CN1720992A - 瑞图希单抗的鞘内施用,用于中枢神经系统淋巴瘤的治疗 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了利用抗B-细胞抗体(优选地抗-CD20,最优选地瑞图希单抗)治疗脑B细胞淋巴瘤,特别是原发性中枢神经系统淋巴瘤(PCNSL),和预防脑膜复发的方法。这些抗体能单独鞘内施用,或与其它化疗剂(如氨甲喋呤)或其它抗-B细胞抗体联合,治疗无免疫应答或有免疫应答的患者的PCNSL。这些抗体也能用于诊断CNS淋巴瘤患者,特别是无免疫应答的患者。
Description
相关申请的交叉引用
该申请要求对2000年4月25日申请的美国临时系列号60/199,365的优先权,在此引用作为参考。
发明领域
本发明描述了利用抗B细胞靶标抗体(例如:抗-CD20、抗-CD21、抗-CD22、抗-CD23、抗-CD40或抗-CD37抗体,优选地抗-CD20抗体,更加优选地瑞图希单抗(Rituximab))治疗和/或预防中枢神经系统淋巴瘤和预防脑膜复发的方法。这些抗-B细胞抗体能单独使用,或与其它抗体(例如,参与B细胞激活的T细胞的抗体,如抗-CD40L)或其它治疗(例如化学治疗或放射治疗)联合使用。
发明背景
I.抗-CD20抗体
CD20是在90%以上的B细胞淋巴瘤上表达的一种细胞表面抗原,它在肿瘤细胞中不释放或调节(McLaughlin等人,J.Clin.Oncol.16:2825-2833(1998b))。已经制备了抗-CD20抗体用于研究和治疗。一种抗-CD20抗体是单克隆B1抗体(美国专利号5,843,398)。抗-CD20抗体也已经制备为放射性核素的形式用于治疗B细胞淋巴瘤(例如,131I-标记的抗-CD20抗体),以及89Sr-标记的形式用于缓解前列腺癌和乳腺癌转移引起的骨痛(Endo,Gan TO Kagaku Ryoho 26:744-748(1999))。
曾报道通过连续静脉内输液对B细胞淋巴瘤患者施用一种鼠单克隆抗体——1F5(一种抗-CD20抗体)。然而,据报道消除循环肿瘤细胞需要极高水平(>2克)的1F5,结果描述为“短暂的”(Press等人,Blood 69:584-591(1987))。在治疗中使用单克隆抗体的一个可能的问题是,非人类单克隆抗体(例如鼠单克隆抗体)一般缺乏人类效应物功能,例如,它们不能介导补体依赖的裂解,或通过抗体依赖的细胞毒性或Fc受体介导的吞噬作用裂解人类靶细胞。此外,非人类单克隆抗体能被人类宿主作为外源蛋白质识别;因此,重复注射这类外源抗体能诱发免疫应答,导致有害的过敏反应。对于基于鼠的单克隆抗体,通常称为人抗小鼠抗体应答,或“HAMA”应答。另外,这些“外源”抗体能遭到宿主免疫系统的攻击,使得它们实际上在到达靶部位之前即已被中和。
A.瑞图希单抗
瑞图希单抗(也称为Rituxan、MabThera和IDEC-C2B8)是第一种获得FDA批准的单克隆抗体,由IDEC Pharmaceuticals研制(参见美国专利号5,843,439;5,776,456和5,736,137)。瑞图希单抗是一种嵌合的抗-CD20单克隆抗体(MAb),推荐用于治疗轻度或滤泡性B细胞非何杰金氏淋巴瘤(McLaughin等人,Oncology(Huntingt)12:1763-1777(1998a);Leget等人,Curr.Opin.Oncol.10:548-551(1998))。在欧洲,瑞图希单抗已获准用于治疗复发的III/IV期滤泡性淋巴瘤(White等人,Pharm.Sci.Technol.Today 2:95-101(1999))。可用瑞图希单抗治疗的其它疾病包括:滤泡性中枢细胞淋巴瘤(FCC)、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)和小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞淋巴瘤(SLL/CLL)(Nguyen等人,1999)。在I期和II期临床研究中,瑞图希单抗已经显示对轻度非何杰金氏淋巴瘤(NHL)有最小的毒性和明显的治疗活性(Berinstein等人,Ann.Oncol.9:995-1001(1998))。
瑞图希单抗单独用于治疗B细胞NHL,对于复发的或顽固性轻度或滤泡性NHL,剂量一般为每周375mg/M2,4周,它被很好地耐受,具有明显的临床活性(Piro等人,Ann.Oncol.10:655-61(1999);Nguyen等人,Eur.J.Haematol.62:76-82(1999);Coiffier等人,Blood92:1927-1932(1998))。然而,在使用抗体的试验中也施用了高达4周500mg/M2的剂量(Maloney等人,Blood 90:2188-2195(1997))。瑞图希单抗也曾与化疗剂如CHOP(例如,环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)联合,用于治疗轻度或滤泡性B细胞非何杰金氏淋巴瘤患者(Czuczman等人,J.Clin.Oncol.17:268-76(1999)和McLaughlin等人,Oncology(Huntingt)12:1763-1777(1998))。
II.CD40和CD40L
CD40在成熟B细胞表面以及白血病和淋巴B细胞和何杰金氏病(HD)的何杰金氏和里-斯(RS)细胞上表达(Valle等人,Eur.J.Immunol.19:1463-1467(1989);Gruss等人,Leuk.Lymphoma24:393-422(1997))。CD40是一种B细胞受体,可导致正常和恶性B细胞的激活和存活,如非何杰金氏滤泡性淋巴瘤(Johnson等人,Blood82:1848-1857(1993))。通过CD40受体的信号传导保护未成熟的B细胞和B细胞淋巴瘤免于IgM-或fas-诱导的凋亡(Wang等人,J.Immunol.155:3722-5(1995))。类似地,套细胞淋巴瘤细胞也含有高水平的CD40,加入外源CD40L提高了它们的存活率,使它们免于氟达拉滨诱导的凋亡(Clodi等人,Brit.J.Haematol.103:217-9(1998))。相反,其他人报道,CD40刺激可抑制肿瘤B细胞的体外(Funakoshi等人,Blood 83:2787-2794(1994))和体内(Murphy等人,Blood 86:1946-1953(1995))生长。
对小鼠施用的抗-CD40抗体据说提高了荷有人B细胞淋巴瘤的小鼠的存活率(Funakoshi等人,(1994);Tutt等人,J.Immunol.161:3176-3185(1998))。美国专利号5,674,492(1997)和国际PCT申请WO 95/17202中描述了利用抗-CD40抗体抑制CD40-CD40L相互作用治疗肿瘤(包括B细胞淋巴瘤和EBV-诱发的淋巴瘤)的方法,在此引用作为参考。CD40信号据报道也与CD20的协同作用相关(Ledbetter等人,Circ.Shock 44:67-72(1994))。描述抗-CD40抗体的制备和应用的其它参考文献包括美国专利号5,874,085(1999)、5,874,082(1999)、5,801,227(1998)和5,674,492(1997),在此引用作为参考。
gp39(也称为CD40配体或CD40L)是一种CD40配体,在激活而不是静止的CD4+Th细胞上表达(Spriggs等人,J.Exp.Med.176:1543-1550(1992);Lane等人,Eur.J.Immunol.22:2573-2578(1992);Roy等人,J.Immunol.151:1-14(1993))。CD40和CD40L都已经克隆并表征(Stamenkovi等人,EMBO J.8:1403-1410(1989);Armitage等人,Nature 357:80-82(1992);Lederman等人,J.Exp.Med.175:1091-1101(1992);Hollenbaugh等人,EMBO J.11:4313-4321(1992))。用CD40L基因转染并在其表面上表达CD40L蛋白的细胞能触发B细胞增殖,与其它刺激信号一起能诱导抗体产生(Armitage等人,(1992))。在何杰金氏病中,CD40L可能在肿瘤滤泡或里-斯细胞(CD40+)内肿瘤B细胞(CD40+)的细胞接触依赖的相互作用中起作用(Carbone等人,Am.J.Pathol.147:912-22(1995))。
抗-CD40L单克隆抗体已经有效地用于抑制LP-BM5-感染小鼠中鼠AIDS(MAIDS)的诱导(Green等人,Virology 241:260-268(1998))。如美国专利号5,874,082(1999)所述,也已经制备抗-CD40抗体,用以预防或治疗抗体介导的疾病,如变态反应和自身免疫病。据报道,抗-CD40抗体曾经与抗-CD20抗体联合使用,在抑制细胞培养中非何杰金氏B细胞淋巴瘤的生长中产生加成作用(Benoit等人,(1996)Immunopharmacology 35:129-139(1996))。小鼠体内研究证实,在提高荷有某些但不是全部淋巴瘤系的小鼠的存活率方面,抗-CD20抗体比个别施用的抗-CD40更有效(Funakoshi等人,J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.19:93-101(1996))。抗-CD19在对两种同系小鼠B细胞淋巴瘤——BCL1和A31——的治疗中也在体内有效(Tutt等人,(1998))。
曾经描述了抗-CD40L抗体用于治疗与B细胞激活有关的疾病(欧洲专利号555,880(1993))。抗-CD40L抗体包括如美国专利号5,747,037(1998)所述的单克隆抗体3E4、2H5、2H8、4D9-8、4D9-9、24-31、24-43、89-76和89-79,和美国专利号5,876,718(1999)描述的用于治疗移植物抗宿主疾病的抗-CD40L抗体。
III.中枢神经系统癌症及其治疗
A.原发性中枢神经系统淋巴瘤(PCNSL)
原发性中枢神经系统淋巴瘤(PCNSL)定义为限于脑和脑干的淋巴瘤,不含全身性疾病。该术语适用于起源于并局限于中枢神经系统(CNS)的非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。过去,这种肿瘤也被称为小神经胶质细胞瘤、网状细胞肉瘤或血管周围肉瘤。然而到今天,其淋巴来源已经明确。
PCNSL以前是一种罕见的肿瘤,只占全部颅内肿瘤的0.5-1.2%,通常与先天性、获得性或医源性免疫缺陷状态有关,如威斯科特-奥尔德里奇综合征或肾移植引起的免疫抑制。据报道,获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者的PCNSL发病率最高,为1.9-6%(DeAngelis等人,“原发性中枢神经系统淋巴瘤”,《癌症:肿瘤学原理与实践》2233-2242(Devita等人编写,1997))。然而,在有免疫应答的患者中PCNSL的发病率提高。
AIDS患者中可发生全身性和原发性CNS非何杰金氏淋巴瘤(Kramer等人,Cancer 80:2469-2477(1997))。而且,AIDS与非AIDS患者之间的PCNSL临床、诊断和预后也有较大差别(Fine等人,Ann.Intern.Med.119:1093-1104(1993))。
HIV相关的PCNSL是一种侵袭性非何杰金氏淋巴瘤(NHL),只限于CNS内。大多数HIV相关的PCNSL在组织学上分类为B细胞来源的弥漫性、大细胞或大细胞免疫母细胞淋巴瘤。另外,PCNSL的来源仍有争议,问题在于它是起因于浸润性非恶性淋巴细胞的颅内转化,还是外周肿瘤细胞迁移到CNS内并只在其中结合(Moses等人,1999)。
PCNSL的最佳治疗尚未确定(Reni等人,Ann.Oncol.8:227-234(1997);Lesser等人,Cancer Treat.Rev.19:261-281(1993))。起因于AIDS并发症的PCNSL由于其位置和多病灶性通常不能外科切除。典型治疗是颅脑照射,包括剂量为4000-5000cGy的外部波束(externalbeam)放射治疗。尽管临床和放射显影改善迅速,但存活期中位数只是2-5个月。也曾经使用全脑照射和佐剂化学治疗,包括照射前CHOP(例如,环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)和照射后阿糖胞苷,然而,许多患者仍然死亡(O’Neill等人,Int’l J.Radiation Oncol.Biol.Phys.33:663-673(1995))。据报道,联合使用阿糖胞苷(例如ARA-C)、氨甲喋呤和颅脑放射治疗比单独的放射治疗更加有效(Abrey等人,J.Clin.Oncol.16:859-63(1998))。据报道,高剂量氨甲喋呤、甲酰四氢叶酸、硫替哌、长春新碱和地塞米松的组合也可有效地治疗有免疫应答的患者(Sandor等人,J.Clin.Oncol.16:3000-3006(1998))。据报道,使用Ommaya容器组合施用氨甲喋呤和阿糖胞苷可有效治疗涉及CNS的复合性眼内淋巴瘤(Valluri等人,Retina 15:125-9(1995));对这种眼内淋巴瘤的新治疗方法是有效的,因为20%的PCNSL患者累及眼睛(Monjour等人,Rev.Neurol.(巴黎)148:589-600(1992))。遗憾的是,据报道这种加强治疗由于医源性脑白质病导致严重的认知缺陷。回顾数据提示,在放射治疗之前应用化学治疗时发生痴呆的危险提高(Fine等人,Annals Intern.Med.119:1093-1104(1993)和Blay等人,J.Clin.Oncol.16:864-871(1998))。其它研究提议单独用化学疗法治疗PCNSL。据说应用提高化疗剂通过血-脑屏障通透性的药剂,能提高化学治疗的效果(Cheng等人,Cancer 82:1946-51(1998))。
但是,尽管有这些治疗选择,存活期中位数仍固定在约40个月(Abrey等人,J.Clin.Onc.16:859-863(1998))。而且,这些治疗可能导致延迟性神经毒性的明确、固定的危险,这在100%的60岁以上患者中十分严重(Abrey等人,“原发性中枢神经系统淋巴瘤的联合化学治疗”(摘要) Proc.Am.Soc.Clin.Onc.(1999))。累及CNS也使5-29%的全身性NHL病例变复杂,与极严重的预后相关(Fine等人,Ann.Intern.Med.119:1093-1104(1993);van Besien等人,Blood91:1178-1184(1998))。
B.其它CNS癌症及其治疗
其它CNS癌症包括NHL向脑的转移,如软脑膜转移(LM)。曾经用Ommaya内注射氨甲喋呤和111铟-二乙撑三胺五乙酸(111In-DTPA)治疗LM,获得不同的结果(Mason等人,Neurology50:438-444(1998))。也曾经用阿糖胞苷和硫替哌联合照射治疗LM(Schabet等人,Nervenarzt 63:317-27(1992))。在IV期何杰金氏病(HD)患者中也诊断有LM;据报道用全脑照射和鞘内施用氨甲喋呤能成功治疗这些患者(Orlowski等人,Cancer 53:1833-1835(1984))。
当前对原发性脑瘤、脑转移和软脑膜癌扩散的治疗,包括使用单克隆抗体,是不够的,或者具有很差的治疗活性。已经提出将单克隆抗体与蛋白质毒素连接作为治疗CNS癌症的药物(Youle,Semin.Cancer Biol.7:65-70(1996))。例如,曾报道在LM动物模型中使用免疫毒素,如抗-CD7篦麻毒素A链(DA7)(Herrlinger等人,J.Neurooncol.40:1-9(1998))。据报道曾经用LMB-7(由鼠单克隆抗体B3和截短的假单胞菌外毒素PE38构建的一种单链免疫毒素)治疗小鼠模型的肿瘤性脑膜炎(Pastan等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA92:2765-2769(1995))。
IV.药物向脑的输送
为了治疗任何类型的脑瘤向脑部输送治疗剂由于血-脑屏障(BBB)而成为一个障碍。治疗脑癌的方法包括:(1)可能时采用外科手段;(2)全脑放射治疗;(3)在有免疫应答的患者中使用皮质类固醇;(4)能穿过BBB的化学治疗。化疗剂的施用可以用任何输液途径,如脑间质输液(Shin等人,J.Neurosurg.82:1021-1029(1995))或鞘内施用。也设计了渗透BBB破坏方法用来治疗脑内肿瘤(Kroll等人,Neurosurgery 42:1083-99(1998))。
也研制了能穿过BBB的其它药剂。例如,亲脂性输送载体(例如甲基苄肼)以及高剂量CNS穿透剂(例如高剂量的氨甲喋呤)推荐用于治疗PCNSL(DeAngelis等人,1997)。最近,提出使用单克隆抗体OX26靶向脑癌,它允许通过大鼠BBB进行载体介导的药物输送(Partridge等人,Pharm.Res.15:576-82(1998))。据报道,OX26 MAb能用于向脑部输送偶联的肽放射性药物(Deguchi等人,Bioconjug.Chem.10:32-37(1999))。据报道也制备了其它单克隆抗体作为脑部药物输送载体,它们针对含有体内BBB的脑毛细血管内皮上的细胞表面受体(例如转铁蛋白受体或胰岛素受体)(Wu等人,Drug.Metabl.Dispos.26:937-9(1998))。也制备了免疫脂质体(抗体定向的脂质体),据说它能向大鼠脑中输送抗肿瘤剂柔红霉素(Huwyler等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 93:14164-14169(1996))。也描述了生物分子亲脂性复合物,据说它们能向哺乳动物脑中输送活性剂(美国专利号5,716,614)。
