KR20160042080A - 1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌 이량체 항체-약물 접합체 화합물, 및 사용 및 치료 방법 - Google Patents

1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌 이량체 항체-약물 접합체 화합물, 및 사용 및 치료 방법 Download PDF

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토마스 에이치. 필로우
브라이언 사피나
비샬 베르마
빈칭 웨이
윌리엄 데니
안나 기든스
호 리
궈-량 루
크리스티안 밀러
고든 류캐슬
모아나 터셀
뮤리엘 보넷
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Abstract

본 발명은 링커를 통해 1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌 (CBI) 이량체 약물 모이어티에 접합된 항체를 포함하는 항체-약물 접합체, 및 상기 항체-약물 접합체의 사용 방법을 제공한다.

Description

1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌 이량체 항체-약물 접합체 화합물, 및 사용 및 치료 방법 {1-(CHLOROMETHYL)-2,3-DIHYDRO-1H-BENZO[E]INDOLE DIMER ANTIBODY-DRUG CONJUGATE COMPOUNDS, AND METHODS OF USE AND TREATMENT}
관련 출원에 대한 상호 참조
37 CFR §1.53(b) 하에 출원된 본 정식 출원은 35 USC §119(e) 하에 2013년 8월 12일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/864,889, 2013년 12월 16일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/916,388, 및 2014년 3월 24일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/969,499의 이익을 주장하며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌 (CBI) 이량체 약물 모이어티에 접합되어 치료 또는 진단 용도를 갖는 항체-약물 접합체를 형성하는 항체에 관한 것이다. 항체는 CBI 이량체 약물-링커 중간체와의 접합을 위해 반응성인 유리 시스테인 아미노산을 사용하여 조작될 수 있다. 본 발명은 또한 포유동물 세포 또는 연관된 병리학적 상태의 시험관내, 계내 또는 생체내 진단 또는 치료를 위해 CBI 이량체 항체-약물 접합체 화합물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
항체 약물 접합체 (ADC)는, 강력한 세포독성 약물의 항원-발현 종양 세포로의 표적화, 내재화 및 약물의 방출에 의해 항체 및 세포독성 약물 둘 다의 특성을 조합함으로써 그의 항종양 활성을 증진시키는 표적화된 화학요법제 분자이다 (Carter, P. and Senter, P. (2008) The Cancer Jour. 14(3):154-169). 주어진 표적 항원에 대한 성공적인 ADC 개발은 항체 선택의 최적화, 링커 설계 및 안정성, 세포독성 약물 효력, 및 항체에 대한 약물 및 링커 접합의 방식에 의존한다 (Polakis, P. (2005) Current Opinion in Pharmacology 5:382-387).
DNA 작은 홈 알킬화제의 5-아미노-1-(클로로메틸)-1,2-디히드로-3H-벤즈[e]인돌 (아미노 CBI) 부류는 강력한 세포독소이며 (Atwell, et al. (1999) J. Med. Chem., 42:3400), 암 요법을 위해 설계된 전구약물의 다수의 부류에서 이펙터 단위로 이용된 바 있다. 이들은 항체 접합체 (Jeffrey, et al. (2005) J. Med. Chem., 48:1344), 니트로벤질 카르바메이트 기재의 유전자 요법을 위한 전구약물 (Hay, et al. (2003) J. Med. Chem. 46:2456) 및 저산소상태-활성화 전구약물로서의 상응하는 니트로-CBI 유도체 (Tercel, et al. (2011) Angew. Chem., Int. Ed., 50:2606-2609)를 포함하였다. CBI 및 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 (PBD) 약물작용발생단이 알킬 쇄에 의해 함께 연결된 바 있다 (Tercel et al. (2003) J. Med. Chem 46:2132-2151). 2개의 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 단위가 알킬렌 또는 알킬렌-아릴렌 쇄에 의해 테더링된 PBD 이량체는 DNA 작은 홈에서 구아닌과 반응하는 고도로 효율적인 가닥간 가교제이며 (Rahman et al. (2009) Jour. Amer. Chem. Soc. 131(38):13756-13766; Thurston et al. (1994) Chem. Rev., 94:433-465; Bose et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:4939-4941; Gregson et al. (2004) Jour. Med. Chem. 47(5):1161-1174; US 7511032; US 7528126; US 7557099; US 7049311; US 7067511; US 7265105), 그람-양성 박테리아 (Doyle et al. (2009) Jour. Antimicrob. Chemo. 65(5):949-959; Hadjivassileva et al. (2005) Jour. Antimicrob. Chemo. 56(3):513-518), 인간 B-세포 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 세포 (Pepper et al. (2004) Cancer Res. 64(18):6750-6755) 및 고형 종양 (Hochhauser et al. (2009) Clin. Cancer Res. 15(6):2140-2147; Alley et al. (2004) 64(18):6700-6706; Hartley et al. (2004) Cancer Res. 64(18):6693-6699)에 대한 활성을 갖는다. PBD의 이량체 형태가 ADC를 형성하기 위해 항체에 연결된 바 있다 (US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; WO 2011/130598, WO 2011/130616; US 2013/0028919).
본 발명은 링커에 의해 공유 부착되어 치료 또는 진단 용도를 갖는 항체-약물 접합체 (ADC) 화합물을 형성하는 1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌 (CBI) 이량체 약물 모이어티를 포함한다.
본 발명의 측면은 하기 화학식을 갖는 항체-약물 접합체 화합물이다.
Figure pct00001
상기 식에서,
Ab는 항체이고;
L은 하기 화학식을 갖는 링커이고,
Figure pct00002
여기서 Str은 항체에 공유 부착된 스트레쳐 단위이고; Pep는 2 내지 12개의 아미노산 잔기의 임의적인 펩티드 단위이고, Sp는 이량체 약물 모이어티에 공유 부착된 임의적인 스페이서 단위이고, m 및 n은 독립적으로 0 및 1로부터 선택되고;
p는 1 내지 8의 정수이고;
D는 하기 화학식을 갖는 이량체 약물 모이어티이고,
Figure pct00003
여기서
R1은 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb, 또는 L에 대한 결합으로부터 선택되고;
R2는 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb, 또는 L에 대한 결합으로부터 선택되고;
Ra 및 Rb는 독립적으로 H, 및 1개 이상의 F로 임의로 치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되거나,
또는 Ra 및 Rb는 5 또는 6원 헤테로시클릴 기를 형성하고;
T는 C3-C12 알킬렌, Y, (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C2-C6 알케닐렌)-Y-(C2-C6 알케닐렌), 및 (C2-C6 알키닐렌)-Y-(C2-C6 알키닐렌)으로부터 선택된 테더 기이고;
여기서 Y는 독립적으로 O, S, NR1, 아릴, 및 헤테로아릴로부터 선택되고;
여기서 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 F, OH, O(C1-C6 알킬), NH2, NHCH3, N(CH3)2, OP(O)3H2, 및 C1-C6 알킬로 독립적으로 및 임의로 치환되고, 여기서 알킬은 1개 이상의 F로 임의로 치환되거나;
또는 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 L에 대한 결합으로 독립적으로 및 임의로 치환되고;
D'는
Figure pct00004
로부터 선택된 약물 모이어티이고;
여기서 파상선은 T에 대한 부착 부위를 나타내고;
X1 및 X2는 독립적으로 O 및 NR3으로부터 선택되고, 여기서 R3은 H, 및 1개 이상의 F로 임의로 치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되고;
R4는 H, CO2R, 또는 L에 대한 결합이고, 여기서 R은 C1-C6 알킬 또는 벤질이고;
R5는 H 또는 C1-C6 알킬이다.
본 발명의 측면은 항체-약물 접합체 화합물 및 제약상 허용되는 담체, 활택제, 희석제 또는 부형제의 제약 조성물이다.
본 발명의 측면은 환자에게 치료 유효량의 항체-약물 접합체 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법이다.
본 발명의 측면은
a) 제약 조성물; 및
b) 사용 지침서
를 포함하는, 암을 치료하기 위한 키트이다.
본 발명의 측면은 하기로부터 선택된 링커-약물 중간체이다.
Figure pct00005
상기 식에서,
X는 말레이미드, 티올, 아미노, 브로마이드, 브로모아세트아미도, 아이오도아세트아미도, p-톨루엔술포네이트, 아이오다이드, 히드록실, 카르복실, 피리딜 디술피드, 및 N-히드록시숙신이미드로부터 선택된 반응성 관능기이고;
L은 하기 화학식을 갖는 링커이고,
Figure pct00006
여기서 Str은 X에 공유 부착된 스트레쳐 단위이고; Pep는 2 내지 12개의 아미노산 잔기의 임의적인 펩티드 단위이고, Sp는 이량체 약물 모이어티에 공유 부착된 임의적인 스페이서 단위이고, m 및 n은 독립적으로 0 및 1로부터 선택되고;
D는 하기 화학식을 갖는 이량체 약물 모이어티이고,
Figure pct00007
여기서
R1은 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb, 또는 L에 대한 결합으로부터 선택되고;
R2는 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb, 또는 L에 대한 결합으로부터 선택되고;
Ra 및 Rb는 독립적으로 H, 및 1개 이상의 F로 임의로 치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되거나, 또는 Ra 및 Rb는 5 또는 6원 헤테로시클릴 기를 형성하고;
T는 C3-C12 알킬렌, Y, (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C2-C6 알케닐렌)-Y-(C2-C6 알케닐렌), 및 (C2-C6 알키닐렌)-Y-(C2-C6 알키닐렌)으로부터 선택된 테더 기이고;
여기서 Y는 독립적으로 O, S, NR1, 아릴, 및 헤테로아릴로부터 선택되고;
여기서 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 F, OH, O(C1-C6 알킬), NH2, NHCH3, N(CH3)2, OP(O)3H2, 및 C1-C6 알킬로 독립적으로 및 임의로 치환되고, 여기서 알킬은 1개 이상의 F로 임의로 치환되거나;
또는 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 L에 대한 결합으로 독립적으로 및 임의로 치환되고;
D'는
Figure pct00008
로부터 선택된 약물 모이어티이고;
여기서 파상선은 T에 대한 부착 부위를 나타내고;
X1 및 X2는 독립적으로 O 및 NR3으로부터 선택되고, 여기서 R3은 H, 및 1개 이상의 F로 임의로 치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되고;
R4는 H, CO2R, 또는 L에 대한 결합이고, 여기서 R은 C1-C6 알킬 또는 벤질이고;
R5는 H 또는 C1-C6 알킬이다.
본 발명의 측면은 항체를 링커-약물 중간체에 접합시킴으로써 항체-약물 접합체를 제조하는 방법이다.
본 발명의 측면은 하기 화학식을 갖는 CBI 이량체 약물 모이어티 화합물이다.
Figure pct00009
상기 식에서
R1은 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb로부터 선택되고;
R2는 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb로부터 선택되고;
Ra 및 Rb는 독립적으로 H, 및 1개 이상의 F로 임의로 치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되거나,
또는 Ra 및 Rb는 5 또는 6원 헤테로시클릴 기를 형성하고;
T는 C3-C12 알킬렌, Y, (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C2-C6 알케닐렌)-Y-(C2-C6 알케닐렌), 및 (C2-C6 알키닐렌)-Y-(C2-C6 알키닐렌)으로부터 선택된 테더 기이고;
여기서 Y는 독립적으로 O, S, NR1, 아릴, 및 헤테로아릴로부터 선택되고;
여기서 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 F, OH, O(C1-C6 알킬), NH2, NHCH3, N(CH3)2, OP(O)3H2, 및 C1-C6 알킬로 독립적으로 및 임의로 치환되고, 여기서 알킬은 1개 이상의 F로 임의로 치환되거나;
또는 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 L에 대한 결합으로 독립적으로 및 임의로 치환되고;
D'는
Figure pct00010
로부터 선택된 약물 모이어티이고;
여기서 파상선은 T에 대한 부착 부위를 나타내고;
X1 및 X2는 독립적으로 O 및 NR3으로부터 선택되고, 여기서 R3은 H, 및 1개 이상의 F로 임의로 치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되고;
R4는 H, CO2R이고, 여기서 R은 C1-C6 알킬 또는 벤질이고;
R5는 H 또는 C1-C6 알킬이다.
도 1은 (S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 51a로부터의 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 2-(2-브로모-N-메틸아세트아미도)에틸(메틸)카르바메이트 51의 합성을 제시한다.
도 2는 (R)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-(디페닐메틸렌아미노)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 53a로부터의 N-((R)-1-(클로로메틸)-3-(5-((R)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 53의 합성을 제시한다.
도 3은 (S)-5-(5-(벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜탄산 57c로부터의 1-((S)-5-아미노-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)펜탄-1,5-디온 53j의 합성을 제시한다.
도 4는 (R)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 53k로부터의 비천연 거울상이성질체, 1-((R)-5-아미노-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-((R)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)펜탄-1,5-디온 53p의 합성을 제시한다.
도 5는 (S)-(2-아미노-4-히드록시-5-메톡시페닐)(2-(히드록시메틸)피롤리딘-1-일)메타논 54a로부터의 N-(4-(((S)-1-(클로로메틸)-3-(6-((S)-7-메톡시-5-옥소-2,3,5,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일옥시)헥사노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일옥시)메틸)페닐)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 54의 합성을 제시한다.
도 6은 (S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 51a로부터의 N-((S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일옥시)메틸)페닐아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 55의 합성을 제시한다.
도 7은 (S)-tert-부틸 8-(6-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-니트로벤질옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-6-옥소헥실옥시)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 54g로부터의 (S)-tert-부틸 8-(6-((S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-6-옥소헥실옥시)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 56d의 합성을 제시한다.
도 8은 (S)-tert-부틸 8-(6-((S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-6-옥소헥실옥시)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 56d로부터의 N-((S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(클로로메틸)-3-(6-((S)-7-메톡시-5-옥소-2,3,5,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일옥시)헥사노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일옥시)메틸)페닐아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 56의 합성을 제시한다.
도 9는 (S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 51a로부터의 (S)-5-(1-(클로로메틸)-5-(디-tert-부톡시포스포릴옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜탄산 57d의 합성을 제시한다.
도 10은 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산산으로부터의 (S)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-메틸헥산아미도)에틸(메틸)카르바메이트 57i의 합성을 제시한다.
도 11은 (S)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-메틸헥산아미도)에틸(메틸)카르바메이트 57i로부터의 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(포스포노옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-메틸헥산아미도)에틸(메틸)카르바메이트 57의 합성을 제시한다.
도 12는 (S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 51a로부터의 (S)-3-(5-((S)-5-(4-아미노벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트 58e의 합성을 제시한다.
도 13은 (S)-3-(5-((S)-5-(4-아미노벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트 58e로부터의 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트 58의 합성을 제시한다.
도 14는 (S)-tert-부틸 5-(4-((S)-2-((S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 55e로부터의 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 디히드로겐 포스페이트 59의 합성을 제시한다.
도 15는 (S)-tert-부틸 5-아미노-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 61a로부터의 2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(포스포노옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일카르바메이트 61의 합성을 제시한다.
도 16은 51a로부터의 2-(피리딘-2-일디술파닐)프로필 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(포스포노옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일카르바메이트 62의 합성을 제시한다.
도 17은 (S)-2,2,2-트리클로로에틸 6-(5-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-(2-(히드록시메틸)피롤리딘-1-카르보닐)-2-메톡시페녹시)헥사노에이트 54c로부터의 (S)-3-(6-(4-((S)-2-(아세톡시메틸)피롤리딘-1-카르보닐)-5-아미노-2-메톡시페녹시)헥사노일)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트 65d의 합성을 제시한다.
도 18은 (S)-2-(알릴옥시카르보닐아미노)-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥산산 65e로부터의 벤질 알콜 리신 65g의 합성을 제시한다.
도 19는 (S)-3-(6-(4-((S)-2-(아세톡시메틸)피롤리딘-1-카르보닐)-5-아미노-2-메톡시페녹시)헥사노일)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트 65d로부터의 (S)-4-((S)-2-((S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-3-메틸부탄아미도)-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥산아미도)벤질 8-(6-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-메틸피페라진-1-카르보닐옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-6-옥소헥실옥시)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 65k의 합성을 제시한다.
도 20은 65k로부터의 (S)-4-((S)-6-아미노-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)헥산아미도)벤질 8-(6-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-메틸피페라진-1-카르보닐옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-6-옥소헥실옥시)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 65의 비스-트리플루오로아세테이트 염으로서의 합성을 제시한다.
도 21은 51a로부터 제조된 (S)-tert-부틸 5-(벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 57a로부터의 (S)-디-tert-부틸 1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 포스페이트 66d의 합성을 제시한다.
도 22는 (2E,2'E)-tert-부틸 3,3'-(2-니트로-1,4-페닐렌)디아크릴레이트 66e로부터의 N-(3-(2,5-비스((E)-3-((S)-1-(클로로메틸)-5-포스폰옥시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-3-옥소프로프-1-에닐)페닐아미노)-3-옥소프로필)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 66의 합성을 제시한다.
도 23은 (2E,2'E)-tert-부틸 3,3'-(2-(3-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)프로판아미도)-1,4-페닐렌)디아크릴레이트 66g로부터의 N-(3-(2,5-비스((E)-3-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-3-옥소프로프-1-에닐)페닐아미노)-3-옥소프로필)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 67의 합성을 제시한다.
도 24는 66d, 67c, 67d로부터의 (S)-1-(클로로메틸)-3-((E)-3-(4-((E)-3-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-3-옥소프로프-1-에닐)-2-(3-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)프로판아미도)페닐)아크릴로일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 디히드로겐 포스페이트 68의 합성을 제시한다.
도 25는 티오 hu 항-CD22 HC A121C-MC-vc-PAB-(CBI 이량체) 101 및 티오 hu 항-Her2 HC A121C-MC-vc-PAB-(CBI 이량체) 102의 농도 (μg/ml)에 대한 제3일에서의 SK-BR-3 시험관내 세포 생존율의 플롯에서의 항체-약물 접합체의 효능을 제시한다.
도 26은 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI-PBD) 103 및 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI-PBD) 104의 농도 (μg/ml)에 대한 제3일에서의 SK-BR-3 시험관내 세포 생존율의 플롯에서의 항체-약물 접합체의 효능을 제시한다.
도 27은 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI 이량체) 116 및 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI 이량체) 117의 농도 (μg/ml)에 대한 제3일에서의 SK-BR-3 시험관내 세포 생존율의 플롯에서의 항체-약물 접합체의 효능을 제시한다.
도 28은 티오 Hu 항-CD33 15G15.33 HC A118C-MC-MMED-(CBI 이량체 포스) 125의 농도 (μg/ml)에 대한 제3일에서의 EOL-1 시험관내 세포 생존율의 플롯에서의 항체-약물 접합체의 효능을 제시한다.
도 29는 티오 Hu 항-MUC16 3A5 HC A118C-MC-ED-(CBI 이량체 DVB 디포스) 126 및 티오 Hu 항-CD33 15G15.33 HC A118C-MC-ED-(CBI 이량체 DVB 디포스) 127의 농도 (μg/ml)에 대한 제3일에서의 EOL-1 시험관내 세포 생존율의 플롯에서의 항체-약물 접합체의 효능을 제시한다.
도 30은 티오 Hu 항-CD33 15G15.33 HC A118C-MC-ED-(CBI 이량체 DVB 디포스) 127, 티오 Hu 항-CD33 15G15.33 HC A118C-MC-ED-(CBI 이량체 DVB 포스) 129 및 티오 Hu 항-MUC16 3A5 HC A118C-MC-ED-(CBI 이량체 DVB 포스) 130의 농도 (μg/ml)에 대한 제3일에서의 EOL-1 시험관내 세포 생존율의 플롯에서의 항체-약물 접합체의 효능을 제시한다.
도 31은 (1) 비히클: 히스티딘 완충제 #8: 20mM 히스티딘 아세테이트, pH 5.5, 240mM 수크로스, 0.02% PS 20, (2) 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C-MC-MMED-(CBI 이량체 포스) 110, (3) 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI 이량체 MePip) 108, (4) 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI 이량체 포스) 111, (5) 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-MC-MMED-(CBI 이량체 포스) 109, (6) 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI 이량체 MePip) 107, (7) 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI 이량체 포스) 112로 IV 1회 투여 후에, CRL nu/nu 마우스의 유방 지방 패드 내로 접종된 MMTV-HER2 Fo5 트랜스제닉 유방 종양에서 시간 경과에 따른 생체내 핏팅된 종양 부피 변화의 플롯에서의 항체-약물 접합체의 효능을 제시한다. ADC는 10 mg/kg으로 투여하였다.
도 32는 (1) 비히클: 히스티딘 완충제 #8: 20mM 히스티딘 아세테이트, pH 5.5, 240mM 수크로스, 0.02% PS 20, (2) 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C-DSE-(CBI 이량체 포스) 120, 10 mg/kg, (3) 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C-DSE-(CBI 이량체 포스) 122, 10 mg/kg, (4) 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C-MC-vc-PAB-(N10,PBD-CBI MePip) 124, 10 mg/kg, (5) 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-DSE-(CBI 이량체 포스) 119, 3 mg/kg, (6) 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-DSE-(CBI 이량체 포스) 119, 10 mg/kg, (7) 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-DSP-(CBI 이량체 포스) 121, 3 mg/kg, (8) 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-DSP-(CBI 이량체 포스) 121, 10 mg/kg (9) 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(N10,PBD-CBI MePip) 123, 3 mg/kg, (10) 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(N10,PBD-CBI MePip) 123, 10 mg/kg으로 IV 1회 투여 후에, CRL nu/nu 마우스의 유방 지방 패드 내로 접종된 MMTV-HER2 Fo5 트랜스제닉 유방 종양에서 시간 경과에 따른 생체내 핏팅된 종양 부피 변화의 플롯에서의 항체-약물 접합체의 효능을 제시한다.
도 33은 (1) 비히클: 히스티딘 완충제 #8: 20mM 히스티딘 아세테이트, pH 5.5, 240mM 수크로스, 0.02% PS 20, (2) 티오 Hu 항-CD33 15G15.33 HC A118C-MC-ED-(CBI 이량체 DVB 디포스) 127, 3 mg/kg, (3) 티오 Hu 항-MUC16 3A5 HC A118C-MC-ED-(CBI 이량체 DVB 디포스) 126, 3 mg/kg, (4) 티오 Hu 항-MUC16 3A5 HC A118C-MC-ED-(CBI 이량체 DVB 디포스) 126, 1 mg/kg으로 IV 1회 투여 후에, C.B-17 SCID 마우스 내로 접종된 OVCAR3X2.1 인간 난소 종양에서 시간 경과에 따른 생체내 핏팅된 종양 부피 변화의 플롯에서의 항체-약물 접합체의 효능을 제시한다.
도 34는 (1) 비히클: 히스티딘 완충제 #8: 20mM 히스티딘 아세테이트, pH 5.5, 240mM 수크로스, 0.02% PS 20, (2) 티오 Hu 항-CD33 15G15.33 HC A118C-MC-MMED-(CBI 이량체 포스) 125, (3) 티오 Hu 항-CD33 15G15.33 HC A118C-MC-ED-(CBI 이량체 DVB 디포스) 127, (4) 티오 Hu 항-MUC16 3A5 HC A118C-MC-MMED-(CBI 이량체 포스) 128, (5) 티오 Hu 항-MUC16 3A5 HC A118C-MC-ED-(CBI 이량체 DVB 디포스) 126으로 20 μg/m2로 IV 1회 투여 후에, C.B-17 SCID 마우스 내로 접종된 HL-60 인간 급성 골수성 백혈병에서 시간 경과에 따른 생체내 핏팅된 종양 부피 변화의 플롯에서의 항체-약물 접합체의 효능을 제시한다.
도 35a는 HL-60 인간 급성 골수성 백혈병 종양을 갖는 SCID 마우스에서의 ADC138의 효능을 제시한다. ADC138은 비히클 군과 비교하여 종양 성장의 용량-의존성 억제를 나타내었다. 비-표적화 대조 ADC135는 종양 성장에 어떠한 영향도 미치지 않았다.
도 35b는 HL-60 인간 급성 골수성 백혈병 종양을 갖는 SCID 마우스에서의 ADC139의 효능을 제시한다. ADC139는 비히클 군과 비교하여 종양 성장의 명백한 억제를 나타내었다. 1 mg/kg의 비-표적화 대조 ADC136은 종양 성장에 대해 중간 정도의 효과를 가졌으나; 매칭되는 용량의 ADC139는 실질적으로 보다 효과적이었으며 완전한 종양 완화를 유도하였다.
도 36은 Igrov-1 인간 난소 종양을 갖는 SCID-베이지 마우스에서의 ADC134의 효능을 제시한다. ADC134는 비히클 군과 비교하여 종양 성장의 용량-의존성 억제를 나타내었다. 비-표적화 대조 ADC137은 종양 성장에 어떠한 영향도 미치지 않았다.
도 37은 N-(3-(2,5-비스((E)-3-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-메틸피페라진-1-카르보닐옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-3-옥소프로프-1-에닐)페닐아미노)-3-옥소프로필)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 (화합물 번호 69, 표 4)의 합성을 제시한다.
도 38은 2-(피리딘-2-일디술파닐)프로필 2,5-비스((E)-3-((S)-1-(클로로메틸)-5-(포스포노옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-3-옥소프로프-1-에닐)페닐카르바메이트 (표 4, 화합물 번호 72, 도 38)의 합성을 제시한다.
도 39는 [(1S)-1-(클로로메틸)-3-[(E)-3-[4-[(E)-3-[(1S)-1-(클로로메틸)-5-포스포노옥시-1,2-디히드로벤조[e]인돌-3-일]-3-옥소-프로프-1-에닐]-2-[2-[2-(2,5-디옥소피롤-1-일)에톡시]에톡시]페닐]프로프-2-에노일]-1,2-디히드로벤조[e]인돌-5-일] 디히드로겐 포스페이트 (화합물 번호 78, 표 4, 도 39)의 합성을 제시한다.
도 40은 [(1S)-1-(클로로메틸)-3-[(E)-3-[4-[(E)-3-[(1S)-1-(클로로메틸)-5-포스포노옥시-1,2-디히드로벤조[e]인돌-3-일]-3-옥소-프로프-1-에닐]-2-[2-(2,5-디옥소피롤-1-일)에톡시]페닐]프로프-2-에노일]-1,2-디히드로벤조[e]인돌-5-일] 디히드로겐 포스페이트 (화합물 번호 79, 표 4, 도 40)의 합성을 제시한다.
도 41은 2-(2-피리딜디술파닐)프로필 N-[1-(클로로메틸)-3-[5-[1-(클로로메틸)-5-히드록시-1,2-디히드로벤조[e]인돌-3-일]-5-옥소-펜타노일]-1,2-디히드로벤조[e]인돌-5-일]카르바메이트 (화합물 번호 80, 표 4, 도 41)의 합성을 제시한다.
도 42-43은 2-(2-피리딜디술파닐)프로필 3-[6-[1-(클로로메틸)-5-(4-메틸피페라진-1-카르보닐)옥시-1,2-디히드로벤조[e]인돌-3-일]-6-옥소-헥속시]-6-히드록시-2-메톡시-11-옥소-6a,7,8,9-테트라히드로-6H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-카르복실레이트, 2-(2-피리딜디술파닐)프로필 3-[6-[1-(클로로메틸)-5-포스포노옥시-1,2-디히드로벤조[e]인돌-3-일]-6-옥소-헥속시]-6-히드록시-2-메톡시-11-옥소-6a,7,8,9-테트라히드로-6H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-카르복실레이트, 및 2-(2-피리딜디술파닐)프로필 3-[6-[1-(클로로메틸)-5-히드록시-1,2-디히드로벤조[e]인돌-3-일]-6-옥소-헥속시]-6-히드록시-2-메톡시-11-옥소-6a,7,8,9-테트라히드로-6H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-카르복실레이트 (화합물 번호 81-83, 표 4, 도 42-43)의 합성을 제시한다.
도 44는 (1S)-1-(클로로메틸)-3-((2E)-3-{4-((1E)-3-{(1S)-1-(클로로메틸)-5-[(6-메틸-β-D-글루코피라누로노실)옥시]-1,2-디히드로-3H-벤조[e]인돌-3-일}-3-옥소-1-프로페닐)-2-[(3-{[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일) 헥사노일] 아미노} 프로파노일)아미노]페닐}-2-프로페노일)-1,2-디히드로-3H-벤조[e]인돌-5-일 메틸 β-D-글루코피라노시두로네이트 (화합물 번호 84, 표 4, 도 44)의 합성을 제시한다.
도 45는 (S)-(1-메틸-1H-피롤-2,5-디일)비스(((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)메타논) (화합물 번호 15, 표 1, 도 45)의 합성을 제시한다.
도 46은 N-(2,5-비스((E)-3-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-3-옥소프로프-1-에닐)페닐)아세트아미드 (화합물 번호 16, 표 1, 도 46)의 합성을 제시한다.
도 47은 (S,2E,2'E)-3,3'-(2-메톡시-1,4-페닐렌)비스(1-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)프로프-2-엔-1-온) (화합물 번호 17, 표 1, 도 47)의 합성을 제시한다.
도 48은 (S,2E,2'E)-3,3'-(1-메틸-1H-피롤-2,5-디일)비스(1-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)프로프-2-엔-1-온) (화합물 번호 18, 표 1, 도 48)의 합성을 제시한다.
도 49는 (S)-3,3'-(2-메톡시-1,4-페닐렌)비스(1-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)프로프-2-인-1-온) (화합물 19, 표 1, 도 49)의 합성을 제시한다.
이제 본 발명의 특정 실시양태를 상세하게 언급할 것이고, 그 예는 수반되는 구조 및 화학식에서 예시된다. 본 발명은 예시된 실시양태와 함께 기재될 것이나, 이것이 본 발명을 이들 실시양태로 제한하려는 의도가 아님을 이해할 것이다. 반대로, 본 발명은 특허청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형 및 등가물을 포함하는 것으로 의도된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 다수의 방법 및 물질을 인지할 것이다. 본 발명은 어떠한 방식으로도 기재된 방법 및 물질로 제한되지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖고, 문헌 [Singleton et al. (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd Ed., J. Wiley & Sons, New York, NY; 및 Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York]과 부합된다.
정의
달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 하기 용어 및 어구는 하기 의미를 갖는 것으로 의도된다.
본원에서 상표명이 사용되는 경우에, 본 출원인은 상표명 제품 제제, 제네릭 약물 및 상표명 제품의 활성 제약 성분(들)이 독립적으로 포함되는 것으로 의도한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 이량체, 다량체, 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체), 및 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편을 포함한다 (Miller et al. (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861). 항체는 뮤린, 인간, 인간화, 키메라이거나, 또는 다른 종으로부터 유래될 수 있다. 항체는 특정 항원을 인식하고 그에 결합할 수 있는, 면역계에 의해 생성되는 단백질이다. (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York). 표적 항원은 일반적으로 다수의 항체 상의 CDR에 의해 인식되는, 에피토프로도 불리는 많은 결합 부위를 갖는다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 각각의 항체는 상이한 구조를 갖는다. 따라서, 1개의 항원은 1개 초과의 상응하는 항체를 가질 수 있다. 항체는 전장 이뮤노글로불린 분자 또는 전장 이뮤노글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 관심 표적 항원 (이러한 표적은 암 세포, 또는 자가면역 질환과 연관된 자가면역 항체를 생성하는 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않음) 또는 그의 일부와 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 본원에 개시된 이뮤노글로불린은 이뮤노글로불린 분자의 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA), 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류일 수 있다. 이뮤노글로불린은 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 그러나, 한 측면에서, 이뮤노글로불린은 인간, 뮤린 또는 토끼 기원의 것이다.
"항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 미니바디 (Olafsen et al. (2004) Protein Eng. Design & Sel. 17(4):315-323), Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 항-이디오타입 (항-Id) 항체, CDR (상보성 결정 영역), 및 암 세포 항원, 바이러스 항원 또는 미생물 항원에 면역특이적으로 결합하는 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편, 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 이러한 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 지시되어 고도로 특이적이다. 또한, 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 그의 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 다른 항체에 의해 오염되지 않은 상태로 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 특징이 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것임을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 요구한다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al. (1975) Nature, 256:495]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, US 4816567; US 5807715 참조)에 의해 제조될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한, 예를 들어 문헌 [Clackson et al. (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 그에 상동성이고 쇄(들)의 나머지 부분은 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 그에 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 상기 항체의 단편을 포함한다 (US 4816567; 및 Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855). 본원에서 관심 키메라 항체는 비-인간 영장류 (예를 들어, 구세계 원숭이, 유인원 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다.
본원에서 "무손상 항체"는 VL 및 VH 도메인 뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 무손상 항체는, 항체의 Fc 불변 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭하는 1종 이상의 "이펙터 기능"을 가질 수 있다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 및 세포 표면 수용체, 예컨대 B 세포 수용체 및 BCR의 하향 조절을 포함한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단까지 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 본원에 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은, EU 인덱스로도 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 무손상 항체는 상이한 "부류"로 지정될 수 있다. 5가지 주요 부류의 무손상 이뮤노글로불린 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 "하위부류" (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 널리 공지되어 있다. Ig 형태는 힌지-변형 또는 무힌지 형태를 포함한다 (Roux et al. (1998) J. Immunol. 161:4083-4090; Lund et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256; US 2005/0048572; US 2004/0229310).
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 분명히 배제한다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택 시 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우에 하위군은 상기 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우에 하위군은 상기 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 III이다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열이 초가변성이고/거나 구조적으로 한정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR; VH 내의 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내의 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터의 및/또는 "상보성 결정 영역" (CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 서열 가변성이 가장 높고/거나 항원 인식과 관련된다. 예시적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3)에서 발생한다. (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) 예시적인 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65 및 H3의 95-102에서 발생한다. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) VH 내의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원에 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 단축-CDR, 또는 a-CDR로 불리는 CDR의 영역 내에 함유된다. 예시적인 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58 및 H3의 95-102에서 발생한다. (문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조.) 달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인 내의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 상기 문헌 [Kabat et al.]에 따라 넘버링된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원에 대한 항체의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조.) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 연결되어 있는 또 다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어는 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라, 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 통합된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
"유리 시스테인 아미노산"은 모 항체 내로 조작되고 티올 관능기 (-SH)를 가지며 분자내 또는 분자간 디술피드 가교로서 쌍형성되지 않는 시스테인 아미노산 잔기를 지칭한다.
"링커", "링커 단위" 또는 "링크"는 항체를 약물 모이어티에 공유 부착시키는 원자의 쇄를 포함하는 화학적 모이어티를 의미한다. 다양한 실시양태에서, 링커는 L로 명시되는 2가 라디칼이다.
치환기의 수를 나타내는 경우에, 용어 "1개 이상"은 1개의 치환기 내지 최대 가능한 수의 치환 범위, 즉 치환기에 의한 1개의 수소의 대체 내지 모든 수소의 대체를 지칭한다. 용어 "치환기"는 모 분자 상의 수소 원자를 대체하는 원자 또는 원자단을 나타낸다. 용어 "치환된"은 명시된 기가 1개 이상의 치환기를 보유함을 나타낸다. 임의의 기가 다수의 치환기를 보유할 수 있고 다양한 가능한 치환기가 제공될 경우에, 치환기는 독립적으로 선택되고, 동일할 필요는 없다. 용어 "비치환된"은 명시된 기가 치환기를 보유하지 않음을 의미한다. 용어 "임의로 치환된"은 명시된 기가 비치환되거나 또는 가능한 치환기의 군으로부터 독립적으로 선택된 1개 이상의 치환기로 치환됨을 의미한다. 치환기의 수를 나타내는 경우에, 용어 "1개 이상"은 1개의 치환기 내지 최대 가능한 수의 치환, 즉 치환기에 의한 1개의 수소의 대체 내지 모든 수소의 대체를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "알킬"은 1 내지 12개의 임의의 길이의 탄소 원자 (C1-C12)의 포화 선형 또는 분지쇄 1가 탄화수소 라디칼을 지칭하며, 상기 알킬 라디칼은 독립적으로 하기 기재된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 알킬 라디칼은 1 내지 8개의 탄소 원자 (C1-C8) 또는 1 내지 6개의 탄소 원자 (C1-C6)이다. 알킬 기의 예는 메틸 (Me, -CH3), 에틸 (Et, -CH2CH3), 1-프로필 (n-Pr, n-프로필, -CH2CH2CH3), 2-프로필 (i-Pr, i-프로필, -CH(CH3)2), 1-부틸 (n-Bu, n-부틸, -CH2CH2CH2CH3), 2-메틸-1-프로필 (i-Bu, i-부틸, -CH2CH(CH3)2), 2-부틸 (s-Bu, s-부틸, -CH(CH3)CH2CH3), 2-메틸-2-프로필 (t-Bu, t-부틸, -C(CH3)3), 1-펜틸 (n-펜틸, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-펜틸 (-CH(CH2CH3)2), 2-메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH2CH3), 3-메틸-2-부틸 (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-메틸-1-부틸 (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-메틸-1-부틸 (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-헥실 (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-헥실 (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-헥실 (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-메틸-2-펜틸 (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-메틸-3-펜틸 (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-메틸-3-펜틸 (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-디메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-디메틸-2-부틸 (-CH(CH3)C(CH3)3, 1-헵틸, 1-옥틸 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "알킬렌"은 1 내지 12개의 임의의 길이의 탄소 원자 (C1-C12)의 포화 선형 또는 분지쇄 2가 탄화수소 라디칼을 지칭하며, 상기 알킬렌 라디칼은 독립적으로 하기 기재된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 알킬렌 라디칼은 1 내지 8개의 탄소 원자 (C1-C8) 또는 1 내지 6개의 탄소 원자 (C1-C6)이다. 알킬렌 기의 예는 메틸렌 (-CH2-), 에틸렌 (-CH2CH2-), 프로필렌 (-CH2CH2CH2-) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "알케닐"은 적어도 1개의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소, sp2 이중 결합을 갖는, 2개 내지 8개의 임의의 길이의 탄소 원자 (C2-C8)의 선형 또는 분지쇄 1가 탄화수소 라디칼을 지칭하며, 여기서 알케닐 라디칼은 독립적으로 하기 기재된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고, "시스" 및 "트랜스" 배향 또는 대안적으로는 "E" 및 "Z" 배향을 갖는 라디칼을 포함한다. 그 예는 에틸레닐 또는 비닐 (-CH=CH2), 알릴 (-CH2CH=CH2) 등을 포함한다.
용어 "알케닐렌"은 적어도 1개의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소, sp2 이중 결합을 갖는, 2 내지 8개의 임의의 길이의 탄소 원자 (C2-C8)의 선형 또는 분지쇄 2가 탄화수소 라디칼을 지칭하며, 여기서 알케닐 라디칼은 독립적으로 하기 기재된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고, "시스" 및 "트랜스" 배향 또는 대안적으로 "E" 및 "Z" 배향를 갖는 라디칼을 포함한다. 그 예는 에틸레닐렌 또는 비닐렌 (-CH=CH-), 알릴 (-CH2CH=CH-) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "알키닐"은 적어도 1개의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소, sp 삼중 결합을 갖는, 2개 내지 8개의 임의의 길이의 탄소 원자 (C2-C8)의 선형 또는 분지형 1가 탄화수소 라디칼을 지칭하며, 여기서 알키닐 라디칼은 독립적으로 하기 기재된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있다. 그 예는 에티닐 (-C≡CH), 프로피닐 (프로파르길, -CH2C≡CH) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "알키닐렌"은 적어도 1개의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소, sp 삼중 결합을 갖는, 2 내지 8개의 임의의 길이의 탄소 원자 (C2-C8)의 선형 또는 분지쇄 2가 탄화수소 라디칼을 지칭하며, 여기서 알키닐렌 라디칼은 독립적으로 본원에 기재된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있다. 그 예는 에티닐렌 (-C≡C-), 프로피닐렌 (프로파르길렌, -CH2C≡C-) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "카르보사이클", "카르보시클릴", "카르보시클릭 고리" 및 "시클로알킬"은 모노시클릭 고리로서 3 내지 12개의 탄소 원자 (C3-C12)를 갖거나 비시클릭 고리로서 7 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 1가 비-방향족 포화 또는 부분 불포화 고리를 지칭한다. 7 내지 12개의 원자를 갖는 비시클릭 카르보사이클은 예를 들어 비시클로 [4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로 배열될 수 있고, 9 또는 10개의 고리 원자를 갖는 비시클릭 카르보사이클은 비시클로 [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로서, 또는 가교 시스템, 예를 들어 비시클로[2.2.1]헵탄, 비시클로[2.2.2]옥탄 및 비시클로[3.2.2]노난으로서 배열될 수 있다. 스피로 모이어티가 또한 상기 정의의 범위 내에 포함된다. 모노시클릭 카르보사이클의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 1-시클로펜트-1-에닐, 1-시클로펜트-2-에닐, 1-시클로펜트-3-에닐, 시클로헥실, 1-시클로헥스-1-에닐, 1-시클로헥스-2-에닐, 1-시클로헥스-3-에닐, 시클로헥사디에닐, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 시클로노닐, 시클로데실, 시클로운데실, 시클로도데실 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 카르보시클릴기는 독립적으로 본원에 기재된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다.
"아릴"은 모 방향족 고리계의 단일 탄소 원자로부터 1개의 수소 원자를 제거하여 유도되는, 6-20개의 탄소 원자 (C6-C20)의 1가 방향족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 일부 아릴 기는 예시적인 구조에서 "Ar"로 표시된다. 아릴은 포화, 부분 불포화 고리, 또는 방향족 카르보시클릭 고리에 융합된 방향족 고리를 포함하는 비시클릭 라디칼을 포함한다. 전형적인 아릴 기는 벤젠 (페닐), 치환된 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 비페닐, 인데닐, 인다닐, 1,2-디히드로나프탈렌, 1,2,3,4-테트라히드로나프틸 등으로부터 유도된 라디칼을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 아릴 기는 독립적으로 본원에 기재된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다.
"아릴렌"은 모 방향족 고리계의 2개의 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자를 제거하여 유도되는, 6 내지 20개의 탄소 원자 (C6-C20)의 2가 방향족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 일부 아릴렌 기는 예시적인 구조에서 "Ar"로 표시된다. 아릴렌은 포화, 부분 불포화 고리, 또는 방향족 카르보시클릭 고리에 융합된 방향족 고리를 포함하는 비시클릭 라디칼을 포함한다. 전형적인 아릴렌 기는 벤젠 (페닐렌), 치환된 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 비페닐렌, 인데닐렌, 인다닐렌, 1,2-디히드로나프탈렌, 1,2,3,4-테트라히드로나프틸 등으로부터 유도된 라디칼을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 아릴렌 기는 독립적으로 본원에 기재된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다.
용어 "헤테로사이클", "헤테로시클릴" 및 "헤테로시클릭 고리"는 본원에서 교환가능하게 사용되고, 3 내지 약 20개의 고리 원자의 포화 또는 부분 불포화 (즉, 고리 내에 1개 이상의 이중 및/또는 삼중 결합을 가짐) 카르보시클릭 라디칼을 지칭하며, 여기서 적어도 1개의 고리 원자는 질소, 산소, 인 및 황으로부터 선택된 헤테로원자이고, 나머지 고리 원자는 C이며, 여기서 1개 이상의 고리 원자는 독립적으로 하기 기재된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다. 헤테로사이클은 3 내지 7개의 고리원을 갖는 모노사이클 (2 내지 6개의 탄소 원자, 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자) 또는 7 내지 10개의 고리원을 갖는 비사이클 (4 내지 9개의 탄소 원자, 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자), 예를 들어 비시클로 [4,5], [5,5], [5,6], 또는 [6,6] 시스템일 수 있다. 헤테로사이클은 문헌 [Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968)], 특히 챕터 1, 3, 4, 6, 7 및 9; 문헌 ["The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present)], 특히 13, 14, 16, 19 및 28권; 및 문헌 [J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566]에 기재되어 있다. "헤테로시클릴"은 또한 헤테로사이클 라디칼이 포화, 부분 불포화 고리 또는 방향족 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리와 융합된 라디칼을 포함한다. 헤테로시클릭 고리의 예는 모르폴린-4-일, 피페리딘-1-일, 피페라지닐, 피페라진-4-일-2-온, 피페라진-4-일-3-온, 피롤리딘-1-일, 티오모르폴린-4-일, S-디옥소티오모르폴린-4-일, 아조칸-1-일, 아제티딘-1-일, 옥타히드로피리도[1,2-a]피라진-2-일, [1,4]디아제판-1-일, 피롤리디닐, 테트라히드로푸라닐, 디히드로푸라닐, 테트라히드로티에닐, 테트라히드로피라닐, 디히드로피라닐, 테트라히드로티오피라닐, 피페리디노, 모르폴리노, 티오모르폴리노, 티옥사닐, 피페라지닐, 호모피페라지닐, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 호모피페리디닐, 옥세파닐, 티에파닐, 옥사제피닐, 디아제피닐, 티아제피닐, 2-피롤리닐, 3-피롤리닐, 인돌리닐, 2H-피라닐, 4H-피라닐, 디옥사닐, 1,3-디옥솔라닐, 피라졸리닐, 디티아닐, 디티올라닐, 디히드로피라닐, 디히드로티에닐, 디히드로푸라닐, 피라졸리디닐이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 3-아자비시클로[3.1.0]헥사닐, 3-아자비시클로[4.1.0]헵타닐, 아자비시클로[2.2.2]헥사닐, 3H-인돌릴 퀴놀리지닐 및 N-피리딜 우레아를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 스피로 모이어티가 또한 상기 정의의 범위 내에 포함된다. 2개의 고리 원자가 옥소 (=O) 모이어티로 치환된 헤테로시클릭기의 예는 피리미디노닐 및 1,1-디옥소-티오모르폴리닐이다. 본원에서 헤테로사이클 기는 독립적으로 본원에 기재된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다.
용어 "헤테로아릴"은 5-, 6- 또는 7-원 고리의 1가 방향족 라디칼을 지칭하고, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1개 이상의 헤테로원자를 함유하는 5 내지 20개 원자의 융합된 고리계 (이들 중 적어도 1개는 방향족임)를 포함한다. 헤테로아릴 기의 예는 피리디닐 (예를 들어 2-히드록시피리디닐 포함), 이미다졸릴, 이미다조피리디닐, 1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸, [1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딘, 피리미디닐 (예를 들어 4-히드록시피리미디닐 포함), 피라졸릴, 트리아졸릴, 피라지닐, 테트라졸릴, 푸릴, 티에닐, 이속사졸릴, 티아졸릴, 옥사디아졸릴, 옥사졸릴, 이소티아졸릴, 피롤릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조푸라닐, 신놀리닐, 인다졸릴, 인돌리지닐, 프탈라지닐, 피리다지닐, 트리아지닐, 이소인돌릴, 프테리디닐, 퓨리닐, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 티아디아졸릴, 푸라자닐, 벤조푸라자닐, 벤조티오페닐, 벤조티아졸릴, 벤족사졸릴, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 나프티리디닐 및 푸로피리디닐이다. 헤테로아릴 기는 독립적으로 본원에 기재된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다.
헤테로사이클 또는 헤테로아릴 기는 가능한 경우에 탄소 (탄소-연결), 또는 질소 (질소-연결) 결합될 수 있다. 비제한적인 예로서, 탄소 결합된 헤테로사이클 또는 헤테로아릴은 피리딘의 위치 2, 3, 4, 5, 또는 6, 피리다진의 위치 3, 4, 5, 또는 6, 피리미딘의 위치 2, 4, 5, 또는 6, 피라진의 위치 2, 3, 5, 또는 6, 푸란, 테트라히드로푸란, 티오푸란, 티오펜, 피롤 또는 테트라히드로피롤의 위치 2, 3, 4, 또는 5, 옥사졸, 이미다졸 또는 티아졸의 위치 2, 4, 또는 5, 이속사졸, 피라졸, 또는 이소티아졸의 위치 3, 4, 또는 5, 아지리딘의 위치 2 또는 3, 아제티딘의 위치 2, 3, 또는 4, 퀴놀린의 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 또는 이소퀴놀린의 위치 1, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8에서 결합된다.
비제한적인 예로서, 질소 결합된 헤테로사이클 또는 헤테로아릴은 아지리딘, 아제티딘, 피롤, 피롤리딘, 2-피롤린, 3-피롤린, 이미다졸, 이미다졸리딘, 2-이미다졸린, 3-이미다졸린, 피라졸, 피라졸린, 2-피라졸린, 3-피라졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌, 인돌린, 1H-인다졸의 위치 1, 이소인돌, 또는 이소인돌린의 위치 2, 모르폴린의 위치 4, 및 카르바졸 또는 β-카르볼린의 위치 9에서 결합된다.
용어 "키랄"은 거울상 파트너와 비-중첩가능한 특성을 갖는 분자를 지칭하고, 용어 "비키랄"은 그의 거울상 파트너 상에 중첩가능한 분자를 지칭한다.
용어 "입체이성질체"는 동일한 화학적 구성을 갖지만 공간 내 원자 또는 기의 배열이 상이한 화합물을 지칭한다.
"부분입체이성질체"는 2개 이상의 키랄성 중심을 가지며 분자들이 서로의 거울상이 아닌 입체이성질체를 지칭한다. 부분입체이성질체는 상이한 물리적 특성, 예를 들어, 융점, 비점, 스펙트럼 성질, 및 반응성을 갖는다. 부분입체이성질체의 혼합물은 전기영동 및 크로마토그래피와 같은 고해상도 분석 절차 하에 분리될 수 있다.
"거울상이성질체"는 서로 비-중첩가능한 거울상인, 화합물의 2종의 입체이성질체를 지칭한다.
본원에 사용된 입체화학 정의 및 규정은 일반적으로 문헌 [S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; 및 Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc. New York]에 따른다. 수많은 유기 화합물은 광학 활성 형태로 존재하며, 즉 이들은 평면 편광의 평면을 회전하는 능력을 갖는다. 광학 활성 화합물을 기재하는데 있어서, 접두어 D 및 L, 또는 R 및 S는 키랄 중심(들)에 대한 분자의 절대 배위를 나타내기 위해 사용된다. 접두어 d 및 l 또는 (+) 및 (-)는 화합물에 의한 평면 편광 회전의 부호를 나타내기 위해 사용되며, (-) 또는 l은 화합물이 좌선성임을 의미한다. 접두어 (+) 또는 d를 갖는 화합물은 우선성이다. 주어진 화학적 구조에서, 이들 입체이성질체는 이들이 서로 거울상인 것을 제외하고는 동일하다. 특정 입체이성질체가 또한 거울상이성질체로 지칭될 수 있으며, 이러한 이성질체의 혼합물은 종종 거울상이성질체 혼합물로 불린다. 거울상이성질체의 50:50 혼합물은 라세미 혼합물 또는 라세미체로 지칭되며, 이들은 화학 반응 또는 과정에 있어서 입체선택성 또는 입체특이성이 없는 경우에 생성될 수 있다. 용어 "라세미 혼합물" 및 "라세미체"는 광학 활성이 없는, 2종의 거울상이성질체 종의 등몰 혼합물을 지칭한다.
본원에 사용된 어구 "제약상 허용되는 염"은 항체-약물 접합체 (ADC)의 제약상 허용되는 유기 또는 무기 염을 지칭한다. 예시적인 염은 술페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 니트레이트, 비술페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 비타르트레이트, 아스코르베이트, 숙시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄술포네이트, 에탄술포네이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트, 및 파모에이트 (즉, 1,1'-메틸렌-비스 -(2-히드록시-3- 나프토에이트)) 염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 제약상 허용되는 염은 또 다른 분자, 예컨대 아세테이트 이온, 숙시네이트 이온 또는 다른 반대이온의 내포를 포함할 수 있다. 반대이온은 모 화합물 상의 전하를 안정화시키는 임의의 유기 또는 무기 모이어티일 수 있다. 또한, 제약상 허용되는 염은 그의 구조 내에 1개 초과의 하전된 원자를 가질 수 있다. 다수의 하전된 원자가 제약상 허용되는 염의 일부인 경우에는 다수의 반대이온을 가질 수 있다. 따라서, 제약상 허용되는 염은 1개 이상의 하전된 원자 및/또는 1개 이상의 반대이온을 가질 수 있다.
하기 약어가 본원에 사용되며, 나타낸 정의를 갖는다: BME는 베타-메르캅토에탄올이고, Boc는 N-(t-부톡시카르보닐)이고, cit는 시트룰린 (2-아미노-5-우레이도 펜탄산)이고, DCC는 1,3-디시클로헥실카르보디이미드이고, DCM은 디클로로메탄이고, DEA는 디에틸아민이고, DEAD는 디에틸아조디카르복실레이트이고, DEPC는 디에틸포스포릴시아니데이트이고, DIAD는 디이소프로필아조디카르복실레이트이고, DIEA는 N,N-디이소프로필에틸아민이고, DMA는 디메틸아세트아미드이고, DMAP는 4-디메틸아미노피리딘이고, DME는 에틸렌글리콜 디메틸 에테르 (또는 1,2-디메톡시에탄)이고, DMF는 N,N-디메틸포름아미드이고, DMSO는 디메틸술폭시드이고, DTT는 디티오트레이톨이고, EDCI는 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드이고, EEDQ는 2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디히드로퀴놀린이고, ES-MS는 전기분무 질량 분광측정법이고, EtOAc는 에틸 아세테이트이고, Fmoc는 N-(9-플루오레닐메톡시카르보닐)이고, gly는 글리신이고, HATU는 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트이고, HOBt는 1-히드록시벤조트리아졸이고, HPLC는 고압 액체 크로마토그래피이고, ile는 이소류신이고, lys는 리신이고, MeCN(CH3CN)는 아세토니트릴이고, MeOH는 메탄올이고, Mtr은 4-아니실디페닐메틸 (또는 4-메톡시트리틸)이고, NHS는 N-히드록시숙신이미드이고, PBS는 포스페이트-완충 염수 (pH 7)이고, PEG는 폴리에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜의 단위 (-OCH2CH2-)이고, Ph는 페닐이고, Pnp는 p-니트로페닐이고, MC는 6-말레이미도카프로일이고, phe는 L-페닐알라닌이고, PyBrop는 브로모 트리스-피롤리디노 포스포늄 헥사플루오로포스페이트이고, SEC는 크기-배제 크로마토그래피이고, Su는 숙신이미드이고, TFA는 트리플루오로아세트산이고, TLC는 박층 크로마토그래피이고, UV는 자외선이고, val은 발린이다.
시스테인 조작된 항체
본 발명의 화합물은 야생형 또는 모 항체의 1개 이상의 아미노산이 시스테인 아미노산으로 치환된 시스테인 조작된 항체를 포함하는 항체-약물 접합체를 포함한다. 임의의 형태의 항체가 그와 같이 조작, 즉 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 모 Fab 항체 단편은 본원에서 "티오Fab"로 지칭되는 시스테인 조작된 Fab를 형성하도록 조작될 수 있다. 유사하게, 모 모노클로날 항체는 "티오Mab"를 형성하도록 조작될 수 있다. 단일 부위 돌연변이는 티오Fab에 단일 조작된 시스테인 잔기를 생성하지만, IgG 항체의 이량체 특성 때문에 단일 부위 돌연변이는 티오Mab에 2개의 조작된 시스테인 잔기를 생성함을 유념해야 한다. 치환된 ("조작된") 시스테인 (Cys) 잔기를 갖는 돌연변이체는 새로 도입되고 조작된 시스테인 티올 기의 반응성에 대해 평가된다. 티올 반응성 값은 0 내지 1.0 범위의 상대적인 수치 구간이고, 임의의 시스테인 조작된 항체에 대해 측정될 수 있다. 본 발명의 시스테인 조작된 항체의 티올 반응성 값은 0.6 내지 1.0; 0.7 내지 1.0; 또는 0.8 내지 1.0의 범위 내이다.
시스테인 아미노산은 항체 내의 반응성 부위에서 조작될 수 있고, 쇄내 또는 분자간 디술피드 연결을 형성하지 않는다 (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al. (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249, Shen et al. (2012) Nature Biotech., 30(2):184-191; Junutula et al. (2008) Jour of Immun. Methods 332:41-52). 조작된 시스테인 티올은 티올-반응성, 친전자성 기, 예컨대 말레이미드 또는 알파-할로 아미드를 갖는 본 발명의 링커 시약 또는 링커-약물 중간체와 반응하여 시스테인 조작된 항체 (티오Mab) 및 약물 (D) 모이어티를 갖는 ADC를 형성할 수 있다. 따라서, 약물 모이어티의 위치는 설계, 제어 및 공지될 수 있다. 약물 로딩은, 조작된 시스테인 티올 기가 전형적으로 티올-반응성 링커 시약 또는 링커-약물 중간체와 고수율로 반응하기 때문에 제어될 수 있다. 항체를 조작하여 중쇄 또는 경쇄 상의 단일 부위에서의 치환에 의해 시스테인 아미노산을 도입하는 것은, 대칭 항체 상에 2개의 새로운 시스테인을 제공한다. 거의 2의 약물 로딩 및 거의 동질성의 접합 생성물 ADC가 달성될 수 있다.
본 발명의 시스테인 조작된 항체는 바람직하게는 그의 야생형 모 항체 대응물의 항원 결합 능력을 보유한다. 따라서, 시스테인 조작된 항체는 항원에, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 항원은 예를 들어 종양-연관 항원 (TAA), 세포 표면 수용체 단백질 및 다른 세포 표면 분자, 막횡단 단백질, 신호전달 단백질, 세포 생존 조절 인자, 세포 증식 조절 인자, 조직 발생 또는 분화와 연관된 (예를 들어, 조직 발생 또는 분화에 기능적으로 기여하는 것으로 공지되거나 또는 의심되는) 분자, 림포카인, 시토카인, 세포 주기 조절에 관여하는 분자, 혈관형성에 관여하는 분자 및 혈관신생과 연관된 (예를 들어, 혈관신생에 기능적으로 기여하는 것으로 공지되거나 또는 의심되는) 분자를 포함한다. 종양-연관 항원은 클러스터 분화 인자 (즉, CD 단백질)일 수 있다. 시스테인 조작된 항체가 결합할 수 있는 항원은 상기 언급된 카테고리 중 하나의 하위세트의 구성원일 수 있고, 여기서 상기 카테고리의 다른 하위세트(들)는 (관심 항원에 관한) 특징적인 특성을 갖는 다른 분자/항원을 포함한다.
시스테인 조작된 항체는 쇄내 디술피드 기의 환원 및 재산화에 의해 링커-약물 중간체와의 접합을 위해 제조된다 (실시예 19).
암의 치료에 있어서 본 발명의 항체-약물 접합체에 유용할 수 있는 시스테인 조작된 항체는 세포 표면 수용체 및 종양-연관 항원 (TAA)에 대한 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 종양-연관 항원은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 관련 기술분야에 널리 공지된 방법 및 정보를 사용하여 항체를 생성하는데 사용하기 위해 제조될 수 있다. 암 진단 및 요법에 효과적인 세포 표적을 발견하기 위한 시도에서, 연구자들은 1종 이상의 정상적인 비-암성 세포(들)와 비교하여 1종 이상의 특정한 유형(들)의 암 세포의 표면에서 특이적으로 발현되는 막횡단 또는 달리 종양-연관된 폴리펩티드를 확인하기 위한 모색을 해왔다. 종종, 이러한 종양-연관 폴리펩티드는 비-암성 세포의 표면에서와 비교하여 암 세포의 표면에서 보다 풍부하게 발현된다. 이러한 종양-연관 세포 표면 항원 폴리펩티드의 확인은, 항체-기반 요법을 통해 파괴할 암 세포를 특이적으로 표적화하는 능력을 생성한다.
