CN116903727A - 具有和不具有t细胞抑制蛋白的april和baff抑制性免疫调节蛋白及其使用方法 - Google Patents

具有和不具有t细胞抑制蛋白的april和baff抑制性免疫调节蛋白及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本文提供免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白展现单独的BAFF和APRIL(或BAFF/APRIL异三聚体)的中和活性，或者还与对T细胞共刺激的抑制偶联的所述中和活性。本文提供的免疫调节蛋白包括单独的B细胞成熟抗原(BCMA)的变体结构域，或者抑制B细胞应答并且还可以抑制T细胞共刺激的多结构域免疫调节蛋白。还提供编码所述免疫调节蛋白的核酸分子。所述免疫调节蛋白提供针对多种免疫疾病或病症的治疗效用。还提供用于制备和使用这样的蛋白质的组合物和方法。

Description

具有和不具有T细胞抑制蛋白的APRIL和BAFF抑制性免疫调节 蛋白及其使用方法
本申请是申请号为202180047593.5的中国专利申请(申请日：2021年5月17日，发明名称：具有和不具有T细胞抑制蛋白的APRIL和BAFF抑制性免疫调节蛋白及其使用方法)的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求对2020年5月8日提交的标题为“具有和不具有T细胞抑制蛋白的APRIL和BAFF抑制性免疫调节蛋白及其使用方法(APRIL AND BAFF INHIBITORYIMMUNOMODULATORY PROTEINS WITH AND WITHOUT A T CELL INHIBITORY PROTEIN ANDMETHODS OF USE THEREOF)”的美国临时申请63/022,373、2020年6月3日提交的标题为“具有和不具有T细胞抑制蛋白的APRIL和BAFF抑制性免疫调节蛋白及其使用方法(APRIL ANDBAFF INHIBITORY IMMUNOMODULATORY PROTEINS WITH AND WITHOUT A T CELLINHIBITORY PROTEIN AND METHODS OF USE THEREOF)”的美国临时申请63/034,361、以及2020年9月18日提交的标题为“具有和不具有T细胞抑制蛋白的APRIL和BAFF抑制性免疫调节蛋白及其使用方法(APRIL AND BAFF INHIBITORY IMMUNOMODULATORY PROTEINS WITHAND WITHOUT A T CELL INHIBITORY PROTEIN AND METHODS OF USE THEREOF)”的美国临时申请63/080,643的优先权，所述申请中每一申请的内容出于所有目的通过引用以其整体并入。
通过引用并入序列表
本申请是与电子形式的序列表一起提交的。序列表以2021年5月4日创建的标题为761612002340SeqList.TXT的文件提供，其大小为992,602字节。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开文本提供免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白展现单独的BAFF和APRIL(或BAFF/APRIL异三聚体)的中和活性，或者还与对T细胞共刺激的抑制偶联的所述中和活性。所述免疫调节蛋白包括单独的B细胞成熟抗原(BCMA)的变体结构域，以及抑制B细胞应答并且还可以抑制T细胞共刺激的多结构域免疫调节蛋白。本公开文本还提供编码所述免疫调节蛋白的核酸分子。所述免疫调节蛋白提供针对多种免疫疾病或病症的治疗效用。提供用于制备和使用这样的蛋白质的组合物和方法。
背景技术
通过在涉及可溶配体与其受体之间的相互作用的过程中进行干预来调节免疫应答越来越引起医学方面的兴趣。目前，用于增强或抑制免疫应答的生物制品通常限制于抗体(例如，抗PD-1抗体)或针对单一细胞表面分子的可溶受体(例如，Fc-CTLA-4)。需要改进的治疗剂，其可以调节免疫应答，并且特别地调节B细胞免疫应答，并且在一些情形中还调节T细胞免疫应答。提供了满足这样的需求的实施方案。
发明内容
本文提供一种免疫调节蛋白，其含有至少一种T细胞抑制分子(TIM)，所述至少一种T细胞抑制分子与T细胞刺激性受体或T细胞刺激性受体的配体结合；并且拮抗T细胞刺激性受体的活性；以及至少一种B细胞抑制分子(BIM)，所述至少一种B细胞抑制分子与B细胞刺激性受体的配体结合和/或拮抗B细胞刺激性受体的活性。在一些任何实施方案中，所述免疫调节蛋白含有至少一种T细胞抑制分子(TIM)，所述至少一种T细胞抑制分子与T细胞刺激性受体或T细胞刺激性受体的配体结合；或拮抗T细胞刺激性受体的活性；以及至少一种B细胞抑制分子(BIM)，所述至少一种B细胞抑制分子与B细胞刺激性受体的配体结合和/或拮抗B细胞刺激性受体的活性。
在一些任何实施方案中，所述TIM与T细胞刺激性受体的配体结合。在一些任何实施方案中，所述T细胞刺激性受体是CD28；并且所述T细胞刺激性受体的配体是CD80或CD86。在一些任何实施方案中，所述T细胞刺激性受体是CD28；或者所述T细胞刺激性受体的配体是CD80或CD86。
在一些任何实施方案中，所述TIM是CTLA-4细胞外结构域或其与CD80或CD86结合的结合部分。在一些任何实施方案中，所述CTLA-4细胞外结构域或其结合部分由以下组成：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列、具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少85％的序列同一性的变体CTLA-4氨基酸序列；或其含有IgV结构域的部分。在一些任何实施方案中，所述CTLA-4细胞外结构域由SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列组成。在一些任何实施方案中，所述CTLA-4细胞外结构域由具有与SEQ ID NO:1或其含有IgV结构域的部分至少85％的序列同一性的变体CTLA-4氨基酸序列组成，其中所述变体序列包含SEQ ID NO:1或其含有所述IgV结构域的部分中的一个或多个氨基酸取代。
在一些任何实施方案中，所述变体CTLA-4序列包含氨基酸取代C122S。在一些实施方案中，所述CTLA-4细胞外结构域或其结合部分示于SEQ ID NO:668中。
在一些任何实施方案中，所述变体CTLA-4与CD80和CD86的胞外域结合，任选地其中与SEQ ID NO:1中所示的序列或其含有所述IgV结构域的部分相比，与CD80和CD86中的一种或两种的结合亲和力有所增加。
在一些任何实施方案中，变体CLTA-4多肽中的所述一个或多个氨基酸取代包括选自以下的氨基酸取代：L12F、R16H、G29W、T53S、M56T、N58S、L63P、L98Q或Y105L或其组合。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括G29W、L98Q和Y105L。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是G29W/N58S/L63P/Q82R/L98Q/Y105L。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是L12F/R16H/G29W/M56T/L98Q/Y105L。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是G29W/L98Q/Y105L。
在一些任何实施方案中，变体CTLA-4多肽是如下多肽：其中所述变体CTLA-4多肽具有与SEQ ID NO:1至少约85％、至少约90％或至少约95％的序列同一性，并且含有如所述的一个或多个氨基酸取代。
在一些任何实施方案中，变体CTLA-4多肽是如下多肽：其中所述变体CTLA-4多肽具有与SEQ ID NO:2至少约85％、至少约90％或至少约95％的序列同一性，并且含有如所述的一个或多个氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述CTLA-4细胞外结构域或其结合部分示于以下中的任一项中：SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:186或其包含所述IgV结构域的部分。
在一些任何实施方案中，所述变体CTLA-4由SEQ ID NO:92中所示的序列或其含有所述IgV结构域的部分组成。在一些任何实施方案中，所述变体CTLA-4由SEQ ID NO:113中所示的序列或其含有所述IgV结构域的部分组成。在一些任何实施方案中，所述变体CTLA-4由SEQ ID NO:165中所示的序列或其含有所述IgV结构域的部分组成。在一些任何实施方案中，所述变体CTLA-4由SEQ ID NO:186中所示的序列或其含有所述IgV结构域的部分组成。
在一些任何实施方案中，B细胞刺激性受体的所述配体是APRIL或BAFF；并且所述B细胞刺激性受体是TACI、BCMA或BAFF受体。在一些任何实施方案中，B细胞刺激性受体的所述配体是APRIL或BAFF；或者所述B细胞刺激性受体是TACI、BCMA或BAFF受体。
在一些任何实施方案中，所述BIM是TACI多肽，所述TACI多肽由TACI细胞外结构域或其与APRIL、BAFF或BAFF/APRIL异三聚体结合的结合部分组成。在一些实施方案中，所述BIM是TACI细胞外结构域或其具有如以下所示的细胞外结构域序列的结合部分：(i)SEQ IDNO:709中所示的氨基酸序列，(ii)具有与SEQ ID NO:709至少95％的序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)(i)或(ii)的包含CRD1结构域和CRD2结构域中的一个或两个的部分，所述部分与APRIL、BAFF或BAFF/APRIL异三聚体结合。在一些实施方案中，所述BIM是TACI细胞外结构域或其包含所述CRD1结构域和所述CRD2结构域的结合部分。
在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述TACI多肽是由SEQ ID NO:516中所示的序列组成的截短的野生型TACI细胞外结构域。
在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是截短的野生型TACI细胞外结构域或者是其变体，其中所述截短的野生型TACI细胞外结构域含有富半胱氨酸结构域2(CRD2)但缺少完整的富半胱氨酸结构域1(CRD1)，和/或其中所述变体TACI多肽包含所述截短的野生型TACI细胞外结构域中的一个或多个氨基酸取代。
在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是截短的野生型TACI细胞外结构域或者是其变体，其中关于SEQ ID NO:709中所示的位置，所述截短的野生型TACI细胞外结构域由氨基酸残基67-118内所含的包括氨基酸残基71-104的连续序列组成，其中所述变体TACI多肽包含所述截短的野生型TACI细胞外结构域中的一个或多个氨基酸取代。
在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述截短的野生型TACI细胞外结构域的长度为35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、59、50或51个氨基酸。在一些任何实施方案中，所述截短的野生型TACI细胞外结构域由SEQ ID NO:709中所示的氨基酸残基68-110组成。在一些任何实施方案中，所述TACI多肽由SEQ ID NO:528中所示的氨基酸序列组成，或者是其含有SEQ ID NO:528中所示的序列中的一个或多个氨基酸取代的变体。
在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述TACI多肽是由SEQ ID NO:528中所示的序列组成的截短的野生型TACI细胞外结构域。
在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述截短的TACI多肽或其变体与APRIL、BAFF或BAFF/APRIL异三聚体结合。
在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述TACI多肽是变体TACI多肽，其中与所述截短的TACI多肽相比，所述变体TACI多肽具有增加的与APRIL和BAFF中的一种或两种的结合亲和力。
在一些任何实施方案中，所述变体TACI多肽包含参考TACI多肽的细胞外结构域(ECD)或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于SEQID NO:709中所示编号的选自74、75、76、77、78、79、82、83、84、85、86、87、88、92、95、97、98、99、101、102和103的位置处。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代选自E74V、Q75E、Q75R、G76S、K77E、F78Y、Y79F、L82H、L82P、L83S、R84G、R84L、R84Q、D85E、D85V、C86Y、I87L、I87M、S88N、I92V、Q95R、P97S、K98T、Q99E、A101D、Y102D、F103S、F103V、F103Y或其保守氨基酸取代。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括E74V、K77E、Y79F、L82H、L82P、R84G、R84L、R84Q、D85V或C86Y中的至少一个。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是D85E/K98T、I87L/K98T、L82P/I87L、G76S/P97S、K77E/R84L/F103Y、Y79F/Q99E、L83S/F103S、K77E/R84Q、K77E/A101D、K77E/F78Y/Y102D、Q75E/R84Q、Q75R/R84G/I92V、K77E/A101D/Y102D、R84Q/S88N/A101D、R84Q/F103V、K77E/Q95R/A101D或I87M/A101D。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是K77E/F78Y/Y102D。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是Q75E/R84Q。在一些实施方案中，作为TACI多肽的BIM是SEQ ID NO:541中所示的变体TACI多肽。在一些实施方案中，作为TACI多肽的BIM是SEQ ID NO:542中所示的变体TACI多肽。
在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述TACI多肽是变体TACI多肽，所述变体TACI多肽包含参考TACI多肽的细胞外结构域(ECD)或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于SEQ ID NO:709中所示位置编号的选自40、59、60、61、74、75、76、77、78、79、82、83、84、85、86、87、88、92、95、97、98、99、101、102和103的位置处。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代选自W40R、Q59R、R60G、T61P、E74V、Q75E、Q75R、G76S、K77E、F78Y、Y79F、L82H、L82P、L83S、R84G、R84L、R84Q、D85E、D85V、C86Y、I87L、I87M、S88N、I92V、Q95R、P97S、K98T、Q99E、A101D、Y102D、F103S、F103V、F103Y或其保守氨基酸取代。
在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括E74V、K77E、Y79F、L82H、L82P、R84G、R84L、R84Q、D85V或C86Y中的至少一个。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代K77E。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代R84G。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代R84Q。
在一些任何实施方案中，所述参考TACI多肽是截短的多肽，所述截短的多肽由TACI的细胞外结构域或其与APRIL、BAFF或BAFF/APRIL异三聚体结合的特异性结合部分组成。
在一些任何实施方案中，所述参考TACI多肽包含(i)SEQ ID NO:709中所示的氨基酸序列，(ii)具有与SEQ ID NO:709至少95％的序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)(i)或(ii)的含有CRD1结构域和CRD2结构域中的一个或两个的部分，所述部分与APRIL、BAFF或BAFF/APRIL异三聚体结合。在一些任何实施方案中，所述参考TACI多肽缺少N末端甲硫氨酸。在一些任何实施方案中，所述参考TACI多肽包含所述CRD1结构域和所述CRD2结构域。在一些任何实施方案中，所述参考TACI多肽包含SEQ ID NO:516中所示的序列。在一些任何实施方案中，所述参考TACI多肽由SEQ ID NO:516中所示的序列组成。在一些任何实施方案中，所述参考TACI多肽基本上由所述CRD2结构域组成。在一些任何实施方案中，所述参考TACI多肽包含SEQ ID NO:528中所示的序列。在一些任何实施方案中，所述参考TACI多肽由SEQ ID NO:528中所示的序列组成。
在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是D85E/K98T、I87L/K98T、R60G/Q75E/L82P、R60G/C86Y、W40R/L82P/F103Y、W40R/Q59R/T61P/K98T、L82P/I87L、G76S/P97S、K77E/R84L/F103Y、Y79F/Q99E、L83S/F103S、K77E/R84Q、K77E/A101D、K77E/F78Y/Y102D、Q75E/R84Q、Q75R/R84G/I92V、K77E/A101D/Y102D、R84Q/S88N/A101D、R84Q/F103V、K77E/Q95R/A101D或I87M/A101D。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是K77E/F78Y/Y102D。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是Q75E/R84Q。
在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述变体TACI多肽具有与SEQ ID NO:709至少约85％、至少约90％或至少约95％的序列同一性，并且含有如所述的一个或多个氨基酸取代。
在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述变体TACI多肽具有与SEQ ID NO:719至少约85％、至少约90％或至少约95％的序列同一性，并且含有如所述的一个或多个氨基酸取代。
在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述变体TACI多肽具有与SEQ ID NO:718至少约85％、至少约90％或至少约95％的序列同一性，并且含有如所述的一个或多个氨基酸取代。
在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述变体TACI多肽具有与SEQ ID NO:516至少约85％、至少约90％或至少约95％的序列同一性，并且含有如所述的一个或多个氨基酸取代。
在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述变体TACI多肽具有与SEQ ID NO:528至少约85％、至少约90％或至少约95％的序列同一性，并且含有如所述的一个或多个氨基酸取代。
在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是如下多肽：其中与所述参考TACI多肽相比，所述变体TACI多肽具有增加的与APRIL和BAFF中的一种或两种的结合亲和力。在一些任何实施方案中，所述变体TACI多肽具有增加的与APRIL的结合亲和力。在一些任何实施方案中，所述变体TACI多肽具有增加的与BAFF的结合亲和力。在一些任何实施方案中，所述变体TACI多肽具有增加的与APRIL和BAFF的结合亲和力。在一些任何实施方案中，所述增加的对BAFF或APRIL的结合亲和力是独立地增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。
在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述变体TACI多肽包含SEQ ID NO:517-527、536、537、682-701中任一项中所示的序列。在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述变体TACI多肽包含SEQ ID NO:529-535、538-550或673-681中任一项中所示的序列。在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是如下多肽：其中变体TACI多肽由SEQ ID NO:517-527、536、537、682-701中任一项中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述变体TACI多肽由SEQ ID NO:529-535、538-550、673-681中任一项中所示的序列组成或基本上由其组成。
在一些任何实施方案中，BIM是如下TACI多肽：其中所述变体TACI多肽示于以下中的任一项中：SEQ ID NO:535、SEQ ID NO:541、SEQ ID NO:542或SEQ ID NO:688。
在一些任何实施方案中，BIM是TACI多肽，所述TACI多肽是如下多肽：其中所述变体TACI多肽由SEQ ID NO:535中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述变体TACI多肽由SEQ ID NO:541中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述变体TACI多肽由SEQ ID NO:542中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述变体TACI多肽由SEQ ID NO:688中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，作为TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述变体TACI多肽由SEQ ID NO:535中所示的序列组成或基本上由其组成。
在一些任何实施方案中，所述BIM是BCMA多肽，所述BCMA多肽由BCMA细胞外结构域或其与APRIL、BAFF或BAFF/APRIL异三聚体结合的结合部分组成。在一些任何实施方案中，所述BCMA细胞外结构域或其结合部分是如以下所示的细胞外结构域序列：(i)SEQ ID NO:356中所示的氨基酸序列，(ii)具有与SEQ ID NO:356至少95％的序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)(i)或(ii)的包含CRD结构域的部分。
在一些任何实施方案中，所述BCMA多肽由SEQ ID NO:356中所示的序列组成。在一些任何实施方案中，所述BCMA多肽是变体BCMA多肽，所述变体BCMA多肽含有参考BCMA多肽的细胞外结构域(ECD)或特异性结合片段中的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于SEQ ID NO:710中所示编号的选自9、10、11、14、16、19、20、22、25、27、29、30、31、32、35、36、39、43、45、46、47和48的位置处。
本文提供一种含有变体BCMA多肽的免疫调节蛋白，其中所述变体BCMA多肽包含参考BCMA多肽的细胞外结构域(ECD)或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于SEQ ID NO:710中所示位置编号的选自9、10、11、14、16、19、20、22、25、27、29、30、31、32、35、36、39、43、45、46、47和48的位置处。在一些任何实施方案中，所述参考BCMA多肽是如下多肽，所述多肽由BCMA的细胞外结构域或其与APRIL、BAFF或BAFF/APRIL异三聚体结合的特异性结合部分组成。在一些任何实施方案中，所述参考BCMA多肽包含(i)SEQ ID NO:710中所示的氨基酸序列，(ii)具有与SEQ ID NO:710至少95％的序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)(i)或(ii)的含有所述CRD的部分。在一些任何实施方案中，所述参考BCMA缺少N末端甲硫氨酸。
在一些任何实施方案中，所述参考BCMA多肽包含(i)SEQ ID NO:356中所示的氨基酸序列，(ii)具有与SEQ ID NO:356至少95％的序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)(i)或(ii)的含有所述CRD的部分。在一些任何实施方案中，所述参考BCMA多肽包含SEQ ID NO:356中所示的序列。在一些任何实施方案中，所述参考BCMA多肽由SEQ ID NO:356中所示的序列组成。
在一些任何实施方案中，BCMA多肽的一个或多个氨基酸取代选自S9G、S9N、S9Y、Q10E、Q10P、N11D、N11S、F14Y、S16A、H19A、H19C、H19D、H19E、H19F、H19G、H19I、H19K、H19L、H19M、H19N、H19P、H19Q、H19R、H19S、H19T、H19V、H19W、H19Y、A20T、I22L、I22V、Q25E、Q25F、Q25G、Q25H、Q25I、Q25K、Q25L、Q25M、Q25S、Q25V、Q25Y、R27H、R27L、S29P、S30G、S30Y、N31D、N31G、N31H、N31K、N31L、N31M、N31P、N31S、N31V、N31Y、T32I、T32S、L35A、L35M、L35P、L35S、L35V、L35Y、T36A、T36G、T36N、T36M、T36S、T36V、R39L、R39Q、A43E、A43S、V45A、V45D、V45I、T46A、T46I、N47D、N47Y、S48G或其保守氨基酸取代。
在一些任何实施方案中，BCMA多肽的一个或多个氨基酸取代包含在位置19处的至少一个取代。在一些实施方案中，至少一个取代选自H19A、H19C、H19D、H19E、H19F、H19G、H19I、H19K、H19L、H19M、H19N、H19P、H19Q、H19R、H19S、H19T、H19V、H19W、H19Y。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代H19L。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代H19K。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代H19R。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代H19Y。
在一些任何实施方案中，BCMA多肽的一个或多个氨基酸取代包含在位置25处的至少一个取代。在一些实施方案中，至少一个取代选自Q25E、Q25F、Q25G、Q25H、Q25I、Q25K、Q25L、Q25M、Q25S、Q25V、Q25Y。
在一些任何实施方案中，BCMA多肽的一个或多个氨基酸取代包含在位置31处的至少一个取代。在一些实施方案中，至少一个取代选自N31D、N31G、N31H、N31K、N31L、N31M、N31P、N31S、N31V、N31Y。
在一些任何实施方案中，BCMA多肽的一个或多个氨基酸取代包含在位置35处的至少一个取代。在一些实施方案中，至少一个取代选自L35A、L35M、L35P、L35S、L35V、L35Y。
在一些任何实施方案中，BCMA多肽的一个或多个氨基酸取代包含在位置36处的至少一个取代。在一些实施方案中，至少一个取代选自T36A、T36G、T36N、T36M、T36S、T36V。
在一些任何实施方案中，BCMA多肽的一个或多个氨基酸取代是H19Y/S30G；H19Y/V45A；F14Y/H19Y；H19Y/V45D；H19Y/A43E；H19Y/T36A；H19Y/I22V；N11D/H19Y；H19Y/T36M；N11S/H19Y；H19Y/L35P/T46A；H19Y/N47D；S9D/H19Y；H19Y/S30G/V45D；H19Y/R39Q；H19Y/L35P；S9D/H19Y/R27H；Q10P/H19Y/Q25H；H19Y/R39L/N47D；N11D/H19Y/N47D；H19Y/T32S；N11S/H19Y/S29P；H19Y/R39Q/N47D；S16A/H19Y/R39Q；S9N/H19Y/N31K/T46I；H19Y/R27L/N31Y/T32S/T36A；N11S/H19Y/T46A；H19Y/T32I；S9G/H19Y/T36S/A43S；H19Y/S48G；S9N/H19Y/I22V/N31D；S9N/H19Y/Q25K/N31D；S9G/H19Y/T32S；H19Y/T36A/N47Y；H19Y/V45A/T46I；H19Y/Q25K/N31D；H19Y/Q25H/R39Q/V45D；H19Y/T32S/N47D；Q10E/H19Y/A20T/T36S；H19Y/T32S/V45I；H19F/Q25E/N31L/L35Y/T36S；H19F/Q25F/N31S/T36S；H19I/Q25F/N31S/T36V；H19F/Q25V/N31M/T36S；H19Y/Q25Y/N31L/L35Y/T36S；H19F/Q25I/N31M/L35A/T36S；H19I/Q25L/N31L/L35Y/T36S；H19F/Q25L/N31G/L35P/T36A；H19Y/I22L/N31G；H19F/I22V/Q25M/N31P/T36M；H19Y/N31L/L35Y/T36S；H19L/S30G/N31H/L35A；H19L/Q25S/N31V/L35S/T36V；H19L/Q25S/S30Y/N31G/L35M/T36V；H19F/Q25F/N31L/L35Y/T36S；H19F/Q25F/N31S/T36G；H19F/I22V/Q25S/N31V/L35S/T36V；H19F/Q25G/N31S/L35V/T36N；H19L/Q25H/N31D/L35S；或H19F/Q25F/N31S/L35Y/T36S。
在一些任何实施方案中，BCMA多肽的一个或多个氨基酸取代包括H19F、H19L、H19K、H19M、H19R、H10Y、N11D/H19Y/N47D、H19Y/R39Q/N47D；S16A/H19Y/R39Q、S9G/H19Y/T32S；H19Y/T36A/N47Y；或Q10E/H19Y/A20T/T36S。在一些任何实施方案中，BCMA多肽的一个或多个氨基酸取代包括S16A/H19Y/R39Q。
在一些任何实施方案中，变体BCMA多肽是如下多肽：其中所述变体BCMA多肽具有与SEQ ID NO:710至少约85％、至少约90％或至少约95％的序列同一性，并且含有如所述的一个或多个氨基酸取代。
在一些任何实施方案中，变体BCMA多肽是如下多肽：其中所述变体BCMA多肽具有与SEQ ID NO:356至少约85％、至少约90％或至少约95％的序列同一性，并且含有如所述的一个或多个氨基酸取代。
在一些任何实施方案中，与所述参考BCMA多肽相比，所述变体BCMA多肽具有多达10个氨基酸取代。在一些任何实施方案中，与所述参考BCMA多肽相比，所述变体BCMA多肽具有多达5个氨基酸取代。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽具有与SEQ ID NO:356至少90％的序列同一性。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽具有与SEQ ID NO:356至少95％的序列同一性。
在一些任何实施方案中，与所述参考BCMA多肽相比，所述变体BCMA多肽具有增加的与APRIL和BAFF中的一种或两种的结合亲和力。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽具有增加的与APRIL的结合亲和力。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽具有增加的与BAFF的结合亲和力。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽具有增加的与APRIL和BAFF的结合亲和力。在一些任何实施方案中，所述增加的对BAFF或APRIL的结合亲和力是独立地增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。
在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽包含SEQ ID NO:357-435中任一项中所示的序列。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:357-435中任一项中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽由SEQ IDNO:357中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:377中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:380中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:381中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:390中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:391中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:396中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:402中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:405中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽由SEQ IDNO:406中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:407中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:411中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:405中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:406中所示的序列组成或基本上由其组成。
在一些任何实施方案中，所述免疫调节蛋白含有与至少一种BCMA多肽连接的异源部分。在一些任何实施方案中，所述异源部分是半衰期延长部分、多聚化结构域、与细胞表面上的分子结合的靶向部分或可检测标记。在一些任何实施方案中，所述半衰期延长部分包括多聚化结构域、白蛋白、白蛋白结合多肽、Pro/Ala/Ser(PAS)、人绒毛膜促性腺素的β亚基的C末端肽(CTP)、聚乙二醇(PEG)、长非结构化亲水氨基酸序列(XTEN)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合小分子或其组合。
在一些任何实施方案中，所述免疫调节蛋白含有与至少一种BCMA多肽连接的免疫球蛋白的Fc区。
在一些任何实施方案中，所述至少一个TIM包括仅一个TIM。在一些任何实施方案中，所述至少一个TIM包括2、3、4或5个TIM，任选地其中每个TIM是相同的。在一些任何实施方案中，每个TIM是直接连接或经由接头间接连接，任选地其中所述接头是肽接头。在一些任何实施方案中，所述至少一个BIM包括仅一个BIM。在一些任何实施方案中，所述至少一个BIM包括2、3、4或5个BIM，任选地其中每个BIM是相同的。在一些任何实施方案中，每个BIM是直接连接或经由接头间接连接，任选地其中所述接头是肽接头。
在一些任何实施方案中，所述接头是肽接头并且所述肽接头选自GSGGS(SEQ IDNO:592)、GGGGS(G4S；SEQ ID NO:593)、GSGGGGS(SEQ ID NO:590)、GGGGSGGGGS(2xGGGGS；SEQ ID NO:594)、GGGGSGGGGSGGGGS(3xGGGGS；SEQ ID NO:595)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(4xGGGGS；SEQ ID NO:600)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(5XGGGGS；SEQ ID NO:671)、GGGGSSA(SEQ ID NO:596)或其组合。
在一些任何实施方案中，所述至少一个TIM和所述至少一个BIM是直接连接或经由接头间接连接，任选地其中所述接头包含肽接头和/或多聚化部分。在一些任何实施方案中，所述接头包括肽接头并且所述肽接头选自GSGGS(SEQ ID NO:592)、GGGGS(G4S；SEQ IDNO:593)、GSGGGGS(SEQ ID NO:590)、GGGGSGGGGS(2xGGGGS；SEQ ID NO:594)、GGGGSGGGGSGGGGS(3xGGGGS；SEQ ID NO:595)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(4xGGGGS；SEQ IDNO:600)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(5XGGGGS；SEQ ID NO:671)、GGGGSSA(SEQ ID NO:596)或其组合。在一些任何实施方案中，所述接头包括肽接头并且所述肽接头选自SEQ IDNO:711(1xEAAAK)、SEQ ID NO:712(2xEAAAK)、SEQ ID NO:713(3xEAAAK)、SEQ ID NO:714(4xEAAAK)、SEQ ID NO:715(5xEAAAK)、SEQ ID NO:665(6xEAAAK)。在一些任何实施方案中，所述免疫调节蛋白是单体和/或包含单一多肽链。
在一些任何实施方案中，所述至少一个TIM在所述多肽中位于所述至少一个BIM的氨基末端。在一些任何实施方案中，所述至少一个TIM在所述多肽中位于所述至少一个BIM的羧基末端。
在一些任何实施方案中，所述免疫调节蛋白还包含可检测标记，任选地其中所述可检测标记是Flag标签、His标签或myc标签。在一些任何实施方案中，所述免疫调节蛋白包含SEQ ID NO:618-623中任一项中所示的氨基酸序列，或者展现与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性且保留活性的序列。
在一些任何实施方案中，所述免疫调节蛋白包含SEQ ID NO:703-708中任一项中所示的氨基酸序列，或者展现与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性且保留活性的序列。
在一些实施方案中，所述TIM和所述BIM是通过多聚化结构域来连接。在一些任何实施方案中，所述多聚化结构域促进二聚化、三聚化、四聚化或五聚化。在一些任何实施方案中，所述多聚化结构域是免疫球蛋白Fc区。在一些任何实施方案中，所述免疫调节蛋白是二聚体。在一些任何实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区是同二聚Fc区。在一些任何实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区是异二聚Fc区。
在一些任何实施方案中，所述免疫调节蛋白是同二聚体，其中所述二聚体的每个多肽是相同的。在一些任何实施方案中，每个多肽包含至少一个TIM和至少一个BIM，并且其中所述至少一个TIM在每个多肽中位于所述至少一个BIM的氨基末端。在一些任何实施方案中，每个多肽包含至少一个TIM和至少一个BIM，并且其中所述至少一个TIM在每个多肽中位于所述至少一个BIM的羧基末端。
在一些任何实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区是IgG2 Fc结构域。在一些实施方案中，所述IgG2 Fc结构域包含SEQ ID NO:729或853中所示的氨基酸，或展现与SEQ ID NO:729或853至少95％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IgG2 Fc结构域示于SEQ ID NO:729中。在一些实施方案中，所述IgG2 Fc结构域示于SEQ ID NO:853中。
在一些任何实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区是IgG4 Fc结构域。在一些任何实施方案中，所述IgG4 Fc结构域是包含氨基酸取代S228P的变体IgG4 Fc结构域。在一些实施方案中，所述IgG4 Fc结构域包含SEQ ID NO:731或854中所示的氨基酸，或展现与SEQ ID NO:731或854至少95％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IgG4 Fc结构域示于SEQ ID NO:731中。在一些实施方案中，所述IgG4 Fc结构域示于SEQ ID NO:854中。
在一些任何实施方案中，所述免疫球蛋白Fc是IgG1 Fc结构域，或者是展现降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能的变体Fc，任选地如与野生型IgG1 Fc结构域相比。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc是IgG1 Fc结构域，并且所述Fc包括SEQ IDNO:597中所示的氨基酸序列。在一些任何实施方案中，所述免疫球蛋白Fc是野生型或修饰的IgG4 Fc结构域。
在一些任何实施方案中，所述免疫球蛋白Fc是变体IgG1 Fc结构域，其含有按照EU编号选自L234A、L234V、L235A、L235E、G237A、S267K、R292C、N297G和V302C的一个或多个氨基酸取代。在一些任何实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区含有按照EU编号的氨基酸取代L234A、L235E和G237A或者按照EU编号的氨基酸取代R292C、N297G和V302C。在一些实施方案中，所述Fc是包括SEQ ID NO:589中所示的氨基酸序列的变体Fc。在一些实施方案中，所述Fc是包括SEQ ID NO:855中所示的氨基酸序列的变体Fc。
在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白是BCMA-Fc融合蛋白。在一些任何实施方案中，所述BCMA-Fc融合蛋白包含以下结构：BCMA多肽(BCMA)-接头-Fc区。在一些实施方案中，所述BCMA-Fc融合蛋白示于SEQ ID NO:629中。
本文还提供一种免疫调节性BCMA-Fc融合蛋白，其为包含通过共价二硫键连接的SEQ ID NO:629中所示的BCMA-Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
在一些任何实施方案中，所述免疫调节蛋白是具有以下结构的BCMA-Fc融合蛋白：(BCMA)-接头-Fc区-接头-(BCMA)。在一些实施方案中，所述BCMA-Fc融合蛋白示于SEQ IDNO:809中。在一些实施方案中，所述BCMA-Fc融合蛋白示于SEQ ID NO:812中。
在一些任何实施方案中，所述BCMA-Fc融合蛋白具有以下结构：(BCMA)-接头-(BCMA)-接头-Fc区。在一些实施方案中，所述BCMA-Fc融合蛋白示于SEQ ID NO:813中。
在一些任何实施方案中，含有至少一个TIM和至少一个BIM的所述免疫调节蛋白包含SEQ ID NO:610-617、624-627、637、638、643、644、648、653和654中任一项中所示的氨基酸序列，或者展现与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性且保留活性的序列。
在一些实施方案中，所述TIM是野生型CTLA-4细胞外结构域或其结合部分，并且所述BIM是包含对应于SEQ ID NO:709中所示位置的氨基酸取代K77E/F78Y/Y102D、Q75E/R84Q或R84G的TACI细胞外结构域或其结合部分。在一些实施方案中，所述TIM示于SEQ ID NO:1中并且所述BIM示于SEQ ID NO:535、541、542或688中。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白包含SEQ ID NO:611、SEQ ID NO:788、SEQ ID NO:789、SEQ ID NO:790或SEQ ID NO:792中所示的序列。
本文提供一种免疫调节蛋白，其为包含通过共价二硫键连接的SEQ ID NO:611中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
本文提供一种免疫调节蛋白，其为包含通过共价二硫键连接的SEQ ID NO:788中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
本文提供一种免疫调节蛋白，其为包含通过共价二硫键连接的SEQ ID NO:789中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
本文提供一种免疫调节蛋白，其为包含通过共价二硫键连接的SEQ ID NO:790中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
本文提供一种免疫调节蛋白，其为包含通过共价二硫键连接的SEQ ID NO:792中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
在一些任何实施方案中，所述TIM是野生型CTLA-4细胞外结构域或其结合部分，并且所述BIM是包含CRD2结构域的截短的TACI细胞外结构域。在一些实施方案中，所述TIM示于SEQ ID NO:1中并且所述BIM示于SEQ ID NO:528中。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白包含SEQ ID NO:759、SEQ ID NO:853、SEQ ID NO:854或SEQ ID NO:791中所示的序列。
本文提供一种免疫调节蛋白，其为包含通过共价二硫键连接的SEQ ID NO:759中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
本文提供一种免疫调节蛋白，其为包含通过共价二硫键连接的SEQ ID NO:853中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
本文提供一种免疫调节蛋白，其为包含通过共价二硫键连接的SEQ ID NO:854中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
本文提供一种免疫调节蛋白，其为包含通过共价二硫键连接的SEQ ID NO:791中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
在一些任何实施方案中，所述TIM是包含对应于SEQ ID NO:1中所示位置的氨基酸取代G29W/L98Q/Y105L的CTLA-4细胞外结构域或其结合部分，并且所述BIM是包含对应于SEQ ID NO:709中所示位置的氨基酸取代K77E/F78Y/Y102D、Q75E/R84Q或R84G的TACI细胞外结构域或其结合部分。在一些实施方案中，所述TIM示于SEQ ID NO:186中并且所述BIM示于SEQ ID NO:535、541、542或688中。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白包含SEQ IDNO:610中所示的序列。
本文提供一种免疫调节蛋白，其包含通过共价二硫键连接的SEQ ID NO:610中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝。
在一些任何实施方案中，含有至少一个TIM和至少一个BIM的所述免疫调节蛋白包含SEQ ID NO:601-609、631-636、645-647、649-652、655-659中任一项中所示的氨基酸序列，或者展现与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性且保留活性的序列。
在一些任何实施方案中，所述TIM是野生型CTLA-4细胞外结构域或其结合部分，并且所述BIM是包含对应于SEQ ID NO:710中所示位置的氨基酸取代H19L的BCMA细胞外结构域或其结合部分。在一些实施方案中，所述TIM示于SEQ ID NO:1中并且所述BIM示于SEQ IDNO:406中。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白包含SEQ ID NO:602中所示的序列。
本文提供一种免疫调节蛋白，其为包含通过共价二硫键连接的SEQ ID NO:602中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
在一些任何实施方案中，所述TIM是包含对应于SEQ ID NO:1中所示位置的氨基酸取代G29W/L98Q/Y105L的CTLA-4细胞外结构域或其结合部分，并且所述BIM是关于SEQ IDNO:710中所示位置包含氨基酸取代H19L的BCMA细胞外结构域或其结合部分。在一些实施方案中，所述TIM示于SEQ ID NO:186中并且所述BIM示于SEQ ID NO:406中。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白包含SEQ ID NO:601中所示的序列。
本文提供一种免疫调节蛋白，其为包含通过共价二硫键连接的SEQ ID NO:601中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
在一些任何实施方案中，所述免疫调节蛋白是异二聚体，其中所述二聚体的每个多肽与单独含有野生型Fc结构域中的一个或多个氨基酸修饰的免疫球蛋白Fc结构域连接，以在所述多肽之间实现异二聚体形成。在一些任何实施方案中，所述野生型免疫球蛋白Fc是IgG1 Fc结构域。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰选自杵臼结构(knob-into-hole)修饰和电荷突变，所述电荷突变用于因电荷排斥而减少或防止自缔合。在一些任何实施方案中，所述Fc区还含有一个或多个氨基酸取代以降低与Fc受体的结合亲和力和/或降低效应子功能，任选地如与野生型IgG1 Fc结构域相比。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代按照EU编号选自L234A、L234V、L235A、L235E、G237A、S267K、R292C、N297G和V302C。在一些任何实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区含有按照EU编号的氨基酸取代L234A、L235E和G237A或者按照EU编号的氨基酸取代R292C、N297G和V302C。
在一些任何实施方案中，所述异二聚体包含含有SEQ ID NO:662或663中所示的氨基酸序列的第一多肽和含有SEQ ID NO:660中所示的氨基酸序列的第二多肽。
在一些任何实施方案中，所述免疫调节蛋白阻断APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体与BCMA或TACI的结合；并且所述免疫调节蛋白在施用至受试者之后降低血液中循环APRIL、BAFF或APRIL/BAFF的水平。在一些任何实施方案中，所述免疫调节蛋白阻断APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体与BCMA或TACI的结合；或者所述免疫调节蛋白在施用至受试者之后降低血液中循环APRIL、BAFF或APRIL/BAFF的水平。在一些任何实施方案中，所述免疫调节蛋白降低或抑制B细胞成熟、分化和增殖。
在一些任何实施方案中，所述免疫调节蛋白阻断CD80或CD86与共刺激受体的结合，任选地其中所述共刺激受体是CD28；并且所述免疫调节蛋白降低或抑制T细胞共刺激。在一些任何实施方案中，所述免疫调节蛋白降低或抑制B细胞成熟、分化或增殖。在一些任何实施方案中，所述免疫调节蛋白阻断CD80或CD86与共刺激受体的结合，任选地其中所述共刺激受体是CD28；或者所述免疫调节蛋白降低或抑制T细胞共刺激。
本文提供一种或多种核酸分子，所述一种或多种核酸分子编码任何本文所述的实施方案的免疫调节蛋白。在一些任何实施方案中，所述核酸分子是合成核酸。在一些任何实施方案中，所述核酸分子是cDNA。
本文提供一种载体，所述载体含有任何本文所述的实施方案的核酸分子。在一些任何实施方案中，所述载体是表达载体。在一些任何实施方案中，所述载体是哺乳动物表达载体或病毒载体。
本文提供一种细胞，所述细胞含有任何本文所述的实施方案的核酸或任何本文所述的实施方案的载体。在一些任何实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些任何实施方案中，所述细胞是人细胞。
本文提供一种产生免疫调节蛋白的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达所述蛋白质的条件下将任何本文所述的实施方案的核酸分子或任何本文所述的实施方案的载体引入所述细胞中。在一些任何实施方案中，所述方法包括从所述细胞分离或纯化所述免疫调节蛋白。
本文提供一种通过任何本文所述的实施方案的方法产生的免疫调节蛋白。
本文提供一种药物组合物，所述药物组合物包括任何本文所述的实施方案的免疫调节蛋白。
本文提供一种变体BCMA-Fc融合蛋白，所述变体BCMA-Fc融合蛋白包括变体BCMA多肽、Fc区以及所述BCMA多肽与所述Fc区之间的接头，其中所述变体BCMA多肽包含未修饰的BCMA多肽的细胞外结构域(ECD)或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代对应于关于SEQ ID NO:710中所示的位置选自9、10、11、14、16、19、20、22、25、27、29、30、31、32、35、36、39、43、45、46、47和48的位置。
在一些任何实施方案中，所述参考BCMA多肽是如下多肽，所述多肽由BCMA的细胞外结构域或其与APRIL、BAFF或BAFF/APRIL异三聚体结合的特异性结合部分组成。在一些任何实施方案中，所述参考BCMA多肽包含(i)SEQ ID NO:710中所示的氨基酸序列，(ii)具有与SEQ ID NO:710至少95％的序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)(i)或(ii)的含有所述CRD的部分。在一些任何实施方案中，所述参考BCMA缺少N末端甲硫氨酸。
在一些任何实施方案中，所述参考BCMA多肽包含(i)SEQ ID NO:356中所示的氨基酸序列，(ii)具有与SEQ ID NO:356至少95％的序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)(i)或(ii)的含有所述CRD的部分。在一些任何实施方案中，所述参考BCMA多肽包含SEQ ID NO:356中所示的序列。在一些任何实施方案中，所述参考BCMA多肽由SEQ ID NO:356中所示的序列组成。
在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代选自S9G、S9N、S9Y、Q10E、Q10P、N11D、N11S、F14Y、S16A、H19A、H19C、H19D、H19E、H19F、H19G、H19I、H19K、H19L、H19M、H19N、H19P、H19Q、H19R、H19S、H19T、H19V、H19W、H19Y、A20T、I22L、I22V、Q25E、Q25F、Q25G、Q25H、Q25I、Q25K、Q25L、Q25M、Q25S、Q25V、Q25Y、R27H、R27L、S29P、S30G、S30Y、N31D、N31G、N31H、N31K、N31L、N31M、N31P、N31S、N31V、N31Y、T32I、T32S、L35A、L35M、L35P、L35S、L35V、L35Y、T36A、T36G、T36N、T36M、T36S、T36V、R39L、R39Q、A43E、A43S、V45A、V45D、V45I、T46A、T46I、N47D、N47Y、S48G或其保守氨基酸取代。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置19处的至少一个取代，任选地其中所述至少一个取代选自H19A、H19C、H19D、H19E、H19F、H19G、H19I、H19K、H19L、H19M、H19N、H19P、H19Q、H19R、H19S、H19T、H19V、H19W、H19Y。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代H19L。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代H19K。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代H19R。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代H19Y。
在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置25处的至少一个取代，任选地其中所述至少一个取代选自Q25E、Q25F、Q25G、Q25H、Q25I、Q25K、Q25L、Q25M、Q25S、Q25V、Q25Y。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置31处的至少一个取代，任选地其中所述至少一个取代选自N31D、N31G、N31H、N31K、N31L、N31M、N31P、N31S、N31V、N31Y。
在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置35处的至少一个取代，任选地其中所述至少一个取代选自L35A、L35M、L35P、L35S、L35V、L35Y。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置36处的至少一个取代，任选地其中所述至少一个取代选自T36A、T36G、T36N、T36M、T36S、T36V。在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是H19Y/S30G；H19Y/V45A；F14Y/H19Y；H19Y/V45D；H19Y/A43E；H19Y/T36A；H19Y/I22V；N11D/H19Y；H19Y/T36M；N11S/H19Y；H19Y/L35P/T46A；H19Y/N47D；S9D/H19Y；H19Y/S30G/V45D；H19Y/R39Q；H19Y/L35P；S9D/H19Y/R27H；Q10P/H19Y/Q25H；H19Y/R39L/N47D；N11D/H19Y/N47D；H19Y/T32S；N11S/H19Y/S29P；H19Y/R39Q/N47D；S16A/H19Y/R39Q；S9N/H19Y/N31K/T46I；H19Y/R27L/N31Y/T32S/T36A；N11S/H19Y/T46A；H19Y/T32I；S9G/H19Y/T36S/A43S；H19Y/S48G；S9N/H19Y/I22V/N31D；S9N/H19Y/Q25K/N31D；S9G/H19Y/T32S；H19Y/T36A/N47Y；H19Y/V45A/T46I；H19Y/Q25K/N31D；H19Y/Q25H/R39Q/V45D；H19Y/T32S/N47D；Q10E/H19Y/A20T/T36S；H19Y/T32S/V45I；H19F/Q25E/N31L/L35Y/T36S；H19F/Q25F/N31S/T36S；H19I/Q25F/N31S/T36V；H19F/Q25V/N31M/T36S；H19Y/Q25Y/N31L/L35Y/T36S；H19F/Q25I/N31M/L35A/T36S；H19I/Q25L/N31L/L35Y/T36S；H19F/Q25L/N31G/L35P/T36A；H19Y/I22L/N31G；H19F/I22V/Q25M/N31P/T36M；H19Y/N31L/L35Y/T36S；H19L/S30G/N31H/L35A；H19L/Q25S/N31V/L35S/T36V；H19L/Q25S/S30Y/N31G/L35M/T36V；H19F/Q25F/N31L/L35Y/T36S；H19F/Q25F/N31S/T36G；H19F/I22V/Q25S/N31V/L35S/T36V；H19F/Q25G/N31S/L35V/T36N；H19L/Q25H/N31D/L35S；或H19F/Q25F/N31S/L35Y/T36S。
在一些任何实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括S16A/H19Y/R39Q。在一些任何实施方案中，与所述参考TACI多肽相比，所述变体BCMA多肽具有增加的与APRIL和BAFF中的一种或两种的结合亲和力。
在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽具有增加的与APRIL的结合亲和力。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽具有增加的与BAFF的结合亲和力。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽具有增加的与APRIL和BAFF的结合亲和力。
在一些任何实施方案中，所述增加的对BAFF或APRIL的结合亲和力是独立地增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽包含SEQ ID NO:357-435中任一项中所示的序列。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:357-435中任一项中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:381中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽由SEQID NO:411中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:405中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些任何实施方案中，所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:406中所示的序列组成或基本上由其组成。
在一些任何实施方案中，所述接头包括肽接头并且所述肽接头选自GSGGS(SEQ IDNO:592)、GGGGS(G4S；SEQ ID NO:593)、GSGGGGS(SEQ ID NO:590)、GGGGSGGGGS(2xGGGGS；SEQ ID NO:594)、GGGGSGGGGSGGGGS(3xGGGGS；SEQ ID NO:595)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(4xGGGGS；SEQ ID NO:600)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(5XGGGGS；SEQ ID NO:671)、GGGGSSA(SEQID NO:596)或其组合。
在一些任何实施方案中，所述Fc融合蛋白是二聚体。在一些任何实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区是同二聚Fc区。
在一些任何实施方案中，所述免疫球蛋白Fc是IgG1 Fc结构域，或者是展现降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能的变体Fc，任选地如与野生型IgG1 Fc结构域相比。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc是IgG1 Fc结构域，并且所述Fc包括SEQ IDNO:597中所示的氨基酸序列。在一些任何实施方案中，所述免疫球蛋白Fc是变体IgG1 Fc结构域，其含有按照EU编号选自L234A、L234V、L235A、L235E、G237A、S267K、R292C、N297G和V302C的一个或多个氨基酸取代。在一些任何实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区含有按照EU编号的氨基酸取代L234A、L235E和G237A或者按照EU编号的氨基酸取代R292C、N297G和V302C。
在一些任何实施方案中，所述免疫球蛋白Fc示于SEQ ID NO:586中。在一些实施方案中，所述Fc是包含SEQ ID NO:589中所示的氨基酸序列的变体Fc。在一些实施方案中，所述Fc融合蛋白是同二聚体。
在一些实施方案中，所述Fc融合蛋白中和APRIL和BAFF。在一些实施方案中，中和APRIL的IC50是小于100pM、小于50pM、小于40pM、小于30pM、小于20pM、小于10pM、小于5pM或小于1pM，或者是前述任何项之间的任何值；和/或中和BAFF的IC50是小于400pM、小于300pM、小于200pM、小于100pM、小于75pM、小于50pM、小于25pm或小于10pM，或者是前述任何项之间的任何值。
在一些任何实施方案中，所述Fc融合蛋白阻断APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体与BCMA或TACI的结合；并且所述Fc融合蛋白在施用至受试者之后降低血液中循环APRIL、BAFF或APRIL/BAFF的水平。在一些任何实施方案中，所述免疫球蛋白Fc示于SEQ ID NO:586中。在一些任何实施方案中，所述Fc融合蛋白阻断APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体与BCMA或TACI的结合；或者所述Fc融合蛋白在施用至受试者之后降低血液中循环APRIL、BAFF或APRIL/BAFF的水平。在一些任何实施方案中，所述免疫调节蛋白降低或抑制B细胞成熟、分化和/或增殖。
本文提供一种或多种核酸分子，所述核酸分子编码任何本文所述的实施方案的Fc融合蛋白。在一些任何实施方案中，所述核酸分子是合成核酸。在一些任何实施方案中，所述核酸分子是cDNA。
本文提供一种载体，所述载体含有任何本文所述的实施方案的核酸分子。在一些任何实施方案中，所述载体是表达载体。在一些任何实施方案中，所述载体是哺乳动物表达载体至病毒载体。
本文提供一种细胞，所述细胞含有任何本文所述的实施方案的核酸或任何本文所述的实施方案的载体。在一些任何实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些任何实施方案中，所述细胞是人细胞。
本文提供一种产生免疫调节蛋白的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达所述蛋白质的条件下将任何本文所提供的实施方案的核酸分子或任何本文所提供的实施方案的载体引入所述细胞中。在一些任何实施方案中，所述方法还包括从所述细胞分离或纯化Fc融合蛋白。本文提供一种产生Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达所述蛋白质的条件下将任何本文所提供的实施方案的核酸分子或任何本文所提供的实施方案的载体引入所述细胞中。
本文提供一种通过任何本文所述的实施方案的方法产生的Fc融合蛋白。
本文提供一种药物组合物，所述药物组合物包括任何本文所述的实施方案的Fc融合蛋白。在一些任何实施方案中，所述药物组合物含有药学上可接受的赋形剂。在一些任何实施方案中，所述药物组合物是无菌的。
本文提供一种制品，其包括在小瓶或容器中的任何本文所述的实施方案的药物组合物。在一些任何实施方案中，所述小瓶或容器是密封的。
本文提供一种试剂盒，其包括任何本文所提供的实施方案的药物组合物和使用说明书。在一些任何实施方案中，所述试剂盒包括任何本文所述的实施方案的制品和使用说明书。
本文提供一种降低受试者的免疫应答的方法，所述方法包括将任何本文所述的实施方案的免疫调节蛋白施用至有需要的受试者。
本文提供一种降低受试者的免疫应答的方法，所述方法包括将任何本文所述的实施方案的Fc融合蛋白施用至有需要的受试者。
本文提供一种降低受试者的免疫应答的方法，所述方法包括将任何本文所述的实施方案的药物组合物施用至有需要的受试者。在一些任何实施方案中，B细胞免疫应答在受试者中降低，借此使B细胞成熟、分化和/或增殖降低或抑制。在一些任何实施方案中，APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体的循环水平在受试者中降低。
本文提供一种降低受试者的APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体的循环水平的方法，所述方法包括将任何本文所述的实施方案的药物组合物施用至所述受试者。在一些任何实施方案中，T细胞免疫应答在所述受试者中降低，借此使T细胞共刺激降低或抑制。在一些任何实施方案中，降低所述免疫应答治疗所述受试者的疾病或病症。
本文提供一种治疗受试者的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括将任何本文所述的实施方案的免疫调节蛋白施用至有需要的受试者。
本文提供一种治疗受试者的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括将任何本文所述的实施方案的Fc融合蛋白施用至有需要的受试者。
本文提供一种治疗受试者的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括将任何本文所述的实施方案的药物组合物施用至有需要的受试者。
本文还提供任何所述免疫调节蛋白或含有其的药物组合物，用于治疗受试者的疾病、障碍或病症。本文还提供任何所述免疫调节蛋白或含有其的药物组合物用于配制用于治疗受试者的疾病、障碍或病症的药物的用途。
在一些任何实施方案中，所述疾病、障碍或病症是自身免疫性疾病、炎性病症、B细胞癌症、抗体介导的病状、肾病、移植物排斥、移植物抗宿主病或病毒感染。所治疗的所述疾病或病症可以是如本文所述的任一种。在一些任何实施方案中，所述疾病或病症是选自以下的自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮(SLE)；舍格伦综合征、硬皮病、多发性硬化、糖尿病、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、IgA肾病、视神经炎、淀粉样变性、抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性多内分泌腺综合征II型(APS II)、自身免疫性甲状腺疾病(AITD)、格雷夫斯病、自身免疫性肾上腺炎和寻常型天疱疮。在一些任何实施方案中，所述疾病或病症是B细胞癌症并且所述癌症是骨髓瘤。在一些任何实施方案中，骨髓瘤的类型包括多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、多发性孤立性浆细胞瘤和/或髓外骨髓瘤。在一些任何实施方案中，骨髓瘤的类型包括轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤和/或IgD或IgE骨髓瘤。
附图说明
图1显示通过BCMA或TACI进行的涉及重组APRIL和BAFF的功能抑制测定的示意性代表图。在所述测定中，Jurkat细胞用基于萤光素酶的NF-κB报告物转导并且用于基于细胞表面表达来稳定表达小鼠或人TACI。在通过重组APRIL或BAFF激活后，内源NF-KB转录因子与控制萤火虫萤光素酶基因的转录的DNA应答元件结合。可以监测萤光素酶表达，如通过用Bio-GloTM试剂检测和使用Cytation 3读取器测量。
图2显示用于阻断人APRIL(上图)和BAFF(下图)介导的信号传导的示例性人BCMATD Fc融合分子。将示例性BCMA TD Fc融合物与APRIL(2nM)或BAFF(4nM)一起孵育20min(室温和振荡)，然后将其添加至含有150,000个Jurkat/TACI/NFκB-萤光素酶细胞的孔中持续5小时。
图3A-图3B显示单独的或与CTLA-4IgD堆叠时的示例性BCMA TD Fc融合分子用于阻断APRIL(每个附图的上图)或BAFF(每个附图的下图)的功能。图3A和图3B显示人BCMA TD在与CTLA-4堆叠时保留功能。
图3C-图3D显示与CTLA-4IgD堆叠时的示例性TACI TD Fc融合分子用于阻断APRIL(每个附图的上图)或BAFF(每个附图的下图)的功能。图3C和图3D显示人TACI TD在与CTLA-4堆叠时保留功能。
图4显示单独的人BCMA融合分子或者与CTLA-4IgD堆叠时的BCMA或TACI TD Fc融合分子用于阻断小鼠APRIL(左图)和BAFF(右图)介导的信号传导。
图5A显示相对于TACI 13-118-Fc、TACI 30-110-Fc和贝利木单抗，单独的或与CTLA-4IgD堆叠时的人BCMA TD Fc融合分子用于阻断人APRIL(上图)和BAFF(下图)介导的信号传导。
图5B显示相对于TACI 13-118-Fc、TACI 30-110-Fc和贝利木单抗，与CTLA-4IgD堆叠时的人TACI TD Fc融合分子用于阻断人APRIL(上图)和BAFF(下图)介导的信号传导。
图6显示CD80/CD86-CD28介导的共刺激的功能抑制测定的示意性代表图。在用抗CD3和抗CD28刺激物刺激时，Jurkat/IL-2细胞稳定表达由IL-2启动子驱动的萤光素酶报告物。受体介导的信号传导导致IL-2启动子介导的发光，并且可以对生物发光信号进行检测和定量，如通过使用Bio-GloTM底物和辉光值测定仪来进行。
图7A和图7B显示在与BCMA至TACI TD一起包括于多特异性(堆叠)构建体分子中时，野生型或CTLA-4vIgD(IgSF结构域)维持用于阻断CD80(左图)或CD86(右图)的功能。
图8A-图8F显示在自体TFH-B细胞测定中单独的或在与BCMA或TACI TD一起包括于多特异性(堆叠)分子中时的CTLA-4vIgD用于抑制人滤泡辅助T(TFH)和B细胞的活性。将B-Tfh细胞培养物在递增的(100,000-32pM)蛋白质的存在下孵育7天。将培养的细胞通过流式细胞术针对以下进行表面染色和分析：(图8A)CD4+T细胞回收、(图8B)CD4+CD40L+细胞回收、(图8C)CD4+ICOS+细胞回收、(图8D)CD19+B细胞回收以及(图8E)B细胞激活/CD86上调。收集上清液并通过ELISA确定IgM分泌的水平(图8F)。数据表示每种条件的三次重复的平均值(±SEM)。
图9显示在KLH免疫模型中在终止时(第19天)血清中的抗KLH IgM抗体水平。通过单因素ANOVA确定每组之间的统计学差异；仅列出显著差异(p<0.05)。
图10显示在KLH免疫模型中在终止时(第19天)血清中的抗KLH IgG1抗体水平。通过单因素ANOVA确定每组之间的统计学差异；仅列出显著差异(p<0.05)。
图11显示在KLH模型中在终止时(第19天)的脾重量。通过t检验来确定Fc对照与其他测试品之间的统计学差异；仅列出显著(p<0.05)差异。
图12A-图12H显示在KLH模型中在终止时(第19天)对脾细胞B细胞和Tfh子集流式细胞术分析。对脾进行处理并通过流式细胞术针对以下加以分析：B220+B细胞(图12A、图12E)；边缘区(MZ)B细胞(图12B、图12F)；生发中心(GC)B细胞(图12C，图12G)；T滤泡辅助(Tfh)细胞(图12D、图12H)。“Fc对照”＝SEQ ID NO:589中所示的Fc。通过单因素ANOVA和未校正的Fisher's LSD检验来计算相比于Fc对照或阿巴西普的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图13A-图13D显示在KLH模型中在终止时(第19天)对脾细胞T效应记忆子集的流式细胞术分析。对脾进行处理并通过流式细胞术针对以下加以分析：CD4+(图13A、图13C)和CD8+(图13B、图13D)T效应记忆(Tem)细胞。“Fc对照”＝SEQ ID NO:589中所示的Fc。通过单因素ANOVA和未校正的Fisher's LSD来计算相比于Fc对照或阿巴西普的统计学上显著的差异(p<0.05)。
图14A-图14I显示在人SLE的NZB/NZW鼠模型中评估的参数的分析。在20周龄开始评估蛋白尿得分(图14A)、体重的平均变化百分比(图14B)和存活率百分比(图14C)。针对抗双链DNA IgG滴度(图14D)和血尿素氮(BUN)(图14E)分析血清(**相比于Fc，通过未校正的Dunn检验，p＝0.0047和p＝0.0065；***相比于Fc，通过未校正的Dunn检验，p＝0.0004)。对肾进行处理并在重复过碘酸希夫(PAS)染色切片中通过组织学加以分析，且单独的组分和总组织学得分描绘于图14F中。还将冷冻的肾脏切片并染色用于小鼠IgG和补体C3肾小球沉积的免疫组织化学分析，分别如图14G和图14H中所示。图14I显示组织学得分±SEM。
图15描绘示例性BCMA-Fc融合蛋白的示意性代表图。
图16描绘所提供的多结构域(堆叠)免疫调节蛋白的示例性Fc融合物格式的示意性代表图。
图17A和图17B描绘用于鉴定与参考序列相比序列中的相应残基的示例性序列比对。两个比对的氨基酸之间的符号“*”指示比对的氨基酸是相同的。符号“-”指示比对中的空位。用于本文所述的氨基酸取代的示例性非限制性位置用粗体文本指示。基于具有共有的相同残基的两个类似序列的比对，技术人员可以通过使用保守且相同的氨基酸残基作为指导与参考序列相比较来鉴定序列中的“相应”位置。图17A提供SEQ ID NO:709中所示的参考TACI细胞外结构域序列(含有具有CRD1和CRD2以及起始甲硫氨酸残基的完整细胞外结构域)与SEQ ID NO:528中所示的TACI细胞外结构域序列(仅含有单一CRD，即CRD2)的示例性比对；比对相同残基显示，例如，SEQ ID NO:528中的氨基酸残基E7对应于SEQ ID NO:709中的残基E74，SEQ ID NO:528中的氨基酸残基K10对应于SEQ ID NO:709中的残基K77，SEQ IDNO:528中的氨基酸残基Y12对应于SEQ ID NO:709中的Y79，SEQ ID NO:528中的氨基酸残基L15对应于SEQ ID NO:709中的L82，SEQ ID NO:528中的氨基酸残基R17对应于SEQ ID NO:709中的R84；并且SEQ ID NO:528中的氨基酸残基D16对应于SEQ ID NO:709中的D85。图17B提供SEQ ID NO:710中所示的参考BCMA细胞外结构域序列(含有具有CRD和起始甲硫氨酸残基的完整细胞外结构域)与SEQ ID NO:356中所示的BCMA细胞外结构域序列(不含起始甲硫氨酸)的示例性比对；比对相同残基显示，例如，SEQ ID NO:356中的氨基酸残基H18对应于SEQ ID NO:710中的残基H19，并且SEQ ID NO:356中的氨基酸残基R38对应于SEQ ID NO:710中的残基R39。技术人员可以熟练地在两个类似蛋白质序列之间进行类似比对以鉴定相应残基，包括基于本文的例示和描述来进行。
图18A-图18D显示鼠钥孔血蓝蛋白(KLH)模型中评估的参数的分析。将血清-KLHIgM OD水平评估为初次应答(图18A)和再次应答(图18B)。类似地，将血清抗KLH IgG1 OD水平评估为初次应答(图18C)和再次应答(图18D)二者。
图19A-图19B显示从鼠钥孔血蓝蛋白(KLH)免疫模型评估的收获的脾的分析。对脾进行处理并通过重量(图19A)以及总细胞数量(图19B)加以分析。
图20描绘从鼠钥孔血蓝蛋白(KLH)模型针对细胞亚型群体组成评估的脾的分析，并且显示相对于组平均值的B细胞子集数量的结果。
图21描绘从鼠钥孔血蓝蛋白(KLH)模型针对细胞亚型表型组成评估的脾的分析，并且显示生发中心B细胞和浆细胞的数量的结果(图21)。
图22A-图22D描绘鼠钥孔血蓝蛋白(KLH)模型中的T细胞数量。脾CD3+、CD8+、CD4+和滤泡辅助T细胞分别描绘于图22A、图22B、图22C和图22D中。
图23描绘鼠钥孔血蓝蛋白(KLH)模型中的Tcm和Tem细胞群体。
图24A-图24B和图25A-图25B描绘在用186-CTLA-4Fc和CTLA4 186-GSG4S-Fc-(G4S)4-TACI 541测试分子治疗后，在易患糖尿病的小鼠中涎腺炎(图24A-图24B)和胰岛炎(图25A-图25B)的总体发病率和程度。
