CN1845755A - 眼部疾病的抗cd－20治疗 - Google Patents

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Abstract

本申请描述了利用结合CD－20的拮抗剂诸如抗体的眼部疾病的治疗。

Description

眼部疾病的抗CD-20治疗
本申请为非临时申请，根据35 USC§119要求2003-8-29提交的临时申请60/498,791的优先权，所述临时申请包含在本文作为参考。
技术领域
本发明涉及利用于CD20结合的拮抗剂诸如抗体的眼部疾病的治疗。
背景技术
淋巴细胞是血细胞生成过程中由骨髓产生的多种类型白细胞中的一种。淋巴细胞有两类主要群体：B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴细胞(T细胞)。本发明特别感兴趣的淋巴细胞是B淋巴细胞。
B细胞在骨髓中成熟，离开骨髓时在其细胞表面表达与抗原结合的抗体。当初始B细胞首次与其膜结合抗体特异的抗原相遇时，细胞开始迅速分裂，其子代分化成记忆B细胞和称为“浆细胞”的效应细胞。记忆B细胞寿命很长，并继续表达与其亲代细胞具有相同特异性的膜结合抗体。浆细胞不产生膜结合抗体，而代之产生可分泌型的抗体，可分泌的抗体是体液免疫的重要效应分子。
CD20抗原(也称为人B淋巴细胞限制性分化抗原Bp35)是原B细胞和成熟B淋巴细胞上的疏水性跨膜蛋白，分子量大约35kD(Valentine等生物学化学杂志264(19)：11282-11287(1989)；和Einfeld等，欧洲分子生物学组织杂志7(3)：711-717(1988))。该抗原也在大于90％的B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)上表达(Anderson等，血液63(6)：1424-1433(1984))，但在造血干细胞，原B细胞，正常浆细胞或其它正常组织中未发现(Tedder等，免疫学杂志135(2)：973-979，1985)。CD20在细胞周期启动和分化的活化过程早期阶段起调节作用(Tedder等，同上)，并可能发挥钙离子通道的功能(Tedder等，细胞生物学杂志14D：195(1990))。
由于CD20在B细胞淋巴瘤中表达，这一抗原可作为用于“靶向”这类淋巴瘤的候选者。实质上，这种靶向可如下归纳：将B细胞表面抗原CD20的特异性抗体给予患者。这些抗CD20抗体与正常和恶性B细胞(表面的)CD20抗原特异结合；与表面抗原CD20结合的抗体可引起肿瘤性B细胞的破坏和耗竭。此外，具有破坏肿瘤潜力的化学制剂或放射活性标记能与抗CD20抗体偶联，从而将所述制剂特异性“运送”至肿瘤性B细胞。不管用什么方法，一个主要目的是破坏肿瘤；可根据所使用的具体抗CD20抗体确定具体方法，因此，靶向CD20抗原的现有方法很多。
rituximab(RITUXAN)抗体是一种遗传工程化鼠/人嵌合单克隆抗CD20抗体。Rituximab在1998年4月7日授权的美国专利5,736,137号(Anderson等)中称为“C2B8”的抗体。RITUXAN被指示用于治疗复发或难治的低级或滤泡性CD20阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤。体外作用机制研究显示RITUXAN与人补体结合，并通过补体依赖性细胞毒作用(CDC)裂解淋巴样B细胞系(Reff等，血液83(2)：435-445(1994))。此外，在抗体依赖的细胞性细胞毒作用(ADCC)试验中有显著活性。最近，RITUXAN在氚标胸腺嘧啶掺入实验中显示抗增殖效应并直接诱导凋亡，而其它抗CD20抗体则不能(Maloney等，血液88(10)：637a(1996))。实验还发现RITUXAN与化疗和毒素有协同作用。尤其是RITUXAN使耐药的人B细胞淋巴瘤细胞系对阿霉素，CDDP，VP-16，白喉毒素和蓖麻毒蛋白的细胞毒效应较敏感(Demidem等，癌症化疗及放射性药物(Cancer Chemotherapy &Radiopharmaceuticals)12(3)：177-186(1997))。体内临床前研究显示RITUXIMAB使来源于弥猴(cynomolgus)外周血，淋巴结和骨髓的B细胞耗竭，推测是通过补体和细胞介导的过程完成(Reff等，血液83(2)：435-445(1994))。
涉及CD20抗体的专利和专利申请包括美国专利5,776,456，5,736,137，6,399,061，和5,843,439，以及美国专利申请US 2002/0197255A1，US2003/0021781A1，US 2003/0082172 A1，US 2003/0095963 A1，US2003/0147885 A1(Anderson et al.)；美国专利6,455,043B1和WO00/09160(Grillo-Lopez，A.)；WO00/27428(Grillo-Lopez和White)；WO00/27433(Grillo-Lopez和Leonard)；WO00/44788(Braslawsky et al.)；WO01/10462(Rastetter，W.)；WO01/10461(Rastetter和White)；WO01/10460(White和Grillo-Lopez)；美国专利申请US2002/0006404和WO02/04021(Hanna和Hariharan)；美国专利申请US2002/0012665 A1和WO01/74388(Hanna，N.)；美国专利申请US 2002/0058029 A1(Hanna，N.)；美国专利申请US 2003/0103971 A1(Hariharan和Hanna)；美国专利申请US2002/0009444A1，和WO01/80884(Grillo-Lopez，A.)；WO01/97858(White，C.)；美国专利申请US2002/0128488A1 and WO02/34790(Reff，M.)；WO02/060955(Braslawsky et al.)；WO2/096948(Braslawsky etal.)；WO02/079255(Reff和Davies)；美国专利6,171,586B1，andWO98/56418(Lam et al.)；WO98/58964(Raju，S.)；WO99/22764(Raju，S.)；WO99/51642，美国专利6,194,551B1，美国专利6,242,195B1，美国专利6,528,624B1 and美国专利6,538,124(Idusogie et al.)；WO00/42072(Presta，L.)；WO00/67796(Curd et al.)；WO01/03734(Grillo-Lopez et al.)；美国专利申请US 2002/0004587A1和WO01/77342(Miller and Presta)；美国专利申请US2002/0197256(Grewal，I.)；美国专利申请US 2003/0157108A1(Presta，L.)；美国专利6,090,365B1，6,287,537B1，6,015,542，5,843,398，and 5,595,721，(Kaminski et al.)；美国专利5,500,362，5,677,180，5,721,108，and 6,120,767(Robinson et al.)；美国专利6,410,391B1(Raubitschek et al.)；美国专利6,224,866B1和WO00/20864(Barbera-Guillem，E.)；WO01/13945(Barbera-Guillem，E.)；WO00/67795(Goldenberg)；US Appl No.US2003/01339301 A1 and WO00/74718(Goldenberg and Hansen)；WO00/76542(Golay et al.)；WO01/72333(Wolin和Rosenblatt)；美国专利6,368,596B1(Ghetie et al.)；美国专利申请US2002/0041847 A1，(Goldenberg，D.)；美国专利申请US2003/0026801A1(Weiner和Hartmann)；WO02/102312(Engleman，E.)；美国专利申请2003/0068664(Albitar et al.)；WO03/002607(Leung，S.)；WO049694(Wolin et al.)；WO03/061694(Sing和Siegall)，每篇文献都包含在本文作为参考。也参见，美国专利5,849,898和EP申请330,191(Seed et al.)；美国专利4,861,579和EP332,865A2(Meyer andWeiss)；USP4,861,579(Meyer et al.)和WO95/03770(Bhat et al.)。
涉及利用Rituximab的治疗的公开出版物包括：Perotta和Abuel“Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to Rituximab”Abstract# 3360 Blood 10(1)(part 1-2)：p.88B(1998)；Stashi et al.“Rituximab chimericanti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathicthrombocytopenic purpura” Blood 98(4)：952-957(2001)；Matthews，R.“Medical Heretics”New Scientist(2001-4-7)；Leandro et al.“Clinicaloutcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocytedepletion”Ann Rheum Dis 61：833-888(2002)；Leandro et al.“Lymphocytedepletion in rheumatoid arthritis：early evidence for safety，efficacy and doseresponse.Arthritis and Rheumatism 44(9)：S370(2001)；Leandro et al.“Anopen study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus”，Arthris & Rheumatism 46(1)：2673-2677(2002)；Edwards and Cambridge“Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designedto deplete B lymphocytes”Rhematology 40：205-211(2001)；Edwards et al.“B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmunedisorders”Biochem.Soc.Trans.30(4)：824-828(2002)；Edwards et al.“Efficacyand safety of Rituximab，a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody：Arandomized，placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis.Arthritis and Rheumatism 46(9)：S197(2002)；Levine and Pestronk“IgMantibody-related polyneuropathies：B-cell depletion chemotherapy usingRituximab”Neurology 52：1701-1704(1999)；DeVita et al.“Efficacy ofselective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis”Arthritis &Rheum 46：2029-2033(2002)；Hidashida et al.“Treatment ofDMARD-Refractory rheumatoid arthritis with rituximab.”，参见AnnualScientific Meeting of the Ameican College of Rheumatology；Oct 24-29；NewOrleans，LA 2002；Tuscano，J.“Successful treatment of Infliximab-refractoryrheumatoid arthritis with rituximab”，参见Annual Scientific Meeting of theAmerican College of Rheumatology；Oct 24-29；New Orleans，LA 2002。
