EA041483B1

EA041483B1 - Связывающие lag-3 молекулы и способы их применения

Info

Publication number: EA041483B1
Application number: EA201792657
Authority: EA
Inventors: Мотт-Мохс Росс Ла; Калпана ШАН; Дуглас Х. Смит; Лесиль С. Джонсон; Пол А. Мур; Эцио Бонвини; Скотт КОЕНИГ
Original assignee: Макродженикс, Инк.
Priority date: 2015-06-08
Filing date: 2016-06-07
Publication date: 2022-10-28

Description

Ссылки на родственные заявки

Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с заявками на выдачу патента США № 62/255094 (поданной 13 ноября 2015 г.; на рассмотрении) и № 62/172277 (поданной 8 июня 2015 г.; на рассмотрении), каждая из этих заявок включена в настоящий документ при помощи ссылки в полном их объеме.

Ссылка на перечень последовательностей

Настоящая заявка включает один или несколько перечней последовательностей в соответствии с 37 C.F.R. 1.821 и далее, которые раскрыты на машиночитаемом носителе (название файла: 1301_0121PCT_Sequence_Listing_ST25.txt, создан 18 мая 2016 г. и имеет размер 105774 байта), при этом данный файл включен в настоящий документ с помощью ссылки в полном его объеме.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к связывающим LAG-3 молекулы, которые содержат связывающий LAG-3 домен выбранных антител к LAG-3: LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6, которые способны связываться как с LAG-3 яванского макака, так и с LAG-3 человека. Настоящее изобретение, в частности, относится к связывающим LAG-3 молекулам, которые являются гуманизированными или химерными версиями таких антител или которые содержат связывающие LAG-3 фрагменты таких антител к LAG-3 (особенно к иммуноконъюгатам, диателам, BiTE, биспецифическим антителам и т.д.). Настоящее изобретение, в частности, относится к таким связывающим LAG-3 молекулам, которые дополнительно способны связываться с эпитопом молекулы, участвующей в регуляции иммунной контрольной точки, которая присутствует на поверхности иммунной клетки. Настоящее изобретение также относится к способам применения таких связывающих LAG-3 молекул для детекции LAG-3 или для стимуляции иммунного ответа. Настоящее изобретение также относится к способам комбинированной терапии, при которых связывающую LAG молекулу, которая содержит один или несколько связывающих LAG-3 доменов таких выбранных антител к LAG-3, вводят в комбинации с одной или несколькими дополнительными молекулами, которые эффективны в стимуляции иммунного ответа, тем самым дополнительно усиливая, стимулируя или повышая такой иммунный ответ у субъекта.

Уровень техники

I. Клеточные иммунные ответы

Иммунная система людей и других млекопитающих отвечает за обеспечение защиты от инфекции и заболевания. Такая защита обеспечивается как гуморальным иммунным ответом, так и клеточным иммунным ответом. Гуморальный ответ приводит в результате к выработке антител и других биомолекул, которые способны распознавать и нейтрализовать инородные мишени (антигены). Для сравнения, при клеточном иммунном ответе происходит активация макрофагов, натуральных киллеров (NK) и антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов Т-клетками и высвобождение различных цитокинов в ответ на распознание антигена (Dong, С. et al. (2003) Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules Immunolog. Res. 28(1):39-48).

Способность Т-клеток оптимально опосредовать иммунный ответ на антиген нуждается в двух различных сигнальных взаимодействиях (Viglietta, V. et al. (2007) Modulating Co-Stimulation Neurotherapeutics 4:666-675; Korman, A.J. et al. (2007) Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy Adv. Immunol. 90:297-339). Во-первых, антиген, который дислоцируется на поверхности антигенпрезентирующих клеток (APC), должен быть презентирован антиген-специфической наивной CD4+ Т-клетке. Такое презентирование доставляет сигнал с помощью Т-клеточного рецептора (TCR), который заставляет Т-клетку инициировать иммунный ответ, который будет специфическим к презентируемому антигену. Во-вторых, серия костимулирующих и коингибирующих сигналов, опосредуемых взаимодействиями между APC и различными молекулами на поверхности Т-клеток, запускает сначала активацию и пролиферацию Тклеток и в конечном итоге их ингибирование. Таким образом, первый сигнал придает специфичность иммунному ответу, в то время как второй сигнал служит для определения природы, величины и продолжительности ответа.

Иммунная система жестко контролируется костимулирующими и коингибирующими лигандами и рецепторами. Такие молекулы обеспечивают второй сигнал для активации Т-клеток и обеспечивают сбалансированную сеть положительных и отрицательных сигналов для максимизации иммунных ответов к инфекции, при этом ограничивая иммунитет к своим клеткам (Wang, L. et al. (2011) VISTA, A Novel Mouse Ig Superfamily Ligand That Negatively Regulates T-Cell Responses J. Exp. Med. 10.1084/jem.20100619:1-16; Lepenies, В. et al. (2008) The Role Of Negative Costimulators During Parasitic Infections, Endocrine, Metabolic & Immune Disorders - Drug Targets 8:279-288). Ингибирующие пути, важные для сохранения аутотолерантности и модулирования продолжительности и величины иммунных ответов, совместно называют иммунными контрольными точками. Особое значение имеет связывание лигандов В7.1 (CD80) и В7.2 (CD86) антиген-презентирующих клеток с рецепторами CD28 и CTLA-4 у CD4+ T-лимфоцита (Sharpe, A.H. et al. (2002) The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Dong, C. et al. (2003) Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules, Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation, Immunol. Rev.

- 1 041483

229:307-321). Связывание В7.1 или В7.2 с CD28 стимулирует активацию Т-клеток; связывание В7.1 или В7.2 с CTLA-4 ингибирует такую активацию (Dong, С. et al. (2003) Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules, Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation, Immunol. Rev. 229:307-321; Greenwald, R.J. et al. (2005) The B7 Family Revisited, Ann. Rev. Immunol. 23:515-548). CD28 конститутивно экспрессируется на поверхности Тклеток (Gross, J., et al. (1992) Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor CD28 In The Mouse, J. Immunol. 149:380-388), в то время как экспрессия CTLA-4 быстро возрастает после активации Т-клеток (Linsley, P. et al. (1996) Intracellular Trafficking Of CTLA4 And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement, Immunity 4:535-543). Поскольку CTLA-4 является более высокоаффинным рецептором (Sharpe, A.H. et al. (2002) The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116-126), связывание сначала инициирует пролиферацию Т-клеток (посредством CD28), а затем ингибирует ее (посредством начинающейся экспрессии CTLA-4), тем самым ослабляя эффект, если в пролиферации более нет необходимости.

Дополнительные исследования в лигандах рецептора CD28 привели к выявлению и описанию характеристик ряда родственных молекул В7 (суперсемейство В7) (Sharpe, A.H. et al. (2002) The B7CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Greenwald, R.J. et al. (2005) The B7 Family Revisited, Ann. Rev. Immunol. 23:515-548; Collins, M. et al. (2005) The В7 Family Of Immune-Regulatory Ligands, Genome Biol. 6:223.1-223.7; Loke, P. et al. (2004) Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T-Cells, Arthritis Res. Ther. 6:208-214; Korman, A.J. et al. (2007) Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy, Adv. Immunol. 90:297-339; Flies, D.B. et al. (2007) The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity, J. Immunother. 30(3):251-260; Agarwal, A. et al. (2008) The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance, Curr. Opin. Organ Transplant. 13:366372; Wang, S. et al. (2004) Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses, Microbes Infect. 6:759-766). В настоящее время существует несколько известных членов семейства: В7.1 (CD80), В7.2 (CD86), индуцируемый костимулирующий лиганд (ICOS-L), лиганд программируемой смерти 1 (PD-L1; В7-Н1), лиганд программируемой смерти 2 (PD-L2; B7-DC), В7-НЗ, В7-н4 и В7-Н6 (Collins, M. et al. (2005) The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands, Genome Biol. 6:223.1-223.7; Flajnik, M.F. et al. (2012) Evolution Of The B7 Family: Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC, Immunogenetics 64(8):571-90).

II. Ген активации лимфоцитов 3 (LAG-3)

Ген активации лимфоцитов 3 кодирует белок рецептора клеточной поверхности, который называют LAG-3 или CD223 (Triebel, F. et al. (1990) LAG-3, A Novel Lymphocyte Activation Gene Closely Related To CD4, J. Exp. Med. 171 (5): 1393-1405). LAG-3 экспрессируется у активированных CD4⁺ и CD8⁺ Тклеток и NK-клеток и конститутивно экспрессируются у плазмоцитоидных дендритных клеток. LAG-3 не экспрессируется у В клеток, моноцитов или клеток любого другого протестированного типа (Workman, CJ. et al. (2009) LAG-3 Regulates Plasmacytoid Dendritic Cell Homeostasis, J. Immunol. 182(4): 18851891).

Было обнаружено, что LAG-3 является близкородственным Т-клеточному корецептору CD4 (Triebel, F. et al. (1990) LAG-3, A Novel Lymphocyte Activation Gene Closely Related To CD4, J. Exp. Med. 171(5): 1393-1405; Grosso, J.F. et al. (2009) Functionally Distinct LAG-3 and PD-1 Subsets on Activated and Chronically Stimulated CD8 T-Cells, J. Immunol. 182(11):6659-6669; Huang, C.T. et al. (2004) Role Of LAG-3 In Regulatory T-Cells, Immunity 21:503-513; Workman, C.J. et al. (2009) LAG-3 Regulates Plasmacytoid Dendritic Cell Homeostasis, J. Immunol. 182(4): 1885-1891). Как и CD4, LAG-3 также связывается с молекулами МНС II класса, но делает это со значительно более высокой аффинностью (Workman, C.J. et al. (2002) Phenotypic Analysis Of The Murine CD4-Related Glycoprotein, Cd223 (LAG-3), Eur. J. Immunol. 32:2255-2263; Huard, B. et al. (1995) CD4/Major Histocompatibility Complex Class II Interaction Analyzed With CD4-And Lymphocyte Activation Gene-3 (LAG-3)-Ig Fusion Proteins, Eur. J. Immunol. 25:2718-2721; Huard, B. et al. (1994) Cellular Expression And Tissue Distribution Of The Human LAG-3Encoded Protein, AnMHC Class II Ligand, Immunogenetics 39:213-217).

Исследования показали, что LAG-3 играет важную роль в отрицательной регуляции Т-клеточной пролиферации, функции и гомеостазе (Workman C.J. et al. (2009) LAG-3 Regulates Plasmacytoid Dendritic Cell Homeostasis, J. Immunol. 182(4): 1885-1891; Workman C.J. et al. (2002) Cutting Edge: Molecular Analysis Of The Negative Regulatory Function Of Lymphocyte Activation Gene-3, J. Immunol. 169:5392-5395; Workman, C.J. et al. (2003) The CD4-Related Molecule, LAG-3 (CD223), Regulates The Expansion Of Activated T-Cells, Eur. J. Immunol. 33:970-979; Workman, C.J. (2005) Negative Regulation Of T-Cell Homeostasis By Lymphocyte Activation Gene-3 (CD223), J. Immunol. 174:688-695; Hannier, S. et al. (1998) CD3/TCR Complex-Associated Lymphocyte Activation Gene-3 Molecules Inhibit CD3/TCR Signaling, J. Immunol. 161:4058-4065; Huard, B. et al. (1994) Lymphocyte-Activation Gene 3/Major Histocompatibility Complex Class II Interaction Modulates The Antigenic Response Of CD4⁺ T Lymphocytes, Eur. J. Immunol. 24:32163221).

Исследования показали, что ингибирование функции LAG-3 посредством блокады антителами мо- 2 041483 жет обращать LAG-3-опосредованное ингибирование иммунной системы и частично восстанавливать эффекторную функцию (Grosso, J.F. et al. (2009) Functionally Distinct LAG-3 and PD-1 Subsets on Activated and Chronically Stimulated CD8 T-Cells, J. Immunol. 182(11):6659-6669; Grosso, J.F. et al. (2007) LAG-3 Regulates CD8⁺ T-Cell Accumulation And Effector Function During Self And Tumor Tolerance, J. Clin. Invest. 117:3383-3392). Было обнаружено, что LAG-3 отрицательно регулирует размножение Тклеток посредством ингибирования TCR-индуцируемых кальциевых потоков и контролирует размер пула Т-клеток памяти (Matsuzaki, J. et al. (2010) Tumor-Infiltrating NY-ESO-1-Specific CD8⁺ T-Cells Are Negatively Regulated By LAGS and PD-1 In Human Ovarian Cancer, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 107(17):7875-7880; Workman C.J., et al. (2004) Lymphocyte Activation Gene-3 (CD223) Regulates The Size Of The Expanding T-Cell Population Following Antigen Activation in vivo, J. Immunol. 172:5450-5455).

Тем не менее, несмотря на все такие предыдущие достижения, сохраняется потребность в усовершенствованных композициях, способных сильнее заставлять иммунную систему организма атаковать клетки злокачественной опухоли или инфицированные патогеном клетки, особенно в более низких терапевтических концентрациях. Даже несмотря на то, что адаптивная иммунная система может быть сильным защитным механизмом от злокачественной опухоли и заболевания, она зачастую подавляется иммуносупрессорными механизмами в опухолевом микроокружении, таком как экспрессия LAG-3. Кроме того, коингибирующие молекулы, экспрессируемые опухолевыми клетками, иммунными клетками и стромальными клетками в опухолевой среде, могут доминантно ослаблять Т-клеточные ответы на клетки злокачественной опухоли. Таким образом, сохраняется потребность в высокоактивных связывающих LAG-3 молекулах. Так, в частности, существует потребность в связывающих LAG-3 молекулах, которые имеют требуемый профиль кинетики связывания, связывают различные эпитопы LAG-3 и/или характеризуются активностью в отношении отдельного агента, что может повысить терапевтическое значение для пациентов, страдающих от злокачественной опухоли или других заболеваний или состояний. Настоящее изобретение относится к решению этих и других задач.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Если подробно, настоящее изобретение относится к связывающей LAG-3 молекуле, которая способна связываться как с LAG-3 человека, так и с LAG-3 яванского макака, причем указанная молекула содержит три домена CDR тяжелой цепи: CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3, и три домена CDR легкой цепи: CDRL1, CDRL2 и CDRL3, причем:

(A) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой CDR тяжелой цепи из LAG-3 mAb 1 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой CDR легкой цепи из LAG-3 mAb 1 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15 или (B) (1) домен CDR_H1, домен CDR_H2 и домен CDR_H3 представляют собой CDR тяжелой цепи из hLAG-3 mAb 1 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой CDR легкой цепи из hLAG-3 mAb 1 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15; или (C) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой CDR тяжелой цепи из LAG-3 mAb 2 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой CDR легкой цепи из LAG-3 mAb 2 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 и

- 3 041483

SEQ ID NO: 38; или (D) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой CDR тяжелой цепи из LAG-3 mAb 3 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой CDR легкой цепи из LAG-3 mAb 3 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 48; или (E) (1) домен CDR_H1, домен CDR_H2 и домен CDR_H3 представляют собой CDR тяжелой цепи из LAG-3 mAb 4 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 53; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой CDR легкой цепи из LAG-3 mAb 4 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58; или (F) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой CDR тяжелой цепи из LAG-3 mAb 5 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 63; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой CDR легкой цепи из LAG-3 mAb 5 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 и SEQ ID NO: 68; или (G) (1) домен CDR_H1, домен CDR_H2 и домен CDR_H3 представляют собой CDR тяжелой цепи из LAG-3 mAb 6 VH1 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой CDR легкой цепи из LAG-3 mAb 6 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78; или (H) (1) домен CDR_H1, домен CDR_H2 и домен CDR_H3 представляют собой CDR тяжелой цепи из LAG-3 hAb 6 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой CDR легкой цепи из hLAG-3 hAb 6 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких связывающих LAG-3 молекул, где вариабельный домен тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49 или SEQ ID NO: 59.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких связывающих LAG-3 молекул, где вариабельный домен легкой цепи имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 54 или SEQ ID NO: 64.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких связывающих LAG-3 молекул, где вариабельный домен тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 79 или SEQ ID NO: 80.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких связывающих LAG-3 молекул, где вариабельный домен легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 83 или SEQ ID NO: 85.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления всех таких связывающих LAG-3 молекул, где молекула представляет собой антитело и особенно где молекула представляет собой химерное антитело или гуманизированное антитело.

Настоящее изобретение дополнительно относится к варианту осуществления, где связывающая LAG-3 молекула представляет собой биспецифическую связывающую молекулу, способную одновременно связываться с LAG-3 человека и со вторым эпитопом, и, в частности, относится к варианту осуществления, где второй эпитоп представляет собой эпитоп молекулы, участвующей в регуляцию иммунной контрольной точки, присутствующей на поверхности иммунной клетки (особенно где второй эпитоп представляет собой эпитоп В7-НЗ, В7-Н4, BTLA, CD40, CD40L, CD47, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, CTLA-4, галектина-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, KIR, LAG-3, LIGHT, МНС I или II класса, NKG2a, NKG2d, OX40, OX40L, PD1H, PD-1, PD-L1, PD-L2, PVR, SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 или VISTA, и, наиболее конкретно, где второй эпитоп представляет собой эпитоп CD137, ОХ40, PD-1, TIGIT или TIM-3).

Настоящее изобретение дополнительно относится к варианту осуществления таких связывающих LAG-3 молекул, где молекула представляет собой диатело и особенно где диатело представляет собой ковалентно связанный комплекс, который содержит два или три, или четыре, или пять или более пяти полипептидных цепей. Настоящее изобретение дополнительно относится к варианту осуществления таких связывающих LAG-3 молекул антител, где молекула представляет собой трехвалентную связывающую молекулу, причем трехвалентная связывающая молекула представляет собой ковалентно связанный

- 4 041483 комплекс, который содержит три, четыре, пять или более полипептидных цепей. Настоящее изобретение дополнительно относится к варианту осуществления таких связывающих LAG-3 молекул, где молекула включает Fc-участок. Настоящее изобретение дополнительно относится к варианту осуществления таких связывающих LAG-3 молекул, где молекула содержит альбумин-связывающий домен и особенно деиммунизированный альбумин-связывающий домен.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления всех таких связывающих LAG-3 молекул, где молекула включает Fc-участок (кристаллизующийся фрагмент), и где Fcучасток представляет собой вариантный Fc-участок, который содержит одну или несколько аминокислотных модификаций, которые уменьшают аффинность вариантного Fc-участка в отношении FcyR и/или увеличивают период полужизни в сыворотке, и, более конкретнее, где модификации содержат по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из:

(1) L234A;

(2) L235A;

(3) L234A и L235A;

(4) M252Y, M252Y и S254T;

(5) M252Y и Т256Е;

(6) M252Y, S254T и Т256Е или (7) К288В и H435K;

причем указанная нумерация соответствует EU системе нумерации по Kabat.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления, где любые описанные выше связывающие LAG-3 молекулы применяются для стимуляции Т-клеточного иммунного ответа. Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления, где любая из описанных выше связывающих LAG-3 молекул применяется при лечении заболевания или состояния, ассоциированного с подавленной иммунной системой, особенно злокачественной опухоли или инфекции.

Настоящее изобретение, в частности, относится к такому применению при лечении, или диагностике, или прогнозировании развития злокачественной опухоли, причем злокачественная опухоль характеризуется присутствием клетки злокачественной опухоли, выбранной из группы, состоящей из клетки: опухоли надпочечника, ассоциированной со СПИДом злокачественной опухоли, альвеолярной саркомы мягких тканей, астроцитарной опухоли, злокачественной опухоли мочевого пузыря, злокачественной опухоли костей, злокачественной опухоли головного и спинного мозга, метатастатической опухоли головного мозга, злокачественной опухоли молочной железы, опухолей каротидного тельца, цервикальной злокачественной опухоли, хондросаркомы, хордомы, хромофобной почечно-клеточной карциномы, светло-клеточной карциномы, злокачественной опухоли толстой кишки, колоректальной злокачественной опухоли, кожной доброкачественной фиброзной гистиоцитомы, десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли, эпендимомы, опухоли Юинга, внескелетной слизеподобной хондросаркомы, несовершенного костного фиброгенеза, фиброзной дисплазии кости, злокачественной опухоли желчного пузыря или желчевыводящих путей, злокачественной опухоли желудочно-кишечного тракта, гестационной трофобластической болезни, эмбрионально-клеточной опухоли, злокачественной опухоли головы и шеи, гепатоклеточной карциномы, опухоли островков поджелудочной железы, саркомы Капоши, злокачественной опухоли почки, лейкоза, липомы/доброкачественной липоматозной опухоли, липосаркомы/злокачественной липоматозной опухоли, злокачественной опухоли печени, лимфомы, злокачественной опухоли легкого, гранулобластомы, меланомы, менингиомы, множественных эндокринных неоплазий, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, нейробластомы, нейроэндокринных опухолей, злокачественной опухоли яичника, злокачественной опухоли поджелудочной железы, папиллярной карциномы щитовидной железы, опухоли паращитовидных желез, детской злокачественной опухоли, опухоли оболочки периферического нерва, феохромоцитомы, опухоли гипофиза, злокачественной опухоли предстательной железы, увеальной меланомы заднего отдела глаза, редкого нарушения со стороны кроветворной системы, почечной метастатической злокачественной опухоли, рабдоидной опухоли, рабдомиосаркомы, саркомы, злокачественной опухоли кожи, саркомы мягких тканей, плоскоклеточной злокачественной опухоли, злокачественной опухоли желудка, синовиальной саркомы, злокачественной опухоли яичка, тимуснои карциномы, тимомы, метастатической злокачественной опухоли щитовидной железы и злокачественной опухоли матки.

Настоящее изобретение, в частности, относится к такому применению при лечении, или диагностике, или прогнозировании развития злокачественной опухоли, причем злокачественная опухоль представляет собой колоректальную злокачественную опухоль, гепатоклеточную карциному, глиому, злокачественную опухоль почки, злокачественную опухоль молочной железы, множественную миелому, злокачественную опухоль мочевого пузыря, нейробластому; саркому, неходжкинскую лимфому, немелкоклеточную злокачественную опухоль легкого, злокачественную опухоль яичника, злокачественную опухоль поджелудочной железы, злокачественную опухоль прямой кишки, острый миелоидный лейкоз (AML), хронический миелогенный лейкоз (CML), острый В-лимфобластный лейкоз (B-ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), волосатоклеточный лейкоз (HCL), новообразование из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток (BPDCN), неходжкинские лимфомы (NHL), включая мантийноклеточную

- 5 041483 лимфому (MCL) и мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL), ходжкинскую лимфому, системный мастоцитоз или лимфому Беркитта.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления, в которых любая из вышеописанных связывающих LAG-3 молекул помечена детектируемой меткой и применяется в детекции LAG-3.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлено схематическое изображение типичного ковалентно связанного диатела с двумя эпитопсвязывающими сайтами, состоящей из двух полипептидных цепей, каждая из которых имеет способствующий образованию гетеродимера домен с Е-спиралью или K-спиралью. Цистеиновый остаток может присутствовать в линкере и/или в способствующем образованию гетеродимера домене, как показано на фиг. 3В. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны одинаковой штриховкой или заливкой.

На фиг. 2 представлено схематическое изображение типичной ковалентно связанной молекулы диатела с двумя эпитопсвязывающими сайтами, состоящей из двух полипептидных цепей, каждая из которых имеет домен СН2 и СН3, так чтобы ассоциированные цепи образовывали весь Fc-участок или его часть. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны одинаковой штриховкой или заливкой.

На фиг. 3А-3С представлены схематически изображения, на которых показаны типичные четырехвалентные диатела с четырьмя эпитопсвязывающими сайтами, состоящие из двух пар полипептидных цепей (т.е. всего четырех полипептидных цепей). Один полипептид каждой пары обладает доменом СН2 и СН3, так чтобы связанные цепи образовывали весь Fc-участок или его часть. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны одинаковой штриховкой или заливкой. Две пары полипептидных цепей могут быть одинаковыми. В соответствии с такими вариантами осуществления, если домены VL и VH распознают различные эпитопы (как показано на фиг. 3А-3С), полученная в результате молекула обладает четырьмя эпитоп-связывающими сайтами и является биспецифической и двухвалентной по отношению к каждому связываемому эпитопу. В соответствии с такими вариантами осуществления, если домены VL и VH распознают один и тот же эпитоп (например, на обеих цепях задействованы одинаковые CDR домена VL и одинаковые CDR домена VH), полученная в результате молекула обладает четырьмя эпитопсвязывающими сайтами и является моноспецифической и четырехвалентной по отношению к одному эпитопу. Альтернативно, две пары полипептидов могут различаться. В соответствии с такими вариантами осуществления, если домены VL и VH каждой пары полипептидов распознают различные эпитопы (как показано на фиг. 3С), полученная в результате молекула обладает четырьмя эпитопсвязывающими сайтами и является тетраспецифической и одновалентной по отношению к каждому связываемому эпитопу. На фиг. 3А показано Fc-диатело, которое содержит пептидный способствующий образованию гетеродимера домен, содержащий цистеиновый остаток. На фиг. 3В показано содержащее Fc-участок диатело, которое содержит Fc-участок и способствующие образованию гетеродимера домены с Е-спиралью и K-спиралью, содержащие цистеиновый остаток и линкер (с необязательным цистеиновым остатком). На фиг. 3С показано содержащее Fc-участок диатело, которое содержит домены СН1 и CL антитела.

На фиг. 4А и 4В представлены схематические изображения типичной ковалентно связанной молекулы диатела, имеющей два эпитоп-связывающих сайта, состоящих из трех полипептидных цепей. Две полипептидные цепи имеют домен СН2 и СН3, так чтобы связанные цепи образовывали весь Fc-участок или его часть. Полипептидные цепи, содержащие домен VL и VH, дополнительно содержат способствующий образованию гетеродимера домен. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны одинаковой штриховкой или заливкой.

На фиг. 5 представлены схематические изображения типичной ковалентно связанной молекулы диатела, имеющей четыре эпитопсвязывающих сайта, состоящих из пяти полипептидных цепей. Две полипептидные цепи имеют домен СН2 и СН3, так чтобы связанные цепи образовывали Fc-участок, который представляет собой весь Fc-участок или его часть. Полипептидные цепи, содержащие соединенные домены VL и VH, дополнительно содержат способствующий образованию гетеродимера домен. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны одинаковой штриховкой или заливкой.

На фиг. 6A-6F представлены схематические изображения типичных Fc-участков, содержащих трехвалентные связывающие молекулы, имеющие три эпитопсвязывающих сайта. На фиг. 6А и 6В соответственно схематично проиллюстрированы домены трехвалентных связывающих молекул, содержащих два связывающих домена по типу диател и связывающий домен по типу Fab, имеющих различные ориентации доменов, в которых связывающие домены по типу диатела являются N-концевыми или Сконцевыми к Fc-участку. Молекулы на фиг. 6А и 6В содержат четыре цепи. На фиг. 6С и 6D соответственно схематично проиллюстрированы домены трехвалентных связывающих молекул, содержащих два N-концевых к Fc-участку связывающих домена по типу диатела и связывающий домен Fab-типа, в котором легкая цепь и тяжелая цепь соединены с помощью полипептидного линкерного спейсера, или связывающий домен scFv-типа. Для трехвалентных связывающих молекул на фиг. 6Е и 6F соответственно схематически проиллюстрированы домены трехвалентных связывающих молекул, содержащих два С

- 6 041483 концевых к Fc-участку связывающих домена по типу диатела и присоединенный связывающий домен Fab-типа или связывающий домен scFv-типа, в которых находятся связывающие домены по типу диатела. Трехвалентные связывающие молекулы на фиг. 6C-6F содержат три цепи. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны одинаковой штриховкой или заливкой.

На фиг. 7А-7С показаны характеристики связывания LAG-3 mAb 1 и LAG-3 mAb 6 с LAG-3 яванского макака. Кривые связывания Biacore для hLAG-3 mAb 6 (1.1) (фиг. 7А), hLAG-3 mAb 1 (1.4) (фиг. 7В) и LAG-3 mAb А (фиг. 7С), демонстрирующие, что hLAG-3 mAb 6 (1.1) характеризуется лучшим связыванием с LAG-3 яванского макака (RU - единицы ответа).

На фиг. 8A-8D показано, что LAG-3 mAb 1 и LAG-3 mAb 6 связывают эпитоп, отличный от того, который связывается эталонным антителом LAG 3 mAb А. Профили связывания меченых LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 6 и LAG-3 mAb А в отсутствие конкурентного антитела (фиг. 8А), в присутствии избыточного LAG-3 mAb 1 (фиг. 8В), избыточного LAG-3 mAb 6 (фиг. 8С) или LAG-3 mAb А (фиг. 8D) (RU единицы ответа).

На фиг. 9А-9В показано, что выделенные антитела ингибируют связывание растворимого LAG-3 человека (shLAG-3) с МНС II класса, по результатам определения в анализе ИФА. На фиг. 9А показаны кривые ингибирования для LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4 и LAG-3 mAb 5. На фиг. 9В показаны кривые ингибирования для LAG-3 mAb А, гуманизированного hLAG-3 1 (1.4) и hLAG-3 6 (1.1) (RLU - относительные единицы люминесценции).

На фиг. 10А-10С показано, что выделенные антитела ингибируют связывание shLAG-3 с поверхностью клеток Дауди, экспрессирующих МНС II класса. На фиг. 10А показаны кривые ингибирования для LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 и эталонного антитела LAG-3 mAb А. На фиг. 10В показаны кривые ингибирования для LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 6 и LAG-3 mAb А. На фиг. 10С показаны кривые ингибирования LAG-3 mAb 1 и гуманизированного hLAG-3 1 (1.4), hLAG3 1 (1.2), hLAG-3 1 (2.2), hLAG-3 1 (1.1). Каждая цифра представляет собой отдельный эксперимент; MFI - средняя интенсивность флуоресценции.

На фиг. 11А-11С показано, что экспрессия LAG-3 повышается в простимулированных CD4+ Тклетках. Проточный цитометрический анализ экспрессии LAG-3 на непростимулированных CD4+ Тклетках (фиг. 11А) и простимулированных CD3/CD28 гранулами CD4+ Т-клетках от двух различных доноров (фиг. 11В и 11С) соответственно на 11-е и 14-е сутки. Все клетки были совместно окрашены антителом к CD4.

На фиг. 12 (секции A-F) показано, что выделенные антитела к LAG-3 связываются с простимулированными, но не с непростимулированными Т-клетками. Проточный цитометрический анализ простимулированных CD3/CD28 CD4+ Т-клеток (секции А-С) и непростимулированных CD4+ Т-клеток (секции DF), помеченных с помощью LAG-3 mAb 1 (секции А и D), LAG-3 mAb 2 (секции В и Е) или LAG-3 mAb 3 (секции С и F). Все клетки были совместно окрашены антителом к CD4.

На фиг. 13 (секции A-D) показано, что выделенные антитела к LAG-3 связываются с простимулированными, но не с непростимулированными Т-клетками.

Проточный цитометрический анализ простимулированных CD3/CD28 CD4+ Т-клеток (секции А-В) и непростимулированных CD4+ Т-клеток (секции C-D), помеченных с помощью LAG-3 mAb 4 (секции А и С) или LAG-3 mAb 5 (секции В и D). Все клетки были совместно окрашены антителом к CD4.

На фиг. 14 (секции A-D) показано, что экспрессия LAG-3 и PD-1 повышается на мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС), простимулированных энтеротоксином типа В (SEB) Staphylococcus aureus, которые были получены от типичного донора D:34765. Проточный цитометрический анализ SEB-простимулированных РВМС от типичного донора спустя 48 ч после первичной стимуляции (секции А-В), помеченных антителами к LAG-3/к CD3 (секция А) или антителами к PD-1/к CD3 (секция В), и на пятые сутки после SEB-стимуляции (секции C-D) клетки, обработанных только SEB (секция С) или изотипическим контрольным антителом (секция D) во время вторичной стимуляции, помеченные антителами к LAG-3/к PD-1.

На фиг. 15 (секции A-D) показано, что экспрессия LAG-3 и PD-1 повышается на SEBпростимулированных РВМС от другого типичного донора D:53724. Проточный цитометрический анализ SEB-простимулированных РВМС от типичного донора через 48 ч после первичной стимуляции (секции А-В), помеченных антителами к LAG-3/к CD3 (секция А) или антителами к PD-1/к CD3 (секция В), и на пятые сутки после SEB-стимуляции (секции C-D) клетки, обработанные только SEB (секция С) или изотипическим контрольным антителом (секция D), помеченные антителами к LAG-3/к PD-1.

На фиг. 16А-16В показано, что LAG-3 mAb 1 способно стимулировать выработку цитокинов до уровней, сравнимых с обработкой антителами к PD-1. Профили секреции IFNy (фиг. 16А) и TNFa (фиг. 16В) у SEB-простимулированных РВМС, обработанных антителами к LAG-3 или к PD-1.

На фиг. 17 показано, что LAG-3 mAb 1 способно стимулировать выработку цитокинов до уровней, сравнимых с обработкой антителами к PD-1, и что обработка посредством LAG-3 mAb 1 в комбинации с антителами к PD-1 обеспечивала наибольшее усиление высвобождения цитокинов. Профили секреции IFNy из SEB-простимулированных РВМС, обработанных антителами к LAG-3 и к PD-1 в отдельности и в

- 7 041483 комбинации.

На фиг. 18А-18В показано связывание антител к LAG-3: hLAG-3 mAb 6 (1.1) и LAG-3 mAb А, с эндогенным LAG-3, экспрессируемым SEB-простимулированными PBMC яванского макака от двух доноров (фиг. 18А и 18В). Антитело к PD-1, PD-1 mAb А, было включено в качестве положительного контроля для SEB-стимуляции.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

I. Антитела и их связывающие домены

Антитела по настоящему изобретению представляют собой молекулы иммуноглобулина, способные иммуноспецифически связываться с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д., с помощью по меньшей мере одного эпитопраспознающего сайта, расположенного в вариабельном домене молекулы иммуноглобулина.

Применяемый в контексте настоящего документа термин антитело обозначает молекулу иммуноглобулина, способную иммуноспецифически связываться с полипептидом или белком или небелковой молекулой в связи с наличием на такой молекуле конкретного домена, или фрагмента, или конформации (эпитопа). Эпитоп-содержащая молекула может обладать иммуногенной активностью, такой, что вызывает ответ с выработкой антител у животного; такие молекулы называют антигенам). Эпитопсодержащие молекулы не обязательно являются иммуногенными.

Связывающие домены по настоящему изобретению связываются с эпитопами иммуноспецифическим образом. В контексте настоящего документа говорят, что антитело, диатело или другая эпитопсвязывающая молекула иммуноспецифически связывается (или характеризуется специфическим связыванием) с участком другой молекулы (т.е. эпитопом), если она вступает в реакцию или ассоциируется чаще, быстрее, дольше и/или с большей аффинностью с таким эпитопом, относительно альтернативных эпитопов. Например, антитело, которое специфически связывается с эпитопом LAG-3, является антителом, которое связывает такой эпитоп LAG-3 с большей аффинностью, авидностью, легче и/или дольше, чем оно связывается с другими эпитопами LAG-3 или с отличным от LAG-3 эпитопом. Также при прочтении этого определения будет понятно, что, например, антитело (или фрагмент, или эпитоп), которое иммуноспецифически связывается с первой мишенью, может специфически или предпочтительно связываться или не связываться со второй мишенью. Таким образом, иммуноспецифическое связывание не обязательно указывает (хотя и может включать) на исключительное связывание. Как правило, но не обязательно, отсылка к связыванию означает специфическое связывание. Говорят, что две молекулы способны связываться друг с другом физиоспецифическим образом, если такое связывание характеризуется специфичностью, с которой рецепторы связываются с их соответствующими лигандами. Способность антитела иммуноспецифически связываться с эпитопом может быть определена, например, с помощью иммуноанализа.

