KR20060132554A - 안과 질병의 항-ｃｄ２０ 치료 - Google Patents

Abstract

본원은 CD20에 결합하는 길항제, 예를 들어 항체를 사용하는 안과 질병의 치료를 설명한다.

안과 질병, 항체

Description

안과 질병의 항-ＣＤ２０ 치료 {ANTI-CD20 THERAPY OF OCULAR DISORDERS}

본 출원은 전문을 본원에 참고로 포함시킨 미국 가출원 60/498,791 (2003년 8월 29일 출원)에 대해 미국 특허법 35 USC§119 하의 우선권을 주장하는 정규출원이다.

본 발명은 CD20에 결합하는 길항제, 예를 들어 항체를 사용하는 안과 질병의 치료에 관한 것이다.

림프구는 조혈 과정 동안 골수에서 생산된 많은 종류의 백혈구 중 하나이다. 2가지 주요 집단의 림프구, 즉 B 림프구 (B 세포) 및 T 림프구 (T 세포)가 존재한다. 본원에서 특히 관심있는 림프구는 B 세포이다.

B 세포는 골수 내에서 성숙하고 그의 세포 표면에 항원 결합 항체를 발현하며 골수를 떠난다. 나이브 (naive) B 세포가 처음 그의 멤브레인-결합 항체가 특이적인 항원을 만나면, 세포는 빠르게 분할하기 시작하고, 그의 후손체는 메모리 (memory) B 세포 및 "혈장 세포"로 불리는 이펙터 세포로 분화한다. 메모리 B 세포는 더 긴 수명을 갖고, 본래의 모세포와 동일한 특이성을 갖는 멤브레인-결합 항체를 계속 발현한다. 혈장 세포는 멤브레인-결합 항체를 생산하지 않는 대신, 분비될 수 있는 형태의 항체를 생산한다. 분비된 항체는 체액성 면역의 주요 이펙터 분자이다.

CD20 항원 (인간 B-림프구-제한된 분화 항원, Bp35로도 불림)은 예비(pre)-B 및 성숙 B 림프구 상에 위치하는 분자량 약 35 kD의 소수성 트랜스멤브레인 단백질이다 (Valentine et al. J. Biol. Chem. 264(19): 11282-11287 (1989); 및 Einfeld et al. EMBO J. 7(3): 711-717 (1988)). 항원은 또한 90%를 초과하는 B 세포 비-호지킨 (non-Hodgkin) 림프종 (NHL) 상에서 발현되지만 (Anderson et al. Blood 63(6): 1424-1433 (1984)), 조혈 줄기 세포, 전구(pro)-B 세포, 정상 혈장 세포 또는 다른 정상 조직 상에서는 발견되지 않는다 (Tedder et al. J. Immunol. 135(2): 973-979 (1985)). CD20은 세포 사이클 개시 및 분화를 위한 활성화 과정에서 초기 단계(들)을 조절하고 (Tedder 등, 상기 문헌), 가능하게는 칼슘 이온 채널으로서 기능한다 (Tedder et al. J. Cell. Biochem. 14D: 195 (1990)).

B 세포 림프종에서 CD20의 발현에서, 상기 항원은 상기 림프종의 "표적화 (targeting)" 후보로서 기능한다. 본질적으로, 상기 표적화는 다음과 같이 일반화될 수 있다. 즉, B 세포의 CD20 표면 항원에 특이적인 항체가 환자에게 투여된다. 이 항-CD20 항체는 (표면상으로) 정상 및 악성 B세포 모두의 CD20 항원에 특이적으로 결합하고, CD20 표면 항원에 결합한 항체는 신생 B 세포의 파괴 및 고갈을 야기할 수 있다. 부가적으로, 종양 파괴능을 갖는 화학제 또는 방사성 표지는 이들이 신생 B 세포에 특이적으로 "전달"되도록 항-CD20 항체에 컨쥬게이팅될 수 있다. 방법에 상관없이, 1차 목표는 종양을 파괴하는 것이고, 특정 방법은 이용되는 특정 항-CD20 항체에 의해 결정될 수 있고, 따라서 CD20 항원의 표적화에 이용가능한 방 법은 크게 상이할 수 있다.

리툭시맙 (RITUXAN(등록상표)) 항체는 CD20 항원에 대해 작용하는 유전공학적으로 처리된 키메릭 (chimeric) 쥐/인간 모노클로날 항체이다. 리툭시맙은 미국 특허 5,736,137 (1998년 4월 7일 허여됨 (Anderson 등))에서 "C2B8"로 명명된 항체이다. RITUXAN(등록상표)은 재발 또는 난치성 저등급 (low-grade) 또는 여포성, CD20 포지티브 (positive), B 세포 비-호지킨 림프종 환자 치료를 위해 처방된다. 시험관내 작용 메카니즘 연구는 RITUXAN(등록상표)이 인간 보체에 결합하고 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 통해 림프양 B 세포주를 용해시킨다는 것을 입증하였다 (Reff et al. Blood 83(2): 435-445 (1994)). 부가적으로, 이는 항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC) 분석에서 유의한 활성을 갖는다. 보다 최근에, RITUXAN(등록상표)은 삼중수소 티미딘 도입 분석에서 항증식 효과를 갖고 직접 아폽토시스를 유도하는 것으로 밝혀진 반면, 다른 항-CD19 및 CD20 항체는 그렇지 않다 (Maloney et al. Blood 88 (10): 637a (1996)). RITUXAN(등록상표) 및 화학요법제 및 톡신 사이의 시너지도 실험에서 관찰되었다. 특히, RITUXAN(등록상표)은 약물 내성 인간 B 세포 림프종 세포주를 독소루비신, CDDP, VP-16, 디프테리아 톡신 및 리신의 세포독성 효과에 민감하게 만든다 (Demidem et al. Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12 (3): 177-186 (1997)). 생체내 전임상 연구는 아마도 보체 및 세포 매개 과정을 통해 RITUXAN(등록상표)이 사이노몰거스 원숭이의 말초 혈액, 림프절 및 골수로부터 B 세포를 고갈시키는 것으로 밝혀졌다 (Reff et al. Blood 83 (2): 435-445 (1994)).

CD20 항체에 관한 특허 및 특허 공개는 각각 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,776,456, 5,736,137, 6,399,061 및 5,843,439와 미국 특허 출원 공개 2002/0197255A1, 2003/0021781A1, 2003/0082172Al, 2003/0095963Al, 2003/0147885 Al (Anderson 등); 미국 특허 6,455,043B1 및 WO00/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO00/27428 (Grillo-Lopez 및 White); WO00/27433 (Grillo-Lopez 및 Leonard); WO00/44788 (Braslawsky 등); WO01/10462 (Rastetter, W.); WO01/10461 (Rastetter 및 White); WO01/10460 (White 및 Grillo-Lopez); 미국 특허 출원 공개 2002/0006404 및 WO02/04021 (Hanna 및 Hariharan); 미국 특허 출원 공개 2002/0012665 Al 및 WO01/74388 (Hanna, N.); 미국 출원 공개 2002/0058029 Al (Hanna, N.); 미국 특허 출원 공개 2003/0103971 Al(Hariharan 및 Hanna); 미국 특허 출원 공개 2002/0009444A1 및 WO01/80884 (Grillo-Lopez, A.); WO01/97858 (White, C.); 미국 특허 출원 공개 2002/0128488A1 및 WO02/34790 (Reff, M.); WO02/060955 (Braslawsky 등); WO2/096948 (Braslawsky 등); WO02/079255 (Reff 및 Davies); 미국 특허 6,171,586B1 및 WO98/56418 (Lam 등); WO98/58964 (Raju, S.); WO99/22764 (Raju, S.); WO99/51642, 미국 특허 6,194,551B1, 미국 특허 6,242,195B1, 미국 특허6,528,624B1 및 미국 특허 6,538,124 (Idusogie 등); WO/42072 (Presta, L.); WO00/67796 (Curd 등); WO01/03734 (Grillo-Lopez 등); 미국 특허 출원 공개 2002/0004587A1 및 WO01/77342 (Miller 및 Presta); 미국 특허 출원 공개 2002/0197256 (Grewal, I.); 미국 특허 출원 공개 2003/0157108 Al (Presta, L.); 미국 특허 6,090,365B1, 6,287,537B1, 6,015,542, 5,843,398 및 5,595,721 (Kaminski 등); 미국 특허 5,500,362, 5,677,180, 5,721,108 및 6,120,767 (Robinson 등); 미국 특허 6,410,391B1 (Raubitschek 등); 미국 특허 6,224,866B1 및 WO00/20864 (Barbera-Guillem, E.); WO01/13945 (Barbera-Guillem, E.); WO00/67795 (Goldenberg); 미국 특허 출원 공개 2003/01339301 Al 및 WO00/74718 (Goldenberg 및 Hansen); WO00/76542 (Golay 등); WO01/72333 (Wolin 및 Rosenblatt); 미국 특허 6,368,596B1 (Ghetie 등); 미국 특허 출원 공개 2002/0041847Al, (Goldenberg, D.); 미국 특허 출원 공개 03/0026801A1 (Weiner 및 Hartmann); WO02/102312 (Engleman, E.); 미국 특허 출원 공개 2003/0068664 (Albitar 등); WO03/002607 (Leung, S.); WO049694 (Wolin 등); WO03/061694 (Sing 및 Siegall)를 포함한다. 또한, 미국 특허 5,849,898 및 EP 출원 330,191 (Seed 등); 미국 특허 4,861,579 및 EP332,865A2 (Meyer 및 Weiss); USP 4,861,579 (Meyer 등) 및 WO95/03770 (Bhat 등)를 참조한다.