涉及眼部疾病中的自身免疫抗体的公开出版物包括：Haldar et al.Invest Ophthalmol Visual Sci 29：37(1988)；Kahaly et al.Horm.Metab.Res.21(3)：137-141(1989)；Peek et al.Investigative Ophthalmology & VisualSciece 39(10)：1976-1979(1998)；Harper和Foster InternationalOphthalmology Clinics 38(1)：1-19(1998)；Bartalena et al.Bailliere’s ClinicalEndocrinology and Metabolism 11(3)：521-536(1997)；Seider et al.BritishJournal of Ophthalmology 85(11)：1287-1288(2001)；Hiromatsu et al.Endocrinologia Japonica 39(6)：593-600(1992)；Donnelly，J Autoimmunity1(3)：207-216(1988)；Hollows，F.Australian Journal of Ophthalmology9(3)：239-245(1981)；Weetman and McGregor Endocrine Reviews 5(2)：309-355(1984)；Waltman和Yarian American Journal of Ophthalmology 77(6)：891-894(1974)；Aronson et al.JAMA 196(3)：225-228(1966)；Hekenlively et al.ArchOphthalmol.118(11)：1497-507(2000)；和Bartalena et al.European Journal ofNuclear Medicine 29(Suppl.2)：S458-S465(2002)。
WO00/402262描述了利用抗CD4单链Fv(scFv)片段治疗眼部疾病。
发明内容
本发明涉及治疗哺乳动物中的眼部疾病的方法，包括将有效治疗所述眼部疾病的量的CD20拮抗剂给予所述哺乳动物。优选，所述拮抗剂是抗体诸如Rituximab或人源化的2H7，包括完整抗体以及抗体片段。本发明可治疗的眼部疾病的实例包括葡萄膜炎(uveitis)(包括虹膜炎)，甲状腺眼病(thyroid eye disease)或Grave’s眼病(Graves’ophthalmology)，眼白塞病(ocularBehcet’s disease)，眼重症肌无力(ocular myasthenia gravis)，眼类天疱疮(ocular pemphigoid)，自身免疫性视网膜病(autoimmune retinopathy)，盘尾丝虫病(onchocerciasis)，巩膜表外层炎(episcleritis)，巩膜炎(scleritis)，复发型类固醇依赖性视神经炎(relapsing steroid dependent optic neuritis)，韦格纳肉芽肿的眼部累及(ocular involvement of Wegener’s granulomatosis)，干燥综合征眼部并发症(Sjogren’s eye complication)，黑素瘤相关的视网膜病(melanoma associated retinopathy)以及癌相关的视网膜病(cancer associatedretinopathy)。
优选实施方案的详述
I.定义
本文术语“眼部疾病(ocular disorder)”是涉及眼的疾病或病症。具有本发明的眼部疾病的哺乳动物通常显示眼疾病的一或多种症状。具体感兴趣的本发明的眼部疾病包括，但不限于，葡萄膜炎(包括虹膜炎和急性前葡萄膜炎)，甲状腺眼病或Grave’s眼病，眼白塞病，眼重症肌无力，眼类天疱疮，自身免疫性视网膜病，盘尾丝虫病，巩膜表外层炎，巩膜炎，复发型类固醇依赖性视神经炎，韦格纳肉芽肿的眼部累及，干燥综合征眼部并发症，黑素瘤相关的视网膜病以及癌相关的视网膜病等。
本文术语“自身抗体”指哺乳动物产生的针对一或多种其自身抗原的抗体。自身抗体可在来自哺乳动物的生物样品(诸如泪液，眼活检，血清，血浆等)中，利用Western印迹分析，ELISA，免疫组织化学，chromatoscanning等检出。
本文术语“眼抗原”是抗原，诸如蛋白抗原，其存在于眼内或眼周围。所述眼抗原可存在眼以及其它组织(例如骨骼肌组织)的内部或周围，或相比于哺乳动物的其它细胞或组织而言，可主要或仅仅存在眼内或周围，例如视网膜蛋白诸如recoverin，眼肌肉抗原，视网膜Muller细胞，uveal等。
为本发明的目的，“免疫复合物”包含非共价连接的复合物，其是抗体(例如自身抗体)和抗原(例如眼内和周围发现的抗原)形成的。
“CD20”抗原是在90％以上来自外周血或淋巴器官的B细胞表面发现的一种～35kDa的非糖基化磷蛋白。CD20在早期前B细胞发育阶段表达，并保持到浆细胞分化。CD20在正常B细胞和恶性B细胞上均可发现。文献中CD20亦称为“B淋巴细胞限制性抗原”或“Bp35”。例如，在Clark等PNAS(USA)82：1766(1985)有对CD20抗原的描述。
“拮抗剂”是这样的分子，其一旦结合B细胞上的CD20，就破坏和耗竭哺乳动物中的B细胞和/和干扰一或多种B细胞功能，例如通过降低和防止B细胞激发的体液反应。所述拮抗剂优选可耗竭利用其治疗的哺乳动物的B细胞(即降低循环B细胞水平)。所述耗竭可经由各种机制实现，诸如抗体依赖的细胞介导的细胞毒(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒(CDC)，抑制B细胞增殖和/或诱导B细胞死亡(例如经由凋亡)。包含在本发明范围内的拮抗剂包括抗体，合成和天然序列肽，以及结合CD20的小分子拮抗剂，可选偶联和融合于细胞毒制剂。优选的拮抗剂包括抗体。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用”和“ADCC”指一种细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒细胞(如自然杀伤(NK)细胞，中性粒细胞，和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，并随后引起靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞即NK细胞仅表达FcγR III，而单核细胞表达FcγR I，FcγR II和FcγR III。Raveth和Kinet在免疫学年鉴9：457-92(1991)，464页的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。为评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC试验，如美国专利5,500,362号或5,821,337号中所述。这类试验中有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。任选或另外，目的分子的ADCC活性可在体内评估，例如在Clynes等PNAS(USA)95：652-656(1998)公开的动物模型种。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应物的功能的白细胞。优选所述细胞表达至少FcγR III并执行ADCC效应物的功能。例如可介导ADCC的人白细胞包括人外周血单个核细胞(PBMC)，自然杀伤(NK)细胞，单核细胞，细胞毒T细胞和中性粒细胞；其中优选PBMC和NK细胞。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列的人FcR。而且，优选的FcR是与IgG抗体结合的受体(γ受体)，其包括FcγR I，FcγR II和FcγR III亚型，以及这些受体的等位基因变体和可替换的剪接形式。FcγR II受体包括FcγR IIA(“活化型受体”)和FcγR IIB(“抑制型受体”)，二者的氨基酸序列相似，主要区别在其胞浆结构域。活化型受体FcγR IIA在其胞浆结构域包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制型受体FcγR IIB在其胞浆结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(见Daeron，免疫学年鉴15：203-234(1997))。在Ravetch和Kinet，免疫学年鉴9：457-92(1991)；Capel等，免疫方法(免疫学方法)4：25-34(1994)；和de Haas等，实验室及临床医学杂志(J.Lab.Clin.Med.)126：330-41(1995)中对FcR进行了综述。其它FcR，包括将来被确定的，均被包含在术语“FcR”中。该术语也包括新生期的受体，FcRn，其负责将母体的IgG转运至胎儿(Guyer等，免疫学杂志117：587(1976)和Kim等，免疫学杂志24：249(1994))。
“补体依赖性细胞毒作用”或“CDC”是指在补体存在时分子裂解标靶的能力。补体活化途径由补体系统第一个成分(Clq)结合至一个与同源抗原形成化合物的分子(如抗体)来启动。为评价补体活化，可如Gazzano-Santoro等，免疫学方法杂志202：163(1996)所述进行CDC试验。
“生长抑制”拮抗剂是指那些阻止或减少可与拮抗剂结合之抗原的表达细胞增殖的拮抗剂。例如拮抗剂可在体内或体外阻止或减少B细胞的增殖。
“诱导凋亡”的拮抗剂是指那些可诱导例如，B细胞程序性细胞死亡的拮抗剂，所述凋亡可通过标准凋亡试验，如annexin V的结合，DNA片段化，细胞皱缩，内质网膨胀，细胞碎裂，和/或膜泡(称为凋亡小体)形成确定。
这里的术语“抗体”用其最广泛的意义，尤其包含完整的单克隆抗体，多克隆抗体，由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，以及能显示所需生物学活性的任何抗体片段。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选包括抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab’，F(ab’)2，和Fv片段；二价抗体；线性化抗体；单链抗体分子；和由抗体片段构成的多特异性抗体。
“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)构成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，免疫球蛋白不同型的重链中二硫键数目不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每个重链在其一个端有可变区(VH)，紧接着多个恒定区。每个轻链在其一端有可变区(VL)，而另一端有恒定区；轻链恒定区与重链第一恒定区并列，轻链的可变区与重链的可变区并列。认为某些氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
术语“可变的”是指不同抗体的可变区特定部分序列差异很大，且这些部分在每种抗体与其特定抗原的结合和特异性中有用。然而在抗体整个可变区中可变性的分布并不均等。它集中在轻链和重链可变区的三个被称为高变区的节段中。可变区的更高度保守部分被称为框架区(FR)。天然轻链和重链的可变区分别包含四个FR，它们大多采用β片层构象，通过三个高变区相连，这些高变区形成环状，有时形成β片层结构的一部分。每条链的高变区通过FR紧密连接，并与其他链的高变区共同形成抗体的抗原结合位点(见Kabat等，具有免疫学意义的蛋白的序列，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定区不直接参与抗体对抗原的结合，但显示多种效应功能，如使抗体参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。
抗体经木瓜蛋白酶消化产生两个相同的称为“Fab”的抗原结合片段和一个残余“Fc”片段，每个Fab片段具有单个抗原结合位点，Fc的名称反映了其容易形成结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab’)2片段，它有两个抗原结合位点并仍能与抗原交叉结合。
“Fv”是包含完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。这个区域是由一条重链和一个轻链可变区紧密、非共价结合成的二聚体。在VH-VL二聚体表面，每个可变区的三个高变区在此构型中相互作用，从而限定一个抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特性。但即使单个可变区(或Fv中仅包含三个抗原特异性高变区的那一半)也能识别并结合抗原，只是比完整结合位点的亲和力低。
