CN1446104A - 利用b细胞排除抗体和免疫调制抗体联合治疗b细胞恶性肿瘤的相关应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了使用免疫调节抗体，特别是抗－B7、抗－CD23或抗－CD40L抗体和B细胞排除抗体，特别是抗－CD19、抗－CD20、抗－CD22或抗－CD37抗体，用于治疗B细胞恶性肿瘤的联合抗体治疗方法。优选地这种联合治疗方法包括抗－B7和抗－CD20抗体的施用。

Description

利用B细胞排除抗体和免疫调制抗体联合治疗 B细胞恶性肿瘤的相关应用

相关申请的相互参考

本申请要求了2000年7月12日申请的美国顺序No.60/217,706和2001年1月31日申请的美国顺序No.09/772,938的显著权，并且全文引用以作参考。

发明领域

本发明涉及用于治疗B细胞恶性肿瘤，特别是B细胞淋巴瘤和白血病的协同组合抗体治疗。这种协同抗体组合包括至少一种具有基本B细胞排除活性的抗体(例如，抗-CD19、CD20、CD22或CD37抗体)和例如通过调制B细胞/T细胞的相互作用和/或B细胞活性、分化或增殖而调制或调节免疫系统的抗体(例如，抗-B7、抗-CD40、抗-CD23或抗-CD40L)。特别地，本发明包括用于CO40+恶性肿瘤的的组合抗体治疗，包括使用抗CD40L抗体阻止CD40L结合CD40。这些能够抑制CD40/CD40L相互作用的抗体或其它物质进一步能够与化学治疗的、放射治疗和/或其它抗体，优选B细胞排除抗体(例如抗-CD19、抗-CD20、抗-CD22和/或抗-CD40抗体)或者其片段组合。

发明背景

脊椎动物(例如，灵长类，包括人、猿、猴子等)的免疫系统由多种器官和细胞类型组成，其进化为：准确而特异性识别入侵脊椎动物宿主的外来微生物(″抗原″)；与这样的外来微生物特异性结合；和，排除/破坏这样的外来微生物。淋巴细胞，以及其它细胞类型，对于免疫系统和对于外来微生物的排除和破坏是非常重要的。胸腺、脾脏和骨髓(成年人)中产生淋巴细胞，并且大约占人(成年人)循环系统中存在的全部白细胞的30％。淋巴细胞主要有两个亚群：T细胞和B细胞。T细胞负责细胞介导的免疫，而B细胞负责抗体产生(体液免疫)。但是，T细胞和B细胞可以被认为是相互依赖的——在典型的免疫应答中，当T细胞受体结合抗原片段时T细胞被激活，所述抗原结合抗原呈递细胞表面上主要组织相容性复合体(″MHC″)糖蛋白；这样的激活作用引起生物介质的释放(″白细胞介素″或″细胞因子″)实质上，生物介质刺激B细胞分化并产生针对该抗原的抗体(″免疫球蛋白″)。

宿主中的各个B细胞在其表面上表达不同的抗体—这样一个B细胞表达对一种抗原有特异性的抗体，而另一个B细胞表达对不同的抗原有特异性的抗体。因此，B细胞是十分多样的，而这种多样性对于免疫系统是非常重要的。对于人来说，各个B细胞能够产生数目巨大的抗体分子(即大约10⁷至10⁸)。通常当外来抗原被中和时这样的抗体产生中止(或基本降低)。但是，偶然地，特定B细胞的增殖将不减弱地持续；这样的增殖可导致癌症，称为″B细胞淋巴瘤″。

非何杰金氏淋巴瘤是淋巴瘤地一种类型，其特征在于B淋巴细胞的恶性增长。根据美国癌症协会估计大约诊断的54,000例新病历中65％归类为中等-或高-级淋巴瘤。诊断为中级淋巴瘤的患者平均成活率是2-5年，诊断为高级淋巴瘤的患者平均成活率是诊断之后6个月至2年。

常规治疗包括化学疗法和放射疗法，如果可获得合适的供体，以及如果骨髓含有太多的收获的肿瘤细胞，则可能伴有自体或同种异体骨髓移植或干细胞移植。尽管患者经常对常规的治疗有反应，但其通常在几个月内复发。

已知使用具有B细胞排除活性的B细胞抗原特异性抗体可能成功治疗B细胞恶性肿瘤，例如B细胞淋巴瘤和白血病。已报道对B细胞恶性肿瘤的治疗有实际或潜在应用的B细胞抗体的例子包括对CD20、CD19、CD22、CD37和CD40特异性的抗体。

还有，全面报道过使用具有B细胞排除活性的抗-CD37抗体具有治疗B细胞淋巴瘤的效力。参见，例如，Presr等，J：Clin.Oncol.7(8)：1027-1038(1989年8月)；Grossbard等，Blood 8(4)：863-876(1992年8月15日)。

A.抗-CD20抗体

CD20是在90％以上的B细胞淋巴瘤上表达的细胞表面抗原，其在赘生性细胞中不释放或调制(McLaughlin等，J.Clin.Oncol.16：2825-2833(1998b))。CD20抗原是在胞内信号发生、B-细胞分化和钙通道动员中涉及的没有糖基化的、35kDa B-细胞膜蛋白(Clark等，Adv.Cancer Res.52：81-149(1989)；Tedder等，Immunology Today 15：450-454(1994))。该抗原似乎为人B-细胞系的早期标记物，并且以不同的抗原密度在正常和恶性B-细胞群上普遍表达。然而，完全成熟B-细胞(例如，血浆细胞)、早期B-细胞群和干细胞上不存在该抗原，使得其成为抗体介导的治疗的合适的靶物。

已为研究和治疗应用制备了抗-CD20抗体。一种抗-CD20抗体是单克隆B1抗体(美国专利No.5,843,398)。也已制备了用于治疗B-细胞淋巴瘤的放射性核素形式的抗-CD20抗体(例如，¹³¹I-标记的抗-CD20抗体)，以及用于减轻前列腺癌和乳腺癌转移引起的骨骼疼痛的⁸⁹Sr-标记的形式(Endo，Gan To Kagaku Ryoho 26：744-748(1999))。

据报道，通过连续静脉内输液对B-细胞淋巴瘤患者施用了鼠单克隆抗体，1F5，(抗-CD20抗体)。但是据报道，排除循环肿瘤细胞需要非常高水平(＞2克)的1F5，结果被描述为″短暂的″(Press等，Blood 69：584-591(1987))。在治疗中使用单克隆抗体的潜在的问题是非人单克隆抗体(例如，鼠单克隆抗体)一般没有人效应子功能，例如，其中包括它们不能介导补体依赖性溶胞作用或者通过抗体依赖性细胞毒性或Fc-受体介导的吞噬作用来溶解人靶细胞。此外，非人单克隆抗体可被人宿主识别作为外来蛋白质；因此，反复注射这样的外源抗体能导致诱导导致有害过敏性反应的免疫应答。对于以鼠为基础的单克隆抗体，这通常被称为人抗-鼠抗体反应，或者″HAMA″反应。另外，这些″外源″抗体能够受到宿主免疫系统的攻击，这样，实际上在它们到达它们的靶位点之前就被中和了。

RITUXAN.RITUXAN(也称为Rituximab、MabThera^、IDEC-C2B8和C2B8)是第一个FDA-批准的单克隆抗体，并且在IDECPharmaceuticals开发(参见美国专利No.5,843,439；5,776,456和5,736,137)用于治疗人B-细胞淋巴瘤(Reff等，Blood 83：435-445(1994))。RITUXAN是嵌合的抗-CD20单克隆抗体(MAb)，其是生长抑制的、并且据报道在体外通过化学治疗药物致敏某些淋马瘤细胞系的程序性细胞死亡(Demidem等，Cancer Biotherapy &Radiopharmaceuticals 12：177-(1997))。当使用鼠异种移植动物模型体内试验时也证实了RITUXAN抗肿瘤活性。RITUXAN有效结合人补体，具有强FcR结合，并且能够通过补体依赖性(CDC)和抗体依赖性(ADCC)机制体外有效杀死人淋巴细胞(Reff等，Blood 83：435-445(1994))。对于恒河猴(maeaques)，该抗体从血液和淋巴结中选择性排除正常B-细胞。

已经推荐RITUXAN用于治疗患有低级或滤泡B-细胞非何杰金氏(non-Hodgkins)淋巴瘤的患者(McLaughlin等，Oncology(Huntingt)12：1763-1777(1998a)；Maloney等，Oncology 12：63-76(1998)；Leget等，Curr.Opin.Oncol.10：548-551(1998))。在欧洲，RITUXAN已被批准治疗复发阶段的III/IV滤泡淋巴瘤(White等，Pharm.Sci.Technol. Today 2：95-101(1999))，并且据报道，其有效抗滤泡中心细胞淋巴瘤(FCC)(Nguyen等，Eur.J.Haematol 62：76-82(1999))。用RITUXAN治疗的其它疾病包括滤泡中心细胞淋巴瘤(FCC)外套(Mantle)细胞淋巴瘤(MCL)、扩散大细胞淋巴瘤(DLCL)和小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞性白血病(SLL/CLL)(Nguyen等，1999))。据报道，患有顽固的或不可治愈的NHL的患者对RITUXAN和CHOP(例如，环磷酰胺、长春花新碱、强的松和阿霉素)联合治疗有反应(Ohnishi等，Gan To Kagaku Ryoho 25：2223-8(1998))。RITUXAN在I期和II期临床研究中对低级非何杰金氏淋巴瘤(NHL)表现出小的毒性和显著的治疗活性(Berinstein等，Ann.Oncol.9：995-1001(1998))。

单独使用RITUXAN治疗B-细胞NHL，通常周剂量是375mg/M²，给药四星期，治疗复发或顽固的低级或滤泡NHL，其耐受性很好，并且具有显著的临床活性(Piro等，Ann.Oncol.10：655-61(1999)；Nguyen等，(1999)；和Coiffer等，Blood 92：1927-1932(1998))。但是，在使用抗体的试验期间还施用了多达500mg/M²的四星期剂量(Maloney等，Blood 90：2188-2195，(1997))。RITUXAN还与化学治疗例如CHOP(例如，环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)联合治疗患有低级或滤泡B-细胞非何杰金氏淋巴瘤患者(Czuczman等，JClin.Oncol.17：268-76(1999)；和McLaughlin等，(1998a))。

还有，在属于IDEC Pharmaceuticals Corporation的专利中提到抗-B7抗体治疗B-细胞淋巴瘤的应用。但是，该专利的焦点是其治疗其免疫抑制是治疗有益的疾病的用途。例子包括变态反应性的、自身免疫和移植适应症。还提到了讨论的抗-B7抗体治疗B-细胞淋巴瘤的应用。(美国专利No.6,113,198)。

B.CD40和CD40L

CD40在成熟B-细胞，以及在白血病和淋巴细胞B-细胞，和在何杰金氏病(Hodgkins Disease)(HD)的何杰金氏和Reed-Sternberg(RS)细胞表面上表达(Valle等，Eur.J Immunol.19：1463-1467(1989)；和Gruss等，Leuk.Lymphoma 24：393-422(1997))。CD40是导致正常和恶性B-细胞例如非何杰金氏滤泡细胞淋巴瘤的激活和存活的B-细胞受体(Johnson等，Blood 82：1848-1857(1993)；和Metkar等，CancerImmunol.Immunother.47：104(1998))。通过CD40受体的信号发生保护未成熟B-细胞和B-细胞淋巴瘤不经受IgM-或Fas-诱导的程序性细胞死亡(Wang等，J.Immunology 155：3722-3725(1995))。类似地，外套细胞淋巴瘤细胞具有高水平的CD40，并且外源CD40L的加入提高了它们的成活率，并且使其避免氟达拉滨(fludarabin)-诱导的程序性细胞死亡(Clodi等，Brit.J Haematol.103：217-219(1998))。相反，其它人报道说CD40刺激作用可能体外(Funakoshi等，Blood 83：2787-2794(1994))和体内(Murphy等，Blood 86：1946-1953(1995))抑制肿瘤B-细胞生长。

对小鼠施用抗-CD40抗体(参见美国专利No.5,874,082和5,667,165)提高了具有人B-细胞淋巴瘤的小鼠的存活(Funakoshi等，(1994)；和Tutt等，J.Immunol. 161：3176-3185(1998))。美国专利No.5,674,492(1997)描述了使用模拟(mimicking)CD40L作用从而送递死亡信号的抗-CD40抗体治疗肿瘤包括B-细胞淋巴瘤和EBV-诱导的淋巴瘤的方法，该专利在此全文引作参考。CD40信号发生与和与CD20的协同作用有关(Ledbetter等，Circ.Shock 44：67-72(1994))。其它参考文献描述了抗-CD40抗体的制备和用途，包括美国专利No.5,874,085(1999)、5,874,082(1999)、5,801,227(1998)、5,674,492(1997)和5,667,165(1997)，这些文献在此全文引作参考。

CD40配体，gp39(也称为CD40配体，CD40L或CD154)，在激活的但是不静息的CD4⁺Th细胞上表达(Spriggs等，J Exp.Med.176：1543-1550(1992)；Lane等，Eur.J.Immunol.22：2573-2578(1992)；和Roy等，J.Immunol.151：1-14(1993))。已经克隆并表征了CD40和CD40L(Stamenkovi等，EMBO J.8：1403-1410(1989)；Armitage等，Nature 357：80-82(1992)；Lederman等，J.Exp.Med.175：1091-1101(1992)；和Hollenbaugh等，EMBO J.11：4313_4321(1992))。美国专利No.5,945,513也描述了人CD40L。CD40L基因转染并且在它们的表面上表达CD40L蛋白质的细胞能够触发B-细胞增殖，并且与其它刺激信号一起能够诱导抗体产生(Armitage等，(1992)；和美国专利No.5,945,513)。CD40L在何杰金氏病域中的肿瘤滤泡或Reed-Sternberg细胞(CD40⁺)中的肿瘤B-细胞(CD40⁺)的细胞接触依赖性相互作用中起着重要作用(Carbone等，Am.J.Pathol.147：912-922(1995))。据报道，抗-CD40L单克隆抗体已有效用于抑制在LP BM5-感染小鼠中鼠AIDS(MAIDS)的诱导(Green等，Virology 241：260-268(1998))。但是，导致恶性肿瘤B-细胞的成活对抗细胞死亡应答的CD40L-CD40信号发生机理是不清楚的。例如，曾有人认为在滤泡淋巴瘤细胞中诱导TRAIL分子(APO-2L)的程序性细胞死亡的下调(Ribeiro等，British J：Haematol.103：684-689(1998))和BCL-2的过表达，以及在B-CLL情况下，CD95(Fas/APO-1)的下调(Laytragoon-Lewin等，Eur.J.Haematol.61：266-271(1998))是存活的机制。相反，滤泡淋巴瘤中存在证据，即CD40激活作用导致TNF(Worm等，International Immunol.6：1883-1890(1994))CD95分子(Plumas等，Blood 91：2875-2885(1998))的上调。

还已制备出了抗-CD40抗体预防或治疗抗体介导的疾病，例如美国专利No.5,874,082(1999)中描述的过敏反应和自身免疫疾病。据报道，抗-CD40抗体已与抗-CD20抗体有效联合在抑制细胞培养物中非何杰金氏B-细胞淋巴瘤生长方面有加和效果(Benoit等，Immunopharmacology 35：129-139(1996))。据称对小鼠的体内研究证明在单独施用促进携带某些而不是全部的淋巴瘤系的小鼠的存活方面抗-CD20抗体比抗-CD40抗体更有效(Funakoshi等，J.Immunother.Emphasis Tumor ImmunoL 19：93-101(1996))。据报道抗-CD19抗体在体内治疗两种同系小鼠B-细胞淋巴瘤BCL1和A31中也是有效的(Tutt等(1998))。也曾描述过CD40L抗体治疗与B-细胞激活相关的疾病的用途(欧洲专利No.555,880(1993))。如美国专利No.5,7474,037(1998)所述，抗-CD40L抗体包括单克隆抗体3E4、2H5、2H8、4D9-8、4D9-9、24-31、24-43、89-76和89-79，美国专利No.5,876,718(1999)中描述的用于治疗移植物抗宿主疾病的抗-CD40L抗体。

C.抗-CD22抗体

也曾报道过CD22单克隆抗体的合成和它们在治疗中的用途。CD22是在B-细胞粘着中涉及的B-细胞特异性分子，其可以在同型或异型相互作用中发挥功能(Stamenkovic等，Nature 344：74(1990)；Wilson等，J.Exp.Med.173：137(1991)；Stamenkovic等，Cell 66：1133(1991))。CD22蛋白质在祖B和前-B-细胞的细胞质中表达(Dorken等，J.Immunol.136：4470(1986)；Dorken等，″Expression ofcytoplasmic CD22 in B-cell ontogeny。In Leukocyte Typing III，WhiteCell Differentiation Antigens.McMichael等，eds，Oxford UniversityPress，Oxford，p.474(1987)；Schwarting等，Blood 65：974(1985)；Mason等，Blood 69：836(1987))，但只是在成熟B-细胞的表面发现，和表面IgD同时存在(Dorken等，J.Immunol.136：4470(1986))。激活之后CD22表达增加，并且随着进一步分化而消失(Wilson等，J.Exp.Med.173：137(1991)；Dorken等，J.Immunol.136：4470(1986))。在淋巴组织中，滤泡外套膜带和边缘带B-细胞表达CD22，而生发中心B-细胞只是弱表达(Dorken等，J.Immunol.136：4470(1986)；Ling等，″B-cell and plasma antigens：new and previously defined clusters″，Leukocyte Typing III.White Cell Differentiation Antigens，McMichael等，eds.，Oxford University Press，Oxford，p.302(1987))。但是，原位杂交表明生发中心CD22 mRNA的表达最强而在外套膜带中表达较弱(Wilson等，J.Exp.Med.173：137(1991))。推测CD22参与B-细胞激活作用的调节，因为发现体外CD22 mAb与B-细胞的结合增加细胞内游离钙的增加和表面Ig的交联之后诱导的增殖的增加(Pezzutto等，J.Immunol.138：98(1987)；Pezzutto等，J Immunol 140：1791(1988))。但是其他研究得出这样的结论，即抗-Ig诱导的的增殖的增加是适度的(Dorken等，J.Immunol.136：4470(1986))。CD22被组成型磷酸化，但是在用PMA处理细胞之后磷酸化水平提高(Boue等，J.Immunol.140：192(1988))。此外，CD22的可溶形式抑制CD3介导的人T-细胞激活作用，提示CD22在T-细胞B-细胞相互作用中可能是重要的(Stamenkovic等，Cell 66：1133(1991))。

