CN1568198A - 免疫调节抗体在治疗肿瘤性疾病中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于治疗B细胞恶性肿瘤的联合抗体治疗，使用免疫调节抗体，特别是抗B7、抗CD23或抗CD40L抗体，和B细胞耗尽抗体，特别是抗CD19、抗CD20、抗CD22或抗CD37抗体。优选所述联合治疗将包括施用抗B7抗体和抗CD20抗体。

Description

免疫调节抗体在治疗肿瘤性疾病中的用途

相关申请的交叉参考

本申请要求以下专利申请的优先权：2001年1月31日提交的美国顺序号No.09/772,938；2001年5月16日提交的美国顺序号No.09/855,717；2001年11月5日提交的美国顺序号No.09/985,646和2001年11月9日提交的美国临时申请No.60/331,187，上述各申请以其整体引入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及用于治疗肿瘤，特别是B细胞淋巴瘤和白血病的协同联合抗体治疗。在优选的实施方案中，该协同抗体组合包含一种调节或调制免疫系统的抗体，例如通过调节B细胞/T细胞相互作用和/或B细胞活性、分化或增殖(例如抗-B7，抗-CD40，抗-CD23或抗-CD40L)；以及任选地至少一种具有实质性B细胞耗尽活性的抗体(例如抗-CD19，CD20，CD22或CD37抗体)。在其他优选的实施方案中，本发明可包含两种诸如抗-CD40L和抗-B7的免疫调节抗体的协同组合。

发明背景

脊椎动物(例如包括人、猿和猴子等的灵长类动物)的免疫系统由多种器官和细胞类型组成，其进化为：准确地并特异性地识别侵入脊椎动物宿主的外来微生物(“抗原”)；特异性地结合这种外来微生物；并消除/破坏这种外来微生物。淋巴细胞，以及其他类型的细胞，对于免疫系统和消除及破坏外来微生物是关键的。淋巴细胞在胸腺、脾脏和骨髓(成年人)中产生，占人(成年人)的循环系统中存在的白血细胞总数的约30％。淋巴细胞有两种主要的亚群：T细胞和B细胞。T细胞负责细胞介导的免疫，而B细胞负责抗体产生(体液免疫)。但是，T细胞和B细胞可被认为是互相依赖的——在典型的免疫应答中，当T细胞受体与抗原片段结合时，T细胞被激活，而这种抗原片段是与抗原呈递细胞表面上的主要组织相容性复合体(“MHC”)糖蛋白相结合的；这种活化导致生物介质(“白介素”或“细胞因子”)的释放，其在本质上刺激B细胞分化和产生针对该抗原的抗体(“免疫球蛋白”)。

宿主中的每个B细胞在其表面上表达一种不同的抗体——由此一个B细胞会表达特异性针对一种抗原的抗体，而另一个B细胞会表达特异性针对不同的抗原的抗体。相应地，B细胞相当多样，而这种多样性对于免疫系统是关键的。在人类中，每个B细胞可产生数量巨大的抗体分子(即，约10⁷至10⁸)。这种抗体产生最典型的是当外来抗原被中和时停止(或大量减少)。但是，偶尔地，特定B细胞的增殖会持续不衰；此种增殖可导致一种被称为“B细胞淋巴瘤”的癌症。

非霍奇金淋巴瘤是一种特征在于B淋巴细胞恶性生长的淋巴瘤。根据美国癌症学会估计将有54000新病例被诊断，其中65％将被分类为中间-或高-分级淋巴瘤。被诊断为中间分级淋巴瘤的患者的平均存活率为2-5年，而被诊断为高分级淋巴瘤的患者在确诊后平均存活6个月至2年。

传统疗法包括化疗和辐射，如果可以找到合适的供体和如果在采收时骨髓含有太多肿瘤细胞，可能同时进行自体或同种异体骨髓或干细胞移植。尽管患者通常对传统疗法有反应，他们常在数月之内复发。

已知B细胞恶性肿瘤，例如B细胞淋巴瘤和白血病，可使用具有B细胞耗尽活性的特异性针对B细胞抗原的抗体成功地进行治疗。已报道具有实际的或潜在的治疗B细胞恶性肿瘤的应用价值的B细胞抗体的实例包括特异性针对CD20，CD19，CD22，CD37和CD40的抗体。

另外，已广泛报道使用具有B细胞耗尽活性的抗CD37抗体具有治疗B细胞淋巴瘤的潜能。参见，例如，Presr等，J.Clin.Oncol.7(8)：1027-1038(1989年8月)；Grossbard等，Blood 8(4)：863-876(1992年8月15日)。

CD20是一种在超过90％B细胞淋巴瘤上表达的细胞表面抗原，其在肿瘤细胞中不脱落或调变(McLaughlin等，J.Clin.Oncol.16：2825-2833(1998b))。CD20抗原是一种非糖基化的35kDa的B细胞膜蛋白，其参与细胞内信号作用，B细胞分化和钙离子通道转移(Clark等，Adv.Cancer Res.52：81-149(1989)；Tedder等，Immunology Today15：450-454(1994))。该抗原作为人B细胞系的早期标记出现，并以不同抗原密度在正常和恶性B细胞群上均普遍表达。但是，该抗原在完全成熟的B细胞(例如浆细胞)、早期B细胞群和干细胞上缺失，使其成为抗体介导疗法的合适靶标。

已制备了抗CD20抗体用于研究和治疗。一种抗CD20抗体是单克隆B1抗体(美国专利No.5,843,398)。还制备了放射性核素形式的抗CD20抗体，用于治疗B细胞淋巴瘤(例如¹³¹I标记的抗CD20抗体)，以及⁸⁹Sr标记的形式用于缓解由前列腺和乳腺癌转移引起的骨痛(Endo，Gan To Kagaku Ryoho 26：744-748(1999))。

有报道将一种小鼠单克隆抗体1F5(抗CD20抗体)通过连续静脉内输注而施用于B细胞淋巴瘤患者。然而，据报道需要极高水平(＞2克)的1F5才能耗尽循环肿瘤细胞，而且结果被描述为“短暂的”(Press等，Blood 69：584-591(1987))。使用单克隆抗体进行治疗的一个潜在问题是非人单克隆抗体(例如小鼠单克隆抗体)通常缺乏人效应物功能，例如它们不能介导补体依赖性溶胞作用或通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性溶解人靶细胞或Fc受体介导的吞噬作用。此外，非人单克隆抗体可被人类宿主识别为外来蛋白；因此重复注射这种外来抗体可导致诱发免疫应答，这会导致有害的超敏反应。对于基于小鼠的单克隆抗体，这通常称为人抗小鼠抗体反应，或“HAMA”反应。另外，这些“外来”抗体可遭到宿主免疫系统的攻击，由此它们实际上在到达其靶部位之前就被中和了。

RITUXAN(也称为Rituximab，MabThera，IDEC-C2B8和C2B8)是第一个FDA批准的单克隆抗体，其由IDEC Pharmaceuticals开发(参见美国专利No.5,843,439；5,776,456和5,736,137)，用于治疗人B细胞淋巴瘤(Reff等，Blood 83：435-445(1994))。RITUXAN是一种嵌合的抗CD20单克隆(Mab)抗体，它是生长抑制性的，并且据报道在体外可敏化某些淋巴瘤细胞系发生化疗剂诱发的细胞凋亡(Demidem等，Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals12：177-(1997))。当使用小鼠异种移植动物模型在体内测试时，还证实RITUXAN具有抗肿瘤活性。RITUXAN有效地结合人补体，具有强FcR结合，并能在体外通过补体依赖性(CDC)和抗体依赖性(ADCC)机制有效地杀死人淋巴细胞(Reff等，Blood 83：435-445(1994))。在猕猴中，该抗体选择性地耗尽血液和淋巴结中的正常B细胞。

RITUXAN已被推荐用于治疗低分级或滤泡性B细胞非霍奇金淋巴瘤(McLaughlin等，Oncology(Huntingt)12：1763-1777(1998a)；Maloney等，Oncology 12：63-76(1998)；Leget等，Curr.Opin.Oncol.10：548-551(1998))。在欧洲，RITUXAN已被批准用于治疗复发的III/IV期滤泡性淋巴瘤(White等，Pharm.Sci.Technol.Today2：95-101(1999))并且据报道对滤泡中心细胞淋巴瘤(FCC)有效(Nguyen等，Eur.J.Haematol 62：76-82(1999))。用RITUXAN治疗的其他疾病包括滤泡中心细胞淋巴瘤(FCC)、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)和小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病(SLL/CLL)(Nguyen等，1999))。据报道难治或不治的NHL患者对RITUXAN和CHOP(例如环磷酰胺、长春新碱、强的松和阿霉素)的联合治疗有反应(Ohnishi等，Gan To KagakuRyoho 25：2223-8(1998))。在I和II期临床研究中，RITUXAN在低分级非霍奇金淋巴瘤(NHL)中表现出极低的毒性和显著的治疗活性(Berinstein等，Ann.Oncol.9：995-1001(1998))。

RITUXAN，单独用于治疗B细胞NHL的每周剂量通常为375mg/M²，对于复发或难治的低分级或滤泡性NHL持续4周，其耐受良好，并具有显著的临床活性(Piro等，Ann.Oncol.10：655-61(1999)；Nguyen等，(1999)；和Coiffier等，Blood 92：1927-1932(1998))。但是，4个高达500mg/M²的周剂量也已在使用该抗体的试验中给予(Maloney等，Blood 90：2188-2195(1997))。RITUXAN还已与化疗剂如CHOP(例如环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)联合来治疗低分级或滤泡性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者(Czuczman等，J.Clin.Oncol.17：268-76(1999)；和McLaughlin等，(1998a))。

此外，在转让给IDEC Pharmaceuticals Corporation的一项专利(美国专利No.6,113,198)中提及使用抗B7抗体治疗B细胞淋巴瘤。然而，该专利集中在其用于治疗疾病的用途，在该疾病中，免疫抑制对于治疗是有益的。例子包括过敏性、自身免疫和移植适应症。

CD40在成熟B细胞的细胞表面以及白血病和淋巴细胞B细胞及霍奇金病(HD)的霍奇金细胞和镜形(RS)细胞上表达(Valle等，Eur.J.Immunol.19：1463-1467(1989)；和Gruss等，Leuk.Lymphoma24：393-422(1997))。CD40是导致正常和恶性B细胞如非霍奇金滤泡性淋巴瘤活化和存活的B细胞受体(Johnson等，Blood82：1848-1857(1993)；和Metkar等，Cancer Immunol.Immunother.47：104(1998))。通过CD40受体的信号作用保护未成熟B细胞和B细胞淋巴瘤免受IgM或Fas诱发的细胞凋亡(Wang等，J.Immunology155：3722-3725(1995))。类似地，套细胞淋巴瘤细胞具有高水平的CD40，加入外源性CD40L可增加其存活并使它们免受氟达拉滨诱发的细胞凋亡(Clodi等，Brit.J.Haematol.103：217-219(1998))。相比之下，其他人报道了CD40刺激可在体外(Funakoshi等，Blood83：2787-2794(1994))和在体内(Murphy等，Blood 86：1946-1953(1995))抑制肿瘤B细胞生长。

抗CD40抗体(参见美国专利No.5,874,082和5,667,165)施用于小鼠可增加带有人B细胞淋巴瘤的小鼠的存活(Funakoshi等，(1994)；和Tutt等，J.Immunol.161：3176-3185(1998))。使用抗CD40抗体模拟CD40L的作用从而传递死亡信号来治疗肿瘤包括B细胞淋巴瘤和EBV诱发的淋巴瘤的方法在美国专利No.5,674,492(1997)中有所记载，在此以其整体引入本文作为参考。CD40信号作用还与其与CD20的协同相互作用相关(Ledbetter等，Circ.Shock 44：67-72(1994))。其它描述抗CD40抗体制备和应用的参考文献包括美国专利No.5,874,085(1999)、5,874,082(1999)、5,801,227(1998)、5,674,492(1997)和5,667,165(1997)，在此以其整体引入本文作为参考。

一种CD40配体，gp39(也称为CD40配体，CD40L或CD154)在活化的但不是静止的CD4⁺Th细胞上表达(Spriggs等，J.Exp.Med.176：1543-1550(1992)；Lane等，Eur.J.Immunol.22：2573-2578(1992)；和Roy等，J.Immunol.151：1-14(1993))。CD40和CD40L均已被克隆并表征(Stamenkovi等，EMBO J.8：1403-1410(1989)；Armitage等，Nature 357：80-82(1992)；Lederman等，J.Exp.Med.175：1091-1101(1992)；和Hollenbaugh等，EMBO J.11：4313-4321(1992))。人CD40L还记载于美国专利No.5,945,513中。用CD40L基因转染并在其表面表达CD40L蛋白的细胞可触发B细胞增殖，并且与其他刺激信号一起可诱发抗体产生(Armitage等，(1992)；和美国专利No.5,945,513)。CD40L可能在霍奇金病区域中肿瘤滤泡内的肿瘤B细胞(CD4⁺)或镜形细胞(CD4⁺)的细胞接触依赖性相互作用中起重要作用(Carbone等，Am.J.Pathol.147：912-922(1995))。抗CD40L单克隆抗体据报道已被有效用于在LP-BM5-感染的小鼠中抑制小鼠AIDS(MAIDS)的诱发(Green等，Virology 241：260-268(1998))。但是，CD40L-CD40信号作用导致恶性B细胞的存活vs.细胞死亡反应的机制还不清楚。例如，在滤泡性淋巴瘤细胞中，凋亡诱导TRAIL分子(APO-2L)的下调(Ribeiro等，British J.Haematol.103：684-689(1998))和过量表达BCL-2，而在B-CLL情况下，CD95(Fas/APO-1)的下调(Laytragoon-Lewin等，Eur.J.Haematol.61：266-271(1998))，已被提出作为存活的机制。与此相比，在滤泡性淋巴瘤中存在证据，即CD40活化导致TNF(Worm等，International Immunol.6：1883-1890(1994))CD95分子(Plumas等，Blood 91：2875-2885(1998))的上调.

还已制备了抗CD40抗体用于预防或治疗抗体介导的疾病，如过敏和自身免疫病，如美国专利No.5,874,082(1999)中所述。据报道，抗CD40抗体已有效地与抗CD20抗体相联合，在抑制培养的非霍奇金B细胞淋巴瘤的生长中产生加合作用(Benoit等，Immunopharmacology35：129-139(1996))。在小鼠中的体内研究据称证实了抗CD20抗体比个别施用抗CD40抗体在促进携带某些但不是全部淋巴瘤系的小鼠存活方面更为有效(Funakoshi等，J.Immunother.Emphasis TumorImmunol.19：93-101(1996))。据报道，抗CD19抗体在体内治疗两种同源小鼠B细胞淋巴瘤BCL1和A31中也有效(Tutt等(1998))。还描述了针对CD40L的抗体用于治疗与B细胞活化有关的疾病(欧洲专利NO.555,880(1993))。抗CD40L抗体包括单克隆抗体3E4，2H5，2H8，4D9-8，4D9-9，24-31，24-43，89-76和89-79，如美国专利NO.5,7474,037(1998)中所述，在美国专利NO.5,876,718(1999)中所述的抗CD40L抗体被用于治疗移植物抗宿主疾病。

抗CD22单克隆抗体的合成及其在治疗方案中的应用也已有报道。CD22是一种参与B细胞粘附的B细胞特异性分子，其可能在同型或异型相互作用中发挥功能(Stamenkovic等，Nature344：74(1990)；Wilson等，J.Exp.Med.173：137(1991)；Stamenkovic等，Cell66：1133(1991))。CD22蛋白在祖B细胞和前B细胞的胞质中表达(Dorken等，J.Immunol.136：4470(1986)；Dorken等，Expression ofcytoplasmic CD22 in B-cell ontogeny.In Leukocyte Typing III，WhiteCell Differentiation Antigens.McMichael等编著，Oxford UniversityPress，Oxford，p.474(1987)；Schwarting等，Blood65：974(1985)；Mason等，Blood69：836(1987))，但仅在成熟B细胞表面发现。与表面IgD存在时间相同(Dorken等，J.Immunol.136：4470(1986))。CD22表达在活化后增加并随着进一步分化而消失(Wilson等，J.Exp.Med.173：137(1991)；Dorken等，J.Immunol.136：4470(1986))。在淋巴样组织中，CD22由滤泡的套和边缘区B细胞表达，但生发中心B细胞仅微弱表达(Dorken等，J.Immunol.136：4470(1986)；Ling等，”B-cell and plasma antigens：new and previously defined cluster”，Leukocyte Typing III.White Cell Differentiation Antigens，McMichael等编著，Oxford University Press，Oxford，p.302(1987))。但是，原位杂交显示，CD22 mRNA在生发中心内表达最强，而在套区域内表达较弱(Wilson等，J.Exp.Med.173：137(1991))。预计CD22参与B细胞活化的调节，因为发现在体外CD22 mAb与B细胞的结合增加胞内游离钙和表面Ig交联后诱导的增殖(Pezzutto等，J.Immunol.138：98(1987)；Pezzutto等J.Immunol.140：1791(1988))。但是，其它研究确定，抗Ig诱导增殖的增加不大(Dorken等，J.Immunol.136：4470(1986))。CD22为构成性磷酸化，但磷酸化水平在用PMA处理细胞后增加(Boue等，J.Immunol.140：192(1988))。此外，可溶形式的CD22抑制CD3介导的人T细胞活化，提示CD22可能在T细胞-B细胞相互作用中是重要的(Stamenkovic等，Cell66：1133(1991))。

特异性结合CD22受体的配体已被报道在多种疾病的治疗中具有潜在应用价值，特别是B细胞淋巴瘤和自身免疫病。具体地说，已报道了使用标记的和未标记的抗CD22抗体治疗这类疾病。

例如，Tedder等，美国专利5,484,892声称高亲和力结合CD22并阻断CD22与其它配体的相互作用。这些单克隆抗体据称可用于治疗自身免疫病，如肾小球肾炎、Goodpasture综合征、坏死性血管炎、淋巴结炎、结节性动脉周围炎、系统性红斑狼疮、关节炎、血小板减少性紫癜、粒细胞缺乏、自身免疫性溶血性贫血，并用于抑制针对外来抗原如妊娠期间的胚胎抗原的免疫反应，重症肌无力、胰岛素抵抗糖尿病、Grave′s病和过敏反应。

此外，Leung等，美国专利5,789,557公开了由CDR移植产生的嵌合的和人源化的抗CD22单克隆抗体及其缀合和非缀合形式在治疗和诊断B细胞淋巴瘤和白血病中的用途。该参考文献特别公开了与细胞毒性物质如化疗药物、毒素、重金属和放射性核素缀合的这种抗体(参见美国专利5,789,554，1998年8月4日授予Leung等，并转让给Immunomedics)。

另外，PCT申请WO 98/42378，WO 00/20864和WO 98/41641描述了特异性针对CD22的单克隆抗体、缀合物和片段及其治疗用途，特别是用于治疗B细胞相关疾病。