Fab片段还包含轻链恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab’不同于Fab片段之处在于，其重链CH1区的羧基端添加了数个残基，其中包括来自抗体铰链区的一或多个半胱氨酸。本文中Fab’-SH指一种Fab’，其中恒定区的半胱氨酸残基有至少一个游离巯基。F(ab’)2抗体片段最初是作为Fab’片段对且它们之间有铰链区半胱氨酸的形式产生的。抗体片段的其它化学连接也是已知的。
脊椎动物任何物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以是两种完全不同的型(κ和λ)之一，型别区分的依据是其恒定区氨基酸序列。
抗体依据其重链恒定区氨基酸序列分为不同的类。完整抗体有五大类：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中几种能进一步分为亚型(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。对应于不同类抗体的重链恒定区分别被称为α，δ，ε，γ和μ。免疫球蛋白不同类的亚单位和三维构型是已知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，这些结构域存在于单个多肽链上。优选Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含一个多肽接头，它能使scFv形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述见Pluckthun在《单克隆抗体的药理学》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)。
术语“二价抗体(diabodies)”是指具有两个抗原结合位点的小分子抗体片段，这些片段在一条多肽链(VH-VL)上含有相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。利用一种非常短的接头，其使得同一条链上的两个结构域无法配对，不得不与另一条链上的互补结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。在EP 404,097；WO93/11161；和Hollinger等，美国国家科学院学报，90：6444-6448(1993)中有对二价抗体的更详细描述。
本文中术语“单克隆抗体”指从实质上均一的抗体群获得的抗体，即包含该群体的单个抗体除了可能自然发生的很少量突变以外都相同。单克隆抗体均以高度特异性直接针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的传统(多克隆)抗体制剂相比，每种单克隆抗体直接针对抗原上的单个决定簇。单克隆抗体除了具有特异性，其优势还在于，它们是通过杂交瘤培养而合成的，无其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆的”指抗体获自实质上均一的抗体群的特征，不应理解为需要由任何具体方法产生抗体。例如根据本发明使用的单克隆抗体可以用由Kohler等，自然，256：495(1975)首次描述的杂交瘤方法来制备，或用重组DNA法(如美国专利4,816,567)来制备。“单克隆抗体”还可以是用Clackson等，自然，352：624-628(1991)和Marks等，分子生物学杂志，222：581-597(1991)所述技术从噬菌体抗体库中分离得到。
本文中单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中所述嵌合抗体中重链和/或轻链的一部分等同于或同源于来自特定物种的抗体或属于特定抗体类或亚类的抗体的相应序列，链的其余部分等同于或同源于来自其它物种的抗体或属于另一抗体类或亚类的抗体的相应序列，只要它们展示所需生物学活性(见美国专利4,816,567；Morrison等，美国国家科学院学报，81：6851-6855(1984))。本文的目标嵌合抗体包括“灵长源化(primatized)”抗体，其包含源于非人灵长类可变区的抗原结合序列(如Old WorldMonkey，如狒狒，猕猴(rhesus)或恒河猴(cynomolgus monkey))和人的恒定区序列(美国专利5,693,780)。
“人源化”形式的非人(如鼠)抗体是包含源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在多数情况下，人源化抗体是下述人免疫球蛋白(受者(recipient)抗体)，其中受者的高变区残基被非人物种如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类(供者(donor)抗体)的具有所需特异性、亲和力和容量(capacity)的高变区的残基取代。在一些例子中，人免疫球蛋白框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。而且人源化抗体可包含未在受者抗体或供者抗体中发现的残基。这些修饰旨在进一步改进抗体的功能。一般情况下，人源化抗体基本上包含至少一个、通常两个完整可变区，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，所有或基本上所有FR是人的免疫球蛋白序列中的那些。人源化抗体任选还包含免疫球蛋白、通常为人免疫球蛋白的恒定区(Fc)的至少一部分。详见Jones等，自然321：522-525(1986)；Riechmann等，自然332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
本文中术语“高变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区含有“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变区的残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，重链可变区的残基31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，具有免疫学意义的蛋白的序列，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))，和/或“高变环”的残基(例如轻链可变区的残基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)，重链可变区的残基26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，分子生物学杂志196：901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基是除本文所定义的高变区残基以外的可变区残基。
与CD20抗原结合的抗体有：“C2B8”现在被称为“rituximab”(“RITUXAN”)(美国专利5,736,137，引入作为参考)；钇-[90]-标记的2B8鼠抗体“Y2B8”或“Ibritumomab Tiuxetan ZEVALIN”(美国专利5,736,137，引入作为参考)；任选用131I标记鼠IgG2a“B1”(也称为Tositumomab)产生“131I-B1”抗体(碘I131 tositumomab BEXXARTM)(美国专利5,595,721，引入作为参考)；鼠单克隆抗体“IF5”(Press等Blood 69(2))：584-591(1987))；和“框架区修补的(patched)“或人源化的IF5嵌合2H7抗体(美国专利5,677,180，引入作为参考)(WO03/002607，Leung，S.)；ATCC保藏号HB-96450)；鼠2H7和嵌合2H7抗体(美国专利5,677,180，包含在本文作为参考)；人源化的2H7；huMax-CD20(Genmab，Denmark)；AME-133(AppliedMolecular Evolution)；；和可从国际白细胞分型小组(International LeukocyteTyping Workshop)获得的单克隆抗体L27，G28-2，93-1B3，B-C1或NU-B2(Valentine等，在《白细胞分型III)》(McMichael编，第440页，OxfordUniversity Press(1987))。
本文中术语“rituximab”或“RITUXAN”指经遗传工程改造的、针对CD20抗原的嵌合鼠/人单克隆抗体，在美国专利5,736,137(引入作为参考)中命名为“C2B8”，包括其保持与CD20的结合能力的片段。
完全为了本发明的目的，“人源化的2H7″指完整抗体和包含可变轻链序列的抗体片段：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：1)；以及可变重链序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQM[NSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：2)
如果人源化的2H7抗体是完整抗体，优选其包含轻链氨基酸序列：MGWSCIILFLVATATGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：3)；和重链氨基酸序列MGWSCIILFLVATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：4)。
“分离”的拮抗剂是已经从其自然环境组分中鉴定并分离和/或回收的拮抗剂。其自然环境中的污染成分有，可干扰该拮抗剂的诊断和治疗应用的物质，可能包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白溶质。在优选实施方案中，，该拮抗剂的纯度应达到：(1)经 Lowery 法确定的拮抗剂比重为95％以上，最优选99％以上，(2)足以获得用旋转杯状(spinning cup)序列分析仪所测至少15个残基的N端或内部氨基酸序列，(3)通过还原或非还原条件下的SDS-PAGE以及考马斯亮蓝染色、优选银染所证实的均质性。分离的拮抗剂包括重组细胞内的原位拮抗剂，因为该拮抗剂的自然环境中的至少一种组分已不存在。但一般情况下分离的拮抗剂可通过至少一个纯化步骤来制备。
需要治疗的“哺乳动物”是指归为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园里的动物、参与运动项目的动物或宠物如狗、马、猫、牛等。优选所述哺乳动物为人类。
“治疗”是指治疗方法和预防措施。需要治疗者包括已经患眼部疾病者，以及需要对眼部疾病进行预防者。因此，哺乳动物可能被诊断为患眼部疾病或对所述疾病有倾向或易感。
“治疗有效量”是指能有效阻止，改善或治疗目标眼部疾病的拮抗剂的量。
本文用于辅助治疗的术语“免疫抑制剂”是指能抑制或掩盖所治哺乳动物的免疫系统的物质。这将包括能抑制细胞因子的产生，下调或抑制自身抗原的表达，或掩盖MHC抗原的物质。这些制剂的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(见美国专利4,665,077，其全文引入本文作参考)；非类固醇类抗炎药(NSAID)；硫唑嘌呤(azathioprine)；环磷酰胺；溴麦角环肽；达那唑；氨苯砜；戊二醛(它掩盖MHC抗原，如美国专利4,120,649所述)；抗MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A；类固醇如糖皮质激素，例如强的松，甲基强的松和地塞米松；氨甲蝶呤(口服或皮下)；羟氯喹(hydroxycloroquine)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；leflunomide；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂包括抗IFN-γ，-β或-α抗体，抗TNF-α抗体(infliximab或adalimumab)；抗TNF-α免疫粘附素(etanercept)，抗TNF-β抗体，抗IL-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗LFA-1抗体，包括抗CD11a和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；泛(pan)-T抗体，优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；包含LFA-3结合结构域的可溶性肽(公开于7/26/90的WO90/08187)；链激酶；TGF-β；链道酶(streptodorrrnase)；源于宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素；雷帕霉素；T细胞受体(Cohen等，美国专利5,114,721)；T细胞受体片段(Offner等，科学，251：430-432(1991))；WO90/11294；Ianeway，自然，341：482(1989)；和WO91/01133)；和T细胞受体抗体(EP 340,109)例如T10B9。