据报道，特异性结合CD22受体的配体在各种疾病尤其是B-细胞淋巴瘤和自身免疫疾病的治疗中有潜在应用。特别地，曾报道过标记的和没有标记的抗-CD22抗体治疗这样的疾病的用途。

例如，Tedder等，美国专利5,484,892，据称以高亲和力结合CD22并且阻断CD22与其他配体的相互作用。公开了这些单克隆抗体在治疗自身免疫疾病(例如肾小球肾炎、古德帕斯彻综合征(Goodpasture’s syndrome)、坏死性脉管炎、淋巴腺炎、结节性动脉外膜炎、全身性红斑狼疮、关节炎、血小板减少性紫癜、粒细胞缺乏症、自身免疫性溶血性贫血)及抑制针对外来抗原例如怀孕期间胎儿抗原的免疫反应、重症肌无力、胰岛素-抗性型糖尿病、格雷夫斯病(Gravew’disease)和过敏反应中非常有用。

还有，Leung等，美国专利5,789,557，公开了通过CD嫁接产生的嵌合的和人源化的抗-CD22单克隆抗体，以及其缀合和未缀合形式在治疗和诊断B-细胞淋巴瘤和白血病的用途。该参考文献具体公开了与细胞毒性物质例如化学治疗药物、毒素、重金属和放射性核素缀合的这样的抗体(参见美国专利5,789,554，1998年8月4日颁发给Leung等，并且转让给Immunomedics.)。

此外，PCT申请WO 98/42378、WO 00/20864和WO 98/41641描述了CD22特异的单克隆抗体、缀合物和片段及其治疗用途，特别是治疗B-细胞相关疾病的用途。

另外，有人提出过抗-CD22抗体用于治疗自身免疫疾病和癌症的用途。参见例如，美国专利5,443,953，1995年8月22日颁发给Hansen等，并转让给Immunomedics Inc.，其主要描述了抗-CD22免疫缀合物用于诊断和治疗，特别是用于治疗病毒和细菌感染疾病、心血管疾病、自身免疫疾病和癌症，美国专利5,484,892，1998年1月16日颁发给Tedder等，并转让给Dana-Farber Cancer institute，Inc.，其主要描述了定向针对CD22的多种单克隆抗体用于治疗其中CD22粘着功能的延迟或阻断在治疗上是有益的疾病，特别是自身免疫疾病。这些文献提示抗-CD22抗体或片段可以直接或间接缀合期望的效应子部分，例如，可以被检测的标记(例如酶、萤光团、放射性核素、体外免疫检测或体内成像中的电子转移试剂)，或者治疗效应子部分，例如毒素，药物或放射性同位素。

此外，可以从Leinco Technologies购得TgGl同型抗人CD22单克隆抗体，并且据报道其用于治疗B-细胞淋巴瘤和白血病，包括毛状细胞白血病。(Campana，D.等，J：Immunol.134：1524(1985))。还有，Dorken等，J Immunol.150：4719(1993)和Engel等，J.Immunol.150：4519(1993)，这两篇文献都描述了CD22特异性单克隆抗体。

D.抗-CD19抗体

另外，文献中还报道过抗-CD19抗体及其片段治疗淋巴瘤的用途。例如，美国专利5,686,072,1997年11月11日颁发给Uhr等，并转让给Texas大学，公开了抗-CD19和抗-CD22抗体和免疫毒素治疗白血病淋巴瘤的用途。该专利文献在此全文引入作为参考。

此外，有人报道过抗-CD19抗体对白血病的状态和预后分类的用途。

因此，在上述的基础上，很明显曾报道过多种抗体具有治疗B细胞恶性肿瘤的治疗潜力。尽管如此，本发明的一个目的是提供用于治疗B细胞淋巴瘤的新的抗体方法。

发明简述

为此，本发明的一个目的是提供用于治疗B细胞恶性肿瘤(包括所有等级的何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤)的新的改进的抗体疗法。

更具体地说，本发明的一个目的是提供用于治疗B细胞恶性肿瘤的新的抗体疗法，包括施用至少一种B细胞排除抗体和至少一种免疫调制或免疫调节抗体。

更具体地说，本发明的一个目的是提供用于治疗B细胞恶性肿瘤的新的抗体疗法，包括施用至少一种优选选自抗-CD20、抗-CD19、抗-CD22或抗-CD37抗体的B细胞排除抗体和至少一种优选选自抗-B7、抗-CD23、抗-CD40、抗-CD40L或抗-CD4抗体的免疫调制或免疫调节抗体。

本发明的另一个目的是提供通过施用CD20抗体(优选RITUXAN)和B7抗体或CD40L抗体(分别优选Anderson等的美国专利6,113,198中描述的灵长类化的抗-B7抗体，或者转让给IDECPharmaceuticals Corporation的美国专利6,001,358中描述的人源化抗-CD40L抗体)治疗B细胞恶性肿瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤或慢性淋巴细胞性白血病(CLL))的新的治疗方法。

本发明的另一个目的是提供用于治疗B细胞恶性肿瘤B细胞淋巴瘤和白血病的新的组合物和试剂盒，其包括至少一种免疫调制或免疫调节抗体和至少一种B细胞排除抗体。优选地，所述免疫调制或免疫调节抗体包括抗-CD40、抗-CD40L或抗-B7抗体，所述B细胞排除抗体对CD20、CD19、CD22或CD37是特异性的。更优选地，所述组合物含有抗-CD40L或抗-B7抗体和抗-CD20抗体。

本发明的另一个目的是提供用于治疗B-细胞性淋巴瘤或B-细胞性白血病的联合疗法，其包括抗-CD40L抗体或抗体片段或CD40L拮抗剂和至少下面的一项：(a)化学治疗剂或化学治疗剂组合，(b)放治射疗，(c)抗-CD20抗体或其片段，(d)抗-CD40抗体或其片段，(e)抗-CD19抗体或其片段；(f)抗-CD22抗体或其片段，(g)细胞因子及其组合物，其中抗体可以与毒素或放射性标记物缀合，或者可以改造具有人恒定区，以激发人抗体效应子机理，即导致靶细胞的程序性细胞死亡或死亡。

附图简述

图1.接触4小时之后B-淋巴瘤细胞对阿霉素的敏感性。

图2.(A栏)抗CD40L(IDEC-131)克服B-淋巴瘤细胞的CD40L介导的对ADM杀伤的抗性。(B栏)RITUXAN对正常和sCD40L预处理的DHL-4细胞的作用。

图3.(A栏)抗-CD40L抗体(IDEC-131)对CD40L介导的B-CLL细胞存活的阻断。(B栏)Rituxan对CD40L介导的B-CLL细胞存活的阻断。

图4.FACS分析，包括在与sCD40L培养的或不与sCD40L培养的CD19⁺CLL细胞中HLA-DR表达。

发明详述

本发明提供新的联合抗体治疗方法，包括施用至少一种免疫调制或免疫调节抗体(例如抗-B7或抗-CD40或抗-CD40L抗体)和至少一种B-细胞排除抗体(例如具有基本B-细胞排除活性的抗-CD20、抗-CD19、抗-CD22或抗-CD37抗体)。

相信这样的联合会提供不同机理的协同结果，抗体通过不同机理激发治疗效益。特别地，理论上，补充作用机理将得到更持久而有效的临床效果，因为相信B-细胞排除抗体将排除对免疫调制或免疫调节抗体例如抗-B7或抗-CD40L抗体的作用有抗性的活化的B细胞。这样的活化的B细胞可另外作为有效的对T细胞的抗原呈递细胞和抗体产生细胞。从B细胞恶性肿瘤来说，这样的活化的B细胞可包括(除非另有说明)能形成新生癌细胞和肿瘤的恶性细胞。

在讨论本发明之前，提供下面的定义：

这里使用的术语″抗体″意指包括对指定的蛋白质或者其肽特异性反应的免疫球蛋白及其片段。抗体可以包括人抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体、与其他蛋白质或放射性标记融合的抗体和抗体片段。

这里使用的术语″抗体″以最广义使用，具体包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段(只要它们表现出期望的生物学活性)。

″抗体片段″包括完整抗体的一部分，优选包括其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体。应用常规技术可以分离抗体片段。例如，通过用胃蛋白酶处理抗体能够产生F(ab′)₂片段。可以处理得到的F(ab′)₂片段以去除二硫桥产生Fab′片段。

″天然抗体″通常是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成的大约150,000道尔顿的杂四聚体糖蛋白。每一条轻链通过一个共价二硫键连接重链，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键的数目不同。每一条重链和轻链还具有有规律间隔的链内二硫桥。每条重链在一个末端有可变区(V_H)接着有多个恒定区。每条轻链在一个末端有可变区(V_L)，并且在其另一个末端有一个恒定区；该轻链的恒定区与重链的第一恒定区排成一行，并且轻链可变区与重链的可变区排成一行。相信特定氨基酸残基在轻链与重链可变区之间形成接触面。

术语″可变的″指这样的事实，即抗体中可变区的某些部分序列上广泛不同，并且用于各特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。但是，抗体的可变区中可变性分布不均匀。在轻链和重链可变区三个片段(称为高变区)中较集中。可变区较高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区每个包括四个FR，大都采取β-折叠构型，联有三个高变区，形成连接β-折叠结构的环，并且在某些情况下形成β-折叠结构的部分。各条链中将高变区通过FR紧密联系在一起，和其它链的高变区一起形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出多种效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中的抗体参与。

抗体的木瓜蛋白酶消化产生两种相同的抗原结合片段(称为″Fab″片段，每一个片段具有一个抗原结合位点)和残留的″Fc″片段(其名称反映出其容易结晶的能力)。胃蛋白酶处理得到F(ab′)₂片段，其具有两个抗原结合位点，并且仍然能够与抗原交联。

″Fv″是包含完全抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。这个区由一条重链和一条轻链可变区紧密地非共价连接的二聚体组成。该构型中各个可变区的三个高变区相互作用确定V_H-V_L二聚体表面上的抗原结合位点。总之，六个高变区赋予抗体抗原结合特异性。但是，单一可变区(或只包括三个对抗原特异性的高变区的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管比完全结合位点的亲合力低。

Fab片段也包含轻链恒定区和重链的第一恒定区(CHI)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于在包括来自抗体绞链区的一个或多个半胱氨酸的重链CHI区的羧基末端加入几个残基。Fab′-SH在这里是指其中恒定区的半胱氨酸残基带有至少一个自由巯基的的Fab′。F(ab′)Z抗体片段原指Fab′片段对，它们之间有绞合的半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。

以恒定区的氨基酸序列为基础，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的″轻链″分为两种截然不同类型的一种，称为κ和λ。

根据重链的恒定区的氨基酸序列，抗体可分为不同的种类。有五个主要类别的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgGI、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。相应于不同类抗体的重链恒定区，分别称为α，δ，ε，γ和ζ。优选地，重链恒定区使γ-1，γ-2，γ-3和γ-4恒定区完全。优选地，这些恒定区还包括提高抗体稳定性的修饰，例如在这里全文引作参考的美国专利No.6,011,138公开的P和E修饰。不同类型免疫球蛋白的亚单位结构和三维构象也是公知的。

″单链Fv″或″scFv″抗体片段包括抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于单多肽链中。优选地，Fv多肽进一步包括V_H和V_L结构域之间的多肽接头，其使得scFv形成用于抗原结合的期望的结构。有关scFv的综述，参见Pluckthun，The Pharmacology of MonoclonalAntibodies，vol 113，Rosenburg和Moore编著，Springer-Verlag，NewYork，pp.269-315(1994)。

术语″双抗″指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其片段相同的多肽链中包括与轻链可变区(VL)连接的重链可变区(VH)(VH-VL)。通过使用因为太短而不能使相同链上两个结构域之间配对的接头，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，并且产生两个抗原结合位点。例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)中详细描述了双抗。

这里使用的术语″单克隆抗体″指从基本上同源的抗体群中获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能天然产生的突变体之外，包括该总体的各抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，定向针对单一的抗原位点。此外，与一般包括针对不同的决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每一种单克隆抗体针对抗原上的单一抗原决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们是通过杂交瘤培养合成的，不污染有其它免疫球蛋白。修饰语″单克隆″指从基本上同源的抗体群获得的抗体特征，而不认为是要求通过特定方法产生抗体。例如，通过任何杂交瘤方法(由Kohler等，Nature，256：495(1975)第一次提出)或者通过重组DNA方法(参见，例如，美国专利No.4,816,567)可以制备本发明使用的单克隆抗体。″单克隆抗体″也可以应用例如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，JMol. Biol.，222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库分离。

所谓″人源化抗体″指从非人抗体、一般是鼠抗体衍生的抗体，其保留或基本上保留亲代抗体的抗原结合性质，但是在人体中几乎没有免疫原性。这可通过多种方法实现，包括(a)将整个非人可变区接枝到人恒定区得到嵌合抗体；(b)只将非人互补决定区(CDR)接枝到人构架区和恒定区，有或没有保留关键的构架残基；和(c)移植整个非人可变区，但是通过表面残基置换用人样片段将它们″掩蔽″。这样的方法公开于Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851-5(1984)；Morrison等，Adv.Immunol.44：65-92(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28：489-498(1991)；和Padlan，Molec.Immun.31：169-217(1994)，所有这些文献在此全文引作参考。根据1995年11月7日申请的美国专利申请No.08/554,840所述能够制备人源化抗-CD40L抗体，该文献在此全文引作参考。

所谓″人抗体″指通过任何公知标准方法制备的包含整个人轻链和重链以及恒定区的抗体。

所谓″灵长类化抗体″指经改造而包含猴(或其它灵长类)抗体(特别是猕猴抗体)的可变重链和轻链结构域及含有人恒定区序列(优选人免疫球蛋白γ1或γ4恒定区(或PE变体))的重组抗体。这样的抗体的制备描述于Newman等，Biotechnology，10：1458-1460(1992)；也参见共同转让的08/379,072、08/487,550或08/746,361，所有这些文献在此全文引作参考。据报道，这些抗体表现出与人抗体的高度同源性，即，85-98％，表现出人效应子功能，具有降低的免疫原性，并且可表现出对人抗原的高亲合力。

所谓″抗体片段″指抗体的片段例如Fab、F(ab′)₂、Fab′和scFv。

所谓″嵌合抗体″指包含从两种通常是不同种的不同抗体衍生的序列的抗体。最典型地，嵌合抗体包括人和鼠抗体片段，和一般地，人恒定区和鼠可变区。

″B细胞排除抗体″在这里是施用时导致可证实的B细胞排除的抗体或片段。典型地，这样的抗体结合B细胞表面上表达的B细胞抗原或B细胞标记。优选地，这样的抗体在施用之后，一般在大约几天或更短时间之内，将导致B细胞数排除大约50％或更多。在优选的实施方案中，B细胞排除抗体是RITUXAN(嵌合的抗CD20抗体)或者与RITUXAN基本上具有相同的或至少20-50％的RITUXAN细胞排除活性的抗体。

″B细胞表面标记″或″B细胞靶物″或″B细胞抗原″在这里是B细胞表面上表达的抗原，与其结合的拮抗剂能够定向该B细胞。例举的B细胞表面标记包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86白细胞表面标记。特别令人感兴趣的B细胞表面标记与哺乳动物其它非B细胞组织相比显著在B细胞上表达，并且可以在前体B细胞和成熟B细胞上表达。在一个实施方案中，所述标记是象CD20或CD19的一种，其可在从干细胞阶段至最终分化成浆细胞之前的整个细胞系分化中的B细胞上发现。优选的B细胞表面标记在这里是CD19和CD20。

″免疫调节抗体″指通过不同于B细胞排除的机理(例如通过CDL和/或ADCC活性)而激发对免疫系统的作用的抗体。这样的例子包括通过诱导耐受性(抗-CD40L，抗-CD40)而抑制T细胞免疫性、B细胞免疫性的抗体，或者其它免疫抑制抗体，例如抑制B7细胞信号传导的抗体(抗-B7.1，抗-B7.2，抗-CD4，抗-CD23等)。在某些情况下，免疫调节抗体可能具有加强程序性细胞死亡的能力。另外，至于利用不同的效应子机理，通过证实人恒定区可以将正常是B细胞排除抗体的抗体改造成为免疫调制的。

″B细胞表面标记″这里是B细胞表面上表达的抗原，与其结合的拮抗剂能够定向该B细胞。例举的B细胞表面标记包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80(B7.1)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86(B7.2)白细胞表面标记。特别令人感兴趣的B细胞表面标记与哺乳动物其它非B细胞组织相比显著在B细胞上表达，并且可能在前体B细胞和成熟B细胞上表达。在一个实施方案中，所述标记是象CD20或CD19的一种，其可在从干细胞阶段至最终分化成浆细胞之前的整个细胞系分化中的B细胞上发现。优选的B细胞表面标记在这里是CD19、CD20、CD23、CD80和CD86。