Естественные антитела (такие как антитела IgG) состоят из двух легких цепей в комплексе с двумя тяжелыми цепями. Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен (VL) и константный домен (CL). Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный домен (VH), три константных домена (CH1, CH2 и СН3) и шарнирный домен (Н), расположенный между доменами СН1 и СН2. Таким образом, основной структурной единицей естественных иммуноглобулинов (например, IgG) является тетрамер, имеющий две легкие цепи и две тяжелые цепи, обычно экспрессируемые в виде гликопротеина с массой приблизительно 150000 Да. Аминоконцевая (N-концевая) часть каждой цепи включает в себя вариабельный домен, содержащий приблизительно 100-110 или более аминокислот, в основном ответственных за распознавание антигена. Карбоксиконцевая (С-концевая) часть каждой цепи определяет константный участок, причем легкие цепи имеют один константный домен, а тяжелые цепи обычно имеют три константных домена и шарнирный домен. Таким образом, структура легких цепей молекулы IgG представляет собой n-VL-CL-c, а структура тяжелых цепей IgG представляет собой n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (где п и с

- 8 041483 представляют собой соответственно N-конец и С-конец полипептида). Способность антитела связывать эпитоп антигена зависит от наличия и аминокислотной последовательности доменов VL и VH антитела. В результате взаимодействия легкой цепи антитела и тяжелой цепи антитела и, в частности, взаимодействия его доменов VL и VH образуется один из двух эпитоп-связывающих сайтов естественного антитела. Естественные антитела способны связываться только с одним видом эпитопа (т.е. они являются моноспецифическими), при этом они могут связывать несколько копий такого вида (т.е. характеризуются бивалентностью или мультивалентностью). Вариабельные домены молекулы IgG состоят из определяющих комплементарность участков (CDR), которые содержат остатки, вступающие в контакт с эпитопом, и не относящиеся к CDR сегменты, называемые каркасными сегментами (FR), которые обычно поддерживают структуру и определяют позиционирование петель CDR с тем, чтобы сделать такой контакт возможным (хотя некоторые каркасные остатки также могут вступать в контакт с антигеном). Таким образом, домены VL и VH имеют структуру n-FR1-CDRL-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-C. Полипептиды, которые представляют собой (или могут выступать в их роли) первый, второй и третий CDR легкой цепи антитела, в настоящем документе соответственно обозначены доменом CDRL1, доменом CDRL2 и доменом CDRL3. Аналогичным образом, полипептиды, которые представляют собой (или могут выступать в их роли) первый, второй и третий CDR тяжелой цепи антитела, в настоящем документе соответственно обозначены доменом CDR_H1, доменом CDR_H2 и доменом CDR_H3. Таким образом, термины домен CDRL1, домен CDRL2, домен CDRL3, домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 относятся к полипептидам, которые при включении в белок приводит к тому, что белок становится способным связываться со специфическим эпитопом независимо от того, является ли белок антителом, имеющим легкую и тяжелую цепи, или диателом, или одноцепочечной связывающей молекулой (например, scFv, BiTe и т. д.) или является другим типом белка. Следовательно, применяемый в контексте настоящего документа термин эпитопсвязывающий домен обозначает такую часть эпитопсвязывающей молекулы, которая отвечает за способность такой молекулы иммуноспецифически связывать эпитоп. Эпитопсвязывающий фрагмент может содержать 1, 2, 3, 4, 5 или все 6 доменов CDR такого антитела и, хотя он и способен иммуноспецифически связываться с таким эпитопом, может характеризоваться иммуноспецифичностью, аффинностью или селективностью в отношении такого эпитопа, которые отличаются от таковых, у такого антитела. Предпочтительно тем не менее, эпитопсвязывающий фрагмент будет содержать все 6 доменов CDR такого антитела. Эпитопсвязывающий фрагмент антитела может представлять собой отдельную полипептидную цепь (например, scFv) или может содержать две или более полипептидных цепей, каждая из которых имеет аминоконец и карбоксиконец (например, диатело, Fab-фрагмент, F(ab')₂-фрагмент и т.д.).

Применяемый в контексте настоящего документа термин антитело охватывает моноклональные антитела, мультиспецифические антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, синтетические антитела, химерные антитела, поликлональные антитела, камелизированные антитела, одноцепочечные Fvs (scFv), одноцепочечные антитела, иммунологически активные фрагменты антитела (например, фрагменты антитела, способные связываться с эпитопом, например, Fab-фрагменты, Fab'фрагменты, F(ab')₂-фрагменты, Fv-фрагменты, фрагменты, содержащие домен V_L и/или VH, или которые содержат 1, 2 или 3 определяющих комплементарность участков (CDR) такого домена VL (т. е. CDRL1, CDR_L2 и/или CDR_L3) или домена VH (т. е. CDR_H1, CDR_H2 и/или CDR_H3)), которые специфически связывают антиген и т.д., бифункциональные или мультифункциональные антитела, связанные дисульфидным мостиком биспецифические Fvs (sdFv), интраантитела и диатела и эпитопсвязывающие фрагменты любых из перечисленных выше. Так, в частности, термин антитело подразумевают как охватывающий молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные фрагменты молекул иммуноглобулина, т. е. молекул, которые содержат эпитоп-связывающий сайт. Молекулы иммуноглобулина могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA1 и IgA₂) или подкласса (см., например, патентные публикации США №№ 20040185045, 20050037000, 20050064514, 20050215767, 20070004909, 20070036799, 20070077246 и 20070244303). Последние несколько десятилетий наблюдается оживление интереса в терапевтическом потенциале антител, а антитела становятся одним из лидирующих классов получаемых биотехнологическими методами лекарственных средств (Chan, C.E. et al. (2009) The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases, Singapore Med. J. 50(7):663-666). Более 200 лекарственных средств на основе антител были одобрены для применения или находятся на стадии разработки.

К антителам к LAG-3 по настоящему изобретению относятся гуманизированные, химерные или канинизированные варианты антител LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6.

Термин химерное антитело обозначает антитело, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична антителу от одного вида (например, мыши) или класса или подкласса антитела, в то время как оставшаяся часть идентична или гомологична антителу другого вида (например, человека) или класса или подкласса антитела, при условии, что они характеризуются необходимой биологической активностью. К представляющим интерес химерным антителам по настоящему описанию относятся примитизированные антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена, полученные от отличного от человека примата (например, мартышковых, человекообраз

- 9 041483 ных обезьян и т.д.), и последовательности константного участка человека.

Применяемый в контексте настоящего описания термин моноклональное антитело обозначает антитело популяции практически однородных антител, т.е. отдельные антитела, входящие в состав популяции, являются идентичными, за исключением возможных антител, обладающих встречающимися в природе мутациями, которые могут присутствовать в незначительном количестве, а применяемый в контексте настоящего документа термин поликлональное антитело обозначает антитело, полученное из популяции гетерогенных антител. Термин моноклональное указывает на характерных признак антитела как являющегося популяцией практически однородных антител, и его не следует истолковывать как обозначающее получение антитела каким-либо конкретным способом (например, с помощью гибридомы, фагового отбора, рекомбинантной экспрессии, трансгенных животных и т.д.). Термин включает целые иммуноглобулины, а также фрагменты и т.д., описанные выше под определением антитела. Способы получения моноклональных антител известны из уровня техники. Одним способом, который можно использовать, является способ Kohler, G. et al. (1975) Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity, Nature 256:495-497, или его модификация. Как правило, моноклональные антитела разрабатывают на мышах, крысах или кроликах. Антитела получают путем иммунизации животного иммуногенным количеством клеток, клеточных экстрактов или белковых препаратов, которые содержат необходимый эпитоп. Иммуноген может представлять собой без ограничения первичные клетки, культивируемые клеточные линии, злокачественные опухолевые клетки, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты или ткань.

Применяемые для иммунизации клетки можно культивировать в течение некоторого периода времени (например, по меньшей мере 24 ч) перед их применением в качестве иммуногена. Клетки можно применять в качестве иммуногенов сами по себе или в комбинации с неденатурирующим адъювантом, таким как Ribi (см., например, Jennings, V.M. (1995) Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production, ILAR J. 37(3): 119-125). Обычно клетки следует поддерживать интактными и предпочтительно жизнеспособными при применении в качестве иммуногенов. Интактные клетки могут обеспечивать для иммунизированных животных лучшую детекцию антигенов, чем разрушенные клетки. Применение денатурирующих или агрессивных адъювантов, например, адъюванта Фрейнда, может разрушить клетки и, следовательно, не рекомендуется. Иммуноген можно вводить многократно с периодическими интервалами, такими как два раза в неделю или раз в неделю, или можно вводить таким образом, чтобы сохранялась его жизнеспособность у животного (например, в рекомбинантной ткани). Альтернативно, существующие моноклональные антитела и любые другие эквивалентные антитела, которые являются иммуноспецифическими для необходимого патогенного эпитопа, можно секвенировать и получить рекомбинантно любыми способами, известными из уровня техники. В соответствии с одним вариантом осуществления такое антитело секвенируют, а полинуклеотидную последовательность затем клонируют в вектор для экспрессии или размножения. Последовательность, кодирующую представляющее интерес антитело, можно сохранять в векторе в клетке-хозяине, а затем клетку-хозяина можно размножить и заморозить для последующего применения. Полинуклеотидную последовательность таких антител можно применять для генетической манипуляции с целью создания моноспецифических или мультиспецифических (например, биспецифических, триспецифических и тетраспецифических) молекул по настоящему изобретению, а также антитела с оптимизированной аффинностью, химерного антитела, гуманизированного антитела и/или канинизированного антитела для улучшения аффинности или других характеристик антитела.

Термин scFv относится к одноцепочечным фрагментам вариабельных доменов. Молекулы scFv получают путем связывания вариабельного домена легкой и/или тяжелой цепи с помощью короткого соединяющего пептида. В работе Bird et al. (1988) (Single-Chain Antigen-Binding Proteins, Science 242:423-426) описан пример соединяющих пептидов, которые соединяют мостиком примерно 3,5 нм между карбоксильным концом одного вариабельного домена и аминоконцом другого вариабельного домена. Были разработаны и применяются линкеры с другими последовательностями (Bird et al. (1988) Single-Chain Antigen-Binding Proteins, Science 242:423-426). В свою очередь, линкеры можно модифицировать для дополнительных функций, таких как присоединение лекарственных средств или прикрепление к твердым подложкам. Одноцепочечные варианты можно получить либо рекомбинантно, либо синтетически. Для синтетического получения scFv можно применять автоматизированный синтезатор. Для рекомбинантного получения scFv подходящую плазмиду, содержащую полинуклеотид, который кодирует scFv, можно ввести в подходящую клетку-хозяина, либо эукариотическую, такую как дрожжевые клетки, клетки растения, насекомого или млекопитающих, либо прокариотическую, такую как E. coli. Полинуклеотиды, кодирующие представляющий интерес scFv, можно получить обычными манипуляциями, такими как лигирование полинуклеотидов. Полученный в результате scFv можно выделить с помощью стандартных методик очистки белка, известных из уровня техники.

Настоящее изобретение, в частности, относится к гуманизированным вариантам антител к LAG-3 по настоящему изобретению и к мультиспецифическим связывающим молекулам, содержащим их. Термин гуманизированное антитело обозначает химерную молекулу, обычно полученную с помощью рекомбинантных методик, имеющую эпитопсвязывающий сайт иммуноглобулина от не относящихся к че

- 10 041483 ловеку вида и остальную иммуноглобулиновую структуру молекулы, которая основана на структуре и/или последовательности иммуноглобулина человека. Эпитопсвязывающий сайт может содержать либо полные вариабельные домены, слитые на константных доменах, либо только CDR, привитые на соответствующие каркасные участки в вариабельных доменах. Эпитоп-связывающие сайты могут быть дикого типа или модифицированы одной или несколькими аминокислотными заменами. Это устраняет константный участок в качестве иммуногена у людей, но возможность иммунного ответа на чужеродный вариабельный участок сохраняется (LoBuglio, A.F. et al. (1989) Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). В другом подходе основное внимание уделяется не только обеспечению наличия константных участков человеческого происхождения, но и модификации вариабельных участков, а также изменению их формы на как можно более близкую к человеческой форме. Известно, что вариабельные участки как тяжелых, так и легких цепей содержат три CDR, которые варьируют в зависимости от рассматриваемых антигенов и определяют связывающую способность, фланкированные четырьмя каркасными участками (FR), которые относительно консервативны у заданного вида и которые предположительно обеспечивают каркас для CDR. При получении отличных от человеческих антител к конкретному антигену вариабельные участки можно переформировать или гуманизировать путем прививки CDR, полученных из отличного от человеческого антитела, на FR, присутствующие в подлежащем модификации человеческом антителе. Применение такого подхода к различным антителам рассмотрено в работе Sato, K. et al. (1993) Reshaping A Human Antibody To Inhibit The Interleukin 6-Dependent Tumor Cell Growth, Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies for Therapy, Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity, Science 239:1534-1536; Kettleborough, С. A. et al. (1991) Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation, Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity, Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo, Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) Humanized Antibodies For Antiviral Therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) Humanization Of An Anti-p 185her 2 Antibody For Human Cancer Therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; и Co, M.S. et al. (1992) Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen, J. Immunol. 148:1149-1154. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, гуманизированные антитела сохраняют все последовательности CDR (например, гуманизированное мышиное антитело, которое содержит все шесть CDR из мышиных антител). В соответствии с другими вариантами осуществления гуманизированные антитела имеют один или несколько CDR (один, два, три, четыре, пять или шесть), которые изменены по их аминокислотной последовательности(ям) относительно исходного антитела, которые также называют одним или несколькими CDR, которые являются производными от одного или нескольких CDR из исходного антитела (т.е. являются производными от таких CDR, которые получены благодаря сведениям об аминокислотных последовательностях таких CDR и т.д.). Полинуклеотидную последовательность, которая кодирует вариабельный домен антитела, можно применять для создания таких производных и улучшения аффинности или других характеристик таких антител. Общий принцип гуманизации антитела предусматривает сохранение основной последовательности эпитопсвязывающей части антитела при замене оставшейся нечеловеческой части антитела на последовательности человеческого антитела. Существует четыре общих стадии гуманизации моноклонального антитела. Эти стадии следующие:

(1) определение нуклеотидной и прогнозируемой аминокислотной последовательности вариабельных доменов легких и тяжелых цепей исходного антитела, (2) конструирование гуманизированного антитела или канинизированного антитела, т. е. принятие решения о том, какой каркасный участок антитела применять в процессе гуманизации или канинизации, (3) фактические методологии/методики гуманизации или канинизации и (4) трансфекция и экспрессия гуманизированного антитела. См., например, патенты США №№ 4816567, 5807715, 5866692 и 6331415.

Эпитопсвязывающий сайт молекул по настоящему изобретению может содержать полный вариабельный домен, слитый с константным доменом, или только определяющие комплементарность участки (CDR) такого вариабельного участка, привитые к соответствующим каркасным участкам. Эпитопсвязывающие сайты могут быть дикого типа или модифицированы одной или несколькими аминокислотными заменами. Это устраняет константный участок в качестве иммуногена у людей, но возможность иммунного ответа на чужеродный вариабельный домен сохраняется (LoBuglio, A.F. et al. (1989) Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). В другом подходе основное внимание уделяется не только обеспечению наличия константных участков человеческого происхождения, но и модификации вариабельных доменов, а также изменению их формы на как можно более близкую к человеческой форме. Известно, что вариабельные домены как тяжелых, так и легких цепей содержат три определяющий комплементарность уча

- 11 041483 стка (CDR), которые варьируют в зависимости от рассматриваемых антигенов и определяют связывающую способность, фланкированные четырьмя каркасными участками (FR), которые относительно консервативны у заданного вида и которые предположительно обеспечивают каркас для CDR. При получении отличных от человеческих антител к конкретному антигену вариабельные домены можно переформировать или гуманизировать путем прививки CDR, полученных из отличного от человеческого антитела, на FR, присутствующие в подлежащем модификации человеческом антителе. Применение такого подхода к различным антителам рассмотрено в работе Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies for Therapy, Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity, Science 239:1534-1536; Kettleborough, С. A. et al (1991) Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation, Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity, Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo, Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) Humanized Antibodies For Antiviral Therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) Humanization Of An Anti-p 185her 2 Antibody For Human Cancer Therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; и Co, M.S. etal (1992) Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen, J. Immunol. 148:1149-1154. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления гуманизированные антитела сохраняют все последовательности CDR (например, гуманизированное мышиное антитело, которое содержит все шесть CDR из мышиных антител). В соответствии с другими вариантами осуществления гуманизированные антитела имеют один или несколько CDR (один, два, три, четыре, пять или шесть), которые различаются по последовательности относительно исходного антитела.

Был описан ряд гуманизированных молекул антител, содержащих эпитопсвязывающий сайт, полученный из отличного от человеческого иммуноглобулина, включая химерные антитела, имеющие вариабельный домен грызуна или модифицированный вариабельный домен грызуна и ассоциированный с ним определяющие комплементарность участки (CDR), слитые с константными доменами человека (см., например, Winter et al. (1991) Man-made Antibodies, Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. (1987) Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1 A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen, J. Immunol. 138:4534-4538, и Brown et al. (1987) Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody, Cancer Res. 47:3577-3583). В других источниках описаны CDR грызунов, привитые в поддерживающий каркасный участок (FR) человека перед слиянием с соответствующим константный доменом человеческого антитела (см., например, Riechmann, L. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies for Therapy, Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity, Science 239:1534-1536; и Jones et al. (1986) Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse, Nature 321:522-525). В другом источнике описаны CDR грызунов, поддерживаемые рекомбинантно венированными каркасными участками грызунов. См., например, публикацию европейского патента № 519596. Такие гуманизированные молекулы сконструированы для минимизации нежелательного иммунологического ответа на молекулы антител грызунов к антителу человека, что ограничивает продолжительность и эффективность терапевтических применений таких фрагментов у принимающих такой препарат людей. Другие способы гуманизации антител, которые также можно использовать, раскрыты в работе Daugherty et al. (1991) Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins, Nucl. Acids Res. 19:2471-2476, и в патентах США №№ 6180377,6054297, 5997867 и 5866692.

II. Рецепторы Fcy (FcyR)

Домены СН2 и СН3 двух тяжелых цепей взаимодействуют с образованием Fc-участка, который является доменом, который распознается клеточными рецепторами Fc, в том числе без ограничения гаммарецепторами Fc (FcyR). Применяемый в контексте настоящего документа термин Fc-участок применяют для обозначения С-концевого участка тяжелой цепи IgG. Аминокислотная последовательность домена СН2-СН3 иллюстративного IgG1 человека представляет собой (SEQ ID NO: 1):

- 12 041483

231 240	250	260	270	280
APELLGGPSV	FLFPPKPKDT	LMISRTPEVT	CVVVDVSHED	PEVKFNWYVD
290	300	310	320	330
GVEVHNAKTK	PREEQYNSTY	RVVSVLTVLH	QDWLNGKEYK	CKVSNKALPA
340	350	360	370	380
PIEKTISKAK	GQPREPQVYT	LPPSREEMTK	NQVSLTCLVK	GFYPSDIAVE
390	400	410	420	430
WESNGQPENN	YKTTPPVLDS	DGSFFLYSKL	TVDKSRWQQG	NVFSCSVMHE
440	447
ALHNHYTQKS	LSLSPGX

которая пронумерована согласно EU системе нумерации по Kabat, где X является лизином (K) или отсутствует.

Аминокислотная последовательность домена СН2-СН3 иллюстративного IgG2 человека представляет собой (SEQ ID NO: 2):

231 240	250	260	270	280
APPVA-GPSV	FLFPPKPKDT	LMISRTPEVT	CVVVDVSHED	PEVQFNWYVD
290	300	310	320	330
GVEVHNAKTK	PREEQFNSTF	RVVSVLTVVH	QDWLNGKEYK	CKVSNKGLPA
340	350	360	370	380
PIEKTISKTK	GQPREPQVYT	LPPSREEMTK	NQVSLTCLVK	GFYPSDISVE
390	400	410	420	430
WESNGQPENN	YKTTPPMLDS	DGSFFLYSKL	TVDKSRWQQG	NVFSCSVMHE

440 447

ALHNHYTQKS LSLSPGX которая пронумерована согласно EU системе нумерации по Kabat, где X является лизином (K) или отсутствует.

Аминокислотная последовательность домена СН2-СН3 иллюстративного IgG3 человека представ-

ляет собой (SEQ ID NO: 3):
231 240	250	260	270	280
APELLGGPSV	FLFPPKPKDT	LMISRTPEVT	CVVVDVSHED	PEVQFKWYVD
290	300	310	320	330
GVEVHNAKTK	PREEQYNSTF	RVVSVLTVLH	QDWLNGKEYK	CKVSNKALPA
340	350	360	370	380
PIEKTISKTK	GQPREPQVYT	LPPSREEMTK	NQVSLTCLVK	GFYPSDIAVE
390	400	410	420	430
WESSGQPENN	YNTTPPMLDS	DGSFFLYSKL	TVDKSRWQQG	NIFSCSVMHE
440	447
ALHNRFTQKS	LSLSPGX

Аминокислотная последовательность домена СН2-СН3 иллюстративного IgG4 человека представ-

ляет собой (SEQ ID NO: 4):
231 240	250	260	270	280
APEFLGGPSV	FLFPPKPKDT	LMISRTPEVT	CVVVDVSQED	PEVQFNWYVD
290	300	310	320	330
GVEVHNAKTK	PREEQFNSTY	RVVSVLTVLH	QDWLNGKEYK	CKVSNKGLPS
340	350	360	370	380
SIEKTISKAK	GQPREPQVYT	LPPSQEEMTK	NQVSLTCLVK	GFYPSDIAVE
390	400	410	420	430
WESNGQPENN	YKTTPPVLDS	DGSFFLYSRL	TVDKSRWQEG	NVFSCSVMHE
440	447
ALHNHYTQKS	LSLSLGX

По всему настоящему описанию нумерация остатков в константном участке тяжелой цепи IgG соответствует EU системе нумерации по Kabat et al., SEQUENCES OF Proteins of Immunological Interest, 5^thEd. Public Health Service, NH1, MD (1991) (Kabat), явным образом включенной в настоящий документ посредством ссылок. EU система нумерации по Kabat относится к нумерации EU антитела IgG1 человека. Аминокислоты из вариабельных доменов зрелых тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов обозначены по положению аминокислоты в цепи, a CDR указан согласно определению по Kabat (будет понятно, что CDRH1, согласно определению по Chothia, С. & Lesk, A. M. ((1987) Canonical structures for the

- 13 041483 hypervariable regions of immunoglobulins, J. Mol. Biol. 196:901-917) начинается на пять остатков раньше). Kabat описал многочисленные аминокислотные последовательности для антител, определил аминокислотную консенсусную последовательность для каждой подгруппы и присвоил каждой аминокислоте номер остатка. Схема нумерации по Kabat можно расширить на антитела, не включенные в его сборник, путем выравнивания рассматриваемого антитела с одной из консенсусных последовательностей по Kabat с учетом консервативных аминокислот. Этот способ присвоения номеров остатков стал стандартным в настоящей области техники и позволяет легко выявить аминокислоты в эквивалентных положениях у разных антител, в том числе у химерных или гуманизированных вариантов. Например, аминокислота в положении 50 легкой цепи антитела человека занимает эквивалентное положение аминокислоте в положении 50 легкой цепи антитела мыши.

По ряде различных положений в пределах константных участках антитела наблюдались полиморфизмы (например, по положениям Fc, в том числе без ограничения положениям 270, 272, 312, 315, 356 и 358, пронумерованным согласно EU системе нумерации по Kabat), и, следовательно, могут иметь место небольшие различия между представленной последовательностью и последовательностями, известными из уровня техники. Были хорошо охарактеризованы полиморфные формы иммуноглобулинов человека. В настоящее время известны 18 Gm аллотипов: G1m (1, 2, 3, 17) или G1m (a, X, f, z), G2m (23) или G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) или G3m (b1, с3, b3, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation, Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). В частности, предполагается, что антитела по настоящему изобретению могут включать любой аллотип, изоаллотип или гаплотип любого гена иммуноглобулина и не ограничены аллотипом, изоаллотипом или гаплотипом последовательностей, представленных в настоящем документе. Кроме того, в некоторых системах экспрессии Сконцевой аминокислотный остаток (выделен жирным выше) домена СН3 может быть удален посттрансляционно. Соответственно, С-концевой остаток домена СН3 является необязательным аминокислотным остатком в связывающих LAG-3 молекулах по настоящему изобретению. В частности, настоящее изобретение относится к связывающим LAG-3 молекулам без С-концевого остатка домена СН3. Также, в частности, настоящее изобретение относится к таким конструкциям, которые содержат С-концевой остаток лизина домена СН3.

Активирующие и ингибирующие сигналы трансдуцируются при лигировании Fc-участка с клеточным рецептором Fc (FcyR). Способность такого лигирования приводить к диаметрально противоположным функциям проистекает изструктурных различий среди различных изоформ рецепторов. Различные ответы обуславливают два различных домена в цитоплазматических сигнальных доменах рецептора, называемые иммунорецепторными тирозиновыми активирующими мотивами (ITAM) и иммунорецепторными тирозиновыми ингибирующими мотивами (ITIMS). Привлечение различных цитоплазматических ферментов в такие структуры обуславливает результат FcγR-опосредованных клеточных ответов. К ITAM-содержащим комплексам FcyR относятся FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA, тогда как к ITIM-содержащим комплексам относится только FcyRIIB. Человеческие нейтрофилы экспрессируют ген FcyRIIA. Группировка FcyRIIA посредством иммунных комплексов или сшивания со специфическими антителами способствует агрегации ITAM с рецептор-ассоциированными киназами, которые облегчают фосфорилирование ITAM. Фосфорилирование ITAM выполняет роль сайта докинга для Syk-киназы, активация которой приводит в результате к активации последующих субстратов (например, PI3K). Клеточная активация приводит к высвобождению провоспалительных медиаторов. Ген FcyRIIB экспрессируется на Влимфоцитах; его внеклеточный домен на 96% идентичен FcyRIIA и связывает комплексы IgG неразличимым образом. Наличие ITIM в цитоплазматическом домене FcyRIIB определяет этот ингибирующий подкласс FcyR.

Недавно была установлена молекулярная основа такого ингибирования. При совместном лигировании с активирующим FcyR, ITIM в FcyRIIB становится фосфорилированным и притягивает домен SH2 инозитолполифосфат-5'-фосфатазы (SHIP), который гидролизирует фосфоинозитоловые мессенджеры, высвобождаемые в результате активации ITAM-содержащей FcyR-зависимой тирозинкиназы, в результате предотвращается приток внутриклеточного Ca++. Таким образом, перекрестное сшивание FcyRIIB ослабляет активирующий ответ на лигирование FcyR и ингибирует клеточную ответную реакцию. Следовательно, активация В-клеток, пролиферация В-клеток и секреция антител прекращаются.

III. Биспецифические антитела, мультиспецифические диатела и диатела DART®

Функциональность антител может быть повышена путем создания мультиспецифических молекул на основе антител, которые могут одновременно связывать два отдельных и разных антигена (или различные эпитопы одного и того же антигена), и/или путем создания молекулы на основе антител, имеющей более высокую валентность (т. е. более двух сайтов связывания) для одного эпитопа и/или антигена.

Для получения молекул, обладающих большими функциональными возможностями, чем природные антитела, был разработан широкий спектр форматов рекомбинантных биспецифических антител (см., например, PCT публикации WO 2008/003116, WO 2009/132876, WO 2008/003103, WO 2007/146968, WO 2009/018386, WO 2012/009544, WO 2013/070565), большинство из которых предусматривают при

- 14 041483 менение линкерных пептидов либо для слияния дополнительного эпитоп-связывающего фрагмента (например, scFv, VL, VH и т.д.) с остовом антитела или в остове антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM), либо для слияния множества эпитопсвязывающих фрагментов (например, двух Fab-фрагментов или scFvs). Альтернативные форматы предусматривают применение линкерных пептидов для слияния эпитопсвязывающего фрагмента (например, scFv, VL, VH и т.д.) с доменом димеризации, таким как домен СН2СН3, или альтернативными полипептидами (WO 2005/070966, WO 2006/W7786A WO 2006/107617А, WO 2007/046893). Как правило, такие подходы предусматривают компромиссы и баланс преимуществ и недостатков. Например, в PCT публикациях wO 2013/174873, WO 2011/133886 и WO 2010/136172 раскрыто, что применение линкеров может вызывать проблемы в терапевтических планах, и предложено триспецифическое антитело, в котором домены CL и СН1 переключены из их соответствующих природных положений, а домены VL и VH сделаны разнообразными (WO 2008/027236, WO 2010/108127) для обеспечения им возможности связываться с более чем одним антигеном. Таким образом, в раскрытых в этих документах молекулах специфичность связывания принесена в жертву способности связывать дополнительные виды антигенов. В PCT публикациях WO 2013/163427 и WO 2013/119903 раскрыта модификация домена СН2 для включения аддукта слитого белка, содержащего связывающий домен. В документе отмечается, что домен СН2, вероятно, играет лишь минимальную роль в опосредовании эффекторной функции. В PCT публикациях WO 2010/028797, WO 2010028796 и WO 2010/028795 раскрыты рекомбинантные антитела, Fc-участки которых были заменены дополнительными доменами VL и VH с образованием трехвалентных связывающих молекул. В PCT публикациях WO 2003/025018 и WO2003012069 раскрыты рекомбинантные диатела, отдельные цепи которых содержат домены scFv. В PCT публикации WO 2013/006544 раскрыты многовалентные молекулы Fab, которые синтезируются в виде единой полипептидной цепи, а затем подвергаются протеолизу с образованием на выходе гетеродимерных структур. Таким образом, у раскрытых в этих документах молекул полную или частичную способность опосредовать эффекторную функцию принесена в жертву способности связывать дополнительные виды антигенов. В PCT публикациях WO 2014/022540, WO 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2008/024188, WO 2007/024715, WO 2007/075270, WO 1998/002463, WO 1992/022583 и WO 1991/003493 раскрыто добавление дополнительных связывающих доменов или функциональных групп к антителу или части антитела (например, добавление диатела к легкой цепи антитела, или добавление дополнительных доменов VL и VH к легким и тяжелым цепям антитела, или добавление гетерологичного слитого белка, или связывание нескольких доменов Fab друг с другом в цепь). Таким образом, у раскрытых в этих документах молекул нативная структура антитела принесена в жертву способности связывать дополнительные виды антигенов.

Кроме того, в уровне техники отмечалась возможность получения диател, которые отличаются от таких природных антител способностью связывать два или более различных видов эпитопов (т. е. характеризуются биспецифичностью или мультиспецифичностью в дополнение к двухвалентности или многовалентности) (см., например, Holliger et al. (1993) 'Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.); uS 2004/0220388/WO 02/02781 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity, J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al.); Olafsen, T. et al. (2004) Covalent Disulfide-LinkedAnti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications, Protein Eng. Des. Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange, Protein Engineering 14(2): 1025-1033; Asano et al. (2004) A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain, Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P. A. et al. (2009) Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy, Cancer Res. 69(12):4941-4944).

Конструкция диатела основана на производном антитела, известном как одноцепочечный фрагмент вариабельного домена (scFv). Такие молекулы получают путем связывания вариабельных доменов легкой и/или тяжелой цепи с помощью короткого соединяющего пептида. В свою очередь, линкеры можно модифицировать для дополнительных функций, таких как присоединение лекарственных средств или прикрепление к твердым подложкам. Одноцепочечные варианты можно получить либо рекомбинантно, либо синтетически. Для синтетического получения scFv можно применять автоматизированный синтезатор. Для рекомбинантного получения scFv подходящую плазмиду, содержащую полинуклеотид, который кодирует scFv, можно ввести в подходящую клетку-хозяина, либо эукариотическую, такую как дрожжевые клетки, клетки растения, насекомого или млекопитающих, либо прокариотическую, такую как E. coli. Полинуклеотиды, кодирующие представляющий интерес scFv, можно получить обычными манипуляциями, такими как лигирование полинуклеотидов. Полученный в результате scFv можно выделить с помощью стандартных методик очистки белка, известных из уровня техники.

Создание немоноспецифических диател дает значительное преимущество перед антителами, включая без ограничения способность совместно лигировать и совместно локализовать клетки, которые экс

- 15 041483 прессируют различные эпитопы. Таким образом, биспецифические диатела имеют широкий спектр применений, в том числе в терапии и иммунодиагностике. Биспецифичность обеспечивает большую гибкость в конструировании и разработке диатела для различных задач, в обеспечении повышенной авидности к мультимерным антигенам, в перекрестном сшивании различных антигенов и в направленном нацеливании на конкретные типы клеток, исходя из наличие обоих целевых антигенов. Благодаря их повышенной валентности, низким скоростям диссоциации и быстрому выведению из кровотока (для диател небольших размеров, на уровне или ниже ~50 кДа), для известных из уровня техник молекул диател также было продемонстрировано особое применение в области визуализации опухоли (Fitzgerald et al. (1997) Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichiapastoris, Protein Eng. 10:1221).

Биспецифичность диател привела к их применению для совместного лигирования различных клеток, например, перекрестного сшивания цитотоксических Т-клеток с опухолевыми клетками (Staerz et al. (1985) Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By TCells, Nature 314:628-631, и Holliger et al. (1996) Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody, Protein Eng. 9:299-305; Marvin et al. (2005) Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies, Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658). Альтернативно, или дополнительно, биспецифические диатела можно применять для совместного лигирования рецепторов на поверхности различных клеток или на одной клетке. Совместное лигирование различных клеток и/или рецепторов полезно для модулирования эффекторных функций и/или передачи сигналов у иммунной клетки. Мультиспецифические молекулы (например, биспецифические диатела), содержащие эпитоп-связывающие сайты, могут быть направлены на поверхностную детерминанту любой иммунной клетки, такую как В7-Н3 (CD276), В7-Н4 (VTCN1), BTLA (CD272), CD3, CD8, CD16, CD27, CD32, CD40, CD40L, CD47, CD64, CD70 (CD27L), CD80 (В7-1), CD86 (В7-2), CD94 (KLRD1), CD137 (4-1ВВ), CD137L (4-1BBL), CD226, CTLA-4 (CD152), галектин-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS (CD278), ICOSL (CD275), рецептор активации киллеров (KIR), LAG-3 (CD223), LIGHT (TNFSF14, CD258), МНС I или II класса, NKG2a, NKG2d, OX40 (CD134), OX40L (CD134L), PD1H, PD-1 (CD279), PD-L1 (B7-H1, CD274), PD-L2 (B7-CD, CD273), PVR (NECL5, CD155), SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 (HAVCR2) и/или VISTA (PD-1H), которые экспрессируются на Т-лимфоцитах, натуральных киллерах (NK), антигенпрезентирующих клетках или других мононуклеарных клетках. Так, в частности, эпитопсвязывающие сайты, направленные на рецептор клеточной поверхности, который участвует в регуляции иммунной контрольной точки (или ее лиганда), полезны для создания биспецифических или мультиспецифических связывающих молекул, которые антагонизируют или блокируют передачу ингибирующего сигнала молекулами иммунной контрольной точки и тем самым стимулируют, повышают или усиливают иммунные ответы у субъекта. К молекулам, участвующим в регуляции иммунных контрольных точек, относятся без ограничения В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD40L, CD47, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, CTLA-4, галектин-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, KIR, LAG-3, LIGHT, МНС I или II класса, NKG2a, NKG2d, OX40, OX40L, PD1H, PD-1, PD-L1, PD-L2, PVR, SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 и/или VISTA.

