CN101851278B - B细胞激活因子拮抗剂及其制备方法与用途 - Google Patents

B细胞激活因子拮抗剂及其制备方法与用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程药物领域，具体涉及一种新型B细胞激活因子(BAFF)拈抗剂及其用途。本发明要解决的技术问题是为自身免疫性疾病的防治寻找新的有效选择。该B细胞激活因子受体拈抗剂主要由TACI受体与BAFF结合的结构域2与Br3受体与BAFF结合的结构域融合，并将其与IgG1的Fc片段融合，得到新的融合蛋白分子。实验表明，其具有BAFF拈抗剂的功能，能够治疗自身免疫性疾病，为自身免疫性疾病的防治提供了一种新的有效选择。

Description

B细胞激活因子拮抗剂及其制备方法与用途
技术领域
本发明属于基因工程药物领域，具体涉及一种新型B细胞激活因子(BAFF)拮抗剂及其制备方法和用途。
背景技术
自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、
Figure GDA0000021759820000011
氏综合症(
Figure GDA0000021759820000012
syndrome，干燥综合症或修格林氏综合症)等都与机体的B细胞或浆细胞过分增殖、体液免疫激活密切相关。
B细胞激活因子(B cell activating factor，BAFF)，又称BLyS，TALL-1，THANK，zTNF4或TNFSF-13B，是1999年发现的TNF家族成员[1]，在B细胞的存活和成熟过程中起重要作用。BAFF为II型跨膜蛋白，以膜结合和可溶两种形式存在，前者由285个氨基酸组成，经蛋白酶水解后，可形成由152个氨基酸组成的可溶性蛋白。在正常生理条件下，可溶性BAFF以三聚体形式存在并具有生物活性。BAFF与另一TNF家族成员APRIL(AProliferaion-inducing Ligand)的蛋白序列具有33％的同源性[2]。BAFF主要由外周血单个核细胞(PBMNC)表达，包括巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞[3]。
现已发现BAFF的三个受体：BCMA(B cell maturation antigen)、TACI(transmembraneactivator and CAML interactor)及BAFF-R(BAFF receptor，Br3)均为III型跨膜蛋白。BAFF和APRIL均能够高亲和性地结合TACI和BCMA，但BAFF还能与BAFF-R结合。TNF受体的胞外区含有多个半胱氨酸丰富区(cysteine-rich domain，CRD)，每个CRD由6个半胱氨酸残基形成3个二硫键。BCMA具有单一的CRD，与BCMA相比，TACI含有两个典型的CRD，但N端的CRD不参与配体结合[11]。BAFF-R仅含有1个由4个半胱氨酸残基组成的部分CRD，与BAFF的结合域减少到26个氨基酸，主要介导BAFF-R和BAFF的相互作用[12]。
BAFF除具有促进B细胞存活的作用外，在维持生发中心反应、同型转换、T细胞的活化等方面都具有重要的调节作用。BAFF对T细胞激活的作用，可能在自身免疫疾病的发病机制中起重要作用。因此，BAFF及其受体作为治疗自身免疫疾病的新靶标，受到广泛的关注。BAFF特异的拮抗剂(包括可溶受体TACI-Fc，Br3-Fc或抗BAFF抗体等)能抑制BAFF的生物活性，从而起到治疗类风湿关节炎(RA)、综合症和系统性红斑狼疮(SLE)等自身免疫疾病的作用。目前，对TACI-Fc治疗SLE及RA治疗研究已进入II/III期临床试验，人抗BAFF单克隆抗体LymphoStat-BTM治疗RA和SLE病人的研究也进入III期临床试验，初步结果表明，Lympho Stat-BTM能显著降低外周血成熟B细胞的数目，治疗效果明确。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为自身免疫性疾病的防治，尤其是通过拮抗BAFF来防治自身免疫性疾病寻找新的有效选择。
本发明解决技术问题的技术方案是提供一种新型B细胞激活因子拮抗剂。该B细胞激活因子拮抗剂包含有一段结构域，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。该结构域起主要的B细胞激活因子结合作用。
进一步的，该B细胞激活因子拮抗剂(BAFF Trap)的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。
