JP6955507B2 - Pd‐1及びctla‐4との免疫応答性を有する二重特異性並びにその使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許出願第62/266,944号(2015年12月14日出願;係属中)の一部継続出願であり、また上記特許出願に対する優先権を主張するものであり、上記出願はその全体が本出願に援用される。
本出願は、連邦規則法典第37巻第1.821節以下による1つ又は複数の配列表を含み、これらの配列表は、コンピュータ可読媒体(ファイル名:1301_0134PCT_ST25.txt、2016年12月4日作成、サイズ:186,040バイト)において開示されており、上記ファイルは、参照によりその全体が本出願に援用される。
哺乳類の免疫系は、癌細胞を認識して排除する体制を自然に取っている(非特許文献1)。健康な個体では、免疫系は静止状態であり、多様な阻害性受容体及びリガンドによって阻害される。このような免疫「チェックポイント(checkpoint)」経路は、自己寛容性を維持する(即ち被検体が自身の細胞に対する免疫系の攻撃を発生させること(「自己免疫(autoimmune)応答」)を防止する)にあたって、及び抗菌又は抗アレルギ性免疫応答中の付帯的な組織損傷を制限するにあたって、重要である。癌抗原の認識、微生物病原体の検出又はアレルゲンの存在が発生すると、活性化受容体及びリガンドのアレイは、免疫系の活性化を誘発する。このような活性化は、マクロファージ、ナチュラルキラー(NK)細胞及び抗原特異性細胞傷害性T細胞の活性化につながり、様々なサイトカインの放出を促進し、これらのサイトカインは全て、被検体の健康に対する知覚された脅威に対抗するよう作用する(非特許文献2、3、4)。免疫系は、相殺阻害性免疫シグナルが活性化免疫シグナルよりも大きい場合に、その正常な静止状態に戻ることができる。
細胞傷害性T‐リンパ球関連タンパク質‐4(CTLA‐4;CD152)は、ジスルフィド結合ホモ二量体を形成するシングルパスI型膜タンパク質である(非特許文献10)。異なるアイソフォームをエンコードする複数の選択スプライス変異体が特性決定されており、これはモノマーとして機能する可溶性アイソフォームを含む(非特許文献11、12)。
プログラム死‐1(「PD‐1」、「CD279」としても公知)は、免疫応答を幅広く下方制御するT細胞制御因子の拡張CD28/CTLA‐4ファミリーの、およそ31kDのI型膜タンパク質メンバーである(非特許文献26、特許文献3〜11)。
上記分子は:
(A)PD‐1に結合する抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン;並びに
(B)CTLA‐4に結合する抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン
を備え、
ここで上記二重特異性結合分子は:
(i)2つ、3つ、4つ若しくは5つのポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、ダイアボディ;又は
(ii)3つ、4つ、5つ又は6つ以上のポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、3価結合性分子
である。
(A)FcγRに対する上記変異型Fc領域の親和性を低減する1つ若しくは複数のアミノ酸修飾;及び/又は
(B)上記変異型Fc領域の血清半減期を向上させる1つ若しくは複数のアミノ酸修飾
を備える、変異型Fc領域である、上述の二重特異性分子の実施形態に関する。
(A)免疫細胞増殖;並びに/又は
(B)免疫細胞産生及び/若しくは少なくとも1つのサイトカインの放出;並びに/又は
(C)免疫細胞産生及び/若しくは少なくとも1つの溶解性分子の放出;並びに/又は
(D)少なくとも1つの活性化マーカの、免疫細胞発現
をもたらす、上述の全ての二重特異性分子の実施形態に関する。
(A)PD‐1 mAb 1のVHドメイン(配列番号47)及びPD‐1 mAb 1のVLドメイン(配列番号48);又は
(B)PD‐1 mAb 2のVHドメイン(配列番号49)及びPD‐1 mAb 2のVLドメイン(配列番号50);又は
(C)PD‐1 mAb 3のVHドメイン(配列番号51)及びPD‐1 mAb 3のVLドメイン(配列番号52);又は
(D)PD‐1 mAb 4のVHドメイン(配列番号53)及びPD‐1 mAb 4のVLドメイン(配列番号54);又は
(E)PD‐1 mAb 5のVHドメイン(配列番号55)及びPD‐1 mAb 5のVLドメイン(配列番号56);又は
(F)PD‐1 mAb 6のVHドメイン(配列番号57)及びPD‐1 mAb 6のVLドメイン(配列番号58);又は
(G)PD‐1 mAb 6‐I VHのVHドメイン(配列番号86)及びPD‐1 mAb 6‐SQ VLのVLドメイン(配列番号87);又は
(H)PD‐1 mAb 7のVHドメイン(配列番号59)及びPD‐1 mAb 7のVLドメイン(配列番号60);又は
(I)PD‐1 mAb 8のVHドメイン(配列番号61)及びPD‐1 mAb 8のVLドメイン(配列番号62)
を備える、上述の全ての二重特異性分子の実施形態に関する。
(A)CTLA‐4 mAb 1のVHドメイン(配列番号76)及びCTLA‐4 mAb 1のVLドメイン(配列番号77);又は
(B)CTLA‐4 mAb 2のVHドメイン(配列番号78)及びCTLA‐4 mAb 2のVLドメイン(配列番号79);又は
(C)CTLA‐4 mAb 3のVHドメイン(配列番号90)及びCTLA‐4 mAb 3のVLドメイン(配列番号91)
を備える、上述の全ての二重特異性分子の実施形態に関する。
(A)PD‐1のエピトープに免疫特異的に結合できる上記エピトープ結合部位が、PD‐1 mAb 6‐I VHのVHドメイン(配列番号86)及びPD‐1 mAb 6‐SQのVLドメイン(配列番号87)を備え;
(B)CTLA‐4のエピトープに免疫特異的に結合できる1つ以上の上記エピトープ結合部位が、CTLA‐4 mAb 3のVHドメイン(配列番号90)及びCTLA‐4 mAb 3のVLドメイン(配列番号91)を備える、上述の二重特異性分子の実施形態に関する。
(A)配列番号95を有する2つのポリペプチド鎖、及び配列番号96を有する2つのポリペプチド鎖;又は
(B)配列番号97を有する2つのポリペプチド鎖、及び配列番号98を有する2つのポリペプチド鎖;又は
(C)配列番号99を有する2つのポリペプチド鎖、及び配列番号100を有する2つのポリペプチド鎖;又は
(D)配列番号102を有する2つのポリペプチド鎖、及び配列番号103を有する2つのポリペプチド鎖;又は
(E)配列番号101を有する2つのポリペプチド鎖、及び配列番号100を有する2つのポリペプチド鎖;又は
(F)配列番号104を有する1つのポリペプチド鎖、配列番号105を有する1つのポリペプチド鎖、配列番号106を有する1つのポリペプチド鎖、及び配列番号107を有する1つのポリペプチド鎖;又は
(G)配列番号108を有する1つのポリペプチド鎖、配列番号105を有する1つのポリペプチド鎖、配列番号109を有する1つのポリペプチド鎖、及び配列番号107を有する1つのポリペプチド鎖
を含む、上述の全ての二重特異性分子の実施形態に関する。
(A)上記使用が癌の治療におけるものであり、上記癌は:副腎癌;AIDS関連癌;胞巣状軟部肉腫;星細胞腫瘍;膀胱癌;骨癌;脳及び脊髄癌;転移性脳腫瘍;乳癌;頸動脈球腫瘍;子宮頸癌;軟骨肉腫;脊索腫;発色性腎細胞癌;明細胞癌;大腸癌;結腸直腸癌;皮膚良性線維性組織球腫;線維形成性小円形細胞腫瘍;上衣腫;ユーイング腫瘍;骨外性粘液型軟骨肉腫;骨性線維形成不全症;線維性骨異形成症;胆嚢若しくは胆管癌;消化器癌;妊娠性絨毛性疾患;胚細胞腫瘍;頭頸部癌;肝細胞癌;膵島細胞腫;カポジ肉腫;腎臓癌、白血病、脂肪腫/良性リポソーム腫瘍、脂肪肉腫/悪性リポソーム腫瘍、肝臓癌;リンパ腫;肺癌;髄芽腫;黒色腫;髄膜腫;多発性内分泌腫瘍;多発性骨髄腫;骨髄異形成症候群;神経芽細胞腫;神経内分泌腫瘍;卵巣癌;膵臓癌;乳頭状甲状腺癌;副甲状腺腫瘍;小児癌;末梢神経鞘腫瘍;褐色細胞腫;下垂体腫瘍;前立腺癌;後部ブドウ膜黒色腫;希少な血液学的障害;腎転移性癌;ラブドイド腫瘍;横紋筋肉腫;肉腫;皮膚癌;軟組織肉腫;扁平上皮細胞癌;胃癌;滑膜肉腫;精巣癌;胸腺癌;胸腺腫;甲状腺転移性癌;及び子宮癌の細胞からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする;又は
(B)上記使用が感染症の治療におけるものであり、上記感染症は:エプスタイン・バーウイルス;A型肝炎ウイルス(HAV);B型肝炎ウイルス(HBV);C型肝炎ウイルス(HCV);ヘルペスウイルス(例えばHSV‐1、HSV‐2、HHV‐6、CMV);ヒト免疫不全ウイルス(HIV);水疱性口内炎ウイルス(VSV);桿菌;シトロバクター;コレラ;ジフテリア;エンテロバクター;淋菌;ヘリコバクター・ピロリ;クレブシエラ;レジオネラ;髄膜炎菌;マイコバクテリア;シュードモナス;肺炎球菌;リケッチア細菌;サルモネラ;セラチア;ブドウ球菌;連鎖球菌;破傷風;アスペルギルス(フミガーツス、クロコウジカビ等);ブラストミセス・デルマチチジス;カンジダ(アルビカンス、クルセイ、グラブラタ、トロピカリス等);クリプトコッカス・ネオフォルマンス;ムコラエ属(ケカビ、ユミケカビ、クモノスカビ);スポロスリックス・シェンキー;パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス;コクシジオイデス・イムチス;ヒストプラスマ・カプスラツム;レプトスピラ症;ボレリア・ブルグドルフェリ;蠕虫性寄生虫(鉤虫、条虫、吸虫、扁虫(例えば住血吸虫));ランブル鞭毛虫;トリキネラ属;二核アメーバ;トリパノソーマ・ブルセイ;トリパノソーマ・クルージ;及びドノバン・リーシュマニアの存在を特徴とする、慢性ウイルス性、バクテリア性、菌類性及び寄生虫性感染症である、実施形態に関する。
本発明の抗体は、当該免疫グロブリン分子の可変ドメインに位置する少なくとも1つの抗原認識部位によって、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的に特異的に結合できる、免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、用語「抗体(antibody及びantibodies)」は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、単鎖Fv(scFv)、単鎖抗体、Fab断片、F(ab’)断片、ジスルフィド結合二重特異性Fv(sdFv)、細胞内抗体、及び以上のうちのいずれかのエピトープ結合断片を包含する。特に、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の断片、即ちエピトープ結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ(例えばIgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY)、クラス(例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスのものとすることができる。本明細書において使用される場合、「Fc領域(Fc region)は、そのアミノ酸配列が他のIgGアイソタイプよりもある特定のIgGアイソタイプに対して最も高い相同性を有する場合、当該特定のIgGアイソタイプ、クラス又はサブクラスのものを指す。抗体は、診断学におけるその公知の使用法に加えて、治療剤として有用であることが示されている。抗体は、ポリペプチド又はタンパク質又は非タンパク質分子に免疫特異的に結合できる。というのは、このような分子上に特定のドメイン又は部分又は形態(「エピトープ(epitope)」)が存在するためである。エピトープ含有分子は、免疫学的活性を有することができ、これにより、動物における抗体産生応答を誘発する。このような分子を「抗原(antigen)」と呼ぶ。この数十年、抗体の治療的潜在能力に対する関心が再び高まっており、抗体は、生命工学由来の薬剤の筆頭となるクラスの1つとなっている(Chan, C.E. et al. (2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases,” Singapore Med. J. 50(7):663-666)。200を超える抗体系薬剤が使用認可済み、又は開発中である。
2つの重鎖のCH2及びCH3ドメインは相互作用してFc領域を形成し、このFc領域は、Fcγ受容体(FcγR)を含むがこれに限定されない細胞Fc受容体によって認識されるドメインである。本明細書において使用される場合、用語「Fc領域(Fc region)」は、IgG重鎖のC末端領域を定義するために使用される。例示的なヒトIgG1のCH2‐CH3ドメインのアミノ酸配列は、(配列番号1):
231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSPGX
であり、これはKabatにおけるようなEUインデックスによって番号付与されており、Xはリシン(K)であるか、又は不在である。
231 240 250 260 270 280
APPVA-GPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSPGX
であり、これはKabatにおけるようなEUインデックスによって番号付与されており、Xはリシン(K)であるか、又は不在である。
231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE
440 447
ALHNRFTQKS LSLSPGX
であり、これはKabatにおけるようなEUインデックスによって番号付与されており、Xはリシン(K)であるか、又は不在である。
231 240 250 260 270 280
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
340 350 360 370 380
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSLGX
であり、これはKabatにおけるようなEUインデックスによって番号付与されており、Xはリシン(K)であるか、又は不在である。
抗体が抗原のエピトープに結合する能力は、抗体のVL及びVHドメインの存在並びにアミノ酸配列に依存する。抗体軽鎖と重鎖との相互作用、特にそのVLドメインとVHドメインとの相互作用は、IgG等の天然抗体の2つのエプトープ結合部位のうちの1つを形成する。天然抗体は、1つのエピトープ種にのみ結合できる(即ちこれらは単一特異性である)が、これらは上記種の複数の複製に結合できる(即ち2価性又は多価性を示す)。
(1)PD‐1の2つの同一のエピトープと:
(a)CTLA‐4の2つの同一のエピトープ;又は
(b)CTLA‐4の2つの重複するエピトープ;又は
(c)CTLA‐4の2つの別個のエピトープ
とに結合する能力;あるいは
(2)PD‐1の2つの重複するエピトープと:
(a)CTLA‐4の2つの同一のエピトープ;又は
(b)CTLA‐4の2つの重複するエピトープ;又は
(c)CTLA‐4の2つの別個のエピトープ
とに結合する能力;あるいは
(3)PD‐1の2つの別個のエピトープと:
(a)CTLA‐4の2つの同一のエピトープ;又は
(b)CTLA‐4の2つの重複するエピトープ;又は
(c)CTLA‐4の2つの別個のエピトープ
とに結合する能力
を有するPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子が得られると明らかに考えられる。
本発明の一実施形態は、「第1のエピトープ」及び「第2のエピトープ」に結合できるPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子に関し、これらのエピトープは互いに同一ではない。このような二重特異性分子は、第1のエピトープに結合できる「VL1」/「VH1」ドメイン、及び第2のエピトープに結合できる「VL2」/「VH2」ドメインを備える。表記法「VL1」及び「VH1」はそれぞれ、このような二重特異性分子の「第1の」エピトープに結合する軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを指す。同様に、表記法「VL2」及び「VH2」はそれぞれ、このような二重特異性分子の「第2の」エピトープに結合する軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを指す。ある特定のエピトープが第1のエピトープ又は第2のエピトープのいずれとして指定されるかは無関係であり、このような表記法は、本発明の結合分子のポリペプチド鎖のドメインの存在又は配向のみに関連する。一実施形態では、このようなエピトープのうちの1つは、ヒトPD‐1のエピトープであり、このようなエピトープのうちのもう1つは、CTLA‐4のエピトープである。特定の実施形態では、二重特異性分子は、3つ以上のエピトープ結合部位を備える。このような二重特異性分子は、少なくとも1つのPD‐1のエピトープ及び少なくとも1つのCTLA‐4のエピトープに結合することになり、更にPD‐1の追加のエピトープ及び/又はCTLA‐4の追加のエピトープに結合してよい。
