CN103154025B - 共价双抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开了双抗体分子及其在治疗各种疾病和疾患，包括免疫学疾患、传染病、中毒和癌症中的用途。所述双抗体分子包含缔合形成可识别相同或不同抗原上的相同或不同表位的至少两个表位结合位点的两条多肽链。另外，所述抗原可来自相同或不同的分子。所述双抗体分子的单独的多肽链可通过非肽键的共价键，例如位于每条多肽链内的半胱氨酸残基的二硫键共价结合。所述双抗体分子还可包含允许抗体样功能被构建到所述分子的Fc区。

Description

共价双抗体及其用途
本申请要求美国专利申请序列号为61/370,046(2010年8月2日递交；待决)和美国专利申请序列号为60/671,657(2005年4月15日递交；期满)；11/409,339(2006年4月17日递交；待决)；PCT/US06/014481(2006年4月17日递交；期满)；60/945,523(2007年6月21日递交；期满)；61/019,051(2008年1月4日递交；期满)；12/138,867(2008年6月13日递交，待决)、PCT/US08/066957(2008年6月13日递交，待决)；61/139,352(2008年12月19日递交，待决)；61/156,035(2009年2月27日递交，待决)；61/256,779(2009年10月30日递交；待决)和12/641,095(2009年12月17日递交；待决)的权益，所有这些申请都被通过引用全部并入本文。
1.发明领域
本发明涉及另外被称为“双亲和力再靶向试剂”(“DART”)的双抗体分子，及其在治疗各种疾病和疾患，包括免疫学疾患和癌症中的用途。本发明的双抗体分子包含缔合形成可识别相同或不同表位的至少两个表位结合位点的至少两条多肽链。另外，这些表位可来自相同或不同的分子或可位于相同或不同的细胞上。该双抗体分子的单独多肽链可通过非肽键的共价键例如但不限于位于每条多肽链内的半胱氨酸残基的二硫键共价结合。在特定实施方式中，本发明的双抗体分子还包含Fc区，Fc区允许抗体样功能被构建到分子中。
2.发明背景
共价双抗体的设计基于单链Fv构建体(scFv)(Holliger等人(1993)“‘Diabodies’：Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448；本文通过引用将其全部并入)。在完整的未修饰的IgG中，VL和VH结构域分别位于单独的多肽链，即轻链和重链 上。抗体轻链和抗体重链的相互作用且特别是VL和VH结构域的相互作用形成抗体的表位结合位点之一。相比而言，scFv构建体包含被包含在单一多肽链中的抗体的VL和VH结构域，其中这些结构域被具有足以允许这两个结构域自身组装成功能性表位结合位点的长度的柔性接头隔开。如由于接头长度不足(少于约12个氨基酸残基)这两个结构域的自身组装是不可能的，则两个scFv构建体彼此相互作用以形成二价分子，一条链的VL与另一条链的VH结合(被综述在Marvin等人(2005)“Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies，”Acta Pharmacol.Sin.26：649-658中)。此外，已表明向构建体的c-末端添加半胱氨酸残基允许多肽链的二硫键结合(disulfide bonding)，稳定所得的二聚体而不干扰该二价分子的结合特征(参见例如Olafsen等人(2004)“Covalent Disulfide-LinkedAnti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications，”Prot.Engr.Des.Sel.17：21-27)。另外，如果选择具有不同特异性的VL和VH结构域，则可构建不仅为二价而且为双特异性的分子。
二价双抗体具有广阔范围的应用，包括治疗和免疫诊断。二价允许在各种不同应用中设计和构建双抗体的极大的灵活性，提供增强的对多聚体抗原的亲合力，不同抗原的交联及依赖于两种靶抗原存在的对特定细胞类型的定向靶向。由于其增加的效价，低的离解速率和从循环中的快速清除(对于为～50kDa或低于～50kDa的小尺寸的双抗体)，本领域已知的双抗体分子还已表明在肿瘤成像领域中的用途(Fitzgerald等人(1997)“Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris，”Protein Eng.10：1221)。特别重要的是不同细胞的交联，例如细胞毒性T细胞与肿瘤细胞的交联(Staerz等人(1985)“Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells，”Nature314：628-631，和Holliger等人(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody，”Protein Eng.9：299-305)。双抗体的表位结合结构域还可被定向到任何免疫效应细胞的表面决定簇例如表达在T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞或其他单核细胞上的CD3、CD16、CD32或CD64上。在许多研究中，还发现双抗体与效应细胞决定簇，例如Fcγ受体(FcγR)的结合 活化该效应细胞(Holliger等人(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody，”Protein Eng.9：299-305；Holliger等人(1999)“Carcinoembryonic Antigen(CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins，”Cancer Res.59：2909-2916)。通常，效应细胞的活化由结合了抗原的抗体与效应细胞通过Fc-FcγR相互作用引发；因此，就这一点而言，本发明的双抗体分子可不依赖于其包含还是不包含Fc结构域而表现出Ig-样功能(例如，如在本领域已知或本文例示的任何效应功能测定(例如，ADCC测定)中测定的)。通过使肿瘤细胞和效应细胞的交联，双抗体不仅将效应细胞带到肿瘤细胞附近区域内而且导致有效的肿瘤杀伤(参见例如，Cao等人(2003)“Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics，”Adv.Drug.Deliv.Rev.55：171-197，在此通过引用将其全部并入本文)。
2.1效应细胞受体及其在免疫系统中的作用
在传统的免疫功能中，抗体-抗原复合体与免疫系统的细胞的相互作用产生大量的反应，范围从效应功能例如抗体依赖的细胞毒性，肥大细胞脱粒和吞噬作用到免疫调节信号例如调节淋巴细胞增殖和抗体分泌。所有这些相互作用通过抗体或免疫复合体的Fc结构域与造血细胞上特定细胞表面受体的结合被引发。抗体和免疫复合体所引发的细胞反应的多样性是由Fc受体的结构异质性引起的。Fc受体共有可能介导细胞内信号传导的结构上相关的抗原结合结构域。
免疫球蛋白基因超家族蛋白质的成员，Fcγ受体，是可结合免疫球蛋白分子的Fcγ部分的表面糖蛋白。该家族的每个成员通过Fcγ受体的α链上的识别域识别一个或多个同种型的免疫球蛋白。Fcγ受体通过其对免疫球蛋白亚型的特异性来定义。用于IgG的Fcγ受体称为FcγR，用于IgE的Fcγ受体称为FcεR，而用于IgA的Fcγ受体称为FcαR。不同的佐细胞携带不同同种型的抗体的Fcγ受体，且抗体的同种型决定哪些佐细胞将参与特定反应(由Ravetch J.V.等人(1991)“Fc Receptors，”Annu.Rev.Immunol.9：457-92；Gerber J.S.等人(2001)“Stimulatory And Inhibitory Signals  Originating From The Macrophage Fcgamma Receptors，”Microbes and Infection，3：131-139；Billadeau D.D.等人(2002)，“ITAMs Versus ITIMs：Striking A Balance During Cell Regulation，”The Journal of Clinical Investigation，2(109)：161-168l；Ravetch J.V.等人(2000)“Immune Inhibitory Receptors，”Science，290：84-89；Ravetch J.V.等人，(2001)“IgG Fc Receptors，”Annu.Rev.Immunol.19：275-90；Ravetch J.V.(1994)“Fc Receptors：Rubor Redux，”Cell，78(4)：553-60综述)。表1中归纳了不同的Fcγ受体，表达它们的细胞及其同种型的特异性(从Immunobiology：The  Immune System in Health and Disease，第4版.1999，Elsevier Science Ltd/Garland Publishing，New York改编)。
Fcγ受体
该家族的每个成员都是完整的膜糖蛋白，具有与C2组免疫球蛋白-相关结构域有关的胞外结构域，单一的跨膜结构域和可变长度的胞质内结构域。存在三种已知的FcγR，被指定为FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、和FcγRIII(CD16)。这三种受体由不同的基因编码；但是，这三个家族成员之间的广泛的同源性表明其可能因基因重复而来自共同的祖先。
FcγRII(CD32)
由于对单体Ig低的亲和力(106M-1)，FcγRII是只结合复合的IgG的40kDa的完整的膜糖蛋白。该受体是表达最为广泛的FcγR，存在于所有造血细胞上，包括单核细胞、巨噬细胞、B细胞、NK细胞、中性白细胞、肥大细胞和血小板。FcγRII在其免疫球蛋白结合链中只有两个免疫球蛋白样区域且因此对IgG的亲和力比FcγRI低得多。存在三种人FcγRII基因(FcγRII-A、FcγRII-B、FcγRII-C)，其都结合聚集物或免疫复合体中的IgG。
FcγRII-A和FcγRII-B的胞质结构域内的显著区别造成对受体连接的两种功能上异质性的反应。根本区别在于A同种型引发导致细胞活化的细胞内信号传导，细胞活化例如吞噬作用和呼吸爆发，而B同种型引发抑制性信号，例如抑制B-细胞活化。
FcγRIII(CD16)
由于该类别内的异质性，小鼠和人的FcγRIII的大小在40和80kDa 之间的范围内。两种人基因编码两种转录物，一种完整的膜糖蛋白FcγRIIIA和一种糖基磷脂酰-肌醇(GPI)-连接的形式FcγRIIIB。一种鼠基因编码与跨膜的人FcγRIIIA同源的FcγRIII。FcγRIII与其他两种FcγR中的每一种具有共同的结构特征。如FcγRII一样，FcγRIII以低的亲和力结合IgG且包含相应的两个细胞外Ig样结构域。FcγRIIIA在巨噬细胞、肥大细胞中表达且是NK细胞中唯一的FcγR。目前已知GPI-连接的FcγRIIIB只在人的中性白细胞中表达。
通过FcγR的信号传导
活化和抑制性信号都通过连接后的FcγR转导。这些完全相反的功能由不同的受体同种型之间的结构差异引起。受体的胞质信号传导结构域内的称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的两个独特的结构域负责这些不同的反应。将不同的胞质酶召集到这些结构指示FcγR-介导的细胞反应的结果。包含ITAM的FcγR复合体包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA，而包含ITIM的复合体只包括FcγRIIB。