리툭시맙을 사용하는 치료에 관한 문헌은 문헌 [Perotta and Abuel "Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to Rituximab" Abstract #3360 Blood 10(1) (part 1-2): p. 88B (1998); Stashi et al. "Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathic thrombocytopenic purpura" Blood 98(4): 952-957 (2001); Matthews, R. "Medical Heretics" New Scientist (7 April, 2001); Leandro et al. "Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion" Ann Rheum Dis 61: 833-888 (2002); Leandro et al. "Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response. Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001); Leandro et al."An open study of B Lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus", Arthritis & Rheumatism 46(1): 2673-2677 (2002); Edwards and Cambridge "Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes" Rhematology 40: 205-211 (2001); Edwards et al. "B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders" Biochem. Soc. Trans. 30(4): 824-828 (2002); Edwards et al. "Efficacy and safety of Rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism 46(9): S197 (2002); Levine and Pestronk "IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using Rituximab" Neurology 52: 1701-1704 (1999); DeVita et al. "Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheum 46: 2029-2033 (2002); Hidashida et al. "Treatment of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis with Rituximab." Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002; Tuscano, J. "Successful treatment of Infliximab-refractory rheumatoid arthritis with Rituximab" Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002]를 포함한 다.

안과 질병에서 자가항체에 관한 문헌은 문헌 [Haldar et al. Invest Ophthalmol Visual Sci 29: 37(1988); Kahaly et al. Horm. Metab. Res. 21(3): 137-141 (1989); Peek et al. Investigative Opthalmology & Visual Science 39(10): 1976-1979 (1998); Harper and Foster International Opthalmology Clinics 38(1): 1-19 (1998); Bartalena et al. Bailliere's Clinical Endocrinology and Metabolism 11(3): 521-536 (1997); Seider et al. British Journal of Opthalmology 85(11): 1287-1288 (2001); Hiromatsu et al. Endocrinologia Japonica 39(6): 593-600 (1992); Donnelly, J Autoimmunity 1(3): 207-216(1988); Hollows, F. Australian Journal of Opthalmology 9(3): 239-245 (1981); Weetman and McGregor Endocrine Reviews 5(2): 309-355 (1984); Waltman and Yarian American Journal of Opthalmology 77(6): 891-894 (1974); Aronson et al. JAMA 196(3): 225-228 (1966); Hekenlively et al. Arch Ophtalmol. 118(11): 1497-507 (2000); 및 Bartalena et al. European Journal of Nuclear Medicine 29 (Suppl. 2): S458-S465 (2002)]를 포함한다.

WO00/402262에서는 항-CD4 단쇄 Fv(scFv) 단편을 사용하여 안과 질병을 치료하는 것을 설명한다.

발명의 개요

본 발명은 CD20 길항제를 안과 질병 치료에 효과적인 양으로 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 포유동물의 안과 질병의 치료 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 길항제는 무손상 항체 및 항체 단편을 포함하여 항체, 예를 들어 리툭시맙 또는 인간화 2H7이다. 본 발명에서 치료될 수 있는 안과 질병의 예는 포도막염 (홍채염 포함), 갑상선 눈 질환 또는 그레이브스 (Graves) 안질환, 눈 베체트 (Behcet) 병, 눈 중증근무력증, 눈 유사천포창 (pemphigoid), 자가면역 망막병증, 회선사상충증, 상공막염, 공막염, 재발성 (relapsing) 스테로이드 의존성 시각 신경염, 베게너 (Wegener) 육아종증의 눈 병발 (involvement), 쇼그렌 (Sjogren) 눈 합병증, 흑색종 관련 망막병증 및(또는) 암 관련 망막병증을 포함한다.

바람직한 실시태양의 상세한 설명

I. 정의

본원에서 "안과 질병"은 눈에 관련된 질병 또는 질환이다. 본원에서 안과 질병에 걸린 포유동물은 일반적으로 눈 질환의 하나 이상의 증상을 보일 것이다. 본원에서 특히 관심의 대상이 되는 안과 질병은 포도막염 (홍채염 및 급성 전부 포도막염 포함), 갑상선 눈 질환 또는 그레이브스 안질환, 눈 베체트 병, 눈 중증근무력증, 눈 유사천포창, 자가면역 망막병증, 회선사상충증, 상공막염, 공막염, 재발성 스테로이드 의존성 시각 신경염, 베게너 육아종증의 눈 병발, 쇼그렌 눈 합병증, 흑색종 관련 망막병증, 암 관련 망막병증 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

본원에서 "자가항체"는 하나 이상의 그 자신의 항원에 대해 포유동물이 생성시키는 항체를 의미한다. 자가항체는 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석, ELISA, 면역조직화학, 크로마토스캐닝 등을 사용하여 포유동물의 생물학적 시료 (예를 들어 눈물, 눈 생검체, 혈청, 혈장 등)에서 검출될 수 있다.

본원에서 "눈 항원"은 눈 또는 그 주위에 존재하는 항원, 예를 들어 단백질 항원이다. 눈 항원은 눈 또는 그 주위 뿐만 아니라 다른 조직 (예, 골격근 조직)에 존재할 수 있거나, 또는 포유동물의 다른 세포 또는 조직, 예를 들어 망막 단백질, 예를 들어 레코베린, 눈 근육 항원, 망막 물러 (Muller) 세포, 포도막 등에 비해 주로 눈 또는 그 주위에 또는 눈에만 존재할 있다.

본 발명의 목적을 위해, "면역 복합체"는 항체 (예, 자가항체)와 항원 (예, 눈 또는 그 주위에서 발견된 항원) 사이에 형성되는 비공유결합으로 회합된 복합체를 포함한다.

"CD20" 항원은 말초혈액 또는 림프양 기관의 B 세포의 90%를 초과하는 표면에서 발견되는 ~35 kDa의 비-글리코실화된 인단백질이다. CD20은 초기 예비 B 세포 발생 동안 발현되어 혈장 세포 분화까지 유지된다. CD20은 정상 B 세포 및 악성 B 세포 모두에 존재한다. 문헌에서 CD20의 다른 명칭은 "B-림프구-제한 항원" 및 "Bp35"을 포함한다. CD20 항원은 예를 들어 문헌 [Clark et al. PNAS (USA) 82: 1766(1985)]에 기재되어 있다.

"길항제"는 예를 들어 B 세포에 의해 발생하는 체액 반응을 저하 또는 억제함으로써 B 세포 상의 CD20에 결합시에 포유동물에서 B 세포의 파괴 또는 고갈 및(또는) 하나 이상의 B 세포 기능의 간섭 기능을 갖는 분자이다. 길항제는 바람직하게는 치료되는 포유동물에서 B 세포를 고갈 (즉, 순환하는 B 세포 수준의 저하)시킬 수 있다. 이러한 고갈은 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및(또는) 보체 의존성 세포독성 (CDC), B 세포 증식의 억제 및(또는) B 세포 사멸의 유도 (예를 들어 아폽토시스를 통해)와 같은 다양한 메카니즘을 통해 달성할 수 있다. 본 발명의 범위에 포함되는 길항제는 세포독성제에 임의로 컨쥬게이팅되거나 융합된, CD20에 결합하는 항체, 합성 또는 천연 서열 펩티드 및 작은 분자 길항제를 포함한다. 바람직한 길항제는 항체를 포함한다.

"항체 의존성 세포 매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 마크로파지)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식한 후, 표적 세포의 용해를 야기하는 세포 매개 반응이다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하지만, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포에 대한 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Anne. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)]의 464 페이지 표 3에 요약되어 있다. 목적하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 예를 들어 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석에 유용한 이펙터 세포는 말초혈액 단핵세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 별법으로, 또는 부가적으로, 목적하는 분자의 ADCC 활성은 예를 들어 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998)]에 기재된 동물 모델에서 생체내에서 평가할 수 있다.

"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 상기 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고, ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초혈액 단핵세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하고, PBMC 및 NK 세포가 바람직하다.

용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 더욱이, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하고 상기 수용체의 대립 유전자 변이체 및 별법으로 스플라이싱된 형태를 포함하여 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 그의 세포질 도메인에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다. 억제 수용체 FcγRIIB은 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함한다 (Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997) 참고). FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)]에 개시되어 있다. 미래에 확인되는 것을 포함하여 다른 FcR가 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 또한, 이 용어는 모체의 IgG의 태아로의 전달에 작용하는 신생아의 수용체 FcRn를 포함한다 (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) 및 Kim et al, J. Immunol. 24: 249 (1994)).

"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적을 용해시키는 분자의 능력을 의미한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템의 제1 성분 (Clq)이 동족 항원과 복합체화된 분자 (예를 들어 항체)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 CDC 분석을 수행할 수 있다.

"성장 억제" 길항제는 길항제가 결합하는 항원을 발현하는 세포의 증식을 억제 또는 감소시키는 것이다. 예를 들어, 길항제는 B 세포의 시험관내 및(또는) 생체내 증식을 억제하거나 감소시킨다.

"아폽토시스를 유도"하는 길항제는 표준 아폽토시스 분석, 예를 들어 아넥신 V의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 소포체의 팽창, 세포 단편화 및(또는) 멤브레인 베지클 (아폽토시스 바디로 칭함)의 형성에 의해 결정되는, 예를 들어 B 세포의 프로그래밍된 세포 사멸을 유도하는 것이다.

본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로 형성된 다중특이적 항체 (예, 양특이성 (bispecific) 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 보이는 항체 단편을 포함한다.

"항체 단편"은 바람직하게는 그의 항원 결합 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편; 디아바디 (diabody); 선형 항체; 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이성 항체를 포함한다.

본 발명의 목적을 위해, "무손상 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 및 Fc 영역을 포함하는 것이다.

"천연 항체"는 대체로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 디술피드 공유결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 연결의 수는 상이한 면역글로불린 이소타입의 중쇄에서 상이하다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 사슬내 디술피드 다리를 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인 (V_H)을 갖고, 이어서 많은 불변 도메인이 존재한다. 각각의 경쇄는 한 말단에 가변 도메인 (V_L)을 갖고, 그의 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인에 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인에 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 내의 서열이 크게 상이하고 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용됨을 의미한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 이것은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에 초가변 영역으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인의 보다 보존도가 큰 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 언급된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 루프 연결부를 형성하고 일부 경우에 β-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결되는, 주로 β-시트 형태를 취하는 4개의 FR을 각각 포함한다. 각 사슬 내의 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬의 초가변 영역은 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체의 항원 결합에 직접 관여하지 않지만, 상이한 이펙터 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포독성 (ADCC)에서 항체의 참여를 보인다.

항체를 파파인으로 분해하면, 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는, "Fab" 단편으로 언급되는 2개의 동일한 항원 결합 단편 및 잔여 "Fc" 단편이 생성되고, 이 명칭은 그의 쉽게 결정화되는 능력을 반영한다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있는 F(ab')₂ 단편을 생성시킨다.