图26描绘在用186-CTLA-4Fc和CTLA4 186-GSG4S-Fc-(G4S)4-TACI 541测试分子治疗后，在易患糖尿病的小鼠中，在第7天、第8天、第9天和第10天，如在血液中测量的平均血糖浓度(mg/dL)。
图27和图28A-图28C描绘来自用示例性CTLA4 186-GSG4S-Fc-(G4S)4-TACI 541多结构域分子测试，并且与仅WT-TACI Fc相比较的体内鼠bm12诱导性SLE模型的结果。来自在第82天(研究终止)收集的血清的BUN浓度显示于图27中。图28A-图28C描绘来自在第14天、第42天和第82天收集的血清的IgG2b(图28A)、IgG2c(图28B)和IgG3(图28C)的水平。
图29描绘来自在用示例性CTLA4 186-GSG4S-Fc-(G4S)4-TACI 541多结构域分子测试的体内鼠bm12诱导性SLE模型中收集的血清的抗dsDNA抗体水平的水平。
具体实施方式
本文提供免疫调节蛋白，其与一种或多种其他免疫受体或配体(例如在抗原呈递细胞上或作为可溶因子产生的)接合以抑制或降低B细胞应答或活性，并且在一些情形中也抑制或降低T细胞应答。所提供的免疫调节蛋白包括与BAFF或APRIL配体结合以中和其活性并阻断或拮抗B细胞刺激性受体(如TACI或BCMA)的活性的蛋白质。所提供免疫调节蛋白可以是BCMA细胞外结构域或其结合部分(下文的BCMA ECD)与多聚化结构域的融合蛋白，如免疫球蛋白Fc。例如，本文提供BCMA-Fc融合蛋白。仍进一步提供多结构域免疫调节蛋白(也称为“堆叠”免疫调节蛋白)，其含有至少一个第一结合结构域，所述第一结合结构域与BAFF或APRIL配体结合以中和其活性并阻断或拮抗B细胞刺激性受体(如TACI或BCMA)的活性；以及至少一个第二结合结构域，所述第二结合结构域阻断或拮抗T细胞刺激性受体的活性，如通过与CD80或CD86配体结合以中和其活性，经由与T细胞刺激性受体CD28或负调节蛋白CTLA-4相互作用。在一些实施方案中，本文提供的免疫调节蛋白可以用于治疗与失调的免疫应答相关，如与炎性或自身免疫性症状相关的疾病、障碍或病症，包括炎性或自身免疫性疾病。
免疫系统依赖于免疫检查点来预防自身免疫(即，自身耐受)并防止组织在免疫应答期间(例如在针对病原体感染的攻击期间)受到过度损伤。然而，在一些情形中，免疫系统可能变得失调并且可能针对正常身体部分或组织发动异常免疫应答，从而导致自身免疫性疾病或病症或自身免疫性症状。在其他情形中，可能对外来组织如移植物发动不期望的免疫应答，从而导致移植排斥。
在一些方面，改变免疫细胞活性(如B细胞活性和/或T细胞活性)的免疫疗法可以治疗免疫应答失调的某些疾病、障碍和病症。特定地，免疫应答(如B细胞应答和/或T细胞应答)的抑制或减弱对于减少或预防不期望的炎症、自身免疫性症状和/或移植排斥可能是合意的。然而，追求调节配体与其受体之间的介导免疫应答的相互作用(包括在免疫突触中)的治疗方法并不完全令人满意。在一些情形中，用于干预和改变免疫细胞(例如T细胞或B细胞)激活的免疫调节作用的疗法受制于空间定向要求以及免疫突触界限所施加的大小限制。在一些方面，现有的治疗药物(包括抗体药物)可能无法同时与调节这些相互作用中所涉及的多种靶蛋白相互作用。例如，可溶受体和抗体通常竞争性结合(例如，一次结合不超过一个靶种类)，并因此缺少同时结合多个靶标的能力。另外，独立地靶向这些受体中的一种的药物之间的药代动力学差异可能在整个治疗过程中在适当维持靶向两个不同靶标的药物组合的所需血液浓度方面造成困难。
BAFF和APRIL是结合B细胞上的TACI和BCMA二者的TNF超家族成员；BAFF还结合第3种受体BAFF-R。BAFF和APRIL一起支持B细胞发育、分化和存活。它们的共中和明显降低B细胞功能，包括抗体产生，而对单独的BAFF或APRIL的抑制介导相对不大的效应。尽管阻断T细胞共刺激的基于CTLA-4的治疗剂在许多疾病环境中提供安全且适度有效的T细胞抑制，并且尽管B细胞靶向疗法已经显示有前景的治疗潜力，但它们并不完全令人满意。
所提供的实施方案包括提供改进的中和活性以及对B细胞应答的抑制或降低的那些。在一些实施方案中，所述改进的活性由所提供的免疫调节蛋白与BAFF和/或APRIL的增加的或改进的结合或相互作用介导。例如，本文提供含有一个或多个氨基酸取代(替代或突变)的变体BCMA多肽，所述取代赋予所述蛋白质对BAFF和/或APRIL改进的结合亲和力。特定地，所提供的实施方案包括提供改进的组合BAFF和APRIL抑制的那些。此外，所提供的免疫调节蛋白包括仅抑制BAFF和/或APRIL介导的活性(例如BCMA-Fc)或与抑制T细胞共刺激偶联的那些。例如，所提供的实施方案包括与T细胞抑制分子(TIM)融合的B细胞抑制剂分子(BIM)的多结构域免疫调节蛋白，所述B细胞抑制剂分子是与BAFF和/或APRIL结合的细胞外结构域部分(例如BCMA ECD)，并且所述T细胞抑制分子是与T细胞刺激性受体的配体和/或与T细胞刺激性受体结合以拮抗或阻断T细胞应答的另一结构域。考虑所提供的免疫调节蛋白仅提供改进的调节B细胞应答的活性，或者与T细胞应答的调节一起提供。因此，所提供的免疫调节蛋白在自身免疫性或炎性疾病(包括严重的B细胞相关自身免疫性疾病，如SLE)的治疗中提供有效且持久的疾病抑制。
例如，所提供的实施方案是基于如下发现：通过对某些分子(例如BCMA)的胞外域的TNFR结构域(TD)的亲和力修饰进行的定向进化有利于对APRIL和/或BAFF具有改进的亲和力的分子的开发。因此，所述亲和力修饰产生含有变体TNFR结构域(vTD)的变体BCMA。这样的分子与免疫球蛋白Fc的融合得到抑制B细胞活性和应答的免疫调节蛋白。同样，所提供的实施方案还基于如下发现：进一步包括TD结构域(例如野生型(WT)TD或vTD)作为与T细胞抑制分子的免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域(如CTLA-4细胞外结构域)的多结构域融合物进一步加强免疫抑制活性。这样的活性可以通过对CTLA-4的IgSF结构域进行亲和力修饰以产生变体IgSF结构域(vIgD)以进一步增强对CD80和/CD86配体(其为CD28共刺激受体和抑制性CTLA-4受体的配体)的亲和力进行定向进化来进一步改进。本文的发现证实，这些免疫调节蛋白在体外和体内始终展现强效免疫抑制活性和功效，表现得优于现有的和/或批准的免疫调节剂，如贝利木单抗、阿巴西普、阿塞西普或泰它西普。这样的生物制品因此可以是用于治疗严重自身免疫性和/或炎性疾病(包括B细胞相关疾病，如SLE、舍格伦综合征和其他结缔组织疾病)的有吸引力的开发候选物。
将在本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其整体并入，其并入程度如同将每个单独出版物通过引用单独并入一般。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开申请和其他出版物中阐述的定义相反或在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
本文所用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
I.定义
除非另外定义，否则本文所用的所有领域术语、符号以及其他技术和科学术语或命名都旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情形中，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且在本文中包括此类定义不一定应当被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
除非上下文另有明确规定，否则如说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代物。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知晓的对应值的通常误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如在蛋白质的结构域的情况下使用的术语“亲和力修饰的”意指如下哺乳动物蛋白，其在细胞外结构域或其特异性结合部分中具有改变的氨基酸序列(相对于相应野生型亲代或未修饰的结构域)，使得与亲代野生型或未修饰的(即，非亲和力修饰的结构域)蛋白质相比，其具有增加的或降低的与其结合配偶体(可替代地“反结构”)中的至少一种的结合活性(如结合亲和力)。在一些实施方案中，亲和力修饰的结构域可以含有野生型或未修饰的结构域中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个氨基酸差异(如氨基酸取代)。结合活性(例如结合亲和力)的增加或降低可以使用熟知的结合测定(包括流式细胞术)来确定。Larsen等人，AmericanJournal of Transplantation，第5卷：443-453(2005)。还参见Linsley等人，Immunity,1:7930801(1994)。蛋白质与其一种或多种结合配偶体的结合活性(例如亲和力)的增加是增加至如下值：比野生型对照大至少10％，并且在一些实施方案中，比野生型对照值大至少20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、500％、1000％、5000％或10000％。蛋白质与其结合配偶体中的至少一种的结合活性(例如亲和力)的降低是降低至如下值：不大于对照的90％但不小于野生型对照值的10％，并且在一些实施方案中，不大于野生型对照值的80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％但不小于10％。亲和力修饰的蛋白质在细胞外结构域或其特异性结合部分的一级氨基酸序列中通过氨基酸残基的取代、添加或缺失发生改变。术语“亲和力修饰的”不被视为对借之产生亲和力修饰的蛋白质的任何特定的起始组合物或方法强加任何条件。因此，亲和力修饰的蛋白质不限于随后通过任何特定的亲和力修饰过程转化为亲和力修饰的结构域的野生型蛋白质结构域。亲和力修饰的结构域多肽可以例如从野生型哺乳动物结构域序列信息开始生成，然后在电脑中针对与其结合配偶体的结合进行建模，最后进行重组或化学合成以产生物质的亲和力修饰的结构域组合物。在仅一个替代性例子中，亲和力修饰的结构域可以通过野生型结构域的定点诱变来产生。因此，亲和力修饰的IgSF结构域或亲和力修饰的TD结构域表示产物，并且不必是通过任何给定方法产生的产物。可以采用多种技术，包括重组方法、化学合成或其组合。
术语“亲和力修饰的IgSF结构域”是指免疫球蛋白超家族(IgSF)蛋白的成员的亲和力修饰的结构域，其具有IgSF蛋白的细胞外结构域或其特异性结合部分内的免疫球蛋白结构域(例如IgV)的改变的氨基酸序列(相对于相应野生型亲代或未修饰的结构域)，使得与含有非亲和力修饰的或未修饰的IgSF结构域的亲代野生型或未修饰的蛋白质相比，其具有增加的或降低的与其结合配偶体(可替代地“反结构”)中的至少一种的结合活性(如结合亲和力)。
术语“亲和力修饰的TD结构域”是指肿瘤坏死受体超家族(TNFRSF)蛋白的成员或其TNF配体的亲和力修饰的结构域，其分别在其中具有TNFR结构域或TNF结构域的改变的氨基酸序列。例如，TNFRSF蛋白的亲和力修饰的TD结构域具有TNFR结构域的改变的氨基酸序列，所述改变的氨基酸序列由TNFRSF蛋白的细胞外结构域或其特异性结合部分内的至少一个富半胱氨酸结构域(CRD)构成(相对于相应野生型亲代或未修饰的结构域)，使得与含有非亲和力修饰的或未修饰的TD结构域的亲代野生型或未修饰的蛋白质相比，其具有增加的或降低的与其结合配偶体(可替代地“反结构”)中的至少一种的结合活性(如结合亲和力)。
术语“B细胞抑制分子”或BIM是指拮抗或阻断B细胞刺激性受体的活性的蛋白质分子。BIM可以通过以下方式来拮抗B细胞刺激性受体的活性：直接与B细胞刺激性受体的同源配体结合，从而阻断或降低所述配体与所述B细胞刺激性受体之间的结合。例如，BIM与APRIL和/或BAFF(其为B细胞刺激性受体的配体)结合，所述B细胞刺激性受体即B细胞成熟抗原(BCMA)、B细胞激活因子受体(BAFF-R)以及跨膜激活物和钙调节物和亲环蛋白配体相互作用物(TACI)。在特定实施方案中，本文提供的BIM含有B细胞刺激性受体的细胞外结构域或其含有TNF受体超家族结构域(TD，例如CRD)的部分，所述细胞外结构域或部分与同源配体APRIL和/或BAFF以及APRIL和BAFF的异三聚体结合。例如，BIM包括TACI的细胞外结构域，或者TACI的细胞外结构域的与同源配体APRIL和/或BAFF以及APRIL和BAFF的异三聚体结合的含有TD结构域的部分。在其他例子中，BIM包括BCMA的细胞外结构域，或者BCMA的细胞外结构域的与同源配体APRIL和/或BAFF以及APRIL和BAFF的异三聚体结合的含有TD结构域的部分。BIM还可以包括TACI或BCMA的细胞外结构域或其部分的亲和力修饰的变体，所述变体具有TD中的一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)，所述修饰增加对同源配体(例如APRIL和/或BAFF，以及APRIL和BAFF的异三聚体)的结合亲和力。
如本文所用，“B细胞刺激性受体”是指以下中的一种或多种：B细胞成熟抗原(BCMA)、B细胞激活因子受体(BAFF-R)，以及跨膜激活物和钙调节物和亲环蛋白配体相互作用物(TACI)，它们是在B细胞上表达的相关的肿瘤坏死因子(TNFR)超家族受体。这些相关受体与其同源配体BAFF和/或APRIL或者APRIL和BAFF的异三聚体的接合或连接调节B细胞稳态，包括B细胞存活、B细胞成熟和分化以及免疫球蛋白类别转换。B细胞刺激性受体通常含有细胞外部分、跨膜结构域和胞质区，其中所述胞质区含有一个或多个TNF受体相关因子(TRAF)结合位点。将各种TRAF分子募集至胞质结构域可以激活各种转录因子，如NF-κB(例如NF-κB1或NF-κB2)，介导调节B细胞稳态的B细胞信号传导途径。
如本文所用，“结合(bind)”、“结合(bound)”或其语法变型是指分子参与和另一种分子的任何有吸引力的相互作用，导致稳定缔合，其中这两种分子彼此非常靠近。结合包括但不限于非共价键、共价键(如可逆和不可逆共价键)，并且包括分子之间的相互作用，所述分子如但不限于蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质和小分子，如包括药物在内的化学化合物。
如本文所用，结合活性是指分子(例如多肽)的与其是否以及如何结合一种或多种结合配偶体相关的特征。结合活性可以包括一种分子对结合配偶体的结合的任何量度。结合活性包括结合一种或多种结合配偶体的能力、其与结合配偶体结合的亲和力(例如高亲和力)、其与结合配偶体结合的亲合力、与结合配偶体的键合的强度和/或与结合配偶体结合的特异性或选择性。
如本文所用术语“结合亲和力”意指在特异性结合条件下蛋白质对其结合配偶体(即，其反结构)的特异性结合亲和力。结合亲和力是指两种或更多种分子(如结合配偶体)之间的相互作用的强度，通常为两种结合配偶体之间的非共价相互作用的强度。亲和力修饰的结构域或含有亲和力修饰的结构域的免疫调节蛋白与结合配偶体的结合亲和力的增加或减弱是相对于未修饰的结构域(例如，天然或野生型IgSF结构域或者天然或野生型TD结构域)的结合亲和力确定的。用于确定结合亲和力或相对结合亲和力的方法是本领域中已知的，固相ELISA免疫测定、ForteBio Octet、Biacore测量或流式细胞术。参见例如，Larsen等人,American Journal of Transplantation,第5卷:443-453(2005)；Linsley等人,Immunity,第1卷(9):793-801(1994)。在一些实施方案中，结合亲和力可以通过流式细胞术来测量，如在流动结合测定中基于平均荧光强度(MFI)来测量。
如本文所用术语“结合亲合力”意指在特异性结合条件下蛋白质对其结合配偶体(即，其反结构)的特异性结合亲合力。在生化动力学中，亲合力是指单独非共价结合相互作用(如在蛋白质与其结合配偶体(即，其反结构)之间)的多重亲和力的累积强度。因此，亲合力与描述单一相互作用的强度的亲和力不同。
术语“生物半衰期”是指物质(如免疫调节蛋白)丧失其药理学或生理学活性或浓度的一半所花费的时间长度。生物半衰期可能受以下影响：物质的消除、排泄、降解(例如，酶促降解/消化)，或者在身体某些器官或组织中的吸收和浓缩。在一些实施方案中，生物半衰期可以通过确定物质的血浆浓度达到其稳态水平的一半所花费的时间(“血浆半衰期”)来评估。可以用于衍生并增加蛋白质的生物半衰期的缀合物是本领域中已知的，并且包括但不限于多聚化结构域(例如Fc免疫球蛋白结构域)、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、XTEN(延长的重组肽；参见WO 2013130683)、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、脂质(酰化)，以及聚-Pro-Ala-Ser(PAS)、聚谷氨酸(谷氨酰化)。
如本文所用术语“细胞表面反结构”(可替代地“细胞表面结合配偶体”)是在哺乳动物细胞上表达的反结构(可替代地是结合配偶体)。通常，所述细胞表面结合配偶体是跨膜蛋白。在一些实施方案中，所述细胞表面结合配偶体是受体。
关于蛋白质(如受体、可溶配体)或关于其细胞外结构域或部分或其亲和力修饰的变体的术语“结合配偶体”或“反结构”是指参考蛋白质在特异性结合条件下特异性结合的至少一种分子(通常为天然哺乳动物蛋白)。在一些方面，亲和力修饰的结构域或含有亲和力修饰的结构域的免疫调节蛋白与天然或野生型蛋白质的相应结构域的结合配偶体特异性结合，但是亲和力有所增加或减弱。“细胞表面结合配偶体”是在哺乳动物细胞上表达的结合配偶体。通常，所述细胞表面结合配偶体是跨膜蛋白。在一些实施方案中，所述细胞表面结合配偶体是在形成免疫突触的细胞(如哺乳动物细胞，例如免疫细胞)上表达或由所述细胞表达的受体或受体的配体。
关于与细胞表面分子结合的术语“顺式”是指与两种或更多种不同的细胞表面分子结合，其中每种存在于相同细胞的表面上。在一些实施方案中，顺式意指，所述两种或更多种细胞表面分子仅存在于形成IS的两种哺乳动物细胞中的一种上或者仅存在于另一种(但并非两种)上。
如本文所用的术语“保守氨基酸取代”意指如下氨基酸取代，其中氨基酸残基被另一氨基酸残基取代，所述另一氨基酸残基具有化学特性(例如，电荷或疏水性)相似的侧链R基。具有化学特性相似的侧链的氨基酸基团的例子包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸取代基团为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸盐-天冬氨酸盐和天冬酰胺-谷氨酰胺。
关于蛋白质位置的术语“对应于”，如核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开序列中的核苷酸或氨基酸位置的叙述，如序列表中所述，是指在基于结构序列比对或使用标准比对算法(如GAP算法)与所公开序列比对后鉴定的核苷酸或氨基酸位置。通过比对序列，本领域技术人员可例如使用保守和相同的氨基酸残基作为指导来鉴定相应残基。图17A和图17B例示通过比对两个序列来鉴定相应残基。
如本文所用，“结构域”(通常是三个或更多个，一般5或7个或更多氨基酸，例如10至200个氨基酸残基)是指分子(例如蛋白质或编码核酸)的一部分，其在结构上和/或功能上与所述分子的其他部分不同，并且是可鉴定的。例如，结构域包括多肽链的那些部分，所述部分可在由一个或多个结构基序构成的蛋白质内形成独立折叠的结构和/或借助功能活性(例如结合活性)而被识别。蛋白质可以具有一个或超过一个独特结构域。例如，结构域可以按照一级序列或结构与相关家族成员的同源性(如与基序的同源性)来鉴定、定义或区分。在另一个例子中，结构域可以通过其功能来区分，例如与生物分子(例如同源结合配偶体)相互作用的能力。结构域可独立地展现生物学功能或活性，使得结构域可独立地或与另一份子融合后发挥活性，例如结合。结构域可以是线性氨基酸序列或非线性氨基酸序列。多种多肽含有多个结构域。这样的结构域是已知的，并且可由本领域技术人员来鉴定。为了本文的示例，提供了定义，但应理解，通过名称识别特定结构域在本领域技术范围内。如果需要，可采用适当软件来鉴定结构域。应理解，提及氨基酸(包括提及用于描述结构域组织(例如IgSF结构域或TD结构域的组织)的示为SEQ ID NO的特定序列)用于说明性目的，并且不欲限制所提供的实施方案的范围。应理解，多肽和其结构域的描述是在理论上基于与相似分子的同源性分析和比对而导出的。同样，在一些情形中，给定结构域(例如IgSF结构域或TD)的相邻N和/或C末端氨基酸也可以包括在序列中，例如以确保所述结构域在表达时的适当折叠。因此，确切基因座可变，并且对于每种蛋白质不一定相同。例如，特定IgSF结构域(如特定IgV结构域或IgC结构域)可能长或短几个氨基酸(1-10，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)。同样，特定TD结构域(如特定CRD结构域)可能长或短几个氨基酸(1-10，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)。
在本文中可互换使用的术语“胞外域”、“细胞外结构域”或“ECD”是指在从细胞表达全长形式的膜蛋白(如跨膜蛋白)时，所述膜蛋白的位于液泡膜外部(例如，细胞外部的空间)的区域。出于本文的目的，应理解，提及ECD时是指构成该区域的序列和结构域，且不要求含有ECD的蛋白质是膜蛋白或所述结构域存在于细胞外部。例如，可溶免疫调节蛋白可以含有与另一部分(如多聚化结构域，例如Fc区)融合的膜蛋白的ECD序列。胞外域通常与特异性配体或特异性细胞表面受体相互作用，例如通过特异性地结合至配体或细胞表面受体的结合结构域来相互作用。结合结构域的例子包括免疫球蛋白结构域(IgD，也称为IgSF结构域)或富半胱氨酸结构域(CRD)。免疫球蛋白超家族成员的胞外域含有IgD(例如IgV结构域)。TNFR超家族成员的胞外域含有TD结构域(例如CRD结构域)。因此，本文中提及ECD时包括膜蛋白的ECD的全长序列，以及其与配体或同源结合配偶体结合的含有IgD或CRD的特异性结合片段。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指治疗组合物(如含有免疫调节蛋白或Fc融合蛋白)在单独地(即，作为单一疗法)或与另外的治疗剂组合地离体(通过与来自患者的细胞接触)或体内(通过施用至患者体内)施用时，对疾病进展产生统计学显著的抑制(如例如通过改善或消除疾病的症状和/或病因)的量和/或浓度。用于治疗疾病、病症或障碍(如免疫系统疾病或障碍)的有效量可以是减轻、减少或缓解与所述疾病、病症或障碍相关的至少一种症状或生物反应或效应、预防所述疾病、病症或障碍的进展或者改进患者的身体机能的量。在细胞疗法的情形中，有效量是施用至患者的细胞的有效剂量或数量。在一些实施方案中，所述患者是人患者。
如本文所用，融合蛋白是指由含有两种或更多种蛋白质(在一些情形中，2、3、4、5或更多种蛋白质)的编码序列的核酸序列编码的多肽，其中所述编码序列位于同一阅读框中，使得当在宿主细胞中转录并翻译融合构建体时，产生含有所述两种或更多种蛋白质的蛋白质。所述两种或更多种蛋白质中的每一种可以与构建体中的另一种蛋白质相邻，或者被接头多肽隔开，所述接头多肽含有1、2、3或更多个氨基酸，但通常少于20、15、10、9、8、7或6个氨基酸。由融合构建体编码的蛋白质产物被称为融合多肽。根据所提供的实施方案的融合蛋白的例子是Fc融合蛋白，其含有与免疫球蛋白Fc结构域连接的亲和力修饰的结构域(例如BCMA或其含有CRD的部分的变体)。
术语“半衰期延长部分”是指多肽融合物或化学缀合物的部分，与未与所述部分如此缀合的蛋白质的半衰期相比，所述部分延长蛋白质在哺乳动物血清中循环的半衰期。在一些实施方案中，半衰期被延长大于或约1.2倍、约1.5倍、约2.0倍、约3.0倍、约4.0倍、约5.0倍或约6.0倍。在一些实施方案中，与没有半衰期延长部分的蛋白质相比，在体内施用后，半衰期被延长超过6小时、超过12小时、超过24小时、超过48小时、超过72小时、超过96小时或超过1周。半衰期是指蛋白质丧失其浓度、量或活性的一半所花费的时间长度。半衰期可例如通过使用ELISA测定或活性测定来确定。示例性半衰期延长部分包括Fc结构域、多聚化结构域、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、XTEN(延伸的重组肽；参见，WO 2013130683)、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、脂质(酰化)、和聚-Pro-Ala-Ser(PAS)以及聚谷氨酸(谷氨酰胺化)。
免疫球蛋白分子的Fc(可结晶片段)区或结构域(也称为Fc多肽)主要对应于免疫球蛋白重链的恒定区，并且其在一些情形中负责多种功能，包括抗体的一种或多种效应子功能。Fc结构域含有免疫球蛋白分子的部分或全部铰链结构域加上CH2和CH3结构域。在用于包括在所提供的融合蛋白中的一些情形中，Fc铰链序列的全部或一部分可能缺失。Fc结构域可以形成通过一个或多个二硫键接合的两条多肽链的二聚体。在一些实施方案中，Fc是变体Fc，其展现降低(例如降低大于约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)的活性以促进效应子功能。在一些实施方案中，除非关于具体的SEQ ID NO进行描述，否则提及Fc区中的氨基酸取代是按照EU编号系统。EU编号是已知的，并且符合最新更新的IMGTScientific Chart(国际ImMunoGeneTics信息系统/>http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html(创建：2001年5月17日，最后更新：2013年1月10日)和如以下文献中报道的EU索引：Kabat,E.A.等人Sequences of Proteinsof Immunological interest.第5版US Department of Health and Human Services,NIH公开号91-3242(1991)。
免疫球蛋白Fc融合物(“Fc融合物”)(如免疫调节Fc融合蛋白)是包含与免疫球蛋白的Fc区可操作地连接的一种或多种多肽的分子。Fc融合物可以包含例如与所提供的免疫调节蛋白的TIM或BIM可操作地连接的Fc区。Fc融合物可以包含例如与BCMA细胞外结构域或其含有CRD的部分(包括其任何所提供的亲和力修饰的变体)可操作地连接的Fc区。免疫球蛋白Fc区可以与一种或多种多肽间接或直接连接。多种接头是本领域中已知的，并且可以任选地用于将Fc与融合配偶体相连接以生成Fc融合物。相同种类的Fc融合物可以二聚化以形成Fc融合物同二聚体。不同种类的Fc融合物(例如杵臼结构工程化)可以用于形成Fc融合物异二聚体。在一些实施方案中，Fc是哺乳动物Fc，如鼠或人Fc。
术语“宿主细胞”是指可用于表达由重组表达载体编码的蛋白质的任何细胞。宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌(E.coli)，或其可以是真核生物，例如，单细胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人类细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。宿主细胞的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物，例如在无血清培养基中生长的Veggie CHO和相关细胞系，或缺乏DHFR的CHO株系DX-B11。
如本文所用术语“免疫突触(immunological synapse)”或“免疫突触(immunesynapse)”(缩写为“IS”)意指表达MHC I(主要组织相容性复合物)或MHC II的哺乳动物细胞(例如抗原呈递细胞或肿瘤细胞)与哺乳动物淋巴细胞(例如效应T细胞或天然杀伤(NK)细胞之间的界面。
如本文所用术语“免疫球蛋白”(缩写为“Ig”)与术语“抗体”(缩写为“Ab”)同义，并且是指哺乳动物免疫球蛋白，包括五个人类类别中的任一类别：IgA(其包括子类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(其包括子类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)和IgM。所述术语还包括小于全长的免疫球蛋白，不论是完全或部分合成的(例如，重组或化学合成)还是自然产生的，包括其含有所述免疫球蛋白分子的可变重(VH)链和/或可变轻(VL)链区的至少一部分的任何片段，所述片段足以形成抗原结合位点并且在组装时足以特异性结合抗原。所述抗体还可包括恒定区的全部或一部分。这样的片段包括抗原结合片段(Fab)、含有VH和VL的可变片段(Fv)、含有连接在一条链中的VH和VL的单链可变片段(scFv)以及其他抗体V区片段，如Fab'、F(ab)2、F(ab')2、dsFv双抗体、Fc和Fd多肽片段。因此，应理解，本文中提及抗体时包括全长抗体和抗原结合片段。术语抗体还包括具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、双抗体和单链分子。同双特异性和异双特异性的双特异性抗体包括在所述术语的含义内。抗体包括多克隆抗体或单克隆抗体。抗体还包括合成抗体或重组产生的抗体。对于不同抗体类别的结构和特性，参见例如，Basic and ClinicalImmunology,第8版,Daniel P.Sties,Abba I.Terr和Tristram G.Parsolw(编辑),Appleton&Lange,Norwalk,CT,1994,第71页和第6章。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“全抗体”可互换使用，指代呈其基本上完整形式的抗体，与抗体片段相反。全长抗体是典型地具有两个全长重链(例如，VH-CH1-CH2-CH3或VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和两个全长轻链(VL-CL)以及铰链区的抗体，如通过分泌B细胞的抗体从哺乳动物物种(例如人、小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物等)产生的抗体和合成产生的具有相同结构域的抗体。具体地，完全抗体包括具有重链和轻链(包括Fc区)的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可具有一种或多种效应物功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分、完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗体片段(包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd'片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等人,ProteinEng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子，包括单链Fv(scFv)或单链Fab(scFab)；上文任一种的抗原结合片段以及来自抗体片段的多特异性抗体。
“Fv”由通过非共价缔合连接的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域构成。从这两个结构域的折叠发散出六个互补决定区(CDR)(重链和轻链各有3个)，它们贡献用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单一可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的CDR的Fv的一半)具有识别并结合抗原的能力，但是在一些情形中，其亲和力低于整个结合位点。
“dsFv”是指具有稳定VH-VL对的工程化的分子间二硫键的Fv。
“Fd片段”是含有抗体重链的可变结构域(VH)和一个恒定区结构域(CH1)的抗体片段。
“Fab片段”是通过用木瓜蛋白酶消化全长免疫球蛋白得到的抗体片段，或者具有合成(例如，通过重组方法)产生的相同结构的片段。Fab片段含有轻链(含有VL和CL)以及含有重链可变结构域(VH)和重链的一个恒定区结构域(CH1)的另一条链。
“F(ab')2片段”是通过在pH 4.0-4.5下用胃蛋白酶消化免疫球蛋白得到的抗体片段，或者具有合成(例如，通过重组方法)产生的相同结构的片段。F(ab')2片段基本上含有两个Fab片段，其中每个重链部分含有另外几个氨基酸，包括形成接合两个片段的二硫键的半胱氨酸残基。
“Fab'片段”是含有F(ab')2片段的一半(一条重链和一条轻链)的片段。
“Fd'片段”是含有F(ab')2片段的一个重链部分的抗体片段。
“Fv'片段”是仅含抗体分子的VH和VL结构域的片段。
“scFv片段”是指含有通过多肽接头以任何顺序共价连接的可变轻链(VL)和可变重链(VH)的抗体片段。所述接头的长度使得两个可变结构域在不被严重干扰的情况下桥接。示例性接头是(Gly-Ser)n残基，其中一些Glu或Lys残基遍布各处以增加溶解性。
“双抗体”是二聚scFv；双抗体通常具有短于scFv的肽接头，并且优先发生二聚化。
如本文所用的术语“免疫球蛋白超家族”或“IgSF”意指参与细胞的识别、结合或粘附过程的细胞表面蛋白和可溶蛋白的组。基于与免疫球蛋白(即抗体)共有的结构特征，将分子归类为此超家族的成员；它们都具有称为免疫球蛋白结构域或折叠的结构域。许多“非抗体IgSF”成员包括并非抗体的细胞表面蛋白或受体。IgSF成员包括免疫系统的细胞表面抗原受体、共受体和共刺激分子、参与抗原呈递至淋巴细胞的分子、细胞粘附分子、某些细胞因子受体和细胞内肌肉蛋白。其一般与免疫系统中的作用相关。免疫突触中的蛋白质通常是IgSF成员。还可以基于共有特性(如功能)将IgSF分类为“亚家族”。这样的亚家族通常包括4至30个IgSF成员。
如本文所用术语“IgSF结构域”或“免疫球蛋白结构域”或“Ig结构域”或“IgD”是指IgSF蛋白的一个或多个结构性结构域。Ig结构域是根据免疫球蛋白分子来命名。其含有约70-110个氨基酸并根据其大小和功能来归类。Ig结构域具有特征性Ig折叠，其具有由两条反平行β链形成的夹心样结构。夹心结构内侧上的疏水性氨基酸之间的相互作用以及B链和F链中的半胱氨酸残基之间形成的高保守二硫键稳定Ig折叠。在一些情形中，Ig结构域的一个末端具有称为互补决定区的部分，在一些方面，所述部分参与抗体对其配体的特异性。可以将Ig样结构域分类(为多个类别)为：IgV、IgC1、IgC2或IgI。大多数Ig结构域是可变的(IgV)或恒定的(IgC)。具有9条β链的IgV结构域通常比具有7条β链的IgC结构域更长。一些IgSF成员的Ig结构域的氨基酸序列与IgV结构域相似，而大小与IgC结构域相似。这些Ig结构域称为IgC2结构域，而标准IgC结构域称为IgC1结构域。T细胞受体(TCR)链含有细胞外部分中的两个Ig结构域、N末端的一个IgV结构域和与细胞膜相邻的一个IgC1结构域。“非抗体IgSF结构域”是指存在于除了抗体以外的蛋白质中的一个或多个IgSF结构域，其通常存在于某些细胞表面蛋白的细胞外部分或结构域中。因此，IgSF家族成员的细胞外结构域(ECD)含有一个或多个Ig结构域；因此，术语Ig结构域也关于这样的蛋白质分子的ECD来使用。提及变体IgSF结构域(vIgD)是指IgD的变体或修饰的序列。
如本文所用术语“免疫活性”是指免疫细胞(如T细胞或B细胞)的一种或多种活性，包括例如激活、细胞存活、细胞增殖、细胞因子产生(例如干扰素-γ)、细胞毒性活性或者激活NF-κB途径或导致激活免疫细胞中的转录因子的其他信号传导级联的能力。可以将用于评估免疫调节蛋白的免疫活性的测定与具有抑制活性的对照蛋白相比较。
“免疫调节蛋白”或“免疫调节多肽”是调节免疫活性的蛋白质。“调节(modulation)”或“调节(modulating)”免疫反应意指被增强或抑制的免疫活性。这样的调节包括对免疫细胞(如B细胞或T细胞)的免疫活性的任何诱导、或者程度或范围的改变、或者抑制。例如，本文中的可溶Fc融合蛋白可以抑制B细胞、T细胞或B细胞和T细胞二者的免疫活性。免疫调节蛋白可以是单一多肽链或通过例如链间二硫键相互共价键合的至少两条多肽链的多聚体(二聚体或更高级多聚体)。因此，单体、二聚和更高级多聚蛋白在所定义术语的范围内。多聚蛋白可以是同多聚(具有相同多肽链)或异多聚(具有不同多肽链)。
如本文所用，修饰是关于对多肽的氨基酸序列或核酸分子中的核苷酸序列的修饰，并且分别包括序列的氨基酸或核苷酸的变化。氨基酸修饰或变化可以分别是氨基酸或核苷酸缺失、插入或替代(取代)。修饰多肽的方法对于本领域技术人员是常规的，如通过使用重组DNA方法。
术语“多聚化结构域”是指促进两种或更多种多肽的多聚体形成的氨基酸序列。多聚化结构域包括促进多肽分子与一种或多种另外的多肽分子的稳定相互作用的序列，每种另外的多肽分子含有互补多聚化结构域(例如第一多聚化结构域和第二多聚化结构域)，所述互补多聚化结构域可以是相同或不同的多聚化结构域。互补多聚化结构域之间的相互作用(例如，第一多聚化结构域与第二多聚化结构域之间的相互作用)形成稳定的蛋白质-蛋白质相互作用，以产生多肽分子与另外的多肽分子的多聚体。在一些情况下，多聚化结构域是相同的并且与自身相互作用，以在两条多肽链之间形成稳定的蛋白质-蛋白质相互作用。通常，多肽直接或间接地与多聚化结构域接合。示例性的多聚化结构域包括免疫球蛋白序列或其部分、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区和相容的蛋白质-蛋白质相互作用结构域。例如，多聚化结构域可以是免疫球蛋白恒定区或结构域，如例如来自IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA、IgE、IgD和IgM及其修饰形式的Fc结构域或其部分。
术语“核酸”与“多核苷酸”可互换使用，是指呈单链或双链形式的核酸残基(例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合物。除非明确限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，并且所述类似物具有与天然核苷酸类似的结合特性，并且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除非另有指示，否则特定核酸序列还暗示涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补核苷酸序列以及明确指示的序列。具体地，简并密码子取代可通过生成其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现。术语核酸或多核苷酸涵盖基因编码的cDNA或mRNA。
如本文所用术语“呈可操作的组合”、“按可操作的顺序”和“可操作地连接的”是指核酸序列的连接方式或定向使得区段的排列使它们协同作用于其既定目的。在一些实施方案中，所述术语是指核酸连接以产生能够引导给定基因的转录的核酸分子，和/或产生具有功能性的所需蛋白质分子。例如，DNA序列的区段(例如编码序列和一个或多个调节序列)以这样的方式连接以允许在适当分子(例如转录激活蛋白)与调节序列结合时进行基因表达。
术语“药物组合物”是指适合于哺乳动物受试者(通常是人)的医药用途的组合物。药物组合物通常包含有效量的活性剂(例如，免疫调节蛋白)以及载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂或稀释剂通常分别是药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的分子链。所述术语并非是指特定长度的产物。因此，“肽”和“寡肽”包括于多肽的定义内。所述术语包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。所述术语还包括其中包括一个或多个氨基酸类似物或非经典或非天然氨基酸的分子，如可合成或使用已知的蛋白质工程化技术重组表达的。另外，蛋白质可通过熟知的有机化学技术如本文所述来衍生。
如应用于核酸(如编码免疫调节蛋白或蛋白质(例如免疫调节蛋白)的核酸)的术语“纯化的”通常表示如通过本领域熟知的分析技术所确定基本上不含其他组分的核酸或多肽(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经历密度梯度离心的介质中形成离散谱带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一个谱带的核酸或多肽是“纯化的”。纯化的核酸或蛋白质是至少约50％纯的，通常至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、99％或更高纯度(例如，重量百分比或以摩尔计)。
术语“重组”表明，材料(例如，核酸或多肽)已通过人为干预发生人工(即非天然)改变。所述改变可以对处于其自然环境或状态内的材料进行，或者对从其自然环境或状态取出的材料进行。例如，“重组核酸”是例如在克隆、亲和力修饰、DNA改组或其他熟知的分子生物学程序期间通过重组核酸来制备的核酸。“重组DNA分子”是由借助此类分子生物学技术接合在一起的DNA区段构成。如本文所用术语“重组蛋白”或“重组多肽”是指使用重组DNA分子表达的蛋白质分子(例如，免疫调节蛋白)。“重组宿主细胞”是含有和/或表达重组核酸或以其他方式通过遗传工程化改变的细胞，例如通过向细胞中引入编码重组蛋白(例如本文所提供的免疫调节蛋白)的核酸分子来改变。真核生物中的转录控制信号包括“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由DNA序列的短阵列组成，所述序列与参与转录的细胞蛋白特异性相互作用。已经从多种真核来源分离出启动子和增强子元件，所述来源包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞以及病毒中的基因(在原核生物中也发现了类似的控制元件，即启动子)。特定启动子和增强子的选择取决于要使用何种细胞类型来表达目的蛋白质。
如本文所用术语“重组表达载体”是指含有所需编码序列(例如，编码免疫调节蛋白)和在特定细胞中表达可操作连接的编码序列所需的适当核酸序列的DNA分子。在原核生物中表达所需的核酸序列包括启动子、任选地操纵子序列、核糖体结合位点和可能的其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止信号和多腺苷酸化信号。分泌信号肽序列还可以任选地由重组表达载体编码，所述重组表达载体与编码序列可操作地连接使得所表达的蛋白质可以由重组宿主细胞分泌，如用于其作为可分泌蛋白质的表达或者用于更容易地从细胞分离或纯化免疫调节蛋白(如果需要的话)。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞基因组中的载体。所述载体包括病毒载体，如慢病毒载体。
如本文所用术语“序列同一性”是指基因或蛋白质之间分别在核苷酸或氨基酸水平上的序列同一性。“序列同一性”是蛋白质之间在氨基酸水平上的同一性量度以及核酸之间在核苷酸水平上的同一性量度。蛋白质序列同一性可通过比较在比对序列时每个序列中给定位置的氨基酸序列来确定。类似地，核酸序列同一性可通过比较在比对序列时每个序列中给定位置的核苷酸序列来确定。用于比对序列以供比较的方法是本领域中熟知的，这样的方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件、FASTA和TFASTA。BLAST算法计算序列同一性百分比并对两个序列之间的相似性进行统计学分析。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)网站公开获得。在一些情形中，可以将序列同一性百分比确定为在比对序列并引入空位(如果需要)以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中与参考序列中的氨基酸残基(或核苷酸残基)相同的氨基酸残基(或核苷酸残基)的百分比。提及序列同一性时包括横跨所比较的每个序列的全长的序列同一性。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
如本文关于蛋白质使用的术语“可溶的”意指，所述蛋白质并非膜蛋白或者未锚定于细胞膜中。可以通过仅包括细胞外结构域或其部分且不具有跨膜结构域将蛋白质构建为可溶蛋白。在一些情形中，可以通过直接或经由接头间接连接或附接至Fc结构域或其他半衰期延长分子来改进蛋白质的溶解性，所述Fc结构域或其他半衰期延长分子在一些情形中也可以改进所述蛋白质的稳定性和/或半衰期。在一些方面，可溶蛋白是Fc融合蛋白。
如本文所用的术语“特异性结合”意指蛋白质在特异性结合条件下与靶蛋白结合，使得其亲和力或亲合力是相同蛋白质与足够统计量的随机肽或多肽集合的平均亲和力或亲合力的至少10倍，但是任选地50、100、250或500倍，或甚至至少1000倍的能力。特异性结合蛋白无需仅与单一靶标分子结合，而是可以与超过一种靶标分子特异性结合。在一些情形中，特异性结合蛋白可以与结构构象与靶蛋白类似的蛋白质(例如，旁系同源物或直系同源物)结合。技术人员将认识到，特异性结合至在不同物种的动物中具有相同功能的分子(即，直系同源物)或与靶分子具有基本上类似的表位的分子(例如，旁系同源物)是可能的，并且不会减弱相对于独特非靶标(例如，随机多肽)的统计学上有效的集合来确定的结合特异性。因此，本发明的免疫调节蛋白或其BIM或TIM可以由于交叉反应性而与超过一个不同种类的靶分子特异性结合。固相ELISA免疫测定、ForteBio Octet或Biacore测量可以用于确定两种蛋白质之间的特异性结合。通常，两种结合蛋白之间的相互作用的解离常数(Kd)小于约1x10-5M，并且通常低至约1x10-12M。在本公开文本的某些方面，两种结合蛋白之间的相互作用的解离常数小于约1x10-6M、1x10-7M、1x10-8M、1x10-9M、1x10-10M或1x10-11M或更小。
如本文关于蛋白质使用的术语“特异性结合片段”或“片段”意指如下多肽，其短于全长蛋白或其特定结构域或区域，并且在体外和/或体内与所述全长蛋白或特定结构域或区域的结合配偶体特异性结合。特异性结合片段是关于多肽或多肽的结合结构域的全长细胞外结构域的片段，但是仍与所述结合结构域的结合配偶体结合。例如，特异性结合片段是关于IgSF家族成员或其全长IgSF结构域(例如IgV或IgC)的全长细胞外结构域的片段，但是仍与所述IgSF家族成员或IgSF家族成员的IgSF结构域的结合配偶体结合。在另一例子中，特异性结合片段是关于全长TNFR家族成员或其全长TNFR结构域(TD)(例如CRD)的细胞外结构域的片段，但是仍与所述TNFR家族成员或TNFR家族成员的CRD的结合配偶体结合。在一些实施方案中，所述特异性结合片段具有细胞外结构域或者细胞外结构域的结构域或区域的全长序列的至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列长度。在一些实施方案中，特异性结合片段可具有至少50个氨基酸，例如至少60、70、80、90、100或110个氨基酸的氨基酸长度。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。受试者可以是雄性或雌性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、幼年、青少年、成年和老年受试者。
如本文所用，关于例如合成核酸分子或合成基因或合成肽的“合成的”是指通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的核酸分子或多肽分子。
如本文所用术语“TNF受体超家族”或“TNFRSF”意指细胞表面细胞因子受体的组，所述细胞因子受体都是I型(N末端细胞外)跨膜糖蛋白，在其细胞外结构域中含有一至六个富半胱氨酸结构域(CRD)。基于共有的结构特征将分子分类为该超家族的成员，所述结构特征包括存在于其N末端细胞外区域中的一个或多个富半胱氨酸结构域(CRD)，所述富半胱氨酸结构域通常在蛋白质与其同源结合配偶体或配体的结合中发挥作用。TNFRSF蛋白可以仅具有一个或几个CRD(例如CRD1、CRD2等)。通常，TNFRSF成员的ECD或胞外域含有1与6个之间的CRD假重复序列。例如，BAFF受体和BCMA各自含有一个CRD，而TACI含有两个CRD(CRD1和CRD2)。TNFRSF成员通常为三聚或多聚复合物，它们通过其半胱氨酸内二硫键来稳定。TNFRSF蛋白与其配体的结合促进细胞中的多种生物活性，如凋亡性细胞死亡或细胞存活和增殖的诱导。
术语“TD”是指TNFRSF蛋白或TNF家族配体的一个或多个结构性结构域。例如，TNFRSF蛋白的TD是约40个氨基酸的富半胱氨酸结构域(CRD)模块，其含有六(6)个保守半胱氨酸。因此，提及CRD时也可以与关于TNFRSF蛋白的TD的术语TD互换使用。所述六个半胱氨酸参与链内二硫键的形成。TNFRSF成员的细胞外结构域(ECD)含有一个或多个CRD结构域；因此，术语TD也关于这样的蛋白质分子的ECD来使用。提及变体TD(vTD)时是指TD的变体或修饰的序列。
术语“T细胞抑制分子”或TIM是指拮抗或阻断T细胞刺激性受体的活性的蛋白质分子。TIM可以通过以下方式来拮抗T细胞刺激性受体的活性：与T细胞刺激性受体或T细胞刺激性受体的配体直接结合，从而阻断或降低所述配体与所述T细胞刺激性受体之间的结合。例如，TIM拮抗或抑制T细胞共刺激受体如CD28的活性。在特定实施方案中，本文提供的TIM含有T细胞刺激性受体的同源配体的细胞外结构域或其含有免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域(如IgV结构域)的部分。例如，TIM包括CTLA-4的细胞外结构域或者CTLA-4的细胞外结构域的部分，所述部分含有与T细胞刺激性受体(例如CD28)结合的IgSF结构域(例如IgV结构域)。TIM还可以包括T细胞刺激性受体(例如CTLA-4)的同源配体的细胞外结构域或其部分的亲和力修饰的变体，所述变体在IgSF结构域中具有一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)，所述修饰增加对T细胞刺激性受体(例如CD28)的结合亲和力。
如本文所用，“T细胞刺激性受体”是指在T细胞上表达的细胞表面分子，其中所述分子的接合或连接导致所述细胞中一种或多种酪氨酸激酶的直接或间接激活，和/或最终导致表达所述分子的T细胞的一种或多种效应子细胞功能的诱导或加强。T细胞刺激性受体通常含有细胞外部分、跨膜结构域和胞质区。在一些实施方案中，胞质区含有细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM；定义为序列YXX(L/I)X6-8YXX(L/I))，或者原本能够与参与或调节信号转导途径中的酪氨酸磷酸化的一种或多种辅助蛋白(如一种或多种衔接体蛋白质)相互作用或缔合。在一些情形中，T细胞刺激性受体与含有ITAM的衔接体蛋白质或者含有一个或多个蛋白质结合结构域(如例如，Src同源2(SH2)和SH3结构域)的衔接体蛋白质相互作用或缔合，所述蛋白质结合结构域结合信号转导途径中的蛋白质内的特定氨基酸序列，例如磷酸酪氨酸残基。衔接体蛋白质的例子包括但不限于Lck、Fyn、ZAP70、SLP76、PI3K、Grb2、PKCθ和SHC1。因此，应理解，T细胞刺激性受体自身无需具有固有的酶活性，但是可以经由辅助蛋白或衔接体蛋白质间接介导酶活性。通常，T细胞刺激性受体的接合启动、介导或加强T细胞的激活，从而导致T细胞中可测量的形态、表型和/或功能变化，包括细胞增殖、细胞溶解活性、细胞因子产生或分泌或者细胞表面分子如受体或粘附分子的表达。在一些实施方案中，T细胞刺激性受体包括T细胞受体(TCR)、CD3、CD4、CD8、CD28、ICOS或CD2。例如，T细胞刺激性受体是共刺激受体，如CD28。
关于与细胞表面分子的结合的术语“反式”是指与两种不同的细胞表面分子结合，其中每种存在于不同细胞的表面上。在一些实施方案中，反式意指，关于两种不同的细胞表面分子，第一种仅存在于形成IS的两种哺乳动物细胞中的一种上，并且第二种仅存在于形成IS的两种哺乳动物细胞中的另一种上。
如本文所用的术语“跨膜蛋白”意指基本上或完全跨越脂质双层的膜蛋白，所述脂质双层如在生物膜(如哺乳动物细胞)中或在人工构建体(如脂质体)中发现的那些脂质双层。跨膜蛋白包含跨膜结构域(“跨膜结构域”)，所述跨膜蛋白通过所述跨膜结构域整合至脂质双层中，并且所述整合通过所述跨膜结构域在生理条件下是热力学稳定的。跨膜结构域通常可通过很多的市售生物信息学软件应用，基于其相对于与水性环境(例如胞质溶胶、细胞外液)相互作用的蛋白质区域提高的疏水性，从其氨基酸序列来预测。跨膜结构域通常为跨越膜的疏水性α螺旋。跨膜蛋白可一次或多次穿过脂质双层的两个层。
如本文所用的术语疾病或障碍的“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”或“疗法”意指减慢、停止或逆转疾病、病症或障碍的进展，如通过临床或诊断症状的减少、停止或消除所证实的，通过施用单独的或与如本文所述的另一种化合物组合的本发明的免疫调节蛋白或工程化细胞来实现。“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”或“疗法”还意指急性或慢性疾病、病症或障碍的症状严重程度的降低，或如例如在复发型或缓解型自身免疫性疾病病程或炎性病症的情形中复发率的降低，或在自身免疫性疾病或炎性病症的炎症方面的情形中炎症的减少。如在本发明的情况下使用的对疾病或障碍的“预防(preventing)”、“预防(prophylaxis)”或“预防(prevention)”是指施用单独的或与另一种化合物组合的免疫调节蛋白，以预防疾病或障碍或者疾病、病症或障碍的一些或所有症状的发生或发作，或者减小疾病、病症或障碍发作的可能性。
如关于变体蛋白或多肽使用的术语“变体”(也称为“修饰的”或“突变体”，它们可以互换使用)意指通过人为干预产生的蛋白质，如哺乳动物(例如，人或鼠)蛋白质。变体是相对于未修饰的或野生型蛋白质或者相对于其结构域，具有改变的或修饰的氨基酸序列的多肽，如通过一个或多个氨基酸取代、缺失、添加或其组合来改变或修饰。变体多肽可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个氨基酸差异(如氨基酸取代)。变体多肽通常展现与相应形式的野生型或未修饰的蛋白质(如其成熟序列(缺少信号序列)或其含有细胞外结构域或其结合结构域的部分)至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。非天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸包括在可允许的取代或添加的范围内。变体蛋白不限于任何特定的制备方法，并且包括例如化学合成、重组DNA技术或其组合。本发明的变体蛋白与至少一种或多种结合配偶体特异性结合。在一些实施方案中，改变的氨基酸序列导致改变的(即，增加的或降低的)与一种或多种结合配偶体的结合活性，如结合亲和力或亲合力。变体蛋白因此可以是如本文所述的“亲和力修饰的”蛋白质。
如本文所用的可互换使用的术语“野生型”或“天然的(natural)”或“天然的(native)”是结合在自然界中发现且未通过人为干预修饰的生物材料(如核酸分子、蛋白质、宿主细胞等)来使用。
II.BCMA免疫调节蛋白和变体BCMA多肽
本文提供BCMA免疫调节蛋白，其含有与至少一种BCMA同源结合配偶体结合的BCMA受体的细胞外结构域(ECD)的一部分或其变体。本文还提供变体BCMA多肽，其展现改变的(例如增加的)对一种或多种BCMA同源结合配偶体的结合活性或亲和力。在一些实施方案中，所述BCMA同源结合配偶体是BAFF或APRIL中的一种或多种或者是BAFF/APRIL异三聚体。所提供的BCMA免疫调节蛋白和多肽包括其可溶融合蛋白，其中细胞外结构域或其部分的BCMA部分与另一部分(如免疫球蛋白Fc或其他多聚化结构域或半衰期延长部分)连接。因此，在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白是BCMA-Fc融合蛋白。在一些实施方案中，提供BCMA-Fc融合蛋白，其含有(1)BCMA多肽，其由BCMA受体的细胞外结构域或其与至少一种BCMA同源结合配偶体结合的部分或其变体BCMA多肽构成，以及(2)Fc结构域。BCMA多肽或变体BCMA多肽可以与Fc结构域直接或间接(例如经由肽接头)连接。
BCMA是肿瘤坏死因子受体家族成员，其特征为具有含有富半胱氨酸假重复序列结构域(CRD)的细胞外结构域(ECD)。BCMA是一种膜结合受体，其具有含有单一CRD的细胞外结构域、跨膜结构域以及含有用于与TRAF信号传导分子结合的TRAF结合位点的胞质结构域。BCMA与同源配体APRIL和BAFF结合，但是与BAFF结合的亲和力较弱。据报道，BCMA与BAFF的结合比BAFF与其其他同源受体BAFF-R和TACI之间的结合弱二至三个数量级(Bossen和Schneider等人2006Seminars in Immunology,18:263-75)。
全长BCMA的氨基酸序列示于SEQ ID NO:667中。所述蛋白质是II型膜蛋白并且缺少信号肽；在真核细胞中表达后，N末端甲硫氨酸被去除。在一些实施方案中，成熟BCMA蛋白不含如SEQ ID NO:667中所示的N末端甲硫氨酸。BCMA的细胞外结构域(SEQ ID NO:667的氨基酸残基1-54；SEQ ID NO:710中所示的ECD)含有一个富半胱氨酸结构域(CRD，下文也称为肿瘤坏死家族受体结构域或TD)，其展现对于与APRIL结合以及以较低程度与BAFF结合的亲和力。所述CRD含有SEQ ID NO:710中所示序列的氨基酸残基7-41。
在一些实施方案中，本文提供的变体BCMA多肽含有参考BCMA多肽(如含有CRD(下文也称为TD)的野生型或未修饰的BCMA多肽)的细胞外结构域中的一个或多个氨基酸修饰，如一个或多个取代(可替代地“突变”或“替代”)、缺失或添加。因此，所提供的变体BCMA多肽是或包含变体TD(“vTD”)，其中所述一个或多个氨基酸修饰(例如取代)位于CRD中。
在一些实施方案中，参考(例如未修饰的)BCMA序列是野生型BCMA序列或者是其含有CRD的部分。在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)BCMA是或包含BCMA的细胞外结构域(ECD)或其含有CRD的部分。在一些实施方案中，变体BCMA多肽包含CRD或其特异性结合片段或基本上由其组成。在一些实施方案中，变体BCMA是可溶多肽并且缺少跨膜结构域。在一些实施方案中，变体BCMA多肽还包含跨膜结构域，并且在一些情形中，还包含胞质结构域。
在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)BCMA序列是哺乳动物BCMA序列。在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)BCMA序列可以是哺乳动物BCMA，其包括但不限于人、小鼠、食蟹猴或大鼠BCMA。在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)BCMA序列是人的。示例性人BCMA序列的细胞外结构域示于SEQ ID NO:710中。
在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)BCMA序列具有(i)SEQ ID NO:710中所示的氨基酸序列或其缺少N末端甲硫氨酸的序列，(ii)展现与SEQ ID NO:710至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性并且与APRIL或BAFF结合的氨基酸序列，或者(iii)是(i)或(ii)的含有CRD的片段或部分，其中所述部分与APRIL或BAFF结合。在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)BCMA序列缺少如SEQ ID NO:710中所示的N末端甲硫氨酸。
BCMA细胞外结构域(ECD)：SEQ ID NO:710
MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNA
在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)BCMA序列缺少如SEQ ID NO:710中所示的N末端甲硫氨酸。在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)BCMA序列具有(i)SEQ ID NO:356中所示的氨基酸序列，(ii)展现与SEQ ID NO:356至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性并且与APRIL或BAFF结合的氨基酸序列，或者(iii)是(i)或(ii)的含有CRD的片段或部分，其中所述部分与APRIL或BAFF结合。
BCMA细胞外结构域(ECD)：SEQ ID NO:356
LQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNA
所提供的BCMA多肽包括变体BCMA多肽。还提供免疫调节蛋白，如BCMA-Fc融合蛋白，其含有所提供的变体BCMA多肽。在一些任何所提供的实施方案中，变体BCMA序列具有参考(例如未修饰的)BCMA序列的序列，如上文所述的任一种，但是另外含有一个或多个氨基酸修饰，如一个或多个氨基酸取代。特定地，本文提供变体BCMA多肽，其含有至少一个亲和力修饰的TD结构域(CRD)或其特异性结合片段，所述结构域或其特异性结合片段含有参考(例如，未修饰的或野生型)BCMA多肽的TD结构域中的一个或多个氨基酸取代，使得与参考(例如，未修饰的或野生型)BCMA多肽相比，变体BCMA多肽展现改变的(例如增加的)对APRIL或BAFF中的一种或两种的结合活性或亲和力。在一些实施方案中，变体BCMA多肽对APRIL和/或BAFF的结合亲和力与参考(例如，未修饰的或野生型)BCMA多肽对照序列不同，如通过例如固相ELISA免疫测定、流式细胞术或Biacore测定所确定。对每种同源结合配偶体的结合亲和力是独立的；也就是说，在一些实施方案中，相对于参考(例如，未修饰的或野生型)BCMA多肽，变体BCMA多肽具有增加的对APRIL和BAFF中的一种或两种的结合亲和力，以及降低的或不变的对APRIL或BAFF中另一种的结合亲和力。
在一些实施方案中，相对于参考(未修饰的或野生型)BCMA多肽，变体BCMA多肽具有增加的对BAFF的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于参考(未修饰的或野生型)BCMA多肽，变体BCMA多肽具有增加的对APRIL的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于参考(未修饰的或野生型)BCMA多肽，变体BCMA多肽具有增加的对APRIL和BAFF的结合亲和力。同源配体BAFFF和/或APRIL可以是哺乳动物蛋白，如人蛋白或鼠蛋白。在一些实施方案中，相对于参考(例如，未修饰的或野生型)BCMA多肽对照，具有增加的或更大的对APRIL和/或BAFF的结合亲和力的变体BCMA多肽将具有至少约5％(如至少约10％、15％、20％、25％、35％或50％)的结合亲和力的增加。在一些实施方案中，结合亲和力相对于参考(例如，未修饰的或野生型)BCMA多肽的增加是超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在任何例子中，参考(例如，未修饰的或野生型)BCMA多肽具有与变体BCMA多肽相同的序列，但是它不含一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。
在一些实施方案中，前述实施方案中任一项与BAFF的平衡解离常数(Kd)可以是小于1x10-5M、1x10-6M、1x10-7M、1x10-8M、1x10-9M、1x10-10M或1x10-11M或1x10-12M。在一些实施方案中，前述实施方案中任一项与BAFF的Kd小于或小于约1x10-9M、1x10-10M或1x10-11M或1x10-12M。在一些实施方案中，前述实施方案中任一项与BAFF的Kd在1x10-9M与为或约1x10-12M之间。在一些实施方案中，前述实施方案中任一项与BAFF的Kd是为或约1x10-9M、为或约2x10- 9M、为或约4x10-9M、为或约6x10-9M、为或约8x10-9M、为或约1x10-10M、为或约2x10-10M、为或约4x10-10M、为或约6x10-10M、为或约8x10-10M、为或约1x10-11M、为或约2x10-11M、为或约4x10- 11M、为或约6x10-11M、为或约8x10-11M或者为或约1x10-12M，或前述任何项之间的任何值。在一些实施方案中，所提供的实施方案包括如上所述的变体BCMA多肽，并且与BAFF的Kd减小(更高结合亲和力)大于或大于约1.5倍，如大于或约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。
在一些实施方案中，前述实施方案中任一项与APRIL的平衡解离常数(Kd)可以是小于1x10-5M、1x10-6M、1x10-7M、1x10-8M、1x10-9M、1x10-10M或1x10-11M或1x10-12M。在一些实施方案中，前述实施方案中任一项与APRIL的Kd小于或小于约1x10-9M、1x10-10M或1x10-11M或1x10-12M。在一些实施方案中，前述实施方案中任一项与APRIL的Kd在1x10-9M与为或约1x10-12M之间。在一些实施方案中，前述实施方案中任一项与APRIL的Kd是为或约1x10-9M、为或约2x10-9M、为或约4x10-9M、为或约6x10-9M、为或约8x10-9M、为或约1x10-10M、为或约2x10-10M、为或约4x10-10M、为或约6x10-10M、为或约8x10-10M、为或约1x10-11M、为或约2x10-11M、为或约4x10-11M、为或约6x10-11M、为或约8x10-11M或者为或约1x10-12M，或前述任何项之间的任何值。在一些实施方案中，所提供的实施方案包括如上所述的变体BCMA多肽，并且与APRIL的Kd减小(更高结合亲和力)大于或大于约1.5倍，如大于或约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。
参考(例如，未修饰的或野生型)BCMA序列不一定必须用作起始组合物以生成本文所述的变体BCMA多肽。因此，术语“修饰”(如“取代”)的使用并不意味着本发明实施方案限于制备变体BCMA多肽或含有变体BCMA多肽的免疫调节蛋白的特定方法。变体BCMA多肽可例如通过从头肽合成来制备，因此在改变密码子以编码修饰(例如取代)的意义上，不一定需要修饰，例如“取代”。这个原则也扩展到术语氨基酸残基的“添加”和“缺失”，其同样不暗示特定制备方法。设计或产生变体BCMA多肽的方法不限于任何特定方法。然而，在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的或野生型)BCMA编码核酸是从参考(例如，未修饰的或野生型)BCMA遗传物质诱变的，并且针对所需特异性结合亲和力或其他功能活性进行筛选。在一些实施方案中，变体BCMA多肽是利用可在任何数量的公共可获得的数据库获得的蛋白质或核酸序列从头合成的，然后进行筛选。国家生物技术信息中心提供此类信息，并且其网站可通过互联网公开访问，如前所述，UniProtKB数据库也是如此。
除非另外陈述，否则如本公开文本通篇所指示，变体BCMA多肽中的一个或多个氨基酸修饰是按照对应于SEQ ID NO:710中所示的参考ECD序列的位置编号的氨基酸位置编号来命名。技术人员可以熟练地鉴定修饰(例如氨基酸取代)在BCMA多肽(包括其含有其TD(CRD)的部分)中的相应位置，如通过比对参考序列(例如SEQ ID NO:356)与SEQ ID NO:710。鉴定相应残基的比对例示于图17B中。在本公开文本通篇的修饰列表中，在中间指示氨基酸位置，且相应的参考(例如未修饰的野生型)的氨基酸列示于编号之前，并且所鉴定的变体氨基酸取代列示于编号之后。如果修饰是位置的缺失，那么指示“del”，并且如果修饰是位置的插入，那么指示“ins”。在一些情况下，插入与在中间指示的氨基酸位置一起列示，且相应的参考氨基酸列示于编号之前和之后，并且所鉴定的变体氨基酸插入列示于未修饰的(例如，野生型)氨基酸之后。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽具有参考(例如，未修饰的或野生型)BCMA序列中的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)，例如如所述的任一个。一个或多个氨基酸修饰(例如取代)可能位于参考(例如，未修饰的或野生型)BCMA序列的胞外域(细胞外结构域)中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如取代)位于CRD结构域或其特异性结合片段中。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰(例如，取代)。修饰(例如取代)可能位于CRD中。在一些实施方案中，变体BCMA多肽具有CRD或其特异性结合片段中的多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。在一些实施方案中，含有如所述的一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)的变体BCMA多肽具有与参考(例如，未修饰的或野生型)BCMA多肽或其特异性结合片段(如与SEQ ID NO:710或356的氨基酸序列)的至少约85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施方案中，含有如所述的一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)的变体BCMA多肽具有与SEQ ID NO:710的氨基酸序列的至少约85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施方案中，含有如所述的一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)的变体BCMA多肽具有与SEQ IDNO:356的氨基酸序列的至少约85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽具有参考BCMA多肽或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)，所述氨基酸修饰关于SEQ ID NO:710的编号对应于一个或多个位置9、10、11、14、16、19、20、22、25、27、29、30、31、32、35、36、39、43、45、46、47或48。在一些实施方案中，变体BCMA多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)：S9G、S9N、S9Y、Q10E、Q10P、N11D、N11S、F14Y、S16A、H19A、H19C、H19D、H19E、H19F、H19G、H19I、H19K、H19L、H19M、H19N、H19P、H19Q、H19R、H19S、H19T、H19V、H19W、H19Y、A20T、I22L、I22V、Q25E、Q25F、Q25G、Q25H、Q25I、Q25K、Q25L、Q25M、Q25S、Q25V、Q25Y、R27H、R27L、S29P、S30G、S30Y、N31D、N31G、N31H、N31K、N31L、N31M、N31P、N31S、N31V、N31Y、T32I、T32S、L35A、L35M、L35P、L35S、L35V、L35Y、T36A、T36G、T36N、T36M、T36S、T36V、R39L、R39Q、A43E、A43S、V45A、V45D、V45I、T46A、T46I、N47D、N47Y、S48G或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，参考BCMA多肽示于SEQ ID NO:356中。
保守氨基酸修饰(例如取代)是落入与取代的氨基酸具有相同的氨基酸类别中的除参考(例如，未修饰的)或野生型氨基酸之外的任何氨基酸。氨基酸的类别是脂肪族(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)、羟基或含硫(丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和蛋氨酸)、环状(脯氨酸)、芳香族(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)、碱性(组氨酸、赖氨酸和精氨酸)和酸性/酰胺(天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包括在位置9处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是S9G、S9N、S9Y。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包括在位置10处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是Q10E、Q10P。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包括在位置11处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是N11D、N11S。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包括在位置19处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是H19A、H19C、H19D、H19E、H19F、H19G、H19I、H19K、H19L、H19M、H19N、H19P、H19Q、H19R、H19S、H19T、H19V、H19W、H19Y。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是H19L。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是H19K。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是H19Q。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是H19R。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是H19Y。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包括在位置22处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是I22L、I22V。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包括在位置25处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是Q25E、Q25F、Q25G、Q25H、Q25I、Q25K、Q25L、Q25M、Q25S、Q25V、Q25Y。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包括在位置27处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是R27H、R27L。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包括在位置30处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是S30G、S30Y。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包括在位置31处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是N31D、N31G、N31H、N31K、N31L、N31M、N31P、N31S、N31V、N31Y。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包括在位置32处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是T32I、T32S。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包括在位置35处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是L35A、L35M、L35P、L35S、L35V、L35Y。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包括在位置36处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是T36A、T36G、T36N、T36M、T36S、T36V。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包括在位置39处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是R39L、R39Q。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包括在位置43处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是A43E、A43S。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包括在位置45处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是V45A、V45D、V45I。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包括在位置46处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是T46A、T46I。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包括在位置47处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是N47D、N47Y。
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括S16A/H19Y/R39Q。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包含表1中列出的任何突变。表1还提供参照参考(例如，未修饰的)BCMA多肽以及示例性变体BCMA多肽的SEQ ID NO的示例性序列。如所指出的，对应于给定结构域的确切基因座或残基可以变化，如根据用于鉴定或分类结构域的方法变化。同样，在一些情形中，给定结构域(例如CRD)的相邻N和/或C末端氨基酸也可以包括于变体BCMA多肽的序列中，例如以确保所述结构域在表达时的适当折叠。因此，应当理解，表1中SEQ ID NO的例示不应解释为具有限制性。例如，变体BCMA多肽的特定结构域(如ECD结构域或其含有CRD1/CRD2或仅含CRD2的部分)可以比相应SEQ ID NO中所示的氨基酸序列长或短几个氨基酸，如长或短1-10个(例如，1、2、3、4、5、6或7个)氨基酸。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包含表1中列出的任何突变。在一些例子中，所述突变是在含有SEQ ID NO:710中所示的氨基酸序列的参考BCMA中进行。在一些例子中，所述突变是在含有SEQ ID NO:356中所示的氨基酸序列的参考BCMA中进行。
术语“修饰”(如“取代”或“突变”)的使用并不意味着本发明实施方案限于制备免疫调节蛋白的特定方法。变体BCMA多肽可以例如通过从头肽合成来制备，并且因此在改变密码子以编码修饰(例如取代)的意义上，不一定需要所述修饰(如“取代”)。这个原则也扩展到术语氨基酸残基的“添加”和“缺失”，其同样不暗示特定制备方法。用以设计或产生vTD的手段并不限于任何特定方法。然而，在一些实施方案中，野生型或未修饰的TD编码核酸是从野生型或未修饰的TD遗传物质诱变的，并且针对所需特异性结合活性(例如结合亲和力)和/或NF-κB调节或其他功能活性的改变进行筛选。在一些实施方案中，vTD是利用可在任何数量的公共可获得的数据库获得的蛋白质或核酸序列从头合成的，然后进行筛选。国家生物技术信息中心提供此类信息，并且其网站可经由互联网公开访问，UniProtKB数据库也是如此。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包含SEQ ID NO:357-435中任一项中所示的细胞外结构域(ECD)序列。在一些实施方案中，变体BCMA多肽包含如下多肽序列，其展现与SEQID NO:357-435中的任一项至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性，如至少96％的同一性、97％的同一性、98％的同一性或99％的同一性，并且在其中保留参考(例如，未修饰的或野生型)BCMA中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，变体BCMA多肽包含SEQ ID NO:357-435中任一项的特异性结合片段，其中所述特异性结合片段结合BAFF和/或APRIL并且在其中含有如下连续序列，所述连续序列在其中含有参考(例如，未修饰的或野生型)BCMA中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包含SEQ ID NO:381中所示的序列。在一些实施方案中，变体BCMA多肽基本上由SEQ ID NO:381中所示的序列组成。在一些实施方案中，变体BCMA多肽由SEQ ID NO:381中所示的序列组成。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包含SEQ ID NO:405中所示的序列。在一些实施方案中，变体BCMA多肽基本上由SEQ ID NO:405中所示的序列组成。在一些实施方案中，变体BCMA多肽由SEQ ID NO:405中所示的序列组成。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包含SEQ ID NO:406中所示的序列。在一些实施方案中，变体BCMA多肽基本上由SEQ ID NO:406中所示的序列组成。在一些实施方案中，变体BCMA多肽由SEQ ID NO:406中所示的序列组成。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包含SEQ ID NO:410中所示的序列。在一些实施方案中，变体BCMA多肽基本上由SEQ ID NO:410中所示的序列组成。在一些实施方案中，变体BCMA多肽由SEQ ID NO:410中所示的序列组成。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽包含SEQ ID NO:411中所示的序列。在一些实施方案中，变体BCMA多肽基本上由SEQ ID NO:411中所示的序列组成。在一些实施方案中，变体BCMA多肽由SEQ ID NO:411中所示的序列组成。