进一步的，该B细胞激活因子拮抗剂的氨基酸序列为在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的C-末端还连接有人免疫球蛋白的Fc片段的氨基酸序列。
其中，该B细胞激活因子拮抗剂的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
进一步的，在该B细胞激活因子拮抗剂其N-末端还连接有信号肽。
其中，该B细胞激活因子拮抗剂的氨基酸序列为SEQ ID No.3所示。
本发明还提供了编码上述的B细胞激活因子拮抗剂的核苷酸序列。
进一步的，该核苷酸序列为SEQ ID No.4所示。
更进一步的，该核苷酸序列为SEQ ID No.5所示。
本发明还提供了含有权利要求6～8任一项所述核苷酸序列的基因载体。
本发明还提供了含有权利要求9所述基因载体的宿主细胞。
本发明同时也提供了上述的B细胞激活因子拮抗剂、或上述核苷酸序列、或上述基因载体在制备治疗自身免疫疾病的药物中的用途。
本发明同时提供了上述的B细胞激活因子拮抗剂、或上述核苷酸序列、或上述的基因载体在作为主要活性成分的防治自身免疫疾病的药物。
其中，上述的自身免疫性疾病主要是指类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合症(
Figure GDA0000021759820000021
氏综合症)。
为了更好的实施本发明，本发明还提供了一种制备上述B细胞激活因子拮抗剂的方法。该方法包括以下步骤：将编码B细胞激活因子拮抗剂的基因可操作地装入表达载体，将表达载体转入宿主，宿主培养增殖后即从宿主和/或其培养上清液分离纯化得到B细胞激活因子拮抗剂。
其中，上述B细胞激活因子拮抗剂的制备方法中所述的表达载体为真核质粒表达载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
其中，上述B细胞激活因子拮抗剂的制备方法中所述的宿主为真核细胞。
其中，上述B细胞激活因子拮抗剂的制备方法中所述的分离纯化方法为将大规模培养宿主的上清液用美国GE公司的凝胶Mab-Select柱进行纯化，再过SP柱层析得到B细胞激活因子拮抗剂。
显然，上述方法中的表达载体可使用常用的真核表达载体、各种基因工程常用的宿主细胞，分离纯化方法也可以参考使用现有的常用方法以获得较纯的本发明B细胞激活因子拮抗剂。而将编码B细胞激活因子拮抗剂的基因可操作地装入表达载体，以及将表达载体转入宿主，则可以参照各种基因工程手册和具体使用的载体与宿主细胞的说明进行。
本发明设计并构建了TACI受体与BAFF结合的结构域2(CRD2)与Br3受体与BAFF结合的结构域(CRD)融合的片段SEQ ID No.1，为了提高其体内稳定性、延长半衰期，可将其与免疫球蛋白的Fc片段进行融合，得到新的融合蛋白分子。比如可将其与IgG1、IgG2或IgG4的Fc片段融合，本发明实例中将其与IgG1的Fc片段融合得到新的融合蛋白分子-BAFF Trap，实验表明具有B细胞激活因子拮抗剂的功能。当然，本发明B细胞激活因子拮抗剂由于是蛋白质，因此主要的制备方法还是借用现有的基因工程方法进行发酵生产。而在进行基因工程发酵生产的时候，为了便于回收产物，一股会在BAFF Trap的编码序列的N端加上各种常用的分泌信号肽的编码核苷酸序列，比如人IL-2信号肽的编码核苷酸序列。
本发明的有益效果在于：本发明的新型B细胞激活因子拮抗剂——BAFF Trap可大大提高与BAFF的结合效果，降低治疗使用剂量，提高治疗自身免疫疾病的效果。为自身免疫性疾病的防治提供了一种新的有效选择。
附图说明
图1BAFF与其受体的相互作用示意图，摘自Nature Review Immunology，2002，2：465-475。
图2BAFF Trap结构示意图。
图3IgG1 Fc的RT-PCR结果(1％Agarose电泳)。M：100bp DNA Ladder(Invitrogen)；1：RT-PCR产物。
图4重组质粒pEF-BT的构建过程示意图。
图5真核表达载体pEF1/V5-His A的质粒图谱。
图6重组质粒pEF-TACI-Br3的Kpn I/BamHI双酶切鉴定结果(1％Agarose电泳)。M：1kb DNALadder(Invitrogen)；11、15、16、26、27分别代表不同克隆。
图7重组质粒pEF-BT的Kpn I/Pme I双酶切鉴定结果(1％Agarose电泳)。M：1kb DNALadder(Invitrogen)；1、2、5、6、7、10分别代表不同克隆。
图8纯化后蛋白的电泳图谱(12％SDS-PAGE)。M：蛋白分子量标准；1：非还原条件；2：还原条件。
图9融合蛋白BT与BAFF结合常数的测定结果。
图10类风湿性关节炎模型中体重以及临床评分的变化
A为体重变化；B为临床评分变化。
图11  类风湿性关节炎模型中踝关节的HE图(放大倍数：40)。
