CN1407901A - 使用抗cd40l抗体并联合抗cd20抗体和/或化疗剂和放疗治疗b细胞恶性瘤 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于治疗B细胞淋巴瘤和白血病以及其它CD40+恶性瘤的组合物、联合疗法、和方法。组合物中的主要活性剂是抗CD40L抗体或可抑制CD40－CD40L相互作用的其它CD40L拮抗剂。为了治疗所述疾病，组合物可额外包含或利用即联合下述中任何一种或多种：抗CD20抗体、化疗剂、化疗混合物和放疗。

Description

使用抗CD40L抗体并联合抗CD20抗体和/或 化疗剂和放疗治疗B细胞恶性瘤
                      发明领域
本发明描述了通过调控CD40与其配体CD40L之间的相互作用或调控CD40信号来治疗B细胞淋巴瘤和白血病以及其它CD40+恶性瘤的方法和联合疗法。具体而言，可使用抗CD40L抗体来防止CD40L结合CD40，从而抑制相互作用。这些抗体或能够抑制CD40/CD40L相互作用的其它试剂还可联合化疗剂、放疗、和/或抗CD20抗体、和抗CD40抗体使用。
                      发明背景
淋巴瘤即淋巴细胞瘤。90％的淋巴瘤是B细胞起源的，剩余的10％是T细胞起源的。大多数患者经诊断患有何杰金(Hodgkin)病或非何杰金型淋巴瘤(NHL)。
根据诊断的淋巴瘤，治疗选择包括放疗、化疗、和使用单克隆抗体。1.抗CD20抗体
CD20是在超过90％的B细胞淋巴瘤上表达的细胞表面抗原，它在赘生性细胞中不脱落或调控(McLaughlin等人，J.Clin.Oncol.，16：2825-2833，1998b)。CD20抗原是非糖基化的35kDa B细胞膜蛋白，其涉及胞内信号、B细胞分化、和钙通道动员(Clark等人，Adv.CancerRes.，52：81-149，1989；Tedder等人，Immunology Today，15：450-454，1994)。该抗原似乎是人B细胞谱系的早期标记，而且以多种抗原密度广泛表达于正常和恶性B细胞群。然而，完全成熟的B细胞(如浆细胞)、早期B细胞群、和干细胞上不存在该抗原，使之适合于作为抗体介导疗法的靶子。
已经制备了抗CD20抗体,以用于研究和治疗。一种抗CD20抗体是单克隆B1抗体(美国专利号5,843，398)。已经以用于治疗B细胞淋巴瘤的放射性核素的形式(如131I标记的抗CD20抗体)，以及用于减轻由前列腺癌和乳腺癌转移引起的骨痛的89Sr标记形式制备了抗CD20抗体(Endo，Gan To Kagaku Ryoho，26：744-748，1999)。
据报导，通过连续静脉内输注将鼠单克隆抗体1F5(抗CD20抗体)施用于B细胞淋巴瘤患者。然而，据报道，消除循环中的肿瘤细胞需要极高水平(＞2克)的1F5，而且结果据说是“暂时的”(Press等人，Blood，69：584-591，1987)。在治疗中使用单克隆抗体的潜在问题是非人单克隆抗体(如鼠单克隆抗体)通常缺乏人效应子功能性，如它们尤其不能介导依赖补体的裂解或者通过依赖抗体的细胞毒性或由Fc受体介导的吞噬来裂解人靶细胞。另外，非人单克隆抗体可被人宿主识别成外来蛋白质；因此，重复注射这些外来蛋白质可诱导免疫应答，导致有害的超敏反应。对于鼠基单克隆抗体，这常常称为人抗小鼠抗体应答或“HAMA”应答。另外，这些“外来”抗体可受到宿主免疫系统的攻击，使之在到达靶位点之前就被有效中和。
RITUXAN
RITUXAN(也称为Rituximab、MabThera、IDEC-C2B8、和C2B8)是第一种经FDA批准的单克隆抗体，并在IDEC Pharmaceuticals(参阅美国专利号5,843,439、5,776,456、和5,736,137)进行开发，用于治疗人B细胞淋巴瘤(Reff等人，Blood 83：435-445，1994)。RITUXAN是嵌合型抗CD20单克隆抗体，它抑制某些淋巴瘤细胞系的生长，而且据报道在体外使之对由化疗剂诱导的凋亡敏感(Demidem等人，Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals，12：177-缺，1997)。在使用鼠异种移植动物模型的体内测试中还证明了RITUXAN的抗肿瘤活性。RITUXAN有效结合人补体，具有强FcR结合，而且能够通过依赖补体(CDC)和依赖抗体(ADCC)的两种机制在体外有效杀死人淋巴细胞(Reff等人，Blood 83：435-445，1994)。在恒河猴中，该抗体选择性消除来自血液和淋巴结的正常B细胞。
RITUXAN已经被推荐用于治疗低级或滤泡B细胞非何杰金淋巴瘤患者(McLaughlin等人，Oncology(Huntingt)，12：1763-1777，1998a；Maloney等人，Oncology，12：63-76，1998；Leget等人，Curr.Opin.Oncol.，10：548-551，1998)。在欧洲，RITUXAN已经批准用于治疗复发III/IV期滤泡淋巴瘤(White等人，Pharm.Sci.Technol.Today，2：95-101，1999)，而且据报道可有效抗击滤泡中心细胞淋巴瘤(FCC)(Nguyen等人，Eur.J.Haematol.，62：76-82，1999)。用RITUXAN治疗的其它紊乱包括滤泡中心细胞性淋巴瘤(FCC)、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫型大细胞淋巴瘤(DLCL)、和小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病(SLL/CLL)(Nguyen等人，1999)。据报道，难治或无治NHL患者可应答RITUXAN与CHOP(如环磷酰胺、长春花新碱、强的松、和阿霉素)的联合疗法(Ohnishi等人，Gan To Kagaku Ryoho，25：2223-2228，1998)。在I期和II期临床研究中，RITUXAN在低级非何杰金淋巴瘤(NHL)中展示最小的毒性和显著的治疗活性(Berinstein等人，Ann.Oncol.，9：995-1001，1998)。
单独用于治疗B细胞NHL的RITUXAN(以通常375mg/m2的每周剂量达4周用于复发或难治的低级或滤泡NHL)得到很好的耐受而且具有显著的临床活性(Piro等人，Ann.Oncol.，10：655-661，1999；Nguyen等人，1999；和Coiffier等人，Blood，2：1927-1932，1998)。然而，在使用该抗体的实验期间，还给与了高达500mg/M2的每周剂量达4周(Maloney等，Blood 90：2188-2195(1997)。RITUXAN还联合了化疗剂诸如CHOP(如环磷酰胺、阿霉素、长春花新碱、和强的松)，以治疗低级或滤泡B细胞非何杰金淋巴瘤的患者(Czuczman等人，J.CLin.Oncol.，17：268-276，1999；和McLaughlin等人，1998a)。2.CD40和CD40L
CD40表达于成熟B细胞、白血病和淋巴细胞B细胞、以及何杰金病(HD)的何杰金细胞和Reed-Sternberg(RS)细胞的表面(Valle等人，Eur.J.Immunol.，19：1463-1467，1989；和Gruss等人，Leuk.Lymphoma，24：393-422，1997)。CD40是导致正常和恶性B细胞(诸如非何杰金滤泡淋巴瘤)激活和存活的B细胞受体(Johnson等人，Blood，82：1848-1857，1993；和Metkar等人，Cancer Immunol.Immunother.，47：104，1998)。通过CD40受体的信号可保护未成熟B细胞和B细胞淋巴瘤免于由IgM或Fas诱导的凋亡(Wang等人，J.Immunology，155：3722-3725，1995)。相似的，套细胞淋巴瘤细胞具有高水平的CD40，而且加入外源CD40L可增强它们的存活并挽救它们免于由氟达拉滨诱导的凋亡(Clodi等人，Brit.J.Haematol.，103：217-219，1998)。相反的，其他人报道了CD40刺激在体外(Funakoshi等人，Blood，83：2787-2794，1994)和在体内(Murphy等人，Blood，86：1946-1953，1995)都可抑制赘生性B细胞生长。
对小鼠施用抗CD40抗体(参阅美国专利号5,874,082和5,667,165)可增加患有人B细胞淋巴瘤的小鼠的存活(Funakoshi等人，1994；和Tutt等人，J.Immunol.，161：3176-3185，1998)。美国专利号5,674,492(1997)(完整收入本文作为参考)描述了使用模拟CD40L的作用由此送递死亡信号的抗CD40抗体来治疗肿瘤(包括B细胞淋巴瘤和由EBV诱导的淋巴瘤)的方法。CD40信号还与CD20的协同作用有关(Ledbetter等人，Circ.Shock，44：67-72，1994)。描述抗CD40抗体的制备和使用的其它参考包括美国专利号5,874,085(1999)、5,874,082(1999)、5,801,227(1998)、5,674,492(1997)、和5,667,165(1997)(完整收入本文作为参考)。
CD40配体gp39(也称为CD40配体、CD40L、或CD154)表达于激活的而非休眠的CD4+Th细胞(Spriggs等人，J.Exp.Med，176：1543-1550，1992；Lane等人，Eur.J.Immunol.，22：2573-2578，1992；和Roy等人，J.Immunol.，151：1-14，1993)。CD40和CD40L都已经克隆并表征(Stamenkovi等人，EMBO J.，8：1403-1410，1989；Armitage等人，Nature，57：80-82，1992；Lederman等人，J.Exp.Med，175：1091-1101，1992；和Hollenbaugh等人，EMBO j.，11：4313-4321，1992)。美国专利号5,945,513也描述了人CD40L。用CD40L基因转染并在其表面表达CD40L蛋白质的细胞可触发B细胞增殖，并能够与其它刺激信号一起诱导抗体生成(Armitage等人，1992；和美国专利号5,945,513)。CD40L可能在何杰金病区域中的赘生性滤泡内的肿瘤B细胞(CD40+)或Reed-Sternberg细胞(CD40+)之依赖细胞接触的相互作用中发挥重要作用(Carbone等人，Am.J.Pathol.，147：912-922，1995)。据报道，抗CD40L单克隆抗体可有效用于抑制LP-BM5感染小鼠中鼠AIDS(MAIDS)的诱导(Green等人，Virology，241：260-268，1998)。然而，导致恶性B细胞的存活对细胞死亡应答的CD40L-CD40信号的机制尚不清楚。例如，有人提出，滤泡淋巴瘤细胞中诱导凋亡的TRAIL分子(APO-2L)(Riberiro等人，British J.Haematol.，103：684-689，1998)的下调和BCL-2的过度表达，以及B-CLL中CD95(Fas/APO-1)(Laytragoon-Lwein等人，Eur.J.Haematol.，61：266-271，1998)的下调是存活的机制。相反，在滤泡淋巴瘤中存在证据表明CD40激活导致TNF(Worm等人，International Immunol.，6：1883-1890，1994)和CD95分子(Plumas等人，Blood，91：2875-2885，1998)的上调。
