MXPA06002134A - Terapia de trastornos oculares. - Google Patents

Abstract

La presente invencion describe la terapia de trastornos oculares utilizando antagonistas, tales como anticuerpos que se enlazan a CD20.

Description

TERAPIA DE TRASTORNOS OCULARES Esta es una solicitud no provisional que reivindica prioridad bajo 35 USC § 119 para la solicitud provisional número 60/498,791 presentada en Agosto 29 de 2003, cuya descripción completa se incorpora en la presente mediante la referencia. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la terapia de trastornos oculares utilizando antagonistas,, tales como anticuerpos, que se enlazan a CD20. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los linfocitos son uno de muchos tipos de células sanguíneas blancas producidas en la médula espinal durante el proceso de hematopoyesis. Existen dos poblaciones principales de linfocitos: linfocitos B (células B) y linfocitos T (células T) . Los linfocitos de particular interés en la presente son las células B. Las células B maduran dentro de la médula espinal y dejan la médula expresando un anticuerpo de enlace de antigeno en su superficie celular. Cuando una célula B natural encuentra primero el antígeno para el cual es específico su anticuerpo enlazado a la membrana, la célula comienza a dividirse rápidamente y su progenie se diferencia en células B de memoria y células efectoras llamadas "células de plasma" . Las células B de memoria tienen un lapso de vida más largo y continúan expresando el anticuerpo enlazado a la membrana con la misma especificidad que la célula precursora original . Las células de plasma no producen el anticuerpo enlazado a la membrana, pero en su lugar, producen el anticuerpo en una forma que puede secretarse. Los anticuerpos secretados son la molécula efectora principal de ¦ la inmunidad humoral. El antígeno CD20 (llamado también antigeno humano de diferenciación restringido por el linfocito B, Bp35) es una proteína de transmembrana hidrófoba con un peso molecular de aproximadamente 35 kD localizada en linfocitos pre-B y B maduros (Valentine et al., J. Biol . Chem. 264 (19) : 11282-11287 (1989); y Einfeld et al., EMBO J. 7 (3): 711-717 (1988)). El antígeno también se expresa en más del 90% de linfomas no de Hodgkin de célula B (NHL) (Anderson et al., Blood, 63 (6) :1424-1433 (1984)), pero no se encuentra en células germinales hematopoyéticas , células pro-B, células de plasma normales u otros tejidos normales (Tedder et al., J. Immunol., 135 (2) : 973-979 (1985)). El CD20 regula etapa(s) tempranas en el proceso de activación para la iniciación y diferenciación del ciclo celular (Tedder et al., supra) y posiblemente funcione como un canal de ion de calcio (Tedder et al., J. Cell Biochem. 14D:195 (1990)). Dada la expresión del CD20 en linfomas de célula B, este antígeno puede servir como un candidato para "dirigir" tales linfornas. En esencia, tal dirección puede generalizarse como sigue.- los anticuerpos específicos para el antígeno CD20 de superficie de las células B se administran a un paciente. Estos anticuerpos anti-CD20 se enlazan específicamente al antigeno CD20 de (ostensiblemente) ambas células B normales y malignas,- el anticuerpo enlazado al antigeno CD20 de superficie puede conducir a la destrucción y al agotamiento de las células B neoplásicas . Adicionalmente, pueden conjugarse agentes químicos o marcas radiactivas que tienen el potencial para destruir el tumor, al anticuerpo anti-CD20 de modo que el agente se "suministra" específicamente a las células B neoplásicas. Sin tener en cuenta el procedimiento, una meta principal es destruir el tumor; el procedimiento especifico puede determinarse por medio del anticuerpo antí-CD20 particular que se utiliza, y por tanto, pueden variar considerablemente los procedimientos disponibles para dirigir el antígeno CD20. El anticuerpo rituximab (RITUXAN®) es un anticuerpo monoclonal murino/humano quimérico genéticamente diseñado dirigido contra el antígeno CD20. Rituximab es el anticuerpo llamado "C2B8" en la Patente de E.U. No. 5,736,137 expedida en Abril 7 de 1998 (Anderson et al.). RITUXAN® se indica para el tratamiento de pacientes con linfoma no de Hodgkin de célula B, CD20 positivo, reincidente o refractario de bajo grado o folicular. Estudios in vitro del mecanismo de acción han demostrado que RITUXAN® se enlaza al complemento humano y lisa las líneas celulares B linfoides a través de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) (Reff et al., Blood 83 (2) :435-445 (1994)). Adicionalmente, tiene una actividad significativa en análisis para citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . Más recientemente, RITUXAN® ha mostrado tener efectos anti-proliferativos en análisis de incorporación de timidina tritiada y para inducir la apoptosis directamente, mientras que otros anticuerpos anti-CD19 o CD20 no lo hacen (Maloney et al., Blood 88(10) :637a (1996)). La sinergia entre RITUXAN® y quimioterapias y toxinas también se ha observado experimentalmente . En particular, RITUXAN® sensibiliza las líneas celulares de linfoma de célula B humana resistentes a las drogas para los efectos citotóxicos de doxorrubicina, CDDP, VP-16, toxina de difteria y ricina (Demidem et al-, Cáncer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12 (3) : 177-186 (1997) ) . Estudios preclínicos in vivo han mostrado que RITUXAN® agota las células B de la sangre periférica, los nodos linfáticos y médula espinal de monos cinomolgus, presumiblemente a través de procesos de complemento y mediados por la célula (Reff et al., Blood, 83 (2) :435-445 (1994) ) . Las patentes y publicaciones de patente referentes a anticuerpos CD20 incluyen las Patentes de E.U. Nos. ,776,456, 5,736,137, 6,399,061 y 5,843,439, así como las solicitudes de patente de E.U. Nos., US 2002/0197255A1, US 2003/0021781A1, US 2003/0092172A1, US 2003/0095963A1 , US 2003/01477885A1 (Anderson et al.); Patente de E.U. No. 6,4557043B1 y WO00/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO00/27428 (Grillo-Lopez y White) ; WO00/27433 (Grillo-Lopez y Leonard) ; O00/44799 (Brasla sky et al.); WO00/10462 (Rastetter, W.); WOOl/10461 (Rastetter y White) ; WO01/10460 (White y Grillo-Lopez) ; solicitud de E.U. No. US 2002/0006404 y WO02/04021 (Hanna y Hariharan); solicitud de E.U. No. US 2002/0012665A1 y WO01/74388 (Hanna, N . ) ; solicitud de E.U. No. US 2002/0058029A1 (Hanna, N. ) ; solicitud de E.U. No. US 2003/0103971A1 (Hariharan y Hanna); solicitud de E.U. No. US 2002/0009444A1 y WO01/80884 (Grillo-Lopez, A.); WO01/97858 (White, C.); solicitud de E.U. No. US 2002/0128488A1 y WO02/34790 (Reff, M . )'; WO02/060955 (Braslawsky et al.); WO02/096948 (Braslawsky et al.); WO02/079255 (Reff y Davies) ; Patente de E.U.: No. 6,171,586B1, y W098/56418 (Lam et al . ) ; W098/58964 (Raju, S.); W099/22764 (Raju, S.); W099/51642, Patente de E.U. No. 6,194,551B1, . Patente de E.U. No. 6,242,195B1, Patente de E.U. No. 6,528,624B1 y Patente de E.U. No. 6,538,124 (Idusogie et al.); WO00/42072 (Presta, L.); WO00/67796 (Curd et al.),- WO01/03734 (Grillo-Lopez et al.); solicitud de E.U. No. US 2002/0004587A1 y WO01/77342 (Miller y Presta); solicitud de E.U. No. US 2002/0197256 (Grewal, I.); solicitud de E.U. No. US 2003/0157108A1 (Presta, I.); Patentes de E.U. Nos. 6,090,365B1, 6,287,537B1, 6,015,542, 5,843,398 y 5,595,721 (Kaminski et al.); Patentes de E.U. Nos. 5,500,362, 5,677,180, 5,721,108 y 6,120,767 (Robinson et al.); Patente de E.U. No. 6,410,391B1 (Raubitschek et al.); Patente de E.U. No. 6,224, 866B1 y WO00/20864 (Barbera-Guillem, E.); WOOl/13945 (Barbera-Guillem, E.); WO00/67795 (Goldenberg) ; solicitud de E.U. No. US 2003/0133930 Al y WO00/74718 (Goldenberg y Hansen) ; WO00/76542 (Golay et al.); WOOl/72333 (Wolin y Rosenblatt) ; Patente de E.U. No. 6,368,596B1 (Ghetie et al.); solicitud de E.U. No. US 2002/0041847A1 (Goldenberg, D . ) ,- solicitud de E.U. No. US 2003/0026801A1 ( einer y Hartmann) ; WO02/102312 (Engleman, E.); solicitud de patente de E.U. No. 2003/0068664 (Albitar et al.); WO03/002607 (Leung, S.); WO03/049694 (Wolin et al.); WO03/061694 (Sing y Siegall) , cada una de las cuales se incorpora en la presente expresamente por la referencia. Ver también, Patente de E.U. No. 5,849,898 y solicitud EP No. 330,191 (Seed et al.); Patente de E.U. No. 4,861,579 y EP 332,865A2 (Meyer y Weiss) ; USP 4,861,579 (Meyer et al.) y WO95/03770 (Bhat et al . ) . Las publicaciones referentes a la terapia con Rituximab incluyen: Perrotta y Abuel "Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to Rituximab" Extracto # 3360 Blood 10(1) (parte 1-2: p. 88B (1998); Stasi et al., "Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idiopathic thrombocytophenic purpura" Blood 98 (4) : 952-957 (2001); Matthews, R. "Medical Heretics" New Scientist (7 de Abril de 2001); Leandro et al., "Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthiritis treated with B lymphocyte depletion" Ann Rheum Dis 61:883-888 (2002); Leandro et al . , "Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis early evidence for safety, efficacy and dose response" . Arthritis and Rheumatism 44(9):S370 (2001); Leandro et al., "An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erithematosis" . Arthritis & Rheumatism 46 (1) :2673-2677 (2002); Edwards y Cambridge "Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes" Rheumatology 40:205-211 (2001); Edwards et al., "B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders" Biochem. Soc. Trans. 30 (4) : 824-828 (2002); Edwards et al., "Efficacy and safety of Rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism 46(9):S197 (2002); Levine y Pestronk "IgM antibody related polineuropathies : B-cell depletion chemotherapy using Rituximab" Neurology 52:1701-1704 (1999); DeVita et al., "Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheum 46:2029-2033 (2002); Higashida et al . , "Treatment of SMARD refractory rheumatoid arthritis with rituximab" . Presentada en el Annual Scientific Meetlng of the American College of Rheumatology; Oct. 24-29; New Orleans, LA 2002; Tuscano, J. "Successful treatment of Infliximab refractory rheumatoid arthritis with rituximab" Presentada en el Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct. 24-29; New Orleans, LA 2002. Las publicaciones referentes a autoanticuerpos en trastornos oculares incluyen Haldar et al., Invest Ophthalmol Visual Sci. 29:37 (1988); Kahaly et al., Horm. Metab. Res. 21 (3) :137-141 (1989); Peek et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science 39 (10) : 1976-1979 (1988); Harper y Foster International Ophthalmology Clinics 38(1).-1-19 (1998); Bartalena et al., Bailliere's Clinical Endocrinology and Metabolism 11 (3) : 521-536 (1997); Seider et al., British Journal of Ophthalmology 85 (11) : 1287-1288 (2001); Hiromatsu et al., Endocrinología Japónica 39(6) :593-600 (1992); Donnelly J. Autoimmunity 1(3):207-216 (1988); Hollows, F. Australian Journal of Ophthalmology 9(3):239-245 (1981); eetman y McGregor Endocrine Reviews 5(2):309-355 (1984) ; Waltman y Yarian American Journal of Ophthalmology 77 (6) :891-894 (1974); Aronson et al., JAMA 196 (3) : 225-228 (1966); Shields et al., Arch Ophthalmol . 