A为建模组；B为hIgG组；C为BT组。
图12 B220流式检测图
A：正常大鼠组；B：生理盐水组；H：hIgG组；B：BT组。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明进行详细说明
实施例一BAFF Trap蛋白编码基因的构建及表达
一、BAFF Trap蛋白编码基因的获得
采用全基因合成的方法得到TACI结构域1与Br3结构域融合cDNA片段，5’端包含人Il-2信号肽序列。
同时，设计如下引物扩增IgG1 Fc片段cDNA：
5’引物(SEQ ID No.6)：5’CGG GAT CCG ACA AAA CTC ACA CAT GCC 3’
3’引物(SEQ ID No.7)：5’AGC TTT GTT TAA ACT CAT TTA CCC GGA GAC AGG3’
为了能将PCR产物插入克隆载体，在5’引物中设计入BamH I位点，在3’引物中设计入Pme I位点。
以人淋巴细胞总RNA为模板，RT-PCR扩增IgG1 Fc片段，反应条件如下：
RT-PCR反应混合物在50℃变性30分钟后，按下列条件进行反应：
逆转录反应：94℃变性30秒；55℃退火30秒；68℃延伸1分钟。反应10个循环。
PCR反应：94℃变性30秒；60℃退火30秒；68℃延伸1分钟。反应25个循环。然后68℃再延伸12分钟。
反应完成后，1％琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物。如图3所示得到了预计大小(～700bp)的DNA片段。
全长的BAFF Trap的核苷酸与蛋白序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.3所示。BAFFTrap的结构示意图如图2所示，融合蛋白以二聚体形式存在。
二、BAFF Trap蛋白编码基因重组质粒的构建
如上所述，在全基因合成片段(TACI-Br3)中的5’端设计入Kpn I酶切位点，3’端设计入BamH I酶切位点，这样可将TACI-Br3的cDNA片段直接插入真核表达载体pEF1/V5-HisA(购自美国Invitrogen公司，其图谱见图5)的多克隆位点Kpn I/BamH I中，IgG1 Fc片段插入到多克隆位点BamH I/Pme I中，即可得到BAFF Trap融合片段。其构建过程见图4。
1.重组质粒pEF-TACI-Br3的构建
将全基因合成片段TACI-Br3插入pEF1/V5-HisA的Kpn I/BamH I位点，连接产物pEF-TACI-Br3转化大肠杆菌JM109，随机挑选28个克隆进行筛选。11、15、16、26和27号克隆均用Kpn I/BamH I回切出目的片段，重组质粒pEF-TACI-Br3的酶切鉴定结果见图6。选26号克隆进行测序鉴定，其序列正确，进一步构建与IgG1 Fc的融合基因。
2.重组质粒pEF-BT的构建
以pEF-TACI-Br3 26号克隆为基础，将IgG1 Fc片段插入BamH I/Pme I位点，连接产物pEF-BT转化大肠杆菌JM109，随机挑选12个克隆进行筛选。重组质粒pEF-BT的酶切鉴定结果见图7，1、2、6、7、10号克隆均用Kpn I/Pme I回切出目的片段，选10号克隆送去测序鉴定。测序结果表明，我们得到的重组质粒中的目的基因与设计的BAFF Trap基因(TACI-Br3-IgG1 Fc)序列(即SEQ ID No.5)一致。
四、目的蛋白的稳定表达株-CHO-BT的筛选及鉴定
取5μg大量制备的上述重组质粒pEF-BT，利用脂质体Lipofectamine2000转染CHO-K1细胞(购自美国ATCC)，两天后按1∶5的比例传代，加入0.4mg/ml的G418(购自美国Invitrogen公司)筛选，10天可见克隆形成。随机消化96个边缘明显分开、细胞状态良好的单克隆接种于6个24孔板培养(第一轮筛选)。
取两天后的培养上清用ELISA检测融合蛋白的表达情况，从中选出表达阳性的24个克隆分别接种于1个24孔板(第二轮筛选)，培养2天后，取上清用ELISA检测融合蛋白的表达情况，从中选取表达较高的6个克隆：1-B2、1-B8、1-D7、1-E1、2-D1、2-F6进一步用有限稀释法进行筛选。
分别接种96孔板(1细胞/孔/200μl)(第三轮筛选)，待细胞长满后(大约8天后)，取培养上清用ELISA检测融合蛋白的表达情况，分别挑取表达较高的6个克隆接种24孔板。待细胞长满后，接种6孔板，ELISA检测各克隆的表达情况，结果见表1。
表1  ELISA检测第三轮筛选出的6个克隆的亚克隆48小时后上清的表达情况
    1-B2     A450     1-B8     A450     1-D7     A450