已经制备了抗CD40抗体，以预防或治疗由抗体介导的疾病，诸如美国专利号5,874,082(1999)中描述的变态反应和自身免疫紊乱。据报道，抗CD40抗体可有效联合抗CD20抗体，在抑制细胞培养中非何杰金B细胞淋巴瘤的生长方面产生加性效应(Benoit等人，Immunopharmacology，35：129-139，1996)。据说，小鼠体内研究证明，在促进携有一些而非所有淋巴瘤系的小鼠的存活而进行个别施用时，抗CD20抗体比抗CD40抗体更有效(Funakoshi等人，J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.，19：93-101，1996)。据报道，抗CD19抗体在体内治疗两种同系小鼠B细胞淋巴瘤BCL1和A31中也是有效的(Tutt等人，1998)。针对CD40L的抗体据说可用于治疗与B细胞激活有关的紊乱(欧洲专利号555，880，1993)。抗CD40L抗体包括美国专利号5,7474,037(1998)中描述的单克隆抗体3E4、2H5、2H8、4D9-8、4D9-9、24-31、24-43、89-76、和89-79，美国专利号5,876,718(1999)中描述的用于治疗移植物抗宿主疾病的抗CD40L抗体。
因此，不管先前的文献中已经报道了什么，需要改进用于治疗B细胞淋巴瘤和白血病的治疗方法和联合疗法。含抗CD40L抗体和拮抗CD40-CD40L相互作用的其它试剂的组合物的使用提供了另一种治疗癌症患者的方法，它的毒性可能低于现有疗法。具体而言，建议用于抑制CD40刺激以防止癌细胞变成耐受由化疗或其它癌症疗法引起的程序性细胞死亡的方法和组合物，提供了先前未知的方法，可增强癌症疗法并降低细胞对疗法产生耐受性的潜力。
                      发明概述
本发明的一个目的是提供用于治疗B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、和其它CD40+恶性瘤的方法，包括施用治疗有效量的可结合CD40L的抗体或抗体片段。B细胞淋巴瘤包括任何等级的何杰金淋巴瘤和非何杰金淋巴瘤。
本发明的另一个目的是提供用于治疗B细胞淋巴瘤或B细胞白血病的联合疗法，包括抗CD40L抗体或抗体片段或者CD40L拮抗剂，和下列至少一种：(1)化疗剂或化疗剂组合、(2)放疗、(3)抗CD20抗体或其片段、和(4)抗CD40抗体或其片段。
                     图的简述
图1。暴露4小时后B淋巴瘤细胞对阿霉素的敏感性。
图2。(A图)抗CD40L(IDEC-131)消除由CD40L介导的针对ADM杀伤B淋巴瘤细胞的耐受性。(B图)RITUXAN对正常的和用sCD40L预处理的DHL-4细胞的作用。
图3。(A图)用抗CD40L抗体(IDEC-131)阻断由CD40L介导的B-CLL细胞存活。(B图)用IDEC的C2B8阻断由CD40L介导的B-CLL存活。
图4。比较与和不与sCD40L一起培养的CD19+CLL细胞中HLA-DR表达的FACS分析。
                        发明详述
本发明的另一方面是提供用于治疗白血病和淋巴瘤以及表达CD40的其它恶性瘤的组合物。本发明的优选实施方案是组合物和使用它们来治疗B细胞谱系的淋巴瘤和白血病的方法。该组合物可包含拮抗CD40信号或CD40与CD40L之间的相互作用的试剂。该试剂任选可包含一种试剂，诸如抗CD40L抗体或其片段，以及肽片段、肽模拟物、或化学化合物。或者，该组合物可包含靶向除CD40信号或CD40/CD40L相互作用外的其它恶性方面的多种活性剂(诸如化疗剂、其它抗体)，并/或可与放疗联合施用。1.定义
在用于本文时，术语“CD40L抗体”意欲包括可与CD40L蛋白质或其肽或CD40L融合蛋白发生特异性反应的免疫球蛋白及其片段。CD40L抗体可包括人抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、和人源化抗体。
在用于本文时，“CD40抗体”意欲包括可与CD40蛋白质或其肽或CD40融合蛋白发生特异性反应的免疫球蛋白及其片段。CD40抗体可包括人抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、和人源化抗体。
在用于本文时，“CD20抗体”意欲包括可与CD20蛋白质或其肽或CD20融合蛋白发生特异性反应的免疫球蛋白及其片段。CD40抗体可包括人抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、和人源化抗体。抗CD20抗体包括单克隆B1抗体和RITUXAN。
“人源化抗体”指由非人抗体(通常是鼠抗体)衍生的、保留或基本保留亲本抗体的抗原结合特性但在人体中免疫原性较低的抗体。这可以通过多种方法来实现，包括(1)将整个非人可变结构域移植到人恒定区上以产生嵌合抗体；(2)只将非人互补决定簇(CDR)移植到人框架和恒定区中，保留或不保留至关重要的框架残基；和(3)移植整个非人可变结构域，但通过表面残基的取代用人样区段 “掩盖”它们。这些方法公开于Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，81：6851-6855，1984；Morrison等人，Adv.Immunol.，44：65-92，1988；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536，1988；Padlan，Molec.Immun.，28：489-498，1991；和Padlan，Molec.Immun.，31：169-217，1994(都完整收入本文作为参考)。可以如1995年11月7日提交的美国专利申请号08/554,840(也完整收入本文作为参考)中所述来制备人源化的抗CD40L抗体。
“人抗体”指通过任何已知标准方法产生的包含整个人轻链和重链以及恒定区的抗体。
“灵长类化抗体”指经改造包含猴(或其它灵长类)抗体(特别是食蟹猴抗体)的重链和轻链可变结构域且包含人恒定结构域序列(优选人免疫球蛋白γ1或γ4恒定结构域(或PE变体))的重组抗体。这些抗体的制备描述于Newman等人，Biotechnology，10：1458-1460，1992；还有共同转让的08/379,072、08/487,550、或08/746,361(都完整收入本文作为参考)。据报道，这些抗体展示与人抗体有高度同源性(即85-98％)，展示人效应子功能，具有降低的免疫原性，并可展示与人抗原的高亲和力。
“抗体片段”指诸如Fab、F(ab’)2、Fab’、和scFv等抗体片段。
“嵌合抗体”指包含由两种不同抗体(通常来自不同物种)衍生的序列的抗体。最常见的是，嵌合抗体包含人和鼠抗体片段，而且通常是人恒定区和鼠可变区。
“双特异性抗体”指具有对一种抗原特异的一个抗原结合位点和对另一种抗原特异的另一个抗原结合位点的抗体分子。
“免疫原性”指靶向蛋白质或治疗性部分在施用于受试者后引发免疫应答(如体液或细胞)的能力。
特别有利的是将胃肠外组合物配制成剂量单位形式，以便于施用和统一剂量。在用于本文时， “剂量单位形式”指适合作为单元剂量用于待治疗的哺乳动物受试者的物理上离散的单位；计算包含预定量的活性化合物的每个单位，以产生期望的治疗效果，并联合所要求的制药学载体。本发明剂量单位形式的规格是通过并直接根据下列各项规定的：(1)活性化合物的独特特征和待实现的具体治疗效果；和(2)本领域内为了个体中的治疗灵敏度而复合这种活性化合物的内在限制。2.CD40L拮抗剂
依照本发明的方法，对受试者施用CD40L拮抗剂以干预CD40L与其结合配偶体CD40的相互作用。“CD40L拮抗剂”定义为干预这种相互作用的分子。CD40L拮抗剂可以是针对CD40L的抗体(如针对CD40L的单克隆抗体)、针对CD40L的抗体的片段或衍生物(如Fab或F(ab’)2片段)、嵌合抗体或人源化抗体、CD40的可溶性形式、包含CD40的融合蛋白的可溶性形式、或破坏或干预CD40L-CD40相互作用或者干预CD40信号的制药学试剂。
抗体
为了制备抗CD40L抗体，可以用CD40L蛋白质或蛋白质片段(如肽片段)的免疫原形式免疫哺乳动物(如小鼠、仓鼠、兔、或有蹄类)，从而在动物中引发抗体应答。在其表面上表达CD40L的细胞也可用做免疫原。其它免疫原包括纯化的CD40L蛋白质或蛋白质片段。可以通过标准纯化技术由表达CD40L的细胞纯化CD40L(Armitage等人，1992；Lederman等人，1992；和Hollenbaugh等人，1992)。或者，可以根据Armitage等人(1992)公开的CD40L氨基酸序列来制备CD40L肽。赋予蛋白质以免疫原性的技术包括缀合载体或本领域众所周知的其它技术。例如，可以在存在佐剂时施用蛋白质。可以通过检测血浆或血清中的抗体效价来监控免疫过程。标准ELISA或其它免疫测定法可以与作为抗原的免疫原一起用于评估抗体水平。免疫后，可获取抗血清并分离多克隆抗体。为了生成单克隆抗体，可以获取生成抗体的细胞，并如美国专利号5,833,987(1998)和5,747,037(1997)中所述，使用标准体细胞融合流程来融合骨髓瘤细胞。
抗体可以是使用常规技术获得的片段，并以上文关于完整抗体所述的相同方式筛选片段的效用。例如，可以通过用胃蛋白酶处理抗体来产生F(ab’)2片段。可以处理得到的F(ab’)2片段以还原二硫键，从而产生Fab’片段。预期的其它抗体片段包括Fab和scFv。
除了常用的免疫遏制，在将非人抗体治疗性用于人时使对其的识别最小化的一种方法是生成嵌合抗体衍生物，即包含非人动物可变区和人恒定区的抗体分子。人源化嵌合抗体分子可包含例如来自小鼠、大鼠、或其它物种抗体的抗原结合结构域和人恒定区。用于生成这些人源化嵌合抗体的方法包括美国专利号5,833,987(1998)中引用的参考文献。
为了人治疗性目的，可通过生成人可变区嵌合物，其中可变区部分(尤其是抗原结合结构域的保守框架区)是人类起源的，而只有高变区是非人起源的，从而将可与CD40L蛋白质或肽发生特异性反应的抗体进一步人源化。可以通过本领域知道的几种技术来生成这些改变的免疫球蛋白分子(如Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：7308-7312，1983；Kozbor等人，Immunology Today，4：7279，1983；Olsson等人，Meth.Enzymol.，92：3-16，1982)，优选依照PCT发表物WO 92/06193或EP 0,239,400的技术。人源化抗体可以通过商业途径生成，例如Scotgen Limited，2 Holly Road，Twickenham，Middlesex，英国。优选的人源化gp39(CD40L)抗体IDEC-131公开于准许的美国申请08/554,840(完整收入本文作为参考)。