还提出了使用抗CD22抗体治疗自身免疫病和癌症。参见例如美国专利5,443,953，1995年8月22日授予Hansen等，并转让给Immunomedics Inc.，其描述了抗CD22免疫缀合物用于诊断和治疗，特别是用于治疗病毒和细菌感染性疾病、心血管疾病、自身免疫病和癌症；美国专利5,484,892，1998年1月16日授予Tedder等，并转让给Dana-Farber Cancer institute，Inc.，其描述了多种针对CD22的单克隆抗体，用于治疗疾病，在所述疾病中延迟或阻断CD22粘附功能对于治疗是有益的，特别是自身免疫病。这些参考文献提示抗CD22抗体或片段可直接或间接缀合至所需的效应部分，例如可检测的标记，如酶、荧光团、放射性核素、电子转移剂(在体外免疫测定或体内显像过程中)，或治疗效应部分，例如毒素、药物或放射性同位素。

另外，IgG1同种型的抗人CD22单克隆抗体可从LeincoTechnologies购得，并且据报道可用于治疗B细胞淋巴瘤和白血病，包括毛细胞白血病。(Campana，D.等，J.Immunol.134：1524(1985))。Dorken等，J.Immunol.150：4719(1993)和Engel等，J.Immunol.150：4519(1993)也均描述了特异性针对CD22的单克隆抗体。

此外，文献中已报道了使用抗CD19抗体及其片段治疗淋巴瘤。例如，美国专利5,686,072，1997年11月11日授予Uhr等，并转让给University of Texas，公开了使用抗CD19和抗CD22抗体及免疫毒素治疗白血病淋巴瘤。该专利以其整体引入本文作为参考。

另外已报道了使用抗CD19抗体对白血病的状况和预后进行分类。

由此基于前述，很明显已报道了多种单独抗体具有治疗肿瘤性疾病的治疗潜能。虽然这样，本方面的一个目的是提供用于治疗多种恶性肿瘤包括淋巴瘤和白血病的新的抗体方案。

发明概述及目的

为此，本方面的一个目的是提供一种新的改进的抗体疗法用于治疗多种肿瘤性疾病包括B细胞恶性肿瘤，如任何级别的霍奇金和非霍奇金淋巴瘤。

更具体地说，本发明的一个目的是提供一种新的抗体方案，用于治疗肿瘤性疾病，包括施用至少一种免疫调节或免疫调制抗体，以及任选地至少一种B细胞耗尽抗体。

更具体地说，本发明的一个目的是提供一种新的抗体疗法用于治疗肿瘤性疾病，其包括施用至少一种免疫调节或免疫调制抗体，优选选自抗B7抗体、抗CD23抗体、抗CD40抗体、抗CD40L抗体和抗CD4抗体；以及任选地至少一种B细胞耗尽抗体，优选选自抗CD20抗体、抗CD19抗体、抗CD22抗体和抗CD37抗体。在一个特别优选的实施方案中，所述治疗或疗法将包括施用治疗有效量的抗B7抗体，与施用治疗有效量的抗CD20抗体相结合。

在其他的实施方案中，本发明的特别目的是提供对肿瘤性疾病的治疗或预防，包括施用治疗有效量的针对CD40L的抗体与治疗有效量的针对B7的抗体相结合。优选施用该抗体组合以治疗B细胞恶性肿瘤如非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病(CLL)，甚至更优选所述组合包括那些在美国专利6,113,898中公开的B7抗体和那些在美国专利6,001,358中公开的抗CD40L抗体。

因此，本发明的一个重要方面包括治疗哺乳动物的肿瘤性疾病的方法，其包括以下步骤：

向所述哺乳动物施用治疗有效量的第一免疫调节抗体；和

向所述哺乳动物施用治疗有效量的第二免疫调节抗体或B细胞耗尽抗体，其中所述第一和第二免疫调节抗体结合不同的抗原，并且第一免疫调节抗体和第二免疫调节抗体或B细胞耗尽抗体可以以任何次序或同时施用。

本发明的另一目的是提供新的组合、产品和/或药盒用于治疗肿瘤性疾病包括B细胞恶性肿瘤，B细胞淋巴瘤和白血病，其中所述药盒或产品包括至少一种免疫调节或免疫调制抗体，和任选地至少一种B细胞耗尽抗体。优选地，所述免疫调节或免疫调制抗体将包括至少一种抗CD23抗体、抗CD40抗体、抗CD40L抗体或抗B7抗体，而B细胞耗尽抗体将特异性针对CD20，CD19，CD22或CD37。最优选所述药盒或产品将包括抗CD40L或抗B7抗体或其组合以及任选地抗CD20抗体。另外，所述产品将包括插页、使用说明或带标签的容器，指示其内容物可用于治疗肿瘤性疾病。

本方面的另一个目的是提供一种用于治疗B细胞淋巴瘤或B细胞白血病的联合疗法，包括抗CD40L抗体或抗体片段或CD40L拮抗剂，和至少一种以下物质：(a)化疗剂或化疗剂组合，(b)放疗，(c)抗CD20抗体或其片段，(d)抗CD40抗体或其片段，(e)抗CD19抗体或其片段，(f)抗CD22抗体或其片段，(g)细胞因子，(h)抗B7抗体或其片段，其中抗体可以缀合毒素或者放射性标记，或用人恒定区进行改造以引发人抗体效应机制，及导致靶细胞的凋亡或死亡。

参考以下对优选的示例性实施方案的详细描述，本领域的技术人员将清楚了解本发明的其它目的、特征和优点。

附图说明

图1、暴露4小时之后B淋巴瘤细胞对阿霉素的敏感性。

图2、(A)抗CD40L(IDEC-131)克服B淋巴细胞瘤对ADM杀伤的CD40L介导抗性。(B)RITUXAN对正常的和sCD 40L预处理的DHL-4细胞的作用。

图3、(A)抗CD40L抗体(IDEC-131)对B-CLL的CD40L介导细胞存活的阻断。(B)Rituxan对B-CLL的CD40L介导存活的阻断。

图4、在与sCD40L一起培养和不与sCD40L一起培养的CD19⁺CLL细胞中HLA-DR表达的FACS分析。

图5、图示两个不同批次的IDEC-114与膜结合CD80细胞的结合活性，使用表达CD80分子的CHO细胞通过流式细胞仪进行测定。

图6、图示IDEC-114和rituximab对SB或SKW细胞的ADCC活性。

图7、图示IDEC-114、rituximab及其组合对从两个供体A和B获得的活化宿主细胞的ADCC活性。

图8A、图示IDEC-114对表达CD80的CHO细胞的CDC活性。

图8B、图示IDEC-114和rituximab对表达CD80的SKW细胞的CDC活性。

图8C、图示IDEC-114和rituximab对表达CD80的Daudi细胞的CDC活性。

图9A、图示SKW/SCID小鼠对IDEC-114的抗肿瘤应答。

图9B、图示SKW/SCID小鼠对rituximab的抗肿瘤应答。

图10、图示SKW/SCID小鼠对IDEC-114与rituximab相结合的抗肿瘤应答。

发明详述

尽管本发明可以以许多不同的形式实施，本文公开的是其具体的示例性实施方案，其例示本发明的原理。应该强调本发明并不限于所例举的具体实施方案。

本发明提供了新的抗体方案，包括施用至少一种免疫调制或免疫调节抗体(对于本文所公开内容，所述术语可以互换使用)，例如抗B7抗体、抗CD23抗体、抗CD40抗体或抗CD40L抗体，和任选地至少一种B细胞耗尽抗体，例如抗CD20、抗CD19、抗CD22或抗CD37抗体，其具有实质性的B细胞耗尽活性。

基于所述抗体引发治疗效益的不同机制，这种组合将产生协同效果。具体地说，理论上认为互补的作用机制将产生更为持久和有效的临床反应，因为两种或多种免疫调节抗体或免疫调节抗体与B细胞耗尽抗体可一致攻击任何肿瘤细胞。例如，在某些实施方案中，B细胞耗尽抗体将耗尽活化的B细胞，该细胞可能对免疫调节或免疫调制抗体如抗B7或抗CD40L抗体的作用抵抗。对于T细胞以及抗体产生细胞，这种活化的B细胞可能作为有效的抗原呈递细胞发挥作用。在B细胞恶性肿瘤中，这种活化的B细胞可能包括恶性细胞，这种细胞如果不根除，将产生新的癌细胞和肿瘤。

因此，本发明一个优选实施方案包括治疗患有肿瘤性疾病患者的方法，包括施用治疗有效量的免疫调节抗体的组合或免疫调节抗体与B细胞耗尽抗体。在特别优选的实施方案中，免疫调节抗体的组合将包括针对CD40L的抗体或其免疫反应性片段和针对B7的抗体或其免疫反应性片段。本领域技术人员将理解所述两种免疫调节抗体可以以任何次序或同时施用，并且治疗有效量可以用熟知的技术容易地进行判断。此外，施用免疫调节抗体与辅助治疗如B细胞耗尽抗体、化疗或放射免疫治疗的组合属于本发明的范围之内。

在此“B细胞耗尽抗体”是经施用导致可证明的B细胞耗尽的抗体或片段。通常这种抗体会与在B细胞表面上表达的B细胞抗原或B细胞标记结合。优选这种抗体在施用后，通常在约数天之内或更短，会导致B细胞数目减少约50％或更多。在优选的实施方案中，B细胞耗尽抗体是RITUXAN(一种抗CD20嵌合抗体)或具有基本上相同或至少20-50％RITUXAN细胞耗尽活性的抗体。

在此“B细胞表面标记”或“B细胞靶”或“B细胞抗原”是在B细胞表面上表达的抗原，与其结合的激动剂或拮抗剂可以以其为目标。示例性的B细胞表面标记包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80(B7.1)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86(B7.2)白细胞表面标记。特别感兴趣的B细胞表面标记较哺乳动物的其它非B细胞组织优先在B细胞上表达，并且可能在前体B细胞和成熟的B细胞上均有表达。在一个实施方案中，所述标记类似于CD20或CD19，是在该细胞系的整个分化过程中(从干细胞阶段直至就在最终分化为浆细胞之前的那一点)的B细胞上均有发现的一种标记。在此优选的B细胞表面标记是CD19和CD20。在此优选的B细胞表面标记是CD19、CD20、CD22、CD23、CD80和CD86。

在此使用的“免疫调节抗体”或“免疫调制抗体”指通过与耗尽B细胞不同的机制而产生对免疫系统的效应的抗体，例如通过CDL和/或ADCC活性，并可能是激动剂。其实例包括抑制T细胞免疫、B细胞免疫的抗体，例如通过诱导耐受(抗CD40L，抗CD40)，或其它免疫抑制抗体，例如抑制B7细胞信号作用的抗体(抗-B7.1，抗-B7.2、抗CD4、抗CD23等)。在某些情况下，免疫调节抗体可能具有增强凋亡的能力。另外，正常情况下为B细胞耗尽抗体的抗体可被改造成为免疫调节性，通过实体化人恒定区以利用不同的效应机制。

在讨论本发明之前，提供以下额外定义：

在此使用的术语“抗体”旨在包括免疫球蛋白及其片段，它对其所指定的蛋白或肽有特异反应性。抗体可包括人抗体、灵长类动物源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体、与其他蛋白或放射性标记融合的抗体以及抗体片段。此外，在此术语“抗体”使用其最广义并具体涵盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、从至少两种完整的抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们呈现出所需要的生物学活性即可。除非特别指明或在上下文中指出，对于本申请和权利要求的目的而言术语“抗体”应广义理解，并明确包括所有变体、其片段或免疫反应性构建体，其提供如本文所述的所需要的调节或耗尽效应。

“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选包括其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)²和Fv片段；diabodies；线状抗体；单链抗体分子；结构域缺失的抗体；和从抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段可以使用常规技术分离。例如，F(ab¹)₂片段可通过用胃蛋白酶处理抗体而生成。所得的F(ab¹)₂片段可作处理以还原二硫键从而产生Fab¹片段。

“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键连接到重链，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之中各异。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变区(VH)然后是数个恒定区。每条轻链在一端具有一个可变区(VL)，在其另一端具有一个恒定区；轻链的恒定区与重链的第一恒定区并列，而轻链可变区与重链的可变区并列。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成界面。

术语“可变”指这样一个事实，即可变区的某些部分的序列在抗体之中有广泛的差异并用于各特定抗体与其特定抗原的结合和特异性。但是，变异性在整个抗体可变区中并不是平均分布的。它集中在称为高变区的3个节段(在轻链可变区和重链可变区中均有)。可变区中更为高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各包含4个FR，大部分采取β折叠构型，由3个高变区连接，其形成连接β折叠结构的袢，在某些情况下形成部分β-折叠结构。在每条链中的高变区由FR紧紧拉到一起，并且与来自另一条链的高变区一起作用于形成抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，5^th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定区不直接涉及抗体与抗原的结合，但表现出多种效应子功能，如抗体参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。

用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各有单一的抗原结合部位，和残余的“Fc”片段，其名称反映了其容易结晶的能力。用胃蛋白酶处理产生一个F(ab’)²片段，其具有两个抗原结合部位并仍能交联抗原。

“Fv”是最小的抗体片段，其含有完整的抗原识别和抗原结合部位。该区域由紧密非共价结合的一个重链和一个轻链可变区的二聚体组成。它取这种构型，使得各可变区的3个高变区相互作用，以在VH-VL二聚体表面上形成一个抗原结合部位。6个高变区集中起来赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单一一个可变区(或Fv的一半，仅包含对抗原特异性的3个高变区)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力比整个结合部位要低。

Fab片段还含有轻链的恒定区和重链的第一恒定区(C_HI)。Fab’片段与Fab片段的差异在于在重链C_HI区的羧基末端添加了几个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab’-SH是此处对其中恒定区的半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基团的Fab’的命名。F(ab’)Z抗体片段最初是作为成对Fab’片段产生的，其间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。

来自任何脊椎动物种类的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”基于其恒定区的氨基酸序列，可以归于两个明显不同的类型(称为κ和λ)之一。

取决于其重链的恒定区的氨基酸序列，抗体可以归于不同的种类。完整抗体有5个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中几种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgGI、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同抗体类别的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。优选重链恒定区将完善γ1、γ2、γ3和γ4恒定区。优选这些恒定区还包含修饰以增强抗体稳定性，如在美国专利No.6,011,138(在此全部引入作为参考)中公开的P和E修饰。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型也是熟知的。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL区，其中这些区以单一多肽链存在。优选Fv多肽进一步包含在VH和VL区之间的多肽接头，其使scFv能形成结合抗原所需的结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg和Moore编著，Springer-Verlag，New York，269-315页(1994)。

术语“diabodies”指具有两个抗原结合部位的小抗体片段，该片段在相同多肽链(VH-VL)中包含重链可变区(VH)连接到轻链可变区(VL)。通过使用一个短接头(其长度不足以使得在相同链上的两个区之间发生配对)，强制所述区与另一条链的互补区配对并创建两个抗原结合部位。关于diabodies更完全的记载，参见例如EP404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)。

在此术语“单克隆抗体”用于指从一群实质上同质的抗体中获得的抗体，即构成该群体的各抗体除了可能的天然发生的突变(其可能以较小量存在)外是完全相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的传统(多克隆)抗体制剂相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优势在于它们是通过杂交瘤培养而合成的，未被其它免疫球蛋白污染。

“人源化抗体”是指从非人抗体通常是小鼠抗体衍生的抗体，其保留了或基本上保留了亲本抗体的抗原结合特性，但在人类中免疫原性较低。这可以通过多种方法实现，包括(a)将整个非人可变区移植到人恒定区上以生成嵌合抗体；(b)仅将非人互补决定区(CDR)移植入人构架区和恒定区，保留或不保留关键的构架残基；和(c)移植整个非人可变区，但通过替换表面残基而用人样部分“庶掩”它们。这种方法公开在以下文献中：Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851-5(1984)；Morrison等，Adv.Immunol.44：65-92(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28：489-498(1991)；和Padlan，Molec.Immun.31：169-217(1994)，上述文献均以其整体引入本文作为参考。人源化抗CD40L抗体可以如1995年11月7日提交的U.S.P.N.6,001,358中所述进行制备，该专利亦以其整体引入本文作为参考。

“人抗体”是指完整包含人轻链和重链以及恒定区的抗体，由任何已知的标准方法制备。

“灵长类动物源化抗体”是指一种重组抗体，其经改造而包含猴(或其它灵长类动物)抗体特别是猕猴抗体的重链和轻链可变区，并且含有人恒定区序列，优选人免疫球蛋白γ1或γ4恒定区(或PE变体)。这种抗体的制备如以下文献中所述：Newman等，Biotechnology，10：1458-1460(1992)；以及普通转让的08/379,072、08/487,550或08/746,361，以上文献均以其整体引入本文作为参考。这些抗体据报道表现出与人抗体的高度同源性，即85-98％，展现出人效应功能，免疫原性降低，并且可表现出与人抗原的高亲和力。

“抗体片段”是指抗体的片段，如Fab、F(ab’)₂、Fab’和scFv。

“嵌合抗体”是指包含来源于两种不同抗体(通常为不同物种)的序列的抗体。最为典型的情况是，嵌合抗体包含人和小鼠抗体片段，通常是人恒定区和小鼠可变区。

“CD20”抗原是一种在大于90％来自外周血或淋巴样器官的B细胞表面上发现的35kDa非糖基化磷蛋白。CD20在早期前B细胞发育过程中表达并保持到直至分化为浆细胞。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞上。在文献中CD20的其它名称包括“B淋巴细胞限制性抗原”和“Bp35”。Clark等，PNAS(USA)82：1766(1985)描述了CD20抗原。

“CD19”抗原指例如由HD237-CD19或B4抗体识别的一种90kDa抗原(Kiesel等，Leukemia Research II，12：1119(1987))。象CD20一样，发现CD20存在于该细胞系整个分化过程中(从干细胞阶段直至就在最终分化为浆细胞之前的那一点)的细胞上。拮抗剂与CD19的结合可引起CD19抗原的内化。

“CD22”抗原指一种在B细胞上表达的抗原，也称为“BL-CAM”和“LybB”，其参与B细胞信号作用和粘附(参见Nitschke等，Curr.Biol.7：133(1997)；Stamenkovic等，Nature 345：74(1990))。该抗原是一种膜免疫球蛋白相关抗原，当膜Ig连接时发生酪氨酸磷酸化(Engel等，J.Etyp.Med.181(4)：1521，1586(1995))。已克隆了编码该抗原的基因，并表征了其lg结构域。

B7抗原包括B7.1(CD80)、B7.2(CD86)和B7.3抗原，它们是在B细胞上表达的跨膜抗原。特异性结合B7抗原包括人B7.1和B7.2抗原的抗体在本领域中是已知的。优选的B7抗体包括由Anderson等在美国专利No.6,113,198(转让给IDEC PharmaceuticalsCorporation)中公开的灵长类动物源化B7抗体，以及人和人源化B7抗体。

CD23指由B和其它细胞表达的IgE的低亲和性受体。在本发明中，CD23优选是人CD23抗原。CD23抗体在本领域中也是已知的。在本发明中最优选CD23抗体是人抗人CD23抗体或包含人IgGI或IgG3恒定区的嵌合抗人CD23抗体。

B细胞“拮抗剂”是这样一种分子，其经与B细胞表面标记结合而破坏或耗尽哺乳动物的B细胞和/或干扰一种或多种B细胞功能，例如通过减少或阻止由B细胞引发的体液应答。所述拮抗剂优选能耗尽用其治疗的哺乳动物的B细胞(即降低循环B细胞水平)。这种耗尽可通过多种机制实现，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，抑制B细胞增殖和/或诱导B细胞死亡(例如通过凋亡)。在本发明范围之内的拮抗剂包括抗体、合成或天然序列肽以及结合B细胞标记的小分子拮抗剂，所述拮抗剂可选择性地与细胞毒性剂结合或融合。