人中性白细胞表达FcγRIIA基因。通过免疫复合体或特定抗体交联的FcγRIIA玫瑰花结用来将ITAM连同促进ITAM磷酸化的受体相关的激酶聚集在一起。ITAM磷酸化用作Syk激酶的停靠位点，该激酶的活化导致下游底物(例如，PI3K)的活化。细胞活化导致促炎性调节因子(proinflammatory mediator)的释放。
FcγRIIB基因表达在B淋巴细胞上；其细胞外结构域与FcγRIIA96％相同并以不可区分的方式结合IgG复合体。ITIM在FcγRIIB的胞质结构域中的存在定义了这一抑制性亚类的FcγR。最近，确立了这种抑制的分子基础。当与活化性FcγR共连接时，FcγRIIB中的ITIM变得磷酸化并吸引肌醇磷酸5’-磷酸酶(SHIP)的SH2结构域，该酶水解由于包含ITAM的FcγR-介导的酪氨酸激酶活化而被释放的磷酸肌醇信使，从而防止细胞内Ca++内流。因此，FcγRIIB的交联抑制对FcγR连接的活化反应并抑制细胞反应性。因此中止了B细胞活化、B细胞增殖和抗体分泌。
3.发明概述
本发明涉及共价双抗体和/或共价双抗体分子及其在治疗各种疾病和疾患包括癌症、自身免疫性疾患、过敏性疾患和由细菌、真菌或病毒导致的传染病中的用途。优选地，本发明的双抗体可结合两种不同的细胞上的两种不同的表位，其中第一表位表达在与第二种表位不同的细胞类型上，使得双抗体可将两种细胞聚集在一起。
在一个实施方式中，本发明涉及共价双特异性双抗体，该双抗体包含第一多肽链和第二多肽链，该第一多肽链包含(i)第一结构域，其包含对第一表位特异性的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL1)的结合区域，(ii)第二结构域，其包含对第二表位特异性的第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VH2)的结合区域，以及任选地(iii)第三结构域，其包含至少一个半胱氨 酸残基，所述第一和第二结构域被共价连接成使得第一和第二结构域不缔合形成表位结合位点；所述第二多肽链包含(i)第四结构域，其包含第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL2)的结合区域，(ii)第五结构域，其包含第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VH1)的结合区域，以及任选地(iii)第六结构域，其包含至少一个半胱氨酸残基，所述第四和第五结构域被共价连接成使得第四和第五结构域不缔合形成表位结合位点；且其中第一多肽链和第二多肽链共价连接，条件是该共价连接不是肽键；其中第一结构域和第五结构域缔合形成结合第一表位的第一结合位点(VL1)(VH1)；其中第二结构域和第四结构域缔合形成结合第二表位的第二结合位点(VL2)(VH2)。
在另一个实施方式中，本发明涉及共价双特异性双抗体，该双抗体包含第一多肽链和第二多肽链，该第一多肽链包含(i)第一结构域，其包含对第一表位特异性的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL1)的结合区域，(ii)第二结构域，其包含对第二表位特异性的第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VH2)的结合区域，以及(iii)第三结构域，其包含Fc结构域或其部分，所述第一和第二结构域被共价连接成使得第一和第二结构域不缔合形成表位结合位点；该第二多肽链包含(i)第四结构域，其包含第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL2)的结合区域，(ii)第五结构域，其包含第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VH1)的结合区域，所述第四和第五结构域被共价连接成使得第三和第四结构域不缔合形成表位结合位点；且其中第一多肽链和第二多肽链共价连接，条件是该共价连接不是肽键；其中第一结构域和第五结构域缔合形成结合第一表位的第一结合位点(VL1)(VH1)；其中第二结构域和第四结构域缔合形成结合第二表位的第二结合位点(VL2)(VH2)。
在某些方面，本发明涉及双抗体分子，该分子包含第一多肽链和第二多肽链，该第一多肽链包含(i)第一结构域，其包含对第一表位特异性的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL1)的结合区域，(ii)第二结构域，其包含对第二表位特异性的第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VH2)的结合区域，以及(iii)第三结构域，其包含Fc结构域或其部分，所述第一和第二结构域被共价连接成使得第一和第二结构域不缔合形成表位结合位点；第二 多肽链包含(i)第四结构域，其包含第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL2)的结合区域，(ii)第五结构域，其包含第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VH1)的结合区域，以及(iii)第六结构域，其包含至少一个半胱氨酸残基，所述第四和第五结构域被共价连接成使得第四和第五结构域不缔合形成表位结合位点；且其中第一多肽链和第二多肽链共价连接，条件是该共价连接不是肽键；其中第一结构域和第五结构域缔合形成结合第一表位的第一结合位点(VL1)(VH1)；其中第二结构域和第四结构域缔合形成结合第二表位的第二结合位点(VL2)(VH2)。
在某些实施方式中，本发明涉及共价双特异性双抗体，该双抗体是双抗体分子的二聚体，每个双抗体分子包含第一多肽链和第二多肽链，该第一多肽链包含(i)第一结构域，其包含对第一表位特异性的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL1)的结合区域，(ii)第二结构域，其包含对第二表位特异性的第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VH2)的结合区域，以及(iii)第三结构域，其包含Fc结构域或其部分，所述第一和第二结构域被共价连接成使得第一和第二结构域不缔合形成表位结合位点；且该第二多肽链包含(i)第四结构域，其包含第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL2)的结合区域，(ii)第五结构域，其包含第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VH1)的结合区域，以及(iii)第六结构域，其包含至少一个半胱氨酸残基，所述第四和第五结构域被共价连接成使得第四和第五结构域不缔合形成表位结合位点；且其中每个双抗体分子的第一多肽链和第二多肽链共价连接，条件是该共价连接不是肽键；其中每个双抗体分子的第一结构域和第五结构域缔合形成结合第一表位的第一结合位点(VL1)(VH1)；其中每个双抗体分子的第二结构域和第四结构域缔合形成结合第二表位的第二结合位点(VL2)(VH2)。
又在其他实施方式中，本发明涉及共价四特异性双抗体，所述双抗体是双抗体分子的二聚体，第一双抗体分子包含第一和第二多肽链，所述第一多肽链包含(i)第一结构域，其包含对第一表位特异性的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL1)的结合区域，(ii)第二结构域，其包含对第二表位特异性的第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VH2)的结合区域，以及(iii)第 三结构域，其包含Fc结构域或其部分，所述第一和第二结构域被共价连接成使得第一和第二结构域不缔合形成表位结合位点；且所述第二多肽链包含(i)第四结构域，其包含第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL2)的结合区域，(ii)第五结构域，其包含第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VH1)的结合区域，以及(iii)第六结构域，其包含至少一个半胱氨酸残基，所述第四和第五结构域被共价连接成使得第四和第五结构域不缔合形成表位结合位点；且其中所述第一多肽链和第二多肽链共价连接，条件是该共价连接不是肽键；其中第一结构域和第五结构域缔合形成结合第一表位的第一结合位点(VL1)(VH1)；其中第二结构域和第四结构域缔合形成结合第二表位的第二结合位点(VL2)(VH2)；且第二双抗体分子包含第一和第二多肽链，所述第一多肽链包含(i)第一结构域，其包含对第三表位特异性的第三免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL3)的结合区域，(ii)第二结构域，其包含对第四表位特异性的第四免疫球蛋白的重链可变结构域(VH4)的结合区域，以及(iii)第三结构域，其包含Fc结构域或其部分，所述第一和第二结构域被共价连接成使得第一和第二结构域不缔合形成表位结合位点；且所述第二多肽链包含(i)第四结构域，其包含第四免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL4)的结合区域，(ii)第五结构域，其包含第三免疫球蛋白的重链可变结构域(VH3)的结合区域，以及(iii)第六结构域，其包含至少一个半胱氨酸残基，所述第四和第五结构域被共价连接成使得第四和第五结构域不缔合形成表位结合位点；且其中所述第一多肽链和第二多肽链共价连接，条件是该共价连接不是肽键；其中第一结构域和第五结构域缔合形成结合第三表位的第一结合位点(VL3)(VH3)；其中第二结构域和第四结构域缔合形成结合第四表位的第二结合位点(VL4)(VH4)。
在本发明的某些方面，第一表位、第二表位，且在适用情况下，第三表位及第四表位可以是相同的。在其他方面，第一表位、第二表位，且在适用情况下，第三表位及第四表位可各自与另一个不同。在包含第三表位结合结构域的本发明的某些方面，第一表位和第三表位可以是相同的。在包含第四表位结合结构域的本发明的某些方面，第一表位和第四表位可以是相同的。在包含第三表位结合结构域的本发明的某些方面，第二表位和第三表位可以是相同的。在包含第四表位结合结构域的本发明的某些方 面，第二表位和第四表位可以是相同的。在本发明优选的方面，第一表位和第二表位是不同的。又在包含第三表位结合结构域和第四表位结合结构域的本发明的其他方面，第三表位和第四表位可以是不同的。应当理解，前述的任何组合被包括在本发明内。
在本发明特定的方面，双抗体或双抗体分子的第一结构域和第五结构域可衍生自同一免疫球蛋白。在另一方面，双抗体或双抗体分子的第二结构域和第四结构域可衍生自同一免疫球蛋白。又在另一方面，双抗体或双抗体分子的第一结构域和第五结构域可衍生自不同的免疫球蛋白。又在另一方面，双抗体或双抗体分子的第二结构域和第四结构域可衍生自不同的免疫球蛋白。应当理解，前述的任何组合被包括在本发明内。
