KR20040019105A - ＴＡＣＩｓ 및 ＢＲ3 폴리펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

ＴＡＣＩｓ 및 ＢＲ3 폴리펩티드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본원에서 "TACIs" 및 "BR3"로 지칭되는 신규 수용체, 이의 아고니스트 및 길항제, 및 TACIs 및 BR를 사용하여 예를 들면, 종양 괴사 인자 (TNF) 및 TALL-1, APRIL, TACI 및 BCMA로 지칭되는 TNF 및 TNFR의 일원을 비롯한 TNFR-관련 분자의 활성을 조절하는 방법이 제공된다. 상기 TNF 및 TNFR-관련 분자와 연관된 포유동물 세포 또는 병적 상태의 시험관내, 인 시추(in situ) 및(또는) 생체내 치료 방법 또한 제공된다.

Description

ＴＡＣＩｓ 및 ＢＲ3 폴리펩티드 및 이의 용도{TACIs and BR3 Polypeptides and Uses Thereof}
종양 괴사 인자-α("TNF-α"), 종양 괴사 인자-β("TNF-β" 또는 "림포톡신-α"), 림포톡신-β("LT-β"), CD30 리간드, CD27 리간드, CD40 리간드, OX-40 리간드, 4-1BB 리간드, Apo-1 리간드 (또한 본원에서 Fas 리간드 또는 CD95 리간드로 지칭됨), Apo-2 리간드 (또한 본원에서 TRAIL로 지칭됨), Apo-3 리간드 (또한 본원에서 TWEAK로 지칭됨), APRIL, OPG 리간드 (또한 본원에서 RANK 리간드, ODF 또는 TRANCE로 지칭됨) 및 TALL-1 (또한 본원에서 BlyS, BAFF 또는 THANK로 지칭됨)과같은 다양한 분자가 사이토카인의 종양 괴사 인자 ("TNF") 패밀리의 멤버로 동정되었다 [예를 들면, Gruss and Dower,Blood,85:3378-3404 (1995); Schmid et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.,83:1881 (1986); Dealtry et al.,Eur. J. Immunol.,17:689 (1987); Pitti et al.,J. Biol. Chem.,271:12687-12690 (1996); Wiley et al.,Immunity,3:673-682 (1995); Browning et al.,Cell,72:847-856 (1993); Armitage et al.Nature,357:80-82 (1992), WO 97/01633 (1997년 1월 16일 공개), WO 97/25428 (1997년 7월 17일 공개); Marsters et al.,Curr. Biol.,8:525-528 (1998); Chicheportiche et al.,Biol. Chem.,272:32401-32410 (1997); Hahne et al.,J. Exp. Med.,188:1185-1190 (1998); WO 98/28426 (1998년 7월 2일 공개); WO 98/46751 (1998년 10월 22일공개); WO 98/18921 (1998년 5월 7일 공개); Moore et al.,Science,285:260-263 (1999); Shu et al.,J. Leukocyte Biol.,65:680 (1999); Schneider et al.,J. Exp. Med.,189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al.,J. Biol. Chem.,274:15978-15981 (1999) 참조]. 이들 분자 중에서, TNF-α, TNF-β, CD30 리간드, 4-1BB 리간드, Apo-1 리간드, Apo-2 리간드 (Apo2L/TRAIL) 및 Apo-3 리간드 (TWEAK)가 아폽토틱(apoptotic) 세포 사멸에 관여하는 것으로 보고되었다.
TNF 패밀리의 다양한 분자는 또한 면역계의 기능 또는 발달에서 역할(들)을 하는 것으로 보고되었다 [Gruss et al.,Blood,85:3378 (1995)]. 젱(Zheng) 등은 TNF-α가 CD8-포지티브(positive) T 세포의 후-자극 아폽토시스(apoptosis)에 관여함을 보고하였다 [Zheng et al.,Nature,377:348-351 (1995)]. 다른 연구자들은CD30 리간드가 흉선에서 자가 반응성 T 세포의 결실에 관여할 수 있음을 보고하였다 [Amakawa et al., Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, Abstr. No. 10, (1995)]. CD40 리간드는 증식, 면역글로불린 분비 및 생존을 비롯한 B 세포의 많은 기능을 활성화시킨다 [Renshaw et al.,J. Exp. Med.,180:1889 (1994)]. 다른 근래 동정된 TNF 패밀리 사이토카인, TALL-1 (BlyS)는 특정 조건하에서 B 세포 증식 및 면역글로불린 분비를 유도하는 것으로 보고되었다 [Moore et al.,supra; Schneider et al.,supra; Mackay et al.,J. Exp. Med.,190:1697 (1999); Shu et al.,J. Leukocyte Biol.,65:680-683 (1999); Gross et al.,Nature,404:995-999 (2000)].
마우스 Fas/Apo-1 수용체 또는 리간드 유전자 (각각lpr및gld로 지칭됨)에서의 돌연변이는 일부 자가면역 장애와 연관되어 있으며, 이는 Apo-1 리간드가 말초에서의 자가 반응성 림프구의 클로날 결실의 조절에서 역할을 할 수 있음을 나타내는 것이다 [Krammer et al.,Curr. Op. Immunol.,6:279-289 (1994); Nagata et al.,Science,267:1449-1456 (1995)]. Apo-1 리간드는 또한 CD4-포지티스 T 림프구 및 B 림프구에서의 후-자극 아폽토시스를 유발하는 것으로 보고되었으며, 활성화된 림프구의 기능이 더 이상 필요하지 않을 때 활성화된 림프구의 제거에 관여할 수 있다 [Krammer et al.,supra; Nagata et al.,supra]. Apo-1 수용체에 특이적으로 결합하는 아고니스트 마우스 모노클로날 항체는 TNF-α에 필적하거나 유사한 세포 사멸 활성을 나타내는 것으로 보고되었다 [Yonehara et al.,J. Exp. Med.,169:1747-1756 (1989)].
OPG 리간드 (또한 RANK 리간드, TRANCE 또는 ODF로 지칭됨)로 불리는 TNF-관련 리간드는 문헌에서 특정 면역조절 활성에 일부 관여하는 것으로 보고되어 있다. WO 98/28426 (1998년 7월 2일 공개)는 상기 리간드를 (상기 문헌에서는 RANK 리간드로 지칭함)를 가용성 형태에서 수지상 세포의 성숙을 유도하고, MLR에서 CD1a+ 수지상 세포 알로-자극 성능(allo-stimulatory capacity)을 증가시키고, TGF-베타의 존재하에서 시험관내 생존가능한 인간 말초 혈액 T 세포의 수를 증가시키는 것으로 나타난 타입 2 막통과 단백질로 기술한다 [또한, Anderson et al.,Nature,390:175-179 (1997) 참조]. WO 98/28426 문헌은 또한 상기 리간드가 한 대식세포 종양 세포주에 의한 TNF-알파의 생성을 증가시키나, 상기 종양 세포 (RAW 264.7로 불림; ATCC TIB71)에 의한 니트릭 옥사이드 생성을 자극하지 않음을 개시한다.
수지상 세포 활성의 조절에서 [예를 들면, Wong et al.,J. Exp. Med.,186:2075-2080 (1997); Wong et al.,J. Leukocyte Biol.,65:715-724 (1999); Josien et al.,J. Immunol.,162:2562-2568 (1999); Josien et al.,J. Exp. Med.,191:495-501 (2000) 참조] 및 면역 반응에서 T 세포 활성화에 영향을 미치는 것에서 [예를 들면, Bachmann et al.,J. Exp. Med.,189:1025-1031 (1999); Green et al.,J. Exp. Med.,189:1017-1020 (1999) 참조]의 OPG 리간드/TRANCE/ODF의 추정 역할은 문헌에서 탐구된 바 있다. 문헌[Kong et al.,Nature,397:315-323 (1999)]는 붕괴된opgl유전자를 갖는 마우스는 심한 골다공증을 나타내고, 파골세포가 결여되어 있으며, T 및 B 림프구의 초기 분화에서 결함을 나타냄을 보고한다. Kong 등은 나아가 생체내 T 세포의 전신적 활성화는 파골세포생성 및 골 손실에서OPGL-매개 증가에 이름을 보고한다 [Kong et al., Nature,402:304-308 (1999)].
상기 TNF 패밀리 사이토카인에 의해 매개되는 다양한 세포 반응의 유도는 이들의 특정 세포 수용체에 대한 결합에 의해 개시되는 것으로 여겨진다. 종래, 약 55-kDa (TNFR1) 및 75-kDa (TNFR2)의 2개의 상이한 TNF 수용체가 동정되었다 [Hohman et al.,J. Biol. Chem.,264:14927-14934 (1989); Brockhaus et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.,87:3127-3131 (1990); EP 417,563 (1991년 3월 20일 공개); Loetscher et al.,Cell,61:351 (1990); Schall et al.,Cell,61:361 (1990); Smith et al.,Science,248:1019-1023 (1990); Lewis et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.,88:2830-2834 (1991); Goodwin et al.,Mol. Cell. Biol.,11:3020-3026 (1991)]. 이들 TNFRs는 세포외, 막통과 및 세포내 영역을 포함하는 세포 표면 수용체의 통상적 구조를 공유하는 것임을 발견하였다. 양 수용체의 세포외 부분은 천연적으로 또한 가용성 TNF-결합 단백질임을 발견하였다 [Nophar , Y. et al.,EMBO J.,9:3269 (1990); and Kohno, T. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,87:8331 (1990); Hale et al.,J. Cell. Biochem. Supplement 15F,1991, p. 113 (P424)].
타입 1 및 타입 2 TNFRs (TNFR 1 및 TNFR2)의 세포외 부분은 NH2-말단으로부터 시작하는 1 내지 4로 지정된 4개의 시스테인-리치 도메인 (cysteine-rich domains; CRDs)의 개별 아미노산 서열 패턴을 포함한다. [Schall et al.,supra; Loetscher et al.,supra; Smith et al.,supra; Nophar et al.,supra; Kohno etal.,supra; Banner et al.,Cell,73:431-435 (1993)]. CRDs의 유사 개별 패턴은 p75 신경 성장 인자 수용체 (NGFR) [Johnson et al.,Cell,47:545 (1986); Radeke et al.,Nature,325:593 (1987)], B 세포 항원 CD40 [Stamenkovic et al.,EMBO J.,8:1403 (1989)], T 세포 항원 OX40 [Mallet et al.,EMBO J.,9:1063 (1990)] 및 Fas 항원 [Yonehara et al.,supra및 Itoh et al.,Cell,66:233-243 (1991)]을 비롯한 여러 다른 세포-표면 단백질에 존재한다. CRDs는 또한 쇼페(Shope) 및 미코마(myxoma) 폭스바이러스(poxviruse)의 가용성 TNFR (sTNFR)-유사 T2 단백질에서 발견된다 [Upton et al.,Virology,160:20-29 (1987); Smith et al.,Biochem. Biophys. Res. Commun.,176:335 (1991); Upton et al.,Virology,184:370 (1991)]. 이들 서열의 최적 배열은 시스테인 잔기의 위치가 잘 보존되어 있음을 나타낸다. 이들 수용체는 때로는 총체적으로 TNF/NGF 수용체 수퍼패밀리의 멤버로로 지칭된다.
림포톡신-α를 제외하고 현재까지 동정된 TNF 패밀리 리간드는 통상적으로 타입 II 막통과 단백질이고, 이의 C-말단은 세포외에 있다. 반대로, 현재까지 동정된 TNF 수용체 (TNFR) 패밀리의 대부분의 수용체는 통상적으로 타입 I 막통과 단백질이다. 그러나, TNF 리간드 및 수용체 패밀리 양측에서, 패밀리 멤버간에 확인된 상동성은 주로 세포외 도메인 (extracellular domain; "ECD")에서 발견되었다. TNF-α, Apo-1 리간드 및 CD40 리간드를 비롯한 TNF 패밀리 사이토카인은 세포 표면에서 단백분해 절단되고, 생성된 단백질은 각 경우 통상적으로 가용성 사이토카인으로 기능하는 호모트리메릭(homotrimeric) 단백질을 형성한다. TNF 수용체 패밀리 단백질은 또한 통상적으로 단백분해 절단되어 동족 사이토카인의 억제제로 기능할 수 있는 가용성 수용체 ECDs를 방출한다.
RANK로 지칭되는 TNFR 패밀리 멤버가 OPG 리간드에 대한 수용체로서 동정되었다 (WO 98/28426 (1998년 7월 2일 공개); Anderson et al.,Nature,390:175-179 (1997); Lacey et al.,Cell,93:165-176 (1998) 참조). OPG (FDCR-1 또는 ㅒCIF)로 지칭되는 다른 TNFR-관련 분자가 또한 OPG 리간드에 대한 수용체로서 동정되었다 (Simonet et al.,Cell,89:309 (1997); Yausda et al.,Endocrinology,139;1329 (1998); Yun et al.,J. Immunol.,161:6113-6121 (1998)]. 문헌[Yun et al., supra]는 OPG/FDCR-1/OCIF는 막-결합 형태 및 분비 형태 모두로 발현되고, 수지상 세포, EBV-형질전환 B 세포주 및 편도 B 세포를 비롯한 면역계의 세포에서 제한된 발현 패턴을 가짐을 개시한다. Yun 등은 또한 B 세포 및 수지상 세포에서 OPG/FDCR-1/OCIF의 발현은 B 세포 활성화에 관여하는 분자인 CD40에 의해 상승조절될 수 있음을 개시한다. 그러나, Yun 등은 OPG/FDCR-1/OCIF가 면역 반응의 조절에서 어떻게 기능하는지는 알지 못함을 인정하고 있다.
더욱 근래에, TNFR 패밀리의 다른 멤버가 동정되었다. 문헌[von Bulow et al.,Science,278:138-141 (1997)]에서, 연구자들은 막통과 활성화인자(Transmembrane Activator) 및 CAML-인터액터(CAML-Interactor) 또는 "TACI"로 지칭되는 혈장 막 수용체를 기술한다. TACI 수용체는 TNFR 패밀리의 특징적인 시스테인-리치 모티프를 포함하는 것으로 보고되었다. 시험관내 분석에서, TACI-특이적 항체로 트랜스펙션된 주르카트(Jurkat) 세포의 표면에 TACI를 교차 결합시키는 것은 NF-KB를 활성화시켰다. [또한, WO 98/39361 (1998년 9월 18일 공개)를 참조]. TACI 녹아웃(knockout) 마우스는 과반응성 B 세포를 갖는 한편, BCMA눌(null) 마우스는 식별가능한 표현형을 가지지 않는 것으로 보고되었다 [Yan et al.,Nature Immunology,2:638-643 (2001); von Bulow et al.,Immunity,14:573-582 (2001); Xu et al.,Mol. Cell. Biology,21:4067-4074 (2001)].
문헌[Laabi et al.,EMBO J.,11:3897-3904 (1992)]는 그 발현이 B 세포 말단 돌연변이와 일치하는 것으로 발견된 "BCM"으로 지칭되는 신규 유전자의 동정을보고하였다. BCM 정상 cDNA의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 단일 막통과 도메인을 갖는 184 아미노산 길이 폴리펩티드를 예측하였다. 상기 연구자들은 이후 상기 유전자를 "BCMA"로 명명하였다 [Laabi et al.,Nucleic Acids Res.,22;1147-1154 (1994)]. BCMA mRNA 발현은 프로(pro)-B 림프구 단계를 나타내는 인간 악성 B 세포에서 없는 것으로 보고되었고, 따라서 림프구의 분화 단계와 연관이 있는 것으로 여겨진다 [Gras et al.,Int. Immunology,7:1093-1106 (1995)]. 문헌[Madry et al.,Int. Immunology,10:1693-1702 (1998)]에서는, 뮤린(murine) BCMA cDNA의 클로닝을 기술하고 있다. 뮤린 BCMA cDNA는 인간 BCMA 폴리펩티드와 62% 동일성을 갖는 185 아미노산 길이 폴리펩티드를 코딩하는 것으로 보고되었다. 뮤린 및 인간 BCMA 단백질 서열의 정렬은 N-말단 영역에서 6개의 시스테인의 보존 모티프를 밝혀내었고, 이는 BCMA 단백질은 TNFR 수퍼패밀리에 속함을 시사한다 [Madry et al.,supra].
Tall-1 (BlyS) 리간드는 TACI 및 BCMA 수용체에 결합하는 것으로 보고되어있다 [Gross et al.,supra, (2000); Thompson et al.,J. Exp. Med.,192:129-135 (2000); Yan et al.,supra, (2000); Marsters et al.,Curr. Biol.,10:785-758 (2000); WO 00/40716 (2000년 7월 13일 공개); WO 00/67034 (2000년 11월 9일 공개)]. TACI 및 BCMA는 마찬가지로 April로 알려진 리간드에 결합하는 것으로 보고되어 있다.
문헌[Marsters et al.,Curr. Biol.,6:750 (1996)]에서는, 연구자들은 세포외 시스테인 리치 반복부분(cysteine-rich repeats)에서 TNFR 패밀리와 유사성을 나타내고, 세포질 사멸 도메인 서열을 포함하는 점에서 TNFR1 및 CD95를 닮은, Apo-3로 지칭되는 전장(full length) 천연 서열 인간 폴리펩티드를 기술한다 [또한, Marsters et al.,Curr. Biol.,6:1669 (1996) 참조]. Apo-3는 또한 다른 연구자들에 의해서 DR3, wsl-1, TRAMP 및 LARD로 지칭된 바 있다 [Chinnaiyan et al.,Science,274:990 (1996); Kitson et al.,Nature,384:372 (1996); Bodmer et al.,Immunity,6:79 (1997); Screaton et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.,94:4615-4619 (1997)].
Pan 등은 "DR4"로 지칭되는 다른 TNF 수용체 패밀리 멤버를 개시한다 [Pan et al.,Science,276:111-113 (1997); 또한 WO 98/32856 (1998년 7월 30일 공개)를 참조]. DR4는 세포 자멸 장치에 관련될 수 있는 세포질 사멸 도메인을 포함하는 것으로 보고되었다. Pan 등은 DR4가 Apo2L/TRAIL로 알려진 리간드에 대한 수용체인 것으로 여겨짐을 개시한다.
문헌[Sheridan et al.,Science,277:818-821 (1997) 및 Pan et al.,Science,277:815-818 (1997)]에는, Apo2L/TRAIL에 대한 수용체인 것으로 여겨지는 다른 분자가 기술되어 있다 [또한, WO 98/51793 (1998년 11월 19일 공개); WO 98/41629 (1998년 9월 24일 공개) 참조]. 상기 분자는 DR5로 지칭된다 (또한, 별법으로 Apo-2L, TRAIL-R, TR6, Tano-63, hAPO8, TRICK2 또는 KILLER로 지칭됨). [Screaton et al.,Curr. Biol.,7:693-696 (1997); Walczak et al.,EMBO J.,16:5386-5387 (1997); Wu et al.,Nature Genetics,17;141-143 (1997); WO 98/35986 (1998년 8월 20일 공개); EP 870,827 (1998년 10월 14일 공개); WO 98/46643 (1998년 10월 22일 공개); WO 99/02653 (1999년 1월 21일 공개); WO 99/09165 (1999년 2월 25일 공개; WO 99/11791 (1999년 3월 11일 공개)]. 마찬가지로, DR4, DR5는 세포질 사멸 도메인을 포함하고, 아폽토시스를 신호전달(signlaing) 가능한 것으로 보고되었다. Apo-2L/TRAIL 및 DR5 간에 형성된 복합체의 결정 구조는 문헌[Hymowitz et al.,Molecular Cell,4:563-571 (1999)]에 기술되어 있다.
또 다른 사멸 도메인 포함 수용체인 DR6가 근래 동정되었다 [Pan et al.,FEBS Letters,431:351-356 (1998)]. 4개의 추정 세포외 시스테인-리치 도메인 및 세포질 사멸 도메인을 포함하는 이외에, DR6는 세포질 영역에서 프롤린-리치 모티프와 중첩되는 추정 류신-지퍼(leucine-zipper) 서열을 포함하는 것으로 여겨진다. 프롤린-리치 모티프는 많은 세포내 신호-도입 분자에서 발견되는 src-상동성-3 도메인에 결합하는 서열과 닮았다. 상기 언급된 다른 사멸 도메인 함유 수용체와 반대로, DR6는 아폽토시스 민감성 지표 세포주인 MCF-7에서 세포 사멸을 유도하지 않으며, 이는 상기 수용체에 대한 별도 기능을 시사한다. 상기 관찰과 일관하여, DR6는 활성화된 사멸 수용체로부터의 다운스트림 신호전달을 매개하는 FADD, RAIDD 및 RIP와 같은 사멸 도메인 함유 어댑터(adapter) 분자와 연관되지 않은 것으로 여겨진다 [Pan et al.,FEBS Lett.,431:351 (1998)].
근래 동정된 수용체의 다른 군은 신호전달의 트랜스듀서(transducer) 보다는억제제로 작용하는 것으로 여겨지는 "데코이 수용체(decoy receptors)"로 지칭된다. 상기 군은 DCR1 (또한 TRID, LIT 또는 TRAIL-R3로 지칭됨) [Pan et al.,Science,276:111-113 (1997); Sheridan et al.,Science,277:818-821 (1997); McFarlane et al.,J. Biol. Chem.,272:25417-25420 (1997); Schneider et al.,FEBS Letters,416:329-334 (1997); Degli-Esposti et al.,J. Exp. Med.,186:1165-1170 (1997); 및 Mongkolsapaya et al.,J. Immunol.,160:3-6 (1998)] 및 DCR2 (또한 TRUNDD 또는 TRAIL-R4로 지칭됨) [Marsters et al.,Curr. Biol.,7:1003-1006 (1997); Pan et al.,FEBS Letters,424:41-45 (1998); Degli-Esposti et al.,Immunity,7:813-820 (1997)], 모두 세포 표면 분자인 OPT [Simonet et al.,supra; Emery et al.,infra] 및 DCR3 [Pitti et al.,Nature,396:699-703 (1998)] (이들은 분비된 가용성 단백질임)을 포함한다.
추가로 근래 동정된 TNFR 패밀리의 멤버는 CAR1, HVEM, GITR, ZTNFR-5, NTR-1 및 TNFL1을 포함한다 [Brojatsch et al.,Cell,87:845-855 (1996); Montgomery et al.,Cell,87:427-436 (1996); Marsters et al.,J. Biol. Chem.,272:14029-14032 (1997); Nocentini et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA94:6216-6221(1997); Emery et al.,J. Biol. Chem.,273:14363-14367 (1998); WO 99/04001 (1999년 1월 28일 공개); WO 99/07738 (1999년 2월 18일 공개); WO 99/33980 (1999년 7월 8일 공개)].
Tewari 등에 의해 근래 검토된 바와 같이 TNFR1, TNFR2 및 CD40은 전사 인자 NF-κB의 활성화를 통해서 전염증성 및 코스티모듈러토리(costimodulatory) 사이토카인, 사이토카인 수용체 및 세포 유착 분자의 발현을 조절한다 [Tewari et al.,Curr. Op. Genet. Develop.,6:39-44 (1996)]. NF-κB는 그 서브유닛이 보존된 Rel 영역을 포함하는 다이머성(dimeric) 전사 인자 패밀리의 전구형(prototype)이다 [Verma et al.,Genes Develop.,9:2723-2735 (1996); Baldwin,Ann. Rev. Immuol.,14:649-681 (1996)]. 잠재 형태에서, NF-κB는 IκB 억제제 패밀리의 멤버와 복합체화되어 있으며, 특정 자극에 대한 반응으로 IκB가 불활성화되면 방출된 NF-κB 는 핵으로 이동되고 여기서 특이적 DNA 서열에 결합하고 유전자 전사를 활성화한다. 상기 기술한 바와같이, 현재까지 동정된 TNFR 멤버는 세포내 사멸도메인 영역을 포함하거나 이것이 결여되어 있다. TNFR2, CD40, HVEM 및 GITR가 같은 사멸 도메인이 결여된 일부 TNFR 분자는 NF-κB 활성을 조절할 수 있다 [예를 들면, Lotz et al.,J. Leukocyte Biol.,60:1-7 (1996) 참조].
사이토카인의 TNF 패밀리 및 그들의 수용체의 검토에 대해서는 문헌[Ashkenazi and Dixit,Science,281:1305-1308 (1998); Golstein,Curr. Biol.,7:750-753 (1997); Gruss and Dower,supra, 및 Nagata,Cell,88:355-365 (1997)]을 참조하라.
본 발명은 일반적으로 본원에서 "TACIs" 및 "BR3"로 지칭되는 신규 수용체, 이의 아고니스트(agonists) 및 길항제, 및 예를 들면, TALL-1, APRIL, TACI 및 BCMA로 지칭되는 TNF 및 TNFR 패밀리의 멤버를 비롯한 종양 괴사 인자 (TNF) 및 TNFR-관련 분자의 활성을 조절하기 위하여 TACIs 및 BR3 뿐만 아니라 이의 아고니스트 또는 길항제를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 TNF 및 TNFR-관련 분자와 연관된 포유동물 세포 또는 병적 상태의 시험관내(in vitro), 세인 시추(in situ) 및(또는) 생체내(in vivo) 진단 및(또는) 치료 방법에 관한 것이다.
발명의 요약
본 발명자들은 "TACIs" 및 "BR3"로 지칭되는 신규 분자를 동정하였다. TACIs 폴리펩티드는 2개의 시스테인-리치 도메인을 포함하는 폰 불로우(von Bulow) 등의 상기 문헌에 기술된 전장 인간 TACI 분자와 대조적으로, 단일 시스테인-리치 도메인을 갖는 것을 특징으로 한다. 마찬가지로, 본원에 기술된 BR3 폴리펩티드는 단일 시스테인-리치 도메인을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명자들은 놀랍게도 TALL-1 및 April로 지칭되는 TNF 패밀리 리간드가 TACIs 수용체에 결합함을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 놀랍게도 TALL-1으로 지칭되는 TNF 패밀리 리간드가 BR3 수용체에 결합함을 발견하였다. TACI 및 BCMA 수용체와 대조적으로, BR3는 April 리간드에 결합하지 않는 것으로 나타났고, NF-κB 경로를 활성화하지 않는다. 따라서, 본 발명은 이들 TNF-관련 리간드 및 수용체의 길항제 또는 아고니스트를 사용하는 신규 방법을 제공한다. 본원에 기술된 길항제 및 아고니스트는 다른 것들 중에서, TALL-1, APRIL, TACI, BCMA, TACIs 또는 BR3의 존재 (또는 부재)와 연관된 포유동물 세포 또는 병적 상태의 시험관내, 인 시추 또는 생체내 진단 또는 치료에 유용하다.
일 실시태양에서, 본 발명은 TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 특정 측면에서, 단리된 핵산은 도 5B (서열 번호 14)의 아미노산 잔기 1 내지 246 또는 1 내지 119를 갖는 TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하거나, 또는 상기 코딩 핵산 서열에 상보적이고, 적어도 중간, 임의로는 고 엄격성 조건하에서 이에 안정하게 결합되어 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포 또한 제공된다. 예를 들면, 숙주 세포는 CHO 세포, 이. 콜라이(E. coli) 또는 효모일 수 있다. TACIs 폴리펩티드를 제조하는 방법이 추가로 제공되고, 숙주 세포를 TACIs 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 배양하고 세포 배양물로부터 TACIs 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 단리된 TACIs 폴리펩티드를 포함한다. 특히, 본 발명은 도 5B (서열 번호 14)의 잔기 1 내지 246을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 TACIs 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 추가 실시태양은 도 5B (서열 번호 14)에 나타낸 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 119를 포함하는 TACIs 폴리펩티드의 단리된 세포외 도메인 서열, 또는 이의 단편, 특히 생물학적으로 활성인 단편에 관한 것이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 TACI 폴리펩티드 또는 세포외 도메인 서열 또는 이의 다른 단편을 포함하는 키메릭(chimeric) 분자를 제공한다. 상기 키메릭 분자의 예는 에피토프(epitope) 태그(tag) 서열 또는 면역글로불린의 Fc 영역에 융합된 TACIs 폴리펩티드를 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 TACIs 폴리펩티드 또는 이의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 임의로, 항체는 모노클로날 항체이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 TACIs 폴리펩티드 또는 TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 사용한 진단 및 치료 방법을 제공한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 특정 측면에서, 단리된 핵산은 도 6B (서열 번호 16)의 아미노산 잔기 1 내지 184, 1 내지 77 또는 2 내지 62를 갖는 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하거나, 상기 코딩 핵산 서열 서열에 상보적이고, 적어도 중간, 임의로는 고 엄격성 조건하에서 이에 안정하게 결합되어 있다.
다른 실시태양에서, 본 바명은 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포 또한 제공된다. 예를 들면, 숙주 세포는 CHO 세포, 이. 콜라이, 또는 효모일 수 있다. BR3 폴리펩티드를 제조하는 방법 또한 제공되고, 숙주 세포를 BR3 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 배양하고 세포 배양물로부터 BR3 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
다른 실시태양에셔, 본 발명은 단리된 BR3 폴리펩티드를 제공한다. 특히, 본 발명은 도 6B (서열 번호 16)의 잔기 1 내지 184, 1 내지 77 또는 2 내지 62를 포함하는 단리된 BR3 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 추가 실시태양은 도 6B (서열 번호 16)에 나타낸 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 77 또는 2 내지 62를 포함하는 BR3 폴리펩티드의 단리된 세포외 도메인 서열 또는 이의 단편에 관한 것이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 BR3 폴리펩티드 또는 세포외 도메인 서열 또는 이의 다른 단편을 포함하는 키메릭 분자를 제공한다. 상기 키메릭 분자의 예는 에피토프 태그 서열 또는 면역글로불린의 Fc 영역에 융합된 BR3 폴리펩티드를 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 BR3 폴리펩티드 또는 이의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 임의로, 항체는 모노클로날 항체이다.
또 다른 실시태양에셔, 본 발명은 BR3 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 사용하는 진단 및 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 증가 또는 강화된 TALL-1 또는 APRIL 발현 및(또는) 활성과 연관되거나 이로부터 유래하는 포유동물에서의 병적 상태 또는 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 상기 치료 방법에서, TALL-1 길항제 또는 APRIL 길항제가 상기 병적 상태 또는 질환에 걸린 포유동물에 투여될 수 있다. 본 발명에서 사용되도록 예상되는 TALL-1 길항제 및 APRIL 길항제는 TACIs 수용체 이뮤노어드헤신(immunoadhesin) 또는 BR3 수용체 이뮤노어드헤신 뿐만 아니라 TAlL-1 리간드 및(또는) APRIL 리간드에 의한 각각의 수용체 결합 또는 활성화를 바람직하게 차단 또는 감소시키는 TACIs 수용체 또는 BR3 수용체에 대한 항체를 포함한다. 예를 들면, TACIs 수용체 이뮤노어드헤신을 이용하여 류마티스성 관절염 또는 다발성 경화증을 치료할 수 있다. 추가로 사용하도록 예상되는 TALL-1 길항제 및 APRIL 길항제는 TACIs 또는 BR3 수용체에 대한 각각의 리간드의 결합을 차단 또는 감소시킬 수 있는 항-TALL-1 항체 또는 항-APRIL 항체를 포함한다. 또 다른 길항제 분자는 TACIs 또는 BR3를 포함하는 공유 개질 형태 또는 융합 단백질을 포함한다. 예를 들면, 상기 길항제는 페길레이티드(pegylated) TACIs 또는 BR3, 및에피토프 태그 또는 류신 지퍼와 같은 이종 서열에 융합된 TACIs 또는 BR3를 포함할 수 있다. 임의로, 상기 방법에 이용되는 길항제 분자(들)은 TALL-1 및 APRIL 모두의 활성을 차단 또는 중화할 수 있고, 예를 들면 TALL-1 및 APRIL 모두의 활성을 차단 또는 중화하는 이중(dual) 길항제일 수 있다. 임의로, 상기 방법에 이용되는 길항제 분자(들)은 TALL-1의 활성을 차단 또는 중화하나 APRIL의 활성은 차단 또는 중화하지 않을 수 잇으며, 예를 들면 TALL-1의 활성을 차단 또는 중화하는 길항제 (예: BR3 이뮤노어드헤신)일 수 있다. 예를 들면, BR3 이뮤노어드헤신을 이용하여 루푸스(lupus)와 같은 자가면역 장애를 치료할 수 있다. 상기 방법은 단일 유형의 길항제 분자 또는 2 이상의 유형의 길항제의 조합의 사용을 예상한다.
본 발명의 다른 실시태양에서, TALL-1 및 TACIs 및(또는) BR3 간의 상호작용을 차단 또는 중화하는 TALL-1 길항제를 사용하는 방법이 제공된다. 상기 길항제는 또한 TALL-1 및 TACI 및(또는) BCMA 간의 상호작용을 차단 또는 중화할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 백혈구 세포 (바람직하게는 B 세포)와 같은 포유동물 세포를 TALL-1 리간드의 활성을 감소, 중화 또는 차단하기 효과적인 양의 1 이상의 TALL-1 길항제에 노출하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 상기 세포는 세포 배양물 중에, 또는 포유동물, 예를 들면 면역 관련 질환 또는 암에 걸린 포유동물 중에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명은 효과적인 양의 1 이상의 본원에 개시된 바와 같은 TALL-1 길항제를 투여하는 것을 포함하는 면역 관련 질환 또는 암과 같은 병적 상태에 걸린 포유동물을 치료하는 방법을 포함한다. 특정 실시태양에서, 면역 관련 장애는 관절염 또는 루푸스와 같은 자가면역 질환이다.
본 발명은 또한 APRIL 및 TACIs 간의 상호작용을 차단 또는 중화하기 위하여 APRIL 길항제를 사용하는 방법을 제공한다. 상기 길항제는 또한 APRIL 및 TACI 및(또는) BCMA 간의 상호작용을 차단 또는 중화할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 백혈구 세포 (바람직하게는 B 세포)와 같은 포유동물 세포를 APRIL 리간드의 활성을 감소, 중화 또는 차단하기 효과적인 양의 1 이상의 TALL-1 길항제에 노출하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 상기 세포는 세포 배양물 중에, 또는 포유동물, 예를 들면 면역 관련 질환 또는 암에 걸린 포유동물 중에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명은 효과적인 양의 1 이상의 본원에 개시된 바와 같은 APRIL 길항제를 투여하는 것을 포함하는 면역 관련 질환 또는 암과 같은 병적 상태에 걸린 포유동물을 치료하는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 1 이상의 TALL-1 길항제 또는 APRIL 길항제를 포함하는 조성물을 제공한다. 임의로, 본 발명의 조성물은 제약적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 병적 상태 또는 질환을 치료하기 치료적으로 효과적인 양의 1 이상의 TALL-1 길항제 또는 APRIL 길항제를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 1 이상의 TALL-1 길항제 또는 APRIL 길항제를 포함하는 제품 및 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 예를 들면 TACIs 수용체 또는 BR3 수용체를 자극 또는 활성화하기 위하여 TACIs 아고니스트 또는 BR3 아고니스트를 사용하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (예를 들면, 면역 항-암 반응을 항진시키는 것에 의해서) 면역결핍 또는 암과 같은 불충분한 TALL-1 또는 APRIL 발현 또는 활성을 특징으로 하거나, 또는 이와 연관된 병적 상태를 치료하는데 유용할 수 있다. TACIs 아고니스트 또는 BR3 아고니스트는 아고니스트적 항-TACIs 또는 항-BR3 항체를 포함할 수 있다. 상기 TACIs 아고니스트 또는 BR3 아고니스트의 아고니스트적 활성은 TACIs 또는 BR3에 대한 천연 리간드의 활성과 동일 또는 실질적으로 동일 (즉, 모방)한 TACIs 또는 BR3에 대한 천연 리간드의 활성을 강화시키는 것을 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한 1 이상의 TACIs 아고니스트 또는 BR3 아고니스트를 포함하는 조성물을 제공한다. 임의로, 본 발명의 조성물은 제약적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 TACIs 또는 BR3에 의한 신호 트랜스덕션(signal transduction)을 자극하기 치료적으로 효과적인 양의 1 이상의 TACIs 아고니스트 또는 BR3 아고니스트를 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명은 1 이상의 TACIs 아고니스트 또는 BR3 아고니스트를 포함하는 제품 및 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 TALL-1 및 TACIs 또는 BR3 간의 상호작용에 관련되거나, 또는 APRIL 및 TACIs 간의 상호작용에 대한 아고니스트 또는 길항제로 작용하는 소분자 화합물, 폴리펩티드 또는 항체와 같은 후보 분자를 동정하기 위한 스크리닝 분석을 수행하는 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1A-1B는 천연 서열 인간 TACI를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 (서열번호 1) (역 상보 서열은 서열 번호 2에 제공됨) 및 이의 추정 아미노산 서열 (서열 번호 3)을 나타낸다.
도 2는 천연 서열 인간 BCMA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 번호 4) (역 상보 서열은 서열 번호 5에 제공됨) 및 이의 추정 아미노산 서열(서열 번호 6)을 나타낸다.
도 3은 천연 서열 인간 TALL-1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 번호 7) (역 상보 서열은 서열 번호 8에 제공됨) 및 이의 추정 아미노산 서열 (서열 번호 9)를 나타낸다.
도 4A-4B는 천연 서열 인간 APRIL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 번호 10) (역 상보 서열은 서열 번호 11에 제공됨) 및 이의 추정 아미노산 서열 (서열 번호 12)을 나타낸다.
도 5A는 천연 서열 인간 TACIs를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 (개시 및 종결 코돈을 밑줄로 표시함) (서열 번호 13)을 나타내고 도 5B는 이의 추정 아미노산 서열 (서열 번호 14)를 나타낸다.
도 6A는 천연 서열 인간 BR3의 폴리뉴클레오티드 서열 (개시 및 종결 코돈을 밑줄로 표시함) (서열 번호 15)를 나타내고, 도 6B는 이의 추정 아미노산 서열 (서열 번호 16)을 나타내고, 도 6C는 뮤린 BR3를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(개시 및 종결 코돈을 밑줄로 표시함) (서열 번호 17)을 나타내고, 도 9A는 이의 추정 아미노산 서열 (서열 번호 18)을 나타낸다.
도 7A-7B는 "PRO"로 명시된 아미노산 서열에 대하여 "비교단백질(Comparison Protein)"으로 명시된 아미노산 서열의 % 아미노산 서열 동일성을 계산하는 예시적 방법을 나타낸다. 본원의 목적에서, "PRO" 서열은 본원 도면에서 언급된 TACI, BCMA, TALL-1, APRIL, TACIs 또는 BR3 서열일 수 있다.