    1-B2-4     0.968     1-B8-1     0.965     1-D7-4     0.632
    1-B2-7     1.079     1-B8-2     1.051     1-D7-7     0.775
    1-B2-8     0.369     1-B8-3     0.748     1-D7-10     0.758
    1-B2-9     0.432     1-B8-5     0.639     1-D7-13     0.302
    1-B2-11     0.751     1-B8-8     0.112     1-D7-14     0.456
    1-B2-13     0.919     1-B8-11     0.357     1-D7-17     0.34
    1-E1     A450     2-D1     A450     2-F6     A450
    1-E1-1     0.562     2-D1-2     0.256     2-F6-2     0.607
    1-E1-3     0.929     2-D1-3     0.181     2-F6-3     0.873
    1-E1-6     0.984     2-D1-4     0.187     2-F6-4     0.835
    1-E1-7     0.948     2-D1-5     0.135     2-F6-5     0.352
    1-E1-12     0.794     2-D1-9     0.178     2-F6-6     0.904
    1-E1-16     0.593     2-D1-13     0.268     2-F6-7     0.281
选择表达较高的1-B8-1、1-D7-7和1-E1-7放大培养，扩入T75方瓶，4天后收获上清用Pr.A-Sepharose吸附，检测融合蛋白的表达情况，结果表明纯化得到的蛋白与预计蛋白分子量大小一致，并通过Western Blot进行了验证。
分别取1-B8-1、1-D7-7、1-E1-7接种96孔板(1细胞/孔/200μl)(第四轮筛选)，待细胞长满后(大约10天后)，取培养上清用ELISA检测融合蛋白的表达情况，三个克隆均为均一的克隆，将其中表达最高的分别扩增、保种，命名为CHO-BT(1-B8-1)、CHO-BT(1-D7-7)、CHO-BT(1-E1-7)，挑取CHO-BT(1-E1-7)进行下一步表达和纯化。
五、融合蛋白BAFF Trap(BT)的大量表达及纯化
大规模培养上述筛选出的CHO-BT(1-E1-7)细胞，上清液用凝胶Mab-Select(购自美国GE公司)进行纯化，再过SP柱层析，两步柱层析后蛋白的电泳图谱见图8。结果表明，纯化后目的蛋白在还原性条件下分子量为38kDa，在非还原条件下分子量为76kDa，以二聚体形式存在，与我们预计一致。纯化后蛋白纯度可达到95％以上。
实施例二融合蛋白BAFF Trap(BT)的鉴定和功效实验
1、融合蛋白BAFF Trap(BT)与BAFF结合常数的测定
采用Human BAFF/BLYS/TNFSF13B Immunoassay试剂盒(购自美国R&D Systems公司)检测融合蛋白BT与BAFF的结合，将标准BAFF蛋白与不同浓度的BT室温孵育过夜，同时设置Br3-Fc(购自美国R&D Systems公司)和TACI-Fc(购自美国R&D Systems公司)对照品以及标准品，其余操作严格按试剂盒说明进行，实验结果见图9。结果表明，与TACI-Fc和Br3-Fc相比，BT能更为有效地与BAFF结合，其结合常数至少可提高3倍以上。该结果表明本发明的新型BAFF拮抗剂——BAFF Trap能够有效结合BAFF，效果远优于TACI-Fc和Br3-Fc。
2、融合蛋白BAFF Trap(BT)体外细胞结合的鉴定
Raji细胞(购自美国ATCC)为高表达BAFF受体(TACI和Br3)的人B细胞株，我们用于检测BT竞争性拮抗BAFF的结合作用。收获处于对数生长期的Raji细胞，分别加入不同浓度的BT蛋白和抗TACI抗体/抗Br3抗体，室温孵育1小时，洗涤后加入FITC标记二抗，室温避光孵育半小时，洗涤后上流式细胞仪检测，结果见表2。(其中，hIgG包含人IgG1 Fc片段，作为无关蛋白组。)
表2 BT阻断Raji细胞表面BAFF受体的流式检测结果
Figure GDA0000021759820000071
结果表明，BT可竞争性抑制抗体与Raji细胞上的BAFF受体——TACI和Br3的结合，并且呈现剂量依存关系。说明在体外实验中，BT可以作为拮抗剂抑制BAFF与其细胞膜表面受体的结合。
