PT2139517E - Combinação de inibição de blys e micofenolato mofetil para tratamento de doença auto-imune - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "COMBINAÇÃO DE INIBIÇÃO DE BLYS E MICOFENOLATO MOFETIL PARA TRATAMENTO DE DOENÇA AUTO-IMUNE"

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a novas terapias de combinação envolvendo a inibição de BLyS ou BLyS/APRIL e imunossupressores para o tratamento de doenças auto-imunes, como definido nas reivindicações.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os linfócitos são uma de muitas populações de glóbulos brancos do sangue; reconhecem e respondem especificamente a antigénios estranhos. As três principais classes de linfócitos são linfócitos B (células B) , linfócitos T (células T) e células assassinas naturais (NK) . Os linfócitos B são as células responsáveis pela produção de anticorpos e proporcionam imunidade humoral. As células B maturam na medula óssea e deixam a medula expressando um anticorpo de ligação a antigénio à sua superfície celular. Quando uma célula B naive encontra o antigénio para o qual o seu anticorpo ligado a membrana é específico, a célula começa a dividir-se rapidamente e a sua progenia diferencia-se em células B de memória e células efectoras chamadas células plasmáticas. As células B de memória têm uma vida mais longa e continuam a expressar anticorpo ligado a membrana com a mesma especificidade que a célula parental 1 original. As células plasmáticas não produzem anticorpo ligado a membrana mas produzem, de um modo preferido, a forma excretada do anticorpo. Os anticorpos excretados são as principais moléculas efectoras de imunidade humoral.

Um grupo de receptores do factor de necrose tumoral (TNF), encontrados na superfície de células B sob várias condições, está entre os reguladores celulares da função da célula B no sistema imune. Em particular, três receptores de TNF: activador transmembranar e interactuador de CAML (TACI), activador de célula B que pertence ao receptor da família de TNF (BAFF-R) e proteína de maturação de célula B (BCMA) são conhecidos por se ligarem a um ou mais ligandos de TNF - o estimulador de linfócito B (BLyS também conhecido como BAFF, TALL-1, ztnf4 e THANK) e um ligando indutor de proliferação (APRIL). Especif icamente, TACI e BCMA são conhecidos por se ligarem a BLyS e APRIL, e BAFF-R apenas se liga a BLyS.

Uma variedade de antagonistas de BLyS e/ou APRIL foram desenvolvidos de modo a bloquear as várias funções de BLyS, as quais incluem, mas não se devem limitar a co-estimulação de célula B, sobrevivência de célula plasmática e plasmoblasto, permuta de classe de Ig, função celular intensificada de apresentação de antigénio de célula B, sobrevivência de células B malignas, desenvolvimento da função da célula B-l, desenvolvimento da célula B para além da fase T-l e formação completa do centro germinal. Algumas destas moléculas também se podem ligar e bloquear o efeito de APRIL em células B e outros componentes do sistema imune (Dillon et al. (2006) Nat. Rev.

Drug Dis. 5, 235-246). As moléculas que foram desenvolvidas para afectar a função da célula B por interferência com a ligação a BLyS e/ou APRIL incluem anticorpos de BLyS, tal como

Lymphostat-B (Belimumab) (Baker et al., (2003) Artritis Rheum, 2 48, 3253-3265 e documento WO 02/02641); proteínas de fusão receptor-domínio extracelular/domínio Fc, tal como TACI-Ig, incluindo uma forma de realização particular, atacicept (Pedido de Patente U.S. N° 20060034852), BAFF-R-F c (documento WO 05/0000351) e BCMA-Ig ou outras proteínas de fusão que utilizam domínios extracelulares de receptor. Uma classe adicional de antagonistas de BLyS e/ou APRIL inclui outras moléculas que se baseiam na capacidade de ligação de BLyS para bloquear a ligação aos seus receptores, tais como AMG 623, anticorpos receptores e outras moléculas divulgadas nos documentos WO 03/035846 e WO 02/16312. A abordagem actual para tratamento de doenças auto-imunes é a supressão da reacção imune não desejada. Por exemplo, no tratamento de nefrite lúpica (LN), uma complicação séria que envolve os rins de doentes que sofrem de nefrite lúpica sistémica (SLE), vários fármacos imunossupressores provarem ser benéficos. Estes fármacos incluem ciclofosfamida (CYC), azatioprina (AZA), ciclosporina A (CSA) e micofenolato mofetil (MMF) (para revisões gerais ver, Mok et al. (2003) Ann Rheum Dis 62, 799-804 e Iaccarino et al. (2007) Autoimmunity Reviews 6, 190-195). Embora estes fármacos sejam benéficos, permanece na técnica uma necessidade para melhorar a resposta a fármacos imunossupressores de modo a tratar eficazmente doença auto-imune. O documento WO 01/60397 descreve anticorpos anti-APRIL e células de hibridoma. O documento WO 2007/019618 descreve um método profiláctico e/ou terapêutico para tratar a doença auto-imune. 3 0 documento W0 2006/068867 descreve uma terapia de combinação para distúrbios da célula B. O documento WO 03/014294 descreve polipéptidos TACI e BR3 e suas utilizações. O documento WO 03/055979 descreve anticorpos que se ligam imunoespecificamente a BLyS. agonistas moléculas O documento AU 2006/210471 descreve utilizações de e antagonistas para modular a actividade de relacionadas com TNF. O documento WO 2006/052493 descreve polipéptidos que se ligam a BAFF e/ou APRIL. O documento WO 03/001877 descreve métodos para diagnóstico e tratamento da rejeição de tecido cardíaco.

Um aspecto da presente invenção refere-se ao tratamento de um distúrbio auto-imune regulado por células B num mamífero, por redução dos níveis de imunoglobulina utilizando um antagonista de BLyS e um fármaco imunossupressor, como definido nas reivindicações. O antagonista de BLyS é uma proteína de fusão TACI-Fc compreendendo o domínio extracelular de TACI ou um seu fragmento funcional. Numa forma de realização particular, a proteína de fusão TACI-Fc compreende uma sequência polipeptídica seleccionada de SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 25 ou SEQ ID N°: 26.

Os antagonistas de BLyS incluem também um anticorpo de BLyS, de um modo preferido, que se ligue a BLyS numa região compreendendo os aminoácidos 162-275 da SEQ ID N°: 8 ou o 4 anticorpo de BLyS conhecido como LymphoStat-B. Os antagonistas de BLyS incluem também um anticorpo de TACI, de um modo preferido, que se ligue TACI numa região compreendendo 72-109 de SEQ ID N°: 2 ou 82-222 de SEQ ID N°: 2.

Os fármacos imunossupressores incluem ciclofosfamida (CYC), azatioprina (AZA), ciclosporina A (CSA) ou micofenolato mofetil (MMF), embora qualquer fármaco que suprima o sistema imune possa ser adequado. O nível de imunoglobulina que é reduzido pelo presente método pode ser IgM, IgG, IgA, IgD ou IgE ou as suas combinações. A presente invenção refere-se ao alívio de um distúrbio auto-imune regulado por células B num doente que sofre do distúrbio, utilizando uma quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco imunossupressor MMF e de um antagonista de BLyS como definido nas reivindicações. Numa forma de realização, o distúrbio auto-imune é seleccionado do grupo consistindo de artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, lúpus eritematoso sistémico (SLE), nefrite lúpica (LN), doença de Wegener, doença inflamatória do intestino, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia auto-imune, esclerose múltipla, psoríase, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM, miastenia gravis, vasculite, diabetes mellitus, síndrome de Reinaud, síndrome de Sjorgen e glomerulonefrite. Uma doença tratada especificamente desta forma é a nefrite lúpica.

Numa forma de realização, particularmente quando o distúrbio auto-imune é artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico ou nefrite lúpica, o antagonista de BLyS e o fármaco imunossupressor pode ser administrado em associação adicional com terapia utilizando um segundo fármaco imunossupressor, tais 5 como fármacos anti-inflamatórios não esteróides (NSAID), glucocorticóides, prednisona e fármaco anti-reumático modificador de doença (DMARD). A presente invenção utiliza um fármaco imunossupressor que mostrou ser eficaz no tratamento de doença auto-imune em combinação com o antagonista de BLyS. 0 fármaco imunossupressor contemplado para utilização na presente invenção é micofenolato mofetil (MMF).

Em qualquer das utilizações para tratamento ou alivio de um distúrbio em que MMF e o antagonista de BLyS sejam administrados a um doente, o MMF e o antagonista de BLyS podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente. Numa forma de realização especifica, o agente imunossupressor é administrado antes do antagonista de BLyS. É também proporcionada uma composição compreendendo MMF e um antagonista de BLyS. É aqui também descrito um artigo fabricado compreendendo um agente imunossupressor, um antagonista de BLyS e um rótulo, em que o rótulo indica que a composição é para o tratamento de um distúrbio auto-imune regulado por células B.

Em quaisquer das formas de realização das utilizações e composições da invenção, o antagonista de BLyS é uma proteína de fusão entre o domínio extracelular de um receptor que se liga a BLyS e o domínio Fc de uma imunoglobulina, ou uma proteína de fusão Fc. A proteína de fusão Fc é uma proteína de fusão Fc TACI compreendendo o domínio extracelular de TACI, em particular atacicept. 6

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIGURA 1 representa graficamente o valor médio (± desvio padrão) de IgG para os quatro grupos de tratamento - veiculo, apenas MMF, apenas atacicept, e atacicept e MMF. Todas as comparações por pares destes valores foram estatisticamente significativas (p < 0,05) utilizando dados transformados por log à excepção de veiculo vs. MMF por si só. A FIGURA 2 representa graficamente o valor médio (± desvio padrão) de IgM para os quatro grupos de tratamento - veiculo, MMF por si só, apenas atacicept, e atacicept e MMF. Todas as comparações por pares destes valores foram estatisticamente significativas (p < 0,05) utilizando dados transformados por log à excepção de veiculo vs. MMF por si só. A FIGURA 3 representa graficamente o valor médio (± desvio padrão) de IgA para os quatro grupos de tratamento - veiculo, MMF por si só, apenas atacicept, e atacicept e MMF. Todas as comparações por pares destes valores foram estatisticamente significativas (p < 0,05) utilizando dados transformados por log à excepção de veiculo vs. MMF por si só.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇAO PREFERIDAS

Embora o tratamento com imunossupressores pareça útil no tratamento da doença auto-imune, verificou-se a partir de experiências aqui descritas que a administração de uma combinação de imunossupressores com um antagonista de BLyS é um método de tratamento que irá bloquear múltiplas vias de sinal em células B que se pensa serem responsáveis pela produção de anticorpos dirigidos a auto-antigénios, despoletando e/ou 7 perpetuando assim o estado auto-imune. Isto resulta numa redução da imunoglobulina circulante num mamífero que se submete a tal tratamento. Como se pensa que essa imunoglobulina circulante é, pelo menos parcialmente, responsável por despoletar os sintomas negativos da doença auto-imune, a combinação de fármacos imunossupressores e terapias dirigidas contra a via de BLyS proporciona assim um novo método de tratamento de doenças mediadas por células B, tal como doenças auto-imunes com base em células B. A terapia de combinação de fármacos imunossupressores com um antagonista de BLyS pode oferecer alternativas mais eficazes aos tratamentos existentes para determinadas doenças, e. g., nefrite lúpica.

Aqui uma "doença auto-imune" é qualquer doença ou distúrbio não maligno que surge a partir de anticorpos que são produzidos dirigidos contra os próprios (auto) antigénios e/ou tecidos de um indivíduo.

Como aqui utilizado, "depleção de células B" refere-se a uma redução nos níveis de células B num animal ou humano após tratamento com fármaco ou anticorpo, em comparação com o nível antes do tratamento. Os níveis de células B são mensuráveis utilizando ensaios bem conhecidos, tal como obter uma contagem sanguínea completa, por análise de FACS com coloração para marcadores conhecidos de células B e por métodos tal como descritos nos Exemplos Experimentais. A depleção de células B pode ser parcial ou completa. Num doente que recebe um fármaco depletor de células B, as células B são geralmente esgotadas durante o tempo em que o fármaco está a circular no corpo do doente e o tempo de recuperação de células B.

Os "fármacos imunossupressores" são quaisquer moléculas que interferem com o sistema imune e atenuam a sua resposta a antigénios estranhos ou próprios. A ciclofosfamida (CYC) e o micofenolato mofetil (MMF) são dois desses tipos de moléculas. Esta expressão pretende abranger qualquer fármaco ou molécula útil como um agente terapêutico na regulação negativa do sistema imune. Este método contempla particularmente os fármacos que foram utilizados para tratar doenças auto-imunes, tais como artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, lúpus eritematoso sistémico (SLE), nefrite lúpica (LN), doença de Wegener, doença inflamatória do intestino, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia auto-imune, esclerose múltipla, psoríase, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM, miastenia gravis, vasculite, diabetes mellitus, sindrome de Reinaud, sindrome de Sjorgen e glomerulonefrite.

Os termos e expressões "BLyS" ou "polipéptido de BLyS," "TALL-1" ou "polipéptido de TALL-1" ou "BAFF" ou "polipéptido de BAFF", quando aqui utilizados, abrangem "polipéptidos de BLyS de sequência nativa" e "variantes de BLyS". "BLyS" é uma designação atribuída àqueles polipéptidos que estão codificados pela sequência de BLyS humana (SEQ ID N° : 7) ou sequência de BLyS de murganho (SEQ ID N°: 9). Os polipéptidos que apresentam actividade biológica de BLyS estão também abrangidos por esta designação. Por exemplo, um BLyS biologicamente activo potência qualquer um ou uma combinação dos seguintes eventos in vitro ou in vivo: uma sobrevivência aumentada de células B, um nível aumentado de IgG e/ou IgM, números aumentados de células plasmáticas e processamento de NF-Kb2/100 a p52NF-Kb em células B esplénicas (e. g., batten, M et al., (2000) J. Exp. Med. 192: 1453-1465; Moore, et al., (1999) Science 285: 260-263; Kayagaki, et al., (2002) 10: 515-524). Diversos ensaios úteis para testar antagonistas de BLyS e/ou APRIL, tal como o ensaio de proliferação de células B descrito no documento WO 00/40716 9 entre outros, sao bem conhecidos de um técnico com conhecimento geral na matéria.

Resumidamente, as células B humanas são isoladas a partir de células mononucleares de sangue periférico utilizando esferas magnéticas CD19 e o sistema de separação magnética VarioMacs (Miltenyi Biotec Auburn, CA) de acordo com as instruções do fabricante. As células B purificadas são misturadas com BLyS solúvel (25 ng/mL) e IL-4 recombinante humana (10 ng/mL, Pharmingen) e as células são plaqueadas em placas de fundo redondo de 96 poços a 1 x 105 células por poço. O antagonista de BLyS e/ou APRIL a ser testado pode ser diluído desde cerca de 5 pg/mL a cerca de 6 ng/mL e incubado com as células B durante cinco dias, pulsando, de um dia para o outro, no dia quatro com 1 pCi de 3H-timidina por poço. Como um controlo, o antagonista de BLyS e/ou APRIL pode também ser incubado com células B e IL-4 sem BLyS. As placas são recolhidas utilizando um recolector de placas da Packard e contadas utilizando o leitor da Packard.

Um polipéptido de "sequência nativa" compreende um polipéptido tendo a mesma sequência de aminoácidos que o polipéptido correspondente, derivado da natureza. Tais polipéptidos de sequência nativa podem ser isolados a partir da natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes e/ou sintéticos. A expressão "sequência nativa" abrange especificamente formas truncadas, solúveis ou excretadas naturais (e. g., uma sequência de domínio extracelular), formas variantes naturais (e. g., formas de splice alternativo) e variantes alélicas naturais do polipéptido.

Em geral, os polipéptidos "variantes" para qualquer dos polipéptidos divulgados na presente descrição incluem polipéptidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são 10 adicionados ou removidos no N e/ou C terminal, assim como dentro de um ou mais domínios internos da sequência de aminoácidos da "sequência nativa" ou de tamanho total. Ao discutir domínios extracelulares de receptores, os fraqmentos que se liqam a um polipéptido de BLyS de sequência nativa estão também contemplados. Inversamente, ao discutir fragmentos de BLyS, os fragmentos que se ligam a um ou mais dos três receptores de BLyS estão contemplados. Habitualmente, um polipéptido variante terá, pelo menos, cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 81% de identidade de sequência de aminoácidos, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 82% de identidade de sequência de aminoácidos, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 83% de identidade de sequência de aminoácidos, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 84% de identidade de sequência de aminoácidos, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 85% de identidade de sequência de aminoácidos, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 86% de identidade de sequência de aminoácidos, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 8 7% de identidade de sequência de aminoácidos, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 88% de identidade de sequência de aminoácidos, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 89% de identidade de sequência de aminoácidos, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 91% de identidade de sequência de aminoácidos, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 92% de identidade de sequência de aminoácidos, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 93% de identidade de sequência de aminoácidos, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 94% de identidade de sequência de aminoácidos, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 95% de identidade de sequência de aminoácidos, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 96% de identidade de sequência 11 de aminoácidos, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 97% de identidade de sequência de aminoácidos, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 98% de identidade de sequência de aminoácidos, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 99% de identidade de sequência de aminoácidos com o polipéptido ou um seu fragmento especificado. Geralmente, os polipéptidos variantes não abrangem a sequência nativa do polipéptido. Habitualmente, os polipéptidos variantes têm, pelo menos, cerca de 10 aminoácidos de comprimento, frequentemente, pelo menos, cerca de 20 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente, pelo menos, cerca de 30 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente, pelo menos, cerca de 40 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente, pelo menos, cerca de 50 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente, pelo menos, cerca de 60 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente, pelo menos, cerca de 70 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente, pelo menos, cerca de 80 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente, pelo menos, cerca de 90 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente, pelo menos, cerca de 100 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente, pelo menos, cerca de 150 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente, pelo menos, cerca de 200 aminoácidos em comprimento, mais frequentemente, pelo menos, cerca de 250 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente, pelo menos, cerca de 300 aminoácidos de comprimento ou mais.

Como mencionado acima, um antagonista de BLyS e/ou APRIL pode funcionar de um modo directo ou indirecto para bloquear parcial ou totalmente, inibir ou neutralizar a sinalização de BLyS, in vitro ou in vivo. Por exemplo, o antagonista de BLyS e/ou APRIL pode-se ligar directamente a BLyS. Por exemplo, um ligante directo pode ser um polipéptido compreendendo o domínio 12 extracelular (ECD) de um receptor de BLyS, tais como TACI, BAFF-R e BCMA.

Os receptores de BLyS envolvidos na presente invenção podem ser descritos como se segue. Os polipéptidos de TACI da invenção incluem polipéptidos de TACI compreendendo ou consistindo nos aminoácidos 1-246 da SEQ ID N°: 2. 0 termo geral "TACI" inclui os polipéptidos de TACI descritos nos documentos WO 98/39361, WO 00/40716, WO 01/85782, WO 01/87979, WO 01/81417 e WO 02/094852. Os polipéptidos de TACI da invenção podem ser isolados a partir de uma variedade de fontes, tais como tipos de tecidos humanos ou a partir de outras fontes, ou preparados por métodos recombinantes e/ou sintéticos. Os polipéptidos de BAFF-R da invenção incluem o polipéptido de BAFF-R compreendendo ou consistindo na sequência contígua de resíduos de aminoácidos 1 a 184 da SEQ ID N°:4. O termo geral "BAFF-R" inclui os polipéptidos de BAFF-R descritos nos documentos WO 02/24909 e WO 03/14294. Os polipéptidos de BAFF-R da invenção podem ser isolados a partir de uma variedade de fontes, tais como tipos de tecidos humanos ou a partir de outras fontes, ou preparados por métodos recombinantes e/ou sintéticos. O polipéptido de BCMA da invenção inclui os polipéptidos de BCMA compreendendo ou consistindo nos resíduos de aminoácidos 1-184 da SEQ ID N°:6. O termo geral "BCMA" inclui os polipéptidos de BCMA descritos em Laabi et al., EMBO J., 11: 3897-3904 (1992); Laabi et al., Nucleic Acids Res., 22: 1147-1154 (1994); Gras et al., Int. Immunology, 7: 1093-1106 (1995); e Madry et al., Int.

Immunology, 10 : 1693-1702 (1998). Os polipéptidos de BCMA da invenção podem ser isolados a partir de uma variedade de fontes, tais como tipos de tecidos humanos ou a partir de outras fontes, ou preparados por métodos recombinantes e/ou sintéticos. 13

Para os objectivos de funcionamento como um antagonista de BLyS e/ou APRIL, o ECD destes receptores é um polipéptido essencialmente livre dos domínios transmembranares ou citoplasmáticos que retêm geralmente a capacidade para se ligarem a BLyS. Especificamente, o domínio extracelular de TACI pode compreender os aminoácidos 1 a 154 da sequência do polipéptido de TACI (SEQ ID N°: 2). Adicionalmente, o ECD pode ser fragmentos ou variantes desta sequência, tal como formas do ECD de TACI como descrito por von Bulow et al., supra, documentos WO 98/39361, WO 00/40716, WO 01/85782, WO 01/87979 e WO 01/81417. Em particular, estas formas de ECD podem compreender aminoácidos 1-106 da SEQ ID N°: 2, aminoácidos 1-142 da SEQ ID N°: 2, aminoácidos 30-154 da SEQ ID N°: 2, aminoácidos 30-106 da SEQ ID N°: 2, aminoácidos 30-110 da SEQ ID N°: 2, aminoácidos 30-119 da SEQ ID N°: 2, aminoácidos 1-166 da SEQ ID N°: 2, aminoácidos 1-165 da SEQ ID N°: 2, aminoácidos 1-114 da SEQ ID N°: 2, aminoácidos 1-119 da SEQ ID N°: 2, aminoácidos 1-120 da SEQ ID N°: 2 e aminoácidos 1-126 da SEQ ID N°: 2. Além disso, o ECD de TACI pode compreender aquelas moléculas tendo apenas um domínio rico em cisteína

As formas de ECD de BAFF-R incluem aqueles aminoácidos compreendendo 1-71 da sequência do polipéptido de BAFF-R (SEQ ID N° : 4) . Adicionalmente, o ECD pode ser fragmentos ou variantes desta sequência, tal como formas de ECD de BAFF-R como descrito nos documentos WO 02/24909, WO 03/14294, e WO 02/38766. Em particular, estas formas de ECD podem compreender aminoácidos 1- 77 da SEQ ID N° : 4, aminoácidos 7-77 da SEQ ID N° : 4, aminoácidos 1-69 da SEQ ID N°: 4, aminoácidos 7-69 da SEQ ID N°: 4, aminoácidos 2-62 da SEQ ID N°: 4, aminoácidos 2-71 da SEQ ID N°: 4, aminoácidos 1-61 da SEQ ID N° : 4 e aminoácidos 2- 63 da SEQ ID N°: 4, aminoácidos 1-45 da SEQ ID N°: 4, aminoácidos 1-39 da SEQ ID N°: 4, aminoácidos 7-39 da 14 SEQ ID N°: 4, aminoácidos 1-17 da SEQ ID N°: 4, aminoácidos 39-64 da SEQ ID N°: 4, aminoácidos 19-35 da SEQ ID N°: 4 e aminoácidos 17-42 da SEQ ID N°: 4. Além disso, o ECD de BAFF-R pode compreender aquelas moléculas tendo um domínio rico em cisteína.

As formas de ECD de BCMA incluem aqueles aminoácidos compreendendo 1-48 da sequência do polipéptido de BCMA (SEQ ID N°: 6) . Adicionalmente, o ECD pode ser fragmentos ou variantes desta sequência, tal como formas de ECD de BCMA como descrito nos documentos WO 00/40716 e WO 05/075511. Em particular, estas formas de ECD podem compreender aminoácidos 1-150 da SEQ ID N° : 6, aminoácidos 1-48 da SEQ ID N°: 6, aminoácidos 1-41 da SEQ ID N°: 6, aminoácidos 8-41 da SEQ ID N°: 6, aminoácidos 8-37 da SEQ ID N°: 6, aminoácidos 8-88 da SEQ ID N° : 6, aminoácidos 41-88 da SEQ ID N° : 6, aminoácidos 1-54 da SEQ ID N° : 6, aminoácidos 4-55 da SEQ ID N° : 6, aminoácidos 4-51 da SEQ ID N°: 6 e aminoácidos 21-53 da SEQ ID N°: 6. Além disso, o ECD de BCMA pode compreender aquelas moléculas tendo apenas um domínio parcialmente rico em cisteína.

Numa forma de realização adicional, a região de ligação a BLyS de um receptor de BLyS (e. g., um domínio extracelular ou um seu fragmento de BAFF-R, BCMA ou TACI) pode ser fundido a uma porção de Fc de uma molécula de imunoglobulina para facilitar a sua solubilidade In vivo. De acordo com uma forma de realização, o antagonista de BLyS liga-se a um polipéptido de BLyS com uma afinidade de ligação de 100 nM ou menos. De acordo com outra forma de realização, o antagonista de BLyS liga-se a um polipéptido de BLyS com uma afinidade de ligação de 10 nM ou menos. De acordo ainda com outra forma de realização, o antagonista de BLyS liga-se a um polipéptido de BLyS com uma afinidade de ligação de 1 nM ou menos. 15

Noutro exemplo, os antagonistas de BLyS incluem polipéptidos que se ligam a BLyS que não são sequências nativas ou as suas variantes. Alguns exemplos de tais polipepéptidos são aqueles tendo a sequência da Fórmula I, Fórmula II, Fórmula III como descrito no documento WO 05/000351. Em particular, alguns polipéptidos que se ligam incluem ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID N°: 13), ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N°: 14), ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID N° : 15), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID N°: 16), ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N°: 17) ou as sequências listadas na FIG. 32 do documentos WO 05/000351.

Alternativamente, o antagonista de BLyS pode ligar-se a um domínio extracelular da sequência nativa TACI, BAFF-R ou BCMA na sua região de ligação a BLyS para bloquear parcial ou totalmente, inibir ou neutralizar a ligação de BLyS in vitro, in situ ou in vivo. Por exemplo, tal antagonista indirecto é um anticorpo de TACI que se liga numa região de TACI de modo que a ligação de BLyS seja estericamente impedida. Por exemplo, pensa-se que a ligação nos aminoácidos 72-109 ou numa região vizinha bloqueie a ligação a BLyS. Poderia também ser vantajoso bloquear a ligação de APRIL a esta molécula que se pensa ocorrer na região dos aminoácidos 82-222. Um outro antagonista de BLyS e/ou APRIL é um anticorpo de BAFF-R que se liga numa região de BAFF-R de modo que a ligação de BAFF-R humano a BLyS seja estericamente impedida. Por exemplo, crê-se que a ligação nos aminoácidos 23-38 ou aminoácidos 17-42 ou numa região vizinha bloqueie a ligação a BLyS. Finalmente, um antagonista indirecto adicional seria um anticorpo de BCMA que que se liga numa região de BCMA de modo que a ligação de BLyS seja estericamente impedida. Por exemplo, pensa-se que a ligação nos aminoácidos 5-43 ou numa região vizinha bloqueie a ligação a BLyS (ou APRIL). 16 0 termo "anticorpo" quando referido é utilizado no sentido mais amplo e cobre especificamente, por exemplo, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos com especificidade poliepitópica, anticorpos de cadeia única e fragmentos de anticorpos. Um polipéptido desta invenção pode ser fundido numa estrutura de anticorpo, por exemplo, na região variável ou numa CDR de modo que o anticorpo se possa ligar e inibir a ligação de BLyS a TACI, BAFF-R ou BCMA ou inibir a sinalização de BLyS. Os anticorpos compreendendo um polipéptido podem ser quiméricos, humanizados ou humanos. Os anticorpos compreendendo um polipéptido podem ser um fragmento de anticorpo. Alternativamente, um anticorpo pode ser produzido por imunização de um animal com um polipéptido desta invenção. Assim, é aqui descrito um anticorpo dirigido contra um polipéptido desta invenção.

Em particular, são descritos anticorpos específicos para BLyS que se ligam dentro de uma região de BLyS humano (SEQ ID N° : 8) compreendendo os resíduos 162-275 e/ou um aminoácido vizinho dos aminoácidos seleccionados do grupo consistindo de 162, 163, 206, 211, 231, 233, 264 e 265 de BLyS humano. A ligação dos anticorpos é tal que o anticorpo impede estericamente a ligação de BLyS a um ou mais dos seus receptores. Tais anticorpos são descritos nos documentos WO 02/02641 e WO 03/055979. Um anticorpo particularmente preferido é aquele descrito como Lymphostat-B (Baker et al. (2003) Arthritis Rheum, 48, 3253-3265).

Como aqui utilizado, a expressão "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população substancialmente homogénea de anticorpos, i. e., os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos à excepção 17 de possíveis mutações naturais que se podem apresentar em quantidades menores.

Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigénico. Além disso, ao contrário de preparações convencionais de anticorpos (policlonais) que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos no sentido de serem sintetizados por cultura de hibridoma, não contaminada por outras imunoglobulinas. 0 termo "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogénea de anticorpos e não deve ser interpretada como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos pelo método do hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al.r Nature, 256: 495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos de ADN recombinante (ver, e. g., Patente U.S. N° 4816567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de bibliotecas fágicas de anticorpos utilizando, por exemplo, as técnicas descritas em Clackson et al.r Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).

Os anticorpos monoclonais incluem aqui especificamente anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados a partir de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse particular de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencer a uma outra classe ou subclasse de 18 anticorpos, assim como fragmentos de tais anticorpos, desde que apresentem a actividade biológica desejada (Patente U.S. N° 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Os métodos de produção de anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica.

As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (e. g., murino) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou os seus fragmentos (como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação a antigénio de anticorpos) as quais contêm sequência mínima derivada de uma imunoglobulina não humana.

Para a maioria dos casos, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) em que resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do recipiente são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador), tais como murganho, rato ou coelho tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns exemplos, os resíduos da região de estrutura Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente nem nas sequências importadas de CDR ou de estrutura. Estas modificações são feitas para adicionalmente refinar e maximizar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de, pelo menos, um e tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as ansas hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas das regiões FR podem são aquelas de uma sequência humana de imunoglobulina, embora as regiões FR possam incluir uma ou mais substituições de aminoácido que melhoram a 19 afinidade de ligação. 0 número destas substituições de aminoácido na FR é tipicamente não mais de 6 na cadeia H e não mais de 3 na cadeia L. 0 anticorpo humanizado irá também compreender, numa situação óptima, pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992). 0 anticorpo humanizado inclui um anticorpo PRIMATIZADO em que a região de ligação a antigénio do anticorpo é derivada de um anticorpo produzido por, e. g., macacos imunizados com o antigénio de interesse. Os métodos de produção de anticorpos humanizados são conhecidos na técnica.

Os anticorpos humanos podem também ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas no campo técnico, incluindo bibliotecas de apresentação de fagos. Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991) . As técnicas de Cole et al. e Boemer et al. estão também disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991) .