도 8은 스플라이싱 변이체로 여겨지는 "hTACI (265)" (서열 번호 19)로 지칭되는 TACI 수용체, 및 또한 도 1A-1B에서 언급된 "hTACI" (서열 번호 3)에 대한 2개의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다.
도 9A는 인간 (서열 번호 16) 및 뮤린 BR3 (서열 번호 18)의 서열 정렬을 나타낸다. 인간 및 뮤린 BR3에서 동일한 아미노산은 굵은 글씨로 나타낸다. 보존 아미노산은 플러스(+) 기호로 표시한다. 4개의 시스테인 잔기를 포함하는 영역은 밑줄로 표시하고, 예측 막-스패닝(membrane-spanning) 영역은 이중 밑줄로 표시한다. 도 9B는 BR3의 노던 블롯(Northern Blot) 분석을 보여준다. 인간 (좌측) 및 마우스 (우측) 복수 조직 노던 블롯 (Clontech)는 인간 또는 뮤린 BR3의 코딩 영역에 상응하는32P-라벨링된 cDNA 단편으로 프로빙하였다. 도 9C는 인간 복수 조직 cDNA 패널의 PCR 분석을 보여준다 (Clontech). cDNA 단편은 유전자 특이적 프라이머(primer)로 증폭하였다. 레인 1-9: 1, PBL; 2, 휴지 CD4+ 세포; 3, 활성화된 CD4+ 세포; 4, 휴지 CD8+ 세포; 5, 활성화된 CD8+ 세포; 6, 휴지 CD19+ 세포; 7, 활성화된 CD19+ 세포; 8, 림프절; 9, 비장.
도 10A-10D는 수행한 분석의 결과를 나타내고, 나타낸 BR3는 TALL-1에 대한 특이적 수용체이나, APRIL에 대해서는 그러하지 아니하며, NF-κB 경로를 활성화시키지 않았다. (a) hBR3 (1,2) 또는 TACI (3,4)로 트랙스펙션시킨 COS 7을 AP-TALL-1 (1,3) 또는 AP-April (2,4)를 포함하는 조절 배지로 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 고정하였으며, 세포내에서 AP 활성에 대하여 염색하였다. (b) TALL-1 (1,2) 또는 April (3,4)로 트랜스펙션시킨 COS7 세포를 hBR3-hFc (1,3) 또는 TACI-hFc (2,4)로 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 고정하였으며, 결합된 수용체-hFc 단백질을 비오티닐화 염소 항-인간 항체 및 이어서 Cy3-스트렙타비딘을 사용하여 검출하였다. (c) BR3-hFc (1,2) 또는 TACI-hFc (3,4)를 Flag-TALL-1 (1,3) 또는 Flag-April (2,4)로 인큐베이션하였다. 단백질-A-아가로스로 침전시킨 수용체-Fc 융합 단백질을 항-Flag 항체로 면역블로팅하였다. 동량의 리간드 (중간 패널) 또는 수용체-hFc (아래측)을 결합 실험에 사용하였다. (d) 293E 세포 (Invitrogen)을 0.25 ug의 NF-κB 루시페라제 레포터 유전자 구조물, 25 ng pRL-TK 및 표시된 양의 hBR3, mBR3, TACI 및 BCMA를 코딩하는 발현 구성체로 트랜스펙션시켰다. NF-κB 활성화를 듀얼-루시페라제 레포터 분석 키트 (Promega)를 사용하여 20-24 시간 후에 측정하였다.
도 11A-11D는 BR3-Fc가 루푸스 치료에 효과적임을 나타내는 분석 결과를 설명한다. 도 11A-11B는 BR3-Fc가 NZB x NZW (F1) 마우스에서 단백뇨를 차단함을 나타내고; 도 11C는 BR3-FC 처리 동물이 생존 증가를 나타냄을 보이고; 도 11D는 BR3-Fc 처리 동물이 항-dsDNA 항체의 존재가 감소함을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
I. 정의
본원에서 사용되는 용어 "BR3", "BR3 폴리펩티드" 또는 "BR3 수용체"는 "천연 서열 BR3 폴리펩티드" 및 "BR3 변이체" (본원에서 추가로 정의됨)을 포함한다. "BR3"는 도 6에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 및 이의 변이체 또는 단편, 도 6에 나타낸 서열을 포함하는 핵산 분자 및 이의 변이체 뿐만 아니라 상기의 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 지칭하는 것이다. 본 발명의 BR3 폴리펩티드는 인간 조직 유형과 같은 다양한 원천 또는 다른 원천으로부터 단리되거나, 또는 재조합 및(또는) 합성법에 의해 제조될 수 있다.
"천연 서열" BR3 폴리펩티드는 천연으로부터 유래하는 상응하는 BR3 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 천연 서열 BR3 폴리펩티드는 천연으로부터 단리될 수 있거나, 또는 재조합 및(또는) 합성법에 의해 제조될 수 있다. "천연 서열 BR3 폴리펩티드"라는 용어는 구체적으로 상기 폴리펩티드의 천연 발생 절단(truncated) 또는 분비 형태 (예: 세포외 도메인 서열), 천연 발생 변이 형태 (예: 별도 스플라이싱 형태) 및 천연 발생 대립유전자 변이체를 포함한다. 본 발명의 BR3 폴리펩티드는 도 6B의 아미노산 잔기 1 내지 184 (서열 번호 16)의 근접(contigous) 서열을 포함하거나 이로 이루어진 BR3 폴리펩티드를 포함한다.
BR3 "세포외 도메인" 또는 "ECD"는 실질적으로 막통과 및 세포질 도메인이 없는 BR3 폴리펩티드의 형태를 지칭한다. 통상적으로 BR3 폴리펩티드 ECD는 상기 막통과 및(또는) 세포질 도메인을 약 1% 미만 가질 수 있으며, 바람직하게는 상기도메인을 약 0.5% 미만 가질 수 있다. 본 발명의 BR3 폴리펩티드에 대하여 확인된 임의의 막통과 도메인(들)은 소수성 도메인 유형을 확인하기 위하여 당업계에서 통상적으로 이용되는 기준에 따라서 확인된다. 막통과 도메인의 정확한 경게는 달라질 수 있으나, 대개의 경우 최초 확인된 도메인의 각 말단에서 약 5 아미노산 이하이다. BR3의 ECD 형태는 도 6B의 아미노산 1 내지 77 또는 2 내지 62를 포함하는 것을 포함한다.
"BR3 변이체"는 천연 서열 전장 BR3 또는 BR3 ECD의 아미노산 서열과 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 BR3 폴리펩티드를 의미한다. 임의로, BR3 변이체는 단일 시스테인 리치 도메인을 포함한다. 바람직하게는, 상기 BR3 변이체는하기 정의된 바와 같은 길항제 또는 아고니스트로 작용한다. 상기 BR3 변이체 폴리펩티드는 예를 들면, 전장 아미노산 서열의 N- 및(또는) C-말단에서, 뿐만 아니라 1 이상의 내부 도메인 내에서 1 이상의 아미노산 잔기가 첨가, 또는 결실된 BR3 폴리펩티드를 포함한다. BR3 ECD의 단편이 또한 예상된다. 통상적으로, BR3 변이체 폴리펩티드는 도 6에 나타낸 핵산 분자에 의해 코딩되는 BR3 폴리펩티드 또는 이의 지정된 단편과 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 81% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 82% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 83% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 84% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 86% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 87% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약88% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 89% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 91% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 92% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 93% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 94% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 96% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 97% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 98% 아미노산 서열 동일성, 더더욱 바람직하게는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. BR3 변이체 폴리펩티드는 천연 BR3 폴리펩티드 서열을 포함하지 않는다. 통상적으로, BR3 변이체 폴리펩티드는 적어도 약 10 아미노산 길이, 자주 적어도 약 20 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 30 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 40 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 50 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 60 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 70 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 80 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 90 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 100 아미노산 길이, 더욱자주 약 150 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 200 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 250 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 300 아미노산 길이, 또는 그 이상이다.
본원에서 사용된 용어 "TACI" 또는 "TACI 폴리펩티드" 또는 "TACI 수용체"는 "쳔언 서열 TACI 폴리펩티드" 및 "TACI 변이체" (본원에서 추가로 정의됨)을 포함한다. "TACI"는 도 1에서 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 및이의 변이체 또는 단편, 도 1에 나타낸 서열을 포함하는 핵산 분자 및 이의 변이체 뿐만 아니라 상기의 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명의 TACI 폴리펩티드는 인간 조직 유형과 같은 다양한 원천 또는 다른 원천으로부터 단리되거나, 또는 재조합 및(또는) 합성법에 의해 제조될 수 있다.
"천연 서열" TACI 폴리펩티드는 천연으로부터 유래한 상응하는 TACI 폴리펩티드와 동일하 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 천연 서열 TACI 폴리펩티드는 천연으로부터 단리될 수 있거나, 또는 재조합 및(또는) 합성법에 의해 제조될 수 있다. "천연 서열 TACI 폴리펩티드"라는 용어는 구체적으로 상기 폴리펩티드의 천연 발생 절단 또는 분비 형태 (예: 세포외 도메인 서열), 천연 발생 변이 형태 (예: 별도 스플라이싱 형태) 및 천연 발생 대립유전자 변이체를 포함한다. 본 발명의 TACI 폴리펩티드는 폰 불로우(von Bulow) 등의 상기 문헌 및 WO 98/39361 (1998년 9월 11일 공개)에 기술된 폴리펩티드, 스플라이싱 변이체 (상기 "hTACI (265)"로 지칭하고 도 8에 나타냄 (서열 번호 19)), 및 도 1의 아미노산 잔기 1 내지 293 (서열 번호 3)의 근접 서열을 포함하는 TACI 폴리펩티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
TACI "세포외 도메인" 또는 "ECD"는 실질적으로 막통과 및 세포질 도메인이 없는 TACI 폴리펩티드의 형태를 지칭한다. 통상적으로 TACI 폴리펩티드 ECD는 상기 막통과 및(또는) 세포질 도메인을 약 1% 미만 가질 수 있으며, 바람직하게는 상기도메인을 약 0.5% 미만 가질 수 있다. 본 발명의 TACI 폴리펩티드에 대하여 확인된 임의의 막통과 도메인(들)은 소수성 도메인 유형을 확인하기 위하여 당업계에서 통상적으로 이용되는 기준에 따라서 확인된다. 막통과 도메인의 정확한 경게는 달라질 수 있으나, 대개의 경우 최초 확인된 도메인의 각 말단에서 약 5 아미노산 이하이다. TACI의 ECD 형태는 폰 불로우 등의 상기 문헌 및 WO 98/39361에 기술된 것을 포함한다.
"TACI 변이체"는 천연 서열 전장 TACI 또는 TACI ECD의 아미노산 서열과 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 TACI 폴리펩티드를 의미한다. 바람직하게는, 상기 TACI 변이체는 하기 정의된 바와 같은 TALL-1 길항제 또는 APRIL 길항제로 작용한다. 상기 TACI 변이체 폴리펩티드는 예를 들면, 전장 아미노산 서열의 N- 및(또는) C-말단에서, 뿐만 아니라 1 이상의 내부 도메인 내에서 1 이상의 아미노산 잔기가 첨가, 또는 결실된 TACI 폴리펩티드를 포함한다. TACI ECD의 단편이 또한 예상된다. 통상적으로, TACI 변이체 폴리펩티드는 도 1에 나타낸 핵산 분자에 의해 코딩되는 TACI 폴리펩티드 또는 이의 지정된 단편과 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 81% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 82% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 83% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 84% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 86% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 87% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 88% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 89% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 91% 아미노산 서열 동일성,더욱 바람직하게는 적어도 약 92% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 93% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 94% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 96% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 97% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 98% 아미노산 서열 동일성, 더더욱 바람직하게는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. TACI 변이체 폴리펩티드는 천연 TACI 폴리펩티드 서열을 포함하지 않는다. 통상적으로, TACI 변이체 폴리펩티드는 적어도 약 10 아미노산 길이, 자주 적어도 약 20 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 30 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 40 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 50 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 60 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 70 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 80 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 90 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 100 아미노산 길이, 더욱 자주 약 150 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 200 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 250 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 300 아미노산 길이, 또는 그 이상이다.
본원에서 사용된 용어 "TACIs"는 도 5B의 잔기 1 내지 246의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체를 지칭하고, 단일 시스테인 리치 도메인을 포함한다. 임의로, 상기 TACIs 폴리펩티드는 도 5B의 잔기 1 내지 246의 근접 서열을 포함한다. 임의로, 상기 TACIs 폴리펩티드는 도 5A에 나타낸 코딩 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 코딩된다. 본 발명의TACIs 폴리펩티드는 인간 조직 유형과 같은 다양한 원천 또는 다른 원천으로부터 단리되거나, 또는 재조합 및(또는) 합성법에 의해 제조될 수 잇다. "TACIs"라는 용어는 본원에서 "TACI"로 정의된 폴리펩티드를 명시적으로 배제한다. "천연 서열" TACIs 폴리펩티드는 천연으로부터 유래한 폴리펩티드를 포함한다. 상기 천연 서열 TACIs 폴리펩티드는 천연으로부터 단리될 수 있거나, 또는 재조합 및(또는) 합성법에 의해 제조될 수 있다. TACIs 폴리펩티드는 도 5B에 나타낸 폴리펩티드의 단편 또는 변이체를 포함하고, 도 5B에 나타낸 서열과 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 도 5A에 나타낸 코딩 핵산 서열에 의해 코딩되는 TACIs 폴리펩티드 또는 이의 지정된 단편과 적어도 약 81% 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 82% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 83% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 84% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 86% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 87% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 88% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 89% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 91% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 92% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 93% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 94% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 96% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 97%아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 98% 아미노산 서열 동일성, 더더욱 바람직하게는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 상기 TACIs 변이체는 하기 정의된 바와 같은 TALL-1 길항제 또는 APRIL 길항제로 작용한다. 상기 변이체 폴리펩티드는, 예를 들면 도 5B에 나타낸 아미노산 서열의 N- 및(또는) C-말단에서 뿐만 아니라 1 이상의 내부 도메인 중에서 1 이상의 아미노산 잔기가 첨가, 또는 결실된 폴리펩티드를 포함한다.
TACIs "세포외 도메인" 또는 "ECD"는 실질적으로 막통과 및 세포질 도메인이 없는 TACIs 폴리펩티드의 형태를 지칭한다. 통상적으로 TACIs 폴리펩티드 ECD는 상기 막통과 및(또는) 세포질 도메인을 약 1% 미만 가질 수 있으며, 바람직하게는 상기 도메인을 약 0.5% 미만 가질 수 있다. 본 발명의 TACIs 폴리펩티드에 대하여 확인된 임의의 막통과 도메인(들)은 소수성 도메인 유형을 확인하기 위하여 당업계에서 통상적으로 이용되는 기준에 따라서 확인됨을 이해할 수 있다. 막통과 도메인의 정확한 경계는 달라질 수 있으나, 대개의 경우 최초 확인된 도메인의 각 말단에서 약 5 아미노산 이하이다. TACIs의 ECD 형태는 도 5B의 아미노산 잔기 1 내지 119 및, 임의로 도 5B의 근접 아미노산 잔기 1 내지 119의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용된 "BCMA" 또는 "BCMA 폴리펩티드" 또는 "BCMA 수용체"는 "천연 서열 BCMA 폴리펩티드" 및 "BCMA 변이체" (본원에서 추가로 정의됨)을 포함한다. "BCMA"는 도 2에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 및 이의 변이체, 도 2에 나타낸 서열을 포함하는 핵산 분자 및 이의 변이체 뿐만 아니라상기의 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명의 BCMA 폴리펩티드는 인간 조직 유형과 같은 다양한 원천 또는 다른 원천으로부터 단리되거나, 또는 재조합 및(또는) 합성법에 의해 제조될 수 있다.
"천연 서열" BCMA 폴리펩티드는 천연으로부터 유래한 상응하는 BCMA 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 천연 서열 BCMA 폴리펩티드는 천연으로부터 단리될 수 있거나, 또는 재조합 및(또는) 합성법에 의해 제조될 수 있다. "천연 서열 BCMA 폴리펩티드"라는 용어는 구체적으로 상기 폴리펩티드의 천연 발생 절단 또는 분비 형태 (예: 세포외 도메인 서열), 천연 발생 변이체 형태 (예: 별도 스플라이싱 형태) 및 천연 발생 대립유전자 변이체를 포함한다. 본 발명의 BCMA 폴리펩티드는 문헌[Laabi et al.,EMBO J.,11:3897-3904 (1992); Laabi et al.,Nucleic Acids Res.,22;1147-1154 (1994); Gras et al.,Int. Immunology,7:1093-1106 (1995); Madry et al.,Int. Immunology,10:1693-1702 (1998)]에 기술된 폴리펩티드; 및 도 2의 아미노산 잔기 1-184 (서열 번호 6)의 근접 서열을 포함하는 BCMA 폴리펩티드를 포함한다.
BCMA "세포외 도메인" 또는 "ECD"는 실질적으로 막통과 및 세포질 도메인이 없는 BCMA 폴리펩티드의 형태를 지칭한다. 통상적으로 BCMA 폴리펩티드 ECD는 상기 막통과 및(또는) 세포질 도메인을 약 1% 미만 가질 수 있으며, 바람직하게는 상기 도메인을 약 0.5% 미만 가질 수 있다. 본 발명의 BCMA 폴리펩티드에 대하여 확인된 임의의 막통과 도메인(들)은 소수성 도메인 유형을 확인하기 위하여 당업계에서 통상적으로 이용되는 기준에 따라서 확인됨을 이해할 수 있다. 막통과 도메인의 정확한 경게는 달라질 수 있으나, 대개의 경우 최초 확인된 도메인의 각 말단에서 약 5 아미노산 이하이다. BCMA의 ECD 형태는 문헌[Laabi et al.,EMBO J.,11:3897-3904 (1992); Laabi et al.,Nucleic Acids Res.,22:1147-1154 (1994); Gras et al.,Int. Immunology,7:1093-1106 (1995); Madry et al.,Int. Immunology,10:1693-1702 (1998)]에 기술된 것을 포함한다.
"BCMA 변이체"는 천연 서열 BCMA 또는 BCMA ECD의 아미노산 서열과 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 BCMA 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 상기 BCMA 변이체는 하기 정의되는 바와 같은 TALL-1 길항제 또는 APRIL 길항제로 작용한다. 상기 BCMA 변이체 폴리펩티드는, 예를 들면 전장 아미노산 서열의 N- 및(또는) C-말단에서 뿐만 아니라 1 이상의 내부 도메인 중에서 1 이상의 아미노산 잔기가 첨가 또는 결실된 BCMA 폴리펩티드를 포함한다. BCMA ECD의 단편이 또한 예상된다. 임의로, BCMA 변이체 폴리펩티드는 도 2에 나타낸 핵산 분자에 의해 코딩되는 BCMA 폴리펩티드 또는 이의 지정된 단편과 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 81% 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 82% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 83% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 84% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 86% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 87% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 88% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 89% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 아미노산 서열동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 91% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 92% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 93% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 94% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 96% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 97% 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 98% 아미노산 서열 동일성, 더더욱 바람직하게는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. BCMA 변이체 폴리펩티드는 천연 BCMA 폴리펩티드 서열을 포함하지 않는다. 통상적으로, BCMA 변이체 폴리펩티드는 적어도 약 10 아미노산 길이, 자주 적어도 약 20 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 30 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 40 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 50 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 60 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 70 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 80 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 90 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 100 아미노산 길이, 더욱 자주 약 150 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 200 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 250 아미노산 길이, 더욱 자주 적어도 약 300 아미노산 길이, 또는 그 이상이다.
본원에서 사용된 용어 "TALL-1" 또는 "TALL-1 폴리펩티드"는 "천연 서열 TALL-1 폴리펩티드" 및 "TALL-1 변이체"를 포함한다. "TALL-1"은 도 3에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 및 이의 변이체, 도 3에 나타낸 서열을 포함하는 핵산 분자 및 이의 변이체에 의해 코딩되는 폴리펩티드 뿐만 아니라천연 서열 TALL-1의 생물학적 활성을 갖는 상기의 단편을 지칭한다. TALL-1의 변이체는 바람직하게는 도 3에 나타낸 천연 서열 TALL-1 폴리펩티드와 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더더욱 바람직하게는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. "천연 서열" TALL-1 폴리펩티드는 천연으로부터 유래한 상응하는 TALL-1 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 천연 서열 TALL-1 폴리펩티드는 천연으로부터 단리될 수 있거나, 또는 재조합 및(또는) 합성법에 의해 제조될 수 있다. "천연 서열 TALL-1 폴리펩티드"라는 용어는 구체적으로 상기 폴리펩티드의 천연 발생 절단 또는 분비 형태 (예: 세포외 도메인 서열), 천연 발생 변이체 형태 (예: 별도 스플라이싱 형태) 및 천연 발생 대립유전자 변이체를 포함한다. "TALL-1"이라는 용어는 수(Shu) 등, 진뱅크 수탁 번호(GenBank Accession No.) AF136293; WO 98/18921 (1998년 5월 7일 공개); EP 869,180 (1998년 10월 7일 공개); WO 98/27114 (1998년 6월 25일 공개); WO 99/12964 (1999년 3월 18일 공개); WO 99/33980 (1999년 7월 8일 공개); Moore et al.,supra; Schneider et al.,supra; 및 Mukhopadhyay et al.,supra에 기술된 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "APRIL" 또는 "APRIL 폴리펩티드"는 "천연 서열 APRIL 폴리펩티드" 및 "APRIL 변이체"를 포함한다. "APRIL"은 도 4A-4B에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 및 이의 변이체, 도 4A-4B에 나타낸 서열을 포함하는 핵산 분자 및 이의 변이체에 의해 코딩되는 폴리펩티드 뿐만 아니라 천연 서열 APRIL의 생물학적 활성을 갖는 상기의 단편을 지칭한다. APRIL의 변이체는도 4A-4B에 나타낸 천연 서열 APRIL 폴리펩티드와 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더더욱 바람직하게는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. "천연 서열" APRIL 폴리펩티드는 천연으로부터 유래한 상응하는 APRIL 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 천연 서열 APRIL 폴리펩티드는 천연으로부터 단리될 수 있거나, 또는 재조합 및(또는) 합성법에 의해 제조될 수 있다. 용어 "천연 서열 APRIL 폴리펩티드"는 구체적으로 상기 폴리펩티드의 천연 발생 절단 또는 분비 형태 (예: 세포외 도메인 서열), 천연 발생 변이체 형태 (예: 별도 스플라이싱 형태) 및 천연 발생 대립유전자 변이체를 포함한다. "APRIL"이라는 용어는 문헌[Hahne et al.,J. Exp. Med.,188;1185-1190 (1998)]; 진뱅크 수탁 번호 AF046888; WO 99/00518 (1999년 1월 7일 공개); WO 99/35170 (1999년 7월 15일 공개); WO 99/12965 (1999년 3월 18일 공개); WO 99/33980 (1999년 7월 8일); WO 97/33902 (1997년 9월 18일); WO 99/11791 (1999년 3월 11일); EP 911,633 (1999년 3월 28일 공개); 및 WO 99/50416 (1999년 10월 7일 공개)에 기술된 폴리펩티드를 포함한다.
혼성화 반응의 "엄격성"은 당업자에 의해 용이하게 결정되고, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 의존하는 실험상 계산이다. 일반적으로, 더 긴 프로브는 적합한 어닐링(annealing)을 위하여 더 높은 온도를 필요로 하는 반면, 더 짧은 프로브는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 상보 가닥이 이들의 용융 온도 아래의 환경에 존재하는 경우 변성 DNA가 재-어닐링되는 능력에 의존한다. 프로브 및 혼성화가능한 서열 간의 요구되는 동일성의 정도가 더높을수록 사용도리 수 있는 상대 온도가 더 높다. 결과적으로, 더 높은 상대 온도는 반응 조건을 더욱 엄격하게하는 경향이 있는 반면, 더 낮은 온도는 덜 그러할 수 있다. 혼성화 반응의 엄격성에 대한 추가 세부사항 및 설명은 문헌[Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)]를 참고하라.
본원에서 정의된 "염격한 조건" 또는 "고 엄격성 조건"은 (1) 이온 강도가 낮고 세척 온도가 높은 조건, 예를 들면 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1 % 나트륨 도데실 술페이트를 50 ℃에서 사용하는 것; (2) 42 ℃에서 0.1 % 소혈청 알부민/0.1 % 피콜/0.1 % 폴리비닐피롤리돈/750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨이 함유된 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)이 함유된 50 % (v/v) 포름아미드 등의 포름아미드와 같은 변성화제를 혼성화시에 사용하는 것; (3) 50 % 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1 % 피로인산 나트륨, 5 x 덴하르트(Denhardt's) 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1 % SDS, 및 10 % 덱스트란 술페이트를 42 ℃에서 사용하고, 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산 나트륨)로 42 ℃ 및 50 % 포름아미드로 55 ℃에서 세척한 후, 55 ℃에서 EDTA가 함유된 0.1 x SSC로 이루어진 고 엄격성 세척을 수행하는 것이다.
"중간 정도의 엄격한 조건"이란 문헌[Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재된 바와 같고, 세척액 및 상기한 것보다 엄격성이 낮은 혼성화 조건 (예를 들어 온도, 이온강도 및 %SDS)의 사용을 포함한다. 중간 정도의 엄격한 조건의 예는 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 트리소듐 시트레이트), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 전단변형시킨 변성 연어 정액 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃에서 밤배 인큐베이션한 후 필터를 약 37 내지 50℃에서 1 x SSC로 세척하는 조건이다. 당업계의 숙련가는 프로브 길이 등과 같은 인자를 조정하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등을 조절하는 방법을 잘 알 것이다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 프리서열 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 근접하고, 또한 분비 리더의 경우 근접하고 리딩 상 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 근접할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 라이게이션에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따라 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 사용한다.
"아미노산" 및 "아미노산들"이라는 용어는 모든 천연 발생 L-알파-아미노산을 지칭한다. 상기 정의는 노르류신, 오르니틴 및 호모시스테인을 포함하는 것을의미한다. 아미노산은 하기와 같은 단문자 또는 3문자 명칭으로 확인된다:
Asp D 아스파르트산 Ile I 이소류신
Thr T 트레오닌 Leu L 류신
Ser S 세린 Tyr Y 티로신
Glu E 글루탐산 Phe F 페닐알라닌
Pro P 프롤린 His H 히스티딘
Gly G 글리신 Lys K 리신
Ala A 알라닌 Arg R 아르기닌
Cys C 시스테인 Trp W 트립토판
Val V 발린 Gln Q 글루타민
Met M 메티오닌 Asn N 아스파라긴
서열 목록 및 도면에서, 특정 다른 단문자 또는 3문자 명칭을 사용하여 서열 중 주어진 위치에서의 2 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드를 지칭하고 확인할 수 있다.
본원에 동정된 리간드 또는 수용체 폴리펩티드에 대하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭(gap)을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성한 후, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 고려하지 않고, 본원에 동정된 상기 리간드 또는 수용체 서열 중 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 중 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위한 목적의 정렬은 당업자들의 범위 내에 있는 다양한 방법, 예를 들면 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자들은 비교되는 서열의 전장에 걸친 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리듬을 비롯한, 정렬을 측정하기 위한 적합한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적에서, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2 (여기서, ALIGN-2 프로그램에 대한 완전 소스 코드는 하기 표에 제공됨)을 사용하여 하기 기술된 바와 같이 얻는다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.)가 만든 것으로, 미국 저작권청(U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559)에 사용자 문서로 제출되었고 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (미국 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재)를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 또는 하기 표에 제공된 소스 코드를 따를 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동 시스템, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D 상에서 사용되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변경되지 않는다.
<표 - 소스 코드>
본원의 목적을 위해, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 상기 서열과의, 또는 상기 서열과 대비한 소정의 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (달리, 소정 아미노산 서열 B에 대한, 상기 서열과의, 또는 상기 서열과 대비한 일정한 % 아미노산 서열 동일성을 가진 또는 이를 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다.
분수 X/Y ×100 배
여기서, X는 프로그램의 A 및 B의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 기록된 아미노산의 수이고, Y는 서열 B 중 총 아미노산의 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, 서열 A의 B에 대한 % 아미노산 서열 동일성이 서열 B의 A에 대한 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것이라는 점이 이해될 것이다. % 아미노산 서열 동일성 계산의 예로, 도 7A-7B는 "비교 단백질"로 표시된 아미노산 서열의 "PRO"로 표시된 서열에 대한 % 아미노산 서열 동일성을 어떻게 계산하는지를 보여준다.
달리 구체적으로 언급되지 않았다면, 본원에서 사용된 모든 % 아미노산 서열 수치는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 사용하여 상기에서 기술된 것 같이 획득된다. 그러나, % 아미노산 서열 동일성은 또한 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2 을 이용하여 계산될 수도 있다 (Altschul et al., Nucleic AAcids Res. 25: 3389-3402 (1997)). NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 NCBI 인터넷 웹 사이트로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-BLAST2는 다수의 서치 파라미터를 사용하고, 여기서, 이들 서치 파라미터 모두는 예를 들어, 다음과 같이 디폴트값으로 설정된다: 드러남 = yes, 스트랜드 = all, 예상 발생수 = 10, 최소의 낮은 복잡 길이 = 15/5, 멀티 패스 e-값 = 0.01, 멀티 패스 상수 = 25, 최총 갭 정렬의 감소 = 25 및 스코아 매트릭스 = BLOSUM62.
아미노산 서열 비교를 위해 NCBI-BLAST2가 사용되는 경우, 소정 아미노산 서열 B에 대한, 상기 서열과의, 또는 상기 서열과 대비한 소정 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (달리, 소정 아미노산 서열 B에 대한, 상기 서열과의, 또는 상기 서열과 대비한 일정한 % 아미노산 서열 동일성을 가진 또는 이를 포함하는 소정 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다.
분수 X/Y ×100 배
여기서, X는 프로그램의 A 및 B의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST2에 의해 동일한 매치로 기록된 아미노산의 수이고, Y는 서열 B 중 총 아미노산의 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, 서열 A의 B에 대한 % 아미노산 서열 동일성이 서열 B의 A에 대한 % 아미노산서열 동일성과 동일하지 않을 것이라는 점이 이해될 것이다.
본원에서 사용된 "에피토프 태그된(epitope tagged)"란 용어는 "태그 폴리펩티드(tag polypeptide)"와 융합된 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 제조될 수 있는 에피토프를 제공하기 위해 충분한 잔기를 포함한다. 또한, 태그 폴리펩티드는 항체가 다른 에피토프와 실질적으로 교차반응하지 않도록 상당히 독특한 것이다. 적합한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기, 일반적으로 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기를 포함한다 (바람직하게는, 약 10 내지 20 개의 아미노산 잔기).
본원에서 사용된 "면역어드헤신(immunoadhesin)"이란 용어는 이종 단백질 ("어드헤신 (adhesin)")의 결합 특이성과 면역글로블린 불변 도메인의 작용기 기능을 결합한 항체 유사 분자를 지칭한다. 구조적으로, 면역어드헤신은 항원 인식 및 항체 결합 부위 이외에 목적한 결합 특이성을 갖는 (즉, "이종의") 아미노산 서열 및 면역글로블린 불변 도메인 서열의 융합을 포함한다. 면역어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 일반적으로 최소한 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 연속적으로 인접한 아미노산 서열이다. 면역어드헤신 중의 면역글로블린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로블린, 예를 들어, IgG-1, IgG-2, IgG-3 및 IgG-4 아형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 얻을 수 있다.
"길항제"란 용어는 가장 넓은 의미로 사용되고, 시험관내, 인 시추 또는 생체내에서 TALL-1 폴리펩티드, APRIL 폴리펩티드, 또는 TALL-1 및 APRIL 모두의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 충분히 차단, 억제 또는 중화시키는임의의 분자를 포함한다. TALL-1 및 APRIL 폴리펩타이드의 이같은 생물학적 활성의 예는 TALL-1 또는 APRIL의 TACI, BCMA, TACIs 또는 BR3로의 결합, NF-κB의 활성화 및 B 세포 증식 및 B 세포에 의한 Ig 분비의 활성화 및 B 세포에 의한 Ig 분비의 활성화, 면역 관련 증상, 예를 들어, 류마티스성 관절염과 아울러 문헌에 보고된 것들을 포함한다. 길항제는 직접적으로 또는 간접적으로 작용할 수 있다. 예를 들어, 길항제는 TALL-1, APRIL, BCMA, TACIs 또는 BR3에 직접 결합한 결과, 시험관내, 인 시추 또는 생체내에서 TALL-1 폴리펩티드, APRIL 폴리펩티드, 또는 TALL-1 및 APRIL 모두의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 충분히 차단, 억제 또는 중화시키도록 작용할 수 있다. 또한, 길항제는 예를 들어, 다른 작용체 분자를 차단 또는 억제한 결과, 간접적으로 시험관내, 인 시추 또는 생체내에서 TALL-1 폴리펩티드, APRIL 폴리펩티드, 또는 TALL-1 및 APRIL 모두의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 충분히 차단, 억제 또는 중화시키도록 작용할 수 있다. 길항제 분자는 TALL-1 및 APRIL의 모두의 생물학적 활성을 충분히 또는 부분적으로 차단, 억제 또는 중화시킬 수 있는 분자인 "이중" 길항제 활성을 포함할 수 있다.
"아고니스트"란 용어는 가장 넓은 의미로 사용되고, 시험관내, 인 시추 또는 생체내에서 TACIs 폴리펩티드, BR3 폴리펩티드, 또는 TACIs 및 BR3 모두의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 충분히 향상, 자극 또는 활성화시키는 임의의 분자를 포함한다. TACIs 및 BR3의 이같은 생물학적 활성의 예는 NF-κB의 활성화, 면역글로블린 생산 및 분비의 유도 및 세포 증식을 포함한다. 아고니스트는직접적으로 또는 간접적인 방식으로 작용할 수 있다. 예를 들어, 아고니스트는 TACIs 또는 BR3에 직접적으로 결합하여 수용체 활성화 또는 시그날 전달을 초래하여 시험관내, 인 시추 또는 생체내에서 TACIs 폴리펩티드, BR3 폴리펩티드, 또는 TACIs 및 BR3 모두의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 충분히 향상, 자극 또는 활성화시키도록 작용할 수 있다. 또한, 아고니스트는 예를 들어, 다른 작용체 분자를 자극하고, 이어서 이는 TACIs 또는 BR3 수용체의 활성화 또는 시그날 트랜스덕션을 일으킨 결과, 간접적으로 시험관내, 인 시추 또는 생체내에서 TACIs 폴리펩티드, BR3 폴리펩티드, 또는 TACIs 및 BR3 모두의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 충분히 향상, 자극 또는 활성화시키도록 작용할 수 있다. 아고니스트가 TACIs 또는 BR3 활성화 또는 활성을 향상시키거나 또는 증가시키도록 간접적으로 작용하는 증폭제 분자로 고안될 수 있다. 예를 들어, 아고니스트는 포유동물 중에서 내재 TALL-1 또는 APRIL의 활성을 증가시킬 수 있다. 이는 예를 들어, TACIs 또는 BR3를 사전복합체화시키거나 또는 각각의 리간드와 TACIs 또는 BR3 수용체의 복합체를 안정화시켜 달성할 수 있다 (예를 들어, TALL-1R과 TACIs 또는 APRIL과 TACIs 사이에 형성된 천연 복합체의 안정화).
"TALL-1 길항제" 또는 "APRIL 길항제"란 용어는 TALL-1 또는 APRIL 각각, 또는 TAPP-1 및 APRIL 모두의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 충분히 차단, 억제 또는 중화시키는 임의의 분자를 지칭하고, TACIs 수용체 또는 BR3 수용체의 가용성 형태, 예를 들어, TACIs 또는 BR3의 세포외 도메인 서열, TACIs 수용체 면역어드헤신, BR3 수용체 면역어드헤신, TACIs 수용체 융합 단백질, BR3 수용체 융합 단백질, TACIs 수용체의 공유결합으로 변형된 형태, BR3 수용체의 공유결합으로 변형된 형태, TACIs 변이체, BR3 변이체, TACIs 수용체 항체, BR3 수용체 항체, TALL-1 항체 및 APRIL 항체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. TALL-1 길항제 분자가 TALL-1 또는 APRIL의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 충분히 차단, 억제 또는 중화시키는지 측정하기 위해서, 예를 들어, TALL-1 또는 APRIL의 TACIs 또는 BR3로의 결합, 또는 각각의 리간드에 의한 NF-κB 활성화에 대한 길항제 분자의 영향(들)을 평가하기 위한 분석이 수행될 수 있다. 이같은 분석은 공지의 시험관내 또는 생체내 분석 형태로, 예를 들어, BR3 및(또는) TACIs를 발현하는 세포 중에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 본원에서 기술된 방법 중에 사용된 TALL-1 길항제는 하나 이상의 TALL-1 활성을 차단 또는 중화시킬 수 있고, 이는 본원에서 기술된 것과 같은 분석 중에서 임의로 측정될 수 있다. APRIL 길항제 분자가 TALL-1 또는 APRIL의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 충분히 차단, 억제 또는 중화시키는지 측정하기 위해서, 예를 들어, TALL-1 또는 APRIL의 TACIs 또는 BR3로의 결합, 또는 각각의 리간드에 의한 NF-κB 활성화에 대한 길항제 분자의 영향(들)을 평가하기 위한 분석이 수행될 수 있다. 이같은 분석은 공지의 시험관내 또는 생체내 분석 형태로, 예를 들어, TACIs 또는 BR3 (또는 TACIs 및 BR3 모두)로 형질전환된 세포를 사용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 본원에서 기술된 방법 중에 사용된 APRIL 길항제는 하나 이상의 APRIL 활성을 차단 또는 중화시킬 수 있고, 이는 결합 분석 또는 IgM-생성 분석 중에서 임의로 측정될 수 있다. 임의로, TALL-1 길항제 또는 APRIL 길항제는 결합 분석 중에 TALL-1 또는 APRIL (또는 TALL-1 및 APRIL 모두)의TACIs 또는 BR3로의 결합을 음성 대조구 분자에 비해 50 % 이상, 바람직하게는 90 % 이상, 보다 바람직하게는 99 % 이상, 가장 바람직하게는 100 % 감소 또는 억제시킬 수 있다. 한 실시태양에서, TALL-1 길항제 또는 APRIL 길항제는 다른 리간드 또는 항체의 TACIs 또는 BR3로의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체를 포함할 것이다. 경쟁적 억제에 의한 항체 특이성 및 친화도를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 [예를 들어, Harlow et al.,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998); Colligan et al.,Current Protocols in Immunology, Green Publishing Assoc., NY (1992; 1993); Muller,Meth. Enzym., 92:589-601 (1983) 참조].