因此,由于不能施行以前文献中所报道的,需要改进对PCNSL和其它B细胞脑淋巴瘤的诊断和治疗。而且,据发明者所知,还没有人提出单独鞘内施用抗-CD20抗体或与其它抗癌剂或抗体(例如,抗-CD40或抗-CD40L抗体)联合,治疗中枢神经系统淋巴瘤和脑膜复发。
发明目的与概述
本发明的一个目的在于提供一种治疗或预防淋巴瘤患者脑膜复发的方法,包括施用治疗有效量的B细胞靶标抗体(例如抗-CD22、抗-CD21、抗-CD23、抗-CD37、抗-CD40、抗-CD20抗体或其片段)的步骤。本发明的另一个目的在于提供一种治疗中枢神经系统(CNS)淋巴瘤的方法,包括施用治疗有效量的B细胞抗体或影响B细胞激活的抗体(例如抗-CD21、抗-CD22、抗-CD23、抗-CD40、抗-CD40L或抗-CD20抗体或其片段)的步骤。可以治疗的CNS淋巴瘤包括:原发性CNS淋巴瘤(PCNSL)、软脑膜转移(LM)或累及CNS的何杰金氏病。
本发明的一个特殊目的在于使用抗-B细胞抗体(它是人类抗体、人源化抗体、双特异性抗体或嵌合抗体)治疗CNS淋巴瘤。例如,抗-CD20、抗-CD21、抗-CD22、抗-CD23、抗-CD40或抗-CD40L抗体片段,如Fab、Fab’和F(ab’)2也计划用于治疗CNS淋巴瘤。
本发明的一个更优选的目的在于使用瑞图希单抗作为抗-CD20抗体治疗CNS淋巴瘤。该抗-CD20抗体优选地能以每周约10-375mg/M2的剂量心室内或鞘内施用4周。
本发明的另一个目的在于与下列任一种或多种物质联合施用抗-CD20抗体治疗CNS淋巴瘤:(1)抗-CD40抗体或另一种B细胞结合抗体,(2)CD40L拮抗剂,(3)化疗剂,和/或(4)抗-B细胞抗体。
本发明的另一个目的在于将抗-B细胞抗体(例如抗-CD20抗体或下文所述其它B细胞靶标的抗体)与放射性同位素连接,用于CNS淋巴瘤的治疗或诊断。抗-CD20抗体或另一种抗-B细胞抗体能与211At、212Bi、67Cu、123I、131I、111In、32P、212Pb、186Re、188Re、153Sm、99mTc或90Y连接,如果为了治疗目的施用,对患者施用放射免疫治疗有效的量。
本发明的另一个目的在于一种诊断患者的CNS淋巴瘤(如PCNSL)的方法,包括下列步骤:(A)对患者施用与可检测标记物结合的B细胞抗体、抗-CD20抗体或抗-CD20抗体片段;(B)检测该标记物的位置。
为治疗CNS淋巴瘤施用的组合物能与血-脑屏障(BBB)通透增强剂联合或连接。
发明详述
I.定义
“CNS淋巴瘤”是指中枢神经系统(CNS)的任何B细胞淋巴瘤。包括何杰金氏病(ND)淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、软脑膜转移和原发性CNS淋巴瘤(“PCNSL”)。
在此使用时,术语“抗体”是指完整的抗体及其Fab片段、Fv、scFv和F(ab)2片段。完整抗体包括单克隆抗体,如鼠单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体、灵长类动物化(primatized)抗体、人源化抗体和人类抗体。抗体的生产和完整抗体、Fab片段和F(ab)2片段的蛋白质结构以及编码这些分子的基因序列的组构众所周知,例如在Harlow等人,《抗体:实验室手册》,冷泉港实验室,冷泉港,纽约(1988)中描述,在此引用作为参考。抗体(例如抗-CD20抗体、抗-B细胞抗体等)可以是免疫毒素或双特异性抗体形式中的完整抗体或片段。
“抗-CD40抗体”包括免疫球蛋白及其片段,它们对CD40蛋白或其肽或CD40融合蛋白有特异反应性。抗-CD40抗体包括人类抗体、嵌合抗体、双特异性抗体和人源化抗体。
“B细胞表面标志”或“B细胞靶标”或“B细胞抗原”是指B细胞表面表达的一种抗原,它针对与之结合的拮抗剂。代表性B细胞表面标志包括CD10、CD14、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CD75、CD76、CD77、CD78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86白细胞表面标志。与哺乳动物的其它非B细胞组织相比,特别重要的B细胞表面标志在B细胞上优先表达,并且可以在前体B细胞和成熟B细胞上表达。在一个实施方案中,B细胞标志使用CD19、CD20或CD22,在谱系由干细胞阶段分化直到最终分化为浆细胞之前的整个过程中存在于B细胞上。最优选的B细胞标志是CD20。
“B细胞抗体”是特异结合B细胞上抗原(如下文所述)的抗体。
“B细胞拮抗剂”是指一种分子,它在与B细胞表面标志结合后,例如通过降低或防止B细胞引发的体液反应,破坏或消耗哺乳动物的B细胞,和/或干扰一种或多种B细胞功能。拮抗剂优选地能消耗用它治疗的哺乳动物的B细胞(即降低循环B细胞水平)。这种消耗可通过多种机制实现,如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC),B细胞增殖的抑制和/或B细胞死亡的诱导(例如通过凋亡)。本发明范围内包括的拮抗剂包括能与B细胞标志结合的抗体、合成或天然序列肽和小分子拮抗剂,任选地与细胞毒性剂偶联或融合。优选的拮抗剂包括抗体,更优选地是B细胞消耗性抗体。
“抗-CD40L抗体”包括免疫球蛋白及其片段,它们对CD40L蛋白或及肽或CD40L融合蛋白有特异反应性。抗-CD40L抗体包括人类抗体、嵌合抗体、双特异性抗体和人源化抗体。
“抗-CD20抗体”包括免疫球蛋白及其片段,它们对CD20或其肽有特异反应性。抗-CD20抗体包括人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体和双特异性或三特异性抗体。一种优选的抗-CD20抗体是瑞图希单抗。
“B细胞消耗性抗体”是指任何抗体(包括嵌合和人源化抗体)或其片段或含有它们的免疫毒素,当治疗施用时,它能消耗施用抗体的患者的B细胞数量。这类B细胞消耗性抗体包括但不限于能结合上述任何B细胞抗原的抗体,优选地包括抗-CD20抗体、抗-CD19抗体、抗-CD22抗体、抗-CD38抗体(例如OKT10抗体,参见,Flavell等人,Int.J.Cancer 62:337-44(1995))和抗主要组织相容性复合物(MHC)II抗体(参见Illidge等人,Blood 94:233-43(1999))。B细胞消耗性抗体优选地是抗-CD20抗体。B细胞消耗性抗体可以是与治疗用同位素连接的放射性形式,与毒剂连接的免疫毒素,完整抗体或其片段(例如Fab’),以及B细胞消耗性抗体的嵌合抗体和人源化抗体。
“抗-CD19抗体”是指可识别并结合B细胞上表达的CD19抗原的任何抗体或其片段或免疫毒素。优选的抗-CD19抗体能治疗性消耗患者的B细胞或影响B细胞,使其对其它试剂更敏感或减少细胞的寿命。特异性抗-CD19抗体包括但不限于:单克隆抗体HD37(参见Ghetie等人,Clin.Cancer Res.5:3920-7(1999))、单克隆抗体B43或其衍生的单链Fv(VFS191)(Li等人,Cancer Immunol.Immunother.47:121-30(1998))、单克隆鼠抗体HD37(Stone等人,Blood 88:1188-97(1996))和单链Fv(scFv)抗体片段FVS192(Bejcek等人,Cancer Res.55:2346-51(1995))。
“抗-CD22抗体”是指可识别并结合B细胞上表达的CD22抗原的任何抗体或其片段或免疫毒素。优选的抗-CD22抗体能治疗性消耗患者的B细胞或影响B细胞,使其对其它试剂更敏感或减少细胞的寿命。特异性抗-CD22抗体包括但不限于:人源化抗-CD22抗体hLL2(Behr等人,Clin.Cancer Res.5:3304s-14s(1999))、单克隆抗体OM124(Bolognesi等人,Br.J.Haematol.101:179-88(1998))和抗-CD22IgG1抗体RFB4及其免疫毒素(Mansfield等人,Bioconjug.Chem.7:557-63(1996))。
“双特异性抗体”是指一种抗体分子,它含有一个对一种抗原特异的抗原结合部位,和对另一种抗原特异的另一个抗原结合部位。
“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指一种细胞介导的反应,其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体,随后导致靶细胞裂解。介导ADCC的主要细胞——NK细胞只表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页的表3中。为了估计目的分子的ADCC活性,可以进行体外ADCC测定,如美国专利号5,500,362或5,821,337所述。可用于这种测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。此外,也可在体内估测目的分子的ADCC活性,例如使用动物模型,如Clynes等人,PNAS(USA)95:652-656(1998)所公开的。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并行使效应细胞功能的白细胞。优选地,这些细胞至少表达FcγRIII,并行使ADCC效应细胞功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞;PBMC和NK细胞是优选的。
术语“Fc受体”或“FCR”用于描述可与抗体Fc区结合的受体。
优选的FcR是一种天然序列人FcR。而且,一种优选的FcR可结合IgG抗体(一种γ受体),包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体,包括这些受体的等位变体和其它剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(一种“激活受体”和)和FcγRIIB(一种“抑制受体”),它们具有类似的氨基酸序列,区别主要在于胞质域。激活受体FcγRIIA在胞质域含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在胞质域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991);Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994);de Hass等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)综述了FcR。此处的术语“FCR”包括其它FcR,包括将来鉴定的。该术语也包括新生受体FcRn,它负责母亲IgG向胎儿的转移(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))。
“补体依赖的细胞毒性”或“CDC”是指一种分子在补体存在下裂解靶标的能力。补体系统的第一种成分(C1q)结合与同源抗原复合的分子(例如抗体),起始补体激活途径。为了估计补体激活,可以进行CDC测定,如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)所述。
“生长抑制”拮抗剂可阻止或降低表达一种可与拮抗剂结合的抗原的细胞增殖。例如,拮抗剂可以阻止或降低B细胞的体外和/或体内增殖。
“诱导凋亡”的拮抗剂可诱导例如B细胞的程序性死亡,这可用标准凋亡试验测定,如膜联蛋白V的结合,DNA的破碎,细胞收缩,内质网膨胀,细胞破碎,和/或膜泡的形成(称为凋亡体)。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分,优选地包括其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括:Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段;叠抗;线性抗体;单链抗体分子;由抗体片段形成的多特异性抗体。
“天然抗体”通常是约150000道尔顿的异四聚体糖蛋白,它由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与一条重链连接,而在不同免疫球蛋白同种型的重链之间,二硫键数量不同。每条重链和轻链也含有一定间距的链内二硫键。每条重链在一端含有一个可变域(VH),随后是许多恒定域。每条轻链在一端含有一个可变域(VL),在另一端含有一个恒定域;轻链的恒定域与重链的恒定域对准,轻链的可变域与重链的可变域对准。认为特定氨基酸残基在轻链和重链可变域之间形成一个界面。
术语“可变”是指抗体之间可变域的某些部分的序列广泛不同,用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,可变性在抗体的整个可变域中并非平等分布。它集中于轻链和重链可变域中被称为超变区的三个片段中。可变域的更加高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变域每个含有4个FR,大多采用β-折叠构型,通过三个超变区连接,形成与β折叠结构连接的环,有时形成β折叠结构的一部分。每条链的超变区通过FR与另一个链的超变区紧密邻接在一起,有助于形成抗体的抗原结合部位(参见Kabat等人,《具有免疫学意义的蛋白质的序列》,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合,但显示不同的效应物功能,如抗体参与抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两条相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段,每条含有一个抗原结合部位),和剩余的“Fc”片段,该名称反映它容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab’)2片段,它具有两个抗原结合部位,仍能交联抗原。
“Fv”是含有完整抗原识别和抗原结合部位的最小抗体片段。该区域包含紧密非共价结合的一条重链和一条轻链可变域的二聚体。该构型中每个可变域的三个超变区相互作用,在VH-HL二聚体表面上确定了一个抗原结合部位。概括起来,六个超变区为抗体提供抗原结合特异性。然而,甚至一个可变域(或者只含抗原特异的三个超变区的Fv的一半)也具有识别并结合抗原的能力,尽管亲和力低于完整结合部位。
Fab片段也含有轻链的恒定域和重链的第一个恒定域(CHI)。Fab’片段不同于Fab片段,在重链CHI域的羧基端添加了一个新残基,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是此处对恒定区的半胱氨酸残基含有至少一个游离巯基的Fab’的命名。F(ab’)2抗体片段最初作为Fab’片段对产生,在片段之间含有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也周知。
来自任何脊椎动物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”,根据恒定域的氨基酸序列,能够归类为两种截然不同的类型之一,称为kappa(κ)和lambda(λ)。
根据重链恒定域的氨基酸序列,抗体能被归为不同的类型。完整的抗体有5个主要类型:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中几种可以进一步分为亚型(同种型),例如:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同抗体类型的重链恒定域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类型免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型众所周知。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段含有抗体的VH和VL域,其中这些域存在于多肽单链中。优选地,Fv多肽在VH和VL域之间还含有一个多肽接头,它使scFv能形成抗原结合所希望的结构。scFv的综述参见Pluckthun的《单克隆抗体药理学》,第113卷,Rosenburg和Moore编写,Springer-Verlag,纽约,269-315(1994)。
术语“叠抗(diabody)”是指含有两个抗原结合部位的小抗体片段,该片段在同一多肽链(VH-VL)中含有一个与轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)。利用一个因太短而不能使同一条链上的两个域配对的接头,使该域与另一条链的互补域配对,产生两个抗原结合部位。例如在EP 404,097;WO 93/11161和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中详述了叠抗。