Os "fragmentos funcionais" de anticorpos de ligação são aqueles fragmentos que retêm ligação a BLyS, TACI, BAFF-R ou BCMA com substancialmente a mesma afinidade que a molécula de cadeia total intacta da qual foram derivados e podem ser capazes de esgotar as células B como medido por ensaios in vitro ou in vivo, tal como aqueles aqui descritos. 20

As "funções efectoras" de anticorpo referem-se àquelas actividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de seguência nativa ou uma região Fc variante de sequência de aminoácidos) de um anticorpo e varia com o isotipo do anticorpo. Os exemplos de funções efectoras de anticorpo incluem: ligação a Clq e citotoxicidade dependente do complemento; ligação ao receptor de Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) ; fagocitose; regulação negativa de receptores de superfície celular (e. g., receptor de células B) ; e activação de células B. A "citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo" ou "ADCC" refere-se a uma forma de citotoxicidade em que Ig excretada ligada a receptores Fc (FcR) presentes em determinadas células citotóxicas (e. g., células assassinas naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) permitem a estas células efectoras citotóxicas ligarem-se especificamente a uma célula alvo contendo antigénio e matar, subsequentemente, a célula alvo com citotoxinas. Os anticorpos "armam" as células citotóxicas e são absolutamente requeridos para tal morte. As células primárias para mediar a ADCC, células NK, expressas apenas FcyRIII, enquanto os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em célula hematopoiéticas é resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Ann. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991) . Para avaliar a actividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode ser realizado um ensaio de ADCC in vitro, tal como aquele descrito nas Patente U.S. N° 5500362 ou 5821337. As células efectoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células assassinas naturais (NK) . Alternativamente, ou adicionalmente, a actividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, e. g., num modelo animal, tais como aquele divulgado em Clines et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998). 21 A "citotoxicidade dependente do complemento" ou "CDC" refere-se à lise de uma célula alvo na presença do complemento. A activação de uma via clássica do complemento é iniciada com a ligação do primeiro componente do sistema do complemento (Clq) a anticorpos (da subclasse apropriada) que estão ligados ao seu antigénio cognato. Para avaliar a activação do complemento, podem ser realizado um ensaio de CDC, e. g., como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).

Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com utilizações diagnósticas ou terapêuticas para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteicos ou não proteicos. Em formas de realização preferidas, o anticorpo será purificado (1) em mais de 95% em peso de anticorpo como determinado pelo método de Lowry e, de um modo muito preferido, mais de 99% em peso, (2) num grau suficiente para obter, pelo menos, 15 resíduos do N terminal ou sequência de aminoácidos interna por utilização de um sequenciador de copo rotativo ou (3) até à homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras utilizando coloração de azul de Coomassie ou, de um modo preferido, de prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes uma vez que, pelo menos, um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Habitualmente, contudo, o anticorpo isolado será preparado através de, pelo menos, um passo de purificação. 22

Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com semelhanças nas propriedades das suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger, em Biochemistry, segunda ed., pp. 73-75, worth Publishers, Nova Iorque (1975)): (1) não polar: Ala (A), Vai (V), Leu (L) , Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W) , Met (M) (2) polar não carregado: Gly (G), Ser (S), Thr (T) , Cys (C) , Tyr (Y) , Asn (N) , Gin (Q) (3) acidico: Asp (D), Glu (E) (4) básico: Lys (K) , Arg (R) , His (H—). Alternativamente, os resíduos naturais podem ser divididos em grupos com base nas propriedades das cadeias laterais comuns: (1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, Ile; (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; (3) acidico: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; (6) aromático: Trp, Tyr, Phe. 0 termo substituição de aminoácido "conservadora" como utilizado nesta invenção pretende referir-se a substituições de aminoácidos que substituem aminoácidos funcionalmente equivalentes. As alterações conservadoras de aminoácidos resultam em alterações silenciosas na sequência de aminoácidos do péptido resultante. Por exemplo, um ou mais aminoácidos de uma polaridade semelhante actuam como equivalentes funcionais e resultam numa alteração silenciosa dentro da sequência de aminoácidos do péptido. Em geral, as substituições dentro de um grupo podem ser consideradas conservadoras relativamente à estrutura e função. Contudo, o especialista na técnica reconhecerá que o papel de um resíduo particular é determinado pelo seu contexto dentro da estrutura tridimensional da molécula em que ocorre. Por exemplo, os resíduos de Cys podem ocorrer na forma oxidada (dissulfureto) , o qual é menos polar do que a forma reduzida (tiol). A longa porção alifática da cadeia lateral de Arg pode constituir uma característica crítica do seu papel estrutural ou funcional e esta pode ser melhor conservada por substituição de um resíduo não polar, em vez de outro 23 básico. Também será reconhecido que cadeias laterais contendo grupos aromáticos (Trp, Tyr e Phe) podem participar em interacções iónicas-aromáticas ou "catião-pi". Nestes casos, a substituição de uma destas cadeias laterais com um membro do grupo acidico ou polar não carregado pode ser conservadora relativamente à estrutura e função. Os residuos tais como Pro, Gly e Cys (forma dissulfureto) têm efeitos directos na conformação da cadeia principal e frequentemente não podem ser substituídos sem distorções estruturais. "Percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácido" relativamente às sequências polipeptidicas do ligando ou do receptor é definida como a percentagem de residuos de aminoácidos numa sequência candidata que são idênticos aos residuos de aminoácidos numa tal sequência de ligando ou receptor aqui identificada, após alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para conseguir a máxima percentagem de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. 0 alinhamento para objectivos de determinar a percentagem de identidade da sequência de aminoácidos pode ser conseguido de várias formas que estão dentro do conhecimento na técnica, por exemplo, utilizando software de computador publicamente disponível, tal como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os especialistas na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para conseguir o alinhamento máximo ao longo da totalidade das sequências a ser comparadas. Contudo, para os objectivos aqui definidos, os valores de % de identidade da sequência de aminoácidos são obtidos como descrito abaixo por utilização do programa de computador ALIGN-2 de comparação de sequências, em que o completo código de fonte para o programa ALIGN-2 é proporcionado na tabela abaixo. 0 programa de computador ALIGN-2 de comparação de sequências é da autoria da Genentech, Inc. e o código de fonte mostrado na tabela abaixo foi apresentado com a documentação de utilizador no Instituto Americano de Copyright, Washington D.C., 20559, onde está registado sob o Registo U.S. de Copyright N° TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível através da Genentech, Inc., São Francisco, Sul, Califórnia ou pode ser compilado a partir do código de fonte proporcionado na tabela abaixo. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para utilização num sistema operativo UNIX, de um modo preferido, digital UNIX V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequências são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.

Um método útil para identificação de determinados resíduos ou regiões numa proteína que são posições preferidas para mutagénese, é denominado "mutagénese de varrimento de alanina" como descrito por Cunningham e Wells Science, 244: 1081-1085 (1989) . Um resíduo ou um grupo de resíduos alvo são identificados (e. g., resíduos carregados, tais como arg, asp, his, lys e glu) e substituídos por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (de um modo muito preferido, alanina ou polialanina) para afectar a interacção dos aminoácidos com um alvo de ligação. Tais posições de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições são depois refinadas por introdução de mais ou outros variantes em, ou para, os locais de substituição. Assim, embora o local para introduzir uma variação de sequência de aminoácido seja predeterminado, a natureza da mutação não necessita por si só de ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação num dado local, é realizada mutagénese aleatória ou de varrimento de ala no codão ou região alvo e os variantes expressos são rastreados para a actividade desejada. 25 A expressão "ângulo diedro" refere-se a uma rotação numa ligação. Ver, e. g., Creighton, T.E., (1993) Protein: Structures and Molecular Properties, 2 ed., W. H. Freeman and Company, Nova Iorque, NI. 0 termo "fi" é um ângulo diedro que se refere a uma rotação na ligação N-C de um aminoácido. Ver, e. g., Creighton, T.E., (1993) Protein: Structures and Molecular Properties, 2 ed., W. H. Freeman and Company, Nova Iorque, NI. Voltas beta tipo I são descritas em Hutchinson, E.G. & Thornton, J.MN. (1994) A revised set of potentials for beta turn formation in proteins. Protein Science 3, 2207-2216.

Uma "proteína de fusão" e um "polipéptido de fusão" referem-se a um polipéptido tendo duas porções ligadas covalentemente entre si, onde cada uma das porções é um polipéptido tendo uma propriedade diferente. A propriedade pode ser uma propriedade biológica, tal como actividade in vitro ou in vivo. A propriedade pode também ser uma simples propriedade química ou física, tais como a ligação a uma molécula alvo, catálise de uma reacção, etc. As duas porções podem ser ligadas directamente através de uma única ligação peptídica ou através de um ligante peptídico contendo um ou mais resíduos de aminoácidos. Geralmente, as duas porções e o ligante estarão em grelha de leitura entre si.

Um "conjugado" refere-se a qualquer molécula híbrida, incluindo proteínas de fusão e, assim como, moléculas que contêm porções de aminoácidos ou proteínas e porções não proteicas. Os conjugados podem ser sintetizados por uma variedade de técnicas conhecidas no campo técnico incluindo, por exemplo, técnicas de ADN recombinante, síntese de fase sólida, síntese em solução, técnicas de síntese química orgânica ou uma combinação destas técnicas. A escolha da síntese dependerá da molécula particular a ser produzida. Por exemplo, uma molécula híbrida não 26 inteiramente "proteica" na natureza pode ser sintetizada através de uma combinação de técnicas recombinantes e técnicas de síntese em solução.

Como aqui utilizada, a expressão "proteína de fusão Fc" designa moléculas de tipo anticorpo que combinam a especificidade de ligação de uma proteína heteróloga com as funções efectoras de domínios constantes de imunoglobulina.

Estruturalmente, as proteínas de fusão Fc compreendem uma fusão de uma sequência de aminoácidos com a desejada especificidade de ligação que é diferente do sítio de reconhecimento e ligação ao antigénio de um anticorpo (i. e., é "heterólogo") , e uma sequência de domínio constante de imunoglobulina. A molécula de proteína de fusão Fc inclui tipicamente uma sequência de aminoácidos contígua compreendendo, pelo menos, o sítio de ligação de um receptor ou de um ligando. A sequência de domínio constante de imunoglobulina na proteína de fusão Fc pode ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tais como subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 ou IgG-4, IgA (incluindo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD ou IgM. Por exemplo, proteínas de fusão Fc úteis de acordo com esta invenção são polipéptidos que compreendem as porções de ligação a BLyS de um receptor de BLyS sem as sequências transmembranares ou citoplasmáticas do receptor de BLyS. Numa forma de realização, o domínio extracelular de BAFF-R, TACI ou BCMA é fundido a um domínio constante de uma sequência de imunoglobulina. 0 termo "mamífero" refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de criação, e animais de jardim zoológico, de desporto ou de estimação, tais como cães, cavalos, gatos, vacas, etc. De um modo preferido, o animal aqui é humano. 27 A expressão uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um anticorpo ou de um fármaco antagonista eficaz para "aliviar" ou "tratar" uma doença ou distúrbio num indivíduo ou mamífero. No caso de cancro, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco pode reduzir o número de células cancerígenas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (i. e., abrandar até certo ponto e, de um modo preferido, parar) a infiltração de células cancerosas em órgãos periféricos; inibir (i. e., abrandar até certo ponto e, de um modo preferido, parar) metástases tumorais; inibir, até certo ponto, o crescimento tumoral; e/ou aliviar até certo ponto um ou mais dos sintomas associados com o cancro. Ver a definição de "tratado" abaixo. 0 facto de o fármaco poder prevenir o crescimento e/ou matar células tumorais existentes, este pode ser citostático e/ou citotóxico.

Os anticorpos de BLyS ou de receptor de BLyS podem ser produzidos por transfecção transiente ou estável de células hospedeiras eucarióticas, tal como células CHO.

Como aqui utilizado, "veículos" inclui veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis que são não tóxicos à célula ou mamíferos a eles expostos nas dosagens e concentrações utilizadas. Frequentemente o veículo fisiologicamente aceitável é uma solução aquosa com pH tamponado. Os exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipéptido de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e 28 outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tal como EDTA; álcoois de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; contra-iões formadores de sal, tal como sódio; e/ou tensioactivos não iónicos, tais como TWEEN polietilenoglicol (PEG) e PLURONICSTM.

Polinucleótidos, Vectores, Células Hospedeiras

De acordo com um número de formas de realização aqui divulgadas, o antagonista de BLyS definido nas reivindicações pode compreender polipéptidos específicos que são produzidos utilizando polinucleótidos específicos em vectores específicos e utilizando células hospedeiras específicas. Os vários tipos de polipéptidos da presente invenção são sequências baseadas em receptor que se ligam a BLyS e foram isoladas ou derivadas de domínios do receptor TACI que se ligam a BLyS in vivo. As sequências baseadas em anticorpo são aquelas que são produzidas utilizando tecnologia de desenvolvimento de anticorpos e mantêm a estrutura geral de uma molécula de anticorpo. Os exemplos de sequências baseadas em anticorpo são LymphoStat-B ou anticorpos para receptores de BLyS. Os exemplos das sequências de ligação artificial incluem os péptidos 17mer aqui descritos, polipéptidos que incorporam um ou mais péptidos 17mer como regiões de núcleo e formas covalentemente modificadas dos péptidos e polipéptidos 17mer (e. g., proteínas de fusão Fc, polipéptidos marcados, polipéptidos protegidos, polipéptidos conjugados, proteínas de fusão, etc.). As várias técnicas que são utilizadas para fazer estas formas de polipéptidos são aqui descritas. Os métodos para marcar polipéptidos e conjugar moléculas a polipéptidos são conhecidos na técnica. 29

As composiçoes da invenção podem ser preparadas utilizando as técnicas recombinantes conhecidas no campo técnico. A descrição abaixo refere-se a métodos de produzir tais polipéptidos específicos por cultivo de células hospedeiras transformadas ou transfectadas com um vector contendo o ácido nucleico codificado e recuperar o polipéptido a partir da cultura de células. (ver, e. g., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nova Iorque: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)) . 0 ácido nucleico (e. g., ADNc ou ADN genómico) codificando o polipéptido desejado pode ser introduzido num vector replicável para clonagem adicional (amplificação do ADN) ou para expressão. Vários vectores estão publicamente disponíveis. Os componentes do vector incluem geralmente, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor e uma sequência de terminação de transcrição, cada dos quais é descrito abaixo. Sequências de sinal, origens de replicação, genes marcadores, elementos intensificadores e sequências de terminação de transcrição opcionais que podem ser utilizadas são conhecidas na técnica e descritas com mais detalhe no documento WO 97/25428.

Os vectores de expressão e clonagem contêm geralmente um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está operativamente ligado à sequência de ácidos nucleicos codificante . Os promotores são sequências não traduzidas localizadas a montante (5') do codao de início de um gene estrutural (geralmente dentro de cerca de 100 a 1000 pb) que controlam a transcrição e tradução de uma sequência particular 30 de ácidos nucleicos, à qual estão operativamente ligados. Tais promotores enquadram-se tipicamente em duas classes, indutiveis e constitutivos. Os promotores indutiveis são promotores que iniciam niveis aumentados de transcrição a partir de ADN sob seu controlo em resposta a alguma alteração nas condições de cultura, e. g., na presença ou ausência de um nutriente ou uma alteração na temperatura. Presentemente é conhecido um grande número de promotores reconhecidos por uma variedade de potenciais células hospedeiras. Estes promotores estão operativamente ligados ao ADN codificante por remoção do promotor a partir do ADN fonte, por digestão com enzimas de restrição e inserção da sequência isolada do promotor no vector. A construção de vectores adequados, contendo um ou mais dos componentes listados acima, emprega técnicas convencionais de ligação. Os plasmídeos ou fragmentos isolados de ADN são clivados, processados e ligados novamente na forma desejada para produzir os plasmídeos requeridos. Para análise para confirmar as sequências correctas nos plasmídeos construídos, as misturas de ligação podem ser utilizadas para transformar a estirpe 294 de E. coli K12 (ATCC 31446) e os transformantes bem-sucedidos seleccionados por resistência à ampicilina ou tetraciclina, quando apropriado. Os plasmídeos dos transformantes são preparados, analisados por digestão com endonuclease de restrição e/ou sequenciados utilizando técnicas convencionais conhecidas no campo técnico [ver, e. g., Messing et al., Nucleic Acids Res., 9 : 309 (1981); Maxam et al., Methods in Enzymology, 65: 499 (1980)] .

Podem ser utilizados vectores de expressão que proporcionam expressão transiente em células de mamíferos do ADN codificante. Em geral, a expressão transiente envolve a utilização de um vector de expressão que é capaz de replicar eficientemente numa 31 célula hospedeira, de modo que a célula hospedeira acumule muitas cópias do vector de expressão e, por sua vez, sintetize níveis elevados de um polipéptido desejado codificado pelo vector de expressão [Sambrook et al., supra]. Os sistemas de expressão transiente, compreendendo um vector de expressão adequado e uma célula hospedeira, permitem uma identificação conveniente positiva de polipéptidos codificados por ADN clonado, assim como para o rastreio rápido de tais polipéptidos para propriedades biológicas ou fisiológicas desejadas.

Outros métodos, vectores e células hospedeiras adequados para adaptação à síntese do polipéptido desejado em cultura celular recombinante de vertebrados são descritas em Gething et al., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979); documento EP 117060; e documento EP 117058.

As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de ADN nos vectores aqui incluem células procarióticas, de levedura ou de eucariotas superiores. Os procarióticas adequados para este objectivo incluem, mas não estão limitados a, eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, enterobactérias tais como Escherichia, e. g., E. coli, enterobacter, Erwinia, klebsiela, Proteus, salmonela, e. g., Salmonella typhimurium, Serratia, e. g., Serratia marcescans, e Shigella, assim como bacilos, tais como B. subtilis e B. licheniformis (e. g., B. licheniformis 41P divulgado no documento DD 266710 publicado em 12 de Abril de 1989), Pseudomonas, tais como P. aeruginosa, e Streptomyces. De um modo preferido, a célula hospedeira deve excretar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. 32

Além de procarióticos, os micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros adequados de clonagem ou expressão para vectores. As células hospedeiras adequadas para a expressão de polipéptidos glicosilados são derivados de organismos multicelulares. Exemplos de todas essas células hospedeiras são adicionalmente descritos no documento W097/25428.

As células hospedeiras são transfectadas e, de um modo preferido, transformadas com vectores de expressão ou clonagem descritos acima e cultivadas em meio nutriente modificado, quando apropriado, para induzir promotores, seleccionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas. A transfecção refere-se à incorporação de um vector de expressão por uma célula hospedeira, independentemente de quaisquer sequências codificantes serem de facto expressas. São conhecidos do técnico com conhecimento geral na matéria numerosos métodos de transfecção, por exemplo, Cap04 e electroporação. A transfecção bem-sucedida é geralmente reconhecida quando ocorre indicação da operação deste vector dentro da célula hospedeira. A transformação significa introduzir ADN num organismo de modo que o ADN seja replicável, como um elemento extracromossomal ou por integração cromossomal. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é realizada utilizando técnicas convencionais apropriadas para tais células. 0 tratamento de cálcio utilizando cloreto de cálcio, como descrito em Sambrook et al., supra, ou electroporação é geralmente utilizado para procariotas ou outras células que contêm barreiras substanciais de parede celular. A infecção com 33

Agrobacterium tumefaciens é utilizada para a transformação de determinadas células vegetais, como descrito por Shaw et al., Gene, 23: 315 (1983) e documento WO 89/05859 publicado em 29 de

Junho de 1989. Além disso, as plantas podem ser transfectadas utilizando tratamento de ultrassons como descrito no documento WO 91/00358 publicado em 10 de Janeiro de 1991.

Para células de mamíferos sem tais paredes celulares, pode ser utilizado o método de precipitação com fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978). Os aspectos gerais de transformações em sistemas de células hospedeiras de mamíferos foram descritos na Pat. U.S. N° 4399216. As transformações em levedura são tipicamente realizadas de acordo com o método de Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 76 : 3829 (1979). Contudo, podem também ser utilizados outros métodos para introduzir ADN em células, tais como microinjecção nuclear, electroporação, fusão de protoplastos bacterianos com células intactas, ou policatiões, e. g., polibreno, poliornitina. Para várias técnicas para transformar células de mamíferos, ver Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) e Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988).

As células procarióticas podem ser cultivadas em meios de cultura adequados como descritos genericamente em Sambrook et al., supra. Os exemplos de meios de cultura comercialmente disponíveis incluem F10 de Ham (Sigma) , Meio Essencial Mínimo ("MEM", Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e meio de Eagle modificado por Dulbecco ("DMEM", Sigma). Qualquer desses meios pode ser suplementado, quando necessário, com hormonas e/ou outros factores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou factor de crescimento epidérmico) , sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tal como HEPES), 34 nucleósidos (tais como adenosina e timidina) , antibióticos (tais como gentamicina), elementos vestigiais (definidos como compostos inorgânicos geralmente presentes a concentrações finais na gama micromolar) e glucose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos a concentrações apropriadas que seriam conhecidas dos especialistas na técnica. As condições de cultura, tais como temperatura, pH, e semelhantes, são aquelas utilizadas previamente com a célula hospedeira seleccionada para a expressão e será evidente ao técnico com conhecimento geral na matéria.

Em geral, os princípios, protocolos e técnicas práticas para maximizar a produtividade de culturas de células de mamifero podem ser encontrados em Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991).

Os polipéptidos expressos podem ser recuperados a partir do meio de cultura como um polipéptido excretado, embora possa também ser recuperado a partir de lisados de célula hospedeira quando produzidos directamente sem um sinal de excreção. Se o polipéptido estiver ligado à membrana, este pode ser libertado da membrana utilizando uma solução adequada de detergente (e. g., Triton X-100) ou a sua região extracelular pode ser libertada por clivagem enzimática.

Quando o polipéptido é produzido numa célula recombinante diferente de uma de origem humana, esta está livre de proteínas ou polipéptidos de origem humana. Contudo, é geralmente necessário recuperar ou purificar o polipéptido a partir de proteínas ou polipéptidos celulares recombinantes para obter preparações que estão substancialmente homogéneas. Como um primeiro passo, o meio de cultura ou o lisado pode ser 35 centrifugado para remover partículas de restos celulares. 0 que se segue são processos exemplificativos de processos de purificação adequados: por fraccionamento numa coluna de permuta iónica; precipitação com etanol; HPLC de fase reversa; cromatografia em sílica ou numa resina de permuta catiónica, tal como DEAE; cromatofocagem; SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amónio; filtração em gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75; e colunas de proteína A Sepharose para remoção de contaminantes, tal como IgG.

Apresentação de fagos

De acordo com algumas formas de realização, os polipéptidos desta invenção seleccionados do grupo consistindo de: Fórmula I, Fórmula II, Fórmula III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID N°: 13), ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N°: 14), ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID N°: 15), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID N°: 16), ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N°: 17), e as sequências listadas na FIG. 32 do documento WO 05/000351, podem ser utilizados na apresentação de fagos.

Utilizando as técnicas de apresentação de fagos permite a produção de grandes bibliotecas de variantes proteicas que podem ser rapidamente tríadas para aquelas sequências que se ligam a uma molécula alvo com afinidade elevada. Os ácidos nucleicos que codificam polipéptidos variantes são fundidos a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína de revestimento virai, tais como a proteína do gene III ou a proteína do gene VIII. Foram desenvolvidos sistemas de apresentação de fago monovalentes onde a sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína ou o polipéptido é fundida a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma porção da proteína do gene III. 36 (Bass, S., Proteins, 8: 309 (1990); Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3: 205 (1991)). Num sistema de apresentação de fagos monovalente, a fusão génica é expressa em níveis baixos e as proteínas do gene III de tipo selvagem são também expressas de modo que a infectividade das partículas seja retido. Os métodos para produzir bibliotecas de péptidos e o rastreio dessas bibliotecas foram divulgados em muitas patentes (e. g., Patente U.S. N° 5723286; Patente U.S. N° 5432018; Patente U.S. N° 5580717; Patente U.S. N° 5427908; e Patente U.S. N° 5498530) .

Em algumas formas de realização, a Fórmula I, Fórmula II ou Fórmula III são expressas como bibliotecas de péptidos em fagos. O fago que expressa a biblioteca de polipéptidos de Fórmula I, Fórmula II ou Fórmula III é depois submetido a selecção com base na ligação a BLyS. Em algumas formas de realização, o processo de selecção envolve permitir alguma ligação de fagos a BLyS biotinilado que é subsequentemente ligado a uma placa de neutravidina. O fago ligado à placa através de ligação BLyS-biotina-neutravidina é recuperado e propagado. Em algumas formas de realização, o fago é submetido a várias rondas de selecção. Em algumas formas de realização, o fago é incubado com BLyS-biotina, seguido por adição de BLyS não biotinilado como um ligante competitivo. É proporcionada nos exemplos orientação adicional relativamente à utilização de apresentação de fagos no contexto da presente invenção. 37

Polipéptidos fundidos ou conjugados a polipéptidos heterólogos

As moléculas de proteína de fusão Fc compreendendo os polipéptidos desta invenção estão ainda contemplados para utilização nos métodos aqui apresentados. Em algumas formas de realização, a molécula compreende uma fusão de um polipéptido desta invenção com uma imunoglobulina ou uma região particular de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente da proteína de fusão Fc, tal fusão compreende utilmente a região Fc de uma molécula de IgG. Numa forma de realização adicional, a região Fc é de uma molécula IgGl humana. Em algumas formas de realização, a fusão de imunoglobulina inclui as regiões de charneira, CH2 e CH3, ou CHI, CH2 e CH3 de uma molécula de IgGl.

Para a produção de fusões de imunoglobulina, ver também a Patente U.S. N° 5428130, Patente U.S. N° 5843725, Patente U.S. N° 6018026, e Chamow et al., TIBTECH, 14: 52-60 (1996). A concepção mais simples e mais directa de proteína de fusão Fc combina frequentemente o(s) domínio(s) de ligação de um polipéptido antagonista desta invenção, de um modo preferido, uma sequência nativa, com a região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Noutra forma de realização, o polipéptido pode ser artificial, tal como um polipéptido compreendendo uma sequência de Fórmula I, Fórmula II, Fórmula III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID N° : 13), ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N°: 14), ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID N°: 15), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID N° : 16), ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N°: 17), ou as sequências listadas na FIG. 32 podem ser covalentemente ligadas a uma porção Fc de uma imunoglobulina. Além disso, um ou mais destes polipéptidos podem ser ligados um ao outro e ligados a uma porção Fc de uma imunoglobulina. 38

Habitualmente, ao preparar as proteínas de fusão Fc da presente invenção, o ácido nucleico que codifica o domínio de ligação será fundido no C terminal ao ácido nucleico que codifica o N terminal de uma sequência de domínio constante de imunoglobulina, contudo as fusões de N terminal são também possíveis.

Tipicamente, em tais fusões o polipéptido quimérico codificado reterá, pelo menos, domínios de charneira, CH2 e CH3 funcionalmente activos da região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina. As fusões são feitas também no C terminal da porção Fc de um domínio constante, ou imediatamente no N terminal de CHI da cadeia pesada ou na região correspondente da cadeia leve. 0 sítio preciso em que a fusão é feita não é crítico; os locais particulares são bem conhecidos e podem ser seleccionados de modo a optimizar a actividade biológica, secreção ou as características de ligação da proteína de fusão FC.

Numa forma de realização preferida, a sequência do domínio de ligação é fundido ao N terminal da região Fc de imunoglobulina G1 (IgGl). É possível fundir a totalidade da região constante da cadeia pesada à sequência do domínio de ligação. Contudo, de um modo mais preferido, uma sequência que começa na região de charneira imediatamente a montante do sítio de clivagem da papaína que define IgG Fc quimicamente (i. e., o resíduo 216, tirando o primeiro resíduo da região constante da cadeia pesada para ser 114), ou sítios análogos de outras imunoglobulinas são utilizados na fusão. Numa forma de realização particularmente preferida, a sequência de aminoácidos do domínio de ligação é fundido (a) à região de charneira e CH2 e CH3 ou (b) à charneira CHI, domínios CH2 e CH3, de uma cadeia pesada de IgG. 39

Para proteínas de fusão Fc biespecíficas, as proteínas de fusão Fc são montadas como multímeros, e particularmente como heterodímeros ou heterotetrâmeros. Geralmente, estas imunoglobulinas montadas terão estruturas unitárias conhecidas. Uma unidade estrutural básica de quatro cadeias é a forma em que existe IgG, IgD e IgE. Uma unidade de quatro cadeias é repetida nas imunoglobulinas de maior peso molecular; IgM existe geralmente como um pentâmero de quatro unidades básicas mantidas juntas por ligações dissulfureto. A globulina IgA, e ocasionalmente a globulina IgG, podem também existir na forma multimérica no soro. No exemplo do multímero, cada das quatro unidades pode ser igual ou diferente. Várias proteínas de fusão Fc montadas exemplificativas dentro do âmbito da presente invenção são representadas esquematicamente abaixo: (a) ACL-ACL; (b) ACH-(ACH, ACL-ACH, ACL-VHCH ou VLCL-ACH); (c) ACL-ACH-(ACL-ACH, ACL-VHCH, VLCL-ACH, OU VLCL-VHCH) (d) ACL-VHCH-(ACH ou ACL-VHCH ou VLCL-ACH); (e) VLCL-ACH-(ACL-VHCH ou VLCL-ACH); e (f) (A-Y)n-(VLCL-VHCH)2, em que cada A representa polipéptidos idênticos ou diferentes compreendendo um sequência de aminoácidos de sequências derivadas de domínios do receptor de BLyS, sequências derivadas de anticorpos para BLyS ou de receptores para BLyS, ou sequências artificiais, tais como Fórmula I, Fórmula II, Fórmula III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID N°: 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N°: 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID N°: 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID N°: 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N°: 9), ou sequências listadas na FIG. 32 ou as suas combinações; VL é um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VH é um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH é um 40 domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina; n é um número inteiro maior que 1; Y designa o resíduo de um agente de reticulação covalente.

Por questões de brevidade, as estruturas anteriores apenas mostram características chave; não indicam junções (J) ou outros domínios de imunoglobulinas, nem são mostradas as ligações dissulfureto. Contudo, onde tais domínios são requeridos para a actividade de ligação, deve ser interpretado como estando presentes nas posições habituais que ocupam nas moléculas de imunoglobulina.

Alternativamente, as sequências de Fc podem ser introduzidas entre sequências de cadeia pesada e cadeia leve de imunoglobulina, de modo que seja obtida uma imunoglobulina compreendendo uma cadeia pesada quimérica. Nesta forma de realização, as sequências de Fc são fundidas na extremidade 3' de uma cadeia pesada de imunoglobulina em cada braço de uma imunoglobulina, entre a charneira e o domínio CH2, ou entre os domínios CH2 e CH3. Foram descritas construções semelhantes por Hoogenboom et al., Mol. Immunol., 28: 1027-1037 (1991).

Embora a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina não seja requerida nas proteínas de fusão Fc da presente invenção, uma cadeia leve de imunoglobulina pode estar presente, associada covalentemente a um polipéptido de fusão de cadeia pesada de imunoglobulina-domínio de ligação, ou fundida directamente ao domínio de ligação. No primeiro caso, o ADN que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina é co-expresso tipicamente com o ADN que codifica a proteína de fusão de cadeia pesada de imunoglobulina-domínio de ligação. Após secreção, a cadeia pesada híbrida e a cadeia leve serão covalentemente associadas para proporcionar uma estrutura de tipo imunoglobulina 41 compreendendo dois pares de cadeia leve-cadeia pesada de imunoglobulina ligadas por dissulfureto. Os métodos adequados para a preparação de tais estruturas são, por exemplo, divulgados na Patente U.S. N° 4816567, concedida em 28 de Março de 1989.