"TACIs 아고니스트" 또는 "BR3 아고니스트"란 용어는 TACIs 또는 BR3 각각 또는 TACIs 및 BR3 모두의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 충분히 향상, 자극 또는 활성화시키는 임의의 분자를 지칭하고, 항-TACIs 수용체 항체 및 항-BR3 수용체 항체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. TACIs 아고니스트 분자가 TACIs 또는 BR3 각각 또는 TACIs 및 BR3 모두의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 충분히 향상, 자극 또는 활성화시키는지 측정하기 위해서, PBLs 또는 TACIs 또는 BR3-형질전환된 세포에 대한 아고니스트 분자의 영향(들)을 평가하기 위한 분석이 수행될 수 있다. 이같은 분석은 공지의 시험관내 또는 생체내 분석 형태로 수행될 수 있다. 바람직하게는, 본원에서 기술된 방법 중 사용된 TACIs 아고니스트는 TACIs 활성의 하나 이상의 유형을 향상시키거나 또는 활성화시킬 수 있고, 이는 상기에서 기술된 것 같은 분석 중에서 임의로 측정될 수 있다. BR3 아고니스트 분자가 TACIs 또는BR3 각각 또는 TACIs 및 BR3 모두의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 충분히 향상, 자극 또는 활성화시키는지 측정하기 위해서, 예를 들어, TALL-1 또는 BR3 활성에 대한 아고니스트 분자의 영향(들)을 평가하기 위한 분석이 수행될 수 있다. 이같은 분석은 공지의 시험관내 또는 생체내 분석 형태로, 예를 들어, PBLs 또는 BR3-형질전환된 세포를 사용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, TACIs 아고니스트 또는 BR3 아고니스트는 TACIs 또는 BR3 수용체에 대해 천연 리간드(들)에 의해 달성되는 정도로 TACIs 또는 BR3 각각을 자극시키거나 또는 활성화시킬 수 있다.
"항체"란 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 예를 들어, BR3, TACIs, TALL-1, APRIL, TACI 또는 BCMA에 대한 단일 모노클로날 항체, 폴리에피토프 특이성을 가진 항체 조성물, 단쇄 항체, 및 항체의 단편을 포함한다. 본원에서 사용된 "항체"란 용어는 완전 면역글로블린 또는 항체 분자, 폴리클로날 항체, 다중특이성 항체 (즉, 둘 이상의 완전 항체로부터 형성된 이중특이성 항체) 및 면역글로블린 단편 (예를 들어, Fab, F(ab')2 또는 Fv)이 본원에서 기술된 임의의 목적한 아고니스트 또는 길항제 성질을 나타내기만 한다면, 이들을 포함한다.
항체는 일반적으로 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 천연 항체는 통상 이종사량체 당단백질로, 두 개의 동일한 경쇄 (L)와 두 개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된다. 일반적으로 각각의 경쇄는 한개의 공유결합 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되는데, 이황화 결합의 수는 상이한 면역글로블린 아이소타입 (isotype)의 중쇄마다 다르다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄에는 규칙적으로 이격된 사슬 내 이황화 가교가 있다. 각각의 중쇄에는 한쪽 끝에 가변도메인 (VH)이 있고, 그 뒤에 다수의 불변 도메인이 존재한다. 각각의 경쇄에는 한쪽 끝에 가변 도메인 (VL)이 있고, 다른 쪽 끝에 한 개의 불변 도메인이 있다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 첫번째 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄의 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이에 경계면을 형성하는 것으로 생각된다 [Chothia et al., J. Mol. Biol., 186: 651-663 (1985); Novotny and Harber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-4596 (1985)]. 임의의 척추동물 종 유래의 항체의 경쇄는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초해, 두 종류의 명백하게 상이한 유형, 이른바 카파 (κ) 및 람다 ( λ)중 하나로 지정될 수 있다. 이들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로블린은 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 다섯 가지 클래스의 면역글로블린이 존재한다: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이며 이들 중 다수는 서브클래스 (아이소타입), 예를 들어, IgG-1, IgG-2, IgG-3 및 IgG-4; IgA-1 및 IgA-2로 추가적으로 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로블린에 해당하는 중쇄의 불변 도메인은 각각 알파 (α), 델타 (δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 및 뮤 (μ)로 지칭된다.
"항체 단편"은 완전한 항체의 일부, 일반적으로는 완전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab. Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 이중항체, 단쇄 항체 분자 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함한다.
"가변"이란 용어는 본원 중에서 항체들 사이에서 서열이 상이하고, 그 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용되는 가변 도메인의 특정 부분을 기술하기 위해 사용되었다. 그러나, 가변성이란 일반적으로 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균일하게 분포되는 것이 아니다. 이는 일반적으로, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 중의 상보성 결정 영역 (CDRs) 또는 초가변 영역이라 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인에서 보다 고도로 보존된 부분은 골격 (FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 각각의 가변 도메인은 4개의 FR 영역을 포함하고, 대부분 연결 루프를 형성하는 3개의 CDRs로 연결된 β-시트 배열을 채택하고, 어떤 경우는 부분적으로 β-시트 구조를 형성한다. 각각의 도메인 중의 CDRs은 FR 영역에 의해 다른 사슬의 CDRs과 매우 근접한 위치에 고정되고, 항체의 항원 결합 부의 형성에 기여한다 [Kabat, E.A., et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987), 참조]. 불변 도메인은 항체의 항원에 대한 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 항체-의존적 세포 독성 중 항체의 참여와 같은 다양한 작용 기능을 나타낸다.
"모노클로날 항체"란 용어는 본원에서 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻은 항체, 즉, 집단을 포함하는 개별 항체들은 미세한 양으로 존재하는 자연 발생적인 가능한 돌연변이를 제외하고는 동일하다는 것을 나타내기 위해 사용되었다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위에 대한 것이다. 아울러, 일반적으로 다양한 결정인자 (에피토프들)에 대한 상이한 항체들을 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대한 것이다.
본원의 모노클로날 항체는 이들이 목적한 생물학적 활성 또는 성질을 나타내기만 한다면 공급원의 종이나 면역글로블린 클래스나 서브클래스 종류와는 관계없이, 원하는 항체의 가변 (초가변 영역 포함) 도메인을 불변 도메인과 접합하여 (예를 들어, "인간화" 항체), 또는 경쇄를 중쇄와 접합하거나 또는 한 종의 사슬을 다른 종의 사슬과 접합하거나, 또는 이종 단백질과 융합하여 생성된 도메인 키메라, 하이브리드 및 재조합 항체와 아울러 항체 단편 (예를 들어, Fab, F(ab')2및 Fv)를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 및 문헌 [Mage et al., inMonoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.79-97 (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987] 참조.
따라서, 수식어 "모노클로날"이란 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내며, 어떤 특정한 방법에 의해 항체의 제조를 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법으로 제조될 수 있거나, 또는 미국 특허 제4,816,567호에 기술된 것과 같은 재조합 DNA 방법으로 제조될 수 있다. 또한, "모노클로날 항체"는 예를 들어, 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기술된 기술을 사용하여 제조된 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
비인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로블린으로부터 유래된 최소한의 서열을 포함하는, 특이적 키메라 면역글로블린, 면역글로블린 사슬, 또는 이들의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2또는 기타 항체의 항원-결합 하부서열)이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용체의 상보성 결정 영역 (CDR) 유래의 잔기가 목적한 특이성, 친화도 및 능력을 보유한 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종 (공여자 항체) CDR 유래의 잔기로 치환된 인간 면역글로블린이다 (수용자 항체). 어떤 경우, 인간 면역글로블린의 Fv 골격 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비인간 잔기로 치환된다. 아울러, 인간화 항체는 수용체 항체 또는 도입된 CDR 또는 골격 서열 중에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 다듬고 최적화하기 위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 비인간 면역글로블린의 CDR 영역에 해당하고, FR 영역은 인간 면역글로블린 보존 서열의 FR 영역인, 하나 이상, 그리고 일반적으로는 두개의 가변 도메인의 실질적으로 대부분을 포함할 것이다. 또한, 인간화 항체는 면역글로블린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 최소한 일부,일반적으로는 인간 면역글로블린의 일부를 포함할 것이다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열 및(또는) 당업계에 공지된 또는 본원에서 기술된 임의의 인간 항체 제조 기술을 사용하여 제조된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 하나 이상의 인간 중쇄 폴리펩티드 또는 하나 이상의 인간 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체, 예를 들어, 래트 경쇄 및 인간 중쇄를 포함하는 항체를 포함한다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 한 실시태양에서, 인간 항체는 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 선택된다 [Vaughan et al.,Nature Biotechnology, 14: 309-314 (1996): Sheets et al.,PNAS, (USA) 95:6157-6162 (1998); Hoogenboom and Winter,J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. 또한, 인간 항체는 인간 면역글로블린 유전자좌를 트랜스제닉 동물, 예를 들어, 내인성 면역글로블린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스 중으로 도입하여 제조될 수 있다. 면역화시키면, 인간 항체 생산이 관측되고, 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 레퍼토리를 포함하는 모든 점에서 인간에서 관측되는 현상과 매우 유사하다. 이 접근법은 예를 들어, 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호 및 하기 과학 문헌 중에 기술되어 있다: [Marts et al.,Bio/Technology, 10:779-783 (1992); Lonberg et al.,Nature, 368:856-859 (1994); Morrison,Nature, 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14:845-51 (1996); Neuberger,Nature Biotechnology, 14:826 (1996); Lonberg and Huszar,Intern. Rev, Immunol., 13:65-93 (1995)]. 별법으로, 인간 항체는 표적 항원에 대한 항체를 생산하는 인간 B 림프구의 불사멸화에 의해 제조될 수 있다 (이같은 B 림프구는 개별적으로 회수되거나 또는 시험관 내에서 면역화될 수 있다). 예를 들어, 문헌 [Colet et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al.,J. Immunol., 147 (1):86-95 (1991); 및 미국 특허제5,750,373호] 참조.
"Fc 영역"이란 용어는 완전한 항체의 파파인 (papain) 분해로 생성될 수 있는 면역글로블린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로블린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 변화될 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 약 Cys226번 위치의 아미노산 잔기로부터, 또는 약 Pro230번 위치로부터 Fc 영역의 카르복시 말단의 범위로 정의된다 (본원에서는 문헌 [Kabat et al.,supra]에 따른 넘버링 체계를 따름). 면역글로블린의 Fc 영역은 일반적으로 두개의 불변 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 임의로, CH4 도메인을 포함한다.
"Fc 영역 사슬"이란 본원에서 Fc 영역의 두개의 폴리펩티드 사슬 중 하나를 의미한다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인" ("Cγ2" 도메인으로도 지칭됨)은 일반적으로 약 231번 위치의 아미노산 잔기로부터 약 340번 위치의 아미노산 잔기의 범위이다. CH2 도메인은 다른 도메인과 밀접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 독특하다. 그보다는, 두개의 N-연결된 분지쇄 탄수화물 사슬이 완전한 천연 IgG 분자의 두개의 CH2 도메인 사이에 삽입된다. 탄수화물은 도메인-도메인 접합을 치환할 수 있으며, CH2 도메인을 안정화시키는 것을 돕는 것으로 추측되어 왔다. [Burton,Molec. Immunol., 22:161-206 (1985)]. 본원에서 CH2 도메인은 천연 서열 CH2 도메인 또는 변이체 CH2 도메인일 수 있다.
"CH3 도메인"은 C-말단 잔기로부터 Fc 영역 중의 CH2 도메인까지 범위를 포함한다 (즉, IgG의 약 341번 위치의 아미노산 잔기로부터 약 447번 위치의 아미노산 잔기). 본원에서 CH3 영역은 천연 서열 CH3 도메인 또는 변이체 CH3 도메인일 수 있다 (예를 들어, 이들의 사슬 중 하나에 도입된 "융기"와 다른 사슬 중에 상응하는 도입된 "공동"을 갖는 CH3 도메인; 미국 특허 제5,821,33호 참조). 이같은 변이체 CH3 도메인은 본원에서 기술된 것과 같은 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체를 제조하는 데 사용될 수 있다.
"힌지 (hinge) 영역"이란 일반적으로 인간 IgG1의 약 Glu216 또는 약 Cys226으로부터 약 Pro230 범위로 정의된다 (Burton, Molec.Immunol. 22:161-206 (1985)). 다른 IgG 아이소타입의 힌지 영역은 동일한 위치에서 중쇄 사이에 S-S 결합을 형성하는 첫번째 및 마지막 시스테인 잔기를 배열하여 IgG1 서열과 정렬될 수 있다. 본원에서 힌지 영역은 천연 서열 힌지 영역 또는 변이체 힌지 영역일 수 있다. 변이체 힌지 영역의 두개의 폴리펩티드 사슬은 일반적으로 폴리펩티드 사슬 당 하나 이상의 시스테인 잔기를 보유하여, 변이체 힌지 영역의 두개의 폴리펩티드 사슬이 두개의 사슬 사이에 이황화 결합을 형성할 수 있다. 본원에서 바람직한 힌지 영역은 천연 서열 인간 힌지 영역, 예를 들어, 천연 서열 인간 IgG1 힌지 영역이다.
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 하나 이상의 "작용체 기능"을 보유한다. 예시적인 "작용체 기능들"은 C1q 결합; 보체 의존적 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포 매개 독성 (DCC); 식균 작용, 세포 표면 수용체의 하강 조절 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR) 등이다. 이같은 작용체 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 결합될 것을 요구하고, 이같은 항체 작용체 기능을 평가하기 위해 당업계에 공지된 다양한 분석법을 사용하여 평가될 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연계에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 하나 이상의 아미노산 변이로 인해 천연 서열 Fc 영역의 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 비교해서 또는 양친 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교해서 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, 천연 서열 Fc 영역 또는 양친 폴리펩티드의 Fc 영역 중에 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 가진다. 본원에서 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및(또는) 양친 폴리펩티드의 Fc 영역과 바람직하게는 약 80 % 이상의 서열 동일성을 가지며, 보다 바람직하게는 이들과 약 90 % 이상의 서열 동일성을 가지며, 가장 바람직하게는 이들과 약 95 % 이상의 서열 동일성을 갖는다.
"항체-의존적 세포-매개 독성" 및 "ADCC"란 Fc 수용체 (FcRs)을 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 천연 살생 (NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인지하고, 이어서 표적 세포의 용균을 일으키는 세포-매개 반응을 지칭한다. ADCC을 매개하는 일차적인 세포는 FcΥRIII 만을 발현하는 NK 세포인데, 단핵구는 이에 반해 FcΥRI, FcΥRII 및 FcΥRIIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet,Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)]의 464 페이지의 표 3에 정리되어 있다. 해당 분자의 ADCC의 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기술된 것과 같은 시험관내 ADCC 분석이 수행될 수 있다. 이같은 분석을 위해 유용한 작용체 세포는 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 및 천연 살생 (NK) 세포를 포함한다. 별법으로, 또는 추가적으로, 해당 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어, 문헌 [Clynes et al., PNAS (USA), 95:652-656 (1998)]에 기술된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
"인간 작용체 세포"는 하나 이상의 FcRs을 발현하고, 작용체 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포는 하나 이상의 FcΥRIIII을 발현하고, ADCC 작용체 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC), 천연 살생 (NK) 세포, 단핵 세포, 세포독성 T 세포 및 호중구이고, PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 작용체 세포는 이들의 천연 공급원으로부터, 예를 들어, 본원에서 기술된 것과 같이 혈액 또는 PBMCs로부터 단리될 수 있다.
"Fc 수용체" 및 "FcR"이란 용어는 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 서열 사람 FcR이다. 아울러, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합하는 것 (감마 수용체)으로, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를 포함하고, 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 달리 스플라이스된 형태를 포함한다. FcγRIII 수용체는 주로 이들의 세포질 도메인에서 상이한, 유사한 아미노산 서열을 가진 FcγRIIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIIB ("억제 수용체")를 포함한다. 활성화 수용체 FcγRIIIA는 그 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재 활성화 모티브 (ITAM)을 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIIB는 그 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재 억제 모티브 (ITIM)을 함유한다. (Daeeron,Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997) 중에서 조사됨). FcRs은 문헌 [Ravetch and Kinet,Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capet et al.,Immunomethod, 4:25-34 (1994); and de Hass et al.,J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995)] 중에서 조사되었다. 앞으로 확인될 것들을 포함하여 다른 FcRs은 본원 중 "FcR"이란 용어로 포괄된다. 또한, 이 용어는 모체의 IgGs를 태아로 이동시키는 데 관여하는 신생아 수용체, FcRn을 포함한다 (Guyer et al.,J. Immunol., 117:587 (1976); and Kim et al.,J. Immunol., 24: 249 (1994)).
"보체 의존적 세포독성" 및 "CDC"란 보체 존재 하에서 표적의 용균을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 보체계의 첫번째 성분 (C1q)가 동족 항원과 복합체를 이룬 분자 (예를 들어, 항체)에 결합하여 저해된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al.,J. Immunol. Methods, 292:163 (1996)] 중에 기술된 것과 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다.
"친화도 성숙된" 항체란 이들의 CDR 중 하나 이상이 항원에 대한 항체의 친화도의 향상을 일으키는 변형을 가져, 이들 변형(들)을 갖지 않은 양친 항체에 비해 친화도가 향상된 것이다. 바람직한 친화도 성숙된 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 피코몰 수준의 친화도를 가진다. 친화도 성숙된 항체는 당업계에 공지된 방법으로 제조된다. 문헌 [Marks et al.,Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]은 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙을 기술하고 있다. CDR 및(또는) 골격 잔기의 무작위 돌연변이화는 문헌 [Barbas et al.,Proc. Nat. Acad. Sci,USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al.,Gene, 169:147-155 (1995); Yelton et al.,J. Immunol., 155:1994-2004 (1995); Jackson et al.,J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995); and Hawkins et al.,J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)]에 의해 기술되고 있다.
"면역특이적"이란 용어, 예를 들어, "면역특이적 항체 결합"에서 사용된 것과 같은 상기 용어는 항체의 항원-결합 부위와 이 항체의 의해 인지되는 특이적 항원 사이에 일어나는 항원 특이적 결합 작용을 지칭한다.
"단리된"이란 용어는 본원에서 기술된 다양한 단백질을 기술하기 위해 사용되었을 때 동정되고 분리되고(또는) 그 자연 환경의 성분으로부터 회수된 단백질을 의미한다. 그들이 존재하는 자연환경에서 유래한 오염성분은 단백질의 진단적 또는 치료적 사용을 방해는 물질로, 효소, 호르몬 및 기타 단백성 또는 비단백성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 단백질은 (1) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 획득하기에 충분한 정도로, 또는 (2) 코마시 블루 (Coomassie blue) 또는 바람직하게는, 실버 스테인 (silver stain)을 사용하여 비환원 또는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 균일한 정도로 정제될 것이다. 단리된 단백질은 재조합 세포 중의 세포내 단백질을 포함하는데, 이는 단백질의 천연 환경에서 하나 이상의 성분이 존재하지 않기 때문이다. 그러나, 통상적으로는 단리된 단백질은 하나 이상의 정제 단계로 제조될 것이다.
"처치" 또는 "치료"란 치료적 처치 및 보호적 또는 예방적 처치를 지칭한다.
치료 또는 처치 목적의 "포유류"란 포유류로 분류된 임의의 동물을 지칭하고, 인간, 가축 및 사육 동물, 동물원 동물, 스포츠 동물, 또는 애완 동물, 예를 들어, 개, 말, 고양이, 소 등을 포함한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다.
"TALL-1-관련된 병적 상태" 및 "APRIL-관련된 병적 상태"은 각각 TALL-1 또는 APRIL 발현 또는 활성의 비정상적 수준, 정상적인 건강한 포유동물 중의 발현 또는 활성 수준보다 과량이거나, 또는 부족한 수준과 관련된 병태 또는 증상을 지칭하는 것으로, 여기서 이같은 과량의 또는 감소된 수준은 전체적으로, 국부적으로 또는 특정 조직 또는 특정 세포 유형 또는 신체 내의 특정 위치에서 일어난다. TALL-1-관련 병적 상태 및 APRIL-관련 병적 상태는 급성 또는 만성 면역 관련 질환 및 암을 포함한다.
"암", "암성" 및 "악성"이란 용어는 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장에 특징이 있는 포유류 중의 병적 상태를 지칭하거나 기술한다. 암의 예는 샘암종, 림프종, 모세포종, 흑색종, 육종 및 백혈병을 포함하는 암종을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이같은 암의 보다 구체적인 예는 편평세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 위장관암, 호지킨스 (Hodgkin's) 및 비호지킨스 림프종, 췌장암, 아교모세포종, 자궁암, 난소암, 간 암종 및 간암과 같은 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 직장결장암, 자궁내막암, 골수종 (예를 들어, 다발골수종), 침샘암종, 신장 세포 암종 및 윌름 (Wilms') 종양과 같은 신장암, 기저세포 암종, 흑색종, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 고환암, 식도암 및 다양한 유형의 머리 및 목암을 포함한다. 임의로, 암은 TALL-1, APRIL, TACI, TACIs, BR3 또는 BCMA를 발현하거나, 암세포가 이들과 연관되어 있다. 예로서, 결장, 폐 및 흑색종 암은 APRIL을 발현하는 것으로 문헌 중에 보고되고 있다. 본원에서 치료되기 바람직한 암은 림프종, 백혈병 및 골수종 및 이들의 아형, 예를 들어, 버킷스 (Burkitt's) 림프종, 다발 골수종, 급성 림프모구 또는 림프구 백혈병, 비호지킨스 및 호지킨스 림프종 및 급성 골수종 백혈병을 포함한다.
"면역 관련 질환"이란 용어는 포유류의 면역계의 한 성분이 포유류 중의 병적 상태를 일으키거나, 이를 매개하거나 또는 달리 이에 기여하는 것을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 개입이 질환 진행에 개선적인 영향을 갖는 질환을 포함한다. 이 용어 중에 포함되는 것은, 자가면역 질환, 면역 매개 염증성 질환, 비면역 매개 염증성 질환, 감염성 질환 및 면역결핍 질환이다. 면역 관련 및 염증성 질환의 예로, 이들 중 일부는 면역 또는 T 세포 매개된 것으로 본원발명에 따라 치료될 수 있는 것은 전신성 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 척추관절병증, 전신피부 경화증 (피부경화증), 특발 염증성 근육병증 (피부근육염, 다발근육염), 죠그렌 (Sjogren) 증후군, 전신성 혈관염, 사르코이드증, 자가면역 용혈 빈혈 (면역 범혈구감소증, 발작야간 혈색뇨증), 자가면역 저혈소판증 (특발혈소판감소자색반병, 면역 매개 저혈소판증), 갑상샘염 (그래브스 (Grave's) 질환, 하시모토스 (Hashimoto's) 갑상샘염, 소아 림프구 갑상샘염, 위축 갑상샘염), 당뇨, 면역-매개 신장 질환 (사구체신염, 요세관사이질 콩팥염), 중추 및 말초 신경계의 말이집탈락병, 예를 들어, 다발경화증, 특발 말이집탈락 다발신경병증 또는 굴라인-바레 (Guillain-Barree) 증후군, 및 만성 염증성 말이집탈락 다발성신경병증, 간답즙 질환, 예를 들어, 감염성 간염 (감염 A, B, C, D, E 및 기타 비간친화 바이러스), 자가면역 만성 활성 간염, 및 경화쓸개간염, 염증성 및 섬유성 폐 질환, 예를 들어, 염증성 장 질환 (궤양결장염: 크론스 (Crohn's) 질환), 글루텐 민감성 창자병증 및 위플레스 (Whipple's) 질환, 수포성 피부 질환, 다형 홍반 및 접촉 피부염을 포함하는 자가면역 또는 면역-매개 피부 질환, 건선, 알러지성 질환, 예를 들어, 천식, 알러지성 비염, 아토피 피부염, 음식 과민성 및 두드러기, 폐의 면역성 질환, 예를 들어, 호산구성 폐렴, 특발 폐 섬유증 및 과민성 폐렴, 이식 거부 및 이식 대 숙주병을 포함하는 이식 관련 질환을 포함한다. 감염성 질환은 AIDS (HIV 감염), 간염 A, B, C, D 및 E, 세균성 감염, 진균성 감염, 원생동물 감염 및 기생충 감염을 포함한다.
"자가 면역 질환"이란 그 또는 그녀 자신의 조직 구성에 대한 개별 포유동물의 호르몬성 또는 세포성 면역 반응으로 정상적 또는 건강한 조직의 파괴가 일어나는 포유동물 중의 질환 또는 증상을 지칭하기 위해 본원에서 가장 넓은 일반적인 의미로 사용된다. 그 예는 홍반성 루푸스, 갑상샘증, 류마티스성 관절염, 건선, 다발성 경화증, 자가면역 당뇨병 및 염증성 장 질환 (IBD)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된 "전구약물"이란 용어는 그 양친형 약물에 비해 암 세포에 대한 독성이 덜하고, 보다 활성인 양친형으로 효소적으로 활성화되거나 전환될 수 있는 제약적으로 활성인 물질의 전구체 또는 유도체를 지칭한다. 문헌 [Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biocehmical Society Transactions, 14, pp>375-382, 615th Meeting Belfast (1986) and Stella et al., "Prodtrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.) pp. 247-267, Humana Press (1985)]을 참조. 본 발명의 전구약물은 보다 활성인 세포독성 자유 약물로 전환될 수 있는 인산염 함유 전구약물, 티오인산염 함유 전구약물, 황산염 함유 전구약물, 펩티드 함유 전구약물, D-아미노산 변형 전구약물, 당화된 전구약물, 베타-락탐 함유 전구약물, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드 함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 기타 5-플루오로우리딘 전구약물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서 사용되기 위한 전구약물 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예는 하기에서 기술되는 화학치료제제들을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
"세포 독성제"란 용어는 본원에서 세포의 기능을 억제 또는 방해하고(또는) 세포 파괴를 일으키는 물질을 지칭하기 위해 사용된다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32및 Lu의 방사성 동위원소), 화학치료제, 및 소분자 독소 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 원점의 효소적으로 활성인 독소 (이들의 단편 및(또는) 변이체를 포함)를 포함하도록 의도되었다.
"화학치료제"란 암과 같은 증상의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료제의 예는 알킬화제, 예를 들어, 티오테파 및 시클로스포스파미드(CYTOXAN™); 알킬 술포네이트, 예를 들어, 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들어, 벤조도파, 카르보콘, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민 (알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파로라미드 및 트리메틸로로멜라민을 포함); 아세토제닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 캄토테신 (합성 동족체 토코테칸을 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 동족체를 포함); 크립토피신 (특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르미신 (합성 동족체, KW-2189 및 CBI-TMI를 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르타민, 메클로르타민 옥사이드 히드록클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 질소성 우레아, 예를 들어, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테머스틴, 로머스틴, 니머스틴, 라니머스틴; 항생제, 예를 들어, 에네딘 항생제 (예를 들어,칼리케아미신, 특히, 칼리케아미신 γ1 I및 칼리케아미신 θI 1, 예를 들어, 문헌 [Agnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994)] 참조; 디네미신 (디네미신 A를 포함); 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 발색단백질 에네딘 항생제 발색단). 아클라시노미신, 액티노바이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 캑티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 댁티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루류신, 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신 , 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 디옥소독소루비신을 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마셀로마이신, 마이토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 겔라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 동족체, 예를 들어, 데노테린, 메토트렉세이트, 테로테린, 트리메트렉세이트; 푸린 동족체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-멀캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 동족체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모러프, 시타라빈, 디독시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리진, 5-FU; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로보스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신, 예를 들어, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어, 프로린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 디포파민; 디메콜신; 디아지콘; 엘포르니틴; 엘립티눔 아세테이트; 에포틸론; 에토글리시드; 갈리움 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스파틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK; 라토탄; 리토신; 시조피란; ㅅ스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지콘; 2,2'2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄;빈데신; 다카르바진; 만노머스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포르파미드; 티오테파, 타소이드, 예를 들어, 파실타셀 (TAXOL, 뉴저지주 프린스톤 소재 브리스톨-마이어스 스퀴브 종양학) 및 도세타셀 (TAXOTERE, 프랑스 앤토니 소재 론-뿔랑 로레); 클로르암부실; 제미타빈; 6-티오구아닌; 멀캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 동족체, 예를 들어, 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 마이토마이신 C; 마이토산트론; 빈크리스틴; 비노레빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노테린; 젤로다; 이반드로네이트; CTP-11; 위성이성질화효소 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로르니틴 (DMFO); 레티노산; 카페시타빈; 및 임의의 상기 화합물들의 제약적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한, 이 정의에 포함되는 것은 항-에스트로겐과 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하도록 작용하는 항-호르몬 제제로, 예를 들어, 타모시펜, 랄로시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타모시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (파레스톤); 및 항-안드로겐, 예를 들어, 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 루프롤리드 및 고세레린; 및 임의의 상기 화합물들의 제약적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
"성장 억제제"란 본원에서 사용되었을 때, 시험관내 또는 생체 내에서 세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성장 억제제는 S기에 이같은 유전자를 과발현하는 세포의 %를 상당히 감소시키는 것이다. 성장 억제제의 예는 세포 사이클 진행 (S기 이외의 단계에서)을 차단하는 물질로, 예를 들어, G1 중단 및 M-단계 중단을 유도하는 약물을 포함한다. 전통적인 M-단계 차단제는 빈카스 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔, 및 위상이성질화효소 II 억제제, 예를 들어, 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 중단시키는 약물은 S-단계 중단도 유도하는데, 예를 들어, 타모시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C와 같은 DNA 알킬화제이다. 추가적인 정보는 문헌 [The Molecualr Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, 표제 "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), 특히, p.13] 중에서 찾을 수 있다.
"사이토카인"이란 용어는 다른 세포에 대해 세포간 매개체로 작용하는 한 세포 집단에서 방출되는 단백질에 대한 일반 명칭이다. 이같은 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인, 및 통상적인 폴리펩티드 호르몬이다. 사이토카인 중에 포함되는 것은 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상샘; 티로신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예를 들어, 난포 자극 호르몬 (FSH); 갑상샘 자극 호르몬 (TSH); 및 황체형성 호르몬; 간 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α및 -β; 뮬러-억제 물질; 마우스 성선 자극 호르몬-관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 맥관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자 (TGF), 예를 들어, TGF-α및 TGF-β; 인슐린 성장 인자-I 및 II; 에리트로포이에틴 (EPO); 뼈유도 인자; 인터페론, 예를 들어, 인터페론-α, -β 및 -γ; 결장 자극 인자 (CFSs) 예를 들어, 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (ILs) 예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; 및 기타 LIF 및 키트 리간드 (KL)을 포함하는 폴리펩티드 인자이다. 본원에서 사용된 것과 같이, 사이토카인이란 용어는 천연 공급원 유래 또는 재조합 세포 배양액 유래의 단백질 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적으로 활성인 등가물을 포함한다.
II. 방법 및 재료
본 발명은 본원에서 TACIs 및 BR3로 지칭되는 새로 동정되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 구체적으로, 출원인은 하기 실시예에서 보다 상세히 개시되는 TACIs 폴리펩티드를 코딩하고, BR3 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 동정하고 단리하였다.
A. TACIs 및 BR3 폴리펩티드의 변이체
본원에서 기술된 전장 TACIs 폴리펩티드 및 BR3 폴리펩티드와 아울러, 각각의 폴리펩티드 변이체가 제조될 수 있도록 고안된다. 폴리펩티드 변이체는 TACIs- 또는 BR3-폴리펩티드 코딩 DNA 중에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하거나, 또는 목적한 TACIs 또는 BR3 폴리펩티드를 합성하여 제조될 수 있다. 당업자들은 아미노산 변화가 폴리펩티드의 번역후 과정을 변화시킬 수 있다는 것, 예를 들어, 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키거나 또는 막 고정 특성을 변화시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
천연 전장 서열 폴리펩티드 또는 본원에서 기술된 폴리펩티드의 다양한 도메인 중의 변이체는 예를 들어, 미국 특허 제5,364,934호에 기술된 보존적 및 비보존적 돌연변이에 대한 임의의 기술 및 가이드라인을 사용하여 제조될 수 있다. 변이는 천연 서열 폴리펩티드와 비교하여 TACIs 또는 BR3 폴리펩티드 아미노산 서열에 변화를 가져오는 TACIs 또는 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 변이는 TACIs 또는 BR3 폴리펩티드의 하나 이상의 도메인 중에서 하나 이상의 아미노산이 임의의 다른 아미노산으로 치환되는 것이다.
목적한 활성에 불리한 영향을 미치지 않으면서 어떤 아미노산 잔기가 삽입, 치환 또는 결실될지 결정하는 지침은 폴리펩티드의 서열을 공지의 동종 단백질 분자의 서열과 비교하고, 높은 상동성 영역 중에서 아미노산 서열의 변화를 최소화하여 찾을 수 있다. 아미노산 치환은 한개의 아미노산을 유사한 구조 및(또는) 화학적 성질을 가진 아미노산으로 치환, 예를 들어, 류신을 세린으로 치환, 즉, 보존적인 아미노산 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 1 내지 5개의 아미노산 범위에서 임의적일 수 있다. 허용된 변이는 서열 중의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 만들고, 생성된 변이체의 활성을 시험하여 결정될 수 있다.
변이체는 올리고뉴클레오티드-매개된 (위치-지정된) 돌연변이, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이화와 같은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다 위치-지정된 돌연변이화 [Carter et al.,Nucl. Acids Res.,13:4331 (1986); Zoller et al.,Nucl. Acids Res.,10:6487 (1987)], 카세트 돌연변이화 [Wells etal.,Gene, Res.,10:6487 (1987)], 제한 선택 돌연변이화 [Wells et al.,Philos. Trans. R. Soc. London SerA,317:415 (1986)] 또는 기타 공지된 기술을 클로닝된 DNA에서 수행하여 TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드-코딩 변이체 DNA를 제조할 수 있다.
또한, 스캐닝 아미노산 분석은 연속한 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 아미노산은 비교적 작고, 중성인 아미노산이다. 이같은 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 이 군에서 알라닌이 일반적으로 바람직한 스캐닝 아미노산인데, 이는 베타-사슬을 넘는 측쇄를 제거하고, 변이체의 주요 사슬 배열을 변형시킬 가능성이 보다 적기 때문이다. 또한, 알라닌이 일반적으로 바람직한데, 이는 알라닌이 가장 흔한 아미노산이기 때문이다. 아울러, 알라닌은 흔히 묻혀진 위치 및 노출된 위치 양쪽에서 발견된다 [Creighton,The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia,J. Mol. Biol.,150:1 (1976)]. 알라닌 치환이 적절한 양의 변이체를 생산하지 못한다면, 등전자의 아미노산이 사용될 수 있다.
B. TACIs 또는 BR3 폴리펩티드의 변형
TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드의 공유결합 변형이 본 발명의 범위 내에 포함된다. N-말단 메티오닌 잔기는 본원 중에 기술된 폴리펩티드 상에 존재하거나 또는 부재할 수 있다. 한 유형의 공유결합 변형은 TACIs 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 TACIs 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키는 것을 포함한다. BR3 폴리펩티드는 선택된 측쇄를 갖는 표적 아미노산 잔기 또는 그 N- 또는 C-말단 잔기에서 유사하게 변형될 수 있다.
이관능기화제에 의한 유도체화는 예를 들어, 항-TACIs 폴리펩티드 항체를 정제하기 위한 방법에서 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 TACIs 폴리펩티드를 가교결합시키는 데 유용하거나, 그 반대일 수 있다. 또한, 이같은 이관능기화제는 항-BR3 폴리펩티드 항체를 정제하기 위한 방법에서 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 BR3 폴리펩티드를 가교결합시키는 데 유용하거나, 그 반대일 수 있다. 통상 사용되는 가교결합제는 예를 들어, 1,1,-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어, 4-아미도살리실산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스-(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동종이관능기 이미도에스테르, 이관능기 말레이미드, 예를 들어, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 약물을 포함한다.
기타 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 상응하는 글루타밀 및 아스파틸로의 디아디드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세린 또는 트레오닌 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], N-말단 아민의 아세틸화 및 임의의 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
본 발명의 범위 내에 포함되는 TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드의 다른 유형의 공유결합 변형은 두 폴리펩티드 중 하나의 천연 글리코실화 패턴을 변화시키는 것을 포함한다. "천연 글리코실화 패턴의 변화"는 본원 중에서 천연 서열 TACIs 폴리펩티드 중에 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기를 결실시키고, 천연 서열 BR3 폴리펩티드 중에 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기를 결실시키고, 천연 서열 TACIs 폴리펩티드 중에는 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 첨가하고(또는) 천연 서열 BR3 폴리펩티드 중에는 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 첨가하는 것을 의미하도록 의도된다.
TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드로의 글리코실화 위치의 첨가는 이들의 아미노산 서열을 변화시킴으로써 수행될 수 있다. 변화는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 천연 서열 TACIs 폴리펩티드 중으로 첨가하거나, 이들 잔기로 치환하거나, 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 천연 서열 TACIs 폴리펩티드 중으로 첨가하거나, 이들 잔기로 치환하여 만들어질 수 있다 (O-연결 글리코실화 자리에 대해). TACIs 폴리펩티드 아미노산 서열은 DNA 수준에서의 변화를 통해, 특히 사전선택된 염기에서 TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 돌연변이시켜 목적한 아미노산으로 번역되는 코돈이 생성되도록하여 임의로 변화될 수 있다. 유사하게, BR3 폴리펩티드 아미노산 서열은 DNA 수준에서의 변화를 통해, 특히 사전선택된 염기에서 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 돌연변이시켜 목적한 아미노산으로 번역되는 코돈이 생성되도록하여 임의로 변화될 수 있다.
TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 다른 방법은 글리코시드의 폴리펩티드로의 화학적 또는 효소적 커플링이다. 이같은 방법은 당업계에 기술되어 있는데, 예를 들어, WO 제87/05330호 (1987. 9. 11 공개) 및 문헌 [Aplin and Wriston,CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]이다.
TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드 상에 존재하는 탄수화물 잔기의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 또는 글리코실화의 표적으로 작용하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이적 치환으로 수행될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업게에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Hakimuddin, et al.,Arch. Biochem. Biophys.,259:52 (1987) and Edge et al.,Anal. Biochem.,118:131 (1981)]에 기술되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄화수소의 효소적 절단은 문헌 [Thotakura et al.,Meth. Enzymol.,138:350 (1987)]에 기술되어 있는 것과 같은 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다아제를 사용하여 달성될 수 있다.
TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드의 다른 유형의 공유결합 변형은 폴리펩티드를 다양한 비단백성 폴리머, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 기술된 방식으로 결합시키는 것을 포함한다.