"Fv"는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 긴밀하게 비공유 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 상기 형태에서, 각 가변 도메인의 3개의 초가변 영역은 상호작용하여 V_H-V_L 이량체의 표면 상의 항원 결합 부위를 규정한다. 집합적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)도 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도이지만 항원을 인식하여 결합할 능력을 갖는다.

Fab 단편도 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇개의 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 적어도 하나의 유리 티올기를 포함하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 본래 그들 사이의 힌지 시스테인을 갖는 한쌍의 Fab' 단편으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 당업계에 공지되어 있다.

임의의 척추동물종의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2개의 분명하게 상이한 종류의 하나로 분류될 수 있다.

그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 종류로 분류할 수 있다. 5개의 주요 클래스의 무손상 항체인 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (이소타입), 예를 들어 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 종류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 언급된다. 상이한 종류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형태는 공지되어 있다.

"단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합에 요구되는 구조를 형성하게 하는 V_H 도메인과 V_L 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv에 대해서는, 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.

용어 "디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 의미하고, 이 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (V_H-V_L) 내의 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 페어링하여 2개의 항원 결합 부위를 생성시키게 된다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 상세하게 기재되어 있다.

본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 말하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수도 있는 가능한 자연발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 특이성이 높다. 또한, 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 일반적으로 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제에 비해, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 작용한다. 그들의 특이성 외에도, 모노클로날 항체는 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양으로 합성된다는 점에서 유리하다. 변경 표현 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의해 항체 제조를 필요로 하는 것으로서 생각하지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256: 495 (1975)]에 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어 미국 특허 4,816,567 참조)에 의해 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.

본원에서 모노클로날 항체는 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 종류 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이고 사슬(들)의 나머지는 다른 종에서 유래하거나 다른 항체 종류 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메릭" 항체 (면역글로불린) 및 구체적으로 요구되는 생물학적 활성을 보이는 상기 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 4,816,567; 및 Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)). 본원에서 목적하는 키메릭 항체는 비-인간 영장류 (예, 구세계 원숭이, 예를 들어 비비, 붉은털 원숭이, 사이노몰거스 원숭이)에서 유래한 가변 도메인 항원 결합 서열 및 인간 불변 영역 서열 (미국 특허 5,693,780)을 포함하는 "프리머타이즈드 (primatized)" 항체를 포함한다.

비-인간 (예, 쥐) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린에서 유래한 최소 서열을 포함하는 키메릭 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수여자의 초가변 영역의 잔기가 요구되는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비인간종 (공여 항체), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역의 잔기로 치환된 인간 면역글로불린 (수여자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 대응하는 비인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수여자 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변경은 항체 성능을 보다 개선하기 위한 것이다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 초가변 루프에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 FR 영역에 대응한다. 인간화 항체는 또한 임의로 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 일반적으로 일부의 인간 면역글로불린을 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332: 323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)] 참조.

본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역"은 항원 결합에 필요한 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 및(또는) "초가변 루프"로부터의 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987))를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 규정되는 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기이다.

CD20 항원에 결합하는 항체의 예는 "리툭시맙"("RITUXAN(등록상표)")으로 현재 언급되는 "C2B8" (미국 특허 5,736,137, 본원에 참고로 포함됨); "Y2B8" 또는 "이브리투모맙 티욱세탄" ZEVALIN(등록상표)으로 명명된 이트륨-[90]-표지된 2B8 쥐 항체 (미국 특허 5,736,137, 본원에 참고로 포함됨); "¹³¹I-B1" 항체(요오드 I131 토시투모맙, BEXXAR(등록상표))를 생성시키기 위해 ¹³¹I로 임의로 표지된, "토시투모맙"으로도 불리는 쥐 IgG2a "B1" (미국 특허 5,595,721, 본원에 참고로 포함됨); 쥐 모노클로날 항체 "1F5" (Press et al. Blood 69(2): 584-591 (1987) 및 "프레임워크 패치된" 또는 인간화 1F5 (WO03/002607, Leung, S.); ATCC 기탁 번호 HB-96450); 쥐 2H7 및 키메릭 2H7 항체 (미국 특허 5,677,180, 본원에 참고로 포함됨); 인간화 2H7; huMax-CD20(Genmab, Denmark); AME-133 (Applied Molecular Evolution); 및 International Leukocyte Typing Workshop으로부터 입수가능한 모노클로날 항체 L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 또는 NU-B2 (Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987))를 포함한다.

본원에서 용어 "리툭시맙" 또는 "RITUXAN(등록상표)"은 CD20에 결합하는 능력을 보유하는 그의 단편을 포함하여, CD20 항원에 대해 작용하고 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,736,137에서 "C2B8"로 명명된 유전공학적으로 처리된 키메릭 쥐/인간 모노클로날 항체를 의미한다.

순전히 본 발명의 목적을 위해, "인간화 2H7"은 하기 서열 1의 가변 경쇄 서열 및 서열 2의 가변 중쇄 서열을 포함하는 무손상 항체 또는 항체 단편을 의미한다.

인간화 2H7 항체가 무손상 항체인 경우, 바람직하게는 하기 서열 3의 경쇄 아미노산 서열 및 서열 4의 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.

"단리된" 길항제는 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및(또는) 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 길항제의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질 또는 비단백질 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 길항제는 (1) 로우리 (Lowry) 방법에 의해 측정시에 길항제의 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과 수준까지, (2) 스피닝 컵 (spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 길항제는 길항제의 자연 환경의 적어도 한 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 (in situ) 길항제를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 길항제는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

치료를 목적으로 하는 "포유동물"은 포유동물로 분류된 임의의 동물을 가리키며, 인간, 가축, 및 동물원, 운동, 또는 애완 동물, 예를 들어 개, 말, 고양이, 소 등을 포함한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.

"치료"는 치료적 처리 및 예방적 조치를 모두 의미한다. 치료를 필요로 하는 대상은 질환이 이미 안과 질병이 발생한 대상 및 안과 질병 예방이 필요한 대상을 포함한다. 따라서, 포유동물은 안과질병을 갖는 것으로서 진단되었거나 안과질병에 걸리기 쉽거나 취약할 수 있다.

표현 "유효량"은 목적하는 안과 질병의 예방, 완화 또는 치료에 효과적인 길항제의 양을 의미한다.

보조 요법을 위해 본원에서 사용되는 용어 "면역억제제"는 본 발명에서 치료되는 포유동물의 면역 시스템을 억제 또는 차단하는 작용을 하는 물질이다. 이것은 사이토카인 생성을 억제하거나, 자가 항원 발현을 하향조절 또는 억제하거나 MHC 항원을 차단하는 물질을 포함할 것이다. 상기 억제제의 예는 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘 (그 내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 4,665,077 참조); 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAID); 아자티오프린; 시클로포스파미드; 브로모크립틴; 다나졸; 답손; 글루타르알데히드 (미국 특허 4,120,649에 기재된 바와 같이 MHC 항원을 차단); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-개별특이형 항체; 시클로스포린 A; 스테로이드, 예를 들어 글루코코르티코스테로이드, 예를 들어 프레드니손, 메틸프레드니솔론 및 덱사메타손; 메토트렉세이트 (경구 또는 피하); 히드록시클로로퀸; 술파살라진; 레플루노미드; 사이토카인 또는 사이토카인 수용체 길항제, 예를 들어 항-인터페론-γ, -β 또는 -α 항체, 항-종양 괴사인자-α 항체 (인플릭시맙 또는 아달리무맙), 항-TNFα 이뮤노어드헤신 (에타네르셉트), 항-종양 괴사인자-β항체, 항-인터류킨-2 항체 및 항-IL-2 수용체 항체; 항-LFA-1 항체, 예를 들어 항-CD1la 및 항-CD 18 항체; 항-L3T4 항체; 이종성 항-림프구 글로불린; pan-T 항체, 바람직하게는 항-CD3 또는 항- CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합 도메인을 포함하는 가용성 펩티드 (WO 90/08187); 스트렙토키나제; TGF-β; 스트렙토도르나제; 숙주로부터의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 데옥시스페르구알린; 라파마이신; T-세포 수용체 (Cohen 등, 미국 특허 5,114,721); T-세포 수용체 단편 (Offner et al., Science, 251: 430-432 (1991); WO 90/11294; Ianeway, Nature, 341: 482 (1989); 및 WO 91/01133); 및 T 세포 수용체 항체 (EP 340,109), 예를 들어 T10B9을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "세포독성제"는 세포의 기능의 억제 또는 제한 및(또는) 세포의 파괴를 야기하는 물질을 의미한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 At^21l, I^l31, I^l25, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi^2l2, P³² 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 톡신, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 톡신 또는 효소학적 활성 톡신, 또는 그의 단편을 포함하고자 한 것이다.

"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 시클로스포스파미드 (CYTOXAN(등록상표)); 알킬 술포네이트, 예를 들어 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 염산염, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예를 들어 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신, 항-대사체, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 푸린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-메르캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘, 5-FU; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미토잔트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK(등록상표); 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (TAXOL(등록상표); Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 독세탁셀 (TAXOTERE(등록상표); Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미토잔트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포아이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈 및 상기 임의의 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한, 상기 정의에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예를 들어 항-에스트로겐, 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 4(5)-이미다졸을 억제하는 아로마타제, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (Fareston); 항-안드로겐, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린 및 상기 임의의 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.