118 (11) : 1497-1507 (2000); y Bartalena et al., European Journal of Nuclear Medicine 29(Suppl. 2) :S458-S465 (2002). WO 2000/40262 describe el tratamiento de trastornos oculares con un fragmento Fv (scFv) monocatenario anti-CD4. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para tratar un trastorno ocular en un mamífero, que comprende administrar un antagonista de CD20 al mamífero en una cantidad efectiva para tratar el trastorno ocular. Preferentemente, el antagonista es un anticuerpo tal como Rituximab o 2H7 humanizado, que incluye anticuerpos intactos así como fragmentos de anticuerpo. Ejemplos de trastornos oculares que pueden tratarse en la presente incluyen uveitis (incluyendo iritis) , enfermedad ocular tiroidea u oftalmología de Grave, enfermedad ocular de Behcet, miastenia gravis ocular, pemfigoide ocular, retinopatía autoinmune, oncocerciasis , episcleritis, escleritis, neuritis óptica reincidente dependiente de esteroide, implicación ocular de granulomatosis de Wegener, complicación ocular de Sjogren, retinopatía asociada a melanoma, y/o retinopatía asociada al cáncer. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS I. Definiciones Un "trastorno ocular" en la presente es una enfermedad o trastorno que involucra el ojo. El mamífero con un trastorno ocular en la presente, presentará generalmente uno o más síntomas del trastorno ocular. Los trastornos oculares de interés particular en la presente, incluyen, pero no se limitan a uveitis (incluyendo iritis) , enfermedad ocular tiroidea u oftalmología de Grave, enfermedad ocular de Behcet, miastenia gravis ocular, pemfigoide ocular, retinopatía autoinmune, oncocerciasis , episcleritis , escleritis, neuritis óptica reincidente dependiente de esteroide, implicación ocular de granulomatosis de Wegener, complicación ocular de Sjogren, retinopatía asociada a melanoma, retinopatía asociada al cáncer, etc. Por ¾autoanticuerpos" se entiende en la presente, anticuerpos que un mamífero genera contra uno o más de sus propios antígenos. Los autoanticuerpos pueden detectarse en una muestra biológica proveniente del mamífero (tal como lágrimas, biopsia ocular, suero, plasma, etc.) utilizando inmunoanálisis Western, ELISA, inmunohistoquímica, cromatoexploración, etc. Un "antígeno ocular" en la presente, es un antígeno, tal como un antígeno proteínico, que se encuentra presente en o alrededor del ojo. El antígeno ocular puede encontrarse presente en o alrededor del ojo así como en otros tejidos (e.g., tejido muscular esquelético), o puede encontrarse presente predominantemente, o solo, en o alrededor del ojo en comparación con otras células o tejidos del mamífero, por ejemplo, proteínas retínales, tales como recoverina, antígenos del músculo ocular, células Muller retínales, uveal, etc. Para los propósitos en la presente, "complejos inmunes" comprenden complejos no covalentemente asociados que se forman .entre anticuerpos (e.g., autoanticuerpos) y antígenos (e.g., antígenos encontrados en o alrededor del ojo) . El antígeno "CD20" es una fosfoproteína no glicosilada de -35 kDa encontrada en la superficie de más del 90% de las células B de sangre periférica u órganos linfoide. El CD20 se expresa durante el desarrollo de la célula pre-B y permanece hasta la diferenciación de la célula de plasma. El CD20 se encuentra presente tanto en células B normales como en células B malignas. Otros nombres para el CD20 en la literatura incluyen "antígeno restringido por el linfocito B" , y "Bp35" . El antígeno CD20 se describe en Clark et al., PNAS (EUA) 82:1756 (1985), por ejemplo. Un "antagonista" es una molécula que, al enlazarse a CD20 en células B, destruye o agota las células B en un mamífero y/o interfiere con una o más ded las funciones de la célula B, e.g., reduciendo o. evitando la respuesta humoral que emite la célula B. El antagonista preferentemente, es capaz de agotar las células B (i.e., reducir los niveles circulantes de la célula B) en un mamífero tratado con el mismo. Tal agotamiento puede lograrse a través de diversos mecanismos tales como citotoxicidad dependiente del anticuerpo mediada por la célula (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) , inhibición de la proliferación de la célula B y/o inducción de la muerte de la célula B (e.g., a través de apoptosis) . Los antagonistas incluidos dentro del alcance de la presente invención incluyen anticuerpos, péptidos de secuencia sintética o natural y antagonistas de molécula pequeña que se enlazan a CD20, opcionalmente conjugados con o fusionados a un agente citotóxico. El antagonista preferido comprende un anticuerpo . "Citotoxicidad dependiente del anticuerpo mediada por la célula" y "ADCC" se refiere a una reacción mediada por la célula en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fe (FcRs) (e.g., células de destrucción natural (NK) , neutrófilos, y macrófagos) , reconocen el anticuerpo enlazado en una célula objetivo y subsecuentemente ocasionan la lisis de la célula objetivo. Las células primarias para mediar la ADCC, células NK, expresan solo FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión FcR en las células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 434 de Ravetech y Kinet , Annu. Rev. Immunol . , 9:457-92 (1991). Para determinar la actividad ADCC de una molécula de interés, puede efectuarse un análisis ADCC in vitro, tal como el descrito en la Patente de E.U. No. 5,500,362 o 5,821,337. Las células efectoras útiles para tales análisis incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células de destrucción natural (NK) . Alternativamen e, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede determinarse in vivo, e.g., en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al., PNAS (EUA) 95:652-656 (1998) . Las "células efectoras" humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y efectúan funciones de efector. Preferentemente, las células expresan al menos Fcy II y llevan a cabo una función efector ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre perif rica (PBMC) , células de destrucción natural (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; siendo preferidas las células PBMCs y NK. Los términos "receptor Fe" o "FcR" se utilizan para describir un receptor que se enlaza a la región Fe de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia natural. Además, un FcR preferido es uno que se enlaza a un anticuerpo IgG (un receptor gama) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y formas alternativamente divididas de estos receptores. Los receptores FcyRIII incluyen, FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor de inhibición") que tienen secuencias de aminoácido similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos . El receptor de activación FcyRIIA. contiene un motivo de activación de inmunorreceptor en base a tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico . El receptor de inhibición FcyRIIB contiene un motivo de inhibición de inmunorreceptor en base a tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico. (Ver, Daéron, Annu. Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)). Los FcRs se revisan en Ravetech y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y Haas et al., J. Lab. Clin. ed., 126:330-41 (1995). Otros FcyRs, incluyendo aquellos que van a identificarse en el futuro, se encuentran comprendidos por el término "FcR" en la presente. El término incluye también el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgGs maternos al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117-587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). "Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula para lisar un objetivo en presencia del complemento. La ruta de activación del complemento se inicia' por el enlace del primer complemento del sistema de complemento (Clq) a una molécula (e.g., un anticuerpo) complejada con un antigeno cognado. Para" determinar la activación del complemento, puede llevarse a cabo un análisis CDC, e.g., como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Met ods 202:163 (1996). Antagonistas "inhibidores del crecimiento", son aquellos que evitan o reducen la proliferación de una células que expresan un antígeno al cual se enlaza el antagonista. Por ejemplo, el antagonista puede evitan o reducir la proliferación de las células B in vitro y/o in vivo. Los antagonistas que "inducen apoptosis" son aquellos que inducen la destrucción celular programada, e.g., de una célula B, como se determina mediante análisis de apoptosis estándar, . tal como el enlace de anexina V, fragmentación de ADN, encogimiento celular, dilatación del retículo endoplásmico, fragmentación celular, y/o formación de vesículas de membrana (llamadas cuerpos apoptóticos) . El término "anticuerpo" en la presente se utiliza en el más amplio sentido y cubre específicamente anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (e.g., anticuerpos biespecíficos) formados de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo mientras que exhiben la actividad biológica deseada . "Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferentemente comprendiendo su región de enlace de antígeno. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab' , F(ab')2, y Fv; diabodies; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenarias; y anticuerpos multiespecífieos formados de fragmentos de anticuerpo. Para los propósitos de la presente, un "anticuerpo intacto" es uno que comprende dominio variables pesados y ligeros así como una región Fe. "Anticuerpos naturales" son comúnmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se encuentra enlazada a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varia entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina . Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se encuentra alineada con el primer dominio constante de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácido particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada . El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en el enlace y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se encuentra uniformemente distribuida a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Ésta se concentra en tres segmentos, llamados regiones hipervariables, en los dominios tanto de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan las regiones de estructura (FRs) . Los dominios variables de cadenas naturales pesada y ligera comprenden cada uno cuatro FRs, adoptando mayormente una configuración de lámina ß, conectada por tres regiones hipervariables, que forman lazos que conectan, y en algunos forman parte de la estructura de lámina ß. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en cercana proximidad mediante las FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace de antígeno de los anticuerpos (ver, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)). Los dominios constantes no se encuentran implicados directamente en el enlace de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben diversas funciones de efector, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) .