C. TACIs 및 BR3 폴리펩티드의 제조
하기의 기술은 주로 TACIs 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드를 TACIs 폴리펩티드 코딩 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양하여 제조하는 것에 관한 것이다. 당업계에 공지된 별도의 방법이 TACIs 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용될 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, TACIs 폴리펩티드 서열, 또는 이들의 일부는 고상 기술을 사용하여 직접적인 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다 [예를 들어, Stewart et al.,Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield,J. Am. Chem. Soc.,85:2149-2154 (1963) 참조]. 시험관내 단백질 합성은 수동적 기술을 사용하거나 또는 자동화로 수행될 수 있다. 자동 합성은 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템즈 펩티드 신터사이져 (Applied Biosystems Peptide Synthesizer) (캘리포니아 포스터 시티 소재)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행될 수 있다. TACIs 폴리펩티드의 다양한 부분이 개별적으로 화학 합성되고, 전장 TACIs 폴리펩티드를 제조하기 위해 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 결합될 수 있다.
또한, 하기 기술은 BR3 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드를 BR3 폴리펩티드 코딩 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양하여 제조하는 것에 관한 것이다. 당업계에 공지된 별도의 방법이 BR3 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용될 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, BR3 폴리펩티드 서열, 또는 이들의 일부는 고상 기술을 사용하여 직접적인 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. BR3 폴리펩티드의 다양한 부분이 개별적으로 화학 합성되고, 전장 BR3 폴리펩티드를 제조하기 위해 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 결합될 수 있다.
1. TACIs 또는 BR3 폴리펩티드 코딩 DNA의 단리
TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 TACIs 폴리펩티드 mRNA을 보유하고, 이를 탐지될 수 있는 수준으로 발현하는 것으로 생각되는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 따라서, 인간 TACIs 폴리펩티드 코딩 DNA는 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 용이하게 얻을 수 있다. 또한, TACIs 폴리펩티드 코딩 유전자는 게놈 라이브러리로부터, 또는 올리고뉴클레오티드 합성으로 얻을 수 있다.
유사하게, BR3 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 BR3 폴리펩티드 mRNA을 보유하고, 이를 탐지될 수 있는 수준으로 발현하는 것으로 생각되는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 따라서, 인간 BR3 폴리펩티드 코딩 DNA는 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 용이하게 얻을 수 있다. 또한, BR3 폴리펩티드 코딩 유전자는 게놈 라이브러리로부터, 또는 올리고뉴클레오티드 합성으로 얻을 수 있다.
라이브러리는 목적 유전자 또는 이들에 의해 코딩되는 단백질을 확인하도록 고안된 프로브 (예를 들어, TACIs 폴리펩티드에 대한 항체, BR3 폴리펩티드에 대한 항체 또는 약 20-80 염기 이상의 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 스크린될 수 있다. 선택된 프로브를 사용한 cDAN 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 표준 방법, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기술된 것과 같이 수행될 수 있다. TACIs 폴리펩티드 코딩 유전자 또는 BR3 폴리펩티드 코딩 유전자를 단리하기 위한 별도의 방법은 PCR 방법을 사용하는 것이다 [Sambrook et al.,supra; Dieffenbach et al.,PCR Primer: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 기술에서, 프로브로 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 충분한 길이를 가져야 하고, 거짓 양성반응이 최소화되도록 충분히 확실해야 한다. 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 스크리닝되는 라이브러리 중 DNA로의 혼성화시 탐지될 수 있도록 라벨링된다. 라벨링 방법은 당업계에 공지되어 있고, 방사능32P-라벨링된 ATP, 바이오틴화 또는 효소 라벨링의 사용을 포함한다. 중간 엄격성 및 고 엄격성 포함하는 혼성화 조건은 문헌 [Sambrook et al.,supra]에서 찾을 수 있고, 상기와 같이 정의된다. 임의로, 혼성화 조건은 22면, 6-20행에 정의된 것같이 고 엄격성이다.
이같은 라이브러리 스크리닝 방법 중에서 동정된 서열은 기탁되고, 공중의 데이타베이스, 예를 들어, 진뱅크(GenBank) 또는 기타 민간 서열 데이타베이스에서 얻을 수 있는 기타 공지의 서열과 비교되고 정렬될 수 있다. 분자의 한정된 영역 내 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준)이 상기에서 언급된 것과 같은 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하고, 임의로 본원에서 제공되는 ALIGN-2 프로그램을 사용하여 서열 정렬을 통해 측정될 수 있다.
단백질 코딩 서열을 포함하는 핵산은 본원에서 최초로 개시된 중첩된 아미노산 서열을 사용하고, 또한, 필요하다면, 전구체를 탐지하기 위한 문헌 [Sambrooket al.,supra]에 기술된 것과 같은 통상의 프라이머 연장 방법을 사용하여 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하고, 또한, cDNA로 역전사되지 않은 중간체 mRNA를 가공하여 얻을 수 있다.
2. 숙주 세포의 선택 및 형질전환
숙주 세포는 TACIs 폴리펩티드 생산을 위해 본원에서 기술된 것과 같은 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환된다. 별법으로, 숙주 세포는 BR3 폴리펩티드 생산을 위해 본원에서 기술된 것과 같은 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환된다. 숙주 세포는 프로모터를 유도하고, 형질전환체를 선별하거나, 또는 목적한 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키도록 적절하게 개질된 통상의 영양 배지 중에서 배양된다. 배지, 온도, pH 등과와 같은 배양 조건은 과도한 실험을 요하지 않고, 당업자에 의해 선택될 수 있다. 일반적으로, 세포 배양의 생산성을 최적화시키기 위한 원리, 프로토콜 및 실제적인 기술은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) and Sambrook et al., supra]에서 찾아볼 수 있다. 형질감염 방법은 당업자에게 공지된 것으로, 예를 들어, CaPO4및 전기천공법(electroporation)이다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이같은 세포에 적절한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 문헌 [Sambrook et al.,supra]에 기술된 것과 같은 염화칼륨을 사용한 칼슘 처리 또는 전기천공이 일반적으로 원핵세포 또는 실질적인 세포벽 경계를 함유한 다른세포를 위해 사용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염이 문헌 [Shaw et al.,Gene,23:315 (1983)] 및 WO 제89/05859호에 기술된 것과 같이 특정 식물 세포의 형질전환을 위해 사용된다. 이같은 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, 문헌 [Graham and vander Eb,Virology,52:456-457 (1978)]의 인산칼륨 방법이 사용될 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질전환체의 일반적인 면은 미국 특허 제4,399,216호에 기술되어 있다. 효모 중으로의 형질전환은 일반적으로 문헌 [Van Solingen et al.,J. Bact.,130:946 (1977) and Hsiao et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. (USA),76:3829 (1979)]의 방법에 따라 수행된다. 그러나, DNA를 세포 중으로 도입하는 다른 방법, 예를 들어, 핵 미세주입, 전기천공, 완전한 세포와 세포 원형질체의 융합, 또는 다가양이온, 예를 들어, 폴리브렌, 폴리오리틴이 또한 사용될 수 있다. 포유동물 세포를 위한 다양한 기술은 문헌 [Keown et al.,Methods in Enzymology,185:527-537 (1990) and Mansour et al.,Nature,336:348-352 (1988)]을 참조하면 된다.
본원의 벡터 중에서 DNA를 클로닝 또는 발현하기 위해 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 또는 고등 진핵 세포를 포함한다. 적합한 원핵생물은 진정세균, 예를 들어, 그람 음성 또는 그람 양성 생물체, 예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli)와 같은 장내세균을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주를 공개적으로 구입할 수 있는데, 예를 들어, 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446); 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537); 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325)및 K5 772 (ATCC 53,635)이다.
원핵생물과 아울러, 사상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 벡터 또는 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 위해 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 통상적으로 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다.
글리코실화된 TACIs 폴리펩티드 또는 글리코실화된 BR3 폴리펩티드의 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 다세포 생물체로부터 유래한다. 무척추 세포의 예는 드로소필라 (Drosophila) S2 및 스포도테라 (Spodoptera) Sf9와 같은 곤충 세포와 아울러 식물 세포를 포함한다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 및 COS 세포를 포함한다. 보다 구체적인 예는 SV40로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 또는 현탁 배약 중 성장을 위한 293 세포 서브클로닝, Graham et al.,J. Gem Virol.,36:59 (1977); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin,Proc. Natl., Acad. Sci. USA,77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather,Biol. Reprod.,23:243-251 (1980)); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 및 마우스 유선 암종 (MMT 060562, ATCC CCL51)을 포함한다. 적절한 숙주 세포의 선택은 당업계 기술 범위 내인 것으로 여겨진다.
3. 복제가능한 벡터의 선택 및 사용
목적한 TACIs 폴리펩티드를 코딩하거나 또는 목적한 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)가 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터 중으로 삽입될 수 있다. 다양한 벡터를 공개적으로 구입할 수 있다. 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지 형태일 수 있다. 적절한 핵산 서열은 다양한 방법으로 벡터 중으로 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 적절한 제한 내부핵산효소 위치(들) 중으로 도입된다. 벡터 성분은 일반적으로 하나 이상의 시그날 서열, 복제 원점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 인자, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 하나 이상의 이들 성분을 포함하는 적합한 벡터의 제조는 당업자들에게 공지된 표준 라이게이션 (ligation) 기술을 사용한다.
목적한 TACIs 폴리펩티드 또는 목적한 BR3 폴리펩티드는 직접적으로 뿐만 아니라, 시그날 서열이거나 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 위치를 갖는 기타 폴리펩티드인 이종 폴리펩티드와의 융합 펩티드로서 재조합적으로 생산될 수 있다. 일반적으로, 시그날 서열은 벡터의 성분일 수 있고, 이는 벡터 중으로 삽입되는 TACIs 폴리펩티드 코딩 DNA의 일부일 수 있거나, 또는 이는 벡터 중으로 삽입되는 BR3 폴리펩티드 코딩 DNA의 일부일 수 있다. 시그날 서열은 예를 들어, 알칼라인 포스파타아제, 페니실린, lpp 또는 기타 열-안정성 내독소 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵 시그날 서열일 수 있다. 효모 분비의 경우, 시그날 서열은 예를 들어, 효모 인버타제 리더, 알파 인자 리더 (사카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) α-인자 리더, 미국 특허 제5,010,182호에 기술된 리더를 포함) 또는 산 포스파타제 리더, 시. 알비칸스 (C.albicans) 글루코아밀라제 리더 (EP 제362,179호, 1990. 4. 4 공개), 또는 WO 제90/13646호에 기술된 시그날 (1990. 11. 15 공개)일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 시그날 서열은 단백질의 분비를 지시하기 위해 사용될 수 있고, 예를 들어, 동일하거나 또는 관련된 종의 분비된 폴리펩티드 유래의 시그날 서열과 아울러 바이러스성 분비성 리더이다.
발현 및 클로닝 벡터는 모두 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포 중에서 복제될 수 있도록 하는 핵산 서열을 함유한다. 이같은 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322 유래의 복제 원점이 대부분의 그람 음성 세균에서 적합하고, 2 미크론 플라스미드 원점이 효모에서 적합하고, 다양한 바이러스 원점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)가 포유동물 세포 중에서 벡터를 클로닝하기 위해 유용하다.
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 선별 유전자 (선별 마커로도 불림)을 함유한다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어, 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 단백질, (b) 영양요구 결핍을 보완하는 단백질, 또는 (c) 복합 배지로부터 얻을 수 없는 중요 영양소를 공급하는 단백질 (예를 들어, 바실러스 (Bacillus)을 위해 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자)을 코딩한다.
포유동물을 위해 적합한 선별 마커의 예는 TACIs 폴리펩티드 코딩 핵산 또는 BR3 폴리펩티드 코딩 핵산을 흡수할 수 있는 세포의 동정을 가능하게 하는 것으로, 예를 들어, DHFR 또는 타이미딘 키나아제이다. 야생형 DHFR이 사용되었을 때, 적절한 숙주 세포는 문헌 [Urlaub et al.,Proc. Natal. Acad. Sci. USA,77:4216 (1980)]에 기술된 것과 같이 제조되고 증식되는 DHFR 활성이 결핍된 CHO 세포주이다. 효모에서 사용하기에 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7 중에 존재하는 trp1 유전자이다 [Stinchcomb et al.,Nature,282:39 (1979); Kingsman et al.,Gene,7:141 (1979); Tschemper et al.,Gene,10:157 (1980)]. trp1 유전자는 트립토판 중에서 성장할 수 있는 능력이 결여된 효모의 돌연변이 세포주, 예를 들어, ATCC No.44076 또는 PEP4-1 [Jones,Genetics,85:12 (1977)]에 대한 선별 마커를 제공한다.
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 TACIs 폴리펩티드-코딩 핵산 서열 또는 BR3 폴리펩티드-코딩 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 이 프로모터는 mRNA 합성을 지시한다. 다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인지되는 프로모터가 공지되어 있다. 원핵 숙주에서 사용하기에 적합한 프로모터는 베타-락타마제 및 락토오즈 프로모터 시스템 [Chang et al.,Nature,275:615 (1978); Goeddel et al.,Nature,281:544 (1979)], 알칼라인 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 [Goeddel,Nucleic Acids Res.,8:4057 (1980); EP 제36,776호] 및 tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터 [deBoer et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,80:21-25 (1983)]을 포함한다. 또한, 세균 시스템 중에서 사용하기 위한 프로모터는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.
효모 숙주에서 사용하기 위해 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나아제 [Hitzeman et al.,J. Biol. Chem.,255:2073 (1980)] 또는 기타 당분해 효소 [Hess et al.,J. Adv. Enzyme Reg.,7:149 (1968); Holland,Biocehmistry,17:4900 (1978)], 예를 들어, 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 헥소키나아제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포 프럭토키나제, 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코즈 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
성장 환경에 의해 전사가 조절되는 추가적인 장점이 있는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 디히드로게나제 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인,글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 및 말토즈 및 갈락토즈 이용에 관여하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에서 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 추가적으로 EP 제73,657호에 기술되어 있다.
포유동물 숙주 세포 중 TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드 전사는 조절되는데, 이들 프로모터가 숙주 세포계에 적합성이 있기만 하다면, 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스 (fowlpox virus) (UK 제2,211,504호, 1989. 7. 5 공개),아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로 바이러스, 레트로 바이러스, 간염-B 바이러스 및 유인원 바이러스 40 (SV 40)와 같은 바이러스 게놈 유래의 프로모터, 이종 포유동물 프로모터 (예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로블린 프로모터) 유래의 프로모터및 열-쇼크 프로모터 유래의 프로모터에 의해 조절된다.
TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 또는 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 고등 진핵생물에 의한 전사는 벡터 중으로 인핸서 서열을 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 DNA의 시스-작용 요소로, 일반적으로 약 10 내지 300 bp이고, 프로모터에 작용하여 전사를 증가시킨다. 포유동물 유전자 유래 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질, 및 인슐린)의 다수의 인핸서 서열이 공지되어 있다. 그러나, 일반적으로 진핵 세포 바이러스 유래의 인핸서를 사용할 수 있다. 그 예는 복제 원점의 후기 측면 상의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로 바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 원점 후기 측면 상의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 인핸서는 TACIs 폴리펩티드 코딩 서열에 대해 5' 또는 3' 위치에서 벡터 중으로 접합되어 들어갈 수 있지만, 프로모터의 5' 위치에 존재하는 것이 바람직하다. 유사하게, 인핸서는 BR3 폴리펩티드 코딩 서열에 대해 5' 또는 3' 위치에서 벡터 중으로 접합되어 들어갈 수 있지만, 프로모터의 5' 위치에 존재하는 것이 바람직하다.
진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 기타 다세포 생물체 유래의 핵을 가진 세포) 중에서 발현 벡터는 또한 mRNA의 전사를 종결시키고 안정화시키기 위해 필요한 서열을 포함할 것이다. 이같은 서열은 통상적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 종종 3' 비번역 영역으로부터 얻어진다. 이들 영역은 TACIs 폴리펩티드의 mRNA 또는 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분 중의 폴리아데닐화된 단편으로 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다.
재조합 척추 세포 배양약 중에서 TACIs 폴리펩티드 및(또는) BR3 폴리펩티드 합성에 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌 [Gething et al., Nature, 293:620-625 (1982); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 제117,060호 및 EP 제117,058호]에 기술되어 있다.
4. 유전자 증폭/발현의 탐지
유전자 증폭 및(또는) 발현은 본원에서 제공되는 서열 기재의 적절히 라벨링된 프로브를 사용하여 예를 들어, 통상의 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량화하기 위한 노던 블롯팅 [Thomas,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)], 도트 블롯팅 (DNA 분석) 또는 세포내 혼성화로 직접적으로 샘플 중에서 측정될 수 있다. 별법으로, DNA 이중 나선, RNA 이중 나선 및 DNA-RNA 혼성 이중 나선 또는 DNA-단백질 이중나선을 포함하는 특정 이중 나선을 인지할 수 있는 항체가 사용될 수 있다. 이어서, 항체는 라벨링될 수 있고, 이중 나선을 표면에 부착시켜 표면에 이중 나선이 형성되었을 때, 이중나선에 결합된 항체의 존재를 탐지할 수 있도록 분석을 수행할 수 있다.
별법으로, 유전자 발현은 유전자 생성물의 발현을 직접적으로 정량화하기 위한 면역학적 방법, 예를 들어, 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학적 염색 및 세포 배양액 또는 체액의 분석으로 측정될 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 샘플액의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 중 하나일 수 있고,임의의 포유동물 중에서 제조될 수 있다. 적절하게는, 천연 서열 TACIs 폴리펩티드, 천연 서열 BR3 폴리펩티드, 본원에서 제공되는 DNA 서열 기재 합성 펩티드, TACIs 폴리펩티드 코딩 DNA에 융합되고 특이적 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열, 또는 BR3 폴리펩티드 코딩 DNA에 융합되고 특이적 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대해 항체가 제조될 수 있다.
5. 폴리펩티드 정제
TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드 형태는 배양 배지 또는 숙주 세포 용균액으로부터 회수될 수 있다. 막 결합된 형태라면, 이들은 적합한 계면활성제 용액을 사용하거나 (예를 들어, Triton-X 100) 또는 효소적 절단에 의해 막으로부터 분리될 수 있다. TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드 발현 중에 사용되는 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 방법으로, 예를 들어, 동결-해동 사이클링, 초음파 분해, 기계적 파괴, 또는 세포 용균제에 의해 파괴될 수 있다.
재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드를 정제하는 것이 바람직할 것이다. 하기 방법은 적합한 정제 방법의 예이다: 이온 교환 칼럼 상에서 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어, DEAE) 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄염 침전; 겔 여과 (예를 들어, Sephadex G-75를 사용함); IgG와 같은 오염물을 제거하기 위한 단백질 A 세파로즈 칼럼; 및 TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드의 에피토프-태그된 형태에 결합하기 위한 금속 킬레이팅 칼럼. 단백질 정제의 다양한 방법이 사용될 수 있고, 이같은 방법은 당업계에 공지되어 있고, 문헌 [Deutscher,Methods in Enzymology,182(1990); Scopes,Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기술되어 있다. 선택된 정제 단계(들)은 예를 들어, 사용된 생산 방법의 성질 및 생산되는 특정 TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드에 따라 달라질 것이다.
6. TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드의 용도
TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (또는 이들의 상보서열) 및 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 또는 이들의 상보서열은 혼성화 프로브서의 사용, 염색체 및 유전자 맵핑 및 안티센스 RNA 및 DNA의 제조를 포함하여, 분자 생물학 분야에서 다양하게 응용될 수 있다. 또한, TACIs 폴리펩티드 코딩 핵산은 본원에서 기술된 재조합 기술을 사용하여 TACIs 폴리펩티드를 제조하는 데 유용할 것이다. 유사하게, BR3 폴리펩티드 코딩 핵산은 본원에서 기술된 재조합 기술을 사용하여 BR3 폴리펩티드를 제조하는 데 유용할 것이다.
TACIs 폴리펩티드 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 이들의 임의의 변형된 형태 또한 트랜스제닉 동물, 또는 "녹아웃" 동물을 제조하는 데 유용하게 사용될 수 있고, 이들 동물은 치료적으로 유용한 약물의 개발 및 스크리닝에 유용하다.
트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스 또는 래트)은 태아기, 예를 들어, 배아단계에서 동물 또는 동물의 조상 중에 도입된 트랜스유전자를 함유하는 세포를 가진 동물이다. 트랜스유전자는 그 세포로부터 트랜스제닉 동물이 발달해 나가는 세포의 게놈 중에 도입되는 DNA이다. 한 실시태양에서, TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA가 확립된 기술에 따라 TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝하기 위해 사용될 수 있고, 게놈 서열은 TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 발현하는 세포를 함유한 트랜스제닉 동물을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시태양에서, BR3 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA가 확립된 기술에 따라 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝하기 위해 사용될 수 있고, 게놈 서열은 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 발현하는 세포를 함유한 트랜스제닉 동물을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
트랜스제닉 동물, 특히 마우스 또는 랫트와 같은 동물을 생성하기 위한 방법이 당업계에 일반화되었고, 예를 들어 미국 특허 제4,736,866호 및 제4,870,009호에 기재되어 있다. 일반적으로, 조직 특이적 인핸서와 함께 TACIs 폴리펩티드 및(또는) BR3 폴리펩티드 트랜스진 합일화는 특정 세포를 표적으로 할 것이다. 배아 단계에서 동물의 배 혈통에 도입된 TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스진 카피를 포함하는 트랜스제닉 동물을 사용하여, TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 증가된 발현의 효과를 조사할 수 있다. 별법으로, 배아 단계에서 동물의 배 혈통에 도입된 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스진 카피를 포함하는 트랜스제닉 동물을 사용하여, BR3 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 증가된 발현의 효과를 조사할 수 있다. 상기 동물들을, 예를 들어, 이의 과다발현과 관련된 병리적 상태로부터의 보호를 부여하는 것으로 생각되는 시약에 대한 시험 동물로 사용할 수 있다. 본 발명의 이러한 면에 따라, 동물을 시약으로 처리하고, 트랜스진을 함유하는 비처리 동물과비교시, 병적 상태의 감소된 발현은 병적 상태에 대한 잠재적인 치료학적 개입을 지시할 것이다.
별법으로, TACIs 폴리펩티드의 비인간 동종체를 사용하여, TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 유전자와 동물의 배아 세포에 도입된 TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 변경된 게놈 DNA 사이의 동종 재조합의 결과로서 TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 결손 또는 변경 유전자를 갖는 TACIs 폴리펩티드 "녹아웃(knock-out)" 동물을 구축할 수 있다. 예를 들면, TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 사용하여, 확립된 기법에 따라 TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA의 일부를 결실시키거나, 또는 예를 들어, 통합을 모니터링하는데 사용될 수 있는 선택가능한 마커를 코딩하는 유전자와 같은 또 다른 유전자로 대체할 수 있다.
유사하게, BR3 폴리펩티드의 비인간 동종체를 사용하여, BR3 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 유전자와 동물의 배아 세포에 도입된 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 변경된 게놈 DNA 사이의 동종 재조합의 결과로서 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 결손 또는 변경 유전자를 갖는 TACIs 폴리펩티드 "녹아웃" 동물을 구축할 수 있다. 예를 들면, BR3 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 사용하여, 확립된 기법에 따라 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. BR3 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA의 일부를 결실시키거나, 또는 예를 들어, 통합을 모니터링하는데 사용될 수 있는 선택가능한 마커를 코딩하는 유전자와 같은 또 다른 유전자로 대체할 수 있다.
일반적으로, "녹아웃 동물"의 구축시, (5' 및 3' 말단 모두에) 수 킬로베이스의 변경되지 않은 플랭킹 DNA가 벡터에 포함된다(예를 들어, 동종 재조합 벡터의기재에 대해 Thomas and Capecchi,Cell,51:503 (1987) 참조). 벡터가 (예를 들어, 전기천공법(electroporation)에 의해) 배아 줄기 세포 혈통에 도입되고, 도입된 DNA가 내인성 DNA와 동종 재조합된 세포가 선택된다(예를 들어, Li 등,Cell,69:915 (1992) 참조). 이어서, 선택된 세포가 동물(예, 마우스 또는 랫트)의 주머니배에 주사되어, 응집 키메라를 형성한다(예를 들어, Bradley, inTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), 113-152면 참조). 이어서, 키메릭 배아는 적당한 거짓임신 암컷 양(foster) 동물에 착상되고, 배아는 "녹아웃" 동물을 생성할 수 있게 된다. 그의 배아 세포에 동종 재조합된 DNA를 보유하는 프로제니를 일반 기법에 의해 동정하여, 동물의 모든 세포가 동종 재조합된 DNA를 함유하는 동물을 번식시키는데 사용할 수 있다. 녹아웃 동물은, 예를 들어, 어떤 병적 상태에 대한 방어력, 및 TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드의 부재에 기인한 병적 상태의 전개를 특징으로 한다.
TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드는 종종 유전자 요법으로 불리는 상기 폴리펩티드의 생체내 발현에 의해 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
(임의로 벡터에 함유된) 핵산을 환자의 세포에 도입하는 방법은 생체내 및 생체외 2 가지가 있다. 생체내 전달의 경우, 보통 폴리펩티드가 요구되는 부위에서 핵산을 환자에 직접 주사한다. 예를 들면, TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은, 공지된 경우 TACIs 폴리펩티드의 합성 부위에서 주사되거나, 또는 TACIs 폴리펩티드의 생물학적 활성이 요구되는 부위에서 주사될 것이다. 예를 들면, BR3 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은, 공지된 경우 BR3 폴리펩티드의 합성 부위에서 주사되거나, 또는 BR3 폴리펩티드의 생물학적 활성이 요구되는 부위에서 주사될 것이다. 생체외 처리의 경우, 환자의 세포를 회수하고, 핵산을 이 단리된 세포에 도입하고, 변경된 세포를 직접 환자에게 투여하거나, 또는 예를 들어, 환자에게 삽입되는 다공성 막 내로 캡슐화한다(예를 들어, 미국 특허 제4,892,538호 및 제5,283,187호 참조).
핵산을 생세포에 도입하기 위해 이용가능한 다양한 기법이 있다. 상기 기법은 핵산이 시험관내 배양된 세포 내로 형질감염되는가, 또는 목적하는 숙주 세포에 생체내 형질감염되는가에 따라 달라진다. 핵산의 포유류 세포로의 시험관내 전달에 적당한 기법은 리포솜, 전기천공법, 마이크로인젝션, 형질도입, 세포융합, DEAE-덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전법 등의 사용을 포함한다. 형질도입은 복제-결손, 재조합 바이러스(바람직하게는, 레트로바이러스) 입자를 세포 수용체와 결합한 다음, 입자에 의해 함유된 핵산을 세포로 도입하는 것을 포함한다. 유전자의 생체외 전달에 통상 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.
현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기법은 바이러스 또는 비바이러스 벡터(예, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 단순 헤르페스 I 바이러스 또는 아데노-결합 바이러스(AAV)) 및 지질 기재 시스템(유전자의 지질-매개 전달에 유용한 지질은, 예를 들어, DOTMA, DOPE 및 DC-Chol이다; 예, Tonkinson 등,Cancer Investigation,14(1):54-65 (1996) 참조)을 사용한 형질감염을 포함한다. 유전자 요법에 사용하기에 가장 바람직한 벡터는 바이러스이고, 가장 바람직하게는 아데노바이러스, AAV, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스이다. 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터는 하나 이상의 전사 프로모터/인핸서 또는 유전자자리-규정 요소(들), 또는 교대 스플라이싱, 핵 RNA 엑스포트 또는 전령물질의 번역후 변경과 같은 다른 수단에 의해 유전자 발현을 조절하는 기타 요소들을 포함한다. 또한, 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터는, TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 또는 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 존재 하에서 전사될 때 거기에 작동가능하게 연결되어 번역 개시 서열로서 작용하는 핵산 분자를 포함한다. 상기 백터 구조체는 또한 꾸리기 신호, 긴 말단 반복서열(LTRs) 또는 이의 부분, 및 (바이러스 벡터에 미리 존재하지 않을 경우) 사용된 바이러스에 적당한 양성 및 음성 가닥 프라이머 결합 부위를 포함한다. 또한, 상기 벡터는 일반적으로 TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드를 이것이 위치해 있는 숙주 세포로부터 분리하기 위한 신호 서열을 포함한다. 바람직하게는, 이을 위한 신호 서열은 포유류 신호 서열, 가장 바람직하게는 TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드의 선천 신호 서열이다. 임의로, 벡터 구조체는 폴리아데닐화를 지시하는 신호, 및 하나 이상의 제한 부위 및 번역 종결 서열을 포함할 수도 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 일반적으로 5' LTR, tRNA 결합 부위, 꾸리기 신호, 제2 가닥 DNA 합성 기원, 및 3' LTR 또는 이의 부분을 포함할 것이다. 양이온 지질, 폴리라이신 및 덴드라이머와 같이, 바이러스가 아닌 기타 벡터를 사용할 수 있다.
어떤 경우에, 핵산원에 표적 세포를 목표로 하는 물질, 예를 들면, 세포-표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등을 제공하는 것이 바람직하다. 리포솜이 사용될 경우, 세포내이입과 결합된 세포-표면 막 단백질에 결합하는 단백질, 예를 들면, 특정 세포형 지향 캡시드 단백질 또는 이의 단편, 순환시 내재화되는 단백질의 항체, 및 세포내 위치화를 목표로 하고 세포내 반감기를 증진하는 단백질이 표적화 및(또는) 흡수를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 수용체-매개 세포내이입 기법이, 예를 들어, 문헌[Wu 등,J. Biol. Chem.,262:4429-4432 (1987); 및 Wagner 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87:3410-3414 (1990)]에 기재되어 있다. 현재 공지된 유전자 표지 및 유전자 요법 프로토콜 검토를 위해, 문헌[Anderson 등,Science,256:808-813 (1992)]을 참조한다. 또한, WO 93/25673 및 거기에 인용된 참고문헌을 참조한다. 적당한 유전자 요법, 및 레트로바이러스 입자 및 구조 단백질의 제조 방법이, 예를 들어, 미국 특허 제5,681,746호에서 발견될 수 있다.
본 발명은 추가로, 세포를 TALL-1 또는 APRIL의 TACI, BCMA, TACIs 또는 BR3와의 상호작용에 영향을 미치는 길항제 또는 아고니스트 요구량에 노출시키는 것을 포함하는, 포유류 세포에서 TALL-1, APRIL, TACI, BCMA, TACIs 및(또는) BR3 활성을 조절하기 위한 방법을 제공한다. 바람직하게는, 사용되는 길항제 또는 아고니스트의 양은 치료 효과를 달성하기 위한 각 리간드 또는 각 수용체의 결합 및(또는) 활성에 영향을 미치는데 유효한 양일 것이다. 이것은, 예를 들면, 하기 및 실시예에 기재된 방법에 따라 생체내 또는 생체외로 달성될 수 있다. 상기 TALL-1길항제 또는 APRIL 길항제로 치료되는 질환 또는 장애의 예는 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 건선 및 낭창, 또는 포유류에서 B 세포 반응이 비정상적으로 상승조절된 암과 같은 기타 병리학적 질환을 비롯한, 임상적으로 자가면역 질환으로 지칭되는 질환을 포함한다. TACIs 아고니스트 또는 BR3 아고니스트로 치료되는 질환 또는 장애의 예는 면역결핍 및 암을 포함한다.
진단 방법도 본원에서 제공된다. 예를 들면, 길항제 또는 아고니스트를 사용하여, TALL-1 관련 병적 상태 또는 APRIL 관련 병적 상태를 갖는 것으로 공지되거나 의심되는 포유류에서 각 리간드(TALL-1 또는 APRIL) 또는 수용체(TACIs 또는 BR3)를 검출할 수 있다. 예를 들어, 면역분석에 길항제 또는 아고니스트 분자를 사용하여, 샘플 중의 TALL-1 또는 APRIL을 검출 또는 정량화할 수 있다. 포유류로부터 얻은 세포와 같은 샘플을 라벨링된 길항제 또는 아고니스트 분자의 존재 하에서 배양할 수 있고, 샘플 중에서 결합된 상기 라벨링된 길항제 또는 아고니스트를 검출할 수 있다. 다양한 임상 분석 방법을 비롯한 상기 분석이, 예를 들면, 문헌[Voller 등,Immunoassays, University Park, 1981]에 기재된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다.
상기 방법에 사용될 수 있는 길항제 및 아고니스트는 TACIs 및 BR3 수용체의 가용 형태, TACIs 수용체 면역어드헤신 및 BR3 수용체 면역어드헤신, TACIs 또는 BR3를 포함하는 융합 단백질, TACIs 또는 BR3의 공유적 변형 형태, TACIs 수용체 변이체 및 BR3 수용체 변이체, TACIs 또는 BR3 수용체 항체, 및 TALL-1 또는 APRIL 항체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 길항제 및 아고니스트를 제조하는데 사용될 수 있는 다양한 기법이 본원에 기술된다. 예를 들면, TACIs 및 BR3 폴리펩티드의 제조 방법 및 기법이 상술되었다. 하기에서, 상기 폴리펩티드, 및 TACIs 및 BR3에 대한 항체의 추가의 변형이 기술된다.
TACIs 수용체 또는 BR3 수용체의 가용 형태는 본 발명의 방법에 길항제로서 사용될 수 있다. 상기 TACIs 또는 BR3의 가용 형태는 각 수용체의 세포외 도메인을 포함 또는 이로 구성(및 각 수용체의 막통과 및 세포내 도메인은 결손)될 수 있다. TACIs 또는 BR3의 세포외 도메인 서열 자체는 길항제로 사용될 수 있거나, 또는 하기에 기술되는 바와 같이 (예를 들어, 면역글로불린, 에피토프 태그 또는 류신 지퍼에 융합됨으로써) 더 변경될 수 있다. 당업자는 과도한 실험 없이, TACIs 또는 BR3의 목적하는 세포외 도메인 서열을 선택하여 길항제로 사용할 수 있을 것이다.
면역어드헤신 분자도 본 발명의 방법의 사용에 고려된다. TACIs 수용체 면역어드헤신은 TACIs의 다양한 형태, 예를 들면, 전장 폴리펩티드, 및 세포외 도메인(ECD) 서열 또는 ECD 서열의 단편을 포함하는 수용체의 가용 형태를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 상기 분자는 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 영역과 TACIs 수용체의 융합을 포함할 수 있다. 면역어드헤신의 이가(bivalent) 형태를 위해, 상기 융합은 IgG 분자의 Fc 영역에 대한 것일 수 있다. Ig 융합은 바람직하게는, Ig 분자 내 하나 이상의 가변 영역 대신 수용체 폴리펩티드의 가용(막통과 도메인의 결실 또는 불활성화) 형태의 치환을 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 면역글로불린 융합은 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1,CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 면역글로불린 융합의 제조를 위해, 문헌[미국 특허 제5,428,130호(1995. 6. 27.자 특허) 및 Chamow 등,TIBTECH,14:52-60 (1996)]을 참조한다.
가장 단순하고 가장 용이한 면역어드헤신 설계는 어드헤신의 결합 도메인(예, 수용체의 세포외 영역(ECD))을 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역과 결합하는 것이다. 보통, 본 발명의 면역어드헤신 제조시, 어드헤신의 결합 도메인을 코딩하는 핵산은 면역글로불린 불변 도메인 서열의 N-말단을 코딩하는 핵산에 C-말단에서 융합될 것이나, N-말단 융합도 가능하다.
일반적으로, 상기 융합에서, 코딩된 키메릭 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄의 불변 영역의 적어도 기능적으로 활성인 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 보유할 것이다. 융합은 또한 중쇄의 불변 도메인의 Fc 부분의 C-말단 또는 CH1쪽으로의 바로 N-말단, 또는 경쇄의 대응하는 영역에 대해 이루어진다. 융합이 이루어지는 정확한 부위는 중요하지 않다. 특정 부위는 널리 공지되어 있고, 면역어드헤신의 생물학적 활성, 분비 또는 결합 특성을 최적화하기 위해 선택될 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 어드헤신 서열이 면역글로불린 G1(IgG1)의 Fc 영역의 N-말단에 융합된다. 전체 중쇄 불변 영역을 어드헤신 서열에 융합시킬 수 있다. 그러나, 더 바람직하게는, IgG Fc를 화학적으로 규정하는 파파인 절단 부위의 바로 상류의 힌지 부위에서 시작하는 서열(즉, 중쇄 불변 영역의 제1 잔기를 114로 할 때, 잔기 216), 또는 다른 면역글로불린의 유사 부위가 융합에 사용된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 어드헤신 아미노산 서열이 IgG 중쇄의 (a) 힌지, CH2 및CH3, 또는 (b) CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인에 융합된다.
이중특이적 면역어드헤신의 경우, 면역어드헤신이 복합체, 특히 이종이합체 또는 이종사합체로 조합된다. 일반적으로, 조합된 면역글로불린은 공지된 유닛 구조를 가질 것이다. 기본 4쇄 구조 유닛은 IgG, IgD 및 IgE가 존재하는 형태이다. 보다 고 분자량 면역글로불린에서 4쇄 유닛이 반복된다. IgM은 일반적으로 디술파이드 결합에 의해 고정된 기본 4쇄의 5합체로 존재한다. IgA 글로불린, 및 종종 IgG 글로불린도 혈청에서 복합체 형태로 존재할 수도 있다. 복합체의 경우, 4개 유닛 각각은 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 범위 내의 다양한 조합 면역어드헤신의 예를 하기에 개략적으로 나타내었다:
(a) ACL-ACL;
(b) ACH-(ACH, ACL-ACH, ACL-VHCH또는 VLCL-ACH);
(c) ACL-ACH-(ACL-ACH, ACL-VHCH, VLCL-ACH또는 VLCL-VHCH);
(d) ACL-VHCH-(ACH, ACL-VHCH또는 VLCL-ACH);
(e) VLCL-ACH-(ACL-VHCH또는 VLCL-ACH); 및
(f) (A-Y)n-(VLCL-VHCH)2
(여기서, 각 A는 동일하거나 상이한 어드헤신 아미노산 서열을 나타내고;
VL은 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
VH는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이고;
CH는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인이고;
n은 1보다 큰 정수이고;
Y는 공유 교차 결합제의 잔기를 나타냄).
간결성 측면에서, 상기 구조는 단지 핵심을 나타낸 것이며, 면역글로불린의 결합(J) 또는 다른 도메인이나 디술파이드 결합은 나타내지 않았다. 그러나, 상기 도메인이 결합 활성에 요구되는 경우, 이들은, 이들이 면역글로불린 분자에서 차지하는 통상의 위치에 존재하도록 구성될 것이다.