在本发明的某些方面，双抗体或双抗体分子的第一多肽链和第二多肽链之间的共价连接可通过第一多肽链上的至少一个半胱氨酸残基和第二多肽链上的至少一个半胱氨酸残基之间的二硫键。负责二硫键键合的第一或第二多肽链上的半胱氨酸残基可在多肽链的任何地方，包括在第一、第二、第三、第四、第五和第六结构域内发现。在特定实施方式中，第一多肽链上的半胱氨酸残基在第一结构域内发现且第二多肽链上的半胱氨酸残基在第五结构域内发现。第一、第二、第四和第五结构域对应于负责结合的可变区。在优选的实施方式中，负责第一和第二多肽链之间的二硫键键合的半胱氨酸残基分别位于第三和第六结构域内。在该实施方式的特定方面，第一多肽链的第三结构域包含人κ轻链C-末端的6个氨基酸，FNRGEC(SEQ ID NO：23)，其可由氨基酸序列(SEQ ID NO：17)编码。在该实施方式的另一方面，第二多肽链的第六结构域包含人κ轻链C-末端的6个氨基酸，FNRGEC(SEQ ID NO：23)，其可由氨基酸序列(SEQ ID NO：17)编码。又在该实施方式的另一方面，第一多肽链的第三结构域包含衍生自人IgG的铰链结构域的氨基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO：77)，且其可由核苷酸序列(SEQ ID NO：78)编码。在该实施方式的另一方面，第二多肽链的第六结构域包含衍生自人IgG的铰链结构域的氨基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO：77)，且其可由核苷酸序列(SEQ ID NO：78)编码。在该实施方式的某些方面，第一多肽链的第三结构域包含人κ轻链C末端的6个氨基酸， FNRGEC(SEQ ID NO：23)；且第二多肽链的第六结构域包含氨基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO：77)。在该实施方式的其他方面，第二多肽链的第六结构域包含人κ轻链C末端的6个氨基酸，FNRGEC(SEQ ID NO：23)；且第一多肽链的第三结构域包含氨基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO：77)。又在该实施方式的其他方面，第一多肽链的第三结构域包含人κ轻链C末端的6个氨基酸，FNRGEC(SEQ ID NO：23)；且第二多肽链的第六结构域包含铰链结构域。在该实施方式的其他方面，第二多肽链的第六结构域包含人κ轻链C末端的6个氨基酸，FNRGEC(SEQ ID NO：23)；且第一多肽链的第三结构域包含铰链结构域。又在该实施方式的其他方面，第一多肽链的第三结构域包含人κ轻链C末端的6个氨基酸，FNRGEC(SEQ ID NO：23)；且第一多肽链的第六结构域包含Fc结构域或其部分。又在该实施方式的其他方面，第二多肽链的第六结构域包含人κ轻链C末端的6个氨基酸，FNRGEC(SEQ ID NO：23)；且第一多肽链的第三结构域包含Fc结构域或其部分。
在其他实施方式中，负责二硫键键合的第一或第二多肽上的半胱氨酸残基可位于第一多肽链上第一、第二或第三结构域的外部以及第二多肽链上第四、第五和第六结构域的外部。特别地，第一多肽链上的半胱氨酸残基可在第一结构域的N末端或可在第一结构域的C末端。第一多肽链上的半胱氨酸残基可在第二结构域的N末端或可在第二结构域的C末端。第一多肽链上的半胱氨酸残基可在第三结构域的N末端或可在第三结构域的C末端。另外，第二多肽链上的半胱氨酸残基可在第四结构域的N末端或可在第四结构域的C末端。第二多肽链上的半胱氨酸残基可在第五结构域的N末端或可在第五结构域的C末端。相应地，第二多肽链上的半胱氨酸残基可在第六结构域的C末端或可在第六结构域的N末端。在特别的方面，二硫键可在第一多肽链上的至少两个半胱氨酸残基和第二多肽链上的至少两个半胱氨酸残基之间。在特定的方面，其中第三结构域和第六结构域不包含Fc结构域或其部分，半胱氨酸残基可在第一多肽链的C末端和第二多肽链的C末端。应当理解，前述的任何组合被包括在本发明内。
在上文描述的本发明的特定实施方式中，本发明的共价双抗体包括双 抗体分子的二聚体，其中每个双抗体分子包含第一和第二多肽链。在该实施方式的某些方面，这些双抗体分子可共价连接以形成二聚体，条件是该共价连接不是肽键。在该实施方式优选的方面，所述共价连接是二聚体的每个双抗体分子的第一多肽链上的至少一个半胱氨酸残基之间的二硫键。又在本发明更优选的方面，所述共价连接是形成二聚体的每个双抗体分子的第一多肽链上的至少一个半胱氨酸残基之间的二硫键，其中所述至少一个半胱氨酸残基位于每个第一多肽链的第三结构域内。
在本发明的某些方面，第一多肽链上的第一结构域可在第二结构域的N末端或可在第二结构域的C末端。第一多肽链上的第一结构域可在第三结构域的N末端或可在第三结构域的C末端。第一多肽链上的第二结构域可在第一结构域的N末端或可在第一结构域的C末端。另外，第一多肽链上的第二结构域可在第三结构域的N末端或可在第三结构域的C末端。相应地，第一多肽链上的第三结构域可在第一结构域的N末端或可在第一结构域的C末端。第一多肽链上的第三结构域可在第二结构域的N末端或可在第二结构域的C末端。关于第二多肽链，第四结构域可在第五结构域的N末端或可在第五结构域的C末端。第四结构域可在第六结构域的N末端或可在第六结构域的C末端。第二多肽链上的第五结构域可在第四结构域的N末端或可在第四结构域的C末端。第二多肽链上的第五结构域可在第六结构域的N末端或可在第六结构域的C末端。相应地，第二多肽链上的第六结构域可在第四结构域的N末端或可在第四结构域的C末端。第二多肽链上的第六结构域可在第五结构域的N末端或可在第五结构域的C末端。应当理解，前述的任何组合被包括在本发明内。
在某些实施方式中，第一结构域和第二结构域可位于第一多肽链上第三结构域的C末端；或第一结构域和第二结构域可位于第一多肽链上第三结构域的N末端。关于第二多肽链，第四结构域和第五结构域可在第六结构域的C末端，或第四结构域和可第五结构域可在第六结构域的N末端。在该实施方式的某些方面，本发明涉及共价双特异性双抗体，该双抗体是双抗体分子的二聚体，每个双抗体分子包含第一多肽链和第二多肽链，该第一多肽链包含(i)第一结构域，其包含对第一表位特异性的第一免疫球蛋 白的轻链可变结构域(VL1)的结合区域，(ii)第二结构域，其包含对第二表位特异性的第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VH2)的结合区域，以及(iii)第三结构域，其包含Fc结构域或其部分，该第一和第二结构域被共价连接成使得第一和第二结构域不缔合形成表位结合位点，且其中第三结构域位于第一结构域和第二结构域的N末端；且所述第二多肽链包含(i)第四结构域，其包含第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL2)的结合区域，(ii)第五结构域，其包含第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VH1)的结合区域，以及(iii)第六结构域，其包含至少一个半胱氨酸残基，第四和第五结构域被共价连接成使得第四和第五结构域不缔合形成表位结合位点；且其中每个双抗体分子的第一多肽链和第二多肽链共价连接，条件是该共价连接不是肽键；其中每个双抗体分子的第一结构域和第五结构域缔合形成结合第一表位的第一结合位点(VL1)(VH1)；其中每个双抗体分子的第二结构域和第四结构域缔合形成结合第二表位的第二结合位点(VL2)(VH2)。
又在另一个实施方式中，本发明涉及共价四特异性双抗体，所述双抗体是双抗体分子的二聚体，第一双抗体分子包含第一和第二多肽链，所述第一多肽链包含(i)第一结构域，其包含对第一表位特异性的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL1)的结合区域，(ii)第二结构域，其包含对第二表位特异性的第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VH2)的结合区域，以及(iii)第三结构域，其包含Fc结构域或其部分，所述第一和第二结构域被共价连接成使得第一和第二结构域不缔合形成表位结合位点，且其中第三结构域位于第一结构域和第二结构域的N末端；且所述第二多肽链包含(i)第四结构域，其包含第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL2)的结合区域，(ii)第五结构域，其包含第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VH1)的结合区域，以及(iii)第六结构域，其包含至少一个半胱氨酸残基，所述第四和第五结构域被共价连接成使得第四和第五结构域不缔合形成表位结合位点；且其中所述第一多肽链和第二多肽链共价连接，条件是该共价连接不是肽键；其中第一结构域和第五结构域缔合形成结合第一表位的第一结合位点(VL1)(VH1)；其中第二结构域和第四结构域缔合形成结合第二表位的第二结合位点(VL2)(VH2)；且第二双抗体分子包含第一和第二多肽链，所述第一多肽链包含(i)第一结构域，其包含对第三表位特异性的第三免疫球蛋白 的轻链可变结构域(VL3)的结合区域，(ii)第二结构域，其包含对第四表位特异性的第四免疫球蛋白的重链可变结构域(VH4)的结合区域，以及(iii)第三结构域，其包含Fc结构域或其部分，所述第一和第二结构域被共价连接成使得第一和第二结构域不缔合形成表位结合位点，且其中第三结构域位于第一结构域和第二结构域的N末端；且所述第二多肽链包含(i)第四结构域，其包含第四免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL4)的结合区域，(ii)第五结构域，其包含第三免疫球蛋白的重链可变结构域(VH3)的结合区域，以及(iii)第六结构域，其包含至少一个半胱氨酸残基，所述第四和第五结构域被共价连接成使得第四和第五结构域不缔合形成表位结合位点；且其中所述第一多肽链和第二多肽链共价连接，条件是该共价连接不是肽键；其中第一结构域和第五结构域缔合形成结合第三表位的第一结合位点(VL3)(VH3)；其中第二结构域和第四结构域缔合形成结合第四表位的第二结合位点(VL4)(VH4)。
如以上讨论的，单独的多肽链上的结构域共价连接。在特定的方面，第一和第二结构域、第一和第三结构域、第二和第三结构域、第四和第五结构域、第四和第六结构域、和/或第五和第六结构域之间的共价连接可以是肽键。特别地，第一和第二结构域以及第四和第五结构域可分别被第三和第六结构域，或被另外的氨基酸残基隔开，只要第一和第二以及第四和第五结构域不缔合形成结合位点。氨基酸残基的数目可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸残基。在一个优选的方面，结构域之间的氨基酸残基的数目是8。
在本发明的某些方面，第一和第二多肽链的包含Fc结构域的结构域，即，任选地，分别为第三和第六结构域，还可包含铰链结构域使得所述结构域包含铰链-Fc区。在替代实施方式中，第一多肽链或第二多肽链可包含铰链结构域而没有同样包含Fc结构域。用于本发明中的重链、轻链、铰链区、Fc结构域和/或铰链-Fc结构域可衍生自任何免疫球蛋白类型，包括IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在优选的方面，免疫球蛋白类型是IgG，或其任何亚型，即IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在其他方面，轻链和重链所来源的免疫球蛋白是人源化或嵌合的。
另外，双抗体或双抗体分子所结合的第一表位和第二表位，以及如果情况适用的话，第三表位和第四表位可以是来自同一抗原的不同表位或可以是来自不同抗原的不同表位。抗原可以是可对其产生抗体的任何分子。例如，蛋白质、核酸、细菌毒素、细胞表面标志、自身免疫标志、病毒蛋白质、药物等。在特别的方面，双抗体的至少一个表位结合位点是对特定细胞，例如B细胞、T细胞、吞噬细胞、自然杀伤(NK)细胞或树突状细胞上的抗原特异性的。