在一些实施方案中，变体BCMA多肽是由SEQ ID NO:437-515中任一项中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，变体BCMA多肽是由如下核苷酸序列编码，所述核苷酸序列展现与SEQ ID NO:437-515中的任一项至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性，如至少96％的同一性、97％的同一性、98％的同一性或99％的同一性，并且在其中保留参考(例如，未修饰的或野生型)BCMA中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。本文还提供一种核酸，其含有SEQ ID NO:437-515中任一项中所示的序列或者展现与SEQ ID NO:437-515中的任一项至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性(如至少96％的同一性、97％的同一性、98％的同一性或99％的同一性)的序列。
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在一些实施方案中，本文还提供BCMA ECD融合序列，其中上文BCMA序列中的任一个与多聚化结构域(如本文所述的任一个)连接或融合。示例性多聚化结构域描述于章节IV.C中。在一些实施方案中，多聚化结构域是免疫球蛋白(例如IgG1)Fc区，其中融合蛋白是含有以下的BCMA-Fc：(1)含有任何所提供的BCMA ECD序列的BCMA序列；以及(2)免疫球蛋白Fc区。因此，所提供的实施方案包括含有以下的BCMA-Fc融合蛋白：(1)含有任何上述BCMAECD多肽序列或由其组成的BCMA序列，如变体BCMA多肽；以及(2)免疫球蛋白Fc区。在一些实施方案中，BCMA-Fc融合物是变体BCMA-Fc融合物，其含有任何上述变体BCMA多肽和免疫球蛋白Fc区或由其组成。
在一些实施方案中，本文提供一种变体BCMA-Fc融合序列，其含有(1)含有SEQ IDNO:357-435中任一项中所示的序列的BCMA ECD序列，以及(2)免疫球蛋白Fc区。在一些实施方案中，本文提供一种变体BCMA-Fc融合序列，其含有(1)由SEQ ID NO:357-435中任一项中所示的序列组成或基本上由其组成的BCMA ECD序列，以及(2)免疫球蛋白Fc区。
在一些实施方案中，本文提供一种变体BCMA-Fc融合序列，其含有(1)含有SEQ IDNO:357-435中任一项中所示的序列的BCMA ECD序列，以及(2)免疫球蛋白Fc区。在一些实施方案中，本文提供一种变体BCMA-Fc融合序列，其含有(1)由SEQ ID NO:357-435中任一项中所示的序列组成或基本上由其组成的BCMA ECD序列，以及(2)免疫球蛋白Fc区。
在BCMA-Fc的所提供实施方案中，免疫球蛋白Fc区可以是免疫球蛋白的野生型Fc，如IgG1 Fc。在一些情形中，Fc区可以是缺少效应子功能的变体Fc(也称为“无效应子Fc”)。所提供的BCMA-Fc融合蛋白中的示例性Fc区及其变体描述于下文章节IV.C中。
在一些实施方案中，所述Fc是鼠或人Fc。在一些实施方案中，所述Fc是哺乳动物或人IgG1、lgG2、lgG3或lgG4 Fc区。
在一些实施方案中，所述Fc源自IgG1，如人IgG1。在一些实施方案中，所述Fc是SEQID NO:586中所示的IgG1 Fc，其具有含有按照EU编号在位置356和358处的残基Glu(E)和Met(M)的同种异型。在一些实施方案中，所述Fc包含SEQ ID NO:586中所示的氨基酸序列或者展现与SEQ ID NO:586至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，所述Fc是如下IgG1 Fc，其含有人G1m1同种异型的氨基酸，如含有在位置356和358处的Asp(D)和Leu(L)的残基，例如如SEQ ID NO:597中所示。因此，在一些情形中，本文提供的Fc可以含有氨基酸取代E356D和M358L以重构同种异型G1 m1的残基。在一些实施方案中，所述Fc包含SEQ ID NO:597中所示的氨基酸序列或者展现与SEQ ID NO:597至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述Fc区具有SEQ ID NO:597中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，变体Fc包含SEQ ID NO:755中所示的序列。在一些实施方案中，变体Fc包含SEQ ID NO:756中所示的序列。在一些实施方案中，在本文提供的构建体中使用的Fc区可能进一步缺少C末端赖氨酸残基。
在一些实施方案中，Fc来源于IgG2，如人IgG2。在一些实施方案中，Fc包含SEQ IDNO:726所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:726至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fc源自IgG4，如人IgG4。在一些实施方案中，Fc包含SEQ IDNO:727所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:727至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IgG4 Fc是稳定的Fc，其中人IgG4的CH3结构域被人IgG1的CH3结构域取代，并且其展现被抑制的聚集体形成；抗体，其中人IgG4的CH3和CH2结构域分别被人IgG1的CH3和CH2结构域取代；或者抗体，其中在Kabat等人提出的EU索引中指示的人IgG4的位置409处的精氨酸被赖氨酸取代，并且其展现被抑制的聚集体形成(参见例如，美国专利号8,911,726)。在一些实施方案中，Fc是含有S228P突变的IgG4，已显示其通过Fab-臂交换防止治疗性抗体与内源IgG4之间的重组(参见例如，Labrijin等人(2009)Nat.Biotechnol.,27(8):767-71)。在一些实施方案中，Fc包含SEQ ID NO:728中所示的氨基酸序列或者展现与SEQ ID NO:728至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fc区是变体Fc区，其中野生型Fc被一个或多个氨基酸取代修饰，以降低效应子活性或使Fc对Fc效应子功能呈惰性。示例性无效应子或惰性突变包括本文(包括在章节IV.C中)所述的那些。在一些实施方案中，免疫调节蛋白的Fc区具有如下Fc区，其中与天然Fc区相比，在位置234、235、236、237、238、239、270、297、298、325和329(通过EU编号指示)处的任何一个或多个氨基酸被不同的氨基酸取代。Fc区的这样的改变包括例如：Current Opinion in Biotechnology(2009)20(6),685-691中所述的诸如去糖基化的链(N297A和N297Q)、IgG1-N297G、IgG1-L234A/L235A、IgG1-L234A/L235E/G237A、IgG1-A325A/A330S/P331S、IgG1-C226S/C229S、IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A、IgG1-E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、IgG1-L234F/L235E/P331S、IgG1-S267E/L328F、IgG2-V234A/G237A、IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S、IgG4-L235A/G237A/E318A和IgG4-L236E的改变；WO 2008/092117中所述的诸如G236R/L328R、L235G/G236R、N325A/L328R和N325LL328R的改变；在位置233、234、235和237(通过EU编号指示)处的氨基酸插入；以及在WO 2000/042072中所述位点处的改变。
在一些实施方案中，变体Fc区包含一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)，源自野生型IgG1，如野生型人IgG1。在一些实施方案中，野生型IgG1 Fc可以是SEQ ID NO:586中所示的Fc，其具有含有按照EU编号在位置356和358处的残基Glu(E)和Met(M)的同种异型。在一些实施方案中，变体Fc区源自SEQ ID NO:586中所示的氨基酸序列。在其他实施方案中，野生型IgG1 Fc含有人G1m1同种异型的氨基酸，如含有在位置356和358处的Asp(D)和Leu(L)的残基，例如如SEQ ID NO:597中所示。因此，在一些情形中，变体Fc源自SEQ ID NO:597中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fc区缺少对应于SEQ ID NO:586或597中所示的野生型或未修饰的Fc的位置232的C末端赖氨酸(按照EU编号对应于K447del)。
在一些实施方案中，按照SEQ ID NO:586的编号，变体Fc区包含野生型或未修饰的Fc区的C5S氨基酸修饰(按照EU编号对应于C220S)。
在一些实施方案中，Fc区是含有至少一个氨基酸取代变体Fc，所述氨基酸取代按照SEQ ID NO:586的编号为N82G(按照EU编号对应于N297G)。在一些实施方案中，Fc还含有至少一个氨基酸取代，所述氨基酸取代按照SEQ ID NO:586的编号为R77C或V87C(按照EU编号对应于R292C或V302C)。在一些实施方案中，变体Fc区还包含按照SEQ ID NO:586编号的C5S氨基酸修饰(按照EU编号对应于C220S)。例如，在一些实施方案中，变体Fc区包含以下氨基酸修饰：按照EU编号，N297G和以下氨基酸修饰C220S、R292C或V302C中的一个或多个(关于SEQ ID NO:586，对应于N82G和以下氨基酸修饰C5S、R77C或V87C中的一个或多个)，例如，Fc区包含SEQ ID NO:598中所示的序列。
在一些实施方案中，按照EU编号，变体Fc含有氨基酸取代L234A/L235E/G237A。在一些实施方案中，按照EU编号，变体Fc含有氨基酸取代A330S/P331S。在一些实施方案中，变体Fc含有氨基酸取代L234A/L235E/G237A/A330S/P331S(Gross等人(2001)Immunity 15:289)。在一些实施方案中，变体Fc包含SEQ ID NO:757中所示的序列。在一些实施方案中，变体Fc包含SEQ ID NO:758中所示的序列。在一些实施方案中，在本文提供的构建体中使用的Fc区可能进一步缺少C末端赖氨酸残基。
在一些实施方案中，Fc区是变体Fc，按照EU编号，其包括突变L234A、L235E和G237A。在一些实施方案中，通过去除一个或多个半胱氨酸残基，如通过按照EU编号在位置220处将半胱氨酸残基替代为丝氨酸残基(C220S)，进一步修饰野生型Fc。具有降低的效应子功能的示例性惰性Fc区示于SEQ ID NO:599和SEQ ID NO:591中，它们分别基于SEQ IDNO:586或SEQ ID NO:597中所示的同种异型。在一些实施方案中，Fc区可能进一步缺少C末端赖氨酸残基。在一些实施方案中，变体Fc区包含氨基酸修饰C220S、L234A、L235E或G237A中的一个或多个，例如Fc区包含SEQ ID NO:589、591、599或724中所示的序列。在一些实施方案中，变体Fc包含具有SEQ ID NO:589中所示的序列。在一些实施方案中，变体Fc包含具有SEQ ID NO:591中所示的序列。在一些实施方案中，变体Fc包含具有SEQ ID NO:599中所示的序列。在一些实施方案中，变体Fc包含具有SEQ ID NO:724中所示的序列。
在一些实施方案中，Fc区是变体Fc，其具有SEQ ID NO:589中所示的序列。
在一些实施方案中，Fc区是变体Fc区，其包含氨基酸修饰C220S、L235P、L234V、L235A、G236del或S267K中的一个或多个，例如Fc区包含SEQ ID NO:722中所示的序列。在一些实施方案中，Fc区缺少对应于SEQ ID NO:586中所示的野生型或未修饰的Fc的位置232的C末端赖氨酸(按照EU编号对应于K447del)。
在一些实施方案中，Fc区是变体Fc区，其包含氨基酸修饰C220S、R292C、N297G、V302C中的一个或多个。在一些实施方案中，Fc区缺少对应于SEQ ID NO:586中所示的野生型或未修饰的Fc的位置232的C末端赖氨酸(按照EU编号对应于K447del)。示例性变体Fc区示于SEQ ID NO:723中。
在一些实施方案中，变体Fc区包含氨基酸修饰C220S/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K中的一个或多个。在一些实施方案中，Fc区缺少对应于SEQ ID NO:586中所示的野生型或未修饰的Fc的位置232的C末端赖氨酸(按照EU编号对应于K447del)。示例性变体Fc区示于SEQ ID NO:725中。
在一些实施方案中，Fc区是变体Fc区，其含有表4中的Fc突变的任何组合。在一些实施方案中，Fc区是变体Fc区，其具有表4中任一项SEQ ID NO中所示的序列。
例如，变体Fc区可以是无效应子Fc，其展现与SEQ ID NO:586或SEQ ID NO:597中所示的野生型IgG1相比降低的效应子活性。在一些实施方案中，变体Fc包含SEQ ID NO:591、598、599、722、589、723、724或725中任一项中所示的氨基酸序列，或者展现与SEQ IDNO:591、598、599、722、589、723、724或725中的任一项至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体Fc具有SEQ ID NO:589中所示的序列。
在一些实施方案中，BCMA多肽(如变体BCMA多肽)与Fc序列直接连接。在一些实施方案中，BCMA多肽(如变体BCMA多肽)与Fc序列间接连接，如经由接头连接。在一些实施方案中，一个或多个“肽接头”连接BCMA多肽(例如变体BCMA多肽)与Fc区。在一些实施方案中，肽接头的长度可以是单一氨基酸残基或更长。在一些实施方案中，肽接头的长度为至少一个氨基酸残基但不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。示例性接头示于小节“接头”中。
在一些实施方案中，接头为(按单字母氨基酸代码)：GGGGS(“4GS”；SEQ ID NO:593)或4GS接头的多聚体，如2、3、4或5个4GS接头的重复序列。在一些实施方案中，肽接头为(GGGGS)2(SEQ ID NO:594)、(GGGGS)3(SEQ ID NO:595)、(GGGGS)4(SEQ ID NO:600)或(GGGGS)5(SEQ ID NO:671)。在一些实施方案中，接头还可以单独包括一系列丙氨酸残基或者还包括另一个肽接头(如4GS接头或其多聚体)。在一些实施方案中，接头(按单字母氨基酸代码)为GSGGGGS(SEQ ID NO:590)或GGGGSSA(SEQ ID NO:596)。在一些例子中，接头为2xGGGGS和之后的三个丙氨酸(GGGGSGGGGSAAA；SEQ ID NO:721)。
在一些实施方案中，提供一种BCMA-Fc融合蛋白，其为由两种相同的如所述与Fc结构域连接的BCMA Fc多肽(例如变体BCMA多肽)形成的二聚体。在一些实施方案中，任何所提供的BCMA-Fc融合多肽(例如变体BCMA-Fc融合物)中的相同种类将二聚化以产生同二聚体。在一些实施方案中，所述二聚体是同二聚体，其中两种BCMA Fc多肽(例如变体BCMA Fc多肽)是相同的。对于生成同二聚Fc分子，Fc区是能够通过单独Fc区在细胞中的共表达与匹配的Fc区形成同二聚体的Fc区。
还提供编码BCMA-Fc融合蛋白(例如变体BCMA-Fc融合蛋白)的核酸分子。在一些实施方案中，对于Fc融合蛋白的产生，将编码BCMA-Fc融合蛋白(例如变体BCMA-Fc融合蛋白)的核酸分子插入适当的表达载体中。所得BCMA-Fc融合蛋白(例如变体BCMA-Fc融合蛋白)可以在用表达转化的宿主细胞中表达，其中通过在Fc部分之间形成的链间二硫键进行Fc结构域之间的组装，以产生二聚(如二价)BCMA-Fc融合蛋白。所得Fc融合蛋白可以通过亲和色谱在蛋白A或蛋白G柱上容易地纯化。
在实施方案中，在从细胞产生和表达时，所提供的免疫调节蛋白(如BCMA-Fc)是含有两条相同多肽链的同二聚体。图15描绘本文提供的示例性BCMA-Fc融合蛋白的结构。
III.多结构域免疫调节蛋白
本文提供多结构域免疫调节蛋白，其含有(1)与B细胞刺激性受体的配体结合的一种或多种B细胞抑制分子(BIM)，以及(2)与T细胞刺激性受体或T细胞刺激性受体的配体结合的一种或多种T细胞抑制分子(BIM)。所提供的多结构域免疫调节蛋白包括如下的那些：其中BIM拮抗(如降低或抑制)B细胞刺激性受体的活性，并且其中TIM拮抗(如降低或抑制)T细胞刺激性受体的活性。因此，所提供的免疫调节蛋白将B细胞抑制剂与T细胞抑制剂组合成单一分子。在一些实施方案中，BIM和TIM直接或间接连接。所提供的免疫调节蛋白可以是融合蛋白，其中多结构域BIM和TIM组分进一步连接至另一部分，如多聚化结构域或半衰期延长分子。在特定实施方案中，多结构域免疫调节蛋白是BIM/TIM Fc融合蛋白。所提供的分子可以用于调节B细胞途径和T细胞途径，从而治疗自身免疫性疾病，特别是病因与B细胞应答和T细胞应答相关的自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，B细胞刺激性受体是在B细胞上表达的受体，所述受体刺激B细胞应答，如B细胞成熟和分化。B细胞刺激性受体可以是BAFF-R、BCMA和/或TACI。在特定实施方案中，所提供的多结构域免疫调节蛋白拮抗BAFF-R、BCMA或TACI中的一种或多种的活性。在一些实施方案中，BIM与BAFF-R、BCMA或TACI的配体结合。所述配体可以是BAFF或APRIL，其为TNF超家族成员共有的同三聚分子。BAFF和APRIL二者主要由髓系细胞表达，并且已被报道作为共刺激B细胞因子来起作用。BAFF和APRIL共享两种受体TACI和BCMA；BAFF也能够结合并刺激BAFF-R。在一些情形中，所述配体可以是BAFF和APRIL的异三聚体。例如，APRIL和BAFF的异三聚复合物发现于血清中，特别是在患有自身免疫性疾病的受试者(如患有基于免疫的系统性风湿性疾病的那些受试者)中。
在一些实施方案中，T细胞刺激性受体包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)或者与T细胞的信号转导途径中涉及的衔接体蛋白质相互作用以转导激活信号。T细胞刺激性受体可以是在T细胞上表达的共刺激受体，如CD28或ICOS。在特定实施方案中，所提供的多结构域免疫调节蛋白拮抗T细胞刺激性受体(如T细胞共刺激受体，例如CD28或ICOS)的活性。TIM可以与共刺激受体或与共刺激受体的配体结合。在一些实施方案中，可以生成所提供的多结构域免疫调节蛋白，使得TIM直接结合T细胞刺激性受体。例如，TIM可以是CD28或ICOS结合分子。在其他实施方案中，可以生成所提供的多结构域免疫调节蛋白，使得TIM结合T细胞刺激性受体的配体，从而间接拮抗或抑制所述T细胞刺激性受体。例如，TIM与CD28的配体CD80或CD86结合。
在一些实施方案中，一个或多个TIM和/或BIM独立地包括抗体或抗原结合抗体片段。在一些方面，TIM和/或BIM可以是人抗体和/或结合人蛋白的抗体。
在一些实施方案中，TIM或BIM中的至少一种不是抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，TIM或BIM中的至少一种是或含有在免疫细胞上表达的细胞表面分子的细胞外结构域。例如，非抗体免疫球蛋白超家族(IgSF)的某些成员在T细胞上表达或者调节T细胞的活性。这些包括例如某些T细胞共刺激分子或其配体。在一些情形中，TIM包括IgSF成员的(IgSF)结构域(IgD)(例如野生型IgD)或变体IgD(下文称为“vIgD”)，其中一个或多个氨基酸修饰(例如取代)含于IgD中。同样，TNF受体超家族的某些成员在B细胞上表达或者调节B细胞的活性。这些包括例如某些B细胞刺激性受体，如TACI或BCMA。在一些情形中，BIM包括TNFR超家族成员的TNF受体结构域(TD)(例如野生型TD)或变体TD(下文称为“vTD”)(其中在TD中含有一个或多个氨基酸修饰(例如取代))。
在一些实施方案中，BIM可以与具有至少某种结合活性(如结合亲和力)的B细胞刺激性受体的配体结合，如通过多种已知方法中的任一种所测量。在一些实施方案中，TIM可以与具有至少某种结合活性(如结合亲和力)的T细胞刺激性受体或T细胞刺激性受体的配体结合，如通过多种已知方法中的任一种所测量。在一些实施方案中，所述亲和力由平衡解离常数(KD)表示或者由EC50表示。已知多种测定用于评估结合活性(包括结合亲和力)和/或确定结合分子(例如，TIM或BIM)是否与特定结合配偶体特异性结合。在一些实施方案中，可以使用仪器使用表面等离子体共振(SPR)分析来确定两种蛋白质之间的复合物的结合动力学和常数(参见例如，Scatchard等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660,1949；Wilson,Science 295:2103,2002；Wolff等人,Cancer Res.53:2560,1993；以及美国专利号5,283,173、5,468,614或同等文献)。在其他实施方案中，可以利用使用ForteBio Octet系统的生物膜层干涉术(BLI)，如具有链霉亲和素涂布的传感器和生物素化的重组蛋白结构域。用于测量一种蛋白质与另一种蛋白质的结合的其他合适的测定包括例如免疫测定(如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA))或通过借助荧光、紫外吸收、圆二色性或核磁共振(NMR)监测蛋白质的光谱或光学性质的变化来确定结合。其他示例性测定包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、分析型超速离心、光谱法、流式细胞术、测序和用于检测所表达的核酸或蛋白质结合的其他方法。
在一些实施方案中，BIM和TIM独立地展现对结合配偶体的结合亲和力，其KD(即，特定结合相互作用的平衡解离常数，单位为M；等于此缔合反应的解离速率[koff或kd]与缔合速率[kon或ka]的比率，假定为双分子相互作用)等于或小于10-5M。例如，平衡解离常数KD的范围为10-6M至10-12M，如10-7M至10-11M、10-8M至10-10M或者10-9M至10-10M。缔合速率(缔合速率常数；kon或ka；单位为1/Ms)和解离速率(解离速率常数；koff或kd；单位为1/s)可以使用本领域中已知的任何测定方法(例如表面等离子体共振(SPR))来确定。
在一些实施方案中，BIM展现的对B细胞刺激性受体的配体的结合亲和力为从或从约0.001nM至1000nM，如从或从约0.01nM至约500nM、从或从约0.01nM至约400nM、从或从约0.01nM至约100nM、从或从约0.01nM至约50nM、从或从约0.01nM至约10nM、从或从约0.01nM至约1nM、从或从约0.01nM至约0.1nM，为从或从约0.1nM至约500nM、从或从约0.1nM至约400nM、从或从约0.1nM至约100nM、从或从约0.1nM至约50nM、从或从约0.1nM至约10nM、从或从约0.1nM至约1nM、从或从约0.5nM至约200nM、从或从约1nM至约500nM、从或从约1nM至约100nM、从或从约1nM至约50nM、从或从约1nM至约10nM、从或从约2nM至约50nM、从或从约10nM至约500nM、从或从约10nM至约100nM、从或从约10nM至约50nM、从或从约50nM至约500nM、从或从约50nM至约100nM或者从或从约100nM至约500nM。在某些实施方案中，BIM对抑制性受体的结合亲和力是为或小于或约400nM、300nM、200nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM或更小。
在一些实施方案中，TIM展现的对T细胞刺激性受体或T细胞刺激性受体的配体的结合亲和力为从或从约0.001nM至约1000nM，如从或从约0.01nM至约500nM、从或从约0.01nM至约400nM、从或从约0.01nM至约100nM、从或从约0.01nM至约50nM、从或从约0.01nM至约10nM、从或从约0.01nM至约1nM、从或从约0.01nM至约0.1nM，为从或从约0.1nM至约500nM、从或从约0.1nM至约400nM、从或从约0.1nM至约100nM、从或从约0.1nM至约50nM、从或从约0.1nM至约10nM、从或从约0.1nM至约1nM、从或从约0.5nM至约200nM、从或从约1nM至约500nM、从或从约1nM至约100nM、从或从约1nM至约50nM、从或从约1nM至约10nM、从或从约2nM至约50nM、从或从约10nM至约500nM、从或从约10nM至约100nM、从或从约10nM至约50nM、从或从约50nM至约500nM、从或从约50nM至约100nM或者从或从约100nM至约500nM。在某些实施方案中，TIM对刺激性受体或T细胞刺激性受体的配体的结合亲和力是为或小于或约400nM、300nM、200nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM或更小。
在一些实施方案中，TIM或含有TIM的多结构域免疫调节蛋白不是T细胞刺激性(例如共刺激)受体的激动剂。在一些实施方案中，TIM或含有TIM的多结构域免疫调节蛋白与T细胞共刺激受体(例如CD28或ICOS)结合，但是对T细胞共刺激受体展现相对较低的亲和力。在一些实施方案中，TIM对T细胞共刺激受体的结合亲和力为大于1x10-9M，如在为或约1x10-7M与为或约1x10-9M之间。在一些实施方案中，TIM对T细胞共刺激受体的结合亲和力是为或约1x10-7M、为或约2.5x10-7M、为或约5x10-7M、为或约7.5x10-7M、为或约1x10-8M、为或约2.5x10-8M、为或约5x10-8M、为或约7.5x10-8M或者为或约1x10-9M，或前述任何项之间的任何值。
在一些实施方案中，所提供的多结构域免疫调节蛋白的TIM不直接与T细胞共刺激受体结合。在一些实施方案中，所提供的多结构域免疫调节蛋白的TIM与T细胞共刺激受体的配体结合。
在一些实施方案中，所提供的多结构域免疫调节蛋白可以包括呈各种浓度或格式的BIM和TIM，包括具有一个或多个其他部分的格式。在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白包括如下多肽，其中一个或多个BIM位于TIM的N末端。在一些实施方案中，一个或多个BIM位于TIM的C末端。一个或多个BIM和一个或多个TIM可以直接连接或经由接头间接连接。在一些实施方案中，免疫调节蛋白可以经由与多聚化结构域(如Fc蛋白)融合被格式化为多聚分子。在一些实施方案中，多结构域免疫调节蛋白可以被格式化为多聚分子，例如，二聚、三聚、四聚或五聚分子。在一些实施方案中，免疫调节蛋白被格式化为单体分子，其含有一个或多个BIM和一个或多个TIM的单一多肽融合物。图16描绘示例性格式和构型，所提供的多结构域免疫调节蛋白可以涵盖所有这些格式和构型。
在下文的小节中，描述所提供的多结构域免疫调节蛋白的示例性BIM和TIM组分，还描述这样的免疫调节蛋白的示例性格式。
A.B细胞抑制分子(BIM)
在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白含有与B细胞刺激性受体的一种或多种配体结合的BIM。在一些实施方案中，所述B细胞刺激性受体是TNFRSF的成员。在一些实施方案中，一种或多种B细胞刺激性受体是TACI和BCMA。在一些实施方案中，所述B细胞刺激性受体的配体是BAFF或APRIL。在一些实施方案中，BIM与BAFF、APRIL和/或BAFF/APRIL异三聚体结合。在一些实施方案中，BIM能够与BAFF、APRIL和BAFF/APRIL异三聚体结合。
在一些实施方案中，BIM是与B细胞刺激性受体的配体结合的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，BIM是结合BAFF和/或APRIL(如人BAFF和/或人APRIL)的抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，BIM是或含有B细胞刺激性受体的配体的结合配偶体。在一些实施方案中，本文提供的多结构域免疫调节蛋白是可溶蛋白和/或不含包括跨膜结构域的部分。技术人员将了解，细胞表面蛋白(包括TNFRSF的蛋白质，如B细胞刺激性受体，例如BCMA和TACI)通常具有细胞内结构域、跨膜结构域和细胞外结构域(ECD)，并且可以使用细胞外结构域或其免疫活性子序列来制备可溶形式的这样的蛋白质。因此，在一些实施方案中，BIM缺少B细胞刺激性受体(例如BCMA或TACI)的跨膜结构域或跨膜结构域的部分。在一些实施方案中，BIM缺少B细胞刺激性受体(例如BCMA或TACI)的细胞内(胞质)结构域或细胞内结构域的部分。在一些实施方案中，BIM仅含ECD结构域或其含有TD(如CRD)的部分或其特异性结合片段。
例如，在一些方面，BIM是或含有B细胞刺激性受体的ECD，或其与所述B细胞刺激性受体的配体结合的含有至少一个TD(例如至少一个CRD)的特异性结合部分或片段。例如，BIM可以含有TACI或BCMA的ECD，或者TACI或BCMA的与APRIL、BAFF和/或APRIL/BAFF异三聚体结合的含有至少一个TD(例如至少一个CRD)的特异性结合部分或片段。在一些实施方案中，BIM由B细胞刺激性受体的ECD或其含有至少一个TD(例如至少一个CRD)的特异性结合部分或片段组成或基本上由其组成，如由TACI或BCMA的ECD或者TACI或BCMA的ECD的含有至少一个TD(例如至少一个CRD)的特异性结合部分或片段组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，BIM小于B细胞刺激性受体的ECD的全长序列。在一些实施方案中，BIM是或仅含一个CRD或所述CRD的特异性结合片段。在一些实施方案中，BIM由B细胞刺激性受体的CRD组成或基本上由其组成，如由TACI或BCMA的仅一个CRD组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，含有ECD或其含有TD(例如至少一个CRD)的结合部分或片段的BIM的序列是哺乳动物序列，其包括但不限于人、小鼠、食蟹猴或大鼠序列。在一些实施方案中，所述BIM序列是人序列和/或结合人蛋白。
在一些方面，BIM是或包括vTD，所述vTD是亲和力修饰的结构域，与未修饰的或野生型TD对相同分子的结合活性相比，所述亲和力修饰的结构域展现对B细胞刺激性受体的配体增加的结合活性(如增加的结合亲和力)。在一些实施方案中，BIM含有与TNFRSF成员的TD(例如BCMA或TACI)相比，具有一个或多个氨基酸取代的vTD，其中，所述一个或多个氨基酸取代赋予或导致对B细胞刺激性受体的同源配体增加的结合亲和力。
在一些实施方案中，BIM是或含有vTD，相对于B细胞刺激性受体的配体的结合配偶体的野生型或未修饰的TD，所述vTD含有一个或多个氨基酸修饰，如一个或多个取代(可替代地“突变”或“替代”)、缺失或添加。在一些方面，所述vTD含有B细胞刺激性受体的TNFRSF结合配偶体的TD结构域中的多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰，如氨基酸取代、缺失或添加。所述修饰(例如，取代)可能位于CRD中。在一些实施方案中，所述vTD具有CRD或其特异性结合片段中的多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰(例如，取代)。在一些实施方案中，所述vTD具有与野生型或未修饰的TD或其特异性结合片段的至少约85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
所提供的多结构域免疫调节蛋白中的BIM的非限制性例子描述于以下小节中。可以将任何本文所述的BIM与如章节III.B中所述的TIM组合。
1.TACI
在一些实施方案中，BIM是或含有野生型TACI ECD或其与APRIL、BAFF和/或APRIL/BAFF异三聚体结合的含有至少一个TD(例如至少一个CRD)的特异性结合部分或片段。在一些实施方案中，BIM是或含有变体TACI ECD或其与APRIL、BAFF和/或APRIL/BAFF异三聚体结合的含有至少一个TD(例如至少一个CRD)的特异性结合部分或片段。在一些实施方案中，BIM是TACI多肽或其具有任何本文所示序列的变体。
TACI是肿瘤坏死因子受体家族成员，其特征为具有含有富半胱氨酸假重复序列结构域(CRD)的细胞外结构域(ECD)。TACI是膜结合受体，其具有含有两个富半胱氨酸假重复序列(CRD1和CRD2)的细胞外结构域、跨膜结构域和与CAML(钙调节物和亲环蛋白配体)相互作用的胞质结构域，CAML是位于细胞内囊泡处的整合膜蛋白，其在Jurkat细胞中过表达时是NF-AT激活的共诱导物。TACI与B细胞和T细胞的子集相关。TACI受体结合肿瘤坏死因子(TNF)配体家族的两个成员。一种配体命名为BAFF(TNF家族的B细胞激活因子)，并且还以不同方式命名为ZTNF4、“中性因子-α(neutrokine-α)”、“BLyS”、“TALL-1”和“THANK”(Yu等人,国际公开号WO98/18921(1998)；Moore等人,Science 285:269(1999)；Mukhopadhyay等人,J.Biol.Chem.274:15978(1999)；Schneider等人,J.Exp.Med.189:1747(1999)；Shu等人,J.Leukoc.Biol.65:680(1999))。另一种配体已经被命名为APRIL，并且还以不同方式命名为“ZTNF2”和“TNRF死亡配体-1”(Hahne等人,J.Exp.Med.188:1185(1998)；Kelly等人,Cancer Res.60:1021(2000))。两种配体还被B细胞成熟受体(BCMA)结合(Gross等人,Nature 404:995(2000))。TACI受体与其配体BAFF或APRIL的结合刺激B细胞应答，包括非T细胞依赖性B细胞抗体应答、同种型转换和B细胞稳态。
全长TACI的氨基酸序列示于SEQ ID NO:666中。所述蛋白质是III型膜蛋白并且缺少信号肽；在真核细胞中表达后，N末端甲硫氨酸被去除。在一些实施方案中，成熟TACI蛋白不含如SEQ ID NO:666中所示的N末端甲硫氨酸。TACI的细胞外结构域(SEQ ID NO:666的氨基酸残基1-166；SEQ ID NO:709中所示的ECD)含有两个富半胱氨酸结构域(CRD，下文也称为肿瘤坏死家族受体结构域或TD)，它们各自展现与BAFF和APRIL结合的亲和力。第一富半胱氨酸结构域(CRD1)含有SEQ ID NO:709中所示的序列的氨基酸残基34-66。第二富半胱氨酸结构域(CRD2)对应于SEQ ID NO:709中所示的序列的氨基酸71-104。TACI还在细胞外结构域含有在第二半胱氨酸重复序列后的约60个氨基酸的茎区，对应于SEQ ID NO:709中所示的序列的氨基酸残基105-165。
在一些实施方案中，BIM是变体TACI多肽，其含有参考TACI多肽的细胞外结构域中的一个或多个氨基酸修饰，如一个或多个取代(可替代地“突变”或“替代”)、缺失或添加，如含有一个或多个CRD(下文也称为TD)的野生型或未修饰的TACI多肽。因此，作为变体TACI多肽的所提供的BIM是或包含变体TD(“vTD”)，其中一个或多个氨基酸修饰(例如取代)位于CRD中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(如一个或多个取代(可替代地“突变”或“替代”)、缺失或添加)位于CRD1区中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(如一个或多个取代(可替代地“突变”或“替代”)、缺失或添加)位于CRD2区中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(如一个或多个取代(可替代地“突变”或“替代”)、缺失或添加)位于CRD1区和CRD2区二者内的氨基酸中。
在一些实施方案中，参考(例如未修饰的)TACI序列是野生型TACI序列或者是其含有一个或两个CRD的部分。在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)TACI是或包含TACI的细胞外结构域(ECD)或其含有一个或两个CRD结构域的部分。在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)TACI多肽的细胞外结构域包含CRD1和CRD2。然而，变体TACI多肽无需包含CRD1和CRD2二者。在一些实施方案中，变体TACI多肽包含CRD1或其特异性结合片段或基本上由其组成。在一些实施方案中，变体TACI多肽包含CRD2或其特异性结合片段或基本上由其组成。在一些实施方案中，变体TACI是可溶多肽并且缺少跨膜结构域。在一些实施方案中，变体TACI多肽还包含跨膜结构域，并且在一些情形中也包含胞质结构域。
在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)TACI序列是哺乳动物TACI序列。在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)TACI序列可以是哺乳动物TACI，其包括但不限于人、小鼠、食蟹猴或大鼠TACI。在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)TACI序列是人的。示例性人TACI序列的细胞外结构域示于SEQ ID NO:709中。
在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)TACI序列具有(i)SEQ ID NO:709中所示的氨基酸序列或其缺少N末端甲硫氨酸的序列，(ii)展现与SEQ ID NO:709至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性并且与APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体结合的氨基酸序列，或者(iii)是(i)或(ii)的含有CRD1和/或CRD2的片段或部分，其中所述部分与APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体结合。在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)TACI序列缺少如SEQ ID NO:709中所示的N末端甲硫氨酸。
TACI细胞外结构域(ECD)：SEQ ID NO:709
MSGLGRSRRGGRSRVDQEERFPQGLWTGVAMRSCPEEQYWDPLLGTCMSCKTICNHQSQRTCAAFCRSLSCRKEQGKFYDHLLRDCISCASICGQHPKQCAYFCENKLRSPVNLPPELRRQRSGEVENNSDNSGRYQGLEHRGSEASPALPGLKLSADQVALVYST
在一些实施方案中，参考(例如未修饰的)TACI序列是TACI的细胞外结构域序列，其为ECD的相对于SEQ ID NO:709中所示的氨基酸序列含有N末端缺失的部分。在一些实施方案中，所述N末端缺失是N末端氨基酸残基1-28的缺失，所述残基对应于SEQ ID NO:709中所示的残基。在一些实施方案中，所述N末端缺失是N末端氨基酸残基1-29的缺失，所述残基对应于SEQ ID NO:709中所示的残基。在一些实施方案中，所述N末端缺失是N末端氨基酸残基1-30的缺失，所述残基对应于SEQ ID NO:709中所示的残基。在一些实施方案中，所述N末端缺失是N末端氨基酸残基1-31的缺失，所述残基对应于SEQ ID NO:709中所示的残基。在一些实施方案中，所述N末端缺失是N末端氨基酸残基1-32的缺失，所述残基对应于SEQ IDNO:709中所示的残基。在一些实施方案中，所述N末端缺失是N末端氨基酸残基1-33的缺失，所述残基对应于SEQ ID NO:709中所示的残基。
在一些任何所提供的实施方案中，参考(例如未修饰的)TACI序列是含有TACI细胞外结构域的茎部分的一个或多个残基的缺失的ECD部分。在一些实施方案中，参考(例如未修饰的)TACI序列是缺少一个或多个连续C末端氨基酸残基的ECD部分，所述连续C末端氨基酸残基在残基105处开始并且直至或包括氨基酸残基166，所述残基对应于SEQ ID NO:709中所示的ECD序列的残基。在一些实施方案中，ECD序列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62缺失。
在一些实施方案中，参考(例如未修饰的)TACI序列含有具有连续氨基酸序列的ECD部分，所述连续氨基酸序列包括CRD1和/或CRD2(例如CRD1和CRD2或仅CRD2)以及茎序列的仅区段或部分。合适的茎区段包括SEQ ID NO:709的氨基酸残基105至154的一个或多个氨基酸。例如，茎区段可以关于SEQ ID NO:709由以下组成：氨基酸残基105、氨基酸残基105至106、氨基酸残基105至107、氨基酸残基105至108、氨基酸残基105至109、氨基酸残基105至110、氨基酸残基105至111、氨基酸残基105至112、氨基酸残基105至113、氨基酸残基105至114、氨基酸残基105至115、氨基酸残基105至116、氨基酸残基105至117、氨基酸残基105至118、氨基酸残基105至119、氨基酸残基105至120、氨基酸残基105至121、氨基酸残基105至122、氨基酸残基105至123、氨基酸残基105至124、氨基酸残基105至125、氨基酸残基105至126、氨基酸残基105至127、氨基酸残基105至128、氨基酸残基105至129、氨基酸残基105至130、氨基酸残基105至131、氨基酸残基105至132、氨基酸残基105至133、氨基酸残基105至134、氨基酸残基105至135、氨基酸残基105至136、氨基酸残基105至137、氨基酸残基105至138、氨基酸残基105至139、氨基酸残基105至140、氨基酸残基105至141、氨基酸残基105至142、氨基酸残基105至143、氨基酸残基105至144、氨基酸残基105至145、氨基酸残基105至146、氨基酸残基105至147、氨基酸残基105至148、氨基酸残基105至149、氨基酸残基105至150、氨基酸残基105至151、氨基酸残基105至152、氨基酸残基105至153以及氨基酸残基105至154。
在一些实施方案中，参考(例如未修饰的)TACI序列缺少一个或多个潜在弗林蛋白酶切割位点或在其中发生突变。在一些情形中，参考(例如未修饰的)TACI序列是ECD或部分，其中在位置119处的精氨酸残基发生突变，例如R119G。在一些情形中，参考(例如未修饰的)TACI序列是ECD或部分，其中在位置121处的谷氨酰胺残基发生突变，例如Q121P。在一些情形中，参考(例如未修饰的)TACI序列是ECD或部分，其中在位置122处的精氨酸残基发生突变，例如R122Q。
在一些实施方案中，参考TACI序列是如国际PCT公开号WO2000/067034、WO2002/094852或WO2008/154814中所示的TACI ECD序列。
在一些实施方案中，参考TACI序列是TACI ECD序列，其具有SEQ ID NO:719中所示的序列或由其组成。
TACI ECD(CRD1/CRD2)：SEQ ID NO:719
SRVDQEER FPQGLWTGVA MRSCPEEQYW DPLLGTCMSCKTICNHQSQR TCAAFCRSLSCRKEQGKFYD HLLRDCISCA SICGQHPKQCAYFCENKLRS PVNLPPEL
在一些实施方案中，参考TACI序列是TACI ECD序列，其具有SEQ ID NO:718中所示的序列或由其组成。
TACI ECD(CRD1/CRD2)：SEQ ID NO:718
AMRSCPEEQYWDPLLGTCMSCKTICNHQSQRTCAAFCRSLSCRKEQGKFYDHLLRDCISCASICGQHPKQCAYFCENKLRS
在一些实施方案中，参考TACI序列是TACI ECD序列，其具有SEQ ID NO:516中所示的序列(由SEQ ID NO:551中所示的核苷酸序列编码)或由其组成。
TACI ECD(CRD1/CRD2)：SEQ ID NO:516
VAMRSCPEEQYWDPLLGTCMSCKTICNHQSQRTCAAFCRSLSCRKEQGKFYDHLLRDCISCASICGQHPKQCAYFCENKLRS
在一些实施方案中，参考TACI序列是TACI的细胞外结构域区域，其基本上由仅CRD2序列组成并且缺失或缺少整个CRD1序列以及基本上全部茎区。尽管先前研究已经显示，茎区中的残基可能含有蛋白水解酶切割位点，但是据信TACI的足够的表达和/或对其同源配体的结合活性需要至少CRD1和CRD2。例如，国际PCT公开号WO2002/094852证实，含有CRD1和CRD2，但是其中整个氨基末端区域和部分茎区序列缺失的TACI分子在表达时展现降低的蛋白质降解。其他研究显示，在CRD1之前的N末端区域的至少一部分是TACI对其同源配体的足够结合活性所需的，参见例如国际公开号WO2008/154814，其中确定TACI细胞外区域的残基13-118或13-108是生物活性所需的同时将TACI在表达期间的降解降至最低。令人惊讶地，本文(例如实施例8)中发现，与含有CRD1和CRD2二者的更长的TACI分子相比，基本上仅由具有小部分茎区的CRD2组成的TACI细胞外区域展现显著改进的同源结合活性。
在一些实施方案中，BIM是TACI多肽，其为TACI细胞外结构域(ECD)区域的含有CRD2的部分，且例如相对于SEQ ID NO:709中所示的氨基酸序列，缺失N末端区域和CRD1并且缺失TACI细胞外结构域的茎部分的一个或多个残基。在一些实施方案中，TACI细胞外结构域的含有CRD2的部分包括氨基酸残基71-104，所述残基对应于SEQ ID NO:709中所示的残基。在所提供的实施方案中，免疫调节蛋白的BIM是TACI多肽，其含有N末端氨基酸残基1-66的缺失，所述残基对应于SEQ ID NO:709中所示的残基。在所提供的实施方案中，免疫调节蛋白的BIM是TACI多肽，其含有N末端氨基酸残基1-67的缺失，所述残基对应于SEQ IDNO:709中所示的残基。在所提供的实施方案中，免疫调节蛋白的BIM是TACI多肽，其含有N末端氨基酸残基1-68的缺失，所述残基对应于SEQ ID NO:709中所示的残基。在所提供的实施方案中，免疫调节蛋白的BIM是TACI多肽，其含有N末端氨基酸残基1-69的缺失，所述残基对应于SEQ ID NO:709中所示的残基。在所提供的实施方案中，免疫调节蛋白的BIM是TACI多肽，其含有N末端氨基酸残基1-70的缺失，所述残基对应于SEQ ID NO:709中所示的残基。在一些任何这样的实施方案中，免疫调节蛋白的BIM是缺少一个或多个连续C末端氨基酸残基的TACI多肽，所述连续C末端氨基酸残基在残基105处开始并且直至或包括氨基酸残基166，所述残基对应于SEQ ID NO:709中所示的ECD序列的残基。在一些实施方案中，ECD序列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62缺失。
在一些实施方案中，本文提供的免疫调节蛋白的BIM是具有含有ECD部分的序列的TACI多肽，所述ECD部分具有TACI ECD的连续氨基酸序列，所述连续氨基酸序列包括CRD2(例如关于SEQ ID NO:709的残基71-104)，但是例如相对于SEQ ID NO:709中所示的氨基酸序列缺失N末端区域和CRD1并且缺失TACI细胞外结构域的茎部分的一个或多个残基。例如，TACI ECD部分可以关于SEQ ID NO:709中所示的氨基酸残基由以下组成：氨基酸残基67至118、氨基酸残基67至117、氨基酸残基67至116、氨基酸残基67至115、氨基酸残基67至114、氨基酸残基67至113、氨基酸残基67至112、氨基酸残基67至111、氨基酸残基67至110、氨基酸残基67至109、氨基酸残基67至108、氨基酸残基67至107、氨基酸残基67至106、氨基酸残基67至105或者氨基酸残基67至104。在一些例子中，TACI ECD部分可以关于SEQ ID NO:709中所示的残基由以下组成：氨基酸残基68至118、氨基酸残基68至117、氨基酸残基68至116、氨基酸残基68至115、氨基酸残基68至114、氨基酸残基68至113、氨基酸残基68至112、氨基酸残基68至111、氨基酸残基68至110、氨基酸残基68至109、氨基酸残基68至108、氨基酸残基68至107、氨基酸残基68至106、氨基酸残基68至105或者氨基酸残基68至104。在一些例子中，TACI ECD部分可以关于SEQ ID NO:709中所示的残基由以下组成：氨基酸残基69至118、氨基酸残基69至117、氨基酸残基69至116、氨基酸残基69至115、氨基酸残基69至114、氨基酸残基69至113、氨基酸残基69至112、氨基酸残基69至111、氨基酸残基69至110、氨基酸残基69至109、氨基酸残基69至108、氨基酸残基69至107、氨基酸残基69至106、氨基酸残基69至105或者氨基酸残基69至104。在一些例子中，TACI ECD部分可以关于SEQ ID NO:709中所示的残基由以下组成：氨基酸残基70至118、氨基酸残基70至117、氨基酸残基70至116、氨基酸残基70至115、氨基酸残基70至114、氨基酸残基70至113、氨基酸残基70至112、氨基酸残基70至111、氨基酸残基70至110、氨基酸残基70至109、氨基酸残基70至108、氨基酸残基70至107、氨基酸残基70至106、氨基酸残基70至105或者氨基酸残基70至104。在一些例子中，TACI ECD部分可以关于SEQ ID NO:709中所示的残基由以下组成：氨基酸残基71至118、氨基酸残基71至117、氨基酸残基71至116、氨基酸残基71至115、氨基酸残基71至114、氨基酸残基71至113、氨基酸残基71至112、氨基酸残基71至111、氨基酸残基71至110、氨基酸残基71至109、氨基酸残基71至108、氨基酸残基71至107、氨基酸残基71至106、氨基酸残基71至105或者氨基酸残基71至104。任何上文TACI ECD序列还可以是根据TIM的TACI参考序列，所述TIM是本文提供的免疫调节蛋白中的变体TACI，其中这样的免疫调节蛋白含有与这样的TACI参考序列相比，通过如本文所述的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)来修饰的变体TACI多肽。
特定地，所提供的免疫调节蛋白的BIM包括TACI ECD序列，其具有SEQ ID NO:528中所示的序列(由SEQ ID NO:563中所示的核苷酸序列编码)或由其组成。在一些实施方案中，参考TACI序列具有SEQ ID NO:528中所示的序列或由其组成，其中与这样的参考TACI序列相比，所提供的变体TACI多肽通过如本文所述的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)来修饰。
TACI ECD序列(CRD2)：SEQ ID NO:528
SLSCRKEQGKFYDHLLRDCISCASICGQHPKQCAYFCENKLRS
所提供的免疫调节蛋白中的BIM包括变体TACI多肽。在一些任何所提供的实施方案中，变体TACI序列具有参考(例如未修饰的)TACI序列(如上文所述的任一种)的序列，但是另外含有一个或多个氨基酸修饰，如一个或多个氨基酸取代。特定地，本文提供的BIM可以是变体TACI多肽，其含有至少一个亲和力修饰的TD结构域(例如，CRD1和/或CRD2)或其特异性结合片段，所述结构域或其特异性结合片段含有参考(例如，未修饰的或野生型)TACI多肽的TD结构域中的一个或多个氨基酸取代，使得与参考(例如，未修饰的或野生型)TACI多肽相比，所述变体TACI多肽展现改变的(例如增加的)对APRIL或BAFF中的一种或两种的结合活性或亲和力。在一些实施方案中，BIM是变体TACI多肽，其对APRIL和/或BAFF的结合亲和力与参考(例如，未修饰的或野生型)TACI多肽对照序列不同，如通过例如固相ELISA免疫测定、流式细胞术或Biacore测定所确定。对每种同源结合配偶体的结合亲和力是独立的；也就是说，在一些实施方案中，相对于参考(例如，未修饰的或野生型)TACI多肽，变体TACI多肽具有增加的对APRIL和BAFF中的一种或两种的结合亲和力，以及降低的或不变的对APRIL或BAFF中另一种的结合亲和力。
在一些实施方案中，BIM是变体TACI多肽，其具有相对于参考(未修饰的或野生型)TACI多肽增加的对BAFF的结合亲和力。在一些实施方案中，BIM是变体TACI多肽，其具有相对于参考(未修饰的或野生型)TACI多肽增加的对APRIL的结合亲和力。在一些实施方案中，BIM是变体TACI多肽，其具有相对于参考(未修饰的或野生型)TACI多肽增加的对APRIL和BAFF的结合亲和力。同源配体BAFF和/或APRIL可以是哺乳动物蛋白，如人蛋白或鼠蛋白。在一些实施方案中，相对于参考(例如，未修饰的或野生型)TACI多肽对照，作为具有增加的或更大的与APRIL和/或BAFF的结合亲和力的变体TACI多肽的BIM将具有至少约5％(如至少约10％、15％、20％、25％、35％或50％)的结合亲和力的增加。在一些实施方案中，相对于参考(例如，未修饰的或野生型)TACI多肽，结合亲和力的增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在任何例子中，参考(例如，未修饰的或野生型)TACI多肽具有与变体TACI多肽相同的序列，但是它不含一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。
在一些实施方案中，前述实施方案中任一项与BAFF的平衡解离常数(Kd)可以是小于1x10-5M、1x10-6M、1x10-7M、1x10-8M、1x10-9M、1x10-10M或1x10-11M或1x10-12M。在一些实施方案中，前述实施方案中任一项与BAFF的Kd小于或小于约1x10-9M、1x10-10M或1x10-11M或1x10-12M。在一些实施方案中，前述实施方案中任一项与BAFF的Kd在1x10-9M与为或约1x10-12M之间。在一些实施方案中，前述实施方案中任一项与BAFF的Kd是为或约1x10-9M、为或约2x10- 9M、为或约4x10-9M、为或约6x10-9M、为或约8x10-9M、为或约1x10-10M、为或约2x10-10M、为或约4x10-10M、为或约6x10-10M、为或约8x10-10M、为或约1x10-11M、为或约2x10-11M、为或约4x10- 11M、为或约6x10-11M、为或约8x10-11M或者为或约1x10-12M，或前述任何项之间的任何值。在一些实施方案中，所提供的实施方案的BIM是如上所述的变体TACI多肽，并且与BAFF的Kd减小(更高结合亲和力)大于或大于约1.5倍，如大于或约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。
在一些实施方案中，前述实施方案中任一项与APRIL的平衡解离常数(Kd)可以是小于1x10-5M、1x10-6M、1x10-7M、1x10-8M、1x10-9M、1x10-10M或1x10-11M或1x10-12M。在一些实施方案中，前述实施方案中任一项与APRIL的Kd小于或小于约1x10-9M、1x10-10M或1x10-11M或1x10-12M。在一些实施方案中，前述实施方案中任一项与APRIL的Kd在1x10-9M与为或约1x10-12M之间。在一些实施方案中，前述实施方案中任一项与APRIL的Kd是为或约1x10-9M、为或约2x10-9M、为或约4x10-9M、为或约6x10-9M、为或约8x10-9M、为或约1x10-10M、为或约2x10-10M、为或约4x10-10M、为或约6x10-10M、为或约8x10-10M、为或约1x10-11M、为或约2x10-11M、为或约4x10-11M、为或约6x10-11M、为或约8x10-11M或者为或约1x10-12M，或前述任何项之间的任何值。在一些实施方案中，所提供的实施方案的BIM是如上所述的变体TACI多肽，并且与APRIL的Kd减小(更高结合亲和力)大于或大于约1.5倍，如大于或约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多。
参考(例如，未修饰的或野生型)TACI序列不一定必须用作起始组合物以生成作为本文所述的变体TACI多肽的BIM。因此，术语“修饰”(如“取代”)的使用并不意味着本发明实施方案限于制备变体TACI多肽或含有变体TACI多肽的免疫调节蛋白的特定方法。变体TACI多肽可例如通过从头肽合成来制备，因此在改变密码子以编码修饰(例如取代)的意义上，不一定需要修饰，例如“取代”。这个原则也扩展到术语氨基酸残基的“添加”和“缺失”，其同样不暗示特定制备方法。设计或产生变体TACI多肽的方法不限于任何特定方法。在一些实施方案中，然而，参考(例如，未修饰的或野生型)TACI编码核酸是从参考(例如，未修饰的或野生型)TACI遗传物质诱变的，并且针对所需特异性结合亲和力或其他功能活性进行筛选。在一些实施方案中，使用可在任何数量的公共可获得的数据库中获得的蛋白质或核酸序列从头合成变体TACI多肽，然后进行筛选。国家生物技术信息中心提供此类信息，并且其网站可通过互联网公开访问，如前所述，UniProtKB数据库也是如此。
除非另外陈述，否则如本公开文本通篇所指示，提及作为变体TACI多肽的BIM的一个或多个氨基酸修饰时是按照对应于SEQ ID NO:709中所示的参考ECD序列的位置编号的氨基酸位置编号来命名。技术人员可以熟练地鉴定修饰(例如氨基酸取代)在TACI多肽(包括其含有TD(例如CRD1和/或CRD2)的部分)中的相应位置，如通过比对参考序列(例如SEQID NO:516或528)与SEQ ID NO:709。鉴定相应残基的比对例示于图17A中。在本公开文本通篇的修饰列表中，在中间指示氨基酸位置，且相应的参考(例如未修饰的野生型)的氨基酸列示于编号之前，并且所鉴定的变体氨基酸取代列示于编号之后。如果修饰是位置的缺失，那么指示“del”，并且如果修饰是位置的插入，那么指示“ins”。在一些情况下，插入与在中间指示的氨基酸位置一起列示，且相应的参考氨基酸列示于编号之前和之后，并且所鉴定的变体氨基酸插入列示于未修饰的(例如，野生型)氨基酸之后。
在一些实施方案中，BIM是变体TACI多肽，其具有参考(例如，未修饰的或野生型)TACI序列中的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)，例如如所述的任一个。一个或多个氨基酸修饰(例如取代)可以位于参考(例如，未修饰的或野生型)TACI序列的胞外域(细胞外结构域)中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如取代)位于CRD1结构域或其特异性结合片段中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如取代)位于CRD2结构域或其特异性结合片段中。在变体TACI多肽的一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如取代)中的一些位于CRD1结构域或其特异性结合片段中，并且一个或多个氨基酸修饰(例如取代)中的一些位于CRD2结构域或其特异性结合片段中。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰(例如取代)。所述修饰(例如取代)可以位于CRD1结构域或CRD2结构域中。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM具有CRD1结构域或其特异性结合片段中的多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM具有CRD2结构域或其特异性结合片段中的多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。在一些实施方案中，含有如所述的一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)的变体TACI多肽具有与参考(例如，未修饰的或野生型)TACI多肽或其特异性结合片段(如与SEQID NO:516、528或709的氨基酸序列)的至少约85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施方案中，含有如所述的一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)的变体TACI多肽具有与SEQ ID NO:709的氨基酸序列的至少约85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施方案中，含有如所述的一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)的变体TACI多肽具有与SEQ ID NO:516的氨基酸序列的至少约85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施方案中，含有如所述的一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)的变体TACI多肽具有与SEQ ID NO:528的氨基酸序列的至少约85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM具有参考TACI多肽或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)，所述氨基酸修饰关于SEQ ID NO:709的编号对应于一个或多个位置40、59、60、61、74、75、76、77、78、79、82、83、84、85、86、87、88、92、95、97、98、99、101、102和103。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM具有选自以下的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)：W40R、Q59R、R60G、T61P、E74V、Q75E、Q75R、G76S、K77E、F78Y、Y79F、L82H、L82P、L83S、R84G、R84L、R84Q、D85E、D85V、C86Y、I87L、I87M、S88N、I92V、Q95R、P97S、K98T、Q99E、A101D、Y102D、F103S、F103V、F103Y或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，参考TACI多肽包括CRD1结构域或CRD2结构域，例如参考TACI多肽示于SEQ IDNO:516或SEQ ID NO:709中。
在一些实施方案中，氨基酸取代仅位于CRD2结构域中。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM具有参考TACI多肽或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)，所述氨基酸修饰关于SEQ ID NO:709的编号对应于一个或多个位置74、75、76、77、78、79、82、83、84、85、86、87、88、92、95、97、98、99、101、102和103。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM具有选自以下的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)：E74V、Q75E、Q75R、G76S、K77E、F78Y、Y79F、L82H、L82P、L83S、R84G、R84L、R84Q、D85E、D85V、C86Y、I87L、I87M、S88N、I92V、Q95R、P97S、K98T、Q99E、A101D、Y102D、F103S、F103V、F103Y或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，在CRD结构域中，参考TACI多肽仅包括CRD2结构域但缺少CRD1结构域，例如参考TACI多肽示于SEQ ID NO:528中。因此，在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括TACI多肽的ECD序列的包括CRD2结构域但缺少CRD1结构域的部分。
保守氨基酸修饰(例如取代)是落入与取代的氨基酸具有相同的氨基酸类别中的除参考(例如，未修饰的)或野生型氨基酸之外的任何氨基酸。氨基酸的类别是脂肪族(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)、羟基或含硫(丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和蛋氨酸)、环状(脯氨酸)、芳香族(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)、碱性(组氨酸、赖氨酸和精氨酸)和酸性/酰胺(天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括关于SEQ ID NO:709的编号在位置75处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，与不含所述氨基酸取代的参考(例如野生型或未修饰的)TACI多肽相比，在位置75处的氨基酸取代赋予增加的与BAFF或APRIL的结合。在一些实施方案中，与参考(例如野生型或未修饰的)TACI多肽相比，取代的氨基酸是酸性氨基酸或酰胺，如取代为不同的酸性氨基酸或酰胺。在一些实施方案中，在位置75处的取代的氨基酸是谷氨酸(Glu，E)。在一些实施方案中，在位置75处的取代的氨基酸是天冬氨酸(Asp，D)。在一些实施方案中，在位置75处的取代的氨基酸是天冬酰胺(Asn，N)。在一些实施方案中，在位置75处的取代的氨基酸是谷氨酰胺(Gln，Q)。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括关于SEQ ID NO:709的编号在位置77处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，与不含所述氨基酸取代的参考(例如野生型或未修饰的)TACI多肽相比，在位置77处的氨基酸取代赋予增加的与BAFF或APRIL的结合。在一些实施方案中，在位置77处的取代的氨基酸是酸性氨基酸或酰胺。在一些实施方案中，在位置77处的取代的氨基酸是谷氨酸(Glu，E)。在一些实施方案中，在位置77处的取代的氨基酸是天冬氨酸(Asp，D)。在一些实施方案中，在位置77处的取代的氨基酸是天冬酰胺(Asn，N)。在一些实施方案中，在位置77处的取代的氨基酸是谷氨酰胺(Gln，Q)。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括关于SEQ ID NO:709的编号在位置78处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，与不含所述氨基酸取代的参考(例如野生型或未修饰的)TACI多肽相比，在位置78处的氨基酸取代赋予增加的与BAFF或APRIL的结合。在一些实施方案中，与参考(例如野生型或未修饰的)TACI多肽相比，在位置78处的取代的氨基酸是芳香族氨基酸，如取代为不同的芳香族氨基酸。在一些实施方案中，在位置78处的取代的氨基酸是苯丙氨酸(Phe，F)。在一些实施方案中，在位置78处的取代的氨基酸是酪氨酸(Tyr，Y)。在一些实施方案中，在位置78处的取代的氨基酸是色氨酸(Trp，W)。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括关于SEQ ID NO:709的编号在位置84处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，与不含所述氨基酸取代的参考(例如野生型或未修饰的)TACI多肽相比，在位置84处的氨基酸取代赋予增加的与BAFF或APRIL的结合。在一些实施方案中，在位置84处的取代的氨基酸是酸性氨基酸或酰胺。在一些实施方案中，在位置84处的取代的氨基酸是谷氨酸(Glu，E)。在一些实施方案中，在位置84处的取代的氨基酸是天冬氨酸(Asp，D)。在一些实施方案中，在位置84处的取代的氨基酸是天冬酰胺(Asn，N)。在一些实施方案中，在位置84处的取代的氨基酸是谷氨酰胺(Gln，Q)。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括关于SEQ ID NO:709的编号在位置102处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，与不含所述氨基酸取代的参考(例如野生型或未修饰的)TACI多肽相比，在位置102处的氨基酸取代赋予增加的与BAFF或APRIL的结合。在一些实施方案中，在位置102处的取代的氨基酸是酸性氨基酸或酰胺。在一些实施方案中，在位置102处的取代的氨基酸是谷氨酸(Glu，E)。在一些实施方案中，在位置102处的取代的氨基酸是天冬氨酸(Asp，D)。在一些实施方案中，在位置102处的取代的氨基酸是天冬酰胺(Asn，N)。在一些实施方案中，在位置102处的取代的氨基酸是谷氨酰胺(Gln，Q)。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括至少一个氨基酸取代E74V。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括至少一个氨基酸取代Q75E。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括至少一个氨基酸取代K77E。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括至少一个氨基酸取代F78Y。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括至少一个氨基酸取代Y79F。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括至少一个氨基酸取代L82H。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括至少一个氨基酸取代L82P。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括至少一个氨基酸取代R84G。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括至少一个氨基酸取代R84L。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括至少一个氨基酸取代R84Q。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括至少一个氨基酸取代D85V。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括至少一个氨基酸取代C86Y。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括至少一个氨基酸取代Y102D。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM含有前述任两个或更多个中的两个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代是前述任一个的保守氨基酸取代。在所提供的实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括如所述的任何参考TACI多肽序列中的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代位于SEQ ID NO:516中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代位于SEQ ID NO:528中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代位于SEQ ID NO:718中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代位于SEQ ID NO:719中所示的参考TACI序列中。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括氨基酸取代E74V。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括氨基酸取代Q75E。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括氨基酸取代K77E。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括氨基酸取代F78Y。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括氨基酸取代Y79F。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括氨基酸取代L82H。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括氨基酸取代L82P。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括氨基酸取代R84G。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括氨基酸取代R84L。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括氨基酸取代R84Q。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括氨基酸取代D85V。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括氨基酸取代C86Y。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括氨基酸取代Y102D。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM含有前述任两个或更多个中的两个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代是前述任一个的保守氨基酸取代。在所提供的实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括如所述的任何参考TACI多肽序列中的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQID NO:516中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:528中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:718中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:719中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是D85E/K98T。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是I87L/K98T。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是R60G/Q75E/L82P。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是R60G/C86Y。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是W40R/L82P/F103Y。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是W40R/Q59R/T61P/K98T。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是L82P/I87L。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是G76S/P97S。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是K77E/R84L/F103Y。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是Y79F/Q99E。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是L83S/F103S。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是K77E/R84Q。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是K77E/A101D。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是K77E/F78Y/Y102D。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是Q75E/R84Q。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是Q75R/R84G/I92V。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是K77E/A101D/Y102D。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是R84Q/S88N/A101D。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是R84Q/F103V。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是K77E/Q95R/A101D。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是I87M/A101D。在所提供的实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括如所述的任何参考TACI多肽序列中的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:516中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:528中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:718中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:719中所示的参考TACI序列中。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括氨基酸取代K77E和F78Y(K77E/F78Y)。在所提供的实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括如所述的任何参考TACI多肽序列中的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:516中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:528中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:718中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:719中所示的参考TACI序列中。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括氨基酸取代K77E和Y102D(K77E/Y102D)。在所提供的实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括如所述的任何参考TACI多肽序列中的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:516中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:528中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:718中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:719中所示的参考TACI序列中。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM含有氨基酸取代F78Y和Y102D(F78Y/Y012D)。在所提供的实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括如所述的任何参考TACI多肽序列中的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:516中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:528中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:718中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:719中所示的参考TACI序列中。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM含有氨基酸取代K77E、F78Y和Y102D(K77E/F78Y/Y102D)。在所提供的实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括如所述的任何参考TACI多肽序列中的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:516中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:528中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:718中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:719中所示的参考TACI序列中。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM含有氨基酸取代Q75E/R84Q。在所提供的实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包括如所述的任何参考TACI多肽序列中的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:516中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:528中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:718中所示的参考TACI序列中。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于SEQ ID NO:719中所示的参考TACI序列中。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包含表2中列出的任何突变。表2还提供参照参考(例如，未修饰的)TACI多肽以及示例性变体TACI多肽的SEQ ID NO的示例性序列。如所指出的，对应于给定结构域的确切基因座或残基可以变化，如根据用于鉴定或分类结构域的方法变化。同样，在一些情形中，给定结构域(例如CRD)的相邻N和/或C末端氨基酸也可以包括在作为变体TACI多肽的BIM的序列中，例如以确保所述结构域在表达时的适当折叠。因此，应当理解，表2中SEQ ID NO的示例不应解释为限制。例如，变体TACI多肽的特定结构域(如ECD结构域或其含有CRD1/CRD2或仅含CRD2的部分)可以比相应SEQ ID NO中所示的氨基酸序列长或短几个氨基酸，如长或短1-10个(例如，1、2、3、4、5、6或7个)氨基酸。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包含表2中列出的任何突变(氨基酸取代)。在一些例子中，所述突变(氨基酸取代)是在含有SEQ ID NO:709中所示的氨基酸序列的参考TACI中进行。在一些例子中，所述突变(氨基酸取代)是在含有TACI的CRD1和CRD2结构域的参考TACI(例如如SEQ ID NO:516中所示)中进行。在一些例子中，所述突变(氨基酸取代)是在通过缺失N末端和C末端氨基酸残基以保留CRD2来进一步截短的参考TACI(例如如SEQ ID NO:528中所示)中进行。
