 60:4907-12; Glynne-Jones et al (2001) Int J Cancer. Oct 15;94(2):178-84;
(37)PMEL17(シルバーホモログ(silver homolog);SILV;D12S53E;PMEL17;(SI);(SIL);ME20;gp100)BC001414;BT007202;M32295;M77348;NM_006928; McGlinchey, R.P. et al (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (33), 13731-13736; Kummer, M.P. et al (2009) J. Biol. Chem. 284 (4), 2296-2306;
(38)TMEFF1(EGF様及び2つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通型タンパク質1;Tomoregulin−1;H7365;C9orf2;C9ORF2;U19878;X83961)NM_080655;NM_003692; Harms, P.W. (2003) Genes Dev. 17 (21), 2624-2629; Gery, S. et al (2003) Oncogene 22 (18):2723-2727;
(39)GDNF−Ra1(GDNFファミリーレセプターアルファ1;GFRA1;GDNFR;GDNFRA;RETL1;TRNR1;RET1L;GDNFR−アルファ1;GFR−ALPHA−1;U95847;BC014962;NM_145793)NM_005264; Kim,M.H. et al (2009) Mol. Cell. Biol. 29 (8), 2264-2277; Treanor, J.J. et al (1996) Nature 382 (6586):80-83;
(40)Ly6E(リンパ球抗原6複合体、遺伝子座E;Ly67,RIG−E,SCA−2,TSA−1)NP_002337.1;NM_002346.2; de Nooij-van Dalen,A.G. et al (2003) Int. J. Cancer 103 (6), 768-774; Zammit,D.J. et al (2002) Mol. Cell. Biol. 22 (3):946-952;
(41)TMEM46(シサホモログ(shisa homolog)2(アフリカツメガエル);SHISA2)NP_001007539.1;NM_001007538.1; Furushima,K. et al (2007) Dev. Biol. 306 (2), 480-492; Clark,H.F. et al (2003) Genome Res. 13 (10):2265-2270;
(42)Ly6G6D(リンパ球抗原6複合体、遺伝子座G6D;Ly6−D,MEGT1)NP_067079.2;NM_021246.2; Mallya, M. et al (2002) Genomics 80 (1):113-123; Ribas,G. et al (1999) J. Immunol. 163 (1):278-287;
(43)LGR5(ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型レセプター5;GPR49,GPR67)NP_003658.1;NM_003667.2;Salanti,G. et al (2009) Am. J. Epidemiol. 170 (5):537-545; Yamamoto,Y. et al (2003) Hepatology 37 (3):528-533;
(44)RET(retプロトオンコジーン;MEN2A;HSCR1;MEN2B;MTC1;(PTC);CDHF12;Hs.168114;RET51;RET−ELE1)NP_066124.1;NM_020975.4;Tsukamoto,H. et al (2009) Cancer Sci. 100 (10):1895-1901; Narita,N. et al (2009) Oncogene 28 (34):3058-3068;
(45)LY6K(リンパ球抗原6複合体、遺伝子座K;LY6K;HSJ001348;FLJ35226)NP_059997.3;NM_017527.3; Ishikawa,N. et al (2007) Cancer Res. 67 (24):11601-11611; de Nooij-van Dalen,A.G. et al (2003) Int. J. Cancer 103 (6):768-774;
(46)GPR19(Gタンパク質共役型レセプター19;Mm.4787)NP_006134.1;NM_006143.2;Montpetit, A. and Sinnett,D. (1999) Hum. Genet. 105 (1-2):162-164; O'Dowd, B.F. et al (1996) FEBS Lett. 394 (3):325-329;
(47)GPR54(KISS1レセプター;KISS1R;GPR54;HOT7T175;AXOR12)NP_115940.2;NM_032551.4; Navenot, J.M. et al (2009) Mol. Pharmacol. 75 (6):1300-1306; Hata, K. et al (2009) Anticancer Res. 29 (2):617-623;
(48)ASPHD1(アスパラギン酸β−ヒドロキシラーゼドメイン含有1;LOC253982)NP_859069.2;NM_181718.3; Gerhard, D.S. et al (2004) Genome Res. 14 (10B):2121-2127;
(49)チロシナーゼ(TYR;OCAIA;OCA1A;チロシナーゼ;SHEP3)NP_000363.1;NM_000372.4; Bishop,D.T. et al (2009) Nat. Genet. 41 (8):920-925; Nan, H. et al (2009) Int. J. Cancer 125 (4):909-917;
(50)TMEM118(リングフィンガータンパク質,膜貫通型2;RNFT2;FLJ14627)NP_001103373.1;NM_001109903.1; Clark, H.F. et al (2003) Genome Res. 13 (10):2265-2270; Scherer,S.E. et al (2006) Nature 440 (7082):346-351
(51)GPR172A(Gタンパク質共役型レセプター172A;GPCR41;FLJ11856;D15Ertd747e)NP_078807.1;NM_024531.3; Ericsson, T.A. et al (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (11):6759-6764; Takeda, S. et al (2002) FEBS Lett. 520 (1-3):97-101.
本発明の抗体−薬物コンジュゲート化合物は、CBI二量体薬物部分Dを含む。CBI二量体薬物部分は、二つのCBI薬物単位又は1つのCBI薬物単位及び一つのPBD薬物単位から構成され得る。
CBI二量体薬物部分Dは式:
を有し、
ここで
R1は、H,P(O)3H2,C(O)NRaRbから選択され;
R2は、H,P(O)3H2,C(O)NRaRbから選択され;
Ra及びRbは、H及び一以上のFで任意置換されたC1−C6アルキルから独立に選択され,
又はRa及びRbは、5又は6員複素環基を形成し;
Tは、C3−C12アルキレン,Y,(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン),(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン),(C2−C6アルケニレン)−Y−(C2−C6アルケニレン)及び(C2−C6アルキニレン)−Y−(C2−C6アルキニレン)から選択されるテザー基であり;
ここで、YはO、S、NR1、アリール、及びヘテロアリールから独立に選択され;
ここで、アルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、F,OH,O(C1−C6アルキル),NH2,NHCH3,N(CH3)2,OP(O)3H2,及びC1−C6アルキルで独立に任意置換され、ここでアルキルは、一以上のFで任意置換され;
又はアルキレン、アルケニレン、アリール及びヘテロアリールは、Lへの結合で独立に任意置換され;
D’は
から選択される薬物部分であり、
ここで波線はTへの結合部位を示し;
X1及びX2は、O及びNR3から独立に選択され、ここでR3は、H及び一以上のFで任意置換されたC1−C6アルキルから選択され;
R4は、H,CO2Rであり、ここでRはC1−C6アルキル又はベンジルであり;及び
R5は、H又はC1−C6アルキルである。
本発明の抗体−薬物コンジュゲート(ADC)化合物は、式:
を有するリンカーLを含み、
ここで、Strは抗体に共有結合したストレッチャー単位であり;Pepは2から12個のアミノ酸残基の任意のペプチド単位であり、Spは二量体の薬物部分に共有結合した任意のスペーサー単位であり、m及びnは0及び1から独立に選択され;
例示的な実施態様において、Strは、1,3−二置換、ピロリジン−2,5−ジオン(スクシンイミド)式:
を有し、
ここで、R6は、C1−C10アルキレン,C3−C8カルボシクリル,O−(C1−C8アルキル),アリーレン,C1−C10アルキレン−アリーレン,アリーレン−C1−C10アルキレン,C1−C10アルキレン−(C3−C8カルボシクリル),(C3−C8カルボシクリル)−C1−C10アルキレン,C3−C8ヘテロシクリル,C1−C10アルキレン−(C3−C8ヘテロシクリル),(C3−C8ヘテロシクリル)−C1−C10アルキレン,C1−C10アルキレン−C(O)N(R8)−C2−C6アルキレン−N(R8),N(R8)−(C2−C6アルキレン)及び(CH2CH2O)r−CH2からなる群から選択され;ここでR8は、H又はC1−C6アルキル、rは1から10の範囲の整数である。
を有し、
ここで、R7は、C1−C10アルキレン,C1−C10アルキレン−O,N(R8)−(C2−C6アルキレン)−N(R8),N(R8)−(C2−C6アルキレン),及び(CH2CH2O)r−CH2から選択され;ここでR8はH又はC1−C6アルキル、rは1から10の範囲の整数である。
を有し、
ここで、R9は、C1−C10アルキレン,C1−C10アルキレン−O,(C2−C6アルキレン)−N(R8),及び(CH2CH2O)r−CH2から選択され;ここでR8は、H又はC1−C6アルキル、rは1から10の範囲の整数である。
抗体−薬物コンジュゲートを調製するための抗体へのコンジュゲーションに有用なリンカー−薬物中間体は、式:
を有し、
ここで、
Xは、マレイミド、チオール、アミノ、ブロミド、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、p−トルエンスルホン酸塩、ヨウ化物、ヒドロキシル、カルボキシル、ピリジルジスルフィド、及びN−ヒドロキシスクシンイミドから選択される反応性官能基である。
Lは、式:
を有するリンカーであり;
ここで、Strは反応性官能基Xに共有結合したストレッチャー単位であり;Pepは2から12個のアミノ酸残基の任意のペプチド単位であり、Spは二量体の薬物部分に共有結合した任意のスペーサー単位であり、m及びnは0及び1から独立に選択され;
Dは式:
を有する二量体薬物部分であり、
ここで
R1は、H,P(O)3H2,C(O)NRaRb,又はLへの結合から選択され;
R2は、H,P(O)3H2,C(O)NRaRb,又はLへの結合から選択され;
Ra及びRbは、H及び一以上のFで任意置換されたC1−C6アルキルから独立に選択され、又はRa及びRbは、5又は6員複素環基を形成し;
Tは、C3−C12アルキレン,Y,(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン),(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン),(C2−C6アルケニレン)−Y−(C2−C6アルケニレン)及び(C2−C6アルキニレン)−Y−(C2−C6アルキニレン)から選択されるテザー基であり;
ここで、YはO、S、NR1、アリール、及びヘテロアリールから独立に選択され;
ここで、アルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、F,OH,O(C1−C6アルキル),NH2,NHCH3,N(CH3)2,OP(O)3H2,及びC1−C6アルキルで独立に任意置換され、ここでアルキルは、一以上のFで任意置換され;
又はアルキレン、アルケニレン、アリール及びヘテロアリールは、Lへの結合で独立に任意置換され;
D’は、
から選択される薬物部分であり、
ここで波線はTへの結合部位を示し;
X1及びX2は、O及びNR3から独立に選択され、ここでR3は、H及び一以上のFで任意置換されたC1−C6アルキルから選択され;
R4は、H,CO2R、又はLへの結合であり、ここでRはC1−C6アルキル又はベンジルであり;及び
R5は、H又はC1−C6アルキルである。
本発明の抗体−薬物コンジュゲート(ADC)化合物は、強力なCBI二量体薬物部分に連結された腫瘍関連抗原に特異的な抗体を含み、癌を含む多数uの過剰増殖性疾患に効果的な治療活性を有するものが含まれる。薬物部分の生物学的活性は、抗体との結合によって調節される。本発明のADCは、CBI二量体薬物又は毒素の有効量を腫瘍細胞又は部位に選択的に送達し、それによって治療指数(「治療ウインドウ」)を増加させつつ、より大きな選択性、すなわちより低い有効用量を達成することができる。例示的な実施態様において、ADC化合物は、CBI二量体薬物部分に、リンカーによりコンジュゲートした、すなわち共有結合したシステイン操作抗体を含む。
を有し、
ここで、
Abは抗体であり;
Lは、式:
を有するリンカーであり;
ここで、Strは抗体に共有結合したストレッチャー単位であり;Pepは2から12個のアミノ酸残基の任意のペプチド単位であり、Spは二量体の薬物部分に共有結合した任意のスペーサー単位であり、m及びnは0及び1から独立して選択され;
pは1から8の整数であり;
Dは式:
を有する二量体薬物部分であり、
ここで
R1は、H,P(O)3H2,C(O)NRaRb,又はLへの結合から選択され;
R2は、H,P(O)3H2,C(O)NRaRb,又はLへの結合から選択され;
Ra及びRbは、H及び一以上のFで任意置換されたC1−C6アルキルから独立に選択され,
又はRa及びRbは、5又は6員複素環基を形成し;
Tは、C3−C12アルキレン,Y,(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン),(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン),(C2−C6アルケニレン)−Y−(C2−C6アルケニレン)及び(C2−C6アルキニレン)−Y−(C2−C6アルキニレン)から選択されるテザー基であり;
ここで、YはO、S、NR1、アリール、及びヘテロアリールから独立に選択され;
ここで、アルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、F,OH,O(C1−C6アルキル),NH2,NHCH3,N(CH3)2,OP(O)3H2,及びC1−C6アルキルで独立に任意置換され、ここでアルキルは、一以上のFで任意置換され;
又はアルキレン、アルケニレン、アリール及びヘテロアリールは、Lへの結合で独立に任意置換され;
D’は
から選択される薬物部分であり、
ここで波線はTへの結合部位を示し;
X1及びX2は、O及びNR3から独立して選択され、ここでR3は、H及び任意で一以上のFで置換されたC1−C6アルキルから選択され;
R4は、H,CO2Rであり、ここでRはC1−C6アルキル又はベンジルであり;及び
R5はHである。
を有し、
ここで、AA1及びAA2は、アミノ酸側鎖から独立に選択される。アミノ酸側鎖は、H,−CH3,−CH2(C6H5),−CH2CH2CH2CH2NH2,−CH2CH2CH2NHC(NH)NH2,−CHCH(CH3)CH3、及び−CH2CH2CH2NHC(O)NH2から独立に選択される。
薬物負荷は、抗体あたりのCBI薬物部分の平均数である。薬物負荷は、抗体(Ab)あたり1から8の薬物におよび得る。すなわち、ここで、1、2、3、4、5、6、7、及び8の薬物部分が抗体に共有結合され得る。ADCの組成物は、1〜8個の範囲の薬物にコンジュゲートした抗体の集団を含む。コンジュゲート反応からのADCの調製における抗体あたりの薬物の平均数は、質量分析、ELISAアッセイ、電気泳動及びHPLCなどの一般的な手段により特徴づけられ得る。pの観点からADCの量的分布もまた決定され得る。ELISAにより、ADCの特定の調製物におけるpの平均値を決定することができる(Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Sanderson et al (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852)。しかし、p(薬物)値の分布は、抗体−抗原結合及びELISAの検出限界によって識別可能ではない。また、薬物部分が重鎖若しくは軽鎖断片、又は特定のアミノ酸残基など抗体に結合されている場合、抗体−薬物コンジュゲートの検出のためのELISAアッセイは判断しない。場合によっては、均一なADCの分離、精製、及び特徴づけ(pは他の薬物負荷を伴うADCからの特定の何らかの値である)は、逆相HPLC又は電気泳動などの手段により達成され得る。
本発明の典型的な抗体−薬物コンジュゲート(ADC)化合物101−139が、実施例20に従って、表4に示されるようにリンカー−薬物中間体51−68をから調製された。
表5のADCの抗CD22抗体は、米国特許第8226945号に従って、3つの軽鎖超可変領域(HVR−L1、HVR−L2及びHVR−L3)及び3つの重鎖超可変領域(HVR−H1、HVR−H2及びHVR−H3)を含む:
HVR−L1 RSSQSIVHSVGNTFLE (配列番号1)
HVR−L2 KVSNRFS (配列番号2)
HVR−L3 FQGSQFPYT (配列番号3)
HVR−H1 GYEFSRSWMN (配列番号4)
HVR−H2 GRIYPGDGDTNYSGKFKG (配列番号5)
HVR−H3 DGSSWDWYFDV (配列番号6)
表5のADCの抗MUC16抗体は、米国特許第7989595号に従って、3つの軽鎖超可変領域(HVR−L1、HVR−L2及びHVR−L3)及び3つの重鎖超可変領域(HVR−H1、HVR−H2及びHVR−H3)を含む:
HVR−L1 KASDLIHNWLA (配列番号7)
HVR−L2 YGATSLET (配列番号8)
HVR−L3 QQYWTTPFT (配列番号9)
HVR−H1 GYSITNDYAWN (配列番号10)
HVR−H2 GYISYSGYTTYNPSLKS (配列番号11)
HVR−H3 ARWTSGLDY (配列番号12)
E V Q L V E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G Y S I T N D Y A W N W V R Q A P G K G L E W V G Y I S Y S G Y T T Y N P S L K S R F T I S R D T S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A R W T S G L D Y W G Q G T L V T V S S (配列番号13)
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C K A S D L I H N W L A W Y Q Q K P G K A P K L L I Y G A T S L E T G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y W T T P F T F G Q G T K V E I K R (配列番号14)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITNDYAWNWVRQAPGKGLEWVGYISYSGYTTYNPSLKSRFTISRDTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWTSGLDYWGQGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(配列番号47)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDLIHNWLAWYQQKPGKAPKLLIYGATSLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYWTTPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(配列番号48)
DVQLQESGPGLVNPSQSLSLTCTVTGYSITNDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYINYSGYTTYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLHLNSVTTEDTATYYCARWDGGLTYWGQGTLVTVSACSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(配列番号49)
DIQMTQSSSFLSVSLGGRVTITCKASDLIHNWLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGNDYTLSIASLQTEDAATYYCQQYWTTPFTFGSGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(配列番号50)
ある実施態様において、表5のADCは、抗HER2抗体を含む。本発明の一実施態様において、本発明のADCの抗HER2抗体は、ヒト化抗HER2抗体、例えば、米国特許第5821337号の表3に記載されるhuMAb4D5−1,huMAb4D5−2,huMAb4D5−3,huMAb4D5−4,huMAb4D5−5,huMAb4D5−6,huMAb4D5−7及びhuMAb4D5−8を含む。それらの抗体は、HER2に結合するマウス抗体(4D5)の相補性決定領域を有するヒトフレームワーク領域を含む。ヒト化抗体huMAb4D5−8は、商品名ハーセプチン(登録商標)で市販されるトラスツズマブとも呼ばれる。本発明の別の実施態様において、本発明のADCの抗HER2抗体は、米国特許第7862817号に記載されているように、ヒト化抗HER2抗体、例えば、ヒト化2C4を含む。典型的なヒト化2C4抗体は、商品名PERJETA(登録商標)で市販されるペルツズマブである。
表5のADCの抗CD33抗体15G15.33は、3つの軽鎖超可変領域(HVR−L1、HVR−L2及びHVR−L3)及び3つの重鎖超可変領域(HVR−H1、HVR−H2及びHVR−H3)を含む
HVR−L1 RSSQSLLHSNGYNYLD (配列番号51)
HVR−L2 LGVNSVS (配列番号52)
HVR−L3 MQALQTPWT (配列番号53)
HVR−H1 NHAIS (配列番号54)
HVR−H2 GIIPIFGTANYAQKFQG (配列番号55)
HVR−H3 EWADVFD (配列番号56)
EIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGVNSV
SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPWTFGQGTKVEIK
(配列番号57)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGIFSNHAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANY
AQKFQGRVTITADESTSTAFMELSSLRSEDTAVYYCAREWADVFDIWGQGTMVTVSS
(配列番号58)
9C3−HVR L1 RASQGIRNDLG (配列番号59)
9C3−HVR L2 AASSLQS (配列番号60)
9C3−HVR L3 LQHNSYPWT (配列番号61)
9C3−HVR H1 GNYMS (配列番号62)
9C3−HVR H2 LIYSGDSTYYADSVKG (配列番号63)
9C3−HVR H3 DGYYVSDMVV (配列番号64)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRF
SGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKLEIK
(配列番号65)
EVQLVESGGALIQPGGSLRLSCVASGFTISGNYMSWVRQAPGKGLEWVSLIYSGDSTYYADS
VKGRFNISRDISKNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDGYYVSDMVVWGKGTTVTVSS
(配列番号66)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRF
SGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKLEIK
(配列番号67)
EVQLVESGGALIQPGGSLRLSCVASGFTISGNYMSWVRQAPGKGLEWVSLIYSGDSTYYADS
VKGRFTISRDISKNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDGYYVSDMVVWGKGTTVTVSS
(配列番号68)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRF
SGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKLEIK
(配列番号69)
EVQLVESGGALIQPGGSLRLSCVASGFTISGNYMSWVRQAPGKGLEWVSLIYSGDSTYYADS
VKGRFSISRDISKNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDGYYVSDMVVWGKGTTVTVSS
(配列番号70)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRF
SGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKLEIK
(配列番号71)
EVQLVESGGALIQPGGSLRLSCVASGFTISGNYMSWVRQAPGKGLEWVSLIYSGDSTYYADS
VKGRFAISRDISKNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDGYYVSDMVVWGKGTTVTVSS
(配列番号72)
一般に、抗体−薬剤コンジュゲート(ADC)の細胞毒性又は細胞増殖抑制効果は、細胞培養培地中で、レセプタータンパク質、例えばHER2を有する哺乳動物細胞を細胞培地中でADCの抗体に曝露し;その細胞を約6時間から約5日間のある期間にわたって培養し;細胞生存率を測定することにより測定される。細胞ベースのインビトロアッセイが、本発明のADCの生存率(増殖)、細胞毒性、及びアポトーシスの誘導(カスパーゼ活性化)を測定するために用いられる。
本発明の抗体−薬物コンジュゲート(ADC)のインビボでの有効性は、マウスにおける腫瘍異種移植研究によって測定することができる(実施例22)。抗体−薬物コンジュゲート(ADC)のインビボでの有効性は、マウスにおける腫瘍増殖阻害を測定した(実施例21)。ADCは、腫瘍増殖の阻害において驚くべきかつ予想外の効力を示した。ADCの有効性は、腫瘍細胞の標的抗原の発現と相関していた。
本発明の抗体−薬剤コンジュゲートは治療されるべき疾患に適した任意の経路で投与され得る。ADCは典型的には非経口的に、すなわち点滴、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内及び硬膜外に投与される。
本発明の治療用抗体−薬物コンジュゲート(ADC)の薬学的製剤は、典型的には、非経口投与、すなわちボーラス、静脈内、腫瘍内注射用に、薬学的に許容される非経口ビヒクルとともに単位用量の注射可能形態で調製される。所望の程度の純度を有する抗体−薬物コンジュゲート(ADC)は、任意で凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤又は安定剤(Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16th edition, Osol, A. Ed.)と混合される。
本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、例えば腫瘍抗原の過剰発現によって特徴付けられる種々の疾患又は障害を治療するために用いられ得る。典型的な病気又は過剰増殖性疾患には、良性又は悪性固形腫瘍、白血病及びリンパ系悪性腫瘍などの血液疾患が含まれる。他には、神経細胞、グリア、星状、視床下部、マクロファージ、上皮性、間質性、胞胚腔(blastocoelic)、炎症性、血管新生及び自己免疫性を含む免疫に関する障害を含む。
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療に有用な物質を含む製造品又は「キット」が提供される。製造品は、容器とラベル又は容器上にある又は容器に付属する添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ブリスター包装等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療のために有効である抗体−薬剤コンジュゲート(ADC)及び無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも一の活性剤はADCである。ラベル又は添付文書は、組成物ががんのような選択した症状の治療のために使用されることを示している。或いは、又は加えて、製造品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例えば注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二(又は第三)の容器を更に含んでもよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望まれる他の材料を更に含んでもよい。
L. F. Tietze, J. M. von Hof, M. Mueller, B. Krewer, I. Schuberth, Angew. Chem. Int. Ed. (2010) 49:7336-7339の手順に従って、(S)−tert−ブチル1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート51aは、HClで脱保護され、グルタロイルジクロリドでアシル化された(図1)。分取HPLCの代わりに、反応溶媒を真空下で除去し、得られた残留物をメタノールで粉砕し、オフホワイトの固体として、1,5−ビス((S)−1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)ペンタン−1,5−ジオン51bを得た(収率51%)。Rf=0.50(酢酸エチル/石油エーテル=2:1).NMR及びMSのデータは報告されている値と同じである。[α]D 26=−46.3°(c=0.41,DMA).
氷浴で冷却されたDMA(5mL)中の51bの溶液(650mg,1.15mmol)に、DIPEA(0.40mL,2.31mmol)及び4−ニトロフェニルクロロホルメート(302mg,1.50mmol)が添加された。混合物を室温まで温めて一晩攪拌した後で、tert−ブチル メチル(2−(メチルアミノ)エチル)カルバメート(652mg,3.00mmol)が添加された。混合物を7時間室温で撹拌し、次いで酢酸エチルと冷希NaHCO3水溶液との間で再分配した。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒を除去し、残留物を更に、酢酸エチルと石油エーテルの勾配混合物(v/v 1:1から4:1)、次いで溶離液として酢酸エチルのを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製し、オフホワイトの固体として、Boc (S)−1−(クロロメチル)−3−(5−((S)−1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル メチル(2−(メチルアミノ)エチル)カルバメート51c(359mg,40%)を得た;mp 157℃(dec.).[α]D 26=−45.4°(c=1.08,酢酸エチル).1H NMR(DMSO)(回転異性体の混合物) δ10.35(s,1H),8.25(s,1H),8.08(d,J=8.2Hz,1H),8.02(s,1H),7.87−7.77(m,2H),7.58(t,J=7.6Hz,1H),7.50−7.42(m,2H),7.31(t,J=7.9Hz,1H),4.42(t,J=9.7Hz,1H),4.36−4.31(m,2H),4.25(d,J=10.3Hz,1H),4.19−4.13(m,2H),4.05(dd,J=2.9,11.0Hz,1H),3.98(dd,J=2.6,10.9Hz,1H),3.92(dd,J=7.2,10.9Hz,1H),3.79(dd,J=8.5,10.2Hz,1H),3.69(br s,1H),3.52−3.42(m,3H),3.21−2.79(m,6H,2NMe),2.75−2.67(m,2H),2.64−2.58(m,2H),2.00−1.93(m,2H),1.44−1.35(m,9H,But)ppm.HRMS(ESI) found m/z777.2801(M+H).C41H47Cl2N4O7 requires 777.2816.
また、同じクロマトグラフィー分離から得られるのは、ビス−Bocで保護された51d及び白色固体として保護されていない回収された開始物質51bであった(15mg,2%)。51d(429mg,37%)がオフホワイトの固体として得られた。[α]D 26=−32.0°(c=1.00,酢酸エチル).1H NMR(DMSO)(回転異性体の混合物)δ8.25(s,2H),7.95(d,J=8.4Hz,2H),7.87−7.76(m,2H),7.58(t,J=7.6Hz,2H),7.44(t,J=7.6Hz,2H),4.41(t,J=9.8Hz,2H),4.32(br s,2H),4.24(d,J=10.6Hz,2H),4.06−4.03(m,2H),3.98(dd,J=7.3,10.8Hz,2H),3.69(br s,2H),3.52−3.43(m,6H),3.21−2.79(m,12H,4NMe),2.75−2.69(m,2H),2.66−2.58(m,2H),1.99−1.95(m,2H),1.44−1.35(m,18H,2But)ppm.HRMS(ESI) found m/z1013.3991(M+Na).C51H64Cl2N6NaO10 requires 1013.3991.
氷浴で冷却されたDCM(3mL)中の51cの溶液(200mg,0.26mmol)に、トリフルオロ酢酸、TFA(1.5mL)が滴下して添加された。混合物は室温まで温められ、2時間攪拌された。全ての揮発性成分が除去され、オフホワイトの固体として、(S)−1−(クロロメチル)−3−(5−((S)−1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イルメチル(2−(メチルアミノ)エチル)カルバメート51eの粗トリフルオロ酢酸塩を得て、これは直接使用された。1H NMR(DMSO)(回転異性体の混合物)δ10.36(s,1H),8.64(br s,1H),8.48(br s,1H),8.35(s,1H),8.08(d,J=8.1Hz,1H),8.01(s,1H),7.97(d,J=8.4Hz,1H),7.94−7.88(m,1H),7.78(d,J=8.4Hz,1H),7.61−7.57(m,2H),7.51−7.45(m,2H),7.34−7.30(m,1H),4.43(t,J=9.8Hz,1H),4.36−4.31(m,2H),4.26(d,J=10.4Hz,1H),4.18−4.14(m,2H),4.06(dd,J=2.9,11.0Hz,1H),4.00(dd,J=2.7,10.8Hz,1H),3.94(dd,J=7.5,11.0Hz,1H),3.89−3.84(m,1H),3.79(dd,J=8.1,10.8Hz,1H),3.63(t,J=5.7Hz,1H),3.33−3.30(m,6H,2NMe),2.78−2.55(m,6H),2.00−1.94(m,2H)ppm.HRMS(ESI) found m/z677.2306(M+H).C36H39Cl2N4O5 requires 677.2292.
−5℃で、THF中の51eの溶液(4mL)に、DIPEAの液滴を添加し、続いてブロモアセチルブロミド(34μL,0.39mmol)をゆっくり添加し、次いでDIPEAの残り(合計で448μL,2.57mmol)を添加した。混合物は室温まで温められ、1時間攪拌された。全ての揮発性成分をロータリーエバポレーター、次いで、高真空ポンプで除去した。得られた残留物を酢酸エチルと共に攪拌し、濾液をクロマトグラフィーカラムにロードする前に、不溶固体が濾過された。酢酸エチル及び石油エーテルの勾配混合物(v/v 1:4から1:1)が溶離液として使用され、オフホワイトの固体として、(S)−1−(クロロメチル)−3−(5−((S)−1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル 2−(2−ブロモ−N−メチルアセトアミド)エチル(メチル)カルバメート 51(80mg,39%);mp 167−170℃.[α]D 26=−64.0°(c=0.25,酢酸エチル)を得た。1H NMR(DMSO)(回転異性体の混合物)δ10.39(s,1H),8.25−8.20(m,1H),8.08(d,J=8.3Hz,1H),8.01(s,1H),7.96(d,J=8.3Hz,1H),7.89(d,J=7.4Hz,0.34H),7.82(d,J=7.4Hz,0.66H),7.78(d,J=8.4Hz,1H),7.58(t,J=7.6Hz,1H),7.51−7.45(m,2H),7.31(t,J=7.6Hz,1H),4.42(t,J=9.6Hz,1H),4.36−4.31(m,1H),4.24(d,J=10.7Hz,1H),4.18−4.09(m,3H(CH2Brを含む)),4.07−4.03(dd,J=2.8,10.9Hz,1H),4.00−3.97(dd,J=2.6,10.8Hz,1H),3.96−3.91(m,1H),3.82−3.75(m,1H),3.70−3.68(m,1H),3.58−3.43(m,3H),3.26−2.89(m,6H,2NMe),2.78−2.67(m,2H),2.65−2.55(m,2H),1.99−1.92(m,2H)ppm.HRMS(ESI) found m/z819.1316(M+Na).C38H38BrCl2N4O6 requires 819.1322.
実施例6の実験手順に従って、リンカー−薬物中間52が調製された(図7及び8)。HPLC:純度96.7%;mp 210oC(dec.);1H NMR[(CD3)2SO]δ10.03(s,1H(D2Oと交換可能)),8.23−8.11(m,2H),8.09(d,J=7.3Hz,1H(D2Oと交換可能)),7.85(d,J=8.5Hz,1H),7.80(d,J=8.3Hz,1H(D2Oと交換可能)),7.66(d,J=8.6Hz,2H),7.59−7.44(m,3H),7.38(brt,J=7.6Hz,1H),7.04(s,1H),6.99(s,2H),6.69(s,1H),6.38(br s,1H(D2Oと交換可能)),5.99(t,J=5.5Hz,1H(D2Oと交換可能)),5.49−5.34(m,3H;D2O交換後、d,1H,J=9.5Hz),5.20(s,2H),4.44−4.30(m,2H),4.26−4.13(m,3H),4.10−3.91(m,3H),3.88−3.76(m,1H),3.79(s,3H),3.53−3.44(m,1H),3.41−3.20(m,4H(水ピークにより部分的に不明瞭)),3.09−2.88(m,2H),2.66−2.42(m,2H(DMSOピークにより部分的に不明瞭)),2.25−1.24(m,21H),1.31(s,9H),1.24−1.11(m,2H),0.86(d,J=6.8Hz,3H),0.82(d,J=6.7Hz,3H).元素分析(C55H71ClN8O11・H2O)Calc:C,61.53;H,6.85;N,10.44.Found:C,61.39;H,7.11;N,10.15.
室温(r.t.)でTHF−H2O(150mL/75mL)中の(R)−tert−ブチル1−(クロロメチル)−5−(ジフェニルメチレンアミノ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート53a(1.00g,2.01mmol)の攪拌溶液に酢酸(50mL)が添加され、混合物を一晩撹拌した(図2)。19.5時間後、THFを真空下で除去し、混合物をEtOAcで希釈し、その層を十分に振盪し、次いで分離した。有機層を飽和NaHCO3水溶液(4×)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去した。ヘキサン:EtOAc100:0から90:10を用いたシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製により、オレンジ色のゲル状固体として、(R)−tert−ブチル 5−アミノ−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート53b(382mg,57%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)8.01(d,J=8.4Hz,1H),7.64(d,J=8.0Hz,1H),7.42−7.38(m,1H),7.37(br s,1H),7.22−7.18(m,1H),5.91(s,2H),4.08−3.91(m,4H),3.66(dd,J=10.6,8.2Hz,1H),1.53(s,9H).
乾燥DMA中で53b(380mg,1.14mmol)、(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサン酸(361mg,1.71mmol)、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDCI.HCl,765mg,3.99mmol)及びパラ−トルエンスルホン酸(TsOH,49mg,0.285mmol)の混合物(10mL)が、室温で一晩、窒素下で攪拌された。17時間後、溶媒を真空下で除去した。粗生成物をDCM:ヘキサン75:25から100:0次いでDCM:MeOH99:1から97:3を用いてシリカゲル上でカラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物含有画分を乾燥するまで蒸発させた。次いで、得られた物質をEtOAcに溶解し、有機層をH2O(2x)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を除去し、黄色い固体として、(R)−tert−ブチル 1−(クロロメチル)−5−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 53c(282mg,47%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)9.86(s,1H),8.24(br s,1H),7.99(d,J=8.4Hz,1H),7.88(d,J=8.3Hz,1H),7.55−7.51(m,1H),7.43−7.39(m,1H),7.01(s,2H),4.21−4.11(m,2H),4.08−4.00(m,2H),3.87(dd,J=10.9,6.9Hz,1H),3.42(t,J=7.0Hz,2H),2.45(t,J=7.1Hz,2H),1.69−1.62(m,2H),1.56−1.54(m,2H),1.54(s,9H),1.35−1.28(m,2H).
トリフルオロ酢酸(3.9mL)及びH2O(0.1mL)が、0℃で、DCM(4mL)中の53c(66mg,0.125mmol)の溶液に添加された。混合物は、0℃で1時間20分間攪拌され、次いで、氷及びH2Oが添加された。混合物は、0℃で飽和NaHCO3水溶液でpH8に塩基性化された。有機層と水層は分離され、有機層をH2O(1×)で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去し、黄色の固体として、(R)−N−(1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル)−6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド 53d(50mg,94%)を得て、これは精製せずに次の工程で使用された。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)9.70(s,1H),7.87(d,J=8.5Hz,1H),7.64(d,J=8.2Hz,1H),7.39(ddd,J=8.1,6.9,1.0Hz,1H),7.21−7.15(m,2H),7.01(s,2H),5.92(s,1H),4.02−3.96(m,1H),3.85(dd,J=10.8,3.5Hz,1H),3.69(t,J=9.3Hz,1H),3.63−3.55(m,2H),3.42(t,J=7.0Hz,2H),2.42(t,J=7.1Hz,2H),1.64(td,J=15.2,7.6Hz,2H),1.55(td,J=14.5,7.2Hz,2H),1.35−1.26(m,2H).
乾燥DMA中で53d(50mg,0.117mmol)、(R)−5−(1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタン酸 53e(56mg,0.161mmol)、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩EDCI.HCl(58mg,0.303mmol)及びTsOH(8mg,0.0465mmol)の混合物(2mL)が、室温で一晩、窒素下で攪拌された。19時間後、混合物をH2Oで希釈し、溶液から固体が沈殿した。水性懸濁液が、EtOAc(1×),DCM(1×),DCM:MeOH95:5(1×)を用いて抽出され、混合有機物は乾燥され(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去した。粗生成物は、DCM:MeOH100:0から94:6を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製され、黄色い固体として、N−((S)−1−(クロロメチル)−3−(5−((S)−1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル)−6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド 53(15mg,17%,HPLC純度:82.3%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)10.35(s,1H),9.88(s,1H),8.58(s,1H),8.08(d,J=8.2Hz,1H),8.02(s,1H),7.96(d,J=8.3Hz,1H),7.92(d,J=8.4Hz,1H),7.78(d,J=8.3Hz,1H),7.55(t,J=7.4Hz,1H),7.51−7.47(m,1H),7.46−7.42(m,1H),7.33−7.30(m,1H),7.01(s,2H),4.42−4.28(m,3H),4.25−4.13(m,3H),4.01(ddd,J=19.6,10.9,2.6Hz,2H),3.90(dd,J=10.9,7.5Hz,1H),3.79(dd,J=10.8,8.1Hz,1H),3.43(t,J=6.7Hz,2H),2.77−2.57(m,4H),2.46−2.43(m,2H),2.01−1.96(m,2H),1.70−1.62(m,2H),1.60−1.53(m,2H),1.36−1.28(m,2H).HRMSm/z777.2186[(M+Na)+,C41H40Cl2N4NaO6として計算:777.2217].
10%Pd/C(1.5g)が、−20℃で、窒素下で、THF−25%NH4HCO2水溶液(60mL/23mL)中の(S)−5−(5−(ベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタン酸57c(2.00g,4.57mmol)の攪拌溶液に添加された(図3)。反応混合物を3.5時間、−15から−10℃で撹拌した。次いで、反応混合物を一晩−20℃に保った。17.5時間後、混合物を−10℃に温め、5時間、−1から−5℃で撹拌した。次いで、混合物を0℃に温め、そして、30分間この温度で撹拌し、次いでMeOHで希釈し、セライトを通して濾過し、セライトプラグをMeOHで洗浄し(3×)、固体が溶液から沈殿するまで、溶媒を真空下で濃縮した。次いで、これはH2O(150mL)及びヘキサン(150mL)で希釈され、濃縮HClでpH1に酸性化されつつ室温で撹拌された。混合物を更に30分間撹拌し、固体を濾過により回収し、H2O及びヘキサンで洗浄し、乾燥し、ベージュ色の固体として、(S)−5−(1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタン酸53h(1.43g,90%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)12.07(br s,1H),10.35(s,1H),8.08(d,J=8.0Hz,1H),7.98(s,1H),7.77(d,J=8.3Hz,1H),7.50−7.46(m,1H),7.33−7.29(m,1H),4.30(t,J=10.4Hz,1H),4.14−4.12(m,2H),3.98(dd,J=10.9,2.8Hz,1H),3.78(dd,J=10.8,7.8Hz,1H),2.63−2.45(m,2H),2.35(t,J=7.4Hz,2H),1.89−1.78(m,2H).
塩化水素ガス(HCl)が、室温で、乾燥ジオキサン(12mL)(3A以上のモレキュラーシーブ)中の(S)−tert−ブチル1−(クロロメチル)−5−(ジフェニルメチレンアミノ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート53f(425mg,0.855mmol)の溶液を通してバブリングされた。(図3)。溶液から固体が沈殿し、溶媒は15分後に真空下で除去された。粗固体の(S)−1−(クロロメチル)−N−(ジフェニルメチレン)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−アミン53gは精製せずに次の工程で使用された。乾燥DMA(10mL)が、窒素下、室温で、53g、(S)−5−(1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタン酸53h(327mg,0.941mmol),EDCI.HCl(573mg,2.99mmol)及び3A(オングストローム)モレキュラーシーブの混合物に添加された。2日と19.5時間後、溶媒を真空下で除去した。粗物質は、DCM:MeOH100:0から90:10を使用して、シリカ上でゲルカラムクロマトグラフィーによって精製され、次いで物質は再びヘキサン:DCM100:0から50:50から0:100、次いでDCM:MeOH99:1から98:2を使用してクロマトグラフされ、1−((S)−1−(クロロメチル)−5−(ジフェニルメチレンアミノ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−((S)−1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)ペンタン−1,5−ジオン53iを得た(193mg,31%、53fから2工程かけて)。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)10.35(s,1H),8.08(d,J=8.1Hz,1H),8.00(s,1H),7.84(t,J=9.0Hz,2H),7.79−7.74(m,3H),7.62−7.57(m,2H),7.54−7.46(m,4H),7.40−7.36(m,1H),7.33−7.29(m,1H),7.27−7.22(m,3H),7.09−7.08(m,2H),4.34−4.26(m,2H),4.22−4.12(m,4H),4.01−3.97(m,2H),3.83−3.76(m,2H),2.69−2.50(m,4H),1.93−1.86(m,2H).HRMSm/z726.2264[(M+H)+,C44H38Cl2N3O3として計算:726.2285].
室温(r.t.)でTHF−H2O(24mL/12mL)中53i(190mg,0.261mmol)の攪拌溶液に、酢酸(HOAc,8mL)が添加され、混合物を一晩撹拌した。19時間後、混合物をH2Oで希釈し、固体が沈殿した。THFを真空下で除去し、水性懸濁液は中性になるまでDIPEAで処理された。固体を乾燥させ、濾過により回収し、H2Oで洗浄した。固体をDMF(1.5mL)に溶解し、固体を沈殿させ、MeOHで希釈した。溶媒をデカントし、ヘキサン:DCM90:10を固体に添加し、懸濁液を振盪し、溶媒をデカントした。このプロセスは、ヘキサン:EtOAc90:10、続いてヘキサン単独を用いて繰り返された。次いで、固体をDMF/THF中に溶解し、シリカゲルに吸着させ、生成物をDCM:MeOH100:0から90:10を用いて溶出した。物質は分取HPLC(カラム:Synergi−MAXRP4μ,21.20×250mm;流速:13mL/分;移動相:溶媒A:H2O/TFApH2.5,溶媒B:MeCN/H2O90:10;方法:アイソクラティック:溶媒A:溶媒B20:80,15分;波長:254nm、330nm)により更に精製され、白色固体として、1−((S)−5−アミノ−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−((S)−1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)ペンタン−1,5−ジオン 53j,30mg,22%,HPLC純度:87.9%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)10.36(s,1H),8.08(d,J=8.1Hz,1H),8.04−8.02(m,2H),7.79−7.77(m,2H),7.69(d,J=8.3Hz,1H),7.51−7.47(m,1H),7.42(t,J=7.5Hz,1H),7.34−7.30(m,1H),7.23(t,J=7.6Hz,1H),5.91(s,2H),4.36−4.26(m,2H),4.19−4.13(m,3H),4.08−4.04(m,1H),4.01−3.93(m,2H),3.79(dd,J=10.7,8.2Hz,1H),3.70(dd,J=10.5,8.9Hz,1H),2.75−2.66(m,2H),2.63−2.54(m,2H),2.00−1.93(m,2H).HRMSm/z584.1456[(M+Na)+,C31H29Cl2N3NaO3として計算:584.1478].[α]D 28=−37.6o(c=0.559,DMSO).
トリエチルアミン(Et3N,0.54mL,3.89mmol)及びトリフルオロメタンスルホン酸無水物(0.60mL,3.60mmol)が、0℃でDCM(100mL)中の(R)−tert−ブチル1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート53kの攪拌溶液に添加された(図4)。反応物を、20分間、0℃で攪拌し、次いで、H2Oで希釈し、層を分離し、水層をDCM(1×)で抽出した。混合した有機層を乾燥し(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去した。ヘキサン:EtOAc100:0から96:4を用いたシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製は、オレンジ色の泡状固体として、(R)−tert−ブチル 1−(クロロメチル)−5−(トリフルオロメチルスルホニルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 53l(1.30g,93%)を得た。1H NMRδ(400MHz,CDCl3)8.30(br s,1H),8.03(d,J=8.5Hz,1H),7.76(d,J=8.4Hz,1H),7.62−7.58(m,1H),7.53−7.49(m,1H),4.32(br s,1H),4.20−4.15(m,1H),4.09−4.03(m,1H),3.92(dd,J=11.2,2.8Hz,1H),3.54−3.49(m,1H),1.61(s,9H).