CD40L拮抗剂是特异性结合CD40L并优选拮抗CD40L与CD40相互作用的一种分子。其实例包括特异性结合CD40L的抗体和抗体片段、可溶性CD40、可溶性CD40融合蛋白和结合CD40L的小分子。根据本发明优选的拮抗剂包括特异性针对CD40的抗体或抗体片段。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指一种细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞溶解。介导ADCC的主要细胞—NK细胞仅表达FcyRIII，而单核细胞表达FcyRI、FcyRII和FcyRIII。在造血细胞上的FcR表达总结于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页的表3。为了评价感兴趣分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，如在美国专利No.5,500,362或5,821,337中描述的测定。对这种测定有用的效应细胞包括外周血单核的细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可供选择地，或额外地，可以在体内评价感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，如在Clynes等，PNAS(USA)95：652-656(1998)中公开的动物模型。

“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。优选所述细胞至少表达FcyRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核的细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如在此所述从血液或PBMC中分离。

术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是一种天然序列人FeR。此外，优选的FcR与IgG抗体结合(γ受体)并包括FcyRI、FcyRII和FcyRIII亚类的受体，包括等位基因变异体和可供选择地这些受体的剪接形式。FcyRII受体包括FcyRIIA(一种“活化受体”)和FcyRIIB(一种“抑制受体”)，其具有相似的氨基酸序列，主要区别在于其胞质结构域。活化受体FcyRIIA在其胞质结构域中含有免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcyRIIB在其胞质结构域中含有免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITAM)(参见综述M.in Daeon，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。关于FcR的综述见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)；Capel等，Immunomethods4：25-34(1994)；和de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。其它FcR，包括那些有待在将来鉴定的，在此都被术语“FcR”所包括。该术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等，J.Immunol.24：249(1994))。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指分子在补体的存在下溶解目标靶的能力。补体活化途径由补体系统的第一成分(Clq)结合与相关抗原复合的分子(例如抗体)而启动。为了评价补体活化，可以进行CDC测定，例如在Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods202：163(1996)中所述。

“生长抑制性”拮抗剂阻止或减少表达拮抗剂所结合的抗原的细胞的增殖。例如，该拮抗剂可在体外和/或体内阻止或减少B细胞的增殖。

“锈导凋亡”的拮抗剂诱导例如B细胞的编程性细胞死亡，如由结合膜联蛋白V、DNA断裂、细胞皱缩、内质网扩张、细胞破碎和/或形成膜囊泡(称为凋亡小体)所确定。

术语“高变区”当用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如在轻链可变区中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，以及在重链可变区中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5^th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))，和/或那些来自“高变袢”的残基(例如在轻链可变区中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及在重链可变区中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。“构架”或“FR”残基是那些除了在此定义的高变区残基之外的可变区残基。

“结合”感兴趣抗原如B细胞表面标记的拮抗剂能以足够的亲和力结合该抗原，从而该拮抗剂可用作以表达该抗原的细胞即B细胞为靶目标的治疗剂。

在此“抗CD20抗体”是特异性结合CD20抗原优选人CD20的抗体，其具有可测量的B细胞耗尽活性，优选具有至少约10％的RITUXAN(参见美国专利No.5,736,137，全部引入本文作为参考)的B细胞耗尽活性。

如先前所提到的，在此术语“rituximab”或“RITUXAN”指针对CD20抗原的基因工程嵌合小鼠/人单克隆抗体，在美国专利No.5,736,137(在此特别引作参考)中命名为“C2B8”。该抗体是一种IgGIκ免疫球蛋白，含有小鼠轻链和重链可变区序列以及人恒定区序列。Rituximab对CD20抗原的结合亲和力大约为8.0nM。

在此“抗CD22抗体”是特异性结合CD22抗原优选人CD22的抗体，其具有可测量的B细胞耗尽活性，优选具有至少约10％的RITUXAN的B细胞耗尽活性。

在此“抗CD19抗体”是特异性结合CD19抗原优选人CD19的抗体，其具有可测量的B细胞耗尽活性，优选具有至少约10％的RITUXAN的B细胞耗尽活性。

在此“抗CD37抗体”是特异性结合CD37抗原优选人CD37的抗体，其具有可测量的B细胞耗尽活性，优选具有至少约10％的RITUXAN的B细胞耗尽活性。

在此“抗-B7抗体”是特异性结合B7.1、B7.2或B7.3最优选人B7.3的抗体，该抗体抑制B7/CD28相互作用，并且实质上不抑制B7/CTLA-4相互作用，甚至更优选在美国专利6,113,898(在此全部引入作为参考)中描述的特定抗体。IDEC-114(IDEC Pharmaceuticals，San Diego CA)是一种抗B7抗体，其目前正处于II期临床试验，可适用于本发明的优选实施方案。近来已显示这些抗体促进凋亡。因此，它们非常适合抗肿瘤应用。结合B7抗原的抗体的其他实例包括以下抗体：授予Linsley等的美国专利5,885,577中报道的B7抗体；授予DeBoer等(转让给Chiron Corporation)的美国专利5,869,050中报道的抗B7抗体。

“抗CD40L抗体”是特异性结合CD40L(也称为CD154，gp39，TBAM)的抗体，优选具有激动剂活性。优选的抗CD40L抗体具有在美国专利No.6,011,358(转让给IDEC Pharmaceuticals Corporation，在此全部引入作为参考)中公开的人源化抗体的特异性。IDEC-131(IDEC Pharmaceuticals，San Diego CA)是一种抗CD40L抗体，其目前正处于II期临床试验，可适用于本发明的优选实施方案。

“抗CD4抗体”是特异性结合CD4优选人CD4的抗体，更优选是灵长类动物源化或人源化抗CD4抗体。

“抗CD40抗体”是特异性结合CD40优选人CD40的抗体，如在美国专利5,874,085、5,874,082、5,801,227、5,674,442和5,667,165(在此全部引作参考)中公开的那些。

优选B细胞耗尽抗体和免疫调节抗体均含有人恒定区。合适的抗体可包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型。

结合CD20抗原的抗体的具体实例包括：“Rituximab”(“RITUXAN”)(美国专利No.5,736,137，特别在此引作参考)；钇-[90]-标记的2B8小鼠抗体“Y2B8”(美国专利No.5,736,137，特别在此引作参考)；任选地用¹³¹I标记(¹³¹I B1)的小鼠IgG2a“B1”抗体(BEXXAR^TM)(美国专利No.5,595,721，特别在此引作参考)；小鼠单克隆抗体“1F5”(Press等，Blood 69(2)：584-591(1987))；和“嵌合2H7”抗体(美国专利No.5,677,180，特别在此引作参考)。

结合CD22的抗体的具体实例包括由Immunomedics报道的Lymphocide^TM，现在处于对非霍奇金淋巴瘤的临床试验之中。

结合CD23的抗体的具体实例是广为人知的，优选包括由Reff等在1999年7月4日颁发的美国专利No.6,011,138(普通转让给IDECPharmaceuticals Corp.和Seikakagu Corporation of Japan)中报道的特异性针对人CD23的灵长类动物源化抗体；由Bonnefoy等，No.9612741；Rector等，J.Immunol.55：481-488(1985)；Flores-Rumeo等，Science 241：1038-1046(1993)；Sherr等，J.Immunol.，142：481-489(1989)；和Pene等，PNAS，USA 85：6820-6824(1988)报道的那些。IDEC-152(IDEC Pharmaceuticals，San Diego CA)是一种抗CD23抗体，其目前正处于II期临床试验，可适用于本发明的优选实施方案。据报道这些抗体可用于治疗过敏、自身免疫病和炎性疾病。

“分离的”拮抗剂指已被鉴定并分离和/或从其天然环境的组分中回收。其天然环境的污染组分是会干扰拮抗剂的诊断或治疗应用的物质，并可包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶质。在优选的实施方案中，拮抗剂将被纯化(1)至大于95wt％的拮抗剂，如Lowry法所确定，并最优选超过99wt％，(2)其纯化程度足以通过使用转杯式测序仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基，或(3)纯化至使用考马斯蓝或优选银染在还原或非还原条件下SDS-PAGE中表现为均一。分离的拮抗剂包括在重组细胞内原位的拮抗剂，因为拮抗剂的天然环境的至少一种组分将不存在。但是通常分离的拮抗剂将通过至少一个纯化步骤来制备。

用于治疗目的的“哺乳动物”指任何分类为哺乳动物的动物，包括人、家畜和农场动物以及动物园、运动或宠物动物，如狗、马、猫、牛等。优选所述哺乳动物是人。

“治疗”指治疗性治疗和预防性措施。那些需要治疗的包括已患有疾病或障碍的以及有待预防疾病或障碍的那些。因此，所述哺乳动物可能已经被诊断为患有疾病或障碍或可能倾向于或易患该疾病。

如以上详细讨论的，本发明提供用于治疗需要治疗的哺乳动物对象中的肿瘤性疾病的化合物、组合物、药盒和方法。优选所述对象是人。所述肿瘤性疾病(例如癌症和恶性肿瘤)可包括实体瘤如黑素瘤、神经胶质瘤、肉瘤和癌以及髓样或血液系统恶性肿瘤如淋巴瘤和白血病。一般来说，本文所公开的发明可用于预防性或治疗性治疗任何肿瘤，所述肿瘤包含抗原性标记，从而经修饰的抗体可以靶向针对癌细胞。可治疗的癌症实例包括但不限于：前列腺、结肠、皮肤、乳腺、卵巢、肺和胰腺癌。在优选的实施方案中，所选的本发明抗体组合可用于诊断或治疗结肠癌或其他胃癌。更具体地，本发明的抗体可用于治疗卡波西肉瘤、CNS肿瘤(毛细血管母细胞瘤、脑膜瘤和脑转移)、黑素瘤、胃肠和肾肉瘤、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤(优选多形性胶质母细胞瘤)、平滑肌肉瘤、视网膜母细胞瘤、卵巢的乳头状囊腺癌、Wilm’s肿瘤或小细胞肺癌。应理解，鉴于本发明所公开的内容，可根据与每种前述肿瘤相关的肿瘤相关抗原得到适宜的抗体组合，而无需过多试验。

可用本发明治疗的血液系统恶性肿瘤的实例包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤以及白血病，包括ALL-L3(伯基特型白血病)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和单核细胞白血病。应理解本发明的化合物和方法对治疗多种B细胞淋巴瘤特别有效，包括低分级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、细胞淋巴瘤(FCC)、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中间分级/滤泡性NHL、中间分级弥漫性NHL、高分级免疫母细胞NHL、高分级淋巴母细胞NHL、高分级小未分裂细胞NHL、bulky disease NHL和Waldenstrom巨球蛋白血症。本领域技术人员应很清楚，由于不断改变的分类系统，这些淋巴瘤和白血病通常会有不同的命名，患有分类为不同名称的血液系统恶性肿瘤的患者也可受益于本发明的联合治疗方案。除了前述肿瘤性疾病之外，应理解本发明可有利地用于治疗其他携带相容的肿瘤相关抗原的恶性肿瘤。

在优选的实施方案中，所述肿瘤性疾病将包括B细胞恶性肿瘤。根据本发明，这包括任何B细胞恶性肿瘤，例如B细胞淋巴瘤和白血病。优选的实例包括霍奇金病(所有形式，例如复发性霍奇金病、耐药的霍奇金病)、非霍奇金淋巴瘤(低分级、中间分级、高分级和其他类型)。实例包括小淋巴细胞/B细胞慢性淋巴细胞白血病(SLL/B-CLL)、浆细胞样淋巴细胞性(lymphoplasmacytoid)淋巴瘤(LPL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、伯基特淋巴瘤(BL)、AIDS相关淋巴瘤、单核细胞B细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞淋巴结病；小淋巴细胞、滤泡性、弥漫性大细胞、弥漫性小分裂细胞、大细胞免疫母细胞淋巴母细胞瘤；小未分裂、伯基特和非伯基特、滤泡性大细胞为主、滤泡性小分裂细胞为主、和滤泡性混合的小分裂细胞和大细胞淋巴瘤。参见，Gaidono等，“Lymphomas”，CANCER：PRINCIPLES&PRACTICEOF ONCOLOGY，Vol.2：2131-2145(De Vita等编著，第5版，1997).

其他类型的淋巴瘤分类包括免疫细胞瘤性Waldenstrom’sMALT-型/类单核细胞B细胞、套细胞淋巴瘤B-CLL/SLL、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和前体B-LBL。

如所述，B细胞恶性肿瘤还特别包括白血病，如ALL-L3(伯基特型白血病)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性白细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、淋巴母细胞白血病、淋巴细胞白血病、单核细胞白血病、髓细胞白血病和前髓细胞白血病及单核细胞白血病。

术语“治疗有效量”指对于预防、改善或治疗所关注的B细胞恶性肿瘤性疾病有效的拮抗剂的量。

此处用于辅助治疗所用的术语“免疫抑制剂”指作用于抑制或掩蔽在此接受治疗的哺乳动物的免疫系统的物质。这会包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自身抗原表达或掩蔽MHC抗原的物质。这种药剂的实例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶类(参见美国专利No.4,665,077，其内容在此引作参考)、硫唑嘌呤；环磷酰胺；溴隐亭；达那唑；氨苯砜；戊二醛(其掩蔽MHC抗原，如美国专利No.4,120,649中所述)；针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A；类固醇如糖皮质激素，例如强的松、甲基强的松龙和地塞米松；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂包括抗-干扰素-α、β-或δ-抗体，抗-肿瘤坏死因子-α抗体，抗-肿瘤坏死因子-β抗体，抗-白介素-2抗体和抗-IL-2受体抗体；抗-LFA-1抗体，包括抗-CD11a和抗-CD18抗体；抗-L3T4抗体；异种抗-淋巴细胞球蛋白；泛-T抗体，优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合域的可溶性肽(公开于7/26/90的WO 90/08187)，streptolanase；TGF-β；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素；雷怕霉素；T细胞受体(Cohen等，美国专利No.5,114,721)；T细胞受体片段(Offner等，Science，251：430-432(1991)；WO 90/11294；laneway，Nature，341：482(1989)；和WO 91/01133)；和T细胞受体抗体(EP 340,109)如T10B9。

在此所用的“细胞毒素或细胞毒性剂”指对细胞的生长和增殖有害的并可作用于减轻、抑制或破坏其所接触的恶性肿瘤的任何物质。示例性的细胞毒素包括但不限于放射性核素、生物毒素、抑制细胞增殖的或细胞毒性的治疗剂、前药、免疫活性配体和生物应答修饰剂如细胞因子。如以下将要更详细讨论的，特别优选放射性核素细胞毒素用于本发明。但是，任何作用于阻碍或减缓恶性细胞生长或消除恶性细胞并可与本文所公开的经修饰抗体相结合的细胞毒素均在本发明范围之内。

应理解，在先前的研究之中，用同位素标记的抗肿瘤抗体已被成功地用于在动物模型中有时在人类中破坏实体瘤以及淋巴瘤/白血病中的细胞。放射性核素通过产生电离辐射而起作用，所述辐射引起核DNA中的多处链断裂，导致细胞死亡。用于制备治疗缀合物的同位素通常产生高能α-、γ-或β-粒子，其具有治疗有效的光程长度。这类放射性核素杀死其临近的细胞，例如所述缀合物附着或进入的肿瘤细胞。它们通常对非局限细胞无作用或作用极小。放射性核素基本上是无免疫原性的。

至于在本发明中使用放射性标记的缀合物，可以直接标记(如通过碘化作用)或通过使用螯合剂间接标记抗体。在此所用的短语“间接标记”和“间接标记方法”均指将螯合剂共价连到抗体上，以及将至少一种放射性核素与螯合剂相结合。这种螯合剂通常称为双功能螯合剂，因为它们结合多肽和放射性同位素这两者。特别优选的螯合剂包括1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(“MX-DTPA”)和环己基二亚乙基三胺五乙酸(“CHX-DTPA”)衍生物。其它螯合剂包括P-DOTA和EDTA衍生物。用于间接标记的特别优选的放射性核素包括¹¹¹In和⁹⁰Y。

本文所用的短语“直接标记”和“直接标记方法”均指将放射性核素直接共价连到抗体上(通常通过氨基酸残基)。更具体地说，这些连接技术包括随机标记和定点标记。在后一种情况中，标记定向于二聚体或四聚体上的特定位点，如仅存在于缀合物的Fc部分上的N-连接的糖残基。此外，多种直接标记技术和方案均适合于本发明。例如，锝-99m标记的抗体可以通过配体交换方法制备，通过用亚锡离子溶液还原高锝酸盐(TcO₄ ^-)，将还原的锝螯合到Sephadex柱上，并将抗体应用于该柱；或者通过分批标记技术，例如通过温育高锝酸盐、还原剂如SnCl₂、缓冲溶液如邻苯二甲酸钠-钾溶液，和抗体。在任何情况下，优选的用于直接标记抗体的放射性核素是本领域熟知的，特别优选的用于直接标记的放射性核素是¹³¹I，通过酪氨酸残基共价相连。本发明的抗体可以与例如放射性碘化钠或碘化钾及以下物质一起衍生：化学氧化剂如次氯酸钠、氯胺T等，或酶氧化剂如乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖。但是，对于本发明的目的而言，特别优选间接标记方法。

涉及螯合剂和螯合剂缀合物的专利在本领域中是已知的。例如，Gansow的美国专利No.4,831,175针对多取代的二亚乙基三胺五乙酸螯合物和含有其的蛋白缀合物，以及其制备方法。Gansow的美国专利No.5,099,069；5,246,692；5,286,850；5,434,287和5,124,471也涉及多取代的DTPA螯合物。这些专利以其整体引入本文。适合的金属螯合剂的其他实例为乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，1，4，8，11-四氮杂十四烷，1，4，8，11-四氮杂十四烷-1，4，8，11-四乙酸，1-氧杂-4，7，12，15-四氮杂十七烷-4，7，12，15-四乙酸等。特别优选环己基-DTPA或CHX-DTPA，并在以下详细例示。其他合适的螯合剂包括那些有待发现的螯合剂，可容易地由本领域技术人员进行辨别，并清楚地落入本发明范围之内。

优选选择合适的螯合剂，包括用于促进螯合的特定双功能螯合剂(在同时待审的申请08/475,813；08/475,815和08/478,967中)以提供对三价金属的高亲和性，表现出肿瘤对非肿瘤之比增加和骨摄取减少，以及放射性核素在靶部位(即B细胞淋巴瘤肿瘤部位)的体内停留延长。但是，可能具有或不具有所有这些特征的其他双功能螯合剂在本领域中是已知的并可能在肿瘤治疗中也有益。

还应理解，根据本文的教导，抗体可以缀合至不同的放射性标记用于诊断和治疗目的。为此，前述的同时待审的申请(在此以其整体引入本文作为参考)公开了用于在施用治疗抗体之前进行肿瘤诊断性“显像”的放射性标记的治疗缀合物。“In2B8”缀合物包含特异性针对人CD20抗原的小鼠单克隆抗体2B8，其通过双功能螯合剂即MX-DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)连到¹¹¹In上，所述螯合剂包含1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基-DTPA和1-甲基-3-异硫氰酸根合苄基-DTPA的1∶1混合物。特别优选¹¹¹In作为诊断性放射性核素，因为可以安全地施用约1-约10mCi，而无可检测到的毒性；显像数据通常可预测随后的⁹⁰Y标记的抗体分布。大多数显像研究利用5mCi¹¹¹In标记的抗体，因为该剂量既安全又具有与较低剂量相比增加的显像效率，最佳显像在施用抗体之后3-6天发生。参见例如Murray，J.Nuc.Med.26：3328(1985)和Carraguillo等，J.Nuc.Med.26：67(1985)。

