CN101678106A - 用于治疗自身免疫疾病的BLyS抑制和/或APRIL抑制与免疫抑制剂的组合 - Google Patents

用于治疗自身免疫疾病的BLyS抑制和/或APRIL抑制与免疫抑制剂的组合 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于治疗自身免疫疾病的新型联合疗法，所述联合疗法牵涉BLyS或BLyS/APRIL抑制以及免疫抑制剂。一种优选的方法是这样的，其中BLyS和/或APRIL拮抗剂为Fc融合蛋白，所述Fc融合蛋白可以是包含TAC I的细胞外结构域或其功能性片段的TACI－Fc融合蛋白、包含BAFF－R的细胞外结构域或其功能性片段的BAFF－R－Fc融合蛋白或者包含BCMA的细胞外结构域或其功能性片段的BCMA－Fc融合蛋白。在本发明的方法中，所考虑的免疫抑制药物中的一些包括环磷酰胺(CYC)、硫唑嘌呤(AZA)、环孢菌素A(CSA)或吗替麦考酚酸酯(MMF)，虽然任何抑制免疫系统的药物可以是适合的。本发明的方法降低需要此类降低的患者(例如患有自身免疫疾病的那些患者)中各种免疫球蛋白的水平。

Description

用于治疗自身免疫疾病的BLyS抑制和/或APRIL抑制与免疫抑制剂的组合
发明领域
本发明涉及用于治疗自身免疫疾病的新型联合疗法，所述联合疗法牵涉BLyS或BLyS/APRIL抑制以及免疫抑制剂。
发明背景
淋巴细胞是几种白细胞群体之一；它们特异性地识别外来抗原并对其作出应答。淋巴细胞的三种主要类别为B淋巴细胞(B细胞)、T淋巴细胞(T细胞)和天然杀伤(NK)细胞。B细胞是负责抗体产生的细胞，并且提供体液免疫。B细胞在骨髓内成熟，并且伴随着在其细胞表面上表达抗原结合性抗体而离开骨髓。当幼稚B细胞首次遇到结合在其膜上的抗体所特异于的抗原时，细胞开始快速分裂，并且其后代分化为记忆B细胞和称为浆细胞的效应细胞。记忆B细胞具有更长的寿命，并且继续表达具有与原始亲本细胞相同的特异性的膜结合抗体。浆细胞不产生膜结合抗体而是产生分泌形式的抗体。分泌型抗体是体液免疫的主要效应分子。
在各种条件下在B细胞表面上发现的一组肿瘤坏死因子(TNF)受体属于在免疫系统中的B细胞功能的细胞调节剂。特别地，三种TNF受体：跨膜激活剂与CAML相互作用物(transmembrane activator andCAML interactor，TACI)，属于TNF家族的B细胞激活因子的受体(Bcell activator belonging to the TNF family receptor，BAFF-R)，以及B细胞成熟蛋白(B cell maturation protein，BCMA)，已知与下列两种TNF配体之一或两者结合：B淋巴细胞刺激剂(BLyS(BLymphocyte stimulator)，也称为为BAFF、TALL-1、ztnf4和THANK)和增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand，APRIL)。特别地，已知TACI和BCMA结合BLyS和APRIL两者，而BAFF-R只结合BLyS。
已经开发了许多BLyS和/或APRIL拮抗剂以阻断BLyS的各种功能，所述功能包括但不应限于B细胞共刺激、成浆细胞和浆细胞存活、Ig类别转换、增强的B细胞抗原呈递细胞功能、恶性B细胞的存活、B-1细胞功能的形成、超过T-1期的B细胞发育、以及完全的生发中心的形成。这些分子中的一些还可以结合APRIL并阻断APRIL对于B细胞和免疫系统其他组分的效应(Dillon等人，(2006)Nat.Rev.Drug Dis.5，235-246)。已开发的通过干扰BLyS和/或APRIL结合来影响B细胞功能的分子包括BLyS抗体例如Lymphostat-B(贝利木单抗(Belimumab))(Baker等人，(2003)Arthritis Rheum，48，3253-3265和WO 02/02641)；受体细胞外结构域/Fc结构域融合蛋白例如TACI-Ig，包括一个具体的实施方案，即atacicept(美国专利申请号20060034852)，BAFF-R-Fc(WO 05/0000351)，和BCMA-Ig或其他使用受体细胞外结构域的融合蛋白。BLyS和/或APRIL拮抗剂的另外类别包括其他依靠BLyS结合能力从而阻断与其受体结合的分子，例如AMG 623、受体抗体以及在WO 03/035846和WO 02/16312中公开的其他分子。
目前用于治疗自身免疫疾病的方法是抑制不希望的免疫反应。例如，在狼疮肾炎(LN)(一种牵涉患有系统性红斑狼疮(SLE)的患者的肾的严重并发症)的治疗中，几种免疫抑制药物已被证明是有益的。这些药物包括环磷酰胺(CYC)、硫唑嘌呤(AZA)、环孢菌素A(CSA)和吗替麦考酚酸酯(MMF)(关于综合性的综述，可参见Mok等人，(2003)Ann Rheum Dis 62，799-804；和Iaccarino等人，(2007)AutoimmunityReviews 6，190-195)。虽然这些药物是有益的，但在本领域中仍然需要改善对于免疫抑制药物的应答以有效地治疗自身免疫疾病。
发明概述
本发明的一个方面为用于降低哺乳动物中的免疫球蛋白水平的方法，所述方法包括施用BLyS和/或APRIL拮抗剂和免疫抑制药物。一种优选的方法是这样的，其中所述BLyS和/或APRIL拮抗剂为Fc融合蛋白，所述Fc融合蛋白可以是包含TACI的细胞外结构域或其功能性片段的TACI-Fc融合蛋白、包含BAFF-R的细胞外结构域或其功能性片段的BAFF-R-Fc融合蛋白或者包含BCMA的细胞外结构域或其功能性片段的BCMA-Fc融合蛋白。特别地，所述Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的多肽序列。
在另一个实施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂为BLyS抗体，其优选地在包含SEQ ID NO：8的氨基酸162-275的区域内结合BLyS；或者称为LymphoStat-B的BLyS抗体。在进一步的实施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂为TACI抗体，其优选地在包含选自SEQ ID NO：2的氨基酸72-109或SEQ ID NO：2的氨基酸82-222的区域内结合TACI。
在本发明的方法中，所考虑的免疫抑制药物中的一些包括环磷酰胺(CYC)、硫唑嘌呤(AZA)、环孢菌素A(CSA)或吗替麦考酚酸酯(MMF)，尽管任何抑制免疫系统的药物可以是适合的。通过本发明方法而降低的免疫球蛋白水平可以是IgM、IgG、IgA、IgD或IgE或者其组合。
本发明还包括用于减轻由B-细胞调节的自身免疫病症的方法，所述方法包括给患有所述病症的患者施用治疗有效量的免疫抑制药物以及BLyS和/或APRIL拮抗剂。在一个实施方案中，所述自身免疫病症选自类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮肾炎(LN)、韦格纳病(Wegener’s disease)、炎症性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化症、银屑病、IgA肾病、IgM多发性神经病、重症肌无力、脉管炎、糖尿病、Reynaud’s综合征、Sjorgen’s综合征和肾小球肾炎。特别用该方式治疗的一种疾病为狼疮肾炎。
特别地，当自身免疫病症为类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮或狼疮肾炎时，在一个实施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂和所述免疫抑制药物可以以进一步与使用第二免疫抑制药物的疗法相联合的方式进行施用，所述第二免疫抑制药物例如为非类固醇抗炎药(NSAID)、糖皮质激素、泼尼松和疾病缓解抗风湿药(DMARD)。
本发明的方法使用与BLyS和/或APRIL拮抗剂相组合的已显示在治疗自身免疫疾病方面有效的免疫抑制药物。被考虑用于本发明方法的免疫抑制药物包括环磷酰胺(CYC)、硫唑嘌呤(AZA)、环孢菌素A(CSA)或吗替麦考酚酸酯(MMF)。
在其中给患者施用免疫抑制药物和BLyS和/或APRIL拮抗剂的用于治疗或减轻病症的任何方法中，所述免疫抑制药物和所述BLyS和/或APRIL拮抗剂可以同时或顺次施用。在一个特别的实施方案中，免疫抑制剂在BLyS和/或APRIL拮抗剂之前施用。
还提供了包含免疫抑制剂和BLyS和/或APRIL拮抗剂的组合物。
本发明进一步提供了制品，其包含免疫抑制剂、BLyS和/或APRIL拮抗剂以及标签，其中所述标签指明所述组合物用于治疗由B细胞调节的自身免疫病症。
在本发明的方法、组合物和制品的任何实施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂，如果是抗体，那么包括嵌合抗体和人源化抗体。
在本发明的方法、组合物和制品的任何实施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂，在一个实施方案中，为结合BLyS的受体的细胞外结构域和免疫球蛋白的Fc结构域之间的融合蛋白，或者Fc融合蛋白。在特别的实施方案中，所述Fc融合蛋白选自包含TACI的细胞外结构域的TACI Fc融合蛋白，特别是atacicept；包含BAFF-R的细胞外结构域的BAFF-R Fc融合蛋白，特别是BR3-Ig；和包含BCMA的细胞外结构域的BCMA Fc融合蛋白。在其他实施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂为BLyS抗体，特别是在包含残基162-275的BLyS的区域内结合BLyS的BLyS抗体，特别是Lymphostat B。在另一个实施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂为BAFF-R抗体，包括在包含人BAFF-R的残基23-38的区域中进行结合的BAFF-R抗体。在另一个实施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂为TACI抗体、BCMA抗体或与这两种分子都结合的抗体，如美国专利申请号2003-0012783中所描述的。
附图简述
图1显示了四个治疗组的IgG的平均值(±标准差)：媒介物(vehicle)，仅MMF，仅atacicept，以及atacicept和MMF。通过使用经对数转换的数据，除了“媒介物”对“仅MMF”之外，这些值的所有成对比较都是统计学上显著的(p＜0.05)。
图2显示了四个治疗组的IgM的平均值(±标准差)：媒介物，仅MMF，仅atacicept，以及atacicept和MMF。通过使用经对数转换的数据，除了“媒介物”对“仅MMF”之外，这些值的所有成对比较都是统计学上显著的(p＜0.05)。
图3显示了四个治疗组的IgA的平均值(±标准差)：媒介物，仅MMF，仅atacicept，以及atacicept和MMF。通过使用经对数转换的数据，除了“媒介物”对“仅MMF”之外，这些值的所有成对比较都是统计学上显著的(p＜0.05)。
优选实施方案的详细描述
尽管免疫抑制治疗看起来在自身免疫疾病的治疗中有用，但是从此处所描述的实验中发现，施用免疫抑制剂与BLyS和/或APRIL拮抗剂的组合是一种将会阻断B细胞中的多条信号途径的治疗方法，所述信号途径被认为负责针对自身抗原的抗体的产生，从而触发和/或维持自身免疫状况。这导致在经历此类治疗的哺乳动物中循环免疫球蛋白减少。由于此类循环免疫球蛋白被认为至少部分地负责触发自身免疫疾病的负性症状(negative symptoms)，因此免疫抑制药物和针对BLyS途径的疗法的组合提供了用于治疗由B细胞介导的疾病(例如基于B细胞的自身免疫疾病)的新型方法。免疫抑制药物与BLyS和/或APRIL拮抗剂的联合疗法可以为某些疾病例如狼疮肾炎的现有治疗提供更有效的备选方案。
在本文中，“自身免疫疾病”为任何起因于针对个体自己(自身)抗原和/或组织而产生的抗体的非恶性疾病或病症。
如本文中所使用的，“B细胞耗竭”是指在药物或抗体治疗后，与治疗前的水平相比较，动物或人中的B细胞水平的降低。使用众所周知的测定法，例如通过获得全血细胞计数，通过对于已知的B细胞标志物进行FACS分析染色，和通过诸如在实验性实施例中所描述的方法，可以测量B细胞水平。B细胞耗竭可以是部分的或完全的。在接受B细胞耗竭性药物的患者中，一般地，在当药物在患者体内循环和恢复B细胞的时间期间，B细胞被耗尽。
“免疫抑制药物”为干扰免疫系统并钝化其对于外来或自身抗原的应答的任何分子。环磷酰胺(CYC)和吗替麦考酚酸酯(MMF)是两种此种类型的分子。该术语意欲包括任何在下调免疫系统中可用作治疗剂的药物或分子。该方法特别考虑了已被用于治疗自身免疫疾病例如类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮肾炎(LN)、韦格纳病、炎症性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化症、银屑病、IgA肾病、IgM多发性神经病、重症肌无力、脉管炎、糖尿病、Reynaud’s综合征、Sjorgen’s综合征和肾小球肾炎的药物。
当在本文中使用时，术语“BLyS”或“BLyS多肽”、“TALL-1”或“TALL-1多肽”、或者“BAFF”或“BAFF多肽”包括“天然序列BLyS多肽”和“BLyS变体”。“BLyS”是给予由人BLyS序列(SEQ IDNO：7)或小鼠BLyS序列(SEQ ID NO：9)所编码的那些多肽的名称。显示出BLyS生物学活性的多肽也被包括在此名称之内。例如，具有生物学活性的BLyS在体外或在体内加强下列事件中的任何一个或组合：增加的B细胞存活、增加的IgG和/或IgM水平、增加的浆细胞数目以及在脾B细胞中NF-Kb2/100被加工成p52NF-Kb(例如，Batten，M等人，(2000)J.Exp.Med.192：1453-1465；Moore等人，(1999)Science 285：260-263；Kayagaki等人，(2002)10：515-524)。几种可用于测试BLyS和/或APRIL拮抗剂的测定法，例如WO 00/40716中所描述的B细胞增殖测定法，尤其是本领域普通技术人员所熟知的。
简而言之，根据制造商的指导，用CD19磁珠和VarioMacs磁力分离系统(Miltenyi Biotec Auburn，CA)从外周血单核细胞中分离人B细胞。将经纯化的B细胞与可溶性BLyS(25ng/ml)和重组人IL-4(10ng/ml Pharmingen)相混合，并且以1×105个细胞/孔将细胞铺板在圆底96孔平板上。待测试的BLyS和/或APRIL拮抗剂可以从约5μg/ml稀释至约6ng/ml，并与B细胞一起温育五天，其中在第四天用lμCi 3H-胸苷/孔进行脉冲过夜。作为对照，还可以将BLyS和/或APRIL拮抗剂与没有BLyS的B细胞和IL-4一起温育。用Packard平板收获器来对平板进行收获，并用Packard阅读器进行计数。
“天然序列”多肽包括具有与源自自然界的相应多肽相同的氨基酸序列的多肽。此类天然序列多肽可以从自然界中分离，或者通过重组和/或合成手段来产生。特别地，术语“天然序列”包括所述多肽的天然出现的截短的、可溶性的或分泌的形式(例如，细胞外结构域序列)，所述多肽的天然出现的变体形式(例如，选择性剪接的形式)，和所述多肽的天然出现的等位基因变体。
一般地，在本说明书中公开的任何多肽的“变体”多肽包括这样的多肽，其中在全长或“天然序列”氨基酸序列的N-和/或C-末端以及一个或多个内部结构域内添加或删除了一个或多个氨基酸残基。当讨论受体的细胞外结构域时，还考虑了与天然序列BLyS多肽结合的片段。反过来，当讨论BLyS片段时，考虑了与三种BLyS受体中的一种或多种结合的片段。一般地，变体多肽将会与所述多肽或其指定片段具有至少约80％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约81％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约82％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约83％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约84％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约85％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约86％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约87％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约88％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约89％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约90％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约91％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约92％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约93％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约94％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约95％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约96％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约97％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约98％的氨基酸序列同一性和更加优选地至少约99％的氨基酸序列同一性。一般地，变体多肽不包括天然多肽序列。通常，变体多肽的长度为至少约10个氨基酸，经常至少约20个氨基酸，更经常至少约30个氨基酸，更经常至少约40个氨基酸，更经常至少约50个氨基酸，更经常至少约60个氨基酸，更经常至少约70个氨基酸，更经常至少约80个氨基酸，更经常至少约90个氨基酸，更经常至少约100个氨基酸，更经常至少约150个氨基酸，更经常至少约200个氨基酸，更经常至少约250个氨基酸，更经常至少约300个氨基酸，或者更长。
如上面所提及的，BLyS和/或APRIL拮抗剂可以在体外或在体内以直接或间接的方式发挥功能，以部分地或完全地阻断、抑制或中和BLyS信号传导。例如，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂可以直接结合BLyS。例如，直接的结合剂为包含BLyS受体例如TACI、BAFF-R和BCMA的细胞外结构域(ECD)的多肽。
可以如下来描述在本发明中涉及的BLyS受体。本发明的TACI多肽包括包含或由SEQ ID NO：2的氨基酸1-246组成的TACI多肽。总括的术语“TACI”包括在WO 98/39361、WO 00/40716、WO 01/85782、WO 01/87979、WO 01/81417和WO 02/094852中描述的TACI多肽。本发明的TACI多肽可以分离自各种来源，例如人组织类型或其他来源，或者通过重组和/或合成方法来制备。本发明的BAFF-R多肽包括包含或由SEQ ID NO：4的氨基酸残基1至184的邻接序列组成的BAFF-R多肽。总括的术语“BAFF-R”包括在WO 02/24909和WO 03/14294中描述的BAFF-R多肽。本发明的BAFF-R多肽可以分离自各种来源，例如人组织类型或其他来源，或者通过重组和/或合成方法来制备。本发明的BCMA多肽包括包含由SEQ ID NO：6的氨基酸残基1-184组成的BCMA多肽。总括的术语“BCMA”包括了在Laabi等人，EMBO J.，11：3897-3904(1992)；Laabi等人，Nucleic Acids Res.，22：1147-1154(1994)；Gras等人，Int.Immunology，7：1093-1106(1995)；和Madry等人，Int.Immunology，10：1693-1702(1998)中描述的BCMA多肽。本发明的BCMA多肽可以分离自各种来源，例如人组织类型或其他来源，或者通过重组和/或合成方法来制备。
为了发挥作为BLyS和/或APRIL拮抗剂的功能，这些受体的ECD为基本上没有跨膜或胞质结构域的多肽，其一般保留了结合BLyS的能力。特别地，TACI的细胞外结构域可以包含TACI多肽序列(SEQ ID NO：2)的氨基酸1至154。此外，ECD可以是该序列的片段或变体，例如在von Bulow等人(同上)、WO 98/39361、WO 00/40716、WO 01/85782、WO 01/87979和WO 01/81417中描述的TACI的ECD形式。特别地，这些ECD形式可以包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-106、SEQ ID NO：2的氨基酸1-142、SEQ ID NO：2的氨基酸30-154、SEQ ID NO：2的氨基酸30-106、SEQ ID NO：2的氨基酸30-110、SEQ ID NO：2的氨基酸30-119、SEQ ID NO：2的氨基酸1-166、SEQ ID NO：2的氨基酸1-165、SEQ ID NO：2的氨基酸1-114、SEQ ID NO：2的氨基酸1-119、SEQ ID NO：2的氨基酸1-120和SEQ ID NO：2的氨基酸1-126。此外，TACI ECD可以包括只具有一个富含半胱氨酸的结构域的那些分子。
BAFF-R的ECD形式包括包含BAFF-R多肽序列(SEQ ID NO：4)的氨基酸1-71的那些。此外，ECD可以是该序列的片段或变体，例如在WO 02/24909、WO 03/14294和WO 02/38766中描述的BAFF-R的ECD形式。特别地，这些ECD形式可以包含SEQ ID NO：4的氨基酸1-77、SEQ ID NO：4的氨基酸7-77、SEQ ID NO：4的氨基酸1-69、SEQ IDNO：4的氨基酸7-69、SEQ ID NO：4的氨基酸2-62、SEQ ID NO：4的氨基酸2-71、SEQ ID NO：4的氨基酸1-61和SEQ ID NO：4的氨基酸2-63、SEQ ID NO：4的氨基酸1-45、SEQ ID NO：4的氨基酸1-39、SEQ ID NO：4的氨基酸7-39、SEQ ID NO：4的氨基酸1-17、SEQ IDNO：4的氨基酸39-64、SEQ ID NO：4的氨基酸19-35和SEQ ID NO：4的氨基酸17-42。此外，BAFF-R ECD可以包括具有富含半胱氨酸的结构域的那些分子。
BCMA的ECD形式包括包含BCMA多肽序列(SEQ ID NO：6)的氨基酸1-48的那些。此外，ECD可以是该序列的片段或变体，例如在WO00/40716和WO 05/075511中描述的BCMA的ECD形式。特别地，这些ECD形式可以包含SEQ ID NO：6的氨基酸1-150、SEQ ID NO：6的氨基酸1-48、SEQ ID NO：6的氨基酸1-41、SEQ ID NO：6的氨基酸8-41、SEQ ID NO：6的氨基酸8-37、SEQ ID NO：6的氨基酸8-88、SEQ IDNO：6的氨基酸41-88、SEQ ID NO：6的氨基酸1-54、SEQ ID NO：6的氨基酸4-55、SEQ ID NO：6的氨基酸4-51和SEQ ID NO：6的氨基酸21-53。此外，BCMA ECD可以包括只具有部分富含半胱氨酸的结构域的那些分子。
在进一步的实施方案中，BLyS受体的BLyS结合区域(例如BAFF-R、BCMA或TACI的细胞外结构域或其片段)可以与免疫球蛋白分子的Fc部分相融合以促进其在体内的溶解性。根据一个实施方案，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂以100nM或更低的结合亲和力与BLyS多肽结合。根据另一个实施方案，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂以10nM或更低的结合亲和力与BLyS多肽结合。根据另外一个实施方案，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂以1nM或更低的结合亲和力与BLyS多肽结合。
在另一个实例中，BLyS和/或APRIL拮抗剂包括这样的BLyS结合多肽，其不是天然序列或其变体。此类多肽的一些例子为在WO05/000351中描述的具有式I、式II、式III的序列的那些多肽。特别地，一些结合多肽包括ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ ID NO：13)、ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ ID NO：14)、ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQ IDNO：15)、ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQ ID NO：16)、ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQ ID NO：17)、或在WO 05/000351的图32中所列出的序列。
备选地，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂可以在体外、原位或在体内，在其BLyS结合区域处与天然序列TACI、BAFF-R或BCMA的细胞外结构域结合，从而部分或完全地阻断、抑制或中和BLyS结合。例如，此类间接拮抗剂为TACI抗体，所述TACI抗体在TACI的区域中进行结合，从而在空间上阻碍了BLyS的结合。例如，在氨基酸72-109或邻近区域处的结合被认为阻断了BLyS结合。阻断APRIL与该分子结合也可以是有利的，所述结合被认为发生在氨基酸82-222的区域中。另一种BLyS和/或APRIL拮抗剂为BAFF-R抗体，所述BAFF-R抗体在BAFF-R的区域中进行结合，从而在空间上阻碍了人BAFF-R与BLyS的结合。例如，在氨基酸23-38或氨基酸17-42或者邻近区域处的结合被认为阻断了BLyS结合。最后，另外的间接拮抗剂为BCMA抗体，所述BCMA抗体在BCMA的区域中进行结合，从而在空间上阻碍了BLyS的结合。例如，在氨基酸5-43或邻近区域处的结合被认为阻断了BLyS(或APRIL)结合。
在一些实施方案中，根据本发明的BLyS和/或APRIL拮抗剂为BLyS抗体。当提及时，术语“抗体”以最宽的意义进行使用，并且特别地涵盖例如单克隆抗体、多克隆抗体、具有多表位特异性的抗体、单链抗体、和抗体的片段。根据一些实施方案，将本发明的多肽融合入抗体框架中，例如在可变区中或在CDR中，从而所述抗体可以与BLyS结合，并抑制BLyS与TACI、BAFF-R或BCMA的结合，或抑制BLyS信号传导。包含本发明多肽的抗体可以是嵌合的、人源化的或人的。包含本发明多肽的抗体可以是抗体片段。备选地，本发明的抗体可以通过用本发明的多肽对动物进行免疫接种来产生。因此，考虑了针对本发明的多肽的抗体。
特别地，考虑了特异于BLyS的抗体，所述抗体在人BLyS(SEQ IDNO：8)的区域内进行结合，所述区域包含残基162-275和/或选自人BLyS的162、163、206、211、231、233、264和265的氨基酸的邻近氨基酸。所述抗体的结合是这样的，即从而所述抗体在空间上阻碍BLyS与一种或多种其受体的结合。此类抗体描述于WO 02/02641和WO03/055979中。特别优选的抗体为被描述为Lyphostat-B的抗体(Baker等人，(2003)Arthritis Rheum，48，3253-3265)。
本文所使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体的群体中获得的抗体，即包含该群体的那些独个抗体是同样的，除了可能的天然出现的突变外，所述突变可以以较少的量存在。
单克隆抗体是高度特异性的，其针对单一抗原位点。此外，与常规的(多克隆)抗体制备物(其通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性外，单克隆抗体也是有利的，因为它们是通过杂交瘤培养物来合成的，没有被其他免疫球蛋白污染。修饰词“单克隆的”将抗体的特征指明为获自基本上同质的抗体群体，而并不是解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。例如，待根据本发明进行使用的单克隆抗体可以通过首次由Kohler等人，Nature，256：495(1975)所描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567)来制备。还可以例如通过使用在Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol，222：581-597(1991)中所描述的技术，从噬菌体抗体文库中分离出“单克隆抗体”。