″CD20″抗原是在来自外周血或淋巴器官的90％以上的B细胞上发现的-35kDa、没有糖基化的磷蛋白。在早期前-B细胞发育期间表达CD20并且保持到血浆细胞分化。CD20存在于正常B细胞和恶性B细胞之上。文献中CD20的其它名称包括″B-淋巴细胞限制抗原″和″Bp35″。CD20抗原描述于Clark等，PNAS(USA)82：1766(1985)。

″CD19″抗原指例如HD237-CD19或B4抗体(Kiesel等，Leukemia Research II，12：1119(1987))鉴定的-90kDa抗原。类似于CD20，从干细胞阶段至最终分化成血浆细胞之前的整个细胞系分化中的细胞上发现CD19。CD19的拮抗剂的结合可以引起CD19抗原的内在化作用。

″CD22″抗原指在B细胞上表达的抗原，也已知为″BL-CAM″和″LybB″，其参与B细胞信号发生和粘着(参见Nitschke等，Curr.Biol.7：133(1997)；Stamenkovic等，Nature345：74(1990))。该抗原是膜免疫球蛋白-相关抗原，当连接膜Ig时，其被酪氨酸磷酸化(Engel等，JEtyp.Med.181(4)：1521-1586(1995))。已经克隆出了编码该抗原的基因，并且表征了其Ig结构域。

B7抗原包括B7.1(CD80)、B7.2(CD81)和B7.3抗原，其是B细胞上表达的跨膜抗原。本领域公知特异性结合B7抗原(包括人B7.1和B7.2抗原)的抗体。优选的B7抗体包括Anderson等在转让给IDECPharmaceuticals Corporation的美国专利No.6,113,198中公开的灵长类化B7抗体，以及人和人源化B7抗体。

CD23指B细胞和其它细胞表达的对IgE低亲合力受体。在本发明中，CD23优选是人CD23抗原。在本领域中CD23抗体也是已知的。更优选地，在本发明中，CD23抗体是包括人IgGI或IgG3恒定区的人或嵌合抗人CD23抗体。

B细胞″拮抗剂″是当与B细胞表面标记结合时，例如通过减少或防止B细胞激发的体液应答而破坏或排除哺乳动物体内B细胞和/或干扰一种或多种B细胞功能的分子。拮抗剂优选能够从用此处理的哺乳动物排除B细胞(即降低循环B细胞水平)。通过多种机理例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)、抑制B细胞增殖和/或诱导B细胞死亡(例如通过程序性细胞死亡)可以实现这样的排除作用。本发明范围中包括的拮抗剂包括抗体合成的或天然序列肽和小分子拮抗剂，其结合B细胞标记，并且任选地与细胞毒剂偶联或融合。

CD40L拮抗剂是特异性结合CD40L、并且优选拮抗CD40L和CD40的相互作用的分子。其例子包括特异性结合CD40L、可溶性CD40、可溶性CD40融合蛋白的抗体和抗体片段，和结合CD40L的小分子。根据本发明的优选的拮抗剂包括对CD40特异的抗体或抗体片段。

″抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性″和″ADCC″指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤细胞(NK)、嗜中性白细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，并且接着引起靶细胞的溶胞作用。介导ADCC的主要细胞NK细胞只表达FcyRIII，而单核细胞表达FcyRI、FcyRII和FcyRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)第464页表3概括了造血细胞上FcR表达。为了评价目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测试，例如美国专利No.5,500,362或5,821,337描述的测试。用于该项测试的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤细胞(NK)。或者，或者另外地，也可以体内评价目的分子的ADCC活性，例如在哺乳动物模型中，例如Clynes等，PNAS(USA)95：652-656(1998)公开的那些模型。

″人效应细胞″是表达一种或多种FcR并且发挥效应子功能的白细胞。优选地，该细胞至少表达FcyRIII并且发挥ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤细胞(NK)、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性白细胞；PBMC和NK细胞是优选的。可以从其天然来源，例如从血液或这里描述的PBMC中分离效应细胞。

术语″Fc受体″或″FcR″用来描述结合抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR结合IgG抗体(γ受体)，并且包括FcyRI、FcyRII和FcyRII亚类受体，包括等位变体或者这些受体的剪接形式。FcyRII受体包括FcyRIIA(″活化受体″)和FcyRUB(″抑制受体″)，它们具有相似的氨基酸序列，主要不同之处在于其细胞质结构域。活化受体FcyRIIA在其细胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸-为基础的活化基元(ITAM)。抑制受体FcyRIIB在其细胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸-为基础的抑制基元(ITIM)。(参见综述M.in Daeon，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR综述见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)；Capel等，Immunomethods 4：25-34(1994)；和de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。其它FcR，包括以后鉴定的那些，都包括在这里的术语″FcR″之内。该术语还包括新生儿受体FcRn，其负责母体IgGs转移给胎儿(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等，J.Immunol.24：249(1994))。

″补体依赖性细胞毒性″或″CDC″指在补体存在下分子溶解靶物质的能力。补体系统的第一成分(Clq)对与同源抗原复合的分子(例如抗体)的结合起始补体活化途径。为了评价补体活化作用，可以进行CDC测试，例如Gazzano-Santoro等，J Immunol.Methods 202：163(1996)所描述。

″生长抑制″拮抗剂是防止或减少表达拮抗剂结合的抗原的细胞的增殖的物质。例如，拮抗剂可以体外和/或体内防止或减少B细胞增殖。

″诱导程序性细胞死亡″的拮抗剂是诱导根据膜联蛋白V的结合、DNA的片段化、细胞收缩、内质网膨胀、细胞破碎和/或膜囊泡形成(称为程序性细胞死亡体)确定的程序化细胞(例如B细胞)死亡的物质。

此处所用术语″高变区″指负责抗原-结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括来自″互补决定区″或″CDR″的氨基酸残基(例如轻链可变区中残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变区中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第五版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或来自″高变环″的那些残基(例如轻链可变区中残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变区中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk.l.Mol.Biol.196：901-917(1987))。″构架″或FR″残基是除了这里定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。

″结合″目的抗原(例如B细胞表面标记)的拮抗剂能以足够的亲合力结合抗原使得拮抗剂用作定向表达该抗原的细胞例如B细胞的治疗物质。

″抗-CD20抗体″在这里是特异性结合CD20抗原(优选人CD20)、具有可测定的B细胞排除活性(优选具有RITUXAN的至少大约10％B细胞排除活性)的抗体(参见美国专利No.5,736,137，这里全文引作参考)。

″抗-CD22抗体″在这里是特异性结合CD22抗原(优选人CD22)、具有可测定的B细胞排除活性(优选具有RITUXAN的至少大约10％B细胞排除活性)的抗体(参见美国专利No.5,736,137，这里全文引作参考)。

″抗-CD19抗体″在这里是特异性结合CD19抗原(优选人CD19)、具有可测定的B细胞排除活性(优选具有RITUXAN的至少大约10％B细胞排除活性)的抗体(参见美国专利No.5,736,137，这里全文引作参考)。

″抗-CD37抗体″在这里是特异性结合CD37抗原(优选人CD37)、具有可测定的B细胞排除活性(优选具有RITUXAN的至少大约10％B细胞排除活性)的抗体(参见美国专利No.5,736,137，这里全文引作参考)。

″抗-B7抗体″这里是特异性结合B7.1、B7.2或B7.3、最优选人B7.3、抑制B7/CD28相互作用、基本上不抑制B7/CTLA-4相互作用的抗体，并且更优选地，为美国专利6,113,898中描述的特殊抗体，该专利文献在此全文引作参考。最近证明这些抗体促进程序性细胞死亡。因此，它们很好地适合抗肿瘤应用。

″抗-CD40L抗体″是特异性结合CD40L(也称为CD154、gp39、TBAM)的抗体，优选具有拮抗活性的抗体。优选的抗-Cd40L抗体是具有美国专利No.6,011,358(转让给IDEC Pharmaceuticals Corporation)公开的人源化抗体特异性的抗体，该专利文献在此全文引作参考。

″抗-CD4抗体″是特异性结合CD4、优选人CD4的抗体、更优选灵长类化的或人源化的抗-CD4抗体。

″抗-CD40抗体″是特异性结合CD40、优选人CD40的抗体，例如美国专利5,874,085、5,874,082、5,801,227、5,674,442或5,667,165公开的那些，所有这些专利文献在此全文引作参考。

优选地，B细胞排除抗体和免疫调节抗体的包含人恒定区。合适的抗体可以包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4同种型。

结合CD20抗原的抗体的具体例子包括：″Rituximab″(″RITUXAN″)(美国专利No.5,736,137，特别在这里引作参考)；钇-[90]-标记的2B8鼠抗体″Y2B8″(美国专利No.5,736,B7，特别在这里引作参考)；任选标记有1311的IgG2a″Bl″，1311 B1″抗体(BEXXARTM)(美国专利No.5,595,721，特别在这里引作参考)；鼠单克隆抗体″1F5″(Press等，Blood 69(2)：584-591(1987)；和″嵌合2H7″抗体(美国专利No.5,677,180，特别在这里引作参考)。

结合CD22的抗体的具体的例子包括Immunomedics报道的LymphocideTM，现在在对非何杰金氏淋巴瘤的临床试验中。结合B7抗原的抗体的例子包括颁发给Linsley等的美国专利5,885,577报道的B7抗体、颁发给DeBoer等转让给Chiron Corporation的美国专利5,869,050报道的抗-B7抗体，和Anderson等的美国专利6,113,198公开的灵长类化抗-B7抗体，所有这些专利文献在这里全文引作参考。

结合CD23的抗体的具体的例子众所周知，优选包括Reff等在1999年7月4日颁发的、共同转让给IDEC Pharmaceuticals Corp.和Seikakagu Corporation of Japan的美国专利6,011,138中报道的对人CD23特异的灵长类化抗体；Bonnefoy等在No.96 12741中报道的那些；Rector等，J.Immunol 55：481-488(1985)；Flores-Rumeo等，Science 241：1038-1046(1993)；Sherr等，J.Immunol.，142：481-489(1989)；和Pene等，PNAS，USA 85：6820-6824(1988)报道的那些。据报道这些抗体用于治疗变态反应、自身免疫疾病和炎症。

属于″rituximab″或″RITUXAN″在这里指基因工程的针对CD20抗原的嵌合鼠/人单克隆抗体，并且在美国专利No.5,736,B7中定义为″C2B8″，该专利文献特别在这里引作参考。所述抗体是包含鼠轻链和重链可变区序列和人恒定区序列的IgGIκ免疫球蛋白。Rituximab对CD20抗原具有结合亲合力(大约8.0nM)。

″分离的″拮抗剂是已经被鉴定，并且从其天然环境成份中分离和/或回收。其天然环境的污染成分是将干扰拮抗剂的诊断或治疗用途的物质，可能包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，拮抗剂可以被纯化为(1)通过Lowry方法测定，达到拮抗剂重量的95％以上，最优选99％重量以上，(2)利用转杯式测序仪达到足以获得至少15个N-末端氨基酸残基或内部氨基酸序列的程度，或者(3)在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选地银染剂通过SDS-PAGE达到同质性。分离的拮抗剂包括重组细胞原位中的拮抗剂，因为不存在拮抗剂天然环境的至少一种成分。但是，通常通过至少一个纯化步骤制备分离的拮抗剂。

治疗目的的″哺乳动物″指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物，和动物园、运动或宠物动物，例如狗、马、猫、牛等。优选地，所述哺乳动物是人。

″治疗″指治疗性治疗和预防性或防止性措施。需要治疗的包括已经患有疾病的以及要预防疾病的。因此，哺乳动物可以已被诊断患有疾病，或者可以预先安排或易患有疾病。

B细胞恶性肿瘤

根据本发明，包括任何B细胞恶性肿瘤，例如，B细胞性淋巴瘤和白血病。优选的例子包括何杰金氏病(所有的形式，例如，复发的何杰金氏病，抗性何杰金氏病)、非何杰金氏淋巴瘤(低级、中级、高级和其它类型)。例子包括小淋巴细胞/B细胞慢性淋巴细胞性白血病(SLL/B-CLL)、淋巴浆细胞样(lymhoplasmacytoid)淋巴瘤(LPL)、外套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡淋巴瘤(FL)、扩散大细胞淋巴瘤(DLCL)、伯基特氏淋巴瘤(BL)、AIDS-相关淋巴瘤、单核细胞B细胞性淋巴瘤、血管成免疫细胞淋巴结病、小淋巴细胞、滤泡、扩散大细胞、扩散小分裂细胞、大细胞免疫细胞成淋巴细胞瘤、小的没有分裂的、伯基特氏和非伯基特氏、滤泡、显著大细胞；滤泡、显著小裂解细胞；和滤泡、混合的小裂解的和大细胞性淋巴瘤。参见Gaidono等，″Lymphomas″，IN CANCER：PRINCIPLES & PRACTICE OFONCOLOGY，Vol.2：2131-2145(DeVita等，编著，第五版，1997)。

其它类型的淋巴瘤类别包括免疫细胞Waldenstrom′s MALT-型/单核细胞样B细胞、外套细胞淋巴瘤B-CLL/SLL、扩散大B-细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、和前体B-LBL。

如所指出的，B细胞恶性肿瘤进一步特别包括白血病例如ALL-L3(伯基特氏型白血病)、慢性淋巴细胞性性白血病(CLL)、慢性白细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、单核细胞性白血病、髓细胞性白血病、和前髓细胞性白血病和单核细胞性白血病。

词语″治疗有效量″指有效预防、减轻或治疗所讨论的B细胞恶性肿瘤病的拮抗剂的量。

这里使用的术语″免疫抑制剂″用于辅助治疗时指抑制或掩蔽这里接受治疗的哺乳动物的免疫系统的物质。这可包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自身抗原表达或屏蔽MHC抗原的物质。这样的试剂的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(参见美国专利No.4,665,077，其公开内容在这里引作参考)、硫唑嘌呤(azathioprine)；环磷酰胺；溴隐亭(bromocryptine)；达那唑(danazol)；氨苯砜(dapson)；戊二醛(其屏蔽MHC抗原，如美国专利No.4,120,649所述)；MHC抗原和MHC片段的抗-独特型抗体；环孢菌素A；类固醇如糖皮质激素，例如强的松、甲基强的松龙和地塞米松；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗-干扰素-α、β-或δ-抗体、抗-肿瘤坏死因子-α抗体、抗-肿瘤坏死因子-β抗体、抗-白细胞介素-2抗体和抗-IL-2受体抗体；抗-LFA-1抗体，包括抗-CDl 1a和抗-CD18抗体；抗-L3T4抗体；异种抗-淋巴细胞球蛋白；pan-T抗体，优选抗-CD3或抗-CD4/CD4a抗体；包含LFA-3结合结构域的可溶性肽(WO 90/08187，7/26/90公开)，链激酶(streptolanase)；TGF-β；链球菌DNA酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；去氧精胍菌素；雷帕霉素；T-细胞受体(Cohen等，美国专利No.5,114,721)；T-细胞受体片段(Offner等，Science，251：430-432(1991)；WO 90/11294；laneway，Nature，341：482(1989)；和WO 91/01133)；和T-细胞受体抗体(EP 340，109)，例如T10B9。

这里使用的术语″细胞毒性试剂″指抑制或妨碍细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意指包括放射性同位素(例如At211 I131I125 Y9o Re186 Relg8 sM153 Bi212 p32和Lu的放射性同位素)、化学治疗剂和毒素例如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物源的酶学活性毒素，或其片段。