本文中术语“细胞毒制剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性核素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32和镥的放射性同位素)，化疗制剂，毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或它们的片段。
“化疗制剂”是在癌症治疗中使用的化学化合物。化疗制剂实例包括烷化剂，如噻替哌(thiotepa)；环膦酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶如苄替哌(benzodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；氮丙啶和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，胆磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥；左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan)，新氮芥(novembichin)，胆甾醇苯乙酸氮芥，松龙苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)如亚硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如阿克拉霉素，放线菌素，authramycin，重氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C(cactinomycin)，加利车霉素(calicheamicin)，carabicin，更生霉素(carminomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素(chromomycin)，放线菌素D(dactinomycin)，道诺红菌素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，发波霉素(marcellomycin)，丝裂霉素，霉酚酸，诺加霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素；链脲霉素(streptozocin)，杀结核菌素，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)，氨甲蝶呤，丁蝶翼素(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，doxifluridine，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷，5-FU；雄激素类如二甲睾酮，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，环硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类如氨鲁米特(aminoglutethimide)，邻氯苯对氯苯二氯乙烷(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂如frolinic acid；醋葡内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依达曲沙(edatraxate)；磷氨氮芥(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfomithine)；醋酸羟吡咔唑(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼树酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；乌拉坦(urethan)；长春碱酰胺；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；溴丙哌嗪(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替哌(thiotepa)；紫杉烷(taxoid)，如紫杉醇(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和doxetaxel(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；鬼臼乙叉甙(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾(vinorelbine)；新霉酰氨(navelbine)；二羟基蒽酮(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；柔红霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸；esperamicins；capecitabine；以及上述任何物质的可药用盐，酸或衍生物。此定义还包括能调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素制剂，如抗雌激素制剂包括他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制剂4(5)-咪唑，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，奥那司酮(onapristone)，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素制剂如氟他氨(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)，bicalutamide，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物质的可药用盐，酸或衍生物。
术语“细胞因子”是由一个细胞群释放的、作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白的总称。这类细胞因子有淋巴因子，单核因子，和传统的多肽激素。包括生长激素，如人生长激素，N-甲二磺酰人生长激素，和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；原胰岛素；松驰素；原松驰素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲状腺刺激激素(TSH)，促黄体(生成)激素(LH)；肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳激素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和β；苗勒-抑制物；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；苯丙酸诺龙(activin)；血管内皮细胞生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factors)；干扰素如干扰素-α，-β，-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-15；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和kit配体(KL)。本文中术语细胞因子包括天然蛋白或来自重组细胞培养物的蛋白以及天然序列细胞因子的生物活性等效物。
本发明使用的术语“前体药物”是指药物活性物质的前体或衍生物形式，其相对于亲本药物对肿瘤细胞的细胞毒作用较小且可酶促活化或被转换成更具活性的亲本形式。例见Wilman，“癌症化疗中的前体药物”Biochemical Society Transaction，14，pp.375-382，615th Meeting Belfast(1986)和Stella等，“前体药物：一种药物定向运送的化学方法”定向药物运送，Borchardt等(编)，pp.247-267，Humana press(1985)。本发明的前体药物包括，但不限于含有磷酸盐的前体药物，含有硫代磷酸盐的前体药物，含有硫酸盐的前体药物，含有肽的前体药物，D-氨基酸修饰的前体药物，糖基化的前体药物，含有β-内酰胺的前体药物，含有任选取代的苯氧乙酰胺的前体药物或含有任选取代的苯基乙酰胺的前体药物，可转化为更具细胞毒活性的游离药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前体药物。可衍生为本发明所用前体药物形式细胞毒药物包括，但不限于上述化疗试剂。
“B细胞恶性疾病”是涉及B细胞的恶性疾病。实例包括霍奇金病(Hodgkin’s disease)，包括淋巴细胞优势型霍奇金病(lymphocytepredominant Hodgkin’s disease)(LPHD)；非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma)(NHL)；滤泡中心细胞淋巴瘤(follicular center cell(FCC)lymphoma)；急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia(ALL))；慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia(CLL))；毛细胞白血病(hairycell leukemia)；浆细胞样淋巴细胞淋巴瘤(plasmacytoid lymphocyticlymphoma)；套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)；AIDS和HIV-相关的淋巴瘤；多发性骨髓瘤(multiple myeloma)；中枢神经系统淋巴瘤(central nervoussystem(CNS)lymphoma)；移植后淋巴增生性疾病(post-transplantlymphoproliferative disorder)(PTLD)；Waldenstrom′s巨球蛋白血症(macroglobulinemia)(淋巴浆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma))；粘膜相关的淋巴样组织淋巴瘤(mucosa-associated lymphoid tissue(MALT)lymphoma)；以及边缘区淋巴瘤/白血病(and marginal zonelymphoma/leukemia)。
非霍奇金淋巴瘤(NHL)包括，但不限于低级/滤泡(low grade/follicularNHL)，复发型和难治性(relapsed or refractory)NHL，前线低级(front line lowgrade)NHL，III/IV期NHL，化疗抗性(chemotherapy resistant)NHL，小淋巴细胞性(small lymphocytic)(SL)NHL，中间级/滤泡(intermediategrade/follicular)NHL，中间级弥漫型(intermediate grade diffuse)NHL，弥漫型大细胞淋巴瘤(diffuse large cell lymphoma)，进展性(aggressive)NHL(包括进展性前线NHL和进展性复发型NHL)，自体干细胞移植后的NHL复发或自体干细胞移植难治性NHL(relapsing after or refractory to autologousstem cell transplantation)，高级免疫母细胞性(high grade immunoblastic)NHL，高级淋巴母细胞性(high grade lymphoblastic)NHL，高级小非凹陷的细胞(high grade small non-cleaved cell)NHL，bulky病NHL等。
II.拮抗剂的制备
本发明的方法和制品使用，或掺入了一种能结合CD20的拮抗剂。相应地，本文还描述了产生这类拮抗剂的方法。
用于产生或筛选拮抗剂的CD20可以是，如CD20的可溶形式或其一部分，包括所需表位。或者，或任选，在表面表达所述CD20的细胞可用于产生或筛选拮抗剂。可用于产生拮抗剂的其它形式的CD20为本领域所显而易见。
虽然优选的拮抗剂是抗体，但除抗体以外的其它拮抗剂也包括在此。例如，拮抗剂可含有任选融合至或偶联于细胞毒制剂(如本文所公开的那些)的小分子。可在小分子文库中筛选本文的目标CD20，以便鉴定能与该抗原结合的小分子。还可进一步筛选小分子的拮抗特性和/或其与细胞毒试剂的偶联。
拮抗剂也可以是经合理设计或噬菌体展示产生的肽(例见WO98/35036，1998年8月13日公开)。在一个具体实施方案中，所选的分子可以是“CDR类似物”或基于抗体CDR而设计的抗体类似物。尽管所述肽本身可能就有拮抗性，但任选将此肽与细胞毒制剂融合，以便添加或增强此肽的拮抗性。