乾燥THF(60mL、脱気)中の53lの溶液(1.30g,2.79mmol)が、窒素下で、Cs2CO3(1.27g,3.91mmol),BINAP(209mg,0.336mmol)及びPd(OAc)2(63mg,0.281mmol)の混合物に添加された。次いでジフェニルメタンアミン(0.56mL、3.34mmol)を添加し、混合物を窒素下で一晩還流した。20時間後、反応温度を60−65℃に低下させ、反応物を1日間窒素下でこの温度で撹拌した。追加のTHF(10mL)が添加され、その混合物を別の日に同じ温度で撹拌し、再び混合物に更にTHF(25mL)を添加した。別の日の後、Pd(OAc)2(19mg,0.0846mmol),BINAP(52mg,0.0835mmol)及びTHF(30mL)の追加部分が添加され、その混合物を窒素下で一晩70℃で加熱した。更なる28時間後、Pd(OAc)2(31mg,0.138mmol),BINAP(104mg,0.167mmol)の追加部分が再び添加され、反応は22時間続けられた。次いで、反応混合物を室温に冷却し、DCMで希釈し、セライトを通して濾過し、洗浄液に色が存在しなくなるまでセライトプラグをDCMで洗浄し、濾液を真空下で蒸発させた。ヘキサン:DCM100:0から50:50を用いたシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製は、黄色い泡状固体として、(R)−tert−ブチル 1−(クロロメチル)−5−(ジフェニルメチレンアミノ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 53a(1.19g,85%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)7.85(d,J=8.3Hz,1H),7.80(d,J=8.4Hz,1H),7.75(d,J=7.2Hz,2H),7.61−7.57(m,1H),7.54−7.49(m,3H),7.37−7.33(m,1H),7.30−7.23(m,3H),7.06(d,J=6.8Hz,2H),4.13−4.02(m,2H),4.00−3.94(m,2H),3.77(dd,J=10.9,7.5Hz,1H),1.46(s,9H),1H(観測されず)。[α]D 27=+101o(c=1.04,DCM).
塩化水素ガス(HCl(g))が、室温で、乾燥ジオキサン(10mL)(3A以上のモレキュラーシーブ)中の53a(300mg,0.604mmol)の溶液を通してバブリングされた。10分後、溶液から固体が沈殿し、溶媒は20分後に真空下で除去された。粗固体(R)−1−(クロロメチル)−N−(ジフェニルメチレン)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−アミン 53mを、精製せずに次の工程に使用した。
炭素上のパラジウム、10%Pd/C(690mg)が、−10℃で、窒素下で、THF−25%NH4HCO2水溶液(40mL/16mL)中の(R)−5−(5−(ベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタン酸53n(1.38g,3.15mmol)の攪拌溶液に添加された。反応混合物を3時間、−10から−5℃で撹拌した。次いで、反応混合物を一晩−20℃に保った。−20℃で15時間後、混合物を、MeOHで希釈し、セライトで濾過し、セライトプラグをMeOHで洗浄し、そして溶媒は、真空下で、固体が溶液から沈殿するまで濃縮された。次いで、懸濁液はH2O(130mL)及びヘキサン(100mL)で希釈され、濃縮HClでpH1に酸性化されつつ室温で撹拌された。混合物を、30分間攪拌し沈降させ、ヘキサンをデカントした。追加のヘキサン(120mL)が添加され、混合物は更に30分間撹拌され、ヘキサンを再びデカントし、次いで固体を濾過により収集し、H2O及びヘキサンで洗浄し、乾燥し、ベージュ色の固体として、(R)−5−(1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタン酸 53e(925mg,84%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)12.06(br s,1H),10.35(s,1H),8.08(d,J=8.0Hz,1H),7.98(s,1H),7.77(d,J=8.3Hz,1H),7.50−7.46(m,1H),7.33−7.29(m,1H),4.30(t,J=10.5Hz,1H),4.14−4.12(m,2H),3.98(dd,J=10.9,2.8Hz,1H),3.78(dd,J=10.8,7.9Hz,1H),2.63−2.45(m,2H),2.35(t,J=7.4Hz,2H),1.89−1.78(m,2H).
乾燥DMA(8mL)が、窒素下、室温で、前の反応からの53m、53e(241mg,0.693mmol)、EDCI.HCl(404mg,2.11mmol)及び3Aモレキュラーシーブの混合物に添加された。反応混合物は一晩撹拌された。19.5時間後、混合物をH2Oで希釈し、得られた懸濁液を濾過した。水性濾液をEtOAcで抽出し(3×)、濾過した固体をEtOAc/MeOHに溶解し、EtOAc抽出物と混合した。混合した有機溶液をシリカゲルに吸着させ、生成物は、ヘキサン:DCM50:50から0:100、次いでDCM:MeOH99.5:0.5から97:3を用いて溶出され、暗黄色固体として、1−((R)−1−(クロロメチル)−5−(ジフェニルメチレンアミノ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−((R)−1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)ペンタン−1,5−ジオン 53o(155mg,35%,53aから2工程かけて)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)10.35(s,1H),8.08(d,J=8.0Hz,1H),8.00(s,1H),7.85(t,J=8.9Hz,2H),7.79−7.74(m,3H),7.62−7.57(m,2H),7.54−7.46(m,4H),7.40−7.36(m,1H),7.33−7.29(m,1H),7.27−7.22(m,3H),7.09−7.08(m,2H),4.34−4.27(m,2H),4.22−4.11(m,4H),4.02−3.97(m,2H),3.83−3.76(m,2H),2.69−2.51(m,4H),1.93−1.85(m,2H),NMRスペクトルは、53iのそれと一致した。HRMSm/z748.2077[(M+Na)+,C44H37Cl2N3NaO3として計算:748.2104].
室温(r.t.)でTHF−H2O(12mL/6mL)中53o(80mg,0.110mmol)の攪拌溶液に、酢酸(HOAc,4mL)が添加され、混合物を一晩撹拌した。18時間後、混合物をH2Oで希釈し、固体が沈殿した。THFは、真空下で除去され、水性懸濁液はpH8になるまでDIPEAで処理され、更なる固体の沈殿を生じた。固体を濾過により回収し、乾燥させ、DCM:MeOH100:0から97:3を使用するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーにより精製し、黄褐色の固体として、1−((R)−5−アミノ−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−((R)−1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)ペンタン−1,5−ジオン 53p(20mg,32%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)10.36(s,1H),8.08(d,J=8.2Hz,1H),8.04−8.02(m,2H),7.79−7.77(m,2H),7.69(d,J=8.3Hz,1H),7.51−7.47(m,1H),7.42(t,J=7.5Hz,1H),7.34−7.30(m,1H),7.23(t,J=7.6Hz,1H),5.91(s,2H),4.36−4.26(m,2H),4.19−4.13(m,3H),4.08−4.04(m,1H),4.01−3.93(m,2H),3.79(dd,J=10.7,8.3Hz,1H),3.71(dd,J=10.5,8.9Hz,1H),2.75−2.66(m,2H),2.63−2.53(m,2H),2.00−1.93(m,2H)、NMRスペクトルは、53jのそれと一致した。
無水THF(140mL)中の、Terceletal(2003)J.Med.Chem46:2132−2151の手順により調製された(S)−(2−アミノ−4−ヒドロキシ−5−メトキシフェニル)(2−(ヒドロキシメチル)ピロリジン−1−イル)メタノン54a(7.6g,28.6mmol)とジ−t−ブチルジカーボネート(12.48g,57.2mmol)の混合物が、18時間、窒素雰囲気中で還流下で撹拌された。反応混合物は室温まで冷却され、2NのNaOH(57.2mL,114mmol)及びMeOH(70mL)が添加された。混合物を、6時間、室温で撹拌した。揮発物は、35−40℃(浴温度)で、減圧下で蒸発させた。氷水(250mL)が添加され、0℃でpHは8−9に調整された。混合物を石油エーテル−酢酸エチル(20:1)(2x400mL)と共に室温で15分間攪拌した。有機層は分離され、廃棄された。水層をDCM(4×300mL)で抽出し、混合した抽出物を乾燥し(MgSO4)、減圧下で蒸発させ、ピンクホワイトの固体として、(S)−tert−ブチル 5−ヒドロキシ−2−(2−(ヒドロキシメチル)ピロリジン−1−カルボニル)−4−メトキシフェニルカルバメート 54b(9.36g,89%)を得た;mp 154−156oC;1H NMR[(CD3)2SO]δ9.51(s,1H),8.90(s,1H),7.27(s,1H),6.91(s,1H),4.73(t,J=5.8Hz,1H),4.16−4.02(m,1H),3.73(s,3H),3.64−3.34(m,4H),1.99−1.60(m,4H),1.43(s,9H).元素分析(C18H26N2O6)Calc:C,59.00;H,7.15;N,7.65.Found:C,58.94;H,7.31;N,7.39.
乾燥DMA(7mL)中、54b(2.88g,7.87mmol)とTerceletal(2003)J.Med.Chem46:2132−2151の手順により調製された2,2,2−トリクロロエチル6−ブロモヘキサノエート(3.86g,11.8mmol)の溶液に、無水K2CO3(2.61g,18.9mmol)が添加された。得られた混合物を、68時間、室温で撹拌した。それを氷水(600mL)に注ぎ、生成物を酢酸エチル(600mL)中に抽出した。抽出物を、冷(0℃)の2NのNa2CO3水溶液(2×400mL)及び水(400mL)で連続的に洗浄し、次いで、乾燥させた(MgSO4)。溶媒を蒸発させると褐色油を与え、これはSiO2カラムクロマトグラフィー(DCM:酢酸エチル=2:1)により精製され、淡黄色の泡状物として、純粋な(S)−2,2,2−トリクロロエチル 6−(5−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)−4−(2−(ヒドロキシメチル)ピロリジン−1−カルボニル)−2−メトキシフェノキシ)ヘキサノエート 54c(3.62g,76%)を得た;mp 36−39oC;1H NMR[(CD3)2SO]δ9.90(s,1H),7.33(s,1H),6.93(s,1H),4.89(s,2H),4.74(t,J=5.8Hz,1H),4.17−4.02(m,1H),3.94(t,J=6.4Hz,2H),3.73(s,3H),3.63−3.26(m,4H),2.55−2.46(m,2H(DMSOピークにより部分的に不明瞭)),2.00−1.55(m,8H),1.53−1.36(m,11H).元素分析(C26H37N2O8)Calc:C,51.03;H,6.09;N,4.58.Found:C,51.33;H,6.21;N,4.35.
乾燥DCM(12mL)中の54c(3.62g,5.92mmol)の溶液に、デス・マーチン・ペルヨージナン(DMP:1,1,1−トリアセトキシ−1,1−ジヒドロ−1,2−ベンズヨードキソール−3(1H)−オン、CASReg.No.87413−09−0)(3.27g,7.70mmol)が室温で15分間少量ずつ添加された。反応混合物を、45分間、室温で撹拌した。それをDCM(800mL)で希釈し、10%Na2S2O3(100mL)、冷(0oC)NaHCO3溶液(400mL)、及び水(300mL)で連続的に洗浄し、次いで乾燥(MgSO4)した。溶媒を蒸発させると琥珀色の固体を与え、これはSiO2カラムクロマトグラフィー(石油エーテル−酢酸エチル=3:4)により精製され、粘着性の泡状物として、(S)−tert−ブチル 11−ヒドロキシ−7−メトキシ−5−オキソ−8−(6−オキソ−6−(2,2,2−トリクロロエトキシ)ヘキシルオキシ)−2,3,11,11a−テトラヒドロ−1H−ベンゾ[e]ピロロ[1,2−a][1,4]ジアゼピン−10(5H)−カルボキシレート 54d(2.61g,72%)を得た;1H NMR[(CD3)2SO]δ7.03(s,1H),6.67(s,1H),6.38(s,1H),5.41(s,1H),4.89(s,2H),4.06−3.87(m,2H),3.79(s,3H),3.52−3.43(m,1H),3.42−3.28(m,1H(水ピークにより部分的に不明瞭)),3.27−3.20(m,1H),2.08−1.82(m,5H),1.81−1.71(m,2H),1.71−1.61(m,2H),1.53−1.40(m,3H),1.31(s,9H).HRMS(ESI)m/zC26H35Cl3N2NaO8として計算:631.1351, found :631.1361[MNa+].
アセトン−水(3:2)(100mL)中の54dの撹拌溶液(1.80g,2.95mmol)に、窒素下で、Zn(7.72g,118mmol)及びNH4Cl(6.32g,118mmol)が添加された。混合物を室温で28時間撹拌した。上清をデカントし、Zn残留物はNaHCO3水溶液(3×100mL)で洗浄された。洗浄液及び上清を合わせ、DCMで攪拌した(300mL、次いで2×100mL)。DCM層は分離され、廃棄された。水層は、0℃で、濃塩酸でpH<1に酸性化された。生成物はDCM中に抽出され(400mL;2x200mL)、乾燥し(MgSO4)され、蒸発させ、無色の泡状物として、(S)−tert−ブチル 8−(5−ヒドロペルオキシヘキサ−5−エニルオキシ)−11−ヒドロキシ−7−メトキシ−5−オキソ−2,3,11,11a−テトラヒドロ−1H−ベンゾ[e]ピロロ[1,2−a][1,4]ジアゼピン−10(5H)−カルボキシレート 54e(1.34g,95%)を得た;mp 65−67oC;1H NMR[(CD3)2SO]δ11.99(br s,1H),7.04(s,1H),6.67(s,1H),6.37(br s,1H),5.41(d,J=9.4Hz,1H),4.06−3.87(m,2H),3.79(s,3H),3.53−3.19(m,3H(水ピークにより部分的に不明瞭)),2.22(t,J=7.2Hz,2H),2.09−1.81(m,4H),1.80−1.67(m,2H),1.62−1.49(m,2H),1.49−1.37(m,2H),1.31(s,9H).元素分析(C24H34N2O8・1/4H2O)Calc:C,59.68;H,7.20;N,5.80.Found:C,59.37;H,7.20;N,5.62.
DMA(7mL)中の54e(1.16g,2.42mmol)、(S)−1−(クロロメチル)−5−(4−ニトロベンジルオキシ)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール 54f(893mg,2.42mmol),EDCI.HCl(1.39g,7.26mmol)、及び無水TsOH(83mg,0.48mmol)は、4時間、窒素雰囲気下で室温で攪拌された。水(120mL)が添加され、混合物は室温で15分間撹拌された。沈殿した固体は濾過され、水(4x40mL)、0.01%NH4OH(4x40mL)、及び石油エーテル(4x40mL)で連続的に洗浄され、次いで乾燥され、淡黄色の固体として、N−Boc−(S)−8−(6−((S)−1−(クロロメチル)−5−(4−ニトロベンジルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−6−オキソヘキシルオキシ)−11−ヒドロキシ−7−メトキシ−2,3,11,11a−テトラヒドロ−1H−ベンゾ[e]ピロロ[1,2−a][1,4]ジアゼピン−5(10H)−オン 54g(1.71g,85%)を得た;mp 130−133oC;1H NMR[(CD3)2SO]δ8.30(d,J=8.8Hz,2H),8.23(d,J=8.1Hz,1H),8.18(s,1H),7.92−7.82(m,3H),7.57(td,J=8.2,1.1Hz,1H),7.43(t,J=8.0Hz,1H),7.03(s,1H),6.69(s,1H),6.39(br s,1H),5.51−5.35(m,3H),4.36(t,J=9.5Hz,1H),4.28−4.15(m,2H),4.10−3.90(m,3H),3.85(dd,J=11.1,7.8Hz,1H),3.79(s,3H),3.52−3.42(m,1H),3.42−3.20(m,2H(水ピークにより部分的に不明瞭)),2.68−2.50(m,2H(DMSOピークにより部分的に不明瞭)),2.11−1.95(m,1H),1.95−1.75(m,5H),1.
75−1.61(m,2H),1.59−1.45(m,2H),1.31(s,9H).元素分析(C44H49ClN4O10)Calc:C,63.72;H,5.96;N,6.76.Found:C,63.33;H,5.97;N,6.92.
THF(90mL)、アセトン(70mL)、及び水(40mL)の混合物中の54gの撹拌溶液(1.70g,2.05mmol)に、窒素下で、Zn(2.68g,41.0mmol)及びNH4Cl(4.39g,82.0mmol)が添加された。混合物を、室温で45分間撹拌し、次いでセライトを通して濾過し、THFで数回洗浄した濾液は室温で減圧下で約60mLに濃縮された。0.01%のNH4OH(400mL)の溶液が添加され、混合物は室温で15分間撹拌された。固体を回収し、0.01%NH4OH(3x100mL)、水(3x100mL)及び石油エーテル(3x100mL)で連続的に洗浄された。固体は乾燥されて54dのアニリン誘導体(1.16g,100%)を与え、乾燥DMA(2mL)中で6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサン酸(253mg,1.20mmol),EDCI.HCl(576mg,3.00mmol)及び無水TsOH(34.4mg,0.20mmol)で処理された。混合物を、室温で窒素下で17時間撹拌した。NaHCO3溶液(50mL)が添加され、混合物を室温で30分間撹拌した。固体を収集し、水で洗浄し、乾燥させ、シリカカラムクロマトグラフィー(DCM:酢酸エチル=1:1)により精製し、黄色の固体として、純粋な(S)−tert−ブチル 8−(6−((S)−1−(クロロメチル)−5−(4−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド)ベンジルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−6−オキソヘキシルオキシ)−11−ヒドロキシ−7−メトキシ−5−オキソ−2,3,11,11a−テトラヒドロ−1H−ベンゾ[e]ピロロ[1,2−a][1,4]ジアゼピン−10(5H)−カルボキシレート 54h(194mg,33%)を得た;mp 128−132oC;1H NMR[(CD3)2SO]δ9.91(s,1H),8.20−8.11(m,2H),7.84(d,J=8.3Hz,1H),7.62(d,J=8.5Hz,2H),7.54(brt,J=8.1Hz,1H),7.47(d,J=8.5Hz,2H),7.38(brt,J=8.0Hz,1H),7.04(s,1H),7.00(s,2H),6.69(s,1H),6.38(br s,1H),5.45−5.37(m,1H),5.20(s,2H),4.36(t,J=10.2Hz,1H),4.26−4.13(m,2H),4.10−3.92(m,3H),3.88−3.79(m,1H),3.79(s,3H),3.52−3.30(m,4H),3.24(brt,J=8.9Hz,1H),2.66−2.50(m,2H(DMSOピークにより部分的に不明瞭)),2.28(t,J=7.3Hz,2H),2.08−1.95(m,1H),1.95−1.76(m,5H),1.76−1.64(m,2H),1.64−1.20(m,8H),1.31(s,9H).元素分析(C54H62ClN5O11)Calc:C,65.35;H,6.30;N,7.06.Found:C,65.08;H,6.39;N,6.67.
窒素雰囲気下で−10から−11℃で攪拌されたDCM(15mL)中のN−(4−(((S)−1−(クロロメチル)−3−(6−((S)−7−メトキシ−5−オキソ−2,3,5,11a−テトラヒドロ−1H−ベンゾ[e]ピロロ[1,2−a][1,4]ジアゼピン−8−イルオキシ)ヘキサノイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イルオキシ)メチル)フェニル)−6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド 54h(204mg,0.21mmol)の溶液に、2.5%の水を含有するTFA(15ml)が(30分かけて)滴下された。添加後、混合物を4時間、更にこの温度で撹拌した。混合物を、氷、DCM、及び十分に飽和したNaHCO3溶液の混合物に注ぎ、0℃でpH7−8を得た。混合物を室温で15分間撹拌した。DCM層を分離し、更にNaHCO3水溶液及び水で洗浄し、次いで乾燥した(MgSO4)。溶媒を25℃(浴温度)で蒸発させ、黄色の固体を得た(172mg,94%の材料が回収された)。この粗生成物を分取HPLC(Synergi−MaxRPカラム)により精製し(30%ギ酸アンモニウム緩衝液pH=3.5;70%水性(10%)アセトニトリル;流速:13mL/分で溶出)、54(30mg,16%)を得た,HPLC:98.8%純度;mp 190oC(dec.);[α20 D+320o(c0.100,DCM);1H NMR[CDCl3]δ8.29(d,J=8.3Hz,1H),8.18(s,1H),7.69−7.63(m,2H),7.61−7.44(m,6H),7.37(brt,J=7.3Hz,2H),6.82(s,1H),6.66(s,2H),5.24(s,2H),4.34−4.19(m,2H),4.19−4.00(m,3H),3.99−3.92(m,1H),3.89(s,3H),3.86−3.78(m,1H),3.76−3.70(m,1H),3.63−3.49(m,3H),3.42(t,J=10.8Hz,1H),2.68−2.47(m,2H),2.40−2.27(m,3H),2.12−1.92(m,5H),1.92−1.82(m,2H),1.82−1.71(m,2H),1.71−1.54(m,4H(水ピークにより部分的に不明瞭)),1.43−1.32(m,2H).HRMS(ESI)m/zC49H52ClN5NaO8として計算:896.3397, found :896.3375[MNa+].
室温で、炭酸カリウム、K2CO3(2.50g,18.1mmol)が、DMF(12mL)中の(S)−tert−ブチル 1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 51a(2.01g,6.02mmol)及び1−(ブロモメチル)−4−ニトロベンゼン(5.20g,24.1mmol)に添加された(図6)。反応混合物を室温で2時間撹拌し、次いで、EtOAc及びH2Oで希釈し、層を分離した。有機層をH2O(3×)、かん水(1×)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去した。ヘキサン:EtOAc100:0から96:4を用いたシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる2回の精製により、山吹色固体として、(S)−tert−ブチル 1−(クロロメチル)−5−(4−ニトロベンジルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 55a(2.17g,77%)を得た。1H NMRδ(400MHz,CDCl3)8.31−8.27(m,3H),7.85(br s,1H),7.72(d,J=8.4Hz,2H),7.67(d,J=8.3Hz,1H),7.54(ddd,J=8.2,6.8,1.2Hz,1H),7.38(ddd,J=8.2,6.8,1.1Hz,1H),4.28−4.25(m,1H),4.16−4.10(m,1H),4.02−3.92(m,2H),3.45(t,J=10.6Hz,1H),1.60(s,9H).HRMSm/z491.1338[(M+Na)+,C25H25ClN2NaO5として計算:491.1344].
還元法A:55a(1.53g,3.26mmol)が、THF−アセトン(75mL/60mL)に溶解された。55aが溶解するとH2O(30mL)が添加された。NH4Cl(10.5g,196mmol)及びZn粉末(6.40g,97.9mmol)を添加し、得られた混合物を1時間窒素下で室温で撹拌した。次いで、反応混合物を、セライトを通して濾過し、セライトプラグをDCMで洗浄し、混合した濾液をH2O(1x)で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)で洗浄し、溶媒を真空下で除去し、オレンジ色の固体として化合物55bを得た。粗生成物を精製せずに次の工程に使用した。
還元法B:THF−MeOH−H2O(150mL/50mL/20mL)中の55aの溶液にマーキュリー−アルミニウムアマルガムが添加された。15分後、反応混合物を、DCMで希釈し、セライトを通して濾過し、セライトプラグをDCMで洗浄した。有機物を、H2Oで洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去し、オレンジ色の固体として、(S)−tert−ブチル 5−(4−アミノベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 55bを得た。生成物を精製せずに次の工程に使用した。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)8.06(d,J=8.6Hz,1H),7.80(d,J=8.3Hz,1H),7.53−7.49(m,1H),7.34−7.30(m,1H),7.19(d,J=8.2Hz,2H),6.60(d,J=8.4Hz,2H),5.16(s,2H),5.04(d,J=1.3Hz,2H),4.18−4.05(m,3H),4.00−3.97(m,1H),3.81(dd,J=10.9,6.9Hz,1H),1.56(s,9H),1H(観測されず)。
DMA(15mL)中の(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニルアミノ)−5−ウレイドペンタン酸(Fmoc−L−シトルリン、3.26g,8.20mmol)及び2−エトキシ−1−エトキシカルボニル−1,2−ジヒドロキノリン(EEDQ,CASReg.No.16357−59−8,3.12g,12.6mmol)の混合物が、室温で窒素下で20分間攪拌された。次いでDMA(15mL)中の55b(2.77g,6.31mmol)の溶液が添加され、得られた混合物を窒素で洗浄し、一晩攪拌したままにした。16時間後、反応混合物を氷の上に注ぎ、H2Oで希釈した。得られた沈殿物を濾過し、H2Oで洗浄し、DCM/MeOHに溶解し、乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去した。粗生成物を粉砕することによって精製し、生成物はヘキサン:EtOAc94:6により沈殿させ、溶媒をデカントし、そのプロセスは、ヘキサン:EtOAc90:10、次いでヘキサン:EtOAc95:5を用いて繰り返された。材料は、その後、DCM:MeOH100:0から95:5を使用してシリカゲル上でカラム処理され、黄色い固体として、(S)−tert−ブチル 5−(4−((S)−2−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニルアミノ)−5−ウレイドペンタンアミド)ベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 55c(4.23g,79%、55aから2工程かけて、HPLC純度:95.3%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)10.12(s,1H),8.12(d,J=8.4Hz,1H),7.89(d,J=7.5Hz,2H),7.82(d,J=8.3Hz,1H),7.77−7.74(m,2H),7.70−7.67(m,3H),7.55−7.49(m,3H),7.42(t,J=7.4Hz,2H),7.37−7.31(m,3H),6.00(t,J=5.7Hz,1H),5.43(s,2H),5.22(s,2H),4.29−4.27(m,2H),4.24−4.05(m,6H),4.01−3.98(m,1H),3.82(dd,J=10.9,7.0Hz,1H),3.09−2.92(m,2H),1.74−1.35(m,4H),1.55(s,9H).HRMSm/z840.3101[(M+Na)+,C46H48ClN5NaO7として計算:840.3134].
ピペリジン(1.5mL,10%v/v)が、室温でDMF(15mL)中の55c(4.18g,5.11mmol)の攪拌溶液に添加された。反応混合物を1時間撹拌した。得られた懸濁液は、ヘキサン:EtOAc90:10(100mL)で希釈され、10分間攪拌した。二つの層が形成され、最上層をデカントした。保持された下部層中の溶媒を真空下で除去した。DCM:MeOH100:0から85:15を用いたシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製は、黄色の粉末として、(S)−tert−ブチル 5−(4−((S)−2−アミノ−5−ウレイドペンタンアミド)ベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 55d(2.97g,97%,HPLC純度:99.1%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)9.93(br s,1H),8.12(d,J=8.3Hz,1H),7.82(d,J=8.3Hz,1H),7.70(d,J=8.6Hz,2H),7.55−7.48(m,3H),7.37−7.33(m,1H),5.94(t,J=5.7Hz,1H),5.37(s,2H),5.22(s,2H),4.19−4.05(m,4H),4.01−3.98(m,1H),3.82(dd,J=10.9,7.0Hz,1H),3.04−2.91(m,2H),1.71−1.36(m,4H),1.55(s,9H),3H(観測されず)。HRMSm/z596.2627[(M+H)+,C31H39ClN5O5として計算:596.2634].
DMA(15mL)中の(S)−2,5−ジオキソピロリジン−1−イル2−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニルアミノ)−3−メチルブタノアート(Fmoc−Val−OSu,3.19g,7.31mmol)及び55d(2.91g,4.87mmol)の混合物が、窒素下、室温で一晩攪拌された。20時間後、ヘキサン:EtOAc80:20(150mL)が添加され、その懸濁液を30分間撹拌した。次いで、溶媒を、固体を残してデカントした。これはヘキサン:EtOAc75:25を用いて複数回繰り返された。次いで固体はDCM:MeOH75:25に懸濁され、そして懸濁液を超音波処理した。懸濁液をヘキサン(200mL)で希釈し、固体を濾過し、ヘキサン:EtOAcを65:35で洗浄し、乾燥させ、オレンジ色の粉末として、(S)−tert−ブチル 5−(4−((S)−2−((S)−2−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニルアミノ)−3−メチルブタンアミド)−5−ウレイドペンタンアミド)ベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 55e(3.79g,85%,HPLC純度:92.4%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)10.12(s,1H),8.14−8.12(m,2H),7.89(d,J=7.5Hz,2H),7.82(d,J=8.4Hz,1H),7.75(t,J=7.6Hz,2H),7.66(d,J=8.5Hz,2H),7.55−7.48(m,3H),7.45−7.30(m,6H),5.98(t,J=5.7Hz,1H),5.41(s,2H),5.22(s,2H),4.45(dd,J=13.6,7.7Hz,1H),4.36−4.04(m,6H),4.02−3.90(m,2H),3.82(dd,J=10.8,6.9Hz,1H),3.08−2.91(m,2H),2.05−1.96(m,1H),1.76−1.34(m,4H),1.55(s,9H),0.89(d,J=6.8Hz,3H),0.86(d,J=6.8Hz,3H).HRMSm/z939.3808[(M+Na)+,C51H57ClN6NaO8として計算:939.3819].
Boc除去法A:0℃で、DCM(10mL)中の55eの懸濁液(685mg,0.747mmol)に、TFA(9.5mL)を少量ずつ添加した。反応混合物を1時間45分間0℃で攪拌した。次いでNH3水溶液(0.25%、100mL)が0℃で混合物に少量ずつ添加され、次いでpHが9−10になるまで濃縮されたNH3水溶液が添加された。ヘキサン:EtOAc90:10が次いで添加され、混合物は0℃で40分間攪拌され、懸濁液を超音波処理し、沈殿物を濾過により回収し、H2O,H2O:MeOH80:20,ヘキサン:EtOAc60:40,ヘキサン:Et2O50:50、ヘキサンで洗浄し、乾燥させ、褐色の固体として、(9H−フルオレン−9−イル)メチル (S)−1−((S)−1−(4−(((S)−1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イルオキシ)メチル)フェニルアミノ)−1−オキソ−5−ウレイドペンタン−2−イルアミノ)−3−メチル−1−オキソブタン−2−イルカルバメート 55f(364mg,60%)を得た。
Boc除去法B:DCM(40mL)中のBF3.Et2O(0.07mL,0.552mmol)が0℃で55eの懸濁液に添加された。1時間50分後懸濁液は、室温で真空下でほんの僅かのDCMが残るまで濃縮された。沈殿が溶解するまで少量のMeOHが添加され、次いで溶液をH2Oで希釈した。固体が析出し、H2Oをデカントした。ヘキサン:EtOAc90:10(20mL)が添加され、そして懸濁液は超音波処理され、固体を濾過により回収した。固体がH2O及びヘキサンにより洗浄され、乾燥され、茶色の固体として、(9H−フルオレン−9−イル)メチル (S)−1−((S)−1−(4−(((S)−1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イルオキシ)メチル)フェニルアミノ)−1−オキソ−5−ウレイドペンタン−2−イルアミノ)−3−メチル−1−オキソブタン−2−イルカルバメート 55f(66mg,70%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)10.10(s,1H),8.12(d,J=7.6Hz,1H),8.00(d,J=8.3Hz,1H),7.89(d,J=7.4Hz,2H),7.74(t,J=7.7Hz,2H),7.64(d,J=8.5Hz,2H),7.58(d,J=8.3Hz,1H),7.46−7.37(m,5H),7.34−7.30(m,2H),7.13−7.09(m,1H),6.55(s,1H),5.97(t,J=5.7Hz,1H),5.41(s,2H),5.17(s,2H),4.43(dd,J=13.0,7.5Hz,1H),4.34−4.21(m,3H),3.95−3.90(m,2H),3.83(dd,J=10.7,3.4Hz,1H),3.70−3.66(m,1H),3.61−3.51(m,2H),3.08−2.90(m,2H),2.04−1.96(m,1H),1.76−1.33(m,4H),0.89(d,J=6.8Hz,3H),0.86(d,J=6.8Hz,3H),2H(観測されず)。HRMSm/z839.3266[(M+Na)+,C46H49ClN6NaO6として計算:839.3294].
DMA(10mL)中の55f(485mg,0.593mmol),53h(206mg,0.593mmol),EDCI.HCl(293mg,1.48mmol)及びTsOH(26mg,0.151mmol)の混合物は窒素で洗浄され、一晩室温で攪拌された。19.5時間後、反応混合物はH2Oで希釈され、得られた固体は濾過により回収され、H2O及びヘキサン:EtOAc50:50で洗浄された。DCM:MeOH100:0から90:10を用いたシリカゲルのプラグ上で濾過カラムクロマトグラフィーは、次の工程で未精製で使用される
(9H−フルオレン−9−イル)メチル (S)−1−((S)−1−(4−(((S)−1−(クロロメチル)−3−(5−((S)−1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イルオキシ)メチル)フェニルアミノ)−1−オキソ−5−ウレイドペンタン−2−イルアミノ)−3−メチル−1−オキソブタン−2−イルカルバメート 55g(391mg)を得た。HRMSm/z1144.4169[(M−H)+,C64H64Cl2N7O9として計算:1144.4148].
ピペリジン(0.39mL,3.95mmol)が、室温でDMF(6mL)中の55gの懸濁液(910mg,0.793mmol)に添加された。10分後、混合物は真空下で濃縮された。DCM:MeOH95:5から85:15を用いるシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによる精製と続く分取HPLCによる更なる精製(カラム:Synergi−MAXRP4μ,21.20×250mm;流速:12ml/分;移動相A:H2O/TFApH2.47,溶媒B:MeCN/H2O90:10;方法:勾配、溶媒A:溶媒B60:40から22:78から60:40,24分;波長:254nm,330nm)は、クリーム色の固体として、(S)−2−((S)−2−アミノ−3−メチルブタンアミド)−N−(4−(((S)−1−(クロロメチル)−3−(5−((S)−1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イルオキシ)メチル)フェニル)−5−ウレイドペンタンアミド トリフルオロアセタート 55h(75mg,9%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)10.35(s,1H),10.24(s,1H),8.69(d,J=7.7Hz,1H),8.20(s,1H),8.15(d,J=8.4Hz,1H),8.09−8.02(m,4H),7.86(d,J=8.4Hz,1H),7.78(d,J=8.4Hz,1H),7.65(d,J=8.5Hz,2H),7.57−7.47(m,3H),7.40−7.37(m,1H),7.34−7.30(m,1H),6.04(t,J=5.8Hz,1H),5.48(br s,2H),5.22(s,2H),4.57−4.51(m,1H),4.40−4.33(m,2H),4.25−4.14(m,4H),4.03−3.98(m,2H),3.85(dd,J=10.7,7.6Hz,1H),3.79(dd,J=10.3,8.6Hz,1H),3.66(t,J=5.2Hz,2H),3.09−2.97(m,2H),2.75−2.57(m,4H),2.11−2.06(m,1H),2.01−1.96(m,2H),1.78−1.70(m,1H),1.68−1.58(m,1H),1.53−1.40(m,2H),0.95(d,J=6.8Hz,3H),0.94(d,J=6.8Hz,3H).HRMSm/z924.3672[(M+H)+,C49H56Cl2N7O7として計算:924.3613].
DMF(3mL)中のジイソプロピルエチルアミン、DIPEA(10mg,0.0774mmol)が、55h(74mg,0.0712mmol)及び2,5−ジオキソピロリジン−1−イル 6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサノエート(33mg,0.107mmol)に添加され、得られた混合物は窒素下で室温で攪拌された。5.5時間後、追加の部分のDIPEA(0.9mg,0.00693mmol)及び2,5−ジオキソピロリジン−1−イル 6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサノエート(4.4mg,0.0143mmol)が添加された。更に1時間後、追加の部分の2,5−ジオキソピロリジン−1−イル 6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサノエート(8mg,0.0259mmol)が添加され、混合物は一晩−20℃に保たれた。15時間後、混合物は室温に温められ、追加の部分の2,5−ジオキソピロリジン−1−イル 6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサノエート(4.4mg,0.0143mmol)が添加された。更に1時間後、追加の部分の2,5−ジオキソピロリジン−1−イル 6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサノエート(7.5mg,0.0243mmol)が添加された。1時間後、ヘキサン:EtOAc95:5(25mL)、続いてDCM(5mL)が添加され、混合物は20分間撹拌された。この期間にわたり、溶液から固体が沈殿した。混合物を沈降させ、次いで溶媒がデカントされた。次いで、ヘキサン:DCM95:5が添加され、懸濁液は撹拌され、静置され、溶媒がデカントされ、固体は乾燥された。分取HPLCによる精製(カラム:Synergi−MAXRP4μ,21.20×250mm;流速:13ml/分;移動相A:H2O/TFApH2.47,溶媒B:MeCN/H2O90:10;方法:アイソクラチック、溶媒A:溶媒B35:65、35分;波長:254nm、330nm)は、淡黄色粉末として、N−((S)−1−((S)−1−(4−(((S)−1−(クロロメチル)−3−(5−((S)−1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イルオキシ)メチル)フェニルアミノ)−1−オキソ−5−ウレイドペンタン−2−イルアミノ)−3−メチル−1−オキソブタン−2−イル)−6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド 55(13.7mg,17%,HPLC純度:92.5%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)10.35(s,1H),10.02(s,1H),8.19(s,1H),8.15(d,J=8.3Hz,1H),8.08(d,J=8.1Hz,2H),8.02(s,1H),7.86(s,1H),7.81−7.77(m,2H),7.66(d,J=8.5Hz,2H),7.57−7.53(m,1H),7.50−7.47(m,3H),7.40−7.36(m,1H),7.33−7.30(m,1H),6.99(s,2H),5.97(t,J=5.5Hz,1H),5.40(br s,2H),5.21(s,2H),4.42−4.32(m,3H),4.22−4.14(m,4H),4.03−3.98(m,2H),3.87−3.77(m,2H),3.34(t,J=7.0Hz,2H),3.07−3.05(m,2H),2.76−2.59(m,4H),2.22−2.08(m,2H),2.02−1.92(m,3H),1.74−1.57(m,2H),1.51−1.33(m,6H),1.23−1.14(m,3H),0.85(d,J=6.7Hz,3H),0.82(d,J=6.8Hz,3H).HRMSm/z1115.4170[(M−H)+,C59H65Cl2N8O10として計算:1115.4206].
(S)−tert−ブチル 8−(6−((S)−1−(クロロメチル)−5−(4−ニトロベンジルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−6−オキソヘキシルオキシ)−11−ヒドロキシ−7−メトキシ−5−オキソ−2,3,11,11a−テトラヒドロ−1H−ベンゾ[e]ピロロ[1,2−a][1,4]ジアゼピン−10(5H)−カルボキシレート54g(829mg,1.00mmol)が(上記54hの合成について報告された方法により)対応するアニリンへ還元され(Zn/NH4Cl)、乾燥DMA(3mL)に溶解された。この溶液に、(S)−2−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニルアミノ)−5−ウレイドペンタン酸(Fmoc−L−シトルリン,1.19g,3.00mmol)及び2−エトキシ−1−エトキシカルボニル−1,2−ジヒドロキノリンEEDQ(0.99g,4.00mmol)を乾燥DMA(4mL)中で室温で40分間攪拌することにより形成された混合物が添加された。最終反応混合物は室温で窒素雰囲気下で19時間撹拌された。混合物に水が注がれ室温で5時間撹拌された。固体が回収され、水で複数回洗浄され、乾燥させ、シリカカラムクロマトグラフィー(0−5%からのDCM−MeOH勾配)により精製され、ベージュ色の固体として、(S)−tert−ブチル 8−(6−((S)−5−(4−((S)−2−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニルアミノ)−5−ウレイドペンタンアミド)ベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−6−オキソヘキシルオキシ)−11−ヒドロキシ−7−メトキシ−5−オキソ−2,3,11,11a−テトラヒドロ−1H−ベンゾ[e]ピロロ[1,2−a][1,4]ジアゼピン−10(5H)−カルボキシレート 56a(0.91g,77%),mp 172oC;1H NMR[(CD3)2SO]δ10.10(s,1H),8.22−8.11(m,2H),7.94−7.62(m,8H),7.59−7.46(m,3H),7.46−7.27(m,5H),7.04(s,1H),6.69(s,1H),6.39(br s,1H),5.99(t,J=5.6Hz,1H),5.51−5.32(m,3H),5.22(s,2H),4.42−3.90(m,10H),3.88−3.75(m,1H),3.79(s,3H),3.53−3.18(m,3H),3.15−2.87(m,2H),2.66−2.44(m,2H(DMSOピークにより部分的に不明瞭)),2.11−1.20(m,14H),1.31(s,9H)を得た。元素分析(C65H72ClN7O12・1/2H2O)Calc:C,65.73;H,6.20;N,8.26.Found:C,65.64;H,6.19;N,8.27.
0℃で、窒素雰囲気下で、乾燥DMA(9mL)中のN−Fmoc56a(0.91g,0.77mmol)の攪拌溶液に、DMA(1.0mmol(mL溶液あたり))中のピペリジンの溶液(3.85mL,3.85mmol)が添加された。添加後、混合物はこの温度で2時間更に攪拌され、次いで、酢酸エチル−石油エーテル(1:10)(150mL)の混合物に注がれ、30分間0℃で撹拌された。溶媒は不溶性物質からデカントされ廃棄された。洗浄工程は、室温で追加の酢酸エチル−石油エーテル(1:3)(2x150mL)を用いて繰り返された。固体は回収され、酢酸エチル−石油エーテル(1:3)で洗浄され、乾燥され、無色の固体として、(S)−tert−ブチル 8−(6−((S)−5−(4−((S)−2−アミノ−5−ウレイドペンタンアミド)ベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−6−オキソヘキシルオキシ)−11−ヒドロキシ−7−メトキシ−5−オキソ−2,3,11,11a−テトラヒドロ−1H−ベンゾ[e]ピロロ[1,2−a][1,4]ジアゼピン−10(5H)−カルボキシレート 56b(0.73g,99%);mp 223oC(dec.);1H NMR[(CD3)2SO]δ10.60−9.30(br s,3H),8.24−8.12(m,2H),7.84(d,J=8.2Hz,1H),7.70(d,J=8.5Hz,2H),7.54(brt,J=7.5Hz,1H),7.50(d,J=8.5Hz,2H),7.39(brt,J=7.6Hz,1H),7.04(s,1H),6.69(s,1H),6.39(br s,1H),5.93(t,J=5.7Hz,1H),5.47−5.28(m,3H),5.21(s,2H),4.36(t,J=10.8Hz,1H),4.28−4.13(m,2H),4.10−3.92(m,3H),3.90−3.77(m,1H),3.79(s,3H),3.54−3.20(m,3H(水ピークにより部分的に不明瞭)),3.06−2.89(m,2H),2.70−2.49(m,3H(DMSOピークにより部分的に不明瞭)),2.10−1.25(m,14H),1.31(s,9H)を得た。元素分析(C50H62ClN7O10・3/4H2O)Calc:C,61.91;H,6.60;N,10.11.Found:C,62.05;H,6.96;N,10.08.