特别地，此处的单克隆抗体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源；以及此类抗体的片段，只要它们展示出所希望的生物学活性(美国专利号4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。制备嵌合抗体的方法是本领域中已知的。
非人(例如，鼠类)抗体的“人源化”形式为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如抗体的Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或其他抗原结合亚序列)，其包含最小限度的源自非人免疫球蛋白的序列。
在极大程度上，人源化抗体为这样的人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者的互补决定区(CDR)的残基被来自具有所希望的特异性、亲和力和能力的非人物种(供者抗体)(例如小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基所替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基所替代。此外，人源化抗体可以包含这样的残基，所述残基既不在受者抗体中也不在所输入的CDR或构架序列中发现。进行这些修饰以进一步细化和最大化抗体性能。一般地，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，和通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环(hypervariable loop)相应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR区为人免疫球蛋白序列的那些，尽管FR区可以包括一个或多个改善结合亲和力的氨基酸置换。FR中的这些氨基酸置换的数目在H链中通常不多于6，和在L链中不多于3。最好地，人源化抗体还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常为人免疫球蛋白的Fc)的至少一部分。进一步的细节，参见Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann等人，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol，2：593-596(1992)。人源化抗体包括灵长类化抗体(PRIMATIZED antibody)，其中该抗体的抗原结合区域源自通过例如用目的抗原对猕猴进行免疫接种而产生的抗体。制备人源化抗体的方法在本领域中是已知的。
还可以通过使用各种本领域中已知的技术(包括噬菌体展示文库)来产生人抗体。Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581(1991)。Cole等人和Boerner等人的技术对于制备人单克隆抗体也是可用的。Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner等人，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)。
本发明的结合性抗体的“功能性片段”为这样的那些片段，所述片段保持了以与它们所源自的完整全长链分子基本上相同的亲和力与BLyS、TACI、BAFF-R或BCMA结合，并且可以能够耗竭B细胞，如通过体外或体内测定法(例如本文所描述的那些)所测量的。
抗体“效应子功能”是指归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性，并且随着抗体同种型而变化。抗体效应子功能的例子包括：Clq结合和依赖补体的细胞毒性；Fc受体结合；依赖抗体的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞激活。
“依赖抗体的细胞毒性”或“ADCC”是指这样的细胞毒性形式，其中在存在于某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcRs)之上所结合的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性地与携带抗原的靶细胞结合并随后用细胞毒素杀伤靶细胞。抗体“武装”了细胞毒性细胞，并且是此类杀伤所绝对必需的。用于介导ADCC的初级细胞，NK细胞，只表达FcyRIII，而单核细胞表达FcyRI、FcyRII和FcyRIII。在Ravetch和Kinet，Ann.Rev.Immunol 9：457-92(1991)的第464页上的表3中概括了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定法，例如在美国专利号5,500,362或5,821,337中所描述的那种。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或者另外地，目的分子的ADCC活性可以在体内进行评估，例如在动物模型中，例如Clynes等人，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所公开的那种。
“依赖补体的细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的激活是通过补体系统的第一组分(Clq)与(合适亚类的)抗体结合来起始的，所述抗体结合至其关联抗原(cognateantigen)。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法，例如如在Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所描述的。
“分离的”抗体是已被鉴定并且与其天然环境的组分分开和/或从中回收的抗体。其天然环境的污染物组分为干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，所述物质可以包括酶、激素和其他蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体(1)纯化至抗体的大于95重量％，如通过Lowry方法所测得的，和最优选地大于99重量％，(2)纯化至这样的程度，即足以通过使用旋杯式序列分析仪来获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基，或者(3)纯化至通过使用考马斯蓝或优选地银染色，经在还原或非还原条件下的SDS-PAGE而确定的同质性。
分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不会存在。然而，通常，经过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体。
氨基酸可以根据其侧链性质的相似性进行分组(A.L.Lehninger，Biochemistry，第二版，第73-75页，Worth Publishers，New York(1975))：(1)非极性的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电荷且极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)；(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H-)。备选地，基于共同的侧链性质，可以将天然存在的残基划分为几个组：(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性且亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性的：Asp、Glu；(4)碱性的：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
在本发明中所使用的术语“保守”氨基酸置换意指这样的氨基酸置换，其替换了功能上等价的氨基酸。保守氨基酸改变导致所得的肽的氨基酸序列中的沉默改变。例如，具有相似极性的一个或多个氨基酸充当了功能等价物，并导致在肽的氨基酸序列内的沉默改变。一般地，组内的置换可以被认为在结构和功能方面是保守的。然而，技术人员将会认识到，特定残基的作用是由它在分子(该残基出现在所述分子中)的三维结构中的情境所决定的。例如，Cys残基可以以氧化(二硫化物)形式存在，这具有比还原(硫醇)形式更小的极性。Arg侧链的长脂肪族部分可以构成其结构或功能作用的关键特征，并且这可以通过非极性的而不是另一个碱性的残基的置换而最佳地得到保存。此外，还将会认识到，包含芳香族基团的侧链(Trp、Tyr和Phe)可以参与离子-芳香族相互作用或“阳离子-π”相互作用。在这些情况下，用酸性的或不带电荷且极性的组的成员置换这些侧链之一可以是在结构和功能方面保守的。诸如Pro、Gly和Cys(二硫化物形式)的残基可以对主链构象具有直接的影响，并且常常不可能在没有结构变形的情况下被置换。
关于本文所鉴定的配体或受体多肽序列，“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为候选序列中这样的氨基酸残基的百分比，所述氨基酸残基在经过下列程序后与本文所鉴定的此类配体或受体序列中的氨基酸残基相同：对这些序列进行比对，并如果需要则引入缺口以获得最大序列同一性百分比，并且不将任何保守置换考虑作为序列同一性的一部分。为了测定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以处于本领域技能之内的各种方式来达到，例如，使用公众可获得的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上获得最大比对所需的任何算法。然而，为了此处的目的，如下面所描述的，通过使用序列比较计算机程序ALIGN-2来获得氨基酸序列同一性％值，其中ALIGN-2程序的完整源代码提供在下表中。ALIGN-2序列比较计算机程序的创造者是Genentech，Inc.，并且下表中所显示的源代码已与用户文档一起提交给了美国版权局(U.S.Copyright Office，Washington D.C.，20559)，在那里它以美国版权注册号TXU510087进行了注册。ALIGN-2程序是通过Genentech，Inc.，South San Francisco，California而公众可获得的，或者可以从下表中所提供的源代码进行编译。为了在UNIX操作系统，优选地数字UNIX V4.0D上进行使用，应当对ALIGN-2程序进行编译。所有序列比较参数由ALIGN-2程序进行设置并且不再变化。
用于鉴定在蛋白质中的作为优选的诱变位置的某些残基或区域的一种有用方法称为“丙氨酸扫描诱变法(alanine scanningmutagenesis)”，如由Cunningham和Wells，Science，244：1081-1085(1989)所描述的。鉴定出一个或一组靶残基(例如，带电荷的残基例如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选地，丙氨酸或聚丙氨酸)来替代之以影响所述氨基酸与结合靶的相互作用。然后，通过在置换位点处或者为置换位点引入进一步的或其他的变体，来对那些显示出对于置换的功能敏感性的氨基酸位置进行细化。因此，虽然用于引入氨基酸序列变化的位点是预先确定的，但是突变本身的性质不需要预先确定。例如，为了分析在给定位点处的突变的性能，在靶密码子或区域处进行丙氨酸扫描或随机诱变，并且就所希望的活性来对所表达的变体进行筛选。
术语“双面角”是指围绕键的旋转。参见例如，Creighton，T.E.，(1993)Protein：Structures and Molecular Properties，第2版，W.H.Freeman and Company，New York，NY。术语“φ”是表示了围绕氨基酸的N-C键的旋转的双面角。参见例如，Creighton，T.E.，(1993)Protein：Structures and Molecular Properties，第2版，W.H.Freeman and Company，New York，NY。I型β转角描述于Hutchinson，E.G.& Thornton，J.M.(1994)Arevised set ofpotentials for beta turn formation in proteins.Protein Science3，2207-2216中。
“融合蛋白”和“融合多肽”是指具有共价连接在一起的两个部分的多肽，其中每一部分为具有不同特性的多肽。所述特性可以是生物学特性，例如体外或体内活性。所述特性也可以是简单的化学或物理特性，例如与靶分子的结合、反应的催化等。所述两个部分可以通过单个肽键直接连接，或者通过包含一个或多个氨基酸残基的肽连接体来连接。一般地，所述两个部分和连接体将会彼此地处于阅读框中。
“缀合物”是指任何杂合分子，包括融合蛋白以及包含氨基酸或蛋白质部分和非蛋白质部分的分子。缀合物可以通过本领域中已知的各种技术来合成，包括例如重组DNA技术、固相合成、液相合成、有机化学合成技术或这些技术的组合。合成的选择将依赖于待产生的特定分子。例如，性质上不是完全“蛋白质”的杂合分子可以通过重组技术和液相技术的组合来合成。
如本文中所使用的，术语“Fc融合蛋白”是指抗体样分子，其组合了异源蛋白质的结合特异性和免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能。从结构上说，Fc融合蛋白包含了具有所希望的结合特异性的氨基酸序列(其不同于抗体的抗原识别和结合位点(即，是异源的))与免疫球蛋白恒定结构域序列的融合。Fc融合蛋白分子通常包括至少包含受体或配体的结合位点的邻接氨基酸序列。Fc融合蛋白中的免疫球蛋白恒定结构域序列可以获自任何免疫球蛋白，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型，IgA(包括lgA-1和IgA-2)，IgE，IgD或IgM。例如，根据本发明有用的Fc融合蛋白为包含BLyS受体的BLyS结合部分而没有BLyS受体的跨膜或胞质序列的多肽。在一个实施方案中，BAFF-R、TACI或BCMA的细胞外结构域与免疫球蛋白序列的恒定结构域相融合。
术语“哺乳动物”是指任何被归类为哺乳类的动物，包括人、家养和农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，例如狗、马、猫、牛等。优选地，此处的哺乳动物为人。
术语“治疗有效量”是指对于“减轻”或“治疗”受试者或哺乳动物中的疾病或病症而言有效的抗体或拮抗剂药物的量。在癌症的情况下，治疗有效量的药物可以减少癌细胞的数目；减少肿瘤大小；抑制(即，在某种程度上减缓和优选地终止)癌细胞浸润入外周器官中；抑制(即，在某种程度上减缓和优选地终止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上缓解一种或多种与癌症相关的症状。参见下面的“治疗”的定义。在药物可以阻止生长或杀死现有的癌细胞方面来说，它可以是抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。
本发明的BLyS或BLyS受体抗体可以通过瞬时或稳定转染真核宿主细胞例如CHO细胞来产生。
本文所用的“载体(carrier)”包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度的情况下对暴露于它们的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学上可接受的载体为pH被缓冲的水溶液。生理学上可接受的载体的例子包括缓冲液，例如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；和/或非离子型表面活性剂，例如TWEEN、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
多核苷酸，载体(vector)，宿主细胞
根据本文公开的许多实施方案，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂可以包括通过使用在特定载体中的特定多核苷酸和使用特定宿主细胞而产生的特定多肽。本发明的各种类型的多肽可以宽泛地进行描述，并且选自基于受体的序列、基于抗体的序列和人工的(即非天然的)结合序列。基于受体的序列的例子为结合BLyS的那些序列，其分离自或源自在体内结合BLyS的受体(例如TACI、BAFF-R或BCMA)的结构域。基于抗体的序列为通过使用抗体形成技术而产生的并保持了抗体分子一般结构的那些序列。基于抗体的序列的例子为LymphoStat-B或针对BLyS的受体的抗体。人工的结合序列的例子包括本文所描述的17肽，掺入了一个或多个17肽作为核心区的多肽，以及17肽和多肽的经共价修饰的形式(例如Fc融合蛋白、经标记的多肽、受保护的多肽、经缀合的多肽、融合蛋白等)。用于制备这些形式的多肽各种技术在本文中进行了描述。用于标记多肽和将分子缀合至多肽的方法是本领域中已知的。
本发明的组合物可以通过使用本领域中已知的重组技术来制备。
下面的描述涉及通过培养用包含编码性核酸的载体转化或转染的宿主细胞并从细胞培养物中回收多肽来产生此类特定多肽的方法。(参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)；Dieffenbach等人，PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press，1995))。
为了进一步的克隆(DNA的扩增)或表达，可以将编码所希望的多肽的核酸(例如，cDNA或基因组DNA)插入可复制的载体中。各种载体是公众可获得的。载体组分一般包括但不限于下列中的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，它们中的每个均在下面进行了描述。可以采用的可选的信号序列、复制起点、标记基因、增强子元件和转录终止子序列是本领域中已知的并在WO 97/25428中作了进一步详细的描述。
通常，表达和克隆载体包含被宿主生物体所识别并有效连接至编码性核酸序列的启动子。启动子是位于结构基因的起始密码子上游(5′)的非翻译序列(一般在约100至1000bp之内)，其控制与它们有效连接的特定核酸序列的转录和翻译。通常，此类启动子分为两类，即诱导型的和组成型的。诱导型启动子为这样的启动子，所述启动子响应于培养条件的某些变化(例如，营养物的存在或不存在，或者温度的变化)而起始从在其控制之下的DNA上所进行的转录的水平增加。目前，众所周知许多被各种潜在的宿主细胞所识别的启动子。通过经限制酶消化从源DNA中移除启动子并将分离的启动子序列插入到载体中，将这些启动子有效连接至编码性DNA。
包含一种或多种上面所列的组分的合适载体的构建采用标准连接技术。将分离的质粒或DNA片段进行切割、剪裁、并重新连接为对于产生所需要的质粒而言所希望的形式。为了进行分析以确认所构建的质粒中的正确序列，可以使用连接混合物来转化大肠杆菌(E.coli)K12菌株294(ATCC 31，446)，并在合适时通过氨苄青霉素或四环素抗性来选择成功的转化体。从转化体中制备质粒，通过限制性核酸内切酶消化进行分析，和/或通过使用本领域中已知的标准技术进行测序。[参见例如，Messing等人，Nucleic Acids Res.，9：309(1981)；Maxam等人，Methods in Enzymology，65：499(1980)]。
可以采用提供了编码性DNA在哺乳动物细胞中的瞬时表达的表达载体。一般地，瞬时表达牵涉使用这样的表达载体，其能够在宿主细胞中有效地复制，从而使得宿主细胞积累许多拷贝的该表达载体，并从而合成高水平的由该表达载体所编码的所希望的多肽[Sambrook等人，同上]。包含合适的表达载体和宿主细胞的瞬时表达系统使得能够方便而肯定地鉴定出由经克隆的DNA所编码的多肽，以及就所希望的生物学或生理学特性来快速地筛选此类多肽。
适合于为了在重组脊椎动物细胞培养物中合成所希望的多肽而进行调整的其他方法、载体和宿主细胞描述于Gething等人，Nature，293：620-625(1981)；Mantei等人，Nature，281：40-46(1979)；EP 117,060；和EP 117,058中。
用于在此处的载体中克隆或表达DNA的适合的宿主细胞包括原核细胞、酵母或高等真核细胞。用于此目的的适合的原核细胞包括但不限于真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠杆菌，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacillus)例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如，在于1989年4月12日公布的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属(Pseudomonas)例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，和链霉菌属(Streptomyces)。优选地，宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶。
除了原核生物以外，真核微生物例如丝状真菌或酵母也是载体的合适的克隆或表达宿主。用于表达糖基化多肽的合适的宿主细胞源自多细胞生物体。所有此类宿主细胞的例子在WO97/25428中作了进一步描述。
用上面描述的表达或克隆载体转染和优选地转化宿主细胞，并在营养基质中进行培养，所述营养基质经改良而适合于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所希望的序列的基因。
“转染”是指，表达载体被宿主细胞吸收，不论编码序列是否事实上被表达。众多转染方法是普通技术人员已知的，例如，CaPO4和电穿孔。一般地，当该载体的运转的任何指征出现在宿主细胞内时，认为是成功的转染。
“转化”表示将DNA引入生物体中，从而该DNA作为染色体外元件或通过染色体整合体而成为可复制的。依赖于所使用的宿主细胞，可以通过使用适合于此类细胞的标准技术来进行转化。一般地，将采用氯化钙的钙处理(如在Sambrook等人(同上)中所描述的)或电穿孔用于原核细胞或包含实质性细胞壁屏障的其他细胞。将使用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的感染用于转化某些植物细胞，如由Shaw等人，Gene，23：315(1983)和于1989年6月29日公布的WO 89/05859所描述的。此外，可以通过使用超声处理来转染植物，如在于1991年1月10日公布的WO 91/00358中所描述的。
对于没有此类细胞壁的哺乳动物细胞，可以采用Graham和vander Eb，Virology，52：456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转化的一般方面已在美国专利号4,399,216中作了描述。通常，根据Van Solingen等人，J.Bact.，130：946(1977)和Hsiao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，76：3829(1979)的方法来施行向酵母中的转化。然而，也可以使用用于将DNA引入细胞中的其他方法，例如通过核微量注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞融合、或者聚阳离子(例如polybrene、聚鸟氨酸)。关于用于转化哺乳动物细胞的各种技术，参见Keown等人，Methods in Enzymology，185：527-537(1990)，和Mansour等人，Nature，336：348-352(1988)。
原核细胞可以在合适的培养基中进行培养，如在Sambrook等人(同上)中所一般性地描述的。商购可得的培养基的例子包括Ham′sF10(Sigma)、极限必需培养基(″MEM″，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改良的Eagle培养基(″DMEM″，Sigma)。在需要时，任何此类培养基可以补充有激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如庆大霉素)、痕量元素(其定义为通常以在微重量摩尔浓度范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等价的能量来源。还可以以本领域技术人员将会知晓的适当浓度包含任何其他必需的补充物。培养条件，例如温度、pH等，为先前关于被选择用于表达的宿主细胞所使用的那些，并且对于普通技术人员来说将会是显而易见的。
一般地，用于最大化哺乳动物细胞培养物的生产力的原理、方案和实用技术可以在Mammalian Cell Biotechnology：A PracticalApproach，M.Butler(编辑)(IRL Press，1991)中找到。
经表达的多肽可以作为分泌型多肽从培养基中回收，虽然当直接产生而没有分泌信号时，也可以从宿主细胞裂解液中回收。如果多肽是膜结合的，可以通过使用合适的去污剂溶液(例如Triton-X 100)从膜上将它释放出来，或者可以通过酶促切割来释放其细胞外区域。
当在非人起源的重组细胞中产生多肽时，它没有人起源的蛋白质或多肽。但是，常常必需从重组细胞蛋白质或多肽中回收或纯化所述多肽，以获得基本上同质的制备物。作为第一步，可以离心培养基或裂解液以去除颗粒状的细胞碎片。下面是合适的纯化操作程序的示例性的操作程序：在离子交换柱上进行分级；乙醇沉淀；反相HPLC；在二氧化硅或阳离子交换树脂(例如DEAE)上的色谱法；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；凝胶过滤，其使用例如Sephadex G-75；和A蛋白Sepharose柱，以去除污染物例如IgG。
噬菌体展示
根据一些实施方案，选自下列的本发明的多肽可以在噬菌体展示中使用：式I、式II、式III、ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ ID NO：13)、ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ ID NO：14)、ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQ IDNO：15)、ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQ ID NO：16)、ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQ ID NO：17)和在WO 05/000351的图32中所列出的序列。
使用噬菌体展示技术使得能够产生大的蛋白质变体文库，可以就那些以高亲和力与靶分子结合的序列来快速地对所述蛋白质变体进行分选。将编码变体多肽的核酸与编码病毒外壳蛋白(例如基因III蛋白或基因VIII蛋白)的核酸序列相融合。已开发出了单价噬菌体展示系统，其中编码所述蛋白质或多肽的核酸序列与编码基因III蛋白的部分的核酸序列相融合。(Bass，S.，Proteins，8：309(1990)；Lowman和Wells，Methods：A Companion to Methods in Enzymology，3：205(1991))。在单价噬菌体展示系统中，基因融合物以低水平表达，并且还表达了野生型基因III蛋白，从而保持了颗粒的感染性。用于产生肽文库和筛选那些文库的方法已在许多专利(例如，美国专利号5,723,286；美国专利号5,432,018；美国专利号5,580,717；美国专利号5,427,908；和美国专利号5,498,530)中公开。
在一些实施方案中，式I、式II或式III被表达为在噬菌体上的肽文库。然后，使表达式I、式II或式III的多肽文库的噬菌体经历基于BLyS结合的选择。在一些实施方案中，选择过程牵涉允许某些噬菌体与生物素化的BLyS结合，后者随后被结合至中性抗生物素蛋白(neutravidin)平板。回收并繁殖通过BLyS-生物素-中性链霉抗生物素蛋白结合而结合至平板的噬菌体。在一些实施方案中，使所述噬菌体经历几轮选择。在一些实施方案中，将所述噬菌体与BLyS-生物素一起进行温育，随后添加未生物素化的BLyS作为竞争结合剂。