La digestión de papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de enlace de antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab" , cada uno con un solo sitio de enlace de antígeno, y un fragmento "Fe" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de enlace de antígeno y aún es capaz de reticular el antígeno . "Fv" es el mínimo fragmento de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento de antígeno y de enlace de antígeno. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en estrecha asociación no covalente. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace de antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de enlace de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y enlazar el antígeno, aunque a una afinidad menor que el sitio de enlace completo. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en la terminación carboxi del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región de articulación del anticuerpo. Fab' -SH es la designación en la presente para Fab', en la cual el (los) residuo (s) cisteína de los dominios constantes contienen al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de articulación entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno o dos tipos claramente distintos, llamados kappa ( ) y lambda (?) , en base a las secuencias ded aminoácidos de otros dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos pueden asignarse a diferentes clases. Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, y varias de estas pueden dividirse adicionalmente en sub-clases (isotipos) , e.g., IgGl, IgG2 , IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan a, d, e, y, y µ, respectivamente. Se conocen bien las estructuras de sub-unidad y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas . Los fragmentos "Fv monocatenarios" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios se encuentran presentes en una sola cadena de polipéptidos . Preferentemente, el polipeptido Fv comprende además un enlazador de polipeptido entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para el enlace de antígeno. Para una revisión de scFv ver, Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies , vol . 113 , Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, New York, p . 269-315 (1994) . El término iabodies" se refiere a pequeños fragmentos con dos sitios de enlaces de antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptidos (VH-VL) utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se fuerzan a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de enlace de antígeno. Los diabodies se describen más completamente, por ejemplo, en la EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 90:6444-6448 (1993). El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, i . e . , los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden presentarse en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con preparaciones convencionales (policlonales) de anticuerpo que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra una sola determinante en el antígeno. En adición a su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que se sintetizan por medio del cultivo de hibridoma, no contaminado por otras inmunoglobulinas . El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe entenderse que requiere la producción del anticuerpo por medio de algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden elaborarse mediante el método de hibridoma primeramente descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden elaborarse mediante métodos de ADM recombinante (ver, e.g., Patente de E.U. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos fago utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol . 222:581-597 (1991), por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homologa para las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenece a una clase o sub-clase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la(s) caden (s) es idéntico a u homólogo para las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenece a otra clase o sub-clase de anticuerpo, así como fragmentos de tales anticuerpos, mientras que exhiban la actividad biológica deseada (Patente de E.U. No. 4,816,567; Morrison et al., Proc . Nati. Acad. Sci. EUA 81:6851-6855 (1984)) . Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de enlace de antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (e.g., mono del viejo mundo, tal como mono baboon, rhesus o cinomolgus) y secuencias humanas de región constante (Pat. de E.U. No. 5,693,780) . Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (e.g., murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunas instancias, los residuos de región de estructura (F ) de la inmunoglobulina .humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se efectúan para refinar adicionalmente el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos dominios variables en los cuales todos o sustancialmente todos los lazos hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FRs son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol . 2:593-596 (1992).

El término "región hipervariable" al utilizarse en la presente, se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables del enlace de antigeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácido de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (e.g., residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un "lazo hipervariable" (e.g., residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987)). Residuos de "estructura" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los residuos de región hipervariable como se definieron en la presente. Ejemplos de anticuerpos que se enlazan al antígeno CD20 incluyen: "C2B8" que se denomina ahora "Rituximab" ("RITUXAN®") (Patente de E.U. No. 5,736,137, expresamente incorporada en la presente por la referencia) ; el anticuerpo murino 2B8 marcado con itrio [90] designado "Y2B8" o "Ibritumomab Tiuxetan" ZEVALIN® (Patente de E.U. No. 5,736,137, expresamente incorporada en la presente por la referencia) ; IgG2a murino "Bl" , también llamado "Tositumomab" , opcionalmente marcado con 131I para generar el anticuerpo "131I-B1" (yodo 1131 tositumomab, BEXXAR™) (Patente de E.U. No. 5,595,721, expresamente incorporada en la presente por la referencia) ; anticuerpo monoclonal murino "IF5" (Press et al., Blood 69 (2 ): 584-591 (1987) e IF5 "de estructura compuesta" o humanizado (WO03/002607 , Leung, S.); depósito ATCC HB-96450) ; anticuerpo 2H7 murino y 2H7 quimérico (Patente de E.U. No. 5,677,180, incorporada en la presente por referencia) ; 2H7 humanizado; huMax-CD20 (Genmab, Dinamarca) ; AME-133 (Applied Molecular Evolution) ; y anticuerpos monoclonales L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl o NU-B2 disponibles en International Leukocyte Typing orkshop (Valentine et al., en: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed. , p. 440, Oxford University Press (1987)). Los términos "rituximab" o "RITUXAN®" en la presente, se refieren al anticuerpo monoclonal quimérico murino/humano genéticamente diseñado dirigido contra el antígeno CD20 y designado "C2B8" en la Patente de E.U. No. 5,736,137, expresamente incorporada en la presente por la referencia, incluyendo sus fragmentos que retienen la capacidad para enlazarse a CD20. Puramente para los propósitos de la presente, "2H7 humanizado" se refiere a un anticuerpo intacto o anticuerpo de fragmento que comprende la secuencia variable ligera: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPS LASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 1); y la secuencia variable pesada: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWWQAPG GLEWVGAIYPGNG DTSY QKF GRFTISVDKSK TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDV GQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 2) . Cuando el anticuerpo 2H7 humanizado es un anticuerpo intacto, preferentemente comprende la secuencia de aminoácidos de cadena ligera: G SCIILFLVATATGYHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQ KPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFG QGT VEI RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKV-Q KVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSIADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT SFNRGEC (SEQ ID NO: 3); y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada: MGWSCIILFLVATATG SEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMH V RQAPGKGLEWGAIYPGNGTDSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR WYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP DTL ISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQD LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE1OTYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4) . Un antagonista "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado dé un componente de su ambiente natural . Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos para el antagonista, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos . En modalidades preferidas, el antagonista se purificará (1) a más del 95% por peso del antagonista como se determina por el método Lowry, y de mayor preferencia a más del 99% por peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de terminación N o de la secuencia de aminoácido interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) a homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones de reducción o de no reducción utilizando azul de Coomassie o preferentemente colorante de plata. El antagonista aislado incluye el antagonista in situ dentro de células recombinantes dado que al menos un componente del ambiente natural del antagonista no se encontrar presente. Sin embargo, ordinariamente, el antagonista aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación. "Mamífero" para los propósitos de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja y animales de zoológico, para deportes o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferentemente, el mamífero es humano.

"Tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Los que necesitan tratamiento, incluyen aquellos que ya tienen el trastorno ocular así como aquellos en los cuales va a prevenirse el trastorno ocular. De aquí que puede haberse diagnosticado que el mamífero tiene el trastorno ocular o puede encontrarse predispuesto o susceptible al trastorno ocular . La expresión "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad del antagonista que es efectiva para prevenir, mejorar o tratar el trastorno ocular en cuestión. El término "agente inmunosupresor" como se utiliza en la presente para terapia adjunta, se refiere a sustancias que actúan para suprimir o enmascarar el sistema inmune del mamífero que se trata en la presente. Éste incluye sustancias que suprimen la producción de citosina, sub-regulan o suprimen la expresión de auto-antígeno, o enmascaran los antígenos MHC. Ejemplos de tales agentes incluyen pirimidinas 2-amino-6-aril-5-sustituidas (ver, Pat. de E.U. No. 4,665,077, cuya descripción se incorpora en la presente por referencia) ; drogas anti-inflamatorias no esteroidales (NSAIDs) / azatioprina; ciclofosfamida; bromocriptina; danazol; dapsona; glutaraldehído (que enmascara los antígenos MHC, como se describe en la Pat. de E.U. No. 4,120,649); anticuerpos anti-idiotípicos para antígenos MHC y fragmentos MHC; ciclosporin A; esferoides tales como glucocortiesteroides , e.g., prednisona, metilprednisolona, y dexametasona; metotrexato (oral o subcutáneo) ; hidroxicloroquina; sulfasalazina; leflunomida; citosina o antagonistas receptores de citosina incluyendo anticuerpos y, ß o a anti-interferón, anticuerpos factor-a anti-necrosis tumoral (infliximab o adalimumab) , inmunoadhesina anti-TNFa (etanercept) , anticuerpos factor-/? anti-necrosis tumoral, anticuerpos anti-interleucina-2 y anticuerpos receptor anti-IL-2; anticuerpos anti-LFA-1, incluyendo anticuerpos anti-CDlla y anti-CD18; anticuerpos anti-L3T4; globulina heteróloga anti-linfocito; anticuerpos pan-T, preferentemente anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4/CD4a; péptido soluble conteniendo un dominio de enlace LFA-3 (WO 90/08187 publicada el 7/26/90) ; estreptosinasa; TGF-ß; estreptodornasa; ARN o ADN del huésped; FK506; RS-61443; deoxispergualina; rapamicina,- receptor de célula T (Cohén et al., Pat . de E.U. No. 5,114,721); fragmentos del receptor de célula T (Offner et al., Science, 251:430-432 (1991); WO 90/11294; Ianeway, Nature, 341:482 (1989); y WO 91/01133); y anticuerpos del receptor de célula T (EP 340,109) tales como T10B9. El término "agente citotóxico" como se utiliza en la presente, se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de las células y/o ocasiona la destrucción de las células. El término pretende incluir isótopos radiactivos (e.g., At-211, T1131 iT125 , v?