术语“修饰”(如“取代”或“突变”)的使用并不意味着本发明实施方案限于制备免疫调节蛋白的特定方法。作为变体TACI多肽的BIM可以例如通过从头肽合成来制备，并且因此在改变密码子以编码修饰(例如取代)的意义上，不一定需要所述修饰(如“取代”)。这个原则也扩展到术语氨基酸残基的“添加”和“缺失”，其同样不暗示特定制备方法。用以设计或产生vTD的手段并不限于任何特定方法。然而，在一些实施方案中，野生型或未修饰的TD编码核酸是从野生型或未修饰的TD遗传物质诱变的，并且针对所需特异性结合活性(例如结合亲和力)和/或NF-κB调节或其他功能活性的改变进行筛选。在一些实施方案中，vTD是利用可在任何数量的公共可获得的数据库获得的蛋白质或核酸序列从头合成的，然后进行筛选。国家生物技术信息中心提供此类信息，并且其网站可经由互联网公开访问，UniProtKB数据库也是如此。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包含含有CRD1和CRD2的细胞外结构域(ECD)序列，如SEQ ID NO:517-527、536、537、682-701中任一项中所示的变体TACI多肽。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包含如下多肽序列，所述多肽序列展现与SEQID NO:517-527、536、537、682-701中的任一项至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性，如至少96％的同一性、97％的同一性、98％的同一性或99％的同一性，并且在其中保留参考(例如，未修饰的或野生型)TACI中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包含SEQ ID NO:517-527、536、537、682-701中任一项的特异性结合片段，其中所述特异性结合片段结合BAFF、APRIL或BAFF/APRIL异三聚体，并且在其中含有如下连续序列，所述连续序列在其中含有参考(例如，未修饰的或野生型)TACI中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM由SEQ ID NO:517-527、536、537、682-701中任一项中所示的变体TACI细胞外结构域(ECD)序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM由如下多肽序列组成或基本上由其组成，所述多肽序列展现与SEQ ID NO:517-527、536、537、682-701中的任一项至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性，如至少96％的同一性、97％的同一性、98％的同一性或99％的同一性，并且在其中保留参考(例如，未修饰的或野生型)TACI中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM由SEQ ID NO:517-527、536、537、682-701中任一项的特异性结合片段组成或基本上由其组成，其中所述特异性结合片段结合BAFF、APRIL或APRIL/BAFF异三聚体，并且在其中含有如下连续序列，所述连续序列在其中含有参考(例如，未修饰的或野生型)TACI中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包含参考TACI多肽的含有CRD2但缺少CRD1的细胞外结构域(ECD)序列，如SEQ ID NO:529-535、538-550、673-681中任一项中所示的变体TACI多肽。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包含如下多肽序列，所述多肽序列展现与SEQ ID NO:529-535、538-550、673-681中的任一项至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性，如至少96％的同一性、97％的同一性、98％的同一性或99％的同一性，并且在其中保留参考(例如，未修饰的或野生型)TACI中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM包含SEQ ID NO:529-535、538-550、673-681中任一项的特异性结合片段，其中所述特异性结合片段结合BAFF、APRIL或BAFF/APRIL异三聚体，并且在其中含有如下连续序列，所述连续序列在其中含有参考(例如，未修饰的或野生型)TACI中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM由SEQ ID NO:529-535、538-550、673-681中任一项中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM由如下多肽序列组成或基本上由其组成，所述多肽序列展现与SEQ ID NO:529-535、538-550、673-681中的任一项至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性，如至少96％的同一性、97％的同一性、98％的同一性或99％的同一性，并且在其中保留参考(例如，未修饰的或野生型)TACI中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM由SEQ ID NO:529-535、538-550、673-681中任一项的特异性结合片段组成或基本上由其组成，其中所述特异性结合片段结合BAFF、APRIL或BAFF/APRIL异三聚体，并且在其中含有如下连续序列，所述连续序列在其中含有参考(例如，未修饰的或野生型)TACI中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述变体TACI多肽包含SEQ ID NO:535中所示的序列。在一些实施方案中，所述变体TACI多肽基本上由SEQ IDNO:535中所示的序列组成。在一些实施方案中，所述变体TACI多肽由SEQ ID NO:535中所示的序列组成。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述变体TACI多肽包含SEQ ID NO:541中所示的序列。在一些实施方案中，所述变体TACI多肽基本上由SEQ IDNO:541中所示的序列组成。在一些实施方案中，所述变体TACI多肽由SEQ ID NO:541中所示的序列组成。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述变体TACI多肽包含SEQ ID NO:542中所示的序列。在一些实施方案中，所述变体TACI多肽基本上由SEQ IDNO:542中所示的序列组成。在一些实施方案中，所述变体TACI多肽由SEQ ID NO:542中所示的序列组成。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述变体TACI多肽包含SEQ ID NO:688中所示的序列。在一些实施方案中，所述变体TACI多肽基本上由SEQ IDNO:688中所示的序列组成。在一些实施方案中，所述变体TACI多肽由SEQ ID NO:688中所示的序列组成。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM是如下多肽：其中the变体TACI多肽是由SEQ ID NO:552-562、571或572中任一项中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，所述变体TACI多肽是由如下核苷酸序列编码，所述核苷酸序列展现与SEQ ID NO:552-562、571或572中的任一项至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性，如至少96％的同一性、97％的同一性、98％的同一性或99％的同一性，并且在其中保留参考(例如，未修饰的或野生型)TACI中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
在一些实施方案中，作为变体TACI多肽的BIM是如下多肽：其中所述变体TACI多肽是由SEQ ID NO:564-570或573-585中任一项中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，所述变体TACI多肽是由如下核苷酸序列编码，所述核苷酸序列展现与SEQ ID NO:564-570或573-585中的任一项至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性，如至少96％的同一性、97％的同一性、98％的同一性或99％的同一性，并且在其中保留参考(例如，未修饰的或野生型)TACI中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
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在一些实施方案中，BIM是或含有TACI的野生型或未修饰的ECD或其与APRIL、BAFF和/或APRIL/BAFF异三聚体结合的含有至少一个TD(例如至少一个CRD，如CRD1和/或CRD2)的特异性结合部分或片段。在一些实施方案中，BIM含有SEQ ID NO:709中所示的ECD序列，(ii)展现与SEQ ID NO:709至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性并且与APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体结合的氨基酸序列，或者(iii)是(i)或(ii)的含有CRD1和/或CRD2的片段或部分，其中所述部分与APRIL、BAFF或APRI/BAFF异三聚体结合。在一些实施方案中，BIM是TACI序列，其由SEQ ID NO:709中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，BIM是含有SEQID NO:709的残基2-166的TACI序列，其缺少如SEQ ID NO:709中所示的N末端甲硫氨酸。在一些实施方案中，BIM是TACI序列，其由如SEQ ID NO:709的氨基酸2-166所示的序列组成或基本上由其组成。
在一些实施方案中，BIM是或含有TACI的野生型或未修饰的ECD或其特异性结合部分或片段的结合部分，所述结合部分含有TACI的CRD1和CRD2并且与APRIL、BAFF和/或APRIL/BAFF异三聚体结合。在一些实施方案中，BIM含有SEQ ID NO:719中所示的序列，(ii)展现与SEQ ID NO:719至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性并且与APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体结合的氨基酸序列，或者(iii)是(i)或(ii)的含有CRD1和/或CRD2的一部分的片段或部分，其中所述部分与APRIL、BAFF或APRI/BAFF异三聚体结合。在一些实施方案中，BIM包含SEQ ID NO:719中所示的序列。在一些实施方案中，BIM是TACI序列，其由SEQ ID NO:719中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，BIM含有SEQ ID NO:718中所示的序列，(ii)展现与SEQ ID NO:718至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性并且与APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体结合的氨基酸序列，或者(iii)是(i)或(ii)的含有CRD1和/或CRD2的一部分的片段或部分，其中所述部分与APRIL、BAFF或APRI/BAFF异三聚体结合。在一些实施方案中，BIM包含SEQ ID NO:718中所示的序列。在一些实施方案中，BIM是TACI序列，其由SEQ ID NO:718中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，BIM含有SEQ ID NO:516中所示的序列，(ii)展现与SEQ ID NO:516至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性并且与APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体结合的氨基酸序列，或者(iii)是(i)或(ii)的含有CRD1和/或CRD2的一部分的片段或部分，其中所述部分与APRIL、BAFF或APRI/BAFF异三聚体结合。在一些实施方案中，BIM包含SEQ ID NO:516中所示的序列。在一些实施方案中，BIM是TACI序列，其由SEQ IDNO:516中所示的序列组成或基本上由其组成。
在一些实施方案中，BIM是或含有TACI的野生型或未修饰的ECD或其特异性结合部分或片段的结合部分，所述结合部分仅含TACI的CRD2并且与APRIL、BAFF和/或APRIL/BAFF异三聚体结合。在一些实施方案中，BIM含有SEQ ID NO:528中所示的序列，(ii)展现与SEQID NO:528至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性并且与APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体结合的氨基酸序列，或者(iii)是(i)或(ii)的含有CRD2的一部分的片段或部分，其中所述部分与APRIL、BAFF或APRI/BAFF异三聚体结合。在一些实施方案中，BIM包含SEQ ID NO:528中所示的序列。在一些实施方案中，BIM是TACI序列，其由SEQ ID NO:528中所示的序列组成或基本上由其组成。
在一些实施方案中，BIM是含有ECD或其特异性结合部分或片段的变体TACI，所述变体TACI具有相对于参考TACI序列含有一个或多个氨基酸取代(突变或替代)的vTD。所述参考TACI序列可以包括如上文章节II中所述的任一种。一个或多个氨基酸取代可以包括任何上文章节II中所述的氨基酸取代。例如，BIM可以是含有ECD或其特异性结合片段的变体TACI，所述变体TACI具有含有任何表2中所示的氨基酸取代的vTD。在一些例子中，所述突变是在含有SEQ ID NO:709中所示的氨基酸序列的参考TACI中进行。在一些例子中，所述突变是在含有TACI的CRD1和CRD2结构域的参考TACI(例如如SEQ ID NO:516中所示)中进行。在一些例子中，所述突变是在通过缺失N末端和C末端氨基酸残基以保留CRD2来进一步截短的参考TACI(例如如SEQ ID NO:528中所示)中进行。
在一些实施方案中，BIM包含含有CRD1和CRD2的细胞外结构域(ECD)序列，如SEQID NO:517-527、536、537、682-701中任一项中所示的变体TACI多肽。在一些实施方案中，BIM是包含如下多肽序列的变体TACI多肽，所述多肽序列展现与SEQ ID NO:517-527、536、537、682-701中的任一项至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性，如至少96％的同一性、97％的同一性、98％的同一性或99％的同一性，并且在其中保留参考(例如，未修饰的或野生型)TACI中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，BIM是如下变体TACI多肽，所述变体TACI多肽包含SEQ ID NO:517-527、536、537、682-701中任一项的特异性结合片段，其中所述特异性结合片段结合BAFF、APRIL或BAFF/APRIL异三聚体并且在其中含有如下连续序列，所述连续序列在其中含有参考(例如，未修饰的或野生型)TACI中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
在一些实施方案中，BIM是如下变体TACI多肽，其由SEQ ID NO:517-527、536、537、682-701中任一项中所示的变体TACI细胞外结构域(ECD)序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，BIM是由如下多肽序列组成或基本上由其组成的变体TACI多肽，所述多肽序列展现与SEQ ID NO:517-527、536、537、682-701中的任一项至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性，如至少96％的同一性、97％的同一性、98％的同一性或99％的同一性，并且在其中保留参考(例如，未修饰的或野生型)TACI中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，BIM是如下变体TACI多肽，其由SEQ ID NO:517-527、536、537、682-701中任一项的特异性结合片段组成或基本上由其组成，其中所述特异性结合片段结合BAFF、APRIL或APRIL/BAFF异三聚体，并且在其中含有如下连续序列，所述连续序列在其中含有参考(例如，未修饰的或野生型)TACI中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
在一些实施方案中，BIM是如下变体TACI多肽，其包含参考TACI多肽的含有CRD2但缺少CRD1的细胞外结构域(ECD)序列，如SEQ ID NO:529-535、538-550、673-681、769-794中任一项中所示的变体TACI多肽。在一些实施方案中，BIM是包含如下多肽序列的变体TACI多肽，所述多肽序列展现与SEQ ID NO:529-535、538-550、673-681中的任一项至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性，如至少96％的同一性、97％的同一性、98％的同一性或99％的同一性，并且在其中保留参考(例如，未修饰的或野生型)TACI中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，BIM是如下变体TACI多肽，其包含SEQ ID NO:529-535、538-550、673-681、769-794中任一项的特异性结合片段，其中所述特异性结合片段结合BAFF、APRIL或BAFF/APRIL异三聚体并且在其中含有如下连续序列，所述连续序列在其中含有参考(例如，未修饰的或野生型)TACI中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
在一些实施方案中，BIM是如下变体TACI多肽，其由SEQ ID NO:529-535、538-550、673-681、769-794中任一项中所示的序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，BIM是由如下多肽序列组成或基本上由其组成的变体TACI多肽，所述多肽序列展现与SEQ IDNO:529-535、538-550、673-681、769-794中的任一项至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性，如至少96％的同一性、97％的同一性、98％的同一性或99％的同一性，并且在其中保留参考(例如，未修饰的或野生型)TACI中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，BIM是如下变体TACI多肽，其由SEQ ID NO:529-535、538-550、673-681、769-794中任一项的特异性结合片段组成或基本上由其组成，其中所述特异性结合片段结合BAFF、APRIL或BAFF/APRIL异三聚体，并且在其中含有如下连续序列，所述连续序列在其中含有参考(例如，未修饰的或野生型)TACI中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
在一些实施方案中，BIM是包含SEQ ID NO:535中所示的序列的变体TACI多肽。在一些实施方案中，BIM是基本上由SEQ ID NO:535中所示的序列组成的变体TACI多肽。在一些实施方案中，BIM是由SEQ ID NO:535中所示的序列组成的变体TACI多肽。
在一些实施方案中，BIM是包含SEQ ID NO:541中所示的序列的变体TACI多肽。在一些实施方案中，BIM是基本上由SEQ ID NO:541中所示的序列组成的变体TACI多肽。在一些实施方案中，BIM是由SEQ ID NO:541中所示的序列组成的变体TACI多肽。
在一些实施方案中，BIM是包含SEQ ID NO:542中所示的序列的变体TACI多肽。在一些实施方案中，BIM是基本上由SEQ ID NO:542中所示的序列组成的变体TACI多肽。在一些实施方案中，BIM是由SEQ ID NO:542中所示的序列组成的变体TACI多肽。
在一些实施方案中，BIM是包含SEQ ID NO:688中所示的序列的变体TACI多肽。在一些实施方案中，BIM是基本上由SEQ ID NO:688中所示的序列组成的变体TACI多肽。在一些实施方案中，BIM是由SEQ ID NO:688中所示的序列组成的变体TACI多肽。
2.BCMA
在一些实施方案中，BIM是或含有野生型BCMA ECD或其与APRIL、BAFF和/或APRIL/BAFF异三聚体结合的含有TD(例如CRD)的特异性结合部分或片段。在一些实施方案中，BIM是或含有变体BCMA ECD或其与APRIL、BAFF和/或APRIL/BAFF异三聚体结合的含有TD(例如CRD)的特异性结合部分或片段。在一些实施方案中，BIM是具有任何上文章节II(例如表1)中所示的序列的BCMA多肽或其变体。
在一些实施方案中，BIM是或含有BCMA的野生型或未修饰的ECD或其与APRIL、BAFF和/或APRIL/BAFF异三聚体结合的含有TD(例如CRD)的特异性结合部分或片段。在一些实施方案中，BIM含有SEQ ID NO:710中所示的ECD序列，(ii)展现与SEQ ID NO:710至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性并且与APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体结合的氨基酸序列，或者(iii)是(i)或(ii)的含有CRD的片段或部分，其中所述部分与APRIL、BAFF或APRI/BAFF异三聚体结合。在一些实施方案中，BIM是由SEQ ID NO:710中所示的序列组成或基本上由其组成的BCMA序列。在一些实施方案中，BIM是含有SEQ ID NO:710的残基2-54的BCMA序列，其缺少如SEQ IDNO:710中所示的N末端甲硫氨酸。在一些实施方案中，BIM是BCMA序列，其由如SEQ ID NO:710的氨基酸2-54所示的序列组成或基本上由其组成。
在一些实施方案中，BIM含有SEQ ID NO:356中所示的序列，(ii)展现与SEQ IDNO:356至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性并且与APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体结合的氨基酸序列，或者(iii)是(i)或(ii)的含有CRD的一部分的片段或部分，其中所述部分与APRIL、BAFF或APRI/BAFF异三聚体结合。在一些实施方案中，BIM包含SEQ ID NO:356中所示的序列。在一些实施方案中，BIM是由SEQ ID NO:356中所示的序列组成或基本上由其组成的BCMA序列。
在一些实施方案中，BIM是含有ECD或其特异性结合部分或片段的变体BCMA，其具有相对于参考BCMA序列含有一个或多个氨基酸取代(突变或替代)的vTD。所述参考BCMA序列可以包括如上文章节II中所述的任一种。一个或多个氨基酸取代可以包括任何上文章节II中所述的氨基酸取代。例如，BIM可以是含有ECD或其特异性结合片段的变体BCMA，其具有含有表1中所示的任何氨基酸取代的vTD。在一些例子中，所述突变是在含有SEQ ID NO:710中所示的氨基酸序列的参考BCMA中进行。在一些例子中，所述突变是在含有BCMA的CRD结构域的参考BCMA中进行。在一些例子中，所述突变是在SEQ ID NO:356中所示的参考BCMA中进行。
在一些实施方案中，BIM包含SEQ ID NO:357-435中任一项中所示的变体BCMA多肽。在一些实施方案中，BIM是包含如下多肽序列的变体BCMA多肽，所述多肽序列展现与SEQID NO:357-435中的任一项至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性，如至少96％的同一性、97％的同一性、98％的同一性或99％的同一性，并且在其中保留参考(例如，未修饰的或野生型)BCMA中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，BIM是如下变体BCMA多肽，其包含SEQ ID NO:357-435中任一项的特异性结合片段，其中所述特异性结合片段结合BAFF、APRIL或BAFF/APRIL异三聚体并且在其中含有如下连续序列，所述连续序列在其中含有参考(例如，未修饰的或野生型)BCMA中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
在一些实施方案中，BIM是如下变体BCMA多肽，其由SEQ ID NO:357-435中任一项中所示的变体BCMA细胞外结构域(ECD)序列组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，BIM是由如下多肽序列组成或基本上由其组成的变体BCMA多肽，所述多肽序列展现与SEQID NO:357-435中的任一项至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性，如至少96％的同一性、97％的同一性、98％的同一性或99％的同一性，并且在其中保留参考(例如，未修饰的或野生型)BCMA中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，BIM是如下变体BCMA多肽，其由SEQ ID NO:357-435中任一项的特异性结合片段组成或基本上由其组成，其中所述特异性结合片段结合BAFF、APRIL或APRIL/BAFF异三聚体并且在其中含有如下连续序列，所述连续序列在其中含有参考(例如，未修饰的或野生型)BCMA中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
在一些实施方案中，BIM是包含SEQ ID NO:381中所示的序列的变体BCMA多肽。在一些实施方案中，BIM是基本上由SEQ ID NO:381中所示的序列组成的变体BCMA多肽。在一些实施方案中，BIM是由SEQ ID NO:381中所示的序列组成的变体BCMA多肽。
在一些实施方案中，BIM是包含SEQ ID NO:405中所示的序列的变体BCMA多肽。在一些实施方案中，BIM是基本上由SEQ ID NO:405中所示的序列组成的变体BCMA多肽。在一些实施方案中，BIM是由SEQ ID NO:405中所示的序列组成的变体BCMA多肽。
在一些实施方案中，BIM是包含SEQ ID NO:406中所示的序列的变体BCMA多肽。在一些实施方案中，BIM是基本上由SEQ ID NO:406中所示的序列组成的变体BCMA多肽。在一些实施方案中，BIM是由SEQ ID NO:406中所示的序列组成的变体BCMA多肽。
在一些实施方案中，BIM是包含SEQ ID NO:410中所示的序列的变体BCMA多肽。在一些实施方案中，BIM是基本上由SEQ ID NO:410中所示的序列组成的变体BCMA多肽。在一些实施方案中，BIM是由SEQ ID NO:410中所示的序列组成的变体BCMA多肽。
在一些实施方案中，BIM是包含SEQ ID NO:411中所示的序列的变体BCMA多肽。在一些实施方案中，BIM是基本上由SEQ ID NO:411中所示的序列组成的变体BCMA多肽。在一些实施方案中，BIM是由SEQ ID NO:411中所示的序列组成的变体BCMA多肽。B.T细胞抑制分子(TIM)
在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白含有与T细胞刺激性受体结合或与T细胞刺激性受体的配体结合的TIM。在一些方面，所述T细胞刺激性受体包含含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的胞质区，或者与细胞的信号转导途径中涉及的一种或多种衔接体蛋白质相互作用以诱导、介导或加强T细胞激活的胞质区。在一些实施方案中，所述衔接体蛋白质含有对刺激性受体的胞质区中的磷酸酪氨酸残基具有特异性的结合结构域。在一些实施方案中，所述T细胞刺激性受体包括TCR复合物的组分或者是放大或增强TCR信号传导的共受体或共刺激分子。在一些实施方案中，所述T细胞刺激性受体是TCR、CD3、CD4、CD8、CD28、ICOS或CD2，包括其任何哺乳动物直系同源物。在一些实施方案中，所述T细胞刺激性受体靶标是人TCR、人CD3、人CD4、人CD8、人CD28、人ICOS或人CD2。在一些实施方案中，T细胞刺激性受体在人T细胞上表达。
在一些实施方案中，TIM与T细胞刺激性受体直接结合，如与TCR复合物的组分或放大或增强TCR信号传导的共受体或共刺激分子直接结合。在一些实施方案中，TIM与TCR、CD3、CD4、CD8、CD28、ICOS或CD2(包括其任何哺乳动物直系同源物)结合。在一些实施方案中，TIM与人TCR、人CD3、人CD4、人CD8、人CD28、人ICOS或人CD2结合。
在一些情形中，TIM与T细胞刺激性受体的配体结合。在一些实施方案中，TIM与TCR复合物的组分的配体或放大或增强TCR信号传导的共受体或共刺激分子的配体结合。在一些实施方案中，TIM与TCR、CD3、CD4、CD8、CD28、ICOS或CD2分子(包括在T细胞(例如人T细胞)上表达的这样的分子)的配体结合。在一些实施方案中，TIM与CD28的配体(如在T细胞(例如人T细胞)上表达的CD28的配体)结合。在一些实施方案中，所述配体是CD80或CD86，如人CD80或人CD86。在一些实施方案中，所述配体在APC上表达。
在一些实施方案中，TIM是与T细胞刺激性受体结合或与T细胞刺激性受体的配体结合的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，TIM是与TCR、CD3、CD4、CD8、CD28、ICOS或CD2(包括其任何哺乳动物直系同源物)结合的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段与人TCR、人CD3、人CD4、人CD8、人CD28、人ICOS或人CD2(包括在人T细胞上表达的这样的分子)结合。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段与CD80或CD86结合。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段与人CD80或人CD86(包括在人APC上表达的这样的分子)结合。
在一些实施方案中，TIM是或含有T细胞刺激性受体或T细胞刺激性受体的配体的结合配偶体。可以用作TIM的分子包括IgSF蛋白成员(特别是作为T细胞刺激性受体或其配体的IgSF成员)的细胞外结构域。
在一些方面，TIM是或含有IgSF家族成员的IgD，其与T细胞刺激性受体结合，如与TCR、CD3、CD4、CD8、CD28、ICOS或CD2结合，或者是所述IgD与T细胞刺激性受体结合的特定片段或vIgD。在特定实施方案中，所述T细胞刺激性受体是CD28或ICOS，并且所述TIM与CD28或ICOS结合。作为CD28或ICOS的结合配偶体或者与CD28或ICOS结合的示例性IgSF家族成员包括例如CD80、CD86和ICOSL，如人CD80、CD86或ICOSL。在一些例子中，TIM是或含有野生型CD80、CD86或ICOSL的IgD，或者是或含有其vIgD，其中所述TIM与CD28特异性结合。
在其他方面，TIM是或含有IgSF家族成员的IgD，其与T细胞刺激性受体的配体结合，如与CD80或CD86结合，或者是所述IgD与T细胞刺激性受体的配体结合的特定片段或vIgD。作为CD80或CD86的结合配偶体或与CD80或CD86结合的示例性IgSF家族成员包括例如CTLA-4，如人CTLA-4。在一些例子中，TIM是或含有野生型CTLA-4的IgD，或者是或含有其vIgD，其中所述TIM与CD80或CD86特异性结合。用于作为TIM包括于所提供的多结构域免疫调节蛋白中的示例性序列包括国际PCT公开申请号WO2019/074983中所述的分子。
在一些实施方案中，本文提供的多结构域免疫调节蛋白是可溶蛋白和/或不含包括跨膜结构域的部分。技术人员将了解，细胞表面蛋白(包括IgSF的蛋白质)通常具有细胞内结构域、跨膜结构域和细胞外结构域(ECD)，并且这样的蛋白质的可溶形式可以使用细胞外结构域或其免疫活性子序列来制备。因此，在一些实施方案中，TIM缺少IgSF成员的跨膜结构域或跨膜结构域的部分。在一些实施方案中，TIM缺少IgSF成员的细胞内(胞质)结构域或细胞内结构域的部分。在一些实施方案中，TIM仅含含有IgSF结构域(如IgV结构域)的ECD结构域或其部分或其特异性结合片段。
例如，在一些方面，TIM是或含有IgSF受体的ECD，或其与T细胞刺激性受体的配体结合的含有至少一个IgD(例如IgV)的特异性结合部分或片段。例如，TIM可以含有CTLA-4的ECD，或者CTLA-4的与CD80或CD86结合的含有至少一个IgD(例如IgV)的特异性结合部分或片段。在一些实施方案中，TIM由IgSF受体的ECD或其含有至少一个IgD(例如IgV)的特异性结合部分或片段组成或基本上由其组成，如由CTLA-4的ECD或CTLA-4的ECD的含有IgD(例如IgV)的特异性结合部分或片段组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，TIM小于T细胞刺激性受体的配体的受体的ECD的全长序列。在一些实施方案中，TIM是或仅含一个vIgD(例如IgV)或者仅一个vIgD(例如IgV)的特异性结合片段。在一些实施方案中，TIM由T细胞刺激性受体的配体的受体的IgV组成或基本上由其组成，如仅由CTLA-4的IgV组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，含有ECD或其含有IgD(例如IgV)的结合部分或片段的TIM的序列是哺乳动物序列，其包括但不限于人、小鼠、食蟹猴或大鼠序列。在一些实施方案中，TIM序列是人的和/或结合人蛋白。
在一些方面，vIgD是亲和力修饰的结构域，与未修饰的或野生型IgD对相同分子的结合活性相比，所述vIgD展现对T细胞刺激性受体或T细胞刺激性受体的配体增加的结合活性(如增加的结合亲和力)。在一些实施方案中，与IgSF成员(例如CTLA-4)的IgD相比，TIM含有具有一个或多个氨基酸取代的vIgD，其中，所述一个或多个氨基酸取代赋予或导致与作为T细胞刺激性受体或T细胞刺激性受体的配体的同源结合配偶体的增加的结合亲和力。
在一些实施方案中，TIM是或含有vIgD，相对于T细胞刺激性受体或T细胞刺激性受体的配体的结合配偶体的野生型或未修饰的IgD，所述vIgD含有IgD中的一个或多个氨基酸修饰，如一个或多个取代(可替代地“突变”或“替代”)、缺失或添加。在一些方面，所述vIgD含有T细胞刺激性受体或T细胞刺激性受体的配体的IgSF结合配偶体的IgD结构域中的多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰，如氨基酸取代、缺失或添加。所述修饰(例如，取代)可以位于IgV结构域或IgC结构域中。在一些实施方案中，所述vIgD具有IgV结构域或其特异性结合片段中的多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰(例如，取代)。在一些实施方案中，所述vIgD具有IgC结构域或其特异性结合片段中的多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰(例如，取代)。在一些实施方案中，所述vIgD具有与野生型或未修饰的IgD或其特异性结合片段的至少约85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
所提供的多结构域免疫调节蛋白中的TIM的非限制性例子描述于以下小节中。可以将任何本文所述的TIM与如章节III.A中所述的BIM组合。
1.配体结合TIM，例如CTLA-4
本文提供免疫调节蛋白，其含有与T细胞刺激性受体的配体结合的T细胞分子(TIM)。在一些方面，T细胞刺激性受体是CD28，例如人CD28，和/或所述T细胞刺激性受体的配体是CD80或CD86，例如人CD80或人CD86。在一些实施方案中，免疫调节蛋白的TIM与CD80或CD86的细胞外部分或胞外域结合。在一些实施方案中，TIM与细胞表面上(如APC表面上)的CD80或CD86结合。
在一些实施方案中，TIM是结合CD80或CD86的抗体或者是其抗原结合抗体片段(例如Fab或scFv)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合抗体片段结合人CD80或人CD86。在一些实施方案中，抗体是单链可变片段(例如scFv)，其含有抗CD80抗体或抗原结合片段或抗CD86抗体或抗原结合片段的VH和VL。
在一些实施方案中，TIM是或含有结合CD80或CD86(如人CD80或人CD86)的IgSF家族成员的IgD(例如IgV)或其特异性结合片段，如未修饰的或野生型IgD或其vIgD或特异性结合片段。在一些实施方案中，TIM是或含有一个或多个IgD，所述IgD是CTLA-4多肽(如野生型CTLA-4，例如人CTLA-4)的IgD或其vIgD。在一些方面，TIM含有一个或多个IgD(例如IgV)，所述IgD是与野生型或未修饰的CTLA-4的IgD相比含有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代、缺失或添加)的vIgD，在一些方面，所述氨基酸修饰导致增加的TIM与CD80或CD86的结合。描述用于作为TIM包括在所提供的免疫调节蛋白中的CTLA-4结合配偶体的示例性IgD或vIgD。在一些实施方案中，TIM是或含有vIgD多肽，其展现与相应野生型或未修饰的IgD相比增加的对CD80或CD86的结合活性(如结合亲和力)。作为TIM用于所提供的多结构域免疫调节蛋白中的CTLA-4的示例性IgD或vIgD包括国际PCT公开申请号WO 2019/074983中所述的分子。
CTLA-4已经用作治疗药物，用于经由调节CD80和/或CD86相互作用通过减弱T细胞激活来治疗自身免疫性疾病。具体而言，阿巴西普和贝拉西普是FDA批准的治疗药，分别用于类风湿性关节炎和移植物环境中。阿巴西普是与抗体的Fc部分融合的野生型CTLA-4IgSF结构域。阿巴西普的CTLA-4部分的序列示于SEQ ID NO:1中。贝拉西普是CTLA-4IgSF结构域的修饰的变体，其含有位置31处酪氨酸取代丙氨酸和位置106处谷氨酸取代亮氨酸(A31Y/L106E)(对应于SEQ ID NO:1中所示的野生型参考CTLA-4ECD序列位置31和106)，以赋予增加的对CD80和CD86配体的亲和力(Kremer等人,N Engl JMed.2003；349(20):1907-1915；Larsen等人,Am J Transplant.2005；5(3):443-453)。贝拉西普的CTLA-4部分的序列示为SEQ ID NO:672。
在一些实施方案中，TIM并非CTLA-4的全长序列。在一些方面，TIM是可溶多肽，不是膜表达的和/或缺少CTLA-4的跨膜和/或胞质结构域。在一些实施方案中，TIM仅含细胞外结构域(ECD)或其含有IgD或vIgD的特异性结合片段，如仅含IgV结构域或IgC结构域或其特异性结合片段或其组合。
在一些实施方案中，TIM是或含有SEQ ID NO:1中所示的ECD序列或者是其特异性结合片段。在一些实施方案中，TIM是或含有SEQ ID NO:2中所示的ECD序列或者是其特异性结合片段。在一些实施方案中，TIM是或含有CTLA-4(如人CTLA-4)的IgD(例如IgV)序列。在一些实施方案中，TIM是或含有SEQ ID NO:191中所示的IgD(例如IgV)序列，或者是其特异性结合片段。
KAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD(SEQ ID NO:1)
KAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQ(SEQ ID NO:2)
HVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYY(SEQ ID NO:191)
在一些实施方案中，TIM含有SEQ ID NO:1中所示的序列，(ii)展现与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性并且与CD80或CD86结合的氨基酸序列，或者(iii)是(i)或(ii)的含有IgD(例如IgV)的片段或部分，其中所述部分与CD80或CD86结合。在一些实施方案中，TIM包含SEQ ID NO:1中所示的序列。在一些实施方案中，TIM是CTLA-4序列，其由SEQ IDNO:1中所示的序列组成或基本上由其组成。
在一些实施方案中，TIM含有SEQ ID NO:2中所示的序列，(ii)展现与SEQ ID NO:2至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性并且与CD80或CD86结合的氨基酸序列，或者(iii)是(i)或(ii)的含有IgD(例如IgV)的片段或部分，其中所述部分与CD80或CD86结合。在一些实施方案中，TIM包含SEQ ID NO:2中所示的序列。在一些实施方案中，TIM是CTLA-4序列，其由SEQ IDNO:2中所示的序列组成或基本上由其组成。
在一些实施方案中，TIM含有SEQ ID NO:191中所示的序列，(ii)展现与SEQ IDNO:191至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性并且与CD80或CD86结合的氨基酸序列，或者(iii)是(i)或(ii)的含有IgD(例如IgV)的片段或部分，其中所述部分与CD80或CD86结合。在一些实施方案中，TIM包含SEQ ID NO:191中所示的序列。在一些实施方案中，TIM是CTLA-4序列，其由SEQ ID NO:191中所示的序列组成或基本上由其组成。
在一些实施方案中，免疫调节蛋白含有TIM，所述TIM是或含有vIgD，所述vIgD含有野生型或未修饰的CTLA-4的IgD中的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)。在一些实施方案中，本文提供的修饰可以位于含有SEQ ID NO:1、2或191中所示的未修饰的IgD的TIM中，或者位于与SEQ ID NO:1、2或191具有85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列中。在一些实施方案中，含有CTLA-4的vIgD的TIM具有与SEQ ID NO:1、2或191中任一项中所示的序列的至少约85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，TIM是或含有vIgD，所述vIgD是亲和力修饰的IgSF结构域，相对于野生型或未修饰的IgD对CD80或CD86的结合活性，其具有增加的对CD80或CD86的结合活性(如结合亲和力)。在一些实施方案中，对CD80或CD86的结合活性(例如结合亲和力)的增加是增加至少约5％，如至少约10％、15％、20％、25％、35％、50％、75％、100％、200％或更多。在一些实施方案中，结合活性(例如结合亲和力)的增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在这样的例子中，野生型或未修饰的IgD具有与所述vIgD相同的序列，但是它不含一个或多个氨基酸修饰(例如取代)。
在一些实施方案中，TIM与CD80或CD86的平衡解离常数(Kd)可以是小于1x10-5M、1x10-6M、1x10-7M、1x10-8M、1x10-9M、1x10-10M或1x10-11M或1x10-12M或更小。在一些实施方案中，TIM与CD80或CD86结合的Kd为从或从约100pm至5000pm、100pm至2000pm、100pm至1500pm、100pm至1000pm、100pm至800pm、100pm至500pm、100pm至400pm、400pm至4000pm、400pm至2000pm、400pm至1500pm、400pm至1000pm、400pm至800pm、400pm至500pm、500pm至5000pm、500pm至2000pm、500pm至1500pm、500pm至1000pm、500pm至800pm、800pm至5000pm、800pm至2000pm、800pm至1500pm、800pm至1000pm、1000pm至5000pm、1000pm至2000pm、1000pm至1500pm、1500pm至5000pm、1500至2000pm至2000pm至50000pm。在一些实施方案中，TIM与CD80或CD86结合的Kd是小于200pM、300pM、400pM、500pM。在一些实施方案中，TIM与CD80或CD86结合的Kd是大于或大于约500pm但小于或小于约2000pm，如从或从约500pm至1500pm、500pm至1250pm、500pm至1000pm、500pm至750pm、750pm至1500pm、750pm至1250pm、750pm至1000pm、1000pm至2000pm、1000pm至1500pm或1500pm至2000pm。
除非另外陈述，否则CTLA-4ECD或其IgD(例如IgV)的vIgD中存在的一个或多个氨基酸修饰是按照对应于SEQ ID NO:1或2中所示的未修饰的ECD序列的位置编号的氨基酸位置编号来命名。技术人员可以熟练地鉴定修饰(例如氨基酸取代)在ECD或其含有其IgSF结构域(例如IgV)的部分中的相应位置，如通过比对参考序列与SEQ ID NO:1或2。在本公开文本通篇的修饰列表中，在中间指示氨基酸位置，且相应的未经修饰(例如野生型)的氨基酸列示于编号之前，并且所鉴定的变体氨基酸取代列示于编号之后。如果修饰是位置的缺失，那么指示“del”，并且如果修饰是位置的插入，那么指示“ins”。在一些情况下，插入与在中间指示的氨基酸位置一起列示，且相应的未经修饰(例如，野生型)的氨基酸列示于编号之前和之后，并且所鉴定的变体氨基酸插入列示于未经修饰(例如，野生型)的氨基酸之后。
在一些实施方案中，TIM含有vIgD，所述vIgD具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰(例如取代)。一个或多个氨基酸修饰(例如取代)可以位于野生型或未修饰的CTLA-4的胞外域(细胞外结构域)中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如取代)位于CTLA-4的ECD结构域或其特异性结合片段中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如取代)位于CTLA-4的IgV结构域或其特异性结合片段中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如取代)位于CTLA-4的IgC结构域或其特异性结合片段中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如取代)位于CTLA-4的IgV结构域或其特异性结合片段中以及CTLA-4或其特异性结合片段的一个或多个IgC结构域中。
在一些实施方案中，TIM是或含有vIgD，所述vIgD具有CTLA-4或其特异性结合片段的未修饰的IgD中的一个或多个氨基修饰(例如取代)，所述氨基修饰关于SEQ ID NO:1中所示的位置对应于以下一个或多个位置：6、10、12、14、15、16、18、19、20、22、24、26、27、28、29、30、31、33、35、37、38、41、42、43、45、46、47、48、53、54、55、56、58、59、61、63、64、65、67、69、71、72、73、75、76、82、85、86、87、89、91、93、95、96、97、98、99、105、106、108、110、113、115、116、117、I18、119、120、121、122、124、125和/或126。
在一些实施方案中，TIM含有vIgD，所述vIgD具有未修饰的CTLA-4或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)，所述氨基酸修饰关于SEQ ID NO:1或2中所示的位置对应于以下一个或多个位置：12、18、26、29、31、53、56、58、63、72、98、99、105、106和/或117。在一些实施方案中，TIM是或含有CTLA-4的vIgD，所述vIgD具有选自以下的一个或多个氨基酸修饰：L12F、L12H、L12P、I18A、I18F、I18N、I18T、I18V、A26D、A26S、A26T、G29R、G29W、A31Y、T53S、M56K、M56L、M56R、M56T、M56V、N58D、N58S、L63H、L63P、S72G、S72T、L98Q、L98R、M99I、M99L、Y105F、Y105L、L106E、L106I、L106R、I117E、I117L、I117M和/或I117T或其保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，TIM是或含有CTLA-4的vIgD，所述vIgD具有选自以下的一个或多个氨基酸修饰：A6T、V10A、L12F、L12H、L12I、L12P、S14N、S15P、R16C、R16G、R16H、I18A、I18F、I18N、I18T、I18V、A19V、S20N、V22A、V22I、E24Q、A26D、A26S、A26T、S27P、P28L、G29R、G29W、K30R、A31Y、E33M、E33V、R35K、T37S、V38I、Q41L、A42S、A42T、A42V、D43N、Q45H、V46E、T47A、E48R、T53S、Y54F、M55R、M55T、M55V、M56K、M56L、M56R、M56T、M56V、N58D、N58S、E59D、E59G、T61A、T61I、T61N、T61R、T61S、L63H、L63P、D64E、D64N、D64V、D65G、I67N、I67T、I67V、T69A、T69I、T69S、T71A、T71I、S72G、S72T、S73R、N75D、Q76R、Q82H、Q82R、R85G、A86T、M87A、M87K、M87T、M87V、T89A、T89M、T89S、L91R、I93L、I93V、K95R、V96I、E97Q、L98Q、L98R、M99I、M99L、Y105F、Y105L、L106E、L106I、L106N、L106R,L106V、I108F、I108V、N110K、N110S、N110Y、Q113H、Y115H、Y115N、V116A、I117E、I117K、I117L、I117M、I117T、P119H、E120D、P121S、C122P、D124P、D124I、S125I、S125P、D126P和/或D126T或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，TIM是或含有vIgD，所述vIgD具有来自以下的一个或多个氨基酸修饰：L12F、L12H、L12I、L12P、I18A、I18F、I18N、I18T、I18V、A26D、A26S、A26T、G29R、G29W、E33M、E33V、T53S、M55R、M55T、M55V、M56K、M56L、M56R、M56T、M56V、N58D、N58S、L63H、L63P、S72G、S72T、M87A、M87K、M87T、M87V、L98Q、L98R、M99I、M99L、Y105F、Y105L、L106I、L106N、L106R、L106V、I117E、I117K、I117L、I117M和/或I117T或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，TIM是或含有vIgD，所述vIgD具有选自以下的一个或多个氨基酸修饰：I12F、L12P、I18T、A26T、G29W、T53S、M55T、M56K、M56T、N58S、S72G、M99L、L63P、L98Q、Y105L、L106I和/或I117L或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，TIM是或含有vIgD，所述vIgD具有选自以下的一个或多个氨基酸修饰：L12P、I18T、A26T、G29W、A31Y、T53S、M55T、M56K、N58S、S72G、M99L、L63P、L98Q、Y105L、L106E、L106I和/或I117L或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，TIM是或含有vIgD，所述vIgD具有选自以下的一个或多个氨基酸修饰：A26T、G29W、L63P、S72G、L98Q、M99L、Y105L和/或L106I或其保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，TIM是或含有vIgD，所述vIgD具有选自以下的两个或更多个氨基酸修饰：A6T、V10A、L12F、L12H、L12I、L12P、S14N、S15P、R16C、R16G、R16H、I18A、I18F、I18N、I18T、I18V、A19V、S20N、V22A、V22I、E24Q、A26D、A26S、A26T、S27P、P28L、G29R、G29W、K30R、A31Y、E33M、E33V、R35K、T37S、V38I、Q41L、A42S、A42T、A42V、D43N、Q45H、V46E、T47A、E48R、T53S、Y54F、M55R、M55T、M55V、M56K、M56L、M56R、M56T、M56V、N58D、N58S、E59D、E59G、T61A、T61I、T61N、T61R、T61S、L63H、L63P、D64E、D64N、D64V、D65G、I67N、I67T、I67V、T69A、T69I、T69S、T71A、T71I、S72G、S72T、S73R、N75D、Q76R、Q82H、Q82R、R85G、A86T、M87A、M87K、M87T、M87V、T89A、T89M、T89S、L91R、I93L、I93V、K95R、V96I、E97Q、L98Q、L98R、M99I、M99L、Y105F、Y105L、L106E、L106I、L106N、L106R,L106V、I108F、I108V、N110K、N110S、N110Y、Q113H、Y115H、Y115N、V116A、I117E、I117K、I117L、I117M、I117T、P119H、E120D、P121S、C122P、D124P、D124I、S125I、S125P、D126P和/或D126T。
在一些实施方案中，TIM是或含有CTLA-4的vIgD，所述vIgD具有未修饰的或野生型CTLA-4多肽或其特异性结合片段中的氨基酸取代，所述氨基酸取代对应于A26T、G29W、T53S、L63P、S72G、L98Q、M99L、Y105L和/或L106I。在一些实施方案中，TIM是或含有CTLA-4的vIgD，所述vIgD含有氨基酸取代A26T/G29W、A26T/T53S、A26T/L63P、A26T/S72G、A26T/L98Q、A26T/M99L、A26T/Y105L、A26T/L106I、A26T/G29W、G29W/T53S、G29W/L63P、G29W/S72G、G29W/L98Q、G29W/M99L、G29W/Y105L、G29W/L106I、A26T/T53S、G29W/T53S、T53S/L63P、T53S/S72G、T53S/L98Q、T53S/M99L、T53S/Y105L、或T53S/L106I、A26T/L63P、G29W/L63P、T53S/L63P、L63P/S72G、L63P/L98Q、L63P/M99L、L63P/Y105L、或L63P/L106I、A26T/S72G、G29W/S72G、T53S/S72G、L63P/S72G、S72G/L98Q、S72G/M99L、S72G/Y105L或S72G/L106I、A26T/L98Q、G29W/L98Q、T53S/L98Q、L63P/L98Q、S72G/L98Q、L98Q/M99L、L98Q/Y105L或L98Q/L106I、A26T/M99L、G29W/M99L、T53S/M99L、L63P/M99L、S72G/M99L、L98Q/M99L、M99L/Y105L、M99L/L106I、A26T/Y105L、G29W/Y105L、T53S/Y105L、L63P/Y105L、S72G/Y105L、L98Q/Y105L、M99L/Y105L、Y105L/L106I、A26T/L106I、G29W/L106I、T53S/L106IL63P/L106I、S72G/L106I、L98Q/L106I、M99L/L106I、Y105L/L106I。变体CTLA-4多肽可以包括根据所提供的实施方案的其他氨基酸修饰(例如取代)，如本文所述的任一个。
在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)是A31Y/L106E、A6T/A26T/M55T/M99L/Y105L、V10A/G29W/T53S/M56K/L63P/L98Q/Y105L/P121S、V10A/L63P/D64V/S72G/L98Q/M99L/Y105L、V10A/L63P/L98Q/Y105L、L12F/R16H/G29W/M56T/L98Q/Y105L、L12F/A26T/L63P/L98Q/Y105L/L106R、L12F/K30R/S72G/Q82R/L98Q/M99L/Y105L、L12H/I18V/A42T/M55T/N58D/L98R/Y105L/L106I/P121S、L12H/E33M/L98Q/Y105L、L12H/M55T/E59D/L63P/M99L、L12H/L63P/S72G/L98Q/Y105L、L12I/M55T/M56V/I67T/M99L/L106R/I108F、L12P/R16H/A26T/T61S/L63P/M87V/L98Q/M99L/Y105L/L106I/I117L、L12P/I18T/A26T/M55T/T69S/S72G/M99L/Y105L、L12P/A26T、L12P/A26T/L63P、L12P/A26T/L63P/S72G/T89M/L98Q/M99L/Y105L、L12P/G29W/L63P/S72G/L98Q/Y105L、L12P/G29W/L63P/S72G/L98Q/Y105L/L106I、L12P/A26T/L63P/L98Q/M99L/Y105L、L12P/A26T/L63P/L98Q/Y105L、L12P/A26T/L63P/L98Q/Y105L/L106I、L12P/G29W/D43N/N58S/L63P/L98Q/M99L/Y105L、L12P/M56V/L63P/V96I/L98Q/M99L/Y105L/Y115H、L12P/L63P/S72G/L98Q/M99L/Y105L、L12P/L63P/S72G/L98Q/M99L/Y105L/L106N、L12P/L63P/S72G/L98Q/M99L/Y105L/L106N/I117L、S14N/R16C/I18T/M56K/T61A/L63P/A86T/M99L、S15P/I18V/M56T/L98Q/M99L/Y105L、R16C/G29W/E33V/M55T/L63P/L98Q/Y105L、I18A/L63P/S72G/L98Q/Y105L、I18F/L63P/L98Q/M99L/Y105L/P121S、I18N/A26T/L63H/T89A/L98Q/M99L/Y105L、I18N/L63P/S72T/M87T/L98Q/Y105L/N110S、I18T/A26S/M55T/M56V/L63P/S72G/L98Q/M99L/Y105L/I117K、I18T/A26T/L63P/S72G/L98Q/Y105L、I18T/A26T/L63P/Q82R/L98Q/Y105L、I18T/G29R/L63P/S72G/L98Q/M99L/Y105L、I18T/G29W/L63P/L98Q/Y105L、I18T/E48R/L63P/T69S/L98Q/Y105L/N110Y、I18T/T61R/L63P/S72G/L98Q/M99L/Y105L、I18T/L63P/S72G/M87K/L98Q/M99L/Y105L、I18T/L63P/S72G/L98Q/M99L/Y105L、I18T/L63P/S72G/L98Q/Y105L/I108V、I18V/A26T/L63P/D64E/L98Q/Y105L/L106R/N110K、I18V/G29W/L63P/S72G/L98Q/Y105L、A19V/G29W/R35K/L63P/L98Q/M99L/Y105L、S20N/A26T/L63P/L98Q/M99L/Y105L、V22A/L63P/L98Q/M99L/Y105L/P119H、V22I/L63P/L98Q/Y105L/I117M、E24Q/L63P/S72G/L98Q/M99L/Y105L、A26D/S72G/L98Q/M99L/Y105L、A26T/A42V/Q45H/I67N/M87K/E97Q/M99L、A26T/V46E/L63P/D65G/L98Q、A26T/T47A/M56K/L63P/S72G/Q82R/L98Q/M99L/Y105L、A26T/T53S/M56K/L63P/L98Q/Y105L、A26T/T53S/L63P/L98Q/Y105L/L106I/I117L、A26T/Y54F/M56K/M99L/Y105L、A26T/M55R/L98Q/M99L/Y105L、A26T/M55T/L63P/S72G/L98Q/M99L/Y105L、A26T/M55T/L63P/L98Q/M99L/Y105L、A26T/L63P/D65G/L98Q/M99L/Y105L、A26T/L63P/M87V/N110K/I117E、A26T/L63P/S72G/L98Q/M99L/Y105L、A26T/L63P/S72G/L98Q/Y105L/L106I/I117L、A26T/L63P/L98Q/M99L/Y105L、A26T/I67N/S72G/L98Q/M99L/Y105L、S27P/M56K/L63P/S72G/S73R/T89A/M99L/Y105L/I117M、P28L/E33V/L63P/S72G/L98Q/M99L/Y105L、P28L/E33V/L63P/S72G/L98R/M99L/Y105L、G29W/T53S/M56K/N58S/L63P/M87V/L98Q/Y105L、G29W/T53S/M56K/N58S/L63P/M87V/L98Q/Y105L/I108V、G29W/T53S/M56K/N58S/L63P/M87V/L98Q/Y105L/P121S、G29W/T53S/M56K/T61N/L63P/L98Q/Y105L、G29W/T53S/M56K/L63P/Q82H/L98Q/M99I/Y105L、G29W/T53S/M56K/L63P/L98Q/Y105L、G29W/T53S/L63P/S72G/L98Q/Y105L、G29W/M55V/E59G/L63P/L98Q/Y105L、G29W/M56T/L63P/L98Q/Y105L/L106I/I117L、G29W/N58D/I67V/L98Q/M99L/Y105L、G29W/N58S/L63P/D64N/L98Q/M99L/Y105L、G29W/N58S/L63P/T69I/L98Q/M99L/Y105L、G29W/N58S/L63P/S72G/L98Q/Y105L、G29W/N58S/L63P/S72G/L98Q/Y105L/L106I、G29W/N58S/L63P/S72G/L98Q/Y105L/L106V、G29W/N58S/L63P/S72G/M87V/L98Q/Y105L、G29W/N58S/L63P/Q82R/L98Q/Y105L、G29W/N58S/L63P/M87T/L98Q/M99L/Y105L、G29W/N58S/L63P/L98Q/Y105L、G29W/E59G/L63P/L98Q/Y105L、G29W/T61I/L63P/S72G/L98Q/M99L/Y105L、G29W/L63P/D65G/S72G/L98Q/Y105L、G29W/L63P/I67V/S72G/L98Q/Y105L、G29W/L63P/S72G/L98Q/Y105L/L106I、G29W/L63P/S72G/L98Q/Y105L/L106I/I117L、G29W/L63P/S72G/L98Q/Y105L/I117L、G29W/L63P/S72G/L98Q/Y105L/P121S,G29W/L63P/L98Q/M99L/Y105L、G29W/S72G/Q76R/L98Q/Y105L/L106I/Q113H、G29W/M87K/T89S/L98Q/M99L/Y105L/I108V/I117L、G29W/M87K/I93V/L98Q/M99L/Y105L、G29W/L98Q/M99L/Y105L、E33M/A42T/L98Q/Y105L、E33M/L63P/S72G/L98Q/Y105L、E33M/L63P/S72G/L98Q/Y105L/I108F、E33M/L63P/S72G/L98Q/Y105L/I117L、E33M/Q82H/L98Q/M99L/Y105L、E33V/A42S/M55T/L98Q/M99L/Y105L、T37S/M56V/L98Q/Y105L、V38I/L63P/S72G/L98Q/M99L/Y105L、Q41L/Y54F/M56K/M99L/I108F、T53S/M56V/L98Q/Y105L、M55T/L63P/T71I/M99L/Y105L、M55T/S72G/L98Q/M99L/Y105L、M55T/E97Q/M99L/Y105F、M56K/L63P/N75D/V96I/M99L/Y105L/L106I、M56L/L63P/L98Q/Y105L/L106I/I117L、M56R/L63P/L98Q/M99L/Y105L、M56T/L91R/L98Q/Y105L、M56V/E59G/L63P/S72G/M87K/I93V/L98Q/M99L/Y105L/I117E、T61A/L63P/S72G/L98Q/M99L/Y105L、L63P/T69A/L98Q/M99L/Y105L/L106R/V116A、L63P/S72G/M87A/L98Q/Y105L、L63P/S72G/I93L/L98Q/M99L/Y105L、L63P/S72G/L98Q/M99L/Y105L、L63P/S72G/L98Q/M99L/Y105L/L106I/I117L、L63P/S72G/L98Q/Y105L、L63P/S72G/L98Q/Y105L/L106I/I117L、L63P/S72G/Y105L、L63P/M87K/M99L/L106R、L63P/Q82H/L98Q/M99L/Y105L、L63P/K95R、L63P/L98Q、L63P/L98Q/M99L/Y105L、L63P/L98Q/M99L/Y105L/L106I、L63P/L98Q/M99L/Y105L/I108V、L63P/L98Q/M99L/Y105L/I117M、L63P/L98Q/Y105L、L63P/L98Q/V116A、L63P/L98R/N110K、L63P/M99L/Y105L/I108F、I67V/S72G/Q82H/T89A/L98Q/M99L/Y105L、S72G/R85G/L98Q/M99L/Y105L/L106I、S72G/L98Q/M99L/Y105L/I117T、L98Q/M99L/Y105L、L98Q/M99L/Y105L/L106I/I117T、L98Q/M99L/Y105L/L106I/Y115N、L98Q/Y105L和L98R/N110K。
在一些实施方案中，TIM是或含有CTLA-4的vIgD，所述vIgD关于SEQ ID NO:1或2中所示的位置另外包括氨基酸修饰C122S。
在一些实施方案中，TIM是或含有CTLA-4的vIgD，所述vIgD关于SEQ ID NO:1或2中所示的位置包括氨基酸修饰C122S。在一些实施方案中，TIM具有SEQ ID NO:668中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，TIM是或含有表3中所示的野生型CTLA-4的IgD(例如IgV)或其包含表3中列出的任何修饰(例如取代)的vIgD。表3还提供参照CTLA-4的细胞外结构域(ECD)或IgV结构域的SEQ ID NO的示例性序列。如所指出的，对应于给定结构域的确切基因座或残基可以变化，如根据用于鉴定或分类结构域的方法变化。同样，在一些情形中，给定结构域(例如IgV)的相邻N和/或C末端氨基酸也可以包括于TIM的序列中，如以确保所述结构域在表达时的适当折叠。因此，应理解，表3中SEQ ID NO的例示不应被视为具有限制性。例如，变体CTLA-4多肽的特定结构域如IgV结构域可以比相应的SEQ ID NO所示的氨基酸序列长或短若干个氨基酸，如长或短1-10个氨基酸，如1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。
在一些实施方案中，TIM是或含有SEQ ID NO:3-190中任一项中所示的变体CTLA-4ECD。在一些实施方案中，TIM是或含有如下序列，所述序列展现与SEQ ID NO:3-190中的任一项至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性，如至少96％的同一性、97％的同一性、98％的同一性或99％的同一性，并且含有野生型或未修饰的CTLA-4中不存在(例如SEQ ID NO:1或2中不存在)的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，TIM是或含有SEQID NO:3-190中任一项中所示的任何ECD序列的特异性结合片段，并且所述特异性结合片段含有野生型或未修饰的CTLA-4中不存在(例如SEQ ID NO:1或2中不存在)的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
在一些实施方案中，TIM是或含有SEQ ID NO:192-355中任一项中所示的变体IgV序列。在一些实施方案中，TIM是或含有如下序列，所述序列展现与SEQ ID NO:192-355中任一项中所示的任何IgV序列至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性，如至少96％的同一性、97％的同一性、98％的同一性或99％的同一性，并且含有野生型或未修饰的CTLA-4中不存在(例如SEQ ID NO:191中不存在)的一个或多个氨基酸修饰(例如，一个或多个取代)。在一些实施方案中，TIM是SEQ ID NO:192-355中任一项中所示的任何IgV序列的特异性结合片段，并且所述特异性结合片段含有野生型或未修饰的CTLA-4中不存在(例如SEQ ID NO:191中所示)的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
在一些实施方案中，TIM是包含SEQ ID NO:92中所示的序列的变体CTLA-4多肽。在一些实施方案中，TIM是基本上由SEQ ID NO:92中所示的序列组成的变体CTLA-4多肽。在一些实施方案中，TIM是由SEQ ID NO:92中所示的序列组成的变体CTLA-4多肽。
在一些实施方案中，TIM是包含SEQ ID NO:113中所示的序列的变体CTLA-4多肽。在一些实施方案中，TIM是基本上由SEQ ID NO:113中所示的序列组成的变体CTLA-4多肽。在一些实施方案中，TIM是由SEQ ID NO:113中所示的序列组成的变体CTLA-4多肽。
在一些实施方案中，TIM是包含SEQ ID NO:165中所示的序列的变体CTLA-4多肽。在一些实施方案中，TIM是基本上由SEQ ID NO:165中所示的序列组成的变体CTLA-4多肽。在一些实施方案中，TIM是由SEQ ID NO:165中所示的序列组成的变体CTLA-4多肽。
在一些实施方案中，TIM是包含SEQ ID NO:186中所示的序列的变体CTLA-4多肽。在一些实施方案中，TIM是基本上由SEQ ID NO:186中所示的序列组成的变体CTLA-4多肽。在一些实施方案中，TIM是由SEQ ID NO:186中所示的序列组成的变体CTLA-4多肽。
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C.格式
含有本文提供的一个或多个BIM和一个或多个TIM的多结构域免疫调节蛋白可以以多种方式格式化，包括格式化为单链多肽融合物或多聚(例如二聚、三聚、四聚或五聚)分子。选择特定格式使得免疫调节蛋白的BIM与B细胞刺激性受体的配体特异性结合并且TIM与T细胞刺激性受体或T细胞刺激性受体的配体特异性结合。在一些方面，选择特定格式以实现T细胞刺激性受体和B细胞刺激性受体的活性的减弱，例如以降低或减小分别由T细胞和B细胞介导的免疫应答。在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白的模块格式提供工程化或生成免疫调节蛋白的灵活性，用于调节在涉及B细胞刺激性受体和T细胞刺激性受体与其配体之间的相互作用的免疫突触处的活性。
在一些实施方案中，选择多结构域免疫调节蛋白的格式以避免T细胞刺激性受体的交联或接合。因此，在一些方面，所提供的免疫调节蛋白不展现与T细胞刺激性受体的多价结合。例如，对于其中TIM与T细胞刺激性受体(例如CD28)结合的所生成的免疫调节蛋白，考虑所述免疫调节蛋白的相对较小的分子量、单体和/或单链多肽融合物。
在一些实施方案中，所提供的多结构域免疫调节蛋白可以包括一个或多个BIM和一个或多个TIM。在一些实施方案中，免疫调节蛋白可以包括本文所述的一个或多个BIM和本文所述的任何一个或多个TIM。在一些实施方案中，免疫调节蛋白确切地包含1、2、3、4、5个BIM，在一些方面，它们在包括多个时是相同的或具有相同序列。在一些实施方案中，多个(例如2、3、4或5个)中的每一个与另一BIM直接连接或经由接头间接连接。在一些实施方案中，免疫调节蛋白确切地包含1、2、3、4、5个TIM，在一些方面，它们在包括多个时是相同的或具有相同序列。在一些实施方案中，多个TIM(例如2、3、4或5个)中的每一个与另一TIM直接连接或经由接头间接连接。
在一些实施方案中，多结构域免疫调节蛋白含有包括至少一个BIM和至少一个TIM的多肽。在一些方面，一个或多个BIM分子中的至少一个与一个或多个TIM中的至少一个直接连接或经由接头间接连接。在一些实施方案中，免疫调节蛋白包括以任一顺序含有与TIM直接连接或经由接头间接连接的BIM的多肽。在一些实施方案中，至少一个BIM在所述多肽中位于至少一个TIM的氨基末端。在一些实施方案中，至少一个BIM在所述多肽中位于至少一个TIM的羧基末端。
除了单一多肽链实施方案，在一些实施方案中，两个、三个、四个或更多个含有一个或多个BIM和/或一个或多个BIM的多肽可以彼此共价或非共价附接。在一些实施方案中，至少一条多肽链含有一个或多个BIM并且至少一条多肽链含有一个或多个TIM。在一些实施方案中，至少两条多肽链中的每一条含有至少一个BIM和至少一个TIM。因此，本文提供单体、二聚和更高阶(例如，3、4、5或更高)多聚蛋白。例如，在一些实施方案中，确切的两个多肽(各自含有一个或多个BIM和/或一个或多个TIM)可以彼此共价或非共价附接以形成二聚体。在一些实施方案中，所述两个多肽可以经由多聚化结构域来附接，其中在一些方面，BIM和TIM中的一个或两个与所述多聚化结构域直接连接或经由接头间接连接。在这样的实施方案中，所述多聚化结构域可以是相同的或不同的。在一些实施方案中，多聚化结构域如Fc区促进两条多肽链经由链间半胱氨酸二硫键来附接。包含两种或更多种多肽的组合物可以具有相同的多肽序列或基本上相同的多肽序列(例如，同二聚体)，或者具有不同多肽序列(例如，异二聚体)。
在一些实施方案中，多结构域免疫调节蛋白还可以包括标签或部分。
用于包括在所提供的格式中的组分的非限制性例子进一步描述于以下小节中。所提供的多结构域免疫调节蛋白的示例性Fc融合物格式描绘于图16中。
1.接头
对于本文提供的多结构域免疫调节蛋白，接头(可与术语间隔子互换使用)可以用于连接多肽的组分，如本文提供的任何BIM和/或TIM。在一些情形中，接头是肽或多肽序列(例如合成肽或多肽序列)，或者是能够连接两个部分的非肽接头。在一些方面，使用或选择接头来维持单独残基或者在多肽融合蛋白的结构域的二级、三级或四级结构层面上的结构灵活性和其他构象特征，例如以维持免疫调节蛋白的功能特性。接头还可以向所述蛋白提供另外的有益特性，如在哺乳动物表达系统中增加的蛋白质表达、改进的生物物理学特性如稳定性和溶解性、改进的蛋白质纯化和检测和/或增强的酶活性。在一些例子中，两个或更多个接头可以串联连接。
在一些方面，接头可以是肽接头。在其他方面，接头包括化学连接剂和异双功能连接剂。在一些情形中，接头是不可切割的。在其他情形中，接头可以含有一个或多个蛋白水解酶可切割位点，其可以位于接头序列内或者在接头序列的任一端侧接接头。