本発明は、PD‐1及びCTLA‐4に同時に結合できる二重特異性抗体を包含する。いくつかの実施形態では、PD‐1及びCTLA‐4に同時に結合できる上記二重特異性抗体は、国際公開第1998/002463号、国際公開第2005/070966号、国際公開第2006/107786号、国際公開第2007/024715号、国際公開第2007/075270号、国際公開第2006/107617号、国際公開第2007/046893号、国際公開第2007/146968号、国際公開第2008/003103号、国際公開第2008/003116号、国際公開第2008/027236号、国際公開第2008/024188号、国際公開第2009/132876号、国際公開第2009/018386号、国際公開第2010/028797、国際公開第2010028796号、国際公開第2010/028795号、国際公開第2010/108127号、国際公開第2010/136172号、国際公開第2011/086091号、国際公開第2011/133886号、国際公開第2012/009544号、国際公開第2013/003652号、国際公開第2013/070565号、国際公開第2012/162583号、国際公開第2012/156430号、国際公開第2013/174873号、及び国際公開第2014/022540号に記載の方法のうちのいずれを用いて産生され、上記文献はそれぞれ、参照によりその全体が本出願に援用される。
本発明の一実施形態は、第1のポリペプチド鎖及び第2のポリペプチド鎖を含み、最も好ましくは上記第1のポリペプチド鎖及び第2のポリペプチド鎖から構成される、二重特異性ダイアボディに関し、その配列は、上記ポリペプチド鎖が互いに対して共有結合して、PD‐1及びCTLA‐4に同時に結合できる共有結合ダイアボディを形成することを可能とする。
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLID 66NAKS 70 A 71EGVKALIDE ILAALP(配列番号23)
又はアミノ酸配列:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA 64 A 65NNAKT VEGVKALIA 79E ILAALP(配列番号24)
又はアミノ酸配列:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS 66NAKS 70 VEGVKALIA 79E ILAALP(配列番号25)
を有する、変異型脱免疫化ABDが特に好ましい。というのは、このような脱免疫化ABDは、MHCクラスII結合の減衰を提供しながら、略野生型の結合を呈するためである。従って、ABDを有するこのようなダイアボディの上記第1のポリペプチド鎖は、好ましくはこのようなポリペプチド鎖のEコイル(又はKコイル)ドメインに対してC末端に位置決めされることによって、上記Eコイル(又はKコイル)ドメインとABD(これは好ましくは脱免疫化ABDである)との間に介在する、第3のリンカー(リンカー3)を含有する。このようなリンカー3の好ましい配列は、配列番号7:GGGSである。
本発明の一実施形態は、Fc領域を備える、PD‐1及びCTLA‐4に同時に結合できる二重特異性ダイアボディに関する。上記ダイアボディポリペプチド鎖のうちの一方又は両方にIgG CH2‐CH3ドメインを追加して、上記ダイアボディ鎖の複合体化によってFc領域が形成されるようにすると、上記ダイアボディの生物学的半減期が増大し、及び/又は価数が変化する。上記ダイアボディポリペプチドの両方にIgG CH2‐CH3ドメインを組み込むと、2鎖二重特異性Fc領域含有ダイアボディの形成が可能となる(図2)。
本発明の更なる実施形態は、PD‐1のエピトープ及びCTLA‐4上に存在するエピトープに同時に結合できるFc領域を備える、二重特異性3価結合性分子に関する。このような二重特異性3価結合性分子は3つのエピトープ結合部位を備え、そのうちの2つは、結合部位A及び結合部位Bを提供するダイアボディ型結合ドメインであり、1つは、結合部位Cを提供するFab型結合ドメイン(又はscFv型結合ドメイン)である(例えば図6A〜6F、並びにPCT出願第PCT/US15/33081号及びPCT出願第PCT/US15/33076号を参照)。このような二重特異性3価分子は従って、第1のエピトープに結合できる「VL1」/「VH1」ドメイン、並びに第2のエピトープに結合できる「VL2」/「VH2」ドメイン、並びに上記3価分子の「第3の」エピトープに結合できる「VL3」及び「VH3」ドメインを備える。「ダイアボディ型結合ドメイン」は、ダイアボディ、特に上述のようなDART(登録商標)ダイアボディ中に存在するエピトープ結合のタイプである。「Fab型結合ドメイン」及び「scFv型結合ドメイン」はそれぞれ、イムノグロブリン軽鎖のVLドメインと、相補的なイムノグロブリン重鎖のVHドメインとの相互作用によって形成される、エピトープ結合部位である。Fab型結合ドメインは、Fab型結合ドメインを形成する2つのポリペプチド鎖が単一のエピトープ結合部位しか備えないが、ダイアボディ型結合ドメインを形成する2つのポリペプチド鎖は少なくとも2つのエピトープ結合部位を備えるという点で、ダイアボディ型結合ドメインとは異なる。同様に、scFv型結合ドメインも、これらが単一のエピトープ結合部位しか備えないという点で、ダイアボディ型結合ドメインとは異なる。よって本明細書において使用される場合、Fab型及びscFv型結合ドメインは、ダイアボディ型結合ドメインとは別個である。
ここで提示されるのは、本発明のPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子(例えば、抗体、ダイアボディ、3価結合分子等)の生成に有用な抗体定常ドメインである。
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG
NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK
SFNRGEC
である。
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA
GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP
TECS
である。
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
である。
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
である。
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV
である。
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGX
ここでXはリシン(K)であるか、又は不在である。
(A)M252Y、S254T及びT256E;
(B)M252Y及びS254T;
(C)M252Y及びT256E;
(D)T250Q及びM428L;
(E)T307Q及びN434A;
(F)A378V及びN434A;
(G)N434A及びY436I;
(H)V308P及びN434A;又は
(I)K288D及びH435K
の置換を含む変異型IgG Fc領域を有する。
(A)エフェクタ機能及び/又はFcγRを変化させる、1つ又は複数の突然変異;並びに
(B)血清半減期を延長させる、1つ又は複数の突然変異
を含む可変Fc領域を有するPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子を包含する。
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGX
ここでXはリシン(K)であるか、又は不在である。
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSLGX
を含み、ここでXはリシン(K)であるか又は不在である。
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGX
を有し、ここでXはリシン(K)であるか又は不在である。
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNRYTQKS LSLSPGX
を有し、ここでXはリシン(K)であるか又は不在である。
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGX
を有し、ここでXはリシン(K)であるか、又は不在である。
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNRYTQKS LSLSPGX
を有し、ここでXはリシン(K)であるか、又は不在である。
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSLGX
を有し、ここでXはリシン(K)であるか、又は不在である。
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
ALHNRYTQKS LSLSLGX
を有し、ここでXはリシン(K)であるか、又は不在である。
PD‐1に対して免疫特異的な抗体は公知である(例えば米国特許出願第62/198,867号;米国特許出願第62/239,559号:米国特許出願第62/255,140号;米国特許第8,008,449号;米国特許第8,552,154号;国際公開第2012/135408号;国際公開第2012/145549;及び国際公開第2013/014668号を参照)。本発明のPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子の生成において有用な好ましいPD‐1結合能力は、ヒトPD‐1(CD279)の連続した又は不連続の(例えば立体配置の)部分に結合でき、好ましくは1つ又は複数の非ヒト種、特に霊長類種(及び特にカニクイザル等の霊長類種)のPD‐1分子への結合能力も呈する。更に望ましい抗体は、PD‐1又はそのペプチド断片を用いて誘発された抗体分泌ハイブリドーマの単離によって作製してよい。代表的なヒトPD‐1ポリペプチド(NCBI配列番号NP_005009.2;20アミノ酸残基のシグナル配列(下線を付して示す)及び268アミノ酸残基の成熟タンパク質を含む)は、アミノ酸配列(配列番号46):
MQIPQAPWPV VWAVLQLGWRPGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA
TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL
PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE
VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGS LVLLVWVLAV ICSRAARGTI
GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT
IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL
を含む。
PD‐1 mAb 1のVHドメインのアミノ酸配列(配列番号47)を以下に示す(CDRH残基は下線を付して示す):
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL DCKASGITFS NSGMHWVRQA PGKGLEWVAV
IWYDGSKRYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCATND
DYWGQGTLVT VSS
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD
ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ
GTKVEIK
PD‐1 mAb 2のVHドメインのアミノ酸配列(配列番号49)を以下に示す(CDRH残基は下線を付して示す):
QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG
INPSNGGTNF NEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRD
YRFDMGFDYW GQGTTVTVSS
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASKGVS TSGYSYLHWY QQKPGQAPRL
LIYLASYLES GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQHSRDLPL
TFGGGTKVEIK
PD‐1 mAb 3のVHドメインのアミノ酸配列(配列番号51)を以下に示す(CDRH残基は下線を付して示す):
QVQLQQSGAE LAKPGASVQM SCKASGYSFT SSWIHWVKQR PGQGLEWIGY
IYPSTGFTEY NQKFKDKATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARWR
DSSGYHAMDY WGQGTSVTVSS
DIVLTQSPAS LTVSLGQRAT ISCRASQSVS TSGYSYMHWY QQKPGQPPKL
LIKFGSNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YCQHSWEIPY
TFGGGTKLEI K
PD‐1 mAb 4のVHドメインのアミノ酸配列(配列番号53)を以下に示す(CDRH残基は下線を付して示す):
QVQLVQSGSE LKKPGASVKI SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLQWMGW
INTDSGESTY AEEFKGRFVF SLDTSVNTAY LQITSLTAED TGMYFCVRVG
YDALDYWGQG TLVTVSS
EIVLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSARSSVS YMHWFQQKPG KAPKLWIYRT
SNLASGVPSR FSGSGSGTSY CLTINSLQPE DFATYYCQQR SSFPLTFGGG
TKLEIK
PD‐1 mAb 5のVHドメインのアミノ酸配列(配列番号55)を以下に示す(CDRH残基は下線を付して示す):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFVFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY
ISSGSMSISY ADTVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRTED TALYYCASLS
DYFDYWGQGT TVTVSS
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCRSSQSLV HSTGNTYLHW YLQKPGQSPQ
LLIYRVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCSQTTHVP
WTFGQGTKLE IK
PD‐1 mAb 6のVHドメインのアミノ酸配列(配列番号57)を以下に示す(CDRH残基は下線を付して示す):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWXGV
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH
YGTSPFAYWG QGTLVTVSS
ここでX1はI又はAである。
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRAX 1 ESVDNYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNX 2 GS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI K
ここで;X1はN若しくはSであり、X2はQ若しくはRであり;又はX1はNであり、X2はQであり;又はX1はSでありX2はQであり;又はX1はSであり、X2はRである。
(a)配列番号57、ただしX1はIである;及び配列番号58、ただしX1はNであり、X2はQである;又は
(b)配列番号57、ただしX1はIである;及び配列番号58、ただしX1はであり、X2はQである
を含む。
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH
YGTSPFAYWG QGTLVTVSS
を有する。
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI K
を有する。
PD‐1 mAb 7のVHドメインのアミノ酸配列(配列番号59)を以下に示す(CDRH残基は下線を付して示す):
EVQLVESGGG LX1RPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVX 2 WVRQA PGKGLEWX3AT
ISGGGGNTYY SDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSX4RAED TATYYCARYG
FDGAWFAYWG QGTLVTVSS
ここでX1はV若しくはAであり、X2はS若しくはGであり、X3はV若しくはTであり、X4はL若しくはAであるか;又はX1はVであり、X2はSであり、X3はVであり、X4はLであるか;又はX1はAであり、X2はGであり、X3はTであり、X4はAである。
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASENIY X 1 YLAWYQQKP GKAPKLLIYX 2
AKTLAAGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYAVPWTFGQ
GTKLEIK
ここで:X1はS若しくはNであり、X2はN若しくはDであるか;又はX1はSであり、X2はNであるか;又はX1はNであり、X2はDである。
(a)配列番号59、ただしX1はVであり、X2はSであり、X3はVであり、X4はLである;及び配列番号60、ただしX1はSであり、X2はNである;又は
(b)配列番号59、ただしX1はAであり、X2はGであり、X3はTであり、X4はAである;及び配列番号60、ただしX1はNであり、X2はDである
を含む。
PD‐1 mAb 8のVHドメインのアミノ酸配列(配列番号61)を以下に示す(CDRH残基は下線を付して示す):
EVQLVESGGG LVRPGGSLRL SCAASGFTFS SYLISWVRQA PGKGLEWVAA
ISGGGADTYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TATYYCARRG
TYAMDYWGQG TLVTVSS
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASENIY NYLAWYQQKP GKAPKLLIYD
AKTLAAGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYAVPWTFGQ
GTKLEIK
本発明のPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子の生成に利用できる更なる抗PD‐1抗体を、表6に提供する。
「PD‐1 mAb 6 G4P」と呼ばれる例示的な抗PD‐1抗体は:PD‐1 mAb 6IのVHドメイン(配列番号86)と、IgG4 CH1ドメイン(配列番号42)と、安定化IgG4ヒンジ(配列番号36)と、C末端リシンを有しないIgG4 CH2‐CH3ドメイン(配列番号4)とを有する重鎖;及びPD‐1 mAb 6SQのVLドメイン(配列番号87)とκCL(配列番号38)とを有する軽鎖を含む。
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH
YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APCSRSTSES TAALGCLVKD
YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTKTY
TCNVDHKPSN TKVDKRVESK YGPPCPPCPA PEFLGGPSVF LFPPKPKDTL
MISRTPEVTC VVVDVSQEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTYR
VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPSS IEKTISKAKG QPREPQVYTL
PPSQEEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD
GSFFLYSRLT VDKSRWQEGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSLG
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
THQGLSSPVT KSFNRGEC
CTLA‐4に対して免疫特異的な抗体は公知である(例えば米国特許第6,984,720号;米国特許第6,682,736号;米国特許第7,034,121号;米国特許第7,109,003号;米国特許第7,132,281号;米国特許第7,411,057号;米国特許第7,605,238号;米国特許第7,807,797号;米国特許第7,824,679号;米国特許第8,017,114号;米国特許第8,143,379号;米国特許第8,318,916号;米国特許第8,491,895号;米国特許第8,784,815号;及び米国特許第8,883,984号;米国公開特許第2009/0123477号;米国公開特許第2009/0252741号;及び米国公開特許第2014/0105914号;国際公開第00/37504号;国際公開第01/14424号;国際公開第01/54732号;国際公開第2006/029219号;国際公開第2006/066568号;及び国際公開第2012/120125号;並びに表7)。本発明のPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子の生成において有用な好ましいCTLA‐4結合能力は、ヒトCTLA‐4の連続した又は不連続の(例えば立体配置の)部分に結合でき、好ましくは1つ又は複数の非ヒト種、特に霊長類種(及び特にカニクイザル等の霊長類種)のCTLA‐4分子への結合能力も呈する。更に望ましい抗体は、CTLA‐4又はそのペプチド断片を用いて誘発された抗体分泌ハイブリドーマの単離によって作製してよい。代表的なヒトCTLA‐4ポリペプチド(NCBI配列番号NP_005205.2;35アミノ酸残基のシグナル配列(下線を付して示す)及び188アミノ酸残基の成熟タンパク質を含む)は、アミノ酸配列(配列番号75):
MACLGFQRHK AQLNLATRTW PCTLLFFLLF IPVFCKAMHV AQPAVVLASS
RGIASFVCEY ASPGKATEVR VTVLRQADSQ VTEVCAATYM MGNELTFLDD
SICTGTSSGN QVNLTIQGLR AMDTGLYICK VELMYPPPYY LGIGNGTQIY
VIDPEPCPDS DFLLWILAAV SSGLFFYSFL LTAVSLSKML KKRSPLTTGV
YVKMPPTEPE CEKQFQPYFI PIN
を含む。
CTLA‐4 mAb 1のVHドメインのアミノ酸配列(配列番号76)を以下に示す(CDRH残基は下線を付して示す):
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYTMHWVRQA PGKGLEWVTF
ISYDGNNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAIYYCARTG
WLGPFDYWGQ GTLVTVSS
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVG SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY
GAFSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPWTFG
QGTKVEIK
CTLA‐4 mAb 2のVHドメインのアミノ酸配列(配列番号78)を以下に示す(CDRH残基は下線を付して示す):
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAV
IWYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDP
RGATLYYYYY GMDVWGQGTT VTVSS
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIN SYLDWYQQKP GKAPKLLIYA
ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YYSTPFTFGP
GTKVEIK
CTLA‐4 mAb 3のVHドメインのアミノ酸配列(配列番号90)を以下に示す(CDRH残基は下線を付して示す):
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYTMHWVRQA PGKGLEWVTF
ISYDGSNKHY ADSVKGRFTV SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAIYYCARTG
WLGPFDYWGQ GTLVTVSS
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSFLAWYQQK PGQAPRLLIY
GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPWTFG
QGTKVEIK
本発明のPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子の生成に利用できる更なる抗CTLA‐4抗体を、表7に提供する。
「CTLA‐4 mAb 3 G1AA」と呼ばれる例示的な抗CTLA‐4抗体は、CTLA‐4 mAb 3のVHドメイン(配列番号90)と、IgG1 CH1ドメイン(配列番号40)と、IgG1ヒンジ(配列番号33)と、置換L234A/L235Aを含むIgG1 CH2‐CH3ドメイン(配列番号43)とを有する重鎖を含む。
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYTMHWVRQA PGKGLEWVTF
ISYDGSNKHY ADSVKGRFTV SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAIYYCARTG
WLGPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD
TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYTMHWVRQA PGKGLEWVTF
ISYDGSNKHY ADSVKGRFTV SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAIYYCARTG
WLGPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PCSRSTSEST AALGCLVKDY
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTKTYT
CNVDHKPSNT KVDKRVESKY GPPCPPCPAP EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM
ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV
VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP
PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG
SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLG
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSFLAWYQQK PGQAPRLLIY
GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPWTFG
QGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK
VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ
GLSSPVTKSF NRGEC
A.E/Kコイルを有する例示的な4鎖Fc領域含有ダイアボディ
E/Kコイルヘテロ二量体促進ドメインを備える、3つの例示的なPD‐1×CTLA‐4二重特異性、4鎖、Fc領域含有ダイアボディを生成した(「DART B」、「DART C」及び「DART D」と呼ぶ)。これらのFc領域含有ダイアボディの構造を以下に詳述する。これらの例示的なPD‐1×CTLA‐4ダイアボディは本発明の範囲の例示を目的としており、本発明の範囲の限定は全く意図していない。
DART Bは、PD‐1に対して特異的な2つの結合部位、CTLA‐4に対して特異的な2つの結合部位、半減期を延長するために操作された変異型IgG4 Fc領域、及びE/Kコイルヘテロ二量体促進ドメインを有する、二重特異性、4鎖、Fc領域含有ダイアボディである。DART Bの第1及び第3のポリペプチド鎖は、N末端からC末端への方向に:N末端;CTLA‐4に結合できるモノクローナル抗体のVLドメイン(VLCTLA-4 CTLA‐4 mAb 1 VL)(配列番号77);介在リンカーペプチド(リンカー1:GGGSGGGG(配列番号5));PD‐1に結合できるモノクローナル抗体のVHドメイン(VHPD-1 PD‐1 mAb 6‐I VH)(配列番号86);システイン含有介在リンカーペプチド(リンカー2:GGCGGG(配列番号6));システイン含有ヘテロ二量体促進(Eコイル)ドメイン(EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK(配列番号20));安定化IgG4ヒンジ領域(配列番号36);置換M252Y/S254T/T256Eを含みかつC末端残基を有しない、IgG4 CH2‐CH3ドメインの変異型(配列番号81);及びC末端を備える。
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVG SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY
GAFSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA SGYSFTSYWM
NWVRQAPGQG LEWIGVIHPS DSETWLDQKF KDRVTITVDK STSTAYMELS
SLRSEDTAVY YCAREHYGTS PFAYWGQGTL VTVSSGGCGG GEVAACEKEV
AALEKEVAAL EKEVAALEKE SKYGPPCPPC PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD
TLYITREPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY
TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLG
である。
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS
YTMHWVRQAP GKGLEWVTFI SYDGNNKYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL
QMNSLRAEDT AIYYCARTGW LGPFDYWGQG TLVTVSSGGC GGGKVAACKE
KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
である。
DART Cは、PD‐1に対して特異的な2つの結合部位、CTLA‐4に対して特異的な2つの結合部位、半減期を延長するために操作された変異型IgG4 Fc領域、及びE/Kコイルヘテロ二量体促進ドメインを有する、二重特異性、4鎖、Fc領域含有ダイアボディである。DART Cの第1及び第3のポリペプチド鎖は、N末端からC末端への方向に:N末端;CTLA‐4に結合できるモノクローナル抗体のVLドメイン(VLCTLA-4 CTLA‐4 mAb 3 VL)(配列番号91);介在リンカーペプチド(リンカー1:GGGSGGGG(配列番号5));PD‐1に結合できるモノクローナル抗体のVHドメイン(VHPD-1 PD‐1 mAb 6‐I VH)(配列番号86);システイン含有介在リンカーペプチド(リンカー2:GGCGGG(配列番号6));システイン含有ヘテロ二量体促進(Eコイル)ドメイン(EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK(配列番号20));安定化IgG4ヒンジ領域(配列番号36);置換M252Y/S254T/T256Eを含みかつC末端残基を有しない、IgG4 CH2‐CH3ドメインの変異型(配列番号81);及びC末端を備える。
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSFLAWYQQK PGQAPRLLIY
GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA SGYSFTSYWM
NWVRQAPGQG LEWIGVIHPS DSETWLDQKF KDRVTITVDK STSTAYMELS
SLRSEDTAVY YCAREHYGTS PFAYWGQGTL VTVSSGGCGG GEVAACEKEV
AALEKEVAAL EKEVAALEKE SKYGPPCPPC PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD
TLYITREPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY
TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLG
である。
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS
YTMHWVRQAP GKGLEWVTFI SYDGSNKHYA DSVKGRFTVS RDNSKNTLYL
QMNSLRAEDT AIYYCARTGW LGPFDYWGQG TLVTVSSGGC GGGKVAACKE
KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
である。