3、融合蛋白BAFF Trap(BT)在类风湿性关节炎模型小鼠中的治疗作用
建立大鼠佐剂型关节炎模型(AIA)研究BT的体内治疗效果。
实验方法：6-8周龄的雌性Lewis大鼠，尾根部皮内注射100μl含5mg/ml灭活卡介苗的不完全弗氏佐剂，对照组老鼠不做处理。发病后随机分成3组进行处理：生理盐水组、hIgG组、融合蛋白BT组，每组10只，腹腔给药100μg/100μl/只，每周治疗两次。(hIgG组，包含人IgG1 Fc片段，作为无关治疗组。)每天称量其体重，双盲法对其四肢进行临床评分。每周一次眼眶静脉取血，分离血清，负80度冰箱保存。
治疗后45天处死老鼠，取其踝关节，HE染色。取脾脏分离淋巴细胞，用流式细胞仪检测脾脏B细胞含量(B220抗体检测)。
实验结果：各组小鼠体重以及临床评分的变化见图10，与生理盐水组和hIgG组相比，BT治疗组大鼠体重恢复较快，有显著性差异(P＜0.01)；临床得分BT组治疗后开始下降，免疫后31天回复到0，而hIgG组到第5 1天回复到0，生理盐水组要到第61天回复到0，具有显著性差异(P＜0.01)。
各组关节HE染色结果见图11，可见生理盐水组和hIgG组关节面破坏，关节腔内有大量淋巴细胞浸润，而BT治疗组关节面光滑，关节腔内的淋巴细胞数量很少，与正常的关节一致。
B220流式检测结果见图12，BT治疗组大鼠脾细胞B220阳性细胞比例为17.6％，远低于生理盐水组(32.6％)和hIgG治疗组(27.1％)，具有显著性差异(P＜0.01)，与正常大鼠(21.4％)基本一致。
通过上述实例表明，本发明成功制得了融合蛋白BAFF Trap(BT)，该融合蛋白能够作为BAFF受体的拮抗剂使用。能够对AIA模型小鼠产生明显的治疗作用，为自身免疫疾病的治疗提供了一种新的有效选择。
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SEQUENCE LISTING
<110>四川大学
<120>B细胞激活因子拮抗剂及其制备方法与用途
<130>A100188K
<160>7
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>87
<212>PRT
<213>artificial
<220>
<223>artificial
<400>1
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1               5                   10                  15
Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys
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<223>artificial
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Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
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<210>3
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Pro Gly Lys
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<213>artificial
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<223>artificial
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ctgctggtcc gccactgcgt ggcctgcggg ctcctgcgca cgccgcggcc gaaaccggcc    240
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cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc    360
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct    420
gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg    480
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag    540