용어 "사이토카인"은 세포간 매개자로서 다른 세포에 대해 작용하는 한 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반 용어이다. 상기 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다. 사이토카인에는 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 전구인슐린; 릴랙신; 전구릴랙신; 당단백질 호르몬, 예를 들어 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 및 황체 형성 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사인자-α 및 -β 및 물러관 억제 물질; 마우스 고나도트로핀 결합 펩티드; 인히빈; 악티빈; 혈관내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-β; 혈소판 성장 인자; 형질전환 성장 인자 (TGF), 예를 들어 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예를 들어 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 마크로파지-CSF (M-CSF); 과립구-마크로파지-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터류킨 (IL), 예를 들어 IL-1, IL-lα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; 종양 괴사인자, 예를 들어 TNF-α 또는 TNF-β; 및 다른 폴리펩티드 인자, 예를 들어 LIF 및 kit 리간드 (KL)가 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 사이토카인은 천연 원료로부터 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적 활성 동등물을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "전구약물"은 모약물에 비해 종양 세포에 대한 세포독성이 작고 효소 활성화되거나 보다 활성의 모형태로 전환될 수 있는, 제약상 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 의미한다 (예를 들어, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) 및 Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al. (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985) 참조). 본 발명의 전구약물은 보다 활성인 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 술페이트-함유 전구약물, 펩티드-함유 전구약물, D-아미노산-변형 전구약물, 글리코실화 전구약물, 베타-락탐-함유 전구약물, 임의 치환된 페녹시아세타미드-함유 전구약물 또는 임의 치환된 페닐아세타미드-함유 전구약물, 5-플루오로사이토신 및 다른 5-플루오로우리딘 전구약물을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용하기 위한 전구약물 형태로 유도될 수 있는 세포독성 약물의 예는 상기한 화학요법제를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

"B 세포 악성 종양"은 B 세포 수반 악성 종양이다. 그 예는 림프구 우세 호지킨 병 (LPHD)을 포함하는 호지킨 (Hodgkin) 병; 비-호지킨 림프종 (NHL); 여포 중심 세포 (FCC) 림프종; 급성 림프구성 백혈병 (ALL); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 털세포 백혈병; 형질세포양 림프구성 림프종; 외투 (mantle) 세포 림프종; AIDS 또는 HIV-관련 림프종; 다발성 골수종; 중추신경계 (CNS) 림프종; 이식후 림프 증식성 질환 (PTLD); 왈덴스트롬 (Waldenstrom) 거대 글로불린혈증 (림프형질세포성 림프종); 점막관련 림프양 조직 (MALT) 림프종; 및 변연대 림프종/백혈병을 포함한다.

비-호지킨 림프종 (NHL)은 저등급/여포성 NHL, 재발 또는 난치성 NHL, 전선 (front line) 저등급 NHL, 단계 III/IV NHL, 화학요법 내성 NHL, 소림프구성 (SL) NHL, 중등급/여포성 NHL, 중등급 미만성 NHL, 미만성 대세포성 림프종, 침습성 NHL (침습성 전선 NHL 및 침습성 재발성 NHL 포함), 자가 줄기 세포 이식 후의 재발하거나 난치성인 NHL, 고등급 면역모세포성 NHL, 고등급 림프모세포성 NHL, 고등급 비분해 소세포 (small non-cleaved cell) NHL, 벌키한 (bulky) 질병 NHL 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

II. 길항제의 생산

본 발명의 제조 방법 및 용품은 CD20에 결합하는 길항제를 사용하거나 포함한다. 따라서, 상기 길항제를 생성하기 위한 방법을 설명할 것이다.

길항제(들)의 제조 또는 스크리닝에 사용되는 CD20 항원은 예를 들어 가용성 형태의 CD20 또는 목적하는 에피토프를 포함하는 그의 단편일 수 있다. 별법으로, 또는 부가적으로, 그의 세포 표면에서 CD20을 발현하는 세포는 길항제(들)의 생성 또는 스크리닝에 사용될 수 있다. 길항제 생성에 유용한 다른 형태의 CD20은 당업계의 숙련자가 분명히 알 수 있을 것이다.

바람직한 길항제는 항체이지만, 항체 이외의 길항제가 본원에 포함된다. 예를 들어, 길항제는 임의로 세포독성제 (예를 들어 본원에 기재된 것들)에 융합되거나 컨쥬게이팅된 소분자 길항제를 포함할 수 있다. 소분자의 라이브러리는 항원에 결합하는 소분자를 확인하기 위해 본원에서 목적하는 CD20 항원에 대해 스크리닝할 수 있다. 소분자는 추가로 그의 길항제 특성에 대해 스크리닝 및(또는) 세포독성제에 컨쥬게이팅될 수 있다.

또한, 길항제는 합리적인 디자인 또는 파지 디스플레이에 의해 생성된 펩티드일 수 있다 (예를 들어 WO98/35036 (1998년 8월 13일 공개) 참조). 하나의 실시태양에서, 선택된 분자는 항체의 CDR을 기초로 하여 디자인된 "CDR 모방체 (mimic)" 또는 항체 유사체일 수 있다. 상기 펩티드는 그 단독으로 길항 특성을 보일 수 있지만, 펩티드는 펩티드의 길항제 특성을 부가 또는 증강시키기 위해 임의로 세포독성제에 융합될 수 있다.

본 발명에 따라 사용된 항체 길항제의 제조를 위한 예시적인 기술에 대해 아래에서 설명한다.

(i) 폴리클로날 항체

폴리클로날 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 어쥬번트의 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 다중 주사에 의해 동물에서 생성된다. 2관능성 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 컨쥬게이션), N-히드록시숙신이미드 (라이신 잔기를 통한), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOC1₂ 또는 R¹N=C=NR (여기서, R 및 R^l은 상이한 알킬기임)를 사용하여 면역처리되는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 컨쥬게이팅시키는 것이 유용할 수 있다.

동물은 예를 들어 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 컨쥬게이트 (각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3 부피의 프로이트 (Freund) 완전 보조제와 합한 후 용액을 다중 부위에 피내 주사함으로써 항원, 면역원성 컨쥬게이트, 또는 유도체에 대해 면역처리된다. 1개월 후에, 동물은 프로이트 완전 보조제 중의 펩티드 또는 컨쥬게이트를 처음 양의 1/5 내지 1/10로 다중 부위에 피하 주사하여 부스터된다. 7일 내지 14일 후에, 동물에서 채혈하여 혈청의 항체 역가를 분석한다. 동물은 역가 평탄역까지 부스터한다. 바람직하게는, 동물은 상이한 단백질에 및(또는) 상이한 가교결합제를 통해 컨쥬게이팅된 동일한 항원의 컨쥬게이트로 부스터된다. 컨쥬게이트는 또한 단백질 융합체로서 재조합 세포 배양으로 제조될 수도 있다. 또한, 면역 반응을 증강시키기 위해 응집제, 예를 들어 명반을 적절하게 사용한다.

(ii) 모노클로날 항체

모노클로날 항체는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 말하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수도 있는 가능한 자연발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 변경 표현 "모노클로날"은 별개의 항체의 혼합물이 아닌 것으로서 항체의 특성을 나타낸다.

예를 들어, 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256: 495 (1975)]에 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어 미국 특허 4,816,567 참조)에 의해 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터는 면역처리를 위해 사용된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 상기 설명한 바와 같이 면역처리된다. 별법으로, 림프구는 시험관내에서 면역처리될 수 있다. 이어서, 림프구는 하이브리도마 세포를 형성하기 위해 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합된다 (Goding, Monoclonal antibody: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

이와 같이 제조한 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 모골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함하는 적합한 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 모골수종 세포에 효소 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결핍된 경우, 하이브리도마의 배지는 일반적으로 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)를 포함할 것고, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제한다.

바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생성 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생성을 지지하고, 배지, 예를 들어 HAT 배지에 민감한 세포이다. 이 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 쥐 골수종 라인, 예를 들어 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center)) 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 (미국 메릴랜드주 록빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection))에서 유도된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체 생성을 위해 설명된 바 있다 (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker,Inc., New York, 1987)).

하이브리도마 세포가 성장하는 배지는 항원에 대해 작용하는 모노클로날 항체의 생성에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 방사성 면역 분석 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 결정한다.

모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980)]의 스캐챠드 (Scatchard) 분석에 의해 결정할 수 있다.

목적하는 특이성, 친화도 및(또는) 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후에, 클론은 제한 희석 과정에 의해 서브클로닝하고 표준 방법(Goding, Monoclonal Antibody: Principles and Practice 9 pp. 59-103 (Academic Press, 1986))으로 성장시킬 수 있다. 상기 목적에 적합한 배지는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내에서 성장시킬 수 있다.

서브클론에서 분비되는 모노클로날 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예를 들어 단백질 A-세파로즈, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.

모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 쉽게 단리되고, 통상적인 방법을 사용하여 (예를 들어 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 서열을 결정한다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 일단 단리된 DNA는 발현 벡터에 삽입되고, 이 벡터는 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성하기 위해 본래 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포를 형질감염시킨다. 항체를 코딩하는 DNA의 세균에서의 재조합 발현은 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) 및 Pluckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992)]을 참조한다.

추가 실시태양에서, 항체 또는 항체 단편은 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990)]에 기재된 기술을 이용하여 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에서는 파지 라이브러리를 사용하여 각각 쥐 및 인간 항체의 단리를 설명하고 있다. 후속 문헌은 사슬 셔플링에 의한 고친화도(nM 범위) 인간 항체의 생성 (Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), 및 매우 큰 파지 라이브러리 제조를 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al., Nuc. Acids.Res., 21: 2265-2266 (1993))을 설명하고 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술의 실행가능한 대안이다.

또한, DNA는 예를 들어 상동성 쥐 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 코딩 서열을 치환시키거나 (미국 특허 4,816,567; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984)), 비-면역글로불린 폴리펩티드 코팅 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유결합시킴으로써 변형시킬 수 있다.

대체로, 상기 비-면역글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인을 대체하거나, 항체의 한 항원 결합 부위의 가변 도메인을 대체하여 항원에 대한 특이성을 갖는 한 항원 결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메릭 2가 항체를 생성시킨다.

(iii) 인간화 항체

비-인간 항체를 인간화하기 위한 방법은 당업계에 기술되어 있다. 바람직하게는, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 일반적으로 "도입 (import)" 가변 도메인으로부터 취한 "도입" 잔기로서 종종 언급된다. 인간화는 본질적으로 인간 항체의 대응하는 서열을 초가변 영역 서열로 대체함으로써 윈터 (Winter) 등의 방법 (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988))을 따라 수행할 수 있다. 따라서, 상기 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 도메인이 비-인간종의 대응하는 서열로 대체된 키메릭 항체 (미국 특허 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 일반적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 대체된 인간 항체이다.