DART Dは、PD‐1に対して特異的な2つの結合部位、CTLA‐4に対して特異的な2つの結合部位、半減期を延長するために操作された変異型IgG4 Fc領域、及びE/Kコイルヘテロ二量体促進ドメインを有する、二重特異性、4鎖、Fc領域含有ダイアボディである。DART Dの第1及び第3のポリペプチド鎖は、N末端からC末端への方向に:N末端;PD‐1に結合できるモノクローナル抗体のVLドメイン(VLPD-1 PD‐1 mAb 6‐SQ VL)(配列番号87);介在リンカーペプチド(リンカー1:GGGSGGGG(配列番号5));CTLA‐4に結合できるモノクローナル抗体のVHドメイン(VHCTLA-4 CTLA‐4 mAb 3 VH)(配列番号90);システイン含有介在リンカーペプチド(リンカー2:GGCGGG(配列番号6));システイン含有ヘテロ二量体促進(Eコイル)ドメイン(EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK(配列番号20));安定化IgG4ヒンジ領域(配列番号36);置換M252Y/S254T/T256Eを含みかつC末端残基を有しない、IgG4 CH2‐CH3ドメインの変異型(配列番号81);及びC末端を備える。
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS
YTMHWVRQAP GKGLEWVTFI SYDGSNKHYA DSVKGRFTVS RDNSKNTLYL
QMNSLRAEDT AIYYCARTGW LGPFDYWGQG TLVTVSSGGC GGGEVAACEK
EVAALEKEVA ALEKEVAALE KESKYGPPCP PCPAPEFLGG PSVFLFPPKP
KDTLYITREP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ
VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV
LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSLG
である。
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSFLAWYQQK PGQAPRLLIY
GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA SGYSFTSYWM
NWVRQAPGQG LEWIGVIHPS DSETWLDQKF KDRVTITVDK STSTAYMELS
SLRSEDTAVY YCAREHYGTS PFAYWGQGTL VTVSSGGCGG GKVAACKEKV
AALKEKVAAL KEKVAALKE
である。
DART Fは、PD‐1に対して特異的な2つの結合部位、CTLA‐4に対して特異的な2つの結合部位、エフェクタ機能を低減/消去するため及び半減期を延長するために操作された変異型IgG1 Fc領域、並びにE/Kコイルヘテロ二量体促進ドメインを有する、二重特異性、4鎖、Fc領域含有ダイアボディである。DART Fの第1及び第3のポリペプチド鎖は、N末端からC末端への方向に:N末端;PD‐1に結合できるモノクローナル抗体のVLドメイン(VLPD-1 PD‐1 mAb 6‐SQ VL)(配列番号87);介在リンカーペプチド(リンカー1:GGGSGGGG(配列番号5));CTLA‐4に結合できるモノクローナル抗体のVHドメイン(VHCTLA-4 CTLA‐4 mAb 3 VH)(配列番号90);システイン含有介在リンカーペプチド(リンカー2:GGCGGG(配列番号6));システイン含有ヘテロ二量体促進(Eコイル)ドメイン(EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK(配列番号20));IgG1ヒンジ領域(配列番号33);置換L235A/L235A/M252Y/S254T/T256Eを含みかつC末端残基を有しない、IgG1 CH2‐CH3ドメインの変異型(配列番号80);及びC末端を備える。
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS
YTMHWVRQAP GKGLEWVTFI SYDGSNKHYA DSVKGRFTVS RDNSKNTLYL
QMNSLRAEDT AIYYCARTGW LGPFDYWGQG TLVTVSSGGC GGGEVAACEK
EVAALEKEVA ALEKEVAALE KLEPKSADKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF
PPKPKDTLYI TREPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP
REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT
TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL
SPG
である。
「DART E」と呼ばれる、CL/CH1ドメインを備える、例示的なPD‐1×CTLA‐4二重特異性、4鎖、Fc領域含有ダイアボディを生成した。このFc領域含有ダイアボディの構造を以下に詳述する。この例示的なPD‐1×CTLA‐4ダイアボディは本発明の範囲の例示を目的としており、本発明の範囲の限定は全く意図していない。
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSFLAWYQQK PGQAPRLLIY
GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA SGYSFTSYWM
NWVRQAPGQG LEWIGVIHPS DSETWLDQKF KDRVTITVDK STSTAYMELS
SLRSEDTAVY YCAREHYGTS PFAYWGQGTL VTVSSLGGGS GASTKGPSVF
PLAPCSRSTS ESTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS
SGLYSLSSVV TVPSSSLGTK TYTCNVDHKP SNTKVDKRVE SKYGPPCPPC
PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD TLYITREPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV
DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP
SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV
EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH
EALHNHYTQK SLSLSLG
である。
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS
YTMHWVRQAP GKGLEWVTFI SYDGSNKHYA DSVKGRFTVS RDNSKNTLYL
QMNSLRAEDT AIYYCARTGW LGPFDYWGQG TLVTVSSLGG GSGRTVAAPS
VFIFPPSDEQ LKSGTASVVC LLNNFYPREA KVQWKVDNAL QSGNSQESVT
EQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC
である。
2つの例示的なPD‐1×CTLA‐4二重特異性、4鎖、Fc領域含有3価結合性分子を生成した(「TRIDENT A」及び「TRIDENT B」と呼ばれる)。これらのFc領域含有3価結合性分子の構造を以下に詳述する。以下では、「TRIDENT C」と呼ばれる、生成され得る3鎖変異型も提示される。これらの例示的なPD‐1×CTLA‐4 3価結合性分子は本発明の範囲の例示を目的としており、本発明の範囲の限定は全く意図していない。
TRIDENT Aは、PD‐1に対して特異的な2つの結合部位、CTLA‐4に対して特異的な1つの結合部位、半減期を延長するために操作された変異型ノブ/ホール担持IgG4 Fc領域、E/Kコイルヘテロ二量体促進ドメイン、及びCL/CH1ドメインを有する、二重特異性、4鎖、Fc領域含有3価結合性分子である。TRIDENT Aの第1のポリペプチド鎖は、N末端からC末端への方向に:PD‐1に結合できるモノクローナル抗体のVLドメイン(VLPD-1 PD‐1 mAb 6‐SQ VL)(配列番号87);介在リンカーペプチド(リンカー1:GGGSGGGG(配列番号5));PD‐1に結合できるモノクローナル抗体のVHドメイン(VHPD-1 PD‐1 mAb 6‐I VH)(配列番号86);システイン含有介在リンカーペプチド(リンカー2:GGCGGG(配列番号6));システイン含有ヘテロ二量体促進(Eコイル)ドメイン(EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK(配列番号20));安定化IgG4ヒンジ領域(配列番号36);置換M252Y/S254T/T256Eを含みかつC末端残基を有しない、ノブ担持IgG4 CH2‐CH3ドメイン(配列番号84);及びC末端を備える。
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYSFTS
YWMNWVRQAP GQGLEWIGVI HPSDSETWLD QKFKDRVTIT VDKSTSTAYM
ELSSLRSEDT AVYYCAREHY GTSPFAYWGQ GTLVTVSSGG CGGGEVAACE
KEVAALEKEV AALEKEVAAL EKESKYGPPC PPCPAPEFLG GPSVFLFPPK
PKDTLYITRE PEVTCVVVDV SQEDPEVQFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQF
NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK GLPSSIEKTI SKAKGQPREP
QVYTLPPSQE EMTKNQVSLW CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP
VLDSDGSFFL YSRLTVDKSR WQEGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSLG
である。
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYSFTS
YWMNWVRQAP GQGLEWIGVI HPSDSETWLD QKFKDRVTIT VDKSTSTAYM
ELSSLRSEDT AVYYCAREHY GTSPFAYWGQ GTLVTVSSGG CGGGKVAACK
EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE
である。
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYTMHWVRQA PGKGLEWVTF
ISYDGSNKHY ADSVKGRFTV SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAIYYCARTG
WLGPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PCSRSTSEST AALGCLVKDY
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTKTYT
CNVDHKPSNT KVDKRVESKY GPPCPPCPAP EFLGGPSVFL FPPKPKDTLY
ITREPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV
VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP
PSQEEMTKNQ VSLSCAVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG
SFFLVSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNRYTQKSLS LSLG
である。
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSFLAWYQQK PGQAPRLLIY
GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPWTFG
QGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK
VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ
GLSSPVTKSF NRGEC
である。
TRIDENT Bは、PD‐1に対して特異的な2つの結合部位、CTLA‐4に対して特異的な1つの結合部位、エフェクタ機能を低減/消去するため及び半減期を延長するために操作された変異型ノブ/ホール担持IgG1 Fc領域、E/Kコイルヘテロ二量体促進ドメイン、並びにCL/CH1ドメインを有する、二重特異性、4鎖、Fc領域含有3価結合性分子である。TRIDENT Bの第1のポリペプチド鎖は、N末端からC末端への方向に:PD‐1に結合できるモノクローナル抗体のVLドメイン(VLPD-1 PD‐1 mAb 6‐SQ VL)(配列番号87);介在リンカーペプチド(リンカー1:GGGSGGGG(配列番号5));PD‐1に結合できるモノクローナル抗体のVHドメイン(VHPD-1 PD‐1 mAb 6‐I VH)(配列番号86);システイン含有介在リンカーペプチド(リンカー2:GGCGGG(配列番号6));システイン含有ヘテロ二量体促進(Eコイル)ドメイン(EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK(配列番号20));リンカー(配列番号31);置換L234A/L235A/M252Y/S254T/T256Eを含みかつC末端残基を有しない、ノブ担持IgG1 CH2‐CH3ドメイン(配列番号82);及びC末端を備える。
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYSFTS
YWMNWVRQAP GQGLEWIGVI HPSDSETWLD QKFKDRVTIT VDKSTSTAYM
ELSSLRSEDT AVYYCAREHY GTSPFAYWGQ GTLVTVSSGG CGGGEVAACE
KEVAALEKEV AALEKEVAAL EKGGGDKTHT CPPCPAPEAA GGPSVFLFPP
KPKDTLYITR EPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ
YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL WCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP
PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP
GK
である。
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYTMHWVRQA PGKGLEWVTF
ISYDGSNKHY ADSVKGRFTV SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAIYYCARTG
WLGPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD
TLYITREPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK
である。
本明細書において提示されるように、3つのポリペプチド鎖を含む3価結合性分子は、2つの別個のポリペプチド鎖の結合ドメインを1つの鎖へと組み合わせる(例えばエンコードヌクレオチドを融合する等)によって生成してよい。生成され得るある二重特異性、3鎖、Fc領域含有3価結合性分子は、PD‐1に対して特異的な2つの結合部位、CTLA‐4に対して特異的な1つの結合部位、半減期を延長するために操作された変異型ノブ/ホール担持IgG4 Fc領域、及びE/Kコイルヘテロ二量体促進ドメインを有する(「TRIDENT C」)。TRIDENT Cの第1及び第2のポリペプチド鎖は、上述のTRIDENT Aのものと同一であってよい。
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSFLAWYQQK PGQAPRLLIY
GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPWTFG
QGTKVEIKGG GGSGGGGSGG GGSQVQLVES GGGVVQPGRS LRLSCAASGF
TFSSYTMHWV RQAPGKGLEW VTFISYDGSN KHYADSVKGR FTVSRDNSKN
TLYLQMNSLR AEDTAIYYCA RTGWLGPFDY WGQGTLVTVS SESKYGPPCP
PCPAPEFLGG PSVFLFPPKP KDTLYITREP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW
YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG
LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSQEE MTKNQVSLSC AVKGFYPSDI
AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLV SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV
MHEALHNRYT QKSLSLSLG
である。
最も好ましくは、本発明のPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子は、当該技術分野において公知であるように、上記ポリペプチドをエンコードする核酸分子の組み換え発現によって産生される。
本発明は、本発明のPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子(例えば、二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、3価結合性分子等)、このような分子由来のポリペプチド、このような分子又はポリペプチドをエンコードする配列を含むポリヌクレオチド、及び本明細書に記載の他の作用剤を含む、医薬組成物を含む組成物を包含する。
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に使用できるバルク薬剤組成物(例えば不純又は非滅菌組成物)、及び単位剤形の調製に使用できる医薬組成物(即ち被験体又は患者への投与に好適な組成物)を含む。これらの組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明のPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子、又はこのような作用剤と薬学的に許容可能なキャリアとの組み合わせを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明のPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子のうちの1つ又は複数と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。本発明はまた、特定の癌抗原に対して特異的である第2の治療用抗体(例えば腫瘍特異性モノクローナル抗体)、及び薬学的に許容可能なキャリアを更に含む、上記医薬組成物も包含する。
本発明の組成物は、有効量の本発明の融合タンパク質若しくはコンジュゲート分子又は本発明の融合タンパク質若しくはコンジュゲート分子を含む医薬組成物を被験体に投与することによる、疾患、障害又は感染症に関連する1つ又は複数の症状の治療、予防及び改善のために提供できる。好ましい態様では、上記組成物は実質的に精製される(即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を実質的に含まない)。ある具体的実施形態では、被験体は動物、好ましくは非霊長類(例えばウシ属、ウマ科、ネコ科、イヌ科、げっ歯類等)又は霊長類(例えばカニクイザル等のサル、ヒト等)といった哺乳類である。ある好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
本発明は、実施形態E1〜E4を特に対象とする:
E1.PD‐1の1つ以上のエピトープに免疫特異的に結合できる1つ又は複数のエピトープ結合部位と、CTLA‐4の1つ以上のエピトープに免疫特異的に結合できる1つ又は複数のエピトープ結合部位との両方を有する、二重特異性分子であって、
上記分子は:
(A)PD‐1に結合する抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン;並びに
(B)CTLA‐4に結合する抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン
を備え、
ここで上記分子は:
(i)2つ、3つ、4つ若しくは5つのポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、ダイアボディ;又は
(ii)3つ、4つ、5つ又は6つ以上のポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、3価結合性分子
である、二重特異性分子。
E2.上記分子は、一方がPD‐1に結合する上記抗体の上記重鎖可変ドメイン及び上記軽鎖可変ドメインを有し、もう一方がCTLA‐4に結合する上記抗体の上記重鎖可変ドメイン及び上記軽鎖可変ドメインを有する、2つの単一特異性分子によって呈される活性に対して、増強された活性を呈する、実施形態E1の二重特異性分子。
E3.上記分子は、それを必要とする被検体に投与した場合に、CTLA‐4に結合する単一特異性抗体の投与によって誘発される免疫関連有害事象(irAE)よりも少ないirAEを誘発する、実施形態E1又はE2の二重特異性分子。
E4.CTLA‐4に結合する上記単一特異性抗体は、イピリムマブである、実施形態3の二重特異性分子。
E5.上記分子はFc領域を備える、実施形態E1〜E4のいずれか1つの二重特異性分子。
E6.上記Fc領域は、変異型Fc領域であって:
(A)FcγRに対する上記変異型Fc領域の親和性を低減する1つ若しくは複数のアミノ酸修飾;及び/又は
(B)上記変異型Fc領域の血清半減期を向上させる1つ若しくは複数のアミノ酸修飾
を備える変異型Fc領域である、実施形態5の二重特異性分子。
E7.FcγRに対する上記変異型Fc領域の親和性を低減する上記修飾は、L234A;L235A;又はL234A及びL235A(上記番号付与はKabat中のEUインデックスの番号付与である)の置換を含む、実施形態E6の二重特異性分子。
E8.上記変異型Fc領域の血清半減期を向上させる上記修飾は、M252Y;M252Y及びS254T;M252Y及びT256E;M252Y、S254T及びT256E;又はK288D及びH435K(上記番号付与はKabat中のEUインデックスの番号付与である)の置換を含む、実施形態E6又はE7の二重特異性分子。
E9.上記分子は上記ダイアボディであり、PD‐1のエピトープに免疫特異的に結合できる2つのエピトープ結合部位と、CTLA‐4のエピトープに免疫特異的に結合できる2つのエピトープ結合部位とを含む、実施形態E1〜E8のいずれか1つの二重特異性分子。
E10.上記分子は上記3価結合性分子であり、PD‐1のエピトープに免疫特異的に結合できる2つのエピトープ結合部位と、CTLA‐4のエピトープに免疫特異的に結合できる1つのエピトープ結合部位とを含む、実施形態E1〜E8のいずれか1つの二重特異性分子の実施形態に関する。
E11.上記分子は、上記細胞表面上に存在するPD‐1及びCTLA‐4分子に結合できる、実施形態E1〜E10のいずれか1つの二重特異性分子。
E12.上記分子は、PD‐1及びCTLA‐4分子に同時に結合できる、実施形態E1〜E11のいずれか1つの二重特異性分子。
E13.上記分子は、免疫細胞の刺激を促進する、実施形態E1〜E12のいずれか1つの二重特異性分子。
E14.上記免疫細胞の刺激は:
(A)免疫細胞増殖;並びに/又は
(B)免疫細胞産生及び/若しくは少なくとも1つのサイトカインの放出;並びに/又は
(C)免疫細胞産生及び/若しくは少なくとも1つの溶解性分子の放出;並びに/又は
(D)少なくとも1つの活性化マーカの、免疫細胞発現
をもたらす、実施形態E13の二重特異性分子。
E15.上記免疫細胞はTリンパ球又はNK細胞である、実施形態E13又はE14の二重特異性分子。
E16.PD‐1のエピトープに免疫特異的に結合できる上記エピトープ結合部位は:
(A)PD‐1 mAb 1のVHドメイン(配列番号47)及びPD‐1 mAb 1のVLドメイン(配列番号48);又は
(B)PD‐1 mAb 2のVHドメイン(配列番号49)及びPD‐1 mAb 2のVLドメイン(配列番号50);又は
(C)PD‐1 mAb 3のVHドメイン(配列番号51)及びPD‐1 mAb 3のVLドメイン(配列番号52);又は
(D)PD‐1 mAb 4のVHドメイン(配列番号53)及びPD‐1 mAb 4のVLドメイン(配列番号54);又は
(E)PD‐1 mAb 5のVHドメイン(配列番号55)及びPD‐1 mAb 5のVLドメイン(配列番号56);又は
(F)PD‐1 mAb 6のVHドメイン(配列番号57)及びPD‐1 mAb 6のVLドメイン(配列番号58);又は
(G)PD‐1 mAb 6‐I VHのVHドメイン(配列番号86)及びPD‐1 mAb 6‐SQ VLのVLドメイン(配列番号87);又は
(H)PD‐1 mAb 7のVHドメイン(配列番号59)及びPD‐1 mAb 7のVLドメイン(配列番号60);又は
(I)PD‐1 mAb 8のVHドメイン(配列番号61)及びPD‐1 mAb 8のVLドメイン(配列番号62)
を備える、実施形態E1〜E15のいずれか1つの二重特異性分子。
E17.CTLA‐4のエピトープに免疫特異的に結合できる1つ以上の上記エピトープ結合部位は:
(A)CTLA‐4 mAb 1のVHドメイン(配列番号76)及びCTLA‐4 mAb 1のVLドメイン(配列番号77);又は
(B)CTLA‐4 mAb 2のVHドメイン(配列番号78)及びCTLA‐4 mAb 2のVLドメイン(配列番号79);又は
(C)CTLA‐4 mAb 3のVHドメイン(配列番号90)及びCTLA‐4 mAb 3のVLドメイン(配列番号91)
を備える、実施形態E1〜E16のいずれか1つの二重特異性分子。
E18.(A)PD‐1のエピトープに免疫特異的に結合できる上記エピトープ結合部位が、PD‐1 mAb 6‐I VHのVHドメイン(配列番号86)及びPD‐1 mAb 6‐SQのVLドメイン(配列番号87)を備え;
(B)CTLA‐4のエピトープに免疫特異的に結合できる1つ以上の上記エピトープ結合部位が、CTLA‐4 mAb 3のVHドメイン(配列番号90)及びCTLA‐4 mAb 3のVLドメイン(配列番号91)を備える、実施形態E17の二重特異性分子。
E19.前記分子は:
(A)配列番号95を有する2つのポリペプチド鎖、及び配列番号96を有する2つのポリペプチド鎖;又は
(B)配列番号97を有する2つのポリペプチド鎖、及び配列番号98を有する2つのポリペプチド鎖;又は
(C)配列番号99を有する2つのポリペプチド鎖、及び配列番号100を有する2つのポリペプチド鎖;又は
(D)配列番号102を有する2つのポリペプチド鎖、及び配列番号103を有する2つのポリペプチド鎖;又は
(E)配列番号101を有する2つのポリペプチド鎖、及び配列番号100を有する2つのポリペプチド鎖;又は
(F)配列番号104を有する1つのポリペプチド鎖、配列番号105を有する1つのポリペプチド鎖、配列番号106を有する1つのポリペプチド鎖、及び配列番号107を有する1つのポリペプチド鎖;又は
(G)配列番号108を有する1つのポリペプチド鎖、配列番号105を有する1つのポリペプチド鎖、配列番号109を有する1つのポリペプチド鎖、及び配列番号107を有する1つのポリペプチド鎖
を含む、実施形態E1〜E18のいずれか1つの二重特異性分子。
E20.有効量の、実施形態E1〜E19のいずれか1つの二重特異性分子のうちのいずれと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物。
E21.上記分子は、それを必要とする被検体の免疫仲介性応答の刺激を促進するために使用される、実施形態E1〜E19のいずれか1つの二重特異性分子。
E22.上記分子は、抑制された免疫系に関連する疾患又は状態の治療に使用される、実施形態E1〜E19のいずれか1つの二重特異性分子。
E23.上記疾患又は状態は、癌又は感染症である、実施形態E22の二重特異性分子。
E24.上記癌は:副腎癌;AIDS関連癌;胞巣状軟部肉腫;星細胞腫瘍;膀胱癌;骨癌;脳及び脊髄癌;転移性脳腫瘍;乳癌;頸動脈球腫瘍;子宮頸癌;軟骨肉腫;脊索腫;発色性腎細胞癌;明細胞癌;大腸癌;結腸直腸癌;皮膚良性線維性組織球腫;線維形成性小円形細胞腫瘍;上衣腫;ユーイング腫瘍;骨外性粘液型軟骨肉腫;骨性線維形成不全症;線維性骨異形成症;胆嚢若しくは胆管癌;消化器癌;妊娠性絨毛性疾患;胚細胞腫瘍;頭頸部癌;肝細胞癌;膵島細胞腫;カポジ肉腫;腎臓癌、白血病、脂肪腫/良性リポソーム腫瘍、脂肪肉腫/悪性リポソーム腫瘍、肝臓癌;リンパ腫;肺癌;髄芽腫;黒色腫;髄膜腫;多発性内分泌腫瘍;多発性骨髄腫;骨髄異形成症候群;神経芽細胞腫;神経内分泌腫瘍;卵巣癌;膵臓癌;乳頭状甲状腺癌;副甲状腺腫瘍;小児癌;末梢神経鞘腫瘍;褐色細胞腫;下垂体腫瘍;前立腺癌;後部ブドウ膜黒色腫;希少な血液学的障害;腎転移性癌;ラブドイド腫瘍;横紋筋肉腫;肉腫;皮膚癌;軟組織肉腫;扁平上皮細胞癌;胃癌;滑膜肉腫;精巣癌;胸腺癌;胸腺腫;甲状腺転移性癌;及び子宮癌の細胞からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする、実施形態E23の二重特異性分子。
E25.上記感染症は、バクテリア性、菌類性、ウイルス性及び寄生虫性病原体の存在を特徴とする、実施形態E24の二重特異性分子。
E26.上記感染症は:エプスタイン・バーウイルス;A型肝炎ウイルス(HAV);B型肝炎ウイルス(HBV);C型肝炎ウイルス(HCV);ヘルペスウイルス(例えばHSV‐1、HSV‐2、HHV‐6、CMV);ヒト免疫不全ウイルス(HIV);水疱性口内炎ウイルス(VSV);桿菌;シトロバクター;コレラ;ジフテリア;エンテロバクター;淋菌;ヘリコバクター・ピロリ;クレブシエラ;レジオネラ;髄膜炎菌;マイコバクテリア;シュードモナス;肺炎球菌;リケッチア細菌;サルモネラ;セラチア;ブドウ球菌;連鎖球菌;破傷風;アスペルギルス(フミガーツス、クロコウジカビ等);ブラストミセス・デルマチチジス;カンジダ(アルビカンス、クルセイ、グラブラタ、トロピカリス等);クリプトコッカス・ネオフォルマンス;ムコラエ属(ケカビ、ユミケカビ、クモノスカビ);スポロスリックス・シェンキー;パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス;コクシジオイデス・イムチス;ヒストプラスマ・カプスラツム;レプトスピラ症;ボレリア・ブルグドルフェリ;蠕虫性寄生虫(鉤虫、条虫、吸虫、扁虫(例えば住血吸虫));ランブル鞭毛虫;トリキネラ属;二核アメーバ;トリパノソーマ・ブルセイ;トリパノソーマ・クルージ;及びドノバン・リーシュマニアの存在を特徴とする、実施形態E25の二重特異性分子。
2つの免疫調節経路を調節する別個の細胞表面タンパク質、PD‐1及びLAG‐3に対する特異性を有する二重特異性分子を生成し、「DART A」と命名した。
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SVVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYSFTSYWMN
WVRQAPGQGL EWIGVIHPSD SETWLDQKFK DRVTITVDKS TSTAYMELSS
LRSEDTAVYY CAREHYGTSP FAYWGQGTLV TVSSGGCGGG EVAACEKEVA
ALEKEVAALE KEVAALEKES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT
LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG
である。
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD
YNMDWVRQAP GQGLEWMGDI NPDNGVTIYN QKFEGRVTMT TDTSTSTAYM
ELRSLRSDDT AVYYCAREAD YFYFDYWGQG TTLTVSSGGC GGGKVAACKE
KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
である。
本明細書で提供され、かつ当該技術分野において公知の方法を用いて、PD‐1及びCTLA‐4に対する特異性を有する二重特異性分子を生成した。いくつかのPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子のポリペプチド鎖の一般構造を表8に提示する。特に、PD‐1に対する1つの結合部位及びCTLA‐4に対する1つの結合部位を有する2つのポリペプチド鎖を含む、二重特異性2価ダイアボディ分子を生成でき、ここでは上記ポリペプチド鎖は、変異型Iの一般構造を有する(例えば図1も参照)。PD‐1に対する1つの結合部位、CTLA‐4に対する1つの結合部位及びFc領域を有する3つのポリペプチド鎖を含む、二重特異性2価ダイアボディ分子を生成でき、ここでは上記ポリペプチド鎖は、変異型IIの一般構造を有する(例えば図4Aも参照)。PD‐1に対する2つの同一の結合部位、CTLA‐4に対する2つの同一の結合部位及びFc領域を有する4つのポリペプチド鎖を含む、二重特異性3価ダイアボディ分子を生成でき、ここでは上記ポリペプチド鎖は、変異型III又はIVの一般構造を有する(例えば図3A〜3Cも参照)。更に、PD‐1に対する2つの結合部位及びCTLA‐4に対する1つの結合部位(又はCTLA‐4に対する2つの結合部位及びPD‐1に対する1つの結合部位)並びにFc領域を有する4つのポリペプチド鎖を含む、二重特異性3価ダイアボディ分子を生成でき、ここでは上記ポリペプチド鎖は、変異型Vの一般構造を有する(例えば図6Aも参照)。更に、PD‐1に対する1つの結合部位、CTLA‐4に対する1つの結合部位及びFc領域を有する4つのポリペプチド鎖を含む、二重特異性2価ダイアボディ分子を生成でき、ここでは上記ポリペプチド鎖は、変異型VIの一般構造を有する(例えば米国特許第7,695,936号、及び国際公開第2011/143545号も参照)。