术语“单克隆抗体”在此使用时是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体,即该群体的抗体除了可能较少出现的自然发生的突变之外相同。单克隆抗体高度特异,针对一个抗原部位。而且,与一般包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品不同,每种单克隆抗体只针对抗原上的一种决定簇。除了特异性之外,单克隆抗体的优点还在于通过杂交瘤培养合成,不被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”是指抗体从基本上同质的抗体群体获得的特征,不应视为需要用任何特殊方法产生。例如,根据本发明使用的单克隆抗体可以利用Kohler等人,Nature 256:495(1975)第一次描述的杂交瘤法制备,或者可以利用重组DNA方法制备(参见,例如,美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可以利用如Clackson等人,Nature352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体库中分离。
此处的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白),其中重链和/或轻链的一部分与来自特定种或属于特定抗体类型或亚型的抗体的相应序列相同或同源,而链的其余部分与来自另一个种或属于另一抗体类型或亚型的抗体的相应序列相同或同源,以及这些抗体的片段,只要它们显示希望的生物活性(美国专利号4,816,567;Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。此处的目的嵌合抗体包括“灵长类动物化”抗体,其含有来自非人类灵长类动物(例如Old World猴,如狒狒、恒河猴或猕猴)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列(美国专利号5,693,780)。
非人类(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有来自非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体的大部分是人类免疫球蛋白(受体抗体),其中来自受体超变区的残基被替换为来自非人类物种(如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物)的超变区的残基(供体抗体),具有希望的特异性、亲和力和能力。有时,人类免疫球蛋白的构架区(FR)残基被替换为相应的非人类残基。此外,人源化抗体还可含有在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。为了进一步精修抗体的性能进行这些修饰。总之,人源化抗体含有基本上所有或至少一个,一般两个可变域,其中所有或基本上所有超变环对应于非人类免疫球蛋白的超变环,所有或基本上所有FR具有人类免疫球蛋白序列。人源化抗体任选地也至少含有免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分,一般是人类免疫球蛋白的。进一步的详述参见Jones等人,Nature321:522-525(1986);Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
术语“超变区”在此使用时是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。超变区含有来自“补体决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变域的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3),和重链可变域的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等人,《具有免疫学意义的蛋白质的序列》,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))和/或来自“超变环”的残基(例如轻链可变域的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3),和重链可变域的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3);Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。“构架区”或“FR”残基是不同于此处所述超变区残基的可变域残基。“可结合”目的抗原(如B细胞表面标志)的拮抗剂能够以足够的亲和力和/或亲合力结合该抗原,使得该拮抗剂可用作针对表达该抗原的细胞的治疗剂。
可结合CD20抗原的抗体的例子包括:“C2B8”,现在称为“瑞图希单抗”(“RITUXAN”)(美国专利号5,736,137,在此引用作为参考);钇-[90]标记的2138鼠抗体,命名为“Y2B8”(美国专利号5,736,137,在此引用作为参考);任选地用1311标记的鼠IgG2a“131”,产生“1311-B1”抗体(BEXXARTM) (美国专利号5,595,721,在此引用作为参考);鼠单克隆抗体“1F5”(Press等人,Blood 69(2):584-591(1987));“嵌合2H7”抗体(美国专利号5,677,180,在此引用作为参考);可从国际白细胞分型会获得的单克隆抗体L27、G28-2、93-1133、B-C1或NU-B2(Valentine等人,《白细胞分型III》,McMichael编写,第440页,牛津大学出版社(1987))。可结合CD19抗原的抗体的例子包括Hekman等人,Cancer Immunol.Immunother.32:364-372(1991)和Vlasveld等人,Cancer Immunol.Immunother.40:37-47(1995)中的抗-CD19抗体,和Kiesel等人,Leukemia Research11,12:1119(1987)中的B4抗体。
术语“瑞图希单抗”或“RITUXAN”在此是指抗CD20抗原的遗传工程嵌合鼠/人单克隆抗体,在美国专利号5,736,137中命名为“C2B8”,在此引用作为参考。该抗体是一种IgG,κ免疫球蛋白,含有鼠轻链和重链可变区序列和人恒定区序列。瑞图希单抗对CD20抗原有大约8.0nM的结合亲和力。
“分离的”拮抗剂是指从其天然环境成分中鉴定、分离和/或回收的拮抗剂。天然环境的污染成分是干扰拮抗剂诊断或治疗用途的物质,可包括:酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选实施方案中,拮抗剂将被纯化为(1)大于拮抗剂的95%重量,最优选地大于99%重量,利用Lowry法测定,(2)利用自旋杯式测序仪足以获得至少15个N端残基或内部氨基酸序列的程度,或(3)在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE经考马斯蓝或者优选地银染显示均质。分离的拮抗剂包括重组细胞内的原位拮抗剂,因为拮抗剂自然环境中的至少一种成分将不存在。然而,分离的拮抗剂通常通过至少一个纯化步骤制备。用于处理的“哺乳动物”是指被归类为哺乳动物的任何动物,包括人、家畜和农畜、动物园动物、运动动物或宠物,如狗、马、猫、牛等。优选地,哺乳动物是人。
“处理”是指治疗性处理和预防性措施。需要处理的动物包括已经患有疾病的以及将要预防疾病的动物。因此,哺乳动物可能已诊断为患病或可能易患疾病。
表述“治疗有效量”是指可有效预防、改善或治疗所述自身免疫病的拮抗剂的量。术语“免疫抑制剂”在此用于辅助治疗时是指用于抑制或遮蔽所治疗的哺乳动物免疫系统的物质。包括可抑制细胞因子产生、下调或抑制自身抗原表达或遮蔽MHC抗原的物质。
这些试剂的实例包括:2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(参见美国专利号4,665,077,其内容在此引用作为参考);硫唑嘌呤;环磷酰胺;溴环肽;达那唑;氨苯砜;戊二醛(遮蔽MHC抗原,如美国专利号4,120,649所述);MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体;环孢菌素A;类固醇,如糖皮质类固醇,例如强的松、甲基强的松龙和地塞米松;细胞因子或细胞因子受体拮抗剂,包括抗干扰素-γ、-β或-α抗体,抗肿瘤坏死因子-α抗体,抗肿瘤坏死因子-β抗体,抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体;抗LFA-1抗体,包括抗CD11a和抗CD18抗体;抗L3T4抗体;异源抗淋巴细胞球蛋白;全T抗体,优选地抗CD3或抗CD4/CD4a抗体;含有LFA-3结合域的可溶性肽(1990年7月26日公开的WO 90/08187);链激酶;TGF-O;链激酶;来自宿主的RNA或DNA;FK506;RS-61443;脱氧精胍菌素;雷帕霉素;T细胞受体(Cohen等人,美国专利号5,114,721);T细胞受体片段(Offner等人,Science 251:430-432(1991);WO 90/11294;Ianeway,Nature,341:482(1989);WO 91/01133);和T细胞受体抗体(EP 340,109),如TLOB9。
术语“细胞毒性剂”在此使用时是指可抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语包括放射性同位素(如I131、Y90、Ar211、P32、Re188、Re186、Sm153、B212等)、化疗剂和毒素,如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素,或其片段。
“化疗剂”是可用于癌症治疗的化学化合物。化疗剂的例子包括:烷化剂,如硫替哌和环磷酰胺(CYTOXANTM);烷基磺酸,如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡;氮丙啶,如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替派;氮丙啶和甲基吐根胺(amelamine),包括六甲蜜胺、曲他胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine);氮芥,如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、盐酸氧化双氯乙基甲胺、美法仑、novembiehin、苯芥胆固醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥;亚硝基脲,如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀;抗生素,如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加利车霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、久莫霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-二嗪-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、idambicin、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、绛色霉素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星;抗代谢物,如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物,如二甲叶酸、氨甲喋呤、蝶罗呤、三甲曲沙;嘌呤类似物,如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤;嘧啶类似物,如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU;雄激素,如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、表硫雄醇、美雄氨、睾内酯;抗肾上腺素,如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦;叶酸补充剂,如frolinic acid;醋葡醛内酯;aldophosphamide糖苷;氨基乙酰丙酸;安吖啶;bestrabucil;比生群;依达曲沙;defofamine;地美可辛;地吖醌;依氟鸟氨酸;乙酸elliptinium;依托格鲁;硝酸镓;羟基脲;香菇多糖;氯尼达明;米托胍腙;米托蒽醌;莫哌达醇;nitracrine;喷司他丁;phenamet;吡柔比星;podophyllinic acid;2-乙基酰肼;甲基苄肼;PSK;丙亚胺;西佐喃;锗螺胺;细格孢氮杂酸;三亚胺醌;2,2’,2”-三氯三乙胺;乌拉坦;长春地辛;达卡巴嗪;甘露莫司汀;二溴甘露醇;二溴卫矛醇;哌泊溴烷;gacytosine;阿拉伯糖苷(“Ara-C”); 环磷酰胺;硫替哌;紫杉烷,例如紫杉醇(TAXOLO,Bristol-Myers SquibbOncology,Princeton,NJ)和紫杉萜(TAXOTEW,Rh6ne-Pulenc Rorer,Antony,法国);苯丁酸氮芥;吉西他滨;6-硫鸟嘌呤;巯基嘌呤;氨甲喋呤;铂类似物,如顺铂和卡铂;长春碱;铂;表鬼臼毒吡喃葡糖苷(VP-16);异环磷酰胺;丝裂霉素C;米托蒽醌;长春新碱;长春瑞宾;navelbine;三羟基蒽醌;替尼泊甙;柔红霉素;氨基蝶呤;xeloda;伊拜膦酸盐;CPT-11;拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);视黄酸;埃斯波霉素;capecitabine;和上述任一种的药学可接受的盐、酸或衍生物。该定义也包括用来调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂,如抗雌激素,包括如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、onapristone和托瑞米芬(Fareston);和抗雄激素,如氟他胺、尼鲁米特、bicalutamide、亮丙瑞林、戈舍瑞林;和上述任一种的药学可接受的盐、酸或衍生物。
术语“细胞因子”是由一个细胞群体产生的,作为细胞间介质作用于另一种细胞的蛋白质的通称。细胞因子的实例包括淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子包括:生长激素,如人类生长激素、N-甲硫氨酰人类生长激素和牛生长激素;甲状旁腺激素;甲状腺素;胰岛素;胰岛素原;松驰素;松驰素原;糖蛋白激素,如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH);肝生长因子;成纤维细胞生长因子;催乳素;胎盘催乳激素;肿瘤坏死因子-α和-o;mullerian-抑制物;小鼠促性腺激素相关肽;抑制素;激活素;血管内皮生长因子;整联蛋白;血小板生成素(TPO);神经生长因子,如NGF-P;血小板生长因子;转化生长因子(TGF),如TGF-α和TGF-o;胰岛素样生长因子-I和-II;促红细胞生成素(EPO);骨诱导(osteoinductive)因子;干扰素,如干扰素-α、-β和-γ;集落刺激因子(CSF),如巨噬细胞-CSF(M-CSF);粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF);和粒细胞-CSF(G-CSF);白介素(IL),如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15;肿瘤坏死因子,如TNF-α或TNF-β;和其它多肽因子,包括LIF和kit配体(KL)。在此使用时,术语细胞因子包括自然来源或来自重组细胞培养的蛋白质,和天然序列细胞因子的生物活性相当物。
术语“前体药物”在本申请书中使用时是指药学活性物质的前体或衍生形式,与亲本药物相比,它对肿瘤细胞的细胞毒性较低,并且能被酶促激活或者转化为更有活性的亲本形式。参见,例如,Wihnan,“癌症化学治疗中的前体药物”Biochemical Society Transactions,14,375-382,615th Meeting Belfast(1986)和Stella等人,“前体药物:定向药物输送的一种化学方法”《定向药物输送》,Borchardt等人(编写),247-267,Humana Press(1985)。本发明的前体药物包括但不限于:含磷酸盐的前体药物、含硫代磷酸盐的前体药物、含硫酸盐的前体药物、含肽的前体药物、D-氨基酸修饰的前体药物、糖基化前体药物、含β-内酰胺的前体药物、任选地取代的含苯氧基乙酰胺的前体药物或任选地取代的含苯基乙酰胺的前体药物、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物,它们能转化为更有活性的细胞毒性游离药物。能衍生为本发明使用的前体药物形式的细胞毒性药物的实例包括但不限于上述化疗剂。