在该实施方式的某些方面，双抗体或双抗体分子的至少一个表位结合位点是对Fc受体特异性的，该Fc受体可以是活化性Fc受体或抑制性Fc受体。在特定的方面，Fc受体是Fcγ受体，且所述Fcγ受体是FcγRI、FcγRII或FcγRIII受体。在更优选的方面，FcγRIII受体是FcγRIIIA(CD16A)受体或FcγRIIIB(CD16B)受体，且更优选地，FcγRIII受体是FcγRIIIA(CD16A)受体。在另一个优选的方面，FcγRII受体是FcγRIIA(CD32A)受体或FcγRIIB(CD32B)受体，且更优选地，FcγRIIB(CD32B)受体。在特别优选的方面，双抗体的一个结合位点是对CD32B特异性的而另一个结合位点是对CD16A特异性的。在本发明的特定实施方式中，双抗体或双抗体分子的至少一个表位结合位点是对活化性Fc受体特异性的，而至少另一个位点是对抑制性Fc受体特异性的。在该实施方式的某些方面，所述活化性Fc受体是CD32A而所述抑制性Fc受体是CD32B。在该实施方式的其他方面，所述活化性Fc受体是BCR而所述抑制性Fc受体是CD32B。又在该实施方式的其他方面，所述活化性Fc受体是IgERI而所述抑制性Fc受体是CD32B。
在其中一个表位结合位点是对CD16A特异性的实例中，VL和VH结构域可与小鼠抗体3G8的VL和VH结构域相同或相似，3G8的序列已被克隆并在本文中列出。在其中一个表位结合位点是对CD32A特异性的其他实例中，VL和VH结构域可与小鼠抗体IV.3的VL和VH结构域相同或相似。又在其中一个表位结合位点是对CD32B特异性的其他实例中，VL和VH结构域可与小鼠抗体2B6的VL和VH结构域相同或相似，2B6的序列已被克隆并在本文中列出。应当理解，3G8、2B6和IV.3抗体的任 何VL或VH结构域中的任何一个可以以任何组合使用。本发明还涉及双特异性双抗体或双抗体分子，其中第一表位是对CD32B特异性的，且第二表位是对CD16A特异性的。
在其他方面，表位结合位点可以是对致病性抗原特异性的。如本文所用的，致病性抗原是参与特定病原性疾病包括癌症、传染病和自身免疫病的抗原。因此，致病性抗原可以是肿瘤抗原、细菌抗原、病毒抗原或自身免疫抗原。示例性的致病性抗原包括但不限于脂多糖，选自由来自人免疫缺陷病毒、腺病毒、呼吸道合胞体病毒、西尼罗病毒(例如E16和/或E53抗原)和肝炎病毒的病毒抗原组成的组的病毒抗原，核酸(DNA和RNA)及胶原。优选地，致病性抗原是中和抗原。在优选的方面，其中一个表位结合位点是对CD16A或CD32A特异性的，另一个表位结合位点是对不包括自身免疫抗原的致病性抗原特异性的。又在另一个优选的方面，其中一个表位结合位点是对CD32B特异性的，另一个表位结合位点是对任何致病性抗原特异性的。在特定实施方式中，本发明的双抗体分子结合同一细胞上的两个不同的抗原，一个抗原结合位点是对活化性Fc受体特异性的，而另一个是对抑制性Fc受体特异性的。在其他实施方式中，双抗体分子结合两个不同的病毒中和表位，例如但不限于西尼罗病毒的E16和E53。
又在本发明的另一个实施方式中，本发明的双抗体可用来治疗各种疾病和疾患。因此，本发明涉及用于治疗疾病或疾患的方法，该方法包括对需要其的患者施用有效量的本发明的共价双抗体或双抗体分子，其中至少一个结合位点是对致病性抗原，例如表达在癌细胞表面上或细菌或病毒粒子的表面上的抗原特异性的且至少一个其他结合位点是对Fc受体，例如CD16A特异性的。
又在另一个实施方式中，本发明涉及用于治疗疾病或疾患的方法，该方法包括对需要其的患者施用有效量的本发明的双抗体或双抗体分子，其中至少一个结合位点是对CD32B特异性的且至少一个其他结合位点是对CD16A特异性的。
又在另一个实施方式中，本发明涉及用于引发针对致病性抗原的免疫耐受的方法，该方法包括对需要其的患者施用有效量的本发明的共价双抗 体或共价双抗体分子，其中至少一个结合位点是对CD32B特异性的且至少一个其他结合位点是对所述致病性抗原特异性的。在该实施方式的方面中，致病性抗原可以是过敏原或期望对其的免疫耐受的另一种分子，例如移植的组织上表达的蛋白质。
又在另一个实施方式中，本发明涉及用于解毒的方法，该方法包括对需要其的患者施用有效量的本发明的共价双抗体或双抗体分子，其中至少一个结合位点是对细胞表面标志特异性的且至少一个其他结合位点是对毒素特异性的。在特定的方面，被施用的本发明的双抗体是这样一种，其中一个结合位点是对细胞表面标志例如Fc特异性的而另一个结合位点是对细菌毒素或对药物特异性的。一方面，未在红细胞上发现该细胞表面标志。
3.1定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语、符号和其他科学术语或用辞意在具有本发明所涉及领域的技术人员通常理解的相同含义。在某些情况中，本文为了清楚和/或为了易于引用定义了具有通常理解的含义的术语，且本文包括这些定义不应被必须解释为表示较本领域所通常理解的含义有显著差异。除非另外指明，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术。在文献，例如Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人，编辑，1999，包括遍及2001年的增刊)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人，编辑，1987，包括遍及2001年的增刊)；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版(Sambrook and Russel，2001)；PCR：The Polymerase Chain Reaction，(Mullis等人，编辑，1994)；The Immunoassay Handbook(D.Wild，编辑，Stockton Press NY，1994)；Bioconjugate Techniques(Greg T.Hermanson，编辑，Academic Press，1996)；Methods of Immunological Analysis(R.Masseyeff，W.H Albert，和N.A.Staines，编辑，Weinheim：VCH Verlags gesellschaft mbH，1993)，Harlow和Lane Using Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1999；及Beaucage等人编辑， Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley&Sons，Inc.，New York，2000)中详细地解释了这些技术。
如本文所用的，术语“抗体(antibody)”和抗体(antibodies)”是指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、多克隆抗体、骆驼化抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫键连接的双特异性Fv(sdFv)、胞内抗体(intrabody)和抗独特型(抗-Id)抗体(包括，例如针对本发明的抗体的抗-Id和抗-抗-Id抗体)，以及上述中任一种的表位结合片段。特别地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性片段，即包含抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
如本文所用的，术语“免疫特异性结合”、“免疫特异性识别”、“特异性结合”、“特异性识别”及类似术语是指特异性结合一种抗原(例如，表位或免疫复合体)且不特异性结合另一种分子的分子。特异性结合一种抗原的分子可以以如通过例如免疫测定、BIAcore或本领域已知的其他测定确定的较低的亲和力结合其他的肽或多肽。优选地，特异性结合一种抗原的分子不与其他蛋白质交叉反应。特异性结合一种抗原的分子可通过例如免疫测定、BIAcore或本领域技术人员已知的其他技术来鉴定。
如本文所用的，“免疫复合体”指当至少一种靶分子和至少一种包含异源性Fcγ区域的多肽彼此结合形成更大分子量的复合体时形成的结构。免疫复合体的实例是可为可溶的或颗粒状的抗原-抗体复合体(例如，细胞表面上的抗原/抗体复合体)。
如本文所用的，术语“重链”、“轻链”、“可变区”、“框架区”、“恒定结构域”及类似术语具有其在免疫学领域内的一般含义且指天然存在的免疫球蛋白中的结构域和合成(例如，重组)的结合蛋白质(例如，人源化抗体、单链抗体、嵌合抗体等)的对应结构域。天然存在的免疫球蛋白(例如，IgG)的基础结构单元是通常以约150,000Da的糖蛋白表达的具有两条轻链和两条重链的四聚体。每条链的氨基末端(“N”)部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端(“C”)部分界定了 恒定区，轻链具有单一的恒定结构域而重链通常具有三个恒定结构域和一个铰链区。因此，IgG分子的轻链结构是n-VL-CL-c而IgG重链的结构为n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c(其中H是铰链区)。IgG分子的可变区由互补决定区(CDR)组成，互补决定区包含与抗原接触的残基和称为框架区段的非CDR区段，框架区段通常保持结构并决定CDR环的定位(尽管某些框架残基也可接触抗原)。因此，VL和VH结构域具有结构n-FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4-c。
当提到结合蛋白质或抗体(如本文广义地定义的)时，对每个结构域的氨基酸分配是根据Kabat，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1987和1991)的定义。来自免疫球蛋白的成熟重链和轻链的可变区的氨基酸按照氨基酸在链中的位置指定。Kabat描述了抗体的许多氨基酸序列，确定了对于每个亚组的氨基酸共有序列，并为每个氨基酸分配了残基编号。通过将讨论中的抗体与Kabat中的一种共有序列比对经参考保守氨基酸，Kabat的编号方案可延伸到未包括在其纲要中的该抗体。这种用于分配残基编号的方法已成为该领域内的标准且易于鉴定处于不同抗体，包括嵌合变体和人源化变体中的等效位置处的氨基酸。例如，人抗体轻链的位置50处的氨基酸占据了与小鼠抗体轻链的位置50处的氨基酸等效的位置。
如本文所用的，术语“重链”用来定义IgG抗体的重链。在完整的天然IgG中，重链包含免疫球蛋白的结构域VH、CH1、铰链、CH2和CH3。遍布本说明书，残基在IgG重链中的编号是被明确地通过引用并入本文的Kabat等人，Sequence of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，NH1，MD(1991)中EU索引的编号。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1EU抗体的编号。包含人IgG1铰链区、CH2和CH3结构域的氨基酸序列的实例被示出在如下文描述的图1A和1B中。图1A和1B还列出了IgG2、IgG3和IgG4的铰链区、CH2和CH3结构域的氨基酸序列。通过将形成重链间S-S键的各自的铰链区的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于相同位置来比对IgG2、IgG3和IgG4同种型的氨基酸序列与IgG1的序列。对于IgG2和IgG3铰链区，并不是所有残基都由EU索引编号。