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc    600
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg    660
cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc    720
ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac    780
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<210>5
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<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>artificial
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<223>artificial
<400>7
agctttgttt aaactcattt acccggagac agg                                  33

Claims (18)

1.一种B细胞激活因子拮抗剂，其特征在于：是包含有具B细胞激活因子结合作用的结构域的蛋白，该结构域的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的B细胞激活因子拮抗剂，其特征在于：其氨基酸序列为在SEQID No.1所示的氨基酸序列的C-末端连接人免疫球蛋白的Fc片段的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的B细胞激活因子拮抗剂，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ IDNo.2所示。
4.根据权利要求1所述的B细胞激活因子拮抗剂，其特征在于：在其N-末端连接有信号肽。
5.根据权利要求4所述的B细胞激活因子拮抗剂，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ IDNo.3所示。
6.编码权利要求1～5任一项所述的B细胞激活因子拮抗剂的核酸。
7.根据权利要求6所述编码B细胞激活因子拮抗剂的核酸，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.4所示。
8.根据权利要求6所述编码B细胞激活因子拮抗剂的核酸，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.5所示。
9.含有权利要求6～8任一项所述核酸的基因载体。
10.含有权利要求9所述基因载体的宿主细胞。
11.权利要求1～5任一项所述的B细胞激活因子拮抗剂在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于：所述的自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮或干燥综合症。
13.治疗自身免疫性疾病的药物，其特征在于：以权利要求1～5任一项所述的B细胞激活因子拮抗剂作为主要活性成分。
14.根据权利要求13所述的治疗自身免疫性疾病的药物，其特征在于：所述的自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮或干燥综合症。
15.权利要求1～5任一项所述的B细胞激活因子拮抗剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将编码B细胞激活因子拮抗剂的基因装入表达载体，将表达载体转入宿主细胞，宿主细胞培养增殖后从宿主细胞或培养上清液分离纯化得到B细胞激活因子拮抗剂。
16.根据权利要求15所述的B细胞激活因子拮抗剂的制备方法，其特征在于：所述的表达载体为真核质粒表达载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
17.根据权利要求15所述的B细胞激活因子拮抗剂的制备方法，其特征在于：所述的宿主细胞为真核细胞。
18.根据权利要求15所述的B细胞激活因子拮抗剂的制备方法，其特征在于：所述的分离纯化方法为将大规模培养宿主细胞的上清液用美国GE公司的凝胶Mab-Select柱进行纯化，再过SP柱层析得到B细胞激活因子拮抗剂。
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