종양-연관 항원 TAA의 예는 하기 열거된 TAA (1)-(51)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 편의상, 이들 항원에 관한 정보 (이들 모두는 관련 기술분야에 공지되어 있음)가 하기 열거되어 있고, 미국 국립 생물 공학 정보 센터 ((NCBI)의 핵산 및 단백질 서열 확인 규정에 따른 명칭, 대체 명칭, 진뱅크(Genbank) 수탁 번호 및 주요 참고문헌(들)을 포함한다. TAA (1)-(51)에 상응하는 핵산 및 단백질 서열은 공개 데이터베이스, 예컨대 진뱅크에서 입수가능하다. 항체에 의해 표적화되는 종양-연관 항원은 언급된 참고문헌에서 확인되는 서열과 비교하여 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 보유나 언급된 참고문헌에서 확인되는 서열을 갖는 TAA와 실질적으로 동일한 생물학적 특성 또는 특징을 나타내는 모든 아미노산 서열 변이체 및 이소형을 포함한다. 예를 들어, 일반적으로, 변이체 서열을 갖는 TAA는 열거된 상응하는 서열을 갖는 TAA에 특이적으로 결합하는 항체에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에서 구체적으로 인용된 참고문헌의 서열 및 개시내용은 명백하게 참조로 포함된다.
종양-연관 항원:
(1) BMPR1B (골 형태발생 단백질 수용체-유형 IB, 진뱅크 수탁 번호 NM_001203)
문헌 [ten Dijke,P., et al. Science 264 (5155):101-104 (1994), Oncogene 14 (11):1377-1382 (1997)]; WO2004063362 (청구항 2); WO2003042661 (청구항 12); US2003134790-A1 (페이지 38-39); WO2002102235 (청구항 13; 페이지 296); WO2003055443 (페이지 91-92); WO200299122 (실시예 2; 페이지 528-530); WO2003029421 (청구항 6); WO2003024392 (청구항 2; 도 112); WO200298358 (청구항 1; 페이지 183); WO200254940 (페이지 100-101); WO200259377 (페이지 349-350); WO200230268 (청구항 27; 페이지 376); WO200148204 (실시예; 도 4)
NP_001194 골 형태발생 단백질 수용체, 유형 IB /pid=NP_001194.1 -
상호-참조: MIM:603248; NP_001194.1; AY065994
(2) E16 (LAT1, SLC7A5, 진뱅크 수탁 번호 NM_003486)
문헌 [Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 (6699):288-291 (1998), Gaugitsch, H.W., et al. (1992) J. Biol. Chem. 267 (16):11267-11273]; WO2004048938 (실시예 2); WO2004032842 (실시예 IV); WO2003042661 (청구항 12); WO2003016475 (청구항 1); WO200278524 (실시예 2); WO200299074 (청구항 19; 페이지 127-129); WO200286443 (청구항 27; 페이지 222, 393); WO2003003906 (청구항 10; 페이지 293); WO200264798 (청구항 33; 페이지 93-95); WO200014228 (청구항 5; 페이지 133-136); US2003224454 (도 3); WO2003025138 (청구항 12; 페이지 150);
NP_003477 용질 운반체 패밀리 7 (양이온성 아미노산 수송체, y+ 시스템), 구성원 5 /pid=NP_003477.3 - 호모 사피엔스(Homo sapiens)
상호-참조: MIM:600182; NP_003477.3; NM_015923; NM_003486_1
(3) STEAP1 (전립선의 6회 막횡단 상피 항원, 진뱅크 수탁 번호 NM_012449)
문헌 [Cancer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R.S., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (25):14523-14528]; WO2004065577 (청구항 6); WO2004027049 (도 1L); EP1394274 (실시예 11); WO2004016225 (청구항 2); WO2003042661 (청구항 12); US2003157089 (실시예 5); US2003185830 (실시예 5); US2003064397 (도 2); WO200289747 (실시예 5; 페이지 618-619); WO2003022995 (실시예 9; 도 13A, 실시예 53; 페이지 173, 실시예 2; 도 2A);
NP_036581 전립선의 6회 막횡단 상피 항원
상호-참조: MIM:604415; NP_036581.1; NM_012449_1
(4) 0772P (CA125, MUC16, 진뱅크 수탁 번호 AF361486)
문헌 [J. Biol. Chem. 276 (29):27371-27375 (2001)]; WO2004045553 (청구항 14); WO200292836 (청구항 6; 도 12); WO200283866 (청구항 15; 페이지 116-121); US2003124140 (실시예 16); 상호-참조: GI:34501467; AAK74120.3; AF361486_1
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, 거핵구 강화 인자, 메소텔린, 진뱅크 수탁 번호 NM_005823) 문헌 [Yamaguchi, N., et al. Biol. Chem. 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20):11531-11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (1):136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37):21984-21990 (1995)]; WO2003101283 (청구항 14); (WO2002102235 (청구항 13; 페이지 287-288); WO2002101075 (청구항 4; 페이지 308-309); WO200271928 (페이지 320-321); WO9410312 (페이지 52-57); 상호-참조: MIM:601051; NP_005814.2; NM_005823_1
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 운반체 패밀리 34 (인산나트륨), 구성원 2, 유형 II 나트륨-의존성 포스페이트 수송체 3b, 진뱅크 수탁 번호 NM_006424)
문헌 [J. Biol. Chem. 277 (22):19665-19672 (2002), Genomics 62 (2):281-284 (1999), Feild, J.A., et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578-582]; WO2004022778 (청구항 2); EP1394274 (실시예 11); WO2002102235 (청구항 13; 페이지 326); EP875569 (청구항 1; 페이지 17-19); WO200157188 (청구항 20; 페이지 329); WO2004032842 (실시예 IV); WO200175177 (청구항 24; 페이지 139-140);
상호-참조: MIM:604217; NP_006415.1; NM_006424_1
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm. 42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 5b Hlog, sema 도메인, 7개 트롬보스폰딘 반복부 (유형 1 및 유형 1-유사), 막횡단 도메인 (TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 5B, 진뱅크 수탁 번호 AB040878)
문헌 [Nagase T., et al. (2000) DNA Res. 7 (2):143-150]; WO2004000997 (청구항 1); WO2003003984 (청구항 1); WO200206339 (청구항 1; 페이지 50); WO200188133 (청구항 1; 페이지 41-43, 48-58); WO2003054152 (청구항 20); WO2003101400 (청구항 11);
수탁: Q9P283; EMBL; AB040878; BAA95969.1. Genew; HGNC:10737;
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자, 진뱅크 수탁 번호 AY358628); 문헌 [Ross et al. (2002) Cancer Res. 62:2546-2553]; US2003129192 (청구항 2); US2004044180 (청구항 12); US2004044179 (청구항 11); US2003096961 (청구항 11); US2003232056 (실시예 5); WO2003105758 (청구항 12); US2003206918 (실시예 5); EP1347046 (청구항 1); WO2003025148 (청구항 20);
상호-참조: GI:37182378; AAQ88991.1; AY358628_1
(9) ETBR (엔도텔린 유형 B 수용체, 진뱅크 수탁 번호 AY275463);
문헌 [Nakamuta M., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34-39, 1991; Ogawa Y., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248-255, 1991; Arai H., et al. Jpn. Circ. J. 56, 1303-1307, 1992; Arai H., et al. J. Biol. Chem. 268, 3463-3470, 1993; Sakamoto A., Yanagisawa M., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 656-663, 1991; Elshourbagy N.A., et al. J. Biol. Chem. 268, 3873-3879, 1993; Haendler B., et al. J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, s1-S4, 1992; Tsutsumi M., et al. Gene 228, 43-49, 1999; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; Bourgeois C., et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116-3123, 1997; Okamoto Y., et al. Biol. Chem. 272, 21589-21596, 1997; Verheij J.B., et al. Am. J. Med. Genet. 108, 223-225, 2002; Hofstra R.M.W., et al. Eur. J. Hum. Genet. 5, 180-185, 1997; Puffenberger E.G., et al. Cell 79, 1257-1266, 1994; Attie T., et al., Hum. Mol. Genet. 4, 2407-2409, 1995; Auricchio A., et al. Hum. Mol. Genet. 5:351-354, 1996; Amiel J., et al. Hum. Mol. Genet. 5, 355-357, 1996; Hofstra R.M.W., et al. Nat. Genet. 12, 445-447, 1996; Svensson P.J., et al. Hum. Genet. 103, 145-148, 1998; Fuchs S., et al. Mol. Med. 7, 115-124, 2001; Pingault V., et al. (2002) Hum. Genet. 111, 198-206]; WO2004045516 (청구항 1); WO2004048938 (실시예 2); WO2004040000 (청구항 151); WO2003087768 (청구항 1); WO2003016475 (청구항 1); WO2003016475 (청구항 1); WO200261087 (도 1); WO2003016494 (도 6); WO2003025138 (청구항 12; 페이지 144); WO200198351 (청구항 1; 페이지 124-125); EP522868 (청구항 8; 도 2); WO200177172 (청구항 1; 페이지 297-299); US2003109676; US6518404 (도 3); US5773223 (청구항 1a; Col 31-34); WO2004001004;
(10) MSG783 (RNF124, 가설 단백질 FLJ20315, 진뱅크 수탁 번호 NM_017763);
WO2003104275 (청구항 1); WO2004046342 (실시예 2); WO2003042661 (청구항 12); WO2003083074 (청구항 14; 페이지 61); WO2003018621 (청구항 1); WO2003024392 (청구항 2; 도 93); WO200166689 (실시예 6);
상호-참조: LocusID:54894; NP_060233.2; NM_017763_1
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선암 연관 유전자 1, 전립선암 연관 단백질 1, 전립선의 6회 막횡단 상피 항원 2, 6회 막횡단 전립선 단백질, 진뱅크 수탁 번호 AF455138)
문헌 [Lab. Invest. 82 (11):1573-1582 (2002)]; WO2003087306; US2003064397 (청구항 1; 도 1); WO200272596 (청구항 13; 페이지 54-55); WO200172962 (청구항 1; 도 4B); WO2003104270 (청구항 11); WO2003104270 (청구항 16); US2004005598 (청구항 22); WO2003042661 (청구항 12); US2003060612 (청구항 12; 도 10); WO200226822 (청구항 23; 도 2); WO200216429 (청구항 12; 도 10);
상호-참조: GI:22655488; AAN04080.1; AF455138_1
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 전위 양이온 채널, 서브패밀리 M, 구성원 4, 진뱅크 수탁 번호 NM_017636)
문헌 [Xu, X.Z., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (19):10692-10697 (2001), Cell 109 (3):397-407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33):30813-30820 (2003)]; US2003143557 (청구항 4); WO200040614 (청구항 14; 페이지 100-103); WO200210382 (청구항 1; 도 9A); WO2003042661 (청구항 12); WO200230268 (청구항 27; 페이지 391); US2003219806 (청구항 4); WO200162794 (청구항 14; 도 1A-D);
상호-참조: MIM:606936; NP_060106.2; NM_017636_1
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유래 성장 인자, 진뱅크 수탁 번호 NP_003203 또는 NM_003212)
문헌 [Ciccodicola, A., et al. EMBO J. 8 (7):1987-1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3):555-565 (1991)]; US2003224411 (청구항 1); WO2003083041 (실시예 1); WO2003034984 (청구항 12); WO200288170 (청구항 2; 페이지 52-53); WO2003024392 (청구항 2; 도 58); WO200216413 (청구항 1; 페이지 94-95, 105); WO200222808 (청구항 2; 도 1); US5854399 (실시예 2; Col 17-18); US5792616 (도 2);
상호-참조: MIM:187395; NP_003203.1; NM_003212_1
(14) CD21 (CR2 (보체 수용체 2) 또는 C3DR (C3d/엡스타인 바르 바이러스 수용체) 또는 Hs.73792 진뱅크 수탁 번호 M26004)
문헌 [Fujisaku et al. (1989) J. Biol. Chem. 264 (4):2118-2125); Weis J.J., et al. J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988; Moore M., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 9194-9198, 1987; Barel M., et al. Mol. Immunol. 35, 1025-1031, 1998; Weis J.J., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639-5643, 1986; Sinha S.K., et al. (1993) J. Immunol. 150, 5311-5320]; WO2004045520 (실시예 4); US2004005538 (실시예 1); WO2003062401 (청구항 9); WO2004045520 (실시예 4); WO9102536 (도 9.1-9.9); WO2004020595 (청구항 1);
수탁: P20023; Q13866; Q14212; EMBL; M26004; AAA35786.1.
(15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (이뮤노글로불린-연관 베타), B29, 진뱅크 수탁 번호 NM_000626 또는 11038674)
문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (7):4126-4131, Blood (2002) 100 (9):3068-3076, Muller et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6):1621-1625]; WO2004016225 (청구항 2, 도 140); WO2003087768, US2004101874 (청구항 1, 페이지 102); WO2003062401 (청구항 9); WO200278524 (실시예 2); US2002150573 (청구항 5, 페이지 15); US5644033; WO2003048202 (청구항 1, 페이지 306 및 309); WO 99/558658, US6534482 (청구항 13, 도 17A/B); WO200055351 (청구항 11, 페이지 1145-1146);
상호-참조: MIM:147245; NP_000617.1; NM_000626_1
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (포스파타제 앵커 단백질 1a를 함유하는 SH2 도메인), SPAP1B, SPAP1C, 진뱅크 수탁 번호 NM_030764, AY358130)
문헌 [Genome Res. 13 (10):2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87-95 (2002), Blood 99 (8):2662-2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17):9772-9777 (2001), Xu, M.J., et al. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768-775]; WO2004016225 (청구항 2); WO2003077836; WO200138490 (청구항 5; 도 18D-1-18D-2); WO2003097803 (청구항 12); WO2003089624 (청구항 25);
상호-참조: MIM:606509; NP_110391.2; NM_030764_1
(17) HER2 (ErbB2, 진뱅크 수탁 번호 M11730)
문헌 [Coussens L., et al. Science (1985) 230(4730):1132-1139; Yamamoto T., et al. Nature 319, 230-234, 1986; Semba K., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6497-6501, 1985; Swiercz J.M., et al. J. Cell Biol. 165, 869-880, 2004; Kuhns J.J., et al. J. Biol. Chem. 274, 36422-36427, 1999; Cho H.-S., et al. Nature 421, 756-760, 2003; Ehsani A., et al. (1993) Genomics 15, 426-429]; WO2004048938 (실시예 2); WO2004027049 (도 1I); WO2004009622; WO2003081210; WO2003089904 (청구항 9); WO2003016475 (청구항 1); US2003118592; WO2003008537 (청구항 1); WO2003055439 (청구항 29; 도 1A-B); WO2003025228 (청구항 37; 도 5C); WO200222636 (실시예 13; 페이지 95-107); WO200212341 (청구항 68; 도 7); WO200213847 (페이지 71-74); WO200214503 (페이지 114-117); WO200153463 (청구항 2; 페이지 41-46); WO200141787 (페이지 15); WO200044899 (청구항 52; 도 7); WO200020579 (청구항 3; 도 2); US5869445 (청구항 3; Col 31-38); WO9630514 (청구항 2; 페이지 56-61); EP1439393 (청구항 7); WO2004043361 (청구항 7); WO2004022709; WO200100244 (실시예 3; 도 4);
수탁: P04626; EMBL; M11767; AAA35808.1. EMBL; M11761; AAA35808.1.
(18) NCA (CEACAM6, 진뱅크 수탁 번호 M18728);
문헌 [Barnett T., et al. Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi Y., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1988; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:16899-16903, 2002]; WO2004063709; EP1439393 (청구항 7); WO2004044178 (실시예 4); WO2004031238; WO2003042661 (청구항 12); WO200278524 (실시예 2); WO200286443 (청구항 27; 페이지 427); WO200260317 (청구항 2);
수탁: P40199; Q14920; EMBL; M29541; AAA59915.1. EMBL; M18728;
(19) MDP (DPEP1, 진뱅크 수탁 번호 BC017023)
문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26):16899-16903 (2002)]; WO2003016475 (청구항 1); WO200264798 (청구항 33; 페이지 85-87); JP05003790 (도 6-8); WO9946284 (도 9);
상호-참조: MIM:179780; AAH17023.1; BC017023_1
(20) IL20Rα (IL20Ra, ZCYTOR7, 진뱅크 수탁 번호 AF184971);
문헌 [Clark H.F., et al. Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Mungall A.J., et al. Nature 425, 805-811, 2003; Blumberg H., et al. Cell 104, 9-19, 2001; Dumoutier L., et al. J. Immunol. 167, 3545-3549, 2001; Parrish-Novak J., et al. J. Biol. Chem. 277, 47517-47523, 2002; Pletnev S., et al. (2003) Biochemistry 42:12617-12624; Sheikh F., et al. (2004) J. Immunol. 172, 2006-2010]; EP1394274 (실시예 11); US2004005320 (실시예 5); WO2003029262 (페이지 74-75); WO2003002717 (청구항 2; 페이지 63); WO200222153 (페이지 45-47); US2002042366 (페이지 20-21); WO200146261 (페이지 57-59); WO200146232 (페이지 63-65); WO9837193 (청구항 1; 페이지 55-59);
수탁: Q9UHF4; Q6UWA9; Q96SH8; EMBL; AF184971; AAF01320.1.
(21) 브레비칸 (BCAN, BEHAB, 진뱅크 수탁 번호 AF229053)
문헌 [Gary S.C., et al. Gene 256, 139-147, 2000; Clark H.F., et al. Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002]; US2003186372 (청구항 11); US2003186373 (청구항 11); US2003119131 (청구항 1; 도 52); US2003119122 (청구항 1; 도 52); US2003119126 (청구항 1); US2003119121 (청구항 1; 도 52); US2003119129 (청구항 1); US2003119130 (청구항 1); US2003119128 (청구항 1; 도 52); US2003119125 (청구항 1); WO2003016475 (청구항 1); WO200202634 (청구항 1);
(22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, 진뱅크 수탁 번호 NM_004442)
문헌 [Chan,J. and Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991) Oncogene 10 (5):897-905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196:177-244 (2000)]; WO2003042661 (청구항 12); WO200053216 (청구항 1; 페이지 41); WO2004065576 (청구항 1); WO2004020583 (청구항 9); WO2003004529 (페이지 128-132); WO200053216 (청구항 1; 페이지 42);
상호-참조: MIM:600997; NP_004433.2; NM_004442_1
(23) ASLG659 (B7h, 진뱅크 수탁 번호 AX092328)
US20040101899 (청구항 2); WO2003104399 (청구항 11); WO2004000221 (도 3); US2003165504 (청구항 1); US2003124140 (실시예 2); US2003065143 (도 60); WO2002102235 (청구항 13; 페이지 299); US2003091580 (실시예 2); WO200210187 (청구항 6; 도 10); WO200194641 (청구항 12; 도 7b); WO200202624 (청구항 13; 도 1A-1B); US2002034749 (청구항 54; 페이지 45-46); WO200206317 (실시예 2; 페이지 320-321, 청구항 34; 페이지 321-322); WO200271928 (페이지 468-469); WO200202587 (실시예 1; 도 1); WO200140269 (실시예 3; 페이지 190-192); WO200036107 (실시예 2; 페이지 205-207); WO2004053079 (청구항 12); WO2003004989 (청구항 1); WO200271928 (페이지 233-234, 452-453); WO 0116318;
(24) PSCA (전립선 줄기 세포 항원 전구체, 진뱅크 수탁 번호 AJ297436)
문헌 [Reiter R.E., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1735-1740, 1998; Gu Z., et al. Oncogene 19, 1288-1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275(3):783-788]; WO2004022709; EP1394274 (실시예 11); US2004018553 (청구항 17); WO2003008537 (청구항 1); WO200281646 (청구항 1; 페이지 164); WO2003003906 (청구항 10; 페이지 288); WO200140309 (실시예 1; 도 17); US2001055751 (실시예 1; 도 1b); WO200032752 (청구항 18; 도 1); WO9851805 (청구항 17; 페이지 97); WO9851824 (청구항 10; 페이지 94); WO9840403 (청구항 2; 도 1B);
수탁: O43653; EMBL; AF043498; AAC39607.1.
(25) GEDA (진뱅크 수탁 번호 AY260763);
AAP14954 지방종 HMGIC 융합-파트너-유사 단백질 /pid=AAP14954.1 - 호모 사피엔스
종: 호모 사피엔스 (인간)
WO2003054152 (청구항 20); WO2003000842 (청구항 1); WO2003023013 (실시예 3, 청구항 20); US2003194704 (청구항 45);
상호-참조: GI:30102449; AAP14954.1; AY260763_1
(26) BAFF-R (B 세포-활성화 인자 수용체, BLyS 수용체 3, BR3, 진뱅크 수탁 번호 AF116456); BAFF 수용체 /pid=NP_443177.1 - 호모 사피엔스
문헌 [Thompson, J.S., et al. Science 293 (5537), 2108-2111 (2001)]; WO2004058309; WO2004011611; WO2003045422 (실시예; 페이지 32-33); WO2003014294 (청구항 35; 도 6B); WO2003035846 (청구항 70; 페이지 615-616); WO200294852 (Col 136-137); WO200238766 (청구항 3; 페이지 133); WO200224909 (실시예 3; 도 3);
상호-참조: MIM:606269; NP_443177.1; NM_052945_1; AF132600
(27) CD22 (B-세포 수용체 CD22-B 이소형, BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814, 진뱅크 수탁 번호 AK026467);
문헌 [Wilson et al. (1991) J. Exp. Med. 173:137-146]; WO2003072036 (청구항 1; 도 1);
상호-참조: MIM:107266; NP_001762.1; NM_001771_1
(28) CD79a (CD79A, CD79α, 이뮤노글로불린-연관 알파, Ig 베타 (CD79B)와 공유적으로 상호작용하고 표면 상에서 Ig M 분자와 복합체를 형성하며 B-세포 분화에 관련된 신호를 변환시키는 B 세포-특이적 단백질), pI: 4.84, MW: 25028 TM: 2 [P] 유전자 염색체: 19q13.2, 진뱅크 수탁 번호 NP_001774.10)
WO2003088808, US20030228319; WO2003062401 (청구항 9); US2002150573 (청구항 4, 페이지 13-14); WO9958658 (청구항 13, 도 16); WO9207574 (도 1); US5644033; 문헌 [Ha et al. (1992) J. Immunol. 148(5):1526-1531; Mueller et al. (1992) Eur. J. Biochem. 22:1621-1625; Hashimoto et al. (1994) Immunogenetics 40(4):287-295; Preud'homme et al. (1992) Clin. Exp. Immunol. 90(1):141-146; Yu et al. (1992) J. Immunol. 148(2) 633-637; Sakaguchi et al. (1988) EMBO J. 7(11):3457-3464];
(29) CXCR5 (버킷 림프종 수용체 1, CXCL13 케모카인에 의해 활성화되고 림프구 이동 및 체액 방어에서 기능하며 HIV-2 감염 및 아마도 AIDS, 림프종, 골수종 및 백혈병의 발생에서 역할을 하는 G 단백질-커플링된 수용체); 372 aa, pI: 8.54 MW: 41959 TM: 7 [P] 유전자 염색체: 11q23.3, 진뱅크 수탁 번호 NP_001707.1)
WO2004040000; WO2004015426; US2003105292 (실시예 2); US6555339 (실시예 2); WO200261087 (도 1); WO200157188 (청구항 20, 페이지 269); WO200172830 (페이지 12-13); WO200022129 (실시예 1, 페이지 152-153, 실시예 2, 페이지 254-256); WO9928468 (청구항 1, 페이지 38); US5440021 (실시예 2, col 49-52); WO9428931 (페이지 56-58); WO9217497 (청구항 7, 도 5); 문헌 [Dobner et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22:2795-2799; Barella et al. (1995) Biochem. J. 309:773-779];
(30) HLA-DOB (펩티드에 결합하고 이를 CD4+ T 림프구에 제시하는 MHC 부류 II 분자의 베타 서브유닛 (Ia 항원)); 273 aa, pI: 6.56 MW: 30820 TM: 1 [P] 유전자 염색체: 6p21.3, 진뱅크 수탁 번호 NP_002111.1)
문헌 [Tonnelle et al. (1985) EMBO J. 4(11):2839-2847; Jonsson et al. (1989) Immunogenetics 29(6):411-413; Beck et al. (1992) J. Mol. Biol. 228:433-441; Strausberg et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903; Servenius et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:8759-8766; Beck et al. (1996) J. Mol. Biol. 255:1-13; Naruse et al. (2002) Tissue Antigens 59:512-519]; WO9958658 (청구항 13, 도 15); US6153408 (Col 35-38); US5976551 (col 168-170); US6011146 (col 145-146); 문헌 [Kasahara et al. (1989) Immunogenetics 30(1):66-68; Larhammar et al. (1985) J. Biol. Chem. 260(26):14111-14119];
(31) P2X5 (퓨린성 수용체 P2X 리간드-게이팅 이온 채널 5, 세포외 ATP에 의해 게이팅된 이온 채널 (시냅스 전달 및 신경발생에 관련될 수 있고, 결핍은 특발성 배뇨근 불안정의 병리생리상태에 기여할 수 있음); 422 aa), pI: 7.63, MW: 47206 TM: 1 [P] 유전자 염색체: 17p13.3, 진뱅크 수탁 번호 NP_002552.2)
문헌 [Le et al. (1997) FEBS Lett. 418(1-2):195-199]; WO2004047749; WO2003072035 (청구항 10); 문헌 [Touchman et al. (2000) Genome Res. 10:165-173]; WO200222660 (청구항 20); WO2003093444 (청구항 1); WO2003087768 (청구항 1); WO2003029277 (페이지 82);
(32) CD72 (B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2) 단백질 서열 전체 maeaity...tafrfpd (1..359; 359 aa), pI: 8.66, MW: 40225 TM: 1 [P] 유전자 염색체: 9p13.3, 진뱅크 수탁 번호 NP_001773.1)
WO2004042346 (청구항 65); WO2003026493 (페이지 51-52, 57-58); WO200075655 (페이지 105-106); 문헌 [Von Hoegen et al. (1990) J. Immunol. 144(12):4870-4877; Strausberg et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903];
(33) LY64 (림프구 항원 64 (RP105), 류신 풍부 반복부 (LRR) 패밀리의 유형 I 막 단백질 (B-세포 활성화 및 아폽토시스를 조절하고, 기능 상실은 전신 홍반성 루푸스를 갖는 환자에서 증가된 질환 활성과 연관됨); 661 aa, pI: 6.20, MW: 74147 TM: 1 [P] 유전자 염색체: 5q12, 진뱅크 수탁 번호 NP_005573.1)
US2002193567; WO9707198 (청구항 11, 페이지 39-42); 문헌 [Miura et al. (1996) Genomics 38(3):299-304; Miura et al. (1998) Blood 92:2815-2822]; WO2003083047; WO9744452 (청구항 8, 페이지 57-61); WO200012130 (페이지 24-26);
(34) FcRH1 (Fc 수용체-유사 단백질 1, C2 유형 Ig-유사 및 ITAM 도메인을 함유하는 이뮤노글로불린 Fc 도메인에 대한 추정 수용체 (B-림프구 분화에서 역할을 할 수 있음); 429 aa, pI: 5.28, MW: 46925 TM: 1 [P] 유전자 염색체: 1q21-1q22, 진뱅크 수탁 번호 NP_443170.1)
WO2003077836; WO200138490 (청구항 6, 도 18E-1-18-E-2); 문헌 [Davis et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98(17):9772-9777]; WO2003089624 (청구항 8); EP1347046 (청구항 1); WO2003089624 (청구항 7);
(35) IRTA2 (이뮤노글로불린 슈퍼패밀리 수용체 전위 연관 2, B 세포 발생 및 림프종발생에서 가능한 역할을 갖는 추정 면역수용체; 전위에 의한 유전자의 탈조절이 일부 B 세포 악성종양에서 일어남); 977 aa, pI: 6.88 MW: 106468 TM: 1 [P] 유전자 염색체: 1q21, 진뱅크 수탁 번호 인간:AF343662, AF343663, AF343664, AF343665, AF369794, AF397453, AK090423, AK090475, AL834187, AY358085; 마우스:AK089756, AY158090, AY506558; NP_112571.1
WO2003024392 (청구항 2, 도 97); 문헌 [Nakayama et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277(1):124-127]; WO2003077836; WO200138490 (청구항 3, 도 18B-1-18B-2);
(36) TENB2 (TMEFF2, 토모레귤린, TPEF, HPP1, TR, 추정 막횡단 프로테오글리칸 (성장 인자의 EGF/헤레귤린 패밀리 및 폴리스타틴과 관련됨)); 374 aa, NCBI 수탁: AAD55776, AAF91397, AAG49451, NCBI RefSeq: NP_057276; NCBI 유전자: 23671; OMIM: 605734; 스위스프로트 Q9UIK5; 진뱅크 수탁 번호 AF179274; AY358907, CAF85723, CQ782436
WO2004074320 (서열 810); JP2004113151 (서열 2, 4, 8); WO2003042661 (서열 580); WO2003009814 (서열 411); EP1295944 (페이지 69-70); WO200230268 (페이지 329); WO200190304 (서열 2706); US2004249130; US2004022727; WO2004063355; US2004197325; US2003232350; US2004005563; US2003124579; 문헌 [Horie et al. (2000) Genomics 67:146-152; Uchida et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:593-602; Liang et al. (2000) Cancer Res. 60:4907-12; Glynne-Jones et al. (2001) Int J Cancer. Oct 15;94(2):178-84];
(37) PMEL17 (은 상동체; SILV; D12S53E; PMEL17; (SI); (SIL); ME20; gp100) BC001414; BT007202; M32295; M77348; NM_006928; 문헌 [McGlinchey, R.P. et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (33), 13731-13736; Kummer, M.P. et al. (2009) J. Biol. Chem. 284 (4), 2296-2306];
(38) TMEFF1 (EGF-유사 및 2개의 폴리스타틴-유사 도메인을 갖는 막횡단 단백질 1; 토모레귤린-1; H7365; C9orf2; C9ORF2; U19878; X83961) NM_080655; NM_003692; 문헌 [Harms, P.W. (2003) Genes Dev. 17 (21), 2624-2629; Gery, S. et al. (2003) Oncogene 22 (18):2723-2727];
(39) GDNF-Ra1 (GDNF 패밀리 수용체 알파 1; GFRA1; GDNFR; GDNFRA; RETL1; TRNR1; RET1L; GDNFR-알파1; GFR-알파-1; U95847; BC014962; NM_145793) NM_005264; 문헌 [Kim, M.H. et al. (2009) Mol. Cell. Biol. 29 (8), 2264-2277; Treanor, J.J. et al. (1996) Nature 382 (6586):80-83];
(40) Ly6E (림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 E; Ly67,RIG-E,SCA-2,TSA-1) NP_002337.1; NM_002346.2; 문헌 [de Nooij-van Dalen, A.G. et al. (2003) Int. J. Cancer 103 (6), 768-774; Zammit, D.J. et al. (2002) Mol. Cell. Biol. 22 (3):946-952];
(41) TMEM46 (shisa 상동체 2 (크세노푸스 라에비스(Xenopus laevis)); SHISA2) NP_001007539.1; NM_001007538.1; 문헌 [Furushima, K. et al. (2007) Dev. Biol. 306 (2), 480-492; Clark, H.F. et al. (2003) Genome Res. 13 (10):2265-2270];
(42) Ly6G6D (림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 G6D; Ly6-D, MEGT1) NP_067079.2; NM_021246.2; 문헌 [Mallya, M. et al. (2002) Genomics 80 (1):113-123; Ribas, G. et al. (1999) J. Immunol. 163 (1):278-287];
(43) LGR5 (류신-풍부 반복부-함유 G 단백질-커플링된 수용체 5; GPR49, GPR67) NP_003658.1; NM_003667.2; 문헌 [Salanti, G. et al. (2009) Am. J. Epidemiol. 170 (5):537-545; Yamamoto, Y. et al. (2003) Hepatology 37 (3):528-533];
(44) RET (ret 원종양유전자; MEN2A; HSCR1; MEN2B; MTC1; (PTC); CDHF12; Hs.168114; RET51; RET-ELE1) NP_066124.1; NM_020975.4; 문헌 [Tsukamoto, H. et al. (2009) Cancer Sci. 100 (10):1895-1901; Narita, N. et al. (2009) Oncogene 28 (34):3058-3068];
(45) LY6K (림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K; LY6K; HSJ001348; FLJ35226) NP_059997.3; NM_017527.3; 문헌 [Ishikawa, N. et al. (2007) Cancer Res. 67 (24):11601-11611; de Nooij-van Dalen, A.G. et al. (2003) Int. J. Cancer 103 (6):768-774];
(46) GPR19 (G 단백질-커플링된 수용체 19; Mm.4787) NP_006134.1; NM_006143.2; 문헌 [Montpetit, A. and Sinnett, D. (1999) Hum. Genet. 105 (1-2):162-164; O'Dowd, B.F. et al. (1996) FEBS Lett. 394 (3):325-329];
(47) GPR54 (KISS1 수용체; KISS1R; GPR54; HOT7T175; AXOR12) NP_115940.2; NM_032551.4; 문헌 [Navenot, J.M. et al. (2009) Mol. Pharmacol. 75 (6):1300-1306; Hata, K. et al. (2009) Anticancer Res. 29 (2):617-623];
(48) ASPHD1 (아스파르테이트 베타-히드록실라제 도메인 함유 1; LOC253982) NP_859069.2; NM_181718.3; 문헌 [Gerhard, D.S. et al. (2004) Genome Res. 14 (10B):2121-2127];
(49) 티로시나제 (TYR; OCAIA; OCA1A; 티로시나제; SHEP3) NP_000363.1; NM_000372.4; 문헌 [Bishop, D.T. et al. (2009) Nat. Genet. 41 (8):920-925; Nan, H. et al. (2009) Int. J. Cancer 125 (4):909-917];
(50) TMEM118 (ring 핑거 단백질, 막횡단 2; RNFT2; FLJ14627) NP_001103373.1; NM_001109903.1; 문헌 [Clark, H.F. et al. (2003) Genome Res. 13 (10):2265-2270; Scherer, S.E. et al. (2006) Nature 440 (7082):346-351]
(51) GPR172A (G 단백질-커플링된 수용체 172A; GPCR41; FLJ11856; D15Ertd747e) NP_078807.1; NM_024531.3; 문헌 [Ericsson, T.A. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (11):6759-6764; Takeda, S. et al. (2002) FEBS Lett. 520 (1-3):97-101].
모 항체는 또한 알부민-결합 펩티드 (ABP) 서열을 포함하는 융합 단백질일 수 있다 (Dennis et al. (2002) "Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J Biol Chem. 277:35035-35043; WO 01/45746). 본 발명의 항체는 (i) 문헌 [Dennis et al. (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043]의 표 III 및 IV, 페이지 35038; (ii) US 20040001827의 [0076]; 및 (iii) WO 01/45746의 페이지 12-13 (이들 모두는 본원에 참조로 포함됨)에 교시된 ABP 서열을 갖는 융합 단백질을 포함한다.
돌연변이유발에 의해 시스테인 조작된 항체를 제조하기 위해, 출발 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 DNA가 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이들 방법은 폴리펩티드를 코딩하는 앞서 제조된 DNA의 부위-지정 (또는 올리고뉴클레오티드-매개) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 재조합 항체의 변이체는 또한 제한 단편 조작에 의해 또는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용한 중복 연장 PCR에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이유발 프라이머는 시스테인 코돈 치환(들)을 코딩한다. 표준 돌연변이유발 기술이 이러한 돌연변이체 시스테인 조작된 항체를 코딩하는 DNA를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 일반적인 안내는 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; 및 Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, N.Y., 1993]에서 찾아볼 수 있다.
항체는 재조합 방법 및 조성물을 사용하여, 예를 들어 US 4816567에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 한 실시양태에서, 단리된 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩한다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 1개 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한 이러한 실시양태에서, 숙주 세포는 다음을 포함한다 (예를 들어, 이것으로 형질감염된다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 방법은 상기 제공된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 임의로 회수하는 것을 포함한다.
재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 1개 이상의 벡터 내로 삽입한다. 이러한 핵산은 통상의 절차를 사용하여 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의함). 항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 경우에, 항체는 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 US 5648237, US 5789199 및 US 5840523을 참조한다. (또한, 이. 콜라이(E coli)에서의 항체 단편의 발현을 기재하는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조). 발현 후에, 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 항체를 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다. 원핵생물 이외에도, 진핵 미생물, 예컨대 사상 진균 또는 효모, 예를 들어 글리코실화 경로가 "인간화"되어 항체를 부분 또는 완전 인간 글리코실화 패턴으로 생산하는 진균 및 효모 균주가 항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 숙주 발현에 적합하다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다. 글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주가 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 것으로 확인된 바 있다. US 5959177, US 6040498, US 6420548, US 7125978, 및 US 6417429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)™ 기재)에 기재된 것들과 같은 식물 세포 배양물이 또한 숙주로 이용될 수 있다. 척추동물 세포가 또한 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장시키는데 적합화된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))를 비롯한 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
부위-지정 돌연변이유발은 치환 변이체, 즉 돌연변이 단백질을 제조하기 위한 한가지 방법이다 (Carter (1985) et al. Nucleic Acids Res. 13:4431-4443; Ho et al. (1989) Gene (Amst.) 77:51-59; 및 Kunkel et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488). 출발 DNA는 먼저, 목적 돌연변이를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 상기 출발 DNA의 단일 가닥에 혼성화함으로써 변경된다. 혼성화 후에, 혼성화된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하고 출발 DNA의 단일 가닥을 주형으로서 사용하면서 DNA 폴리머라제를 사용하여 전체 제2 가닥을 합성한다. 따라서, 목적 돌연변이를 코딩하는 올리고뉴클레오티드는 생성된 이중 가닥 DNA 내에 도입된다. 부위-지정 돌연변이유발은 발현 플라스미드에서 돌연변이유발될 단백질을 발현하는 유전자 내에서 수행될 수 있고, 생성된 플라스미드는 목적 시스테인 치환 돌연변이의 도입을 확인하기 위해 서열분석될 수 있다 (Liu et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:20252-20260). 부위-지정 돌연변이유발 프로토콜 및 포맷, 예를 들어 퀵체인지(QuikChange)® 다중 부위-지정 돌연변이유발 키트 (스트라타진(Stratagene), 캘리포니아주 라 졸라)가 널리 이용가능하다.
PCR 돌연변이유발은 또한 출발 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체를 제조하는데 적합한다. 문헌 [Higuchi, (1990) in PCR Protocols, pp.177-183, Academic Press; Ito et al. (1991) Gene 102:67-70; Bernhard et al. (1994) Bioconjugate Chem., 5:126-132; 및 Vallette et al. (1989) Nuc. Acids Res., 17:723-733]을 참조한다. 간략하게, 소량의 주형 DNA를 PCR에서 출발 물질로 사용하였을 때, 주형 DNA 내의 상응하는 영역으로부터의 서열이 약간 상이한 프라이머를 사용하여, 프라이머가 주형과 상이한 위치에서만 주형 서열과 상이한 특정 DNA 단편을 비교적 대량으로 생성할 수 있다.
변이체의 또 다른 제조 방법인 카세트 돌연변이유발은 문헌 [Wells et al. (1985) Gene, 34:315-323]에 기재된 기술을 기초로 한다. 출발 물질은 돌연변이시킬 출발 폴리펩티드 DNA를 포함하는 플라스미드 (또는 다른 벡터)이다. 돌연변이시킬 출발 DNA 내의 코돈(들)이 확인된다. 확인된 돌연변이 부위(들)의 각각의 측면 상에 특징적인 제한 엔도뉴클레아제 부위가 존재해야 한다. 이러한 제한 부위가 존재하지 않는 경우에, 이들을 출발 폴리펩티드 DNA 내의 적절한 위치에 도입하기 위해 상기 기재된 올리고뉴클레오티드-매개 돌연변이유발 방법을 이용하여 제한 부위를 생성할 수 있다. 플라스미드 DNA는 선형화를 위해 상기 부위에서 절단된다. 제한 부위 사이의 DNA의 서열을 코딩하지만 목적 돌연변이(들)를 함유하는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 표준 절차를 사용하여 합성되고, 여기서 올리고뉴클레오티드의 2개의 가닥은 개별적으로 합성된 후, 표준 기술을 사용하여 함께 혼성화된다. 상기 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 카세트로 지칭된다. 상기 카세트는 플라스미드에 직접 라이게이션될 수 있도록 선형화된 플라스미드의 말단과 혼화성인 5' 및 3' 말단을 갖도록 설계된다. 상기 플라스미드는 이제 돌연변이된 DNA 서열을 함유한다. 코딩된 시스테인 치환을 함유하는 돌연변이체 DNA는 DNA 서열분석에서 확인될 수 있다.
단일 돌연변이는 또한 PCR 기반 돌연변이유발에 의해 주형으로서 이중 가닥 플라스미드 DNA를 사용하는 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이유발에 의해 생성된다 (Sambrook and Russel, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; Zoller et al. (1983) Methods Enzymol. 100:468-500; Zoller, M.J. and Smith, M. (1982) Nucl. Acids Res. 10:6487-6500).
특정 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 1개 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 모든 이펙터 기능은 아니지만 일부 이펙터 기능을 보유하며, 생체내 항체 반감기가 중요하긴 하지만 특정 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 유해한 적용에 대한 바람직한 후보가 되는 항체 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정이 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합이 결여되어 있지만 (따라서 ADCC 활성 결여 가능성이 있음) FcRn 결합 능력은 보유하는 것을 보장하기 위해 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정이 수행될 수 있다.
CBI 이량체 약물 모이어티
본 발명의 항체-약물 접합체 화합물은 CBI 이량체 약물 모이어티 D를 포함한다. CBI 이량체 약물 모이어티는 2개의 CBI 약물 단위, 또는 1개의 CBI 약물 단위 및 1개의 PBD 약물 단위로 구성될 수 있다.
CBI 이량체 약물 모이어티 D는 하기 화학식을 갖는다.
Figure pct00011
상기 식에서,
R1은 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb로부터 선택되고;
R2는 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb로부터 선택되고;
Ra 및 Rb는 독립적으로 H, 및 1개 이상의 F로 임의로 치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되거나,
또는 Ra 및 Rb는 5 또는 6원 헤테로시클릴 기를 형성하고;
T는 C3-C12 알킬렌, Y, (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C2-C6 알케닐렌)-Y-(C2-C6 알케닐렌), 및 (C2-C6 알키닐렌)-Y-(C2-C6 알키닐렌)으로부터 선택된 테더 기이고;
여기서 Y는 독립적으로 O, S, NR1, 아릴, 및 헤테로아릴로부터 선택되고;
여기서 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 F, OH, O(C1-C6 알킬), NH2, NHCH3, N(CH3)2, OP(O)3H2, 및 C1-C6 알킬로 독립적으로 및 임의로 치환되고, 여기서 알킬은 1개 이상의 F로 임의로 치환되거나;
또는 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 L에 대한 결합으로 독립적으로 및 임의로 치환되고;
D'는
Figure pct00012
로부터 선택된 약물 모이어티이고;
여기서 파상선은 T에 대한 부착 부위를 나타내고;
X1 및 X2는 독립적으로 O 및 NR3으로부터 선택되고, 여기서 R3은 H, 및 1개 이상의 F로 임의로 치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되고;
R4는 H, CO2R이고, 여기서 R은 C1-C6 알킬 또는 벤질이고;
R5는 H 또는 C1-C6 알킬이다.
특정 실시양태에서, Y는 페닐, 피리딜, 1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸, 또는 [1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딘이다.
CBI 이량체 약물 모이어티 D 화합물은 표 1의 것들을 포함하며, 이들은 표 3의 링커-CBI 약물 중간체를 제조하는데 유용하다.
<표 1> CBI 이량체 약물 모이어티 화합물
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
CBI 이량체 약물 모이어티 D 화합물을 제조하는데 유용한 테더 시약은 표 2의 것들을 포함한다.
<표 2> 테더 시약
Figure pct00016
Figure pct00017
링커
본 발명의 항체-약물 접합체 (ADC) 화합물은 하기 화학식을 갖는 링커 L을 포함한다.
Figure pct00018
상기 식에서 Str은 항체에 공유 부착된 스트레쳐 단위이고; Pep는 2 내지 12개의 아미노산 잔기의 임의적인 펩티드 단위이고, Sp는 이량체 약물 모이어티에 공유 부착된 임의적인 스페이서 단위이고, m 및 n은 독립적으로 0 및 1로부터 선택된다.
예시적인 실시양태에서, Str은 1,3-이치환된, 피롤리딘-2,5-디온 (숙신이미드) 화학식을 갖는다.
Figure pct00019
상기 식에서 R6은 C1-C10 알킬렌, C3-C8 카르보시클릴, O-(C1-C8 알킬), 아릴렌, C1-C10 알킬렌-아릴렌, 아릴렌-C1-C10 알킬렌, C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보시클릴), (C3-C8 카르보시클릴)-C1-C10 알킬렌, C3-C8 헤테로시클릴, C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로시클릴), (C3-C8 헤테로시클릴)-C1-C10 알킬렌, C1-C10 알킬렌-C(O)N(R8)-C2-C6 알킬렌-N(R8), N(R8)-(C2-C6 알킬렌), 및 (CH2CH2O)r-CH2로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 R8은 H 또는 C1-C6 알킬이고, r은 1 내지 10 범위의 정수이다.
Str 스트레쳐 단위의 1,3-이치환된, 피롤리딘-2,5-디온 실시양태는 항체의 시스테인 티올과 표 4의 것들과 같은 링커-약물 중간체의 말레이미드 기의 접합으로부터 형성될 수 있다.
또 다른 예시적인 실시양태에서, Str은 하기 화학식을 갖는다.
Figure pct00020
상기 식에서 R7은 C1-C10 알킬렌, C1-C10 알킬렌-O, N(R8)-(C2-C6 알킬렌)-N(R8), N(R8)-(C2-C6 알킬렌), 및 (CH2CH2O)r-CH2로부터 선택되고; 여기서 R8은 H 또는 C1-C6 알킬이고, r은 1 내지 10 범위의 정수이다.
또 다른 예시적인 실시양태에서, Str은 하기 화학식을 갖는다.
Figure pct00021
상기 식에서 R9는 C1-C10 알킬렌, C1-C10 알킬렌-O, (C2-C6 알킬렌)-N(R8), 및 (CH2CH2O)r-CH2로부터 선택되고; 여기서 R8은 H 또는 C1-C6 알킬이고, r은 1 내지 10 범위의 정수이다.
또 다른 예시적인 실시양태에서, L은 항체에서 시스테인 아미노산과 디술피드 결합을 형성하고, R9는 C2-C6 알킬렌-O이고 여기서 알킬렌은 F, OH, O(C1-C6 알킬), NH2, NHCH3, N(CH3)2, OP(O)3H2, 및 C1-C6 알킬로 임의로 치환되고, 여기서 알킬은 1개 이상의 F로 임의로 치환된다.
링커 시약 및 링커-약물 중간체는 2 내지 12개 또는 그 초과의 아미노산 잔기의 펩티드 단위를 가질 수 있다.
예시적인 실시양태에서, m은 1이고 Pep는 글리신, 알라닌, 페닐알라닌, 리신, 아르기닌, 발린, 및 시트룰린으로부터 독립적으로 선택된 2 내지 12개의 아미노산 잔기를 포함한다.
예시적인 실시양태에서, Pep는 발린-시트룰린이다.
펩티드-링커 시약은 기재된 바와 같이 제조하였다 (WO 2012113847; US 7659241; US 7498298; US 2009/0111756; US 2009/0018086; US 6214345; Dubowchik et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13(4):855-869).
예시적인 실시양태에서, Sp는 파라-아미노벤질 또는 파라-아미노벤질옥시카르보닐을 포함한다.
표 3은 표 4의 링커-CBI 약물 중간체를 제조하는데 유용한 예시적인 링커 시약을 나타낸다.
<표 3> 펩티드-링커 시약
Figure pct00022
ADC에 유용한 링커-약물 중간체
항체에 접합시켜 항체-약물 접합체를 제조하는데 유용한 링커-약물 중간체는 하기 화학식을 갖는다.
Figure pct00023
상기 식에서,
X는 말레이미드, 티올, 아미노, 브로마이드, 브로모아세트아미도, 아이오도아세트아미도, p-톨루엔술포네이트, 아이오다이드, 히드록실, 카르복실, 피리딜 디술피드, 및 N-히드록시숙신이미드로부터 선택된 반응성 관능기이고;
L은 하기 화학식을 갖는 링커이고,
Figure pct00024
여기서 Str은 반응성 관능기 X에 공유 부착된 스트레쳐 단위이고; Pep는 2 내지 12개의 아미노산 잔기의 임의적인 펩티드 단위이고, Sp는 이량체 약물 모이어티에 공유 부착된 임의적인 스페이서 단위이고, m 및 n은 독립적으로 0 및 1로부터 선택되고;
D는 하기 화학식을 갖는 이량체 약물 모이어티이고,
Figure pct00025
여기서
R1은 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb, 또는 L에 대한 결합으로부터 선택되고;
R2는 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb, 또는 L에 대한 결합으로부터 선택되고;
Ra 및 Rb는 독립적으로 H, 및 1개 이상의 F로 임의로 치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되거나, 또는 Ra 및 Rb는 5 또는 6원 헤테로시클릴 기를 형성하고;
T는 C3-C12 알킬렌, Y, (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C2-C6 알케닐렌)-Y-(C2-C6 알케닐렌), 및 (C2-C6 알키닐렌)-Y-(C2-C6 알키닐렌)으로부터 선택된 테더 기이고;
여기서 Y는 독립적으로 O, S, NR1, 아릴, 및 헤테로아릴로부터 선택되고;
여기서 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 F, OH, O(C1-C6 알킬), NH2, NHCH3, N(CH3)2, OP(O)3H2, 및 C1-C6 알킬로 독립적으로 및 임의로 치환되고, 여기서 알킬은 1개 이상의 F로 임의로 치환되거나;
또는 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 L에 대한 결합으로 독립적으로 및 임의로 치환되고;
D'는
Figure pct00026
로부터 선택된 약물 모이어티이고;
여기서 파상선은 T에 대한 부착 부위를 나타내고;
X1 및 X2는 독립적으로 O 및 NR3으로부터 선택되고, 여기서 R3은 H, 및 1개 이상의 F로 임의로 치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되고;
R4는 H, CO2R, 또는 L에 대한 결합이고, 여기서 R은 C1-C6 알킬 또는 벤질이고;
R5는 H 또는 C1-C6 알킬이다.
표 4의 링커-약물 중간체는 실시예 1-18 및 도 1-24에 예시된 바와 같이 CBI 이량체 약물 모이어티를 링커 시약과 커플링함으로써 제조하였다.
<표 4> 링커-CBI 약물 중간체
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
항체-약물 접합체 (ADC)
본 발명의 항체-약물 접합체 (ADC) 화합물은 강력한 CBI 이량체 약물 모이어티에 연결된 종양-연관 항원에 특이적인 항체를 포함하고, 암을 비롯한 다수의 과다증식성 장애에 대해 효과적인 치료 활성을 갖는 것들을 포함한다. 약물 모이어티의 생물학적 활성은 항체에 대한 접합에 의해 조정된다. 본 발명의 ADC는 유효 용량의 CBI 이량체 약물 또는 독소를 종양 세포 또는 부위에 선택적으로 전달함으로써, 치료 지수 ("치료 범위")를 증가시키면서 보다 큰 선택성, 즉 보다 낮은 유효 용량을 달성할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, ADC 화합물은 CBI 이량체 약물 모이어티에 접합된, 즉 링커에 의해 공유 부착된 시스테인-조작된 항체를 포함한다.
본 발명의 항체-약물 접합체 화합물은 하기 화학식을 갖는다.
Figure pct00037
상기 식에서,
Ab는 항체이고;
L은 하기 화학식을 갖는 링커이고,
Figure pct00038
여기서 Str은 항체에 공유 부착된 스트레쳐 단위이고; Pep는 2 내지 12개의 아미노산 잔기의 임의적인 펩티드 단위이고, Sp는 이량체 약물 모이어티에 공유 부착된 임의적인 스페이서 단위이고, m 및 n은 독립적으로 0 및 1로부터 선택되고;
p는 1 내지 8의 정수이고;
D는 하기 화학식을 갖는 이량체 약물 모이어티이고,
Figure pct00039
여기서
R1은 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb, 또는 L에 대한 결합으로부터 선택되고;
R2는 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb, 또는 L에 대한 결합으로부터 선택되고;
Ra 및 Rb는 독립적으로 H, 및 1개 이상의 F로 임의로 치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되거나,
또는 Ra 및 Rb는 5 또는 6원 헤테로시클릴 기를 형성하고;
T는 C3-C12 알킬렌, Y, (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C2-C6 알케닐렌)-Y-(C2-C6 알케닐렌), 및 (C2-C6 알키닐렌)-Y-(C2-C6 알키닐렌)으로부터 선택된 테더 기이고;
여기서 Y는 독립적으로 O, S, NR1, 아릴, 및 헤테로아릴로부터 선택되고;
여기서 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 F, OH, O(C1-C6 알킬), NH2, NHCH3, N(CH3)2, OP(O)3H2, 및 C1-C6 알킬로 독립적으로 및 임의로 치환되고, 여기서 알킬은 1개 이상의 F로 임의로 치환되거나;
또는 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 L에 대한 결합으로 독립적으로 및 임의로 치환되고;
D'는
Figure pct00040
로부터 선택된 약물 모이어티이고;
여기서 파상선은 T에 대한 부착 부위를 나타내고;
X1 및 X2는 독립적으로 O 및 NR3으로부터 선택되고, 여기서 R3은 H, 및 1개 이상의 F로 임의로 치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되고;
R4는 H, CO2R이고 여기서 R은 C1-C6 알킬 또는 벤질이고;
R5는 H이다.
한 실시양태에서, Ra 및 Rb는 N-메틸피페라지닐, 모르폴리닐, 피페리딜, 및 피롤리디닐로부터 선택된 5 또는 6원 헤테로시클릴 기를 형성한다.
한 실시양태에서, 약물 모이어티는 프로테아제 절단가능한, 대부분의 포유동물 세포 유형에서 발견되는 리소솜 프로테아제인 카텝신 B에 의해 절단가능한 펩티드 링커를 통해 항체에 연결될 수 있다 (US 6214345; Dubowchik et al. (2002) Bioconj. Chem. 13:855-869). 본 발명은 임의의 특정한 작용 메카니즘에 의해 제한 또는 규정되지 않지만, ADC는 링커가 절단될 때까지 약물이 불활성이라는 점에서 전구약물로서 작용할 수 있다. ADC는 질환이 통상적인 화학요법에 의해 불량하게 치료될 수 있는 종양 세포 위치에 활성 약물을 특이적으로 집중시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 약물 모이어티는 관능기 예컨대 디술피드 또는 숙신이미딜 기를 포함할 수 있는 비-펩티드, 비-프로테아제 절단가능한 링커를 통해 항체에 부착된다.
항체 분자에 반응성 링커 모이어티를 통해 접합될 수 있는 약물 모이어티의 수는 본원에 기재된 방법에 의해 도입된 유리 시스테인 잔기의 수에 의해 제한될 수 있다. 따라서, 예시적인 ADC는 1, 2, 3 또는 4개의 조작된 시스테인 아미노산을 갖는 항체를 포함한다 (Lyon, R. et al. (2012) Methods in Enzym. 502:123-138).
한 실시양태에서, 항체-약물 접합체 화합물은 하기 화학식을 갖는다.
Figure pct00041
상기 식에서 AA1 및 AA2는 독립적으로 아미노산 측쇄로부터 선택된다. 아미노산 측쇄는 독립적으로 H, -CH3, -CH2(C6H5), -CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2NHC(NH)NH2, -CHCH(CH3)CH3, 및 -CH2CH2CH2NHC(O)NH2로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항체-약물 접합체 화합물은 하기 화학식을 갖는다.
Figure pct00042
한 실시양태에서, 항체-약물 접합체 화합물은 하기 화학식을 갖는다.
Figure pct00043
한 실시양태에서, 항체-약물 접합체 화합물은 하기 화학식을 갖는다.
Figure pct00044
한 실시양태에서, 항체-약물 접합체 화합물은 하기 화학식을 갖는다.
Figure pct00045
한 실시양태에서, 항체-약물 접합체 화합물은 하기 화학식을 갖는다.
Figure pct00046
한 실시양태에서, 항체-약물 접합체 화합물은 하기 화학식을 갖는다.
Figure pct00047
한 실시양태에서, 항체-약물 접합체 화합물은 하기 화학식을 갖는다.
Figure pct00048
한 실시양태에서, 항체-약물 접합체 화합물은 하기 화학식을 갖는다.
Figure pct00049
상기 식에서 R7은 독립적으로 H 및 C1-C12 알킬로부터 선택된다.
한 실시양태에서, p는 1, 2, 3 또는 4이다.
한 실시양태에서, p는 2이다.
한 실시양태에서, D는 표 1에 열거된 화합물 또는 그의 유도체로부터 선택된 모이어티이다.
한 실시양태에서, L-D는 표 4에 열거된 화합물 또는 그의 유도체로부터 선택된 모이어티이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 표 5에 열거된 분자로부터 선택된 접합체에 관한 것이다.
ADC의 약물 로딩
약물 로딩은 항체당 CBI 약물 모이어티의 평균 수이다. 약물 로딩은 항체 (Ab) 1개 당 1개 내지 8개의 약물 (D) 범위일 수 있으며, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8개의 약물 모이어티가 항체에 공유 부착된다. ADC의 조성은 1 내지 8개 범위의 약물과 접합된 항체의 집합체를 포함한다. 접합 반응에 의한 ADC의 제제에서의 항체당 약물의 평균 수는 통상적인 수단, 예를 들어 질량 분광분석, ELISA 검정, 전기영동 및 HPLC에 의해 특성화될 수 있다. 또한, ADC의 정략적 분포가 p의 측면에서 결정될 수 있다. ELISA에 의해, ADC의 특정한 제제에서의 p의 평균 값을 결정할 수 있다 (Hamblett et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Sanderson et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852). 그러나, p (약물) 값의 분포는 항체-항원 결합 및 ELISA의 검출 한계로 인해 식별불가능하다. 또한, 항체-약물 접합체를 검출하기 위한 ELISA 검정은 약물 모이어티가 항체, 예컨대 중쇄 또는 경쇄 단편, 또는 특정한 아미노산 잔기에 부착되는 위치를 결정하지 못한다. 일부 경우에, p가 다른 약물 로딩을 갖는 ADC로부터의 특정 값인 균질 ADC의 분리, 정제 및 특성화는 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 수단에 의해 달성될 수 있다.
일부 항체-약물 접합체의 경우에, p는 항체 상의 부착 부위의 수에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 항체는 시스테인 티올 기를 단지 1개 또는 수개 가질 수도 있거나, 또는 링커가 부착될 수 있는 충분히 반응성인 티올 기를 단지 1개 또는 수개 가질 수 있다. 약물 로딩이 높을수록 (예를 들어 p >5), 특정 항체-약물 접합체의 응집, 불용성, 독성, 또는 세포 투과성 상실이 유발될 수 있다.
전형적으로, 이론적 최대치 미만의 약물 모이어티가 접합 반응 동안 항체에 접합된다. 항체는 예를 들어 링커-약물 중간체 (X-L-D) 또는 링커 시약과 반응하지 않는 다수의 리신 잔기를 함유할 수 있다. 오직 가장 반응성인 리신 기만이 아민-반응성 링커 시약과 반응할 수 있다. 또한, 오직 가장 반응성인 시스테인 티올 기만이 티올-반응성 링커 시약 또는 링커-약물 중간체와 반응할 수 있다. 일반적으로, 항체는 약물 모이어티에 연결될 수 있는 유리 및 반응성 시스테인 티올 기를 함유하더라도 다수 함유하지는 않는다. 화합물의 항체 내의 대부분의 시스테인 티올 잔기는 디술피드 가교로 존재하고, 부분적 또는 완전한 환원 조건 하에 환원제, 예컨대 디티오트레이톨 (DTT) 또는 TCEP를 사용하여 환원시켜야 한다. ADC의 로딩 (약물/항체 비, "DAR")은 여러 상이한 방식, 예를 들어 (i) 항체에 대한 몰 과량의 약물-링커 중간체 또는 링커 시약의 제한, (ii) 접합 반응 시간 또는 온도의 제한, 및 (iii) 시스테인 티올 변형에 대한 부분적 또는 제한적 환원 조건에 의해 제어될 수 있다.
항체의 1개 초과의 친핵성 또는 친전자성 기가 약물-링커 중간체 또는 링커 시약에 이어서 CBI 이량체 약물 모이어티 시약과 반응하는 경우에, 생성된 생성물은 항체에 부착된 약물 모이어티의 분포가 예를 들어 1, 2, 3 등인 ADC 화합물의 혼합물이다. 액체 크로마토그래피 방법, 예컨대 중합체 역상 (PLRP) 및 소수성 상호작용 (HIC)은 혼합물 중의 화합물을 약물 로딩 값에 따라 분리할 수 있다. 단일 약물 로딩 값 (p)을 갖는 ADC의 제제가 단리될 수 있지만, 이들 단일 로딩 값 ADC는, 약물 모이어티가 항체 상의 여러 부위에서 링커를 통해 부착될 수 있기 때문에 여전히 불균질 혼합물일 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체-약물 접합체 조성물은 항체가 1개 이상의 약물 모이어티를 가지며 약물 모이어티가 다양한 아미노산 잔기에서 항체에 부착될 수 있는 항체-약물 접합체 화합물의 혼합물을 포함한다.
항체-약물 접합체의 제조 방법