用于生成与CD40L蛋白质或肽(诸如美国专利号5,945,513中描述的gp39融合蛋白)发生反应的特异性抗体或抗体片段的另一种方法是用CD40L蛋白质或肽筛选在细菌中表达的编码免疫球蛋白基因或其部分的表达文库。例如，可以使用噬菌体表达文库在细菌中表达完整Fab片段、VH区、和Fv区。参阅例如Ward等人，Nature，341：544-546，1989；Huse等人，Science，246：1275-1281，1989；和McCafferty等人，Nature，348：552-554，1990。用例如CD40L肽筛选这些文库可鉴定与CD40L发生反应的免疫球蛋白片段。或者，可使用SCID-hu小鼠(可由Genpharm获得)来生成抗体或其片段。
用于生成针对CD40L(包括人CD40L和小鼠CD40L)的单克隆抗体(MAb)和适用于本发明方法的单克隆抗体的方法学描述于题为“Anti-gp39 Antibodies and Uses Therefor”(抗gp39抗体及其用途)的PCT专利申请号WO 95/06666(将其传授完整收入本文作为参考)。本发明中特别优选的抗人CD40L抗体是分别由杂交瘤24-31和89-76生成的Mab 24-31和89-76。根据布达佩斯条约，将分别生成89-76和24-31抗体的89-76和24-31杂交瘤于1994年9月2日保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)，10801University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209)。89-76杂交瘤指定ATCC编号HB 11713，24-31杂交瘤指定ATCC编号HB 11712。
可依照标准重组DNA技术通过操作编码抗CD40L抗体的核酸(如DNA或cDNA)来生成重组抗CD40L抗体，诸如嵌合和人源化抗体。因此，本发明的另一方面是关于编码可与CD40L(特别是人CD40L)发生反应的免疫球蛋白重链或轻链或其部分的分离核酸分子。编码免疫球蛋白的核酸可编码免疫球蛋白轻链(VL)或重链(VH)可变区，包含或不含相连的重链或轻链恒定区或其部分。可以通过标准技术由生成抗人CD40L MAb的细胞(如杂交瘤)分离这些核酸。例如，可以通过cDNA文库筛选、PCR扩增、或其它标准技术，分别由24-31和89-76杂交瘤分离编码24-31或89-76 MAb的核酸。此外，可以将编码抗人CD40L MAb的核酸掺入表达载体并导入合适的宿主细胞，以便于表达并生成抗人CD40L抗体的重组形式。
灵长类化抗体
用于生成重组抗体的另一种高效方法公开于Newman，Biotechnology，10：1455-1460，1992(完整收入本文作为参考)。更具体的说，这种技术导致包含猴可变结构域和人恒定序列的灵长类化抗体的生成。此外，这种技术还描述于共同转让的1995年1月25日提交的美国申请号08/379,072，这是1992年7月10日提交的美国流水号07/912,292的继续申请，这又是1992年3月23日提交的美国流水号07/856,281的部分继续申请，这最后是1991年7月25日提交的美国流水号07/735,064的部分继续中请(都完整收入本文作为参考)。
这种技术可修饰抗体，使之在施用于人时不被抗原性排斥。这种技术依赖用人抗原或受体免疫食蟹猴。开发这种技术是为了生成针对人细胞表面抗原的高亲和力单克隆抗体。
可使用共同转让的1995年6月7日提交的美国申请号08/487,550(完整收入本文作为参考)中描述的方法，通过筛选噬菌体展示文库或猴异种杂交瘤(使用来自用CD40L免疫的猴子的B淋巴细胞而获得的)来鉴定针对人CD40L的恒河猴抗体。
据报道，使用这些申请书中描述的方法而生成的抗体展示人效应子功能，具有降低的免疫原性，和较长的血清半寿期。该技术依赖于如下事实：尽管食蟹猴与人在系统发生上相似，但它们仍然将许多人蛋白质识别成外来的，因此发动免疫应答。此外，因为食蟹猴在系统发生上接近人，所以发现在这些猴子中生成的抗体与在人中生成的抗体具有高度氨基酸同源性。事实上，在对恒河猴免疫球蛋白轻链和重链可变区基因测序后，发现每个基因家族的序列与其人对应物85-98％同源(Newman等人，1992)。以这种方式生成的第一种抗体(抗CD40抗体)与人免疫球蛋白框架区的共有序列91-92％同源(Newman等人，1992)。
如上所述，本发明部分涉及对人CD40L抗原特异且能够抑制CD40信号或抑制CD40/CD40L相互作用的单克隆抗体或其灵长类化形式的鉴定。用经鉴定的抗体(或其治疗有效片段)阻断CD40与CD40L之间的主要激活位点，同时使对阳性共刺激的拮抗效应与对阴性信号的激动效应联合，将是用于干预恶性瘤(尤其是B细胞淋巴瘤和白血病)的复发形式的有用治疗方法。通过阻断CD40的信号从而允许它存活并避免由IgM或Fas诱导的凋亡来确定经鉴定抗体的功能性。
可以使用共同待审的美国申请流水号08/487,550中描述的方法和本文所列方法生产可特异性结合人CD40L或CD40的新型猴单克隆抗体以及由其衍生的灵长类化抗体。这些抗体具有对CD40L的高亲和力，因此可用作抑制CD40L/CD40途径的免疫遏制剂。
优选通过筛选噬菌体展示文库或通过制备猴异种杂交瘤(使用由用CD40L(如人CD40)免疫的猴子得到的B淋巴细胞)来进行猴单克隆抗体的制备。人CD40还可以来自美国专利号5,945,513中描述的融合蛋白。
如上所述，用于生成抗CD40L抗体的第一种方法包括重组噬菌体展示技术。上文一般性描述了这种技术。
本质上，这将包括构建针对展示在丝状噬菌体表面上的CD40L抗原的重组免疫球蛋白文库和筛选分泌对CD40L抗原具有高亲和力的抗体的噬菌体。如上所述，优选选择可结合人CD40L和CD40二者的抗体。为了进行这种方法学，本发明的发明人构建了猴库的独特文库，它降低了重组的可能性并改进了稳定性。
本质上，为了将噬菌体展示用于恒河猴库，该载体包含用于PCR扩增猴免疫球蛋白基因的特异引物。在开发灵长类化技术和包含人序列的数据库时，这些引物基于得到的恒河猴序列。
合适的引物公开于共同转让的08/379,072(收入本文作为参考)。
第二种方法包括针对人CD40L抗原的猴子(即恒河猴)免疫。上文讨论了恒河猴用于生成单克隆抗体的内在优势。具体而言，可针对人抗原或受体免疫这些猴子(即食蟹猴)。此外，可依照Newman等人(1992)和Newman等人，共同转让的1995年1月25日提交的美国流水号08/379,072(完整收入本文作为参考)的方法学，将得到的抗体用于生成灵长类化抗体。
得自食蟹猴的抗体的重大优势是这些猴子将许多人蛋白质识别成外来的，因此提供抗体形成，有些具有对期望人抗原(如人表面蛋白质和细胞受体)的高亲和力。此外，因为它们在系统发生上接近人，所以得到的抗体展示与在人中生成的抗体有高度氨基酸同源性。如上所述，在对恒河猴免疫球蛋白轻链和重链可变区基因测序后，发现每个基因家族的序列与其人对应物85-88％同源(Newman等人，1992)。
本质上，对食蟹猴施用人CD40L抗原，由其分离B细胞，如由该动物采集淋巴结活组织标本，然后使用聚乙二醇(PEG)使B淋巴细胞融合KH6/B5(小鼠x人)异种骨髓瘤细胞。然后鉴定分泌可结合人CD40L抗原的抗体的异种杂交瘤。
可以中断或调控CD40信号的方式结合CD40L或CD40的抗体比较合乎需要，因为这些抗体潜在可用于抑制CD40L与CD40、与它们的对应受体的相互作用。若能够开发针对CD40L或CD40上超过一个表位的抗体，并一起利用这些抗体，则它们的联合活性可潜在提供协同效应。
本文公开的发明包括使用已接触抗原以生成特定抗体的动物(如灵长类，诸如organgutan、狒狒、恒河猴、和食蟹猴)。可用于生成针对人CD40L的抗体的其它动物包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猴、猪、山羊、和兔。
共同拥有的、共同待审的美国专利申请流水号08/488,376中公开了使用SCID小鼠生成人抗体的优选方法。
已经克隆了编码CD40、CD40L、和CD20抗原的人基因，并进行了测序，因此可容易的通过重组方法进行生产。
优选的是，例如通过表达编码已除去了跨膜和胞质结构域由此只剩下胞外部分(即胞外超家族V和C样结构域)的抗原的基因，而以可溶性形式施用人CD40L、CD40、或CD20抗原。
在导致其特异性抗体生成的条件下用CD40L抗原(优选其可溶性形式)免疫恒河猴。优选的是，可溶性人CD40L抗原将与佐剂联合施用，如完全弗氏佐剂(CFA)、明矾(Alum)、皂苷(Saponin)、或其它已知佐剂，及其组合。一般而言，这将需要重复免疫，如通过几个月的重复注射。例如，在佐剂中进行可溶性人CD40L抗原的施用，以及3-4个月的加强免疫，得到的血清包含结合人CD40L抗原的抗体。
免疫后，收集B细胞，如通过由经免疫动物采集的淋巴结活组织标本，并使用聚乙二醇使B淋巴细胞融合KH6/B5(小鼠x人)异种骨髓瘤细胞。用于制备这些异种骨髓瘤的方法是已知的，而且可以在Newman等人于1995年1月25提交的美国流水号08/379,072(收入本文作为参考)中找到。
然后鉴定分泌可结合人CD40L的抗体的异种杂交瘤。这可以通过已知技术来进行。例如，这可以通过使用酶或放射性核素标记的人CD40L抗原经ELISA或放射免疫测定法来测定。
然后将分泌具有对人CD40L抗原的期望特异性的抗体的细胞系亚克隆成单克隆性。
然后将表达可特异性结合人CD40L抗原的抗体的细胞系用于克隆可变结构域序列，从而基本上如Newman等人(1992)和Newman等人于1995年1月25日提交的美国流水号08/379,072(都收入本文作为参考)中所述生成灵长类化抗体。本质上，这必需由所述细胞系提取RNA，转变成cDNA，并使用Ig特异引物通过PCR扩增所述序列。合适的引物描述于Newman等人，1992和美国流水号08/379,072。
然后将克隆的猴可变基因插入包含人重链和轻链恒定区基因的表达载体。优选的是，这是使用IDEC公司专有的表达载体(称为NEOSPLA)进行的。该载体包含巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β珠蛋白主要启动子、SV40复制起点、牛生长激素聚腺苷酸化信号、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、人免疫球蛋白κ或λ恒定区、二氢叶酸还原酶基因、人免疫球蛋白γ1或γ4 PE恒定区、和前导序列。发现在掺入猴可变区基因、转染CHO细胞、随后在含G418培养基中选择和氨甲蝶呤扩增之后，该载体产生很高水平的灵长类化抗体表达。
例如，根据先前的报道，该表达系统产生了针对CD4和其它人细胞表面受体具有高亲合力(Kd≤10-10M)的灵长类化抗体。此外，发现这些抗体展示与原始猴抗体相同的亲和力、特异性、和功能活性。该载体系统基本公开于共同转让的美国流水号379,072(收入本文作为参考)以及1993年11月3日提交的美国流水号08/149,099(也完整收入本文作为参考)。该系统提供了高表达水平，即＞30pg/细胞/天。