“脂质体”是由多种类型的脂类、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊泡,它可用于向哺乳动物输送药物(如此处公开的拮抗剂,和任选地化疗剂)。脂质体的成分通常以双层结构排列,类似于生物膜的脂类排列。术语“包装插页”用来指治疗产物商品包装中通常包含的说明书,包括关于适应证、用法、剂量、施用、禁忌症的信息和/或关于使用这些治疗性产物的警告。
“治疗有效量”或“预防有效量”或“施用有效量”是指可抑制CNS淋巴瘤发展的药剂量。这种抑制可以是导致淋巴瘤不可检测的完全反应或部分反应。以易于施用和剂量均一的剂量单位形式配制肠胃外组合物是特别有利的。“剂量单位形式”在此使用时是指物理分散的单位,适于作为所治疗的哺乳动物患者的单一剂量;计算含有预定量的活性化合物的每一单位,产生与需要的药物载体有关的希望的治疗效果。本发明的剂量单位形式的特性直接取决于:(A)活性化合物的独特特性和将要达到的特殊治疗效果;(B)这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的混合技术所固有的限制。
“放射免疫治疗有效量”是指与放射性同位素连接的抗-CD20抗体的量,当为了治疗CNS淋巴瘤对患者施用时,使CNS淋巴瘤完全或部分地恢复。一般而言,所述任何抗体以300-1500mg/m3的剂量施用。
“药用赋形剂”是指为了制备适宜或方便的剂型而与活性药物、试剂或抗原结合的任何惰性物质。
“免疫原性”是指导向的蛋白质或治疗部分当对患者施用时引发免疫应答(例如体液或细胞应答)的能力。
II.拮抗剂的生产
本发明的生产方法和产品使用或加入可结合B细胞表面标志的拮抗剂,例如CD20、CD19、CD21、CD22、CD40等。因此,此处将描述生产这些拮抗剂的方法。用于生产或筛选拮抗剂的B细胞表面标志或细胞因子可以是例如含有希望的表位的可溶性抗原或其部分。另外,在细胞表面表达B细胞表面标志的细胞能用来生产或筛选拮抗剂。本领域技术人员知道可用于生产拮抗剂的B细胞表面标志的其它方式。优选地,B细胞表面标志是CD19或CD20抗原。
尽管优选的拮抗剂是抗体,但此处也涉及抗体之外的拮抗剂。例如,拮抗剂可包括任选地与细胞毒性剂(如此处所述)融合或偶联的小分子拮抗剂。为了鉴定可结合该抗原的小分子,可以针对目的B细胞表面标志筛查小分子文库。可以根据拮抗性质进一步筛选小分子,和/或与细胞毒性剂偶联。
拮抗剂也可以是通过合理设计或噬菌体展示产生的肽(参见,例如,1998年8月13日公开的WO98/35036)。在一个实施方案中,选择的分子可以是根据抗体的CDR设计的“CDR模拟物”或抗体类似物。虽然这些肽可被其本身拮抗,但任选地可将肽与细胞毒性剂融合,以添加或增强该肽的拮抗性质。
下面描述了用于生产根据本发明使用的抗体拮抗剂的典型技术。
多克隆抗体
多克隆抗体优选地通过对动物多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂产生。可以利用双功能剂或衍化剂,如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOC12或R1N=C=NR(其中R和R1是不同的烷基),偶联相关抗原与在所免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质,例如匙孔戚血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。动物用抗原、免疫原性偶联物或衍生物免疫,方法是将例如100pg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂组合,在多个部位皮内注射该溶液。一个月后,通过在多个部位皮下注射初始量1/5-1/10的肽或偶联物与弗氏完全佐剂,加强动物。7-14天后,动物放血,测定血清的抗体效价。加强动物直到效价稳定。优选地,用与不同蛋白质偶联的同一抗原和/或通过不同交联剂的偶联物加强动物。偶联物也能作为融合蛋白在重组细胞培养中制备。聚集剂(如明矾)也适用于增强免疫应答。
单克隆抗体
单克隆抗体从基本上同质的抗体群体中获得,即,该群体的各种抗体除可能少量存在的自然发生的突变之外相同。因此,修饰语“单克隆”是指抗体不是不同抗体混合物的性质。例如,单克隆抗体可以利用Kohler等人,Nature 256:495(1975)第一次描述的杂交瘤技术制备,或者可以通过重组DNA方法制备(美国专利号4,816,567)。
在杂交瘤方法中,如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物,如仓鼠,诱导产生或能产生可特异结合免疫用蛋白质的抗体的淋巴细胞。此外,也可以在体外免疫淋巴细胞。然后应用合适的融合剂,如聚乙二醇,将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,形成杂交瘤细胞[Goding,《单克隆抗体:原理与实践》,59-103页(Academic Press,1986)]。
这样制备的杂交瘤细胞接种于合适的培养基中生长,其中优选地含有一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如,如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT),用于杂交瘤的培养基一般含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基),这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
优选的骨髓瘤细胞是有效融合的,支持选择的抗体产生细胞稳定、高水平地产生抗体,并且对培养基(如HAT培养基)敏感。其中,优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系,如可从Salk Institute CellDistribution Center,San Diego,California USA获得的来源于MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系,和可从美国模式培养物保藏中心,Rockville,Maryland USA获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。也曾描述了人骨髓瘤和小鼠人异骨髓瘤细胞系用于人单克隆抗体生产[Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等人,《单克隆抗体生产技术和应用》,51-63页(Marcel Dekker,Inc.,纽约,1987)]。
测定培养杂交瘤细胞的培养基中针对该抗原的单克隆抗体的产生。优选地,通过免疫沉淀或体外结合试验,如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和力例如可通过Munson等人,Anal.Biochem.,107:220(1980)所述的夹心分析法测定。
在确定可产生具有希望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后,可以通过有限稀释法亚克隆这些克隆,并通过标准方法培养(Goding,《单克隆抗体:原理与实践》,59-103页(Academic Press,1986))。适用于该目的的培养基包括,例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外,杂交瘤细胞也可以作为腹水肿瘤在动物体内生长。
这些亚克隆分泌的单克隆抗体通过常规免疫球蛋白纯化方法,如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析,从培养基、腹水或血清中适当分离。
编码单克隆抗体的DNA利用常规方法(例如,利用能特异结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离并测序。杂交瘤细胞用作该DNA的优选来源。分离后,DNA可置于表达载体中,然后转染宿主细胞,如不产生免疫球蛋白的大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞,在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中重组表达的综述文章包括Skerra等人,Curr.Opinion in Immunol.5:256-262(1993)和Phickthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在另一个实施方案中,能利用McCafferty等人,Nature,348:552-554(1990)所述的技术从抗体噬菌体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)分别描述了利用噬菌体文库对鼠和人抗体的分离。以后的文章描述了应用链改组(shuffling)以及联合感染和体内重组作为构建极大噬菌体文库的策略(Waterhouse等人,Nuc.AcidsRes.21:2265-2266(1993)),产生高亲和力(nM级)人抗体(Marks等人,BioTechnology,10:779-783(1992))。因此,这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的有效备选技术。
DNA也可以修饰,例如,用人重链和轻链恒定域的编码序列代替同源鼠序列(美国专利号4,816,567;Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851(1984)),或者共价连接免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列。一般用这些非免疫球蛋白多肽代替抗体的恒定域,或者代替抗体的一个抗原结合部位的可变域,产生一种嵌合双价抗体,其含有一个具有抗原特异性的抗原结合部位和另一个具有不同抗原特异性的抗原结合部位。
人源化抗体
人源化非人类抗体的方法在本领域中已经描述。优选地,人源化抗体中引入一个或多个来自非人类来源的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常被称为“引入(import)”残基,一般来自“引入”可变域。人源化基本上能按照Winter及其同事(Jones等人,Nature,321:522-525(1986);Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988);Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988))的方法进行,是用超变区序列代替人类抗体的相应序列。因此,“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567),其中大大少于完整人类可变域部分被替换为来自非人类物种的相应序列。实际上,人源化抗体一般是人类抗体,其中一些超变区残基,或许一些FR残基被替换为来自啮齿类动物抗体类似位点的残基。
用于生产人源化抗体的人类可变域(轻链和重链)的选择对于降低抗原性极其重要。根据所谓的“最佳拟合(best-fit)”法,对已知人类可变域序列的完整文库筛查啮齿类动物抗体的可变域序列。然后用最接近啮齿类动物的人类序列作为人源化抗体的人类构架区(FR)(Sims等人,J.Immunol.,151:2296(1993);Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901(1987))。另一种方法使用特定轻链或重链亚型的所有人类抗体的共有序列衍生的特定构架区。几种不同的人源化抗体可以使用相同的框架(Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);Presta等人,J.Immunol.151:2623(1993))。
抗体人源化对于保持高度的抗原亲和力和其它有利的生物学性质是十分重要的。为了达到这一目的,按照一种优选方法,利用亲代和人源化序列的三维模型,通过对亲代序列和不同概念人源化产物的分析方法,制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型一般可以获得,为本领域技术人员所周知。可以获得图形显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。观察这些图示可分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能的作用,即分析影响候选免疫球蛋白结合抗原能力的残基。这样,能从受体引入序列中选择并结合FR残基,以获得希望的抗体特性,如提高的靶抗原亲和力。超变区残基通常直接并最充分地参与影响抗原结合。
人类抗体
作为人源化的备选,可以生产人类抗体。例如,现在能生产在免疫后能产生全套人类抗体而不产生内源免疫球蛋白的转基因动物(例如小鼠)。例如,已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失使内源抗体产生被完全抑制。这种种系突变小鼠中人种系免疫球蛋白基因排列的转移导致在抗原攻击后产生人类抗体。参见,例如,Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993);Jakobovits等人,Nature,362:255-258(1993);Bruggermann等人,Year in Immuno.,7:33(1993);美国专利号5,591,669、5,589,369和5,545,807。此外,也能用噬菌体展示技术(McCafferty等人,Nature348:552-553(1990))由未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因全部成分(repertoire)在体外生产人类抗体和抗体片段。按照该技术,将抗体V域基因符合读框地克隆到丝状噬菌体(如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中,在噬菌体颗粒表面展示为功能抗体片段。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝,基于抗体功能性的选择也导致选择编码显示这些性质的抗体的基因。因此,该噬菌体模拟B细胞的一些性质。噬菌体展示能用多种方式进行;综述参见,例如Johnson,Kevin S.和Chiswell,David J.,Current Opinion inStructural Biology 3:564-571(1993)。V基因片段的几种来源能用于噬菌体展示。Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)从来自免疫小鼠脾脏的V基因小随机组合文库中分离了不同排列的抗恶唑啉抗体。能够构建来自未免疫的人类供体的V基因全部成分,并能基本上按照Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等人,EMBO J.12:725-734(1993)所述的技术,分离抗不同抗原(包括自身抗原)的抗体。参见,美国专利号5,565,332和5,573,905。人类抗体也可由体外激活的B细胞产生(参见美国专利号5,567,610和5,229,275)。
抗体片段
已经发展了多种技术生产抗体片段。传统上是通过蛋白水解消化完整抗体产生这些片段(参见,例如,Morimoto等人,Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)和Brennan等人,Science,229:81(1985))。然而,现在能由重组宿主细胞直接产生这些片段。例如,能从上述抗体噬菌体文库中分离抗体片段。此外,也能直接从大肠杆菌中回收Fab’-Sli片段,并化学偶联形成F(ab’)2片段[Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992)]。按照另一种方法,能直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab’)2片段。生产抗体片段的其它技术为技术人员所知。在其它实施方案中,选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185;美国专利号5,571,894;美国专利号5,587,458。抗体片段也可以是“线性抗体”,如美国专利5,641,870所述。这些线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两种不同的表位具有结合特异性的抗体。典型的双特异性抗体可以结合B细胞表面标志的两种不同表位。其它抗体可以结合第一种B细胞标志,并进一步结合第二种B细胞表面标志。此外,抗B细胞标志结合臂可以与结合白细胞上的触发分子(如T细胞受体分子,如CD2或CD3,或IgG的Fc受体(FcγR),如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16))的臂结合,以将细胞防御机制集中于B细胞。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位于B细胞。这些抗体具有一个B细胞标志结合臂,和一个结合细胞毒性剂(例如皂草素、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒素A链、氨甲喋呤或放射性同位素半抗原)的臂。双特异性抗体能制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。