“铰链区”或“铰链结构域”通常被定义为从人IgG1的Glu216延伸到Pro230。人IgG1铰链区的氨基酸序列的实例被示出在图1A(图1A中的氨基酸残基根据Kabat系统编号)中。可通过将形成重链间S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于相同位置来比对其他IgG同种型的铰链区与IgG1的序列，如图1A中所示。
如本文所用的，术语“Fc区”、“Fc结构域”或类似的术语用来定义IgG重链的C末端区域。图1B中示出了包含人IgG1的氨基酸序列的实例。如根据Kabat系统所编号的，虽然边界可以略微不同，但是Fc结构域从氨基酸231延伸到氨基酸447(图1B中的氨基酸残基根据Kabat系统编号)。图1B还提供了IgG同种型IgG2、IgG3和IgG4的Fc区的氨基酸序列的实例。
IgG的Fc区包含两个恒定结构域，CH2和CH3。根据Kabat的编号系统，人IgG Fc区的CH2结构域通常从氨基酸231延伸到氨基酸341(图1B)。根据Kabat的编号系统，人IgG Fc区的CH3结构域通常从氨基酸342延伸到氨基酸447(图1B)。人IgG Fc区的CH2结构域(也称为“Cγ2”结构域)是独特的，因为其不与另一个结构域紧密配对。更确切地，两个N连接的支链碳水化合物链被插入在完整的天然IgG的两个CH2结构域之间。
如本文所用的，术语“FcγR结合蛋白质”、“FcγR抗体”和“抗-FcγR抗体”互换地使用并指各种免疫球蛋白样蛋白质或免疫球蛋白衍生的蛋白质。“FcγR结合蛋白”通过与VL和/或VH结构域的相互作用结合FcγR(如与Fcγ-介导的结合不同)。FcγR结合蛋白的实例包括完全的人抗体、多克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体(例如，包含2条重链和2条轻链)，其片段(例如，Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段)、双功能和多功能抗体(参见，例如，Lanzavecchia等人(1987)“The Use Of Hybrid Hybridomas To Target Human Cytotoxic T Lymphocytes，”Eur.J.Immunol.17：105-111)、单链抗体(参见，例如，Bird等人(1988)“Single-Chain Antigen-Binding Proteins，”Science242：423-26)、融合蛋白(例如，噬菌体展示融合蛋白)、“微型抗体”(参见例如美国专利第5,837,821号)以及包含VL和/或VH结构域或其片段的其他抗原结合蛋白。一方面，FcγRIIIA结合蛋白是“四聚体抗体”即，通常具有天然存在的IgG的结构且包含可变结构域和恒定结构域，即两条轻链包含 VL结构域和轻链恒定结构域而两条重链包含VH结构域和重链铰链结构域和恒定结构域。
如本文所用的，术语“FcγR拮抗剂”以及类似的术语指蛋白质和非蛋白质物质，包括拮抗FcγR的至少一种生物学活性，例如阻断信号传导的小分子。例如，本发明的分子通过阻断IgG与FcγR的结合来阻断信号传导。
如本文所用的，多肽或蛋白质背景下的术语“衍生物”指包含已通过引入氨基酸残基置换、缺失或添加而被改变的氨基酸序列的多肽或蛋白质。如本文所用的术语“衍生物”还指已被修饰的多肽或蛋白质，即通过将任何类型的分子共价连接到该多肽或蛋白质。例如但非限制性地，抗体可例如，通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封端基团衍生、蛋白酶裂解、连接到细胞内抗原或其他蛋白质等而被修饰。衍生多肽或蛋白质可使用本领域技术人员已知的技术，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、代谢合成衣霉素等通过化学修饰产生。另外，衍生多肽或蛋白质衍生物具有与其所来源的多肽或蛋白质相似或相同的功能。
如本文所用的，非蛋白质衍生物背景下的术语“衍生物”指基于第一有机或无机分子的结构形成的第二有机或无机分子。有机分子的衍生物包括但不限于例如通过添加或去除羟基、甲基、乙基、羧基或胺基而被修饰的分子。有机分子还可被酯化、烷基化和/或磷酸化。
如本文所用的，术语“双抗体分子”指各自包含至少一个VL结构域和一个VH结构域或其片段的两种或更多种多肽链或蛋白质的复合体，其中两种结构域都被包含在单一多肽链内。在某些实施方式中，“双抗体分子”包括包含Fc或铰链-Fc结构域的分子。复合体中的所述多肽链可以是相同或不同的，即双抗体分子可以是同多聚体(homo-multimer)或异多聚体(hetero-multimer)。在特定的方面，“双抗体分子”包括二聚体或四聚体或包含VL和VH结构域的所述多肽链。构成多聚体蛋白质的单独的多肽链可通过链间二硫键被共价连接到该多聚体的至少一种其他多肽。
如本文所用的，术语“疾患”和“疾病”被互换地使用来指受治疗者的病症。特别地，术语“自身免疫病”与术语“自身免疫疾患”互换地使用来指通 过由受治疗者与其自身的细胞、组织和/或器官的免疫反应引起的以所述细胞、组织和/或器官损伤为特征的该受治疗者的病症。术语“炎性疾病”与术语“炎性疾患”互换地使用来指以炎症，优选地慢性炎症为特征的受治疗者的病症。自身免疫疾患可能与炎症有关或可能与炎症无关。此外，炎症可能由自身免疫疾患引起或可能不是由自身免疫疾患引起。因此，某些疾患可被表征为自身免疫疾患和炎性疾患两者。
如本文所用的“相同的多肽链”还指具有几乎相同的氨基酸序列的多肽链，例如，包括具有一个或多个氨基酸差异，优选地，保守氨基酸置换的链，使得两条多肽链的活性不明显不同。
如本文所用的，术语“癌症”指由细胞的异常的、不受控制的生长引起的赘生物或肿瘤。如本文所用的，癌症明确地包括白血病和淋巴瘤。在某些实施方式中，癌症指保持在局部的良性肿瘤。在其他实施方式中，癌症指已侵入并破坏相邻的身体结构并散布到远距离部位的恶性肿瘤。在某些实施方式中，癌症与特定的癌症抗原有关。
如本文所用的，术语“免疫调节剂”及其变化形式指调节宿主免疫系统的剂。在某些实施方式中，免疫调节剂是免疫抑制剂。在某些其他实施方式中，免疫调节剂是免疫刺激剂。免疫调节剂包括但不限于小分子、肽、多肽、融合蛋白、抗体、无机分子、模拟物(mimetic agent)和有机分子。
如本文所用的，术语“表位”指在动物优选地在哺乳动物，且最优选地在人体内具有抗原或免疫原活性的多肽或蛋白质或非蛋白质分子的片段。具有免疫原活性的表位是在动物体内引发抗体反应的多肽或蛋白质的片段。具有抗原活性的表位是抗体免疫特异性结合的多肽或蛋白质的片段，所述结合通过本领域技术人员熟知的任何方法，例如通过免疫测定来确定。抗原表位不一定必须是免疫原性的。
如本文所用的，术语“片段”指包含另一种多肽的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续 氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列的肽或多肽。在特定的实施方式中，多肽片段保留该多肽的至少一种功能。
如本文所用的，术语“核酸”和“核苷酸序列”包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、DNA和RNA分子的组合或杂交DNA/RNA分子以及DNA或RNA分子的类似物。这些类似物可使用例如包括但不限于肌苷或三苯甲基化的碱基的核苷酸类似物产生。这些类似物还可包含DNA或RNA分子，所述DNA或RNA分子包含为该分子增添有益特性例如诸如核酸酶抗性或增加的穿过细胞膜的能力的被修饰的骨架。核酸或核苷酸序列可以是单链的、双链的，可包含单链和双链部分，且可包含三链部分，但优选地是双链DNA。
如本文所用的，“治疗有效量”指足以治疗或控制疾病或疾患的治疗剂的量。治疗有效量可以指足以延迟疾病的发作或将疾病的发作降至最低，例如延迟癌症的蔓延或将癌症的蔓延降至最低的治疗剂的量。治疗有效量还可以指在疾病的治疗或控制中提供治疗性益处的治疗剂的量。另外，关于本发明的治疗剂的治疗有效量是指在疾病的治疗或控制中提供治疗性益处的单独的治疗剂或与其他治疗组合的治疗剂的量。
如本文所用的，术语“预防剂(prophylactic agent)”和“预防剂(prophylactic agents)”是指可用于预防疾患，或预防疾患的复发或蔓延的任何剂。预防有效量可指足以预防高度增生性疾病特别是癌症的复发或蔓延或这些疾病在患者，包括但不限于易患高度增生性疾病的患者，例如遗传学上易患癌症或之前被暴露于致癌物的患者体内的复发的预防剂的量。预防有效量还可以指在疾病的预防中提供预防性益处的预防剂的量。另外，关于本发明的预防剂的预防有效量是指在疾病的预防或控制中提供预防性益处的单独的预防剂或与其他治疗组合的预防剂的量。
如本文所用的，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”指由于施用预防剂或治疗剂而预防受治疗者的疾患的一种或多种症状的复发或发作。
如本文所用的，术语“组合地”指使用多于一种的预防和/或治疗剂。使用术语“组合地”不限制向患有疾患的受治疗者施用预防和/或治疗剂的顺序。第一预防剂或治疗剂可在对患有疾患的受治疗者施用第二预防剂或治疗剂之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、与之同时或在其之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用。
如本文所用的“效应功能”是指由抗体的Fc区与Fc受体或抗原的相互作用导致的生物化学事件。效应功能包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和补体依赖的细胞毒性(CDC)。效应功能包括在结合抗原之后执行的功能和独立于抗原结合执行的功能。
如本文所用的“效应细胞”是指表达一种或多种Fc受体并介导一种或多种效应功能的免疫系统的细胞。效应细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、中性白细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞、自然杀伤(NK)细胞，且可来自任何生物体包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。
如本文所用的，术语“特异性结合免疫复合体”及类似术语是指特异性结合一种免疫复合体且不特异性结合另一种分子的分子。特异性结合一种免疫复合体的分子可以以如通过例如免疫测定、BIAcore或本领域已知的其他测定确定的较低的亲和力结合其他肽或多肽。优选地，特异性结合一种免疫复合体的分子不与其他蛋白质交叉反应。特异性结合一种免疫复合体的分子可通过例如免疫测定、BIAcore或本领域技术人员已知的其他技术鉴定。
如本文所用的“稳定的融合蛋白”指在生产和/或储存期间经历使用本领域技术人员已知的常见生化和功能测定所评价的最小至不可检测的水平的降解且可被储存用于延长的时期而没有生物学活性，例如FcγR结合 方面的损失的融合蛋白。
4.附图简述
图1A-B 人IgG CH1、铰链区和Fc区的氨基酸序列
图1提供了IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的铰链(A)结构域和Fc(B)结构域的氨基酸序列。(IgG1铰链结构域(SEQ ID NO：1)；IgG2铰链结构域(SEQ ID NO：2)；IgG3铰链结构域(SEQ ID NO：3)；IgG4铰链结构域(SEQ ID NO：4)；IgG1Fc结构域(SEQ ID NO：5)；IgG2Fc结构域(SEQ ID NO：6)；IgG3Fc结构域(SEQ ID NO：7)；IgG1Fc结构域(SEQ ID NO：8))。图1A和1B中所示的氨基酸残基根据Kabat EU编号系统编号。通过将形成重链间S-S键的各自的铰链区的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于相同位置来比对同种型的序列与IgG1的序列。对于图1B，CH2结构域中的残基用+表示，而CH3结构域中的残基用～表示。