可通过本领域普通技术人员众所周知的标准技术来测定产生治疗效果所需要的抗体量。通常将通过标准技术在制药学可接受缓冲剂中提供抗体，而且可以通过任何期望路径来进行施用。由于本文要求的抗体的功效和人对它们的耐受，有可能重复施用这些抗体以抗击人的多种疾病或疾病状态。
本领域技术人员通过常规实验将能够测定对于诱导免疫遏制目的所需要的抗体的有效、无毒量是多少。然而，一般而言，有效剂量的范围将是大约0.05-100mg/kg体重/天。
本发明的抗体或其片段还应当可用于治疗哺乳动物的肿瘤。更具体的说，它们应当可用于缩小肿瘤大小、抑制肿瘤生长、和/或延长携有肿瘤的动物的存活时间。因此，本发明还涉及通过对人或其它动物施用有效、无毒量的抗体来治疗所述人或动物的肿瘤的方法。本领域技术人员通过常规实验将能够测定对于治疗致癌肿瘤目的所需要的抗CD40L抗体的有效、无毒量是多少。然而，一般而言，有效剂量的范围预计将是大约0.05-100mg/kg体重/天。
可以依照上述治疗方法，以足以产生治疗或预防程度的这种效果的量将本发明的抗体施用于人或其它动物。可以常规剂量形式将本发明的这些抗体施用于这些人或其它动物，所述常规剂量形式是通过依照已知技术联合本发明抗体与常规制药学可接受载体或稀释剂而制备的。本领域技术人员将认识到，制药学可接受载体或稀释剂的形式和特性是由它将联合的活性成份的量、施用的路径、和其它众所周知的变量规定的。
本发明抗体或其片段的施用路径可以是口服、胃肠外、吸入、或局部。在用于本文时，术语胃肠外包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠、或阴道施用。胃肠外施用的皮下和肌内形式通常是优选的。
采用本发明化合物在预防或治疗上诱导免疫遏制或者在治疗上治疗致癌肿瘤的日常胃肠外和口服剂量方案的范围通常是大约0.05-100mg/kg体重/天，但优选是大约0.5-10mg/kg体重/天。
还可以通过吸入来施用本发明的抗体。“吸入”指鼻内和口服吸入施用。可以通过常规技术来制备用于这种施用的合适剂量形式，诸如气雾剂配方或计量剂量吸入器。将采用的本发明化合物的优选剂量的范围通常是大约10-100mg。
还可以局部施用本发明的抗体。局部施用指非全身施用，包括将本发明的抗体或其片段化合物外部应用于表皮、口腔，和将这种抗体滴注到耳、眼、和鼻中，和它不显著进入血流的部位。全身施用指口服、静脉内、腹膜内、和肌内施用。当然，治疗或预防效果所需要的抗体量将随着选择的抗体、待治疗状况的本质和严重性、和接受治疗的动物而变化，而且最终取决于医生的判断。本发明抗体的合适局部剂量的范围通常将是大约1-100mg/kg体重/天。3.CD40L的可溶性配体
除了可识别并结合CD40L且抑制它与CD40的相互作用的抗体，其它CD40L拮抗剂也试图用于治疗B细胞淋巴瘤和白血病，其或是单独施用或是联合其它疗法(如放疗或化疗)使用。其它CD40L拮抗剂是CD40L配体的可溶性形式。CD40L的单价可溶性配体(诸如CD40)可结合CD40L，由此抑制CD40L与表达于B细胞上的CD40的相互作用。术语“可溶性”指配体不是永久的结合细胞膜。可以通过化学合成或优选通过重组DNA技术(例如通过只表达配体的胞外结构域而缺乏跨膜和胞质结构域)来制备可溶性CD40L配体。优选的可溶性CD40L配体是可溶性CD40。或者，可溶性CD40L配体可以是融合蛋白的形式。这种融合蛋白包含CD40L配体的至少一个部分且附着于第二种分子。例如，可以与免疫球蛋白的融合蛋白(即CD40Ig融合蛋白)的形式表达CD40。在一个实施方案中，生成的融合蛋白包含CD40分子的胞外结构域部分的氨基酸残基，且连接对应于免疫球蛋白重链(如Cα)的铰链、CH2、和CH3区序列的氨基酸残基，以形成CD40Ig融合蛋白(参阅例如Linsley等人，J.Exp.Med.，1783：721-730，1991；Capon等人，Nature，337：525-531，1989；和美国专利号5,116,964(1992))。可以通过化学合成或优选通过基于CD40的cDNA的重组DNA技术来生成这些融合蛋白(Stamenkovic等人，EMBO J.，8：1403-1410，1989)。4.抗CD40L的施用
以适用于体内制药学施用的生物学相容形式将CD40L拮抗剂施用于受试者。“适用于体内施用的生物学相容形式”指待施用的拮抗剂的形式，其中蛋白质的治疗作用超过任何有毒作用。在用于本说明书时，术语“受试者”意欲包括其体内可引发免疫应答的活的生物体，如哺乳动物。优选受试者的范例包括人、狗、猫、马、有蹄类、牛、猪、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、及其转基因物种。可以任何制药学形式施用CD40L拮抗剂，任选在制药学可接受载体中施用。治疗有效量的拮抗剂的施用定义为在剂量和时间方面实现期望结果(如抑制待治疗淋巴瘤的进展或增殖)所必需的有效量。例如，CD40L拮抗剂的治疗活性量可随着诸如疾病阶段(如I期对IV期)、年龄、性别、医学并发症(如与AIDS有关或由其引起的淋巴瘤或其它免疫遏制状况或疾病)、受试者的体重、和拮抗剂在受试者中引发期望应答的能力等因素而变化。可以调整剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，可每天施用几次分开的剂量，或者可根据治疗情况的紧急事件成比例降低剂量。
可以方便的方式，诸如注射(皮下、肌内、静脉内等)、口服施用、吸入、经皮施用、或直肠施用，来施用活性化合物(诸如抗CD40L抗体)自身或联合其它活性剂。根据施用的路径，可以用某种材料包被活性化合物，以保护化合物免于酶、酸、和可能灭活该化合物的其它天然条件的作用。优选的施用路径是静脉内(i.v.)注射。
为了通过胃肠外施用以外的方式施用CD40L拮抗剂，可能必需用某种材料包被拮抗剂或与其共施用以防止它的灭活。例如，可以在适当载体或稀释剂中对个体施用拮抗剂，与酶抑制剂共施用，或者在适当载体(诸如脂质体)中进行施用。制药学可接受稀释剂包括盐水和含水缓冲液。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸(DFP)、和抑肽酶。脂质体包括水包油包水乳剂和常规的脂质体(Strejan等人，J.Neuroimmunol.，7：27-41，1984)。其它制药学可接受载体和赋形剂在本领域是知道的。
也可以胃肠外或腹膜内施用活性化合物。还可以在甘油、液态聚乙二醇、及其混合物、和油中制备分散体。在储存和使用的普通条件下，这些制剂可包含防腐剂以防止微生物的生长。
适用于注射的制药学组合物包括无菌水性溶液(水溶性时)或分散体，和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉剂。在所有情况中，组合物必须是无菌的，且流态程度必须易于注射。它在生产和储存条件下必须是稳定的，而且必须受到针对微生物(诸如细菌和真菌)污染作用的防护。载体可以是溶剂或分散剂，包括例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、和液态聚乙二醇等等)、及其合适混合物。例如可以通过敷料(诸如卵磷脂)的使用、通过所需颗粒大小的维持(在分散体的情况中)、和通过表面活性剂的使用来维持适当的流动性。可以通过多种抗细菌和抗真菌剂来实现对微生物作用的防护，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等等。在许多情况中，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖)、山梨醇、或氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来延长可注射组合物的吸收。
可以将在合适溶剂中包含所需量的活性化合物(如CD40L拮抗剂自身或联合其它活性剂)掺入适量的一种或组合的本文所列成份，随后过滤除菌，由此制备无菌可注射溶液。一般而言，通过将活性化合物掺入包含基本的分散剂和所需的上文所列其它成份的无菌载体来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冻干，它能够由先前的无菌过滤溶液产生活性成份加任何额外期望成份的粉末。
当活性成份如上所述受到适当保护时，则可以口服施用该蛋白质，例如与惰性稀释剂或可同化可食用载体一起。在用于本文时，“制药学可接受载体”包括任何和所有溶剂、分散剂、敷料、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等等。这些介质和试剂用于制药学活性物质的用途在本领域是众所周知的。除非任何常规介质或试剂都与活性化合物不相容，否则就涵盖将它们用于治疗性组合物的用途。上文所述用于CD40L拮抗剂的所有组合物还可在组合物中包含辅助活性化合物(如抗CD20抗体中的化疗剂)。5.抗CD40L与其它试剂的施用
何杰金病
在美国每年诊断大约7500件何杰金病(HD)新病例。单独的放疗已经用于治疗I、II、和甚至III期HD。还已经联合使用放疗与化疗(如ABVD和MOPP)。参阅V.T.DeVita等人，“Hodgkin’s Disease”(何杰金病)，在《Cancer：Principles & Practice of Oncology》(癌症：肿瘤学原理和实践)一书中，第2卷，第2 142-2283页，DeVita等人编，第5版，1997，及其关于施用放疗和化疗方案以治疗HD的参考文献。
可用于治疗HD的化疗药物包括烷化剂、长春花生物碱(如长春花新碱和长春花碱)、甲基苄肼、氨甲蝶呤、和强的松。四种药物的联合MOPP(二氯甲基二乙胺(mechlethamine)(氮芥子气)、长春花新碱(Oncovin)、甲基苄肼、和强的松)在治疗HD中很有效。在MOPP耐受性患者中，可以使用ABVD(如阿霉素、博来霉素、长春花碱、和达卡巴嗪)、ChlVPP(苯丁酸氮芥、长春花碱、甲基苄肼、和强的松)、CABS(洛莫司汀、阿霉素、博来霉素、和链脲菌素)、MOPP加ABVD、MOPP加ABV(阿霉素、博来霉素、和长春花碱)、或BCVPP(亚硝基脲氮芥、环磷酰胺、长春花碱、甲基苄肼、和强的松)组合。Arnold S.Freedman和Lee M.Nadler，“Malignant Lymphomas”恶性淋巴瘤)，在《Harrison’s Principles of Internal Medicine》(内科医学的哈里森原则)一书中，第1774-1788页，Kurt J.Isselbacher等人编，第13版，1994和V.T.DeVita等人(1997)，及其引用的关于标准剂量和方案的参考文献。这些疗法可以不变的使用，或者根据特定患者的需要进行改变，联合CD40L拮抗剂本身或进一步联合抗CD20抗体或其片段。