生产双特异性抗体的方法在本领域周知。全长双特异性抗体的传统生产是基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达,其中这两条链具有不同的特异性(Millstein等人,Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类,这些杂交瘤(细胞杂交瘤)产生一种可能含有10种不同抗体分子的混合物,其中只有一种抗体分子具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常利用亲和层析步骤进行,十分繁琐,产物产量较低。WO 93/08829和Traunecker等人,EMBO J.10:3655-3659(1991)公开了类似的方法。
按照不同的方法,具有希望的结合特异性的抗体可变域(抗体-抗原结合部位)与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选地与免疫球蛋白重链恒定域融合,它含有铰链、CH2和CH3区的至少一部分。优选地含有第一个重链恒定区(CHI),它含有轻链结合所必需的部位,存在于至少一种融合体中。将编码免疫球蛋白重链融合体的DNA,必要时将编码免疫球蛋白轻链的DNA,插入分别的表达载体中,共转染合适的宿主生物。当在构建中使用的三种多肽链的不相等比例获得最佳产量时,提供了调节实施方案中三种多肽片段相互比例的较大灵活性。然而,当比例相等的至少两种多肽链的表达导致高产量时,或当比例不是特别显著时,能在一个表达载体中插入两种或全部三种多肽链的编码序列。
在该方法的一个优选实施方案中,双特异性抗体含有在一条臂上具有第一种结合特异性的杂合免疫球蛋白重链,和在另一条臂上的杂合免疫球蛋白重链轻链对(具有第二种结合特异性)。发现这种不对称的结构有利于从不必要的免疫球蛋白链组合中分离希望的双特异性化合物,因为只有一半双特异性抗体中存在免疫球蛋白轻链提供了一种简单的分离方法。该方法在WO 94/04690中公开。关于生产双特异性抗体的进一步的细节,参见,例如,Suresh等人,Methods inEnzymology,121:210(1986)。
按照美国专利号5,731,168所述的另一种方法,能改造一对抗体分子之间的界面,使得从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分数最大。优选的界面包含抗体恒定域的CH3域的至少一部分。在该方法中,来自第一种抗体分子的界面的一条或多条小氨基酸侧链被替换为较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)。通过将较大的氨基酸侧链替换为较小的侧链(例如丙氨酸或苏氨酸),在第二种抗体分子的界面上产生与较大侧链相同或相似大小的补偿“腔”。这提供了提高异二聚体产量,高于其它不必要的终产物(如同型二聚体)的一种机制。
双特异性抗体包括交联的或“异偶联”抗体。例如,异偶联物中的一种抗体能与亲合素偶联,另一种与生物素偶联。例如,这些抗体已经打算用于将免疫系统细胞导向不希望的细胞(美国专利号4,676,980),并用于HIV感染的治疗(WO 91/00360,WO 92/200373和EP 03089)。异偶联抗体可以利用任何适宜的交联法制备。合适的交联剂在本领域众所周知,在美国专利号4,676,980中公开,还有许多交联技术。
由抗体片段生产双特异性抗体的技术已经在文献中描述。例如,双特异性抗体可以利用化学连接制备。Brennan等人,Science,229:81(1985)描述了一种方法,其中蛋白水解切割完整的抗体,产生F(ab’)2片段。这些片段在双硫醇复合剂亚砷酸钠存在下还原,稳定邻近的双硫醇并防止分子间二硫并阻止分子间二硫化物形成。然后将产生的Fab’片段转化为硫代硝基苯甲酸(TNB)衍生物。然后通过巯乙胺还原将Fab’-TNB衍生物之一恢复为Fab’-硫醇,并与等摩尔量的另一种Fab’-TNB衍生物混合,形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体能用作酶的选择性固定的试剂。
最新进展有利于从大肠杆菌中直接回收Fab’-SH片段,它们能够化学偶联,形成双特异性抗体。Shalaby等人,J.Exp.Med.175:217-225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体F(ab’)2分子的产生。每条Fab’片段由大肠杆菌分别分泌,在体外直接化学偶联,形成双特异性抗体。这样形成的双特异性抗体能够结合过量表达ErbB2受体的细胞和正常人类T细胞,并触发人类细胞毒性淋巴细胞对人类乳癌靶标的裂解活性。
也描述了直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如,曾经利用亮氨酸拉链生产了双特异性抗体。Kostelny等人,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab’部分连接。抗体同型二聚体在铰链区处还原,形成单体,然后再次氧化,形成抗体异二聚体。该方法也能用于生产抗体同型二聚体。Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)描述的“叠抗”技术提供了一种生产双特异性抗体片段的备选机制。这些片段含有通过接头与轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH),该接头因太短而不能使同一条链上的两个域配对。
因此,使一条片段的VH和VL域与另一条片段的互补VL和VH域配对,从而形成两个抗原结合部位。也曾经报道了利用单链Fv(sFv)二聚体生产双特异性抗体的另一个策略。参见,Gruber等人,J.Immunol.152:5368(1994)。预期两价以上的抗体。例如,能制备三特异性抗体。Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)。
III.拮抗剂的偶联和其它修饰
此处所述方法中使用的或产品中所含的拮抗剂任选地与一种细胞毒性剂偶联。可用于生产这种拮抗剂-细胞毒性剂偶联物的化疗剂在上文中已经描述。
在此也涉及拮抗剂与一种或多种小分子毒素(如加利车霉素、美登素(美国专利号5,208,020)、trichothene和CC1065)的偶联物。在本发明的一个实施方案中,拮抗剂与一个或多个美登素分子偶联(例如,每个拮抗剂分子约1-10个美登素分子)。例如,美登素可以转化为May-SS-Me,它可还原为May-SH3,并与修饰的拮抗剂反应(Chari等人,Cancer Research 52:127-131(1992)),产生类美登素-拮抗剂偶联物。
此外,拮抗剂也可与一个或多个加利车霉素分子偶联。抗生素加利车霉素家族能在亚皮摩尔浓度引起双链DNA断裂。可以使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于:yJ1、a21、a31、N-乙酰-yl’、PSAG和011(Hinman等人,Cancer Research 53:3336-3342(1993)和Lode等人,Cancer Research 58:2925-2928(1993))。
能够使用的酶活性毒素及其片段包括:白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、非洲蒴莲毒蛋白(modeccin)A链、α-八叠球菌、leuritesfordii蛋白、dianthin蛋白、美洲商陆(phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒素、巴豆毒素、sapaonaria officinalis抑制剂、gelonin、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯(tricothecene)。参见,例如,1993年10月28日公开的WO 93/21232。
本发明进一步涉及与具有核裂解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶,如脱氧核糖核酸酶;DNase)偶联的拮抗剂。多种放射性同位素可用于生产放射偶联的拮抗剂。实例包括At211、I125、Re188、In111、Tc99m、Pb212、Y90、Re186、Sm153、Cu67、I131、P52、Bi212和Lu的放射性同位素。拮抗剂与细胞毒性剂的偶联物可以用多种双功能蛋白质偶联剂制备,如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶双硫醇)-丙酸盐(SPDP)、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己胺-1-羧酸、亚氨基thiolane(IT)、亚氨酯的双功能衍生物(如二甲基乙二酰亚胺HCL)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺)、醛类(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对-叠氮苯甲酰)己二胺)、双重氮衍生物(如双(重氮苯甲酰)-乙二胺)、二异氰酸酯(如亚苄基-2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如,蓖麻毒素免疫毒素能如Vitetta等人,Science 238:1098(1987)所述制备。碳-14-标记的1-异硫氰酰苄基-3-甲基二乙烯三胺基戊乙酸(MX-DTPA)是用于结合放射性核苷酸与拮抗剂的一种典型螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是便于从细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如,可以使用酸不稳定的接头、肽酶敏感的接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等人,Cancer Research 52:127-131(1992))。此外,含有拮抗剂和细胞毒性剂的融合蛋白也可以通过例如重组技术或肽合成法制备。
在另一个实施方案中,拮抗剂可以与一种“受体”(如链霉亲和素)偶联,用于肿瘤预导向,其中对患者施用拮抗剂-受体偶联物,随后利用螯合剂从循环中除去未结合的偶联物,然后施用与细胞毒性剂(如放射性核苷酸)偶联的“配体”(如亲和素)。本发明的拮抗剂也可以与一种能将前体药物(如肽酰化疗剂,参见WO81/01145)转化为活性抗癌药物的前体药物-激活的酶偶联。参见,例如,WO 88/07378和美国专利号4,975,278。
这些偶联物的酶组分包括能作用于前体药物使其转化为更具活性的细胞毒性形式的任何酶。本发明的方法中有用的酶包括但不限于:可用于将含磷酸前体药物转化为游离药物的碱性磷酸酶;可用于将含硫酸盐前体药物转化为游离药物的芳基硫酸酯酶;可用于将无毒5-氟胞嘧啶转化为抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨基酶;可用于将含肽前体药物转化为游离药物的蛋白酶,如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L);可用于转化含D-氨基酸取代基的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶;可用于将糖基化前体药物转化为游离药物的碳水化合物裂解酶,如li-半乳糖苷酶和神经氨酸酶;可用于将β-内酰胺衍生的药物转化为游离药物的β-内酰胺酶;可用于将胺氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍化的药物转化为游离药物的青霉素酰胺酶,如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。此外,具有酶活性的抗体在本领域中也被称作“抗体酶”,能用来将本发明的前体药物转化为游离活性药物(参见,例如,Massey,Nature 328:457-458(1987))。拮抗剂-抗体酶偶联物能如此处所述制备,用于对肿瘤细胞群输送抗体酶。
能利用本领域众所周知的技术,如使用上述异双功能交联剂,将本发明的酶与拮抗剂共价结合。此外,也能用本领域众所周知的重组DNA技术构建融合蛋白,其至少含有本发明的拮抗剂的抗原结合区,至少与本发明的酶的功能活性部分连接[参见,例如,Neuberger等人,Nature,312:604-608(1984)]。
此处也涉及拮抗剂的其它修饰。例如,拮抗剂可以与多种非蛋白质聚合物之一连接,例如:聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物。此处公开的拮抗剂也可以配制为脂质体。含有拮抗剂的脂质体通过本领域周知的方法制备,如Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688(1985);Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4030(1980);美国专利号4,485,045和4,544,545;和1997年10月23日公布的WO 97/38731所述。美国专利号5,013,556中公开了循环时间延长的脂质体。
特别有用的脂质体能用反相蒸发法产生,其中使用含有磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)脂类组合物。脂质体通过规定孔径的滤器喷出,产生具有希望的直径的脂质体。本发明的抗体的Fab’片段能通过二硫化物交换反应与如Martin等人,J.Biol.Chem.257:286-288(1982)所述的脂质体偶联。脂质体中任选地含有化疗剂。参见Gabizon等人,J.National Cancer Inst.81(19):1484(1989)。涉及此处所述的蛋白质或肽拮抗剂的氨基酸序列修饰。例如,希望改善拮抗剂的结合亲和力和/或其它生物学性质。
通过向拮抗剂核酸中引入适当核苷酸改变,或通过肽合成,制备拮抗剂的氨基酸序列变体。这些修饰包括,例如:拮抗剂氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或置换。进行缺失、插入和置换的任一组合,以获得最终构建体,只要最终构建体具有希望的特性。氨基酸改变也可改变拮抗剂的翻译后加工,如改变糖基化位点的数量或位置。
一种方法可用于鉴定拮抗剂中是优选诱变位置的某些残基或区域,称作“丙氨酸扫描诱变法”,如Cunningham和Wells,Science,244:1081-1085(1989)所述。在此确定了一个残基或一组靶残基(例如,带电残基,如arg、asp、his、lys和glu),并替换为中性或带负电的氨基酸(最优选的是丙氨酸或聚丙氨酸),以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在置换位点引入其它变异,精确确定证实对置换功能敏感的氨基酸位置。因此,预先确定用于引入氨基酸序列变异的位点,而不需预先确定突变本身的性质。例如,为了分析特定位点突变的表现,在靶密码子或区域处进行丙氨酸扫描或随机诱变,并根据希望的活性筛选表达的拮抗剂变体。
氨基酸序列插入包括氨基端和/或羧基端融合,其长度从一个残基到含有一百个或以上残基的多肽,以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括含有一个N端甲硫氨酰残基的拮抗剂,或与细胞毒性多肽融合的拮抗剂。拮抗剂分子的其它插入变体包括与酶拮抗剂N端或C端的融合体,或延长拮抗剂血清半衰期的多肽。
另一种变体是氨基酸置换变体。这些变体在拮抗剂分子中至少一个氨基酸残基被替换为不同的残基。最适于抗体拮抗剂置换诱变的位点包括超变区,但是也包括FR改变。
表1在“优选置换”标题下列出了保守置换。如果这些置换导致生物活性改变,可引入更大改变,在表1中被命名为“代表性置换”,或者如以下关于氨基酸类别所进一步描述,并且筛选产物。
表1
原始残基 | 代表性置换 | 优选置换 |
Ala(A) | val;leu;ile | val |
Arg(R) | lys;gin;asn | lys |