별법으로, 어드헤신 서열을 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열 사이에 삽입하여, 키메릭 중쇄를 포함하는 면역글로불린을 얻을 수 있다. 이 실시태양에서, 어드헤신 서열이 힌지 및 CH2 도메인 사이, 또는 CH2 및 CH3 도메인 사이에서, 면역글로불린의 각 암에서 면역글로불린 중쇄의 3' 말단에 융합된다. 유사한 구조체가 문헌[Hoogenboom 등,Mol. Immunol.,28:1027-1037 (1991)]에 의해 보고되었다.
면역글로불린 경쇄의 존재가 본 발명의 면역어드헤신에 요구되는 것은 아니나, 면역글로불린 경쇄가 어드헤신-면역글로불린 중쇄 융합 폴리핍티드에 공유 결합되어 존재하거나, 또는 어드헤신에 직접 융합될 수 있다. 전자의 경우, 일반적으로 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA가 어드헤신-면역글로불린 중쇄 융합 단백질을 코딩하는 DNA와 공동발현된다. 분비시, 하이브리드 중쇄 및 경쇄가 공유 결합되어, 2개의 다이술파이드-연결된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 면역글로불린-유사 구조를 제공할 것이다. 상기 구조체의 제조에 적합한 방법이, 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호(1989. 3. 28.자 특허)에 개시되어 있다.
면역어드헤신은 어드헤신 부분을 인-프래임(in-frame)으로 코딩하는 cDNA 서열을 면역글로불린 cDNA 서열에 융합함으로써 가장 편리하게 구축된다. 그러나, 게놈 면역글로불린 단편에의 융합도 사용될 수 있다(예를 들어, Aruffo 등,Cell,61:1303-1313 (1990); 및 Stamenkovic 등,Cell,66:1133-1144 (1991) 참조). 후자의 융합은 발현을 위해 Ig 조절 서열의 존재를 필요로 한다. IgG 중쇄 불변 영역을 코딩하는 cDNA는 비장 또는 말초혈 림프구로부터 유래된 cDNA 라이브러리로부터 공개된 서열에 기초하여, 하이브리드화 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기법에 의해 단리될 수 있다. 면역어드헤신의 "어드헤신" 및 면역글로불린 부분을 코딩하는 cDNAs를 선택된 숙주 세포에서 효율적인 발현을 지시하는 플라스미드 벡터에 앞뒤로 삽입한다.
상기 가용 ECD 서열의 예는 도 5B에 나타낸 TACIs 서열의 아미노산 1 내지 119를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. TACIs 수용체 면역어드헤신은 당업계에 기재된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있다.
BR3 수용체 면역어드헤신도 유사하게 구성될 수 있다. BR3 면역어드헤신을 구성하는데 사용하기 위한 가용 ECD 서열의 예는 도 6B에 나타낸 BR3 서열의 아미노산 1 내지 77 또는 2 내지 62를 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, TACIs 또는 BR3 수용체는 미국 특허 제4,640,835호,제4,496,689호, 제4,301,144호, 제4,670,417호, 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 개시된 방식으로, 수용체 폴리펩티드를 다양한 비단백성 폴리머, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에 연결함으로써 공유적으로 변경될 수 있다. 상기 TACIs 또는 BR3 수용체의 페길화(pegylated) 형태는 당업계에 공지된 기법을 사용하여 제조할 수 있다.
상기 분자의 류신 지퍼 형태도 본 발명에서 고려된다. "류신 지퍼"는 그의 융합 파트너(예, 류신 지퍼가 융합되거나 연결된 서열 또는 분자)의 이합체화 또는 삼합체화를 증진, 촉진 또는 유도하는 류신 리치 서열을 지칭하기 위해 사용되는 전문 용어이다. 다양한 류신 지퍼 폴리펩티드가 당업계에서 기술되었다. 예를 들어, 문헌[Landschulz 등,Science,240:1759 (1988); 미국 특허 제5,716,805호; WO 94/10308; Hoppe 등,FEBS Letters,344:1991 (1994); Maniatis 등,Nature,341:24 (1989)]을 참조한다. 당업자는 류신 지퍼 서열이 TACIs 또는 BR3 수용체 분자의 5' 또는 3' 말단에서 융합될 수 있다는 것을 알 것이다.
본 발명의 TACIs 또는 BR3 폴리펩티드는 수용체 폴리펩티드를 또 다른 이종의 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합시킴으로써 키메릭 분자를 형성하는 방식으로 변경될 수도 있다. 바람직하게는, 상기 이종의 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 키메릭 분자를 올리고머화하는 것이다. 한 실시태양에서, 상기 키메릭 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 TACIs 또는 BR3 수용체 폴리펩티드의 융합을 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 수용체 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실-말단에 위치한다. 상기 수용체의 에피토프-태그 형태의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그의 제공으로 인해, 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 또 다른 유형의 친화 매트릭스를 사용하는 친화 정제에 의해 수용체를 쉽게 정제할 수 있다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들의 각 항체가 당업계에 널리 공지되어 있다. 예는 폴리-히스티딘(폴리-히스) 또는 폴리-히스티딘-글리신(폴리-히스-글리) 태그; 플루 HA 태그 폴리펩티드 및 이의 항체 12CA5(Field 등,Mol. Cell. Biol.,8:2159-2165 (1988)); c-myc 태그 및 이의 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체(Evan 등,Molecular and Cellular Biology,5:3610-3616 (1985)); 및 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그 및 이의 항체(Paborsky 등,Protein Engineering,3(6):547-553 (1990))를 포함한다. 다른 태그 폴리펩티드는 플래그-펩티드(Hopp 등,BioTechnology,6:1204-1210 (1988)); KT3 에피토프 펩티드(Martin 등,Science,255:192-194 (1992)); 알파-튜불린 에피토프 펩티드(Skinner 등,J. Biol. Chem.,266:15163-15166 (1991)); 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그(Lutz-Freyermuth 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87:6393-6397 (1990))를 포함한다.
항-TACIs 수용체 항체 또는 항-BR3 항체도 여기 개시된 방법에 사용될 수 있을 것으로 생각된다. 상기 분자의 예는 TALL-1 또는 ATRIL의 TACIs 또는 BR3 수용체에 대한 결합을 바람직하게 억제할 수 있는 중화 또는 차단 항체를 포함한다. 항-TACIs 항체 또는 항-BR3 항체는 모노클로날 항체일 수 있다.
모노클로날 항체는 문헌[Kohler and Milstein,Nature,256:495 (1975)]에기재된 것과 같은 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 다른 적당한 숙주 동물을 일반적으로 면역화제로 면역화하여, 면역화제에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도한다. 별법으로, 림프구를 시험관내 면역화할 수 있다.
면역화제는 일반적으로 TACIs 또는 BR3 폴리펩티드(또는 TACIs ECD 또는 BR3 ECD) 또는 이의 융합 단백질, 예를 들면, TACIs ECD-IgG 융합 단백질을 포함할 것이다. 별법으로, 면역화제는 TALL-1 또는 ATRIL의 TACIs 또는 BR3에 대한 결합에 관여하는 하나 이상의 아미노산을 갖는 TACIs 또는 BR3의 단편 또는 부분을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 면역화제는 IgG 서열에 융합된 TACIs 또는 BR3의 세포외 도메인 서열을 포함한다.
일반적으로, 인간 근원의 세포가 바람직한 경우 말초혈 림프구("PBLs")가 사용되거나, 비인간 포유류 원이 바람직한 경우 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서, 림프구를 폴리에티렌 글리콜과 같은 적당한 융합제를 사용하여 불사의 세포 혈통에 융합시켜, 하이브리도마 세포를 형성한다(Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, 59-103면). 불사의 세포 혈통은 보통 형질전환된 포유류 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 근원의 골수종 세포이다. 일반적으로, 랫트 또는 마우스 골수종 세포 혈통이 사용된다. 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 비융합된 불사의 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적당한 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들면, 모 세포가 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 전이효소(HGPRT 또는 HPRT)가 부족한 경우, 하이브리도마용 배지는 일반적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 저해하는 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘("HAT 배지")을 포함할 것이다.
바람직한 불사의 세포 혈통은 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생성 세포에 의한 항체의 안정한 고 수준의 발현을 지지하고, HAT 배지와 같은 배지에 감수성인 것들이다. 더 바람직한 불사의 세포 혈통은, 예를 들어, 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 샐크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center) 및 버지니아주 마나싸스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 얻을 수 있는 마우스 골수종 혈통이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포 혈통도 인간 모노클로날 항체의 생성에 기재되었다[Kozbor,J. Immunol.,133:3001 (1984); Brodeur 등,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987, 51-63면].
하이브리도마 세포가 배양된 배지를 TACIs 또는 BR3에 대한 모노클로날 항체의 존재에 대해 분석할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들면, 방사면역분석(RIA) 또는 효소-결합 면역흡수 분석(ELISA)에 의해 결정한다. 상기 기법 및 분석이 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도를, 예를 들어, 문헌[Munson and Pollard,Anal. Biochem.,107:220 (1980)]의 스케쳐드(Scatchard) 분석에 의해 결정할 수 있다.
목적하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 한계 희석법에 의해 클론을 서브클로닝하고, 일반적 방법에 의해 성장시킬 수 있다(Goding, 상기 문헌). 이 목적에 적당한 배지는, 예를 들면, 둘베코 조제 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 별법으로, 하이브리도마 세포를 포유동물에서 복수(ascites)로 생체내 성장시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체를 통상의 면역글로불린 정제 방법, 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화 크로마토그래피에 의해 배지 또는 복수액으로부터 단리 또는 정제할 수 있다.
미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 모노클로날 항체를 제조할 수도 있다. 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 방법을 사용하여(예, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 쉽게 단리되고, 서열화된다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로 기능한다. 단리된 DNA를 발현 벡터로 위치시킨 다음, 다른 방법으로는 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 얻는다. DNA는, 예를 들면, 동종 마우스 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인의 코딩 서열을 치환하거나(Morrison 등,Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 (1984)), 또는 비면역글로불린 폴리펩티드 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유결합시킴으로써 변경할 수도 있다.
일반적으로, 상기 비면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인으로 치환되거나, 또는 본 발명의 항체의 한 항원-결합 부위의 가변 도메인으로 치환되어, TACIs 또는 BR3에 특이성을 갖는 항원-결합 부위 및 다른 항원에 특이성을 갖는 또 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메릭 이가성 항체를 생성한다.
교차결합제를 사용하는 것을 비롯하여, 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 사용하여 키메릭 또는 하이브리드 항체를 시험관내 제조할 수도 있다. 예를 들면, 다이술파이드 교환 반응을 사용하거나, 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 면역독소를 구축할 수 있다. 이 목적에 적당한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티리미데이트를 포함한다.
문헌[Iliades 등,FEBS Letters,409:437-441 (1997)]에 기재된 바와 같은 단쇄 Fv 단편을 제조할 수도 있다. 다양한 연결인자를 사용하여 상기 단쇄 단편을 커플링시키는 것이 문헌[Kortt 등,Protein Engineering, 10:423-433 (1997)]에 기재되어 있다. 다양한 재조합체 제조 및 항체의 조작 기법이 당업계에 널리 공지되어 있다. 당업자에 의해 일반적으로 사용되는 상기 기법의 예가 하기에 더 자세히 기술된다.
(i) 인간화 항체
일반적으로, 인간화 항체는 비인간 원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "임포트(import)" 잔기로 지칭되며, 일반적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 유래된다. 인간화는 설치류 CDRs 또는 CDR 서열을 인간 항체의 대응 서열로 치환함으로써, 윈터(Winter) 및 동료의방법을 따라 본질적으로 수행될 수 있다(Jones 등,Nature,321:522-525 (1986); Riechmann 등,Nature,332:323-327 (1988); Verhoeyen 등,Science,239:1534-1536 (1988)).
따라서, 상기 "인간화" 항체는 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 소수가 비인간 종으로부터의 대응하는 서열에 의해 치환된 키메릭 항체이다. 실제로, 인간화 항체는 일반적으로, 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.
항원에 대한 높은 친화도 및 다른 유리한 생물학적 성질을 보유한 채 항체를 인간화하는 것이 중요하다. 이 목적을 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따르면, 모 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 가상의 인간화 산물을 분석함으로써 인간화 항체를 제조한다. 3차원 면역글로불린 모델은 흔히 이용가능하고, 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 예상되는 3차원 배열을 도시하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이를 검사하여, 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기들의 유망한 역할을 분석한다. 즉, 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석한다. 이로써, 목적하는 항체 특성, 예를 들면, 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성되도록, FR 잔기가 컨센서스 임포트 서열로부터 선택되어 조합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기가 항원 결합에 영향을 미치는데 가장 실질적으로 직접 관여한다.
(ii) 인간 항체
하이브리도마 방법에 의해 인간 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Kozbor,J. Immunol. 133, 3001 (1984), 및 Brodeur 등,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63면 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]에 인간 모노클로날 항체 제조용 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포 혈통이 기재되어 있다.
면역화시, 내인성 면역글로불린 생성 없이, 인간 항체 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물(예, 마우스)을 제조하는 것이 현재 가능하다. 예를 들면, 키메릭 및 배-혈통 변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역(JH) 유전자의 동종접합 결실이 내인성 항체 생성을 완전히 억제한다는 것이 기재되어 있다. 인간 배-혈통 면역글로불린 유전자 어레이를 상기 배-혈통 변이 마우스에 전달하는 것은 항원 접종시 인간 항체의 생성을 가져올 것이다. 예를 들어, 문헌[Jakobovits 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90, 2551-255 (1993); Jakobovits 등,Nature,362, 255-258 (1993)]을 참조한다.
멘데즈(Mendez) 등(Nature Genetics15: 146-156 (1997))은 상기 기법을 더 개선시켜, 항원 접종시 고 친화도의 완전한 인간 항체를 생성하는, "제노마우스 II"로 표시되는 일련의 트랜스제닉 마우스를 제조하였다. 이것은 메가베이스 인간 중쇄 및 경쇄 유전자자리를 상기 기술된 바와 같이 내인성 JH부분이 결실된 마우스에 배-혈통 통합시킴으로써 달성되었다. 제노마우스 II는 약 66 JH유전자, 완전 DH및 JH영역 및 3개의 상이한 불변 영역(μ, δ및 χ)을 함유하는 1,020 kb의 인간 중쇄 유전자자리를 보유하며, 또한 32 Vκ유전자, Jκ부분 및 Cκ유전자를 함유하는 800 kb의 인간 κ유전자자리를 보유한다. 이들 마우스에서 생성된 항체는 유전자 재배열, 회합 및 레퍼토리를 비롯한 모든 면에서 인간에서 관찰되는 것과 매우 유사하다. 마우스 유전자자리에서 유전자 재배열을 방지하는 내인성 JH부분의 결실로 인해, 인간 항체가 내인성 항체보다 우세하게 발현된다.
별법으로, 파지 디스플레이 기법(McCafferty 등,Nature,348, 552-553 (1990))을 사용하여, 비면역화된 도너 유래의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내 제조할 수 있다. 이 기법에 따르면, 항체 V 도메인 유전자를 실모양 박테리오파지, 예를 들면, M13 또는 fd의 주(major) 또는 소(minor) 코트 단백질 유전자로 인-프래임 클로닝시키고, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로 디스플레이시킨다. 실모양 입자가 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하므로, 항체의 기능적 특성에 기초한 선택은 또한 그러한 성질을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자의 선택을 가져온다. 따라서, 파지는 B-세포의 특성의 일부를 모방한다. 다양한 형태로 파지 디스플레이를 수행할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J.,Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993)]을 참조한다. 파지 디스플레이에 여러 V-유전자 부분 공급원을 사용할 수 있다. 클랙슨(Clackson) 등(Nature 352, 624-628 (1991))은 면역화 마우스의 비장에서 유래한 V 유전자의 작은 랜덤 조합 라이브러리로부터 다양한 항-옥사졸론 항체 어레이를 단리하였다. 비면역화인간 도너로부터의 V 유전자 레퍼토리를 구축할 수 있고, 본질적으로 문헌[Marks 등,J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991) 또는 Griffith 등,EMBO J. 12, 725-734 (1993)]에 기재된 기법에 따라 (자기-항원을 비롯한) 다양한 항원 어레이에 대한 항체를 단리할 수 있다. 선천 면역 반응에서, 항체 유전자는 높은 속도로 돌연변이를 축적한다(체세포 고돌연변이). 도입된 변화 중 일부는 더 높은 친화도를 부여할 것이고, 나중의 항원 접종 동안 고 친화도 표면 면역글로불린을 나타내는 B 세포가 우세하게 복제되고 분화된다. "연쇄 셔플링(chain shuffling)"으로 알려진 기법을 사용하여 이 선천적 과정을 모방할 수 있다(Marks 등,Bio/Technol. 10, 779-783 (1992)). 이 방법에서, 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 비면역화 도너로부터 얻어진 V 도메인 유전자의 천연 변이체 레퍼토리로 순차적으로 대체함으로써, 파지 디스플레이에 의해 얻어진 "일차" 인간 항체의 친화도를 개선할 수 있다. 이 기법에 의해, nM 범위의 친화도를 갖는 항체 및 항체 단편을 제조할 수 있다. 매우 큰 파지 항체 레퍼토리("마더-오브-올 라이브러리스(mother-of-all libraries)"로도 공지됨)를 제조하기 위한 전략이 문헌[Waterhouse 등,Nucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993)]에 기재되어 있다. 유전자 셔플링을 사용하여 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도할 수도 있으며, 인간 항체가 출발 설치류 항체에 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 임프린팅(epitope imprinting)"으로도 지칭되는 이 방법에 따르면, 파지 디스플레이 기법에 의해 얻어진 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자가 인간 V 도메인 유전자 레퍼토리로 치환되어 설치류-인간 키메라를 생성한다. 항원에 대한 선택이 기능적 항원-결합 부위를 복구할 수있는 인간 변수의 단리를 가져온다. 즉, 에피토프가 파트너의 선택을 지배(임프린팅)한다. 나머지 설치류 V 도메인을 치환하기 위해 이 과정을 반복할 경우, 인간 항체가 얻어진다(PCT 특허 출원 WO 93/06213(1993. 4. 1. 공개) 참조). CDR 이식에 의한 설치류 항체의 전통적인 인간화와 달리, 이 기법은 설치류 기원의 틀 또는 CDR 잔기를 함유하지 않는 완전한 인간 항체를 제공한다.
하기에 논의되는 바와 같이, 본 발명의 항체는 임의로 단량체 항체, 이합체 항체, 및 다가 형태의 항체를 포함할 수 있다. 당업자는 당업계에 공지된 기법에 의해 상기 이합체 또는 다가(multivalent) 형태를 구축할 수 있다. 다가 항체의 제조 방법도 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 중쇄 교차결합을 방지하기 위해, 중쇄는 일반적으로 Fc 영역의 임의의 지점에서 절단된다. 별법으로, 교차결합을 방지하기 위해, 관련 시스테인 잔기를 또 다른 아미노산 잔기로 치환하거나, 결실시킨다.
(iii) 이중특이성(bispecific) 항체
이중특이성 항체는 2 이상의 상이한 항원에 결합 특이성을 갖는 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 이 경우에, 결합 특이성 중 하나는 TACIs 또는 BR3 수용체에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 바람직하게는 또 다른 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다. 예를 들면, TACIs 또는 BR3 수용체 및 또 다른 세포자멸사/신호전달 수용체에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체는 본 발명의 범위 내이다.
이중특이성 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이성 항체의 재조합적 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현에 기초하며, 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다(Millstein and Cuello,Nature 305, 537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 랜덤 분류로 인해, 이들 하이브리도마(쿼드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성하고, 이중 하나만 정확한 이중특이성 구조를 갖는다. 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 수율이 낮다. 유사한 방법이 문헌[PCT 출원 공개 번호 WO 93/08829(1993. 5. 13. 공개) 및 Traunecker 등,EMBO 10, 3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.
더 바람직한 다른 방법에 따르면, 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인(항체-항원 결합 부위)을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인으로 융합시키는 것이 바람직하다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 경쇄 불변 영역(CH1)이 하나 이상의 융합체에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체, 및 필요한 경우, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별도의 발현 벡터에 삽입하고, 적당한 숙주로 공동 형질감염시킨다. 이것은 구축에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 비동등 비율이 최적의 수율을 제공하는 태양에서, 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는데 큰 융통성을 제공한다. 그러나, 동등한 비율의 2 이상의 폴리펩티드 사슬의 발현이 고 수율을 가져오거나, 또는 비율이 그다지 중요하지 않을 경우, 2개 또는 3개 모두의 폴리펩티드 사슬의 코딩 서열을 하나의 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 이 방법의 바람직한 태양에서, 이중특이성 항체는 하나의 암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 암에 (제2 결합 특이성을 제공하는) 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함한다. 이중특이성 분자의 1/2에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 쉬운 분리를 제공하므로, 이 비대칭 구조가 원하지 않는 면역글로불린 사슬 조합으로부터 목적하는 이중특이성 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이 방법이 PCT 공개 번호 WO 94/04690(1994. 3. 3. 공개)에 기재되어 있다.
이중특이성 항체 제조의 더 자세한 사항에 대해, 예를 들어, 문헌[Suresh 등,Methods in Enzymology 121, 210 (1986)]을 참조한다.
(iv) 이종콘쥬게이트 항체
이종콘쥬게이트 항체도 본 발명의 범위 내이다. 이종콘쥬게이트 항체는 2개의 공유 결합 항체로 구성된다. 상기 항체는 예를 들어, 면역계 세포를 원하지 않는 세포로의 표적화(미국 특허 제4,676,980호) 및 HIV 감염의 치료(PCT 공개 번호 WO 91/00360 및 WO 92/200373; EP 03089)를 위해 제안되었다. 이종콘쥬게이트 항체는 통상의 교차결합 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 적당한 교차결합제가 당업계에 공지되어 있으며, 다수의 교차결합 기법과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.
(v) 항체 단편
일정 태양에서, (뮤린, 인간 및 인간화 항체 및 항체 변이체를 비롯한) 항-TACIs 또는 항-BR3 항체는 항체 단편이다. 다양한 기법이 항체 단편의 제조를 위해 개발되었다. 전통적으로, 온전한 항체의 단백분해 소화에 의해 이들 단편이 유래되었다(예를 들어, Morimoto 등,J. Biochem. Biophys. Methods24:107-117 (1992) 및 Brennan 등,Science229:81 (1985)). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 제조할 수 있다. 예를 들면, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고, 화학적으로 커플링되어 F(ab')2단편을 형성할 수 있다(Carter 등,Bio/Technology10:163-167 (1992)). 또 다른 태양에서, F(ab')2는 F(ab')2분자의 회합을 촉진하기 위해 류신 지퍼 GCN4를 사용하여 형성된다. 또 다른 방법에 따르면, Fv, Fab 또는 F(ab')2단편은 재조합 숙주 세포 배양액으로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 다양한 제조 방법이 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들면, 파파인을 사용하여 소화를 수행할 수 있다. 파파인 소화의 예가 WO 94/29348(1994. 12. 22. 공개) 및 미국 특허 제4,342,566호에 기재되어 있다. 항체의 파파인 소화는 일반적으로, 각각 단일 항원 결합 부위를 갖고 Fab 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편 및 나머지 Fc 단편을 생성한다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원을 교차결합할 수 있는 F(ab')2단편을 생성한다.
항체 소화에서 생성된 Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 항체 힌지에서 유래한 하나 이상의 시스테인을 비롯한 수 개의 잔기가 첨가되어 있다는 점에서 Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 자유 티올기를 함유하는 Fab'를 나타낸다. 원래 F(ab')2항체 단편은 그 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
항체는 불변 영역의 보존된 위치에서 글리코실화된다(Jefferis and Lund,Chem. Immunol. 65:111-128 (1997); Wright and Morrison,TibTECH 15:26-32 (1997)). 면역글로불린의 올리고당류 측쇄는 단백질의 기능(Boyd 등,Mol. Immunol. 32:1311-1318 (1996); Wittwe and Howard,Biochem. 29:4175-4180 (1990)), 및 당단백질의 배열 및 제공된 3차원 표면에 영향을 미칠 수 있는 당단백질 부분 사이의 분자내 상호작용(Hefferis and Lund, 상기 문헌; Wyss and Wagner,Current Opin. Biotech. 7:409-416 (1996))에 영향을 미친다. 올리고당류는 당해 당단백질을 특이적 인식 구조에 기초하여 일정 분자로 표적화할 수 있다. 예를 들면, 아갈락토실화 IgG에서, 올리고당류 부분이 CH2간 공간으로부터 플립(flip)되어, 말단 N-아세틸글루코사민 잔기가 만노스 결합 단백질에 결합할 수 있게 된다는 것이 보고되었다(Malhotra 등,Nature Med. 1:237-243 (1995)). 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 생성된 CAMPATH-1H(인간 림프구의 CDw52 항원을 인식하는, 재조합 인간화 뮤린 모노클로날 IgG1 항체)로부터 글리코펩티다제(glycopeptidase)에 의한 올리고당류의 제거는 보체 매개 분해(CMCL)의 완전한 감소를 초래한 반면(Boyd 등,Mol. Immunol. 32:1311-1318 (1996)), 뉴라미니다제(neuraminidase)를 사용한 시알산 잔기의 선택적 제거는 DMCL의 손실을 야기하지 않았다. 또한, 항체의 글리코실화가 항체-의존성 세포독성(ADCC)에도 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 특히, 이등분면 GlcNAc의 형성을 촉매하는 글리코실전이효소인 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐전이효소 III(GnTIII)의 테트라시클린-조절 발현을 갖는 CHO 세포가 개선된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되었다(Umana 등,Mature Biotech. 17:176-180 (1999)).
항체의 글리코실화 변이체는 항체의 글리코실화 양식이 변경된 변이체이다. 변경이란 항체에서 발견되는 하나 이상의 카르보히드레이트 부분의 결실, 하나 이상의 카르보히드레이트 부분의 항체에의 첨가, 글리코실화 (글리코실화 양식) 조성, 글리코실화 정도 등의 변화를 의미한다. 글리코실화 변이체는, 예를 들어, 항체를 코딩하는 핵산 서열에서 하나 이상의 글리코실화 부위의 제거, 변화 및(또는) 첨가에 의해 제조될 수 있다.
항체의 글리코실화는 일반적으로 N-연결 또는 O-연결 형태이다. N-연결은 카르보히드레이트 부분이 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 카르보히드레이트 부분의 아스파라긴 측쇄에의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드에서 상기 트리펩티드 중 어느 하나의 존재는 잠재적 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결 글리코실화는 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 한 개 당의 (5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신도 사용될 수 있으나) 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린또는 트레오닌에의 부착을 지칭한다.
글리코실화 부위의 항체에의 첨가는 (N-연결 글리코실화 부위의 경우) 아미노산 서열을 이것이 하나 이상의 상기 기술된 트리펩티드 서열을 함유하도록 변경함으로써 펀리하게 달성된다. 상기 변경은 (O-연결 글리코실화 부위의 경우) 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 원래 항체의 서열에 첨가하거나 치환함으로써 달성될 수도 있다.
항체의 (글리코실화 양식을 비롯한) 글리코실화는 기초 뉴클레오티드 서열의 변경 없이 변경될 수도 있다. 글리코실화는 주로 항체의 발현에 사용되는 숙주 세포에 의존한다. 잠재적 치료제로서의 재조합 당단백질(예, 항체)의 발현에 사용된 세포 유형이 천연 세포인 경우가 드물기 때문에, 항체의 글리코실화 양식의 상당한 변형을 기대할 수 있다(예를 들어, Hse 등,J. Biol. Chem. 272:9062-9070 (1997) 참조). 숙주 세포의 선택 뿐만 아니라, 항체의 재조합 생산 동안 글리코실화에 영향을 미치는 인자는 성장 방식, 배지 조성, 배양 밀도, 산소화, pH, 정제 체계 등을 포함한다. 올리고당류 생산에 관여하는 일정 효소를 도입 또는 과다발현시키는 것을 비롯한 다양한 방법이 특정 숙주 유기체에서 달성되는 글리코실화 양식을 변경하는 것으로 제안되었다(미국 특허 제5,047,335호, 제5,510,261호 및 제5,278,299호). 글리코실화 또는 어떤 유형의 글리코실화는, 예를 들어, 엔도글리코시다제(endoglycosidase) H(엔도 H)를 사용하여 당단백질로부터 효소적으로 제거될 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포는, 예를 들어, 어떤 종류의 다당류를 처리하는데 불완전하도록 유전학적으로 설계될 수 있다. 이들 및 유사한 기법이 당업계에 널리 공지되어 있다.
항체의 글리코실화 구조는 렉틴 크로마토그래피, NMR, 질량 분광법, HPLC, GPC, 단당류 조성 분석, 순차적 효소 소화, 및 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 전하에 기초하여 올리고당류를 분리하는 HPAEC-PAD를 비롯한 일반적 카르보히드레이트 분석 기법에 의해 쉽게 분석될 수 있다. 분석 목적을 위해 올리고당류를 유리시키는 방법도 공지되어 있고, 효소 처리(일반적으로 펩티드-N-글리코시다제 F/엔도-β-갈락토시다제를 사용하여 수행됨), 혹독한 알칼리성 환경을 사용하여 주로 O-연결 구조를 유리시키는 제거, 및 무수 히드라진을 사용하여 N- 및 O-연결 올리고당류를 유리시키는 화학적 방법을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
트리아보디(triabodies)도 본 발명의 범위 내이다. 상기 항체가 예를 들어, 문헌[Iliades 등, 상기 문헌 및 Kortt 등, 상기 문헌]에 기재되어 있다.
본 발명의 항체는 항체를 (독소 분자와 같은) 세포독성제, 또는 프로드럭(예, 펩티딜 화학요법제, WO 81/01145 참조)을 활성 항암제로 전환시키는 프로드럭-활성화 효소에 콘쥬게이션시킴으로써 변경할 수 있다. 예를 들어, WO 88/07378 및 미국 특허 제4,975,278호를 참조한다. 이 기법은 "항체 의존성 효소 매개 프로드럭 요법"(ADEPT)으로도 지칭된다.
ADEPT에 유용한 면역콘쥬게이트의 효소 성분은 프로드럭을 더 활성인 세포독성 형태로 전환시키는 방식으로 프로드럭 상에 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 효소는 포스페이트 함유 프로드럭을 유리 약물로전환시키는데 유용한 알칼리 인산분해효소; 술페이트 함유 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴술파타아제; 비독성 5-플로오로시토신을 항암제인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 디아미나아제; 펩티드 함유 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 단백분해효소, 예를 들면, 세라티아 단백분해효소, 테르몰리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신(예, 카텝신 B 및 L); 카스파제-3과 같은 카스파제; D-아미노산 치환체를 함유하는 프로드럭을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 베타-갈락토시다제 및 뉴라미니다제와 같은 카르보히드레이트-절단 효소; 베타-락탐으로 유도된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 베타-락타마아제; 및 아민 질소에서 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸기로 유도된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제와 같은 페니실린 아미다제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 별법으로, 당업계에 "아브자임(abzymes)"으로도 알려져 있는, 효소 활성을 갖는 항체를 사용하여, 본 발명의 프로드럭을 유리 활성 약물로 전환할 수 있다(예, Massey,Nature328:457-458 (1987) 참조). 아브자임을 종양 세포 집단에 전달하기 위한 항체-아브자임 콘쥬게이트를 본원에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
이종이작용성(heterobifunctional) 교차결합 시약의 사용과 같은 당업계에 널리 공지된 기법에 의해 효소를 항체에 공유 결합시킬 수 있다. 별법으로, 본 발명의 효소의 적어도 하나의 기능적으로 활성인 부분에 연결된 본 발명의 항체의 적어도 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질을 당업계에 널리 공지된 재조합 DNA기법을 사용하여 구축할 수 있다(예, Neuberger 등,Nature, 312:604-608 (1984) 참조).
추가의 항체 변경이 고려된다. 예를 들면, 항체를 다양한 비단백성 폴리머, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중 하나에 연결할 수 있다. 항체를, 예를 들어, 액적형성 기법 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐(예, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐), 콜로이드 약물 전달 시스템(예, 리포솜, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에 가둘 수도 있다. 상기 기법이 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)]에 개시되어 있다. 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어, 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같이, 구제(salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체(특히, 항체 단편) 내로 합일화시킬 수 있다. 본원에서, "구제 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 IgG 분자(예, IgG1, IgG2, IgG3또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.
D. 분석 방법
경쟁 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석 및 면역침전 분석과 같은 임의의 공지된 방법으로 리간드/수용체 결합 연구를 수행할 수 있다. 세포-기초 분석 및 동물 모델을 진단 방법으로 사용하여, 본원에서 동정된 리간드 및 수용체와 본원에 언급된 질병 및 질환의 전개 및 발병 사이의 상호작용을 더 이해할 수 있다.
한 방법에서, 포유류 세포를 본원에 기재된 리간드 또는 수용체로 형질감염시킬 수 있고, 결합 또는 활성을 촉진 또는 억제하는 아고니스트 또는 길항제의 능력을 분석한다. 적당한 세포를 목적하는 유전자로 형질감염시키고, 활성을 모니터링할 수 있다. 그 후, 상기 형질감염된 세포 혈통을 사용하여, 아고니스트(들) 또는 길항제(들)의, 예를 들어, B-세포 증식 또는 Ig 분비의 촉진 또는 억제 능력을 시험할 수 있다. 추가로, 본원에서 동정된 유전자의 코딩 서열로 형질감염된 세포를 사용하여, 면역 관련 질환 또는 암의 치료를 위한 약물 후보를 동정할 수 있다.
또한, 트랜스제닉 동물로부터 유래된 일차 배양물을 세포-기초 분석에 사용할 수 있다. 트랜스제닉 동물로부터 연속 세포 혈통을 유도하는 기법이 당업계에 널리 공지되어 있다[예를 들어, Small 등,Mol. Cell. Biol.,5:642-648 (1985) 참조].
한 적당한 세포 기초 분석은 각 수용체를 함유하거나 발현하는 세포에 에피토프-태그 리간드(예, AP 또는 플래그)를 첨가하고, (예기된 길항제의 존재 또는 부재 하에서) 항-태그 항체로 FACS 염색에 의해 결합을 분석하는 것이다. 다른 분석에서는, TALL-1 또는 APRIL 유도된 B 세포 증식을 억제하는 길항제의 능력을 분석한다. B 세포 또는 세포 혈통을 예기된 길항제의 존재 또는 부재 하에서 TALL-1 또는 APRIL과 배양하고, B 세포의 증식을3H-티미딘 혼입 또는 세포 수에 의해 측정할 수 있다.
세포 기초 시험관내 분석 결과를 생체내 동물 모델을 사용하여 더 확인할 수 있다. 널리 공지된 다양한 동물 모델을 사용하여, 본원에서 동정된 길항제 및 아고니스트의, 예를 들어, 면역 관련 질환 또는 암의 전개 및 발병에서의 역할을 이해하고, 후보 치료제의 효능을 시험할 수 있다. 상기 모델의 생체내 측면으로 인해, 특히 인간 환자에서의 반응을 예상할 수 있다. 면역 관련 질환의 동물 모델은 비-재조합 및 재조합 (트랜스제닉) 동물 모두를 포함한다. 비-재조합 동물 모델은, 예를 들어, 설치류(예, 뮤린 모델)을 포함한다. 일반적 기법, 예를 들어, 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 비장 이식, 복강내 이식 및 신 캡슐 하에서의 이식을 사용하여 세포를 동계(syngeneic) 뮤린에 도입함으로써 상기 모델을 생성할 수 있다.
예를 들어, 이식-대-숙주 질환용 동물 모델이 공지되어 있다. 이식-대-숙주 질환은 면역적격 세포가 면역억제 또는 내성 환자에 이식될 경우 일어난다. 도너 세포가 숙주 항원을 인식하여 반응한다. 반응은 생명을 위협하는 심한 감염에서부터 설사 및 체중 감소의 경증까지 달라질 수 있다. 이식-대-숙주 질환 모델은 MHC 항원 및 소(minor) 이식 항원에 대한 T 세포 반응성을 평가하는 수단을 제공한다. 적당한 방법이 문헌[Current Protocols in Immunology, 4.3 단원]에 자세히 기재되어 있다.
피부 동종이식 거부에 대한 동물 모델은, 항-바이러스 및 종양 면역에 있어서의 T 세포의 역할을 나타내는 척도인, 생체내 조직 파괴를 매개하는 T 세포의 능력을 시험하는 수단이다. 가장 흔한 승인된 모델은 마우스 꼬리 피부 이식을 사용한다. 반복된 실험은 피부 동종이식 거부가 항체가 아닌, T 세포, 조력 T 세포 및세포독성-작동 T 세포에 의해 매개된다는 것을 나타내었다(Auchincloss, H. Jr. and Sachs, D. H.,Fundamental Immunology, 2nd ed., W. E. Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889-992). 적당한 방법이 문헌[Current Protocols in Immunology, 4.4 단원]에 자세히 기재되어 있다. 본 발명의 조성물을 시험하는데 사용될 수 있는 다른 이식 거부 모델은 문헌[Tanabe, M. 등,Transplantation, (1994) 58:23 및 Tinubu, S. A. 등,J. Immunol., (1994) 4330-4338]에 기재된 동종계(allogeneic) 심장 이식 모델이다.
지연 과민에 대한 동물 모델은 또한 세포 매개 면역 기능의 분석을 제공한다. 지연 과민 반응은 항원 접종 후 일정 기간이 경과한 후에야 비로소 피크에 도달하는 감염을 특징으로 하는 T 세포 매개 생체내 면역 반응이다. 이 반응은 또한 다발성 경화증(MS) 및 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE, MS의 모델)과 같은 조직 특이적 자가면역 질환에서 일어난다. 적당한 방법이 문헌[Current Protocols in Immunology, 4.5 단원]에 자세히 기재되어 있다.
관절염에 대한 동물 모델은 콜라겐-유도 관절염이다. 이 모델은 인간 자가면역 류마티스성 관절염의 임상적, 조직학적 및 면역학적 특징을 공유하고, 인간 자가면역 관절염의 만족스러운 모델이다. 마우스 및 랫트 모델은 윤활막염, 연골 및 연골밑 뼈의 미란을 특징으로 한다. 본 발명의 화합물을 문헌[Current Protocols in Immunology, 15.5 단원]에 기재된 프로토콜을 사용하여 자가면역 관절염에 대한 활성에 대해 시험할 수 있다. 또한, 문헌[Issekutz, A. C. 등,Immunology,(1996) 88:569]에 기재된 CD18 및 VLA-4 인테그린에 대한 모노클로날항체를 사용한 모델을 참조한다.