인간화 항체 제조에 사용되는 경쇄 및 중쇄 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성 감소에 매우 중요하다. 소위 "최적 맞춤 (best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인 서열은 공지의 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 설치류와 가장 근접한 인간 서열은 이어서 인간화 항체의 인간 프레임워크 영역 (FR)으로서 허용된다 (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol, 196: 901 (1987)). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래한 특정 프레임워크 영역을 이용한다. 동일한 프레임워크가 복수개의 상이한 인간화 항체에 대해 사용될 수 있다 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)).

항체가 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 더욱 중요하다. 이를 달성하기 위해서, 바람직한 방법에 따르면, 인간화 항체는 모서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 모서열 및 상이한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상 입수가능하고, 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 그려 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 상기 디스플레이의 조사를 통해 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 끼치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수여자 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 목적하는 항체 특성, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 대한 영향에 직접적으로 가장 실질적으로 관련된다.

(iv) 인간 항체

인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역처리시에 내생 면역글로불린 생성의 부재시에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성시킬 수 있는 트랜스제닉 (transgenic) 동물 (예, 마우스)을 현재 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 키메릭 및 생식세포 돌연변이체 마우스의 항체 중쇄 연결 영역 (J_H) 유전자의 동종 접합성 결실이 내생 항체 생성을 완전히 억제한다고 설명되었다. 상기 생식세포 돌연변이체 마우스에서 인간 생식세포 면역글로불린 유전자 어레이의 전이는 항원 시험시에 인간 항체의 생성을 야기할 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993)] 및 미국 특허 5,591,669, 5,589,369 및 5,545,807을 참조한다.

별법으로, 파지 디스플레이 기술 (McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990))을 사용하여 비면역처리된 공여자로부터 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관 내에서 생성시킬 수 있다. 이 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 필라멘트성 박테리오파지, 예를 들어 M13 또는 fd의 주요 또는 마이너 코트 단백질 유전자 내로 인 프레임으로 클로닝되어 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로 디스플레이된다. 필라멘트성 입자는 파지 게놈의 단일가닥 DNA 카피를 포함하기 때문에, 항체의 기능성 특성에 기초한 선별을 통해 또한 상기 특성을 보이는 항체를 코딩하는 유전자의 선택이 가능하다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행할 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993)]을 참조한다. V-유전자 세그먼트의 복수의 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에서는 면역처리된 마우스의 췌장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 랜덤 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 단리하였다. 비면역처리된 인간 공여자로부터의 V 유전자 레퍼토리를 제조할 수 있고, 다양한 항원 어레이 (자가항원 포함)에 대한 항체는 본질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), 또는 Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라 단리될 수 있다. 또한 미국 특허 5,565,332 및 5,573,905를 참조한다.

인간 항체는 또한 시험관 내에서 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다 (미국 특허 5,567,610 및 5,229,275 참조).

(v) 항체 단편

항체 단편의 생산을 위해 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백분해성 소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). 다른 방법에 따라, F(ab')₂ 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 숙련된 실무자에게 명백할 것이다. 다른 실시태양에서, 선택되는 항체는 단쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO93/16185; 미국 특허 5,571,894; 및 미국 특허 5,587,458을 참조한다. 항체 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 5,641,870에 기재된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 상기 선형 항체 단편은 일특이성 또는 양특이성일 수 있다.

(vi) 양특이성 항체

양특이성 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 양특이성 항체는 CD20 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 상기 항체는 CD20에 결합하고 추가로 제2 B 세포 표면 마커에 결합할 수 있다. 별법으로, 항-CD20 결합 아암 (arm)은 세포 방어 메카니즘을 B 세포에 집중시키도록 백혈구 상의 촉발 (triggering) 분자, 예를 들어 T-세포 수용체 분자 (예, CD2 또는 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 예를 들어 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII(CD16)에 결합하는 아암과 결합될 수 있다. 양특이성 항체는 또한 세포독성제를 B 세포에 편재하도록 사용될 수 있다. 이들 항체는 CD20 결합 아암 및 세포독성제 (예, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 (ricin) A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 아암을 갖는다. 양특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예, F(ab')₂ 양특이성 항체)로서 제조될 수 있다.

양특이성 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 양특이성 항체의 전통적인 제조는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초하고, 여기서 2개의 사슬은 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 랜덤 분류 때문에, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마 (quadroma))는 하나만 정확한 양특이성 구조를 갖는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생산한다. 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고, 생성물 수율은 낮다. 유사한 절차가 WO93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.

상이한 방법에 따라, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)를 갖는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 융합체의 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및, 필요한 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 동시형질감염시킨다. 이는 제작에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 불균등한 비율이 최적 수율을 제공하는 실시태양에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 큰 탄력성을 제공한다. 그러나, 균등한 비율의 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현이 고수율을 나타낼 때 또는 상기 비가 특히 중요하지 않을 때 하나의 발현 벡터 내에 2개 또는 3개 모두의 폴리펩티드 사슬의 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.

상기 방법의 바람직한 실시태양에서, 양특이성 항체는 한쪽 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 쪽 아암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄쌍 (제2 결합 특이성을 제공하는)으로 이루어진다. 양특이성 분자의 반쪽에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 손쉬운 분리 방법을 제공하므로 상기 비대칭 구조는 원치않는 면역글로불린 사슬 조합물로부터 목적하는 양특이성 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이 방법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 양특이성 항체를 생성하는 추가의 상세한 내용에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)]을 참조한다.

미국 특허 5,731,168에 기재된 다른 방법에 따라, 한쌍의 항체 분자들 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 비율을 최대화하도록 처리될 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 C_H3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예, 티로신 또는 트립토판)으로 교체된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예, 알라닌 또는 트레오닌)으로 교체함으로써 큰 측쇄(들)에 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "캐비티 (cavity)"가 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 다른 원치않는 최종 생성물, 예를 들어 동종이량체 (homodimer)에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키기 위한 메카니즘을 제공한다.

양특이성 항체는 가교결합된 또는 "헤테로컨쥬게이트" 항체를 포함한다. 예를 들어, 헤테로컨쥬게이트 내의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 그러한 항체는 예를 들어, 면역계 세포를 원치않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089) 제안되었다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 잘 알려져 있고, 많은 가교결합 기술과 함께 미국 특허 4,676,980에 개시되어 있다.

항체 단편으로부터 양특이성 항체를 생성하기 위한 기술은 또한 문헌에서 설명되었다. 예를 들어, 양특이성 항체는 화학적 결합을 이용하여 제조될 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]에서는 무손상 항체가 단백분해적으로 절단되어 F(ab')₂ 단편을 생성하는 절차를 기술하고 있다. 이들 단편은 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지하기 위해 디티올 착화제인 아비소산나트륨의 존재 하에 환원된다. 이어서 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 이어서 Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민으로 환원시켜 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 양특이성 항체를 형성한다. 생산된 양특이성 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 약제로서 사용될 수 있다.

최근의 진보는 양특이성 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]에서는 완전 인간화 양특이성 항체 F(ab')₂ 분자의 생산을 기술하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 개별적으로 분비되었고, 양특이성 항체를 형성하도록 시험관 내에서 화학 커플링되었다. 이렇게 형성된 양특이성 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 뿐만 아니라 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 (lytic) 활성을 촉발시킬 수 있었다.

양특이성 항체 단편을 재조합 세포 배양액으로부터 직접 제조하고 단리시키기 위한 다양한 기술이 또한 설명되었다. 예를 들어, 양특이성 항체는 류신 지퍼 (zipper)를 사용하여 생산되었다 (Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성한 다음, 재산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 본 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산에 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 양특이성 항체 단편 제조를 위한 다른 메카니즘을 제공하였다. 이 단편은 동일한 사슬 상의 두개의 도메인 사이에 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 V_H 및 V_L 도메인은 다른 단편의 상보성 V_L 및 V_H 도메인과 페어링하고, 이에 의해 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용한 양특이성 항체 단편의 다른 제조 전략도 보고된 바 있다 (Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994) 참조).

3가 이상의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 (Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)).

III. 길항제의 컨쥬게이트 및 다른 변형

본원에서 방법에 사용되거나 제조 용품에 포함된 길항제는 임의로 세포독성제에 컨쥬게이팅된다.

그러한 길항제-세포독성제 컨쥬게이트의 생성에 유용한 화학요법제는 상기하였다.

길항제 및 하나 이상의 작은 분자 톡신, 예를 들어 칼리케아미신, 메이탄신 (미국 특허 5,208,020), 트리코텐 및 CC1065의 컨쥬게이트도 또한 본원에서 고려된다. 본 발명의 한 실시태양에서, 길항제는 하나 이상의 메이탄신 분자에 컨쥬게이팅된다 (예, 길항제 분자 당 약 1 내지 약 10 메이탄신 분자). 메이탄신은 예를 들어 May-SS-Me로 전환될 수 있고, 이는 May-SH3으로 환원되고 변형된 길항제와 반응하여 (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)) 메이탄시노이드-길항제 컨쥬게이트를 생성할 수 있다.

별법으로, 길항제는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 컨쥬게이팅된다. 칼리케아미신 패밀리의 항생제는 피코몰 미만 농도에서 이중가닥 DNA 브레이크 (break)를 생산할 수 있다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조 유사체는 γ₁ ^I, α₂ ^I, α₃ ^I, N-아세틸-γ₁ ^I, PSAG 및 θ^I ₁을 포함하지만 이에 제한되지 않는다 (Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993) 및 Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)).

사용될 수 있는 효소학적 활성 톡신 및 그의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 톡신의 비결합 활성 단편, 엑소톡신 A 사슬 (슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이토라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, WO 93/21232 (1993년 10월 28일 공개)를 참조한다.

본 발명은 핵산 분해 활성을 갖는 화합물 (예, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들어 데옥시리보뉴클레아제; DNase)과 컨쥬게이팅된 길항제를 추가로 고려한다.

다양한 방사성 동위원소가 방사성 컨쥬게이팅된 길항제의 제조에 이용가능하다. 그 예는 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다.

길항제 및 세포독성제의 컨쥬게이트는 다양한 2관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예를 들어 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역톡신은 문헌 [Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)이 길항제에 방사성 뉴클레오티드의 컨쥬게이션을 위한 예시적인 킬레이팅제이다. WO94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진시키는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드 함유 링커 (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992))를 사용할 수 있다.

별법으로, 길항제 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다.