Asn(N) | gin;his;asp,lys;arg | gln |
Asp(D) | glu;asn | glu |
Cys(C) | ser;ala | ser |
Gin(Q) | asn;glu | asn |
Glu(E) | asp;gin | asp |
Gly(G) | ala | ala |
His(H) | asn;gin;lys;arg | arg |
Ile(I) | leu;val;met;ala;phe;正亮氨酸 | ICU |
Lea(L) | 正亮氨酸;ile;val;met;ala;phe | ile |
Lys(K) | arg;gln;asn | arg |
Met(M) | leu;phe;ile | leu |
Phe(F) | leu;val;ile;ala;tyr | tyr |
Pro(P) | ala | ala |
Ser(S) | thr | thr |
Thr(T) | ser | ser |
TIP(W) | tyr;phe | tyr |
Tyr(Y) | trp;phe;thr;ser | phe |
Val(V) | ile;leu;met;phe;ala;正亮氨酸 | ICU |
拮抗剂生物学性质的本质改变通过选择置换实现,这些置换在下列方面显著不同:影响保持(a)置换区域中多肽主链的结构,如片层或螺旋构象,(b)靶部位处分子的电荷或疏水性,或(c)侧链的大小。自然存在的残基根据共同的侧链性质分为以下几类:
(1)疏水:正亮氨酸,met,ala,val,leu,ile;
(2)中性亲水:cys,ser,thr;
(3)酸性:asp,glu;
(4)碱性:asn,gln,his,lys,arg;
(5)影响链方向的残基:gly,pro;和
(6)芳族:trp,tyr,phe。
非保守性置换需要将这些类别之一的成员换为另一类别。
不参与保持拮抗剂正确构象的任何半胱氨酸残基一般也可以置换为丝氨酸,以提高分子的氧化稳定性并防止异常交联。反之,也可以向拮抗剂中加入半胱氨酸键,以提高其稳定性(特别是在拮抗剂是抗体片段如Fv片段时)。
一种特别优选的置换变体包括置换亲本抗体的一个或多个超变区残基。为进一步发展选择的变体一般具有比亲本抗体改进的生物学性质。生产这些置换变体的一种适宜方法是利用噬菌体展示的亲和成熟法。简言之,突变几个超变区位点(例如6-7个位点),产生每个位点的所有可能的氨基置换。这样产生的抗体变体由丝状噬菌体颗粒以单价方式展示,作为与包装于每个颗粒中的M13的基因III产物的融合体。然后根据此处公开的生物活性(例如结合亲和力)筛选噬菌体展示的变体。为了确定用于修饰的候选超变区位点,能进行丙氨酸扫描诱变,以确定明显有助于抗原结合的超变区残基。此外,为了确定抗体与抗原之间的接触点,分析抗原-抗体复合物的晶体结构也是有利的。这些接触残基和邻近残基是按照此处详述的技术置换的候选残基。产生这些变体后,如此处所述筛选全部变体,可以选择在一次或多次相关试验中具有优越性质的抗体进一步发展。
拮抗剂的另一种氨基酸变体改变了拮抗剂的原始糖基化模型。改变是指删除拮抗剂中的一个或多个碳水化合物部分,和/或添加一个或多个拮抗剂中没有的糖基化位点。
多肽的糖基化一般是N-连接的或O-连接的。N-连接的是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸之外的任一氨基酸)是碳水化合物部分酶促连接天冬酰胺侧链的识别序列。因此,多肽中存在这些三肽序列中的任一种产生可能的糖基化位点。O-连接的糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸)连接,尽管也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。方便地通过改变氨基酸序列使其含有一种或多种上述三肽序列向拮抗剂中添加糖基化位点(用于N-连接的糖基化位点)。也可以通过向原始拮抗剂序列中添加或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基进行这种改变(用于O-连接的糖基化位点)。
编码拮抗剂的氨基酸序列变体的核酸分子用本领域周知的多种方法制备。这些方法包括但不限于:从天然来源分离(对于天然存在的氨基酸序列变体),或通过寡核苷酸介导(或定点)诱变、PCR诱变和盒诱变以前制备的拮抗剂变体或非变体形式。
希望在效应物功能方面修饰本发明的拮抗剂,例如,提高拮抗剂的抗原依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体拮抗剂的Fc区中引入一个或多个氨基酸置换实现。此外,也可以在Fc区中导入半胱氨酸残基,从而在该区中形成链间二硫键。这样产生的同型二聚抗体可能具有提高的内化能力和/或增强的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人,J.Exp.Med.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.J.Immunol.148:2918-2922(1992)。抗肿瘤活性提高的同型二聚抗体也可以应用如Wolff等人,Cancer Research 53:2560-2565(1993)所述的异双功能交联剂制备。此外,也能构建含有双Fc区从而具有增强的补体裂解和ADCC能力的抗体。参见Stevenson等人,Anti-Cancer DrugDesign 3:219-230(1989)。
为了提高拮抗剂的血清半衰期,可以向拮抗剂(特别是抗体片段)中加入补救受体结合表位,如美国专利5,739,277所述。在此使用时,术语“补救受体结合表位”是指负责延长IgG分子体内血清半衰期的IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc区的表位。
IV.药用制剂
通过将具有希望的纯度的拮抗剂与任选地药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(《Remington制药学》第16版,Osol,A.编写(1980)),制备按照本发明使用的拮抗剂的治疗制剂以备贮存,形式为冻干制剂或水溶液。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度时对受体无毒,包括:缓冲液,如磷酸、柠檬酸或其他有机酸缓冲液;抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(如二甲苯十八烷酯氯化铵;氯化己烷双胺;氯化苯甲烃铵、苯索氯铵;苯酚、丁基或苄基乙醇;烷基对羟基苯甲酸酯,如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯;儿茶酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;和m-甲酚;低分子量(少于10个残基)多肽;蛋白质,如血清白蛋白,明胶或免疫球蛋白;亲水聚合物,如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、双糖或其它碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,如EDTA;糖,如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成盐反离子,如钠;金属络合物(如锌-蛋白质络合物);和/或非离子表面活性剂,如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
WO98/56418描述了代表性抗-CD20抗体制剂,在此引用作为参考。该公开文本描述了一种液体多剂量制剂,其含有40mg/ml瑞图希单抗、25mM乙酸盐、150mM海藻糖、0.9%苯甲醇、0.02%聚山梨酸酯20,pH5.0,在2-8℃下最短贮存期限为2年。另一种目的抗-CD20制剂在9.0mg/ml氯化钠、7.35mg/ml二水合柠檬酸钠、0.7mg/ml聚山梨酸酯80和无菌注射用水中含有10mg/ml瑞图希单抗,pH6.5。WO97/04801描述了适于皮下施用的冻干制剂。这些冻干制剂可以用合适的稀释剂重建为高蛋白质浓度,重建的制剂可以对此处治疗的哺乳动物皮下施用。
此处所述制剂也可含有一种以上的活性化合物,它们是所治疗的特定适应证所需的,优选地具有不会彼此不利影响的补充活性。例如,希望进一步提供一种细胞毒性剂、化疗剂、细胞因子或免疫抑制剂(例如作用于T细胞的,如环孢菌素或结合T细胞的抗体,例如结合LFA-1的抗体)。这种试剂的有效量取决于制剂中所含的拮抗剂的量,所治疗的疾病类型,和上述其它因素。它们一般以上文使用的施用途径以相同剂量使用,或者约为现在使用剂量的1-99%。
活性成分也可以包封于通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中,例如,分别是羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基异丁烯酸)微胶囊,在胶体药物输送系统(例如脂质体、白蛋白小球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或大乳剂中。Osol,A.编写的《Remington制药学》第16版(1980)中公开了这些技术。
也可以制备缓释制剂。缓释制剂的适当实例包括含有拮抗剂的固体疏水聚合物的半透性基质,该基质为成形形式,例如薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-异丁烯酸)),或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙烯基乙酸、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物,如LUPRON DEPOTTM(由乳酸乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射小球体)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
将用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可通过无菌滤膜过滤实现。
V.施用抗-B细胞抗体的方法和组合物
A.施用抗-B细胞抗体的方法
用于治疗CNS淋巴瘤中的施用抗-B细胞抗体的方法可以是静脉内(iv)、口服或腹膜内施用。然而,为治疗中枢神经系统淋巴瘤或相关疾病,施用抗-B细胞抗体(例如抗-CD20抗体)或其免疫原性片段的优选方法可以是鞘内施用。鞘内施用优选地通过Ommaya容器施用,但也能通过腰部穿刺或心室内施用。抗-B细胞抗体能通过相同途径与另一种药物联合施用;第二种药剂也能通过不同的途径施用。另外,预期的抗-B细胞抗体也可以在颅脑照射之前或之后施用。
此外,也能够破坏血脑屏障(BBB),随后动脉内施用药物。抗-B细胞抗体,如可结合B细胞的抗-CD20抗体,或可抑制B细胞的抗-CD40L抗体,能单独或与其它药剂(例如,抗-CD40抗体、其它抗-B细胞抗体、氨甲喋呤、环磷酰胺、甲基苄肼和地塞米松)联合动脉内施用。破坏BBB的方法包括Kroll等人,Neurosurgery 42:1083-99(1998)和Dahlborg等人,Cancer J.Sci.Am.2:166(1996)所述的方法。
如上所述,抗-B细胞抗体,例如抗-CD20抗体,如瑞图希单抗,或其治疗有效的片段(例如Fab、Fab’ 或F(ab’)2),可单独或与另外一种或多种活性剂联合施用。另外的活性剂包括其它化疗剂,如甲酰四氢叶酸、CHOP、氨甲喋呤、阿糖胞苷、硫替哌或长春新碱,如前所述。抗-B细胞抗体或其治疗有效片段也能与抑制CD40与其配体CD40L相互作用的试剂联合施用。CD40/CD40L抑制剂包括抗-CD40抗体或其片段、抗-CD40L抗体或其片段和CD40或CD40L的拟肽。特别是,抗-CD20抗体也能与其它抗-B细胞抗体(如抗-CD19、抗-CD22、抗-CD38和抗-MHC II抗体)联合施用。而且,抗-CD20抗体能单独施用,与其它抗体联合或与其它治疗形式(例如化学治疗和放射治疗)联合施用,以及其组合。
这些活性剂(例如抗-CD20抗体,如瑞图希单抗)能够在药学有效的载体中。载体包括亲脂性载体(例如甲基苄肼)或免疫亲脂性载体,如Huwyler等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 93:14164-14169(1996)和美国专利号5,716,614所述。此外,活性剂也能与导向脑上皮上的受体(如转铁蛋白受体)的载体连接(参见Wu等人,Drug.Metabol.Dispos.26:937-9(1998))。
VI.抗-CD20抗体与其它药剂或治疗形式的联合应用
A.抗-B细胞抗体与照射联合
已经证明,在治疗PCNSL时单独照射不如与其它形式(如化学治疗)联合应用有效。本发明的一方面涉及单独应用抗-CD20抗体或与其它药剂(如CHOP)及脑部照射联合治疗脑淋巴瘤患者。抗体能在脑部照射之前、之后或同时在之前和之后施用。例如,能对患者施以全脑放射治疗(WBRT),随后用阿糖胞苷和单独用抗-CD20抗体或与其它抗-B细胞抗体联合高剂量治疗。优选地对患者施以4000-5000cGy。此外,如DeAngelis等人所述,能对患者脑部施以4000cGy放射治疗,并对有关区域以2000cGy加强。如果患者累及眼睛,则可对眼睛施以3600cGy。
能首先施以照射,然后单独用抗-CD20抗体或与其它抗-B细胞抗体联合治疗。照射后施用抗-CD20抗体能与甲基苄肼、洛莫司汀和长春新碱(PCV)联合。PCV的施用能如Chamberlain等人,J.Neuro.Oncol.14:271-275(1992)所述进行。此外,抗体也能与环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松(CHOP)或环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和地塞米松(CHOD)联合。能在全脑放射治疗之前施以这些抗体和化学治疗组合。在颅脑照射之前,本发明的抗-CD20抗体也能与氨甲喋呤(400mg/M2)、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、强的松和博来霉素(MACOP-B)联合。MACOP-B、CHOP和CHOD的施用能如DeAngelis等人,1997和此处引用的参考文献所述进行。
此外,抗-CD20抗体本身也可以与医学上有用的同位素连接。这些放射性核素在下文中进一步详述。
B.抗-CD20抗体与化学治疗联合
本发明的另一个实施方案是应用抗-B细胞抗体(例如抗-CD20抗体)或其治疗有效片段与化疗剂联合而不与放射治疗联合治疗脑淋巴瘤。
一个实例是施用抗-CD20抗体与高剂量的氨甲喋呤。也能联合施用其它试剂。例如,本发明的抗-CD20抗体能与高剂量的氨甲喋呤(2.5mg/M2)、甲基苄肼和长春新碱一起施用,氨甲喋呤、甲基苄肼和长春新碱如Freilich等人,Neurology 46:435-439(1996)所述施用。高剂量氨甲喋呤也能如Perez-Jaffe等人,Diagn.Cytopathol.20:219-223(1999)所述施用。此外,抗-CD20抗体也能与高剂量阿糖胞苷(3g/M2)一起施用。高剂量阿糖胞苷的施用能如Strauchen等人,Cancer 63:1918-21(1989)所述进行。本发明的另一个实施方案涉及抗-CD20抗体与化疗剂和/或与抗-CD40或抗-CD40L抗体和/或与其它抗-B细胞抗体的联合施用。
C.抗-B细胞抗体(如抗-CD20抗体)与提高血脑屏障通透性的试剂联合
因为血脑屏障能对向患者施用药物造成困难,在不希望鞘内施用的情况中,或者在优选的另一种抗-CD20抗体施用形式时,可以应用可提高血脑屏障(BBB)通透性的试剂或方法。可提高BBB通透性的试剂的一个实例是对脑毛细血管内皮细胞上存在的转铁蛋白受体有反应性的抗体。对转铁蛋白受体的至少一部分有反应性的单克隆抗体包括:OX-26、B3/25、Tf6/14、OKT-9、L5.1、5E-9、RI7 217和T58/30。这些抗转铁蛋白受体抗体能如美国专利号5,182,107所述应用,在此引用作为参考。
本发明涉及的组合物也可含有亲脂性载体(例如甲基苄肼),用于向脑中的靶部位输送抗体。也涉及免疫脂质体(Huwyler等人,1996)。亲脂性分子优选地是Ω-3系列的脂肪酸或其脂衍生物。其它亲脂性分子有脂肪酸、甘油二酯、二酰磷脂、溶血磷脂、胆固醇和含有18-46个碳原子的多不饱和烃基的其它类固醇。
优选的生物聚合物载体是:聚(α)-氨基酸(例如PLL、聚L-精氨酸:PLA、聚L-鸟氨酸:PLO)、人血清白蛋白、氨基葡聚糖、酪蛋白等。这些载体优选地是可生物降解的、生物相容的,可能是药物输送系统的优良候选物。关于这些载体及其施用的进一步描述,参见美国专利号5,716,614,在此引用作为参考。
VII.抗-B细胞抗体(如抗-CD20抗体)与干扰CD40/CD40L相互作用的试剂的联合施用
本发明涉及的另一种方法是用B细胞抗体(优选地B细胞消耗性抗体,最优选地是消耗性抗-CD20抗体)与干扰CD40/CD40L相互作用的试剂(优选地抗-CD40或抗-CD40L抗体)联合治疗脑淋巴瘤。