″化学治疗剂″是用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的例子包括烷基化试剂，例如硫化三磷和环磷酰胺(CYTOXAN^TM)；磺酸烷基酯，例如白消安、胺丙磺酯和哌酰硫烷；氮丙啶，例如苄替派(benzodopa)、卡波醌、四甲尿烷亚胺(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；氮丙啶和甲基密胺(methylamelamines)包括六甲密胺，三亚胺嗪，三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫化磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethyolomelamime)氮芥例如苯丁酸氮芥(chiorambucil)，萘氮芥，胆磷酰胺(cholophosphamide)，雌二醇氮芥，异环磷酰胺，氮芥，盐酸氧氮芥，苯丙氨酸氮芥，新氮芥，苯芥胆甾醇，松龙苯芥，氯乙烷环磷酰胺，尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)例如卡氮芥，氯脲菌素，福替目丁，罗氮芥，尼氮芥，雷诺氮芥；抗生素例如阿克拉霉素，放线菌素，奥斯霉素(authramycin)，重氮丝氨酸，博莱霉素，放线菌素C(cactinomycin)，加利车霉素(calicheamicin)，加菜素(carabicin)，洋红霉素，嗜癌素，色霉素，放线菌素D，柔红霉素，德特霉素(detorubicin)，6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸，阿霉素，表阿霉素，去羟阿霉素，去甲氧柔红霉素，麻西罗霉素，丝裂霉素，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素，培来霉素，培弗来霉素(potfiromycin)，嘌呤霉素，三铁阿霉素，罗道鲁霉素(rodorubicin)，链黑霉素，链脲霉素，杀结核菌素，羟氨苯丁酰亮氨酸，新制癌素，佐柔比星(zorubcinin)；抗-代谢产物例如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物例如二甲叶酸，氨甲喋呤，喋酰三谷氨酸，曲美沙特；嘌呤类似物例如氟达拉滨，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如环胞苷，氮杂胞苷，6-氮杂尿苷(6-azauridine)，卡莫氟，阿糖孢苷，二脱氧尿苷，doxifluridine，依诺他滨，氟尿苷，5-FU；雄性激素例如二甲睾酮，丙酸甲雄烷酮，环硫雄醇，环戊缩环硫雄烷，睾内酯；抗-肾上腺例如氨苯乙哌啶酮，米托坦(邻氯苯对氯苯二氯乙烷)，曲洛司坦；叶酸补充物(replenisher)例如frolinic acid；醋匍内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基戊酮酸；胺苯吖啶；bestrabucil；比山群(bisantrene)；edatraxate；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；elfornithine；醋酸羟哔咔唑；环氧甘醚；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；丙酮双脒腙；二羟基蒽酮；单哌潘生丁；二胺硝吖啶；pentostatin；蛋氨氮芥；吡喃阿霉素；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基苄肼；PSK；丙亚胺；西索菲兰；螺旋锗；细交链孢菌酮酸；三乙撑亚胺苯醌；2，2′，2″-三氯乙胺；尿烷；长春碱酰胺；达卡巴嗪(三嗪咪唑胺)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；溴丙哌嗪；gacytosine；阿拉伯糖苷(″Ara-C″)；环磷酰胺；塞替派(三胺硫磷)；taxoids，例如紫杉醇(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和doxetaxel(Taxotere，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，法国)；苯丁酸氮芥；gemcitabine；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；鬼臼亚乙苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌(二羟基蒽酮)；长春花新碱；维诺利宾；navelbine；二羟基蒽酮；鬼臼噻吩苷；道诺霉素；氨基喋呤；xeloda；ibandronate；CPT11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；esperamicins；capecitabine；和上述任何化合物的药学可接受盐，酸或衍生物。该定义还包括起作用来调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素试剂，例如抗雌激素，包括，例如他莫昔芬(tamoxifen)，raloxifene，抑制4(5)-咪唑的芳香酶，4-羟基他莫昔芬，氢萘吡苯酮，keoxifene，LY117018，奥那司酮(onapristone)，和托米芬(Fareston)；和抗-雄激素例如氟他胺，尼鲁米特，bicalutamide，利普安，和性瑞林；和上述任何化合物的药学可接受盐、酸或衍生物。

术语″细胞因子″是一种细胞群释放的作用于作为细胞间介质的另一个细胞的蛋白质的属名。这样的细胞因子的例子淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素例如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素例如滤泡刺激激素(FSH)、甲状腺刺激激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；副中肾-抑制物质；小鼠促性腺激素-相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子例如NGF-13；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导(osteoinductive)因子；干扰素例如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)例如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子例如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和试剂盒配体(KL)。如这里使用的，术语细胞因子包括天然来源的或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物活性等价物。

本申请中使用的术语″前药″指与亲代药物相比对肿瘤细胞细胞毒性较小并且能够被酶促激活或转化为更具有活性的亲代形式的药物活性物质的前体或衍生形式。参见，例如，Wilman，″Prodrugs in CancerChemotherapy″，Biochemical Society Trasactions，14，pp.375-382，615th Meeting Belfast(1986)和Stella等，″Prodrugs：AChemical Approach to Targeted Drug Delivery″，Directed DrugDelivery，Borchardt等，(编著)，pp.247-267，Humana Press(1985)。本发明前药包括但不限于含有磷酸盐的前药、含有硫代磷酸盐的前药、含有硫酸盐的前药、含有肽的前药、D-氨基酸-修饰的前药、糖基化前药、含有β-内酰胺的前药，含有任选被取代的苯氧乙酰胺的前药或含有任选被取代的苯乙酰胺的前药、能够被转化为更具活性的没有细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前药。可以衍生化生成在本发明中使用的前药的细胞毒性药物的例子包括但不限于上述那些化学治疗剂。

″脂质体″是用于对哺乳动物送递药物(例如这里公开的拮抗剂，和任选地，化学治疗剂)的由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小泡。脂质体的成份一般排列成双层结构，类似于生物膜的脂排列。

术语″包装附件(packaye insert)″用来指可购得的治疗产品包中通常包括的说明，包括关于适应症、使用、剂量、给药、禁忌症和/或关于该治疗产品的使用的注意事项等信息。

II.抗体的制备

本发明的制备方法和产品使用或结合使用具有免疫调节活性的抗体，例如抗-B7、抗-CD23、抗-CD40L、抗-CD4或抗-CD40抗体，和与具有B排除活性的B细胞表面标记结合的抗体，例如，抗-CD20、抗-CD22、抗-CD19、或抗-CD37抗体。因此，这里将描述产生这样的抗体的方法。

用于制备或筛选抗原的分子可以是例如抗原的可溶形式或者含有期望的表位的其部分。或者，或另外可以使用在它们的细胞表面表达抗原的细胞来产生或筛选拮抗剂。用于产生拮抗剂B细胞表面标记的其它形式对于本领域技术人员是显而易见的。用于产生本发明的抗体的抗原CD40L、CD40、CD19、CD20、CD22、CD23、CD37、CD4和B7抗原(例如.，B7.1，B7.2)的合适的抗原来源众所周知。另外，可以基于氨基酸序列合成制备肽。例如，关于CD40L，公开于Armitage等(1992)。

优选地，CD40L抗体或抗-CD40L抗体是1999年6月14日颁发的美国专利6,001,358(转让给IDEC Pharmaceuticals Corporation)公开的人源化抗-CD40L抗体。

优选的CD40L拮抗剂是一种抗体，也可以施用不是抗体的拮抗剂。例如，拮抗剂可以包括可溶性CD40、CD40融合蛋白或任选地与细胞毒性剂(如此处所述)融合或缀合的小分子拮抗剂。为了鉴定与那种抗原结合的小分子，可以针对目的B细胞表面标记筛选小分子库。可以针对其拮抗性质和/或与细胞毒性剂的缀合进一步筛选小分子。

拮抗剂还可以是例如通过合理设计或通过噬菌体展示产生的肽(W098/35036，1998年8月13日公开)。在一个实施方案中，选择的分子可以是″CDR模拟物″或者例如基于抗体的CDR设计的抗体类似物。所述肽可以拮抗其本身，同时肽可以任选地与细胞毒性剂或免疫球蛋白Fc区融合(例如，这样给所述肽带来ADCC和/或CDC活性)。

举例描述根据本发明使用的抗体拮抗剂的制备技术。

(i)多克隆抗体

通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关的抗原和佐剂优选在动物体内产生多克隆抗体。使用双官能或衍生化试剂，例如马来酰苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)，N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl₂、或R¹N＝C＝NR(其中R和R¹是不同的烷基)使相关的抗原与在要免疫的物种中是免疫原性的蛋白质缀合是有用的，所述蛋白质是例如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶。

通过组合例如100微克或5微克的蛋白质或缀合物(分别对兔或小鼠)和3体积的弗氏完全佐剂，并且在多个位点皮内注射该溶液，免疫动物该抗原、免疫原性缀合物或衍生物。一个月之后，通过在多个位点皮下注射1/5至1/10原量的弗氏完全佐剂中肽或缀合物对动物加强免疫。7-14天之后对动物取血并且对血清测定抗体效价。对动物加强免疫直到效价平稳。优选地，用相同抗原的缀合物、但是与不同的蛋白质缀合和/或通过不同的交联剂对动物加强免疫。也可以在重组细胞培养物中制备蛋白质融和产物缀合物。还有，凝集剂例如明矾适合用来增强免疫应答。

(ii)单克隆抗体

从基本上同种的抗体群体获得单克隆抗体，即，包括该群体的各个抗体是相同的，除了可能少量存在的可能的天然存在的突变体。因此，修饰语″单克隆″指不是分散的抗体的混合物的抗体的特征。

例如，利用杂交瘤方法可以制备单克隆抗体，杂交瘤方法由Kohler等，Nature，256：495(1975)第一次提出，或者可以通过重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)制备。

在杂交瘤方法中，如上所述对小鼠或者其它合适的宿主动物(例如仓鼠)免疫，激发产生或能产生特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。或者，体外对淋巴细胞免疫。然后使用合适的融合试剂例如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。

在优选含有一种或多种抑制没有融合的亲代骨髓瘤细胞的生长或存活的物质的合适的培养基中接种并培养如此制备的杂交瘤细胞。例如，如果亲代骨髓瘤细胞没有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，用于杂交瘤的培养基一般包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，其防止HGPRT-缺陷细胞的生长。

优选的骨髓瘤细胞是充分融合的，通过筛选产生抗体的细胞而支持稳定高水平抗体产生，并且对培养基例如HAT培养基敏感。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，例如从Salk Institute CellDistribution Center，San Diego，California USA获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤衍生的，和从美国典型培养物中心(the AmericanType Culture Collection，Manassas，Virginia，USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。也有人描述过人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于产生人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。

对其中生长有杂交瘤细胞的培养基测定针对该抗原的单克隆抗体的产生。优选地，通过免疫沉淀或通过体外结合测定(例如放射免疫测试(RIA)或酶联免疫吸附测试(ELISA))测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。

例如，通过Munson等，Anal.Biochenz.，107：220(1980)的30Scatchard分析可以测定单克隆抗体的结合亲和性。

对产生目的特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞鉴定之后，通过有限稀释法将克隆亚克隆，并且通过标准方法培养(Goding，Monocional Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。用于该目的的合适的培养基包括例如，D-MEM或RPML-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以体内作为动物腹水肿瘤生长。

通过常规免疫球蛋白纯化方法(例如蛋白质A-琼脂糖凝胶，羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析)从培养基，腹水或血清适当分离亚克隆分泌的单克隆抗体。

利用常规方法容易分离并且测序编码单克隆抗体的DNA(例如，通过使用能特异性结合鼠抗体的重链和轻链编码基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是这样的DNA的优选的来源。一旦分离后，可以将该DNA置于表达载体中，然后转染到宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或者另外不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)，在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。有关编码抗体的DNA在细菌中重组表达的综述文章包括Skerra等，Curr.Opinionin Immunol.，5：256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.，130：151-188(1992)。

产生针对CD40L、CD19、CD22、CD20或CD40蛋白质或肽(例如美国专利No.5,945,513描述的gp39融合蛋白)的特异性抗体或抗体片段的另一种方法是筛选在有CD40L、CD19、CD20、or CD22蛋白质或肽的细菌中表达的编码免疫球蛋白基因或者其部分的表达文库。例如，使用噬菌体表达文库，完全Fab片段、V_H区和Fv区可以在细菌中被表达。参见，例如，Ward等，Nature 341：544-546(1989)；Huse等，Science 246：1275-1281(1989)；和McCafferty等，Nature 348：552-554(1990)。用例如CD40L、CD22、CD19或CD20肽筛选这样的文库能鉴定与CD40L、CD22、CD19或CD20反应的免疫球蛋白片段。或者，可以使用SCID_hu小鼠(从Genpharm获得)制备抗体或者其片段。

在另一个实施方案中，利用McCafferty等，Nature，348：552-554(1990)描述的技术可以从产生的抗体噬菌体文库分离抗体或者抗体片段。Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)描述了使用噬菌体文库分别分离鼠和人抗体。下面的出版物描述了通过链改组(Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992))及作为构建非常大的噬菌体文库的策略的组合感染和体内重组(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))产生高亲和性(nM范围)人抗体。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的替代方法。

制备针对CD40L，包括人CD40L和小鼠CD40L的单克隆抗体(MAb)的方法，和在本发明的方法中使用的合适的单克隆抗体，描述于PCT专利申请No.WO 95/06666，发明名称是″抗-gp39抗体及其用途″，其中教导在这里全文引作参考。本发明特别优选的抗-人CD40L抗体是分别通过杂交瘤24-31和89-76产生的MAb24-31和89-76。分别产生89-76和24-31抗体的89-76和24-31杂交瘤根据布达佩斯条约于1994年9月2日保藏在美国典型培养物中心(ATCC)，10801University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209。89-76杂交瘤的保藏号是ATCC HB11713，24-31杂交瘤的保藏号是ATCC HB11712。

例如通过用人重链和轻链恒定区的编码序列替代同源鼠序列(美国专利No.4,816,567；Morrison，等，Proc.Natl Acad.ScL USA，81：6851(1984))，或者通过共价连接免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分，可以修饰DNA。

通常，用这样的非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定区，或者它们取代抗体的一个抗原结合位点的可变区，产生包括一个对一种抗原具有特异性的抗原结合位点和另一个对一种不同的抗原具有特异性的抗原结合位点的嵌合二价抗体。

(iii)人源化抗体

现有技术描述过将非人抗体人源化的方法。优选地，人源化抗体具有一个或多个导入到其中的来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常被称作″引入″残基，其通常取自″引入″可变区。基本上根据Winter及同事(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))的方法，通过用相应的人抗体的序列取代高变区序列，实现人源化作用。因此，这样的″人源化″抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中基本上少于完整人可变区被相应的来自非人物种的序列取代。实际上，人源化抗体一般是其中一些高变区残基和可能的一些FR残基被来自啮齿类抗体的同源位点的残基取代的人抗体。

对于降低抗原性来说，制备人源化抗体使用的人可变区(轻链和重链)的选择是非常重要的。根据所谓″最好吻合(best-fit)″方法，对已知的人可变区序列的全文库筛选啮齿类抗体的可变区的序列。然后接受与啮齿类的序列最接近的人序列为人源化抗体的人构架区(FR)(Suns等，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol，196：901(1987))。另一种方法使用从轻链或重链的特定亚组所有的人抗体的共有序列衍生的特定构架区。对于几种不同的人源化抗体可以使用相同的构架(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.，151：2623(1993))。

还有重要的一点是被人源化的抗体保留对抗原的高亲合力和其它有益的生物学性质。为了实现该目的，根据优选的方法，使用亲代和人源化序列的三维模型通过亲代序列和各种概念人源化产物分析方法制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，并且对于本领域技术人员是熟悉的。可获得详细说明和显示选择的候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序。研究这些显示可分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中可能的作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。用这种方法，可以从受体和引入序列筛选FR残基并组合，以获得期望的抗体特征，例如对于靶抗原提高的亲合力。一般情况下，影响抗原结合中直接并且大多数基本上涉及高变区残基。

(iv)灵长类化抗体

Newman，Biotechnology，10：1455-1460(1992)公开了产生重组抗体的另一种高效方法。更特别地，该项技术导致含有猴可变区和人恒定序列的灵长类化抗体的产生。该文献在此全文引作参考。此外，该项技术也描述于1995年1月25日申请的普通转让的美国申请No.08/379,072,其是1992年7月10日申请的美国顺序号是No.07/912,292，的连续申请，而后者是1992年3月23日申请的美国顺序号是No.07/856,281的部分连续申请，后者最后是1991年7月25日申请的美国顺序号是No.07/735,064的部分连续申请。08/379,072及其母申请在这里全文引作参考。

该项技术修饰抗体使得对人施用时不会抗原排斥。该项技术依赖用人抗原或受体对猕猴(cynomolgus)的免疫。开发该项技术制备针对人细胞表面抗原的高亲和性单克隆抗体。

利用一般转让的1995年6月7日申请的美国申请No.08/487,550描述的方法可以进行通过筛选噬菌体展示文库或使用由CD40L、CD20、CD22、CD40或CD19免疫的猴的B淋巴细胞获得的猴异种杂交瘤而对人CD40L、CD20、CD22、CD40或CD19的猕猴抗体的鉴定，该专利文献在此全文引作参考。

先前有人报道利用这些专利申请中描述的方法产生的抗体显示人效应子功能，具有降低的免疫原性，和长的血清半寿期。该项技术依赖这样的事实，即尽管猕猴系统发育类似于人，它们还将很多人蛋白质识别为外来蛋白质，因此表现出免疫应答。此外，因为猕猴系统发育接近于人，发现这些猴产生的抗体与人产生的抗体具有高度氨基酸同源性。事实上，对恒河猴免疫球蛋白轻链和重链可变区基因测序之后，发现各个基因家族的序列与其人副本85-98％同源(Newman等，1992)。用该方法产生的第一种抗体，抗-CD4抗体，与人免疫球蛋白构架区的共有序列91-92％同源(Newman等，1992)。

如上所述，本发明部分涉及对人CD40L抗原特异性的并且能够抑制CD40信号发生或抑制CD40/CD40L相互作用的单克隆抗体或其灵长类化形式的用途。用鉴定的抗体(或者其治疗有效片段)阻断CD40和CD40L之间主要激活位点，同时对正的共同刺激有联合拮抗作用对负信号发生有不可知作用，这对复发形式的恶性肿瘤，特别是B-细胞淋巴瘤和白血病的介入治疗是有用的治疗方法。通过阻断CD40信号，使得其存活并且避免IgM-或Fas-诱导的程序性细胞死亡来确定鉴定的抗体的功能活性。

利用都是转让给IDEC Pharmaceuticals Corporation的美国专利No.6,001,358或5,750,105描述的方法或者其它已知方法可以进行特异性结合人CD40L的单克隆抗体以及从中衍生的灵长类化抗体的制备。优选地，这样的抗体对CD40L具有高亲和性，因此可以用作抑制CD40L/CD40途经的免疫抑制剂。相似技术会得到对CD20、CD19、CD22或CD40特异性的猴抗体。

优选通过筛选噬菌体展示文库或者通过使用从CD40L(例如人CD40L)免疫的猴获得的B淋巴细胞制备猴异种杂交瘤进行猴单克隆抗体的制备。也可以从美国专利No.5,945,513描述的融合蛋白获得人CD40。