以下为本发明所用抗体拮抗剂的产生技术举例。
(i)多克隆抗体
多克隆抗体优选通过多次给动物皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂而产生。将所述相关抗原与在所免疫的物种中具有免疫原性的蛋白(如匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)用双功能试剂或衍生试剂，如马来酰亚氨苯甲酰基硫代琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基结合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(R和R1是不同烷基)，进行偶联是有效的。
用所述抗原、免疫原性偶联物或衍生物免疫动物，方法是，将100μg或5μg蛋白或偶联物(分别针对兔或鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混合，在多位点皮内注射该溶液。1个月后，多位点皮下注射起始量的1/5-1/10的肽或与弗氏完全佐剂中的偶联物来加强免疫。7-14天后，对动物采血，测定血清中的抗体滴度。对动物的加强免疫直到滴度达到平台期为止。优选给动物加强注射相同抗原的偶联物，但也可以是偶联至不同蛋白和/或通过不同的交联剂偶联。偶联物还可以是重组细胞培养物中产生的融合蛋白。此外，可用明矾等聚集剂增强免疫应答。
(ii)单克隆抗体
单克隆抗体来自基本均一的抗体群，即该群体中的每个抗体除了可能的很小量天然突变外都相同。因此，修饰词“单克隆”指所述抗体的并非不同抗体混合物的特性。
例如，单克隆抗体可用由Kohler等，自然(1975)首次描述的杂交瘤技术制备，或用重组DNA方法制备(美国专利4,816,567)。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适合的宿主动物如仓鼠，以激发那些产生或能产生与用于免疫之蛋白特异性结合的抗体的淋巴细胞。另外，可体外免疫淋巴细胞。然后用适当融合剂，如聚乙二醇，使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding，单克隆抗体：原理及应用，pp.59-103(Academic Press，1986))。
将如此制备的杂交瘤细胞接种至适当培养基中并培养，优选该培养基含有一或多种能抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤培养基通常将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT-缺陷型细胞的生长。
优选骨髓瘤细胞是那些能有效融合、支持所选抗体生成细胞以稳定的高水平产生抗体，并对诸如HAT培养基等类似培养基敏感的细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，如由Salk Institute Cell DistreibutionCenter，San Diego，California USA提供的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤细胞和由美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland USA提供的SP-2或X63-Ag8-653细胞。也有报道称人骨髓瘤以及小鼠-人异质性骨髓瘤细胞系可用于产生人单克隆抗体(Kozbor，免疫学杂志133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体制备技术及应用，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))
可在含有生长的杂交瘤细胞的培养基中分析针对所述抗原的单克隆抗体的产生。优选，杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合试验，如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)来分析。
单克隆抗体的结合亲和力可通过如Muson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)所述Scatchard分析来测定。
一旦鉴定出能产生具有所需特异性、亲和力、和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，将这些克隆通过有限稀释法进一步克隆并用标准方法进行培养(Goding，单克隆抗体：原理及应用，PP.59-103(Academic Press，1986))。适于此目的的培养基包括如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可作为腹水中肿瘤的形式在动物体内生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体可用常规免疫球蛋白纯化方法如蛋白-A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基、腹水或血清中适宜地分离。
编码单克隆抗体的DNA可用常规方法很容易地分离和测序(如利用能与编码小鼠抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是这类DNA的优选来源。DNA分离后，可将其插入表达载体中，然后用此表达载体转染宿主细胞，如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以便在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述见Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5：256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.，130：151-188(1992)。
在另一实施方案中，可从用 McCafferty等，自然，348：552-554(1990)所述技术产生的抗体噬菌体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson等，自然，352：624-628(1991)和Marks等，分子生物学杂志222：581-597(1991)分别描述了用噬菌体文库分离鼠和人的抗体。后来的文献描述了通过链改组制备高亲和力(nM范围)的人型抗体(Marks等，生物/技术10：779-783(1992))，以及用于构建大规模噬菌体文库的组合感染和体内重组方法(Waterhouse等，核酸研究21：2265-2266(1993))。因此，这些技术都可取代传统单克隆抗体杂交瘤技术来分离克隆抗体。
DNA也可通过例如用人类重链和轻链的恒定区编码序列取代小鼠同源序列来修饰(美国专利4,816,567；Morrison等，美国国家科学院学报81：6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价结合来修饰。
通常用所述非免疫球蛋白多肽取代抗体恒定区，或取代抗体的一个抗原结合点的可变区，形成二价嵌合抗体，其中一个抗原结合位点特异于一种抗原而另一个抗原结合位点特异于另一种抗原。
(iii)人源化抗体
本领域已有关于人源化非人类抗体的制备方法的描述。优选人源化抗体中已导入一或多个源自非人类的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常称为“引进的”残基，它们通常来自“引进的”可变区。人源化过程基本如Winter及其同事(Jones等，自然，321：522-525(1986)；Riechmann等，自然，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，科学，239：1534-1536(1988))所述，用高变区序列取代人类抗体的相应序列来进行。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中完整人类可变区的很少一部分被非人类物种的相应序列取代。实践中，人源化抗体通常是人的抗体，其中高变区残基且可能有部分FR残基被啮齿类抗体中类似位点的残基取代。
对用于制备人源化抗体的人类可变区包括重链和轻链的选择，对降低抗原性非常重要。根据所谓“最适应”方法，针对已知人类可变区序列的整个文库筛选啮齿类抗体可变区序列。将与啮齿类的序列最相似的人类序列作为人源化抗体的人框架区(FR)(Sims等，免疫学杂志，151：2296(1993)；Chothia等，分子生物学杂志，196：901(1987))。另一种方法是用人类轻链或重链特定亚型的所有抗体的共有序列作为特定框架区。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等，美国国家科学院学报，89：4285(1992)；Presta等，免疫学杂志，151：2623(1993))。
更重要的是，将抗体人源化后保留了对抗原的高亲和力和其它有利的生物特性。为达到此目的，在一种优选方法中，通过用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物来制备人源化抗体。免疫球蛋白三维模型已有商品，是本领域技术人员所熟悉的。还有用于描述和展示所选免疫球蛋白序列可能的三维构象的计算机程序。通过观察这些展示结果可分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能发挥的作用，即分析能影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基，通过这种方法，可从受者和引进序列中选出FR残基并组合，从而得到所需抗体性质，如对靶抗原的亲和力增加。总之，高变区残基直接并且最主要涉及对抗原结合的影响。
(iv)人类抗体
除了进行人源化以外还可制备人类抗体。例如现在已能产生如下转基因动物(如小鼠)，它们通过免疫能产生人类抗体的所有成分而不产生内源免疫球蛋白。例如，有报道称，嵌合及种系(germ-line)突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源抗体的产生被完全抑制。将人类种系免疫球蛋白基因阵列转移到这类种系突变小鼠中将导致因抗原攻击而诱导人类的抗体产生。见Jakobovits等，美国国家科学院学报，90：2551(1993)；Jakobovits等，自然，362：255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno.7：33(1993)；和美国专利5591669，5589369和5545807。
或者，可用噬菌体展示技术(McCafferty等，自然348：552-553(1990))从未免疫供者的免疫球蛋白可变(V)区基因的所有组成而体外产生人类抗体和抗体片段。依据此技术，将抗体V区基因克隆在与丝状噬菌体(如M13或fd)主要或次要衣壳蛋白基因相同的框架内，并在噬菌体颗粒的表面展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，根据抗体的功能特点进行的选择也导致对显示这些性质的抗体的编码基因进行选择。因此，噬菌体模仿了B细胞的部分特点。噬菌体展示可以以多种形式进行；这些综述见Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，结构生物学的最新观点(Current Opinion in Structural Biology)3：564-571(1993)。可使用V基因片段的多个来源进行噬菌体展示。Clackson 等，自然，352：624-628(1991)从免疫小鼠脾脏来源的V基因的随机组合小文库中分离了抗-恶唑酮抗体的多样性阵列。可基本如Marks等，分子生物学杂志222：581-597(1991)，或 Griffith等，EMBO J.12：725-734(1993)所述构建未免疫人类供者的V基因所有组成成分，并分离针对抗原多样性阵列(包括自身抗原)的抗体。亦参见美国专利5565332和5573905。
人类抗体也可通过体外活化的B细胞而产生(见美国专利5,567,610和5,229,275)。
(v)抗体片段
已开发了生成抗体片段的多种技术。传统上，这些片段通过对完整抗体的蛋白水解性消化获得(见 Morimoto等，生物化学和生物物理学方法杂志(Journal of Biochemical and Biophysical Methods)24：107-117(1992))和Brennan等，科学，229：81(1985))。但现在可直接通过重组宿主细胞产生这些片段。例如，可从上述抗体噬菌体库分离抗体片段。另外，可从大肠杆菌直接回收Fab’-SH片段，并经化学连接形成F(ab’)2片段(Carter等，生物/技术10：163-167(1992))。依据另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养中分离F(ab’)2片段。其它产生抗体片段的技术对本领域技术人员是显而易见的。在其它实施方案中，所选抗体是单链Fv片段(scFv)。见WO 93/16185；美国专利5,571,894；和美国专利5,587,458。抗体片段也可以是“线性化抗体”，如美国专利5,641,870所述。这类线性化抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