图2 共价双功能双抗体的多肽链的图示呈现
共价、双功能双抗体的多肽由被短肽接头隔开的抗体VL结构域和抗体VH结构域组成。8个氨基酸残基的接头防止单一多肽链自身组装成scFv构建体，并且，代替地，不同多肽链的VL和VH结构域之间的相互作用占主导。制备了4种构建体(每个构建体从该构建体左侧的氨基末端(“n”)向图右侧的羧基末端(“c”)描述)：构建体(1)(SEQ ID NO：9)，包含n-Hu2B6的VL结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu3G8的VH结构域-及C-末端序列(LGGC)-c；构建体(2)(SEQ ID NO：11)包含n-Hu3G8的VL结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu2B6的VH结构域-及C-末端序列(LGGC)-c；构建体(3)(SEQ ID NO：12)包含n-Hu3G8的VL结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu3G8的VH结构域-及C-末端序列(LGGC)-c；构建体(4)(SEQ ID NO：13)，包含n-Hu2B6的VL结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu2B6的VH结构域-及C-末端序列(LGGC)-c。
图3 亲和纯化的双抗体的SDS-PAGE分析
在还原(泳道1-3)或非还原(泳道4-6)条件下对亲和纯化的双抗体进行SDS-PAGE分析。指出了标准物(位于泳道3和4之间)的大致分子量。泳道1和4，h3G8CMD；泳道2和5，h2B6CMD；及泳道3和6，h2B6-h3G8CBD。
图4A-B 亲和纯化的双抗体的SEC分析
对亲和纯化的双抗体进行SEC分析。(A)已知标准物的洗脱曲线：全长IgG(～150kDa)，IgG的Fab片段(～50kDa)，及scFv(～30kDa)；(B)h2b6CMD、h3G8CMD和h2B6-h3G8CBD的洗脱曲线。
图5 h2B6-h3G8CBD与sCD32B和sCD16A的结合
在夹心ELISA中测定h2B6-h3G8CBD与sCD32B和sCD16A的结合。sCD32B用作靶蛋白。第二探针是HRP偶联的sCD16A。结合CD16A的h3G8CMD用作对照。
图6A-C 双抗体与sCD16A、sCD32B以及sCD32B结合的BIACORE分析
h2B6-h3G8CBD、h2B6CMD和h3G8CMD与sCD16A、sCD32B和sCD32A(阴性对照)的结合通过SPR分析来测定。还测试了作为对照的h3G8scFv。(A)与sCD16的结合；(B)与sCD32B的结合以及(C)与sCD32A的结合。将100NM浓度的双抗体，并将200nM浓度的scFv以50ml/min的流速注射到受体表面上，持续60sec。
图7A-C 双抗体与sCD16A及sCD32B结合的BIACORE分析
h2B6-h3G8CBD、h2B6CMD和h3G8CMD与sCD16A和sCD32B的结合通过SPR分析来测定。还测试了作为对照的h3G8scFv。(A)h3G8CMD与sCD16A的结合；(B)h2B6-h3G8CBD与sCD16A的结合；(C)h3G8scFv与sCD16A的结合；(D)h2B6CMD与sCD32B的结合；以及(E)h2B6-h3G8CBD与sCD32B的结合。将6.25-200nM浓度的双抗体以70ml/min的流速注射到受体表面上，持续180sec。
图8 描绘包含VL和VH结构域的多肽链形成共价双特异性双抗体分子的相互作用的图示
NH2和COOH分别表示每条多肽链的氨基末端和羧基末端。S表示每条多肽链上的C-末端半胱氨酸残基。VL和VH分别表示轻链可变结构域和重链可变结构域。点划线和短划线是为了区分两条多肽链且，特别地，表示所述链的接头部分。h2B6Fv和h3G8Fv分别表示对CD32B和CD16特异性的表位结合位点。
图9 共价双特异性双抗体的包含Fc结构域的多肽链的图示呈现
呈现了本发明的双抗体分子的多肽构建体(每个构建体从该构建体左侧的氨基末端(“n”)向图右侧的羧基末端(“c”)描述)。构建体(5)(SEQ ID NO：14)，包含n-Hu2B6的VL结构域-第一接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu3G8的VH结构域-第二接头(LGGC)-及人IgG1的C-末端Fc结构域-c；构建体(6)(SEQ ID NO：15)包含n-Hu3G8的VL结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu2B6的VH结构域-及第二接头(LGGC)-及人IgG1的C-末端Fc结构域-c；构建体(7)(SEQ ID NO：16)，包含n-Hu2B6的VL结构域-第一接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu3G8的VH结构域-及C-末端序列(LGGCFNRGEC)(SEQ ID NO：17)-c；构建体(8)(SEQ ID NO：18)包含n-Hu3G8的VL结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu2B6的VH结构域-及第二接头(LGGC)-及人IgG1的C-末端铰链/Fc结构域(具有氨基酸置换A215V)-c。
图10 包含Fc结构域的双抗体分子与sCD32B和sCD16A的结合
在夹心ELISA中测定包含Fc结构域的双抗体分子与sCD32B和sCD16A的结合。通过3种重组表达系统产生待测定的双抗体：分别表达构建体1和6的pMGX669和pMGX674的共转染；分别表达构建体2和5的pMGX667和pMGX676的共转染；和分别表达构建体5和6的pMGX674和pMGX676的共转染。sCD32B用作靶蛋白。第二探针是HRP偶联的sCD16A。
图11 描绘各自包含Fc结构域的两条多肽链形成二价共价双抗体的相互作用的图示
NH2和COOH分别表示每条多肽链的氨基末端和羧基末端。S表示每 条多肽链的第二接头序列中的半胱氨酸残基之间的至少一个二硫键。VL和VH分别指示轻链可变结构域和重链可变结构域。点划线和短划线是为了区分两条多肽链且，特别地为了表示所述链的第一接头部分。CH2和CH3表示Fc结构域的CH2和CH3恒定结构域。h2B6Fv和h3G8Fv分别指示对CD32B和CD16特异性的表位结合位点。
图12 包含铰链/Fc结构域的双抗体分子与sCD32B和sCD16A的结合
在夹心ELISA中测定包含Fc结构域的双抗体分子与sCD32B和sCD16A的结合。通过4种重组表达系统产生待测定的双抗体：分别表达构建体1和6的pMGX669+pMGX674的共转染；分别表达构建体2和8的pMGX669+pMGX678的共转染；分别表达构建体7和6的pMGX677+pMGX674的共转染；以及分别表达构建体7和8的pMGX677+pMGX678的共转染。sCD32B用作靶蛋白。第二探针是HRP偶联的sCD16A。
图13 描绘多肽链形成四聚体双抗体分子的相互作用的图示
NH2和COOH分别表示每条多肽链的氨基末端和羧基末端。S表示具有Fc的‘较重的’多肽链的第二接头序列中的半胱氨酸残基和不具有Fc的‘较轻的’多肽链的C末端序列中的半胱氨酸残基之间的至少一个二硫键。VL和VH分别表示轻链可变结构域和重链可变结构域。点划线和短划线是为了区分多肽链且，特别地为了表示所述较重的链的第一接头部分或所述较轻的链的接头。CH2和CH3表示Fc结构域的CH2和CH3恒定结构域。h2B6Fv和h3G8Fv分别表示对CD32B和CD16特异性的表位结合位点。
图14 形成共价双特异性双抗体的包含Fc结构域的多肽链的图示呈现
呈现了形成本发明的双抗体分子的多肽构建体(每个构建体从该构建体左侧的氨基末端(“n”)向图右侧的羧基末端(“c”)描述)。构建体(9)(SEQ ID NO：19)包含n-人IgG1的铰链/Fc结构域-Hu3G8的VL结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10)-Hu2B6的VH结构域-接头 (GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-及C末端LGGC序列-c；构建体(10)(SEQ ID NO：20)包含n-人IgG1的Fc结构域-Hu3G8的VL结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10)-Hu2B6的VH结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-及C-末端LGGC序列-c；构建体(11)(SEQ ID NO：21)包含n-Hu2B6的VL结构域(G105C)-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu3G8的VH结构域-及具有氨基酸置换A215V的人IgG1的C末端铰链/Fc结构域-c；构建体(12)(SEQ ID NO：22)包含n-VL结构域Hu3G8-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu2B6的VH结构域(G44C)-及C-末端FNRGEC(SEQ ID NO：23)序列-c。
图15A-B 亲和四聚体双抗体的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析
对通过共转染表达构建体10和1、构建体9和1以及构建体11和12的载体的重组表达系统产生的双抗体进行非还原条件下的SDS-PAGE分析(A)和使用山羊抗人IgG1H+L作为探针的蛋白质印迹分析(B)。通过Simply Blue Safestain(Invitrogen)观察SDS-PAGE凝胶中的蛋白质。对于图A和B，包含构建体10和1、构建体9和1以及构建体11和12的双抗体分子分别在泳道1、2和3中。
图16 包含Fc结构域和构建的链间二硫键的双抗体分子与sCD32B和sCD16A的结合
在夹心ELISA中测定包含Fc结构域和被构建在‘较轻’和‘较重’的多肽链之间的二硫键的双抗体分子与sCD32B和sCD16A的结合。分别通过3种重组表达系统产生待测定的双抗体：表达构建体1和10、表达构建体1和9以及表达构建体11和12。sCD32B用作靶蛋白。第二探针是HRP偶联的sCD16A。对h3G8的结合用作对照。
图17 双抗体分子的多蛋白前体的图示呈现和包含λ轻链和/或铰链结构域的多肽链的图示呈现