如上所述，有多种放射性核素可应用于本发明，相信本领域技术人员应能容易地确定在不同的情况之下何种放射性核素是最适宜的。例如，¹³¹I是一种熟知的用于靶向免疫治疗的放射性核素。但是¹³¹I的临床有用性可受到几种因素的限制，包括：8天的物理半衰期；碘化抗体在血液中和在肿瘤部位的脱卤化作用；和发射特征(例如大γ成分)，其对于在肿瘤中的局部化剂量沉积可能不最理想。随着优异的螯合剂的出现，将金属螯合基团连到蛋白质的机会增加了利用其它放射性核素如¹¹¹In和⁹⁰Y的机会。对于在放射免疫治疗中的应用，⁹⁰Y提供了几种益处：⁹⁰Y的半衰期为64小时，其长度足以使得肿瘤蓄积抗体，并且与例如¹³¹I不同，⁹⁰Y是纯的高能β发射体，在其衰变中不伴有γ辐射，其在组织中的范围为100-1000细胞直径。而且，最低量的穿透辐射使得可对门诊病人施用⁹⁰Y标记的抗体。另外，对于细胞杀伤，不需要标记抗体的内化，并且电离辐射的局部发射对缺乏靶抗原的临近肿瘤细胞应是致死性的。

⁹⁰Y标记的经修饰的抗体的有效单一治疗剂量(即治疗有效量)为约5-约75mCi，更优选约10-约40mCi。¹³¹I标记的抗体的有效单一治疗非骨髓重度抑制剂量从约5-约70mCi，更优选约5-约40mCi。¹³¹I标记的抗体的有效单一治疗重度骨髓抑制剂量(即可能需要自体骨髓移植)为约30-约600mCi，更优选约50-小于约500mCi。与嵌合抗体相结合，碘-131标记的嵌合抗体因其相对于小鼠抗体更长的循环半衰期，其有效单一治疗非骨髓重度抑制剂量从约5-约40mCi，更优选小于约30mCi。对于例如¹¹¹In标记，显像标准通常小于约5mCi。

尽管对于¹³¹I和⁹⁰Y已取得了大量临床经验，其它放射性标记在本领域中也是已知的并已用于类似目的。有其它放射性同位素用于显像。例如，适合本发明范围的其它放射性同位素包括但不限于¹²³I，¹²⁵I，³²P，⁵⁷Co，⁶⁴Cu，⁶⁷Cu，⁷⁷Br，⁸¹Rb，⁸¹Kr，⁸⁷Sr，¹¹³In，¹²⁷Cs，¹²⁹Cs，¹³²I，¹⁹⁷Hg，²⁰³Pb，²⁰⁶Bi，¹⁷⁷Lu，¹⁸⁶Re，²¹²Pb，²¹²Bi，⁴⁷Sc，¹⁰⁵Rh，¹⁰⁹Pd，¹⁵³Sm，¹⁸⁸Re，¹⁹⁹Au，²²⁵Ac，²¹¹At，和²¹³Bi。在这方面，α、γ和β发射体均适于本发明。此外，鉴于本发明所公开的内容，认为本领域技术人员可以容易地确定何种放射性核素适于所选择的疗程而无需过度试验。为此，已用于临床诊断的其它放射性核素包括¹²⁵I，¹²³I，⁹⁹Tc，⁴³K，⁵²Fe，⁶⁷Ga，⁶⁸Ga以及¹¹¹In。抗体也已用多种放射性核素进行标记，以潜在用于靶向免疫治疗Peirersz等，Immunl.Cell Biol.65：111-125(1987)。这些放射性核素包括¹⁸⁸Re和¹⁸⁶Re以及¹⁹⁹Au和⁶⁷Cu(较低程度)。美国专利No.5,460,785提供了有关这种放射性同位素的额外数据，引入本文作为参考。

除了放射性核素之外，本发明的经修饰抗体可以缀合至或结合多种生物反应修饰剂、药剂、毒素或免疫活性配体中的任何一种。本领域技术人员将理解，取决于所选择的细胞毒素，可以使用多种技术装配这些非放射性缀合物。例如，与生物素的缀合物可以这样制备：例如通过使经修饰的抗体与生物素的活化酯如生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯反应。类似的，与荧光标记的缀合物可以在有偶联剂如以上所列的那些偶联剂的存在下进行制备，或通过与异硫氰酸酯优选异硫氰酸荧光素反应。本发明嵌合抗体与抑制细胞增殖的/细胞毒性物质的缀合物和金属螯合物以类似的方式制备。

优选的用于本发明的药剂为细胞毒性药物，特别是那些用于癌症治疗的药物。这种药物包括，一般来说，抑制细胞增殖的药剂、烷化剂、抗代谢剂、抗增殖剂、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂等。可适于本发明的细胞增殖抑制剂的例子包括烷化物质，如氮芥、三乙撑磷酰胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、美法仑或三亚胺醌，还有亚硝基脲化合物，如卡莫司汀、洛莫司汀或司莫司汀。其它优选类别的细胞毒性剂包括例如蒽环家族的药物、长春花药物、丝裂霉素、博来霉素、细胞毒性核苷、蝶啶家族的药物、diynene和鬼臼毒素。这些类别中特别有用的成员包括例如阿德里亚霉素、洋红霉素、柔红霉素(正定霉素)、阿霉素、氨基蝶呤、氨甲蝶呤、甲氨蝶呤、普卡霉素、链霉黑素、二氯氨甲蝶呤、丝裂霉素C、放线菌素D、泊非霉素、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、替加氟、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖甙、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物例如依托泊甙或依托泊甙磷酸盐、美法仑、长春碱、长春新碱、异长春碱、长春地辛、环氧长春碱等。其它适合本文教导的细胞毒素包括紫杉醇、紫杉烷、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴乙锭、吐根碱、替尼泊苷(tenoposide)、秋水仙碱、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、以及嘌罗霉素及其类似物或同类物。激素和激素拮抗剂，如皮质类固醇类，例如强的松；孕激素类，例如羟孕酮或美屈孕酮(medroprogesterone)；雌激素类，例如己烯雌酚；抗雌激素类，例如他莫昔芬；雄激素类，例如睾酮；和芳香酶抑制剂，例如氨基导眠能，也适合本文的教导。如前所述，本领域技术人员可对所需的化合物进行化学修饰，以使该化合物的反应对于制备本发明的缀合物的目的而言更为便利。

特别优选的细胞毒素的一个实例包括enediyne家族抗肿瘤抗生素的成员或衍生物，包括加利车霉素、埃斯波霉素或dynemicin。这些毒素效力非常强，通过裂解核DNA而起作用，导致细胞死亡。与可在体内被切割而产生许多无活性但有免疫原性的多肽片段的蛋白毒素不同，诸如加利车霉素，埃斯波霉素和其它enediynes的毒素是小分子，其基本上无免疫原性。这些非肽毒素可通过先前用于标记单克隆抗体和其它分子的技术而化学连接到二聚体或四聚体上。这些连接技术包括通过仅存在于缀合物Fc部分上的N-连接的糖残基的位点专一性连接。这种定点连接方法的优点在于减少连接对缀合物结合特性的可能影响。

如前所述，合适的细胞毒素可包括前药。本文所用的术语“前药”指药学活性物质的前体或衍生物形式，与亲本药物相比其对肿瘤细胞的细胞毒性较低，并能被酶促活化或转化为活性更高的亲本形式。适合本发明的前药包括但不限于含磷酸的前药、含硫代磷酸的前药、含硫酸的前药、含肽的前药、含β-内酰胺的前药、含选择性取代的苯氧乙酰胺的前药或含选择性取代的苯基乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前药，其可转换为更具活性的细胞毒性游离药物。用于本发明的可衍生为前药形式的细胞毒性药物的其它实例包括以上所述的那些化疗剂。

在其它细胞毒素之中，应理解所述抗体也可以与生物毒素相结合，如蓖麻毒素A亚基、相思豆毒蛋白、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、(botulinum)、cyanginosin、石房蛤毒素、志贺菌毒素、破伤风、河豚毒素、单端孢霉烯、青霉颤抖毒素或毒性酶。优选这种构建体将使用允许直接表达所述抗体-毒素构建体的基因工程技术制备。可与本发明的修饰抗体相结合的其它生物反应修饰剂包括细胞因子，如淋巴因子和干扰素。此外，如上所述，类似的构建体可用于将免疫活性配体(例如抗体或其片段)与本发明的修饰抗体相结合。优选这些免疫活性配体会针对免疫活性效应细胞表面上的抗原。在这些情况下，构建体可用于使效应细胞如T细胞或NK细胞与携带肿瘤相关抗原的肿瘤细胞相接近，从而引发所需的免疫应答。鉴于本文所公开的内容，认为本领域技术人员可使用常规技术容易地形成这类构建体。

“化疗剂”是用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂如噻替哌和环磷酰胺(CYTOXAN^TM)；烷基磺酸盐(酯)类如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；吖啶类如苯并多巴、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替派；氮丙啶类和甲基蜜胺类包括六甲基蜜胺、曲他胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；氮芥类如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯环磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆固醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮乙酰丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加利车霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶酰蝶呤、三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素类如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄氨、睾内酯；抗肾上腺药如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如frolinicacid；醋葡醛内酯；aldophosphamide glycoside；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；defofamine；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2，2’，2”-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXOL，Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton，NJ)和多西他赛(泰索帝，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊甙(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾；navelbine；二羟基蒽酮；替尼泊甙；柔红霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸盐；CPT11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素；capecitabine；和以上任何物质的可药用盐、酸或衍生物。还包括在此定义之内的是抗激素剂，其作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用，如抗雌激素类，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬，抑制芳香酶的4(5)-咪唑类、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奥那司酮，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素类如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和任何上述物质的可药用盐、酸或衍生物。

术语“细胞因子”是对由一个细胞群释放的作为细胞间介质作用于另一个细胞的蛋白质的总称。这种细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括有生长激素如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素，和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如卵泡刺激激素(FSH)、甲状腺刺激激素(TSH)和促黄体生成激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；米勒管-抑制物质；小鼠促性腺激素-相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-13；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素如干扰素-α、-β和-γ；集落剌激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-g、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和试剂盒配体(KL)。在此所用的术语细胞因子包括来自天然来源或重组细胞培养物的蛋白质以及天然序列细胞因子的生物学活性等同物。

本申请中所用的术语“前药”指药学活性物质的前体或衍生物形式，与亲本药物相比其对肿瘤细胞的细胞毒性较低，并能被酶促活化或转变为活性更高的亲本形式。参见例如Wilman，“Prodrugs inCancer Chemotherapy，”Biochemical Society Transactions，14，pp.375-382，615^th Meeting Belfast(1986)和Stella等，“Prodrugs：AChemical Approach to Targeted Drug Delivery，”Directed DrugDelievery，Borchardt等，(ed.)，pp.247-267，Humana Press(1985)。本发明的前药包括但不限于含磷酸的前药、含硫代磷酸的前药、含硫酸的前药、含肽的前药、D-氨基酸-修饰的前药、糖基化的前药、含β-内酰胺的前药、含选择性取代的苯氧乙酰胺的前药或含选择性取代的苯基乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前药，其可转换为更具活性的细胞毒性游离药物。可衍生为前药形式用于本发明的  细胞毒性药物的实例包括但不限于以上所述的那些化疗剂。

“脂质体”是一种由多种类型脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊泡，其可用于将药物(如在此所公开的拮抗剂，以及选择性地化疗剂)递送至哺乳动物。脂质体的成分通常排列成双层结构，类似于生物膜的脂质排列方式。

术语“包装插页”用来指常规包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于使用这种治疗产品的适应症、用法、剂量、给药、禁忌症和/或警告方面的信息。

本发明的方法和产品使用或引入至少一种具有免疫调节活性的抗体，例如抗-B7、抗-CD23、抗-CD40L、抗-CD4或抗-CD40抗体，和任选地至少一种结合B细胞表面标记具有B细胞耗尽活性的抗体，例如抗-CD20、抗-CD22、抗-CD19或抗-CD37抗体。相应地，生成这种抗体的方法将在此进行描述。

用于进行制备或筛选的分子可以是例如可溶形式的抗原或其一部分，含有所需要的表位。或者，或额外地，在其细胞表面表达所述抗原的细胞可用于产生或筛选拮抗剂。用于产生拮抗剂的其它形式的B细胞表面标记对本领域的技术人员而言是显而易见的。用于产生本发明的抗体的CD40L、CD40、CD19、CD20、CD22、CD23、CD37、CD4和B7抗原(例如B7.1或B7.2)的合适抗原来源是广为人知的。或者，可以基于氨基酸序列合成制备肽。例如，对于CD40L，其氨基酸序列在Armitage等(1992)中公开。

优选CD40L抗体或抗-CD40L抗体是在美国专利6,001,358(颁布于1999年6月14日，并转让给IDEC Pharmaceuticals Corporation)中公开的人源化抗-CD40L抗体。

尽管优选的CD40L拮抗剂是抗体，也可以施用除抗体以外的拮抗剂。例如，所述拮抗剂可以包括可溶性CD40、CD40融合蛋白或选择性与细胞毒性剂(如在此所述的那些)融合或缀合的小分子拮抗剂。可以用在此感兴趣的B细胞表面标记筛选小分子文库，以鉴定与该抗原结合的小分子。可进一步筛选小分子的拮抗特性和/或将其与细胞毒性剂缀合。

所述拮抗剂也可以是例如通过合理设计或通过噬菌体展示(WO98/35036，公开于1998年8月13日)产生的肽。在一个实施方案中，所选择的分子可以是例如基于抗体的CDR设计的“CDR模拟物”或抗体类似物。尽管所述肽可以自身即为拮抗性的，可以选择性地将该肽与细胞毒性剂或免疫球蛋白Fc区融合(例如，从而赋予该肽以ADCC和/或CDC活性)。

关于产生用于本发明的抗体拮抗剂的示例性技术如下所述。

优选在动物中产生多克隆抗体，通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂。使用双功能或衍生剂例如马来酰亚氨基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl₂或R¹N＝C＝NR(其中R和R¹是不同的烷基)，将相关抗原缀合至在待免疫物种中具有免疫原性的蛋白例如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂可能是有用的。

通过联合例如100μg或5μg的蛋白或缀合物(分别对于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂并将所述溶液在多个部位进行皮内注射，而对动物进行针对所述抗原、免疫原性缀合物或衍生物的免疫。一个月之后，通过在多个部位皮下注射处于弗氏完全佐剂中的1/5或1/10最初量的肽或缀合物而对动物进行强化免疫。7-14天之后，对动物取血并测定血清的抗体滴度。对动物进行强化免疫直到滴度达到平台。优选用相同抗原但缀合至不同蛋白和/或通过不同的交联试剂得到的缀合物对动物进行强化。缀合物也可以在重组细胞培养物中制备，为蛋白融合物。此外，适当采用聚集剂如明矾以增强免疫应答。

单克隆抗体是从一群本质上均一的抗体获得的，即构成该群体的各抗体除了可能的天然发生的突变之外是完全相同的，所述突变可能以较小量存在。因此，修饰词“单克隆”表示抗体不是离散抗体的混合物的特征。

例如，单克隆抗体可以使用由Kohler等，Nature，256：495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)制备。

在杂交瘤方法中，对小鼠或其它适宜的宿主动物如仓鼠如以上所述进行免疫，以得到产生或能产生将特异性结合用于免疫的蛋白的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可以在体外进行免疫。然后使用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。

将如此制备的杂交瘤细胞接种并生长于合适的培养基中，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常会包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质阻止HGPRT缺陷细胞的生长。

优选的骨髓瘤细胞是那些有效融合、支持所选择的抗体产生细胞稳定高水平产生抗体的骨髓瘤细胞，并对诸如HAT培养基敏感。其中，优选的骨髓瘤细胞系是小鼠骨髓瘤系，如来源于可以从SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，California USA得到的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤，和可以从American Type CultureCollection，Manassas，Virginia，USA得到的SP-2或X63-Ag8-653细胞。还描述过人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系用于产生人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(MarcelDekker，Inc.，New York，1987))。

测定杂交瘤细胞生长于其中的培养基中针对所述抗原的单克隆抗体的产生情况。优选由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀印迹或通过体外结合测定如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。

单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)的30 Scatchard分析来测定。

在鉴定了产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，所述克隆可以通过有限稀释方法进行亚克隆并通过标准方法培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPML-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以在动物体内作为腹水肿瘤生长。

通过常规的免疫球蛋白纯化操作例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，从培养基、腹水或血清中适当地分离由亚克隆所分泌的单克隆抗体。

使用常规的方法易于分离编码单克隆抗体的DNA并对其进行测序(例如，通过使用能特异性结合编码小鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞作为这种DNA的优选来源。一旦被分离之后，可以将DNA置入表达载体中，然后将其转染入宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或原本不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，从而在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5：256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.，130：151-188(1992)。

另一种生成对CD40L，CD19，CD22，CD20或CD40蛋白或肽(例如在美国专利No.5,945,513中描述的gp39融合蛋白)有反应的特异性抗体或抗体片段的方法是，用CD40L，CD19，CD20或CD22蛋白或肽筛选在细菌中表达的编码免疫球蛋白基因或其部分的表达文库。例如，用噬菌体表达文库可在细菌中表达完整的Fab片段、V_H区和Fv区。参见，例如Ward等，Nature 341：544-546(1989)；Huse等，Science246：1275-1281(1989)；和McCafferty等，Nature 348：552-554(1990)。用例如CD40L，CD22，CD19或CD20肽筛选这种文库可鉴定出可与CD40L，CD22，CD19或CD20反应的免疫球蛋白片段。或者，可利用SCID-hu小鼠(可从Genparm得到)来产生抗体或其片段。

在另一个实施方案中，可以从使用在McCafferty等，Nature，348：552-554(1990)中描述的技术生成的抗体噬菌体文库分离抗体或抗体片段。Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离小鼠和人抗体。随后的出版物描述了高亲和力(nM范围)人抗体的产生，通过链改组(Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为策略构建非常大的噬菌体文库(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))。由此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行备选方案。

用于制备针对CD40L(包括人CD40L和小鼠CD40L)的单克隆抗体(MAb)和用于本发明方法的合适单克隆抗体的方法学在标题为“Anti-gp39 Antibodies and Uses Therefor”的PCT申请WO 95/06666中有所描述，该专利申请的教导以其整体引入本文作为参考。特别优选的本发明的抗人CD40L抗体是MAb 24-31和89-76，分别由杂交瘤24-31和89-76产生。分别产生89-76和24-31抗体的89-76和24-31杂交瘤已在1994年9月2日根据布达佩斯条约的规定进行保藏，保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC))，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209。89-76杂交瘤的ATCC保藏号为HB11713，24-31杂交瘤的ATCC保藏号为HB11712。

所述DNA也可以是经修饰的，例如，通过置换人重链和轻链恒定区的编码序列来代替同源的小鼠序列(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接至免疫球蛋白编码序列。