As proteínas de fusão Fc são muito convenientemente construídas por fusão da sequência de ADNc que codifica a porção do domínio de ligação em-grelha com uma sequência de ADNc de imunoglobulina. Contudo, a fusão com fragmentos genómicos de imunoglobulina também é utilizada (ver, e. g. Aruffo et ai., Cell, 61: 1303-1313 (1990); e Stamenkovic et ai., Cell, 66: 1133-1144 (1991)) . O último tipo de fusão requer a presença de sequências reguladoras de Ig para a expressão. Os ADNc que codificam regiões constantes de cadeia pesada de IgG podem ser isolados com base em sequências publicadas de bibliotecas de ADNc derivadas de linfócitos de baço ou de sangue periférico, por técnicas de hibridação ou de reacção em cadeia da polimerase (PCR) . Os ADN que codificam o domínio de ligação e as partes de imunoglobulina da proteína de fusão Fc são introduzidos em tandem num vector plasmídico que conduz a expressão eficiente nas células hospedeiras escolhidas.

Foram feitas modificações particulares para produzir sequências Fc úteis para criar moléculas de fusão, tal como as moléculas de fusão Fc antagonista de BLyS para utilização na presente invenção. Especificamente, foram produzidas seis versões de uma Fc IgGl humana modificada para criar proteínas de fusão Fc e são denominadas Fc-488, assim como Fc4, Fc5, Fc6, Fc7 e Fc8. Fc-488 (SEQ ID N°: 39) foi concebida para clonagem conveniente de uma proteína de fusão contendo a região Fc γΐ humana, e foi construída utilizando a região constante yl humana de imunoglobulina de tipo selvagem como um molde. A preocupação 42 relativamente aos potenciais efeitos prejudiciais devido a um resíduo de cisteína desemparelhado conduziu à decisão de substituir a cisteína que normalmente estabelece ligações dissulfureto com a região constante da cadeia leve de imunoglobulina com um resíduo de serina. Foi introduzida uma alteração adicional no codão que codifica a posição 218 no índice EU para introduzir um sitio de reconhecimento da enzima de restrição BglII para facilitar futuras manipulações de ADN. Estas alterações foram introduzidas no produto de PCR codificado nos iniciadores de PCR. Devido à posição do sitio BglII e de modo a completar a região de charneira de Fc, foram incorporados codões para as posições 216 e 217 do índice EU nas sequências do parceiro da proteína de fusão.

Fc4, Fc5 e Fc6 contêm mutações para reduzir as funções efectoras mediadas por Fc através de redução a ligação a FcyRI e ligação do complemento Clq. Fc4 contém as mesmas substituições de aminoácidos que foram introduzidas em Fc-488. Foram introduzidas substituições de aminoácidos adicionais para reduzir potenciais funções efectoras mediadas por Fc. Especificamente, foram introduzidas três substituições de aminoácidos para reduzir a ligação a FcyRI. Estas são as substituições nas posições 234, 235 e 237 do índice EU. Foi demonstrado que as substituições nestas posições reduzem a ligação a FcyRI (Duncan et al., Nature 332:563 (1988)). Estas substituições de aminoácidos podem também reduzir a ligação a FcyRIIa, assim como ligação a FcyRIII (Sondermann et al., Nature 406:267 (2000); Wines et al., J. Immunol. 164:5313 (2000)). Vários grupos descreveram a relevância das posições 330 e 331 do índice EU (resíduos de aminoácidos 134 e 135 da SEQ ID N°: 6) na ligação do complemento Clq e subsequente fixação do complemento (Canfield e Morrison, J. Exp. Med. 43 173:1483 (1991); Tao et al.r J. Exp. Med. 178:661 (1993)). As substituições de aminoácidos nestas posições foram introduzidas em Fc4 para reduzir a fixação do complemento. 0 domínio CH3 de Fc4 é idêntico àquele encontrado no polipéptido correspondente de tipo selvagem, à excepção do codão de terminação, o qual foi alterado de TGA para TAA para eliminar um potencial sítio de metilação dam quando o ADN clonado é cultivado em estirpes dam mais de E. coli.

Em Fc5, o resíduo de arginina na posição 218 do índice EU foi mutado de volta a uma lisina, porque o esquema de clonagem de BglII não foi utilizado em proteínas de fusão contendo este Fc particular. 0 restante da sequência Fc5 condiz com a descrição acima para Fc4.

Fc6 é idêntico a Fc5 excepto o codão de lisina do terminal carboxilo que foi eliminado. A lisina do C terminal de imunoglobulinas maduras é frequentemente removida pós-tradução de imunoglobulinas maduras antes da secreção a partir de células B, ou removida durante a circulação sérica. Consequentemente, o resíduo de lisina do C terminal não é tipicamente encontrado em anticorpos circulantes. Como em Fc4 e Fc5 acima, o codão de terminação na sequência Fc6 foi mudado para TAA.

Fc7 é idêntico ao Fc γΐ de tipo selvagem excepto para uma substituição de aminoácido na posição 297 do índice EU localizada no domínio Cm- A posição Asn-297 do índice EU é um sítio de ligação de hidrato de carbono ligado por N. 0 hidrato de carbono ligado por N introduz uma potencial fonte de variabilidade numa proteína expressa recombinantemente devido a potenciais variações de lote-para-lote na estrutura do hidrato de carbono. Numa tentativa para eliminar esta potencial variabilidade, a Asn-297 foi mutada para um resíduo de glutamina 44 para prevenir a ligação do hidrato de carbono ligado por N nessa posição do resíduo. 0 hidrato de carbono no resíduo 297 está também envolvido na ligação de Fc a FcRIII (Sondermann et al., Nature 406:267 (2000)). Deste modo, a remoção do hidrato de carbono deve diminuir a ligação de proteínas de fusão contendo Fc7 recombinante aos FcyR em geral. Como acima, o codão de terminação na sequência Fc7 foi mutado para TAA.

Fc8 é idêntico à região γΐ de imunoglobulina de tipo selvagem mostrada na SEQ ID N°: 6, excepto que o resíduo de cisteína na posição 220 do índice EU foi substituído com um resíduo de serina. Esta mutação eliminou o resíduo de cisteína que normalmente estabelece ligações dissulfureto com a região constante da cadeia leve de imunoglobulina. A utilização de alguns destes domínios Fc específicos para a formação do antagonista de BLyS e/ou APRIL é dentro do âmbito da presente invenção.

As formas de fecho de leucina destas moléculas estão também contempladas pela invenção. "Fecho de leucina" é uma expressão técnica utilizada para se referir a uma sequência rica em leucinas que intensifica, promove ou conduz à dimerização ou trimerização do seu parceiro de fusão (e. g., a sequência ou a molécula a que o fecho de leucina é fundido ou ligado) . Foram descritos na técnica vários polipéptidos de fecho de leucina. Ver, e. g., Landschulz et al., Science, 240: 1759 (1988);

Patente U.S. 5716805; dDocumento WO 94/10308; Hoppe et al., FEBS Letters, 344: 1991 (1994); Maniatis et al., Nature, 341: 24 (1989). Os especialistas na técnica entenderão que uma sequência de fecho de leucina pode ser fundida na extremidade 5' ou 3' do polipéptido desta invenção. 45

Os polipéptidos da presente invenção podem também ser modificados de um modo que forme moléculas quiméricas através de fusão do polipéptido com outra sequência de aminoácidos ou polipeptidica heteróloga.

De acordo com algumas formas de realização, tal sequência de aminoácidos ou polipeptidica heteróloga é uma que actua de modo a oligomerizar a molécula quimérica. Em algumas formas de realização, tal molécula quimérica compreende uma fusão do polipéptido com um polipéptido marcador que proporciona um epitopo ao qual um anticorpo marcador se pode ligar selectivamente. 0 marcador epitopo é geralmente colocado no terminal amino ou carboxilo do polipéptido. A presença de tais formas marcadas com epitopo do polipéptido pode ser detectada utilizando um anticorpo contra o polipéptido marcador. Também, a provisão do marcador epitopo permite o polipéptido de ser prontamente purificado por purificação de afinidade utilizando um anticorpo marcador ou outro tipo de matriz de afinidade que se liga ao marcador epitopo.

Os vários polipéptidos marcadores e seus respectivos anticorpos são bem conhecidos na técnica. Os exemplos incluem marcadores de poli-histidina (poli-his) ou poli-histidina-glicina (poli-his-gly); o polipéptido marcador HA da gripe e o seu anticorpo 12CA5 [Field et al.r Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)]; o marcador c-myc e os seus anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; e o marcador de glicoproteina D (gD) do vírus Herpes simplex e o seu anticorpo [Paborski et al., Protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)]. Outros polipéptidos marcadores incluem o péptido-Flag [Hopp et al., BioTechnology, 46 6: 1204-1210 (1988)]; o péptido epitopo KT3 [Martin et al.,

Science, 255: 192-194 (1992)]; um péptido epitopo de tubulina [skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; e o marcador peptidico da proteína 10 do gene T7 [Lutz-Freiermut et al., Proc. Natl. Acad.Sci: USA, 87: 6393-6397 (1990)] .

Construção de Conjugados Péptido-Polímero

Em algumas formas de realização, a estratégia para a conjugação de um polímero, (e. g., PEGilação) de péptidos sintéticos consiste em combinar, através da formação de uma ligação conjugada em solução, um péptido e uma unidade PEG, cada um contendo uma funcionalidade especial que seja mutuamente reactiva relativamente ao outro. Os péptidos podem ser facilmente preparados com síntese de fase sólida convencional. Os péptidos são "pré-activados" com um grupo funcional apropriado num sítio específico. Os precursores são purificados e totalmente caracterizados antes de reagirem com a unidade PEG. A ligação do péptido com PEG ocorre geralmente em fase aquosa e pode ser facilmente monitorizada por HPLC analítica de fase reversa. Os péptidos PEGilados podem ser facilmente purificados por HPLC preparativa e caracterizados por HPLC analítica, análise de aminoácidos e espectrometria de massa de dessorção a laser.

Em algumas formas de realização, um péptido é covalentemente ligado através de um ou mais resíduos de aminoácidos do péptido a um grupo reactivo terminal no polímero, dependendo principalmente das condições de reacção, peso molecular do polímero, etc. O polímero com o(s) grupo (s) reactivo (s) é aqui designado como polímero activado. O grupo reactivo reage selectivamente com o amino livre ou outros grupos reactivos no 47 péptido. Os potenciais sítios reactivos incluem: grupo amino N terminal, grupos amino epsilon em resíduos de lisina, assim como outros grupos amino, imino, carboxilo, sulfidrilo, hidroxilo e outros hidrofílicos. No entanto, será entendido que o tipo e quantidade do grupo reactivo escolhido, assim como o tipo de polímero utilizado, para obter resultados óptimos, vai depender do péptido particular utilizado para evitar ter o grupo reactivo a reagir com demasiados grupos particularmente activos no péptido. Em algumas formas de realização, um resíduo reactivo (e. g., lisina (k), um aminoácido modificado não natural ou outra pequena molécula) pode ser substituído numa posição adequada para conjugação.

Em algumas formas de realização, o péptido compreende a Fórmula III, ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N°: 7), ECFDLLVRHWVACGLLR na FIG. 32 do terminal. sequência de Fórmula I, Fórmula II ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID N°: 5),

(SEQ ID N°: 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID N°: 8), (SEQ ID N°: 9), ou as sequências listadas documento WO 05/000351 tendo um grupo reactivo

Em algumas formas de realização, o péptido compreende, pelo menos um e, de um modo mais preferido, mais do que um de um polipéptido compreendendo uma sequência de Fórmula I, Fórmula II, Fórmula III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID N°: 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N°: 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID N°: 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID N°: 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N°: 9), ou sequências listadas na FIG. 32 do documento WO 05/000351. Os polipéptidos que estão ligados em conjunto podem ter a mesma sequência ou ter sequências diferentes e um grupo reactivo terminal. Em algumas formas de realização, estes polipéptidos podem ser ligados uns aos outros, opcionalmente, através da utilização de um ligante. 48

Embora a conjugação possa ocorrer em qualquer aminoácido reactivo no polipéptido, em algumas formas de realização, o aminoácido reactivo é a lisina, a qual está ligada ao grupo reactivo do polimero activado através do seu grupo amino epsilon livre, ou ácido glutâmico ou aspártico, a qual está ligado ao polimero através de uma ligação amida. Em algumas formas de realização, os aminoácidos reactivos do péptido não são resíduos de cisteína em posições X2 e Xlz. 0 grau de conjugação do polímero com cada péptido irá variar dependendo do número de sítios reactivos do péptido, do peso molecular, hidrofilicidade e outras características do polímero e dos sítios particulares de derivatização do péptido escolhidos. Em algumas formas de realização, o conjugado tem uma razão molar final de 1 a 10 moléculas de polímero por molécula de péptido, mas estão também contemplados números maiores de moléculas de polímero ligadas aos péptidos da invenção. Em algumas formas de realização, cada conjugado contém uma molécula de polímero. A quantidade desejada de derivatização é facilmente conseguida através da utilização de uma matriz experimental em que o tempo, temperatura e outras condições de reacção são variadas para mudar o grau de substituição, após o qual o nível de substituição polimérica dos conjugados é determinada por cromatografia de exclusão de tamanho ou outros meios conhecidos na técnica.

Em algumas formas de realização, o polímero contém apenas um único grupo que é reactivo. Isto ajuda a evitar a reticulação de moléculas de proteína. Contudo, está dentro do âmbito da invenção maximizar as condições de reacção para reduzir a reticulação, ou para purificar os produtos de reacção através de filtração gel ou cromatografia de permuta iónica para recuperar derivados substancialmente homogéneos. Noutras formas de 49 realizaçao, o polímero contém dois ou mais grupos reactivos para o objectivo de ligar péptidos múltiplos à estrutura do polímero.

Novamente, a filtração gel ou cromatografia de permuta iónica pode ser utilizada para recuperar o derivado desejado em forma substancialmente homogénea. Em algumas formas de realização, o polímero é ligado covalentemente directamente ao péptido sem a utilização de um agente de reticulação multifunctional (habitualmente bifuncional). Em algumas formas de realização, existe uma razão molar 1:1 da cadeia PEG para péptido. A reacção de modificação covalente pode ocorrer através de qualquer método apropriado geralmente utilizado para reagir materiais biologicamente activos com polímeros inertes, de um modo preferido, a cerca de pH 5-9, de um modo mais preferido, 7-9 se os grupos reactivos no péptido forem grupos lisina. Geralmente, o processo envolve preparar um polímero activado (o polímero tem tipicamente, pelo menos, um grupo hidroxilo terminal para ser activado), preparar um substrato activo a partir deste polímero e posteriormente fazer reagir o péptido com o substrato activo para produzir o péptido adequado para formulação. A reacção de modificação acima pode ser realizada através de diversos métodos que podem envolver um ou mais passos. Exemplos de agentes modificadores que podem ser utilizados para produzir o polímero activado, numa reacção de um passo, incluem cloreto de ácido cianúrico (2,4,6-tricloro-S-triazina) e fluoreto de ácido cianúrico.

Em algumas formas de realização, a reacção de modificação ocorre em dois passos em que que o polímero é feito reagir primeiramente com um anidrido ácido, tais como anidrido succínico ou glutárico, para formar um ácido carboxílico, e o 50 ácido carboxílico é depois feito reagir com um composto capaz de reagir com o ácido carboxílico para formar um polímero activado com um grupo éster reactivo gue seja capaz de reagir com o péptido. Os exemplos de tais compostos incluem ácido N-hidroxissuccinimida, 4-hidroxi-3-nitrobenzenossulfónico e semelhantes e, de um modo preferido, são utilizados N-hidroxissuccinimida ou ácido 4-hidroxi-3-nitrobenzeno-sulfónico. Por exemplo, o PEG substituído com monometilo pode ser feito reagir a temperaturas elevadas, de um modo preferido, cerca de 100-110 °C durante quatro horas, com anidrido glutárico. O PEG-monometilo-ácido glutárico assim produzido é depois feito reagir com N-hidroxissuccinimida na presença de um reagente de carbodiimida, tais como diciclo-hexilo ou isopropilo carbodiimida para produzir o polímero activado, glutarato de metoxipolietilenoglicolil-N-succinimidilo, o qual pode depois ser feito reagir com o GH. Este método é descrito em detalhe em Abuchowski et al., Câncer Biochem. Biophy., 7: 175-186 (1984). Noutro exemplo, o PEG substituído com monometilo pode ser feito reagir com anidrido glutárico, seguido por reacção com ácido 4-hidroxi-3-nitrobenzenossulfónico (HNSA) na presença de diciclo-hexilcarbodiimida para produzir o polímero activado. O HNSA é descrito por Bhatnagar et al., Peptides:Synthesis-Structure-Function. Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Rich et al. (eds.) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1981), p. 97-100, e Nitecki et al., High-Technology Route to Virus Vaccines (American Society for Microbiology: 1986) com o título "Novel Agent for Coupling Synthetic Peptides to Carriers and its Applications".

Em algumas formas de realização, a ligação covalente a grupos amino é realizada através de químicas conhecidas com base em cloreto cianúrico, carbonildiimidazole, grupos reactivos de aldeído (PEG alcóxido mais dietilacetal de bromoacetaldeído; PEG 51 mais DMSO e anidrido acético, ou cloreto de PEG mais o fenóxido de 4-hidroxibenzaldeído, ésteres de succinimidilo activados, PEG de ditiocarbonato activado, 2,4,5-triclorofenilcloroformato ou PEG activado com P-nitrofenilcloroformato. Os grupos carboxilo são derivatizados por acoplamento de PEG-amina utilizando carbodiimida. Os grupos sulfidrilo são derivatizados por acoplamento de PEG substituído com maleimido (e. g., alcoxi-PEG amina mais 4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-l-carboxilato de sulfossuccinimidilo) como descrito no documento WO97/10847 publicado em 27 de Março de 1997, ou PEG-maleimida disponível comercialmente a partir de Nektar Technologies, San Carlos, CA (anteriormente Shearwater Polymers, Inc.). Alternativamente, grupos amino livres no péptido (e. g., grupos amino epsilon em resíduos de lisina) podem ser acoplados a PEG substituído com N-hidroxissucciminidilo (PEG-NHS disponível a partir de Nektar Technologies) ou pode ser tiolado com 2-imino-tiolano (reagente de Traut) e depois acoplado a derivados contendo maleimida de PEG como descrito em Pedley et al., Br. J. Câncer, 70: 1126-1130 (1994) .

Muitos polímeros inertes, incluindo mas não limitado ao PEG, são adequados para utilização em produtos farmacêuticos. Ver, e. g., Davis et al., Biomedical Polymers: Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use, pp. 441-451 (1980). Em algumas formas de realização da invenção, é utilizado um polímero não proteico. 0 polímero não proteico é tipicamente um polímero sintético hidrofílico, i. e., um polímero de outra forma não encontrado na natureza. Contudo, os polímeros que existem na natureza e são produzidos por métodos recombinantes ou in vitro são também úteis, assim como são polímeros que são isolados de fontes nativas. Os polímeros polivinílicos hidrofílicos enquandram-se no âmbito desta invenção, e. g., polivinilálcool e polivinilpirrolidona. São particularmente 52 úteis os éteres de polialquileno, tal como polietilenoglicol (PEG); polioxialquilenos, tais como polioxietileno, polioxipropileno e copolímeros de bloco de polioxietileno e polioxipropileno (Pluronics); polimetacrilatos; carbómeros; polissacáridos ramificados ou não ramificados que compreendem os monómeros de sacárido D-manose, D- e L-galactose, fucose, fructose, D-xilose, L-arabinose, ácido D-glucurónico, ácido siálico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico (e. g., ácido polimanurónico ou ácido alginico) , D-glucosamina, D-galactosamina, D-glucose e ácido neuraminico incluindo homopolissacáridos e heteropolissacáridos, tais como lactose, amilopectina, amido, hidroxietilamido, amilose, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glicogénio ou a subunidade polissacaridica de ácidos mucopolissacáridos, e. g. , ácido hialurónico; polímeros de álcoois de açúcar, tais como polisorbitol e polimanitol; heparina ou heparona. 0 polímero antes da conjugação não necessita ser, mas é de um modo preferido, hidrossolúvel, mas o conjugado final é, de um modo preferido, hidrossolúvel. De um modo preferido, o conjugado apresenta uma solubilidade na água de, pelo menos, cerca de 0,01 mg/mL, e, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 0,1 mg/mL e, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 1 mg/mL.

Além disso, o polímero não deve ser muito imunogénico na forma conjugada, nem deve possuir uma viscosidade que é incompatível com infusão intravenosa, injecção ou inalação, se o conjugado for pretendido para ser administrado através de tais vias. 53 0 peso molecular do polímero pode variar até cerca de 100000 D e, de um modo preferido, é pelo menos, cerca de 500 D, ou, pelo menos, cerca de 1000 D ou, pelo menos, cerca de 5000 D. Em algumas formas de realização, o PEG ou outro polímero têm um peso molecular na gama de 5000 a 20000 D. O peso molecular escolhido pode depender do tamanho efectivo do conjugado a ser conseguido, da natureza (e. g., estrutura, tais como linear ou ramificada) de polímero e do grau de derivatização, i. e., o número de moléculas de polímero por péptido e do sítio ou sítios de ligação polimérica no péptido. Em algumas formas de realização, pode ser utilizado PEG ramificado para induzir um grande aumento no tamanho efectivo dos péptidos. O PEG ou outros conjugados poliméricos podem ser utilizados para aumentar a semi-vida, aumentar a solubilidade, estabilizar contra ataque proteolítico e reduzir a imunogenicidade.

Os polímeros de PEG funcionalizados para modificar os péptidos da invenção estão disponíveis a partir de Nektar Technologies of San Carlos, CA (anteriormente Shearwater Polymers, Inc.). Tais derivados de PEG comercialmente disponíveis incluem, mas não estão limitados a amino-PEG, ésteres aminoacídicos de PEG., química de PEG-N-hidroxissuccinamida (NHS), PEG-hidrazida, PEG-tiol, PEG-succinato, PEG carboximetilado, PEG-ácido propiónico, aminoácidos PEG, PEG succinimidilsuccinato, PEG succinimidilpropionato, éster succinimidílico de PEG carboximetilado, carbonato de succinimidilo de PEG, ésteres succinimidílicos de PEG aminoácidos, PEG-xicarbonilimidazole, PEG-nitrofenilcarbonato, PEG tresilato, éter glicidílico de PEG, PEG-aldeído, PEG vinilsulfona, PEG-maleimida, PEG-ortopiridil-dissulfureto, PEG heterofuncionais, derivados vinilo de PEG, PEG silanos e PEG fosfolidos. As condições reaccionais para acoplar estes derivados de PEG irão variar dependendo da proteína, do 54 grau desejado de PEGilação e do derivado de PEG utilizado. Alguns factores envolvidos na escolha de derivados de PEG incluem: o ponto desejado de ligação (tal como R-grupos de lisina ou cisteina), estabilidade e reactividade hidrolítica dos derivados, estabilidade, toxicidade e antigenicidade da ligação, adequabilidade para análise, etc. As instruções especificas para utilização de qualquer derivado particular estão disponíveis a partir do fabricante.

Os conjugados podem ser caracterizados por SDS-PAGE, filtração gel, RMN, mapeamento tríptico, cromatrografia líquida-espectrofotometria de massa e ensaios biológicos in vitro. Por exemplo, a extensão da conjugação de PEG pode ser mostrada através de SDS-PAGE a filtração gel e depois analisada por RMN, o qual tem um pico específico de ressonância para os hidrogénios de metileno de PEG. 0 número de grupos PEG em cada molécula pode ser calculado a partir de espectro de RMN ou espectrometria de massa. A electroforese em gel de poliacrilamida em 10% de SDS é realizada apropriadamente em 10 mM de Tris-HCl pH 8,0, 100 mM de NaCl como tampão de eluição. Para demonstrar que resíduo está PEGilado, pode ser realizado mapeamento tríptico. Assim, os péptidos PEGilados são digeridos com tripsina a uma razão proteína/enzima de 100 a 1 numa base em mg, a 37 °C durante 4 horas em 100 mM de acetato de sódio, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM de cloreto de cálcio, pH 8,3 e acidificado a pH <4 para parar a digestão antes de separar em HPLC NucleosilC-18 (4,6 mm X 150 mm, 5 μ, 100 A) . O cromatograma é comparado àquele de material inicial não PEGilado. Cada pico pode ser depois analisado por espectrometria de massa para verificar o tamanho do fragmento no pico. O fragmento(s) fragmentos tendo grupos PEG não são geralmente retidos na coluna de HPLC após injecção e desaparecem da cromatografia. Tal desaparecimento da cromatografia é uma indicação de PEGilação nesse fragmento 55 particular que deve conter, pelo menos, um resíduo de lisina. Os péptidos PEGilados podem ser depois ensaiados para a capacidade de se ligarem ao BLyS através de métodos convencionais.

Em algumas formas de realização, os conjugados são purificados por cromatografia de permuta iónica (e. g., HPLC de permuta iónica). A química de muitos dos PEG electrofilicamente activados resulta numa redução da carga do grupo amino do produto PEGilado. Assim, pode ser utilizada cromatografia de permuta iónica de elevada resolução para separar as proteínas livres e conjugadas, e para resolver espécies com diferentes níveis de PEGilação.

De facto, a resolução de diferentes espécies (e. g., contendo um ou dois resíduos PEG) é também possível devido à diferença nas propriedades iónicas dos aminoácidos não reagidos. Numa forma de realização, as espécies com diferentes níveis de PEGilação são resolvidas de acordo com os métodos descritos no documento WO 96/34015 (Pedido internacional N° PCT/US96/05550 publicado em 31 de Outubro de 1996). As espécies heterólogas dos conjugados são purificadas a partir umas das outras da mesma forma.

Em algumas formas de realização, o PEG-N-hidroxissuccinamida (NHS) reage com uma amina primária (e. g. lisinas no N terminal). Em algumas formas de realização, o PEG-NHS reage com uma lisina (K) do C terminal do polipéptido. Em algumas formas de realização, o resíduo de lisina foi adicionado ao C terminal do polipéptido 17-mer, enquanto noutras formas de realização, Xi é substituído com lisina. Em algumas formas de realização, o polímero reage com o N terminal. Numa forma de realização preferida, o conjugado é gerado por utilização dos 56 métodos de derivatizaçao e purificação descritos nos exemplos abaixo.

Num aspecto, a descrição descreve qualquer um dos conjugados descritos acima formados pelas suas partes componentes, i. e., um ou mais péptidos covalentemente ligados a uma ou mais moléculas de polímero, sem qualquer matéria estranha na estrutura molecular covalente do conjugado. A descrição descreve ligação um anticorpo que se liga a BLyS ou um ou mais dos seus três receptores e métodos para produzir tais anticorpos. 0 BLyS ou o receptor de BLyS a ser utilizado para produção ou rastreio de anticorpos pode ser, e. g., uma forma solúvel do antigénio ou de uma sua porção, contendo o epitopo desejado. Como acima descrito, a sequência de BLyS e a sequência dos receptores de BLyS são conhecidos, assim como são os limites dos vários domínios destes polipéptidos. Os fragmentos peptídicos do domínio extracelular (ECD) podem ser utilizados como imunogénios. Com base nestas sequências e limites de domínio conhecidos, uma especialista na técnica pode expressar os polipéptidos de BLyS ou dos receptores de BLyS e os seus fragmentos para utilização na produção de anticorpos.

Para produzir anticorpos para BLyS ou os seus receptores, podem ser utilizados polipéptidos tamanho total ou fragmentos peptídicos de 6 ou mais resíduos de comprimento como imunogénios para produzir anticorpos em roedores, incluindo murganhos, hámsteres e ratos, em coelhos, cabras ou outro animal adequado. 0 polipéptido solúvel de BLyS ou do receptor de BLyS ou os seus fragmentos imunogénicos pode ser expresso em células hospedeiras adequadas, tais como bactérias ou células eucarióticas. Numa 57 forma de realização, os BLyS de tamanho total solubilizados em detergente, humanos e de murino, são produzidos em E. coli e utilizados para imunizar e rastrear hibridomas que produzem anticorpos de BLyS.

Alternativamente, ou adicionalmente, as células B ou linhas celulares que expressam BLyS ou receptores de BLyS à sua superfície celular podem ser utilizados para produzir e/ou rastrear anticorpos. Outras formas de BLyS úteis para produzir anticorpos serão evidentes aos especialistas na técnica, tal como a metodologia de apresentação de fagos pode também ser utilizada para produzir anticorpos que se ligam a BLyS. Os anticorpos que se ligam a BLyS ou aos receptores de BLyS podem ser quiméricos, humanizados ou humanos. Tais anticorpos e métodos de os produzir são os descritos mais detalhadamente abaixo.

Os anticorpos policlonais são produzidos, de um modo preferido, em animais através de múltiplas injecções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antigénio relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antigénio relevante a uma proteína que seja imunogénica na espécie a ser imunizada, e. g., hemocianina de caramujo, albumina sérica, tiroglobulina bovina ou inibidor da tripsina de soja utilizando um agente bifuncional ou derivatizante, por exemplo, éster de maleimidobenzoilsulfossuccinimida (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, S0C12 ou R1N=C=NR, onde R e R' são diferentes grupos alquilo.

Os animais são imunizados contra o antigénio, conjugados imunogénicos ou derivados por combinação, e. g., de lOOwu ou 5 g da proteína ou conjugado (para coelhos ou murganhos, 58 respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injectando a solução intradermicamente em múltiplos sítios. Um mês depois, os animais são reforçados com 1/5 a 1/10 da quantidade original do péptido ou conjugado em adjuvante completo de Freund por injecção subcutânea em múltiplos sítios. Depois de sete a 14 dias é removido sangue dos animais e o soro é ensaiado para o título do anticorpo. Os animais são reforçados até o título atingir um patamar. De um modo preferido, o animal é reforçado com o conjugado do mesmo antigénio, mas conjugado com uma proteína diferente e/ou através de um diferente reagente de reticulação. Os conjugados também podem ser feitos em cultura celular recombinante como proteínas de fusão. Além disso, podem ser apropriadamente utilizados agentes agregantes, tal como alúmen, para aumentar a resposta imune.

Os anticorpos monoclonais são obtidos a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i. e., os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos excepto para as mutações naturais possíveis que podem estar presentes em quantidades menores. Assim, o "monoclonal" modificador indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos discretos.

Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser feitos utilizando o método do hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), ou podem ser feitos por métodos de ADN recombinante (patente U.S. N° 4816567). No método do hibridoma, um murganho ou o outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado como aqui descrito acima para induzir linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que irão ligar-se especificamente à proteína utilizada para immunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são depois fundidos 59 com células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

As células de hibridoma assim preparadas são inoculadas e cultivadas num meio de cultura adequado que contém, de um modo preferido, uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma parentais não tiverem a enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), cujas substâncias previnem o crescimento de células deficientes em HGPRT.

As células de mieloma preferidas são aquelas que fundem eficientemente, suportam a produção estável de elevado nivel do anticorpo através das células produtoras de anticorpos seleccionadas e são sensíveis a um meio, tal como meio HAT.

Entre estas, as linhas celulares de mieloma preferidas são linhas de mieloma de murino, tais como aquelas derivadas de tumores de murganho MOPC-21 e MPC-11 disponíveis a partir de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, USA, e células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis a partir da American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EUA. As linhas celulares de heteromielona de murganho-humano e de mieloma humano foram também descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987) . 60 0 meio de cultura em que as células de hibridoma são cultivadas é ensaiado para a produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio. De um modo preferido, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tais como radioimunoensaio (RIA) ou imunoensaio de adsorção ligado à enzima (ELISA). A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada por análise de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980).