본 발명의 예시적인 항체-약물 접합체 (ADC) 화합물 101-139는 실시예 20에 따라, 표 4에 제시된 바와 같은 링커-약물 중간체 51-68로부터 제조되었다.
<표 5> 항체-약물 접합체 (ADC)
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
* DAR = 약물/항체 비 평균
** A118C (EU 넘버링) = A121C (순차적 넘버링) = A114C (카바트 넘버링)
항-CD22 항체
US 8226945에 따르면, 표 5의 ADC의 항-CD22 항체는 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3) 및 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3)을 포함한다:
항-MUC16 항체
US 7989595에 따르면, 표 5의 ADC의 항-MUC16 항체는 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3) 및 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3)을 포함한다:
Figure pct00054
표 5의 ADC의 항-MUC16 항체는 서열 13의 가변 중쇄 서열 및 서열 14의 가변 경쇄 서열을 포함한다.
Figure pct00055
한 실시양태에서, 본 발명의 ADC의 항-MUC16 항체는 서열 15-32로부터 선택된 경쇄 서열 또는 서열 33-46으로부터 선택된 중쇄 서열에 위치하는 1개 이상의 유리 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 시스테인-조작된, 티오MAb이다.
Figure pct00056
Figure pct00057
한 실시양태에서, 항-MUC16 시스테인-조작된, 티오MAb는 서열 47의 중쇄 서열을 포함하는 인간화 항체이다.
Figure pct00058
한 실시양태에서, 항-MUC16 시스테인-조작된, 티오MAb는 서열 48의 경쇄 서열을 포함하는 인간화 항체이다.
Figure pct00059
한 실시양태에서, 항-MUC16 시스테인-조작된, 티오MAb는 서열 49의 중쇄 서열을 포함하는 키메라 항체이다.
Figure pct00060
한 실시양태에서, 항-MUC16 시스테인-조작된, 티오MAb는 서열 50의 경쇄 서열을 포함하는 키메라 항체이다.
Figure pct00061
항-HER2 항체
특정 실시양태에서, 표 5의 ADC는 항-HER2 항체를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 ADC의 항-HER2 항체는 US 5821337의 표 3에 기재된 바와 같은 인간화 항-HER2 항체, 예를 들어 huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8을 포함한다. 이들 항체는 HER2에 결합하는 뮤린 항체 (4D5)의 상보성-결정 영역을 갖는 인간 프레임워크 영역을 함유한다. 인간화 항체 huMAb4D5-8은 또한 상표명 헤르셉틴(HERCEPTIN)® 하에 상업적으로 입수가능한 트라스투주맙으로 지칭된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 ADC의 항-HER2 항체는 US7862817에서 기재된 바와 같은 인간화 항-HER2 항체, 예를 들어 인간화 2C4를 포함한다. 예시적인 인간화 2C4 항체는 상표명 페르제타(PERJETA)® 하에 상업적으로 입수가능한 페르투주맙이다.
표 5의 ADC를 제조하는데 사용된 시스테인-조작된 티오MAb 항체는 중쇄의 118-알라닌 부위 (EU 넘버링)에 도입된 시스테인 잔기를 갖는다. 이 부위는 순차적 넘버링에 의해 121로 또는 카바트 넘버링에 의해 114로 넘버링된다.
항-CD33 항체
표 5의 ADC의 항-CD33 항체 15G15.33은 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3) 및 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3)을 포함한다.
Figure pct00062
표 5의 ADC의 항-CD33 항체 15G15.33은 서열 57의 경쇄 가변 영역 및/또는 서열 58의 중쇄 가변 영역을 포함한다.
Figure pct00063
항-CD33 항체 9C3 및 다른 실시양태
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-CD33 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 및 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 64로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL도메인을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
임의의 상기 실시양태에서, 항-CD33 항체는 인간화된다. 한 실시양태에서, 항-CD33 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 인간 수용자 프레임워크, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 수용자 프레임워크는 인간 VL 카파 I 컨센서스 (VLKI) 프레임워크 및/또는 VH 프레임워크 VH1이다. 특정 실시양태에서, 인간 수용자 프레임워크는 하기 돌연변이 중 어느 하나를 포함하는 인간 VL 카파 I 컨센서스 (VLKI) 프레임워크 및/또는 VH 프레임워크 VH1이다.
또 다른 측면에서, 항-CD33 항체는 서열 66, 서열 68, 서열 70 및/또는 서열 72의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 66, 서열 68, 서열 70 및/또는 서열 72의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대한 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-CD33 항체는 CD33에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 66, 서열 68, 서열 70 및/또는 서열 72에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 서열 66, 서열 68, 서열 70 및/또는 서열 72에서 총 1 내지 5개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항-CD33 항체는 서열 66, 서열 68, 서열 70 및/또는 서열 72의 VH 서열을 포함한다 (이들 서열의 번역후 변형 포함). 특정한 실시양태에서, VH는 (a) 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 63의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 항-CD33 항체는 서열 65, 서열 67, 서열 69 및/또는 서열 71의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-CD33 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 65, 서열 67, 서열 69 및/또는 서열 71의 아미노산 서열에 대해 적어도 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대한 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-CD33 항체는 CD33에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 65, 서열 67, 서열 69 및/또는 서열 71에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 서열 65, 서열 67, 서열 69 및/또는 서열 71에서 총 1 내지 5개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항-CD33 항체는 서열 65, 서열 67, 서열 69 및/또는 서열 71의 VL 서열을 포함한다 (이들 서열의 번역후 변형 포함). 특정한 실시양태에서, VL은 (a) 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-CD33 항체가 제공된다.
한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 66 및 서열 65의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (이들 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 68 및 서열 67의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (이들 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 70 및 서열 69의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (이들 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 72 및 서열 71의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (이들 서열의 번역후 변형 포함).
추가 측면에서, 본원에 제공된 항-CD33 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 본원에 제공된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 각각 서열 66, 서열 68, 서열 70 및/또는 서열 72의 VH 서열 및 서열 65, 서열 67, 서열 69 및/또는 서열 71의 VL 서열을 포함하는 항-CD33 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
본 발명의 추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-CD33 항체는 인간 항체를 비롯한 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항-CD33 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 실질적으로 전장 항체, 예를 들어 IgG1 항체, IgG2a 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다.
추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-CD33 항체는 하기 기재된 바와 같은 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.
시험관내 세포 증식 검정
일반적으로, 항체-약물 접합체 (ADC)의 세포독성 또는 세포증식억제성 활성은 수용체 단백질, 예를 들어 HER2를 갖는 포유동물 세포를 세포 배양 배지에서 ADC의 항체에 노출시키고; 약 6시간 내지 약 5일의 기간 동안 세포를 배양하고; 세포 생존율을 측정함으로써 측정된다. 세포-기반 시험관내 검정을 사용하여 본 발명의 ADC의 생존율 (증식), 세포독성, 및 아폽토시스의 유도 (카스파제 활성화)를 측정하였다.
항체-약물 접합체 (ADC)의 시험관내 효력을 세포 증식 검정 (실시예 21)에 의해 측정하였다. ADC는 종양 세포 증식의 억제에 있어서 놀라운 예상치 못한 효력을 나타내었다. ADC의 효력은 세포의 표적 항원 발현과 상호관련되었다. 도 25-30의 데이터는 시험된 접합체가 시험관내에서 세포의 표면 상에 발현된 특정 항원에 결합하고 이들 세포의 사멸을 유발할 수 있다는 것을 나타낸다.
셀타이터-글로(CellTiter-Glo)® 발광 세포 생존율 검정은 상업적으로 입수가능하며 (프로메가 코포레이션(Promega Corp.), 위스콘신주 매디슨), 딱정벌레목 루시퍼라제의 재조합 발현을 기초로 하는 균질 검정 방법이다 (US 5583024; US5674713; US5700670). 이러한 세포 증식 검정은 대사적으로 활성인 세포의 지표인 ATP 존재의 정량화에 기초하여 배양물 중 생존 세포의 수를 결정한다 (Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88; US 6602677). 셀타이터-글로® 검정을 96웰 포맷으로 수행하였으며, 이는 상기 검정을 자동화 고처리량 스크리닝 (HTS)에 적용될 수 있게 한다 (Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404). 균질 검정 절차는 단일 시약 (셀타이터-글로® 시약)을 혈청-보충 배지에서 배양된 세포에 직접적으로 첨가하는 것을 포함한다. 세포 세척, 배지 제거, 및 다중 피펫팅 단계는 필요하지 않다. 상기 시스템은 시약을 첨가하고 혼합한 후 10분 내에 384웰 포맷에서 겨우 15개 세포/웰에 불과한 것도 검출한다. 세포는 ADC로 계속적으로 처리될 수 있거나, 또는 이들은 처리되고 ADC로부터 분리될 수 있다. 일반적으로, 잠시, 즉 3시간 처리된 세포는 계속적으로 처리된 세포와 동일한 효력 효과를 나타내었다.
균질 "첨가-혼합-측정" 포맷은 세포 용해 및 존재하는 ATP의 양에 비례하는 발광 신호를 일으킨다. ATP의 양은 배양물에 존재하는 세포의 수에 직접적으로 비례한다. 셀타이터-글로® 검정은 루시페라제 반응에 의해 생성되는 "성장-유형" 발광 신호를 생성하고, 이는 사용되는 세포 유형 및 배지에 따라 일반적으로 5시간 초과의 반감기를 갖는다. 생존 세포는 상대 발광 단위 (RLU)에 반영된다. 기질인 딱정벌레 루시페린은 재조합 반딧불이 루시페라제에 의해 산화적으로 탈카르복실화되며, 이와 동시에 ATP가 AMP로 전환되고, 광자가 생성된다.
세포-기반 시험관내 검정이 본 발명의 ADC의 생존율 (증식), 세포독성, 및 아폽토시스의 유도 (카스파제 활성화)를 측정하는데 사용된다. 일반적으로, 항체-약물 접합체 (ADC)의 세포독성 또는 세포증식억제성 활성은 항원 예컨대 Her2 또는 MUC16 폴레펩티드를 발현하는 포유동물 세포를 세포 배양 배지에서 ADC에 노출시키고; 약 6시간 내지 약 5일의 기간 동안 세포를 배양하고; 세포 생존율을 측정함으로써 측정된다. 항-MUC16 ADC에 대한 세포 증식 검정에 유용한 포유동물 세포는 (1) MUC16 폴리펩티드-발현 세포주 OVCAR-3; (2) 세포 표면 상에 MUC16 폴리펩티드의 일부를 안정하게 발현하도록 조작된 PC3-유래 세포주 (PC3/MUC16); (3) MUC16 폴리펩티드를 발현하지 않는 모 PC3 세포주; 및 (4) MUC16 폴리펩티드를 발현하지 않지만 외인성 MUC16 발현을 유도하는데 사용되는 벡터를 보유하는 PC3 세포주 (PC3/neo)를 포함한다.
도 25는 티오 hu 항-CD22 HC A121C-MC-vc-PAB-(CBI 이량체) 101 및 티오 hu 항-Her2 HC A121C-MC-vc-PAB-(CBI 이량체) 102의 농도 (μg/ml)에 대한 제3일에서의 SK-BR-3 시험관내 세포 생존율의 플롯에서의 항체-약물 접합체의 효능을 제시한다. Her2 항원은 SK-BR-3 세포에서 고도로 발현된다. 항-Her2 ADC 102는 선형, 비-용량 반응 세포-사멸 활성을 나타내는 반면, 대조, 오프-타겟 항-CD22 ADC 101은 보다 낮은 활성을 나타낸다.
도 26은 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI-PBD) 103 및 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI-PBD) 104의 농도 (μg/ml)에 대한 제3일에서의 SK-BR-3 시험관내 세포 생존율의 플롯에서의 항체-약물 접합체의 효능을 제시한다. 항-Her2 ADC 103은 선형, 비-용량 반응 세포-사멸 활성을 나타내는 반면, 대조, 오프-타겟 항-CD22 ADC 104는 보다 낮은 활성을 나타낸다.
도 27은 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI 이량체) 116 및 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI 이량체) 117의 농도 (μg/ml)에 대한 제3일에서의 SK-BR-3 시험관내 세포 생존율의 플롯에서의 항체-약물 접합체의 효능을 제시한다. 항-Her2 ADC 117은 선형, 비-용량 반응 세포-사멸 활성을 나타내는 반면, 대조, 오프-타겟 항-CD22 ADC 116은 보다 낮은 활성을 나타낸다.
도 28은 티오 Hu 항-CD33 15G15.33 HC A118C-MC-MMED-(CBI 이량체 포스) 125의 농도 (μg/ml)에 대한 제3일에서의 EOL-1 시험관내 세포 생존율의 플롯에서의 항체-약물 접합체의 효능을 제시하며, 이는 중간 정도의 용량 반응 세포-사멸 활성을 나타낸다.
도 29는 티오 Hu 항-MUC16 3A5 HC A118C-MC-ED-(CBI 이량체 DVB 디포스) 126 및 티오 Hu 항-CD33 15G15.33 HC A118C-MC-ED-(CBI 이량체 DVB 디포스) 127의 농도 (μg/ml)에 대한 제3일에서의 EOL-1 시험관내 세포 생존율의 플롯에서의 항체-약물 접합체의 효능을 제시한다. 항-CD33 ADC 127은 강력한, 용량 반응성 세포-사멸 활성을 나타내는 반면, 대조, 오프-타겟 항-MUC16 ADC 126은 보다 낮은 활성을 나타낸다.
도 30은 티오 Hu 항-CD33 15G15.33 HC A118C-MC-ED-(CBI 이량체 DVB 디포스) 127, 티오 Hu 항-CD33 15G15.33 HC A118C-MC-ED-(CBI 이량체 DVB 포스) 129 및 티오 Hu 항-MUC16 3A5 HC A118C-MC-ED-(CBI 이량체 DVB 포스) 130의 농도 (μg/ml)에 대한 제3일에서의 EOL-1 시험관내 세포 생존율의 플롯에서의 항체-약물 접합체의 효능을 제시한다. 항-CD33 ADC 127 및 129는 강력한, 용량 반응성 세포-사멸 활성을 나타내는 반면, 대조, 오프-타겟 항-MUC16 ADC 130은 보다 낮은 활성을 나타낸다.
생체내 효능
본 발명의 항체-약물 접합체 (ADC)의 생체내 효능은 마우스에서의 종양 이종이식 연구 (실시예 22)에 의해 측정될 수 있다. 항체-약물 접합체 (ADC)의 생체내 효능은 마우스에서의 종양 성장 억제 (실시예 21)에 의해 측정되었다. ADC는 종양 성장의 억제에 있어서 놀라운 예상치 못한 효력을 나타내었다. ADC의 효능은 종양 세포의 표적 항원 발현과 상호관련되었다.
항체-약물 접합체의 효능은 암 세포의 동종이식편 또는 이종이식편을 설치류에 이식하고 종양을 ADC로 처리함으로써 생체내에서 측정되었다. 세포주, 암 세포에 존재하는 수용체에 대한 ADC의 항체 결합의 특이성, 투여 요법, 및 다른 인자에 따라 다양한 결과가 예상된다. ADC의 생체내 효능은 중간 정도 내지 높은 수준의 종양-연관 항원, 예컨대 Her2, MUC16 및 CD33을 발현하는 트랜스제닉 외식편 마우스 모델을 사용하여 측정되었다. 대상체를 ADC로 1회 처리하고, 3-6주에 걸쳐서 모니터링하여 종양 배가까지의 시간, 로그 세포 사멸 및 종양 수축을 측정하였다. 추적 용량-반응 및 다중-용량 실험을 수행하였다.
예를 들어, 본 발명의 항-HER2 ADC의 생체내 효능은 고 발현 HER2 트랜스제닉 외식편 마우스 모델에 의해 측정될 수 있다 (Phillips et al. (2008) Cancer Res. 68:9280-90). 동종이식편은 헤르셉틴® 요법에 반응하지 않거나 그에 불량하게 반응하는 Fo5 mmtv 트랜스제닉 마우스로부터 전파된다. 대상체를 특정 용량 수준 (mg/kg)의 ADC 및 위약 완충제 대조군 (비히클)으로 1회 처리하고, 2주 이상에 걸쳐 모니터링하여 종양 배가까지의 시간, 로그 세포 사멸 및 종양 수축을 측정하였다.
도 31은 (1) 비히클: 히스티딘 완충제 #8: 20mM 히스티딘 아세테이트, pH 5.5, 240mM 수크로스, 0.02% PS 20, (2) 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C-MC-MMED-(CBI 이량체 포스) 110, (3) 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI 이량체 MePip) 108, (4) 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI 이량체 포스) 111, (5) 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-MC-MMED-(CBI 이량체 포스) 109, (6) 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI 이량체 MePip) 107, (7) 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(CBI 이량체 포스) 112로 IV 1회 투여 후에, CRL nu/nu 마우스의 유방 지방 패드 내로 접종된 MMTV-HER2 Fo5 트랜스제닉 유방 종양에서 시간 경과에 따른 생체내 핏팅된 종양 부피 변화의 플롯에서의 항체-약물 접합체의 효능을 제시한다. ADC는 10 mg/kg으로 투여하였다.
도 32는 (1) 비히클: 히스티딘 완충제 #8: 20mM 히스티딘 아세테이트, pH 5.5, 240mM 수크로스, 0.02% PS 20, (2) 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C-DSE-(CBI 이량체 포스) 120, 10 mg/kg, (3) 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C-DSE-(CBI 이량체 포스) 122, 10 mg/kg, (4) 티오 Hu 항-CD22 10F4v3 HC A118C-MC-vc-PAB-(N10,PBD-CBI MePip) 124, 10 mg/kg, (5) 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-DSE-(CBI 이량체 포스) 119, 3 mg/kg, (6) 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-DSE-(CBI 이량체 포스) 119, 10 mg/kg, (7) 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-DSP-(CBI 이량체 포스) 121, 3 mg/kg, (8) 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-DSP-(CBI 이량체 포스) 121, 10 mg/kg (9) 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(N10,PBD-CBI MePip) 123, 3 mg/kg, (10) 티오 Hu 항-Her2 4D5 HC A118C-MC-vc-PAB-(N10,PBD-CBI MePip) 123, 10 mg/kg으로 IV 1회 투여 후에, CRL nu/nu 마우스의 유방 지방 패드 내로 접종된 MMTV-HER2 Fo5 트랜스제닉 유방 종양에서 시간 경과에 따른 생체내 핏팅된 종양 부피 변화의 플롯에서의 항체-약물 접합체의 효능을 제시한다.
도 33은 (1) 비히클: 히스티딘 완충제 #8: 20mM 히스티딘 아세테이트, pH 5.5, 240mM 수크로스, 0.02% PS 20, (2) 티오 Hu 항-CD33 15G15.33 HC A118C-MC-ED-(CBI 이량체 DVB 디포스) 127, 3 mg/kg, (3) 티오 Hu 항-MUC16 3A5 HC A118C-MC-ED-(CBI 이량체 DVB 디포스) 126, 3 mg/kg, (4) 티오 Hu 항-MUC16 3A5 HC A118C-MC-ED-(CBI 이량체 DVB 디포스) 126, 1 mg/kg으로 IV 1회 투여 후에, C.B-17 SCID 마우스 내로 접종된 OVCAR3X2.1 인간 난소 종양에서 시간 경과에 따른 생체내 핏팅된 종양 부피 변화의 플롯에서의 항체-약물 접합체의 효능을 제시한다.
ADC 126의 항-MUC16 항체 (3A5 및 11D10 변이체 포함)는 WO 2007/001851; US 7989595; US 8449883에 기재된 바 있으며 이들 내용은 참조로 포함된다. 3A5 모노클로날 항체는 OVCAR-3 스캐차드 분석에 의해 MUC16 폴리펩티드의 다중 부위에 433 pM 친화도로 결합한다 (Chen et al. (2007) Cancer Res. 67(10): 4924-4932).
도 34는 (1) 비히클: 히스티딘 완충제 #8: 20mM 히스티딘 아세테이트, pH 5.5, 240mM 수크로스, 0.02% PS 20, (2) 티오 Hu 항-CD33 15G15.33 HC A118C-MC-MMED-(CBI 이량체 포스) 125, (3) 티오 Hu 항-CD33 15G15.33 HC A118C-MC-ED-(CBI 이량체 DVB 디포스) 127, (4) 티오 Hu 항-MUC16 3A5 HC A118C-MC-MMED-(CBI 이량체 포스) 128, (5) 티오 Hu 항-MUC16 3A5 HC A118C-MC-ED-(CBI 이량체 DVB 디포스) 126으로 20 μg/m2로 IV 1회 투여 후에, C.B-17 SCID 마우스 내로 접종된 HL-60 인간 급성 골수성 백혈병에서 시간 경과에 따른 생체내 핏팅된 종양 부피 변화의 플롯에서의 항체-약물 접합체의 효능을 제시한다.
항체-약물 접합체의 투여
본 발명의 항체-약물 접합체 (ADC)는 치료될 상태에 적절한 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. ADC는 전형적으로 비경구로, 즉 주입, 피하, 근육내, 정맥내, 피내, 척수강내 및 경막외로 투여될 것이다.
제약 제제
본 발명의 치료 항체-약물 접합체 (ADC)의 제약 제제는 전형적으로 제약상 허용되는 비경구 비히클과 함께 단위 투여 주사가능한 형태로, 비경구 투여, 즉 볼루스, 정맥내, 종양내 주사를 위해 제조된다. 원하는 정도의 순도를 갖는 항체-약물 접합체 (ADC)는 제약상 허용되는 희석제, 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16th edition, Osol, A. Ed.)와 함께 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 임의로 혼합된다.
항체-약물 접합체 치료
본 발명의 항체-약물 접합체 (ADC)를 사용하여 예를 들어 종양 항원의 과발현을 특징으로 하는 다양한 질환 또는 장애를 치료할 수 있음이 고려된다. 예시적인 상태 또는 과다증식성 장애는 양성 또는 악성 고형 종양 및 혈액 장애 예컨대 백혈병 및 림프성 악성종양을 포함한다. 다른 것은 뉴런, 신경교, 성상세포, 시상하부, 선상, 대식세포, 상피, 기질, 포배강, 염증성, 혈관신생 및 면역 (자가면역 포함) 장애를 포함한다.
일반적으로, 치료할 질환 또는 장애는 과다증식성 질환 예컨대 암이다. 본원에서 치료할 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프성 악성종양을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 편평 세포암 (예를 들어 상피 편평 세포암), 폐암, 예를 들어 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포성암, 위의 암 또는 위암, 예를 들어 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종 뿐만 아니라 두경부암을 포함한다.
ADC 화합물을 치료에 사용할 수 있는 자가면역 질환은 류마티스 장애 (예컨대, 예를 들어, 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군, 경피증, 루푸스 예컨대 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 및 루푸스 신염, 다발근염/피부근염, 한랭글로불린혈증, 항-인지질 항체 증후군, 및 건선성 관절염), 골관절염, 자가면역 위장 및 간 장애 (예컨대, 예를 들어, 염증성 장 질환 (예를 들어, 궤양성 결장염 및 크론병), 자가면역 위염 및 악성 빈혈, 자가면역 간염, 원발성 담즙성 간경변증, 원발성 경화성 담관염, 및 복강 질환), 혈관염 (예컨대, 예를 들어, ANCA-연관 혈관염, 예를 들어 처그-스트라우스 혈관염, 베게너 육아종증, 및 다발동맥염), 자가면역 신경계 장애 (예컨대, 예를 들어, 다발성 경화증, 안진전 근간대성경련 증후군, 중증 근무력증, 시신경척수염, 파킨슨병, 알츠하이머병 및 자가면역 다발신경병증), 신장애 (예컨대, 예를 들어, 사구체신염, 굿패스쳐 증후군 및 베르게르병), 자가면역 피부과 장애 (예컨대, 예를 들어, 건선, 두드러기, 심마진, 심상성 천포창, 수포성 유천포창, 및 피부 홍반성 루푸스), 혈액 장애 (예컨대, 예를 들어, 혈소판감소성 자반증, 혈전성 혈소판감소성 자반증, 수혈후 자반증 및 자가면역 용혈성 빈혈), 아테롬성동맥경화증, 포도막염, 자가면역 청각 질환 (예컨대, 예를 들어, 내이 질환 및 청각 상실), 베체트병, 레이노 증후군, 기관 이식, 및 자가면역 내분비 장애 (예컨대, 예를 들어, 당뇨병-관련 자가면역 질환 예컨대 인슐린-의존성 당뇨병 (IDDM), 애디슨병 및 자가면역 갑상선 질환 (예를 들어, 그레이브스병 및 갑상선염))을 포함한다. 보다 바람직한 이러한 질환은 예를 들어 류마티스 관절염, 궤양성 결장염, ANCA-연관 혈관염, 루푸스, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 그레이브스병, IDDM, 악성 빈혈, 갑상선염 및 사구체신염을 포함한다.
질환을 예방 또는 치료하는데 적절한 ADC 투여량은 상기 정의된 바와 같은 치료할 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 분자가 예방 목적으로 투여되는지 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 분자는 환자에게 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해서든 또는 연속 주입에 의해서든 관계없이, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어 0.1-20 mg/kg)의 분자가 환자에게 투여할 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 환자에게 투여될 ADC의 예시적인 투여량은 약 0.1 내지 약 10 mg/kg 환자 체중의 범위이다.
제조 물품
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 장애의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품 또는 "키트"가 제공된다. 제조 물품은 용기, 및 용기 상에 있거나 용기에 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, 블리스터 팩 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 상태의 치료에 효과적인 항체-약물 접합체 (ADC) 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 조성물 중의 적어도 1종의 활성제는 ADC이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 상태, 예컨대 암을 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 대안적으로 또는 추가로, 제조 물품은 제약상-허용되는 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 비롯한 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 2-(2-브로모-N-메틸아세트아미도)에틸(메틸)카르바메이트 51
문헌 [L. F. Tietze, J. M. von Hof, M. Mueller, B. Krewer, I. Schuberth, Angew. Chem. Int. Ed. (2010) 49:7336-7339]의 절차에 따라, (S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 51a를 HCl로 탈보호하고, 글루타로일 디클로라이드로 아실화하였다 (도 1). 정제용 HPLC 대신에, 반응 용매를 진공 하에 제거하고, 생성된 잔류물을 메탄올로 연화처리하여 1,5-비스((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)펜탄-1,5-디온 51b를 회백색 고체 (수율 51%)로서 수득하였다. Rf = 0.50 (에틸 아세테이트 / 석유 에테르 =2:1). NMR 및 MS 데이터는 보고된 값과 동일하였다.
[α]D 26 = -46.3° (c = 0.41, DMA).
빙조에서 냉각시킨 DMA (5 mL) 중 51b (650 mg, 1.15 mmol)의 용액에 DIPEA (0.40 mL, 2.31 mmol) 및 4-니트로페닐 클로로포르메이트 (302 mg, 1.50 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고 밤새 교반한 후, tert-부틸 메틸(2-(메틸아미노)에틸)카르바메이트 (652 mg, 3.00 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 7시간 동안 교반한 다음, 에틸 아세테이트와 차가운 묽은 수성 NaHCO3 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물에 이어서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 용매를 제거하고, 잔류물을 추가로 칼럼 크로마토그래피에 의해, 용리액으로서 에틸 아세테이트 및 석유 에테르의 구배 혼합물 (v/v 1:1 → 4:1)에 이어서 에틸 아세테이트 단독을 사용하여 정제하여 Boc (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 메틸(2-(메틸아미노)에틸)카르바메이트 51c를 회백색 고체 (359 mg, 40%)로서 수득하였다.
mp 157℃ (분해). [α]D 26 = -45.4° (c = 1.08, 에틸 아세테이트). 1H NMR (DMSO) (회전이성질체의 혼합물) δ 10.35 (s, 1H), 8.25 (s, 1H), 8.08 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.87-7.77 (m, 2H), 7.58 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.50-7.42 (m, 2H), 7.31 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 4.42 (t, J = 9.7 Hz, 1H), 4.36-4.31 (m, 2H), 4.25 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 4.19-4.13 (m, 2H), 4.05 (dd, J = 2.9, 11.0 Hz, 1H), 3.98 (dd, J = 2.6, 10.9 Hz, 1H), 3.92 (dd, J = 7.2, 10.9 Hz, 1H), 3.79 (dd, J = 8.5, 10.2 Hz, 1H), 3.69 (br s, 1H), 3.52-3.42 (m, 3H), 3.21-2.79 (m, 6H, 2NMe), 2.75-2.67 (m, 2H), 2.64-2.58 (m, 2H), 2.00-1.93 (m, 2H), 1.44-1.35 (m, 9H, But) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 777.2801 (M + H). C41H47Cl2N4O7 요구치 777.2816.
또한 동일한 크로마토그래피 분리로부터 비스-Boc 보호된 51d 및 탈보호된 회수된 출발 물질 51b를 백색 고체 (15 mg, 2%)로서 수득하였다. 51d (429 mg, 37%)를 회백색 고체로서 수득하였다.
[α]D 26 = -32.0° (c = 1.00, 에틸 아세테이트). 1H NMR (DMSO) (회전이성질체의 혼합물) δ 8.25 (s, 2H), 7.95 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.87-7.76 (m, 2H), 7.58 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.44 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 4.41 (t, J = 9.8 Hz, 2H), 4.32 (br s, 2H), 4.24 (d, J = 10.6 Hz, 2H), 4.06-4.03 (m, 2H), 3.98 (dd, J = 7.3, 10.8 Hz, 2H), 3.69 (br s, 2H), 3.52-3.43 (m, 6H), 3.21-2.79 (m, 12H, 4NMe), 2.75-2.69 (m, 2H), 2.66-2.58 (m, 2H), 1.99-1.95 (m, 2H), 1.44-1.35 (m, 18H, 2But) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 1013.3991 (M + Na). C51H64Cl2N6NaO10 요구치 1013.3991.
빙조에서 냉각시킨 DCM (3 mL) 중 51c (200 mg, 0.26 mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산, TFA (1.5 mL)를 적가하였다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 2시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 제거하여 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 메틸(2-(메틸아미노)에틸)카르바메이트 51e의 조 트리플루오로아세테이트 염을 회백색 고체로서 수득하였으며, 이를 직접 사용하였다.
1H NMR (DMSO) (회전이성질체의 혼합물) δ 10.36 (s, 1H), 8.64 (br s, 1H), 8.48 (br s, 1H), 8.35 (s, 1H), 8.08 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.97 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.94-7.88 (m, 1H), 7.78 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.61-7.57 (m, 2H), 7.51-7.45 (m, 2H), 7.34-7.30 (m, 1H), 4.43 (t, J = 9.8 Hz, 1H), 4.36-4.31 (m, 2H), 4.26 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 4.18-4.14 (m, 2H), 4.06 (dd, J = 2.9, 11.0 Hz, 1H), 4.00 (dd, J = 2.7, 10.8 Hz, 1H), 3.94 (dd, J = 7.5, 11.0 Hz, 1H), 3.89-3.84 (m, 1H), 3.79 (dd, J = 8.1, 10.8 Hz, 1H), 3.63 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 3.33-3.30 (m, 6H, 2NMe), 2.78-2.55 (m, 6H), 2.00-1.94 (m, 2H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 677.2306 (M + H). C36H39Cl2N4O5 요구치 677.2292.
-5℃에서, THF (4 mL) 중 51e의 용액에 한 방울의 DIPEA를 첨가한 다음, 브로모아세틸 브로마이드 (34 μL, 0.39 mmol)를 천천히 첨가하고, 이어서 나머지 DIPEA (448 μL, 전체 중 2.57 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 1시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 회전 증발기에 이어서 고진공 펌프에 의해 제거하였다. 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트와 함께 교반하고, 불용성 고체를 여과한 후, 여과물을 크로마토그래피 칼럼 상에 로딩하였다. 에틸 아세테이트 및 석유 에테르의 구배 혼합물 (v/v 1:4 → 1:1)을 용리액으로서 사용하여 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 2-(2-브로모-N-메틸아세트아미도)에틸(메틸)카르바메이트 51을 회백색 고체 (80 mg, 39%)로서 수득하였다.
mp 167-170℃. [α]D 26 = -64.0° (c = 0.25, 에틸 아세테이트). 1H NMR (DMSO) (회전이성질체의 혼합물) δ 10.39 (s, 1H), 8.25-8.20 (m, 1H), 8.08 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.96 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 7.4 Hz, 0.34H), 7.82 (d, J = 7.4 Hz, 0.66H), 7.78 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.58 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.51-7.45 (m, 2H), 7.31 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 4.42 (t, J = 9.6 Hz, 1H), 4.36-4.31 (m, 1H), 4.24 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.18-4.09 (m, 3H (CH2Br 포함)), 4.07-4.03 (dd, J = 2.8, 10.9 Hz, 1H), 4.00-3.97 (dd, J = 2.6, 10.8 Hz, 1H), 3.96-3.91 (m, 1H), 3.82-3.75 (m, 1H), 3.70-3.68 (m, 1H), 3.58-3.43 (m, 3H), 3.26-2.89 (m, 6H, 2NMe), 2.78-2.67 (m, 2H), 2.65-2.55 (m, 2H), 1.99-1.92 (m, 2H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 819.1316 (M + Na). C38H38BrCl2N4O6 요구치 819.1322.
실시예 2 (11S,11aS)-tert-부틸 8-(6-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-6-옥소헥실옥시)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 52
실시예 6의 실험 절차에 따라, 링커-약물 중간체 52를 제조하였다 (도 7 및 8).
HPLC: 96.7% 순도; mp 210℃ (분해); 1H NMR [(CD3)2SO] δ 10.03 (s, D2O로 교환가능함, 1 H), 8.23-8.11 (m, 2 H), 8.09 (d, J = 7.3 Hz, D2O로 교환가능함, 1 H), 7.85 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.80 (d, J = 8.3 Hz, D2O로 교환가능함, 1 H), 7.66 (d, J = 8.6 Hz, 2 H), 7.59-7.44 (m, 3 H), 7.38 (br t, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.04 (s, 1 H), 6.99 (s, 2 H), 6.69 (s, 1 H), 6.38 (br s, D2O로 교환가능함, 1 H), 5.99 (t, J = 5.5 Hz, D2O로 교환가능함, 1 H), 5.49-5.34 (m, 3 H, D2O 후에 d로서의 1 H로 감소, J = 9.5 Hz), 5.20 (s, 2 H), 4.44-4.30 (m, 2 H), 4.26-4.13 (m, 3 H), 4.10-3.91 (m, 3 H), 3.88-3.76 (m, 1 H), 3.79 (s, 3 H), 3.53-3.44 (m, 1 H), 3.41-3.20 (m, 물 피크에 의해 부분적으로 가려짐, 4 H), 3.09-2.88 (m, 2 H), 2.66-2.42 (m, DMSO 피크에 의해 부분적으로 가려짐, 2 H), 2.25-1.24 (m, 21 H), 1.31 (s, 9 H), 1.24-1.11 (m, 2 H), 0.86 (d, J = 6.8 Hz, 3 H), 0.82 (d, J = 6.7 Hz, 3 H). 분석 (C55H71ClN8O11H2O) 계산치: C, 61.53; H, 6.85; N, 10.44. 실측치: C, 61.39; H, 7.11; N, 10.15.
실시예 3 N-((R)-1-(클로로메틸)-3-(5-((R)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 53
아세트산 (50 mL)을 실온 (r.t.)에서 THF-H2O (150 mL/75 mL) 중 (R)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-(디페닐메틸렌아미노)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 53a (1.00 g, 2.01 mmol)의 교반 용액에 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다 (도 2). 19.5시간 후, THF를 진공 하에 제거하고, 혼합물을 EtOAc로 희석하고, 층을 잘 진탕시킨 다음, 분리하였다. 유기 층을 포화 수성 NaHCO3 (4 x)으로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 헥산:EtOAc 100:0 → 90:10을 사용하여 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (R)-tert-부틸 5-아미노-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 53b (382 mg, 57%)를 오렌지색 겔-유사 고체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 8.01 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.42-7.38 (m, 1H), 7.37 (br s, 1H), 7.22-7.18 (m, 1H), 5.91 (s, 2H), 4.08-3.91 (m, 4H), 3.66 (dd, J = 10.6, 8.2 Hz, 1H), 1.53 (s, 9H).
건조 DMA (10 mL) 중 53b (380 mg, 1.14 mmol), 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산산 (361 mg, 1.71 mmol), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDCI.HCl, 765 mg, 3.99 mmol) 및 파라-톨루엔술폰산 (TsOH, 49 mg, 0.285 mmol)의 혼합물을 질소 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 17시간 후, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 DCM:헥산 75:25 → 100:0에 이어서 DCM:MeOH 99:1 → 97:3을 사용하여 정제하고, 생성물-함유 분획을 증발 건조시켰다. 이어서, 생성된 물질을 EtOAc 중에 용해시키고, 유기 층을 H2O (2 x)로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 제거하여 (R)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 53c (282 mg, 47%)를 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 9.86 (s, 1H), 8.24 (br s, 1H), 7.99 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.55-7.51 (m, 1H), 7.43-7.39 (m, 1H), 7.01 (s, 2H), 4.21-4.11 (m, 2H), 4.08-4.00 (m, 2H), 3.87 (dd, J = 10.9, 6.9 Hz, 1H), 3.42 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.45 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.69-1.62 (m, 2H), 1.56-1.54 (m, 2H), 1.54 (s, 9H), 1.35-1.28 (m, 2H).
트리플루오로아세트산 (3.9 mL) 및 H2O (0.1 mL)를 0℃에서 DCM (4 mL) 중 53c (66 mg, 0.125 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 1시간 20분 동안 교반하고, 이어서 얼음 및 H2O를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 포화 수성 NaHCO3을 사용하여 pH 8로 염기성화시켰다. 유기 및 수성 층을 분리하고, 유기 층을 H2O (1 x)로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하여 (R)-N-(1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 53d (50 mg, 94%)를 황색 고체로서 수득하였으며, 이를 후속 단계에 정제 없이 사용하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 9.70 (s, 1H), 7.87 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.39 (ddd, J = 8.1, 6.9, 1.0 Hz, 1H), 7.21-7.15 (m, 2H), 7.01 (s, 2H), 5.92 (s, 1H), 4.02-3.96 (m, 1H), 3.85 (dd, J = 10.8, 3.5 Hz, 1H), 3.69 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 3.63-3.55 (m, 2H), 3.42 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.42 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.64 (td, J = 15.2, 7.6 Hz, 2H), 1.55 (td, J = 14.5, 7.2 Hz, 2H), 1.35-1.26 (m, 2H).
건조 DMA (2 mL) 중 53d (50 mg, 0.117 mmol), (R)-5-(1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜탄산 53e (56 mg, 0.161 mmol), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 EDCI.HCl (58 mg, 0.303 mmol) 및 TsOH (8 mg, 0.0465 mmol)의 혼합물을 질소 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 19시간 후, 혼합물을 H2O로 희석하였고, 고체가 용액으로부터 침전되었다. 수현탁액을 EtOAc (1 x), DCM (1 x), DCM:MeOH 95:5 (1 x)로 추출하고, 합한 유기부를 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 DCM:MeOH 100:0 → 94:6을 사용하여 정제하여 N-((S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 53 (15 mg, 17%, HPLC 순도: 82.3%)을 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 10.35 (s, 1H), 9.88 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.08 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.96 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.78 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.55 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.51-7.47 (m, 1H), 7.46-7.42 (m, 1H), 7.33-7.30 (m, 1H), 7.01 (s, 2H), 4.42-4.28 (m, 3H), 4.25-4.13 (m, 3H), 4.01 (ddd, J = 19.6, 10.9, 2.6 Hz, 2H), 3.90 (dd, J = 10.9, 7.5 Hz, 1H), 3.79 (dd, J = 10.8, 8.1 Hz, 1H), 3.43 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.77-2.57 (m, 4H), 2.46-2.43 (m, 2H), 2.01-1.96 (m, 2H), 1.70-1.62 (m, 2H), 1.60-1.53 (m, 2H), 1.36-1.28 (m, 2H). HRMS m/z 777.2186 [(M+Na)+ 계산치 C41H40Cl2N4NaO6 777.2217].
실시예 3a 1-((S)-5-아미노-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)펜탄-1,5-디온 53j
10% Pd/C (1.5 g)를 -20℃에서 질소 하에 THF-25% 수성 NH4HCO2 (60 mL/23 mL) 중 (S)-5-(5-(벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜탄산 57c (2.00 g, 4.57 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다 (도 3). 반응 혼합물을 -15 내지 -10℃에서 3.5시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 -20℃에서 밤새 유지하였다. 17.5시간 후, 혼합물을 -10℃로 가온하고, -10 내지 -5℃에서 5시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 0℃로 가온되도록 하고, 이 온도에서 30분 동안 교반한 다음, MeOH로 희석하고, 셀라이트를 통해 여과하고, 셀라이트 플러그를 MeOH (3 x)로 세척하고, 고체가 용액으로부터 침전될 때까지 용매를 진공 하에 농축시켰다. 이어서, 이것을 H2O (150 mL) 및 헥산 (150 mL)으로 희석하고, 실온에서 교반하면서 진한 HCl을 사용하여 pH 1로 산성화시켰다. 혼합물을 추가로 30분 동안 교반한 다음, 고체를 여과에 의해 수집하고, H2O 및 헥산으로 세척하고, 건조시켜 (S)-5-(1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜탄산 53h (1.43 g, 90%)를 베이지색 고체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 12.07 (br s, 1H), 10.35 (s, 1H), 8.08 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.77 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.50-7.46 (m, 1H), 7.33-7.29 (m, 1H), 4.30 (t, J = 10.4 Hz, 1H), 4.14-4.12 (m, 2H), 3.98 (dd, J = 10.9, 2.8 Hz, 1H), 3.78 (dd, J = 10.8, 7.8 Hz, 1H), 2.63-2.45 (m, 2H), 2.35 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.89-1.78 (m, 2H).
염화수소 기체 (HCl)를 실온에서 (3 A 분자체 상에서) 건조 디옥산 (12 mL) 중 (S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-(디페닐메틸렌아미노)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 53f (425 mg, 0.855 mmol)의 용액을 통해 버블링하였다 (도 3). 고체가 용액으로부터 침전되었고, 15분 후에 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 고체, (S)-1-(클로로메틸)-N-(디페닐메틸렌)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-아민 53g를 후속 단계에 정제 없이 사용하였다. 건조 DMA (10 mL)를 53g, (S)-5-(1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜탄산 53h (327 mg, 0.941 mmol), EDCI.HCl (573 mg, 2.99 mmol) 및 3A (옹스트롬) 분자체의 혼합물에 실온에서 질소 하에 첨가하였다. 2일 19.5시간 후, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 물질을 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 DCM:MeOH 100:0 → 90:10을 사용하여 정제한 다음, 이 물질을 헥산:DCM 100:0 → 50:50 → 0:100에 이어서 DCM:MeOH 99:1 → 98:2를 사용하여 다시 크로마토그래피하여, 1-((S)-1-(클로로메틸)-5-(디페닐메틸렌아미노)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)펜탄-1,5-디온 53i (193 mg, 53f로부터 2 단계에 걸쳐 31%)를 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 10.35 (s, 1H), 8.08 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.84 (t, J = 9.0 Hz, 2H), 7.79-7.74 (m, 3H), 7.62-7.57 (m, 2H), 7.54-7.46 (m, 4H), 7.40-7.36 (m, 1H), 7.33-7.29 (m, 1H), 7.27-7.22 (m, 3H), 7.09-7.08 (m, 2H), 4.34-4.26 (m, 2H), 4.22-4.12 (m, 4H), 4.01-3.97 (m, 2H), 3.83-3.76 (m, 2H), 2.69-2.50 (m, 4H), 1.93-1.86 (m, 2H). HRMS m/z 726.2264 [(M+H)+ 계산치 C44H38Cl2N3O3 726.2285].
아세트산 (HOAc, 8 mL)을 THF-H2O (24 mL/12 mL) 중 53i (190 mg, 0.261 mmol)의 교반 용액에 실온에서 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 19시간 후, 혼합물을 H2O로 희석하였고, 고체가 침전되었다. THF를 진공 하에 제거하고, 중성이 될 때까지 수현탁액을 DIPEA로 처리하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고, H2O로 세척하고, 건조시켰다. 고체를 DMF (1.5 mL) 중에 용해시키고, MeOH로 희석하여 고체의 침전을 일으켰다. 용매를 경사분리하고, 헥산:DCM 90:10을 고체에 첨가하고, 현탁액을 진탕시키고, 용매를 경사분리하였다. 이 과정을 헥산:EtOAc 90:10에 이어서 헥산 단독을 사용하여 반복하였다. 이어서, 고체를 DMF/THF 중에 용해시키고, 실리카 겔 상에 흡수시키고, 생성물을 DCM:MeOH 100:0 → 90:10을 사용하여 용리시켰다. 물질을 추가로 정제용 HPLC (칼럼: 시너지-맥스(Synergi-MAX) RP 4 μ, 21.20 x 250 mm; 유량: 13 mL/분; 이동상: 용매 A: H2O/TFA pH 2.5, 용매 B: MeCN/H2O 90:10; 방법: 등용매, 용매 A:용매 B 20:80, 15분; 파장: 254 nm, 330 nm)에 의해 정제하여 1-((S)-5-아미노-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)펜탄-1,5-디온 53j (30 mg, 22%, HPLC 순도: 87.9%)를 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 10.36 (s, 1H), 8.08 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.04-8.02 (m, 2H), 7.79-7.77 (m, 2H), 7.69 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.51-7.47 (m, 1H), 7.42 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.34-7.30 (m, 1H), 7.23 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 5.91 (s, 2H), 4.36-4.26 (m, 2H), 4.19-4.13 (m, 3H), 4.08-4.04 (m, 1H), 4.01-3.93 (m, 2H), 3.79 (dd, J = 10.7, 8.2 Hz, 1H), 3.70 (dd, J = 10.5, 8.9 Hz, 1H), 2.75-2.66 (m, 2H), 2.63-2.54 (m, 2H), 2.00-1.93 (m, 2H). HRMS m/z 584.1456 [(M+Na)+ 계산치 C31H29Cl2N3NaO3 584.1478]. [α]D 28 = -37.6o (c = 0.559, DMSO).
실시예 3b 1-((R)-5-아미노-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-((R)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)펜탄-1,5-디온 53p
트리에틸아민 (Et3N, 0.54 mL, 3.89 mmol) 및 트리플산 무수물 (0.60 mL, 3.60 mmol)을 0℃에서 DCM (100 mL) 중 (R)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 53k (1.00 g, 3.00 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다 (도 4). 반응물을 0℃에서 20분 동안 교반한 다음, H2O로 희석하고, 층을 분리하고, 수성 층을 DCM (1 x)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 헥산:EtOAc 100:0 → 96:4를 사용하여 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (R)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-(트리플루오로메틸술포닐옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 53l (1.30 g, 93%)을 오렌지색 발포성 고체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, CDCl3) 8.30 (br s, 1H), 8.03 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.76 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.62-7.58 (m, 1H), 7.53-7.49 (m, 1H), 4.32 (br s, 1H), 4.20-4.15 (m, 1H), 4.09-4.03 (m, 1H), 3.92 (dd, J = 11.2, 2.8 Hz, 1H), 3.54-3.49 (m, 1H), 1.61 (s, 9H).
건조 THF (60 mL, 탈기됨) 중 53l (1.30 g, 2.79 mmol)의 용액을 Cs2CO3 (1.27 g, 3.91 mmol), BINAP (209 mg, 0.336 mmol) 및 Pd(OAc)2 (63 mg, 0.281 mmol)의 혼합물에 질소 하에 첨가하였다. 이어서, 디페닐메탄이민 (0.56 mL, 3.34 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 질소 하에 밤새 환류하였다. 20시간 후, 반응 온도를 60-65℃로 감소시키고, 반응물을 이 온도에서 질소 하에 1일 동안 교반하였다. 추가의 THF (10 mL)를 첨가하고, 혼합물을 동일한 온도에서 추가로 1일 동안 교반한 후, 추가의 THF (25 mL)를 다시 혼합물에 첨가하였다. 추가로 1일 후, 추가량의 Pd(OAc)2 (19 mg, 0.0846 mmol), BINAP (52 mg, 0.0835 mmol) 및 THF (30 mL)를 첨가하고, 혼합물을 70℃에서 질소 하에 밤새 가열하였다. 추가로 28시간 후, 추가량의 Pd(OAc)2 (31 mg, 0.138 mmol), BINAP (104 mg, 0.167 mmol)를 다시 첨가하고, 반응을 22시간 동안 계속하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, DCM으로 희석하고, 셀라이트를 통해 여과하고, 세척물에 색상이 더 이상 없어질 때까지 셀라이트 플러그를 DCM으로 세척하고, 여과물을 진공 하에 증발시켰다. 헥산:DCM 100:0 → 50:50을 사용하여 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (R)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-(디페닐메틸렌아미노)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 53a (1.19 g, 85%)를 황색의 발포성 고체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 7.85 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.61-7.57 (m, 1H), 7.54-7.49 (m, 3H), 7.37-7.33 (m, 1H), 7.30-7.23 (m, 3H), 7.06 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 4.13-4.02 (m, 2H), 4.00-3.94 (m, 2H), 3.77 (dd, J = 10.9, 7.5 Hz, 1H), 1.46 (s, 9H), 1H는 관찰되지 않음. [α]D 27 = +101o (c = 1.04, DCM).
염화수소 기체 (HCl (g))를 실온에서 (3 A 분자체 상에서) 건조 디옥산 (10 mL) 중 53a (300 mg, 0.604 mmol)의 용액을 통해 버블링하였다. 10분 후, 고체가 용액으로부터 침전되었고, 20분 후에 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 고체, (R)-1-(클로로메틸)-N-(디페닐메틸렌)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-아민 53m을 후속 단계에 정제 없이 사용하였다.
탄소 상 팔라듐, 10% Pd/C (690 mg)를 -10℃에서 질소 하에 THF-25% 수성 NH4HCO2 (40 mL/16 mL) 중 (R)-5-(5-(벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜탄산 53n (1.38 g, 3.15 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 -10 내지 -5℃에서 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 -20℃에서 밤새 유지하였다. -20℃에서 15시간 후, 혼합물을 MeOH로 희석하고, 셀라이트를 통해 여과하고, 셀라이트 플러그를 MeOH로 세척하고, 고체가 용액으로부터 침전될 때까지 용매를 진공 하에 농축시켰다. 이어서, 현탁액을 H2O (130 mL) 및 헥산 (100 mL)으로 희석하고, 실온에서 교반하면서 진한 HCl을 사용하여 pH 1로 산성화시켰다. 혼합물을 30분 동안 교반하고, 정치시키고, 헥산을 경사분리하였다. 추가의 헥산 (120 mL)을 첨가하고, 혼합물을 추가로 30분 동안 교반하고, 헥산을 다시 경사분리하고, 이어서 고체를 여과에 의해 수집하고, H2O 및 헥산으로 세척하고, 건조시켜 (R)-5-(1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜탄산 53e (925 mg, 84%)를 베이지색 고체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 12.06 (br s, 1H), 10.35 (s, 1H), 8.08 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.77 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.50-7.46 (m, 1H), 7.33-7.29 (m, 1H), 4.30 (t, J = 10.5 Hz, 1H), 4.14-4.12 (m, 2H), 3.98 (dd, J = 10.9, 2.8 Hz, 1H), 3.78 (dd, J = 10.8, 7.9 Hz, 1H), 2.63-2.45 (m, 2H), 2.35 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.89-1.78 (m, 2H).
건조 DMA (8 mL)를 실온에서 질소 하에 이전 반응으로부터의 53m, 53e (241 mg, 0.693 mmol), EDCI.HCl (404 mg, 2.11 mmol) 및 3A 분자체의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 19.5시간 후, 혼합물을 H2O로 희석하고, 생성된 현탁액을 여과하였다. 수성 여과물을 EtOAc (3 x)로 추출하고, 여과된 고체를 EtOAc/MeOH 중에 용해시키고, EtOAc 추출물과 합하였다. 합한 유기 용액을 실리카 겔 상에 흡수시키고, 생성물을 헥산:DCM 50:50 → 0:100에 이어서 DCM:MeOH 99.5:0.5 → 97:3을 사용하여 용리시켜 1-((R)-1-(클로로메틸)-5-(디페닐메틸렌아미노)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-((R)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)펜탄-1,5-디온 53o (155 mg, 53a로부터 2 단계에 걸쳐 35%)를 암황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 10.35 (s, 1H), 8.08 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.85 (t, J = 8.9 Hz, 2H), 7.79-7.74 (m, 3H), 7.62-7.57 (m, 2H), 7.54-7.46 (m, 4H), 7.40-7.36 (m, 1H), 7.33-7.29 (m, 1H), 7.27-7.22 (m, 3H), 7.09-7.08 (m, 2H), 4.34-4.27 (m, 2H), 4.22-4.11 (m, 4H), 4.02-3.97 (m, 2H), 3.83-3.76 (m, 2H), 2.69-2.51 (m, 4H), 1.93-1.85 (m, 2H), NMR 스펙트럼은 53i의 것과 매칭됨. HRMS m/z 748.2077 [(M+Na)+ 계산치 C44H37Cl2N3NaO3 748.2104].
아세트산 (HOAc, 4 mL)을 THF-H2O (12 mL/6 mL) 중 53o (80 mg, 0.110 mmol)의 교반 용액에 실온에서 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 18시간 후, 혼합물을 H2O로 희석하였고, 고체가 침전되었다. THF를 진공 하에 제거하고, pH 8이 될 때까지 수현탁액을 DIPEA로 처리하였고, 추가의 고체의 침전이 일어났다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 건조시키고, 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 DCM:MeOH 100:0 → 97:3을 사용하여 정제하여 1-((R)-5-아미노-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-((R)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)펜탄-1,5-디온 53p (20 mg, 32%)를 황갈색 고체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 10.36 (s, 1H), 8.08 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.04-8.02 (m, 2H), 7.79-7.77 (m, 2H), 7.69 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.51-7.47 (m, 1H), 7.42 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.34-7.30 (m, 1H), 7.23 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 5.91 (s, 2H), 4.36-4.26 (m, 2H), 4.19-4.13 (m, 3H), 4.08-4.04 (m, 1H), 4.01-3.93 (m, 2H), 3.79 (dd, J = 10.7, 8.3 Hz, 1H), 3.71 (dd, J = 10.5, 8.9 Hz, 1H), 2.75-2.66 (m, 2H), 2.63-2.53 (m, 2H), 2.00-1.93 (m, 2H), NMR 스펙트럼은 53j의 것과 매칭됨.
실시예 4 N-(4-(((S)-1-(클로로메틸)-3-(6-((S)-7-메톡시-5-옥소-2,3,5,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일옥시)헥사노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일옥시)메틸)페닐)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 54
무수 THF (140 mL) 중 (S)-(2-아미노-4-히드록시-5-메톡시페닐)(2-(히드록시메틸)피롤리딘-1-일)메타논 54a (7.6 g, 28.6 mmol) (문헌 [Tercel et al (2003) J. Med. Chem 46:2132-2151]의 절차에 의해 제조), 및 디-t-부틸 디카르보네이트 (12.48 g, 57.2 mmol)의 혼합물을 질소 분위기에서 환류 하에 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 2N NaOH (57.2 mL, 114 mmol) 및 MeOH (70 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 35-40℃ (조 온도)에서 감압 하에 증발시켰다. 빙수 (250 mL)를 첨가하고, 0℃에서 pH를 8-9로 조정하였다. 혼합물을 석유 에테르-에틸 아세테이트 (20:1) (2x400 mL)와 함께 실온에서 15분 동안 교반하였다. 유기 층을 분리하고, 버렸다. 수성 층을 DCM (4x300 mL)으로 추출하고, 합한 추출물을 건조 (MgSO4)시키고 감압 하에 증발시켜 (S)-tert-부틸 5-히드록시-2-(2-(히드록시메틸)피롤리딘-1-카르보닐)-4-메톡시페닐카르바메이트 54b를 분홍색-백색 고체 (9.36 g, 89%)로서 수득하였다.
mp 154-156℃; 1H NMR [(CD3)2SO] δ 9.51 (s, 1 H), 8.90 (s, 1 H), 7.27 (s, 1 H), 6.91 (s, 1 H), 4.73 (t, J = 5.8 Hz, 1 H), 4.16-4.02 (m, 1 H), 3.73 (s, 3 H), 3.64-3.34 (m, 4 H), 1.99-1.60 (m, 4 H), 1.43 (s, 9 H). 분석 (C18H26N2O6) 계산치: C, 59.00; H, 7.15; N, 7.65. 실측치: C, 58.94; H, 7.31; N, 7.39.
건조 DMA (7 mL) 중 54b (2.88 g, 7.87 mmol) 및 2,2,2-트리클로로에틸 6-브로모헥사노에이트 (3.86 g, 11.8 mmol) (문헌 [Tercel et al (2003) J. Med. Chem 46:2132-2151]의 절차에 의해 제조)의 용액에 무수 K2CO3 (2.61 g, 18.9 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 68시간 동안 교반하였다. 이를 빙수 (600 mL)에 붓고, 생성물을 에틸 아세테이트 (600 mL)로 추출하였다. 추출물을 차가운 (0℃) 수성 2N Na2CO3 용액 (2x400 mL) 및 물 (400 mL)로 연속적으로 세척한 다음, 건조시켰다 (MgSO4). 용매를 증발시켜 갈색 오일을 수득하였으며, 이를 SiO2 칼럼 크로마토그래피 (DCM-에틸 아세테이트 = 2:1)에 의해 정제하여 순수한 (S)-2,2,2-트리클로로에틸 6-(5-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-(2-(히드록시메틸)피롤리딘-1-카르보닐)-2-메톡시페녹시)헥사노에이트 54c (3.62 g, 76%)를 연황색 발포체로서 수득하였다.
mp 36-39℃; 1H NMR [(CD3)2SO] δ 9.90 (s, 1 H), 7.33 (s, 1 H), 6.93 (s, 1 H), 4.89 (s, 2 H), 4.74 (t, J = 5.8 Hz, 1 H), 4.17-4.02 (m, 1 H), 3.94 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 3.73 (s, 3 H), 3.63-3.26 (m, 4 H), 2.55-2.46 (m, 2 H, DMSO 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.00-1.55 (m, 8 H), 1.53-1.36 (m, 11 H). 분석 (C26H37N2O8) 계산치: C, 51.03; H, 6.09; N, 4.58. 실측치: C, 51.33; H, 6.21; N, 4.35.
건조 DCM (12 mL) 중 54c (3.62 g, 5.92 mmol)의 용액에 데스-마르틴 퍼아이오디난 (DMP, 1,1,1-트리아세톡시-1,1-디히드로-1,2-벤즈아이오독솔-3(1H)-온, CAS Reg. No. 87413-09-0) (3.27 g, 7.70 mmol)을 실온에서 15분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 45분 동안 교반하였다. 이를 DCM (800 mL)으로 희석하고, 10% Na2S2O3 (100 mL), 차가운 (0℃) NaHCO3 용액 (400 mL), 및 물 (300 mL)로 연속적으로 세척한 다음, 건조시켰다 (MgSO4). 용매를 증발시켜 호박색 고체를 수득하였으며, 이를 SiO2 칼럼 크로마토그래피 (석유 에테르-에틸 아세테이트 = 3:4)에 의해 정제하여 (S)-tert-부틸 11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-8-(6-옥소-6-(2,2,2-트리클로로에톡시)헥실옥시)-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 54d (2.61g, 72%)를 점착성 발포체로서 수득하였다.