在免疫调节蛋白中在BIM、TIM或其他部分之间存在多个接头时，每个接头可以是相同的或不同的。通常，接头或多个接头为多肽分子提供灵活性。
在一些实施方案中，一个或多个“肽接头”连接免疫调节蛋白的BIM、TIM或其他部分。在一些实施方案中，肽接头的长度可以是单一氨基酸残基或更长。在一些实施方案中，肽接头的长度为至少一个氨基酸残基但不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。在一些实施方案中，接头是柔性接头。连接部分描述于例如以下文献中：Huston等人(1988)PNAS 85:5879-5883；Whitlow等人(1993)ProteinEngineering 6:989-995；以及Newton等人,(1996)Biochemistry35:545-553。其他合适的肽接头包括美国专利号4,751,180或4,935,233中所述的那些中的任一种。
在一些例子中，肽接头包括肽(或多肽)(例如，天然的或非天然存在的肽)，其包括如下氨基酸序列，所述氨基酸序列将第一线性氨基酸序列与在自然界中并非与其天然连接或遗传融合的第二线性氨基酸序列连接或遗传融合。例如，肽接头可以包括非天然存在的多肽，其为天然存在的多肽的修饰的形式(例如，其包括突变，如添加、取代或缺失)。在另一例子中，肽接头可以包括非天然存在的氨基酸。在另一例子中，肽接头可以包括存在于在自然界中不存在的线性序列中的天然存在的氨基酸。在仍另一例子中，肽接头可以包括天然存在的多肽序列。连接部分还可以包括天然存在的氨基酸的衍生物和类似物，以及本领域中已知的疏水或非疏水的各种非天然存在的氨基酸(D-或L-)。
示例性肽接头是具有式Ser(Gly4Ser)n或(Gly-Ser)n残基的接头，其具有一些Glu或Lys残基遍布各处以提高溶解性，其中n可以是1至20的整数，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。其他示例性接头包括具有式[(Gly)x-Sery]z的肽接头，其中x为1至4，y为0或1，并且z为1至50。在其他例子中，肽接头包括序列Gn，其中n可以是1至100的整数。在另一例子中，肽接头的序列可以是(GA)n或(GGS)n。
在一些实施方案中，接头为(按单字母氨基酸代码)：GGGGS(“4GS”；SEQ ID NO:593)或4GS接头的多聚体，如2、3、4或5个4GS接头的重复序列。在一些实施方案中，肽接头为(GGGGS)2(SEQ ID NO:594)、(GGGGS)3(SEQ ID NO:595)、(GGGGS)4(SEQ ID NO:600)或(GGGGS)5(SEQ ID NO:671)。在一些实施方案中，接头还可以单独包括一系列丙氨酸残基或者还包括另一个肽接头(如4GS接头或其多聚体)。在一些实施方案中，每个系列中的丙氨酸残基的数量为：2、3、4、5或6个丙氨酸。在一些实施方案中，接头是刚性接头。例如，接头是α螺旋接头。在一些实施方案中，接头是(按单字母氨基酸代码)：EAAAK(SEQ ID NO:711)或EAAAK接头的多聚体，如2、3、4、5或6个EAAAK接头的重复序列，如SEQ ID NO:712(2xEAAAK)、SEQ ID NO:713(3xEAAAK)、SEQ ID NO:714(4xEAAAK)、SEQ ID NO:715(5xEAAAK)或SEQ IDNO:665(6xEAAAK)中所示。在一些实施方案中，接头还可以包括通过克隆引入和/或来自限制位点的氨基酸，例如接头可以包括如通过使用限制位点BAMHI引入的氨基酸GS(按单字母氨基酸代码)。在一些实施方案中，接头(按单字母氨基酸代码)为GSGGGGS(SEQ ID NO:590)或GGGGSSA(SEQ ID NO:596)。在一些例子中，接头为2xGGGGS和之后的三个丙氨酸(GGGGSGGGGSAAA；SEQ ID NO:721)。
在一些实施方案中，可以使用任何合适的常规技术将编码所需肽接头的多核苷酸插入编码所提供的免疫调节蛋白中的任何TIM、BIM或其他部分的多核苷酸之间，并且与所述多核苷酸在同一阅读框中，以及在另一部分之间。
2.多聚化结构域
在一些实施方案中，含有一个或多个BIM和/或TIM的免疫调节蛋白是多聚的，如二聚的、三聚的、四聚的或五聚的。对于二聚格式，免疫调节蛋白包含第一多肽和第二多肽。在一些实施方案中，第一和/或第二多肽是或含有BIM、TIM或二者。在方面中，BIM和/或TIM与多聚化结构域直接连接或经由接头间接连接。在一些方面，多聚化结构域增加分子的半衰期。接头可以包括如上所述的任一种。
在一个例子中，本文提供的免疫调节蛋白是二聚体。在一些情形中，免疫调节蛋白是同二聚体，其含有相同的第一和第二多肽亚基，即，所述亚基各自具有含有相同的一个或多个BIM和一个或多个TIM的相同氨基酸序列。同二聚体可以通过将编码变体多肽的核酸分子转化至细胞中来形成，所述细胞在分泌后引起多肽亚基的残基之间的共价或非共价相互作用以介导所述二聚体的形成。
在另一例子中，免疫调节蛋白是异二聚体，其含有不同的第一和第二多肽亚基。在这样的例子中，第一或第二多肽亚基中的一个或两个含有BIM和TIM的氨基酸序列。在一些情形中，第一和第二多肽亚基二者都可以含有BIM的氨基酸序列和TIM的氨基酸序列。异二聚体可以通过将编码第一多肽亚基的第一核酸分子和编码不同的第二多肽亚基的第二核酸分子二者转化至细胞中来形成。在一些方面，异二聚体是由于两个多肽亚基的残基之间的共价或非共价相互作用介导二聚体形成，在表达和分泌后从细胞产生。在这样的过程中，通常形成二聚分子的混合物，所述混合物包括同二聚体和异二聚体。对于异二聚体的形成，可能需要另外的用于纯化的步骤。例如，可以将第一和第二多肽工程化以包括具有金属螯合物或其他表位的标签，其中所述标签是不同的。加标签的结构域可以用于通过金属螯合物色谱和/或通过抗体进行快速纯化，以允许在生物测定中通过蛋白质印迹、免疫沉淀或者活性耗尽/阻断来检测。
免疫调节蛋白的两种或更多种多肽的相互作用可以通过其与任何部分或其他多肽的直接或间接连接来促进，所述部分或其他多肽本身能够相互作用以形成稳定结构。例如，单独编码的多肽链可以通过多聚化来接合，借此通过多聚化结构域介导多肽的多聚化。通常，多聚化结构域提供第一多肽与第二多肽之间的稳定蛋白质间相互作用的形成。
在一些实施方案中，免疫调节蛋白的两种或更多种单独多肽可以通过多聚化来接合，如接合为二聚、三聚、四聚或五聚分子。在一些情形中，所述单独多肽是相同的。例如，三聚分子可以从三个拷贝的相同单独多肽形成。在其他例子中，四聚分子是从四个拷贝的相同单独多肽生成。在其他例子中，五聚分子是从五个拷贝的相同单独多肽生成。在所述构型的一些实施方案中，含有BIM和/或TIM的免疫调节蛋白的单独多肽与多聚化结构域融合。所述多聚化结构域可以是促进多肽链的二聚化、三聚化、四聚化或五聚化的结构域。
在一些实施方案中，免疫调节蛋白形成多聚体，例如，二聚体。在一些实施方案中，二聚体是同二聚体，其中免疫调节蛋白的两个多肽是相同的。在一些实施方案中，二聚体是异二聚体，其中免疫调节蛋白的两个多肽是不同的。
在一些实施方案中，多聚化结构域包括能够形成稳定的蛋白质-蛋白质相互作用的任何结构域。多聚化结构域可以通过以下来相互作用：免疫球蛋白序列(例如Fc结构域；参见例如，国际专利公开号WO 93/10151和WO 2005/063816 US；美国公开号2006/0024298；美国专利号5,457,035)；亮氨酸拉链(例如，来自核转化蛋白fos和jun，或原癌基因c-myc，或来自一般氮控制(General Control of Nitrogen，GCN4))(参见例如，Busch和Sassone-Corsi(1990)Trends Genetics,6:36-40；Gentz等人,(1989)Science,243:1695-1699)；疏水区；亲水区；或者在同多聚体或异多聚体的嵌合分子之间形成分子间二硫键的游离硫醇。另外，多聚化结构域可以包括与包含孔的氨基酸序列互补的包含突起的氨基酸序列，如例如以下文献中所述：美国专利号5,731,168；国际专利公开号WO 98/50431和WO 2005/063816；Ridgway等人(1996)Protein Engineering,9:617-621。这种多聚化区域可以被工程化使得空间相互作用不仅促进稳定相互作用，而且还促进从嵌合单体的混合物形成异二聚体超过同二聚体。通常，突起是通过用较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替代第一多肽的界面中的小氨基酸侧链来构建。任选地通过用较小侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替代大氨基酸侧链在第二多肽的界面上产生突起的相同或类似大小的补偿腔。示例性多聚化结构域描述于下文中。
BIM和/或TIM可以在任何位置接合，但通常经由其N末端或C末端与多聚化结构域的N末端或C末端接合，以形成嵌合多肽。连接可以是直接连接或经由接头的间接连接。同样，嵌合多肽可以是融合蛋白或者可以通过化学连接来形成，如通过共价或非共价相互作用来形成。例如，在制备含有多聚化结构域的嵌合多肽时，可以将编码全部或部分BIM和/或TIM的核酸与编码多聚化结构域序列的核酸直接或间接或任选地经由接头结构域可操作地连接。在一些情形中，构建体编码嵌合蛋白，其中BIM和/或TIM的C末端与多聚化结构域的N末端接合。在一些情况下，构建体可以编码嵌合蛋白，其中BIM和/或TIM的N末端与多聚化结构域的N末端或C末端接合。
多肽多聚体含有两个嵌合蛋白，所述嵌合蛋白是通过将两个相同或不同的BIM和/或TIM与多聚化结构域直接或间接连接而产生。在一些例子中，在多聚化结构域是多肽的情况下，将编码BIM和/或TIM和多聚化结构域的基因融合物插入适当表达载体中。所得嵌合或融合蛋白可以在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达，并且允许组装为多聚体，其中多聚化结构域相互作用以形成多价多肽。多聚化结构域与BIM和/或TIM的化学连接可以使用异双功能接头来实现。
所得嵌合多肽(如融合蛋白)和由其形成的多聚体可以通过任何合适的方法来纯化，如例如通过亲和色谱在蛋白A或蛋白G柱上纯化。在将编码不同多肽的两种核酸分子转化至细胞中的情况下，将发生同二聚体和异二聚体的形成。可以调整表达条件，使得相对于同二聚体形成更偏好异二聚体形成。
在一些实施方案中，免疫调节蛋白包含附接至免疫球蛋白Fc的BIM和/或TIM(产生“免疫调节Fc融合物”)。在一些实施方案中，BIM和/或TIM的附接位于Fc的N末端处。在一些实施方案中，BIM和/或TIM的附接位于Fc的C末端处。在一些实施方案中，两个或更多个BIM和/或TIM(相同或不同)独立地附接于N末端处和C末端处。因此，同多聚或异多聚多肽可以从单独的含有BIM和/或TIM的多肽的共表达来生成。第一和第二多肽可以是相同或不同的。在一些实施方案中，第一和/或第二多肽各自含有与Fc序列连接的两个或更多个BIM和/或TIM。在一些实施方案中，第一和/或第二多肽各自含有与Fc序列连接的三个TIM和一个BIM。所提供的多结构域免疫调节蛋白的示例性Fc融合物形式描绘于图16中。
在一些实施方案中，所述Fc是鼠或人Fc。在一些实施方案中，所述Fc是哺乳动物或人IgG1、lgG2、lgG3或lgG4 Fc区。
在一些实施方案中，所述Fc源自IgG1，如人IgG1。在一些实施方案中，所述Fc是SEQID NO:586中所示的IgG1 Fc，其具有含有按照EU编号在位置356和358处的残基Glu(E)和Met(M)的同种异型。在一些实施方案中，所述Fc包含SEQ ID NO:586中所示的氨基酸序列或者展现与SEQ ID NO:586至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，所述Fc是如下IgG1 Fc，其含有人G1m1同种异型的氨基酸，如含有在位置356和358处的Asp(D)和Leu(L)的残基，例如如SEQ ID NO:597中所示。因此，在一些情形中，本文提供的Fc可以含有氨基酸取代E356D和M358L以重构同种异型G1 m1的残基。在一些实施方案中，所述Fc包含SEQ ID NO:597中所示的氨基酸序列或者展现与SEQ ID NO:597至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述Fc区具有SEQ ID NO:597中所示的氨基酸序列。
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:597)
在一些实施方案中，变体Fc包含SEQ ID NO:755中所示的序列。在一些实施方案中，变体Fc包含SEQ ID NO:756中所示的序列。在一些实施方案中，在本文提供的构建体中使用的Fc区可能进一步缺少C末端赖氨酸残基。
在一些实施方案中，Fc来源于IgG2，如人IgG2。在一些实施方案中，Fc包含SEQ IDNO:726所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:726至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc区是具有SEQ ID NO:726中所示的序列的IgG2 Fc区。在一些实施方案中，Fc区是具有SEQ ID NO:822中所示的序列的IgG2 Fc区。
在一些实施方案中，Fc源自IgG4，如人IgG4。在一些实施方案中，Fc包含SEQ IDNO:727中所示的氨基酸序列或者展现与SEQ ID NO:727至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IgG4 Fc是稳定的Fc，其中人IgG4的CH3结构域被人IgG1的CH3结构域取代，并且其展现被抑制的聚集体形成；抗体，其中人IgG4的CH3和CH2结构域分别被人IgG1的CH3和CH2结构域取代；或者抗体，其中在Kabat等人提出的EU索引中指示的人IgG4的位置409处的精氨酸被赖氨酸取代，并且其展现被抑制的聚集体形成(参见例如，美国专利号8,911,726)。在一些实施方案中，Fc是含有S228P突变的IgG4，已显示其通过Fab-臂交换防止治疗性抗体与内源IgG4之间的重组(参见例如，Labrijin等人(2009)Nat.Biotechnol.,27(8):767-71)。在一些实施方案中，Fc包含SEQ ID NO:728中所示的氨基酸序列或者展现与SEQ ID NO:728至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc区是SEQ ID NO:728中所示的IgG4 Fc区。在一些实施方案中，Fc区是SEQ ID NO:823中所示的IgG4 Fc区。
在一些实施方案中，Fc区含有一个或多个修饰以改变(例如减少)其正常功能中的一种或多种。通常，除了作为免疫球蛋白的主要功能的抗原结合能力之外，Fc区还负责效应子功能，如补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。此外，Fc区中存在的FcRn序列通过与体内FcRn受体缀合增加体内半衰期而起到调节血清中IgG水平的作用。在一些实施方案中，可以在Fc中降低或改变此类功能以与提供的Fc融合蛋白一起使用。
在一些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入Fc区中，从而生成Fc区变体。在一些实施方案中，Fc区变体具有降低的效应子功能。有许多可改变效应子功能的Fc序列的变化或突变的例子。例如，WO 00/42072、WO 2006019447、WO 2012125850、WO2015/107026、US2016/0017041和Shields等人J Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)描述具有改进的或减小的与FcR的结合的示例性Fc变体。那些出版物的内容通过引用明确并入本文。
在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白包含展现降低的效应子功能的Fc区，这使其成为某些应用的期望候选物，在所述应用中，免疫调节蛋白的体内半衰期是重要的，但是某些效应子功能(如CDC和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保，免疫调节蛋白缺少FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的Fc表达总结于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)第464页的表2中。用于评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性例子描述于以下文献中：美国专利号5,500,362(参见例如，Hellstrom,I.等人Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))；以及Hellstrom,I等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。可替代地，可以采用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.山景城，加利福尼亚州)；以及CytoTox 96TM非放射性细胞毒性测定(Promega，麦迪逊，威斯康星州))。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地，或另外地，可以在体内(例如，在动物模型中)评估目的分子的ADCC活性，如在Clynes等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所披露。还可以进行C1q结合测定以确认，免疫调节蛋白n不能结合C1q，并因此缺少CDC活性。参见例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见例如，Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.等人,Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应子功能的免疫调节蛋白包括按照EU编号具有以下Fc区残基中的一个或多个的取代的那些：238、265、269、270、297、327和329(美国专利号6,737,056)。这样的Fc突变体包括按照EU编号在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个位置处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297取代为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
在一些方面，通过一个或多个氨基酸取代修饰野生型Fc以降低效应子活性或使Fc对于Fc效应子功能呈惰性。示例性无效应子或惰性突变包括本文所述的那些。在一些实施方案中，免疫调节蛋白的Fc区具有如下Fc区，其中与天然Fc区相比，在位置234、235、236、237、238、239、270、297、298、325和329(通过EU编号指示)处的任何一个或多个氨基酸被不同的氨基酸取代。Fc区中这样的改变并不限于上述改变，并且包括例如：Current Opinionin Biotechnology(2009)20(6),685-691中所述的改变，如去糖基化链(N297A和N297Q)、IgG1-N297G、IgG1-L234A/L235A、IgG1-L234A/L235E/G237A、IgG1-A325A/A330S/P331S、IgG1-C226S/C229S、IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A、IgG1-E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、IgG1-L234F/L235E/P331S、IgG1-S267E/L328F、IgG2-V234A/G237A、IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S、IgG4-L235A/G237A/E318A和IgG4-L236E；WO 2008/092117中所述的改变，如G236R/L328R、L235G/G236R、N325A/L328R和N325LL328R；在位置233、234、235和237处的氨基酸插入(通过EU编号指示)；以及在WO 2000/042072中所述的位点处的改变。描述了具有改进的或减小的与FcR的结合的某些Fc变体。(参见例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312、WO 2006019447和Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在一些实施方案中，提供一种免疫调节蛋白，其包含含有一个或多个氨基酸取代的变体Fc区，所述取代延长半衰期和/或改进与新生Fc受体(FcRn)的结合。具有延长的半衰期和改进的与FcRn的结合的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)或WO 2015107026中。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，所述取代改进Fc区与FcRn的结合。这样的Fc变体包括按照EU编号在以下Fc区残基中的一个或多个处具有取代的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
在一些实施方案中，免疫调节蛋白的Fc区包含按照EU编号的一个或多个氨基酸取代C220S、C226S和/或C229S。在一些实施方案中，免疫调节蛋白的Fc区包含一个或多个氨基酸取代R292C和V302C。关于Fc区变体的其他例子也参见Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO 94/29351。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，所述改变导致减小的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如以下文献中所述：美国专利号6,194,551、WO 99/51642；以及Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
在一些实施方案中，提供一种免疫调节蛋白，其包含含有一个或多个氨基酸修饰的变体Fc区，其中所述变体Fc区源自野生型IgG1，如野生型人IgG1。在一些实施方案中，野生型IgG1 Fc可以是SEQ ID NO:586中所示的Fc，其具有含有按照EU编号在位置356和358处的残基Glu(E)和Met(M)的同种异型。在一些实施方案中，变体Fc区源自SEQ ID NO:586中所示的氨基酸序列。在其他实施方案中，野生型IgG1 Fc含有人G1m1同种异型的氨基酸，如含有在位置356和358处的Asp(D)和Leu(L)的残基，例如如SEQ ID NO:597中所示。因此，在一些情形中，变体Fc源自SEQ ID NO:597中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fc区缺少对应于SEQ ID NO:586或597中所示的野生型或未修饰的Fc的位置232的C末端赖氨酸(按照EU编号对应于K447del)。
在一些实施方案中，Fc含有至少一个氨基酸取代，所述氨基酸取代按照SEQ IDNO:586的编号为N82G(按照EU编号对应于N297G)。在一些实施方案中，Fc还含有至少一个氨基酸取代，所述氨基酸取代按照SEQ ID NO:586的编号为R77C或V87C(按照EU编号对应于R292C或V302C)。在一些实施方案中，变体Fc区还包含按照SEQ ID NO:586编号的C5S氨基酸修饰(按照EU编号对应于C220S)。例如，在一些实施方案中，变体Fc区包含以下氨基酸修饰：按照EU编号，N297G和以下氨基酸修饰C220S、R292C或V302C中的一个或多个(关于SEQ IDNO:586，对应于N82G和以下氨基酸修饰C5S、R77C或V87C中的一个或多个)，例如，Fc区包含SEQ ID NO:598中所示的序列。
在一些实施方案中，按照EU编号，变体Fc含有氨基酸取代L234A/L235E/G237A。在一些实施方案中，按照EU编号，变体Fc含有氨基酸取代A330S/P331S。在一些实施方案中，变体Fc含有氨基酸取代L234A/L235E/G237A/A330S/P331S(Gross等人(2001)Immunity 15:289)。在一些实施方案中，变体Fc包含SEQ ID NO:757中所示的序列。在一些实施方案中，变体Fc包含SEQ ID NO:758中所示的序列。在一些实施方案中，在本文提供的构建体中使用的Fc区可能进一步缺少C末端赖氨酸残基。
在一些实施方案中，在本文提供的免疫调节蛋白构建体中使用的变体Fc可以包括按照EU编号的无效应子突变L234A、L235E和G237A。在一些实施方案中，通过去除一个或多个半胱氨酸残基，如通过按照EU编号在位置220处将半胱氨酸残基替代为丝氨酸残基(C220S)，进一步修饰野生型Fc。具有降低的效应子功能的示例性惰性Fc区示于SEQ ID NO:599和SEQ ID NO:591中，它们分别基于SEQ ID NO:586或SEQ ID NO:597中所示的同种异型。在一些实施方案中，在本文提供的构建体中使用的Fc区可能进一步缺少C末端赖氨酸残基。在一些实施方案中，变体Fc区包含氨基酸修饰C220S、L234A、L235E或G237A中的一个或多个，例如Fc区包含SEQ ID NO:589、591、599或724中所示的序列。在一些实施方案中，变体Fc包含具有SEQ ID NO:589中所示的序列。在一些实施方案中，变体Fc包含具有SEQ ID NO:591中所示的序列。在一些实施方案中，变体Fc包含具有SEQ ID NO:599中所示的序列。在一些实施方案中，变体Fc包含具有SEQ ID NO:724中所示的序列。
在一些实施方案中，Fc区是变体Fc，其具有SEQ ID NO:589中所示的序列。
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:589)
在一些实施方案中，Fc区是变体Fc，其具有SEQ ID NO:824中所示的序列。
DKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW
YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP
IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:824)
在一些实施方案中，所述变体Fc区包含氨基酸修饰C220S、L235P、L234V、L235A、G236del或S267K中的一个或多个，例如，Fc区包含SEQ ID NO:722中所示序列。在一些实施方案中，Fc区缺少对应于SEQ ID NO:586中所示的野生型或未修饰的Fc的位置232的C末端赖氨酸(按照EU编号对应于K447del)。
在一些实施方案中，变体Fc区包含氨基酸修饰C220S、R292C、N297G、V302C中的一个或多个。在一些实施方案中，Fc区缺少对应于SEQ ID NO:586中所示的野生型或未修饰的Fc的位置232的C末端赖氨酸(按照EU编号对应于K447del)。用于免疫调节蛋白构建体中的示例性变体Fc区示于SEQ ID NO:723中。
在一些实施方案中，变体Fc区包含氨基酸修饰C220S/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K中的一个或多个。在一些实施方案中，Fc区缺少对应于SEQ ID NO:586中所示的野生型或未修饰的Fc的位置232的C末端赖氨酸(按照EU编号对应于K447del)。用于免疫调节蛋白构建体中的示例性变体Fc区示于SEQ ID NO:725中。
在一些实施方案中，免疫调节蛋白是同二聚体，其含有第一免疫调节Fc融合多肽和第二免疫调节Fc融合多肽，其中所述第一多肽和所述第二多肽是相同的。在一些实施方案中，第一Fc多肽融合物含有Fc区和一个或多个BIM和/或TIM，并且第二多肽融合物含有相同的Fc区和相同的一个或多个BIM和/或TIM。在这样的实施方案中，所述Fc区可以是如上所述的任一种。
用于包括于免疫调节多肽中的这样的Fc区的例子示于表4中。
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在一些实施方案中，提供一种免疫调节蛋白，其包含至少一个BIM(例如如章节III.A中所述)、至少一个TIM(例如章节III.B中所示的任一种)以及展现与SEQ ID NO:586或597中所示的野生型IgG1相比降低的效应子活性的变体Fc区。在一些实施方案中，变体Fc包含SEQ ID NO:591、598、599、722、589、723、724、725、757、758或824中任一项中所示的氨基酸序列或者展现与SEQ ID NO:591、598、599、722、589、723、724、725、757、758或824中的任一项至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。例如，本文提供一种免疫调节蛋白，其包含至少一个BIM(例如如章节III.A中所述)、至少一个TIM(例如章节III.B中所示的任一种)以及SEQ ID NO:589中所示的变体Fc区。在实施方案中，在从细胞产生和表达时，所提供的免疫调节蛋白是含有两条相同多肽链的同二聚体。
在一些实施方案中，免疫调节蛋白含有第一免疫调节Fc融合多肽和第二免疫调节Fc融合多肽，其中所述第一多肽和所述第二多肽是不同的。在一些实施方案中，第一Fc多肽融合物含有Fc区和一个或多个BIM和/或TIM，并且第二多肽融合物含有Fc区和一个或多个BIM和/或TIM。在这样的实施方案中，Fc区可以是促进或有利于异二聚体形成的区域。
在一些实施方案中，第一和第二免疫调节Fc融合多肽中的一种或两种的Fc结构域包含修饰(例如取代)，使得Fc分子的界面被修饰以有利于和/或促进异二聚化。促进Fc链异二聚化的方法包括诱变Fc区，如通过包含一组“杵臼结构”突变或包含突变以实现Fc的静电操纵以有利于不同多肽链之间的吸引相互作用。在一些实施方案中，异二聚分子的Fc区另外可以含有一个或多个其他Fc突变，如上文所述的任一种。在一些实施方案中，所述异二聚体分子含有具有降低效应子功能的突变的Fc区。在一些实施方案中，这样的Fc区按照EU编号含有突变C220S、L234A、L235E和/或G237A。在一些实施方案中，Fc骨架中的上文突变中的任一个可以在按照EU编号含有位置356和358处的残基Glu(E)和Met(M)的同种异型中进行。在其他实施方案中，Fc骨架中的上文突变中的任一个可以在按照EU编号含有位置356和358处的残基Asp(D)和Leu(L)的同种异型中进行。
在一些实施方案中，修饰包括将突起(杵)引入第一Fc多肽中并将腔(臼)引入第二Fc多肽中，使得突起可位于腔中以促进第一和第二含Fc的多肽的复合。靶向用于替代和/或修饰以在多肽中产生突起或腔的氨基酸通常是与第二多肽的界面中的一个或多个氨基酸相互作用或接触的界面氨基酸。
在一些实施方案中，被修饰以含有突起(杵)氨基酸的第一多肽包含用具有至少一个侧链的氨基酸替代天然或原始氨基酸，所述至少一个侧链从第一多肽的界面突出，因此可位于第二多肽的相邻界面中的补偿腔(臼)中。最常见的是，替代氨基酸是具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸。本领域技术人员了解如何测定和/或评估氨基酸残基的性质以鉴定产生突起的理想的替代氨基酸。在一些实施方案中，用于形成突起的替代残基是天然存在的氨基酸残基，并且包括例如精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)。在一些例子中，经鉴定用于替代的原始残基是具有小侧链的氨基酸残基，例如像丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
在一些实施方案中，被修饰以含有腔(臼)的第二多肽是包含用具有至少一个侧链的氨基酸替代天然或原始氨基酸的多肽，所述至少一个侧链从第二多肽的界面凹进，因此能够从第一多肽的界面容纳相应的突起。最常见的是，替代氨基酸是具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸。本领域技术人员了解如何测定和/或评估氨基酸残基的性质以鉴定对于形成腔而言理想的替代残基。通常，用于形成腔的替代残基是天然存在的氨基酸，并且包括例如丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。在一些例子中，经鉴定用于替代的原始氨基酸是具有大侧链的氨基酸，例如像酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
例如，人IgG1的CH3界面涉及位于四条反向平行β链上的每个结构域上的十六个残基，其掩埋来自每个表面的10902(参见例如，Deisenhofer等人(1981)Biochemistry,20:2361-2370；Miller等人,(1990)J Mol.Biol.,216,965-973；Ridgway等人,(1996)Prot.Engin.,9:617-621；美国专利号5,731,168)。修饰CH3结构域以产生突起或腔描述于例如以下文献中：美国专利号5,731,168；国际专利申请WO98/50431和WO 2005/063816；以及Ridgway等人,(1996)Prot.Engin.,9:617-621。在一些例子中，修饰CH3结构域以产生突起或腔通常靶向位于两条中心反向平行β链上的残基。目的是最小化以下风险，即产生的突起可通过突出到周围溶剂中而被容纳而不是由配偶体CH3结构域中的补偿腔容纳。
在一些实施方案中，异二聚体分子含有“杵链”的CH3结构域中的T366W突变，以及“臼链”的CH3结构域中的T366S、L368A、Y407V突变。在一些情况下，例如通过将Y349C突变引入“杵”或“臼”链的CH3结构域中，以及将E356C突变或S354C突变引入另一条链的CH3结构域中，还可以使用CH3结构域之间的另外的链间二硫桥(Merchant,A.M.等人,NatureBiotech.16(1998)677-681)。在一些实施方案中，异二聚体分子含有两个CH3结构域之一中的S354C、T366W突变，以及两个CH3结构域中的另一个中的Y349C、T366S、L368A、Y407V突变。例如，杵Fc可以含有SEQ ID NO:669中所示的序列，其含有S354C和T366W，以及SEQ ID NO:670中所示的臼Fc，其含有突变Y349C、T366S、L368A和Y407V)。在一些实施方案中，异二聚分子包含两个CH3结构域中的一个中的E356C、T366W突变，以及两个CH3结构域中的另一个中的Y349C、T366S、L368A、Y407V突变。在一些实施方案中，异二聚分子包含两个CH3结构域中的一个中的Y349C、T366W突变，以及两个CH3结构域中的另一个中的E356C、T366S、L368A、Y407V突变。在一些实施方案中，异二聚体分子包含两个CH3结构域中的一个中的Y349C、T366W突变，以及两个CH3结构域中的另一个中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变。其他杵臼结构技术的例子是本领域已知的，例如如EP 1 870 459 A1所述。
在一些实施方案中，可以将含有CH3突起(杵)或腔(臼)修饰的Fc变体在任何位置与多结构域免疫调节多肽接合，但通常经由其N末端或C末端与一个或多个BIM或TIM的N末端或C末端接合，如以形成融合多肽。连接可以是直接连接或经由接头的间接连接。通常，通过含有一个或多个CH3突起修饰的Fc变体连接的第一堆叠的免疫调节多肽与含有一个或多个CH3腔修饰的Fc变体连接的第二堆叠的免疫调节多肽的共表达来产生杵和臼分子。
杵和臼Fc多肽的示例性序列分别示于SEQ ID NO:716和717中。在一些实施方案中，杵或臼Fc区缺少对应于SEQ ID NO:586中所示的野生型或未修饰的Fc的位置232的C末端赖氨酸(按照EU编号对应于K447del)。杵和臼Fc多肽的示例性序列分别示于SEQ ID NO:669和670中。
在一些实施方案中，提供一种免疫调节蛋白，其包含含有至少一个BIM(例如如章节III.A中所述)和/或至少一个TIM(例如章节III.B中所示的任一种)和SEQ ID NO:716中所示的第一变体Fc的第一多肽；以及含有至少一个BIM(例如如章节III.A中所述)和/或至少一个TIM(例如章节III.B中所示的任一种)和SEQ ID NO:717中所示的第二变体Fc的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种免疫调节蛋白，其包含含有至少一个BIM(例如如章节III.A中所述)和/或至少一个TIM(例如章节III.B中所示的任一种)和SEQ ID NO:669中所示的第一变体Fc的第一多肽；以及含有至少一个BIM(例如如章节III.A中所述)和/或至少一个TIM(例如章节III.B中所示的任一种)和SEQ ID NO:670中所示的第二变体Fc的第二多肽。在实施方案中，在从细胞产生和表达时，所提供的免疫调节蛋白是含有两条不同多肽链的异二聚体。在例子中，所述多肽之一可以表达TIM，并且所述多肽之一可以表达BIM。
在一些实施方案中，异二聚体的每个多肽的Fc区包括突变以改变横跨Fc二聚体界面的电荷极性，使得静电匹配的Fc链的共表达支持有利的吸引相互作用，从而促进所需Fc异二聚体形成，而不利的排斥电荷相互作用抑制不期望的Fc同二聚体形成(Guneskaran等人(2010)JBC,285:19637-19646)。在一些实施方案中，含有BIM和/或TIM的至少一种多肽与含有变为带正电荷残基的突变(例如，按照EU编号，E356K、E357K和/或D399K；命名为所示的K链)的Fc(如SEQ ID NO:729中所示)直接或间接连接。在这样的实施方案中，异二聚体的含有BIM和/或TIM的另一多肽与含有变为带负电荷残基的突变(例如，按照EU编号，K370D、K392D和K409D；命名为D链)Fc(如SEQ ID NO:730中所示)直接或间接连接。当在细胞中共表达时，K链与D链之间的缔合是可能的，但是所述链由于电荷排斥而基本上不会自缔合。
在一些实施方案中，提供一种免疫调节蛋白，其包含含有至少一个BIM(例如如章节III.A中所述)和/或至少一个TIM(例如章节III.B中所示的任一种)和SEQ ID NO:729中所示的第一变体Fc的第一多肽；以及含有至少一个BIM(例如如章节III.A中所述)和/或至少一个TIM(例如章节III.B中所示的任一种)和SEQ ID NO:730中所示的第二变体Fc的第二多肽。在实施方案中，在从细胞产生和表达时，所提供的免疫调节蛋白是含有两条不同多肽链的异二聚体。在例子中，所述多肽之一可以表达TIM，并且所述多肽之一可以表达BIM。
在一些实施方案中，多结构域多肽的单独多肽或单结构域多肽的单独多肽与形成免疫调节蛋白的多聚化结构域连接，是三聚体、四聚体或五聚体。在一些实施方案中，这样的分子的单独多肽是相同的。在一些实施方案中，这样的多聚化结构域是软骨寡聚基质蛋白(COMP)组装结构域、血管舒张剂刺激磷蛋白(VASP)四聚化结构域或ZymoZipper(ZZ)12.6结构域。
在一些实施方案中，多聚化结构域是软骨寡聚基质蛋白(COMP)组装结构域的一部分(Voulgaraki等人,Immunology(2005)115(3):337-346)。在一些例子中，COMP是或含有如SEQ ID NO:734中所示的氨基酸序列(例如全长COMP的氨基酸29-72，Uniprot登录号P49747)或者与SEQ ID NO:734具有85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多聚化结构域是血管舒张剂刺激磷蛋白(VASP)四聚化结构域(Bachmann等人,J Biol Chem(1999)274(33):23549-23557)。在一些实施方案中，VASP是或含有如SEQ ID NO:735中所示的氨基酸序列(例如全长VASP的氨基酸343-375；Uniprot登录号P50552)或与SEQ ID NO:735具有85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多聚化结构域是ZymoZipper(ZZ)12.6结构域。在一些实施方案中，ZZ结构域是或含有如SEQ ID NO:736中所示的氨基酸序列(参见美国专利号7,655,439)或与SEQ ID NO:736具有85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列。
在一些构型中，可以将异二聚Fc融合蛋白的第一和第二多肽与用于检测和/或纯化的部分连接。在一些方面，将第一和第二多肽与不同的标签或部分连接。在一些方面，第一和第二多肽的标签或部分独立地选自多组氨酸标签(HHHHHH；SEQ ID NO:702)、flag标签(DYKDDDDK；SEQ ID NO:588)、Myc标签或荧光蛋白标签(例如，EGFP，SEQ ID NO:731、732或733中所示)。在一些例子中，含有BIM的第一多肽和含有TIM的第二多肽各自还含有用于检测和/或纯化的部分，如多组氨酸标签(HHHHHH；SEQ ID NO:702)和/或flag标签(DYKDDDDK；SEQ ID NO:588)。
在一些实施方案中，BIM和/或TIM与Fc序列直接连接。在一些实施方案中，BIM和/或TIM与Fc序列间接连接，如经由接头。在一些实施方案中，一个或多个“肽接头”连接BIM和/或TIM与Fc结构域。在一些实施方案中，肽接头的长度可以是单一氨基酸残基或更长。在一些实施方案中，肽接头的长度为至少一个氨基酸残基但不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。示例性接头示于小节“接头”中。
在一些实施方案中，接头为(按单字母氨基酸代码)：GGGGS(“4GS”；SEQ ID NO:593)或4GS接头的多聚体，如2、3、4或5个4GS接头的重复序列。在一些实施方案中，肽接头为(GGGGS)2(SEQ ID NO:594)、(GGGGS)3(SEQ ID NO:595)、(GGGGS)4(SEQ ID NO:600)或(GGGGS)5(SEQ ID NO:671)。在一些实施方案中，接头还可以单独包括一系列丙氨酸残基或者还包括另一个肽接头(如4GS接头或其多聚体)。在一些实施方案中，接头(按单字母氨基酸代码)为GSGGGGS(SEQ ID NO:590)或GGGGSSA(SEQ ID NO:596)。在一些例子中，接头为2xGGGGS和之后的三个丙氨酸(GGGGSGGGGSAAA；SEQ ID NO:721)。
还提供编码免疫调节蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，对于免疫调节蛋白的产生，将编码所述免疫调节蛋白的核酸分子插入适当的表达载体中。所得免疫调节蛋白可以在用表达转化的宿主细胞中表达，其中通过在Fc部分之间形成的链间二硫键进行Fc结构域之间的组装，以产生二聚(如二价)免疫调节蛋白。
含有BIM、TIM和Fc的所得免疫调节蛋白可以通过亲和色谱在蛋白A或蛋白G柱上容易地纯化。对于异二聚体的形成，可能需要另外的用于纯化的步骤。例如，在将编码不同免疫调节蛋白的两种核酸转化至细胞中的情况下，异二聚体的形成必须以生化方式来实现，因为携带Fc结构域的免疫调节蛋白也将被表达为二硫键连接的同二聚体。因此，同二聚体可以在有利于破坏链间二硫键但不影响链内二硫键的条件下还原。在一些情形中，将不同免疫调节蛋白单体以等摩尔量混合并氧化，以形成同二聚体与异二聚体的混合物。通过色谱技术分离该混合物的组分。可替代地，可以通过使用下文所述的杵臼结构方法基因工程化和表达包含含有一个或多个BIM和/或TIM的Fc融合分子的免疫调节蛋白来偏向这种类型的异二聚体的形成。
3.标签或部分
在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白中含有BIM和/或TIM的一种或多种多肽还可以包括标签或部分。在一些实施方案中，所述另外的部分是蛋白质、肽、小分子或核酸。在一些情形中，将免疫调节蛋白与超过一种其他部分(如2、3、4、5或6种)其他部分直接或间接连接。
在一些实施方案中，所述部分是半衰期延长分子。示例性的这样的半衰期延长分子包括但不限于白蛋白、白蛋白结合多肽、Pro/Ala/Ser(PAS)、人绒毛膜促性腺素的β亚基的C末端肽(CTP)、聚乙二醇(PEG)、长非结构化亲水氨基酸序列(XTEN)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合小分子或其组合。
在一些实施方案中，包含BIM和/或TIM的免疫调节多肽可以包括由氨基酸Pro、Ala和Ser构成的构象无序的多肽序列(参见例如，WO2008/155134，SEQ ID NO:904)。在一些情况下，氨基酸重复序列是至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸残基，其中每个重复序列包含一个或多个Ala、Ser和Pro残基。因此，本文提供一种免疫调节蛋白，其为PAS化蛋白，其中BIM和/或TIM与Pro/Ala/Ser(PAS)直接连接或经由接头间接连接。在一些实施方案中，可以使用一个或多个另外的接头结构。
在一些实施方案中，所述部分有利于免疫调节蛋白的检测或纯化。在一些情形中，免疫调节蛋白(如其多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体或五聚体)的至少一个多肽或每个多肽)包含连接的标签或部分，例如亲和标签或纯化标签。在一些方面，可以将这样的标签或部分与多肽的N末端和/或C末端直接连接或经由接头间接连接。各种合适的多肽标签和/或融合结构域是已知的，并且包括但不限于多组氨酸(His)标签(SEQ ID NO:702)、FLAG标签(SEQ ID NO:588)、Myc标签和荧光蛋白标签(例如，EGFP，SEQ ID NO:734、735或736中所示)。在一些情形中，所述标签是含有至少六个组氨酸残基的His标签(SEQ ID NO:702中所示)。
在一些情形中，包含BIM和TIM的免疫调节蛋白还包含部分的各种组合。例如，包含BIM或TIM的免疫调节蛋白还包含一个或多个多组氨酸标签和FLAG标签。在一些情形中，部分(如两个或更多个部分)的组合可以包括于同一多肽上。在一些情形中，部分(如两个或更多个部分)的组合可以包括于不同多肽上，如与涉及异二聚免疫调节多肽的实施方案结合。
IV.用于产生所述多肽或细胞的核酸、载体和方法
本文提供分离的或重组的核酸(统称为“核酸”)，其编码本文提供的免疫调节蛋白中的任一种。在一些实施方案中，本文提供的核酸(包括下文所述的所有核酸)可用于本文提供的免疫调节蛋白的重组产生(例如，表达)。在一些实施方案中，本文提供的核酸(包括下文所述的所有核酸)可用于本文提供的免疫调节蛋白(如本文提供的BCMA融合蛋白或多结构域免疫调节蛋白)的表达。本文提供的核酸可以呈RNA形式或呈DNA形式，并且包括mRNA、cRNA、重组或合成RNA和DNA，以及cDNA。本文提供的核酸通常是DNA分子，并且通常是双链DNA分子。然而，还提供包含本发明的任何核苷酸序列的单链DNA、单链RNA、双链RNA和杂合DNA/RNA核酸或其组合。
在一些情形中，可以将异源(非天然)信号肽添加至编码免疫调节蛋白的核酸。这可能是期望的，例如，在表达不含氨基末端信号序列的BCMA融合蛋白或所提供的多结构域免疫调节蛋白的情形中。在一些实施方案中，信号肽是来自以下的信号肽：免疫球蛋白(如IgG重链或IgG-κ轻链)、细胞因子(如白介素-2(IL-2)或CD33)、血清白蛋白蛋白质(例如HSA或白蛋白)、人天青杀素前蛋白信号序列、萤光素酶、胰蛋白酶原(例如胰凝乳蛋白酶原或胰蛋白酶原)，或者能够有效表达且在一些方面从细胞分泌蛋白质的其他信号肽。示例性信号肽包括表5中所述的任一种。
在一些实施方案中，免疫调节蛋白在表达时包含信号肽，并且在分泌时从免疫调节蛋白切割所述信号肽(或其部分)。
本文还提供可用于产生免疫调节蛋白(如本文提供的BCMA融合蛋白或多结构域免疫调节蛋白)的重组表达载体和重组宿主细胞。
在上文提供的任何实施方案中，可以使用重组DNA和克隆技术将编码本文提供的免疫调节多肽的核酸引入细胞中。为此，制备编码免疫调节多肽的重组DNA分子。制备此类DNA分子的方法是本领域中熟知的。例如，可以使用合适的限制性酶从DNA切除肽的编码序列。可替代地，可以使用化学合成技术(如亚磷酰胺法)来合成DNA分子。同样，可以使用这些技术的组合。在一些情况下，可以通过聚合酶链式反应(PCR)来生成重组或合成核酸。如本领域技术人员已知，可以将编码免疫调节蛋白的DNA插入物克隆至适当的转导/转染载体中。还提供含有所述核酸分子的表达载体。
在一些实施方案中，所述表达载体能在适当细胞中在适于表达蛋白质的条件下表达免疫调节蛋白。在一些方面，核酸分子或表达载体包含编码免疫调节蛋白的DNA分子，所述免疫调节蛋白与适当的表达控制序列操作性连接。在将DNA分子插入载体中之前或之后实现这种操作性连接的方法是熟知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、起始信号、终止信号、加帽信号、多腺苷酸化信号和涉及转录或翻译控制的其他信号。
在一些实施方案中，免疫调节蛋白的表达受启动子或增强子控制，以控制或调节表达。所述启动子与核酸分子中编码变体多肽或免疫调节蛋白的部分可操作地连接。
使用其上具有DNA分子的所得重组表达载体来转化适当宿主。该转化可以使用本领域中熟知的方法来进行。在一些实施方案中，本文提供的核酸还包含编码分泌或信号肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列与编码免疫调节多肽的核酸可操作地连接，使得从培养基、宿主细胞或宿主细胞周质回收所得的可溶性免疫调节多肽。在其他实施方案中，选择适当的表达控制信号以允许免疫调节多肽的膜表达。此外，可商购试剂盒以及签约制造公司也可以用于制备本文提供的工程化细胞或重组宿主细胞。
在一些实施方案中，使用其上具有DNA分子的所得表达载体来转化(如转导)适当细胞。可以使用本领域熟知的方法进行引入。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括经由病毒(例如，逆转录病毒或慢病毒)转导、转座子和电穿孔。在一些实施方案中，表达载体是病毒载体。在一些实施方案中，通过慢病毒或逆转录病毒转导方法将核酸转移至细胞中。
大量公共可获得且熟知的哺乳动物宿主细胞(包括哺乳动物T细胞或APC)中的任一种可用于制备多肽或工程化细胞。细胞的选择取决于本领域中公认的多种因素。这些因素包括例如与所选表达载体的相容性、由DNA分子编码的肽的毒性、转化率、回收肽的容易性、表达特征、生物安全性和成本。要平衡这些因素，必须深入理解，并非所有细胞都可以同等有效地用于特定DNA序列的表达。
在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。合适的哺乳动物宿主细胞的例子包括非洲绿猴肾细胞(Vero；ATCC CRL 1587)、人胚肾细胞(293-HEK；ATCC CRL 1573)、幼仓鼠肾细胞(BHK-21、BHK-570；ATCC CRL 8544、ATCC CRL 10314)、犬肾细胞(MDCK；ATCC CCL34)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1；ATCC CCL61；CHO DG44(Chasin等人,Som.Cell.Molec.Genet.12:555,1986))、大鼠垂体细胞(GH1；ATCC CCL82)、HeLa S3细胞(ATCC CCL2.2)、大鼠肝癌细胞(H-4-II-E；ATCC CRL 1548)、SV40转化的猴肾细胞(COS-1；ATCC CRL 1650)和鼠胚细胞(NIH-3T3；ATCC CRL 1658)。
在一些实施方案中，所述宿主细胞可以是多种真核细胞，如酵母细胞，或哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)或HEK293细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是悬浮细胞，并且多肽是在培养悬浮液中，如在培养的悬浮CHO细胞(例如，CHO-S细胞)中进行工程化或产生。在一些例子中，所述细胞系是缺乏DHFR(DHFR-)CHO细胞系，如DG44和DUXB11。在一些实施方案中，所述细胞缺乏谷氨酰胺合酶(GS)，例如，CHO-S细胞、CHOK1 SV细胞和CHOZN((R))GS-/-细胞。在一些实施方案中，所述CHO细胞(如悬浮CHO细胞)可以是CHO-S-2H2细胞、CHO-S-克隆14细胞或ExpiCHO-S细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞也可以是原核细胞，如大肠杆菌。将转化的重组宿主在多肽表达条件下培养，然后将其纯化以获得可溶蛋白质。可以在常规发酵条件下培养重组宿主细胞，使得表达所需多肽。此类发酵条件是本领域熟知的。最后，可以通过本领域熟知的多种方法中的任一种从重组细胞培养物回收和纯化本文提供的多肽，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法和亲和色谱法。在完成成熟蛋白质的构型时，可以视需要使用蛋白质重折叠步骤。最后，可以在最终纯化步骤中采用高效液相色谱法(HPLC)。
在一些实施方案中，所述重组载体是病毒载体。示例性重组病毒载体包括慢病毒载体基因组、痘病毒载体基因组、痘苗病毒载体基因组、腺病毒载体基因组、腺病毒相关病毒载体基因组、疱疹病毒载体基因组和α病毒载体基因组。病毒载体可以是活的、减毒的、有复制条件的或复制缺陷的、非致病的(缺陷性)、可复制的病毒载体，和/或被修饰以表达异源基因产物，例如，本文提供的变体免疫调节多肽。用于生成病毒的载体还可以被修饰以改变病毒的衰减，其包括增加或减少转录或翻译负荷的任何方法。
可以使用的示例性病毒载体包括修饰的痘苗病毒载体(参见例如，Guerra等人,J.Virol.80:985-98(2006)；Tartaglia等人,AIDS Research and Human Retroviruses 8:1445-47(1992)；Gheradi等人,J.Gen.Virol.86:2925-36(2005)；Mayr等人,Infection 3:6-14(1975)；Hu等人,J.Virol.75:10300-308(2001)；美国专利号5,698,530、6,998,252、5,443,964、7,247,615和7,368,116)；腺病毒载体或腺病毒相关病毒载体(参见例如，Molin等人,J.Virol.72:8358-61(1998)；Narumi等人,Am J.Respir.Cell Mol.Biol.19:936-41(1998)；Mercier等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:6188-93(2004)；美国专利号6,143,290；6,596,535；6,855,317；6,936,257；7,125,717；7,378,087；7,550,296)；逆转录病毒载体，包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、亲嗜性逆转录病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和组合的那些(参见例如，Buchscher等人,J.Virol.66:2731-39(1992)；Johann等人,J.Virol.66:1635-40(1992)；Sommerfelt等人,Virology 176:58-59(1990)；Wilson等人,J.Virol.63:2374-78(1989)；Miller等人,J.Virol.65:2220-24(1991)；Miller等人,Mol.Cell Biol.10:4239(1990)；Kolberg,NIHRes.4:43 1992；Cornetta等人,Hum.Gene Ther.2:215(1991))；慢病毒载体，包括基于人免疫缺陷病毒(HIV-1)、HIV-2、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和梅迪/维斯那病毒的那些(参见例如，Pfeifer等人,Annu.Rev.GenomicsHum.Genet.2:177-211(2001)；Zufferey等人,J.Virol.72:9873,1998；Miyoshi等人,J.Virol.72:8150,1998；Philpott和Thrasher,Human Gene Therapy 18:483,2007；Engelman等人,J.Virol.69:2729,1995；Nightingale等人,Mol.Therapy,13:1121,2006；Brown等人,J.Virol.73:9011(1999)；WO 2009/076524；WO 2012/141984；WO 2016/011083；McWilliams等人,J.Virol.77:11150,2003；Powell等人,J.Virol.70:5288,1996)或其任何变体，和/或可以用于生成任何上述病毒的载体。在一些实施方案中，重组载体可以包括调节序列，如启动子或增强子序列，所述调节序列可以调节病毒基因组(如在RNA病毒的情况下)在包装细胞系中的表达(参见例如，美国专利号5,385,839和5,168,062)。
在一些方面，核酸或表达载体包含与适当表达控制序列操作性连接的编码免疫调节蛋白的核酸序列。在编码免疫调节蛋白的核酸序列插入载体中之前或之后实现这种可操作连接的方法是公知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、起始信号、终止信号、加帽信号、多腺苷酸化信号和涉及转录或翻译控制的其他信号。所述启动子可以与核酸序列中编码免疫调节蛋白的部分可操作地连接。
转录调节序列包括足以引导RNA合成的起始的启动子区域。合适的真核启动子包括小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer等人,J.Molec.Appl Genet.1:273(1982))、疱疹病毒的TK启动子(McKnight,Cell 31:355(1982))、SV40早期启动子(Benoist等人,Nature290:304(1981))、劳斯肉瘤病毒启动子(Gorman等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 79:6777(1982))、巨细胞病毒启动子(Foecking等人,Gene 45:101(1980))和小鼠乳腺瘤病毒启动子(大体上参见Etcheverry,"Expression of Engineered Proteins in Mammalian CellCulture",Protein Engineering:Principles and Practice,Cleland等人(编辑),第163-181页(John Wiley&Sons,Inc.1996))。启动子与增强子的一种有用的组合由骨髓增生性肉瘤病毒启动子和人巨细胞病毒增强子提供。
可替代地，如果原核启动子受真核启动子调节，则所述原核启动子(如噬菌体T3RNA聚合酶启动子)可以用于控制免疫调节蛋白在哺乳动物细胞中的产生(Zhou等人,MolCell.Biol.10:4529(1990)；以及Kaufman等人,Nucl.Acids Res.19:4485(1991))。
可以使用多种标准技术将表达载体引入宿主细胞中，所述标准技术包括磷酸钙转染、脂质体介导的转染、微射弹介导的递送、电穿孔等。可以选择并繁殖转染的细胞以提供包含稳定整合于宿主细胞基因组中的表达载体的重组宿主细胞。用于将载体引入真核细胞中的技术以及用于使用显性可选标记来选择这样的稳定转化体的技术例如由Ausubel(1995)以及由Murray(编辑),Gene Transfer and Expression Protocols(HumanaPress1991)描述。
例如，一种合适的可选标记是提供对抗生素新霉素的抗性的基因。在此情形中，在新霉素型药物(如G-418等)的存在下进行选择。选择系统还可以用于增加目的基因的表达水平，所述过程被称为“扩增”。通过以下方式进行扩增：在低水平的选择剂的存在下培养转染子，然后增加选择剂的量以选择产生高水平的所引入基因的产物的细胞。合适的可扩增可选标记是二氢叶酸还原酶，其赋予对氨甲蝶呤的抗性。还可以使用其他抗药性基因(例如，潮霉素抗性、多药抗药性、嘌呤霉素乙酰转移酶)。可替代地，可以通过诸如FACS分选或磁珠分离技术的手段使用引入改变的表型的标记(如绿色荧光蛋白，或细胞表面蛋白(如CD4、CD8、I类MHC、胎盘碱性磷酸酶))来分选转染的细胞与未转染的细胞。
在一些实施方案中，本文提供的多肽还可以通过合成方法来制备。固相合成是制备单独肽的优选技术，因为它是制备小肽的最划算的方法。例如，熟知的固相合成技术包括保护基团、接头和固相支持物的使用，以及特定的保护和去保护反应条件、接头切割条件、清除剂的使用，以及固相肽合成的其他方面。然后可以将肽组装成如本文所提供的多肽。
V.药物组合物
本文提供含有任何本文所述的所提供的免疫调节蛋白的组合物。所述药物组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂。例如，所述药物组合物可以含有一种或多种赋形剂，用于改变、维持或保持例如组合物的pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透。这样的组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物是固体，如粉末、胶囊或片剂。例如，所述药物组合物的组分可以是冻干的。在一些实施方案中，在施用之前在液体中重构或溶解固体药物组合物。
在一些实施方案中，所述药物组合物是液体，例如溶解于水溶液(如生理盐水或林格氏溶液)中的免疫调节蛋白。在一些实施方案中，所述药物组合物的pH在约4.0与约8.5之间(如在约4.0与约5.0之间、在约4.5与约5.5之间、在约5.0与约6.0之间、在约5.5与约6.5之间、在约6.0与约7.0之间、在约6.5与约7.5之间、在约7.0与约8.0之间或在约7.5与约8.5之间)。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂，例如填充剂、粘合剂、包衣、防腐剂、润滑剂、调味剂、甜味剂、着色剂、溶剂、缓冲剂、螯合剂或稳定剂。药学上可接受的填充剂的例子包括纤维素、磷酸氢钙、碳酸钙、微晶纤维素、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、麦芽酚、预胶化淀粉、玉米淀粉或马铃薯淀粉。药学上可接受的粘合剂的例子包括聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、乳糖、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、明胶、蔗糖、聚乙二醇、甲基纤维素或纤维素。药学上可接受的包衣的例子包括羟丙基甲基纤维素(HPMC)、虫胶、玉米蛋白玉米醇溶蛋白或明胶。药学上可接受的崩解剂的例子包括聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素或羟基乙酸淀粉钠。药学上可接受的润滑剂的例子包括聚乙二醇、硬脂酸镁或硬脂酸。药学上可接受的防腐剂的例子包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸或山梨酸。药学上可接受的甜味剂的例子包括蔗糖、糖精、阿斯巴甜或山梨糖醇。药学上可接受的缓冲剂的例子包括碳酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、乙酸盐、磷酸盐或酒石酸盐。
在一些实施方案中，所述药物组合物还包含用于产物的受控释放或持续释放的药剂，如可注射微球、生物可侵蚀颗粒、聚合化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、珠或脂质体。
在一些实施方案中，所述药物组合物是无菌的。灭菌可以通过经由无菌滤膜过滤或辐射来完成。在冻干组合物的情况下，可以在冻干和重构之前或之后使用此方法进行灭菌。用于肠胃外给药的组合物可以以冻干形式或溶液形式储存。另外，通常将肠胃外组合物置入具有无菌进入口的容器中，例如，静脉内输液袋或具有皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶。
药学上可接受的载体可以是药学上可接受的材料、组合物或媒介物。例如，所述载体可以是液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，或其一些组合。载剂的每一组分必须是“药学上可接受的”，因为其必须与配制品中的其他成分相容。它还必须适于与它可能遇到的身体的任何组织、器官或部分接触，这意味着它不得带有毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或过多超出其治疗益处的任何其他并发症的风险。
在一些实施方案中，将所述药物组合物施用至受试者。通常，根据标准药学实践，根据受试者的体型和状况确定药物组合物的剂量和给药途径。例如，最初可以在细胞培养测定中或在动物模型(如小鼠、大鼠、兔、狗、猪或猴)中估计治疗有效剂量。动物模型还可以用于确定适当的浓度范围和施用途径。这样的信息随后可用于确定在人体中的可用剂量和施用途径。确切的剂量将根据与需要治疗的受试者相关的因素来确定。调整剂量和施用以提供足够水平的活性化合物或以维持所需效果。可以考虑的因素包括疾病状态的严重程度、受试者的总体健康状况、受试者的年龄、体重和性别、施用的时间和频率、一种或多种药物组合、反应敏感性以及对疗法的反应。
长效药物组合物可以根据特定制剂的半衰期和清除率每3至4天、每周或每两周施用一次。给药频率将取决于所用制剂中分子的药代动力学参数。通常，施用组合物直至达到实现所需效果的剂量。因此，组合物可以以单一剂量的方式施用，或随时间以多个剂量(以相同或不同的浓度/剂量)的方式施用，或以连续输注的方式施用。常规地对合适的剂量做出进一步改进。可以通过使用适当的剂量反应数据来确定适当剂量。
在一些实施方案中，通过任何途径向受试者施用所述药物组合物，包括口服、透皮、通过吸入、静脉内、动脉内、肌内、直接应用于伤口部位、应用于外科手术部位、腹膜内、通过栓剂、皮下、皮内、经皮、通过雾化、胸膜内、心室内、关节内、眼内或脊柱内。
所提供的药物配制品可以例如呈适于静脉内输注的形式。
在一些实施方案中，所述药物组合物的剂量是单一剂量或重复剂量。在一些实施方案中，每天一次、每天两次、每天三次或每天四次或更多次将所述剂量给予受试者。在一些实施方案中，在一周内给予约1或更多(如约2或更多、约3或更多、约4或更多、约5或更多、约6或更多或约7或更多)个剂量。在一些实施方案中，在数天、数周、数月或数年的过程中给予多个剂量。在一些实施方案中，治疗过程为约1或更多个剂量(例如约2或更多个剂量、约3或更多个剂量、约4或更多个剂量、约5或更多个剂量、约7或更多个剂量、约10或更多个剂量、约15或更多个剂量、约25或更多个剂量、约40或更多个剂量、约50或更多个剂量或约100或更多个剂量)。
在一些实施方案中，所施用的药物组合物的剂量为每kg受试者体重约1μg蛋白质或更多(如每kg受试者体重约2μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约5μg蛋白质)或更多、每kg受试者体重约10μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约25μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约50μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约100μg蛋白质或更高、每kg受试者体重约250μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约500μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约1mg蛋白质或更多、每kg受试者体重约2mg蛋白质或更多或每kg受试者体重约5mg蛋白质或更多)。
VI.用于评估免疫调节蛋白的活性和免疫调节的方法
在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白(如本文提供的BCMA融合蛋白或多结构域免疫调节蛋白)展现免疫调节活性。所提供的免疫调节蛋白(如BCMA融合蛋白或多结构域免疫调节蛋白)可以调节B细胞活性，如B细胞增殖、分化或存活中的一种或多种。在一些情形中，所提供的免疫调节蛋白(如多结构域免疫调节蛋白)可以另外调节T细胞激活或应答。在一些实施方案中，T细胞激活或应答被降低、减少或减弱。
可以使用多种方法检查免疫调节蛋白的功能以评估所述蛋白质与同源结合配偶体结合的能力。例如，可以评估BCMA融合蛋白与APRIL或BAFF的结合。在本文的多结构域免疫调节蛋白的情形中，可以评估所述蛋白质与同源结合配偶体的结合，如与T细胞刺激性受体的配体(例如CD80或CD86)或直接与T细胞刺激性受体(例如CD28)的结合，和/或与B细胞刺激性受体的配体(例如APRIL或BAFF)的结合。已知多种测定用于评估结合亲和力和/或确定结合分子(例如，免疫调节蛋白)是否与特定结合配偶体特异性结合。技术人员可以熟练地确定结合分子(例如，免疫调节蛋白)对结合配偶体(例如，APRIL或BAFF)的结合亲和力，如通过使用本领域中熟知的多种结合测定中的任一种。各种结合测定是已知的并且包括但不限于例如ELISA KD、KinExA、流式细胞术和/或表面等离子体共振装置，包括本文所述的那些。此类方法包括但不限于涉及或流式细胞术的方法。例如，在一些实施方案中，可以使用/>仪器使用表面等离子体共振(SPR)分析来确定两种蛋白质之间的复合物的结合动力学和常数(参见例如，Scatchard等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660,1949；Wilson,Science 295:2103,2002；Wolff等人,Cancer Res.53:2560,1993；以及美国专利号5,283,173、5,468,614或同等文献)。在分子结合至表面或从表面解离时，SPR测量传感器表面处分子浓度的变化。SPR信号的变化与靠近表面的质量浓度变化成正比，从而允许测量两个分子之间的结合动力学。可以通过监测当缓冲液通过芯片时折射率相对于时间的变化来确定复合物的解离常数。用于测量一种蛋白质与另一种蛋白质的结合的其他合适的测定包括例如免疫测定(如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA))或通过借助荧光、紫外吸收、圆二色性或核磁共振(NMR)监测蛋白质的光谱或光学性质的变化来确定结合。其他示例性测定包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、分析型超速离心、光谱法、流式细胞术、测序和用于检测所表达的多核苷酸或蛋白质结合的其他方法。
还可以在多种评估中的任一种中评估所提供的免疫调节蛋白以评估对T细胞或B细胞活性的调节。一种这样的测定是细胞增殖测定。在存在或不存在测试化合物(例如免疫调节蛋白)的情况下培养细胞，并且通过例如测量含氚胸苷的掺入或基于3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT)的代谢分解通过比色测定来检测细胞增殖(Mosman,J.Immunol.Meth.65:55-63,1983)。替代性测定格式使用进一步工程化以表达报告基因的细胞。所述报告基因与对受体连锁途径有反应的启动子元件连接，并且所述测定检测对所述报告基因转录的激活。在细胞提取物中易于测定的多种报告基因是本领域中已知的，例如，大肠杆菌lacZ、氯霉素乙酰转移酶(CAT)和血清应答元件(SRE)(参见例如，Shaw等人,Cell 56:563-72,1989)。示例性报告基因是萤光素酶基因(de Wet等人,Mol.Cell.Biol.7:725,1987)。使用本领域中已知的方法通过发光检测萤光素酶基因的表达(例如，Baumgartner等人,J.Biol.Chem.269:29094-101,1994；Schenborn和Goiffin,Promega Notes 41:11,1993)。萤光素酶活性测定试剂盒可从例如Promega Corp.(威斯康星州麦迪逊市)商购。
所提供的免疫调节蛋白的特征可以是抑制可溶APRIL或BAFF对人B细胞的刺激的能力，如由Gross等人在国际公开号WO00/40716中所述。简言之，将人B细胞从外周血单个核细胞分离，如使用CD19磁珠分离(例如Miltenyi Biotec Auburn，加利福尼亚州)。可以将纯化的B细胞在刺激的条件下(例如在可溶APRIL的存在下)孵育，并进一步在递增浓度的免疫调节蛋白的存在下孵育。所述B细胞可以用增殖染料来标记，或者可以用1μCi 3H-胸苷来标记，以测量增殖。可以随时间确定B细胞的数量。
可以制备在转录因子(如NF-κB、NFAT-1和AP-1)的可操作控制下表达报告基因的报告细胞系，其表达TACI或BCMA。例如，报告细胞可以包括Jurkat和其他B淋巴瘤细胞系。这些细胞与可溶BAFF或APRIL配体一起孵育经由这些构建体中的报告基因发信号。可以评估所提供的免疫调节蛋白调节该信号传导的作用。
可获得完善的动物模型来测试所提供的免疫调节蛋白在某些疾病状态(包括涉及自身免疫性或炎性病症的那些)中的体内功效。例如，自身免疫性疾病的动物模型包括例如MRL-lpr/lpr或NZB×NZW F1同类系小鼠品系，其用作SLE(系统性红斑狼疮)的模型。这样的动物模型是本领域中已知的，参见例如Autoimmune Disease Models A Guidebook,Cohen和Miller编辑Academic Press。新西兰黑色(NZB)与新西兰白色(NZW)小鼠之间杂交的后代发生自发形式的SLE，它与人SLE非常相似。称为NZBW的后代小鼠在1月龄时开始产生针对T细胞的IgM自身抗体，并且截至5-7月龄，Ig抗DNA自身抗体为显性免疫球蛋白。多克隆B细胞过度活跃导致自身抗体的过多产生。这些自身抗体、特别是针对单链DNA的自身抗体的沉积与肾小球肾炎的发展相关，肾小球肾炎在临床上表现为蛋白尿、氮质血症和因肾衰竭而死亡。肾衰竭是受自发性SLE影响的小鼠的首要死因，并且在NZBW品系中，这个过程是慢性的和闭塞的。所述疾病在雌性中比在雄性中更快且更严重，平均存活时间仅为245天，与之相比，雄性为406天。尽管许多雌性小鼠截至7-9月龄将有症状(蛋白尿)，但是一些雌性小鼠在出现症状时可能显著更年轻或更年老。在NZBW小鼠中见到的致命的免疫肾炎与在人SLE中见到的肾小球肾炎非常相似，使得这种自发性鼠模型对于测试潜在的SLE治疗药非常有吸引力(Putterman和Naparstek,Murine Models of Spontaneous Systemic LupusErythematosus,Autoimmune Disease Models:A Guidebook,第14章,第217-34页,1994；Mohan等人,J.Immunol.154:1470-80,1995；以及Daikh等人,J.Immunol.159:3104-08,1997)。可以评估将所提供的免疫调节蛋白施用至这些小鼠以评价改善症状的功效和对病程的改变。
炎症和狼疮样疾病的另一种小鼠模型是bm12诱导性小鼠SLE模型(Klarquist和Janssen,2015.J.Vis.Exp.(105),e53319)。来自雌性I-Abm12B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ(“bm12”)小鼠的脾细胞悬浮液过继转移至雌性C57BL/6NJ受体小鼠中。H2-Ab1bm12与H2-Ab1b相差3个核苷酸，导致MHC II类I-A分子的β链中3个氨基酸的改变。受体抗原呈递细胞对供体bm12 CD4+T细胞的同种激活导致慢性GVHD，其症状与SLE非常相似，包括自身抗体产生、免疫细胞子集的变化以及轻度肾病。具有免疫复合物沉积的肾小球肾炎在所述模型中较晚出现，主要由与IgG1、IgG2b、IgG2c和IgG3抗体结合的自身抗原构成。该模型的终点可以包括抗dsDNA抗体的浓度、选择IgG同种型、血尿素氮(BUN)、和血清中的肌酐、脾和子宫颈LN中的免疫细胞子集组成，以及肾组织学。
在一些实施方案中，可以使用舍格伦综合征(SjS)的小鼠模型。可以基于由Zhou等人,2016Sci.Rep.6,39105所公开方案的修改形式，使用抗小鼠(m)PD-L1抗体的重复给药，在雌性的易患糖尿病的非肥胖糖尿病(NOD)小鼠中诱导SjS疾病以及糖尿病的加速发作。在6周龄开始，在研究第0天、第2天、第4天和第6天，向小鼠腹膜内(IP)注射100μg抗PD-L1抗体，并在不同天数用所提供的免疫调节蛋白治疗所述小鼠。包括初试小鼠作为终点分析的对照。通常在研究第10天处死所有小鼠，并且从每只小鼠收集下颌下腺(SMG)和胰腺用于组织病理学评价，以评估涎腺炎和胰岛炎的体征和严重性。可以在不同天数测量血糖水平。
在一些实施方案中，可以使用实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)的小鼠模型。所述模型类似于人多发性硬化，并且由于对神经蛋白如髓鞘碱性蛋白(MBP)或蛋白脂质蛋白(PLP)的T细胞激活而发生脱髓鞘作用。用抗原接种导致诱导CD4+II类MHC限制性T细胞(Th1)。用于EAE的方案中的变化可以产生所述模型的急性的、慢性-复发的或被动转移的变体(Weinberg等人,J.Immunol.162:1818-26,1999；Mijaba等人,Cell.Immunol.186:94-102,1999；以及Glabinski,Meth.Enzym.288:182-90,1997)。可以评估施用所提供的免疫调节蛋白以改善症状和对病程的改变。
在一些实施方案中，可以使用胶原诱发关节炎(CIA)模型，其中小鼠患上慢性炎性关节炎，它与人类风湿性关节炎(RA)非常相似。由于CIA与RA共有类似的免疫和病理学特征，这使其成为用于筛选潜在的人抗炎性化合物的理想模型。使用CIA模型的另一个优点在于，发病机制是已知的。已经鉴定出II型胶原上的T细胞和B细胞表位，并且已经确定与免疫介导的关节炎相关的各种免疫学(延迟型超敏反应和抗胶原抗体)和炎性(细胞因子、趋化因子和基质降解酶)参数，并且它们可以用于评估测试化合物在所述模型中的功效(Wooley,Curr.Opin.Rheum.3:407-20,1999；Williams等人,Immunol.89:9784-788,1992；Myers等人,Life Sci.61:1861-78,1997；以及Wang等人,Immunol.92:8955-959,1995)。可以评估施用所提供的免疫调节蛋白以改善症状和对病程的改变。
在一些实施方案中，可以在小鼠被注射卵白蛋白并用抗原经鼻再刺激(其在支气管中产生类似于哮喘的哮喘性反应)时，创建支气管感染(如哮喘)的模型。可以评估施用所提供的免疫调节蛋白以改善症状和对病程的改变。
在一些实施方案中，重症肌无力(MG)是另一种可针对其获得鼠模型的自身免疫性疾病。MG是一种神经肌肉传递障碍，其涉及针对烟碱型乙酰胆碱受体(AChR)的自身抗体的产生。MG是获得性或遗传性的，其临床特征包括在体力活动时异常的乏力和疲劳。已经建立MG小鼠模型。(Christadoss等人,Establishment of a Mouse Model of MyastheniaGravis Which Mimics Human Myasthenia Gravis Pathogenesis for ImmuneIntervention,Immunobiology of Proteins and Peptides VIII,Atassi和Bixler编辑,1995,第195-99页。)实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)是一种抗体介导的疾病，其特征为针对AChR的抗体的存在。这些抗体破坏所述受体，导致神经肌肉电脉冲缺陷，从而导致肌无力。在EAMG模型中，用烟碱型乙酰胆碱受体对小鼠进行免疫。MG的临床体征在第二次免疫后数周变得明显。通过几种方法评价EAMG，所述方法包括通过放射免疫测定测量AChR抗体的血清水平(Christadoss和Dauphinee,J.Immunol.136:2437-40,1986；以及Lindstrom等人,Methods Enzymol.74:432-60,1981)、测量肌肉AChR或肌电测量术(Wu等人Protocolsin Immunology.第3卷,Coligen,Kruisbeak,Margulies,Shevach和Strober编辑.JohnWiley and Sons,纽约,第15.8.1页,1997)。
体内模型的另一种用途包括将抗原激发递送至动物，之后施用免疫调节蛋白并测量T细胞和B细胞应答。可以如Perez-Melgosa等人,J.Immunol.163:1123-7,1999中所述来测量T细胞依赖型和非T细胞依赖性免疫应答。可以进行经历常规抗原激发(例如，钥孔血蓝蛋白(KLH)、绵羊红细胞(SRBC)、卵白蛋白或胶原)之后施用所提供的免疫调节蛋白的动物中的免疫应答以测量对B细胞应答的作用。
可以使用药代动力学研究与放射性标记的免疫调节蛋白结合来确定这样的多肽在体内的分布和半衰期。
还可以评估用于评估对T细胞应答的活性的测定。可以采用T细胞激活测定，其中测量IFN-γ或其他效应细胞因子。可以评估免疫调节蛋白在T细胞激活后抑制或减少效应细胞因子分泌的能力。用于确定免疫活性的增强或抑制的测定包括测量培养上清液中的干扰素-γ细胞因子水平的MLR(混合淋巴细胞反应)测定(Wang等人,Cancer ImmunolRes.2014年9月:2(9):846-56)、SEB(葡萄球菌肠毒素B)、T细胞刺激测定(Wang等人,CancerImmunol Res.2014年9月:2(9):846-56)以及抗CD3 T细胞刺激测定(Li和Kurlander,JTransl Med.2010:8:104)。由于T细胞激活与IFN-γ细胞因子的分泌相关，检测来自这些体外人T细胞测定的培养上清液中的IFN-γ水平可以使用市售ELISA试剂盒来测定(Wu等人,Immunol Lett 2008年4月15日；117(1):57-62)。测定还包括评价细胞毒性的测定，包括标准51Cr释放测定(参见例如Milone等人，(2009)Molecular Therapy 17:1453-1464)或流式细胞毒性测定，或基于阻抗的细胞毒性测定(Peper等人(2014)Journal of ImmunologicalMethods,405:192-198)。在一些实施方案中，所使用的测定是抗CD3共固定化测定。在该测定中，通过与或不与另外的重组蛋白一起固定的抗CD3来刺激原代T细胞。在通常24-72小时的时间点收获培养上清液。在另一实施方案中，所用测定是混合淋巴细胞反应(MLR)。在该测定中，用同种异体APC刺激原代T细胞。在通常24-72小时的时间点收获培养上清液。通过标准ELISA技术在培养物上清液中测量人类IFN-γ水平。在一些情形中，可从供货商获得市售试剂盒，并且所述测定可以根据制造商的推荐来进行。