Após serem identificadas as células de hibridoma que produzem anticorpos de especificidade, afinidade e/ou actividade desejadas, os clones podem ser subclonados por processos de diluição limitante e cultivados por métodos convencionais identificados (Goding, Monoclonal Antibodies Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Os meios de cultura adequados para este objectivo incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores asciticos num animal.

Os anticorpos monoclonais excretados pelos subclones são apropriadamente separados a partir de meio de cultura, fluido ascitico ou soro por processos convencionais de purificação de imunoglobulinas, tais como, por exemplo, proteína A-Sepharose, cromatografia de hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise, ou cromatografia de afinidade. O ADN que codifica os anticorpos monoclonais é prontamente isolado e sequenciado utilizando processos convencionais (e. g., utilizando sondas oligonucleotídica que são capazes de se ligarem especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos de murino). As células de hibridoma servem como uma fonte preferida de tal ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado 61 em vectores de expressão, que são depois transfectados em células hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS de simio, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Os artigos de revisão sobre a expressão recombinante em bactérias de ADN que codifica o anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) e Plucktun, Immunol Revs., 130: 151-188 (1992).

Numa forma de realização adicional, anticorpos ou fragmentos de anticorpo podem ser isolados a partir de bibliotecas fágicas de anticorpo produzidas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990).

Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos de murino e humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas fágicas. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de elevada afinidade (gama de nM) por arranjo combinatório de cadeias (Marks et al., BiolZ'echraology, 10 : 779-783 (1992)), assim como infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para a construção de bibliotecas fágicas muito grandes (waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). Assim, estas técnicas são alternativas viáveis às técnicas tradicionais de hibridoma de anticorpo monoclonal para o isolamento de anticorpos monoclonais. O ADN também pode ser modificado, por exemplo, através de substituição da sequência codificante para os domínios constantes de cadeia pesada e leve humana no lugar das sequências homólogas de murino (Patente U.S. N° 4816567; 62

Morrison, et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA, 81: 6851 (1984)), ou através de ligação covalente à sequência codificante de imunoglobulina toda ou parte da sequência codificante para um polipéptido não de imunoglobulina.

Tipicamente tais polipéptidos não de imunoglobulina são substituídos para os domínios constantes de um anticorpo, ou são substituídos para os domínios variáveis de um sítio de combinação de antigénio de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico compreendendo um sítio de combinação de antigénio tendo especificidade para um antigénio e um outro sítio de combinação de antigénio tendo a especificidade para um antigénio diferente.

Os métodos para humanizar anticorpos não humanos foram descritos na técnica. De um modo preferido, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos aí introduzidos a partir de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente referidos como resíduos de "importação", os quais são tipicamente retirados de um domínio variável de "importação". A humanização pode ser realizada essencialmente após o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeien et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), por substituição das sequências da região hipervariável para as sequências correspondentes de um anticorpo humano. Desta forma, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente U.S. N° 4816567) em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente a partir de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos da região hipervariável e possivelmente alguns resíduos FR são 63 substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedor. A escolha de domínios variáveis humanos, leves e pesados, para serem utilizados na produção de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o denominado método do "melhor ajustamento", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é rastreado contra a biblioteca inteira de sequências de domínio variável humanas conhecidas. A sequência humana que está mais perto daquela de roedor é depois aceite como a região estrutural humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196 : 901 (1987)). Um outro método utiliza uma região estrutural particular derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para diversos anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 15-1:2623 (1993) ) . É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de elevada afinidade para o antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para conseguir este objectivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados através de um processo de análise das sequências parentais e de vários produtos humanizados conceptuais utilizando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas.

Os modelos tridimensionais de imunoglobulina estão geralmente disponíveis e são familiares aos especialistas na técnica. Estão disponíveis programas de computador que ilustram 64 conformacionais tridimensionais e apresentam estruturas prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas seleccionadas. A inspecção destas apresentações permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, i. e., a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para se ligar ao seu antigénio. Desta forma, os resíduos da FR podem ser seleccionados e combinados a partir das sequências de receptor e de importação de modo que seja conseguida a característica desejada do anticorpo, tal como afinidade aumentada para o(s) antigénio(s) alvo(s). Em geral, os resíduos da região hipervariável estão directamente e muito substancialmente envolvidos em influenciar a ligação do antigénio.

Como uma alternativa à humanização, podem ser produzidos anticorpos humanos. Por exemplo, é agora possível produzir animais transgénicos (e. g., murganhos) que são capazes, após imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de ligação (JH) da cadeia pesada de anticorpo em murganhos mutantes quiméricos e da linha germinal resulta em inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência da série do gene da imunoglobulina da linha germinal humana em tais murganhos mutantes da linha germinal irá resultar na produção de anticorpos humanos após desafio de antigénio. Ver, e. g., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993); e

Patentes U.S. N° 55916695, 589369 e 5545807. 65

Alternativamente, a tecnologia de apresentação de fagos (McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990)) pode ser utilizada para produzir anticorpos e fragmentos de anticorpo humanos in vitro, a partir de repertórios do gene do dominio variável (V) de imunoglobulina de doadores não imunizados. De acordo com esta técnica, os genes do dominio V de anticorpo são clonados em-grelha num gene da proteína da capa maior ou menor de um bacteriófago filamentoso, tais como M13 ou fd, e apresentados como fragmentos de anticorpo funcionais na superfície da partícula fágica. Uma vez que a partícula filamentosa contém uma cópia do ADN de cadeia simples do genoma do fago, as selecções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na selecção do gene que codifica o anticorpo que apresenta aquelas propriedades. Assim, o fago mimetiza algumas das propriedades da célula B. A apresentação de fagos pode ser realizada numa variedade de formatos; para a sua revisão ver, e. g., Johnson, Kevin S. e Chiswell , David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993) . Diversas fontes de segmentos de gene V são utilizados para a apresentação de fagos. Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) isolou uma série diversa de anticorpos anti-oxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados de baços de murganhos imunizados. Um repertório de genes V de dadores humanos não imunizados pode ser construído e os anticorpos para uma série diversa de antigénio (incluindo auto-antigénios) pode ser isolado seguindo essencialmente as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), ou Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993). Ver, também, Patentes U.S. N° 5565332 e 5573905. Os anticorpos humanos podem também ser produzidos por células B activadas in vitro (ver Patentes U.S. 5567610 e 5229275). 66

Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos eram derivados por digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, e. g., Morimoto et ai., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Contudo, estes fragmentos podem agora ser produzidos directamente por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir das bibliotecas fágicas de anticorpo discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser recuperados directamente a partir de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordo com uma outra abordagem, os fragmentos F(ab')2 podem ser isolados directamente a partir de cultura de célula hospedeira recombinante. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes ao especialista. Noutras formas de realização, o anticorpo escolhido é um fragmento Fv de cadeia simples (scFv). Ver documento WO 93/16185; Patente U.S. N° 5571894; e Patente U.S. N° 5587458. O fragmento de anticorpo pode também ser um "anticorpo linear", e. g., como descrito na Patente 5641870, por exemplo. Tais fragmentos lineares de anticorpos podem ser monoespecificos ou biespecificos.

Os anticorpos biespecificos são anticorpos tendo especificidades de ligação para, pelo menos, dois epitopos diferentes. Os anticorpos biespecificos exemplificativos podem se ligar a dois epitopos diferentes do marcador de superfície da célula B. Outros tais anticorpos podem-se ligar a um primeiro marcador de célula B e ainda ligarem-se a um segundo marcador da superfície de célula B. Alternativamente, um braço de ligação anti-marcador de célula B pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula despoletadora num leucócito tal como uma 67 molécula do receptor de célula T (e. g. CD2 ou CD3), ou receptores Fc para IgG (FcyR), como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16) para focar mecanismos de defesa celulares à célula B. Os anticorpos biespecificos podem também ser utilizados para localizar agentes citotóxicos à célula B.

Estes anticorpos possuem um braço de ligação a marcador de célula B e um braço que se liga ao agente citotóxico (e. g., saporina, anti-interferão, alcaloide vinca, cadeia de ricina A, metotrexato ou hapteno de isótopo radioactivo).

Os anticorpos biespecificos podem ser preparados como anticorpos de tamanho total ou fragmentos de anticorpos (e. g., anticorpos biespecificos F(ab')2). Os métodos para produzir anticorpos biespecificos são conhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecificos de tamanho total é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada-leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias têm especificidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)).

Por causa da variedade aleatória de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma potencial mistura de 10 moléculas diferentes de anticorpo, das quais apenas uma tem a estrutura biespecifica correcta. A purificação da molécula correcta, a qual é geralmente feita por passos de cromatografia de afinidade, é bastante incómoda e os rendimentos de produto são baixos. Processos semelhantes são divulgados no documento WO93/08829 e em Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).

De acordo com uma abordagem diferente, os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação anticorpo-antigénio) são fundidos a sequências de 68 domínio constante de imunoglobulina. A fusão é, de um modo preferido, com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo, pelo menos, parte da charneira e regiões CH2 e CH3. É preferido ter a primeiro região constante de cadeia pesada (CHI) contendo o sítio necessário para ligação à cadeia leve, presente em, pelo menos, uma das fusões. Os ADN que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são introduzidos em vectores de expressão separados e são co-transfectados num organismo hospedeiro adequado. Isto proporciona grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos polipeptídicos em formas de realização, quando razões desiguais das três cadeias polipeptídicas utilizadas na construção proporcionam um rendimento óptimo. É, contudo, possível introduzir as sequências codificantes para duas ou todas as três cadeias polipeptídicas num vector de expressão quando a expressão de, pelo menos, duas cadeias polipeptídicas em razões iguais resulta em rendimentos elevados ou quando as razões não têm qualquer significado particular.

Numa forma de realização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação num braço e um par de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina híbrida (proporcionando uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Verificou-se que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado a partir de combinações não desejadas de cadeia de imunoglobulina, uma vez que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina é apenas um meio da molécula biespecífica que proporciona um modo fácil de separação. Esta abordagem é divulgada no documento WO 94/04690. Para mais detalhes sobre a produção de anticorpos biespecíficos ver, por exemplo, Suresh 69 et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986). De acordo com outra abordagem descrita na Patente U.S. N° 5731168, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser manipulada para maximizar a percentagem de heterodímeros que são recuperados a partir da cultura celular recombinante. A interface preferida compreende, pelo menos, uma parte do domínio CH3 de um domínio constante de anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácido pequeno da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeia laterais maiores (e. g., tirosina ou triptofano). São criadas "cavidades" compensadoras de tamanho idêntico ou semelhante à cadeia ou cadeias laterais na interface da segunda molécula de anticorpo por substituição das cadeias laterais de aminoácidos grandes com menores (e. g., alanina ou treonina) . Isto proporciona um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero relativamente a outros subprodutos não desejados, tal como homodímeros.

Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado a avidina, o outro a biotina. Tais anticorpos, por exemplo, foram propostos para direccionarem células do sistema imune a células não desejadas (Patente U.S. N° 4676980) e para tratamento de infecção por HIV (documentos WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 03089). Os anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos utilizando quaisquer métodos convenientes de reticulação. Os agentes adequados de reticulação são bem conhecidos na técnica e são divulgados na Patente U.S. N° 4676980, em conjunto com uma variedade de técnicas de reticulação. 70

As técnicas para produzir anticorpos biespecificos a partir de fragmentos de anticorpos foram também descritas na literatura. Por exemplo, os anticorpos biespecificos podem ser preparados utilizando ligação química. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) descreve um processo em que anticorpos intactos são clivados proteoliticamente para produzir fragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante de ditiol, arsenito de sódio, para estabilizar ditióis vizinhos e prevenir a formação de dissulfuretos intermoleculares. Os fragmentos Fab' produzidos são depois convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab'-TNB é depois reconvertido no Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecifico. Os anticorpos biespecificos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização selectiva de enzimas. 0 progresso recente facilitou a recuperação directa de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, os quais podem ser acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecificos. Shalabi et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) descreve a produção de uma molécula F(ab')2 de anticorpo biespecifico totalmente humanizada. Cada fragmento Fab' foi excretado separadamente de E. coli e submetido a acoplamento químico dirigido in vitro para formar o anticorpo biespecifico. 0 anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar a células que sobreexpressam o receptor ErbB2 e a células T normais humanas, assim como despoletar a actividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor da mama humano. 71

Foram também descritas várias técnicas para produzir e isolar fragmentos de anticorpos biespecificos directamente a partir de cultura celular recombinante. Por exemplo, os anticorpos biespecificos foram produzidos utilizando fechos de leucina. Kostelni et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992) . Os péptidos de fecho de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligadas a porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão génica.

Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região de charneira para formar monómeros e depois oxidados novamente para formar os heterodímeros de anticorpo. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia "diabody" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 6444-6448 (1993) tem proporcionado um mecanismo alternativo para produzir fragmentos de anticorpos biespecificos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) através de um ligante que é demasiado curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Desta forma, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelharem com os domínios VL e VH complementares de um outro fragmento, formando assim dois sítios de ligação a antigénio. Outra estratégia para produzir fragmentos de anticorpos biespecificos através da utilização de dímeros de cadeia simples Fv (sFv) foi também descrita. Ver Gruber et al., J. ImmunoL, 152: 5368 (1994) .

Estão comtemplados anticorpos com mais de duas valências. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos triespecíficos. Tutt et ai., J. Immunol. 147: 60(1991). 72

Está(ão) contemplada a(s) modificação(ões) de sequências de aminoácidos de antagonistas proteicos ou peptidicos e anticorpos aqui descritos. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do antagonista ou anticorpo de ligação a BLYS. As variantes de sequência de aminoácidos do antagonista são preparadas por introdução de alterações nucleotidicas apropriadas no ácido nucleico do antagonista ou por síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições, de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do antagonista. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição é feita para conseguir a construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As alterações de aminoácidos também podem alterar processos pós-tradução do antagonista, tal como a alteração do número ou posição de sítios de glicosilação.

Um método útil para identificação de determinados resíduos ou regiões do antagonista que são posições preferidas para mutagénese é denominado "mutagénese de varrimento de alanina" como descrito por Cunningham e Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989) . Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvo são identificados (e. g., resíduos carregados, tais como arg, asp, his, lys e glu) e substituídos por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (de um modo muito preferido, alanina ou polialanina) para afectar a interacção dos aminoácidos com o antigénio. Aquelas posições de aminoácido que demonstram sensibilidade funcional às substituições são depois refinadas por introdução de mais ou outras variantes nos sítios de substituição. Assim, embora o sítio para introduzir uma variação de sequência de aminoácido seja predeterminado, a natureza da mutação não necessita, por si própria, ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação num 73 determinado sítio, é conduzido varrimento de ala ou mutagénese aleatória no codão ou região alvo e as variantes de antagonista expressas são rastreadas para a actividade desejada.

As inserções de sequências de aminoácidos incluem fusões de terminal amino e/ou carboxilo que variam de tamanho desde um resíduo até polipéptidos contendo cem ou mais resíduos, assim como inserções intra-sequência de um ou múltiplos resíduos de aminoácidos. Os exemplos de inserções terminais incluem um antagonista com um resíduo metionilo N terminal ou o antagonista fundido com um polipéptido citotóxico. Outras variantes de inserção da molécula de antagonista incluem a fusão ao N ou C terminal do antagonista de uma enzima, ou um polipéptido que aumenta a semi-vida sérica do antagonista.

Um outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácido. Estas variantes têm, pelo menos, um resíduo de aminoácido na molécula de antagonista substituído por um resíduo diferente. Os sítios de maior interesse para mutagénese de substituição de antagonistas do anticorpo incluem as regiões hipervariáveis, mas estão também contempladas alterações da FR. As substituições conservadoras são mostradas na Tabela 1 sob o título "substituições preferidas". Se tais substituições resultarem numa alteração da actividade biológica, então mais alterações substanciais, denominadas "substituições exemplificativas" na Tabela 1, ou como adicionalmente descrito abaixo com referência a classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos rastreados.

As modificações substanciais nas propriedades biológicas do antagonista são realizadas por selecção de substituições que diferem significativamente no seu efeito na manutenção da (a) estrutura central do polipéptido na área de substituição, 74 por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) volume da cadeia lateral. Os resíduos naturais são divididos em grupos com base nas propriedades comuns das ceias laterais: (1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile; (2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr; (3) acídicos: asp, glu; (4) básicos: asn, gin, his, lys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e (6) aromáticos: trp, tyr, phe. As substituições não conservadoras pretendem trocar um membro de uma destas classes por outra classe.

Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada do antagonista também pode ser substituído, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir reticulação aberrante. Inversamente, podem ser adicionadas ligações de cisteína ao antagonista para melhorar a sua estabilidade (particularmente nos casos em que o antagonista é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fv).

Um tipo particularmente preferido de variante de substituição envolve substituir um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental. Geralmente, a variante ou variantes resultantes seleccionadas para desenvolvimento adicional terá propriedades biológicas melhoradas relativamente ao anticorpo parental a partir do qual foi gerada. Um modo conveniente para produzir tais variantes de substituição é maturação de afinidade utilizando apresentação de fagos. Resumidamente, diversos sítios da região hipervariável (e. g., 6-7 sítios) são mutados para produzir todas as substituições amino possíveis em cada sítio. As variantes de anticorpo assim produzidas são apresentadas de um modo monovalente a partir de partículas fágicas filamentosas como fusões ao produto do gene 75 III de M13 empacotados dentro de cada partícula. As variantes de apresentação fágica são depois rastreadas para a sua actividade biológica (e. g., afinidade de ligação) como aqui divulgado. De modo a identificar sítios candidatos de região hipervariável para modificação, pode ser realizada mutagénese de varrimento de alanina para identificar resíduos de região hipervariável que contribuem significativamente para ligação a antigénio. Alternativamente ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antigénio-anticorpo para identificar pontos de contacto entre o anticorpo e o antigénio. Tais resíduos de contacto e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas aqui elaboradas. Uma vez produzidas tais variantes, o painel de variantes é submetido a rastreio como aqui descrito e os anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser seleccionados para desenvolvimento adicional.

Outro tipo de variante de aminoácido do antagonista altera o perfil de glicosilação original do antagonista. Por alterar entende-se remover uma ou mais unidades de hidrato de carbono encontradas no antagonista e/ou adicionar um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no antagonista. A glicosilação de polipéptidos é tipicamente ligada por N ou 0. A ligada por N refere-se à ligação da unidade de hidrato de carbono à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é um aminoácido excepto prolina, são as sequências de reconhecimento para ligação enzimática da unidade de hidrato de carbono à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer destas sequências tripeptídicas num polipéptido cria um potencial sítio de glicosilação. A glicosilação ligada por 0 refere-se à ligação de um dos açúcares 76 N-aceilgalactosamina, galactose ou xilose a um ácido hidroxiamino, mais geralmente serina ou treonina, embora também possa ser utilizada 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina. A adição de sitios de glicosilação ao antagonista é convenientemente realizada por alteração da sequência de aminoácidos de modo a conter uma ou mais das sequências tripeptídicas descritas acima (para sítios de glicosilação ligados por N). A alteração pode também ser feita por adição ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do antagonista original (para sítios do glicosilação ligados por 0).

As moléculas de ácidos nucleicos que codificam variantes de sequência de aminoácidos do antagonista são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a, isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes de sequências de aminoácidos naturais) ou preparação por mutagénese mediada por oligonucleótidos (ou dirigida) , mutagénese por PCR e mutagénese de cassete de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não variante do antagonista.

Pode ser desejável modificar o antagonista da invenção relativamente à função efectora, e. g., de modo a aumentar a citotoxicidade mediada por célula dependente de antigénio (ADCC) e/ou complementar a citotoxicidade dependente (CDC) do antagonista. Isto pode ser conseguido por introdução de uma ou mais substituições de aminoácido numa região Fc de um antagonista de anticorpo. Alternativamente ou adicionalmente, o ou os resíduos de cisteínas podem ser introduzidos na região Fc, permitindo assim a formação de ligação de dissulfureto inter-cadeia nesta região. 77 0 anticorpo homodimérico assim produzido pode ter capacidade de internalização melhorada e/ou capacidade aumentada para matar células com mediação do complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpo aumentada (ADCC). Ver Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) e Shopes, B.J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Os anticorpos homodiméricos com actividade antitumoral aumentada podem também ser preparados utilizando reticulantes heterobifuncionais como descrito em Wolff et al. Câncer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, um anticorpo pode ser concebido de modo a ter duas regiões Fc e pode assim ter lise do complemento e potencialidades de ADCC aumentadas. Ver Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989) .

Para aumentar a semi-vida sérica do antagonista, pode-se incorporar, por exemplo, um epitopo de ligaçao ao receptor de salvamento no antagonista (especialmente um fragmento de anticorpo) como descrito na Patente U.S. 5739277. Como agui utilizado, a expressão "epitopo de ligação ao receptor de salvamento" refere-se a um epitopo da região Fc de uma molécula de IgG (e. g., IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4) gue é responsável por aumentar a semi-vida sérica in vivo da molécula de IgG.

Ensaios

As concentrações de células B periféricas são determinadas através de um método FACS gue conta células CD3-/Cd40+. A percentagem de células B CD3-CD40+ de linfócitos totais em amostras pode ser obtida através da seguinte estratégia de selecção. A população de linfócitos é marcada na dispersão para a frente/dispersão lateral no diagrama de dispersão para definir 78 a região 1 (Ri) . Utilizando eventos em RI, são apresentadas representações gráficas de pontos de intensidade de fluorescência para os marcadores CD40 e CD3. São utilizados controlos isotípicos marcados com fluorescência para determinar pontos limite respectivos para a positividade de CD40 e CD3.

Análise de FACS

Meio milhão de células são lavadas e ressuspensas em 1001 de tampão FACS, o qual é soro fisiológico tamponado com fosfato com 1% de BSA, contendo 5 uL de anticorpo de coloração ou de controlo. Todos os anticorpos de coloração, incluindo controlos isotípicos, são obtidos da PharMingen, San Diego, CA. A expressão de BLYS humano é avaliada por coloração com Rituxan@ em conjunto com anticorpo secundário anti-IgGl humana conjugado com FITC. A análise de FACS é conduzida utilizando FACScan e Cell Quest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) . Todos os linfócitos são definidos nas dispersões de luz para a ferente e laterais, enquanto todos os linfócitos B são definidos com a expressão de B220 na superfície celular. A depleção e recuperação de células B são avaliadas por contagens de células B periféricas e análise de células hBLYS+ B por FACS de baço, nódulos linfáticos e medula óssea numa base diária, para a primeira semana após injecção e posteriormente numa base semanal. Os níveis séricos do anticorpo variante 2H7 injectado são monitorizados. 79

Formulações Farmacêuticas

As formulações terapêuticas de antagonistas de BLyS, tal como anticorpos de ligação a BLyS, são preparadas para armazenamento por mistura de um anticorpo tendo o grau desejado de pureza com os veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Science, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações utilizadas, e incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como octadecildimetil-benzilcloreto de amónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos, tais como metilparabeno ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tal como olivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tal como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-iões formadores de sal, tal como sódio; complexos metálicos (e. g., complexos Zn-proteína); e/ou tensioactivos não iónicos, tais como TWEEN, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG). A formulação aqui apresentada pode também conter mais do que um composto activo, como necessário para a indicação particular a ser tratada, de um modo preferido, aqueles com actividades 80 complementares que não se afectam adversamente uns aos outros. Por exemplo, pode ser desejável proporcionar adicionalmente um agente citotóxico, agente quimioterapêutico, citocina ou agente imunossupressor (e. g., um que actua em células T, tal como ciclosporina ou um anticorpo que se liga a células T, e. g., um que se liga a LFA-1). A quantidade eficaz de outros tais agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, tipo de doença ou distúrbio ou tratamento e outros factores discutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração como aqui descrito ou desde cerca de 1 a 99% das dosagens até agora utilizadas.

Os ingredientes activos podem também ser confinados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacilato) , respectivamente, em sistemas de distribuição farmacológica coloidais (por exemplo, lipossomas, microsferas de albumina, microemulsões, nanoparticulas e nanocápsulas) ou macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Science, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).

Ppreparações de libertação sustida podem ser preparadas. Os exemplos adequados de preparações de libertação sustida incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o antagonista, cujas matrizes estão na forma de artigos com forma definida, e. g., películas ou microcápsulas. Os exemplos de matrizes de libertação sustida incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) ou poli(vinilálcool)), polilactidos (Pat. U.S. N° 3773919), copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de etilo, etileno-acetato de vinilo não degradável, copolímeros de ácido 81 láctico-ácido glicólico, tal como LUPRON DEPOT (microsferas injectáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico degradável.

As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é prontamente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis.

Tratamento de Doenças

Doenças

Os fármacos imunossupressores e os antagonistas de BLyS da invenção são úteis para tratar distúrbios auto-imunes regulados por células B. As doenças auto-imunes reguladas por células B incluem a artrite (artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, osteodistrofia, artrite psoriática), psoriase, dermatite incluindo dermatite atópica; urticária auto-imune crónica, polimiosite/dermatomiosite, necrólise epidérmica tóxica, escleroderma sistémica e esclerose, respostas associadas com doença inflamatória do intestino (IBD) (doença de Crohn, colite ulcerosa), sindrome de dificuldade respiratória, síndrome de dificuldade respiratória do adulto (ARDS), meningite, rinite alérgica, encefalite, uveite, colite, glomerulonefrite, estados alérgicos, eczema, asma, estados que envolvem infiltração de células T e respostas inflamatórias crónicas, ateroesclerose, miocardite auto-imune, deficiência de adesão de leucócito, lúpus eritematoso sistémico (SLE), lúpus (incluindo nefrite, não renal, discóide, alopecia), diabetes de início juvenil, esclerose múltipla, encefalomielite alérgica, respostas imunes associadas com hipersensibilidade aguda e retardada mediada por 82 citocinas e linfócitos T, tuberculose, sarcoidose, granulomatose incluindo granulomatose de Wegener, agranulocitose, vasculite (incluindo ANCA), anemia aplásica, anemia positiva de Coombs, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolítica imune incluindo anemia hemolítica auto-imune (AIHA), anemia perniciosa, aplasia pura dos glóbulos vermelhos (PRCA), deficiência do Factor VIII, hemofilia A, neutropenia auto-imune, pancitopenia, leucopenia, doenças que envolvem diapedese do leucócito, distúrbios inflamatórios do SNC, síndrome de lesão de órgãos múltiplos, miastenia Gravis, doenças mediadas por complexos antigénio-anticorpo, doença anti-membrana basal glomerular, síndrome do anticorpo anti-fosfolípido, neurite alérgica, doença de Bechet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome miasténica de Lambert-Eaton, síndrome de Reinaud, síndrome de Sjorgen, síndrome de Stevens-Johnson, rejeição de transplante de órgão sólido (incluindo pré-tratamento para títulos de anticorpo reactivo para painel elevado, depósito de IgA em tecidos, etc.), doença de hospedeiro contra enxerto (GVHD), penfigóide bolhosa, penfigus (todos incluindo vulgar, foliáceo) , poliendocrinopatias auto-imunes, doença de Reiter, síndrome do homem rígido, arterite da célula gigante, nefrite do complexo imune, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM ou neuropatia mediada por IgM, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia auto-imune, doença auto-imune dos testículos e ovários incluindo orquite do e ooforite auto-imune, hipotiroidismo primário; doenças endócrinas auto-imunes incluindo tiroidite auto-imune, tiroidite crónica (tiroidite de Hashimoto), tiroidite subaguda, hipotiroidismo idiopático, doença de Addison, doença de Grave, síndromes poliglandulares auto-imunes (ou síndromes de endocrinopatia poliglandular), diabetes de Tipo I também referida como diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM) e síndrome de Sheehan; hepatite auto-imune, pneumonite 83 intersticial linfóide (HIV), bronquiolite obliterante (não transplante) vs. NSIP, síndrome de Guillain-Barré, vasculite de vasos grandes (incluindo polimialgia reumática e arterite de célula gigante (de Takayasu)), vasculite de vasos médios (incluindo doença de Kawasaki e nodosa poliarterite), espondilite anquilosante, doença de Berger (nefropatia de IgA) , glomerulonefrite de progressão rápida, cirrose biliar primária, doença celíaca (enteropatia por glúten), crioglobulinemia, ALS, doença coronária arterial. 0 nível desejado de depleção de células B dependerá da doença. De um modo preferido, a depleção de células B é suficiente para prevenir a progressão da doença durante, pelo menos, 2 meses, de um modo mais preferido, 3 meses, de um modo ainda mais preferido, 4 meses, de um modo mais preferido, 5 meses, de um modo ainda mais preferido, 6 ou mais meses. Em formas de realização ainda mais preferidas, a depleção de células B é suficiente para aumentar o tempo de remissão em, pelo menos, 6 meses, de um modo mais preferido, 9 meses, de um modo mais preferido, um ano, de um modo mais preferido, 2 anos, de um modo mais preferido, 3 anos, de um modo ainda mais preferido, 5 ou mais anos. Numa forma de realização muito preferida, a depleção de células B é suficiente para curar a doença. Em formas de realização preferidas, a depleção de células B no doente auto-imune é, pelo menos transientemente, cerca de 75% e, de um modo mais preferido, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% e mesmo 100% do nível da linha de base antes de tratamento.

Para tratamento de uma doença auto-imune, pode ser desejável modular a extensão da depleção de células B dependendo da doença e/ou da gravidade do estado no doente individual, por ajuste da dosagem do fármaco imunossupressor ou do antagonista de BLyS. Assim, a depleção de células B pode, mas não tem que ser 84 completa. Ou, a depleção total de células B pode ser desejada no tratamento inicial mas em tratamentos subsequentes, a dosagem pode ser ajustada para atingir apenas depleção parcial. Numa forma de realização, a depleção de células B é, pelo menos, 20%, i. e., 80% ou menos de células B permanecem em comparação ao nivel da linha de base antes do tratamento. Em outras formas de realização, a depleção de células B é 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou maior.

De um modo preferido, a depleção de células B é suficiente para parar a progressão da doença, de um modo mais preferido, para aliviar os sinais e sintomas da doença particular sob tratamento, de um modo ainda mais preferido, curar a doença.

Para aplicações terapêuticas, as composições de fármaco imunossupressor e antagonista de BLyS da invenção podem ser utilizadas em terapia de combinação com fármacos adicionais, tal como fármacos anti-inflamatórios, incluindo DMARDS e outros produtos biológicos. Os métodos de tratamento anteriores podem ser administrados em conjunto com outras formas de terapia convencional para doenças auto-imunes, consecutivamente, ou antes ou depois de terapia convencional.

Um doente é aliviado ou tratado com sucesso de doenças auto-imunes reguladas por células B através dos métodos da presente invenção se houver melhoria mensurável nos sintomas, ou em outros critérios aplicáveis, após administração das composições da invenção comparativamente a antes do tratamento. O efeito de tratamento pode ser evidente dentro de 3-10 semanas após a administração das composições da invenção. Os critérios aplicáveis para cada doença serão bem conhecidos do médico especialista na técnica. Por exemplo, o médico pode monitorizar o doente tratado para prova clinica ou serológica de doença, 85 tais como marcadores serológicos de doença, contagem sanguínea completa incluindo contagem de células B e níveis séricos de imunoglobulina. Os níveis séricos de IgG e IgM são reduzidos em murganhos tratados com antagonistas de BLyS e/ou APRIL, tal como atacicept. Os doentes humanos gue respondem ao tratamento de actacicept mostram igualmente uma redução nos níveis séricos de IgG e IgM.