1H NMR [(CD3)2SO] δ 7.03 (s, 1 H), 6.67 (s, 1 H), 6.38 (s, 1 H), 5.41 (s, 1 H), 4.89 (s, 2 H), 4.06-3.87 (m, 2 H), 3.79 (s, 3 H), 3.52-3.43 (m, 1 H), 3.42-3.28 (m, 1 H, 물 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 3.27-3.20 (m, 1 H), 2.08-1.82 (m, 5 H), 1.81-1.71 (m, 2 H), 1.71-1.61 (m, 2 H), 1.53-1.40 (m, 3 H), 1.31 (s, 9 H). HRMS (ESI) m/z 계산치 C26H35Cl3N2NaO8: 631.1351, 실측치: 631.1361 [MNa+].
질소 하에 아세톤-물 (3:2) (100 mL) 중 54d (1.80 g, 2.95 mmol)의 교반 용액에 Zn (7.72 g, 118 mmol) 및 NH4Cl (6.32 g, 118 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 28시간 동안 교반하였다. 상청액을 경사분리하고, Zn 잔류물을 수성 NaHCO3 (3x100 mL)으로 세척하였다. 세척물 및 상청액을 합하고, DCM (300 mL에 이어서 2x100 mL)과 함께 교반하였다. DCM 층을 분리하고, 버렸다. 수성 층을 0℃에서 진한 HCl을 사용하여 pH<1로 산성화시켰다. 생성물을 DCM (400 mL; 2x200 mL) 내로 추출하고, 이를 건조 (MgSO4)시키고, 증발시켜 (S)-tert-부틸 8-(5-히드로퍼옥시헥스-5-에닐옥시)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 54e (1.34 g, 95%)를 무색 발포체로서 수득하였다.
mp 65-67℃; 1H NMR [(CD3)2SO] δ 11.99 (br s, 1 H), 7.04 (s, 1 H), 6.67 (s, 1 H), 6.37 (br s, 1 H), 5.41 (d, J = 9.4 Hz, 1 H), 4.06-3.87 (m, 2 H), 3.79 (s, 3 H), 3.53-3.19 (m, 3 H, 물 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.22 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 2.09-1.81 (m, 4 H), 1.80-1.67 (m, 2 H), 1.62-1.49 (m, 2 H), 1.49-1.37 (m, 2 H), 1.31 (s, 9 H). 분석 (C24H34N2O8·¼H2O) 계산치: C, 59.68; H, 7.20; N, 5.80. 실측치: C, 59.37; H, 7.20; N, 5.62.
DMA (7 mL) 중 54e (1.16 g, 2.42 mmol), (S)-1-(클로로메틸)-5-(4-니트로벤질옥시)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌 54f (893 mg, 2.42 mmol), EDCI.HCl (1.39 g, 7.26 mmol), 및 무수 TsOH (83 mg, 0.48 mmol)의 혼합물을 질소 분위기 하에 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 물 (120 mL)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과하고, 물 (4x40 mL), 0.01% NH4OH (4x40 mL), 및 석유 에테르 (4x40 mL)로 연속적으로 세척하고, 이어서 건조시켜 N-Boc-(S)-8-(6-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-니트로벤질옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-6-옥소헥실옥시)-11-히드록시-7-메톡시-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-5(10H)-온 54g (1.71 g, 85%)를 연황색 고체로서 수득하였다.
mp 130-133℃; 1H NMR [(CD3)2SO] δ 8.30 (d, J = 8.8 Hz, 2 H), 8.23 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 8.18 (s, 1 H), 7.92-7.82 (m, 3 H), 7.57 (td, J = 8.2, 1.1 Hz, 1 H), 7.43 (t, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.03 (s, 1 H), 6.69 (s, 1 H), 6.39 (br s, 1 H), 5.51-5.35 (m, 3 H), 4.36 (t, J = 9.5 Hz, 1 H), 4.28-4.15 (m, 2 H), 4.10-3.90 (m, 3 H), 3.85 (dd, J = 11.1, 7.8 Hz, 1 H), 3.79 (s, 3 H), 3.52-3.42 (m, 1 H), 3.42-3.20 (m, 2H, 물 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.68-2.50 (m, 2 H, DMSO 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.11-1.95 (m, 1 H), 1.95-1.75 (m, 5 H), 1.75-1.61 (m, 2 H), 1.59-1.45 (m, 2 H), 1.31 (s, 9 H). 분석 (C44H49ClN4O10) 계산치: C, 63.72; H, 5.96; N, 6.76. 실측치: C, 63.33; H, 5.97; N, 6.92.
질소 하에 THF (90 mL), 아세톤 (70 mL), 및 물 (40 mL)의 혼합물 중 교반 용액 54g (1.70 g, 2.05 mmol)에 Zn (2.68 g, 41.0 mmol) 및 NH4Cl (4.39 g, 82.0 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 45분 동안 교반한 다음, THF로 수회 세척하면서 셀라이트를 통해 여과하였다. 여과물을 실온에서 감압 하에 약 60 mL로 농축시켰다. 0.01% NH4OH의 용액 (400 mL)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 고체를 수집하고, 0.01% NH4OH (3x100 mL), 물 (3x100 mL), 및 석유 에테르 (3x100 mL)로 연속적으로 세척하였다. 고체를 건조시켜 54g의 아닐리노 유도체 (1.16 g, 100%)를 수득하였으며, 이를 건조 DMA (2 mL) 중 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산산 (253 mg, 1.20 mmol), EDCI.HCl (576 mg, 3.00 mmol) 및 무수 TsOH (34.4 mg, 0.20 mmol)로 처리하였다. 혼합물을 실온에서 질소 하에 17시간 동안 교반하였다. NaHCO3 용액 (50 mL)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 고체를 수집하고, 물로 세척하고, 건조시키고, 실리카 칼럼 크로마토그래피 (DCM-에틸 아세테이트 = 1:1)에 의해 정제하여 순수한 (S)-tert-부틸 8-(6-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)벤질옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-6-옥소헥실옥시)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 54h (194 mg, 33%)를 황색 고체로서 수득하였다.
mp 128-132℃; 1H NMR [(CD3)2SO] δ 9.91 (s, 1 H), 8.20-8.11 (m, 2 H), 7.84 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.62 (d, J = 8.5 Hz, 2 H), 7.54 (br t, J = 8.1 Hz, 1 H), 7.47 (d, J = 8.5 Hz, 2 H), 7.38 (br t, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.04 (s, 1 H), 7.00 (s, 2 H), 6.69 (s, 1 H), 6.38 (br s, 1 H), 5.45-5.37 (m, 1 H), 5.20 (s, 2 H), 4.36 (t, J = 10.2 Hz, 1 H), 4.26-4.13 (m, 2 H), 4.10-3.92 (m, 3 H), 3.88-3.79 (m, 1 H), 3.79 (s, 3 H), 3.52-3.30 (m, 4 H), 3.24 (br t, J = 8.9 Hz, 1 H), 2.66-2.50 (m, 2H, DMSO 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.28 (t, J = 7.3 Hz, 2 H), 2.08-1.95 (m, 1 H), 1.95-1.76 (m, 5 H), 1.76-1.64 (m, 2 H), 1.64-1.20 (m, 8 H), 1.31 (s, 9 H). 분석 (C54H62ClN5O11) 계산치: C, 65.35; H, 6.30; N, 7.06. 실측치: C, 65.08; H, 6.39; N, 6.67.
질소 분위기 하에 -10 내지 -11℃에서 교반된 DCM (15 mL) 중 N-(4-(((S)-1-(클로로메틸)-3-(6-((S)-7-메톡시-5-옥소-2,3,5,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일옥시)헥사노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일옥시)메틸)페닐)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 54h (204 mg, 0.21 mmol)의 용액에 2.5% 물을 함유하는 TFA (15 mL)를 (30분에 걸쳐) 적가하였다. 첨가한 후, 혼합물을 이 온도에서 추가로 4시간 동안 교반하였다. 혼합물을 얼음, DCM, 및 충분한 포화 NaHCO3 용액의 혼합물에 부어 0℃에서 pH 7-8을 얻었다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. DCM 층을 분리하고, 추가의 수성 NaHCO3 및 물로 세척한 다음, 건조시켰다 (MgSO4). 용매를 25℃ (조 온도)에서 증발시켜 황색 고체 (172 mg, 94% 물질 회수)를 수득하였다. 이 조 생성물을 정제용 HPLC (시너지-맥스 RP 칼럼) (30% 포름산암모늄 완충제 pH = 3.5; 70% 수성 (10%) 아세토니트릴로 용리; 유량: 13 mL/분)에 의해 정제하여 54 (30 mg, 16%)를 수득하였다.
HPLC: 98.8% 순도; mp 190℃ (분해); [α20 D +320o (c 0.100, DCM); 1H NMR [CDCl3] δ 8.29 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 8.18 (s, 1 H), 7.69-7.63 (m, 2 H), 7.61-7.44 (m, 6 H), 7.37 (br t, J = 7.3 Hz, 2 H), 6.82 (s, 1 H), 6.66 (s, 2 H), 5.24 (s, 2 H), 4.34-4.19 (m, 2 H), 4.19-4.00 (m, 3 H), 3.99-3.92 (m, 1 H), 3.89 (s, 3 H), 3.86-3.78 (m, 1 H), 3.76-3.70 (m, 1 H), 3.63-3.49 (m, 3H), 3.42 (t, J = 10.8 Hz, 1 H), 2.68-2.47 (m, 2 H), 2.40-2.27 (m, 3 H), 2.12-1.92 (m, 5 H), 1.92-1.82 (m, 2 H), 1.82-1.71 (m, 2 H), 1.71-1.54 (m, 4 H, 물 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 1.43-1.32 (m, 2 H). HRMS (ESI) m/z 계산치 C49H52ClN5NaO8: 896.3397, 실측치: 896.3375 [MNa+].
실시예 5 N-((S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일옥시)메틸)페닐아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 55
탄산칼륨, K2CO3 (2.50 g, 18.1 mmol)을 실온에서 DMF (12 mL) 중 (S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 51a (2.01 g, 6.02 mmol) 및 1-(브로모메틸)-4-니트로벤젠 (5.20 g, 24.1 mmol)의 혼합물에 첨가하였다 (도 6). 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, EtOAc 및 H2O로 희석하고, 층을 분리하였다. 유기 층을 H2O (3x), 염수 (1x)로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 헥산:EtOAc 100:0 → 96:4를 사용하여 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 2회 정제하여 (S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-(4-니트로벤질옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 55a (2.17 g, 77%)를 담황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, CDCl3) 8.31-8.27 (m, 3H), 7.85 (br s, 1H), 7.72 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.67 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.54 (ddd, J = 8.2, 6.8, 1.2 Hz, 1H), 7.38 (ddd, J = 8.2, 6.8, 1.1 Hz, 1H), 4.28-4.25 (m, 1H), 4.16-4.10 (m, 1H), 4.02-3.92 (m, 2H), 3.45 (t, J = 10.6 Hz, 1H), 1.60 (s, 9H). HRMS m/z 491.1338 [(M+Na)+ 계산치 C25H25ClN2NaO5 491.1344].
환원 방법 A: 55a (1.53 g, 3.26 mmol)를 THF-아세톤 (75 mL/60 mL) 중에 용해시켰다. 55a가 용해되면 H2O (30 mL)를 첨가하였다. NH4Cl (10.5 g, 196 mmol) 및 Zn 분말 (6.40 g, 97.9 mmol)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 질소 하에 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 셀라이트 플러그를 DCM으로 세척하고, 합한 여과물을 H2O (1x)로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하여 화합물 55b를 오렌지색 고체로서 수득하였다. 조 생성물을 후속 단계에 정제 없이 사용하였다.
환원 방법 B: 수은-알루미늄 아말감을 THF-MeOH-H2O (150 mL/50 mL/20 mL) 중 55a의 용액에 첨가하였다. 15분 후, 반응 혼합물을 DCM으로 희석하고, 셀라이트를 통해 여과하고, 셀라이트 플러그를 DCM으로 세척하였다. 유기부를 H2O로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하여 (S)-tert-부틸 5-(4-아미노벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 55b를 오렌지색 고체로서 수득하였다. 생성물을 후속 단계에 정제 없이 사용하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 8.06 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.53-7.49 (m, 1H), 7.34-7.30 (m, 1H), 7.19 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.60 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.16 (s, 2H), 5.04 (d, J = 1.3 Hz, 2H), 4.18-4.05 (m, 3H), 4.00-3.97 (m, 1H), 3.81 (dd, J = 10.9, 6.9 Hz, 1H), 1.56 (s, 9H), 1H는 관찰되지 않음.
DMA (15 mL) 중 (S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-5-우레이도펜탄산 (Fmoc-L-시트룰린, 3.26 g, 8.20 mmol) 및 2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디히드로퀴놀린 (EEDQ, CAS Reg. No. 16357-59-8, 3.12 g, 12.6 mmol)의 혼합물을 실온에서 질소 하에 20분 동안 교반하였다. 이어서, DMA (15 mL) 중 55b (2.77 g, 6.31 mmol)의 용액을 첨가하고, 생성된 혼합물을 질소로 플러싱하고, 밤새 교반하면서 방치하였다. 16시간 후, 반응 혼합물을 얼음에 붓고, H2O로 희석하였다. 생성된 침전물을 여과하고, H2O로 세척하고, DCM/MeOH 중에 용해시키고, 건조시키고 (Na2SO4), 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 연화처리에 의해 정제하였고, 여기서 생성물을 헥산:EtOAc 94:6으로 침전시키고, 용매를 경사분리하고, 헥산:EtOAc 90:10에 이어서 헥산:EtOAc 95:5를 사용하여 과정을 반복하였다. 이어서, 물질을 DCM:MeOH 100:0 → 95:5를 사용하여 실리카 겔 상에서 칼럼 처리하여 (S)-tert-부틸 5-(4-((S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 55c (4.23 g, 55a로부터 2 단계에 걸쳐 79%, HPLC 순도: 95.3%)를 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 10.12 (s, 1H), 8.12 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.82 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.77-7.74 (m, 2H), 7.70-7.67 (m, 3H), 7.55-7.49 (m, 3H), 7.42 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.37-7.31 (m, 3H), 6.00 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.22 (s, 2H), 4.29-4.27 (m, 2H), 4.24-4.05 (m, 6H), 4.01-3.98 (m, 1H), 3.82 (dd, J = 10.9, 7.0 Hz, 1H), 3.09-2.92 (m, 2H), 1.74-1.35 (m, 4H), 1.55 (s, 9H). HRMS m/z 840.3101 [(M+Na)+ 계산치 C46H48ClN5NaO7 840.3134].
피페리딘 (1.5 mL, 10% v/v)을 실온에서 DMF (15 mL) 중 55c (4.18 g, 5.11 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 헥산:EtOAc 90:10 (100 mL)으로 희석하고, 10분 동안 교반하였다. 2개의 층이 형성되었고, 상부 층을 경사분리하였다. 남아 있는 하부 층의 용매를 진공 하에 제거하였다. DCM:MeOH 100:0 → 85:15를 사용하여 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (S)-tert-부틸 5-(4-((S)-2-아미노-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 55d (2.97 g, 97%, HPLC 순도: 99.1%)를 황색 분말로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 9.93 (br s, 1H), 8.12 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.55-7.48 (m, 3H), 7.37-7.33 (m, 1H), 5.94 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 5.37 (s, 2H), 5.22 (s, 2H), 4.19-4.05 (m, 4H), 4.01-3.98 (m, 1H), 3.82 (dd, J = 10.9, 7.0 Hz, 1H), 3.04-2.91 (m, 2H), 1.71-1.36 (m, 4H), 1.55 (s, 9H), 3H는 관찰되지 않음. HRMS m/z 596.2627 [(M+H)+ 계산치 C31H39ClN5O5 596.2634].
DMA (15 mL) 중 (S)-2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-3-메틸부타노에이트 (Fmoc-Val-OSu, 3.19 g, 7.31 mmol) 및 55d (2.91 g, 4.87 mmol)의 혼합물을 실온에서 질소 하에 밤새 교반하였다. 20시간 후, 헥산:EtOAc 80:20 (150 mL)을 첨가하고, 현탁액을 30분 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 경사분리하여 고체를 남겼다. 헥산:EtOAc 75:25를 사용하여 이를 수회 반복하였다. 이어서, 고체를 DCM:MeOH 75:25 중에 현탁시키고, 현탁액을 초음파처리하였다. 현탁액을 헥산 (200 mL)으로 희석하고, 고체를 여과하고, 헥산:EtOAc 65:35로 세척하고 건조시켜 (S)-tert-부틸 5-(4-((S)-2-((S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 55e (3.79 g, 85%, HPLC 순도: 92.4%)를 오렌지색 분말로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 10.12 (s, 1H), 8.14-8.12 (m, 2H), 7.89 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.82 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.75 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.66 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.55-7.48 (m, 3H), 7.45-7.30 (m, 6H), 5.98 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.22 (s, 2H), 4.45 (dd, J = 13.6, 7.7 Hz, 1H), 4.36-4.04 (m, 6H), 4.02-3.90 (m, 2H), 3.82 (dd, J = 10.8, 6.9 Hz, 1H), 3.08-2.91 (m, 2H), 2.05-1.96 (m, 1H), 1.76-1.34 (m, 4H), 1.55 (s, 9H), 0.89 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.86 (d, J = 6.8 Hz, 3H). HRMS m/z 939.3808 [(M+Na)+ 계산치 C51H57ClN6NaO8 939.3819].
Boc 제거 방법 A: TFA (9.5 mL)를 DCM (19 mL) 중 55e (685 mg, 0.747 mmol)의 현탁액에 0℃에서 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 1시간 45분 동안 교반하였다. 이어서, 수성 NH3 (0.25%, 100 mL)을 0℃에서 혼합물에 조금씩 첨가한 다음, pH 9-10이 될 때까지 진한 수성 NH3을 첨가하였다. 이어서, 헥산:EtOAc 90:10을 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 40분 동안 교반하고, 현탁액을 초음파처리하고, 침전물을 여과에 의해 수집하고, H2O, H2O:MeOH 80:20, 헥산:EtOAc 60:40, 헥산:Et2O 50:50, 헥산으로 세척하고, 건조시켜 (9H-플루오렌-9-일)메틸 (S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일옥시)메틸)페닐아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일카르바메이트 55f를 갈색 고체 (364 mg, 60%)로서 수득하였다.
Boc 제거 방법 B: BF3.Et2O (0.07 mL, 0.552 mmol)를 0℃에서 DCM (40 mL) 중 55e (0.106 g, 0.116 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 1시간 50분 후, 단지 약간의 DCM만이 남을 때까지 현탁액을 실온에서 진공 하에 농축시켰다. 침전물이 용해될 때까지 약간의 MeOH를 첨가하고, 이어서 용액을 H2O로 희석하였다. 고체가 침전되었고, H2O를 경사분리하였다. 헥산:EtOAc 90:10 (20 mL)을 첨가하고, 현탁액을 초음파처리한 후, 고체를 여과에 의해 수집하였다. 고체를 H2O 및 헥산으로 세척하고, 건조시켜 (9H-플루오렌-9-일)메틸 (S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일옥시)메틸)페닐아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일카르바메이트 55f (66 mg, 70%)를 갈색 고체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 10.10 (s, 1H), 8.12 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.00 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.74 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 7.64 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.58 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.46-7.37 (m, 5H), 7.34-7.30 (m, 2H), 7.13-7.09 (m, 1H), 6.55 (s, 1H), 5.97 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.17 (s, 2H), 4.43 (dd, J = 13.0, 7.5 Hz, 1H), 4.34-4.21 (m, 3H), 3.95-3.90 (m, 2H), 3.83 (dd, J = 10.7, 3.4 Hz, 1H), 3.70-3.66 (m, 1H), 3.61-3.51 (m, 2H), 3.08-2.90 (m, 2H), 2.04-1.96 (m, 1H), 1.76-1.33 (m, 4H), 0.89 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.86 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 2H는 관찰되지 않음. HRMS m/z 839.3266 [(M+Na)+ 계산치 C46H49ClN6NaO6 839.3294].
DMA (10 mL) 중 55f (485 mg, 0.593 mmol), 53h (206 mg, 0.593 mmol), EDCI.HCl (293 mg, 1.48 mmol) 및 TsOH (26 mg, 0.151 mmol)의 혼합물을 질소로 플러싱하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 19.5시간 후, 반응 혼합물을 H2O로 희석하고, 생성된 고체를 여과에 의해 수집하고, H2O 및 헥산:EtOAc 50:50으로 세척하였다. DCM:MeOH 100:0 → 90:10을 사용하여 실리카 겔의 플러그 상에서 여과 칼럼 크로마토그래피하여 (9H-플루오렌-9-일)메틸 (S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일옥시)메틸)페닐아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일카르바메이트 55g (391 mg)를 수득하였고, 이를 후속 단계에 조 물질로 사용하였다.
HRMS m/z 1144.4169 [(M-H)+ 계산치 C64H64Cl2N7O9 1144.4148].
피페리딘 (0.39 mL, 3.95 mmol)을 실온에서 DMF (6 mL) 중 55g (910 mg, 0.793 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 10분 후, 혼합물을 진공 하에 농축시켰다. DCM:MeOH 95:5 → 85:15를 사용하여 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하고, 이어서 정제용 HPLC (칼럼: 시너지-맥스 RP 4 μ, 21.20 x 250 mm; 유량: 12 mL/분; 이동상: 용매 A: H2O/TFA pH 2.47, 용매 B: MeCN/H2O 90:10; 방법: 구배, 용매 A:용매 B 60:40 → 22:78 → 60:40, 24분; 파장: 254 nm, 330 nm)에 의해 추가로 정제하여 (S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-N-(4-(((S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일옥시)메틸)페닐)-5-우레이도펜탄아미드 트리플루오로아세테이트 55h (75 mg, 9%)를 크림색 고체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 10.35 (s, 1H), 10.24 (s, 1H), 8.69 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.20 (s, 1H), 8.15 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.09-8.02 (m, 4H), 7.86 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.78 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.57-7.47 (m, 3H), 7.40-7.37 (m, 1H), 7.34-7.30 (m, 1H), 6.04 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 5.48 (br s, 2H), 5.22 (s, 2H), 4.57-4.51 (m, 1H), 4.40-4.33 (m, 2H), 4.25-4.14 (m, 4H), 4.03-3.98 (m, 2H), 3.85 (dd, J = 10.7, 7.6 Hz, 1H), 3.79 (dd, J = 10.3, 8.6 Hz, 1H), 3.66 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.09-2.97 (m, 2H), 2.75-2.57 (m, 4H), 2.11-2.06 (m, 1H), 2.01-1.96 (m, 2H), 1.78-1.70 (m, 1H), 1.68-1.58 (m, 1H), 1.53-1.40 (m, 2H), 0.95 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.94 (d, J = 6.8 Hz, 3H). HRMS m/z 924.3672 [(M+H)+ 계산치 C49H56Cl2N7O7 924.3613].
DMF (3 mL) 중 디이소프로필에틸아민, DIPEA (10 mg, 0.0774 mmol)를 55h (74 mg, 0.0712 mmol) 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (33 mg, 0.107 mmol)에 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 질소 하에 교반하였다. 5.5시간 후, 추가량의 DIPEA (0.9 mg, 0.00693 mmol) 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (4.4 mg, 0.0143 mmol)를 첨가하였다. 추가로 1시간 후, 추가량의 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (8 mg, 0.0259 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 -20℃에서 밤새 유지하였다. 15시간 후, 혼합물을 실온으로 가온하고, 추가량의 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (4.4 mg, 0.0143 mmol)를 첨가하였다. 추가로 1시간 후, 추가량의 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (7.5 mg, 0.0243 mmol)를 첨가하였다. 1시간 후, 헥산:EtOAc 95:5 (25 mL)를 첨가하고, 이어서 DCM (5 mL)을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 교반하였다. 이 기간에 걸쳐 고체가 용액으로부터 침전되었다. 혼합물을 정치시켜 침강시키고, 이어서 용매를 경사분리하였다. 이어서, 헥산:DCM 95:5를 첨가하고, 현탁액을 교반하고, 정치시켜 침강시키고, 용매를 경사분리하고, 고체를 건조시켰다. 정제용 HPLC (칼럼: 시너지-맥스 RP 4 μ, 21.20 x 250 mm; 유량: 13 mL/분; 이동상: 용매 A: H2O/TFA pH 2.47, 용매 B: MeCN/H2O 90:10; 방법: 등용매, 용매 A:용매 B 35:65, 35분; 파장: 254 nm, 330 nm)에 의해 정제하여 N-((S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일옥시)메틸)페닐아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 55 (13.7 mg, 17%, HPLC 순도: 92.5%)를 연황색 분말로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 10.35 (s, 1H), 10.02 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 8.15 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.08 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 8.02 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.81-7.77 (m, 2H), 7.66 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.57-7.53 (m, 1H), 7.50-7.47 (m, 3H), 7.40-7.36 (m, 1H), 7.33-7.30 (m, 1H), 6.99 (s, 2H), 5.97 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 5.40 (br s, 2H), 5.21 (s, 2H), 4.42-4.32 (m, 3H), 4.22-4.14 (m, 4H), 4.03-3.98 (m, 2H), 3.87-3.77 (m, 2H), 3.34 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.07-3.05 (m, 2H), 2.76-2.59 (m, 4H), 2.22-2.08 (m, 2H), 2.02-1.92 (m, 3H), 1.74-1.57 (m, 2H), 1.51-1.33 (m, 6H), 1.23-1.14 (m, 3H), 0.85 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.8 Hz, 3H). HRMS m/z 1115.4170 [(M-H)+ 계산치 C59H65Cl2N8O10 1115.4206].
실시예 6 N-((S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(클로로메틸)-3-(6-((S)-7-메톡시-5-옥소-2,3,5,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일옥시)헥사노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일옥시)메틸)페닐아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 56
(S)-tert-부틸 8-(6-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-니트로벤질옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-6-옥소헥실옥시)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 54g (829 mg, 1.00 mmol)를 (상기 54h의 합성에 대해 보고된 방법에 의해) 상응하는 아닐린으로 환원시키고 (Zn/NH4Cl), 건조 DMA (3 mL) 중에 용해시켰다. 이 용액에, 실온에서 40분 동안 건조 DMA (4 mL) 중에서 (S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-5-우레이도펜탄산 (Fmoc-L-시트룰린, 1.19 g, 3.00 mmol) 및 2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디히드로퀴놀린 EEDQ (0.99g, 4.00 mmol)를 교반함으로써 형성된 혼합물을 첨가하였다. 최종 반응 혼합물을 실온에서 질소 분위기 하에 19시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물에 붓고, 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 고체를 수집하고, 물로 수회 세척하고, 건조시키고, 실리카 칼럼 크로마토그래피 (0-5%의 DCM-MeOH 구배)에 의해 정제하여 (S)-tert-부틸 8-(6-((S)-5-(4-((S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-6-옥소헥실옥시)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 56a (0.91 g, 77%)를 순수한 베이지색 고체로서 수득하였다.
mp 172℃; 1H NMR [(CD3)2SO] δ 10.10 (s, 1 H), 8.22-8.11 (m, 2 H), 7.94-7.62 (m, 8 H), 7.59-7.46 (m, 3 H), 7.46-7.27 (m, 5 H), 7.04 (s, 1 H), 6.69 (s, 1 H), 6.39 (br s, 1 H), 5.99 (t, J = 5.6 Hz, 1 H), 5.51-5.32 (m, 3 H), 5.22 (s, 2 H), 4.42-3.90 (m, 10 H), 3.88-3.75 (m, 1 H), 3.79 (s, 3 H), 3.53-3.18 (m, 3 H), 3.15-2.87 (m, 2 H), 2.66-2.44 (m, 2 H, DMSO 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.11-1.20 (m, 14 H), 1.31 (s, 9 H). 분석 (C65H72ClN7O12·½H2O) 계산치: C, 65.73; H, 6.20; N, 8.26. 실측치: C, 65.64; H, 6.19; N, 8.27.
질소 분위기 하에 0℃에서 건조 DMA (9 mL) 중 N-Fmoc 56a (0.91 g, 0.77 mmol)의 교반 용액에 DMA 중 피페리딘의 용액 (용액 mL당 1.0 mmol) (3.85 mL, 3.85 mmol)을 첨가하였다. 첨가한 후, 혼합물을 이 온도에서 2시간 동안 추가로 교반하고, 이어서 에틸 아세테이트-석유 에테르 (1:10)의 혼합물 (150 mL)에 붓고, 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 용매를 불용성 물질로부터 경사분리하고, 버렸다. 세척 단계를 실온에서 추가의 에틸 아세테이트-석유 에테르 (1:3) (2x150 mL)를 사용하여 반복하였다. 고체를 수집하고, 에틸 아세테이트-석유 에테르 (1:3)로 세척하고, 건조시켜 (S)-tert-부틸 8-(6-((S)-5-(4-((S)-2-아미노-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-6-옥소헥실옥시)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 56b를 무색 고체 (0.73 g, 99%)로서 수득하였다.
mp 223℃ (분해); 1H NMR [(CD3)2SO] δ 10.60-9.30 (br s, 3 H), 8.24-8.12 (m, 2 H), 7.84 (d, J = 8.2 Hz, 1 H), 7.70 (d, J = 8.5 Hz, 2 H), 7.54 (br t, J = 7.5 Hz, 1 H), 7.50 (d, J = 8.5 Hz, 2 H), 7.39 (br t, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.04 (s, 1 H), 6.69 (s, 1 H), 6.39 (br s, 1 H), 5.93 (t, J = 5.7 Hz, 1 H), 5.47-5.28 (m, 3 H), 5.21 (s, 2 H), 4.36 (t, J = 10.8 Hz, 1 H), 4.28-4.13 (m, 2 H), 4.10-3.92 (m, 3 H), 3.90-3.77 (m, 1 H), 3.79 (s, 3 H), 3.54-3.20 (m, 3 H, 물 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 3.06-2.89 (m, 2 H), 2.70-2.49 (m, 3 H, DMSO 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.10-1.25 (m, 14 H), 1.31 (s, 9 H). 분석 (C50H62ClN7O10·¾H2O) 계산치: C, 61.91; H, 6.60; N, 10.11. 실측치: C, 62.05; H, 6.96; N, 10.08.
건조 DMA (7 mL) 중 아민 56b (0.73 g, 0.763 mmol) 및 (S)-2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-3-메틸부타노에이트 (Fmoc-Val-Osu, 0.50 g, 1.15 mmol)의 혼합물을 실온에서 질소 분위기 하에 18시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트-석유 에테르 (1:2) (100 mL)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 용매를 불용성 물질로부터 경사분리하고, 세척 단계를 추가의 에틸 아세테이트-석유 에테르 (1:1) (2x100 mL)를 사용하여 반복하였다. 무색 고체를 건조시켜 (S)-tert-부틸 8-(6-((S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-6-옥소헥실옥시)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 56c (0.89 g, 91%)를 수득하였다.
mp 191℃ (분해); 1H NMR [(CD3)2SO] δ 10.11 (s, 1 H), 8.22-8.08 (m, 3 H), 7.92-7.81 (m, 3 H), 7.74 (t, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.65 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 7.54 (br t, J = 7.2 Hz, 1 H), 7.48 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 7.46-7.35 (m, 4 H), 7.32 (br t, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.04 (s, 1 H), 6.69 (s, 1 H), 6.39 (br s, 1 H), 5.97 (br s, 1 H), 5.47-5.34 (m, 3 H), 5.21 (s, 2 H), 4.53-4.13 (m, 7 H), 4.10-3.75 (m, 5 H), 3.79 (s, 3 H), 3.53-3.20 (m, 3 H, 물 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 3.10-2.87 (m, 2 H), 2.69-2.45 (m, 2 H, DMSO 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.10-1.25 (m, 15 H), 1.31 (s, 9 H), 0.88 (d, J = 6.8 Hz, 3 H), 0.85 (d, J = 6.7 Hz, 3 H). 분석 (C70H81ClN8O13·¾H2O) 계산치: C, 65.10; H, 6.44; N, 8.68. 실측치: C, 64.85; H, 6.48; N, 8.67.
질소 분위기 하에 0℃에서 건조 DMA (6 mL) 중 N-Fmoc 화합물 56c (0.89 g, 0.70 mmol)의 교반 용액에 DMA 중 피페리딘의 용액 (용액 mL당 1.0 mmol) (3.48 mL, 3.48 mmol)을 첨가하였다. 첨가한 후, 혼합물을 이 온도에서 1.5시간 동안 추가로 교반하였다. 에틸 아세테이트-석유 에테르 (1:2)의 혼합물 (90 mL)을 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반하였다. 용매 층을 불용성 물질로부터 경사분리하고, 버렸다. 세척 단계를 실온에서 추가의 에틸 아세테이트-석유 에테르 (1:2) (2x90 mL)를 사용하여 반복하였다. 남아 있는 무색 고체를 건조시켜 (S)-tert-부틸 8-(6-((S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-6-옥소헥실옥시)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 56d (0.68 g, 93%)를 수득하였다.
mp 225℃ (분해); 1H NMR [(CD3)2SO] δ 10.16 (s, D2O로 교환가능함, 1 H), 8.23-8.07 (m, 3 H, D2O 후에 2 H로 감소), 7.84 (d, J = 8.2 Hz, 1 H), 7.65 (d, J = 8.5 Hz, 2 H), 7.59-7.45 (m, 3 H), 7.37 (br t, J = 7.5 Hz, 1 H), 7.04 (s, 1 H), 6.69 (s, 1 H), 6.38 (br s, D2O로 교환가능함, 1 H), 5.96 (t, J = 5.8 Hz, D2O로 교환가능함, 1 H), 5.45-5.30 (m, 3 H, D2O 후에 d로서의 1 H로 감소, J = 9.6 Hz), 5.21 (s, 2 H), 4.41 (br s, D2O 후에 dd가 됨, J = 8.4, 5.4 Hz, 1 H), 4.36 (br t, J = 10.7 Hz, 1 H), 4.26-4.13 (m, 2 H), 4.10-3.91 (m, 3 H), 3.88-3.76 (m, 1 H), 3.79 (s, 3 H), 3.53-3.43 (m, 1 H), 3.41-3.20 (m, 2 H), 3.09-2.88 (m, 3 H), 2.70-2.50 (m, 2 H, DMSO 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.10-1.20 (m, 15 H), 1.31 (s, 9 H), 0.88 (d, J = 6.9 Hz, 3 H), 0.79 (d, J = 6.8 Hz, 3 H), 2 H는 관찰되지 않음. 분석 (C55H71ClN8O11·H2O) 계산치: C, 61.53; H, 6.85; N, 10.44. 실측치: C, 61.39; H, 7.11; N, 10.15.
건조 DMA (6 mL) 중 아민 56d (0.68 g, 0.64 mmol) 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (말레이미도-Osu, 0.50 g, 1.61 mmol)의 혼합물을 질소 분위기 하에 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트-석유 에테르 (1:2)의 혼합물 (90 mL)을 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하였다. 용매 층을 불용성 물질로부터 경사분리하고, 버렸다. 세척 단계를 실온에서 추가의 에틸 아세테이트-석유 에테르 (1:1) (90 mL)에 이어서 순수한 에틸 아세테이트 (50 mL)를 사용하여 반복하였다. 남아 있는 베이지색 고체를 건조시켜 (S)-tert-부틸 8-(6-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-6-옥소헥실옥시)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 52 (0.72 g, 90%)를 수득하였다.
HPLC: 96.7% 순도; mp 210℃ (분해); 1H NMR [(CD3)2SO] δ 10.03 (s, D2O로 교환가능함, 1 H), 8.23-8.11 (m, 2 H), 8.09 (d, J = 7.3 Hz, D2O로 교환가능함, 1 H), 7.85 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.80 (d, J = 8.3 Hz, D2O로 교환가능함, 1 H), 7.66 (d, J = 8.6 Hz, 2 H), 7.59-7.44 (m, 3 H), 7.38 (br t, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.04 (s, 1 H), 6.99 (s, 2 H), 6.69 (s, 1 H), 6.38 (br s, D2O로 교환가능함, 1 H), 5.99 (t, J = 5.5 Hz, D2O로 교환가능함, 1 H), 5.49-5.34 (m, 3 H, D2O 후에 d로서의 1 H로 감소, J = 9.5 Hz), 5.20 (s, 2 H), 4.44-4.30 (m, 2 H), 4.26-4.13 (m, 3 H), 4.10-3.91 (m, 3 H), 3.88-3.76 (m, 1 H), 3.79 (s, 3 H), 3.53-3.44 (m, 1 H), 3.41-3.20 (m, 물 피크에 의해 부분적으로 가려짐, 4 H), 3.09-2.88 (m, 2 H), 2.66-2.42 (m, DMSO 피크에 의해 부분적으로 가려짐, 2 H), 2.25-1.24 (m, 21 H), 1.31 (s, 9 H), 1.24-1.11 (m, 2 H), 0.86 (d, J = 6.8 Hz, 3 H), 0.82 (d, J = 6.7 Hz, 3 H). 분석 (C55H71ClN8O11H2O) 계산치: C, 61.53; H, 6.85; N, 10.44. 실측치: C, 61.39; H, 7.11; N, 10.15.
-10 내지 -12℃ (조 온도)에서 DCM (10 mL) 중 N-tBoc 유도체 52 (125 mg, 0.10 mmol)의 교반 용액에 TFA 중 2.5% 물의 용액 (10 mL)을 10분에 걸쳐 적가하였다. 첨가한 후, 혼합물을 추가로 이 온도에서 3시간 동안 교반하였다. 차가운 (-25℃) 에틸 아세테이트-석유 에테르 (1:10) (300 mL)를 첨가하고, 이어서 -10℃ (조 온도)에서 NaHCO3의 포화 수용액을 천천히 첨가하여 pH 6-7을 얻었다. 유기 층을 제거하고, 세척 단계를 추가의 에틸 아세테이트-석유 에테르 (1:1) (300 mL)를 사용하여 반복하였다. 고체를 수집하고, 물 및 에틸 아세테이트로 연속적으로 수회 세척하고, 건조시켜 조 생성물을 연황색 고체 (102 mg)로서 수득하였다. 이를 정제용 HPLC [제넨테크(Genentech)]에 의해 정제하여 N-((S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(클로로메틸)-3-(6-((S)-7-메톡시-5-옥소-2,3,5,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일옥시)헥사노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일옥시)메틸)페닐아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 56 (4.1 mg, 3.6%)을 수득하였다.
HRMS (ESI) m/z 계산치 C60H72ClN9NaO11: 1152.4932, 실측치: 1152.4906 [MNa+]. 계산치 C60H73ClN9O11: 1130.5113, 실측치: 1130.5077 [MH+].
실시예 7 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(포스포노옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-메틸헥산아미도)에틸(메틸)카르바메이트 57
실온에서, DMF (5 mL) 중 (S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 51a (2.00 g, 5.99 mmol)의 용액에 벤질 브로마이드 (7.13 mL, 59.90 mmol), 아이오딘화칼륨 KI (50 mg, 0.30 mmol) 및 탄산칼륨 K2CO3 (4.14 g, 30.00 mmol)을 첨가하였다. 도 9를 참조한다. 혼합물을 2시간 동안 교반한 다음, 에틸 아세테이트로 희석하였다. 침전물을 여과하였다. 여과물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 용매를 회전 증발기에 의해 제거하고, 잉여 벤질 브로마이드를 펌핑하였다. 생성된 잔류물을 칼럼 크로마토그래피에 의해 용리액으로서 에틸 아세테이트 및 석유 에테르의 혼합물 (v/v 1:10)을 사용하여 정제하여 (S)-tert-부틸 5-(벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 57a를 백색 고체 (1.97 g, 78%)로서 수득하였다.
mp 186-188℃. 1H NMR (CDCl3) δ 8.29 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.86 (br s, 1H), 7.65 (d, J = 8.29 Hz, 1H), 7.55-7.49 (m, 3H), 7.45-7.41 (m, 2H), 7.38-7.31 (m, 2H), 5.26 (s, 2H), 4.26 (br s, 1H), 4.13 (t, J = 10.8 Hz, 1H), 4.00-3.92 (m, 2H), 3.44 (t, J = 10.5 Hz, 1H), 1.61 (s, 9H) ppm. LRMS (APCI) 실측치 m/z 424.8 (M + H). C25H27ClNO3 요구치 424.2. (Boger D., Ishizakilb T., Kitos P. and Suntornwat O., (1990) J. Org. Chem., 55, 5823-5832).
에틸 아세테이트 및 석유 에테르의 혼합물 (v/v 1:1)을 사용한 추가 용리에 의해 도 9에 제시된 시클로프로필 생성물을 황색 오일 (345 mg, 19%)로서 수득하였다. (Lajiness J. and Boger D., (2011) J. Org. Chem., 76, 583-587).
빙조에서 냉각시킨 DCM (15 mL) 중 57a (1.60 g, 3.77 mmol)의 용액에 디옥산 중 4N HCl (40 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 3시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하여 (S)-5-(벤질옥시)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌 57b를 히드로클로라이드 염으로서 수득하였다. 염을 THF (15 mL) 중에 용해시키고, 빙조에서 냉각시켰다. 글루타르산 무수물 (646 mg, 5.66 mmol), DMAP (46 mg, 0.38 mmol) 및 피리딘 (5 mL)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑한 후, 잔류물을 묽은 수성 NaHCO3 중에 용해시키고, 에틸 아세테이트로 3회 세척하였다. 수성 상을 1N HCl을 사용하여 2의 pH로 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 에틸 아세테이트 추출물을 물 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, MeOH 및 에틸 아세테이트의 혼합물 (v/v 1:10)로 세척하면서 실리카 겔 패드를 통해 여과하였다. 용매를 제거하여 (S)-5-(5-(벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜탄산 57c를 회백색 고체 (978 mg, 59%)로서 수득하였다.
-10℃에서, THF (20 mL) 중 57c (978 mg, 2.23 mmol)의 용액에 25% 수성 포름산암모늄 (20 mL)에 이어서 Pd-C 촉매 (10%, 습윤, 500 mg)를 첨가하고, 혼합물을 -10℃에서 7시간 동안 교반하였다. 추가의 Pd-C 촉매 (500 mg)를 첨가하고, 혼합물을 동일한 온도에서 밤새 교반하였다. 촉매를 셀라이트를 통해 여과하고, 셀라이트를 THF로 세척하였다. THF를 여과물로부터 펌핑하고, 나머지 수용액을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 추출물을 물 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하였다. 용매를 제거하여 (S)-5-(1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜탄산 53h를 회백색 고체 (487 mg, 63%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 12.08 (br s, 1H), 10.35 (br s, 1H), 8.08 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.77 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.50-7.46 (m, 1H), 7.33-7.29 (m, 1H), 4.30 (t, J = 10.5 Hz, 1H), 4.14-4.12 (m, 2H), 3.98 (dd, J = 2.8, 10.9 Hz, 1H), 3.78 (dd, J = 7.8, 10.8 Hz, 1H), 2.63-2.54 (m, 2H), 2.34 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.99-1.83 (m, 2H) ppm. LRMS (APCI) 실측치 m/z 348.6 (M + H). C18H19ClNO4 요구치 348.1.
THF (15 mL) 중 53h (500 mg, 1.44 mmol)의 용액에 테트라졸 (아세토니트릴 중 3%, 51 mL, 17.25 mmol)에 이어서 디-tert-부틸-N,N-디이소프로필 포스포르아미다이트 (5.73 mL, 17.25 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 이어서 빙조에서 냉각시키고, H2O2 (30% 수용액, 3.53 mL, 34.5 mmol)를 적가하였다. 생성된 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 5시간 동안 교반하였다. 반응물을 빙조에서 냉각시키면서 10% 수성 아황산나트륨의 첨가에 의해 켄칭하였다. 유기 휘발성 물질을 회전 증발기에 의해 제거하여 현탁된 오일을 함유하는 수성 상을 수득하였다. 석유 에테르를 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 형성된 침전물을 여과에 의해 수집하고, 물 및 석유 에테르로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 (S)-5-(1-(클로로메틸)-5-(디-tert-부톡시포스포릴옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜탄산 57d (660 mg, 85%)를 회백색 발포체로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 12.07 (br s, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.04 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.60-7.56 (m, 1H), 7.50-7.46 (m, 1H), 4.38 (t, J = 9.8 Hz, 1H), 4.32-4.26 (m, 1H), 4.20-4.18 (m, 1H), 4.02 (dd, J = 2.9, 11.0 Hz, 1H), 3.90 (dd, J = 7.1, 11.0 Hz, 1H), 2.67-2.53 (m, 2H), 2.34 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.87-1.78 (m, 2H), 1.481 및 1.476 (2×s, 18H) ppm. 31P NMR (DMSO) δ -15.46 ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 562.1719 (M + Na). C26H35ClNNaO7P 요구치 562.1732.
빙조에서 냉각시킨 DCM (20 mL) 중 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산산 (1.00 g, 4.73 mmol)의 현탁액에 한 방울의 DMF에 이어서 옥살릴 클로라이드 (2.03 mL, 23.67 mmol)를 적가하였다. 도 10을 참조한다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 밤새 교반하여 암갈색 용액을 수득하였다. 모든 휘발성 성분을 회전 증발기에 이어서 고진공 펌프에 의해 제거하였다. 생성된 잔류물을 DCM (5 mL) 중에 용해시키고, 용매를 회전 증발기에 이어서 고진공 펌프에 의해 제거하였다. 상기 용해 및 제거 절차를 1회 더 반복하여 조 6-말레이미도카프로일 클로라이드를 암갈색 오일로서 수득하였다. 빙조에서 냉각시킨 DCM (5 mL) 중 tert-부틸 메틸(2-(메틸아미노)에틸)카르바메이트 (891 mg, 4.73 mmol)의 용액에 DCM (20 mL) 중 상기-제조된 6-말레이미도카프로일 클로라이드의 용액을 적가하였다. 생성된 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 밤새 교반하였다. DCM을 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시켰다. 용액을 수성 NaHCO3, 차가운 수성 5% 시트르산, 및 염수로 세척하고, 이어서 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 에틸 아세테이트로 세척하면서 실리카 겔 패드를 통해 여과하였다. 용매를 제거하여 tert-부틸 2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-메틸헥산아미도)에틸(메틸)카르바메이트 57e를 갈색 오일 (1.33 g, 74%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) (회전이성질체의 혼합물) δ 7.006 & 7.005 (2×s, 1H), 3.39-3.36 (m, 4H), 3.29-3.25 (m, 2H), 2.92-2.75 (m, 6H, 2NMe), 2.21 (t, J = 7.38 Hz, 2H), 1.50-1.44 (m, 4H), 1.37 (s, 9H), 1.24-1.16 (m, 2H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 382.2338 (M + H). C19H32N3O5 요구치 382.2336.
빙조에서 냉각시킨 DCM (5 mL) 중 57e (274 mg, 0.72 mmol)의 용액에 TFA (5 mL)를 적가하였다. 혼합물을 동일한 온도에서 2시간 동안 교반한 후, 모든 휘발성 성분을 회전 증발기에 이어서 고진공 펌프에 의해 제거하였다. 생성된 잔류물, 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-메틸-N-(2-(메틸아미노)에틸)헥산아미드 트리플루오로아세테이트 57f를 그대로 사용하였다.
실온에서, 51a (200 mg, 0.60 mmol)를 DCM (5 mL) 및 DIPEA (0.3 mL, 1.72 mmol) 중에 용해시키고, 이어서 4-니트로페닐 클로로포르메이트 (145 mg, 0.72 mmol)를 첨가하여 (S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-((4-니트로페녹시)카르보닐옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 57g를 형성하였다. 혼합물을 5시간 동안 교반한 후, DCM (5 mL) 및 DIPEA (0.7 mL, 4.02 mmol) 중 조 57f의 용액을 첨가하여 담황색 용액을 수득하였으며, 이를 밤새 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 수성 5% 암모니아 및 염수로 세척하였다. 수득한 조 물질을 추가로 칼럼 크로마토그래피에 의해 용리액으로서 에틸 아세테이트, DCM 및 석유 에테르 (v/v/v 1:2:1)의 혼합물에 이어서 에틸 아세테이트 및 DCM (v/v 1:2)의 혼합물을 사용하여 정제하여 (S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-((2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-메틸헥산아미도)에틸)(메틸)카르바모일옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 57h (223 mg, 58%)를 회백색 고체로서 수득하였다.
mp 53-56℃. 1H NMR (CDCl3) (회전이성질체의 혼합물) δ 8.04 (br s, 1H), 7.86-7.78 (m, 1H), 7.72-7.68 (m, 1H), 7.53-7.48 (m, 1H), 7.40-7.34 (m, 1H), 6.67 (s, 2H), 4.25 (br s, 1H), 4.46-4.10 (m, 1H), 4.06-3.98 (m, 1H), 3.92-3.72 (명백한 d, J = 11.2 Hz, 1H), 3.72-3.42 (m, 7H), 3.28, 3.10, 3.09, 2.99 (4×s, 6H, 2NMe), 2.38-2.21 (m, 2H), 1.67-1.54 (m, 4H), 1.57 (s, 9H), 1.33-1.25 (m, 2H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 641.2728 (M + H). C33H42ClN4O7 요구치 641.2737.
빙조에서 냉각시킨 DCM (2 mL) 중 57h (110 mg, 0.17 mmol)의 용액에 TFA (2 mL)를 적가하였다. 혼합물을 동일한 온도에서 2시간 동안 교반한 다음, 모든 휘발성 성분을 제거하였다. 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트와 차가운 묽은 수성 NaHCO3 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물에 이어서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 용매를 제거하여 (S)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-메틸헥산아미도)에틸(메틸)카르바메이트 57i를 황색 고체 (86 mg, 92%)로서 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 그대로 사용하였다.
1H NMR (CDCl3) (회전이성질체의 혼합물) δ 7.76 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.63-7.59 (m, 1H), 7.48-7.41 (m, 1H), 7.25-7.20 (m, 1H), 6.79 (s, 1H), 6.68 (s, 2H), 4.01-3.94 (m, 1H), 3.88-3.78 (m, 3H), 3.74-3.68 (m, 2H), 3.62-3.47 (m, 5H), 3.28, 3.10, 3.06, 3.00 (4×s, 6H, 2NMe), 2.38-2.21 (m, 2H), 1.69-1.50 (m, 4H), 1.33-1.25 (m, 2H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 541.2217 (M + H). C28H34ClN4O5 요구치 541.2212.
빙조에서 냉각시킨 DMA (3 mL) 중 57i (83 mg, 0.15 mmol)의 용액에 (S)-5-(1-(클로로메틸)-5-(디-tert-부톡시포스포릴옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜탄산 57d (99 mg, 0.18 mmol)에 이어서 EDCI 히드로클로라이드 (88 mg, 0.46 mmol)에 이어서 p-톨루엔술폰산 (2.6 mg, 0.015 mmol)을 첨가하였다. 도 11을 참조한다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 밤새 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트와 차가운 묽은 수성 NaHCO3 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물에 이어서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 용매를 제거하고, 생성된 잔류물을 석유 에테르로 연화처리하였다. 수득된 고체를 DCM 및 이소프로판올로부터 재침전시켜 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(디-tert-부톡시포스포릴옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-메틸헥산아미도)에틸(메틸)카르바메이트 57j를 황색 고체 (116 mg, 71%)로서 수득하였다.
mp 81℃ (분해). 1H NMR (CDCl3) (회전이성질체의 혼합물) δ 8.63 (s, 1H), 8.36 (s, 1H), 8.23 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.89-7.82 (m, 1H), 7.72-7.67 (m, 2H), 7.54-7.50 (m, 2H), 7.43-7.39 (m, 2H), 6.66 (s, 2H), 4.34-4.25 (m, 4H), 4.10-4.05 (m, 2H), 3.98-3.93 (m, 2H), 3.72-3.69 (m, 2H), 3.50-3.46 (m, 5H), 3.28, 3.10, 3.09, 2.99 (4×s, 6H, 2NMe), 2.79-2.73 (m, 2H), 2.70-2.62 (m, 2H), 2.38-2.32 (m, 1H), 2.27-2.20 (m, 3H), 1.67-1.54 (m, 3H), 1.56 (s, 9H), 1.55 (s, 9H), 1.33-1.25 (m, 4H) ppm. 31P NMR (CDCl3) δ -15.71 ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 1084.3755 (M + Na). C54H66Cl2N5NaO11P 요구치 1084.3766.
빙조에서 냉각시킨 DCM (1 mL) 중 57j (55 mg, 0.052 mmol)의 용액에 TFA (1 mL)를 적가하였다. 혼합물을 동일한 온도에서 1.5시간 동안 교반한 다음, 모든 휘발성 성분을 제거하였다. 생성된 잔류물을 DCM 및 에틸 아세테이트로부터 재침전시켜 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(포스포노옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-메틸헥산아미도)에틸(메틸)카르바메이트 57을 회색 고체 (33 mg, 67%, HPLC 순도: 89%)로서 수득하였다.
mp 191-194℃ (분해). 1H NMR (DMSO) (회전이성질체의 혼합물) δ 8.49 (s, 1H), 8.23-8.21 (m, 1H), 8.10 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.95-7.76 (m, 3H), 7.59-7.53 (m, 2H), 7.45-7.39 (m, 2H), 6.97, 6.96, 6.94, 6.90 (4×s, 전체 2H, 말레이미딜 기), 4.34-4.21 (m, 4H), 4.06-4.01 (m, 2H), 3.95-3.85 (m, 2H), 3.71-3.61 (m, 2H), 3.54-3.30 (m, 5H), 3.23, 3.18, 3.04, 3.00, 2.97, 2.95, 2.89, 2.85 (8×s, 전체 6H, 2NMe ), 2.37-2.28 (m, 2H), 2.19 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 2.00-1.95 (m, 2H), 1.50-1.40 (m, 5H), 1.25-1.15 (m, 5H) ppm. 31P NMR (DMSO) δ -5.79 ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 972.2488 (M + Na). C46H50Cl2N5NaO11P 요구치 972.2514.
실시예 8 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트 58
CH2Cl2 (80 mL) 중 (S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 51a (3.338 g, 10 mmol), 4-메틸피페라진-1-카르보닐 클로라이드 히드로클로라이드 (5.98 g, 30 mmol), Et3N (3.5 g, 35 mmol) 및 DMAP (1.34 g, 11 mmol)의 혼합물을 실온에서 2일 동안 교반하였다. 도 12를 참조한다. 혼합물을 물로 세척하고, 용매를 건조시키고, 진공 하에 제거하여 (S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-(4-메틸피페라진-1-카르보닐옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 58a (Boger D.L. et al, Synthesis, (1999), 1505-1509)를 정량적 수율로 수득하였다.
mp 98℃; 1H NMR (CDCl3) δ 8.11 (br, 1H), 7.84 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.50 (ddd, J = 8.2, 6.9, 1.1 Hz, 1H), 7.37 (ddd, J = 8.1, 6.9, 1.0 Hz, 1H), 4.34-4.20 (m, 1H), 4.17-4.10 (m, 1H), 4.01-3.98 (m, 1H), 3.94 (dd, J = 9.6, 2.4 Hz, 1H), 3.87-3.80 (br, 2H), 3.68-3.60 (br, 2H), 3.47 (t, J = 10.8 Hz, 1H), 2.57-2.48 (m, 4H), 2.83 (s, 3H), 1.58 (s, 9H); MS (APCI+) m/z 461.2 MH+. 분석 계산치 C24H30ClN3O4: C, 62.7; H, 6.6; N, 9.1. 실측치: C, 62.5; H, 6.8; N, 9.2%.
CH2Cl2 (50 mL) 중 58a (2.30 g, 5 mmol)의 용액을 0℃에서 과량의 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 4시간 동안 처리하고, 혼합물을 차가운 수성 NH3으로 중화시켰다. 헥산으로 희석하여 고체의 침전을 일으켰고, 이를 여과에 의해 수집하고, 물 및 헥산으로 세척하고, 건조시켜 (S)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트 58b (1.60 g, 89%)를 수득하였다.
mp 144-147℃; 1H NMR (CDCl3) δ 7.69 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.45 (ddd, J = 8.3, 6.9, 1.2 Hz, 1H), 7.25 (ddd, J = 8.4, 6.8, 1.2 Hz, 1H), 6.82 (s, 1H), 5.30 (s, 1H), 4.17-4.05 (m, 2H), 4.03-3.96 (m, 2H), 3.89-3.77 (m, 4H), 3.54 (t, J = 10.9 Hz, 1H), 3.20-2.90 (m, 4H), 2.76 (s, 3H). 분석 계산치 C19H22ClN3O2: C, 63.4; H, 6.2; N, 11.7. 실측치: C, 63.2; H, 6.2; N, 11.5%.
디옥산 (30 mL) 중 용액 55a (4.689 g, 10 mmol)를 HCl (디옥산 중 4M, 10 mL)로 처리하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 수산화암모늄을 첨가하고, 용매를 제거하여 (S)-1-(클로로메틸)-5-(4-니트로벤질옥시)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌 54f를 수득하였으며, 이를 CH2Cl2 (50 mL) 중 글루타르산 무수물 (3.4 g, 30 mmol)과 혼합하였다. 0℃로 냉각시킨 후, Et3N (5.05 g, 50 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 천천히 가온되도록 하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 묽은 HCl을 첨가하여 고체를 수득하였으며, 이를 여과에 의해 수집하고, 물 및 CH2Cl2로 세척하고, 건조시켜 (S)-5-(1-(클로로메틸)-5-(4-니트로벤질옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜탄산 58c (2.95 g, 61%)를 수득하였다.
1H NMR (DMSO-d6) δ 12.07 (br s, 1H), 8.30 (br d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.24 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.89-7.85 (m, 3H), 7.57 (ddd, J = 8.2, 6.9, 1.1 Hz, 1H), 7.43 (ddd, J = 8.1, 7.1, 1.0 Hz, 1H), 5.46 (s, 2H), 4.34 (t, J = 9.7 Hz, 1H), 4.25-4.13 (m, 2H), 4.01 (dd, J = 11.0, 2.8 Hz, 1H), 3.85 (dd, J = 10.9, 7.4 Hz, 1H), 2.66-2.57 (m, 1H), 2.55-2.46 (m, 1H), 2.35 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.87-1.79 (m, 2H).
DMA (25 mL) 중 58b (1.33 g, 3.7 mmol) 및 58c (1.63 g, 3.38 mmol)의 혼합물과 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDCI.HCl, 3.26 g, 17.0 mmol)를 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 수성 NaHCO3으로 희석하고, 생성된 침전물을 물 및 메탄올로 연속적으로 세척하고, 건조시켰다. 먼저 EtOAc/MeOH 9:1로, 이어서 EtOAc/MeOH 4:1로 용리시키면서 실리카 상에서 크로마토그래피하여 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-니트로벤질옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트 58d (0.98 g, 35%)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 8.35 (s, 1H), 8.33-8.27 (m, 3H), 8.17 (s, 1H), 7.85 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.73-7.68 (m, 4H), 7.58-7.49 (m, 2H), 7.45-7.38 (m, 2H), 5.33 (q, J = 13.0 Hz, 2H), 4.39-4.27 (m, 4H), 4.14-4.06 (m, 2H), 4.01-3.95 (m, 2H), 3.83-3.77 (m, 2H), 3.64-3.59 (m, 2H), 3.48 (dt, J = 10.5, 7.3 Hz, 2H), 2.85-2.65 (m, 4H), 2.55-2.47 (m, 4H), 2.38 (s, 3H), 2.28-2.21 (m, 2H).