在一些实施方案中，在免疫调节蛋白调节(例如增加或降低)IFN-γ表达的能力的测定中，可以使用T细胞报告物测定。在一些实施方案中，T细胞是Jurkat T细胞系，或者源自Jurkat T细胞系。在报告物测定中，还生成报告细胞系(例如Jurkat报告细胞)以过表达作为免疫调节蛋白的同源结合配偶体的受体。在一些实施方案中，报告T细胞还含有报告构建体，其含有与报告物可操作地连接的对T细胞激活有反应的诱导性启动子。在一些实施方案中，所述报告物是荧光或发光报告物。在一些实施方案中，所述报告物是萤光素酶。在一些实施方案中，所述启动子响应于CD3信号传导。在一些实施方案中，所述启动子是NFAT启动子。在一些实施方案中，所述启动子响应于共刺激信号传导，例如，CD28共刺激信号传导。在一些实施方案中，所述启动子是IL-2启动子。在报告物测定的方面，刺激报告细胞系，如通过与表达T细胞共刺激受体的野生型配体的抗原呈递细胞(APC)共孵育来进行刺激。在一些实施方案中，APC是人工APC。人工APC是技术人员熟知的。在一些实施方案中，人工APC源自一种或多种哺乳动物细胞系，如K562、CHO或293细胞。
VII.治疗性应用
本文所述的药物组合物(包括包含本文所述的免疫调节蛋白的药物组合物)可以用于多种治疗性应用(如疾病的治疗)中。例如，在一些实施方案中，所述药物组合物用于治疗哺乳动物的炎性或自身免疫性障碍、癌症、器官移植、病毒感染和/或细菌感染。所述药物组合物可以调节(例如减少)免疫应答以治疗疾病。
这样的方法和用途包括治疗性方法和用途，例如，其设计将分子或含有所述分子的组合物施用至患有疾病、病症或障碍的受试者。在一些情形中，如所述，所述疾病或障碍是自身免疫性或炎性疾病、病症或障碍。在一些实施方案中，所述分子或工程化细胞是以有效量来施用，以实现对疾病、病症或障碍的治疗。用途包括含有免疫调节蛋白的分子的用途，以及在制备药物以进行这样的治疗性方法中的用途。在一些实施方案中，通过将所提供的免疫调节蛋白或包含其的组合物施用至患有或怀疑患有疾病或病症的受试者来进行所述方法。在一些实施方案中，所述方法从而治疗受试者的疾病或病症或障碍。
说明性受试者包括哺乳动物受试者，如耕畜、家畜和人类患者。在特定实施方案中，所述受试者是人类受试者。
本文所述药物组合物可用于多种治疗性应用中，例如疾病的治疗。例如，在一些实施方案中，药物组合物用于治疗哺乳动物的炎性或自身免疫性障碍、器官移植、病毒感染和/或细菌感染。药物组合物可调节免疫应答以治疗疾病。在一些实施方案中，药物组合物抑制免疫应答，其可用于炎性或自身免疫性障碍或器官移植的治疗中。
据信所提供的方法可用于多种应用中，包括但不限于例如用于治疗哺乳动物的多种免疫系统疾病或病症的预防性或治疗性方法中，在所述疾病或病症中免疫系统和免疫系统反应的调节或调控是有益的。例如，阻抑免疫应答在预防性和/或治疗性方法中可以是有益的，用于抑制受体对来自供体的组织、细胞或器官移植物的排斥。在治疗性情况下，哺乳动物受试者通常是患有免疫系统疾病或病症的受试者，并且进行施用以防止疾病或病症的进一步进展。
所提供的免疫调节蛋白(包括BCMA融合蛋白和多结构域免疫调节蛋白)可以用于以下疾病的治疗：自身免疫性疾病、B细胞癌症、免疫调节、EBD和任何抗体介导的病状(例如，ITCP、重症肌无力等)、肾病、间接T细胞免疫应答、移植物排斥以及移植物抗宿主病。免疫调节蛋白的施用可以在免疫应答期间特异性调节B细胞应答。另外，所提供的免疫调节蛋白的施用可以用于调节B细胞发育、其他细胞的发育、抗体产生和细胞因子产生。所提供的免疫调节蛋白的施用或使用还可以调节T细胞和B细胞通信，如通过仅中和BAFF或APRIL的增殖效应，或者在所提供的多结构域免疫调节蛋白的情形中还通过中和由T细胞刺激性分子介导的增殖效应(如通过中和CD80/CD86对CD28的增殖效应)。
在一些实施方案中，药物组合物抑制免疫应答，其可用于炎性或自身免疫性障碍或器官移植的治疗中。在一些实施方案中，药物组合物含有展现对B细胞刺激性受体和/或T细胞刺激性受体的拮抗剂活性的免疫调节蛋白，从而降低或减少免疫应答。
在一些实施方案中，组合物可用于治疗自身免疫疾病。在一些实施方案中，将含有本文提供的免疫调节蛋白的治疗组合物施用至患有免疫系统疾病(例如，自身免疫性疾病)的受试者可以导致对这样的免疫系统攻击或与其相关的生物反应的阻抑或抑制。通过抑制对健康身体组织的这种免疫系统攻击，可减少或缓解因针对健康组织的所述攻击所致或与所述攻击相关的所得物理症状(例如，疼痛、关节炎症、关节肿胀或压痛)，并且可减少、减缓或停止因免疫系统攻击所致或与所述攻击相关的生物和物理损伤。在预防性情况下，受试者可以是患有、易患或被认为呈现免疫系统疾病、障碍或病症的受试者，并且通常进行施用以防止疾病、障碍或病症进展，抑制或缓解与其相关的症状、体征或生物反应，防止可能由其造成的身体损伤，和/或维持或改善受试者的身体机能。
在一些实施方案中，可以通过本文所述的药物组合物治疗的疾病或病症是通过以下介导的任何疾病：免疫复合物沉积(例如狼疮性肾炎、血管炎)；对途经的直接干扰(例如灾难性抗磷脂抗体综合征、重症肌无力危象；抗Jo-1病)；对细胞的调理作用或直接损伤(例如特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血)；抗体介导的对同种异体移植物的排斥(例如高度敏化的肾移植患者)；或者针对生物替代因子、载体的抗药抗体(例如抗因子8)。
在一些实施方案中，可以通过本文所述的药物组合物治疗的炎性和自身免疫性障碍是系统性红斑狼疮(SLE)，包括不使用糖皮质激素的爆发预防；舍格伦综合征；原发性胆汁性肝硬化(PBC)；系统性硬皮病；多发性肌炎；糖尿病预防；IgA肾病；IgA血管炎；B细胞癌症，例如骨髓瘤；多发性硬化或视神经炎。
在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白可以用于治疗前B细胞白血病或B细胞白血病(如浆细胞白血病、慢性或急性淋巴细胞白血病)、骨髓瘤(如多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、内皮骨髓瘤和巨大细胞骨髓瘤)以及淋巴瘤(如非霍奇金淋巴瘤)。
在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白可以用作免疫抑制剂以选择性阻断B淋巴细胞的作用，用于治疗疾病。例如，某些自身免疫性疾病的特征为产生自身抗体，所述自身抗体促进组织破坏和疾病加重。自身抗体还可能导致免疫复合物沉积并发症的发生并导致系统性红斑狼疮的许多症状(包括肾衰竭、神经痛症状和死亡)。调节与细胞应答无关的抗体产生在许多疾病状态中也会是有益的。还已经显示B细胞在类风湿性关节炎中在致关节炎免疫球蛋白的分泌中起作用。所提供的免疫调节蛋白用于抑制、阻断或中和B细胞的作用，从而阻抑抗体产生的方法和用途在以下疾病的治疗中会是有益的：自身免疫性疾病，如重症肌无力、类风湿性关节炎、多关节型幼年型类风湿性关节炎和银屑病关节炎。
在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白可以用于阻断或中和与末期肾病相关的B细胞作用，所述B细胞作用可能与自身免疫性疾病相关或可能无关。这样的方法还将可用于治疗免疫性肾病。这样的方法还将可用于治疗与诸如以下的疾病相关的肾小球肾炎：膜性肾病、IgA肾病或Berger病、IgM肾病、IgA血管炎、古德帕斯彻病、感染后肾小球肾炎、系膜增生性疾病、慢性淋巴性白血病、微小病变型肾病综合征。这样的方法还将用作用于治疗与诸如以下的疾病相关的继发性肾小球肾炎或血管炎的治疗性应用：狼疮、多发性大动脉炎、过敏性紫癜、硬皮病、HTV相关疾病、淀粉样变性或溶血尿毒症综合征。所提供的方法还将可用作用于治疗与以下疾病相关的间质性肾炎或肾盂肾炎的治疗性应用的部分：慢性肾盂肾炎、镇痛药滥用、肾钙沉着症、由其他因素引起的肾病、肾结石或者慢性或急性间质性肾炎。本文提供的方法还包括在高血压或大血管疾病的治疗中使用所提供的免疫调节蛋白，所述疾病包括肾动脉狭窄或阻塞以及胆固醇栓塞或肾栓塞。所提供的方法和用途还可以用于治疗肾或泌尿系肿瘤、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、轻链神经病或淀粉样变性。
在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白还可以用于治疗哮喘和其他慢性气道疾病，如支气管炎和肺气肿。所提供的免疫调节蛋白还可以用于治疗舍格伦综合征。
在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白的方法和用途包括免疫抑制，特别是用于诸如用于移植物抗宿主病和移植物排斥的治疗性用途。在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白的方法和用途包括诸如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和克罗恩病的自身免疫性疾病的治疗。本文提供的方法将具有另外的治疗价值，用于治疗慢性炎性疾病，特别是用于减轻关节疼痛、肿胀、贫血和其他相关症状以及治疗感染性休克。
在一些实施方案中，可以通过含有本文所述的免疫调节蛋白的药物组合物治疗的炎性和自身免疫性障碍包括但不限于失弛缓症；艾迪生病；成人斯蒂尔病；无丙种球蛋白血症；斑秃；淀粉样变性；强直性脊柱炎；抗GBM/抗TBM肾炎；抗磷脂综合征；自身免疫性肾上腺炎(艾迪生病)；自身免疫性血管性水肿；自身免疫性自主神经机能异常；自身免疫性脑脊髓炎；自身免疫性肝炎；自身免疫性内耳疾病(AIED)；自身免疫性心肌炎；自身免疫性卵巢炎；自身免疫性睾丸炎；自身免疫性胰腺炎；自身免疫性多腺性综合征II型(APS II)；自身免疫性视网膜病变；自身免疫性甲状腺疾病(AITD)，即桥本甲状腺炎；自身免疫性荨麻疹；轴突和神经元神经病(AMAN)；巴洛病；眼-口-生殖器综合征；良性黏膜类天疱疮；大疱性类天疱疮；卡斯尔曼病(CD)；乳糜泻；美洲锥虫病；慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)；慢性复发性多病灶性骨髓炎(CRMO)；Churg-Strauss综合征(CSS)或嗜酸性肉芽肿(EGPA)；瘢痕性类天疱疮；寇甘综合征；冷凝集素病；先天性心脏传导阻滞；柯萨奇病毒性心肌炎；CREST综合征；克罗恩病；疱疹样皮炎；皮肌炎；德维克病(视神经脊髓炎)；盘状狼疮；心肌梗死后综合征；子宫内膜异位症；嗜酸细胞性食管炎(EoE)；嗜酸细胞性筋膜炎；结节性红斑；重症混合型冷球蛋白血症；伊文思综合征；纤维肌痛；纤维化肺泡炎；巨细胞动脉炎(颞动脉炎)；巨细胞心肌炎；肾小球肾炎；古德帕斯丘综合征；肉芽肿合并多血管炎；格雷夫斯病；格林-巴利综合征；桥本甲状腺炎；溶血性贫血；过敏性紫癜(HSP)；妊娠疱疹或妊娠性类天疱疮(PG)；化脓性汗腺炎(HS)(反常性痤疮)；低丙球蛋白血症；IgA肾病；IgA血管炎；IgG4相关硬化性疾病；免疫性血小板减少性紫癜(ITP)；包涵体肌炎(IBM)；间质性膀胱炎(IC)；幼年型关节炎；幼年型糖尿病(1型糖尿病)；幼年型肌炎(JM)；川崎病；兰伯特-伊顿综合征；白细胞破碎性血管炎；紫癜风；硬化性苔癣；木样结膜炎；线性IgA病(LAD)；狼疮；慢性莱姆病；美尼尔氏病；显微镜下多血管炎(MPA)；混合性结缔组织病(MCTD)；蚕蚀性角膜溃疡；穆-哈二氏病；多灶性运动神经病(MMN)或MMNCB；多发性硬化；重症肌无力；肌炎；发作性睡病；新生儿狼疮；视神经脊髓炎；中性粒细胞减少症；眼瘢痕性类天疱疮；视神经炎；复发性风湿病(PR)；PANDAS；副肿瘤性小脑变性(PCD)；阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)；Parry Romberg综合征；睫状体扁平部炎(中间葡萄膜炎)；Parsonage-Turner综合征；天疱疮、寻常型天疱疮；周围神经病；静脉周脑脊髓炎；恶性贫血(PA)；POEMS综合征；结节性多动脉炎；多腺性综合征I型、II型、III型；风湿性多肌痛；多发性肌炎；心肌梗死后综合征；心包切开术后综合征；原发性胆汁性肝硬化；原发性硬化性胆管炎；孕酮性皮炎；银屑病；银屑病关节炎；纯红细胞再生障碍(PRCA)；坏疽性脓皮病；雷诺现象；反应性关节炎；反射交感性营养不良；复发性多软骨炎；不宁腿综合征(RLS)；腹膜后纤维化；风湿热；类风湿性关节炎；结节病；施密特综合征；巩膜炎；硬皮病；舍格伦综合征；精子和睾丸自身免疫；僵人综合征(SPS)；亚急性细菌性心内膜炎(SBE)；Susac综合征；交感性眼炎(SO)；Takayasu动脉炎；颞动脉炎/巨细胞动脉炎；血小板减少性紫癜(TTP)；托洛萨-亨特综合征(THS)；横贯性脊髓炎；1型糖尿病；溃疡性结肠炎(UC)；未分化结缔组织病(UCTD)；葡萄膜炎；血管炎；白癜风或伏格特-小柳-原田病。
在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白(包括BCMA-Fc融合蛋白和所提供的多结构域免疫调节(例如TIM-BIM)融合蛋白)可以用于治疗硬皮病、重症肌无力、GVHD(包括急性GVHD或慢性GVHD)、与移植相关的免疫应答；抗磷脂抗体综合征；多发性硬化；舍格伦综合征；IgG4相关疾病；I型糖尿病；类风湿性关节炎(包括糖皮质激素疗法(GC)RA)或急性狼疮性肾炎。
在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白(包括BCMA-Fc融合蛋白和所提供的多结构域免疫调节(例如TIM-BIM)融合蛋白)可以用于治疗肌萎缩侧索硬化、视神经脊髓炎、横贯性脊髓炎、CNS自身免疫、格林-巴利综合征、神经囊尾蚴病、结节病(T/seroneg)、Churg-Strauss综合征、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、免疫性血小板减少症(ITP)、艾迪生病、多发性肌炎或皮肌炎。
在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白(包括BCMA-Fc融合蛋白和所提供的多结构域免疫调节(例如TIM-BIM)融合蛋白)可以用于治疗IgA肾病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、抗合成酶病如Jo-1综合征或ANCA血管炎。
在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白(包括BCMA-Fc融合蛋白和所提供的多结构域免疫调节(例如TIM-BIM)融合蛋白)可以用于治疗B细胞癌症。在一些实施方案中，所述B细胞癌症是如下癌症，其中在向B细胞提供自分泌生存环时涉及或牵涉到BAFF和APRIL。在一些实施方案中，所述癌症是B细胞慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，所述癌症是骨髓瘤。
在一些实施方案中，施用治疗量的药物组合物。通常，要施用的本发明组合物的精确量可以由医师在考虑患者(受试者)的年龄、体重、感染程度和身体状况的个体差异后决定。特定患者的最佳剂量和治疗方案可以由医学领域技术人员通过监测患者的疾病征候并相应调整治疗而容易地确定。
主题组合物的基于可以任何便捷方式来实施，包括通过气溶胶吸入、注射、摄入、输液、植入或移植来实施。本文所述的组合物可以皮下、真皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用。在一个实施方案中，治疗组合物是通过真皮内或皮下注射施用至患者。在另一实施方案中，治疗组合物是通过静脉内注射来施用。
在一些实施方案中，药物组合物是作为单一疗法(即，作为单一药剂)或作为组合疗法(即，与一种或多种另外的免疫抑制剂组合)来施用。在一些实施方案中，所述另外的药剂是糖皮质激素(例如，泼尼松、地塞米松和氢化可的松)、细胞抑制剂(如影响T细胞和/或B细胞的增殖的细胞抑制剂(例如，嘌呤类似物、烷化剂或抗代谢物))、抗体(例如，抗CD20、抗CD25或抗CD3单克隆抗体)、环孢菌素、他克莫司、西罗莫司、依维莫司、干扰素、阿片类、TNF结合蛋白、霉酚酸酯、小型生物制剂(如芬戈莫德或多球壳菌素)、细胞因子(如干扰素β-1a)、整联蛋白激动剂或整联蛋白拮抗剂。
VIII.制品和试剂盒
本文还提供了处于合适包装中的包含本文所述药物组合物的制品。用于本文所述组合物的合适包装是本领域已知的，并且包括例如小瓶(如密封小瓶)、器皿、安瓿、瓶子、罐子、软包装(例如，密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。可进一步将这些制品灭菌和/或密封。
还提供试剂盒，其包含本文所述的药物组合物(或制品)，所述试剂盒还可以包含关于使用所述组合物的方法(如本文所述的用途)的一个或多个说明书。本文所述的试剂盒还可以包括商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器以及具有进行本文所述的任何方法的说明书的包装插页。
IX.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白包含：
(1)至少一种T细胞抑制分子(TIM)，所述至少一种T细胞抑制分子与(i)T细胞刺激性受体或(ii)T细胞刺激性受体的配体结合；和/或拮抗T细胞刺激性受体的活性；以及
(2)至少一种B细胞抑制分子(BIM)，所述至少一种B细胞抑制分子与B细胞刺激性受体的配体结合和/或拮抗B细胞刺激性受体的活性。
2.根据实施方案1所述的免疫调节蛋白，其中所述TIM与T细胞刺激性受体的配体结合。
3.根据实施方案2所述的免疫调节蛋白，其中：
所述T细胞刺激性受体是CD28；和/或
所述T细胞刺激性受体的配体是CD80或CD86。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述TIM是CTLA-4细胞外结构域或其与CD80或CD86结合的结合部分。
5.根据实施方案4所述的免疫调节蛋白，其中所述CTLA-4细胞外结构域或其结合部分由以下组成：(i)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，(ii)具有与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2至少85％的序列同一性的变体CTLA-4氨基酸序列；或者(iii)其包含IgV结构域的部分。
6.根据实施方案4或实施方案5所述的免疫调节蛋白，其中所述CTLA-4细胞外结构域由SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列组成。
7.根据实施方案4或实施方案5所述的免疫调节蛋白，其中所述CTLA-4细胞外结构域由具有与SEQ ID NO:1至少85％的序列同一性的变体CTLA-4氨基酸序列或其包含IgV结构域的部分组成，其中所述变体序列包含SEQ ID NO:1或其包含所述IgV结构域的部分中的一个或多个氨基酸取代。
8.根据实施方案7所述的免疫调节蛋白，其中所述变体CTLA-4与CD80和CD86的胞外域结合，任选地其中与SEQ ID NO:1中所示的序列或其包含所述IgV结构域的部分相比，与CD80和CD86中的一种或两种的结合亲和力有所增加。
9.根据实施方案8所述的免疫调节蛋白，其中所述变体CTLA-4由SEQ ID NO:92中所示的序列或其包含所述IgV结构域的部分组成。
10.根据实施方案8所述的免疫调节蛋白，其中所述变体CTLA-4由SEQ ID NO:113中所示的序列或其包含所述IgV结构域的部分组成。
11.根据实施方案8所述的免疫调节蛋白，其中所述变体CTLA-4由SEQ ID NO:165中所示的序列或其包含所述IgV结构域的部分组成。
12.根据实施方案8所述的免疫调节蛋白，其中所述变体CTLA-4由SEQ ID NO:186中所示的序列或其包含所述IgV结构域的部分组成。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的免疫调节蛋白，其中：B细胞刺激性受体的所述配体是APRIL或BAFF；和/或
所述B细胞刺激性受体是TACI、BCMA或BAFF受体。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述BIM是TACI多肽，所述TACI多肽由所述TACI细胞外结构域或其与APRIL、BAFF或BAFF/APRIL异三聚体结合的结合部分组成。
15.根据实施方案14所述的免疫调节蛋白，其中所述TACI多肽是截短的野生型TACI细胞外结构域或者是其变体，其中所述截短的野生型TACI细胞外结构域含有富半胱氨酸结构域2(CRD2)但缺少完整的富半胱氨酸结构域1(CRD1)，其中所述变体TACI多肽包含所述截短的野生型TACI细胞外结构域中的一个或多个氨基酸取代。
16.根据实施方案14或实施方案15所述的免疫调节蛋白，其中所述TACI多肽是截短的野生型TACI细胞外结构域或者是其变体，其中关于SEQ ID NO:709中所示的位置，所述截短的野生型TACI细胞外结构域由氨基酸残基67-118内所含的由氨基酸残基71-104组成的连续序列组成，其中所述变体TACI多肽包含所述截短的野生型TACI细胞外结构域中的一个或多个氨基酸取代。
17.根据实施方案1-13中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述BIM是BCMA多肽，所述BCMA多肽由BCMA细胞外结构域或其与APRIL、BAFF或BAFF/APRIL异三聚体结合的结合部分组成。
18.根据实施方案14-16中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述截短的野生型TACI细胞外结构域的长度为35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、59、50或51个氨基酸。
19.根据实施方案14-16和17中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述截短的野生型TACI细胞外结构域由SEQ ID NO:709中所示的氨基酸残基68-110组成。
20.根据实施方案14-16和17-19中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述TACI多肽由SEQ ID NO:528中所示的氨基酸序列组成，或者是其含有SEQ ID NO:528中所示的序列中的一个或多个氨基酸取代的变体。
21.根据实施方案14-16和17-20中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述截短的TACI多肽或其变体与APRIL、BAFF或BAFF/APRIL异三聚体结合。
22.根据实施方案14-16中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述TACI多肽是由SEQ ID NO:516中所示的序列组成的截短的野生型TACI细胞外结构域。
23.根据实施方案14-16和17-21中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述TACI多肽是由SEQ ID NO:528中所示的序列组成的截短的野生型TACI细胞外结构域。
24.根据实施方案15-16和17-21中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述TACI多肽是变体TACI多肽，其中与所述截短的TACI多肽相比，所述变体TACI多肽具有增加的与APRIL和BAFF中的一种或两种的结合亲和力。
25.根据实施方案15-16、17-21和24中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体TACI多肽包含在对应于SEQ ID NO:709中所示编号的选自74、75、76、77、78、79、82、83、84、85、86、87、88、92、95、97、98、99、101、102和103的位置处的一个或多个氨基酸取代。
26.根据实施方案25所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代选自E74V、Q75E、Q75R、G76S、K77E、F78Y、Y79F、L82H、L82P、L83S、R84G、R84L、R84Q、D85E、D85V、C86Y、I87L、I87M、S88N、I92V、Q95R、P97S、K98T、Q99E、A101D、Y102D、F103S、F103V、F103Y或其保守氨基酸取代。
27.根据实施方案25或实施方案26所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括E74V、K77E、Y79F、L82H、L82P、R84G、R84L、R84Q、D85V或C86Y中的至少一个。
28.根据实施方案25-27中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代是D85E/K98T、I87L/K98T、L82P/I87L、G76S/P97S、K77E/R84L/F103Y、Y79F/Q99E、L83S/F103S、K77E/R84Q、K77E/A101D、K77E/F78Y/Y102D、Q75E/R84Q、Q75R/R84G/I92V、K77E/A101D/Y102D、R84Q/S88N/A101D、R84Q/F103V、K77E/Q95R/A101D或I87M/A101D。
29.根据实施方案25-28中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代是K77E/F78Y/Y102D。
30.根据实施方案25-28中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代是Q75E/R84Q。
31.根据实施方案25-29中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体TACI多肽示于SEQ ID NO:541中。
32.根据实施方案25-28和30中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体TACI多肽示于SEQ ID NO:542中。
33.根据实施方案14所述的免疫调节蛋白，其中所述TACI多肽是变体TACI多肽，所述变体TACI多肽包含参考TACI多肽的细胞外结构域(ECD)或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于SEQ ID NO:709中所示位置编号的选自40、59、60、61、74、75、76、77、78、79、82、83、84、85、86、87、88、92、95、97、98、99、101、102和103的位置处。
34.根据实施方案33所述的免疫调节蛋白，其中所述参考TACI多肽是截短的多肽，所述截短的多肽由TACI的细胞外结构域或其与APRIL、BAFF或BAFF/APRIL异三聚体结合的特异性结合部分组成。
35.根据实施方案33和34中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考TACI多肽包含(i)SEQ ID NO:709中所示的氨基酸序列，(ii)具有与SEQ ID NO:709至少95％的序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)(i)或(ii)的包含CRD1结构域和CRD2结构域中的一个或两个的部分，所述部分与APRIL、BAFF或BAFF/APRIL异三聚体结合。
36.根据实施方案33-35中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考TACI多肽缺少N末端甲硫氨酸。
37.根据实施方案33-36中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考TACI多肽包含所述CRD1结构域和所述CRD2结构域。
38.根据实施方案33-37中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考TACI多肽包含SEQ ID NO:516中所示的序列。
39.根据实施方案33-37中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考TACI多肽由SEQ ID NO:516中所示的序列组成。
40.根据实施方案33-36中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考TACI多肽基本上由所述CRD2结构域组成。
41.根据实施方案33-36和40中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考TACI多肽包含SEQ ID NO:528中所示的序列。
42.根据实施方案33-36和40中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考TACI多肽由SEQ ID NO:528中所示的序列组成。
43.根据实施方案33-42中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代选自W40R、Q59R、R60G、T61P、E74V、Q75E、Q75R、G76S、K77E、F78Y、Y79F、L82H、L82P、L83S、R84G、R84L、R84Q、D85E、D85V、C86Y、I87L、I87M、S88N、I92V、Q95R、P97S、K98T、Q99E、A101D、Y102D、F103S、F103V、F103Y或其保守氨基酸取代。
44.根据实施方案33-43中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括E74V、K77E、Y79F、L82H、L82P、R84G、R84L、R84Q、D85V或C86Y中的至少一个。
45.根据实施方案33-44中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代K77E。
46.根据实施方案33-44中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代R84G。
47.根据实施方案33-44中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代R84Q。
48.根据实施方案33-47中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代是D85E/K98T、I87L/K98T、R60G/Q75E/L82P、R60G/C86Y、W40R/L82P/F103Y、W40R/Q59R/T61P/K98T、L82P/I87L、G76S/P97S、K77E/R84L/F103Y、Y79F/Q99E、L83S/F103S、K77E/R84Q、K77E/A101D、K77E/F78Y/Y102D、Q75E/R84Q、Q75R/R84G/I92V、K77E/A101D/Y102D、R84Q/S88N/A101D、R84Q/F103V、K77E/Q95R/A101D或I87M/A101D。
49.根据实施方案33-44、45和48中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代是K77E/F78Y/Y102D。
50根据实施方案33-44、47和48中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代是Q75E/R84Q。
51.根据实施方案33-50中任一项所述的免疫调节蛋白，其中与所述参考TACI多肽相比，所述变体TACI多肽具有增加的与APRIL和BAFF中的一种或两种的结合亲和力。
52.根据实施方案24或实施方案51所述的免疫调节蛋白，其中所述变体TACI多肽具有增加的与APRIL的结合亲和力。
53.根据实施方案24或实施方案51所述的免疫调节蛋白，其中所述变体TACI多肽具有增加的与BAFF的结合亲和力。
54.根据实施方案24或实施方案51所述的免疫调节蛋白，其中所述变体TACI多肽具有增加的与APRIL和BAFF的结合亲和力。
55.根据实施方案24和51-54中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述增加的对BAFF或APRIL的结合亲和力是独立地增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。
56.根据实施方案15-16、17-21和24-55中任一项所述的免疫调节蛋白，其中：
所述变体TACI多肽包含SEQ ID NO:517-527、536、537、682-701中任一项中所示的序列；或者
所述变体TACI多肽包含SEQ ID NO:529-535、538-550、673-681中任一项中所示的序列。
57.根据实施方案15-16、17-21和24-55中任一项所述的免疫调节蛋白，其中：
所述变体TACI多肽由SEQ ID NO:517-527、536、537、682-701中任一项中所示的序列组成或基本上由其组成；或者
所述变体TACI多肽由SEQ ID NO:529-535、538-550、673-681中任一项中所示的序列组成或基本上由其组成。
58.根据实施方案15-16、17-21、24-55和57中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体TACI多肽由SEQ ID NO:541中所示的序列组成或基本上由其组成。
59.根据实施方案15-16、17-21、24-55和57中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体TACI多肽由SEQ ID NO:542中所示的序列组成或基本上由其组成。
60.根据实施方案15-16、17-21、24-55和57中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体TACI多肽由SEQ ID NO:688中所示的序列组成或基本上由其组成。
61.根据实施方案15-16、17-21、24-55和57中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体TACI多肽由SEQ ID NO:535中所示的序列组成或基本上由其组成。
62.根据实施方案15-16、17-21和24-61中任一项所述的免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白包含与至少一种TACI多肽连接的异源部分。
63.根据实施方案62所述的免疫调节蛋白，其中所述异源部分是半衰期延长部分、多聚化结构域、与细胞表面上的分子结合的靶向部分或可检测标记。
64.根据实施方案63所述的免疫调节蛋白，其中所述半衰期延长部分包括多聚化结构域、白蛋白、白蛋白结合多肽、Pro/Ala/Ser(PAS)、人绒毛膜促性腺素的β亚基的C末端肽(CTP)、聚乙二醇(PEG)、长非结构化亲水氨基酸序列(XTEN)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合小分子或其组合。
65.根据实施方案17所述的免疫调节蛋白，其中所述BCMA多肽由SEQ ID NO:356中所示的序列组成。
66.根据实施方案17所述的免疫调节蛋白，其中所述BCMA多肽是变体BCMA多肽，所述变体BCMA多肽包含参考BCMA多肽的细胞外结构域(ECD)或特异性结合片段中的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于SEQ ID NO:710中所示编号的选自9、10、11、14、16、19、20、22、25、27、29、30、31、32、35、36、39、43、45、46、47和48的位置处。
67.一种免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白包含变体BCMA多肽，其中所述变体BCMA多肽包含参考BCMA多肽的细胞外结构域(ECD)或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于SEQ ID NO:710中所示位置编号的选自9、10、11、14、16、19、20、22、25、27、29、30、31、32、35、36、39、43、45、46、47和48的位置处。
68.根据实施方案66或实施方案67所述的免疫调节蛋白，其中所述参考BCMA多肽是如下多肽，所述多肽由BCMA的细胞外结构域或其与APRIL、BAFF或BAFF/APRIL异三聚体结合的特异性结合部分组成。
69.根据实施方案66-68中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考BCMA多肽包含(i)SEQ ID NO:710中所示的氨基酸序列，(ii)具有与SEQ ID NO:710至少95％的序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)(i)或(ii)的包含所述CRD的部分。
70.根据实施方案66-69中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考BCMA缺少N末端甲硫氨酸。
71.根据实施方案66-70中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考BCMA多肽包含(i)SEQ ID NO:356中所示的氨基酸序列，(ii)具有与SEQ ID NO:356至少95％的序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)(i)或(ii)的包含所述CRD的部分。
72.根据实施方案66-71中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考BCMA多肽包含SEQ ID NO:356中所示的序列。
73.根据实施方案66-71中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考BCMA多肽由SEQ ID NO:356中所示的序列组成。
74.根据实施方案66-73中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代选自S9G、S9N、S9Y、Q10E、Q10P、N11D、N11S、F14Y、S16A、H19A、H19C、H19D、H19E、H19F、H19G、H19I、H19K、H19L、H19M、H19N、H19P、H19Q、H19R、H19S、H19T、H19V、H19W、H19Y、A20T、I22L、I22V、Q25E、Q25F、Q25G、Q25H、Q25I、Q25K、Q25L、Q25M、Q25S、Q25V、Q25Y、R27H、R27L、S29P、S30G、S30Y、N31D、N31G、N31H、N31K、N31L、N31M、N31P、N31S、N31V、N31Y、T32I、T32S、L35A、L35M、L35P、L35S、L35V、L35Y、T36A、T36G、T36N、T36M、T36S、T36V、R39L、R39Q、A43E、A43S、V45A、V45D、V45I、T46A、T46I、N47D、N47Y、S48G或其保守氨基酸取代。
75.根据实施方案66-74中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置19处的至少一个取代，任选地其中所述至少一个取代选自H19A、H19C、H19D、H19E、H19F、H19G、H19I、H19K、H19L、H19M、H19N、H19P、H19Q、H19R、H19S、H19T、H19V、H19W、H19Y。
76.根据实施方案66-75中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代H19L。
77.根据实施方案66-75中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代H19K。
78.根据实施方案66-75中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代H19R。
79.根据实施方案66-75中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代H19Y。
80.根据实施方案66-79中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置25处的至少一个取代，任选地其中所述至少一个取代选自Q25E、Q25F、Q25G、Q25H、Q25I、Q25K、Q25L、Q25M、Q25S、Q25V、Q25Y。
81.根据实施方案66-80中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置31处的至少一个取代，任选地其中所述至少一个取代选自N31D、N31G、N31H、N31K、N31L、N31M、N31P、N31S、N31V、N31Y。
82.根据实施方案66-81中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置35处的至少一个取代，任选地其中所述至少一个取代选自L35A、L35M、L35P、L35S、L35V、L35Y。
83.根据实施方案66-82中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置36处的至少一个取代，任选地其中所述至少一个取代选自T36A、T36G、T36N、T36M、T36S、T36V。
84.根据实施方案66-83中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代是H19Y/S30G；H19Y/V45A；F14Y/H19Y；H19Y/V45D；H19Y/A43E；H19Y/T36A；H19Y/I22V；N11D/H19Y；H19Y/T36M；N11S/H19Y；H19Y/L35P/T46A；H19Y/N47D；S9D/H19Y；H19Y/S30G/V45D；H19Y/R39Q；H19Y/L35P；S9D/H19Y/R27H；Q10P/H19Y/Q25H；H19Y/R39L/N47D；N11D/H19Y/N47D；H19Y/T32S；N11S/H19Y/S29P；H19Y/R39Q/N47D；S16A/H19Y/R39Q；S9N/H19Y/N31K/T46I；H19Y/R27L/N31Y/T32S/T36A；N11S/H19Y/T46A；H19Y/T32I；S9G/H19Y/T36S/A43S；H19Y/S48G；S9N/H19Y/I22V/N31D；S9N/H19Y/Q25K/N31D；S9G/H19Y/T32S；H19Y/T36A/N47Y；H19Y/V45A/T46I；H19Y/Q25K/N31D；H19Y/Q25H/R39Q/V45D；H19Y/T32S/N47D；Q10E/H19Y/A20T/T36S；H19Y/T32S/V45I；H19F/Q25E/N31L/L35Y/T36S；H19F/Q25F/N31S/T36S；H19I/Q25F/N31S/T36V；H19F/Q25V/N31M/T36S；H19Y/Q25Y/N31L/L35Y/T36S；H19F/Q25I/N31M/L35A/T36S；H19I/Q25L/N31L/L35Y/T36S；H19F/Q25L/N31G/L35P/T36A；H19Y/I22L/N31G；H19F/I22V/Q25M/N31P/T36M；H19Y/N31L/L35Y/T36S；H19L/S30G/N31H/L35A；H19L/Q25S/N31V/L35S/T36V；H19L/Q25S/S30Y/N31G/L35M/T36V；H19F/Q25F/N31L/L35Y/T36S；H19F/Q25F/N31S/T36G；H19F/I22V/Q25S/N31V/L35S/T36V；H19F/Q25G/N31S/L35V/T36N；H19L/Q25H/N31D/L35S；或H19F/Q25F/N31S/L35Y/T36S。
85.根据实施方案66-75、79和84中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括S16A/H19Y/R39Q。
86.根据实施方案66-85中任一项所述的免疫调节蛋白，其中与所述参考TACI多肽相比，所述变体BCMA多肽具有增加的与APRIL和BAFF中的一种或两种的结合亲和力。
87.根据实施方案86所述的免疫调节蛋白，其中所述变体BCMA多肽具有增加的与APRIL的结合亲和力。
88.根据实施方案86所述的免疫调节蛋白，其中所述变体BCMA多肽具有增加的与BAFF的结合亲和力。
89.根据实施方案86所述的免疫调节蛋白，其中所述变体BCMA多肽具有增加的与APRIL和BAFF的结合亲和力。
90.根据实施方案86-89中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述增加的对BAFF或APRIL的结合亲和力是独立地增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。
91.根据实施方案66-90中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体BCMA多肽包含SEQ ID NO:357-435中任一项中所示的序列。
92.根据实施方案66-90中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:357-435中任一项中所示的序列组成或基本上由其组成。
93.根据实施方案66-90中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:381中所示的序列组成或基本上由其组成。
94.根据实施方案66-90中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:411中所示的序列组成或基本上由其组成。
95.根据实施方案66-90中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:405中所示的序列组成或基本上由其组成。
96.根据实施方案66-90中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:406中所示的序列组成或基本上由其组成。
97.根据实施方案17和66-96中任一项所述的免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白包含与至少一种BCMA多肽连接的异源部分。
98.根据实施方案97所述的免疫调节蛋白，其中所述异源部分是半衰期延长部分、多聚化结构域、与细胞表面上的分子结合的靶向部分或可检测标记。
99.根据实施方案98所述的免疫调节蛋白，其中所述半衰期延长部分包括多聚化结构域、白蛋白、白蛋白结合多肽、Pro/Ala/Ser(PAS)、人绒毛膜促性腺素的β亚基的C末端肽(CTP)、聚乙二醇(PEG)、长非结构化亲水氨基酸序列(XTEN)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合小分子或其组合。
100.根据实施方案17和66-99中任一项所述的免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白包含与至少一种BCMA多肽连接的免疫球蛋白的Fc区。
101.根据实施方案1-17、18-20、21-23、24-33、39-66和68-100中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述至少一个TIM包括仅一个TIM。
102.根据实施方案1-17、18-20、21-23、24-33、39-66和68-100中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述至少一个TIM包含2、3、4或5个TIM，任选地其中每个TIM是相同的。
103.根据实施方案102所述的免疫调节蛋白，其中每个TIM是直接连接或经由接头间接连接，任选地其中所述接头是肽接头。
104.根据实施方案1-17、18-20、21-23、24-33、39-66和68-103中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述至少一个BIM包括仅一个BIM。
105.根据实施方案1-17、18-20、21-23、24-33、39-66和68-103中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述至少一个BIM包含2、3、4或5个BIM，任选地其中每个BIM是相同的。
106.根据实施方案105所述的免疫调节蛋白，其中每个BIM是直接连接或经由接头间接连接，任选地其中所述接头是肽接头。
107.根据实施方案103或实施方案106所述的免疫调节蛋白，其中所述接头是肽接头并且所述肽接头选自GSGGS(SEQ ID NO:592)、GGGGS(G4S；SEQ ID NO:593)、GSGGGGS(SEQID NO:590)、GGGGSGGGGS(2xGGGGS；SEQ ID NO:594)、GGGGSGGGGSGGGGS(3xGGGGS；SEQ IDNO:595)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(4xGGGGS；SEQ ID NO:600)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(5XGGGGS；SEQ ID NO:671)、GGGGSSA(SEQ ID NO:596)或其组合。
108.根据实施方案1-17、18-20、21-23、24-33、39-66和68-107中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述至少一个TIM和所述至少一个BIM是直接连接或经由接头间接连接，任选地其中所述接头包含肽接头和/或多聚化部分。
109.根据实施方案108所述的免疫调节蛋白，其中所述接头包括肽接头并且所述肽接头选自GSGGS(SEQ ID NO:592)、GGGGS(G4S；SEQ ID NO:593)、GSGGGGS(SEQ ID NO:590)、GGGGSGGGGS(2xGGGGS；SEQ ID NO:594)、GGGGSGGGGSGGGGS(3xGGGGS；SEQ ID NO:595)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(4xGGGGS；SEQ ID NO:600)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(5XGGGGS；SEQ ID NO:671)、GGGGSSA(SEQ ID NO:596)或其组合。
110.根据实施方案108所述的免疫调节蛋白，其中所述接头包括肽接头并且所述肽接头选自SEQ ID NO:711(1xEAAAK)、SEQ ID NO:712(2xEAAAK)、SEQ ID NO:713(3xEAAAK)、SEQ ID NO:714(4xEAAAK)、SEQ ID NO:715(5xEAAAK)、SEQ ID NO:665(6xEAAAK)。
111.根据实施方案1-17、18-20、21-23、24-33、34-66和68-110中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白是单体和/或包含单一多肽链。
112.根据实施方案111所述的免疫调节蛋白，其中所述至少一个TIM在所述多肽中位于所述至少一个BIM的氨基末端。
113.根据实施方案111所述的免疫调节蛋白，其中所述至少一个TIM在所述多肽中位于所述至少一个BIM的羧基末端。
114.根据实施方案1-17、18-20、21-23、24-33、39-66和68-113中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白还包含可检测标记，任选地其中所述可检测标记是Flag标签、His标签或myc标签。
115.根据实施方案1-17、18-20、21-23、24-33、39-64和101-114中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白包含SEQ ID NO:618-623中任一项中所示的氨基酸序列，或者展现与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性且保留活性的序列。
116.根据实施方案18-20、21-23、24-33、39-64和101-113中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白包含SEQ ID NO:703-708中任一项中所示的氨基酸序列，或者展现与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性且保留活性的序列。
117.根据实施方案108所述的免疫调节蛋白，其中所述接头包含多聚化结构域，其中所述多聚化结构域促进二聚化、三聚化、四聚化或五聚化。
118.根据实施方案108或实施方案117所述的免疫调节蛋白，其中所述多聚化结构域是免疫球蛋白Fc区。
119.根据实施方案1-16、18-20、21-23、24-33、39-66和68-110、117和118中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白是二聚体。
120.根据实施方案100和118所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区是同二聚Fc区。
121.根据实施方案100和118所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区是异二聚Fc区。
122.根据实施方案1-16、18-20、21-23、24-33、39-66和68-110和117-120所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白是同二聚体，其中所述二聚体的每个多肽是相同的。
123.根据实施方案122所述的免疫调节蛋白，其中每个多肽包含至少一个TIM和至少一个BIM，并且其中所述至少一个TIM在每个多肽中位于所述至少一个BIM的氨基末端。
124.根据实施方案122所述的免疫调节蛋白，其中每个多肽包含至少一个TIM和至少一个BIM，并且其中所述至少一个TIM在每个多肽中位于所述至少一个BIM的羧基末端。
125.根据实施方案100、实施方案118-120和122-124中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc是IgG1 Fc结构域，或者是展现降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能的变体Fc，任选地如与野生型IgG1 Fc结构域相比。
126.根据实施方案100、实施方案118-120和122-125中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc是IgG1 Fc结构域，并且所述Fc包含SEQ ID NO:597中所示的氨基酸序列。
127.根据实施方案100、实施方案118-120和122-125中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc是变体IgG1 Fc结构域，其包含按照EU编号选自L234A、L234V、L235A、L235E、G237A、S267K、R292C、N297G和V302C的一个或多个氨基酸取代。
128.根据实施方案127所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区含有按照EU编号的氨基酸取代L234A、L235E和G237A或者按照EU编号的氨基酸取代R292C、N297G和V302C。
129.根据实施方案100、实施方案118-120和122-125、实施方案127和实施方案128中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述Fc是包含SEQ ID NO:589中所示的氨基酸序列的变体Fc。
130.根据实施方案1-16、18-20、21-23、24-33、39-65和68-110和117-128中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白包含SEQ ID NO:610-617、624-627、637、638、643、644、648、653和654中任一项中所示的氨基酸序列，或者展现与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性且保留活性的序列。
131.根据实施方案1-13、17、65、66、68-110和117-128中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白包含SEQ ID NO:601-609、631-636、645-647、649-652、655-659中任一项中所示的氨基酸序列，或者展现与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性且保留活性的序列。
132.根据实施方案1-16、18-20、21-23、24-33、39-66、68-110、117-119和121所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白是异二聚体，其中所述二聚体的每个多肽与单独包含野生型Fc结构域中的一个或多个氨基酸修饰的免疫球蛋白Fc结构域连接，以在所述多肽之间实现异二聚体形成。
133.根据实施方案132所述的免疫调节蛋白，其中所述野生型免疫球蛋白Fc是IgG1Fc结构域。
134.根据实施方案132或实施方案133所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸修饰选自杵臼结构修饰和电荷突变，所述电荷突变用于因电荷排斥而减少或防止自缔合。
135.根据实施方案132-134中任一项所述的免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白还包含一个或多个氨基酸取代以降低与Fc受体的结合亲和力和/或降低效应子功能，任选地如与野生型IgG1 Fc结构域相比。
136.根据实施方案135所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代按照EU编号选自L234A、L234V、L235A、L235E、G237A、S267K、R292C、N297G和V302C。
137.根据实施方案135或实施方案136所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区含有按照EU编号的氨基酸取代L234A、L235E和G237A或者按照EU编号的氨基酸取代R292C、N297G和V302C。
138.根据实施方案132-137中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述异二聚体包含含有SEQ ID NO:662或663中所示的氨基酸序列的第一多肽和含有SEQ ID NO:660中所示的氨基酸序列的第二多肽。
139.根据实施方案1-138中任一项所述的免疫调节蛋白，其中：
所述免疫调节蛋白阻断APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体与BCMA或TACI的结合；和/或
所述免疫调节蛋白在施用至受试者之后降低血液中循环APRIL、BAFF或APRIL/BAFF的水平。
140.根据实施方案1-138中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白降低或抑制B细胞成熟、分化和/或增殖。
141.根据实施方案1-17、18-20、21-34、34-66、68-134中任一项所述的免疫调节蛋白，其中：
所述免疫调节蛋白阻断CD80或CD86与共刺激受体的结合，任选地其中所述共刺激受体是CD28；和/或
所述免疫调节蛋白降低或抑制T细胞共刺激。
142.一种或多种核酸分子，所述一种或多种核酸分子编码根据实施方案1-141中任一项所述的免疫调节蛋白。
143.根据实施方案142所述的核酸分子，所述核酸分子是合成核酸。
144.根据实施方案142或实施方案143所述的核酸分子，所述核酸分子是cDNA。
145.一种载体，所述载体包含根据实施方案142-144中任一项所述的核酸分子。
146.根据实施方案145所述的载体，所述载体是表达载体。
147.根据实施方案145或实施方案146所述的载体，其中所述载体是哺乳动物表达载体或病毒载体。
148.一种细胞，所述细胞包含根据实施方案142-144中任一项所述的核酸或根据实施方案145-147中任一项所述的载体。
149.根据实施方案148所述的细胞，所述细胞是哺乳动物细胞。
150.根据实施方案148或实施方案149所述的细胞，所述细胞是人细胞。
151.一种产生免疫调节蛋白的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达所述蛋白质的条件下将根据实施方案142-144中任一项所述的核酸分子或根据实施方案145-147中任一项所述的载体引入所述细胞中。
152.根据实施方案151所述的方法，所述方法还包括从所述细胞分离或纯化所述免疫调节蛋白。
153.一种通过根据实施方案151或实施方案152所述的方法产生的免疫调节蛋白。
154.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案1-141和153中任一项所述的免疫调节蛋白。
155.一种变体BCMA-Fc融合蛋白，所述变体BCMA-Fc融合蛋白包含变体BCMA多肽、Fc区以及所述BCMA多肽与所述Fc区之间的接头，其中所述变体BCMA多肽包含未修饰的BCMA多肽的细胞外结构域(ECD)或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代对应于关于SEQ ID NO:710中所示的位置选自9、10、11、14、16、19、20、22、25、27、29、30、31、32、35、36、39、43、45、46、47和48的位置。
156.根据实施方案155所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述参考BCMA多肽是如下多肽，所述多肽由BCMA的细胞外结构域或其与APRIL、BAFF或BAFF/APRIL异三聚体结合的特异性结合部分组成。
157.根据实施方案155或实施方案156所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述参考BCMA多肽包含(i)SEQ ID NO:710中所示的氨基酸序列，(ii)具有与SEQ ID NO:710至少95％的序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)(i)或(ii)的包含所述CRD的部分。
158.根据实施方案155-157中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述参考BCMA缺少N末端甲硫氨酸。
159.根据实施方案155-158中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述参考BCMA多肽包含(i)SEQ ID NO:356中所示的氨基酸序列，(ii)具有与SEQ ID NO:356至少95％的序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)(i)或(ii)的包含所述CRD的部分。
160.根据实施方案155-159中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述参考BCMA多肽包含SEQ ID NO:356中所示的序列。
161.根据实施方案155-159中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述参考BCMA多肽由SEQ ID NO:356中所示的序列组成。
162.根据实施方案155-161中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代选自S9G、S9N、S9Y、Q10E、Q10P、N11D、N11S、F14Y、S16A、H19A、H19C、H19D、H19E、H19F、H19G、H19I、H19K、H19L、H19M、H19N、H19P、H19Q、H19R、H19S、H19T、H19V、H19W、H19Y、A20T、I22L、I22V、Q25E、Q25F、Q25G、Q25H、Q25I、Q25K、Q25L、Q25M、Q25S、Q25V、Q25Y、R27H、R27L、S29P、S30G、S30Y、N31D、N31G、N31H、N31K、N31L、N31M、N31P、N31S、N31V、N31Y、T32I、T32S、L35A、L35M、L35P、L35S、L35V、L35Y、T36A、T36G、T36N、T36M、T36S、T36V、R39L、R39Q、A43E、A43S、V45A、V45D、V45I、T46A、T46I、N47D、N47Y、S48G或其保守氨基酸取代。
163.根据实施方案155-162中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置19处的至少一个取代，任选地其中所述至少一个取代选自H19A、H19C、H19D、H19E、H19F、H19G、H19I、H19K、H19L、H19M、H19N、H19P、H19Q、H19R、H19S、H19T、H19V、H19W、H19Y。
164.根据实施方案155-163中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代H19L。
165.根据实施方案155-163中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代H19K。
166.根据实施方案155-163中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代H19R。
167.根据实施方案155-163中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括至少氨基酸取代H19Y。
168.根据实施方案155-167中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置25处的至少一个取代，任选地其中所述至少一个取代选自Q25E、Q25F、Q25G、Q25H、Q25I、Q25K、Q25L、Q25M、Q25S、Q25V、Q25Y。
169.根据实施方案155-168中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置31处的至少一个取代，任选地其中所述至少一个取代选自N31D、N31G、N31H、N31K、N31L、N31M、N31P、N31S、N31V、N31Y。
170.根据实施方案155-169中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置35处的至少一个取代，任选地其中所述至少一个取代选自L35A、L35M、L35P、L35S、L35V、L35Y。
171.根据实施方案155-170中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置36处的至少一个取代，任选地其中所述至少一个取代选自T36A、T36G、T36N、T36M、T36S、T36V。
172.根据实施方案155-171中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代是H19Y/S30G；H19Y/V45A；F14Y/H19Y；H19Y/V45D；H19Y/A43E；H19Y/T36A；H19Y/I22V；N11D/H19Y；H19Y/T36M；N11S/H19Y；H19Y/L35P/T46A；H19Y/N47D；S9D/H19Y；H19Y/S30G/V45D；H19Y/R39Q；H19Y/L35P；S9D/H19Y/R27H；Q10P/H19Y/Q25H；H19Y/R39L/N47D；N11D/H19Y/N47D；H19Y/T32S；N11S/H19Y/S29P；H19Y/R39Q/N47D；S16A/H19Y/R39Q；S9N/H19Y/N31K/T46I；H19Y/R27L/N31Y/T32S/T36A；N11S/H19Y/T46A；H19Y/T32I；S9G/H19Y/T36S/A43S；H19Y/S48G；S9N/H19Y/I22V/N31D；S9N/H19Y/Q25K/N31D；S9G/H19Y/T32S；H19Y/T36A/N47Y；H19Y/V45A/T46I；H19Y/Q25K/N31D；H19Y/Q25H/R39Q/V45D；H19Y/T32S/N47D；Q10E/H19Y/A20T/T36S；H19Y/T32S/V45I；H19F/Q25E/N31L/L35Y/T36S；H19F/Q25F/N31S/T36S；H19I/Q25F/N31S/T36V；H19F/Q25V/N31M/T36S；H19Y/Q25Y/N31L/L35Y/T36S；H19F/Q25I/N31M/L35A/T36S；H19I/Q25L/N31L/L35Y/T36S；H19F/Q25L/N31G/L35P/T36A；H19Y/I22L/N31G；H19F/I22V/Q25M/N31P/T36M；H19Y/N31L/L35Y/T36S；H19L/S30G/N31H/L35A；H19L/Q25S/N31V/L35S/T36V；H19L/Q25S/S30Y/N31G/L35M/T36V；H19F/Q25F/N31L/L35Y/T36S；H19F/Q25F/N31S/T36G；H19F/I22V/Q25S/N31V/L35S/T36V；H19F/Q25G/N31S/L35V/T36N；H19L/Q25H/N31D/L35S；或H19F/Q25F/N31S/L35Y/T36S。
173.根据实施方案155-163、167和172中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括S16A/H19Y/R39Q。
174.根据实施方案155-173中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中与所述参考BCMA多肽相比，所述变体BCMA多肽具有增加的与APRIL和BAFF中的一种或两种的结合亲和力。
175.根据实施方案155-174中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述变体BCMA多肽具有增加的与APRIL的结合亲和力。
176.根据实施方案155-174中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述变体BCMA多肽具有增加的与BAFF的结合亲和力。
177.根据实施方案155-174中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述变体BCMA多肽具有增加的与APRIL和BAFF的结合亲和力。
178.根据实施方案174-177中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述增加的对BAFF或APRIL的结合亲和力是独立地增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。
179.根据实施方案155-178中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述变体BCMA多肽包含SEQ ID NO:357-435中任一项中所示的序列。
180.根据实施方案155-178中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:357-435中任一项中所示的序列组成或基本上由其组成。
181.根据实施方案155-178中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:381中所示的序列组成或基本上由其组成。
182.根据实施方案155-178中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:411中所示的序列组成或基本上由其组成。
183.根据实施方案155-178中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:405中所示的序列组成或基本上由其组成。
184.根据实施方案155-178中任一项所述的变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述变体BCMA多肽由SEQ ID NO:406中所示的序列组成或基本上由其组成。
185.根据实施方案155-184中任一项所述的Fc融合蛋白，其中所述接头包括肽接头并且所述肽接头选自GSGGS(SEQ ID NO:592)、GGGGS(G4S；SEQ ID NO:593)、GSGGGGS(SEQID NO:590)、GGGGSGGGGS(2xGGGGS；SEQ ID NO:594)、GGGGSGGGGSGGGGS(3xGGGGS；SEQ IDNO:595)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(4xGGGGS；SEQ ID NO:600)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(5XGGGGS；SEQ ID NO:671)、GGGGSSA(SEQ ID NO:596)或其组合。
186.根据实施方案155-185中任一项所述的Fc融合蛋白，所述Fc融合蛋白是二聚体。
187.根据实施方案155-186中任一项所述的Fc融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区是同二聚Fc区。
188.根据实施方案155-187中任一项所述的Fc融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc是IgG1 Fc结构域，或者是展现降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能的变体Fc，任选地如与野生型IgG1 Fc结构域相比。
189.根据实施方案155-188中任一项所述的Fc融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc是IgG1 Fc结构域，并且所述Fc包含SEQ ID NO:597中所示的氨基酸序列。
190.根据实施方案155-188中任一项所述的Fc融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc是变体IgG1 Fc结构域，其包含按照EU编号选自L234A、L234V、L235A、L235E、G237A、S267K、R292C、N297G和V302C的一个或多个氨基酸取代。
191.根据实施方案190所述的Fc融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区含有按照EU编号的氨基酸取代L234A、L235E和G237A或者按照EU编号的氨基酸取代R292C、N297G和V302C。
192.根据实施方案155-191中任一项所述的Fc融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc示于SEQ ID NO:586中。
193.根据实施方案155-192中任一项所述的Fc融合蛋白，其中所述Fc是包含SEQID NO:589中所示的氨基酸序列的变体Fc。
194.根据实施方案155-193中任一项所述的Fc融合蛋白，所述Fc融合蛋白是二聚体。
195.根据实施方案155-194中任一项所述的Fc融合蛋白，所述Fc融合蛋白是同二聚体。
196.根据实施方案155-195中任一项所述的Fc融合蛋白，其中所述Fc融合蛋白中和APRIL和BAFF。
197.根据实施方案155-196中任一项所述的Fc融合蛋白，其中：
中和APRIL的IC50是小于100pM、小于50pM、小于40pM、小于30pM、小于20pM、小于10pM、小于5pM或小于1pM，或者是前述任何项之间的任何值；和/或
中和BAFF的IC50是小于400pM、小于300pM、小于200pM、小于100pM、小于75pM、小于50pM、小于25pm或小于10pM，或者是前述任何项之间的任何值。
198.根据实施方案155-196中任一项所述的Fc融合蛋白，其中：
所述Fc融合蛋白阻断APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体与BCMA或TACI的结合；和/或
所述Fc融合蛋白在施用至受试者之后降低血液中循环APRIL、BAFF或APRIL/BAFF的水平。
199.根据实施方案155-198中任一项所述的Fc融合蛋白，其中所述免疫调节蛋白降低或抑制B细胞成熟、分化和/或增殖。
200.一种或多种核酸分子，所述核酸分子编码根据实施方案155-199中任一项所述的Fc融合蛋白。
201.根据实施方案200所述的核酸分子，所述核酸分子是合成核酸。
202.根据实施方案200或实施方案201所述的核酸分子，所述核酸分子是cDNA。
203.一种载体，所述载体包含根据实施方案200-202中任一项所述的核酸分子。
204.根据实施方案203所述的载体，所述载体是表达载体。
205.根据实施方案203或实施方案204所述的载体，其中所述载体是哺乳动物表达载体或病毒载体。
206.一种细胞，所述细胞包含根据实施方案200-202中任一项所述的核酸或根据实施方案203-205中任一项所述的载体。
207.根据实施方案206所述的细胞，所述细胞是哺乳动物细胞。
208.根据实施方案206或实施方案207所述的细胞，所述细胞是人细胞。
209.一种产生Fc融合蛋白的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达所述蛋白质的条件下将根据实施方案200-202中任一项所述的核酸分子或根据实施方案203-205中任一项所述的载体引入所述细胞中。
210.根据实施方案209所述的方法，所述方法还包括从所述细胞分离或纯化所述Fc融合蛋白。
211.一种通过根据实施方案209或实施方案210所述的方法产生的Fc融合蛋白。
212.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案155-199和211中任一项所述的Fc融合蛋白。
213.根据实施方案154或实施方案212所述的药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂。
214.根据实施方案154、212和213中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物是无菌的。
215.一种制品，所述制品包含在小瓶或容器中的根据实施方案154和212-214中任一项所述的药物组合物。
216.根据实施方案215所述的制品，其中所述小瓶或容器是密封的。
217.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据实施方案154和212-214中任一项所述的药物组合物和使用说明书。
218.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据实施方案215或实施方案216所述的制品和使用说明书。
219.一种降低受试者的免疫应答的方法，所述方法包括将根据实施方案1-141或153中任一项所述的免疫调节蛋白施用至有需要的受试者。
220.一种降低受试者的免疫应答的方法，所述方法包括将根据实施方案155-199和211中任一项所述的Fc融合蛋白施用至有需要的受试者。
221.一种降低受试者的免疫应答的方法，所述方法包括将根据实施方案154和211-214中任一项所述的药物组合物施用至有需要的受试者。
222.根据实施方案219-221中任一项所述的方法，其中B细胞免疫应答在所述受试者中降低，借此使B细胞成熟、分化和/或增殖降低或抑制。
223.根据实施方案219-222中任一项所述的方法，其中APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体的循环水平在所述受试者中降低。
224.一种降低受试者的APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体的循环水平的方法，所述方法包括将根据实施方案155和211-214中任一项所述的药物组合物施用至所述受试者。
225.根据实施方案128或实施方案221所述的方法，其中T细胞免疫应答在所述受试者中降低，借此使T细胞共刺激降低或抑制。
226.根据实施方案219-225中任一项所述的方法，其中降低所述免疫应答治疗所述受试者的疾病或病症。
227.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括将根据实施方案1-141或153中任一项所述的免疫调节蛋白施用至有需要的受试者。