通常，这种非免疫球蛋白多肽被用来代替抗体的恒定区，或者它们被用来代替抗体的一个抗原结合部位的可变区，以创建包含一个对一种抗原具有特异性的抗原结合部位和另一个对不同抗原具有特异性的抗原结合部位的嵌合二价抗体。

将非人抗体人源化的方法已在现有技术中有所记载。优选人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自于“输入”可变区。可以基本上遵循以下方法进行人源化：Winter和同事的方法(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))，通过用高变区序列代替人抗体的相应序列。因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中实质上小于完整的人可变区被来自非人物种的相应序列代替。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中部分高变区残基及可能部分FR残基被来自啮齿类动物抗体中类似位点的残基所代替。

选择用于制备人源化抗体的人可变区(轻链和重链)对降低抗原性是非常重要的。根据所谓的“最适”方法，用啮齿类动物抗体可变区的序列筛选已知的人可变区序列的整个文库。然后接受最接近啮齿类动物的人序列作为人构架区(FR)用于人源化抗体(Suns等，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。另一种方法使用来源于具有特定亚型轻链或重链的所有人抗体的共有序列的特定构架区。该相同的构架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.，151：2623(1993))。

另外重要的是，抗体被人源化时保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了实现这一目标，根据优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和多种构思的人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可以得到的并且是本领域的技术人员所熟悉的。说明并展示所选择的候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序是可以得到的。观察这些展示可分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中可能起的作用，特别是分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以此方式，可以从受者和输入序列选择并组合FR残基，从而获得所需要的抗体特征，如对靶抗原的亲和力增加。一般来说，高变区残基直接并最为实质性地参与对抗原结合的影响。

另一种高效的生成重组抗体的方式由Newman，Biotechnology，10：1455-1460(1992)公开。更具体地说，该技术导致生成包含猴可变区和人恒定序列的灵长类动物源化抗体。该参考文献以其整体引入本文作为参考。此外，该技术还记载于以下文献：普通转让的美国申请No.08/379,072(1995年1月25日提交)，它是U.S.Serial No.07/912,292(1992年7月10日提交)的继续申请，而后者是U.S.SerialNo.07/856,281(1992年3月23日提交)的部分继续申请，No.07/856,281又是U.S.Serial No.07/735,064(1991年7月25日提交)的部分继续申请。08/379,072及其母案申请均以其整体引入本文作为参考。

该技术修饰抗体，从而使得它们在施用于人时不受到抗原性排斥。该技术依赖于用人抗原或受体免疫猕猴。该技术被开发用于创建针对人细胞表面抗原的高亲和性单克隆抗体。

可使用在普通转让的美国申请No.08/487,550(1995年6月7日提交，以其整体引入本文作为参考)中描述的方法，筛选噬菌体展示文库或利用来自CD40L，CD20，CD22，CD40或CD19免疫猴的B淋巴细胞所获得的猴异杂交瘤，鉴定抗人CD40L，CD20，CD22，CD40或CD19的猕猴抗体。

据先前的报道，使用在这些申请中所述的方法生成的抗体表现出人效应功能，免疫原性降低，并且血清半衰期长。该技术依赖于这样的事实，即尽管猕猴与人类在系统发生上相近似，它们仍识别许多人蛋白为外来物并因此产生免疫应答。而且，由于猕猴与人类在系统发生上相近，在这些猴中生成的抗体已被发现与在人中产生的抗体具有高度的氨基酸同源性。事实上，在对猕猴免疫球蛋白轻链和重链可变区基因进行测序之后，发现各基因家族的序列与其人对应物的同源性为85-98％(Newman等，1992)。以这种方式产生的第一个抗体，抗CD4抗体，与人免疫球蛋白构架区的共有序列的同源性为91-92％(Newman等，1992)。

如上所述，本发明部分地涉及单克隆抗体或其灵长类动物源化形式的用途，所述抗体特异性针对人CD40L抗原，并能抑制CD40信号作用或抑制CD40/CD40L相互作用。用所鉴定的抗体(或其治疗有效片段)阻断CD40与CD40L之间的主要活化位点，同时使得对正向共同刺激的拮抗作用与对负向信号作用的激动作用相结合，将成为对在复发形式的恶性肿瘤特别是B细胞淋巴瘤和白血病中进行干预的有用治疗方法。所鉴定抗体的功能活性由阻断CD40的信号(使其存活并避免IgM-或Fas-诱导的凋亡)来定义。

可以使用在美国专利No.6,001,358或5,750,105(均转让给IDECPharmaceuticals Corporation)中描述的方法或其它已知方法，制备特异性结合人CD40L的单克隆抗体以及由其衍生的灵长类动物源化抗体。优选这种抗体将具有对CD40L的高度亲和性，并因此可用作抑制CD40L/CD40途径的免疫抑制剂。类似的技术将产生特异性针对CD20，CD19，CD22或CD40的猴抗体。

制备猴单克隆抗体将优选通过以下方法实现：筛选噬菌体展示文库，或使用从用CD40L(例如人CD40L)免疫的猴获得的B淋巴细胞制备猴异杂交瘤。人CD40也可以来自在美国专利No.5,945,513中描述的融合蛋白。

如上所述，生成抗CD40L，CD19，CD20，CD22或CD40抗体的第一种方法涉及重组噬菌体展示技术。通常这将包括合成针对靶目标的重组免疫球蛋白文库，所述靶目标即在丝状噬菌体表面上展示的CD19，CD22，CD20，CD40或CD40L抗原，和选择分泌具有对CD40L抗原高亲和性的抗体的噬菌体。如上文所述，优选将选择结合人CD40L和CD40这两者的抗体。为实现这种方法，本发明人创建了对于猴文库的独特文库，其降低了重组的可能性并提高了稳定性。

基本上，为采用用于猕猴文库的噬菌体展示，该载体含有为PCR扩增猴免疫球蛋白基因的特异性引物。这些引物是基于开发灵长类动物源化技术时所获得的猕猴序列和包含人序列的数据库。适宜的引物公开于普通转让的08/379,072(引入本文作为参考)。

第二种方法涉及对猴即猕猴进行针对目的抗原靶即人CD19，CD20，CD22，CD40或CD40L的免疫。将猕猴用于产生单克隆抗体的固有优点在上文中已讨论。具体地说，可以用人抗原或受体免疫这种猴即猕猴。此外，所得的抗体可用于根据Newman等(1992)和Newman等普通转让的U.S.Serial No.08/379,072(1995年1月25日提交，以其整体引入本文作为参考)的方法制备灵长类动物源化抗体。

从猕猴获得的抗体的显著优点在于，这些猴识别许多人蛋白为外来物并因而会形成抗体，其中某些对所需的人抗原如人表面蛋白和细胞受体具有高亲和性。而且，由于其与人类在系统发生上相近，所得的抗体表现出与在人类中产生的抗体高度的氨基酸同源性。如上所述，在对猕猴免疫球蛋白轻链和重链可变区基因进行测序之后，发现各基因家族的序列与其人对应物的同源性为85-88％(Newman等，1992)。

更具体地说，对猕猴施用人CD19，CD20，CD22，CD40或CD40L抗原，从其中分离B细胞，例如从动物取淋巴结活检，然后使用聚乙二醇(PEG)将B淋巴细胞与KH6/B5(小鼠x人)异骨髓瘤细胞融合。然后鉴定分泌结合人CD40L抗原的抗体的异杂交瘤。

对于结合CD40L或CD40的抗体，理想的是它们发生结合的方式可干扰或调节CD40信号作用，因为这种抗体，与其反受体一起，可潜在地用于抑制CD40L与CD40的相互作用。如果可开发针对CD40L或CD40上超过一种表位的抗体，并将所述抗体一起应用，则它们的联合活性可能会提供协同效应。

本发明涉及使用一种动物，其被致敏以产生特定的抗体(例如，灵长类动物，如organgutan、狒狒、恒河猴和猕猴)。可用于产生针对人CD40L的抗体的其它动物包括但不限于以下：小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猴、猪、山羊和兔。

然后将表达特异性结合人CD40L抗原的抗体的细胞系用于克隆可变区序列以制备灵长类动物源化抗体，基本上如以下文献中所述：Newman等，(1992)和Newman等，U.S.Serial No.379,072(1995年1月25日提交)，这两篇文献均引入本文作为参考。基本上，这必需包括从中提取RNA，转化为cDNA，并使用Ig特异性引物通过PCR对其进行扩增。合适的引物在Newman等，1992和U.S.Serial No.379,072中有所记载。类似的技术将产生表达特异性针对CD40，CD19，CD20或CD22的抗体的细胞系。

然后将克隆的猴可变基因插入表达载体中，该表达载体含有人重链和轻链恒定区基因。优选使用被称为NEOSPLA的IDEC，Inc.专利表达载体来实现该步骤。该载体含有巨细胞病毒启动子/增强子，小鼠β球蛋白主要启动子，SV40复制起点，牛生长激素聚腺苷酸化序列，新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2，人免疫球蛋白κ或λ恒定区，二氢叶酸还原酶基因，人免疫球蛋白γ1或γ4 PE恒定区和前导序列。已发现该载体经引入猴可变区基因、转染入CHO细胞、然后在含G418的培养基中选择及氨甲蝶呤扩增后，会非常高水平地表达灵长类动物源化抗体。

例如，先前公开了该表达体系会产生对CD4和其它人细胞表面受体具有高亲和性(Kd≤10^-10M)的灵长类动物源化抗体。而且，已发现所述抗体表现出与原始的猴抗体相同的亲和性、特异性和功能活性。该载体系统实质上记载于普通转让的U.S.Serial No.379,072(引入本文作为参考)以及U.S.Serial No.08/149,099(1993年11月3日提交，也以其整体引入本文作为参考)。该体系提供高表达水平，即＞30pg/细胞/天。当然，可使用相同的方法制备产生特异性针对CD19，CD20，CD22或CD40的抗体的细胞系。

作为人源化的备选方案，可以产生人抗体。例如，现在已可能产生转基因动物(例如小鼠)，其经免疫能产生人抗体的所有组成成分而无内源性免疫球蛋白产生。例如，已描述了在嵌合和种系突变小鼠中纯合缺失抗体重链连接区PH)基因导致完全抑制内源性抗体产生。在这种种系突变小鼠中转入人种系免疫球蛋白基因阵列会导致在抗原攻击时产生人抗体。参见例如Jakobovits等，Proc.Mad.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等，Year in immuno.，7：33(1993)；和美国专利No.5,591,669、5,589,369和5,545,807。

或者，可以使用噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature348：552-553(1990))，从来自非免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因所有组成成分，在体外产生人抗体和抗体片段。根据该技术，将抗体V区基因符合读框地克隆入丝状噬菌体如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因，并在噬菌体颗粒的表面上展示为有功能的抗体片段。由于丝状颗粒含有单链DNA拷贝的噬菌体基因组，基于抗体功能特性的选择还导致选择编码表现出那些特性的抗体的基因。因此，该噬菌体模拟B细胞的某些特性。噬菌体展示可以以多种形式进行；关于其综述参见例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。可以使用几种来源的V基因片段用于噬菌体展示。Clackson等，Nature，352：624-628(1991)从来源于免疫小鼠脾的V基因小随机组合文库分离了一大批不同的抗噁唑酮抗体。可以基本上遵循以下技术构建来自未免疫人供体的V基因的所有组成成分，并且可以分离针对一大批不同的抗原(包括自身抗原)的抗体：Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.12：725-734(1993)。还参见美国专利No.5,565,332和5,573,905。

还可以由体外活化的B细胞产生人抗体(参见美国专利No.5,567,610和5,229,275)。使用SCID小鼠生成人抗体的优选方式公开于共有的同时待审的申请中。

已发展了多种技术用于产生抗体片段。传统的做法是通过蛋白水解消化完整的抗体而产生这些片段(参见例如Morimoto等，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan等，Science，229：81(1985))。然而，这些片段现在可以由重组宿主细胞直接产生。例如，可以从上述抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可以从大肠杆菌直接回收Fab’-SH片段并化学偶联以形成F(ab’)2片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992)).根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab’)2片段。用于产生抗体片段的其它技术对技术人员而言是显而易见的。在其它的实施方案中，所选的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894；和美国专利No.5,587,458。抗体片段还可以是“线状抗体”，例如在美国专利No.5,641,870中所述。这种线状抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。

双特异性抗体是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。示例性的双特异性抗体可结合B细胞表面标记的两种不同表位。其它的这种抗体可结合第一B细胞标记并进一步结合第二B细胞表面标记。或者抗B细胞标记结合臂可与结合白细胞上的触发分子的臂联合，所述触发分子如T细胞受体分子(例如CD2或CD3)或IgG的Fc受体(FcyR)如FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16)，以将细胞防御机制集中到B细胞。双特异性抗体还可以用于使细胞毒性剂局限定位于B细胞。这些抗体具有B细胞标记结合臂和结合细胞毒性剂(例如皂草素、抗干扰素α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab)2双特异性抗体)。

制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上产生全长双特异性抗体是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Millstein等，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配组合，这些杂交瘤(quadroma)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。对正确分子的纯化(通常是通过亲和层析步骤完成)相当麻烦，并且产物的产率低。类似的操作公开于WO 93/08829和Traunecker等，EMBO J.，10：3655-3659(1991)。

根据一种不同的方法，将具有所需要的结合特异性(抗体-抗原结合部位)的抗体可变区融合至免疫球蛋白恒定区序列。所述融合优选是与免疫球蛋白重链恒定区，包括至少部分铰链区、CH2和CH3区。优选在至少一种融和中存在包含轻链结合所必需位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物，和如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入分别的表达载体，并共转染至适合的宿主生物体中。当构建中所用的3种多肽链的不等比例提供最理想的产率时，这为在实施方案中调节3种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。但是，当至少两种多肽链以相等比例表达导致高产率时或当比例无关紧要时，可将两种或全部3种多肽链的编码序列插入一个表达载体中。

在该方法的优选实施方案中，双特异性抗体由在其一条臂的具有第一结合特异性的杂种免疫球蛋白重链，和在其另一条臂的杂种免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现该不对称结构有助于所需要的双特异性化合物从不需要的免疫球蛋白链组合分离，因为仅在双特异性分子的一半存在免疫球蛋白轻链为分离提供了便利的途径。该方法公开于WO 94/04690。关于产生双特异性抗体的更多细节，参见例如Suresh等，Methods in Enzymology，121：210(1986)。

根据在美国专利No.5,731,168中描述的另一种方法，可以将一对抗体分子之间的界面改造成使从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比达到最大。优选的界面包括抗体恒定区CH3域的至少一部分。在该方法中，将来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链置换为较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)置换大氨基酸侧链而在第二抗体分子的界面上创建与大侧链相同或相似大小的互补“空穴”。这提供了一种机制来增加异二聚体相对于其它不想要的终产物如同二聚体的产率。

双特异性抗体包括交联的或“异缀合”抗体。例如异缀合物中的抗体之一可以偶联至抗生物素蛋白，而另一抗体偶联至生物素。已提出例如用这种抗体使免疫系统细胞瞄准不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)，并用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可以使用任何便利的交联方法来制备异缀合抗体。合适的交联剂以及多种交联技术是本领域广为人知的，并公开于美国专利No.4,676,980中。

用于从抗体片段生成双特异性抗体的技术在文献中也已有记载。例如，可以使用化学键合制备双特异性抗体。Brennan等，Science，229：81(1985)描述了一种方法，其中将完整的抗体进行蛋白水解切割，以生成F(ab’)2片段。将这些片段在二硫醇配位剂亚砷酸钠的存在下还原以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫化键形成。然后将生成的Fab’片段转换为硫代硝基苯甲酸(TNB)衍生物。然后将Fab’-TNB衍生物之一通过用巯基乙胺进行还原而重新转换为Fab’-硫醇，并与等摩尔量的另一Fab’-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可用作选择性固定酶的物质。

近来的研究进展有助于从大肠杆菌直接回收Fab’-SH片段，其可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.，175：2 17-225(1992)描述了完全人源化双特异性抗体F(ab’)₂分子的产生。各Fab’片段分别从大肠杆菌中分泌出来，并在体外进行定向的化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能结合过量表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，以及引发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶的溶解活性。

用于直接从重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的多种技术也已有记载。例如，已使用亮氨酸拉链制备了双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合连接到两种不同抗体的Fab’部分。将该抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后再氧化以形成抗体异二聚体。此方法还可用于产生抗体同二聚体。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)描述的“diabody”技术为制备双特异性抗体片段提供了备选机制。所述片段包含重链可变区(V_H)，通过接头连接至轻链可变区(V_L)，所述接头的长度不足以使得相同链上的两个区之间发生配对。因此，一个片段的V_H和V_L区被迫与另一个片段的互补V_L和V_H区配对，从而形成两个抗原结合部位。通过使用单链Fv(sFv)二聚体而制备双特异性抗体片段的另一种策略也已有报道，参见Gruber等，J.Immunol.，152：5368(1994)。

可以想到具有超过二价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.147：60(1991)。

在此可以预见对所述抗体的其它修饰。例如，抗体可以连接到多种非蛋白质聚合物中的一种，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物。

在此公开的抗体还可以制成脂质体。含有拮抗剂的脂质体通过本领域已知的方法制备，如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；美国专利No.4,485,045和4,544,545；和WO97/38731(公开于1997年10月23日)。循环时间延长的脂质体公开于美国专利No.5,013,556。

特别有用的脂质体可以如下产生：通过反相蒸发方法，使用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物。通过确定孔径的滤器挤出脂质体以产生具有所需直径的脂质体。本发明抗体的Fab’片段可以如Martin等，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)所述通过二硫化物互换反应而缀合至脂质体。在脂质体中可选择性地含有化疗剂。参见Gabizon等，J.National CancerInst.81(19)1484(1989)。

可以预见在此描述的蛋白或肽拮抗剂的氨基酸序列修饰。例如，可能想要改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变异体通过如下方法制备：将适宜的核苷酸改变引入抗体编码核酸，或通过肽合成。这种修饰包括，例如缺失，和/或插入，和/或置换拮抗剂氨基酸序列中的残基。对缺失、插入和置换作任何组合以得到最终的构建体，条件是最终的构建体具有所需要的特征。氨基酸改变还可能改变拮抗剂的翻译后过程，如改变糖基化位点的数目或位置。

一种用于鉴定抗体中作为诱变优选位置的特定残基或区域的有用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells，Science，244：1081-1085(1989)所述。在此，靶残基中的一个或一组得到鉴定(例如带电荷的残基，如arg，asp，his，lys和glu)，并被中性或带负性电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)置换以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对置换位点引入进一步的或其它的变异体来精修那些证实对置换在功能上敏感的氨基酸位置。这样，尽管预先确定引入氨基酸序列变异的位点，但突变本身的性质并不需要预先确定。例如，为了分析在给定位点突变所表现出的作用，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达的拮抗剂变异体进行所需活性的筛选。

氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-末端融合，长度从1个残基至含有100个或更多个残基的多肽，以及序列内插入单个或多个氨基酸残基。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的拮抗剂或融合至细胞毒性多肽的拮抗剂。拮抗剂分子的其它插入变异体包括酶或延长拮抗剂血清半衰期的多肽融合至拮抗剂的N-或C-末端。