Os parâmetros para avaliar a eficácia ou sucesso do tratamento de uma doença auto-imune ou relacionada com auto-imunidade serão conhecidos do médico especialista na doença apropriada. Geralmente, o médico especialista procurará a redução dos sinais e sintomas da doença específica. Os seguinte é apresentado a título exemplificativo. A artrite reumatóide (RA) é um distúrbio auto-imune de etiologia desconhecida. A maioria dos doentes de RA sofre um curso crónico da doença que, mesmo com terapia, possa resultar em destruição da articulação progressiva, deformação, incapacidade e mesmo morte prematura. Os objectivos da terapia da RA são prevenir ou controlar a lesão da articulação, prevenir a perda de função e diminuição da dor. A terapia inicial da RA envolve geralmente a administração de um ou de mais dos seguintes fármacos: fármacos anti-inflamatórios não esteróides (NSAID), glucocorticóides (através de injecção na articulação) e baixa dose de prednisona. Ver "Directrizes para a gestão da artrite reumatóide", Arthritis & Rhemmatism 46 (2): 328-346 (Fevereiro, 2002) . A maioria dos doentes com RA recentemente diagnosticada é iniciada com terapia com fármaco anti-reumático modificador de doença (DMARD) dentro de 3 meses do diagnóstico.

Os DMARD geralmente utilizados na RA são hidroxicloroquina, sulfasalazina, metotrexato, leflunomida, etanercept, infliximab 86 (mais metrotrexato oral e subcutâneo), azatioprina, D-penicilamina, ouro (oral), ouro (intramuscular), minociclina, ciclosporina, imunoadsorção de proteína A estafilocócica.

Uma vez que o corpo produz factor alfa de necrose tumoral (TNFa) durante a RA, os inibidores de TNFa têm sido utilizados para a terapia dessa doença. Etanercept (ENBREL) é um fármaco injectável aprovado nos EUA para terapia de RA activa. 0 etanercept liga-se ao TNFa e serve para remover a maioria do TNFa das articulações e sangue, prevenindo assim que o TNFa promova inflamação e outros sintomas da artrite reumatóide. 0 etanercept é uma proteína de fusão "proteína de fusão-Fc" que consiste na porção extracelular de ligação a ligando do receptor do factor de necrose tumoral (TNFR) humano de 75 kD (p75) ligado à porção Fc de uma IgGl humana. 0 infliximab, vendido sob a marca registada REMICADE, é um fármaco supressor imune prescrito para tratar a RA e a doença de Crohn. 0 infliximab é um anticorpo monoclonal quimérico que se liga a TNF e reduz a inflamação no corpo por se direccionar e ligar a TNFa que produz a inflamação. 0 adalimumab (HUMIRA™, Abbott Laboratories) , previamente conhecido como D2E7, é um anticorpo monoclonal humano que se liga a TNFa e é aprovado para reduzir os sinais e sintomas e inibir a progressão da lesão estrutural em adultos com RA moderadamente até gravemente activa que tiveram resposta insuficiente a um ou mais DMARD modificadores de doença tradicionais. 0 tratamento da artrite reumatóide por administração de fármacos imunossupressores e um antagonista de BLyS pode ser 87 realizado em conjunto com terapia com um ou mais dos fármacos mencionado acimas para RA. Para a artrite reumatóide, por exemplo, as medidas de progresso no tratamento podem incluir o número de articulações inchadas e doridas e a duração da rigidez matinal. Os doentes podem ser examinados quanto às articulações das mãos e pés foi erodido utilizando raios X e um sistema de classificação conhecido como indice de Sharp. Um outro sistema de classificação é baseado nos critérios da American College of Rheumatology para avaliar a resposta às terapias.

Um método de avaliação da eficácia do tratamento na RA é baseado nos critérios da American College of Rheumatology (ACR), os quais medem a percentagem de em articulações doridas e inchadas, entre outras coisas. 0 doente de RA pode ser classificado em, por exemplo, ACR 20 (20 porcento de melhoria) comparativamente com tratamento sem anticorpo (e. g., linha de base antes do tratamento) ou tratamento com placebo. Outros modos de avaliar a eficácia do tratamento com anticorpos incluem a classificação de raios X, tal como o indice de Sharp de raios X utilizado para classificar lesão estrutural, tais como erosão óssea e estreitamento do espaço articular. Os doentes podem também ser avaliados para a prevenção ou melhoria de incapacidade numa classificação com base o Questionário de Avaliação de Saúde baseada na contagem do questionário da avaliação da saúde [HAQ], indice AIMS, SF-36 em períodos de tempo durante ou após o tratamento. Os critérios de ACR 20 podem incluir uma melhoria de 20% na contagem da articulação dorida (dolorosa) e na contagem da articulação inchada, mais uma melhoria de 20% em, pelo menos, 3 das 5 medidas adicionais: 1. avaliação da dor do doente por escala análoga visual (VAS), 2. avaliação global do doente da actividade da doença (VAS), 3. avaliação global do médico da actividade da doença (VAS), 88 4. incapacidade auto-avaliada pelo doente medida pelo Questionário de Avaliação de Saúde e 5. reagentes de fase aguda, CRP ou ESR.

Os ACR 50 e 70 são definidos analogamente. De um modo preferido, é administrado ao doente uma quantidade de um anticorpo de ligação a BLYS da invenção eficaz em atingir, pelo menos, uma contagem de ACR 20, de um modo preferido, pelo menos, ACR 30, de um modo mais preferido, pelo menos, ACR50, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, ACR70, de um modo muito preferido, pelo menos, ACR 75 e superior. A artrite psoriática tem caracteristicas radiográficas únicas e distintas. Para a artrite psoriática, a erosão da articulação e o estreitamento do espaço articular também podem ser avaliados pelo indice de Sharp. Os anticorpos humanizados de ligação a BLYS aqui divulgados podem ser utilizados para prevenir à lesão de articulação, assim como para reduzir os sinais da doença e os sintomas do distúrbio.

Ainda outro aspecto da invenção refere-se ao tratamento de Lúpus ou SLE num doente que sofre de SLE, utilizando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de BLyS e/ou APRIL (como definido nas reivindicações) em combinação com o fármaco imunossupressor MMF. A contagem de SLEDAI proporciona uma quantificação numérica da actividade da doença. 0 SLEDAI é um indice ponderado de 24 parâmetros clinicos e laboratoriais conhecidos por se correlacionarem com a actividade da doença, com uma gama numérica de 0-103. Ver Brian Gescuk & John Davis, "Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus" em Current Opinion in Rheumatology 2002,14: 515-521. Pensa-se que anticorpos para ADN de dupla cadeia provoquem exacerbação renal e outras manifestações de lúpus. Os doentes que se submetem a 89 tratamento de anticorpo podem ser monitorizados para o tempo até exacerbação renal, o qual é definido como um aumento significativo, reprodutível, na creatinina sérica, proteína na urina ou sangue na urina. Alternativamente ou além disso, os doentes podem ser monitorizados para níveis de anticorpos antinucleares e anticorpos de ADN de dupla cadeia. Os tratamentos para SLE incluem elevada dose de corticosteróides e/ou ciclofosfamida (HDCC). Para o lúpus eritematoso sistémico, os doentes podem ser monitorizados para níveis de anticorpos antinucleares e anticorpos de ADN de dupla cadeia.

Um aspecto particular da presente invenção é o tratamento de nefrite lúpica com uma combinação do fármaco imunossupressor MMF e um antagonista de BLyS, tal como atacicept, como definido nas reivindicações.

As espondiloartropatias são um grupo de distúrbios das articulações, incluindo a espondilite anquilosante, artrite psoriática e doença de Crohn. 0 sucesso do tratamento pode ser determinado através ferramentas de medição validadas de avaliação global do médico e doente.

Uma doença auto-imune adicional que pode ser tratada utilizando a presente invenção é a psoríase. São presentemente utilizadas várias medicações para tratar a psoríase; o tratamento difere directamente com relação à gravidade da doença. Os doentes com uma forma mais suave de psoríase utilizam tipicamente tratamentos tópicos, tais como esteróides tópicos, antralina, calcipotrieno, clobetasol e tazaroteno, para controlar a doença, enquanto os doentes com psoríase moderada e grave utilizam mais provavelmente terapias sistémicas (metotrexato, retinóides, ciclosporina, PLTVA e UVB). São também utilizados alcatrões. Estas terapias têm uma combinação de 90 cuidados de segurança, regimes temporais de consumo ou processos inconvenientes de tratamento. Além disso, alguns requerem equipamento caro e espaço dedicado no consultório clínico. As medicações sistémicas podem produzir efeitos secundários sérios, incluindo hipertensão, hiperlipidemia, supressão da medula óssea, doença hepática, doença renal e transtornos gastrointestinais. Além disso, a utilização de fototerapia pode aumentar a incidência de cancros da pele. Além da inconveniência e desconforto associado com a utilização de terapias tópicas, os tratamentos de fototerapia e sistémicos requerem doentes cíclicos, presença e ausência de terapia e monitorização da exposição ao longo da vida, devido aos seus efeitos secundários. A eficácia do tratamento para a psoríase é avaliada através da monitorização das alterações nos sinais e sintomas clínicos da doença, incluindo alterações na Avaliação Global do Médico (PGA) e contagens do índice da Área e Gravidade da Psoríase (PASI), Avaliação dos Sintomas de Psoríase (PSA), comparativamente com o estado de linha de base. 0 doente pode ser medido periodicamente ao longo do tratamento na escala análoga visual, utilizada para indicar o grau de prurido sentido em pontos temporais específicos. Várias outras doenças inflamatórias tendo causa auto-imune estão também dentro do âmbito da presente invenção. Entre as doenças especificamente contempladas estão a hepatite auto-imune e a tiroidite auto-imune. A hepatite auto-imune envolve inflamação do fígado devido ao auto-ataque pelo próprio sistema imune do doente. De modo semelhante, o auto ataque e a inflamação resultante da tiróide é a causa biológica da tiroidite auto-imune. É esperado que doenças como estas sejam aliviadas utilizando a combinação de antagonista de BLyS e/ou APRIL com um fármaco imunossupressor como MMF. 91

Dosagem

Dependendo da indicação a ser tratada e de factores relevantes para a dosagem que um médico especialista no campo técnico estaria familiar, os antagonistas de BLyS e MMF serão administrados numa dosagem que seja eficaz para tratamento dessa indicação, ao mesmo tempo que minimizam a toxicidade e os feitos secundários. Geralmente, o antagonista de BLyS da presente invenção será administrado a um doente humano a uma gama de dosagem de cerca de 0,25 mg/kg a cerca de 25 mg/kg de peso corporal, de um modo preferido, em cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Expressa de forma alternativa, uma gama preferida de dosagens para o antagonista de BLyS é cerca de 75 a cerca de 190 mg por dose. Numa forma de realização preferida, a dosagem é cerca de 150 mg por dose para o antagonista de BLyS. A descrição descreve uma combinação de administração simultânea e sequencial de fármacos imunossupressores e do antagonista de BLyS (ambas aqui referidas como as unidades de tratamento). Na administração sequencial, as unidades de tratamento são administradas em qualquer ordem, i. e., fármacos imunossupressores primeiro, seguidos pelo antagonista de BLyS. O doente pode ser tratado com um fármaco e monitorizado para a eficácia antes do tratamento com esse fármaco. Por exemplo, se o fármaco imunossupressor produzir uma resposta parcial, o tratamento pode ser seguido com o antagonista de BLyS para atingir uma resposta total e vice-versa. Alternativamente, podem ser inicialmente administrados ao doente ambos os fármacos e a dosagem subsequente pode ser apenas com um ou o outro fármaco.

Para condicionar o doente a tolerar os fármacos e/ou reduzir a ocorrência de efeitos adversos, tal como sintomas relacionados com infusão que surgem das administrações iniciais e 92 subsequentes do composto terapêutico, pode ser administrada ao mamífero com a sua necessidade uma primeira ou inicial dose condicionante para um ou ambos os fármacos e depois administrada, pelo menos, uma segunda dose terapeuticamente eficaz de um ou ambos os fármacos, em que a segunda e todas as doses subsequentes são superiores à primeira dose. A primeira dose serve para condicionar o mamífero a tolerar a segunda dose terapêutica mais elevada. Deste modo, o mamífero é capaz de tolerar doses mais elevadas do composto terapêutico do que poderia ser administrado inicialmente. Uma "dose condicionante" é uma dose que atenua ou reduz a frequência ou gravidade dos efeitos secundários adversos da primeira dose associada com a administração de um composto terapêutico. A dose condicionante pode ser uma dose terapêutica, uma dose sub-terapêutica, uma dose sintomática ou uma dose sub-sintomática. Uma dose terapêutica é uma dose que apresenta um efeito terapêutico no doente e uma dose sub-terapêutica é uma dose que não apresenta um efeito terapêutico no doente tratado. Uma dose sintomática é uma dose que induz, pelo menos, um efeito adverso por administração e uma dose sub-sintomática é uma dose que não induz um efeito adverso. Alguns efeitos adversos são febre, dores de cabeça, náuseas, vómitos, dificuldades respiratórias, mialgia e arrepios.

Além de um regime de dose condicionante, existe uma variedade de outros regimes que podem ser seguidos para conseguir um alívio da doença. Uma tal abordagem é um período de tratamento curto com um fármaco imunossupressor, seguido por diminuição, seguido por tratamento com a combinação de um outro fármaco imunossupressor e o antagonista de BLyS. Por exemplo, os corticosteróides (não no âmbito das reivindicações) podem ser administrados oralmente a 1000-1500 mg, duas vezes por dia durante quatro semanas, seguido por diminuição de 5 mg/semana a 93 10 mg/dia durante 10 semanas. Assim que for o momento de começar o antagonista de BLyS, pode ser apropriado um regime de dose de carga. Em particular, pode ser administrado atacicept duas vezes por semana durante quatro semanas, seguido por administração semanal durante um período prolongado de tempo, tal como 48 semanas. Pelo contrário, o fármaco imunossupressor tenderá a ser administrado num regime crescente de dose. Por exemplo, o MMF pode ser administrado numa dose de 500 mg duas vezes por dia e aumentado até 750 mg duas vezes por dia, após duas semanas. Os avanços semanais da dosagem podem ser realizados até uma dose máxima de 1000 mg, 3 vezes ao dia, se a contagem de glóbulos brancos sanguíneos do doente permanecer em níveis aceitáveis (i. e., acima de 3,0 X 109/L ou 3000/mm2) . Em particular, seria esperado que a gama máxima de administração de MMF seria desde 2000 a 3000 mg por doente por dia.

Via de administração O antagonista de BLyS e o MMF podem ser para administração a um doente humano de acordo com métodos conhecidos, tais como por administração intravenosa, e. g., como um bolus ou por infusão contínua durante um período de tempo, por vias subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intra-cerobrospinal, intra-articular, intra-sinovial, intratecal ou inalação. Os fármacos imunossupressores com formulação apropriada podem também ser administrados oralmente ou topicamente. O antagonista de BLyS e o MMF serão geralmente para administração por via intravenosa ou subcutânea. As diferentes unidades de tratamento podem ser administradas pelas mesmas ou diferentes vias. 94

Artigos de Manufactura e Kits A descrição descreve um artigo de manufactura compreendendo um antagonista de BLyS e fármacos imunossupressores para tratar um distúrbio auto-imune regulado por células B, como acima divulgado. 0 artigo de manufactura pode conter actacicept e MMF para tratamento de nefrite lúpica. 0 artigo de manufactura compreende, pelo menos, um recipiente e um rótulo ou folheto informativo sobre o recipiente ou associado ao mesmo. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, frascos, frasquinhos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico. 0 recipiente contém uma composição da invenção que é eficaz para tratar o estado e pode ter uma entrada de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco para solução intravenosa ou um frasquinho tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica). A rótulo ou o folheto informativo indicam que a composição é utilizada para tratar o estado particular, e. g., nefrite lúpica ou artrite reumatóide. 0 rótulo ou folheto informativo irá ainda compreender instruções para administrar a composição ao doente. Adicionalmente, o artigo de manufactura pode ainda compreender um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tais como água bacteriostática para injecção (BWFI), soro fisiológico tamponado com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e de utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas. 95 São também proporcionados kits que são úteis para vários fins, e. g., para ensaios de morte por células B. Como com o artigo de manufactura, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou folheto informativo sobre o recipiente ou associado ao mesmo. 0 recipiente contém uma composição compreendendo, pelo menos, um fármaco imunossupressor e um antagonista de BLyS da invenção. Podem ser incluídos recipientes adicionais que contêm, e. g., diluentes e tampões, anticorpos de controlo. 0 rótulo ou folheto informativo pode proporcionar uma descrição da composição, assim como instruções para a utilização in vitro ou diagnóstica pretendida.

Exemplos Experimentais

Exemplo 1

Produção de antagonista de BLyS e/ou APRIL

Foram produzidas quatro versões truncadas no amino terminal de TACI-Fc. Todos as quatro tinham uma sequência de sinal modificada do activador de plasminogénio tecidular humano, como divulgada no documento WO 02/094852 (SEQ ID N°: 41), fundida ao resíduo de aminoácido número 30 da SEQ ID N°: 2. Contudo, as quatro proteínas diferiam na posição do ponto em que Fc5 era fundido à sequência de aminoácidos de TACI da SEQ ID N°: 2. A Tabela 1 apresenta as estruturas das quatro proteínas de fusão. 96

Tabela 1

Proteínas de Fusão Fc de TACI

Designação de TACI-Fc Resíduos de aminoácidos de TACI TACI(dl-29)-Fc5 30 a 154 da SEQ ID N°: 2 TACI(dl-29, dl07-154)-Fc5 30 a 106 da SEQ ID N°: 2 TACI(dl-29, dlll-154)-Fc5 30 a 110 da SEQ ID N°: 2 TACI(dl-29, dl20-154)-Fc5 30 a 119 da SEQ ID N°: 2

As cassetes de expressão que codificam proteína foram produzidas por PCR de sobreposição utilizando técnicas convencionais (ver, por exemplo, Horton et al., Gene 77:61 (1989)) . Uma molécula de ácido nucleico que codifica TACI e uma molécula de ácido nucleico que codifica Fc5 foram utilizados como moldes de PCR. Os iniciadores oligonucleotidicos são identificados nas Tabelas 2 e 3.

Tabela 2

Iniciadores oligonucleotidicos utilizados para produzir proteínas de fusão de TACI

Designação de TACI-Fc Designações dos Oligonucleótidos 5' TACI 3' TACI 5' FC5 3 ' FC5 TACI(dl-29)-Fc5 ZC24,903 ZC2 4, 955 ZC24,952 ZC2 4, 946 TACI(dl-29, dl07-154)-Fc5 ZC24,903 ZC2 4, 951 ZC2 4, 949 ZC2 4, 946 TACI(dl-29, dlll-154)-Fc5 ZC24,903 ZC2 8, 978 ZC2 8, 979 ZC2 4, 946 TACI(dl-29, dl20-154)-Fc5 ZC24,903 ZC2 8, 981 ZC2 8, 980 ZC2 4, 946 97

Tabela 3

Sequência dos oligonucleótidos INICIADOR Sequência Nucleotídica SEQ ID N° C24,903 5' TATTAGGCCGGCCACCATGGATGCAATGA 3' 27 ZC2 4, 955 5' TGAAGATTTGGGCTCCTTGAGACCTGGGA 3' 28 ZC2 4, 952 5' TCCCAGGTCTCAAGGAGCCCAAATCTTCA 3' 29 ZC2 4, 946 5' TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' 30 ZC2 4, 951 5’ TGAAGATTTGGGCTCGTTCTCACAGAAGTA 3’ 31 ZC24,949 5’ ATACTTCTGTGAGAACGAGCCCAAATCTTCA 3’ 32 ZC2 8, 978 5' TTTGGGCTCGCTCCTGAGCTTGTTCTCACA 3' 33 ZC2 8, 979 5' CTCAGGAGCGAGCCCAAATCTTCAGACA 3' 34 ZC2 8, 981 5' TTTGGGCTCCCTGAGCTCTGGTGGAA 3' 35 ZC28,980 5' GAGCTCAGGGAGCCCAAATCTTCAGACA 3' 36 A primeira ronda de amplificações de PCR consistiu de duas reacções para cada uma das quatro versões de amino terminal truncado. As duas reacções foram realizadas separadamente utilizando os oligonucleótidos de TACI 5' e 3' em uma reacção, e os oligonucleótidos de Fc5 5' e 3' numa outra reacção para cada versão. As condições para a primeira ronda de amplificação por PCR foram como se segue. A um volume final de 25 pL foi adicionado, aproximadamente, 200 ng de ADN molde, 2,5 pL de Tampão de reacção lOx Pfu (Stratagene) , 2 pL de dNTPs a 2,5 mM, 0,5 pL de 20 pM de cada oligonucleótido 5' e oligonucleótido 3' e 0,5 pL de Pfu polimerase (2,5 unidades, Stratagene). O perfil térmico de amplificação consistiu de 94 °C durante 3 minutos, 35 ciclos a 94 °C durante 15 segundos, 50 °C durante 15 segundos, 72 °C durante 2 minutos, seguido por uma extensão de 2 min a 72 °C. Os produtos de reacção foram fraccionados por electroforese em gel de agarose e as bandas que correspondem aos tamanhos previstos foram excisadas do gel e recuperadas 98 utilizando um Kit de Extracção de Gel QIAGEN QIAQUICK (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. A segunda ronda de amplificação por PCR, ou reacção de amplificação por PCR de sobreposição, foi realizada utilizando os fragmentos purificados do gel da primeira ronda de PCR como o molde de ADN. As condições da segunda ronda de amplificação de PCR foram como se segue. A um volume final de 25 pL foi adicionado, aproximadamente, 10 ng de ADN molde de cada dos fragmentos de TACI e fragmentos de Fc5, 2,5 pL de Tampão de reacção lOx Pfu (Stratagene) , 2 pL de dNTP a 2,5 mM, 0,5 pL de 20 pM cada ZC24,903 (SEQ ID N°: 27) e ZC24,946 (SEQ ID N°: 30) e 0,5 pL de Pfu polimerase (2,5 unidades, Stratagene) . O perfil térmico de amplificação consistiu de 94 °C durante 1 minuto, 35 ciclos a 94 °C durante 15 segundos, 55 °C durante 15 segundos, 72 °C durante 2 minutos, seguido por uma extensão de 2 min a 72 °C. Os produtos de reacção foram fraccionados por electroforese em gel de agarose e as bandas que correspondem aos tamanhos previstos foram excisadas do gel e recuperadas utilizando um Kit de Extracção de Gel QIAGEN QIAQUICK (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante.

Cada uma das quatro versões dos produtos de PCR TACI-Fc truncados no amino terminal foi clonada separadamente utilizando clonados o Kit de Clonagem ZEROBLUNT TOPO PCR da Invitrogen, seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. A Tabela 4 identifica as sequências nucleotidicas e de aminoácidos destas construções TACI-Fc. 99

Tabela 4

Sequência das Variantes de TACI-Fc

Designação de TACI-Fc SEQ I Nucleótido D N° Aminoácido TACI(dl-29)-Fc5 18 19 TACI(dl — 2 9, dl07-154)-Fc5 20 21 TACI(dl-29, dlll-154)-Fc5 22 23 TACI(dl-29, dl20-154)-Fc5 24 25

Depois das sequências nucleotidicas terem sido verificadas, os plasmideos compreendendo cada uma das quatro versões das fusões TACI-Fc truncadas no amino terminal foram digeridos com Fsel e Asei para libertar os segmentos que codificam os aminoácidos. Os fragmentos Fsel-AscI foram ligados num vector de expressão de mamífero contendo um promotor CMV e um segmento poli A de SV40. Os vectores de expressão foram introduzidos em células de ovário de hamster Chinês como descrito abaixo.

Exemplo 2

Produção de Proteínas TACI-Fc por Células de Ovário de Hamster Chinês

As construções de expressão de TACI-Fc foram utilizadas para transfectar, por electroporação, células DG44 de ovário de hamster Chinês (CHO) adaptadas a suspensão, cultivadas em meio sem proteína animal (Urlaub et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555 (1986)). As células CHO DG44 carecem de um gene funcional da di-hidrofolato redutase devido a deleções em ambas as posições cromossomais da di-hidrofolato redutase. 0 crescimento 100 das células na presença de concentrações aumentadas de metotrexato resulta na amplificação do gene da di-hidrofolato redutase e do gene codificado da proteína recombinante ligado na construção de expressão.

As células CHO DG44 foram passadas em meio PFCHO (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 4 mM de L-Glutamina (JRH Biosciences), e suplemento de hipotanxina-timidina lx (Life Technologies) e as células foram incubadas a 37 °C e 5% de CO2 em frascos de agitação Corning a 120 rpm numa plataforma de agitação rotativa. As células foram transfectadas separadamente com plasmídeos de expressão linearizados. Para assegurar a esterilidade, um único passo de precipitação com etanol foi realizada em gelo durante 25 minutos por combinação de 200 pg de ADN plasmídico num tubo Eppendorf com 20 pL de ADN veículo de esperma de salmão sonicado (5' ->· 3' Inc. Boulder, CO, 10 mg/mL) , 22 pL de NaOAc 3 M (pH 5,2) e 484 pL de etanol 100% (Gold Shield Chemical Co., Hayward, CA) . Após incubação, o tubo foi centrifugado a 14000 rpm numa microcentrifugadora colocada numa câmara fria a 4 °C, o sobrenadante removido e o precipitado lavado duas vezes com 0,5 mL de etanol 70% e deixado a secar ao.

As células CHO DG44 foram preparadas, enquanto o precipitado de ADN estava a secar, por centrifugação de 106 células totais (16,5 mL) num tubo cónico de centrifugada de 25 mL a 900 rpm durante 5 minutos. As células CHO DG44 foram ressuspensas num volume total de 300 pL de meio de cultura PFCHO e colocadas numa cuvette do Gene-Pulser com um espaço entre eléctrodos de 0,4 cm (Bio-Rad). O ADN, após aproximadamente 50 minutos de tempo de secagem, foi ressuspenso em 500 pL de meio de cultura PFCHO e adicionado às células na cuvette, de modo que o volume total não excedeu 800 pL e foi deixado a repousar à temperatura ambiente durante 5 minutos para diminuir a formação de bolhas. A cuvette 101 foi colocada numa unidade BioRad Gene Pulser II regulada a 0,296 kV (quilovolts) e 0,950 HC (elevada capacitância) e imediatamente submetida a electroporação.

As células foram incubadas 5 minutos à temperatura ambiente antes da colocação em 20 mL de volume total de meio PFCHO num frasco T-75 CoStar. O balão foi colocado a 37 °C e 5% de CO2 durante 48 horas, quando as células foram então contadas num hemocitómetro utilizando exclusão de azul tripano e colocadas em meio de selecção PFCHO sem suplemento de hipotanxina-timidina e contendo 200 mM de metotrexato (CalBiochem).

Após recuperação do processo de selecção de metotrexato, o meio condicionado contendo as proteínas TACI-Fc excretadas foi examinado por análise de Transferência de Western.

Exemplo 3

Combinação de atacicept e MMF em murganhos A co-administração de atacicept e MMF (CellCept) foi testada num estudo de 28 dias em murganhos CD-I. Cento e cinquenta animais foram distribuídos entre quatro grupos de tratamento. O grupo 1 recebeu artigos de controlo de veículo utilizados para atacicept e MMF utilizando as mesmas vias e regime utilizados para cada artigo de teste. O grupo 2 recebeu MMF (351 mg/kg) através de sonda esofágica oral diária. O grupo 3 recebeu atacicept (20 mg/kg) três vezes por semana através de injecção subcutânea. O grupo 4 recebeu atacicept (20 mg/kg, 3x/semana, SC) e MMF (351 mg/kg, diariamente, oral), administrados tipicamente dentro do intervalo de 30 minutos entre si. A dose administrada de MMF foi escolhida como a dose máxima praticável 102 em murganhos e mimetizando a dose equivalente humana para um humano de 70 kg de 29 mg/kg, utilizada para doentes de transplante hepático (aproximadamente 2 g/dia), utilizando a área de superfície corporal para fazer a correspondência de escala entre a dose humana e de murganhos.

Os animais foram sacrificados na linha de base (Dia -1) e nos Dias 14, 28 (último dia de tratamento), 42, 56 e 112. Os murganhos foram verificados diariamente quanto a mortalidade, anomalias e sinais de dor ou aflição. Os pesos corporais foram medidos e registados no Dia -1 do estudo e posteriormente semanalmente, e antes do sacrifício. O sangue foi recolhido dos animais sacrificados para análises químicas séricas e hematológicas detalhadas, análises de citometria do fluxo dos subtipos de linfócitos e concentrações séricas totais de IgG, IgM e IgA. As IgG, IgM e IgA séricas totais foram medidas utilizando. Necropsias detalhadas foram conduzidas em animais sacrificados para avaliação de alterações do peso dos órgãos, patologias gerais e histopatologia.

Os níveis totais de IgG foram avaliados utilizando um kit de quantificação de ELISA de IgG de murganho (catálogo N° E90-131, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX), combinado com ELISA Starter Accessory Package (catálogo N° E101, Bethyl

Laboratories, Montgomery, TX) . Toda a manipulação de líquidos foi realizada utilizando o sistema integrado de manipulação de líquidos Freedom Evo 150 e Columbus Washer (TECAN, Dinamarca). Os poços de microtitulação foram revestidos com IgG de cabra anti-murganho, purificada por afinidade, e incubados à temperatura ambiente durante 1 hora. Os poços foram aspirados, lavados com solução de lavagem e depois bloqueados com solução de bloqueamento durante 30 minutos. A solução de bloqueamento foi removida, as placas lavadas e as amostras/padrões 103 adicionadas em duplicados. Após 1 hora, as amostras/padrões foram aspirados e os poços lavados com solução de lavagem. Foi adicionada IgG de cabra anti-murganho conjugada com peroxidase de rábano e os poços foram incubados à temperatura ambiente durante 1 hora. 0 anticorpo conjugado não ligado foi removido por lavagem e a quantidade de conjugado remanescente no poço foi medida por incubação com substrato TMB (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) durante 10 minutos. A reacção colorida foi parada com adição do H2SO4 2 M e a absorvência resultante (OD-450) foi medida num leitor de microplacas Spectramax 190.

Os cálculos dos dados para a IgG total foram realizados como se segue: o valor médio de OD-450 do padrão zero (branco de placa) foi subtraído de cada amostra e padrão, e foi calculada a média das leituras duplicadas. Foi criada uma curva padrão por representação gráfica da OD média para cada padrão vs. concentração, utilizando um ajuste logístico de curva de quatro parâmetros. As concentrações da amostra foram obtidas por interpolação a partir da curva padrão. A concentração média da amostra foi multiplicada pelo factor e diluição. Os dados analisados utilizando software SoftMax®Pro incluía valores de OD, curva(s) padrão, desvio padrão e %CV entre replicados, e o valor interpolado da(s) amostra(s) desconhecida(s).