在实施例中提供了在本发明的情况下使用噬菌体展示的另外的指导。
融合或缀合至异源多肽的多肽
进一步考虑在此处的方法中使用包含本发明的多肽的Fc融合蛋白分子。在一些实施方案中，所述分子包含本发明的多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定区域的融合。对于Fc融合蛋白的二价形式，这样的融合物有用地包含IgG分子的Fc区。在进一步的实施方案中，Fc区来自人IgG1分子。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合物包括IgG1分子的铰链、CH2和CH3区或者铰链、CH1、CH2和CH3区。
关于免疫球蛋白融合物的产生，还可参见美国专利号5,428,130，美国专利号5,843,725，美国专利号6,018,026，和Chamow等人，TIBTECH，14：52-60(1996)。
最简单和最直接的Fc融合蛋白设计常常将本发明的拮抗剂多肽(优选地，天然序列)的结合结构域与免疫球蛋白重链的Fc区相组合。在另一个实施方案中，所述多肽可以是人工的，例如可以将包含下列序列的多肽共价连接至免疫球蛋白的Fc部分：式I、式II、式III、ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ ID NO：13)、ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ IDNO：14)、ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQ ID NO：15)、ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQ ID NO：16)、ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQ ID NO：17)、或在图32中所列出的序列。此外，这些多肽中的一个或多个可以彼此连接和连接至免疫球蛋白的Fc部分。
通常，当制备本发明的Fc融合蛋白时，将编码结合结构域的核酸在C-末端融合至编码免疫球蛋白恒定结构域序列的N-末端的核酸，然而，N-末端融合物也是可能的。
通常，在此类融合物中，所编码的嵌合多肽将会至少保留免疫球蛋白重链恒定区的在功能上有活性的铰链、CH2和CH3结构域。也可以向恒定结构域的Fc部分的C-末端进行融合，或者在对于重链的CH1或轻链的相应区域而言紧N-末端处进行融合。进行融合的精确位点不是关键性的；具体位点是众所周知的并且可以进行选择以优化Fc融合蛋白的生物学活性、分泌或结合特征。
在一个优选的实施方案中，将结合结构域序列融合至免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc区的N-末端。可以将整个重链恒定区与结合结构域序列相融合。然而，更优选地，在融合中使用这样的序列，所述序列开始于刚好在木瓜蛋白酶切割位点(其在化学上定义了IgG Fc)(即残基216，将重链恒定区的第一个残基作为残基114)或其他免疫球蛋白的类似位点上游的铰链区。在一个特别优选的实施方案中，将结合结构域氨基酸序列融合至IgG重链的(a)铰链区以及CH2和CH3，或者(b)CH1、铰链、CH2和CH3结构域。
对于双特异性Fc融合蛋白，将Fc融合蛋白装配为多聚体，和特别地异二聚体或异四聚体。一般地，这些经装配的免疫球蛋白将会具有已知的单元结构。基本的四链结构单元为IgG、IgD和IgE所存在的形式。四链单元在更高分子量的免疫球蛋白中重复；IgM一般作为通过二硫键而联合在一起的四基本单元的五聚体存在。IgA球蛋白，和偶然地IgG球蛋白，也可以以多聚体形式存在于血清中。在多聚体的情况下，所述四单元中的每一个可以是相同的或不同的。
在本文范围内的各种示例性的经装配的Fc融合蛋白示意性地图解如下：(a)ACL-ACL；(b)ACH-(ACH，ACL-ACH，ACL-VHCH，或VLCL-ACH)；(c)ACL-ACH-(ACL-ACH，ACL-VHCH，VLCL-ACH，或VLCL-VHCH)；(d)ACL-VHCH-(ACH，或ACL-VHCH，或VLCL-ACH)；(e)VLCL-ACH-(ACL-VHCH，或VLCL-ACH)；和(f)(A-Y)n-(VLCL-VHCH)2，其中每个A代表相同或不同的多肽，所述多肽包含下列氨基酸序列：源自BLyS受体结构域的序列，源自针对BLyS或针对BLyS受体的抗体的序列，或者人工序列，例如式I、式II、式III、ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ ID NO 5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ ID NO6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQ ID NO 7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQID NO 8)、ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQ ID NO 9)或在图32中所列出的序列，或其组合。
VL为免疫球蛋白轻链可变结构域；VH为免疫球蛋白重链可变结构域；CL为免疫球蛋白轻链恒定结构域；CH为免疫球蛋白重链恒定结构域；n为大于1的整数；Y指明了共价交联剂的残基。
为了简洁，上述结构只显示关键特征；它们没有标明免疫球蛋白的连接(J)或其他结构域，也没有显示二硫键。但是，当此类结构域是结合活性所必需的时，应当将它们构建成存在于它们在免疫球蛋白分子中所占据的通常位置中。
备选地，可以将Fc序列插入在免疫球蛋白重链和轻链序列之间，从而获得包含嵌合重链的免疫球蛋白。在该实施方案中，在铰链和CH2结构域之间，或者在CH2和CH3结构域之间，将Fc序列融合至在免疫球蛋白的每个臂中的免疫球蛋白重链的3′末端。Hoogenboom等人，Mol.Immunol，28：1027-1037(1991)已报道了类似的构建体。
虽然在本发明的Fc融合蛋白中免疫球蛋白轻链的存在不是必需的，但是可以存在免疫球蛋白轻链，其或者共价联合至结合结构域-免疫球蛋白重链融合多肽，或者直接融合至结合结构域。在前一种情况下，编码免疫球蛋白轻链的DNA通常与编码结合结构域-免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA一起共表达。在分泌后，所述杂合的重链和轻链将会共价联合，从而提供包含两个经二硫键连接的免疫球蛋白重链-轻链对的免疫球蛋白样结构。适合于制备此类结构的方法例如在于1989年3月28日授权的美国专利号4,816,567中公开。
最方便地，通过将编码结合结构域部分的cDNA按阅读框架融合至免疫球蛋白cDNA序列来构建Fc融合蛋白。然而，也可以使用与基因组免疫球蛋白片段的融合(参见例如，Aruffo等人，Cell，61：1303-1313(1990)；和Stamenkovic等人，Cell，66：1133-1144(1991))。后一种类型的融合要求存在用于表达的Ig调节序列。基于所发表的来自源于脾或外周血淋巴细胞的cDNA文库的序列，通过杂交或通过聚合酶链式反应(PCR)技术可以分离出编码IgG重链恒定区的cDNA。将编码所述Fc融合蛋白的结合结构域和免疫球蛋白部分的cDNA串联插入到指导在所选宿主细胞中的有效表达的质粒载体中。
进行了特定的修饰，以产生在形成用于在本发明中使用的融合分子(例如，BLyS和/或APRIL拮抗剂Fc融合分子)中有用的Fc序列。特别地，产生了六种形式的经修饰的人IgG1 Fc以用于形成Fc融合蛋白，并将它们命名为Fc-488以及Fc4、Fc5、Fc6、Fc7和Fc8。Fc-488(SEQ ID NO：39)被设计用于方便地克隆包含人γ1 Fc区的融合蛋白，并且通过使用野生型人免疫球蛋白γ1恒定区作为模板来构建它。对于由于未成对的半胱氨酸残基而引起的潜在有害影响的关注导致决定用丝氨酸残基替代通常与免疫球蛋白轻链恒定区形成二硫键的半胱氨酸。在编码EU索引(EU index)位置218的密码子处引入另外的变化以引入BglII限制酶识别位点，从而方便将来的DNA操作。将这些变化被引入在PCR引物上所编码的PCR产物之中。由于BglII位点的位置并且为了使Fc铰链区完整，将EU索引位置216和217的密码子掺入到融合蛋白伙伴序列中。
Fc4、Fc5和Fc6包含突变，以通过减少FcγRI结合和补体Clq结合来降低由Fc介导的效应子功能。Fc4包含被引入Fc-488中的相同氨基酸置换。引入另外的氨基酸置换以降低潜在的由Fc介导的效应子功能。特别地，引入三个氨基酸置换以减少FcγRI结合。这些为在EU索引位置234、235和237处的置换。在这些位置处的置换已显示减少了与FcγRI的结合(Duncan等人，Nature 332：563(1988))。这些氨基酸置换还可以减少FcγRIIa结合，以及FcγRIII结合(Sondermann等人，Nature 406：267(2000)；Wines等人，J.Immunol.164：5313(2000))。
几个小组已经描述了EU索引位置330和331(SEQ ID NO：6的氨基酸残基134和135)在补体Clq结合和随后的补体固定中的相关性(Canfield和Morrison，J.Exp.Med.173：1483(1991)；Tao等人，J.Exp.Med.178：661(1993))。在Fc4中引入在这些位置处的氨基酸置换以减少补体固定。Fc4的CH3结构域与在相应的野生型多肽中发现的相同，除了终止密码子外，所述终止密码子被从TGA改变为TAA以消除当所克隆的DNA在大肠杆菌的dam+菌株中生长时潜在的dam甲基化位点。
在Fc5中，将EU索引位置218处的精氨酸残基突变回赖氨酸，因为在包含该特定Fc的融合蛋白中未使用BglII克隆流程。Fc5的其余部分与上面关于Fc4的描述相匹配。
Fc6与Fc5相同，除了已消除了羧基末端赖氨酸密码子外。常常在从B细胞中分泌之前在翻译后从成熟免疫球蛋白中去除成熟免疫球蛋白的C-末端赖氨酸，或者在血清循环期间去除。因此，在循环抗体上通常找不到C-末端赖氨酸残基。正如上面在Fc4和Fc5中，Fc6序列中的终止密码子被改变为TAA。
Fc7与野生型γ1 Fc相同，除了位于CH2结构域中的EU索引位置297处的氨基酸置换外。EU索引位置Asn-297是N-联碳水化合物附着位点。由于碳水化合物结构中潜在的批与批之间的(batch-to-batch)变化，因而N-联碳水化合物在重组表达的蛋白质中引入潜在的变异性来源。在消除这种潜在变异性的尝试中，将Asn-297突变为谷氨酰胺残基以防止N-联碳水化合物附着在该残基位置处。残基297处的碳水化合物还参与Fc与FcRIII的结合(Sondermann等人，Nature 406：267(2000))。因此，一般地，碳水化合物的去除应当减少了包含重组Fc7的融合蛋白与FcγR的结合。如上面一样，将Fc7序列中的终止密码子突变为TAA。
Fc8与SEQ ID NO：6中所显示的野生型免疫球蛋白γ1区相同，除了在EU索引位置220处的半胱氨酸残基被丝氨酸残基替代外。该突变消除了通常与免疫球蛋白轻链恒定区形成二硫键的半胱氨酸残基。使用这些特定Fc结构域中的任一种来形成所述BLyS和/或APRIL拮抗剂在本发明的范围之内。
本发明还考虑了这些分子的亮氨酸拉链形式。“亮氨酸拉链”是在本领域中用于指富含亮氨酸的序列的术语，所述富含亮氨酸的序列增强、促进或驱动其融合伙伴(例如，亮氨酸拉链所融合或连接至的序列或分子)的二聚化或三聚化。各种亮氨酸拉链多肽已在本领域中作了描述。参见例如，Landschulz等人，Science，240：1759(1988)；美国专利5,716,805；WO 94/10308；Hoppe等人，FEBS Letters，344：1991(1994)；Maniatis等人，Nature，341：24(1989)。本领域技术人员将会意识到，可以将亮氨酸拉链序列融合在本发明的多肽的5′或3′末端。
还可以以这样的方式来修饰本发明的多肽，即通过将所述多肽融合至另一个异源多肽或氨基酸序列而形成嵌合分子。
根据一些实施方案，此类异源多肽或氨基酸序列为发挥使嵌合分子低聚化的作用的多肽或氨基酸序列。在一些实施方案中，这样的嵌合分子包含所述多肽与标签多肽的融合，所述标签多肽提供了标签抗体可以选择性地与之结合的表位。该表位标签一般置于所述多肽的氨基或羧基末端。
可以通过使用针对该标签多肽的抗体来检测所述多肽的此类带有表位标签的形式的存在。此外，提供表位标签使得所述多肽能够容易地通过亲和纯化来进行纯化，其中使用标签抗体或与该表位标签结合的另一类型的亲和基质。
各种标签多肽及其各自的抗体是本领域中众所周知的。例子包括多组氨酸(poly-his)或多组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；fluHA标签多肽及其抗体12CA5[Field等人，Mol.Cell.Biol.，8：2159-2165(1988)]；c-myc标签及针对其的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体[Evan等人，Molecular and Cellular Biology，5：3610-3616(1985)]；和单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体[Paborsky等人，Protein Engineering，3(6)：547-553(1990)]。其他标签多肽包括Flag-肽[Hopp等人，BioTechnology，6：1204-1210(1988)]；KT3表位肽[Martin等人，Science，255：192-194(1992)]；α-微管蛋白表位肽”[Skinner等人，J.Biol.Chem.，266：15163-15166(1991)]；和T7基因10蛋白肽标签[Lutz-Freyermuth等人，Proc.Natl.Acad.Sci：USA，87：6393-6397(1990)]。
肽-聚合物缀合物的构建
在一些实施方案中，用于给合成肽缀合聚合物(例如PEG化)的策略在于，通过在溶液中形成缀合物连接来将肽和PEG部分相组合，它们各自携带有能相互反应的特殊官能度。可以用常规的固相合成而容易地制备所述肽。在特定位点处用合适的官能团来“预活化”所述肽。在与PEG部分反应之前，纯化并充分表征所述前体。所述肽与PEG的连接通常在水相中发生，并且可以通过反相分析型HPLC而容易地进行监测。PEG化的肽可以容易地通过制备型HPLC来进行纯化，并且通过分析型HPLC、氨基酸分析和激光解吸质谱法来进行表征。
在一些实施方案中，主要依赖于反应条件、聚合物的分子量等，经由肽的一个或多个氨基酸残基将所述肽共价键合至聚合物上的末端反应性基团。具有反应性基团的聚合物在本文中被称为活化的聚合物。所述反应性基团选择性地与所述肽上的游离氨基或其他反应性基团反应。潜在的反应位点包括：N-末端氨基，赖氨酸残基上的ε-氨基，以及其他氨基、亚氨基、羧基、巯基、羟基和其他亲水基团。然而，可以理解，为了获得最佳结果而选择的反应性基团的类型和数量以及所采用的聚合物的类型将会依赖于所采用的特定的肽，以避免使反应性基团与太多的在所述肽上的特别活跃的基团发生反应。在一些实施方案中，可以在适合于缀合的位置处置换反应性残基(例如，赖氨酸(K)、经修饰的非天然氨基酸或其他小分子)。
在一些实施方案中，所述肽包含下列序列：WO 05/000351的式I、式II、式III、ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ ID NO 5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ ID NO 6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQ ID NO 7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQ ID NO 8)、ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQ ID NO9)、或在图32中所列出的序列，具有末端反应性基团。
在一些实施方案中，所述肽包含至少一个，和更优选地多于一个的包含下列序列的多肽：WO 05/000351的式I、式II、式III、ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ ID NO 5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ ID NO6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQ ID NO 7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQID NO 8)、ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQ ID NO 9)、或在图32中所列出的序列。被连接在一起的多肽可以具有相同的序列或具有不同的序列和末端反应性基团。在一些实施方案中，这些多肽可以彼此连接，可选地，通过使用连接体。
尽管缀合可以出现在所述多肽上的任何反应性氨基酸处，但在一些实施方案中，反应性氨基酸为赖氨酸，其通过其游离ε-氨基而连接至活化的聚合物的反应性基团，或者为谷氨酸或天冬氨酸，其通过酰胺键而连接至所述聚合物。在一些实施方案中，所述肽的反应性氨基酸在位置X2和Xlz处不是半胱氨酸残基。
与每种肽的聚合物缀合的程度将依赖于所述肽上反应位点的数目，聚合物的分子量、亲水性和其他特性，以及所选择的具体的肽衍生化位点。在一些实施方案中，所述缀合物具有1至10个聚合物分子/肽分子的最终摩尔比，但也考虑了更大数目的附着至本发明的肽的聚合物分子。在一些实施方案中，每个缀合物包含一个聚合物分子。通过使用实验矩阵(experimental matrix)(其中改变时间、温度和其他反应条件以改变置换的程度)容易地获得所希望的数量的衍生化，在这之后通过大小排阻层析或其他本领域中已知的手段来测定缀合物的聚合物取代的水平。
在一些实施方案中，所述聚合物仅包含单个具有反应性的基团。这有助于避免蛋白质分子的交联。但是，在本文范围之内的是，使反应条件最大化以减少交联，或者通过凝胶过滤或离子交换色谱法来纯化反应产物以回收基本上同质的衍生物。在其他实施方案中，所述聚合物包含两个或更多个反应性基团，以便将多个肽连接至聚合物主链。
再次，可以使用凝胶过滤或离子交换色谱法来以基本上均质的形式回收所希望的衍生物。在一些实施方案中，所述聚合物直接共价键合至所述肽，而不使用多官能的(通常双官能的)交联剂。在一些实施方案中，存在1∶1的PEG链对肽的摩尔比。
共价修饰反应可以通过一般用于使具有生物学活性的材料与惰性聚合物进行反应的任何合适的方法来进行，优选地，在约pH 5-9，更优选地7-9，如果在所述肽上的反应性基团为赖氨酸基团。一般地，所述过程牵涉制备活化的聚合物(通常具有至少一个待活化的末端羟基的聚合物)，从该聚合物制备活性基材，和之后使所述肽与所述活性基材反应从而产生适合于配制的肽。上面的修饰反应可以通过几种方法来进行，所述方法可以牵涉一个或多个步骤。可以用于在一步反应中产生活化的聚合物的修饰试剂的例子包括氯化三聚氰酸(2，4，6-三氯-S-三嗪)和氟化三聚氰酸。
在一些实施方案中，修饰反应以两步发生，其中使聚合物首先与酸酐例如琥珀酸酐或戊二酸酐进行反应从而形成羧酸，然后使所述羧酸与能够与羧酸反应的化合物进行反应从而形成活化的聚合物，该活化的聚合物具有能够与所述肽反应的反应性酯基团。此类化合物的例子包括N-羟基琥珀酰亚胺、4-羟基-3-硝基苯磺酸等，并且优选地使用N-羟基琥珀酰亚胺或4-羟基-3-硝基苯磺酸。例如，可以在提高的温度，优选地约100-110℃下，使单甲基取代的PEG与戊二酸酐反应四小时。然后，在碳二亚胺试剂例如二环己基碳二亚胺或异丙基碳二亚胺存在下，使如此产生的单甲基PEG-戊二酸与N-羟基琥珀酰亚胺反应从而产生活化的聚合物，甲氧基聚乙二醇基-N-琥珀酰亚胺基戊二酸酯，它然后可以与GH反应。该方法在Abuchowski等人，Cancer Biochem.Biophys.，7：175-186(1984)中详细作了描述。在另一个实施方案中，单甲基取代的PEG可以与戊二酸酐反应，随后在二环己基碳二亚胺存在下与4-羟基-3-硝基苯磺酸(HNSA)反应从而产生活化的聚合物。HNSA由Bhatnagar等人，Peptides：Synthesis-Structure-Function.Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium，Rich等人(编辑)(Pierce Chemical Co.，RockfordI11，1981)，第97-100页，以及在Nitecki等人，High-Technology Route to VirusVaccines(American Society for Microbiology：1986)，题名为″Novel Agent for Coupling Synthetic Peptides to Carriers andIts Applications.″中作了描述。
在一些实施方案中，与氨基的共价结合通过基于氰尿酰氯、碳酰二咪唑、醛反应性基团(PEG醇盐+溴代乙醛的二乙基乙缩醛；PEG+DMSO和乙酸酐，或PEG氯化物+4-羟基苯甲醛的酚盐、活化的琥珀酰亚胺基酯，活化的二硫代碳酸酯PEG，2，4，5-三氯苯基氯甲酸酯或对硝基苯基氯甲酸酯活化的PEG)的已知化学来实现。通过使用碳二亚胺偶联PEG-胺来使羧基衍生化。通过偶联至经马来酰亚氨基取代的PEG(例如，烷氧基-PEG胺+4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺基酯)(如在于1997年3月27日公布的WO97/10847中所描述的)，或者偶联至从Nektar Technologies，San Carlos，CA(以前称为Shearwater Polymers，Inc.)商购可得的PEG-马来酰亚胺来使巯基衍生化。备选地，可以将所述肽上的游离氨基(例如赖氨酸残基上的ε-氨基)偶联至经N-羟基琥珀酰亚胺基取代的PEG(从Nektar Technologies可得的PEG-NHS)，或者可以用2-亚氨基-四氢噻吩(Traut试剂)进行硫醇化，然后偶联至PEG的含有马来酰亚胺的衍生物，如在Pedley等人，Br.J.Cancer，70：1126-1130(1994)中所描述的。
许多惰性聚合物(包括但不限于PEG)适合于在药物中使用。参见例如，Davis等人，Biomedical Polymers：Polymeric Materials andPharmaceuticals for Biomedical Use，第441-451页(1980)。在本发明的一些实施方案中，使用非蛋白质性质的聚合物。通常，非蛋白质性质的聚合物通常为亲水性的合成聚合物，即否则在自然界中找不到的聚合物。但是，存在于自然界中的并且通过重组或体外方法产生的聚合物也是有用的，如从天然来源分离出的聚合物。亲水性聚乙烯基聚合物在本发明的范围内，例如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。特别有用的是聚亚烷基醚，例如聚乙二醇(PEG)；聚氧化烯，例如聚氧乙烯、聚氧丙烯，以及聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物(Pluronics)；聚甲基丙烯酸酯；卡波姆；支化的或非支化的多糖，其包含糖单体D-甘露糖、D-和L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(例如，聚甘露糖醛酸或藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神经氨酸，包括同多糖和杂多糖，例如乳糖、支链淀粉、淀粉、羟乙基淀粉、直链淀粉、硫酸葡聚糖、葡聚糖、糊精、糖原或酸性粘多糖(例如，透明质酸)的多糖亚单位；糖醇的聚合物，例如聚山梨糖醇和聚甘露醇；肝素或乙酰肝素。
缀合之前的聚合物不需要，但优选地，为水溶性的，但是最终的缀合物优选地为水溶性的。优选地，缀合物展示出至少约0.01mg/ml，和更优选地至少约0.1mg/ml，和更加优选地至少约1mg/ml的水溶解度。
此外，聚合物在缀合物形式中不应是高度免疫原性的，也不应具有与静脉内输液、注射或吸入不相容的粘度，如果缀合物意欲通过此类途径进行施用的话。
聚合物的分子量可以高至100,000D，和优选地至少约500D，或至少约1,000D，或至少约5,000D。在一些实施方案中，PEG或其他聚合物具有5000至20,000D的分子量。所选择的分子量可以依赖于待实现的缀合物的有效尺寸，聚合物的性质(例如，结构，例如线性或支化的)，和衍生化的程度，即聚合物分子的数目/肽，以及聚合物在肽上的附着位点。在一些实施方案中，支化的PEG可以用于引起肽的有效尺寸的大大增加。PEG或其他聚合物缀合物可以用于增加半衰期、增加溶解度、抵抗蛋白水解攻击和降低免疫原性。
用于修饰本发明的肽的官能化的PEG聚合物是从NektarTechnologies of San Carlos，CA(以前称为Shearwater Polymers，Inc.)可得的。此类商购可得的PEG衍生物包括但不限于，氨基-PEG、PEG氨基酸酯、PEG-N-羟基琥珀酰亚胺化学(NHS)、PEG-酰肼、PEG-硫醇、PEG-琥珀酸酯、羧甲基化的PEG、PEG-丙酸、PEG氨基酸、PEG琥珀酸琥珀酰亚胺基酯、PEG丙酸琥珀酰亚胺基酯、羧甲基化的PEG的琥珀酰亚胺基酯、PEG的碳酸琥珀酰亚胺基酯、氨基酸PEG的琥珀酰亚胺基酯、PEG-氧基羰基咪唑、PEG-碳酸硝基苯酯、PEG三氟乙磺酸酯、PEG-缩水甘油醚、PEG-醛、PEG乙烯基砜、PEG-马来酰亚胺、PEG-邻吡啶基二硫化物、杂官能的PEG、PEG乙烯基衍生物、PEG硅烷和PEGphospholides。用于偶联这些PEG衍生物的反应条件将会依赖于蛋白质、所希望的PEG化程度和所使用的PEG衍生物而变化。在选择PEG衍生物中所牵涉的因素包括：所希望的附着点(例如，赖氨酸或半胱氨酸R-基团)，衍生物的水解稳定性和反应性，连接物的稳定性、毒性和抗原性，用于分析的适宜性等。关于使用任何特定衍生物的具体指导可从制造商处获得。
所述缀合物可以通过SDS-PAGE、凝胶过滤、NMR、胰蛋白酶消化作图(tryptic mapping)、液相色谱-质谱法和体外生物学测定法来进行表征。例如，PEG缀合的程度可以通过SDS-PAGE和凝胶过滤来显示，然后通过NMR进行分析，该NMR具有关于PEG的亚甲基氢的特殊的共振峰。每个分子上PEG基团的数目可以由NMR谱或质谱法进行计算。合适地，在10mM Tris-HCl pH 8.0，100mM NaCl(作为洗脱缓冲液)中进行在10％ SDS中的聚丙烯酰胺凝胶电泳。为了证明哪个残基被PEG化了，可以进行胰蛋白酶消化作图。因此，在100mM乙酸钠，10mMTris-HCl，1mM氯化钙，pH 8.3中，在37℃下，以100∶1(以mg为基础)的蛋白质/酶比率，用胰蛋白酶消化PEG化的肽4小时，并且酸化至pH＜4以终止消化，随后在HPLC Nucleosil C-18(4.6mm×150mm，5.mu.，100A)上进行分离。将色谱图与非PEG化的起始材料的色谱图进行比较。然后，每个峰可以通过质谱法来进行分析，以验证该峰中的片段的大小。携带PEG基团的片段通常在注射后不滞留在HPLC柱上，并且从色谱上消失。这种从色谱上的消失是在应当包含至少一个赖氨酸残基的那个特定片段上的PEG化的指征。然后，可以通过常规方法就与BLyS结合的能力来分析PEG化的肽。
在一些实施方案中，通过离子交换色谱法(例如离子交换HPLC)来纯化缀合物。许多经亲电活化的PEG的化学导致PEG化的产物的氨基负荷减少。因此，可以使用高分辨率离子交换色谱法来分开游离的和缀合的蛋白质，并且分辨出具有不同PEG化水平的种类。
事实上，由于未反应的氨基酸的离子特性的差异，分辨不同的种类(例如，包含一个或两个PEG残基)也是可能的。在一个实施方案中，根据WO 96/34015(国际申请号PCT/US96/05550，1996年10月31日公布)中所描述的方法来分辨具有不同PEG化水平的种类。以相同的方式，相互纯化出异质的缀合物种类。
在一些实施方案中，PEG-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与伯胺(例如赖氨酸和N-末端)反应。在一些实施方案中，PEG-NHS与多肽的C-末端赖氨酸(K)反应。在一些实施方案中，将赖氨酸残基添加至所述17聚体多肽的C-末端，而在其他实施方案中，Xi被赖氨酸置换。在一些实施方案中，聚合物与N-末端反应。在一个优选的实施方案中，通过在下面实施例中所描述的衍生化和纯化方法来产生缀合物。
在一个方面，本发明提供了任何由其组成部分(即一个或多个共价附着于一个或多个聚合物分子的肽)形成的上面所描述的缀合物，在所述缀合物的共价分子结构中没有任何无关物质。
本发明的方法和制品使用或掺入了抗体，所述抗体与BLyS或者其三种受体中的一种或多种结合。因而，将在此处描述用于产生此类抗体的方法。