另一类型的变异体是氨基酸置换变异体。对于这些变异体，拮抗剂分子中的至少一个氨基酸残基被不同的残基置换。对抗体拮抗剂进行置换诱变的最有用位点包括高变区，但也可以预见FR改变。保守置换如表1所示，标题为“优选的置换”。如果这种置换导致生物学活性改变，则可以引入表1中的更为实质性的改变(称为“示例性置换”)或如以下参照氨基酸类别进一步描述，并对产物进行筛选。

                       表1

原始残基	示例性置换	优选的置换
			Ala(A)	val；leu；ile	val
Arg(R)	lys；gin；asn	lys
			Asn(N)	gln；his；asp，lys；arg	gln
Asp(D)	glu；asn	glu
			Cys(C)	ser；ala	ser
Gln(Q	asn；glu	asn
			Glu(E)	asp；gin	asp

Gly(G)	ala	ala
			His(H)	asn；gin；lys；arg	arg
Ile(I)	leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸	leu
			Leu(L)	正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe	ile
Lys(K)	arg；gln；asn	arg
			Met(M)	leu；phe；ile	leu
Phe(F)	leu；val；ile；ala；tyr	tyr
			Pro(P)	ala	ala
Ser(S)	thr	thr
			Thr(T)	ser	ser
Trp(W)	tyr；phe	tyr
			Tyr(Y)	trp；phe；thr；ser	phe
Val(V)	ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸	leu

对抗体的生物学特性的实质性修饰是通过如下方法实现的：通过选择其对维持(a)在置换区域的多肽主链的结构，例如作为折叠或螺旋构象，(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小的效应显著不同的置换。天然存在的残基基于共同的侧链特性分为以下几组：

(1)  疏水性：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；

(2)  中性亲水性：cys，ser，thr；

(3)  酸性：asp，glu；

(4)  碱性：asn，gln，his，lys，arg；

(5)  影响链取向的残基：gly，pro；和

(6)  芳香族：trp，tyr，phe。

非保守置换将伴有这些类别之一的成员换成另一类别。

任何不参与维持拮抗剂适当构象的半胱氨酸残基也可以被置换，通常置换为丝氨酸，以提高分子的氧化稳定性并防止异常的交联。反过来，可以将半胱氨酸(键)添加入拮抗剂以改善其稳定性(特别是当拮抗剂是抗体片段如Fv片段的情况)。

特别优选类型的置换变异体包括置换亲本抗体(如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变异体相对于产生其的亲本抗体具有改善的生物学特性。产生这种置换变异体的便利方法是使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，对几个高变区位点(例如6-7个位点)进行突变以产生在每个位点所有可能的氨基酸置换。如此产生的抗体变异体以单价的方式由丝状噬菌体颗粒展示，作为在每个颗粒中包装的与M13的基因III产物的融合体。然后如在此所公开的，对由噬菌体展示的变异体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定进行修饰的候选高变区位点，可以对已鉴定的对抗原结合起显著作用的高变区残基进行丙氨酸扫描诱变。或者，或另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体与抗原之间的接触点可能是有益的。这种接触残基和邻近的残基可作为根据在此详述的技术进行置换的候选对象。一旦产生了这种变异体，对这些变异体如在此所述进行筛选，可选择在一种或多种相关测定中显示出优异特性的抗体作进一步开发。

抗体的另一类型氨基酸变异体改变了拮抗剂原本的糖基化模式。改变意味着去除拮抗剂中存在的一个或多个糖部分，和/或添加拮抗剂中不存在的一个或多个糖基化位点。

多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接指糖部分附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是糖部分酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中这些三肽序列中任一个的存在创建潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸的附着，所述羟基氨基酸最常见为丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。

通过改变氨基酸序列使得其含有一个或多个上述三肽序列而便利地实现向抗体添加糖基化位点(对于N-连接的糖基化位点)。还可以通过向最初拮抗剂的序列添加或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行改变(对于O-连接的糖基化位点)。

编码抗体的氨基酸序列变异体的核酸分子可通过多种本领域已知的方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(对于天然存在的氨基酸序列变异体的情况)，或通过对拮抗剂的较早制备的变异体或非变异形式进行寡核苷酸介导(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。

可能需要修饰本发明中所使用的抗体，以改善效应功能。例如，增强拮抗剂的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可以通过将一个或多个氨基酸置换引入抗体拮抗剂的Fc区来实现。或者或额外地，可以将半胱氨酸残基引入Fc区，从而在该区域中形成链间二硫键。如此生成的同二聚体抗体可能内化能力提高和/或补体介导的细胞杀伤作用及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)增强。参见Caron等，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。也可以使用如Wolff等，Cancer Research 53：2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂制备抗肿瘤活性增强的同二聚体抗体。或者可以改造具有双重Fc区的抗体，从而可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。

为了延长抗体的血清半衰期，可以将补救受体结合表位引入拮抗剂(特别是抗体片段)，例如如美国专利5,739,277中所述。在此所用的术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1，IgG2，IgG3或IgG4)的Fc区的表位，它使得IgG分子在体内的血清半衰期延长。

包含本发明所使用的拮抗剂的治疗制剂是这样制备用于贮存的：将具有所需纯度的拮抗剂与选择性的可药用载体、赋形剂或稳定剂相混合(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16^th edition，Osol，A.Ed.(1980))，制成冻干制剂或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂以所采用的剂量和浓度对接受者是无毒性的，包括缓冲剂如磷酸、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；苯扎氯铵，氯化苄乙氧铵；苯酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐平衡离子如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和/或非离子型表面活性剂如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。

免疫调节抗体和B细胞耗尽抗体可以处于同一制剂中或以不同制剂给药。所述组合物可进一步包括其它非抗体拮抗剂，例如CD40L或B7拮抗剂。其实例包括可溶性CD40、B7及其融合物。给药可以是同时的或序贯的，并且任一次序都会有效。

示例性的抗CD20抗体制剂如WO98/56418所述(在此特别引入作为参考)。该公开文献描述了一种液体多剂量制剂，包含40mg/mLrituximab，25mM乙酸，150mM海藻糖，0.9％苄醇，0.02％聚山梨酯20，pH为5.0，最低架期为贮存于2-8℃两年。另一种有用的抗CD20制剂包含10mg/mL rituximab，处于9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨酯80及无菌注射用水中，pH6.5。

适于皮下给药的冻干制剂如WO97/04801中所述。这种冻干制剂可以用合适的稀释剂重新配制至高蛋白浓度，并可将重新配制的制剂对在此待治疗的哺乳动物进行皮下给药。

在此所述制剂还可以包含超过一种对所治疗的特定适应症所必需的活性化合物，优选具有互补活性彼此不产生不利影响的那些。例如，可能想要进一步提供一种化疗剂、细胞因子或免疫抑制剂(例如作用于T细胞的物质，如环孢菌素，或结合T细胞的抗体，例如结合LFA-1的抗体)。这种其它物质的有效量取决于制剂中存在的拮抗剂的量、疾病或障碍或治疗的类型，以及以上讨论的其它因素。这些物质通常以与上文所用相同的剂量和给药途径使用，或迄今所采用剂量的约1-99％。

活性成分还可以包入例如通过30凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，分别在胶态药物递送体系中(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳状液、纳米颗粒和纳米胶囊)或处于粗滴乳状液中。这种技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences 16^th edition，Osol，A.Ed.(1980)。

可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物的半透基质，所述基质为成形产品的形式，例如薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物与醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。用于体内给药的制剂必须是无菌的。通过经无菌过滤膜滤过可以容易地实现这一要求。

将配制、调剂量并以符合正规医学实践的方式施用包含B细胞耗尽抗体和/或免疫调节抗体的组合物。在这种情况下要考虑的因素包括所治疗的特定恶性肿瘤或疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床情况、疾病或障碍的病因、药剂递送部位、给药方法、给药方案和医学从业者所知道的其它因素。待施用的抗体的治疗有效量将通过这些考虑因素来控制和决定。

如以上广泛讨论的，所选择的本发明的实施方案包括向患者施用抗体，或与一种或多种辅助治疗如放疗或化疗相联合或结合(即联合治疗方案)。如在此所用的，施用抗体与另一种选择的抗体或辅助治疗相结合或联合意味着序贯、同时、延伸及同时间、并行、相伴或同时期的给药或应用所公开的抗体和/或治疗。本领域的技术人员将理解可以设定施用或应用所述联合治疗方案的各种组成成分的时间，以增加治疗的总有效性。例如，可以以标准的熟知的疗程施用免疫调节抗体，然后在数周之内施用本发明的B细胞耗尽抗体。反过来，可以静脉内施用与细胞毒素结合的B细胞耗尽抗体，然后是局限于肿瘤局部的外射线照射。在另外的实施方案中，免疫调节抗体可以与一种或多种所选择的B细胞耗尽抗体在一次就诊中同时施用。技术人员(如有经验的肿瘤学家)基于所选择的抗体和本申请说明书的教导，能容易地判断有效的联合治疗方案，而无需过多试验。

在这方面，应理解所选择的抗体组合可以以任何次序并在对患者提供治疗裨益的任何时间框架内施用。即，免疫调节抗体以及任选地B细胞抗体可以以任何次序或同时施用。在选择的实施方案中，本发明的免疫调节抗体将施用于先前经历过B细胞耗尽的患者。在其它的实施方案中，选择的免疫调节抗体(例如抗B7和抗CD40L)将基本上同时或相伴施用。在优选的实施方案中，选择的抗体(无论免疫调节或B细胞耗尽)将在彼此用药1年之内施用。在其它优选的实施方案中，选择的抗体将在彼此用药10、8、6、4或2个月内施用。在另外优选的实施方案中，选择的抗体将在彼此用药4、3、2或1周内施用。在另外的实施方案中，选择的抗体将在彼此用药5、4、3、2或1天内施用。也可以理解所选择的药剂或治疗可在事实上数小时或数分钟之内(即基本上同时)施用于患者。

作为一般的建议，每剂胃肠外给药的抗体的治疗有效量通常为大约0.1-500毫克/公斤患者体重/天，通常所用拮抗剂的初始范围为大约2-100毫克/公斤。

优选的B细胞耗尽抗体是RITUXAN。这种抗体的合适剂量是例如从大约20mg/m²至大约1000mg/m²。该抗体的剂量可以与现在推荐RITUXAN用于治疗非霍奇金淋巴瘤的剂量相同或不同。例如，可以给予患者一剂或多剂实质上小于375mg/m²的抗体，例如剂量从大约20mg/m²至大约250mg/m²，例如从大约50mg/m²至大约200mg/m²。

此外，可以施用一个或多个初始剂量的抗体，然后施用一个或多个后续剂量，其中在后续剂量中的mg/m²抗体剂量超过在初始剂量中的mg/m²抗体剂量。例如，初始剂量可以从大约20mg/m²至大约250mg/m²(例如从大约50mg/m²至大约200mg/m²)，而后续剂量可以从大约250mg/m²至大约1000mg/m²。

然而，如以上提到的，免疫调节抗体和B细胞耗尽抗体的这些建议量均要经受大量的治疗判断。在选择适宜剂量和时序安排中的关键因素是获得的结果，如以上所指出的。例如，对于治疗正在发生的和急性的疾病，最初可能需要相对较高的剂量。为了获得最有效的结果，取决于特定的B细胞恶性肿瘤，拮抗剂的给予要尽可能接近所述疾病或障碍最初的征象、诊断、表现或发生或在所述疾病或障碍的消退期间。

可通过任何合适的方式给予抗体，包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内，如果需要进行局部免疫抑制治疗，可通过病损内给药。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。另外，抗体可以适当地通过脉冲输注给予，例如用下降剂量的抗体。优选通过注射给药，最优选静脉内或皮下注射，部分地取决于给药是短暂的还是长期的。

可以与本文的抗体一起另外施用其它化合物，如化疗剂、免疫抑制剂和/或细胞因子。联合给药包括使用单独分开的制剂或单一的药物制剂共同给药，以及以任一次序的序贯给药，其中优选存在一个时间段，而使两种(或全部)活性剂同时发挥其生物学活性。

除了将抗体给予患者之外，本发明还预见通过基因疗法施用抗体。这种编码所述抗体的核酸的给药包括在“施用治疗有效量的拮抗剂”表述之中。参见例如WO96/07321(公开于1996年3月14日)，其涉及使用基因疗法产生胞内抗体。

有两种主要的方法将核酸(选择性地包含在载体之中)置入患者细胞中：体内和离体。对于体内递送，将核酸直接注射入患者体内，通常在需要拮抗剂的部位进行注射。对于离体治疗，取出患者细胞，将核酸引入这些分离的细胞中，并将经修饰的细胞直接给予患者或例如包封入多孔膜内植入患者体内(参见例如美国专利No.4,892,538和5,283,187)。有多种可利用的技术将核酸引入活细胞中。这些技术各异，取决于核酸是在体外转移入培养的细胞，还是在体内转移入指定宿主的细胞中。适于在体外将核酸转移入哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体、电穿孔、微注射、细胞融合、DEAF-葡聚糖、磷酸钙沉淀方法等。用于离体递送基因的常用载体是逆转录病毒。

当前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(如腺病毒、单纯疱疹I病毒或腺伴随病毒)转染和基于脂质的体系(对脂质介导的基因转移有用的脂质是例如DOTMA，DOPE和DC-Chol)。在某些情况下，需要给核酸来源提供以靶细胞为目标的物质，如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异性的抗体，靶细胞上受体的配体等。当采用脂质体时，可以使用结合与胞吞作用相关的细胞表面膜蛋白的蛋白以定向和/或促进摄取，例如亲特定细胞类型的衣壳蛋白或其片段、针对在循环中经历内化作用的蛋白的抗体，和引导胞内定位并延长胞内半衰期的蛋白。受体介导的胞吞技术有所记载，例如Wu等，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987)；和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：3410-3414(1990)。关于目前已知的基因标记和基因疗法方案的综述，参见Anderson等，Science 256：808-813(1992)。还可参见WO93/25673及其中引用的参考文献。

如先前所讨论的，本发明的抗体、其免疫反应性片段或重组体可以以药学有效量施用以在体内治疗哺乳动物恶性肿瘤。在此方面，应理解所公开的抗体将配制为易化给药和增加活性剂的稳定性。优选本发明的药物组合物包括可药用无毒无菌载体，如生理盐水，无毒缓冲剂、防腐剂等。对于本申请的目的而言，缀合或未缀合至细胞毒性剂的治疗抗体、其免疫反应性片段或重组体的治疗有效量应被认为意味着足以实现与肿瘤细胞上的所选择免疫反应性抗原有效结合并使那些细胞死亡增加的量。当然，本发明的药物组合物可以以单剂或多剂施用以提供药学有效量的经修饰抗体。

更具体地说，所公开的抗体和方法应可用于减小肿瘤体积，抑制肿瘤生长和/或延长携带肿瘤的动物的存活时间。因此，本发明还涉及治疗人类或其它动物中的肿瘤的方法，通过向所述人或动物施用有效无毒量的至少一种免疫调节抗体，以及任选地至少一种B细胞耗尽抗体。本领域技术人员能通过常规试验确定为治疗恶性肿瘤目的的经修饰抗体的有效无毒量。例如，经修饰抗体的治疗活性量可根据多种因素而变化，诸如疾病阶段(例如I期相对于IV期)、治疗对象的年龄、性别、医学并发症(例如免疫抑制病症或疾病)和体重，以及所述抗体在该对象中引发所需应答的能力。可以调整剂量方案，以提供最理想的治疗反应。例如，每天可施用几个分开的剂量，或者根据治疗情况的紧急事件可成比例地减少剂量。然而一般来说，预计有效剂量在约0.05-100毫克/公斤体重/天的范围之内，更优选0.5-10毫克/公斤体重/天。

依据本文公开内容的范围，本发明的抗体可按照上述治疗方法以足以产生治疗或预防程度的作用的量施用于人或其它动物。本发明的抗体可以以常规剂型施用于所述人或其它动物，该剂型是按照已知技术通过将本发明的抗体与常规可药用载体或稀释剂相结合而制备的。本领域技术人员将认识到，可药用载体或稀释剂的形式和性质取决于其有待与之结合的活性成分的量，给药途径和其它已知的变量。本领域技术人员还将理解，包含一种或多种本发明的单克隆抗体的混合剂可能证实特别有效。

制备和施用抗体、其免疫反应性片段或重组体与治疗剂的缀合物的方法对于本领域技术人员而言是熟知的或可以容易确定。本发明抗体(或其片段)的给药途径可以是口服、胃肠外、吸入或局部用药。本文所用的术语胃肠外包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道给药。通常优选静脉内、动脉内、皮下和肌内形式的胃肠外给药。尽管所有这些形式的给药很明显均在本发明范围之内，优选的给药形式为注射溶液，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。通常，适于注射的药物组合物可包含缓冲剂(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、表面活性剂(例如聚山梨酯)，任选地稳定剂(例如人白蛋白)等。但是，在其它符合本文教导的方法中，抗体可以被直接递送恶性肿瘤部位，从而增加肿瘤组织与治疗剂的接触。

用于胃肠外给药的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬液和乳液。非水溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水，醇/水溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。在本发明中，可药用载体包括但不限于，0.01-0.1M优选0.05M磷酸缓冲液或0.8％盐水。其它常用的胃肠外载体包括磷酸钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化林格氏液或不挥发油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂如基于林格氏葡萄糖的那些，和诸如此类。防腐剂和其它添加剂也可能存在，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

更具体地说，适于注射应用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性)或分散体，和无菌粉末用于临时制备无菌注射溶液或分散体。在这种情况下，组合物必须是无菌的，并且其流动程度应易于注射。该组合物在制备和贮存条件下应该是稳定的，并优选贮存时不受微生物如细菌和真菌的污染。载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物。通过例如使用包衣如卵磷脂，通过维持所需的粒径(分散体)和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。

通过利用多种抗菌剂和抗真菌剂可预防微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇，或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝和明胶，可延长注射组合物的吸收。

在任何情况下，可以这样制备无菌注射溶液：将活性化合物(例如经修饰的抗体本身或与其它活性剂相结合)以所需量，根据需要与一种在此列举的成分或其组合一起，在适宜的溶剂中混合，然后过滤除菌。通常，分散体是这样制备的：将活性化合物掺入无菌载体中，所述载体含有基础分散介质和所需的选自以上所列的其它成分。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法为真空干燥和冻干，产生来自其先前无菌滤过溶液的活性成分加上任何额外的所需成分的粉末。

按照本领域已知的方法，对注射制剂进行加工处理，注入容器内，所述容器如安瓿、袋、瓶、注射器或小瓶，并在无菌条件下进行密封。另外，所述制剂可以进行包装并以药盒形式出售，如在同时待审的U.S.S.N.09/259,337和U.S.S.N.09/259,338(各引入本文作为参考)中描述的那些。作为整体，所述产品或药盒可包含一种或几种组合物。在那些组合物中的一种中的至少一种活性剂是具有免疫调节活性的抗体，如抗CD40L，抗CD40，抗CD23，抗CD4或抗B7抗体。其还可包括从商业和使用者角度所需要的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。这种产品将优选具有标签、使用说明或包装插页，指示相关组合物可用于治疗患有或倾向于患癌症、恶性肿瘤或肿瘤性疾病的对象。在优选的实施方案中，使用说明或标签将指示所述癌症或恶性肿瘤是B细胞肿瘤。