Тем не менее, вышеупомянутые преимущества обходятся высокой ценой. Для образование таких немоноспецифических диател необходима успешная сборка двух или более разных и различных полипептидов (т.е. для такого образования необходимо, чтобы диатела образовывались посредством гетеродимеризации полипептидных цепей различных видов). Этот факт сильно отличает их от моноспецифических диател, которые образуются посредством гомодимеризации идентичных полипептидных цепей. Поскольку должны быть представлены по меньшей мере два разнородных полипептида (т. е. полипептиды двух видов) для образования немоноспецифического диатела, а также поскольку гомодимеризация таких полипептидов приводит к получению неактивных молекул (Takemura, S. et al. (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, Protein Eng. 13(8):583588), получение таких полипептидов необходимо осуществлять таким образом, чтобы предотвратить ковалентное связывание между полипептидами одного вида (т.е. предотвратить гомодимеризацию) (Takemura, S. et al. (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, Protein Eng. 13(8):583-588). Таким образом, в уровне техники было раскрыто нековалентное связывание таких полипептидов (см., например, Olafsen et al. (2004) Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications, Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain, Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, Protein Eng. 13(8):583-588; Lu D. et al. (2005) A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity , J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672).

Тем не менее, из уровня техники известно, что биспецифические диатела, состоящие из нековалентно связанных полипептидов, являются нестабильными и легко диссоциируют на нефункциональные мономеры (см., например, Lu, D. et al. (2005) А Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Anti

- 16 041483 tumor Activity, J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672).

Ввиду этой проблемы, в области техники удалось разработать стабильные, ковалентно связанные гетеродимерные немоноспецифические диатела, называемые диателами DART® (Dual Affinity ReTargeting Reagents - целенаправленные реагенты с двойной аффинностью); см., например, патентные публикации США №№ 2013-0295121, 2010-0174053 и 2009-0060910; публикации европейских патентов №№ EP 2714079, EP 2601216, EP 2376109, EP 2158221 и PCT публикации WO 2012/162068, WO 2012/018687, WO 2010/080538, WO 2008/157379, WO 2006/113665 и Sloan, D.D. et al. (2015) Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells, PLoS Pathog. 11(11):e1005233. doi: 10.1371/journal.ppat.l005233; A1 Hussaini, M. et al. (2015) Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART®) Platform, Blood 127(1): 122-131; Chichili, G.R. et al. (2015) A CD3xCDI23 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates, Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Moore, P.A. et al. (2011) Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma, Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) Therapeutic Control Of В Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold, Arthritis Rheum. 62(7): 1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion, J. Mol. Biol. 399(3):436-449; Marvin, J.S. et al. (2005) Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies, Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658; Olafsen, T. et al. (2004) Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications, Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Holliger, P. et al. (1993) 'Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448. Такие диатела содержат два или более ковалентно связанных в комплекс полипептида и предусматривают включение способами инженерии одного или нескольких цистеиновых остатков в каждом из используемых видов полипептида, которые обеспечивают образование дисульфидных связей и тем самым ковалентно связывают две полипептидные цепи. Например, было показано, что добавление цистеинового остатка к С-концу таких конструкций позволяет образовать дисульфидную связь между полипептидными цепями, стабилизируя полученный в результате гетеродимер без вмешательства в характеристики связывания двухвалентной молекулы. Каждый из двух полипептидов простейшего биспецифического диатела DART® содержит три домена. Первый полипептид содержит (в направлении от N-конца к Сконцу):

(i) первый домен, который содержит участок связывания вариабельного домена легкой цепи первого иммуноглобулина (VL1), (ii) второй домен, который содержит участок связывания вариабельного домена тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2), и (iii) третий домен, который содержит цистеиновый остаток (или цистеин-содержащий домен) и способствующий образованию гетеродимера домен, который способствует гетеродимеризации со вторым полипептидом диатела и ковалентно связывает первый и второй полипептид диатела друг с другом.

Второй полипептид содержит (в направлении от N-конца к С-концу):

(i) первый домен, который содержит участок связывания вариабельного домена легкой цепи второго иммуноглобулина (VL2), (ii) второй домен, который содержит участок связывания вариабельного домена тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VH1), и (iii) третий домен, который содержит цистеиновый остаток (или цистеинсодержащий домен) и комплементарный способствующий образованию гетеродимера домен, который образует комплекс со способствующим образованию гетеродимера доменом первой полипептидной цепи для того, чтобы способствовать гетеродимеризации с первой полипептидной цепью.

Цистеиновый остаток (или цистеин-содержащий домен) третьего домена второй полипептидной цепи способствует образованию ковалентной связи второй полипептидной цепи с первой полипептидной цепью диатела. Такие молекулы являются стабильными, высокоактивными и обладают способностью одновременно связывать два или более антигенов. В соответствии с одним вариантом осуществления третьи домены каждого из первого и второго полипептидов содержат цистеиновый остаток, который предназначен для связывания полипептидов друг с другом посредством дисульфидной связи. На фиг. 1 представлено схематическое изображение такого диатела, в котором используются способствующие образованию гетеродимера домены с E-спиралью/K-спиралью и цистеинсодержащий линкер для ковалентного связывания. На фиг. 2 и 3А-3С показано, что один или оба полипептида могут дополнительно обладать последовательностью домена СН2-СН3, так чтобы комплексообразование между двумя полипептидами диатела формировало Fc-участок, который способен связываться с рецептором Fc у клеток (таких как В-лимфоциты, дендритные клетки, натуральные киллеры, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и тучные клетки). Как более подробно представлено ниже, домены СН2 и/или СН3 таких полипептидных цепей не обязательно должны быть идентичными по последовательности, и преимуществен

- 17 041483 но они модифицированы таким образом, чтобы это содействовало комплексообразованию между двумя полипептидными цепями.

Было описано множество вариантов таких молекул (см., например, патентные публикации США №№ 2015/0175697, 2014/0255407, 2014/0099318, 2013/0295121, 2010/0174053 и 2009/0060910; публикации европейских патентов №№ EP 2714079, EP 2601216, EP 2376109, EP 2158221 и PCT публикации WO 2012/162068, WO 2012/018687, WO 2010/080538). Такие содержащие Fc-участок диатела DART® могут содержать две пары полипептидных цепей. Первая полипептидная цепь содержит (в направлении от Nконца к С-концу):

(i) первый домен, который содержит участок связывания вариабельного домена легкой цепи первого иммуноглобулина (VL1), (ii) второй домен, который содержит участок связывания вариабельного домена тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2), (iii) третий домен, который содержит цистеиновый остаток (или цистеинсодержащий домен) и способствует гетеродимеризации со вторым полипептидом диатела и ковалентно связывает первый и второй полипептид диатела друг с другом, и (iv) домен СН2-СН3.

(i) первый домен, который содержит участок связывания вариабельного домена легкой цепи второго иммуноглобулина (VL2), (ii) второй домен, который содержит участок связывания вариабельного домена тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VH1), и (iii) третий домен, который содержит цистеиновый остаток (или цистеин-содержащий домен) и способствующий образованию гетеродимера домен, который способствует гетеродимеризации с первой полипептидной цепью.

В этом случае два первых полипептида образуют комплекс друг с другом с образованием Fcучастка. На фиг. 3А-3С представлены схематические изображения трех вариантов таких диател с использованием различных способствующих образованию гетеродимера доменов.

Другие содержащие Fc-участок диатела DART® могут содержать три полипептидные цепи. Первый полипептид таких диател DART® содержит три домена:

(i) VL1-содержащий домен, (ii) VL2-содержащий домен и (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СН3.

Второй полипептид таких диател DART® содержит:

(i) VL2-содержащий домен, (ii) VH1-содержащий домен и (iii) домен, который способствует гетеродимеризации и ковалентному связыванию первой полипептидной цепи диатела. Третий полипептид таких диател DART® содержит последовательность СН2-СН3.

Таким образом, первая и вторая полипептидные цепи таких диател DART® ассоциируются друг с другом с образованием сайт связывания VL1/VH1, который способен связываться с эпитопом, а также сайта связывания VL2/VH2, который способен связываться со вторым эпитопом. Такие более сложные молекулы DART® также имеют цистеин-содержащие домены, функция которых заключается в образовании ковалентно связанного комплекса. Таким образом, первый и второй полипептиды связаны друг с другом посредством дисульфидной связи с участием цистеиновых остатков в их соответствующих третьих доменах. Следует отметить, что первая и третья полипептидные цепи объединяются в комплекс друг с другом с образованием Fc-участка, который стабилизирован дисульфидной связью. На фиг. 4А-4В представлены схематические изображения таких диател, содержащих три полипептидные цепи.

Еще одни содержащие Fc-участки диатела DART® могут содержать пять полипептидных цепей, которые могут содержать участки связывания из вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей от трех или менее различных иммуноглобулинов (называемые VL1/VH1, VL2/VH2 и VL3/VH3). Например, первая полипептидная цепь таких диател может содержать:

(i) VH1-содержащий домен, (ii) CH1-содержащий домен и (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СН3.

Вторая и пятая полипептидные цепи таких диател могут содержать:

(i) VL1-содержащий домен и (ii) CL-содержащий домен.

Третья полипептидная цепь таких диател может содержать:

(i) VH1-содержащий домен, (ii) CH1-содержащий домен, (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СН3, (iv) VL2-содержащий домен, (v) VH3-содержащий домен и

- 18 041483 (vi) способствующий образованию гетеродимера домен, где способствующие образованию гетеродимера домены способствуют димеризации третьей цепи с четвертой цепью.

Четвертый полипептид таких диател может включать:

(i) VL3-содержащий домен, (ii) VH2-содержащий домен и (iii) домен, который способствует гетеродимеризации и ковалентному связыванию третьей полипептидной цепи диатела.

В этом случае первый и третий полипептиды образуют комплекс друг с другом с образованием Fcучастка. Такие более сложные молекулы DART® также имеют цистеин-содержащие домены, функция которых заключается в образовании ковалентно связанного комплекса, так чтобы каждая полипептидная цепь была связана по меньшей мере с одной присоединяемой полипептидной цепью посредством дисульфидной связи с участием цистеиновых остатков. Предпочтительно такие домены расположены в порядке от N-конца к С-концу. На фиг. 5 представлены схематические изображения таких диател, содержащих пять полипептидных цепей.

Из уровня техники известны альтернативные конструкции для задач, где требуется четырехвалентная молекула, но не требуется Fc, включая без ограничения четырехвалентные тандемные антитела, также называемые TandAb (см., например, патентные публикации США №№ 2005-0079170, 2007-0031436, 2010-0099853, 2011-020667 2013-0189263; публикации европейских патентов №№ EP 1078004, EP 2371866, EP 2361936 и EP 1293514; PCT публикации WO 1999/057150, WO 2003/025018 и WO 2013/013700), которые образованы в результате гомодимеризации двух идентичных цепей, каждая из которых обладает доменом VH1, VL2, VH2 и VL2.

Недавно были описаны трехвалентные структуры, включающие два связывающих домена по типу диатела и один домен отличного от диатела типа и Fc-участок (см., например, PCT заявку PCT/US15/33076 под названием Триспецифические связывающие молекулы и способы их применения (Tri-Specific Binding Molecules и Methods of Use Thereof), поданную 29 мая 2015 г.; и PCT/US 15/33081 под названием Триспецифические связывающие молекулы, которые специфически связываются со множеством антигенов злокачественных опухолей, и способы их применения (Tri-Specific Binding Molecules That Specifically Bind to Multiple Cancer Antigens and Methods of Use Thereof), поданную 29 мая 2015 г.). Такие трехвалентные молекулы можно использовать для создания моноспецифических, биспецифических или триспецифических молекул. На фиг. 6A-6F представлены схематические изображения таких трехвалентных молекул, содержащих 3 или 4 полипептидные цепи.

IV. Связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению

К предпочтительным связывающим LAG-3 молекулам по настоящему изобретению относятся антитела, диатела, BiTE и т.д., и они способны связываться со сплошной или дискретной (например, конформационной) частью (эпитопом) LAG-3 человека. Связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению будут предпочтительно также характеризоваться способностью связываться с молекулами LAG-3 одного или нескольких отличных от человека видов, в частности, приматов (и особенно таких приматов, как яванский макак). Типичный полипептид LAG-3 человека (последовательность в NCBI NP_002277.4, включая сигнальную последовательность из 22 аминокислотных остатков (показанную подчеркнуто) и зрелый белок из 503 аминокислотных остатков) имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 5):

MWEAQFLGLL FLQPLWVAPV KPLQPGAEVP WWAQEGAPA QLPCSPTIPL

QDLSLLRRAG VTWQHQPDSG PPAAAPGHPL APGPHPAAPS SWGPRPRRYT

VLSVGPGGLR SGRLPLQPRV QLDERGRQRG DFSLWLRPAR RADAGEYRAA

VHLRDRALSC RLRLRLGQAS MTASPPGSLR ASDWVILNCS FSRPDRPASV

HWFRNRGQGR VPVRESPHHH LAESFLFLPQ VSPMDSGPWG CILTYRDGFN

VSIMYNLTVL GLEPPTPLTV YAGAGSRVGL PCRLPAGVGT RSFLTAKWTP

PGGGPDLLVT GDNGDFTLRL EDVSQAQAGT YTCHIHLQEQ QLNATVTLAI

ITVTPKSFGS PGSLGKLLCE VTPVSGQERF VWSSLDTPSQ RSFSGPWLEA

QEAQLLSQPW QCQLYQGERL LGAAVYFTEL SSPGAQRSGR APGALPAGHL

LLFLILGVLS LLLLVTGAFG FHLWRRQWRP RRFSALEQGI HPPQAQSKIE

ELEQEPEPEP EPEPEPEPEP EPEQL

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению характеризуются любым (одним или несколькими) из следующих критериев:

(1) специфически связывает LAG-3 человека в качестве эндогенно экспрессируемого на поверхности простимулированных Т-клеток человека;

(2) специфически связывает LAG-3 человека с равновесной константой связывания (KD) 40 нМ или менее;

(3) специфически связывает LAG-3 человека с равновесной константой связывания (K_D) 0,5 нМ или

- 19 041483 менее;

(4) специфически связывает LAG-3 отличного от человека примата (например, LAG-3 яванского макака);

(5) специфически связывает LAG-3 отличного от человека примата с равновесной константой связывания (K_D) 50 нМ или менее;

(6) специфически связывает LAG-3 отличного от человека примата с равновесной константой связывания (K_D) 5 нМ или менее;

(7) ингибирует (т.е. блокирует или препятствует ему) связывание LAG-3 с МНС II класса;

(8) стимулирует иммунный ответ;

(9) стимулирует антигенспецифический Т-клеточный ответ в качестве отдельного средства;

(10) проявляет синергизм с антителом к PD-1, стимулируя антигенспецифический Т-клеточный ответ;

(11) связывает такой же эпитоп LAG-3, что и антитело к LAG-3: LAG-3 mAb 1 или LAG-3 mAb 6, и/или (12) не конкурирует с антителом к LAG-3 257F (BMS 986016, Medarex/BMS) за связывание с LAG-3 (например, по результатам измерений с помощью анализа Biacore).

Применяемый в контексте настоящего документа термин антигенспецифический Т-клеточный ответ относится к ответам, производимым Т-клетками, которые являются результатом стимуляции Тклетки антигеном, в отношении которого Т-клетка является специфической. К неограничивающим примерам ответов, производимых Т-клеткой при антигенспецифической стимуляции, относятся пролиферация и выработка цитокинов (например, выработку TNF-α, IFN-γ). Способность молекулы стимулировать антигенспецифический Т-клеточный ответ можно определить, например, с помощью описанного в настоящем документе анализа PBMC, простимулированных антигеном энтеротоксина типа В (SEB) Staphylococcus aureus.

Предпочтительные связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению имеют домены VH и/или VL мышиных моноклональных антител к LAG-3: LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 и/или LAG-3 mAb 6, и более предпочтительно имеют 1, 2 или все 3 CDR_H из домена VH и/или 1, 2 или все 3 CDRL из домена VL таких моноклональных антител к LAG-3. К таким предпочтительным связывающим LAG-3 молекулам относятся биспецифические (или мультиспецифические) антитела, химерные или гуманизированные антитела, BiTe, диатела и т. д. и такие связывающие молекулы, которые имеют вариантные Fc-участки.

Настоящее изобретение, в частности, относится к связывающим LAG-3 молекулам, содержащим связывающий LAG-3 домен, который имеет:

(A) (1) три CDRH из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 1 или VL4 hLAG-3 mAb 1;

(2) три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 1;

(3) три CDRH из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 1 и три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 1;

(4) домен VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 1;

(5) домен VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 1;

(6) домены VH и VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 1;

(B) (1) три CDRH из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 2;

(2) три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 2;

(3) три CDRH из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 2 и три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 2;

(4) домен VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 2;

(5) домен VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 2;

(6) домены VH и VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 2;

(c) (1) три CDR_H из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 3;

(2) три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 3;

(3) три CDR_H из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 3 и три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 3;

(4) домен VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 3;

(5) домен VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 3;

(6) домены VH и VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 3;

(D) (1) три CDR_H из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 4;

(2) три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 4;

(3) три CDR_H из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 4 и три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 4;

(4) домен VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 4;

(5) домен VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 4;

(6) домены VH и VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 4;

(E) (1) три CDR_H из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 5;

- 20 041483 (2) три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 5;

(3) три CDRH из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 5 и три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 5;

(4) домен VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 5;

(5) домен VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 5;

(6) домены VH и VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 5;

(F) (1) три CDRH из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 6;

(2) три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 6;

(3) три CDRH из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 6 и три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 6;

(4) домен VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 6;

(5) домен VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 6;

(6) домены VH и VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 6, (G) (1) три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, VL4 hLAG-3 mAb 1;

(2) три CDR_H из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 1 и три CDR из домена VL антитела к LAG-3, VL4 hLAG-3 mAb 1; или который связывается или конкурирует за связывание с эпитопом, который иммуноспецифически связывает LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6.

А. Антитело к LAG, LAG-3 mAb 1

1. Мышиное антитело к антителу человека LAG-3 mAb 1

Аминокислотная последовательность домена VH LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 6) показана ниже (остатки CDRH показаны подчеркнутыми).

QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFR NYGMNWVKQA PGKVLKWMGW

INTYTGESTY ADDFEGRFAF SLGTSASTAY LQINILKNED TATYFCARES

LYDYYSMDYW GQGTSVTVSS

CDRhI из LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO:8): NYGMN

CDR_H2 из LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO:9): WINTYTGESTYADDFEG

CDR_H3 из LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 10): ESLYDYYSMDY

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VH из LAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 7 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, показаны подчеркнутыми): cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc tcctgcaagg cttctgggta taccttcaga aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct ccaggaaagg ttttaaagtg gatgggctgg ataaacacct acactggaga gtcaacatat gctgatgact tcgagggacg gtttgccttc tctttgggaa cctctgccag cactgcctat ttgcagatca acatcctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagagaatcc ctctatgatt actattctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 11) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми):

DWVTQTPLT LSVTIGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQRPGQSPE RLIYLVSELD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKLE IK

CDRlI of LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO:13): KSSQSLLHSDGKTYLN

CDR_l2 of LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO:14): LVSELDS

CDR_L3 of LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO:15): WQGTHFPYT

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VL из LAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 12 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми): gatgttgtgg tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc atctcttgca agtcaagtca gagcctctta catagtgatg gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccagag cgcctaatct atctggtgtc tgaactggac tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa

2. Гуманизация антитела к LAG-3 LAG-3 mAb 1 для образования hLAG-3 mAb 1

Вышеописанное мышиное антитело к LAG-3, LAG-3mAb 1, было гуманизировано для демонстрации возможности гуманизации антитела к LAG-3 с целью уменьшения его антигенности при введении принимающему такой препарат человеку. Гуманизация давала на выходе два гуманизированных домена VH, обозначенных в настоящем документе как VL-1 hLAG-3 mAb 1 и VH-2 hLAG-3 mAb 1, и четыре

- 21 041483 гуманизированных домена VL, обозначенных в настоящем документе как VL-1 hLAG-3 mAb 1, VL-2 hLAG-3 mAb 1, VL-3 hLAG-3 mAb 1 и VL-4 hLAG-3 mAb 1. Любой из гуманизированных доменов VL может формировать пару с гуманизированными доменами VH. Соответственно любое антитело, содержащее один из гуманизированных доменов VL, соединенный в паре с гуманизированным доменом VH, в общем называют hLAG-3 mAb 1, а конкретные комбинации гуманизированных доменов VH/VL называют с указанием конкретных доменов VH/VL, например, гуманизированное антитело, содержащее VL-1 hLAG-3 mAb 1 и VL-2 hLAG-3 mAb 1, в частности, называют hLAG-3 mAb 1 (1.2).

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из VL-1 hLAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 16) (остатки CDR_H показаны подчеркнутыми):

QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-1 hLAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 17 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDR_H, показаны подчеркнутыми): caggtgcaac tggttcaatc cggcgccgag gtgaaaaagc ctggcgcctc cgtgaaagtg tcctgtaagg catctgggta tacgttcaca aattatggta tgaactgggt gcgacaggca ccagggcagg gactggaatg gatggggtgg atcaatactt atacaggcga gagtacttat gctgacgatt tcgagggcag atttgtcttc tccatggaca ccagcgctag taccgcttat ctccagatta gttctctcaa ggcggaggac acagctgttt attattgtgc ccgcgagagt ttgtatgact actatagcat ggattactgg ggacaaggta caaccgtgac agtgagttcc

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из VH-2 hLAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 18) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми):

QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYFCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует VH-2 hLAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 19 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, показаны подчеркнутыми): caggtgcaac tggttcaatc cggcgccgag gtgaaaaagc ctggcgcctc cgtgaaagtg tcctgtaagg catctgggta tacgttcaca aattatggta tgaactgggt gcgacaggca ccagggcagg gactggaatg gatggggtgg atcaatactt atacaggcga gagtacttat gctgacgatt tcgagggcag atttgtcttc tccatggaca ccagcgctag taccgcttat ctccagatta gttctctcaa ggcggaggac acagctgttt atttctgtgc ccgcgagagt ttgtatgact actatagcat ggattactgg ggacaaggta caaccgtgac agtgagttcc

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из VL-1 hLAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 20) (остатки CDR_L показаны подчеркнутыми):

DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQKPGQSPE

RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IK

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-1 hLAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 21 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми): gatatcgtta tgactcagac accactgtca ctgagtgtga ccccaggtca gcccgctagt atttcctgta aatcatccca gtccctcctg catagcgatg gaaagaccta tttgaactgg cttctgcaga aaccaggcca aagtccagag agattgatct acctcgtttc agaactcgac agtggagtgc ccgatcgctt ctcagggtcc ggctctggga ctgattttac tctcaagatc tcaagagtgg aggccgagga cgtcggggtt tactactgtt ggcagggtac ccacttccct tatacatttg gcggaggcac aaaagtggag attaaa

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из VL-2 hLAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 22) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми):

DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQRPGQSPE

RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IK

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-2 hLAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 23 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми):

- 22 041483 gatatcgtta tgactcagac accactgtca ctgagtgtga ccccaggtca gcccgctagt atttcctgta aatcatccca gtccctcctg catagcgatg gaaagaccta tttgaactqq cttctgcaga qaccaqqcca aagtccaqag agattgatct acctcgtttc agaactcgac agtggagtgc ccgatcgctt ctcagggtcc ggctctggqa ctgattttac tctcaagatc tcaagagtgg aqqccgaqqa cgtcggggtt tactactqtt ggcagggtac ccacttccct tatacatttq gcggaggcac aaaagtggag attaaa

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из VL-3 hLAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 24) (остатки CDR_L показаны подчеркнутыми):

DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQKPGQPPE

RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP

YTFGGGTKVE IK

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-3 hLAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 25 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми): gatatcgtta tgactcagac accactgtca ctgagtgtga ccccaggtca gcccgctagt atttcctgta aatcatccca gtccctcctg catagcgatg gaaagaccta tttgaactqg cttctgcaga aaccaggcca accgccagag agattgatct acctcgtttc agaactcgac agtggagtgc ccgatcgctt ctcagggtcc ggctctggga ctgattttac tctcaagatc tcaagagtgg aggccgagga cgtcggggtt tactactgtt ggcagggtac ccacttccct tatacatttg gcggaggcac aaaagtggag attaaa

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из VL-4 hLAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 26) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми):

DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE

RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP

YTFGGGTKVE IK

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-4 hLAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 27 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми): gatatcgtta tgactcagac accactgtca ctgagtgtga ccccaggtca gcccgctagt atttcctgta aatcatccca gtccctcctg catagcgatg caaagaccta tttgaactgg cttctgcaga aaccaggcca accgccagag agattgatct acctcgtttc agaactcgac agtggagtgc ccgatcgctt ctcagggtcc ggctctggga ctgattttac tctcaagatc tcaagagtgg aggccgagga cgtcggggtt tactactgtt ggcagggtac ccacttccct tatacatttg gcggaggcac aaaagtggag attaaa

CDRL1 из домена VL, VL-4 hLAG-3 mAb 1, содержит аминокислотную замену глицина на аланин и имеет аминокислотную последовательность: KSSQSLLHSDAKTYLN (SEQ ID NO: 28), замененный аланин показан подчеркнутым). Предполагается, что аналогичная замена может быть включена в любой из описанных выше доменов CDRL1 LAG-3 mAb 1.

В. Антитело к LAG, LAG-3 mAb 2

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO: 29) (остатки CDR_H показаны подчеркнутыми):

EVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKTSGYTFT DYNIHWLRQS HGESLEWIGY

IYPYSGDIGY NQKFKNRATL TVDNSSSTAY MDLRSLTSED SAVFYCARWH

RNYFGPWFAY WGQGTPVTVS A

CDR_H1 из LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO:31): DYNIH

CDR_H2 VH из LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO:32): YIYPYSGDIGYNQKFKN

CDR_H3 VH из LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO:33): WHRNYFGPWFAY

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VH из LAG-3 mAb 2, представляет собой SEQ ID NO: 30 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDR_H, показаны подчеркнутыми): gaggtccagc ttcagcagtc aggacctgag ctggtgaaac ctggggcctc agtgaaqatt tcctgcaaga cttctggata cacatttact gactacaaca tacactqqtt gaggcagagc catggagaga gccttgagtg qattqqatat atttatcctt acagtggtga tattggatac aaccagaagt tcaagaacag ggccacattg actgtagaca attcctccag cacagcctac atggatctcc gcagcctgac atctgaagac tctgcagtct tttactgtgc aagatggcac aggaactact ttggcccctg gtttgcttac tggggccaag ggactccggt cactgtctct gca

- 23 041483

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO: 34) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми):

DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGESYMNWY QQKPGQPPKL

LIYWSNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQQSSEDPL TFGAGTKLEL К

CDR_l1 из LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO:36): KASQSVDYDGESYMN

CDR_l2 из LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO:37): WSNLES

CDR_l3 из LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO:38): QQSSEDPLT

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VL из LAG-3 mAb 2, представляет собой SEQ ID NO: 35 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми): gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg Iaaagttatat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatttatg ttgtatccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtagtga ggatccgctc acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa

С. Антитело к LAG, LAG-3 mAb 3

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO: 39) (остатки CDR_H показаны подчеркнутыми):

EVRLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYTFT DYNIHWVRQS HGQSLEWIGY

IYPYNGDTGY NQKFKTKATL TVDNSSNTAY MELRSLASED SAVYYCTRWS RNYFGPWFAY WGQGTLVTVS A

CDRhI из LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO:41): DYNIH

CDR_H2 из LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO:42): YIYPYNGDTGYNQKFKT

CDR_H3 из LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO:43): WSRNYFGPWFAY

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VH из LAG-3 mAb 3, представляет собой SEQ ID NO: 40 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, показаны подчеркнутыми): gaggtccggc ttcagcagtc aggacctgag ctggtgaaac ctggggcctc agtgaagata tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaaca ttcactgggt gaggcagagc catggacaga gccttgagtg gattggatat atttatcctt ataatggtga tactggctac aaccagaagt tcaagaccaa ggccacattg actgtagaca attcctccaa cacagcctac atggaactcc gcagcctggc atctgaagac tctgcagtct attactgtac aagatggagc aggaactact ttggcccctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct gca

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO: 44) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми):

DIVLTQSPTS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGDSYMNWY QQKPGQPPKL LIYAASNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQQSSEDPL TFGAGTKLEL К

CDRlI из LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO:46): KASQSVDYDGDSYMN

CDR_l2 из LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO:47): AASNLES

CDR_l3 из LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO:48): QQSSEDPLT

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VL из LAG-3 mAb 3, представляет собой SEQ ID NO: 45 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, показаны подчеркнутыми): gacattgtgc tgacccaatc tccaacttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtat caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtagtga ggatccgctc acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa

D. Антитело к LAG, LAG-3 mAb 4

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO: 49) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми):

- 24 041483

EVQLHQSGPE LVKPGASVKI SCKTSGYTFT DYNIHWVKQS HGKSLEWIGY IYPYNGDAGY NQNFKTKATL TVDNSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARWN MNYFGPWFAY WGQGTLVTVS A

CDRhI из LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO:51): DYNIH

CDR_H2 из LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO:52): YIYPYNGDAGYNQNFKT

CDR_H3 из LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO:53): WNMNYFGPWFAY

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VH из LAG-4 mAb 4, представляет собой SEQ ID NO: 50 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDR_H, показаны подчеркнутыми): gaggtccagc ttcaccagtc aggacctgag ctggtgaaac ctggggcctc agtgaagata tcctgcaaga cttctggata cactttcact gactacaaca tacactgggt gaagcagagc catggaaaga gccttgagtg gattggatat atttatcctt acaatggtga tgctggctac aaccagaact tcaagaccaa ggccacattg actgtagaca attcctccag cacagcctac atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatggaac atgaactact ttggcccctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct gcg

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO: 54) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми):

DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGVTYINWY QQKPGQPPKL LIFAASNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQQSNEDPL TFGAGTKLEL К

CDRlI из LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO:56): KASQSVDYDGVTYIN

CDR_l2 из LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO:7570): AASNLES

CDR_l3 из LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO:58): QQSNEDPLT

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VL из LAG-3 mAb 4, представляет собой SEQ ID NO: 55 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми): gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg ttacttatat caactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctttg ctgcatccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgctc acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa

Е. Антитело к LAG, LAG-3 mAb 5

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO: 59) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми):

EVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYTFT DYNIHWVKQS PGKSLEWIGY IYPYSGDFGY NQKFKSKATL TVDNSSSTAY MDLRSLTSED SAVFYCARWH RNYFGPWFAY WGQGTLVTVS A

CDR_H1 из LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO:61): DYNIH

CDR_H2 из LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO:62): YIYPYSGDFGYNQKFKS

CDR_H3 из LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO:63): WHRNYFGPWFAY

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VH из LAG-3 mAb 5, представляет собой SEQ ID NO: 60 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, показаны подчеркнутыми): gaggtccagc ttcagcagtc aggacctgag ctggtgaaac ctggggcctc agtgaagatt tcctgcaaag cttctggata cacatttact gactacaaca tacactgggt gaagcagagc cctggaaaga gccttgaatg gattggatat atttatcctt acagtggtga ttttggatac aaccagaagt tcaagagcaa ggccacattg actgtagaca attcctccag cacagcctac atggatctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct tttactgtgc aagatggcac aggaactact ttggcccctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct gca

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO: 64) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми): DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGESYMNWY QQKPGQPPKL

- 25 041483

LIYWSNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQQSSEDPL TFGAGTKLEL К

CDRlI из LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO:66): KASQSVDYDGESYMN

CDR_l2 из LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO:67): WSNLES

CDR_l3 из LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO:68): QQSSEDPLT

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VL из LAG-3 mAb 5, представляет собой SEQ ID NO: 65 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDR_L, показаны подчеркнутыми): gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg Iaaagttatat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatttatg ttgtttccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtagtga ggatccgctc acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa

F. Антитело к LAG, LAG-3 mAb 6

1. Мышиное антитело к антителу человека LAG-3 mAb 6

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO: 69) (остатки CDR_H показаны подчеркнутыми):

EVLLQQSGPE LVKPGASVKI PCKASGYTFT DYNMDWVKQS HGESLEWIGD INPDNGVTIY NQKFEGKATL TVDKSSSTAY MELRSLTSED TAVYYCAREA DYFYFDYWGQ GTTLTVSS

CDR_H1 из LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO:71): DYNMD

CDR_H2 из LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO:72): DINPDNGVTIYNQKFEG

CDR_H3 из LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO:72): EADYFYFDY

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VH из LAG-3 mAb 6, представляет собой SEQ ID NO: 70 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDR_H, показаны подчеркнутыми): gaggtcctgc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata ccctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaaca tggactgggt gaagcagagc catggagaga gccttgagtg gattggagat attaatcctg acaatggtgt tactatctac aa^cagaagt ttgagggcaa ggccacactg actgtagaca agtcctccag tacagcctac atggagctcc gcagcctgac atctgaggac actgcagtct attactgtgc aaqagaggcg gattacttct actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO: 74) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми):

DIVMTQSHRF MSTSVGDRVS ITCKASQDVS SWAWYQQKP GQSPKLLIFS ASYRYTGVPD RFTGSGSGTD FTFTISSVQA ADLAVYYCQQ HYSTPWTFGG GTKLEIK

CDRlI из LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO:76): KASQDVSSWA

CDR_l2 из LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO:77): SASYRYT

CDR_l3 из LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO:78): QQHYSTPWT

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VL из LAG-3 mAb 6, представляет собой SEQ ID NO: 75 (нуклеотиды, кодирующие CDR, показаны подчеркнутыми): gacattgtga tgacccagtc tcacagattc atgtccacat cagttggaga cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt tctgttgtag cctggtatca acagaaacca ggacaatctc ctaaattact gattttttcg gcatcctacc ggtacactqg agtccctgat cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct gcagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta ctccgtggac gttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcaa a

2. Гуманизация антитела к LAG-3 LAG-3 mAb 6 для образования hLAG-3 mAb 6

Вышеописанное мышиное антитело к LAG-3, LAG-3mAb 6, было гуманизировано для демонстрации возможности гуманизации антитела к LAG-3 с целью уменьшения его антигенности при введении принимающему такой препарат человеку. Гуманизация дала на выходе два гуманизированных домена VH, обозначенных в настоящем документе как VL-1 hLAG-3 mAb 6 и VH-2 hLAG-3 mAb 6, и два гуманизированных домена VL, обозначенных в настоящем документе как VL-1 hLAG-3 mAb 6 и VL-2 hLAG-3 mAb 6. Любой из гуманизированных доменов VL может формировать пару с любым из гуманизированных доменов VH. Соответственно любое антитело, содержащее один из гуманизированных до

- 26 041483 менов VL, соединенный в паре с гуманизированным доменом VH, в общем называют hLAG-3 mAb 6, а конкретные комбинации гуманизированных доменов VH/VL называют с указанием конкретных доменов VH/VL, например, гуманизированное антитело, содержащее VL-1 hLAG-3 mAb 6 и VL-2 hLAG-3 mAb 6, в частности, называют hLAG-3 mAb 6 (1.2).