根据本发明这一方面,对患者施用“CD40L拮抗剂”,以干扰CD40L与其结合配偶体CD40的相互作用,联合施用抗-B细胞抗体,如RITUXAN。“CD40L拮抗剂”定义为干扰这一相互作用的分子。CD40L拮抗剂可以是抗CD40L抗体(例如抗CD40L的单克隆抗体)、抗CD40L抗体的片段或衍生物(例如Fab或F(ab’)片段、嵌合抗体或人源化抗体)、CD40的可溶形式、含CD40的融合蛋白的可溶形式,或破坏或干扰CD40L-CD40相互作用的药剂。
为了制备抗-CD40L抗体,能用可在哺乳动物中引发抗体应答的CD40L蛋白或其蛋白质片段(例如肽片段)的免疫原形式免疫哺乳动物(例如小鼠、仓鼠、兔或有蹄类动物)。在其表面表达CD40L的细胞也能用作免疫原。其它免疫原包括纯化的CD40L蛋白或蛋白质片段。CD40L能用标准纯化技术从表达CD40L的细胞中纯化(Armitage等人,Nature 357:80-82(1992);Lederman等人,J.Exp.Med.175:1091-1101(1992);Hollenbaugh等人,EMBO J.11:4313-4321(1992))。此外,也能如Armitage等人(1992)所公开的,根据CD40L的氨基酸序列制备CD40L肽。赋予蛋白质免疫原性的技术包括与载体偶联或本领域周知的其它技术。例如,能在佐剂存在下施用蛋白质。能通过检测血浆或血清中的抗体滴度监视免疫过程。标准ELISA或其它免疫测定能使用免疫原作为抗原,评价抗体水平。免疫后,能获得抗血清,并分离多克隆抗体。为了生产单克隆抗体,收获抗体生产细胞,并利用标准体细胞融合方法与骨髓瘤细胞融合,如美国专利号5,833,987(1998)和5,747,037(1997)所述。抗-CD20抗体和抗-CD40抗体能用类似的方法制备。文献中已经报道了几种抗-CD40L抗体、抗-CD40抗体和抗-CD20抗体,它们可以公开获得。
抗体可以是片段,筛选的些片段与以上对完整抗体所述相同的方法应用。例如,能用胃蛋白酶处理抗体产生F(ab’)2片段。能够处理得到的F(ab’)2片段,还原二硫键产生Fab’片段。预期的其它抗体片段包括Fab和scFv。
对人类治疗应用时,使非人类抗体的识别最小化而不是普遍免疫抑制的一种方法是,产生嵌合抗体衍生物,即组合了非人类动物可变区和人类恒定区的抗体分子。嵌合抗体分子可包含,例如,来自小鼠、大鼠或其它种的抗体的抗原结合域,及人类恒定区。制备嵌合抗体的方法包括美国专利号5,833,987(1998)所述的方法。
为了人类治疗目的,通过产生人类可变区嵌合体能进一步使对CD40L蛋白或肽有特异反应性的抗体人源化,其中可变区部分,特别是抗原结合域的保守构架区,是人类来源的,只有超变区是非人类来源的。这些改变的免疫球蛋白分子可以通过本领域周知的几种方法之一制备(例如,Teng等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 80:7308-7312(1983);Kozbor等人,Immunology Today 4:7279(1983);Olsson等人,Meth.Enzymol.92:3-16(1982)),优选地按照PCT申请WO92/06193或EP0239400所述制备。人源化抗体可由例如Scotgen Limited(2Holly Road,Twickenham,Middlesex,英国)商业生产。
生产对CD40L蛋白或肽有反应性的特异性抗体或抗体片段的另一种方法是用CD40L蛋白或肽筛查在细菌中表达的编码免疫球蛋白基因或其片段的表达文库。例如,完整Fab片段、VH区和Fv区能用噬菌体表达文库在细菌中表达。参见,例如,Ward等人,Nature341:544-546(1989);Huse等人,Science 246:1275-1281(1989);McCafferty等人,Nature 348:552-554(1990)。例如,用CD40L肽筛查这些文库能鉴定CD40L反应性的免疫球蛋白片段。此外,SCID-hu小鼠(可从Genpharm获得)也能用来生产抗体或其片段。
标题为“抗-gp39抗体及其应用”的PCT专利申请号WO 95/06666描述了生产抗CD40L(包括人CD40L和小鼠CD40L)单克隆抗体(mAb)的方法和适用于本发明的方法的单克隆抗体,其内容在此引用作为参考。本发明特别优选的抗人CD40L抗体是MAb 24-31和89-76,分别由杂交瘤24-31和89-76产生。(这些抗体如美国专利号5,747,037所述克隆)。分别产生89-76和24-31抗体的89-76和24-31杂交瘤按照布达佩斯条约条款于1994年9月2日保藏于美国模式培养物保藏中心,10801 University Blvd.,Manassas,VA 20110-2209。89-76杂交瘤分配ATCC保藏号HB11713,24-31杂交瘤分配ATCC保藏号HB11712。
重组抗-CD40L抗体,如嵌合和人源化抗体,能根据标准重组DNA技术通过操作编码抗-CD40L抗体的核酸(例如DNA或cDNA)生产。因此,本发明的另一方面涉及编码免疫球蛋白重链或轻链的分离的核酸分子,或其部分,它们对CD40L特别是人CD40L有反应性。编码免疫球蛋白的核酸能编码免疫球蛋白轻链(VL)或重链(VH)可变区,含有或不含连接的重链或轻链恒定区(或其部分)。这些核酸能通过标准技术从产生抗-人CD40L mAb的细胞(例如杂交瘤)中分离。例如,编码24-31或89-76mAb的核酸能通过cDNA文库筛查、PCR扩增或其它标准技术分别从24-31或89-76杂交瘤中分离。而且,编码抗-人CD40L mAb的核酸能掺入表达载体中,并导入合适的宿主细胞,以利于重组抗-人CD40L抗体的表达和产生。
为了制备抗-CD20、抗-CD40L或抗-CD40抗体,能使用上述方法。
除了可识别并结合CD40L并抑制CD40与CD40L相互作用的抗体之外,还涉及其它CD40L拮抗剂,单独或与其它治疗(例如放射治疗或化学治疗)联合用于治疗B细胞淋巴瘤和白血病。CD40L拮抗剂可以是CD40L配体的可溶形式。CD40L的单价可溶性配体,如可溶性CD40,能结合CD40L,从而抑制CD40L与表达的B细胞上的CD40的相互作用。术语“可溶性”是指配体不与细胞膜永久结合。可溶性CD40L配体能通过化学合成或优选地通过重组DNA技术制备,例如只表达配体的胞外域(缺乏跨膜和胞质域)。一种优选的可溶性CD40L配体是可溶性CD40。此外,可溶性CD40L配体也可以是融合蛋白的形式。这种融合蛋白含有与第二种分子连接的CD40L配体的至少一部分。例如,CD40能表达为含免疫球蛋白的融合蛋白(即CD40Ig融合蛋白)。在一个实施方案中,生产一种融合蛋白,其含有CD40分子胞外域部分的氨基酸残基,与对应于免疫球蛋白重链(例如Cα1)铰链、CH2和CH3区的序列的氨基酸残基连接,形成CD40Ig融合蛋白(参见,例如,Linsley等人,J.Exp.Med.1783:721-730(1991);Capon等人,Nature 337:525-531(1989);美国专利号5,116,964(1992))。这些融合蛋白能通过化学合成或优选地根据CD40的cDNA通过重组DNA技术生产(Stamenkovic等人,EMBO J.8:1403-1410(1989))。
以适于体内给药的生物相容形式对患者施用CD40L或CD40拮抗剂。“适于体内施用的生物相容形式”是指将要施用的拮抗剂形式,其中蛋白质的治疗效果超过毒性作用。术语“患者”包括能引发免疫应答的活生物,例如哺乳动物。优选的患者的例子包括:人、狗、猫、马、母牛、猪、山羊、绵羊、小鼠、大鼠及其转基因种。CD40L或CD40拮抗剂能以任何药理学形式施用,任选地在药学可接受的载体中。治疗有效量的CD40L或CD40拮抗剂的施用定义为有效的量,即获得希望的结果(例如抑制所治疗的脑淋巴瘤的进展或增殖)所需的剂量和时间。例如,CD40L拮抗剂的治疗有效量可根据因素不同而不同,如患者的疾病分期(例如I期与IV期)、年龄、性别、医学并发症(例如AIDS)和体重,和拮抗剂在患者中引发希望的反应的能力。可以调整剂量方案,以产生最佳治疗反应。例如,可以每天施用几份分开的剂量,或者可以按照治疗情况急需按比例减少剂量。活性化合物(如抗-CD40抗体)自身或与其它活性剂组合,可以以方便的方式施用,例如注射(皮下、肌内、鞘内、心室内、静脉内等)、口服、吸入、穿皮或直肠施用。根据施用途径,活性化合物可以包被于物质中,以保护化合物免遭酶、酸或可灭活该化合物的其它自然条件的作用。一种优选的施用途径是静脉内(i.v.)注射。
为了通过肠胃外施用之外的方式施用CD40L拮抗剂或CD40拮抗剂,可能必须用防止其灭活的物质包被该拮抗剂,或与之同时施用。例如,拮抗剂能在合适的载体或稀释剂中对个体施用,与酶抑制剂同时施用,或在合适的载体如脂质体中。药学可接受的稀释剂包括盐水和水缓冲液。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸(DEP)和抑肽酶。脂质体包括油包水、水包油型乳剂,以及常规脂质体(Strejan等人,J.Neuroimmunol.7:27(1984))。其它药学可接受的载体和赋形剂在本领域中周知。
活性化合物也可以肠胃外或腹膜内施用。也能在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中进行分散。在普通贮存和使用条件下,这些制品可含有防腐剂,以防止微生物的生长。
适于注射的药用组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或分散液和用于随时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下,组合物必须是无菌的,并且必须具有易于注射的流动性。它在生产和贮存条件下必须稳定,必须能防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的分散基质及其合适的混合物。例如,使用包被如卵磷脂,在分散时保持需要的颗粒大小,使用表面活性剂,都能保持适当的流动性。使用多种抗细菌剂和抗真菌剂能防止微生物的作用,如paraben、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况中,组合物中优选地包含等渗剂,例如糖、多元醇,如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。使组合物中含有一种延迟吸收的试剂,如单硬脂酸铝和明胶,能实现注射组合物的延时吸收。
无菌注射溶液的制备方法是:在合适的溶剂中掺入需要量的活性化合物(例如CD40L或CD40的拮抗剂自身,或与其它活性剂或抗-CD20抗体和抗-B细胞抗体组合),需要时含有此处列举的一种成分或其组合,随后过滤除菌。分散液一般如下制备:向无菌载体中掺入活性化合物,该载体含有基本分散基质和需要的上述其它成分。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥,这由无菌过滤的溶液产生活性成分加其它任何希望的成分的粉末。
当活性化合物如上所述被适当保护时,蛋白质可以与例如惰性稀释剂或可食用、可吸收的载体一起口服。在此使用时,“药学可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散基质、包被、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这些基质和试剂在药学活性物中的用途在本领域众所周知。除了任一常规基质或试剂与活性化合物不相容的情况,它在治疗组合物中的应用是所希望的。上述使用CD40L或CD40拮抗剂的所有组合物也可含有附加的活性化合物(例如化疗剂)。而且,上述药用组合物也可用于制备含抗-CD20抗体的化合物。
VIII.利用放射免疫疗法对CNS的治疗
对于放射性标记用作治疗或诊断剂的活性抗体(例如抗-B细胞抗体等),有几种考虑。首先,必须选择放射性同位素,然后必须选择使放射性同位素与抗体结合的方法。对于放射性同位素的选择,考虑因素的综述见Magerstadt,《抗体偶联物与恶性疾病》,93-109(1991)。必须主要考虑希望的辐射范围(受肿瘤组织类型、是实体瘤还是播散性肿瘤、所有肿瘤细胞是否预期都是抗原阳性的等参数影响)、能量释放率、与输注时间相比同位素的半衰期和清除率、是成像还是治疗有助于标记抗体的施用等。对于根据本发明的诊断成像目的,认为用99Tc、111In、123I或131I标记是优选的,用111In或131I标记最优选的。对于根据本发明的治疗目的,认为用β-发射器如90Y或131I标记是优选的。值得为治疗或诊断应用考虑的医学上合适的其它同位素有:186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、211At、67Cu、212Pb和Lu的放射性同位素。
考虑连接放射性同位素与抗体的方法时,必须首先考虑同位素的性质。碘同位素能通过多种方法与抗体连接,它们使同位素直接与蛋白质共价连接。氯胺T标记(Greenwood等人,Biochem.J.89:114(1963))和iodogen标记(Fraker等人,Biochem.Biophys.Res.Comm.80:849-857(1978))是两种常用的放射性碘标记方法。对于金属同位素,例如90Y或186Re,同位素的连接方法一般是共价连接螯合部分与抗体,然后使螯合剂与金属配位。这些方法例如在Gansow等人,美国专利号4,831,175;4,454,106和4,472,509中描述,在此引用作为参考。应当指出,用碘同位素(例如131I)标记的抗体在向靶细胞内化后脱卤,而通过螯合标记的抗体经历放射诱导的螯合剂断裂,从而通过配位复合物解离丢失放射性同位素。在某些情况中,从复合物中解离的金属能再次复合,从而更快地清除非特异性定位的同位素,因此对非靶组织有极低的毒性。例如,螯合剂化合物如EDTA或DTPA能输入到患者体内,使螯合剂结合释放的放射性金属,并促使游离的放射性同位素从尿中排泄。也注意到,脱卤产生的游离碘和小的碘化蛋白质从体内快速清除。这有利于使正常组织(包括骨髓)免遭放射毒性作用。
Magerstadt(1991)也综述了施用方法。对于淋巴瘤的治疗,一方面考虑静脉内注射是一种良好方法,因为完全循环对于快速破坏标记抗体是有利的,特别是对于避免注射部位处放射性标记的局部高浓度。静脉内(iv)施用受限于“血管屏障”,包括血管的内皮细胞和也负责BBB的内皮下基质。本领域技术人员周知如何配制适用于上述任何注射途径的标记抗体组合物。
施用时间可能十分不同。能在一个大丸剂中提供全部剂量。此外,也能通过延长的输液法或通过长达数周的重复注射提供剂量。放射免疫治疗之间优选的间隔时间是6-12周。如果用低剂量进行放射免疫治疗,能以2周间隔施用药剂。如果部分输送总治疗剂量,能在2-4天时间内施用。由于输注的剂量较低,能以较短间隔施用示踪标记的剂量;对于临床应用,优选1-2周的间隔。
使用的放射剂量可能十分不同。对于免疫诊断成像,应用抗体的示踪标记,一般用约1-35mCi放射性同位素标记约1-20mg抗体。剂量在一定程度上依赖于用于成像的同位素;此范围的高限,优选地约20-30mCi,应当使用99mTc和123I;此范围的低限,优选地约1-10mCi,应当应用131I和111In。为了成像,对患者施用约1-30mg这种示踪标记的抗体。为了放射免疫治疗,抗体标记为高比活性。获得的比活性取决于使用的放射性同位素;对于131I,活性一般为1-10mCi/mg。对患者施用足量的抗体,使得接受的全身剂量可达1100cGy,但优选地低于或等于500cGy。抗体(包括标记的和未标记的抗体)的量约为0.2-40mg/kg患者体重。标记的抗-CD20抗体或抗-CD40抗体能用来诊断或确定PCNSL或其它脑淋巴瘤的位置。
向全身提供约500cGy的放射性强度估计约为825mCi的131I。再次使用的放射性强度部分取决于选择的同位素。对于使用131I的治疗方案,可使用约5-1500mCi,优选的是约5-800mCi,约5-250mCi是最优选的。对于90Y治疗,认为约1-200mCi的放射性是合适的,更优选的是约1-150mCi,约1-100mCi是最优选的。由使用的放射性强度估计组织剂量的优选方法是用示踪剂量进行成像或其它药物动力学方案,以获得预测剂量的估计值。
在诊断和治疗施用之一或两者之前能“预施用”未标记的抗体。发现预施用对成像和治疗的影响因患者而不同。一般优选使用预剂量逐渐提高的未标记抗体,进行一系列诊断成像施用。然后应用可产生最佳肿瘤剂量与全身剂量之比的预剂量,之后施以放射免疫治疗剂量。
Goldberg等人描述了使用抗癌胚抗原(CEA)抗体对实体瘤(癌)的放射免疫诊断成像和放射免疫治疗(J.Clin.Oncol.9:548(1991))。美国专利号4,348,376和4,460,559(在此引用作为参考)描述的材料与方法的许多方面也适用于本发明,它是针对大脑淋巴瘤的诊断和治疗。参考文献中提供了用于估计患者接受放射剂量的方法的其它描述(Siegel等人,Med.Phys.20:579-582(1993))。
IX.药用组合物