对于复发或抗性HD，可以联合利用常规剂量抢救联合方案与抗CD40L抗体(单独或联合抗CD20抗体)。常规剂量抢救联合HD方案的范例包括使用V.T.DeVita等人(1997)中所述剂量和方案的VABCD(长春花碱、阿霉素、达卡巴嗪、洛莫司汀、和博来霉素)、ABDIC(阿霉素、博来霉素、达卡巴嗪、洛莫司汀、和强的松)、CBVD(洛莫司汀、博来霉素、长春花碱、和地塞米松)、PCVP(长春花碱、甲基苄肼、环磷酰胺、和强的松)、CEP(洛莫司汀、依托泊苷、和泼尼氮芥(prednimustine))、EVA(依托泊苷、长春花碱、和阿霉素)、MOPLACE(环磷酰胺、依托泊苷、强的松、氨甲蝶呤、阿糖胞苷、和长春花新碱)、MIME(甲基GAG、异环磷酰胺、氨甲蝶呤、和依托泊苷)、MINE(米托喹酮(mitoquazone)、异环磷酰胺、长春瑞宾(vinorelbine)、和依托泊苷)、MTX-CHOP(氨甲蝶呤和CHOP)、CEM(洛莫司汀、依托泊苷、和氨甲蝶呤)、CAVP(洛莫司汀、苯丙氨酸氮芥、依托泊苷、和强的松)、EVAP(依托泊苷、长春花碱、阿糖胞苷、和顺式铂氨)、EPOCH(依托泊苷、长春花新碱、阿霉素、环磷酰胺、和强的松)。
非何杰金氏淋巴瘤(NHL)
在美国每年诊断大约40,000件NHL新病例，而且这个数目似乎在增加。此外，NHL在每年死于癌症的患者总数中排名第四。NHL包括淋巴瘤的几种亚型，它们具有独特的临床表现和自然史。通过NHL的常用分类即操作公式(Working Formulaton)列出了NHL亚型的细目分类。表1列出了3级操作公式。
              表1
    等级     NHL亚型
低级 小淋巴细胞性滤泡型小裂细胞性滤泡型小裂和大细胞混合性
中级 滤泡型大细胞为主性弥漫型小裂细胞性弥漫型小和大细胞混合性弥漫型大细胞性
高级 免疫母细胞大细胞性原始淋巴细胞性小非裂细胞Burkitt和非Burkitt
其它类型 AIDS相关淋巴瘤皮肤T细胞淋巴瘤成年T细胞白血病/淋巴瘤血管免疫母细胞淋巴结病单核细胞样B细胞淋巴瘤
NHL的B细胞型包括：小淋巴细胞性淋巴瘤/B细胞慢性淋巴细胞性白血病(SLL/B-CLL)、淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫型大细胞淋巴瘤(DLCL)、和Burkitt淋巴瘤(BL)。参阅Gaidano等人，“Lymphomas”(淋巴瘤)，在《Cancer：Principles & Practice of Oncology》(癌症：肿瘤学原理和实践)一书中，第2卷，第2131-2145页，DeVita等人编，第5版，1997。其它两种公式(如基尔公式和修订后的欧洲美洲淋巴瘤分类(REAL)也用于肿瘤学，而且NHL的名称可以在两种分类系统之间变化。参阅M.A.Shipp等人，“Non-Hodgkin’s Lymphomas”(非何杰金淋巴瘤)，在《Cancer：Principles & Practice of Oncology》(癌症：肿瘤学原理和实践)一书中，第2卷，第2165-2220页，DeVita等人编，第5版，1997。NHL淋巴瘤可根据诊断的患者年龄进一步分类。参阅M.A.Shipp等人(1997)。
                     表2
成年B细胞淋巴瘤 儿童B细胞淋巴瘤
滤泡性淋巴瘤弥漫型大B细胞淋巴瘤套细胞淋巴瘤B-CLL/SLL免疫细胞瘤/Waldenstrom病MALT型/单核细胞样B细胞 Burkitt淋巴瘤弥漫型大B细胞淋巴瘤滤泡性淋巴瘤前身B-LBL
放疗通常受限于治疗诊断患有I或II期低级NHL的患者，而且可以作为阶段已经进展的患者的潜在治疗形式。本发明包括联合CD40L拮抗剂与放疗还有其它癌症治疗形态来治疗NHL。
化疗可用于大多数II期患者和所有III和IV期患者。方案包括使用单一烷化剂，诸如环磷酰胺或苯丁酸氮芥，或者组合，诸如CVP(环磷酰胺、长春花新碱、和强的松)、CHOP(CVP和阿霉素)、C-MOPP(环磷酰胺、长春花新碱、强的松、和甲基苄肼)、CAP-BOP(CHOP加甲基苄肼和博来霉素)、m-BACOD(CHOP加氨甲蝶呤、博来霉素、和甲酰四氢叶酸)、ProMACE-MOPP(强的松、氨甲蝶呤、阿霉素、环磷酰胺、依托泊苷、和甲酰四氢叶酸加标准MOPP)、ProMACE-CytaBOM(强的松、阿霉素、环磷酰胺、依托泊苷、阿糖胞苷、博来霉素、长春花新碱、氨甲蝶呤、和甲酰四氢叶酸)、和MACOP-B(氨甲蝶呤、阿霉素、环磷酰胺、长春花新碱、固定剂量的强的松、博来霉素、和甲酰四氢叶酸)。关于标准剂量和方案参阅Shipp等人(1977)。还将CHOP联合博来霉素、氨甲蝶呤、甲基苄肼、氮芥子气、阿糖胞苷、和依托泊苷使用。用于治疗NHL的较少用药物包括：2-氯脱氧腺苷(2-CDA)、2’-脱氧助间型霉素、和氟达拉滨。对于患有中级和高级NHL且未能实现缓解或复发的患者，使用抢救疗法。抢救疗法采用诸如阿糖胞苷、顺式铂氨、依托泊苷、和异环磷酰胺等药物，单独或组合给药。Arnold S.Freedman和Lee M.Nadler，“Malignant Lymphomas”恶性淋巴瘤)，在《Harrison’s Principles of Internal Medicine》(内科医学的哈里森原则)一书中，第1774-1788页。在NHL的复发、侵入性形式的情况中，推荐下列方案：使用Shipp等人(1997)中所述剂量和方案的IMVP-16(异环磷酰胺、氨甲蝶呤、和依托泊苷)、MIME(甲基GAG、异环磷酰胺、氨甲蝶呤、和依托泊苷)、DHAP(地塞米松、高剂量的阿糖胞苷、和顺式铂氨)、ESHAP(依托泊苷、甲基强的松、HD阿糖胞苷、和顺式铂氨)、CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、甲基苄肼、强的松、和博来霉素)、和CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷、和强的松)。
根据小儿科NHL组织学和阶段推荐的方案如下：
                          表3
    组织学              方案
原始淋巴细胞性1期2期3期4期 CHOPCOMPAPOLSA2L2、NHL-BFM 86
小型非裂细胞性或Burkitt淋巴瘤1期2期3期4期/B-ALL CHOPCOMPNHL-BFM 86、St.Jude总B、LMB 89LMB 89
大细胞性1期2期3期4期 CHOPCOMPAPONHO-BFM 86、ACOP
APO＝阿霉素、强的松、和长春花新碱；COMP＝环磷酰胺、长春花新碱、氨甲蝶呤、和强的松。参阅H.J.Weinstein等人，“Leukemias andLymphomas of Childhood”(儿童期的白血病和淋巴瘤)，在《Cancer：Principles & Practice of Oncology》(癌症：肿瘤学原理和实践)一书中，第2卷，第2145-2165页，DeVita等人编，第5版，1997，及其引用的参考文献(都收入本文作为参考)。
抗CD40L抗体和拮抗剂可用于联合目前使用的任何化疗剂和/或放疗法以治疗诊断的HD或NHL亚型。还可以在使用的治疗剂混合物中加入抗CD20抗体。在与抗CD40L抗体或CD40L拮抗剂的组合中将使用的化疗剂的量可以随受试者而变化，或者可依照本领域所知进行施用。参阅例如Bruce A.Chabner等人，“Antineoplastic Agent”(抗肿瘤剂)，在Goodman & Gilman的《The Pharmacological Basis ofTherapeutics》(治疗剂的制药学基础)，第1233-1287页，Joel G.Hardman等人编，第9版，1996。
白血病和其它恶性瘤
本发明的预期疗法和治疗方法还可用于治疗B细胞白血病，包括ALL-L3(Burkitt型白血病)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，以及单核细胞白血病和表达CD40的其它恶性瘤。
用于ALL的治疗包括长春花新碱和强的松的使用。蒽环霉素(anthracycline)、环磷酰胺、L-天冬酰胺酶也已经加入这些治疗。其它诱导疗法包括四种药物(长春花新碱、强的松、蒽环霉素、和环磷酰胺或天冬酰胺酶)或五种药物(长春花新碱、强的松、蒽环霉素、环磷酰胺、和天冬酰胺酶)的组合。关于其它疗法和剂量参阅D.A.Scheinberg等人，“Acute Leukemias”急性白血病)，在《Cancer：Principles & Practice of Oncology》(癌症：肿瘤学原理和实践)一书中，第2卷，第2193-2321页，DeVita等人编，第5版，1997。
用于CLL的治疗包括CMP、CVP、CHOP、COP、和CAP(环磷酰胺、阿霉素、和强的松)化疗剂组合。患有难治CLL患者的治疗包括嘌呤类似物(如氟达拉滨单磷酸盐、2-氯脱氧腺苷、和戊制菌素)的使用。参阅A.B.Deisseroth等人，“Chronic Leukemias”(慢性白血病)，在《Cancer：Principles & Practice of Oncology》(癌症：肿瘤学原理和实践)一书中，第2卷，第2193-2321页，DeVita等人编，第5版，1997。
抗CD20和抗CD40抗体
本发明还涵盖联合抗CD40L抗体(诸如IDEC-131)与抗CD20抗体或其治疗有效片段和/或抗CD40抗体或其治疗有效片段。优选的抗CD20抗体是RITUXAN和B1(参阅美国专利号5,843,398)。关于抗CD40L(也称为抗gp39)的描述、制备、和使用参阅共同转让的1995年11月7日提交的美国专利申请流水号08/554,840、1997年9月8日提交的08/925,339、1998年4月30日提交的09/069,871、和1999年6月14日提交的09/332,595，和美国专利号5,747,037。优选的抗CD40抗体及其制备描述于美国专利号5,874,085、5,874,082、5,801,227、5,667,165、5,674,492、和5,667,165(都完整收入本文作为参考)。本文关于抗CD20抗体所述的所有讨论同样应用于抗CD40抗体。
因为外周血B细胞紊乱根据定义可指示对血液进行治疗的必要性，所以免疫学活性嵌合抗CD20抗体和放射性标记抗CD20抗体的施用路径优选胃肠外；在用于本文时，术语“胃肠外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道、或腹膜内施用，其中最优选静脉内施用。
通常使用标准技术在制药学可接受缓冲剂(例如无菌盐水、无菌缓冲水、丙二醇、上述组合等)中提供免疫学活性嵌合抗CD20抗体和放射性标记抗CD20抗体。用于制备胃肠外可施用试剂的方法描述于“Pharmaceutical Carriers & Formulatons”(制药学载体和配方)，Martin，在《Remington’s Pharmaceutical Scinece》(雷明顿制药科学)，第15版，Mack出版公司，Easton，Pa.，1975(收入本文作为参考)，或如上所述。