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из VL-1 hLAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO: 79) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми):

QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYNMDWVRQA PGQGLEWMGD

INPDNGVTIY NQKFEGRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAREA DYFYFDYWGQ GTTLTVSS

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-1 hLAG-3 mAb 6, представляет собой SEQ ID NO: 80 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, показаны подчеркнутыми): caggtccagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcaag cgtgaaggtg tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacaaca tggactgggt ccgacaggcc ccaggacagg gcctggaatg gatgggcgac atcaaccccg acaacggcgt gaccatctac aaccagaaat tcgagggcag agtgaccatg accaccgaca ccagcaccag caccgcctac atggaactgc ggtccctgcg gagcgacgac accgccgtgt actactgcgc cagagaggcc gactacttct acttcgacta ctggggccag ggcaccaccc tgaccgtgtc ctcc

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из VH-2 hLAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO: 81) (остатки CDR_H показаны подчеркнутыми):

EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS DYNMDWVRQA PGKGLEWVSD

INPDNGVTIY NQKFEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREA DYFYFDYWGQ GTTLTVSS

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует VH-2 hLAG-3 mAb 6, представляет собой SEQ ID NO: 82 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, показаны подчеркнутыми): gaggtccagc tggtggaatc tggcggcgga ctggtcaagc ctggcggcag cctgagactg agctgcgctg ccagcggctt caccttcagc gactacaaca tggactgggt ccgacaggcc cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgac atcaaccccg acaacggcgt gaccatctac aaccagaagt tcgagggccg gttcaccatc agccgggaca acgccaagaa cagcctgtac ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagaggcc gactacttct acttcgacta ctggggccag ggcaccaccc tgaccgtgtc ctcc

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из VL-1 hLAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO: 83) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SWAWYQQKP GKAPKLLIYS

ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWTFGG

GTKLEIK

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-1 hLAG-3 mAb 6, представляет собой SEQ ID NO: 84 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми): gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc atcacctgtc gggccagcca ggatgtgtcc agcgtggtgg cctggtatca gcagaagccc ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacacagg cgtgcccagc agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacagca ccccctggac cttcggcgga ggcaccaagc tggaaatcaa g

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из VL-2 hLAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO: 85) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми):

DIVMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SWAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPD RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIAVYYCQQ HYSTPWTFGG GTKLEIK

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-2 hLAG-3 mAb 6, представляет собой SEQ ID NO: 86 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми):

- 27 041483 gacatcgtga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc atcacctgtc gggccagcca ggatgtgtcc agcgtggtgg cctggtatca gcagaagccc ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacacagg cgtgcccgat agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccttca ccatcagcag cctgcagccc gaggacatcg ccgtttacta ctgccagcag cactacagca ccccctggac cttcggcgga ggcaccaagc tggaaatcaa g

CDRL1 из домена VL, VL-1 и VL-2 hLAG-3 mAb 2, содержит аминокислотную замену лизина на аргинин и имеет аминокислотную последовательность rasqdvsswa (SEQ ID NO: 87), замененный аргинин показан подчеркнутым). Предполагается, что аналогичная замена может быть включена в любую из описанных выше областей LAG-3 mAb 6 CDRL1.

Предусмотрены незначительные изменения в аминокислотной последовательности представленных в настоящем документе доменов VH и/или VL. Например, С-концевой аминокислотный остаток любого из описанных в настоящем документе доменов VH и/или VL может быть заменен для облегчения субклонирования.

V. Антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 и/или LAG-3 mAb 6, и их производные, имеющие сконструированный Fc-участок

В традиционной иммунной функции взаимодействие комплексов антитело-антиген с клетками иммунной системы приводит в результате к широкому спектру ответов, начиная от эффекторных функций, таких как антителозависимая цитотоксичность, дегрануляция тучных клеток и фагоцитоз, до иммуномодулирующих сигналов, таких как регуляция пролиферации лимфоцитов и секреции антител. Все эти взаимодействия инициируются при связывании Fc-участка антител или иммунных комплексов со специализированными рецепторами клеточной поверхности на гематопоэтических клетках. Разнообразие клеточных ответов, запускаемых антителами и иммунными комплексами, обусловлено структурной гетерогенностью трех рецепторов Fc: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) и FcyRIII (CD16). FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A) и FcyRIII (CD16) являются активирующими (т.е. усиливающими иммунную систему) рецепторами; FcyRIIB (CD32B) является ингибирующим (т.е. ослабляющим иммунную систему) рецептором. Кроме того, взаимодействие с неонатальным рецептором Fc (FcRn) опосредует рециркуляцию молекул IgG из эндосомы на клеточную поверхность и высвобождение в кровь. Выше представлена аминокислотная последовательность иллюстративного IgG1 (SEQ ID NO: 1), IgG2 (SEQ ID NO: 2), IgG3 (SEQ ID NO: 3) и IgG4 (SEQ ID NO: 4)

Модификация Fc-участка обычно приводит к изменению фенотипа, например, изменению периода полужизни в сыворотке, изменению стабильности, изменению восприимчивости к клеточным ферментам или изменению эффекторной функции. Может быть необходима модификация антитела или другой связывающей молекулы по настоящему изобретению в отношении эффекторной функции, например, с тем чтобы повысить эффективность такой молекулы при лечении злокачественной опухоли. В некоторых случаях необходимо уменьшение или исключение эффекторной функции, например, в случае антител, механизм действия которых предусматривает блокировку или антагонизм, но не уничтожение клеток, несущих целевой антиген. Повышенная эффекторная функция, как правило, необходима в отношении нежелательных клеток, таких как опухолевые и чужеродные клетки, где FcyR экспрессируются на низких уровнях, например опухолеспецифические В-клетки с низкими уровнями FcyRIIB (например, при неходжкинской лимфоме, CLL и лимфоме Беркитта). В соответствии с указанными вариантами осуществления молекулы по настоящему изобретению, которым придали или изменили эффекторную функциональную активность, полезны для лечения и/или предупреждения заболевания, нарушения или инфекции, при которых необходима повышенная эффективность эффекторной функциональной активности.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению содержат Fc-участок, который имеет одну или несколько модификаций (например, замены, делеции или вставки) относительно последовательности аминокислот Fc-участка дикого типа (например, SEQ ID NO: 1), которые уменьшают аффинность и авидность Fc-участка и, следовательно, молекулы по настоящему изобретению к одному или нескольким рецепторам FcyR. В соответствии с другими вариантами осуществления, молекулы по настоящему изобретению содержат Fc-участок, который имеет одну или несколько модификаций относительно аминокислот Fc-участка дикого типа, которые увеличивают аффинность и авидность Fc-участка и, следовательно, молекулы по настоящему изобретению к одному или нескольким рецепторам FcyR. В соответствии с другими вариантами осуществления, молекулы содержат вариантный Fc-участок, причем указанный вариант придает или опосредует повышенную активность, а именно антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC), и/или повышенное связывание с FcyRIIA относительно молекулы, не содержащей Fc-участок или содержащей Fc-участок дикого типа. В соответствии с альтернативными вариантами осуществления молекулы содержат вариантный Fc-участок, причем указанный вариант придает или опосредует пониженную ADCC-активность (или другую эффекторную функцию) и/или повышенное связывание с

- 28 041483

FcyRIIB относительно молекулы, не содержащей Fc-участок или содержащей Fc-участок дикого типа. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящее изобретение относится к связывающим LAG-3 молекулам, содержащим вариантный Fc-участок, причем у такого вариантного Fc-участка не наблюдают поддающегося детекции связывания с любым FcyR относительно сравниваемой молекулы, содержащей Fc-участок дикого типа. В соответствии с другими вариантами осуществления настоящее изобретение относится к связывающим LAG-3 молекулам, содержащим вариантный Fc-участок, причем такой вариантный Fc-участок связывает лишь один FcyR, предпочтительно один из FcyRIIA, FcyRIIB или FcyRIIIA. Любую такую повышенную аффинность и/или авидность предпочтительно оценивают путем измерения in vitro степени поддающегося детекции связывания с FcyR или FcyR-связанной активности в клетках, которые экспрессируют низкие уровни FcyR, если активность связывания исходной молекулы (без модифицированного Fc-участка) нельзя детектировать в клетках, или в клетках, которые экспрессируют целевые антигены отличного от FcyR рецептора с плотностью от 30000 до 20000 молекул/клетка, с плотностью от 20000 до 10000 молекул/клетка, с плотностью от 10000 до 5000 молекул/клетка, с плотностью от 5000 до 1000 молекул/клетка, с плотностью от 1000 до 200 молекул/клетка или с плотностью 200 молекул/клетка или менее (но по меньшей мере 10, 50, 100 или 150 молекул/клетка).

Связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению могут содержать вариантный Fcучасток, имеющий измененные аффинности в отношении активирующего и/или ингибирующего рецептора Fcy. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая LAG-3 молекула содержит вариантный Fc-участок, который обладает повышенной аффинностью в отношении FcyRIIB и пониженной аффинностью в отношении FcyRIIIA и/или FcyRIIA относительно сравниваемой молекулы с Fcучастком дикого типа. В соответствии с другим вариантом осуществления, связывающая LAG-3 молекула по настоящему изобретению содержит вариантный Fc-участок, который обладает пониженной аффинностью в отношении FcyRIIB и повышенной аффинностью в отношении FcyRIIIA и/или FcyRIIA относительно сравниваемой молекулы с Fc-участком дикого типа. В соответствии с еще одним вариантом осуществления связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению содержат вариантный Fcучасток, который обладает пониженной аффинностью в отношении FcyRIIB и пониженной аффинностью в отношении FcyRIIIA и/или FcyRIIA относительно сравниваемой молекулы с Fc-участком дикого типа. В соответствии с еще одним вариантом осуществления связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению содержат вариантный Fc-участок, который обладает неизмененной аффинность в отношении FcyRIIB и пониженной (или повышенной) аффинностью в отношении FcyRIIIA и/или FcyRIIA относительно сравниваемой молекулы с Fc-участком дикого типа.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению содержат вариантный Fc-участок, обладающий измененной аффинностью в отношении FcyRIIIA и/или FcyRIIA с тем, чтобы иммуноглобулин имел усиленную эффекторную функцию. К неограничивающим примерам эффекторных клеточных функций относятся антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность, антителозависимый фагоцитоз, фагоцитоз, опсонизация, опсонофагоцитоз, клеточное связывание, розеткообразование, связывание с C1q и комплементзависимая клеточноопосредованная цитотоксичность.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, изменение аффинности или эффекторной функции является по меньшей мере 2-кратным, предпочтительно по меньшей мере 4-кратным, по меньшей мере 5-кратным, по меньшей мере 6-кратным, по меньшей мере 7-кратным, по меньшей мере 8кратным, по меньшей мере 9-кратным, по меньшей мере 10-кратным, по меньшей мере 50-кратным или по меньшей мере 100-кратным относительно сравниваемой молекулы, содержащей Fc-участок дикого типа. В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего изобретения, вариантный Fcучасток иммуноспецифически связывает один или несколько FcR с аффинностью, которая по меньшей мере на 65%, предпочтительно по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 125%, по меньшей мере на 150%, по меньшей мере на 175%, по меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 225% или по меньшей мере на 250% больше, чем у молекулы, содержащей Fc-участок дикого типа. Такие измерения можно осуществлять с помощью in vivo или in vitro анализа, и в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, in vitro анализами, такими как анализы ИФА или на основе поверхностного плазмонного резонанса.

В соответствии с различными вариантами осуществления, связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению содержат вариантный Fc-участок, причем указанный вариант оказывает агонистическое действие по меньшей мере на одну активность рецептора FcyR или антагонистическое действие по меньшей мере на одну активность рецептора FcyR. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления молекулы содержат вариант, который оказывает антагонистическое действие на одну или несколько активностей FcyRIIB, например, опосредуемой В-клеточным рецептором передачу сигнала, активацию В-клеток, пролиферацию В-клеток, выработку антител, приток внутриклеточного кальция у В-клеток, прогрессирование клеточного цикла, FcyRIIB-опосредуемое ингибирование передачи сигнала

- 29 041483

FcεRI, фосфорилирование FcyRIIB, SHIP-рекрутинг, SHIP-фосфорилирование и ассоциацию с Shc, или активность одной или нескольких последующих молекул (например, МАР-киназы, JNK, р38 или Akt) в пути сигнальной транедукции с участием FcyRIIB. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению содержат вариант, который оказывает агонистическое действие на одну или несколько активностей FcεRI, например активацию тучных клеток, мобилизацию кальция, дегрануляцию, выработку цитокинов или высвобождение серотонина.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления молекулы содержат Fc-участок, содержащий участки от двух или более изотипов IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4). В контексте настоящего документа говорят, что Fc-участок относится к определенному изотипу IgG, если его аминокислотная последовательность является наиболее гомологичной такому изотипу относительно других изотипов IgG. Различные изотипы IgG характеризуются различными физическими и функциональными свойствами, включая период полужизни в сыворотке, связывание комплемента, аффинности связывания FcyR и активности эффекторных функций (например, ADCC, CDC и т.д.), из-за различий в аминокислотных последовательностях их шарнира и/или Fc-участков, например, как описано у Flesch и Neppert (1999) J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156; Chappel et al. (1993) J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9036-9040; или Brhggemann et al. (1987) J. Exp. Med 166:1351-1361. Такой тип вариантного Fc-участка можно использовать отдельно или в комбинации с аминокислотной модификацией для воздействия на Fc-опосредованную эффекторную функцию и/или активность связывания. В комбинации аминокислотная модификация и шарнир/Fc-участоk IgG могут проявлять сходную функциональность (например, повышенную аффинность в отношении FcyRIIA) и могут действовать аддитивно или, что более предпочтительно синергически, модифицируя эффекторную функциональность молекулы по настоящему изобретению относительно молекулы по настоящему изобретению, содержащей Fc-участок дикого типа. В соответствии с другими вариантами осуществления аминокислотная модификация и Fc-участок IgG могут проявлять противоположную функциональность (например, соответственно повышенную и пониженную аффинность в отношении FcyRIIA) и могут действовать, селективно ослабляя или уменьшая специфическую функциональность молекуле по настоящему изобретению относительно молекулы, не содержащей Fc-участок или содержащей Fc-участок дикого типа того же изотипа.

В соответствии с предпочтительным конкретным вариантом осуществления связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению содержат вариантный Fc-участок, причем указанный вариантный Fc-участок содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию относительно Fc-участка дикого типа, так чтобы указанная молекула имела измененную аффинность в отношении FcR, при условии, что указанный вариантный Fc-участок не имеет замены в положениях, которые непосредственно контактируют с FcyR, по результатам кристаллографического и структурного анализа взаимодействий Fc-FcR, таких как описанные у Sondermann et al. (2000) Nature 406:267-73. Примерами положений в Fcучастке, которые непосредственно контактируют с FcyR, являются аминокислотные остатки 234-239 (шарнирный участок), аминокислотные остатки 265-269 (петля В/С), аминокислотные остатки 297-299 (петля С7Е) и аминокислотные остатки 327-332 (петля F/G). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления молекулы по настоящему изобретению содержат вариантные Fc-участки, которые содержат модификацию по меньшей мере одного остатка, которая не создает непосредственного контакта с FcyR, по результатам кристаллографического и структурного анализа, например, не находится в сайте связывания Fc-FcyR.

Вариантные Fc-участки хорошо известны из уровня техники, и в соответствии с настоящим изобретением, можно применять любой известный вариантный Fc-участок для придания или модификации эффекторной функции, проявляемой молекулой по настоящему изобретению, содержащей Fc-участок (или его часть), согласно результатам функционального анализа, например, в NK-зависимом или макрофагзависимом анализе. Например, варианты Fc-участка, выявленные как изменяющие эффекторную функцию, раскрыты в PCT публикациях WO 04/063351, WO 06/088494, WO 07/024249, WO 06/113665, WO 07/021841, WO 07/106707 и WO 2008/140603, и в настоящих молекулах можно применять любой подходящий раскрытый в них вариант.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению содержат вариантный Fc-участок, имеющий одну или несколько аминокислотных модификаций в одном или нескольких участках, при этом модификация(ии) изменяет (относительно Fc-участка дикого типа) соотношение аффинностей вариантного Fc-участка к активирующему FcyR (такому как FcyRIIA или FcyRIIIA) относительно ингибирующего FcyR (такого как FcyRIIB):

Изменение у дикого типа к вариантному аффинности к ГсуКлктивирующий

Соотношение аффинностей= ___________________________________________________

Изменение у дикого типа к вариантному аффиности к ГсуДингибирующий

Особенно предпочтительными являются связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению, которые имеют вариантный Fc-участок (относительно Fc-участка дикого типа), при этом такой вариантный Fc-участок имеет соотношение аффинностей, превышающее 1. Такие молекулы особенно по

- 30 041483 лезны при осуществлении терапевтического или профилактического лечения заболевания, нарушения или инфекции или ослаблении их симптома, когда необходима повышенная эффективность эффекторной клеточной функции (например, ADCC), опосредованной FcyR, например, в случае злокачественной опухоли или инфекционного заболевания. Для сравнения, вариантный Fc-участок, имеющий соотношение аффинностей менее 1, опосредует пониженную эффективность эффекторной клеточной функции. В табл. 1 приведены иллюстративные одиночные, двойные, тройные, четверные и пятикратные мутации по значениям их соотношения аффинностей, которые либо превышают 1, либо нет.

- 31 041483

Таблица 1. Иллюстративные одиночные или множественные мутации, приведенные с помощью __________________соотношения аффинностей_____________

Одино чная	Двойная	Тройная	Четверная	Пятерная
Соотношение аффинностей >1
F243L D270E R292G R292P	F243L и R292P F243L и Y300L F243L и P396L D270E и P396L R292P и Y300L R292P и V305I R292P и P396L Y300L и P396L P396L и Q419H	F243L, P247L и N421K F243L, R292P и Y300L F243L, R292P и V305I F243L, R292P и P396L F243L, Y300L и P396L P247L, D270E и N421K R255L, D270E и P396L D270E, G316D и R416G D270E, К392Т и P396L D270E, P396L и Q419H V284M, R292L и K370N R292P, Y300L и P396L	L234F, F243L, R292P и Y300L L235I, F243L, R292P и Y300L L235Q, F243L, R292P и Y300L F243L, P247L, D270EhN421K F243L, R255L, D270E и P396L F243L, D270E, G316DhR416G F243L, D270E, К392Т и P396L F243L, D270E, P396LhQ419H F243L, R292P, Y300L, и P396L F243L, R292P, V305I и P396L P247L, D270E, Y300LhN421K R255L, D270E, R292GhP396L R255L, D270E, Y300LhP396L	L235V, F243L, R292P, Y300L и P396L L235P, F243L, R292P, Y300L и P396L F243L, R292P, V305I, Y300L и P396L
			D270E, G316D, P396LhR416G
Соотношение аффинностей <1
Y300L	F243L и P396L	F243L, R292P и V305I
P396L	P247L и N421K
	R255L и P396L
	R292P и V3O5I
	К392Т и P396L
	P396L и Q419H

В соответствии с конкретным вариантом осуществления, в вариантных Fc-участках любые аминокислотные модификации (например, замены) приходятся на любые из положений 235, 240, 241, 243, 244, 247, 262, 263, 269, 298, 328 или 330 и предпочтительно на один или несколько из следующих остатков: А240, I240, L241, L243, Н244, N298, I328 или V330. В соответствии с другим конкретным вариантом

- 32 041483 осуществления в вариантных Fc-участках любые аминокислотные модификации (например, замены) приходятся на любые из положений 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439 и предпочтительно на один или несколько из следующих остатков: Н280, Q280, Y280, G290, S290, Т290, Y290, N294, K295, Р296, D298, N298, Р298, V298, I300 или L300.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления в вариантных Fc-участках, которые связывают FcyR с измененной аффинностью, любые аминокислотные модификации (например, замены) приходятся на любые из положений 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439. Предпочтительно вариантный Fc-участок имеет любой из следующих остатков: А256, N268, Q272, D286, Q286, S286, А290, S290, А298, М301, A312, E320, M320, Q320, R320, E322, A326, D326, E326, N326, S326, K330, Т339, А333, А334, Е334, H334, L334, M334, Q334, V334, K335, Q335, A359, A360 или А430.

В соответствии с другим вариантом осуществления в вариантных Fc-участках, которые связывают FcyR (посредством его Fc-участка) с уменьшенной аффинностью, любые аминокислотные модификации (например, замены) приходятся на любые из положений 252, 254, 265, 268, 269, 270, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 или 439.

В соответствии с другим вариантом осуществления в вариантных Fc-участках, которые связывают FcyR (посредством его Fc-участка) с увеличенной аффинностью, любые аминокислотные модификации (например, замены) приходятся на любые из положений 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398 или 430. В соответствии с другим вариантом осуществления в вариантных Fc-участках, которые связывают FcyRIIA с увеличенной аффинностью, находятся любые из следующих остатков: А255, А256, А258, А267, А268, N268, А272, q272, А276, А280, А283, А285, А286, D286, Q286, S286, А290, S290, М301, Е320, М320, Q320, R320, Е322, А326, D326, Е326, S326, K330, А331, Q335, А337 или А430.

Предпочтительные варианты включают одну или несколько модификаций в любых положениях: 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 271, 273, 275, 281, 284, 291, 296, 297, 298, 299, 302, 304, 305, 313, 323, 325, 326, 328, 330 или 332.

Особенно предпочтительные варианты включают одну или несколько модификаций, выбранных из групп A-AI:

- 33 041483

А	228Е, 228К, 228Y или 228G;
В	230А, 23 0Е, 23 0Y или 23 0G;
С	231Е, 231К, 231Y, 231Р или 231G;
D	232Е, 232К, 232Y, 232G;
Е	233D;
F	2341 или 234F;
G	235D, 235Q, 23 5Р, 2351 или 235V;
Н	239D, 239Е, 239N или 239Q;
I	240А, 2401, 240М или 240Т;
J	243R, 243, 243Y, 243L, 243Q, 243W, 243Н или 2431;
К	244Н;
L	245А;
М	247G, 247V или 247L;
N	262А, 262Е, 2621, 262Т, 262Е или 262F;
О	263А, 2631, 263М или 263Т;
Р	264F, 264Е, 264R, 2641, 264А, 264Т или 264W;
Q	265F, 265Y, 265Н, 2651, 265L, 265Т, 265V, 265N или 265Q;
R	266А, 2661, 266М или 266Т;
S	271D, 271Е, 271N, 271Q, 271К, 271R, 271S, 271Т, 271Н, 271А, 271V, 271L, 2711, 271F, 271М, 271Y, 271W или 271G;
т	2731;
и	275L или 275W;
V	281D, 281К, 281Y или 281Р;
W	284Е, 284N, 284Т, 284L, 284Y или284М;
X	291D, 291Е, 291Q, 29IT, 291Н, 2911 или 291G;
Y	299А, 299D, 299Е, 299F, 299G, 299Н, 2991, 299К, 299L, 299М, 299N, 299Р, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W или 299Y;
Z	3021;
АА	304D, 304N, 304Т, 304Н или 304L
АВ	3051;
АС	313F;
AD	3231;
АЕ	325А, 325D, 325Е, 325G, 325Н, 3251, 325L, 325К, 325R, 325S, 325F, 325М, 325Т, 325V, 325Y, 325W или 325Р;
AF	328D, 328Q, 328К, 328R, 328S, 328Т, 328V, 3281, 328Y, 328W, 328Р, 328G, 328А, 328Е, 328F, 328Н, 328М или 328N;
AG	330L, 330Y, 3301 или 330V;
АН	332А, 332D, 332Е, 332Н, 332N, 332Q, 332Т, 332К, 332R, 332S, 332V, 332L, 332F, 332М, 332W, 332Р, 332G или 332Y; и
AI	336Е, 336К или 336Y

Еще более особенные варианты включают одну или несколько модификаций, выбранных из групп 1-105:

- 34 041483

Группа	Вариант	Группа	Вариант
1	A330L/I332E	54	S239D / D265L / N297D / I332E
2	D265F/N297E/I332E	55	S239D / D265T / N297D / I332E
3	D265Y/N297D/I332E	56	S239D / D265V / N297D / I332E
4	D265Y / N297D / T299L / I332E	57	S239D / D265Y / N297D / I332E
5	F241E / F243Q / V262T / V264F	58	S239D /133 2D
6	F241E / F243Q / V262T / V264E / I332E	59	S239D / I332E
7	F241E / F243R / V262E / V264R	60	S239D/I332E/A330I
8	F241E / F243R / V262E / V264R / I332E	61	S239D / I332N
9	F241E / F243Y / V262T / V264R	62	S239D / I332Q
10	F241E / F243Y / V262T / V264R / I332E	63	S239D/N297D/I332E
И	F241L / F243L / V262I / V264I	64	S239D / N297D / I332E / A330Y
12	F241L/V262I	65	S239D / N297D / I332E / A330Y / F241S / F243H / V262T / V264T
13	F241R / F243Q / V262T / V264R	66	S239D / N297D / I332E / К326Е
14	F241R / F243Q / V262T / V264R / I332E	67	S239D /N297D / I332E / L235D
15	F241W / F243W / V262A / V264A	68	S239D/S298A/I332E

- 35 041483

16	F241Y / F243Y / V262T / V264T	69	S239D / V264I / A330L / I332E
17	F241Y / F243Y / V262T / V264T /N297D/I332E	70	S239D / V264I / I332E
18	F243L / V262I / V264W	71	S239D / V264I / S298A / I332E
19	P243L / V264I	72	S239E/D265N
20	L328D / I332E	73	S239E/D265Q
21	L328E/I332E	74	S239E/I332D
22	L328H/I332E	75	S239E/I332E
23	L328I/I332E	76	S239E/I332N
24	L328M/I332E	77	S239E/I332Q
25	L328N/I332E	78	S239E/N297D/I332E
26	L328Q / I332E	79	S239E / V264I / A330Y / 1332 Е
27	L328T / I332E	80	S239E / V264I / 1332 Е
28	L328V/I332E	81	S239E / V264I / S298A / A330Y / I332E
29	N297D/A330Y/I332E	82	S239N/A330L/I332E
30	N297D / I332E	83	S239N/A330Y/I332E
31	N297D / I332E / S239D / A330L	84	S239N/I332D
32	N297D / S298A / A330Y / I 332Е	85	S239N/I332E
33	N297D/T299L/I332E	86	S239N/I332N
34	N297D / T299F / I332E / N297D / T299H/I332E	87	S239N/I332Q
35	N297D / T299I / I332E	88	S239N1S298A / I332E
36	N297D/T299L/I332E	89	S239Q/I332D
37	N297D/T299V/I332E	90	S239Q/I332E
38	N297E/I332E	91	S239Q/I332N
39	N297S / I332E	92	S239Q/I332Q
40	P230A/E233D/I332E	93	S239Q / V264I / I332E
41	Р244Н/Р245A /P247V	94	S298A/I332E
42	S239D/A330L/I332E	95	V264E/N297D/I332E
43	S239D/A330Y/I332E	96	V264I / A330L / I332E
44	S239D / A33OY / I332E / К326Е	97	V264I / A330Y / I332E
45	S239D / A33OY / I332E / К326Т	98	V264I/I332E
46	S239D / A330Y / I332E / L234I	99	V264I / S298A / I332E
47	S239D / A330Y / I332E / L235D	100	Y296D/N297D/I332E
48	S239D / A330Y / I332E / V240I	101	Y296E/N297D/I332E
49	S239D / A330Y / I332E / V264T	102	Y296H/N297D/I332E
50	S239D / A330Y / I332E / V266I	103	Y296N/N297D/I332E
51	S239D / D265F / N297D / I332E	104	Y296Q/N297I/I332E
52	S239D / D265H / N297D / I332E	105	Y296T/N297D/I332E
53	S239D / D265I / N297D / I332E

В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая LAG-3 молекула по настоящему изобретению будет содержать вариантный Fc-участок, имеющий по меньшей мере одну модификацию в

Fc-участке. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, вариантный Fc-участок содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L, причем указанная нумерация соответствует EU системе нумерации по Kabat.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления, вариантный Fc-участок содержит:

(A) по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L;

(B) по меньшей мере две замены, выбранные из группы, состоящей из:

(1) F243L и P396L;

(2) F243L и R292P; и (3) R292P и V305I;

(C) по меньшей мере три замены, выбранные из группы, состоящей из:

- 36 041483 (1) F243L, R292P и Y300L;

(2) F243L, R292P и V305I;

(3) F243L, R292P и P396L; и (4) R292P, V305I и P396L;

(D) по меньшей мере четыре замены, выбранные из группы, состоящей из:

(1) F243L, R292P, Y300L и P396L; и (2) F243L, R292P, V305I и P396L или (E) по меньшей мере пять замен, выбранных из группы, состоящей из:

(1) F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L; и (2) L235V, F243L, R292P, Y300L и P396L.

В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления вариантный Fc-участок содержит замены из:

(A) F243L, R292P и Y300L;

(b) L235V, F243L, R292P, Y300L и P396L; или (C) F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L.

В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая LAG-3 молекула по настоящему изобретению содержит вариантный Fc-участок, который характеризуется пониженным (или практически отсутствующим) связыванием с FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) или FcyRIIIB (CD16b) (относительно связывания, которым характеризуется Fc-участок IgG1 дикого типа (SEQ ID NO: 1)). В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая LAG-3 молекула по настоящему изобретению будет содержать вариантный Fc-участок, который характеризуется уменьшенным (или практически отсутствующим) связыванием с FcyR (например, FcyRIIIA) и уменьшенной (или практически отсутствующей) ADCC-эффекторной функцией. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, вариантный Fc-участок содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из L234A, L235A, D265A, N297Q и N297G. В соответствии с конкретным вариантом осуществления вариантный Fc-участок содержит замену из L234A, L235A, L234A и L235A, D265A, N297Q или N297G.

В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая LAG-3 молекула по настоящему изобретению содержит Fc-участок, который изначально характеризуется пониженным (или практически отсутствующим) связыванием с FcyRIIIA (CD16а) и/или уменьшенной эффекторной функцией (относительно связывания, которым характеризуется Fc-участок IgG1 дикого типа (SEQ ID NO: 1)). В соответствии с конкретным вариантом осуществления связывающая LAG-3 молекула по настоящему изобретению содержит Fc-участок IgG2 (SEQ ID NO: 2) или Fc-участок IgG4 (SEQ ID NO: 4). При использовании Fcучастка IgG4 настоящее изобретение также относится к внесению стабилизирующей мутации, такой как замена S228P в шарнирном участке IgG4 (см., например, ^SE$^{ID NO:117:} eskygppcppcp, (Lu et al. (2008) The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultmcentrifugation, J. Pharmaceutical Sciences 97:960-969) для уменьшения случаев обмена цепями. В Fc-участок IgG4 могут быть введены и другие стабилизирующие мутации, известные из уровня техник (Peters, P et al. (2012) Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability, J. Biol. Chem., 287:24525-24533; патентная PCT публикация WO 2008/145142).

В соответствии с другими вариантами осуществления настоящее изобретение относится к применению любого известного из уровня техники варианта Fc, такого как раскрытые в работе Jefferis, B.J. et al. (2002) Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models, Immunol. Lett. 82:57-65; Presta, L.G. et al. (2002) Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function, Biochem. Soc. Trans. 30:48790; Idusogie, E.E. et al. (2001) Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement, J. Immunol. 166:2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R, J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2000) Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc, J. Immunol. 164:4178-84; Reddy, M.P. et al. (2000) Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4, J. Immunol. 164:1925-1933; Xu, D. et al. (2000) In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies, Cell. Immunol. 200:16-26; Armour, K.L. et al. (1999) Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities, Eur. J. Immunol. 29:2613-24; Jefferis, R. et al. (1996) Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions, Immunol. Lett. 54:101-04; Lund, J. et al. (1996) Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains, J. Immunol. 157:4963-4969; Hutchins et al. (1995) Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:1198084; Jefferis, R. et al. (1995) Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation, Immunol. Lett. 44:111-17; Lund J. et al. (1995) Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modu

- 37 041483 late Recognition By Fc Gamma Receptors, FASEB J. 9:115-19; Alegre, M.L. et al. (1994) A Non-Activating Humanized, Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo Transplantation 57:1537-1543; Lund et al. (1992) Multiple Binding Sites On The Ch2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma R11, Mol. Immunol. 29:53-59; Lund et al. (1991) Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG, J. Immunol. 147:2657-2662; Duncan, A.R. et al. (1988) Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG, Nature 332:563-564; патенты США №№ 5624821, 5885573, 6194551, 7276586 и 7317091; и PCT публикации WO 00/42072 и WO 99/58572.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления молекулы по настоящему изобретению дополнительно содержат один или несколько сайтов гликозилирования, так чтобы один или несколько углеводных фрагментов были ковалентно присоединены к молекуле. Предпочтительно молекулы по настоящему изобретению с одним или несколькими сайтами гликозилирования и/или одной или несколькими модификациями в Fc-участке придают или имеют повышенную антителоопосредованную эффекторную функцию, например, повышенную ADCC-активность по сравнению с немодифицированным антителом. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящее изобретение дополнительно относится к молекулам, содержащим одну или несколько модификаций аминокислот, которые известны как непосредственно или опосредовано взаимодействующие с углеводным фрагментом Fcучастка, включая без ограничения аминокислоты в положениях 241, 243, 244, 245, 245, 249, 256, 258, 260, 262, 264, 265, 296, 299 или 301. Аминокислоты, которые непосредственно или опосредовано взаимодействуют с углеводным фрагментом Fc-участка, известны из уровня техники, см., например, Jefferis et al., 1995 Immunology Letters, 44: 111-7, которая включена в настоящий документ посредством ссылки в полном ее объеме.

В соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к молекулам, которые были модифицированы внесением одного или нескольких сайтов гликозилирования в один или несколько сайтов молекул, предпочтительно без изменения функциональности молекул, например, активности связывания с целевым антигеном или FcyR. Сайты гликозилирования могут быть внесены в вариабельный и/или константный участок молекул по настоящему изобретению. Применяемые в контексте настоящего документа сайты гликозилирования включают любую специфическую аминокислотную последовательность в антителе, к которой будет специфически или ковалентно присоединен олигосахарид (т. е. углеводы, содержащие два или более соединенных вместе простых Сахаров). Боковые олигосахаридные цепи обычно связаны с остовом антитела посредством либо N-, либо O-связей. Nсвязанное гликозилирование относится к присоединению олигосахаридного фрагмента к боковой цепи аспарагинового остатка.