또다른 실시태양에서, 길항제는 종양 예비타게팅 (pretargeting)에 사용하기 위한 "수용체" (예를 들어 스트렙타비딘)에 컨쥬게이팅될 수 있고, 여기서 길항제-수용체 컨쥬게이트는 환자에게 투여된 후, 제거제 (clearing agent)를 사용하여 순환계로부터 비결합 컨쥬게이트를 제거하고 세포독성제 (예, 방사성 뉴클레오티드)에 컨쥬게이팅된 "리간드" (예, 아비딘)를 투여한다.

본 발명의 길항제는 또한 전구약물 (예, 펩티딜 화학요법제, WO81/01145 참조)을 활성 항암 약물로 전환시키는 전구약물-활성화 효소와 컨쥬게이팅될 수 있다. 예를 들어, WO88/07378 및 미국 특허 4,975,278를 참조한다.

상기 컨쥬게이트의 효소 성분은 전구약물을 그의 보다 활성인 세포독성 형태로 전환시키도록 하는 방식으로 전구약물에 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한다.

본 발명의 방법에 유용한 효소는 포스페이트 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼린 포스파타제; 술페이트 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴술파타제; 무독성 5-플루오로시토신을 항암 약물인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예를 들어 세라티아 (serratia) 프로테아제, 테르몰리신, 섭틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예를 들어, 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약물을 전화시키는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화된 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물-절단 효소, 예를 들어 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 그들의 아민 질소에서 각각 페녹시아세틸기 또는 페닐아세틸기로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예를 들어 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 별법으로, 효소 활성을 갖는 항체 (당업계에서 "아브자임 (abzyme)"으로도 알려짐)가 본 발명의 전구약물을 유리 활성 약물로 전환시키기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Massey, Nature 328: 457-458 (1987)] 참조). 길항제-아브자임 컨쥬게이트는 종양 세포 집단으로 아브자임의 전달을 위해 본원에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.

본 발명의 효소는 당업계에 잘 알려진 기술에 의해, 예를 들어 상기 논의된 헤테로 2관능성 가교결합제를 사용하여 길항제에 공유 결합될 수 있다. 별법으로, 적어도 본 발명의 효소의 기능적 활성 부분에 연결된 본 발명의 길항제의 항원 결합 영역을 적어도 포함하는 융합 단백질은 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 기술을 이용하여 제작할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984)]을 참조한다).

길항제의 다른 변형이 본원에서 고려된다. 예를 들어, 길항제는 다양한 비단백성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중 하나에 연결될 수 있다. 하나 이상의 PEG 분자에 연결된 항체 단편, 예를 들어 Fab'가 본 발명의 특히 바람직한 실시태양이다.

본원에 개시된 길항제는 또한 리포좀으로서 제형화될 수 있다. 길항제를 함유하는 리포좀은 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 미국 특허 4,485,045 및 4,544,545; 및 WO97/38731 (1997년 10월 23일 공개)]에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 향상된 순환 시간을 갖는 리포좀은 미국 특허 5,013,556에 개시되어 있다.

특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하는 역상 증발법에 의해 생성할 수 있다. 리포좀은 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 수득하도록 규정된 공극 크기의 필터를 통해 압출된다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디술피드 상호교환 반응을 통해 문헌 [Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀에 컨쥬게이트될 수 있다. 화학요법제는 임의로 리포좀 내에 함유된다. 문헌 [Gabizon et al. J. National Gancer Inst. 81 (19)1484 (1989)]를 참조한다.

본원에 기재된 단백질 또는 펩티드 길항제의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 길항제의 결합 친화도 및(또는) 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 길항제의 아미노산 서열 변이체는 길항제 핵산 내에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입함으로써 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 그러한 변형은 예를 들어 길항제의 아미노산 서열 내의 잔기로부터 결실 및(또는) 잔기 내로 삽입 및(또는) 잔기의 치환을 포함한다. 최종 구조체가 목적하는 특성을 갖는다면, 최종 구조체에 도달하도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어진다. 아미노산 변화는 또한 길항제의 번역후 프로세싱을 변경시킬 수 있으며, 예를 들어 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시킨다.

돌연변이 발생에 대해 바람직한 위치인 길항제의 특정 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells Science, 244: 1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이 발생"으로 불린다. 여기서, 표적 잔기들의 잔기 또는 기가 확인되고 (예, arg, asp, his, lys 및 glu과 같은 대전된 잔기), 항원과의 아미노산의 상호작용에 영향을 주도록 중성 또는 음으로 대전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 교체된다. 이어서, 치환에 대한 기능적 감수성을 나타내는 이들 아미노산 위치는 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대해 추가의 또는 다른 변이체를 도입함으로써 개량된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 자체의 성질은 미리 결정할 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해 ala 스캐닝 또는 랜덤 돌연변이 발생이 표적 코돈 또는 영역에서 수행되고, 발현된 길항제 변이체는 목적하는 활성에 대해 스크리닝된다.

아미노산 서열 삽입은 길이가 하나의 잔기 내지 100 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지인 아미노- 및(또는) 카르복실-말단 융합체 및 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 길항제 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 길항제를 포함한다. 길항제 분자의 다른 삽입 변이체는 효소의 길항제의 N- 또는 C-말단, 또는 길항제의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 융합을 포함한다.

다른 종류의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 길항제 분자의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 상이한 잔기로 치환된다. 항체 길항제의 치환 돌연변이를 위한 가장 흥미로운 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변이도 포함된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제 하에 표 1에 나타낸다. 상기 치환이 생물학적 활성을 변경시키면, 하기 표 1에 "예시적인 치환"으로 명명된 또는 아미노산 종류에 대해 아래에서 상세히 설명하는 보다 큰 변화가 도입되고, 생성물을 스크리닝한다.

본래 서열	예시적인 치환	바람직한 치환
Ala (A)	val; leu; ile	val
Arg (R)	lys; gln; asn	lys
Asn (N)	gln; his; asp, lys; arg	gln
Asp (D)	glu; asn	glu
Cys (C)	ser; ala	ser
Gln (Q)	asn; glu	asn
Glu (E)	asp; gln	asp
Gly (G)	ala	ala
His (H)	asn; gln; lys; arg	arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe; 노르류신	leu
Leu (L)	노르류신; ile; val; met; ala; phe	ile
Lys (K)	arg; gln; asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala; tyr	tyr
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	thr	thr
Thr (T)	ser	ser
Trp (W)	tyr; phe	tyr
Tyr (Y)	trp; phe; thr; ser	phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; 노르류신	leu

길항제의 생물학적 특성에서 실질적인 변형은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 형태로서의 치환 영역 내의 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 대부분의 측쇄를 유지하는 것에 대한 그의 효과가 크게 상이한 치환을 선택함으로써 달성한다. 천연 잔기는 통상적인 측쇄 특성을 기초로 하여 다음 군으로 분류된다.

(1) 소수성: 노르뉴신, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비보존성 치환은 상기 종류의 하나의 멤버를 다른 종류와 교환하는 것을 수반한다.

길항제의 적절한 형태를 유지하는데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기가 또한 분자의 산화적 안정성을 개선시키고 비정상적 가교결합을 방지하기 위해 일반적으로 세린으로 치환될 수 있다. 반대로, 그의 안정성을 개선시키기 위해 시스테인 결합(들)이 길항제에 첨가될 수 있다 (특히 길항제가 항체 단편, 예를 들어 Fv 단편인 경우).

특히 바람직한 종류의 치환 변이체는 모 항체의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선택된 생성되는 변이체(들)은 이들이 생성되는 모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 그러한 치환 변이체를 생성하기 위한 간편한 방법은 파지 디스플레이를 사용하는 친화도 성숙이다. 간단히, 몇몇 초가변 영역 부위 (예를 들어 6-7개의 부위)가 각 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성하도록 돌연변이된다. 이렇게 생성된 항체 변이체는 각 입자 내에 패키지된 M13의 유전자 III 산물에 대한 융합체로서 필라멘트상 파지 입자로부터 1가 양식으로 디스플레이된다. 이어서 파지-디스플레이된 변이체를 본원에 개시된 바와 같이 그들의 생물학적 활성 (예를 들어 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인하도록 알라닌 스캐닝 돌연변이를 수행할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 그러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 본원에서 설명된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 일단 그러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널을 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝시키고, 하나 이상의 관련 분석에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가 개발을 위해 선택할 수 있다.

길항제의 다른 종류의 아미노산 변이체는 길항제의 원래 글리코실화 패턴을 변경시킨다. 이러한 변경은 길항제에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 부분의 결실및(또는) 길항제 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 첨가를 포함한다.

폴리펩티드의 글리코실화는 대개 N-연결되거나 또는 0-연결된다. N-연결된은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 부분의 부착을 나타낸다. 트리펩티드 서열, 즉 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)이 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 부분의 효소적 부착을 위한 인지 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내의 이들 트리펩티드 서열 중 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. 0-연결된 글리코실화는 히드록시아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 당, 즉 N-아세일갈락토사민, 갈락토즈 또는 크실로즈 중의 하나의 부착을 나타내지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신이 또한 사용될 수 있다.

길항제에 대한 글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기한 트리펩티드 서열을 갖도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 간편하게 달성된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 변경은 또한 본래의 길항제의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가하거나 치환시켜 이루어질 수 있다 (0-연결된 글리코실화 부위의 경우).

항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 여기에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 푸코즈가 결핍된 성숙 탄수화물 구조를 갖는 항체는 미국 특허 출원 공개 2003/0157108 A1 (Presta, L.)에 기재되어 있다. 항체의 Fc 영역에 부착된 탄수화물에 이등분 (bisecting) N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)을 갖는 항체는 WO03/011878 (Jean-Mairet 등)과 미국 특허 6,602,684 (Umana 등)에 언급되어 있다. 항체의 Fc 영역에 부착된 올리고당 내에 적어도 하나의 갈락토즈 잔기를 갖는 항체는 WO97/30087 (Patel 등)에 보고되어 있다. 또한, 그의 Fc 영역에 부착된 변경된 탄수화물을 갖는 항체에 관하여 WO98/58964 (Raju, S.)와 WO99/22764 (Raju, S.)를 참조한다.