可以通过本领域普通技术人员众所周知的标准技术来确定可用于在任何指定患者中产生独特治疗效果的免疫学活性嵌合抗CD20抗体的具体治疗有效量。免疫学活性嵌合抗CD20抗体的有效剂量(即治疗有效量)的范围是大约0.001-大约30mg/kg体重，更优选大约0.01-大约25mg/kg体重，最优选大约0.4-大约20.0mg/kg体重。其它剂量也是可行的。影响剂量的因素包括但不限于疾病的严重程度、早先的治疗方法、患者的整体健康、患者的年龄、存在的其它疾病等。相信熟练技术人员能够容易的评估特定患者并确定落入范围内或范围外(如果必要)的所需合适剂量。可以作为一次治疗或一系列治疗来进行这些剂量范围的免疫学活性嵌合抗CD20抗体或其它CD20抗体(如RITUXAN或B1)的导入。关于嵌合抗体，优选通过一系列治疗来进行这种施用。这种优选方法基于与这种疾病有关的治疗方法学。实际上，虽然一次剂量可提供好处且能够有效用于疾病治疗/管理，但是优选治疗过程可具有几个阶段；最优选的是，在大约2-大约10周(最优选大约4周)的时间里每周一次将大约0.4-大约20mg/kg体重的免疫学活性嵌合抗CD20抗体或另一种抗CD20抗体导入患者。
关于放射性标记抗CD20抗体和/或抗CD40抗体的使用，偏爱的是抗体是(1)非嵌合的，或(2)删除结构域的嵌合人源化抗体，或(3)人抗体。这种偏爱是基于删除结构域或鼠抗体与完整的嵌合或人源化抗体相比循环半寿期显著更短(即循环半寿期越长，放射性核素在患者体内存在的时间也越长)。然而，可以有效利用放射性标记的嵌合抗体，其中所用较低毫居(mCi)剂量联合相对于抗体的未标记嵌合抗体。这种情况能够将骨髓毒性降至可接受水平，同时维持治疗功效。可以如美国专利号5,776,456和5,843,439中所述制备抗CD20的特异放射性标记嵌合形式。
钇-90标记的抗CD20抗体的有效一次治疗剂量(即治疗有效量)的范围是大约5-大约120mCi，更优选大约10-大约40mCi(鼠抗体)和大约30-大约100mCi(删除结构域的抗体)。碘-131标记的抗CD20抗体的有效一次治疗非骨髓销蚀剂量的范围是大约5-大约70mCi，更优选大约5-大约40mCi。碘-131标记的抗CD20抗体的有改一次治疗销蚀剂量(即可能需要自体骨髓移植)的范围是大约30-大约600mCi，更优选大约50-低于大约500mCi。联合嵌合抗CD20抗体后，由于与鼠抗体相比循环半寿期较长，因此碘-131标记的嵌合抗CD20抗体的有效一次治疗非骨髓销蚀剂量的范围是大约5-大约40mCi，更优选低于大约30mCi。如铟-111标记的成像标准通常低于大约5mCi。可以在美国专利号5,843,398和5,843,439(完整收入本文作为参考)中找到关于放射性标记抗CD20抗体的生产和使用的其它讨论。
放射性标记的抗体
关于放射性标记抗体(如对CD40、CD40L、和/或CD20特异的)的使用，偏爱的是抗体是非嵌合的；这种偏爱是基于嵌合抗体与鼠抗体相比循环半寿期显著更长(即由于循环半寿期较长，因此放射性核素在患者体内存在的时间延长)。然而，可以有效利用放射性标记的嵌合抗体，其中相对于鼠抗体使用更低毫居(mCi)剂量的嵌合抗体。这种情况可将骨髓毒性降至可接受水平，同时维持治疗功效。
多种放射性核素可应用于本发明，而且相信本领域技术人员有能力容易的确定在各种境况中哪种放射性核素是最合适的。例如，碘-131(131I)是众所周知用于靶向免疫疗法的放射性核素。然而，131I的临床效用受限于几个因素，包括：8天身体半寿期；碘化抗体在血液中和在肿瘤位点的脱卤；和对于肿瘤中局部化剂量沉积而言次佳的发射特征(如大γ成份)。随着优良螯合剂的出现，将金属螯合基团附着于蛋白质的机会增加了利用其它放射性核素诸如铟-131(131In)和钇-90(90Y)的机会。90Y在放射免疫疗法应用中提供了几种利用优势：90Y的半寿期为64小时，足以允许肿瘤积累抗体，而且与如131I不同，90Y是高能纯β发射体，在它的衰变中不伴随γ发射，组织范围是100-1000个细胞直径。此外，穿透放射的最小量允许对门诊患者施用90Y标记的抗体。另外，细胞杀伤不要求标记抗体的内在化，而且离子化放射的局部发射对于缺乏靶抗原的邻近肿瘤细胞应当是致死的。
对90Y的一个非治疗限制是基于缺乏显著γ放射，使得成像困难。为了避免这个问题，诊断“成像”放射性核素，诸如铟-111(111In)，可用于在施用治疗剂量的90Y标记抗CD20之前确定肿瘤的位置和相对大小。铟-111作为诊断性放射性核素是特别优选的，因为可以安全的施用大约1-大约10mCi而没有可检测的毒性；而且成像资料通常是随后90Y标记抗体分布的预示。大多数成像研究利用5mCi111In标记抗体，因为这个剂量是安全的，而且与较低剂量相比增加成像效率，最佳成像发生于抗体施用后3-6天。参阅例如Murray，J.Nuc.Med，26：3328，1985和Carraguillo等人，J.Nuc.Med，26：67，1985。
90Y标记抗体(如抗CD40L、抗CD20、和抗CD40抗体)的有效一次治疗剂量的范围是大约5-大约75mCi，更优选大约10-大约40mCi。131I标记抗体的有效一次治疗非骨髓销蚀剂量范围是大约5-大约70mCi，更优选大约5-大约40mCi。131I标记抗体的有效一次治疗销蚀剂量(即可能需要自体骨髓移植)的范围是大约30-大约600mCi，更优选大约50-低于大约500mCi。联合嵌合抗体后，由于与鼠抗体相比循环半寿期较长，因此碘-131(131I)标记嵌合抗体的有效一次治疗非骨髓销蚀剂量的范围是大约5-大约40mCi，更优选低于大约30mCi。如111In标记的成像标准通常低于大约5mCi。
关于用于治疗的放射性标记抗体，还可以使用一次治疗或使用多次治疗的剂量。由于放射性核素成份，优选的是在治疗之前，为经历由放射引起的潜在致命骨髓毒性的患者“收集”周围干细胞(“PSC”)或骨髓(“BM”)。使用标准技术收集BM和/或PSC，然后净化并冻存，用于可能的再灌注。另外，最优选的是在治疗之前对患者进行使用诊断标记抗体(如使用111In)的诊断剂量学研究，其目的是确保治疗标记抗体(如使用90Y)将不会在任何正常器官或组织中不必要的“浓缩”。
可利用的其它放射性同位素包括123I、125I、131In、32P、64Cu、67Cu、211At、177Lu、90Y、186Re、212Pb、212Bi、47Sc、105Rh、109Pd、153Sm、188Re、199Au、211At和213Bi。放射投递量将部分取决于粒子发射的半寿期和类型。
下文所述实验使用了下列材料和方法。下文提供的实施例不限制本文所描述或要求的发明，而仅仅是提供所要求的发明的实施方案。
                        实施例实施例1：B淋巴瘤细胞DHL-4细胞的特性
通过使用IDEC-131并将B淋巴瘤细胞系DHL-4(Roos等人，Leuk.Res.，10：195-202，1986)暴露于阿霉素(ADM)，在体外测试了抗CD40L抗体能够阻断由CD40L-CD40介导的恶性B细胞在由化疗诱导的毒性/凋亡中存活的观点。IDEC-131是鼠单克隆抗人CD40L抗体24-31的人源化形式。
最初，通过将DHL-4细胞暴露于不同浓度的ADM达4小时而测定ADM对DHL-4细胞的胞毒最小浓度。通过Alamar Blue(一种肝细胞染料还原测定法)测量了培养5天后DHL-4细胞的细胞毒性(参阅Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Meth.，202：163-171，1997)。简而言之，将1×105个DHL-4细胞在含不同浓度ADM(1×10-6M-1×10-8M)的生长培养基(RMPI-1640加10％胎牛血清)中在细胞培养管中于37℃保温4小时。保温后，清洗细胞，以1×105个细胞/ml的浓度重悬于生长培养基，并向96孔平底板的每个孔中加入200μl细胞悬浮液。将平板于37℃保温，并测试不同时间点的细胞毒性。在保温的最后18个小时，向每个孔中加入50μl氧化还原染料Alamar Blue(BiosourceInternational，目录编号DAL 1100)。保温后，通过于室温在摇床上保温10分钟以冷却平板，并测定染料的胞内还原。使用96孔荧光计读取530nm激发和590nm发射的荧光。结果表述成相对荧光单位(RFU)。如下计算细胞毒性百分比：
[1-(测试样品的平均RFU÷对照细胞的平均RFU)]×100％。绘制ADM细胞毒性的滴定曲线并为随后的测定法选择该药物细胞毒性的最小浓度。
如图1所示，结果显示培养了5天且在培养前暴露于ADM(2×10-7M和4×10-8M)4小时的DHL-4细胞的细胞毒性。如上所述，暴露后清洗细胞一次，在生长培养基中培养5天，并通过Alamar Blue染料摄取测定法测定细胞毒性。另外，通过流式细胞计量术对DHL-4细胞表征选定CD分子的膜表达。发现DHL-4细胞表达CD19、CD20、CD40分子，但是没有检测到CD40L的表达。实施例2：抗CD40L抗体消除由CD40L介导的针对阿霉素杀伤B淋巴瘤细胞的耐受性
图2A显示了抗CD40L抗体(IDEC-131)对由CD40L-CD40介导的DHL-4细胞对由ADM诱导的细胞死亡的耐受性的效果。将DHL-4细胞(0.5×106个细胞/ml)在存在10μg/ml可溶性CD40L(sCD40L，P.A.Brams、E.A.Padlan、K.Hariharan、K.Slater、J.Leonard、R.Noelle、和R.Newman，“A humanized anti-human CD154 monoclonalantibody blocks CD154-CD40 mediated human B cell activation”(人源化抗人CD154单克隆抗体阻断由CD154-CD40介导的人B细胞激活)，手稿已提交)时于37℃保温1小时。保温1小时后，加入低浓度的ADM(2×10-7M-4×10-8M)并在存在或缺乏CD40L(10μg/ml)时继续保温4小时。暴露于ADM后，清洗细胞，以0.5×106个细胞/ml的浓度重悬于生长培养基，并向96孔平底板的每个孔中加入100μl细胞悬浮液(双份，包含或不含sCD40L)。向ADM处理过程中连续暴露于sCD40L的培养物和ADM暴露过程中没有sCD40L的培养物中加入sCD40L(10μg/ml)。另外，向培养物中加入IDEC-131(10μg/ml)以测定其对与sCD40L和ADM一起保温的DHL-4细胞的作用。5天后，如上所述，通过Alamar Blue染料摄取测定法测量细胞毒性。
数据显示，sCD40L延长了DHL-4细胞在ADM处理后的存活，然而，正如预期的，在暴露于ADM且缺乏sCD40L的细胞中观察到细胞毒性增加。此外，抗CD40L抗体(IDEC-131)的加入逆转了由CD40L介导的细胞存活，导致细胞毒性增加(图2A)。
IDEC-131的单独加入对用sCD40L处理的DHL-4细胞没有影响，这指示抗体自身对DHL-4细胞不具有任何直接抑制性或细胞毒性(图2B)。将与或未与sCD40L预保温的DHL-4细胞在存在不同浓度的IDEC-131、RITUXAN、抗CD20抗体CE9.1、和抗CD4抗体(Anderson等人，Clin.Immunol.& Immunopathol.，84：73-84，1997)时进行培养。5天后，如上所述，通过Alamar Blue测定法测定DHL-4细胞的细胞毒性/增殖。图2B显示IDEC-131对DHL-4细胞的增殖或细胞毒性没有影响，然而，正如预期的，RITUXAN抑制细胞增殖并诱导细胞毒性。在与抗CD4抗体一起培养的DHL-4细胞中没有看到影响。实施例3：CD40L-CD40信号防止由抗CD20抗体RITUXAN诱导的B淋巴瘤细胞的凋亡