О-связанное гликозилирование относится к присоединению олигсахаридного фрагмента к гидроксиаминокислоте, например, серину, треонину. Молекулы по настоящему изобретению могут содержать один или несколько сайтов гликозилирования, включая сайты N-связанного и O-связанного гликозилирования. В соответствии с настоящим изобретением, можно применять любой известный из уровня техники сайт гликозилирования для N-связанного или O-связанного гликозилирования. Иллюстративным сайтом N-связанного гликозилирования, который является пригодным в соответствии со способами по настоящему изобретению, является аминокислотная последовательность: Asn-X-Thr/Ser, где X может быть любой аминокислотой, a Thr/Ser обозначает треонин или серин. Такой сайт или сайты можно внести в молекулу по настоящему изобретению с помощью способов, хорошо известных в области техники, к которой относится настоящее изобретение (см., например, In VITRO MUTAGENESIS, Recombinant DNA: A Short COURSE, J. D. Watson, et al., W.H. Freeman and Company, New York, 1983, chapter 8, pp. 106-116, которая включена в настоящий документ посредством ссылки в полном ее объеме. Иллюстративный способ внесения сайта гликозилирования в молекулу по настоящему изобретению может предусматривать модификацию или мутацию аминокислотной последовательности молекулы так, чтобы получить необходимую последовательность Asn-X-Thr/Ser.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, настоящее изобретение относится к способам модификации углеводного содержимого молекулы по настоящему изобретению путем добавления или удаления сайта гликозилирования. Способы модификации углеводного содержимого антител (и молекул, содержащих домены антитела, например, Fc-участок) хорошо известны из уровня техники и охватываются настоящим изобретением, см., например, патент США № 6218149, EP 0359096 В1; публикацию US 2002/0028486, WO 03/035835; публикацию США № 2003/0115614; патент США № 6218149; патент США № 6472511; все из которых включены в настоящий документ в полном их объеме. В соответствии с другими вариантами осуществления, настоящее изобретение относится к способам модификации углеводного содержимого молекулы по настоящему изобретению путем удаления одного или нескольких эндогенных углеводных фрагментов молекулы. В соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к сдвигу сайта гликозилирования Fc-участка антитела путем модификации положений, прилегающих к 297. В соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к модификации положения 296 так, чтобы гликозилировалось положение 296, а не положение 297.

- 38 041483

Эффекторную функцию также можно модифицировать с помощью таких методик, как введение одного или нескольких цистеиновых остатков в Fc-участок, тем самым обеспечивая возможность образования межцепочечной дисульфидной связи в этом участке, в результате чего образуется гомодимерное антитело, которое может характеризоваться улучшенной способностью к интернализации и/или повышенным комплементзависимым цитолизом клеток и ADCC (Caron, Р.С. et al. (1992) Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies, J. Exp. Med. 176:1191-1195; Shopes, B. (1992) A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity, J. Immunol. 148(9):2918-2922. Гомодимерные антитела с повышенной противоопухолевой активностью также можно получить с помощью гетеробифункциональных сшивающих линкеров, как описано в работе Wolff, E.A. et al. (1993) Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice, Cancer Research 53:25602565. Альтернативно, может быть сконструировано антитело, которое имеет двойные Fc-участки и, таким образом, может иметь повышенные комплементзависимые литические и ADCC-характеристики (Stevenson, G.T. et al. (1989) A Chimeric Antibody With Dual Fc Regions (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230).

Период полужизни в сыворотке молекул по настоящему изобретению, содержащих Fc-участки, может быть увеличен путем увеличения аффинности связывания Fc-участка с FcRn. Применяемый в контексте настоящего документа термин период полужизни означает фармакокинетическое свойство молекулы, которое представляет собой меру среднего времени жизни молекул после их введения. Период полужизни может быть выражен как время, необходимое для устранения пятидесяти процентов (50%) известного количества молекулы из организма субъекта (например, пациента-человека или другого млекопитающего) или его конкретной части, например, которое измерено в сыворотке, т. е. период полужизни в кровотоке, или в других тканях. Как правило, увеличение периода полужизни приводит в результате к увеличению среднего времени удержания (MRT) в кровотоке для вводимой молекулы.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению содержат вариантный Fc-участок, который содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию относительно Fc-участка дикого типа и которые характеризуются увеличенным периодом полужизни (относительно Fc-участка дикого типа).

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению содержат вариантный Fc-участок, который содержит увеличивающую периодом полужизни аминокислотную замену по одному или нескольким положениям, выбранным из группы, состоящей из 238, 250, 252, 254, 256, 257, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428, 433, 434, 435 и 436, которые пронумерованы согласно EU системе нумерации по Kabat. Многочисленные конкретные мутации, способные увеличивать период полужизни содержащей Fc-участок молекулы, известны из уровня техники и включают, например, M252Y, S254T, Т256Е и их комбинации. Например, см. мутации, описанные в патентах США №№ 6277375, 7083784, 7217797, 8088376, публикациях США №№ 2002/0147311, 2007/0148164 и международных публикациях WO 98/23289, WO 2009/058492 и WO 2010/033279, которые включены в настоящий документ посредством ссылки в полном их объеме. Содержащие Fc-участок молекулы с увеличенным периодом полужизни также включают молекулы с заменами по двум или более остаткам Fc-участка 250, 252, 254, 256, 257, 288, 307, 308, 309, 311, 378, 428, 433, 434, 435 и 436. В частности, две или более замен выбраны из: T250Q, M252Y, S254T, Т256Е, K288D, T307Q, V308P, A378V, M428L, N434A, Н435К и Y436I.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления, вариантный Fc-участок содержит замены из:

(A) 252Y, 254Т и 256Е;

(b) M252Y и S254T;

(C) M252Y и Т256Е;

(D) 250Q и 428L;

(E) T307Q и N434A;

(F) A378V и N434A;

(G) N434A и Y436I;

(Н) V3O8P и N434A; или (I) K288D и Н435К.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантным Fc-участкам, содержащим:

(A) одну или несколько мутаций, которые изменяют эффекторную функцию и/или FcyR; и (B) одну или несколько мутаций, которые продлевают период полужизни в сыворотке.

VI. Биспецифические связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к биспецифическим связывающим молекулам, которые способны связываться с первым эпитопом и вторым эпитопом, причем первый эпитоп представляет собой эпитоп LAG-3 человека, а второй эпитоп представляет собой такой же или отличный эпитоп LAG-3 или представляет собой эпитоп другой молекулы, которая присутствует на поверхности иммунной клетки (такой как Т-лимфоцит) и участвует в регуляции иммунной контрольной точки. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления второй эпитоп предпочтительно не представляет собой эпитоп LAG-3. В соответствии с одним вариантом осуществления второй эпитоп

- 39 041483 представляет собой эпитоп В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD3, CD8, CD16, CD27, CD32, CD40, CD40L, CD47, CD64, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, CTLA-4, галектина-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, KIR, LAG-3, LIGHT, МНС I или II класса, NKG2a, NKG2d, OX40, OX40L, PD1H, PD-1, PD-L1, PD-L2, PVR, SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 или VISTA. В соответствии с конкретным вариантом осуществления второй эпитоп представляет собой CD137, PD-1, OX40, TIGIT или TIM-3. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления такие биспецифические молекулы содержат более двух эпитоп-связывающих сайтов. Такие биспецифические молекулы могут, например, связывать два или более различных эпитопов LAG-3 и по меньшей мере один эпитоп молекулы, которая не является LAG-3.

Настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам, способным одновременно связываться с LAG-3 и вторым эпитопом (например, В7-НЗ, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA4, ICOS, KIR, МНС I или II класса, ОХ40, PD-1, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления биспецифическое антитело, способное одновременно связываться с PD-1 и вторым эпитопом, получают с помощью любого из способов, описанных в PCT публикациях WO 1998/002463, WO 2005/070966, WO 2006/107786 WO 2007/024715, WO 2007/075270, WO 2006/107617, WO 2007/046893, WO 2007/146968, WO 2008/003103, WO 2008/003116, WO 2008/027236, WO 2008/024188, WO 2009/132876, WO 2009/018386, WO 2010/028797, WO2010028796, WO 2010/028795, WO 2010/108127, WO 2010/136172, WO 2011/086091, WO 2011/133886, WO 2012/009544, WO 2013/003652, WO 2013/070565, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2013/174873 и WO 2014/022540, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном ее объеме.

1. Биспецифические диатела, не имеющие Fc-участков

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к биспецифическим одновалентным диателам, которые содержат первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, и наиболее предпочтительно состоят из них, последовательности которых позволяют полипептидным цепям ковалентно связываться друг с другом с образованием ковалентно связанного диатела, которое способно одновременно связываться с первым эпитопом (эпитопом 1) и вторым эпитопом (эпитопом 2), причем такие эпитопы не идентичны друг другу. Таким образом, такие биспецифические диатела содержат домены VL1/VH1, которые способны связываться с первым эпитопом (VL_{эnuтоn 1}/VH_эпитоп 1), и домены VL2/VH2, которые способны связываться со вторым эпитопом (VL_{эnuтоn 2}/VHJ_{пиmоп 2}). Обозначения VL1 и VH1 обозначают соответственно вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, которые связывают первый эпитоп такого биспецифического диатела. Аналогичным образом, обозначения VL2 и VH2 обозначают соответственно вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, которые связывают второй эпитоп такого биспецифического диатела. В соответствии с одним вариантом осуществления, эпитоп 1 таких молекул диатела является эпитопом LAG-3, а эпитоп 2 таких молекул диатела не является эпитопом LAG-3 (например, он представляет собой эпитоп из В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, MHCI или II класса, ОХ40, PD-1, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). Домен VL первой полипептидной цепи таких связующих LAG-2 диател взаимодействует с доменом VH второй полипептидной цепи с образованием первого функционального эпитопсвязывающего сайта, который специфичен к первому антигену (т.е. либо LAG-3, либо антигену, который содержит второй эпитоп). Аналогичным образом, домен VL второй полипептидной цепи взаимодействует с доменом VH первой полипептидной цепи с образованием второго функционального эпитопсвязывающего сайта, который специфичен ко второму антигену (т.е. либо антигену, который содержит второй эпитоп, либо LAG-3). Таким образом, выбор доменов VL и VH первой и второй полипептидных цепей скоординирован таким образом, чтобы две полипептидные цепи диатела в совокупности содержали домены VL и VH, способные связываться как с эпитопом LAG-3, так и со вторым эпитопом (т. е. они в совокупности содержат домены VL_lag.₃/VH_lag.₃ и УЬ_эпитоп 2/VH_{эпитоп 2}). He имеет значения, обозначена ли конкретная пара связывающих доменов (т.е. VL_{эпиmоп 1}/VH_эпитоп 1 или VL_эпитоп 2^_{Нэпитоп 2}), эпитоп антигена с эпитопом 1 или эпитоп антигена с эпитопом 2), как первый относительно второго эпитоп диатела; такие обозначения имеют отношение только к наличию и ориентации доменов полипептидных цепей связывающих молекул по настоящему изобретению.

Первая полипептидная цепь по варианту осуществления таких биспецифических одновалентных диател содержит, в направлении от N-конца до С-конца, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться либо с первым эпитопом, либо с доменом VL моноклонального антитела, способного связываться со вторым эпитопом (т.е. либо VL_lag.₃, либо VL_{эnитоn 2}), первый промежуточный спейсерный пептид (линкер 1), домен VH моноклонального антитела, способного связываться либо со вторым эпитопом (если такая первая полипептидная цепь содержит VL_lag.₃), либо с доменом VH моноклонального антитела, способного связываться с первым эпитопом (если такая первая полипептидная цепь содержит VL_{эnитоn 2}), второй промежуточный спейсерный пептид (линкер 2), необязательно содержащий цистеиновый остаток способствующего образованию гетеродимера домена, и С-конец (фиг. 1).

Вторая полипептидная цепь по варианту осуществления биспецифических одновалентных диател содержит в направлении от N-конца до С-конца N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 или доменом VL моноклонального антитела, способного связываться со вторым эпитопом (т. е. либо VL_lag.₃, либо VL_{эnитоn 2}, и являющийся доменом VL, который не выбран для

- 40 041483 включения в первую полипептидную цепь антитела), промежуточный линкерный пептид (линкер 1), домен VH моноклонального антитела, способного связываться либо со вторым эпитопом (если такая вторая полипептидная цепь содержит VLLAG-3), либо с доменом VH моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (если такая вторая полипептидная цепь содержит VL_эпuтоп 2), второй промежуточный спейсерный пептид (линкер 2), необязательно содержащий цистеиновый остаток способствующего образованию гетеродимера домена, и С-конец (фиг. 1).

Наиболее предпочтительно, длину промежуточного линкерного пептида (например, линкера 1), который разделяет такие домены VL и VH) выбирают такую, чтобы практически или полностью предупредить связывание доменов VL и VH полипептидной цепи друг с другом. Таким образом, домены VL и VH первой полипептидной цепи практически или полностью не способны связываться друг с другом. Аналогично, домены VL и VH второй полипептидной цепи практически или полностью не способны связываться друг с другом. Предпочтительный промежуточный спейсерный пептид (линкер 1) имеет последовательность (^SEQ ^ID NO:88): GGGSGGGG.

Длину и состав второго промежуточного линкерного пептида (линкер 2) выбирают на основе выбора способствующих образованию гетеродимера доменов. Обычно второй промежуточный линкерный пептид (линкер 2) будет содержать 3-20 аминокислотных остатков. Так, в частности, если способствующие образованию гетеродимера домены не содержат цистеиновый остаток, то используют цистеинсодержащий второй промежуточный линкерный пептид (линкер 2). Цистеинсодержащий второй промежуточный спейсерный пептид (линкер 2) будет содержать 1, 2, 3 или более 3 цистеиновых остатков. Предпочтительный цистеинсодержащий спейсерный пептид (линкер 2) имеет последовательность (SEQ ID NO:89): GGCGGG

Альтернативно, линкер 2 не содержит цистеин (например,

GGG, GGGS (SEQ ID NO:90),

LGGGSG (SEQ ID NO:91), GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:92), ASTKG (SEQ ID NO:93), LEPKSS (SEQ ID NO:94), APSSS (SEQ ID NO:95) и т.д.), и тогда, как описано ниже, применяют цистеинсодержащий, способствующий образованию гетеродимера домен. Необязательно, применяют как цистеинсодержащий линкер 2, так и цистеинсодержащий способствующий образованию гетеродимера домен.

Способствующие образованию гетеродимера домены могут представлять собой GVEPKSC (SEQ ID NO:96), или VEPKSC (SEQ ID NO:97), или AEPKSC (SEQ ID_NO:98) на одной полипептидной цепи и GFNRGEC (SEQ ID NO:99) или FNRGEC (SEQ IDNO:100) на другой полипептидной цепи (US 2007/0004909).

Более предпочтительно тем не менее способствующие образованию гетеродимера домены таких диател образуются из одного, двух, трех или четырех тандемно повторяемых спиральных доменов с противоположным зарядом, которые содержат последовательность по меньшей мере из шести, по меньшей мере из семи или по меньшей мере из восьми аминокислотных остатков, так чтобы способствующий образованию гетеродимера домен обладал полным зарядом (Apostolovic, В. et al. (2008) pH-Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil, Biomacromolecules 9:3173-3180; Arndt K.M. et al. (2001) Helixstabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain, J. Molec. Biol. 312:221-228; Arndt K.M. et al. (2002) Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils, Structure 10:1235-1248; Boucher, С. et al. (2010) Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions, Analytical Biochemistry 399:138-140; Cachia, P. J. et al. (2004) Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy, J. Mol. Recognit. 17:540-557; De Crescenzo, G.D. et al. (2003) Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding, Biochemistry 42:1754-1763; Fernandez-Rodriquez, J. et al. (2012) Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled-Coil Tag, Protein Science 21:511-519; Ghosh, T.S. et al. (2009) End-To-End And End-To-Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures, Acta Crystallographica D65:1032-1041; Grigoryan, G. et al. (2008) Structural Specificity In Coiled-Coil Interactions, Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477-483; Litowski, J.R. et al. (2002) Designing Heterodimeric Two-Stranded α-Helical Coiled-Coils: The Effects Of Hydrophobicity And α-Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity, J. Biol. Chem. 277:37272-37279; Steinkruger, J.D. et al. (2012) The d'-d-d' Vertical Triad is Less Discriminating Than the a'-a-a' Vertical Triad in the Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif’, J. Amer. Chem. Soc. 134(5):2626-2633; Straussman, R. et al. (2007) Kinking the Coiled Coil - Negatively Charged Residues at the Coiled-coil Interface, J. Molec. Biol. 366:12321242; Tripet, B. et al. (2002) Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin С and the C-terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance, J. Molec. Biol. 323:345-362; Woolfson, D.N. (2005) The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies, Adv. Prot. Chem. 70:79-112; Zeng, Y. et al. (2008) A Ligand-Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism, J. Gene Med. 10:355-367).

- 41 041483

Такие повторяющиеся спиральные домены могут быть точными повторами или могут иметь замены. Например, спиральный домен способствующего образованию гетеродимера домена первой полипептидной цепи может содержать последовательность из восьми аминокислотных остатков, выбранных для придания отрицательного заряда такому способствующему образованию гетеродимера домену, а спиральный домен способствующего образованию гетеродимера домена второй полипептидной цепи может содержать последовательность из восьми аминокислотных остатков, выбранных для придания положительного заряда такому способствующему образованию гетеродимера домену. Не имеет значения, какая спираль предусмотрена для первой или второй полипептидных цепей при условии, что, если в обеих полипептидных цепях представлены такие способствующие образованию гетеродимеров домены, то для другой полипептидной цепи используется спираль с противоположным зарядом. Положительно заряженная аминокислота может представлять собой лизин, аргинин, гистидин и т.д., и/или отрицательно заряженная аминокислота может представлять собой глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту и т.д. Положительно заряженная аминокислота предпочтительно представляет собой лизин, и/или отрицательно заряженная аминокислота предпочтительно представляет собой глутаминовую кислоту. Можно использовать только один способствующий образованию гетеродимера домен (поскольку такой домен будет ингибировать гомодимеризацию и тем самым способствовать гетеродимеризации), тем не менее, предпочтительно, чтобы способствующие образованию гетеродимера домены содержали как первая, так и вторая полипептидные цепи диател по настоящему изобретению.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, один из способствующих образованию гетеродимера доменов будет содержат четыре тандемных спиральных домена с E-спиралями (SEQ ID NO: 101: evaalek-evaalek-ev7\alek-evaalek), глутаматные остатки которых образуют будут формировать отрицательный заряд при pH 7, в то время как другой из способствующих образованию гетеродимера доменов будет содержать четыре тандемных спиральных домена с K-спиралями (SEQ ID NO: 102: kvaalke-kvaalke-kvaalke-kvaalke), лизиновые остатки которых будут образовывать положительный заряд при pH 7. Наличие таких заряженных доменов способствует ассоциации между первым и вторым полипептидами и, следовательно, способствует образованию гетеродимера. Особенно предпочтительным является способствующий образованию гетеродимера домен, в котором один из четырех тандемных спиральных доменов с Е-спиралью с SEQ ID NO: 101 был модифицирован с включением цистеинового остатка: (SEQ ID NO: 103).

Аналогично, особенно предпочтительным является способствующий образованию гетеродимера домен, в котором один из четырех тандемных спиральных доменов с K-спиралью с SEQ ID NO: 102 был модифицирован с включением цистеинового остатка: ^^cke-kvaalke-kvaalke-kvaalke (SEQ id NO:104).

В WO 2012/018687 раскрыто, что для улучшения фармакокинетических свойств in vivo диател диатело можно модифицировать с включением полипептидной части связывающегося в сыворотке белка на одном или нескольких концах диатела. Наиболее предпочтительно такая полипептидная часть связывающегося в сыворотке белка будет встроена в С-конец диатела. Альбумин является самым распространенным белком в плазме и имеет период полужизни у людей, составляющий 19 дней. Альбумин имеет несколько сайтов связывания малых молекул, которые позволяют ему нековалентно связываться с другими белками и тем самым продлевать их период полужизни в сыворотке. Альбуминсвязывающий домен 3 (ABD3) белка G из штамма G148 Streptococcus состоит из 46 аминокислотных остатков, образующих стабильный трехспиральный пучок, и имеет широкую альбуминсвязывающую специфичность (Johansson, M.U. et al. (2002) Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules, J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120. Таким образом, особо предпочтительная полипептидная часть связывающегося в сыворотке белка для улучшения фармакокинетических свойств in vivo диатела представляет собой альбуминсвязывающий домен (ABD) из стрептококкового белка G и более предпочтительно альбуминсвязывающий домен 3 (ABD3) белка G из штамма G148 Streptococcus (SEQ ID NO: 105): LAEAKVLANR eldkygvsdy yknlidnaks aegvkalide ilaalp.

Как раскрыто в WO 2012/162068 (включенной в настоящий документ посредством ссылки), деиммунизированные варианты SEQ ID NO: 105 обладают способностью ослаблять или исключать связывание с МНС II класса. Исходя из результатов комбинационной мутации, следующие комбинации замен считают предпочтительными заменами для образования такого деиммунизированного ABD: 66D/70S +71А; 66S/70S +71А; 66S/70S +79А; 64А/65А/71А; 64A/65A/71A+66S; 64A/65A/71A+66D; 64А/65А/71А+66Е; 64A/65A/79A+66S; 64A/65A/79A+66D; 64А/65А/79А+66Е. Вариантные ABD, имеющие модификации L64A, I65A и D79A или модификации N66S, T70S и D79A. Вариантный деиммунизированный ABD, имеющий аминокислотную последовательность:

LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLID66NAKS70 A71EGVKALIDE ILAALP (SEQ

ID NO: 106), или аминокислотную последовательность:

LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA₆₄A₆5NNAKT VEGVKALIA79E ILAALP (SEQ

ID NO: 107), или аминокислотную последовательность:

- 42 041483

LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLISeeNAKSvo VEGVKALIA79E ILAALP (SEQ

ID NO: 108), особенно предпочтительны, поскольку такие деиммунизированные ABD характеризуются связыванием практически равным дикому типу, при этом обеспечивая ослабленное связывание с МНС II класса. Таким образом, первая полипептидная цепь такого диатела, имеющего ABD, содержит третий линкер (линкер 3), предпочтительно расположенный на С-конце относительно домена с Е-спиралью (или Kспиралью) такой полипептидной цепи с тем, чтобы находиться между доменом с Е-спиралью (или Kспиралью) и ABD (который предпочтительно является деиммунизированным ABD). Предпочтительной последовательностью для такого линкера 3 является SEQ ID NO:90: GGGS.

2. Биспецифические содержащие Fc-участок диатела

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к биспецифическим диателам, содержащим Fc-участок, способный одновременно связываться с LAG-3 и вторым эпитопом (например, В7-НЗ, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, МНС I или II класса, ОХ40, PD-1, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). Добавление домена СН2-СН3 IgG в одну или обе из полипептидных цепей диатела, так чтобы образование комплекса между цепями диатела приводило в результате к образованию Fc-участка, увеличивает биологический период полужизни и/или изменяет валентность диатела. Включение домена СН2-СН3 IgG в оба полипептида диатела будет обеспечивать образование двухцепочечного биспецифического диатела, содержащего Fc-участок (фиг. 2).

Альтернативно, включение домена СН2-СН3 IgG только в один полипептид диатела обеспечивать образование более сложного четырехцепочечного биспецифического диатела, содержащего Fc-участок (фиг. 3А-3С). На фиг. 3С показано типичное четырехцепочечное диатело, имеющее константный домен легкой цепи (CL) и константный домен тяжелой цепи СН1, тем не менее, в качестве альтернативы можно использовать фрагменты таких доменов, а также другие полипептиды (см., например, фиг. ЗА и 3В, патентные публикации США №№ 2013-0295121, 2010-0174053 и 2009-0060910; публикации европейских патентов EP 2714079, EP 2601216, EP 2376109, EP 2158221 и PCT публикации WO 2012/162068, WO 2012/018687, WO 2010/080538). Таким образом, например, вместо домена СН1 можно использовать пептид с аминокислотной последовательностью GVEPKSC (SEQ ID NO:96) VEPKSC (SEQ ID NO:97) или VEPKSC (SEQ ID NO:98), полученный из шарнирного домена IgG человека, а вместо домена CL можно использовать 6 С-концевых аминокислот легкой каппа-цепи человека, GFNRGEC (SEQ ID NO:99) или FNRGEC (SEQ ID NO: 100).

Типичное четырехцепочечное диатело, содержащее пептид, показано на фиг. 3А. В качестве альтернативы или в дополнение, можно использовать пептид, содержащий тандемные спиральные домены с противоположным зарядом, такие как спиральные домены с Е-спиралью (SEQ ID NO: 101: ЕVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK или SEQ ID

NO: 103: EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK);

и домены с K-спиралью

ID NO:102: KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE или SEQ ID NO:104: KVAACKE(SEQ KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE).

Типичное четырехцепочечное диатело, содержащее домен, который содержит спираль, показан на фиг. 3В.

Содержащие Fc-участок молекулы диател по настоящему изобретению обычно включают дополнительный промежуточные линкерные пептиды (линкеры). Как правило, дополнительные линкеры будут содержать 3-20 аминокислотных остатков. Дополнительные или альтернативные линкеры, которые можно использовать в содержащих Fc-участок молекулах диател по настоящему изобретению, включают

GGGS (SEQ ID NO:90), LGGGSG (SEQ ID NO:91), GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:92), ASTKG (SEQ ID NO:93), DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:109), LEPKSS (SEQ ID NO:94), APSSS (SEQ ID NO:95) и APSSSPME (SEQ ID NO:110), LEPKSADKTHTCPPC (SEQ IDNO:111), GGC и GGG.

Для облегчения клонирования можно применять SEQ ID NO: 94 вместо GGG или ggc.

Кроме того, после аминокислотной последовательности GGG или SEQ ID NO: 94 может сразу же следовать SEQ ID NO: 109 для образования альтернативных линкеров:

GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 112); и LEPKSSDKTHTCPPCP; (SEQ ID NO:113).

Содержащая Fc-участок молекула диатела по настоящему изобретению может включать шарнирный участок IgG в дополнение к линкеру или вместо него. Иллюстративные шарнирные участки включают вариант шарнира EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:114) из IgG1, ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO:115) из IgG2, ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO:116) из IgG4 и eskygppcppcp (SEQ id NO:117) из IgG4, содержащий стабилизирующую замену для уменьшения обмена цепями.

Как приведено на фиг. 3А-3С, диатела по настоящему изобретению могут содержать четыре различных цепи. Первая и третья полипептидные цепи такого диатела содержат три домена:

(i) VL1-содержащий домен,

- 43 041483 (ii) VL2-содержащий домен, (iii) способствующий образованию гетеродимера домен и (iv) домен, содержащий последовательность СН2-СН3.

Вторая и четвертая полипептидные цепи содержат:

(i) VL2-содержащий домен, (ii) VH1-содержащий домен и (iii) способствующий образованию гетеродимера домен, причем способствующие образованию гетеродимера домены способствуют димеризацию первой/третьей полипептидных цепей со второй/четвертой полипептидными цепями.

Домены VL и/или VH третьей и четвертой полипептидных цепей и домены VL и/или VH первой и второй полипептидных цепей могут быть одинаковыми или различаться для обеспечения четырехвалентного связывания, которое является либо моноспецифическим, либо биспецифическим, либо тетраспецифическим. Обозначения VL3 и VH3 обозначают соответственно вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, которые связывают третий эпитоп такого диатела (эпитоп 3). Аналогичным образом, обозначения VL4 и VH4 обозначают соответственно вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, которые связывают четвертый эпитоп такого диатела (эпитоп 4). Общая структура полипептидных цепей типичных содержащих Fc-участок четырехцепочечных диател по настоящему изобретению представлена в табл. 2.

Таблица 2

Биспецифическое	2-я цепь	NH₂-VL2-VH1-HPD-COOH
1-я цепь	NH₂-VL 1 - VH2-HPD-CH2-CH3 -СООН
1-я цепь	NH₂-VL 1 - VH2-HPD-CH2-CH3 -СООН
2-я цепь	NH₂-VL2-VH1-HPD-COOH
Тетраспецифическое	2-я цепь	NH₂-VL2-VH1-HPD-COOH
1-я цепь	NH₂-VL 1 - VH2-HPD-CH2-CH3 -COOH
3-я цепь	NH₂-VL3 - VH4-HPD-CH2-CH3 -COOH
4-я цепь	NH₂-VL4-VH3-HPD-COOH

HPD=способствующий образованию гетеродимера домен

В соответствии с конкретным вариантом осуществления, диатела по настоящему изобретению являются биспецифическими, четырехвалентными (т.е. обладают четырьмя эпитопсвязывающими сайтами), Fc-содержащими диателами (фиг. 3А-3С), которые состоят из четырех полных полипептидных цепей. Биспецифические, четырехвалентные, Fc-содержащие диатела по настоящему изобретению содержат два эпитоп-связывающих сайта, иммуноспецифических к LAG-3 (которые могут быть способны связываться с одним и тем же эпитопом LAG-3 или с различными эпитопами LAG-3), и два эпитопсвязывающих сайта, специфичных ко второму эпитопу (например, В7-НЗ, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, MHC I или II класса, ОХ40, PD-1, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.).

В соответствии с дополнительным вариантом осуществления биспецифические содержащие Fcучасток диатела могут содержать три полипептидные цепи. Первый полипептид такого диатела содержит три домена:

Второй полипептид таких диател содержит:

(i) VL2-содержащий домен, (ii) VH1-содержащий домен и (iii) домен, который способствует гетеродимеризации и ковалентному связыванию первой полипептидной цепи диатела.

Третий полипептид таких диател содержит последовательность СН2-СН3. Таким образом, первая и вторая полипептидные цепи таких диател объединяются вместе с образованием сайта связывания VL1/VH1, который способен связываться с первым эпитопом, а также сайта связывания VL2/VH2, который способен связываться со вторым эпитопом. Первый и второй полипептиды связаны друг с другом посредством дисульфидной связи с участием цистеиновых остатков в их соответствующих третьих доменах. Следует отметить, что первая и третья полипептидные цепи объединяются в комплекс друг с другом с образованием Fc-участка, который стабилизирован дисульфидной связью. Такие диатела имеют повышенную активность. На фиг 4А и 4В показаны структуры таких диател. Такие содержащие Fcучасток биспецифические диатела могут иметь любую из двух ориентации (табл. 3):

- 44 041483

Таблица 3

Первая ориентация	3-я цепь	NH₂-CH2-CH3-COOH
1-я цепь	NH₂-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3 -СООН
2-я цепь	NH₂-VL2-VH1-HPD-COOH
Вторая ориентация	3-я цепь	NH₂-CH2-CH3-COOH
1-я цепь	NH₂-CH2-CH3 -VL1-VH2-HPD-COOH
2-я цепь	NH₂-VL2-VH1-HPD-COOH

В соответствии с конкретным вариантом осуществления, диатела по настоящему изобретению являются биспецифическими, двухвалентными (т.е. имеют два эпитопсвязывающих сайта), Fcсодержащими диателами (фиг. 4А-4В), которые состоят из трех полных полипептидных цепей. Биспецифические, двухвалентные Fc-содержащие диатела по настоящему изобретению содержат один эпитопсвязывающий сайт, иммуноспецифический к LAG-3 и один эпитоп-вязывающий сайт, специфичный ко второму эпитопу (например, B7-H3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 МНС I или II класса, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.).

В соответствии со следующим вариантом осуществления биспецифические содержащие Fc-участок диатела могут содержать все пять полипептидных цепей. В соответствии с конкретным вариантом осуществления, две из указанных пяти полипептидных цепей имеют одинаковую аминокислотную последовательность. Первая полипептидная цепь таких диател включает:

(i) VH1-содержaщий домен, (ii) СН1-содержащий домен и (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СН3.

Первая полипептидная цепь может представлять собой тяжелую цепь антитела, которая содержит VH1 и константный участок тяжелой цепи. Вторая и пятая полипептидные цепи таких диател содержат:

Вторая и/или пятая полипептидные цепи таких диател могут представлять собой легкие цепи антитела, которое содержат VL1, комплементарный VH1 первой/третьей полипептидной цепи. Первую, вторую и/или пятую полипептидные цепи можно выделить из естественных антител. Альтернативно, их можно сконструировать рекомбинантными способами. Третья полипептидная цепь таких диател содержит:

(i) VH1-содержащий домен, (ii) CH1-содержащий домен, (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СН3, (iv) VL2-содержaщий домен, (v) VH3-содержащий домен и (vi) способствующий образованию гетеродимера домен, где способствующие образованию гетеродимера домены способствуют димеризации третьей цепи с четвертой цепью.

Четвертый полипептид таких диател содержит:

Таким образом, первая и вторая, а также третья и пятая полипептидные цепи таких диател объединятся вместе с образованием двух связывающих сайтов VL1/VH1, способных связывать первый эпитоп. Третья и четвертая полипептидные цепи таких диател объединяются вместе с образованием сайта связывания VL2/VH2, который способен связываться со вторым эпитопом, а также сайта связывания VL3/VH3, который способен связываться с третьим эпитопом. Первый и третий полипептиды связаны друг с другом посредством дисульфидной связи с участием цистеиновых остатков в их соответствующих константных участках. Следует отметить, что первая и третья полипептидные цепи объединяются в комплекс друг с другом с образованием Fc-участка. Такие диатела имеют повышенную активность. На фиг. 5 показана структура таких диател. Следует понимать, что домены VL1/VH1, VL2/VH2 и VL3/VH3 могут быть одинаковыми или различаться для обеспечения связывания, которое является моноспецифическим, биспецифическим или триспецифическим. Тем не менее, как представлено в настоящем документе, такие домены предпочтительно выбраны так, чтобы связывать LAG-3 и второй эпитоп (или второй и третий эпитоп (например, B7-H3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 MHC I или II класса, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). Второй и третий эпитопы могут быть различными эпитопами одной и той же молекулы антигена или могут быть эпитопами различных молекул антигена. Такие

- 45 041483 аспекты настоящего изобретения более подробно рассмотрены ниже.

Таким образом, домены VL и VH полипептидных цепей выбраны таким образом, чтобы образовывались сайты связывания VL/VH, специфичные к требуемым эпитопам. Сайты связывания VL/VH, образованные в результате связывания полипептидных цепей, могут быть одинаковыми или различаться для обеспечения четырехвалентного связывания, которое является моноспецифическим, биспецифическим, триспецифическим или тетрапецифическим. В частности, домены VL и VH могут быть выбраны таким образом, чтобы биспецифическое диатело могло содержать два сайта связывания к первому эпитопу и два сайта связывания ко второму эпитопу, или три сайта связывания к первому эпитопу и один сайт связывания ко второму эпитопу, или два сайта связывания к первому эпитопу, один сайт связывания ко второму эпитопу и один сайт связывания к третьему эпитопу (как показано на фиг. 5). Общая структура полипептидных цепей типичных содержащих Fc-участок пятицепочечных диател по настоящему изобретению представлена в табл. 4.