동물을 난백 알부민으로 감작시킨 다음, 에어로졸에 의해 전달되는 동일 단백질로 동물을 접종시키는 것에 의해 항원-유도 기도 과다반응, 폐 호산구증가증 및 감염이 유도되는 천식 모델이 기재되어 있다. 몇 개의 동물 모델(기니아 피그, 랫트, 비-인간 영장류)은 에어로졸 항원으로 접종시 인간의 아토피 천식에 유사한 증후를 나타낸다. 뮤린 모델은 인간 천식의 다수의 특징을 갖는다. 본 발명의 화합물을 천식의 치료에 있어서 활성 및 효능에 대해 시험하는데 적당한 방법이 문헌[Wolyniec, W. W. 등,Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., (1998) 18:777] 및 거기에 인용된 참고 문헌에 기재되어 있다.
또한, 본 발명의 조성물을 건선류 질환에 대한 동물 모델에서 시험할 수 있다. 마우스가 건선에 유사한 조직병리학적 피부 병변을 나타내는, 문헌[Schon, M. P. 등,Nat. Med., (1997) 3:183]에 기재된 scid/scid 마우스 모델에서 본 발명의 화합물을 시험할 수 있다. 또 다른 적당한 모델은 문헌[Nickoloff, B. J. 등,Am. J. Path., (1995) 146:580]에 기술된 바와 같이 제조된 인간 피부/scid 마우스 키메라이다.
후보 치료 조성물의 항암 활성을 시험하기 위한 다양한 동물 모델이 널리 공지되어 있다. 이들은 누드 마우스 또는 scid/scid 마우스로의 인간 종양 이종이식, 또는 p53 녹아웃 마우스와 같은 유전적 뮤린 종양 모델을 포함한다.
트랜스제닉 동물을 제조하는 일반적인 기법을 사용하여, 본원에서 동정된 분자의 코딩 부분을 관심있는 동물의 게놈에 도입함으로써 재조합 (트랜스제닉) 동물모델을 설계할 수 있다. 트랜스제닉 조작을 위한 표적으로 기능할 수 있는 동물은 마우스, 랫트, 토끼, 기니아 피그, 양, 염소, 돼지 및 비-인간 영장류(예, 비비, 침팬지 및 원숭이)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 트랜스진을 상기 동물에 도입하기 위한 당업계에 공지된 기법은 전핵 마이크로인젝션(Hoppe 및 Wanger, 미국 특허 제4,873,191호); 배 혈통으로의 레트로바이러스-매개 유전자 전달(예, Van der Putten 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82, 6148-615 (1985)) ; 배아 줄기 세포에서 유전자 표적화(Thompson 등,Cell,56, 313-321 (1989)); 배아의 엘렉트로포레이션(Lo,Mol. Cel. Biol.,3, 1803-1814 (1983)); 정자-매개 유전자 전달(Lavitrano 등,Cell,57, 717-73 (1989))을 포함한다. 검토를 위해, 예를 들어, 미국 특허 제4,736,866호를 참조한다.
본 발명의 목적을 위해, 트랜스제닉 동물은 트랜스진을 그의 세포의 일부에만 함유하는 것들을 포함한다("모자이크 동물"). 트랜스진은 단일 트랜스진으로서, 또는 콘카타머(예, 머리-대-머리 또는 머리-대-꼬리 관계)로 통합될 수 있다. 트랜스진의 특정 세포 유형으로의 선택적 도입은, 예를 들어, 문헌[Lasko 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89, 6232-636 (1992)]의 방법에 따라서도 가능하다.
일반적 방법에 의해 트랜스제닉 동물에서 트랜스진의 발현을 모니터링할 수 있다. 예를 들면, 서던 블롯 분석 또는 PCR 증폭을 사용하여 트랜스진의 통합을 확인할 수 있다. 이 후, mRNA 발현 수준을 제자리 하이브리드화, 노던 블롯 분석, PCR 또는 면역세포화학법과 같은 기법을 사용하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 면역 세포의 특정 조직으로의 침윤을 결정하기 위한 조직학적 검사에 의해 면역 질환병리의 증상을 더 검사할 수 있거나, 또는 암성 또는 악성 조직의 존재에 대해 동물을 더 검사할 수 있다.
별법으로, 본원에서 동정된 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 유전자와 동물의 배아 세포에 도입된 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 변경된 게놈 DNA 사이의 동종 재조합의 결과로서 상기 폴리펩티드를 코딩하는 결손 또는 변경 유전자를 갖는 "녹아웃" 동물을 구축할 수 있다. 예를 들면, 특정 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 사용하여, 확립된 기법에 따라 상기 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. 특정 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA의 일부를 결실시키거나, 또는 예를 들어, 통합을 모니터링하는데 사용될 수 있는 선택가능한 마커를 코딩하는 유전자와 같은 또 다른 유전자로 대체할 수 있다. 일반적으로, (5' 및 3' 말단 모두에) 수 킬로베이스의 변경되지 않은 플랭킹 DNA가 벡터에 포함된다(예를 들어, 동종 재조합 벡터의 기재에 대해 Thomas and Capecchi,Cell,51:503 (1987) 참조). 벡터가 (예를 들어, 전기천공법에 의해) 배아 줄기 세포 혈통에 도입되고, 도입된 DNA가 내인성 DNA와 동종 재조합된 세포가 선택된다(예를 들어, Li 등,Cell,69:915 (1992) 참조). 이어서, 선택된 세포를 동물(예, 마우스 또는 랫트)의 주머니배에 주사하여, 응집 키메라를 형성한다(예를 들어, Bradley, inTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) 113-152면 참조). 이어서, 키메릭 배아를 적당한 거짓임신 암컷 양 동물에 착상시켜, 배아가 "녹아웃" 동물을 생성하게 할 수 있다. 그의 배 세포에 동종 재조합된 DNA를 보유하는 프로제니를 일반 기법에 의해 동정하여, 동물의 모든 세포가 동종 재조합된 DNA를 함유하는 동물을 번식시키는데 사용할 수 있다. 녹아웃 동물은, 예를 들어, 어떤 병적 상태에 대한 방어력, 및 상기 폴리펩티드의 부재에 기인한 병적 상태의 전개로 특징지을 수 있다.
E.조성물
본원에 기재된 TACIs 또는 BR3 분자, 또는 길항제 또는 아고니스트는 임의로 담체에서 사용된다. 적당한 담체 및 그의 조성물이 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co., edited by Osol 등]에 기재되어 있다. 일반적으로, 조성물을 등장성으로 하기 위해 적당량의 제약적으로 허용가능한 염이 담체에 사용된다. 담체의 예는 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함한다. 담체의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 더 바람직하게는 약 7.4 내지 약 7.8이다. 일정 담체가, 예를 들어, 투여 경로 및 투여되는 활성 약제의 농도에 따라 더 바람직할 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 담체는 동결건조 조성물 또는 수용액 형태일 수 있다.
만족스러운 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 용량 및 농도에서 바람직하게는 세포 및(또는) 수용체에 비독성이고, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제, 예를들면, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 파라벤, 카테콜, 레저르시놀, 시클로헥사놀, 3-펜타놀 및 m-크레졸; 저 분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 반대 이온; 및(또는) TWEENTM, PLURONICSTM또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
조성물은 치료되는 특정 질환에 대해 필요에 따라 하나 이상의 활성 화합물을 포함할 수도 있고, 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 보완 활성을 갖는 것들이 바람직하다.
본원에 기재된 TACIs 또는 BR3, 또는 길항제 또는 아고니스트는, 예를 들어, 액적형성 기법 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐(예, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐), 콜로이드 약물 전달 시스템(예, 리포솜, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에 가둘 수도 있다. 상기 기법이 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용하기 위한 조성물은 무균이어야 한다. 이것은 무균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 적당한 서방성 제제의 예는 활성 약제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔(예, 폴리(2-히드록시에틸메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리액티드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 Y 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, LUPRON DEPOTTM(락트산-글리콜산 공중체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미세구)와 같은 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일에 걸쳐 분자를 방출할 수 있고, 일정 하이드로겔은 더 단기간 동안 단백질을 방출한다.
F. 치료 방식
본원에 기재된 분자는 면역 관련 질환 또는 암과 같은 다양한 질환의 치료에 유용하다. 이들 질환은, 예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 길항제 또는 아고니스트의 투여를 통해 포유류에서 TALL-1, APRIL, TACI, BCMA, TACIs 또는 BR3와 관련된 선택된 활성을 촉진 또는 억제함으로써 치료될 수 있다.
개업의에 의해 본원에 기재된 다양한 질환의 진단이 포유류에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 포유류에서 암 또는 면역 관련 질환의 진단 또는 검출을 허용하는 진단법이 당업계에서 이용가능하다. 예를 들면, 촉진, 혈액 검사, X-선, NMR 등을 비롯한 방법을 통해 암을 확인할 수 있다. 면역 관련 질환도 쉽게 확인할 수 있다. 전신 홍반 루푸스에서, 질병의 중요 매개자는 자기 단백질/조직에 대한 자가-반응성 항체의 생성 및 이에 따른 면역-매개 염증의 발생이다. 신장, 폐, 근골격계, 점막피부, 눈, 중추신경계, 심혈관계, 위장관, 골수 및 혈액을 비롯한 복수의 기관 및 시스템이 임상적으로 영향을 받는다.
류마티스성 관절염(RA)은 주로 복수 관절의 윤활막을 포함하고 결과적으로 관절 연골에 손상을 미치는, 만성 전신 자가면역 염증성 질환이다. 발병은 T 림프구 의존성이고, 류마티스성 인자인 자기 IgG에 대한 자가-항체의 생성과 관련되어 있으며, 그 결과 관절액 및 혈액에서 높은 수준에 도달하는 면역 복합체를 형성한다. 관절에서 상기 복합체는 림프구 및 단핵구의 윤활로의 현저한 침윤 및 이에 따른 현저한 윤활 변화를 유도할 수 있다. 관절강/액이 다수의 호중구의 부가와 함께 유사한 세포에 의해 침윤된다. 손상 조직은 주로 관절이고, 주로 대칭형이다. 그러나, 관절외 질환도 2개의 주요 형태로 일어난다. 한 형태는 진행 관절 질환 및 폐 섬유증, 혈관염 및 피부 궤양의 전형적인 병변과 함께 관절외 병변의 전개이다. 관절외 질환의 두 번째 형태는 RA 질환 동안의 후기, 때때로 관절 질환이 정지한 후에 일어나는, 소위 펠티(Felty) 증후군이며, 호중성백혈구감소증, 저혈소판증 및 비장비대의 존재를 포함한다. 이것은 경색, 피부 궤양 및 괴저의 형성과 함께 복수 기관에서 혈관염을 수반할 수 있다. 환자는 또한 손상된 관절에 걸친 피하 조직에서 종종 류마티스성 결절을 보인다. 후기의 결절은 혼합 염증 세포 침윤물에 의해 둘러싸인 괴사 중심을 갖는다. RA에서 일어날 수 있는 다른 소견은 폐 섬유증, 건조 각막결막염 및 류마티스성 결절과 함께 심장막염, 흉막염, 관상동맥염, 간질 폐렴을 포함한다.
소아 만성 관절염은 종종 16세 미만에서 시작되는 만성 특발성 염증성 질환이다. 표현형은 RA와 일부 유사하다. 류마티스성 인자 양성인 일부 환자는 소아 류마티스성 관절염으로 분류된다. 이 질환은 소수관절, 다발관절 및 전신의 3개의 주 카테고리로 세분류된다. 관절염은 심할 수 있고, 일반적으로 파괴성이며, 관절강직 및 성장 지연에 이른다. 다른 소견은 만성 전방 포도막염 및 전신 아밀로이드증을 포함할 수 있다.
척추관절병증은 HLA-B27 유전자 산물의 발현과 공통된 임상적 특징 및 관련을 갖는 질환 군이다. 질환은 강직 척추염, 레이터(Reiter) 증후군(반응 관절염), 염증성 장 질환 관련 관절염, 건선 관련 척추염, 소아 발생 척추관절병증 및 미분화 척추관절병증을 포함한다. 특징은 척추염을 수반하거나 그렇지 않는 천골장골관절염; 염증성 비대칭 관절염; HLA-B27(I군 MHC의 HLA-B 유전자자리의 혈청학적 규정 대립유전자)과의 연관성; 눈 염증; 및 다른 류마티스성 질환과 관련된 자가항체의 부재를 포함한다. 질병의 유도에 대한 핵심으로서 가장 고려되는 세포는 I군 MHC 분자에 의해 제공된 항원을 목표로 하는 세포인 CD8+ T 림프구이다. CD8+ T 세포는 I군 MHC 대립유전자 HLA-B27에 대해, 이것이 I군 MHC 분자에 의해 발현된 이종 펩티드인 것처럼 반응할 수 있다. HLA-B27의 에피토프가 박테리아 또는 다른 미생물 항원 에피토프를 모방함으로써 CD8+ T 세포 반응을 유도할 수 있다고 가정되어 왔다.
전신 경화증(피부경화증)의 병인은 알려져 있지 않다. 질병의 특징은 피부 경화이고, 이것 역시 활성 염증 과정에 의해 유도된다. 피부경화증은 국소 또는전신성일 수 있다. 혈관 병변이 흔하고, 전신 경화증의 전개에서 미소혈관에서의 내피 세포 손상이 초기의 중요한 사건이다. 혈관 손상은 면역 매개될 수 있다. 피부 병변에서 단핵 세포 침윤뮬의 존재 및 다수의 환자에서 항핵 항체의 존재에 의해 면역학적 기초가 암시된다. ICAM-1은 피부 병변에서 섬유모세포의 세포 표면 상에서 종종 상승조절되고, 상기 세포와 T 세포의 상호작용이 질병의 발병에 역할을 할 수 있다는 것을 암시한다. 관련된 다른 기관은 위장관: 연동/운동 이상을 초래하는 평활근 위축 및 섬유증; 신장: 소 궁상 및 소엽사이 동맥에 영향을 미쳐서 신 피질 혈류의 감소를 가져오는 동심 내피밑 내막 증식은 단백뇨, 질소혈증 및 고혈압을 야기한다; 골격근: 위축, 간질 섬유증, 염증; 폐: 간질 폐렴 및 간질 섬유증; 및 심장: 수축띠 괴사, 흉터형성/섬유증을 포함한다.
피부근육염, 다발근육염 등을 비롯한 특발성 염증성 근육병증은 병인이 알려지지않은 만성 근육 염증 질환이며, 근육 약화를 초래한다. 근육 손상/염증은 종종 전신성 및 진행성이다. 자가항체가 대부분의 형태와 관련된다. 근육염-특이성 자가항체는 단백 합성에 관련된 성분, 단백질 및 RNA에 대하여 그 기능을 억제한다.
쇼그렌(Sjogren) 증후군은 면역-매개 염증 및 이에 따른 눈물샘 및 침샘의 기능적 파괴에 기인한다. 이 질병은 염증성 연결 조직 질병과 관련이 있거나 이를 수반할 수 있다. 이 질병은 소 RNA-단백질 복합체인 Ro 및 La 항원에 대한 자가항체 생성과 관련된다. 병변은 담관성 간경화, 말초 또는 감각 신경병증 및 촉지 자색반을 비롯한 기타 소견과 함께 건조 각막결막염, 구강건조를 초래한다.
전신 혈관염은 일차 병변이 염증 및 이에 따른 혈관 손상이고, 이것이 손상된 혈관에 의해 공급되는 조직의 허혈/괴사/변성 및 어떤 경우에는 궁극적으로 말단-기관 기능장애를 초래하는 질병이다. 혈관염은, 특히, 면역 복합체의 형성과 관련된 질환에서 류마티스성 관절염, 전신 경화증 등과 같은 다른 면역-염증 매개 질환의 이차 병변 또는 후유증으로 일어날 수도 있다. 일차 전신 혈관염 군의 질환은 전신 괴사 혈관염: 결절 다발동맥염, 알레르기 혈관염 및 육아종증, 다발혈관염; 베게너(Wegener) 육아종증; 림프종모양 육아종증; 및 거대 세포 동맥염을 포함한다. 잡종 혈관염은 점막피부 림프절 증후군(MLNS 또는 가와사키(kawasaki)병), 단리된 CNS 혈관염, 베헷(Behet)병, 폐쇄 혈전혈관염(부르거(Buerger)병) 및 피부 괴사 혈관염을 포함한다. 열거한 대부분의 혈관염의 발병 기전은 주로 혈관벽에 면역글로불린 복합체의 침착 및 그에 따른 ADCC, 보체 활성화 또는 둘 다를 통한 염증성 반응의 유도에 기인하는 것으로 생각된다.
사르코이드증은 병인이 알려지지 않은 질환으로, 인체의 거의 모든 조직에서 상피 육아종의 존재를 특징으로 하며, 가장 흔하게는 폐가 관련된다. 발병은 질병 부위에서 활성화된 대식세포 및 림프계 세포의 지속, 및 이들 세포에 의해 방출된 국소 및 전신적으로 활성인 생성물의 유리에 기인한 만성 후유증을 포함한다.
자가면역성 용혈성 빈혈, 면역성 범혈구감소증 및 발작성 야간 혈색소뇨증을 포함하는 자가면역성 용혈성 빈혈은 적혈구 세포(및 일부 경우, 혈소판도 포함하는 기타 혈구 세포)의 표면 상에 발현되는 항원과 반응하는 항체의 생성의 결과이다.
혈소판감소성 자반병을 포함하는 자가면역성 혈소판 감소증 및 기타 임상상황에서의 면역 매개성 혈소판 감소증에서, 혈소판 파괴/제거는 혈소판에 항체 또는 보체가 부착된 후 보체 용해, ADCC 또는 FC-수용체 매개 기전에 의해 제거되는 결과로서 일어난다.
그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 소아 림프구성 갑상선염 및 위축성 갑상선염을 포함하는 갑상선염은 갑상선에 존재하고 종종 특이적인 단백질과 반응하는 항체의 생성을 갖는 티로이드 항원에 대한 면역성 반응의 결과이다. 실험 모델은 야생 모델(래트(BUF 및 BB 래트) 및 닭(비만 닭 계통)), 유도 모델(티로글로불린이나 갑상선 마이크로좀 항원(갑상선 과산화효소)를 갖는 동물의 면역화)를 포함한다.
I형 당뇨병 또는 인슐린-의존성 당뇨병은 췌장 섬 β세포의 자가면역성 파괴이며, 이러한 파괴는 자가-항체 및 자가-반응성 T 세포에 의해 매개된다. 인슐린에 대한 항체 또는 인슐린 수용체도 인슐린-무-반응성의 표현형을 생성시킬 수 있다.
사구체신염 및 세뇨관 간질성 신염을 포함하는 면역 매개성 신질환(renal disease)은 직접적으로는 신장 항원에 대한 자가반응성 항체 또는 T 세포의 생성의 결과이고 간접적으로는 기타 비신장성 항원에 대해 반응성인 신장 내의 면역 복합체 및(또는) 항체의 침적의 결과인 신장 조직에 대한 항체 또는 T 림프구 매개 손상의 결과이다. 따라서, 면역 복합체의 형성을 가져오는 기타 면역 매개성 질환도 간접적 후유증으로서 면역 매개성 신질환을 유발할 수 있다. 직접 및 간접 면역 기전 둘 다 결과적 기관 기능 손상을 갖는 신장 조직들에서 병변(lesion)의 진행을형성 또는 유발하는 염증성 반응을 가져오고, 일부 경우 신질환(renal failure)으로 진행된다. 체액성 및 세포성 면역 기전 둘 다 병변의 발생기전에 포함될 수 있다.
다발성 경화증을 포함하는 중추 및 말초 신경계의 탈수초 질환, 특발성 탈수초성 다발신경병증 또는 길랑-바레 증후군, 및 만성염증 탈수초 다발신경병증은 자가면역에 기인한 것으로 생각되며, 핍지교세포 또는 미엘린에 직접적으로 유발된 손상의 결과로서 신경 탈수초를 가져온다. MS에서, 질병 유발 및 진행이 T 림프구에 의존적이라는 제시에 대한 증거가 있다. 다발성 경화증은 T 림프구 의존성이고 재발-이장성 경로 또는 만성 진행성 경로를 갖는 탈수초 질환이다. 그 병인은 알려져 있지 않다. 그러나, 바이러스 감염, 유전적 소인, 환경 및 자가면역성 모두가 기여한다. 병변은 주로 T 세포 매개된, 미세아교 세포의 침윤 및 침윤 대식세포를 포함하고, CD4+T 림프구는 병변에서의 주된 세포 형태이다. 핍지교세포 괴사에 이은 탈수초의 기전은 알려져 있지 않지만, T 림프구에 의해 작동되는 것 같다.
호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증 및 과민성 폐렴을 포함하는 염증성 및 섬유성 폐질환은 불규칙적 면역-염증성 반응을 포함할 수 있다. 그러한 반응의 억제는 치료적 이점이 있을 것이다.
수포성 피부병, 다형 홍반 및 접촉 피부염을 포함하는 자가면역성 또는 면역-매개성 피부병은 그 발생이 T 림프구 의존성인 자가-항체에 의해 매개된다.
건선은 T 림프구-매개 염증성 질환이다. 병변은 T 림프구, 대식세포 및 항원처리세포 및 일부 호중구의 침윤을 포함한다.
천식, 알러지성 비염, 아토피 피부염, 음식물 과민반응 및 두드러기를 포함하는 알러지성 질환은 T 림프구 의존성이다. 이들 질환은 주로 T 림프구 유도 염증, IgE 매개-염증, 또는 이 둘의 조합에 의해 주로 매개된다.
이식 거부 반응 및 이식편-숙주 반응질환(GVHD)를 포함하는 이식 관련 질환은 T 림프구 의존성이고, T 림프구 기능의 억제가 개선적이다.
면역 및(또는) 염증성 반응의 개입이 유리한 기타 질환은 바이러스 감염(AIDS, A, B, C, D, E형 간염을 포함하지만 이에 한하지 않음), 세균 감염, 진균 감염, 및 원충 및 기생충 감염(MLR을 자극하는 분자(또는 유도체/길항제)가 치료에 이용되어 감염 물질에 대한 면역 반응을 개선시킬 수 있음), 면역길핍 질환(MLR을 자극하는 분자/유도체/길항제가 치료에 이용되어 선천적, 후천적, 감염 유도(HIV 감염에서와 같이), 또는 의원성(즉, 화학요법으로부터와 같이) 면역결핍, 신생물 조건에 대한 면역 반응을 개선시킬 수 있음)을 포함하지만 이에 한하지 않는 감염성 질환이다.
길항제(들) 또는 아고니스트(들)이 순간 투여 또는 일정 기간에 걸친 지속적 주입과 같은 정맥내 투여, 근내, 복강내, 지주막하, 경구, 국소 또는 흡입 경로들과 같은 공지된 방법에 따라 투여될 수 있다. 경우에 따라, 다양한 시판되는 장치를 사용하여 미니펌프 주입을 통하여 투여를 할 수 있다. 당업계에서 기술되고 있는 유전자 요법 기술을 사용하여 길항제 또는 아고니스트를 이용할 수도 있다.
길항제 또는 아고니스트를 투여하는 유효 투여량 및 시간은 실험에 의해 결정될 수 있고, 그러한 결정은 당업계의 기술 범위에 속한다. 단일 또는 다중 투여량을 이용할 수 있다. 현재 단독으로 사용되는 길항제 또는 아고니스트의 유효 투여량 또는 효과적인 양은 1일 당 체중 1kg 당 약 1㎍ 내지 약 100mg일 수 있다고 여겨진다. 투여량의 종간차이 예측(interspecies scaling)은 당업계에 공지된 방식, 예를 들어 문헌 [Pharmaceut. Res., 8:1351 (1991)](Mordenti 등)에 기술된 바와 같은 방식으로 행할 수 있다.
그의 아고니스트 또는 길항제의 생체내 투여를 이용할 경우, 통상적 투여량은 1일 당 포유동물 체중 1kg 당 약 10ng 내지 100mg 이상으로 변할 수 있고, 바람직하게는 투여 경로에 따라 약 1㎍/kg/일 내지 10mg/kg/일일 수 있다. 특정 투여량 및 전달 방법에 대한 설명은 문헌에 제공되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,657,760호, 제5,206,344호 또는 제5,225,212호 참조). 상이한 제형들이, 예를 들어 하나의 기관 또는 조직을 표적으로 하는 투여가 다른 기관 또는 조직에 대한 것과 상이한 방식으로 전달할 필요가 있을 수 있는 상이한 처리 화합물 또는 상이한 장애에 효과적일 것이라는 것이 예상된다. 당업계의 숙련자들은 투여될 길항제 또는 아고니스트의 투여량이 예를 들어, 상기 아고니스트 또는 길항제를 투여받을 포유동물, 투여경로 및 포유동물에 투여되는 기타 약물 또는 치료 요법에 따라 변할 것이라는 것을 이해할 것이다.
세포 형태 및(또는) 질병의 경중에 따라, 길항제 항체 또는 아고니스트 항체 약 1㎍/kg 내지 15mg/kg(예; 0.1-20mg/kg)이, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의하든 지속 주입에 의하든, 투여에 대한 초기 후보 투여량이다. 전형적 1일 투여량은 상기 요인들에 따라, 약 1㎍/kg 내지 100mg/kg 이상일 수 있다. 며칠 이상에걸친 반복 투여의 경우, 조건에 따라, 목적하는 질환 증상의 억제가 일어날 때까지 처리를 유지한다. 그러나, 다른 투여량 처방이 유용할 수 있다.
경우에 따라, 임의의 길항제 또는 아고니스트의 투여 전에, 포유동물 또는 환자를 시험하여 TALL-1, APRIL, TACI, BCMA, TACIs 또는 BR3의 활성 또는 수준을 결정할 수 있다. 이러한 시험은 혈청 표본 또는 말초 혈액 백혈구의 ELISA 또는 FACS에 의해 행할 수 있다.
길항제 또는 아고니스트의 단독 형태가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, TACIs 수용체 면역어드헤신 분자와 같은 TALL-1 길항제를 투여할 수 있다. 별법으로는, 숙련자는 상기 방법 중 길항제 또는 아고니스트의 조합(예를 들어, TACIs 수용체 면역어드헤신 및 항-APRIL 항체의 조합)을 이용하는 것을 택할 수 있다. 이중 길항제(dual antagonist), 즉, TALL-1 및 APRIL 모두 차단 또는 억제하는 작용을 하는 길항제를 이용하는 것이 더 바람직할 수 있다. 그러한 길항제 분자는 예를 들어 TALL-1과 APRIL 사이에 또는 TACI, TACIs, BR3 및 BCMA 사이에 보전되는 에피토프에 결합될 수 있다.
추가적 치료법이 상기 방법에 사용될 수 있음을 고려한다. 하나 이상의 다른 치료법들에는 방사능 투여 요법, 당업계에 공지되고, 상기 단원 I에 특정적으로 추가 정의된 시토킨(들), 성장 억제제(들), 화학치료제(들), 세포살상제(들), 티로신 키나아제 억제제들, 라스 파네실 전달효소 억제제들, 혈관형성 억제제들 및 시클린-의존성 키나아제 억제제들의 투여가 있지만 이에 한하지 않는다. 또한, 치료법은 Rituxan(상표명) 또는 Herceptin(상표명)과 같은 종양 항원뿐만 아니라 항-VEGF와 같은 항-혈관생성 항체를 표적으로 하는 치료 항체에 기초한다.
화학치료 제제에 대한 제조 및 투여 스케쥴을 제조자 지침 또는 숙련된 실행자에 의해 실험적으로 결정되는 바와 같이 사용할 수 있다. 그러한 화학요법을 위한 제제 및 투여 스케쥴은 또한 문헌 [Chemotherapy ServiceEd., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에 기술되어 있다. 화학치료제는 예를 들어 길항제의 투여 전에 또는 후에 투여되거나, 동시에 제공될 수 있다. 길항제는, 예를 들어, 온나프리스톤(onapristone)(EP 616812 참조)과 같은 항-프로게스테론 또는 타목시펜과 같은 항-에스트로겐 화합물과 그러한 분자들에 대해 공지된 투여량으로 배합할 수 있다.
CD20, CD11a, CD18, CD40, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, 혈관내피 성장 인자(VEGF) 또는 기타 TNFR 패밀리 멤버들(예; DR4, DR5, OPG, TNFR1, TNFR2)에 결합된 항체와 같은 기타 항원들에 대한 항체들을 투여하는 것도 바람직할 수 있다. 별법으로는, 또는 추가로는, 본 명세서에 개시된 동일하거나 2종 이상의 상이한 항원에 결합하는 2종 이상의 항체를 환자에게 공동투여할 수 있다. 때때로, 환자에게 1종 이상의 시토킨을 투여하는 것도 이로울 수 있다. 한 실시태양에서는, 본원의 상기 항체들은 성장억제제와 함께 투여된다. 예를 들어, 성장억제제를 먼저 투여하고, 이어서 본 발명의 길항제를 투여할 수 있다.
길항제 또는 아고니스트(및 1종 이상의 기타 치료제)를 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 길항제 또는 아고니스트의 투여 후, 시험관내 처리 세포를 분석할 수 있다. 생체내 처리가 있는 경우, 처리된 포유동물을 숙련된 실행자에게공지된 다양한 방식으로 모니터링할 수 있다. 예를 들면, Ig 생성과 같은 B 세포 활성 표지(marker)(비특이적 또는 항원 특이적)를 분석할 수 있다.
G. 스크리닝 방법
본 발명은 또한 APRIL/TACIs 상호작용 또는 TALL-1/TACIs/BR3 상호작용의 아고니스트 또는 길항제로서 작용할 수 있는 것들을 동정하는 분자의 스크리닝 방법을 포함한다. 그러한 분자들은 항체를 포함하는, 작은 분자 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 작은 분자의 예로는 작은 펩티드들 또는 펩티드류 분자들, 바람직하게는 가용성 펩티드들, 및 합성 비-펩티딜(non-peptidyl) 유기 또는 무기 화합물들이 있지만, 이에 한하지 않는다. 약물 후보군에 대한 스크리닝 분석은 본 발명에서 동정된 리간드 또는 수용체 폴리펩티드와 결합하거나 복합체를 형성하거나, 아니면 기타 세포 단백질과 이들 폴리펩티드의 상호작용에 간섭하는 화합물 또는 분자들을 동정하기 위해 고안된다. 그러한 스크리닝 분석은 작은 분자 약물 후보군을 동정하는데 특히 적합하게 하는, 화합물 라이브러리의 대량처리(high-throughput) 스크리닝에 따르는 분석을 포함할 것이다.
상기 분석은 당업계에 특성화가 잘 되어 있는, 단백질-단백질 결합 분석, 생화학 스크리닝 분석, 면역분석 및 세포-기재 분석을 포함하는 다양한 형식으로 행할 수 있다.
예를 들어, 길항제를 위한 분석은 본 발명에서 동정된 리간드 또는 수용체 폴리펩티드와 후보 약물을, 이들 두 성분들이 상호작용하게 하는데 충분한 시간 및조건하에서 접촉시킬 것을 요구하는 점에서 통상적이다.
결합 분석에서, 상호작용은 결합이고, 형성된 복합체는 반응 혼합물 중에서 단리시키거나 검출할 수 있다. 특정 실시태양에서는, 본 발명에서 동정된 상기 리간드 또는 수용체 폴리펩티드 또는 후보 약물을 고체 상에서, 예를 들면 미소적정판(microtiter plate) 상에서 공유 또는 비공유 부착에 의해 고정시킨다. 비공유 부착은 일반적으로 리간드 또는 수용체 폴리펩티드의 용액으로 상기 고체 표면을 코팅하고 건조시켜 행해진다. 별법으로는, 고정된 항체, 예를 들어 고정된 리간드 또는 수용체 폴리펩티드에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 그것을 고체 표면에 부착시킬 수 있다. 상기 분석은 검출가능한 라벨로 라벨링될 수 있는 비-고정화 성분을 고정된 성분, 예를 들어 부착 성분을 함유하는 코팅된 표면에 가하여 행해진다. 반응이 완료될 때, 비-반응성 성분들은, 예를 들어 세척에 의해 제거되고, 고체 표면상에 부착된 복합체들이 검출된다. 처음의 비-고정화 성분이 검출가능한 라벨을 지닐 경우는, 표면 상 고정된 표지의 검출은 복합체 형성이 일어났음을 가리킨다. 처음의 비-고정화 성분이 라벨을 지니지 않는 경우는, 예를 들어 고정화 복합체에 특이적으로 결합하는 라벨링된 항체를 사용하여 복합체 형성을 검출할 수 있다.
상기 후보 화합물이 본 발명에서 동정된 특정 리간드 또는 수용체 폴리펩티드와 상호작용을 하지만 결합하지는 않는다면, 그 폴리펩티드와의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 공지된 방법으로 분석할 수 있다. 그러한 분석에는 전통적인 접근법, 예를 들면, 가교결합, 공-면역침전(co-immunoprecipitation)및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 공-정제(co-purification)를 포함한다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌[Fields and Song,Nature (London), 340:245-246 (1989)](Fields와 공동연구자들), [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)](Chien 등)에 의해 기술되고, 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991)](Chevray와 Nathans)에 개시된 효모-기재 유전자 시스템을 이용하여 모니터링할 수 있다. 효모 GAL4와 같은 다수의 전사 활성화제는 두 개의 물리적으로 이산된 모듈 도메인(modular domain)(하나는 DNA-결합 도메인으로서 작용하고, 다른 하나는 전사-활성화 도메인으로서 기능함)으로 구성된다. 전기 문헌들에 기술된 효모 발현 시스템(일반적으로 "이중 하이브리드 시스템(two-hybrid system)"라 함)은 이러한 특성의 이점을 가지며, 이중 하이브리드 단백질(하나는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인에 융합되고, 다른 하나는 후보 활성화 단백질이 활성화 도메인이 융합됨)을 이용한다. GAL4-활성화 프로모터(promoter)의 조절하에 GAL1-lacZ 레포터 유전자(reporter gene)의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 의존한다. 상호작용 폴리펩티드를 함유하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 발색 기질로 검출한다. 이중 하이브리드 기술을 이용하는 두 개의 특이적 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용을 동정하기 위한 완전 키트(MATCHMAKER(상표명))는 클론테크(Clontech) 사로부터 구입할 수 있다. 이러한 시스템은 또한 특이 단백질 상호작용에 포함된 단백질 도메인을 맵핑하는 것 뿐 아니라 이들 상호작용에 중요한 아미노산 잔기 위치를 정확히 밝히는 것까지 연장될 수 있다.
본 발명에서 동정된 리간드 또는 수용체 폴리펩티드의 상호작용에 간섭하는 화합물 또는 분자들 및 기타 세포내 또는 세포외 성분들은 다음과 같이 시험할 수 있다: 일반적으로 반응 혼합물은 두 생성물의 상호작용 및 결합을 허용하는 시간 및 조건 하에서 세포내 또는 세포외 성분과 유전자의 생성물을 함유하도록 제조된다. 결합을 억제하는 후보 화합물 능력을 시험하기 위하여, 반응은 시험 화합물의 존재 및 부재하에 전개된다. 또한, 위약을 제3 반응 혼합물에 가하여 양성 대조군으로서 적용할 수 있다. 시험 화합물과 혼합물에 존재하는 세포내 또는 세포외 성분 간의 결합(복합체 형성)은 상기한 바와 같이 모니터링한다. 대조 반응(들)(단, 시험 화합물을 함유하는 반응 혼합물 중에서는 아님)에서 복합체의 형성은 시험 화합물과 그 반응 상대의 상호작용에 시험 화합물이 간섭하는 것을 나타낸다.
길항제에 대한 분석을 위해서, 리간드 또는 수용체 폴리펩티드를 특정 활성에 대하여 스크리닝할 화합물과 함께 세포에 가할 수 있고, 상기 리간드 또는 수용체 폴리펩티드의 존재하에 주목하는 활성을 억제하는 화합물의 능력은 그 화합물이 리간드 또는 수용체 폴리펩티드에 대한 길항제라는 것을 나타낸다. 별법으로는, 길항제는 그 리간드 또는 수용체 폴리펩티드 및 잠재적 길항제를 경쟁적 억제 분석에 대한 적절한 조건하에서 막-결합 폴리펩티드 수용체 또는 재조합 수용체와 결합시켜 검출할 수 있다. 리간드 또는 수용체 폴리펩티드는 수용체에 결합되는 폴리펩티드 수가 잠재적 길항제의 효능을 결정하는데 사용될 수 있도록, 방사능과 같은 것에 의해 라벨링될 수 있다. 수용체 코딩 유전자는 당업계의 숙련자에게 공지된 다수의 방법, 예를 들어, 리간드 패닝 및 FACS 분리(sorting)에 의해 동정할 수 있다. 문헌[Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)](Coligan 등). 바람직하게는, 폴리아데닐화 RNA가 리간드 또는 수용체 폴리펩티드에 대해 반응성인 세포로부터 제조되고, 이러한 RNA로부터 생성되는 cDNA 라이브러리가 리간드 또는 수용체 폴리펩티드에 대해 반응성이 아닌 기타 세포 또는 COS 세포를 트랜스펙션시키는데 사용되는 경우에 발현 클로닝이 이용된다. 유리 슬라이드 상에서 배양된 트랜스펙션된 세포를 라벨링된 리간드 또는 수용체 폴리펩티드에 노출시킨다. 리간드 또는 수용체 폴리펩티드는 위치-특이적 단백질 키나아제에 대한 인식 자리의 요오드화 또는 포접을 포함하는 다양한 수단에 의해 라벨링될 수 있다. 고정 및 배양 후, 슬라이드에 자가방사그래픽(autoradiographic) 분석을 적용한다. 양성 풀(pool)을 동정하고, 하위풀(sub-pool)을 제조하고, 상호작용적 하위풀 및 재스크리닝 방법을 이용하여 재트랜스펙션시키고, 최종적으로 추정되는 수용체를 코딩하는 단일 클론을 생성시킨다.
별법적 접근법으로서, 라벨링된 리간드 폴리펩티드를 수용체 분자를 발현하는 세포막 또는 추출 제제와 광친화성-연결(photoaffinity-linking)시킬 수 있다. 가교결합 물질은 PAGE에 의해 분해되고 X선 필름에 노출된다. 수용체를 함유하는 라벨링된 복합체는 절개되고 분해되어 펩티드 단편이 될 수 있고, 단백질 마이크로-서열분석을 적용할 수 있다. 마이크로-서열분석으로부터 얻어지는 아미노산 서열이, 추정되는 수용체를 코딩하는 유전자를 동정하기 위한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 일련의 퇴보된(degenerated) 올리고뉴클레오티드 프로브를 고안하는데 이용될 것이다.