0℃에서 THF (35 mL), MeOH (15 mL), 및 물 (5 mL)의 혼합물 중 58d (0.41 g, 5 mmol)의 현탁액을 알루미늄 아말감 (2 g)으로 처리하고, 교반 혼합물을 3시간에 걸쳐 실온으로 가온되도록 하였다. MeOH로 희석한 후, 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 여과물을 증발 건조시켜 (S)-3-(5-((S)-5-(4-아미노벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트 58e (0.31 g, 78%)를 수득하였으며, 이를 직접 후속 단계에 사용하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 8.37 (s, 1H), 8.26 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.86 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.49-7.43 (m, 2H), 7.39 (br t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.34-7.26 (m, 3H), 6.68 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 5.10 (q, J = 10.9 Hz, 2H), 4.32-4.15 (m, 4H), 4.07-3.97 (m, 2H), 3.94-3.90 (m, 2H), 3.86-3.79 (m, 2H), 3.66-3.60 (m, 2H), 3.50-3.40 (m, 2H), 2.77-2.58 (m, 4H), 2.56-2.48 (m, 4H), 2.27 (s, 3H), 2.22-2.14 (m, 2H).
2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디히드로퀴놀린 (EEDQ, 0.58 g, 2.3 mmol) 및 (S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-5-우레이도펜탄산 (Fmoc-L-시트룰린, 0.69 g, 1.7 mmol)의 혼합물을 모든 고체가 용해될 때까지 건조 DMA (10 mL) 중에서 질소 하에 10분 동안 교반하였다. 도 13을 참조한다. 조 58e (0.31 g, 0.39 mmol)를 첨가하고, 교반을 밤새 계속하였다. 혼합물을 EtOAc로 희석하고, 물을 첨가하여 생성물을 침전시키고, 이를 여과에 의해 수집하고, 비등하는 MeOH로 연화처리하여 조 (S)-3-(5-((S)-5-(4-((S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트 58f (0.62 g, >100%)를 수득하였으며, 이를 실온에서 30분 동안 건조 DMF (20 mL) 중 피페리딘 (50 mg, 0.59 mmol)으로 처리하였다. EtOAc, 헥산 및 물로 희석하여 침전물을 수득하였고, 이를 여과에 의해 수집하고, 헥산 및 물로 세척하여 조 (S)-3-(5-((S)-5-(4-((S)-2-아미노-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트 58g (0.33 g, 89%, HPLC에 의해 85% 순도)를 수득하였으며, 이를 건조 DMA (10 mL) 중 1.5 당량의 Fmoc-Val-OSu (N-α-Fmoc-L-발린 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 0.23 g, 0.53 mmol)로 밤새 처리하였다. EtOAc 및 물로 희석하여 고체를 수득하였고, 이를 여과에 의해 수집하고, 건조시켜 조 (S)-3-(5-((S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트 58h (0.38 g, 85%)를 수득하였다.
1H NMR (DMSO-d6) δ 10.11 (s, 1H), 8.24-8.11 (m, 3H), 7.96 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.90-7.80 (m, 4H), 7.74 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.65 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.61-7.53 (m, 2H), 7.50-7.36 (m, 6H), 7.32 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 5.97 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 5.40 (s, 2H), 5.20 (s, 2H), 4.44-4.19 (m, 9H), 4.08-3.81 (m, 5H), 3.74-3.70 (br, 2H), 3.50-3.42 (br, 2H), 3.07-2.89 (m, 2H), 2.77-2.55 (m, 4H), 2.52-2.36 (m, 4H), 2.25 (s, 3H), 2.03-1.94 (m, 3H), 1.76-1.53 (m, 2H), 1.49-1.30 (m, 2H), 0.87 (dd, J = 11.2, 6.8 Hz, 6H).
조 58h (0.38 g, 0.3 mmol)를 실온에서 1시간 동안 DMA 중에서 피페리딘과 반응시키고, 혼합물을 EtOAc 및 물로 희석하여 고체를 수득하였으며, 이를 수집하고, 건조시켜 (S)-3-(5-((S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트 58i (0.23 g, 73%, HPLC에 의해 83% 순도)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 9.34 (br, 1H), 8.35 (br s, 1H), 8.28 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.14 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.86 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.65-7.60 (m, 2H), 7.54-7.47 (m, 2H), 7.46-7.33 (m, 4H), 7.29 (td, J = 7.4, 1.3 Hz, 1H), 5.20 (br s, 2H), 5.17-5.09 (m, 1H), 4.82-4.73 (m, 1H), 4.59-4.50 (m, 1H), 4.33-4.15 (m. 3H), 4.07-4.01 (m, 1H), 3.98-3.90 (m, 2H), 3.86-3.76 (m, 3H), 3.65-3.57 (m, 2H), 3.55-3.39 (m, 3H), 3.25 (br s, 1H), 2.81-2.60 (m, 3H), 2.59-2.41 (m, 6H), 2.37 (s, 3H), 2.27-2.16 (m, 3H), 1.55-1.48 (m, 2H), 0.98 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.83 (d, J = 6.6 Hz, 3H).
건조 DMF (10 mL) 중 조 58i (0.105 g, 0.1 mmol) 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (62 mg, 0.2 mmol)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 혼합물을 EtOAc 및 물로 희석하여 고체를 수득하였으며, 이를 수집하고, 건조시켜 조 물질 (70 mg, HPLC에 의해 71% 순도)을 수득하였으며, 이를 정제용 HPLC에 의해 정제하여 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트 58을 수득하였다.
MS m/z 1243.4 [(M+H)+ 계산치 C65H76Cl2N10O11 1243.5].
실시예 9 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 디히드로겐 포스페이트 59
DMF (10 mL) 중 (S)-tert-부틸 5-(4-((S)-2-((S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 55e (1.00 g, 1.09 mmol)의 용액에 피페리딘 (1.08 mL, 10.90 mmol)을 첨가하였다. 도 14를 참조한다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 모든 휘발성 성분을 펌핑하였다. 생성된 잔류물을 에테르로 연화처리하여 (S)-tert-부틸 5-(4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 59a를 백색 고체 (700 mg, 92%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 10.17 (s, 1H), 8.17 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.12 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.55-7.49 (m, 3H), 7.37-7.33 (m, 1H), 5.98 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.22 (s, 2H), 4.51-4.48 (m, 1H), 4.19-3.98 (m, 4H), 3.84-3.80 (m, 1H), 3.08-2.90 (m, 3H), 1.99-1.91 (m, 2H), 1.75-1.65 (m, 2H), 1.55 (s, 9H), 1.49-1.33 (m, 2H), 0.89 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.80 (d, J = 6.8 Hz, 3H) ppm.
DMSO (10 mL) 중 59a (688 mg, 0.99 mmol), 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (SuOMC, 320 mg, 1.04 mmol), 및 DIPEA (190 μL, 1.09 mmol)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하였다. 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트로 연화처리하여 (S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 59b를 회백색 고체 (832 mg, 95%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 10.03 (s, 1H), 8.13-8.08 (m, 2H), 7.83-7.79 (m, 2H), 7.66 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.55-7.48 (m, 3H), 7.35 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.99 (s, 2H), 5.97 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.21 (s, 2H), 4.43-4.38 (m, 1H), 4.22-3.98 (m, 4H), 3.84-3.80 (m, 1H), 3.38-3.33 (m, 3H), 3.08-2.90 (m, 2H), 2.24-2.06 (m, 2H), 2.01-1.91 (m, 1H), 1.74-1.14 (m, 10H), 1.55 (s, 9H), 0.86 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.83 (d, J = 6.7 Hz, 3H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 910.3897 (M + Na). C46H58ClN7NaO9 요구치 910.3877.
빙조에서 냉각시킨 DCM (2 mL) 중 59b (100 mg, 0.11 mmol)의 현탁액에 TFA (2 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 빙조에서 3시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하였다. 생성된 잔류물을 THF 중에 용해시키고, 에틸 아세테이트와 차가운 5% 수성 암모니아 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트를 통해 여과하고, 용매를 제거하여 N-((S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일옥시)메틸)페닐아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 59c를 녹색빛-갈색 고체 (80 mg, 90%)로서 수득하였으며, 이를 직접 사용하였다.
1H NMR (DMSO) δ 10.02 (s, 1H), 8.09-8.07 (m, 1H), 7.99 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.56 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.38 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 7.09 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.99 (s, 2H), 5.97 (br s, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.16 (s, 2H), 4.46-4.35 (m, 1H), 4.21-4.17 (m, 1H), 3.96-3.87 (m, 1H), 3.84-3.80 (m, 1H), 3.70-3.65 (m, 1H), 3.60-3.49 (m, 1H), 3.38-3.33 (m, 3H), 3.06-2.92 (m, 2H), 2.22-2.08 (m, 2H), 2.02-1.92 (m, 1H), 1.75-1.14 (m, 10H), 0.86 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.7 Hz, 3H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 810.3332 (M + Na). C41H50ClN7NaO7 요구치 810.3352.
실온에서, DMA (3 mL) 중 59c (75 mg, 0.095 mmol) 및 (S)-5-(1-(클로로메틸)-5-(디-tert-부톡시포스포릴옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜탄산 57d (62 mg, 0.11 mmol)의 용액에 EDCI 히드로클로라이드 (40 mg, 0.21 mmol)에 이어서 파라-톨루엔술폰산 (1.6 mg, 0.0095 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 5시간 동안 교반한 후, 추가의 EDCI 히드로클로라이드 (35 mg, 0.18 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하였다. 생성된 잔류물을 THF 중에 용해시키고, 에틸 아세테이트와 차가운 묽은 수성 NaHCO3 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트를 통해 여과하고, 용매를 제거하여 디-tert-부틸 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 포스페이트 59d를 갈색 고체 (104 mg, 83%)로서 수득하였으며, 이를 직접 사용하였다.
1H NMR (DMSO) δ 10.03 (s, 1H), 8.60 (s, 1H), 8.19-7.38 (m, 14H), 6.87 (s, 2H), 5.97 (br s, 1H), 5.40 (s, 2H), 5.20 (br s, 2H), 4.45-3.82 (m, 10H), 3.38-3.33 (m, 3H), 3.07-2.90 (m, 2H), 2.75-2.50 (m, 2H), 2.20-2.08 (m, 4H), 2.02-1.92 (m, 2H), 1.75-1.10 (m, 12H), 1.48 (s, 18H), 0.86-0.82 (m, 6H) ppm. 31P NMR (DMSO) δ -15.46 ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 1331.5071 (M + Na). C67H83Cl2N8NaO13P 요구치 1331.5086.
빙조에서 냉각시킨 DCM (2 mL) 중 59d (95 mg, 0.073 mmol)의 현탁액에 TFA (1 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 빙조에서 1.5시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하였다. 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트로 연화처리하여 청색빛 회색 고체 (77 mg, 90%)를 수득하였으며, 이를 추가로 정제용 HPLC (칼럼: 시너지-맥스 RP 4μ, 250 x 21.20 mm; 이동상: A/B = 30:70 (A: H2O-TFA pH 2.56, B: 물 중 90% 아세토니트릴); 유량 13 mL/분)에 의해 정제하여 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 디히드로겐 포스페이트 59를 회백색 고체 (5 mg, HPLC 순도 97%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 10.04 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 8.19-8.09 (m, 4H), 7.87-7.81 (m, 2H), 7.66 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.56-7.48 (m, 4H), 7.40-7.36 (m, 2H), 6.98 (s, 2H), 6.01 (br s, 1H), 5.43 (br s, 2H), 5.22 (s, 2H), 4.42-3.34 (m, 2H), 4.25-4.12 (m, 4H), 4.03-3.98 (m, 2H), 3.88-3.81 (m, 2H), 3.38-3.33 (m, 3H), 3.10-2.90 (m, 2H), 2.75-2.55 (m, 4H), 2.20-2.08 (m, 2H), 2.00-1.92 (m, 2H), 1.75-1.10 (m, 12H), 0.88-0.81 (m, 6H) ppm. 31P NMR (DMSO) δ -5.60 ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 1219.3794 (M + Na). C59H67Cl2N8NaO13P 요구치 1219.3834.
실시예 10 N-((S)-1-((S)-1-(4-(((S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일옥시)메틸)페닐아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 60
(S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 디히드로겐 포스페이트 59를 효소에 의해 탈인산화시켜 60을 수득하였다.
실시예 11 2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(포스포노옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일카르바메이트 61
건조 DCM (10 mL) 중 트리포스겐 (136 mg, 0.458 mmol)의 용액을 실온에서 건조 DCM (30 mL) 중 (S)-tert-부틸 5-아미노-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 61a (150 mg, 0.451 mmol) 및 DMAP (386 mg, 3.16 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 도 15를 참조한다. 45분 후, 건조 DCM (10 mL) 중 2-(피리딘-2-일디술파닐)에탄올 (Chem. Eur. J. (2006) 12:3655-3671) (350 mg, 1.87 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 20시간 후, 혼합물을 MeOH (30 mL)로 희석하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 헥산:DCM 100:0 → 0:100에 이어서 DCM:EtOAc 100:0 → 95:5를 사용하여 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 61b 및 출발 물질 2-(피리딘-2-일디술파닐)에탄올의 혼합물 (389 mg)을 수득하였다. 이 혼합물을 후속 단계에 사용하였다. DMF (1.5 mL) 중 TBDMSCl (262 mg, 1.74 mmol)의 용액을 0℃에서 DMF (4 mL) 중 생성물 61b, 2-(피리딘-2-일디술파닐)에탄올, 및 이미다졸 (118 mg, 1.74 mmol)의 교반 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고, 45분 동안 교반한 다음, EtOAc 및 H2O로 희석하였다. 층을 분리하고, 유기 층을 H2O (3 x)로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 헥산:DCM 50:50 → 0:100에 이어서 DCM:EtOAc 98:2 → 94:6을 사용하여 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-((2-(피리딘-2-일디술파닐)에톡시)카르보닐아미노)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 61b (190 mg, 61a로부터 2 단계에 걸쳐 77%)를 연황색 발포성 고체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, CDCl3) 8.49 (br s, 1H), 8.48-8.47 (m, 1H), 7.84 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.71 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 7.63 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.54-7.50 (m, 1H), 7.40 (ddd, J = 8.2, 6.8, 1.1 Hz, 1H), 7.09 (ddd, J = 7.3, 4.9, 1.0 Hz, 1H), 6.93 (br s, 1H), 4.48 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 4.31-4.27 (m, 1H), 4.15-4.10 (m, 1H), 4.04-3.98 (m, 1H), 3.91 (dd, J = 11.1, 2.4 Hz, 1H), 3.45 (t, J = 10.7 Hz, 1H), 3.13 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.60 (s, 9H).
TFA (4.8 mL)를 0℃에서 DCM (9.5 mL) 중 61b (180 mg, 0.330 mmol)의 용액에 천천히 첨가하고, 혼합물을 이 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 DCM 및 H2O로 희석하고, pH 7-8이 될 때까지 포화 수성 NaHCO3으로 중화시켰다. 층을 분리하고, 유기 층을 H2O (1 x)로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하여 (S)-2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸 1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일카르바메이트 61c (113 mg, 77%)를 황색 고체로서 수득하였으며, 이를 후속 단계에 정제 없이 사용하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 9.52 (s, 1H), 8.48-8.46 (m, 1H), 7.88 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.83-7.78 (m, 2H), 7.64 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.39 (ddd, J = 8.1, 6.9, 1.0 Hz, 1H), 7.25 (ddd, J = 6.5, 4.8, 2.2 Hz, 1H), 7.14 (ddd, J = 8.2, 6.8, 1.0 Hz, 1H), 7.09 (s, 1H), 5.94 (br s, 1H), 4.33 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 4.02-3.96 (m, 1H), 3.85 (dd, J = 10.8, 3.5 Hz, 1H), 3.70 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 3.63-3.55 (m, 2H), 3.18 (t, J = 6.1 Hz, 2H).
DMA (6 mL) 중 (S)-5-(1-(클로로메틸)-5-(디-tert-부톡시포스포릴옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜탄산 57d (135 mg, 0.250 mmol)의 용액을 실온에서 질소 하에 61c (110 mg, 0.247 mmol) 및 EDCI.HCl (116 mg, 0.605 mmol)의 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 18.5시간 후, 추가의 DMA (0.5 mL) 중 57d (40 mg, 0.0741 mmol)의 용액 및 고체 EDCI.HCl (28.4 mg, 0.148 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 질소 하에 교반하였다. 추가로 6시간 후, 추가량의 DMA (0.5 mL) 중 57d (7 mg, 0.0130 mmol) 및 고체 EDCI.HCl (24 mg, 0.125 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 추가로 2일 16.5시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 H2O로 희석하였고, 고체가 침전되었다. 고체를 여과에 의해 수집하고, H2O, 포화 수성 NaHCO3, H2O 및 헥산으로 세척하였다. 고체를 EtOAc 중에 용해시키고, 용액을 포화 수성 NaHCO3 (3 x) 및 H2O (1 x)로 세척한 다음 건조시키고 (Na2SO4), 용매를 진공 하에 제거하였다. 이어서, 고체를 DCM 중에 재용해시키고, 추가의 포화 수성 NaHCO3 (3 x)으로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 용매를 진공 하에 제거하였다. 이어서, 고체를 헥산:EtOAc 95:5 → 90:10으로 연화처리하여 2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(디-tert-부톡시포스포릴옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일카르바메이트 61d (117 mg, HPLC 순도: 86.1%)를 베이지색 고체로서 수득하였으며, 이를 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
HRMS m/z 989.2289 [(M+Na)+ 계산치 C47H53Cl2N4NaO8PS2 989.2312].
TFA (1 mL)를 DCM (2 mL) 중 61d의 교반 용액에 0℃에서 적가하고, 혼합물을 이 온도에서 70분 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 25℃에서 진공 하에 제거하였다. 생성된 흑색 잔류물을 DCM 중에 용해시키고, 용액을 EtOAc로 희석하였다. DCM을 진공 하에 제거하여 EtOAc 중 현탁액을 수득하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고, EtOAc 및 헥산으로 연화처리하고, 건조시켜 녹색 고체를 수득하였다. 이를 추가로 정제용 HPLC (칼럼: 시너지-맥스 RP 4 μ, 21.20 x 250 mm; 유량: 12 mL/분; 이동상: 용매 A: H2O/TFA pH 2.6, 용매 B: MeCN/H2O 90:10; 방법: 구배, 용매 A:용매 B 60:40 → 2:98, 35분; 파장: 254 nm, 330 nm)에 의해 정제하여 61 (16 mg, 61c로부터 2 단계에 걸쳐 8%, HPLC 순도: 97.2%)을 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 9.69 (s, 1H), 8.57-8.46 (m, 3H), 8.09 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.01 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.91 (dd, J = 8.3, 2.4 Hz, 2H), 7.82 (d, J = 3.3 Hz, 2H), 7.59-7.52 (m, 2H), 7.47-7.40 (m, 2H), 7.27-7.23 (m, 1H), 4.42-4.22 (m, 8H), 4.06-4.01 (m, 2H), 3.90 (td, J = 11.2, 7.4 Hz, 2H), 3.19 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.77-2.59 (m, 4H), 2.01-1.94 (m, 2H). 2개의 양성자는 관찰되지 않음. 31P NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) -6.01. HRMS m/z 877.1053 [(M+Na)+ 계산치 C39H37Cl2N4NaO8PS2 877.1060]. [α]D 24 = -42.3o (c = 0.213, DMSO).
실시예 12 2-(피리딘-2-일디술파닐)프로필 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(포스포노옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일카르바메이트 62
트리에틸아민, Et3N (0.92 mL, 6.62 mmol) 및 트리플산 무수물 (1.03 mL, 6.11 mmol)을 0℃에서 DCM (160 mL) 중 51a (1.70 g, 5.09 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 도 16을 참조한다. 반응물을 0℃에서 20분 동안 교반한 다음 H2O로 희석하고, 층을 분리하고, 수성 층을 DCM (1 x)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 헥산:EtOAc 100:0 → 95:5를 사용하여 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-(트리플루오로메틸술포닐옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 62a (2.20 g, 93%)를 베이지색 발포성 고체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, CDCl3) 8.30 (br s, 1H), 8.03 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.76 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.62-7.59 (m, 1H), 7.53-7.49 (m, 1H), 4.32 (br s, 1H), 4.21-4.15 (m, 1H), 4.09-4.03 (m, 1H), 3.92 (dd, J = 11.2, 2.8 Hz, 1H), 3.54-3.49 (m, 1H), 1.61 (s, 9H).
건조 THF (60 mL) 중 62a (2.15 g, 4.61 mmol)의 용액을 밀봉된 튜브에서 Cs2CO3 (2.10 g, 6.44 mmol), BINAP (430 mg, 0.690 mmol) 및 Pd(OAc)2 (155 mg, 0.690 mmol)의 혼합물에 질소 하에 첨가하였다. 이어서, 디페닐메탄이민 (1.0 mL, 5.98 mmol)을 반응 혼합물에 첨가하고, 질소를 혼합물을 통해 10분 동안 버블링하였다. 밀봉된 튜브를 60-65℃에서 4일 동안 가열하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, DCM으로 희석하고, 셀라이트를 통해 여과하고, 세척물에 색상이 더 이상 없어질 때까지 셀라이트 플러그를 DCM으로 세척하고, 여과물을 진공 하에 증발시켰다. 잔류물을 헥산:DCM 100:0 → 50:50을 사용하여 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-(디페닐메틸렌아미노)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 53f (2.09 g, 91%)를 황색의 발포성 고체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 7.85 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.61-7.57 (m, 1H), 7.54-7.49 (m, 3H), 7.37-7.33 (m, 1H), 7.30-7.23 (m, 3H), 7.06 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 4.14-4.02 (m, 2H), 3.99-3.94 (m, 2H), 3.77 (dd, J = 10.8, 7.4 Hz, 1H), 1.46 (s, 9H), 1H는 관찰되지 않음. HRMS m/z 497.1984 [(M+H)+ 계산치 C31H30ClN2O2 497.1990]. [α]D 28 = -101.5o (c = 0.995, DCM).
빙초산, HOAc (65 mL)를 THF 및 H2O (195 mL/98 mL) 중 53f (1.30 g, 2.62 mmol)의 교반 용액에 실온에서 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 18시간 후, 30℃ 초과로 가열하지 않으면서 반응 혼합물을 진공 하에 농축시켜 대부분의 THF를 제거하였다. 이어서, 혼합물을 EtOAc (200 mL)로 희석하고, 유기 층을 분리하고, 포화 수성 NaHCO3 (4 x, 세척물이 pH 8이 될 때까지)으로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 잔류물을 헥산:EtOAc 100:0 → 90:10을 사용하여 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (S)-tert-부틸 5-아미노-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 61a (503 mg, 58%)를 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 8.01 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.40 (ddd, J = 8.1, 6.8, 0.9 Hz, 1H), 7.36 (br s, 1H), 7.20 (ddd, J = 8.1, 6.8, 1.1 Hz, 1H), 5.91 (s, 2H), 4.11-3.91 (m, 4H), 3.66 (dd, J = 10.6, 8.2 Hz, 1H), 1.53 (s, 9H).
건조 THF (10 mL) 중 2-메르캅토프로판산 (3.02 g, 28.5 mmol)의 용액을 건조 THF (40 mL) 중 LiAlH4 (1.29 g, 34.0 mmol)의 교반 현탁액에 0℃에서 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 0℃로 냉각시키고, H2O (5 mL) 및 5% 수성 NaOH 용액 (3 mL)으로 켄칭하였다. 혼합물을 0℃에서 20분 동안 교반하고, 셀라이트를 통해 여과하고, 셀라이트 플러그를 Et2O (3 x)로 세척하고, 합한 유기부를 건조 (Na2SO4)시키고, 여과하고, 용매를 제거하여 2-메르캅토프로판-1-올 (944 mg)을 수득하였으며, 이를 후속 단계에 정제 없이 사용하였다. MeOH (7 mL) 중 1,2-디(피리딘-2-일)디술판 (Bioorg. Med. Chem. Lett. (2011) 21:4985-4988.) (470 mg, 5.10 mmol)의 용액을 MeOH (4 mL) 중 2-메르캅토프로판-1-올의 용액에 실온에서 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 17.5시간 후, 용매를 진공 하에 제거하였다. 헥산:DCM 50:50 → 0:100에 이어서 DCM:EtOAc 99:1 → 75:25를 사용하여 알루미나 (중성) 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 2-(피리딘-2-일디술파닐)프로판-1-올 (528 mg, 2-메르캅토프로판산으로부터 2 단계에 걸쳐 18%)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, CDCl3) 8.50 (ddd, J = 5.0, 1.8, 0.9 Hz, 1H), 7.57 (ddd, J = 8.0, 7.4, 1.8 Hz, 1H), 7.39 (td, J = 8.1, 1.0 Hz, 1H), 7.15 (ddd, J = 7.4, 5.0, 1.1 Hz, 1H), 5.93 (dd, J = 8.8, 5.8 Hz, 1H), 3.68 (ddd, J = 12.5, 8.8, 3.8 Hz, 1H), 3.40 (ddd, J = 12.4, 7.8, 5.8 Hz, 1H), 3.14-3.06 (m, 1H), 1.31 (d, J = 6.9 Hz, 3H).
건조 DCM (10 mL) 중 트리포스겐 (127 mg, 0.428 mmol)의 용액을 실온에서 건조 DCM (40 mL) 중 61a (250 mg, 0.751 mmol) 및 DMAP (551 mg, 4.51 mmol)의 혼합물에 천천히 첨가하였다. 황색 고체가 즉시 침전되었다. 30분 후, 건조 DCM (6 mL) 중 2-(피리딘-2-일디술파닐)프로판-1-올 (420 mg, 2.09 mmol)의 용액을 첨가하고, 침전물을 용해시켰다. 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 18시간 후, 1M NaOH (30 mL)를 첨가하고, 혼합물을 교반하였다. 이어서, 층을 분리하고, 유기 층을 건조 (Na2SO4)시키고, MeOH (15 mL)로 희석하고, 실리카 겔 상에 흡수시켰다. 생성물을 헥산:DCM 100:0 → 50:50 → 0:100에 이어서 DCM:EtOAc 99:1 → 92:8을 사용하여 용리시켰다. 이어서, 물질을 다시 헥산:DCM 100:0 → 50:50 → 0:100에 이어서 DCM:EtOAc 98:2 → 95:5를 사용하여 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하였다. 이와 같이 하여 62b 및 2-(피리딘-2-일디술파닐)프로판-1-올의 혼합물 (385 mg)을 수득하였다. 이 혼합물을 후속 단계에 사용하였다. DMF (1 mL) 중 TBDMSCl (81 mg, 0.535 mmol)의 용액을 0℃에서 DMF (2 mL) 중 62b 및 2-(피리딘-2-일디술파닐)프로판-1-올, 및 이미다졸 (36 mg, 0.535 mmol)의 교반 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고, 50분 동안 교반한 다음, EtOAc 및 H2O로 희석하였다. 혼합물을 잘 교반하고, 층을 분리하고, 유기 층을 H2O (3 x)로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피 (헥산:DCM 50:50 → 0:100에 이어서 DCM:EtOAc 95:5)에 의해 정제하여 (1S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-((2-(피리딘-2-일디술파닐)프로폭시)카르보닐아미노)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 62b (295 mg, 화합물 61a로부터 2 단계에 걸쳐 70%)를 연황색 발포성 고체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, CDCl3) 8.49 (br s, 1H), 8.46 (ddd, J = 4.8, 1.7, 0.8 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.75-7.73 (m, 2H), 7.64-7.60 (m, 1H), 7.54 (ddd, J = 8.1, 6.9, 1.0 Hz, 1H), 7.42 (ddd, J = 8.2, 6.8, 1.1 Hz, 1H), 7.08 (ddd, J = 7.4, 4.9, 0.8 Hz, 1H), 6.97 (br s, 1H), 4.37-4.28 (m, 3H), 4.17-4.11 (m, 1H), 4.05-3.99 (m, 1H), 3.92 (dd, J = 11.1, 2.5 Hz, 1H), 3.47 (t, J = 10.7 Hz, 1H), 3.38-3.30 (m, 1H), 1.62 (s, 9H), 1.41 (d, J = 6.9 Hz, 3H). HRMS m/z 582.1265 [(M+Na)+ 계산치 C27H30ClN3NaO4S2 582.1258].
TFA (7 mL)를 0℃에서 DCM (14 mL) 중 62b (285 mg, 509 mmol)의 용액에 천천히 첨가하고, 혼합물을 이 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 DCM 및 H2O로 희석하고, pH 7이 될 때까지 포화 수성 NaHCO3으로 중화시켰다. 층을 분리하고, 유기 층을 H2O (1 x)로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하여 2-(피리딘-2-일디술파닐)프로필 (S)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일카르바메이트 62c (220 mg, 94%)를 황색 고체로서 수득하였으며, 이를 후속 단계에 정제 없이 사용하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 9.52 (s, 1H), 8.45 (ddd, J = 4.8, 1.7, 0.8 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.85-7.83 (m, 1H), 7.79-7.75 (m, 1H), 7.64 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.39 (ddd, J = 8.1, 6.8, 1.0 Hz, 1H), 7.23 (ddd, J = 7.3, 4.8, 1.0 Hz, 1H), 7.15 (ddd, J = 8.1, 6.8, 1.0 Hz, 1H), 7.08 (s, 1H), 5.93 (br s, 1H), 4.24-4.13 (m, 2H), 4.02-3.96 (m, 1H), 3.85 (dd, J = 10.8, 3.5 Hz, 1H), 3.70 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 3.63-3.55 (m, 2H), 3.43-3.36 (m, 1H), 1.34 (d, J = 6.9 Hz, 3H).
DMA (10 mL) 중 (S)-5-(1-(클로로메틸)-5-(디-tert-부톡시포스포릴옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜탄산 57d (365 mg, 0.676 mmol)의 용액을 실온에서 62c (215 mg, 0.467 mmol) 및 EDCI.HCl (268 mg, 1.40 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. TsOH (16 mg, 0.0929 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 질소 하에 (3A 분자체 상에서) 밤새 교반하였다. 27.5시간 후, 혼합물을 EtOAc 및 H2O로 희석하고, 잘 진탕시키고, 층을 분리하였다. 유기 층을 포화 수성 NaHCO3 (3 x), 염수 (1 x)로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 DCM 중에 용해시키고, 고체가 용액으로부터 침전될 때까지 헥산으로 희석하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 고체를 헥산:EtOAc 95:5로 연화처리하여 2-(피리딘-2-일디술파닐)프로필 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(디-tert-부톡시포스포릴옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일카르바메이트 62d (372 mg)를 황갈색 고체로서 수득하였으며, 이를 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
HRMS m/z 1003.2445 [(M+Na)+ 계산치 C48H55Cl2N4NaO8PS2 1003.2468].
TFA (3.5 mL)를 0℃에서 DCM (7 mL) 중 62d (상기와 같이 제조됨)의 교반 용액에 천천히 첨가하였다. 혼합물을 이 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 25℃에서 진공 하에 제거하였다. 생성된 암녹색 잔류물을 DCM 중에 용해시키고, 용액을 EtOAc로 희석하여 용액으로부터 고체가 침전되도록 유도하였다. 용매를 30℃에서 진공 하에 제거하고, 잔류물을 다시 DCM 중에 용해시키고, EtOAc로 희석하였다. DCM을 진공 하에 제거하여 EtOAc 중 현탁액을 수득하였다. 고체를 여과에 의해 수집한 다음, 고체를 EtOAc 및 헥산으로 세척하고, 건조시켜 녹색 고체를 수득하였다. 이를 추가로 정제용 HPLC (칼럼: 시너지-맥스 RP 4 μ, 21.20 x 250 mm; 유량: 12 mL/분; 이동상: 용매 A: H2O/포름산암모늄 완충제 pH 3.5, 용매 B: MeCN/H2O 90:10; 방법: 구배, 19분에 걸쳐 용매 A:용매 B 25:75 → 0:100)에 의해 정제하여 2-(피리딘-2-일디술파닐)프로필 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(포스포노옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일카르바메이트 62 (78 mg, 62c로부터 2 단계에 걸쳐 19%, HPLC 순도: 87.4%)를 크림색 분말로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 9.69 (s, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.44 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 8.15 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.00 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.85-7.76 (m, 3H), 7.55-7.48 (m, 2H), 7.44-7.40 (m, 1H), 7.36-7.32 (m, 1H), 7.24-7.21 (m, 1H), 4.41-4.14 (m, 8H), 4.05-3.99 (m, 2H), 3.91 (dd, J = 10.8, 7.2 Hz, 1H), 3.85-3.81 (m, 1H), 3.37-3.28 (m, 1H), 2.74-2.57 (m, 4H), 1.98-1.95 (m, 2H), 1.34 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 2개의 양성자는 관찰되지 않음. 31P NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) -5.09. HRMS m/z 891.1221 [(M+Na)+ 계산치 C40H39Cl2N4NaO8PS2 891.1216].
실시예 13 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-메틸헥산아미도)에틸(메틸)카르바메이트 63
(S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(포스포노옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-메틸헥산아미도)에틸(메틸)카르바메이트 57을 효소에 의해 탈인산화시켜 63을 수득하였다.
실시예 14 2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일카르바메이트 64
2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸 (S)-1-(클로로메틸)-3-(5-((S)-1-(클로로메틸)-5-(포스포노옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-5-옥소펜타노일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일카르바메이트 61을 효소에 의해 탈인산화시켜 64를 수득하였다.
실시예 15 (11aS)-4-((S)-6-아미노-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)헥산아미도)벤질 8-(6-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-메틸피페라진-1-카르보닐옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-6-옥소헥실옥시)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 65
실온에서 건조 DCM (10 mL) 중 (S)-2,2,2-트리클로로에틸 6-(5-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-(2-(히드록시메틸)피롤리딘-1-카르보닐)-2-메톡시페녹시)헥사노에이트 54c (1.66 g, 2.71 mmol)의 교반 용액에 아세트산 무수물 (1.29 mL, 13.6 mmol) 및 트리에틸아민 (2.27 mL, 16.3 mmol)을 첨가하였다. 도 17을 참조한다. 반응 혼합물을 추가로 4시간 동안 교반하였다. 건조 MeOH (1.5 mL)를 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트 (200 mL)를 첨가하고, 에틸 아세테이트 층을 분리한 다음, 물로 여러 번 세척하였다. 에틸 아세테이트 용액을 건조 (MgSO4)시키고, 증발시켜 (S)-2,2,2-트리클로로에틸 6-(4-(2-(아세톡시메틸)피롤리딘-1-카르보닐)-5-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2-메톡시페녹시)헥사노에이트 65a (1.8 g, 100%)를 연황색 점착물로서 수득하였다.
1H NMR [(CD3)2SO] δ 8.82 (br s, 1 H), 7.27 (s, 1 H), 6.86 (s, 1 H), 4.89 (s, 2 H), 4.39-4.20 (m, 3 H), 3.93 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 3.74 (s, 3 H), 3.50-3.33 (m, 2 H), 2.10-1.94 (m, 4 H), 1.92-1.61 (m, 7 H), 1.53-1.42 (m, 2 H), 1.43 (s, 9 H), 2 H는 DMSO 피크에 의해 가려짐. HRMS (ESI) m/z 계산치 C28H39Cl3N2NaO9: 675.1613, 실측치: 675.1603 [MNa+]. 계산치 C28H40Cl3N2O9: 653.1794, 실측치: 653.1778 [MH+].
질소 하에 아세톤 (30 mL), 물 (20 mL), 및 THF (12 mL)의 혼합물 중 65a (1.76 g, 2.69 mmol)의 교반 용액에 Zn (7.06 g, 108 mmol) 및 NH4Cl (11.6 g, 216 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 23시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트 (100 mL)를 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 유기 층을 경사분리하였다. 추출을 추가의 에틸 아세테이트 (2x100 mL)를 사용하여 반복하였다. 합한 유기 용액을 물 (2x100 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 셀라이트를 통해 여과하고, 증발시켜 (S)-6-(4-(2-(아세톡시메틸)피롤리딘-1-카르보닐)-5-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2-메톡시페녹시)헥산산 65b (1.36 g, 96%)를 점착성 무색 발포체로서 수득하였다.
1H NMR [(CD3)2SO] δ 11.49 (매우 br s, 1 H), 8.83 (s, 1 H), 7.27 (s, 1 H), 6.86 (br s, 1 H), 4.39-4.02 (m, 3 H), 3.93 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 3.74 (s, 3 H), 3.51-3.33 (m, 2 H, 물 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.21 (t, J = 7.1 Hz, 2 H), 2.11-1.93 (m, 4 H), 1.90-1.66 (m, 5 H), 1.62-1.50 (m, 2 H), 1.50-1.35 (m, 2 H), 1.43 (s, 9 H). 분석 (C26H38N2O9.) 계산치: C, 59.76; H, 7.33; N, 5.36. 실측치: C, 59.66; H, 7.49; N, 5.29.
질소 분위기 하에 0℃에서 건조 DMA (5 mL) 중 65b (0.87 g, 2.41 mmol) 및 (S)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트 58b (1.26 g, 2.41 mmol)의 교반 용액에 p-디옥산 중 4M HCl (1.21 mL, 4.82 mmol)에 이어서 EDCI.HCl (1.39 g, 7.23 mmol), 및 무수 TsOH (83 mg, 0.48 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소 하에 0℃에서 21시간 동안 교반한 다음, 에틸 아세테이트 (500 mL)와 물 (500 mL) 사이에 분배하였다. 에틸 아세테이트 층을 분리하고, 수성 층을 추가의 에틸 아세테이트 (200 mL)로 추가로 추출하였다. 합한 에틸 아세테이트 추출물을 물 (200 mL), 포화 NaHCO3 용액 (2x200 mL) 및 물 (200 mL)로 연속적으로 세척하였다. 에틸 아세테이트 층을 건조시키고, 증발시켜 (S)-3-(6-(4-((S)-2-(아세톡시메틸)피롤리딘-1-카르보닐)-5-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2-메톡시페녹시)헥사노일)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트 65c (1.66 g, 80%)를 베이지색 고체-발포체로서 수득하였다.
mp 84-87℃; 1H NMR [(CD3)2SO] δ 8.84 (br s, 1 H), 8.21 (s, 1 H), 7.95 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.81 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.58 (br t, J = 7.7, 1 H), 7.46 (br t, J = 8.1 Hz, 1 H), 7.29 (s, 1 H), 6.86 (s, 1 H), 4.40 (t, J = 10.0 Hz, 1 H), 4.36-3.86 (m, 10 H), 3.83-3.74 (m, 1 H), 3.73 (s, 3 H), 3.54-3.36 (m, 4 H), 2.67-2.34 (m, 6 H, DMSO 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.26 (s, 3 H), 2.02 (br s, 3 H), 1.93-1.62 (m, 8 H), 1.60-1.47 (m, 2 H), 1.42 (s, 9 H). 분석 (C45H58ClN5O10·1½H2O) 계산치: C, 60.63; H, 6.90; N, 7.86. 실측치: C, 60.39; H, 6.66; N, 8.08.
질소 분위기 하에 0℃에서 DCM (20 mL) 중 65c (2.17 g, 2.51 mmol)의 교반 용액에 TFA (20 mL)를 첨가하였다. 첨가한 후, 혼합물을 이 온도에서 2.5시간 동안 추가로 교반하였다. 혼합물을 NaHCO3 (50 g), 물 (700 mL), 및 DCM (500 mL)의 차가운 (0℃) 혼합물에 붓고, 15분 동안 교반하였다 (pH 약 8). DCM 층을 분리하고, 추가의 수성 NaHCO3 (200 mL) 및 물 (200 mL)로 세척한 다음, 건조시켰다 (MgSO4). 용매를 증발시켜 (S)-3-(6-(4-((S)-2-(아세톡시메틸)피롤리딘-1-카르보닐)-5-아미노-2-메톡시페녹시)헥사노일)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트 65d를 연갈색 고체-발포체 (1.76 g, 92%)로서 수득하였다.
mp 62℃; 1H NMR [(CD3)2SO] δ 8.21 (s, 1 H), 7.95 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.81 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.57 (br t, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.46 (br t, J = 7.2 Hz, 1 H), 6.67 (s, 1 H), 6.37 (s, 1 H), 5.09 (s, 2 H), 4.41 (t, J = 9.7 Hz, 1 H), 4.36-4.20 (m, 3 H), 4.17-4.00 (m, 3 H), 3.97-3.86 (m, 3 H), 3.81-3.70 (m, 2 H), 3.63 (s, 3 H), 3.54-3.32 (m, 5 H), 2.66-2.34 (m, 6 H, DMSO 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.26 (s, 3 H), 2.08-1.96 (m, 1 H), 2.10 (s, 3 H), 1.93-1.63 (m, 7 H), 1.57-1.45 (m, 2 H). 분석 (C40H50ClN5O8·½H2O) 계산치: C, 62.13; H, 6.65; N, 9.06. 실측치: C, 62.12; H, 6.76; N, 8.77.
건조 DMA (10 mL) 중 (S)-2-(알릴옥시카르보닐아미노)-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥산산 65e (3.30 g, 10.0 mmol) 및 EEDQ (3.71 g, 15.0 mmol)의 혼합물을 질소 하에 실온에서 15분 동안 교반하였다. 도 18을 참조한다. 상기 예비형성된 혼합물에 건조 DMA (3 mL) 중 4-((tert-부틸디메틸실릴옥시)메틸)아닐린 (DMF 중 상응하는 p-니트로벤질 알콜 및 TBDMSCl로부터 제조, 이어서 Zn/NH4Cl을 사용하여 환원) (2.37 g, 10.0 mmol)의 용액을 첨가하였다. 최종 반응 혼합물을 실온에서 질소 분위기 하에 23시간 동안 추가로 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (500 mL)와 물 (500 mL) 사이에 분배하였다. 에틸 아세테이트 층을 분리하고, 포화 NaHCO3 (2x300 mL) 및 물 (300 mL)로 연속적으로 세척한 다음, 건조시켰다 (MgSO4). 용매를 증발시켜 오렌지색 오일을 수득하였으며, 이를 실리카 칼럼 크로마토그래피 (10-35%의 석유 에테르-에틸 아세테이트 구배)에 의해 정제하여 TBDMS-보호된 리신 65f (4.87 g, 89%)를 점착성 베이지색 고체-발포체로서 수득하였다.
1H NMR [(CD3)2SO] δ 9.97 (s, 1 H), 7.55 (d, J = 8.50 Hz, 2 H), 7.44 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 7.21 (d, J = 8.5 Hz, 2 H), 6.75 (t, J = 5.3 Hz, 1 H), 5.99-5.82 (m, 1 H), 5.28 (br d, J = 17.2 Hz, 1 H), 5.17 (br d, J = 10.5 Hz, 1 H), 4.64 (s, 2 H), 4.46 (d, J = 5.2 Hz, 2 H), 4.12-4.02 (m, 1 H), 2.93-2.83 (m, 2 H), 1.70-1.52 (m, 2 H), 1.46-1.20 (m, 4 H), 1.35 (s, 9 H), 0.89 (s, 9 H), 0.06 (s, 6 H). HRMS (ESI) m/z 계산치 C28H47N3NaO6Si: 572.3126, 실측치: 572.3136 [MNa+].
실온에서 THF (30 mL) 중 65f (4.81 g, 8.75 mmol)의 교반 용액에 THF 중 테트라부틸암모늄 플루오라이드의 1M 용액 (17.5 mL, 17.5 mmol)을 첨가하였다. 첨가한 후, 혼합물을 이 온도에서 추가로 2.5시간 동안 교반하였다. 수성 NH4Cl (300 mL)을 첨가하고, 생성물을 에틸 아세테이트 (500 mL) 내로 추출하였다. 에틸 아세테이트를 물 (2x100 mL)로 세척하고, 건조시켰다 (MgSO4). 용매를 증발시켜 벤질 알콜 리신 65g (3.81 g, 100%)를 베이지색 고체로서 수득하였다.
mp 101-103℃; 1H NMR [(CD3)2SO] δ 9.94 (s, 1 H), 7.52 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 7.44 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 7.23 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 6.76 (t, J = 5.4 Hz, 1 H), 5.97-5.84 (m, 1 H), 5.29 (br d, J = 17.2 Hz, 1 H), 5.17 (br d, J = 10.4 Hz, 1 H), 5.08 (t, J = 5.7 Hz, 1 H), 4.47 (d, J = 5.3 Hz, 2 H), 4.43 (d, J = 5.7 Hz, 2 H), 4.13-4.03 (m, 1 H), 2.96-2.82 (m, 2 H), 1.72-1.52 (m, 2 H), 1.46-1.20 (m, 4 H), 1.36 (s, 9 H). HRMS (ESI) m/z 계산치 C22H33N3NaO6: 458.2262, 실측치: 458.2272 [MNa+]; 계산치 C22H33N3KO6: 474.2001, 실측치: 474.1998 [MK+].
질소 하에 실온에서 건조 DCM (15 mL) 중 65d (764 mg, 1.00 mmol) 및 DMAP (367 mg, 3.00 mmol)의 교반 용액에 건조 DCM 중 디포스겐의 용액 (mL당 0.05 mmol, 12 mL, 0.60 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 추가로 20분 동안 교반하였다. 도 19를 참조한다. 이 혼합물에 건조 DCM (80 mL) 중 65g (3.97 g, 9.13 mmol)의 용액을 첨가하였다. 최종 반응 혼합물을 실온에서 질소 분위기 하에 48시간 동안 추가로 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (500 mL)와 물 (300 mL) 사이에 분배하였다. 에틸 아세테이트 층을 분리하고, 수성 층을 추가로 에틸 아세테이트 (2x200 mL)로 추출하였다. 합한 에틸 아세테이트 용액을 추가의 물 (2x200 mL)로 세척하고, 건조시켰다 (MgSO4). 30℃ (조 온도)에서 용매를 증발시켜 오렌지색 오일을 수득하였으며, 이를 실리카 칼럼 크로마토그래피 (에틸 아세테이트-MeOH = 10:1)에 의해 정제하여 (S)-3-(6-(4-((S)-2-(아세톡시메틸)피롤리딘-1-카르보닐)-5-((4-((S)-2-(알릴옥시카르보닐아미노)-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥산아미도)벤질옥시)카르보닐아미노)-2-메톡시페녹시)헥사노일)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트 65h (1.04 g, 85%)를 연오렌지색 고체로서 수득하였다.
mp 90-93℃; 1H NMR [(CD3)2SO] δ 10.04 (s, 1 H), 9.10 (br s, 1 H), 8.21 (s, 1 H), 7.95 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.81 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.63-7.53 (m, 3 H), 7.51-7.42 (m, 2 H), 7.32 (d, J = 8.5 Hz, 2 H), 7.21 (br s, 1 H), 6.85 (br s, 1 H), 6.79-6.72 (m, 1 H), 5.97-5.83 (m, 1 H), 5.29 (br d, J = 17.2 Hz, 1 H), 5.17 (br d, J = 10.4 Hz, 1 H), 5.08-4.96 (m, 2 H), 4.52-4.37 (m, 3 H), 4.37-3.85 (m, 10 H), 3.83-3.66 (m, 2 H), 3.74 (s, 3 H), 3.54-3.41 (m, 2 H), 3.41-3.23 (m, 2 H, 물 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.95-2.83 (m, 2 H), 2.66-2.34 (m, 6 H, DMSO 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.25 (s, 3 H), 2.07-1.92 (m, 4 H), 1.87-1.45 (m, 11 H), 1.45-1.20 (m, 4 H), 1.35 (s, 9 H). HRMS (ESI) m/z 계산치 C63H82ClN8O15: 1225.5583, 실측치: 1225.5557 [MH+]; 계산치 C63H81ClN8NaO15: 1247.5402, 실측치: 1247.5401 [MNa+]; 계산치 C63H81ClKN8O15: 1263.5142, 실측치: 1263.5141 [MK+].
DCM (20 mL) 및 MeOH (10 mL) 중 65h (1.01 g, 0.824 mmol) 및 K2CO3 (1.14 g, 8.24 mmol)의 혼합물을 실온에서 1시간 40분 동안 교반하였다. 혼합물을 DCM (200 mL)으로 희석하고, 빙수 (200 mL)와 함께 10분 동안 교반하였다. DCM 층을 분리하고, 수성 층을 추가로 DCM (2x100 mL)으로 추출하였다. 합한 DCM 용액을 추가의 물 (200 mL)로 세척하고, 건조시켰다 (MgSO4). 25℃ (조 온도)에서 용매를 증발시켜 (S)-3-(6-(5-((4-((S)-2-(알릴옥시카르보닐아미노)-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥산아미도)벤질옥시)카르보닐아미노)-4-((S)-2-(히드록시메틸)피롤리딘-1-카르보닐)-2-메톡시페녹시)헥사노일)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 4-메틸피페라진-1-카르복실레이트 65i (0.94 g, 96%)를 베이지색 고체로서 수득하였다.
mp 104-107℃; 1H NMR [(CD3)2SO] δ 10.04 (s, 1 H), 9.17 (br s, 1 H), 8.21 (s, 1 H), 7.95 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.80 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.63-7.53 (m, 3 H), 7.51-7.42 (m, 2 H), 7.38-7.21 (m, 3 H), 6.93 (s, 1 H), 5.32 (t, J = 5.4 Hz, 1 H), 5.98-5.83 (m, 1 H), 5.30 (br d, J = 17.2 Hz, 1 H), 5.17 (br d, J = 11.7 Hz, 1 H), 5.03 (s, 2 H), 4.73 (t, J = 5.7 Hz, 1 H), 4.52-4.36 (m, 3 H), 4.36-4.17 (m, 2 H), 4.17-3.85 (m, 6 H), 3.83-3.66 (m, 2 H), 3.73 (s, 3 H), 3.61-3.40 (m, 4 H), 3.40-3.20 (m, 2 H, 물 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.94-2.83 (m, 2 H), 2.67-2.34 (m, 6 H, DMSO 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.25 (s, 3 H), 1.96-1.45 (m, 12 H), 1.45-1.20 (m, 4 H), 1.35 (s, 9 H). HRMS (ESI) m/z 계산치 C61H80ClN8O14: 1183.5477, 실측치: 1183.5445 [MH+]; 계산치 C61H79ClN8NaO14: 1205.5296, 실측치: 1205.5256 [MNa+]; 계산치 C61H79ClKN8O14: 1221.5036, 실측치: 1221.5026 [MK+].
0℃에서 건조 DCM (20 mL) 중 65i (0.92 g, 0.78 mmol)의 교반 용액에 데스-마르틴 퍼아이오디난 (DMP, 1,1,1-트리아세톡시-1,1-디히드로-1,2-벤즈아이오독솔-3(1H)-온, CAS Reg. No. 87413-09-0, 492 mg, 1.16 mmol)을 조금씩 (8분에 걸쳐) 첨가하였다. 첨가가 완결된 후, 반응 혼합물을 추가로 0℃에서 2시간 동안, 이어서 실온에서 45시간 동안 교반하였다. 혼합물을 DCM (100 mL)으로 희석하고, 실온에서 10% Na2S2O3 (100 mL)과 함께 10분 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 DCM (400 mL)과 포화 NaHCO3 용액 (400 mL) 사이에 분배하였다. DCM 층을 분리하고, 수성 층을 추가로 DCM (2x100 mL)으로 추출하였다. 합한 DCM 용액을 추가로 포화 NaHCO3 용액 (200 mL) 및 물 (200 mL)로 세척한 다음, 건조시켰다 (MgSO4). 25℃ (조 온도)에서 용매를 증발시켜 연갈색 고체를 수득하였으며, 이를 SiO2 칼럼 크로마토그래피 (DCM-에틸 아세테이트-MeOH = 15:15:1, 15:15:3으로 구배)에 의해 정제하여 (S)-4-((S)-2-(알릴옥시카르보닐아미노)-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥산아미도)벤질 8-(6-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-메틸피페라진-1-카르보닐옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-6-옥소헥실옥시)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 65j (0.64g, 70%)를 연황색 고체로서 수득하였다.
mp 137℃ (분해); 1H NMR [(CD3)2SO] δ 10.02 (s, 1 H), 8.21 (s, 1 H), 7.95 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.80 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.65-7.38 (m, 5 H), 7.18 (d, J = 7.0 Hz, 2 H), 7.03 (s, 1 H), 6.82-6.63 (m, 2 H), 6.49 (불완전하게 분해된 d, J = 4.7 Hz, D2O로 교환가능함, 1 H), 5.96-5.82 (m, 1 H), 5.46 (불완전하게 분해된 dd, J = 9.8, 4.7 Hz, D2O 후에 d로 됨, J = 10.1 Hz, 1 H), 5.27 (br d, J = 17.1 Hz, 1 H), 5.21-5.10 (m, 2 H), 4.81 (br d, J = 12.3 Hz, 1 H), 4.51-4.17 (m, 5 H), 4.13-3.84 (m, 4 H), 3.84-3.67 (m, 2 H), 3.77 (s, 3 H), 3.55-3.20 (m, 6 H, 물 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.66-2.30 (m, 6 H, DMSO 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.26 (s, 3 H), 2.10-1.20 (m, 16 H), 1.35 (s, 9 H). HRMS (ESI) m/z 계산치 C61H78ClN8O14:1181.5321, 실측치: 1181.5286 [MH+]; 계산치 C61H77ClN8NaO14: 1203.5140, 실측치: 1203.5130 [MNa+]; 계산치 C61H77ClKN8O14: 1219.4879, 실측치: 1219.4861 [MK+].
질소 분위기 하에 0℃에서 건조 DCM (15 mL) 중 65j (623 mg, 0.53 mmol)의 교반 용액에 피롤리딘 (0.86 mL, 10.5 mmol)에 이어서 Pd(Ph3P)4 (30 mg, 9.8% Pd)를 첨가하였다. 첨가한 후, 반응 혼합물을 추가로 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 석유 에테르 (100 mL)로 희석하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 용매를 불용성 물질로부터 경사분리하고, 세척 단계를 DCM-석유 에테르 (1:10) (100 mL)를 사용하여 반복하였다. 남아 있는 점착성 고체를 DCM (200 mL) 중에 용해시키고, 물 (3x100 mL)로 세척하고, 이어서 건조시키고 (MgSO4), 짧은 SiO2 칼럼에 통과시켜 기저 물질을 제거하였다. 필요한 화합물을 DCM-MeOH 구배 (2 → 5%)를 사용하여 용리시켰다. 25℃ (조 온도)에서 용매를 증발시켜 연황색 고체-발포체 (472 mg, 82%)를 수득하였으며, 이를 직접 후속 단계에 사용하였다. 이 조 아민을 실온에서 질소 분위기 하에 건조 DMA (8 mL) 중 Fmoc-val-Osu (N-α-Fmoc-L-발린 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 550 mg, 1.26 mmol)로 처리하고, 혼합물을 5시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트-석유 에테르 (1:10, 100 mL)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 용매를 불용성 물질로부터 경사분리하고, 세척 단계를 추가의 에틸 아세테이트-석유 에테르 (1:10, 2x50 mL)를 사용하여 반복하였다. 남아 있는 점착성 고체를 건조시키고, SiO2 칼럼 크로마토그래피 (DCM-에틸 아세테이트-MeOH = 20:10:3)에 의해 정제하여 (S)-4-((S)-2-((S)-2-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)-3-메틸부탄아미도)-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥산아미도)벤질 8-(6-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-메틸피페라진-1-카르보닐옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-6-옥소헥실옥시)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 65k (246 mg, 47%)를 무색 고체로서 수득하였다.
mp 143℃ (분해); 1H NMR [(CD3)2SO] δ 10.03 (s, D2O로 교환가능함, 1 H), 8.21 (s, 1 H), 8.05 (br d, J = 7.5 Hz, D2O로 교환가능함, 1 H), 7.95 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.87 (d, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.81 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.72 (t, J = 7.0 Hz, 2 H), 7.62-7.25 (m, 10 H, D2O 후에 9 H로 감소), 7.18 (불완전하게 분해된 d, J = 5.8 Hz, 2 H), 7.04 (s, 1 H), 6.70 (br s, 2 H, D2O 후에 1 H로 감소), 6.50 (br s, D2O로 교환가능함, 1 H), 5.53-5.40 (m, D2O 후에 d로 됨, J = 9.9 Hz, 1 H), 5.15 (br d, J = 12.4 Hz, 1 H), 4.82 (br d, J = 12.3 Hz, 1 H), 4.46-4.16 (m, 7 H), 4.07-3.85 (m, 4 H), 3.83-3.67 (m, 2 H), 3.76 (s, 3 H), 3.56-3.23 (m, 5 H, 물 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.93-2.79 (m, 2 H), 2.64-2.32 (m, 6 H, DMSO 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.25 (s, 3 H), 2.09-1.20 (m, 17 H), 1.35 (s, 9 H), 0.87 (d, J = 7.0 Hz, 3 H), 0.83 (d, J = 6.8 Hz, 3 H). HRMS (ESI) m/z 계산치 C77H93ClN9O15:1418.6474, 실측치: 1418.6420 [MH+]; 계산치 C77H92ClN9NaO15: 1440.6294, 실측치: 1440.6231 [MNa+]; 계산치 C77H92ClKN9O15: 1456.6033, 실측치: 1456.6021 [MK+].
질소 분위기 하에 0℃에서 건조 DMA (2 mL) 중 65k (224 mg, 0.158 mmol)의 교반 용액에 N,N-디메틸아세트아미드 중 피페리딘의 용액 (DMA, mL당 1.0 mmol, 1.58 mL, 1.58 mmol)을 첨가하였다. 도 20을 참조한다. 첨가한 후, 혼합물을 이 온도에서 추가로 1시간 45분 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트-석유 에테르의 혼합물 (1:5, 50 mL)을 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 20분 동안 교반하였다. 용매 층을 불용성 물질로부터 경사분리하고, 버렸다. 세척 단계를 실온에서 추가의 에틸 아세테이트-석유 에테르 (1:5, 2x30 mL)를 사용하여 반복하였다. 남아 있는 연황색 고체를 건조시켜 (S)-4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥산아미도)벤질 8-(6-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-메틸피페라진-1-카르보닐옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-6-옥소헥실옥시)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 65l (173 mg, 99%)을 수득하였다.