Os níveis totais de IgM foram avaliados utilizando um kit de quantificação de ELISA de IgM de murganho (catálogo N° E90-101, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX), combinado com ELISA Starter Accessory Package (catálogo N° E101, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) . Toda a manipulação de líquidos foi realizada utilizando o sistema integrado de manipulação de líquidos Freedom Evo 150 e Columbus Washer (TECAN, Dinamarca). Os poços de microtitulação foram revestidos com IgM de cabra anti-murganho, purificada por afinidade, e incubados à 104 temperatura ambiente durante 1 hora. Os poços foram aspirados, lavados com solução de lavagem e depois bloqueados com solução de bloqueamento durante 30 minutos. A solução de bloqueamento foi removida, as placas lavadas e as amostras/padrões adicionadas em duplicados. Após 1 hora, as amostras/padrões foram aspirados e os poços lavados com solução de lavagem. Foi adicionada IgM de cabra anti-murganho conjugada com peroxidase de rábano e os poços foram incubados à temperatura ambiente durante 1 hora. O anticorpo conjugado não ligado foi removido por lavagem e a quantidade de conjugado remanescente no poço foi medida por incubação com substrato TMB (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) durante 10 minutos. A reacção colorida foi parada com adição do H2S04 2 M e a absorvência resultante (OD-450) foi medida num leitor de microplacas Spectramax 190.

Os cálculos dos dados para a IgM total foram realizados como se segue: o valor médio de OD-450 do padrão zero (branco de placa) foi subtraído de cada amostra e padrão, e foi calculada a média das leituras duplicadas. Foi criada uma curva padrão por representação gráfica da OD média para cada padrão vs. concentração, utilizando um ajuste logístico de curva de quatro parâmetros. As concentrações da amostra foram obtidas por interpolação a partir da curva padrão. A concentração média da amostra foi multiplicada pelo factor e diluição. Os dados analisados utilizando software SoftMax®Pro incluía valores de OD, curva(s) padrão, desvio padrão e %CV entre replicados, e o valor interpolado da(s) amostra(s) desconhecida(s).

Os níveis totais de IgA foram avaliados utilizando um kit de quantificação de ELISA de IgA de murganho (catálogo N° E90-103, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) , combinado com ELISA Starter Accessory Package (catálogo N° E101, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) . Toda a manipulação de líquidos 105 foi realizada utilizando o sistema integrado de manipulação de líquidos Freedom Evo 150 e Columbus Washer (TECAN, Dinamarca). Os poços de microtitulação foram revestidos com IgA de cabra anti-murganho, purificada por afinidade, e incubados à temperatura ambiente durante 1 hora. Os poços foram aspirados, lavados com solução de lavagem e depois bloqueados com solução de bloqueamento durante 30 minutos. A solução de bloqueamento foi removida, as placas lavadas e as amostras/padrões adicionadas em duplicados. Após 1 hora, as amostras/padrões foram aspirados e os poços lavados com solução de lavagem. Foi adicionada IgA de cabra anti-murganho conjugada com peroxidase de rábano e os poços foram incubados à temperatura ambiente durante 1 hora. O anticorpo conjugado não ligado foi removido por lavagem e a quantidade de conjugado remanescente no poço foi medida por incubação com substrato TMB (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) durante 10 minutos. A reacção colorida foi parada com adição do H2S04 2 M e a absorvência resultante (OD-450) foi medida num leitor de microplacas Spectramax 190.

Os cálculos dos dados para a IgA total foram realizados como se segue: o valor médio de OD-450 do padrão zero (branco de placa) foi subtraído de cada amostra e padrão, e foi calculada a média das leituras duplicadas. Foi criada uma curva padrão por representação gráfica da OD média para cada padrão vs. concentração, utilizando um ajuste logístico de curva de quatro parâmetros. As concentrações da amostra foram obtidas por interpolação a partir da curva padrão. A concentração média da amostra foi multiplicada pelo factor e diluição. Os dados analisados utilizando software SoftMax®Pro incluía valores de OD, curva(s) padrão, desvio padrão e %CV entre replicados, e o valor interpolado da(s) amostra(s) desconhecida(s). 106

Os resultados médios da variação nas medidas de imunoglobulina são registados na Tabela 5 abaixo e graficamente nas Figuras 1, 2, e 3.

Tabela 5

Resultados das médias numéricas de IgG, IgM e IgA no Dia 28 e Diferença face ao Veiculo (pg/mL)

Veiculo (V) MMF Actacicept (A) Actacicept + MMF (A+M) IgG 179 185 75 31 IgM 238 317 76 19 IgA 498 506 105 33

Como se pode observar dos cálculos, a combinação tem um efeito sinérgico na redução da imunoglobulina para todos os três tipos (i. e., a variação média do veículo com a combinação (Δ3) é mais do que a adição da variação média do veículo para MMF isoladamente (Δ1) com a variação média do veículo para Atacicept isoladamente (Δ2) (ou, matematicamente, Δ3 > Δ1+Δ2)).

Conclusão

As experiências aqui apresentadas demonstram resultados surpreendentes uma vez que a combinação de fármacos imunossupressores e antagonistas de BLyS e/ou APRIL, tais como MMF e atacicept, resultou numa depleção sinérgica dos níveis de Ig comparativamente ao nível de redução com fármacos imunossupressores e antagonistas de BLyS e/ou APRIL isoladamente. 107

Exemplo 4

Repetição e extensão de experiência de combinação com Atacicept e MMF

Utilizando processos semelhantes àqueles descritos no Exemplo 3 e doseando até ao dia 91, os resultados do Exemplo 3 foram replicados e estendidos no tempo até aos dias 35, 91, 126 e 182. Os resultados desta experiência confirmaram o efeito sinérgico de Atacicept e MMF nos niveis médios de imunoglobulina para, pelo menos, um dos três tipos de imunoglobulina em cada ponto do tempo. Os resultados sinérgicos são resumidos nas Tabelas 6 abaixo.

Tabela 6

Resultados Sinérgicos dos Resultados da Média Numérica de IgG, IgM e IgA para a Experiência de Extensão e Diferença face ao

Veiculo (pg/mL)

Amostra Dia Tipo de imunoglobulina Veiculo (V) MMF Actacicept (A) Actacicept + MMF (A+M) 35 IgG 519, 7 940,13 261,35 148,59 ' 35 IgM 105, 7 141,34 5,54 5, 11 91 IgG 697,01 1192,87 191,84 128,22 91 IgA 924,36 1764,55 37,53 0 126 IgA 1113,48 1467,05 817,22 778,05 182 IgM 73,95 53, 77 73, 75 47, 63 108

Amostra Dia Tipo de Imunoglobulina Δ1 (V-MMF) Δ2 (V-A) Δ1 + Δ2 Δ3 (V-(A+M)) Δ3 Comparado a Δ1+Δ2 35 IgG -420,43 258,35 -162,08 371,11 371,11 > -162,08 35 IgM -35,64 100,16 64, 52 100,59 100,59 > 64, 52 91 IgG -495,86 505,17 9,31 568,79 568,79 > 9,31 91 IgA -840,19 886,83 46,64 924,36 924,36 > 46,64 126 IgA -353,57 296,26 57, 31 335,43 335,43 > 57, 31 182 IgM 20, 18 , 20 20,38 26,32 26,32 > 20,38

Deve ser assinalado que à medida que os subtipos seleccionados de imunoglobulina atingem supressão máxima, a capacidade para observar o efeito sinérgico é mascarado devido aos números absolutos baixos. Este "efeito de máscara" explica porque a sinergia foi menos consistentemente observada ao longo de todos os três subtipos de imunoglobulina em pontos tardios do tempo. Em resuma, estes resultados confirmam os efeitos sinérgicos de combinação de Atacicept e MMF na média numérica dos níveis dos tipos indicados de imunoglobulina vistos no Exemplo 3 e estendem essa conclusão a um período de tempo a partir de 35, 91, 126 e 182 dias.

Para completar, o seguinte descreve os grupos experimentais, doses, volumes administrados e concentrações utilizadas nesta experiência de repetição e extensão: 109

Tabela 7

Grupo N° de animais Dose (mg/kg/dia) Via de Dosagem Plano de Dosagem 1 Veículo 1 2 0M + 0 s.c. 3/semana + Veículo 2 20F 0 oral diariamente 2 Atacicept 2 0M + 20F 20 s.c. 3/semana 3 MMF 2 0M + 20F 350 oral diariamente 4 Atacicept 20M + 20 s.c. 3/semana + MMF 20F 350 oral diariamente

Regime de administração ATACICEPT: dois em dois dias, 3 dias/semana, por via subcutânea. MMF: diariamente, por via oral. 0 grupo 1 recebeu ambos o veiculo para ATACICEPT e o veiculo para CellCept na mesma frequência de tratamento que os grupos tratados. 0 grupo 2 foi tratado apenas com ATACICEPT. 0 grupo 3 recebeu apenas CellCept. 0 grupo 4 recebeu sonda esofágica oral de CellCept, seguida por injecção s.c. de ATACICEPT dentro de um período de aproximadamente 30 minutos. O dia do primeiro tratamento foi considerado o dia 1 do estudo. Ao longo do período de estudo, foram realizadas observações clínicas, testes hematológicos e testes de química sanguínea, toxicocinéticas e investigações adicionais. 110

Determinações de IgG, IgM e IgA totais/Grupos satélite 9, 10, 11 e 12

Foram utilizados grupos satélite adicionais de animais para determinações de imunoglobulina total e determinação de anticorpos. Estes foram tratados e pesados de acordo com os mesmos processos que o estudo principal.

Tabela 8

Grupo/sexo (N° de animais) ATACICEPT Doses (mg/kg/dia) Subcutânea MMF Doses (mg/kg/dia) Oral 9 M (15) 0 0 9 F (15) 10 M (12) 20 n. a. 10 F (12) 11 M (12) n. a. 350 11 F (12) 12 M (12) 20 350 12 F (12

Os animais foram alojados em 3 murganhos/sexo/gaiola.

Foram recolhidas amostras de sangue de 3 animais/sexo/grupo (na ordem numérica progressiva) para a determinação dos niveis séricos de IgG, IgM e IgA nos seguintes tempos: de animais do grupo de controlo (gr.9): Pré-dose de animais dos grupos 9, 10, 11 e 12: 111 - no dia 34 do período de tratamento de 5 semanas - no dia 90 do período de tratamento de 13 semanas - no dia 34 do período de recuperação de 5 semanas - no dia 90 do período de recuperação de 13 semanas O sangue (pelo menos 0,8-1 mL) foi recolhido da aorta abdominal de murganhos, após terem sido totalmente anestesiados com éter dietílico.

As amostras foram recolhidas em tubos sem qualquer anticoagulante e deixados a coagular à temperatura ambiente durante cerca de 1 hora. O coágulo foi centrifugado a 3000 rpm a +4 °C durante 15 minutos. As células sanguíneas foram rejeitadas e o soro armazenado em fracções de 100 pL (quatro fracções para cada análise individual) e armazenadas a -80 °C até análise. Os níveis totais de IgG, IgM e IgA foram determinados por métodos de ELISA validados. O sacrifício foi realizado no final do período de tratamento de 5 semanas em 4 animais/sexo/grupo (primeiros em ordem numérica); no final do período de tratamento de 13 de semanas em 8 animais/sexo/grupo (segundos em ordem numérica); no final do período de recuperação de 5 de semanas em 4 animais/sexo/grupo (os primeiros animais recuperados em ordem numérica); e no final do período de recuperação de 13 de semanas em 4 animais/sexo/grupo (os restantes animais).

Conclusão A experiência de extensão aqui descrita corrobora os resultados do Exemplo 3 onde foi surpreendentemente mostrado que 112 a combinação de fármacos imunossupressores e antagonistas de BLyS e/ou APRIL, tais como MMF e atacicept, resultou numa depleção sinérgica dos níveis de Ig comparativamente ao nível de redução com fármacos imunossupressores e antagonistas BLyS e/ou APRIL isoladamente. 113 <110> <110> <120> PARA <13 0> <150> <151> <16 0> <17 0> <210> <211> <212> <213> <220> <221>

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

Rafael A. Ponce, Jr.

Wayne J. wallis

Matthew S. Holdren

Linda zuckerman

Alisa M. Littau

Kirk P. Van Ness

Claudia Pena Rossi

Hans Otto Lennart Graffner

COMBINAÇÃO DE INIBIÇÃO DE BLyS E/OU E IMUNOSSUPRESSORES TRATAMENTO DA DOENÇA AUTO-IMUNE

07-04PC 60/908365 2007-03-27 41

FastSEQ para Windows versão 4.0 1 1377

ADN

Homo sapiens CDS (14)... (892) 114 <222> <4 Ο 0> 1 aacatcctga gta atg agt ggc ctg ggc cgg age agg cga ggt ggc cgg 49

Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg 15 10 cgt gtg gac cag gag gag ege ttt cca cag ggc ctg tgg acg ggg ser Arg vai 15 Asp Gin Glu Glu Arg 20 Phe Pro Gin Gly Leu 25 Trp Thr Gly gtg 145 Vai gct atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag tac tgg gat cct ctg ctg Ala 30 Met Arg Ser Cys Pro 35 Glu Glu Gin Tyr Trp 40 Asp Pro Leu Leu acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc aac cat cag age cag ege Gly Thr 45 Cys Met Ser Cys 50 Lys Thr ile Cys Asn 55 His Gin ser Gin Aer8 acc 241 tgt gea gee ttc tgc agg tea etc age tgc ege aag gag caa ggc Thr cys Ala Ala Phe 6S Cys Arg ser Leu Ser 70 Cys Arg Lys Glu Gin 75 Gly aag 289 Lys ttc tat gac cat etc ctg agg gac tgc ate age tgt gee tcc ate Phe Tyr Asp 80 His Leu Leu Arg Asp 85 cys lie ser cys Ala 90 ser ile tgt gga cag cac cct aag caa tgt gea tac ttc tgt gag aac aag etc mJ mj t cys Gly Gin 95 His Pro Lys Gin Cys 100 Ala Tyr phe Cys Glu 105 Asn Lys Leu Hf age cca gtg aac ctt cca cca gag etc agg aga cag cgg agt gga Arg Ser 110 Pro Vai Asn Leu Pro 115 Pro Glu Leu Arg 128 Gin Arg Ser Gly gaa 433 Glu 125 gtt gaa aac aat tea gac aac teg gga agg tac caa gga ttg gag vai Gl u Asn Asn Ser 130 Asp Asn Ser Gly Arg 135 Tyr Gin Gly Leu Glu 140 cac 481 Hi S aga ggc tea gaa gea agt cca gct etc ccg ggg ctg aag ctg agt Arg Gly ser Glu 145 Ala ser pro Ala Leu 150 pro Gly Leu Lys Leu 155 ser gea 529 Ala gat cag gtg gee ctg gtc tac age acg ctg 999 etc tgc ctg tgt Asp Gin vai 160 Ala Leu vai Tyr Ser 165 Thr Leu Gly Leu Cys 170 Leu cys gee 577 Ala gtc etc tgc tgc ttc ctg gtg gcg gtg gee tgc ttc etc aag aag vai Leu 175 Cys cys Phe Leu vai 180 Ala vai Ala Cys Phe 185 Leu Lys Lys 115 agg 999 gat ccc tgc tcc tgc cag ccc ege tea agg ccc cgt caa agt Arg Gly 190 Asp pro Cys Ser Cys 195 Gin pro Arg Ser Arg 200 Pro Arg Gin ser ccg 673 ΡΓΟ gee aag tet tcc cag gat cac gcg atg gaa gee ggc age cct gtg Ala Lys Ser Ser Gin Asp Hi s Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro Val 205 210 215 220 age aca tcc ccc gag cca 9tg gag acc tgc age ttc tgc ttc cct gag 721 Thr Ser Thr Ser pro Glu pro vai Glu Cys ser Phe Cys phe Pro Glu 225 230 235 tgc agg gcg ccc acg cag 9ag age gea gtc acg cct 999 acc ccc gac 769 Vai Thr Cys Arg Ala Pro Thr Gin Glu Ser Ala Pro Gly Thr Pro Asp 240 245 2 50 ccc 817 pro act tgt gct gga agg tgg ggg tgc cac acc agg acc aca gtc ctg Thr Cys Ala Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr vai Leu 255 260 265 cag 865 Gin cct tgc cca cac ate cca gac agt ggc ctt ggc att gtg tgt gtg pro cys Pro His ile Pro Asp Ser Gly Leu Gly Ile vai Cys val 270 275 280 cct 912 Pro gee cag gag 999 99C cca ggt gea taaatggggg tcagggaggg Ala Gl n Glu Gly Gly Pro Gly Ala 285 290 aaaggaggag ggagagagat ggagaggagg ggagagagaa agagaggtgg ggagagggga 972 gagagatatg aggagagaga gacagaggag gcagaaaggg agagaaacag aggagacaga 1032 gagggagaga gagacagagg gagagagaga cagaggggaa gagaggcaga gagggaaaga 1092 ^cagagaag gaaagagaca ggcagagaag gagagaggca gagagggaga gaggcagaga ci^agagagg cagagagaca gagagggaga gagggacaga gagagataga gcaggaggtc ggggcactct gagtcccagt tcccagtgca gctgtaggtc gtcatcacct aaccacacgt 1272 gcaataaagt cctcgtgcct gctgctcaca gcccccgaga gcccctcctc ctggagaata 1332

aaacctttgg cagctgccct tcctcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1377 <210> 2 <211> 293 <212> PRT <213> Homo sapiens 116 <400> 2

Met Ser 1 Gin Glu Ser cys Ser Cys 50 Phe Cys 65 Hi s Leu Pro Lys Asn Leu Asn Ser 130 Glu Ala 145 Ala Leu cys Phe Cys ser

Gly Leu Glu Arg 20 Pro Glu 35 Lys Thr Arg Ser Leu Arg Gin Cys 100 Pro Pro 115 Asp Asn Ser Pro Vai Tyr Leu vai 180 Cys Gin

Gly Arg 5 Phe Pro Glu Gin ile Cys Leu Ser 70 Asp Cys 85 Ala Tyr Glu Leu Ser Gly

Ala Leu 150 Ser Thr 165 Ala vai

Ser Arg Gin Gly Tyr Trp 40 Asn His 55 Cys Arg Ile Ser Phe Cys Arg Arg Arg Tyr 135 Pro Gly

Leu Gly Ala cys Pro Arg Ser Arg Arg Gly KV Gly Leu XV Trp Thr 25 ASP Pro Leu Gin Ser Gin Lys Glu Gin 75 Cys Ala Ser 90 Glu Asn Lys 105 Gin Arg ser Gin Gly Leu Leu Lys Leu 155 Leu Cys Leu 170 Phe Leu Lys 185 pro Arg Gin

Arg Ser Arg Gly vai Ala 30 Leu Gly Thr 45 Arg Thr Cys 60 Gly Lys Phe Ile Cys Gly Leu Arg Ser 110 Gly Glu vai 125 Glu His Arg 140 Ser Ala Asp Cys Ala vai Lys Arg Gly 190 Ser Pro Ala

Vai Asp 15 Met Arg cys Met Ala Ala Tyr Asp 80 Gin His 95 Pro Val Glu Asn Gly Ser Gin val 160 Leu Cys 175 Asp Pro Lys Ser ser Gin 210 Glu Pro 225 Thr Gin Gly Arg His ile Gly Gly 290 195 Asp His Vai Glu Glu ser Trp Gl

Giy 260

Pro Asp 275 Pro Gly

Ala Met Thr cys 230 Ala vai 245 Cys His Ser Gly Ala 200 Glu Ala 215 ser Phe Thr Pro Thr Arg Leu Gly 280 205 Gly ser pro vai ser Thr 220 cys Phe pro Glu cys Arg 235 Gly Thr pro Asp Pro Thr 250 Thr Thr vai Leu Gin Pro 265 270 Ile vai Cys vai Pro Ala

Ser Pro Ala Pro 240 Cys Ala 255 Cys Pro Gin Glu 285 <210> 3 <211> 586 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (27)... (578) 117 <4Ο0> 3 gcagcttgtg cggcggcgtc ggcacc atg agg cga ggg ccc cgg age ctg cgg wet Arg Arg Gly Pro Arg ser Leu Arg 1 5 agg gac gcg cca gee ccc acg ccc tgc gtc ccg gee gag tgc ttc Gly Arg Asp Ala Pro Ala pro Thr pro cys val Pro Ala Glu Cys phe 10 15 20 25 gac 149 asp ctg ctg gtc ege cac tgc gtg gee tgc ggg etc ctg ege acg ccg Leu Leu vai AS8 His cys val Ala cíí Gly Leu Leu Arg Thr 40 pro cgg 197 Arg ceg aaa ccg gee 999 gee age age cct gcg ccc agg acg gcg ctg pro Lys pro Ala Gly Ala ser ser pro Ala pro Arg Thr Ala Leu 45 50 55 cag ccg cag gag teg gtg ggc gcg ggg gee ggc gag gcg gcg ctg ccc 245 Glu Ala Ala Gin pro Gin Glu Ser val Gly Ala Gly Ala Gly Leu pro 60 65 70 ctg 293 Leu ccc 999 ctg etc ttt ggc gee ccc gcg ctg ctg 09C ctg gea ctg Pro Gly Leu Leu Phe Gly Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu 75 80 85 Sí val ctg 9cg ctg gtc ctg gtg ggt ctg gtg age tgg agg cgg cga cag Leu Ala Leu val Leu val dy Leu val Ser Trp Arg Arg Arg Gin 90 95 100 105 113 Arg cgg ctt ege ggc gcg tcc tcc gea gag gee ccc gac gga gac aag Arg Leu Arg Gly 110 Ala ser ser Ala Glu 115 Ala pro Asp Gly ASp 120 Lys gac 437 Asp gee cca gag ccc ctg gac aag gtc ate att ctg tet ccg gga ate Ala Pro Glu Pro Leu Asp Lys val He ile Leu Ser pro Gly ile 125 130 135 tet 485 ser gat gee aca gct cct gee tgg cct cct cct ggg gaa gac cca gga Asp Ala Thr Ala Pro Ala Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly 140 145 150 acc acc cca cct ggc cac agt gtc cct gtg cca gee aca gag ctg ggc 533 Thr Thr Pro Pro Gly Hl s ser val pro val Pro Ala Thr Glu Leu Gly 155 160 165 tcc 578 ser act gaa ctg gtg acc acc aag acg gee ggc cct gag caa caa Thr Glu Leu val Thr Thr Lys Thr Ala Gly pro Glu Gin Gin 170 175 180 tagcaggg 586 118 <210> 4 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 Ο Ο > 4

Met Arg 1 Thr ργο vai Ala ser ser 50 Ala Gly 65 Ala Pro Gly Leu Ser Ala

Lys Vai 130

vai Pro Lys Thr

Arg Gly Cys vai 20 Cys Gly 35 pro Ala Ala Gly Ala Leu vai Ser 100 Glu Ala 115 lie lie Pro Pro vai Pro Ala Gly 180

Pro Arg ser Leu pro Ala Glu Cys Leu Leu Arg Thr 40 pro Arg Thr Ala 55 Glu Ala Ala Leu 70 Leu Gly Leu Ala 85 Trp Arg Arg Arg pro Asp Gly Asp 120 Leu Ser Pro Gly 135 Gly Glu Asp Pro 150 Ala Thr Glu Leu 165 pro Glu Gin Gin

Arg Gly 10 phe Asp 25 Pro Arg Leu Gin Pro Leu Leu vai 90 Gin Arg 105 Lys Asp

Arg Asp Leu Leu pro Lys Pro Gin 60 Pro Gly 75 Leu Ala Arg Leu Ala pro

Ala Pro vai Arg 30 Pro Ala 45 Glu Ser Leu Leu Leu vai Arg Gly 110 Glu Pro 125

Ala Pro 15 hís cys Gly Ala vai Gly Phe Gly 80 Leu vai 95 Ala ser I A 11 Acn lie ser Asp Ala Thr Ala Pro Ala 140 Gly Thr Thr Pro Pro Gly His Ser 155 160 Gly Ser Thr Glu Leu vai Thr Thr 170 175 <210> 5 <211> 995 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (219)... (770) 119 <400> 5 aagactcaaa cttagaaact tgaattagat gtggtattca 60 aatccttacg tgccgcgaag acacagacag cccccgtaag aacccacgaa gcaggcgaag 120 ttcattgttc tcaacattct agctgctctt gctgcatttg ctctggaatt cttgtagaga i δη tattacttgt ccttccaggc tgttctttct gtagctccct tgttttcttt ttgtgatc atg ttg cag atg gct ggg Met Leu Gin Met Ala Gly 1 5 cag 284 Gin tgc tcc caa aat gaa tat ttt gac agt ttg ttg cat gct tgc ata cys ser Gin Asn Glu Tyr Phe Asp Ser Leu Leu HiS Ala Cys Ile 10 15 20 cct 332 ΡΓΟ tgt caa ctt cga tgt tet tet aat act cct cct cta aca tgt cag Cys Gin Leu Arg cys Ser Ser Asn Thr pro pro Leu Thr Cys Gin 25 30 35 cgt «Π tat tgt aat gca agt gtg acc aat tea gtg aaa gga acg aat gcg jOV Arg Tyr Cys Asn Ala ser val Thr Asn ser val Lys Gly Thr Asn Ala 40 45 50 att 428 Ile ctc tgg acc tgt ttg gga ctg age tta ata att tet ttg gca gtt Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu ile ile Ser Leu Ala val 55 60 65 70 ttc gtg cta atg ttt ttg cta agg aag ata age tet gaa cca tta aag 476 Glu Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile Ser Ser Pro Leu Lys 75 80 85 gac 524 Asp gag ttt aaa aac aca gga tea ggt ctc ctg ggc atg gct aac att Glu Phe LU Asn Thr Gly Ser Gly 95 Leu Leu Gly Met Ala 100 Asn ile gac 572 Asp ctg gaa aag age agg act ggt gat gaa att att ctt ccg aga ggc Leu Glu Lys ser Arg Thr Gly Asp Glu ile Ile Leu Pro Arg Gly 105 110 115 ctc gag tac acg gtg gaa gaa tgc acc tgt gaa gac tgc ate aag age 620 Glu ile Leu Glu Tyr Thr val Glu Glu Cys Thr cys Asp cys Lys Ser 120 125 130 aaa 668 iSi ccg aag gtc gac tet gac cat tgc ttt cca ctc cca gct atg gag Pro Lys val Asp Ser 140 Asp His cys Phe Pro 145 Leu pro Ala Met Glu 150 K8 Glu ggc gca acc att ctt gtc acc acg aaa acg aat gac tat tgc aag Glv Ala Thr Ile Leu val Thr Thr Lys Thr Asn ASp Tyr Cys Lys 155 160 165 120 age ctg cca gct gct ttg agt gct acg gag ata gag aaa tea att tet 764

Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu Ile Glu Lys Ser ile Ser 170 175 180 gct agg taattaacca tttcgactcg agcagtgcca ctttaaaaat cttttgtcag 820

Ala Arg aatagatgat gtgtcagatc tctttaggat gactgtattt ttcagttgcc gatacagctt 880 tttgtcctct aactgtggaa actctttatg ttagatatat ttctctaggt tactgttggg 940 agcttaatgg tagaaacttc cttggtttca tgattaaagt cttttttttt cctga 995 <210> 6 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met 1 Leu Gin Met Leu Leu Hi s Ala 20 Pro pro Leu 35 Thr val Lys 50 Ile Gly Thr ile 65 Ser Leu Ser ser Glu Pro Leu Gly Met Ala 100 ile Ile Leu 115 Pro Glu ASp 130 Cys Ile Pro 145 Leu Pro Ala Thr Asn ASp Tyr Ile Glu Lys Ser 180

Ala Gly Gin Cys 5 Cys ile Pro Cys Cys Gin Arg Tyr 40 Leu Asn Ala Ile 55 Ala val Phe val 70 Glu Leu Lys Asp 85 Asn ile ASp Leu Arg Gly Leu Glu 120 Lys ser Lys pro 135 Met Glu Glu Gly 150 Cys Lys ser Leu 165 Ile ser Ala Arg

Ser Gin 10 Asn Glu Gin 25 Leu Arg Cys Cys Asn Ala Ser Trp Thr Cys Leu 60 Leu Leu Met Phe 75 phe Lys 90 Asn Thr Glu 105 Lys Ser Arg Tyr Thr val Glu Lys val Asp Ser 140 Ala Thr Ile 155 Leu pro Ala 170 Ala Leu

Tyr Phe Asp 15 Ser Ser ser 30 Asn Thr val 45 Thr Asn Ser Gly Leu Ser Leu Leu Arg Lys Ile 80 Leu Gly ser Gly 95 Thr Gly 110 ASP Glu Glu 125 Cys Thr Cys ASp His Cys phe Val Thr Thr Lys 160 Ser Ala Thr 175 Glu 121

<210> 7 <211> 1149 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (173)... (1023) < 4 0 0 > 7 gaattcggca cgaggcagaa aggagaaaat tcaggataac tctcctgagg ggtgagccaa 60 ^ccctgccat gtagtgcacg caggacatca acaaacacag ataacaggaa atgatccatt ccctgtggtc acttattcta aaggccccaa ccttcaaagt tcaagtagtg at atg gat 178

Met Asp 1 gac 226 ASP tcc aca gaa agg gag cag tea ege ctt act tet tgc ctt aag aaa ser Thr 5 Glu Arg Glu Gin Ser 10 Arg Leu Thr ser Cys 15 Leu Lys Lys 2% gaa gaa atg aaa ctg aag gag tgt gtt tcc ate etc cca cgg aag Arg Glu 20 Glu Met Lys Leu Lys 25 Glu cys vai ser ile 30 Leu pro Arg Lys gaa 322 Glu 35 age ccc tet gtc cga tcc tcc aaa gac gga aag ctg ctg gct gea ser pro ser vai Arg 40 ser ser Lys Asp Gly 45 Lys Leu Leu Ala Ala 50 acc 370 Thr ttg ctg ctg gea ctg ctg tet tgc tgc etc acg gtg gtg tet ttc Leu Leu Leu Ala 55 Leu Leu Ser Cys Cys 60 Leu Thr vai vai Ser 65 Phe tac 418 Tyr cag gtg gee gee ctg caa ggg gac ctg gee age etc cgg gea gag Gin vai Ala 70 Ala Leu Gin Gly Asp 75 Leu Ala Ser Leu AS8 Ala Glu ctg 466 Leu cag ggc cac cac gcg gag aag ctg cca gea gga gea gga gee ccc Gin Gly 85 His Hi s Ala Glu Lys 90 Leu Pro Ala Gly Ala 95 Gly Ala pro aag 51* Lys gee ggc ctg gag gaa gct cca gct gtc acc gcg gga ctg aaa ate Ala 100 Gly Leu Glu Glu Ala 105 Pro Ala vai Thr Ala 110 Gly Leu Lys lie 122 ttt 562 Phe gaa cca cca gct cca 99* gaa ggc aac tcc agt cag aac age aga Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gin Asn Ser Arg 115 120 125 130 aat aag cgt gcc gtt cag ggt cca gaa gaa aca gtc act caa gac tgc 610 Gin Asn Lys Arg Ala vai 135 Gin Gly Pro Glu Glu 140 Thr Val Thr K! Cys §1? Leu caa ctg att gca gac agt gaa aca cca act ata caa aaa gga tet Gin Leu He Ala ASp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gin Lys Gly Ser 150 155 160 tac aca ttt gtt cca tgg ctt ctc age ttt aaa agg gga agt gcc cta 706 Gly Ala Tyr Thr Phe vai Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Ser Leu 165 170 175 gaa 754 Glu gaa aaa gag aat aaa ata ttg gtc aaa gaa act ggt tac ttt ttt Glu Lys Glu Asn Lys He Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe 180 185 190 ata 802 ile tat ggt cag gtt tta tat act gat aag acc tac gcc atg gga cat Tyr Gly Gin Vai Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met Gly His 195 200 205 210 cta 850 Leu att cag agg aag aag gtc cat 9tc ttt ggg gat gaa ttg agt ctg He Gin Arg Lys Lys val His val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu 215 220 225 358 act ttg ttt cga tgt att caa aat atg cct gaa aca cta ccc aat 070 val Thr Leu Phe Arg Cys ile Gin Asn Met Pro Glu Thr Leu Pro Asn 230 235 240 aat tcc tgc tat tca gct ggc att gca aaa ctg gaa gaa gga gat gaa 946 Glu 255 Gly Glu Asn ser cys 245 Tyr Ser Ala Gly He 250 Ala Lys Leu Glu Asp ctc caa ctt gca ata cca aga gaa aat gca caa ata tca ctg gat gga 994 Ile Gly Leu Gin Leu Ala lie pro Arg 265 Glu Asn Ala Gin Ser Leu Asp 260 270 gat 1043 ASP gtc aca ttt ttt ggt gca ttg aaa ct gctgtgacct acttacacca vai Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys 275 280 tgtctgtagc tattttcctc cctttctctg tacctctaag aagaaagaat ctaactgaaa 1103 ataccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ccctcgagcg gccgcc 1149 123