乾燥DMA(7mL)中のアミン56b(0.73g,0.763mmol)及び(S)−2,5−ジオキソピロリジン−1−イル2−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニルアミノ)−3−メチルブタノアート(Fmoc−Val−Osu,0.50g,1.15mmol)の混合物が室温で窒素雰囲気下で18時間攪拌された。溶媒は不溶性物質からデカントされ、洗浄工程は追加の酢酸エチル−石油エーテル(1:1)(2×100mL)を用いて繰り返された。無色の固体は乾燥され、(S)−tert−ブチル 8−(6−((S)−5−(4−((S)−2−((S)−2−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニルアミノ)−3−メチルブタンアミド)−5−ウレイドペンタンアミド)ベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−6−オキソヘキシルオキシ)−11−ヒドロキシ−7−メトキシ−5−オキソ−2,3,11,11a−テトラヒドロ−1H−ベンゾ[e]ピロロ[1,2−a][1,4]ジアゼピン−10(5H)−カルボキシレート 56c(0.89g,91%);mp 191oC(dec.);1H NMR[(CD3)2SO]δ10.11(s,1H),8.22−8.08(m,3H),7.92−7.81(m,3H),7.74(t,J=7.4Hz,2H),7.65(d,J=8.4Hz,2H),7.54(brt,J=7.2Hz,1H),7.48(d,J=8.4Hz,2H),7.46−7.35(m,4H),7.32(brt,J=7.4Hz,2H),7.04(s,1H),6.69(s,1H),6.39(br s,1H),5.97(br s,1H),5.47−5.34(m,3H),5.21(s,2H),4.53−4.13(m,7H),4.10−3.75(m,5H),3.79(s,3H),3.53−3.20(m,3H(水ピークにより部分的に不明瞭)),3.10−2.87(m,2H),2.69−2.45(m,2H(DMSOピークにより部分的に不明瞭)),2.10−1.25(m,15H),1.31(s,9H),0.88(d,J=6.8Hz,3H),0.85(d,J=6.7Hz,3H)を得た。元素分析(C70H81ClN8O13・3/4H2O)Calc:C,65.10;H,6.44;N,8.68.Found:C,64.85;H,6.48;N,8.67.
0℃で、窒素雰囲気下で、乾燥DMA(6mL)中のN−Fmoc化合物56c(0.89g,0.70mmol)の攪拌溶液に、DMA中のピペリジンの溶液(1.0mmol(mL溶液あたり))(3.48mL,3.48mmol)が添加された。添加後、混合物はこの温度で1.5時間更に攪拌された。酢酸エチル−石油エーテル(1:10)(90mL)の混合物が添加され、混合物は0℃で10分間撹拌された。溶媒層は不溶性物質からデカントされ廃棄された。洗浄工程は、室温で追加の酢酸エチル−石油エーテル(1:2)(2x90mL)を用いて繰り返された。無色の固体が後に残され、(S)−tert−ブチル 8−(6−((S)−5−(4−((S)−2−((S)−2−アミノ−3−メチルブタンアミド)−5−ウレイドペンタンアミド)ベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−6−オキソヘキシルオキシ)−11−ヒドロキシ−7−メトキシ−5−オキソ−2,3,11,11a−テトラヒドロ−1H−ベンゾ[e]ピロロ[1,2−a][1,4]ジアゼピン−10(5H)−カルボキシレート 56d(0.68g,93%)を得た;mp 225oC(dec.);1H NMR[(CD3)2SO]δ10.16(s,1H(D2Oと交換可能)),8.23−8.07(m,3H,D2O交換後2H),7.84(d,J=8.2Hz,1H),7.65(d,J=8.5Hz,2H),7.59−7.45(m,3H),7.37(brt,J=7.5Hz,1H),7.04(s,1H),6.69(s,1H),6.38(br s,1H(D2Oと交換可能)),5.96(t,J=5.8Hz,1H(D2Oと交換可能)),5.45−5.30(m,3H,D2O交換後d,1H,J=9.6Hz),5.21(s,2H),4.41(br s,D2O交換後dd,J=8.4,5.4Hz,1H),4.36(brt,J=10.7Hz,1H),4.26−4.13(m,2H),4.10−3.91(m,3H),3.88−3.76(m,1H),3.79(s,3H),3.53−3.43(m,1H),3.41−3.20(m,2H),3.09−2.88(m,3H),2.70−2.50(m,2H(DMSOピークにより部分的に不明瞭)),2.10−1.20(m,15H),1.31(s,9H),0.88(d,J=6.9Hz,3H),0.79(d,J=6.8Hz,3H),2H(観測されず)。元素分析(C55H71ClN8O11・H2O)Calc:C,61.53;H,6.85;N,10.44.Found:C,61.39;H,7.11;N,10.15.
乾燥DMA(6mL)中のアミン56d(0.68g,0.64mmol)及び2,5−ジオキソピロリジン−1−イル6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサノアート(マレイミド−Osu,0.50g,1.61mmol)の混合物が、0℃で窒素雰囲気下で、1時間攪拌された。酢酸エチル−石油エーテルの混合物(1:2)(90mL)が添加され、混合物が0℃で15分間攪拌された。溶媒層は不溶性物質からデカントされ廃棄された。洗浄工程は、室温で追加の酢酸エチル−石油エーテル(1:1)(90mL)を用い、続いて純粋な酢酸エチル(50mL)を用いて繰り返された。後に残されたベージュ色の固体は乾燥され、(S)−tert−ブチル 8−(6−((S)−1−(クロロメチル)−5−(4−((S)−2−((S)−2−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド)−3−メチルブタンアミド)−5−ウレイドペンタンアミド)ベンジルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−6−オキソヘキシルオキシ)−11−ヒドロキシ−7−メトキシ−5−オキソ−2,3,11,11a−テトラヒドロ−1H−ベンゾ[e]ピロロ[1,2−a][1,4]ジアゼピン−10(5H)−カルボキシレート 52(0.72g,90%)を得た;HPLC:純度96.7%;mp 210oC(dec.);1H NMR[(CD3)2SO]δ10.03(s,1H(D2Oと交換可能)),8.23−8.11(m,2H),8.09(d,J=7.3Hz,(D2Oと交換可能),1H),7.85(d,J=8.5Hz,1H),7.80(d,J=8.3Hz,H(D2Oと交換可能),),7.66(d,J=8.6Hz,2H),7.59−7.44(m,3H),7.38(brt,J=7.6Hz,1H),7.04(s,1H),6.99(s,2H),6.69(s,1H),6.38(br s,1H(D2Oと交換可能)),5.99(t,J=5.5Hz,1H(D2Oと交換可能)),5.49−5.34(m,3H,D2O交換後d,1H,J=9.5Hz),5.20(s,2H),4.44−4.30(m,2H),4.26−4.13(m,3H),4.10−3.91(m,3H),3.88−3.76(m,1H),3.79(s,3H),3.53−3.44(m,1H),3.41−3.20(m,4H(水ピークにより部分的に不明瞭)),3.09−2.88(m,2H),2.66−2.42(m,2H(DMSOピークにより部分的に不明瞭)),2.25−1.24(m,21H),1.31(s,9H),1.24−1.11(m,2H),0.86(d,J=6.8Hz,3H),0.82(d,J=6.7Hz,3H)を得た。元素分析(C55H71ClN8O11・H2O)Calc:C,61.53;H,6.85;N,10.44.Found:C,61.39;H,7.11;N,10.15.
−10から−12℃(浴温度)で、DCM(10mL)中のN−tBoc誘導体52(125mg,0.10mmol)の攪拌溶液に、TFA中の2.5%の水の溶液(10mL)が10分間かけて滴下された。添加後、混合物を3時間、更にこの温度で撹拌した。冷(−25℃)酢酸エチル−石油エーテル(1:10)(300mL)が添加され、続いて−10℃(浴温度)でNaHCO3の飽和水溶液がゆっくり添加され、pH6−7を与えた。有機層が除去され、洗浄工程は、追加の酢酸エチル−石油エーテル(1:1)(300mL)を用いて繰り返された。固体が回収され、水及び酢酸エチルで複数回連続的に洗浄され、乾燥させ、淡黄色の固体(102mg)として粗生成物を得た。これは、分取HPLC[ジェネンテック]により精製され、N−((S)−1−((S)−1−(4−(((S)−1−(クロロメチル)−3−(6−((S)−7−メトキシ−5−オキソ−2,3,5,11a−テトラヒドロ−1H−ベンゾ[e]ピロロ[1,2−a][1,4]ジアゼピン−8−イルオキシ)ヘキサノイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イルオキシ)メチル)フェニルアミノ)−1−オキソ−5−ウレイドペンタン−2−イルアミノ)−3−メチル−1−オキソブタン−2−イル)−6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド 56(4.1mg,3.6%)を得た;
HRMS(ESI)m/zC60H72ClN9NaO11として計算:1152.4932, found :1152.4906[MNa+].
C60H73ClN9O11として計算:1130.5113, found :1130.5077[MH+].
室温でDMF(5mL)中の(S)−tert−ブチル 1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 51a(2.00g,5.99mmol)の溶液に、臭化ベンジル(7.13mL,59.90mmol)、ヨウ化カリウムKI(50mg,0.30mmol)及び炭酸カリウムK2CO3(4.14g,30.00mmol)が添加された。図9を参照。混合物は2時間撹拌され、次いで酢酸エチルで希釈された。沈殿物が濾過された。濾液は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水及びかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒はロータリーエバポレーターにより除去され、過剰の臭化ベンジルは排出された。得られた残留物は、溶離液として酢酸エチルと石油エーテルの混合物(V/V1:10)を用いてカラムクロマトグラフィーにより精製され、白色固体として、(S)−tert−ブチル 5−(ベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 57a(1.97g,78%);mp 186−188℃を得た。1H NMR(CDCl3)δ8.29(d,J=8.3Hz,1H),7.86(br s,1H),7.65(d,J=8.29Hz,1H),7.55−7.49(m,3H),7.45−7.41(m,2H),7.38−7.31(m,2H),5.26(s,2H),4.26(br s,1H),4.13(t,J=10.8Hz,1H),4.00−3.92(m,2H),3.44(t,J=10.5Hz,1H),1.61(s,9H)ppm.LRMS(APCI) found m/z424.8(M+H).C25H27ClNO3 requires 424.2.(Boger D., Ishizakilb T., Kitos P. and Suntornwat O., (1990) J. Org. Chem., 55, 5823-5832.)
酢酸エチル及び石油エーテルの混合物(v/v1:1)によるでさらなる溶出は、黄色油として、図9に示されるシクロプロピル生成物(345mg,19%)を得た。(Lajiness J. and Boger D., (2011) J. Org. Chem., 76, 583-587.)
氷浴で冷却されたDCM(15mL)中の57aの溶液(1.60g,3.77mmol)に、ジオキサン中の4NのHCl(40mL)が添加された。混合物は室温まで温められ、3時間撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、塩酸塩として、(S)−5−(ベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール57bを得た。塩はTHF(15mL)に溶解され、氷浴中で冷却された。グルタル酸無水物(646mg,5.66mmol),DMAP(46mg,0.38mmol)及びピリジン(5mL)が添加され、得られた混合物は室温で4時間撹拌された。全ての揮発性成分が排出された後、残留物は希釈NaHCO3水溶液に溶解され、酢酸エチルで3回洗浄された。水相は1NのHClを用いてpH2に酸性化され、酢酸エチルで3回抽出された。混合した酢酸エチル抽出物は水及びかん水で洗浄され、無水Na2SO4で乾燥させ、MeOH及び酢酸エチル(v/v 1:10)の混合物を用いたシリカゲルパッド洗浄を通して濾過された。溶媒が除去され、オフホワイトの固体として、(S)−5−(5−(ベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタン酸 57c(978mg,59%)を得た。
−10℃で、THF(20mL)中の57cの溶液(978mg,2.23mmol)に、25%水性ギ酸アンモニウム(20mL)、続いてPd−C触媒(10%、湿潤、500mg)が添加され、混合物は7時間−10℃で撹拌された。追加のPd−C触媒(500mg)が添加され、その混合物は同じ温度で一晩撹拌された。
触媒はセライトを通して濾過され、セライトはTHFで洗浄された。THFは、濾液から排出され、残りの水溶液は酢酸エチルで3回抽出された。混合された抽出物を水及びかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、濾過した。溶媒を除去して、オフホワイトの固体として、(S)−5−(1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタン酸 53h(487mg,63%)を得た;1H NMR(DMSO)δ12.08(br s,1H),10.35(br s,1H),8.08(d,J=8.0Hz,1H),7.98(s,1H),7.77(d,J=8.3Hz,1H),7.50−7.46(m,1H),7.33−7.29(m,1H),4.30(t,J=10.5Hz,1H),4.14−4.12(m,2H),3.98(dd,J=2.8,10.9Hz,1H),3.78(dd,J=7.8,10.8Hz,1H),2.63−2.54(m,2H),2.34(t,J=7.4Hz,2H),1.99−1.83(m,2H)ppm.LRMS(APCI) found m/z348.6(M+H).C18H19ClNO4 requires 348.1.
THF(15mL)中の53hの溶液(500mg,1.44mmol)に、テトラゾール(アセトニトリル中に3%、51mL,17.25mmol)、続いてジ−tert−ブチル−N,N−ジイソプロピル ホスホルアミジット(5.73mL,17.25mmol)が添加された。混合物は室温で一晩撹拌され、次いで、氷浴中で冷却され、H2O2(30%水溶液,3.53mL,34.5mmol)が滴下された。得られた混合物は室温まで温められ、5時間撹拌された。反応物は、氷浴で冷却しながら10%水性亜硫酸ナトリウムの添加によりクエンチされた。有機揮発性物質はロータリーエバポレーターで除去され、懸濁油を含む水相を得た。石油エーテルが添加され、混合物は半時間攪拌された。形成されら沈殿物は濾過により回収され、水及び石油エーテルで洗浄され、真空下で乾燥させ、オフホワイトの泡として、(S)−5−(1−(クロロメチル)−5−(ジ−tert−ブトキシホスホリルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタン酸 57d(660mg,85%)を得た;1H NMR(DMSO)δ12.07(br s,1H),8.56(s,1H),8.04(d,J=8.2Hz,1H),7.93(d,J=8.4Hz,1H),7.60−7.56(m,1H),7.50−7.46(m,1H),4.38(t,J=9.8Hz,1H),4.32−4.26(m,1H),4.20−4.18(m,1H),4.02(dd,J=2.9,11.0Hz,1H),3.90(dd,J=7.1,11.0Hz,1H),2.67−2.53(m,2H),2.34(t,J=7.4Hz,2H),1.87−1.78(m,2H),1.481及び1.476(2×s,18H)ppm.31PNMR(DMSO)δ−15.46ppm.HRMS(ESI) found m/z562.1719(M+Na).C26H35ClNNaO7P requires 562.1732.
氷浴中で冷却されたDCM(20mL)中の6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサン酸(1.00g,4.73mmol)の懸濁液に、1滴のDMFが添加され、次いで塩化オキサリル(2.03mL,23.67mmol)が滴下された。図10を参照。混合物は室温まで温められ、一晩攪拌され、暗褐色の溶液を得た。全ての揮発性成分は、ロータリーエバポレーター、次いで、高真空ポンプで除去された。得られた残留物はDCM(5mL)に溶解され、溶媒はロータリーエバポレーター、次いで、高真空ポンプで除去された。上記の溶解及び除去手順はもう一度繰り返され、暗褐色の油として粗6−マレイミドカプロイル塩化物を得た。氷浴中で冷却されたDCM(5mL)中のtert−ブチルメチル(2−(メチルアミノ)エチル)カルバメートの溶液(891mg,4.73mmol)に、上記で作製されたDCM(20mL)中の粗6−マレイミドカプロイル塩化物の溶液が滴下された。得られた混合物は室温まで温められ、一晩攪拌された。DCMは除去され、残留物は酢酸エチルに溶解された。溶液はNaHCO3水溶液で洗浄し、冷たい5%クエン酸水溶液及びかん水で洗浄し、次いで、無水Na2SO4で乾燥させ、酢酸エチルを用いたシリカゲルパッド洗浄を通して濾過された。溶媒が除去され、褐色油として、tert−ブチル 2−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)−N−メチルヘキサンアミド)エチル(メチル)カルバメート57eを得た;1H NMR(DMSO)(回転異性体の混合物)δ7.006&7.005(2×s,1H),3.39−3.36(m,4H),3.29−3.25(m,2H),2.92−2.75(m,6H,2NMe),2.21(t,J=7.38Hz,2H),1.50−1.44(m,4H),1.37(s,9H),1.24−1.16(m,2H)ppm.HRMS(ESI) found m/z382.2338(M+H).C19H32N3O5 requires 382.2336.
氷浴で冷却されたDCM(5mL)中の51eの溶液(274mg,0.72mmol)に、TFA(5mL)が滴下して添加された。混合物は同じ温度で2時間温められ、全ての揮発性成分はロータリーエバポレーター、次いで、高真空ポンプで除去された。得られた残留物、6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)−N−メチル−N−(2−(メチルアミノ)エチル)ヘキサンアミド トリフルオロアセタート 57fはそのまま使用された。
室温で、51a(200mg,0.60mmol)がDCM(5mL)に溶解され、DIPEA(0.3mL,1.72mmol)、続いて4−ニトロフェニルクロロホルマート(145mg,0.72mmol)が添加され、(S)−tert−ブチル 1−(クロロメチル)−5−((4−ニトロフェノキシ)カルボニルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 57gを形成した。混合物を5時間撹拌した後、DCM(5mL)中の粗い57f及びDIPEA(0.7mL,4.02mmol)の溶液が添加され、明るい黄色の溶液が得られ、これを一晩撹拌した。全ての揮発性成分が除去された。残留物は酢酸エチルに溶解され、5%アンモニア水溶液及びかん水で洗浄された。得られた粗物質は、酢酸エチル、DCM、及び石油エーテル(v/v/v 1:2:1)の混合物、続いて酢酸エチル及びDCM(v/v 1:2)を溶離液として使用するカラムクロマトグラフィーにより更に精製され、オフホワイトの固体として、(S)−tert−ブチル 1−(クロロメチル)−5−((2−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)−N−メチルヘキサンアミド)エチル)(メチル)カルバモイルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 57hを得た;mp 53−56℃.1H NMR(CDCl3)(回転異性体の混合物)δ8.04(br s,1H),7.86−7.78(m,1H),7.72−7.68(m,1H),7.53−7.48(m,1H),7.40−7.34(m,1H),6.67(s,2H),4.25(br s,1H),4.46−4.10(m,1H),4.06−3.98(m,1H),3.92−3.72(明らかなd,J=11.2Hz,1H),3.72−3.42(m,7H),3.28,3.10,3.09,2.99(4×s,6H,2NMe),2.38−2.21(m,2H),1.67−1.54(m,4H),1.57(s,9H),1.33−1.25(m,2H)ppm.HRMS(ESI) found m/z641.2728(M+H).C33H42ClN4O7 requires 641.2737.
氷浴で冷却されたDCM(2mL)中の57hの溶液(110mg,0.17mmol)に、TFA(2mL)が滴下して添加された。混合物は同じ温度で2時間温められ、次いで、全ての揮発性成分が除去された。得られた残留物は、酢酸エチルと冷希釈NaHCO3水溶液との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒が除去され、黄色い固体として、(S)−1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル 2−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)−N−メチルヘキサンアミド)エチル(メチル)カルバメート 57i(86mg,92%)を得て、これが更に精製することなくそのまま使用された;1H NMR(CDCl3)(回転異性体の混合物)δ7.76(d,J=8.4Hz,1H),7.63−7.59(m,1H),7.48−7.41(m,1H),7.25−7.20(m,1H),6.79(s,1H),6.68(s,2H),4.01−3.94(m,1H),3.88−3.78(m,3H),3.74−3.68(m,2H),3.62−3.47(m,5H),3.28,3.10,3.06,3.00(4×s,6H,2NMe),2.38−2.21(m,2H),1.69−1.50(m,4H),1.33−1.25(m,2H)ppm.HRMS(ESI) found m/z541.2217(M+H).C28H34ClN4O5 requires 541.2212.
氷浴中で冷却されたDMA(3mL)中の57iの溶液(83mg,0.15mmol)に、(S)−5−(1−(クロロメチル)−5−(ジ−tert−ブトキシホスホリルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタン酸 57d(99mg,0.18mmol)、続いてEDCI塩酸塩(88mg,0.46mmol)、次いでp−トルエンスルホン酸(2.6mg,0.015mmol)が添加された。図11を参照。混合物は室温まで温められ、一晩攪拌された。混合物は、酢酸エチルと冷希釈NaHCO3水溶液との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒は除去され、得られた残留物は石油エーテルで粉砕された。得られた固体は、DCM及びイソプロパノールから再沈殿され、黄色い固体として、(S)−1−(クロロメチル)−3−(5−((S)−1−(クロロメチル)−5−(ジ−tert−ブトキシホスホリルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル 2−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)−N−メチルヘキサンアミド)エチル(メチル)カルバメート 57j(116mg,71%);mp 81℃(dec.)を得た。1H NMR(CDCl3)(回転異性体の混合物)δ8.63(s,1H),8.36(s,1H),8.23(d,J=8.5Hz,1H),7.89−7.82(m,1H),7.72−7.67(m,2H),7.54−7.50(m,2H),7.43−7.39(m,2H),6.66(s,2H),4.34−4.25(m,4H),4.10−4.05(m,2H),3.98−3.93(m,2H),3.72−3.69(m,2H),3.50−3.46(m,5H),3.28,3.10,3.09,2.99(4×s,6H,2NMe),2.79−2.73(m,2H),2.70−2.62(m,2H),2.38−2.32(m,1H),2.27−2.20(m,3H),1.67−1.54(m,3H),1.56(s,9H),1.55(s,9H),1.33−1.25(m,4H)ppm.31PNMR(CDCl3)δ−15.71ppm.HRMS(ESI) found m/z1084.3755(M+Na).C54H66Cl2N5NaO11P requires 1084.3766.
氷浴で冷却されたDCM(1mL)中の57jの溶液(55mg,0.052mmol)に、TFA(1mL)が滴下して添加された。混合物は同じ温度で1.5時間温められ、次いで、全ての揮発性成分が除去された。得られた残留物は、DCM及び酢酸エチルから再沈殿され、灰色の固体として、(S)−1−(クロロメチル)−3−(5−((S)−1−(クロロメチル)−5−(ホスホノオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル 2−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)−N−メチルヘキサンアミド)エチル(メチル)カルバメート 5733mg,67%,HPLC純度:89%)を得た;mp 191−194℃(dec.).1H NMR(DMSO)(回転異性体の混合物)δ8.49(s,1H),8.23−8.21(m,1H),8.10(d,J=8.4Hz,1H),7.95−7.76(m,3H),7.59−7.53(m,2H),7.45−7.39(m,2H),6.97,6.96,6.94,6.90(4×s,2H(合計),マレイミド基),4.34−4.21(m,4H),4.06−4.01(m,2H),3.95−3.85(m,2H),3.71−3.61(m,2H),3.54−3.30(m,5H),3.23,3.18,3.04,3.00,2.97,2.95,2.89,2.85(8×s,6H (合計),2NMe),2.37−2.28(m,2H),2.19(d,J=7.4Hz,1H),2.00−1.95(m,2H),1.50−1.40(m,5H),1.25−1.15(m,5H)ppm.31PNMR(DMSO)δ−5.79ppm.HRMS(ESI) found m/z972.2488(M+Na).C46H50Cl2N5NaO11P requires 972.2514.
CH2Cl2(80mL)中の(S)−1−(クロロメチル)−3−(5−((S)−1−(クロロメチル)−5−(4−((S)−2−(S)−tert−ブチル 1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 51a(3.338g,10mmol)、4−メチルピペラジン−1−カルボニルクロリド塩酸塩(5.98g,30mmol),Et3N(3.5g,35mmol)及びDMAP(1.34g,11mmol)の混合物が室温で2日間攪拌された。図12を参照。混合物は水で洗浄され、溶媒を乾燥させ、真空下で除去され、(S)−tert−ブチル 1−(クロロメチル)−5−(4−メチルピペラジン−1−カルボニルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 58a(Boger D.L. et al, Synthesis, (1999), 1505-1509)を定量的収率で得た:mp 98℃;1H NMR(CDCl3)δ8.11(br,1H),7.84(d,J=8.4Hz,1H),7.70(d,J=8.4Hz,1H),7.50(ddd,J=8.2,6.9,1.1Hz,1H),7.37(ddd,J=8.1,6.9,1.0Hz,1H),4.34−4.20(m,1H),4.17−4.10(m,1H),4.01−3.98(m,1H),3.94(dd,J=9.6,2.4Hz,1H),3.87−3.80(br,2H),3.68−3.60(br,2H),3.47(t,J=10.8Hz,1H),2.57−2.48(m,4H),2.83(s,3H),1.58(s,9H);MS(APCI+)m/z461.2MH+.元素分析CalcdforC24H30ClN3O4:C,62.7;H,6.6;N,9.1.Found:C,62.5;H,6.8;N,9.2%.
CH2Cl2(50mL)中の58aの溶液(2.30g,5mmol)が、0℃で4時間、過剰のトリフルオロ酢酸(TFA)で処理され、その混合物は冷NH3水溶液で中和された。ヘキサンで希釈すると、固体の沈殿を生じ、これは濾過により回収され、水及びヘキサンで洗浄され、乾燥され、(S)−1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル 4−メチルピペラジン−1−カルボキシレート 58b(1.60g,89%)を得た:mp 144−147℃;1H NMR(CDCl3)δ7.69(d,J=8.4Hz,1H),7.63(d,J=8.4Hz,1H),7.45(ddd,J=8.3,6.9,1.2Hz,1H),7.25(ddd,J=8.4,6.8,1.2Hz,1H),6.82(s,1H),5.30(s,1H),4.17−4.05(m,2H),4.03−3.96(m,2H),3.89−3.77(m,4H),3.54(t,J=10.9Hz,1H),3.20−2.90(m,4H),2.76(s,3H).元素分析CalcdforC19H22ClN3O2:C,63.4;H,6.2;N,11.7.Found:C,63.2;H,6.2;N,11.5%.
ジオキサン(30mL)中の溶液55a(4.689g,10mmol)はHCl(ジオキサン中に4M、10mL)で処理され、混合物は室温で一晩撹拌された。水酸化アンモニウムが添加され、溶媒が除去され、(S)−1−(クロロメチル)−5−(4−ニトロベンジルオキシ)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール54fを得て、CH2Cl2(50mL)中のグルタル酸無水物(3.4g,30mmol)と混合された。0℃に冷却後、Et3N(5.05g,50mmol)が添加され、混合物はゆっくりと温められ、室温で一晩撹拌された。希釈HClが添加されて固体を得て、これを濾過により回収し、水及びCH2Cl2で洗浄し、乾燥し、(S)−5−(1−(クロロメチル)−5−(4−ニトロベンジルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタン酸 58c(2.95g,61%)を得た:1H NMR(DMSO−d6)δ12.07(br s,1H),8.30(brd,J=8.8Hz,2H),8.24(d,J=8.1Hz,1H),8.17(s,1H),7.89−7.85(m,3H),7.57(ddd,J=8.2,6.9,1.1Hz,1H),7.43(ddd,J=8.1,7.1,1.0Hz,1H),5.46(s,2H),4.34(t,J=9.7Hz,1H),4.25−4.13(m,2H),4.01(dd,J=11.0,2.8Hz,1H),3.85(dd,J=10.9,7.4Hz,1H),2.66−2.57(m,1H),2.55−2.46(m,1H),2.35(t,J=7.3Hz,2H),1.87−1.79(m,2H).
DMA(25mL)中の58b(1.33g,3.7mmol)と58c(1.63g,3.38mmol)及び1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDCI.HCl,3.26g,17.0mmol)の混合物が室温で一晩撹拌された。混合物はNaHCO3水溶液で希釈され、得られた沈殿物は水及びメタノールで連続的に洗浄され乾燥された。シリカ上でクロマトグラフィー処理され、最初にEtOAc/MeOH9:1、次いでEtOAc/MeOH4:1で溶出され、(S)−1−(クロロメチル)−3−(5−((S)−1−(クロロメチル)−5−(4−ニトロベンジルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル 4−メチルピペラジン−1−カルボキシレート 58d(0.98g,35%)を得た:1H NMR(CDCl3)δ8.35(s,1H),8.33−8.27(m,3H),8.17(s,1H),7.85(d,J=8.3Hz,1H),7.73−7.68(m,4H),7.58−7.49(m,2H),7.45−7.38(m,2H),5.33(q,J=13.0Hz,2H),4.39−4.27(m,4H),4.14−4.06(m,2H),4.01−3.95(m,2H),3.83−3.77(m,2H),3.64−3.59(m,2H),3.48(dt,J=10.5,7.3Hz,2H),2.85−2.65(m,4H),2.55−2.47(m,4H),2.38(s,3H),2.28−2.21(m,2H).
0℃で、THF(35mL)、MeOH(15mL)及び水(5mL)の混合物中の58dの懸濁液(0.41g,5mmol)は、アルミニウムアマルガム(2g)で処理され、撹拌した混合物は3時間かけて室温まで温められた。MeOHで希釈した後、混合物はセライトを通じて濾過され、濾液は蒸発乾固され、(S)−3−(5−((S)−5−(4−アミノベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル 4−メチルピペラジン−1−カルボキシレート 58e(0.31g,78%)を得て、これが次の工程で直接使用された:1H NMR(CDCl3)δ8.37(s,1H),8.26(d,J=8.2Hz,1H),8.18(s,1H),7.86(d,J=8.3Hz,1H),7.67(d,J=8.3Hz,1H),7.60(d,J=8.3Hz,1H),7.49−7.43(m,2H),7.39(brt,J=7.6Hz,1H),7.34−7.26(m,3H),6.68(d,J=8.3Hz,2H),5.10(q,J=10.9Hz,2H),4.32−4.15(m,4H),4.07−3.97(m,2H),3.94−3.90(m,2H),3.86−3.79(m,2H),3.66−3.60(m,2H),3.50−3.40(m,2H),2.77−2.58(m,4H),2.56−2.48(m,4H),2.27(s,3H),2.22−2.14(m,2H).
2−エトキシ−1−エトキシカルボニル−1,2−ジヒドロキノリン(EEDQ,0.58g,2.3mmol)及び(S)−2−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニルアミノ)−5−ウレイドペンタン酸(Fmoc−L−citrulline,0.69g,1.7mmol)の混合物は、全固体が溶解するまで10分間窒素下で乾燥DMA中で攪拌された。図13を参照。粗い58e(0.31g,0.39mmol)が添加され、撹拌が一晩続けられた。混合物はEtOAcで希釈され、水が添加され、生成物を沈殿させ、これを濾過により回収し、沸騰するMeOH中で粉砕しし、粗い(S)−3−(5−((S)−5−(4−((S)−2−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニルアミノ)−5−ウレイドペンタンアミド)ベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル−4−メチルピペラジン−1−カルボキシレート 58f(0.62g,>100%)を得て、これが室温で30分間、乾燥DMF(20mL)中のピペリジン(50mg,0.59mmol)で処理された。EtOAc、ヘキサン及び水で希釈すると、沈殿物が得られ、これは濾過により回収され、ヘキサン及び水で洗浄され、粗い(S)−3−(5−((S)−5−(4−((S)−2−アミノ−5−ウレイドペンタンアミド)ベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル−4−メチルピペラジン−1−カルボキシレート 58g(0.33g,89%,HPLCにより純度85%)を得て、これが乾燥DMA(10mL)中のFmoc−Val−OSu(N−α−Fmoc−L−バリンN−ヒドロキシスクシンイミドエステル0.23g,0.53mmol)の1.5当量で一晩処理された。EtOAc及び水で希釈して固体が得られ、これは濾過により回収され、乾燥され、粗い(S)−3−(5−((S)−5−(4−((S)−2−((S)−2−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニルアミノ)−3−メチルブタンアミド)−5−ウレイドペンタンアミド)ベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル−4−メチルピペラジン−1−カルボキシレート 58h(0.38g,85%)を得た:1H NMR(DMSO−d6)δ10.11(s,1H),8.24−8.11(m,3H),7.96(d,J=8.4Hz,1H),7.90−7.80(m,4H),7.74(t,J=7.4Hz,2H),7.65(d,J=8.4Hz,2H),7.61−7.53(m,2H),7.50−7.36(m,6H),7.32(t,J=7.5Hz,2H),5.97(t,J=5.4Hz,1H),5.40(s,2H),5.20(s,2H),4.44−4.19(m,9H),4.08−3.81(m,5H),3.74−3.70(br,2H),3.50−3.42(br,2H),3.07−2.89(m,2H),2.77−2.55(m,4H),2.52−2.36(m,4H),2.25(s,3H),2.03−1.94(m,3H),1.76−1.53(m,2H),1.49−1.30(m,2H),0.87(dd,J=11.2,6.8Hz,6H).
粗い58h(0.38g,0.3mmol)を、1時間室温でDMF中でピペリジンと反応させ、混合物はEtOAc及び水で希釈され、固体が得られ、これが回収され、乾燥され、(S)−3−(5−((S)−5−(4−((S)−2−((S)−2−アミノ−3−メチルブタンアミド)−5−ウレイドペンタンアミド)ベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル 4−メチルピペラジン−1−カルボキシレート 58i(0.23g,73%,HPLCにより純度83%)を得た:1H NMR(CDCl3)δ9.34(br,1H),8.35(br s,1H),8.28(d,J=8.1Hz,1H),8.14(s,1H),8.02(s,1H),7.86(d,J=8.2Hz,1H),7.75(d,J=7.5Hz,1H),7.70(d,J=7.6Hz,1H),7.65−7.60(m,2H),7.54−7.47(m,2H),7.46−7.33(m,4H),7.29(td,J=7.4,1.3Hz,1H),5.20(br s,2H),5.17−5.09(m,1H),4.82−4.73(m,1H),4.59−4.50(m,1H),4.33−4.15(m.3H),4.07−4.01(m,1H),3.98−3.90(m,2H),3.86−3.76(m,3H),3.65−3.57(m,2H),3.55−3.39(m,3H),3.25(br s,1H),2.81−2.60(m,3H),2.59−2.41(m,6H),2.37(s,3H),2.27−2.16(m,3H),1.55−1.48(m,2H),0.98(d,J=6.7Hz,3H),0.83(d,J=6.6Hz,3H).
乾燥DMF(10mL)中の粗い58i(0.105g,0.1mmol)及び2,5−ジオキソピロリジン−1−イル6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサン酸(62mg,0.2mmol)の混合物が室温で一晩撹拌され、混合物はEtOAc及び水で希釈され、固体が得られ、これが回収されて乾燥され、粗物質(70mg,HPLCにより純度71%)が得られ、これがprep−HPLCにより精製され、(S)−1−(クロロメチル)−3−(5−((S)−1−(クロロメチル)−5−(4−((S)−2−((S)−2−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド)−3−メチルブタンアミド)−5−ウレイドペンタンアミド)ベンジルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル 4−メチルピペラジン−1−カルボキシレート 58を得た。MSm/z1243.4[(M+H)+,C65H76Cl2N10O11として計算:1243.5].
DMF(10mL)中の(S)−tert−ブチル−5−(4−((S)−2−((S)−2−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニルアミノ)−3−メチルブタンアミド)−5−ウレイドペンタンアミド)ベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 55(1.00g,1.09mmol)の溶液に、ピペリジン(1.08mL,10.90mmol)が添加された。図14を参照。混合物は室温で2時間温められ、次いで、全ての揮発性成分が排出された。得られた残留物はエーテルで粉砕され、白色固体として、(S)−tert−ブチル 5−(4−((S)−2−((S)−2−アミノ−3−メチルブタンアミド)−5−ウレイドペンタンアミド)ベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 59a(700mg,92%)を得た。1H NMR(DMSO)δ10.17(s,1H),8.17(d,J=8.0Hz,1H),8.12(d,J=8.4Hz,1H),7.82(d,J=8.4Hz,1H),7.66(d,J=8.6Hz,2H),7.55−7.49(m,3H),7.37−7.33(m,1H),5.98(t,J=5.7Hz,1H),5.41(s,2H),5.22(s,2H),4.51−4.48(m,1H),4.19−3.98(m,4H),3.84−3.80(m,1H),3.08−2.90(m,3H),1.99−1.91(m,2H),1.75−1.65(m,2H),1.55(s,9H),1.49−1.33(m,2H),0.89(d,J=6.8Hz,3H),0.80(d,J=6.8Hz,3H)ppm.
DMSO(10mL)中の59a(688mg,0.99mmol)、2,5−ジオキソピロリジン−1−イル6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサン酸(SuOMC,320mg,1.04mmol)及びDIPEA(190μL,1.09mmol)の混合物は一晩室温で攪拌された。全ての揮発性成分排出された。得られた残留物は酢酸エチルで粉砕され、オフホワイトの固体として、(S)−tert−ブチル 1−(クロロメチル)−5−(4−((S)−2−((S)−2−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド)−3−メチルブタンアミド)−5−ウレイドペンタンアミド)ベンジルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 59b(832mg,95%)を得た。1H NMR(DMSO)δ10.03(s,1H),8.13−8.08(m,2H),7.83−7.79(m,2H),7.66(d,J=8.4Hz,2H),7.55−7.48(m,3H),7.35(t,J=7.5Hz,1H),6.99(s,2H),5.97(t,J=5.4Hz,1H),5.41(s,2H),5.21(s,2H),4.43−4.38(m,1H),4.22−3.98(m,4H),3.84−3.80(m,1H),3.38−3.33(m,3H),3.08−2.90(m,2H),2.24−2.06(m,2H),2.01−1.91(m,1H),1.74−1.14(m,10H),1.55(s,9H),0.86(d,J=6.8Hz,3H),0.83(d,J=6.7Hz,3H)ppm.HRMS(ESI) found m/z910.3897(M+Na).C46H58ClN7NaO9 requires 910.3877.
氷浴で冷却されたDCM(2mL)中の57bの懸濁液(100mg,0.11mmol)に、TFA(2mL)が添加された。混合物は3時間氷浴中で攪拌された。全ての揮発性成分が排出された。得られた残留物はTHFに溶解され、酢酸エチルと冷5%アンモニア水溶液との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物は、水及びかん水で洗浄され、無水Na2SO4で乾燥され、セライトを通じて濾過され、溶媒が除去され、緑がかった茶色の固体として、N−((S)−1−((S)−1−(4−(((S)−1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イルオキシ)メチル)フェニルアミノ)−1−オキソ−5−ウレイドペンタン−2−イルアミノ)−3−メチル−1−オキソブタン−2−イル)−6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド 59c(80mg,90%)が得られ、これが直接使用された。1H NMR(DMSO)δ10.02(s,1H),8.09−8.07(m,1H),7.99(d,J=8.3Hz,1H),7.80(d,J=8.5Hz,1H),7.65(d,J=8.3Hz,2H),7.56(d,J=8.3Hz,1H),7.45(d,J=8.4Hz,2H),7.38(t,J=7.1Hz,1H),7.09(t,J=7.4Hz,1H),6.99(s,2H),5.97(br s,1H),5.41(s,2H),5.16(s,2H),4.46−4.35(m,1H),4.21−4.17(m,1H),3.96−3.87(m,1H),3.84−3.80(m,1H),3.70−3.65(m,1H),3.60−3.49(m,1H),3.38−3.33(m,3H),3.06−2.92(m,2H),2.22−2.08(m,2H),2.02−1.92(m,1H),1.75−1.14(m,10H),0.86(d,J=6.7Hz,3H),0.82(d,J=6.7Hz,3H)ppm.HRMS(ESI) found m/z810.3332(M+Na).C41H50ClN7NaO7 requires 810.3352.
室温で、DMA(3mL)中の59c(75mg,0.095mmol)及び(S)−5−(1−(クロロメチル)−5−(ジ−tert−ブトキシホスホリルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタン酸 57d(62mg,0.11mmol)の溶液に、EDCI塩酸塩(40mg,0.21mmol)、次いで、パラ−トルエンスルホン酸(1.6mg,0.0095mmol)が添加された。混合物を5時間撹拌した後、更なるEDCI塩酸塩(35mg,0.18mmol)が添加され、混合物は一晩撹拌された。全ての揮発性成分排出された。得られた残留物はTHFに溶解され、酢酸エチルと冷希釈NaHCO3水溶液との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物は、水及びかん水で洗浄され、無水Na2SO4で乾燥され、セライトを通じて濾過され、溶媒が除去され、茶色い固体として、ジ−tert−ブチル−(S)−1−(クロロメチル)−3−(5−((S)−1−(クロロメチル)−5−(4−((S)−2−((S)−2−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド)−3−メチルブタンアミド)−5−ウレイドペンタンアミド)ベンジルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル−リン酸 59(104mg,83%)が得られ、これが直接使用された。1H NMR(DMSO)δ10.03(s,1H),8.60(s,1H),8.19−7.38(m,14H),6.87(s,2H),5.97(br s,1H),5.40(s,2H),5.20(br s,2H),4.45−3.82(m,10H),3.38−3.33(m,3H),3.07−2.90(m,2H),2.75−2.50(m,2H),2.20−2.08(m,4H),2.02−1.92(m,2H),1.75−1.10(m,12H),1.48(s,18H),0.86−0.82(m,6H)ppm.31PNMR(DMSO)δ−15.46ppm.HRMS(ESI) found m/z1331.5071(M+Na).C67H83Cl2N8NaO13P requires 1331.5086.
氷浴で冷却されたDCM(2mL)中の59dの懸濁液(95mg,0.073mmol)に、TFA(1mL)が添加された。混合物は1.5時間氷浴中で攪拌された。全ての揮発性成分が排出された。得られた残留物は酢酸エチルで粉砕され、青灰色の固体(77mg,90%)が得られ、更に分取HPLC(カラム:Synergi−MaxRP4μ,250×21.20mm:移動相:A/B=30:70(A:H2O−TFApH2.56,B:90%水中のアセトニトリル);流速13mL/分)により精製され、オフホワイトの固体として、(S)−1−(クロロメチル)−3−(5−((S)−1−(クロロメチル)−5−(4−((S)−2−((S)−2−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド)−3−メチルブタンアミド)−5−ウレイドペンタンアミド)ベンジルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル−二水素リン酸塩59(5mg,HPLC純度97%)を得た。1H NMR(DMSO)δ10.04(s,1H),8.49(s,1H),8.19−8.09(m,4H),7.87−7.81(m,2H),7.66(d,J=8.5Hz,2H),7.56−7.48(m,4H),7.40−7.36(m,2H),6.98(s,2H),6.01(br s,1H),5.43(br s,2H),5.22(s,2H),4.42−3.34(m,2H),4.25−4.12(m,4H),4.03−3.98(m,2H),3.88−3.81(m,2H),3.38−3.33(m,3H),3.10−2.90(m,2H),2.75−2.55(m,4H),2.20−2.08(m,2H),2.00−1.92(m,2H),1.75−1.10(m,12H),0.88−0.81(m,6H)ppm.31PNMR(DMSO)δ−5.60ppm.HRMS(ESI) found m/z1219.3794(M+Na).C59H6
7Cl2N8NaO13P requires 1219.3834.