如所指出的，产生抗-CD40L、CD19、CD20、CD22或rCD40抗体的第一种方法涉及重组噬菌体展示技术。该项技术在上文中有过一般描述。

基本来说，其包括针对靶物的重组免疫球蛋白库的合成和分泌具有对CD40L抗原高亲和性的抗体的噬菌体的筛选，所述靶物即丝状噬菌体表面上展示的CD19、CD22、CD20、CD40或CD40L抗原。如上所述，优选筛选即结合人CD40L又结合CD40的抗体。为了实施这样的方法，本发明人制备了独特的猴文库，该文库降低了重组可能性并且提高了稳定性。

基本上，为了采用使用恒河猴文库的噬菌体展示，该载体包含PCR扩增猴免疫球蛋白基因的特异性引物。这些引物以在开发灵长类化技术获得的恒河猴序列和包含人序列的数据库为基础。

合适的引物公开于一般转让的08/379,072，这里引作参考。

第二种方法涉及猴即恒河猴的免疫，其针对目的抗原靶物，即人CD19、CD20、CD22、CD40或CD40L。上文讨论了恒河猴用于制备单克隆抗体的固有的好处。特别地，这样的猴，即猕猴，可以针对人抗原或受体免疫。此外，可根据Newman等，(1992)，和Newman等，一般转让的美国顺序号N0.08/379,072，1995年1月25日申请的方法，使用得到的抗体制备灵长类化抗体，该文献在此全文引作参考。

从猕猴获得的抗体的显著的优点是这些猴将很多人蛋白质识别为外来蛋白质，从而提供于抗体的形成，一些对目的人抗原例如人表面抗原和细胞受体具有高亲和性。此外，因为其系统发育接近人，所以得到的抗体表现出与人产生的抗体的高度氨基酸同源性。如上所述，对恒河猴免疫球蛋白轻链和重链可变区基因测序之后，发现各个基因家族的序列与其人副本85-98％同源(Newman等，1992)。

基本来说，对猕猴施用人CD19、CD20、CD22、CD40或CD40L抗原，从中分离B细胞，例如从动物取淋巴结活组织检查，然后用聚乙二醇(PEG)使B淋巴细胞与KH6/B5(小鼠×人)异种杂交瘤细胞融合。然后鉴定分泌结合人CD40L抗原的抗体的异种杂交瘤。

在结合CD40L或CD40抗体的情况下，期望它们以妨碍或调节CD40信号发生的方式进行，因为这样的抗体可以潜在地用来抑制CD40L与CD40、与它们的对应受体的相互作用。如果可以开发针对CD40L或CD40上一个以上表位的抗体，并且这些抗体可以一起使用，则它们的结合活性可以潜在地提供协同作用。

本发明涉及被致敏产生特定抗体的动物(例如，灵长类，organgutan，狒狒，恒河猴和猕猴)的应用。可以用来产生人CD40L抗体的其他动物包括但不限于下面的动物：小鼠，大鼠，豚鼠、仓鼠、猴、猪、山羊和兔。

然后根据Newman等，(1992)和Newman等，1995年1月25日申请的美国顺序号No.379,072所述，使用表达特异性结合人CD40L抗原的抗体的细胞系克隆用于制备灵长类化抗体的可变区序列，这两篇文献在这里引作参考。基本上，其详细说明了从中提取RNA、转化为cDNA、并且使用Ig特异引物通过PCR扩增。合适的引物描述于Newman等，1992，美国顺序号No.379,072。相似技术将得到表达CD40、CD19、CD20或CD22特异性抗体的细胞系。

然后根据Newman等，(1992)和Newman等，1995年1月25日申请的美国顺序号No.379,072所述，使用表达特异性结合人CD40L抗原的抗体的细胞系克隆用于制备灵长类化抗体的可变区序列，这两篇文献在这里引作参考。基本上，其详细说明了从中提取RNA、转化为cDNA、并且使用Ig特异引物通过PCR扩增。合适的引物描述于Newman等，1992，美国顺序号No.379,072。相似技术将得到表达CD40、CD19、CD20或CD22特异性抗体的细胞系。

然后根据Newman等，(1992)和Newman等，1995年1月25日申请的美国顺序号No.379,072所述，使用表达特异性结合人CD40L抗原的抗体的细胞系克隆用于制备灵长类化抗体的可变区序列，这两篇文献在这里引作参考。基本上，其详细说明了从中提取RNA、转化为cDNA、并且使用Ig特异引物通过PCR扩增。合适的引物描述于Newman等，1992，美国顺序号No.379,072。相似技术将得到表达CD40、CD19、CD20或CD22特异性抗体的细胞系。

然后将克隆的猴可变基因插入包含人重链和轻链恒定区基因的表达载体中。优选地，使用指定为NEOSPLA的IDEC，Inc.的专利表达载体进行。该载体包含巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β珠蛋白主要启动子、SV40复制起点牛生长激素聚腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、人免疫球蛋白κ或λ恒定区、二氢叶酸还原酶基因、人免疫球蛋白γ1或γ4 PE恒定区和前导序列。发现该载体在插入猴可变区基因、转染CHO细胞中后，在含有G418的培养基中筛选并且氨甲喋呤扩增时，其导致灵长类化抗体的高水平表达。

例如，先前公开过该表达系统产生灵长类化抗体具有针对CD4和其他人细胞表面受体的高亲合力(Kd≤10^-10M)。此外，发现抗体表现出和源猴抗体一样的亲和性、特异性和功能活性。一般转让的美国顺序号No.379,072中基本公开了该载体系统，和1993年11月3日申请的美国顺序号No.08/149,099一样，该文献在此全文引作参考。该系统提供高表达水平，即，＞30pg/细胞/天。当然，可以使用相同的方法制备产生对CD19、CD20、CD22或CD40特异性的抗体的细胞系。

(v)人抗体

作为人源化作用的替代，可以产生人抗体。例如，现在有可能制备在免疫时能够产生完全人抗体所有组成成分而不存在内源免疫球蛋白产生的转基因动物。例如，有人描述过嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区PH基因纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。在这样的种系突变小鼠中人种系免疫球蛋白基因阵列的转移将导致在抗原攻击时人抗体的产生。参见，例如，Jakobovits等，Proc.Mad.Acad.Sci.USA，90：255 1(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等，Year in immuno.，7：33(1993)；和美国专利No.5,591,669、5,589,369和5,545,807。

或者，可以利用噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature 348：552-553(1990))体外从来自没有免疫的供者的免疫球蛋白可变(V)区基因所有组成成分产生人抗体和抗体片段。根据该项技术，将抗体V结构域基因符合读框地克隆到丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，例如M13或fd，并且在噬菌体颗粒的表面上展示为功能抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体的功能性质的筛选也导致编码表现该性质的抗体的基因的筛选。因此，该噬菌体模拟B细胞的一些性质。可以以各种形式进行噬菌体展示；有关综述参见，例如，Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology 3：564-57 1(1993)。可使用几种来源的V-基因片段进行噬菌体展示。Clackson等，Nature，352：624-628(1991)从来自免疫小鼠脾的V基因小的随机组合文库分离不同阵列的抗噁唑酮抗体。可以构建来自没有免疫的人供体的V基因所有组成成分，并且根据Marks等，J.Mol.Biol，222：581-597(1991)，或Griffith等，EMBOJ.12：725-734(1993)描述的技术基本上可以分离不同阵列的抗原(包括自身抗原)的抗体。也参见美国专利No.5,565,332和5,573,905。

通过体外激活的B细胞也可以产生人抗体(参见美国专利205,567,610和5,229,275)。在共同拥有的同时待审的申请中公开了使用SCID小鼠产生人抗体的优选的方法。

(vi)抗体片段

已经研发出产生抗体片段的多种技术。传统上，通过完整抗体的蛋白水解消化产生这些片段(参见例如，Morimoto等，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan等，Science，229：81(1985))。但是，现在可通过重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，从上面讨论的抗体噬菌体文库可以分离抗体片段。或者，可以直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并且化学偶联形成F(ab′)₂片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)₂片段。制备抗体片段的其他技术对于技术人员是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894；和美国专利No.5,587,458。抗体片段也可以是″线性抗体″，例如，如美国专利5,641,870所述。这样的线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。

(vii)双特异性抗体

双特异性抗体是对至少两个不同的表位有结合特异性的抗体。举例的双特异性抗体可以结合B细胞表面标记的两个不同的表位。其他这样的抗体可以结合一个B细胞标记并且进一步结合另一个B细胞表面标记。或者，抗-B细胞标记结合臂可以与结合白细胞上触发分子例如T-细胞受体分子(例如CD2或CD3)，或IgG的Fc受体(FcyR)，例如FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16)的臂结合，这样构成对B细胞的细胞防御机理。还可以使用双特异性抗体使细胞毒性试剂定位B细胞。这些抗体具有B细胞标记结合臂和结合细胞毒性试剂(例如皂草素、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻蛋白A链、氨甲喋呤或放射性同位素半抗原)的臂。可以将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab)₂双特异性抗体)。

制备双特异性抗体的方法是本领域公知的。全长双特异性抗体的常规制备以两条免疫球蛋白重链-轻链对的共表达为基础，其中两条链具有不同的特异性(Millstein等，Nature，305：537-539(1983))。因为免疫球蛋白重链-轻链的随机分配，这些杂交瘤(quadromas)产生10种不同的抗体分子的可能的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化，通常通过亲和色谱步骤进行，比较麻烦，并且产物的产率低。相似方法公开于WO 93/08829和Traunecker等，EMBO J.，10：3655-3659(1991)。

根据不同的方法，具有期望的结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。优选与免疫球蛋白重链恒定结构域进行融合，其至少包括绞合区、CH2和CH3区。优选具有含有轻链结合所必须的位点的第一重链恒定区(CHI)，存在于至少一个融合体中。如果需要，免疫球蛋白重链融合体的编码DNA和免疫球蛋白轻链被插入分开的表达载体中，并且共转染到合适的宿主生物体中。当构建体中使用不同比例的三种多肽链提供最佳产率时，这对于在实施例中调节三种多肽片段的相互比例上有极大的灵活性。但是，当至少两种多肽链以相等比例表达时导致高产率或者当比例没有特殊意义时，可以在一个表达载体中插入两个或所有三个多肽链的编码序列。

在该方法的优选实施方案中，双特异性抗体由在一个臂中有一种结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和在另一个臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供另一种结合特异性)组成。发现这种不对称结构有利于使目的双特异性化合物与不期望的免疫球蛋白链组合物分离，因为只一半双特异性分子中存在免疫球蛋白轻链为分离提供了有利途径。该方法公开于WO 94/04690。有关制备双特异性抗体的进一步细书参见，例如，Suresh等，Methods in Enzymology，121：210(1986)。

根据美国专利No.5,731,168描述的另一种方法，可以对一对抗体分子对之间的界面进行改造，使从重组细胞培养物回收的杂二聚体的百分比最大。优选的界面包括抗体恒定区的CH3结构域的至少一部分。在该方法中，用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)置换第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链。通过用较小的侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)置换大的氨基酸侧链而在第二抗体分子的界面上产生与大的侧链大小相同或相似的补偿″腔″。这为杂二聚体产率超过不期望的终产物例如同二聚体提供了机理。

双特异性抗体包括交联或″杂缀合物″抗体。例如，杂缀合物中的一个抗体可以与抗生物素蛋白偶联，另一个抗体与生物素偶联。例如已经提出这样的抗体使免疫系统细胞定向不期望的细胞(美国专利No.4,676,980)，并且用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。利用常规交联方法可以制备杂缀合物抗体。合适的交联剂及许多交联技术是本领域公知的，并且公开于美国专利No.4,676,980。

文献中也描述过从抗体片段制备双特异性抗体的技术。例如，可以利用化学键合制备双特异性抗体。Brennan等，Science，229：81(1985)描述了其中将完整抗体蛋白分解裂解产生F(ab′)₂片段的技术。这些片段在二硫酚络合剂亚砷酸钠存在下被还原，来稳定附近的二硫酚并且防止分子内二硫键形成。产生的Fab′片段然后被转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。Fab′-TNB衍生物中的一种然后通过用巯基乙胺还原而被再转化为Fab′-硫醇，并且与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，形成双特异性抗体。制备的双特异性抗体可以被用作用于酶的选择性固定化试剂。

最近的进展已促进从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，其可以化学偶联生成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.，175：2 17-225(1992)描述了全人源化双特异性抗体F(ab′)₂分子的制备。大肠杆菌分别分泌每种Fab′片段，并且体外直接化学偶联，生成双特异性抗体。这样生成的双特异性抗体能结合过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，并且触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺癌靶物的溶胞活性。

也有人描述过从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，利用亮氨酸拉链制备双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。通过基因融合，将来自Fos和Jun蛋白质的亮氨酸拉链肽连接至两个不同的抗体的Fab′部分。抗体同二聚体在绞合区被还原生成单体，然后再被氧化生成抗体杂二聚体。该方法也可以用于制备抗体同二聚体。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)描述的″双抗″技术提供了制备双特异性抗体片段的替代机理。片段包括通过太短以致不能使相同链的两个结构域之间配对的接头与轻链可变区(V_L)连接的重链可变区(V_H)。因此，一个片段的V_H和V_L结构域被迫与另一个片段的互补V_L和V_H结构域配对，从而生成两个抗原-结合位点。也有人报道过利用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一个策略。参见Gruber等，J.Immunol.，152：5368(1994)。

涉及具有二价以上的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.147：60(1991)。

III.拮抗剂的缀合物和其他修饰

方法中使用的抗体或这里的制备文献中包括的抗体任选地与细胞毒性试剂缀合。

上文描述过制备这样的抗体-细胞毒性试剂缀合物中有用的化学治疗剂。

这里还包括抗体和一种或多种小分子毒素例如加利车霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)(美国专利No.5,208,020)、单端孢素(trichothene)、和CC1065的缀合物。在本发明的一个优选的实施方案中，拮抗剂与一个或多个美登素分子偶联(例如每个拮抗剂分子大约1至大约10个美登素分子)。美登素可以例如被转化为MaySS-Me，其可以被还原为May-SH3并且与修饰的拮抗剂反应(Charm等，Cancer Research 52：127-131(1992))，产生美登素类-拮抗剂缀合物。

或者，抗体可以和一个或多个加利车霉素分子偶联。加利车霉素抗生素家族能够以亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。可以使用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ₁ ^I、α₂ ^I、α₃ ^I、N-乙酰基-γ₁ ^I、PSAG和O^I ₁(Hinman等，Cancer Research 53：3336-3342(1993)和Lode等，Cancer Research 58：2925-2928(1998))。

可以使用的酶学活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaerugnosa))、蓖麻蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、modeccin A链、α八叠球菌、Aleurites fordii蛋白质、dianthin蛋白质、Phytolacaamericana蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、momordica charantia抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonaria officinalis抑制剂、植物核糖体失活蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素、伊诺霉素和tricothecenes。参见，例如1993年10月28日公开的WO 93/21232。

本发明进一步涉及与具有溶核活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切酶例如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)偶联的抗体。

可利用多种放射性同位素制备放射缀合的拮抗剂。例子包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、RE¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素。

使用例如下面的双官能蛋白质偶联剂可以制备抗体和细胞毒性试剂的缀合物：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫醇)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨基硫醇烷(iminothiolane)(IT)，亚氨酯的双官能衍生物(例如己二酰亚胺二甲酯盐酸盐(dimethyl adipimidate HCL))，活性酯(例如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)，醛(例如戊二醛)，双叠氮化合物(例如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)，双-重氮化衍生物(例如双(对-重氮化苯甲酰基)乙二胺)，二异氰酸酯(例如甲苯2，6-二异氰酸酯)，和二活泼氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，根据Vitetta等，Science 238：1098(1987)所述可以制备蓖麻蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三氨基五乙酸(MX-DTPA)是例示的用于放射性核苷酸与拮抗剂缀合的螯合剂。参见W094/11026。接头可以是有利于细胞毒性药物在细胞中释放的″可裂解接头″。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶-敏感性接头、二甲基接头或含有二硫化物的接头(Charm等，Cancer Research 52：127-131(1992))。

或者，例如通过重组技术或肽合成，可以制备包括抗体和细胞毒性试剂的融合蛋白。

在另一个实施方案中，抗体可以与用于肿瘤预先定位的″受体″(例如链霉抗生物素)缀合，其中对患者施用拮抗剂受体缀合物，接着使用清除剂从循环中去除没有结合的缀合物，然后施用与细胞毒性试剂(例如放射性核苷酸)缀合的″配体″(例如抗生物素蛋白)。

本发明的抗体也可以与将前药(例如肽基化学治疗剂，参见W081/01145)转化为活性抗癌药物的前药活化酶缀合。参见，例如，WO88/07378和美国专利No.4,975,278。

所述缀合物的酶成分包括能以将前药转化为其更具活性的细胞毒性形式的方式对前药作用的任何酶。

在本发明中使用的酶包括但不限于用于将含有磷酸根的前药转化为游离药物的碱性磷酸酶；用于将含有硫酸根的前体药物转化为游离药物的芳基硫酸酶；用于将非毒性的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；蛋白酶，例如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B和L)，其用于将含有肽的前药转化为游离药物；D-丙氨酰羧肽酶，用于转化含有D-氨基酸取代基的前药；碳水化合物裂解酶，例如用于将糖基化前药转化为游离药物的13-半乳糖苷酶和唾液酸苷酶；用于将用13-内酰胺衍生的药物转化为游离药物的13-内酰胺酶；和青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，用于分别用苯氧基乙酰基或苯基乙酰基在它们的胺氮原子处衍生化的药物转化为游离药物。或者，可以使用具有酶活性的抗体，本领域中也称为″抗体酶(abzymes)″，将本发明的前药转化为游离活性的药物(参见，例如，Massey，Nature 328：457-458(1987))。可以根据这里的描述制备用于将抗体酶运送到肿瘤细胞群的拮抗剂-抗体酶缀合物。