길항제의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이들 방법은 천연 원료로부터의 단리 (천연 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 길항제의 보다 빨리 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위 지정) 돌연변이, PCR 돌연변이 및 카세트 (cassette) 돌연변이에 의한 제조를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

예를 들어, 길항제의 항원-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및(또는) 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 향상시키도록 이펙터 기능에 관하여 본 발명의 길항제를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 항체 길항제의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 시스테인 잔기(들)이 Fc 영역에 도입되어, 이 영역에서 사슬간 디술피드 결합이 형성될 수 있다. 이렇게 생성된 동종이량체성 항체는 개선된 내재화 능력 및(또는) 증가된 보체 매개 세포 치사 및 항체-의존성 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다. 문헌 [Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) 및 Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)]을 참조한다. 향상된 항종양 활성을 갖는 동종이량체성 항체는 또한 문헌 [Wolff et al. Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같이 헤테로 2관능성 가교결합제를 사용하여 제조될 수 있다. 별법으로, 이중 Fc 영역을 가져서 향상된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있는 항체가 처리될 수 있다. 문헌 [Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)]을 참조한다. WO00/42072 (Presta, L.)에서는 인간 이펙터 세포의 존재 하에 개선된 ADCC를 갖는 항체를 기재하고 있으며, 여기서 항체는 그의 Fc 영역에서 아미노산 치환을 포함한다.

변경된 C1q 결합 및(또는) 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖는 항체는 WO99/51642, 미국 특허 6,194,551B1, 미국 특허 6,242,195B1, 미국 특허 6,528,624B1 및 미국 특허 6,538,124 (Idusogie 등)에 기재되어 있다. 항체는 그의 Fc 영역의 하나 이상의 아미노산 위치 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 및(또는) 334에서 아미노산 치환을 포함한다.

길항제의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 5,739,277에 기재된 바와 같이 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프를 길항제 (특히, 항체 단편) 내로 포함시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 IgG 분자 (예, IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄)의 Fc 영역의 에피토프를 나타낸다. 그의 Fc 영역에서 치환 및 증가된 혈청 반감기를 갖는 항체는 또한 WO00/42072 (Presta, L.)에 기재되어 있다.

3개 이상 (바람직하게는 4개)의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 처리된 항체가 또한 고려된다 (미국 특허 출원 공개 2002/0004587Al, Miller 등).

IV. 제약 제형

본 발명에 따라 사용된 길항제의 치료 제형은 저장을 위해 목적하는 정도의 순도를 갖는 길항제를 선택적인 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합함으로써 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 용량 및 농도에서 수여자에게 무독성이고, 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당류, 예를 들어 수크로즈, 만니톨, 트레할로즈 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착물 (예, Zn-단백질 착물); 및(또는) 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함한다.

예시적인 항-CD20 항체 제형은 표현상 본원에 참고로 포함하는 WO98/56418에 기재되어 있다. 상기 문헌은 2-8℃에서 2년의 최소 저장 수명을 갖는 40 mg/mL 리툭시맙, 25 mM 아세테이트, 150 mM 트레할로즈, 0.9% 벤질 알콜, 0.02% 폴리소르베이트 20 (pH 5.0)을 포함하는 복수회 투여 액체 제형을 설명한다. 관심있는 다른 항-CD20 제형은 9.0 mg/mL 염화나트륨, 7.35 mg/mL 시트르산나트륨 이수화물, 0.7 mg/mL 폴리소르베이트 80 및 주사용 멸균수 (pH 6.5) 중 10 mg/mL 리툭시맙을 포함한다.

피하 투여에 적합한 동결건조 제형은 미국 특허 6,267,958 (Andya 등)에 기재되어 있다. 그러한 동결건조 제형은 적합한 희석제를 사용하여 높은 단백질 농도로 재구성될 수 있고, 재구성된 제형은 본원에서 치료되는 포유동물에 피하 투여될 수 있다.

본원에서 제형은 또한 치료되는 특정 증상에 필요하면 바람직하게는 서로 불리한 영향을 끼치지 않는 상보적인 활성을 갖는 하나 이상의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포독성제, 화학요법제, 사이토카인 또는 면역억제제 (예, T 세포 상에서 작용하는 것, 예를 들어 시클로스포린 또는 T 세포에 결합하는 항체, 예, LFA-1에 결합하는 것)를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 다른 약제의 유효량은 제형 내에 존재하는 길항제의 양, 질환 또는 질병 또는 치료의 종류, 및 상기 논의된 다른 인자에 따른다. 이들은 일반적으로 앞서 사용된 것과 동일한 용량 및 투여 경로로, 또는 지금까지 사용된 용량의 약 1 내지 99%로 사용된다.

활성 성분은 또한 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로에멀젼에서, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로즈 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

지연 방출 제제를 제조할 수 있다. 지연 방출 제제의 적합한 예는 길항제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형된 용품의 형태, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐이다. 지연 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락타이드 (미국 특허 3,773,919), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프로라이드 아세테이트로 이루어진 주사가능 미세구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.

생체내 투여에 사용되는 제형은 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.

V. 길항제를 사용한 치료

본 발명은 CD20에 결합하는 길항제를 사용하는 안과 질병의 치료에 관한 것이다. 바람직한 길항제는 CD20에 결합하는 항체, 예를 들어 리툭시맙 또는 인간화 2H7이다. 항체는 무손상 항체 또는 항체 단편일 수 있다.

본원에서 치료되는 질병의 예는 포도막염 (홍채염 포함), 갑상선 눈 질환 또는 그레이브스 안질환, 눈 베체트 병, 눈 중증근무력증, 눈 유사천포창, 자가면역 망막병증, 회선사상충증, 상공막염, 공막염, 재발성 스테로이드 의존성 시각 신경염, 베게너 육아종증의 눈 병발, 쇼그렌 눈 합병증, 흑색종 관련 망막병증, 및(또는) 암 관련 망막병증을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 일반적으로, 본원에서 치료되는 포유동물은 B-세포 악성 암으로 고통받지 않을 것이다. 본원에서 치료되는 포유동물은 보통 눈 질환의 하나 이상의 증상, 예를 들어 흐린 시력, 통증, 충혈 등을 나타낼 것이다.

본 발명의 한 실시태양에서, 포유동물은 눈에 존재하는 항원(들)을 포함하는 하나 이상의 자체 항원에 결합하는 자가항체를 생산한다. 포유동물은 상기 자가항체를 검출하기 위해 진단 분석을 받을 수 있고, 여기서 상기 분석에서 양성 결과를 갖는 포유동물 또는 환자가 본원에 설명된 바와 같은 치료를 위한 후보이다. 몇몇 경우, 예를 들어 중증근무력증에서, 눈 또는 그 주위 및 다른 곳에 존재하는 항원에 대한 자가항체 (예, 안구 근육을 포함하는 골격근 조직에 대한 자가항체)가 눈에 존재할 수 있고, 이는 진단 분석을 사용하여 검출될 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 류마티스성 관절염 혈관염으로부터 발생하는 공막염과 같이, 환자는 전신 질환 과정의 일부로서 눈에 퇴적된 면역 복합체를 가질 수 있다. 본 발명은 상기한 면역 복합체의 존재를 검출하는 것과, 이들을 갖는 것으로 밝혀진 환자를 치료하는 것을 추가로 고려한다.

CD20 항원에 결합하는 길항제를 포함하는 조성물은 우수 의료 실무에 부합하는 양식으로 제형화하고, 투약되고 투여될 것이다. 본 문맥에서 고려하는 인자는 치료되는 특정 질환 또는 질병, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 질환 또는 질병의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴 및 의사에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 투여되는 길항제의 유효량은 상기한 고려에 의해 결정될 것이다.

일반적인 제안으로서, 투여량 당 비경구 투여된 길항제의 유효량은 1 이상의 용량에 의한 약 20 mg/m² 내지 약 10,000 mg/m² (환자 신체)일 것이다. 무손상 항체에 대해 예시적인 IV 용량 계획 (regimen)은 375 mg/m² (매주) x 4; 1000 mg x 2 (예, 제1일 및 제15일); 또는 1 g x 3이다. 예를 들어 점안제 또는 연고로서 국소적으로 또는 안와내 또는 눈주위 주사를 위해 투여되는 항체 또는 항체 단편에 대해, 예시적인 투여량은 예를 들어 1일 1회, 1일 2회 또는 더 빈번하게 투여되는 약 0.001 내지 약 100 mg, 예를 들어 약 0.1 내지 약 10 mg이다. 전방내 또는 유리체내 주사의 경우, 약 0.01 내지 약 10 mg, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1 mg의 투여량이 고려된다.

그러나, 상기한 바와 같이 이들 제시된 길항제의 양은 치료 판단에 따라 크게 좌우된다. 적절한 투여량 및 스케쥴을 선택하는데 있어서 주요 인자는 상기 나타낸 바와 같이 얻어진 결과이다. 예를 들어, 비교적 보다 고 투여량이 진행중 및 급성 질환의 치료를 위해 초기에 필요할 수 있다. 가장 효능있는 결과를 얻기 위해, 질환 또는 질병에 따라 길항제는 질환 또는 질병의 첫번째 징후, 진단, 출현 또는 발병에 가능한 한 근접하게 또는 질환 또는 질병의 완화 동안 투여된다.

길항제는 비경구, 유리체내, 전방내, 안와내, 눈주위, 국소 (예, 점안액 또는 안연고를 통해), 피하, 복강내, 폐내, 비강내 및(또는) 병변내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 수막강내 투여도 또한 고려된다. 추가로, 길항제는 적합하게는 예를 들어 감소량의 길항제를 사용하는 펄스 주입에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는, 투여량은 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 제공되거나, 눈 또는 그 주위에 투여된다.

다른 화합물, 예를 들어 세포독성제, 화학요법제, 면역억제제 및(또는) 사이토카인을 본원의 길항제와 함께 투여할 수 있다. 예를 들어, CD20 길항제는 글루코르티코이드/프레드니손/메틸프레드니손 (글루코코르티코이드), 정맥내 면역글로불린 (감마 글로불린), 코발트 원격치료, 혈장분리반출술, 레보타이록신, 시클로스포린 A, 소마토스타틴 유사체, 사이토카인 길항제, 항-대사체, 면역억제제, 세포독성제 (예, 클로람부실, 시클로포스파미드, 아자티오프린), 안와 방사선치료, 안와 감압술, 재활 수술, 방사선요오드, 갑상선절제술 등과 결합될 수 있다. 조합 투여는 별개의 제형 또는 단일 제약 제형을 사용하는 동시투여, 및 임의의 순서의 병행 투여를 포함하며, 여기서 바람직하게는 두 (또는 모든) 활성제가 동시에 생물 활성을 발휘하는 동안 시간 간격이 존재한다.