mp 74℃ (분해); 1H NMR [(CD3)2SO] δ 10.09 (s, D2O로 교환가능함, 1 H), 8.21 (s, 1 H), 8.08 (br s, D2O로 교환가능함, 1 H), 7.96 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.81 (d, J = 8.2 Hz, 1 H), 7.66-7.42 (m, 4 H), 7.19 (불완전하게 분해된 d, J = 7.5 Hz, 2 H), 7.04 (s, 1 H), 6.71 (br s, 2 H, D2O 후에 1 H로 감소), 6.49 (br s, D2O로 교환가능함, 1 H), 5.52-5.40 (m, D2O 후에 d로 됨, J = 10.6 Hz, 1 H), 5.16 (br d, J = 12.1 Hz, 1 H), 4.81 (br d, J = 11.7 Hz, 1 H), 4.49-4.18 (m, 4 H), 4.10-3.85 (m, 3 H), 3.85-3.67 (m, 2 H), 3.77 (s, 3 H), 3.59-3.22 (m, 5 H, 물 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 3.03-2.97 (m, D2O 후에 d로 됨, J = 4.8 Hz, 1 H), 2.91-2.81 (m, 2 H), 2.71-2.33 (m, 7 H, DMSO 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.25 (s, 3 H), 2.11-1.20 (m, 17 H), 1.34 (s, 9 H), 0.86 (d, J = 6.5 Hz, 3 H), 0.76 (d, J = 6.7 Hz, 3 H), 2 H는 관찰되지 않음. HRMS (ESI) m/z 계산치 C62H83ClN9O13:1196.5793, 실측치: 1196.5804 [MH+]; 계산치 C62H82ClN9NaO13: 1218.5613, 실측치: 1218.5612 [MNa+]; 계산치 C62H82ClKN9O13: 1234.5352, 실측치: 1234.5359 [MK+].
건조 DMA (2 mL) 중 65l (173 mg, 0.158 mmol) 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (말레이미도-Osu, 122 mg, 0.395 mmol)의 혼합물을 질소 분위기 하에 0℃에서 1시간 45분 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트-석유 에테르의 혼합물 (1:5, 50 mL)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하였다. 용매 층을 불용성 물질로부터 경사분리하고, 버렸다. 세척 단계를 실온에서 추가의 에틸 아세테이트-석유 에테르 (1:5, 2x30 mL)를 사용하여 반복하였다. 남아 있는 고체를 건조시키고, 실리카 칼럼 크로마토그래피 (DCM:에틸 아세테이트:MeOH = 20:10:3)에 의해 정제하여 (S)-4-((S)-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)헥산아미도)벤질 8-(6-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-메틸피페라진-1-카르보닐옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-6-옥소헥실옥시)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 65m (152 mg, 69%)을 연황색 고체로서 수득하였다.
HPLC: 90.6% 순도; mp 120℃; 1H NMR [(CD3)2SO] δ 9.95 (s, D2O로 교환가능함, 1 H), 8.21 (s, 1 H), 8.01 (d, J = 7.4 Hz, D2O로 교환가능함, 1 H), 7.95 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.85-7.73 (m, 2 H, D2O 교환 후에 1 H로 감소), 7.63-7.50 (m, 3 H), 7.46 (t, J = 7.7 Hz, 1 H), 7.17 (불완전하게 분해된 d, J = 8.4 Hz, 2 H), 7.04 (s, 1 H), 6.98 (s, 2 H), 6.81-6.66 (m, 2 H, D2O 교환 후에 1 H로 감소), 6.49 (불완전하게 분해된 d, J = 5.3 Hz, D2O로 교환가능함, 1 H), 5.51-5.41 (m, D2O 후에 d로 됨, J = 9.9 Hz, 1 H), 5.15 (d, J = 12.6 Hz, 1 H), 4.81 (br d, J = 11.3 Hz, 1 H), 4.41 (t, J = 9.7 Hz, 1 H), 4.37-4.27 (m, 2 H), 4.27-4.13 (m, 2 H), 4.10-3.85 (m, 3 H), 3.85-3.63 (m, 2 H), 3.77 (s, 3 H), 3.60-3.21 (m, 8 H, 물 피크에 의해 부분적으로 가려짐, 1 H), 2.92-2.81 (m, 2 H), 2.67-2.33 (m, 6 H, DMSO 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.26 (s, 3 H), 2.23-1.11 (m, 25 H), 1.30 (s, 9 H), 0.84 (d, J = 6.8 Hz, 3 H), 0.81 (d, J = 6.7 Hz, 3 H). HRMS (ESI) m/z 계산치 C72H94ClN10O16:1389.6532, 실측치: 1389.6478 [MH+]; 계산치 C72H94ClN10NaO16: 706.3212, 실측치: 706.3244 [MH+Na+]; 계산치 C72H93ClN10Na2O16: 717.3122, 실측치: 717.3121 [MNa+Na+].
0℃ (조 온도)에서 질소 하에 DCM (0.4 mL) 중 65m (32.2 mg, 0.023 mmol)의 교반 용액에 TFA (0.8 mL)에 이어서 TFA 중 2% 물의 용액 (0.8 mL)을 첨가하였다. 첨가한 후, 혼합물을 이 온도에서 추가로 8시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트-석유 에테르 (1:5, 25 mL)를 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하였다. 침전된 고체를 수집하고, 에틸 아세테이트-석유 에테르 (1:5, 2x30 ml)로 세척하고, 건조시켜 조 생성물 (30 mg)을 수득하였으며, 이를 정제용 HPLC [시너지맥스RP 칼럼; 물-TFA (pH = 2.56; 95% → 55%)/ CH3CN 중 10% H2O (5% → 45%); 유량: 12 mL/분]에 의해 정제하여 (S)-4-((S)-6-아미노-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)헥산아미도)벤질 8-(6-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-메틸피페라진-1-카르보닐옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-6-옥소헥실옥시)-11-히드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라히드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 65를 유리질 고체로서의 비스-트리플루오로아세테이트 염 (22.2 mg, 64%)으로서 수득하였다.
HPLC: 97.1% 순도; mp 114℃; [α]D +43.6o (c 0.275, MeOH); 1H NMR [(CD3)2SO] δ 9.97 (s, 1 H), 9.90 (br s, 1 H), 8.73 (br s, 2 H), 8.27 (s, 1 H), 8.09 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 8.04-7.93 (m, 2 H), 7.89 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.82 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 7.74-7.50 (m, 5 H), 7.46 (br t, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.22 (m, 2 H), 7.04 (s, 1 H), 7.00 (s, 2 H), 6.75 (s, 1 H), 6.51 (br s,1 H), 5.52-5.40 (m, 1 H), 5.18-5.04 (m, 1 H), 4.94-4.82 (m, 1 H), 4.48-3.70 (m, 14 H), 3.43-3.20 (m, 4 H, 물 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 3.17-3.05 (m, 3 H), 2.89 (s, 3 H), 2.82-2.70 (m, 2 H), 2.66-2.48 (m, 2 H, DMSO 피크에 의해 부분적으로 가려짐), 2.25-1.08 (m, 25 H), 0.91-0.77 (m, 6 H), 2 H는 관찰되지 않음. HRMS (ESI) m/z 계산치 C67H86ClN10O14:1289.6008, 실측치: 1289.5975 [MH+]; 계산치 C67H85ClN10NaO14: 1311.5827, 실측치: 1311.5772 [MNa+]; 계산치 C67H85ClN10Na2O14: 667.2860, 실측치: 667.2874 [MNa+Na+]; 계산치 C67H86ClN10NaO14:656.2950, 실측치: 656.2963 [MH+Na+]; 계산치 C67H87ClN10O14: 645.3040, 실측치: 645.3052 [MH+H+].
실시예 16 N-(3-(2,5-비스((E)-3-((S)-1-(클로로메틸)-5-포스폰옥시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-3-옥소프로프-1-에닐)페닐아미노)-3-옥소프로필)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 66
빙조에서 냉각시킨 DCM (15 mL) 중 실시예 7에서 51a로부터 제조한 (S)-tert-부틸 5-(벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 57a (1.595 g, 3.76 mmol)의 용액에 디옥산 중 4N HCl (40 mL)을 첨가하였다. 도 21을 참조한다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 2시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하였다. 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트와 차가운 수성 5% 암모니아 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물에 이어서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 용매를 제거하여 (S)-5-(벤질옥시)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌 57b를 갈색 검으로서 수득하였으며, 이를 직접 사용하였다.
1H NMR (DMSO) δ 8.04 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.45-7.34 (m, 4H), 7.14 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.60 (s, 1H), 5.24 (s, 2H), 3.96-3.92 (m, 1H), 3.84 (dd, J = 3.4, 10.7 Hz, 1H), 3.70 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 3.60 (dd, J = 2.4, 10.0 Hz, 1H), 3.55 (t, J = 10.3 Hz, 1H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 324.1150 (M + H). C20H19ClNO 요구치 324.1150.
중간체 57b를 빙조에서 냉각시키고, 피리딘 (15 mL)을 첨가하고, 이어서 트리플루오로아세트산 무수물 (3.14 mL, 22.57 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 10분 동안 교반하고, 얼음을 첨가하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물에 이어서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 용매를 제거하고, 생성된 잔류물을 칼럼 크로마토그래피에 의해 용리액으로서 에틸 아세테이트 및 석유 에테르의 혼합물 (v/v 1:10)을 사용하여 정제하여 (S)-1-(5-(벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-2,2,2-트리플루오로에타논 66a를 백색 고체 (1.11 g, 70%)로서 수득하였다.
mp 167-170℃. 1H NMR (CDCl3) δ 8.37 (d, J = 8.3Hz, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.72 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.61-7.54 (m, 3H), 7.49-7.42 (m, 3H), 7.39-7.35 (m, 1H), 5.30 (AB q, J = 11.7, 15.7 Hz, 2H), 4.63-4.59 (m, 1H), 4.43-4.38 (m, 1H), 4.15-4.09 (m, 1H), 3.97-3.93 (m, 1H), 3.49 (dd, J = 9.9, 11.3 Hz, 1H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 442.0799 (M + Na). C22H17ClF3NNaO2 요구치 442.0795.
-10℃에서, THF (20 mL) 중 66a (1.10 g, 2.62 mmol)의 용액에 25% 수성 포름산암모늄 (20 mL)에 이어서 Pd-C 촉매 (10%, 습윤, 550 mg)를 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반한 후, 추가의 Pd-C 촉매 (550 mg)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 -10℃에서 밤새 교반하고, 촉매를 셀라이트를 통해 여과하였다. THF를 여과물로부터 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물에 이어서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 용매를 제거하고, 생성된 잔류물을 칼럼 크로마토그래피에 의해 용리액으로서 에틸 아세테이트 및 석유 에테르의 혼합물 (v/v 1:5)을 사용하여 정제하여 (S)-1-(1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-2,2,2-트리플루오로에타논 66b를 회백색 고체 (758 mg, 88%)로서 수득하였다.
mp 209-212℃. 1H NMR (CDCl3) δ 8.33 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.64 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.60-7.56 (m, 1H), 7.51-7.47 (m, 1H), 4.60-4.56 (m, 1H), 4.41-4.36 (m, 1H), 4.00-3.95 (m, 1H), 3.93-3.90 (m, 1H), 3.44 (dd, J = 9.8, 11.3 Hz, 1H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 352.0331 (M + Na). C15H11ClF3NNaO2 요구치 352.0323.
THF (15 mL) 중 66b (250 mg, 0.76 mmol)의 용액에 테트라졸 (아세토니트릴 중 3%, 13.5 mL, 4.55 mmol)에 이어서 디-tert-부틸-N,N-디-이소프로필 포스포르아미다이트 (1.51 mL, 4.55 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 이어서 빙조에서 냉각시키고, H2O2 (30% 수용액, 0.78 mL, 7.58 mmol)를 적가하였다. 생성된 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 5시간 동안 교반하였다. 반응물을 빙조에서 냉각시키면서 10% 수성 아황산나트륨의 첨가에 의해 켄칭하였다. 유기 휘발성 물질을 회전 증발기에 의해 제거하였다. 생성된 혼합물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물에 이어서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 용매를 제거하고, 생성된 잔류물을 용리액으로서 에틸 아세테이트 및 석유 에테르 (v/v 1:6 → 1:3)의 구배 혼합물을 사용하여 플로리실(Florisil)® (US 실리카(US Silica)) 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (S)-디-tert-부틸 1-(클로로메틸)-3-(2,2,2-트리플루오로아세틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 포스페이트 66c를 무색 오일 (367 mg, 93%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 8.44 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.69-7.65 (m, 1H), 7.63-7.59 (m, 1H), 4.61-4.56 (m, 1H), 4.46-4.41 (m, 1H), 4.15-4.12 (m, 1H), 4.06-4.00 (m, 1H), 1.50 (s, 9H), 1.48 (s, 9H) ppm. 31P NMR (DMSO) δ -15.54 ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 544.1236 (M + Na). C23H28ClF3NNaO5P 요구치 544.1238.
빙조에서 냉각시킨 MeOH (2 mL) 중 66c (239 mg, 0.46 mmol)의 용액에 CsCO3 (298 mg, 0.92 mmol) 및 몇 방울의 물을 첨가하였다. 혼합물을 빙조에서 1시간 동안 교반한 다음, 에틸 아세테이트와 물 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트를 통해 여과하고, 용매를 제거하였다. 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 플로리실® (US 실리카) 칼럼 크로마토그래피의 패드를 통해 여과하여 (S)-디-tert-부틸 1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 포스페이트 66d를 회백색 검 (183 mg, 94%)으로서 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 직접 사용하였다.
1H NMR (DMSO) δ 8.08 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.46-7.42 (m, 1H), 7.25-7.21 (m, 1H), 7.13 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 4.00-3.93 (m, 1H), 3.87-3.78 (m, 2H), 3.54-3.42 (m, 2H), 1.50 (s, 9H), 1.49 (s, 9H) ppm. 31P NMR (DMSO) δ -15.58 ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 426.1587 (M + H). C21H30ClNO4P 요구치 426.1595.
2,5-디브로모니트로벤젠 (5.0 g, 17.8 mmol) 및 t-부틸 아크릴레이트 (7.75 mL, 53.40 mmol)를 트리에틸아민 (50 mL) 중에 용해시켰다. 도 22를 참조한다. 용액을 통해 질소 기체를 버블링하여 플라스크를 플러싱하고, 이어서 트리-p-톨릴 포스핀 (433 mg, 1.42 mmol) 및 아세트산팔라듐 (80 mg, 0.36 mmol)을 질소 흐름 하에 첨가하였다. 혼합물을 환류 하에서 질소 하에 밤새 교반하였다. 트리에틸아민을 펌핑하였다. 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 실리카 겔의 패드를 통해 여과하였다. 여과물을 농축시키고 크로마토그래피 칼럼 상에 로딩하였다. 에틸 아세테이트 및 석유 에테르의 혼합물 (1:10)을 용리액으로서 사용하여 (2E,2'E)-tert-부틸 3,3'-(2-니트로-1,4-페닐렌)디아크릴레이트 66e를 백색 고체 (5.85 g, 88%)로서 수득하였다.
mp 123-124℃. 1H NMR (CDCl3) δ 8.14 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.74 (dd, J = 1.7, 8.2 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.50 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.36 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 1.58 (s, 9H), 1.56 (s, 9H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 398.1574 (M + Na). C20H25NNaO6 요구치 398.1574.
빙조에서 냉각시킨 아세톤 (40 mL) 중 66e (5.85 g, 15.58 mmol)의 용액에 아연 분말 (8.15 g, 125.0 mmol)에 이어서 물 (20 mL) 중 NH4Cl (3.33 g, 62.30 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 추가의 아연 분말 (4.00 g) 및 추가의 물 (10 mL) 중 NH4Cl (1.7 g)을 첨가하였다. 1시간 후, 에틸 아세테이트 (100 mL)를 첨가하고, 상부 투명한 용액을 경사분리에 의해 수집하였다. 세척 및 경사분리 단계를 2회 더 반복하였다. 합한 유기 용액을 물에 이어서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 실리카 겔의 패드를 통해 여과하였다. 용매를 제거하여 (2E,2'E)-tert-부틸 3,3'-(2-아미노-1,4-페닐렌)디아크릴레이트 66f를 황색 검 (5.46 g, 100%)으로서 수득하였다.
mp 73-75℃. 1H NMR (CDCl3) δ 7.68 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.46 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.92 (dd, J = 1.5, 8.1 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 6.33 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.31 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 3.99 (br s, 2H), 1.53 (s, 9H), 1.51 (s, 9H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 368.1830 (M + Na). C20H27NNaO4 요구치 368.1832.
DMA (25 mL) 중 66f (2.73 g, 7.90 mmol), 3-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)프로판산 (Fmoc-베타-알라닌, 3.69 g, 11.85 mmol), EDCI 히드로클로라이드 (7.58 g, 39.50 mmol) 및 p-톨루엔술폰산 (136 mg, 0.79 mmol)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물에 이어서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 용매를 제거하여 (2E,2'E)-tert-부틸 3,3'-(2-(3-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)프로판아미도)-1,4-페닐렌)디아크릴레이트 66g를 백색 고체 (4.89 g, 97%)로서 수득하였다.
mp 102-105℃. 1H NMR (CDCl3) δ 7.87 (s, 1H), 7.70-7.66 (m, 2H), 7.62-7.52 (m, 4H), 7.44 (br s, 1H), 7.38-7.34 (m, 3H), 7.29-7.25 (m, 2H), 6.41 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.34 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 4.42 (br s, 2H), 4.19 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 3.59 (br s, 2H), 2.67 (br s, 2H), 1.53 (s, 9H), 1.51 (s, 9H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 661.2878 (M + Na). C38H42N2NaO7 요구치 661.2884.
빙조에서 냉각시킨 DCM (4 mL) 중 66g (530 mg, 0.83 mmol)의 용액에 TFA (1 mL, 12.98 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 밤새 교반하여 백색 현탁액을 수득하였다. 에틸 아세테이트를 첨가하여 추가의 고체를 침전시키고, 이를 여과에 의해 수집하고, 에틸 아세테이트 및 석유 에테르로 세척하여 (2E,2'E)-3,3'-(2-(3-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)프로판아미도)-1,4-페닐렌)디아크릴산 66h를 백색 고체 (404 mg, 92%)로서 수득하였다.
mp 282℃ (분해). 1H NMR (DMSO) δ 12.46 (br s, 1H), 9.92 (s, 1H), 7.89-7.84 (m, 3H), 7.74-7.68 (m, 4H), 7.58-7.54 (m, 2H), 7.44-7.38 (m, 3H), 7.31-7.28 (m, 2H), 6.54 (dd, J = 3.2, 16.0 Hz, 2H), 4.30 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 4.22 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 3.30 (br s, 2H), 2.83-2.79 (m, 2H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 549.1643 (M + Na). C30H26N2NaO7 요구치 549.1632.
DMA (2 mL) 중 66d (178 mg, 조 물질, 약 0.42 mmol), 66h (55 mg, 0.10 mmol), EDCI 히드로클로라이드 (160 mg, 0.84 mmol) 및 p-톨루엔술폰산 (1.8 mg, 0.01 mmol)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트와 차가운 묽은 수성 NaHCO3 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물에 이어서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 용매를 제거하고, 잔류물을 MeOH 및 에틸 아세테이트의 구배 혼합물 (v/v 0.25-5%)을 사용하여 플로리실® (US 실리카) 칼럼 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하여 (9H-플루오렌-9-일)메틸 3-(2,5-비스((E)-3-((S)-1-(클로로메틸)-5-(디-tert-부톡시포스포릴옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-3-옥소프로프-1-에닐)페닐아미노)-3-옥소프로필카르바메이트 66i를 황색 고체 (62 mg, 44%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 10.04 (s, 1H), 8.67 (s, 2H), 8.11-8.05 (m, 3H), 7.97 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.88-7.82 (m, 4H), 7.78 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.73-7.67 (m, 3H), 7.63-7.58 (m, 2H), 7.53-7.47 (m, 3H), 7.38 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.30-7.24 (m, 4H), 4.60-4.50 (m, 4H), 4.42-4.35 (m, 2H), 4.30 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 4.22 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 4.06-3.93 (m, 4H), 3.40-3.33 (m, 2H), 2.63-2.59 (m, 2H), 1.50 (2×s, 18H), 1.47 (2×s, 18H) ppm. 31P NMR (DMSO) δ -15.45 ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 1341.4677 (M + H). C72H81Cl2N4O13P2 요구치 1341.4647.
DMF (1 mL) 중 66i (60 mg, 0.045 mmol)의 용액에 피페리딘 (44 μL, 0.45 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반한 다음, 모든 휘발성 성분을 펌핑하였다. 생성된 잔류물을 에테르 및 석유 에테르의 혼합물 (v/v 1:1)로 연화처리하여 유리 아민 66j를 백색 고체 (44 mg, 96%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 8.68 (s, 2H), 8.11-8.05 (m, 3H), 7.98 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.91-7.86 (m, 2H), 7.78-7.85 (m, 1H), 7.70 (d, J = 15.3 Hz, 1H), 7.63-7.58 (m, 2H), 7.51 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 7.26 (d, J = 15.3 Hz, 2H), 4.66-4.52 (m, 4H), 4.44-4.35 (m, 2H), 4.07-3.95 (m, 4H), 2.95 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.56-2.50 (m, 2H), 1.50-1.49 (m, 36H) ppm. 31P NMR (DMSO) δ -15.42, 15.45 ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 1119.3981 (M + H). C57H71Cl2N4O11P2 요구치 1119.3966.
DMSO (1 mL) 중 66j (40 mg, 0.036 mmol), 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (SuOMC, 12 mg, 0.037 mmol), 및 DIPEA (6.8 μL, 0.039 mmol)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 모든 휘발성 성분을 펌핑하였다. 생성된 잔류물을 에테르로 연화처리하여 비스 (디-tert-부틸포스페이트) N-(3-(2,5-비스((E)-3-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-3-옥소프로프-1-에닐)페닐아미노)-3-옥소프로필)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 66k를 황색 고체 (32 mg, 67%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 10.02 (s, 1H), 8.67 (s, 2H), 8.11-8.05 (m, 3H), 7.98-7.92 (m, 3H), 7.85-7.75 (m, 2H), 7.70 (d, J = 15.3 Hz, 1H), 7.63-7.58 (m, 2H), 7.51 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 7.26 (dd, J = 4.4, 15.4 Hz, 2H), 6.96 (s, 2H), 4.66-4.52 (m, 4H), 4.44-4.35 (m, 2H), 4.07-3.95 (m, 4H), 3.45-3.30 (m, 4H), 2.52-2.50 (m, 2H), 2.08 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.50-1.40 (m, 40H), 1.33-1.25 (m, 2H) ppm. 31P NMR (DMSO) δ -15.42, 15.45 ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 1334.4515 (M + Na). C67H81Cl2N5NaO14P2 요구치 1334.4525.
빙조에서 냉각시킨 DCM (1 mL) 중 66k (30 mg, 0.02 mmol)의 용액에 TFA (1 mL, 12.98 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 3시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하고, 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트로 연화처리하여 N-(3-(2,5-비스((E)-3-((S)-1-(클로로메틸)-5-포스폰옥시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-3-옥소프로프-1-에닐)페닐아미노)-3-옥소프로필)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 66을 황색 고체 (20 mg, 80%, HPLC 순도 95%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 10.01 (s, 1H), 8.59 (s, 2H), 8.16-8.08 (m, 3H), 7.97-7.90 (m, 3H), 7.88-7.73 (m, 2H), 7.69 (d, J = 14.5 Hz, 1H), 7.61-7.55 (m, 2H), 7.46 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 7.29-7.24 (d, J = 14.0 Hz, 2H), 6.97 (s, 2H), 4.62-4.52 (m, 3H), 4.40-4.30 (m, 3H), 4.05-3.90 (m, 4H), 3.43-3.37 (m, 2H), 3.24-3.18 (m, 2H), 2.61-2.55 (m, 2H), 2.08 (br s, 2H), 1.54-1.44 (m, 4H), 1.27-1.15 (m, 2H) ppm. 31P NMR (DMSO) δ -5.81 ppm. HRMS (ESI 음성) 실측치 m/z 1086.2067 (M - H). C51H48Cl2N5O14P2 요구치 1086.2056.
실시예 17 N-(3-(2,5-비스((E)-3-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-3-옥소프로프-1-에닐)페닐아미노)-3-옥소프로필)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 67
DCM (30 mL) 중 (2E,2'E)-tert-부틸 3,3'-(2-(3-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐아미노)프로판아미도)-1,4-페닐렌)디아크릴레이트 66g (4.89 g, 7.66 mmol)의 용액에 피페리딘 (4.5 mL, 45.50 mmol)을 첨가하였다. 도 23을 참조한다. 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반한 후, 모든 휘발성 성분을 회전 증발기에 의해 제거하였다. 용리액으로서 에틸 아세테이트에 이어서 TEA, MeOH, 및 에틸 아세테이트의 혼합물 (v/v 1:10:100)을 사용하여 칼럼 크로마토그래피하여 (2E,2'E)-tert-부틸 3,3'-(2-(3-아미노프로판아미도)-1,4-페닐렌)디아크릴레이트 67a를 백색 고체 (2.33 g, 73%)로서 수득하였다.
mp 62-63℃. 1H NMR (CDCl3) δ 11.04 (s, 1H), 8.32 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.24 (dd, J = 1.5, 8.2 Hz, 1H), 6.42 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.34 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 3.18 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 2.52 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 1.53 (s, 18H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 417.2394 (M + H). C23H33N2O5 요구치 417.2384.
DMF (10 mL) 중 67a (1.00 g, 2.40 mmol), 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (SuOMC, 740 mg, 2.40 mmol), 및 DIPEA (460 μL, 2.64 mmol)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하였다. 생성된 잔류물을 용리액으로서 에틸 아세테이트 및 석유 에테르 (v/v 2:1)의 혼합물에 이어서 에틸 아세테이트 단독을 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 (2E,2'E)-tert-부틸 3,3'-(2-(3-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)프로판아미도)-1,4-페닐렌)디아크릴레이트 67b를 백색 고체 (1.00 g, 68%)로서 수득하였다.
mp 69-72℃. 1H NMR (CDCl3) δ 7.95 (s, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.65 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.69 (br s, 1H), 6.64 (s, 2H), 6.39 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.38 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 3.68-3.63 (m, 2H), 3.43 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 2.69 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 2.21 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.67-1.50 (m, 4H), 1.53 (s, 9H), 1.52 (s, 9H), 1.31-1.24 (m, 2H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 632.2931 (M + Na). C33H43N3NaO8 요구치 632.2942.
빙조에서 냉각시킨 DCM (4 mL) 중 67b (500 mg, 0.82 mmol)의 용액에 TFA (2 mL)를 적가하였다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 4시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑한 후, 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트로 연화처리하여 (2E,2'E)-3,3'-(2-(3-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)프로판아미도)-1,4-페닐렌)디아크릴산 67c를 백색 고체 (380 mg, 93%)로서 수득하였다.
mp 257-261℃. 1H NMR (DMSO) δ 12.47 (s, 2H), 9.90 (s, 1H), 7.89-7.83 (m, 2H), 7.71-7.67 (m, 2H), 7.57-7.53 (m, 2H), 6.99 (s, 2H), 6.53 (d, J = 15.9 Hz, 2H), 3.36-3.30 (m, 4H), 2.54-2.50 (m, 2H), 2.06 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.52-1.42 (m, 4H), 1.22-1.17 (m, 2H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 520.1683 (M + Na). C25H27N3NaO8 요구치 520.1690.
빙조에서 냉각시킨 DCM (5 mL) 중 (S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 51a (298 mg, 0.89 mmol)의 용액에 디옥산 중 4N HCl (10 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 3시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하여 (S)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-올 67d를 히드로클로라이드 염으로서 수득하였고, 여기에 67c (185 mg, 0.37 mmol), EDCI 히드로클로라이드 (428 mg, 2.23 mmol), p-톨루엔술폰산 (6 mg, 0.037 mmol) 및 DMA (5 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반한 후, 추가의 EDCI 히드로클로라이드 (285 mg, 1.49 mmol) 및 톨루엔술폰산 (6 mg, 0.037 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 밤새 교반한 다음, 에틸 아세테이트와 물 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물에 이어서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 용매를 제거하고, 생성된 잔류물을 용리액으로서 MeOH 및 에틸 아세테이트 (v/v 1-15%)의 구배 혼합물을 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하여 67을 황색 고체 (160 mg, 46%, HPLC 순도 96%)로서 수득하였다.
mp 230-234℃ (분해). 1H NMR (DMSO) δ 10.43 (s, 1H), 10.40 (s, 1H), 10.00 (s, 1H), 8.14-8.08 (m, 5H), 7.95 (br s, 1H), 7.83-7.75 (m, 5H), 7.68 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 7.52 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.35 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.28-7.23 (dd, J = 5.2, 15.2 Hz, 2H), 6.95 (s, 2H), 4.58-4.45 (m, 4H), 4.29-4.20 (m, 2H), 4.04-3.97 (m, 2H), 3.88-3.80 (m, 2H), 3.43-3.37 (m, 2H), 3.23 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 2.60-2.56 (m, 2H), 2.09 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 1.50-1.40 (m, 2H), 1.40-1.30 (m, 2H), 1.24-1.14 (m, 2H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 950.2672 (M + Na). C51H47Cl2N5NaO8 요구치 950.2694.
실시예 18 (S)-1-(클로로메틸)-3-((E)-3-(4-((E)-3-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-3-옥소프로프-1-에닐)-2-(3-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)프로판아미도)페닐)아크릴로일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 디히드로겐 포스페이트 68
빙조에서 냉각시킨 MeOH (1 mL) 중 (S)-디-tert-부틸 1-(클로로메틸)-3-(2,2,2-트리플루오로아세틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 포스페이트 66c (125 mg, 0.24 mmol)의 용액에 CsCO3 (298 mg, 0.92 mmol) 및 몇 방울의 물을 첨가하였다. 혼합물을 빙조에서 1시간 동안 교반한 다음, 에틸 아세테이트와 물 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트를 통해 여과하고, 용매를 제거하였다. 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 플로리실® (US 실리카)의 패드를 통해 여과하였다. 용매를 제거하여 (S)-디-tert-부틸 1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 포스페이트 66d를 회백색 검으로서 수득하였으며, 이를 직접 추가 정제 없이 사용하였다.
빙조에서 냉각시킨 DCM (2 mL) 중 (S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카르복실레이트 51a (80 mg, 0.24 mmol)의 용액에 디옥산 중 4N HCl (4 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 2시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하고, (S)-1-(클로로메틸)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-올 67d를 직접 사용하였다.
염-빙조 (-10℃)에서 냉각시킨 DMA (2 mL) 중 66d 및 67d (각각 상기와 같이 제조됨)의 용액에 (2E,2'E)-3,3'-(2-(3-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)프로판아미도)-1,4-페닐렌)디아크릴산 67c (119 mg, 0.24 mmol)를 첨가하고, 이어서 EDCI 히드로클로라이드 (276 mg, 1.44 mmol) 및 p-톨루엔술폰산 (4 mg, 0.024 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 밤새 교반한 다음, 얼음에 부었다. 생성된 침전물을 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하고, 진공 하에 건조시켰다. MeOH 및 DCM (v/v 2-10%)의 구배 혼합물을 사용하여 플로리실® (US 실리카) 크로마토그래피 칼럼에 의해 정제하여 황색 고체 (50 mg)를 수득하였으며, 이는 LC-MS에 의해 디-tert-부틸 ((S)-1-(클로로메틸)-3-((E)-3-(4-((E)-3-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)-2-(3-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)프로판아미도)페닐)아크릴로일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일) 포스페이트 68a 및 디-tert-부틸 ((S)-1-(클로로메틸)-3-((E)-3-(4-((E)-3-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-3-옥소프로프-1-엔-1-일)-3-(3-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)프로판아미도)페닐)아크릴로일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일) 포스페이트 68b (HPLC에 의해 각각 20% 및 23%), 67 (HPLC에 의해 44%) 및 66 (HPLC에 의해 8%)의 혼합물로서 확인되었다. 혼합물을 추가로 정제용 HPLC (칼럼: 시너지-맥스® RP 4μ, 250 x 21.20 mm; 이동상: A/B = 25% → 0% (A: 포름산암모늄 pH 3.45, B: 물 중 90% 아세토니트릴); 유량 12 mL/분, 구배 방법; 파장: 254 nm, 325 nm)에 의해 정제하여 68a 및 68b의 혼합물을 황색 고체 (18 mg, 8%)로서 수득하였다.
HRMS (ESI) 실측치 m/z 1142.3577 (M + Na). C59H64Cl2N5NaO11P 요구치 1142.3609.
빙조에서 냉각시킨 DCM (0.5 mL) 중 68a 및 68b (17 mg, 0.015 mmol)의 용액에 TFA (0.5 mL)을 적가하였다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 3시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하였다. 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트로 연화처리하여 (S)-1-(클로로메틸)-3-((E)-3-(4-((E)-3-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-3-옥소프로프-1-에닐)-2-(3-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)프로판아미도)페닐)아크릴로일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 디히드로겐 포스페이트 68 및 포스페이트 위치이성질체인 (S)-1-(클로로메틸)-3-((E)-3-(4-((E)-3-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-3-옥소프로프-1-에닐)-3-(3-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)프로판아미도)페닐)아크릴로일)-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 디히드로겐 포스페이트 68c의 혼합물을 오렌지색 고체 (11 mg, 72%, HPLC 순도: 95%, 이성질체의 비 1:1)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 10.45 (s, 1H), 10.01 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.15-7.23 (m, 17H), 6.95 (s, 2H), 4.60-3.80 (m, 10H), 3.43-3.37 (m, 2H), 3.27-3.18 (m, 2H), 2.60-2.50 (m, 2H), 2.10-2.00 (m, 2H), 1.55-1.35 (m, 4H), 1.20-1.10 (m, 2H) ppm. 31P NMR (DMSO) δ -5.81 ppm. HRMS (ESI 음성) 실측치 m/z 1006.2394 (M - H). C51H47Cl2N5O11P 요구치 1006.2392.
실시예 23 N-(3-(2,5-비스((E)-3-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-메틸피페라진-1-카르보닐옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-3-옥소프로프-1-에닐)페닐아미노)-3-옥소프로필)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 (화합물 번호 69, 표 4, 도 37)
DMA (2 mL) 중 1 (상기 언급된 절차에 의해 새롭게 제조) 192 mg (0.53 mmol)에 2 (100 mg, 0.20 mmol), EDCI 히드로클로라이드 (231 mg, 1.21 mmol) 및 톨루엔술폰산 (3.5 mg, 0.020 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 밤새 교반한 다음, 수성 암모니아 및 얼음의 혼합물에 부었다. 생성된 침전물을 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하고, 건조시키고, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. MeOH 및 DCM (v/v 1-15%)의 구배 혼합물을 용리액으로서 사용하여 N-(3-(2,5-비스((E)-3-((S)-1-(클로로메틸)-5-(4-메틸피페라진-1-카르보닐옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-3-옥소프로프-1-에닐)페닐아미노)-3-옥소프로필)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드를 황색 고체 (30 mg, 13%, HPLC 순도 96%)로서 수득하였다.
mp 268℃ (분해). 1H NMR (CDCl3) δ 8.60 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.87-7.84 (m, 3H), 7.75-7.60 (m, 5H), 7.40-7.33 (m, 5H), 7.22 (br s, 1H), 6.77 (t, J = 15.3 Hz, 2H), 6.56 (s, 2H), 4.46-4.40 (m, 2H), 4.30-4.25 (m, 2H), 4.11-4.00 (m, 2H), 3.95-3.90 (m, 7H), 3.68 (명백한 s, 6H), 3.53-3.46 (m, 3H), 3.38 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.73 (명백한 s, 2H), 2.59-2.55 (m, 8H), 2.42 (s, 6H), 2.28 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.56-1.49 (m, 2H), 1.31-1.23 (m, 2H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 1180.4416 (M + H). C63H68Cl2N9O10 요구치 1180.4416.
실시예 24 2-(피리딘-2-일디술파닐)프로필 2,5-비스((E)-3-((S)-1-(클로로메틸)-5-(포스포노옥시)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-3-옥소프로프-1-에닐)페닐카르바메이트 (표 4, 화합물 번호 72, 도 38)
1 (상기 언급된 절차에 의해 새롭게 제조) 207 mg (0.49 mmol)에 2 (70 mg, 0.15 mmol), EDCI 히드로클로라이드 (233 mg, 1.22 mmol), 톨루엔술폰산 (3 mg, 0.015 mmol) 및 DMA (0.5 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 밤새 교반한 후, 대부분의 DMA를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물에 이어서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트의 패드를 통해 여과하였다. 용매를 제거하고, 생성된 잔류물을 최소 DCM 중에 용해시키고, 헵탄을 첨가하여 침전시켜 조 생성물 (156 mg)을 수득하였으며, 이를 정제용 HPLC (칼럼: 시너지-맥스 RP 4μ, 250 x 21.20 mm; 이동상: A/B = 10% → 1% (A: 포름산암모늄 pH 3.45, B: 물 중 90% 아세토니트릴); 유량 12 mL/분, 구배 방법; 파장: 254 nm, 325 nm)에 의해 추가로 정제하여 3 (78 mg, 40%)을 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 9.67 (s, 1H), 8.67 (s, 2H), 8.43 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 8.11-8.06 (m, 3H), 7.97 (명백한 d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 15.3 Hz, 1H), 7.84-7.76 (m, 3H), 7.70 (d, J = 15.3 Hz, 2H), 7.61 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.51 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 7.28 (d, J = 15.3 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 15.3 Hz, 1H), 7.23-7.19 (m, 1H), 4.62-4.53 (m, 4H), 4.43-4.37 (m, 2H), 4.23-4.13 (m, 2H), 4.05-3.95 (m, 4H), 3.42-3.37 (m, 1H), 1.51 (s, 9H), 1.50 (s, 9H), 1.49 (s, 9H), 1.48 (s, 9H), 1.34 (d, J = 6.5 Hz, 3H) ppm. 31P NMR (DMSO) δ -15.46 (s) and -15.48 (s) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 1297.3471 (M + Na). C63H74Cl2N4NaO12P2S2 요구치 1297.3489.
빙조에서 냉각시킨 DCM (2 mL) 중 3 (60 mg, 0.047 mmol)의 용액에 TFA (1 mL, 6.49 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 3시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하고, 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트로 연화처리하여 4를 황색 고체 (49 mg, 99%, HPLC 순도 100%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 9.65 (s, 1H), 8.59 (s, 2H), 8.46-8.44 (m, 1H), 8.15-8.08 (m, 3H), 7.96-7.90 (m, 3H), 7.82-7.70 (m, 3H), 7.70 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.59 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 7.48 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.31-7.22 (m, 3H), 5.75 (s, 1H), 4.64-4.53 (m, 4H), 4.40-4.33 (m, 3H), 4.25-4.15 (m, 3H), 4.06-3.93 (m, 3H), 1.35-1.32 (m, 3H) ppm. 31P NMR (DMSO) δ -5.95 (s) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 1073.0949 (M + Na). C47H42Cl2N4NaO12P2S2 요구치 1073.0985.
실시예 25 [(1S)-1-(클로로메틸)-3-[(E)-3-[4-[(E)-3-[(1S)-1-(클로로메틸)-5-포스포노옥시-1,2-디히드로벤조[e]인돌-3-일]-3-옥소-프로프-1-에닐]-2-[2-[2-(2,5-디옥소피롤-1-일)에톡시]에톡시]페닐]프로프-2-에노일]-1,2-디히드로벤조[e]인돌-5-일] 디히드로겐 포스페이트 (화합물 번호 78, 표 4, 도 39)
중간체 3
1 (상기 언급된 절차에 의해 새롭게 제조) 76 mg (0.18 mmol)에 2 (18 mg, 0.045 mmol), EDCI 히드로클로라이드 (69 mg, 0.36 mmol), 톨루엔술폰산 (0.8 mg, 0.005 mmol) 및 DMA (0.25 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 밤새 교반한 후, 대부분의 DMA를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물에 이어서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트의 패드를 통해 여과하였다. 용매를 제거하고, 생성된 잔류물을 최소 DCM 중에 용해시키고, 헵탄을 첨가하여 침전시켜 조 생성물 (54 mg)을 수득하였으며, 이를 정제용 HPLC (칼럼: 시너지-맥스 RP 4μ, 250 x 21.20 mm; 이동상: A/B = 20% → 1% (A: 포름산암모늄 pH 3.45, B: 물 중 90% 아세토니트릴); 유량 12 mL/분, 구배 방법; 파장: 254 nm, 325 nm)에 의해 추가로 정제하여 3 (17 mg, 30%)을 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 8.72 (br s, 2H), 8.23 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.96 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 15.3 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.54-7.50 (m, 3H), 7.42-7.39 (m, 2H), 7.26-7.12 (m, 3H), 6.95-6.88 (m, 1H), 6.67 (s, 2H), 4.57-4.52 (m, 2H), 4.47-4.38 (m, 2H), 4.28-4.24 (m, 2H), 4.16-4.09 (m, 2H), 4.00-3.94 (m, 4H), 3.78 (명백한 s, 4H), 3.55-.348 (m, 2H), 1.57 (s, 36H) ppm. 31P NMR (CDCl3) δ -15.64 (s) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 1238.3862 (M + Na). C62H73Cl2N3NaO14P2 요구치 1238.3837.
빙조에서 냉각시킨 DCM (1 mL) 중 3 (16 mg, 0.013 mmol)의 용액에 TFA (0.5 mL, 3.24 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 3시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하고, 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트로 연화처리하여 화합물 78을 황색 고체 (13 mg, 100%, HPLC 순도 100%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 8.60 (s, 2H), 8.12 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.95-7.87 (m, 4H), 7.72 (d, J = 15.1 Hz, 1H), 7.61-7.57 (m, 2H), 7.53-7.45 (m, 4H), 7.38-7.32 (m, 2H), 6.97 (s, 2H), 4.60-4.48 (m, 4H), 4.30-4.28 (m, 4H), 4.08-3.88 (m, 6H), 3.68-3.58 (m, 4H). 31P NMR (DMSO) δ -5.94 (s) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 1014.1301 (M + Na). C46H41Cl2N3NaO14P2 요구치 1014.1333.
실시예 26 [(1S)-1-(클로로메틸)-3-[(E)-3-[4-[(E)-3-[(1S)-1-(클로로메틸)-5-포스포노옥시-1,2-디히드로벤조[e]인돌-3-일]-3-옥소-프로프-1-에닐]-2-[2-(2,5-디옥소피롤-1-일)에톡시]페닐]프로프-2-에노일]-1,2-디히드로벤조[e]인돌-5-일] 디히드로겐 포스페이트 (화합물 번호 79, 표 4, 도 40)
중간체 3
1 (상기 언급된 절차에 의해 새롭게 제조) 52 mg (0.12 mmol)에 2 (11 mg, 0.031 mmol), EDCI 히드로클로라이드 (35 mg, 0.18 mmol), 톨루엔술폰산 (0.5 mg, 0.003 mmol) 및 DMA (0.25 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 밤새 교반한 후, 대부분의 DMA를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물에 이어서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트의 패드를 통해 여과하였다. 용매를 제거하고, 생성된 잔류물을 최소 DCM 중에 용해시키고, 헵탄을 첨가하여 침전시켜 조 생성물 (71 mg)을 수득하였으며, 이를 정제용 HPLC (칼럼: 시너지-맥스 RP 4μ, 250 x 21.20 mm; 이동상: A/B = 20% → 1% (A: 포름산암모늄 pH 3.45, B: 물 중 90% 아세토니트릴); 유량 12 mL/분, 구배 방법; 파장: 254 nm, 300 nm)에 의해 추가로 정제하여 3 (15 mg, 42%)을 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 8.71 (br s, 2H), 8.25 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.95 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 15.3 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.60-7.52 (m, 3H), 7.46-7.40 (m, 2H), 7.28-7.20 (m, 2H), 7.13-6.99 (m, 2H), 6.78 (s, 2H), 4.64-4.60 (m, 2H), 4.51-4.45 (m, 2H), 4.38-4.32 (m, 2H), 4.15-4.05 (m, 4H), 4.00-3.95 (m, 2H), 3.57-3.49 (m, 2H), 1.58 (s, 36H) ppm. 31P NMR (CDCl3) δ -15.67 (s) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 1194.3606 (M + Na). C60H69Cl2N3NaO13P2 요구치 1194.3575.
화합물 번호 79
빙조에서 냉각시킨 DCM (0.5 mL) 중 3 (13 mg, 0.011 mmol)의 용액에 TFA (0.2 mL, 1.30 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 0.5시간 동안 교반하였다. 디에틸 에테르를 첨가하여 침전물을 수득하였으며, 이를 여과하고, 에틸 아세테이트로 세척하여 4 (화합물 번호 79)를 황색 고체 (8.4 mg, 80%, HPLC 순도 90%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 8.59 (s, 2H), 8.13 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.97-7.82 (m, 4H), 7.71 (d, J = 15.1 Hz, 1H), 7.60-7.52 (m, 3H), 7.49-7.44 (m, 3H), 7.35-7.24 (m, 2H), 7.08 (s, 2H), 4.65-4.50 (m, 4H), 4.40-4.30 (m, 4H), 4.05-3.90 (m, 6H). 31P NMR (DMSO) δ -5.81 (s) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 970.1036 (M + Na). C44H37Cl2N3NaO13P2 요구치 970.1071.
실시예 27 2-(2-피리딜디술파닐)프로필 N-[1-(클로로메틸)-3-[5-[1-(클로로메틸)-5-히드록시-1,2-디히드로벤조[e]인돌-3-일]-5-옥소-펜타노일]-1,2-디히드로벤조[e]인돌-5-일]카르바메이트 (화합물 번호 80, 표 4, 도 41)
건조 DMA (2 mL) 중 62c (31.0 mg, 0.0674 mmol, 상기 언급된 절차에 의해 새롭게 제조), 53h (23.0 mg, 0.0674 mmol, 상기 언급된 절차에 의해 새롭게 제조), EDCI.HCl (38.7 mg, 0.202 mmol) 및 TsOH (2.3 mg, 0.0135 mmol)의 혼합물을 질소 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 18시간 후, 반응 혼합물을 EtOAc 및 H2O로 희석하고, 잘 혼합하였다. 층을 분리하고, 유기 층을 H2O (3 x)로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 DCM:MeOH 100:0 → 98:2를 사용하여 정제하고, 이어서 디이소프로필 에테르로 연화처리하여 화합물 1 (화합물 번호 80, 26.0 mg, 49%, HPLC 순도: 95.2%)을 크림색 고체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 10.36 (s, 1H), 9.69 (s, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.44 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 8.08 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.02-8.00 (m, 2H), 7.92 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.85-7.77 (m, 3H), 7.57-7.53 (m, 1H), 7.51-7.47 (m, 1H), 7.45-7.41 (m, 1H), 7.34-7.30 (m, 1H), 7.24-7.21 (m, 1H), 4.42-4.29 (m, 3H), 4.25-4.13 (m, 5H), 4.05-3.97 (m, 2H), 3.91 (dd, J = 11, 7.2 Hz, 1H), 3.79 (dd, J = 11, 8.3 Hz, 1H), 3.43-3.36 (m, 1H), 2.77-2.56 (m, 4H), 2.01-1.93 (m, 2H), 1.34 (d, J = 6.7 Hz, 3H). HRMS m/z 811.1542 [(M+Na)+ 계산치 C40H38Cl2N4NaO5S2 811.1553].
실시예 28, 2-(2-피리딜디술파닐)프로필 3-[6-[1-(클로로메틸)-5-(4-메틸피페라진-1-카르보닐)옥시-1,2-디히드로벤조[e]인돌-3-일]-6-옥소-헥속시]-6-히드록시-2-메톡시-11-옥소-6a,7,8,9-테트라히드로-6H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-카르복실레이트, 2-(2-피리딜디술파닐)프로필 3-[6-[1-(클로로메틸)-5-포스포노옥시-1,2-디히드로벤조[e]인돌-3-일]-6-옥소-헥속시]-6-히드록시-2-메톡시-11-옥소-6a,7,8,9-테트라히드로-6H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-카르복실레이트, 및 2-(2-피리딜디술파닐)프로필 3-[6-[1-(클로로메틸)-5-히드록시-1,2-디히드로벤조[e]인돌-3-일]-6-옥소-헥속시]-6-히드록시-2-메톡시-11-옥소-6a,7,8,9-테트라히드로-6H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-카르복실레이트 (화합물 번호 81-83, 표 4, 도 42-43)
Figure pct00067
건조 DMA (15 mL) 중 1 (1.40 g, 4.00 mmol, 문헌 절차에 따라 제조: J. Med. Chem. 2003, 46, 2132-2151), 2 (1.31 g, 5.22 mmol, 문헌 절차에 따라 제조: WO2004065491 A1) 및 K2CO3 (829 mg, 6.00 mmol)의 혼합물을 실온에서 43시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 EtOAc 및 H2O로 희석하고, 잘 혼합하고, 층을 분리하였다. 유기 층을 H2O (3 x), 염수 (1 x)로 세척하고 건조시키고 (Na2SO4), 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 EtOAc:Hex 50:50 → 67:33 → 100:0을 사용하여 정제하여 화합물 3 (1.74 g, 84%)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, CDCl3) 8.77 (br s, 1H), 7.79 (s, 1H), 6.82 (s, 1H), 6.02-5.92 (m, 1H), 5.36 (dq, J = 17.2, 1.5 Hz, 1H), 5.26 (dq, J = 10.4, 1.2 Hz, 1H), 4.69-4.60 (m, 2H), 4.47-4.39 (m, 1H), 4.28 (br s, 1H), 4.09-4.05 (m, 2H), 3.83 (s, 3H), 3.90-3.80 (m, 1H), 3.74-3.70 (m, 1H), 3.65-3.59 (m, 1H), 3.54-3.47 (m, 1H), 2.25 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.20-2.15 (m, 1H), 1.93-1.84 (m, 3H), 1.81-1.72 (m, 1H), 1.70-1.63 (m, 3H), 1.53-1.47 (m, 2H), 1.44 (s, 9H). HRMS m/z 543.2666 [(M+Na)+ 계산치 C27H40N2NaO8 543.2677].
Figure pct00068
Et3N (1.32 mL, 9.47 mmol)을 실온에서 건조 DCM (6 mL) 중 3 (821 mg, 1.58 mmol)의 용액에 첨가하였다. 이어서, 아세트산 무수물 (0.75 mL, 7.93 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 건조 MeOH (1 mL)를 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, EtOAc (120 mL)를 첨가하고, 혼합물을 H2O (2 x), 염수 (1 x)로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하여 화합물 4 (891 mg, 정량적)를 수득하였으며, 이를 후속 단계에 정제 없이 사용하였다.
1H NMR δ (400 MHz, CDCl3) 8.88 (br s, 1H), 7.82 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.01-5.91 (m, 1H), 5.36 (dq, J = 17.2, 1.5 Hz, 1H), 5.25 (dq, J = 10.4, 1.3 Hz, 1H), 4.65-4.62 (m, 2H), 4.61-4.54 (m, 1H), 4.32-4.22 (m, 2H), 4.09-4.06 (m, 2H), 3.83 (s, 3H), 3.55-3.47 (m, 2H), 2.26-2.23 (m, 2H), 2.18-2.12 (m, 1H), 2.07 (s, 3H), 1.97-1.77 (m, 5H), 1.70-1.63 (m, 2H), 1.54-1.47 (m, 2H), 1.44 (s, 9H). HRMS m/z 585.2774 [(M+Na)+ 계산치 C29H42N2NaO9 585.2783].
Figure pct00069
피롤리딘 (1.6 mL, 19.2 mmol)을 실온에서 건조 DCM (20 mL) 중 4 (1.06 g, 1.88 mmol)의 용액에 첨가하였다. 이어서, Pd(PPh3)4 (109 mg, 0.0943 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 40분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0.25 M HCl 용액 (2 x 75 mL)으로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 EtOAc:Hex 50:50 → 100:0을 사용하여 정제하여 화합물 5 (726 mg, 81%)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 6.67 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.08 (s, 2H), 4.35-4.30 (m, 1H), 4.13-4.06 (m, 2H), 3.87 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.63 (s, 3H), 3.50-3.44 (m, 1H), 3.42-3.35 (m, 1H), 2.21 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.07-2.00 (m, 1H), 2.01 (s, 3H), 1.89-1.82 (m, 1H), 1.77-1.67 (m, 4H), 1.59-1.51 (m, 2H), 1.44-1.36 (m, 2H), 1.39 (s, 9H). HRMS m/z 501.2573 [(M+Na)+ 계산치 C25H38N2NaO7 501.2571].
Figure pct00070
디포스겐 (0.22 mL, 1.82 mmol)을 건조 DCM (25 mL) 중 5 (726 mg, 1.52 mmol) 및 DMAP (557 mg, 4.56 mmol)의 혼합물에 질소 하에 실온에서 첨가하였다. 30분 후, 건조 DCM (25 mL) 중 6 (2.60 g, 12.9 mmol; 상기 언급된 절차에 의해 새롭게 제조 - 알콜에 대해 이전에 지정된 번호 없음)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 18시간 후, 반응 혼합물을 H2O (1 x)로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 DCM:EtOAc 100:0 → 95:5 → 94:6 (잉여 6이 용리될 때까지)에 이어서 EtOAc:Hex 70:30을 사용하여 정제하여 화합물 7 (920 mg, 86%)을 연황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 9.16 (br s, 1H), 8.45-8.43 (m, 1H), 7.83-7.78 (m, 2H), 7.25-7.21 (m, 1H), 7.15 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 6.87 (s, 1H), 4.29 (br s, 1H), 4.17-3.99 (m, 4H), 3.92 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.75 (s, 3H), 3.42-3.30 (m, 3H), 2.20 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.06-1.95 (m, 4H), 1.83 (br s, 1H), 1.77-1.68 (m, 4H), 1.58-1.49 (m, 2H), 1.43-1.36 (m, 2H), 1.39 (s, 9H), 1.29 (d, J = 6.8 Hz, 3H). HRMS m/z 706.2832 [(M+H)+ 계산치 C34H48N3O9S2 706.2826].