用于产生或筛选抗体的BLyS或BLyS受体可以例如是包含所希望的表位的抗原或其部分的可溶性形式。如在上面所描述的，BLyS序列和BLyS受体序列是已知的，如这些多肽的各种结构域的边界是已知的一样。可以将细胞外结构域(ECD)的肽片段用作免疫原。基于这些已知的序列和结构域描绘，本领域技术人员可以表达出BLyS或BLyS受体多肽及其片段以用于产生抗体。
为了产生针对BLyS或其受体的抗体，可以将全长多肽或者长度为6个或更多个残基的肽片段用作免疫原，以在啮齿动物(包括小鼠、仓鼠和大鼠)中，在兔、山羊或其他合适的动物中引起抗体。可以在合适的宿主细胞例如细菌或真核细胞中表达可溶性BLyS或BLyS受体多肽或其免疫原性片段。在一个实施方案中，在大肠杆菌中产生人和鼠类的经去污剂增溶的全长BLyS，并用于免疫接种和筛选产生BLyS抗体的杂交瘤。
备选地，或者另外地，可以将在其细胞表面上表达BLyS或BLyS受体的B细胞或细胞系用于产生和/或筛选抗体。可用于产生抗体的其他形式的BLyS对于本领域技术人员来说是显而易见的，例如噬菌体展示方法也可以用于产生BLyS结合抗体。结合BLyS或BLyS受体的抗体可以是嵌合的、人源化的或人的。此类抗体和产生它们的方法在下面更详细地进行描述。
优选地，通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂，在动物体中引起多克隆抗体。将相关抗原缀合至在待进行免疫接种的物种中具有免疫原性的蛋白质(例如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)可以是有用的，其中使用双官能或衍生化试剂例如马来酰亚氨基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOC12或R1N＝C＝NR，其中R和R′为不同的烷基。
通过将例如100wu或5g的蛋白质或缀合物(分别对于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂相组合并在多个位点处皮内注射溶液，而针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物对动物进行免疫接种。一个月后，用1/5至1/10原始量的在弗氏完全佐剂中的肽或缀合物，通过在多个位点处进行皮下注射来对动物进行加强免疫。7至14天后，抽取动物的血液，并就抗体滴度来分析血清。对动物进行加强免疫直至滴度的稳定水平。优选地，用相同的但缀合至不同蛋白质和/或通过不同交联剂的抗原的缀合物来对动物进行加强免疫。也可以在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物来制备缀合物。此外，聚集剂(aggregating agent)例如明矾也合适地用于增强免疫应答。
从基本上同质的抗体的群体中获得单克隆抗体，即包含该群体的那些独个抗体是同样的，除了可能的天然出现的突变外，所述突变可以以较少的量存在。因此，修饰词“单克隆的”将抗体的特征指明为不是互不相关的抗体的混合物。
例如，单克隆抗体可以通过使用首次由Kohler等人，Nature，256：495(1975)所描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)来制备。在杂交瘤方法中，如上面所描述的，对小鼠或其他合适的宿主动物例如仓鼠进行免疫接种以引发产生或能够产生抗体的淋巴细胞，所述抗体将会特异性地与用于免疫接种的蛋白质结合。备选地，可以在体外对淋巴细胞进行免疫接种。然后，使用合适的融合试剂(例如聚乙二醇)，使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合从而形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principlesand Practice，第59-103页(Academic Press，1986))。
将如此制备的杂交瘤细胞接种在合适的培养基中并使其生长，所述培养基优选地包含一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶这种酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将会包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞为这样的那些骨髓瘤细胞，所述骨髓瘤细胞有效地进行融合，支持由所选择的抗体生成细胞稳定而高水平地产生抗体，并对培养基例如HAT培养基敏感。
在这些骨髓瘤细胞中，优选的骨髓瘤细胞系为鼠类骨髓瘤系，例如源自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤(从Salk Institute CellDistribution Center，San Diego，California USA可获得)的那些，和SP-2或X63-Ag8-653细胞(从American Type Culture Collection，Rockville，Maryland USA可获得)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系也被描述用于产生人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
就针对所述抗原的单克隆抗体的产生而言，对其中正生长着杂交瘤细胞的培养基进行分析。优选地，通过免疫沉淀或者通过体外结合测定法，例如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，来测定由杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson等人，Anal.Biochem.，107：220(1980)的斯卡查德分析(Scatchard analysis)来进行测定。
在鉴定出了产生具有所希望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，所述克隆可以通过有限稀释程序进行亚克隆并且通过标准方法进行生长(Goding，Monoclonal Antibodies Principles andPractice，第59-103页(Academic Press，1986))。用于该目的的合适的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以作为在动物中的腹水瘤在体内生长。
合适地通过常规的免疫球蛋白纯化程序例如A蛋白-Sepharose、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和层析，从培养基、腹水或血清中分离出由亚克隆所分泌的单克隆抗体。通过使用常规的程序而容易地分离出编码单克隆抗体的DNA并进行测序(例如，通过使用能够与编码鼠类抗体的重链和轻链的基因特异性地结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞充当此类DNA的优选的来源。一旦经分离，就可以将DNA放置入表达载体中，随后将所述表达载体转染入否则不产生免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以获得在重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.，5：256-262(1993)，和Pluckthun，Immunol Revs.，130：151-188(1992)。
在进一步的实施方案中，抗体或抗体片段可以分离自通过使用在McCafferty等人，Nature，348：552-554(1990)中所描述的技术而产生的抗体噬菌体文库。
Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)描述了使用噬菌体文库来分别分离鼠类和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组(chain shuffling)(Marks等人，BiolZ′echraology，10：779-783(1992))，以及作为用于构建非常大的噬菌体文库的组合感染和体内重组(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))，来产生高亲和力(nM范围)的人抗体。因此，这些技术是对于用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行的备选方案。
还可以修饰DNA，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源的鼠类序列(美国专利号4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，81：6851(1984))，或者通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分共价连接至编码免疫球蛋白的序列。
通常，用这样的非免疫球蛋白多肽代替抗体的恒定结构域，或者用它们代替抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，从而形成嵌合的二价抗体，其包含一个对于抗原具有特异性的抗原结合位点和另一个对于不同抗原具有特异性的抗原结合位点。
用于使非人抗体人源化的方法已在本领域中进行了描述。优选地，人源化抗体具有一个或多个被从非人来源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常被称作“输入(import)”残基，其通常取自“输入”可变结构域。可以基本上依照Winter及合作者(Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988))的方法，通过用高变区序列代替人抗体的相应序列，来进行人源化。因此，此类“人源化”抗体为嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中，实质上小于完整的人可变结构域被来自非人物种的相应序列所代替。实际上，人源化抗体通常为这样的人抗体，其中某些高变区残基和可能地某些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基所代替。
待用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链)的选择对于降低抗原性是非常重要的。根据所谓的“最佳适配(best-fit)”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库来对啮齿动物抗体的可变结构域的序列进行筛选。然后，将最接近啮齿动物序列的人序列当作用于人源化抗体的人构架区(FR)(Sims等人，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。另一种方法使用特定的构架区，其源自轻链或重链的特定亚群的所有人抗体的共有序列。相同的构架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.，15-1：2623(1993))。
进一步重要的是，可以在使抗体人源化的同时保留对于抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。为了达到这个目标，根据优选的方法，通过下列方法来制备人源化抗体，即使用亲本和人源化序列的三维模型来分析亲本序列和各种概念上的人源化产品。
三维免疫球蛋白模型是通常可得的，并且是本领域技术人所熟悉的。图解并展示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可得的。检查这些展示使得能够分析所述残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以这种方式，可以从受者和输入序列中选择出FR残基并将它们相组合，从而获得所希望的抗体特征，例如增加的对于靶抗原的亲和力。一般地，高变区残基直接且最实质上地参与影响抗原结合。
作为人源化的一个备选方案，可以产生人抗体。例如，现在可以产生在免疫接种后能够在没有内源免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的完全储库的转基因动物(例如，小鼠)。例如，已描述了，在嵌合的和种系突变型的小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。
将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这样的种系突变型小鼠中将会导致在抗原攻击后产生人抗体。参见例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immuno.，7：33(1993)；和美国专利号5,591,669、5,589,369和5,545,807。
备选地，可以使用噬菌体展示技术(McCafferty等人，Nature 348：552-553(1990))来从来自未免疫接种的供者的免疫球蛋白可变(V)结构域基因储库中在体外产生人抗体和抗体片段。根据该技术，将抗体V结构域基因按阅读框架克隆入丝状噬菌体(例如，M13或fd)的大或小外壳蛋白基因中，并作为功能性抗体片段而展示在噬菌体颗粒的表面上。因为所述丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能特性的选择也导致选择出编码显示那些特性的抗体的基因。因此，所述噬菌体模拟了B细胞的某些特性。
噬菌体展示可以以各种形式来施行；关于其综述，参见例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion inStructural Biology 3：564-571(1993)。V-基因区段的几种来源可用于噬菌体展示。Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)从V基因(源自经免疫接种的小鼠的脾)的小随机组合文库中分离了各种各样的一系列抗噁唑酮抗体。可以构建来自未免疫接种的人供者的V基因储库，并且可以基本上依照由Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)，或Griffith等人，EMBO J.12：725-734(1993)所描述的技术，分离出针对各种各样的一系列抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利号5,565,332和5,573,905。也可以通过体外激活的B细胞来产生人抗体(参见美国专利5,567,610和5,229,275)。
已开发了各种技术用于产生抗体片段。传统地，经由完整抗体的蛋白水解消化而得到这些片段(参见例如，Morimoto等人，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)，和Brennan等人，Science，229：81(1985))。然而，现在可以通过重组宿主细胞而直接产生这些片段。例如，可以从上面所讨论的抗体噬菌体文库中分离出抗体片段。备选地，可以直接从大肠杆菌中回收Fab′-SH片段，并进行化学偶联从而形成F(ab′)2片段(Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物中直接分离出F(ab′)2片段。用于产生抗体片段的其他技术对于技术人员来说将会是显而易见的。在其他实施方案中，所选择的抗体为单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458。抗体片段还可以为“线性抗体”，例如，如在美国专利5,641,870中所描述的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
双特异性抗体为对于至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。示例性的双特异性抗体可以与B细胞表面标志物的两种不同表位结合。其他的此类抗体可以结合第一B细胞标志物和进一步结合第二B细胞表面标志物。备选地，抗B细胞标志物结合臂可以与结合白细胞上的触发分子(triggering molecule)的臂相组合，所述触发分子例如为T-细胞受体分子(例如，CD2或CD3)，或关于IgG的Fc受体(FcyR)，例如FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16)，以便使细胞防御机制集中于B细胞。双特异性抗体也可以用于将细胞毒剂定位至B细胞。
这些抗体拥有结合B细胞标志物的臂和结合细胞毒剂(例如，肥皂草毒蛋白、抗干扰素、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。
可以将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab′)2双特异性抗体)。用于制备双特异性抗体的方法在本领域中是已知的。全长双特异性抗体的传统产生过程基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中该两条链具有不同的特异性(Millstein等人，Nature，305：537-539(1983))。
由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化(其通常通过亲和层析步骤来进行)是相当繁琐的，并且产物产量低。在WO93/08829中，和在Traunecker等人，EMBO J.，10：3655-3659(1991)中公开了相似的程序。
根据一种不同的方法，将具有所希望的结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)融合至免疫球蛋白恒定结构域序列。优选地，该融合物具有包含至少一部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域。优选的是，具有第一重链恒定区(CH1)，其包含对于在所述融合物的至少一个中存在的轻链结合而言所必需的位点。将编码免疫球蛋白重链融合物(和免疫球蛋白轻链，如果需要)的DNA插入到分开的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。这在当在构建中所使用的不等比率的三种多肽链提供了最佳产量这样的实施方案中，在调整所述三种多肽片段的相互比例方面提供了极大的灵活性。然而，当至少两种多肽链以等比率进行表达导致高产量或者当所述比率不是特别重要时，可以将两种或所有三种多肽链的编码序列插入到一个表达载体中。
在该方法的一个优选的实施方案中，双特异性抗体由在一个臂中的具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和在另一个臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现这种不对称的结构有助于将所希望的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开，因为仅在所述双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链提供了一种容易做到的分离方式。该方法公开在WO 94/04690之中。关于产生双特异性抗体的进一步的细节，参见例如Suresh等人，Methodsin Enzymology，121：210(1986)。根据在美国专利号5,731,168中所描述的另一种方法，可以改造抗体分子对之间的界面以使从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面至少包含抗体恒定结构域的CH3结构域的部分。在该方法中，来自第一抗体分子的界面的一个或多个小的氨基酸侧链被更大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替代。通过用更小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替代大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生具有与所述大侧链相同或相似的大小的补偿性“空穴”。这为将异二聚体的产量增加超过其他不想要的最终产物(例如同二聚体)提供了机制。
双特异性抗体包括交联的抗体或“杂缀合物(heteroconjugate)”抗体。例如，可以将杂缀合物中的抗体之一偶联至抗生物素蛋白，另一个偶联至生物素。此类抗体例如已被建议用于使免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利号4,676,980)，和用于治疗HIV感染(WO91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可以使用任何简便的交联方法来制备杂缀合物抗体。合适的交联剂在本领域中是众所周知的，并且在美国专利号4,676,980中与许多交联技术一起被公开。
用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术已在文献中作了描述。例如，可以采用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等人，Science，229：81(1985)描述了其中对完整抗体进行蛋白水解切割以产生F(ab′)2片段的程序。在二巯基络合剂(dithiol complexingagent)亚砷酸钠存在下使这些片段还原，以稳定邻近的二巯基和防止分子间二硫化物的形成。然后，将所产生的Fab′片段转化成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后，通过用巯基乙胺进行还原而将Fab′-TNB衍生物之一再转变成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一Fab′-TNB衍生物相混合以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可以被用作用于酶的选择性固定化的试剂。
最近的进展已促进了从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段，所述Fab′-SH片段可以进行化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等人，J.Exp.Med.，175：217-225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子的产生。每个Fab′片段分开地从大肠杆菌中分泌，并在体外经历直接化学偶联而形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够与过表达ErbB2受体的细胞和正常的人T细胞结合，以及触发人细胞毒性淋巴细胞对于人乳腺肿瘤靶标的裂解活性。
还已描述了用于直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，已通过使用亮氨酸拉链来产生了双特异性抗体。Kostelny等人，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)。通过基因融合将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽连接至两个不同抗体的Fab′部分。
在铰链区使抗体同二聚体还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。该方法也可以用于产生抗体同二聚体。
由Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)所描述的“双抗体”技术为制备双特异性抗体片段提供了备选的机制。所述片段包含通过连接体而联接至轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)，所述连接体太短以致不能允许在同一条链上的两个结构域之间进行配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫与另一个片段的互补的VL和VH结构域进行配对，从而形成两个抗原结合位点。还报道了用于通过使用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等人，J.Immunol，152：5368(1994)。
考虑了具有超过两价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)。
考虑了此处所描述的蛋白质或肽拮抗剂和抗体的氨基酸序列修饰。例如，可以希望改善BLYS结合抗体或拮抗剂的结合亲和力和/或其他生物学特性。通过将合适的核苷酸变化引入拮抗剂核酸中，或者通过肽合成，来制备拮抗剂的氨基酸序列变体。此类修饰包括，例如在拮抗剂的氨基酸序列中的残基的删除和/或插入和/或置换。进行删除、插入和置换的任何组合以获得最终的构建体，条件是所述最终的构建体拥有所希望的特征。氨基酸变化还可以改变拮抗剂的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数目或位置。
用于鉴定拮抗剂的作为优选的诱变位置的某些残基或区域的一种有用方法称为“丙氨酸扫描诱变法”，如由Cunningham和Wells，Science，244：1081-1085(1989)所描述的。在此，鉴定出一个或一组靶残基(例如，带电荷的残基例如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选地，丙氨酸或聚丙氨酸)来替代之以影响所述氨基酸与抗原的相互作用。然后，通过在置换位点处或者为置换位点引入进一步的或其他的变体，来对那些显示出对于置换的功能敏感性的氨基酸位置进行细化。因此，虽然用于引入氨基酸序列变化的位点是预先确定的，但是突变本身的性质不需要预先确定。例如，为了分析在给定位点处的突变的性能，在靶密码子或区域处进行丙氨酸扫描或随机诱变，并且就所希望的活性来对所表达的拮抗剂变体进行筛选。
氨基酸序列插入包括长度为一个残基到包含成百或更多残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰残基的拮抗剂或者融合至细胞毒性多肽的拮抗剂。拮抗剂分子的其他插入性变体包括将酶或增加拮抗剂的血清半衰期的多肽融合至拮抗剂的N-或C-末端。
另一种类型的变体是氨基酸置换变体。这些变体具有至少一个在拮抗剂分子中的被不同残基替代的氨基酸残基。最令人感兴趣的用于抗体拮抗剂的置换诱变的位点包括高变区，但也考虑FR改变。保守置换显示在表1中的标题“优选的置换”之下。如果此类置换导致生物学活性的变化，那么可以引入更多的实质性变化(在表1中命名为“示例性的置换”，或如在下文中关于氨基酸类别而进一步描述的)，并筛选产物。
拮抗剂的生物学特性的实质性修饰通过选择这样的置换来实现，所述置换在它们对于维持下列方面的影响方面显著不同：(a)置换区域中的多肽主链的结构，例如，作为片层或螺旋构象，(b)所述分子在靶位点处的电荷或疏水性，或者(c)侧链的体积。基于共有的侧链特性，将天然出现的残基分成组：(1)疏水性的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性且亲水性的：cys、ser、thr；(3)酸性的：asp、glu；(4)碱性的：asn、gln、his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；和(6)芳香族的：trp、tyr、phe。非保守置换将会导致这些类别之一的成员交换成另一类别的成员。
还可以置换不参与维持拮抗剂的正确构象的任何半胱氨酸残基(通常用丝氨酸来置换)，以改善所述分子的氧化稳定性和防止异常的交联。反过来，可以向拮抗剂添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当所述拮抗剂为抗体片段例如Fv片段时)。
置换变体的一种特别优选的类型牵涉置换亲本抗体的一个或多个高变区残基。一般地，所得的被选择用于进一步开发的变体将会具有相对于亲本抗体(它们从中产生)而言经改善的生物学特性。用于产生此类置换变体的一种简便的方法为通过使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，使几个高变区位点(例如，6-7个位点)发生突变以在每个位点处产生所有可能的氨基酸置换。作为包装在每个颗粒中的与M13的基因III产物的融合物，将如此产生的抗体变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒进行展示。然后，就此处所公开的其生物学活性(例如，结合亲和力)对经噬菌体展示的变体进行筛选。为了鉴定出用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对于抗原结合作出显著贡献的高变区残基。备选地，或者另外地，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定出抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。此类接触残基和相邻残基是用于置换的候选者，根据此处所阐述的技术。一旦产生了此类变体，就使变体小组经历此处所描述的筛选，并且可以在一个或多个相关测定法中选择出具有优异特性的抗体以用于进一步的开发。