-90 , , Sr>ra153 , pBi-i 212 , pP32 e_ isótopos radiactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos , y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacterial, de hongos, vegetal , o animal , o sus fragmentos . Un wagente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes de alquilación tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™) alquil sulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altret mina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilolmelamina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro de óxido de mecloretamina, melfalán, novembicin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocin, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas , actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubiciña, epirrubicina, esorrubicina, isarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamipirina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, ß-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como clausterona, dromostañolona propionato, epitioestanol , mepitioestano, testolactona anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, triloestano; reaprovisionador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicosida; ácido aminoleuvínico; amsacrina; bestrabucil ; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolina; dizicuona; elfornitina; eliptinio acetato; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona ; mitoxantrona ; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina ; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; p ocarbazina; PSK®; razoxano; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2''-tricloroetilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, e.g., paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) , y doxetaxel (TAXOTERE®, R one-Poulenc Rorer, Antony, France) ; clorambucil ; gemcitabina ; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatin y carboplatin; vihblastina,- platino; etoposida (VP-16) ; ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposida; daunomicina; aminopterin; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores . También se incluyen en esta definición agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores, tales como anti-estrógenos incluyendo, por ejemplo, tamoxifen, raloxifeno, 4 (5) -imidazolos inhibidores de aromatasa, 4-hidroxitamoxifen, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (Fareston) ; y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores . El término "citosina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúa en otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citosinas son linfosinas, monosinas y hormonas de polipéptido tradicionales. Incluida entre las citosinas se encuentra la hormona de crecimiento tal como la hormona de crecimiento humana, hormona N-metionil de crecimiento humana, y la hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina,- prorrelaxina; hormonas de glicoproteina tales como la hormona de estimulación de folículo (FSH) , hormona de estimulación tiroidea (TSH) , y hormona luteinizante (LH) ; factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblasto ; prolactina; lactogeno placentario factor y ß de necrosis de tumor; sustancia inhibidora mullerian; péptido de ratón asociado a gonadotropina; inhibina; activina; factor de crecimiento vascular endometrial; integrina; trombopoyetina (TPO) ; factores de crecimiento nervioso tales como NGF-/3; factor de crecimiento de plaquetas; factores de transformación de crecimiento (TGFs) tales como TGF-a; y TGF-ß; factor I y II de crecimiento similares a insulina; eritropoyetina (EPO) ; factores osteoinductores ; interferones tales como interferón-cx y ß y y; factores de estimulación de colonia (CSFs) tales como macrófago CSF (M-CSF) ; granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF) ; y granulocito-CSF (G-CSF) ; interleucinas (ILs) tales como IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; un factor de necrosis de tumor tal como TNF-cx o TNF-/3; y otros factores de polipéptido incluyendo LIF y ligante kit ( L) . Como se utiliza en la presente, el término citosina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citosinas de secuencia natural . El término "prodroga" , como se utiliza en esta solicitud se refiere a una forma precursora o derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica a las células de tumor en comparación con la droga de origen y es capaz de activarse enzimáticamente o de convertirse en la forma de origen más activa. Ver, e.g., ilman, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615a Meeting Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery" , Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.) pp. 247-267, Humana Press (1985) . Las prodrogas de esta invención incluyen, pero no se limitan a, prodrogas que contienen fosfato, prodrogas que contienen tiofosfato, prodrogas que contienen sulfato, prodrogas que contienen p ptido, prodrogas modificadas con D-aminoácido , prodrogas glicosiladas, prodrogas que contienen ß lactam, prodrogas que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o prodrogas que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otras prodrogas de 5-fluorouridina que pueden convertirse en la droga libre citotóxica más activa. Ejemplos de drogas citotóxicas que pueden derivarse en una forma de prodroga para su uso en esta invención, incluyen, pero no se limitan a, los agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente. Un "mal de célula B" es un mal que involucra células B. Los ejemplos incluyen enfermedad de Hodgkin, incluyendo la enfermedad de Hodgkin predominante en linfocitos (LPHD) ; linforna no de Hodgkin (NHL) ; linfoma de célula folicular central (FCC) ; leucemia linfocítica aguda (ALL) '; leucemia linfocítica crónica (CLL) ; leucemia de célula vellosa; linfoma linfocítico plasmacitoide; linfoma de célula cubierta; linfoma relacionado con SIDA o VIH; mieloma múltiple; linfoma del sistema nervioso central (CNS) ; trastorno linfoproliferativo post-transplante (PTLD) ; macroglobulinemia de Waldenstrom (linfoma linfoplasmacítico) ; linfoma del tejido linfoide asociado a la mucosa (MALT) ; y linfoma/leucemia de zona marginal. El linfoma no de Hodgkin incluye, pero no se limita a, NHL de bajo grado/folicular, NHL reincidente o refractario, NHL de línea frontal de bajo grado, NHL de etapa III/IV, NHL resistente a la quimioterapia, NHL linfocítico pequeño (SL) , NHL de grado intermedio/folicular, NHL de grado intermedio difuso, linfoma difuso de célula grande, NHL agresivo, (incluyendo NHL agresivo de línea frontal y NHL agresivo reincidente) , reincidencia del NHL después o refractaria al transplante de célula tronco autóloga, NHL inmunoblástico de alto grado, NHL linfoblástico de alto grado, NHL de célula pequeña no dividida de alto grado, NHL de enfermedad bulbosa, etc. II . Producción de Antagonistas Los métodos y artículos de manufactura de la presente invención, utilizan o incorporan un antagonista que se enlaza a CD20. Por tanto, los métodos para generar tales agonistas se describirán en la presente. El antígeno CD20 que va a utilizarse para la producción de, o la exploración de, antagonista (s) , puede ser, e.g., una forma soluble de CD20 o una porción del mismo, que contiene el epítope deseado. Alternativamente, o adicionalmente, pueden utilizarse las células que expresan CD20 en su superficie celular para generar, o explorar, antagonista (s) . Otras formas de CD20 útiles para generar antagonistas serán aparentes para los expertos en la técnica. Aunque el antagonista preferido es un anticuerpo, se contemplan en la presente antagonistas diferentes a los anticuerpos. Por ejemplo, el antagonista puede comprender un antagonista de molécula pequeña fusionado a, o -conjugado con, un agente citotóxico (tales como los descritos en la presente) . Las bibliotecas de moléculas pequeñas pueden explorarse contra el antígeno CD20 de interés en la presente, a fin .de identificar una molécula pequeña que se enlaza a ese antígeno. La molécula pequeña puede explorarse adicionalmente por sus propiedades antagonistas y/o conjugarse con un agente citotóxico. El antagonista también puede ser un péptido generado por diseño racional o mediante imagen fago (ver, e.g., WO 98/35036 publicada el 13 de Agosto de 1998) . En una modalidad, la molécula seleccionada puede ser un "imitador de CDR" o un análogo de anticuerpo diseñado en base a las CDRs de un anticuerpo. Aunque tales péptidos pueden ser antagonistas por si mismos, el péptido, opcionalmente, puede fusionarse a un agente citotóxico a fin de agregar o mejorar las propiedades antagonistas del péptido. Continúa una descripción de las técnicas ejemplares para la producción de los antagonistas de anticuerpo utilizados de acuerdo con la presente invención. (i) Anticuerpos policlon les Los anticuerpos policlonales preferentemente se crían en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante a una proteína que es inmunógena en las especies que van a inmunizarse, e.g., hemocianina keyhole limpet, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o de derivación, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos cisteína) , M-hidroxisuccinimida (a través de residuos lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12, o R1N=C=NR, en donde R y R1 son grupos alquilo diferentes . Se inmuniza a los animales contra el antígeno, conjugados inmunógenos, o derivados, combinando, e.g., 100 µ.< o 5 g de la proteina o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) , con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución de manera intradérmica en sitios múltiples. Un mes más tarde, se refuerza a los animales con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días después, se sangra a los animales y se analiza el suero para titulación del anticuerpo. Se refuerza a los animales hasta que la titulación se emplaca. Preferentemente, se refuerza al animal con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también pueden elaborarse en cultivo celular recombinante como fusiones de proteína. También, se utilizan adecuadamente agentes de agregación tales como alum para mejorar la respuesta inmune. (íi) Anticuerpos monoclónales los anticuerpos monoclonales se obtienen de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, i.e., los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden presentarse en cantidades menores. De este modo, el modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos discretos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden elaborarse utilizando el método de hibridoma descrito primero por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden elaborarse mediante métodos de ADN recombinante (Patente de E.U. No. 4,816,567) . En el método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, se inmuniza como se describió anteriormente en la presente para emitir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se enlazarán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Después los linfocitos se fusionan con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilen glicol, para formar una célula hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies, Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press 1986) ) . Las células hibridoma así preparadas se siembran y crecen en un medio adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células mieloma de origen no fusionadas. Por ejemplo, si las células mieloma de origen carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGP T o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT) , cuyas sustancias evitan el crecimiento de las células deficientes en HGPRT. Las células mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la producción estable a alto nivel del anticuerpo por las células seleccionadas productoras de anticuerpo, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estas, las líneas celulares mieloma preferidas son las líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores MOPC-21 y MPC-11 de ratón, disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California EUA, y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de American Type Culture Collection, Rockville, aryland EUA. Las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). El medio de cultivo en el cual crecen las células hibridoma se analiza para la producción de anticuerpos monoclónales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales producidos por células hibridoma se determina por inmunoprecipitación o mediante un análisis de enlace in vitro, tal como radioinmunoanálisis (RIA) o análisis inmunoabsorbente enlazado a enzimas (ELISA) . La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal, por ejemplo, puede determinarse mediante el análisis Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem. , 107:220 (1980). Después de identificar las células hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones pueden sub-clonarse mediante procedimientos de limitación de dilución y crecer mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp . 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Adicionalmente, las células hibridoma pueden crecer in vivo como tumores de ascitos en un animal . Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente, del medio de cultivo, el fluido de ascitos, o suero, mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulina tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis, o cromatografía de afinidad. El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales se aisla y se secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (e.g., utilizando sondas de oligonucleótido que son capaces de enlazarse específicamente a genes que codifican para las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos) . Las células hibridoma sirven como una fuente preferente de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que se transfectan entonces en células huésped tales como células de E. coli, células COS de simio, células ováricas de hámster Chino (CHO) , o células mieloma que, de otro modo, no producen proteínas de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes . Los artículos de revisión acerca de la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican para el anticuerpo incluyen, Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol . , 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol . Revs . , 130:151-188 (1992) . En una modalidad adicional, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de bibliotecas fago de anticuerpos generadas utilizando las técnicas descritas en cCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol . , 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas fago. Publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos monoclonales a alta afinidad (rango nM) mediante arrastre de cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), asi como por infección de combinación y recombinación in vivo como estrategia para construir bibliotecas muy grandes (Waterhouse et al., Nucí. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)). De este modo, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia de codificación por dominios constantes humanos de cadena pesada y ligera en lugar de las secuencias murinas homologas (Patente de E.U. No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci., EUA, 81:6851 (1984) ) , o uniendo de manera covalente a la secuencia de codificación de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no de inmunoglobulina. Típicamente, tales polipéptidos no de inmunoglobulina se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico, que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para* un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente. (iii) Anticuerpos humanizados Se han descrito en la técnica métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Preferentemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en el mismo provenientes de una fuente no humana. Estos residuos de aminoácido no humanos se refieren frecuentemente como residuos "importados", que típicamente se toman de un dominio variable "importado" . La humanización puede llevarse a cabo esencialmente siguiendo el método de inter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo secuencias de región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, tales anticuerpos "humanizados son anticuerpos quiméricos (Patente de E.U. No. 4,816,567) en donde menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos' en los cuales algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos provenientes de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