Figure pct00071
DCM-MeOH (34 mL/17 mL) 중 7 (949 mg, 1.34 mmol) 및 K2CO3 (1.85 g, 13.4 mmol)의 혼합물을 실온에서 45분 동안 교반하였다. 혼합물을 DCM으로 희석하고, 얼음 H2O (200 mL)에 붓고, 잘 혼합하고, 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM (1 x)으로 추출하고, 합한 유기 층을 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 DCM:EtOAc 100:0 → 50:50을 사용하여 정제하여 화합물 8 (808 mg, 91%)을 연황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 9.20 (br s, 1H), 8.44 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 7.81-7.80 (m, 2H), 7.25-7.20 (m, 2H), 6.94 (s, 1H), 4.75 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.17-3.99 (m, 3H), 3.92 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.60-3.46 (m, 2H), 3.37-3.20 (m, 3H), 2.20 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.93-1.76 (m, 3H), 1.75-1.68 (m, 3H), 1.58-1.51 (m, 2H), 1.44-1.36 (m, 2H), 1.39 (s, 9H), 1.29 (d, J = 6.9 Hz, 3H). HRMS m/z 664.2721 [(M+H)+ 계산치 C32H46N3O8S2 664.2724].
Figure pct00072
(디아세톡시아이오도)벤젠 (259 mg, 0.804 mmol)을 건조 DCM (10 mL) 중 8 (349 mg, 0.526 mmol) 및 TEMPO (82.2 mg, 0.526 mmol)의 혼합물에 실온에서 첨가하고, 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 24시간 후, 혼합물을 DCM 및 포화 수성 Na2S2O3으로 희석하고, 잘 혼합하였다. 층을 분리하고, 유기 층을 포화 수성 Na2S2O3 (1 x), 포화 수성 NaHCO3 (1 x)으로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 EtOAc:Hex 70:30 → 100:0을 사용하여 정제하여 화합물 9 (248 mg, 71%)를 백색 발포체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 8.45-8.43 (m, 1H), 7.79-7.69 (m, 1H), 7.51-7.48 (m, 1H), 7.24-7.20 (m, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.96 및 6.91 (2s, 1H), 6.55 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 5.46 (dd, J = 8.9, 6.1 Hz, 1H), 4.31-4.21 (m, 1H), 4.02-3.84 (m, 3H), 3.80 및 3.79 (2s, 3H), 3.52-3.46 (m, 1H), 3.40-3.18 (m, 3H), 2.19-2.13 (m, 2H), 2.09-2.00 (m, 1H), 1.96-1.85 (m, 3H), 1.70-1.67 (m, 2H), 1.56-1.45 (m, 2H), 1.40-1.34 (m, 2H), 1.38 및 1.37 (2s, 9H), 1.15-1.10 (m, 3H). HRMS m/z 662.2592 [(M+H)+ 계산치 C32H44N3O8S2 662.2564].
Figure pct00073
9 (254 mg, 0.384 mmol) 및 디옥산 중 4 M HCl (11 mL)의 혼합물을 실온에서 1시간 15분 동안 교반하였다. 용매를 25-30℃에서 진공 하에 제거하여 화합물 10 (162 mg, 70%)을 수득하였으며, 이를 후속 단계에 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00074
건조 DMA (5 mL) 중 10 (161 mg, 0.266 mmol), 58b (195 mg, 0.542 mmol, 상기 언급된 절차에 의해 새롭게 제조), EDCI.HCl (253 mg, 1.32 mmol) 및 TsOH (19.5 mg, 0.113 mmol)의 혼합물을 질소 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 23시간 후, 반응 혼합물을 EtOAc 및 포화 수성 NaHCO3으로 희석하고, 잘 혼합하였다. 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc (1 x)로 추출하였다. 합한 유기 층을 H2O (1 x), 염수 (1 x)로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 DCM:MeOH 100:0 → 93:7을 사용하여 정제하고, 이 물질을 DCM:MeOH 99:1 → 94:6을 사용하여 다시 칼럼처리하여 11 (화합물 번호 81, 118 mg, 47%, HPLC 순도: 98.0%)을 연황색 발포체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 8.43-8.41 (m, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.96 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.73-7.66 (m, 1H), 7.61-7.56 (m, 1H), 7.51-7.45 (m, 2H), 7.22-7.17 (m, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.97 및 6.92 (2s, 1H), 6.56 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 5.46 (dd, J = 9.1, 6.2 Hz, 1H), 4.42-4.20 (m, 4H), 4.05-3.76 (m, 7H), 3.80 및 3.79 (2s, 3H), 3.52-3.47 (m, 1H), 3.38-3.11 (m, 4H), 2.09-1.99 (m, 1H), 1.94-1.88 (m, 3H), 1.77-1.74 (m, 2H), 1.65-1.62 (m, 2H), 1.48-1.42 (m, 2H), 1.35-1.23 (m, 1H), 1.15-1.10 (m, 3H), DMSO에 의해 부분적으로 가려진 9H. HRMS m/z 969.3070 [(M+Na)+ 계산치 C47H55ClN6NaO9S2 969.3053].
Figure pct00075
건조 DMA (5 mL) 중 10 (162 mg, 0.267 mmol), 66d (178 mg, 0.418 mmol, 상기 언급된 절차에 의해 새롭게 제조), EDCI.HCl (184 mg, 0.960 mmol) 및 TsOH (11 mg, 0.0639 mmol)의 혼합물을 질소 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 18.5시간 후, 반응 혼합물을 EtOAc 및 H2O로 희석하고, 잘 혼합하였다. 층을 분리하고, 유기 층을 포화 수성 NaHCO3 (1 x), H2O (1 x), 염수 (1 x)로 세척하고, 건조 (Na2SO4)시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 EtOAc:MeOH 100:0 → 95:5를 사용하여 정제하여 황색 잔류물을 수득하였다. 이를 추가로 정제용 HPLC (칼럼: 시너지-맥스 RP 4 μ, 21.20 x 250 mm; 유량: 12 mL/분; 이동상: 용매 A: H2O/포름산암모늄 완충제 pH 3.45, 용매 B: MeCN/H2O 90:10; 방법: 구배, 30분에 걸쳐 용매 A:용매 B 90:10 → 10:90 → 0:100)에 의해 정제하여 화합물 12 (89.3 mg, 33%, HPLC 순도: 99.5%)를 백색 발포체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 8.56 (s, 1H), 8.43-8.41 (m, 1H), 8.04 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.73-7.67 (m, 1H), 7.60-7.56 (m, 1H), 7.51-7.45 (m, 2H), 7.22-7.17 (m, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.98 및 6.92 (2s, 1H), 6.55 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.47-5.44 (m, 1H), 4.40-4.36 (m, 1H), 4.30-4.19 (m, 3H), 4.04-3.86 (m, 4H), 3.86-3.75 (m, 1H), 3.80 및 3.79 (2s, 3H), 3.52-3.46 (m, 1H), 3.38-3.22 (m, 3H), 3.21-3.15 (m, 1H), 2.09-1.99 (m, 1H), 1.94-1.85 (m, 3H), 1.78-1.74 (m, 2H), 1.69-1.60 (m, 2H), 1.55-1.40 (m, 2H), 1.47 및 1.47 (2s, 18H), 1.28-1.23 (m, 1H), 1.15-1.10 (m, 3H). HRMS m/z 1035.3162 [(M+Na)+ 계산치 C49H62ClN4NaO11PS2 1035.3175].
Figure pct00076
건조 DCM (2 mL) 중 12 (84.0 mg, 0.0829 mmol) 및 TFA (1 mL)의 혼합물을 실온에서 40분 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 25℃에서 진공 하에 제거하여 녹색 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 DCM 중에 용해시키고, 용액을 EtOAc로 희석하고, DCM을 진공 하에 제거하여 백색 고체를 수득하였고, 나머지 용매를 경사분리하였다. 이 과정을 반복하고, 생성된 고체를 EtOAc로 연화처리하고 건조시켜 화합물 13 (화합물 번호 82, 43.8 mg, 59%,의 HPLC 순도: 93.8%)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 8.47 (s, 1H), 8.44-8.42 (m, 1H), 8.08 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.74-7.68 (m, 1H), 7.58-7.54 (m, 1H), 7.51-7.48 (m, 1H), 7.47-7.43 (m, 1H), 7.22-7.18 (m, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.98 및 6.93 (2s, 1H), 5.46 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.39-4.18 (m, 4H), 4.04-3.95 (m, 3H), 3.90-3.85 (m, 1H), 3.84-3.76 (m, 1H), 3.80 및 3.80 (2s, 3H), 3.52-3.47 (m, 1H), 3.40-3.27 (m, 3H), 3.21-3.15 (m, 1H), 2.10-2.02 (m, 1H), 1.94-1.88 (m, 3H), 1.78-1.74 (m, 2H), 1.69-1.60 (m, 2H), 1.48-1.42 (m, 2H), 1.35-1.23 (m, 1H), 1.16-1.10 (m, 3H), 3H는 관찰되지 않음. HRMS m/z 923.1938 [(M+Na)+ 계산치 C41H46ClN4NaO11PS2 923.1923].
Figure pct00077
건조 DMA (3 mL) 중 10 (45.0 mg, 0.0743 mmol), 67d (24.3 mg, 0.0899 mmol, 상기 언급된 절차에 의해 새롭게 제조), EDCI.HCl (42.7 mg, 0.223 mmol) 및 TsOH (3 mg, 0.0174 mmol)의 혼합물을 질소 하에 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 추가량의 67d (24.3 mg, 0.0899 mmol) 및 EDCI.HCl (16.0 mg, 0.0835 mmol)을 혼합물에 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 22시간 후, 반응 혼합물을 EtOAc로 희석하고, H2O (2 x), 염수 (1 x)로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 생성물을 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 EtOAc을 사용하여 정제하여 녹색 분말을 수득하였다. 재차 EtOAc를 사용하여 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피를 수행함으로써 이를 추가로 정제하여 화합물 14 (화합물 번호 83, 8.3 mg, 13.5%, HPLC 순도: 81.2%)를 베이지색 고체로서 수득하였다.
1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 10.33 (s, 1H), 8.43-8.42 (m, 1H), 8.07 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.77 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.74-7.67 (m, 1H), 7.50-7.46 (m, 2H), 7.33-7.29 (m, 1H), 7.24-7.18 (m, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.98 및 6.92 (2s, 1H), 6.56 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 5.47-5.44 (m, 1H), 4.33-4.21 (m, 2H), 4.15-4.13 (m, 2H), 4.05-3.93 (m, 3H), 3.90-3.75 (m, 2H), 3.80 및 3.79 (2s, 3H), 3.52-3.47 (m, 1H), 3.38-3.13 (m, 4H), 2.10-1.99 (m, 1H), 1.94-1.89 (m, 3H), 1.77-1.74 (m, 2H), 1.66-1.62 (m, 2H), 1.52-1.41 (m, 2H), 1.32-1.24 (m, 1H), 1.15-1.10 (m, 3H). HRMS m/z 843.2258 [(M+Na)+ 계산치 C41H45ClN4NaO8S2 843.2260].
실시예 29 (1S)-1-(클로로메틸)-3-((2E)-3-{4-((1E)-3-{(1S)-1-(클로로메틸)-5-[(6-메틸-β-D-글루코피라누로노실)옥시]-1,2-디히드로-3H-벤조[e]인돌-3-일}-3-옥소-1-프로페닐)-2-[(3-{[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일) 헥사노일] 아미노} 프로파노일)아미노]페닐}-2-프로페노일)-1,2-디히드로-3H-벤조[e]인돌-5-일 메틸 β-D-글루코피라노시두로네이트 (화합물 번호 84, 표 4, 도 44)
트리클로로아세트이미데이트 (1)를 문헌 절차에 따라 제조하였다: L. Lazar, E. Mezoe, M. Herczeg, A. Liptak, S. Antus, A. Borbas, Tetrahedron 2012, 68, 7386-7399; L. Tietze, H. Schuster, K. Schmuck, I. Schuberth, F. Alves, Bioorg. & Med. Chem. 2008, 16, 6312-6318.
무수 CH2Cl2 (20 mL) 중 트리클로로아세트이미데이트 (1) (360 mg, 0.75 mmol), 페놀-CBI (2, 처음 특허 출원에서 화합물 51a) (200 mg, 0.60 mmol) 및 활성화된 분자체 4 Å (1 g)의 현탁액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 -10℃로 냉각시킨 다음, BF3·OEt2 (40 μl, 0.3 mmol)를 적가하였다. 온도를 -10℃ 내지 -5℃에서 1시간 동안 유지하고, 이어서 이를 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, BF3·OEt2 (0.24 mL, 1.8 mmol)를 0℃에서 적가하고, 온도를 실온으로 상승되도록 하고, 이를 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 현탁액을 셀라이트로 여과하고, 용매를 증발시켜 조 CBI-글루쿠로니드 (3)를 수득하였으며, 이를 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다. 무수 DMA (4 mL) 중 아민 (3) 및 비스-산 (4, 처음 특허 출원에서 화합물 66h) (126 mg, 0.24 mmol)의 용액을 0℃로 냉각시켰다. 이어서 pTsOH (17 mg, 0.096 mmol) 및 EDCI·HCl (276 mg, 1.44 mmol)를 첨가하고, 온도를 실온으로 상승되도록 하고, 이를 16시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (SiO2, CH2Cl2/MeOH 0-2%)에 이어서 (SiO2, CH2Cl2/MeOH 1-2%)에 의해 정제하여 (1S)-1-(클로로메틸)-3-((2E)-3-{4-((1E)-3-{(1S)-1-(클로로메틸)-5-[(2,3,4-트리-O-아세틸-6-메틸-β-D-글루코피라누로노실)옥시]-1,2-디히드로-3H-벤조[e]인돌-3-일}-3-옥소-1-프로페닐)-2-[(3-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}프로파노일)아미노]페닐}-2-프로페노일)-1,2-디히드로-3H-벤조[e]인돌-5-일 메틸 2,3,4-트리-O-아세틸-β-D-글루코피라노시두로네이트 (5) (127 mg, 27%)를 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, [(CD3)2SO]) δ 10.04 (s, 1 H, NH), 8.38 (br s, 2 H), 8.11 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 7.97 (d, J = 8.5 Hz, 2 H), 7.93 (d, J = 8.2 Hz, 2 H), 7.83-7.88 (m, 4 H), 7.78 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.68-7.72 (m, 3 H), 7.59 (t, J = 7.5 Hz, 2 H), 7.45-7.48 (m, 3 H), 7.38 (t, J = 7.4 Hz, 2 H), 7.25-7.29 (m, 4 H), 5.85 (d, J = 7.7 Hz, 1 H), 5.83 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 5.62-5.65 (m, 2 H), 5.32 (t, J = 8.7 Hz, 2 H), 5.14 (t, J = 9.6 Hz, 2 H), 4.78 (t, J = 8.2 Hz, 2 H), 4.55 (m, 4 H), 4.31-4.38 (m, 4 H), 4.22 (t, J = 6.9 Hz, 1 H), 4.01-4.03 (m, 2 H), 3.91-3.96 (m, 2 H), 3.65 (s, 3 H), 3.63 (s, 3 H), 3.36-3.38 (m, 2 H), 2.59-2.64 (m, 2 H), 1.98-2.03 (m, 18 H); LC-MS (ESI) 계산치 C82H79Cl2N4O25 (M+H)+ m/z 1591.4, 실측치 m/z 1591.4; 계산치 C82H78Cl2N4O25Na (M+Na)+ m/z 1613.4, 실측치 m/z 1613.4.
무수 DMF (5 mL) 중 유도체 (5) (110 mg, 0.07 mmol) 및 피페리딘 (468 μL, 0.7 mmol)의 용액을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 용매를 실온에서 감압 하에 제거하고, 잔류물을 차가운 Et2O로 연화처리하여 조 (1S)-3-{(2E)-3-[2-[(3-아미노프로파노일)아미노]-4-((1E)-3-{(1S)-1-(클로로메틸)-5-[(2,3,4-트리-O-아세틸-6-메틸-β-D-글루코피라누로노실)옥시]-1,2-디히드로-3H-벤조[e]인돌-3-일}-3-옥소-1-프로페닐)페닐]-2-프로페노일}-1-(클로로메틸)-1,2-디히드로-3H-벤조[e]인돌-5-일 메틸 2,3,4-트리-O-아세틸-β-D-글루코피라노시두로네이트 (6) (86 mg, 90%)을 수득하였으며, 이를 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
1H NMR (300 MHz, [(CD3)2SO] δ 8.38 (br s, 2 H), 8.10 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.98 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 7.94 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 7.90 (s, 1 H), 7.88 (d, J = 15.1 Hz, 1 H), 7.76 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.70 (d, J = 15.1 Hz, 1 H), 7.59 (t, J = 7.9 Hz, 2 H), 7.47 (t, J = 7.9 Hz, 2 H), 7.27 (dd, J = 3.4, 15.3 Hz, 2 H), 5.85 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 5.84 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 5.63-5.68 (m, 2 H), 5.32 (dd, J = 7.8, 9.6 Hz, 2 H), 5.14 (dt, J = 1.5, 9.6 Hz, 2 H), 4.79 (d, J = 9.6 Hz, 2 H), 4.56-4.60 (m, 4 H), 4.29-4.41 (m, 2 H), 4.02-4.04 (m, 2 H), 3.92-3.97 (m, 2 H), 3.67 (s, 6 H), 2.93 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 2.03-2.04 (m, 18 H), DMSO 피크 하에 2 H, NH 및 NH2는 관찰되지 않음.
MeOH/CH2Cl2의 (1:1) 혼합물 (10 mL) 중 아민 (6) (110 mg, 0.08 mmol)의 교반 용액에 MeOH (1 mL) 중 NaOMe (8.7 mg, 0.16 mmol)의 용액을 0℃에서 적가하고, 반응 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, AcOH (8 방울)를 첨가하고, 용매를 실온에서 감압 하에 제거하고, 고진공 하에 건조시켜 (1S)-3-{(2E)-3-[2-[(3-아미노프로파노일)아미노]-4-((1E)-3-{(1S)-1-(클로로메틸)-5-[(6-메틸-β-D-글루코피라누로노실)옥시]-1,2-디히드로-3H-벤조[e]인돌-3-일}-3-옥소-1-프로페닐)페닐]-2-프로페노일}-1-(클로로메틸)-1,2-디히드로-3H-벤조[e]인돌-5-일 메틸 β-D-글루코피라노시두로네이트 (7)를 오렌지색 고체로서 수득하였으며, 이를 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다. 무수 DMF (5 mL) 중 아민 (7) 및 N-숙신이미딜 6-말레이미도헥사노에이트 (24 mg, 0.077 mmol)의 교반 용액에 DIEA (78 μL, 0.1 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 용매를 실온에서 감압 하에 제거하고, 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (SiO2, EtOAc/MeOH 10-20%)에 이어서 2회 (SiO2, EtOAc/MeOH 15%)에 의해 정제하여 (1S)-1-(클로로메틸)-3-((2E)-3-{4-((1E)-3-{(1S)-1-(클로로메틸)-5-[(6-메틸-β-D-글루코피라누로노실)옥시]-1,2-디히드로-3H-벤조[e]인돌-3-일}-3-옥소-1-프로페닐)-2-[(3-{[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일) 헥사노일] 아미노} 프로파노일)아미노]페닐}-2-프로페노일)-1,2-디히드로-3H-벤조[e]인돌-5-일 메틸 β-D-글루코피라노시두로네이트 8 (화합물 번호 84) (31 mg, 34%)을 황색 고체로서 수득하였다.
HPLC 순도 95.9%; 1H NMR (300 MHz, [(CD3)2SO] δ 10.01 (s, 1 H), 8.32 (s, 2 H), 8.31 (d, J = 8.6 Hz, 2 H), 8.09 (d, J = 8.2 Hz, 1 H), 7.89-7.95 (m, 3 H), 7.84 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.77 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.70 (d, J = 15.1 Hz, 1 H), 7.58 (t, J = 7.9 Hz, 2 H), 7.43 (t, J = 8.0 Hz, 2 H), 7.27 (d, J = 15.6 Hz, 2 H), 6.96 (s, 2 H), 5.67 (d, J = 5.3 Hz, 1 H), 5.66 (d, J = 5.3 Hz, 1 H), 5.45 (d, J = 5.6 Hz, 2 H), 5.35 (d, J = 4.6 Hz, 2 H), 5.16 (d, J = 7.5 Hz, 2 H), 4.52-4.62 (m, 4 H), 4.33 (br s, 2 H), 3.99-4.04 (m, 4 H), 3.93 (dd, J = 7.4, 10.5 Hz, 2 H), 3.68 (s, 3 H), 3.67 (s, 3 H), 3.37-3.48 (m, 8 H), 2.57-2.61 (m, 2 H), 2.09 (t, J = 7.3 Hz, 2 H), 1.41-1.54 (m, 4 H), 1.14-1.23 (m, 4 H); HRMS (ESI) 계산치 C65H67Cl2N5NaO20 (M + Na+) m/z 1330.3649; 실측치 m/z 1330.3600.
실시예 30 (S)-(1-메틸-1H-피롤-2,5-디일)비스(((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)메타논) (화합물 번호 15, 표 1, 도 45)
NMP (10 mL) 중 1 (500 mg, 3.22 mmol) 및 N,N-디메틸포름아미드 디-tert-부틸 아세탈 (2, 5.24 g, 25.77 mmol)의 혼합물을 100℃까지 가열하고, 밤새 교반하였다. 대부분의 휘발성 성분을 감압 하에 제거하고, 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물에 이어서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 실리카 겔의 패드를 통해 여과하였다. 용매를 제거하고, 3을 연한 결정질 고체 (331 mg, 38%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 12.26 (s, 1H), 6.68 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 1.51 (s, 18H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 290.1362 (M + Na). C14H21NNaO4 요구치 290.1363.
MeCN (1 mL) 및 물 (0.01 mL) 중 3 (50 mg, 0.18 mmol), K2CO3 (52 mg, 0.37 mmol), MeI (0.12 mL, 1.87 mmol) 및 테트라부틸암모늄 아이오다이드 (3.5 mg, 0.0094 mmol)의 혼합물을 35-40℃에서 가열하고, 3일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물에 이어서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 실리카 겔의 패드를 통해 여과하였다. 용매를 제거하고, 4를 담색 오일로서 수득하였으며, 이는 수시간 내에 무색 결정질 고체 (45 mg, 86%)로 되었다.
1H NMR (CDCl3) δ 6.77 (s, 2H), 4.21 (s, 3H), 1.56 (s, 18H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 304.1512 (M + Na). C15H23NNaO4 요구치 304.1519.
실온에서 DCM (1 mL) 중 4 (45 mg, 0.16 mmol)의 용액에 TFA (0.5 mL, 6.49 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 교반하여 분홍색 용액을 수득하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하고, 생성된 잔류물을 석유 에테르로 연화처리하여 5를 분홍색 고체 (25 mg, 93%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 12.81 (s, 2H), 6.80 (s, 2H), 4.15 (s, 3H) ppm. HRMS (ESI 음성) 실측치 m/z 168.0306 (M - H). C7H6NO4 요구치 168.0302.
실온에서 DCM (2 mL) 중 Boc-CBI-OH (화합물 51a, 130 mg, 0.39 mmol)의 용액에 디옥산 중 4N HCl (2 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 2.5시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하고, 생성된 잔류물 (6)을 그대로 직접 사용하였다.
DMA (2 mL) 중 6 (상기 제조함), 5 (22 mg, 0.13 mmol), EDCI 히드로클로라이드 (150 mg, 0.78 mmol) 및 톨루엔술폰산 (2.2 mg, 0.013 mmol)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 대부분의 용매를 펌핑하고, 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물에 이어서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트의 패드를 통해 여과하였다. 용매를 제거하고, 생성된 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 용리액으로서 MeOH 및 DCM의 혼합물 (v/v 2%)을 사용하여 정제하여 7 (화합물 번호 15, 표 1)을 회백색 고체 (60 mg, 77%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 10.43 (s, 2H), 8.12 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.83 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.73 (br s, 2H), 7.52 (dd, J = 1.0, 8.0 Hz, 2H), 7.37 (dd, J = 0.4, 8.0 Hz, 2H), 6.77 (s, 2H), 4.62-4.57 (m, 2H), 4.31-4.27 (m, 2H), 4.10-4.07 (m, 2H), 4.02-4.00 (m, 2H), 3.88-3.85 (m, 5H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 622.1255 (M + Na). C33H27Cl2N3NaO4 요구치 622.1271.
실시예 31 N-(2,5-비스((E)-3-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-3-옥소프로프-1-에닐)페닐)아세트아미드 (화합물 번호 16, 표 1, 도 46)
빙조에 들은 THF (5 mL) 및 피리딘 (5 mL) 중 1 (66f, 500 mg, 1.45 mmol)의 용액에 아세틸 클로라이드 (0.50 mL, 7.03 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 밤새 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하고, 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트와 수성 중탄산나트륨 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물에 이어서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트의 패드를 통해 여과하였다. 용매를 제거하고, 생성된 잔류물을 용리액으로서 에틸 아세테이트 및 석유 에테르 (v/v 1:2)의 혼합물을 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 2를 회백색 고체 (475 mg, 85%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 8.00 (s, 1H), 7.70 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.55-7.51 (m, 2H), 7.31 (명백한 d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.40 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.37 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 2.25 (s, 3H), 1.54 (s, 9H), 1.53 (s, 9H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 410.1921 (M + Na). C22H29NNaO5 요구치 410.1938.
실온에서 DCM (5 mL) 중 2 (470 mg, 1.21 mmol)의 용액에 TFA (2.5 mL, 32.40 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 교반하여 백색 현탁액을 수득하였다. 추가의 DCM을 첨가하여 추가의 고체를 침전시켰으며, 이를 여과에 의해 수집하고, 에틸 아세테이트 및 석유 에테르로 세척하였다. 3을 백색 고체 (290 mg, 87%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 12.40 (br s, 2H), 9.89 (s, 1H), 7.85 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.70 (명백한 d, J = 16.0 Hz, 2H), 7.57-7.53 (m, 2H), 6.54 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 2.09 (s, 3H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 298.0672 (M + Na). C14H13NNaO5 요구치 298.0686.
실온에서 DCM (3 mL) 중 Boc-CBI-OH (화합물 51a, 291 mg, 0.87 mmol)의 용액에 디옥산 중 4N HCl (3 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 2.5시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하고, 생성된 잔류물 (4)을 그대로 직접 사용하였다.
DMA (3 mL) 중 4 (상기 제조함), 3 (80 mg, 0.29 mmol), EDCI 히드로클로라이드 (334 mg, 1.74 mmol) 및 톨루엔술폰산 (5 mg, 0.029 mmol)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하고, 생성된 잔류물을 메탄올로 수회 연화처리하여 조 생성물 (123 mg)을 수득하였으며, 이를 THF 중에 용해시키고, MeOH의 첨가에 의해 침전시켜 5 (화합물 번호 16, 표 1)를 황색 고체 (96 mg, 47%, HPLC 순도 97%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 10.43 (s, 2H), 9.97 (s, 1H), 8.12-8.07 (m, 5H), 7.85-7.81 (m, 4H), 7.74 (명백한 d, J = 6.7 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 7.73 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.35 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.26 (dd, J = 3.2, 15.3 Hz, 2H), 4.58-4.46 (m, 4H), 4.28-4.22 (m, 2H), 4.05-3.98 (m, 2H), 3.88-3.82 (m, 2H), 2.15 (s, 3H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 728.1662 (M + Na). C40H33Cl2N3NaO5 요구치 728.1689.
실시예 32 (S,2E,2'E)-3,3'-(2-메톡시-1,4-페닐렌)비스(1-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)프로프-2-엔-1-온) (화합물 번호 17, 표 1, 도 47)
-30 내지 -40℃에서 드라이 아이스-MeCN 조에 들은 건조 THF (12 mL) 중 1 (2.50 g, 13.30 mmol)의 용액에 N2 하에 삼플루오린화붕소 디에틸 에테레이트 (BF3·Et2O, 4.92 mL, 39.90 mmol)를 적가하였다. 혼합물을 -30℃에서 10분 동안 교반한 후, tBuONO (2.39 mL, 19.94 mmol)를 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 1.5시간 동안 교반하여 현탁액을 수득하였다. 석유 에테르 (50 mL)를 첨가하여 추가의 침전물을 수득하였다. 상청액을 경사분리에 의해 제거하고, 남아 있는 고체를 석유 에테르로 세척하여 백색 고체를 수득하였다. 이 고체를 건조 MeCN (20 mL) 중에 용해시키고, 빙조에서 냉각시켰다. KI (11.00 g, 66.26 mmol) 및 I2 (6.00 g, 23.64 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한 후, 포화 Na2S2O3 용액 (50 mL)을 첨가하여 반응물을 켄칭하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물에 이어서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트의 패드를 통해 여과하였다. 용매를 제거하고, 생성된 잔류물을 용리액으로서 에틸 아세테이트 및 석유 에테르 (v/v 1:9)의 혼합물을 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 2를 담색 고체 (2.83 g, 71%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 7.50 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.84 (dd, J = 2.2, 8.5 Hz, 1H), 5.39 (s, 1H) ppm.
재증류시킨 트리에틸아민 (5 mL) 중 2 (500 mg, 1.67 mmol), tert-부틸 아크릴레이트 (0.728 mL, 5.02 mmol), 아세트산팔라듐 (II) (7.5 mg, 0.033 mmol) 및 트리-오르토-톨릴 포스핀 (41 mg, 0.13 mmol)의 혼합물을 환류 하에 N2 하에 밤새 가열하여 암회색 현탁액을 수득하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하였다. 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시키고, 침전물을 여과하였다. 여과물을 증발시키고, 수득된 잔류물을 칼럼 크로마토그래피에 의해 용리액으로서 에틸 아세테이트 및 석유 에테르의 혼합물 (v/v 1:6)을 사용하여 정제하여 3 (160 mg, 28%)을 회백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 10.43 (s, 1H), 7.75 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 6.56 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 6.41 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 1.483 (s, 9H), 1.478 (s, 9H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 369.1687 (M + Na). C20H26NaO5 요구치 369.1672.
DMF (2 mL) 중 3 (160 mg, 0.46 mmol)의 용액에 K2CO3 (254 mg, 1.84 mmol) 및 MeI (0.28 mL, 4.50 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 침전물을 여과하였다. 생성된 여과물을 물에 이어서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 셀라이트의 패드를 통해 여과하였다. 용매를 제거하고, 생성된 잔류물을 용리액으로서 에틸 아세테이트 및 석유 에테르 (v/v 1:10)의 혼합물을 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 4를 무색 오일 (72 mg, 43%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 7.87 (d, J = 16.2 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.10 (dd, J = 1.3, 8.0 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 6.47 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 6.38 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 3.91 (s, 3H), 1.539 (s, 9H), 1.533 (s, 9H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 383.1838 (M + Na). C21H28NaO5 요구치 383.1829.
실온에서 DCM (2 mL) 중 4 (70 mg, 0.19 mmol)의 용액에 TFA (1 mL, 12.98 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 2.5시간 동안 교반하여 백색 현탁액을 수득하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하고, 생성된 잔류물을 DCM 및 에틸 아세테이트로 연화처리하여 5를 백색 고체 (41 mg, 85%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 12.41 (br s, 2H), 7.80 (d, J = 16.2 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.30 (dd, J = 1.0, 8.1 Hz, 1H), 6.47 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.38 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 3.92 (s, 3H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 271.0573 (M + Na). C13H12NaO5 요구치 271.0577.
실온에서 DCM (2 mL) 중 Boc-CBI-OH (화합물 51a, 161 mg, 0.48 mmol)의 용액에 디옥산 중 4N HCl (2 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 2.5시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하고, 생성된 잔류물 (6)을 그대로 직접 사용하였다.
DMA (1 mL) 중 6 (상기 제조함), 5 (40 mg, 0.16 mmol), EDCI 히드로클로라이드 (185 mg, 0.97 mmol) 및 톨루엔술폰산 (2.8 mg, 0.016 mmol)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하고, 생성된 잔류물을 메탄올로 연화처리하여 황색 고체를 수득하였으며, 이를 THF 중에 용해시키고, 메탄올의 첨가에 의해 침전시켜 7 (화합물 번호 17, 표 1)을 황색 고체 (45 mg, 41%, HPLC 순도 98%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 10.43 (s, 2H), 8.12-8.10 (m, 4H), 8.00-7.95 (m, 2H), 7.85-7.80 (m, 2H), 7.72 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 7.54-7.50 (m, 4H), 7.37-7.26 (m, 4H), 4.57-4.45 (m, 4H), 4.28-4.22 (m, 2H), 4.00-3.99 (m, 5H), 3.90-3.83 (m, 2H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 701.1596 (M + Na). C39H32Cl2N2NaO5 요구치 701.1580.
실시예 33 (S,2E,2'E)-3,3'-(1-메틸-1H-피롤-2,5-디일)비스(1-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)프로프-2-엔-1-온) (화합물 번호 18 표 1, 도 48)
1을 문헌 방법을 사용하여 제조하였다 (문헌 [Russ J Org Chem, 2007, 43, 855-860] 참조).
2
MeCN (2 mL) 및 물 (0.02 mL) 중 1 (50 mg, 0.41 mmol), K2CO3 (112 mg, 0.81 mmol), MeI (0.25 mL, 4.06 mmol) 및 테트라부틸암모늄 아이오다이드 (7.5 mg, 0.020 mmol)의 혼합물을 40℃에서 가열하고, 3시간 동안 교반하였다. 대부분의 휘발성 성분을 감압 하에 제거하고, 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 재분포시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물에 이어서 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 실리카 겔의 패드를 통해 여과하였다. 용매를 제거하고, 2를 백색 고체 (47 mg, 84%)로서 수득하였으며; 1H NMR 스펙트럼은 보고된 것과 동일하였다 (문헌 [C. E. Loader, G. H. Barnett and H. J. Anderson, Can. J. Chem., 1982, 60, 383] 참조).
4
DCM (3 mL) 중 2 (40 mg, 0.29 mmol) 및 메틸 (트리페닐포스포라닐리덴)아세테이트 (3, 400 mg, 1.20 mmol)의 혼합물을 2일 동안 교반하여 황색 용액을 수득하였다. 혼합물을 용리액으로서 에틸 아세테이트 및 석유 에테르 (v/v = 1:5, 1:4 및 1:3)의 구배 혼합물을 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 4를 황색 고체 (63 mg, 87%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 7.61 (d, J = 15.6 Hz, 2H), 6.70 (s, 2H), 6.26 (d, J = 15.6 Hz, 2H), 3.79 (s, 6H), 3.73 (s, 3H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 272.0898 (M + Na). C13H15NNaO4 요구치 272.0893.
5
EtOH (2 mL) 및 THF (1 mL) 중 4 (60 mg, 0.24 mmol) 및 KOH (100 mg, 1.78 mmol)의 혼합물을 70℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 증발 건조시켰다. 생성된 잔류물을 물 중에 용해시키고, pH 5가 될 때까지 1N HCl로 산성화시켜 황색 침전물을 수득하였으며, 이를 여과에 의해 수집한 다음 물 및 석유 에테르로 세척하여 5를 황색 고체 (51 mg, 96%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 12.20 (s, 2H), 7.54 (d, J = 15.6 Hz, 2H), 6.89 (s, 2H), 6.30 (d, J = 15.6 Hz, 2H), 3.70 (s, 3H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 244.0590 (M + Na). C11H11NNaO4 요구치 244.0580.
7
실온에서 DCM (2 mL) 중 Boc-CBI-OH (화합물 51a, 200 mg, 0.60 mmol)의 용액에 디옥산 중 4N HCl (10 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하고, 생성된 잔류물 (6, 화합물 67d)을 그대로 직접 사용하였다.
DMA (2 mL) 중 6 (상기 제조함), 5 (49 mg, 0.22 mmol), EDCI 히드로클로라이드 (255 mg, 1.33 mmol) 및 톨루엔술폰산 (3.8 mg, 0.022 mmol)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 제거하고, 생성된 잔류물을 MeOH 및 에틸 아세테이트의 혼합물 (v/v 3%)을 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하고, 조 생성물을 에틸 아세테이트로 연화처리하여 7을 오렌지색 고체 (60 mg, 41%, HPLC 100%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 10.41 (s, 2H), 8.11 (d, J = 8.2 Hz, 4H), 7.81 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.70 (d, J = 14.9 Hz, 2H), 7.50 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.33 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.12 (s, 2H), 7.01 (d, J = 14.9 Hz, 2H), 4.49-4.42 (m, 4H), 4.24-4.19 (m, 2H), 4.01-3.97 (m, 2H), 3.85-3.82 (m, 5H) ppm. HRMS (ESI 음성) 실측치 m/z 650.1600 (M - H). C37H30Cl2N3O4 요구치 650.1619.
실시예 34 (S)-3,3'-(2-메톡시-1,4-페닐렌)비스(1-((S)-1-(클로로메틸)-5-히드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)프로프-2-인-1-온) (화합물 19, 표 1, 도 49)
2
화합물 2를 US2007/49758에 기재된 것을 기초로 하는 변형된 절차에 의해 합성하였다. DCM (100 mL) 중 1 (5.50 g, 25.00 mmol) 및 아세트산은 (I) (6.26 g, 37.5 mmol)의 현탁액에 DCM (150 mL) 중 아이오딘 (6.98 g, 27.50 mmol)의 용액을 적가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 셀라이트의 패드를 통해 여과하였다. 여과물을 증발시키고, 생성된 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 용리액으로서 에틸 아세테이트 및 석유 에테르의 혼합물 (v/v 1:10)을 사용하여 정제하여 2를 백색 고체 (966 mg, 11%)로서 수득하였다.
mp 97-99℃. 1H NMR (CDCl3) δ 7.342 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.339 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.00 (dd, J = 2.0, 8.3 Hz, 1H), 5.32 (s, 1H) ppm. 13C NMR (CDCl3, 100.6 MHz) δ 155.70, 139.46 (CH), 131.80 (CH), 124.44 (CH), 94.65, 85.52 ppm.
3
DMF (4 mL) 중 2 (270 mg, 0.78 mmol)의 용액에 K2CO3 (162 mg, 1.17 mmol) 및 MeI (0.24 mL, 3.90 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 실리카 겔의 패드를 통해 여과하고, 여과물을 증발시켜 3을 무색 오일 (277 mg, 99%)로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 7.45 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.04 (dd, J = 1.8, 8.1 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H) ppm.
4
재증류시킨 트리에틸아민 (5 mL) 중 3 (274 mg, 0.76 mmol), tert-부틸 프로피올레이트 (0.314 mL, 2.28 mmol), 아이오딘화구리 (I) (5.8 mg, 0.030 mmol), 아세트산팔라듐 (II) (3.4 mg, 0.015 mmol) 및 트리페닐 포스핀 (12 mg, 0.046 mmol)의 혼합물을 60℃에서 N2 하에 밤새 가열하여 암색 현탁액을 수득하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하였다. 생성된 잔류물을 DCM과 함께 교반하고, 침전물을 여과하였다. 여과물을 증발시키고, 수득된 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 용리액으로서 DCM 및 석유 에테르의 혼합물 (v/v=1:1)을 사용하여 정제하여 4 (195 mg, 72%)를 회백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 7.48 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.06 (s, 1H), 3.89 (s, 3H), 1.545 (s, 9H) and 1.514 (s, 9H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 379.1510 (M + Na). C21H24NaO5 요구치 379.1516.
5
실온에서 DCM (2 mL) 중 4 (100 mg, 0.28 mmol)의 용액에 TFA (1 mL, 12.98 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 2.5시간 동안 교반하여 백색 현탁액을 수득하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하고, 생성된 잔류물을 DCM 및 석유 에테르의 혼합물 (v/v=1:1)로 연화처리하여 5를 백색 고체 (66 mg, 96%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 13.92 (br s, 2H), 7.61 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.37 (명백한 s, 1H), 7.25 (dd, J = 1.1, 7.9 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H) ppm.
7
실온에서 DCM (3 mL) 중 Boc-CBI-OH (화합물 51a, 267 mg, 0.80 mmol)의 용액에 디옥산 중 4N HCl (3 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 2.5시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하고, 생성된 잔류물 (6)을 그대로 직접 사용하였다.
DMA (1 mL) 중 6 (상기 제조함), 5 (65 mg, 0.27 mmol), EDCI 히드로클로라이드 (306 mg, 1.60 mmol) 및 톨루엔술폰산 (4.6 mg, 0.027 mmol)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 모든 휘발성 성분을 펌핑하고, 생성된 잔류물을 메탄올로 연화처리하여 황색 고체를 수득하였으며, 이를 THF 중에 용해시키고, 메탄올의 첨가에 의해 침전시켜 7을 황색 고체 (140 mg, 78%, HPLC 순도 99%)로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO) δ 10.52 (s, 2H), 8.12 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.90-7.85 (m, 4H), 7.76 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.56-7.50 (m, 3H), 7.41-7.37 (m, 3H), 4.63-4.49 (m, 4H), 4.29-4.21 (m, 2H), 4.09-4.06 (m, 2H), 4.01 (s, 3H), 3.99-3.94 (m, 1H), 3.91-3.86 (m, 1H) ppm. HRMS (ESI) 실측치 m/z 697.1267 (M + Na). C39H28Cl2N2NaO5 요구치 697.1267.
실시예 19 환원 및 재산화에 의한 접합을 위한 시스테인 조작된 항체의 제조
특정 조건 하에, 시스테인 조작된 항체는 환원제 예컨대 DTT (클리랜드(Cleland) 시약, 디티오트레이톨) 또는 TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드; 문헌 [Getz et al. (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA])로의 처리에 의해 본 발명의 링커-약물 중간체, 예컨대 표 4의 것들과의 접합에 반응성이도록 제조될 수 있다. CHO 세포에서 발현된 전장, 시스테인 조작된 모노클로날 항체 (티오Mab) (Gomez et al. (2010) Biotechnology and Bioeng. 105(4):748-760; Gomez et al. (2010) Biotechnol. Prog. 26:1438-1445)를 예를 들어 약 50배 과량의 DTT를 사용하여 실온에서 밤새 환원시켜 새로 도입된 시스테인 잔기와 배양 배지에 존재하는 시스테인 사이에 형성될 수 있는 디술피드 결합을 환원시켰다.
경쇄 아미노산은 카바트 (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, (1991) 5th Ed., US Dept of Health and Human Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)에 따라 넘버링하였다. 중쇄 아미노산은 카바트 시스템으로 나타낸 경우를 제외하고는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링하였다 (Edelman et al. (1969) Proc. Natl. Acad. of Sci. 63(1):78-85). 단일 문자의 아미노산 약어를 사용하였다.
CHO 세포에서 발현된 전장, 시스테인 조작된 모노클로날 항체 (티오Mab)는 시스테인 부가물 (시스틴)을 보유하거나, 또는 세포 배양 조건으로 인해 조작된 시스테인 상에서 글루타티오닐화된다. 조작된 시스테인의 반응성 티올 기를 유리시키기 위해, 티오MAb를 약 pH 8.0에서 500 mM 붕산나트륨 및 500 mM 염화나트륨 중에 용해시키고, 약 50-100배 과량의 1 mM TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (Getz et al. (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA)로 37℃에서 약 1-2시간 동안 환원시켰다. 대안적으로, DTT를 환원제로서 사용할 수 있다. 쇄간 디술피드 결합의 형성을 비-환원 SDS-PAGE 또는 변성 역상 HPLC PLRP 칼럼 크로마토그래피에 의해 모니터링하였다. 환원된 티오Mab를 희석하고, 10 mM 아세트산나트륨, pH 5 중에서 하이트랩(HiTrap) SP FF 칼럼 상에 로딩하고, 0.3 M 염화나트륨을 함유하는 PBS, 또는 150 mM 염화나트륨을 함유하는 50 mM 트리스-Cl, pH 7.5로 용리하였다.
재산화를 수행함으로써 모 Mab에 존재하는 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 재확립시켰다. 용리된 환원된 티오Mab를 15X 또는 2 mM 데히드로아스코르브산 (dhAA)으로 pH 7에서 3시간 동안, 또는 50 mM 트리스-Cl, pH 7.5 중에서 3시간 동안, 또는 2 mM 수성 황산구리 (CuSO4)로 실온에서 밤새 처리하였다. 관련 기술분야에 공지된 다른 산화제, 즉 산화 작용제, 및 산화 조건이 사용될 수 있다. 주위의 공기 산화가 또한 효과적일 수 있다. 이 온화한 부분적 재산화 단계는 효율적으로 쇄내 디술피드를 고충실도로 형성시킨다. 완충제를 세파덱스(Sephadex) G25 수지 상에서의 용리에 의해 교환하고, 1 mM DTPA를 함유하는 PBS로 용리시켰다. 상기 용액의 280 nm에서의 흡광도로부터 환원된 항체 농도를 결정하고, DTNB (알드리치(Aldrich), 위스콘신주 밀워키)와 반응시켜 412 nm에서의 흡광도를 측정하여 티올 농도를 결정함으로써 티올/Ab 값을 확인하였다.
액체 크로마토그래피/질량 분광측정 분석을 확장된 질량 범위를 갖는 TSQ 퀀텀 트리플(Quantum Triple) 사중극자™ 질량 분광계 (써모 일렉트론(Thermo Electron), 캘리포니아주 산 호세) 상에서 수행하였다. 샘플을 75℃로 가열한 PRLP-S®, 1000 A, 소구경 칼럼 (50mm × 2.1mm, 폴리머 래보러토리즈(Polymer Laboratories), 영국 슈롭셔) 상에서 크로마토그래피하였다. 30-40% B (용매 A: 물 중 0.05% TFA, 용매 B: 아세토니트릴 중 0.04% TFA)의 선형 구배를 사용하였고, 용리액은 전기분무 공급원을 사용하여 직접 이온화하였다. 데이터는 엑스칼리버(Xcalibur)® 데이터 시스템에 의해 수집하였고, 디컨볼루션은 프로매스(ProMass)® (노바티아, 엘엘씨(Novatia, LLC), 뉴저지주)를 사용하여 수행하였다. LC/MS 분석 전에, 항체 또는 약물 접합체 (50 마이크로그램)를 PNGase F (2 단위/mL, 프로자임(PROzyme), 캘리포니아주 산 레안드로)로 37℃에서 2시간 동안 처리하여 N-연결된 탄수화물을 제거하였다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 샘플을 부틸 HIC NPR 칼럼 (2.5 마이크로미터 입자 크기, 4.6 mm × 3.5 cm) (도소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience))에 주입하고, 0 → 70% B, 0.8 ml/분의 선형 구배 (A: 50 mM 인산칼륨, pH 7 중 1.5 M 황산암모늄, B: 50 mM 인산칼륨 pH 7, 20% 이소프로판올)로 용리하였다. 다중 파장 검출기 및 켐스테이션(Chemstation) 소프트웨어가 장착된 애질런트(Agilent) 1100 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 항체당 다양한 비의 약물을 갖는 항체 종을 분석하고 정량화하였다.
실시예 20 항체에 대한 링커-약물 중간체의 접합
실시예 19의 환원 및 재산화 절차 후에, 항체를 PBS (포스페이트 완충 염수) 완충제 중에 용해시키고, 얼음 상에서 냉각시켰다. 과량의, 약 1.5 몰 내지 20 당량의 링커-약물 중간체 (표 4의 51-68을 포함하나 이에 제한되지는 않음)와 티올-반응성 관능기 예컨대 말레이미도 또는 브로모-아세트아미드를 DMSO 중에 용해시키고, 아세토니트릴 및 물 중에 희석하고, PBS 중 냉각 환원된, 재산화된 항체에 첨가하였다. 약 1시간 후, 과량의 말레이미드를 첨가하여 반응물을 켄칭하고, 임의의 미반응 항체 티올 기를 캡핑하였다. 접합체 혼합물을 로딩하고, 하이트랩 SP FF 칼럼을 통해 용리하여 잉여 약물-링커 중간체 및 다른 불순물을 제거할 수 있다. 반응 혼합물을 원심 한외여과에 의해 농축시키고, 시스테인 조작된 항체 약물 접합체를 PBS 중 G25 수지를 통한 용리에 의해 정제 및 탈염하고, 멸균 조건 하에 0.2 μm 필터를 통해 여과하고 냉동시켜 저장하였다.
상기 절차에 의해, 시스테인 조작된, 표 3의 항체 약물 접합체 101-133을 제조하였다.
실시예 21 시험관내 세포 증식 검정
ADC의 효능을 하기 프로토콜을 이용하여 세포 증식 검정에 의해 측정하였다 (셀타이터 글로™ 발광 세포 생존율 검정, 프로메가 코포레이션. 기술 회보 TB288; Mendoza et al. (2002) Cancer Res. 62:5485-5488):
1. 배지 중에 약 104개의 세포 (SKBR-3, BT474, MCF7 또는 MDA-MB-468)를 함유하는 세포 배양물 100 μl의 분취물을 96-웰, 불투명-벽 플레이트의 각 웰에 침착시켰다.
2. 배지를 함유하며 세포는 함유하지 않는 대조군 웰을 제조하였다.
3. ADC를 실험 웰에 첨가하고, 3-5일 동안 인큐베이션하였다.
4. 플레이트를 대략 30분 동안 실온으로 평형화시켰다.
5. 각 웰에 존재하는 세포 배양 배지의 부피와 동등한 부피의 셀타이터-글로™ 시약을 첨가하였다.
6. 내용물을 오비탈 진탕기 상에서 2분 동안 혼합하여 세포 용해를 유도하였다.
7. 플레이트를 실온에서 10분 동안 인큐베이션하여 발광 신호를 안정화시켰다.
8. 발광을 기록하고, RLU = 상대적 발광 단위로서 그래프로 보고하였다.
데이터를 표준 편차 오차 막대와 함께 각 세트의 반복에 대한 발광의 평균으로서 플롯팅하였다. 프로토콜은 셀타이터 글로™ 발광 세포의 변형이었다.
배지: SK-BR-3을 50/50/10%FBS/글루타민 중에서 성장시키고/250 μg/mL G-418 OVCAR-3을 RPMI/20%FBS/글루타민에서 성장시켰다.
실시예 22 고 발현 HER2 트랜스제닉 외식편 마우스 및 다른 종양 모델에서의 종양 성장 억제, 생체내 효능
종양을 확립시키고, (캘리퍼를 사용하여 측정 시에) 150-200 mm3의 부피로 성장하도록 한 후, 제0일에 단일 처리하였다. 종양 부피를 하기 식에 따라 캘리퍼를 사용하여 측정하였다: V (mm3) = 0.5A X B2, 여기서 A 및 B는 각각 긴 직경 및 짧은 직경이다. 종양 부피가 3000 mm3에 도달하기 전에 또는 종양이 절박 궤양화의 징후를 나타내는 경우에 마우스를 안락사시켰다. 각각의 실험군 (군당 10마리 마우스)으로부터 수집된 데이터를 평균 ± SE로 표현하였다.
이전에 기재된 바와 같이 (Phillips GDL, Li GM, Dugger DL, et al. Targeting HER2-Positive Breast Cancer with Trastuzumab-DM1, an Antibody-Cytotoxic Drug Conjugate. (2008) Cancer Res. 68:9280-90) (본원에 참조로 포함됨), Fo5 마우스 유방 종양 모델을 사용하여 단일 용량 정맥내 주사 후에 본 발명의 항체-약물 접합체의 생체내 효능을 평가하였다. 도 31 및 32에 제시된 바와 같이 인간 HER2 유전자가 뮤린 유방 종양 바이러스 프로모터 (MMTV-HER2)의 전사 조절 하에 유방 상피에서 과다발현된 트랜스제닉 마우스 모델인 Fo5 모델을 사용하여 항-Her2 ADC를 시험하였다. HER2 과다발현은 유방 종양의 자발적 발생을 유발한다. 이들 시조 동물 (시조 #5 [Fo5]) 중 1마리의 유방 종양을 종양 단편 (~ 2 × 2 mm 크기)의 연속 이식에 의해 FVB 마우스의 후속 세대에 전파시켰다. 모든 연구는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행하였다. 각각의 항체-약물 접합체 (단일 용량)를 연구 시작 시점 및 이식 14일 후에 9마리의 동물에게 정맥내로 투여하였다. 초기 종양 크기는 약 200 mm3 부피였다. 시간 경과에 따른 본 발명의 항체-약물 접합체 및 대조군에 의한 종양 성장 억제의 측정을 도 31-34에 제시하였다.
OVCAR-3 유방 지방 패드 이식 효능 모델을 기재된 바와 같이 (Chen et al. (2007) Cancer Res 67:4924-4932) 사용하여 단일 정맥내 용량 후에 종양 부피를 평가하고, 이어서 복강내 종양을 보유하는 마우스로부터 절제된 종양을 사용하여 수용자 마우스의 유방 지방 패드 내로 연속적으로 계대배양하였다 (도 33).
항-Napi2B 항체-약물 접합체 (ADC)의 효능을 Igrov-1 (인간 난소암)의 마우스 이종이식편 모델에서 조사하였다.
암컷 C.B-17 SCID-베이지 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories); 캘리포니아주 샌디에고) 각각의 흉부 유방 지방 패드 영역에 5백만개의 Igrov-1 세포를 접종하였다. 이종이식 종양이 100-300 mm3의 평균 종양 부피에 도달하면 (제0일로 지칭함), 동물을 각각 7-10마리 마우스의 군으로 무작위 배정하고, ADC의 단일 정맥내 주사를 제공하였다. 마우스의 종양 및 체중을 연구 전반에 걸쳐 주 1-2회 측정하였다. 체중 감소가 그의 출발 체중의 >20%인 경우에 마우스를 즉시 안락사시켰다. 종양이 3000 mm3에 도달하기 전에 또는 절박 궤양화의 징후를 나타내기 전에 모든 동물을 안락사시켰다.
항-CD33 항체-약물 접합체 (ADC)의 효능을 HL-60 또는 EOL-1 (인간 급성 골수성 백혈병)의 마우스 이종이식편 모델에서 조사하였다. HL-60 세포주는 ATCC (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection); 버지니아주 마나사스)로부터 입수하였고, EOL-1 세포주는 DSMZ (저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘스 앤드 셀 컬쳐스(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures); 독일 브라운슈바이크)로부터 유래되었다.
암컷 C.B-17 SCID 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈; 캘리포니아주 홀리스터) 각각의 측복부 영역에 HL-60 또는 EOL-1의 5백만개의 세포를 피하로 접종하였다. 이종이식 종양이 100-300 mm3의 평균 종양 부피에 도달하면 (제0일로 지칭됨), 동물을 각각 7-10마리 마우스의 군으로 무작위 배정하고, ADC의 단일 정맥내 주사를 제공하였다. ADC 투여 대략 4시간 전에, 동물에게 과량 (30mg/kg)의 항-gD 대조 항체를 복강내로 투여하여 종양 세포 상의 가능한 비특이적 항체 결합 부위를 차단하였다. 마우스의 종양 및 체중을 연구 전반에 걸쳐 주 1-2회 측정하였다. 체중 감소가 그의 출발 체중의 >20%인 경우에 마우스를 즉시 안락사시켰다. 종양이 3000 mm3에 도달하기 전에 또는 절박 궤양화의 징후를 나타내기 전에 모든 동물을 안락사시켰다.
상기 본 발명은 이해의 명확성의 목적을 위해 예시 및 예의 방식으로 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 상기 설명 및 예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 명세서 전반에 걸쳐 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 참고문헌은 명백하게 본원에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. <120> 1-(CHLOROMETHYL)-2,3-DIHYDRO-1H-BENZO[E]INDOLE DIMER ANTIBODY-DRUG CONJUGATE COMPOUNDS, AND METHODS OF USE AND TREATMENT <130> P5625R1-WO <140> <141> <150> 61/969,499 <151> 2014-03-24 <150> 61/916,388 <151> 2013-12-16 <150> 61/864,889 <151> 2013-08-12 <160> 74 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Val Gly Asn Thr Phe Leu Glu 1 5 10 15 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Phe Gln Gly Ser Gln Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Gly Tyr Glu Phe 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Val Thr Glu Gln Asp Cys Lys Asp Ser Thr Tyr 1 5 10 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Gly Leu Ser Ser Pro Cys Thr Lys Ser Phe Asn 1 5 10 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Phe Leu Ser Val Ser Cys Gly Gly Arg Val Thr 1 5 10 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Glu Ile Lys Arg Thr Cys Ala Ala Pro Ser Val 1 5 10 <210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Thr Val Ala Ala Pro Cys Val Phe Ile Phe Pro 1 5 10 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Phe Ile Phe Pro Pro Cys Asp Glu Gln 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 49 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Asn Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Asn Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu His Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Asp Gly Gly Leu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala Cys Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr 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Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp 1 5 10 15 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Leu Gly Val Asn Ser Val Ser 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 54 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 60 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 61 Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 62 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 62 Gly Asn Tyr Met Ser 1 5 <210> 63 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 63 Leu Ile Tyr Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 64 Asp Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Met Val Val 1 5 10 <210> 65 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 65 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val 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Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Leu Ile Tyr Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Met Val Val Trp Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 69 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 69 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 70 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 70 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Gly Asn 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Leu Ile Tyr Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Met Val Val Trp Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 71 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 71 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 72 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 72 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Gly Asn 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Leu Ile Tyr Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Asp Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Met Val Val Trp Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 73 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Met Ala Glu Ala Ile Thr Tyr 1 5 <210> 74 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Thr Ala Phe Arg Phe Pro Asp 1 5