拮抗剂的另一种类型的氨基酸变体改变拮抗剂的原始糖基化模式。“改变”意味着删除一个或多个在所述拮抗剂中发现的碳水化合物部分，和/或添加一个或多个在所述拮抗剂中不存在的糖基化位点。
多肽的糖基化通常为N-联或O-联的。N-联是指碳水化合物部分附着至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列“天冬酰胺-X-丝氨酸”和“天冬酰胺-X-苏氨酸”(其中，X为除了脯氨酸之外的任意氨基酸)为碳水化合物部分酶促附着至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，这些三肽序列中的任一个在多肽中的存在形成了潜在的糖基化位点。O-联糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖这些糖之一附着至羟基氨基酸，最通常为丝氨酸或苏氨酸，虽然也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
通过改变氨基酸序列从而使得其包含一个或多个上面所描述的三肽序列，方便地实现向拮抗剂添加糖基化位点(对于N-联糖基化位点)。所述改变也可以通过向原始拮抗剂的序列添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或者用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基进行置换来进行(对于O-联糖基化位点)。
通过各种本领域中已知的方法来制备编码拮抗剂的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于：从天然来源中分离(在天然出现的氨基酸序列变体的情况下)，或者通过早先制备的变体或非变体形式的拮抗剂的寡核苷酸介导的诱变(或位点定向诱变)、PCR诱变和盒式诱变进行制备。
可以希望就效应子功能对本发明的拮抗剂进行修饰，例如，以便增强拮抗剂的依赖抗体的细胞毒性(ADCC)和/或依赖补体的细胞毒性(CDC)。这可以通过在抗体拮抗剂的Fc区中引入一个或多个氨基酸置换来达到。备选地，或者另外地，可以将半胱氨酸残基引入到Fc区中，从而允许在该区域中形成链间二硫键。
如此产生的同二聚体抗体可具有改善的内在化能力和/或增加的由补体介导的细胞杀伤和依赖抗体的细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。还可以使用在Wolff等人，Cancer Research53：2560-2565(1993)中所描述的异双官能交联剂来制备具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体。备选地，可以改造出这样的抗体，其具有双重Fc区并由此可以具有增强的补体裂解和ADCC能力。参见Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。
为了增加拮抗剂的血清半衰期，可以将补救受体结合表位(salvage receptor binding epitope)掺入到所述拮抗剂(尤其是抗体片段)中，例如，如在美国专利5,739,277中所描述的。如在本文中所使用的，术语“补救受体结合表位”是指IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的这样的表位，其负责增加所述IgG分子的体内血清半衰期。
测定法
通过计数CD3-/CD40+细胞的FACS方法来测定外周B-细胞浓度。
可以通过下述的门控(gating)策略来获得样品中总淋巴细胞的CD3-CD40+B细胞百分比。在前向散射/侧向散射散射图上对淋巴细胞群进行标记以定义区域1(Ri)。通过使用RI中的事件，关于CD40和CD3标志物，展示出荧光密度点图。使用经荧光标记的同种型对照来确定关于CD40和CD3阳性的各自的截止点。
FACS分析
洗涤50万个细胞并重悬浮于1001的FACS缓冲液中，所述FACS缓冲液为具有1％BSA的磷酸缓冲盐水，其包含5ul的染色或对照抗体。所有染色抗体(包括同种型对照)从PharMingen，San Diego，CA获得。通过用
Figure A20088001559000551
(美罗华)以及缀合有FITC的抗人IgG1二抗进行染色来评估人BLYS表达。
使用FACScan和Cell Quest(Becton Dickinson ImmunocytometrySystems，San Jose，CA)来进行FACS分析。以前向和侧向光散射来定义所有淋巴细胞，而用细胞表面上B220的表达来定义所有B淋巴细胞。
通过下列方式来评估B细胞耗竭和回收：在注射后第一周每天和此后每周，分析外周B细胞计数和用FACS分析脾、淋巴结和骨髓中的hBLYS+B细胞。监测所注射的2H7变体抗体的血清水平。
药物制剂
通过将具有所希望的纯度的抗体与可选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remitgtorz′s Phamamaceutical Science，第16版，Osol，A.编辑(1980))相混合，以冻干制剂或水溶液的形式制备BLyS和/或APRIL拮抗剂(例如根据本发明所使用的BLyS结合抗体)的治疗制剂，以用于贮藏。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对于受者是无毒的，并且包括缓冲液，例如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如氯化十八烷基二甲基苄基铵；六甲氯铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯类，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属复合物(例如锌-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如TWEEN、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
此处的制剂还可以包含超过一种活性化合物(对于正进行治疗的特定适应症而言所需要的)，优选地为具有不会不利地相互影响的互补活性的那些。例如，可以希望进一步提供细胞毒剂、化学治疗剂、细胞因子或免疫抑制剂(例如，作用于T细胞的那种，例如环孢菌素，或结合T细胞的抗体，例如结合LFA-1的那种)。此类其他试剂的有效量依赖于存在于制剂中的抗体的量、疾病或病症或者治疗的类型、和其他上面所讨论的因素。一般地，这些试剂以相同的剂量和用此处所描述的施用途径，或者以约1至99％的迄今所采用的剂量进行使用。
还可以将活性成分包载入例如通过凝聚(coacervation)技术或通过界面聚合而制备的微胶囊中，例如，分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，包载入胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳状液、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或者包载入粗乳状液中。此类技术公开在Remington′s PharmaceuticalSciences，第16版，Osol，A.编辑(1980)中。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括包含拮抗剂的固体疏水性聚合物的半渗透性基体，所述基体以成形的物品例如膜或微胶囊的形式存在。缓释基体的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOT(可注射的微球，其由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这经由通过无菌滤膜进行过滤而容易地实现。
疾病治疗
疾病
本发明的免疫抑制药物和BLyS和/或APRIL拮抗剂可用于治疗由B细胞调节的自身免疫病症。由B细胞调节的自身免疫疾病包括关节炎(类风湿性关节炎，青少年类风湿性关节炎，骨关节炎，银屑病关节炎)，银屑病，皮炎(包括特应性皮炎)；慢性自身免疫性荨麻疹，多肌炎/皮肌炎，中毒性表皮坏死溶解，全身性硬皮病和硬化，与炎症性肠病(IBD)(克罗恩病，溃疡性结肠炎)相关的反应，呼吸窘迫综合征，成人型呼吸窘迫综合征(ARDS)，脑膜炎，变应性鼻炎，脑炎，葡萄膜炎，结肠炎，肾小球肾炎，过敏性病状，湿疹，哮喘，牵涉T细胞浸润和慢性炎症反应的病状，动脉粥样硬化，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺陷，系统性红斑狼疮(SLE)，狼疮(包括肾炎，非肾的，盘状的，脱发)，青少年糖尿病，多发性硬化症，变应性脑脊髓炎，与由细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫应答，结核病，结节病，肉芽肿病(包括韦格纳肉芽肿病)，粒细胞缺乏，脉管炎(包括ANCA)，再生障碍性贫血，Coombs阳性贫血，戴-布贫血，免疫性溶血性贫血(包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA))，恶性贫血，纯红细胞再生障碍(PRCA)，因子VIII缺乏，血友病A，自身免疫性中性白细胞减少症，各类血细胞减少症，白细胞减少症，牵涉白细胞渗出的疾病，CNS炎性病症，多器官损伤综合征，重症肌无力，由抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，抗磷脂抗体综合征，变应性神经炎，Bechet病，卡斯尔曼综合征，兰-伊肌无力综合征，Reynaud’s综合征，Sjorgen′s综合征，斯-约综合征，固体器官移植排斥(包括关于高小组反应性抗体(high panel reactive antibody)滴度，IgA在组织中的沉积等的预处理)，移植物抗宿主病(GVHD)，大疱性类天疱疮，天疱疮(所有的，包括寻常性的，落叶性的)，自身免疫性多内分泌腺病，赖特尔病，僵人综合征，巨细胞动脉炎，免疫复合物肾炎，IgA肾病，IgM多发性神经病或由IgM介导的神经病，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，自身免疫性血小板减少症，睾丸和卵巢的自身免疫疾病(包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎)，原发性甲状腺机能减退；自身免疫性内分泌疾病，包括自身免疫性甲状腺炎，慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)，亚急性甲状腺炎，特发性甲状腺机能减退，艾迪生病，格雷夫斯病，自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌病综合征)，I型糖尿病(也称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM))和希恩综合征；自身免疫性肝炎，淋巴样间质性肺炎(HIV)，闭塞性细支气管炎(非移植的)对NSIP，吉-巴综合征，大血管脉管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安)动脉炎，中血管脉管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎)，强直性脊椎炎，贝格尔病(IgA肾病)，急进性肾小球肾炎，原发性胆汁性肝硬化，乳糜泻(麸质性肠病)，冷球蛋白血症，ALS，冠状动脉疾病。
所希望的B-细胞耗竭水平将依赖于疾病。优选地，B细胞耗竭足以阻止疾病进展至少2个月，更优选地3个月，更加优选地4个月，更优选地5个月，更加优选地6个或更多个月。在一个更加优选的实施方案中，B细胞耗竭足以使缓解时间增加至少6个月，更优选地9个月，更优选地1年，更优选地2年，更优选地3年，更加优选地5或更多年。在最优选的实施方案中，B细胞耗竭足以治愈所述疾病。在优选的实施方案中，自身免疫患者中的B细胞耗竭至少暂时地为治疗前基线水平的约75％，和更优选地80％、85％、90％、95％、99％和甚至100％。
对于治疗自身免疫疾病，可以希望通过调整免疫抑制药物或者BLyS和/或APRIL拮抗剂的剂量而根据所述疾病和/或个体患者中病状的严重度来调节B细胞耗竭的程度。因此，B细胞耗竭可以但并非必须是完全的。或者，在初始治疗中可以希望全部的B细胞耗竭，但在随后的治疗中可以调整剂量以达到仅部分的耗竭。在一个实施方案中，B细胞耗竭为至少20％，即相比于治疗前的基线水平而言保留了80％或更少的B-细胞。在另一个实施方案中，B-细胞耗竭为25％、30％、40％、50％、60％、70％或更大。
优选地，B细胞耗竭足以使所述疾病的进展停止，更优选地，减轻处于治疗下的特定疾病的征候和症状，更加优选地，治愈所述疾病。
对于治疗应用，本发明的免疫抑制药物和BLyS和/或APRIL拮抗剂组合物可以以与另外的药物例如抗炎药(包括DMARDS和其他生物制品)的联合疗法形式进行使用。前面的治疗方法可以与用于自身免疫疾病的其他形式的常规疗法相联合地施行，与常规疗法相连续地、在常规疗法之前或在常规疗法之后。
如果在施用了本发明的组合物后相比于治疗前而言在症状或其他适用的标准方面存在有可测量的改善，那么通过本发明的方法减轻了或成功地治疗了患者的由B细胞调节的自身免疫疾病。治疗的效果可以在施用本发明的组合物之后3-10周内是明显的。每种疾病的适用标准对于相称领域中的专业医生来说将是熟知的。例如，医生可以就疾病的临床或血清学证据(例如，疾病的血清学标志物、全血细胞计数(包括B细胞计数)和血清免疫球蛋白水平)来对所治疗的患者进行监测。IgG和IgM的血清水平在经BLyS和/或APRIL拮抗剂(例如atacicept)治疗的小鼠中降低。同样地，响应于atacicept治疗的人患者显示出血清IgG和IgM水平的降低。
用于评估自身免疫疾病或自身免疫相关疾病的治疗的功效或成功的参数对于相称疾病中的专业医生来说将是已知的。一般地，专业医生将会期望所述特定疾病的征候和症状的减少。下面通过实例来进行说明。
类风湿性关节炎(RA)是一种病因学未知的自身免疫病症。大多数RA患者遭受疾病的慢性过程，其(甚至在接受治疗的情况下)可以导致进行性关节破坏、变形、残疾和甚至过早死亡。RA疗法的目标为防止或控制关节损伤、防止功能丧失和减少疼痛。RA的初始疗法常常牵涉施用一种或多种下列药物：非类固醇抗炎药(NSAID)、糖皮质激素(经由关节注射)和低剂量泼尼松。参见″Guidelines for themanagement of rheumatoid arthritis″Arthritis & Rhemmatism46(2)：328-346(2002年2月)。大多数具有新诊断的RA的患者在诊断3个月之内以疾病缓解抗风湿药(DMARD)疗法开始。
通常在RA中使用的DMARD为羟氯喹、柳氮磺吡啶、氨甲蝶呤、来氟米特、依那西普、英利昔单抗(+口服和皮下的氨甲蝶呤)、硫唑嘌呤、D-青霉胺、金制剂(Gold)(口服)、金制剂(肌内)、米诺环素、环孢菌素、葡萄球菌A蛋白免疫吸附。
因为在RA期间机体产生肿瘤坏死因子α(TNFa)，所以已将TNFa抑制剂用于该疾病的治疗。依那西普(ENBREL)是一种在美国被批准用于活动性RA的治疗的可注射药物。依那西普与TNFa结合并用于从关节和血液中移除大多数的TNFa，从而防止TNFa促进类风湿关节炎的炎症和其他症状。
依那西普是一种“Fc-融合蛋白”融合蛋白质，其由连接至人IgG1的Fc部分的人75kD(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的细胞外配体结合部分组成。
英利昔单抗(以商品名REMICADE进行销售)是一种规定用于治疗RA和克罗恩病的免疫抑制药物。英利昔单抗是与TNF结合的嵌合单克隆抗体，并且通过靶向并结合产生炎症的TNFα来减少体内的炎症。
阿达木单抗(HUMIRATM，Abbott Laboratories)(以前称为D2E7)是一种人单克隆抗体，其与TNFa结合，并被批准用于在具有中等至严重活动性RA的成人(其对于一种或多种传统的疾病缓解性DMARD具有不足的应答)中减少征候和症状以及抑制结构损伤的进展。
通过施用免疫抑制药物和BLyS和/或APRIL拮抗剂来治疗类风湿性关节炎可以与使用一种或多种前面所提及的用于RA的药物的疗法相联合地施行。对于类风湿性关节炎，例如，治疗进展的测量可以包括肿胀和触痛的关节的数目和晨僵的时长。可以通过使用X-射线和称为Sharp得分的评分系统，就手和脚中有多少关节已被侵蚀来对患者进行检查。另一种评分系统基于用于评估对疗法的应答的美国风湿病学会(American College of Rheumatology)标准。
一种用于评价在RA中的治疗功效的方法基于美国风湿病学会(ACR)标准，其尤其测量在触痛和肿胀的关节方面改善的百分比。例如，相比于无抗体治疗(例如，治疗前的基线)或用安慰剂的治疗而言，RA患者可以被评分为ACR 20(20％的改善)。用于评价抗体治疗的功效的其他方式包括X-射线评分，例如Sharp X-射线得分，其用于对结构损伤例如骨质侵蚀和关节空间变窄进行评分。还可以在治疗期间或治疗后的时间段，基于健康评估调查表(Health AssessmentQuestionnaire[HAQ])得分、AIMS得分、SF-36，就残疾的防止或改善来对患者进行评价。ACR 20标准可以包括触痛的(疼痛的)关节计数和肿胀的关节计数改善了20％+5个另外的测量中的至少3个改善了20％：
1.患者的疼痛评估，通过直观模拟标尺(visual analog scale，VAS)，
2.疾病活动性的患者的总体评估(VAS)，
3.疾病活动性的医生的总体评估(VAS)，
4.通过健康评估调查表而测量的患者的自我评估的残疾，和
5.急性期反应物，CRP或ESR。
ACR 50和70类似地进行定义。优选地，给患者施用对于达到至少ACR 20的得分，优选地至少ACR 30，更优选地至少ACR 50，更加优选地至少ACR 70，最优选地至少ACR 75和更高得分而言有效的量的本发明的BLYS结合抗体。
银屑病关节炎具有独特和明显的放射摄影术特征。对于银屑病关节炎，关节侵蚀和关节空间变窄也可以通过Sharp得分来进行评价。可以使用此处所公开的人源化的BLYS结合抗体来防止关节损伤以及减少该病症的疾病征候和症状。
本发明的另外一个方面为通过给患有SLE的患者施用治疗有效量的本发明的与免疫抑制药物相组合的BLyS和/或APRIL拮抗剂来治疗狼疮或SLE的方法。SLEDAI得分提供了疾病活动性的数值定量。SLEDAI是已知与疾病活动性相关的24个临床和实验室参数的加权指数，具有0-103的数值范围。参见Bryan Gescuk或John Davis，″Noveltherapeutic agent for systemic lupus erythematosus″，CurrentOpinion in Rheumatology 2002，14：515-521。针对双链DNA的抗体被认为引起狼疮的肾脏突发(renal flare)和其他表现。可以就肾脏突发所需时间来对经历抗体治疗的患者进行监测，所述肾脏突发被定义为尿中的血清肌酸酐、尿蛋白和血液的显著且可重现的增加。备选地或者另外地，可以就抗核抗体和针对双链DNA的抗体来对患者进行监测。对SLE的治疗包括高剂量的皮质类固醇和/或环磷酰胺(HDCC)。对于系统性红斑狼疮，可以就抗核抗体和针对双链DNA的抗体的水平来对患者进行监测。
本发明的一个特别的方面为用免疫抑制药物与BLyS和/或APRIL拮抗剂(例如atacicept)的组合来治疗狼疮肾炎。
脊椎关节病是一组关节病症，包括强直性脊椎炎、银屑病关节炎和克罗恩病。治疗的成功可以通过经验证的患者和医生总体评估测量工具来进行测定。
可以通过使用本发明的方法来治疗的其他自身免疫疾病为银屑病。目前，使用各种药疗法来治疗银屑病；治疗直接地与疾病严重性相关地而不同。具有更温和形式的银屑病的患者通常采用局部治疗(例如局部的类固醇、蒽林、卡泊三烯、氯倍他索和他扎罗汀)来对付该疾病，而具有中等和严重银屑病的患者更可能采用全身性疗法(氨甲蝶呤、类视黄醇、环孢菌素、PLTVA和UVB)。还使用焦油。这些疗法具有治疗的安全性的关注、耗时的制度或不方便的过程的组合。而且，有些需要昂贵的设备和诊所布置中的专用空间。全身性的药疗法可产生严重的副作用，包括高血压、高脂血症、骨髓抑制、肝病、肾病和胃肠不适。此外，光疗法的使用可能增加皮肤癌的发病率。除了与使用局部疗法相关的不方便和不舒适之外，光疗法和全身性治疗还由于其副作用而需要使患者在进行治疗和不进行治疗之间循环，并监测终生暴露量(lifetime exposure)。
银屑病的治疗功效通过监测相比于基线状况而言该疾病的临床征候和症状的改变来进行评估，包括医生的总体评估(Physician′sGlobal Assessment，PGA)变化和银屑病面积和严重度指数(PsoriasisArea and Severity Index，PASI)得分、银屑病症状评估(PsoriasisSymptom Assessment，PSA)。可以通过在直观模拟标尺上进行处理来周期性地对患者进行测量，所述直观模拟标尺用于指明在特定时间点处所经历的瘙痒的程度。
具有自身免疫性起因的各种其他炎性疾病也在本治疗方法的范围之内。其中特别考虑的疾病为自身免疫性肝炎和自身免疫性甲状腺炎。自身免疫性肝炎牵涉由于患者自己的免疫系统进行自身攻击而引起的肝脏的炎症。类似地，甲状腺的自身攻击和所导致的炎症是自身免疫性甲状腺炎的生物学原因。预期诸如此类的疾病通过使用BLyS和/或APRIL拮抗剂与免疫抑制药物(例如MMF)的组合而得到减轻。
按剂量给药(dosing)
依赖于待治疗的适应症和本领域专业医生所熟悉的与按剂量给药相关的因素，本发明的BLyS和/或APRIL拮抗剂和免疫抑制药物将以这样的剂量来施用，所述剂量对于治疗该适应症来说是有效的，而同时最小化毒性和副作用。一般地，本发明的BLyS和/或APRIL拮抗剂将以约0.25mg/kg体重至约25mg/kg体重，优选地约1mg/kg至约10mg/kg的剂量范围施用给人患者。换另一种方式进行表述，BLyS和/或APRIL拮抗剂的优选剂量范围为约75至约190mg/剂。在一个优选的实施方案中，对于BLyS和/或APRIL拮抗剂，剂量为约150mg/剂。
本发明的治疗方法包括同时和顺次地施用免疫抑制药物和BLyS和/或APRIL拮抗剂(在此均称为“治疗部分”)的组合。在顺次施用中，所述治疗部分可以以任一种顺序进行施用，即先施用免疫抑制药物，随后施用BLyS和/或APRIL拮抗剂。患者可以用一种药物进行治疗，并就面对用该种药物进行治疗的功效进行监测。例如，如果免疫抑制药物产生了部分的应答，那么可以用BLyS和/或APRIL拮抗剂继续进行治疗以获得完全的应答，反之亦然。备选地，起初可以给患者施用这两种药物，随后可以只用一种药物或另一种药物进行按剂量给药。
为了使患者适应于耐受所述药物和/或减少由于治疗化合物的初始和后续施用而引起的不良反应(例如与输注相关的症状)的出现，可以给有此需要的哺乳动物施用第一或初始调适剂量的所述一种或两种药物，然后施用至少第二治疗有效剂量的所述一种或两种药物，其中第二和任何后续的剂量比第一剂量高。第一剂量用于使哺乳动物适应于耐受更高的第二治疗剂量。如此，所述哺乳动物能够耐受比在初始时可施用的更高的剂量的治疗化合物。“调适剂量(conditioningdose)”为这样的剂量，其减弱或降低与施用治疗化合物相关的首次剂量不良副作用的频率或严重度。调适剂量可以为治疗剂量、亚治疗剂量、症状剂量(symptomatic dose)或亚症状剂量(sub-symptomaticdose)。治疗剂量为对于患者展现出治疗效应的剂量，和亚治疗剂量为对于所治疗的患者不展现出治疗效应的剂量。症状剂量为在施用时引起至少一种不良反应的剂量，和亚症状剂量为不引起不良反应的剂量。一些不良反应为发热、头痛、恶心、呕吐、呼吸困难、肌痛和寒战。
除了调适剂量给药方案之外，还有许多可以采用以达到本发明的疾病减轻的其他给药方案。一种这样的方法为用一种免疫抑制药物进行短期治疗，接着逐渐减少，随后用另一种免疫抑制药物与BLyS和/或APRIL拮抗剂的组合进行治疗。例如，可以通过在4周内每天两次口服来给予1000-1500mg皮质类固醇，随后在10周的过程中从5mg/周逐渐减少至10mg/天。一旦到了开始BLyS和/或APRIL拮抗剂的时间，负荷剂量给药方案可以是合适的。特别地，atacicept可以每周施用两次并持续4周，随后在延长的时间段(例如48周)内每周进行施用。相反地，免疫抑制药物倾向于以逐步升高的剂量给药方案进行施用。例如，MMF可以以每天两次500mg的剂量进行施用，并在两周后增加至每天两次750mg。如果患者的白细胞计数保持在可接受的水平(即，高于3.0×109/L或3000/mm2)，剂量的每周的进展可以直至每天3次1000mg的最大剂量。特别地，可以预期，MMF施用的最大范围为2000至3000mg/患者/天。
施用途径
根据已知的方法给人患者施用BLyS和/或APRIL拮抗剂和免疫抑制药物，例如通过静脉内施用，例如作为推注或者在一段时间内连续输注，通过皮下、肌内、腹膜内、脑脊髓内、关节内、滑膜内、鞘内或吸入途径。采用合适制剂的免疫抑制药物还可以口服或局部地进行施用。一般地，BLyS和/或APRIL拮抗剂和一些免疫抑制药物将通过静脉内或皮下施用来进行施用。不同的治疗部分可以通过相同或不同的途径来进行施用。
制品和试剂盒
本发明的另一个实施方案为制品，其包含BLyS和/或APRIL拮抗剂和免疫抑制药物以用于治疗上面所公开的由B细胞调节的自身免疫病症。在一个特别的实施方案中，所述制品包含用于治疗狼疮肾炎的actacicept和MMF。
所述制品包含至少一个容器以及在容器上或与容器相连的标签或包装说明书。合适的容器包括，例如瓶子(bottle)、小瓶(vial)、注射器等。所述容器可以由各种材料例如玻璃或塑料形成。所述容器装有对于治疗所述病状而言有效的本发明的组合物，并且可以具有无菌入口(例如，所述容器可以是静脉内溶液袋，或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。所述标签或包装说明书指明，所述组合物用于治疗特定的病状，例如狼疮肾炎或类风湿性关节炎。所述标签或包装说明书将进一步包括关于给患者施用所述组合物的指导。另外，所述制品可以进一步包含第二个容器，其包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐水、林格溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包括从商业或用户观点来看所希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
还提供了试剂盒，其可用于各种目的，例如用于B-细胞杀伤测定法。如关于制品一样，所述试剂盒包含容器以及在容器上或与容器相连的标签或包装说明书。所述容器装有包含本发明的至少一种免疫抑制药物和至少一种BLyS和/或APRIL拮抗剂的组合物。可以包括另外的容器，其包含例如稀释剂和缓冲液、对照抗体。所述标签或包装说明书可以提供关于该组合物的描述以及关于所预计的体外或诊断用途的指导。
实验实施例
实施例1
BLyS和/或APRIL拮抗剂的制备
产生了TACI-Fc的四种氨基末端截短的形式。所有这四种形式具有融合至SEQ ID NO：2的氨基酸残基编号30的在WO 02/094852中公开的经修饰的人组织纤溶酶原激活物信号序列(SEQ ID NO：41)。然而，这四种蛋白质在其中Fc5被融合至SEQ ID NO：2的TACI氨基酸序列的位点方面不同。表1概述了这四种融合蛋白质的结构。
表1
TACI Fc融合蛋白质
  TACI-Fc的名称   TACI氨基酸残基
  TACI(d1-29)-Fc5   SEQ ID NO：2的30至154
  TACI(d1-29，d107-154)-Fc5   SEQ ID NO：2的30至106
  TACI(d1-29，d111-154)-Fc5   SEQ ID NO：2的30至110
  TACI(d1-29，d120-154)-Fc5   SEQ ID NO：2的30至119
使用标准技术，通过重叠PCR来产生编码蛋白质的表达盒(参见例如，Horton等人，Gene 77：61(1989))。将编码TACI的核酸分子和编码Fc5的核酸分子用作PCR模板。寡核苷酸引物列于表2和表3中。
表2
用于产生TACI融合蛋白的寡核苷酸引物
Figure A20088001559000671
表3
寡核苷酸序列
  引物   核苷酸序列   SEQ ID NO.