(a)VL1及びVH1は、抗PD‐1抗体の可変ドメインであり、VL2及びVH2は、抗CTLA‐4抗体の可変ドメインである;又は
(b)VL1及びVH1は、抗CTLA‐4抗体の可変ドメインであり、VL2及びVH2は、抗PD‐1抗体の可変ドメインである。
変異型V及びVIに関しては:VL3及びVH3は抗PD‐1抗体の可変ドメインであるか、又は抗CTLA‐4抗体の可変ドメインである。
あるいは、PD‐1(又はCTLA‐4)に特異的に結合する1つのエピトープ結合部位、及びヘプタン、例えばフルオレセインイソチオシアネート(フルオロイソチオシアネート又はFITCとしても公知)に特異的に結合する第2のエピトープ結合部位を備える、二重特異性分子(例えば二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、3価結合性分子等)を構成してよい。このような二重特異性分子は、PD‐1(又はCTLA‐4)に対して特異的な結合ドメインを、CTLA‐4(又はPD‐1)に対して特異的なフルオレセイン連結結合分子(例えば、抗体、scFv等)と共連結させることができる、汎用二重特異性アダプタ(「UBA」)分子として作用する。例えばこのような汎用二重特異性アダプタ分子のFITC反応性アームを用いて、CTLA‐4(又はPD‐1)に結合するFITC標識抗体に結合することにより、PD‐1及びCTLA‐4に適合された汎用二重特異性アダプタ分子を生成できる。このような汎用二重特異性アダプタ分子は、二重特異性分子の迅速な評価に有用である。
EVKLDETGGG LVQPGRPMKL SCVASGFTFS DYWMNWVRQS PEKGLEWVAQ
IRNKPYNYET YYSDSVKGRF TISRDDSKSS VYLQMNNLRV EDMGIYYCTG
SYYGMDYWGQ GTSVTVSS
DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK
VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP
WTFGGGTKLE IK
生成され得る1つの汎用二重特異性アダプタ分子は、1つのPD‐1エピトープ結合部位及び1つのフルオレセイン結合部位を備える2つのポリペプチド鎖で構成される、共有結合ダイアボディ(「UBA1」)である。
DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK
VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP
WTFGGGTKLE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT
SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY
MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEK
である。
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI KGGGGSGGGG EVKLDETGGG LVQPGRPMKL SCVASGFTFS
DYWMNWVRQS PEKGLEWVAQ IRNKPYNYET YYSDSVKGRF TISRDDSKSS
VYLQMNNLRV EDMGIYYCTG SYYGMDYWGQ GTSVTVSSGG CGGGKVAALK
EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE
である。
上で提示したように、UBA1等のダイアボディの1つのポリペプチド鎖にIgG CH2‐CH3ドメインを組み込むことにより、より複雑な4鎖二重特異性Fc領域含有ダイアボディを形成できる。よって、生成され得る第2の汎用二重特異性アダプタ分子は、2つのPD‐1エピトープ結合部位、2つのフルオレセイン結合部位及びFc領域を備える4つのポリペプチド鎖で構成される、共有結合ダイアボディ(「UBA2」)である。UBA2は、上記2つのフルオレセイン結合部位を介して、2つのフルオレセイン標識分子に結合できることに留意されたい。
DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK
VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP
WTFGGGTKLE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT
SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY
MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGK
である。
生成され得る第3の汎用二重特異性アダプタ分子は、1つのPD‐1エピトープ結合部位、1つのフルオレセイン結合部位及びFc領域を備える3つのポリペプチド鎖で構成される、共有結合ダイアボディ(「UBA3」)である。
DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK
VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP
WTFGGGTKLE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT
SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY
MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGK
である。
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED
PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK
CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG
NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK
である。
生成され得る第4の汎用二重特異性アダプタ分子は、2つのPD‐1エピトープ結合部位、1つのフルオレセイン結合部位及びFc領域を備える4つのポリペプチド鎖で構成される、共有結合3価結合性分子(「UBA4」)である。
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH
YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD
YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY
ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK
DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV
YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK
である。
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
THQGLSSPVT KSFNRGEC
である。
生成され得る第5の汎用二重特異性アダプタ分子は、2つのPD‐1エピトープ結合部位、1つのフルオレセイン結合部位及びFc領域を備える3つのポリペプチド鎖で構成される、共有結合3価結合性分子(「UBA5」)である(例えば図6C〜6Dを参照)。
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI KGGGGSGGGG SGGGGSQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA
SGYSFTSYWM NWVRQAPGQG LEWIGVIHPS DSETWLDQKF KDRVTITVDK
STSTAYMELS SLRSEDTAVY YCAREHYGTS PFAYWGQGTL VTVSSASTKG
PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA
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である。
本発明のPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子は、多様な方法のいずれにおいて特性決定してよい。特に本発明のPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子を、(例えば細胞表面上に存在するもの等の)PD‐1及びCTLA‐4分子に免疫特異的に結合する能力に関してアッセイしてよく、並びに/又は抗原との相互作用の結合動態を決定してよい。二重特異性分子がFc領域(又はその一部分)を備える場合、上記分子が、Fc‐FcγR相互作用、例えばFcγRに対するFc領域(又はその一部分)の特異的結合、エフェクタ機能の仲介、シグナル伝達等を行う能力をアッセイしてよい。本発明のPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子の免疫調節活性及び/又はインビボ抗腫瘍活性を、当該技術分野において公知のインビトロ及びインビボアッセイを用いてアッセイしてよい。
1.ヒト全血からのPBMC及び免疫細胞部分集団の単離
健康なヒトドナーからのPBMCを、例えばFicoll勾配遠心分離を用いて、全血から単離する。簡潔に述べると、全血を、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1:1に希釈する。希釈された血液(35mL)を、50mL試験管中の15mLのFicoll‐Paque(商標)Plus上に重ね、上記試験管を、400×g(1320rpm)で30分間、ブレーキをオフにして遠心分離する。2相の間の緩衝コート層を50mL試験管に回収し、600×g(1620rpm)で5分間遠心分離する。上清を廃棄し、細胞ペレットを(例えば試験管を600×g(1620rpm)で5分間遠心分離することにより)PBSで3回洗浄する。生存細胞数を、Trypan Blue染料を用いて決定する。PBMCを完全培養培地(例えばRPMI 1640、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)中に再懸濁し、5%CO2を用いて37℃で一晩インキュベートするか、又は以下で説明するように、T細胞(例えばT reg、CD8、CD4)、NK細胞、樹状細胞及び単球といった所望の免疫細胞部分集団を単離するために更に処理する。
カニクイザル又はアカゲザルからのPBMCを、例えばFicoll勾配遠心分離を用いて、全血から単離する。簡潔に述べると、全血を、滅菌PBSで1:3に希釈する。希釈された血液(35mL)を、50mLポリプロピレン遠心分離管中の15mLの90%Ficoll‐Paque(商標)Plus(90mLのFicoll+10mLのPBS)上に重ね、上記試験管を、室温において931×g(2000rpm)で30分間、ブレーキをオフにして遠心分離する。2相の間の緩衝コート層を回収して清浄な50mL試験管に移し、試験管を600×g(1620rpm)で5分間遠心分離することにより、45mLのPBSで洗浄する。上清を廃棄し、ペレットをPBSで3回すすぐ。カニクイザル又はアカゲザルPBMCを30mLの完全培養培地に再懸濁して、生存細胞数を、Trypan Blue染料による除外によって決定する。
市販の調製キット(例えばUntouched(商標)ヒト単球キット(Life Technologies/ThermoFisher Scientific))を、製造元の説明書に従って使用して、ドナー由来の精製済みPBMCからヒト単球を単離する。単離されたヒト単球を、組み換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(例えば、hGM‐CSF;Peprotech、100ng/ml)及び組み換えヒトインターロイキン‐4(hIL‐4;Peprotech、40ng/ml)の存在下で、上記単球を、(例えばヌクレオシドを含むα最小必須培地(αMEM)+2%ヒトAB陰性血清+1%ペニシリン/ストレプトマイシン中で)5〜7日間培養することによって、ヒト未成熟mDCへと分化するよう誘導する。未成熟mDCを採取し、以下で詳述するもの等の同種異系混合リンパ球反応(allogeneic mixed lymphocyte reaction:allo‐MLR))アッセイにおいて刺激細胞として使用するために、試験管を600×g(1620rpm)で5分間遠心分離することによって、PBSで洗浄する。
PD‐1及び/又はCTLA‐4を発現する細胞は、当該技術分野において公知の方法を用いて生成してよい。例えば、適切な遺伝子(例えばヒトPD‐1遺伝子)を含有するレトロウイルスベクターを用いて、細胞(例えばNSO、Jurkat、CHO等)を、PD‐1及び/又はCTLA‐4を発現するように操作してよい。あるいは、免疫細胞を、PD‐1及び/又はCTLA‐4を誘発する又は増大させるように刺激してよい。簡潔に述べると、上述のようにして単離された精製済み免疫細胞(例えばPBMC、T細胞、樹状細胞等)を、マイトジェンの存在又は不在下で2〜6日間培養し、PD‐1及び/又はCTLA‐4の発現を、例えばフローサイトメトリーを用いて、未処置(ナイーブ)細胞及び刺激細胞上で検査する。マイトジェン刺激に応答しての、ナイーブ細胞上での発現パターンの予備評価のために、市販の抗PD‐1及び抗CTLA‐4抗体を使用できる。更に、又は任意に、本発明のPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子を使用してよい。
PD‐1若しくはCTLA‐4分子への免疫特異的結合、結合の交差反応性、又はFc‐FcγR相互作用を分析するために使用できるイムノアッセイとしては、限定するものではないが、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、イムノクロマトグラフィアッセイ、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びタンパク質Aイムノアッセイ等といった、競合及び非競合アッセイシステムが挙げられる(例えばAusubel et al.、2008、Current Protocols in Molecular Biologyを参照)。標的抗原に対する結合親和性は典型的には、Biacore競合アッセイ、飽和アッセイ、又はELISA若しくはRIAといったイムノアッセイ等の、標準的な抗体‐抗原アッセイによって測定又は決定される。当業者に公知の技法のうちのいずれを用いた蛍光活性化細胞分類(FACS)を、本発明のPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子を特性決定するための免疫学的又は機能ベースアッセイのために使用してよい。
PD‐1×CTLA‐4二重特異性分子の、細胞表面上で発現されたPD‐1及び/又はCTLA‐4に結合する能力は、PD‐1及び/又はCTLA‐4を発現する細胞(標的細胞)を用いた飽和/希釈ベースのアッセイで測定してよい。このような細胞は、PD‐1及び/若しくはCTLA‐4を発現するよう刺激された免疫細胞、又はPD‐1及び/若しくはCTLA‐4分子を安定して過剰発現するよう操作された細胞株(例えばNSO細胞)であってよい。簡潔に述べると、培養された標的細胞(例えばPD1+を発現するよう操作されたNSO細胞)を採取し、ブロッキングバッファ(例えばFACSバッファ+10%ヒトAB血清)中に(例えば約5×106細胞/mlで)再懸濁する。等モル濃度(例えば合計200μl中20nM)で開始して、PD‐1×CTLA‐4二重特異性分子、抗PD‐1抗体、抗CTLA‐4、又は抗PD‐1と抗CTLA‐4抗体との組み合わせを、別個のマイクロタイタープレートでの希釈用に調製し、その後5〜12回連続希釈(例えば、1:4、1:5、1:10等)して、5〜12点の曲線を生成する。全ての実験における最高の開始濃度は、経験的に決定される。同一体積(例えば50μl)の各希釈物を新しいマイクロタイタープレートに添加し、各ウェルに標的細胞を(例えば0.25×106細胞/ウェルで)添加して、(例えば4〜25℃で30〜120分間)インキュベートする。細胞を1〜3回洗浄し(例えばマイクロタイタープレートを600×g(1620rpm)で5分間スピンさせた後、ブロッキングバッファで洗浄し、再びスピンさせて)、ブロッキングバッファ中に再懸濁する。二次染色のために、適切な二次試薬を選択し、例えばヤギ抗ヒトFc‐APCを用いてヒト一次抗体を検出してよく、またその一方ではヤギ抗マウスIgG Fc Alexa Fluor 647を用いてマウス一次抗体を検出する。選択した二次試薬をブロッキングバッファ中で個々の二次試薬の濃度に基づいて希釈し、原液を作製し、同一体積/ウェルの二次混合物を個々のウェルにアリコートして、(例えば4〜25℃で30〜120分間)インキュベートする。細胞を上述のようにして洗浄し、ブロッキングバッファ中に再懸濁する。染色された細胞をフローサイトメトリーで分析する。フローサイトメトリーデータは、FACSCalibur/Fortessa(Becton Dickinson/Fortessa)で取得でき、FlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いて平均蛍光強度として分析でき、Prism6ソフトウェア(Graphpad)のlog(アゴニスト)vs.反応‐可変傾斜(4パラメータ)関数を用いてプロット及びフィッティングできる。