Claims (63)

  1. 하기 화학식을 갖는 항체-약물 접합체 화합물.
    Figure pct00078

    상기 식에서,
    Ab는 항체이고;
    L은 하기 화학식을 갖는 링커이고,
    Figure pct00079

    여기서 Str은 항체에 공유 부착된 스트레쳐 단위이고; Pep는 2 내지 12개의 아미노산 잔기의 임의적인 펩티드 단위이고, Sp는 이량체 약물 모이어티에 공유 부착된 임의적인 스페이서 단위이고, m 및 n은 독립적으로 0 및 1로부터 선택되고;
    p는 1 내지 8의 정수이고;
    D는 하기 화학식을 갖는 이량체 약물 모이어티이고,
    Figure pct00080

    여기서
    R1은 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb, 또는 L에 대한 결합으로부터 선택되고;
    R2는 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb, 또는 L에 대한 결합으로부터 선택되고;
    Ra 및 Rb는 독립적으로 H, 및 1개 이상의 F로 임의로 치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되거나,
    또는 Ra 및 Rb는 5 또는 6원 헤테로시클릴 기를 형성하고;
    T는 C3-C12 알킬렌, Y, (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C2-C6 알케닐렌)-Y-(C2-C6 알케닐렌), 및 (C2-C6 알키닐렌)-Y-(C2-C6 알키닐렌)으로부터 선택된 테더 기이고;
    여기서 Y는 독립적으로 O, S, NR1, 아릴, 및 헤테로아릴로부터 선택되고;
    여기서 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 F, OH, O(C1-C6 알킬), NH2, NHCH3, N(CH3)2, OP(O)3H2, 및 C1-C6 알킬로 독립적으로 및 임의로 치환되고, 여기서 알킬은 1개 이상의 F로 임의로 치환되거나;
    또는 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 L에 대한 결합으로 독립적으로 및 임의로 치환되고;
    D'는
    Figure pct00081
    로부터 선택된 약물 모이어티이고;
    여기서 파상선은 T에 대한 부착 부위를 나타내고;
    X1 및 X2는 독립적으로 O 및 NR3으로부터 선택되고, 여기서 R3은 H, 및 1개 이상의 F로 임의로 치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되고;
    R4는 H, CO2R, 또는 L에 대한 결합이고, 여기서 R은 C1-C6 알킬 또는 벤질이고;
    R5는 H 또는 C1-C6 알킬이다.
  2. 제1항에 있어서, Str이 하기 화학식을 가지며,
    Figure pct00082

    여기서 R6은 C1-C10 알킬렌, C3-C8 카르보시클릴, O-(C1-C8 알킬), 아릴렌, C1-C10 알킬렌-아릴렌, 아릴렌-C1-C10 알킬렌, C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보시클릴), (C3-C8 카르보시클릴)-C1-C10 알킬렌, C3-C8 헤테로시클릴, C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로시클릴), (C3-C8 헤테로시클릴)-C1-C10 알킬렌, C1-C10 알킬렌-C(O)N(R8)-C2-C6 알킬렌-N(R8), N(R8)-(C2-C6 알킬렌), 및 (CH2CH2O)r-CH2로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 R8은 H 또는 C1-C6 알킬이고, r은 1 내지 10 범위의 정수인
    항체-약물 접합체 화합물.
  3. 제2항에 있어서, R6이 (CH2)5인 항체-약물 접합체 화합물.
  4. 제1항에 있어서, m이 0이고 n이 0인 항체-약물 접합체 화합물.
  5. 제1항에 있어서, m이 0이고 n이 1인 항체-약물 접합체 화합물.
  6. 제1항에 있어서, Str이 하기 화학식을 가지며,
    Figure pct00083

    여기서 R7은 C1-C10 알킬렌, C1-C10 알킬렌-O, N(R8)-(C2-C6 알킬렌)-N(R8), N(R8)-(C2-C6 알킬렌), 및 (CH2CH2O)r-CH2로부터 선택되고; 여기서 R8은 H 또는 C1-C6 알킬이고, r은 1 내지 10 범위의 정수인
    항체-약물 접합체 화합물.
  7. 제1항에 있어서, Str이 하기 화학식을 가지며,
    Figure pct00084

    여기서 R9는 C1-C10 알킬렌, C1-C10 알킬렌-O, (C2-C6 알킬렌)-N(R8), 및 (CH2CH2O)r-CH2로부터 선택되고; 여기서 R8은 H 또는 C1-C6 알킬이고, r은 1 내지 10 범위의 정수인
    항체-약물 접합체 화합물.
  8. 제7항에 있어서, L이 항체의 시스테인 아미노산과 디술피드 결합을 형성하고, R9가 C2-C6 알킬렌-O이고, 여기서 알킬렌이 F, OH, O(C1-C6 알킬), NH2, NHCH3, N(CH3)2, OP(O)3H2, 및 C1-C6 알킬로 임의로 치환되고, 여기서 알킬이 1개 이상의 F로 임의로 치환된 것인 항체-약물 접합체 화합물.
  9. 제1항에 있어서, m이 1이고 n이 1인 항체-약물 접합체 화합물.
  10. 제1항에 있어서, m이 1이고 Pep가 글리신, 알라닌, 페닐알라닌, 리신, 아르기닌, 발린, 및 시트룰린으로부터 독립적으로 선택된 2 내지 12개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 항체-약물 접합체 화합물.
  11. 제10항에 있어서, Pep가 발린-시트룰린인 항체-약물 접합체 화합물.
  12. 제1항에 있어서, n이 1이고 Sp가 파라-아미노벤질 또는 파라-아미노벤질옥시카르보닐을 포함하는 것인 항체-약물 접합체 화합물.
  13. 제9항에 있어서, 하기 화학식을 가지며,
    Figure pct00085

    여기서 AA1 및 AA2는 독립적으로 아미노산 측쇄로부터 선택되고; p는 1 내지 8의 정수인
    항체-약물 접합체 화합물.
  14. 제13항에 있어서, 아미노산 측쇄가 독립적으로 H, -CH3, -CH2(C6H5), -CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2NHC(NH)NH2, -CHCH(CH3)CH3, 및 -CH2CH2CH2NHC(O)NH2로부터 선택된 것인 항체-약물 접합체 화합물.
  15. 제14항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 항체-약물 접합체 화합물.
    Figure pct00086
  16. 제15항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 항체-약물 접합체 화합물.
    Figure pct00087
  17. 제16항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 항체-약물 접합체 화합물.
    Figure pct00088
  18. 제9항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 항체-약물 접합체 화합물.
    Figure pct00089
  19. 제18항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 항체-약물 접합체 화합물.
    Figure pct00090
  20. 제9항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 항체-약물 접합체 화합물.
    Figure pct00091
  21. 제20항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 항체-약물 접합체 화합물.
    Figure pct00092
  22. 제20항에 있어서, 하기 화학식을 가지며,
    Figure pct00093

    여기서 R7은 독립적으로 H 및 C1-C12 알킬로부터 선택된 것인
    항체-약물 접합체 화합물.
  23. 제1항에 있어서, Ra 및 Rb가 N-메틸피페라지닐, 모르폴리닐, 피페리딜, 및 피롤리디닐로부터 선택된 5 또는 6원 헤테로시클릴 기를 형성하는 것인 항체-약물 접합체 화합물.
  24. 제1항에 있어서, T가 C3-C5 알킬렌인 항체-약물 접합체 화합물.
  25. 제24항에 있어서, T가 (CH2)3, (CH2)4 및 (CH2)5로부터 선택된 것인 항체-약물 접합체 화합물.
  26. 제1항에 있어서, T가 (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌)이고, 여기서 Y가 L에 대한 결합으로 치환된 페닐인 항체-약물 접합체 화합물.
  27. 제1항에 있어서, T가 (C2-C6 알케닐렌)-Y-(C2-C6 알케닐렌)이고, 여기서 Y가 L에 대한 결합으로 치환된 페닐인 항체-약물 접합체 화합물.
  28. 제1항에 있어서, Y가 페닐, 피리딜, 1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸, 및 [1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딘으로부터 선택된 것인 항체-약물 접합체 화합물.
  29. 제1항에 있어서, D'가
    Figure pct00094
    인 항체-약물 접합체 화합물.
  30. 제1항에 있어서, D'가
    Figure pct00095
    인 항체-약물 접합체 화합물.
  31. 제1항에 있어서, D'가
    Figure pct00096
    인 항체-약물 접합체 화합물.
  32. 제1항에 있어서, 항체가 하기 수용체 (1)-(51) 중 1종 이상에 결합하는 것인 항체-약물 접합체 화합물:
    (1) BMPR1B (골 형태발생 단백질 수용체-유형 IB);
    (2) E16 (LAT1, SLC7A5);
    (3) STEAP1 (전립선의 6회 막횡단 상피 항원);
    (4) 0772P (CA125, MUC16);
    (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, 거핵구 강화 인자, 메소텔린);
    (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 운반체 패밀리 34 (인산나트륨), 구성원 2, 유형 II 나트륨-의존성 포스페이트 수송체 3b);
    (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm. 42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 5b Hlog, sema 도메인, 7개 트롬보스폰딘 반복부 (유형 1 및 유형 1-유사), 막횡단 도메인 (TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 5B);
    (8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자);
    (9) ETBR (엔도텔린 유형 B 수용체);
    (10) MSG783 (RNF124, 가설 단백질 FLJ20315);
    (11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선암 연관 유전자 1, 전립선암 연관 단백질 1, 전립선의 6회 막횡단 상피 항원 2, 6회 막횡단 전립선 단백질);
    (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 전위 양이온 채널, 서브패밀리 M, 구성원 4);
    (13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유래 성장 인자);
    (14) CD21 (CR2 (보체 수용체 2) 또는 C3DR (C3d/엡스타인 바르 바이러스 수용체) 또는 Hs.73792);
    (15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (이뮤노글로불린-연관 베타), B29);
    (16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (포스파타제 앵커 단백질 1a를 함유하는 SH2 도메인), SPAP1B, SPAP1C);
    (17) HER2;
    (18) NCA;
    (19) MDP;
    (20) IL20Rα;
    (21) 브레비칸;
    (22) EphB2R;
    (23) ASLG659;
    (24) PSCA;
    (25) GEDA;
    (26) BAFF-R (B 세포-활성화 인자 수용체, BLyS 수용체 3, BR3);
    (27) CD22 (B-세포 수용체 CD22-B 이소형);
    (28) CD79a (CD79A, CD79α, 이뮤노글로불린-연관 알파;
    (29) CXCR5 (버킷 림프종 수용체 1);
    (30) HLA-DOB (MHC 부류 II 분자의 베타 서브유닛);
    (31) P2X5 (퓨린성 수용체 P2X 리간드-게이팅 이온 채널 5;
    (32) CD72 (B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2);
    (33) LY64 (림프구 항원 64 (RP105), 류신 풍부 반복부 (LRR) 패밀리의 유형 I 막 단백질);
    (34) FcRH1 (Fc 수용체-유사 단백질 1);
    (35) IRTA2 (이뮤노글로불린 슈퍼패밀리 수용체 전위 연관 2);
    (36) TENB2 (추정 막횡단 프로테오글리칸);
    (37) PMEL17 (은 상동체; SILV; D12S53E; PMEL17; (SI); (SIL); ME20; gp100);
    (38) TMEFF1 (EGF-유사 및 2개의 폴리스타틴-유사 도메인을 갖는 막횡단 단백질 1; 토모레귤린-1; H7365; C9orf2; C9ORF2; U19878; X83961);
    (39) GDNF-Ra1 (GDNF 패밀리 수용체 알파 1; GFRA1; GDNFR; GDNFRA; RETL1; TRNR1; RET1L; GDNFR-알파1; GFR-알파-1; U95847; BC014962);
    (40) Ly6E (림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 E; Ly67,RIG-E,SCA-2,TSA-1);
    (41) TMEM46 (shisa 상동체 2 (크세노푸스 라에비스(Xenopus laevis)); SHISA2);
    (42) Ly6G6D (림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 G6D; Ly6-D, MEGT1);
    (43) LGR5 (류신-풍부 반복부-함유 G 단백질-커플링된 수용체 5; GPR49, GPR67);
    (44) RET (ret 원종양유전자; MEN2A; HSCR1; MEN2B; MTC1; (PTC); CDHF12; Hs.168114; RET51; RET-ELE1);
    (45) LY6K (림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K; LY6K; HSJ001348; FLJ35226);
    (46) GPR19 (G 단백질-커플링된 수용체 19; Mm 4787);
    (47) GPR54 (KISS1 수용체; KISS1R; GPR54; HOT7T175; AXOR12);
    (48) ASPHD1 (아스파르테이트 베타-히드록실라제 도메인 함유 1; LOC253982);
    (49) 티로시나제 (TYR; OCAIA; OCA1A; 티로시나제; SHEP3);
    (50) TMEM118 (ring 핑거 단백질, 막횡단 2; RNFT2; FLJ14627); 및
    (51) GPR172A (G 단백질-커플링된 수용체 172A; GPCR41; FLJ11856; D15Ertd747e).
  33. 제1항에 있어서, 항체가 항-CD22 항체인 항체-약물 접합체 화합물.
  34. 제33항에 있어서, 항-CD22 항체가 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3) 및 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3)을 포함하며, 여기서
    HVR-L1은 서열 1의 아미노산 서열을 포함하고;
    HVR-L2는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고;
    HVR-L3은 서열 3의 아미노산 서열을 포함하고;
    HVR-H1은 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고;
    HVR-H2는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하고;
    HVR-H3은 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    항체-약물 접합체 화합물.
  35. 제1항에 있어서, 항체가 항-MUC16 항체인 항체-약물 접합체 화합물.
  36. 제35항에 있어서, 항-MUC16 항체가 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3) 및 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3)을 포함하며, 여기서
    HVR-L1은 서열 7의 아미노산 서열을 포함하고;
    HVR-L2는 서열 8의 아미노산 서열을 포함하고;
    HVR-L3은 서열 9의 아미노산 서열을 포함하고;
    HVR-H1은 서열 10의 아미노산 서열을 포함하고;
    HVR-H2는 서열 11의 아미노산 서열을 포함하고;
    HVR-H3은 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    항체-약물 접합체 화합물.
  37. 제35항에 있어서, 항-MUC16 항체가 서열 15-32로부터 선택된 경쇄 서열 또는 서열 33-46으로부터 선택된 중쇄 서열에 위치하는 1개 이상의 유리 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 시스테인-조작된 항체인 항체-약물 접합체 화합물.
  38. 제1항에 있어서, 항체가 항-HER2 항체인 항체-약물 접합체 화합물.
  39. 제1항에 있어서, 항-HER2 항체가 트라스투주맙인 항체-약물 접합체 화합물.
  40. 제1항에 있어서, 항체가 항-CD33 항체인 항체-약물 접합체 화합물.
  41. 제40항에 있어서, 항-CD33 항체가 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3) 및 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3)을 포함하며, 여기서
    HVR-L1은 서열 51의 아미노산 서열을 포함하고;
    HVR-L2는 서열 52의 아미노산 서열을 포함하고;
    HVR-L3은 서열 53의 아미노산 서열을 포함하고;
    HVR-H1은 서열 54의 아미노산 서열을 포함하고;
    HVR-H2는 서열 55의 아미노산 서열을 포함하고;
    HVR-H3은 서열 56의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    항체-약물 접합체 화합물.
  42. 제40항에 있어서, 항-CD33 항체가 서열 57의 경쇄 초가변 영역 또는 서열 58의 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체-약물 접합체 화합물.
  43. 제40항에 있어서, 항-CD33 항체가 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3) 및 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3)을 포함하며, 여기서
    HVR-L1은 서열 59의 아미노산 서열을 포함하고;
    HVR-L2는 서열 60의 아미노산 서열을 포함하고;
    HVR-L3은 서열 61의 아미노산 서열을 포함하고;
    HVR-H1은 서열 62의 아미노산 서열을 포함하고;
    HVR-H2는 서열 63의 아미노산 서열을 포함하고;
    HVR-H3은 서열 64의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    항체-약물 접합체 화합물.
  44. 제40항에 있어서, 항-CD33 항체가 서열 65, 서열 67, 서열 69 및 서열 71로부터 선택된 경쇄 초가변 영역; 또는 서열 66, 서열 68, 서열 70 및 서열 72로부터 선택된 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체-약물 접합체 화합물.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 항체-약물 접합체 화합물 및 제약상 허용되는 담체, 활택제, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  46. 환자에게 치료 유효량의 제45항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  47. a) 제45항의 제약 조성물; 및
    b) 사용 지침서
    를 포함하는, 암을 치료하기 위한 키트.
  48. 하기 화학식을 갖는 링커-약물 중간체.
    Figure pct00097

    상기 식에서,
    X는 말레이미드, 티올, 아미노, 브로마이드, 브로모아세트아미도, 아이오도아세트아미도, p-톨루엔술포네이트, 아이오다이드, 히드록실, 카르복실, 피리딜 디술피드, 및 N-히드록시숙신이미드로부터 선택된 반응성 관능기이고;
    L은 하기 화학식을 갖는 링커이고,
    Figure pct00098

    여기서 Str은 X에 공유 부착된 스트레쳐 단위이고; Pep는 2 내지 12개의 아미노산 잔기의 임의적인 펩티드 단위이고, Sp는 이량체 약물 모이어티에 공유 부착된 임의적인 스페이서 단위이고, m 및 n은 독립적으로 0 및 1로부터 선택되고;
    D는 하기 화학식을 갖는 이량체 약물 모이어티이고,
    Figure pct00099

    여기서
    R1은 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb, 또는 L에 대한 결합으로부터 선택되고;
    R2는 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb, 또는 L에 대한 결합으로부터 선택되고;
    Ra 및 Rb는 독립적으로 H, 및 1개 이상의 F로 임의로 치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되거나, 또는 Ra 및 Rb는 5 또는 6원 헤테로시클릴 기를 형성하고;
    T는 C3-C12 알킬렌, Y, (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C2-C6 알케닐렌)-Y-(C2-C6 알케닐렌), 및 (C2-C6 알키닐렌)-Y-(C2-C6 알키닐렌)으로부터 선택된 테더 기이고;
    여기서 Y는 독립적으로 O, S, NR1, 아릴, 및 헤테로아릴로부터 선택되고;
    여기서 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 F, OH, O(C1-C6 알킬), NH2, NHCH3, N(CH3)2, OP(O)3H2, 및 C1-C6 알킬로 독립적으로 및 임의로 치환되고, 여기서 알킬은 1개 이상의 F로 임의로 치환되거나;
    또는 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 L에 대한 결합으로 독립적으로 및 임의로 치환되고;
    D'는
    Figure pct00100
    로부터 선택된 약물 모이어티이고;
    여기서 파상선은 T에 대한 부착 부위를 나타내고;
    X1 및 X2는 독립적으로 O 및 NR3으로부터 선택되고, 여기서 R3은 H, 및 1개 이상의 F로 임의로 치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되고;
    R4는 H, CO2R, 또는 L에 대한 결합이고, 여기서 R은 C1-C6 알킬 또는 벤질이고;
    R5는 H 또는 C1-C6 알킬이다.
  49. 제48항에 있어서, X가
    Figure pct00101
    인 링커-약물 중간체.
  50. 제48항에 있어서,
    Figure pct00102

    Figure pct00103

    Figure pct00104

    Figure pct00105

    Figure pct00106

    로부터 선택된 링커-약물 중간체.
  51. 항체를 하기 화학식을 갖는 링커-약물 중간체에 접합시킴으로써 항체-약물 접합체 화합물을 형성하는 것을 포함하는, 제1항의 항체-약물 접합체 화합물을 제조하는 방법.
    Figure pct00107

    상기 식에서,
    X는 말레이미드, 티올, 아미노, 브로마이드, 브로모아세트아미도, 아이오도아세트아미도, p-톨루엔술포네이트, 아이오다이드, 히드록실, 카르복실, 피리딜 디술피드, 및 N-히드록시숙신이미드로부터 선택된 반응성 관능기이고;
    L은 하기 화학식을 갖는 링커이고,
    Figure pct00108

    여기서 Str은 X에 공유 부착된 스트레쳐 단위이고; Pep는 2 내지 12개의 아미노산 잔기의 임의적인 펩티드 단위이고, Sp는 이량체 약물 모이어티에 공유 부착된 임의적인 스페이서 단위이고, m 및 n은 독립적으로 0 및 1로부터 선택되고;
    D는 하기 화학식을 갖는 이량체 약물 모이어티이고,
    Figure pct00109

    여기서
    R1은 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb, 또는 L에 대한 결합으로부터 선택되고;
    R2는 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb, 또는 L에 대한 결합으로부터 선택되고;
    Ra 및 Rb는 독립적으로 H, 및 1개 이상의 F로 임의로 치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되거나, 또는 Ra 및 Rb는 5 또는 6원 헤테로시클릴 기를 형성하고;
    T는 C3-C12 알킬렌, Y, (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C2-C6 알케닐렌)-Y-(C2-C6 알케닐렌), 및 (C2-C6 알키닐렌)-Y-(C2-C6 알키닐렌)으로부터 선택된 테더 기이고;
    여기서 Y는 독립적으로 O, S, NR1, 아릴, 및 헤테로아릴로부터 선택되고;
    여기서 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 F, OH, O(C1-C6 알킬), NH2, NHCH3, N(CH3)2, OP(O)3H2, 및 C1-C6 알킬로 독립적으로 및 임의로 치환되고, 여기서 알킬은 1개 이상의 F로 임의로 치환되거나;
    또는 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 L에 대한 결합으로 독립적으로 및 임의로 치환되고;
    D'는
    Figure pct00110
    로부터 선택된 약물 모이어티이고;
    여기서 파상선은 T에 대한 부착 부위를 나타내고;
    X1 및 X2는 독립적으로 O 및 NR3으로부터 선택되고, 여기서 R3은 H, 및 1개 이상의 F로 임의로 치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되고;
    R4는 H, CO2R, 또는 L에 대한 결합이고, 여기서 R은 C1-C6 알킬 또는 벤질이고;
    R5는 H 또는 C1-C6 알킬이다.
  52. 제39항에 있어서, 항체가 시스테인 조작된 항체이고 링커-약물 중간체의 X가 말레이미드인 항체-약물 접합체 화합물을 제조하는 방법.
  53. 하기 화학식을 갖는 CBI 이량체 약물 모이어티 화합물.
    Figure pct00111

    상기 식에서,
    R1은 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb로부터 선택되고;
    R2는 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb로부터 선택되고;
    Ra 및 Rb는 독립적으로 H, 및 1개 이상의 F로 임의로 치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되거나,
    또는 Ra 및 Rb는 5 또는 6원 헤테로시클릴 기를 형성하고;
    T는 C3-C12 알킬렌, Y, (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C2-C6 알케닐렌)-Y-(C2-C6 알케닐렌), 및 (C2-C6 알키닐렌)-Y-(C2-C6 알키닐렌)으로부터 선택된 테더 기이고;
    여기서 Y는 독립적으로 O, S, NR1, 아릴, 및 헤테로아릴로부터 선택되고;
    여기서 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 F, OH, O(C1-C6 알킬), NH2, NHCH3, N(CH3)2, OP(O)3H2, 및 C1-C6 알킬로 독립적으로 및 임의로 치환되고, 여기서 알킬은 1개 이상의 F로 임의로 치환되거나;
    또는 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 L에 대한 결합으로 독립적으로 및 임의로 치환되고;
    D'는
    Figure pct00112
    로부터 선택된 약물 모이어티이고;
    여기서 파상선은 T에 대한 부착 부위를 나타내고;
    X1 및 X2는 독립적으로 O 및 NR3으로부터 선택되고, 여기서 R3은 H, 및 1개 이상의 F로 임의로 치환된 C1-C6 알킬로부터 선택되고;
    R4는 H, CO2R이고, 여기서 R은 C1-C6 알킬 또는 벤질이고;
    R5는 H 또는 C1-C6 알킬이다.
  54. 제41항에 있어서,
    Figure pct00113

    Figure pct00114
    로부터 선택된 CBI 이량체 약물 모이어티 화합물.
  55. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, p가 1, 2, 3 또는 4인 접합체.
  56. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, p가 1 또는 2인 접합체.
  57. 제1항에 있어서,
    Figure pct00115
    이며,
    여기서 p는 1-4이고, Ab는 항-HER2, 항-CD33, 항-CLL-1, 항-CD22, 항-CD79b 또는 항-NaPi3b 항체인 접합체.
  58. 제1항에 있어서,
    Figure pct00116
    이며,
    여기서 p는 1-4이고, Ab는 항-HER2, 항-CD33, 또는 항-NaPi3b 항체인 접합체.
  59. 제1항에 있어서,
    Figure pct00117
    이며,
    여기서 p는 1-4이고, Ab는 항-HER2, 항-CD33, 항-CLL-1, 항-CD22, 항-CD79b 또는 항-NaPi3b 항체인 접합체.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, Ab가 항-HER2 항체인 접합체.
  61. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, Ab가 항-CLL-1 항체인 접합체.
  62. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, Ab가 항-CD22 항체인 접합체.
  63. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, Ab가 항-CD79b 항체인 접합체.
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