本发明的更多细节通过以下非限定性实施例进行说明。在本说明书中所有引用文献的内容在此特别引入作为参考。

                       实施例

                       实施例1

            B淋巴瘤细胞DHT-4细胞的特性

使用IDEC-131和暴露于阿霉素(ADM)的B细胞淋巴瘤细胞系DHL-4(Roos等，Leuk.Res.10：195-202(1986))，在体外检验这样的观念，即抗CD40L抗体可阻断恶性B细胞由CD40L-CD40介导的避免化疗诱导的细胞毒性/凋亡而存活的行为。IDEC-131是小鼠单克隆抗人CD40L抗体24-31的人源化形式。

首先，通过将DHL-4细胞暴露于不同浓度的ADM 4小时来确定对DHL-4细胞有细胞毒性的ADM最低浓度。通过Alamar Blue活细胞染料还原试验，测定培养5天后DHL-4细胞的细胞毒性(参见Gazzano-Santoro等，J.Immunol Meth.202：163-171(1997))。简而言之，将处于生长培养基(RMPI-1640加10％胎牛血清)中的1×10⁵DHL-4细胞与不同浓度的ADM(1×10^-6M到1×10^-8M)在细胞培养管中于37℃培养4小时。培养之后，清洗细胞，以1×10⁵细胞/毫升浓度重悬于生长培养基中，取200μl细胞悬液加入96孔平底板的各孔中。将平板于37℃温育，并在不同的时间点测定细胞毒性。在温育的最后18个小时期间，将50μl氧还染料Alamar Blue(BlosourceInternational，Cat.#DAL 1100-)加入各孔。温育之后，通过将平板置于振荡器上于室温温育10分钟而冷却平板，测定染料的细胞内还原。使用96孔荧光计以530nm激发和590nm发射读取荧光。结果表达为相对荧光单位(RFU)。如下计算细胞毒性百分比：

[1-(测试样本的平均RFU÷对照细胞的平均RFU)]×100％

建立ADM细胞毒性的滴定曲线，并选择产生细胞毒性的药物最低浓度用于随后的试验。

结果如图1所示，显示了在培养之前暴露于ADM(2×10^-7M和4×10^-8M的ADM)4小时后培养5天的DHL-4细胞的细胞毒性。在暴露之后将细胞洗一次并在生长培养基中培养5天，如上所述通过Alamar Blue染料摄取试验测定细胞毒性。另外，通过流式细胞仪表征DHL-4细胞对所选择CD分子的膜表达。发现DHL-4细胞表达CD19，CD20，CD40分子，但未检测到CD40L表达。

                      实施例2

           抗CD40L抗体消除CD40L介导的

          B淋巴瘤细胞对阿霉素杀伤的抗性

图2A显示抗CD40L抗体对CD40L-CD40介导的DHL-4细胞对ADM诱导细胞死亡的抗性的作用.将DHL-4细胞(0.5×10⁶细胞/ml)在10μg/ml可溶性CD40L(sCD40L，P.A.Brams，E.A.Padlan，K.Hariharan，K.Slater，J.Leonard，R.Noelle 和R.Newman，“Ahumanized anti-human CD154 monoclonal antibody blocksCD154-CD40 mediated human B cell activation”(手稿已提交))存在下于37℃培养1小时。培养1小时后，加入低浓度的ADM(2×10^-7M-4×10^-8M)，并在存在或缺乏CD40L(10μg/ml)的条件下再培养4小时。暴露于ADM后，清洗细胞并以0.5×10⁶细胞/毫升浓度重悬于生长培养基中，取100μl细胞悬液加入96孔平底板的各孔中，一式两份，有或无sCD40L。将sCD40L(10μg/ml)加入已在ADM处理期间持续暴露于sCD40L的培养物和在接触ADM期间无sCD40L的培养物。此外，将10μg/ml的IDEC-131加入培养物中以测定其对与sCD40L和ADM一起培养的DHL-4细胞的作用。5天之后，如上所述通过Alamar Blue染料摄取试验测定细胞毒性。

数据显示sCD40L延长了DHL-4细胞在ADM处理后的存活，而如所预期的，在缺乏sCD40L条件下暴露于ADM的细胞中观察到了增加的细胞毒性。此外，加入抗CD40L抗体(IDEC-131)逆转了CD40L介导的细胞存活，导致细胞毒性增加(图2A)。

单独加入IDEC-131对用sCD40L处理的DHL-4细胞没有作用，这表示该抗体本身对DHL-4细胞无任何直接的抑制活性或细胞毒活性(图2B)。将与或不与sCD40L一起预温育的DHL-4细胞在不同浓度IDEC-131，RITUXAN，抗CD20抗体CE9.1和抗CD4抗体存在下培养(Anderson等，Clin.Immunol.&Immunopathol.84：73-84(1997))。5天后，如上所述通过Alamar Blue试验测定DHL-4细胞的细胞毒性/增殖。图2B显示了IDEC-131对DHL-4细胞的增殖或细胞毒性无作用，而RITUXAN，如所预期的，抑制细胞增殖和诱导细胞毒性。在与抗CD4抗体一起培养的DHL-4细胞中没有观察到作用。

                     实施例3

         CD40L-CD40信号作用阻止抗CD20抗体

          RITUXAN导致的B淋巴瘤细胞凋亡

使用涉及DHL-4细胞和RITUXAN表面交联的体外系统，测定CD40L-CD40介导的信号作用对抗CD20抗体诱导的B淋巴瘤细胞凋亡的影响。将DHL-4细胞(0.5-1×10⁶细胞/ml)与sCD40L(10μg/ml)一起于37℃培养。过夜培养后，收获细胞，并与10μg/ml的RITUXAN或对照抗体(CE9.1；抗CD4抗体)以及有或无sCD40L(10μg/ml)于冰上培养。培养1小时后，对细胞进行离心以除去未结合的抗体，并以1×10⁶细胞/ml重悬于生长培养基(5％FCS-RPMI)中，于组织培养管中培养。通过以15μg/ml掺加山羊抗人Ig-Fcγ特异性抗体的F(ab’)₂片段，交联细胞表面结合的抗体，并将培养物于37℃培养，直到进行凋亡测定。使用流式细胞仪天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3测定检测凋亡。在4和24小时收获培养的细胞，清洗并使用Cytofix(Cytofix/Cytoperm^TM试剂盒，Pharmingen Cat.#2075KK)于4℃固定。固定20分钟后，清洗细胞并加入15μl亲和纯化的缀合PE的多克隆兔抗天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3抗体(Pharmingen，Cat.#67345)和50μl的cytoperm(Pharmingen；Cat.#2075KK)。将细胞置于冰上于暗处培养30分钟。培养之后将细胞洗一次并重悬于cytoperm中。在FACScan上获取流式细胞仪数据，并使用来自VeritySoftware House的WinList软件进行分析。

表I显示了DHL-4淋巴瘤细胞暴露于sCD40L而对RITUXAN诱导的凋亡的抗性。在这些研究中，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的活化被用作代用标记，因为我们先前的研究显示了天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3与Tunel测定之间的良好相关性。在sCD40L存在下DHL-4细胞表面上RITUXAN的交联降低了凋亡水平，而未暴露于sCD40L的细胞发生凋亡。相比之下，在相同同种型抗体-对照抗体(CE9.1)的存在下培养的培养物不发生细胞凋亡。由此，所述数据提示sCD40L诱导的CD40途径信号作用可导致发生RITUXAN介导的对B淋巴瘤细胞的杀伤。

                   表IsCD40L引起的DHL-4细胞对RITUXAN介导的细胞凋亡的抗性

培养条件	％细胞凋亡(IVHF)(a)4小时           24小时
		暴露于sCD40L的DHT-4细胞只有细胞细胞+RITUXAN细胞+RITUXAN+抗人IgG.F(ab’)2细胞+CE9.1细胞+CE9.1+抗人IgG.F(ab’)2细胞+抗人IgG.F(ab’)2	3.35(17.42)     4.94(7.62)1.97(1.97)      4.54(6.54)21.17(17.39)    9.62(13.44)2.31(13.25)     4.15(7.85)2.09(22.14)     4.14(9.57)1.93(12.57)     5.13(8.02)
未暴露于sCD40L的DHL-4细胞只有细胞细胞+RITUXAN细胞+RITUXAN+抗人IgG.F(ab’)2细胞+CE9.1细胞+CE9.1+抗人IgG.F(ab’)2细胞+抗人IgG.F(ab’)2	4.36(14.34)     5.08(17.62)5.67(10.66)     1.08(17.92)74.82(22.80)    30.63(26.84)5.99(14.00)     3.05(18.24)5.96(12.11)     2.24(18.19)6.09(12.27)     1.85(17.27)

^(a)具有天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活性的阳性细胞百分比及其对数标度的平均荧光强度。

                    实施例4

IDEC-131对慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞存活的作用

为了测定IDEC-131对B-CLL细胞在体外生长和存活的影响，将B-CLL细胞与或不与IDEC-131一起在CD40L存在下体外培养。使用Ficoll-Hypaque梯度离心，从CLL患者血中分离外周血单核的细胞(PBMC)。通过台盼蓝染料排斥确定存活，为＞98％。流式细胞仪分析显示＞70％的淋巴细胞为CD19⁺/CD20⁺。将CLL细胞(PBMC)在CLL生长培养基(例如RPMI-1640培养基补充5％FCS或2％自体供体血浆，添加2mM的L-谷氨酰胺和100U/ml青霉素-链霉素)中培养。另外，对于某些试验，使用CD19⁺Dynabeads^TM根据制造商的使用说明(Dynal，Cat.#111.03/111.04)纯化CD19⁺B细胞并如上培养。在生长培养基中培养的CLL或纯化的B-CLL细胞大多数经历自发的编程性细胞死亡。但是，在sCD40L存在下培养这些细胞延长了其在培养物中的存活。表II显示在不同时间点，在存在或缺乏sCD40L(5μg/ml)条件下生长的CD19⁺B-CLL细胞的细胞存活，并显示CLL细胞的更长存活。与sCD40L一起培养的来自患者#1的B-CLL细胞的存活≥60％超过2周，而在缺乏sCD40L条件下生长的细胞则存活低于10％。

                     表II

         在sCD40L存在下B-CLL细胞的存活

B-CLL样本	时间(小时)	％存活(a)(-)CD40L                            (+)CD40L
				患者#1	04896144	≥90884630	≥90907772
患者#2	07296144	≥90403117	≥90726551

^(a)等于通过台盼蓝染料排斥测定的存活百分比。

图3A显示在培养7天之后，IDEC-131对B-CLL细胞的生长和存活的影响。将来自CLL患者的纯化的B-CLL细胞(2×10⁶细胞/ml)分到两个培养管中。将一个管中的细胞与等体积生长培养基中的sCD40L(5μg/ml)混合，而另一管与等体积生长培养基一起培养作为对照。于37℃培养1小时后，将细胞轻轻混合，并取100μl细胞悬液培养基加入96孔平底板的各孔中，一式两份，有或无不同浓度的IDEC-131(10μg/ml-0.3μg/ml)。7天后，如上所述通过Alamar Blue试验测定培养物中的细胞存活/死亡。数据显示在有sCD40L的培养物中的细胞存活。向培养物中加入IDEC-131导致细胞死亡增加，指示细胞存活的逆转或对细胞死亡致敏。另外，以与IDEC-131相同的浓度施用的RITUXAN对细胞死亡的作用比IDEC-131要小或低(图3B)。

                  实施例5

    CD40L-CD40介导的B-CLL中HLA-DR分子的上调

为了测定CD40L-CD40信号转导途径是否完整，将来自CLL患者的CLL细胞与或不与5μg/ml的CD40L一起于37℃进行培养(5×10⁵细胞/毫升)。在48和144小时，通过流式细胞仪使用标准程序在CD19⁺细胞上测定II类分子HLA-DR表达。简而言之，在不同的时间点收获培养的淋巴细胞，并使用FACScan(Becton-Dickinson)流式细胞仪，用偶联至荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)的抗体单一或双重染色，分析分子表面表达。为了染色用于流式细胞分析，将培养管中的1×10⁶细胞与如下的适宜抗体一起培养：抗CD45-FITC，用于在散点图上分选淋巴细胞群；抗CD19-PE(Pharmingen，Cat.#30655)或抗CD20-FITC(Pharmingen；Cat.#33264)抗体，以确定CD19⁺和/或CD20⁺B细胞；抗CD3-FITC抗体(Pharmingen；Cat.#30104)以去掉(gate-off)T细胞；抗CD19-RPE和抗HLA-DR-FITC抗体(Pharmingen；Cat.#32384)以测定CD19⁺细胞上的II类表达。通过与2ml冷PBS离心(200×g，6分钟)将细胞洗一次，并与抗体一起在冰上培养30分钟，然后将细胞洗一次，固定在0.5％低聚甲醛中并贮存于4℃直到进行分析。在FACScan上获取流式细胞仪数据并使用WinList软件(VeritySoftware House)进行分析。将机器设置为自动门控，以检查含有RPE或FITC单染色、未染色或双重染色的细胞的象限。图4显示在与sCD40L一起培养的CD19⁺细胞和未与sCD40L一起培养的那些细胞中HLA-DR表达的比较。在有sCD40L存在下培养的B-CLL细胞上检测到更高水平的HLA-DR表达(表III)。

                 表III

B-CLL中CD40L-CD40介导的HLA-DR分子的上调

样本	时间	HLA-DR+(a)％阳性                      MFI
				对照	48小时144小时	8188	921655
细胞+sCD40L	48小时	88	101
					144小时	95	2943

^(a)HLA-DR分子阳性的CD19⁺B细胞及其平均荧光强度(MIF)

                   实施例6

           IDEC-131制剂和RITUXAN

为治疗CD40⁺恶性肿瘤，将在配制缓冲液(10mM柠檬酸钠，150mM NaCl，0.02％聚山梨酯80，pH6.5)中约10-约50mg/ml的IDEC-131静脉内输注(iv)给治疗对象。在施用RITUXAN之前、之后或与RITUXAN一起施用IDEC-131。输注的RITUXAN剂量范围从约3-约10mg/kg治疗对象体重。

                   实施例7

              IDEC-131制剂和CHOP

为治疗对CHOP有反应的CD40⁺恶性肿瘤(例如霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病，以及对于其中细胞为CD40⁺的恶性肿瘤的抢救治疗)，在开始CHOP周期之前即刻，以范围从约3-约10mg/kg患者体重的剂量输注IDEC-131。在每个CHOP周期之前将重复IDEC-131给药，总共4-8个周期。

                   实施例8

           施用抗CD40L或抗B7抗体与

      RITUXAN相结合治疗患者的B细胞淋巴瘤

联合治疗可特别用作抢救治疗或用于治疗复发性或侵袭形式的CD40⁺恶性肿瘤(例如霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤和CLL)。当IDEC-131有待与CHOP和RITUXAN联合施用时，如以上在实施例6中所述施用IDEC-131，随后采用在实施例7中所述的CHOP-IDEC-131给药方案。或者，实施相同的方案，其中IDEC-131(抗CD40L)实质上在抗B7抗体之中。

                        实施例9

    使用淋巴瘤细胞系对抗CD80和抗CD20的体外研究

为了加强采用抗CD80和抗CD20作为联合治疗方案用于治疗淋巴瘤的科学基础，使用淋巴瘤细胞系进行以下体外试验。

所用的细胞系：细胞系的获得和维持如下。将表达CD20和B7的B淋巴瘤细胞系(SKW，SB和Daudi细胞)置于完全培养基中培养。完全培养基为RPMI 1640培养基(Irvine Scientific，Santa Ana，CA)，补充10％热灭活的FBS(Hyclone)，2mM l-谷氨酰胺，100单位/ml青霉素和100ug/ml链霉素。SKW细胞系为Epstein-Bar病毒(EBV)阳性，并可被诱导分泌IgM(SKW 6.4，ATCC)。SB细胞系源自一名急性淋巴母细胞白血病患者，并呈EBV阳性(CCL-20，ATCC)。Daudi细胞系是从一名伯基特淋巴瘤患者分离的(CCL-213，ATCC)。使用IDEC Pharmaceuticals专利载体系统生成新霉素抗性的表达CD80的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。

所用的抗体：在这些研究中所用的特异性抗体如下。IDEC-114为一种PRIMATIZED抗人CD80mAb，其包含人γ1重链(Lot114S004F，code 3002G710；Lot ZPPB-01)，而rituximab是抗人CD20特异性小鼠-人γ1嵌合抗体(Lot E9107A1；Lot D9097A1)。所用的其它抗体包括小鼠抗人CD80 mAb L307.4(BD Pharmingen，San Diego，CA)，灵长类动物源化抗人CD4mAb CE9.1，其具有人γ1链(LotM2CD4156)，和小鼠同种型匹配的(IgG1)对照抗体3C9，其在IDECPharmaceuticals开发。

CD80和CD20在某些淋巴瘤细胞系上的表达

为了测定CD80和CD20在某些淋巴瘤细胞系上的细胞表面表达，如下通过荧光激活的细胞分选(FACS)测定在那些细胞系上的IDEC-114和Rituxan结合。将在冷FACS结合缓冲液中稀释至200μl终体积的不同浓度的测试或对照抗体与1×10⁶细胞在细胞培养管中培养。IDEC-114和rituximab用作测试抗体，而CE9.1用作为同种型匹配的阴性对照。将细胞置于冰上培养60分钟，并于培养之后在FACS洗涤缓冲液中洗一次。将细胞重悬于200μl FACS结合缓冲液中，每10⁶细胞加入2μl缀合FITC的山羊F(ab’)₂抗人Igγ链特异性抗体(Southern Biotechnology，Birmingham，AL)。再于冰上培养30分钟后，将细胞洗一次并重悬于200μl冷HBSS中，用200μl 1％甲醛固定。

图5显示来自两个不同批次(Lot 114S004F和Lot 114S015)的IDEC-114与CD80-CHO细胞以浓度依赖性方式特异性结合。正如所预期的，无关特异性的同种型匹配对照抗体(IDEC-152)不结合CD80-CHO细胞。对IDEC-114结合SKW和SB淋巴瘤细胞系上的CD80的测试显示其结合比rituximab低，如较低的阳性细胞百分比(表IV)和较低的平均荧光强度(表V)所证实。

                    表IV

           抗体与B淋巴瘤细胞系的结合

抗体(10μg/ml)	结合活性强度*
				SKW	SB	Daudi
	IDEC-114	1.8	2				3
Rituximab				20	52	60
	CE9.1(对照mAb)	1	1				1

^*与细胞的结合通过流式细胞仪在抗体的饱和浓度下测定。结合活性强度＝测试抗体的MFI÷对照抗体的MFI。

              表V

CD80-CHO和SB细胞上的相对CD80抗原密度

细胞	MFI*
		CD80-CHO	676
SB(B淋巴瘤系)	189
		PBMC对照	51
PBMC活化的	44

^*相对CD80抗原通过平均荧光强度(MFI)测量。在减去背景内部荧光之后数值以单位表示。

这些结果加强了抗CD80和抗CD20作为淋巴瘤治疗剂的适用性。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)