H. 제품
본 발명의 또 다른 실시태양에서는, 상기 장애들의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기로는 병, 바이알, 주사기 및 시험관을 예로 들 수 있다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 만들 수 있다. 용기는 증상 치료에 효과적인 조성물을 보유하고, 무균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 상기 용기는 정맥주사 용액 포장 또는 피하주사용 바늘에 의해 관통가능한 격막을 갖는 바이알일 수 있음). 조성물 중의 활성 물질은 길항제(들) 또는 아고니스트(들)을 포함할 수 있다. 용기 상의 라벨 또는 용기에 연결된 라벨 조성물이 선택된 증상 치료에 사용됨을 나타낸다. 상기 제품은인산염-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액과 같은 제약적으로 허용가능한 완충액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질(기타 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 사용을 위한 지침을 갖는 패키지 삽입물들을 포함)을 추가로 포함할 수 있다.
하기 실시예들은 제한적이지 않은 방식으로 예시로서 제공된다. 본 명세서 내의 모든 인용 문헌들은 참고로 본 발명에 명시적으로 인용된다.
실시예 1: TACIs 및 BR3의 동정 및 발현 클로닝
키메릭 단백질("AP-TALL-1"이라 함)을 도 3에 도시된 아미노산 136-285로 이루어진 TALL-1 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 인간 태반 알칼리 인산화효소(AP)를이용하여 제조하였다. AP는 주형으로서 pAPtag-5 (Genehunter Corporation)를 이용한 PCR 증폭에 의해 얻었고, 이를 융합시키고 클로닝하여 TALL-1 의 N-말단에 AP를 갖는 발현 벡터, pCMV-1 플래그(Flag)(Sigma)를 만들었다. AP-TALL-1를 순간적으로 트랜스펙션시키고(Lipofactamine 시약(Gibco-BRL)을 이용), 인간 배아 신장 293 세포(ATCC)에서 발현시켰다. 트랜스펙션된 293 세포로부터의 조절된 배지(conditioned medium)를 여과하고(0.45 미크론), 4℃에서 20mM Hepes(pH 7.0) 및 1mM 아지드화나트륨을 함유하는 완충액 중에 저장하고, 후속 세포 염색 절차에 사용하였다.
TALL-1에 대한 수용체를 동정하기 위하여, cDNA 발현 라이브러리를 인간 비장 및 IM-9 세포(문헌 [Cell, 63:185 (1990)](Flanagan 등), [Cell, 83:1263-1271 (1995)](Tartaglia 등))로부터 유도된 PolyA+ mRNA 를 이용하여 pRK5 벡터(EP 307,247, 1989년 3월 15일 공개) 중에서 구성하였다. 상기 라이브러리로부터의 약 1000개의 cDNA 클론의 풀(Miniprep DNA(Qiagen))을 퓨진(Fugene) 6(Roche Molecular Biochemicals)를 이용하여 12웰 평판(plate) 중의 COS 7 세포(ATCC)로 트렌스펙션시키고 (Lipofectamine를 이용), 36 내지 48시간 후, AP-TALL-1 조절된 배지로 배양하고, 세척하고, 동일반응계내에서 AP 활성을 위해 염색하였다(얀(Yan) 등의 상기 문헌(2000)). 양성 풀은 연속적으로 더 작은 크기의 풀(TACI 및 BCMA 어느 것도 함유하지 않음)로 쪼개졌다. 수회 스크리닝 후, AP-TALL-1 결합 활성 코딩 cDNA를 동정하였다. cDNA 삽입물의 서열분석은 단일 예견된 막통과 영역을 갖는 단백질을 코딩하는 것으로 예측되는 단일 외래전사해독프레임(open readingframe)을 나타내었다. 이 폴리펩티드(도 6B의 아미노산 잔기 1-184)를 BR3로 칭하였다. (AP-TALL-1 및 AP-APRIL 결합 활성을 코딩하는 또다른 cDNA도 동정하였고, 이 분자는 하기하는 바와 같이 TACIs로서 동정되었다)
서열 정렬은 상기 BR3 분자가 TNF-수용체 수퍼패밀리(superfamily)의 멤버일 것 같지 않음을 나타낸다(상기 수퍼패밀리는 전형적으로 세포외 리간드 결합 도메인 내의 특징적 다중 시스테인-리치(cysteine-rich) 반복서열의 존재에 의해 정의됨). 이들 아미노산 가상반복서열(pseudorepeats)은 대체로 6개의 고도로 보전된 시스테인에 의해 형성된 3개의 분자내 이황화 결합에 의해 정의된다 (문헌 [Cell, 104:487-501 (2001)](Locksley 등)). 더욱이, BR3의 세포외 도메인은 TNF-수용체 패밀리의 임의의 멤버에 대한 상동성을 나타내지 않았다. 또한, BR3는 그 엑토도메인 중에 오직 4개의 시스테인 잔기만을 함유하였다. 데이타베이스 조사는 BR3의 추정적인 뮤린(murine) 오르토로그(orthologue)를 보여주었다(GenBank accession number AK008142). 상기 동정된 인간 BR3와 유사하게, 뮤린 BR3(mBR3)는 단지 4개의 시스테인 잔기만을 보유하였다. 전반적으로, hBR3 및 mBR3은 56% 동일성을 나타내었다. hBR3과 mBR3 둘 다 NH2-말단 시그날 펩티드가 결핍되었고, 이것은 이들이 타입 III 막통과 단백질임을 나타낸다(문헌 [virolgy, 201: 66-76 (1994)](Wilson-Rawls 등)). BR3의 세포내 도메인은 hBR3과 mBR3 사이에 고도로 보전된 것으로 보인다.
당업계의 숙련자에게 공지된 통상적 절차에 따라 노던 블롯팅을 행하였다.즉, 인간 및 뮤린 polyA+ RNA 일반적 조직 블롯(Clontech)을 제조자 지침에 따라 혼성화하였다. 인간 또는 뮤린 BR3의 영역을 코딩하는 뉴클레오티드에 상응하는 DNA 단편을 이용하여32P-라벨링된 프로브를 생성시켰다. 도 9B에 도시한 바와 같이, 상대적으로 높은 발현도가 인간 및 뮤린 비장 조직 및 뮤린 고환에서 검출되었다.
나아가, 인간 cDNA 패널의 PCR 분석은 휴지 CD19+ B-세포 내에서 인간 BR3의 최고 발현을 보여주었고(도 9C), 이것은 BR3이 TALL-1 또는 B-세포에 대한 수용체라는 것과 일치한다. 따라서, 인간 BR3의 발현 패턴은 TACI 및 BCMA와 구별된다. BCMA는 B세포 특이적이고 TACI는 B 세포와 활성화 T 세포 모두에 의해 발현되지만(문헌 [Science, 289:883-884 (2000)](Laabi 등), [Int. Immunol., 7:1093-1106 (1995)](Gras 등), [Science, 278:138-141 (1997)](Bulow 등), [Trends Immunol., 22:61-63 (2001)](Khare 등)), BR3은 휴지 B 세포에 의해 고도로 발현되고 또한 휴지 T 세포에서 검출될 수 있다. 뮤린 BR3에 대한 유전자는 B 세포 백혈병 및 림프종 경향이 있는 4개의 AKXD 마우스(mouse) 세포주 중 하나에서 전사적으로 활성화되는 것으로 보고되었다 (문헌[Genome Res,. 10:237-243 (2000)](Hansen 등)).
플래그-태그된(flag-tagged) 리간드는 다음과 같이 제조하였다. APRIL의 아미노산 105-205(도 4 참조)를 HindIII 자리에서 pCMV-1 플래그(Sigma)으로 클로닝하여, NotI 자리를 사용한 것을 제외하고는 플래그-APRIL에 대해 상기한 바와 같이, 플래그 시그날 및 태그 서열의 아미노산 1-24에 융합시켰다. APRIL 코딩 서열이 AP에 C-말단으로 융합되면서, AP가 플래그에 C-말단으로 융합되도록, APRIL의 아미노산 105-250(도 4 참조) 인간 태반 알칼리 인산화효소를 코딩하는 pCMV-1 플래그 벡터로 클로닝하여 AP-APRIL을 제조하였다. AP-TALL-1은 AP-APRIL에 대하여 상기한 바와 같이, TALL-1의 아미노산 136-285(도 3 참조)를 pCMV-1 플래그, AP 벡터로 클로닝하여 제조하였다. 이어서, 각각 태그된 단백질을 CHO 세포 또는 293 세포 내에서 발현시키고 M2 항-플래그 수지(Sigma)를 이용하여 정제하였다.
정제된 플래그-APRIL 또는 플래그-TALL-1 1㎍을 4℃에서 밤새 BR3 또는 TACI의 ECD의 IgG1-Fc 융합을 포함하는 정제된 인간 면역어드헤신 1㎍으로 배양하였다. 상기 TACI-ECD.hFc 면역어드헤신은 문헌 [Proc. Natil. Acad. Sci., 88: 10535-10539 (1991)](Ashkenazi 등)에 기술된 방법에 의해 제조하였다. 상기 면역어드헤신 구조물은 인간 TACI 폴리펩티드의 아미노산 2-166(도 1 참조)로 구성되었다. TACI-ECD 구조물은 이종(heterologous) 시그날 서열(pCMV-1 플래그의 pre-pro-트립신 아미노산 1-17 (Sigma))을 이용하고 TACI 서열의 인간 IgG1 Fc 영역 다운스트림을 코딩하여 CHO 세포 내에서 발현시킨 다음, 단백질 A 친화 크로마토그래피로 정제하였다. BR3-ECD 면역어드헤신은 상기 문헌(Ashkenazi 등)에 기술된 방법으로 제조하였다. 면역어드헤신 구조물은 인간 BR3 폴리펩티드의 아미노산 2-62(도 6B 참조)로 구성되었다. BR3-ECD 구조물은 이종 시그날 서열(pCMV-1 플래그의 pre-pro-trypsin 아미노산 1-17 (Sigma))을 이용하고 TACI 서열의 인간 IgG1 Fc 영역 다운스트림을 코딩하여 CHO 세포 내에서 발현시킨 다음, 단백질 A 친화 크로마토그래피로 정제하였다.
혼합물에 단백질 A-아가로스(Refligen)로의 수용체-면역어드헤신을 통한 면역침강을 적용하였다. 이어서, 면역침전물을 고추냉이(horseradish) 과산화효소-공액 항-플래그 M2 mAb (Sigma)로의 웨스턴 블롯에 의해 분석하여 플래그 태그 리간드를 검출하였다. 플래그-TALL-1(플래그-APRIL이 아님)을 hBR3-hFc와의 복합체에서 쉽게 검출한 반면, TACI-hFc는 플래그-TALL-1 및 플래그-APRIL 둘 다에 결합되었다. 이러한 결과는 TACI 및 BCMA와 달리, BR3이 특히 APRIL이 아니라 TALL-1에 결합된다는 것을 보여준다.
시험관내 분석에서, COS 7 세포(ATCC)를 트랜스펙션 24시간 전에 12웰 평판내에 뿌렸다. 이어서, 세포를 1 마이크로그램 TACI(상기 인간 TACI의 265개 아미노산 형태, pRK5B 벡터내에서 클로닝됨, 아래 참조) 또는 벡터 플라스미드 (pRK5B) 단독으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 18-24시간 후, 세포를 AP-TALL-1 또는 AP-APRIL을 함유하는 조절된 배지로 실온에서 1시간 동안 배양하고 문헌 [Cell, 83:1263-1271 (1995)](Tartaglia 등)에 기술된 바와 같이 동일반응계에서 AP 활성을 위해 염색하였다.
COS 7 세포 내로의 hBR3 또는 mBR3 발현 구조물의 트랜스펙션은 AP-TALL-1에 대한 강한 결합을 제공하지만, AP-APRIL에 대해서는 그렇지 않았다(도 10 참조, 데이타는 제시하지 않음). 대조적으로, AP-TALL-1 및 AP-APRIL 둘 다 TACI-트랜스펙션된 세포에 결합하였다. hBR3의 엑토도메인을 함유하는 인간 Fc 융합 단백질(hBR3-hFc)은 TALL-1의 전장 막통과 형태를 코딩하는 발현 구조물로 트랜스펙션된 COS 7 세포에 결합되었지만, APRIL 발현 세포에는 결합되지 않았다.
인간 TNF-알파를 pRK5B 벡터로 클로닝하였다(pRK5B는 SfiI 자리를 함유하지 않는 pRK5D의 전구체임, 문헌[Scuebcem 253:1278-1280 (1991)](Holmes 등) 참조). 세포 표면 상의 TNF-알파 발현을 검사하기 위해, 플래그 태그를 아미노산 70과 아미노산 71 사이에 삽입하였다(상기 문헌(Pennica 등)의 서열에 따른 번호매김을 이용). TALL-1(aa 75-285; 도 3 참조), 4-1BBL(aa 59-254; 문헌 [Eur. J. Immunol., 23:2631-2641 (1993)](Goodwin 등)), CD27 리간드 (aa 40-193; 문헌[Cell, 73:447-456 (1993)](Goodwin 등)), CD30 리간드 (aa 61-234; 문헌[Cell, 73:1349-1360 (1993)](Smith 등)), RANKL (aa 71-317; WO98/28426 참조), Apo-2 리간드 (aa 40-281; WO97/25428 참조) 또는 Apo-3L (aa 46-249; WO99/19490 참조)의 세포외 영역을 개별적으로 BamHI 자리에서 클로닝하였다. 이것은 다양한 리간드로부터 세포외 영역 및 TNF-알파로부터 세포내 및 막통과 영역을 갖는 키메릭 리간드를 생성시켰다. APRIL(도 4 참조) 및 EDA-A1에 대하여, EDA-A2(상기 문헌(Srivastrava 등) 참조), 플래그 태그가 없는 전장 cDNA 클론을 사용하였다.
이어서, 트랜스펙션된 COS 7 세포를 TACI.ECD.hFc 면역어드헤신, hBr3-hFc, 또는 mBR3-hFc(상기한 바와 같이 제조)로 배양하였다. 세포를 PBS 중에서 1시간 동안 1㎍/ml에서 TACI ECD-IgG(또는 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci., 88:10535-10539 (1991)](Ashkenazi 등)에 기술된 대로 제조된 TNFR1-IgG 구조물)로 배양하였다. 이어서, 세포를 PBS로 3회 세척하고 PBS 중의 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 비오틴화(biotinylated) 염소 항-인간 항체(Jackson Labs, 1:200 희석)로의 배양에 이어서, Cy3-스트렙타비딘(Jackson Labs, 1:200 희석)에 의해 세포 염색을가시화하였다. hBR30hFc처럼, 뮤린 BR3-Fc도 단지 TALL-1-트랜스펙션되었지만 APRIL-트랜스팩션되지 않은 COS 7 세포에 결합되었다(데이타는 제시하지 않음). 나아가, hBR3-hFc는 몇몇 다른 TNF 패밀리 멤버들(CD27L, CD30L, CD40L, EDA-A1, EDA-A2, 4-1BBL, FasL, Apo2L/TRAIL, Apo3L/TWEAK, OX-40L, RANKL/TRANCE 또는 GITRL을 포함)을 발현하는 세포에 결합하지 못하였다(데이타는 제시하지 않음). 대조적으로, TACI-hFc 융합 단백질은 TALL-1 또는 APRIL 중 어느 하나로 트랜스펙션된 세포에 결합하였다(도 10).
NF-kB 분석에서는, 293 세포(ATCC)를 1 x 105세포/웰로 12-웰 평판에 트랜스펙션 24시간 전에 뿌리고, ELAM-루시퍼라제 레포터 유전자 플라스미드 0.25㎍, pRL-TK(Promega) 25ng 및 각각의 발현 구조물 지시량(도 10 참조)으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 DNA의 총량을 빈 pRK5B 벡터로 보충하여 1mg으로 일정하게 유지시켰다. 세포를 트랜스펙션 20 내지 24시간 후 배양하고, 레포터 유전자 활성을 이중-루시퍼라제 레포터 분석 시스템(Dual-Luciferase Reporter Assay System; Promega)으로 결정하였다.
293 세포로의 트랜스펙션 시, TACI 및 BCMA 둘 다 레포터 유전자 분석에 의해 결정된 바와 같이, 투여량 의존 방식으로 충분한 NF-kB 활성화를 유도하였다. 비슷한 조건 하에서, hBR3 및 mBR3 모두 NF-kB의 검출가능한 활성화를 유발하지 않았다(도 10). BR3-트랜스펙션된 세포가 TACI 또는 BCMA-트랜스펙션된 세포와 동등한 수준으로 리간드(AP-TALL-1)를 결합시키기 때문에, 이 분석에서의 BR3의 NF-kB활성화 실패는 BR3의 불량한 발현 때문인 것 같지는 않다(도 10 참조, 데이타는 제시하지 않음).
비장에서의 BR3의 현저한 발현 및 특히 B 세포에 의한 발현이 그것이 TALL-1에 대한 기능적 수용체라는 것과 일치하지만, 그 발현 패턴은 TACI 및 BCMA와 구별된다. BCMA는 B 세포 특이적이고, TACI는 B-세포 및 활성화 T-세포 둘 다에 의해 발현된다(문헌 [Science,289:883-884 (2000)](Laabi 등), [Int. Immunol.,7:1093-1106 (1995)](Gras 등), [Science,278:138-141 (1997)](von Bulow 등), [Trends Immunol.,22:61-63 (2001)](Khare 등)). 대조적으로, BR3은 휴지 B 세포에 의해 고도로 발현되고, 휴지 T 세포에서 검출될 수 있다. 이것은 활성화시 하향조절되는 것으로 보인다. 흥미롭게도, mBR3에 대한 유전자는 B-세포 백혈병 및 림프종 경향이 있는 4개의 AKXD 마우스 세포주 중 하나에서 전사적으로 활성화되는 것으로 보고되었다(문헌 [Genome Res.,10:237-243 (2000)](Hansen 등)). BR3이 B-세포 항상성에서 중요한 수용체일 수 있고, 그의 조절곤란은 B-세포 신생물 발전에 기여할 수 있는 것으로 생각된다.
APRIL 및 TALL-1 둘 다 TACI 및 BCMA에 결합된다. 그러나, TACI-TALL-1 및 BCMA-APRIL이 바람직한 상대가 되는 경우 결합에서 약간의 우세함이 관찰된다. (Marsters 등의 상기 문헌(2000)). 대조적으로, 본 발명에서의 실험들은 TALL-1에 결합되지만 APRIL에 결합되지 않는 BR3을 보여준다. 본래 종양 세포 성장 인자로서 동정된 APRIL이 TACI 및 BCMA 둘 다에 결합하는 것으로 나타났지만 (Marsters 등의 상기 문헌(2000), [J. Biol. Chem.,275:35478 (2000)](Wu 등), [Nat.Immunol.,1: 252-256 (2000)](Yu 등)), B 세포 기능에서의 그 생리학적 역할(들)은 완전히 이해되지 않았다. BR3이 TALL-1에 특이적이기 때문에, TALL-1을 차단하지만 APRIL은 차단하지 않는 BR3-Fc의 투여(예; 마우스에 면역어드헤신의 투여)가 TACI 및 BCMA의 활성을 유도한 것으로 생각된다.
관련 A/J 세포주와 달리, 말초 B 세포에서의 상당한 결핍에 책임이 있는 Bcmd(B 세포 성숙 결손)라 칭하는 단일 상염색체 공우성 유전자자리(autosomal codominant locus)를 보유하는 단일 B 세포 결핍 A/WySnJ 마우스의 연구가 문헌 [J. Immunol., 157:598-606 (1996)](Lentz 등), [J. Immunol., 160:3743-3747 (1998)](Lentz 등), [Immunogenetics, 51:924-929 (2000)](Hoag 등)에 기술되어 있다. 마우스 염색체 15의 중간 영역에 Bcmd 유전자자리가 맵핑되는데, 이것은 인간 염색체 22 상에 BR3이 맵핑되는 경우에 대해 신테닉(syntenic)하다. A/WysnJ 마우스로부터의 비장 B 세포가 시험관내 및 생체내에서 재조합 TALL-1에 증식성 반응을 보이지 않는 것으로 보고되고 있다. 현재, Bcmd 유전자자리에 의해 유전적으로 정의된 바와 같이 상기 A/WySnJ 마우스에서 유전자 결손은 BR3을 코딩하는 유전자에 있는 것으로 생각된다. 출원인의 실험에서는, RT-PCR 분석은 A/WySnJ 마우스로부터의 비장 또는 B세포 RNA(미국 펜실베니아주 필라델피아 소재 펜실베이나 대학의 Michael Cancro 박사로부터 입수)에서 BR3 전사의 존재를 보여주지 못하였지만, TACI 대조구에 대한 전사는 동일 표본에서 쉽게 관찰되었다. 대조적으로, 완전 BR3 코딩 유전자는 A/J 마우스에게서 쉽게 검출되었다. 이들 데이타는 A/WySnJ 마우스에게서 관찰된 말초 B 세포의 결핍에 책임있는 유전자 결손에 의한 BR3의 불활성화와 일치한다. 현재, BR3에 의해 채택되는 시그날화 통로는 TALL-1의 B 세포 증식 효과의 원인일 수 있고, BR3의 부재하에 B 세포 항상성이 손상된다고 생각된다.
스크리닝에서 동정된 상기한 TACIs 분자는 도 5B의 아미노산 1 내지 246을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 것으로 밝혀졌다. BR3과 마찬가지로, 상기 폴리펩티드는 단일 시스테인-리치 도메인을 포함하는 것으로 보인다. 추정적 ECD는 도 5B의 아미노산 잔기 1 내지 119를 포함한다. 시험관내 결합 분석에서는(AP-TALL-1 염색 및 AP-APRIL 염색을 검출하기 위해 상기한 바와 같이 행함), TACIs는 TALL-1 및 APRIL 둘 다에 결합하는 것으로 밝혀졌다(데이타는 제시되지 않음).
실시예 2: 이. 콜라이에서의 TACIs 폴리펩티드의 발현 또는
BR3 폴리펩티드의 발현
이 실시예는 이. 콜라이에서의 재조합 발현에 의한 TACIs 폴리펩티드의 형성 및 BR3 폴리펩티드의 형성을 예시한다.
TACIs 폴리펩티드 발현의 경우, 전장 TACIs 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 DNA 서열을 선택된 PCR 프라이머를 이용하여 초기에 증폭시켰다. BR3 폴리펩티드의 발현의 경우, 전장 BR3 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 DNA 서열을 선택된 PCR 프라이머를 이용하여 초기에 증폭시켰다.
상기 프라이머들은 선택된 발현 벡터 상의 제한 효소 자리에 상응하는 제한 효소 자리를 함유해야 한다. 다양한 발현 벡터들을 이용할 수 있다. 적합한 벡터의 예는 pBR322(이. 콜라이로부터 유도; 문헌[Gene, 2:95 (1977)](Bolivar 등) 참조)이며, 이것은 암피실린 및 테트라시클린 내성에 대한 유전자를 함유한다. 벡터를 제한 효소로 소화시키고 탈인산화한다. 이어서, PCR 증폭 서열을 벡터에 접합시킨다. 상기 벡터는 바람직하게는 항생제 내성 유전자, trp 프로모터, 폴리-His 리더(leader)(첫번째 6개 STII 코돈, 폴리-His 서열 및 엔테로키나아제 분열 자리를 포함)를 코딩하는 서열, TACIs 폴리펩티드 코딩 영역 또는 BR3 폴리펩티드 코딩 영역, 람다 전사 종결자(terminator) 및 argU 유전자를 포함할 것이다.
이어서, 접합 혼합물을 사용하여 선택된 이. 콜라이 균주를 상기 삼브룩(Sambrook) 등의 문헌에 기술된 방법을 이용하여 형질전환시킨다. 형질전환체들은 LB 평판 상에서 생장 능력에 의해 동정되고, 이어서 항생제 내성 콜로니들이 선택된다. 플라스미드 DNA를 단리시킬 수 있고, 제한 분석 및 DNA 서열분석에 의해 확인할 수 있다.
선택된 클론은 항생제가 보충된 LB 브로쓰(broth)와 같은 액체 배지에서 밤새 배양시킬 수 있다. 철야 배양은 이후 더 대규모 배양을 접종하는데 이용될 수 있다. 이어서, 세포들을 목적하는 광학 밀도로 생장시키고, 그 동안 발현 프로모터가 작동된다.
추가의 몇 시간 동안 세포를 배양한 후, 세포를 원심분리에 의해 수거할 수 있다. 원심분리에 의해 얻은 세포 펠렛을 당업계에 공지된 다양한 제제를 이용하여 가용화할 수 있고, 가용화 TACIs 폴리펩티드 또는 가용화 BR3 폴리펩티드를 이어서 상기 폴리펩티드가 단단히 결합되게 하는 조건하에서 금속 킬레이트 컬럼을 이용하여 정제할 수 있다.
실시예 3: 포유동물 세포에서 TACIs 폴리펩티드의 발현 또는
BR3 폴리펩티드의 발현
이 실시예는 포유동물 세포에서 재조합 세포에 의한 TACIs 폴리펩티드 및 BR3 폴리펩티드의 형성을 예시한다.
벡터 pRK5 (1989년 3월 15일자로 공개된 EP 307,247 참조)는 발현 벡터로서 사용된다. 경우에 따라, 상기 삼브룩 등의 문헌에 기술된 바와 같은 접합 방법을 이용하여 TACIs 폴리펩티드 코딩 DNA가 삽입되게 하기 위해, TACIs 폴리펩티드-코딩 DNA를 선택된 제한 효소로 pRK5 내로 접합시킨다. 생성된 벡터는 pRK5-TACIs 폴리펩티드라 칭한다. 경우에 따라, 상기 삼브룩 등의 문헌에 기술된 바와 같은 접합 방법을 이용하여 BR3 폴리펩티드 코딩 DNA를 삽입되게 하기 위해, 상기 BR3 폴리펩티드-코딩 DNA를 선택된 제한 효소로 pRK5 내로 접합시킨다. 생성된 벡터는 pRK5-BR3 폴리펩티드라 칭한다.
한 실시태양에서는, 선택된 숙주 세포는 293 세포일 수 있다. 인간 293 세포(ATCC CCL 1573)를 우태아혈청 및 경우에 따라, 영양 성분 및(또는) 항생제가 보충된 DMEM과 같은 배지 내에서 조직 배양 평판 내에서 콘플루언스(confluence)가 되도록 생장시킨다. 약 10 마이크로그램의 pRK5-TACIs 폴리펩티드 DNA를 약 1 마이크로그램의 VA RNA 유전자 코딩 DNA(문헌 [Cell, 31:543 (1982)](Thimmappaya 등))와 혼합하고 1mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227M CaCl2500 마이크로리터에 용해시킨다. 별법으로는, 약 10 마이크로그램의 pRK5-BR3 폴리펩티드 DNA를 약 1 마이크로그램의 VA RNA 유전자를 코딩하는 DNA(문헌 [Cell, 31::543 (1982)](Thimmappaya 등))과 혼합하고 1mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227M CaCl2500 마이크로리터에 용해시킨다. 상기 벡터 혼합물에 50mM HEPES (pH 7.35), 280mM NaCl, 1.5mM NaPO4500마이크로리터를 적가하고, 10분 동안 25℃에서 침전물이 형성되게 한다. 침전물을 부유시키고 293 세포에 가하고 약 4시간 동안 37℃에서 침전되게 하였다. 배지를 흡입제거하고 PBS 중의 20% 글리세롤을 30초간 가하였다. 이어서, 293 세포를 무혈청 배지로 세척하고, 새로운 배지를 가하고 세포를 약 5일간 배양하였다.
트랜스펙션 후 약 24시간에, 상기 배지를 제거하고 배지(단독) 또는 200 마이크로Ci/ml35S-시스테인 및 200 마이크로Ci/ml35S-메티오닌을 함유하는 배지로 대체하였다. 12시간 배양 후, 조절된 배지를 수거하고, 스핀 필터 상에서 농축시키고, 15% SDS 겔 상에 놓았다. 처리된 겔을 건조시킬 수 있고, 선택된 시간 동안 필름에 노출시켜 TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드의 존재를 보여줄 수 있다. 트랜스펙션된 세포를 함유하는 배양물은 추가로 배양(무혈청 배지에서)될 수 있고, 배지를 선택된 바이오분석에서 시험한다.
별법적 기술에서는, TACIs 폴리펩티드 코딩 DNA 또는 BR3 폴리펩티드 코딩 DNA를 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)](Somparyrac 등)에 기술된 덱스트란 술페이트 방법을 사용하여 293 세포에 순간적으로 도입시킬 수 있다. 293 세포를 스피너 플라스크에서 최대 밀도로 생장시킨 다음 700 마이크로그램의pRK5-TACIs 폴리펩티드 DNA를 가하거나, 700 마이크로그램의 pRK5-BR3 폴리펩티드 DNA를 가한다. 우선, 세포들을 원심분리에 의해 스피너 플라스크로부터 농축시킨다. DNA-덱스트란 침전물을 4 시간 동안 세포 펠렛 상 배양시킨다. 세포를 90초간 20% 글리세롤로 처리하고, 조직 배지로 세척하고, 조직 배지, 5마이크로그램/ml 소 인슐린 및 0.1마이크로그램/ml 소 트랜스페린을 함유하는 스피너 플라스크에 재도입한다. 약 4일 후, 조절된 배지를 원심분리시키고, 여과하여 세포 및 잔해를 제거한다. 이어서, 발현 TACIs 폴리펩티드 또는 발현 BR3 폴리펩티드를 함유하는 표본을 농축시킬 수 있고, 투석 및(또는) 컬럼 크로마토그래피와 같은 임의의 선택 방법에 의해 정제할 수 있다.
또 다른 실시태양에서는, TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드를 CHO 세포에서 발현시킬 수 있다. pRK5-TACIs 폴리펩티드 벡터 또는 pRK5-BR3 폴리펩티드 벡터를 CaPO4또는 DEAE-덱스트란과 같은 공지된 시약을 사용하여 CHO 세포내로 트랜스펙션시킬 수 있다. 상기한 바와 같이, 세포 배양물을 배양할 수 있고, 배지를 배지(단독) 또는35S-메티오닌과 같은 방사라벨을 함유하는 배지로 대체할 수 있다. 목적하는 폴리펩티드의 존재를 측정한 후, 배지를 무혈청 배지로 대체할 수 있다. 바람직하게는, 배양물을 약 6일간 배양한 다음, 조절된 배지를 수거한다. 이어서, 발현 TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드를 함유하는 배지를 임의의 선택된 방법으로 농축시키고 정제한다.
에피토프-태그된 TACIs 폴리펩티드 또는 에피토프-태그된 BR3 폴리펩티드도숙주 CHO 세포에서 발현될 수 있다. TACIs 폴리펩티드 코딩 DNA 또는 BR3 폴리펩티드 코딩 DNA를 pRK5 벡터로부터 서브클로닝할 수 있다. 상기 서브클론 삽입물은 PCR에 의해 바큘로바이러스 발현 벡터 내로 폴리-His 태그와 같은 선택된 에피토프 태그를 갖는 프레임 내에서 접합될 수 있다. 이어서, 폴리-His 태그된 TACIs 폴리펩티드 코딩 DNA 삽입물 또는 폴리-His 태그된 BR3 폴리펩티드 코딩 DNA 삽입물을 안정한 클론의 선택을 위하여 DHFR과 같은 선택 표시자를 함유하는 SV40 구동 벡터로 서브클로닝시킬 수 있다. 최종적으로, CHO 세포를 SV40 구동 벡터로 (상기한 바와 같이) 트랜스펙션시킬 수 있다. 라벨링을 상기한 바와 같이 행하여 발현을 증명할 수 있다. 이어서, 발현 폴리-His 태그된 TACIs 폴리펩티드 또는 발현 폴리-His 태그된 BR3 폴리펩티드를 함유하는 배지를 농축시키고, Ni2+-킬레이트 친화 크로마토그래피와 같은 임의의 선택된 방법에 의해 정제할 수 있다.
실시예 4: 효모 중에서 TACIs 폴리펩티드 또는
BR3 폴리펩티드의 발현
하기 방법은 효모 중에서 TACIs 폴리펩티드 및 BR3 폴리펩티드의 재조합 발현을 기술한다.
먼저, 효모 발현 벡터들을 ADH2/GAPDH 프로모터로부터 TACIs 폴리펩티드의 분비 또는 세포내 생성을 위해 구성한다. 목적하는 TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 DNA, 선택된 시그날 펩티드 및 프로모터를 TACIs 폴리펩티드의 세포내 발현을 지시하는 선택된 플라스미드 중의 적합한 제한 효소 자리에 삽입한다. 분비를 위해,TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를, ADH2/GAPDH 폭진자를 코딩하는 DNA, 효모 알파-인자 분비 시그날/리더 서열 및 TACIs 폴리펩티드의 발현을 위한 연결기 서열(필요한 경우)과 함께, 선택된 플라스미드로 클로닝할 수 있다.
별법으로는, 효모 발현 벡터는 ADH2/GAPDH 프로모터로부터 BR3 폴리펩티드의 분비 또는 세포내 생성을 위해 구성한다. 목적하는 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 DNA, 선택된 시그날 펩티드 및 프로모터를 TACIs 폴리펩티드의 세포내 발현을 지시하는 선택된 플라스미드 중의 적합한 제한 효소 자리에 삽입한다. 분비를 위해, BR3 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를, ADH2/GAPDH 폭진자를 코딩하는 DNA, 효모 알파-인자 분비 시그날/리더 서열 및 BR3 폴리펩티드의 발현을 위한 연결기 서열(필요한 경우)과 함께, 선택된 플라스미드로 클로닝할 수 있다.
이어서, 효모 균주 AB110과 같은 효모 세포를 상기한 발현 플라스미드로 형질전환시키고, 선택된 발효 배지 내에서 배양할 수 있다. 형질전환된 효모 상징액을 10% 삼염화아세트산으로의 침전 및 SDS-PAGE에 의한 분리에 이어, 쿠마시 블루 염색약으로의 겔 염색에 의해 분석할 수 있다.
이어서, 재조합 TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드를 단리시키고 효모 세포를 발효 배지로부터 원심분리에 의해 제거한 다음 선택된 카트리지 필터를 이용하여 배지를 농축시켜 정제할 수 있다. TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드를 함유하는 농축액을 선택된 컬럼 크로마토그래피 수지를 이용하여 추가로 정제할 수 있다.
실시예 5: 바큘로바이러스-감염 곤충 세포에서의 TACIs 폴리펩티드 또는 BR3폴리펩티드의 발현
하기 방법은 바큘로바이러스 감염 곤충 세포에서 TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드의 재조합 발현을 기술한다.
TACIs 폴리펩티드 코딩 DNA 또는 BR3 폴리펩티드 코딩 DNA를 바큘로바이러스 발현 벡터 내에 함유된 에피토프 태그의 업스트림에 접합시킨다. 상기 에피토프 태그는 폴리-His 태그 및 면역글로불린 태그(IgG의 Fc 영역과 같이)를 포함한다. pVL1393(Novagen)과 같은 시판되는 플라스미드로부터 유도된 플라스미드를 포함하여, 다양한 플라스미드를 이용할 수 있다. 즉, TACIs 폴리펩티드 코딩 DNA 또는 TACIs 폴리펩티드 코딩 DNA의 목적하는 부분(막통과 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열과 같이)을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머로의 PCR에 의해 증폭시킨다. 별법으로는, BR3 폴리펩티드 코딩 DNA 또는 BR3 폴리펩티드 코딩 DNA의 목적하는 부분(막통과 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열과 같이)을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머로의 PCR에 의해 증폭시킨다. 5' 프라이머는 (선택된) 제한 효소 자리를 우회하여 도입할 수 있다. 이어서, 생성물을 선택된 제한 효소로 소화시키고, 발현 벡터로 서브클로닝시킨다.
재조합 바큘로바이러스를 리포펙틴(GIBCO-BRL로부터 구입가능)을 이용하여 상기 플라스미드 및 BaculoGold(상표명) 바이러스 DNA(Pharmingen)를 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda("Sf9")) 세포 (ATCC CRL 1711) 내로의 공트랜스펙션에 의해 생성시킨다. 28℃에서 4 내지 5일 배양 후, 방출된 바이러스를 수거하고 추가 증폭에 사용하였다. 바이러스 감염 및 단백질 발현을 문헌[Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)](O'Reilley 등)에 기술된 바와 같이 행하였다.
이어서, 발현된 폴리-His 태그된 TACIs 폴리펩티드 또는 발현된 폴리-His 태그된 BR3 폴리펩티드를, 예를 들어 Ni2+-킬레이트 친화 크로마토그래피로 다음과 같이 정제할 수 있다. 추출물을 문헌 [Nature, 362:175-179 (1993)](Rupert 등)에 기술된 바와 같이 재조합 바이러스-감염된 Sf9 세포로부터 제조한다. 즉, Sf9 세포를 세척하고, 초음파 처리 완충액(25ml Hepes, ph 7.9; 12.5mM MgCl2; 0.1mM EDTA; 10% 글리세롤; 0.1% NP-40; 0.4M KCl)에 재현탁시키고, 얼음 상에서 20초간 2회 초음파 처리를 한다. 초음파 처리물을 원심분리에 의해 투명하게 만들고, 상징액을 완충액(50mM 인산염, 300mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 7.8)을 가하여 50배 희석시키고, 0.45㎛ 필터를 통해 여과하였다. Ni2+-NTA 아가로스 컬럼(Qiagen으로부터 구입가능)을 베드 부피 5ml로 준비하고, 물 25ml로 세척하고, 충전 완충액 25ml로 평형 상태로 만들었다. 여과된 세포 추출물을 분 당 0.5ml로 컬럼에 충전시켰다. 컬럼을 기준선 A280까지 충전 완충액으로 세척하는데, 이 시점에서 분획 수거를 개시한다. 다음에, 컬럼을 이차 세척 완충액(50mM 인산염; 300mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 6.0)으로 세척하였는데, 이 용출액이 비특이적으로 단백질에 결합하였다. A280기준선에 다시 도달한 후, 컬럼을 이차 세척 완충액 중의 0 내지 500mM 이미다졸 구배로 전개한다. 1ml 분획들을 수거하고 SDS-PAGE 및 은 염색 또는 알칼리 인산화효소에 공액된 Ni2+-NTA(Qiagen)로의 웨스턴 블롯에 의해 분석한다. 용출된 His10-태그된 TACIs 폴리펩티드 또는 용출된 His10-태그된 BR3 폴리펩티드를 함유하는 분획으로 풀을 형성하고 충전 완충액에 대해 투석하였다.
별법으로는 IgG 태그된(또는 Fc 태그된) TACIs 폴리펩티드 또는 IgG 태그된(또는 Fc 태그된) BR3 폴리펩티드의 정제를, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 클로마토그래피를 포함하는 공지의 크로마토그래피 기술을 이용하여 행할 수 있다.