(S)−1−(クロロメチル)−3−(5−((S)−1−(クロロメチル)−5−(4−((S)−2−((S)−2−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド)−3−メチルブタンアミド)−5−ウレイドペンタンアミド)ベンジルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル−二水素リン酸塩 59は酵素的に脱リン酸化され、60を得た。
乾燥DCM(30mL)中のトリホスゲンの溶液(136mg,0.458mmol)が、(S)−tert−ブチル−5−アミノ−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 61a(150mg,0.451mmol)及びDMAP(386mg,3.16mmol)の混合物に室温で添加された。図15を参照。45分後に、DCM(10mL)中の2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)エタノール(Chem.Eur.J.(2006)12:3655−3671)の溶液(350mg,1.87mmol)が添加され、反応混合物は一晩撹拌された。20時間後、混合物をMeOH(30mL)で希釈し、溶媒を真空下で除去した。ヘキサン:DCM100:0から0:100、次いでDCM:EtOAc100:0から95:5を使用するシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製は、化合物61bと出発物質2−(ピリジン−2−イルジスルホニル)エタノールの混合物(389mg)を得た。この混合物が次の工程で使用された。DMF(1.5mL)中のTBDMSCl(262mg,1.74mmol)の溶液が、0℃で、DMF(4mL)中の生成物61b、2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)エタノール及びイミダゾール(118mg,1.74mmol)に添加された。混合物は室温に温められ、45分間撹拌され、次いでEtOAc及びH2Oで希釈された。この層は分離され、有機層をH2O(3×)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去した。ヘキサン:DCM50:50から0:100、次いでDCM:EtOAc98:2から94:6を使用したシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製は、淡黄色の泡状固体として、(S)−tert−ブチル 1−(クロロメチル)−5−((2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)エトキシ)カルボニルアミノ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 61b(190mg,77%、61aから2工程かけて)を得た。1H NMRδ(400MHz,CDCl3)8.49(br s,1H),8.48−8.47(m,1H),7.84(d,J=8.4Hz,1H),7.71(t,J=7.0Hz,2H),7.63(t,J=7.3Hz,1H),7.54−7.50(m,1H),7.40(ddd,J=8.2,6.8,1.1Hz,1H),7.09(ddd,J=7.3,4.9,1.0Hz,1H),6.93(br s,1H),4.48(t,J=6.3Hz,2H),4.31−4.27(m,1H),4.15−4.10(m,1H),4.04−3.98(m,1H),3.91(dd,J=11.1,2.4Hz,1H),3.45(t,J=10.7Hz,1H),3.13(t,J=6.3Hz,2H),1.60(s,9H).
0℃で、DCM(9.5mL)中の61b(180mg,0.330mmol)の溶液に、TFA(4.8mL)がゆっくりと添加され、混合物はこの温度で1時間撹拌された。次いで、反応混合物はDCM及びH2Oで希釈され、pHが7−8になるまで飽和NaHCO3水溶液で中和された。層は分離され、有機層をH2O(1×)で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去し、黄色の固体として、(S)−2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)エチル−1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イルカルバメート 61c(113mg,77%)が得られ、これは精製せずに次の工程で使用された。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)9.52(s,1H),8.48−8.46(m,1H),7.88(d,J=8.4Hz,1H),7.83−7.78(m,2H),7.64(d,J=8.2Hz,1H),7.39(ddd,J=8.1,6.9,1.0Hz,1H),7.25(ddd,J=6.5,4.8,2.2Hz,1H),7.14(ddd,J=8.2,6.8,1.0Hz,1H),7.09(s,1H),5.94(br s,1H),4.33(t,J=6.2Hz,2H),4.02−3.96(m,1H),3.85(dd,J=10.8,3.5Hz,1H),3.70(t,J=9.3Hz,1H),3.63−3.55(m,2H),3.18(t,J=6.1Hz,2H).
DMA(6mL)中の(S)−5−(1−(クロロメチル)−5−(ジ−tert−ブトキシホスホリルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタン酸 57d(135mg,0.250mmol)の溶液が、室温で窒素下で、61c(110mg,0.247mmol)及びEDCI.HCl(116mg,0.605mmol)の混合物に添加され、その混合物は一晩撹拌された。18.5時間後、DMA(0.5mL)中の57d(40mg,0.0741mmol)及び固体EDCI.HCl(28.4mg,0.148mmol)の追加溶液が、窒素下、室温で攪拌された。更に6時間後、DMA(0.5mL)中の57d(7mg,0.0130mmol)の追加部分及び固体EDCI.HCl(24mg,0.125mmol)が添加され、混合物は更に2日間と16.5時間攪拌された。次いで、混合物はH2Oで希釈され、固体が沈殿した。固体は、濾過により回収され、H2O、飽和NaHCO3水溶液、H2O及びヘキサンで洗浄された。固体はEtOAcに溶解され、溶液を飽和NaHCO3水溶液(3×)及びH2O(1×)で洗浄し、次いで乾燥し(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去した。次いで固体はDCMに再溶解され、更なる飽和NaHCO3水溶液(3×)で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去した。固体は、ヘキサン:EtOAc95:5から90:10で粉砕され、ベージュ色の固体として、2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)エチル(S)−1−(クロロメチル)−3−(5−((S)−1−(クロロメチル)−5−(ジ−tert−ブトキシホスホリルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イルカルバメート 61d(117mg,HPLC純度:86.1%)が得られ、これは精製せずに次の工程で使用された。HRMSm/z989.2289[(M+Na)+,C47H53Cl2N4NaO8PS2として計算:989.2312].
TFA(1mL)が、0℃でDCM(2mL)中の61dの撹拌溶液に滴下され、混合物は70分間この温度で撹拌された。次いで、溶媒は25℃にて真空下で除去された。得られた黒色残留物はDCMに溶解され、溶液はEtOAcで希釈された。DCMは真空下で除去され、EtOAc中の懸濁液を得た。固体が濾過により回収され、EtOAcとヘキサンで粉砕され、乾燥し、緑色の固体を得た。これは、分取HPLC(カラム:Synergi−MAXRP4μ,21.20×250mm;流速:12ml/分;移動相:溶媒A:H2O/TFApH2.6,溶媒B:MeCN/H2O90:10;方法:勾配,溶媒A:溶媒B60:40から2:98,24分;波長:254nm,330nm)により更に精製され、61が得られた(16mg,8%、61cから2工程かけて、HPLC純度:97.2%)。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)9.69(s,1H),8.57−8.46(m,3H),8.09(d,J=8.3Hz,1H),8.01(d,J=8.5Hz,1H),7.91(dd,J=8.3,2.4Hz,2H),7.82(d,J=3.3Hz,2H),7.59−7.52(m,2H),7.47−7.40(m,2H),7.27−7.23(m,1H),4.42−4.22(m,8H),4.06−4.01(m,2H),3.90(td,J=11.2,7.4Hz,2H),3.19(t,J=6.0Hz,2H),2.77−2.59(m,4H),2.01−1.94(m,2H).2つのプロトンは観測されなかった。31PNMRδ(400MHz,DMSO−d6)−6.01.HRMSm/z877.1053[(M+Na)+,C39H37Cl2N4NaO8PS2として計算:877.1060].[α]D 24=−42.3o(c=0.213,DMSO).
トリエチルアミン、Et3N(0.92mL,6.62mmol)及びトリフルオロメタンスルホン酸無水物(1.03mL,6.11mmol)が、0℃で、DCM(160mL)中の51a(1.70g,5.09mmol)の溶液に添加された。図16を参照。反応物を、20分間、0℃で攪拌し、次いで、H2Oで希釈し、層を分離し、水層をDCM(1×)で抽出した。混合した有機層を乾燥し(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去した。ヘキサン:EtOAc100:0から95:5を用いたシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製により、ベージュ色の泡状固体として、(S)−tert−ブチル−1−(クロロメチル)−5−(トリフルオロメチルスルホニルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 62a(2.20g,93%)を得た。1H NMRδ(400MHz,CDCl3)8.30(br s,1H),8.03(d,J=8.5Hz,1H),7.76(d,J=8.4Hz,1H),7.62−7.59(m,1H),7.53−7.49(m,1H),4.32(br s,1H),4.21−4.15(m,1H),4.09−4.03(m,1H),3.92(dd,J=11.2,2.8Hz,1H),3.54−3.49(m,1H),1.61(s,9H).
乾燥THF(60mL)中の62a(2.15g,4.61mmol)の溶液が、窒素下で、密封管中で、Cs2CO3(2.10g,6.44mmol),BINAP(430mg,0.690mmol)及びPd(OAc)2(155mg,0.690mmol)の混合物に添加された。ジフェニルメタンアミン(1.0mL,5.98mmol)が反応混合物に添加され、10分間混合物に窒素がバブリングされた。密封されたチューブは、4日間、60−65℃で加熱された。次いで、反応混合物を室温に冷却し、DCMで希釈し、セライトを通して濾過し、洗浄液に色が存在しなくなるまでセライトプラグをDCMで洗浄し、濾液を真空下で蒸発させた。ヘキサン:DCM100:0から50:50を用いたシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる残留物の精製により、黄色泡状固体として、(S)−tert−ブチル−1−(クロロメチル)−5−(ジフェニルメチレンアミノ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 53f(2.09g,91%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)7.85(d,J=8.4Hz,1H),7.80(d,J=8.4Hz,1H),7.75(d,J=7.3Hz,2H),7.61−7.57(m,1H),7.54−7.49(m,3H),7.37−7.33(m,1H),7.30−7.23(m,3H),7.06(d,J=6.7Hz,2H),4.14−4.02(m,2H),3.99−3.94(m,2H),3.77(dd,J=10.8,7.4Hz,1H),1.46(s,9H),1H(観測されず)。HRMSm/z497.1984[(M+H)+,C31H30ClN2O2として計算:497.1990].[α]D 28=−101.5o(c=0.995,DCM).
室温(r.t.)でTHF及びH2O(195mL/98mL)中53f(1.30g,2.62mmol)の攪拌溶液に、氷酢酸、HOAc(65mL)が添加され、混合物が一晩撹拌された。18時間後、反応混合物は真空下で濃縮され、30℃以上に加熱することなく、ほとんどのTHFを除去した。次いで、混合物はEtOAc(200mL)で希釈され、有機層が分離され、飽和NaHCO3水溶液で洗浄され(4×、洗浄液のpHが8になるまで)、乾燥され(Na2SO4)、溶媒は真空下で除去された。ヘキサン:DCM100:0から90:10を用いたシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる残留物の精製により、黄色泡状固体として、(S)−tert−ブチル−5−アミノ−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 61a(503mg,58%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)8.01(d,J=8.4Hz,1H),7.64(d,J=8.0Hz,1H),7.40(ddd,J=8.1,6.8,0.9Hz,1H),7.36(br s,1H),7.20(ddd,J=8.1,6.8,1.1Hz,1H),5.91(s,2H),4.11−3.91(m,4H),3.66(dd,J=10.6,8.2Hz,1H),1.53(s,9H).
乾燥THF(10mL)中の2−メルカプトプロパン酸(3.02g,28.5mmol)の溶液が、0℃で乾燥THF(40mL)中のLiAlH4(1.29g,34.0mmol)の攪拌懸濁液に滴下された。反応混合物は室温に温められ、3時間撹拌された。次いで、混合物を0℃に冷却し、H2O(5mL)及び5%NaOH水溶液(3mL)でクエンチされた。混合物は0℃で20分間攪拌され、セライトを通じて濾過し、セライトプラグはEt2O(3x)で洗浄し、混合した有機物は乾燥され(Na2SO4)、濾過され、溶媒が除去されて、2−メルカプトプロパン−1−オール(944mg)を得て、これは精製せずに次の工程で使用された。MeOH(7mL)中の1,2−ジ(ピリジン−2−イル)ジスルファン(Bioorg. Med. Chem. Lett. (2011) 21:4985-4988.)(470mg,5.10mmol)の溶液が室温でMeOH(4mL)中の2−メルカプトプロパン−1−オールの溶液に添加され、混合物は一晩攪拌された。17.5時間後、溶媒を真空下で除去した。ヘキサン:DCM50:50から0:100、次いでDCM:EtOAc99:1から75:25を使用するアルミナ(中性)上のカラムクロマトグラフィーによる精製により、黄色油として、2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)プロパン−1−オール(528mg,18%,2−メルカプトプロパン酸から2工程かけて)を得た。1H NMRδ(400MHz,CDCl3)8.50(ddd,J=5.0,1.8,0.9Hz,1H),7.57(ddd,J=8.0,7.4,1.8Hz,1H),7.39(td,J=8.1,1.0Hz,1H),7.15(ddd,J=7.4,5.0,1.1Hz,1H),5.93(dd,J=8.8,5.8Hz,1H),3.68(ddd,J=12.5,8.8,3.8Hz,1H),3.40(ddd,J=12.4,7.8,5.8Hz,1H),3.14−3.06(m,1H),1.31(d,J=6.9Hz,3H).
乾燥DCM(40mL)中のトリホスゲンの溶液(127mg,0.428mmol)が、61a(250mg,0.751mmol)及びDMAP(551mg,4.51mmol)の混合物に室温で添加された。すぐに黄色い固体が沈殿した。30分後に、DCM(6mL)中の2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)プロパン−1−オール(420mg,2.09mmol)の溶液が添加され、沈殿物は溶解された。反応混合物は一晩攪拌したままにした。18時間後、1MのNaOH(30mL)が添加され、混合物は撹拌された。次いで、層は分離され、有機層は乾燥され(Na2SO4)、MeOH(15mL)で希釈され、シリカゲルに吸収された。生成物は、ヘキサン:DCM100:0から50:50から0:100、次いでDCM:EtOAc99:1から92:8を使用して溶出された。次いで、物質は、ヘキサン:DCM100:0から50:50から0:100、次いでDCM:EtOAc98:2から95:5を使用して、シリカゲル上で再びクロマトグラム処理された。これは、62b及び2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)プロパン−1−オール(385mg)を得た。この混合物が次の工程で使用された。DMF(1mL)中のTBDMSCl(81mg,0.535mmol)の溶液が、0℃で、DMF(2mL)中の62b及び2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)プロパン−1−オール、及びイミダゾールの攪拌混合物に添加された。混合物は室温に温められ、50分間撹拌され、次いでEtOAc及びH2Oで希釈された。混合物は攪拌され、層が分離され、有機層をH2O(3×)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去した。ヘキサン:DCM50:50から0:100、次いでDCM:EtOAc95:5から94:6を使用したシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製は、淡黄色の泡状固体として、(1S)−tert−ブチル−1−(クロロメチル)−5−((2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)プロポキシ)カルボニルアミノ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 62b(295mg,70%、61aから2工程かけて)を得た。1H NMRδ(400MHz,CDCl3)8.49(br s,1H),8.46(ddd,J=4.8,1.7,0.8Hz,1H),7.86(d,J=8.4Hz,1H),7.75−7.73(m,2H),7.64−7.60(m,1H),7.54(ddd,J=8.1,6.9,1.0Hz,1H),7.42(ddd,J=8.2,6.8,1.1Hz,1H),7.08(ddd,J=7.4,4.9,0.8Hz,1H),6.97(br s,1H),4.37−4.28(m,3H),4.17−4.11(m,1H),4.05−3.99(m,1H),3.92(dd,J=11.1,2.5Hz,1H),3.47(t,J=10.7Hz,1H),3.38−3.30(m,1H),1.62(s,9H),1.41(d,J=6.9Hz,3H).HRMSm/z582.1265[(M+Na)+,C27H30ClN3NaO4S2として計算:582.1258].
0℃で、DCM(14mL)中の62b(285mg,509mmol)の溶液に、TFA(7mL)がゆっくりと添加され、混合物はこの温度で1時間撹拌された。次いで、反応混合物はDCM及びH2Oで希釈され、pHが7になるまで飽和NaHCO3水溶液で中和された。層は分離され、有機層をH2O(1×)で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去し、黄色の固体として、(S)−1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イルカルバメート 2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)プロピル 62c(220mg,94%)が得られ、これは精製せずに次の工程で使用された。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)9.52(s,1H),8.45(ddd,J=4.8,1.7,0.8Hz,1H),7.88(d,J=8.5Hz,1H),7.85−7.83(m,1H),7.79−7.75(m,1H),7.64(d,J=8.2Hz,1H),7.39(ddd,J=8.1,6.8,1.0Hz,1H),7.23(ddd,J=7.3,4.8,1.0Hz,1H),7.15(ddd,J=8.1,6.8,1.0Hz,1H),7.08(s,1H),5.93(br s,1H),4.24−4.13(m,2H),4.02−3.96(m,1H),3.85(dd,J=10.8,3.5Hz,1H),3.70(t,J=9.3Hz,1H),3.63−3.55(m,2H),3.43−3.36(m,1H),1.34(d,J=6.9Hz,3H).
DMA(10mL)中の(S)−5−(1−(クロロメチル)−5−(ジ−tert−ブトキシホスホリルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタン酸 57d(365mg,0.676mmol)の溶液が、62c(215mg,0.467mmol)及びEDCI.HCl(268mg,1.40mmol)の混合物に室温で添加された。TsOHが添加され(16mg,0.0929mmol)、混合物を窒素下(及び3Aモレキュラーシーブ上で)、一晩撹拌された。27.5時間後、混合物をEtOAc及びH2Oで希釈し、よく振盪し、層を分離した。有機層を飽和NaHCO3水溶液(3×)、かん水(1×)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去した。得られた残留物はDCMに溶解され、溶液から固体が沈殿するまでヘキサンで希釈された。溶媒は真空下で除去され、固体はヘキサン:EtOAc95:5で粉砕され、黄褐色の固体として、2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)プロピル(S)−1−(クロロメチル)−3−(5−((S)−1−(クロロメチル)−5−(ジ−tert−ブトキシホスホリルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イルカルバメート 62d(372mg)が得られ、これは精製せずに次の工程で使用された。HRMSm/z1003.2445[(M+Na)+,C48H55Cl2N4NaO8PS2として計算:1003.2468].
0℃で、DCM(7mL)中の62d(上述で調製)の攪拌溶液に、TFA(3.5mL)をゆっくり添加した。混合物はこの温度で1時間撹拌された。次いで、溶媒を25℃にて真空下で除去した。得られた暗緑色の残留物はDCMに溶解され、溶液はEtOAcで希釈され、溶液から固体を沈殿させた。溶媒は、30℃で真空下で除去され、残留物は再びDCMに溶解され、EtOAcで希釈された。DCMは真空下で除去され、EtOAc中の懸濁液を得た。固体が濾過により回収され、次いで固体はEtOAc及びヘキサンで洗浄され、乾燥され、緑色の固体を得た。これは、分取HPLC(カラム:Synergi−MAXRP4μ,21.20×250mm;流速:12ml/分;移動相:溶媒A:H2O/ギ酸アンモニウム緩衝液pH3.5,溶媒B:MeCN/H2O90:10;方法:勾配,溶媒A:溶媒B25:75から0:100,19分かけて)により更に精製され、クリーム粉末として、2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)プロピル(S)−1−(クロロメチル)−3−(5−((S)−1−(クロロメチル)−5−(ホスホノオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イルカルバメート 62(78mg,19%、62cから2工程かけて,HPLC純度:87.4%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)9.69(s,1H),8.56(s,1H),8.48(s,1H),8.44(d,J=4.5Hz,1H),8.15(d,J=8.3Hz,1H),8.00(d,J=8.5Hz,1H),7.90(d,J=8.4Hz,1H),7.85−7.76(m,3H),7.55−7.48(m,2H),7.44−7.40(m,1H),7.36−7.32(m,1H),7.24−7.21(m,1H),4.41−4.14(m,8H),4.05−3.99(m,2H),3.91(dd,J=10.8,7.2Hz,1H),3.85−3.81(m,1H),3.37−3.28(m,1H),2.74−2.57(m,4H),1.98−1.95(m,2H),1.34(d,J=6.7Hz,3H),2つのプロトンは観測されなかった。31PNMRδ(400MHz,DMSO−d6)−5.09.HRMSm/z891.1221[(M+Na)+,C40H39Cl2N4NaO8PS2として計算:891.1216]
(S)−1−(クロロメチル)−3−(5−((S)−1−(クロロメチル)−5−(ホスホノオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル 2−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)−N−メチルヘキサンアミド)エチル(メチル)カルバメート 57は酵素的に脱リン酸化され63を得た。
2−(ピリジン−2−イルジスルファニル)エチル(S)−1−(クロロメチル)−3−(5−((S)−1−(クロロメチル)−5−(ホスホノオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−5−オキソペンタノイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イルカルバメート 61は酵素的に脱リン酸化され64を得た。
乾燥DCM(10mL)中の(S)−2,2,2−トリクロロエチル6−(5−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)−4−(2−(ヒドロキシメチル)ピロリジン−1−カルボニル)−2−メトキシフェノキシ)ヘキサン酸54cの攪拌溶液に、無水酢酸(1.29mL,13.6mmol)及びトリエチルアミン(2.27mL,16.3mmol)が室温で添加された。図17を参照。反応混合物は更に4時間撹拌された。乾燥MeOH(1.5mL)が添加され、混合物は30分間撹拌された。酢酸エチル(200mL)が添加され、酢酸エチル層が分離され、水で数回洗浄された。酢酸エチル溶液は乾燥され(MgSO4)、蒸発させ、淡黄色の接着剤として、(S)−2,2,2−トリクロロエチル 6−(4−(2−(アセトキシメチル)ピロリジン−1−カルボニル)−5−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)−2−メトキシフェノキシ)ヘキサン酸 65a(1.8g,100%)を得た;1H NMR[(CD3)2SO]δ8.82(br s,1H),7.27(s,1H),6.86(s,1H),4.89(s,2H),4.39−4.20(m,3H),3.93(t,J=6.4Hz,2H),3.74(s,3H),3.50−3.33(m,2H),2.10−1.94(m,4H),1.92−1.61(m,7H),1.53−1.42(m,2H),1.43(s,9H),2H(DMSOピークにより部分的に不明瞭)。HRMS(ESI)m/zC28H39Cl3N2NaO9として計算:675.1613, found :675.1603[MNa+].Calc.forC28H40Cl3N2O9:653.1794, found :653.1778[MH+].
アセトン(20mL)、及び水(12mL)及びTHF(12mL)の混合物中の65a(1.76g,2.69mmol)の撹拌溶液に、窒素下で、Zn(7.06g,108mmol)及びNH4Cl(11.6g,216mmol)が添加された。混合物を室温で23時間撹拌した。酢酸エチル(100mL)が添加され、混合物は15分間撹拌された。有機層はデカントされた。抽出は、追加の酢酸エチル(2×100mL)で繰り返された。混合有機溶液は水(2×100mL)で洗浄され、乾燥させ(MgSO4)、セライトを通じて濾過し、蒸発させ、粘着性の無色の泡状物として、(S)−6−(4−(2−(アセトキシメチル)ピロリジン−1−カルボニル)−5−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)−2−メトキシフェノキシ)ヘキサン酸 65b(1.36g,96%)を得た;1H NMR[(CD3)2SO]δ11.49(非常にbr s,1H),8.83(s,1H),7.27(s,1H),6.86(br s,1H),4.39−4.02(m,3H),3.93(t,J=6.4Hz,2H),3.74(s,3H),3.51−3.33(m,2H(水ピークにより部分的に不明瞭)),2.21(t,J=7.1Hz,2H),2.11−1.93(m,4H),1.90−1.66(m,5H),1.62−1.50(m,2H),1.50−1.35(m,2H),1.43(s,9H)。元素分析(C26H38N2O9.)Calc:C,59.76;H,7.33;N,5.36.Found:C,59.66;H,7.49;N,5.29.
乾燥DMA(5mL)中の65b(0.87g,2.41mmol)及び(S)−1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル 4−メチルピペラジン−1−カルボキシレート 58b(1.26g,2.41mmol)の攪拌溶液に、0℃で、窒素下、p−ジオキサン(1.21mL,4.82mmol)中の4MのHCl、続いてEDCI.HCl(1.39g,7.23mmol)及び無水TsOH(83mg,0.48mmol)が添加された。反応混合物は、21時間窒素下で0℃で攪拌され、次いで、酢酸エチル(500mL)及び水(500mL)の間で分配された。酢酸エチル層が分離され、水層は更に酢酸エチル(200mL)で抽出された。混合された酢酸エチル抽出物は、水(200mL)、飽和NaHCO3溶液(2×200mL)及び水(200mL)で連続的に洗浄された。酢酸エチル層は乾燥され、蒸発させ、ベージュ色の固体泡として、(S)−3−(6−(4−((S)−2−(アセトキシメチル)ピロリジン−1−カルボニル)−5−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)−2−メトキシフェノキシ)ヘキサノイル)−1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル 4−メチルピペラジン−1−カルボキシレート65cを得た;mp 84−87oC;1H NMR[(CD3)2SO]δ8.84(br s,1H),8.21(s,1H),7.95(d,J=8.3Hz,1H),7.81(d,J=8.3Hz,1H),7.58(brt,J=7.7,1H),7.46(brt,J=8.1Hz,1H),7.29(s,1H),6.86(s,1H),4.40(t,J=10.0Hz,1H),4.36−3.86(m,10H),3.83−3.74(m,1H),3.73(s,3H),3.54−3.36(m,4H),2.67−2.34(m,6H(DMSOピークにより部分的に不明瞭)),2.26(s,3H),2.02(br s,3H),1.93−1.62(m,8H),1.60−1.47(m,2H),1.42(s,9H).元素分析(C45H58ClN5O10・1 1/2H2O)Calc:C,60.63;H,6.90;N,7.86.Found:C,60.39;H,6.66;N,8.08.
0℃で、窒素雰囲気下で、DCM(20mL)中の65c(2.17g,2.51mmol)の攪拌溶液に、TFA(20mL)が添加された。添加後、混合物は、2.5時間、この温度で更に撹拌された。混合物は、0℃で、NaHCO3(50g)、水(700mL)及びDCM(500mL)の混合物に注がれ、15分間撹拌された(pHは約8)。DCM層は分離され、NaHCO3水溶液(200mL)及び水(200mL)で洗浄され、次いで乾燥された(MgSO4)。溶媒を蒸発させ、淡褐色固体泡として、(S)−3−(6−(4−((S)−2−(アセトキシメチル)ピロリジン−1−カルボニル)−5−アミノ−2−メトキシフェノキシ)ヘキサノイル)−1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル 4−メチルピペラジン−1−カルボキシレート 65dを得た;mp 62oC;1H NMR[(CD3)2SO]δ8.21(s,1H),7.95(d,J=8.3Hz,1H),7.81(d,J=8.3Hz,1H),7.57(brt,J=7.6Hz,1H),7.46(brt,J=7.2Hz,1H),6.67(s,1H),6.37(s,1H),5.09(s,2H),4.41(t,J=9.7Hz,1H),4.36−4.20(m,3H),4.17−4.00(m,3H),3.97−3.86(m,3H),3.81−3.70(m,2H),3.63(s,3H),3.54−3.32(m,5H),2.66−2.34(m,6H(DMSOピークにより部分的に不明瞭)),2.26(s,3H),2.08−1.96(m,1H),2.10(s,3H),1.93−1.63(m,7H),1.57−1.45(m,2H).元素分析(C40H50ClN5O8・1/2H2O)Calc:C,62.13;H,6.65;N,9.06.Found:C,62.12;H,6.76;N,8.77.
乾燥DMA(10mL)中の(S)−2−(アリルオキシカルボニルアミノ)−6−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸65e65e(3.30g,10.0mmol)及びEEDQ(3.71g,15.0mmol)の混合物は、室温で、窒素下、15分間攪拌された。図18を参照。この予め調製された混合物に、4−((tert−ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)アニリン(DMF中で対応するp−ニトロベンジルアルコール及びTBDMSClから調製され;その後乾燥DMA(3mL)中でZn/NH4Cl)(2.37g,10.0mmol)を使用して還元された)の溶液が添加された。最終反応混合物は、23時間、窒素下、室温で攪拌された。混合物は、酢酸エチル(500mL)及び水(500mL)の間で分配された。酢酸エチル層は分離され、飽和NaHCO3水溶液(2×200mL)及び水(300mL)で洗浄され、次いで乾燥された(MgSO4)。溶媒を蒸発させて、橙色の油状物が得られ、シリカカラムクロマトグラフィー(10−15%の石油エーテル−酢酸エチルの勾配)により精製し、粘着性のベージュ色の固体泡としてTBDMS保護リジン65f(4.87g,89%)を得た;;1H NMR[(CD3)2SO]δ9.97(s,1H),7.55(d,J=8.50Hz,2H),7.44(d,J=7.8Hz,1H),7.21(d,J=8.5Hz,2H),6.75(t,J=5.3Hz,1H),5.99−5.82(m,1H),5.28(brd,J=17.2Hz,1H),5.17(brd,J=10.5Hz,1H),4.64(s,2H),4.46(d,J=5.2Hz,2H),4.12−4.02(m,1H),2.93−2.83(m,2H),1.70−1.52(m,2H),1.46−1.20(m,4H),1.35(s,9H),0.89(s,9H),0.06(s,6H).HRMS(ESI)m/zC28H47N3NaO6Siとして計算:572.3126, found :572.3136[MNa+].
THF(30mL)中の65f(4.81g,8.75mmol)の攪拌溶液に、室温で、THF(17.5mL,17.5mmol)中のフッ化テトラブチルアンモニウムの1M溶液が添加された。添加後、混合物は更に2.5時間この温度で撹拌された。NH4Cl水溶液(300mL)が添加され、生成物は酢酸エチル(500mL)中に抽出された。酢酸エチルを水(2×100mL)で洗浄し、乾燥した(MgSO4)。溶媒を蒸発させて、ベージュ色の固体としてベンジルアルコールリジン65g(3.81g,100%)を得た;mp 101−103oC;1H NMR[(CD3)2SO]δ9.94(s,1H),7.52(d,J=8.4Hz,2H),7.44(d,J=7.8Hz,1H),7.23(d,J=8.4Hz,2H),6.76(t,J=5.4Hz,1H),5.97−5.84(m,1H),5.29(brd,J=17.2Hz,1H),5.17(brd,J=10.4Hz,1H),5.08(t,J=5.7Hz,1H),4.47(d,J=5.3Hz,2H),4.43(d,J=5.7Hz,2H),4.13−4.03(m,1H),2.96−2.82(m,2H),1.72−1.52(m,2H),1.46−1.20(m,4H),1.36(s,9H).HRMS(ESI)m/zC22H33N3NaO6として計算:458.2262, found :458.2272[MNa+];C22H33N3KO6として計算:474.2001, found :474.1998[MK+].
乾燥DCM(15mL)中の65d(764mg,1.00mmol)及びDMAP(367mg,3.00mmol)の攪拌溶液に、室温で窒素下で、乾燥DCM中のジホスゲンの溶液(0.05mmol/mLあたり,12mL,0.60mmol)が添加され、混合物は更に20分間撹拌された。図19を参照。この混合物に、乾燥DCM(80mL)中の65g(3.97g,9.13mmol)の溶液が添加された。最終反応混合物は、48時間、窒素下、室温で攪拌された。混合物は、酢酸エチル(500mL)及び水(300mL)の間で分配された。酢酸エチル層が分離され、水層は酢酸エチル(2×200mL)で抽出された。混合された酢酸エチル溶液は追加の水(2×100mL)で洗浄され、乾燥された(MgSO4)。30℃(浴温度)で溶媒を蒸発させるとオレンジ色の油が得られ、シリカカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル−MeOH=10:1)により精製し、淡いオレンジ色の固体として、(S)−3−(6−(4−((S)−2−(アセトキシメチル)ピロリジン−1−カルボニル)−5−((4−((S)−2−(アリルオキシカルボニルアミノ)−6−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサンアミド)ベンジルオキシ)カルボニルアミノ)−2−メトキシフェノキシ)ヘキサノイル)−1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル 4−メチルピペラジン−1−カルボキシレート 65h(1.04g,85%)を得た;mp 90−93oC;1H NMR[(CD3)2SO]δ10.04(s,1H),9.10(br s,1H),8.21(s,1H),7.95(d,J=8.3Hz,1H),7.81(d,J=8.3Hz,1H),7.63−7.53(m,3H),7.51−7.42(m,2H),7.32(d,J=8.5Hz,2H),7.21(br s,1H),6.85(br s,1H),6.79−6.72(m,1H),5.97−5.83(m,1H),5.29(brd,J=17.2Hz,1H),5.17(brd,J=10.4Hz,1H),5.08−4.96(m,2H),4.52−4.37(m,3H),4.37−3.85(m,10H),3.83−3.66(m,2H),3.74(s,3H),3.54−3.41(m,2H),3.41−3.23(m,2H(水ピークにより部分的に不明瞭)),2.95−2.83(m,2H),2.66−2.34(m,6H(DMSOピークにより部分的に不明瞭)),2.25(s,3H),2.07−1.92(m,4H),1.87−1.45(m,11H),1.45−1.20(m,4H),1.35(s,9H).HRMS(ESI)m/zC63H82ClN8O15として計算:1225.5583, found :1225.5557[MH+];C63H81ClN8NaO15として計算:1247.5402, found :1247.5401[MNa+];C63H81ClKN8O15として計算:1263.5142, found :1263.5141[MK+].
DCM(20mL)及びMeOH(10mL)中の65h(1.01g,0.824mmol)及びK2CO3(1.14g,8.24mmol)の混合物は室温で1時間40分間撹拌された。混合物はDCM(200mL)で希釈され、10分間氷水(200mL)で攪拌された。DCM層は分離され、水層はDCM(2×100mL)で抽出された。混合されたDCM溶液は追加の水(200mL)で洗浄され、乾燥された(MgSO4)。25℃(浴温度)で溶媒を蒸発させるとベージュ色の固体として、(S)−3−(6−(5−((4−((S)−2−(アリルオキシカルボニルアミノ)−6−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサンアミド)ベンジルオキシ)カルボニルアミノ)−4−((S)−2−(ヒドロキシメチル)ピロリジン−1−カルボニル)−2−メトキシフェノキシ)ヘキサノイル)−1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル 4−メチルピペラジン−1−カルボキシレート 65i(0.94g,96%)を得た;mp 104−107oC;1H NMR[(CD3)2SO]δ10.04(s,1H),9.17(br s,1H),8.21(s,1H),7.95(d,J=8.4Hz,1H),7.80(d,J=8.3Hz,1H),7.63−7.53(m,3H),7.51−7.42(m,2H),7.38−7.21(m,3H),6.93(s,1H),5.32(t,J=5.4Hz,1H),5.98−5.83(m,1H),5.30(brd,J=17.2Hz,1H),5.17(brd,J=11.7Hz,1H),5.03(s,2H),4.73(t,J=5.7Hz,1H),4.52−4.36(m,3H),4.36−4.17(m,2H),4.17−3.85(m,6H),3.83−3.66(m,2H),3.73(s,3H),3.61−3.40(m,4H),3.40−3.20(m,2H(水ピークにより部分的に不明瞭)),2.94−2.83(m,2H),2.67−2.34(m,6H(DMSOピークにより部分的に不明瞭)),2.25(s,3H),1.96−1.45(m,12H),1.45−1.20(m,4H),1.35(s,9H).HRMS(ESI)m/zC61H80ClN8O14として計算:1183.5477, found :1183.5445[MH+];C61H79ClN8NaO14として計算:1205.5296, found :1205.5256[MNa+];C61H79ClKN8O14として計算:1221.5036, found :1221.5026[MK+].
乾燥DCM(20mL)中の65i(0.92g,0.78mmol)の攪拌溶液に、0℃で、デス・マーチン・ペルヨージナン(DMP:1,1,1−トリアセトキシ−1,1−ジヒドロ−1,2−ベンズヨードキソール−3(1H)−オン,CASReg.No.87413−09−0)(492mg,1.16mmol)が少量ずつ(8分間かけて)添加された。添加が完了した後、反応混合物は、0℃で2時間、次いで室温で45時間更に攪拌された。混合物はDCM(100mL)で希釈され、室温で、10分間、10%Na2S2O3(100mL)で攪拌された。得られた混合物は、DCM(400mL)及び飽和NaHCO3溶液(400mL)との間で分配された。DCM層は分離され、水層はDCM(2×200mL)で更に抽出された。混合されたDCM溶液は、NaHCO3水溶液(200mL)及び水(200mL)で更に洗浄され、次いで乾燥された(MgSO4)。25℃(浴温度)で溶媒を蒸発させ、淡褐色の固体が得られ、これはSiO2カラムクロマトグラフィーにより精製され(DCM−酢酸エチル−MeOH=15:15:1、15:15:3までの勾配)、淡黄色固体として、(S)−4−((S)−2−(アリルオキシカルボニルアミノ)−6−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサンアミド)ベンジル 8−(6−((S)−1−(クロロメチル)−5−(4−メチルピペラジン−1−カルボニルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−6−オキソヘキシルオキシ)−11−ヒドロキシ−7−メトキシ−5−オキソ−2,3,11,11a−テトラヒドロ−1H−ベンゾ[e]ピロロ[1,2−a][1,4]ジアゼピン−10(5H)−カルボキシレート 65j(0.64g,70%)を得た;mp 137oC(dec.);1H NMR[(CD3)2SO]δ10.02(s,1H),8.21(s,1H),7.95(d,J=8.4Hz,1H),7.80(d,J=8.3Hz,1H),7.65−7.38(m,5H),7.18(d,J=7.0Hz,2H),7.03(s,1H),6.82−6.63(m,2H),6.49(不明瞭に分離したd,J=4.7Hz,1H(D2Oと交換可能)),5.96−5.82(m,1H),5.46(不明瞭に分離したdd,J=9.8,4.7Hz,D2O交換後d,J=10.1Hz,1H),5.27(brd,J=17.1Hz,1H),5.21−5.10(m,2H),4.81(brd,J=12.3Hz,1H),4.51−4.17(m,5H),4.13−3.84(m,4H),3.84−3.67(m,2H),3.77(s,3H),3.55−3.20(m,6H(水ピークにより部分的に不明瞭)),2.66−2.30(m,6H(DMSOピークにより部分的に不明瞭)),2.26(s,3H),2.10−1.20(m,16H),1.35(s,9H).HRMS(ESI)m/zC61H78ClN8O14として計算:1181.5321, found :1181.5286[MH+];C61H77ClN8NaO14として計算:1203.5140, found :1203.5130[MNa+];C61H77ClKN8O14として計算:1219.4879, found :1219.4861[MK+].
0℃で、窒素雰囲気下で、乾燥DCM(15mL)中の65j(623mg,0.53mmol)の攪拌溶液に、ピロリジン(0.86mL,10.5mmol)、続いてPd(Ph3P)4(30mg,9.8%Pd)が添加された。添加後、反応混合物は、室温で5時間更に攪拌された。混合物は石油エーテル(100mL)で希釈され、室温で30分間撹拌された。溶媒は、不溶性物質からデカントされ、洗浄工程はDCM−石油エーテル(1:10)(100mL)で繰り返された。後に残された粘着性の固体はDCM(200mL)に溶解され、水(3×100mL)で洗浄され、次いで、乾燥させ(MgSO4)、ベースライン物質を除去するために短いたSiO2カラムに通された。必要とされる化合物を、DCM−MeOH勾配を(2から5%)を用いて溶出した。25℃(浴温度)で溶媒を蒸発させて、淡黄色固体泡(472mg,82%)を得て、これが次の工程で直接使用された。この粗アミンは、乾燥DMA(8mL)中でFmoc−val−Osu(N−α−Fmoc−L−valineN−ヒドロキシスクシンイミドエステル,550mg,1.26mmol)により室温で窒素雰囲気下で処理され、混合物は5時間撹拌された。酢酸エチル−石油エーテル(1:10、100mL)が添加され、混合物は室温で20分間撹拌された。溶媒は不溶性物質からデカントされ、洗浄工程は追加の酢酸エチル−石油エーテル(1:10、2×50mL)で繰り返された。後に残された粘着性の固体は乾燥され、SiO2カラムクロマトグラフィー(DCM−酢酸エチル−MeOH=20:10:3)により精製され、無色の固体として、(S)−4−((S)−2−((S)−2−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニルアミノ)−3−メチルブタンアミド)−6−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサンアミド)ベンジル 8−(6−((S)−1−(クロロメチル)−5−(4−メチルピペラジン−1−カルボニルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−6−オキソヘキシルオキシ)−11−ヒドロキシ−7−メトキシ−5−オキソ−2,3,11,11a−テトラヒドロ−1H−ベンゾ[e]ピロロ[1,2−a][1,4]ジアゼピン−10(5H)−カルボキシレート 65k(246mg,47%)を得た;mp 143oC(dec.);1H NMR[(CD3)2SO]δ10.03(s,1H(D2Oと交換可能)),8.21(s,1H),8.05(brd,J=7.5Hz,1H(D2Oと交換可能)),7.95(d,J=8.5Hz,1H),7.87(d,J=7.4Hz,2H),7.81(d,J=8.3Hz,1H),7.72(t,J=7.0Hz,2H),7.62−7.25(m,10H,D2O交換後9H),7.18(不明瞭に分離したd,J=5.8Hz,2H),7.04(s,1H),6.70(br s,2H,D2O交換後1H),6.50(br s,1H(D2Oと交換可能)),5.53−5.40(m,D2O交換後d,J=9.9Hz,1H),5.15(brd,J=12.4Hz,1H),4.82(brd,J=12.3Hz,1H),4.46−4.16(m,7H),4.07−3.85(m,4H),3.83−3.67(m,2H),3.76(s,3H),3.56−3.23(m,5H(水ピークにより部分的に不明瞭)),2.93−2.79(m,2H),2.64−2.32(m,6H(DMSOピークにより部分的に不明瞭)),2.25(s,3H),2.09−1.20(m,17H),1.35(s,9H),0.87(d,J=7.0Hz,3H),0.83(d,J=6.8Hz,3H).HRMS(ESI)m/zC77H93ClN9O15として計算:1418.6474, found :1418.6420[MH+];C77H92ClN9NaO15として計算:1440.6294, found :1440.6231[MNa+];C77H92ClKN9O15として計算:1456.6033, found :1456.6021[MK+].
0℃で、窒素雰囲気下で、乾燥DMA(2mL)中の65k(224mg,0.158mmol)の攪拌溶液に、N,N−ジメチルアセトアミド中のピペリジンの溶液(DMA,1.0mmol(mLあたり),1.58mL,1.58mmol)が添加された。図20を参照。添加後、混合物はこの温度で更に1時間45分攪拌された。酢酸エチル−石油エーテル(1:5,50mL)の混合物が添加され、混合物は0℃で20分間撹拌された。溶媒層は不溶性物質からデカントされ廃棄された。洗浄工程は、室温で追加の酢酸エチル−石油エーテル(1:5,2x30mL)を用いて繰り返された。後に残された淡黄色固体は乾燥され、(S)−4−((S)−2−((S)−2−アミノ−3−メチルブタンアミド)−6−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサンアミド)ベンジル 8−(6−((S)−1−(クロロメチル)−5−(4−メチルピペラジン−1−カルボニルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−6−オキソヘキシルオキシ)−11−ヒドロキシ−7−メトキシ−5−オキソ−2,3,11,11a−テトラヒドロ−1H−ベンゾ[e]ピロロ[1,2−a][1,4]ジアゼピン−10(5H)−カルボキシレート 65l(173mg,99%)を得た;mp 74oC(dec.);1H NMR[(CD3)2SO]δ10.09(s,1H(D2Oと交換可能)),8.21(s,1H),8.08(br s,1H(D2Oと交換可能)),7.96(d,J=8.4Hz,1H),7.81(d,J=8.2Hz,1H),7.66−7.42(m,4H),7.19(不明瞭に分離したd,J=7.5Hz,2H),7.04(s,1H),6.71(br s,2H,D2O交換後1H),6.49(br s,1H(D2Oと交換可能)),5.52−5.40(m,D2O交換後d,J=10.6Hz,1H),5.16(brd,J=12.1Hz,1H),4.81(brd,J=11.7Hz,1H),4.49−4.18(m,4H),4.10−3.85(m,3H),3.85−3.67(m,2H),3.77(s,3H),3.59−3.22(m,5H(水ピークにより部分的に不明瞭)),3.03−2.97(m,D2O交換後d,J=4.8Hz,1H),2.91−2.81(m,2H),2.71−2.33(m,7H(DMSOピークにより部分的に不明瞭)),2.25(s,3H),2.11−1.20(m,17H),1.34(s,9H),0.86(d,J=6.5Hz,3H),0.76(d,J=6.7Hz,3H),2H(観測されず)。HRMS(ESI)m/zC62H83ClN9O13として計算:1196.5793, found :1196.5804[MH+];C62H82ClN9NaO13として計算:1218.5613, found :1218.5612[MNa+];C62H82ClKN9O13として計算:1234.5352, found :1234.5359[MK+].