使用包括DHL-4细胞和RITUXAN的表面交联的体外系统测定由CD40L-CD40介导的信号对由抗CD20抗体诱导的B淋巴瘤细胞凋亡的影响。将DHL-4细胞(0.5-1×106个细胞/ml)与sCD40L(10μg/ml)一起于37℃进行培养。培养过夜后，收获细胞并与10μg/ml RITUXAN或对照抗体(CE9.1；抗CD4抗体)一起包含或不含sCD40L(10μg/ml)在冰上保温。保温1小时后，离心细胞以除去未结合的抗体，以1×106个细胞/ml重悬于生长培养基(5％FCS-RPMI)，并在组织培养管中进行培养。通过示踪标记山羊抗人Ig-Fcγ特异性抗体的F(ab’)2片段(15μg/ml)使细胞表面结合的抗体发生交联，并将培养物于37℃保温直至测定凋亡。使用流式细胞计量术caspase-3测定法检测凋亡。于4或24小时后收获培养细胞，清洗，并于4℃使用Cytofix(Cytofix/CytopermTM试剂盒，Pharmingen，目录编号2075KK)固定。固定20分钟后，清洗细胞，并加入15μl亲和纯化的PE缀合多克隆兔抗caspase-3抗体(Pharmingen，目录编号67345)和50μl cytoperm(Pharmingen，目录编号2075KK)。将细胞在冰上在黑暗中保温30分钟。保温后，清洗细胞一次，并重悬于cytoperm。在FACScan上获得流式细胞计量术数据，并使用Verity Software House的WinList软件进行分析。
表I显示了DHL-4淋巴瘤细胞通过暴露于sCD40L对由RITUXAN诱导的凋亡的耐受性。在这些研究中，caspase-3的激活用作代用标记，因为我们先前的研究揭示caspase-3与Tunel测定法之间的相关性较好。在存在sCD40L时RITUXAN在DHL-4细胞表面上的交联降低了凋亡水平，而不暴露于sCD40L的细胞发生凋亡。比较而言，在存在相同同种型抗体—对照抗体(CE9.1)时保温的培养物导致没有细胞发生凋亡。因而，这些数据说明由sCD40L诱导的CD40途径信号可导致由RITUXAN介导的B淋巴瘤细胞杀伤。
                        表I：
      sCD40L对由RITUXAN介导的DHL-4凋亡的耐受性
          培养条件       凋亡百分比(MIF)(a)4小时          24小时
暴露于sCD40L的DHL-4细胞只有细胞细胞+RITUXAN细胞+RITUXAN+抗-hu.IgG.F(ab′)2细胞+CE9.1细胞+CE9.1+抗-hu.IgG.F(ab′)2细胞+抗-hu.IgG.F(ab′)2 3.35(17.42)    4.94(7.62)1.97(1.97)     4.54(6.54)21.17(17.39)   9.62(13.44)2.31(13.25)    4.15(7.85)2.09(22.14)    4.14(9.57)1.93(12.57)    5.13(8.02)
不暴露于sCD40L的DHL-4细胞只有细胞细胞+RITUXAN细胞+RITUXAN+抗-hu.IgG.F(ab′)2细胞+CE9.1细胞+CE9.1+抗-hu.IgG.F(ab′)2细胞+抗-hu.IgG.F(ab′)2 4.36(14.34)    5.08(17.62)5.67(10.66)    1.08(17.92)74.82(22.80)   30.63(26.84)5.99(14.00)    3.05(18.24)5.96(12.11)    2.24(18.19)6.09(12.27)    1.85(17.27)
a 具有caspase-3活性的阳性细胞百分比及其对数刻度的平均荧光强度。实施例4：IDEC-131对慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞的作用
为了测定IDEC-131在体外对B-CLL细胞的生长和存活的作用，在体外在包含或不含IDEC-131且存在CD40L时培养B-CLL细胞。使用Ficoll-Hypaque梯度离心由CLL患者的血液分离外周血单核细胞(PBMC)。通过锥虫蓝染料排除测定生存力，为＞98％。流式细胞计量术分析揭示＞70％的淋巴细胞是CD19+/CD20+。在CLL生长培养基(如添加5％FCS或2％自体供体血浆、添加2mM L-谷氨酰胺和100U/ml青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基)中培养CLL细胞(PBMC)。另外，对于有些实验，使用CD19+DynabeadTM，依照制造商的指示(Dynal，目录编号111.03/111.04)纯化CD19+B细胞，并如上所述进行培养。在生长培养基中培养的CLL或纯化的B-CLL细胞大多数经历自发凋亡性细胞死亡。然而，在存在sCD40L时培养这些细胞扩大它们在培养中的生存力。表II指示在存在或缺乏sCD40L(5μg/ml)时生长的CD19+B-CLL细胞在不同时间点的细胞生存力，并指示CLL细胞的生存力较长。来自患者1且与sCD40L一起培养的B-CLL细胞的生存力≥60％达超过2周，而在缺乏sCD40L时生长的细胞其生存力低于10％。
    表II：B-CLL细胞在存在sCD40L时的存活
B-CLL样品   时间(小时)     生存力百分比(a)(-)CD40L    (+)CD40L
  患者1     04896144   ≥90         ≥9088         9046         7730         72
  患者2     07296144   ≥90         ≥9040         7231         6517         51
(a)等于通过锥虫蓝染料排除法测定的生存力百分比。
图3A显示了IDEC-131对培养7天后B-CLL细胞的生长和存活的效果。将由CLL患者纯化的B-CLL细胞(2×106个细胞/ml)分到两个培养管中。将一个管中的细胞与等体积生长培养基中的sCD40L(5μg/ml)混合，将另一个管与等体积生长培养基一起保温作为对照。于37℃保温1小时后，轻轻混合细胞，并向96孔平底板的每个孔中加入100μl细胞悬浮培养基，一式双份，包含和不含不同浓度的IDEC-131(10μg/ml-0.3μg/ml)。7天后，如上所述，通过Alamar Blue测定法测定培养物中的细胞存活/死亡。数据显示了包含sCD40L的培养物中的细胞存活。向培养物中加入IDEC-131导致细胞死亡增加，这指示细胞存活的逆转或对细胞死亡的敏化。另外，以与IDEC-131相同的浓度施用RITUXAN时，对细胞死亡的效果比IDEC-131小(图3B)。实施例5：B-CLL中由CD40L-CD40介导的HLA-DR分子上调
为了确定CD40L-CD40信号转导途径是否是完整的，在存在或缺乏CD40L(5μg/ml)时于37℃培养来自CLL患者的CLL细胞(5×105个细胞/ml)。48和144小时后，通过流式细胞计量术使用标准流程测定CD19+细胞上的II型分子HLA-DR表达。简而言之，在不同时间点收集培养的淋巴细胞，并使用FACScan(Becton-Dickinson)流式细胞计量器用偶联荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)用于单一或双重染色的抗体分析所述分子的表面表达。为了染色用于流式细胞计量术，将培养管中的1×106个细胞与下列合适抗体一起保温：抗CD45-FITC，将淋巴细胞群控制在散点图上；抗CD19-PE(Pharmingen，目录编号30655)或抗CD20-FITC(Pharmingen，目录编号33264)抗体，测定CD19+和/或CD20+B细胞；抗CD3-FITC抗体(Pharmingen，目录编号30104)，逐出T细胞；抗CD19-RPE和抗HLA-DR-FITC抗体(Pharmingen，目录编号32384)，测定CD19+细胞上的II型表达。通过与2ml冷的PBS一起以200xg离心6分钟来清洗细胞一次，并与抗体一起在冰上保温30分钟，然后清洗细胞一次，在0.5％低聚甲醛中固定，并保存于4℃直至分析。在FACScan上获得流式细胞计量术数据，并使用WinList软件(Verity SoftwareHouse)进行分析。将机器设置成自动gate，以检验包含被RPE或FITC单一染色、未染色、或双重染色的细胞的象限。图4显示了与sCD40L一起培养的CD19+CLL细胞与未与sCD40L一起培养的细胞中HLA-DR表达的比较。在存在sCD40L时培养的B-CLL细胞上检测到较高水平的HLA-DR表达(表III)。
    表III：B-CLL中由CD40L-CD40介导的HLA-DR分子上调
    样品     时间(小时)     HLA-DR+a
    阳性百分比   MFI
对照  48  81  92
 144  88  1655
细胞+sCD40L  48  88  101
 144  95  2943
HLA-DR分子阳性的CD19+B细胞及其平均荧光强度(MIF)。实施例6：IDEC-131和RITUXAN的制备
对于CD40+恶性瘤的治疗，将在配方缓冲液10mM柠檬酸钠、150mMNaCl、0.02％Polysorbate 80 pH6.5中的大约10-大约50mg/mlIDEC-131静脉内(iv)灌注到受试者中。在RITUXAN之前、之后、或与之联合施用IDEC-131。RITUXAN灌注剂量的范围是大约3-大约10mg/kg受试者体重。实施例7：IDEC-131和CHOP的制备
对于应答CHOP的CD40+恶性瘤的治疗(如何杰金病、非何杰金淋巴瘤、和慢性淋巴细胞性白血病，以及对于其中细胞是CD40+的恶性瘤的抢救疗法)，立即在开始CHOP循环之前以大约3-大约10mg/kg患者体重的剂量范围灌注IDEC-131。将在合计4-8个CHOP循环的每个循环之前重复IDEC-131施用。实施例8：抗CD40L与RITUXAN的联合施用以治疗受试者的B细胞淋巴瘤
联合疗法作为抢救疗法或用于治疗复发型或侵入性形式的CD40+恶性瘤(如何杰金病、非何杰金淋巴瘤、和CLL)特别有用。在联合施用IDEC-131与CHOP和RITUXAN时，如上文实施例6中所述施用IDEC-131，随后进行实施例7中CHOP-IDEC-131施用特定的方案。
将上文讨论的所有参考文献完整收入本文作为参考。

Claims (56)

1.用于治疗CD40+恶性瘤的方法，包括施用治疗有效量的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段可结合CD40L，由此抑制CD40/CD40L相互作用或CD40信号。