______________________________________________________ Таблица 4

Биспецифическое (2x2)	2-я цепь	NH2-VLI-CL-COOH
1-я цепь	NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH
3-я цепь	NH2-VHI-CHI-CH2-CH3-VL2-VH2-HPD-COOH
5-я цепь	NH2-VLI-CL-COOH
4-я цепь	NH2-VL2-VH2-HPD-COOH
Биспецифическое (3x1)	2-я цепь	NH2-VLI-CL-COOH
1-я цепь	NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH
3-я цепь	NH₂-VH1 -CHI -СН2-СНЗ -VL 1-VH2-HPD-COOH
5-я цепь	NH2-VLI-CL-COOH
4-я цепь	NH₂-VL2-VH1-HPD-COOH
Триспецифическое (2x1x1)	2-я цепь	NH2-VLI-CL-COOH
1-я цепь	NH₂-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH
3-я цепь	NH2-VHI-СН1-СН2-СНЗ -VL2-VH3 -HPD-COOH
5-я цепь	NH2-VLI-CL-COOH
4-я цепь	NH₂-VL3 - VH2-HPD-COOH

В соответствии с конкретным вариантом осуществления, диатела по настоящему изобретению являются биспецифическими четырехвалентными (т.е. обладают четырьмя эпитопсвязывающими сайтами) Fc-содержащими диателами, которые состоят из пяти полных полипептидных цепей, имеющих два сайта связывания к первому эпитопу и два сайта связывания ко второму эпитопу. В соответствии с одним вариантом осуществления, биспецифические четырехвалентные Fc-содержащие диатела по настоящему изобретению содержат два эпитопсвязывающих сайта, иммуноспецифических к LAG-3 (которые могут быть способны связываться с одним и тем же эпитопом LAG-3 или с различными эпитопами LAG-3), и два эпитопсвязывающих сайта, специфичных ко второму эпитопу (например, В7-НЗ, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 MHC I или II класса, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). В соответствии с другим вариантом осуществления биспецифические четырехвалентные Fcсодержащие диатела по настоящему изобретению содержат три эпитопсвязывающих сайта, иммуноспецифических к LAG-3 (которые могут быть способны связываться с одним и тем же эпитопом LAG-3 или с различными эпитопами LAG-3), и один эпитопсвязывающий сайт, специфичный ко второму эпитопу (например, В7-И3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 МНС I или II класса, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). В соответствии с другим вариантом осуществления биспецифические четырехвалентные Fc-содержащие диатела по настоящему изобретению содержат один эпитопсвязывающий сайт, иммуноспецифический к LAG-3, и три эпитоп-связывающих сайта, специфичных ко второму эпитопу (например, В7-НЗ, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 МНС I или II класса, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.).

3. Биспецифические трехвалентные содержащие Fc-участки связывающие молекулы

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к биспецифическим трехвалентным содержащим Fc-участок связывающим молекулам и способным одновременно связываться с первым эпитопом, вторым эпитопом и третьим эпитопом, причем по меньшей мере один из таких эпитопов не идентичен другому из таких эпитопов. Таким образом, такие биспецифические диатела содержат домены VLr7VHr’, которые способны связываться с первым эпитопом, домены ’’VL2/VH2, которые способны связываться со вторым эпитопом, и домены VL37VH3, которые способны связываться с третьим эпитопом. В соответствии с одним вариантом осуществления, один или два из таких эпитопов являются эпитопом LAG-3, а другой (или другие) из таких эпитопов не является эпитопом LAG-3 (например, эпитопом В7-НЗ, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, МНС I или II класса, ОХ40, PD-1, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). Такие биспецифические трехвалентные связывающие молекулы содержат три эпитопсвязывающих сайта, два из которых являются связывающими доме

- 46 041483 нами по типу диатела, которые обеспечивают сайт связывания А и сайт связывания В, и один из которых является связывающим доменом, не относящимся по типу диатела, который обеспечивает сайт связывания С (см., например, фиг. 6A-6F, и PCT заявки №: PCT/US 15/33081 и PCT/US 15/33076).

Как правило, трехвалентные связывающие молекулы по настоящему изобретению будут содержать четыре различных полипептидных цепи (см. фиг. 6А-6В), тем не менее, молекулы могут содержать меньшее или большее количество полипептидных цепей, например, в результате слияния таких полипептидных цепей друг с другом (например, посредством пептидной связи), или в результате разделения таких полипептидных цепей с образованием дополнительных полипептидных цепей, или в результате связывания меньшего количества или дополнительных полипептидных цепей посредством дисульфидных связей. На фиг. 6B-6F приведена иллюстрация этого аспекта настоящего изобретения, на которой схематически изображены такие молекулы с тремя полипептидными цепями. Как представлено на фиг. 6A-6F, трехвалентные связывающие молекулы по настоящему изобретению могут иметь альтернативные ориентации, в которых связывающие домены по типу диатела являются N-концевыми (фиг. 6А, 6С и 6D) или С-концевыми (фиг. 6В, 6Е и 6F) по отношению к Fc-участку.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, первая полипептидная цепь таких трехвалентных связывающих молекул по настоящему изобретению содержит:

(i) VL1-содержащий домен, (ii) VL2-содержащий домен, (iii) способствующий образованию гетеродимера домен и (iv) домен, содержащий последовательность СН2-СН3.

Домены VL1 и VL2 расположены на N-конце или С-конце относительно СН2-СН3-содержащего домена, как представлено в табл. 5 (фиг. 6А и 6В). Вторая полипептидная цепь таких вариантов осуществления содержит:

(i) VL2-содержащий домен, (ii) VH1-содержащий домен и (iii) способствующий образованию гетеродимера домен.

Третья полипептидная цепь по таким вариантам осуществления содержит:

(i) VH3-содержащий домен, (ii) CH1-содержащий домен и (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СН3.

Третья полипептидная цепь может представлять собой тяжелую цепь антитела, которая содержит VH3 и константный участок тяжелой цепи. Четвертый полипептид по таким вариантам осуществления содержит:

(i) VL3-содержащий домен и (ii) CL-содержащий домен.

Четвертая полипептидная цепь может представлять собой легкую цепь антитела, которая содержит VL3, комплементарный VH3 третьей полипептидной цепи. Третью или четвертую полипептидные цепи можно выделить из естественных антител. Альтернативно их можно сконструировать рекомбинантными, синтетическими или другими способами.

Вариабельные домены легкой цепи из первой и второй полипептидных цепей отделены от вариабельных доменов тяжелой цепи из таких полипептидных цепей промежуточным спейсерным линкером, который имеет слишком короткую длину, чтобы позволить их доменам VL1/VH2 (или их VL2/VH1) связаться вместе с образованием эпитоп-связывающего сайта, способного связываться с первым или вторым эпитопом. Предпочтительный промежуточный спейсерный пептид (линкер 1) для такой цели имеет последовательность (SEQ ID NO: 14): GGGSGGGG.

Другие домены трехвалентных связывающих молекул могут быть разделены одним или несколькими промежуточными спейсерными пептидами, необязательно содержащими цистеиновый остаток.

Иллюстративные линкеры, пригодные для создания трехвалентных связывающих молекул, приведены в настоящем описании, а также представлены в PCT заявках PCT/US 15/33081 и PCT/US 15/33076. Таким образом, первая и вторая полипептидные цепи таких трехвалентных связывающих молекул объединяются вместе с образованием сайта связывания VL1/VH1, который способен связывать первый эпитоп, а также сайта связывания VL2/VH2, который способен связываться со вторым эпитопом. Третья и четвертая полипептидные цепи таких трехвалентных связывающих молекул объединяются вместе с образованием сайта связывания VL3/VH3, который способен связываться с третьим эпитопом.

Как описано далее, трехвалентные связывающие молекулы по настоящему изобретению могут содержать три полипептида. Трехвалентные связывающие молекулы, содержащие три полипептидные цепи, могут быть получены путем связывания доменов четвертого полипептида, N-концевого по отношению к VH3-содержащему домену третьего полипептида. Альтернативно, используют третью полипептидную цепь трехвалентной связывающей молекулы по настоящему изобретению, содержащую следующие три домена:

(i) VL3-содержащий домен, (ii) VH3-содержащий домен и

- 47 041483 (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СН3, причем VL3 и VH3 отделены друг от друга промежуточным спейсерным пептидом, который имеет достаточную длину (по меньшей мере 9 или более аминокислотных остатков), чтобы позволить объединение таких доменов с образованием эпитопсвязывающего сайта.

Следует понимать, что домены VL1/VH1, VL2/VH2 и VL3/VH3 таких молекул диател могут быть одинаковыми или различаться для обеспечения связывания, которое является моноспецифическим, биспецифическим или триспецифическим. Тем не менее, как указано в настоящем документе, такие домены предпочтительно выбраны так, чтобы связывать LAG-3 и второй эпитоп (или второй и третий эпитоп) (предпочтительно, такие эпитопы представляли собой эпитопы В7-НЗ, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 MHC I или II класса, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т. д.).

В частности, домены VL и VH могут быть выбраны таким образом, чтобы трехвалентная связывающая молекула содержала два сайта связывания к первому эпитопу и один сайт связывания ко второму эпитопу, или один сайт связывания к первому эпитопу и два сайта связывания ко второму эпитопу, или один сайт связывания к первому эпитопу, один сайт связывания ко второму эпитопу и один сайт связывания к третьему эпитопу. Общая структура полипептидных цепей типичных трехвалентных связывающих молекул по настоящему изобретению представлена на фиг. 6A-6F и в табл. 5:

Таблица 5

1-я ориентация четырех цепей	2-я цепь	NH₂-VL2-VH1-HPD-COOH
1-я цепь	NH₂-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3 -СООН
3-я цепь	NH₂-VH3 -CH 1-СН2-СНЗ -СООН
4-я цепь	NH₂-VL3-CL-COOH
2-я ориентация четырех цепей	2-я цепь	NH₂-VL2-VH1-HPD-COOH
1-я цепь	NH₂-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD СООН
3-я цепь	NH₂-VH3 -CH 1-СН2-СНЗ -СООН
4-я цепь	NH₂-VL3-CL-COOH
1-я ориентация трех цепей	2-я цепь	NH₂-VL2-VH1-HPD-COOH
1-я цепь	NH₂-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3 -СООН
3-я цепь	NH₂-VL3 -VH3-HPD-CH2-CH3 -СООН
2-я ориентация трех цепей	2-я цепь	NH₂-VL2-VH1-HPD-COOH
1-я цепь	NH₂-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD СООН
3-я цепь	NH₂-VL3 -VH3-HPD-CH2-CH3 -СООН

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к биспецифическим трехвалентным связывающим молекулам, которые содержат два эпитопсвязывающих сайта к LAG-3 и один эпитопсвязывающий сайт ко второму эпитопу, присутствующему на молекуле, отличной от LAG-3 (например, В7-И3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC I или II класса, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). Два эпитопсвязывающих сайта к LAG-3 могут связывать один и тот же эпитоп или различные эпитопы. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к биспецифическим трехвалентным связывающим молекулам, которые содержат один эпитопсвязывающий сайт к LAG-3 и два эпитопсвязывающих сайта, которые связывают второй антиген, присутствующий на молекуле, отличной от LAG-3 (например, В7-И3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, МНС I или II класса, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). Два эпитопсвязывающих сайта ко второму антигену могут связывать один и тот же эпитоп или различные эпитопы антигена (например, одинаковые или различные эпитопы LAG-3).

Как показано выше, такие биспецифические трехвалентные связывающие молекулы могут содержать три или четыре полипептидных цепи.

VII. Константные домены и Fc-участки

В настоящем документе представлены константные домены антитела, пригодные для создания связывающих LAG-3 молекул (например, антител, диател, трехвалентных связывающих молекул и т.д.) по настоящему изобретению.

Предпочтительным доменом CL является каппа-домен CL IgG человека. Аминокислотной последовательностью иллюстративного каппа-домена CL человека является (SEQ ID NO: 118):

RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASWCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG

NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC

Альтернативно, иллюстративным доменом CL является лямбда-домен CL IgG человека. Аминокислотной последовательностью иллюстративного каппа-домена CL человека является (SEQ ID NO: 119):

- 48 041483

QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS

Как представлено в настоящем документе, связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению могут содержать Fc-участок. Fc-участок таких молекул по настоящему изобретению может относиться к любому изотипу (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4). Связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению могут дополнительно содержать домен СН1 и/или шарнирный участок. При наличии, домен СН1 и/или шарнирный участок могут относиться к любому изотипу (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), и предпочтительно относятся к тому же изотипу, что и требуемый Fc-участок.

Иллюстративным доменом СН1 является домен СН IgG1. Аминокислотной последовательностью иллюстративного домена CH1 IgG1 человека является (SEQ ID NO: 120):

ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV

HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV

Иллюстративным доменом CH1 является домен СН IgG2. Аминокислотной последовательностью иллюстративного домена CH1 IgG2 человека является (SEQ ID NO: 121):

I ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV

HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV

Иллюстративным доменом СН1 является домен CH1 IgG4. Аминокислотной последовательностью иллюстративного домена CH1 IgG4 человека является (SEQ ID NO: 122):

I ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV

HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV

Одним иллюстративным шарнирным участком является шарнирный участок IgG1 человека. Аминокислотной последовательностью иллюстративного шарнирного участка IgG1 человека является (SEQ ID NO:114): EPKSCDKTHTCPPCP .

Другой иллюстративный шарнирный участок представляет собой шарнирный участок IgG2 человека. Аминокислотной последовательностью иллюстративного шарнирного участка IgG2 человека является (SEQ ID NO:115): ERKCCVECPPCP .

Другой иллюстративный шарнирный участок представляет собой шарнирный участок IgG4 человека. Аминокислотной последовательностью иллюстративного шарнирного участка IgG4 человека является (SEQ ID NO:116): ESKYGPPCPSCP.

Как описано в настоящем документе, шарнирный участок IgG4 может содержать стабилизирующую мутацию, такую как замена S228P. Аминокислотной последовательностью иллюстративного стабилизированного шарнирного участка IgG4 является (^SEQ ^ID NO:117): eskygppcppcp .

Fc-участок содержащих Fc-участок молекул (например, антител, диател и трехвалентных молекул) по настоящему изобретению может представлять собой либо полный Fc-участок (например, полный Fcучасток IgG), либо только фрагмент Fc-участка. Необязательно, Fc-участок содержащих Fc-участок молекул по настоящему изобретению не имеет С-концевой лизиновый аминокислотный остаток. Так, в частности, Fc-участок содержащих Fc-участок молекул по настоящему изобретению может быть сконструированным вариантным Fc-участком. Несмотря на то, что Fc-участок биспецифических содержащих Fc-участок молекул по настоящему изобретению может обладать способностью связываться с одним или несколькими рецепторами Fc (например, FcyR(s)), более предпочтительно такой вариантный Fc-участок будет иметь измененное связывание с FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16а) или FcyRIIIB (CD16b) (относительно связывания, которым характеризуется Fc-участок дикого типа) или будут иметь существенно уменьшенную или отсутствующую способность связываться с ингибирующим(-и) рецептором(-ами). Таким образом, Fc-участок содержащих Fc-участок молекул по настоящему изобретению может включать несколько или все домены СН2 и/или несколько или все домены СН3 полного Fc-участка, или может содержать последовательность вариантного СН2 и/или вариантного СН3 (который может включать, например, одну или несколько вставок и/или одну или несколько делеций по отношению к доменам СН2 или СН3 полного Fc-участка). Такие Fc-участки могут содержать не относящиеся к Fc полипептидные части, или могут содержать части неприродных полных Fc-участков, или могут содержать не встречающиеся в природе ориентации доменов СН2 и/или СН3 (такие как, например, два домена СН2, или два домена СН3, или в направлении от N-конца до С-конца, домен СН3 связанный с доменом СН2 и т.д.).

Из уровня техники известны модификации Fc-участка, которые были определены как изменяющие эффекторную функцию, в том числе модификации, которые увеличивают связывание с активирующими рецепторами (например, FcyRIIA (CD16A) и уменьшают связывание с ингибирующими рецепторами (например, FcyRIIB (CD32B) (см., например, Stavenhagen, J.B. et al. (2007) Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors, Cancer Res. 57(18):8882-8890). Иллюстративные варианты Fc-участков IgG1 человека с уменьшенным связыванием с CD32B и/или увеличенным связыванием с

- 49 041483

CD16A содержат замены F243L, R292P, Y300L, V305I или P296L. Такие аминокислотные замены могут присутствовать в Fc-участке IgG1 человека в любой комбинации или подкомбинации. В соответствии с одним вариантом осуществления вариант Fc-участка IgG1 человека содержит замену F243L, R292P и Y300L. В соответствии с другим вариантом осуществления, вариант Fc-участка IgG1 человека содержит замены F243L, R292P, Y300L, V305I и P296L.

Так, в частности, предпочтительно, чтобы домены СН2-СН3 полипептидных цепей содержащих Fcучасток молекул по настоящему изобретению характеризовались сниженным (или практически отсутствующим) связыванием с FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) или FcyRIIIB (CD16b) (относительно связывания, которым характеризуется Fc-участок IgG1 дикого типа (SEQ ID NO: 1)). Выше описаны вариантные Fc-участки и мутантные формы, способные опосредовать такое измененное связывание. В соответствии с конкретным вариантом осуществления содержащие Fcучасток молекулы по настоящему изобретению содержат Fc-участок IgG, который характеризуется уменьшенной ADCC-эффекторной функцией. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления домен СН2-СН3 первой и/или третьей полипептидных цепей таких молекул включают любую 1, 2 или 3 замены: L234A, L235A, N297Q и N297G. В соответствии с другим вариантом осуществления вариант Fc-участка IgG человека содержит замену N297Q, замену N297G, замены L234A и L235A замены или замену D265A, поскольку эти мутации устраняют связывание FcR. В соответствии с альтернативным вариантом используют домен СН2-СН3, который изначально характеризуется пониженным (или практически отсутствующим) связыванием с FcyRIIIA (CD16а) и/или уменьшенной эффекторной функцией (относительно связывания, которым характеризуется Fc-участок IgG1 дикого типа (SEQ ID NO: 1)). В соответствии с конкретным вариантом осуществления, содержащие Fc-участок молекулы по настоящему изобретению содержат Fc-участок IgG2 (SEQ ID NO: 2) или Fc-участок IgG4 (SEQ ID NO: 4). В случае использования Fc-участка IgG4 настоящее изобретение также относится к внесению стабилизирующей мутации, такой как описанная выше замена S228P в шарнирном участке (см., например, SEQ ID NO: 117). Поскольку замены N297G, N297Q, L234A, L235A и D265A устраняют эффекторную функцию, в тех обстоятельствах, когда необходима эффекторная функция, эти замены предпочтительно не будут ис пользоваться.

Предпочтительная последовательность IgG1 для доменов СН2 и СН3 связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретению будет иметь замены L234A/L235A (SEQ ID NO: 123):

APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGX где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.

Так, в частности, предпочтительно, чтобы Fc-участки полипептидных цепей содержащих Fcучасток молекул по настоящему изобретению характеризовались повышенным период полужизни в сыворотке (относительно периода полужизни, которым характеризуется соответствующий Fc дикого типа). Выше описаны вариантные Fc-участки и мутантные формы, характеризующиеся продолжительным периодом полужизни в сыворотке. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, домен СН2-СН3 первой и/или третьей полипептидных цепей таких содержащих Fc-участок молекул включают любую 1, 2 или 3 замены: M252Y, S254T и Т256Е. Настоящее изобретение дополнительно относится к содержащим Fc-участок молекулам по настоящему изобретению, содержащим вариантные Fc-участки, содержащие:

Предпочтительная последовательность IgG1 для доменов СН2 и СН3 содержащих Fc-участок молекул по настоящему изобретению будут содержать замены L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E (SEQ ID NO: 124):

APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVD

GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA

PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE

WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE

ALHNHYTQKS LSLSPGX где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.

Предпочтительная последовательность IgG4 для доменов СН2 и СН3 содержащих Fc-участок молекул по настоящему изобретению будут содержать замены M252Y/S254T/T256E (SEQ ID NO: 125):

- 50 041483

APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVWDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGX где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.

Для диател и трехвалентных связывающих молекул (первая и третья полипептидные цепи которых не идентичны) желательно уменьшить или предупредить гомодимеризацию между доменами СН2-СН3 двух первых полипептидных цепей или между доменами СН2-СН3 двух третьих полипептидных цепей. Домены СН2 и/или СН3 таких полипептидных цепей не обязательно должны быть идентичными по последовательности, и преимущественно они модифицированы таким образом, чтобы это содействовало комплексообразованию между двумя полипептидными цепями. Например, аминокислотная замена (предпочтительно замена на аминокислоту, содержащую объемную боковую группу, образующую выступ, например, триптофан), может быть введена в домен СН2 или СН3 с тем, чтобы стерическое влияние препятствовало взаимодействию с аналогично мутированным доменом и принуждало мутированный домен образовывать пару с доменом, в который методом инженерии была встроена комплементарная или согласующаяся мутация, т.е. впадина (например, замена на глицин). Такие наборы мутаций могут быть встроены способами инженерии в любую пару полипептидов, содержащих домены СН2-СН3, которые образуют Fc-участок. Способы белковой инженерии для облегчения гетеродимеризации относитель но гомодимеризации хорошо известны их уровня техники, в частности, в отношении инженерии иммуноглобулиноподобных молекул, и охватываются настоящим документом (см., например, Ridgway et al. (1996) 'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization, Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library, J. Mol. Biol. 270: 26-35, и Xie et al. (2005) A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis, J. Immunol. Methods 296:95-101; каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном ее объеме). Предпочтительно, выступ встраивают способами инженерии в домены СН2-СН3 первой полипептидной цепи, а впадину встраивают способами инженерии в домены СН2-СН3 третьей полипептидной цепи диател, содержащих три полипептидные цепи. Таким образом, выступ будет способствовать предупреждению гомодимеризации первой полипептидной цепи через ее домены СН2 и/или СН3. Поскольку третья полипептидная цепь предпочтительно содержит замену впадина, она будет гетеродимеризироваться с первой полипептидной цепью, а также гомодимеризироваться сама по себе. Эта стратегия может быть использована для диател и трехвалентных связывающих молекул, содержащих три, четыре или пять цепей, как подробно описано выше, где выступ встраивают способами инженерии в домены СН2-СН3 первой полипептидной цепи, а впадину встраивают способами инженерии в домены СН2-СН3 третьей полипептидной цепи.

Предпочтительный выступ создают путем модификации Fc-участка IgG с включением модификации T366W. Предпочтительную впадину создают путем модификации Fc-участка IgG с включением модификации T366S, L368A и Y407V. Для облегчения очистки гомодимера несущей впадину третьей полипептидной цепи из конечной биспецифической гетеродимерной содержащей Fc-участок молекулы сайт связывания белка А доменов СН2 и СН3 третьей полипептидной цепи предпочтительно мутируют путем замены аминокислоты в положении 435 (H435R). Таким образом, гомодимер несущей впадину третьей полипептидной цепи не будет связываться с белком А, тогда как биспецифический гетеродимер будет сохранять свою способность связывать белок А посредством сайта связывания белка А на первой полипептидной цепи. В соответствии с альтернативным вариантом осуществления, несущая впадину третья полипептидная цепь может включать аминокислотные замены в положениях 434 и 435 (N434A/N435K).

Предпочтительная аминокислотная последовательность IgG1 для доменов СН2 и СН3 первой полипептидной цепи содержащей Fc-участок молекулы по настоящему изобретению будет иметь несущую выступ последовательность (SEQ ID NO: 126):

APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD

GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA

PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE

WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE

Предпочтительная аминокислотная последовательность IgG1 для доменов СН2 и СН3 второй полипептидной цепи содержащей Fc-участок молекулы по настоящему изобретению, имеющей две полипептидные цепи (или третьей полипептидной цепи содержащей Fc-участок молекулы, имеющей три, четыре, или пять полипептидных цепей), будет иметь несущую впадину последовательность (SEQ ID NO: 127):

- 51 041483

APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVD

GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA

PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE

WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGX где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.

Как можно видеть, домены СН2-СН3 с SEQ ID NO: 126 и SEQ ID NO: 127 включают замену в положении 234 на аланин и 235 на аланин и таким образом образуют Fc-участок, которых характеризуется пониженным (или практически отсутствующим) связыванием с FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) или FcyRIIIB (CD16b) (относительно связывания, которым характеризуется Fc-участок дикого типа (SEQ ID NO: 1). Настоящее изобретение также относится к таким доменам СН2-СН3, которые содержат аланиновые остатки в положениях 234 и/или 235 и/или альтернативные и/или дополнительные замены, которые модифицируют эффекторную функцию и/или связывающую с FyR активность у Fc-участка. Настоящее изобретение также относится к таким доменам СН2-СН3, кото рые дополнительно содержат одну или несколько аминокислотных замен, удлиняющих период полужиз ни. В частности, настоящее изобретение относится к таким несущим впадину и таким несущим выступ доменам СН2-СН3, которые дополнительно содержат M252Y/S254T/T256E.

Предпочтительно, чтобы первая полипептидная цепь имела несущую выступ последовательность СН2-СН3, такую как последовательность SEQ ID NO: 126. Тем не менее, как будет понятно, в первой полипептидной цепи может быть использован несущий впадину домен СН2-СН3 (например, SEQ ID NO: 127), и в этом случае несущий выступ домен СН2-СН3 (например, SEQ ID NO: 126) будет использован во второй полипептидной цепи содержащей Fc-участок молекулы по настоящему изобретению, имеющей две полипептидные цепи (или в третьей полипептидной цепи содержащей Fc-участок молеку лы, имеющей три, четыре или пять полипептидных цепей).

Как подробно описано выше, настоящее изобретение относится к содержащим Fc-участок молеку лам (например, антителам и содержащим Fc-участок диателам), имеющим домены СН2 и СН3 дикого типа или имеющим домены СН2 и СН3, содержащие описанные выше комбинации замен. Иллюстративной аминокислотной последовательностью домена СН2-СН3 IgG1, охватывающей такие изменения, яв ляется (SEQ ID NO: 128):

APEX1X2GGPSV FLFPPKPKDT LX3IX4RX5PEVT CVWDVSHED

PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH

QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT

LPPSREEMTK NQVSLX₆CX₇VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN

YKTTPPVLDS DGSFFLXsSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE

ALHX9X10YTQKS LSLSPGXn где:

(a) как X1, так и X₂ представляют собой L (дикий тип) или представляют собой А (пониженное связывание с FcyR);

(b) Х₃, Х₄ и X₆ соответственно представляют собой М, S и Т (дикий тип) или представляют собой Y, Т и Е (удлиненный период полужизни), (с) Х₆, Х₇ и Х₈ соответственно представляют собой Т, L и Y (дикий тип) или представляют собой W, L и Y (выступ) или S, А и V (впадина);

(d) X9 и Х₁₀ соответственно представляют собой N и Н (дикий тип) или представляют собой N и R (без связывания белка А) или А и K (без связывания белка А) и (e) Х11 представляет собой K или отсутствует.

В соответствии с другими вариантами осуществления настоящее изобретение относится к связывающим LAG-3 молекулам, содержащим домены СН2 и/или СН3, которые были изменены способами инженерии для облегчения гетеродимеризации относительно гомодимеризации с помощью известных из уровня техники мутаций, таких как раскрытые в PCT публикациях WO 2007/110205, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/06867, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки в полном их объеме.

VIII. Эталонные антитела

А. Эталонное антитело к LAG-3

Для оценки и характеристики новых связывающих LAG-3 молекул антител по настоящему изобретению использовали следующее эталонное антитело: 25F7 (BMS-986016, Medarex/BMS, обозначенное в настоящем документе как LAG-3 mAb A).

1. 25F7 (LAG-3 mAb A)

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH у 25F7 (LAG-3 mAb A) (SEQ ID NO: 129) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми):

- 52 041483

QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS DYYWNWIRQP PGKGLEWIGE INHNGNTNSN PSLKSRVTLS LDTSKNQFSL KLRSVTAADT AVYYCAFGYS DYEYNWFDPW GQGTLVTVSS

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL у 25F7 (LAG-3 mAb A) (SEQ ID NO: 130) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми):

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGQ GTNLEIK

В. Эталонные антитела к PD-1

Для оценки и характеристики активности новых связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретению в комбинации с антителом к PD-1 можно применять эталонное антитело. Известны антитела, которые являются иммуноспецифическими к PD-1 (см., например, патенты Соединенных Штатов №№ 8008449, 8552154; патентные PCT публикации WO 2012/135408, WO 2012/145549 и WO 2013/014668), и в их число входят: ниволумаб (также известный как 5С4, BMS-936558, ONO-4538, MDX-1106, и представленный на рынке как OPDIVO® от Bristol-Myers Squibb), обозначенный в настоящем документе как PD-1 mAb 1, пембролизумаб (ранее известный как ламбролизумаб, также известный как МК-3475, SCH-900475, и представленный на рынке как KEYTRUDA® от Merck), обозначенный в настоящем документе как PD-1 mAb 2; ЕН12.2Н7 (Dana Farber), обозначенный в настоящем документе как PD-1 mAb 3; пидилизумаб (также известный как СТ-011, CureTech), обозначенный в настоящем документе как PD-1 mAb 4.

1. Ниволумаб (PD-1 mAb 1)

Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи PD-1 mAb 1 имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 131) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми):

QVQLVESGGG WQPGRSLRL DCKASGITFS NSGMHWVRQA PGKGLEWVAV IWYDGSKRYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCATND DYWGQGTLVT VSS

Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи PD-1 mAb 1 имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 132) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми):

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT L5CRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD

ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ GTKVEIK

2. Пембролизумаб (PD-1 mAb 2)

Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи PD-1 mAb 2 имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 133) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми): QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG INPSNGGTNF NEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRD YRFDMGFDYW GQGTTVTVSS

Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи PD-1 mAb 2 имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 134) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми): EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASKGVS TSGYSYLHWY QQKPGQAPRL LIYLASYLES GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQHSRDLPL TFGGGTKVEIK

3. ЕН12.2Н7 (PD-1 mAb 3)

Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи PD-1 mAb 3 имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 135) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми): QVQLQQSGAE LAKPGASVQM SCKASGYSFT SSWIHWVKQR PGQGLEWIGY IYPSTGFTEY NQKFKDKATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARWR DSSGYHAMDY WGQGTSVTVSS

Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи PD-1 mAb 3 имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 136) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми): DIVLTQSPAS LTVSLGQRAT ISCRASQSVS TSGYSYMHWY QQKPGQPPKL LIKFGSNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YCQHSWEIPY TFGGGTKLEI К

4. Пидилизумаб (PD-1 mAb 4)

Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи PD-1 mAb 4 имеет ами

- 53 041483 нокислотную последовательность (SEQ ID NO: 137) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми): QVQLVQSGSE LKKPGASVKI SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLQWMGW

INTDSGESTY AEEFKGRFVF SLDTSVNTAY LQITSLTAED TGMYFCVRVG YDALDYWGQG TLVTVSS

Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи PD-1 mAb 4 имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 138) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми):

EIVLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSARSSVS YMHWFQQKPG KAPKLWIYRT SNLASGVPSR FSGSGSGTSY CLTINSLQPE DFATYYCQQR SSFPLTFGGG TKLEIK

IX. Способы получения

Антитело к полипептиду LAG-3 и другие LAG-3-агонисты, антагонисты и модуляторы можно создавать из полинуклеотидов и/или последовательностей антител LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6 с помощью известных из уровня техники способов, например, синтетически или рекомбинантно. Один из способов получения таких пептидных агонистов, антагонистов и модуляторов предусматривает химический синтез полипептида с последующей обработкой в окисляющих условиях, подходящих для получения нативной конформации, т. е. правильных соединений посредством дисульфидных связей. Это может быть выполнено с помощью методик, хорошо известных специалистам в настоящей области техники (см., например, Kelley, R. F. et al. (1990) In: GENETIC Engineering Principles and Methods, Setlow J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pp 1-19; Stewart, J.M et al. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; также см. патенты США №№ 4105603, 3972859, 3842067 и № 3862925).

Полипептиды по настоящему изобретению можно легко получить с помощью твердофазного пептидного синтеза (Merrifield, В. (1986) Solid Phase Synthesis, Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century, Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10).

В соответствии с другой альтернативой, полностью человеческие антитела, имеющие один или несколько CDR из LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6, или которые конкурируют с LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6 за связывание с LAG-3 человека или его растворимой формой, можно получить с помощью коммерчески доступных мышей, которые были изменены способами инженерии так, чтобы они экспрессировали конкретные белки иммуноглобулина человека. Для получения гуманизированных или человеческих антител также можно применять трансгенных животных, которые предназначены для выработки более желательных (например, полностью человеческих антител) или более робастного иммунного ответа. Примерами такой методики являются XENOMOUSE™ (Abgenix, Inc., Фримонт, Калифорния) и HuMAb-MOUSE® и ТС MOUSE™ (оба от Medarex, Inc., Принстон, Нью-Джерси).

В альтернативном варианте антитела могут быть получены рекомбинантно и экспрессированы с помощью любого известного из уровня техники способа. Антитела могут быть получены рекомбинантно путем сначала выделения антител, полученных из животных-хозяев, получения последовательности генов и применения последовательности генов для рекомбинантной экспрессии антитела в клеткаххозяевах (например, клетках СНО). Другим способом, который может быть использован, является экспрессия последовательности антител в растениях (например, табаке) или в трансгенном молоке. Были раскрыты подходящие способы рекомбинантной экспрессии антител в растениях или молоке (см., например, Peeters et al. (2001) Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants, Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) Human Antibodies From Transgenic Mice, Int. Rev. Immunol 13:65-93; и Pollock et al. (1999) Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies, J. Immunol Methods 231:147-157). Из уровня техники известны подходящие способы получения производных антител, например, гуманизированных, одноцепочечных и т. д. В другом альтернативном варианте антитела можно получить рекомбинантно с помощью технологии фагового дисплея (см., например, патенты США №№ 5565332, 5580717, 5733743, 6265150 и Winter, G. et al. (1994) Making Antibodies By Phage Display Technology, Annu. Rev. Immunol. 12.433-455).

Представляющие интерес антитела или белок могут быть подвергнуты секвенированию с расщеплением по Эдману, которое хорошо известно специалистам в настоящей области техники. Информацию о пептидах, полученную по результатам масс-спектрометрии или расщепления по Эдману, можно применять для разработки зондов или праймеров, которые применяют для клонирования представляющего интерес белка.

Альтернативным способом клонирования представляющего интерес белка является пэннинг с помощью очищенного LAG-3 или его частей для клеток, экспрессирующих представляющее интерес антитело или белок, которое имеет один или несколько CDR LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3,

- 54 041483

LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5, или LAG-3 mAb 6 или которое конкурирует с LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6 за связывание с LAG-3 человека. Процедуру пэннинга можно проводить путем получения библиотеки кДНК из тканей или клеток, которые экспрессируют LAG-3, сверхэкспрессии кДНК в клетках второго типа и скрининга трансфицированных клеток второго типа в отношении специфического связывания с LAG-3 в присутствии или отсутствии LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6. Подробное описание способов, применяемых при клонировании генов млекопитающих, кодирующих белки клеточной поверхности, с помощью пэннинга, можно найти в уровне техники (см., например, Aruffo, A. et al. (1987) Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573-8577, и Stephan, J. et al. (1999) Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation, Endocrinol. 140:5841-5854).

Векторы, содержащие представляющие интерес полинуклеотиды, могут быть введены в клеткухозяина любым из ряда подходящих способов, включая электропорацию, трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ, бомбардировку микрочастицами, липофекцию и инфекцию (например, где вектор является инфекционным агентом, таким как вирус коровьей оспы). Выбор вводящихся векторов или полинуклеотидов зачастую будет зависеть от особенностей клетки-хозяина.