La selección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que van a utilizarse para preparar los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método llamado "mejor ajuste", se explora la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor contra la biblioteca completa de secuencias conocidas humanas de dominio variable. La secuencia humana más cercana a la del roedor se acepta entonces como la región humana de estructura (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol, 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol . 196:901 (1987)). Otro método utiliza una región de estructura particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un sub-grupo particular de cadenas ligera o pesada. La misma estructura puede utilizarse para diversos anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc . Nati. Acad. Sci . EUA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993) ) . Además, es importante que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, de acuerdo con un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias de origen y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias de origen y humanizadas. Se encuentran comúnmente disponibles modelos tridimensionales de inmunoglobulina y son familiares para los expertos en la técnica. Se encuentran disponibles programas de computadora que ilustran y despliegan probables estructuras tridimensionales de conformación de secuencias de inmunoglobulina candidato seleccionadas . La inspección de estas imágenes permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, i.e., el análisis de residuos que influyen la capacidad de la inmunoglobulina candidato para enlazarse a su antígeno. De esta manera, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias receptoras e importadas de modo que se logra la característica del anticuerpo deseada, tal como afinidad incrementada para el (los) antígeno (s) objetivo. En general, los residuos de región hipervariable se encuentran directa y más sustancialmente implicados en influenciar el enlace al antígeno. (iv) Anticuerpos humanos como una alternativa a la humanización, pueden generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, es posible ahora producir animales transgénicos (e.g., ratones) capaces, al inmunizarse, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homózigua del gen de región de unión (JH) de cadena pesada del anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal, da como resultado la inhibición total de la producción del anticuerpo endógeno. La transferencia de la disposición del gen de inmunoglobulina humano de linea germinal en tales ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos al probar el antígeno. Ver, e.g., Jakobovits et al., Proc . Nati. Acad. Sci. EUA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno . , 7:33 (1993); y las Patentes de E.U. Nos. 5,591,669, 5,589,369 y 5,545,807. Alternativamente, puede utilizarse tecnología de imagen fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de repertorios de gen de inmunoglobulina de dominio variable (V) de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes anticuerpo de dominio V se clonan en marco en un gen de proteína ya sea de cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se despliegan como fragmentos funcionales de anticuerpo en la superficie de la partícula fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica para el anticuerpo que exhibe aquellas propiedad. De este modo, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La visualización fago puede llevarse a cabo en una diversidad de formatos; para su revisión, ver, e.g., Johnson Kevin S. y Chis ell, David J. , Current Opinión in Structural Biology, 3:564-571 (1993). Pueden utilizarse diversas fuentes de segmentos del V-gen para la visualización fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) aisló una disposición diversa de anticuerpos anti-oxazolona a partir de una pequeña biblioteca aleatoria de combinación de genes V derivada de los bazos de ratones inmunizados . Puede construirse un repertorio de genes V provenientes de donantes humanos no inmunizados, y pueden aislarse anticuerpos para una disposición diversa de antígenos (incluyendo autoantigenos) esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks, et al., J. Mol. Biol . , 22:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. , 12:725-734 (1993) . Ver, también, Patentes de E.U. Nos. 5,565,332 y 5,573,905. También pueden generarse anticuerpos humanos mediante células B activadas in vitro (ver Patentes de É.U. 5,567,610 y 5,229,275). (v) Fragmentos de anticuerpo Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron a través de digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, e.g., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden producirse ahora directamente mediante células huésped recombinantes . Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse a partir de las bibliotecas fago de anticuerpos descritas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente a partir de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro procedimiento, los fragmentos F (ab' ) 2 " pueden aislarse directamente a partir del cultivo de célula huésped recombinante . Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán aparentes para el practicante experto. En otras modalidades, el anticuerpo seleccionado es un fragmento Fv monocatenario (scFv) . Ver WO 93/16185; Patente de E.U. No. 5,571,894; y Patente de E.U. No. 5,587,458. El fragmento de anticuerpo también puede ser también un "anticuerpo lineal", e.g., como se describe en la Patente 5,641,870. Tales fragmentos de anticuerpo lineal pueden ser monoespecíficos o biespecíficos . (vi) Anticuerpos biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace para al menos dos epítopes diferentes. Los anticuerpos biespecificos ejemplares pueden enlazarse a dos epítopes diferentes del antígeno CD20. Otros anticuerpos tales pueden enlazarse a CD20 y enlazarse además a un segundo marcador de superficie de célula B. Alternativamente, puede combinarse una sección del enlace anti-CD20 con una sección que se enlaza a una molécula de activación en un leucocito tal como una molécula receptor de célula T (e.g., CD2 u CD3), o receptores Fe para IgG (FcyR) , tales como FcyRI (CD64) , FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) a fin de enfocar los mecanismos celulares de defensa a la célula B. Los anticuerpos biespecificos también pueden utilizarse para localizar agentes citotóxicos para la célula B. Estos anticuerpos poseen una sección de enlace de CD20 y una sección que se enlaza al agente citotóxico (e.g., saporin, anti-interferón-a, vinca alcaloide, cadena A de ricina, metotrexato o hapteno de isótopo radiactivo) . Los anticuerpos biespecificos pueden prepararse como anticuerpos de longitud total o fragmentos de anticuerpo (e.g., anticuerpos biespecificos F(ab')2). Se conocen en la técnica métodos para preparar anticuerpos biespecificos . La producción tradicional de anticuerpos biespecificos de longitud total se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la selección aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpo, de las cuales una tiene la estructura biespecifica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se efectúa comúnmente mediante etapas de cromatografía de afinidad, es de algún modo molesta, y los rendimientos del producto son bajos. Se describen procedimientos similares en la WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991). De acuerdo con un procedimiento diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende al menos parte de las regiones CH2 y CH3 de articulación. Se prefiere que la primera región constante de cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para el enlace de cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican para las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, de cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad al ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos del polipéptido en modalidades en las cuales las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido utilizadas en la construcción, proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptido en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no tienen una significación particular. En una modalidad preferida de este procedimiento, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de enlace en una sección, y un par híbrido de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina (proporcionando una segunda especificidad de enlace) en la otra sección. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones no deseadas de cadena de inmunoglobulina, dado que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo la mitad de la molécula biespecífica proporciona un modo fácil de separación. Este procedimiento se describe en la WO 94/04690. Para detalles adicionales de la generación de anticuerpos biespecíficos, ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acuerdo con otro procedimiento descrito en la Patente de E.U. No. 5,731,168, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo puede diseñarse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recupera del cultivo celular recombinante . La interfaz preferida comprende al menos parte del dominio CH3 de un dominio constante del anticuerpo. En este método, uno o más pequeñas cadenas laterales de aminoácido de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más grandes (e.g., tirosina o triptof n) . Se crean "cavidades" compensadoras de un tamaño idéntico o similar a la(s) grande (s) cadena (s) lateral (es) en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo, reemplazando las grandes cadenas laterales de aminoácido con unas más pequeñas (e.g., alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos secundarios no deseados tales como homodímeros . Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas (Patente de E.U. No. 4,676,980), y para el tratamiento de infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089) . Los anticuerpos heteroconjugados pueden prepararse . utilizando cualquier método conveniente de reticulación. Los agentes de reticulación adecuados son muy conocidos en la técnica, y se describen en la Patente de E.U. No. 4,676,980, conjuntamente con un número de técnicas de reticulación . Las técnicas para generar anticuerpos biespecxficos a partir de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse Utilizando enlace químico. Brennan et al., Science, 229:81 (1985) describe un procedimiento en donde se dividen proteolíticamente anticuerpos intactos para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejador de ditiol, arsenita de sodio para estabilizar los ditioles vecinos y evitar la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab' -TNB se re-convierte entonces en el Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar de otro derivado Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico . Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Los progresos recientes han facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, que pueden acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos . Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) describe la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizada. Cada fragmento Fab' se secretó por separado de E. coli y se sometió a acoplamiento químico directo in vitro para formar el anticuerpo biespecífico . El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de enlazarse a células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y a células T humanas normal, así como de activar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos de tumor de seno. También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente de cultivo celular recombinante . Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando zipers de leucina. ostelny et al., J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992) . Los péptidos de ziper de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos mediante fusión de gen. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región de articulación para formar - monómeros y después se re-oxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede utilizarse para las producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diabody" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci., EUA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para elaborar fragmentos de anticuerpo biespecífico . Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando asi dos sitios de enlace de antigeno. También se ha reportado otra estrategia para elaborar fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante el uso de dímeros monocatenarios Fv (sFv) . Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994). Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos . Tutt et al., J. Immunol., 147:60 (1991). III. Conjugados y Otras Modificaciones del Antagonista El antagonista utilizado en los métodos o incluido en los artículos de manufactura en la presente se conjuga opcionalmente a un agente citotóxico. Se han descrito anteriormente agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales conjugados de antagonista- agente citotóxico. También se contemplan en la presente conjugados de un antagonista y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como caliqueamicina, una maytansina (Patente de E.U. No. 5,208,020), un tricoteno, y CC1065. En una modalidad de la invención, el antagonista se conjuga a una o más moléculas de maytansina (e.g., aproximadamente 1 a aproximadamente 10 moléculas de maytansina por molécula de antagonista) . La maytansina, por ejemplo, puede convertirse en May-SS-Me que puede reducirse a May-5H3 y se reactiva con antagonista modificado (Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992)) para generar un conjugado maytansinoide-antagonista . Alternativamente, el antagonista se conjuga a una o más moléculas de caliqueamicina. La familia caliqueamicina de antibióticos es capaz de producir rompimientos de 7ADM de cuerda doble a concentraciones sub-picomolares . Los análogos estructurales de caliqueamicina que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, ??1. a^1, OÍ3X , N-acetil-??1, PSAG y 0Xi (Hinman et al., Cáncer Research 53:3336-3342 (1993) y Lode et al., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998)). Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden utilizarse pueden incluir cadena A de difteria, fragmentos activos no enlazados de la toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudoraonas aeruginosa) , cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de charantia momordica, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Ver, por ejemplo, WO 93/21232 publicada en Octubre 28 de 1993. La presente invención contempla además antagonista conjugado con un compuesto con actividad nucleolítica (e.g., una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN tal como una desoxirribonucleasa : DNasa) . Se encuentra disponible una diversidad de isótopos radiactivos para la producción de antagonistas radiocon ugados . Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re18S, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radiactivos de Lu. Los conjugados del antagonista y agente citotóxico pueden elaborarse utilizando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como M-succinimidil-3 - (2-piridilditiol) ropionato (SPDP) , succinimidil- - (N-maleimidometil) ciclohexano-l-carboxilato, iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCL) , ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azo (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina) , diisocianatos (tales como tolieno 2 , 6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) .

Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3 -metildietileno triaminapentaacético marcado con carbono 14 (MX-STPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionucleótido al antagonista. Ver WO 94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador divisible" facilitando la liberación de la droga citotoxica en la célula. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazador lábil al ácido, enlazador sensible a peptidasa, enlazador dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992) ) . Alternativamente, puede prepararse una proteina de fusión que comprende el antagonista y el agente citotóxico, e.g., mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptido. Aún en otra modalidad, el antagonista puede conjugarse a un "receptor" (tal como estreptavidina) para su uso en pre-dirección al tumor en donde el conjugado antagonista-receptor se administra al paciente, seguido del retiro del conjugado no enlazado de la circulación, utilizando un agente de despeje y después la administración de un "ligante" (e.g., avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (e.g., un radionucleótido). Los antagonistas de la presente invención también pueden conjugarse con una enzima de activación de prodroga que convierte a una prodroga (e.g., un agente quimioterapéutico de peptidilo, ver WO 81/01145) en una droga activa anti-cáncer. Ver por ejemplo, WO 88/07378 y la Patente de E.U. No. 4,975,278. El componente enzimático de tales conjugados incluyen cualquier enzima capaz de actuar en una prodroga de tal modo que la convierte en una forma citotóxica más activa. Las enzimas útiles en el método de esta invención incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina útil para convertir prodrogas que contienen fosfato en drogas libres; arilsulf tasa útil para convertir las prodrogas que contienen sulfato en drogas libres; citosina diaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en la droga anti-cáncer, 5-fluorouracilo; proteasas, tales como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L) , que son útiles para convertir prodrogas que contienen péptido en drogas libres; D-alanilcarboxipeptidasas , útiles para convertir prodrogas que contienen sustituyentes D-aminoácido ; enzimas de división de carbohidratos tales como b-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir drogas derivatizadas con b-lactams en drogas libres; y amidasas de penicilina tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir drogas derivatizadas en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetil o fenilacetil, respectivamente, en drogas libres. Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "abzimas" para convertir las prodrogas de la invención en drogas libres (ver, e.g., assey, Nature 328:457-458 (1987)). Los conjugados antagonista-abzima pueden prepararse como se describe en la presente para el suministro de la abzima a una población de células de tumor. Las enzimas de esta invención pueden enlazarse covalentemente al antagonista mediante técnicas muy conocidas en la técnica tales como el uso de los reactivos de reticulación eterobifuncionales descritos anteriormen e. Alternativamente, pueden construirse proteínas de fusión que comprenden al menos la región de enlace de antígeno de un antagonista de la invención enlazadas a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención, utilizando técnicas de ADN recombinante muy conocidas en la técnica (ver, e.g., Neuberger et al., Nature, 312:604-608 (1984) ) . Se contemplan en la presente otras modificaciones del antagonista. Por ejemplo, el antagonista puede enlazarse a uno de una diversidad de polímeros no proteináceos , e.g., polietilen glicol (PEG) , polipropilen glicol, polioxialquilenos, o copolímeros de polietilen glicol y polipropilen glicol . Los fragmentos de anticuerpo, tales como Fab' , enlazados a una o más moléculas PEG son una modalidad especialmente preferida de la invención. Los antagonistas descritos en la presente también pueden formularse como liposomas. Los liposomas que contienen el antagonista se preparan por métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci., EUA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 77:4030 (1980); Pat . de E.U. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y WO 97/38731 publicadas en Octubre 23 de 1997. Los liposomas con tiempo de circulación aumentado se describen en la Patente de E.U. No. 5,013,556. Los liposomas particularmente útiles pueden generarse mediante el método de evaporación de fase de reversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE) . Los liposomas se extruyen a través de filtros de un tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' de un anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse a los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol . Chem. 257:286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro. Opcionalmente, se encuentra contenido dentro del liposoma un agente quimioterapéutico . Ver Gabizon et al., J. National C ncer Inst . , 81(19)1484 (1989). Se contempla (n) modificación (es) de la secuencia de aminoácidos de antagonistas de proteína o péptido como se describen en la presente. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de enlace y/o otras propiedades biológicas del antagonista. Las variantes de la secuencia de aminoácidos del antagonista se preparan introduciendo los cambios de nucleótido apropiados en el ácido nucleico del antagonista, o mediante síntesis de péptido. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones de, y/o inserciones en, y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del antagonista. Cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución se hace para lograr la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos post-translacionales del antagonista, tales como el cambio del número o posición de los sitios de glicosilacion. Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del antagonista que son las localizaciones preferidas para la mutagénesis, se denomina "mutagénesis de exploración de alanina" como se describe por Cunningham y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989). Aquí se identifica un residuo o un grupo de residuos objetivo (e.g., residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o de carga negativa (de mayor preferencia alanina o poliamina) para afectar la interacción de los aminoácidos con antigeno. Esos sitios de aminoácido que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones, se refinan entonces introduciendo variantes adicionales o diferentes, en o para los sitios de sustitución. De este modo, aunque se predetermina el sitio de introducción de una variación a la secuencia de aminoácidos, se requiere que la naturaleza de la mutación per se no sea predeterminada. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, se conduce una exploración ala o mutagénesis aleatoria en el codón o región objetivo y se exploran las variantes de antagonista por la actividad deseada. Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones de terminación amino y/o carboxilo que fluctúan en longitud desde un residuo para polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones de intrasecuencia de residuos de aminoácido únicos o múltiples. Ejemplos de las inserciones de terminación, incluyen un antagonista con un residuo de metionilo de terminación N o el antagonista fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula antagonista incluyen la fusión a la terminación N o C del antagonista, de una enzima, o un polipéptido que aumenta la vida media en suero del antagonist . Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula antagonista reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagenesis de sustitución de antagonistas de anticuerpo incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones preferidas" . Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces, pueden introducirse más cambios sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se describe adicionalmente abajo con referencia a las clases de aminoácido y explorar los productos . Tabla 1 Residuo Sustituciones Ejemplares Sustituciones Original Preferidas Ala (A) val; leu; ile val Arg ( ) lys; gln; asn lys Asn (N) gln; his; asp; lys; arg gln Asp (D) glu; asn glu Cys (C) ser; ala ser Gln (Q) asn; glu asn Glu (E) asp; gln asp Gly (G) Ala ala His (H) asn; gln; lys; arg arg He (I) leu; val; met; ala; phe; leu norleucina Leu (L) Norleucina; ile; val; met; ile ala; phe Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr tyr Pro (P) Al ala Ser (S) Thr thr Thr (T) Ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; ala; leu norleucina Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del antagonista se logran " seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto para mantener (a) la estructura de la estructura del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga de hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos de origen natural se dividen en dos grupos en base a las propiedades comunes de la cadena lateral: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr; (3) acídicos: asp, glu,- (4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; (5) residuos que influyen en la orientación de cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe . Las sustituciones no conservadoras asegurarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase . Cualquier residuo cisteína no implicado en mantener la conformación apropiada del antagonista, también puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad de oxidación de la molécula y evitar la reticulación aberrante. Por el contrario, puede (n) agregarse enlace (s) cisteína al antagonista para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el antagonista es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv) . Un tipo particularmente preferido de variante de sustitución implica la sustitución de uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo de origen. Generalmente, la(s) variante (s) resultante (s) seleccionada (s) para el desarrollo adicional, tendrán propiedades biológicas mejoradas en relación al anticuerpo de origen del cual se generan. Una manera conveniente para generar tales variantes de sustitución es la maduración de afinidad utilizando visualización fago. Brevemente, son mutados diversos sitios de región hipervariable (e.g., sitios 6-7) para generar todas las sustituciones amino posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas se despliegan de una manera monovalente a partir de partículas fago como fusiones al producto del gen III de M13 empacado dentro de cada partícula. Las variantes de visualización fago se exploran entonces por su actividad biológica (e.g., afinidad de enlace) como se describe en la presente. A fin de identificar los sitios de región hipervariable candidatos para modificación, puede llevarse a cabo mutagénesis de exploración de alanina para identificar los residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente al enlace del antígeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede ser benéfico analizar una estructura cristalina del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Tales residuos de contacto son candidatos para sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente. Una vez generadas tales variantes, el panel de variantes se somete a selección como se describió en la presente y pueden seleccionarse anticuerpos con propiedades superiores en uno o más análisis relevantes para desarrollo posterior. Otro tipo de variante de aminoácido del antagonista altera el patrón de glicosilación original del antagonista. Tal alteración incluye suprimir uno o más residuos de carbohidrato encontrados en el antagonista, y/o agregar uno o más sitios de glicosilación que no se presentan en el antagonista . La glicosilación de polipéptidos es típicamente de enlace N o de enlace O. Enlace N se refiere a la unión del residuo carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del residuo carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De este modo, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. Glicosilación de enlace O se refiere a la unión de uno de los azúcares M-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede utilizarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina . La adición de sitios de glicosilación al antagonista se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácido de tal modo que contenga uno o más de las secuencias tripéptido antes descritas (para sitios de glicosilación de enlace N) . la alteración también puede efectuarse mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más sitios serina o treonina a la secuencia del antagonista original (para sitios de glicosilación de enlace O) .