乾燥DMA(6mL)中の65l(173mg,0.158mmol)及び2,5−ジオキソピロリジン−1−イル2−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサノアート(マレイミド−Osu,122mg,0.395mmol)の混合物が、0℃で窒素雰囲気下で、1時間45分攪拌された。酢酸エチル−石油エーテルの混合物(1:5,50mL)が添加され、得られた混合物が0℃で15分間攪拌された。溶媒層は不溶性物質からデカントされ廃棄された。洗浄工程は、室温で追加の酢酸エチル−石油エーテル(1:5,2x30mL)を用いて繰り返された。後に残された固体は乾燥され、シリカカラムクロマトグラフィー(DCM−酢酸エチル−MeOH=20:10:3)により精製され、淡黄色の固体として、(S)−4−((S)−6−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)−2−((S)−2−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド)−3−メチルブタンアミド)ヘキサンアミド)ベンジル 8−(6−((S)−1−(クロロメチル)−5−(4−メチルピペラジン−1−カルボニルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−6−オキソヘキシルオキシ)−11−ヒドロキシ−7−メトキシ−5−オキソ−2,3,11,11a−テトラヒドロ−1H−ベンゾ[e]ピロロ[1,2−a][1,4]ジアゼピン−10(5H)−カルボキシレート 65m(152mg,69%)を得た;HPLC:純度90.6%;mp 120oC;1H NMR[(CD3)2SO]δ9.95(s,D2O,1H(D2Oと交換可能)),8.21(s,1H),8.01(d,J=7.4Hz,1H(D2Oと交換可能)),7.95(d,J=8.4Hz,1H),7.85−7.73(m,2H,D2O交換後1H),7.63−7.50(m,3H),7.46(t,J=7.7Hz,1H),7.17(不明瞭に分離したd,J=8.4Hz,2H),7.04(s,1H),6.98(s,2H),6.81−6.66(m,2H,D2O交換後1H),6.49(不明瞭に分離したd,J=5.3Hz,1H(D2Oと交換可能)),5.51−5.41(m,D2O交換後d,J=9.9Hz,1H),5.15(d,J=12.6Hz,1H),4.81(brd,J=11.3Hz,1H),4.41(t,J=9.7Hz,1H),4.37−4.27(m,2H),4.27−4.13(m,2H),4.10−3.85(m,3H),3.85−3.63(m,2H),3.77(s,3H),3.60−3.21(m,8H(水ピークにより部分的に不明瞭),1H),2.92−2.81(m,2H),2.67−2.33(m,6H(DMSOピークにより部分的に不明瞭)),2.26(s,3H),2.23−1.11(m,25H),1.30(s,9H),0.84(d,J=6.8Hz,3H),0.81(d,J=6.7Hz,3H).HRMS(ESI)m/zC72H94ClN10O16として計算:1389.6532, found :1389.6478[MH+];C72H94ClN10NaO16として計算:706.3212, found :706.3244[MH+Na+];C72H93ClN10Na2O16として計算:717.3122, found :717.3121[MNa+Na+].
0℃(浴温度)で、DCM(0.4mL)中の65m(32.2mg,0.023mmol)の攪拌溶液に、窒素下で、TFA(0.8mL)が添加され、続いてTFA中の2%の水の溶液(0.8mL)が添加された。添加後、混合物は更に8時間この温度で撹拌された。酢酸エチル−石油エーテル(1:5,25mL)が添加され、混合物は0℃で15分間攪拌された。沈殿した固体は回収され、酢酸エチル−石油エーテル(1.5、2×30ml)で洗浄され、乾燥させて粗生成物(30mg)を得て、これが分取HPLC[SynergiMaxRPカラム;水−TFA(pH=2.56;95%から55%)/10%H2O(CH3CN(5%から45%)中);流速:12mL/分]により精製され、ガラス状固体として、(S)−4−((S)−6−アミノ−2−((S)−2−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド)−3−メチルブタンアミド)ヘキサンアミド)ベンジル 8−(6−((S)−1−(クロロメチル)−5−(4−メチルピペラジン−1−カルボニルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−6−オキソヘキシルオキシ)−11−ヒドロキシ−7−メトキシ−5−オキソ−2,3,11,11a−テトラヒドロ−1H−ベンゾ[e]ピロロ[1,2−a][1,4]ジアゼピン−10(5H)−カルボキシレート 65をビス−トリフルオロ酢酸塩(22.2mg,64%)として得た;HPLC:純度97.1%;mp 114oC;[α]D+43.6o(c0.275,MeOH);1H NMR[(CD3)2SO]δ9.97(s,1H),9.90(br s,1H),8.73(br s,2H),8.27(s,1H),8.09(d,J=7.6Hz,1H),8.04−7.93(m,2H),7.89(d,J=8.4Hz,1H),7.82(d,J=7.9Hz,1H),7.74−7.50(m,5H),7.46(brt,J=7.6Hz,1H),7.22(m,2H),7.04(s,1H),7.00(s,2H),6.75(s,1H),6.51(br s,1H),5.52−5.40(m,1H),5.18−5.04(m,1H),4.94−4.82(m,1H),4.48−3.70(m,14H),3.43−3.20(m,4H(水ピークにより部分的に不明瞭)),3.17−3.05(m,3H),2.89(s,3H),2.82−2.70(m,2H),2.66−2.48(m,2H(DMSOピークにより部分的に不明瞭)),2.25−1.08(m,25H),0.91−0.77(m,6H),2H(観測されず)。HRMS(ESI)m/zC67H86ClN10O14として計算:1289.6008, found :1289.5975[MH+];C67H85ClN10NaO14として計算:1311.5827, found :1311.5772[MNa+];C67H85ClN10Na2O14として計算:667.2860, found :667.2874[MNa+Na+];C67H86ClN10NaO14として計算:656.2950, found :656.2963[MH+Na+];C67H87ClN10O14として計算:645.3040, found :645.3052[MH+H+].
氷浴中で冷却されたDCM(15mL)中の、実施例7の51aから調製された(S)−tert−ブチル5−(ベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 57aの溶液(1.595g,3.76mmol)に、ジオキサン(40mL)中の4NのHClが添加された。図21を参照。混合物は室温まで温められ、2時間攪拌された。全ての揮発性成分は排出された。得られた残留物は、酢酸エチルと5%の冷アンモニア水溶液との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒は除去され、茶色のガム状物として、(S)−5−(ベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール 57bを得て、これが直接使用された; 1H NMR(DMSO)δ8.04(d,J=8.2Hz,1H),7.61(d,J=8.3Hz,1H),7.53(d,J=7.2Hz,2H),7.45−7.34(m,4H),7.14(t,J=7.3Hz,1H),6.60(s,1H),5.24(s,2H),3.96−3.92(m,1H),3.84(dd,J=3.4,10.7Hz,1H),3.70(t,J=9.3Hz,1H),3.60(dd,J=2.4,10.0Hz,1H),3.55(t,J=10.3Hz,1H)ppm.HRMS(ESI) found m/z324.1150(M+H).C20H19ClNO requires 324.1150.
中間体57bは氷浴中で冷却され、ピリジン(15mL)、続いてトリフルオロ酢酸無水物(3.14mL,22.57mmol)が添加された。得られた混合物は10分間撹拌され、氷が添加された。混合物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒は除去され、得られた残留物は、溶離液として酢酸エチルと石油エーテルの混合物(v/v 1:10)を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製され、白色固体として、(S)−1−(5−(ベンジルオキシ)−1−(クロロメチル)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−2,2,2−トリフルオロエタノン 66a(1.11g,70%)を得た;mp 167−170℃.1H NMR(CDCl3)δ8.37(d,J=8.3Hz,1H),8.05(s,1H),7.72(d,J=8.2Hz,1H),7.61−7.54(m,3H),7.49−7.42(m,3H),7.39−7.35(m,1H),5.30(ABq,J=11.7,15.7Hz,2H),4.63−4.59(m,1H),4.43−4.38(m,1H),4.15−4.09(m,1H),3.97−3.93(m,1H),3.49(dd,J=9.9,11.3Hz,1H)ppm.HRMS(ESI) found m/z442.0799(M+Na).C22H17ClF3NNaO2 requires 442.0795.
−10℃で、THF(20mL)中の66a(1.10g,2.62mmol)の溶液に、25%水性ギ酸アンモニウム(20mL)、続いてPd−C触媒(10%、湿潤、550mg)が添加され、混合物は2時間撹拌され、その後追加のPd−C触媒(550mg)が添加された。得られた混合物は一晩、−10℃で撹拌され、触媒はセライトを通して濾過された。THFは濾液から除去され、残留物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒は除去され、得られた残留物は、溶離液として酢酸エチルと石油エーテルの混合物(v/v 1:5)を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製され、オフホワイトの固体として、(S)−1−(1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−2,2,2−トリフルオロエタノン 66b(758mg,88%)を得た;mp 209−212℃.1H NMR(CDCl3)δ8.33(d,J=8.2Hz,1H),8.10(s,1H),7.85(s,1H),7.64(d,J=8.2Hz,1H),7.60−7.56(m,1H),7.51−7.47(m,1H),4.60−4.56(m,1H),4.41−4.36(m,1H),4.00−3.95(m,1H),3.93−3.90(m,1H),3.44(dd,J=9.8,11.3Hz,1H)ppm.HRMS(ESI) found m/z352.0331(M+Na).C15H11ClF3NNaO2 requires 352.0323.
THF(15mL)中の66b(250mg,0.76mmol)の溶液に、テトラゾール(アセトニトリル中に3%,13.5mL,4.55mmol)、続いてジ−tert−ブチル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミジット(1.51mL,4.55mmol)が添加された。混合物は室温で一晩撹拌され、次いで、氷浴中で冷却され、H2O2(30%水溶液,0.78mL,7.58mmol)が滴下された。得られた混合物は室温まで温められ、5時間撹拌された。反応物は、氷浴で冷却しながら10%水性亜硫酸ナトリウムの添加によりクエンチされた。有機揮発性物質はロータリーエバポレーターで除去された。得られた混合物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒は除去され、得られた残留物は、溶離液として酢酸エチル及び石油エーテルの勾配混合物(v/v 1:6から1:3)を用いるFlorisil(登録商標)(USSilica)カラムクロマトグラフィーにより精製され、無色の油状物として、(S)−ジ−tert−ブチル 1−(クロロメチル)−3−(2,2,2−トリフルオロアセチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル リン酸 66c(367mg,93%)を得た;1H NMR(DMSO)δ8.44(d,J=1.0Hz,1H),8.11(d,J=8.1Hz,1H),8.06(d,J=8.2Hz,1H),7.69−7.65(m,1H),7.63−7.59(m,1H),4.61−4.56(m,1H),4.46−4.41(m,1H),4.15−4.12(m,1H),4.06−4.00(m,1H),1.50(s,9H),1.48(s,9H)ppm.31PNMR(DMSO)δ−15.54ppm.HRMS(ESI) found m/z544.1236(M+Na).C23H28ClF3NNaO5P requires 544.1238.
氷浴で冷却されたMeOH(2mL)中の66c(239mg,0.46mmol)の溶液に、CsCO3(298mg,0.92mmol)及び数滴の水が添加された。混合物は1時間氷浴中で撹拌され、次いで酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水及びかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、セライトを通して濾過し、溶媒が除去された。得られた残留物は酢酸エチルに溶解され、Florisil(登録商標)(USSilica)カラムクロマトグラフィーのパッドを通して濾過され、オフホワイトのガム状物として、(S)−ジ−tert−ブチル 1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル リン酸 66d(183mg,94%)を得て、これが精製せずに次の工程で使用された;1H NMR(DMSO)δ8.08(d,J=8.4Hz,1H),7.58(d,J=8.3Hz,1H),7.46−7.42(m,1H),7.25−7.21(m,1H),7.13(d,J=0.8Hz,1H),4.00−3.93(m,1H),3.87−3.78(m,2H),3.54−3.42(m,2H),1.50(s,9H),1.49(s,9H)ppm.31PNMR(DMSO)δ−15.58ppm.HRMS(ESI) found m/z426.1587(M+H).C21H30ClNO4P requires 426.1595.
2,5−ジブロモニトロベンゼン(5.0g,17.8mmol)及びアクリル酸t−ブチル(7.75mL,53.40mmol)がトリエチルアミン(50mL)に溶解された。図22を参照。フラスコは溶液を通して窒素ガスをバブリングすることにより流され、次いでトリ−p−トリルホスフィン(433mg,1.42mmol)及び酢酸パラジウム(80mg,0.36mmol)が窒素気流下で添加された。混合物は窒素下で一晩還流で撹拌された。トリエチルアミンは排出された。得られた残留物は酢酸エチルに溶解され、シリカゲルのパッドを通して濾過された。濾液は濃縮され、クロマトグラフィーカラムにロードされた。酢酸エチルと石油エーテルの混合物(1:10)が溶離剤として使用され、白色固体として、(2E,2’E)−tert−ブチル 3,3’−(2−ニトロ−1,4−フェニレン)ジアクリル酸 66e(5.85g,88%)を得た;mp 123−124℃.1H NMR(CDCl3)δ8.14(d,J=1.7Hz,1H),7.99(d,J=15.8Hz,1H),7.74(dd,J=1.7,8.2Hz,1H),7.66(d,J=8.1Hz,1H),7.58(d,J=16.0Hz,1H),6.50(d,J=16.0Hz,1H),6.36(d,J=15.8Hz,1H),1.58(s,9H),1.56(s,9H)ppm.HRMS(ESI) found m/z398.1574(M+Na).C20H25NNaO6 requires 398.1574.
氷浴で冷却されたアセトン(40mL)中の66e(5.85g,15.58mmol)の溶液に、亜鉛粉末(8.15g,125.0mmol)、続いて水中(20mL)のNH4Cl(3.33g,62.30mmol)の溶液が添加された。混合物は室温で1時間撹拌された。追加の亜鉛粉末(4.00g)及び水中(10mL)の追加のNH4Cl(1.7g)が添加された。1時間後、酢酸エチル(100mL)が添加され、上部の透明な溶液はデカンティングにより回収された。洗浄及びデカンティング工程は更に2回繰り返された。混合された有機溶液を水、続いてかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、シリカゲルのパッドを通して濾過した。溶媒が除去され、黄色のガム状物として、(2E,2’E)−tert−ブチル 3,3’−(2−アミノ−1,4−フェニレン)ジアクリル酸 66f(5.46g,100%)を得た;mp 73−75℃.1H NMR(CDCl3)δ7.68(d,J=15.8Hz,1H),7.46(d,J=16.0Hz,1H),7.37(d,J=8.1Hz,1H),6.92(dd,J=1.5,8.1Hz,1H),6.81(d,J=1.4Hz,1H),6.33(d,J=16.0Hz,1H),6.31(d,J=15.8Hz,1H),3.99(br s,2H),1.53(s,9H),1.51(s,9H)ppm.HRMS(ESI) found m/z368.1830(M+Na).C20H27NNaO4 requires 368.1832.
DMA(25mL)中の66f(2.73g,7.90mmol),3−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニルアミノ)プロパン酸(Fmoc−ベタ−アラニン,3.69g,11.85mmol),EDCI塩酸塩(7.58g,39.50mmol)及びp−トルエンスルホン酸(136mg,0.79mmol)の混合物は室温で一晩撹拌された。混合物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒が除去され、白色固体として、(2E,2’E)−tert−ブチル 3,3’−(2−(3−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニルアミノ)プロパンアミド)−1,4−フェニレン)ジアクリル酸 66g(4.89g,97%)を得た;mp 102−105℃.1H NMR(CDCl3)δ7.87(s,1H),7.70−7.66(m,2H),7.62−7.52(m,4H),7.44(br s,1H),7.38−7.34(m,3H),7.29−7.25(m,2H),6.41(d,J=16.0Hz,1H),6.34(d,J=15.7Hz,1H),4.42(br s,2H),4.19(t,J=6.4Hz,1H),3.59(br s,2H),2.67(br s,2H),1.53(s,9H),1.51(s,9H)ppm.HRMS(ESI)はm/z661.2878(M+Na)を見いだした。C38H42N2NaO7 requires 661.2884.
氷浴で冷却されたDCM(4mL)中の66g(530mg,0.83mmol)の溶液に、TFA(1mL,12.98mmol)が添加された。混合物は室温まで温められ、一晩攪拌され、白色の懸濁液を得た。酢酸エチルが添加され、より多くの固体を沈殿させ、これを濾過により回収し、酢酸エチルと石油エーテルで洗浄し、白色固体として、(2E,2’E)−3,3’−(2−(3−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニルアミノ)プロパンアミド)−1,4−フェニレン)ジアクリル酸 66h(404mg,92%)を得た。mp 282℃(dec.).1H NMR(DMSO)δ12.46(br s,1H),9.92(s,1H),7.89−7.84(m,3H),7.74−7.68(m,4H),7.58−7.54(m,2H),7.44−7.38(m,3H),7.31−7.28(m,2H),6.54(dd,J=3.2,16.0Hz,2H),4.30(d,J=6.5Hz,2H),4.22(t,J=6.8Hz,1H),3.30(br s,2H),2.83−2.79(m,2H)ppm.HRMS(ESI) found m/z549.1643(M+Na).C30H26N2NaO7 requires 549.1632.
DMA(2mL)中の66d(178mg,crude,ca.0.42mmol),66h(55mg,0.10mmol),EDCI塩酸塩(160mg,0.84mmol)及びp−トルエンスルホン酸(1.8mg,0.01mmol)の混合物は室温で一晩撹拌された。混合物は、酢酸エチルと冷希釈NaHCO3水溶液との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒は除去され、残留物は、MeOH及び酢酸エチルの勾配混合物(v/v 0.25−5%)を用いるFlorisil(登録商標)(USSilica)カラムクロマトグラフィーにより精製され、黄色い固体として、(9H−フルオレン−9−イル)メチル 3−(2,5−ビス((E)−3−((S)−1−(クロロメチル)−5−(ジ−tert−ブトキシホスホリルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−3−オキソプロパ−1−エニル)フェニルアミノ)−3−オキソプロピルカルバメート 66i(62mg,44%)を得た;1H NMR(DMSO)δ10.04(s,1H),8.67(s,2H),8.11−8.05(m,3H),7.97(d,J=8.2Hz,2H),7.88−7.82(m,4H),7.78(d,J=8.4Hz,1H),7.73−7.67(m,3H),7.63−7.58(m,2H),7.53−7.47(m,3H),7.38(t,J=7.4Hz,2H),7.30−7.24(m,4H),4.60−4.50(m,4H),4.42−4.35(m,2H),4.30(d,J=6.7Hz,2H),4.22(t,J=6.6Hz,1H),4.06−3.93(m,4H),3.40−3.33(m,2H),2.63−2.59(m,2H),1.50(2×s,18H),1.47(2×s,18H)ppm.31PNMR(DMSO)δ−15.45ppm.HRMS(ESI) found m/z1341.4677(M+H).C72H81Cl2N4O13P2 requires 1341.4647.
DMF(1mL)中の66i(60mg,0.045mmol)の溶液に、ピペリジン(44μL,0.45mmol)が添加された。混合物は室温で3時間温められ、次いで、全ての揮発性成分が排出された。得られた残留物はエーテル及び石油エーテルの混合物(v/v 1:1)で粉砕され、白色固体として、遊離アミン66j(44mg,96%)を得た。1H NMR(DMSO)δ8.68(s,2H),8.11−8.05(m,3H),7.98(d,J=8.4Hz,2H),7.91−7.86(m,2H),7.78−7.85(m,1H),7.70(d,J=15.3Hz,1H),7.63−7.58(m,2H),7.51(t,J=7.9Hz,2H),7.26(d,J=15.3Hz,2H),4.66−4.52(m,4H),4.44−4.35(m,2H),4.07−3.95(m,4H),2.95(t,J=6.5Hz,2H),2.56−2.50(m,2H),1.50−1.49(m,36H)ppm.31PNMR(DMSO)δ−15.42,15.45ppm.HRMS(ESI) found m/z1119.3981(M+H).C57H71Cl2N4O11P2 requires 1119.3966.
DMSO(1mL)中の59a(40mg,0.036mmol)、2,5−ジオキソピロリジン−1−イル 6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサン酸(SuOMC,12mg,0.037mmol)及びDIPEA(6.8μL,0.039mmol)の混合物は一晩室温で攪拌され、全ての揮発性成分は排出された。得られた残留物はエーテルで粉砕され、黄色い固体として、ビス (ジ−tert−ブチルホスファート) N−(3−(2,5−ビス((E)−3−((S)−1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−3−オキソプロパ−1−エニル)フェニルアミノ)−3−オキソプロピル)−6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド 66k(32mg,67%)を得た。1H NMR(DMSO)δ10.02(s,1H),8.67(s,2H),8.11−8.05(m,3H),7.98−7.92(m,3H),7.85−7.75(m,2H),7.70(d,J=15.3Hz,1H),7.63−7.58(m,2H),7.51(t,J=7.9Hz,2H),7.26(dd,J=4.4,15.4Hz,2H),6.96(s,2H),4.66−4.52(m,4H),4.44−4.35(m,2H),4.07−3.95(m,4H),3.45−3.30(m,4H),2.52−2.50(m,2H),2.08(t,J=7.2Hz,2H),1.50−1.40(m,40H),1.33−1.25(m,2H)ppm.31PNMR(DMSO)δ−15.42,15.45ppm.HRMS(ESI) found m/z1334.4515(M+Na).C67H81Cl2N5NaO14P2 requires 1334.4525.
氷浴で冷却されたDCM(1mL)中の66k(30mg,0.02mmol)の溶液に、TFA(1mL,12.98mmol)が添加された。混合物は室温まで温められ、3時間攪拌された。全ての揮発成分は排出され、得られた残留物は酢酸エチルで粉砕され、黄色い固体として、N−(3−(2,5−ビス((E)−3−((S)−1−(クロロメチル)−5−ホスホノキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−3−オキソプロパ−1−エニル)フェニルアミノ)−3−オキソプロピル)−6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド 66(20mg,80%,HPLC純度95%)を得た;1H NMR(DMSO)δ10.01(s,1H),8.59(s,2H),8.16−8.08(m,3H),7.97−7.90(m,3H),7.88−7.73(m,2H),7.69(d,J=14.5Hz,1H),7.61−7.55(m,2H),7.46(t,J=7.3Hz,2H),7.29−7.24(d,J=14.0Hz,2H),6.97(s,2H),4.62−4.52(m,3H),4.40−4.30(m,3H),4.05−3.90(m,4H),3.43−3.37(m,2H),3.24−3.18(m,2H),2.61−2.55(m,2H),2.08(br s,2H),1.54−1.44(m,4H),1.27−1.15(m,2H)ppm.31PNMR(DMSO)δ−5.81ppm.HRMS(ESInegative) found m/z1086.2067(M−H).C51H48Cl2N5O14P2 requires 1086.2056.
DCM(30mL)中の(2E,2’E)−tert−ブチル3,3’−(2−(3−(((9H−フルオレン−9−イル)メトキシ)カルボニルアミノ)プロパンアミド)−1,4−フェニレン)ジアクリル酸 66g(4.89g,7.66mmol)の溶液に、ピペリジン(4.5mL,45.50mmol)が添加された。図23を参照。混合物は室温で5時間温められ、次いで、全ての揮発性成分がロータリーエバポレーターによって除去された。溶離液として酢酸エチル、次いでTEA,MeOH、酢酸エチル(v/v 1:10:100)の混合物を使用するカラムクロマトグラフィーにより、白色固体として、(2E,2’E)−tert−ブチル3,3’−(2−(3−アミノプロパンアミド)−1,4−フェニレン)ジアクリル酸 67a(2.33g,73%)を得た。mp 62−63℃.1H NMR(CDCl3)δ11.04(s,1H),8.32(d,J=1.4Hz,1H),7.91(d,J=15.7Hz,1H),7.55(d,J=16.1Hz,1H),7.54(d,J=8.0Hz,1H),7.24(dd,J=1.5,8.2Hz,1H),6.42(d,J=16.0Hz,1H),6.34(d,J=15.7Hz,1H),3.18(d,J=5.6Hz,2H),2.52(t,J=5.6Hz,2H),1.53(s,18H)ppm.HRMS(ESI) found m/z417.2394(M+H).C23H33N2O5 requires 417.2384.
DMSO(10mL)中の67a(1.00g,2.40mmol)、2,5−ジオキソピロリジン−1−イル 6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサン酸(SuOMC,740mg,2.40mmol)及びDIPEA(460μL,2.64mmol)の混合物は一晩室温で攪拌された。全ての揮発性成分排出された。得られた残留物は、溶離液として酢酸エチルと石油エーテルの混合物(v/v 2:1)、続いて酢酸エチルを単独でを用いるカラムクロマトグラフィーにより精製され、白色固体として、(2E,2’E)−tert−ブチル 3,3’−(2−(3−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド)プロパンアミド)−1,4−フェニレン)ジアクリル酸 67b(1.00g,68%)を得た。mp 69−72℃.1H NMR(CDCl3)δ7.95(s,1H),7.73(s,1H),7.65(d,J=15.9Hz,1H),7.61(d,J=8.2Hz,1H),7.53(d,J=16.0Hz,1H),7.37(d,J=8.2Hz,1H),6.69(br s,1H),6.64(s,2H),6.39(d,J=16.0Hz,1H),6.38(d,J=15.8Hz,1H),3.68−3.63(m,2H),3.43(d,J=7.0Hz,2H),2.69(d,J=5.5Hz,2H),2.21(t,J=7.3Hz,2H),1.67−1.50(m,4H),1.53(s,9H),1.52(s,9H),1.31−1.24(m,2H)ppm.HRMS(ESI) found m/z632.2931(M+Na).C33H43N3NaO8 requires 632.2942.
氷浴で冷却されたDCM(4mL)中の67b(500mg,0.82mmol)の溶液に、TFA(2mL)が滴下して添加された。混合物は室温まで温められ、4時間攪拌された。全ての揮発性成分は排出された後に、得られた残留物は酢酸エチルで粉砕され、白色固体として、(2E,2’E)−3,3’−(2−(3−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド)プロパンアミド)−1,4−フェニレン)ジアクリル酸 67c(380mg,93%)を得た。mp 257−261℃.1H NMR(DMSO)δ12.47(s,2H),9.90(s,1H),7.89−7.83(m,2H),7.71−7.67(m,2H),7.57−7.53(m,2H),6.99(s,2H),6.53(d,J=15.9Hz,2H),3.36−3.30(m,4H),2.54−2.50(m,2H),2.06(t,J=7.3Hz,2H),1.52−1.42(m,4H),1.22−1.17(m,2H)ppm.HRMS(ESI) found m/z520.1683(M+Na).C25H27N3NaO8 requires 520.1690.
氷浴中で冷却されたDCM(5mL)中の、実施例7の51aから調製された(S)−tert−ブチル1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート51a(298mg,0.89mmol)の溶液に、ジオキサン(10mL)中の4NのHClが添加された。混合物は室温まで温められ、3時間撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、塩酸塩として、(S)−1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−オール67dが得られ、67c(185mg,0.37mmol),EDCI塩酸塩(428mg,2.23mmol),p−トルエンスルホン酸(6mg,0.037mmol)及びDMA(5mL)が添加された。混合物が室温で6時間撹拌された後、追加のEDCI塩酸塩(285mg,1.49mmol)及びp−トルエンスルホン酸(6mg,0.037mmol)が添加された。混合物は一晩攪拌され、次いで酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、セライトを通して濾過した。溶媒は除去され、得られた残留物は溶離液としてMeOH及び酢酸エチルの勾配混合物(v/v 1−15%)を使用するカラムクロマトグラフィーにより更に精製され、黄色い固体として、67(160mg,46%,HPLC純度96%)を得た;mp 230−234℃(dec).1H NMR(DMSO)δ10.43(s,1H),10.40(s,1H),10.00(s,1H),8.14−8.08(m,5H),7.95(br s,1H),7.83−7.75(m,5H),7.68(d,J=15.2Hz,1H),7.52(t,J=7.4Hz,2H),7.35(t,J=7.6Hz,2H),7.28−7.23(dd,J=5.2,15.2Hz,2H),6.95(s,2H),4.58−4.45(m,4H),4.29−4.20(m,2H),4.04−3.97(m,2H),3.88−3.80(m,2H),3.43−3.37(m,2H),3.23(d,J=6.9Hz,2H),2.60−2.56(m,2H),2.09(d,J=7.1Hz,2H),1.50−1.40(m,2H),1.40−1.30(m,2H),1.24−1.14(m,2H)ppm.HRMS(ESI)はm/z950.2672(M+Na)を見いだした。C51H47Cl2N5NaO8 requires 950.2694.
氷浴中で冷却されたMeOH及び酢酸エチル(1mL)中の(S)−ジ−tert−ブチル 1−(クロロメチル)−3−(2,2,2−トリフルオロアセチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル−リン酸 66c(125mg,0.24mmol)の溶液に、CsCO3(298mg,0.92mmol)及び数滴の水が添加された。混合物は1時間氷浴中で撹拌され、次いで酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水及びかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、セライトを通して濾過し、溶媒が除去された。得られた残留物は酢酸エチルに溶解され、Florisil(登録商標)(USSilica)のパッドを通して濾過された。溶媒を除去するとオフホワイトのガム状物として、(S)−ジ−tert−ブチル 1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル リン酸 66dが得られ、これが精製せずに次の工程で使用された。
氷浴中で冷却されたDCM(2mL)中の、実施例7の51aから調製された(S)−tert−ブチル 1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−カルボキシレート 51a(80mg,0.24mmol)の溶液に、ジオキサン(4mL)中の4NのHClが添加された。混合物は室温まで温められ、2時間撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、(S)−1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−オール 67dは直接使用された。
塩−氷浴中(−10℃)で冷却されたDMA(2mL)中の66d及び67dの溶液(各々は上記のように調製)に、(2E,2’E)−3,3’−(2−(3−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド)プロパンアミド)−1,4−フェニレン)ジアクリル酸 67c(119mg,0.24mmol)、次いでEDCI塩酸塩(276mg,1.44mmol)及びp−トルエンスルホン酸(4mg,0.024mmol)が添加された。混合物は室温まで温められ、一晩攪拌され、その後、氷上に注がれた。得られた沈殿物は濾過により回収され、水で洗浄され、真空下で乾燥された。MeOH及びDCMの勾配混合物(v/v 2−10%)を使用するFlorisil(登録商標)(USSilica)クロマトグラフィーカラムによる精製により黄色い固体(50mg)が得られ、これはLC−MSにより、ジ−tert−ブチル((S)−1−(クロロメチル)−3−((E)−3−(4−((E)−3−((S)−1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−3−オキソプロパ−1−エン−1−イル)−2−(3−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド)プロパンアミド)フェニル)アクリロイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル)リン酸 68a及びジ−tert−ブチル((S)−1−(クロロメチル)−3−((E)−3−(4−((E)−3−((S)−1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−3−オキソプロパ−1−エン−1−イル)−3−(3−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド)プロパンアミド)フェニル)アクリロイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル)リン酸68b(HPLCによりそれぞれ20%及び23%)、67(HPLCにより44%)、及び66(HPLCにより8%)の混合物として同定された。混合物は分取HPLC(カラム:Synergi−MAX(登録商標)RP4μ、250×21.20mm;移動相:A/B=25%から0%まで(A:ギ酸アンモニウムpH3.45、B:水中の90%のアセトニトリル):流速12mL/分、勾配法;波長:254nm、325nm)により更に精製され、黄色い固体として、68a及び68bの混合物(18mg,8%)を得た。HRMS(ESI)はm/z1142.3577(M+Na)を見いだした。C59H64Cl2N5NaO11P requires 1142.3609.
氷浴で冷却されたDCM(0.5mL)中の68aと68b(17mg,0.015mmol)の溶液に、TFA(0.5mL)が滴下して添加された。混合物は室温まで温められ、3時間攪拌された。全ての揮発性成分は排出された。得られた残留物は酢酸エチルで粉砕され、オレンジ色の固体として、(S)−1−(クロロメチル)−3−((E)−3−(4−((E)−3−((S)−1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−3−オキソプロパ−1−エニル)−2−(3−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド)プロパンアミド)フェニル)アクリロイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル 二水素リン酸塩 68及びリン酸位置異性体、(S)−1−(クロロメチル)−3−((E)−3−(4−((E)−3−((S)−1−(クロロメチル)−5−ヒドロキシ−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−3−オキソプロパ−1−エニル)−3−(3−(6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド)プロパンアミド)フェニル)アクリロイル)−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[e]インドール−5−イル 二水素リン酸塩 68cの混合物を得た(11mg,72%,HPLC純度:95%,異性体の比率は1:1)。1H NMR(DMSO)δ10.45(s,1H),10.01(s,1H),8.58(s,1H),8.15−7.23(m,17H),6.95(s,2H),4.60−3.80(m,10H),3.43−3.37(m,2H),3.27−3.18(m,2H),2.60−2.50(m,2H),2.10−2.00(m,2H),1.55−1.35(m,4H),1.20−1.10(m,2H)ppm.31PNMR(DMSO)δ−5.81ppm.HRMS(ESInegative) found m/z1006.2394(M−H).C51H47Cl2N5O11P requires 1006.2392.
DMA(2mL)中の1(新たに上記の手順により作製)の192mg(0.53mmol)に、2(100mg,0.20mmol),EDCI塩酸塩(231mg,1.21mmol)及びp−トルエンスルホン酸(3.5mg,0.020mmol)が添加された。混合物は一晩撹拌され、次いでアンモニア水と氷の混合物に注がれた。得られた沈殿物は濾過により回収され、水で洗浄され、乾燥され、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製された。MeOH及びDCMの反応混合物(v/v 1−15%)が溶離液として使用され、黄色い固体として、N−(3−(2,5−ビス((E)−3−((S)−1−(クロロメチル)−5−(4−メチルピペラジン−1−カルボニルオキシ)−1H−ベンゾ[e]インドール−3(2H)−イル)−3−オキソプロパ−1−エニル)フェニルアミノ)−3−オキソプロピル)−6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサンアミド(30mg,13%,HPLC純度96%)を得た。mp 268℃(dec).1H NMR(CDCl3)δ8.60(s,1H),8.46(s,1H),8.42(s,1H),7.87−7.84(m,3H),7.75−7.60(m,5H),7.40−7.33(m,5H),7.22(br s,1H),6.77(t,J=15.3Hz,2H),6.56(s,2H),4.46−4.40(m,2H),4.30−4.25(m,2H),4.11−4.00(m,2H),3.95−3.90(m,7H),3.68(明らかなs,6H),3.53−3.46(m,3H),3.38(t,J=7.0Hz,2H),2.73(明らかなs,2H),2.59−2.55(m,8H),2.42(s,6H),2.28(t,J=7.0Hz,2H),1.56−1.49(m,2H),1.31−1.23(m,2H)ppm.HRMS(ESI) found m/z1180.4416(M+H).C63H68Cl2N9O10 requires 1180.4416.
1(新たに上記の手順により作製)の207mg(0.49mmol)に、2(70mg,0.15mmol),EDCI塩酸塩(233mg,1.22mmol)、p−トルエンスルホン酸(3mg,0.015mmol)及びDMA(0.5mL)が添加された。混合物を一晩撹拌した後、DMAのほとんどが真空下で除去され、残留物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、セライトのパッドを通して濾過した。溶媒が除去され、得られた残留物は最小限のDCMに溶解され、ヘプタンを添加することによって沈殿させ、粗生成物(156mg)が得られ、これは更に分取HPLC(カラム:Synergi−MaxRP4μ、250×21.20mm;移動相:A/B=25%から1%まで(A:ギ酸アンモニウムpH3.45、B:水中の90%のアセトニトリル):流速12mL/分、勾配法;波長:254nm、325nm)により精製され、黄色い固体として、3(78mg,40%)を得た。1H NMR(DMSO)δ9.67(s,1H),8.67(s,2H),8.43(d,J=4.5Hz,1H),8.11−8.06(m,3H),7.97(明らかなd,J=8.5Hz,2H),7.92(d,J=15.3Hz,1H),7.84−7.76(m,3H),7.70(d,J=15.3Hz,2H),7.61(t,J=7.6Hz,2H),7.51(t,J=7.7Hz,2H),7.28(d,J=15.3Hz,1H),7.27(d,J=15.3Hz,1H),7.23−7.19(m,1H),4.62−4.53(m,4H),4.43−4.37(m,2H),4.23−4.13(m,2H),4.05−3.95(m,4H),3.42−3.37(m,1H),1.51(s,9H),1.50(s,9H),1.49(s,9H),1.48(s,9H),1.34(d,J=6.5Hz,3H)ppm.31PNMR(DMSO)δ−15.46(s)and−15.48(s)ppm.HRMS(ESI) found m/z1297.3471(M+Na).C63H74Cl2N4NaO12P2S2 requires 1297.3489.
氷浴で冷却されたDCM(2mL)中の3(60mg,0.047mmol)の溶液に、TFA(1mL,6.49mmol)が添加された。混合物は室温まで温められ、3時間攪拌された。全ての揮発成分は排出され、得られた残留物は酢酸エチルで粉砕され、黄色い固体として、4(49mg,99%,HPLC純度100%)を得た。1H NMR(DMSO)δ9.65(s,1H),8.59(s,2H),8.46−8.44(m,1H),8.15−8.08(m,3H),7.96−7.90(m,3H),7.82−7.70(m,3H),7.70(d,J=15.6Hz,1H),7.59(t,J=6.8Hz,2H),7.48(t,J=7.5Hz,2H),7.31−7.22(m,3H),5.75(s,1H),4.64−4.53(m,4H),4.40−4.33(m,3H),4.25−4.15(m,3H),4.06−3.93(m,3H),1.35−1.32(m,3H)ppm.31PNMR(DMSO)δ−5.95(s)ppm.HRMS(ESI) found m/z1073.0949(M+Na).C47H42Cl2N4NaO12P2S2 requires 1073.0985.
中間体3
1(新たに上記の手順により作製)の76mg(0.18mmol)に、2(18mg,0.045mmol),EDCI塩酸塩(69mg,0.36mmol)、p−トルエンスルホン酸(0.8mg,0.005mmol)及びDMA(0.25mL)が添加された。混合物を一晩撹拌した後、DMAのほとんどが真空下で除去され、残留物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、セライトのパッドを通して濾過した。溶媒が除去され、得られた残留物は最小限のDCMに溶解され、ヘプタンを添加することによって沈殿させ、粗生成物(54mg)が得られ、これは更に分取HPLC(カラム:Synergi−MaxRP4μ,250×21.20mm;移動相:A/B=20%から1%まで(A:ギ酸アンモニウムpH3.45、B:水中の90%のアセトニトリル):流速12mL/分、勾配法;波長:254nm、325nm)により精製され、黄色い固体として、3(17mg,30%)を得た。1H NMR(CDCl3)δ8.72(br s,2H),8.23(d,J=8.4Hz,2H),7.96(d,J=15.2Hz,1H),7.83(d,J=15.3Hz,1H),7.71(d,J=8.2Hz,2H),7.54−7.50(m,3H),7.42−7.39(m,2H),7.26−7.12(m,3H),6.95−6.88(m,1H),6.67(s,2H),4.57−4.52(m,2H),4.47−4.38(m,2H),4.28−4.24(m,2H),4.16−4.09(m,2H),4.00−3.94(m,4H),3.78(明らかなs,4H),3.55−.348(m,2H),1.57(s,36H)ppm.31PNMR(CDCl3)δ−15.64(s)ppm.HRMS(ESI) found m/z1238.3862(M+Na).C62H73Cl2N3NaO14P2 requires 1238.3837.
氷浴で冷却されたDCM(1mL)中の3(16mg,0.013mmol)の溶液に、TFA(0.5mL,3.24mmol)が添加された。混合物は室温まで温められ、3時間攪拌された。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物は酢酸エチルで粉砕され、黄色い固体として、化合物78(13mg,100%,HPLC純度100%)を得た。1H NMR(DMSO)δ8.60(s,2H),8.12(d,J=8.4Hz,2H),7.95−7.87(m,4H),7.72(d,J=15.1Hz,1H),7.61−7.57(m,2H),7.53−7.45(m,4H),7.38−7.32(m,2H),6.97(s,2H),4.60−4.48(m,4H),4.30−4.28(m,4H),4.08−3.88(m,6H),3.68−3.58(m,4H).31PNMR(DMSO)δ−5.94(s)ppm.HRMS(ESI) found m/z1014.1301(M+Na).C46H41Cl2N3NaO14P2 requires 1014.1333.
中間体3
1(新たに上記の手順により作製)の52mg(0.12mmol)に、2(11mg,0.031mmol),EDCI塩酸塩(35mg,0.18mmol)、p−トルエンスルホン酸(0.5mg,0.003mmol)及びDMA(0.25mL)が添加された。混合物を一晩撹拌した後、DMAのほとんどが真空下で除去され、残留物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、セライトのパッドを通して濾過した。溶媒が除去され、得られた残留物は最小限のDCMに溶解され、ヘプタンを添加することによって沈殿させ、粗生成物(71mg)が得られ、これは更に分取HPLC(カラム:Synergi−MaxRP4μ,250×21.20mm;移動相:A/B=20%から1%まで(A:ギ酸アンモニウムpH3.45、B:水中の90%のアセトニトリル):流速12mL/分、勾配法;波長:254nm、300nm)により精製され、黄色い固体として、3(15mg,42%)を得た。1H NMR(CDCl3)δ8.71(br s,2H),8.25(d,J=8.4Hz,2H),7.95(d,J=15.5Hz,1H),7.83(d,J=15.3Hz,1H),7.72(d,J=8.2Hz,2H),7.60−7.52(m,3H),7.46−7.40(m,2H),7.28−7.20(m,2H),7.13−6.99(m,2H),6.78(s,2H),4.64−4.60(m,2H),4.51−4.45(m,2H),4.38−4.32(m,2H),4.15−4.05(m,4H),4.00−3.95(m,2H),3.57−3.49(m,2H),1.58(s,36H)ppm.31PNMR(CDCl3)δ−15.67(s)ppm.HRMS(ESI) found m/z1194.3606(M+Na).C60H69Cl2N3NaO13P2 requires 1194.3575.
化合物番号79
氷浴で冷却されたDCM(0.5mL)中の3(13mg,0.011mmol)の溶液に、TFA(0.2mL,1.30mmol)が添加された。混合物は室温まで温められ、0.5時間攪拌された。ジエチルエーテルが添加され、沈殿物を得て、これは濾過され、酢酸エチルで洗浄され、黄色い固体として、4(化合物番号79)(8.4mg,80%,HPLC純度90%)を得た。1H NMR(DMSO)δ8.59(s,2H),8.13(d,J=8.3Hz,2H),7.97−7.82(m,4H),7.71(d,J=15.1Hz,1H),7.60−7.52(m,3H),7.49−7.44(m,3H),7.35−7.24(m,2H),7.08(s,2H),4.65−4.50(m,4H),4.40−4.30(m,4H),4.05−3.90(m,6H).31PNMR(DMSO)δ−5.81(s)ppm.HRMS(ESI) found m/z970.1036(M+Na).C44H37Cl2N3NaO13P2 requires 970.1071.
乾燥DMA(2mL)中の62c((31.0mg,0.0674mmol,新たに上記の手順により作製)、53h(23.0mg,0.0674mmol,新たに上記の手順により作製)、EDCI.HCl(38.7mg,0.202mmol)及びTsOH(2.3mg,0.0135mmol)の混合物は、窒素下で、室温で一晩攪拌された。18時間後、反応混合物はEtOAc及びH2Oで希釈され、良く混合された。この層は分離され、有機層をH2O(3×)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去した。粗生成物はDCM:MeOH100:0から98:2を使用するシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより精製され、続いてジイソプロピルエーテルで粉砕され、クリーム色の固体として、化合物1(化合物番号80、26.0mg、49%,HPLC純度:95.2%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)10.36(s,1H),9.69(s,1H),8.56(s,1H),8.44(d,J=4.3Hz,1H),8.08(d,J=8.0Hz,1H),8.02−8.00(m,2H),7.92(d,J=8.3Hz,1H),7.85−7.77(m,3H),7.57−7.53(m,1H),7.51−7.47(m,1H),7.45−7.41(m,1H),7.34−7.30(m,1H),7.24−7.21(m,1H),4.42−4.29(m,3H),4.25−4.13(m,5H),4.05−3.97(m,2H),3.91(dd,J=11,7.2Hz,1H),3.79(dd,J=11,8.3Hz,1H),3.43−3.36(m,1H),2.77−2.56(m,4H),2.01−1.93(m,2H),1.34(d,J=6.7Hz,3H).HRMSm/z811.1542[(M+Na)+,C40H38Cl2N4NaO5S2として計算:811.1553].