(vi)双特异性抗体
双特异性抗体是具有针对至少两种不同表位的结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可以与CD20抗原的两种不同表位结合。其它这类抗体可以结合第一个CD20并再结合第二个CD20。或者，可将抗B细胞标志物的结合臂与结合白细胞上引发分子的臂结合，从而集中针对B细胞的细胞防御机制，所述引发分子如T细胞受体分子(CD2或CD3)，或IgG Fc受体(FcγR)如FcγR I(CD64)、FcγR II(CD32)和FcγR III(CD16)。双特异性抗体还可用于将细胞毒制剂定位至B细胞。这些抗体具有B细胞标志物结合臂和结合细胞毒制剂(例如皂草素，抗INF-α，长春花生物碱，蓖麻毒蛋白A链，氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段(如F(ab’)2双特异性抗体)。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。完整双特异性抗体的传统制备方法是基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中这两条链具有不同特异性(Millstein等，自然，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链轻链随机分配，这些四交瘤(quadroma)可能产生10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。对所述正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤来进行)非常复杂，且产量很低。类似的方法见WO93/08829和Traunecker等，EMBOJ，10：3655-3659(1991)。
依据另一种方法，可将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。该融合优选与包含铰链区的至少一部分、CH2及CH3区的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选使含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)出现在至少在一种融合中。可将编码免疫球蛋白重链融合体，以及必要时，编码免疫球蛋白轻链的DNA插入不同表达载体，共转染至适当宿主生物。这使得在使用非等比的三种多肽链进行构建的实施方案中，能够非常灵活地调整三种多肽片段的相互比例，以获得最佳产量。但也可在至少两种多肽链以等比例表达而获得高产时或所述比例无特别意义时，将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一表达载体。
在该方法的一个优选实施方案中，所述双特异性抗体由一条臂上的带有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。已发现这种不对称结构有利于从非必要免疫球蛋白链的混合中分离出所需双特异性化合物，因为只有该双特异性分子的一半上存在免疫球蛋白轻链，这使得分离更加容易。此方法公开于WO94/04690中。制备双特异性抗体的进一步细节，见Suresh等，酶学方法，121：210(1986)。
根据美国专利5,731,168所述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，使得从重组细胞培养中获得的异源二聚体的百分比最大。优选的界面包括抗体恒定区CH3结构域的至少一部分。在该方法中，源于第一抗体分子的界面上的一条或多条氨基酸小侧链被较大侧链(如酪氨酸或色氨酸)取代。与所述大侧链大小相同或相近的互补“沟”可通过将氨基酸大侧链用小侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代而在第二抗体分子的界面上形成。这使得异二聚体的产量比其它不需要的终产物如同型二聚体的高。
双特异性抗体包括交联抗体或“异源偶联的”抗体。例如，可使异源偶联物中的抗体之一与亲和素偶联，使另一抗体与生物素偶联。有观点认为，这类抗体可用于将免疫细胞靶向不想要的细胞(美国专利4676980)，也可用于治疗HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)。异源偶联抗体可通过任何适当的交联方法制备。适当的交联制剂和多种交联技术为本领域已知，可在美国专利4676980号中获得。
从抗体片段制备双特异性抗体的技术已有文献。例如，双特异性抗体可利用化学连接制备。Brennan等，科学229：81(1985)中描述了将完整抗体经蛋白水解制备F(ab’)2片段的方法。这些片段在二巯基复合剂亚砷酸钠存在时被还原，从而稳定相邻的巯基，并阻止分子间二硫键的形成。生成的Fab′片段被转化为硫硝基苯甲酸盐(TNB)衍生物。其中一种Fab′-TNB衍生物经巯基乙胺还原成Fab′-硫醇，再与等分子量的其它Fab′-TNB衍生物混合形成双特异性抗体。如此产生的双特异性抗体可作为酶的选择性固相化中所用的试剂。
近期的进展促进了Fab′-SH片段从大肠杆菌的直接回收，该片段可经化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby等，实验医学杂志，175：217-225(1992)中描述了完全人源化双特异性抗体F(ab′)2分子的产生。每一Fab′片段分别从大肠杆菌中分泌出来，经体外直接化学偶联形成双特异性抗体。如此制备的双特异性抗体能与过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞结合，还能引发人类细胞毒淋巴细胞对人乳腺肿瘤靶的裂解活性。
直接从重组细胞培养中制备并分离双特异性抗体片段的多种技术也已有描述。例如，可用亮氨酸拉链制备双特异性抗体。Kostelny等，免疫学杂志，148(5)：1547-1553(1992))。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab′部分通过基因融合而连接。使抗体的同型二聚体在铰链区被还原成单体，然后被再氧化形成抗体的异二聚体。该方法也可用于制备抗体同型二聚体。由Hollinger等，美国国家科学院学报，90：6444-6448(1993))描述的“二价抗体”技术提供了另一种制备双特异性抗体片段的方法。所述片段中含有重链可变区(VH)，其通过接头与轻链可变区(VL)相连，该接头非常短，使得同一链的两个结构域之间无法配对。因此，同一片段上的VH和VL结构域被迫与另一片段上的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。此外还报道了另一种用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体的策略。见Gruber等，免疫学杂志，152：5368(1994)。
还考虑了二价以上的抗体。如可制备三特异性抗体。Tutt等，免疫学杂志，147：60(1991)。
III.偶联以及对拮抗剂的其它修饰
本文方法或制品中提到的拮抗剂可任选与细胞毒制剂偶联。
可用于制备这些拮抗剂-细胞毒制剂偶联物的化疗试剂如上述。
本文还涉及拮抗剂与一或多种小分子毒素，如加利车霉素(calicheamicin)，美登素(maytansine)(美国专利5,208,020)，单端孢霉烯(trichothene)，CC1065的偶联物。在本发明的一个实施方案中，使拮抗剂与一或多个美登素分子偶联(如每个拮抗剂分子与约1-10个美登素分子偶联)。美登素可转化成May-SS-Me，然后还原成May-SH3，并与修饰过的拮抗剂反应(Chari等，癌症研究52：127-131(1992))产生美登木素生物碱-拮抗剂偶联物。
另外，拮抗剂可以与一或多个加利车霉素分子结合。加利车霉素家族的抗生素能在亚pM浓度水平产生双链DNA断裂。可使用的加利车霉素结构类似物包括，但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG以及θ1 I(Hinmam等，癌症研究53：3336-3342(1993)和Lode等，癌症研究58：2925-2928(1998))。
可以应用的酶活性毒素及其片段包括：白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒素，米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素(tricothecenes)。例见1993年10月28日公开的WO93/21232。
本发明还涉及与具有核裂解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶如脱氧核糖核酸酶；DNase)偶联的拮抗剂。
多种放射性同位素可用于制备放射性偶联的拮抗剂，实例包括At211、I131、I125、y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32以及Lu的放射性同位素。
拮抗剂与细胞毒制剂的偶联物可通过多种双功能蛋白偶联剂来连接，所述双功能蛋白偶联剂如：N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯，iminothiolane(IT)，亚氨酸酯的双功能衍生物(如亚氨基己二酸二甲酯盐酸盐)，活性酯类(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛类(如戊二醛(glutareldehyde))，双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如亚甲代苯基2，6-二异氰酸酯)，和双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，科学238：1098(1987)所述制备。C14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三氨五乙酸酯(MX-DTPA)是将放射性核苷酸偶联至拮抗剂的示例性偶联剂。见WO94/11026。这种接头可能是有利于细胞毒药物在细胞内释放的“可断开的接头”。例如，可使用酸不稳定型接头，肽酶敏感型接头，二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等，癌症研究52：127-131(1992))。
或者，可通过重组技术或肽合成来获得拮抗剂与细胞毒制剂的融合蛋白。
在另一实施方案中，拮抗剂可与肿瘤预靶向中应用的“受体”(如链霉亲和素)偶联，将该拮抗剂-受体偶联物给予患者，之后用清除剂除去循环中未结合的偶联物，再给予已偶联了细胞毒制剂(如放射性核苷酸)的“配体”(如亲和素)。
本发明的拮抗剂还可与前体药物活化酶相结合，该酶可以将前体药物(如肽基化疗剂，见WO81/01145)转化为活性抗癌药物。见WO88/07378和美国专利4,975,278。
这些偶联物中的酶组分包括能作用于前体药物使其转化为活性更强的细胞毒形式的任何酶。
本发明的方法中用到的酶包括，但不限于，能将含磷酸基的前体药物转化为游离药物的碱性磷酸酶；可将含硫酸基的前体药物转化为游离药物的芳香基硫酸酯酶；将无毒的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物，如5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；能将含肽的前体药物转化为游离药物的蛋白酶，如沙雷氏菌属蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)等；可转化含D-氨基酸取代基的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；能将糖基化前体药物转化为游离药物的碳水化合物裂解酶类如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；能将β-内酰胺衍生的药物转化为游离药物的β-内酰胺酶；能在药物中的氨基氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生化的药物称为游离药物的青霉素酰胺酶如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可用本领域称为“抗体酶(abzyme)”的具有酶活性的抗体，将本发明的前体药物转化为游离的活性药物(见Massey，自然328：457-458(1987))。可如本文所述制备拮抗剂-抗体酶偶联物以便将抗体酶运送至肿瘤细胞群。