228.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括将根据权利要求155-199中任一项所述的Fc融合蛋白施用至有需要的受试者。
229.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括将根据实施方案154和211-214中任一项所述的药物组合物施用至有需要的受试者。
230.根据实施方案224-227中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是自身免疫性疾病、B细胞癌症、抗体介导的病状、肾病、移植物排斥、移植物抗宿主病或病毒感染。
231.根据实施方案230所述的方法，其中所述疾病或病症是选自以下的自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮(SLE)；舍格伦综合征、硬皮病、多发性硬化、糖尿病、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、IgA肾病、视神经炎、淀粉样变性、抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性多内分泌腺综合征II型(APS II)、自身免疫性甲状腺疾病(AITD)、格雷夫斯病、自身免疫性肾上腺炎和寻常型天疱疮。
232.根据实施方案230所述的方法，其中所述疾病或病症是B细胞癌症并且所述癌症是骨髓瘤。
X.实施例
以下实施例仅出于说明性目的而被包括，并且不意图限制本发明的范围。
实施例1.作为T细胞抑制分子(TIM)的变体CTLA-4细胞外结构域多肽的生成和评 估
此实施例描述示例性CTLA-4多肽T细胞抑制分子(TIM)，其用作具有B细胞抑制分子(BIM)的所提供的多结构域免疫调节蛋白的部分，包括用于工程化和鉴定与T细胞刺激性受体的配体结合(例如与野生型相比增加)的亲和力修饰的(变体)CTLA-4多肽的方法。
生成人CTLA-4IgSF结构域的突变体DNA构建体用于在作为酵母展示文库的酵母的表面上翻译和表达。
构建含有随机氨基酸取代的文库以基于如下SEQ ID NO:1中所示的野生型人CTLA-4序列鉴定含有免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域的CTLA-4的细胞外结构域(ECD)的变体(CTLA-4vIgD)：
KAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD(SEQ ID NO:1)
将编码野生型CTLA-4ECD的DNA克隆于修饰的酵母展示载体pBYDS03(LifeTechnologies，美国)的BamHI与KpnI位点之间。经由易错PCR利用补充有MnCl2的GenemorphII试剂盒(Agilent，美国)且使用在BamHI和KpnI克隆位点外与pBYDS03克隆载体重叠40bp且包括BamHI和KpnI克隆位点的ECD特异性寡核苷酸来引入突变。将诱变的DNA PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳来纯化，然后使用100ng诱变的PCR产物和OneTaq 2x PCR主混合物(NewEngland Biolabs，美国)进一步扩增。将来自第二PCR的产物经由琼脂糖凝胶电泳和PCR-凝胶纯化(Qiagen，德国)进行纯化，并且重悬于无菌去离子水中。对于每一后续酵母电穿孔，生成总计12μg的PCR产物。
为了准备文库插入，用BamHI和KpnI限制性酶(New England Biolabs，美国)消化pBYDS03载体，并且将大的载体片段进行凝胶纯化并溶解在无菌去离子水中。通过以下方式生成用于下一步骤的电穿孔就绪的DNA：将12μg的文库DNA插入物与4μg线性化载体在总体积50μL的无菌去离子水中混合。
使用电穿孔将CTLA-4DNA文库引入酵母中。简言之，准备酵母菌株BJ5464(ATCC.org；ATCC编号208288)的电穿孔感受态细胞并用基本上如所述来自上文步骤的电穿孔就绪的DNA在Gene Pulser II(Biorad，美国)上进行电穿孔(Colby,D.W.等人2004Methods Enzymology 388,348-358)。唯一不同的是，使转化的细胞在非诱导型最小选择性SCD-Leu培养基中生长，以适应由修饰的质粒pBYDS03携带的LEU2可选标记。生成一升SCD-Leu培养基，其具有14.7克柠檬酸钠、4.29克柠檬酸一水合物、20克右旋糖、6.7克酵母氮源和1.6克不含亮氨酸的酵母合成缺失培养基补充剂。在使用前使用0.22μm真空过滤器装置将培养基过滤灭菌。
文库大小是通过以下方式来确定：将刚回收的细胞的连续稀释物平铺于SCD-Leu琼脂板上，之后从来自平铺的单一集落数推知文库大小，所述平铺生成至少50个集落/板。通常，基于该稀释物测定，文库大小范围为1.0x108至1x109个转化体。使电穿孔的培养物的剩余部分在SCD-Leu中生长至饱和，并将来自该培养的细胞再次传代培养(例如，1/100)至新鲜SCD-Leu中以使未转化细胞的比例降至最低，并生长过夜。为了维持文库多样性，使用所含细胞比所计算文库大小多至少10倍的接种物进行此传代培养步骤。使来自第二饱和培养的细胞重悬于含有无菌25％(重量/体积)甘油的新鲜培养基中至1x1010/mL的密度，并在-80℃下冷冻和储存(冷冻的文库原液)。
针对ICOSL和/或CD86选择表达CTLA-4IgD的亲和力修饰的变体的酵母。将数量等于所估计文库大小的至少10倍的细胞从单独文库原液解冻，在非诱导性SCD-Leu培养基中悬浮至1.0x106个细胞/mL，并生长过夜。第二天，将等于文库大小10倍数量的细胞以2000RPM离心2分钟，并在诱导型SCDG-Leu培养基中重悬至5.0x106个细胞/mL。一升SCDG-Leu诱导培养基由溶于水中并经由0.22μm膜过滤器装置灭菌的5.4克Na2HPO4、8.56克NaH2PO4·H2O、20克半乳糖、2.0克右旋糖、6.7克酵母氮源和1.6克不含亮氨酸的酵母合成缺失培养基补充剂组成。使培养物在诱导培养基中在室温下生长1天，以诱导文库蛋白质在酵母细胞表面上表达。
使用交替加载ICOSL或CD86的磁珠使诱导的酵母文库经历4个循环的珠分选，以减少非结合物并富集具有结合ICOSL或CD86的能力的变体CTLA-4分子。在每个循环的选择后，将经由与磁珠结合而保留的酵母通过在SCD培养基中生长来扩增，之后在SCDG培养基中过夜诱导。在初步选择后进行两轮荧光激活的细胞分选(FACS)(第1轮中使用使用ICOSL-Fc，第2轮中使用CD86-Fc)，以富集展示改进的结合物的酵母细胞的级分。磁珠富集和通过流式细胞术选择基本上如以下文献中所述来进行：Miller等人,Current Protocols inCytometry 4.7.1-4.7.30,2008年7月。
该选择过程利用以下试剂和仪器：人rICOSL.Fc(即，重组ICOSL-Fc融合蛋白)和人rCD86.Fc靶配体蛋白购自R&D Systems(美国)。磁性蛋白A珠是从New England Biolabs(美国)获得。对于双色流式细胞术分选，使用Bio-Rad S3e分选仪。以用Alexafluor 488(LifeTechnologies，美国)标记的抗血凝素抗体监测CTLA-4展示水平。用PE缀合的人Ig特异性山羊Fab(Jackson ImmunoResearch，美国)检测Fc融合蛋白rICOSL.Fc或rCD86.Fc的配体结合。使用前向散射(FSC)/侧向散射(SSC)参数屏蔽双联体酵母，并且分选门是基于在FL2中检测到的较高配体结合，其在FL1中具有更有限的标签表达结合。
针对较高特异性结合亲和力测定来自流式细胞术分选的酵母输出。对分选输出酵母进行扩增和重诱导，以表达其编码的特定IgSF亲和力修饰的结构域变体。然后通过流式细胞术将该群体与亲代野生型酵母株或其他选择的输出(如珠输出酵母群体)进行比较。
在第二轮FACS后，将输出连续稀释并铺板至SCD-琼脂上，使得可以分离单一克隆。将288个菌落挑取至含有150μL补充有卡那霉素、青霉素和链霉素的SCD培养基的圆底微量滴定板中。将板在30℃振荡下孵育。在生长4h后，将80μL转移至新板的孔中，使细胞旋转沉降，去除SCD，将200μL的补充有抗生素的SCDG诱导培养基添加至每孔中，之后在室温和振荡下过夜孵育。使用FACS分析独立地评估每个克隆与rICOSL-Fc、rCD86-Fc和作为表达对照的抗HA Mab的结合。在每个板上运行带有野生型CTLA-4的酵母的对照孔。选择16个克隆再格式化至Fc融合构建体中，并如下所述进行测序。
16个酵母克隆的序列分析揭示突变的单一显性组合(L12P/A26T/L63P/L98Q/Y105L；SEQ ID NO:3)。为了生成另外的克隆多样性并确定增强结合所需的最小突变，将该克隆中的突变用野生型序列部分改组。简言之，设计三对PCR引物，其将ECD编码区分为三等份。PCR引物维持与相邻PCR产物的20bp重叠序列以有利于随后的Gibson Assembly克隆。从野生型(A1、B1、C1)和突变体模板(A2、B2、C2)二者生成三种PCR产物。将3种PCR产物的组合(例如A2,B1,C1；A2,B2,C1等)与修饰的Fc融合物载体混合以使用Gibson Assembly主混合物(NewEngland Biolabs，美国)进行体外重组，随后将其用于热激转化至大肠杆菌菌株5-α中。用野生型序列进行的此改组产生SEQ ID NO:4-10。
经由易错PCR使用来自Gen1选择的克隆作为模板生成随机突变的第二文库。此文库描述为Gen2，是使用与先前所述相同的过程来构建，但是模板DNA由Gen1克隆库代替野生型CTLA-4ECD DNA构成。经由反复多轮FACS分选(在rICOSL-Fc与rCD86-Fc之间交替)筛选所述酵母文库，以生成多个克隆库。如前，经由FACS分析酵母库的结合。基于根据FACS与rICOSL-Fc、rCD86-Fc、rCD80-Fc的结合，选择几个库用于PCR克隆至Fc载体中。随后如针对Gen1所述进行序列分析和蛋白质产生。
将选择输出再格式化为含有与Fc分子融合的CTLA-4的亲和力修饰的(变体)ECD(变体ECD-Fc融合分子)的免疫调节蛋白。为了生成作为含有具有至少一个亲和力修饰的结构域的CTLA-4的ECD的Fc融合蛋白(例如，变体CTLA-4ECD-Fc)的重组免疫调节蛋白，生成编码DNA以编码如下蛋白质：变体(突变体)ECD，之后是7个氨基酸的接头(GSGGGGS；SEQ IDNO:590)，之后是按照EU编号含有突变L234A、L235E和G237A的人IgG1 Fc。由于所述构建体不包括可以与半胱氨酸形成共价键的任何抗体轻链，人IgG1 Fc还含有按照EU编号在位置220处的半胱氨酸残基替代为丝氨酸残基(C220S)(关于SEQ ID NO:586中所示的野生型或未修饰的Fc对应于位置5(C5S))。Fc区还缺少在野生型人IgG1恒定区基因中通常编码的位置447处的C末端赖氨酸(命名为K447del)(对应于SEQ ID NO:586中所示的野生型或未经修饰的Fc的位置232)。融合构建体中的无效应子(惰性)IgG1 Fc示于SEQ ID O:589中：
SEQ ID NO:589
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
使来自最终流式细胞术CTLA-4分选的输出细胞在SCD-Leu培养基中生长至最终密度。使用酵母质粒DNA分离试剂盒(Zymoresearch，美国)分离来自每一输出的质粒DNA。对于Fc融合物，使用适于克隆至所选Fc融合载体中的具有添加的限制性位点的PCR引物，从质粒DNA制剂对突变体靶ECD的编码DNA进行分批扩增。在限制性消化后，将PCR产物连接至适当的Fc融合物载体中，之后如供应商所指导将其热激转化至菌株XL1-Blue大肠杆菌(Agilent，美国)或5-α(New England Biolabs)中。可替代地，用在任一端上含有与修饰的Fc融合物载体的40bp重叠区的引物对所述输出进行PCR扩增，以使用GibsonAssembly主混合物(New England Biolabs，美国)进行体外重组，随后将其用于热激转化至大肠杆菌菌株/>5-α中。示例性Fc融合物载体是pFUSE-hIgG1-Fc2(InvivoGen，美国)。
将转化反应物的稀释物在含有100μg/mL羧苄西林(Teknova，美国)的LB琼脂上铺板以分离单一菌落用于选择。然后使来自每种转化的多达96个菌落在96孔板中在37℃下在LB肉汤(目录号L8112，Teknova，美国)中过夜生长至饱和，并提交来自每孔的小等分试样用于ECD插入物的DNA测序，以鉴定所有克隆中的一个或多个突变。使用服务提供商(Genewiz；南普莱恩菲尔德，新泽西州)提供的方案来进行用于DNA测序的样品制备。在移取用于DNA测序的样品后，将甘油添加至剩余培养物以实现25％的最终甘油含量，并将板储存在-20℃下以供将来作为主板使用(参见下文)。可替代地，通过使用一次性96孔复制器(VWR，美国)从生长的液体培养物影印铺板至固体琼脂板上来生成用于DNA测序的样品。将这些板过夜孵育以生成生长斑，并将所述板提交至Genewiz用于根据其规格进行DNA测序。
在分析Genewiz生成的DNA测序数据后，从主板回收目的克隆，并在5mL的含有100μg/mL羧苄西林(Teknova，美国)的液体LB肉汤中使其单独生长至饱和，然后使用2mL的每种培养物用于使用标准试剂盒如PureYield质粒小规模制备系统(Promega，美国)来制备每种克隆的大约10μg的小规模制备质粒DNA。目的克隆的鉴定通常涉及以下步骤。首先，从Genewiz网站下载DNA序列数据文件。然后手动组织管理所有序列，使得其在ECD编码区的起点开始。使用Ugene软件(http://ugene.net)处理Genewiz序列以生成比对。
然后使用以下标准鉴定所关注克隆：1)相同克隆在比对中出现至少两次，以及2)突变在比对中出现至少两次，并且优选地出现在不同克隆中。通过分选过程来富集最有可能由于改进的结合而符合这些标准中的至少一项的克隆。
通过高通量表达和纯化来生成含有CTLA-4的变体ECD的Fc融合蛋白。重组变体Fc融合蛋白是使用Expi293表达系统(Invitrogen，美国)从悬浮适应的人胚肾(HEK)293细胞产生。将4μg的每种质粒DNA添加至200μL Opti-MEM(Invitrogen，美国)中，同时将10.8μLExpiFectamine单独添加至另外200μL Opti-MEM中。在5分钟后，将200μL质粒DNA与200μLExpiFectamine混合，并且进一步再孵育20分钟，之后将此混合物添加至细胞。将一千万个Expi293细胞分配至无菌的10mL锥形底24深孔生长板(Thomson Instrument Company，美国)的单独孔中的4mL体积的Expi293培养基(Invitrogen，美国)中。将培养板在120RPM下在设定为95％湿度和8％ CO2的哺乳动物细胞培养箱中摇动5天。孵育5天后，使细胞沉淀并去除培养物上清液。
使用高通量96孔蛋白A纯化试剂盒，利用制造商的方案(目录号45202，LifeTechnologies，美国)从上清液中纯化蛋白质。使用Zeba 96孔旋转脱盐板(目录号89807，Life Technologies，美国)，使用制造商的方案，将所得洗脱部分缓冲液交换至PBS中。使用Nanodrop仪器(Thermo Fisher Scientific，美国)测量的280nm吸光度定量纯化的蛋白质，并通过在变性和还原条件下在NUPAGE预制聚丙烯酰胺凝胶(Life Technologies，美国)上加载5μg蛋白质以及随后的凝胶电泳来评估蛋白质纯度。使用标准考马斯染色使蛋白质在凝胶中可视化。
通过选择鉴定的选择的CTLA-4vIgD中的氨基酸取代示于表3中。如下所述测试格式化为Fc融合蛋白的选择的CTLA-4vIgD的结合和功能活性。
A.功能表征
进行结合研究来评估CTLA-4vIgD-Fc融合蛋白对结合配偶体CD80、CD86和ICOSL的特异性和亲和力。在人原代T细胞体外测定中针对生物活性进一步表征Fc融合变体蛋白。
1.结合
为了产生表达结合配偶体的细胞，在pcDNA3.1表达载体(Life Technologies)中设计人CD80、CD86和ICOSL中每一种的全长哺乳动物表面表达构建体，并且所述构建体来源于Genscript(美国)。使用上述Expi293F瞬时转染系统(Life Technologies，美国)进行结合研究。确定实验所需的细胞数，并使用制造商建议的方案进行适当的30mL规模的转染。对于每种反结构或模拟30mL转染，将7500万个Expi293F细胞与30μg表达构建体DNA和1.5mL稀释的ExpiFectamine 293试剂一起孵育48小时，此时收获细胞用于染色。
对于流式细胞术分析，将适当瞬时转染或阴性对照的200,000个细胞铺板于96孔圆底板中。使细胞旋转沉降并悬浮于染色缓冲液(PBS(磷酸盐缓冲盐水)、1％BSA(牛血清白蛋白)和0.1％叠氮化钠)中20分钟，以阻断非特异性结合。之后，再次将细胞离心并悬浮于含有100nM至100pM CTLA-4IgSF变体Fc融合蛋白的50μL染色缓冲液中。进行初级染色45分钟，之后在染色缓冲液中将细胞洗涤两次。对于CD86转染，用以1:150稀释于50μL染色缓冲液中的PE缀合的抗人Fc(Jackson ImmunoResearch，美国)检测结合的蛋白质并孵育30分钟。对于CD80和ICOSL转染，用以1:130稀释于50μL染色缓冲液中的抗CTLA-4抗体(Biolegend，美国)捕获结合的蛋白质。在30分钟孵育后，将细胞洗涤两次并用以1:150稀释于50μL中的PE缀合的抗小鼠Fc(Jackson ImmunoResearch，美国)进行检测，用于另外的30分钟孵育。将细胞洗涤两次以去除未结合的缀合抗体，在2％甲醛/PBS中固定，并且在FACScan(Becton Dickinson，美国)或Hypercyt流式细胞仪(Intellicyte，美国)上进行分析。
用Cell Quest Pro软件(Becton Dickinson，美国)或Forcyte软件(Intellicyt，美国)计算每种转染子和阴性亲代系的平均荧光强度(MFI)。
2.抗CD3共刺激测定中的细胞因子产生
在人混合淋巴细胞反应(MLR)中测试可溶CTLA-4-Fc生物活性。通过以下方式生成人原代树突细胞(DC)：将从PBMC(BenTech Bio，美国)分离的单核细胞在体外与50ng/mLrIL-4(R&D Systems，美国)和80ng/mL rGM-CSF(R&D Systems，美国)一起在Ex-Vivo 15培养基(Lonza，瑞士)中培养7天。在第3天和第5天，去除一半培养基并用含有50ng/mL rIL-4和80ng/mL rGM-CSF的新鲜培养基替代。为了完全诱导DC成熟，在第6天将脂多糖(LPS)(InvivoGen Corp.，美国)以100ng/mL加入DC培养物中，并将细胞再孵育24小时。将大约10,000个成熟的DC和100,000个纯化的同种异体CD3+T细胞(BenTech Bio，美国)与CTLA-4变体Fc融合蛋白和对照在96孔圆底板中在200μl终体积的Ex-Vivo 15培养基中共培养。在第4天至第5天，使用人IFN-γDuoset ELISA试剂盒(R&D Systems，美国)分析培养物上清液中的IFN-γ分泌。在BioTek Cytation多模式微板阅读器(BioTek Corp.，美国)上测量光密度，并针对IFN-γ双组装试剂盒(R&D Systems，美国)中包括的递增的rIFN-γ标准物进行定量。
3.结果
上述针对变体和未修饰的CTLA-4多肽的结合和共刺激生物活性测定的结果总结于表E1-表E3中。对于每一实验，提供如与未修饰的CTLA-4多肽的相应结合和分泌相比(ΔWT)，结合CD80、CD86和ICOSL(MFI)和干扰素-γ分泌[pg/mL]的值以及相对比率。显著低于0.1的结合的相对比率被报告为0。另外，其中变体将干扰素γ的分泌抑制到不可检测的水平的变体的MLR数据也被报告为0。
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实施例2.CTLA-4共有变体的生成和测定
通过鉴定在实施例1中所述的筛选中鉴定的共有残基来设计CTLA-4ECD的另外的变体，所述共有残基一般与如下变体相关：所述变体在MLR测定中展现改进的CD80、CD86和/或ICOSL结合和/或显示对干扰素-γ分泌的抑制。选择的共有突变包括I18T、A26T、E33V、T53S、M55T、M56K、N58S、L63P、M87V、L98Q、M99L和Y105L。使用共有突变体通过关于SEQ IDNO:1中所示的野生型序列进行定点诱变来生成变体CTLA-4ECD，然后将其格式化为如实施例1中所述的Fc融合蛋白。如下所述测试变体CTLA-4ECD-Fc融合物的结合和生物活性。
A.结合和生物活性
1.与细胞表达的反结构的结合
为了产生表达同源结合配偶体的细胞，在pcDNA3.1表达载体(LifeTechnologies)中设计人CD80、CD86和ICOSL中每一种的全长哺乳动物表面表达构建体，并且所述构建体来源于Genscript(美国)。使用上述Expi293F瞬时转染系统(LifeTechnologies，美国)进行结合研究。确定实验所需的细胞数，并使用制造商建议的方案进行适当的30mL规模的转染。对于每种反结构或模拟30mL转染，将7500万个Expi293F细胞与30μg表达构建体DNA和1.5mL稀释的ExpiFectamineTM293试剂一起孵育48小时，此时收获细胞用于染色。
在一些情况下，使用具有同源结合配偶体的稳定表达的细胞。通过慢病毒稳定转导中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，用于全长人CD80、CD86或ICOSL的表面表达。
对于流式细胞术分析，将给定瞬时转染、稳定细胞系或适当阴性对照的200,000个细胞铺板于96孔圆底板中。使细胞旋转沉降并悬浮于染色缓冲液(PBS(磷酸盐缓冲盐水)、1％ BSA(牛血清白蛋白)和0.1％叠氮化钠)中20分钟，以阻断非特异性结合。之后，将细胞再次离心并悬浮于含有100nM至100pM CTLA-4变体Fc融合蛋白或对照的50μL染色缓冲液中。进行初级染色45分钟，之后在染色缓冲液中将细胞洗涤两次。用以1:150稀释于50μL染色缓冲液中的PE缀合的抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，美国)检测结合的CTLA-4并孵育30分钟。可替代地，用以1:130稀释于50μL染色缓冲液中的抗CTLA-4抗体(Biolegend，美国)检测结合的CTLA-4持续30分钟，之后将细胞在染色缓冲液中洗涤两次。然后用以1:150稀释于50μL染色缓冲液中的PE缀合的抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，美国)检测抗CTLA-4抗体并孵育30分钟。
在最终孵育后，将细胞洗涤两次以去除未结合的缀合抗体，在2％甲醛/PBS中固定，并且在Hypercyt(Intellicyte，美国)或LSRII(Becton Dickinson，美国)流式细胞仪上进行分析。
用Cell Quest Pro软件(Becton Dickinson，美国)、FlowJo软件(FlowJo，美国)或Forcyte软件(Intellicyt，美国)计算每个样品的平均荧光强度(MFI)。
a.CD86阻断生物测定
针对阻断CD86-CD28介导的共刺激的能力来测定选择CTLA-4变体Fc融合蛋白，如通过CD86阻断生物测定来确定。通过以下方式生成人工抗原呈递细胞(APC)：用慢病毒转导K562细胞以表达细胞表面抗人CD3单链Fv(OKT3)和人CD86，从而产生K562/OKT3/CD86。通过以下方式生成效应细胞：用慢病毒转导表达IL-2-萤光素酶报告物的Jurkat细胞(Promega)以表达由人ICOS的细胞外结构域和人CD28的细胞内结构域构成的嵌合受体，从而产生Jurkat/IL-2/ICOS-CD28。将APC以2x104个细胞/孔铺板于33μL/孔的测定缓冲液(含有5％FBS的RPMI1640)中，且将CTLA-4-Fc或对照蛋白以300nM置于33μL/孔中。将APC和蛋白质在室温下孵育20分钟，之后将效应细胞以2x105个细胞/孔添加于33μL/孔中。将板转移至以5％ CO2加湿的37℃孵育室中持续5小时，然后取出并使其适应室温15分钟。将100μL/孔的细胞溶解和萤光素酶底物溶液(BioGloTM萤光素酶试剂，Promega)添加至每个板，并在定轨振荡器上孵育10分钟。通过使用Cytation 3成像读取仪(BioTek instruments)以1秒/孔积分时间测量发光来确定每个测试样品的相对发光值(RLU)。使用下式确定通过CD86阻断介导的抑制百分比：[(平均对照RLU-实验RLU)/(平均对照RLU)]x100。
B.结果
结果总结于下表E4中。对于每一实验，提供如与未修饰的CTLA-4多肽相应结合和CD86阻断相比(ΔWT)，结合CD80、CD86和ICOSL(MFI)和CD28共刺激的抑制百分比的值以及相对比率。如表所示，某些突变和突变组合与CTLA-4ECD与ICOSL的结合的显著增加相关，与对CD80或CD86的结合的变化无关。在一些情形中，还观察到与CD80或CD86中的一种或两种的结合的增加。
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实施例3.选择CTLA-4变体的生成和测定
设计另一组具有来自在实施例1中所述筛选中鉴定的变体CTLA-4(具体而言含有突变L12F/R16H/G29W/M56T/L98Q/Y105L的SEQ ID NO:113中所示的变体)的突变的CTLA-4ECD变体，其与增强的与CD80、CD86和ICOSL的结合和对干扰素-γ的抑制相关。在一些情形中，包括S72G，因为已经将其鉴定为在大于35％的其他最优50命中(top 50hits)中出现的热点，所述命中被鉴定为具有抑制活性。对于一些生成的变体，策略包括去除一些突变(回复突变)，例如，以减少变体中的突变数量。通过关于SEQ ID NO:1中所示的野生型序列进行定点诱变来生成变体CTLA-4ECD，然后将其格式化为如实施例1中所述的Fc融合蛋白。如实施例2中所述测试变体CTLA-4ECD-Fc融合物的结合和生物活性。
表E5提供对于每一实验，如与未修饰的CTLA-4多肽的相应结合和CD86阻断相比(ΔWT)，结合CD80、CD86和ICOSL(MFI)和CD28共刺激的抑制百分比的值以及相对比率。
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实施例4.作为B细胞抑制分子(BIM)的亲和力修饰的TACI细胞外结构域多肽的鉴 定
此实施例描述示例性TACI多肽B细胞抑制分子(BIM)，其用作具有T细胞抑制分子(TIM)的所提供的多结构域免疫调节蛋白的部分，包括用于工程化和鉴定与B细胞刺激性受体的配体结合(例如与野生型相比增加)的亲和力修饰的(变体)TACI多肽的方法。
此实施例描述生成人TACI TNFR结构域(TD)的突变体DNA构建体，用于在作为酵母展示文库的酵母的表面上翻译和表达、将DNA文库引入酵母中以及选择表达含有至少一个TD的TACI的细胞外结构域(ECD)的亲和力修饰的变体(TACI vTD)的酵母细胞。
A.TACI TNFR结构域的突变体DNA构建体的生成
构建含有随机氨基酸取代的文库以鉴定TACI的细胞外结构域(ECD)的变体。基于含有TACI的ECD部分的野生型人TACI序列来生成构建体，所述ECD部分包括(1)如SEQ IDNO:516中所示的两个富半胱氨酸蛋白质结构域(CRD，CRD1/CRD2)(对应于如UniProt登录号O14836中所示的残基29-110)，或者(2)仅如SEQ ID NO:528中所示的单一CRD(CRD2)(对应于如UniProt登录号O14836中所示的残基68-110)。
TACI ECD(29-110)(SEQ ID NO:516):
VAMRSCPEEQYWDPLLGTCMSCKTICNHQSQRTCAAFCRSLSCRKEQGKFYDHLLRDCISCASICGQHPKQCAYFCENKLRS
TACI ECD(68-110)(SEQ ID NO:528):
SLSCRKEQGKFYDHLLRDCISCASICGQHPKQCAYFCENKLRS
将编码野生型TACI ECD结构域的DNA克隆于修饰的酵母表达载体PBYDS03(LifeTechnologies，美国)的BamHI与KpnI位点之间，其将TACI ECD置于酵母表面锚定结构域Sag1(酵母α-凝集素的C末端结构域)的N末端，其具有位于所述TACI ECD序列的N末端的框内HA融合标签以及位于所述TACI ECD序列的C末端的c-Myc融合标签。通过诱导性GAL1启动子来控制该载体中的表达。在验证正确的DNA序列后，使用野生型TACI ECD DNA构建体作为模板进行易错PCR，以横跨TACI ECD序列以每个基因拷贝2-5个突变的频率引入随机突变。与0.0至0.6mM的递增量的MnCl2组合使用Genemorph II试剂盒(Agilent，美国)来实现所需错误率。在易错PCR后，使用凝胶和PCR提纯试剂盒(Macherey-Nagel，德国)对诱变的DNA进行凝胶纯化。然后使用含有与pBYDS03同源的48bp重叠区的引物以OneTaq 2xPCR主混合物(New England Biolabs，美国)对该分离的DNA片段进行PCR扩增，用于准备大规模酵母电穿孔。将TACI ECD DNA插入物凝胶纯化并以500ng/μL的标称浓度重悬于无菌去离子水中。
为了制备用于转化的载体，将pBYDS03用BamHI-HF和KpnI-HF限制性酶(NewEngland Biolabs，美国)消化，并且将大的载体片段(预期大小：7671bp)凝胶纯化并以500ng/μL的标称浓度溶解于无菌去离子水中。为了准备酵母转化，对于每一电穿孔，将12μg的文库DNA插入物与4μg的线性化载体混合。
为了将随机DNA文库引入酵母中，紧接在电穿孔之前准备酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株BJ5464(ATCC.org；ATCC编号208288)，如Benatuil,L.等人,Protein Eng Des Sel.2010年4月；23(4):155-159中所详述。简言之，将BJ5464的过夜固定相培养物在100mL YPD培养基(10g/L酵母氮源、20g/L蛋白胨和20g/L D-(+)-葡萄糖)中传代至OD600 0.3，并且将其置于30℃和300rpm的平台振荡器中直至接种的培养物达到OD600 1.6。在约5小时后，通过离心收获细胞并在方案的剩余时间中保持在冰上，除非另外陈述。在收获后，将细胞用50mL冰冷水洗涤两次，并用电穿孔缓冲液(1M山梨醇、1mM CaCl2)洗涤一次。通过以下方式将收集的细胞条件化：重悬于20mL 0.1M LiAc/10mM DTT中并以225rpm在培养瓶中在30℃下振荡30分钟。立即将条件化的细胞离心，用电穿孔缓冲液洗涤两次，并且用约100-200μl的电穿孔缓冲液重悬以使体积达到1mL。此条件化的细胞悬浮液足以在400μl比色皿中进行两次电穿孔反应。
对于每次电穿孔，将12μg的文库DNA插入物和4μg的线性化pBYDS03载体(上文所述)与400μl的电感受态BJ5464混合，并转移至具有2mm电极间隙的预冷的BioRadGenePulser比色皿中。将混合物在冰上保持5分钟，之后使用BTX ECM399指数衰减波电穿孔系统在2500V下进行电穿孔。紧接在电穿孔之后，将细胞添加至8mL的1M山梨醇:1XYPD的1:1混合物，并在室温下无振荡静置10min，然后将其置于平台振荡器上在225rpm和30℃下持续1h。通过离心收集细胞并重悬于250mL SCD-Leu培养基中以适应由修饰的质粒pBYDS03携带的LEU2选择性标记。生成一升SCD-Leu培养基，其具有14.7gm柠檬酸钠、4.29gm柠檬酸一水合物、20gm右旋糖、6.7gm酵母氮源和1.6gm不含亮氨酸的酵母合成缺失培养基补充剂。在使用前使用0.22μm真空过滤器装置将培养基过滤灭菌。通过以下方式来估计文库大小：在SCD-Leu琼脂板上在10-5至10-10的稀释范围内对刚回收的细胞进行点样连续稀释，并且在三天后通过计数菌落进行外推。使电穿孔培养物的其余部分生长至饱和，并且将来自此培养的细胞再次1/100传代培养至相同培养基中并生长至饱和，以使未转化细胞的比例降至最低并允许从可能含有两个或更多个文库变体的细胞分离质粒。为了维持文库多样性，使用所含细胞比计算的文库大小多至少10倍的接种物进行此传代培养步骤。将来自第二饱和培养的细胞重悬于含有25％(重量/体积)甘油的新鲜培养基中至1x1010/mL的密度，并且在-80℃下冷冻和储存(冷冻的文库原液)。
将数量等于所估计文库大小的至少10倍的细胞从单独文库原液解冻，在非诱导性SCD-Leu培养基中悬浮至0.5x107个细胞/mL，并生长过夜。第二天，将等于文库大小10倍数量的细胞以2000RPM离心2分钟，并在诱导型SCDG-Leu培养基中重悬至0.5x107个细胞/mL。生成一升SCDG-Leu诱导培养基，其具有溶于水中并经由0.22μm膜过滤器装置灭菌的5.4gmNa2HPO4、8.56gm NaH2PO4·H20、20gm半乳糖、2.0gm右旋糖、6.7gm酵母氮源和1.6gm不含亮氨酸的酵母合成缺失培养基补充剂。使培养物在诱导培养基中在30℃下生长过夜，以诱导文库蛋白在酵母细胞表面上的表达。
在TACI ECD文库的过夜诱导后，通过磁性分离使用预加载BAFF-9xHis的DynabeadsTMHis标签磁珠分选等同于估计的文库多样性的10倍的细胞数量，以富集具有结合其外源重组反结构蛋白的能力的TACI ECD变体。将来自所述磁性分离的输出用于随后的FACS选择方案中，所述FACS选择方案涉及在BAFF-9xHis与APRIL-FLAG之间交替的四轮阳性选择，其中每轮的反结构浓度同时降低10倍(例如，FACS1：50nM APRIL-FLAG；FACS4：0.05nMBAFF-9xHis)。调整孵育体积以维持反结构超过酵母展示的TACI ECD变体分子的总数量至少10倍化学计量过量(假定每个细胞100,000个拷贝的蛋白质)，以避免可能减小文库区别的配体耗尽伪像。分别用PE缀合的抗6xHis标签抗体(Biolegend，美国)和PE缀合的抗FLAG标签抗体检测BAFF-9xHis和APRIL-FLAG与TACI ECD变体的结合。分离来自FACS3和FACS4输出的变体用于DNA测序和随后的克隆，用于重组Fc融合物表达。
对来自上述FACS4 BAFF-9xHis选择的酵母细胞输出进行第二循环的随机诱变。每次分选使用交替反结构的阳性选择方案与第一循环相同，但是转换反结构的顺序(例如，FACS1：50nM BAFF-9xHis；FACS4：0.05nM APRIL-FLAG)。从FACS3和FACS4酵母细胞输出选择另外的变体。
将来自如上所述的循环1和循环2选择二者的FACS3和FACS4输出的TACI ECD变体插入物亚克隆至Fc融合物载体中用于单独克隆的序列分析。
使来自选择的TACI ECD FACS分选的输出细胞库在SCD-Leu选择培养基中生长至最终密度，并且使用酵母质粒DNA分离试剂盒(Zymoresearch，美国)分离质粒DNA。对于Fc融合物的生成，用在任一端上含有与AfeI和BamHI消化的Fc融合载体(编码Fc区并与Fc区同框)的40bp同源区的引物对亲和力成熟的TACI ECD变体进行PCR扩增，以使用GibsonAssembly主混合物(New England Biolabs)进行体外重组。按照制造商的说明，将GibsonAssembly反应物添加至大肠杆菌菌株NEB5α(New England Biolabs，美国)中用于热激转化。
将转化反应物的稀释液铺板在含有100μg/mL羧苄西林(Teknova，美国)的LB琼脂上以分离单一菌落用于选择。通常，然后使来自每次转化的多达96个菌落在96孔板中在37℃下在含有100μg/mL羧苄西林的LB肉汤(Teknova目录号L8112)中过夜生长至饱和，并且将来自每个孔的小等分试样提交用于DNA测序，以鉴定所有克隆中的一个或多个突变。
在对目标克隆进行序列分析和鉴定后，使用MidiPlus试剂盒(Qiagen)制备质粒DNA。
重组变体Fc融合蛋白是使用Expi293表达系统(Invitrogen，美国)从悬浮适应的人胚肾(HEK)293细胞产生。收获上清液并将Fc蛋白捕获于Mab SelectSure(GE Healthcare目录号17543801)上。使用50mM乙酸盐(pH 3.6)从柱中洗脱蛋白质。合并MabSelect Sure洗脱液，并将pH调整至高于pH 5.0。然后在制备型SEC柱上精制此材料，以生成高度纯化的单体材料。将此材料缓冲液交换至10mM乙酸盐、9％蔗糖(pH 5.0)中。通过分析型SEC评估蛋白质纯度。将材料装入小瓶并储存在-80下。
通过所述选择鉴定并生成的选择的TACI vTD中的氨基酸取代示于表2中。如实施例6中所述测试选择的vTD的结合和功能活性。
实施例5.亲和力修饰的BCMA细胞外结构域多肽和免疫调节蛋白的鉴定
此实施例描述示例性BCMA多肽B细胞抑制分子(BIM)，其用作具有T细胞抑制分子(TIM)的所提供的多结构域免疫调节蛋白的部分，包括用于工程化和鉴定与B细胞刺激性受体的配体结合(例如与野生型相比增加)的亲和力修饰的(变体)BCMA多肽的方法。还将变体BCMA细胞外多肽格式化为作为不含T细胞抑制分子的BCMA Fc融合蛋白的免疫调节蛋白。
此实施例描述人BCMA TNFR结构域(TD)的突变体DNA构建体的生成，用于在作为酵母展示文库的酵母的表面上翻译和表达、将DNA文库引入酵母中以及选择表达含有至少一个TD的BCMA的细胞外结构域(ECD)的亲和力修饰的变体(BCMA vTD)的酵母细胞。然后将选择的BCMA vTD格式化为Fc融合蛋白。
A.BCMA结构域的突变体DNA构建体的生成
构建含有随机氨基酸取代的文库以鉴定BCMA的细胞外结构域(ECD)的变体。基于含有BCMA的ECD部分的野生型人BCMA序列生成构建体，所述ECD部分如SEQ ID NO:356中所示包括富半胱氨酸蛋白质结构域(CRD)(对应于如UniProt登录号Q02223中所示的残基2-54，命名为“BCMA ECD(2-54)”)，如下：
BCMA ECD(2-54)(SEQ ID NO:356):
LQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNA
将编码野生型BCMA ECD结构域的DNA克隆于修饰的酵母表达载体PBYDS03(LifeTechnologies，美国)的BamHI与KpnI位点之间，其将BCMA ECD置于酵母表面锚定结构域Sag1(酵母α-凝集素的C末端结构域)的N末端，其具有位于所述BCMA ECD序列的N末端的框内HA融合标签以及位于所述BCMA ECD序列的C末端的c-Myc融合标签。通过诱导性GAL1启动子来控制该载体中的表达。在验证正确的DNA序列后，使用野生型BCMA ECD DNA构建体作为模板进行易错PCR，以横跨BCMA ECD序列以每个基因拷贝2-5个突变的频率引入随机突变。与0.0至0.6mM的递增量的MnCl2组合使用Genemorph II试剂盒(Agilent，美国)来实现所需错误率。在易错PCR后，使用凝胶和PCR提纯试剂盒(Macherey-Nagel，德国)对诱变的DNA进行凝胶纯化。然后使用含有与pBYDS03同源的48bp重叠区的引物以OneTaq 2xPCR主混合物(New England Biolabs，美国)对该分离的DNA片段进行PCR扩增，用于准备大规模酵母电穿孔。将BCMA ECD DNA插入物凝胶纯化并以500ng/μL的标称浓度重悬于无菌去离子水中。
为了制备用于转化的载体，将pBYDS03用BamHI-HF和KpnI-HF限制性酶(NewEngland Biolabs，美国)消化，并且将大的载体片段(预期大小：7671bp)凝胶纯化并以500ng/μL的标称浓度溶解于无菌去离子水中。为了准备酵母转化，对于每一电穿孔，将12μg的文库DNA插入物与4μg的线性化载体混合。
为了将随机DNA文库引入酵母中，紧接在电穿孔之前准备酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株BJ5464(ATCC.org；ATCC编号208288)，如Benatuil,L.等人,Protein Eng Des Sel.2010年4月；23(4):155-159中所详述。简言之，将BJ5464的过夜固定相培养物在100mL YPD培养基(10g/L酵母氮源、20g/L蛋白胨和20g/L D-(+)-葡萄糖)中传代至OD600 0.3，并且将其置于30℃和300rpm的平台振荡器中直至接种的培养物达到OD600 1.6。在约5小时后，通过离心收获细胞并在方案的剩余时间中保持在冰上，除非另外陈述。在收获后，将细胞用50mL冰冷水洗涤两次，并用电穿孔缓冲液(1M山梨醇、1mM CaCl2)洗涤一次。通过以下方式将收集的细胞条件化：重悬于20mL 0.1M LiAc/10mM DTT中并以225rpm在培养瓶中在30℃下振荡30分钟。立即将条件化的细胞离心，用电穿孔缓冲液洗涤两次，并且用约100-200μl的电穿孔缓冲液重悬以使体积达到1mL。此条件化的细胞悬浮液足以在400μl比色皿中进行两次电穿孔反应。
对于每次电穿孔，将12μg的文库DNA插入物和4μg的线性化pBYDS03载体(上文所述)与400μl的电感受态BJ5464混合，并转移至具有2mm电极间隙的预冷的BioRadGenePulser比色皿中。将混合物在冰上保持5分钟，之后使用BTX ECM399指数衰减波电穿孔系统在2500V下进行电穿孔。紧接在电穿孔之后，将细胞添加至8mL的1M山梨醇:1X YPD的1:1混合物，并在室温下无振荡静置10min，然后将其置于平台振荡器上在225rpm和30℃下持续1h。通过离心收集细胞并重悬于250mL SCD-Leu培养基中以适应由修饰的质粒pBYDS03携带的LEU2选择性标记。生成一升SCD-Leu培养基，其具有14.7gm柠檬酸钠、4.29gm柠檬酸一水合物、20gm右旋糖、6.7gm酵母氮源和1.6gm不含亮氨酸的酵母合成缺失培养基补充剂。在使用前使用0.22μm真空过滤器装置将培养基过滤灭菌。通过以下方式来估计文库大小：在SCD-Leu琼脂板上在10-5至10-10的稀释范围内对刚回收的细胞进行点样连续稀释，并且在三天后通过计数菌落进行外推。使电穿孔培养物的其余部分生长至饱和，并且将来自此培养的细胞再次1/100传代培养至相同培养基中并生长至饱和，以使未转化细胞的比例降至最低并允许从可能含有两个或更多个文库变体的细胞分离质粒。为了维持文库多样性，使用所含细胞比计算的文库大小多至少10倍的接种物进行此传代培养步骤。将来自第二饱和培养的细胞重悬于含有25％(重量/体积)甘油的新鲜培养基中至1x1010/mL的密度，并且在-80℃下冷冻和储存(冷冻的文库原液)。
将数量等于所估计文库大小的至少10倍的细胞从单独文库原液解冻，在非诱导性SCD-Leu培养基中悬浮至0.5x107个细胞/mL，并生长过夜。第二天，将等于文库大小10倍数量的细胞以2000RPM离心2分钟，并在诱导型SCDG-Leu培养基中重悬至0.5x107个细胞/mL。生成一升SCDG-Leu诱导，其具有溶于水中并经由0.22μm膜过滤器装置灭菌的5.4gmNa2HPO4、8.56gm NaH2PO4·H20、20gm半乳糖、2.0gm右旋糖、6.7gm酵母氮源和1.6gm不含亮氨酸的酵母合成缺失培养基补充剂。使培养物在诱导培养基中在30℃下生长过夜，以诱导文库蛋白在酵母细胞表面上的表达。
在幼稚BCMA ECD文库的过夜诱导后，通过磁性分离使用预加载BAFF-9xHis的DynabeadsTMHis标签磁珠分选等同于估计的文库多样性的10倍的细胞数量，以富集具有结合其外源重组反结构蛋白的能力的BCMA ECD变体。将来自所述磁性分离的输出用于随后的FACS选择方案中，所述FACS选择方案涉及在BAFF-9xHis与APRIL-FLAG之间交替的四轮阳性选择，其中每轮的反结构浓度同时降低10倍(例如，FACS1：50nM APRIL-FLAG；FACS4：0.05nMBAFF-9xHis)。调整孵育体积以维持反结构超过酵母展示的BCMA ECD变体分子的总数量至少10倍化学计量过量(假定每个细胞100,000个拷贝的蛋白质)，以避免可能减小文库区别的配体耗尽伪像。分别用PE缀合的抗6xHis标签抗体(Biolegend，美国)和PE缀合的抗FLAG标签抗体检测BAFF-9xHis和APRIL-FLAG与BCMA ECD变体的结合。分离来自FACS3和FACS4输出的变体用于DNA测序和随后的克隆，用于重组Fc融合物表达。
对来自上述FACS4 BAFF-9xHis选择的酵母细胞输出进行第二循环的随机诱变。每次分选使用交替反结构的阳性选择方案与第一循环相同，但是转换反结构的顺序(例如，FACS1：50nM BAFF-9xHis；FACS4：0.05nM APRIL-FLAG)。从FACS3和FACS4酵母细胞输出选择另外的变体。
A.BCMA TNFR结构域的简并密码子突变体DNA构建体的生成
此实施例描述人BCMA TNFR结构域的靶向的简并密码子DNA文库的设计，用于在作为酵母展示文库的酵母的表面上翻译和表达、将DNA文库引入酵母中以及选择表达BCMATNFR的亲和力修饰的变体的酵母细胞。
基于在重组BCMA ECD变体Fc融合蛋白的体外表征后可得的晶体结构和功能数据来构建靶向的DNA寡核苷酸文库，所述重组BCMA ECD变体Fc融合蛋白是从循环1和循环2随机文库亲和力成熟选择分离的。首先，用于靶向诱变的BCMA位置限制于BCMA:BAFF界面接触(PDB ID：1XU2)，使用4.5埃的每残基加权平均距离截止值(PyMOL，)。第二，使用可得的IC50数据生成序列-功能热图以鉴定突变通常改进与BAFF和APRIL的结合的位置。为帮助目视检查，通过相对于全群体突变频率比较重组BCMA ECD变体Fc融合物中IC50在前10％内的所有突变的频率来计算位置特异性倾向得分(PSPS)。根据前10％内的突变频率(即，PSPS的分子项)进一步缩放PSPS，以帮助校正具有高突变负荷的位置的偏差。循环2输出的平均IC50对于BAFF比APRIL低一个数量级，因此，优先考虑取代通常改进BAFF结合的位置。
最后，分别根据蛋白A亲和色谱和尺寸排阻色谱评价对重组BCMA ECD变体Fc蛋白表达产量和同质性的考虑。综上所述，选择七个位置用于三种独立的简并密码子BCMA ECD文库的设计：H19、I22、Q25、S30、N31、L35和T36。使用混合碱基集“NNK”在表E6中指示的期望位置的每一个处进行位点饱和诱变，所述混合碱基集编码所有20种蛋白质氨基酸。使用SnapGene(GSL Biotech LLC，美国)设计每个简并密码子文库，并将其合成为来自Integrated DNA Technologies的单链全长DNA寡核苷酸
基本上如实施例4中所述制备靶向的NNK ssDNA 并将其引入酵母中。基本上如实施例4中所述使用所述文库来选择表达BCMA ECD的亲和力修饰的变体的酵母。基本上如实施例4中所述按照循环1随机文库选择方案来进行选择。在如所述的筛选中鉴定的另外的变体示于表E14中。
B.将选择输出再格式化为Fc融合物
将来自如上所述的选择的BCMA ECD变体输出亚克隆至Fc融合载体中用于单独克隆的序列分析。为了生成作为含有具有至少一个亲和力修饰的结构域的BCMA的ECD的Fc融合蛋白的重组免疫调节蛋白(例如，变体BCMA ECD-Fc)，生成编码DNA以编码如下蛋白质：变体BCMA结构域，之后是7个氨基酸的接头(GSGGGGS；SEQ ID NO:590)，之后是按照用于免疫球蛋白蛋白质的Eu索引编号系统含有突变L234A、L235E和G237A的人IgG1无效应子Fc序列。由于构建体不包括任何可与半胱氨酸形成共价键的抗体轻链，因此人IgG1 Fc还按照用于免疫球蛋白蛋白质的EU索引编号系统在位置220处含有半胱氨酸残基被丝氨酸残基的替代(C220S)(对应于关于SEQ ID NO:586中所示的野生型或未经修饰的Fc的位置5(C5S))。Fc区还缺少在野生型人IgG1恒定区基因中通常编码的位置447处的C末端赖氨酸(命名为K447del)(对应于SEQ ID NO:586中所示的野生型或未经修饰的Fc的位置232)。融合构建体中的无效应子(惰性)IgG1 Fc示于SEQ ID NO:589中：
使来自选择的BCMA ECD FACS分选的输出细胞库在SCD-Leu选择培养基中生长至最终密度，并且使用酵母质粒DNA分离试剂盒(Zymoresearch，美国)分离质粒DNA。对于Fc融合物的生成，用在任一端上含有与AfeI和BamHI消化的Fc融合载体(编码Fc区并与Fc区同框)的40bp同源区的引物对亲和力成熟的BCMA ECD变体进行PCR扩增，以使用GibsonAssembly主混合物(New England Biolabs)进行体外重组。按照制造商的说明，将GibsonAssembly反应物添加至大肠杆菌菌株NEB5α(New England Biolabs，美国)中用于热激转化。
将转化反应物的稀释液铺板在含有100μg/mL羧苄西林(Teknova，美国)的LB琼脂上以分离单一菌落用于选择。通常，然后使来自每次转化的多达96个菌落在96孔板中在37℃下在含有100μg/mL羧苄西林的LB肉汤(Teknova目录号L8112)中过夜生长至饱和，并且将来自每个孔的小等分试样提交用于DNA测序，以鉴定所有克隆中的一个或多个突变。
在对目标克隆进行序列分析和鉴定后，使用MidiPlus试剂盒(Qiagen)制备质粒DNA。
重组变体Fc融合蛋白是使用Expi293表达系统(Invitrogen，美国)从悬浮适应的人胚肾(HEK)293细胞产生。收获上清液并将Fc蛋白捕获于Mab SelectSure(GE Healthcare目录号17543801)上。使用50mM乙酸盐(pH 3.6)从柱中洗脱蛋白质。合并MabSelect Sure洗脱液，并将pH调整至高于pH 5.0。然后在制备型SEC柱上精制此材料，以生成高度纯化的单体材料。将此材料缓冲液交换至10mM乙酸盐、9％蔗糖(pH 5.0)中。通过分析型SEC评估蛋白质纯度。将材料装入小瓶并在-80下储存。
通过选择鉴定的选择的BCMA vTD中的氨基酸取代示于表1中。如实施例6中所述来测试格式化为Fc融合蛋白的选择的BCMA vTD的结合和功能活性。
实施例6.Fc融合蛋白的活性的评估。
此实施例描述使用基于细胞系的体外生物测定对格式化为Fc融合物的含有BCMA结构域的分子(如可溶野生型(WT)或变体BCMA vTD)的活性的表征。
具有激活的B细胞的核因子κ轻链增强子(NF-κB)基于萤光素酶的报告物的Jurkat细胞是购得的(BPS Bioscience)。用慢病毒转导Jurkat/NK-κB细胞以产生小鼠TACI的稳定细胞表面表达(Jurkat/NF-κB/TACI)。表达小鼠TACI的细胞对人和小鼠APRIL或BAFF二者都有反应。在重组人或小鼠APRIL或BAFF与TACI结合后，Jurkat细胞中的内源NK-κB转录因子与控制萤火虫萤光素酶基因转录的DNA应答元件结合。通过添加含有萤光素的底物对萤光素酶产生进行定量，所述底物在氧化时发出可以使用酶标仪测量的光。Jurkat/NF-κB/TACI测定的示意图显示于图1中。
重组人和小鼠APRIL和BAFF配体是购得的：人APRIL(Tonbo Biosciences)；人BAFF(Biolegend)；小鼠APRIL(ProSci Incorporated)；以及小鼠BAFF(R&D Systems)。
为了确定含有BCMA WT或vTD结构域的分子的生物活性，将30μL不同浓度(范围为1-10nM)的重组人或小鼠APRIL或BAFF与30μL固定的或递增的(范围为40nM-66pM)含有BCMA结构域的分子一起孵育。将配体和可溶受体在振荡和室温(RT)下孵育20分钟。将50μL转移至含有1.5x105个Jurkat/NF-κB/TACI细胞/孔的96孔白色平底板中的50μL培养基(RPMI1640+5％胎牛血清[FBS])中。将孔混合并将板在37摄氏度(C)下在加湿的5％CO2孵育室中孵育5小时。将板从孵育器取出并将100μL细胞溶解和萤光素酶底物溶液(Bio-GloTM萤光素酶测定系统，Promega)添加至每孔，并将所述板在定轨振荡器上孵育10分钟。通过使用Cytation 3(BioTek Instruments)成像读取仪以1秒/孔积分时间测量发光来确定每个测试样品的相对发光值(RLU)。在BCMA WT或vTD存在下相对于对照蛋白减小的RLU表示在Jurkat/NF-κB/TACI细胞中对经由转导的TACI受体的配体信号传导的阻断和抑制。
如图2中所示，示例性BCMA-Fc vTD以等于或高于含有WT BCMA结构域的Fc融合蛋白的水平抑制配体信号传导。
实施例7.多结构域T细胞和B细胞抑制性免疫调节蛋白的生成
生成多结构域免疫调节蛋白，其含有(1)与T细胞刺激性受体(如CD28)或其配体结合的至少一种T细胞抑制分子(TIM)；以及(2)与B细胞刺激性受体(如BCMA或APRIL)或其配体结合的至少一种B细胞抑制分子(BIM)。示例性TIM包括与CD28结合的含有IgSF结构域(分别为CTLA-4IgD或vIgD)的野生型(WT)或变体CTLA-4ECD，例如如实施例1中所述的任一种。示例性BIM包括(i)与配体APRIL或BAFF结合的含有TD结构域(分别为TACI TD或vTD)的野生型(WT)或变体TACI ECD，如实施例5中所述；或者(ii)与配体APRIL或BAFF结合的含有TD结构域(分别为BCMA TD或vTD)的WT或变体BCMA ECD，如实施例6中所述。
通过与Fc蛋白融合生成作为任一多聚分子的免疫调节蛋白，或者生成作为单体分子的免疫调节蛋白。
A.多聚构型
通过与呈各种构型的Fc蛋白融合生成作为多聚分子的各种多结构域免疫调节蛋白，如下文所总结。多结构域免疫调节蛋白的TIM或BIM以各种方式经由肽接头与Fc区的N末端或C末端连接，所述肽接头如GSGGGGS(SEQ ID NO:590)、GGGGSGGGGS(2xGGGGS；SEQ IDNO:594)、(GGGGS)4(SEQ ID NO:600)或(GGGGS)5(SEQ ID NO:671)。
为了生成同二聚Fc融合物，生成的构建体中使用的示例性IgG1 Fc区具有SEQ IDNO:589中所示的序列并且含有按照EU编号的突变C220S、按照EU编号的突变L234A、L235E和G237A，以降低效应子功能(关于SEQ ID NO:586中所示的野生型人IgG1 Fc，所述突变对应于C5S、L19A、L20E、G22A)；以及去除C末端赖氨酸，即按照EU编号的K447del(关于SEQ IDNO:586中所示的野生型或未修饰的Fc，对应于位置232的缺失)。
下表E7-A显示示例性生成的多结构域同二聚免疫调节Fc融合蛋白。
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对于异二聚多结构域Fc融合蛋白的生成，通过“杵臼结构”工程化生成作为异二聚分子的多聚多结构域免疫调节蛋白。在这样的例子中，通过共表达TIM和BIM生成异二聚体，所述TIM和BIM各自与以下中的任一种融合：(1)第一“杵”Fc亚基(示于SEQ ID NO:669中，按照EU编号含有突变S354C和T366W，关于SEQ ID NO:586中所示的野生型人IgG1 Fc对应于S139C和T151W)；以及(2)第二“臼”Fc亚基(示于SEQ ID NO:670中，按照EU编号含有突变Y349C、T366S、L368A和Y407V，关于SEQ ID NO:586中所示的野生型人IgG1 Fc对应于Y134C、T151S、L153A和Y192V)，用于表达异二聚分子。另外，杵和臼Fc二者还含有突变L19A、L20E、G22A以降低效应子功能，并且含有位置5处的半胱氨酸残基替代为丝氨酸残基(C5S)，各自与SEQ ID NO:586中所示的野生型或未修饰的Fc相比较(按照EU编号，分别对应于C220S、L234A、L235E和G237A)。
杵Fc(SEQ ID NO:669)：
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
臼Fc(SEQ ID NO:670)：
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
表E7-B显示示例性生成的多结构域异二聚免疫调节融合蛋白。
使用CTLA-4-Fc(阿巴西普)或BCMA-Fc(表E8-A)作为多结构域免疫调节Fc融合蛋白的对照。
根据制造商的说明书用ExpifectamineTM试剂盒培养基使编码目的Fc融合蛋白的表达构建体在Expi293 HEK293细胞(例如Invitrogen)中瞬时表达。收获上清液，并且使用AKTA蛋白质纯化系统从蛋白质A柱中捕获并洗脱蛋白质。然后通过另外的制备型SEC步骤分离洗脱的材料，以生成非聚集的(单体)高度纯化的材料。将该材料缓冲液交换至10mM乙酸盐、9％蔗糖(pH 5.0)(A5Su)中。将所述蛋白质在无菌生物安全柜中装入小瓶并在-80℃下冷冻。将小瓶解冻并通过分析型SEC评估，以证实所述材料在解冻后是稳定的且主要是非聚集的(单体)。
B.单体构型
在一些构型中，生成的多结构域免疫调节蛋白是作为单体分子生成，其含有用肽接头连接在一起的TIM和BIM。在此实施例中，用接头(EAAAK)6(SEQ ID NO:665)生成所述构建体。在一些情形中，单体免疫调节蛋白还含有用于检测和/或纯化的N末端或C末端部分，如多组氨酸标签(HHHHHH；SEQ ID NO:702)和/或flag标签(DYKDDDDK；SEQ ID NO:588)。
表E9描述示例性生成的多结构域免疫调节单体蛋白。
实施例8.与CTLA-4结构域堆叠的含有BCMA或含有TACI的分子对TACI介导的刺激 的BCMA/TACI阻断的生物活性评估。
使用实施例6中所述的基于细胞系的生物测定来评估与CTLA-4WT或vIgSF结构域“堆叠”的含有TACI或含有BCMA的WT、vTD或多结构域蛋白用于阻断Jurkat/NF-κB/TACI细胞中APRIL或BAFF介导的经由TACI受体的配体信号传导的功能表征。评估实施例7中所述的示例性堆叠分子。通过监测细胞中的萤光素酶产生，对APRIL或BAFF介导的配体信号传导进行定量。
A.示例性多结构域分子的生物活性
在一项实验中，使用Jurkat/NF-κB/TACI报告细胞评估表E8中所示的示例性分子对APRIL或BAFF介导的信号传导的阻断。表E10-A提供抑制APRIL和BAFF介导的TACI信号传导的半最大抑制浓度(IC50)的值。还显示每项实验与相应WT BCMA-Fc或WT TACI-Fc对照的比较(Δ亲代vTD)。在一些情况下，不将所测试的蛋白质与其亲代WT对照作比较，并且在下表中表示为(-)。
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B.变体BCMA抑制BAFF和APRIL的活性，或者BCMA或TACI vTD作为多结构域免疫调节蛋白与变体CTLA-4vIgD组合的活性
如图3A中所示，BCMA vTD显示可比较的活性，不论其作为单结构域来使用还是作为多结构域堆叠分子的部分而被包括。如图3B中所示，堆叠分子中包括的BCMA vTD是可互换的并且可用于调节配体抑制。
如图3C中所示，作为多结构域堆叠分子包括的TACI vTD显示阻断APRIL和BAFF二者的能力。如图3D中所示，堆叠分子中包括的TACI vTD是可互换的并且可用于调节配体抑制。
如图4中所示，示例性BCMA vTD-Fc和含有BCMA或TACI vTD与CTLA-4vIgD的堆叠抑制小鼠APRIL和BAFF配体信号传导。总之，结果显示多结构域堆叠分子阻断APRIL和BAFF配体信号传导(在此实施例中通过TACI介导的信号传导来例示)的能力与单一结构对照类似。
C.相对于含有阿塞西普或泰它西普中存在的ECD部分的Fc融合物，变体BCMA vTD与BCMA和TACI vTD多结构域免疫调节蛋白对于阻断APRIL和BAFF介导的信号传导的比较
在另一项类似研究中，评估如实施例7中所述的示例性生成的分子阻断Jurkat/NF-κB/TACI细胞中APRIL或BAFF介导的配体信号传导的能力。对于比较，生成含有与SEQ IDNO:589中所示的Fc序列融合的野生型TACI ECD的对照分子。在一种对照中，融合蛋白含有WT TACI(TACI 30-110，SEQ ID NO:718；对应于阿塞西普中的TACI ECD部分，SEQ ID NO:720)。在另一种对照中，融合蛋白含有WT TACI(TACI 13-118，SEQ ID NO:719，对应于泰它西普中的TACI ECD部分)。将活性与对照分子相比较。还将活性与抗BAFF单克隆抗体贝利木单抗相比较。
将示例性BCMA分子(单独的WT或变体BCMA vTD或者进一步与变体CTLA-4IgSF组合的多结构域分子)逐步增加(在100,000pM-32pM之间)，将其添加至2nM重组人APRIL或BAFF并如上文针对Jurkat/NF-κB测定所述进行测定。如图5A中所示，与TACI 30-110-Fc、TACI13-118-Fc和贝利木单抗相比，含有单独的或作为多结构域蛋白的BCMA TD的示例性分子展现增强的APRIL阻断而非BAFF阻断。
将示例性TACI分子(WT vTD或者进一步与变体CTLA-4IgSF组合的WT和vTD多结构域分子)逐步增加(在100,000pM-32pM之间)，将其添加至2nM重组人APRIL或BAFF并如上文针对Jurkat/NF-κB测定所述进行测定。如图5B中所示，含有作为多结构域蛋白的TACI vTD的示例性分子展现大于TACI 30-100-Fc、TACI 13-118-Fc和贝利木单抗的增强的APRIL和BAFF阻断。仅含TACI的CRD2结构域的WT TACI-Fc也展现大于TACI 30-100-Fc和TACI 13-118-Fc的增强的APRIL阻断。这些结果与如下发现一致：与还含有如存在于阿塞西普和泰它西普中的CRD1结构域的部分的TACI ECD分子相比，最小CRD2结构域(含有氨基酸残基68-110)展现改进的APRIL阻断。
表E10-B提供图5A和图5B中所示的示例性分子抑制APRIL和BAFF介导的TACI信号传导的半最大抑制浓度(IC50)的值。括号中还显示每种测试分子与阿塞西普相比的相对阻断(Δ阿塞西普)。
实施例9.在与野生型或亲和力成熟的BCMA或TACI结构域堆叠时，CTLA-4对CD28介 导的共刺激的CD80/CD86阻断的生物活性评估。
此实施例描述用基于细胞系的体外生物测定依据CD80/CD86的阻断和CD28介导的共刺激的抑制对含有CTLA-4的WT、vIgD或堆叠蛋白的功能表征。
表达由白介素-2(IL-2)启动子驱动的萤光素酶的Jurkat细胞是购得的(Promega)。Jurkat细胞(一种人T细胞白血病细胞系)内源表达T细胞受体(TCR)-CD3复合物和CD28。在与CD80或CD86相互作用后，CD28信号传导介导IL-2启动子的转录上调。经由抗CD3激活Jurkat细胞以及经由CD80或CD86的共刺激导致萤光素酶产生。如实施例6中所述对萤光素酶进行定量。转导K562细胞(一种人髓性白血病细胞系)以稳定表达细胞表面抗人CD3(OKT3)单链片段可变(scFv)和人CD80或CD86(K562/OKT3/CD80或CD86)，以生成人工抗原呈递细胞(aAPC)。Jurkat/IL-2测定的示意图显示于图6中。
为了确定CTLA-4WT或vIgD结构域的生物活性，将含有这些结构域的堆叠蛋白逐步增加(范围为100nM-256pM)，并将其铺板至96孔白色平底板中的33μL培养基(RPMI1640+5％FBS)中。将aAPC以2x104个细胞/孔添加至33μL培养基中的蛋白质，并且在RT和振荡下孵育20分钟。以2x105个细胞/孔添加Jurkat/IL-2细胞以使每孔的终体积达到100uL。将APC和Jurkat细胞在37℃下在加湿的5％ CO2孵育室中孵育5小时。如上所述处理板并对发光进行定量。在CTLA-4WT或vIgD或者CTLA-4堆叠的存在下，相对于对照蛋白减少的RLU表示Jurkat/IL-2细胞中CD80或CD86的阻断和CD28介导的共刺激的抑制。
表E11提供抑制CD80和CD86介导的CD28信号传导的半最大抑制浓度(IC50)的值。还显示每项实验与WT-CTLA-4-Fc参考对照阿巴西普的比较(Δ亲代CTLA-4-Fc)。在一些情况下，不将所测试的蛋白质与其亲代WT对照作比较，并且表示为(-)，或者未确定IC50值(ND)。
图7A和图7B提供示例性分子的进一步结果。含有WT CTLA-4IgD(图7A)或CTLA-4vIgD(图7B)的示例性分子的CD80和CD86的阻断和CD28介导的共刺激的抑制。
总之，结果显示多结构域堆叠分子阻断CD28介导的共刺激的能力类似于(或者在一些情形中优于)单结构域CTLA-4ECD-Fc参考对照阿巴西普。具体而言，与野生型CTLA-4相比，含有CTLA-4vIgD的堆叠分子展现显著改进的阻断CD86介导的CD28共刺激的能力，与其增加的对CD86的亲和力一致。
实施例10.在原代滤泡辅助T细胞(Tfh)和B细胞共培养测定中对含有BCMA或TACI 结构域的分子的生物活性评估。
在原代T细胞和B细胞测定中测试WT BCMA-Fc、WT TACI-Fc、BCMA vTD-Fc或含有BCMA或TACI vTD与CTLA-4IgSF结构域的示例性多结构域堆叠分子的生物活性。测试实施例7和表E7中所述的示例性多结构域分子。
从白细胞减少系统(LRS)锥(Bloodworks Northwest)获得原代细胞。处理所述锥并通过密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC)。根据制造商供应的方案使用阴性选择试剂盒(StemCell Technologies，目录号17954)从PBMC分离总B细胞。使用阴性选择试剂盒(StemCell Technologies，目录号17952)从全PBMC分离总CD4+T细胞。通过CXCR5阳性选择进一步纯化CD4+T细胞以产生Tfh。使用“自己动手(Do-It-Yourself)”试剂盒(StemCellTechnologies，目录号17699)通过将纯化的抗人CXCR5抗体(Biolegend)与磁性颗粒结合来制备CXCR5珠。根据制造商供应的方案分离Tfh(CXCR5+CD4+T)细胞。通过用丝裂霉素C(最终100μg/mL)在37℃下固定30分钟来制备人工抗原呈递细胞(aAPC)(K562/CD80)。将aAPC用含有FBS的RPMI洗涤三次，并在最终洗涤后将其悬浮于无血清X-Vivo 15TM补充培养基(X-Vivo15TM，含有1X GlutaMAX、1X青霉素-链霉素)中。
将B细胞以5.5-7.0x104个细胞/孔与重组IL-21(Biolegend，最终80ng/ml)一起铺板至96孔组织培养处理板中的50μL培养基中。以2.0-7.0x103个细胞/孔添加Tfh细胞于50μL中。将含有WT BCMA或TACI、BCMA vTD或者CTLA-4-Fc-BCMA/TACI多结构域堆叠的Fc融合蛋白逐步增加并一式三份添加于50μL(范围为100nM-32pM)中。将APC以2.0-5.0x103个细胞/孔与可溶抗CD3抗体(OKT3)(Biolegend，最终10nM)一起添加于50μL中。将板在37℃和5％CO2下孵育7天。
将Tfh-B细胞共培养板离心，并将上清液转移至96孔聚丙烯板中且在-20℃下冷冻，直至可以通过多重分析(系统，Millipore EMD)测量分泌的免疫球蛋白为止。通过流式细胞术分析使用两个染色组确定细胞回收和激活。第1组含有抗CD19-BUV395、抗CD38-BV421(或BV785)、抗人IgG-PE(或APC)、抗CD138-APC(或PE)、抗IgD-BV605、抗IgM-PerCP-C5.5、抗CD3-BUV737、抗CD27-BV510、抗CD10-BV711以及LIVE/DEADTMNear-IR可固定染色剂。第2组含有抗CD19-BUV395、抗ICOS-PE、抗CD40L-BV605、抗CD4-PerCP-Cy5.5、抗CD86-BV711(或抗CD19-BV711代替抗CD19-BUV395)、和抗CD28-APC以及LIVE/DEADTMNear-IR可固定染色剂。所有抗体都以1μg/ml使用，以下例外：抗人IgG-PE和抗人IgG-AF647以0.25μg/ml使用。将抗CD19-BUV395以1:50稀释并将抗CD3-BUV737以1:40稀释至其相应的染色混合剂中。在LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)上分析细胞。
对于示例性WT、vIgD或与TACI或BCMA的CTLA-4堆叠蛋白，如依据CD40L的缺少和ICOS上调显示的对CD4+T细胞回收和激活的抑制显示于图8A(CD4+T细胞回收)、图8B(CD4+CD40L+细胞回收)和图8C(CD4+ICOS+细胞回收)中。在此实施例中，所有分子都含有相同的CTLA-4vIgD。仅对于含有CTLA-4IgSF结构域的分子(包括含有TACI或BCMA TD的含有CTLA-4的多结构域堆叠分子)观察到对T细胞活性的抑制。观察到类似的T细胞抑制水平，不论特定的CTLA-4IgSF是作为单结构域来使用还是作为多结构域堆叠分子的部分而被包括。
对于示例性蛋白质，如根据CD86上调的缺少所显示的对总B细胞回收和B细胞激活的抑制分别显示于图8D(CD19+B细胞回收)和图8E(B细胞激活/CD86上调)中。示例性蛋白质对B细胞的IgM分泌的抑制显示于图8F中。仅对于含有TACI vTD或BCMA vTD的多结构域堆叠分子观察到对B细胞活性的抑制。
实施例11.在体内KLH免疫模型中对多特异性构建体的活性的评估
此实施例描述示例性测试的多结构域堆叠蛋白(实施例7和表E7中所述)影响小鼠体内对钥孔血蓝蛋白(KLH)的免疫应答的评估。可以使用小鼠KLH免疫模型来评价在KLH的一次或两次注射后，免疫调节分子对针对T细胞依赖性抗原KLH的抗原特异性应答的作用。KLH的两次注射(每次相隔至少7天)提供可以测试第2次注射后的时间段中的次级免疫应答的模型。此实施例描述如下模型，所述模型评价如与摩尔匹配水平的Fc同种型对照蛋白和阿巴西普相比，响应于KLH的两次注射(在第1天和第13天)的多结构域堆叠分子。在小鼠KLH模型中观察到的测试品的活性通常可以预测所述测试品在人体中的免疫调节作用。
为了开始KLH研究，将10周龄雌性C57/BL6NJ小鼠(The Jackson Laboratories，萨克拉门托，加利福尼亚州)随机化为6组，每组5只小鼠，并且如表E12中所概述经由腹膜内(IP)注射用测试品来给药(在第0天、第6天和第12天给药)。在第1天和第13天经由IP注射向小鼠施用0.25mg KLH(EMD Millipore，目录号374825-25MG)。将KLH的原始商业原液用杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)稀释4倍。三只小鼠保持不治疗/不注射作为初试对照(第7组)。
N/A＝不适用
在第19天，将所有小鼠用异氟醚麻醉并将血液收集至血清分离器管中。处死小鼠，并取出它们的脾，称重并置入冰上的DPBS中。对全血进行离心，取出血清并储存于-80℃下直至通过酶联免疫吸附测定(ELISA)针对抗KLH水平进行分析。将脾处理为单细胞悬浮液，根据制造商的说明书使用RBC溶解缓冲液(Biolegend，目录号420301)溶解红细胞(RBC)，并且使用双重荧光活性，使用吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)染色(Nexcelom，目录号CS2-0106-5mL)计数每个样品中的细胞。
然后使用以下方法将每个脾样品染色用于免疫细胞子集的流式细胞术分析：将1x106个活细胞置入两个96孔板的孔中(Corning，目录号3797；一个板用于B细胞特异性组并且一个板用于T细胞特异性组)，以1500x g离心10秒，去除上清液，并将细胞沉淀用DPBS洗涤两次。将沉淀重悬于100μL live-dead染色剂(LIVE/DEAD可固定浅绿色死细胞染色试剂盒，Life Technologies Corp.，1:1000稀释于DPBS中)中并在暗中在室温下孵育10min。在用流式细胞术缓冲液洗涤两次(每次175μL)后，将肿瘤沉淀重悬于Mouse BD Fc Block(用流动缓冲液以1:50稀释)中，并在暗中在RT下再孵育5min。在不再进行任何洗涤的情况下，将50μL的以下流式细胞术抗体的混合剂(稀释于流式细胞术缓冲液中)添加至B细胞组或T细胞组的每个细胞孔中。对于B细胞组，将以下抗体组合用于混合剂：抗小鼠CD19BUV395(克隆1D3，Becton-Dickinson；1:100)、抗小鼠CD138 BV421(克隆281-2，BioLegendInc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD3εBV510(克隆17A2，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠IgD BV605(克隆11-26c.2a，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠B220 BV785(克隆RA3-6B2，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD95 FITC(克隆SA367H8，BioLegendInc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD23 PerCP Cy5.5(克隆B3B4，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠GL7 PE(克隆GL7，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠Gr1 PE Cy7(克隆RB6-8C5，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD21 APC(克隆7E9，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)以及抗小鼠IgM APC Cy7(克隆RMM-1，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)。对于T细胞组，将以下抗体组合用于混合剂：抗小鼠PD-1BV421(克隆29F.1A12，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD11b BV510(克隆M1/70，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD3εBV605(克隆145-2C11，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD8 BV785(克隆53-6.7，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD44 FITC(克隆IM7，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD4 PerCP Cy5.5(克隆GK1.5，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD62L PE(克隆MEL-14，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CXCR5 PE Dazzle(克隆L138D7，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD25 PE Cy7(克隆PC61.5，BioLegendInc.；1:100，终浓度)以及抗小鼠CD45 AF700(克隆30-F11，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)。将所述细胞与抗体混合剂中的一种在暗中在冰上在温和混合下一起孵育45min，之后用流式细胞术缓冲液洗涤两次(每次洗涤175μL)。将细胞沉淀重悬于200μL流式细胞术缓冲液中并收集于LSRII流式细胞仪上。使用FlowJo软件10.2版(FlowJo LLC，美国)分析数据，并使用GraphPad Prism软件(8.1.2版)图形化。关键细胞子集鉴定分析包括：总B细胞(B220+细胞)、边缘区(MZ)B细胞(B220+、CD19+、CD23-、CD21高、IgM高细胞)、生发中心(GC)B细胞(B220+、CD19+、GL7+、CD95+细胞)、T滤泡辅助(Tfh)细胞(CD45+、CD3+、CD4+、PD1+、CD185+细胞)、CD4+T效应记忆(Tem)细胞(CD45+、CD3+、CD4+、CD44+、CD62L-细胞)以及CD8+Tem细胞(CD45+、CD3+、CD8+、CD44+、CD62L-细胞)。
通过单因素方差分析(ANOVA)或非配对Student's t检验使用GraphPad Prism软件(8.1.2版)确定所有分析的组间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
为了确定与Fc同种型对照(SEQ ID NO:589)相比，多结构域堆叠分子抑制KLH介导的抗体免疫应答的程度，通过两个ELISA测定之一评价血清样品中抗KLH抗体的浓度。所述ELISA测定测量血清中的IgM特异性或IgG1特异性抗KLH水平，并且利用如下测定：其中将多种稀释度的小鼠血清样品在涂布有KLH的板中孵育，之后洗涤并用1:2000山羊抗小鼠IgG1:HRP或1:5000山羊抗小鼠IgM:HRP进行检测。使用TMB底物试剂盒(SeraCare)实现显色，并且在酶标仪( Plus酶标仪，Molecular Devices LLC)上分析ELISA板。所述测定不存在标准曲线，因此使用光学密度(OD)来比较抗KLH抗体的水平；OD越高，血清样品中抗KLH抗体的水平越高。对于抗KLH IgM OD水平，数据呈现于图9中，并且通过单因素ANOVA和Tukey's多重比较检验进行的统计学分析呈现于表E13中；抗KLH IgG1 OD水平呈现于图10中，并且通过单因素ANOVA和Tukey's多重比较检验进行的统计学分析呈现于表E14A中。结果证实，与Fc对照治疗相比，所测试的多结构域堆叠分子中的每一种各自能够显著降低血清中的抗KLH IgM水平，其中在所有测试品中，CTLA-4 186GSG4S Fc(G4S)4TACI 541(SEQ ID NO:610)显示最大降低。与Fc对照治疗相比，阿巴西普治疗对血清中的抗KLH IgM水平无影响。与Fc对照相比，所测试的多结构域堆叠分子中的每一种还能够显著降低抗KLH IgG1水平，其中CTLA-4186GSG4S Fc(G4S)4TACI 541(SEQ ID NO:610)仍显示最大降低。阿巴西普也能够显著降低血清中的抗KLH IgG1水平，但是示例性多结构域堆叠分子与阿巴西普同样有效或者诱导比阿巴西普更明显的降低(图10)。这些结果表明，这些多结构域堆叠分子在降低T细胞依赖性抗体免疫应答方面有效，并且与阿巴西普(一种市售的且获批的用于许多自身免疫性疾病和炎性疾病的治疗药)同样有效或比阿巴西普更有效。
如图11中所示，与Fc对照治疗的小鼠相比，用CTLA-4 186GSG4S Fc(G4S)4TACI541(SEQ ID NO:610)治疗的小鼠在研究结束时(第19天)具有显著更小的脾(p<0.001，通过t检验)，与Fc1.1治疗的小鼠相比，用CTLA-4WT ECD 1GSG4S Fc(G4S)4TACI 541(SEQ IDNO:611)治疗的小鼠也是如此(p＝0.01，通过t检验)。与Fc1.1治疗的小鼠相比，用多结构域堆叠分子CTLA-4 186-GSG4S-Fc-(G4S)4-BCMA 406(SEQ ID NO:601)治疗的小鼠往往具有更小的脾，但是差异在统计学上并不十分显著(p＝0.087，通过t检验)。在Fc同种型对照治疗的小鼠与初试小鼠或者用阿巴西普或CTLA-4WT ECD 1GSG4S Fc(G4S)4BCMA 406(SEQ IDNO:602，其含有与SEQ ID NO:601中的多结构域堆叠分子相同的BCMA vTD，但是含有WTCTLA-4IgD而不是vIgD)治疗的小鼠之间不存在差异。更小的脾指示淋巴细胞的减少，这可能对与加强的免疫应答相关的自身免疫性和炎性疾病(特别是由B细胞和/或T细胞驱动的那些)的发病机制具有免疫调节作用。脾重量的统计学分析显示于表E14B中。
按照这些原则，对自身免疫性和炎性疾病的发病机制特别重要的是促进B细胞存活和分化、抗体产生和T细胞效应记忆的细胞类型。这些细胞类型包括但不限于以下：B细胞、边缘区(MZ)B细胞、生发中心(GC)B细胞、T滤泡辅助(Tfh)细胞以及CD4+和CD8+T效应记忆(Tem)细胞。可预期作用机制包括减少这些细胞类型的治疗药在多种自身免疫性和炎性疾病的治疗中有效。如图12A-图12H中所示，如与Fc同种型对照(SEQ ID NO:589)相比，某些测试的多结构域堆叠分子能够减小每个脾中B细胞、MZ B细胞、GC B细胞和Tfh的百分比和数量，其中CTLA-4 186GSG4S Fc(G4S)4TACI 541(SEQ ID NO:610)在变体中最有效，其次是CTLA-4 186-GSG4S-Fc-(G4S)4-BCMA 406(SEQ ID NO:601)，再次是含有WT CTLA-4IgD和TACIvTD的CTLA-4WT ECD 1GSG4S Fc(G4S)4TACI 541(SEQ ID NO:611)。在减小在B细胞存活和分化和抗体产生中重要的这些群体的百分比或数量的能力方面，这些多结构域堆叠分子与阿巴西普同样有效或比阿巴西普更有效。示例性多结构域堆叠分子与Fc对照或阿巴西普相比的统计学分析显示于表E15中。
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如图13A-图13D中所示，如与Fc同种型对照和阿巴西普相比，含有CTLA-4vIgD和TACI或BCMA vTD的多结构域堆叠分子能够减小每个脾中CD4+和CD8+Tem细胞的百分比和数量。因此，这些结果显示，在减小脾中这些重要的效应记忆群体的百分比或数量的能力方面，示例性测试的多结构域堆叠分子至少与阿巴西普同样有效，并且通常比阿巴西普更有效。示例性多结构域堆叠分子与Fc对照或阿巴西普相比的统计学分析显示于表E16中。
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总之，这些结果表明，抑制T细胞活性和B细胞活性二者的多结构域堆叠分子可以减小由T细胞依赖性抗原KLH在体内介导的免疫应答和细胞子集变化(即血清中的抗KLH水平和免疫细胞子集的变化)。这些结果与CTLA-4和BCMA/TACI多结构域堆叠蛋白作为有效治疗药在过度活跃的淋巴细胞起作用的自身免疫性和炎性疾病的治疗中的用途一致。
实施例12.在体内小鼠狼疮模型中对多特异性构建体的活性的评估.