通过本领域公知的技术，例如使用上述杂双官能交联剂，本发明的酶可以和拮抗剂共价键合。或者，应用本领域公知的重组DNA技术可以构建至少包括至少与本发明的酶的功能活性部分连接的本发明拮抗剂的抗原结合区的融合蛋白(参见，例如，Neuberger等，Nature，312：604-608(1984))。

这里涉及抗体的其他修饰。例如，抗体可以与多种非蛋白质聚合物连接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。

这里公开的抗体可以配制成脂质体。通过本领域公知的方法制备含有拮抗剂的脂质体，例如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.USA,77：4030(1980)；美国专利No.4,485,045和4,544,545；和1997年10月23日公开的W097/38731。美国专利No.5,013,556公开了循环时间延长的脂质体。

通过使用含有卵磷脂、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物的反相蒸发方法制备特别有用的脂质体。将脂质体通过确定孔径的过滤器得到具有期望的直径的脂质体。根据Martin等J.Biol.Chem.257：286-288(1982)所述通过二硫化物互换反应，本发明的抗体Fab′片段能够与脂质体缀合。脂质体中任选地含有化学治疗剂。参见Gabizon等J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。

涉及这里描述的蛋白质或肽拮抗剂的氨基酸序列修饰。例如期望提高抗体的结合亲和性和/或其他生物学活性。通过将合适的核苷酸变化导入抗体编码核酸或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这样的修饰包括例如缺失和/或插入和/或置换拮抗剂氨基酸序列中的残基。进行缺失、插入和置换的任意组合得到最终构建体，前提是最终构建体具有期望的特征。氨基酸变化也可能改变拮抗剂的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数目或位置。

鉴定是诱变的优选的位置的抗体的某些残基或区的有用的方法称为″丙氨酸扫描诱变″，如Cunningham和Wells Science，244：1081-1085(1989)所述。这里，靶残基的残基或基团被鉴定(例如带电荷的残基例如arg，asp，his，lys和glu)并且被中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或多丙氨酸)置换，影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在取代位点进一步导入或者其他变体来精选证实对取代功能敏感的那些氨基酸位置。这样，当预先测定导入氨基酸序列变化的位点时，不需要预先测定突变本身的性质。例如，为了分析给定位点突变性能，目标密码子或区进行丙氨酸扫描或随机诱变，并且对表达的拮抗剂变体筛选期望的活性。

氨基酸序列插入包括长度从一个残基至含有一百或更多残基的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合，以及单个或多个氨基酸残基序列内插入。末端插入的例子包括带有N-末端甲硫氨酰基残基的拮抗剂或与细胞毒性多肽融合的拮抗剂。拮抗剂分子的其他插入变体包括与酶的拮抗剂或者提高拮抗剂的血清半寿期的多肽的N-或C-末端的融合体。

变体的另一种类型是氨基酸置换变体。这些变体是在拮抗剂分子中至少一个氨基酸残基被不同的残基置换。抗体拮抗剂的置换突变最令人感兴趣的位点包括高变区，但是也包括FR改变。表1″优选的置换″的标题下给出保守性置换。如果这样的置换导致生物学活性的改变，则可以导入更大的改变，表1中称为″例示的取代″，或者下面参照氨基酸类别进一步描述，并且筛选产物。表1

原残基	例示的置换	优选的置换
			Ala(A)	val；leu；ile	val
Arg(R)	lys；gin；asn	lys
			Asn(N)	gln；his；asp，lys；arg	gln
Asp(D)	glu；asn	glu
			Cys(C)	ser；ala	ser
Gln(Q	asn；glu	asn
			Glu(E)	asp；gin	asp
Gly(G)	ala	ala
			His(H)	asn；gin；lys；arg	arg
Ile(I)	leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸	leu
			Leu(L)	正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe	ile
Lys(K)	arg；gln；asn	arg
			Met(M)	leu；phe；ile	leu
Phe(F)	leu；val；ile；ala；tyr	tyr
			Pro(P)	ala	ala
Ser(S)	thr	thr
			Thr(T)	ser	ser
Trp(W)	tyr；phe	tyr
			Tyr(Y)	trp；phe；thr；ser	phe
Val(V)	ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸	leu

通过筛选在保持(a)取代区域多肽骨架结构，例如，折叠或螺旋构象，(b)靶位点分子的电荷数或疏水性，或(c)侧链大小方面的作用显著不同的取代来完成抗体的生物学性质的基本修饰。基于共同的侧链性质将天然存在的残基分为下列各组：

(1)疏水性：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；

(2)中性亲水性：cys，ser，thr；

(3)酸性：asp，glu；

(4)碱性：asn，gln，his，lys，arg；

(5)影响链取向的残基：gly，pro；和

(6)芳香性：trp，tyr，phe。

非保守性置换需要将这些类别的一个成员变位另一类的成员。

也可以取代保持拮抗剂的合适的构象中没有涉及的任何半胱氨酸残基，一般用丝氨酸，以提高分子的氧化稳定性并且防止异常交联。相反，可以给拮抗剂加半胱氨酸键以提高其稳定性(特别是当拮抗剂是抗体片段例如Fv片段的情况下)。

特别优选的置换变体类型涉及置换亲代抗体(例如人源化或人抗体)一个或多个高变区残基。一般情况下，相对它们从中产生的亲代抗体来说，为进一步开发而筛选得到的变体有改善的生物学性质。产生这样的置换变体的方便方法是使用噬菌体展示的亲合力成熟。简要来说，诱变几个高变区位点(例如6-7个位点)，在各个位点产生所有可能的氨基置换。这样产生的抗体变体以单价形式作为与各个颗粒中包装的M13的基因III产物的融合体从丝状噬菌体颗粒展示。然后如这里公开的对噬菌体展示变体筛选它们的生物学活性(例如结合亲和性)。为了鉴定用于修饰的侯选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变来鉴定对抗原结合起显著作用的高变区残基。或者，或者另外，分析抗原-抗体复合体的结晶结构鉴定抗体和抗原之间的接触点是有益的。这样的接触残基和邻接残基是根据这里描述的技术的置换的候选者。一旦产生这样的变体，就如上所述对一组变体筛选，可以筛选在一项或多项分析中有优越性质的抗体用于进一步研究。

抗体的另一种类型的氨基酸变体改变拮抗剂的原糖基化模式。所谓改变指缺失拮抗剂中的一个或多个糖基，和/或加入拮抗剂中不存在的一个或多个糖基化位点。

多肽的糖基化作用一般是N-连接O-连接。N-连接指糖基与天冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸)是糖基与天冬酰胺侧链的酶学连接的识别序列。这样，多肽中每种这些三肽序列的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸的连接，最常见丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。

通过改变氨基酸序列使得其含有一个或多个上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)方便实现对抗体的糖基化位点的加入。通过对原拮抗剂序列加入一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或者用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基置换，也可以进行改变(对于O-连接的糖基化位点)。

通过各种本领域公知的方法制备编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括，但不限于，从天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)或者通过拮抗剂较早制备的变体或非变体文本的寡核苷酸-介导的(或者定点)诱变、PCR诱变和盒诱变来制备。

期望修饰本发明中使用的抗体以改进效应子功能，例如提高拮抗剂的抗原依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。通过在抗体拮抗剂的Fc区引入一个或多个氨基酸置换来实现。或者，或者另外，可以在Fc区引入半胱氨酸残基，从而在该区内形成链间二硫键。这样产生的同二聚体抗体可能具有改进的内在化能力和/或提高的补体-介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.J；Immunol.148：2918-2922(1992)。根据Wolff等CancerResearch 53：2560-2565(1993)所述，使用异二官能交联剂也可以制备具有提高的抗肿瘤活性的同二聚体抗体。或者，可以对具有二体Fc区的抗体改造，从而具有增强的补体溶胞作用和ADCC能力。参见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。

为了提高抗体的血清半寿期，例如根据美国专利5,739,277所述，可以向拮抗剂(特别是抗体片段)插入补救受体结合表位。此处所用术语″补救受体结合表位″指IgG分子(例如，IgGI，IgG2，IgG3，orIgG4)的Fc区负责提高IgG分子体内血清半寿期的表位。

IV.药物制剂

通过将具有期望纯度的拮抗剂和任选的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂混合制备含有本发明使用的拮抗剂的用于贮存治疗制剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences，16版，Osol，A.Ed.(1980))，是冻干制剂或水溶液形式。可接受载体、赋形剂或稳定剂是在使用的剂量和浓度下对于接受者是无毒的，并且包括例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲液；抗氧化剂例如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如氯化十八烷基二甲基苯甲基铵；氯化己烷双胺；氯苄烷铵；苯索氯铵；苯酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间-甲酚)；低分子量(小于大约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖，二糖，和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂例如EDTA；糖例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐配对离子例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂例如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

免疫调制抗体和B细胞排除抗体可以在相同的制剂中或者可以在不同的制剂中施用。组合物可以进一步包括其他非抗体拮抗剂，例如CD40L或B7拮抗剂。例子包括可溶性CD40、B7及其融合体。可以同时或顺序给药，任何顺序都是有效的。

WO98/56418描述了例示的抗-CD20抗体制剂，特别在这里引作参考。该文献描述了含有40mg/mL rituximab、25mM乙酸盐、150mM海藻糖、0.9％苄醇、0.02％多乙氧基醚20，pH5.0的液体多剂量制剂，其有在2-8℃下贮存两年的最小贮存期。令人感兴趣的另一种抗-CD20制剂包括10mg/mL rituximab的9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/niL多乙氧基醚80和注射用无菌水，pH6.5。

W097/04801描述了适于皮下施用的冻干制剂。这样的冻干制剂可以用合适的稀释剂重新配制成高蛋白质浓度，并且可对这里要治疗的哺乳动物皮下施用重新配制的制剂。

这里的制剂还可以含有要治疗的特定适应症必需的一种以上的活性化合物，优选具有彼此没有负面影响的互补活性的化合物。例如，期望进一步提供化学治疗剂、细胞因子或免疫抑制剂(例如对T细胞作用的试剂，例如环孢菌素或结合T细胞的抗体，例如结合LFA-1的抗体)。这样的其他试剂的有效量取决于制剂中存在的拮抗剂的量、疾病或症状或治疗的类型和上述其他因素。一般以相同剂量使用，给药途径和此前使用的一样，或者是迄今为止剂量的大约1-99％。

活性成分可以包装在制备的微胶囊中，例如，通过30凝聚技术或者通过界面聚合，例如，在胶体药物送递系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳状液，纳米颗粒和纳米胶囊)或者巨乳状液中分别是羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)(poly-(methylmethacylate)微胶囊。这样的技术公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences 16版，Osol，A.Ed.(1980)。

可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物半渗透基质，基质是有形颗粒例如膜或微胶囊形式。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸)，或聚(乙烯醇))，聚交酯(美国专利No.3,773,919)，L-谷氨酸和γL-谷氨酸乙酯共聚物，不降解的乙酸亚乙基-乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和促性腺激素释放激素类似物(leuprolide)乙酸酯组成的可注射微球)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。体内施用的制剂必须是无菌的。这容易通过无菌膜过滤来实现。

V.用B细胞排除抗体和免疫调节抗体治疗

配制含有B细胞排除抗体和/或免疫调节抗体的组合物，剂量化，并且以好的医学实践相吻合的方式给药。这方面考虑的因素包括要治疗的特定B细胞恶性肿瘤或疾病、要治疗的特定哺乳动物、各个患者的邻床症状、疾病或症状的原因、送递药物的位点、给药方法，给药时序和医师公知的的其他因素。这些考虑决定要施用的拮抗剂的治疗有效量。

如前所述，B细胞排除抗体和免疫调节抗体可以在相同或不同的制剂中。这些拮抗剂制剂可以分开或者同时以任何顺序施用。优选地，与免疫调节抗体例如抗-CD40L抗体、抗-CD40抗体或者抗-B7抗体分开施用对B细胞抗原靶物例如CD20、CD19、CD22、CD37或CD22特异性的B细胞排除抗体。优选地，CD40L抗体是美国专利6,001,358公开的人源化抗-CD40L抗体，而抗-B7抗体是美国专利6,113,898公开的灵长类化抗体。如所指出的，最近证明该抗体具有程序性细胞死亡活性。也证明优选的CD40L抗体在治疗T和B自身免疫疾病中具有效力。还有，Biogen报道，和其他人源化抗-CD40L抗体(5c8)不一样，并不知道该抗体引起任何不利的毒性。

作为一般性建议，非肠胃施用抗体治疗有效量每剂量一般在大约每天0.1-500mg/kg患者体重的范围内，拮抗剂的典型的最初范围在大约2-100mg/kg范围内。

优选的B细胞排除抗体是RITUXAN。这样的抗体的合适的剂量是例如大约20mg/m²至大约1000mg/m²范围。抗体的剂量可以是与当前对RITUXAN治疗非何杰金氏淋巴瘤所推荐的剂量相同或不同。例如，可以对患者施用一剂量或多剂量、基本上少于375mg/m²的抗体，例如剂量范围是大约20mg/m²至大约250mg/m²，例如大约50mg/m²至大约200mg/m²。

此外，可以施用一次或多次初始剂量的抗体后施用一次或多次随后剂量，其中随后剂量中抗体的mg/m²剂量超过初始剂量中的mg/m²剂量。例如，初始剂量可以在大约20mg/m²至大约250mg/m²(例如大约50mg/m²至大约200mg/m²)的范围内，随后剂量可以在大约250mg/m²至大约1000mg/m²范围内。

但是如上所述，免疫调节和B细胞排除抗体的这些建议量受限于大量的治疗因素。选择合适的剂量和时序的关键因素是上文指出的获得的结果。例如，对于治疗正在发病的和急性疾病最初需要相对较高剂量。为了获得最有效的结果，根据具体的B细胞恶性肿瘤，尽可能接近疾病或症状的第一征兆、诊断、表现或发生或者在疾病或症状缓解期间施用拮抗剂。

通过任何合适的方法施用抗体，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内，和鼻内，并且如果期望用于局部免疫抑制治疗、病灶内给药。肠胃外灌注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。另外，通过脉冲式注入可以适当地施用抗体，例如用递减剂量的抗体。优选地，通过注射给药(最优选静脉内或皮下注射)，部分取决于用药是否是短暂的还是长期的。

另外可以和这里所述抗体一起施用其他化合物，例如化学治疗剂、免疫抑制剂和/或细胞因子。联合给药包括共同给药，使用分开的制剂或单一的药物制剂，以任何顺序连续给药，其中优选地有一个时间期，其中两种(或所有的)活性物质同时释放它们的生物学活性。

除了对患者施用抗体之外，本发明涉及通过基因疗法施用抗体。表述″施用治疗有效量的拮抗剂″包括这样编码抗体的核酸的施用。参见，例如，1996年3月14日公开的W096/07321，涉及利用基因疗法产生胞内抗体。

主要有两种将核酸(任选地包含在载体中)送递到患者细胞中的方法：体内和离体(ex vivo)。对于体内送递，直接对患者注射核酸，通常在需要拮抗剂的位点。对于离体治疗，取出患者细胞，将核酸导入这些分离的细胞，并且或者直接或者例如在多孔膜中制成胶囊而将修饰过的细胞施加给患者，所述胶囊埋植在患者体内(参见例如美国专利No.4,892,538和5,283,187)。将核酸导入活细胞有多种技术。该技术根据核酸体外转移到培养的细胞中或体内转移到宿主的细胞中而不同。适合核酸体外转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、微注射、细胞融合、DEAF-葡聚糖、磷酸钙沉淀方法等。离体送递基因的常用的载体是逆转录病毒。

目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(例如腺病毒、单纯性疱疹I病毒、或者腺相关病毒)和基于脂质的系统(用于脂质介导的基因转移的有用的脂质例如是DOTMA，DOPE和DC-Chol)的转染。在一些情况下，期望提供带有定向靶细胞的试剂的核酸源，例如对细胞表面膜蛋白质或靶细胞特异性的抗体、靶细胞上受体的配体等。使用脂质体的情况下，可以使用与胞吞作用相关的细胞表面膜蛋白质结合的蛋白质来定向和/或促进摄取，例如特定细胞类型的衣壳蛋白或其片段，经历周期中内在化的蛋白质抗体，定向胞内定位并且提高胞内半寿期的蛋白质。例如Wu等，.J.Biol.Chem 262：4429-4432(1987)；和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3410-3414(1990)描述了受体介导的胞吞作用技术。有关目前已知的基因制备和基因治疗方法的综述参见Anderson等，Science 256：808-8 13(1992)。也参见WO93/25673和这里引述的参考文献。

VI.制品

在本发明的另一个实施方案中，提供了含有用于治疗上述疾病或症状的材料的制品。

所述制品包括容器、容器上或与容器相关的标签或包装附件。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、针管等。容器可以用多种材料制备例如玻璃或塑料。容器盛有或含有对治疗选择的疾病或症状有效的组合物，及可以有无菌入口(例如容器可以是静脉内用溶液包或具有皮下注射针可穿透塞子的小瓶)。总之，可以有一种或几种组合物。那些组合物中一种中至少一种活性物质是具有B细胞排除活性的抗体并且至少一种抗体是免疫调制抗体例如抗-CD40L、抗-CD40、抗-CD23、抗-CD4或抗-B7抗体。标签或包装附件指明该组合物用于治疗患有或有例如上述那些B细胞恶性肿瘤倾向的患者。所述制品可以进一步包括含有药学可接受缓冲液(例如注射用抑制细菌的水(BWFI)、磷酸缓冲盐、Ringer′s溶液和葡萄糖溶液)的另一个容器。其可以进一步包括商业上和用户观点期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头和针管。