本発明のPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子の、リガンド結合及びシグナリングを変調する(例えばブロック、阻害、刺激する等)能力を分析するために使用できるアッセイを、以下で更に詳細に提供する。
PD‐1×CTLA‐4二重特異性分子の、PD‐1がPD‐L1及び/又はPD‐L2に結合するのを阻害する能力は、PD‐1を発現する細胞(標的細胞)を用いて評価してよい。このような細胞は、PD‐1を発現するよう刺激された免疫細胞、又はPD‐1分子を発現するよう操作された細胞株、例えばヒトPD‐1遺伝子をレトロウィルスで形質移入されたNSO細胞であってよい。簡潔に述べると、PD‐1発現細胞(例えばNSO/PDCD1(NSO‐PD1+))を採取し、ブロッキングバッファ(例えばFACSバッファ+10%ヒトAb血清)中に(例えば約1.5×106細胞/mlで)再懸濁し、マイクロタイタープレートに(例えば0.25×106細胞/ウェルで)播種する。等モル濃度(例えば合計200μl中20nM)で開始して、PD‐1×CTLA‐4二重特異性分子、抗PD‐1抗体、抗CTLA‐4、又は抗PD‐1と抗CTLA‐4抗体との組み合わせを、別個のマイクロタイタープレートでの希釈用に調製し、5〜12回連続希釈(例えば、1:4、1:5、1:10等)して、5〜12点の曲線を生成する。全ての実験における最高の開始濃度は、経験的に決定される。同一体積(例えば50μl)の各希釈物を、標的細胞を内包するマイクロタイタープレートの各ウェルに添加する。PD‐L1結合を評価するために、可溶性PD‐L1融合タンパク質(例えばhPD‐L1(B7H1)TEV‐hIgG1‐Fc‐ビオチン(Ancell))を、未染色の陰性対照ウェルを除いた各ウェルに添加して、(例えば4〜25℃で30〜120分間)インキュベートする。PD‐L2結合を評価するために、可溶性PD‐L2融合タンパク質(例えばCD273(PD‐L2)muIgG/ビオチン(Ancell))を、未染色の陰性対照ウェルを除いた各ウェルに添加して、(例えば4〜25℃で30〜120分間)インキュベートする。細胞を1〜3回洗浄する(例えばマイクロタイタープレートを600×g(1620rpm)で5分間スピンさせた後、ブロッキングバッファで洗浄し、再びスピンさせる)。上記細胞をブロッキングバッファ中に再懸濁する。未染色の陰性対照ウェルを除いて、PD‐L1又はPD‐L2融合タンパク質を検出するための適切な二次試薬(例えばストレプトアビジン‐PE標識二次試薬(eBiosciences))を添加して、(例えば4〜25℃で15〜120分間)インキュベートする。細胞を上述のようにして洗浄し、ブロッキングバッファ中に再懸濁する。染色された細胞をフローサイトメトリーで分析してよい。フローサイトメトリーデータは、FACSCalibur/Fortessa(Becton Dickinson/Fortessa)で取得でき、FlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いて、PD‐1×CTLA‐4二重特異性分子、抗PD‐1抗体、抗CTLA‐4抗体、又は抗PD‐1抗体と抗CTLA‐4抗体との組み合わせの存在下での、sPD‐L1又はsPD‐L2の平均蛍光強度の損失として分析でき、Prism6ソフトウェア(Graphpad)のlog(アゴニスト)vs.反応‐可変傾斜(4パラメータ)関数を用いてプロット及びフィッティングできる。
PD‐1×CTLA‐4二重特異性分子の、CTLA‐4がCD80及び/又はCD86に結合するのを阻害する能力は、CTLA‐4を発現する細胞(標的細胞)を用いて評価してよい。このような細胞は、CTLA‐4を発現するよう刺激された免疫細胞、又はCTLA‐4分子を発現するよう操作された細胞株、例えばヒトCTLA‐4遺伝子をレトロウィルスで形質移入されたNSO細胞であってよい。簡潔に述べると、CTLA‐4発現細胞を採取し、ブロッキングバッファ(例えばFACSバッファ+10%ヒトAb血清)中に再懸濁し、マイクロタイタープレートに(例えば0.25×106〜1.0×106細胞/ウェルで)播種する。等モル濃度(例えば合計200μl中20nM)で開始して、PD‐1×CTLA‐4二重特異性分子、抗PD‐1抗体、抗CTLA‐4、又は抗PD‐1と抗CTLA‐4抗体との組み合わせを、別個のマイクロタイタープレートでの希釈用に調製し、5〜12回連続希釈(例えば、1:4、1:5、1:10等)して、5〜12点の曲線を生成する。全ての実験における最高の開始濃度は、経験的に決定される。同一体積(例えば50μl)の各希釈物を、標的細胞を内包するマイクロタイタープレートの各ウェルに添加する。CD80結合を評価するために、可溶性CD80融合タンパク質(例えばhCD80‐muIg‐ビオチン(ADIPOGEN(登録商標)))を、未染色の陰性対照ウェルを除いた各ウェルに添加して、(例えば4〜25℃で30〜120分間)インキュベートする。CD86結合を評価するために、可溶性CD86融合タンパク質(例えばhCD86‐muIg‐ビオチン(ADIPOGEN(登録商標)))を、未染色の陰性対照ウェルを除いた各ウェルに添加して、(例えば4〜25℃で30〜120分間)インキュベートする。細胞を1〜3回洗浄する(例えばマイクロタイタープレートを600×g(1620rpm)で5分間スピンさせた後、ブロッキングバッファで洗浄し、再びスピンさせる)。上記細胞をブロッキングバッファ中に再懸濁する。未染色の陰性対照ウェルを除いて、CD80又はCD86融合タンパク質を検出するための適切な二次試薬(例えばストレプトアビジン‐PE標識二次試薬(eBiosciences))を添加して、(例えば4〜25℃で15〜120分間)インキュベートする。細胞を上述のようにして洗浄し、ブロッキングバッファ中に再懸濁する。染色された細胞をフローサイトメトリーで分析してよい。フローサイトメトリーデータは、FACSCalibur/Fortessa(Becton Dickinson/Fortessa)で取得でき、FlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いて、PD‐1×CTLA‐4二重特異性分子、抗PD‐1抗体、抗CTLA‐4抗体、又は抗PD‐1抗体と抗CTLA‐4抗体との組み合わせの存在下での、CD86又はCD80の平均蛍光強度の損失として分析でき、Prism6ソフトウェア(Graphpad)のlog(アゴニスト)vs.反応‐可変傾斜(4パラメータ)関数を用いてプロット及びフィッティングできる。
PD‐1とPD‐L1との相互作用のブロックにおける、PD‐1×CTLA‐4二重特異性分子の機能活性を、Promegaが開発した市販のレポータシステムを製造元の指示に従って用いて、評価してよい。簡潔に述べると、刺激因子株又はレポータ細胞株として機能するように操作された2つの細胞株を使用する。刺激因子株は、CHO親株から、PD‐L1分子及びT細胞活性化因子を発現するよう操作されたものであり、膜結合抗CD3アゴニストmAb[CHO/PDL1細胞]である。レポータ細胞株は、CD3陽性Jurkat親株から、活性化T細胞の核因子(NFAT)の転写制御下でルシフェラーゼレポータ構造を発現するよう操作されたもの(NFAT‐luc2/PD‐1 Jurkat細胞)である。共培養すると、CHO‐PDL1細胞株上で発現される抗CD3アゴニストは、Jurkat‐NFAT‐luc/PD‐1細胞株上に存在するTCR/CD3シグナリング複合体の合体によって仲介されるNFATシグナル伝達経路によって、ルシフェラーゼ発現を推進する。抗PD‐1又は抗PD‐L1抗体の不在下において、ルシフェラーゼは、TCR/CD3シグナリングに対してあるレベルで発現するが、ブレーキとして機能するPD‐1/PD‐L1阻害軸の存在によって下方制御又は阻害される。PD‐1/PD‐L1シグナリングを阻害する分子(例えば、抗PD‐1又は抗PD‐L1抗体)の存在下では、この阻害軸又は「ブレーキ」は解放され、これによりルシフェラーゼ発現を増強でき、これを測定できる。従ってPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子のPD‐1阻害活性は、CHO/PDL1をNFAT‐luc2/PD1 Jurkat(3H‐D5)と共に培養することによって評価してよい。簡潔に述べると、CHO‐PDL1をマイクロタイタープレートに(例えば4.0×104細胞/ウェルで)播種し、(例えば10%FBS+100ug/mLハイグロマイシンB+500ug/mL G418を含有するRPMI培地中で)一晩培養する。翌日、アッセイバッファ(例えばRPMI+2%FBS)を、PD‐1×CTLA‐4二重特異性分子の5〜12点連続希釈と共に調製するか、又は等しいモル当量(例えば100〜200nM)での最高希釈点及び5〜12連続希釈(例えば、1:4、1:5、1:10等)を用いて、アッセイバッファ中の抗PD‐1抗体を調製する。以下の順序で、細胞培地中の細胞の一部分を、接着CHO/PDL1細胞を含有するマイクロタイタープレートから取り除き、各希釈物のアリコートをCHO/PDL1細胞に添加する。培養したNFAT‐luc2/PD‐1 Jurkat細胞を採取し、アッセイバッファ中に再懸濁して、CHO/PDL1細胞に(例えば40μl/ウェルにおいて5.0×104細胞/ウェルで)添加する。共培養物を(例えば37℃で6時間)インキュベートする。インキュベーションの終了時、Bio‐Glo基質(Promega)を再構成して、周囲温度平衡マイクロタイタープレートに添加する。インキュベーション後(例えば5〜10分後)、各ウェルの光学密度を、読み出し単位としてルミネッセンス相対光単位(relative light unit:RLU)を用いて、450nmにおいて、VICTOR(商標)X4マルチラベルプレートリーダ(Perkin Elmer #2030‐0040)上で読み取る。次にこのデータを、Prism6ソフトウェア(Graphpad)のlog(アゴニスト)vs.反応‐可変傾斜(4パラメータ)関数を用いてプロット及びフィッティングできる。
本発明のPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子の免疫調節活性を分析するために使用できるアッセイとしては、上述の「SEB」アッセイ等のマイトジェン刺激アッセイ、及び以下で更に詳細に提示されるもののような混合リンパ球反応(MLR)アッセイが挙げられる。本発明のPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子の、PD‐1及びCTLA‐4阻害経路両方を変調する能力は、抗PD1抗体及び抗CTLA‐4抗体単独の場合又はこれらの抗体を組み合わせた場合に比べて、アッセイにおいて増強された刺激を提供すると予測される。
本発明のPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子の抗腫瘍活性は、当該技術分野において公知の様々な動物モデルで評価してよい。本発明のPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子を用いた処置は、抗PD1抗体及び抗CTLA‐4抗体を単独で用いた、又はこのような抗体の組み合わせを用いた処置よりも、腫瘍確立及び/又は腫瘍成長を大幅に阻害すると予測される。
Fc領域含有ダイアボディ、及び4つのポリペプチド鎖を含むFc領域含有3化分子を含む、複数のPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子を生成した。4つのポリペプチド鎖を有しかつE/Kコイルヘテロ二量体促進ドメインを備える、3つのダイアボディを生成し、名称「DART B」、「DART C」及び「DART D」を与えた。4つの鎖を有しかつCH1/CLドメインを備える1つのダイアボディを生成し、名称「DART E」を与えた。4つの鎖を有し、かつE/Kコイルヘテロ二量体促進ドメイン及びCH1/CLドメインを備える、2つの3価結合性分子を生成し、名称「TRIDENT A」及び「TRIDENT B」を与えた。
連続希釈した結合分子(抗体CTLA‐4 mAb 3 G4P、DART D、TRIDENT A又はDART B)の、支持プレート上にコーティングした可溶性hCTLA‐4‐Avi‐His(1μg/mL)又はhPD‐1‐His(1μg/mL)に対する結合を測定するために、ELISA研究を実施した。ヤギ抗ヒト‐Fc‐HRP(1:10,000)を、結合を検出するための二次検出分子として採用した。このような研究の結果を、表10及び図8A〜8Bに示す。このデータは、PD‐1及びCTLA‐4のための2つの結合部位を有するPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子(例えばDART D及びDART B)が、その親抗PD‐1及び抗CTLA‐4抗体と同等の、PD‐1及びCTLA‐4への結合を呈したことを示す。PD‐1に対する2つの結合部位、及びCTLA‐4に対する1つの結合部位を有する、PD‐1×CTLA‐4二重特異性分子(例えばTRIDENT A)は、親抗PD‐1抗体と同等の、PD‐1に対する結合を呈し、また上記3価分子(これはCTLA‐4に対する結合部位を1つしか備えない)の結合活性の低下により、(親抗体に比べて)低下したCTLA‐4への結合を呈した。IgG1 CH1及び/又はIgG1(AA/YTE)Fc領域を有するDART F及びTRIDENT Bに関しても、同様の結合結果が観察された。
本発明の二重特異性分子の、リガンドがPD‐1及びCTLA‐4(単独又は組み合わせ)に結合するのをブロックする能力を評価するために、一連のELISAアッセイを実施した。PD‐1に対するPD‐L1の結合のブロックを、等量の無関係の抗原の存在下、及び等量のCTLA‐4の存在下で評価した。プレートを、His‐タグ付与可溶性ヒトPD‐1(shPD‐1)とHis‐タグを付与された無関係の抗原(irrAg)との1:1混合物(それぞれ2μg/ml)、又はshPD‐1とHis‐タグ付与ヒトCTLA‐4(shCTLA‐4)との1:1混合物(それぞれ2μg/ml)でコーティングした。指示された濃度の、PD‐1 mAb 6 G4P、DART D、TRIDENT A、又は(RSVに対する2つの結合部位及びCTLA‐4に対する1つの結合部位を有する)対照TRIDENTを、6μg/mlのビオチン標識PD‐L1と5分間にわたって事前に混合して、プレートに添加した。PD‐L1結合を、ストレプトアビジンHRP(1:3000)を用いて検出した。この評価の結果を図9A〜9Bに提示する。試験されたPD‐1結合分子は全て、PD‐1に対するPD‐L1の結合を阻害できることが分かった。
DART A、TRIDENT A及びCTLA‐4 mAb 1の、ヒトCTLA‐4及びカニクイザルCTLA‐4に対する結合親和性を、BIACORE(登録商標)分析を用いて調査した。簡潔に述べると、Hisタグ付与可溶性CTLA‐4(ヒスチジン含有ペプチドに融合したヒト又はカニクイザルCTLA‐4の細胞外部分)を、不動化された抗PentaHis上で捕捉し、異なる濃度(12.5〜200nM)のCTLA‐4結合分子に、上記不動化CTLA‐4タンパク質上を通過させた。結合の動態を、BIACORE(登録商標)分析で決定した(1:1ラングミュア結合モデル(同時のka/kd)による親和性;又は別個のka/kdの1:1でのフィットによる結合活性)。これらの研究から算出されたka、kd及びKDを表11に提示する。
DART B、DART D、TRIDENT A、抗CTLA‐4抗体CTLA‐4 mAb 1、CTLA‐4 mAb 3 G4P、及びhIgG対照抗体を、カニクイザルCTLA‐4(cynoCTLA‐4)又はヒトCTLA‐4(huCTLA‐4)を発現するCHO細胞への結合に関して評価した。この評価の結果を図10A〜10Bに示す。これらの結合分子を、カニクイザルCTLA‐4(図10A)又はヒトCTLA‐4(図10Bを)を発現するCHO細胞の存在下でインキュベートした。これらの細胞への結合を、抗ヒトFc二次抗体を用いて検出した。結果は、試験した全ての分子が、CHO細胞の表面上に発現されたヒト及びカニクイザルCTLA‐4に結合できたことを示す。抗CTLA‐4抗体は、huCTLA‐4に対して同等の結合プロファイルを呈し;2価二重特異性分子DART B及びDART Dは、わずかに低下した結合を呈する。CTLA‐4に対して1価である3価結合性分子TRIDENT Aは、CTLA‐4に対してより高い価数を有する分子よりも低い結合を呈した。対照抗体は結合しなかった。同様の結果が、cynoCTLA‐4への結合に関しても観察された。
DART D、TRIDENT A、PD‐1 mAb 6 G4P及びCTLA‐4 mAb 3 G1AAを、PD‐1を発現するがCTLA‐4を発現しないNSO細胞に結合する能力に関して評価した。結合分子を、上記細胞の存在下でインキュベートし、上記細胞の蛍光指数を測定した。この評価の結果を図14に提示する。予測されたように、CTLA‐4抗体は結合せず、全ての二重特異性結合分子は、NSO細胞の表面上に発現されるPD‐1に結合できることが分かった。全ての二重特異性分子は、PD‐1に対して2価であり、NSO細胞に対して同様の結合を呈した。