Для выделения генов, кодирующих представляющее интерес антитело, полипептид или белок, можно применять любую клетку-хозяина, способную к сверхэкспрессии гетерологичных ДНК. Неограничивающие примеры подходящих клеток-хозяев млекопитающих включают без ограничения клетки COS, HeLa и СНО. Предпочтительно, клетки-хозяева экспрессируют кДНК на уровне приблизительно в 5 раз превышающем, более предпочтительно в 10 раз превышающем, еще более предпочтительно в 20 раз превышающем уровень соответствующего представляющего интерес эндогенного антитела или белка, при наличии, у клетки-хозяина. Скрининг клеток-хозяев в отношении специфического связывания с LAG-3 осуществляют иммуноанализом или FACS. Можно выявить клетку, сверхэкспрессирующую представляющее интерес антитело или белок.

Настоящее изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность антител по настоящему изобретению. Полипептиды по настоящему изобретению можно получить с помощью процедур, известных из уровня техники. Полипептиды можно получить с помощью протеолитического или другого расщепления антител, с помощью рекомбинантных способов (т. е. отдельными или слитыми полипептидами), как описано выше, или с помощью химического синтеза. Полипептиды антител, особенно более короткие полипептиды размером приблизительно до 50 аминокислот, обычно получают с помощью химического синтеза. Способы химического синтеза известны из уровня техники и являются коммерчески доступными. Например, антитело к полипептиду LAG-3 можно получить с помощью автоматического синтезатора полипептидов, использующего твердофазный способ.

Настоящее изобретение относится к вариантам антител LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6 и их полипептидным фрагментам, которые связываются с LAG-3, включая функционально эквивалентные антитела и слитые полипептиды, которые не оказывают значительного влияния на свойства таких молекул, а также варианты, которые обладают увеличенной или пониженной активностью. Модификация полипептидов является обычной практикой в настоящей области техники и не нуждается в подробном описании в настоящем документе. Примеры модифицированных полипептидов включают полипептиды с консервативными заменами аминокислотных остатков, одной или несколькими делециями или добавлениями аминокислот, которые не оказывают значительного пагубного влияния на функциональную активность, или с применением химических аналогов. К аминокислотным остаткам, которые могут быть консервативно заменены друг другом, относятся без ограничения глицин/аланин, серин/треонин, валин/изолейцин/лейцин, аспарагин/глутамин, аспарагиновая кислота/глутаминовая кислота, лизин/аргинин и фенилаланин/тирозин. К таким полипептидам также относятся гликозилированные и негликозилированные полипептиды, а также полипептиды с другими посттрансляционными модификациями, такими как, например, гликозилирование различными сахарами, ацетилирование и фосфорилирование. Предпочтительно аминокислотные замены будут консервативными, т. е. внесенная в результате замены аминокислота будет обладать такими же химическими свойствами, что и исходная аминокислота. Такие консервативные замены известны из уровня техники, и их примеры были приведены выше. Аминокислотные модификации могут варьировать от изменения или модификации одной или нескольких аминокислот до полной реорганизации участка, такого как вариабельный домен. Изменения в вариабельном домене могут изменять аффинность и/или специфичность связывания. Другие способы модификации предусматривают применение известных в настоящей области методик связывания, включая без ограничения ферментативные средства, окислительное замещение и хелатирование. Модификации можно применять, например, для прикрепления меток для иммуноанализа, такого как прикрепление радиоактивных фрагментов для радиоиммунологического анализа. Модифицированные полипептиды получают с помощью общепринятых в настоящей области техники процедур, и их можно подвергнуть скринингу с помощью известных в настоящей области техники стандартных ана- 55 041483 лизов.

Настоящее изобретение относится к слитым белкам, содержащим один или несколько полипептидов или антител LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6 по настоящему изобретению. В соответствии с одним вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к слитому полипептиду, который содержит легкую цепь, тяжелую цепь или как легкую, так и тяжелую цепь. В соответствии с другим вариантом осуществления, слитый полипептид содержит гетерологичный константный участок иммуноглобулина. В соответствии с другим вариантом осуществления, слитый полипептид содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи антитела, полученного из общедоступной депонированной гибридомы. В контексте настоящего изобретения слитый белок антитела содержит один или несколько полипептидных доменов, которые специфически связываются с LAG-3, и другую аминокислотную последовательность, к которой он не присоединен в нативной молекуле, например, гетерологичную последовательность или гомологичную последовательность из другого участка.

X. Применения связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретению

Настоящее изобретение относится к композициям, включая фармацевтические композиции, содержащие связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению (например, антитела к LAG-3, биспецифические антитела к LAG-3 и т.д.), полипептиды, полученные из таких молекул, полинуклеотиды, содержащие последовательности, кодирующие такие молекулы или полипептиды, и другие средства, которые описаны в настоящем документе.

Как рассмотрено выше, LAG-3 играет важную роль в отрицательной регуляции пролиферации, функции и гомеостаза Т-клеток. Связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению обладают способностью ингибировать функцию LAG-3 и таким образом обращать опосредованное LAG-3 ингибирование иммунной системы. Таким образом, LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 и LAG-3 mAb 6, их гуманизированные производные и молекулы, содержащие их связывающие LAG-3 фрагменты (например, биспецифические диатела и т.д.) или которые конкурируют за связывание с такими антителами, можно применять для блокировки опосредованного LAG-3 ингибирования иммунной системы и тем самым для того, чтобы способствовать активации иммунной системы.

Биспецифические связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению, которые связываются с LAG-3 и другой молекулой, участвующей в регуляции иммунной контрольной точки, присутствующей на поверхности клетки (например, PD-1), усиливают иммунную систему путем блокировки опосредованного LAG-3 ингибирования иммунной системы и таких молекул иммунной контрольной точки. Таким образом, связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению пригодны для усиления иммунного ответа (например, Т-клеточного иммунного ответа) у субъекта. В частности, связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению можно применять для лечения любого заболевания или состояния, ассоциированного с нежелательно подавленной иммунной системой, в том числе злокачественной опухоли и заболеваний, которые ассоциированы с присутствием патогена (например, бактериальной, грибковой, вирусной инфекции или инфекции простейшими).

Злокачественные опухоли, которые можно лечить с помощью связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретению, включают виды злокачественных опухолей, характеризуемых присутствием клетки злокачественной опухоли, выбранной из группы, состоящей из клетки: опухоли надпочечника, ассоциированной со СПИДом злокачественной опухоли, альвеолярной саркомы мягких тканей, астроцитарной опухоли, злокачественной опухоли мочевого пузыря, злокачественной опухоли костей, злокачественной опухоли головного и спинного мозга, метатастатической опухоли головного мозга, злокачественной опухоли молочной железы, опухолей каротидного тельца, цервикальной злокачественной опухоли, хондросаркомы, хордомы, хромофобной почечно-клеточной карциномы, светло-клеточной карциномы, злокачественной опухоли толстой кишки, колоректальной злокачественной опухоли, кожной доброкачественной фиброзной гистиоцитомы, десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли, эпендимомы, опухоли Юинга, внескелетной слизеподобной хондросаркомы, несовершенного костного фиброгенеза, фиброзной дисплазии кости, злокачественной опухоли желчного пузыря или желчевыводящих путей, злокачественной опухоли желудочно-кишечного тракта, гестационной трофобластической болезни, эмбрионально-клеточной опухоли, злокачественной опухоли головы и шеи, гепатоклеточной карциномы, опухоли островков поджелудочной железы, саркомы Капоши, злокачественной опухоли почки, лейкоза, липомы/доброкачественной липоматозной опухоли, липосаркомы/злокачественной липоматозной опухоли, злокачественной опухоли печени, лимфомы, злокачественной опухоли легкого, гранулобластомы, меланомы, менингиомы, множественных эндокринных неоплазий, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, нейробластомы, нейроэндокринных опухолей, злокачественной опухоли яичника, злокачественной опухоли поджелудочной железы, папиллярной карциномы щитовидной железы, опухоли паращитовидных желез, детской злокачественной опухоли, опухоли оболочки периферического нерва, феохромоцитомы, опухоли гипофиза, злокачественной опухоли предстательной железы, увеальной меланомы заднего отдела глаза, редкого нарушения со стороны кроветворной системы, почечной метастатической злокачественной опухоли, рабдоидной опухоли, рабдомиосаркомы, саркомы, злокачественной опухоли кожи, саркомы мягких тканей, плоскоклеточной злокачественной опухоли, злокачест

- 56 041483 венной опухоли желудка, синовиальной саркомы, злокачественной опухоли яичка, тимусной карциномы, тимомы, метастатической злокачественной опухоли щитовидной железы и злокачественной опухоли матки.

В частности, связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению можно применять для лечения колоректальной злокачественной опухоли, гепатоклеточной карциномы, глиомы, злокачественной опухоли почки, злокачественной опухоли молочной железы, множественной миеломы, злокачественной опухоли мочевого пузыря, нейробластомы; саркомы, неходжкинской лимфомы, немелкоклеточной злокачественной опухоли легкого, злокачественной опухоли яичника, злокачественной опухоли поджелудочной железы и злокачественной опухоли прямой кишки.

К ассоциированным с патогеном заболеваниям, которые можно лечить с помощью связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретению, относятся хронические вирусные, бактериальные, грибковые и паразитарные инфекции. К хроническим инфекциям, которые можно лечить с помощью связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретению, относятся вирус Эпштейна - Барра, вирус гепатита A (HAV), вирус гепатита В (HBV), вирус гепатита С (HCV), вирусы герпеса (например, HSV-1, HSV-2, HHV-6, CMV), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус везикулярного стоматита (VSV),

Bacilli, Citrobacter, Cholera, Diphtheria, Enterobacter,

Gonococci, Helicobacter pylori, Klebsiella, Legionella, Meningococci, микобактерия, Pseudomonas, Pneumonococci, рикетсия, Salmonella, Serratia, Staphylococci, Streptococci, Tetanus, Aspergillus (A. fumigatus, A. niger и m. d\ Blastomyces dermatitidis, Candida (C. albicans, C. krusei, C. glabrata, C. Tropicalis и т. д.), Cryptococcus neoformans, род Mucorales (mucor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Leptospirosis, Borrelia burgdorferi, гельминтовый паразит (анкилостоматиды, ленточные черви, трематоды, плоские черви (например, Schistosomia), Giardia lambia, trichinella, Dientamoeba Fragilis, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi и Leishmania donovani.

Связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению можно комбинировать с иммуногенным средством, таким как противоопухолевая вакцина. Такие вакцины могут содержать очищенные опухолевые антигены (включая рекомбинантные белки, пептиды и молекулы углеводов), аутологичные или аллогенные опухолевые клетки. Был описан ряд стратегий опухолевой вакцины (см., например, Palena, С, et al. (2006) Cancer vaccines: preclinical studies and novel strategies, Adv. Cancer Res. 95, 115-145; Mellman, I, et al. (2011) Cancer immunotherapy comes of age, Nature 480, 480-489; Zhang, X. M. et al. (2008) The Anti-Tumor Immune Response Induced By A Combination of MAGE-3/MAGE-n-Derived Peptides, Oncol. Rep. 20, 245-252; Disis, M. L. et al. (2002) Generation of T-cell Immunity to the HER-2/neu Protein After Active Immunization with HER-2/neu Peptide-Based Vaccines, J. Clin. Oncol. 20:2624-2632; Vermeij, R. et al. (2012) Potentiation of a p53-SLP Vaccine By Cyclophosphamide In Ovarian Cancer: A Single-Arm Phase II Study, Int. J. Cancer 131 :E670-E680). Связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению можно комбинировать с режимами химиотерапевтического лечения. В этих случаях может быть возможность уменьшить дозу вводимого химиотерапевтического реагента (Mokyr. M.B. et al. (1998) Realization Of The Therapeutic Potential Of CTLA-4 Blockade In Low-Dose Chemotherapy-Treated TumorBearing Mice, Cancer Research 58: 5301-5304).

Связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению можно комбинировать с другими иммуностимулирующими молекулами, такими как антитела, которые активируют иммунную ответную реакцию у хозяина для обеспечения повышенных уровни активации Т-клеток. В частности, было продемонстрировано, что антитела к PD-1, антитела к PD-L1 и/или антитела к CTLA-4 активируют иммунную систему (см., например, del Rio, M-L. et al. (2005) Antibody-Mediated Signaling Through PD-1 Costimulates T Cells And Enhances CD28-Dependent Proliferation, Eur. J. Immunol 35:3545-3560; Barber, D. L. et al. (2006) Restoring Function In Exhausted CD8 T Cells During Chronic Viral Infection, Nature 439, 682-687; Iwai, Y. et al. (2002) Involvement of PD-L1 On Tumor Cells In The Escape From Host Immune System And Tumor Immunotherapy by PD-L1 blockade, Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 12293-12297; Leach, D. R., et al. (1996) Enhancement Of Antitumor Immunity By CTLA-4 Blockade, Science 271, 1734-1736). К дополнительным иммуностимулирующим молекулам, которые можно комбинировать со связывающими LAG-3 молекулами по настоящему изобретению, относятся антитела к молекулам на поверхности дендритных клеток, которые активируют функцию дендритных клеток (DC) и презентирование антигена, антитела к CD40, способные замещать Т-клеточную хелперную активность и активацию антител на костимулирующие молекулы Т-клеток, такие как PD-L1, CTLA-4, OX-40 4-1BB и ICOS (см., например, Ito et al. (2000) Effective Priming Of Cytotoxic T Lymphocyte Precursors By Subcutaneous Administration Of Peptide Antigens In Liposomes Accompanied By Anti-CD40 And Anti-CTLA-4 Antibodies, Immunobiology 201:52740; патент США № 5811097; Weinberg et al. (2000) Engagement of the OX-40 Receptor In Vivo Enhances Antitumor Immunity, Immunol 164:2160-2169; Melero et al. (1997) Monoclonal Antibodies Against The 4

- 57 041483

1BB T-Cell Activation Molecule Eradicate Established Tumors, Nature Medicine 3: 682-685; Hutloff et al. (1999) ICOS is An Inducible T-Cell Co-Stimulator Structurally And Functionally Related to CD28, Nature 397: 263-266 и Moran, A.E. et al. (2013) The TNFRs OX40, 4-1BB, and CD40 As Targets For Cancer Immunotherapy, Curr Opin Immunol. 2013 Apr; 25(2): 10.1016/j.coi.2013.01.004), и/или стимулирующие химерные антигенные рецепторы (CAR), содержащие антиген-связывающий домен, направленный к антигену заболевания, слитый с одним или несколькими внутриклеточными сигнальными доменами из различных рецепторов костимулирующего белка (например, CD28, 4-1ВВ, ICOS, OX40 и т.д.), которые предназначены для стимуляции Т-клеток при связывании антигена (см., например, Tettamanti S. et al. (2013) Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD12SSpecific Chimeric Antigen Receptor, Br. J. Haematol. 161:389-401; Gill, S. et al. (2014) Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells, Blood 123(15): 2343-2354; Mardiros, A. et al. (2013) T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia, Blood 122:3138-3148; Pizzitola, I. et al. (2014) Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo, Leukemia 28(8): 1596-1605).

Связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению можно комбинировать с ингибирующими химерными антигенными рецепторами (iCAR) для отведения целенаправленных иммунотерапевтических ответов. Антиген-связывающий домен iCAR, направленный к антигену заболевания, слит с одним или несколькими внутриклеточными сигнальными доменами из различных ингибирующих рецепторов белка (например, CTLA-4, PD-1 и т. д.), которые предназначены для ограничения Т-клеточных ответов при связывании антигена (см., например, Fedorov V.D. (2013) PD-1-and CTLA-4-Based Inhibitory Chimeric Antigen Receptors (iCARs) Divert Off-Target Immunotherapy Responses, Sci Tranl Med. 5(215):215ral72).

В частности, антитело к LAG-3 по настоящему изобретению применяют в комбинации с антителом к CD137, антителом к ОХ40, антителом к PD-1, антителом к PD-L1, антителом к TIGIT, антителом к TIM-3 и/или вакциной против злокачественных опухолей.

Помимо их полезности в терапии связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению можно пометить детектируемой меткой и применять в детекции LAG-3 в образцах или в визуализации LAG-3 на клетках.

XI. Фармацевтические композиции

К композициям по настоящему изобретению относятся бестарные лекарственные композиции, пригодные для изготовления фармацевтических композиций (например, неочищенных или нестерильных композиций), и фармацевтические композиции (т.е. композиции, которые пригодны для введения субъекту или пациенту), которые можно применять при получении стандартных лекарственных форм. Такие композиции содержат профилактически или терапевтически эффективное количество связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретению или комбинацию таких средств и фармацевтически приемлемого носителя. Предпочтительно, композиции по настоящему изобретению содержат профилактически или терапевтически эффективное количество связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Настоящее изобретение, в частности, относится к таким фармацевтическим композициям, в которых связывающая LAG-3 молекула представляет собой антитело LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6; гуманизированное антитело LAG-3 mAb 1; LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6; связывающий LAG-3 фрагмент любого такого антитела; или в которых связывающая LAG-3 молекула представляет собой биспецифическое диатело к LAG-3 (например, LAG-3xPD-1 биспецифическое диатело). Особенно охватываются такие молекулы, которые содержат 3 CDRL и 3 CDRH из LAG-3 mAb 1; или которые содержат 3 CDRL и 3 CDR_H из LAG-3 mAb 2; или которые содержат 3 CDRL и 3 CDRH из LAG-3 mAb 3, или которые содержат 3 CDRL и 3 CDRH из LAG-3 mAb 4, или которые содержат 3 CDRL и 3 CDRH из LAG-3 mAb 5, или которые содержат 3 CDRL и 3 CDRH из LAG-3 mAb 6.

Настоящее изобретение также относится к таким фармацевтическим композициям, которые дополнительно включают второе терапевтическое антитело (например, опухолеспецифическое моноклональное антитело), которое является биспецифическим к конкретному антигену злокачественной опухоли, и фармацевтически приемлемый носитель.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления термин фармацевтически приемлемый означает одобренный регуляторным органом федерального правительства или правительства штата или указанный в перечне в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения на животных, а конкретнее, на людях. Термин носитель относится к разбавителю, адъюванту (например, адъюванту Фрейнда (полному и неполному), вспомогательному средству или среде, с которыми вводят терапевтическое средство. Такими фармацевтическими носителями могут быть стерильные жидкости, такие как вода и масла, в том числе масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Вода является предпочтительным носителем при внутривенном введении фармацевтической композиции. Со

- 58 041483 левые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также можно использовать в качестве жидких носителей, особенно для инъекционных растворов. В число подходящих фармацевтических вспомогательных средств входят крахмал, глюкоза, лактоза, сахароза, желатин, солод, рис, мука, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, вода, этанол и др. При необходимости, композиция может также содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих средств или средств для буферизации pH. Эти композиции могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсии, таблеток, пилюль, капсул, порошков, композиций с замедленным высвобождением и др.

Как правило, ингредиенты композиций по настоящему изобретению поставляют либо раздельно, либо в смешанном друг с другом состоянии в единичной лекарственной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытой емкости, такой как ампула или саше, с указанием количества активного средства. Если композицию необходимо вводить путем инфузии, она может быть дозирована при помощи инфузионного флакона, содержащего стерильную фармацевтическую воду или солевой раствор. Если композицию вводят путем инъекции, может быть предоставлена ампула стерильной воды для инъекций или солевого раствора, с тем чтобы ингредиенты можно было смешать перед введением.

Композиции по настоящему изобретению могут быть составлены в виде нейтральных или солевых форм. Фармацевтически приемлемые соли включают без ограничения соли, образованные анионами, такими как анионы, происходящие из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.д., и соли, образованные катионами, такими как катионы, происходящие из гидроксидов натрия, калия, аммония, кальция, железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической упаковке или набору, которые содержат одну или несколько емкостей, заполненных связывающей LAG-3 молекулой по настоящему изобретению (и более предпочтительно антителом LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6; гуманизированным антителом LAG-3 mAb 1; LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6; связывающим LAG-3 фрагментом любого такого антитела; или в которых связывающая LAG-3 молекула представляет собой биспецифическое диатело к LAG-3 (например, LAG-3xPD-1 биспецифическое диатело)). Особенно охватываются такие молекулы, которые содержат 3 CDRL и 3 CDR_H из LAG-3 mAb 1; или которые содержат 3 CDRL и 3 CDR_H из LAG-3 mAb 2; или которые содержат 3 CDRL и 3 CDRH из LAG-3 mAb 3, или которые содержат 3 CDRL и 3 CDR_H из LAG-3 mAb 4, или которые содержат 3 CDR_L и 3 CDR_H из LAG-3 mAb 5, или которые содержат 3 CDR_L и 3 CDR_H из LAG-3 mAb 6, отдельно или с таким фармацевтически приемлемым носителем. Кроме того, в фармацевтическую упаковку или набор также могут быть включены один или несколько других профилактических или терапевтических средств, пригодных для лечения заболевания. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической упаковке или набору, содержащему одну или несколько емкостей, заполненных одним или несколькими ингредиентами фармацевтических композиций по настоящему изобретению. С такой емкостью(емкостями) необязательно может быть ассоциировано информационное уведомление в форме, предписанной правительственным органом, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, при этом в информационном уведомлении отражено одобрение таким органом производства, применения или продажи для приема человеком.

Настоящее изобретение относится к наборам, которые можно применять в описанных выше способах. Набор может содержат любую из связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретению. Набор может дополнительно содержать одно или несколько других профилактических и/или терапевтических средств, пригодных для лечения злокачественной опухоли, в одной или нескольких емкостях; и/или набор может дополнительно содержать одно или несколько цитотоксических антител, которые связывают один или несколько антигенов злокачественной опухоли, ассоциированных со злокачественной опухолью. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, другое профилактическое или терапевтическое средство представляет собой химиотерапевтическое средство. В соответствии с другими вариантами осуществления, профилактическое или терапевтическое средство представляет собой биологическое или гормональное терапевтическое средство.

XII. Способы введения

Композиции по настоящему изобретению могут быть предусмотрены для лечения, профилактики и облегчения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с заболеванием, нарушением или инфекцией, путем введения субъекту эффективного количества слитого белка или конъюгированной молекулы по настоящему изобретению или фармацевтической композиции, содержащей слитый белок или конъюгированную молекулу по настоящему изобретению. В соответствии с предпочтительным аспектом, такие композиции являются практически чистыми (т.е. практически не содержат веществ, которые ограничивают ее действие или вызывают нежелательные побочные эффекты). В соответствии с конкретным вариантом осуществления, субъектом является животное, предпочтительно млекопитающее, такое как отличное от примата млекопитающее (например, бычьи, лошадиные, кошачьи, псовые, грызуны и т.д.) или примат (например, обезьяна, такая как яванский макак, человек и т.д.). В соответствии с пред

- 59 041483 почтительным вариантом осуществления, субъектом является человек.

Известны различные системы доставки, и их можно применять для введения композиций по настоящему изобретению, например, инкапсулирование в липосомах, микрочастицах, микрокапсулах, рекомбинантных клетках, способных экспрессировать антитело или слитый белок, опосредованный рецепторами эндоцитоз (см., например, Wu et al. (1987) Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), конструирование нуклеиновой кислоты как части ретровирусного или другого вектора и т. д.

Способы введения молекулы по настоящему изобретению предусматривают без ограничения парентеральное введение (например, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное и подкожное), эпидуральное и чрезслизистое (например, интраназальные и пероральные пути). В соответствии с конкретным вариантом осуществления, связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению вводят внутримышечно, внутривенно или подкожно. Композиции можно вводить любым удобным путем, например, посредством инфузии или болюсной инъекции, посредством абсорбции через эпителиальные или слизистые оболочки (например, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и т.д.), и можно вводить вместе с другими биологически активными средствами. Введение может быть системным или локальным. Кроме того, также можно использовать легочное введение, например, с применением ингалятора или небулайзера и состава с аэрозолирующим средством. См., например, патенты США №№ 6019968, 5985320, 5985309, 5934272, 5874064, 5855913, 5290540 и 4880078 и PCT публикации WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 и WO 99/66903, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном ее объеме.

Настоящее изобретение также относится к тому, что связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению упакованы в герметично закрытую емкость, такую как ампула или саше, на которой указано количество молекулы. В соответствии с одним вариантом осуществления, такие молекулы поставляют в виде сухого стерилизованного лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытой емкости, и их можно ресуспендировать, например, водой или солевым раствором до соответствующей концентрации для введения субъекту. Предпочтительно, связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению, поставляют в виде сухого стерильного лиофилизированного порошка в герметично закрытой емкости.

Лиофилизированные связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению следует хранить при температуре от 2 до 8°С в их исходной емкости, и молекулы следует вводить в пределах 12 ч, предпочтительно в пределах 6 ч, в пределах 5 ч, в пределах 3 ч или в пределах 1 ч после ресуспендирования. В соответствии с альтернативным вариантом осуществления такие молекулы поставляют в жидкой форме в герметично закрытой емкости с указанием количества и концентрации молекулы, слитого белка или конъюгированной молекулы. Предпочтительно, такие связывающие LAG-3 молекулы, если они представлены в жидкой форме, поставляют в герметично закрытой емкости.

Количество композиции по настоящему изобретению, которая будет эффективной при лечении, предупреждении или облегчении одного или нескольких симптомов, ассоциированных с нарушением, можно определить с помощью стандартных клинических методик. Точная доза, которая будет использована в составе, также будет зависеть от пути введения и от тяжести состояния и должна определяться на усмотрение практикующего клинициста и с учетом обстоятельств для каждого пациента. Эффективные дозы можно экстраполировать из кривых зависимостей доза-ответ, полученных из тест-систем in vitro или на модельных животных.

В контексте настоящего документа эффективное количество фармацевтической композиции в соответствии с одним вариантом осуществления представляет собой количество, достаточное для достижения полезных или необходимых результатов, включая без ограничения клинические результаты, такие как уменьшение симптомов, вызванных заболеванием, ослабление симптома инфекции (например, вирусной нагрузки, лихорадки, боли, сепсиса и т.д.) или симптома злокачественной опухоли (например, пролиферации клеток злокачественной опухоли, наличие опухоли, метастаз опухоли и т.д.), тем самым повышая качество жизни страдающих заболеванием, уменьшая дозу других лекарственных препаратов, необходимых для лечения заболевания, усиливая эффект другого лекарственного препарата, например, путем нацеливания и/или интернализации, задерживая прогрессирование заболевания и/или продлевая дожитие индивидуумов.

Эффективное количество можно вводить за одно или несколько введений. В контексте настоящего изобретения эффективное количество лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для уменьшения пролиферации (или эффекта) вирусного присутствия и для уменьшения и/или замедления развития вирусного заболевания, либо непосредственно, либо опосредованно. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, эффективное количество лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции может быть или не быть достигнуто в сочетании с другим лекарственным средством, соединением или фармацевтической композицией. Таким образом, эффективное количество можно рассматривать в контексте введения одного или нескольких химиотерапевтических средств, и одно средство можно рассматривать как такое, которое дают в эффективном количестве, если в сочетании с одним или несколькими другими

- 60 041483 средствами может быть достигнут или достигается необходимый результат. Несмотря на то, что индивидуальные потребности различаются, определение оптимальных диапазонов эффективных количеств каждого компонента входит в компетенцию специалистов в настоящей области техники.

Для связывающих LAG-3 молекул, охватываемых настоящим изобретением (например, антител, диател и т.д.), дозировку, вводимую пациенту, предпочтительно определяют, исходя из массы тела (кг) субъекта, принимающего такую молекулу. Для связывающих LAG молекул, охватываемых настоящим изобретением, дозировка, вводимая пациенту, обычно составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 0,05 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 0,1 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 0,2 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 0,5 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 1 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 2 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 3 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 5 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 10 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 20 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 30 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 50 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 100 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 250 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 750 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 1,5 мг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 3 мг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 5 мг/кг массы тела или по меньшей мере приблизительно 10 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 30 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 50 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 75 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 100 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 125 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 150 мг/кг или более массы тела. Рассчитанную дозу будут вводить, исходя из массы тела пациента на исходном уровне лечения. Значительное (>10%) изменение массы тела от исходного уровня или массы при установившемся плато должно приводить к перерасчету дозы.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вводимая пациенту дозировка связывающих LAG-3 биспецифических молекул (например, диател и трехвалентных связывающих молекул), охватываемых настоящим изобретением, обычно составляет по меньшей мере от приблизительно 0,3 нг/кг в сутки до приблизительно 0,9 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 1 нг/кг в сутки до приблизительно 3 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 3 нг/кг в сутки до приблизительно 9 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 10 нг/кг в сутки до приблизительно 30 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 30 нг/кг в сутки до приблизительно 90 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 100 нг/кг в сутки до приблизительно 300 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 200 нг/кг в сутки до приблизительно 600 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 300 нг/кг в сутки до приблизительно 900 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 400 нг/кг в сутки до приблизительно 800 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 500 нг/кг в сутки до приблизительно 1000 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 600 нг/кг в сутки до приблизительно 1000 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 700 нг/кг в сутки до приблизительно 1000 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 800 нг/кг в сутки до приблизительно 1000 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 900 нг/кг в сутки до приблизительно 1000 нг/кг в сутки или составляет по меньшей мере приблизительно 1000 нг/кг в сутки. Рассчитанную дозу будут вводить, исходя из массы тела пациента на исходном уровне лечения. Значительное (>10%) изменение массы тела от исходного уровня или массы при установившемся плато должно приводить к перерасчету дозы.

В соответствии с другим вариантом осуществления введение пациенту осуществляют согласно режиму лечения, предусматривающему одну или несколько доз такого профилактически или терапевтически эффективного количества связывающей LAG-3 молекулы по настоящему изобретению, причем введение согласно режиму лечения осуществляют на протяжении 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления режим лечения предусматривает периодическое введение доз профилактически или терапевтически эффективного количества связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретению (например, введение дозы на 1-е, на 2-е, на 3-и и на 4-е сутки заданной недели) и не введение доз профилактически или терапевтически эффективного количества связывающей LAG-3 молекулы (и, в частности, антитела LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5, LAG-3 mAb 6, гуманизированного антитела LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6, связывающего LAG-3 фрагмента любого такого антитела или в котором связывающая LAG-3 молекула представляет собой биспецифическое LAG-3 диатело (например, LAG-3xPD-1 биспецифическое Fc-диатело)). Особенно охватывается введение (на 5-е, на 6-е и на 7-е сутки той же недели) молекул, которые содержат 3 CDRL и 3 CDRH из LAG-3 mAb 1; или которые содержат 3 CDRL и 3 CDRH из LAG-3 mAb 2; или которые содержат 3 CDRL и 3 CDRH из LAG-3 mAb 3, или которые содержат 3 CDR_L и 3 CDR_H из LAG-3 mAb 4, или которые содержат 3 CDR_L и 3 CDR_H из LAG-3 mAb 5, или которые содержат 3 CDR_L и 3 CDR_H из LAG-3 mAb 6. Обычно имеет место 1, 2, 3, 4, 5 или более курсов лечения. Каждый курс может иметь такой же режим или другой режим лечения.

В соответствии с другим вариантом осуществления, вводимую дозу повышают на протяжении первой четверти, первой половины или первых двух третей или трех четвертей режима(ов) (например, на

- 61 041483 протяжении первого, второго или третьего режима лечения из 4 курсов) до тех пор, пока достигают суточного профилактически или терапевтически эффективного количества связывающей LAG-3 молекулы. В табл. 6 приведены 5 примеров различных режимов приема доз, описанных выше для типичного курса лечения диателом.

Таблица 6

Режим	Сутки	Дозировка диатела (иг диатела на кг массы субъекта в сутки)
1	1,2,3,4	100	100	100	100	100
5, 6, 7	нет	нет	нет	нет	нет
2	1,2,3,4	300	500	700	900	1000
5, 6, 7	нет	нет	нет	нет	нет
3	1,2,3,4	300	500	700	900	1000
5, 6, 7	нет	нет	нет	нет	нет
4	1,2,3,4	300	500	700	900	1000
5, 6, 7	нет	нет	нет	нет	нет

Дозировку и частоту введения связывающей LAG-3 молекулы по настоящему изобретению можно уменьшить или изменить путем усиления поглощения и проникновения в ткань молекулы посредством таких модификаций, как, например, липидизация.

Дозировку связывающей LAG-3 молекулы по настоящему изобретению, вводимую пациенту, можно рассчитать для применения в качестве монотерапии.

Альтернативно, молекулу можно применять в комбинации с другими терапевтическими композициями, и вводимая пациенту дозировка будет ниже, чем при применении указанных молекул в качестве монотерапии.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить локально в нуждающуюся в лечении область; это можно осуществить, например, путем без ограничения локальной инфузии, путем инъекции или посредством имплантата, причем указанный имплантат представляет собой пористый, непористый или желатинообразный материал, включая мембраны, такие как мембраны Sikalastic, или волокна. Предпочтительно, при введении молекулы по настоящему изобретению следует проявлять осторожность в случае применения материалов, в которые молекула не абсорбируется.

Композиции по настоящему изобретению можно доставлять в везикуле, в частности, в липосоме (см. Langer (1990) New Methods Of Drug Delivery, Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 3 17-327).

Композиции по настоящему изобретению можно доставлять в системе с контролируемым высвобождением или с замедленным высвобождением. Для получения составов с замедленным высвобождением, содержащих одну или несколько из связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретению, можно применять любую известную специалисту в настоящей области техники методику. См., например, патент США № 4526938; PCT публикацию WO 91/05548; PCT публикацию WO 96/20698; Ning et al. (1996) Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel, Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) Antibody Mediated Lung Targeting Of LongCirculating Emulsions, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854 и Lam et al. (1997) Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном ее объеме. В соответствии с одним вариантом осуществления можно применять помпу в системе с контролируемым высвобождением (см. Langer, ранее; Sefton, (1987) Implantable Pumps, CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis, Surgery 88:507-516; и Saudek et al. (1989) A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery, N. Engl. J. Med. 321:574-579). В соответствии с другим вариантом осуществления для достижения контролируемого высвобождения молекул можно применять полимерные материалы (см., например, Medical Applications OF Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Levy et al. (1985) Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate, Science 228:190-192; During et al. (1989) Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization, Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al. (1989) Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits, J. Neurosurg. 7(1): 105-112); патент США № 5679377, патент США № 5916597, патент США № 5912015, патент США № 5989463, патент США № 5128326, PCT публика

- 62 041483 цию WO 99/15154 и PCT публикацию WO 99/20253). В число примеров полимеров, применяемых в составах с замедленным высвобождением, входят без ограничения поли(2-гидроксиэтилметакрилат), поли(метилметакрилат), поли(акриловая кислота), сополимеры этилена и винилацетата, поли(метакриловая кислота), полигликолиды (PLG), полиангидриды, поли(N-винилпирролидон), поливиниловый спирт, полиакриламид, поли(этиленгликоль), полилактиды (PLA), сополимеры лактида и гликолида (PLGA) и сложные полиортоэфиры. Систему с контролируемым высвобождением можно разместить вблизи терапевтической мишени (например, легких), таким образом будет необходима лишь часть системной дозы (см., например, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, ранее, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Полимерные композиции, пригодные в качестве имплантатов с контролируемым высвобождением, можно применять в соответствии с Dunn et al. (см. U. S. 5945155). Этот конкретный способ основан на терапевтическом эффекте контролируемого in situ высвобождения биоактивного материала из полимерной системы. Имплантация обычно может происходить в любом месте организма пациента, нуждающегося в терапевтическом лечении. Можно применять неполимерную систему непрерывной доставки, при этом в качестве системы доставки лекарственного средства в организме субъекта применяют неполимерный имплантат. При имплантации в организм органический растворитель имплантата будет разрушаться, диспергироваться или вымываться из композиции в окружающую тканевую жидкость, а неполимерный материал будет постепенно коагулировать или осаждаться с образованием твердой микропористой матрицы (см. US 5888533).