<210> 8 <211> 283 <212> PRT <213> Homo sapiens

Thr Ser Ss Leu Leu Ser ile 30 Pro Gly 45 Lys Leu Leu Leu Thr val Val Ala Ser Leu Arg 80 Gly Ala Gly Ala 95 Gly Thr Ala 110 Leu ser 125 ser Gin Asn Thr val Thr Gin Thr ile Gin Lys 160 Lys Arg Gly 175 Gly Ser Glu Thr 190 Tyr Thr 205 Tyr Ala Met Gly Asp Glu Leu pro Glu Thr Leu 240 Leu Glu Gl u 255 Gly Gin Ile 270 Ser Leu <400> 8 Met 1 Asp ASp Ser Thr 5 Glu Arg Glu Gin ser 10 Arg Leu Lys Lys Arg Glu 20 Ser Glu Met Lys Leu Lys 25 Glu Cys val Arg Lys Glu 35 Thr Pro Ser val Arg 40 Leu Ser Ser Lys ASp Ala Ala 50 Leu Leu Leu Ala 55 Leu Ser Cys Cys 60 Ser 65 Phe Tyr Gin val Ala 70 Ala Leu Gin Gly ASP 75 Leu Ala Glu Leu Gin Gly 85 His Hi s Ala Glu Lys 90 Leu pro Ala Pro Lys Ala 100 Gly Leu Glu Glu Ala 105 Pro Ala val Lys lie Phe 115 Glu Pro pro Ala Pro 120 Gly Glu Gly Asn ser Arg 130 Asn Lys Arg Ala val 135 Gin Gly Pro Glu Glu 140 ASP 145 cys Leu Gin Leu He 150 Ala Asp Ser Glu Thr 155 Pro Gly Ser Tyr Thr phe 165 val Pro Trp Leu Leu 170 Ser Phe Ala Leu Gl u Glu 180 Lys Glu Asn Lys Ile 185 Leu val Lys Phe phe ile 195 Tyr Gly Gin val Leu 200 Tyr Thr ASp Lys Gly His 210 Leu Leu Ile Gin Arg Lys 215 Arg Lys Val His Val Phe 220 ser 225 Vai Thr Leu Phe 230 Cys Ile Gin Asn 235 Met Pro Asn Asn Ser cys 245 Tyr Ser Ala Gly ile 250 Ala Lys Asp Glu Leu Gin 260 Leu Ala ile Pro Arg 265 Glu Asn Ala Asp Gly Asp 275 val Thr Phe Phe Gly 280 Ala Leu Lys <210> 9 <211> 1680 <212> ADN <213> Mus musculus < 2 2 0 >

<221> CDS 124 <222> (164)... (1093) <400> 9 tactcactat agggctcgag cggccgcccg ggcaggtgct cctgggggaa cccagccctg 60 ccatgctctg agggcagtct cccaggacac agatgacagg aaatgaccca cccctgtggt 120 cacttactcc aaaggcctag accttcaaag tgctcctcgt gga atg gat gag tct 175

Met Asp Glu Ser 1 gca aag acc ctg cca cca ccg tgc ctc tgt ttt tgc tcc gag aaa gga 223 Glu 62Í Ala 5 Lys Thr Leu pro Pro 10 pro cys Leu Cys phe 15 Cys Ser Lys gaa gat atg aaa gtg gga tat gat ccc ate act ccg cag aag gag gag 271 Gin Glu Glu Glu Asp Met Lys vai Gly Tyr Asp pro He Thr pro Lys 25 30 35 ggt 319 Gly gcc tgg ttt ggg ate tgc agg gat gga agg ctg ctg gct gct acc Ala Trp Phe 40 Gly ile Cys Arg ASP 45 Gly Arg Leu Leu Ala 50 Ala Thr ctc 367 Leu ctg ctg gcc ctg ttg tcc age agt ttc aca gcg atg tcc ttg tac Leu Leu Ala Leu Leu Ser Ser Ser phe Thr Ala Met Ser Leu Tyr 55 60 65 cag ttg gct gcc ttg caa gca gac ctg atg aac ctg ege atg gag ctg 415 Glu Gin Leu Ala Ala Leu Gin Ala Asp Leu Met Asn Leu Arg Met Leu 70 75 80 cag 463 Gin age tac cga ggt tea gca aca cca gcc gcc gcg ggt gct cca gag Ser Tyr Arg Gly Ser Ala Thr Pro Ala Ala Ala Gly Ala Pro Glu 85 90 95 100 ttg 511 Leu acc gct gga gtc aaa ctc ctg aca ccg gca gct cct cga ccc cac Thr Ala Gly vai Lys Leu Leu Thr pro Ala Ala pro Arg Pro His 105 110 115 aac 559 Asn tcc age ege ggc cac agg aac aga ege gct ttc cag gga cca gag Ser Ser Í38 Gly His Arg Asn Í2r! Arg Ala Phe Gin Gly 130 Pro Glu gaa 607 Glu aca gaa caa gat gta gac ctc tea gct cct cct gca cca tgc ctg Thr Glu Gin Asp vai Asp Leu ser Ala pro pro Ala pro Cys Leu 135 140 145 cct 655 ΡΓΟ gga tgc ege cat tct caa cat gat gat aat gga atg aac ctc aga Gly Cys Arg His Ser Gin His Asp Asp Asn Gly Met Asn Leu Arg 150 155 160 125 aac ate att caa gac tgt ctg cag ctg att gea gac age gac acg ccg 703

Asn ile Ile Gin Asp Cys Leu Gin Leu lie Ala Asp Ser Asp Thr Pro 165 170 175 180 act 751 Thr ata cga aaa gga act tac aca ttt gtt cca tgg ctt CtC age ttt lie Arg Lys Gly Thr Tyr Thr Phe vai Pro Trp Leu Leu ser Phe 185 190 195 aaa 799 Lys aga gga aat gee ttg 9ag gag aaa gag aac aaa ata gtg gtg agg Arg Gly Asn 200 Ala Leu Glu Glu ÍU Glu Asn Lys Ile vai 210 vai Arg caa 847 Gin aca ggc tat ttc ttc ate tac age cag gtt cta tac acg gac ccc Thr Gly Tyr phe Phe lie Tyr Ser Gin vai Leu Tyr Thr Asp pro 215 220 225 ate ttt gct atg ggt cat gtc ate cag agg aag aaa gta cac gtc ttt 895 vai Phe ile Phe Ala Met Gly His vai Ile Gin Arg Lys Lys Vai His 230 235 240 m gac gag ctg age ctg gtg acc ctg ttc cga tgt att cag aat atg Gly asp Glu Leu ser Leu vai Thr Leu Phe 38 cys Ile Gin Asn Met 245 250 260 ccc aaa aca ctg ccc aac aat tcc tgc tac teg gct ggc ate gcg agg 991 Gly Ile Al a Pro Lys Thr Leu pro Asn Asn Ser cys Tyr Ser Ala Arg 265 270 275 íS3s Leu gaa gaa gga gat gag att cag ctt gea att cct cgg gag aat gea Glu Glu Gly ASp Glu Ile Gin Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala 280 285 290 cag att tea ege aac gga gac gac acc ttc ttt ggt gee cta aaa ctg 1087 Ala Gin Ile Ser Arg Asn Gly Asp Asp Thr phe Phe Gly Leu Lys Leu 295 300 305 ctg taa ctcacttgct ggagtgcgtg atccccttcc ctcgtcttct ctgtacctcc 1143

Leu * gagqgagaaa 1203 ctcgtgaccc 1263

Jgccatgtg ttttctccag 1383 ^ttcagaatg tgcaggtcac 1503 cagacgactg gttgaatctg agttatgaga tcctttgcca cagggagatt tgaagcattc gaaaaactaa atccaaacca aacggagccc acacgcaccg tccttgtttt acgctaagtc aagatgggga ggaaatataa gcgctcagaa eaacettgct gcgatttgcc tcaggattta aagccgtcag cagacagcca agaccggatg ttttgccttg atgagaagag ctctcccttc cgaaagtttt caaccgaagt aggaagaccg ggtgacacat ggcccacaac tcatgctaag 126 tacacacacg ctcttttcca ggtaatacta tgggatacta tggaaaggtt gtttgttttt 1563 aaatctagaa gtcttgaact ggcaatagac aaaaatcctt ataaattcaa gtgtaaaata 1623 aacttaatta aaaaggtaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1680

<210> 10 <211> 309 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10

Met Asp Glu Ser Ala Lys Thr Leu Pro Pro Pro Cys Leu Cys Phe Cys 1 5 10 15 ser Glu Lys Gly Glu ASp Met Lys vai 25 Gly Gly Tyr Asp Pro Ile 30 Gly Thr pro Gin Lys Glu Glu Gly Ala Trp Phe ile Cys Arg Asp Arg Leu 35 40 45 phe Thr Ala Leu Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Ser Ser 50 55 60 Met Ser Leu Tyr Gin Leu Ala Ala Leu Gin Ala Asp Leu Met Asn Leu 65 70 75 80 Arg Met Glu Leu Gin Ser Tyr Arg Gly Ser Ala Thr Pro Ala Ala Ala 85 90 95 Gly Ala Pro Glu Leu Thr Ala Gly vai Lys Leu Leu Thr pro Ala Ala 100 105 110 Pro Arg Pro His Asn Ser Ser Arg Gly His Arg Asn Arg Arg Ala Phe 115 120 125 Gin Gly pro Glu Glu Thr Glu Gin Asp Val Asp Leu ser Ala Pro pro 130 135 140 Ala ΡΓΟ cys Leu pro Gly Cys Arg His Ser Gin Hi S Asp Asp Asn Gly 145 150 155 160 Met Asn Leu Arg Asn Ile Ile Gin Asp Cys Leu Gin Leu Ile Ala Asp 165 170 175 ser ASP Thr Pro Thr ile Arg Lys Gly Thr Tyr Thr Phe val Pro Trp 180 185 190 Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Asn Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys 195 200 205 ile vai vai Arg Gin Thr Gly Tyr phe phe ile Tyr 220 Ser Gin Val Leu 210 215 3S Thr Asp pro ile Phe 230 Ala Met Gly His val 235 ile Gin Arg Lys Lys 240 Vai His vai Phe Gly ASP Glu Leu Ser Leu val Thr Leu Phe Arg Cys 245 250 255 ile Gin Asn Met Pro Lys Thr Leu Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala 260 265 270 Gly Ile Ala Arg Leu Gl U Glu Gly Asp Glu Ile Gin Leu Ala Ile pro 275 280 285 Arg Glu Asn Ala Gin Ile Ser Arg Asn Gly Asp Asp Thr Phe Phe Gly 290 295 300 Ala Leu Lys Leu Leu 127 305

<210> 11 <211> 185 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 Ο Ο > 11

Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu 1 5 Glu Thr pro Cys val Pro Ala cys 20 Thr Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg 35 40 Ala Ser ser pro Ala Pro Arg Thr 50 55 Ala Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala 65 70 Gly Gly Ala Pro Ala Leu Leu Leu 85 val Gly Leu val ser Trp Arg Arg 100 Gly Ser Ser Ala Glu Ala Pro ASp 115 120 Asp Lys 130 val Ile Ile Leu Ser 135 pro Ala Trp pro Pro pro Gly Glu Asp 145 150 Glu Ser val pro val pro a! a Thr 165 Glu Gin Thr Lys Thr Ala Gly Pro 180

<210> 12 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapiens

Arg Gly 10 Arg Asp Ala Pro Ala 15 pro phe 25 ASp Leu Leu val Arg 30 HiS Cys pro Arg Pro Lys Pro 45 Gin Ala Gly Ala Ala Leu Gin Pro 60 Glu Ser val Leu pro Leu 75 Pro Gly Leu Leu phe 80 Ala Leu 90 Val Leu Ala Leu val 95 Leu Arg 105 Gin Arg Arg Leu Arg 110 Gly Ala Asp Lys Asp Ala pro 125 Glu Pro Leu Gly ile ser Asp 140 Ala Thr Ala Pro Pro Gly Thr 155 Thr Pro Pro Gly His 160 Leu Gin 185 Gly 170 Ser Thr Glu Leu val 175 Thr <40 0> 12 Met ser Gly Leu Gly 1 5 Gin Glu Glu Arg Trp 20 Tyr Asp His Leu Leu 35 Gin His pro Lys Gin 50 pro Vai Asn Leu Pro 65 Glu Asn Asn Ser Asp 85

Arg Ser Arg val 15 Lys Asp Glu Gin Gly 30 phe Ala ser 45 Ile cys Gly Asn 60 Arg Lys Leu Arg Ser Ser Gly Glu val 80 Arg Gly Leu Glu His 95

Arg Ser Arg Arg Gly Gly 10 ser Leu ser Cys Arg Lys 25

Arg Asp cys ile Ser cys 40

Cys Ala Tyr Phe Cys Glu 55 pro Glu Leu Arg Arg Gin 70 75

Asn Ser Gly Arg Tyr Gin 90 128

Gly Ser Glu Ala ser Pro Ala Leu 100 Gin vai Ala Leu vai Tyr Ser Thr 115 120 Leu 38 Cys phe Leu Vai Ala 135 vai Asp pro cys ser Cys Gin pro Arg 145 Gin 150 Ala Lys Ser Ser Asp Hl S Met 165 ser Pro Glu Pro Vai Gl u Thr Cys 180 vai Ala Pro Thr Gin Glu Ser Ala 195 200 Cys Ala Gly Arg Trp Gly Cys Hi S 210 215 Gly Cys Pro His lie pro Asp ser 225 230 Gin Glu Gly Gly pro Gly Ala 245

<210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial pro 105 Gly Leu Lys Leu Ser 110 Ala ASP Leu Gly Leu Cys Leu 125 cys Ala vai Ala cys phe Leu 140 Lys Lys Arg Giy Ser Arg pro 155 Arg Gl n Ser Pro Ala 160 Glu Ala 170 Gly Ser Pro vai Ser 175 Thr Ser 185 Phe cys Phe Pro Glu 190 Cys Arg Thr pro Gly Thr pro 205 ASP Pro Thr Thr Arg Thr Thr 220 vai Leu Gin pro Leu Gly ile 235 vai Cys vai Pro Ala 240 <22 0>

<223> Polipéptido de ligação a BLyS <40 0> 13

Lys

<210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <220>

<223> Polipéptido de ligação a BLyS 129 <400> 14

Glu Cys phe Asp Leu Leu vai Arg His Trp vai Pro Cys Gly Leu Leu 15 10 15

Arg

<210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Polipéptido de ligação a BLyS <400> 15

Glu Cys Phe Asp Leu Leu vai Arg Arg Trp vai pro cys gIu Met Leu 15 10 15

Gly

<210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Polipéptido de ligação a BLyS <400> 16

Glu cys Phe Asp Leu Leu vai Arg ser Trp vai pro cys hís Met Leu 15 10 15

Arg

<210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial 130 <220> <223> Polipéptido de ligação a BLyS <400> 17

Glu Cys Phe Asp Leu Leu vai Ara hís Trp vai Ala Cys Gly Leu Leu 15 10 15

Arg

<210> 18 <211> 1214 <212> ADN <213> Sequência artificial <220>

<223> Proteína de fusão TACI-Fc <221> CDS <222> (17)... (1192) <400> 18 tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys vai Leu 15 10 io8 ctg tgt ggc gee gtc ttc gtt Leu Leu Cys 15 Gly Ala vai Phe vai 20 gag 148 Glu ttg aga cgc ttc cgt aga gct Leu 30 Arg Arg Phe Arg Arg 35 Ala tac 196 tgg gat cct ctg ctg ggt acc Tyr 45 Trp Asp pro Leu Leu 50 Gly Thr aac 244 cat cag age cag cgc acc tgt teg ctc age cag gaa ate cat gee Ser Leu Ser Gin Glu 25 lie Hi s Ala atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag Met Arg Ser cys 40 Pro Glu Glu Gin tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc Cys Met Ser 55 Cys Lys Thr ile Cys 60 gca gee ttc tgc agg tea ctc age 131

Asn HÍS Gin Ser Gin Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser 65 70 75 tgc too ege aag gag caa ggc aag ttc tat gac cat etc ctg agg gac tgc cys Arg Lys Glu 80 Gin Gly Lys Phe Tyr 85 Asp His Leu Leu A9r8 Asp cys ate 340 lie age tgt gee tcc ate tgt gga cag cac cct aag caa tgt gea tac Ser Cys Ala Ser ile Cys Gly Gin His pro Lys Gin Cys Ala Tyr 95 100 105 ttc tgt gag aac aag etc agg age cca gtg aac ctt cca cca gag etc 388 Glu Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg ser pro vai Asn Leu pro Pro Leu 110 115 120 til Ara aga cag cgg agt gga gaa gtt gaa aac aat tea gac aac teg gga Arg Gin Arg Ser Gly Glu vai Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly 125 130 135 140 agg 484 Arg tac caa gga ttg gag cac aga ggc tea gaa gea agt cca gct etc Tyr Gin Gly Leu Glu HÍS Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu 145 150 155 cca ggt etc aag gag ccc aaa tet tea gac aaa act cac aca tgc cca 532 Thr His Thr 170 Pro Gly Leu Lys 160 Glu Pro Lys Ser Ser 165 ASP Lys Cys pro ccg 580 ΡΓΟ tgc cca gea cct gaa gee gag ggg gea ccg tea gtc ttc etc ttc Cys Pro Ala pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser vai Phe Leu Phe 175 180 185 ccc 628 Pro cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate tcc cgg acc cct gag gtc Pro 190 Lys Pro Lys Asp Thr 195 Leu Met lie Ser Arg 20Õ Thr ΡΓΟ Glu Vai aca 676 Thr tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc Cys vai vai vai Asp Vai Ser His Glu ASP Pro Glu vai Lys Phe 205 210 215 220 aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gee aag aca aag ccg 724 Ala Thr Asn Trp Tyr vai Asp 225 Gly vai Glu vai His 230 Asn Lys ϊϊϊ pro gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc etc acc / í ά Arg Glu Glu Gin Tyr Asn ser Thr Tyr Arg vai vai Ser vai Leu Thr 240 245 250 132 gtc 820 val ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc Leu HiS Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys Vai 255 260 265 tcc aac aaa gcc ctc cca tcc tcc ate gag aaa acc ate tcc aaa gcc 868 ile Glu Ser Asn Lys Ala Leu Pro ser Ser Lys Thr ile Ser Lys Ala 270 275 280 aaa 916 Lys 999 cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin vai Tyr Thr Leu Pro pro Ser Arg 285 290 295 300 gat §64 ASP gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc Glu Leu Thr 3&! Asn Gin vai Ser Leu Thr Cys Leu vai Lys Gly 310 315 ttc 1012 Phe tat 1 ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg Tyr pro Ser 320 Asp ile Ala vai Glu 325 Trp Glu Ser Asn Gly 330 Gin pro gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc 1060 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr ΡΓΟ pro vai Leu Asp Ser Asp Gly ser 335 340 345 ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag 1108 Gin Gin Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr vai Asp Lys Ser Arg Trp 350 355 360 ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac 1156 Ala His His Gly Asn vai Phe Ser Cys Ser vai Met His Glu Leu Asn 365 370 375 380 tac 1202 Tyr acg cag aag age ctc tcc ctg tet ccg ggt aaa taatctagag Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 385 390

gcgcqccaat ta 1214 <210> 19 <211> 392 <212> PRT <213> Sequência artificial 133 <220> <223> Proteína de fusão TACI-Fc <400> 19

Met 1 ASP Ala Met Lys 5 Arg Gly Leu Ala val Phe val 20 Ser Leu Ser Gin Phe Arg Arg 35 Ala Met Arg Ser cys 40 Leu Leu 50 Gly Thr Cys Met Ser 55 cys Gin 65 Arg Thr Cys Ala Ala 70 Phe Cys Gin Gly Lys phe ar ASp HÍS Leu ser lie Cys Gly 100 Gin Hí S Pro Lys Lys Leu Arg 115 Ser pro val Asn Leu 120 ser Gly 130 Glu val Glu Asn Asn 135 ser Leu 145 Glu HÍS Arg Gly ser 150 Glu Ala Glu pro Lys ser ser 165 Gly ASP Lys Thr pro Glu Ala Glu 180 Ala Pro Ser Lys Asp Thr 195 Leu Met Ile Ser Arg 200 vai Asp 210 val Ser HÍS Glu Asp 215 Pro Asp Gly 225 val Glu val Hí s 230 Asn Ala Tyr Asn Ser Thr Tyr 245 Gly Arg val val Asp Trp Leu Asn 260 Lys Glu Tyr Leu pro Ser 275 Ser Ile Glu Lys Thr 280 Arg Glu 290 Pro Gin val Tyr Thr 295 Leu Lys 305 Asn Gin val Ser Leu 310 Thr Cys Asp lie Ala val Glu 325 Trp Glu Ser Lys Thr Thr Pro 340 pro val Leu Asp Ser Lys Leu 355 Thr val Asp Lys Ser 360 Ser Cys 370 ser Val Met Hi s Glu 375 Ala Ser 385 Leu ser Leu Ser Pro 390 Gly Lys

Cys Cys 10 val Leu Leu Leu Cys 15 Gly Glu 25 Ile HÍS Ala Gl u Leu 30 Arg Arg pro Glu Glu Gin Tyr 45 Trp Asp pro Lys Thr ile Cys 60 Asn His Gin Ser S) < Ser Leu 75 Ser Cys Arg Lys Glu 80 Leu Arg 90 Asp Cys ile Ser Cys 95 Ala Gin 105 Cys Ala Tyr Phe Cys 110 Glu Asn pro Pro Glu Leu Arg 125 Arg Arg Gin Arg Asp Asn Ser Gly 140 Tyr Gin Gly ser pro Ala 155 XTU Leu Pro Gly Leu Lys 160 HÍS Thr 170 Cys Pro Pro Cys Pro 175 Ala Val 185 Phe Leu Phe Pro Pro 190 Lys Pro Thr pro Glu val Thr 205 Asn Cys Val val Glu Val Lys Phe 220 pro Trp Tyr val Lys Thr Lys 235 Arg Glu Glu Gin 240 Ser val 250 Leu Thr Val Leu Hi s 255 Gin Lys 265 Cys Lys val Ser Asn 270 Lys Ala ile Ser Lys Ala Lys 285 Gly Gin Pro Pro Pro Ser Ara 300 Gly faO J ASP Glu Leu Thr Leu val Lys 315 Phe Tyr Pro Ser 320 Asn Gly 330 Gin Pro Glu Asn Asn 335 Tyr Ser 345 ASp Gly Ser phe Phe 350 Leu Tyr Arg Trp Gin Gin Gly 365 Asn val Phe Leu HÍS Asn His 380 Tyr Thr Gin Lys 134

<210> 20 <211> 1070 <212> ADN <213> Sequência artificial <220>

<223> Proteína de fusão TACI-Fc <221> CDS <222> (17)... (1048) <400> 20 tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52 _ _

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys vai Leu 15 10 ctg 100 Leu ctg tgt ggc gee 9tc ttc gtt teg ctc age cag gaa ate cat gee Leu Cys Gly Ala vai Phe val Ser Leu Ser Gin Glu Ile Hi s Ala 15 20 25 gag 148 Glu ttg aga ege ttc cgt aga gct atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag Leu Arg Arg Phe Arg Arg Ala Met Arg ser cys pro Glu Glu Gin 30 35 40 tac tgg gat cct ctg ctg ggt acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc 196 Thr Ile Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr cys Met ser Cys Lys Cys 45 50 55 60 aac 244 Asn cat cag age cag ege acc tgt gca gee ttc tgc agg tea ctc age H1S Gin Ser Gin Arg Thr cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser 65 70 75 tgc OQO ege aag gag caa ggc aag ttc tat gac cat ctc ctg agg gac tgc ί'άά Cys Arg Lys Glu 80 Gin Gly Lys Phe Tyr 85 ASp His Leu Leu A58 Asp cys ate 340 Ile age tgt gee tcc ate tgt gga cag cac cct aag caa tgt gca tac Ser cys Ala Ser Ile cys Gly Gin HlS Pro Lys Gin Cys Ala Tyr 95 100 105 ttc 388 Phe tgt gag aac gag ccc aaa tet tea gac aaa act cac aca tgc cca cys Glu Asn Glu pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr Hl 5 Thr Cys Pro 110 115 120 135 ccg A DC tgc cca gca cct gaa gcc gag ggg gca ccg tea gtc ttc ctc ttc ΡΓΟ Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser vai Phe Leu Phe 125 130 135 140 CCC cca aaa CCC aag gac acc ctc atg ate tcc cgg acc cct gag gtc 484 ργο Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu vai 145 150 155 aca cn tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc J J4 Thr Cys vai vai vai Asp vai Ser His Glu Asp Pro Glu vai Lys Phe 160 165 170 aac coo tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg DoU Asn Trp Tyr vai Asp Gly vai Glu vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 175 180 185 m gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc acc &2o Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg vai vai ser vai Leu Thr 190 195 200 gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc 676 vai Leu His Gin ASp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys vai 205 210 215 220 tcc aac aaa gcc ctc cca tcc tcc ate gag aaa acc ate tcc aaa gcc 724 Ser Asn Lys Ala Leu pro Ser Ser ile Glu Lys Thr ile ser Lys Ala 225 230 235 aaa ggg cag CCC cga gaa cca cag gtg tac acc ctg CCC cca tcc cgg 772 Lys Gly Gin Pro Arg Glu pro Gin vai Tyr Thr Leu pro Pro Ser Arg 240 245 250 gat ΟΟΛ gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc o/U ASP Glu Leu Thr Lys Asn Gin vai Ser Leu Thr Cys Leu vai Lys Gly 255 260 265 ttc tat CCC age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg 868 Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin pro 270 275 280 gag aac aac tac aag acc acg cct CCC gtg ctg gac tcc gac ggc tcc 916 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro pro vai Leu Asp Ser ASP Gly ser 285 290 295 300 ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag 964 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 305 310 315 136 ggg^aac gtc ttc

Gly Asn vai Phe 320 tac acg cag aag 1058

Tyr Thr Gin Lys 335 tca tgc tcc gtg ser Cys ser vai age ctc tcc ctg

Ser Leu ser Leu 340 atg cat gag gct

Met His Glu Ala 325 tet ccg ggt aaa Ser Pro Gly Lys ctg cac aac cac

Leu His Asn His 330 taatctagag

ta

<210> 21 <211> 344 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Proteína de fusão TACI-Fc <400> 21

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 Ala Glu 15 Ala val Phe val Ser Leu Ser Gin Glu xle His Leu Arg Arg 20 25 Gin 30 Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Tyr Trp Asp pro 35 40 45 Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile cys Asn His Gin Ser 50 Ala 55 60 Gl n Arg Thr Cys Ala Phe Cys Arg Ser Leu ser Cys Arg Lys Glu 65 70 75 ile 80 Gl n Gly Lys Phe Tyr Asp Hi S Leu Leu Arg Asp cys Ser Cys Ala 85 90 95 Ser Ile Cys Gly Gin Hi S Pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn 100 105 110 Glu Pro Lys Ser Ser ASp Lys Thr His Thr cys Pro Pro cys Pro Ala 115 120 125 pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro ser val Phe Leu Phe Pro pro Lys Pro 130 Ile 135 140 Lys ASp Thr Leu Met Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr cys val val 145 150 155 160 vai Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 165 170 175 Asp Gly val Glu 180 Val Hi s Asn Ala ϊϊί Thr Lys Pro Arg Glu 190 Gl u Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val val Ser val Leu Thr val Leu Hi s Gin 195 200 205 137

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys vai ser Asn Lys Ala 210 215 220

Leu pro ser ser ile Glu Lys Thr ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 225 230 235 240

Ara Glu pro Gin vai Tyr Thr Leu pro Pro ser Arg Asp Glu Leu Thr 245 250 255

Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 260 265 270

Asp ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 275 280 285

Lys Thr Thr Pro Pro vai Leu Asp ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 290 295 300 ser Lys Leu Thr vai Asp Lys ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn vai Phe 305 310 315 320 ser cys ser vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 325 330 335

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340 <210> 22 <211> 1082 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Proteína de fusão TACI <221> CDS <222> (17)... (1060) <400> 22 tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys vai Leu 15 10 ctg ctg tgt ggc gcc gtc ttc gtt tcg ctc age cag gaa ate cat gee

Leu Leu cys Gly Ala vai Phe vai ser Leu ser Gin Glu ile His Ala 15 20 25

Glu Leu Arg Arg Phe Arg Arq Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin 30 35 40 tac tgg gat cct ctg ctg ggt acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr cys Met ser cys Lys Thr ile Cys 45 50 55 60 ttg aga ege ttc cgt aga gct atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag 138 aac 244 Asn cat cag age cag ege acc tgt gea gee ttc tgc agg tea etc age His Gin Ser Gin Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser 65 70 75 tgc ege aag gag caa ggc aag ttc tat gac cat etc ctg agg gac tgc Cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys 80 85 90 ate age tgt gee tcc ate tgt gga cag cac cct aag caa tgt gea tac 340 lie Gly Gin HÍS Ala lie ser cys Ala ser cys Pro Lys Gin Cys Tyr 95 100 105 ttc tgt gag aac aag etc agg age gag CCC aaa tet tea gac aaa act 388 Thr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys 110 115 120 cac 436 His aca tgc cca ccg tgc cca gea cct gaa gee gag ggg gea ccg tea Thr Cys Pro Pro Cys pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala pro Ser 125 130 135 140 vai ttc etc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate tcc cgg Phe Leu Phe Pro Pro Lys pro Lys ASp Thr Leu Met lie Ser Arg 145 150 155 acc 532 cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct Thr Pro Glu vai Thr Cys vai vai vai Asp vai Ser His Glu ASp Pro 160 165 170 §18 gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gee Glu vai Lys phe Asn Trp Tyr vai Asp Gly vai Glu vai His Asn Ala 175 180 185 aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc 628 vai vai Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn ser Thr Tyr Arg 190 195 200 age gtc etc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac 676 Gly Glu Ser vai Leu Thr vai Leu HÍ s Gin Asp Trp Leu Asn Lys Tyr 205 210 215 220 ?ii tgc aag gtc tcc aac aaa gee etc cca tcc tcc ate gag aaa acc Lys Cys Lys vai ser Asn Lys Ala Leu Pro ser ser ile Glu Lys Thr 225 230 235 139 ate tcc aaa gee aaa ggg cag ccc 772 Ala Gly ile ser Lys Lys Gin pro 240 ccc 820 cca tcc cgg gat gag Glu ctg acc Pro pro Ser Arg Asp Leu Thr 255 260 ctg 868 Leu gtc aaa ggc ttc tat ccc age vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 270 275 aat ggg cag ccg gag aac aac tac 916 Glu Asn Gly Gl n Pro Asn Asn Tyr 285 290 tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac 964 Ser Asp Gly Ser Phe 305 Phe Leu Tyr 1812 Arg tgg cag cag ggg aac gtc ttc Trp Gl n Gin Gly Asn vai Phe 320 ctg 1060 Leu cac 1 aac cac tac acg cag aag HiS Asn His Tyr Thr Gin Lys 335 340 cga gaa cca cag gtg tac acc ctg Arg 245 Glu pro Gin vai Tyr 250 Thr Leu aag aac cag gtc age ctg acc tgc Lys Asn Gin vai Ser 265 Leu Thr Cys gac ate gee gtg gag tgg gag age Asp lie Ala Vai 280 Glu Trp Glu Ser aag acc acg cct ccc gtg ctg gac Lys Thr Thr 295 pro Pro vai Leu Asp 300 age aag ctc acc gtg gac aag age Ser Lys 310 Leu Thr vai Asp Lys 315 Ser tea tgc tcc gtg atg cat gag gct ser 325 Cys Ser vai Met His 330 Glu Ala age ctc tcc ctg tet ccg ggt aaa Ser Leu ser Leu Ser 345 Pro Gly Lys taatctagag gcgcgccaat ta 1082