此实施例描述在体内鼠(NZB/NZW)F1自发狼疮模型中对示例性CTLA-4vIgD-Fc分子以及含有TACI vTD和CTLA-4vIgD结构域的示例性多结构域堆叠分子(描述于实施例7和表E7中)影响免疫应答的评估。(NZBxNZW)F1小鼠自发患上与人SLE非常相似的自身免疫性疾病，并且被视为该疾病的最佳小鼠模型之一。(NZB/NZW)F1小鼠在约20周龄开始具有高循环浓度的抗dsDNA抗体，且在约23周龄可检测到疾病的最初临床体征。所述小鼠患上通过肾小球基膜中的免疫复合物沉积介导的溶血性贫血、蛋白尿和进行性肾小球肾炎。
每周两次经由腹膜内(IP)注射用以下对(NZB/NZW)F1小鼠给药：14mg/kg Fc对照，或者摩尔匹配量的CTLA-4vIgD-Fc(186CTLA-4-Fc)(21mg/kg)，或者含有TACI vTD和CTLA-4vIgD的示例性多结构域堆叠Fc融合分子(“CTLA-4vIgD-Fc-TACI vTD”)(CTLA-4 186GSG4SFc(G4S)4TACI 541)(25mg/kg)。治疗在组分配(第22周龄)时开始，并且继续至研究结束。研究在小鼠达到第43周龄时结束，但是在一些动物垂死时在研究中较早将其安乐死。
在20与40周龄之间的不同时间点，收集尿液和血清样品。当小鼠为20周龄时开始，每周用尿液分析测试条(Roche Chemstrip 2GP，目录号11895397160)确定研究中所有小鼠的尿液中的蛋白质浓度。每个治疗组中随时间变化的平均蛋白尿得分呈现于图14A中，并且每组中体重的平均变化百分比(体重减轻与进行性疾病相关)绘图于图14B中。每个治疗组中小鼠的存活率百分比绘图于图14C中。抗双链(ds)DNA IgG血清滴度由HookeLaboratories,Inc.(劳伦斯，马萨诸塞州)使用其内部试剂盒测量，并且结果呈现于图14D中。在患有进行性疾病的这些小鼠中，血尿素氮(BUN)水平增加。在终止研究时(或在提前死亡的小鼠死亡时)，每个治疗组的BUN水平显示于图14E中。使用未校正的Dunn检验进行统计学分析，**表示p＝0.0047和p＝0.0065；***表示p＝0.0004。
在终止时从每只小鼠收集肾并在重复过碘酸希夫(PAS)染色切片中使用Alperovich G等人,2007.Lupus 16:18-24中所述的标准进行组织学分析。由不了解治疗和临床得分的病理学家对所有肾切片进行盲分析。使用0至3的评分系统对肾小球病变(系膜扩张、毛细管内增生、肾小球沉积和毛细管外增生)和肾小管/间质病变(间质浸润、肾小管萎缩和间质纤维化)进行半定量的分析和分级，其中0＝无变化，1＝轻度变化，2＝中度变化，且3＝重度变化。将每只小鼠的总组织学得分计算为单独得分之和(最大总分为21)。总肾小球病变、总肾小管和间质病变以及总肾病变的肾得分显示于图14F中；如与Fc对照治疗的小鼠相比，在用CTLA-4vIgD-Fc(对于总肾病变，相比于Fc组，p＝0.0068)或CTLA-4vIgD-Fc-TACI vTD(相比于Fc组，p<0.0001)治疗的动物中观察到显著改进的肾组织病理学。
对于图14G-图14H，在研究终止时从每只小鼠收集右肾，称重，横向解剖，并在单一最适切割温度化合物(OCT)块中冷冻，之后切片并进行小鼠IgG和小鼠补体C3的免疫组织化学(IHC)染色，以分别评估肾小球IgG和C3沉积。将肾切片用丙酮进行渗透化处理并用以下进行染色：以1:25稀释于初级抗体稀释剂(Leica Biosystems)中的FITC缀合的大鼠单克隆抗小鼠补体成分C3(Cedarlane)，或者以1:200稀释于初级抗体稀释剂中的AF594缀合的山羊抗小鼠IgG(Thermo Fisher Scientific)。由病理学家基于Kelkka等人(2014)AntioxidRedox Signal.21:2231-45中所述的方法使用0至4的半定量评分系统来分析IgG和C3的肾小球沉积，其中0＝无沉积，1＝轻度系膜沉积，2＝明显系膜沉积，3＝系膜和轻微毛细管沉积，且4＝重度系膜和系膜毛细管沉积。如与Fc对照治疗的小鼠相比，在用186CTLA-4vIgD-Fc(对于IgG沉积，相比于Fc对照组，p＝0.0084；并且对于C3沉积，p＝0.0007)或CTLA-4186-GSG4S-Fc(G4S)4-TACI 541(对于IgG，相比于Fc对照组，p<0.0001；并且对于C3，p＝0.0053)治疗的动物中观察到显著减少的肾小球IgG和C3；使用Kruskal-Wallis(非参数性)检验和之后的未校正的Dunn多重比较检验来分析数据中的统计学上显著的差异。
结果证实，在(NZB/NZW)F1小鼠SLE模型中，单独的CTLA-4vIgD或含有CTLA-4vIgD和TACI vTD的多结构域免疫调节Fc蛋白各自能够显著抑制蛋白尿，保持体重，增强总体存活，减少抗dsDNA自身抗体和BUN，减少IgG和C3肾沉积，并预防或改进肾病。示例性分子也能够有效减少这些小鼠的脾和淋巴结中的B细胞和T细胞子集，包括浆细胞、滤泡T辅助细胞、生发中心细胞和记忆T细胞(数据未显示)。
实施例13：在体内KLH免疫模型中对多特异性构建体的比较性评价
此实施例描述示例性测试的单结构域Fc融合蛋白和一种多结构域堆叠蛋白(实施例6、实施例7和表E7中所述)影响小鼠体内针对钥孔血蓝蛋白(KLH)的免疫应答的评估。可以使用小鼠KLH免疫模型来评价在KLH的一次或两次注射后，免疫调节分子对针对T细胞依赖性抗原KLH的抗原特异性应答的作用。KLH的两次注射(每次相隔至少7天)提供如下模型，所述模型可以评价第1次KLH注射后的初级免疫应答和第2次注射后的时间段中的次级免疫应答二者。此实施例描述一项研究，所述研究评价多种含有BCMA单结构域的分子(如格式化为Fc融合物的可溶野生型(WT)或变体BCMA vTD)以及多结构域堆叠分子CTLA4 186-GSG4S-Fc-(G4S)4-TACI 541在没有佐剂的情况下响应KLH的两次注射(在研究第0天和第12天)的活性。将这些测试品与施用摩尔匹配水平的Fc同种型对照蛋白或阿巴西普(WT CTLA-4-Fc)相比较。在小鼠KLH模型中观察到的测试品的活性通常可以预测所述测试品在人体中的免疫调节作用。
为了开始KLH研究，将10周龄雌性C57/BL6NJ小鼠(The Jackson Laboratories，萨克拉门托，加利福尼亚州)随机化为12个组，每组5只小鼠。在第0天和第12天经由腹膜内(IP)注射向小鼠施用0.25mg KLH(EMD Millipore，目录号374825-25MG)；在注射前将KLH的原始商业原液用杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)稀释至适当浓度。如表E17中所概述经由IP注射用测试品对小鼠给药(在第4天和第11天给药)。六只小鼠保持不治疗/不注射作为初试对照(第13组)。在第5天(第1剂量后24h)、第12天(第2剂量后/KLH加强前24h)和第20天手机血清以评价药物暴露、ADA和/或抗KLH抗体水平。第10组中的一只动物接受不完整剂量的测试品，并因此将其从研究去除。
N/A＝不适用
在第20天，将所有小鼠用异氟醚麻醉并将血液收集至血清分离器管中。处死小鼠，并取出它们的脾，称重并置入冰上的DPBS中。对全血进行离心，取出血清并储存于-80℃下直至通过酶联免疫吸附测定(ELISA)针对抗KLH水平进行分析。将脾处理为单细胞悬浮液，根据制造商的说明书使用RBC溶解缓冲液(Biolegend，目录号420301)溶解红细胞(RBC)，并且使用双重荧光活性，使用吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)染色(Nexcelom，目录号CS2-0106-5mL)计数每个样品中的细胞。
然后使用以下方法将每个脾样品染色用于免疫细胞子集的流式细胞术分析：将1x106个活细胞置入两个96孔板的孔中(Corning，目录号3797；一个板用于B细胞特异性组并且一个板用于T细胞特异性组)，以1500x g离心10秒，去除上清液，并将细胞沉淀用DPBS洗涤两次。将沉淀重悬于100μL live-dead染色剂(LIVE/DEAD可固定浅绿色死细胞染色试剂盒，Life Technologies Corp.，1:1000稀释于DPBS中)中并在暗中在室温下孵育10min。在用流式细胞术缓冲液洗涤两次(每次175μL)后，将肿瘤沉淀重悬于Mouse BD Fc Block(用流动缓冲液以1:50稀释)中，并在暗中在RT下再孵育5min。在不再进行任何洗涤的情况下，将50μL的以下流式细胞术抗体的混合剂(稀释于流式细胞术缓冲液中)添加至B细胞组或T细胞组的每个细胞孔中。对于B细胞组，将以下抗体组合用于混合剂：抗小鼠CD19BUV395(克隆1D3，Becton-Dickinson；1:100)、抗小鼠CD138 BV421(克隆281-2，BioLegendInc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD3εBV510(克隆17A2，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠IgD BV605(克隆11-26c.2a，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠B220 BV785(克隆RA3-6B2，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD95 FITC(克隆SA367H8，BioLegendInc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD23 PerCP Cy5.5(克隆B3B4，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠GL7 PE(克隆GL7，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠Gr1 PE Cy7(克隆RB6-8C5，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD21 APC(克隆7E9，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)以及抗小鼠IgM APC Cy7(克隆RMM-1，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)。对于T细胞组，将以下抗体组合用于混合剂：抗小鼠PD-1BV421(克隆29F.1A12，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD11b BV510(克隆M1/70，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD3εBV605(克隆145-2C11，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD8 BV785(克隆53-6.7，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD44 FITC(克隆IM7，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD4 PerCP Cy5.5(克隆GK1.5，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD62L PE(克隆MEL-14，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CXCR5 PE Dazzle(克隆L138D7，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)、抗小鼠CD25 PE Cy7(克隆PC61.5，BioLegendInc.；1:100，终浓度)以及抗小鼠CD45 AF700(克隆30-F11，BioLegend Inc.；1:100，终浓度)。将所述细胞与抗体混合剂中的一种在暗中在冰上在温和混合下一起孵育45min，之后用流式细胞术缓冲液洗涤两次(每次洗涤175μL)。将细胞沉淀重悬于200μL流式细胞术缓冲液中并收集于LSRII流式细胞仪上。使用FlowJo软件10.2版(FlowJo LLC，美国)分析数据，并使用GraphPad Prism软件(8.1.2版)图形化。关键细胞子集分析包括：总B细胞(B220+细胞)、边缘区(MZ)B细胞(B220+、CD19+、CD23-、CD21高、IgM高细胞)、生发中心(GC)B细胞(B220+、CD19+、GL7+、CD95+细胞)、T滤泡辅助(Tfh)细胞(CD45+、CD3+、CD4+、PD-1+、CD185+细胞)、CD4+T效应记忆(Tem)细胞(CD45+、CD3+、CD4+、CD44+、CD62L-细胞)以及CD8+Tem细胞(CD45+、CD3+、CD8+、CD44+、CD62L-细胞)。
通过单因素方差分析(ANOVA)和未校正的Fisher最小显著差异(LSD)多重比较检验使用GraphPad Prism软件(8.1.2版)来确定组间的统计学上显著的差异(p<0.05)。
为了确定与Fc同种型对照(SEQ ID NO:589)相比，测试品抑制KLH介导的抗体免疫应答的程度，在两个ELISA测定中评价血清样品中抗KLH抗体的浓度。ELISA测定测量血清中的IgM特异性或IgG1特异性抗KLH水平。将多种稀释度的小鼠血清样品在涂布有KLH的板中孵育，之后洗涤并用1:2000山羊抗小鼠IgG1:HRP或1:5000山羊抗小鼠IgM:HRP进行检测。使用TMB底物试剂盒(SeraCare)实现显色，并且在酶标仪(iD3酶标仪，MolecularDevices LLC)上分析ELISA板。所述测定不存在标准曲线，因此使用光学密度(OD)来比较抗KLH抗体的水平；OD越高，血清样品中抗KLH抗体的水平越高。对于抗KLH IgM OD水平，数据呈现于图18A(初次应答)、图18B(再次应答)中，并且通过单因素ANOVA和未校正的Fisher'sLSD多重比较检验进行的统计学分析分别呈现于表E18和表E19中。抗KLH IgG1 OD水平呈现于图18C(初次应答)、图18D(再次应答)中，并且通过单因素ANOVA和未校正的Fisher's LSD多重比较检验进行的统计学分析呈现于表E18-表E21中。结果证实，在初级免疫应答期间，与Fc对照治疗相比，每种测试品能够显著降低血清中的抗KLH IgM水平，其中在所有测试品中，CTLA-4186GSG4S Fc(G4S)4TACI 541(SEQ ID NO:610)显示最大降低，并且阿巴西普治疗具有最小作用(图18A)。对于在第20天的再次应答，在第2剂和最后一剂测试品后9天测量，除了TACI 13-118-Fc和406BCMA-Fc外的所有测试品都诱导抗KLH IgM水平显著降低，其中CTLA-4 186GSG4S Fc(G4S)4TACI 541(SEQ ID NO:610)显示最大降低(图18B)。在初级免疫应答期间，与Fc对照相比，每种测试品还能够显著降低抗KLH IgG1水平，其中CTLA-4186GSG4S Fc(G4S)4TACI 541(SEQ ID NO:610)仍显示最大降低(图18C)。对于针对KLH的再次应答，除了TACI 30-110-Fc、TACI 13-118-Fc和411BCMA-Fc外的所有测试品都显著降低抗KLH IgG1的水平(图18D)。这些结果表明，在此小鼠免疫模型中，在降低针对KLH的T细胞依赖性抗体免疫应答方面，大多数含有BCMA vTD的分子是有效的，其中CTLA-4 186GSG4SFc(G4S)4TACI 541(SEQ ID NO:610)和381BMCA-Fc展现最显著的作用。
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如图19A和图19B中所示，在研究结束时(第20天)，与Fc对照治疗的小鼠相比，用除了TACI 30-110-Fc或TACI 13-118-Fc外的所有测试品治疗的小鼠都具有显著更小的脾，如分别依据重量和细胞数量所评估(表E22)，并且用CTLA-4 186GSG4S Fc(G4S)4TACI 541(SEQ ID NO:610)治疗的小鼠具有所有治疗组中最小的脾。用除了186CTLA-4vIgD-Fc外的每种测试品治疗的小鼠还具有显著少于Fc对照组的脾细胞，并且在所有治疗组中，用CTLA-4 186GSG4S Fc(G4S)4TACI 541(SEQ ID NO:610)治疗的小鼠具有最低的脾细胞数量。更小的脾指示淋巴细胞的减少，这可能对与加强的免疫应答相关的自身免疫性和炎性疾病(特别是由B细胞和/或T细胞驱动的那些)的发病机制具有免疫调节作用。脾重量和总细胞数量的统计学分析分别显示于表E22和表E23中。
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对自身免疫性和炎性疾病的发病机制特别重要的是促进B细胞存活和分化、抗体产生和T细胞效应记忆的细胞类型。这些细胞类型包括但不限于以下：总B细胞、边缘区(MZ)B细胞、生发中心(GC)B细胞、T滤泡辅助(Tfh)细胞以及CD4+和CD8+T效应记忆(Tem)细胞。可预期作用机制包括减少这些细胞类型的治疗药在多种自身抗体介导的疾病的治疗中有效。与其余治疗组相比，用CTLA-4 186GSG4S Fc(G4S)4TACI 541(SEQ ID NO:610)或任何BCMA-Fc测试品治疗显著减少多个脾B细胞子集的数量，包括对以下的影响：过渡-2(B220+CD19+CD23+CD21高IgM高)、滤泡(B220+CD19+CD23+CD21+IgM+)、边缘区(B220+CD19+CD23neg CD21高IgM高)、生发中心(B220+CD19+GL7+CD95+)以及浆细胞(B220低CD19+CD138高)(图20和图21)。在减小在B细胞存活和分化和抗体产生中重要的这些群体的百分比(未显示)或数量的能力方面，这些含有BCMA vTD的单结构域分子或者含有TACI vTD或BCMA vTD的多结构域分子与阿巴西普或两种WT TACI-Fc分子(TACI 13-188-Fc和TACI 30-110-Fc)同样有效或者比阿巴西普或所述两种WT TACI-Fc分子更有效。来自第20天脾细胞的流式细胞术数据的统计学分析显示于表E24-表E42中。
脾CD3+、CD4+或CD8+T细胞群体在很大程度上不受含有BCMA vTD的测试品的影响(第7组-第12组)，但是与Fc对照组相比，用CTLA-4 186GSG4S Fc(G4S)4TACI 541(SEQ IDNO:610)(第4组)治疗小鼠确实减少这些T细胞群体的数量(图22A-图22C)。与Fc对照组相比，CTLA-4 186GSG4S Fc(G4S)4TACI 541(SEQ ID NO:610)也减少Tcm和Tem记忆T细胞，而TACI或BCMA单结构域测试品不减少Tcm和Tem记忆T细胞(图23)。如与Fc对照相比，所有测试品都减少滤泡辅助T细胞(CD45+、CD3+、CD4+、PD-1+、CD185+)的数量，所述滤泡辅助T细胞与生发中心中的B细胞相互作用并且是T细胞依赖性抗体应答的重要贡献者(图22D)。
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总之，这些结果表明，抑制B细胞和/或T细胞活性的含有BCMA vTD的单结构域Fc融合分子或者多堆叠结构域分子(CTLA-4 186GSG4S Fc(G4S)4TACI 541(SEQ ID NO:610))可以减小由T细胞依赖性抗原KLH在体内介导的免疫应答和细胞子集变化(即血清中的抗KLH水平和免疫细胞子集的变化)。这些结果与CTLA-4和BCMA/TACI多结构域堆叠蛋白或者单一TACI或BCMA结构域B细胞抑制分子作为临床治疗药在过度活跃的淋巴细胞起作用的自身免疫性和炎性疾病的治疗中的评价一致。
实施例14.在非肥胖糖尿病小鼠的舍格伦综合征模型中的评价
此实施例描述在NOD小鼠的体内短期舍格伦综合征模型中对示例性单结构域186-CTLA4-Fc融合蛋白(与SEQ ID NO:589中所示的Fc融合的变体CTLA-4SEQ ID NO:186)和多结构域堆叠分子CTLA4 186-GSG4S-Fc-(G4S)4-TACI 541(SEQ ID NO:610中所示的多结构域堆叠Fc融合物)的评估，包括对涎腺炎、测试分子的血清水平和胰岛炎的评估。
舍格伦综合征模型是在雌性易患糖尿病的NOD/ShiLtJ小鼠(约6周龄)中通过抗mPD-L1抗体的重复给药来诱导的。具体而言，在第0天、第2天、第4天和第6天通过腹膜内注射施用0.1mg抗mPD-L1抗体。在第0天、第2天和第4天根据下表E43给予测试分子融合蛋白。
缩写：IP＝腹膜内(地)；mg＝毫克；n/a＝不适用
在第7天、第8天、第9天和第10天从小鼠尾静脉获得血液(2-5μL)，将其置于ReliOnPrime血糖测试条上，并使用ReliOn Prime血糖测试系统测量血糖(mg/dL)。在实验第10天，处死小鼠并且收集和分析血清、下颌下腺(SMG)和胰腺。
取出左SMG和胰腺，从相邻淋巴结解剖分离，并将其置入中性缓冲福尔马林(NBF)中持续约72小时，之后将其转移至70％乙醇中。将固定的组织包埋于石蜡中，切片，并在载玻片上用苏木精和伊红(H&E)染色。
用于评价涎腺炎程度的评分系统是根据Nandula等人2011(其中的表6；再现为表E44)来评分，并且对于胰岛炎是根据Gutierrez等人2014(其中的表7；再现为表E45)来评分。
使用单因素方差分析(ANOVA)和之后的Fisher最小显著差异(LSD)检验来确定组织学得分在组间的统计学上显著的差异。使用Kruskal-Wallis(非参数性)检验和之后的Dunn多重比较检验来分析血糖水平的显著差异。使用GraphPad 软件(8.1.2版)进行统计学分析，并且对于所有统计学检验，将p值<0.05视为统计学显著的。
使用两种示例性CTLA4 186-GSG4S-Fc-(G4S)4-TACI 541的治疗降低涎腺炎的发病率(图24A)，并导致比Fc对照的平均得分显著更低的组织学得分(p<0.01)(图24B)。这些结果与如下发现一致：在此舍格伦综合征模型中，用测试分子对注射抗PD-L1的NOD小鼠的治疗降低涎腺炎的发病率和严重性二者。
这些易患糖尿病的小鼠中胰岛炎的总体发病率和用测试分子治疗后的胰岛炎程度显示于图25A和图25B中。CTLA4 186-GSG4S-Fc-(G4S)4-TACI 541显著降低胰岛炎程度，如通过组织学分析所评估(图25B)。
图26描绘每个测试组的平均血糖浓度(mg/dL)，如在第7天、第8天、第9天和第10天的血液中所测量。如图所示，在第7天，与Fc对照相比，血糖水平在186-CTLA-4Fc和CTLA4186-GSG4S-Fc-(G4S)4-TACI 541治疗组中显著更低(分别地，p<0.05，p<0.01，以及p<0.001)。在其他时间点，与Fc对照相比，存在用多结构域堆叠分子CTLA4186-GSG4S-Fc-(G4S)4-TACI 541治疗时血糖水平更低的趋势。
总之，这些结果表明，用测试的示例性多结构域TACI-CTLA-4分子治疗在此小鼠舍格伦综合征模型中降低涎腺炎的发病率和严重性，并且通常在研究过程中维持较低血糖水平方面是有效的。这些结果表明了含有TACI-CTLA-4的多结构域堆叠分子在用于治疗舍格伦综合征的治疗性用途中的潜力，以及TACI-CTLA-4多结构域堆叠分子作为治疗药在人体中影响1型糖尿病的发作的潜力。
实施例15：在体内小鼠狼疮模型中对多特异性构建体的活性的评估。
此实施例描述在体内鼠bm12诱导性SLE模型中示例性CTLA4 186-GSG4S-Fc-(G4S)4-TACI 541多结构域分子针对免疫应答的评估。
将C57BL/6NJ(C57BL/6)小鼠随机分配至表E45中概述的组中。将来自雌性I-Abm12B6(c)-H2-Ab1bm12/KhEgJ(“bm12”)小鼠的脾在RPMI培养基中无菌处理为单细胞悬浮液，并合并为总计8mL。通过经由腹膜内递送注射将总计0.2mL合并的bm12脾细胞过继转移至39只C57BL/6“受体”小鼠。受体抗原呈递细胞对供体bm12 CD4+T细胞的同种激活导致慢性GVHD症状，且症状与SLE非常相似，包括自身抗体产生、免疫细胞子集的变化以及轻度肾病。具有免疫复合物沉积的肾小球肾炎在所述模型中较晚出现，主要由与IgG1、IgG2b、IgG2c和IgG3抗体结合的自身抗原构成。
受体小鼠接受表E45中所述的测试分子的剂量，在脾细胞转移后1小时开始，然后每3-4天给药，持续总计22剂；最后一剂在终止前一周时施用(在第75天最后一剂)。作为对照，用Fc对照、WT全ECD TACI-Fc(阿巴西普)和TACI 30-110-Fc(TACI 30-110，SEQ ID NO:718；对应于阿塞西普中的TACI ECD部分)治疗小鼠。保留五只C57BL/6小鼠和5只bm12小鼠用作初试、未治疗的对照。
使用单因素方差分析(ANOVA)确定在特定时间点，抗dsDNA抗体、IgG同种型、BUN和CRE的血清水平在组间的统计学上显著的差异。进行正态性检验以确定是使用标准ANOVA(用于正态分布的数据)还是使用非参数性Kruskal-Wallis检验。使用未校正的Fisher最小显著差异(LSD)检验(用于标准ANOVA)或未校正的Dunn检验(用于Kruskal-Wallis)进行组间的多重比较检验。对于流式细胞术数据，使用Student's非配对的双尾T检验来分析组间的显著差异。使用GraphPad 软件(8.1.2版)进行统计学分析，并且对于所有统计学检验，将p值<0.05视为统计学显著的。
血尿素氮(BUN)和血清肌酐(CRE)浓度
分析在第82天(研究终止，最后一剂后7天)收集的血清中的BUN和CRE。如图27中所示，BUN浓度在所述模型中显著升高，如通过与初试C57BL/6组相比在Fc对照组中略高的浓度所示(p<0.05)。如与阿巴西普治疗组相比，CTLA4 186-GSG4S-Fc-(G4S)4-TACI 541-和TACI 30-110-FC-Fc两组各自显示显著更低的BUN浓度。总的来说，Fc对照组中CRE水平的增加在此研究中最低，并且在任何组之间没有显著差异。
血清IgG同种型浓度
在研究期间随时间收集血清，并且根据制造商的说明书使用小鼠IgG2b、小鼠IgG2c和小鼠IgG3酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒分析来自第14天、第42天和第82天的样品中IgG2b、IgG2c和IgG3的浓度。(Abcam；剑桥，英国)。对于天然bm12小鼠，仅分析第82天(终末)血清样品。先前已经显示这些IgG同种型在bm12模型中的免疫复合物中增加，因此可能是致病的；具体而言，已经显示所述血清浓度在所述模型中在最初4-5周期间增加，并且随时间逐渐降低(Akieda等人,2015J.Immunol.194(9):4162-74)。
如图28A-图28C中所示，在第14天、第42天和第82天收集的血清显示，用示例性TACI-CTLA-4多结构域堆叠分子CTLA4 186-GSG4S-Fc-(G4S)4-TACI 541治疗导致在整个研究期间每种IgG同种型始终且持续的低水平，对于每种IgG同种型以及在每个所测试的时间点与Fc对照和TACI 30-110-FC-Fc两组显著不同。尽管对照分子WT TACI-Fc(阿巴西普)导致在第14天时间点如与仅Fc对照相比显著更低的每种IgG同种型的水平，且导致在第82天更低的IgG2b浓度，但是示例性TACI-CTLA-4多结构域堆叠分子导致在第42天和第82天时间点如与阿巴西普相比显著更低的每种IgG同种型的水平。总的来说，用示例性TACI-CTLA-4多结构域堆叠分子治疗小鼠与阿巴西普同等地或比阿巴西普更多地降低血清中这些致病性IgG同种型的水平，并且总是比TACI 30-110-FC-Fc更多地降低血清中这些致病性IgG同种型的水平。
血清抗dsDNA抗体分析
在研究期间随时间收集血清，并且根据制造商的说明书使用小鼠抗dsDNA IgG抗体测定试剂盒(Chondrex,Inc；雷蒙德，华盛顿州)分析第7天、第14天、第28天、第42天、第70天和第82天的样品中抗dsDNA抗体的浓度。与随时间变化的血清IgG同种型模式类似，抗dsDNA抗体水平在约6周达到峰值，并且在接下来的几周中逐渐降低。如图29中所示，对于示例性TACI-CTLA-4多结构域堆叠分子CTLA4 186-GSG4S-Fc-(G4S)4-TACI 541治疗组，在第7天、第14天、第28天、第42天、第70天和第82天从每个治疗组的小鼠子集收集并且通过ELISA测定的血清显示在每个时间点始终低水平的抗dsDNA抗体水平。在第14天、第28天和第42天，用WT TACI-Fc(阿巴西普)治疗导致比Fc对照组显著更低的抗dsDNA浓度，然而，在第7天和第82天，用示例性TACI-CTLA-4多结构域堆叠分子治疗显著低于阿巴西普组。这些结果显示，示例性TACI-CTLA-4多结构域堆叠分子始终比阿巴西普更有效地降低血清抗dsDNA抗体(SLE中重要的致病性抗体)的浓度。
淋巴细胞子集的免疫表型分型
在第82天处死小鼠，并如下收集血液和组织：将子宫颈淋巴结(LN)和部分脾置于冰上的杜氏磷酸盐缓冲盐水中用于流式细胞术。将该半脾和LN各自机械处理为单细胞悬浮液，将脾细胞中的红细胞(RBC)用1X RBC溶解缓冲液(Biolegend)溶解，并计数细胞。将来自脾和LN制剂的一百万个活细胞用流式细胞术试剂染色，并进行免疫表型分型以追踪淋巴细胞子集。
表E47显示所治疗小鼠的脾重量、脾细胞数量(脾细胞#)和不同细胞子集在脾中的百分比，如通过流式免疫表型分型所确定。表E48显示不同细胞子集在所治疗小鼠的子宫颈LN中的百分比。
结果显示对与SLE相关的免疫细胞子集的多种作用，包括与Fc对照治疗的小鼠相比，减少生发中心(GC)B细胞和CD4+TFH细胞的百分比和数量。此外，与其他治疗组相比，用TACI-CTLA4-Fc多结构域堆叠分子治疗减少脾和LN中的B220+细胞，绕过不成熟的T1细胞，但是显著减少脾中更成熟的边缘区(MZ)、T2、滤泡B细胞和产生抗体的浆细胞。不希望受理论束缚，这些结果表明，B细胞区室可以在洗除测试分子后从未受影响的T1细胞再生(repopulate)。
结果还证实，与Fc对照治疗相比，用TACI-CTLA-Fc多结构域堆叠分子治疗减少脾和LN中的CD4+和CD8+Tem并增加CD4+和CD8+Tcm细胞子集。此外，与其他治疗组中的每一个相比，用TACI-CTLA-Fc多结构域堆叠分子治疗还减小脾和LN中的ICOS+CD4+和CD8+细胞的百分比。
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ns＝不显著
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ns＝不显著
结论
这些结果支持，在慢性GVHD和SLE的诱导性小鼠模型中，多结构域TACI-CTLA-4堆叠分子(如示例性CTLA4 186-GSG4S-Fc-(G4S)4-TACI 541多结构域堆叠分子)能够抑制关键B淋巴细胞和T淋巴细胞子集的扩增并减少自身抗体和潜在致病性IgG的形成，在大多数情形中比TACI 30-110-Fc或阿巴西普更有效。这些发现表明，同时抑制BAFF/APRIL B细胞和CD80/86-CD28共刺激T细胞两种途径可以导致SLE中的显著疾病改善和对致病性淋巴细胞的控制。因此，通过多结构域TACI-CTLA-4多结构域堆叠分子获得的双重途径抑制剂可能是人SLE的有效治疗。
实施例16.示例性单体和四聚构建体的评估。
使用SEQ ID NO:356中所示的WT BCMA和SEQ ID NO:406中所示的BCMA vTD(H19L)生成含有一个(单体)或四个(四聚杠铃(barbell)和四聚串联)BCMA结构域的另外的BCMAFc融合蛋白。将单体和四聚BCMA WT和BCMA vTD格式化为具有Fc结构域的BCMA WT和BCMAvTD-Fc融合蛋白。示例性生成的Fc融合蛋白是基本上如实施例4中所述来生成，并且描述于表E49A-表E49C中。
简言之，为了生成作为单链Fc融合蛋白的重组单体免疫调节蛋白，生成编码DNA以编码如下蛋白质：WT BCMA或变体BCMA结构域，之后是12个氨基酸的接头(GSGGGGSGGGGS；SEQ ID NO:805)，之后是SEQ ID NO:852中所示的单链Fc(scFc)(由人IgG1无效应子Fc序列构成，其按照用于免疫球蛋白蛋白质(SEQ ID NO:589)的Eu索引编号系统含有突变L234A、L235E和G237A)，之后是(GGGGS)13接头(SEQ ID NO:806)，之后是第二人IgG1无效应子Fc序列(其按照用于免疫球蛋白蛋白质的Eu索引编号系统含有突变L234A、L235E和G237A)。所生成的分子总结于表E49A中。
为了生成作为Fc融合蛋白的重组四聚免疫调节蛋白，以如下不同格式生成蛋白质：
在一种格式中，生成编码DNA以编码如下三种不同的蛋白质形式：BCMA Fc(SEQ ID NO:813)：BCMA vTD结构域SEQ ID NO:406，之后是接头(G4S)3SEQ ID NO:595；之后是BCMAvTD结构域SEQ ID NO:406；之后是接头GSGGGGS SEQ ID NO:590；之后是人IgG1无效应子Fc序列(其按照用于免疫球蛋白蛋白质(SEQ ID NO:589)的Eu索引编号系统含有突变L234A、L235E和G237A)。
在一种格式中，生成编码DNA以编码如下三种不同的蛋白质形式：WT BCMA(SEQ ID NO:809)：WT BCMA结构域SEQ ID NO:356，之后是接头GSGGGGS SEQ ID NO:590；之后是人IgG1无效应子Fc序列(其按照用于免疫球蛋白蛋白质(SEQ ID NO:589)的Eu索引编号系统含有突变L234A、L235E和G237A)，之后是接头(G4S)3SEQ ID NO:595，之后是WT BCMA结构域SEQ ID NO:356。
在一种格式中，生成编码DNA以编码如下三种不同的蛋白质形式：BCMAFc SEQ ID NO:812)：SEQ ID NO:406中所示的BCMA vTD，之后是接头GSGGGGS SEQ ID NO:590；之后是人IgG1无效应子Fc序列(其按照用于免疫球蛋白蛋白质(SEQ ID NO:589)的Eu索引编号系统含有突变L234A、L235E和G237A)，之后是接头(G4S)3SEQ ID NO:595，之后是SEQ ID NO:406中所示的BCMA vTD。
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A.示例性多结构域分子的生物活性
在一项实验中，使用Jurkat/NF-κB/TACI报告细胞评估表E49A-表E49C中所示的示例性分子对APRIL或BAFF介导的信号传导的阻断。表E50提供抑制APRIL和BAFF介导的TACI信号传导的半最大抑制浓度(IC50)的值。在一些情况下，不将所测试的蛋白质与其亲代WT对照作比较，并且在下表中表示为(-)。表E50中的结果证实，所有生成的格式都阻断APRIL和BAFF介导的信号传导二者。
实施例17.多结构域T细胞和B细胞抑制性免疫调节蛋白的生成
大体上如实施例7A中所述生成作为同二聚Fc融合物的多结构域免疫调节蛋白，其含有(1)作为T细胞抑制分子(TIM)的野生型CTLA-4细胞外结构域；以及(2)作为B细胞抑制分子(BIM)的野生型TACI细胞外结构域部分或其变体，其与B细胞刺激性受体(如BCMA或APRIL)结合。
多结构域免疫调节蛋白的TIM(野生型CTLA-4)或BIM(野生型TACI或变体)以各种方式经由肽接头与Fc区的N末端或C末端连接，所述肽接头如GSGGGGS(SEQ ID NO:590)和(GGGGS)4(SEQ ID NO:600)。为了生成同二聚Fc融合物，使用多种示例性IgG1 Fc区，包括SEQ ID NO:589、822、823和824中所示的序列。
下表E51显示示例性生成的多结构域同二聚免疫调节Fc融合蛋白。
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本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施方案例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对所述组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践这样的变化，并且所述变化意图落入本公开文本的范围内。
综上所述，本发明包括但不限于以下项：
1.一种免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白包含：
(1)至少一种T细胞抑制分子(TIM)，所述至少一种T细胞抑制分子与(i)T细胞刺激性受体或(ii)T细胞刺激性受体的配体结合；和/或拮抗T细胞刺激性受体的活性；以及
(2)至少一种B细胞抑制分子(BIM)，所述至少一种B细胞抑制分子与B细胞刺激性受体的配体结合和/或拮抗B细胞刺激性受体的活性。
2.根据项1所述的免疫调节蛋白，其中所述TIM与T细胞刺激性受体的配体结合。
3.根据项2所述的免疫调节蛋白，其中：
所述T细胞刺激性受体是CD28；和/或
所述T细胞刺激性受体的配体是CD80或CD86。
4.根据项1-3中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述TIM是CTLA-4细胞外结构域或其与CD80或CD86结合的结合部分。
5.根据项4所述的免疫调节蛋白，其中所述CTLA-4细胞外结构域或其结合部分是(i)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，(ii)具有与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2至少85％的序列同一性的变体CTLA-4氨基酸序列；或者(iii)(i)或(ii)的包含IgV结构域的部分。
6.根据项4或项5所述的免疫调节蛋白，其中所述CTLA-4细胞外结构域或其结合部分示于SEQ ID NO:1中。
7.根据项4或项5所述的免疫调节蛋白，其中所述CTLA-4细胞外结构域或其结合部分是具有与SEQ ID NO:1或其包含所述IgV结构域的部分至少85％的序列同一性的变体CTLA-4氨基酸序列，其中所述变体CTLA-4序列包含SEQ ID NO:1或其包含所述IgV结构域的部分中的一个或多个氨基酸取代。
8.根据项7所述的免疫调节蛋白，其中所述变体CTLA-4序列包含氨基酸取代C122S。
9.根据项1-5、7和8中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述CTLA-4细胞外结构域或其结合部分示于SEQ ID NO:668中。
10.根据项7-9中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体CTLA-4与CD80和CD86的胞外域结合，任选地其中与SEQ ID NO:1中所示的序列或其包含所述IgV结构域的部分相比，与CD80和CD86中的一种或两种的结合亲和力有所增加。
11.根据项7-8和10中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括选自以下的氨基酸取代：L12F、R16H、G29W、T53S、M56T、N58S、L63P、L98Q或Y105L或其组合。
12.根据项7-8、10和11中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括G29W、L98Q和Y105L。
13.根据项7-8和10-12中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代是G29W/N58S/L63P/Q82R/L98Q/Y105L、L12F/R16H/G29W/M56T/L98Q/Y105L、T53S/L63P/L98Q或G29W/L98Q/Y105L。
14.根据项1-8和10-13中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述CTLA-4细胞外结构域或其结合部分示于以下中的任一项中：SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:165或SEQ ID NO:186或其包含所述IgV结构域的部分。
15.根据项1-14中任一项所述的免疫调节蛋白，其中：
B细胞刺激性受体的所述配体是APRIL或BAFF；和/或
所述B细胞刺激性受体是TACI、BCMA或BAFF受体。
16.根据项1-15中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述BIM是TACI细胞外结构域或其与APRIL、BAFF或BAFF/APRIL异三聚体结合的结合部分。
17.根据项16所述的免疫调节蛋白，其中所述TACI细胞外结构域或其结合部分是如以下所示的细胞外结构域序列：(i)SEQ ID NO:709中所示的氨基酸序列，(ii)具有与SEQID NO:709至少95％的序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)(i)或(ii)的包含CRD1结构域和CRD2结构域中的一个或两个的部分，所述部分与APRIL、BAFF或BAFF/APRIL异三聚体结合。
18.根据项16或项17所述的免疫调节蛋白，其中所述TACI细胞外结构域或其结合部分包含所述CRD1结构域和所述CRD2结构域。
19.根据项16-18中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述TACI细胞外结构域或其结合部分是SEQ ID NO:516中所示的截短的野生型TACI细胞外结构域。
20.根据项16或项17所述的免疫调节蛋白，其中所述TACI细胞外结构域或其结合部分是截短的野生型TACI细胞外结构域，所述截短的野生型TACI细胞外结构域含有富半胱氨酸结构域2(CRD2)但缺少完整的富半胱氨酸结构域1(CRD1)。
21.根据项16、项17或项20所述的免疫调节蛋白，其中所述TACI细胞外结构域或其结合部分是截短的野生型TACI细胞外结构域，关于SEQ ID NO:709中所示的位置，所述截短的野生型TACI细胞外结构域由氨基酸残基67-118内所含的包括氨基酸残基71-104的连续序列组成。
22.根据项20或项21所述的免疫调节蛋白，其中所述截短的野生型TACI细胞外结构域或其结合部分的长度为35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、59、50或51个氨基酸。
23.根据项16、17和20-22中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述TACI细胞外结构域或其结合部分示于SEQ ID NO:528中。
24.根据项16或项17所述的免疫调节蛋白，其中所述TACI细胞外结构域或其结合部分是变体TACI多肽，所述变体TACI多肽包含参考TACI多肽的细胞外结构域(ECD)或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于SEQ ID NO:709中所示位置编号的选自40、59、60、61、74、75、76、77、78、79、82、83、84、85、86、87、88、92、95、97、98、99、101、102和103的位置处。
25.根据项24所述的免疫调节蛋白，其中所述参考TACI多肽是截短的多肽，所述截短的多肽由TACI的细胞外结构域或其与APRIL、BAFF或BAFF/APRIL异三聚体结合的特异性结合部分组成。
26.根据项24或项25所述的免疫调节蛋白，其中所述参考TACI多肽包含SEQ IDNO:709中所示的氨基酸序列，或其包含CRD1结构域和CRD2结构域中的一个或两个的部分，所述部分与APRIL、BAFF或BAFF/APRIL异三聚体结合。
27.根据项24-26中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考TACI多肽包含所述CRD1结构域和所述CRD2结构域。
28.根据项24-27中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考TACI多肽示于SEQID NO:516中。
29.根据项24-26中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考TACI多肽是截短的野生型TACI细胞外结构域，所述截短的野生型TACI细胞外结构域含有富半胱氨酸结构域2(CRD2)但缺少完整的富半胱氨酸结构域1(CRD1)，其中所述变体TACI多肽包含所述截短的野生型TACI细胞外结构域中的一个或多个氨基酸取代。
30.根据项29所述的免疫调节蛋白，其中关于SEQ ID NO:122中所示的位置，所述截短的野生型TACI细胞外结构域由氨基酸残基67-118内所含的包括氨基酸残基71-104的连续序列组成。
31.根据项29或项30所述的免疫调节蛋白，其中所述截短的野生型TACI细胞外结构域的长度为35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、59、50或51个氨基酸。
32.根据项24-26和29-31中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考TACI多肽基本上由所述CRD2结构域组成。
33.根据项24-26和29-31中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考TACI多肽包含SEQ ID NO:528中所示的序列。
34.根据项24-26和29-33中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考TACI多肽示于SEQ ID NO:528中。
35.根据项24-34中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体TACI多肽包含在对应于SEQ ID NO:709中所示编号的选自74、75、76、77、78、79、82、83、84、85、86、87、88、92、95、97、98、99、101、102和103的位置处的一个或多个氨基酸取代。
36.根据项35所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代选自E74V、Q75E、Q75R、G76S、K77E、F78Y、Y79F、L82H、L82P、L83S、R84G、R84L、R84Q、D85E、D85V、C86Y、I87L、I87M、S88N、I92V、Q95R、P97S、K98T、Q99E、A101D、Y102D、F103S、F103V、F103Y或其保守氨基酸取代。
37.根据项35或项36所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括E74V、K77E、Y79F、L82H、L82P、R84G、R84L、R84Q、D85V或C86Y中的至少一个。
38.根据项35-37中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括选自以下的氨基酸取代：Q75E、K77E、F78Y、R84G、R84Q、A101D和Y102D或其任何组合。
39.根据项35-38中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代是D85E/K98T、I87L/K98T、L82P/I87L、G76S/P97S、K77E/R84L/F103Y、Y79F/Q99E、L83S/F103S、K77E/R84Q、K77E/A101D、K77E/F78Y/Y102D、Q75E/R84Q、Q75R/R84G/I92V、K77E/A101D/Y102D、R84Q/S88N/A101D、R84Q/F103V、K77E/Q95R/A101D或I87M/A101D。
40.根据项35-39中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代是K77E/F78Y/Y102D、Q75E/R84Q或R84G。
41.根据项35-40中任一项所述的免疫调节蛋白，其中与所述参考TACI多肽相比，所述变体TACI多肽具有增加的与APRIL和BAFF中的一种或两种的结合亲和力。
42.根据项41所述的免疫调节蛋白，其中所述增加的对BAFF或APRIL的结合亲和力是独立地增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。
43.根据项35-42中任一项所述的免疫调节蛋白，其中：
所述变体TACI多肽包含SEQ ID NO:517-527、536、537、682-701中任一项中所示的序列；或者
所述变体TACI多肽包含SEQ ID NO:529-535、538-550、673-681或760-772中任一项中所示的序列。
44.根据项35-43中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体TACI多肽示于以下中的任一项中：SEQ ID NO:535、SEQ ID NO:541、SEQ ID NO:542或SEQ ID NO:688。
45.根据项1-15中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述BIM是BCMA细胞外结构域或其与APRIL、BAFF或BAFF/APRIL异三聚体结合的结合部分。
46.根据项45所述的免疫调节蛋白，其中所述BCMA细胞外结构域或其结合部分是如以下所示的细胞外结构域序列：(i)SEQ ID NO:356中所示的氨基酸序列，(ii)具有与SEQID NO:356至少95％的序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)(i)或(ii)的包含CRD结构域的部分。
47.根据项45或项46所述的免疫调节蛋白，其中所述BCMA多肽或其结合部分示于SEQ ID NO:356中。
48.根据项45或项46所述的免疫调节蛋白，其中所述BCMA细胞外结构域或其结合部分是变体BCMA多肽，所述变体BCMA多肽包含参考BCMA多肽的细胞外结构域(ECD)中的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于SEQ ID NO:710中所示编号的选自9、10、11、14、16、19、20、22、25、27、29、30、31、32、35、36、39、43、45、46、47和48的位置处。
49.一种免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白包含变体BCMA多肽，其中所述变体BCMA多肽包含参考BCMA多肽的细胞外结构域(ECD)中的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于SEQ ID NO:710中所示位置编号的选自9、10、11、14、16、19、20、22、25、27、29、30、31、32、35、36、39、43、45、46、47和48的位置处。
50.一种免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白包含变体BCMA-Fc融合蛋白，其中所述变体BCMA-Fc融合蛋白包含变体BCMA多肽、Fc区以及所述BCMA多肽与所述Fc区之间的接头，其中所述变体BCMA多肽包含参考BCMA多肽的细胞外结构域(ECD)中的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代对应于关于SEQ ID NO:710中所示的位置选自9、10、11、14、16、19、20、22、25、27、29、30、31、32、35、36、39、43、45、46、47和48的位置。
51.根据项48-50中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考BCMA多肽是BCMA的细胞外结构域或其与APRIL、BAFF或BAFF/APRIL异三聚体结合的结合部分。
52.根据项48-51中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考BCMA缺少N末端甲硫氨酸。
53.根据项48-52中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考BCMA多肽包含SEQIDNO:356中所示的氨基酸序列，或其包含CRD结构域的部分。
54.根据项48-53中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述参考BCMA多肽示于SEQIDNO:356中。
55.根据项48-54中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代选自S9G、S9N、S9Y、Q10E、Q10P、N11D、N11S、F14Y、S16A、H19A、H19C、H19D、H19E、H19F、H19G、H19I、H19K、H19L、H19M、H19N、H19P、H19Q、H19R、H19S、H19T、H19V、H19W、H19Y、A20T、I22L、I22V、Q25E、Q25F、Q25G、Q25H、Q25I、Q25K、Q25L、Q25M、Q25S、Q25V、Q25Y、R27H、R27L、S29P、S30G、S30Y、N31D、N31G、N31H、N31K、N31L、N31M、N31P、N31S、N31V、N31Y、T32I、T32S、L35A、L35M、L35P、L35S、L35V、L35Y、T36A、T36G、T36N、T36M、T36S、T36V、R39L、R39Q、A43E、A43S、V45A、V45D、V45I、T46A、T46I、N47D、N47Y、S48G或其保守氨基酸取代。
56.根据项48-55中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包括选自以下的至少一个氨基酸取代：H19F、H19K、H19L、H19M、H19R或H19Y。
57.根据项48-56中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代是H19Y/S30G；H19Y/V45A；F14Y/H19Y；H19Y/V45D；H19Y/A43E；H19Y/T36A；H19Y/I22V；N11D/H19Y；H19Y/T36M；N11S/H19Y；H19Y/L35P/T46A；H19Y/N47D；S9D/H19Y；H19Y/S30G/V45D；H19Y/R39Q；H19Y/L35P；S9D/H19Y/R27H；Q10P/H19Y/Q25H；H19Y/R39L/N47D；N11D/H19Y/N47D；H19Y/T32S；N11S/H19Y/S29P；H19Y/R39Q/N47D；S16A/H19Y/R39Q；S9N/H19Y/N31K/T46I；H19Y/R27L/N31Y/T32S/T36A；N11S/H19Y/T46A；H19Y/T32I；S9G/H19Y/T36S/A43S；H19Y/S48G；S9N/H19Y/I22V/N31D；S9N/H19Y/Q25K/N31D；S9G/H19Y/T32S；H19Y/T36A/N47Y；H19Y/V45A/T46I；H19Y/Q25K/N31D；H19Y/Q25H/R39Q/V45D；H19Y/T32S/N47D；Q10E/H19Y/A20T/T36S；H19Y/T32S/V45I；H19F/Q25E/N31L/L35Y/T36S；H19F/Q25F/N31S/T36S；H19I/Q25F/N31S/T36V；H19F/Q25V/N31M/T36S；H19Y/Q25Y/N31L/L35Y/T36S；H19F/Q25I/N31M/L35A/T36S；H19I/Q25L/N31L/L35Y/T36S；H19F/Q25L/N31G/L35P/T36A；H19Y/I22L/N31G；H19F/I22V/Q25M/N31P/T36M；H19Y/N31L/L35Y/T36S；H19L/S30G/N31H/L35A；H19L/Q25S/N31V/L35S/T36V；H19L/Q25S/S30Y/N31G/L35M/T36V；H19F/Q25F/N31L/L35Y/T36S；H19F/Q25F/N31S/T36G；H19F/I22V/Q25S/N31V/L35S/T36V；H19F/Q25G/N31S/L35V/T36N；H19L/Q25H/N31D/L35S；或H19F/Q25F/N31S/L35Y/T36S。
58.根据项48-57中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代是或包括H19F、H19L、H19K、H19M、H19R、H10Y、N11D/H19Y/N47D、H19Y/R39Q/N47D；S16A/H19Y/R39Q、S9G/H19Y/T32S；H19Y/T36A/N47Y；或Q10E/H19Y/A20T/T36S。
59.根据项48-58中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代是或包括S16A/H19Y/R39Q。
60.根据项48-59中任一项所述的免疫调节蛋白，其中与所述参考TACI多肽相比，所述变体BCMA多肽具有增加的与APRIL和BAFF中的一种或两种的结合亲和力。
61.根据项60所述的免疫调节蛋白，其中所述增加的对BAFF或APRIL的结合亲和力是独立地增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。
62.根据项48-61中任一项所述的免疫调节蛋白，其中与所述参考BCMA多肽相比，所述变体BCMA多肽具有多达10个氨基酸取代。
63.根据项48-61中任一项所述的免疫调节蛋白，其中与所述参考BCMA多肽相比，所述变体BCMA多肽具有多达5个氨基酸取代。
64.根据项48-63中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体BCMA多肽具有与SEQ ID NO:356至少90％的序列同一性。
65.根据项48-64中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体BCMA多肽具有与SEQ ID NO:356至少95％的序列同一性。
66.根据项48-65中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体BCMA多肽包含SEQID NO:357-435中任一项中所示的序列。
67.根据项48-66中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体BCMA多肽示于以下中的任一项中：SEQ ID NO:357、377、380、381、390、391、396、402、405、406、407或411。
68.根据项49和51-67中任一项所述的免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白包含与所述变体BCMA多肽连接的异源部分。
69.根据项68所述的免疫调节蛋白，其中所述异源部分是半衰期延长部分、多聚化结构域、与细胞表面上的分子结合的靶向部分或可检测标记。
70.根据项69所述的免疫调节蛋白，其中所述半衰期延长部分包括多聚化结构域、白蛋白、白蛋白结合多肽、Pro/Ala/Ser(PAS)、人绒毛膜促性腺素的β亚基的C末端肽(CTP)、聚乙二醇(PEG)、长非结构化亲水氨基酸序列(XTEN)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合小分子或其组合。
71.根据项49和51-67中任一项所述的免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白是BCMA-Fc融合蛋白，其中所述变体BCMA多肽与免疫球蛋白的Fc区连接，任选地经由接头来连接。
72.根据项50-71中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述接头包括肽接头并且所述肽接头选自GSGGS(SEQ ID NO:592)、GGGGS(G4S；SEQ ID NO:593)、GSGGGGS(SEQ ID NO:590)、GGGGSGGGGS(2xGGGGS；SEQ ID NO:594)、GGGGSGGGGSGGGGS(3xGGGGS；SEQ ID NO:595)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(4xGGGGS；SEQ ID NO:600)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(5XGGGGS；SEQ ID NO:671)、GGGGSSA(SEQ ID NO:596)或其组合。
73.根据项1-48和51-67中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白是单一多肽链，所述单一多肽链包含被接头隔开的所述至少一个TIM和所述至少一个BIM。
74.根据项73所述的免疫调节蛋白，其中所述至少一个TIM在所述多肽中位于所述至少一个BIM的氨基末端。
75.根据项73所述的免疫调节蛋白，其中所述至少一个TIM在所述多肽中位于所述至少一个BIM的羧基末端。
76.根据项73-75中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述接头包括肽接头并且所述肽接头选自GSGGS(SEQ ID NO:592)、GGGGS(G4S；SEQ ID NO:593)、GSGGGGS(SEQ ID NO:590)、GGGGSGGGGS(2xGGGGS；SEQ ID NO:594)、GGGGSGGGGSGGGGS(3xGGGGS；SEQ ID NO:595)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(4xGGGGS；SEQ ID NO:600)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(5XGGGGS；SEQ ID NO:671)、GGGGSSA(SEQ ID NO:596)、SEQ ID NO:711(1xEAAAK)、SEQ IDNO:712(2xEAAAK)、SEQ ID NO:713(3xEAAAK)、SEQ ID NO:714(4xEAAAK)、SEQ ID NO:715(5xEAAAK)、SEQ ID NO:665(6xEAAAK)或其组合。
77.根据项1-48、51-67和73-76中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白包含SEQ ID NO:618-623或703-708中任一项中所示的氨基酸序列，或者展现与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性且保留活性的序列。
78.根据项1-48和51-67中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述至少一个TIM或所述至少一个BIM与促进二聚化的多聚化部分连接，其中所述免疫调节蛋白是二聚体。
79.根据项78所述的免疫调节蛋白，其中所述多聚化结构域是免疫球蛋白Fc区。
80.根据项50-72和79中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区是同二聚Fc区，并且所述免疫调节蛋白是包含相同多肽的两个相同拷贝的同二聚体。
81.根据项50-72、79和80中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区是IgG2 Fc结构域，任选地其中所述IgG2 Fc结构域包含SEQ ID NO:726或822中所示的氨基酸序列或者展现与SEQ ID NO:726或822至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
82.根据项50-72、79和80中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区是包含氨基酸取代S228P的IgG4 Fc结构域，任选地其中所述Fc结构域包含SEQ ID NO:728或823中所示的氨基酸序列，或者展现与SEQ ID NO:728或823至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
83.根据项50-72、79和80中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc是IgG1Fc结构域，或者是其展现降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能的变体，任选地如与野生型IgG1 Fc结构域相比。
84.根据项50-72、79、80和83中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc包含SEQ ID NO:597中所示的氨基酸序列。
85.根据项50-72、79、80和83中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc是变体IgG1 Fc结构域，所述变体IgG1 Fc结构域包含按照EU编号选自L234A、L234V、L235A、L235E、G237A、S267K、R292C、N297G和V302C的一个或多个氨基酸取代。
86.根据项85所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区含有按照EU编号的氨基酸取代L234A、L235E和G237A。
87.根据项50-72、79、80、83、85和86中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述Fc是变体Fc，所述变体Fc包含SEQ ID NO:589或SEQ ID NO:824中所示的氨基酸序列。
88.根据项50-72、80和83-87中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述BCMA-Fc融合蛋白包含以下结构：BCMA多肽(BCMA)-接头-Fc区。
89.根据项50-72、80和83-88中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述BCMA-Fc融合蛋白示于SEQ ID NO:629中。
90.一种免疫调节性BCMA-Fc融合蛋白，所述免疫调节性BCMA-Fc融合蛋白是包含通过共价二硫键连接的SEQ ID NO:629中所示的BCMA-Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
91.根据项50-72、80和83-87中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述BCMA-Fc融合蛋白包含以下结构：(BCMA)-接头-Fc区-接头-(BCMA)。
92.根据项50-72、80、83-87和91中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述BCMA-Fc融合蛋白示于SEQ ID NO:809或SEQ ID NO:812中。
93.根据项50-72、80和83-87中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述BCMA-Fc融合蛋白包含以下结构：(BCMA)-接头-(BCMA)-接头-Fc区。
94.根据项50-72、80、83-87和93中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述BCMA-Fc融合蛋白示于SEQ ID NO:813中。
95.根据项50-72、80和83-94中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述Fc融合蛋白中和APRIL和BAFF。
96.根据项95所述的免疫调节蛋白，其中：
中和APRIL的IC50是小于100pM、小于50pM、小于40pM、小于30pM、小于20pM、小于10pM、小于5pM或小于1pM，或者是前述任何项之间的任何值；和/或
中和BAFF的IC50是小于400pM、小于300pM、小于200pM、小于100pM、小于75pM、小于50pM、小于25pm或小于10pM，或者是前述任何项之间的任何值。
97.根据项50-72、80和83-96中任一项所述的免疫调节蛋白，其中：
所述Fc融合蛋白阻断APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体与BCMA或TACI的结合；和/或
所述Fc融合蛋白在施用至受试者之后降低血液中循环APRIL、BAFF或APRIL/BAFF的水平。
98.根据项80-87中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述同二聚体的每个多肽包含所述至少一个TIM和所述至少一个BIM，并且其中所述至少一个TIM在每个多肽中位于所述至少一个BIM的氨基末端。
99.根据项80-87中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述同二聚体的每个多肽包含所述至少一个TIM和所述至少一个BIM，并且其中所述至少一个TIM在每个多肽中位于所述至少一个BIM的羧基末端。
100.根据项1-44、78-87、98和99中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白包含SEQ ID NO:610-617、624-627、637、638、643、644、648、653 654和759-792中任一项中所示的氨基酸序列或者展现与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性且保留活性的序列。
101.根据项1-44、78-87和98-100中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述TIM是野生型CTLA-4细胞外结构域或其结合部分，并且所述BIM是包含对应于SEQ ID NO:709中所示位置的氨基酸取代K77E/F78Y/Y102D、Q75E/R84Q或R84G的TACI细胞外结构域或其结合部分，任选地其中所述TIM示于SEQ ID NO:1中并且所述BIM示于SEQ ID NO:535、541、542或688中。
102.根据项1-44、78-87和98-101中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白包含SEQ ID NO:611、SEQ ID NO:788、SEQ ID NO:789、SEQ ID NO:790或SEQ ID NO:792中所示的序列。
103.一种免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白是包含通过共价二硫键连接的SEQ IDNO:611中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
104.一种免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白是包含通过共价二硫键连接的SEQ IDNO:788中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
105.一种免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白是包含通过共价二硫键连接的SEQ IDNO:789中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
106.一种免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白是包含通过共价二硫键连接的SEQ IDNO:790中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
107.一种免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白是包含通过共价二硫键连接的SEQ IDNO:792中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
108.根据项1-44、78-87和98-100中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述TIM是野生型CTLA-4细胞外结构域或其结合部分，并且所述BIM是包含CRD2结构域的截短的TACI细胞外结构域，任选地其中所述TIM示于SEQ ID NO:1中并且所述BIM示于SEQ ID NO:528中。
109.根据项1-44、78-87、98-100和108中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白包含SEQ ID NO:759、SEQ ID NO:786、SEQ ID NO:787或SEQ ID NO:791中所示的序列。
110.一种免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白是包含通过共价二硫键连接的SEQ IDNO:759中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
111.一种免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白是包含通过共价二硫键连接的SEQ IDNO:786中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
112.一种免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白是包含通过共价二硫键连接的SEQ IDNO:787中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
113.一种免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白是包含通过共价二硫键连接的SEQ IDNO:791中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
114.根据项1-44、78-87和98-100中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述TIM是包含对应于SEQ ID NO:1中所示位置的氨基酸取代G29W/L98Q/Y105L的CTLA-4细胞外结构域或其结合部分，并且所述BIM是包含对应于SEQ ID NO:709中所示位置的氨基酸取代K77E/F78Y/Y102D、Q75E/R84Q或R84G的TACI细胞外结构域或其结合部分，任选地其中所述TIM示于SEQ ID NO:186中并且所述BIM示于SEQ ID NO:535、541、542或688中。
115.根据项1-44、78-87、98-100和114中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白包含SEQ ID NO:610中所示的序列。
116.一种免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白包含通过共价二硫键连接的SEQ IDNO:610中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝。
117.根据项1-15、45-48、51-67、78-87、98和99中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白包含SEQ ID NO:601-609、631-636、645-647、649-652、655-659中任一项中所示的氨基酸序列，或者展现与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性且保留活性的序列。
118.根据项1-15、45-48、51-67、78-87、98、99和117中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述TIM是野生型CTLA-4细胞外结构域或其结合部分，并且所述BIM是包含对应于SEQ ID NO:710中所示位置的氨基酸取代H19L的BCMA细胞外结构域或其结合部分，任选地其中所述TIM示于SEQ ID NO:1中并且所述BIM示于SEQ ID NO:406中，更任选地其中所述免疫调节蛋白包含SEQ ID NO:602中所示的序列。
119.一种免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白是包含通过共价二硫键连接的SEQ IDNO:602中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
120.根据项1-15、45-48、51-67、78-87、98、99和117中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述TIM是包含对应于SEQ ID NO:1中所示位置的氨基酸取代G29W/L98Q/Y105L的CTLA-4细胞外结构域或其结合部分，并且所述BIM是关于SEQ ID NO:710中所示位置包含氨基酸取代H19L的BCMA细胞外结构域或其结合部分，任选地其中所述TIM示于SEQ ID NO:186中并且所述BIM示于SEQ ID NO:406，更任选地其中所述免疫调节蛋白包含SEQ ID NO:601中所示的序列。
121.一种免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白是包含通过共价二硫键连接的SEQ IDNO:601中所示的Fc融合蛋白的两个相同拷贝的同二聚体。
122.根据项79所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区是异二聚Fc区，并且所述免疫调节蛋白是包含第一和第二多肽的异二聚体，其中所述第一多肽包含所述至少一个BIM或所述至少一个TIM中的一个，并且所述第二多肽包含所述至少一个BIM和所述至少一个TIM中的另一个。
123.根据项122所述的免疫调节蛋白，其中所述异二聚Fc包含野生型Fc结构域中的一个或多个氨基酸修饰以在所述多肽之间实现异二聚体形成，任选地其中所述野生型Fc区是IgG1 Fc区。
124.根据项123所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸修饰选自杵臼结构修饰和电荷突变，所述电荷突变用于因电荷排斥而减少或防止自缔合。
125.根据项122-124中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述异二聚Fc区还包含一个或多个氨基酸取代以降低与Fc受体的结合亲和力和/或降低效应子功能，任选地如与野生型IgG1 Fc结构域相比。
126.根据项125所述的免疫调节蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代按照EU编号选自L234A、L234V、L235A、L235E、G237A、S267K、R292C、N297G和V302C。
127.根据项125或项126所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区含有按照EU编号的氨基酸取代L234A、L235E和G237A。
128.根据项122-127中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述异二聚体包含含有SEQ ID NO:662或663中所示的氨基酸序列的第一多肽和含有SEQ ID NO:660中所示的氨基酸序列的第二多肽。
129.根据项1-128中任一项所述的免疫调节蛋白，其中：
所述免疫调节蛋白阻断APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体与BCMA或TACI的结合；和/或
所述免疫调节蛋白在施用至受试者之后降低血液中循环APRIL、BAFF或APRIL/BAFF的水平。
130.根据项1-129中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白降低或抑制B细胞成熟、分化和/或增殖。
131.根据项1-48、51-87和98-130中任一项所述的免疫调节蛋白，其中：
所述免疫调节蛋白阻断CD80或CD86与共刺激受体的结合，任选地其中所述共刺激受体是CD28；和/或
所述免疫调节蛋白降低或抑制T细胞共刺激。
132.一种或多种核酸分子，所述一种或多种核酸分子编码根据项1-131中任一项所述的免疫调节蛋白。
133.一种载体，所述载体包含根据项132所述的核酸分子。
134.根据项133所述的载体，所述载体是表达载体。
135.根据项133或项134所述的载体，其中所述载体是哺乳动物表达载体或病毒载体。
136.一种细胞，所述细胞包含根据项132所述的核酸或根据项133-135中任一项所述的载体。
137.一种产生免疫调节蛋白的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达所述蛋白质的条件下将根据项132所述的核酸分子或根据项133-135中任一项所述的载体引入所述细胞中。
138.根据项137所述的方法，所述方法还包括从所述细胞分离或纯化所述免疫调节蛋白。
139.一种通过根据项137或项138所述的方法产生的免疫调节蛋白。
140.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据项1-131和139中任一项所述的免疫调节蛋白。
141.根据项140所述的药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂。
142.一种制品，所述制品包含在小瓶或容器中的根据项140或项141中任一项所述的药物组合物。
143.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据项142所述的制品和使用说明书。
144.一种降低受试者的免疫应答的方法，所述方法包括将根据项1-131中任一项所述的免疫调节蛋白或者根据项140或项141所述的药物组合物施用至有需要的受试者。
145.根据项144所述的方法，其中B细胞免疫应答在所述受试者中降低，借此使B细胞成熟、分化和/或增殖降低或抑制。
146.根据项144或项145所述的方法，其中APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体的循环水平在所述受试者中降低。
147.根据项144-146中任一项所述的方法，其中T细胞免疫应答在所述受试者中降低，借此使T细胞共刺激降低或抑制。
148.根据项144-147中任一项所述的方法，其中降低所述免疫应答治疗所述受试者的疾病、障碍或病症。
149.一种降低受试者的APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体的循环水平的方法，所述方法包括将根据项1-131中任一项所述的免疫调节蛋白或者根据项140或项141所述的药物组合物施用至所述受试者。
150.一种治疗受试者的疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括将根据项1-131中任一项所述的免疫调节蛋白或者根据项140或项141所述的药物组合物施用至有需要的受试者。
151.根据项148或项150所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是自身免疫性疾病、和炎性病症、B细胞癌症、抗体介导的病状、肾病、移植物排斥、移植物抗宿主病或病毒感染。
152.根据项148、项150或项151所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症选自：系统性红斑狼疮(SLE)；舍格伦综合征、硬皮病、多发性硬化、糖尿病、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、IgA肾病、IgA血管炎、视神经炎、淀粉样变性、抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性多内分泌腺综合征II型(APS II)、自身免疫性甲状腺疾病(AITD)、格雷夫斯病、自身免疫性肾上腺炎和寻常型天疱疮。
153.根据项148和150-152中任一项所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是B细胞癌症并且所述癌症是骨髓瘤。
154.根据项140或项141所述的药物组合物，其用于降低受试者的免疫应答。
155.根据项1-131中任一项所述的免疫调节蛋白或者根据项140或项141所述的药物组合物在制造用于降低受试者的免疫应答的药物中的用途。
156.根据项154所述的用于所述用途的药物组合物或根据项155所述的用途，其中所述免疫应答是B细胞免疫应答，其中降低所述免疫应答降低或抑制B细胞成熟、分化和/或增殖。
157.根据项154-156中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据项154-156中任一项所述的用途，其中降低所述免疫应答降低所述受试者的APRIL、BAFF或APRIL/BAFF异三聚体的循环水平。
158.根据项154-157中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据项154-157中任一项所述的用途，其中T细胞免疫应答在所述受试者中降低，借此使T细胞共刺激降低或抑制。
159.根据项154-158中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据项154-158中任一项所述的用途，其中降低所述免疫应答治疗所述受试者的疾病、障碍或病症。
160.根据项140或项141所述的药物组合物，其用于治疗受试者的疾病、障碍或病症。
161.根据项1-131中任一项所述的免疫调节蛋白或者根据项140或项141所述的药物组合物在制造用于治疗受试者的疾病、障碍或病症的药物中的用途。
162.根据项160所述的用于所述用途的药物组合物或根据项161所述的用途，其中所述疾病、障碍或病症是自身免疫性疾病、炎性病症、B细胞癌症、抗体介导的病状、肾病、移植物排斥、移植物抗宿主病或病毒感染。
163.根据项159-162中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据项159-162中任一项所述的用途，其中所述疾病、障碍或病症选自：系统性红斑狼疮(SLE)；舍格伦综合征、硬皮病、多发性硬化、糖尿病、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、IgA肾病、IgA血管炎、视神经炎、淀粉样变性、抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫性多内分泌腺综合征II型(APS II)、自身免疫性甲状腺疾病(AITD)、格雷夫斯病、自身免疫性肾上腺炎和寻常型天疱疮。
164.根据权利要求159-162中任一项所述的用于所述用途的药物组合物或根据权利要求159-162中任一项所述的用途，其中所述疾病、障碍或病症是B细胞癌症并且所述癌症是骨髓瘤。

Claims (10)

1.一种免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白包含：
(1)至少一种T细胞抑制分子(TIM)，所述至少一种T细胞抑制分子与(i)T细胞刺激性受体或(ii)T细胞刺激性受体的配体结合；和/或拮抗T细胞刺激性受体的活性；以及
(2)至少一种B细胞抑制分子(BIM)，所述至少一种B细胞抑制分子与B细胞刺激性受体的配体结合和/或拮抗B细胞刺激性受体的活性。
2.根据权利要求1所述的免疫调节蛋白，其中所述TIM与T细胞刺激性受体的配体结合。
3.根据权利要求2所述的免疫调节蛋白，其中：
所述T细胞刺激性受体是CD28；和/或
所述T细胞刺激性受体的配体是CD80或CD86。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述TIM是CTLA-4细胞外结构域或其与CD80或CD86结合的结合部分。
5.根据权利要求4所述的免疫调节蛋白，其中所述CTLA-4细胞外结构域或其结合部分是(i)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，(ii)具有与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2至少85％的序列同一性的变体CTLA-4氨基酸序列；或者(iii)(i)或(ii)的包含IgV结构域的部分。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的免疫调节蛋白，其中所述CTLA-4细胞外结构域或其结合部分示于SEQ ID NO:1中。
7.根据权利要求4或权利要求5所述的免疫调节蛋白，其中所述CTLA-4细胞外结构域或其结合部分是具有与SEQ ID NO:1或其包含所述IgV结构域的部分至少85％的序列同一性的变体CTLA-4氨基酸序列，其中所述变体CTLA-4序列包含SEQ ID NO:1或其包含所述IgV结构域的部分中的一个或多个氨基酸取代。
8.根据权利要求7所述的免疫调节蛋白，其中所述变体CTLA-4序列包含氨基酸取代C122S。
9.根据权利要求1-5、7和8中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述CTLA-4细胞外结构域或其结合部分示于SEQ ID NO:668中。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体CTLA-4与CD80和CD86的胞外域结合，任选地其中与SEQ ID NO:1中所示的序列或其包含所述IgV结构域的部分相比，与CD80和CD86中的一种或两种的结合亲和力有所增加。
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