乾燥DMA(15mL)中の1(1.40g,4.00mmol、以下の文献の手順に従って調製:J.Med.Chem.2003,46,2132−2151)、2(1.31g,5.22mmol、以下の文献の手順に従って調製:国際公開第2004065491号(A1))及びK2CO3(829mg,6.00mmol)の混合物は室温で43時間攪拌された。次いで、混合物はEtOAc及びH2Oで希釈され、良く混合され、層は分離された。有機層をH2O(3×)、かん水(1×)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去した。粗生成物は、EtOAc:Hex50:50から67:33から100:0を使用してシリカ上のカラムクロマトグラフィーによって精製され、黄色の油状物として、化合物3(1.74g,84%)を得た。1H NMRδ(400MHz,CDCl3)8.77(br s,1H),7.79(s,1H),6.82(s,1H),6.02−5.92(m,1H),5.36(dq,J=17.2,1.5Hz,1H),5.26(dq,J=10.4,1.2Hz,1H),4.69−4.60(m,2H),4.47−4.39(m,1H),4.28(br s,1H),4.09−4.05(m,2H),3.83(s,3H),3.90−3.80(m,1H),3.74−3.70(m,1H),3.65−3.59(m,1H),3.54−3.47(m,1H),2.25(t,J=7.4Hz,2H),2.20−2.15(m,1H),1.93−1.84(m,3H),1.81−1.72(m,1H),1.70−1.63(m,3H),1.53−1.47(m,2H),1.44(s,9H).HRMSm/z543.2666[(M+Na)+,C27H40N2NaO8として計算:543.2677].
Et3N(1.32mL,9.47mmol)が、室温で乾燥DMF(6mL)中の3(821mg,1.58mmol)の溶液に添加された。無水酢酸(0.75mL,7.93mmol)が添加され、混合物は室温で4.5時間撹拌された。反応混合物は0℃に冷却され、乾燥MeOH(1mL)が添加され、混合物は15分間0℃で撹拌された。EtOAc(120mL)が添加され、混合物はH2O(2×)、かん水(1×)で洗浄され、乾燥され(Na2SO4)、溶媒は真空下で除去され、化合物4(891mg,定量的)が得られ、これは精製せずに次の工程で使用された。1H NMRδ(400MHz,CDCl3)8.88(br s,1H),7.82(s,1H),6.81(s,1H),6.01−5.91(m,1H),5.36(dq,J=17.2,1.5Hz,1H),5.25(dq,J=10.4,1.3Hz,1H),4.65−4.62(m,2H),4.61−4.54(m,1H),4.32−4.22(m,2H),4.09−4.06(m,2H),3.83(s,3H),3.55−3.47(m,2H),2.26−2.23(m,2H),2.18−2.12(m,1H),2.07(s,3H),1.97−1.77(m,5H),1.70−1.63(m,2H),1.54−1.47(m,2H),1.44(s,9H).HRMSm/z585.2774[(M+Na)+,C29H42N2NaO9として計算:585.2783].
ピロリジン(1.6mL,19.2mmol)が、室温で乾燥DMF(20mL)中の4(1.06g,1.88mmol)の溶液に添加された。次いで、Pd(PPh3)4(109mg,0.0943mmol)が添加され、反応混合物は室温で40分間攪拌された。反応混合物は0.25MHCl溶液(2x75mL)で洗浄され、乾燥され(Na2SO4)、溶媒は真空下で除去された。粗生成物は、EtOAc:Hex50:50から100:0を使用してシリカ上のカラムクロマトグラフィーによって精製され、黄色の油状物として、化合物5(726mg,81%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)6.67(s,1H),6.35(s,1H),5.08(s,2H),4.35−4.30(m,1H),4.13−4.06(m,2H),3.87(t,J=6.4Hz,2H),3.63(s,3H),3.50−3.44(m,1H),3.42−3.35(m,1H),2.21(t,J=7.2Hz,2H),2.07−2.00(m,1H),2.01(s,3H),1.89−1.82(m,1H),1.77−1.67(m,4H),1.59−1.51(m,2H),1.44−1.36(m,2H),1.39(s,9H).HRMSm/z501.2573[(M+Na)+,C25H38N2NaO7として計算:501.2571].
ジホスゲン(0.22mL,1.82mmol)が、窒素下で、室温で乾燥DMF(25mL)中の5(726mg,1.52mmol)及びDMAP(557mg,4.56mmol)の混合物に添加された。30分後に、乾燥DCM(25mL)中の6の溶液(2.60g,12.9mmol;新たに上記の手順により作製−数字はアルコールに以前は割り当てられていない)が添加され、混合物は室温で一晩撹拌された。18時間後、反応混合物は、H2O(1×)で洗浄され、乾燥され(Na2SO4)、溶媒は真空下で除去された。粗生成物は、DCM:EtOAc100:0から95:5から94:6を使用してシリカ上のカラムクロマトグラフィーによって過剰の6が溶出するまで精製され、次いでEtOAc:Hex70:30を使用して精製され、淡黄色の油状物として、化合物7(920mg,86%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)9.16(br s,1H),8.45−8.43(m,1H),7.83−7.78(m,2H),7.25−7.21(m,1H),7.15(d,J=2.8Hz,1H),6.87(s,1H),4.29(br s,1H),4.17−3.99(m,4H),3.92(t,J=6.4Hz,2H),3.75(s,3H),3.42−3.30(m,3H),2.20(t,J=7.2Hz,2H),2.06−1.95(m,4H),1.83(br s,1H),1.77−1.68(m,4H),1.58−1.49(m,2H),1.43−1.36(m,2H),1.39(s,9H),1.29(d,J=6.8Hz,3H).HRMSm/z706.2832[(M+H)+,C34H48N3O9S2として計算:706.2826].
DCM−MeOH(34mL/17mL)中の7(949mg,1.34mmol)及びK2CO3(1.85g,13.4mmol)の混合物が室温で45分間攪拌された。混合物はDCMで希釈され、氷H2O(200mL)中に注がれ、よく混合され、層は分離された。水層はDCMで抽出され(1×)、混合した有機層は乾燥され(Na2SO4)、溶媒は真空下で除去された。粗生成物は、DCM:EtOAc100:0から50:50を使用してシリカ上のカラムクロマトグラフィーによって精製され、淡黄色の油状物として、化合物8(808mg,91%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)9.20(br s,1H),8.44(d,J=4.7Hz,1H),7.81−7.80(m,2H),7.25−7.20(m,2H),6.94(s,1H),4.75(t,J=5.6Hz,1H),4.17−3.99(m,3H),3.92(t,J=6.4Hz,2H),3.74(s,3H),3.60−3.46(m,2H),3.37−3.20(m,3H),2.20(t,J=7.2Hz,2H),1.93−1.76(m,3H),1.75−1.68(m,3H),1.58−1.51(m,2H),1.44−1.36(m,2H),1.39(s,9H),1.29(d,J=6.9Hz,3H).HRMSm/z664.2721[(M+H)+,C32H46N3O8S2として計算:664.2724].
(ジアセトキシヨード)ベンゼン(259mg,0.804mmol)が、室温で乾燥DMF(10mL)中の8(349mg,0.526mmol)及びTEMPO(82.2mg,0.526mmol)の混合物に添加され、反応混合物は一晩撹拌された。24時間後、混合物はDCMと飽和Na2S2O3水溶液で希釈され、良く混合された。この層は分離され、有機層は、飽和Na2S2O3水溶液(1×)、飽和NaHCO3水溶液(1×)で洗浄され、乾燥され(Na2SO4)、溶媒は真空下で除去された。粗生成物は、EtOAc:Hex70:30から100:0を使用してシリカ上のカラムクロマトグラフィーによって精製され、白色泡として、化合物9(248mg,71%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)8.45−8.43(m,1H),7.79−7.69(m,1H),7.51−7.48(m,1H),7.24−7.20(m,1H),7.10(s,1H),6.96及び6.91(2s,1H),6.55(t,J=5.9Hz,1H),5.46(dd,J=8.9,6.1Hz,1H),4.31−4.21(m,1H),4.02−3.84(m,3H),3.80及び3.79(2s,3H),3.52−3.46(m,1H),3.40−3.18(m,3H),2.19−2.13(m,2H),2.09−2.00(m,1H),1.96−1.85(m,3H),1.70−1.67(m,2H),1.56−1.45(m,2H),1.40−1.34(m,2H),1.38及び1.37(2s,9H),1.15−1.10(m,3H).HRMSm/z662.2592[(M+H)+,C32H44N3O8S2として計算:662.2564].
ジオキサン(11mL)中の9(254mg,0.384mmol)及び4MのHClの混合物が室温で1時間15分間攪拌された。溶媒は25〜30℃で真空下で除去され、化合物10(162mg,70%)を得て、これは精製せずに次の工程で使用された。
乾燥DMA(5mL)中の10(161mg,0.266mmol)、58b(195mg,0.542mmol,新たに上記の手順により作製)、EDCI.HCl(253mg,1.32mmol)及びTsOH(19.5mg,0.113mmol)の混合物は、窒素下で、室温で一晩攪拌された。23時間後、反応混合物はEtOAc及び飽和NaHCO3水溶液で希釈され、良く混合された。層は分離され、水層はEtOAc(1×)で抽出された。混合された有機層をH2O(1×)、かん水(1×)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去した。粗生成物はDCM:MeOH100:0から93:7を使用するシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより精製され、その物質はDCM:MeOH99:1から94:6を使用して再びカラム処理され、淡黄色の泡として、化合物11(化合物番号81,118mg,47%,HPLC純度:98.0%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)8.43−8.41(m,1H),8.22(s,1H),7.96(d,J=8.4Hz,1H),7.83(d,J=8.4Hz,1H),7.73−7.66(m,1H),7.61−7.56(m,1H),7.51−7.45(m,2H),7.22−7.17(m,1H),7.10(s,1H),6.97及び6.92(2s,1H),6.56(t,J=6.0Hz,1H),5.46(dd,J=9.1,6.2Hz,1H),4.42−4.20(m,4H),4.05−3.76(m,7H),3.80及び3.79(2s,3H),3.52−3.47(m,1H),3.38−3.11(m,4H),2.09−1.99(m,1H),1.94−1.88(m,3H),1.77−1.74(m,2H),1.65−1.62(m,2H),1.48−1.42(m,2H),1.35−1.23(m,1H),1.15−1.10(m,3H),9H(DMSOピークにより部分的に不明瞭).HRMSm/z969.3070[(M+Na)+,C47H55ClN6NaO9S2として計算:969.3053].
乾燥DMA(5mL)中の10(162mg,0.267mmol)、66d(178mg,0.418mmol,新たに上記の手順により作製)、EDCI.HCl(184mg,0.960mmol)及びTsOH(11mg,0.0639mmol)の混合物は、窒素下で、室温で一晩攪拌された。18.5時間後、反応混合物はEtOAc及びH2Oで希釈され、良く混合された。層は分離され、有機層は飽和NaHCO3水溶液(1×)、H2O(1×)、かん水(1×)で洗浄され、乾燥され(Na2SO4)、溶媒は真空下で除去された。粗生成物は、EtOAc:MeOH100:0から95:5を使用してシリカ上のカラムクロマトグラフィーによって精製され、黄色の残留物を得た。これは、分取HPLC(カラム:Synergi−MAXRP4μ,21.20×250mm;流速:12ml/分;移動相:溶媒A:H2O/ギ酸アンモニウム緩衝液pH3.45,溶媒B:MeCN/H2O90:10;方法:勾配,溶媒A:溶媒B90:10から10:90から0:100,30分かけて)により更に精製され、白い泡として12(89.3mg,33%,HPLC純度:99.5%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)8.56(s,1H),8.43−8.41(m,1H),8.04(d,J=8.2Hz,1H),7.92(d,J=8.4Hz,1H),7.73−7.67(m,1H),7.60−7.56(m,1H),7.51−7.45(m,2H),7.22−7.17(m,1H),7.10(s,1H),6.98及び6.92(2s,1H),6.55(t,J=5.6Hz,1H),5.47−5.44(m,1H),4.40−4.36(m,1H),4.30−4.19(m,3H),4.04−3.86(m,4H),3.86−3.75(m,1H),3.80及び3.79(2s,3H),3.52−3.46(m,1H),3.38−3.22(m,3H),3.21−3.15(m,1H),2.09−1.99(m,1H),1.94−1.85(m,3H),1.78−1.74(m,2H),1.69−1.60(m,2H),1.55−1.40(m,2H),1.47and1.47(2s,18H),1.28−1.23(m,1H),1.15−1.10(m,3H).HRMSm/z1035.3162[(M+Na)+,C49H62ClN4NaO11PS2として計算:1035.3175].
乾燥DCM(2mL)中の12(84.0mg,0.0829mmol)及びTFA(1mL)の混合物が室温で40分間攪拌された。次いで、溶媒は25℃で真空下で除去され、緑色の残留物を得た。残留物はDCMに溶解され、溶液はEtOAcで希釈され、DCMは真空下で除去され、白色の固体を得て、残りの溶媒はデカントされた。このプロセスは繰り返され、得られた固体はEtOAcで粉砕され、乾燥され、白色の固体として、化合物13(化合物番号82,43.8mg,59%,HPLC純度:93.8%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)8.47(s,1H),8.44−8.42(m,1H),8.08(d,J=8.3Hz,1H),7.90(d,J=8.3Hz,1H),7.74−7.68(m,1H),7.58−7.54(m,1H),7.51−7.48(m,1H),7.47−7.43(m,1H),7.22−7.18(m,1H),7.10(s,1H),6.98and6.93(2s,1H),5.46(d,J=9.5Hz,1H),4.39−4.18(m,4H),4.04−3.95(m,3H),3.90−3.85(m,1H),3.84−3.76(m,1H),3.80及び3.80(2s,3H),3.52−3.47(m,1H),3.40−3.27(m,3H),3.21−3.15(m,1H),2.10−2.02(m,1H),1.94−1.88(m,3H),1.78−1.74(m,2H),1.69−1.60(m,2H),1.48−1.42(m,2H),1.35−1.23(m,1H),1.16−1.10(m,3H),3H(観測されず)。HRMSm/z923.1938[(M+Na)+,C41H46ClN4NaO11PS2として計算:923.1923].
乾燥DMA(3mL)中の10(45.0mg,0.0743mmol),67d(24.3mg,新たに上記の手順により作製)、EDCI.HCl(42.7mg,0.223mmol)及びTsOH(3mg,0.0174mmol)の混合物は、窒素下で、室温で5時間攪拌された。67d(24.3mg,0.0899mmol)及びEDCI.HCl(16.0mg,0.0835mmol)の付加的部分が混合物に添加され、反応物をは室温で撹拌された。22時間後、反応混合物は、EtOAcで希釈され、H2O(2×)、かん水(1×)で洗浄され、乾燥され(Na2SO4)、溶媒は真空下で除去された。粗生成物は、EtOAcを使用してシリカ上のカラムクロマトグラフィーによって精製され、緑色の粉末を得た。これは、EtOAcをもう一度使用するシリカゲル上でカラムクロマトグラフィーを行って更に精製され、ベージュ色の固体として、化合物14(化合物番号83,8.3mg,13.5%,HPLC純度:81.2%)を得た。1H NMRδ(400MHz,DMSO−d6)10.33(s,1H),8.43−8.42(m,1H),8.07(d,J=8.1Hz,1H),7.98(s,1H),7.77(d,J=8.4Hz,1H),7.74−7.67(m,1H),7.50−7.46(m,2H),7.33−7.29(m,1H),7.24−7.18(m,1H),7.10(s,1H),6.98及び6.92(2s,1H),6.56(t,J=6.0Hz,1H),5.47−5.44(m,1H),4.33−4.21(m,2H),4.15−4.13(m,2H),4.05−3.93(m,3H),3.90−3.75(m,2H),3.80及び3.79(2s,3H),3.52−3.47(m,1H),3.38−3.13(m,4H),2.10−1.99(m,1H),1.94−1.89(m,3H),1.77−1.74(m,2H),1.66−1.62(m,2H),1.52−1.41(m,2H),1.32−1.24(m,1H),1.15−1.10(m,3H).HRMSm/z843.2258[(M+Na)+,C41H45ClN4NaO8S2として計算:843.2260].
トリクロロアセトイミド酸(1)は文献の手順に従って調製された: L. Lazar, E. Mezoe, M. Herczeg, A. Liptak, S. Antus, A. Borbas, Tetrahedron 2012, 68, 7386-7399; L. Tietze, H. Schuster, K. Schmuck, I. Schuberth, F. Alves, Bioorg. & Med. Chem. 2008, 16, 6312-6318.
無水CH2Cl2(20mL)中のトリクロロアセトイミド酸(1)(360mg,0.75mmol),フェノール−CBI(2,最初の特許出願中の化合物51a)(200mg,0.60mmol)及び活性化モレキュラーシーブ4Å(1g)の懸濁液は室温で1時間攪拌された。混合物はー10℃へ冷却され、次いでBF3 .OEt2(40μl,0.3mmol)が滴下された。温度は、1時間、−10℃と−5℃の間に保持され、次いで、これは0℃で30分間撹拌された。続いてBF3 .OEt2(0.24mL,1.8mmol)が0℃で滴下され、温度を室温に上昇させ、それを2時間撹拌した。次いで、懸濁液はセライト上で濾過され、溶媒を蒸発させて、粗CBI−グルクロニド(3)を得て、これは精製せずに次の工程で使用された。無水DMA(4mL)中のアミン(3)及びビス酸(4、最初の特許出願中の化合物66h)(126mg,0.24mmol)の溶液は0℃に冷却された。次いで、pTsOH(17mg,0.096mmol)及びEDCI.HCl(276mg,1.44mmol)が添加され、温度を室温に上昇させ、それを16時間撹拌した。溶媒は減圧下で除去され、残留物はカラムクロマトグラフィー(SiO2,CH2Cl2/MeOH0−2%)次いで(SiO2,CH2Cl2/MeOH1−2%)により精製され、黄色い固体として、(1S)−1−(クロロメチル)−3−((2E)−3−{4−((1E)−3−{(1S)−1−(クロロメチル)−5−[(2,3,4−トリ−O−アセチル−6−メチル−β−D−グルコピラヌロノシル)オキシ]−1,2−ジヒドロ−3H−ベンゾ[e]インドール−3−イル}−3−オキソ−1−プロペニル)−2−[(3−{[(9H−フルオレン−9−イルメトキシ)カルボニル]アミノ}プロパノイル)アミノ]フェニル}−2−プロペノイル)−1,2−ジヒドロ−3H−ベンゾ[e]インドール−5−イル メチル2,3,4−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシドウロン酸(5)(127mg,27%)を得た。1H NMR(300MHz,[(CD3)2SO])d10.04(s,1H,NH),8.38(br s,2H),8.11(d,J=8.1Hz,1H),7.97(d,J=8.5Hz,2H),7.93(d,J=8.2Hz,2H),7.83−7.88(m,4H),7.78(d,J=7.6Hz,1H),7.68−7.72(m,3H),7.59(t,J=7.5Hz,2H),7.45−7.48(m,3H),7.38(t,J=7.4Hz,2H),7.25−7.29(m,4H),5.85(d,J=7.7Hz,1H),5.83(d,J=7.8Hz,1H),5.62−5.65(m,2H),5.32(t,J=8.7Hz,2H),5.14(t,J=9.6Hz,2H),4.78(t,J=8.2Hz,2H),4.55(m,4H),4.31−4.38(m,4H),4.22(t,J=6.9Hz,1H),4.01−4.03(m,2H),3.91−3.96(m,2H),3.65(s,3H),3.63(s,3H),3.36−3.38(m,2H),2.59−2.64(m,2H),1.98−2.03(m,18H);LC−MS(ESI)C82H79Cl2N4O25として計算:(M+H)+m/z1591.4, found m/z1591.4;C82H78Cl2N4O25として計算:Na(M+Na)+m/z1613.4, found m/z1613.4.
無水DMF(5mL)中の誘導体(5)(110mg,0.07mmol)及びピペリジン(468mL,0.7mmol)の溶液は室温で30分間撹拌された。溶媒は室温で減圧下で除去され、残留物は冷Et2Oで粉砕され、粗い(1S)−3−{(2E)−3−[2−[(3−アミノプロパノイル)アミノ]−4−((1E)−3−{(1S)−1−(クロロメチル)−5−[(2,3,4−トリ−O−アセチル−6−メチル−β−D−グルコピラヌロノシル)オキシ]−1,2−ジヒドロ−3H−ベンゾ[e]インドール−3−イル}−3−オキソ−1−プロペニル)フェニル]−2−プロペノイル}−1−(クロロメチル)−1,2−ジヒドロ−3H−ベンゾ[e]インドール−5−イル メチル2,3,4−トリ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシドウロン酸(6)(86mg,90%)を得て、これは精製せずに次の工程で使用された。1H NMR(300MHz,[(CD3)2SO]d8.38(br s,2H),8.10(d,J=8.4Hz,1H),7.98(d,J=8.4Hz,2H),7.94(d,J=8.4Hz,2H),7.90(s,1H),7.88(d,J=15.1Hz,1H),7.76(d,J=7.6Hz,1H),7.70(d,J=15.1Hz,1H),7.59(t,J=7.9Hz,2H),7.47(t,J=7.9Hz,2H),7.27(dd,J=3.4,15.3Hz,2H),5.85(d,J=7.8Hz,1H),5.84(d,J=7.8Hz,1H),5.63−5.68(m,2H),5.32(dd,J=7.8,9.6Hz,2H),5.14(dt,J=1.5,9.6Hz,2H),4.79(d,J=9.6Hz,2H),4.56−4.60(m,4H),4.29−4.41(m,2H),4.02−4.04(m,2H),3.92−3.97(m,2H),3.67(s,6H),2.93(t,J=6.4Hz,2H),2.03−2.04(m,18H),2H(DMSOピーク下),NH及びNH2は観測されなかった。
MeOH/CH2Cl2(10mL)の(1:1)混合物中のアミン(6)(110mg,0.08mmol)の攪拌溶液に、0℃で、MeOH(1mL)中のNaOMe(8.7mg,0.16mmol)の溶液が滴下され、反応混合物は2時間0℃で攪拌された。次いで、AcOH(8滴)が添加され、溶媒は室温で減圧下で除去され、高真空下で乾燥され、オレンジ色の固体として、(1S)−3−{(2E)−3−[2−[(3−アミノプロパノイル)アミノ]−4−((1E)−3−{(1S)−1−(クロロメチル)−5−[(6−メチル−β−D−グルコピラヌロノシル)オキシ]−1,2−ジヒドロ−3H−ベンゾ[e]インドール−3−イル}−3−オキソ−1−プロペニル)フェニル]−2−プロペノイル}−1−(クロロメチル)−1,2−ジヒドロ−3H−ベンゾ[e]インドール−5−イル メチル−β−D−グルコピラノシドウロン酸(7)を得て、これは精製せずに次の工程で使用された。無水DMF(5mL)中のアミン(7)とN−スクシンイミジル−6−マレイミドヘキサン酸(24mg,0.077mmol)の撹拌溶液にDIEA(78mL,0.1mmol)が添加され、混合物は室温で一晩撹拌された。次いで、溶媒は室温で減圧下で除去され、残留物はカラムクロマトグラフィー(SiO2,EtOAc/MeOH10−20%)次いで2回(SiO2,EtOAc/MeOH15%)により精製され、黄色い固体として、(1S)−1−(クロロメチル)−3−((2E)−3−{4−((1E)−3−{(1S)−1−(クロロメチル)−5−[(6−メチル−β−D−グルコピラヌロノシル)オキシ]−1,2−ジヒドロ−3H−ベンゾ[e]インドール−3−イル}−3−オキソ−1−プロペニル)−2−[(3−{[6−(2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)ヘキサノイル]アミノ}プロパノイル)アミノ]フェニル}−2−プロペノイル)−1,2−ジヒドロ−3H−ベンゾ[e]インドール−5−イル メチル−β−D−グルコピラノシドウロン酸 8(化合物番号84)(31mg,34%)を得た。HPLC純度95.9%;1H NMR(300MHz,[(CD3)2SO]d10.01(s,1H),8.32(s,2H),8.31(d,J=8.6Hz,2H),8.09(d,J=8.2Hz,1H),7.89−7.95(m,3H),7.84(t,J=7.6Hz,2H),7.77(d,J=8.0Hz,1H),7.70(d,J=15.1Hz,1H),7.58(t,J=7.9Hz,2H),7.43(t,J=8.0Hz,2H),7.27(d,J=15.6Hz,2H),6.96(s,2H),5.67(d,J=5.3Hz,1H),5.66(d,J=5.3Hz,1H),5.45(d,J=5.6Hz,2H),5.35(d,J=4.6Hz,2H),5.16(d,J=7.5Hz,2H),4.52−4.62(m,4H),4.33(br s,2H),3.99−4.04(m,4H),3.93(dd,J=7.4,10.5Hz,2H),3.68(s,3H),3.67(s,3H),3.37−3.48(m,8H),2.57−2.61(m,2H),2.09(t,J=7.3Hz,2H),1.41−1.54(m,4H),1.14−1.23(m,4H);HRMS(ESI)C65H67Cl2N5NaO20として計算:(M+Na+)m/z1330.3649; found m/z1330.3600.
NMP(10mL)中の1(500mg,3.22mmol)及びN,N−ジメチルホルムアミドジ−tert−ブチル アセタール(2,5.24g,25.77mmol)が100℃まで加熱され、一晩撹拌された。ほとんどの揮発性成分は減圧下で除去され、得られた残留物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、シリカのパッドを通して濾過した。溶媒は除去され、3は、蒼白色の結晶性固体(331mg,38%)として得られた;1H NMR(DMSO)δ12.26(s,1H),6.68(d,J=2.0Hz,2H),1.51(s,18H)ppm.HRMS(ESI) found m/z290.1362(M+Na).C14H21NNaO4 requires 290.1363.
MeCN(1mL)中の3(50mg,0.18mmol),K2CO3(52mg,0.37mmol),MeI(0.12mL,1.87mmol)及びヨウ化テトラブチルアモニウム(3.5mg,0.0094mmol)と水(0.01mL)の混合物は35〜40℃で加熱され、3日間攪拌された。反応混合物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、シリカのパッドを通して濾過した。溶媒は除去され、4は、蒼白色の油状物として得られ、これは、数時間で無色の結晶性固体となった;1H NMR(CDCl3)δ6.77(s,2H),4.21(s,3H),1.56(s,18H)ppm.HRMS(ESI) found m/z304.1512(M+Na).C15H23NNaO4 requires 304.1519.
DCM(1mL)中の4(45mg,0.16mmol)の溶液に、室温で、TFA(0.5mL,6.49mmol)が添加された。混合物は3時間撹拌され、ピンク色の溶液を得た。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物は石油エーテルで粉砕され、ピンク色の固体として5(25mg,93%)を得た。1H NMR(DMSO)δ12.81(s,2H),6.80(s,2H),4.15(s,3H)ppm.HRMS(ESInegative) found m/z168.0306(M−H).C7H6NO4 requires 168.0302.
DCM(2mL)中のBoc−CBI−OH(Comp51a,130mg,0.39mmol)の溶液に、室温で、ジオキサン中の4NのHCl(2mL)が添加された。混合物は2.5時間撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物(6)はそのまま直接使用された。
DMA(2mL)中の6(上記で作製)、5(22mg,0.13mmol)、EDCI塩酸塩(150mg,0.78mmol)及びp−トルエンスルホン酸(2.2mg,0.013mmol)の混合物は室温で一晩撹拌された。ほとんどの揮発性成分は除去され、得られた残留物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、セライトのパッドを通して濾過した。溶媒は除去され、得られた残留物は溶離液としてMeOH及びDCM(v/v 2%)の混合物を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製され、オフホワイトの固体として、7(化合物番号15、表1)(60mg,77%)を得た。1H NMR(DMSO)δ10.43(s,2H),8.12(d,J=8.3Hz,2H),7.83(d,J=8.3Hz,2H),7.73(br s,2H),7.52(dd,J=1.0,8.0Hz,2H),7.37(dd,J=0.4,8.0Hz,2H),6.77(s,2H),4.62−4.57(m,2H),4.31−4.27(m,2H),4.10−4.07(m,2H),4.02−4.00(m,2H),3.88−3.85(m,5H)ppm.HRMS(ESI) found m/z622.1255(M+Na).C33H27Cl2N3NaO4 requires 622.1271.
氷浴中のTHF(5mL)及びピリジン(5mL)中の1(66f,500mg,1.45mmol)の溶液に、塩化アセチル(0.50mL,7.03mmol)が添加された。混合物は室温まで温められ、一晩攪拌された。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物は酢酸エチルと重炭酸ナトリウム水溶液との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、セライトのパッドを通して濾過した。溶媒は除去され、得られた残留物は、溶離液として酢酸エチルと石油エーテルの混合物(v/v 1:2)を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製され、オフホワイトの固体として、2(475mg,85%)を得た;1H NMR(CDCl3)δ8.00(s,1H),7.70(d,J=15.8Hz,1H),7.55−7.51(m,2H),7.31(明らかなd,J=8.6Hz,2H),6.40(d,J=16.0Hz,1H),6.37(d,J=15.8Hz,1H),2.25(s,3H),1.54(s,9H),1.53(s,9H)ppm.HRMS(ESI) found m/z410.1921(M+Na).C22H29NNaO5 requires 410.1938.
DCM(5mL)中の2(470mg,1.21mmol)の溶液に、室温で、TFA(2.5mL,32.40mmol)が添加された。混合物は3時間撹拌され、白色懸濁液を得た。追加のDCMが添加され、より多くの固体を沈殿させ、これを濾過により回収し、酢酸エチル及び石油エーテルで洗浄した。3は白色固体(290mg,87%)として得られた。1H NMR(DMSO)δ12.40(br s,2H),9.89(s,1H),7.85(d,J=8.3Hz,1H),7.70(明らかなd,J=16.0Hz,2H),7.57−7.53(m,2H),6.54(d,J=15.9Hz,1H),6.53(d,J=16.0Hz,1H),2.09(s,3H)ppm.HRMS(ESI) found m/z298.0672(M+Na).C14H13NNaO5 requires 298.0686.
DCM(3mL)中のBoc−CBI−OH(Comp51a,291mg,0.87mmol)の溶液に、室温で、ジオキサン中の4NのHCl(3mL)が添加された。混合物は2.5時間撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物(4)はそのまま直接使用された。
DMA(3mL)中の4(上記で作製)、3(80mg,0.29mmol)、EDCI塩酸塩(334mg,1.74mmol)及びp−トルエンスルホン酸(5mg,0.029mmol)の混合物は室温で一晩撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物はメタノールで数回粉砕され、粗生成物(123mg)を得て、これをTHFに溶解させ、MeOHの添加により沈殿させ、黄色の固体として5(化合物番号16、表1)(96mg,47%,HPLC純度97%)を得た;1H NMR(DMSO)δ10.43(s,2H),9.97(s,1H),8.12−8.07(m,5H),7.85−7.81(m,4H),7.74(明らかなd,J=6.7Hz,1H),7.68(d,J=15.4Hz,1H),7.73(t,J=7.4Hz,2H),7.35(t,J=7.5Hz,2H),7.26(dd,J=3.2,15.3Hz,2H),4.58−4.46(m,4H),4.28−4.22(m,2H),4.05−3.98(m,2H),3.88−3.82(m,2H),2.15(s,3H)ppm.HRMS(ESI) found m/z728.1662(M+Na).C40H33Cl2N3NaO5 requires 728.1689.
ドライアイス−MeCN浴中のー30℃から−40℃での乾燥THF(12mL)中の1(2.50g,13.30mmol)の溶液に、N2下で、三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート(BF3・Et2O,4.92mL,39.90mmol)が滴下された。混合物を10分間−30℃で撹拌した後、tBuONO(2.39mL,19.94mmol)が滴下された。反応混合物は室温まで温められ、1.5時間攪拌され、懸濁液を得た。石油エーテル(50mL)が添加され、追加の沈殿物を得た。上清はデカンテーションにより除去され、残された固体は石油エーテルで洗浄され、白色の固体を得た。この固体は乾燥MeCN(20mL)に溶解され、氷浴中で冷却された。KI(11.00g,66.26mmol)及びI2(6.00g,23.64mmol)が添加された。反応混合物は室温で4時間撹拌され、その後飽和Na2S2O3水溶液(50mL)が添加され、反応をクエンチした。混合物を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、セライトのパッドを通して濾過した。溶媒は除去され、得られた残留物は、溶離液として酢酸エチルと石油エーテルの混合物(v/v 1:9)を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製され、蒼白色の固体として、2(2.83g,71%)を得た;1H NMR(CDCl3)δ7.50(d,J=8.5Hz,1H),7.16(d,J=2.2Hz,1H),6.84(dd,J=2.2,8.5Hz,1H),5.39(s,1H)ppm.
再蒸留トリエチルアミン(5mL)中の2(500mg,1.67mmol),tert−ブチルアクリレート(0.728mL,5.02mmol),酢酸パラジウム(II)(7.5mg,0.033mmol)及びトリ−オルト−トリルホスフィン(41mg,0.13mmol)はN2下で一晩還流で加熱され、濃い灰色の懸濁液を得た。全ての揮発性成分が排出された。得られた残留物は酢酸エチルに溶解され、沈殿物は濾過された。濾液を蒸発させ、得られた残留物は、溶離液として酢酸エチルと石油エーテルの混合物(v/v 1:6)を使用するカラムクロマトグラフィーにより精製され、オフホワイトの固体として、3(160mg,28%)を得た。1H NMR(DMSO)δ10.43(s,1H),7.75(d,J=16.4Hz,1H),7.63(d,J=8.4Hz,1H),7.45(d,J=16.0Hz,1H),7.18(d,J=8.0Hz,1H),7.07(d,J=0.8Hz,1H),6.56(d,J=16.4Hz,1H),6.41(d,J=15.6Hz,1H),1.483(s,9H),1.478(s,9H)ppm.HRMS(ESI) found m/z369.1687(M+Na).C20H26NaO5 requires 369.1672.
DMF(2mL)中の3(160mg,0.46mmol)の溶液に、K2CO3(254mg,1.84mmol)及びMeI(0.28mL,4.50mmol)が添加された。混合物は一晩、室温で撹拌され、沈殿物は濾過された。得られた濾液を水、続いてかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、セライトのパッドを通して濾過した。溶媒は除去され、得られた残留物は、溶離液として酢酸エチルと石油エーテルの混合物(v/v 1:10)を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製され、無色の油状物として、4(72mg,43%)を得た;1H NMR(CDCl3)δ7.87(d,J=16.2Hz,1H),7.54(d,J=15.9Hz,1H),7.49(d,J=8.0Hz,1H),7.10(dd,J=1.3,8.0Hz,1H),7.00(d,J=1.2Hz,1H),6.47(d,J=16.1Hz,1H),6.38(d,J=15.9Hz,1H),3.91(s,3H),1.539(s,9H),1.533(s,9H)ppm.HRMS(ESI) found m/z383.1838(M+Na).C21H28NaO5 requires 383.1829.
DCM(2mL)中の4(70mg,0.19mmol)の溶液に、室温で、TFA(1mL,12.98mmol)が添加された。混合物は2.5時間撹拌され、白色懸濁液を得た。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物はDCMで粉砕され、白色の固体として5(41mg,85%)を得た。1H NMR(DMSO)δ12.41(br s,2H),7.80(d,J=16.2Hz,1H),7.72(d,J=8.0Hz,1H),7.58(d,J=16.0Hz,1H),7.41(d,J=1.2Hz,1H),7.30(dd,J=1.0,8.1Hz,1H),6.47(d,J=16.0Hz,1H),6.38(d,J=16.1Hz,1H),3.92(s,3H)ppm.HRMS(ESI) found m/z271.0573(M+Na).C13H12NaO5 requires 271.0577.
DCM(2mL)中のBoc−CBI−OH(Comp51a,161mg,0.48mmol)の溶液に、室温で、ジオキサン中の4NのHCl(2mL)が添加された。混合物は2.5時間撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物(6)はそのまま直接使用された。
DMA(1mL)中の6(上記で作製)、5(40mg,0.16mmol)、EDCI塩酸塩(185mg,0.97mmol)及びp−トルエンスルホン酸(2.8mg,0.016mmol)の混合物は室温で一晩撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物はメタノールで粉砕され、黄色の固体を得て、これをTHFに溶解させ、メタノールの添加により沈殿させ、黄色の固体として7(化合物番号17、表1)(45mg,41%,HPLC純度98%)を得た;1H NMR(DMSO)δ10.43(s,2H),8.12−8.10(m,4H),8.00−7.95(m,2H),7.85−7.80(m,2H),7.72(d,J=15.4Hz,1H),7.54−7.50(m,4H),7.37−7.26(m,4H),4.57−4.45(m,4H),4.28−4.22(m,2H),4.00−3.99(m,5H),3.90−3.83(m,2H)ppm.HRMS(ESI) found m/z701.1596(M+Na).C39H32Cl2N2NaO5 requires 701.1580.
1は文献の方法を使用して調製された(参考:Russ J Org Chem, 2007, 43, 855-860)。
2
MeCN(2mL)中の1(50mg,0.41mmol),K2CO3(112mg,0.81mmol),MeI(0.25mL,4.06mmol)及びヨウ化テトラブチルアモニウム(7.5mg,0.020mmol)と水(0.02mL)の混合物は40℃で加熱され、3時間攪拌された。ほとんどの揮発性成分は減圧下で除去され、得られた残留物は酢酸エチルと水との間で再分配された。水相を酢酸エチルで3回抽出した。混合された有機抽出物を水、続いてかん水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、シリカのパッドを通して濾過した。溶媒は除去され、白色の固体として2(47mg,84%)が得られ;報告されたものと同一の1H NMRスペクトルを得た(参考:C. E. Loader, G. H. Barnett and H. J. Anderson, Can. J. Chem., 1982, 60, 383)。
4
DCM(3mL)中の2(40mg,0.29mmol)及びメチル(トリフェニルホスホラニリデン)アセタート(3,400mg,1.20mmol)の混合物は2日間攪拌され、黄色い溶液を得た。混合物は、溶離液として酢酸エチルと石油エーテルの勾配混合物(v/v =1:5,1:4及び1:3)を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製され、黄色い固体として4(63mg,87%)を得た;1H NMR(CDCl3)δ7.61(d,J=15.6Hz,2H),6.70(s,2H),6.26(d,J=15.6Hz,2H),3.79(s,6H),3.73(s,3H)ppm.HRMS(ESI) found m/z272.0898(M+Na).C13H15NNaO4 requires 272.0893.
5
EtOH(2mL)及びTHF(1mL)中の4(60mg,0.24mmol)及びKOH(100mg,1.78mmol)の混合物は、70℃で2時間攪拌された。混合物を乾燥するまで減圧下で蒸発させた。得られた残留物は水に溶解されpH5まで1NのHClで酸性化され、黄色の沈殿物を得、これを濾過によって回収し、その後、水及び石油エーテルで洗浄され、黄色の固体として5(51mg,96%)を得た;1H NMR(DMSO)δ12.20(s,2H),7.54(d,J=15.6Hz,2H),6.89(s,2H),6.30(d,J=15.6Hz,2H),3.70(s,3H)ppm.HRMS(ESI) found m/z244.0590(M+Na).C11H11NNaO4 requires 244.0580.
7
DCM(2mL)中のBoc−CBI−OH(Comp51a,200mg,0.60mmol)の溶液に、室温で、ジオキサン中の4NのHCl(10mL)が添加された。混合物は2時間撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物(6,comp67d)はそのまま直接使用された。
DMA(2mL)中の6(上記で作製)、5(49mg,0.22mmol)、EDCI塩酸塩(255mg,1.33mmol)及びp−トルエンスルホン酸(3.8mg,0.022mmol)の混合物は室温で一晩撹拌された。溶媒は除去され、得られた残留物は、MeOHと酢酸エチルの混合物(v/v 3%)を使用するカラムクロマトグラフィーにより精製され、粗生成物は酢酸エチルにより粉砕され、オレンジ色の固体として7(60mg,41%,HPLC100%)を得た;1H NMR(DMSO)δ10.41(s,2H),8.11(d,J=8.2Hz,4H),7.81(d,J=8.3Hz,2H),7.70(d,J=14.9Hz,2H),7.50(t,J=7.4Hz,2H),7.33(t,J=7.5Hz,2H),7.12(s,2H),7.01(d,J=14.9Hz,2H),4.49−4.42(m,4H),4.24−4.19(m,2H),4.01−3.97(m,2H),3.85−3.82(m,5H)ppm.HRMS(ESInegative) found m/z650.1600(M−H).C37H30Cl2N3O4 requires 650.1619.
2
化合物2は、米国特許第2007/49758号に記載されたものに基づいて修飾された手順により合成された。DCM(100mL)中の1(5.50g,25.00mmol)及び酢酸銀(I)(6.26g,37.5mmol)の懸濁液に、DCM(150mL)中のヨード溶液(6.98g,27.50mmol)が滴下された。得られた混合物は室温で一晩撹拌され、次いでセライトのパッドを通して濾過された。濾液を蒸発させ、得られた残留物は、溶離液として酢酸エチルと石油エーテルの混合物(v/v 1:10)を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製され、白色の固体として、2(966mg,11%)を得た;;mp 97−99℃.1H NMR(CDCl3)δ7.342(d,J=8.3Hz,1H),7.339(d,J=2.0Hz,1H),7.00(dd,J=2.0,8.3Hz,1H),5.32(s,1H)ppm.13CNMR(CDCl3,100.6MHz)δ155.70,139.46(CH),131.80(CH),124.44(CH),94.65,85.52ppm.
3
DMF(4mL)中の2(270mg,0.78mmol)の溶液に、K2CO3(162mg,1.17mmol)及びMeI(0.24mL,3.90mmol)が添加された。混合物は室温で2時間攪拌された。混合物はシリカゲルのパッドを通して濾過され、濾液を蒸発させて、無色油状物として3(277mg,99%)を得た;1H NMR(CDCl3)δ7.45(d,J=8.1Hz,1H),7.09(d,J=1.8Hz,1H),7.04(dd,J=1.8,8.1Hz,1H),3.87(s,3H)ppm.
4
再蒸留トリエチルアミン(5mL)中の3(274mg,0.76mmol)、tert−ブチルプロピオル酸(0.314mL,2.28mmol),ヨウ化銅(I)(5.8mg,0.030mmol),酢酸パラジウム(II)(3.4mg,0.015mmol)及びトリフェニルホスフィン(12mg,0.046mmol)はN2下で一晩60℃で加熱され、浅黒い懸濁液を得た。全ての揮発性成分が排出された。得られた残留物はDCMに溶解され、沈殿物は濾過された。濾液を蒸発させ、得られた残留物は、溶離液としてDCMと石油エーテルの混合物(v/v 1:1)を使用するカラムクロマトグラフィーにより精製され、オフホワイトの固体として、4(195mg,72%)を得た。1H NMR(CDCl3)δ7.48(d,J=7.9Hz,1H),7.13(d,J=7.9Hz,1H),7.06(s,1H),3.89(s,3H),1.545(s,9H)及び1.514(s,9H)ppm.HRMS(ESI) found m/z379.1510(M+Na).C21H24NaO5 requires 379.1516.