Системы с контролируемым высвобождением рассмотрены в обзоре Langer (1990, New Methods Of Drug Delivery, Science 249:1527-1533). Для получения составов с замедленным высвобождением, содержащих одно или несколько терапевтических средств по настоящему изобретению, можно применять любую известную специалисту в настоящей области техники методику. См., например, патент США № 4526938; международные публикации WO 91/05548 и WO 96/20698; Ning et al. (1996) Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel, Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; и Lam et al. (1997) Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном ее объеме.

Если композиция по настоящему изобретению представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую связывающую LAG-3 молекулу по настоящему изобретению, нуклеиновую кислоту можно вводить in vivo для стимуляции экспрессии кодируемой ею связывающей LAG-3 молекулы путем конструирования ее как части соответствующего вектора экспрессии нуклеиновой кислоты и введения его таким образом, чтобы он стал внутриклеточным, например, с помощью ретровирусного вектора (см. патент США № 4980286), или путем прямой инъекции, или с помощью бомбардировки микрочастицами (например, генной пушки; Biolistic, Dupont), или покрытия липидами или рецепторами клеточной поверхности или трансфицирующими средствами, или путем введения его в соединении с гомеобоскоподобным пептидом, о котором известно, что он попадает внутрь ядра (см., например, Joliot et al. (1991) Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868) и т. д. В альтернативном варианте нуклеиновую кислоту можно ввести внутриклеточно и встроить в ДНК клетки-хозяина для экспрессии путем гомологичной рекомбинации.

Лечение субъекта терапевтически или профилактически эффективным количеством связывающей LAG-3 молекулы по настоящему изобретению может предусматривать однократное лечение или предпочтительно может предусматривать серию лечений. В предпочтительном примере субъекта лечат таким диателом один раз в неделю в течение приблизительно 1-10 недель, предпочтительно 2-8 недель, более предпочтительно приблизительно 3-7 недель и еще более предпочтительно в течение приблизительно 4, 5 или 6 недель. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить раз в сутки, два раза в сутки или три раза в сутки. В альтернативном варианте фармацевтические композиции можно вводить раз в неделю, два раза в неделю, раз в две недели, раз в месяц, раз в шесть недель, раз в два месяца, два раза в год или раз в год. Также будет понятно, что эффективная дозировка применяемых для лечения молекул может увеличиваться или уменьшаться в ходе курса конкретного лечения.

Примеры

Теперь, после описания в общих чертах настоящего изобретения, то же самое будет более понятным при обращении к приведенным далее примерам, которые представлены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения, если не указано иное. Специалистам в настоящей области техники будет очевидно, что на практике могут быть реализованы многие модификации как в отношении материалов, так и в отношении способов без отступления от объема настоящего раскрытия.

Пример 1.

Характеристика моноклональных антител к LAG-3: LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 и LAG-3 mAb 6

- 63 041483

Шесть мышиных моноклональных антител выделяли как способные иммуноспецифически связываться с LAG-3 как человека, так и яванского макака, и давали им обозначения LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 и LAG-3 mAb 6. Было обнаружено, что CDR этих антител отличаются, и они приведены выше. LAG-3 mAb 1 подвергали гуманизации, что давало на выходе два гуманизированных домена VH, обозначенных в настоящем документе как VL-1 hLAG-3 mAb 1 и VH-2 hLAG-3 mAb 1, и четыре гуманизированных домена VL, обозначенных в настоящем документе как VL-1 hLAG-3 mAb 1, VL-2 hLAG-3 mAb 1, VL-3 hLAG-3 mAb 1 и VL-4 hLAG-3 mAb 1 LAG-3 mAb 6 также гуманизировали, что давало на выходе два гуманизированных домена VH, обозначенных в настоящем документе как VL-1 hLAG-3 mAb 6 и VH-2 hLAG-3 mAb 6, и два гуманизированных домена VL, обозначенных в настоящем документе как VL-1 hLAG-3 mAb 6 и VL-2 hLAG3 mAb 6. Как указано выше, гуманизированные вариабельные домены тяжелых и легких цепей указанного антитела можно применять в любой комбинации, а конкретные комбинации гуманизированных вариабельных доменов указаны при помощи ссылки на конкретные домены VH/VL, например, гуманизированное антитело, содержащее VL-1 hLAG-3 mAb 1 и VL-2 hLAG-3 mAb 1, в частности, указано как hLAG-3 mAb 1(1.2).

Полноразмерные гуманизированные mAb были сконструированы следующим образом: С-конец гуманизированного домена VL сливали с N-концом каппа-участка легкой цепи человека с получением легкой цепи, и каждую легкую цепь спаривали с тяжелой цепью, содержащей гуманизированный домен VH того же антитела, слитый с N-концом либо константного участка IgG1 человека, содержащего замены L234A/L235A (АА), либо константного участка IgG4 человека, содержащего замену S228P.

Аминокислотная последовательность иллюстративного константного участка IgG1 человека, содержащего замены L234A/L235A (АА) (SEQ ID NO: 139):

ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV

HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCWVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGX где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.

В SEQ ID NO: 139 аминокислотные остатки 1-98 соответствуют домену CH1 IgG1 (SEQ ID NO: 120), аминокислотные остатки 99-113 соответствуют шарнирному участку IgG1 (SEQ ID NO: 114), а аминокислотные остатки 114-329 соответствуют домену СН2-СН3 IgG1, содержащему замены L234A/L235A (подчеркнутые) (SEQ ID NO: 123).

Аминокислотная последовательность иллюстративного константного участка IgG4 человека, содержащего замену S228P (SEQ ID NO: 140):

ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV

HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGX где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.

В SEQ ID NO: 140 аминокислотные остатки 1-98 соответствуют домену CH1 IgG4 (SEQ ID NO: 122), аминокислотные остатки 99-110 соответствуют стабилизированному шарнирному участку IgG4, содержащему замены S228P (подчеркнутые) (SEQ ID NO: 117), а аминокислотные остатки 111-326 соответствуют домену СН2-СН3 IgG4 (SEQ ID NO: 4).

Кинетику связывания антител LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5, LAG-3 mAb 6, нескольких гуманизированных и эталонного антитела LAG-3 mAb А исследовали с использованием анализа Biacore. Антитела к LAG-3 захватывали и инкубировали с His-меченным растворимым LAG-3 человека (shLAG-3-His), а кинетику связывания определяли с помощью анализа Biacore. Расчетные k_a, kd и K_D представлены в табл. 7.

- 64 041483

Таблица 7

Антитело к LAG-3	ka (xio⁵)	kd (xlO⁴)	KD (hM)
LAG-3 mAb А	8,7	5,4	0,6
LAG-3 mAb 1^а	20	0,26	0,013
LAG-3 mAb 1^ь	31	0,27	0,01
LAG-3 mAb 2^а	11	21	1,9
LAG-3 mAb 3 ^а	7,7	34	4,4
LAG-3 mAb 4^а	12	9,3	0,8
LAG-3 mAb 5^а	14	13	0,9
LAG-3 mAb 6^а	42	0,84	0,02
hLAG-3 mAb 1 (l,2)^d’^e	23	0,13	0,01
hLAG-3 mAb 1 (2,2)^d’^e	8,2	2,6	0,3
hLAG-3 mAb 1 (l,l)^{d e}	17	0,74	0,04
hLAG-3 mAb 1 (1,4)«^e	16	0,59	0,04
hLAG-3 mAb 1 (l,4)^c’^f	17	0,86	0,05

а=захвачено на иммобилизованном Fab2 козы к мышиному Fc

Ь=захвачено на иммобилизованном белке G с=захвачено на иммобилизованном Fab2 козы к человеческому Fc d=захвачено на иммобилизованном белке А e=человеческий IgG1 (AA) f=IgG4 (S228P)

В дополнительных исследованиях исследовали кинетику связывания гуманизированных антител hLAG-3 mAb 1 (1.4) и hLAG-3 mAb 6 (1.1) и эталонного антитела LAG-3 mAb А к LAG-3 как человека, так и яванского макака с помощью анализа Biacore. В этих исследованиях растворимый слитый белок с растворимым LAG-3 (внеклеточным доменом LAG-3 человека или яванского макака, слитым с IgG2a мыши) захватывали на поверхности с Fab2 козы к Fc мыши и инкубировали с антителом к LAG-3, а кинетику связывания определяли с помощью анализа Biacore. Кривые связывания для LAG-3 mAb A, hLAG-3 mAb 1 (1.4) и hLAG-3 mAb 6 (1.1), связывающихся с LAG-3 яванского макака, показаны соответственно на фиг. 7А-7С, а расчетные k_a, kd и KD представлены в табл. 8. В отдельном исследовании изучали связывание биспецифического содержащего Fc-участок диатела, включающего hLAG-3 mAb 6 (1.1) к LAG-3 как человека, так и яванского макака, с помощью анализа Biacore. В этом исследовании содержащее hLAG-3 mAb 6 (1.1) диатело захватывали на поверхности с Fab₂ козы к Fc человека и инкубировали со слитым белком с растворимым LAG-3 (внеклеточным доменом LAG-3 яванского макака или человека, слитым с His-меткой), а кинетику связывания определяли с помощью анализа Biacore. Расчетные k_a, kd и KD представлены в табл. 8.

Таблица 8

Антитело к LAG-3	Человека	Яванского макака
ka (xlO⁴)	kd (xlO'⁵)	KD (nM)	ka (xlO⁴)	kd (xlO'⁵)	KD (nM)
LAG-3 mAb A	6,2	1,0	0,16	2,4	1100	458
hLAG-3 mAb 1 (l,4)^a	3,4	<1,0	<0,29	1,9	<1,0	<0,53
hLAG-3 mAb 6 (l,l)^a	9,9	<1,0	<0,1	8,2	30	3,7
hLAG-3 mAb 6 (l,l)^b	480	16	0,033	59	78	0,13

а=иммобилизованный слитый белок из IgG2a мыши и LAG-3 яванского макака или человека b=иммобилизованное содержащее Fc-участок антитело, включающее эпитопсвязывающий домен hLAG-3 mAb 6 (1.1)

Из результатов было видно, что LAG-3 mAb 1 и LAG-3 mAb 6 характеризовались лучшей кинетикой связывания, чем эталонное антитело LAG-3 mAb А. Кроме того, гуманизированное LAG-3 mAb 6 характеризовалось лучшей кинетикой перекрестного связывания с LAG-3 яванского макака.

Специфичность к эпитопу у LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 6 и эталонного антитела LAG-3 mAb А исследовали с помощью анализа Biacore. Для определения, связывались ли антитела с различными эпитопами LAG-3, shLAG-3-His захватывали антителом мыши к пента-His, иммобилизованным на чипедатчике СМ5 в соответствии с процедурой, рекомендованной изготовителем. Вкратце, карбоксильные группы на поверхности чип-датчика активировали путем инъекции раствора, содержащего 0,2 М N-этилN-(3-диэтиламинопропил)карбодимид и 0,05 М N-гидроксисукцинимид. Антитело к пента-His вводили инъекцией на активированную поверхность с СМ5 в 10 мМ ацетате натрия, pH 5,0, со скоростью потока

- 65 041483 мкл/мин с последующим введением 1 М этаноламина для дезактивации оставшихся аминогрупп. Эксперименты по связыванию проводили в HBS-EP буфере, который содержал 10 мМ HEPES, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,005% поверхностно-активного вещества Р20. Каждое антитело (LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 6 и LAG-2 mAb А) предварительно вводили инъекцией на захваченный hLAG3-His в течение 180 с при скорости потока 5 мкл/мин в концентрации 1 мкМ с последующим подвижным буфером и инъекцией конкурентного антитела в тех же условиях. Получаемый в результате связывания ответ конкурентного антитела сравнивали с его получаемым в результате связывания ответом на hLAG3-His, предварительно введенным инъекцией с буфером для выявления антител, конкурирующих за один и тот же эпитоп. Регенерацию поверхности с иммобилизованным антителом к пента-His проводили путем импульсной инъекции 10 мМ глицина с pH 1,5. Нормативные кривые получали путем инъекции аналитов на обработанную поверхность без иммобилизованного белка. Кривые связывания строили при помощи программного обеспечения BIAevaluation v4.1 из данных сенсограммы в режиме реального времени.

Результаты этого эксперимента показаны на фиг. 8A-8D. Из результатов этого эксперимента видно, что биотинилированное антитело LAG3 mAb А было способно связываться с shLAG-3-His даже в присутствии избыточных количеств небиотинилированных антител LAG-3 mAb 1 и LAG-3 mAb 6. В отличие от этого LAG-3 mAb 1 блокировало связывание LAG-3 mAb 6. Таким образом, из результатов видно, что LAG-3 mAb 1 и LAG-3 mAb 6 могли связываться с одним и тем же или перекрывающимися эпитопами LAG-3 и конкурировать друг с другом за связывание с LAG-3. Было обнаружено, что как LAG-3 mAb 1, так и LAG-3 mAb 6 связывались с эпитопом, который отличался от эпитопа, связываемого антителом LAG-3 mAb A.

Для дополнительной характеристики антител к LAG3 в двух разных анализах оценивали их способность блокировать связывание между LAG-3 и МНС II класса. В одном анализе исследовали способность антител блокировать связывание слитого белка из Fc и растворимого LAG3 человека с МНС II класса, иммобилизованным на поверхности. Для этого анализа каждый из LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4 и LAG-3 mAb 5 (в количестве 0-67 нМ, 2-кратные серийные разведения) смешивали со слитым белком из Fc и растворимого LAG-3 человека (в концентрации 5 мкг/мл) и отдельно инкубировали с иммобилизованным МНС II класса (1 мкг/мл). Количество LAG-3, связывающегося с иммобилизованным МНС II класса, оценивали с помощью коньюгированного с гамма-HRP вторичного антитела козы к Fc человека. В дополнительных экспериментах LAG-3 mAb А и гуманизированные антитела hLAG-3 mAb 1 (1.4) и hLAG-3 mAb 6 (1.1) (в количестве 0,0096-7,0 нМ, трехкратные серийные разведения) смешивали со слитым белком с растворимым LAG-3 человека (0,2 мкг/мл) и анализировали на связывание с иммобилизованным МНС II класса, как описано выше. Результаты этих экспериментов показаны на фиг. 9А и фиг 9В.

В другом анализе исследовали способность антител к LAG-3 по настоящему изобретению блокировать связывание слитого белка из Fc и растворимого LAG3 человека (shLAG-3-Fc) с нативным МНС II класса на клеточной поверхности. Для этого анализа каждое из LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 и эталонного антитела LAG-3 mAb А (в концентрации 0,1-26,7 нг/мл, 2кратные серийные разведения) смешивали с биотинилированным слитым белком из Fc и растворимого LAG-3 человека (в концентрации 0,5 мкг/мл) и отдельно инкубировали с положительными по МНС II класса клетками Дауди. Количество LAG-3, связывающегося с поверхностью клеток Дауди, определяли с помощью конъюгированного с РЕ вторичного антитела к стрептавидину посредством FACS-анализа. В дополнительных отдельных экспериментах LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 6 и LAG-3 mAb А; или LAG-3 mAb 1 и гуманизированные антитела hLAG-3 mAb 1 (1.4), hLAG-3 mAb 1 (1.2), hLAG-3 mAb 1 (2.2) и hLAG-3 mAb 1 (1.1) анализировали, как описано выше. Результаты этих экспериментов показаны соответственно на фиг. 10А-10С.

Из результатов этих анализов ингибирования (фиг. 9А-9В и фиг. 10А-10С) видно, что все протестированные антитела к LAG-3 блокировали связывание слитого белка shLAG-3-Fc с МНС II класса.

Пример 2. Методология проточной цитометрии

В экспериментах по определению уровней экспрессии ингибиторов контрольных точек: PD-1 и LAG-3 на клетках в описанных ниже экспериментах использовали следующие соответствующим образом меченые флуоресцентной меткой коммерческие антитела: конъюгированное с фикоэритринцианином 7 (РЕ-Су7) антитело к CD4 [клон SK3] или конъюгированное с флуоресцеин-изотиоцианатом (FITC) антитело к CD4 [клон RPA-T4], коньюгированное с фикоэритрином (РЕ) антитело к LAG-3 [клон 3DS223H], коньюгированное с фикоэритрином (РЕ) антитело к PD-1 [клон ЕН12.2Н7] или коньюгированное с аллофикоцианином (APC) антитело (eBiosciences или BioLegend)) и соответствующие изотипические контроли. Все антитела применяли в рекомендованных производителем концентрациях. Окрашивание клеток проводили в буфере для FACS (10% FCS в PBS) на льду в течение 30 мин в темноте для добавления первичных антител. После двух промывок клетки либо окрашивали соответствующим вторичным реагентом на льду в течение 30 мин в темноте, либо сразу анализировали на проточном цитометре. Для исключения мертвых клеток все образцы окрашивали красителем жизнеспособных клеток: 7аминоактиномицин D (7-AAD) (BD Biosceinces или BioLegend) или дигидрохлорид 4',6-диамидино-2фенилиндола (DAPI) (Life Technologies). Все образцы анализировали на проточном цитометре либо

- 66 041483

FACS Calibur, либо Fortessa (BD Biosciences) и анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (TreeStar, Ашленд, Орегон).

Пример 3. Экспрессия LAG-3 и связывание антител с простимулированными Т-клетками

Изучали экспрессию LAG-3 и способность выделенных антител к LAG-3 специфически связывать LAG-3 на поверхности простимулированных CD3/CD28 Т-клеток. Т-клетки получали из мононуклеаров периферической крови (PBMC), вкратце, PBMC очищали с помощью способа центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare), в соответствии с инструкциями производителя, из цельной крови, полученной согласно информированному согласию от здоровых доноров (Biological Specialty Corporation), а затем Т-клетки очищали с помощью набора Dynabeads® Untouched Human T Cells Kit (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Для стимуляции выделенные Тклетки культивировали в течение 10-14 суток в присутствии рекомбинантного IL-2 человека [30 ед./мл] (Peprotech) и активирующих гранул для Т-клеток человека Dynabeads® (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Экспрессию LAG-3 на свежевыделенных непростимулированных CD4+ Т-клетках и простимулированных CD4+ Т-клетках (взятых из культуры на 11-е или 14-е сутки) исследовали с помощью проточной цитометрии, как описано выше, с использованием конъюгированных с FITC антител к CD4 и конъюгированных с РЕ антител к LAG-3.

Результаты этих исследований показаны на фиг. 11А-11С. Экспрессию LAG-3 не наблюдали на непростимулированных CD4+ Т-клетках (фиг. 11А). Однако у CD3/CD8-простимулированных CD4+ Тклеток от двух различных доноров (D:58468 и D:43530) наблюдали резкое увеличение экспрессии LAG-3 (фиг. 11В и 11С).

Исследовали способность LAG-3 mAb 1 (фиг. 12, секции А и D), LAG-3 mAb 2 (фиг. 12, секции В и Е), LAG-3 mAb 3 (фиг. 12, секции С и F), LAG- 3 mAb 4 (фиг. 13, секции А и С) и LAG-3 mAb 5 (фиг. 13, секции В и D) специфически связываться с простимулированными CD4+ Т-клетками. Простимулированные Т-клетки (полученные, как описано выше, от донора D:58468), взятые из культуры на 14-е сутки, и свежие непростимулированные клетки (полученные, как описано выше, от донора D:43530) подвергали проточной цитометрии с применением выделенных антител к LAG-3 и последующего соответствующим образом меченного флуоресцентной меткой вторичного реагента (конъюгированного с PC антитела к IgG мыши (H+L) (Jackson ImmunoResearch Labs)) и конъюгированного с FITC антитела к CD4. Как показано на фиг. 12, секциях A-F, и фиг. 13, секциях AD, каждое из исследованных антител к LAG-3 связывалось только с простимулированными, но не с непростимулированными CD4+Т-клетками.

Из результатов этих исследований видно, что уровень LAG-3 повышался на простимулированных Т-клетках, и что антитела к LAG-3 по настоящему изобретению специфически связывали только простимулированные Т-клетки.

Пример 4. Функциональная активность антител к LAG

Энтеротоксин типа В (SEB) Staphylococcus aureus представляет собой суперантиген микроорганизма, способный активировать большую часть Т-клеток (5-30%). SEB связывается с МНС II вне щелевидной детерминанты пептида и, следовательно, зависит от МНС II, но является нерестректированным и TCR-опосредованным. SEB-стимуляция Т-клеток приводила к пролиферации олигоклональных Т-клеток и продуцированию цитокинов (хотя можно было наблюдать вариабельность среди доноров). Исследовали экспрессию антител к LAG-3 и антител к PD-1 в отдельности и в комбинации на РМВС, простимулированных посредством SEB.

PBMC, очищенные, как описано выше, культивировали в RPMI-среде+10% инактивированного теплом FBS+1% пенициллина/стрептомицина в объемных колбах Т-25 в течение 2-3 суток в отдельности или с SEB (Sigma-Aldrich) в концентрации 0,1 нг/мл (первичная стимуляция). В конце первого раунда SEB-стимуляции PBMC дважды промывали PBS и сразу же высевали в 96-луночные планшеты для культивирования тканей в концентрации 1-5x105 клеток/лунка в только среду, в среду с SEB в концентрации 0,1 нг/мл (вторичная стимуляция) и без антитела или в среду с SEB и с контрольным антителом IgG и культивировали в течение дополнительных 2-3 суток. Через 48 ч после первичной объемной SEBстимуляции клетки изучали в отношении экспрессии PD-1 и LAG-3 с помощью проточной цитометрии с применением конъюгированных с РЕ антител к LAG-3 и конъюгированных с FITC антител к CD3; или конъюгированных с APC антител к PD-1 и конъюгированных с FITC антител к CD3. На 5-е сутки после вторичного культивирования в 96-луночном планшете с SEB-стимуляцией лунки, обработанные раствором без антитела или с контрольным антителом, изучали с помощью проточной цитометрии в отношении экспрессии PD-1 и LAG-3 с применением конъюгированного с РЕ антитела к LAG-3 и конъюгированного с APC антитела к PD-1.

Результаты проточной цитометрии от двух типичных доноров (D:34765 и D:53724) показаны на фиг. 14, секции A-D (D:34765) и фиг. 15, секции A-D (D:53724). Из этих результатов видно, что уровень LAG-3 и PD-1 повышался в течение 48 ч после SEB-стимуляции с дальнейшим усилением, наблюдаемым на 5-е сутки после культивирования с SEB-стимуляцией. В этих исследованиях у донора 1 после SEBстимуляции было больше LAG-3/PD-1 двойных положительных клеток. Добавление контрольного антитела после SEB-стимуляции не изменяло экспрессию LAG-3 или PD-1 (ср. фиг. 14, секции С и D и фиг.

-

Claims

(1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73 и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78.

(1) M252Y и S254T;

(1) L234A, L235A или (2) L234A и L235A, причем указанная нумерация соответствует EU системе нумерации по Kabat.

(1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73 и (2) домен CDR_l1, домен CDR_L2 и домен CDR_L3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78.

(1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73 и (2) домен CDR_l1, домен CDR_L2 и домен CDR_L3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78.

1. Связывающая LAG-3 молекула, которая способна связываться как с LAG-3 человека, так и с LAG-3 яванского макака, причем указанная связывающая LAG-3 молекула содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем указанный вариабельный домен тяжелой цепи содержит домен CDRH1, домен CDRH2 и домен

- 68 041483

CDRH3 и указанный вариабельный домен легкой цепи содержит домен CDR_L1, домен CDR_L2 и домен CDR_l3, причем:

(A) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73 и (2) домен CDR_l1, домен CDR_L2 и домен CDR_L3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78; или (B) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73; и (2) домен CDR_l1, домен CDR_L2 и домен CDR_L3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78.
(2) M252Y и Т256Е;

2. Связывающая LAG-3 молекула по п.1, причем:
(3) M252Y, S254T и Т256Е или (4) K288D и Н435К, причем указанная нумерация соответствует EU системе нумерации по Kabat.

3. Связывающая LAG-3 молекула по любому из пп.1, 2, причем указанная молекула представляет собой антитело.
4. Связывающая LAG-3 молекула по п.3, причем указанная молекула представляет собой химерное антитело или гуманизированное антитело.
5. Связывающая LAG-3 молекула по любому из пп.1-4, причем указанная молекула содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79 или SEQ ID NO: 81.
6. Связывающая LAG-3 молекула по любому из пп.1-5, причем указанная молекула содержит вариабельный домен легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83 или SEQ ID NO: 85.
7. Связывающая LAG-3 молекула по любому из пп.5 или 6, причем указанная молекула содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79 и вариабельный домен легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83.
8. Биспецифическая связывающая молекула, способная одновременно связываться с LAG-3 человека и со вторым эпитопом, причем второй эпитоп представляет собой эпитоп молекулы, участвующей в регуляции иммунной контрольной точки, присутствующей на поверхности иммунной клетки, причем указанная биспецифическая связывающая молекула содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем указанный вариабельный домен тяжелой цепи содержит домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 и указанный вариабельный домен легкой цепи содержит домен CDR_l1, домен CDR_l2 и домен CDR_l3, причем:

(A ) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73 и (2) домен CDR_l1, домен CDR_L2 и домен CDR_L3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78; или (B ) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73 и (2 ) домен CDR_l1, домен CDR_L2 и домен CDR_L3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78.
9. Биспецифическая связывающая молекула по п.8, причем:
10. Биспецифическая связывающая молекула по любому из пп.8, 9, причем указанная молекула содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79 и вариабельный домен легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83.
11. Биспецифическая связывающая молекула по любому из пп.8-10, причем указанный второй эпитоп представляет собой эпитоп В7-И3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD40L, CD47, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, CTLA-4, галектина-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, KIR, LAG-3, LIGHT, MHC I или II класса, NKG2a, NKG2d, OX40, OX40L, PD1H, PD-1, PD-L1, PD-L2, PVR, SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 или VISTA.
12. Биспецифическая связывающая молекула по п.11, причем указанный второй эпитоп представляет собой эпитоп PD-1.
13. Биспецифическая связывающая молекула по любому из пп.8-12, причем указанная молекула представляет собой:

(a) диатело, причем указанное диатело представляет собой ковалентно связанный комплекс, который содержит две, или три, или четыре различных полипептидных цепи; или

- 69 041483 (b) трехвалентную связывающую молекулу, причем указанная трехвалентная связывающая молекула представляет собой ковалентно связанный комплекс, который содержит три, четыре или пять полипептидных цепей.
14. Биспецифическая связывающая молекула по любому из пп.1-13, причем указанная молекула содержит Fc-участок.
15. Биспецифическая связывающая молекула по п.14, причем указанный Fc-участок представляет собой вариантный Fc-участок, который содержит одну или несколько аминокислотных модификаций, которые уменьшают аффинность указанного вариантного Fc-участка в отношении FcyR, причем указанные модификации, которые уменьшают аффинность вариантного Fc-участка в отношении FcyR, содержат замены:

15, секции С и D).

Повышение уровня иммунных белков контрольных точек LAG-3 и PD-1 после SEB-стимуляции PBMC ограничивало высвобождение цитокинов при повторной стимуляции. Изучали способность LAG3 mAb 1, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 6, моноклонального антитела к PD-1, обозначенного как PD-1 mAb 5, и эталонных антител PD-1 mAb 1 (включая Fc-вариант 235А/235А (АА)), PD-1 mAb 2, LAG-3 mAb А и коммерческого антитела к LAG3 17В4 (№ LS-C18692, LS Bio, обозначенного как LAG3 mAb В) усиливать высвобождение цитокинов посредством ингибирования контрольных точек.

PBMC стимулировали посредством SEB, как описано выше, за исключением вторичных стимуляций. Клетки высевали без антител, с изотипическим контрольным антителом или с антителами к LAG-3 и антителами к PD-1 в отдельности или в комбинации. В конце второй стимуляции надосадочные жидкости собирали для измерения секреции цитокинов с применением наборов для ИФА DuoSet на образцах от человека в отношении IFNy, TNFa, IL-10 и IL-4 (R&D Systems) в соответствии с инструкциями производителя. На фиг. 16А-16В показаны профили секреции IFNy (фиг. 16А) и TNFa (фиг. 16В) у PBMC, простимулированных посредством SEB, от типичного донора (D:38166), обработанного раствором без антител или с одним из следующих антител: изотипическим контролем, PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, LAG-3 mAb A, LAG-3 mAb B, LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4 или LAG-3 mAb 6. Для этого исследования использовали антитела в концентрации 0,009, 0,039, 0,156, 0,625, 2,5, 10 и 40 мкг/мл. На фиг. 17 показаны профили секреции IFNy у PBMC, простимулированных посредством SEB, от другого типичного донора (D:58108), обработанного следующим: раствором без антитела, изотипическим контрольным антителом; PD-1 mAb 2 и/или LAG-3 mAb A; PD-1 mAb 5 и/или LAG-3 mAb 1 или PD-1 mAb 5 и/или LAG-3 mAb 3. Для этого исследования применяли антитела в концентрации 10 мкг/мл.

Из результатов этих исследований видно, что антитела к PD-1 значительно усиливали функцию иммунной системы, о чем свидетельствовала увеличенная выработка IFNy (фиг. 16А и 17) и TNFa (фиг. 16В) у PBMC, простимулированных посредством SEB, при повторной стимуляции. К удивлению также наблюдали, что LAG-3 mAb 1 также увеличивало выработку цитокинов у нескольких доноров до уровней, сравнимых с антителами к PD-1, в то время как эталонные mAb к LAG-3, LAG-3 mAb A и LAG-3 mAb В и несколько выделенных антител (LAG-3 mAb 3, LAG-4 и LAG-6) обеспечивали лишь небольшое усиление высвобождения цитокинов. Кроме того, комбинация антител к LAG-3 с антителом к PD-1 приводила к дополнительному усилению высвобождения цитокинов (фиг. 17) из PBMC, простимулированных посредством SEB, при повторной стимуляции. LAG-3 mAb 1 обеспечивало наибольшее усиление высвобождения цитокинов в сочетании с антителом к PD-1 по сравнению с LAG-3 mAb 3 и эталонным антителом LAG-3 mAb A.

Пример 5. Связывание с эндогенным LAG-3 яванского макака

С помощью FACS изучали способность гуманизированного антитела hLAG-3 mAb 6 (1.1) и эталонного антитела LAG-3 mAb А связывать эндогенный LAG-3, экспрессированный на PBMC яванского макака. Для этого исследования PBMC выделяли из цельной крови яванского макака-донора и культивировали отдельно или с SEB-стимуляцией (500 нг/мл), как фактически описано выше. Через 66 ч после SEBстимуляции клетки (непростимулированные и простимулированные) окрашивали антителами hLAG-3 mAb 6 (1.1), LAG-3 mAb А или PD-1 mAb 1 (10-кратные серийные разведения). Антитела детектировали с помощью меченного APC вторичного антитела козы к Fc человека. Связывание отображено в виде графика на фиг. 18А-18В для двух яванских макаков-доноров.

Стимуляцию SEB подтверждали по усиленной экспрессии PD-1, которая была детектирована с помощью антитела к PD-1, PD-1 mAb 1. Из результатов этих исследований было видно, что hLAG-3 mAb 6 (1.1) связывалось с эндогенным LAG-3, экспрессируемым на поверхности простимулированных PBMC яванского макака.

Все упомянутые в настоящем описании публикации и патенты включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и отдельно указана как включенная посредством ссылки в полном ее объеме. Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано в связи с конкретными вариантами его осуществления, будет понятно, что его можно подвергнуть дополнительным модификациям, и настоящая заявка подразумевается как охватывающая любые варианты, применения или адаптации настоящего изобретения, согласно, в целом, принципам настоящего изобретения, и включающая такие отклонения от настоящего раскрытия, которые входят в общеизвестную или общепринятую практику в области техники, к которой относится настоящее изобретение, и которые могут быть применимы к основным признакам, изложенным выше в настоящем документе.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
16. Биспецифическая связывающая молекула по любому из пп.14, 15, причем указанный Fc-участок представляет собой вариантный Fc-участок, который содержит одну или несколько аминокислотных модификаций, которые увеличивают период полужизни в сыворотке указанного вариантного Fc-участка, причем указанные модификации, которые увеличивают период полужизни в сыворотке вариантного Fcучастка содержат замены:
17. Фармацевтическая композиция, содержащая связывающую LAG-3 молекулу по любому из пп.17 и фармацевтически приемлемый носитель или биспецифическую связывающую молекулу по любому из пп.8-16 и фармацевтически приемлемый носитель.
18. Применение биспецифической связывающей молекулы по п.8 для стимуляции Т-клеточного иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта.
19. Применение биспецифической связывающей молекулы по п.8 при лечении злокачественной опухоли или инфекции у субъекта, имеющего подавленную иммунную систему.
20. Применение биспецифичекой связывающей молекулы по любому из пп.18, 19, причем:
21. Применение биспецифической связывающей молекулы по любому из пп.18-20, причем указанная молекула содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79 и вариабельный домен легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83.
22. Применение по любому из пп.19-21, для лечения злокачественной опухоли, выбранной из группы, состоящей из опухоли надпочечника, ассоциированной со СПИДом злокачественной опухоли, альвеолярной саркомы мягких тканей, астроцитарной опухоли, злокачественной опухоли мочевого пузыря, злокачественной опухоли костей, злокачественной опухоли головного и спинного мозга, метатастатической опухоли головного мозга, злокачественной опухоли молочной железы, опухолей каротидного тельца, цервикальной злокачественной опухоли, хондросаркомы, хордомы, хромофобной почечно-клеточной карциномы, светло-клеточной карциномы, злокачественной опухоли толстой кишки, колоректальной злокачественной опухоли, десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли, эпендимомы, опухоли Юинга, внескелетной слизеподобной хондросаркомы, злокачественной опухоли желчного пузыря или желчевыводящих путей, злокачественной опухоли желудочно-кишечного тракта, гестационной трофобластической болезни, эмбрионально-клеточной опухоли, злокачественной опухоли головы и шеи, гепатоклеточной карциномы, опухоли островков поджелудочной железы, саркомы Капоши, злокачественной опухоли почки, лейкоза, липосаркомы/злокачественной липоматозной опухоли, злокачественной опухоли печени, лимфомы, злокачественной опухоли легкого, гранулобластомы, меланомы, менингиомы, множественных эндокринных неоплазий, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, нейробластомы, нейроэндокринных опухолей, злокачественной опухоли яичника, злокачественной опухоли поджелудочной железы, папиллярной карциномы щитовидной железы, опухоли паращитовидных желез, детской злокачественной опухоли, опухоли оболочки периферического нерва, феохромоцитомы, опухоли гипофиза, злокачественной опухоли предстательной железы, увеальной меланомы заднего отдела глаза, почечной метастатической злокачественной опухоли, рабдоидной опухоли, рабдомиосаркомы, саркомы, злокачественной опухоли кожи, саркомы мягких тканей, плоскоклеточной злокачественной опухоли, злокачественной опухоли желудка, синовиальной саркомы, злокачественной опухоли яичка,

-