단백질 길항제를 환자에 투여하는 것 외에, 본원은 유전자 요법에 의한 길항제의 투여를 고려한다. 길항제를 코딩하는 핵산의 그러한 투여는 "유효량의 길항제를 투여하는"이라는 표현에 포함된다. 예를 들어, 세포내 항체를 생성하기 위해 유전자 요법을 이용하는 것에 대해서는 WO96/07321 (1996년 3월 14일 공개)을 참조한다.

핵산 (임의로 벡터 내에 함유된)을 환자의 세포 내로 넣기 위한 2가지 주요 방법, 즉 생체내 및 생체외 방법이 있다. 핵산의 생체내 전달은 환자에게, 보통 길항제가 요구되는 부위에 직접 주사된다. 생체외 치료를 위해, 환자의 세포를 꺼내고, 핵산을 이들 단리된 세포 내에 도입하고, 변형된 세포를 환자에게 직접 또는 예를 들어 환자에게 이식되는 다공성 멤브레인 내에 캡슐화시켜 투여한다 (예를 들어 미국 특허 4,892,538 및 5,283,187을 참조한다). 핵산을 생존 세포 내로 도입하기 위해 이용가능한 다양한 기술이 있다. 이 기술은 핵산이 배양된 세포 내로 시험관 내에서 전달되는지, 또는 의도된 숙주의 세포 내에 생체내 전달될 수 있는 지에 따라 달라진다. 핵산을 포유동물 세포 내로 시험관내 전달에 적합한 기술은 리포좀, 전기천공, 미세주입, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전법 등의 사용을 포함한다. 유전자의 생체외 전달을 위해 일반적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.

현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기술은 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스 (Herpes simplex) I 바이러스 또는 아데노-연합 바이러스) 및 지질계 시스템 (유전자의 지질 매개 전달에 유용한 지질은 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol이다)을 사용하는 형질감염을 포함한다. 몇몇 상황에서, 표적 세포를 타게팅하는 물질, 예를 들어 세포 표면 멤브레인 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등을 갖는 핵산 원료를 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀이 사용되는 경우, 타게팅을 위해 및(또는) 흡수를 용이하게 하기 위해 엔도사이토시스 (endocytosis)와 관련된 세포 표면 멤브레인 단백질에 결합하는 단백질, 예를 들어 특정 세포 유형에 지향성 (tropic)인 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 사이클링시에 내부화를 받는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 배치를 타게팅하고 세포내 반감기를 향상시키는 단백질을 사용할 수 있다. 수용체-매개 엔도사이토시스의 기술은 예를 들어 문헌 [Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987); 및 Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990)]에 기재되어 있다. 현재 공지된 유전자 마킹 (marking) 및 유전자 요법 프로토콜의 개관에 대해서는, 문헌 [Anderson et al., Science 256: 808-813 (1992)]를 참조한다. 또한 WO 93/25673 및 본원에 인용된 참조문을 참조한다.

본 발명의 더욱 상세한 내용을 다음 비제한적 실시예에 의해 설명한다. 명세서에서 모든 인용문헌의 내용은 명백히 본원에 참고로 포함된다.

실시예 1

하나 이상의 안과 질병의 증상으로 진단된 환자를 본 실시예에 따라 치료한다. 본원에서 치료되는 안과 질병의 예는 포도막염 (홍채염을 포함함), 갑상선 눈 질환 (그레이브스 안질환으로도 불림), 눈 베체트 병, 눈 중증근무력증, 눈 유사천포창, 자가면역 망막병증, 회선사상충증, 상공막염, 공막염, 재발성 스테로이드 의존성 시각 신경염, 베게너 육아종증의 눈 병발, 쇼그렌 눈 합병증, 흑색종 관련 망막병증 또는 암 관련 망막병증을 포함한다.

환자는 무손상 리툭시맙 또는 인간화 2H7, 또는 리툭시맙 또는 인간화 2H7의 단편 (예를 들어 Fab, F(ab')₂, Fv, scFv 또는 디아바디)을 사용하여 치료된다.

바람직하게는, 무손상 항체는 (적어도 어느 정도) 순환 CD20 포지티브 B 세포를 고갈시켜 안과 질병의 증상을 경감시키도록 375 mg/m² (매주) x 4, 1000 mg x 2 (예, 제1일 및 제15일) 또는 1 g x 3 중에서 선택된 투여량에서 정맥내 (IV) 투여된다.

예를 들어 공막염 또는 쇼그렌 증후군에서 같이 질환이 눈 표면에 있는 경우, 항체는 전신적으로 투여되거나 (예를 들어, 상기한 바와 같이 정맥내), 또는 항체는 점안액 또는 연고에 의한 국소 투여용으로 제형화된다. 적합한 용량은 1일 1, 2 또는 3회 투여되는 약 0.1 내지 10 mg이다.

예를 들어 포도막염에 대해 안내 관통이 요망되는 경우, 항체 또는 항체 단편은 유리체내 또는 전방내 주사에 의해 투여된다. 상기 투여 방식에 따라, 눈에서의 흡수를 개선하기 위해 항체는 바람직하게는 항체 단편 형태이다. 유리체내 또는 전방내 주사를 위한 항체 단편의 투여량은 약 0.1 내지 약 1.0 mg이다. 항체 또는 항체 단편은 유리체내 또는 전방내 주사에 의해 주기적으로, 예를 들어 매달 1회 투여된다.

CD20 항체를 사용하는 치료는 임의로 안과 질병을 치료하기 위한 하나 이상의 다른 치료, 예를 들어 글루코르티코이드/프레드니손/메틸프레드니손 (글루코코르티코이드), 정맥내 면역글로불린 (감마 글로불린), 소마토스타틴 유사체, 사이토카인 길항제, 혈장분리반출술, 레보타이록신, 시클로스포린 A, 항-대사체, 면역억제제, 세포독성제 (예, 클로람부실, 시클로포스파미드, 아자티오프린), 코발트 원격치료, 안와 방사선치료, 안와 감압술, 재활 수술, 방사선요오드 및(또는) 갑상선절제술과 결합된다.

CD20 항체를 사용하여 치료된 환자는 눈 질환의 증상의 개선, 예를 들어 시력 개선, 불편 또는 눈물 감소, 시력 손실의 개선 또는 방지 등을 보일 것이다.

<110> GENENTECH, INC. BRUNETTA, PAUL G. <120> Therapy of Ocular Disorders <130> P2029R1 PCT <140> PCT/US2004/027164 <141> 2004-08-20 <150> US 60/498,791 <151> 2003-08-29 <160> 4 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized. <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30 Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro 35 40 45 Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 80 85 90 Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 95 100 105 Lys Arg <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized. <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 50 55 60 Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser 95 100 105 Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 110 115 120 Ser Ser <210> 3 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized. <400> 3 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr 1 5 10 15 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly 65 70 75 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 80 85 90 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 95 100 105 Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr 110 115 120 Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile 125 130 135 Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val 140 145 150 Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln 155 160 165 Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser 170 175 180 Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 185 190 195 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 200 205 210 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 215 220 225 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 230 <210> 4 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized. <400> 4 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr 1 5 10 15 Gly Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 35 40 45 Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro 50 55 60 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly 65 70 75 Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 80 85 90 Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 95 100 105 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr 110 115 120 Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 125 130 135 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 140 145 150 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 155 160 165 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 170 175 180 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 185 190 195 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 200 205 210 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 215 220 225 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 245 250 255 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 260 265 270 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 285 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290 295 300 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 305 310 315 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 320 325 330 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 335 340 345 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 350 355 360 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 365 370 375 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 380 385 390 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 395 400 405 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 410 415 420 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 425 430 435 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 440 445 450 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 455 460 465 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 470

Claims (17)

1. CD20 길항제를 안과 질병 치료에 효과적인 양으로 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 포유동물의 안과 질병의 치료 방법.
2. 제1항에 있어서, 길항제가 항체를 포함하는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
4. 제2항에 있어서, 항체가 세포독성제에 컨쥬게이팅되지 않은 것인 방법.
5. 제2항에 있어서, 항체가 리툭시맙을 포함하는 것인 방법.
6. 제2항에 있어서, 항체가 인간화 2H7을 포함하는 것인 방법.
7. 제2항에 있어서, 항체가 세포독성제에 컨쥬게이팅되는 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 필수적으로 포유동물에 길항제를 투여하는 것으로 이루어지는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 포유동물이 하나 이상의 눈 항원에 결합하는 자가항체를 생성하거나 눈에 면역 복합체를 갖는 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 안과 질병이 포도막염, 홍채염, 갑상선 눈 질환 또는 그레이브스 (Graves) 안질환, 눈 베체트 (Behcet) 병, 눈 중증근무력증, 눈 유사천포창, 자가면역 망막병증, 회선사상충증, 상공막염, 공막염, 재발성 스테로이드 의존성 시각 신경염, 베게너 (Wegener) 육아종증의 눈 병발, 쇼그렌 (Sjogren) 눈 합병증, 흑색종 관련 망막병증 및 암 관련 망막병증으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
11. 제1항에 있어서, 항체가 무손상 항체인 방법.
12. 제1항에 있어서, 항체가 CD20에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 항체 단편인 방법.
13. 제12항에 있어서, 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, 단쇄 Fv 단편 (scFv) 및 디아바디 (diabody)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
14. 제1항에 있어서, 항체가 정맥내 투여되는 것인 방법.
15. 제1항에 있어서, 항체가 안와내, 전방내, 눈 주위 또는 유리체내 주사에 의해 투여되는 것인 방법.
16. 제15항에 있어서, 항체가 CD20에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 항체 단편인 방법.
17. 제1항에 있어서, 항체가 눈에 국소 투여되는 것인 방법.