呈现了包含本发明的双抗体分子的多肽构建体(每个构建体从该构建体左侧的氨基末端(“n”)向图右侧的羧基末端(“c”)描述)。构建体(13)(SEQ ID NO：95)包含n-3G8的VL结构域-第一接头(GGGSGGGG(SEQ ID  NO：10))-2.4G2VH的VH结构域-第二接头(LGGC)-弗林蛋白酶识别位点(RAKR(SEQ ID NO：93))-2.4G2的VL结构域-第三接头(GGGSGGG(SEQ ID NO：10)-3G8的VH结构域-及C末端LGGC结构域；(编码SEQ ID NO：95的核苷酸序列被提供在SEQ ID NO：96中)。构建体(14)(SEQ ID NO：97)包含n-3G8的VL结构域-第一接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-2.4G2VH的VH结构域-第二接头(LGGC)-弗林蛋白酶识别位点(RAKR(SEQ ID NO：93))-FMD(口蹄疫病毒蛋白酶C3)位点-2.4G2的VL结构域-第三接头(GGGSGGG(SEQ ID NO：10)-3G8的VH结构域-及C末端LGGC结构域；(编码SEQ ID NO：97的核苷酸序列被提供在SEQ ID NO：98中)。构建体(15)(SEQ ID NO：99)包含n-Hu2B6的VL结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10)-Hu3G8的VH结构域-及C末端FNRGEC(SEQ ID NO：23)结构域；(编码SEQ ID NO：99的核苷酸序列被提供在SEQ ID NO：100中)。构建体(16)(SEQ ID NO：101)包含n-Hu3G8的VL结构域-接头(GGGSGGGG(SEQ ID NO：10))-Hu2B6的VH结构域-及C末端VEPKSC(SEQ ID NO：77)结构域；(编码SEQ ID NO：101的核苷酸序列被提供在SEQ ID NO：102中)。
图18 衍生自多蛋白前体分子的双抗体分子与mCD32B和sCD16A的结合
在夹心ELISA中测定衍生自多蛋白前体分子构建体13(SEQ ID NO：95)的双抗体分子与鼠CD32B(mCD32B)和可溶性CD16A(sCD16A)的结合。mCD32B用作靶蛋白。第二探针是生物素偶联的sCD16A。
图19 包含λ链和/或铰链结构域的双抗体分子与sCD32B和sCD16A的结合
在夹心ELISA中测定包含衍生自人λ轻链的C末端和/或IgG的铰链结构域的结构域的双抗体分子与sCD32B和sCD16A的结合并与包含构建体1和2的双抗体比较(图5)。待测定的双抗体通过表达构建体15和16(分别是SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：101)的重组表达系统产生。sCD32B用作靶蛋白。第二探针是HRP偶联的sCD16A。带有小方框的柱表示构建体15/16的组合，而带有大方框的柱表示构建体1/2的组合。
图20 结合到位于细胞表面的CD32B和荧光素偶联的分子的2B6/4420DART的图示呈现。
示意图表明了DART的“通用衔接子(universal adaptor)”的抗荧光素臂的柔性以及用其他特异性部分置换2B6臂的可能性。V-区域被示为框，GGGSGGGG(SEQ ID NO：10)接头被示为直线，二硫键被示为连接两条链。一条链的组成成分被示为蓝色而另一条链的组成成分被着色为粉色。N，氨基末端；C，羧基末端；FL，荧光素，VL，轻链可变区；VH，重链可变区。
图21(图A和B) 2B6/4420DART特异性结合荧光素偶联的分子且可同时结合CD32B。
(A)2B6/4420或2B6/3G8被结合到包被有FITC-S蛋白质的ELISA平板。2B6臂的结合和功能通过缔合可溶性CD32B，接下来是对CD32B特异性的抗体和偶联到HRP的检测性二抗来检测。(B)2B6/4420或2B6/3G8被结合到包被有HuIgG或FITC-HuIgG(偶联荧光素的)的ELISA平板。通过与对2B6Fv特异性的多克隆血清，接下来与HRP-偶联的二抗的缔合检测结合。
图22(图A和B) 使用抗人CD79B抗体活化纯化的B细胞。
使用渐增浓度的FITC-偶联的抗-人CD79b抗体CB3.1-FITC(A)或CB3.2-FITC(B)及50μg/ml的GAM IgG Fc特异性的F(ab’)2片段(x-轴)活化纯化的B细胞。在PBS(白色柱)或5μg/ml的αFITCαCD32BDART(黑色柱)或αCD16αCD32BDART(灰色柱)的存在下活化B细胞。一式三份地进行反应并计算标准差。
图23(图A和B) 纯化的B细胞的活化
如图22，图B中描述地活化来自第二健康供体的纯化的B细胞。测量在FITC-偶联的抗CD79b抗体CB3.2-FITC(A)的存在下活化的细胞中的增殖指数并与在未标记的CB3.2抗体(B)存在下活化的细胞的增殖指数比较。
图24(上图和下图) 使用MGD261体内去除HCD16A/B转基因小鼠的 小鼠B细胞
在第0、3、7、10、14和17天时对来自MacroGenics繁殖群体的mCD32-/-hCD16A+C57Bl/6、mCD32-/-hCD32B+C57Bl/6和mCD32-/-hCD16A+hCD32B+C57Bl/6小鼠注射MGD261(10、3、1或0.3mg/kg)或无关抗体(hE1610mg/kg)。在第-19(取血前)、4、11、18、25和32天收集血液以便FACS分析。每周三次地记录动物的健康和活动。上图：h2B6-3G8和WNV mAb；下图：h2B6-3G8-hCD16A或h2B6-3G8-hCD32B小鼠和WNV mAb-hCD16A或WNV mAb-hCD32B小鼠。
图25 使用2.4G2-3G8DB体内去除HCD16A/B转基因小鼠的小鼠B细胞
在第0、2、4、7、9、11、14、16和18天时对来自MacroGenics繁殖群体的mCD16-/-、mCD16-/-hCD16A+C57Bl/6、mCD16-/-hCD16B+和mCD16-/-hCD16A+hCD16B+小鼠IP注射2.4G2-3G8DB(75μg/小鼠)或PBS。在第-10(取血前)、4、11和18天收集血液以便FACS分析。每周三次地记录动物的健康和活动。
图26 使用人肿瘤细胞系RAJI的静脉内(IV)模型证实MGD261的抗肿瘤活性
在第0天对来自MacroGenics繁殖群体的12-20周龄的mCD16-/-、hCD16A+、RAG1-/-C57Bl/6小鼠注射5x106Raji细胞。在第6、9、13、16、20、23、27和30天时，另外用250、25或2.5ug MGD261或用PBS(阴性对照)经腹膜内(IP)处理小鼠。然后每天观察小鼠并一周两次地记录体重。处死发展后腿瘫痪的小鼠。
图27 DART在非哺乳动物宿主中的表达
用pET25b(+)T7-lac+3G8/3G8质粒转化BL21DE3细胞(Novagen)并使用amp-抗性的集落来接种肉汤培养物。当培养物达到0.5OD600单位时，加入0.5mM IPTG来诱导表达。使培养物在30℃下生长2小时并收集无细胞培养基。
图28 DART ELISA
使用96-孔Maxisorp平板进行h3G8-h3G8DART结合ELISA。反应后，用PBS-T洗涤平板三次并用80μl/孔的TMB底物显色。孵育5分钟后，通过40μl/孔的1％H2SO4终止反应。使用96-孔读板机和SOFTmax软件读取OD450nm。使用GraphPadPrism3.03软件对读出值作图。
图29 DART-诱导的人B-细胞死亡
将人PBMC与指定分子一起孵育过夜。通过FACS分析将凋亡测定为B细胞的PI+膜联蛋白-V+群体(CD20+细胞)占总的FSC/SSC未门控(ungated)的群体的百分比。
图30 8B5-CB3.1DART构建体
制备了多种8B5-CB3.1DART构建体来阐述本发明。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)将编码构建体5和6，或6和7，或8和9，或9和10的表达质粒共转染到HEK-293细胞中以表达含有或不含抗flag标签的8B5-CB3.1DART。每隔两天收集条件培养基，持续三次。然后使用CD32B亲和柱纯化条件培养基。
图31 8B5-CB3.1DART ELISA
使用96-孔Maxisorp平板进行8B5-CB3.1DART/ch8B5竞争ELISA。反应后，用PBS-T洗涤平板三次并用80μl/孔的TMB底物显色。孵育5分钟后，通过40μl/孔的1％H2SO4终止反应。使用96-孔读板机和SOFTmax软件读取OD450nm。使用GraphPadPrism3.03软件对读出值作图。
图32 四价DART结构的图解阐释
示出了通过四条多肽链的组装产生的DART物质的一般结构。Ig-样DART的四个抗原结合结构域被示为带斜线且深灰色的椭圆。
图33 Ig-样四价DART
提供了Ig-样四价DART的表位结合位点的图示。
图34 mCD32-hCD16A结合ELISA
提供了ELISA的结果，该结果表明实施例6.10的Ig样四价DART物质以比对照(ch-mCD32mAb)抗体或其他DART物质更大的亲和力结合抗 原。
图35 Ig DART分子的图示示例
提供了IgDART分子的图示。由阴影、带图案或白色着色的区域表示特异性，恒定区被示为黑色，且二硫键由黑色点划线表示。所有蛋白质链的N末端朝图的顶部取向，而所有蛋白质链的C末端朝图的底部取向。示例A-E是双特异性的而示例F-J是三特异性的。示例A和E是四价的。示例B、C、F、I和J是六价的。示例D、G和H是八价的。参考图1、2、9、14和17并参考3.1部分以获得对单独结构域的详细描述。
图36 HU2B64.5-HU3G85.1双特异性双抗体的结合能力
图36示出了相对于Hu2B64.5或Hu3G85.1双抗体(三角形)Hu2B64.5-Hu3G85.1双特异性抗体(正方形)结合CD32b和CD16a的能力。
图37 E-卷曲和K-卷曲DART衍生物的图示 
图37示出了E-卷曲和K-卷曲DART衍生物的一般构象。
图38 优选的E-卷曲和K-卷曲分隔物的螺旋排列
图38示出了优选的“E-卷曲”序列(EVAALEK)4(SEQ ID NO：299)和优选的“K-卷曲”序列(KVAALKE)4(SEQ ID NO：300)的螺旋排列。
图39 包含E-卷曲和K-卷曲Fc的DART衍生物
图39示出了可通过链交换形成的不同种类的包含E-卷曲和K-卷曲Fc的DART衍生物。
图40 对h2B6YAhCB3DART的E-卷曲和/或K-卷曲衍生物和包含E-卷曲和/或K-卷曲Fc的衍生物的尺寸排阻层析
图40示出了h2B6YAhCB3DART的E-卷曲和/或K-卷曲衍生物和包含E-卷曲和/或K-卷曲Fc的衍生物的尺寸排阻层析的结果。分析了四种这类分子；都具有E卷曲和K卷曲：EK(无Fc区)，2.1mg；EFc/K(Fc连接到E卷曲)，2.7mg；E/KFc(Fc连接到K卷曲)，1.8mg；EFc/KFc(Fc连接到同一DART的K卷曲和E卷曲)，2.0mg。
图41 所产生的二聚体分子的结构
图41示出了在图40的尺寸排阻层析中鉴定到的所产生的二聚体分子的可能结构。
图42 对h2B6YAhCB3DART的E-卷曲和/或K-卷曲衍生物和包含E-卷曲和/或K-卷曲Fc的衍生物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
图42示出了从h2B6YAhCB3DART的E-卷曲和/或K-卷曲衍生物和包含E-卷曲和/或K-卷曲Fc的衍生物的尺寸排阻层析获得的级分的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的结果。旁侧泳道：分子量标准参照物对照；泳道1：EK(无Fc区)；泳道2：EFc/K，聚集物级分；泳道3：EFc/K，单体级分；泳道4：E/KFc，聚集物级分；泳道5：E/KFc，单体级分；泳道6：EFc/KFc，聚集物级分；泳道7：EFc/KFc，二聚体级分；泳道8：EFc/KFc，单体级分。
图43 双特异性结合ELISA分析
图43示出了双特异性结合ELISA分析的结果，比较了包含E-卷曲/K-卷曲Fc的h2B6YAhCB3DART衍生物(EFc/K或E/KFc)、h2B6YAhCB3DART、对照和EFc/KFc h2B6YAhCB3DART衍生物。