<210> 23 <211> 348 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Proteína de fusão TACI-Fc 140 <400> 23

Met 1 Asp Ala Met Lys 5 Arg Gly Leu Ala vai Phe vai 20 Ser Leu ser Gin Phe Arg Arg 35 Ala Met Arg ser Cys 40 Leu Leu 50 Gly Thr Cys Met Ser 55 Cys Gl n 65 Arg Thr Cys Ala Ala 70 Phe cys Gl n Gly Lys Phe Tyr 85 ASP His Leu ser Ile Cys Gly 100 Ser Gin Hl S Pro Lys Lys Leu Arg 115 Glu pro Lys Ser 120 Pro Cys 130 Pro Ala Pro Glu Ala 135 Glu Pro 145 Pro Lys pro Lys Asp 150 Thr Leu Thr Cys Vai Vai Vai 165 Asp Asp Vai Ser Asn Trp Tyr vai 180 Gin Gly vai Glu Arg Glu Glu 195 Tyr Asn Ser Thr 200 vai Leu 210 HÍ S Gin Asp Trp Leu 215 Asn Ser 225 Asn Lys Ala Leu Pro 230 Ser Ser Lys Gly Gin Pro Arg 245 Glu Pro Gin ASp Glu Leu Thr 260 Lys Asn Gin vai Phe Tyr Pro 275 Ser ASP Ile Ala vai 280 Glu Asn 290 Asn Tyr Lys Thr Thr 295 pro Phe 305 Phe Leu Tyr Ser Lys 310 Leu Thr Gly Asn vai Phe Ser 325 Ser Cys Ser vai Tyr Thr Gin Lys 340 Leu Ser Leu

<210> 24 <211> 1109 <212> ADN <213> Sequência artificial

Cys Cys val Leu Leu Leu Cys Gly 10 15 Glu ile His Ala Glu Leu Arg Arg 25 30 Pro Glu Glu Gin Tyr 45 Asn Trp ASp pro Lys Thr ile cys 60 Ser His Gin ser Arg Ser Leu cys Arg Lys Glu 75 80 Leu Arg Asp Cys Ile ser Cys Ala 90 95 Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn 105 110 Ser Asp Lys Thr His 125 Val Thr Cys pro Gly Ala Pro Ser Phe Leu phe 140 val Met Ile Ser Arg Thr Pro Gl u 155 160 Hi S Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 170 175 val His Asn Ala Lys Thr Lys pro 185 190 Thr Tyr Arg val val ser val Leu 205 val Gly Lys Glu Tyr 220 Thr Lys cys Lys ile Glu & ile Ser Lys Ala 240 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 250 255 Gly Ser Leu Thr Cys Leu val Lys 265 270 Glu Trp Glu Ser Asn 285 ser Gly Gin pro pro val Leu Asp ASp Gly ser 300 Gin Gin Val Asp Lys Ser Arg Trp 315 320 Met His Glu Ala Leu His Asn His 330 335 Ser Pro Gly Lys 345 141 <220> <223> Proteína de fusão TACI-Fc

<221> CDS <222> (17)... (1090) <400> 24 tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu cys Cys vai Leu 15 10 íoS ctg tgt ggc gee gtc ttc gtt Leu Leu Cys Gly Ala vai Phe vai 15 20 gag ttg aga ege ttc cgt aga gct 148 Ala Glu Leu Arg Arg Phe Arg Arg 30 35 tac 196 Tyr tgg gat cct ctg ctg ggt acc Trp ASp pro Leu Leu Gly Thr 45 50 aac 244 cat cag age cag ege acc tgt Asn His Gin Ser Gin 65 Arg Thr Cys tgc ege aag gag caa ggc aag ttc 292 Phe Cys Arg Lys Glu 80 Gin Gly Lys ate 340 Ile age tgt gee tcc ate tgt gga Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly 95 100 ttc 388 Phe tgt gag aac aag ctc agg age Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser 110 115 4§l gag ccc aaa tet tea gac aaa Arg Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys 125 130 gca 484 Ala cct gaa gee gag ggg gca ceg pro Glu Ala Glu Gly Ala pro teg ctc age cag gaa ate cat gee ser Leu Ser Gin Glu 25 ile His Ala atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag Met Arg Ser Cys 40 Pro Glu Glu Gin tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc Cys Met Ser 55 Cys Lys Thr ile Cys 60 gca gee ttc tgc agg tea ctc age Ala Ala 70 Phe Cys Arg Ser Leu 75 Ser tat gac cat ctc ctg agg gac tgc Tyr 85 Asp His Leu Leu AS8 Asp cys cag cac cct aag caa tgt gca tac Gin His Pro Lys Gin 105 Cys Ala Tyr cca gtg aac ctt cca cca gag ctc pro vai Asn Leu 120 pro pro Glu Leu act cac aca tgc cca ceg tgc cca Thr His Thr 135 Cys Pro Pro cys Pro 140 tea gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa Ser vai Phe Leu Phe pro Pro Lys 150 155 142 145 ccc 532 ΡΓΟ aag gac acc etc atg ate tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg Lys Asp Thr 160 Leu Met ile ser Arg 165 Thr Pro Glu val Thr 170 Cys val SS8 vai gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac vai Asp 175 vai Ser His Glu Asp 180 Pro Glu val Lys phe 185 Asn Trp Tyr ||g gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag vai ASP 190 Gly vai Glu vai HIS 195 Asn Ala Lys Thr Lys 200 pro Arg Glu Glu cag 676 tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc etc acc gtc ctg cac Gin 205 Tyr Asn Ser Thr Tyr 210 Arg vai Val Ser val 215 Leu Thr val Leu HlS 220 cag 724 Gin gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa Asp Trp Leu Asn 225 Gly Lys Glu Tyr Lys 230 Cys Lys val ser Asn 235 Lys gcc 772 etc cca tcc tcc ate gag aaa acc ate tcc aaa gcc aaa ggg cag Ala Leu pro ser 240 Ser ile Glu Lys Thr 245 ile Ser Lys Ala Lys 250 Gly Gin ccc 820 ΡΓΟ cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg Arg Glu 255 Pro Gin vai Tyr Thr 260 Leu Pro pro Ser Arg 265 Asp Glu Leu acc 868 Thr aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc Lys 270 Asn Gin vai Ser Leu 275 Thr cys Leu val Lys 280 Gly Phe Tyr ΡΓΟ age 916 Ser 285 gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg gag aac aac Asp Ile Ala vai Glu 290 Trp Glu Ser Asn Gly 295 Gin Pro Glu Asn Asn 300 tac 964 aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc etc Tyr Lys Thr Thr pro 305 pro vai Leu Asp Ser 310 Asp Gly Ser Phe Phe 315 Leu tac 1012 Tyr age aag etc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc Ser Lys Leu 320 Thr vai Asp Lys Ser 325 Arg Trp Gin Gin Gly 330 Asn val ttc 1060 tea > tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag 143

Leu His Asn His Tyr Thr Gin 345 taa tctagaggcg cgccaatta

Phe Ser cys Ser vai Met His Glu Ala 335 340 aag^agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa

Lys ser Leu ser Leu ser pro Gly Lys 350 355

<210> 25 <211> 357 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Proteína de fusão TACI-Fc <400> 25

Met 1 ASp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys 10 val Leu Leu Leu ír Gly Ala vai Phe vai 20 ser Leu ser Gin Glu 25 ile His Ala Glu Leu 30 Arg Arg Phe Arg Arg 35 Gly Ala Met Arg Ser Cys 40 Cys Pro Glu Glu Gin Tyr 45 Asn Trp Asp Pro Leu Leu 50 Thr Cys Met Ser 55 Lys Thr ile Cys 60 His Gin Ser Gin 65 Arg Thr Cys Ala Ala 70 phe cys Arg ser Leu 75 Ser cys Arg Lys Glu 80 Gl n Gly Lys Phe Tyr 85 ASP His Leu Leu Arg 90 Asp Cys ile Ser cys 95 Ala ser lie Cys Gly 100 Gin ΗΊ S pro Lys Gin 105 Cys Ala Tyr Phe Cys 110 Glu Asn Lys Leu Arg 115 Ser Pro val Asn Leu 120 Pro pro Glu Leu Arg 125 Glu Pro Lys Ser Ser 130 Asp Lys Thr Hi S Thr 135 Cys Pro pro Cys Pro 140 Ala Pro Glu Ala Glu 145 Gly Ala Pro Ser val 150 Phe Leu Phe pro pro 155 Lys Pro Lys Asp Thr 160 Leu Met lie ser Arg 165 Thr pro Glu val Thr 170 cys val val val Asp 175 val Ser His Glu Asp 180 Pro Glu val Lys Phe 185 Asn Trp Tyr val Asp 190 Gly val Glu vai His 195 Asn Ala Lys Thr Lys 200 pro Arg Glu Glu Gin 205 Tyr Asn Ser Thr Tyr 210 Arg vai Vai Ser val 215 Leu Thr val Leu His 220 Gin Asp Trp Leu Asn 225 Gly Lys Glu Tyr Lys 230 Cys Lys val ser Asn 235 Lys Ala Leu Pro Ser 240 Ser lie Glu Lys Thr 245 lie ser Lys Ala Lys 250 Gly Gin pro Arg Glu 255 Pro 144

Gin val Tyr Thr Leu Pro pro Ser Arg ASp Glu Leu Thr Lys Asn Gin 260 265 270 Vai Ser Leu Thr cys Leu val Lys Gly phe Tyr pro Ser ASp ile Ala 275 Gly 280 Glu 285 vai Glu Trp Glu Ser Asn Gin Pro Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 290 295 Gly Phe 300 Pro Pro val Leu Asp Ser ASp Ser Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 305 310 Gin Gly 315 320 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Asn Val Phe Ser Cys Ser 325 330 335 vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 340 345 350 Leu ser pro Gly Lys 355 <210 > 26 <211 > 31 1 <212 > PRT <213 > Sequência arti: fiei al <220 > <223 > Proteí: na de fusão BAFF- -R-FC <400> 26 Met ser Ala Leu Leu lie Leu Ala Leu val Gly Ala Ala val Ala ser 1 5 10 Ala 15 Thr Arg Arg Gly 20 pro Arg Ser Leu Arg 25 Gly Arg Asp pro 30 Ala pro Thr Pro Cys val Pro Ala Glu Cys phe ASp Leu Leu val Arg His cys 35 40 45 Ala val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr pro Arg Pro Lys pro Gly Ala 50 55 60 Glu Ser Ser pro Ala pro Arg Thr Ala Leu Gin pro Gin Ser Gin val 65 70 75 Ala 80 Thr Asp Lys Ala Ala HÍS Tyr Thr Leu Cys pro pro cys pro Pro 85 90 95 Glu Leu Leu Gly Gly pro Ser val Phe Leu phe Pro pro Lys Pro Lys 100 105 110 Asp Thr Leu Met ile Ser Arg Thr Pro Glu val Thr Cys val Val Val 115 120 125 Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu val Lys phe Asn Trp Tyr Asp 130 135 140 Glu Glu Glv val Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys pro Arg Gin Tyr 145 150 155 val His Gin 160 Asn Ser Thr Tyr Arg val val Ser val Leu Thr Leu Asp 165 170 175 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys val Ser Asn Lys Ala Leu 180 185 190 145 lie 200 Ser Lys Ala Lys Gly 205 Gin Pro Arg Pro Pro Ser Arg Glu 220 Glu Met Thr Lys Leu val Lys Gly 235 Phe Tyr Pro Ser Asp 240 Asn Gly Gin 250 Pro Glu Asn Asn Tyr 255 Lys ser Asp 265 Trp ciy ser phe Phe Leu 270 Tyr Ser Arg 280 Leu Gin Gin Gly Asn 285 Val Phe Ser His Asn His Tyr 300 Thr Gin Lys Ser

Pr o Ala ΡΓΟ lie Glu Lys Thr 195 Glu ΡΓΟ Gin vai Tyr Thr Leu 210 215 Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys 225 230 lie Ala Vai Glu Trp Glu ser 245 Thr Thr pro Pro val Leu Asp 260 Lys Leu Thr vai Asp Lys Ser 275 cys Ser vai Met His Glu Ala 290 295 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 305 310 <210> 27 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência de iniciador <400> 27 tattaggccg gccaccatgg atgcaatga <210> 28 <211> 29

<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência de iniciador <400> 28 t^aagatttg ggctccttga gacctggga 146 <210> 29 <211> 29

<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência de iniciador <400> 29 tcccaggtct caaggagccc aaatcttca 29

<210> 30 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de iniciador <40 0> 30 taattggcgc gcctctagat tatttacccg gagaca <210> 31 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência de iniciador <400> 31 tcjaagatttg ggctcgttct cacagaagta 147 <210> 32 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência de iniciador <400> 32 atacttctgt gagaacgagc ccaaatcttc a <210> 33 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de iniciador <40 0> 33 tttgggctcg ctcctgagct tgttctcaca 30 <210> 34 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de iniciador 148 <4Ο0> 34 ctcaggagcg agcccaaatc ttcagaca 28 <210> 35 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de iniciador <40 0> 35 tttgggctcc ctgagctctg gtggaa 26 <210> 36 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência de iniciador <400> 36 agctcaggg agcccaaatc ttcagaca 8 <210> 37 <211> 1216 <212> ADN <213> Homo sapiens 149 <220>

<221> CDS <222> (141)... (890) <400> 37 gaattcggct cgagcctttt Ο ctgcccgtac ccttacccgc gttggcaggg tccccagctc 173 tatttctcct tgcgtaacaa ccttcttccc ttctgcacca cccgccacct ccttgctacc ccactcttga aaccacagct atg cca gcc tca tct cct ttc ttg cta gcc ccc Met Pro Ala Ser ser Pro Phe Leu Leu Ala

Pro 1 aaa 221 ggg cct cca ggc aac atg ggg Gly Lys Gly pro Pro Gly Asn Met 15 tca 269 Ser gtt gcc ctc tgg ttg agt tgg Val Ala Leu Trp Leu ser Trp 30 35 tgt 317 Cys gcc atg gct ctg ctg acc caa Ala Met Ala Leu Leu Thr Gin 45 50 aga 365 Ae3 gag gtg age cgg ctg cag ggg Glu val Ser Arg Leu 65 Gin Gly m Glu ggg tat ccc tgg cag agt ctc Gly Tyr pro Trp 80 Gin Ser Leu gaa 461 Glu gcc tgg gag aat ggg gag aga Ala Trp Glu Asn Gly Glu Arg 95 acc caa aaa cag aag aag cag cac 509 Gin His Thr Gin Lys Gin Lys Lys 110 115 aac 557 Asn gcc acc tcc aag gat gac tcc Ala Thr ser Lys Asp Asp Ser 5 10 ggc cca gtc aga gag ccg gea ctc Gly 20 pro val Arg Glu pro 25 Ala Leu ggg gea gct ctg ggg gcc gtg gct Gly Ala Ala Leu Gly 40 Ala Val Ala caa aca gag ctg cag age ctc agg Gin Thr Glu Leu 55 Gin Ser Leu Arg aca gga ggc ccc tcc cag aat ggg Thr Gly Gly 70 Pro Ser Gin Asn Gly 75 ccg gag cag agt tcc gat gcc ctg pro Glu 85 Gin ser Ser ASp Ala 90 Leu tcc cgg aaa agg aga gea gtg ctc Ser 100 Arg Lys Arg Arg Ala 105 val Leu tct gtc ctg cac ctg gtt ccc att ser val Leu Hi s Leu 120 val Pro Ile gat gtg aca gag gtg atg tgg caa Asp val Thr Glu val Met Trp Gin 150 cca 605 ΡΓΟ gct ctt agg cgt ggg aga ggc cta cag gee caa gga tat ggt gtc Ala Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gin Ala Gin Gly Tyr Gly val 140 145 150 155 cga ate cag gat gct gga gtt tat ctg ctg tat age cag gtc ctg ttt ODJ Arg Ile Gin Asp Ala Gly vai Tyr Leu Leu Tyr Ser Gin vai Leu Phe 160 165 170 caa gac gtg act ttc acc atg ggt cag gtg gtg tet cga gaa ggc caa 701 Gly Gin Gin Asp vai Thr phe Thr Met Gly Gin vai vai Ser Arg Glu 175 180 185 gga agg cag gag act cta ttc cga tgt ata aga agt atg ccc tcc cac 749 ile His Gly Arg Gin 190 Glu Thr Leu Phe 19? Cys Arg Ser Met 200 pro Ser fU gac cgg gee tac aac age tgc tat age gea ggt gtc ttc cat tta Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr ser Ala Gly vai Phe His Leu 205 210 215 cac 845 caa ggg gat att ctg agt gtc ata att ccc cgg gea agg gcg Ala aaa Hi S 220 Gin Gly Asp ile Leu 225 Ser vai ile ile Pro 230 Arg Ala Arg 2Ϊ! ctt aac ctc tet cca cat gga acc ttc ctg 999 ttt gtg aaa ctg 890 Leu Asn Leu Ser Pro Hi s Gly Thr Phe Leu Gly Phe vai Lys Leu 240 245 250

<210> 38 <211> 250 <212> PRT <213> Homo sapiens tgattgtgtt 950 cagccaagag 1010 ?07o"CtCC cggatatctt 1130 ggggggacg acagcaccac 1216 ataaaaagtg ctgagtatat ccgttcctca gcttctgttc ggcgccaggc catctagcgg gctcccagct aaaggagagg cttttccctt cccatggagc attgttcaga ccgccg tggaagacca gaatgtgcag ttcattccca tccgaattct cctggtcggg gggtgggtac gaacagaggc ccccctagac tgcgtgtgtg gcccactgga atactggaga gtcttcctgg tttgatttta tagatgaggg agcatccaga 151

Ser 100 Ser Asp Leu Leu Gin 180 Cys Tyr ile Phe ser Ser Pro Phe Pro vai Arg Ala Ala Leu Leu Leu Ala pro Lys Gly Pro Pro Gly 10 val Ala 15 Glu Pro Ala Leu Ser Leu Trp 25 30 Ala Gly Ala val Ala Cys Ala Met Leu 40 45 val Gin ser Leu Arg Arg 60 Glu Glu ser Arg ser Gin Asn Gly Gly Tyr pro Trp 75 Glu 80 Ser Asp Ala Leu Glu Ala Trp Asn 90 95 Arg Ala val Leu Thr Gin Lys Gin Lys 105 110 Leu val pro lie Asn Ala Thr Ser Lys 120 125 val Met Trp Gin Pro Ala Leu Arg Arg 140 Ala 160 Gly Tyr Gly val 155 Phe Arg ile Gin Asp Gin val Leu Gin ASp val Thr Phe 170 175 Thr Arg Glu 185 Gly Gin Gly Arg Gin 190 Glu Met Pro Ser His Pro ASp Arg Ala Tyr 200 205 Gly Ile val Phe His Leu HiS Gin Asp 220 Ala Arg Ala Lys 235 Leu Asn Leu Ser pro 240 val Lys Leu 250 <400> 38

Met ργο Ala 1

Asn Met Gly

Leu Ser Trp 35

Leu Thr Gin 50

Leu Gin Gly 65

Gin ser Leu

Gly Glu Arg

Lys Gin His 115

Asp Asp Ser 130

Gly Arg Gly 145

Gly vai Tyr

Thr Met Gly

Leu Phe Arg 195

Asn Ser Cys 210

Leu Ser vai 225

His Gly Thr

Thr Glu Leu 55

Gly Gly Pro 70

Glu Gin Ser 85

Arg Lys Arg val Leu His vai Thr Glu 135

Gin Ala Gin 150

Leu Tyr ser 165 val val Ser lie Arg Ser

Ser Ala Gly 215 ile Pro Arg 230

Leu Gly Phe 245 <210> 39 <211> 762 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (7)... (759) 152 <4Ο0> 39 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc 48

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu vai Ala Ala Pro 15 10 li3 tgg gtc ctg tcc gag CCC aaa tet tgt gac aaa act cac aca tgc yo Arg Trp vai Leu ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr cys 15 20 25 30 cca 144 ΡΓΟ ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg 999 gga ccg tea gtc ttc ctc Pro cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser val Phe Leu 35 40 45 ttc 192 phe ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg ate tcc cgg acc cct gag pro pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met ile Ser Arg Thr Pro Glu 50 55 60 gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag 240 Glu vai Thr Cys vai vai vai Asp vai Ser His Glu ASp Pro val Lys 65 70 75 ttc 288 Phe aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag Asn 80 Trp Tyr vai ASP Gly 85 vai Glu val His Asn 90 Ala Lys Thr Lys m pro cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg val Val Ser val Leu 95 100 105 110 acc 384 Thr gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag vai Leu His Gin 115 Asp Trp Leu Asn Gly 120 Lys Glu Tyr Lys 3? Lys gtc 432 Vai tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc ate gag aaa acc ate tcc aaa Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 130 135 140 gcc 480 Ala aaa 999 cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 145 150 155 síi gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu val Lys 160 165 170 153 ggc ttc tat ccc age gac ate gee 576 lie Ala Gly Phe Tyr Pro Ser ASP 175 180 III Pro gag aac aac tac aag acc acg Glu Asn Asn Tyr 195 Lys Thr Thr tcc ttc ttc ctc tac age aag ctc 672 Phe Ser Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 210 cag 720 Gin ggg aac gtc ttc tea tgc tcc Gly Asn vai Phe Ser Cys Ser 225 230 cac 762 tac acg cag aag age ctc tcc Hl S Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 240 245

<210> 40 <211> 251 <212> PRT <213> Homo sapiens gtg gag tgg gag age aat ggg cag vai Glu Trp 185 Gl u Ser Asn Gly Gin 190 cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc pro pro 200 vai Leu Asp ser Asp 205 Gly acc gtg gac aag age agg tgg cag Thr 215 vai ASp Lys Ser Arg 220 Trp Gin gtg atg cat gag gct ctg cac aac Vai Met HiS Glu Ala 235 Leu His Asn ctg tet ccg ggt aaa tga Leu Ser Pro Gly Lys 250 <400> 40 Met 1 Lys Hi S Leu Trp 5 Phe Phe Leu Vai Leu Ser Glu 20 pro Pro Lys Ser Cys cys Pro Ala 35 Glu Leu Leu Gly 40 pro Lys 50 pro Lys Asp Thr Leu 55 Met Cys 65 vai vai vai Asp vai 70 Ser His Trp Tyr vai Asp Gly 85 Asn Vai Glu vai Glu Glu Gin Tyr 100 Asp Ser Thr Tyr Leu His Gin 115 Trp Leu Asn Gly 120

Leu Leu 10 vai Ala Ala Pro Arg 15 Trp Asp 25 Lys Thr His Thr Cys 30 Pro Pro Gly pro Ser vai Phe 45 Leu Phe pro ile ser Arg Thr 60 Pro Glu vai Thr Glu ASp Pro 75 Glu vai Lys Phe Asn 80 His Asn 90 Vai Ala Lys Thr Lys Pro 95 Thr Arg Arg 105 vai Ser vai Leu 110 vai Lys Glu Tyr Lys cys 125 Lys vai ser 154

Asn Lys Ai a Leu Pro Ala Pro ile uí 130 135 Gin Pro Arg Glu Pro 150 Gin vai Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser 165 Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu 180 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 195 200 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr vai 210 215 Asn vai Phe ser cys ser vai Met 225 230 Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 245 <210> 41

<211> 35 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Lider tPA Optimizado <400> 41

Glu Lys Thr lie 140 Pro ser Lys Ala Lys Tyr Thr Leu 155 Pro Ser Arg Asp 160 Leu Thr 170 Cys Leu vai Lys Gly 175 Phe Trp 185 Glu Ser Asn Gly Gin 190 Pro Glu vai Leu Asp Ser Asp 205 Gly Ser phe ASp Lys Ser Arg 220 Leu Trp Gin Gin Gly His Glu Pro Gly 250 Ala 235 Lys Hl s Asn His Tyr 240

Met ASP Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys vai Leu Leu Leu Cys Gly 15 10 15

Ala vai phe vai ser Leu ser Gin Glu ile His Ala Glu Leu Arg Arg 20 25 30 phe Arg Arg 35

Lisboa, 2 de Julho de 2013 155

Claims (20)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Antagonista de BLyS e micofenolato mofetil (MMF), para utilização no tratamento de um distúrbio auto-imune regulado por células B num mamífero, através de redução dos níveis de imunoglobulina, em que o referido antagonista de BLyS é uma proteína de fusão TACI-Fc compreendendo o domínio extracelular de TACI ou um seu fragmento funcional; e em que o referido antagonista de BLyS e o referido MMF são para administração numa quantidade que actua sinergicamente para reduzir os níveis de imunoglobulina; em que, de um modo preferido, o nível de imunoglobulina que é reduzido é seleccionado do grupo consistindo de IgM, IgG e IgA.
2. 2. Antagonista de BLyS e micofenolato mofetil (MMF) para utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que o antagonista de BLyS é administrado numa dosagem de 1 a 2,5 mg/kg e o MMF é administrado numa dosagem de 1 a 4 mg/kg; em que o antagonista de BLyS e o MMF actuam sinergicamente para reduzir os níveis de imunoglobulina; em que, de um modo preferido, o nível de imunoglobulina que é reduzido é seleccionado do grupo consistindo de IgM, IgG e IgA.
3. 3. Antagonista de BLyS e micofenolato mofetil (MMF) para utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que a doença 1 auto-imune é seleccionada do grupo consistindo de artrite reumatóide juvenil, doença de Wegener, doença inflamatória do intestino, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia auto-imune, psoriase, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM, miastenia gravis, vasculite, diabetes mellitus, sindrome de Reinauld, glomerulonefrite, hepatite auto-imune e tiroidite auto-imune.
4. 4. Antagonista de BLyS e micofenolato mofetil (MMF) para utilização de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, em que a doença auto-imune é nefrite lúpica.
5. 5. Antagonista de BLyS e micofenolato mofetil (MMF) para utilização de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, em que a doença auto-imune é lúpus eritematoso sistémico.
6. 6. Antagonista de BLyS e micofenolato mofetil (MMF) para utilização de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, em que a doença auto-imune é artrite reumatóide.
7. 7. Antagonista de BLyS e micofenolato mofetil (MMF) para utilização de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, em que a doença auto-imune é sindrome de Sjorgen.
8. 8. Antagonista de BLyS e micofenolato mofetil (MMF) para utilização de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, em que o antagonista de BLyS e MMF são para administração em conjunto com terapia utilizando um segundo fármaco imunossupressor seleccionado do grupo consistindo de fármacos anti-inflamatórios não esteróides (NSAID), glucocorticóides, prednisona e fármacos anti-reumáticos modificadores de doença (DMARD). 2
9. 9. Antagonista de BLyS e micofenolato mofetil (MMF) para utilização de acordo com qualquer das Reivindicações 1-7, em que a proteína de fusão TACI-Fc compreende os aminoácidos 30 a 110 da SEQ ID N°: 2.
10. 10. Antagonista de BLyS e micofenolato mofetil (MMF) para utilização de acordo com qualquer das Reivindicações 1-7, em que a proteína de fusão TACI-Fc compreende a sequência polipeptídica seleccionada do grupo consistindo de SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 23 e SEQ ID N°: 25, em que a sequência do sinal de activação do plasminogénio tecidular modificado (SEQ ID N° : 41) foi removida da referida sequência polipeptídica.
11. 11. Antagonista de BLyS e micofenolato mofetil (MMF) para utilização de acordo com qualquer das Reivindicações 1-7, em que a proteína de fusão TACI-Fc compreende a sequência polipeptídica apresentada na SEQ ID N°: 23, em que a sequência do sinal de activação do plasminogénio tecidular modificado foi removida da referida sequência polipeptídica.
12. 12. Antagonista de BLyS e micofenolato mofetil (MMF) para utilização de acordo com qualquer das Reivindicações 1-7, em que a proteína de fusão TACI-Fc compreende uma forma excretada de uma sequência polipeptídica seleccionada do grupo consistindo da SEQ ID N° : 19, SEQ ID N° : 21, SEQ ID N°: 23 e SEQ ID N°: 25.
13. 13. Antagonista de BLyS e micofenolato mofetil (MMF) para utilização de acordo com qualquer das Reivindicações 1-7, em que a proteína de fusão Fc compreende uma forma excretada do polipéptido apresentado na SEQ ID N°: 23. 3
14. 14. Composição compreendendo um antagonista de BLyS e micofenolato mofetil (MMF), em que o referido antagonista de BLyS compreende uma proteina de fusão TACI-Fc compreendendo o dominio extracelular de TACI ou um seu fragmento funcional e em que o referido antagonista de BLyS e o referido MMF estão presentes numa quantidade que actua sinergicamente para reduzir os niveis de imunoglobulina, em que, de um modo preferido, o nivel de imunoglobulina que é reduzido é seleccionado do grupo consistindo de IgM, IgG e IgA.
15. 15. Kit compreendendo uma composição de acordo com a Reivindicação 14 e um rótulo, em que o rótulo indica que a composição é para tratamento de um distúrbio auto-imune regulado por células B.
16. 16. Composição ou kit da Reivindicação 14 ou 15, em que a proteína de fusão TACI-Fc compreende os aminoácidos 30 a 110 da SEQ ID N°: 2.
17. 17. Composição ou kit da Reivindicação 16, em que a proteína de fusão TACI-Fc compreende a sequência polipeptídica seleccionada do grupo consistindo de SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 23 e SEQ ID N°: 25, em que a sequência do sinal de activação do plasminogénio tecidular modificado (SEQ ID N°: 41) foi removida da referida sequência polipeptídica.
18. 18. Composição ou kit da Reivindicação 17, em que a proteína de fusão Fc compreende a sequência polipeptídica apresentada na SEQ ID N°: 23, em que a sequência do sinal de activação do 4 plasminogénio tecidular modificado foi removida da referida sequência polipeptidica.
19. 19. Composição ou kit da Reivindicação 16, em que a proteina de fusão Fc compreende uma forma excretada de uma sequência polipeptidica seleccionada do grupo consistindo da SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 23 e SEQ ID N°: 25.
20. 20. Composição ou kit da Reivindicação 19, em que a proteina de fusão Fc compreende uma forma excretada do polipéptido apresentado na SEQ ID N°: 23. Lisboa, 2 de Julho de 2013 5