本发明的酶可通过本领域已知的技术，如上述异源双功能交联试剂的使用而与拮抗剂共价结合。或者，可以通过本领域已知的DNA重组技术(如Neuberger等，自然，312：604-608(1984))构建含至少本发明拮抗剂的抗原结合区的融合蛋白，所述拮抗剂与本发明酶的至少一个功能活性部分连接。
本文还涉及对拮抗剂的其它修饰。例如，拮抗剂可与多非蛋白多聚物，如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯(polyoxyalkylene)、或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物中的一种交联。
本文公开的拮抗剂还可配成脂质体。含拮抗剂的脂质体可通过本领域已知方法制备，如Epstein等，美国国家科学院学报82：3688(1985)；Hwang等，美国国家科学院学报77：4030(1980)；美国专利4,485,045和4,544,545及1997年10月23日公开的WO97/38731。在美国专利5,013,566中公开了循环时间增加了的脂质体。
特别有效的脂质体可利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物经反相蒸发法产生。脂质体通过一定孔径大小的滤膜而挤出后获得具有所需直径的脂质体。本发明抗体的Fab’片段可如Martin等，生物学化学杂志，257：286-288(1982)所述，经二硫键交换反应与脂质体偶联。可任选在所述脂质体中包含化疗制剂。见Gabizon等，J.National Cancer Inst，81(19)1484(1989)。
本发明还涉及对本文所述蛋白质或肽类拮抗剂的氨基酸序列修饰。例如，可预期改进拮抗剂的结合亲和力和/或其它生物学特性。拮抗剂的氨基酸序列变体可通过在拮抗剂核酸中导入适当的核苷酸改变，或通过肽合成法来制备。所述修饰包括，如该拮抗剂的氨基酸序列中的残基缺失，和/或插入和/或取代。可对缺失、插入、和取代进行任意组合以获得最终构建体，只要该最终构建体具有所需特性。氨基酸的变化还可改变拮抗剂的翻译后加工，如改变糖基化位点的数目或位置。
一种鉴别拮抗剂中处于诱变优选位置的特定残基或区域的有效方法是Cunningham和Wells，科学244：1081-1085(1989)所述的“丙氨酸扫描诱变”。这里，鉴定一个残基或一组靶残基(例如，带电的残基如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)并用中性或带负电的氨基酸取代(最优选丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以便影响氨基酸与抗原的相互作用。那些证实对取代具有功能敏感性的氨基酸位置通过在取代点引入进一步的或其他的变体而改进。故，尽管引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但突变本身不必是预定的。例如，为分析在指定位点处突变的作用，在所述靶密码子或区域实行丙氨酸扫描或随机诱变，并筛选所表达的具有预期活性的拮抗剂变体。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-端的融合(其长度从一个残基至包括100个或更多残基的多肽)，以及序列内单个或多个氨基酸残基的插入。末端插入的例子包括带有N-末端甲硫氨酰残基的拮抗剂或与细胞毒性多肽融合的拮抗剂。拮抗剂分子的其它插入变体包括在酶或多肽的拮抗剂的N-或C-末端进行融合，以增加拮抗剂在血清中的半衰期。
另一类变体是氨基酸取代变体。这些变体使拮抗剂分子中至少一个氨基酸残基被不同残基取代。抗体拮抗剂分子中最有兴趣进行取代诱变的位点包括高变区，也可以改变FR。保守取代见表1的“优先取代”栏。如果这些取代引起生物学活性的改变，则可引入表1中“取代举例”  栏的更实质性改变，或进一步在下文的氨基酸分类中所述的更实质性改变，并筛选产物。
                       表1
原始残基 取代举例 优先取代
Ala(A) val；leu；ile val
Arg(R) lys；gln；asn lys
Asn(N) gln；his；asp；lys；arg gln
Asp(D) glu；asn glu
Cys(C) ser；ala ser
Gln(Q) asn；glu asn
Glu(E) asp；gln asp
Gly(G) ala ala
His(H) Asn；gln；lys；arg arg
Ile(I) Leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸 leu
Leu(L) 正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe ile
Lys(K) arg；gln；asn arg
Met(M) leu；phe；ile leu
Phe(F) leu；val；ile；ala；tyr tyr
Pro(P) ala ala
Ser(S) thr thr
Thr(T) ser ser
Trp(W) tyr；phe tyr
Tyr(Y) trp；phe；thr；ser phe
Val(V) ile；leu；met；phe ala；正亮氨酸 leu
对拮抗剂的生物学特性的实质性修改可通过选择性取代来完成，所述取代的效应在维持(a)取代区多肽骨架的结构，例如片层结构或螺旋构象，(b)该分子靶位点的电荷或疏水性，(c)侧链的大小这几方面有显著差异。天然残基根据共有的侧链特性可分为：
(1)疏水性：正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸异亮氨酸
(2)中性亲水：半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸
(3)酸性：天冬氨酸，谷氨酸
(4)碱性：天冬酰胺，谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，精氨酸
(5)影响侧链定向的残基：甘氨酸，脯氨酸
(6)芳香族：色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。
非保守取代将限定上述某一类的成员被另一类取代。
与维持拮抗剂正确构象有关的任何半胱氨酸残基也可被取代，如被丝氨酸取代，以提高该分子的氧化稳定性，并阻止异常交联。相反，可在拮抗剂中添加半胱氨酸连接以提高其稳定性(特别当拮抗剂为抗体片段如FV片段时)。
取代变体的特别优选类型包括取代亲本抗体高变区的一或多个残基。通常，所选用于进一步开发的变体相对于其亲本抗体应具有改进的生物学活性。产生这种取代变体的一个方便方法是利用了噬菌体展示的亲和力成熟。简单地说，使高变区的几个位点(如6-7个位点)突变以便在每一位点产生所有可能的氨基酸取代。这样产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，其为与每个颗粒内包装的M13基因III产物的融合体。然后筛选噬菌体展示的变体是否具有本文所述生物学活性(如结合亲和力)。为了鉴定备选的高变区修饰位点，可通过丙氨酸扫描诱变来鉴定对抗原结合作出主要贡献的高变区残基。可选或此外，分析抗原-抗体化合物的晶体结构以确定抗原与抗体之间的接触点也较有利。这些接触残基及其邻近残基是根据本文所述技术进行取代的候选位点。一旦产生这样的变体，如本文所述对它们全部进行筛选，选出在一或多个相关实验中具有优势特性的抗体以便进一步开发。
拮抗剂的另一种氨基酸变体改变了拮抗剂原来的糖基化模式。所谓改变就是去掉拮抗剂中的一或多个碳水化合物部分，和/或添加一或多个原本不存在于该拮抗剂中的糖基化位点。
多肽的糖基化通常为N-连接或O-连接。N-连接指将碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链相连。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是使碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶促相连的识别序列。因此，多肽中存在上述任一种三肽序列都可产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化指将N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖附着于羟基氨基酸，主要是丝氨酸、苏氨酸，但也可用5-羟脯氨酸和5-羟赖氨酸。
在拮抗剂分子中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列，使其包含一或多个上述三肽序列(在N-连接糖基化位点的情况下)而常规实现。这种改变也可通过在原始的拮抗剂序列中添加或取代一或多个丝氨酸或苏氨酸残基来实现(在O-连接糖基化位点的情况下)。
抗体包含Fc区的情况下，附着于所述抗体的碳水化合物可被改变。例如，具有缺乏附着于抗体Fc区的岩藻糖的成熟碳水化合物结构的抗体描述于美国专利申请US 2003/0157108 A1，Presta，L。具有位于附着于抗体Fc区的碳水化合物中的二分型N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体参见wO03/011878，Jean-Mairet et al.和美国专利6,602,684，Umana et al。具有在附着于抗体Fc区的寡糖中的至少一个半乳糖残基的抗体报道于AWO97/30087，Patel et al。也参见WO98/58964(Raju，S.)和WO99/22764(Raju，S.)，其涉及具有附着于其Fc区上的改变的碳水化合物。
编码拮抗剂的氨基酸序列变体的核酸分子由本领域已知的各种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然氨基酸序列变体的情况下)，或通过对早期制备的拮抗剂变体或未变异的拮抗剂进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变，PCR诱变和盒式诱变来制备。
也可预期修饰拮抗剂的效应物功能，如以此增强拮抗剂的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒作用(CDC)。这可以通过在抗体拮抗剂FC区引入一或多个氨基酸取代而获得。此外，可在FC区引入半胱氨酸残基，使得在此区形成链间二硫键。由此产生的同型二聚体抗体可提高内在化能力和/或增强补体介导的细胞杀伤作用和ADCC。见Caron等，实验医学杂志176：1191-1195(1992)和Shopes，B.免疫学杂志148：2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同型二聚体抗体也可用Wolffe等，癌症研究53：2560-2565(1993)所述异源双功能交联剂制备。或者，可通过工程改造产生具有双FC区并因此具有增强的补体裂解效应及ADCC能力的抗体。见Stevenson等，抗癌药物的设计(Anti-Cancer drug design)3：219-230(1989)。WO00/42072(Presta，L.)描述了在存在人效应细胞下具有改善的ADCC功能的抗体，其中所述抗体包含其Fc区中的氨基酸取代。
具有改变的Clq结合和/或补体依赖性细胞毒(CDC)的抗体描述于WO99/51642，美国专利6,194,551B1，美国专利6,242,195B1，美国专利6,528,624B1和美国专利6,538,124(Idusogie et al.)。所述抗体包含位于其Fc区的氨基酸位置270，322，326，327，329，313，333和/或334的氨基酸取代。
为了提高拮抗剂的血清半衰期，一种方法是在拮抗剂(尤其抗体片段)中掺入补救受体结合表位，如美国专利5,739,277所述。本文中术语“补救受体结合表位”是指IgG(例如IgG1，IgG2、IgG3、或IgG4)Fc区中负责延长该IgG分子的体内血清半衰期的表位。其Fc区中具有取代且其血清半寿期延长的抗体描述于WO00/42072(Presta，L.)。
也涉及具有三或更多个(优选四个)功能抗原结合位点的抗体(美国专利申请US2002/0004587 A1，Miller et al.)。
IV.药用制剂
根据本发明使用的拮抗剂的药用制剂通过将具有所需纯度的拮抗剂与任选的药用载体、赋形剂或稳定剂(雷氏药学(Remington’s PharmaceuticalSciences)第16版，Osol，A.编(1980))混合而制备，然后以冻干剂或含水剂的形式保存。可药用载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度下对受者无毒性，并包括缓冲剂例如磷酸盐，柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸;防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵;氯化己烷双胺；氯化苄烷铵(benzalkonium chloride)，苯索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(少于10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属化合物(例如锌-蛋白化合物)；和/或非离子表面活性剂如吐温TM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