通过下面的非限制性实施例详细说明本发明。说明书中所有文献的公开内容特别在这里引作参考。

可以足以产生治疗或预防程度的效果的量根据上述治疗方法对人或其它动物施用本发明的抗体。可以常规剂量形式(通过将本发明的抗体与常规药学可接受载体或稀释剂根据现有技术制备的)对这样的人或其它动物施用本发明的这样的抗体。本领域技术人员应当认识到药学可接受载体或稀释剂的形式和特征受要混合的活性成分的量、给药途经和其它公知变数的限制。

本发明的抗体(或其片段)的给药途经可以是口服、肠胃外、吸入或局部。这里使用的术语肠胃外包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道内给药。一般优选肠胃外给药的皮下和肌内形式。

使用本发明的化合物预防性或治疗性诱导免疫抑制或治疗性处理致癌肿瘤的日肠胃外和口服剂量给药法一般是每千克体重每天大约0.05-100、优选0.5-10毫克范围内。

也可以通过吸入法施用本发明的抗体。所谓″吸入法″指鼻内或口服吸入给药。可以通过常规技术制备这样给药的合适的剂量形式，例如气溶胶制剂或计量吸入器。要使用的本发明化合物的优选剂量一般在大约10-100毫克范围内。

也可以局部施用本发明的抗体。所谓局部施用指不是全身给药并且包括表皮外、口腔外施用本发明的抗体(或其片段)化合物，和将这样的抗体滴入耳内、眼内和鼻内，在那里抗体不明显进入血流。所谓全身给药指口服、静脉内、腹膜内和肌内给药。治疗或预防效果需要的抗体的量当然随着选择的抗体、要治疗的症状的性质和严重程度和动物而不同。

实施例

实施例1

B淋巴细胞。DHT-4细胞的性质

使用接触阿霉素(ADM)的IDEC-131、和B-淋巴瘤细胞系DHL-4(Roos等，Leuk.Res.10：195-202(1986))体外测定了抗-CD40L抗体能够阻断恶性B细胞不经历化学治疗诱导的毒性/程序性细胞死亡的CD40L-CD40介导的存活这一概念。IDEC-131是鼠单克隆抗-人CD40L抗体，24-31的人源化版本。

首先，通过使DHL-4细胞接触不同浓度的ADM 4小时来测定对DHL-4细胞有细胞毒性的最小ADM浓度。通过活细胞Alamar Blue，染料-还原分析(参见Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Meth.202：163-171(1997))测定5天之后培养物中DHL-4细胞的细胞毒性。简要地说，生长培养基(RMPI-1640加10％胎牛血清)中1×10⁵ DHL-4细胞与不同浓度的ADM(1×10^-6M至1×10^-8M)在细胞培养试管中在37℃下温育4小时。温育之后，洗涤细胞，并且重悬于生长培养基中，浓度是1×10⁵细胞/ml，并且向96-孔平底平板每一个孔加入200微升的细胞悬浮液。平板在37℃下温育，并且在不同的时间点测定细胞毒性。温育的最后18小时，向每一个孔加入50微升氧化还原染料Alamar Blue(Biosource International，Cat.&num；DAL 1100)。温育之后，通过在摇动器上在室温下温育10分钟冷却平板，并且测定染料的胞内减少。使用96-孔荧光计在530nm处激发并且在590nm处发射测定荧光。结果表示为相对荧光单位(RFU)。如下计算细胞毒性百分比：

[1-(试验样品的平均RFU÷对照细胞的平均RFU)]×100％。

建立ADM细胞毒性滴定曲线，并且针对随后的试验选择药物细胞毒性的最小浓度。

如图1所示结果，说明在培养之前接触ADM(2×10^-7M和4×10^{- 8}M的ADM)4小时之后培养5天的DHL-4细胞的细胞毒性。接触之后洗涤细胞一次，并且在培养基中培养5天，并且通过如上所述AlamarBlue染料摄取分析测定细胞毒性。另外，通过流式细胞计数仪对表征DHL-4细胞选择的CD分子的膜表达。发现DHL-4细胞表达CD19、CD20、CD40分子，但是没有检测到CD40L表达。

实施例2

抗-CD40L抗体克服CD40L介导的淋巴细胞的对阿霉素杀伤的 抗性

图2A说明抗-CD40L抗体对CD40L-CD40介导的DHL-4细胞对ADM诱导的细胞死亡的抗性的作用。在37℃下，在10微克/毫升可溶性CD40L(sCD40L，P.A.Brams，E.A.Padlan，K.Hariharan，K.Slater，J.Leonard，R.Noelle，和R.Newman，″A humanizedanti-human CD 154 monoclonal antibody blocks CD 154-CD40mediated human B cell activation，″(投递的稿件))的存在下，将DHL-4细胞(0.5×10⁶细胞/ml)温育1小时。温育1小时后，加入低浓度的ADM(2×10^-7M至4×10^-8M)，并且在存在或不存在CD40L(10μg/ml)下再温育4小时。接触ADM之后，洗涤细胞并且以0.5×10⁶细胞/ml的浓度重悬于生长培养基中，一式两份，向96-孔平底平板每一个孔加入100微升的细胞悬浮液，有或没有sCD40L。向在ADM处理期间连续接触sCD40L的培养物和在ADM接触期间没有sCD40L的培养物加入sCD40L(10μg/ml)。另外，向培养物加入10μg/ml的IDEC-131测定其对与sCD40L和ADM温育的DHL-4细胞的作用。5天之后，如上所述通过Alamar Blue染料摄取测定细胞毒性。

数据表明sCD40L延长了DHL-4细胞在ADM处理之后的存活期，而正如所预期的，在没有sCD40L存在下接触ADM的细胞中观察到提高的细胞毒性。此外，加入抗-CD40L抗体(mEC-131)逆转了CD40L介导的细胞存活，导致细胞毒性提高(图2A)。

单独加入IDEC-131对用sCD40L处理过的细胞没有影响，这表明抗体本身对DHL-4细胞没有直接的抑制或细胞毒性活性(图2B)。在不同浓度的IDEC-131、RITUXAN、抗-CD20抗体CE9.1，和抗-CD4抗体(Anderson等，Clin.Immunol.& Immunopathol.84：73-84(1997)的存在下培养用或不用sCD40L预先温育的DHL-4细胞。5天之后，如上所述通过Alamar Blue测定来测定DHL-4细胞的细胞毒性/增殖。图2B表明，IDEC-131对DHL-4细胞的细胞毒性或增殖没有作用，而正如所预期的，RITUXAN抑制细胞增殖并且诱导细胞毒性。与抗-CD4抗体培养的DHL-4细胞没有观察到效果。

实施例3

CD40L-CD40信号发生通过抗-CD20抗体，RITUXAN防止B 淋巴细胞的程序性细胞死亡

使用涉及DHL-4细胞和RITUXAN表面交联剂的体外系统测定CD40L-CD40介导的信号发生对抗-CD20抗体诱导的B淋巴细胞的程序性细胞死亡的作用。37℃下DHL-4细胞(0.5至1×10⁶细胞/毫升)与sCD40L(10μg/毫升)培养。培养过夜之后，收集细胞并且与10μg/ml的RITUXAN或对照抗体(CE9.1；抗-CD4抗体)在有或没有sCD40L(10μg/ml)下在冰上温育。温育1小时之后，将细胞离心去除没有结合的抗体，并且以1×10⁶细胞/ml重悬于生长培养基(5％FCS-RPMI)中，并且在组织培养试管中培养。通过掺入15微克/毫升的山羊抗人Ig-Fcγ特异性抗体的F(ab′)₂片段交联细胞表面结合的抗体，并且37℃下培育培养物，直到用于程序性细胞死亡分析。使用流式细胞计天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)分析检测程序性细胞死亡。在第4和第24小时收集培养的细胞，洗涤并且使用Cytofix(Cytofix/Cytopem^TM Kit，Pharmingen #2075KK)在4℃固定。固定20分钟之后，洗涤细胞，并且加入15微升亲和纯化的PE-缀合的多克隆兔抗-caspase-3抗体(Pharmingen，Cat.#67345)和50微升的cytoperm(Pharmingen；Cat.#2075KK)。细胞在避光下在冰上温育30分钟。温育之后将细胞洗涤一次并且重悬于cytoperm。在FACScan上获得流式细胞计数据并且使用从Verity Software House获得的WinList软件分析。

表I显示了通过接触sCD40L在DHL-4淋巴细胞中的RITUXAN诱导的程序性细胞死亡的抗性。在这些研究中，caspase-3的活化被用作替代标记，因为我们前面的研究表明caspase-3和Tunel分析之间有好的相关性。在sCD40L存在下DHL-4细胞表面上RITUXAN的交联降低了程序性细胞死亡的水平，而没有接触sCD40L的细胞则发生程序性细胞死亡。比较而言，在相同同种型抗体，对照抗体(CE9.1)的存在下温育的培养物，没有导致细胞的程序性细胞死亡。因此，数据提示sCD40L诱导的CD40途经信号发生能够导致RITUXAN介导的B淋巴细胞杀伤的出现。

表I：

sCD40L对RITUXAN介导的DHL-4细胞的编程性细胞死亡的抗性

培养条件	％程序性细胞死亡(IVHF)(a)4小时           24小时
		接触sCD40L的DHT-4细胞只有细胞细胞+RITUXAN细胞+RITUXAN+抗-人IgG.F(ab’)2细胞+CE9.1细胞+CE9.1+抗-人IgG.F(ab’)2细胞+抗-人IgG.F(ab’)2	3.35(17.42)     4.94(7.62)1.97(1.97)      4.54(6.54)21.17(17.39)    9.62(13.44)2.31(13.25)     4.15(7.85)2.09(22.14)     4.14(9.57)1.93(12.57)     5.13(8.02)
没有接触sCD40L的DHL细胞只有细胞细胞+RITUXAN细胞+RITUXAN+抗-人IgG.F(ab’)2细胞+CE9.1细胞+CE9.1+抗-人IgG.F(ab’)2细胞+抗-人IgG.F(ab’)2	4.36(14.34)     5.08(17.62)5.67(10.66)     1.08(17.92)74.82(22.80)    30.63(26.84)5.99(14.00)     3.05(18.24)5.96(12.11)     2.24(18.19)6.09(12.27)     1.85(17.27)

^(a)具有caspase-3活性的阳性细胞百分比及以对数表示的其平均荧光强度。

实施例4

IDEC-131对慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞存活的影响

为了测定IDEC-131体外对B-CLL细胞的生长和存活的影响，在体外存在CD40L下，B-CLL细胞与或者不与IDEC-131培养。使用Ficoll-Hypaque梯度离心从CLL患者血液分离外周血单核细胞(PBMC)。通过苔酚(Trypan)蓝染料排除测定存活率并且＞98％。流式细胞术分析表明＞70％的淋巴细胞是CD 19⁺/CD20⁺。CLL细胞(PBMC)在CLL生长培养基(例如，补充有5％FCS或2％自体供者血浆，补充有2mM L-谷酰胺和100U/ml青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基)中培养。另外，对于一些试验，使用CD19+Dynabeads根据厂商说明(Dynal，Cat.#111.03/111.04)纯化CD19⁺B-细胞，并且如上所述培养。在生长培养基中培养的CLL或纯化的B-CLL细胞大多数自发发生程序性细胞死亡式细胞死亡。但是，在sCD40L存在下培养这些细胞延长了它们在培养基中的存活。表II表明在不同的时间点有或没有sCD40L(5μg/ml)下培养的CD 19⁺B-CLL细胞的细胞存活力，并且表明了更长存活的CLL细胞。来自患者#1的B-CLL细胞与sCD40L培养，具有≥60％大于2周的存活力，而没有sCD40L存在下培养的细胞存活力小于10％。

表II：

sCD40L存在下B-CLL细胞的存活

B-CLL样品	时间(小时)	％存活(a)
				(-)CD40L	(+)CD40L
		患者#1	04896144			≥90884630	≥90907772
患者#2	07296144			≥90403117	≥90726551

^(a)等于通过苔酚蓝染料排除测定的存活百分比。

图3A表明7天之后培养物中IDEC-131对B-CLL细胞的生长和存活的影响。来自CLL患者的纯化的B-CLL细胞(2×10⁶细胞/ml)分为两个培养试管。一个试管中的细胞与等体积的生长培养基中的sCD40L(5μg/ml)混合，而另一个试管与等体积的生长培养基温育作为对照。37℃下温育1小时之后，细胞小心地混合并加入100微升细胞悬浮液培养基至96一孔平底板地每一个孔中，一式两份，有和没有各种浓度的IDEC-131(10μg/ml至0.3μg/ml)。7天之后，如上所述，通过Alamar Blue测定来测定培养物中细胞的存活/死亡。数据表明有sCD40L的培养物中细胞存活。向培养物中加入IDEC-131导致增加的细胞死亡，表明细胞存活或对细胞死亡敏感性逆转。另外，以和IDEC-131相同的浓度施用RITUXAN对细胞死亡产生比IDEC-131低的影响(图3B)。

实施例5

B-CLL中CD40L-CD40介导的HLA-DR分子的上调

为了测定CD40L-CD40信号传导途经是否是完整的，在37℃下，有或没有5μg/ml的CD40下培养来自CLL患者的CLL细胞(5×10⁵细胞/ml)。48小时和144小时之后，使用标准程序通过流式细胞计对CD 19⁺细胞测定II类分子，HLA-DR的表达。简要地说，在不同的时间点收集培养的淋巴细胞，并且使用与荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)偶联的抗体的单或双染色使用FACScan(Becton-Dickinson)流式细胞计分析分子的表面表达。为了对流式细胞计染色，培养管中的1×10⁶细胞与下面的合适的抗体温育：对散点图上分门(gate)淋巴细胞群的抗-CD45-FITC；抗-CD19-PE(Pharmingen，Cat.#30655)或抗-CD20-FITC(Pharmingen；Cat.#33264)抗体，测定CD19⁺和/或CD20⁺ B-细胞；抗-CD3-FITC抗体(Pharmingen；Cat.#30104)，关闭(gate-off)T细胞；抗-CD 19-RPE和抗-HLA-DR-FITC抗体(Pharmingen；Cat.#32384)，测定CD 19⁺细胞上II类表达。用2毫升冷PBS通过离心(200×g，6分钟)洗涤一次细胞，并且与抗体在冰上温育30分钟，之后将细胞洗涤一次，在0.5％多聚甲醛中固定并且在4℃贮存直到分析。在FACScan上获得流式细胞计数据并且使用软件(Verity Software HouseWinList)分析。将机器设置为自动分类(autogating)使进行含有RPE或FITC单一染色的、没有染色的或双染色的细胞的四分体(quadrant)的检查。图4表明sCD40L培养的CD19⁺ CLL细胞和没有与sCD40L培养的那些细胞中HLA-DR表达的比较。sCD40L存在下培养的B-CLL细胞上观察到高水平HLA-DR表达(表III)。

                    表III

    B-CLL中CD40L-CD40介导的HLA-DR分子的上调

样品	时间	HLA-OR+(a)
				阳性％	MFI
		对照	48小时144小时			8188	921655
细胞+sCD40L	48小时144小时			8895	1012943

(a)对HLA-DR分子呈阳性的细胞和其平均荧光强度(MIF).