Cuando el anticuerpo comprende una región Fe, el carbohidrato unido a la misma puede alterarse. Por ejemplo, los anticuerpos con una estructura de carbohidrato madura que carece de fucosa unida a una región Fe del anticuerpo, se describen en la solicitud de Pat . de E.U. No. US 2003/0157108 Al, Pesta, L. Los anticuerpos con una N-acetilglucosamina de bisección (GlcNAc) en el carbohidrato unida a una región Fe del anticuerpo se refieren en la WO 03/011878, Jean-Mairet et al., y la Patente de E.U. No. 6,602,684, Umana et al. los anticuerpos con al menos un residuo galactosa en el oligosacárido unido a una región Fe del anticuerpo se reportan en la WO 97/30087, Patel et al. Ver también la WO 98/58964 (Raju, S.) y la WO 99/22764 (Raju, S.) referente a anticuerpos con carbohidrato alterado unido a su región Fe. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para variantes de secuencia de aminoácidos del antagonista se preparan mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica. estos métodos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos de origen natural) , o preparación mediante mutagenesis mediada por oligonucleótido (o dirigida al sitio) , mutagénesis PCR, y mutagénesis de cásete de una variante recientemente preparada o de una versión no variante del antagonista. Puede ser deseable modificar el antagonista de la invención con respecto a la función de efector, e.g., a fin de mejorar la citotoxicidad dependiente del antígeno mediada por la célula (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del antagonista. Esto puede lograrse introduciendo una o más sustituciones de aminoácido en una región Fe de un antagonista de anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente , el (los) residuo (s) de cisteína puede (n) introducirse en la región Fe, con lo cual permite (n) la formación de enlace disulfuro de intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una capacidad de internalizacion mejorada y/o destrucción celular mejorada mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . Ver, Carón et al., J. Exp. Med., 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B . , J. Immunol . , 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumor aumentada también pueden prepararse utilizando reticuladores heterobifuncionales como se describe en Wolff et al., Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, puede fabricarse un anticuerpo que tiene regiones Fe dobles y puede en consecuencia tener lisis de complemento mejorada y capacidades de ADCC. Ver, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). WO 00/42072 (Presta, L.) describe anticuerpos con función ADCC mejorada en presencia de células efectoras humanas, en donde los anticuerpos comprenden sustituciones de aminoácido en su región Fe . Los anticuerpos con enlace Clq alterado y/o citotoxicidad dependiente del complemento O(CDC), se describen en la O 99/51642, Patente de E.U. NO. 6,194,551B1, Patente de E.U. NO. 6,242,195B1, Patente de E.U. No. 6,528,624B1 y la Patente de E.U. No. 6,538,124 (Idusogie et al . ) . los anticuerpos comprenden una sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones de aminoácido 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 y/o 334 de su región Fe. Para incrementar la vida media en suero del antagonista, puede incorporarse un epítope de enlace de receptor salvaje en el antagonista (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en la Patente de E.U. 5,739,277, por ejemplo. Como se utiliza en la presente, el término "epítope de enlace de receptor salvaje" se refiere a un epitope de la región Fe de una molécula IgG (e.g., IgGi, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de incrementar la vida media en suero de la molécula IgG. Los anticuerpos con sustituciones en su región Fe y vida media en suero aumentada también se describen en la WO 00/42072 (Presta, L . ) . También se contemplan anticuerpos diseñados con tres o más (preferentemente cuatro) sitios de enlace de antígeno funcionales (Solicitud de E.U. No. US 2002/0004587 Al, Miller et al . ) .

IV. Formulaciones Farmacéuticas Las formulaciones farmacéuticas de los antagonistas utilizadas de acuerdo con la presente invención se preparan mezclando un antagonista que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables (Remington' s Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A., Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos a los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes , incluyendo ácido ascórbico y metionina ,- preservativos (tales como cloruro de octadecilmetilbencil amonio,- cloruro de exametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menor que aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sucrosa, manitol, trehalosa o sorbítol contrapones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (e.g., complejos de proteína Zn) ; y/o surfactantes no iónicos, tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilen glicol (PEG) . Se describen las formulaciones ejemplares de anticuerpo anti-CD20 en la WO 98/56418, expresamente incorporada en la presente por la referencia. Esta publicación describe una formulación líquida de dosis múltiple que comprende 40 mg/ml de rituximab, 25 mM de acetato, 150 mM de trehalosa, alcohol bencílico al 0.9%, polisorbato 20 al 0.02% a un pH de 5.0 que tiene una vida en almacenamiento mínima de dos años almacenado a 2-8 °C. Otra formulación anti-CD20 de interés comprende 10 mg/ml de rituximab en 9.0 mg/ml de cloruro de sodio, 7.35 mg/ml de dihidrato de citrato de sodio, 0.7 mg/ml de polisorbato 80, y agua estéril para inyección, pH 6.5. Las formulaciones liofilizadas adaptadas para administración subcutánea se describen en la Pat . de E.U. No. 6,267,958 (Andya et al.). Tales formulaciones liofilizadas pueden reconstituirse con un diluyente adecuado a una alta concentración de proteína y la formulación reconstituida puede administrarse de manera subcutánea al mamífero que va a tratarse en la presente. La formulación en la presente también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario, para la indicación particular que se trata, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar además un agente citotóxico, agente quimioterapéutico, agente de citosina o inmunosupresor (e.g., uno que actúe en las células T, tal como ciclosporina o un anticuerpo que se enlaza a células T, e.g., uno que se enlace a LFA-1) . La cantidad efectiva de otros agentes tales depende de la cantidad de antagonista presente en la formulación, del tipo de enfermedad o trastorno o tratamiento, y otros factores antes tratados. Estos se utilizan generalmente en las mismas dosis y con las vías de administración utilizadas anteriormente en la presente desde aproximadamente 1 a 99% de las dosis empleadas en adelante. Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, mecrocapsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacilato) , respectivamente, en sistemas de suministro de droga coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-particulas y nanoc psulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en emington' s Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980) .

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen, matrices semi-permeables de polímeros sólidos hidrófobos que contienen el antagonista, cuyas matrices se encuentran en forma de artículos configurados, e.g., películas o microcápsulas . Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (vinilalcohol) ) , poliláctidos (Pat. de E.U. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y y etil-L-glutamato, acetato de etileno vinílo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) , y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico . Las formulaciones que van a utilizarse para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas estériles de filtración. V. Tratamiento con el Antagonista La presente invención se refiere a la terapia de trastornos oculares utilizando antagonistas que se enlazan a CD20. El antagonista preferido es un anticuerpo que se enlaza a CD20, e.g., Rituximab o 2H7 humanizado. El anticuerpo puede ser un anticuerpo intacto o un fragmento de anticuerpo . Ejemplos de trastornos que van a tratarse en la presente, incluyen, pero no se limitan a uveitis (incluyendo iritis) , enfermedad ocular, tiroidea u oftalmología de Grave, enfermedad ocular de Behcet, miastenia gravis ocular, pemfigoide ocular, retinopatía autoinmune, oncocerciasis, episcleritis , escleritis, neuritis óptica reincidente dependiente de esteroide, implicación ocular de granulomatosis de Wegener, complicación ocular de Sjogren, retinopatía asociada a melanoma, y/o retinopatía asociada al cáncer. Generalmente, el mamífero tratado en la presente no sufrirá de un mal de célula B. El mamífero tratado en la presente desplegará comúnmente uno o más síntomas de enfermedad ocular, tal como visión borrosa, dolor, enrojecimiento, etc. En una modalidad de la invención, el mamífero produce autoanticuerpos que se enlazan a uno o más auto antígenos, incluyendo antígeno(s) presente (s) en el ojo. El mamífero puede someterse a análisis prognósticos para detectar tales anticuerpos, en donde el mamífero o paciente con un resultado positivo en tal análisis es un candidato para terapia como se describe en la presente. En algunos casos tales como miastenia gravis, los autoanticuerpos contra antígenos que se presentan en o alrededor del ojo y en cualquier otra parte (e.g., autoanticuerpos contra tejido del músculo esquelético, incluyendo músculos extra oculares) , pueden presentarse en el ojo, que pueden detectarse utilizando un análisis pronóstico. Alternativamente o adicionalmente , el paciente puede tener complejos inmunes depositados en el ojo como parte de un proceso de enfermedad sistémica, tal como escleritis que surge de vasculitis por artritis reumatoide. La presente invención contempla además la detección de la presencia de tales complejos inmunes, y el tratamiento del paciente que se encuentra que los tiene. La composición que comprende un antagonista que se enlaza al antlgeno CD20 se formulará, se dosificará y se administrará de una manera consistente con una buena práctica médica. Los factores a considerar en este contexto incluyen la enfermedad o trastorno particular que se trata, el mamífero particular que se trata, la condición clínica del paciente individual, la causa de la enfermedad o trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, el patrón de administración, y otros factor conocidos por los practicantes médicos. La cantidad efectiva del antagonista que va a administrarse se gobernará mediante tales consideraciones. Como propuesta general, la cantidad efectiva del antagonista administrado parenteralmente por dosis se encontrará en el rango de aproximadamente 20 mg/m2 hasta aproximadamente 10,000 mg/m2, del cuerpo del paciente, mediante una o más dosis. Los regímenes de dosis IV ejemplares para anticuerpos intactos incluyen 375 mg/m2 semanalmente x 4; 1000 mg x 2 (e.g., en los días 1 y 15); o 1 gramo x 3. Para anticuerpos o fragmentos de anticuerpo administrados tópicamente, e.g., como gotas oculares o ungüentos, o para inyección intraorbital o pero ocular, las dosis ejemplares se encuentran en el rango de aproximadamente 0.001 hasta aproximadamente 100 mg, e.g., en el rango de desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 10 mg, por ejemplo, aplicadas una vez al día, dos veces al día o más frecuentemente. Para inyección intracameral o intravitreal , se contemplan dosis en el rango de desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 10 mg, preferentemente en el rango de aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 1 mg. Como se anotó anteriormente, estas cantidades sugeridas de antagonista se sujetan en gran medida a discreción terapéutica. El factor clave para seleccionar una dosis y programa apropiados es el resultado obtenido, como se indicó anteriormente. Por ejemplo, pueden necesitarse dosis relativamente más altas inicialmente para el tratamiento de enfermedades iniciales y agudas . Para obtener los más eficaces resultados, dependiendo de la enfermedad o trastorno, el antagonista se administra tan cercano al primer signo, diagnóstico, apariencia, u ocurrencia de la enfermedad o trastorno como sea posible, o durante las remisiones de la - - enfermedad o trastorno . El antagonista se administra mediante cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, intravitreal , intracameral , intraorbital , perio-ocular, tópica (e.g., a través de gotas oculares o ungüento oftálmico=, subcutánea, intraperitoneal , intrapulmonar, intranasasl y/o intralesional . Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal o subcutánea. También se contempla la administración intratecal . Adicionalmente, el antagonista puede administrarse adecuadamente mediante infusión de impulso, e.g., con dosis declinantes del antagonista. Preferentemente, la dosificación se da mediante inyecciones, más preferentemente inyecciones intravenosas, o se administra en o alrededor del ojo. Se puede administrar otros compuestos, tales como agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos , agentes inmunosupresivos y/o citosinas con los antagonistas en la presente. Por ejemplo, el antagonista CD20 puede combinarse con glucocorticoides/prednisona/metilprednisona (Glucocorticoides) , inmunoglobulina intravenosa (gama globulina) , telecobaltoterapia, plasmaferesis, levotiroxina, ciclosporin A, análogos de somatastatina, antagonistas de citosina, anti-metabolitos, agentes inmunosupresores , agentes citotóxicos (e.g., clorambucil, ciclofosfamida, azatioprina) , radioterapia orbital, decompresión orbital, cirugía de rehabilitación, radioyodo, tiroidectomía, etc. la administración combinada incluye la coadministración utilizando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden, en donde preferentemente, existe un periodo de tiempo mientras que ambos (o todos) agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Además de la administración de antagonistas de proteina al paciente, la presente solicitud contempla la administración de antagonistas mediante terapia de gen. Tal administración de ácido nucleico que codifica el antagonista se abarca por la expresión "administrar una cantidad efectiva de un antagonista". Ver, por ejemplo, WO 96/07321 publicada en Marzo 14, de 1996, referente al uso de terapia de gen para generar anticuerpos intracelulares . Existen dos procedimientos principales para obtener el ácido nucleico (contenido opcionalmente en un vector) en las células del paciente; in vivo y ex vivo. Para suministro in vivo, el ácido nucleico se inyecta directamente en el paciente, comúnmente en el sitio en donde se requiere el antagonista. Para tratamiento ex vivo, las células del paciente se retiran, se introduce el ácido nucleico en estas células aisladas y las células modificadas se administran al paciente ya sea directamente o, por ejemplo, se encapsulam dentro de las membranas porosas que se implantan en el paciente (ver, e.g., Patentes de E.U. Nos. 4,892,538 y 5,283,187). Existe una variedad de técnicas disponibles para incluir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere en células cultivadas in vitro, o in vivo en las células del huésped pretendido. Las técnicas adecuadas para la transferencia del ácido nucleico en células de mamífero in vitro, incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAD-dextrano, el método de precipitación ded fosfato de calcio, etc. Un vector comúnmente utilizado para el suministro ex vivo del gen es un retrovirus . Las técnicas actualmente preferidas de transferencia de ácido nucleico in vivo, incluyen transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus de Herpes simple 1, o virus adeno-asociados) y sistemas a base de lipidos (los lipidos útiles para transferencia mediada por lipidos del gen son, DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo) . En algunas situaciones, es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que dirige las células objetivo, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular de la célula objetivo, un ligante para un receptor en la célula objetivo, etc. Cuando se emplean liposomas, las proteínas que se enlazan a una proteína de membrana de superficie celular asociada con endocitosis pueden utilizarse para dirigir y/o facilitar la absorción e.g., de proteínas cápsido o sus fragmentos trópicas para un tipo celular particular, de anticuerpos para proteínas que experimentan internalización al ciclaje, y proteínas que dirigen la localización intracelular y aumentan la vida media intracelular . La técnica de endocitosis mediada por el receptor se describe, por ejemplo, por u et al., J. Biol . Chem. , 262:4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc . Nati. Acad. Sci . EUA, 87:3410-3414 (1990) . Para revisión de la marcación del gen actualmente conocida y los protocolos de terapia del gen, ver Anderson et al., Science 256:808-813 (1S92) . Ver también O 93/25673 y las referencias citadas en la misma. Se ilustran detalles adicionales de la invención mediante el siguiente Ejemplo no limitante. Las descripciones de todas las citas en la especificación se incorporan expresamente en la presente por la referencia. Ejemplo 1 Un paciente diagnosticado con uno o más síntomas de un trastorno ocular se trata de acuerdo con este ejemplo. Ejemplos de trastornos oculares que van a tratarse en la presente incluyen uveitis (incluyendo iritis) , enfermedad ocular tiroidea u oftalmología de Grave, enfermedad ocular de Behcet, miastenia gravis ocular, pemfigoide ocular, - - retinopatía autoinmune, oncocerciasis , episcleritis, escleritis, neuritis óptica reincidente dependiente de esteroide, implicación ocular de granulomatosis de Wegener, complicación ocular de Sjogren, retinopatía asociada a melanoma, y/o retinopatía asociada al cáncer. El paciente se trata con Rituximab intacto o 2H7 humanizado, o un fragmento (tal como un Fab, F(ab')2, Fv, scFv o diabody) de Rituximab o 2H7 humanizado. Preferentemente, el anticuerpo intacto se administra de manera intravenosa (IV) a una dosis seleccionada desde 375 mg/m2 semanalmente x 4, 1000 mg x 2 (e.g., en los días 1 y 15), o 1 gramo x 3 a fin de agotar (al menos en algún grado) la circulación de células B CD20 positivas y así mejorar los síntomas del trastorno ocular. Cuando la enfermedad se encuentra en la superficie del ojo, e.g., como en escleritis o síndrome de Sjogren, el anticuerpo se administra sistémicamente (por ejemplo, de manera intravenosa como se detalló anteriormente) o el anticuerpo se formula para administración tópica, mediante gotas para ojos o ungüento. Las dosis adecuadas se encuentran en el rango de aproximadamente 0.1 a 10 mg, aplicadas una vez, dos veces o tres veces al día. Cuando se desea la penetración infraocular, e.g., como para uveitis, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se administra mediante inyección intraavitreal oo intracameral .

De acuerdo con este modo de administración, el anticuerpo se encuentra pref rentemente en forma de un fragmento de anticuerpo, para mejorar la absorción en el ojo. Las dosis del fragmento de anticuerpo para inyección intravitreal o intracameral se encuentran en el rango de aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 1.0 mg. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo se administra periódicamente, e.g., una vez al mes, mediante inyección intravitreal o intracameral. La terapia con el anticuerpo CD20 se combina opcionalmente con una o más terapias diferentes que tratan el trastorno ocular, tales como glucocorticoides/prednisona/metilprednisona (glucocorticoides) , inmunoglobulina intravenosa (gama globulina) , análogos de somatastatina, antagonistas de citosina, plasmaferesis, levotiroxina, ciclosporina A, anti-metabolitos, agentes inmunosupresores , agentes citotóxicos (e.g., clorambucil, ciclofosfamida, azatioprina) , telecobaltoterapia, radioterapia orbital, decompresión orbital, cirugía de rehabilitación, radioyodo, y/o tiroidectomía . El paciente tratado con el anticuerpo CD20 desplegará una mejora en los síntomas de la enfermedad ocular, tales como agudeza visual mejorada, incomodidad o lagrimeo reducido, mejoramiento o prevención de la pérdida de visión, etc.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para tratar un trastorno ocular en un mamxfero que comprende administrar un antagonista CD20 al mamxfero en una cantidad efectiva para tratar el trastorno ocular.
2. 2. El método de la reivindicación 1 en donde el antagonista comprende un anticuerpo.
3. 3. El método de la reivindicación 1 en donde el mamífero es humano.
4. 4. El método de la reivindicación 2 en donde el anticuerpo no se conjuga con un agente citotóxico.
5. 5. El método de la reivindicación 2 en donde el anticuerpo comprende rituximab.
6. 6. El método de la reivindicación 2 en donde el anticuerpo comprende 2H7 humanizado.
7. 7. El método de la reivindicación 2 en donde el anticuerpo se conjuga con un agente citotóxico.
8. 8. El método de la reivindicación 1 que consiste esencialmente en administrar el antagonista al mamxfero.
9. 9. El método de la reivindicación 1 en donde el mamxfero produce autoanticuerpos que se enlazan a uno o más antxgenos oculares o tiene complejos inmunes en el ojo.
10. 10. El método de la reivindicación 1 en donde el trastorno ocular se selecciona del grupo que consiste de uveitis, iritis, enfermedad ocular tiroidea u oftalmología de Grave, enfermedad ocular de Behcet , miastenia gravis ocular, pemfigoide ocular, retinopatía autoinmune, oncocerciasis , episcleritis, escleritis, neuritis óptica reincidente dependiente de esteroide, implicación ocular de granuíornatosis de Wegener, complicación ocular de Sjogren, retinopatía asociada a melanoma, y/o retinopatía asociada al cáncer .
11. 11. El método de la reivindicación 1 en donde el anticuerpo es un anticuerpo intacto.
12. 12. El método de la reivindicación 1 en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que comprende una región de enlace de antígeno que se enlaza a CD20.
13. 13. El método de la reivindicación 12 en donde el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un Fab, Fab' , F(ab')2, Fv, fragmento Fv monocatenario (scFv) , y diabody.
14. 14. El método de la reivindicación 1 en donde el anticuerpo se administra de manera intravenosa.
15. 15. El método de la reivindicación 1 en donde el anticuerpo se administra mediante inyección intraorbital, intracameral , perio-ocular o intravitreal .
16. 16. El método de la reivindicación 15 en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que comprende una región de enlace de antígeno que se enlaza a CD20.
17. 17. El método de la reivindicación 1 en donde el anticuerpo se administra tópicamente al ojo.