抗CD20抗体制剂的实例如WO98/56418所述，其已引入本文作为参考。其描述了一种液体多剂量制剂，该制剂包含40mg/ml rituximab，25mM乙酸，150mM海藻糖，0.9％苯甲醇，0.02％聚山梨酸酯(polysorbate)20，pH5.0，在2-8℃至少可保存2年。另一种抗CD20目标制剂在9.0mg/ml氯化钠，7.35mg/ml二水柠檬酸钠，0.7mg/ml聚山梨酸酯80，注射用无菌水pH6.5中包含10mg/ml rituximab。
适于皮下给药的冻干剂见WO97/04801所述。这种冻干剂可用适当稀释剂重新恢复至高蛋白浓度，所重建的制剂可皮下给药至这里所治疗的哺乳动物。
所述制剂还可根据所治疗的具体情况而包含一种以上活性成分，优选具有互补活性但相互无负面影响的那些。例如，优选还提供细胞毒试剂，化疗试剂，细胞因子或免疫抑制剂(如作用于T细胞的那些，如环孢菌素或结合T细胞的抗体，如结合LFA-1的抗体)。所述其它试剂的有效量取决于该制剂中拮抗剂的量，疾病或病症或治疗的类型，及上述其它因素。通常应用上文所述剂量和给药方式，或迄今所用剂量的约1-99％。
活性成分也可容纳在通过凝聚技术或界面聚合作用制备的微胶囊中，如分别在胶体性质的药物运送系统(如脂质体，白蛋白小球体，微乳剂，纳米颗粒及纳米胶囊)或大乳剂(macroemulsions)中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(异丁烯酸甲酯)微胶囊。这些技术见雷氏药学，第16版Osol，A.编(1980)。
也可制备控释制剂。控释制剂的适当实例包括含有拮抗剂的固态疏水聚合物的半通透性基质，所述基质为具有一定形状的制品，如膜或微胶囊。控释制剂实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)，聚交酯(美国专利3,773,919)，L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可以通过除菌滤膜过滤而轻易实现。
V.利用所述拮抗剂的治疗
本发明涉及利用结合CD20的拮抗剂治疗眼部疾病。优选的拮抗剂氏结合CD20的抗体，例如Rituximab或人源化的2H7。所述抗体可以是完整抗体或抗体片段。
本发明待治疗的疾病的实例包括但不限于葡萄膜炎(包括虹膜炎)，甲状腺眼病或Grave’s眼病，眼白塞病，眼重症肌无力，眼类天疱疮，自身免疫性视网膜病，盘尾丝虫病，巩膜表外层炎，巩膜炎，复发型类固醇依赖性视神经炎，韦格纳肉芽肿的眼部累及，干燥综合征眼部并发症，黑素瘤相关的视网膜病和/或癌相关的视网膜病等。通常，本发明治疗的哺乳动物将不患有B细胞恶性疾病。本发明的治疗的哺乳动物通常显示一或多种眼疾病的症状，诸如视力模糊，疼痛，发红等。
本发明的一个实施方案中，所述哺乳动物产生结合一或多种自身抗原包括存在于眼中的抗原的自身抗体。所述哺乳动物可接受预后检测，以检测所述自身抗体，其中在所述检测中具有阳性结果的哺乳动物或患者是本发明所述治疗的候选者。一些情况诸如重症肌无力中，存在于眼或其它地方内或周围的针对抗原的自身抗体(例如针对骨骼肌组织的自身抗体，包括眼外肌)可存在眼内，其可利用预后检测来检测。可选或此外，所述患者可具有沉积在眼内的免疫复合物作为部分系统疾病过程，诸如源自类风湿性血管炎的巩膜炎。本发明还涉及检测所述免疫复合物的存在，以及治疗被发现具有所述免疫复合物的患者。
含一种与CD20结合的拮抗剂的组合物可根据常规医疗实践而针对本文所述各种情况进行配制、分剂量、并给药。其中应考虑的因素包括所治疗的具体疾病或紊乱，所治疗的具体哺乳动物，具体患者的临床状况，疾病或紊乱的病因，药物的给药部位，给药方法，给药时间表，和医务人员已知的其它因素。拮抗剂的治疗有效量将参考上述因素而给予。
作为通常的倾向，经胃肠外给药的每剂拮抗剂的有效量为约20mg/m2-约10,000mg/m2患者身体，可通过一或多个剂量给予。完整抗体的示例性IV剂量方案包括375mg/m2每周一次×4；1000mg×2(例如在第1和15天)；或1克×3。对于局部给药的抗体或抗体片段，例如作为滴眼剂或药膏，或用于框内或眼周注射，示例性剂量为约0.001-约100mg，例如约0.1-约10mg，例如每天应用一次，每天应用两次，或更为频繁。对于眼房内(眼房内)或玻璃体内(intravitreal)注射，考虑约0.01-约10mg的剂量，优选约0.1-约1mg。
但是如上所述，所述拮抗剂的量需要大量治疗判断。选择适宜剂量和方案的关键因素是所得的结果，如上所述，例如，可能在治疗进行性或急性疾病的开始需要相对较高的剂量。为获得更为有效的效果，根据所述疾病或病症，所述拮抗剂在尽可能接近所述疾病或病症的病征、诊断、出现或发生时给药，或在所述疾病或病症的缓解期给药。
所述拮抗剂通过适宜方法给药，包括胃肠外，经玻璃体内，眼房内，眶内，眼周，局部(例如经由滴眼剂或眼用药膏)，经皮下，经腹腔内，经肺内，经鼻内，和/或经损伤内给药。经胃肠外给药包括经肌内，经静脉内，经动脉内，经腹腔内，经皮下给药。也涉及经鞘内给药。此外，所述拮抗剂可通过脉冲输注例如利用剂量递减的拮抗剂适宜给药。优选所述剂量通过注射给予，更优选通过静脉内注射，或给予眼内或眼周。
可给药其它化合物，诸如细胞毒制剂，化疗药剂，免疫抑制剂和/或细胞因子连同本发明的拮抗剂。例如，所述CD20拮抗剂可与糖皮质激素/强的松/甲基强的松(糖皮质激素类)，静脉内免疫球蛋白(gamma球蛋白)，telecobalthotherapy，血浆除去法，左旋甲状腺素(levothyroxine)，环孢素(cyclosporin)A，促生长素抑制素类似物(somatastatin analogues)，细胞因子拮抗剂(cytokine antagonist)，抗代谢物(anti-metabolites)，免疫抑制剂(immunosuppressive agent)，细胞毒制剂(cytotoxic agents)(例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，硝基咪唑硫嘌呤(azathioprine))，眼眶放疗(orbital radiotherapy)，眼眶解压(orbitaldecompression)，康复手术(rehabilitative surgery)，放射性碘(radioiodine)，甲状腺切除(thyroidectomy)等。联用的治疗包括共给药，利用分离的配制剂或单个药物配制剂，以及任何顺序的连续给药，其中优选存在两种(或所有)同时发挥它们的生物活性的活性药剂之间的期间。
除了向患者给药蛋白拮抗剂，本申请还考虑通过基因治疗给药拮抗剂。这类编码拮抗剂的核酸的给药以“给予有效治疗剂量的拮抗剂”的表达形式包括在内。例见1996年3月14日公开的WO96/07321，其涉及利用基因治疗产生细胞内抗体。
有两种主要方法可将核酸(任选包含在载体中)引入患者细胞；体内和离体(ex vivo)。体内运送核酸指直接给患者注射，通常注射至需要拮抗剂的位点。离体治疗是将患者细胞取出，将核酸引入这些分离的细胞，然后将这些已改变的细胞直接给予患者或装入多孔膜中再植入患者体内(见美国专利4,892,538和5,283,187)。有多种技术可用于将核酸引入活细胞。可根据是将核酸转移至体外培养的细胞，还是转移至目标宿主的体内细胞而使用不同方法。适于将核酸转移至体外哺乳动物细胞的技术有脂质体的应用、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀法等。常用于离体运送基因的载体是逆转录病毒。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(如腺病毒，单纯疱疹病毒I型或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(可用于基因的脂质介导型转移的有效脂质有DOTMA，DOPE和DC-Chol)的转染。某些情况下，希望提供一种带有能靶向靶细胞的试剂(如特异于细胞表面膜蛋白或靶细胞的抗体，针对靶细胞表面受体的配体，等)的核酸来源。当使用脂质体时，可使用能结合胞吞作用相关性细胞表面膜蛋白的蛋白来靶向和/或促进对下述蛋白的吸收，所述蛋白如对特定细胞类型具有向性的衣壳蛋白或其片段，在循环中进行内在化的蛋白的抗体，靶向细胞内定位和提高细胞内半衰期的蛋白。受体介导型胞吞作用的技术见Wu等，生物学化学杂志262：4429-4432(1987)；和Wagner等，美国国家科学院学报，87：3410-3414(1990)。有关目前已知的基因制备和基因治疗方案的综述见Anderson等，科学256：808-813(1992)。亦参见WO93/25673。
本发明的更详细内容通过以下非限制性实施例举例说明。本说明书中所引用的所有文献均引入作为参考。
实施例1
诊断患有一或多种眼部疾病的症状的患者根据本实施例进行治疗。待本发明的待治疗眼部疾病包括葡萄膜炎(包括虹膜炎)，甲状腺眼病(也称作Grave’s眼病)，眼白塞病，眼重症肌无力，眼类天疱疮，自身免疫性视网膜病，盘尾丝虫病，巩膜表外层炎，巩膜炎，复发型类固醇依赖性视神经炎，韦格纳肉芽肿的眼部累及，干燥综合征眼部并发症，黑素瘤相关的视网膜病或癌相关的视网膜病。
所述患者利用完整Rituximab或人源化2H7，或Rituximab或人源化2H7的片段(诸如Fab，F(ab’)2，Fv，scFv或二价抗体)治疗。
优选，完整抗体经静脉内(IV)给药，所选剂量为375mg/m2每周一次×4,1000mg×2(例如在第1和15天)，或1克×3以耗竭(至少在一定程度上)循环CD20阳性B细胞，由此缓解眼部疾病的症状。
所述疾病在眼表面的情况下，例如在巩膜炎或干燥综合征中，所述抗体系统给药(例如，如上述经静脉内)或所述抗体配制成用于通过滴眼剂或药膏局部给药。适宜剂量范围为约0.1-10mg，每天使用一次，两次或三次。
需要眼内穿透的情况下，例如对于葡萄膜炎，所述抗体或抗体片段通过经玻璃体内或眼房内注射给药。根据该给药模式，所述抗体优选为抗体片段的形式，以改善眼内的吸收。用于经玻璃体内或眼房内注射给药的抗体片段的剂量为约0.1-约1.0mg。所述抗体或抗体片段间歇给药，例如每月一次，通过玻璃体内或眼房内注射。
利用CD20抗体的治疗可选与一或多种其它治疗眼部疾病的疗法组合，诸如糖皮质激素/强的松/甲基强的松(糖皮质激素类)，静脉内免疫球蛋白(gamma球蛋白)，促生长素抑制素类似物，细胞因子拮抗剂，血浆除去法，左旋甲状腺素，环孢素A，抗代谢物，免疫抑制剂，细胞毒制剂(例如苯丁酸氮芥，环磷酰胺，硝基咪唑硫嘌呤)，telecobalthotherapy，眼眶放疗，眼眶解压，康复手术，放射性碘，和/或甲状腺切除。
用CD20治疗的患者显示眼部疾病的症状改善，诸如视力敏锐度提高，不适感或流泪减轻，视力损失得以改善或防止。

Claims (17)

1.治疗哺乳动物中的眼部疾病的方法，包括将有效治疗所述眼部疾病的量的CD20拮抗剂给予所述哺乳动物。
2、权利要求1的方法，其中所述拮抗剂包含抗体。
3、权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人。
4、权利要求2的方法，其中所述抗体不与细胞毒制剂偶联。
5、权利要求2的方法，其中所述抗体包含rituximab。
6.权利要求2的方法，其中所述抗体包含人源化的2H7。
7.权利要求2的方法，其中所述抗体与细胞毒制剂偶联。
8.权利要求1的方法，其基本上包括给予将所述的拮抗剂给予哺乳动物。
9.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物产生结合一或多种眼抗原的自身抗体或在眼内具有免疫复合物。
10.权利要求1的方法，其中所述眼部疾病选自以下疾病组成的组：葡萄膜炎，虹膜炎，甲状腺眼病或Grave’s眼病，眼白塞病，眼重症肌无力，眼类天疱疮，自身免疫性视网膜病，盘尾丝虫病，巩膜表外层炎，巩膜炎，复发型类固醇依赖性视神经炎，韦格纳肉芽肿的眼部累及，干燥综合征眼部并发症，黑素瘤相关的视网膜病以及癌相关的视网膜病。
11.权利要求1的方法，其中所述抗体是完整抗体。
12.权利要求1的方法，其中所述抗体是包含与CD20结合的抗原结合区的抗体片段。
13.权利要求12的方法，其中所述抗原结合片段选自Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv，单链Fv片段(scFv)，和二价抗体组成的组。
14.权利要求1的方法，其中所述抗体经静脉内给药。
15.权利要求1的方法，其中所述抗体经眶内、经眼房内，经眼周，和经玻璃体内注射给药。
16.权利要求15的方法，其中所述抗体是包含结合CD20的抗原结合区的抗体片段。
17.权利要求1的方法，其中所述抗体局部给药于眼。
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