为了进一步证实抗CD80和抗CD20作为淋巴瘤治疗剂的适合性，对每种抗体的实例测定其介导ADCC的能力。在ADCC测定中，SKW或SB细胞和活化的人外周单核细胞(PBMC)分别用作靶和效应细胞。使用Histopaque(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)从健康供体的全血分离PBMC。在75cm²组织培养瓶中以5×10⁶细胞/ml的浓度在含有20U/ml重组人IL-2(Invitrogen，Carlsbad，CA)的完全培养基中于37℃和5％CO₂培养PBMC。过夜培养后，将1×10⁶ SKW或SB靶细胞用150μCi的⁵¹Cr(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)于37℃和5％CO₂标记1小时。将细胞洗4次并重悬于5ml完全培养基中；取50μl细胞悬液分入含有等体积测试或对照抗体的各孔中。

Rituximab(Lot E9107A1)或IDEC-114(Lot 114S004F，code3002G710)用作测试抗体。使用同种型匹配的CE9.1(Lot M2CD4156)或L307.4(BD Pharmingen)，或具有无关特异性的小鼠同种型匹配(IgG₁)抗体3C9。将所有的孔一式三份平板接种到96孔圆底组织培养板中。收获效应细胞，用完全培养基洗一次，并以在100μl体积中的1×10⁶细胞加入每孔，以获得50∶1的效应细胞与靶细胞之比。以下对照孔也一式三份包括在内：与100μl完全培养基一起培养的靶细胞，以测定自发释放；和与100μl 0.5％Triton X-100(Sigma-AldrichCorp.)一起培养的靶细胞，以测定最大释放。将培养物于37℃和5％CO₂培养4小时，通过γ计数器(ISODATA)测定由于细胞溶解在培养上清中释放的⁵¹Cr。细胞毒性表示为特异性溶胞百分比并计算如下：

图6显示IDEC-114和rituximab对CD20⁺/CD80⁺SB和SKW细胞的ADCC活性。总体上，对SB细胞观察到了较SKW细胞更高水平的ADCC活性。IDEC-114显示出对SB和SKW细胞的剂量依赖性杀伤，在10μg/ml，最大杀伤分别为75％和46％。以相当抗体浓度的Rituximab显示出比IDEC-114更高的ADCC活性(对SB细胞为97％，对SKW细胞为65％)，这与rituximab较IDEC-114更高的细胞结合活性相关。如所预期的，不结合人Fc受体的小鼠L307.4显示出微弱的ADCC活性。对于同种型人和小鼠对照(分别为CE9.1和3C9)仅观察到背景水平的ADCC。

进行试验以测定将IDEC-114与rituximab相联合增加宿主效应细胞介导的对肿瘤细胞的杀伤的作用。在这些试验中，固定浓度的IDEC-114与不同浓度的rituximab相联合，以反映方案，其中B淋巴瘤细胞上低CD20密度及正常B7表达可导致有效的肿瘤杀伤。图7显示IDEC-114与rituximab的组合导致对SKW淋巴瘤细胞的ADCC活性增强。10μg/ml固定浓度的IDEC-114与0.1-0.01μg/ml浓度的rituximab相结合介导增强的对SKW细胞的杀伤。使用来自两个供体的宿主效应细胞获得的结果显示ADCC活性的相同趋势。

补体依赖性细胞毒性(CDC)

使用B细胞系和人补体(C)测定IDEC-114和rituximab的CDC活性。以4×浓度稀释抗体，取50μl分入各96孔中，一式三份。将SKW或Daudi细胞用⁵¹Cr(150μCi/10⁶细胞)于37℃和5％CO₂标记1小时。将细胞洗4次并重悬于完全培养基中，将在50μl中的1×10⁴细胞分入各孔中。加入在完全培养基中1∶4或1∶8稀释的100μl正常人血清补体(Quidel，San Diego，CA)。自发和最大释放对照和设置的方法与以上关于ADCC试验所述相同。将培养物于37℃和5％CO2培养4小时。通过γ计数器测定释放入培养上清中的放射性。计算特异性细胞溶解百分比的公式亦如上对ADCC试验所述。

在rituximab与CD20抗原结合之后补体级联的活化导致在体外有效杀伤B淋巴瘤细胞。Reff ME，Carner K，Chambers KS，Chinn PC，Leonard JE，Raab R等，Depletion of B cells in vivo by a chimericmouse human monoclonal antibody to CD20.Blood1994；83(2)：435-45。因此，我们评价了IDEC-114介导对CD80⁺靶细胞的补体依赖性杀伤的能力。结果显示IDEC-114介导对表达CD80的CHO细胞的CDC(图8a)。但是，IDEC-114与CD80⁺Daudi和SKW淋巴瘤细胞系的结合未显示CDC迹象(分别见图8b和图8c)。与此相比，rituximab对这两种细胞系均显示出CDC活性，尽管Daudi细胞系比SKW细胞系对CDC更为敏感(分别见图8b和图8c)。

                      实施例10

使用从肿瘤样本分离的细胞对抗CD80和抗CD20的体外研究

为了进一步评估采用抗CD80和抗CD20作为治疗淋巴瘤的联合治疗方案的科学基础，使用从肿瘤样本分离的细胞进行以下体外试验。

CD80在活化B细胞和活化APC表面上短暂表达，但在静止B细胞和静止APC上微弱表达或不表达。由于CD80是B细胞活化标记，因此其主要在分裂和/或活化的淋巴瘤细胞上表达。报道提示CD80在恶性B细胞上组成型表达。为了证实这些报道，通过流式细胞仪在获自20名患者的一组淋巴瘤和白血病标本中测定CD80的表达。结果表明CD80在淋巴瘤和白血病中以不同的密度表达(表VI)。

                      表VI

         CD80在淋巴瘤/白血病标本上的表达

淋巴瘤	阳性标本*	表达水平
			滤泡性、小分裂、低分级淋巴瘤滤泡性、大细胞、中间分级淋巴瘤小、未分裂伯基特淋巴瘤小、未分裂、高分级淋巴瘤慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤套细胞淋巴瘤(CLL变体)	12/121/12/21/12/22/2	中到高低高弱弱到中中

^*阳性样本/测试的样本

表达水平为主观值，通过分析流式细胞仪数据而估计，并且是阳性分选细胞相对于对照抗体的百分比；

弱＝＜10％，低＝10％-25％，中＝25％-50％，高＝＜50％

在滤泡性小分裂低分级淋巴瘤和小未分裂伯基特淋巴瘤中观察到最高的CD80表达。在一份慢性淋巴细胞淋巴瘤(CLL)样本和一例小未分裂高分级淋巴瘤中见到最低的表达。在滤泡性小分裂低分级淋巴瘤样本上的CD80表达如表VII所示。

              表VIICD80在滤泡性小分裂低分级淋巴瘤标本上的表达

样本	CD80表达百分比
		123456789101112	79％25％26％(小)89％(大)99％100％(小)99％(大)67％(小)95％(大)67％(小)89％(大)64％(小)100％70％88％84％

在这些淋巴瘤细胞上的CD80表达为样本中25％到90％的肿瘤细胞。然而令人感兴趣的是，在相同的淋巴瘤内，“大”细胞为90％-100％阳性，而“小”细胞为25％-100％阳性。可能CD80在增殖或活化的恶性B细胞上表达，这可能可解释表达在测试的淋巴瘤样本之内的变异性。

                  实施例11

使用SCID小鼠模型对抗CD80和抗CD20的体内研究

为了测试联合治疗的有效性，使用抗CD80(IDEC-114)和抗CD20(RITUXAN(rituximab))进行以下体内试验。

IDEC-114和Rituximab单一药剂治疗在淋巴瘤中的体内治疗效果

研制在严重免疫缺陷(SCID)小鼠中的人淋巴瘤肿瘤模型。简而言之，将3×10⁶-4×10⁶人SKW淋巴瘤细胞静脉内(IV)接种到6-8周龄雌性BALB/c SCID小鼠体内，监测其存活45-60天。接种之后，SKW细胞播散遍及小鼠体内并主要在肺和肝中生长。在第1，3，5，7，9和11天，对治疗组小鼠(N＝8)腹膜内注射100μg、200μg或400μg的IDEC-114(a)或rituximab(b)。在致死亡之前，所有的小鼠均发生麻痹形式的该疾病。处死发生严重麻痹的小鼠并记为死亡。使用统计学分析系统(SAS)进行Kaplan-Meier分析，通过log-rank检验生成p值。

图9A和图9B显示，使用3个剂量(100、200和400μg)的抗体，单一药剂IDEC-114(图9A)和单一药剂rituximab(图9B)治疗的抗肿瘤反应。IDEC-114和rituximab单一药剂治疗在全部剂量都显示出对疾病进展的抑制。对IDEC-114观察到的抗肿瘤反应与相同剂量和治疗方案的rituximab的抗肿瘤反应相似。

                    实施例12

IDEC-114/Rituximab联合治疗在淋巴瘤中的体内治疗效果

基于IDEC-114作为单一药剂的抗肿瘤活性，在与以上关于单一药剂研究所述相同的肿瘤模型中，以相同的给药方案，评价IDEC-114和rituximab的组合。

对SKW/SCID小鼠注射200μg的IDEC-114和200μg的rituximab，并与注射200μg或400μg的IDEC-114或者200μg或400μg的rituximab的小鼠作比较。图10显示用IDEC-114/rituximab联合疗法治疗的小鼠与用IDEC-114或rituximab作为单一药剂疗法治疗的小鼠相比的存活优势。结果显示IDEC-114与rituximab的组合与单独的任一种抗体相比，导致无病存活增加。在联合治疗组中，70％(7/10)的小鼠在最后一次抗体注射之后存活超过50天。相比之下，单独用IDEC-114或rituximab治疗的小鼠中少于10％在研究结束时仍存活。通过Kaplan-Meier和log-rank检验分析存活数据(表VIII)。

                      表VIII

          IDEC-114/Rituximab联合治疗与

     IDEC-114或Rituximab单一药剂治疗的比较

比较	p-值*
		IDEC-114/rituximab组合vs.盐水对照组	0.0001
IDEC-114/rituximab组合vs.rituximab(200μg和400μg)	0.0008
		IDEC-114/rituximab组合vs.IDEC-114(200μg和400μg)	0.0017
IDEC-114/rituximab组合vs.IDEC-114(200μg)	0.0403
		IDEC-114/rituximab组合vs.IDEC-114(400μg)	0.001

^*由Log-rank检验生成的p-值

IDEC-114/rituximab联合治疗比200μg或400μg的IDEC-114或

rituximab单一药剂治疗产生统计学上更强的反应。

本领域技术人员会进一步理解本发明可以以其它具体的形式实施而不偏离其实质或中心特质。本发明的前述说明书仅仅公开了示例性的实施方案，应理解也可以想到其它改变在本发明的范围之内。因此，本发明并不限于本文详细描述的特定实施方案，而是应参照所附的权利要求，其表明了本发明的范围和内容。

Claims (50)

1.一种用于治疗患有或倾向于患肿瘤性疾病的哺乳动物的方法，包括以下步骤：

向所述哺乳动物施用治疗有效量的第一免疫调节抗体；和

向所述哺乳动物施用治疗有效量的第二免疫调节抗体或B细胞耗尽抗体，其中所述第一和第二免疫调节抗体结合不同的抗原，并且所述第一免疫调节抗体和第二免疫调节抗体或B细胞耗尽抗体可以以任何次序或同时施用。

2.权利要求1的方法，其中所述第一免疫调节抗体与B7抗原反应或结合。

3.权利要求2的方法，包括施用第二免疫调节抗体，其中所述第二免疫调节抗体与选自以下的抗原反应或结合：CD40L、CD40和CD23。

4.权利要求3的方法，其中所述第二免疫调节抗体结合CD40L抗原。

5.权利要求1的方法，其中所述第一免疫调节抗体、所述第二免疫调节抗体和所述B细胞耗尽抗体为单克隆抗体。

6.权利要求5的方法，其中所述单克隆抗体选自嵌合抗体和人源化抗体。

7.权利要求6的方法，其中至少一种所述单克隆抗体为嵌合抗体且所述嵌合抗体是灵长类动物源化的。

8.权利要求7的方法，其中所述灵长类动物源化的抗体是IDEC-114。

9.权利要求1的方法，其中所述肿瘤性疾病选自：复发性霍奇金病；耐药的霍奇金病；高分级、低分级和中间分级的非霍奇金淋巴瘤；B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)；浆细胞样淋巴细胞性淋巴瘤(LPL)；套细胞淋巴瘤(MCL)；滤泡性淋巴瘤(FL)；弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)；伯基特淋巴瘤(BL)；AIDS相关性淋巴瘤；单核细胞性B细胞淋巴瘤；血管免疫母细胞淋巴结病；小淋巴细胞、滤泡性弥漫性大细胞、弥漫性小分裂细胞、大细胞免疫母细胞成淋巴细胞瘤；小未分裂、伯基特和非伯基特、滤泡性大细胞为主、滤泡性小分裂细胞为主、和滤泡性小分裂细胞和大细胞混合的淋巴瘤。

10.权利要求1的方法，包括施用第一免疫调节抗体和B细胞耗尽抗体。

11.权利要求10的方法，其中所述B细胞耗尽抗体与选自以下的抗原反应或结合：CD20、CD19、CD22和CD37抗原。

12.权利要求11的方法，其中所述B细胞耗尽抗体与CD20反应或结合。

13.权利要求12的方法，其中所述B细胞耗尽抗体与放射性同位素相结合。

14.权利要求12的方法，其中所述B细胞耗尽抗体为RITUXAN。

15.权利要求14的方法，其中所述第一免疫调节抗体为IDEC-114。

16.权利要求14的方法，其中所述第一免疫调节抗体为IDEC-131。

17.权利要求1的方法，还包括施用化疗剂的步骤。

18.一种用于治疗患有或倾向于患肿瘤性疾病的哺乳动物的方法，包括以下步骤：

向所述哺乳动物施用治疗有效量的至少一种化疗剂；和

向所述哺乳动物施用治疗有效量的至少一种免疫调节抗体，其中所述化疗剂和所述免疫调节抗体可以以任何次序或同时施用。

19.权利要求18的方法，其中所述免疫调节抗体结合选自以下的抗原：B7、CD40、CD40L和CD23抗原。

20.权利要求19的方法，其中所述免疫调节抗体包括单克隆抗体。

21.权利要求20的方法，其中所述单克隆抗体选自嵌合抗体和人源化抗体。

22.权利要求21的方法，其中所述免疫调节抗体为嵌合抗体且所述嵌合抗体是灵长类动物源化的。

23.权利要求22的方法，其中所述灵长类动物源化的抗体是IDEC-114。

24.权利要求21的方法，其中所述单克隆抗体是人源化的。

25.权利要求24的方法，其中所述人源化抗体包括IDEC-131。

26.权利要求18的方法，其中所述肿瘤性疾病选自：复发性霍奇金病；耐药的霍奇金病；高分级、低分级和中间分级的非霍奇金淋巴瘤；B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)；浆细胞样淋巴细胞性淋巴瘤(LPL)；套细胞淋巴瘤(MCL)；滤泡性淋巴瘤(FL)；弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)；伯基特淋巴瘤(BL)；AIDS相关性淋巴瘤；单核细胞性B细胞淋巴瘤；血管免疫母细胞淋巴结病；小淋巴细胞、滤泡性弥漫性大细胞、弥漫性小分裂细胞、大细胞免疫母细胞成淋巴细胞瘤；小未分裂、伯基特和非伯基特、滤泡性大细胞为主、滤泡性小分裂细胞为主、和滤泡性小分裂细胞和大细胞混合的淋巴瘤。

27.权利要求18的方法，还包括施用B细胞耗尽抗体的步骤。

28.权利要求27的方法，其中所述B细胞耗尽抗体与CD20抗原反应或结合。

29.一种用于治疗患有或倾向于患肿瘤性疾病的哺乳动物的方法，包括以下步骤：

向所述哺乳动物施用治疗有效量的第一免疫调节抗体；和

向所述哺乳动物施用治疗有效量的第二免疫调节抗体，其中所述第一和第二免疫调节抗体结合不同的抗原，并且所述第一免疫调节抗体和第二免疫调节抗体可以以任何次序或同时施用。

30.权利要求29的方法，其中所述第一和第二免疫调节抗体与选自以下的抗原结合：B7、CD40、CD40L和CD23抗原。

31.权利要求30的方法，其中所述第一免疫调节抗体与B7抗原反应或结合，而所述第二免疫调节抗体与CD40L抗原反应或结合。

32.权利要求31的方法，其中所述第一免疫调节抗体包括IDEC-114，而所述第二免疫调节抗体包括IDEC-131。

33.权利要求32的方法，其中所述肿瘤性疾病选自：复发性霍奇金病；耐药的霍奇金病；高分级、低分级和中间分级的非霍奇金淋巴瘤；B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)；浆细胞样淋巴细胞性淋巴瘤(LPL)；套细胞淋巴瘤(MCL)；滤泡性淋巴瘤(FL)；弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)；伯基特淋巴瘤(BL)；AIDS相关性淋巴瘤；单核细胞性B细胞淋巴瘤；血管免疫母细胞淋巴结病；小淋巴细胞、滤泡性弥漫性大细胞、弥漫性小分裂细胞、大细胞免疫母细胞成淋巴细胞瘤；小未分裂、伯基特和非伯基特、滤泡性大细胞为主、滤泡性小分裂细胞为主、和滤泡性小分裂细胞和大细胞混合的淋巴瘤。

34.权利要求32的方法，还包括施用治疗有效量的至少一种化疗剂的步骤。

35.权利要求32的方法，还包括施用至少一种B细胞耗尽抗体的步骤。

36.权利要求35的方法，其中所述B细胞耗尽抗体与选自以下的抗原反应或结合：CD20、CD19、CD22和CD37抗原。

37.权利要求36的方法，其中所述B细胞耗尽抗体与CD20反应或结合。

38.权利要求37的方法，其中所述B细胞耗尽抗体为RITUXAN。

39.用于治疗患有或倾向于患肿瘤性疾病的哺乳动物的药盒，包括至少一个容器，其中存放有免疫调节抗体；和标签、使用说明或插页，指示所述免疫调节抗体可用于治疗所述肿瘤性疾病。

40.权利要求39的药盒，其中所述免疫调节抗体与选自以下的抗原结合：B7，CD40，CD40L和CD23抗原。

41.权利要求40的药盒，其中所述免疫调节抗体包括单克隆抗体。

42.权利要求41的药盒，其中所述单克隆抗体选自嵌合抗体和人源化抗体。

43.权利要求42的药盒，其中所述免疫调节抗体是嵌合抗体并且所述嵌合抗体是灵长类动物源化的。

44.权利要求43的药盒，其中所述灵长类动物源化的抗体是IDEC-114。

45.权利要求42的药盒，其中所述单克隆抗体是人源化的。

46.权利要求45的药盒，其中所述人源化抗体包括IDEC-131。

47.权利要求39的药盒，还包括一个容器，装有第二免疫调节抗体或B细胞耗尽抗体，其中所述第二免疫调节抗体结合的抗原与所述免疫调节抗体不同。

48.权利要求47的药盒，包含免疫调节抗体和第二免疫调节抗体，其中所述免疫调节抗体结合B7抗原，而所述第二免疫调节抗体结合CD40L抗原。

49.权利要求48的药盒，其中所述免疫调节抗体包括IDEC-114，而所述第二免疫调节抗体包括IDEC-131。

50.权利要求47的药盒，包含免疫调节抗体和B细胞耗尽抗体，其中所述免疫调节抗体与选自CD40L和B7抗原的抗原反应或结合，而所述B细胞耗尽抗体与CD20抗原反应或结合。

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