DART D、TRIDENT A及び陰性対照抗体を、PD‐1及びCTLA‐4を共連結する能力に関して、DiscoverXによる酵素断片相補性アッセイにおいて試験した。簡潔に述べると、U2OS CTLA‐4(1‐195)‐PK PD‐1(1‐199)‐EA細胞株#9のアリコートを、384ウェルプレート上のDiscoverX CP5播種培地に、5000細胞/ウェルで4回播種した。細胞を37℃/5%CO2で4時間付着させた。各結合分子の11点1:3連続希釈物を、PD‐1‐CTLA‐4細胞に添加した。プレートを37℃/5%CO2で一晩(16時間)インキュベートした。PathHunter検出試薬をウェルに添加した後、これを暗所において、室温で1時間インキュベートし、続いてプレートをEnvisionルミノメータで読み取った。この評価の結果を、表14及び図17(U2OS CTLA‐4(1‐195)‐PK PD‐1(1‐199)‐EA細胞株#9)に提示する。二重特異性DART D及びTRIDENT A分子はいずれも、酵素断片相補性によって示されるように、両方の受容体を発現する細胞において相当なPD‐1及びCTLA‐4の合体を示し、これは、本発明の二重特異性分子が、PD‐1及びCTLA‐4に同時に結合できることを示し、更に、PD‐1による係留によって、両方の標的受容体が発現された場合のTRIDENT分子のCTLA‐4結合親和性の低下が補償されることを示す。この発見は、上述のELISA阻害研究と矛盾しない。陰性対照は、PD1‐CTLA4細胞株においてシグナルの有意な増大を誘発しなかった。より高濃度のTRIDENT Aを用いたインキュベーションは、U2OS PD1‐CTLA4二量体化細胞株(S:B=12.7)におけるロバストなシグナル増大を誘発した。PD‐1‐CTLA‐4細胞株における用量応答試験でのDART Dとの反応は、大きさが比較的小さかった(S:B=9.2)が、EC50値はこれらの分子両方に関して同様であった(EC50=20pM)。
A.GVHDマウスモデルにおけるPD‐1×CTLA‐4二重特異性分子の活性
代表的なPD‐1×CTLA‐4二重特異性2価分子、DART Dの活性を、移植片対宿主病(GVHD)のPBMC移植NOGマウスモデルで評価した。この研究の設計を表15に提示する。
代表的なPD‐1×CTLA‐4二重特異性2価分子であるDART D、及び代表的なPD‐1×CTLA‐4二重特異性3価分子であるTRIDENT Aの安全性プロファイルを、カニクイザルにおける非GLP(Good Laboratory Practice:優良試験所基準)投薬研究で評価した。更に、薬物動態学的活性の複数のマーカを検査した。
配列番号1:例示的なヒトIgG1のCH2−CH3ドメイン、Xaaはリジン(K)又は不在である
配列番号2:例示的なヒトIgG2のCH2−CH3ドメイン、Xaaはリジン(K)又は不在である
配列番号3:例示的なヒトIgG3のCH2−CH3ドメイン、Xaaはリジン(K)又は不在である
配列番号4:例示的なヒトIgG4のCH2−CH3ドメイン、Xaaはリジン(K)又は不在である
配列番号5:介在スペーサペプチド(リンカー1)
配列番号6:システイン含有スペーサペプチド(リンカー1)
配列番号7〜12:代替的なスペーサペプチドリンカー2
配列番号13:ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号14、15:ヒトIgGヘテロ二量体促進ドメインのヒンジ領域
配列番号16、17:ヒトκ軽鎖ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号18:Eコイルヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号19:Kコイルヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号20:システイン含有Eコイルヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号21:システイン含有Kコイルヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号22:連鎖球菌株G148のタンパク質Gのアルブミン結合ドメイン3(ABD3)
配列番号23〜25:連鎖球菌株G148のタンパク質Gのアルブミン結合ドメイン3(ABD3)の脱免疫化変異型
配列番号26〜32:介在スペーサリンカー
配列番号33:例示的なIgG1ヒンジ領域
配列番号34:例示的なIgG2ヒンジ領域
配列番号35:例示的なIgG4ヒンジ領域
配列番号36:安定化S228P置換を含むIgG4ヒンジ変異型
配列番号37:介在スペーサペプチド
配列番号38:例示的なヒトIgG CLκドメイン
配列番号39:例示的なヒトIgG CLλドメイン
配列番号40:ヒトIgG 1 CH1ドメイン
配列番号41:ヒトIgG 2 CH1ドメイン
配列番号42:ヒトIgG 4 CH1ドメイン
配列番号43:L234A及びL235A置換(Kabat)を含むヒトIgG1のCH2−CH3ドメイン、Xaaはリジン(K)又は不在である
配列番号44:「ノブ担持」ヒトIgG1 CH2−CH3ドメイン、Xaaはリジン(K)又は不在である
配列番号45:「ホール担持」ヒトIgG1 CH2−CH3ドメイン、Xaaはリジン(K)又は不在である
配列番号46:シグナル配列(NCBI配列番号NP_005009.2)を含むヒトPD‐1
配列番号47:抗ヒトPD‐1抗体PD‐1 mAb 1(ニボルマブ)のVHドメイン
配列番号48:抗ヒトPD‐1抗体PD‐1 mAb 1(ニボルマブ)のVLドメイン
配列番号49:抗ヒトPD‐1抗体PD‐1 mAb 2(ペンブロリズマブ)のVHドメイン
配列番号50:抗ヒトPD‐1抗体PD‐1 mAb 2(ペンブロリズマブ)のVLドメイン
配列番号51:マウス抗ヒトPD‐1抗体PD‐1 mAb 3(EH12.2H7)のVHドメイン
配列番号52:抗ヒトPD‐1抗体PD‐1 mAb 3(EH12.2H7)のVLドメイン
配列番号53:ヒト化抗ヒト抗体PD‐1 mAb 4(ピジリズマブ)のVHドメイン
配列番号54:ヒト化抗ヒト抗体PD‐1 mAb 4(ピジリズマブ)のVLドメイン
配列番号55:ヒト化抗ヒトPD‐1抗体(PD‐1 mAb 5)のVHドメイン
配列番号56:ヒト化抗ヒトPD‐1抗体(PD‐1 mAb 5)のVLドメイン
配列番号57:ヒト化抗ヒトPD‐1抗体(PD‐1 mAb 6)のVHドメイン、Xaaはイソロイシン(I)又はアラニン(A)である
配列番号58:ヒト化抗ヒトPD‐1抗体(PD‐1 mAb 6)のVLドメイン、26位のXaaはアスパラギン(N)又はセリン(S)であり、58位のXaaはグルタミン(Q)またはアルギニン(R)である
配列番号59:ヒト化抗ヒトPD‐1抗体(PD‐1 mAb 7)のVHドメイン、12位のXaaはバリン(V)またはアラニン(A)であり、35位のXaaはセリン(S)またはグリシン(G)であり、48位のXaaはバリン(V)またはトレオニン(T)であり、86位のXaaはロイシン(L)またはアラニン(A)である。
配列番号60:ヒト化抗ヒトPD‐1抗体(PD‐1 mAb 7)のVLドメイン、31位のXaaはセリン(S)またはアスパラギン(N)であり、50位のXaaはアスパラギン(N)またはアスパラテート(D)である
配列番号61:ヒト化抗ヒトPD‐1抗体(PD‐1 mAb 8)のVHドメイン
配列番号62:ヒト化抗ヒトPD‐1抗体(PD‐1 mAb 8)のVLドメイン
配列番号63:PD‐1×LAG‐3DART Aの第1及び第3のポリペプチド鎖
配列番号64PD‐1×LAG‐3DART Aの第2及び第4のポリペプチド鎖
配列番号65:mAb 4‐4‐20のVHドメイン
配列番号66:mAb 4‐4‐20のVLドメイン
配列番号67:汎用二重特異性アダプタ分子UBA−1の第1のポリペプチド鎖
配列番号68:汎用二重特異性アダプタ分子UBA−1の第2のポリペプチド鎖
配列番号69:汎用二重特異性アダプタ分子UBA−2の第1及び第3のポリペプチド
配列番号70:汎用二重特異性アダプタ分子UBA−3の第1のポリペプチド鎖
配列番号71:汎用二重特異性アダプタ分子UBA−3の第3のポリペプチド鎖
配列番号72:汎用二重特異性アダプタ分子UBA−4の第3のポリペプチド鎖
配列番号73:汎用二重特異性アダプタ分子UBA−4の第4のポリペプチド鎖
配列番号74:汎用二重特異性アダプタ分子UBA−5の第3のポリペプチド鎖
配列番号75:シグナル配列(NCBI配列番号NP_005205.2)を含むヒトCTLA−4
配列番号76:抗ヒトCTLA‐4抗体CTLA‐4 mAb 1(イピリムマブ)のVHドメイン
配列番号77:抗ヒトCTLA‐4抗体CTLA‐4 mAb 1(イピリムマブ)のVLドメイン
配列番号78:抗ヒトCTLA‐4抗体CTLA‐4 mAb 2(トレメリムマブ)のVHドメイン
配列番号79:抗ヒトCTLA‐4抗体CTLA‐4 mAb 2(トレメリムマブ)のVLドメイン
配列番号80:M252Y、S254T及びT256E置換を含むIgG1のFC領域のCH2−CH3ドメイン、Xaaはリジン(K)又は不在である
配列番号81:M252Y、S254T及びT256E置換を含むIgG4のFC領域のCH2−CH3ドメイン、Xaaはリジン(K)又は不在である
配列番号82:M252Y、S254T及びT256E置換を含むIgG1のFC領域のCH2−CH3ドメインの「ノブ担持」変異型、Xaaはリジン(K)又は不在である
配列番号83:M252Y、S254T及びT256E置換を含むIgG1のFC領域のCH2−CH3ドメインの「ホール担持」変異型、Xaaはリジン(K)又は不在である
配列番号84:M252Y、S254T及びT256E置換を含むIgG4のFC領域のCH2−CH3ドメインの「ノブ担持」変異型、Xaaはリジン(K)又は不在である
配列番号85:M252Y、S254T及びT256E置換を含むIgG4のFC領域のCH2−CH3ドメインの「ホール担持」変異型、Xaaはリジン(K)又は不在である
配列番号86:ヒト化抗ヒトPD‐1抗体(PD‐1 mAb 6 I VH)のVHドメイン
配列番号87:ヒト化抗ヒトPD‐1抗体(PD‐1 mAb 6 SQ VL)のVLドメイン
配列番号88:抗ヒトPD‐1抗体PD‐1 mAb 6 G4Pの重鎖
配列番号89:抗ヒトPD‐1抗体PD‐1 mAb 6 G4Pの軽鎖
配列番号90:抗ヒトCTLA‐4抗体CTLA−4 mAb 3のVHドメイン
配列番号91:抗ヒトCTLA‐4抗体CTLA−4 mAb 3のVLドメイン
配列番号92:抗ヒトCTLA‐4抗体mAb 3 G1AAの重鎖
配列番号93:抗ヒトCTLA‐4抗体mAb 3 G4Pの重鎖
配列番号94:抗ヒトCTLA‐4抗体mAb 3 G1AA及びmAb 3 G4Pの軽鎖
配列番号95:DART Bの第1及び第3のポリペプチド鎖
配列番号96:DART Bの第2及び第4のポリペプチド鎖
配列番号97:DART Cの第1及び第3のポリペプチド鎖
配列番号98:DART Cの第2及び第4のポリペプチド鎖
配列番号99:DART Dの第1及び第3のポリペプチド鎖
配列番号100:DART Dの第2及び第4のポリペプチド鎖
配列番号101:DART Fの第1及び第3のポリペプチド鎖
配列番号102:DART Eの第1及び第3のポリペプチド鎖
配列番号103:DART Eの第2及び第4のポリペプチド鎖
配列番号104:TRIDENT Aの第1のポリペプチド鎖
配列番号105:TRIDENT Aの第2のポリペプチド鎖
配列番号106:TRIDENT Aの第3のポリペプチド鎖
配列番号107:TRIDENT Aの第4のポリペプチド鎖
配列番号108:TRIDENT Bの第1のポリペプチド鎖
配列番号109:TRIDENT Bの第3のポリペプチド鎖
配列番号110:TRIDENT Cの第3のポリペプチド鎖
Claims (20)
- (A)PD‐1のエピトープに免疫特異的に結合できる1つ以上のエピトープ結合部位が、PD‐1 mAb 6‐I VHのVHドメイン(配列番号86)及びPD‐1 mAb 6‐SQのVLドメイン(配列番号87)を含み;
(B)CTLA‐4のエピトープに免疫特異的に結合できる1つ以上のエピトープ結合部位が、CTLA‐4 mAb 3のVHドメイン(配列番号90)及びCTLA‐4 mAb 3のVLドメイン(配列番号91)を含む、二重特異性分子。 - 前記分子はFc領域を含む、請求項1に記載の二重特異性分子。
- 前記Fc領域は、変異型Fc領域であって:
(A)FcγRに対する前記変異型Fc領域の親和性を低減する1つ若しくは複数のアミノ酸修飾;及び/又は
(B)前記変異型Fc領域の血清半減期を向上させる1つ若しくは複数のアミノ酸修飾
を含む、変異型Fc領域である、請求項2に記載の二重特異性分子。 - FcγRに対する前記変異型Fc領域の親和性を低減する前記修飾は、L234A;L235A;又はL234A及びL235A(前記番号付与はKabat中のEUインデックスの番号付与である)の置換を含む、請求項3に記載の二重特異性分子。
- 前記変異型Fc領域の血清半減期を向上させる前記修飾は、M252Y;M252Y及びS254T;M252Y及びT256E;M252Y、S254T及びT256E;又はK288D及びH435K(前記番号付与はKabat中のEUインデックスの番号付与である)の置換を含む、請求項3又は4に記載の二重特異性分子。
- 前記分子は、抗体、抗体断片、一本鎖結合分子、ダイアボディ、または二重特異性T細胞結合抗体である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の二重特異性分子。
- それぞれ配列番号99を含む2つのポリペプチド鎖、及びそれぞれ配列番号100を含む2つのポリペプチド鎖を含む、請求項1に記載の二重特異性分子。
- 配列番号104を含む1つのポリペプチド鎖、配列番号105を含む1つのポリペプチド鎖、配列番号106を含む1つのポリペプチド鎖、及び配列番号107を含む1つのポリペプチド鎖を含む、請求項1に記載の二重特異性分子。
- それぞれ配列番号101を含む2つのポリペプチド鎖、及びそれぞれ配列番号100を含む2つのポリペプチド鎖を含む、請求項1に記載の二重特異性分子。
- 配列番号108を含む1つのポリペプチド鎖、配列番号105を含む1つのポリペプチド鎖、配列番号109を含む1つのポリペプチド鎖、及び配列番号107を含む1つのポリペプチド鎖を含む、請求項1に記載の二重特異性分子。
- 有効量の、請求項1〜10のいずれか1項に記載の二重特異性分子と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物。
- 薬剤として使用される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の二重特異性分子、又は請求項11に記載の医薬組成物。
- 免疫仲介性応答の刺激を促進するため、又は抑制された免疫系に関連する疾患又は状態を治療するために使用される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の二重特異性分子、又は請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記疾患又は状態は、癌又は感染症である、請求項13に記載の二重特異性分子、又は医薬組成物。
- 前記癌は:副腎癌;AIDS関連癌;胞巣状軟部肉腫;星細胞腫瘍;膀胱癌;骨癌;脳及び脊髄癌;転移性脳腫瘍;乳癌;頸動脈球腫瘍;子宮頸癌;軟骨肉腫;脊索腫;発色性腎細胞癌;明細胞癌;大腸癌;結腸直腸癌;皮膚良性線維性組織球腫;線維形成性小円形細胞腫瘍;上衣腫;ユーイング腫瘍;骨外性粘液型軟骨肉腫;骨性線維形成不全症;線維性骨異形成症;胆嚢若しくは胆管癌;消化器癌;妊娠性絨毛性疾患;胚細胞腫瘍;頭頸部癌;肝細胞癌;膵島細胞腫;カポジ肉腫;腎臓癌;白血病;脂肪腫/良性リポソーム腫瘍;脂肪肉腫/悪性リポソーム腫瘍;肝臓癌;リンパ腫;肺癌;髄芽腫;黒色腫;髄膜腫;多発性内分泌腫瘍;多発性骨髄腫;骨髄異形成症候群;神経芽細胞腫;神経内分泌腫瘍;卵巣癌;膵臓癌;乳頭状甲状腺癌;副甲状腺腫瘍;小児癌;末梢神経鞘腫瘍;褐色細胞腫;下垂体腫瘍;前立腺癌;後部ブドウ膜黒色腫;希少な血液学的障害;腎転移性癌;ラブドイド腫瘍;横紋筋肉腫;肉腫;皮膚癌;軟組織肉腫;扁平上皮細胞癌;胃癌;滑膜肉腫;精巣癌;胸腺癌;胸腺腫;甲状腺転移性癌;及び子宮癌の細胞からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする、請求項14に記載の二重特異性分子、又は医薬組成物。
- 前記癌は:結腸直腸癌;肺癌;子宮頸癌;頭頸部癌;前立腺癌;肉腫;及び胸腺腫の細胞からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする、請求項14に記載の二重特異性分子、又は医薬組成物。
- 前記癌は:結腸直腸癌;肝細胞癌;神経膠腫;腎臓癌;乳癌;多発性骨髄腫;膀胱癌;神経芽細胞腫;肉腫;非ホジキンリンパ腫;非小細胞肺癌;卵巣癌:膵臓癌;及び直腸癌の細胞からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする、請求項14に記載の二重特異性分子、又は医薬組成物。
- 前記癌は:結腸直腸癌;胃癌;黒色腫;前立腺癌;膵臓癌;腎臓癌;膀胱癌;乳癌;肺癌;線維肉腫;ヒトマントル細胞リンパ腫;及びRajiバーキットリンパ腫の細胞からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする、請求項14に記載の二重特異性分子、又は医薬組成物。
- 前記感染症は、バクテリア性、菌類性、ウイルス性及び寄生虫性病原体の存在を特徴とする、請求項14に記載の二重特異性分子、又は医薬組成物。
- 免疫仲介性応答の刺激を促進するための薬剤、又は抑制された免疫系に関連する疾患又は状態を治療するための薬剤の製造のための、請求項1〜10及び12〜19のいずれか1項に記載の二重特異性分子、又は請求項11〜19のいずれか1項に記載の医薬組成物の使用。
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