  ZC24，903   5′TATTAGGCCGGCCACCATGGATGCAATGA 3′   27
  ZC24，955   5′TGAAGATTTGGGCTCCTTGAGACCTGGGA 3′   28
  ZC24，952   5′TCCCAGGTCTCAAGGAGCCCAAATCTTCA 3′   29
  ZC24，946   5′TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3′   30
  ZC24，951   5′TGAAGATTTGGGCTCGTTCTCACAGAAGTA 3′   31
  ZC24，949   5′ATACTTCTGTGAGAACGAGCCCAAATCTTCA 3′   32
  ZC28，978   5′TTTGGGCTCGCTCCTGAGCTTGTTCTCACA 3′   33
  ZC28，979   5′CTCAGGAGCGAGCCCAAATCTTCAGACA 3′   34
  ZC28，981   5′TTTGGGCTCCCTGAGCTCTGGTGGAA 3′   35
  ZC28，980   5′GAGCTCAGGGAGCCCAAATCTTCAGACA 3′   36
对于所述四种氨基末端截短的形式中的每一种，第一轮PCR扩增由两个反应组成。所述两个反应分别如下来进行：对于每一种形式，在一个反应中使用5′和3′TACI寡核苷酸，和在另一个反应中使用5′和3′Fc5寡核苷酸。第一轮PCR扩增的条件如下。向25μl的最终体积中添加约200ng的模板DNA，2.5μl 10x Pfu反应缓冲液(Stratagene)，2μl的2.5mM dNTPs，0.5μl的各20μM的5′寡核苷酸和3′寡核苷酸，和0.5μl的Pfu聚合酶(2.5个单位，Stratagene)。扩增的温度特性谱的组成如下：94℃ 3分钟；以94℃ 15秒，50℃ 15秒，72℃ 2分钟进行35个循环；随后于72℃延伸2分钟。反应产物通过琼脂糖凝胶电泳来进行分级，并且将相应于预期大小的条带从凝胶上切除并根据制造商的指导使用QIAGEN QIAQUICK Gel Extraction Kit(Qiagen)来进行回收。
通过使用来自第一轮PCR的经凝胶纯化的片段作为DNA模板来进行第二轮PCR扩增或重叠PCR扩增反应。第二轮PCR扩增的条件如下。向25μl的最终体积中添加各约10ng的TACI片段和Fc5片段的模板DNA，2.5μl 10x Pfu反应缓冲液(Stratagene)，2μl的2.5mM dNTPs，0.5μl的各20μM的ZC24，903(SEQ ID NO：27)和ZC24，946(SEQ ID NO：30)，和0.5μl的Pfu聚合酶(2.5个单位，Stratagene)。扩增的温度特性谱的组成如下：94℃ 1分钟；以94℃ 15秒，55℃ 15秒，72℃2分钟进行35个循环；随后于72℃延伸2分钟。反应产物通过琼脂糖凝胶电泳来进行分级，并且将相应于预期大小的条带从凝胶上切除并根据制造商的指导使用QIAGEN QIAQUICK Gel Extraction Kit(Qiagen)来进行回收。
根据制造商推荐的方案，使用Invitrogen的ZEROBLUNT TOPO PCRCloning Kit，分开地克隆所述四种形式的氨基末端截短的TACI-Fc PCR产物中的每一种。表4列出了这些TACI-Fc构建体的核苷酸和氨基酸序列。
表4
TACI-Fc变体的序列
Figure A20088001559000691
在验证了核苷酸序列后，将包含所述四种形式的氨基末端截短的TACI-Fc融合物中的每一种的质粒用FseI和AscI进行消化，以释放出氨基酸编码区段。将FseI-AscI片段连接入包含CMV启动子和SV40 poly A区段的哺乳动物表达载体中。如下面所描述的，将表达载体引入中国仓鼠卵巢细胞中。
实施例2
通过中国仓鼠卵巢细胞来产生TACI-Fc蛋白
将TACI-Fc表达构建体用于经由电穿孔来转染生长在无动物蛋白质的培养基中的悬浮适应型中国仓鼠卵巢(CHO)DG44细胞(Urlaub等人，Som.Cell.Molec.Genet.12：555(1986))。CHO DG44细胞由于在两个二氢叶酸还原酶染色体位置处发生缺失而缺乏功能性的二氢叶酸还原酶基因。所述细胞在浓度增加的氨甲蝶呤存在下的生长导致在所述表达构建体上的二氢叶酸还原酶基因以及所连接的编码重组蛋白质的基因的扩增。
使CHO DG44细胞在PFCHO培养基(JRH Biosciences，Lenexa，KS)、4mM L-谷氨酰胺(JRH Biosciences)和1×次黄嘌呤-胸苷补充物(LifeTechnologies)中进行传代，并且在37℃和5％ CO2下在旋转摇动平台上以120 RPM在Corning摇瓶中培育所述细胞。分开地用线性化的表达质粒转染所述细胞。为了确保无菌，通过在Eppendorf管中将200μg质粒DNA与20μl经剪切的鲑精载体DNA(5′→3′Inc.Boulder，CO，10mg/ml)、22μl 3M NaOAc(pH 5.2)和484μl 100％乙醇(Gold ShieldChemical Co.，Hayward，CA)相合并，在冰上进行单次乙醇沉淀步骤25分钟。在温育后，将管在置于4℃冷室中的微量离心机(microfuge)之中以14,000RPM进行离心，除去上清液，并且用0.5ml 70％乙醇洗涤粒状沉淀两次并让其风干。
在干燥DNA粒状沉淀的同时，通过在25ml锥形离心管中以900RPM使106个总细胞(16.5ml)离心5分钟来制备CHO DG44细胞。将CHO DG44细胞重悬浮于总体积为300μl的PFCHO生长培养基中，并置于具有0.4cm电极隙的Gene-Pulser Cuvette(Bio-Rad)中。在大约50分钟的干燥时间后，将DNA重悬浮于500μl的PFCHO生长培养基中，并且以使总体积不超过800μl的方式添加至在杯池(cuvette)中的细胞，和让其在室温下静置5分钟以减少气泡形成。将杯池置于被设置在0.296kV(千伏)和0.950 HC(高电容)的BioRad Gene Pulser II装置中，并立即进行电穿孔。
在置于在CoStar T-75烧瓶中的20ml总体积的PFCHO培养基中之前，将细胞在室温下温育5分钟。将烧瓶置于37℃和5％CO2下48小时，然后采用台盼蓝排除法通过血细胞计数器来对细胞进行计数，并放置在没有次黄嘌呤-胸苷补充物且包含200mM氨甲蝶呤(Cal Biochem)的PFCHO选择培养基中。
在氨甲蝶呤选择过程恢复后，就通过Western印迹分析来检查包含分泌的TACI-Fc融合蛋白的该条件培养基。
实施例3
小鼠中Atacicept和MMF的组合
在一个28天的研究中，在CD-1小鼠中测试atacicept和MMF(CellCept)的共施用。将150只动物分为四个治疗组。组1接受用于atacicept和MMF的媒介物对照物品，其中使用与用于每个测试物品的相同的途径和给药方案。组2经由每天经口管饲法接受MMF(351mg/kg)。组3经由皮下注射每周三次接受atacicept(20mg/kg)。组4接受atacicept(20mg/kg，3次/周，SC)和MMF(351mg/kg，每天，口服)，通常在彼此30分钟内施用。将所施用的MMF的剂量选择为小鼠中的最大可行剂量，并通过使用体表面积将人剂量换算成小鼠剂量来模仿用于肝移植患者的29mg/kg的关于70kg的人而言的人等价剂量(约2g/天)。
在基线(第1天)以及第14、28(治疗的最后一天)、42、56和112天处死动物。每天就死亡率、异常和疼痛或痛苦的征候对小鼠进行检查。在该研究的第1天和此后每周，以及在处死之前，测量和记录体重。为了全面的血液学和血清化学分析，淋巴细胞亚型的流式细胞术分析，以及总血清IgG、IgM和IgA浓度，从被处死的动物中收集血液。使用来测量总血清IgG、IgM和IgA。在被处死的动物上进行全面的尸体剖检，以评价器官重量变化、宏观病理学和组织病理学。
使用小鼠IgG ELISA定量试剂盒(目录号E90-131，BethylLaboratories，Montgomery，TX)，并结合ELISA Starter AccessoryPackage(目录号E101，Bethyl Laboratories，Montgomery，TX)，来评价总IgG水平。所有的液体操作通过使用所整合的Freedom Evo 150液体操作系统和Columbus Washer(TECAN，Denmark)来进行。微量滴定孔用经亲和纯化的山羊抗小鼠IgG来进行包被，并在室温下温育1小时。对所述孔进行抽吸，用洗涤溶液进行洗涤，然后用封闭溶液封闭30分钟。除去封闭溶液，洗涤平板，并一式两份地添加样品/标准品。1小时后，抽吸掉样品/标准品，并用洗涤溶液洗涤所述孔。添加缀合有辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG，并将所述孔在室温下温育1小时。通过洗涤来除去未结合的经缀合的抗体，并通过与TMB底物(BethylLaboratories，Montgomery，TX)一起温育10分钟来测量留存在孔中的缀合物的量。通过添加2M H2SO4来终止颜色反应，并且在Spectramax190微量培养板阅读器上测量所得的吸光度(OD-450)。
关于总IgG的数据计算如下来进行：从每个样品和标准品中减去平均零标准(空白平板)OD-450值，并计算一式两份的读数的平均值。通过将每个标准品的平均OD对浓度进行作图来产生标准曲线，其中采用四参数对数曲线拟合。通过从标准曲线中进行内插法来获得样品浓度。将平均样品浓度乘以稀释倍数。使用
Figure A20088001559000721
Pro软件来分析的数据包括OD值，标准曲线，重复之间的标准差和％CV，以及未知者的内插值。
使用小鼠IgM ELISA定量试剂盒(目录号E90-101，BethylLaboratories，Montgomery，TX)，并结合ELISA Starter AccessoryPackage(目录号E101，Bethyl Laboratories，Montgomery，TX)，来评价总IgM水平。所有的液体操作通过使用所整合的Freedom Evo 150液体操作系统和Columbus Washer(TECAN，Denmark)来进行。微量滴定孔用经亲和纯化的山羊抗小鼠IgM来进行包被，并在室温下温育1小时。对所述孔进行抽吸，用洗涤溶液进行洗涤，然后用封闭溶液封闭30分钟。除去封闭溶液，洗涤平板，并一式两份地添加样品/标准品。1小时后，抽吸掉样品/标准品，并用洗涤溶液洗涤所述孔。添加缀合有辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgM，并将所述孔在室温下温育1小时。通过洗涤来除去未结合的经缀合的抗体，并通过与TMB底物(BethylLaboratories，Montgomery，TX)一起温育10分钟来测量留存在孔中的缀合物的量。通过添加2M H2SO4来终止颜色反应，并且在Spectramax190微量培养板阅读器上测量所得的吸光度(OD-450)。
关于总IgM的数据计算如下来进行：
从每个样品和标准品中减去平均零标准(空白平板)OD-450值，并计算一式两份的读数的平均值。通过将每个标准品的平均OD对浓度进行作图来产生标准曲线，其中采用四参数对数曲线拟合。通过从标准曲线中进行内插法来获得样品浓度。将平均样品浓度乘以稀释倍数。使用
Figure A20088001559000722
Pro软件来分析的数据包括OD值，标准曲线，重复之间的标准差和％CV，以及未知者的内插值。
使用小鼠IgA ELISA定量试剂盒(目录号E90-103，BethylLaboratories，Montgomery，TX)，并结合ELISA Starter AccessoryPackage(目录号E101，Bethyl Laboratories，Montgomery，TX)，来评价总IgA水平。所有的液体操作通过使用所整合的Freedom Evo 150液体操作系统和Columbus Washer(TECAN，Denmark)来进行。微量滴定孔用经亲和纯化的山羊抗小鼠IgA来进行包被，并在室温下温育1小时。对所述孔进行抽吸，用洗涤溶液进行洗涤，然后用封闭溶液封闭30分钟。除去封闭溶液，洗涤平板，并一式两份地添加样品/标准品。1小时后，抽吸掉样品/标准品，并用洗涤溶液洗涤所述孔。添加缀合有辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgM，并将所述孔在室温下温育1小时。通过洗涤来除去未结合的经缀合的抗体，并通过与TMB底物(BethylLaboratories，Montgomery，TX)一起温育10分钟来测量留存在孔中的缀合物的量。通过添加2M H2SO4来终止颜色反应，并且在Spectramax190微量培养板阅读器上测量所得的吸光度(OD-450)。
关于总IgA的数据计算如下来进行：
从每个样品和标准品中减去平均零标准(空白平板)OD-450值，并计算一式两份的读数的平均值。通过将每个标准品的平均OD对浓度进行作图来产生标准曲线，其中采用四参数对数曲线拟合。通过从标准曲线中进行内插法来获得样品浓度。将平均样品浓度乘以稀释倍数。使用
Figure A20088001559000731
Pro软件来分析的数据包括OD值，标准曲线，重复之间的标准差和％CV，以及未知者的内插值。
免疫球蛋白测量值的变化的平均结果记录在下面的表5中，并且以图形形式记录在图1、2和3中。
表5
第28天时的数值平均IgG、IgM和IgA结果
以及与媒介物的差异(μg/mL)
  媒介物(V)   MMF   Actacicept(A)   Atacicept+MMF(A+M)
  IgG   179   185   75   31
  IgM   238   317   76   19
  IgA   498   506   105   33
  Δ1(V-MMF)   Δ2(V-A)   Δ1+Δ2   Δ3(V-(A+M))   Δ3相比于Δ1+Δ2
  IgGIgMIgA   -6-79-8   104162393   9883385   148219464   148＞98219＞83464＞385
如可以从这些计算中所看出的，所述组合对于减少所有三种类型的免疫球蛋白具有协同效应(即，所述组合相对于媒介物的平均变化(Δ3)比从媒介物至仅MMF的平均变化(Δ1)和从媒介物至仅Atacicept的平均变化(Δ2)的加合更大(或者，在数学上来说，Δ3＞Δ1+Δ2))。
结论
此处的实验显示了令人惊人的结果，因为相比于使用单独的免疫抑制药物和BLyS和/或APRIL拮抗剂所导致的减少水平而言，免疫抑制药物与BLyS和/或APRIL拮抗剂(例如，MMF与atacicept)的组合导致Ig水平的协同耗竭。
实施例4
Atacicept和MMF组合实验的重复和延伸
通过使用与在实施例3中所描述的那些相似的程序，并且按剂量给药直至第91天，来重复实施例3的结果并在时间上延伸至第35、91、126和182天。该实验的结果确证了在每个时间点处Atacicept和MMF对于所述三种类型的免疫球蛋白中至少之一的平均免疫球蛋白水平的协同效应。所述协同结果概括在下面的表6中。
表6
关于延伸实验的IgG、IgM和IgA结果的数值平均值的协同结果
以及与媒介物的差异(μg/mL)
  取样第 天   免疫球蛋白类型   媒介物(V)   MMF   Actacicept(A)   Atacicept+MMF(A+M)
  35   IgG   519.7   940.13   261.35   148.59
  35   IgM   105.7   141.34   5.54   5.11
  91   IgG   697.01   1192.87   191.84   128.22
  91   IgA   924.36   1764.55   37.53   0
  126   IgA   1113.48   1467.05   817.22   778.05
  182   IgM   73.95   53.77   73.75   47.63
  取样第 天   免疫球蛋白类型   Δ1(V-MMF)   Δ2(V-A)   Δ1+Δ2   Δ3(V-(A+M))   Δ3相比于Δ1+Δ2
  35   IgG   -420.43   258.35   -162.08   371.11   371.11＞-162.08
  35   IgM   -35.64   100.16   64.52   100.59   100.59＞64.52
  91   IgG   -495.86   505.17   9.31   568.79   568.79＞9.31
  91   IgA   -840.19   886.83   46.64   924.36   924.36＞46.64
  126   IgA   -353.57   296.26   57.31   335.43   335.43＞57.31
  182   IgM   20.18   .20   20.38   26.32   26.32＞20.38
应当注意，当所选择的免疫球蛋白亚型达到最大抑制时，观察到协同效应的能力由于低的绝对数目而被掩蔽了。这种“掩蔽效应”解释了为什么在后面的时间点处在所有三种免疫球蛋白亚型中较少一贯地看到协同作用。总之，这些结果确证了在实施例3中所看到的Atacicept与MMF的组合对于所示免疫球蛋白类型的水平的数值平均值的协同效应，并且将该结论延伸至在35、91、126和182天的时间过程中。
为了完整起见，下面描述了在该重复和延伸实验中所使用的实验组、剂量、施用的体积和浓度：
表7
  组   动物的数目   剂量(mg/kg/天)   给药途径   给药计划表
  1 媒介物1+媒介物2   20M+20F   00   皮下口服   3/周每天
  2 Atacicept   20M+20F   20   皮下   3/周
  3 MMF   20M+20F   350   口服   每天
  4 Atacicept+MMF   20M+20F   20350   皮下口服   3/周每天
施用方案
ATACICEPT：每隔一天，进行3天/周，通过皮下途径。
MMF：每天，通过口服途径。
组1以与治疗组相同的处理频率接受用于ATACICEPT的媒介物和用于CellCept的媒介物。组2只用ATACICEPT进行治疗。
组3只接受CellCept。组4接受CellCept经口管饲法，随后为在约30分钟的时间段内进行ATACICEPT皮下注射。将第一次治疗的那天视为所述研究的第1天。在整个研究期间，进行临床观察、血液学和血液化学测试、毒物动力学和另外的调查。
总IgG、IgM和IgA测定/卫星组9、10、11和12
将另外的卫星组(satellite group)动物用于总免疫球蛋白测定和抗体测定。根据与主研究相同的程序，对它们进行处理和称重。
表8
Figure A20088001559000771
以3只小鼠/性别/笼，对动物进行圈养。
从3只动物/性别/组中收集血液样品(以渐进的号数顺序)，以用于测定在下列时间处的IgG、IgM和IgA血清水平：
从对照组(组9)的动物中：预剂量
从组9、10、11和12的动物中：
-在5周治疗期的第34天
-在13周治疗期的第90天
-在5周恢复期的第34天
-在13周恢复期的第90天。
在用乙醚将它们完全麻醉后，在处死时从小鼠腹主动脉中收集血液(至少0.8-1mL)。
将样品收集在没有任何抗凝剂的管中，并让其在室温下凝固大约1小时。凝块通过于+4℃以3000rpm离心15分钟来旋转沉降。弃去血细胞，并且将血清以100μL等份试样(对于每单个分析，4个等份试样)进行储放，并贮存于-80℃直至分析。通过经验证的ELISA方法来测定总IgG、IgM和IgA水平。
在5周治疗期结束时对4只动物/性别/组(以号数顺序的第一只)施行处死；在13周治疗期结束时对8只动物/性别/组(以号数顺序的第二只)施行处死；在5周恢复期结束时对4只动物/性别/组(以号数顺序的第一只恢复的动物)施行处死；和在13周恢复期结束时对4只动物/性别/组(其余的动物)施行处死。
结论
此处所报道的延伸实验支持了实施例3的结果，其中令人惊奇地显示，相比于使用单独的免疫抑制药物和BLyS和/或APRIL拮抗剂所导致的减少水平而言，免疫抑制药物与BLyS和/或APRIL拮抗剂(例如，MMF与atacicept)的组合导致Ig水平的协同耗竭。
参考文献
在本申请中所引用的参考文献(包括专利、公布的申请和其他出版物)通过提及而合并入本文。
序列表
<110>Rafael A.Ponce，JR
Wayne J.Wallis
Matthew S.Holdren
Linda Zuckerman
Alisa M.Littau
Kirk P.Van Ness
Claudia Pena Rossi
Hans Otto Lennart Graffner
<120>用于治疗自身免疫疾病的BLyS抑制和/或APRIL抑制与免疫抑制剂的组合
<130>054878/374508
<160>41
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>1377
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(14)...(892)
<400>1
agcatcctga gta atg agt ggc ctg ggc cgg agc agg cga ggt ggc cgg   49
               Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg
                1               5                   10
agc cgt gtg gac cag gag gag cgc ttt cca cag ggc ctg tgg acg ggg  97
Ser Arg Val Asp Gln Glu Glu Arg Phe Pro Gln Gly Leu Trp Thr Gly
         15                  20                  25
gtg gct atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag tac tgg gat cct ctg ctg  145
Val Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln Tyr Trp Asp Pro Leu Leu
     30                  35                  40
ggt acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc aac cat cag agc cag cgc  193
Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gln Ser Gln Arg
 45                  50                  55                  60
acc tgt gca gcc ttc tgc agg tca ctc agc tgc cgc aag gag caa ggc     241
Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gln Gly
                 65                  70                  75
aag ttc tat gac cat ctc ctg agg gac tgc atc agc tgt gcc tcc atc     289
Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile
             80                  85                  90
tgt gga cag cac cct aag caa tgt gca tac ttc tgt gag aac aag ctc     337
Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu
         95                 100                 105
agg agc cca gtg aac ctt cca cca gag ctc agg aga cag cgg agt gga     385
Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gln Arg Ser Gly
    110                 115                 120
gaa gtt gaa aac aat tca gac aac tcg gga agg tac caa gga ttg gag     433
Glu Val Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gln Gly Leu Glu
125                 130                 135                 140
cac aga ggc tca gaa gca agt cca gct ctc ccg ggg ctg aag ctg agt     481
His Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser
                145                 150                 155
gca gat cag gtg gcc ctg gtc tac agc acg ctg ggg ctc tgc ctg tgt     529
Ala Asp Gln Val Ala Leu Val Tyr Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys
            160                 165                 170
gcc gtc ctc tgc tgc ttc ctg gtg gcg gtg gcc tgc ttc ctc aag aag     577
Ala Val Leu Cys Cys Phe Leu Val Ala Val Ala Cys Phe Leu Lys Lys
        175                 180                 185
agg ggg gat ccc tgc tcc tgc cag ccc cgc tca agg ccc cgt caa agt     625
Arg Gly Asp Pro Cys Ser Cys Gln Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gln Ser
    190                 195                 200
ccg gcc aag tct  tcc cag gat  cac gcg atg gaa gcc ggc agc cct gtg   673
Pro Ala Lys Ser Ser Gln Asp His Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro Val
205                 210                 215                 220
agc aca tcc ccc gag cca gtg gag acc tgc agc ttc  tgc ttc cct gag    721
Ser Thr Ser Pro Glu Pro Val Glu Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu
                225                 230                 235
tgc agg gcg ccc acg cag gag agc gca gtc acg cct ggg acc ccc gac   769
Cys Arg Ala Pro Thr Gln Glu Ser Ala Val Thr Pro Gly Thr Pro Asp
            240                 245                 250
ccc act tgt gct gga agg tgg ggg tgc cac acc agg acc aca gtc ctg   817
Pro Thr Cys Ala Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr Val Leu
        255                 260                 265
cag cct tgc cca cac atc cca gac agt ggc ctt ggc att gtg tgt gtg   865
Gln Pro Cys Pro His Ile Pro Asp Ser Gly Leu Gly Ile Val Cys Val
    270                 275                 280
cct gcc cag gag ggg ggc cca ggt gca taaatggggg tcagggaggg         912
Pro Ala Gln Glu Gly Gly Pro Gly Ala
285                 290
aaaggaggag ggagagagat ggagaggagg ggagagagaa agagaggtgg ggagagggga 972
gagagatatg aggagagaga gacagaggag gcagaaaggg agagaaacag aggagacaga 1032
gagggagaga gagacagagg gagagagaga cagaggggaa gagaggcaga gagggaaaga 1092
ggcagagaag gaaagagaca ggcagagaag gagagaggca gagagggaga gaggcagaga 1152
gggagagagg cagagagaca gagagggaga gagggacaga gagagataga gcaggaggtc 1212
ggggcactct gagtcccagt tcccagtgca gctgtaggtc gtcatcacct aaccacacgt 1272
gcaataaagt cctcgtgcct gctgctcaca gcccccgaga gcccctcctc ctggagaata 1332
aaacctttgg cagctgccct tcctcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa                 1377
<210>2
<211>293
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Val Asp
 1               5                  10                  15
Gln Glu Glu Arg Phe Pro Gln Gly Leu Trp Thr Gly Val Ala Met Arg
            20                  25                  30
Ser Cys Pro Glu Glu Gln Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met
        35                  40                  45
Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gln Ser Gln Arg Thr Cys Ala Ala
    50                  55                  60
Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gln Gly Lys Phe Tyr Asp
65                  70                  75                  80
His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gln His
                85                  90                  95
Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Pro Val
            100                 105                 110
Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gln Arg Ser Gly Glu Val Glu Asn
        115                 120                 125
Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gln Gly Leu Glu His Arg Gly Ser
    130                 135                 140
Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser Ala Asp Gln Val
145                 150                 155                 160
Ala Leu Val Tyr Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys Ala Val Leu Cys
                165                 170                 175
Cys Phe Leu Val Ala Val Ala Cys Phe Leu Lys Lys Arg Gly Asp Pro
            180                 185                 190
Cys Ser Cys Gln Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gln Ser Pro Ala Lys Ser
        195                 200                 205
Ser Gln Asp His Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro Val Ser Thr Ser Pro
    210                 215                 220
Glu Pro Val Glu Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu Cys Arg Ala Pro
225                 230                 235                 240
Thr Gln Glu Ser Ala Val Thr Pro Gly Thr Pro Asp Pro Thr Cys Ala
                245                 250                 255
Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr Val Leu Gln Pro Cys Pro
            260                 265                 270
His Ile Pro Asp Ser Gly Leu Gly Ile Val Cys Val Pro Ala Gln Glu
        275                 280                 285
Gly Gly Pro Gly Ala
    290
<210>3
<211>586
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(27)...(578)
<400>3
gcagcttgtg cggcggcgtc ggcacc atg agg cga ggg ccc cgg agc ctg cgg 53
                             Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg
                              1               5
ggc agg gac gcg cca gcc ccc acg ccc tgc gtc ccg gcc gag tgc ttc  101
Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe
 10                  15                  20                  25
gac ctg ctg gtc cgc cac tgc gtg gcc tgc ggg ctc ctg cgc acg ccg   149
Asp Leu Leu Val Arg His Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro
                 30                  35                  40
cgg ccg aaa ccg gcc ggg gcc agc agc cct gcg ccc agg acg gcg ctg   197
Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu
             45                  50                  55
cag ccg cag gag tcg gtg ggc gcg ggg gcc ggc gag gcg gcg ctg ccc   245
Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro
         60                  65                  70
ctg ccc ggg ctg ctc ttt ggc gcc ccc gcg ctg ctg ggc ctg gca ctg   293
Leu Pro Gly Leu Leu Phe Gly Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu
     75                  80                  85
gtc ctg gcg ctg gtc ctg gtg ggt ctg gtg agc tgg agg cgg cga cag   341
Val Leu Ala Leu Val Leu Val Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gln
 90                  95                 100                 105
cgg cgg ctt cgc ggc gcg tcc tcc gca gag gcc ccc gac gga gac aag   389
Arg Arg Leu Arg Gly Ala Ser Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys
                110                 115                 120
gac gcc cca gag ccc ctg gac aag gtc atc att ctg tct ccg gga atc   437
Asp Ala Pro Glu Pro Leu Asp Lys Val Ile Ile Leu Ser Pro Gly Ile
            125                 130                 135
tct gat gcc aca gct cct gcc tgg cct cct cct ggg gaa gac cca gga   485
Ser Asp Ala Thr Ala Pro Ala Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly
        140                 145                 150
acc acc cca cct ggc cac agt gtc cct gtg cca gcc aca gag ctg ggc   533
Thr Thr Pro Pro Gly His Ser Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly
    155                 160                 165
tcc act gaa ctg gtg acc acc aag acg gcc ggc cct gag caa caa       578
Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gln Gln
170                 175                 180
tagcaggg                                                          586
<210>4
<211>184
<212>PRT
<213>智人
<400>4
Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro
 1               5                  10                  15
Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys
            20                  25                  30
Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala
        35                  40                  45
Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly
    50                  55                  60
Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu Phe Gly
65                  70                  75                  80
Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Val Leu Val
                85                  90                  95
Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gln Arg Arg Leu Arg Gly Ala Ser
            100                 105                 110
Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu Asp
        115                 120                 125
Lys Val Ile Ile Leu Ser Pro Gly Ile Ser Asp Ala Thr Ala Pro Ala
    130                 135                 140
Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His Ser
145                 150                 155                 160
Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr
                165                 170                 175
Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gln Gln
            180
<210>5
<211>995
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(219)...(770)
<400>5
aagactcaaa cttagaaact tgaattagat gtggtattca aatccttacg tgccgcgaag 60
acacagacag cccccgtaag aacccacgaa gcaggcgaag ttcattgttc tcaacattct  120
agctgctctt gctgcatttg ctctggaatt cttgtagaga tattacttgt ccttccaggc  180
tgttctttct gtagctccct tgttttcttt ttgtgatc atg ttg cag atg gct ggg  236
                                          Met Leu Gln Met Ala Gly
                                           1               5
cag tgc tcc caa aat gaa tat ttt gac agt ttg ttg cat gct tgc ata    284
Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser Leu Leu His Ala Cys Ile
             10                  15                  20
cct tgt caa ctt cga tgt tct tct aat act cct cct cta aca tgt cag    332
Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr Pro Pro Leu Thr Cys Gln
         25                  30                  35
cgt tat tgt aat gca agt gtg acc aat tca gtg aaa gga acg aat gcg    380
Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser Val Lys Gly Thr Asn Ala
     40                  45                  50
att ctc tgg acc tgt ttg gga ctg agc tta ata att tct ttg gca gtt    428
Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu Ile Ile Ser Leu Ala Val
 55                  60                  65                  70
ttc gtg cta atg ttt ttg cta agg aag ata agc tct gaa cca tta aag    476
Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile Ser Ser Glu Pro Leu Lys
                 75                  80                  85
gac gag ttt aaa aac aca gga tca ggt ctc ctg ggc atg gct aac att    524
Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu Leu Gly Met Ala Asn Ile
             90                  95                 100
gac ctg gaa aag agc agg act ggt gat gaa att att ctt ccg aga ggc    572
Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu Ile Ile Leu Pro Arg Gly
        105                 110                 115
ctc gag tac acg gtg gaa gaa tgc acc tgt gaa gac tgc atc aag agc    620
Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys Glu Asp Cys Ile Lys Ser
    120                 125                 130
aaa ccg aag gtc gac tct gac cat tgc ttt cca ctc cca gct atg gag    668
Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe Pro Leu Pro Ala Met Glu
135                 140                 145                 150
gaa ggc gca acc att ctt gtc acc acg aaa acg aat gac tat tgc aag    716
Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys Thr Asn Asp Tyr Cys Lys
                155                 160                 165
agc ctg cca gct gct ttg agt gct acg gag ata gag aaa tca att tct   764
Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu Ile Glu Lys Ser Ile Ser
            170                 175                 180
gct agg taattaacca tttcgactcg agcagtgcca ctttaaaaat cttttgtcag    820
Ala Arg
aatagatgat gtgtcagatc tctttaggat gactgtattt ttcagttgcc gatacagctt 880
tttgtcctct aactgtggaa actctttatg ttagatatat ttctctaggt tactgttggg 940
agcttaatgg tagaaacttc cttggtttca tgattaaagt cttttttttt cctga      995
<210>6
<211>184
<212>PRT
<213>智人
<400>6
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
 1               5                  10                  15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
            20                  25                  30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
        35                  40                  45
Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu
    50                  55                  60
Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu
                85                  90                  95
Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu
            100                 105                 110
Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys
        115                 120                 125
Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe
    130                 135                 140
Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys
145                 150                 155                 160
Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu
                165                 170                 175
Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg
            180
<210>7
<211>1149
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(173)...(1023)
<400>7
gaattcggca cgaggcagaa aggagaaaat tcaggataac tctcctgagg ggtgagccaa 60
gccctgccat gtagtgcacg caggacatca acaaacacag ataacaggaa atgatccatt 120
ccctgtggtc acttattcta aaggccccaa ccttcaaagt tcaagtagtg at atg gat 178
                                                          Met Asp
                                                           1
gac tcc aca gaa agg gag cag tca cgc ctt act tct tgc ctt aag aaa   226
Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu Lys Lys
         5                   10                  15
aga gaa gaa atg aaa ctg aag gag tgt gtt tcc atc ctc cca cgg aag   274
Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro Arg Lys
     20                  25                  30
gaa agc ccc tct gtc cga tcc tcc aaa gac gga aag ctg ctg gct gca   322
Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu Ala Ala
 35                  40                  45                  50
acc ttg ctg ctg gca ctg ctg tct tgc tgc ctc acg gtg gtg tct ttc   370
Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val Ser Phe
                 55                  60                  65
tac cag gtg gcc gcc ctg caa ggg gac ctg gcc agc ctc cgg gca gag   418
Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ala Glu
             70                  75                  80
ctg cag ggc cac cac gcg gag aag ctg cca gca gga gca gga gcc ccc   466
Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly Ala Pro
         85                  90                  95
aag gcc ggc ctg gag gaa gct cca gct gtc acc gcg gga ctg aaa atc   514
Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu Lys Ile
    100                 105                  110
ttt gaa cca cca gct cca gga gaa ggc aac tcc agt cag aac agc aga    562
Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn Ser Arg
115                 120                 125                 130
aat aag cgt gcc gtt cag ggt cca gaa gaa aca gtc act caa gac tgc    610
Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln Asp Cys
                135                 140                 145
ttg caa ctg att gca gac agt gaa aca cca act ata caa aaa gga tct    658
Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys Gly Ser
            150                 155                 160
tac aca ttt gtt cca tgg ctt ctc agc ttt aaa agg gga agt gcc cta    706
Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu
        165                 170                 175
gaa gaa aaa gag aat aaa ata ttg gtc aaa gaa act ggt tac ttt ttt    754
Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe
    180                 185                 190
ata tat ggt cag gtt tta tat act gat aag acc tac gcc atg gga cat    802
Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met Gly His
195                 200                 205                 210
cta att cag agg aag aag gtc cat gtc ttt ggg gat gaa ttg agt ctg    850
Leu Ile Gln Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu
                215                 220                 225
gtg act ttg ttt cga tgt att caa aat atg cct gaa aca cta ccc aat    898
Val Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu Pro Asn
            230                 235                 240
aat tcc tgc tat tca gct ggc att gca aaa ctg gaa gaa gga gat gaa    946
Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu
        245                 250                 255
ctc caa ctt gca ata cca aga gaa aat gca caa ata tca ctg gat gga    994
Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu Asp Gly
    260                 265                 270
gat gtc aca ttt ttt ggt gca ttg aaa ct gctgtgacct acttacacca       1043
Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys
275                  280
tgtctgtagc tattttcctc cctttctctg tacctctaag aagaaagaat ctaactgaaa 1103
ataccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ccctcgagcg gccgcc                1149
<210>8
<211>283
<212>PRT
<213>智人
<400>8
Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu
 1               5                  10                  15
Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro
            20                  25                  30
Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val
    50                  55                  60
Ser Phe Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly
                85                  90                  95
Ala Pro Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu
            100                 105                 110
Lys Ile Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn
        115                 120                 125
Ser Arg Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln
    130                 135                 140
Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys
145                 150                 155                 160
Gly Ser Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser
                165                 170                 175
Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr
            180                 185                 190
Phe Phe Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met
        195                 200                 205
Gly His Leu Ile Gln Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu
    210                 215                 220
Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu
225                 230                 235                 240
Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly
                245                 250                 255
Asp Glu Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu
            260                 265                 270
Asp Gly Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys
        275                 280
<210>9
<211>1680
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(164)...(1093)
<400>9
tactcactat agggctcgag cggccgcccg ggcaggtgct cctgggggaa cccagccctg  60
ccatgctctg agggcagtct cccaggacac agatgacagg aaatgaccca cccctgtggt  120
cacttactcc aaaggcctag accttcaaag tgctcctcgt gga atg gat gag tct    175
                                                Met Asp Glu Ser
                                                 1
gca aag acc ctg cca cca ccg tgc ctc tgt ttt tgc tcc gag aaa gga    223
Ala Lys Thr Leu Pro Pro Pro Cys Leu Cys Phe Cys Ser Glu Lys Gly
 5                   10                  15                  20
gaa gat atg aaa gtg gga tat gat ccc atc act ccg cag aag gag gag    271
Glu Asp Met Lys Val Gly Tyr Asp Pro Ile Thr Pro Gln Lys Glu Glu
                 25                  30                  35
ggt gcc tgg ttt ggg atc tgc agg gat gga agg ctg ctg gct gct acc    319
Gly Ala Trp Phe Gly Ile Cys Arg Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ala Thr
             40                  45                  50
ctc ctg ctg gcc ctg ttg tcc agc agt ttc aca gcg atg tcc ttg tac    367
Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Ser Ser Phe Thr Ala Met Ser Leu Tyr
         55                  60                  65
cag ttg gct gcc ttg caa gca gac ctg atg aac ctg cgc atg gag ctg    415
Gln Leu Ala Ala Leu Gln Ala Asp Leu Met Asn Leu Arg Met Glu Leu
     70                  75                  80
cag agc tac cga ggt tca gca aca cca gcc gcc gcg ggt gct cca gag    463
Gln Ser Tyr Arg Gly Ser Ala Thr Pro Ala Ala Ala Gly Ala Pro Glu
 85                  90                  95                 100
ttg acc gct gga gtc aaa ctc ctg aca ccg gca gct cct cga ccc cac    511
Leu Thr Ala Gly Val Lys Leu Leu Thr Pro Ala Ala Pro Arg Pro His
                105                 110                 115
aac tcc agc cgc ggc cac agg aac aga cgc gct ttc cag gga cca gag    559
Asn Ser Ser Arg Gly His Arg Asn Arg Arg Ala Phe Gln Gly Pro Glu
            120                 125                 130
gaa aca gaa caa gat gta gac ctc tca gct cct cct gca cca tgc ctg    607
Glu Thr Glu Gln Asp Val Asp Leu Ser Ala Pro Pro Ala Pro Cys Leu
        135                 140                 145
cct gga tgc cgc cat tct caa cat gat gat aat gga atg aac ctc aga    655
Pro Gly Cys Arg His Ser Gln His Asp Asp Asn Gly Met Asn Leu Arg
    150                 155                 160
aac atc att caa gac tgt ctg cag ctg att gca gac agc gac acg ccg    703
Asn Ile Ile Gln Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser Asp Thr Pro
165                 170                 175                 180
act ata cga aaa gga act tac aca ttt gtt cca tgg ctt ctc agc ttt    751
Thr Ile Arg Lys Gly Thr Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe
                185                 190                 195
aaa aga gga aat gcc ttg gag gag aaa gag aac aaa ata gtg gtg agg    799
Lys Arg Gly Asn Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile Val Val Arg
            200                 205                 210
caa aca ggc tat ttc ttc atc tac agc cag gtt cta tac acg gac ccc    847
Gln Thr Gly Tyr Phe Phe Ile Tyr Ser Gln Val Leu Tyr Thr Asp Pro
        215                 220                 225
atc ttt gct atg ggt cat gtc atc cag agg aag aaa gta cac gtc ttt    895
Ile Phe Ala Met Gly His Val Ile Gln Arg Lys Lys Val His Val Phe
    230                 235                 240
ggg gac gag ctg agc ctg gtg acc ctg ttc cga tgt att cag aat atg    943
Gly Asp Glu Leu Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met
245                 250                 255                 260
ccc aaa aca ctg ccc aac aat tcc tgc tac tcg gct ggc atc gcg agg    991
Pro Lys Thr Leu Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Arg
                265                 270                 275
ctg gaa gaa gga gat gag att cag ctt gca att cct cgg gag aat gca     1039
Leu Glu Glu Gly Asp Glu Ile Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala
            280                 285                 290
cag att tca cgc aac gga gac gac acc ttc ttt ggt gcc cta aaa ctg    1087
Gln Ile Ser Arg Asn Gly Asp Asp Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu
        295                 300                 305
ctg taa ctcacttgct ggagtgcgtg atccccttcc ctcgtcttct ctgtacctcc     1143
Leu  *
gagggagaaa cagacgactg gaaaaactaa aagatgggga aagccgtcag cgaaagtttt  1203
ctcgtgaccc gttgaatctg atccaaacca ggaaatataa cagacagcca caaccgaagt  1263
gtgccatgtg agttatgaga aacggagccc gcgctcagaa agaccggatg aggaagaccg  1323
ttttctccag tcctttgcca acacgcaccg caaccttgct ttttgccttg ggtgacacat  1383
gttcagaatg cagggagatt tccttgtttt gcgatttgcc atgagaagag ggcccacaac  1443
tgcaggtcac tgaagcattc acgctaagtc tcaggattta ctctcccttc tcatgctaag  1503
tacacacacg ctcttttcca ggtaatacta tgggatacta tggaaaggtt gtttgttttt  1563
aaatctagaa gtcttgaact ggcaatagac aaaaatcctt ataaattcaa gtgtaaaata  1623
aacttaatta aaaaggtaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa     1680
<210>10
<211>309
<212>PRT
<213>小鼠
<400>10
Met Asp Glu Ser Ala Lys Thr Leu Pro Pro Pro Cys Leu Cys Phe Cys
 1               5                  10                  15
Ser Glu Lys Gly Glu Asp Met Lys Val Gly Tyr Asp Pro Ile Thr Pro
            20                  25                  30
Gln Lys Glu Glu Gly Ala Trp Phe Gly Ile Cys Arg Asp Gly Arg Leu
        35                  40                  45
Leu Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Ser Ser Phe Thr Ala
    50                  55                  60
Met Ser Leu Tyr Gln Leu Ala Ala Leu Gln Ala Asp Leu Met Asn Leu
65                  70                  75                  80
Arg Met Glu Leu Gln Ser Tyr Arg Gly Ser Ala Thr Pro Ala Ala Ala
                85                  90                  95
Gly Ala Pro Glu Leu Thr Ala Gly Val Lys Leu Leu Thr Pro Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Arg Pro His Asn Ser Ser Arg Gly His Arg Asn Arg Arg Ala Phe
        115                 120                 125
Gln Gly Pro Glu Glu Thr Glu Gln Asp Val Asp Leu Ser Ala Pro Pro
    130                 135                 140
Ala Pro Cys Leu Pro Gly Cys Arg His Ser Gln His Asp Asp Asn Gly
145                 150                 155                 160
Met Asn Leu Arg Asn Ile Ile Gln Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp
                165                 170                 175
Ser Asp Thr Pro Thr Ile Arg Lys Gly Thr Tyr Thr Phe Val Pro Trp
            180                 185                 190
Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Asn Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys
        195                 200                 205
Ile Val Val Arg Gln Thr Gly Tyr Phe Phe Ile Tyr Ser Gln Val Leu
    210                 215                 220
Tyr Thr Asp Pro Ile Phe Ala Met Gly His Val Ile Gln Arg Lys Lys
225                 230                 235                 240
Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys
                245                 250                 255
Ile Gln Asn Met Pro Lys Thr Leu ProAsn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala
            260                 265                 270
Gly Ile Ala Arg Leu Glu Glu Gly Asp Glu Ile Gln Leu Ala Ile Pro
        275                 280                 285
Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Arg Asn Gly Asp Asp Thr Phe Phe Gly
    290                 295                 300
Ala Leu Lys Leu Leu
305
<210>11
<211>185
<212>PRT
<213>智人
<400>11
Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro
 1               5                  10                  15
Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys
            20                  25                  30
Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala
        35                  40                  45
Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val
    50                  55                  60
Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu Phe
65                  70                  75                  80
Gly Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Val Leu
                85                  90                  95
Val Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gln Arg Arg Leu Arg Gly Ala
            100                 105                 110
Ser Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu
        115                 120                 125
Asp Lys Val Ile Ile Leu Ser Pro Gly Ile Ser Asp Ala Thr Ala Pro
    130                 135                 140
Ala Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His
145                 150                 155                 160
Ser Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr
                165                 170                 175
Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gln Gln
            180                 185
<210>12
<211>247
<212>PRT
<213>智人
<400>12
Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Val Asp
 1               5                  10                  15
Gln Glu Glu Arg Trp Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gln Gly Lys Phe
            20                  25                  30
Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly
        35                  40                  45
Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser
    50                  55                  60
Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gln Arg Ser Gly Glu Val
65                  70                  75                  80
Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gln Gly Leu Glu His Arg
                85                  90                  95
Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser Ala Asp
            100                 105                 110
Gln Val Ala Leu Val Tyr Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys Ala Val
        115                 120                 125
Leu Cys Cys Phe Leu Val Ala Val Ala Cys Phe Leu Lys Lys Arg Gly
    130                 135                 140
Asp Pro Cys Ser Cys Gln Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gln Ser Pro Ala
145                 150                 155                 160
Lys Ser Ser Gln Asp His Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro Val Ser Thr
                165                 170                 175
Ser Pro Glu Pro Val Glu Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu Cys Arg
            180                 185                 190
Ala Pro Thr Gln Glu Ser Ala Val Thr Pro Gly Thr Pro Asp Pro Thr
        195                 200                 205
Cys Ala Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr Val Leu Gln Pro
    210                 215                 220
Cys Pro His Ile Pro Asp Ser Gly Leu Gly Ile Val Cys Val Pro Ala
225                 230                 235                 240
Gln Glu Gly Gly Pro Gly Ala
                245
<210>13
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>BLyS结合多肽
<400>13
Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ala Trp Val Pro Cys Ser Val Leu
 1               5                  10                  15
Lys
<210>14
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>BLyS结合多肽
<400>14
Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Trp Val Pro Cys Gly Leu Leu
 1               5                  10                  15
Arg
<210>15
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>BLyS结合多肽
<400>15
Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Arg Trp Val Pro Cys Glu Met Leu
 1               5                  10                  15
Gly
<210>16
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>BLyS结合多肽
<400>16
Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ser Trp Val Pro Cys His Met Leu
 1               5                  10                  15
Arg
<210>17
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>BLyS结合多肽
<400>17
Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Trp Val Ala Cys Gly Leu Leu
 1               5                  10                  15
Arg
<210>18
<211>1214
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>TACI-Fc融合蛋白
<221>CDS
<222>(17)...(1192)
<400>18
tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52
                  Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu
                   1               5                   10
ctg ctg tgt ggc gcc gtc ttc gtt tcg ctc agc cag gaa atc cat gcc  100
Leu Leu Cys Gly Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala
         15                  20                  25
gag ttg aga cgc ttc cgt aga gct atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag  148
Glu Leu Arg Arg Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln
     30                  35                  40
tac tgg gat cct ctg ctg ggt acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc  196
Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys
 45                  50                  55                  60
aac cat cag agc cag cgc acc tgt gca gcc ttc tgc agg tca ctc agc  244
Asn His Gln Ser Gln Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser
                 65                  70                  75
tgc cgc aag gag caa ggc aag ttc tat gac cat ctc ctg agg gac tgc  292
Cys Arg Lys Glu Gln Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys
             80                  85                  90
atc agc tgt gcc tcc atc tgt gga cag cac cct aag caa tgt gca tac  340
Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr
         95                 100                 105
ttc tgt gag aac aag ctc agg agc cca gtg aac ctt cca cca gag ctc  388
Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu
    110                 115                 120
agg aga cag cgg agt gga gaa gtt gaa aac aat tca gac aac tcg gga  436
Arg Arg Gln Arg Ser Gly Glu Val Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly
125                 130                 135                 140
agg tac caa gga ttg gag cac aga ggc tca gaa gca agt cca gct ctc    484
Arg Tyr Gln Gly Leu Glu His Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu
                145                 150                 155
cca ggt ctc aag gag ccc aaa tct tca gac aaa act cac aca tgc cca    532
Pro Gly Leu Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
            160                 165                 170
ccg tgc cca gca cct gaa gcc gag ggg gca ccg tca gtc ttc ctc ttc    580
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe
        175                 180                 185
ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc    628
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
    190                 195                 200
aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc    676
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
205                 210                 215                 220
aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg    724
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
                225                 230                 235
cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc    772
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
            240                 245                 250
gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc    820
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
        255                 260                 265
tcc aac aaa gcc ctc cca tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc    868
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
    270                 275                 280
aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg    916
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
285                 290                 295                 300
gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc    964
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
                305                 310                 315
ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg  1012
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
            320                 325                 330
gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc  1060
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
        335                 340                 345
ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag  1108
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
    350                 355                 360
ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac  1156
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
365                 370                 375                 380
tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa taatctagag       1202
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                385                 390
gcgcgccaat ta                                                    1214
<210>19
<211>392
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>TACI-Fc融合蛋白
<400>19
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
 1               5                  10                  15
Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg
            20                  25                  30
Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln Tyr Trp Asp Pro
        35                  40                  45
Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gln Ser
    50                  55                  60
Gln Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu
65                  70                  75                  80
Gln Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala
                85                  90                  95
Ser Ile Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn
            100                 105                 110
Lys Leu Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gln Arg
        115                 120                 125
Ser Gly Glu Val Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gln Gly
    130                 135                 140
Leu Glu His Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys
145                 150                 155                 160
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
                165                 170                 175
Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
            180                 185                 190
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
        195                 200                 205
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
    210                 215                 220
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
225                 230                 235                 240
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                245                 250                 255
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            260                 265                 270
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        275                 280                 285
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
    290                 295                 300
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
305                 310                 315                 320
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
                325                 330                 335
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
            340                 345                 350
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
        355                 360                 365
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
    370                 375                 380
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
385                 390
<210>20
<211>1070
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>TACI-Fc融合蛋白
<221>CDS
<222>(17)...(1048)
<400>20
tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52
                  Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu
                   1               5                   10
ctg ctg tgt ggc gcc gtc ttc gtt tcg ctc agc cag gaa atc cat gcc  100
Leu Leu Cys Gly Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala
         15                  20                  25
gag ttg aga cgc ttc cgt aga gct atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag  148
Glu Leu Arg Arg Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln
     30                  35                  40
tac tgg gat cct ctg ctg ggt acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc  196
Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys
 45                  50                  55                  60
aac cat cag agc cag cgc acc tgt gca gcc ttc tgc agg tca ctc agc  244
Asn His Gln Ser Gln Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser
                 65                  70                  75
tgc cgc aag gag caa ggc aag ttc tat gac cat ctc ctg agg gac tgc  292
Cys Arg Lys Glu Gln Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys
             80                  85                  90
atc agc tgt gcc tcc atc tgt gga cag cac cct aag caa tgt gca tac  340
Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr
         95                 100                 105
ttc tgt gag aac gag ccc aaa tct tca gac aaa act cac aca tgc cca  388
Phe Cys Glu Asn Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
    110                 115                 120
ccg tgc ccagca cct gaa gcc gag ggg gca ccg tca gtc ttc ctc ttc   436
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe
125                 130                 135                 140
ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc    484
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
                145                 150                 155
aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc    532
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
            160                 165                 170
aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg    580
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
        175                 180                 185
cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc    628
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
    190                 195                 200
gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc    676
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
205                 210                 215                 220
tcc aac aaa gcc ctc cca tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc    724
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
                225                 230                 235
aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg    772
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
            240                 245                 250
gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc    820
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
        255                 260                 265
ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg    868
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
    270                 275                 280
gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc    916
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
285                 290                 295                 300
ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag    964
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
                305                 310                 315
ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac  1012
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
            320                 325                 330
tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa taatctagag       1058
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        335                 340
gcgcgccaat ta                                                    1070
<210>21
<211>344
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>TACI-Fc融合蛋白
<400>21
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
 1               5                  10                  15
Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg
            20                  25                  30
Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln Tyr Trp Asp Pro
        35                  40                  45
Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gln Ser
    50                  55                  60
Gln Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu
65                  70                  75                  80
Gln Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala
                85                  90                  95
Ser Ile Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn
            100                 105                 110
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
        115                 120                 125
Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
    130                 135                 140
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
145                 150                 155                 160
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
                165                 170                 175
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
            180                 185                 190
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
        195                 200                 205
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
    210                 215                 220
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
225                 230                 235                 240
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
                245                 250                 255
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
            260                 265                 270
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
        275                 280                 285
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
    290                 295                 300
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
305                 310                 315                 320
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
                325                 330                 335
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            340
<210>22
<211>1082
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>TACI-Fc融合蛋白
<221>CDS
<222>(17)...(1060)
<400>22
tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52
                  Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu
                   1               5                   10
ctg ctg tgt ggc gcc gtc ttc gtt tcg ctc agc cag gaa atc cat gcc  100
Leu Leu Cys Gly Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala
         15                  20                  25
gag ttg aga cgc ttc cgt aga gct atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag  148
Glu Leu Arg Arg Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln
     30                  35                  40
tac tgg gat cct ctg ctg ggt acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc     196
Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys
 45                  50                  55                  60
aac cat cag agc cag cgc acc tgt gca gcc ttc tgc agg tca ctc agc     244
Asn His Gln Ser Gln Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser
                 65                  70                  75
tgc cgc aag gag caa ggc aag ttc tat gac cat ctc ctg agg gac tgc     292
Cys Arg Lys Glu Gln Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys
             80                  85                  90
atc agc tgt gcc tcc atc tgt gga cag cac cct aag caa tgt gca tac     340
Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr
         95                 100                 105
ttc tgt gag aac aag ctc agg agc gag ccc aaa tct tca gac aaa act     388
Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr
    110                 115                 120
cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa gcc gag ggg gca ccg tca     436
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser
125                 130                 135                 140
gtc  ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg    484
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
                145                 150                 155
acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct     532
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
            160                 165                 170
gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc     580
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
        175                 180                 185
aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc     628
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
    190                 195                 200
agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac  tgg ctg aat ggc aag gag tac    676
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
205                 210                 215                 220
aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca tcc tcc atc gag aaa acc  724
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
                225                 230                 235
atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg  772
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
            240                 245                 250
ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc  820
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
        255                 260                 265
ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc  868
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
    270                 275                 280
aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac  916
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
285                 290                 295                 300
tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc  964
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                305                 310                 315
agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct  1012
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
            320                 325                 330
ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa  1060
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        335                 340                 345
taatctagag gcgcgccaat ta                                         1082
<210>23
<211>348
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>TACI-Fc融合蛋白
<400>23
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
 1               5                  10                  15
Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg
            20                  25                  30
Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln Tyr Trp Asp Pro
        35                  40                  45
Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gln Ser
    50                  55                  60
Gln Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu
65                  70                  75                  80
Gln Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala
                85                  90                  95
Ser Ile Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn
            100                 105                 110
Lys Leu Arg Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp LysThr His Thr Cys Pro
        115                  120                  125
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe
    130                  135                  140
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
145                 150                 155                 160
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
                165                 170                 175
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
            180                 185                 190
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
        195                 200                 205
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
    210                 215                 220
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
225                 230                 235                 240
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
                245                 250                 255
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
            260                 265                 270
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
        275                 280                 285
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
    290                 295                 300
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
305                 310                 315                 320
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
                325                 330                 335
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
       340                 345
<210>24
<211>1109
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>TACI-Fc融合蛋白
<221>CDS
<222>(17)...(1090)
<400>24
tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52
                  Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu
                   1               5                   10
ctg ctg tgt ggc gcc gtc ttc gtt tcg ctc agc cag gaa atc cat gcc  100
Leu Leu Cys Gly Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala
         15                  20                  25
gag ttg aga cgc ttc cgt aga gct atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag  148
Glu Leu Arg Arg Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln
     30                  35                  40
tac tgg gat cct ctg ctg ggt acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc  196
Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys
 45                  50                  55                  60
aac cat cag agc cag cgc acc tgt gca gcc ttc tgc agg tca ctc agc  244
Asn His Gln Ser Gln Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser
                 65                  70                  75
tgc cgc aag gag caa ggc aag ttc tat gac cat ctc ctg agg gac tgc  292
Cys Arg Lys Glu Gln Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys
             80                  85                  90
atc agc tgt gcc tcc atc tgt gga cag cac cct aag caa tgt gca tac  340
Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr
         95                 100                 105
ttc tgt gag aac aag ctc agg agc cca gtg aac ctt cca cca gag ctc  388
Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu
    110                 115                 120
agg gag ccc aaa tct tca gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca    436
Arg Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
125                 130                 135                 140
gca cct gaa gcc gag ggg gca ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa    484
Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
                145                 150                 155
ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg    532
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
            160                 165                 170
gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct  gag gtc aag ttc aac tgg tac   580
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
        175                 180                 185
gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag    628
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
    190                 195                 200
cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac    676
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
205                 210                 215                 220
cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa    724
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
                225                 230                 235
gcc ctc cca tcc tcc atc gag aaa acc atc  tcc aaa gcc aaa ggg cag   772
Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
            240                 245                 250
ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg    820
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
        255                 260                 265
acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc    868
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
    270                 275                 280
agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac    916
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
285                 290                 295                 300
tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc  964
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
                305                 310                 315
tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc  1012
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
            320                 325                 330
ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag  1060
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
        335                 340                 345
aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa taa tctagaggcg cgccaatta    1109
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys *
    350                 355
<210>25
<211>357
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>TACI-Fc融合蛋白
<400>25
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
 1               5                  10                      15
Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg
            20                  25                  30
Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln Tyr Trp Asp Pro
        35                  40                  45
Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gln Ser
    50                  55                  60
Gln Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu
65                  70                  75                  80
Gln Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala
                85                  90                  95
Ser Ile Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn
            100                 105                 110
Lys Leu Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Glu Pro Lys
        115                 120                 125
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
    130                 135                 140
Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
145                 150                 155                 160
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
                165                 170                 175
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
            180                 185                 190
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
        195                 200                 205
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
    210                 215                 220
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser
225                 230                 235                 240
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
                245                 250                 255
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
            260                 265                 270
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys GlyPhe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
        275                 280                 285
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
    290                 295                 300
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
305                 3103                 15                 320
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
                325                 330                 335
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
            340                 345                 350
Leu Ser Pro Gly Lys
        355
<210>26
<211>311
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>BAFF-R-Fc融合蛋白
<400>26
Met Ser Ala Leu Leu Ile Leu Ala Leu Val Gly Ala Ala Val Ala Ser
 1               5                  10                  15
Thr Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro
            20                  25                  30
Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys
        35                  40                  45
Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala
    50                  55                  60
Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Gln Val
65                  70                  75                  80
Thr Asp Lys Ala Ala His Tyr Thr Leu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
                85                  90                  95
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
            100                 105                 110
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
        115                 120                 125
Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
    130                 135                 140
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
145                 150                 155                 160
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
                165                 170                 175
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
            180                 185                 190
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
        195                 200                 205
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
    210                 215                 220
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
225                 230                 235                 240
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
                245                 250                 255
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
            260                 265                 270
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
        275                 280                 285
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
    290                 295                 300
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
305                 310
<210>27
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>27
tattaggccg gccaccatgg atgcaatga            29
<210>28
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>28
tgaagatttg ggctccttga gacctggga            29
<210>29
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>29
tcccaggtct caaggagccc aaatcttca            29
<210>30
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>30
taattggcgc gcctctagat tatttacccg gagaca   36
<210>31
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>31
tgaagatttg ggctcgttct cacagaagta      30
<210>32
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>32
atacttctgt gagaacgagc ccaaatcttc a    31
<210>33
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>33
tttgggctcg ctcctgagct tgttctcaca    30
<210>34
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>34
ctcaggagcg agcccaaatc ttcagaca     28
<210>35
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>35
tttgggctcc ctgagctctg gtggaa    26
<210>36
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>36
gagctcaggg agcccaaatc ttcagaca    28
<210>37
<211>1216
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(141)...(890)
<400>37
gaattcggct cgagcctttt tatttctcct tgcgtaacaa ccttcttccc ttctgcacca 60
ctgcccgtac ccttacccgc cccgccacct ccttgctacc ccactcttga aaccacagct 120
gttggcaggg tccccagctc atg cca gcc tca tct cct ttc ttg cta gcc ccc 173
                      Met Pro Ala Ser Ser Pro Phe Leu Leu Ala Pro
                       1               5                   10
aaa ggg cct cca ggc aac atg ggg ggc cca gtc aga gag ccg gca ctc   221
Lys Gly Pro Pro Gly Asn Met Gly Gly Pro Val Arg Glu Pro Ala Leu
             15                  20                  25
tca gtt gcc ctc tgg ttg agt tgg ggg gca gct ctg ggg gcc gtg gct   269
Ser Val Ala Leu Trp Leu Ser Trp Gly Ala Ala Leu Gly Ala Val Ala
         30                  35                  40
tgt gcc atg gct ctg ctg acc caa caa aca gag ctg cag agc ctc agg   317
Cys Ala Met Ala Leu Leu Thr Gln Gln Thr Glu Leu Gln Ser Leu Arg
     45                  50                  55
aga gag gtg agc cgg ctg cag ggg aca gga ggc ccc tcc cag aat ggg    365
Arg Glu Val Ser Arg Leu Gln Gly Thr Gly Gly Pro Ser Gln Asn Gly
 60                  65                  70                  75
gaa ggg tat ccc tgg cag agt ctc ccg gag cag agt tcc gat gcc ctg    413
Glu Gly Tyr Pro Trp Gln Ser Leu Pro Glu Gln Ser Ser Asp Ala Leu
                 80                  85                  90
gaa gcc tgg gag aat ggg gag aga tcc cgg aaa agg aga gca gtg ctc    461
Glu Ala Trp Glu Asn Gly Glu Arg Ser Arg Lys Arg Arg Ala Val Leu
             95                 100                 105
acc caa aaa cag aag aag cag cac tct gtc ctg cac ctg gtt ccc att    509
Thr Gln Lys Gln Lys Lys Gln His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile
        110                 115                 120
aac gcc acc tcc aag gat gac tcc gat gtg aca gag gtg atg tgg caa    557
Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln
    125                 130                 135
cca gct ctt agg cgt ggg aga ggc cta cag gcc caa gga tat ggt gtc    605
Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val
140                 145                 150                 155
cga atc cag gat gct gga gtt tat ctg ctg tat agc cag gtc ctg ttt    653
Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe
                160                 165                 170
caa gac gtg act ttc acc atg ggt cag gtg gtg tct cga gaa ggc caa    701
Gln Asp Val Thr Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln
            175                 180                 185
gga agg cag gag act cta ttc cga tgt ata aga agt atg ccc tcc cac    749
Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His
        190                 195                 200
ccg gac cgg gcc tac aac agc tgc tat agc gca ggt gtc ttc cat tta    797
Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu
    205                 210                 215
cac caa ggg gat att ctg agt gtc ata att ccc cgg gca agg gcg aaa    845
His Gln Gly Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys
220                 225                 230                 235
ctt aac ctc tct cca cat gga acc ttc ctg ggg ttt gtg aaa ctg 890
Leu Asn Leu Ser Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu
                240                 245                 250
tgattgtgtt ataaaaagtg gctcccagct tggaagacca gggtgggtac atactggaga 950
cagccaagag ctgagtatat aaaggagagg gaatgtgcag gaacagaggc gtcttcctgg 1010
gtttggctcc ccgttcctca cttttccctt ttcattccca ccccctagac tttgatttta 1070
cggatatctt gcttctgttc cccatggagc tccgaattct tgcgtgtgtg tagatgaggg 1130
gcgggggacg ggcgccaggc attgttcaga cctggtcggg gcccactgga agcatccaga 1190
acagcaccac catctagcgg ccgccg                                      1216
<210>38
<211>250
<212>PRT
<213>智人
<400>38
Met Pro Ala Ser Ser Pro Phe Leu Leu Ala Pro Lys Gly Pro Pro Gly
 1               5                  10                  15
Asn Met Gly Gly Pro Val Arg Glu Pro Ala Leu Ser Val Ala Leu Trp
            20                  25                  30
Leu Ser Trp Gly Ala Ala Leu Gly Ala Val Ala Cys Ala Met Ala Leu
        35                  40                  45
Leu Thr Gln Gln Thr Glu Leu Gln Ser Leu Arg Arg Glu Val Ser Arg
    50                  55                  60
Leu Gln Gly Thr Gly Gly Pro Ser Gln Asn Gly Glu Gly Tyr Pro Trp
65                  70                  75                  80
Gln Ser Leu Pro Glu Gln Ser Ser Asp Ala Leu Glu Ala Trp Glu Asn
                85                  90                  95
Gly Glu Arg Ser Arg Lys Arg Arg Ala Val Leu Thr Gln Lys Gln Lys
            100                 105                 110
Lys Gln His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys
        115                 120                 125
Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg
    130                 135                 140
Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala
145                 150                 155                 160
Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe
                165                 170                 175
Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr
            180                 185                 190
Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr
       195                 200                 205
Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile
    210                 215                 220
Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg AlaArg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro
225                 230                 235                 240
His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu
                245                 250
<210>39
<211>762
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(7)...(759)
<400>39
ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc   48
       Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro
        1               5                   10
aga tgg gtc ctg tcc gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc  96
Arg Trp Val Leu Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
 15                  20                  25                  30
cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc  144
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
                 35                  40                  45
ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag  192
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
            50                  55                  60
gtc acatgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag   240
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
        65                  70                  75
ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag  288
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu ValHis Asn Ala Lys Thr Lys
    80                  85                  90
ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc  336
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
 95                 100                 105                 110
acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag  384
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
                115                 120                 125
gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa  432
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
            130                 135                 140
gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc  480
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
        145                 150                 155
cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa  528
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
    160                 165                 170
ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag  576
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
175                 180                 185                 190
ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc  624
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
                195                 200                 205
tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag  672
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
            210                 215                 220
cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac  720
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
        225                 230                 235
cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga          762
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    240                 245                 250
<210>40
<211>251
<212>PRT
<213>智人
<400>40
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
 1               5                  10                  15
Val Leu Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
            20                  25                  30
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
        35                  40                  45
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
    50                  55                  60
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
65                  70                  75                  80
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
                85                  90                  95
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
            100                 105                 110
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
        115                 120                 125
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
    130                 135                 140
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
145                 150                 155                 160
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
                165                 170                 175
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
            180                 185                 190
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
        195                 200                 205
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
    210                 215                 220
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
225                 230                 235                 240
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                245                 250
<210>41
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>经优化的tPA前导序列
<400>41
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
 1               5                  10                  15
Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg
            20                  25                  30
Phe Arg Arg
        35

Claims (44)

1.用于降低哺乳动物中的免疫球蛋白水平的方法，所述方法包括施用BLyS拮抗剂和免疫抑制药物。
2.权利要求1的方法，其中所述BLyS拮抗剂为Fc融合蛋白。
3.权利要求2的方法，其中所述Fc融合蛋白选自：包含TACI的细胞外结构域或其功能性片段的TACI-Fc融合蛋白、包含BAFF-R的细胞外结构域或其功能性片段的BAFF-R-Fc融合蛋白以及包含BCMA的细胞外结构域或其功能性片段的BCMA-Fc融合蛋白。
4.权利要求3的方法，其中所述Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：25的多肽序列。
5.权利要求3的方法，其中所述Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：26的多肽序列。
6.权利要求1的方法，其中所述BLyS拮抗剂为BLyS抗体。
7.权利要求6的方法，其中所述BLyS抗体在包含SEQ ID NO：8的氨基酸162-275的区域内结合BLyS。
8.权利要求6的方法，其中所述BLyS抗体为LymphoStat-B。
9.权利要求1的方法，其中所述BLyS拮抗剂为TACI抗体。
10.权利要求1的方法，其中所述TACI抗体在包含选自SEQ ID NO：2的72-109和SEQ ID NO：2的82-222的氨基酸的区域内结合TACI。
11.权利要求10的方法，其中所述TACI抗体结合TACI和BCMA两者。
12.权利要求1的方法，其中所述免疫抑制药物选自环磷酰胺(CYC)、硫唑嘌呤(AZA)、环孢菌素A(CSA)和吗替麦考酚酸酯(MMF)。
13.权利要求12的方法，其中所述免疫抑制药物为吗替麦考酚酸酯(MMF)。
14.权利要求1的方法，其中所述BLyS拮抗剂和所述免疫抑制药物协同作用从而降低免疫球蛋白水平。
15.权利要求1的方法，其中被降低的免疫球蛋白水平选自IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。
16.用于减轻由B-细胞调节的自身免疫病症的方法，所述方法包括给患有所述病症的患者施用治疗有效量的BLyS拮抗剂和免疫抑制药物。
17.权利要求16的方法，其中所述BLyS拮抗剂为Fc融合蛋白。
18.权利要求17的方法，其中所述Fc融合蛋白选自：包含TACI的细胞外结构域或其功能性片段的TACI-Fc融合蛋白、包含BAFF-R的细胞外结构域或其功能性片段的BAFF-R-Fc融合蛋白以及包含BCMA的细胞外结构域或其功能性片段的BCMA-Fc融合蛋白。
19.权利要求18的方法，其中所述Fc融合蛋白包含选自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：25的多肽序列。
20.权利要求18的方法，其中所述Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：26的多肽序列。
21.权利要求16的方法，其中所述BLyS拮抗剂为BLyS抗体。
22.权利要求16的方法，其中所述BLyS抗体在包含SEQ ID NO：8的氨基酸162-275的区域内结合BLyS。
23.权利要求16的方法，其中所述BLyS抗体为LymphoStat-B。
24.权利要求16的方法，其中所述BLyS拮抗剂为TACI抗体。
25.权利要求16的方法，其中所述TACI抗体在包含选自SEQ ID NO：2的72-109和SEQ ID NO：2的82-222的氨基酸的区域内结合TACI。
26.权利要求24的方法，其中所述TACI抗体结合TACI和BCMA两者。
27.权利要求16的方法，其中所述免疫抑制药物选自环磷酰胺(CYC)、硫唑嘌呤(AZA)、环孢菌素A(CSA)和吗替麦考酚酸酯(MMF)。
28.权利要求27的方法，其中所述免疫抑制药物为吗替麦考酚酸酯(MMF)。
29.权利要求16的方法，其中所述BLyS拮抗剂和所述免疫抑制药物协同作用从而降低免疫球蛋白水平。
30.权利要求16的方法，其中被降低的免疫球蛋白水平选自IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。
31.权利要求16的方法，其中所述自身免疫疾病选自类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮肾炎(LN)、韦格纳病、炎症性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化症、银屑病、IgA肾病、IgM多发性神经病、重症肌无力、脉管炎、糖尿病、Reynauld’s综合征、Sjorgen’s综合征、肾小球肾炎、自身免疫性肝炎和自身免疫性甲状腺炎。
32.权利要求31的方法，其中所述自身免疫疾病为狼疮肾炎。
33.权利要求16的方法，其中所述BLyS拮抗剂以约1至约2.5mg/kg的剂量进行施用，和所述免疫抑制药物以约1至约4mg/kg的剂量进行施用。
34.权利要求16的方法，其中所述BLyS拮抗剂和所述免疫抑制药物以与使用选自下列的第二免疫抑制药物的疗法相联合的方式进行施用：非类固醇抗炎药(NSAID)、糖皮质激素、泼尼松和疾病缓解抗风湿药(DMARD)。
35.包含BLyS拮抗剂和免疫抑制药物的组合物。
36.包含BLyS拮抗剂和免疫抑制药物以及标签的制品，其中所述标签指明所述组合物用于治疗由B细胞调节的自身免疫病症。
37.权利要求1的方法，其中所述BLyS拮抗剂也是APRIL拮抗剂。
38.权利要求16的方法，其中所述BLyS拮抗剂也是APRIL拮抗剂。
39.权利要求34的组合物，其中所述BLyS拮抗剂也是APRIL拮抗剂。
40.权利要求35的制品，其中所述BLyS拮抗剂也是APRIL拮抗剂。
41.用于降低哺乳动物中的免疫球蛋白水平的方法，所述方法包括施用APRI L拮抗剂和免疫抑制药物。
42.用于减轻由B-细胞调节的自身免疫病症的方法，所述方法包括给患有所述病症的患者施用治疗有效量的APRIL拮抗剂和免疫抑制药物。
43.包含APRIL拮抗剂和免疫抑制药物的组合物。
44.包含APRIL拮抗剂和免疫抑制药物以及标签的制品，其中所述标签指明所述组合物用于治疗由B细胞调节的自身免疫病症。
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