实施例6

IDEC-131和RITUXAN的制备

对于CD40⁺恶性肿瘤的治疗，对受试者静脉内(iv)输入制剂缓冲液10mM柠檬酸钠、150mM NaCl、0.02％多乙氧基醚80、pH6.5中大约10至大约50mg/ml的IDEC-131。在RITUXAN之前、之后或联合施用IDEC-131。输入的RITUXAN剂量范围是大约3至大约10mg/kg受试者体重。

实施例7

IDEC-131和CHOP的制备

对响应CHOP的CD40⁺恶性肿瘤的治疗(例如，何杰金氏疾病，非何杰金氏疾淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病，以及其中细胞是CD40⁺的恶性肿瘤的补救性治疗)，在CHOP周期开始之前立即输入剂量范围是大约3至大约10mg/kg患者体重的IDEC-131。在各CHOP周期之前反复施用IDEC-131，共进行4-8个周期。

实施例8

与RITUXAN联合施用抗-CD40L和抗-B7治疗受试者的B-细胞 淋巴瘤

联合治疗作为补救治疗或治疗复发或侵袭性形式的CD40⁺恶性肿瘤(例如何杰金氏疾病，非何杰金氏疾淋巴瘤和CLL)特别有用。当IDEC-131要与CHOP和RITUXAN联合施用时，如实施例6所述施用IDEC-131，接着是实施例7中CHOP-IDEC-131施用规定的时序。或者，实施相同的给药法，其中IDEC-131(抗-CD40L)基本上在抗-B7抗体中。

所有的上面引用的文献在这里全文引作参考。

Claims (103)

1.一种治疗CD40⁺恶性肿瘤的方法，包括施用治疗有效量的结合CD40L从而抑制CD40/CD40L相互作用或CD40信号发生的抗体或抗体片段。

2.权利要求1的方法，其中所述CD40⁺恶性肿瘤是B-细胞性淋巴瘤或B-细胞性白血病。

3.权利要求2的方法，其中所述B-细胞性淋巴瘤是何杰金氏疾病(HD)或非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。

4.权利要求3的方法，其中所述NHL是低级、中级或高级。

5.权利要求3的方法，其中所述NHL是选自下面的亚型：小淋巴细胞的、滤泡的和显著小裂解细胞、滤泡和混合的小的裂解的和大细胞类型、滤泡和显著大细胞类型、扩散的小裂解细胞、扩散混合的小和大细胞、扩散大细胞、大细胞成免疫细胞的、成淋巴细胞的、小的非裂解的伯基特氏和非伯基特氏型、AIDS-相关淋巴瘤、血管成免疫细胞淋巴结病、外套细胞淋巴瘤和单核细胞样B细胞性淋巴瘤。

6.权利要求2的方法，其中所述B-细胞性白血病是慢性B-细胞性白血病、急性B-细胞系成淋巴细胞性白血病或慢性B-细胞系淋巴细胞性白血病。

7.权利要求2的方法，其中所述结合CD40L的抗体或抗体片段是IDEC-131、3E4、2H5、2H8、4D9-8、4D9-9、24-31、24-43、89-76或89-79。

8.权利要求7的方法，其中所述抗体或抗体片段是嵌合的、双特异性的、人或人源化的。

9.权利要求2的方法，其中所述抗体片段是Fab、Fab’、scFv或F(ab’)₂。

10.权利要求2的方法，进一步包括施用治疗有效量的另一抗体或其片段、化学治疗剂、化学治疗剂和/或放射治疗剂的组合。

11.权利要求10的方法，其中所述放射治疗是外部放射治疗或放射性标记抗体。

12.权利要求11的方法，其中所述放射性标记抗体是放射性标记的IDEC-131、RITUXAN或B1或者其片段。

13.权利要求12的方法，其中所述放射性标记抗体是用¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In、¹³¹In、³²P、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、²¹¹At、¹⁷⁷Lu、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、²¹²Pb、²¹²Bi、⁴⁷Sc、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹⁵³Sm、¹⁸⁸Re、¹⁹⁹AU、²¹¹At、和²¹³Bi放射性标记的。

14.权利要求10的方法，其中所述用于治疗HD的化学治疗剂是下面的一种或几种：烷基化试剂、长春花生物碱、甲基苄肼、氨甲喋呤或强的松。

15.权利要求10的方法，其中所述用于治疗NHL的化学治疗剂是下面的一种或几种：烷基化试剂、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、2-CDA、2’-脱氧助间型霉素、氟达拉滨、阿糖孢苷、顺铂、鬼臼亚乙苷或异环磷酰胺。

16.权利要求10的方法，其中用于治疗HD的化学治疗剂组合是：MOPP、ABVD、ChlVPP、CABS、MOPP加ABVD、MOPP加ABV、BCVPP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、CEM、MTX-CHOP、EVAP或EPOCH。

17.权利要求10的方法，其中用于治疗NHL的化学治疗剂组合是：CVP、CHOP、C-MOPP、CAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEPP(B)或CAMP。

18.权利要求10的方法，其中用于治疗B-细胞性白血病的化学治疗剂至少是下面的一种：氨茴环霉素，环磷酰胺，L-天冬酰胺酶(L-asparginase)和嘌呤类似物。

19.权利要求10的方法，其中用于治疗B-细胞性白血病的化学治疗剂组合是：长春花新碱、强的松、氨茴环霉素和环磷酰胺或天冬酰胺酶；长春花新碱、强的松、氨茴环霉素、环磷酰胺和天冬酰胺酶；CHOP；CMP；CVP；COP或CAP。

20.权利要求10的方法，其中所述另一抗体选自抗-CD20抗体、抗-CD19抗体、抗-CD22抗体和抗-CD40抗体。

21.权利要求21的方法，其中所述抗-CD20抗体是RITUXAN或者其片段，或B1或者其片段。

22.一种治疗CD40⁺恶性肿瘤的方法，包括施用抗-CD40L抗体或者其片段的步骤，其中抗-CD40L抗体或者抗体片段阻断CD40-CD40L相互作用或者抑制CD40信号发生；和包括施用选自抗-CD20抗体、抗-CD40抗体、抗-CD19抗体和抗-CD22抗体或者其片段的另一抗体或其片段。

23.权利要求22的方法，其中所述CD40⁺恶性肿瘤是B-细胞性淋巴瘤或B-细胞性白血病。

24.用于治疗CD40⁺恶性肿瘤的联合疗法，包括CD40L拮抗剂和下面的至少一项(a)化学治疗剂或化学治疗剂的组合，(b)放射治疗，(c)抗-CD20抗体或者其片段，和(d)抗-CD40抗体或者其片段，(e)抗-CD19抗体或者其片段，和(f)抗-CD22抗体或者其片段。

25.权利要求24的方法，其中所述放射治疗是外部放射治疗或放射性标记的抗体。

26.权利要求25的方法，其中所述放射性标记的抗体是用¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹Ih、¹³¹In、³²P、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、²¹¹At、¹⁷⁷Lu、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、²¹²Pb、²¹²Bi、⁴⁷Sc、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹⁵³Sm、¹⁸⁸Re、¹⁹⁹Au、²¹¹At、和²¹³Bi放射性标记的。

27.权利要求24的联合疗法，其中所述CD40⁺恶性肿瘤是B-细胞性巴瘤或B-细胞性白血病。

28.权利要求27的联合疗法，其中所述B-细胞性淋巴瘤是HD或NHL。

29.权利要求28的联合疗法，其中所述NHL是低级、中级或高级。

30.权利要求28的联合疗法，其中所述NHL是选自下面的亚型：小淋巴细胞的滤泡的和显著小裂解细胞、滤泡和混合的小的裂解的和大的细胞类型、滤泡和显著大细胞类型、扩散小裂解细胞、扩散混合的小和大细胞、扩散大细胞、大细胞成免疫细胞的、成淋巴细胞的、小的非裂解的伯基特氏和非伯基特氏型、AIDS-相关淋巴瘤、血管成免疫细胞淋巴结病、外套细胞淋巴瘤、单核细胞样B细胞性淋巴瘤。

31.权利要求28的联合疗法，其中所述B-细胞性白血病是慢性B-细胞性白血病、急性B-细胞系成淋巴细胞性白血病或慢性B-细胞系淋巴细胞性白血病。

32.权利要求24的联合疗法，其中所述CD40L拮抗剂是抗-CD40L抗体或者其片段。

33.权利要求32的联合疗法，其中所述抗-CD40L抗体是IDEC-131或者其片段。

34.权利要求32的联合疗法，其中所述抗-CD40L片段是Fab、Fab’、scFv或F(ab’)₂。

35.权利要求24的联合疗法，其中所述抗-CD20抗体是RITUXAN或者其片段或B1或者其片段。

36.权利要求28的联合疗法，其中所述用于治疗HD的化学治疗剂是下面的一种或几种：烷基化试剂、长春花生物碱、甲基苄肼、氨甲喋呤或强的松。

37.权利要求28的联合疗法，其中所述用于治疗NHL的化学治疗剂是下面的一种或几种：烷基化试剂、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、2-CDA、2’-脱氧助间型霉素、氟达拉滨、阿糖孢苷、顺铂、鬼臼亚乙苷或异环磷酰胺。

38.权利要求28的联合疗法，其中用于治疗HD的化学治疗剂组合是：MOPP、ABVD、ChlVPP、CABS、MOPP加ABVD、MOPP加ABV、BCVPP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、CEM、MTX-CHOP、EVAP或EPOCH。

39.权利要求28的联合疗法，其中用于治疗NHL的化学治疗剂组合是：CVP、CHOP、C-MOPP、CAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEPP(B)或CAMP。

40.权利要求28的联合疗法，其中用于治疗B-细胞性白血病的化学治疗剂是：氨茴环霉素、环磷酰胺、L-天冬酰胺酶和嘌呤类似物。

41.权利要求28的联合疗法，其中用于治疗B-细胞性白血病的化学治疗剂组合是：长春花新碱、强的松、氨茴环霉素和环磷酰胺或天冬酰胺酶；长春花新碱、强的松、氨茴环霉素，环磷酰胺和天冬酰胺酶；CHOP；CMP；CVP；COP或CAP。

42.一种用于治疗CD40⁺恶性肿瘤的组合物，包括(i)抗-CD40L抗体或者其抗体片段和至少下面的一项：(ii)结合CD40L、CD19、CD22或CD20的放射性标记的抗体，(iii)抗-CD20、抗-CD19抗体、抗-CD22抗体或者其片段，或(iv)化学治疗剂或化学治疗剂组合。

43.权利要求42的治疗CD40⁺恶性肿瘤的组合物，其中所述恶性肿瘤是B-细胞性淋巴瘤或B-细胞性白血病。

44.权利要求43的组合物，其中所述B-细胞性白血病是何杰金氏疾病或NHL。

45.权利要求42的组合物，其中所述放射性标记抗体是放射性标记的IDEC-131、RITUXAN或B1。

46.权利要求46的组合物，其中所述放射性标记抗体是用¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In、¹³¹In、³²P、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、²¹¹At、¹⁷⁷Lu、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、²¹²Pb、²¹²Bi、⁴⁷Sc、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹⁵³Sm、¹⁸⁸Re、¹⁹⁹Au、²¹¹At、和²¹³Bi放射性标记的。

47.权利要求44的组合物，其中所述NHL是低级、中级或高级。

48.权利要求44的组合物，其中所述NHL是选自下面的亚型：小淋巴细胞的、滤泡的和显著小裂解细胞、滤泡和混合的小的裂解的和大的细胞类型、滤泡和显著大细胞类型、扩散小裂解细胞、扩散混合的小和大细胞、扩散大细胞、大细胞成免疫细胞的、成淋巴细胞的、小的非裂解的伯基特氏和非伯基特氏型、AIDS-相关淋巴瘤、血管成免疫细胞淋巴结病、外套细胞淋巴瘤、单核细胞样B细胞性淋巴瘤。

49.权利要求42的组合物，其中所述抗-CD40L抗体是IDEC-131或者其片段。

50.权利要求42的组合物，其中所述抗-CD20抗体是RITUXAN或其片段或B1或其片段。

51.权利要求43的组合物，其中所述用于治疗HD的化学治疗剂是下面的一种或几种：烷基化试剂、长春花生物碱、甲基苄肼、氨甲喋呤或强的松。

52.权利要求44的组合物，其中所述用于治疗NHL的化学治疗剂是下面的一种或几种：烷基化试剂、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、2-CDA、2’-脱氧助间型霉素、氟达拉滨、阿糖孢苷、顺铂、鬼臼亚乙苷或异环磷酰胺。

53.权利要求44的组合物，其中用于治疗HD的化学治疗剂组合是：MOPP、ABVD、ChlVPP、CABS、MOPP加ABVD、MOPP加ABV、BCVPP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、CEM、MTX-CHOP、EVAP或EPOCH。

54.权利要求44的方法，其中用于治疗NHL的化学治疗剂组合是：CVP、CHOP、C-MOPP、CAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEPP(B)或CAMP。

55.权利要求43的组合物，其中用于治疗B-细胞性白血病的化学治疗剂是：氨茴环霉素、环磷酰胺，L-天冬酰胺酶、嘌呤类似物。

56.权利要求43的组合物，其中用于治疗B-细胞性白血病的化学治疗剂组合是：长春花新碱、强的松、氨茴环霉素和环磷酰胺或天冬酰胺酶；长春花新碱、强的松、氨茴环霉素，环磷酰胺和天冬酰胺酶；CHOP；CMP；CVP；COP或CAP。

57.一种对需要治疗的B细胞恶性肿瘤患者治疗的方法，包括施用治疗有效量的至少一种选自抗-CD23、抗-B7、抗-CD40、抗-CD40L和抗-CD4抗体的免疫调节或免疫调制抗体和至少一种B细胞排除抗体，其中以分开、联合或以任何顺序给药进行所述抗体施用。

58权利要求57的方法，其中所述B细胞排除抗体选自抗-CD19、抗-CD20、抗-CD22和抗-CD37抗体。

59.权利要求57的方法，其中所述B-细胞恶性肿瘤是非何杰金氏疾淋巴瘤。

60.权利要求59的方法，其中所述NHL是选自下面的亚型：小淋巴细胞的、滤泡的和显著小裂解细胞、滤泡和混合的小的裂解的和大的细胞类型、滤泡和显著大细胞类型、扩散小裂解细胞、扩散混合的小和大细胞、扩散大细胞、大细胞成免疫细胞的、成淋巴细胞的、小的非裂解的伯基特氏和非伯基特氏型、AIDS-相关淋巴瘤、血管成免疫细胞淋巴结病、外套细胞淋巴瘤、单核细胞样B细胞性淋巴瘤。

61.权利要求60的方法，其中所述NHL是低级、中级或高级。

62.权利要求60的方法，其中所述B细胞排除抗体是抗-CD20或抗-CD22抗体。

63.权利要求62的方法，其中所述抗-CD20抗体是RITUXAN。

64.权利要求62的方法，其中所述抗-CD20抗体是人或人源化抗体。

65.权利要求57的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤是B细胞性淋巴瘤。

66.权利要求1的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤是白血病。

67.权利要求66的方法，其中所述白血病是慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病或慢性B-细胞性白血病。

68.权利要求57的方法，其中治疗包括施用抗-B7抗体和抗-CD20抗体。

69.权利要求68的方法，其中所述抗-CD20抗体是RITUXAN。

70.权利要求68的方法，其中所述抗-B7抗体是Primatized抗体。

71.权利要求70的方法，其中所述抗-B7抗体诱导癌细胞的程序性细胞死亡。

72.权利要求57的方法，其中在B细胞排除抗体之后施用免疫调节抗体。

73.权利要求57的方法，其中在B细胞排除抗体之前施用免疫调节抗体。

74.权利要求57的方法，其中在彼此大约一个月之内施用B细胞排除抗体和免疫调节抗体。

75.权利要求57的方法，其中在彼此大约一周之内施用B细胞排除抗体和免疫调节抗体。

76.权利要求57的方法，其中在彼此大约一天之内施用B细胞排除抗体和免疫调节抗体。

77.权利要求57的方法，其中治疗的B细胞恶性肿瘤选自复发的何杰金氏病、抗性何杰金氏病、低级、中级、高级非何杰金氏淋巴瘤、小淋巴细胞/B细胞慢性淋巴细胞性白血病(SLL/B-CLL)、淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)、外套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡淋巴瘤(FL)、扩散大细胞淋巴瘤(DLCL)、伯基特氏淋巴瘤(BL)、AIDS-相关淋巴瘤、单核细胞B细胞淋巴瘤、血管成免疫细胞淋巴结病，小淋巴细胞；滤泡、扩散大细胞；扩散小裂解细胞；大细胞成免疫细胞淋巴细胞瘤；小的、未裂解的；伯基特氏和非伯基特氏；滤泡、显著大细胞；滤泡、显著小裂解细胞；和滤泡、混合的小裂解的和大细胞淋巴瘤。

78.权利要求77的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤是何杰金氏病。

79.权利要求57的方法，其中一个抗体或两个抗体与放射性标记连接。

80.权利要求57的方法，其进一步包括化学治疗或放射治疗。

81.权利要求57的方法，其包括施用对CD40L或B7特异性的非抗体拮抗剂。

82.一种治疗非何杰金氏淋巴瘤的方法，包括分开或联合施用治疗有效量的B7抗体和B细胞排除抗-CD20或抗-CD22抗体。

83.权利要求82的方法，其中所述抗-CD20抗体是RITUXAN。

84.权利要求82的方法，其中所述抗-B7抗体不抑制B7抗原与CTLA4的相互作用。

85.权利要求84的方法，其中所述抗-B7抗体是人、人源化、灵长类化或灵长类抗体。

86.权利要求82的方法，其中所述NHL是高级、中级或低级。

87.权利要求82的方法，其包括施用放射性标记抗体。

88.一种治疗白血病的方法，包括施用治疗有效量的抗-B7抗体和对CD20或CD22特异性的B细胞排除抗体。

89.权利要求88的方法，其中所述抗-CD20抗体是RITUXAN(ATCC69119提供的抗体)。

90.权利要求88的方法，其中所述白血病是慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病或慢性B-细胞性白血病。

91.权利要求88的方法，其中所述抗体之一或两者是嵌合的、双特异性的、人或人源化抗体。

92.权利要求57的方法，其中所述抗-B7抗体是排除抗体。

93.权利要求57的方法，其中所述抗-B7抗体是非排除抗体。

94.权利要求57的方法，其中所述抗-B7抗体特异性结合B7.1(CD80)。

95.权利要求57的方法，其中所述抗-B7抗体特异性结合B7.2(CD86)。

96.权利要求57的方法，包括施用放射性标记的抗-CD22或抗-CD22抗体。

97.权利要求96的方法，其中所述放射性标记是钇。

98.权利要求97的方法，其中所述放射性标记的抗-CD20是钇标记的RITUXAN或钇标记的2B8。

99.权利要求82的方法，其中所述抗-B7抗体是非排除抗体。

100.权利要求82的方法，其中所述抗-B7抗体是排除抗体。

101.权利要求82的方法，其中所述非何杰金氏淋巴瘤选自小淋巴细胞的、滤泡的和显著小裂解细胞、滤泡和混合的小的裂解的和大的细胞类型、滤泡和显著大细胞类型、扩散小裂解细胞、扩散混合的小和大细胞、扩散大细胞、大细胞成免疫细胞的、成淋巴细胞的、小的非裂解的伯基特氏和非伯基特氏型、AIDS-相关淋巴瘤、血管成免疫细胞淋巴结病、外套细胞淋巴瘤、单核细胞样B细胞性淋巴瘤。

102.权利要求57的方法，其包括化学治疗。

103.权利要求82的方法，其包括化学治疗。