실시예 6: TACIs 폴리펩티드 및(또는) BR3 폴리펩티드 결합 항체의 제조
이 실시예는 TACIs 폴리펩티드 및(또는) BR3 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 제조를 예시한다.
모노클로날 항체를 제조하는 기술들은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면 상기 고딩(Goding)의 문헌에 기술되어 있다. 사용될 수 있는 면역원은 정제된 TACIs 폴리펩티드, 정제된 BR3 폴리펩티드, TACIs 폴리펩티드를 함유하는 융합 단백질, BR3 폴리펩티드를 함유하는 융합 단백질, 재조합 TACIs 폴리펩티드를 세포 표면 상에 발현하는 세포 및 재조합 BR3 폴리펩티드를 세포 표면 상에 발현하는 세포를 포함한다. 당업계의 숙련자라면 과도한 실험 없이 면역원을 선택할 수 있다.
Balb/c와 같은 마우스를 완전 프로인드 보강제(complete Freund's adjuvant)에 유화되고 피하 또는 복강내로 1 내지 100 마이크로그램의 양으로 주입되는, TACIs 폴리펩티드 면역원 또는 BR3 폴리펩티드 면역원으로 면역화하였다. 별법으로는, 면역원을 MPL-TDM 보강제(Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) 중에 유화시키고 동물의 뒷발바닥 내로 주입하였다. 이어서, 면역화 마우스를 선택된 보강제 중에 유화된 추가 면역원을 10 내지 12일 후에 제공하였다. 그 후, 몇 주 동안, 마우스들은 또한 추가 면역 주사로 부양될 수 있다. ELISA 분석으로 시험을 위한 레트로-오비탈 채혈에 의해 혈청 표본을 주기적으로 마우스들로부터 얻어 항-TACIs 폴리펩티드 항체 또는 BR3 폴리펩티드 항체를 검출하였다.
적합한 항체 적정 검출 후, 항체에 대한 "양성" 동물에 TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드의 최종 정맥주사를 할 수 있다. 3 내지 4일 후, 마우스를 희생시키고 비장 세포를 수거하였다. 이어서, 비장 세포를 P3X63AgU.1(ATCC No. CRL 1597로 이용가능)와 같은 선택된 뮤린 골수종 세포주에 융합시켰다(35% 폴리에틸렌 글리콜 사용). 융합은 하이브리도마 세포를 생성시켰고, 이것은 HAT(히폭산틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 함유하는 96웰 조직 배양 평판에 투입되어 비융합 세포, 골수종 하이브리드 및 비장 세포 하이브리드의 증식을 억제할 수 있다.
하이브리도마 세포는 TACIs 폴리펩티드에 대한 반응성 또는 BR3 폴리펩티드에 대한 반응성에 대해 ELISA에서 스크리닝될 것이다. TACIs 폴리펩티드 또는 BR3 폴리펩티드에 대한 목적하는 모노클로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포의 결정은 당업계 기술 범위에 속한다.
양성 하이브리도마 세포를 유전적 동계 BAlb/c 마우스에 복강내로 투여하여 항-TACIs 폴리펩티드 모노클로날 항체 또는 항-BR3 폴리펩티드 모노클로날 항체를 함유하는 복수(ascite)를 생성시킬 수 있다. 별법으로는, 하이브리도마 세포를 조직 배양 플라스크 또는 롤러 병에서 생장시킬 수 있다. 복수에서 생성된 모노클로날 항체의 정제는 황산암모늄 침전에 이은, 겔 배제 크로마토그래피에 의해 행할 수 있다. 별법으로는, 항체의 단백질 A 또는 단백질 G에 대한 결합에 기초한 친화 크로마토그래피를 이용할 수 있다.
실시예 7: 생체내 루푸스 모델에서 BR3-Fc 폴리펩티드의 효과
생체내 뮤린 모델에서 전신성 홍반성 루푸스(SLE 또는 루푸스)에 대하여 BR3-Fc 면역어드헤신 폴리펩티드의 효과를 실험하였다.
뮤린 BR3-Fc(실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된 면역어드헤신)를 6월령 NZB x NZW(F1) 마우스(군 당 12마리 마우스)에게 5주 동안(매주 3회 100㎍ 단백질 투여량) 복강내 주사로 투여하였다. 상기 NZB x NZW (F1) 마우스는 잭슨 랩(Jackson Labs)으로부터 입수하였고, 이것은 초기 단계 루푸스에 대한 확립된 동물 모델이다(문헌 [Relevance of systemic lupus erythematosus nephritis animal models to human disease, Foster MH, Sem. Nephrol., 19:122-24 (Jan. 1999)] 참조). 유사하게, 대조 동물에게는 염수를 주사하였다.
동물들을 격주로 다음과 같이 실험하였다: 생존 분석; 체중; dsDNA 항체 적정; 및 단백뇨 측정. 단백뇨 수준은 Multistix(상표명) 시약 스트립(Bayer)을 이용하여 처리 및 대조 동물들로부터 뇨 표본을 새로이 수거하여 측정하였다. DsDNA 항체 수준을 다음과 같이 처리 및 비처리 동물들에게서 측정하였다. 혈청을 6, 8 및 9월령에서 수거하고, 하기 프로토콜에 따라 분석 평판에서 시험하였다. 96-웰 평판(Nalgene NUNC-Immuno(상표명) MaxiSorp(상표명) 표면 평판)을 50㎍ 폴리-L-리신 100㎕(0.01% 용액, Sigma)(0.1M Tris, pH 7.5 에서 희석)로 실온에서 4시간 동안 코팅하였다. 평판을 10% 가열-불활성화(heat-inactivated) 우태아혈청(Gibco)이 보충된 인산염 완충 염수(PBS) 200㎕로 3회 세척하였다. 이어서, 평판을 20㎍/ml 폴리 데옥시아데닐-티미딜산(Sigma) 100㎕(0.1M Tris, pH 7.5로 희석)로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 평판을 10% 우태아혈청(Gibco)이 보충된 PBS 200㎕로 3회 세척하였다. 이어서, 평판을 10% 가열-불활성화 우태아혈청(Gibco)이 보충된 PBS 100㎕로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 평판을 10% 가열-불활성화 우태아혈청(Gibco)가 보강된 200㎕ PBS로 3회 세척하였다. 이어서, 평판을 10% 가열-불활성화 우태아혈청이 보강된 PBS 중에서 1:100으로 희석시킨 100㎕ 혈청 표본으로 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 평판을 10% 가열-불활성화 우태아혈청이 보강된 PBS 200㎕로 3회 세척하였다. 이어서, 10% 가열-불활성화 우태아혈청이 보강된 PBS 중에서 1:2000으로 희석된 HRP-공액 염소 항-마우스 IgG1 (Caltag Labs) 100㎕로 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 평판을 10% 가열-불활성화 우태아혈청이 보강된 PBS 200㎕로 3회 세척하였다. 이어서, 평판을 실온에서 10분간 전개 물질(기질 시약 A 및 B의 1:1 혼합물, BD Pharmingen) 100㎕로 배양하였다. 반응을 4.5N 황산 50㎕를 사용하여 중단시키고, 스펙트라맥스 340 플레이트 판독기를 사용하여 450nm에서 흡광도 값을 측정하였다.
결과는 도 11A 내지 11D에 나타낸다. 도 11A 및 11B는 BR3-Fc 처리 동물들이 단백뇨가 없다는 것을 보여준다. NZB x NZW (F1) 마우스에서, 6월령의 전형적 (비처리) 동물이 단백뇨 수준 약 0 내지 30mg/dl인 반면, 12월령의 경우 동물들은대체로 300mg/dl을 초과하는 단백뇨 수준을 보였고, 결과적으로 80% 치사율을 보였다. 상기 데이타는, BR3-Fc가 BR3-Fc 처리 동물들에게서 루푸스 진행과정동안 단백뇨를 차단할 수 있고, 신장 손상에 대해 보호한다는 것을 제시한다.
BR3-Fc 처리 동물들은 또한 개선된 생존율을 보였다. 도 11C에 도시한 바와 같이, BR3-Fc 투여는 동물들의 생존율을 개선시켰다. 40주령의 대조군에서는 생존율이 75% 미만이지만, BR3-Fc 처리 군에서는 100%의 동물들이 생존하였다. 항-dsDNA 항체 수준도 9월령의 대조군에 비하여 BR3-Fc 처리 동물들에게서는 현저하게 낮았다(도 11D). 이러한 데이타는 BR3-Fc 처리가 루푸스 마우스에게서 B 세포에 의한 자가-항체의 보호를 차단하였고 생체내 TALL-1 기능 차단에 의해 생존율이 개선되었음을 제시한다.

Claims (57)

  1. (a) 서열 번호 14(SEQ ID NO: 14)의 아마노산 잔기 1 내지 246의 서열을 포함하는 TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 DNA, 또는
    (b) 상기 (a)의 DNA 분자의 상보서열
    를 포함하는 단리된 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 DNA가 서열 번호 13(SEQ ID NO:13)의 코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
  3. 제1항에 있어서, 상기 DNA가 서열 번호 13의 코딩 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것인 핵산.
  4. (a) 서열 번호 13의 뉴클레오티드 코딩 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지고,
    (b) TACIs 폴리펩티드를 코딩하는
    DNA를 포함하는 단리된 핵산.
  5. (a) 서열 번호 14의 아미노산 잔기 1 내지 246을 포함하는 TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 DNA;
    (b) 상기 (a)의 DNA에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA 서열;
    (c) 유전암호의 퇴보(degeneracy of the genetic code)로 인하여 상기 (a)의 TACIs 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열; 및
    (d) 상기 (a), (b) 또는 (c)의 DNA에 대해 완전히 상보적인 DNA
    로 이루어진 군으로부터의 DNA를 포함하는 단리된 핵산.
  6. 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 대조 서열에 작동가능하게 연결된 벡터.
  8. 제6항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  9. 제8항에 있어서, CHO 세포인 숙주 세포.
  10. 제8항에 있어서, 이. 콜라이(E. coli)인 숙주 세포.
  11. 제8항에 있어서, 효모 세포인 숙주 세포.
  12. 제8항에 따른 숙주 세포를 상기 TACIs 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 배양하고, 상기 TACIs 폴리펩티드를 세포 배양물로부터 회수하는 것을 포함하는 TACIs 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  13. 도 5B의 아미노산 잔기 1 내지 246(서열 번호 14)을 포함하는 단리된 TACIs 폴리펩티드.
  14. 도 5B의 근접 아미노산 잔기 1 내지 246의 서열(서열 번호 14)을 포함하는 단리된 TACIs 폴리펩티드.
  15. 도 5B의 아미노산 잔기 1 내지 119(서열 번호 14)를 포함하는 단리된 가용성 TACIs 폴리펩티드.
  16. (a) 도 5B의 아미노산 잔기 1 내지 246 또는 1 내지 119(서열 번호 14)를 포함하는 TACIs 폴리펩티드, 및
    (b) 생물학적으로 활성 폴리펩티드인 상기 (a)의 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하는 단리된 TACIs 폴리펩티드.
  17. 이종 아미노산 서열에 융합된 제13항 내지 15항 중 어느 한 항에 따른 TACIs 폴리펩티드를 포함하는 키메릭 분자(chimeric molecule).
  18. 제17항에 있어서, 상기 이종 아미노산 서열이 에피토프 태그(epitope tag) 서열인 키메릭 분자.
  19. 제17항에 있어서, 상기 이종 아미노산 서열이 면역글로불린의 Fc 영역인 키메릭 분자.
  20. 제13항 내지 15항 중 어느 한 항에 따른 TACIs 폴리펩티드에 결합되는 단리된 모노클로날 항체.
  21. 제13항 내지 15항 중 어느 한 항에 따른 TACIs 폴리펩티드 및 담체를 포함하는 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 담체가 제약적으로 허용가능한 담체인 조성물.
  23. (a) 서열 번호 16(SEQ ID NO:16)의 아미노산 잔기 1 내지 184의 서열를 포함하는 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 DNA, 또는
    (b) 상기 (a)의 DNA 분자의 상보서열
    를 포함하는 단리된 핵산.
  24. 제23항에 있어서, 상기 DNA가 서열 번호 15(SEQ ID NO:15)의 코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
  25. 제24항에 있어서, 상기 DNA가 서열 번호 15의 코딩 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것인 핵산.
  26. (a) 서열 번호 15의 뉴클레오티드 코딩 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가지고,
    (b) BR3 폴리펩티드를 코딩하는
    DNA를 포함하는 단리된 핵산.
  27. (a) 서열 번호 16(SEQ ID NO:16)의 아미노산 잔기 1 내지 184를 포함하는 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 DNA;
    (b) 상기 (a)의 DNA에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA 서열;
    (c) 유전암호의 퇴보로 인하여 상기 (a)의 BR3 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열; 및
    (d) 상기 (a), (b) 또는 (c)의 DNA에 대해 완전히 상보적인 DNA
    로 이루어진 군으로부터의 DNA를 포함하는 단리된 핵산.
  28. 제23항, 제26항 및 제27항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  29. 제28항에 있어서, 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 대조 서열에 작동가능하게 연결된 벡터.
  30. 제28항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  31. 제30항에 있어서, CHO 세포인 숙주 세포.
  32. 제30항에 있어서, 이. 콜라이인 숙주 세포.
  33. 제30항에 있어서, 효모 세포인 숙주 세포.
  34. 제30항에 따른 숙주 세포를 상기 BR3 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 배양하고, 상기 BR3 폴리펩티드를 세포 배양물로부터 회수하는 것을 포함하는 BR3 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  35. 도 6B의 아미노산 잔기 1 내지 184(서열 번호 16)를 포함하는 단리된 BR3 폴리펩티드.
  36. 도 6B의 근접 아미노산 잔기 1 내지 184의 서열(서열 번호 16)를 포함하는단리된 BR3 폴리펩티드.
  37. 도 6B의 아미노산 잔기 1 내지 77 또는 2 내지 62(서열 번호 16)를 포함하는 단리된 가용성 BR3 폴리펩티드.
  38. (a) 도 6B의 아미노산 잔기 1 내지 77 또는 2 내지 62(서열 번호 16)를 포함하는 BR3 폴리펩티드, 및
    (b) 생물학적으로 활성 폴리펩티드인 상기 (a)의 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하는 단리된 BR3 폴리펩티드.
  39. 이종 아미노산 서열에 융합된 제35항, 제37항 및 제38항 중 어느 한 항에 따른 BR3 폴리펩티드를 포함하는 키메릭 분자.
  40. 제39항에 있어서, 상기 이종 아미노산 서열이 에피토프 태그 서열인 키메릭 분자.
  41. 제39항에 있어서, 상기 이종 아미노산 서열이 면역글로불린의 Fc 영역인 키메릭 분자.
  42. 제35항, 제37항 및 제38항 중 어느 한 항에 따른 BR3 폴리펩티드에 결합되는 단리된 모노클로날 항체.
  43. 제35항, 제37항 및 제38항 중 어느 한 항에 따른 BR3 폴리펩티드 및 담체를 포함하는 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 상기 담체가 제약적으로 허용가능한 담체인 조성물.
  45. 포유동물 세포를 효과적인 양의 TALL-1 폴리펩티드 길항제에 노출시키는 것을 포함하는 방법으로서, 이 때 상기 TALL-1 폴리펩티드 길항제는
    (a) TACIs 수용체 면역어드헤신(immunoadhesin);
    (b) BR3 수용체 면역어드헤신;
    (c) 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리옥시알킬렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 비단백성 폴리머에 연결된 TACIs 수용체;
    (d) 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리옥시알킬렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 비단백성 폴리머에 연결된 BR3 수용체;
    (e) TACIs 수용체 항체; 및
    (f) BR3 수용체 항체
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인,
    포유동물 세포에서 TALL-1 폴리펩티드 생물학적 활성을 중화하거나 억제하는방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 TACIs 수용체 면역어드헤신이 면역글로불린의 Fc 영역에 융합된 TACIs 세포외 도메인 서열을 포함하는 것인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 BR3 수용체 면역어드헤신이 면역글로불린의 Fc 영역에 융합된 BR3 세포외 도메인 서열을 포함하는 것인 방법.
  48. 제45항에 있어서, 상기 TALL-1 폴리펩티드 길항제가 포유동물 세포에서의 TALL-1 폴리펩티드 및 APRIL 폴리펩티드 생물학적 활성 둘 다 억제하거나 중화하는 길항제 분자를 포함하는 것인 방법.
  49. 제45항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 백혈구 세포를 포함하는 방법.
  50. 포유동물 세포를 효과적인 양의 APRIL 폴리펩티드 길항제에 노출시키는 것을 포함하는 방법으로서, 이 때 상기 APRIL 폴리펩티드 길항제는
    (a) TACIs 수용체 면역어드헤신;
    (b) 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리옥시알킬렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 비단백성 폴리머에 연결된 TACIs 수용체; 및
    (c) TACIs 수용체 항체
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인,
    포유동물 세포에서 APRIL 폴리펩티드 생물학적 활성을 중화하거나 억제하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 TACIs 수용체 면역어드헤신이 면역글로불린의 Fc 영역에 융합된 TACIs 세포외 도메인 서열을 포함하는 것인 방법.
  52. 제50항에 있어서, 상기 APRIL 폴리펩티드 길항제가 포유동물 세포에서의 TALL-1 폴리펩티드 및 APRIL 폴리펩티드 생물학적 활성 둘 다 억제하거나 중화하는 길항제 분자를 포함하는 것인 방법.
  53. 제50항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 백혈구 세포를 포함하는 방법.
  54. 항-TACIs 아고니스트 항체를 포함하는 효과적인 양의 TACIs 폴리펩티드 아고니스트에 포유동물 세포를 노출시키는 것을 포함하는, 포유동물 세포에서 TACIs 폴리펩티드 활성을 강화하거나 자극하는 방법.
  55. 항-BR3 아고니스트 항체를 포함하는 효과적인 양의 BR3 폴리펩티드 아고니스트에 포유동물 세포를 노출시키는 것을 포함하는, 포유동물 세포에서 BR3 폴리펩티드 활성을 강화하거나 자극하는 방법.
  56. 면역글로불린의 Fc 영역에 융합된 BR3 세포외 도메인 서열을 포함하는 효과적인 양의 BR3 수용체 면역어드헤신을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에게서 전신성 홍반성 루푸스를 치료하는 방법.
  57. 제5항 또는 제16항에 따른 TACIs DNA 또는 폴리펩티드, 또는 제27항 또는 제38항에 따른 BR3 DNA 또는 폴리펩티드를 사용하여 분석하는 것을 포함하는, TALL-1, TACI, TACIs, BCMA 또는 BR3의 길항제 또는 아고니스트로 작용하는 후보 분자를 동정하는 스크리닝 분석 실행 방법.
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Families Citing this family (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7833529B1 (en) 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
US20030095967A1 (en) 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
ES2267593T3 (es) * 2000-02-16 2007-03-16 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-april y celulas hibridomas.
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
US20040170997A1 (en) * 2001-02-28 2004-09-02 Shinji Irie Traf3-binding b-cell-specific receptor
AU2002311976A1 (en) 2001-05-24 2002-12-03 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against tumor necrosis factor delta (april)
US7112410B1 (en) 2001-08-29 2006-09-26 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor TR21 and methods based thereon
KR20050116360A (ko) * 2002-07-25 2005-12-12 제넨테크, 인크. Ｔａｃｉ 항체 및 그의 용도
US7700317B2 (en) 2003-03-28 2010-04-20 Biogen Idec Ma Inc. Truncated baff receptors
PT1631313E (pt) 2003-06-05 2015-07-02 Genentech Inc Terapêutica de combinação para distúrbios de células b
ES2697327T3 (es) 2003-11-06 2019-01-23 Seattle Genetics Inc Compuesto intermedio para la preparación de conjugados que comprenden derivados de auristatina y un enlazador
WO2005075511A1 (en) 2004-01-29 2005-08-18 Genentech, Inc. Variants of the extracellular domain of bcma and uses thereof
BRPI0510883B8 (pt) 2004-06-01 2021-05-25 Genentech Inc composto conjugado de droga e anticorpo, composição farmacêutica, método de fabricação de composto conjugado de droga e anticorpo e usos de uma formulação, de um conjugado de droga e anticorpo e um agente quimioterapêutico e de uma combinação
CN101027100A (zh) * 2004-07-22 2007-08-29 健泰科生物技术公司 治疗干燥综合征的方法
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
PL1791565T3 (pl) 2004-09-23 2016-10-31 Modyfikowane cysteiną przeciwciała i koniugaty
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
AP2007004034A0 (en) * 2004-12-31 2007-06-30 Genentech Inc Polypeptides sthat bind br3 and uses thereof
WO2007019575A2 (en) 2005-08-09 2007-02-15 Zymogenetics, Inc. Methods for treating b-cell malignancies using taci-ig fusion molecule
AU2006278227B2 (en) 2005-08-09 2011-10-20 Ares Trading S.A. Methods for the treatment and prevention of abnormal cell proliferation using TACI-fusion molecules
NZ597082A (en) 2005-10-13 2013-11-29 Human Genome Sciences Inc Methods and Compositions for Use in Treatment of Patients with Autoantibody Positive Diseases
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
ES2618543T3 (es) 2005-11-23 2017-06-21 Genentech, Inc. Métodos y composiciones relacionados con ensayos de linfocitos B
AU2007249223B2 (en) * 2006-05-15 2012-08-02 Ares Trading S.A. Methods for treating autoimmune diseases using a TACI-Ig fusion molecule
AU2008230777B8 (en) 2007-03-27 2014-07-03 Ares Trading S.A. Combination of BLyS and/or APRIL inhibition and immunosuppressants for treatment of autoimmune disease
PL2233149T3 (pl) 2007-10-16 2016-08-31 Zymogenetics Inc Kombinacja przezbłonowego aktywatora i ligandu cyklofiliny (taci) oraz przeciwciała anty-cd20 do leczenia chorób autoimmunologicznych
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
JP5867706B2 (ja) * 2009-03-02 2016-02-24 アデュロ・バイオテック・ホールディングス・ヨーロッパ・ベスローテン・フエンノートシャップＡｄｕｒｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ， Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ． 増殖誘導リガンド（ａｐｒｉｌ）に対する抗体
PT2464725T (pt) * 2009-08-11 2020-05-21 Hoffmann La Roche Produção de proteínas em meios de cultura celular isentos de glutamina
MX2012002766A (es) 2009-09-03 2012-04-02 Genentech Inc Metodos para el tratamiento, diagnosis y monitoreo de artritis reumatoide.
CA2809819A1 (en) 2009-09-09 2011-03-17 Centrose, Llc Extracellular targeted drug conjugates
WO2011109280A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Lerner Research Institute Methods and compositions to treat immune-mediated disorders
WO2011130598A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN101851278B (zh) * 2010-05-26 2013-03-13 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 B细胞激活因子拮抗剂及其制备方法与用途
MX336540B (es) 2010-06-08 2016-01-22 Genentech Inc Conjugados y anticuerpos manipulados geneticamente con cisteina.
JP2013530188A (ja) * 2010-06-18 2013-07-25 ヒューマン ゲノム サイエンシズ，インコーポレイテッド 喘息並びに呼吸器系の他のアレルギー性及び炎症性症状を治療するためのｂリンパ球刺激タンパク質アンタゴニストの使用
JP5889912B2 (ja) 2010-11-17 2016-03-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド アラニニルメイタンシノール抗体コンジュゲート
KR20140022815A (ko) 2011-02-28 2014-02-25 제넨테크, 인크. B-세포 길항제에 대한 반응을 예측하기 위한 생물학적 마커 및 방법
ES2567276T3 (es) 2011-05-12 2016-04-21 Genentech, Inc. Método de LC-MS/MS de monitoreo de múltiples reacciones para detectar anticuerpos terapéuticos en muestras de animales usando péptidos de cambio de marco
PT2750713E (pt) 2011-10-14 2016-01-20 Genentech Inc Pirrolobenzodiazepinas e conjugados das mesmas
AU2013215332A1 (en) 2012-01-31 2014-09-04 Genentech, Inc. Anti-Ig-E M1' antibodies and methods using same
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
US10695433B2 (en) 2012-10-12 2020-06-30 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
PL2906253T3 (pl) 2012-10-12 2019-02-28 Adc Therapeutics Sa Koniugaty pirolobenzodiazepina-przeciwciało anty-psma
NZ707543A (en) 2012-10-12 2018-09-28 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
BR112015008174B1 (pt) 2012-10-12 2022-12-27 Medimmune Limited Conjugados de pirrolobenzodiazepina-anticorpo, composição farmacêutica compreendendo ditos conjugados e usos dos mesmos para tratar doença proliferativa e cancêr
ES2680153T3 (es) 2012-10-12 2018-09-04 Adc Therapeutics Sa Conjugados de anticuerpos anti-PSMA-pirrolobenzodiazepinas
ES2530968T3 (es) 2012-10-12 2015-03-09 Spirogen Sarl Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de las mismas
JP6392765B2 (ja) 2012-10-12 2018-09-19 エイディーシー・セラピューティクス・エス・アーＡｄｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｓａ ピロロベンゾジアゼピン−抗体結合体
JP6307519B2 (ja) 2012-12-21 2018-04-04 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピンおよびその結合体
EA032986B1 (ru) 2012-12-21 2019-08-30 Медимьюн Лимитед Пирролобензодиазепины
ES2687439T3 (es) 2013-03-13 2018-10-25 Medimmune Limited Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de las mismas
NZ710745A (en) 2013-03-13 2019-03-29 Genentech Inc Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN105142674B (zh) 2013-03-13 2018-11-13 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓和其结合物
WO2015023355A1 (en) 2013-08-12 2015-02-19 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
NL2011406C2 (en) 2013-09-06 2015-03-10 Bionovion Holding B V Method for obtaining april-binding peptides, process for producing the peptides, april-binding peptides obtainable with said method/process and use of the april-binding peptides.
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2015052532A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3054985B1 (en) 2013-10-11 2018-12-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2015052535A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2015095223A2 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
WO2015095212A1 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
EP3082875B1 (en) 2013-12-16 2020-11-25 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
WO2016037644A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
JP6622293B2 (ja) 2014-09-12 2019-12-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド アントラサイクリンジスルフィド中間体、抗体−薬物複合体、及び方法
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CA2957354A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
BR112017005393A2 (pt) 2014-09-17 2017-12-05 Genentech Inc composto de fórmula i, método de preparação de um conjugado de fórmula a, conjugado de fórmula a1, composição compreendendo uma mistura dos compostos de conjugado de anticorpo-fármaco, composição farmacêutica, e uso de um conjugado ou de uma composição
JP6878287B2 (ja) 2014-11-25 2021-05-26 アーデーセー セラピューティクス ソシエテ アノニム ピロロベンゾジアゼピン−抗体コンジュゲート
CA2969689A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Genentech, Inc. Quaternary amine compounds and antibody-drug conjugates thereof
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
US20170315132A1 (en) 2016-03-25 2017-11-02 Genentech, Inc. Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
JP2019522633A (ja) 2016-05-20 2019-08-15 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｐｒｏｔａｃ抗体コンジュゲート及び使用方法
WO2017205741A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Genentech, Inc. Bioanalytical method for the characterization of site-specific antibody-drug conjugates
EP3464280B1 (en) 2016-06-06 2021-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
CN109689111B (zh) 2016-08-11 2024-04-05 基因泰克公司 吡咯并苯并二氮杂䓬前药及其抗体缀合物
CN110139674B (zh) 2016-10-05 2023-05-16 豪夫迈·罗氏有限公司 制备抗体药物缀合物的方法
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
PL3544636T3 (pl) 2017-02-08 2021-12-06 Adc Therapeutics Sa Koniugaty pirolobenzodiazepina-przeciwciało
PT3612537T (pt) 2017-04-18 2022-08-29 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepina
CN110536703A (zh) 2017-04-20 2019-12-03 Adc治疗有限公司 使用抗axl抗体-药物缀合物的组合疗法
EP3529364B1 (en) 2017-05-09 2020-01-01 Cyano Biotech GmbH Method of producing a non-ribosomal peptide from cyanobacteria
US11512114B2 (en) 2017-05-09 2022-11-29 Cyano Biotech Gmbh Modified microcystins and nodularins
MX2019015042A (es) 2017-06-14 2020-08-06 Adc Therapeutics Sa Regimen de dosificacion.
PL3668874T3 (pl) 2017-08-18 2022-03-28 Medimmune Limited Koniugaty pirolobenzodiazepin
MX2020003089A (es) 2017-09-20 2020-10-15 Ph Pharma Co Ltd Analogos de tailanstatina.
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2020006298A2 (en) * 2018-06-28 2020-01-02 University Of Southern California Cyclotide-based polypeptides for therapeutic targeting of baff receptors in sle
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
CA3115110A1 (en) 2018-10-24 2020-04-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
JP2022513198A (ja) 2018-12-10 2022-02-07 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｆｃ含有タンパク質への部位特異的コンジュゲーションのための光架橋性ペプチド
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
IL297980A (en) 2020-05-08 2023-01-01 Alpine Immune Sciences Inc Immunomodulatory proteins that inhibit april and baff and methods of using them
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds

Family Cites Families (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) * 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
JPS6023084B2 (ja) * 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4640835A (en) * 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4496689A (en) * 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
DE3675588D1 (de) * 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US5182196A (en) * 1985-10-09 1993-01-26 Biogen, Inc. Expression systems for overproduction of desired proteins
US5641663A (en) * 1985-11-06 1997-06-24 Cangene Corporation Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and other heterologous proteins from steptomyces
US6893625B1 (en) * 1986-10-27 2005-05-17 Royalty Pharma Finance Trust Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
IL85035A0 (en) * 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US4861579A (en) * 1988-03-17 1989-08-29 American Cyanamid Company Suppression of B-lymphocytes in mammals by administration of anti-B-lymphocyte antibodies
US5262309A (en) * 1988-09-22 1993-11-16 Teijin Limited Terminal modifications of tumor necrosis factor
US5225538A (en) * 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
EP0939121B2 (de) * 1989-09-12 2007-12-26 AHP Manufacturing B.V. TFN-bindende Proteine
US5519119A (en) * 1990-09-21 1996-05-21 Ishihara Sangyo Kaisha Ltd. Muteins of TNF pharmaceutical compositions and a method of making
CA2055168A1 (en) * 1990-11-21 1992-05-22 Walter Fiers Tnf-muteins
EP0940468A1 (en) * 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
SK376492A3 (en) * 1992-04-02 1995-06-07 Hoffmann La Roche Tnf - muteins and method of their production
US5540926A (en) * 1992-09-04 1996-07-30 Bristol-Myers Squibb Company Soluble and its use in B cell stimulation
US7744877B2 (en) * 1992-11-13 2010-06-29 Biogen Idec Inc. Expression and use of anti-CD20 Antibodies
DE69329503T2 (de) * 1992-11-13 2001-05-03 Idec Pharma Corp Therapeutische Verwendung von chimerischen und markierten Antikörpern, die gegen ein Differenzierung-Antigen gerichtet sind, dessen Expression auf menschliche B Lymphozyt beschränkt ist, für die Behandlung von B-Zell-Lymphoma
US5736137A (en) * 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5595721A (en) * 1993-09-16 1997-01-21 Coulter Pharmaceutical, Inc. Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20
US6509170B1 (en) * 1996-03-14 2003-01-21 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding human tumor necrosis factor delta
US6541224B2 (en) * 1996-03-14 2003-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor delta polypeptides
US6812327B1 (en) * 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
US5969102A (en) * 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
US6306393B1 (en) * 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6171586B1 (en) * 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US6171787B1 (en) * 1997-06-26 2001-01-09 Abbott Laboratories Member of the TNF family useful for treatment and diagnosis of disease
AU8296098A (en) * 1997-07-08 1999-02-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for homoconjugates of antibodies which induce growth arrest or apoptosis of tumor cells
JP2002516069A (ja) * 1997-09-30 2002-06-04 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー Ｔｎｆ関連死リガンド
US6297022B1 (en) * 1997-10-08 2001-10-02 Smithkline Beecham Corporation Method of identifying agonists and antagonists for tumor necrosis related receptor TR1
US6297367B1 (en) * 1997-12-30 2001-10-02 Chiron Corporation Polynucleotide encoding TNFL1
US6551795B1 (en) * 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
US6194551B1 (en) * 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6528624B1 (en) * 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) * 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6355782B1 (en) * 1998-07-09 2002-03-12 Baylor College Of Medicine Hypohidrotic ectodermal dyplasia genes and proteins
CN100409898C (zh) * 1998-08-11 2008-08-13 拜奥根Idec公司 包括施用抗-cd20抗体的b-细胞淋巴瘤联合疗法
US6224866B1 (en) * 1998-10-07 2001-05-01 Biocrystal Ltd. Immunotherapy of B cell involvement in progression of solid, nonlymphoid tumors
ATE437227T1 (de) * 1999-01-07 2009-08-15 Zymogenetics Inc Verfahren zur therapeutischen verwendung von löslichen rezeptoren br43x2
ES2204528T3 (es) * 1999-01-25 2004-05-01 Biogen, Inc. Baff, sus inhibidores y su uso en la modulacion de la respuesta de las celulas b.
US20030095967A1 (en) * 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
US6475986B1 (en) * 1999-02-02 2002-11-05 Research Development Foundation Uses of THANK, a TNF homologue that activates apoptosis
US6383276B1 (en) * 1999-03-12 2002-05-07 Fuji Photo Film Co., Ltd. Azomethine compound and oily magenta ink
US20030022233A1 (en) * 1999-04-30 2003-01-30 Raymond G. Goodwin Methods of use of the taci/taci-l interaction
AU4986700A (en) * 1999-05-06 2000-11-21 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 nucleic acid molecules, proteins, receptors and methods of use thereof
CA2375912C (en) * 1999-06-09 2014-03-11 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target b-cells
DE19930748C2 (de) * 1999-07-02 2001-05-17 Infineon Technologies Ag Verfahren zur Herstellung von EEPROM- und DRAM-Grabenspeicherzellbereichen auf einem Chip
SK288287B6 (sk) * 1999-08-17 2015-07-01 Biogen Idec Ma Inc. Protilátka proti sekvencii SEQ ID No: 1 alebo polypeptid s jej obsahom a ich použitie
UA74798C2 (uk) * 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
US20020006404A1 (en) * 1999-11-08 2002-01-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
CN1407901A (zh) * 1999-11-08 2003-04-02 Idec药物公司 使用抗cd40l抗体并联合抗cd20抗体和/或化疗剂和放疗治疗b细胞恶性瘤
CA2897626C (en) * 2000-02-11 2020-03-24 Biogen Idec Ma Inc. Heterologous polypeptide of the tnf family
US20030185796A1 (en) * 2000-03-24 2003-10-02 Chiron Corporation Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma
AU2001247737A1 (en) * 2000-03-24 2001-10-08 Chiron Corporation Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma using a combination of an antibodyto cd20 and interleuking-2
CA2404365A1 (en) * 2000-03-31 2001-10-11 Idec Pharmaceutical Corporation Combined use of anti-cytokine antibodies or antagonists and anti-cd20 for the treatment of b cell lymphoma
AU2001247616B2 (en) * 2000-04-11 2007-06-14 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
MXPA02010507A (es) * 2000-04-25 2003-05-14 Idec Pharma Corp Administracion intratecal de rituximab para el tratamiento de linfomas del sistema nervioso central.
ATE361318T1 (de) * 2000-05-12 2007-05-15 Amgen Inc Polypeptiden, die die april-vermittelte aktivierung von t-und b-zellen hemmen
WO2001097843A2 (en) * 2000-06-22 2001-12-27 University Of Iowa Research Foundation Methods for enhancing antibody-induced cell lysis and treating cancer
EP2267017A3 (en) * 2000-08-18 2011-07-06 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides for B lymphocyte stimulator protein (BLyS)
KR20040023565A (ko) * 2000-09-18 2004-03-18 아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션 Ｂ 세포 고갈/면역조절 항체 조합을 이용한 자가면역질환의 치료를 위한 조합 요법
UA83458C2 (uk) * 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
ES2329012T3 (es) * 2000-11-07 2009-11-20 Zymogenetics, Inc. Receptor del factor de necrosis tumoral humano.
EP1345968A2 (en) * 2000-12-28 2003-09-24 Altus Biologics Inc. Crystals of whole antibodies and fragments thereof and methods for making and using them
US20030103971A1 (en) * 2001-11-09 2003-06-05 Kandasamy Hariharan Immunoregulatory antibodies and uses thereof
EP2301971A1 (en) * 2001-02-20 2011-03-30 ZymoGenetics, L.L.C. Antibodies that bind both BCMA and TACI
PT1436003E (pt) * 2001-05-24 2010-03-12 Zymogenetics Inc Proteínas de fusão imunoglobulina taci
US7718387B2 (en) * 2001-09-20 2010-05-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Measuring circulating therapeutic antibody, antigen and antigen/antibody complexes using ELISA assays
WO2003024991A2 (en) * 2001-09-21 2003-03-27 Amgen Inc. Tall-1 receptor molecules and uses thereof
CA2463879C (en) * 2001-10-25 2012-12-04 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
EP1448225A1 (en) * 2001-11-28 2004-08-25 Genset S.A. Agonists and antagonists of ryzn for the treatment of metabolic disorders
US20040093621A1 (en) * 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
WO2003068821A2 (en) * 2002-02-14 2003-08-21 Immunomedics, Inc. Anti-cd20 antibodies and fusion proteins thereof and methods of use
US20030180292A1 (en) * 2002-03-14 2003-09-25 Idec Pharmaceuticals Treatment of B cell malignancies using anti-CD40L antibodies in combination with anti-CD20 antibodies and/or chemotherapeutics and radiotherapy
US20030219818A1 (en) * 2002-05-10 2003-11-27 Bohen Sean P. Methods and compositions for determining neoplastic disease responsiveness to antibody therapy
US7150003B2 (en) * 2002-11-25 2006-12-12 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Class coalescence for obfuscation of object-oriented software

Also Published As

Publication number Publication date
CA2453995A1 (en) 2003-02-20
EA200601861A1 (ru) 2007-02-27
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HUP0500992A2 (en) 2007-07-30
EP1572881A4 (en) 2007-06-13
IS7115A (is) 2004-01-15
MXPA04001050A (es) 2004-07-08
US20050070689A1 (en) 2005-03-31
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PL377119A1 (pl) 2006-01-23
JP2005510208A (ja) 2005-04-21
EP1572881A2 (en) 2005-09-14
CN1636067A (zh) 2005-07-06
BR0211614A (pt) 2006-10-31
HUP0500992A3 (en) 2007-11-28
WO2003014294A3 (en) 2006-03-30

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