5
DCM(2mL)中の4(100mg,0.28mmol)の溶液に、室温で、TFA(1mL,12.98mmol)が添加された。混合物は2.5時間撹拌され、白色懸濁液を得た。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物はDCMと石油エーテルの混合物(v/v=1:1)で粉砕され、白色の固体として5(66mg,85%)を得た。1H NMR(DMSO)δ13.92(br s,2H),7.61(d,J=7.9Hz,1H),7.37(明らかなs,1H),7.25(dd,J=1.1,7.9Hz,1H),3.90(s,3H)ppm.
7
DCM(3mL)中のBoc−CBI−OH(Comp51a,267mg,0.80mmol)の溶液に、室温で、ジオキサン中の4NのHCl(3mL)が添加された。混合物は2.5時間撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物(6)はそのまま直接使用された。
DMA(1mL)中の6(上記で作製)、5(65mg,0.27mmol)、EDCI塩酸塩(306mg,1.60mmol)及びp−トルエンスルホン酸(4.6mg,0.027mmol)の混合物は室温で一晩撹拌された。全ての揮発性成分は排出され、得られた残留物はメタノールで粉砕され、黄色の固体を得て、これをTHFに溶解させ、メタノールの添加により沈殿させ、黄色の固体として7(140mg,78%,HPLC純度99%)を得た;1H NMR(DMSO)δ10.52(s,2H),8.12(d,J=8.4Hz,2H),7.90−7.85(m,4H),7.76(d,J=7.9Hz,1H),7.56−7.50(m,3H),7.41−7.37(m,3H),4.63−4.49(m,4H),4.29−4.21(m,2H),4.09−4.06(m,2H),4.01(s,3H),3.99−3.94(m,1H),3.91−3.86(m,1H)ppm.HRMS(ESI) found m/z697.1267(M+Na).C39H28Cl2N2NaO5 requires 697.1267.
特定の条件下で、システイン操作抗体は、DTT(クレランド試薬、ジチオトレイトール)又はTCEP(トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩;Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA)などの還元剤で処理することにより、表4のものなどの本発明のリンカー−薬物中間体とのコンジュゲーションのための反応を行い得る。CHO細胞で発現される全長システイン操作モノクローナル抗体(ThioMab)(Gomez et al (2010) Biotechnology and Bioeng. 105(4):748-760; Gomez et al (2010) Biotechnol. Prog. 26:1438-1445)は、例えば、約50倍過剰のDTTで室温で一晩還元され、新たに導入されたシステイン残基と培養培地中に存在するシステインとの間に形成され得るジスルフィド結合を還元する。
軽鎖アミノ酸はKabatに従って番号付けされる(Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, (1991) 5th Ed., US Dept of Health and Human Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)。重鎖アミノ酸は、Kabatシステムと記された場合を除いてEU番号付けシステムに従って番号付けされる(Edelman et al (1969) Proc. Natl. Acad of Sciences 63(1):78-85)。一文字アミノ酸略語が使用される。
CHO細胞で発現された全長のシステイン操作モノクローナル抗体(ThioMab)は、細胞培養条件によって、システイン付加体(システイン)を有するか又は操作されたシステインにグルタチオン付加される。操作されたシステインの反応性チオール基を遊離させるために、ThioMabを、pHが約8.0にて、500mMのホウ酸ナトリウム及び500mM塩化ナトリウムに溶解させ、1mMのTCEP(トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA)の約50〜100倍過剰で約1〜2時間37℃で還元する。あるいは、DTTを還元試薬として用いることができる。鎖間ジスルフィド結合の形成は、非還元SDS−PAGEによるか、又は逆相HPLC PLRPカラムクロマトグラフィーを変性させるの何れかによってモニターした。還元されたThioMabは10mM酢酸ナトリウムpH5で希釈され、HiTrap SP FFカラム上にロードされ、0.3M塩化ナトリウムを含むPBS、又は150mMの塩化ナトリウムを含む50mMのTris−Cl、pH7.5で溶出した。
ジスルフィド結合は、再酸化を行うことで、親Mabに存在するシステイン残基の間で再確立された。溶出され還元されたThioMabは、室温で一晩、pH7で3時間若しくは50mMのTris−Cl中でpH7.5で3時間、15×若しくは2mMのデヒドロアスコルビン酸(DHAA)で、又は2mMの硫酸銅水溶液(CuSO4)で処理された。当技術分野で知られている他のオキシダント、すなわち酸化剤、及び酸化条件が使用されてもよい。周囲の空気酸化もまた有効であり得る。この穏やかな、部分酸化工程は、高忠実度で効率的に鎖内ジスルフィドを形成する。緩衝液はセファデックスG25樹脂上で溶出によって交換され、1mMのDTPAを含むPBSで溶出される。チオール/Abの値が、溶液の280nmでの吸光度から還元された抗体濃度を決定すること及びDTNB(Aldrich,Milwaukee,WI)との反応によるチオール濃度を決定すること、及び412nmでの吸光度の決定によりチェックされる。
液体クロマトグラフィー/質量分析は、拡張された質量範囲でTSQ量子トリプル四重極TM質量分析計で行った(Thermo Electron,San Jose California)。サンプルは75℃に加熱したPRLP−S(登録商標)、1000A、マイクロボアカラム(50mm×2.1mm,Polymer Laboratories,Shropshire,UK)でクロマトグラフィーにかけた。30−40%のBの直線勾配(溶媒A:0.05%TFA水溶液:アセトニトリル中0.04%のTFA)が用いられ、溶離液は、エレクトロスプレー源を使用して直接イオン化された。データは、Xcalibur(登録商標)データシステムによって収集され、デコンボリューションは、ProMass(登録商標)(Novatia,LLC,NewJersey)を用いて行った。LC/MS分析の前に、抗体又は薬剤コンジュゲート(50マイクログラム)がPNGase F(2単位/ml;PROzyme,San Leandro,CA)により37℃で2時間処理され、N結合型糖を除去した。
疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)のサンプルが、ブチルHIC NPRカラム(2.5ミクロンの粒子サイズ、4.6mm×3.5cm)(東ソーバイオサイエンス)に注入され、0.8ml/分で0から70%のBの線形勾配で溶出した(A:50mMリン酸カリウム中1.5Mの硫酸アンモニウム、pH7、B:50mMのリン酸カリウムpH7、20%イソプロパノール)。多波長検出器とChemstationソフトウエアを備えたAgilent 1100シリーズHPLCシステムが、抗体当たりの薬剤の異なる比率を有する抗体種を分離し、定量化するために使用された。
実施例19の還元と再酸化法の後、抗体をPBS(リン酸緩衝生理食塩水)緩衝液に溶解し、氷上で冷却した。マレイミド又はブロモ酢酸などのチオール反応性官能基を含む、限定されないが表4の51〜58を含む、リンカー−薬物中間体の、過剰の約1.5モルから20当量がDMSOに溶解され、アセトニトリルと水で希釈され、PBS中で冷却され還元され再酸化された抗体に添加された。約1時間後、過剰のマレイミドを添加して反応を停止させ、未反応抗体のチオール基を覆った。コンジュゲーション混合物がロードされ、HiTrap SP Ffカラムを通して溶出され、過剰な薬物−リンカー中間体及び他の不純物を除去した。反応混合物を遠心限外濾過により濃縮し、システイン操作抗体−薬物コンジュゲートを精製し、PBS中でのG25樹脂を通する溶出によって脱塩し、無菌条件下で0.2μmのフィルターを通して濾過し、貯蔵のために凍結した。
上記の手順で、表3のシステイン操作型抗体−薬物コンジュゲートが調製された。
ADCの有効性は、以下のプロトコルを用いて細胞増殖アッセイにより測定した(CELLTITER GLOTM Luminescent Cell Viability Assay,Promega Corp.Technical Bulletin TB288;Mendoza et al (2002) Cancer Res. 62:5485-5488):
1.培地に約104細胞(SKBR−3,BT474,MCF7又はMDA−MB−468)を含む細胞培養物の100μlのアリコートを、96ウェルの不透明壁のプレートの各ウェルに沈着させた。
2.コントロールウェルは細胞無しで培地を含有して調製した。
3.ADCを実験ウェルに添加し、3−5日間インキュベートした。
4.プレートを約30分間室温にて平衡化した。
5.各ウェル中に存在する細胞培養培地の容積に等しい容積のCELLTITER GLOTM試薬を加えた。
6.内容物をオービタルシェーカーで2分間混合して細胞溶解を誘導した。
7.プレートは、発光シグナルを安定化させるために10分間室温でインキュベートした。
8.発光を記録し、RLU=相対発光単位としてグラフにて報告された。
データは、標準偏差誤差バーと共に、反復の各組について発光の平均値としてプロットされている。プロトコルはCELLTITER GLOTM発光細胞の変形である。
培地:SK−BR−3は50/50/10%FBS/グルタミン/250μg/mL G−418で生育し、OVCAR−3はRPMI/20%FBS/グルタミンで生育する。
第0日目の単一処置の前に、腫瘍は確立され、体積で150〜200mm3まで増殖させた。腫瘍体積は、次式に従ってキャリパーを用いて測定した:V(mm3)=0.5A×B2、ここでA及びBは、それぞれ、長い及び短い直径である。腫瘍体積が3000mm3に到達する前に、又は腫瘍が切迫した潰瘍の兆候を示したとき、マウスを安楽死させた。各実験群(1群あたり10匹のマウス)から収集されたデータは、平均±SEとして表した。
Fo5マウス乳腺腫瘍モデルが、前述のように単一用量の静脈注射後に、本発明の抗体−薬物コンジュゲートのインビボ有効性を評価するために採用され(Phillips GDL, Li GM, Dugger DL, et al. Targeting HER2-Positive Breast Cancer with Trastuzumab-DM1, an Antibody-Cytotoxic Drug Conjugate. (2008) Cancer Res. 68:9280-90)、参照により本明細書に組み込まれる。抗Her2 ADCは、図31及び32に示されるように、Fo5モデル、ヒトHER2遺伝子が、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター(MMTV−HER2)の転写制御下で乳腺上皮において過剰発現されるトランスジェニックマウスモデルを用いて試験された。HER2過剰発現は乳腺腫瘍の自発的な増殖を引き起こす。これらの樹立動物(樹立#5[Fo5])の一匹の乳腺腫瘍は腫瘍断片(〜2×2mmの大きさ)の連続移植によってFVBマウスの後の世代に伝播される。全ての研究は、実験動物の管理と使用に関するガイドラインに従って実施された。各抗体−薬物コンジュゲート(単一用量)は、研究の開始、及び移植後第14日に9匹の動物に静脈内投与した。初期腫瘍サイズは約200mm3の体積であった。本発明による抗体−薬物コンジュゲートとコントロールによる時間の経過による腫瘍増殖阻害の測定は図31〜34に示される。
OVCAR−3乳房脂肪パッド移植有効性モデルが、単回静脈内投与後の腫瘍体積を評価し、腹腔内腫瘍を有するマウスから切除され、その後、レシピエントマウスの乳房脂肪パッドに連続的に継代された腫瘍を用いて、記載されているように(Chen et al. (2007) Cancer Res 67:4924-4932)使用された。
抗Napi2B抗体−薬物コンジュゲート(ADC)の有効性は、Igrov−1(ヒト卵巣癌)のマウス異種移植モデルにおいて調べられた。
メスのC.B−17 SCIDベージュマウス(Charles River Laboratories;San Diego,CA)はそれぞれ、00万のIgrov−1細胞を胸部乳房脂肪パッド領域に接種された。異種移植腫瘍が100〜300mm3の平均腫瘍容積に達したとき(第0日と称す)、動物は、各々7〜10匹ずつの群に無作為化され、ADCの単回静脈内注射を受けた。マウスの腫瘍及び体重は、研究を通して週に1〜2回測定された。マウスは、体重の減少が、その出発重量の>20%であった場合速やかに安楽死させた。全ての動物は、腫瘍が3000mm3に達したか、切迫した潰瘍の兆候を示す前に、安楽死させた。
抗CD33抗体−薬物コンジュゲート(ADC)の有効性は、HL−60又はEOL−1(ヒト急性骨髄性白血病)のマウス異種移植モデルにおいて調べられた。HL−60細胞株は、ATCCから入手され(American Type Culture Collection;Manassas,VA)、EOL−1細胞株は、DSMZに由来する(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures;Braunschweig,Germany)。
メスのC.B−17 SCIDマウス(Charles River Laboratories;Hollister,CA)はそれぞれ、HL−60又はEOL−1の500万細胞を脇腹領域に皮下接種された。異種移植腫瘍が100〜300mm3の平均腫瘍容積に達したとき(第0日と称す)、動物は、各々7〜10匹ずつの群に無作為化され、ADCの単回静脈内注射を受けた。ADCの投与の前の約4時間で、動物は、腹腔内に、腫瘍細胞の可能な非特異的抗体結合部位をブロックする抗gD対照抗体の過剰量(30mg/kg)が投与された。マウスの腫瘍及び体重は、研究を通して週に1〜2回測定された。マウスは、体重の減少が、その出発重量の>20%であった場合速やかに安楽死させた。全ての動物は、腫瘍が3000mm3に達したか、切迫した潰瘍の兆候を示す前に、安楽死させた。
Claims (63)
- 式:
を有する抗体−薬物コンジュゲート化合物であって、
ここで、
Abは抗体であり;
Lは、式:
を有するリンカーであり;
ここでStrは抗体に共有結合したストレッチャー単位であり;Pepは2から12個のアミノ酸残基の任意のペプチド単位であり、Spは二量体の薬物部分に共有結合した任意のスペーサー単位であり、m及びnは0及び1から独立に選択され;
pは1から8の整数であり;
Dは式:
を有する二量体薬物部分であり、
ここで
R1は、H、P(O)3H2、C(O)NRaRb、又はLへの結合から選択され;
R2は、H、P(O)3H2、C(O)NRaRb、又はLへの結合から選択され;
Ra及びRbは、H及び一以上のFで任意置換されたC1−C6アルキルから独立に選択され、
又はRa及びRbは、5又は6員複素環基を形成し;
Tは、C3−C12アルキレン、Y、(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン)、(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン)、(C2−C6アルケニレン)−Y−(C2−C6アルケニレン)及び(C2−C6アルキニレン)−Y−(C2−C6アルキニレン)から選択されるテザー基であり;
ここで、YはO、S、NR1、アリール、及びヘテロアリールから独立に選択され;
ここで、アルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、F、OH、O(C1−C6アルキル)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2、及びC1−C6アルキルで独立に任意置換され、ここでアルキルは、一以上のFで任意置換され;
又はアルキレン、アルケニレン、アリール及びヘテロアリールは、Lへの結合で独立に任意置換され;
D’は
から選択される薬物部分であり、
ここで波線はTへの結合部位を示し;
X1及びX2は、O及びNR3から独立して選択され、ここでR3は、H及び任意で一以上のFで置換されたC1−C6アルキルから選択され;
R4は、H、CO2R、又はLへの結合であり、ここでRはC1−C6アルキル又はベンジルであり;及び
R5は、H又はC1−C6アルキルである、抗体−薬物コンジュゲート化合物。 - Strが式:
を有し、
ここで、R6は、C1−C10アルキレン、C3−C8カルボシクリル、O−(C1−C8アルキル)、アリーレン、C1−C10アルキレン−アリーレン、アリーレン−C1−C10アルキレン、C1−C10アルキレン−(C3−C8カルボシクリル)、(C3−C8カルボシクリル)−C1−C10アルキレン、C3−C8ヘテロシクリル、C1−C10アルキレン−(C3−C8ヘテロシクリル)、(C3−C8ヘテロシクリル)−C1−C10アルキレン、C1−C10アルキレン−C(O)N(R8)−C2−C6アルキレン−N(R8)、N(R8)−(C2−C6アルキレン)及び(CH2CH2O)r−CH2からなる群から選択され;ここでR8は、H又はC1−C6アルキル、rは1から10の範囲の整数である、請求項1に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。 - R6が(CH2)5である、請求項2に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- mが0及びnが0である、請求項1に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- mが0及びnが1である、請求項1に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- Lは、抗体のシステインアミノ酸とジスルフィド結合を形成し、R9は、C2−C6アルキレン−Oであり、ここでアルキレンは、F、OH、O(C1−C6アルキル)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2、及びC1−C6アルキルと任意置換され、ここでアルキルは一以上のFと任意置換される、請求項7に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- mが1及びnが1である、請求項1に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- mが1であり、Pepは、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、リジン、アルギニン、バリン、及びシトルリンから独立に選択される2から12個のアミノ酸残基を含む、請求項1に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- Pepがバリン−シトルリンである、請求項10に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- nが1であり、Spがパラ−アミノベンジル又はパラ−アミノベンジルオキシカルボニルを含む、請求項1に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- アミノ酸側鎖は、H、−CH3、−CH2(C6H5)、−CH2CH2CH2CH2NH2、−CH2CH2CH2NHC(NH)NH2、−CHCH(CH3)CH3、及び−CH2CH2CH2NHC(O)NH2から独立に選択される、請求項13に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- Ra及びRbは、N−メチルピペラジニル、モルホリニル、ピペリジル、及びピロリジニルから選択される5又は6員複素環基を形成する、請求項1に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- Tが、C3−C5アルキレンである、請求項1に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- Tが、(CH2)3、(CH2)4及び(CH2)5から選択される、請求項24に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- Tが、(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン)であり、Yが、Lへの結合で置換されるフェニルである、請求項1に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- Tが、(C2−C6アルケニレン)−Y−(C2−C6アルケニレン)であり、Yが、Lへの結合で置換されるフェニルである、請求項1に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- Yが、フェニル、ピリジル、1−メチル−1H−ベンゾ[d]イミダゾール、及び[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジンから選択される、請求項1に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- 抗体が、(1)〜(51):
(1)BMPR1B(骨形成タンパク質レセプタータイプIB);
(2)E16(LAT1、SLC7A5);
(3)STEAP1(前立腺の6回膜貫通型上皮抗原);
(4)0772P(CA125、MUC16);
(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核球増強因子、メソテリン);
(6)Napi3b(NAPI−3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質輸送体ファミリー34(リン酸ナトリウム)、メンバー2、II型ナトリウム依存性リン酸トランスポーター3b);
(7)Sema5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、セマフォリン 5b Hlog、セマドメイン(sema domain)、7回トロンボスポンジン反復(1型及び1型様)、膜貫通ドメイン(TM)及び短い細胞質ドメイン(セマフォリン)5B);
(8)PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12 遺伝子);
(9)ETBR(エンドセリンタイプBレセプター);
(10)MSG783(RNF124、仮想タンパク質 FLJ20315);
(11)STEAP2(HGNC_8639、IPCA−1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前立腺癌関連遺伝子1、前立腺癌関連タンパク質1、前立腺の6回膜貫通型上皮抗原2、6回膜貫通型前立腺タンパク質);
(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、一過性レセプター電位カチオンチャネル、サブファミリーM、メンバー4);
(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、奇形癌腫由来増殖因子);
(14)CD21(CR2(補体レセプター2)又はC3DR(C3d/エブスタインバーウイルスレセプター)又はHs.73792);
(15)CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫グロブリン関連β(immunoglobulin−associated beta))、B29);
(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(SH2ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質1a)、SPAP1B、SPAP1C);
(17)HER2;
(18)NCA;
(19)MDP;
(20)IL20Rα;
(21)ブレビカン;
(22)EphB2R;
(23)ASLG659;
(24)PSCA;
(25)GEDA;
(26)BAFF−R(B細胞活性化因子レセプター、BLySレセプター3、BR3);
(27)CD22(B細胞レセプターCD22−Bアイソフォーム);
(28)CD79a(CD79A、CD79α、免疫グロブリン関連アルファ;
(29)CXCR5(バーキットリンパ腫レセプター1;
(30)HLA−DOB(MHCクラスII分子のベータサブユニット);
(31)P2X5(プリンレセプターP2Xリガンド開口型イオンチャネル5;
(32)CD72(B細胞分化抗原CD72、Lyb−2);
(33)LY64(リンパ球抗原64(RP105)、ロイシンリッチリピート(LRR)ファミリーのI型膜タンパク質);
(34)FcRH1(Fcレセプター様タンパク質1);
(35)IRTA2(免疫グロブリンスーパーファミリーレセプタートランスロケーション関連2);
(36)TENB2(推定上の膜貫通型プロテオグリカン);
(37)PMEL17(シルバーホモログ;SILV;D12S53E;PMEL17;(SI);(SIL);ME20;gp100);
(38)TMEFF1(EGF様及び2つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通型タンパク質1;Tomoregulin−1;H7365;C9orf2;C9ORF2;U19878;X83961;
(39)GDNF−Ra1(GDNFファミリーレセプターアルファ1;GFRA1;GDNFR;GDNFRA;RETL1;TRNR1;RET1L;GDNFR−アルファ1;GFR−ALPHA−1;U95847;BC014962);
(40)Ly6E(リンパ球抗原6複合体、遺伝子座E;Ly67、RIG−E、SCA−2、TSA−1);
(41)TMEM46(シサホモログ(shisa homolog)2(アフリカツメガエル);SHISA2);
(42)Ly6G6D(リンパ球抗原6複合体、遺伝子座G6D;Ly6−D、MEGT1);
(43)LGR5(ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型レセプター5;GPR49、GPR67);
(44)RET(retプロトオンコジーン;MEN2A;HSCR1;MEN2B;MTC1;(PTC);CDHF12;Hs.168114;RET51;RET−ELE1);
(45)LY6K(リンパ球抗原6複合体、遺伝子座K;LY6K;HSJ001348;FLJ35226);
(46)GPR19(Gタンパク質共役型レセプター19;Mm.4787);
(47)GPR54(KISS1レセプター;KISS1R;GPR54;HOT7T175;AXOR12);
(48)ASPHD1(アスパラギン酸β−ヒドロキシラーゼドメイン含有1;LOC253982);
(49)チロシナーゼ(TYR;OCAIA;OCA1A;チロシナーゼ;SHEP3);
(50)TMEM118(リングフィンガータンパク質、膜貫通型2;RNFT2;FLJ14627);及び
(51)GPR172A(Gタンパク質共役型レセプター172A;GPCR41;FLJ11856;D15Ertd747e)
の一以上のレセプターに結合する、請求項1に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。 - 抗体が、抗CD22抗体である、請求項1に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- 抗CD22抗体が、3つの軽鎖超可変領域(HVR−L1、HVR−L2及びHVR−L3)及び3つの重鎖超可変領域(HVR−H1、HVR−H2及びHVR−H3)を含み、
HVR−L1が配列番号1のアミノ酸配列を含み;
HVR−L2が配列番号2のアミノ酸配列を含み;
HVR−L3が配列番号3のアミノ酸配列を含み;
HVR−H1が配列番号4のアミノ酸配列を含み;
HVR−H2が配列番号5のアミノ酸配列を含み;及び
HVR−H3が配列番号6のアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。 - 抗体が、抗MUC16抗体である、請求項1に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- 抗MUC16抗体が、3つの軽鎖超可変領域(HVR−L1、HVR−L2及びHVR−L3)及び3つの重鎖超可変領域(HVR−H1、HVR−H2及びHVR−H3)を含み、
HVR−L1が配列番号7のアミノ酸配列を含み;
HVR−L2が配列番号8のアミノ酸配列を含み;
HVR−L3が配列番号9のアミノ酸配列を含み;
HVR−H1が配列番号10のアミノ酸配列を含み;
HVR−H2が配列番号11のアミノ酸配列を含み;及び
HVR−H3が配列番号12のアミノ酸配列を含む、請求項35に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。 - 抗MUC16抗体が、配列番号15−32から選択される軽鎖配列又は配列番号33−46から選択される重鎖配列に位置する一以上の遊離システインアミノ酸残基を含むシステイン操作抗体である、請求項35に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- 抗体が、抗HER2抗体である、請求項1に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- 抗HER2抗体がトラスツズマブである、請求項1に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- 抗体が、抗CD33抗体である、請求項1に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- 抗CD33抗体が、3つの軽鎖超可変領域(HVR−L1、HVR−L2及びHVR−L3)及び3つの重鎖超可変領域(HVR−H1、HVR−H2及びHVR−H3)を含み、
HVR−L1が配列番号51のアミノ酸配列を含み;
HVR−L2が配列番号52のアミノ酸配列を含み;
HVR−L3が配列番号53のアミノ酸配列を含み;
HVR−H1が配列番号54のアミノ酸配列を含み;
HVR−H2が配列番号55のアミノ酸配列を含み;及び
HVR−H3が配列番号56のアミノ酸配列を含む、請求項40に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。 - 抗CD33抗体が、配列番号57の軽鎖可変領域又は配列番号58の重鎖可変領域を含む、請求項40に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- 抗CD33抗体が、3つの軽鎖超可変領域(HVR−L1、HVR−L2及びHVR−L3)及び3つの重鎖超可変領域(HVR−H1、HVR−H2及びHVR−H3)を含み、
HVR−L1が配列番号59のアミノ酸配列を含み;
HVR−L2が配列番号60のアミノ酸配列を含み;
HVR−L3が配列番号61のアミノ酸配列を含み;
HVR−H1が配列番号62のアミノ酸配列を含み;
HVR−H2が配列番号63のアミノ酸配列を含み;及び
HVR−H3が配列番号64のアミノ酸配列を含む、請求項40に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。 - 抗CD33抗体が、配列番号65、配列番号67、配列番号69、及び配列番号71から選択される軽鎖可変領域又は配列番号66、配列番号68、配列番号70、及び配列番号72から選択される重鎖可変領域を含む、請求項40に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
- 請求項1から44の何れか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物、及び薬学的に許容される担体、流動促進剤、希釈剤、又は賦形剤を含む薬学的組成物。
- 請求項45に記載の薬学的組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
- a)請求項45に記載の薬学的組成物;及び
b)使用説明書
を含む、癌を治療するためのキット。 - 式:
を有するリンカー−薬物中間体であって、
ここで、Xは、マレイミド、チオール、アミノ、ブロミド、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、p−トルエンスルホン酸塩、ヨウ化物、ヒドロキシル、カルボキシル、ピリジルジスルフィド、及びN−ヒドロキシスクシンイミドから選択される反応性官能基であり;
Lは、式:
を有するリンカーであり;
ここで、StrはXに共有結合したストレッチャー単位であり;Pepは2から12個のアミノ酸残基の任意のペプチド単位であり、Spは二量体の薬物部分に共有結合した任意のスペーサー単位であり、m及びnは0及び1から独立に選択され;
Dは式:
を有する二量体薬物部分であり、
ここで
R1は、H、P(O)3H2、C(O)NRaRb、又はLへの結合から選択され;
R2は、H、P(O)3H2、C(O)NRaRb、又はLへの結合から選択され;
Ra及びRbは、H及び一以上のFで任意置換されたC1−C6アルキルから独立に選択され、又はRa及びRbは5又は6員複素環基を形成し;
Tは、C3−C12アルキレン、Y、(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン)、(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン)、(C2−C6アルケニレン)−Y−(C2−C6アルケニレン)及び(C2−C6アルキニレン)−Y−(C2−C6アルキニレン)から選択されるテザー基であり;
ここで、YはO、S、NR1、アリール、及びヘテロアリールから独立に選択され;
ここで、アルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、F、OH、O(C1−C6アルキル)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2、及びC1−C6アルキルで独立に任意置換され、ここでアルキルは、一以上のFで任意置換され;
又はアルキレン、アルケニレン、アリール及びヘテロアリールは、Lへの結合で独立に任意置換され;
D’は
から選択される薬物部分であり、
ここで波線はTへの結合部位を示し;
X1及びX2は、O及びNR3から独立に選択され、ここでR3は、H及び一以上のFで任意置換されたC1−C6アルキルから選択され;
R4は、H、CO2R、又はLへの結合であり、ここでRはC1−C6アルキル又はベンジルであり;及び
R5は、H又はC1−C6アルキルである、リンカー−薬物中間体。 - 式:
を有するリンカー−薬物中間体に抗体をコンジュゲートすることを含み、
ここで、
Xは、マレイミド、チオール、アミノ、ブロミド、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、p−トルエンスルホン酸塩、ヨウ化物、ヒドロキシル、カルボキシル、ピリジルジスルフィド、及びN−ヒドロキシスクシンイミドから選択される反応性官能基であり;
Lは、式:
を有するリンカーであり;
ここで、StrはXに共有結合したストレッチャー単位であり;Pepは2から12個のアミノ酸残基の任意のペプチド単位であり、Spは二量体の薬物部分に共有結合した任意のスペーサー単位であり、m及びnは0及び1から独立に選択され;
Dは式:
を有する二量体薬物部分であり、
ここで
R1は、H、P(O)3H2、C(O)NRaRb、又はLへの結合から選択され;
R2は、H、P(O)3H2、C(O)NRaRb、又はLへの結合から選択され;
Ra及びRbは、H及び一以上のFで任意置換されたC1−C6アルキルから独立に選択され又はRa及びRbは5又は6員複素環基を形成し;
Tは、C3−C12アルキレン、Y、(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン)、(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン)、(C2−C6アルケニレン)−Y−(C2−C6アルケニレン)及び(C2−C6アルキニレン)−Y−(C2−C6アルキニレン)から選択されるテザー基であり;
ここで、YはO、S、NR1、アリール、及びヘテロアリールから独立に選択され;
ここで、アルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、F、OH、O(C1−C6アルキル)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2、及びC1−C6アルキルで独立に任意置換され、ここでアルキルは、一以上のFで任意置換され;
又はアルキレン、アルケニレン、アリール及びヘテロアリールは、Lへの結合で独立に任意置換され;
D’は
から選択される薬物部分であり、
ここで波線はTへの結合部位を示し;
X1及びX2は、O及びNR3から独立に選択され、ここでR3は、H及び一以上のFで任意置換されたC1−C6アルキルから選択され;
R4は、H、CO2R、又はLへの結合であり、ここでRはC1−C6アルキル又はベンジルであり;及び
R5は、H又はC1−C6アルキルであり、
これにより抗体−薬物コンジュゲート化合物が形成される、請求項1に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物を製造するための方法。 - 抗体がシステイン操作抗体であり、リンカー−薬物中間体のXがマレイミドである、請求項39に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物を製造するための方法。
- 式:
を有するCBI二量体薬物部分化合物であって、
ここで
R1は、H、P(O)3H2、C(O)NRaRbから選択され;
R2は、H、P(O)3H2、C(O)NRaRbから選択され;
Ra及びRbは、H及び一以上のFで任意置換されたC1−C6アルキルから独立に選択され、
又はRa及びRbは、5又は6員複素環基を形成し;
Tは、C3−C12アルキレン、Y、(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン)、(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン)−Y−(C1−C6アルキレン)、(C2−C6アルケニレン)−Y−(C2−C6アルケニレン)及び(C2−C6アルキニレン)−Y−(C2−C6アルキニレン)から選択されるテザー基であり;
ここで、YはO、S、NR1、アリール、及びヘテロアリールから独立に選択され;
ここで、アルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、F、OH、O(C1−C6アルキル)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2、及びC1−C6アルキルで独立に任意置換され、ここでアルキルは、一以上のFで任意置換され;
又はアルキレン、アルケニレン、アリール及びヘテロアリールは、Lへの結合で独立に任意置換され;
D’は
から選択される薬物部分であり、
ここで波線はTへの結合部位を示し;
X1及びX2は、O及びNR3から独立に選択され、ここでR3は、H及び一以上のFで任意置換されたC1−C6アルキルから選択され;
R4は、H、CO2Rであり、ここでRはC1−C6アルキル又はベンジルであり;及び
R5は、H又はC1−C6アルキルである、CBI二量体薬物部分化合物。 - pが、1、2、3又は4である、請求項1から22の何れか一項に記載のコンジュゲート。
- pが、1又は2である、請求項1から22の何れか一項に記載のコンジュゲート。
- Abが抗HER2抗体である、請求項57から59の何れか一項に記載のコンジュゲート。
- Abが抗CLL−1抗体である、請求項57から59の何れか一項に記載のコンジュゲート。
- Abが抗CD22抗体である、請求項57から59の何れか一項に記載のコンジュゲート。
- Abが抗CD79b抗体である、請求項57から59の何れか一項に記載のコンジュゲート。
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361864889P | 2013-08-12 | 2013-08-12 | |
US61/864,889 | 2013-08-12 | ||
US201361916388P | 2013-12-16 | 2013-12-16 | |
US61/916,388 | 2013-12-16 | ||
US201461969499P | 2014-03-24 | 2014-03-24 | |
US61/969,499 | 2014-03-24 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016533294A Division JP6993084B2 (ja) | 2013-08-12 | 2014-06-16 | 1-(クロロメチル)-2,3-ジヒドロ-1h-ベンゾ[e]インドール二量体抗体 - 薬物コンジュゲート化合物、並びに使用及び処置の方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020040954A true JP2020040954A (ja) | 2020-03-19 |
Family
ID=51134439
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016533294A Active JP6993084B2 (ja) | 2013-08-12 | 2014-06-16 | 1-(クロロメチル)-2,3-ジヒドロ-1h-ベンゾ[e]インドール二量体抗体 - 薬物コンジュゲート化合物、並びに使用及び処置の方法 |
JP2019194288A Pending JP2020040954A (ja) | 2013-08-12 | 2019-10-25 | 1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1h−ベンゾ[e]インドール二量体抗体 − 薬物コンジュゲート化合物、並びに使用及び処置の方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016533294A Active JP6993084B2 (ja) | 2013-08-12 | 2014-06-16 | 1-(クロロメチル)-2,3-ジヒドロ-1h-ベンゾ[e]インドール二量体抗体 - 薬物コンジュゲート化合物、並びに使用及び処置の方法 |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10442836B2 (ja) |
EP (1) | EP3033111B1 (ja) |
JP (2) | JP6993084B2 (ja) |
KR (1) | KR20160042080A (ja) |
CN (1) | CN105636612B (ja) |
AU (1) | AU2014307080B2 (ja) |
BR (1) | BR112016002829A2 (ja) |
CA (1) | CA2918139A1 (ja) |
CL (1) | CL2016000318A1 (ja) |
CR (1) | CR20160125A (ja) |
EA (1) | EA201690195A1 (ja) |
HK (2) | HK1222544A1 (ja) |
IL (1) | IL243586A0 (ja) |
MX (1) | MX2016001862A (ja) |
PH (1) | PH12016500246A1 (ja) |
SG (1) | SG11201601005XA (ja) |
TW (1) | TWI636792B (ja) |
WO (1) | WO2015023355A1 (ja) |
Families Citing this family (44)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101839163B1 (ko) | 2010-06-08 | 2018-03-15 | 제넨테크, 인크. | 시스테인 조작된 항체 및 접합체 |
US11147852B2 (en) | 2011-12-23 | 2021-10-19 | Pfizer Inc. | Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor |
TW201533060A (zh) * | 2013-12-13 | 2015-09-01 | Genentech Inc | 抗cd33抗體及免疫結合物 |
CN107106700B (zh) | 2013-12-16 | 2020-10-30 | 基因泰克公司 | 肽模拟化合物及其抗体-药物缀合物 |
EA033456B1 (ru) | 2013-12-16 | 2019-10-31 | Genentech Inc | Конъюгаты антитело-лекарственное средство, содержащие пептидомиметические линкеры |
CN105828840B (zh) | 2013-12-16 | 2020-08-04 | 基因泰克公司 | 1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚二聚体抗体-药物缀合物化合物及使用和治疗方法 |
WO2015110935A1 (en) * | 2014-01-27 | 2015-07-30 | Pfizer Inc. | Bifunctional cytotoxic agents |
AU2015282627B2 (en) | 2014-06-30 | 2020-04-02 | Glykos Finland Oy | Saccharide derivative of a toxic payload and antibody conjugates thereof |
TW201625690A (zh) | 2014-09-12 | 2016-07-16 | 建南德克公司 | 抗-cll-1抗體及免疫結合物 |
EP3191521A2 (en) * | 2014-09-12 | 2017-07-19 | F. Hoffmann-La Roche AG | Cysteine engineered antibodies and conjugates |
ES2830385T3 (es) | 2014-09-12 | 2021-06-03 | Genentech Inc | Anticuerpos e inmunoconjugados anti-HER2 |
WO2016090050A1 (en) | 2014-12-03 | 2016-06-09 | Genentech, Inc. | Quaternary amine compounds and antibody-drug conjugates thereof |
US10842882B2 (en) * | 2015-03-09 | 2020-11-24 | Heidelberg Pharma Gmbh | Amatoxin-antibody conjugates |
MX2017012102A (es) | 2015-03-20 | 2018-01-12 | Pfizer | Agentes citotoxicos bifuncionales que contienen el farmacoforo de cti. |
WO2016205176A1 (en) * | 2015-06-15 | 2016-12-22 | Genentech, Inc. | Antibodies and immunoconjugates |
US10501545B2 (en) | 2015-06-16 | 2019-12-10 | Genentech, Inc. | Anti-CLL-1 antibodies and methods of use |
CN106380508A (zh) * | 2015-07-28 | 2017-02-08 | 上海皓元生物医药科技有限公司 | 一种抗体偶联药物连接子的工业化生产方法 |
MA43345A (fr) | 2015-10-02 | 2018-08-08 | Hoffmann La Roche | Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation |
MA43354A (fr) * | 2015-10-16 | 2018-08-22 | Genentech Inc | Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré |
DE102016105449A1 (de) * | 2015-10-29 | 2017-05-04 | Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts | Bifunktionale Prodrugs |
JP6412906B2 (ja) | 2015-11-03 | 2018-10-24 | 財團法人工業技術研究院Industrial Technology Research Institute | 化合物、リンカー−薬物およびリガンド−薬物複合体 |
EP3377112A4 (en) | 2015-11-18 | 2019-06-12 | Sorrento Therapeutics, Inc. | CHEMICALLY BLOCKED BISPECIFIC ANTIBODIES |
TWI726942B (zh) | 2015-11-30 | 2021-05-11 | 美商輝瑞股份有限公司 | 位點專一性her2抗體藥物共軛體 |
PL3458101T3 (pl) | 2016-05-20 | 2021-05-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Koniugaty PROTAC-przeciwciało i sposoby ich stosowania |
EP3465221B1 (en) | 2016-05-27 | 2020-07-22 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Bioanalytical method for the characterization of site-specific antibody-drug conjugates |
JP7043425B2 (ja) * | 2016-06-06 | 2022-03-29 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | シルベストロール抗体-薬物コンジュゲート及び使用方法 |
TWI760344B (zh) | 2016-06-24 | 2022-04-11 | 美商梅爾莎納醫療公司 | 吡咯並苯並二氮呯類和彼等之共軛物類 |
EP3496763A1 (en) | 2016-08-11 | 2019-06-19 | Genentech, Inc. | Pyrrolobenzodiazepine prodrugs and antibody conjugates thereof |
JP7050770B2 (ja) * | 2016-10-05 | 2022-04-08 | エフ・ホフマン-ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 抗体薬物コンジュゲートの調製方法 |
WO2018071455A1 (en) * | 2016-10-10 | 2018-04-19 | Cellerant Therapeutics, Inc. | Isoquinolidinobenzodiazepine (iqb)-1(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole (cbi) dimers |
CN110036028B (zh) | 2016-10-16 | 2023-09-08 | 坎塔吉亚有限责任公司 | 抗il1-rap抗体 |
US10864279B2 (en) | 2016-12-16 | 2020-12-15 | Industrial Technology Research Institute | Linker-drug and antibody-drug conjugate (ADC) employing the same |
EP3441386B1 (en) * | 2017-08-11 | 2024-04-17 | Georg-August-Universität Göttingen | Method for the synthesis of monoprotected bifunctional prodrugs and antibody drug conjugates based thereon as well as a method for preparing antibody drug conjugates |
US11364303B2 (en) | 2017-09-29 | 2022-06-21 | Pfizer Inc. | Cysteine engineered antibody drug conjugates |
US20230053449A1 (en) | 2018-10-31 | 2023-02-23 | Novartis Ag | Dc-sign antibody drug conjugates |
CN113227119A (zh) | 2018-12-10 | 2021-08-06 | 基因泰克公司 | 用于与含Fc的蛋白质进行位点特异性缀合的光交联肽 |
GB201901197D0 (en) | 2019-01-29 | 2019-03-20 | Femtogenix Ltd | G-A Crosslinking cytotoxic agents |
WO2020180158A1 (ko) * | 2019-03-07 | 2020-09-10 | 에이비엘바이오 주식회사 | 항체-약물 접합체 및 이의 용도 |
CN116249556A (zh) | 2020-07-21 | 2023-06-09 | 基因泰克公司 | 降解brm的抗体缀合化学诱导剂及其方法 |
JP2021006531A (ja) * | 2020-09-01 | 2021-01-21 | ハンジョウ ディーエーシー バイオテック シーオー.,エルティディ.Hangzhou Dac Biotech Co.,Ltd. | 細胞結合分子の共役のための架橋連結体 |
CN115192732A (zh) * | 2021-04-01 | 2022-10-18 | 成都百利多特生物药业有限责任公司 | 一种dna毒性二聚体化合物及其偶联物 |
WO2023178641A1 (zh) | 2022-03-25 | 2023-09-28 | 成都百利多特生物药业有限责任公司 | 一种dna毒性二聚体化合物及其偶联物 |
WO2023147329A1 (en) | 2022-01-26 | 2023-08-03 | Genentech, Inc. | Antibody-conjugated chemical inducers of degradation and methods thereof |
WO2023147328A1 (en) | 2022-01-26 | 2023-08-03 | Genentech, Inc. | Antibody-conjugated chemical inducers of degradation with hydolysable maleimide linkers and methods thereof |
Family Cites Families (282)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
JPS6098584A (ja) | 1983-11-02 | 1985-06-01 | Canon Inc | カメラ―体形vtr |
US5807715A (en) | 1984-08-27 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin |
US5583024A (en) | 1985-12-02 | 1996-12-10 | The Regents Of The University Of California | Recombinant expression of Coleoptera luciferase |
CA2023779A1 (en) | 1989-08-23 | 1991-02-24 | Margaret D. Moore | Compositions and methods for detection and treatment of epstein-barr virus infection and immune disorders |
US5959177A (en) | 1989-10-27 | 1999-09-28 | The Scripps Research Institute | Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies |
US5256643A (en) | 1990-05-29 | 1993-10-26 | The Government Of The United States | Human cripto protein |
AU9016591A (en) | 1990-10-25 | 1992-05-26 | Tanox Biosystems, Inc. | Glycoproteins associated with membrane-bound immunoglobulins as antibody targets on B cells |
US5543503A (en) | 1991-03-29 | 1996-08-06 | Genentech Inc. | Antibodies to human IL-8 type A receptor |
US5440021A (en) | 1991-03-29 | 1995-08-08 | Chuntharapai; Anan | Antibodies to human IL-8 type B receptor |
JP4156662B2 (ja) | 1991-03-29 | 2008-09-24 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | ヒトpf4a受容体とその使用 |
DE122004000008I1 (de) | 1991-06-14 | 2005-06-09 | Genentech Inc | Humanisierter Heregulin Antikörper. |
JP3050424B2 (ja) | 1991-07-12 | 2000-06-12 | 塩野義製薬株式会社 | ヒトエンドセリンリセプター |
US5264557A (en) | 1991-08-23 | 1993-11-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Polypeptide of a human cripto-related gene, CR-3 |
JP3951062B2 (ja) | 1991-09-19 | 2007-08-01 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 少なくとも遊離のチオールとして存在するシステインを有する抗体フラグメントの大腸菌での発現、2官能性F(ab’)2抗体の産生のための使用 |
US6011146A (en) | 1991-11-15 | 2000-01-04 | Institut Pasteur | Altered major histocompatibility complex (MHC) determinant and methods of using the determinant |
US6153408A (en) | 1991-11-15 | 2000-11-28 | Institut Pasteur And Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale | Altered major histocompatibility complex (MHC) determinant and methods of using the determinant |
IL107366A (en) | 1992-10-23 | 2003-03-12 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Genes coding for megakaryocyte potentiator |
US5644033A (en) | 1992-12-22 | 1997-07-01 | Health Research, Inc. | Monoclonal antibodies that define a unique antigen of human B cell antigen receptor complex and methods of using same for diagnosis and treatment |
US5801005A (en) | 1993-03-17 | 1998-09-01 | University Of Washington | Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated |
US5869445A (en) | 1993-03-17 | 1999-02-09 | University Of Washington | Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein |
US6214345B1 (en) | 1993-05-14 | 2001-04-10 | Bristol-Myers Squibb Co. | Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates |
US5773223A (en) | 1993-09-02 | 1998-06-30 | Chiron Corporation | Endothelin B1, (ETB1) receptor polypeptide and its encoding nucleic acid methods, and uses thereof |
US5750370A (en) | 1995-06-06 | 1998-05-12 | Human Genome Sciences, Inc. | Nucleic acid encoding human endothlein-bombesin receptor and method of producing the receptor |
US5789199A (en) | 1994-11-03 | 1998-08-04 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
US5840523A (en) | 1995-03-01 | 1998-11-24 | Genetech, Inc. | Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides |
JPH08336393A (ja) | 1995-04-13 | 1996-12-24 | Mitsubishi Chem Corp | 光学活性なγ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法 |
US5707829A (en) | 1995-08-11 | 1998-01-13 | Genetics Institute, Inc. | DNA sequences and secreted proteins encoded thereby |
US20020193567A1 (en) | 1995-08-11 | 2002-12-19 | Genetics Institute, Inc. | Secreted proteins and polynucleotides encoding them |
JP3646191B2 (ja) | 1996-03-19 | 2005-05-11 | 大塚製薬株式会社 | ヒト遺伝子 |
BR9710968A (pt) | 1996-05-17 | 2001-09-04 | Schering Corp | Antìgenos de célula b humana; reagentes correlatos |
US5945511A (en) | 1997-02-20 | 1999-08-31 | Zymogenetics, Inc. | Class II cytokine receptor |
US20030185830A1 (en) | 1997-02-25 | 2003-10-02 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer |
US7033827B2 (en) | 1997-02-25 | 2006-04-25 | Corixa Corporation | Prostate-specific polynucleotide compositions |
US6541212B2 (en) | 1997-03-10 | 2003-04-01 | The Regents Of The University Of California | Methods for detecting prostate stem cell antigen protein |
US6261791B1 (en) | 1997-03-10 | 2001-07-17 | The Regents Of The University Of California | Method for diagnosing cancer using specific PSCA antibodies |
EP1514876B1 (en) | 1997-03-10 | 2013-05-08 | The Regents of The University of California | Antibody against prostate stem cell antigen (PSCA) |
US6555339B1 (en) | 1997-04-14 | 2003-04-29 | Arena Pharmaceuticals, Inc. | Non-endogenous, constitutively activated human protein-coupled receptors |
US6319688B1 (en) | 1997-04-28 | 2001-11-20 | Smithkline Beecham Corporation | Polynucleotide encoding human sodium dependent phosphate transporter (IPT-1) |
US6890749B2 (en) | 1997-05-15 | 2005-05-10 | Abbott Laboratories | Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate |
WO1998051824A1 (en) | 1997-05-15 | 1998-11-19 | Abbott Laboratories | Reagents and methods useful for detecting disease of the urinary tract |
US6040498A (en) | 1998-08-11 | 2000-03-21 | North Caroline State University | Genetically engineered duckweed |
US6602677B1 (en) | 1997-09-19 | 2003-08-05 | Promega Corporation | Thermostable luciferases and methods of production |
US20030060612A1 (en) | 1997-10-28 | 2003-03-27 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
US20020034749A1 (en) | 1997-11-18 | 2002-03-21 | Billing-Medel Patricia A. | Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast |
US6110695A (en) | 1997-12-02 | 2000-08-29 | The Regents Of The University Of California | Modulating the interaction of the chemokine, B Lymphocyte Hemoattractant, and its Receptor, BLR1 |
WO2004031238A2 (en) | 2002-10-03 | 2004-04-15 | Mcgill Univeristy | Antibodies and cyclic peptides which bind cea (carcinoembryonic antigen) and their use as cancer therapeutics |
WO1999046284A2 (en) | 1998-03-13 | 1999-09-16 | The Burnham Institute | Molecules that home to various selected organs or tissues |
JP2002520000A (ja) | 1998-05-13 | 2002-07-09 | エピミューン, インコーポレイテッド | 免疫応答を刺激するための発現ベクターおよびそのベクターの使用方法 |
US20030064397A1 (en) | 1998-05-22 | 2003-04-03 | Incyte Genomics, Inc. | Transmembrane protein differentially expressed in prostate and lung tumors |
US20020187472A1 (en) | 2001-03-09 | 2002-12-12 | Preeti Lal | Steap-related protein |
WO2002016429A2 (en) | 2000-08-24 | 2002-02-28 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
DE69930328T2 (de) | 1998-08-27 | 2006-12-14 | Spirogen Ltd., Ryde | Dimere Pyrrolobenzodiazepine |
WO2000012130A1 (en) | 1998-08-27 | 2000-03-09 | Smithkline Beecham Corporation | Rp105 agonists and antagonists |
JP4689781B2 (ja) | 1998-09-03 | 2011-05-25 | 独立行政法人科学技術振興機構 | アミノ酸輸送蛋白及びその遺伝子 |
AU5963699A (en) | 1998-10-02 | 2000-04-26 | Mcmaster University | Spliced form of (erb)b-2/neu oncogene |
US6858710B2 (en) | 1998-12-17 | 2005-02-22 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer |
US20020119158A1 (en) | 1998-12-17 | 2002-08-29 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer |
US6468546B1 (en) | 1998-12-17 | 2002-10-22 | Corixa Corporation | Compositions and methods for therapy and diagnosis of ovarian cancer |
US6962980B2 (en) | 1999-09-24 | 2005-11-08 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer |
US20030091580A1 (en) | 2001-06-18 | 2003-05-15 | Mitcham Jennifer L. | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer |
AU776672B2 (en) | 1998-12-30 | 2004-09-16 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Characterization of a calcium channel family |
US20030190669A1 (en) | 1998-12-30 | 2003-10-09 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
BR0007840A (pt) | 1999-01-29 | 2002-01-22 | Corixa Corp | Proteìnas de fusão her-2/neu |
GB9905124D0 (en) | 1999-03-05 | 1999-04-28 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
AU3395900A (en) | 1999-03-12 | 2000-10-04 | Human Genome Sciences, Inc. | Human lung cancer associated gene sequences and polypeptides |
US7312303B2 (en) | 1999-05-11 | 2007-12-25 | Genentech, Inc. | Anti-PRO4980 antibodies |
WO2000075655A1 (fr) | 1999-06-03 | 2000-12-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Procede de criblage avec cd100 |
US6949245B1 (en) | 1999-06-25 | 2005-09-27 | Genentech, Inc. | Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies |
DK2283866T3 (en) | 1999-06-25 | 2015-05-18 | Genentech Inc | METHODS OF TREATMENT USING ANTI-ERBB ANTIBODY-MAYTANSINOID CONJUGATES |
US20030119113A1 (en) | 1999-07-20 | 2003-06-26 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US7297770B2 (en) | 1999-08-10 | 2007-11-20 | Genentech, Inc. | PRO6496 polypeptides |
US7294696B2 (en) | 1999-08-17 | 2007-11-13 | Genentech Inc. | PRO7168 polypeptides |
JP3951035B2 (ja) | 1999-09-01 | 2007-08-01 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 分泌及び膜貫通ポリペプチドとそれをコードしている核酸 |
US20030129192A1 (en) | 1999-09-10 | 2003-07-10 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer |
US20030206918A1 (en) | 1999-09-10 | 2003-11-06 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer |
US20030232056A1 (en) | 1999-09-10 | 2003-12-18 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer |
CA2385347C (en) | 1999-10-04 | 2009-12-15 | Medicago Inc. | Method for regulating transcription of foreign genes |
US7125978B1 (en) | 1999-10-04 | 2006-10-24 | Medicago Inc. | Promoter for regulating expression of foreign genes |
US6750054B2 (en) | 2000-05-18 | 2004-06-15 | Lexicon Genetics Incorporated | Human semaphorin homologs and polynucleotides encoding the same |
IL149116A0 (en) | 1999-10-29 | 2002-11-10 | Genentech Inc | Anti-prostate stem cell antigen (psca) antibody compositions and methods of use |
ES2568625T3 (es) | 1999-11-29 | 2016-05-03 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Aislamiento de cinco genes novedosos que codifican nuevos melanomas de tipo receptor de Fc implicados en la patogénesis del linfoma/melanoma |
AU1807401A (en) | 1999-11-30 | 2001-06-12 | Corixa Corporation | Compositions and methods for therapy and diagnosis of breast cancer |
CA2393738A1 (en) | 1999-12-10 | 2001-06-14 | Epimmune Inc. | Inducing cellular immune responses to her2/neu using peptide and nucleic acid compositions |
US6610286B2 (en) | 1999-12-23 | 2003-08-26 | Zymogenetics, Inc. | Method for treating inflammation using soluble receptors to interleukin-20 |
EP1857466B1 (en) | 1999-12-23 | 2010-10-20 | ZymoGenetics, Inc. | Soluble interleukin-20 receptor |
NZ502058A (en) | 1999-12-23 | 2003-11-28 | Ovita Ltd | Isolated mutated nucleic acid molecule for regulation of ovulation rate |
WO2001046261A1 (en) | 1999-12-23 | 2001-06-28 | Zymogenetics, Inc. | Method for treating inflammation |
US20040001827A1 (en) | 2002-06-28 | 2004-01-01 | Dennis Mark S. | Serum albumin binding peptides for tumor targeting |
CA2390691C (en) | 1999-12-24 | 2016-05-10 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for prolonging elimination half-times of bioactive compounds |
US7294695B2 (en) | 2000-01-20 | 2007-11-13 | Genentech, Inc. | PRO10268 polypeptides |
US20030224379A1 (en) | 2000-01-21 | 2003-12-04 | Tang Y. Tom | Novel nucleic acids and polypeptides |
WO2001053463A2 (en) | 2000-01-21 | 2001-07-26 | Corixa Corporation | COMPOUNDS AND METHODS FOR PREVENTION AND TREATMENT OF HER-2/neu ASSOCIATED MALIGNANCIES |
AU2001243142A1 (en) | 2000-02-03 | 2001-08-14 | Hyseq, Inc. | Novel nucleic acids and polypeptides |
US20030104562A1 (en) | 2000-02-11 | 2003-06-05 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US20030219806A1 (en) | 2000-02-22 | 2003-11-27 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Novel 18607, 15603, 69318, 12303, 48000, 52920, 5433, 38554, 57301, 58324, 55063, 52991, 59914, 59921 and 33751 molecules and uses therefor |
US20020142377A1 (en) | 2000-02-22 | 2002-10-03 | Glucksmann Maria Alexandra | 18607, a novel human calcium channel |
US20040005561A1 (en) | 2000-03-01 | 2004-01-08 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies |
US20040002068A1 (en) | 2000-03-01 | 2004-01-01 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies |
EP1261743A2 (en) | 2000-03-07 | 2002-12-04 | Hyseq, Inc. | Novel nucleic acids and polypeptides |
JP2004521602A (ja) | 2000-03-24 | 2004-07-22 | ファハリ サッチオグリュ | 前立腺特異的または精巣特異的な新規の核酸分子、ポリペプチド、ならびに診断法および治療法 |
US20030186889A1 (en) | 2000-03-31 | 2003-10-02 | Wolf-Georg Forssmann | Diagnostic and medicament for analysing the cell surface proteome of tumour and inflammatory cells and for treating tumorous and inflammatory diseases, preferably using a specific chemokine receptor analysis and the chemokine receptor-ligand interaction |
WO2001075177A2 (en) | 2000-04-03 | 2001-10-11 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Tumor markers in ovarian cancer |
AU2001249885A1 (en) | 2000-04-07 | 2001-10-23 | Arena Pharmaceuticals, Inc. | Non-endogenous, constitutively activated known g protein-coupled receptors |
AU2001274888A1 (en) | 2000-05-19 | 2001-12-03 | Human Genome Sciences, Inc. | Nucleic acids, proteins, and antibodies |
US20020051990A1 (en) | 2000-06-09 | 2002-05-02 | Eric Ople | Novel gene targets and ligands that bind thereto for treatment and diagnosis of ovarian carcinomas |
AU2001268471A1 (en) | 2000-06-16 | 2002-01-02 | Incyte Genomics, Inc. | G-protein coupled receptors |
MXPA02012749A (es) | 2000-06-30 | 2003-10-06 | Amgen Inc | Moleculas semejantes a b7 y sus usos. |
JP2004528003A (ja) | 2000-06-30 | 2004-09-16 | インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド | 細胞外マトリクスおよび細胞接着分子 |
WO2002002587A1 (en) | 2000-06-30 | 2002-01-10 | Human Genome Sciences, Inc. | B7-like polynucleotides, polypeptides, and antibodies |
WO2002006339A2 (en) | 2000-07-03 | 2002-01-24 | Curagen Corporation | Proteins and nucleic acids encoding same |
US20040044179A1 (en) | 2000-07-25 | 2004-03-04 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US6891030B2 (en) | 2000-07-27 | 2005-05-10 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | T-cell immunoregulatory molecule |
CA2417671A1 (en) | 2000-07-28 | 2002-02-07 | Ulrich Wissenbach | Trp8, trp9 and trp10, novel markers for cancer |
US7229623B1 (en) | 2000-08-03 | 2007-06-12 | Corixa Corporation | Her-2/neu fusion proteins |
HUP0600780A2 (en) | 2000-08-14 | 2007-01-29 | Corixa Corp | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of her-2/neu-associated malignancies |
WO2002013847A2 (en) | 2000-08-14 | 2002-02-21 | Corixa Corporation | Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies |
GB0020953D0 (en) | 2000-08-24 | 2000-10-11 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
CA2421949A1 (en) | 2000-09-11 | 2002-03-21 | Hyseq, Inc. | Novel nucleic acids and polypeptides |
US6613567B1 (en) | 2000-09-15 | 2003-09-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of Her-2 expression |
US7491797B2 (en) | 2000-09-15 | 2009-02-17 | Genentech, Inc. | PRO6308 polypeptide |
ATE460429T1 (de) | 2000-09-15 | 2010-03-15 | Zymogenetics Inc | Polypeptide enthaltend extrazellulären domäne von il-20ra und/oderr il-20rb |
AU2001292724B2 (en) | 2000-09-18 | 2005-05-26 | Biogen Idec Ma Inc. | CRIPTO mutant and uses thereof |
UA83458C2 (uk) | 2000-09-18 | 2008-07-25 | Байоджен Айдек Ма Інк. | Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf) |
CA2425569A1 (en) | 2000-10-13 | 2002-04-18 | Eos Biotechnology, Inc. | Methods of diagnosis of prostate cancer, compositions and methods of screening for modulators of prostate cancer |
CA2428242A1 (en) | 2000-11-07 | 2002-05-16 | Zymogenetics, Inc. | Human tumor necrosis factor receptor |
US20020150573A1 (en) | 2000-11-10 | 2002-10-17 | The Rockefeller University | Anti-Igalpha-Igbeta antibody for lymphoma therapy |
WO2002061087A2 (en) | 2000-12-19 | 2002-08-08 | Lifespan Biosciences, Inc. | Antigenic peptides, such as for g protein-coupled receptors (gpcrs), antibodies thereto, and systems for identifying such antigenic peptides |
AU2002243495A1 (en) | 2001-01-12 | 2002-07-24 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Bone morphogenetic protein-2 in the treatment and diagnosis of cancer |
US20030119126A1 (en) | 2001-01-16 | 2003-06-26 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US20030119125A1 (en) | 2001-01-16 | 2003-06-26 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US7754208B2 (en) | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
MXPA03006617A (es) | 2001-01-24 | 2004-12-02 | Protein Design Labs Inc | Metodos de diagnostico de cancer de pecho, composiciones y metodos de rastreo de moduladores de cancer de pecho. |
US20030073144A1 (en) | 2001-01-30 | 2003-04-17 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of pancreatic cancer |
US20040170994A1 (en) | 2001-02-12 | 2004-09-02 | Callen David Frederick | DNA sequences for human tumour suppressor genes |
WO2002071928A2 (en) | 2001-03-14 | 2002-09-19 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid molecules and proteins for the identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer |
AU2002311787A1 (en) | 2001-03-28 | 2002-10-15 | Zycos Inc. | Translational profiling |
WO2003008537A2 (en) | 2001-04-06 | 2003-01-30 | Mannkind Corporation | Epitope sequences |
US6820011B2 (en) | 2001-04-11 | 2004-11-16 | The Regents Of The University Of Colorado | Three-dimensional structure of complement receptor type 2 and uses thereof |
MXPA03009510A (es) | 2001-04-17 | 2005-04-29 | Univ Arkansas | Secuencias de repeticion del gen ca125 y su uso para intervenciones de diagnosticos y terapeuticas. |
CA2444691A1 (en) | 2001-04-18 | 2002-10-31 | Protein Design Labs, Inc. | Methods of diagnosis of lung cancer, compositions and methods of screening for modulators of lung cancer |
AU2002334799B2 (en) | 2001-04-26 | 2009-05-07 | Biogen Ma Inc. | Cripto-specific antibodies |
DE60230868D1 (de) | 2001-04-26 | 2009-03-05 | Biogen Inc | Criptoblockierende antikörper und deren verwendung |
WO2002089747A2 (en) | 2001-05-09 | 2002-11-14 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer |
AU2002344326A1 (en) | 2001-05-11 | 2002-11-25 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Nucleic acid sequence encoding ovarian antigen, ca125, and uses thereof |
IL158920A0 (en) | 2001-05-24 | 2004-05-12 | Zymogenetics Inc | Taci-immunoglobulin fusion proteins |
US7157558B2 (en) | 2001-06-01 | 2007-01-02 | Genentech, Inc. | Polypeptide encoded by a polynucleotide overexpresses in tumors |
WO2003000842A2 (en) | 2001-06-04 | 2003-01-03 | Curagen Corporation | Novel proteins and nucleic acids encoding same |
WO2002098358A2 (en) | 2001-06-04 | 2002-12-12 | Eos Biotechnology, Inc. | Methods of diagnosis and treatment of androgen-dependent prostate cancer, prostate cancer undergoing androgen-withdrawal, and androgen-independent prostate cancer |
US20050112568A1 (en) | 2001-06-05 | 2005-05-26 | Lori Friedman | Dgks as modifiers of the p53 pathwha and methods of use |
ATE483976T1 (de) | 2001-06-05 | 2010-10-15 | Exelixis Inc | Gfats als modifikatoren des p53-wegs und verwendungsverfahren |
US7235358B2 (en) | 2001-06-08 | 2007-06-26 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
US7125663B2 (en) | 2001-06-13 | 2006-10-24 | Millenium Pharmaceuticals, Inc. | Genes, compositions, kits and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cervical cancer |
US7189507B2 (en) | 2001-06-18 | 2007-03-13 | Pdl Biopharma, Inc. | Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer |
MXPA03011979A (es) | 2001-06-18 | 2005-04-08 | Eos Biotechnology Inc | Metodos de diagnostico de cancer de ovario composiciones y metodos para rastrear moduladores de cancer de ovario. |
US7705120B2 (en) | 2001-06-21 | 2010-04-27 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer |
WO2003002717A2 (en) | 2001-06-28 | 2003-01-09 | Schering Corporation | Biological activity of ak155 |
WO2003004529A2 (en) | 2001-07-02 | 2003-01-16 | Licentia Ltd. | Ephrin-tie receptor materials and methods |
US20040076955A1 (en) | 2001-07-03 | 2004-04-22 | Eos Biotechnology, Inc. | Methods of diagnosis of bladder cancer, compositions and methods of screening for modulators of bladder cancer |
WO2003003984A2 (en) | 2001-07-05 | 2003-01-16 | Curagen Corporation | Novel proteins and nucleic acids encoding same |
US7446185B2 (en) | 2001-07-18 | 2008-11-04 | The Regents Of The University Of California | Her2/neu target antigen and use of same to stimulate an immune response |
US20030108963A1 (en) | 2001-07-25 | 2003-06-12 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Novel genes, compositions, kit, and methods for identification, assessment, prevention and therapy of prostate cancer |
MXPA04001050A (es) | 2001-08-03 | 2004-07-08 | Genentech Inc | Polipeptidos tacis y br3 y usos de los mismos. |
AU2002324700A1 (en) | 2001-08-14 | 2003-03-03 | Bayer Ag | Nucleic acid and amino acid sequences involved in pain |
US20030092013A1 (en) | 2001-08-16 | 2003-05-15 | Vitivity, Inc. | Diagnosis and treatment of vascular disease |
WO2003018621A2 (en) | 2001-08-23 | 2003-03-06 | Oxford Biomedica (Uk) Limited | Genes |
AU2002357643A1 (en) | 2001-08-29 | 2003-04-14 | Vanderbilt University | The human mob-5 (il-24) receptors and uses thereof |
US20030124579A1 (en) | 2001-09-05 | 2003-07-03 | Eos Biotechnology, Inc. | Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer |
ES2537074T3 (es) | 2001-09-06 | 2015-06-02 | Agensys, Inc. | Ácido nucleico y proteína correspondiente denominados STEAP-1 útiles en el tratamiento y la detección de cáncer |
AU2002330039A1 (en) | 2001-09-17 | 2003-04-01 | Eos Biotechnology, Inc. | Methods of diagnosis of cancer compositions and methods of screening for modulators of cancer |
US20050004017A1 (en) | 2001-09-18 | 2005-01-06 | Yuval Reiss | Methods and compositions for treating hcap associated diseases |
DE60238143D1 (de) | 2001-09-18 | 2010-12-09 | Genentech Inc | Zusammensetzungen und verfahren für die diagnose von tumoren |
WO2003025148A2 (en) | 2001-09-19 | 2003-03-27 | Nuvelo, Inc. | Novel nucleic acids and polypeptides |
US7091186B2 (en) * | 2001-09-24 | 2006-08-15 | Seattle Genetics, Inc. | p-Amidobenzylethers in drug delivery agents |
US20030077644A1 (en) | 2001-09-28 | 2003-04-24 | Bing Yang | Diagnosis and treatment of diseases caused by mutations in CD72 |
US20050130117A1 (en) | 2001-10-03 | 2005-06-16 | Davis Cong L. | Modulators of lymphocyte activation and migration |
WO2003029421A2 (en) | 2001-10-03 | 2003-04-10 | Origene Technologies, Inc. | Regulated breast cancer genes |
US20050089957A1 (en) | 2001-10-19 | 2005-04-28 | Audrey Goddard | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of inflammatory bowel disorders |
US20050123925A1 (en) | 2002-11-15 | 2005-06-09 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
WO2003035846A2 (en) | 2001-10-24 | 2003-05-01 | National Jewish Medical And Research Center | Structure of tall-1 and its cognate receptor |
US7405192B2 (en) | 2001-10-31 | 2008-07-29 | Alcon, Inc. | Bone morphogenic proteins (BMP), BMP receptors and BMP binding proteins and their use in the diagnosis and treatment of glaucoma |
WO2003042661A2 (en) | 2001-11-13 | 2003-05-22 | Protein Design Labs, Inc. | Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer |
US20030232350A1 (en) | 2001-11-13 | 2003-12-18 | Eos Biotechnology, Inc. | Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer |
US7344843B2 (en) | 2001-11-29 | 2008-03-18 | Serono Genetics Institute S.A. | Agonists and antagonists of prolixin for the treatment of metabolic disorders |
AU2002349784A1 (en) | 2001-12-03 | 2003-06-17 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Nf-kappab activating genes |
EP1504099A4 (en) | 2001-12-10 | 2006-05-10 | Nuvelo Inc | NEW NUCLEIC ACIDS AND POLYPEPTIDES |
US20030134790A1 (en) | 2002-01-11 | 2003-07-17 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Bone Morphogenetic Protein-2 And Bone Morphogenetic Protein-4 In The Treatment And Diagnosis Of Cancer |
US7452675B2 (en) | 2002-01-25 | 2008-11-18 | The Queen's Medical Center | Methods of screening for TRPM4b modulators |
JP2005526501A (ja) | 2002-02-21 | 2005-09-08 | デューク・ユニヴァーシティ | 自己免疫疾患用の試薬および治療方法 |
JP2005535290A (ja) | 2002-02-22 | 2005-11-24 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 免疫関連疾患の治療のための組成物と方法 |
WO2003074662A2 (en) | 2002-03-01 | 2003-09-12 | Exelixis, Inc. | SCDs AS MODIFIERS OF THE p53 PATHWAY AND METHODS OF USE |
WO2003104399A2 (en) | 2002-06-07 | 2003-12-18 | Avalon Pharmaceuticals, Inc | Cancer-linked gene as target for chemotherapy |
WO2003101400A2 (en) | 2002-06-04 | 2003-12-11 | Avalon Pharmaceuticals, Inc. | Cancer-linked gene as target for chemotherapy |
EP2258712A3 (en) | 2002-03-15 | 2011-05-04 | Multicell Immunotherapeutics, Inc. | Compositions and Methods to Initiate or Enhance Antibody and Major-histocompatibility Class I or Class II-restricted T Cell Responses by Using Immunomodulatory, Non-coding RNA Motifs |
WO2004000997A2 (en) | 2002-03-19 | 2003-12-31 | Curagen Corporation | Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use |
WO2003081210A2 (en) | 2002-03-21 | 2003-10-02 | Sunesis Pharmaceuticals, Inc. | Identification of kinase inhibitors |
US7193069B2 (en) | 2002-03-22 | 2007-03-20 | Research Association For Biotechnology | Full-length cDNA |
US7317087B2 (en) | 2002-03-25 | 2008-01-08 | The Uab Research Foundation | Members of the FC receptor homolog gene family (FCRH1-3, 6), related reagents, and uses thereof |
WO2003083074A2 (en) | 2002-03-28 | 2003-10-09 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Novel gene targets and ligands that bind thereto for treatment and diagnosis of colon carcinomas |
US20030194704A1 (en) | 2002-04-03 | 2003-10-16 | Penn Sharron Gaynor | Human genome-derived single exon nucleic acid probes useful for gene expression analysis two |
JP2005534287A (ja) | 2002-04-05 | 2005-11-17 | アジェンシス, インコーポレイテッド | 癌の処置および検出において有用な98p4b6との名称の核酸および対応するタンパク質 |
US20040101874A1 (en) | 2002-04-12 | 2004-05-27 | Mitokor Inc. | Targets for therapeutic intervention identified in the mitochondrial proteome |
EP2011886A3 (en) | 2002-04-16 | 2009-02-11 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
AU2003239158A1 (en) | 2002-04-17 | 2003-11-03 | Baylor College Of Medicine | Aib1 as a prognostic marker and predictor of resistance to encocrine therapy |
WO2003093444A2 (en) | 2002-05-03 | 2003-11-13 | Incyte Corporation | Transporters and ion channels |
US20090068178A1 (en) | 2002-05-08 | 2009-03-12 | Genentech, Inc. | Compositions and Methods for the Treatment of Tumor of Hematopoietic Origin |
EP1572925A4 (en) | 2002-05-15 | 2007-08-15 | Avalon Pharmaceuticals | CANCER-RELATED GENE AS A TARGET FOR CHEMOTHERAPY |
AU2003232453A1 (en) | 2002-05-30 | 2003-12-19 | David K. Bol | Human solute carrier family 7 member 11 (hslc7a11) |
AU2003240495A1 (en) | 2002-06-04 | 2003-12-19 | Incyte Corporation | Diagnostics markers for lung cancer |
JP4594085B2 (ja) | 2002-06-06 | 2010-12-08 | オンコセラピー・サイエンス株式会社 | ヒト結腸癌に関連する遺伝子およびポリペプチド |
AU2003242633A1 (en) | 2002-06-06 | 2003-12-22 | Molecular Engines Laboratories | Dudulin genes, non-human animal model: uses in human hematological disease |
AU2003245441A1 (en) | 2002-06-12 | 2003-12-31 | Avalon Pharmaceuticals, Inc. | Cancer-linked gene as target for chemotherapy |
US20040249130A1 (en) | 2002-06-18 | 2004-12-09 | Martin Stanton | Aptamer-toxin molecules and methods for using same |
AU2003247576A1 (en) | 2002-06-18 | 2003-12-31 | Archemix Corp. | Aptamer-toxin molecules and methods for using same |
EP1539218A4 (en) | 2002-06-20 | 2007-08-22 | Univ California | COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING LYMPHOCYTE ACTIVITY |
EP2365004B1 (en) | 2002-06-21 | 2016-01-06 | Johns Hopkins University School of Medicine | Membrane associated tumor endothelium markers |
AU2003281515A1 (en) | 2002-07-19 | 2004-02-09 | Cellzome Ag | Protein complexes of cellular networks underlying the development of cancer and other diseases |
CA2492447A1 (en) | 2002-07-25 | 2004-02-05 | Genentech, Inc. | Taci antibodies and uses thereof |
ES2544527T3 (es) | 2002-07-31 | 2015-09-01 | Seattle Genetics, Inc. | Conjugados de fármacos y su uso para tratar el cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa |
JP2004121218A (ja) | 2002-08-06 | 2004-04-22 | Jenokkusu Soyaku Kenkyusho:Kk | 気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法 |
AU2003251471A1 (en) | 2002-08-06 | 2004-02-25 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostics and therapeutics for diseases associated with human cxc chemokine receptor 5(cxcr5) |
EP1578371A4 (en) | 2002-08-19 | 2009-05-20 | Genentech Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSING AND TREATING TUMORS |
WO2004020583A2 (en) | 2002-08-27 | 2004-03-11 | Bristol-Myers Squibb Company | Polynucleotide predictor set for identifying protein tyrosine kinase modulators |
WO2004020595A2 (en) | 2002-08-29 | 2004-03-11 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Novel human polypeptides encoded by polynucleotides |
AU2002951346A0 (en) | 2002-09-05 | 2002-09-26 | Garvan Institute Of Medical Research | Diagnosis of ovarian cancer |
CN1691964A (zh) | 2002-09-06 | 2005-11-02 | 曼康公司 | 表位序列 |
US20060134109A1 (en) | 2002-09-09 | 2006-06-22 | Nura Inc. | G protein coupled receptors and uses thereof |
JP2004113151A (ja) | 2002-09-27 | 2004-04-15 | Sankyo Co Ltd | 癌遺伝子及びその用途 |
CA2501131A1 (en) | 2002-10-04 | 2004-04-22 | Van Andel Research Institute | Molecular sub-classification of kidney tumors and the discovery of new diagnostic markers |
EP1578447A4 (en) | 2002-10-31 | 2009-06-03 | Genentech Inc | METHODS AND COMPOSITIONS THAT CAN INCREASE ANTIBODY PRODUCTION |
AU2003295401B2 (en) | 2002-11-08 | 2010-04-29 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the treatment of natural killer cell related diseases |
WO2004044178A2 (en) | 2002-11-13 | 2004-05-27 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for diagnosing dysplasia |
WO2004045553A2 (en) | 2002-11-15 | 2004-06-03 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Ca125 gene and its use for diagnostic and therapeutic interventions |
AU2003298650B2 (en) | 2002-11-15 | 2010-03-11 | Musc Foundation For Research Development | Complement receptor 2 targeted complement modulators |
US20080213166A1 (en) | 2002-11-20 | 2008-09-04 | Biogen Idec Inc. | Novel Gene Targets and Ligands that Bind Thereto for Treatment and Diagnosis of Colon Carcinomas |
WO2004047749A2 (en) | 2002-11-21 | 2004-06-10 | University Of Utah Research Foundation | Purinergic modulation of smell |
US20040253606A1 (en) | 2002-11-26 | 2004-12-16 | Protein Design Labs, Inc. | Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators |
EP1581641A4 (en) | 2002-12-06 | 2006-11-15 | Diadexus Inc | COMPOSITIONS, SPREADING VARIATIONS AND METHODS RELATED TO OVARAL SPECIFIC GENES AND PROTEINS |
US20040157278A1 (en) | 2002-12-13 | 2004-08-12 | Bayer Corporation | Detection methods using TIMP 1 |
US7276372B2 (en) | 2002-12-20 | 2007-10-02 | Pdl Biopharma, Inc. | Antibodies against GPR64 and uses thereof |
AU2003299819A1 (en) | 2002-12-23 | 2004-07-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Neutrokine-alpha conjugate, neutrokine-alpha complex, and uses thereof |
EP1597558A2 (en) | 2003-01-08 | 2005-11-23 | Bristol-Myers Squibb Company | Biomarkers and methods for determining sensitivity to epidermal growth factor receptor modulators |
US20050227301A1 (en) | 2003-01-10 | 2005-10-13 | Polgen | Cell cycle progression proteins |
US20050181375A1 (en) | 2003-01-10 | 2005-08-18 | Natasha Aziz | Novel methods of diagnosis of metastatic cancer, compositions and methods of screening for modulators of metastatic cancer |
EP1583820A4 (en) | 2003-01-14 | 2007-07-18 | Bristol Myers Squibb Co | ASSOCIATED POLYNUCLEOTIDES AND POLYPEPTIDES ASSOCIATED WITH THE NF-KB WAY |
JP2007520996A (ja) | 2003-01-15 | 2007-08-02 | ミレニアム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 44390、54181、211、5687、884、1405、636、4421、5410、30905、2045、16405、18560、2047、33751、52872、14063、20739、32544、43239、44373、51164、53010、16852、1587、2207、22245、2387、52908、69112、14990、18547、115、579、15985、15625、760、18603、2395、2554、8675、32720、4809、14303、16816、17827、32620、577、619、1423、2158、8263、15402、16209、16386、21165、30911、41897、1643、2543、9626、13231、32409、84260、2882、8203、32678または55053を用いて泌尿器科障害を処置するための方法および組成物 |
AU2004205684A1 (en) | 2003-01-23 | 2004-08-05 | Genentech, Inc. | Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture |
ES2311736T3 (es) | 2003-01-24 | 2009-02-16 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Tintes hidrofilicos de cianina tiol reactivo y conjugados de los mismos con biomoleculas para el diagnostico por fluorescencia. |
JP2009520459A (ja) | 2003-02-14 | 2009-05-28 | サイグレス ディスカバリー, インコーポレイテッド | 癌における治療標的 |
US20030224411A1 (en) | 2003-03-13 | 2003-12-04 | Stanton Lawrence W. | Genes that are up- or down-regulated during differentiation of human embryonic stem cells |
AU2004284075A1 (en) | 2003-10-22 | 2005-05-06 | Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Pyrrolobenzodiazepine derivatives, compositions comprising the same and methods related thereto |
SG149815A1 (en) | 2003-11-06 | 2009-02-27 | Seattle Genetics Inc | Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands |
EP2412725A3 (en) | 2003-11-17 | 2012-04-25 | Genentech, Inc. | Antibodies against CD79b for the treatment of tumor of hematopoeitic origin |
GB0404577D0 (en) | 2004-03-01 | 2004-04-07 | Spirogen Ltd | Pyrrolobenzodiazepines |
JP5166861B2 (ja) | 2004-03-09 | 2013-03-21 | スピロゲン リミティッド | ピロロベンゾジアゼピン |
CN101065151B (zh) | 2004-09-23 | 2014-12-10 | 健泰科生物技术公司 | 半胱氨酸改造的抗体和偶联物 |
BRPI0622254A2 (pt) | 2005-06-20 | 2011-08-09 | Genentech Inc | anticorpo isolado, conjugado de droga e anticorpo, formulação farmacêutica, método de inibição da proliferação celular, método de tratamento de cáncer, teste de detecção de células cancerosas, artigo industrializado, uso de um composto conjugado de droga e anticorpo e uso de uma formulação farmacêutica |
CA2614436C (en) | 2005-07-07 | 2016-05-17 | Seattle Genetics, Inc. | Monomethylvaline compounds having phenylalanine side-chain modifications at the c-terminus |
WO2007008848A2 (en) | 2005-07-07 | 2007-01-18 | Seattle Genetics, Inc. | Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus |
WO2007025899A1 (en) | 2005-09-01 | 2007-03-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Diaminopyrimidines as p2x3 and p2x2/3 modulators |
PT1813614E (pt) | 2006-01-25 | 2012-01-09 | Sanofi Sa | Agentes citotóxicos compreendendo novos derivados de tomaimicina |
WO2007140371A2 (en) | 2006-05-30 | 2007-12-06 | Genentech, Inc. | Antibodies and immunoconjugates and uses therefor |
KR101528939B1 (ko) | 2006-07-18 | 2015-06-15 | 사노피 | 암 치료를 위한 epha2에 대한 길항제 항체 |
EP1914242A1 (en) | 2006-10-19 | 2008-04-23 | Sanofi-Aventis | Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer |
TWI412367B (zh) | 2006-12-28 | 2013-10-21 | Medarex Llc | 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物 |
EP2144628B1 (en) | 2007-05-08 | 2012-10-17 | Genentech, Inc. | Cysteine engineered anti-muc16 antibodies and antibody drug conjugates |
PT2019104E (pt) | 2007-07-19 | 2013-12-03 | Sanofi Sa | Agentes citotóxicos compreendendo novos derivados de tomaimicina e sua utilização terapêutica |
RU2505544C2 (ru) | 2007-10-19 | 2014-01-27 | Дженентек, Инк. | Антитела против tenb2, сконструированные с цистеином, и конъюгаты антитело - лекарственное средство |
US8426402B2 (en) * | 2009-02-05 | 2013-04-23 | Immunogen, Inc. | Benzodiazepine derivatives |
DE102009051799B4 (de) | 2009-11-03 | 2021-07-01 | Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts | Bifunktionale Prodrugs und Drugs |
CN103755809B (zh) | 2009-11-30 | 2016-06-01 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 治疗和诊断表达slc34a2(tat211=seqid2)的肿瘤的抗体 |
CN102971329B (zh) * | 2010-04-15 | 2016-06-29 | 麦迪穆有限责任公司 | 用于治疗增殖性疾病的吡咯并苯并二氮杂卓 |
EA024730B1 (ru) * | 2010-04-15 | 2016-10-31 | Медимьюн Лимитед | Пирролбензодиазепиновые соединения, их конъюгаты, фармацевтические композиции, содержащие указанные конъюгаты, и применение указанных конъюгатов |
CN103068405A (zh) * | 2010-04-15 | 2013-04-24 | 西雅图基因公司 | 靶向吡咯并苯并二氮杂卓结合物 |
ES2815678T3 (es) | 2010-04-21 | 2021-03-30 | Syntarga Bv | Conjugados de análogos de CC-1065 y conectores bifuncionales |
ES2531471T3 (es) | 2011-02-25 | 2015-03-16 | Lonza Ltd | Enlazador ramificado para conjugados de proteínas-fármacos |
US8852599B2 (en) | 2011-05-26 | 2014-10-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunoconjugates, compositions for making them, and methods of making and use |
KR101877598B1 (ko) | 2011-10-14 | 2018-07-11 | 메디뮨 리미티드 | 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨주게이트 |
EP2869851A1 (en) | 2012-07-09 | 2015-05-13 | Genentech, Inc. | Immunoconjugates comprising anti-cd22 antibodies |
TW201406785A (zh) | 2012-07-09 | 2014-02-16 | Genentech Inc | 抗cd22抗體及免疫結合物 |
CN107106700B (zh) | 2013-12-16 | 2020-10-30 | 基因泰克公司 | 肽模拟化合物及其抗体-药物缀合物 |
CN105828840B (zh) | 2013-12-16 | 2020-08-04 | 基因泰克公司 | 1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚二聚体抗体-药物缀合物化合物及使用和治疗方法 |
-
2014
- 2014-06-16 TW TW103120758A patent/TWI636792B/zh not_active IP Right Cessation
- 2014-06-16 JP JP2016533294A patent/JP6993084B2/ja active Active
- 2014-06-16 MX MX2016001862A patent/MX2016001862A/es unknown
- 2014-06-16 CN CN201480055557.3A patent/CN105636612B/zh active Active
- 2014-06-16 AU AU2014307080A patent/AU2014307080B2/en not_active Ceased
- 2014-06-16 SG SG11201601005XA patent/SG11201601005XA/en unknown
- 2014-06-16 US US14/305,643 patent/US10442836B2/en active Active
- 2014-06-16 KR KR1020167006280A patent/KR20160042080A/ko not_active Application Discontinuation
- 2014-06-16 EP EP14736243.8A patent/EP3033111B1/en active Active
- 2014-06-16 CA CA2918139A patent/CA2918139A1/en not_active Abandoned
- 2014-06-16 BR BR112016002829A patent/BR112016002829A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2014-06-16 WO PCT/US2014/042560 patent/WO2015023355A1/en active Application Filing
- 2014-06-16 EA EA201690195A patent/EA201690195A1/ru unknown
-
2016
- 2016-01-12 IL IL243586A patent/IL243586A0/en unknown
- 2016-02-04 PH PH12016500246A patent/PH12016500246A1/en unknown
- 2016-02-09 CL CL2016000318A patent/CL2016000318A1/es unknown
- 2016-03-11 CR CR20160125A patent/CR20160125A/es unknown
- 2016-09-08 HK HK16110669.1A patent/HK1222544A1/zh unknown
- 2016-09-13 HK HK16110804.7A patent/HK1222566A1/zh unknown
-
2019
- 2019-10-25 JP JP2019194288A patent/JP2020040954A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3033111A1 (en) | 2016-06-22 |
SG11201601005XA (en) | 2016-03-30 |
JP6993084B2 (ja) | 2022-02-03 |
KR20160042080A (ko) | 2016-04-18 |
EA201690195A1 (ru) | 2016-05-31 |
IL243586A0 (en) | 2016-02-29 |
HK1222566A1 (zh) | 2017-07-07 |
US20150165063A1 (en) | 2015-06-18 |
HK1222544A1 (zh) | 2017-07-07 |
AU2014307080A1 (en) | 2016-02-11 |
CL2016000318A1 (es) | 2016-08-19 |
CA2918139A1 (en) | 2015-02-19 |
WO2015023355A1 (en) | 2015-02-19 |
PH12016500246A1 (en) | 2016-05-16 |
CN105636612A (zh) | 2016-06-01 |
MX2016001862A (es) | 2016-08-03 |
AU2014307080B2 (en) | 2018-06-07 |
BR112016002829A2 (pt) | 2017-09-19 |
TW201534327A (zh) | 2015-09-16 |
US10442836B2 (en) | 2019-10-15 |
JP2016530254A (ja) | 2016-09-29 |
CR20160125A (es) | 2016-05-04 |
TWI636792B (zh) | 2018-10-01 |
EP3033111B1 (en) | 2019-03-13 |
CN105636612B (zh) | 2020-01-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2020040954A (ja) | 1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1h−ベンゾ[e]インドール二量体抗体 − 薬物コンジュゲート化合物、並びに使用及び処置の方法 | |
JP6980384B2 (ja) | 1−(クロロメチル)−2,3−ジヒドロ−1h−ベンゾ[e]インドール二量体抗体−薬物コンジュゲート化合物、並びに使用及び処置の方法 | |
US10632210B2 (en) | Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof | |
KR102337414B1 (ko) | 펩타이드 모방체 화합물 및 이의 항체-약물 컨쥬게이트 | |
US9999681B2 (en) | Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof | |
JP7043425B2 (ja) | シルベストロール抗体-薬物コンジュゲート及び使用方法 | |
CN106714844B (zh) | 蒽环类二硫化物中间体、抗体-药物缀合物和方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191125 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20191125 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200124 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201104 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210201 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20210720 |