本发明的抗-B细胞抗体(例如抗-CD20、抗-CD22、抗-CD21、抗-CD40或抗-CD40L抗体或其片段)与可检测标记物或治疗剂的偶联或连接能使用共价或其它化学结合方法。化学结合法包括,例如戊二醛、异双功能和同双功能连接剂。异双功能连接剂包括,例如:SMPT(琥珀酰亚胺羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基dition)-tolume)、SPDP(N-琥珀酰亚胺-3-(2-亚吡啶基硫代)-丙酸和SMCC(琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸。同双功能连接剂包括,例如:DMP(二甲基pimelimidate)、DMA(二甲基suberinidate)和DTBP(二甲基3,3’-二硫-双丙亚胺)。
一些蛋白质可检测标记物和治疗剂能与本发明的单克隆抗体的可变区重组结合,构建作为融合蛋白的组合物,其中单克隆抗体的可变区保持其结合特异性,而可检测标记物或治疗剂保留其活性。构建这些融合蛋白的重组方法在本领域周知。
本发明包括含有单克隆抗体或重组结合蛋白(偶联或未偶联)的药用组合物。一种药用组合物可含有单克隆抗体和药学可接受的载体。对于本发明,“药学可接受的载体”可以是本领域众所周知的任何标准载体。例如,合适的载体包括磷酸缓冲液、乳剂如水包油乳剂和不同类型的湿润剂。其它载体包括无菌溶液、片剂、包衣片剂和胶囊。这些载体一般能含有赋形剂,如淀粉、牛奶、糖、粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或钙、滑石、植物脂或植物油、树胶、甘油或其它已知的赋形剂。这些载体也包括香味和颜色添加剂、防腐剂或其它成分。含有这些载体的组合物通过众所周知的常规方法配制。参见《Remington制药学》(第15版,1980)。
对于诊断用途,能标记或不标记抗体和重组结合蛋白。诊断测定一般需要检测细胞表面上单克隆抗体或重组结合蛋白与人CD20结合形成的复合物。当未标记时,抗体和重组结合蛋白可用于凝集试验。另外,未标记的抗体也能与对单克隆抗体或重组结合蛋白有特异反应性的其它标记抗体(第二抗体)(如免疫球蛋白特异的抗体)组合应用。此外,单克隆抗体和重组结合蛋白也可直接标记。能使用多种标记物,如放射性核素、(上述)荧光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、配体(特别是半抗原)等。多种类型的免疫测定在本领域众所周知。
荧光测定中常使用本发明的单克隆抗体和重组结合蛋白,其中抗体或重组结合蛋白与荧光分子如异硫氰酸荧光素(FITC)偶联。
下列实施例并非意在限制本发明,而是提供本发明的优选实施方案。
实施例
实施例1
非人类灵长类动物中的鞘内瑞图希单抗
由于脑膜复发是淋巴瘤患者的常见复发部位,使用瑞图希单抗可有益于预防或抑制脑膜复发的出现。
材料与方法。一种连续保持的非人类灵长类动物模型已经由NCI批准,它有一个与皮下Ommaya容器连接的慢性留置的Pudenz第4室导管。该导管允许在多个时间点对未麻醉的动物进行脑脊液(CSF)采样(参见,McCully等人,Lab.Animal Sci.40:520-525(1990))。
剂量可达10mg的瑞图希单抗以完全浓度(10mg/ml)施用,或在不含防腐剂的无菌盐水中稀释为可达1ml,。保存稀释药物溶液的样品用于以后分析瑞图希单抗浓度。
使用的动物是4只重约10kg的成年雄性恒河猴(Macacamulatta)。动物靠NIH公开配方压制的非人类灵长类动物饮食维持,每日喂养动物两次。1号动物(缺少CSF采集装置)通过临时腰导管腰内注射瑞图希单抗。如果1号动物耐受瑞图希单抗,另外3只动物通过皮下进入装置在侧脑室中接受瑞图希单抗剂量。从第4室Ommaya容器获得这些动物的样品,至少一只动物也从腰间隙获得。在每次CSF样品采集之前和之后向Ommaya容器泵气4次,以确保与脑室CSF充分混合。带有Ommaya容器的两只动物在腰内施用瑞图希单抗后也进行第4心室CSF采样,以估计药物从腰间隙向心室的分配。在完成药物动力学研究后,通过每周向三只动物腰内注射剂量6周以上估计鞘内瑞图希单抗的耐受。
在鞘内或心室内施用可达10mg后,用4只动物研究瑞图希单抗的CSF药物动力学。在施用之前和施用瑞图希单抗0.5、1、2、3、4、6、8、10、24小时后采集CSF样品(0.3ml)。这些样品立即在-70℃下冷冻,并冻存于聚丙烯管中。
实施例2
在大鼠模型原发性CNS淋巴瘤的治疗中,向脑脊液中施用瑞图希单抗
材料与方法。不荷肿瘤的裸鼠接受通过小脑延髓池穿刺术输送的剂量升高的抗体,估计其毒性。向大鼠施用5-100μl体积(大鼠的CSF体积约为1ml)的瑞图希单抗(10mg/ml)。假如没有毒性,则进行效能研究。将证明抗-CD20敏感的B淋巴瘤细胞植入大鼠的小脑延髓池中。然后将动物分为两组,每组10只:对照和肿瘤植入1周后的瑞图希单抗治疗组。终点是测量神经学性质,体重丧失、存活率和抗淋巴瘤活性的形态学和组织学相关性。
实施例3
人类PCNSL患者中瑞图希单抗的检测
材料与方法。通过向Ommaya容器中注射5-10ml瑞图希单抗给药。注射前,取出相等体积的CSF,使CSF体积的明显流出量最少(成人中的平均CSF体积为104ml)。不进行其它化学治疗或放射治疗。治疗包括向Ommaya容器中注射体积为5-10ml的瑞图希单抗。在1、2、4、24、48、72小时和7天时,并在之后以固定间隔测定瑞图希单抗的CSF和血清水平。
复发PCNSL患者在病理学分析中肯定为CD20+。患者必须为17岁以上,KPS小于50,预期寿命少于2个月,PCNSL累及全身,并且在开始CSF内施用瑞图希单抗不到5周之前不能接受放射或化学治疗。
研究患者分为三组,每组通过Ommaya容器接受一定剂量水平的瑞图希单抗。一周后,以取决于计算的灵长类动物中清除率的间隔向CSF中重复施用瑞图希单抗。瑞图希单抗施用继续90天,其间继续评价毒性和反应。提前终止归类为由CSF内施用瑞图希单抗引起的四级神经毒性。神经毒性是评价安全性和确定研究应当终止还是使用较低剂量的基础。假如在给定的剂量水平没有毒性,则将剂量提高到下一水平。目的在于确定安全剂量,对于人类,其达到的CSF中的瑞图希单抗低谷水平至少10倍于与活性相关的血清低谷水平(McLaughlin等人,J.Clin.Oncol.16:2825-2833(1998))。
实施例4
为了治疗PCNSL对人类患者施用瑞图希单抗与氨甲喋呤的方法
累及CNS的淋巴瘤患者能用鞘内氨甲喋呤(15mg)联合剂量为250mg/M2每周4次到350mg/M2每周4次的瑞图希单抗治疗。
实施例5
用放射性标记的瑞图希单抗和CHOP治疗PCNSL的方法
PCNSL患者能用放射性标记的瑞图希单抗和化学治疗组合CHOP(例如环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)如下治疗。CHOP治疗将按照标准方法静脉内施用。131-碘标记的瑞图希单抗以约1-10mCi的剂量对患者鞘内施用,(标记和未标记的)瑞图希单抗的量为约0.2-40mg/kg患者体重。放射性瑞图希单抗能在一个大丸剂中或在约2-4天时间内施用。
上述所有参考文献在此完整引用作为参考。
Claims (50)
1.治疗有效量的抗-CD20抗体或其片段用于制备治疗中枢神经系统(CNS)淋巴瘤的药物的用途。
2.治疗有效量的抗-CD20抗体或其片段用于制备治疗或预防淋巴瘤患者脑膜复发的药物的用途。
3.权利要求1的用途,其中CNS淋巴瘤选自:原发性CNS淋巴瘤(PCNSL)、软脑膜转移(LM)或累及CNS的何杰金氏病。
4.权利要求3的用途,其中CNS淋巴瘤是LM,且其中抗-CD20抗体或其片段与阿糖胞苷和硫替哌或氨甲喋呤和111In-二乙烯三胺戊乙酸联合施用。
5.权利要求1的用途,其中抗-CD20抗体片段选自Fab、Fab’和F(ab’)2。
6.权利要求2的用途,其中抗-CD20抗体片段选自Fab、Fab’和F(ab’)2。
7.权利要求1的用途,其中抗-CD20抗体是人类抗体、人源化、双特异性或嵌合抗体。
8.权利要求2的用途,其中抗-CD20抗体是人类抗体、人源化、双特异性或嵌合抗体。
9.权利要求1的用途,其中抗-CD20抗体是瑞图希单抗或IF5。
10.权利要求9的用途,其中瑞图希单抗经配制用于以每周约10-约375mg/M2共4周的剂量对患者施用。
11.权利要求9的用途,其中抗-CD20抗体是瑞图希单抗或IF5。
12.权利要求10的用途,其中瑞图希单抗经配制用于以每周约10-约375mg/M2共4周的剂量对患者施用。
13.权利要求1的用途,其中抗-CD20抗体经配制用于鞘内或心室内施用。
14.权利要求2的用途,其中抗-CD20抗体经配制用于鞘内或心室内施用。
15.权利要求1的用途,其中抗-CD20抗体适于与氨甲喋呤、CHOP、CHOD、阿糖胞苷、甲酰四氢叶酸、硫替哌和长春新碱或其组合联合施用。
16.权利要求2的用途,其中抗-CD20抗体适于与氨甲喋呤、CHOP、CHOD、阿糖胞苷、甲酰四氢叶酸、硫替哌和长春新碱或其组合联合施用。
17.权利要求1的用途,其中抗-CD20抗体适于在全脑照射前施用。
18.权利要求1的用途,其中抗-CD20抗体是瑞图希单抗,并适于与氨甲喋呤一起鞘内施用。
19.权利要求1的用途,其中抗-CD20抗体是瑞图希单抗,并且其中瑞图希单抗经标记。
20.权利要求19的用途,其中瑞图希单抗用选自211At、212Bi、67Cu、123I、131I、111In、32P、212Pb、186Re、188Re、153Sm、99mTc和90Y的同位素标记,且其中经标记的瑞图希单抗经配制用于以放射免疫治疗有效量施用。
21.权利要求20的用途,其中经标记的瑞图希单抗经配制用于以约10-约200cGy的量对患者全身施用。
22.治疗有效量的a)抗CD20抗体或其片段和b)抗CD40L抗体或抑制CD40与CD40L相互作用的试剂用于制备治疗CNS淋巴瘤的联合制剂的用途。
23.权利要求22的用途,其中抗CD20抗体经配制用于约0.001-约30mg/kg人体重的剂量范围施用。
24.权利要求23的用途,其中抗CD20抗体经配制用于以约0.01-约25mg/kg人体重的剂量范围施用。
25.权利要求24的用途,其中抗CD20抗体经配制用于以约0.4-约20.0mg/kg人体重的剂量范围施用。
26.标记的抗-CD20抗体或其片段用于制备诊断患者中原发CNS淋巴瘤(PCNSL)的药物的用途。
27.权利要求26的用途,其中标记是:211At、212Bi、67Cu、123I、131I、111In、32P、212Pb、186Re、188Re、153Sm、99mTc或90Y。
28.权利要求26的用途,其中抗-CD20抗体是瑞图希单抗。
29.权利要求1的用途,其中抗-CD20抗体与血脑屏障(BBB)通透性增强剂连接。
30.权利要求29的用途,其中BBB通透性增强剂是:OX-26、B3/25、Tf6/14、OKT-9、L5.1、5E-9、RI7217或T58/30。
31.权利要求1的用途,其中药物进一步含有亲脂性载体或免疫亲脂性载体。
32.权利要求31的用途,其中亲脂性载体是甲基苄肼、Ω-3脂肪酸、甘油二酯、二酰磷脂、溶血磷脂、胆固醇或类固醇。
33.权利要求1的用途,其中药物进一步包括与抗-CD20抗体或其片段联合的抗-B细胞抗体或其片段。
34.权利要求33的用途,其中抗-B细胞抗体是抗-CD19抗体或其片段、抗-CD22抗体或其片段、抗-CD38抗体或其片段或抗-主要组织相容性复合物(MHC)II抗体或其片段。
35.抗-CD20抗体与抗B细胞抗体用于制备联合制剂的用途,所述联合制剂用于顺序或同时鞘内施用于患者以治疗中枢神经系统(CNS)淋巴瘤,其中抗-CD20抗体和抗-B细胞抗体经配制用于以约0.4-20.0mg/kg人体重的剂量范围施用。
36.治疗有效量的可与B细胞抗原结合的抗体或其片段用于制备治疗中枢神经系统(CNS)淋巴瘤的鞘内施用的药物的用途。
37.权利要求36的用途,其中所述抗原选自:CD10、CD14、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CD75、CD76、CD77、CD78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86。
38.权利要求36的用途,其中所述抗体是一种B细胞消耗性抗体。
39.权利要求36的用途,其中所述抗体或抗体片段与一种毒素偶联。
40.权利要求36的用途,其中所述抗体或抗体片段与一种药物偶联。
41.权利要求36的用途,其中所述抗体或抗体片段与一种酶偶联。
42.权利要求36的用途,其中所述抗体或抗体片段与一种放射性核素偶联。
43.可结合B细胞抗原的抗体或抗体片段与至少一种化疗剂用于制备联合制剂的用途,所述联合制剂用于顺序或同时施用于患者以治疗中枢神经系统(CNS)淋巴瘤。
44.权利要求43的用途,其中所述化疗剂选自:硫替哌、环磷酰胺、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯佐替派、卡波醌、美妥替哌、乌瑞替派、六甲蜜胺、曲他胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺、三甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)、苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、盐酸氧化双氯乙基甲胺、美法仑、novembiehin、苯芥胆固醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥、卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加利车霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、久莫霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-二嗪-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、idambicin、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、绛色霉素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、二甲叶酸、氨甲喋呤、蝶罗呤、三甲曲沙、氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU、卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、表硫雄醇、美雄氨、睾内酯、氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、frolinic acid、醋葡醛内酯、aldophosphamide糖苷、氨基乙酰丙酸、安吖啶、bestrabucil、比生群、依达曲沙、defofamine、地美可辛、地吖醌、依氟鸟氨酸、乙酸elliptinium、依托格鲁、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、nitracrine、喷司他丁、phenamet、吡柔比星、podophyllinic acid、2-乙基酰肼、甲基苄肼、丙亚胺、西佐喃、锗螺胺、细格孢氮杂酸、三亚胺醌、2,2’,2”-三氯三乙胺、乌拉坦、长春地辛、达卡巴嗪、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、gacytosine、阿拉伯糖苷、环磷酰胺、硫替哌、紫杉醇、紫杉萜(doxetaxel)、苯丁酸氮芥、吉西他滨、6-硫鸟嘌呤、巯基嘌呤、氨甲喋呤、顺铂、卡铂、长春碱、铂、表鬼臼毒吡喃葡糖苷(VP-16)、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞宾、navelbine、三羟基蒽醌、替尼泊甙、柔红霉素、氨基蝶呤、xeloda、伊拜膦酸盐、拓扑异构酶抑制剂、二氟甲基鸟氨酸(DMFO)、视黄酸、埃斯波霉素、capecitabine、他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、onapristone、托瑞米芬、氟他胺、尼鲁米特、bicalutamide、亮丙瑞林、戈舍瑞林;和上述任一种的药学可接受的盐、酸或衍生物。
45.权利要求36的用途,其中所述抗体或抗体片段对选自CD19、CD20、CD21、CD22、CD37和CD40的B细胞抗原是特异的。
46.图瑞希单抗或抗体片段和至少一种细胞因子用于制备联合制剂的用途,所述联合制剂用于顺序或同时施用于患者以治疗中枢神经系统(CNS)淋巴瘤。
47.权利要求46的用途,其中细胞因子是IL-10。
48.B细胞消耗性抗体和至少一种CD40L拮抗剂用于制备联合制剂的用途,所述联合制剂用于顺序或同时施用于患者以治疗中枢神经系统(CNS)淋巴瘤。
49.权利要求48的用途,其中所述CD40L拮抗剂是一种可特异结合CD40L的抗体。
50.可结合B细胞抗原抗体或抗体片段和放射性标记的抗-CD20抗体用于制备联合制剂的用途,所述联合制剂用于顺序或同时施用于患者以治疗中枢神经系统(CNS)淋巴瘤。
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