2.权利要求1的方法，其中CD40+恶性瘤是B细胞淋巴瘤或B细胞白血病。
3.权利要求2的方法，其中B细胞淋巴瘤是何杰金病(HD)或非何杰金淋巴瘤(NHL)。
4.权利要求3的方法，其中NHL是低级、中级、或高级的。
5.权利要求3的方法，其中NHL是选自下组的亚型：小淋巴细胞性、滤泡型小裂细胞为主性、滤泡型小裂和大细胞混合型、滤泡型大细胞为主型、弥漫型小裂细胞性、弥漫型小和大细胞混合性、弥漫型大细胞性、免疫母细胞性大细胞性、原始淋巴细胞性、小无裂Burkitt和非Burkitt型、AIDS相关淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴结病、套细胞淋巴瘤、和单核细胞样B细胞淋巴瘤。
6.权利要求2的方法，其中B细胞白血病是慢性B细胞白血病、B细胞谱系的急性成淋巴细胞白血病、或B细胞谱系的慢性淋巴细胞白血病。
7.权利要求2的方法，其中可结合CD40L的抗体或抗体片段是IDEC-131、3E4、2H5、2H8、4D9-8、4D9-9、24-31、24-43、89-76、或89-79。
8.权利要求7的方法，其中抗体或抗体片段是嵌合的、双特异性的、人的、或人源化的。
9.权利要求2的方法，其中抗体片段是Fab、Fab’、scFv、或F(ab’)2。
10.权利要求2的方法，还包括施用治疗有效量的第二种抗体或抗体片段、化疗剂、化疗剂组合、和/或放疗。
11.权利要求10的方法，其中放疗是外部放射处理或放射性标记抗体。
12.权利要求11的方法，其中放射性标记抗体是放射性标记的IDEC-131、RITUXAN、或B1或其片段。
13.权利要求12的方法，其中放射性标记抗体是用123I、125I、131I、111In、131In、32P、64Cu、67Cu、211At、177Lu、90Y、186Re、212Pb、212Bi、47Sc、105Rh、109Pd、153Sm、188Re、199Au、211At、和213Bi放射性标记的。
14.权利要求10的方法，其中用于治疗HD的化疗剂是下列任何一种或多种：烷化剂、长春花生物碱、甲基苄肼、氨甲蝶呤、或强的松。
15.权利要求10的方法，其中用于治疗NHL的化疗剂是下列任何一种或多种：烷化剂、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、2-CDA、2’-脱氧助间型霉素、氟达拉滨、阿糖胞苷、顺式铂氨、依托泊苷、或异环磷酰胺。
16.权利要求10的方法，其中用于治疗HD的化疗剂组合是：MOPP、ABVD、ChlVPP、CABS、MOPP加ABVD、MOPP加ABV、BCVPP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、CEM、MTX-CHOP、EVAP、或EPOCH。
17.权利要求1O的方法，其中用于治疗NHL的化疗剂组合是：CVP、CHOP、C-MOPP、CAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEPP(B)、或CAMP。
18.权利要求10的方法，其中用于治疗B细胞白血病的化疗剂是下列至少一种：蒽环霉素、环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、和嘌呤类似物。
19.权利要求10的方法，其中用于治疗B细胞白血病的化疗剂组合是：长春花新碱、强的松、蒽环霉素、和环磷酰胺或天冬酰胺酶；长春花新碱、强的松、蒽环霉素、环磷酰胺、和天冬酰胺酶；CHOP；CMP；CVP；COP；或CAP。
20.权利要求10的方法，其中第二种抗体是抗CD20抗体。
21.权利要求21的方法，其中抗CD20抗体是RITUXAN或其片段或者B1或其片段。
22.用于治疗CD40+恶性瘤的方法，包括施用抗CD40L抗体或其片段的步骤，其中抗CD40L抗体或抗体片段可阻断CD40-CD40L相互作用或抑制CD40信号；和施用抗CD20抗体或其片段。
23.权利要求22的方法，其中CD40+恶性瘤是B细胞淋巴瘤或B细胞白血病。
24.用于治疗CD40+恶性瘤的联合疗法，包括CD40L拮抗剂和下列至少一种：(1)化疗剂或化疗剂组合；(2)放疗；(3)抗CD20抗体或其片段；和(4)抗CD40抗体或其片段。
25.权利要求24的方法，其中放疗是外部放射治疗或放射性标记抗体。
26.权利要求25的方法，其中放射性标记抗体是用123I、125I、131I、111In、131In、32P、64Cu、67Cu、211At、177Lu、90Y、186Re、212Pb、212Bi、47Sc、105Rh、109Pd、153Sm、188Re、199Au、211At、和213Bi放射性标记的。
27.权利要求24的联合疗法，其中CD40+恶性瘤是B细胞淋巴瘤或B细胞白血病。
28.权利要求27的联合疗法，其中B细胞淋巴瘤是HD或NHL。
29.权利要求28的联合疗法，其中NHL是低级、中级、或高级的。
30.权利要求28的联合疗法，其中NHL是选自下组的亚型：小淋巴细胞性、滤泡型小裂细胞为主性、滤泡型小裂和大细胞混合型、滤泡型大细胞为主型、弥漫型小裂细胞性、弥漫型小和大细胞混合性、弥漫型大细胞性、免疫母细胞性大细胞性、原始淋巴细胞性、小无裂Burkitt和非Burkitt型、AIDS相关淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴结病、套细胞淋巴瘤、和单核细胞样B细胞淋巴瘤。
31.权利要求28的联合疗法，其中B细胞白血病是慢性B细胞白血病、B细胞谱系的急性成淋巴细胞白血病、或B细胞谱系的慢性淋巴细胞白血病。
32.权利要求24的联合疗法，其中CD40L拮抗剂是抗CD40L抗体或其片段。
33.权利要求32的联合疗法，其中抗CD40L抗体是IDEC-131或其片段。
34.权利要求32的联合疗法，其中抗CD40L片段是Fab、Fab’、scFv、或F(ab’)2。
35.权利要求24的联合疗法，其中抗CD20抗体是RITUXAN或其片段或者B1或其片段。
36.权利要求28的联合疗法，其中用于治疗HD的化疗剂是下列任何一种或多种：烷化剂、长春花生物碱、甲基苄肼、氨甲蝶呤、或强的松。
37.权利要求28的联合疗法，其中用于治疗NHL的化疗剂是下列任何一种或多种：烷化剂、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、2-CDA、2’-脱氧助间型霉素、氟达拉滨、阿糖胞苷、顺式铂氨、依托泊苷、或异环磷酰胺。
38.权利要求28的联合疗法，其中用于治疗HD的化疗剂组合是：MOPP、ABVD、ChlVPP、CABS、MOPP加ABVD、MOPP加ABV、BCVPP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、CEM、MTX-CHOP、EVAP、或EPOCH。
39.权利要求28的联合疗法，其中用于治疗NHL的化疗剂组合是：CVP、CHOP、C-MOPP、CAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEPP(B)、或CAMP。
40.权利要求28的联合疗法，其中用于治疗B细胞白血病的化疗剂是：蒽环霉素、环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、和嘌呤类似物。
41.权利要求28的联合疗法，其中用于治疗B细胞白血病的化疗剂组合是：长春花新碱、强的松、蒽环霉素、和环磷酰胺或天冬酰胺酶；长春花新碱、强的松、蒽环霉素、环磷酰胺、和天冬酰胺酶；CHOP；CMP；CVP；COP；或CAP。
42.用于治疗CD40+恶性瘤的组合物，其包含(1)抗CD40L抗体或其抗体片段和下列至少一种或多种：(2)放射性标记的可结合CD40L或CD20的抗体、(3)抗CD20抗体或其片段、或(4)化疗剂或化疗剂组合。
43.权利要求42中用于治疗CD40+恶性瘤的组合物，其中恶性瘤是B细胞淋巴瘤或B细胞白血病。
44.权利要求43的组合物，其中B细胞白血病是HD或NHL。
45.权利要求42的组合物，其中放射性标记抗体是放射性标记的IDEC-131、RITUXAN、或B1。
46.权利要求46的组合物，其中放射性标记抗体是用123I、125I、131I、111In、131In、32P、64Cu、67Cu、211At、177Lu、90Y、186Re、212Pb、212Bi、47Sc、105Rh、109Pd、153Sm、188Re、199Au、211At、和213Bi放射性标记的。
47.权利要求44的组合物，其中NHL是低级、中级、或高级的。
48.权利要求44的组合物，其中NHL是选自下组的亚型：小淋巴细胞性、滤泡型小裂细胞为主性、滤泡型小裂和大细胞混合型、滤泡型大细胞为主型、弥漫型小裂细胞性、弥漫型小和大细胞混合性、弥漫型大细胞性、免疫母细胞性大细胞性、原始淋巴细胞性、小无裂Burkitt和非Burkitt型、AIDS相关淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴结病、套细胞淋巴瘤、和单核细胞样B细胞淋巴瘤。
49.权利要求42的组合物，其中抗CD40抗体是IDEC-131或其片段。
50.权利要求42的组合物，其中抗CD20抗体是RITUXAN或其片段或者B1或其片段。
51.权利要求43的组合物，其中用于治疗HD的化疗剂是下列任何一种或多种：烷化剂、长春花生物碱、甲基苄肼、氨甲蝶呤、或强的松。
52.权利要求44的组合物，其中用于治疗NHL的化疗剂是下列任何一种或多种：烷化剂、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、2-CDA、2’-脱氧助间型霉素、氟达拉滨、阿糖胞苷、顺式铂氨、依托泊苷、或异环磷酰胺。
53.权利要求44的组合物，其中用于治疗HD的化疗剂组合是：MOPP、ABVD、ChlVPP、CABS、MOPP加ABVD、MOPP加ABV、BCVPP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、CEM、MTX-CHOP、EVAP、或EPOCH。
54.权利要求44的组合物，其中用于治疗NHL的化疗剂组合是：CVP、CHOP、C-MOPP、CAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEPP(B)、或CAMP。
55.权利要求43的组合物，其中用于治疗B细胞白血病的化疗剂是：蒽环霉素、环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、和嘌呤类似物。
56.权利要求43的组合物，其中用于治疗B细胞白血病的化疗剂组合是：长春花新碱、强的松、蒽环霉素、和环磷酰胺或天冬酰胺酶；长春花新碱、强的松、蒽环霉素、环磷酰胺、和天冬酰胺酶；CHOP；CMP；CVP；COP；或CAP。
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