图44 h2B6YAhCB3DART的E-卷曲和/或K-卷曲衍生物和包含E-卷曲和/或K-卷曲Fc的衍生物抑制T细胞增殖的能力
图44示出了h2B6YAhCB3DART的E-卷曲和/或K-卷曲衍生物和包含E-卷曲和/或K-卷曲Fc的衍生物抑制T细胞增殖的能力。
图45 hCD16-hCD32B ABD-DART
图45示出了重组抗体分子hCD16-hCD32B ABD-DART的图示，其包括被融合到与hCD16和hCD32B抗原免疫反应性的重组双特异性DART的链球菌G蛋白的ABD3结构域。
图46A-46J hCD16-hCD32B ABD-DART的结合亲和力
用2μg/mL浓度的CD16抗原(图46A)或人血清白蛋白(图46B)包被ELISA平板。始于2μg/mL的不同浓度的hCD16-hCD32B ABD-DART(■) 和对照hCD16-hCD32B DART(○)被结合。将生物素化的sCD32B抗原加至平板，接下来加入HRP偶联的链霉亲和素以便检测。图46C表明ABD-DART分子能够同时结合CD32B、CD16A和HSA。图46D-46I表明发现hCD16-hCD32B ABD-DART及其ABD融合衍生物显示出等效地结合可溶性CD32B(sCD32B)和可溶性CD16A(158F)(sCD16A)。图46J表明DART ABD融合物保留了对其亲本DART的双特异性结合并显示出不受人血清白蛋白的存在影响的对sCD16A和CD32B的结合。
图47A/47B DART蛋白质的细胞毒性
图47A表明了PBMC介导的DART蛋白质的细胞毒性。使用与作为效应细胞的PBMC一起孵育的人B细胞系Daudi作为靶细胞进行ADCC测定。以20∶1的效应子与靶的比和抗体：hCD16A-hCD32B DART(●)和hCD16A-hCD32B ABD DART(■)的滴度一式三份地进行单独的测定。通过LDH释放测定测量细胞介导的细胞毒性。在100处较低的曲线是hCD16A-hCD32B ABD DART(■)。图47B表明CD16xCD32B DART结合表达CD16B的效应细胞并因此召集这些细胞来杀伤(通过再导向杀伤(redirected killing))表达CD32B的细胞。
图48 在C57Bl/6小鼠中hCD16-hCD32B ABD-DART的改进的药物动力学性质
通过单次静脉内注射对小鼠(n＝3)注射5mg/kg的(A)hCD16-hCD32B ABD-DART(●)和(B)hCD16-hCD32B DART(▲)。在不同的时间点收集小鼠血清并通过ELISA对血清中的蛋白质浓度定量。使用WinNonlin Professional5.1进行药物动力学计算。
图49A-49C ABD-DART的体内生物学活性
图49A-49C表明hCD16-hCD32B ABD-DART在对小鼠施用后保留并显示出体内生物学活性。发现ABD-DART或其亲本DART进入Tg(mCD16-/-hCD16A+32B+)小鼠的单次剂量能够选择性地减少B细胞浓度(图49A)而不影响T细胞(图49B)或PM细胞(图49C)的浓度。
图50A-50E HER2x TCRb DART对在HER2低表达细胞系组的活性
对具有Her2和T-细胞受体(TCR)结合结构域的DART分子测试了其在多种乳腺癌、结肠癌和膀胱癌细胞系中介导细胞毒性的能力，这些细胞系之前已被表征为显示出低水平的HER2表达(且因此抵制用抗-Her2/neu抗体，的治疗)。所测试的乳腺癌细胞系是ZR75-1(HER22+)(图50A)、MCF-7(HER21+)(图50B)和MDA-MB468(HER2-ve)(图50C)。所测试的非乳腺癌细胞系是HT-29(结肠癌细胞系)(图50D)和SW780(膀胱癌细胞系)(图50E)。
图51A-51B KYK2VL-4420VH-GFNRGEC(SEQ ID NO：313)-E卷曲和4420VL-KYK2VH-GVEPKSC(SEQ ID NO：314)多肽的纯化。
图51A-51B示出了KYK2VL-4420VH-GFNRGEC(SEQ ID NO：313)-E卷曲和4420VL-KYK2VH-GVEPKSC(SEQ Id NO：314)多肽的纯化。
图52 KYK2-4420VF DART的结合特异性
图52示出了KYK2-4420VF DART的结合特异性。
图53 质粒pPAL7K卷曲-ABD的构建
图53示出了构建质粒pPAL7K卷曲-ABD的图示描绘。
图54 通过PROFINITYEXACTTM纯化树脂纯化的K卷曲ABD蛋白质的蛋白质印迹分析
图54示出了通过PROFINITYEXACTTM纯化树脂纯化的K卷曲ABD蛋白质的蛋白质印迹分析(小规模，来自10ml培养物)。泳道1和5：粗裂解物；泳道2和6：流出液；泳道3、4、8和9：纯化的蛋白质；泳道7：标准参照物。一抗：多克隆兔抗-EK抗体；二抗：抗兔HRP。
图55 通过PROFINITYEXACTTM纯化树脂纯化的K卷曲ABD蛋白质的SDS-PAGE分析
图55示出了关于从PROFINITY EXACTTM纯化树脂洗脱的级分的SDS-PAGE分析的结果。L：粗制大肠杆菌(E.coli)裂解物；FT：流出液；W：洗出液；M：标准参照物。
图56A-56C 通过双亲和力ELISA的KYK24420EK ABD DART结合
图56A-56C示出了ELISA结果，表明KYK2-4420VF DART复合体与K卷曲-ABD分子形成具有改善的性质的E卷曲-K卷曲ABD DART。
图56A：用NKG2D Fc捕获并用生物素化的抗EK单克隆抗体检测的DART。图56B：用抗EK单克隆抗体捕获并用HRP-人白蛋白检测的DART。
图56C：用NKG2D Fc捕获并用生物素化的抗FITC抗体检测的DART。ELISA结果表明复合体中的所有结构域可结合其各自的配体。
5.优选实施方式说明
双抗体分子的每条多肽链包含VL结构域和VH结构域，所述VL结构域和VH结构域共价连接成使得这两个结构域受自身组装的限制。两条多肽链的相互作用将产生两种VL-VH配对，形成两个表位结合位点，即，二价分子。VH或VL都不局限于多肽链内的任何位置，即，不局限于氨基(N)末端或羧基(C)末端，这些结构域也不彼此局限于其相对于彼此的位置，即，VL结构域可处于VH结构域的N末端且反之亦然。唯一的限制在于互补多肽链可被按顺序获得以形成功能性双抗体。如果VL和VH结构域来源于同一抗体，则两条互补多肽链可以是相同的。例如，如果结合结构域衍生自对表位A特异性的抗体(即，结合结构域由VLA-VHA相互作用形成)，则每条多肽将包含VHA和VLA。抗体的两条多肽链的同二聚化将导致形成两个VLA-VHA结合位点，产生二价的单特异性抗体。如果VL和VH衍生自对不同抗原特异性的抗体，功能性双特异双抗体的形成需要两条不同多肽链的相互作用，即，形成异二聚体。例如，对于双特异性双抗体，一条多肽链将包含VLA和VLB；所述链的同二聚化将导致形成两个VLA-VHB结合位点，其任何一个不结合或具有不可预测的结合。相比而言，如果两条不同多肽链在例如重组表达系统中自由地相互作用，一条包含VLA和VHB而另一条包含VLB和VHA，则将形成两个不同的结合位点：VLA-VHA和VLB-VHB。对于所有双抗体多肽链对，两条链错配(misalignment)或错误结合的可能性是可能的，即，VL-VL或VH-VH结构域的相互作用；然而，基于适当二聚化的结合位点的免疫特异性使用本领域已知的或本文 例示的基于亲和力的任何方法例如，亲和层析，容易地控制功能性双抗体的纯化。
在其他实施方式中，双抗体的一条或多条多肽链包含Fc结构域。双抗体分子的多肽链中的Fc结构域优先二聚化，导致形成表现出免疫球蛋白样性质，例如Fc-FcγR相互作用的双抗体分子。包含Fc的双抗体可以是二聚体，例如包含两条多肽链，每一条包含VH结构域、VL结构域和Fc结构域。所述多肽链的二聚化产生包含Fc结构域的二价双抗体，但是具有不同于未修饰的二价抗体的结构的结构(图11)。相对于野生型免疫球蛋白，该双抗体分子将显示出改变的表型，例如，改变的血清半衰期、结合性质等。在其他实施方式中，包含Fc结构域的双抗体分子可以是四聚体。这些四聚体包含两条‘较重的’多肽链，即包含VL、VH和Fc结构域的多肽链，和两条‘较轻的’多肽链，即包含VL和VH的多肽链。所述较轻的链和较重的链相互作用形成单体，且所述单体经其未配对的Fc结构域相互作用而形成Ig-样分子。该Ig-样双抗体是四价的且可以是单特异性、双特异性或四特异性的。
双抗体分子的至少两个结合位点可识别相同或不同的表位。不同的表位可来自同一抗原或可以是来自不同抗原的表位。在一个实施方式中，这些表位来自不同的细胞。在另一个实施方式中，这些表位是同一细胞或病毒上的细胞表面抗原。表位结合位点可识别可产生针对其的抗体的任何抗原。例如，蛋白质、核酸、细菌毒素、细胞表面标志、自身免疫标志、病毒蛋白质、药物等。在特别的方面，双抗体的至少一个表位结合位点是对特定细胞，例如B-细胞或T-细胞、吞噬细胞、自然杀伤(NK)细胞或树突状细胞上的抗原特异性的。
双抗体的多肽链的每个结构域，即VL、VH和FC结构域可被肽接头隔开。肽接头可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。在某些实施方式中，氨基酸接头序列为由核酸序列(SEQ ID NO：74)编码的GGGSGGGG(SEQ ID NO：10)。
在某些实施方式中，双抗体分子的每条多肽链可被构建成包含至少一个半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基将与本发明的第二多肽链上对应的至少 一个半胱氨酸残基相互作用以形成链间二硫键。所述链间二硫键用来稳定双抗体分子，提高在重组系统中的表达和回收，导致稳定且一致的制剂以及提高体内分离和/或纯化的产品的稳定性。所述至少一个半胱氨酸残基可作为单一的氨基酸或作为较大的氨基酸序列例如，铰链结构域的一部分被引入到多肽链的任何部分中。在特定实施方式中，所述至少一个半胱氨酸残基被构建成出现在多肽链的C末端。在某些实施方式中，所述至少一个半胱氨酸残基在氨基酸序列LGGC内被引入到多肽链中。在特定的实施方式中，构成本发明的双抗体分子的多肽链的C末端包含氨基酸序列LGGC。在另一个实施方式中，所述至少一个半胱氨酸残基在包含铰链结构域的氨基酸序列，例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4内被引入到多肽中。在特定的实施方式中，本发明的双抗体分子的多肽链的C末端包含IgG铰链结构域的氨基酸序列，例如SEQ ID NO：1。在另一个实施方式中，本发明的双抗体分子的多肽链的C末端包含可由核苷酸序列(SEQ ID NO：78)编码的氨基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO：77)。在其他实施方式中，所述至少一个半胱氨酸残基在可由核苷酸序列(SEQ ID NO：76)编码的氨基酸序列LGGCFNRGEC(SEQ ID NO：17)内被引入到多肽链中。在特定的实施方式中，构成本发明的双抗体的多肽链的C末端包含可由核苷酸序列(SEQ ID NO：76)编码的氨基酸序列LGGCFNRGEC(SEQ ID NO：17)。又在其他实施方式中，所述至少一个半胱氨酸残基在可由核苷酸序列(SEQ ID NO：75)编码的氨基酸序列FNRGEC(SEQ ID NO：23)内被引入到多肽链中。在特定的实施方式中，构成本发明的双抗体的多肽链的C末端包含可由核苷酸序列(SEQ ID NO：75)编码的氨基酸序列FNRGEC(SEQ ID NO：23)。
在某些实施方式中，双抗体分子包含至少两条多肽链，其每一条包含氨基酸序列LGGC并通过所述LGGC序列中的半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接。在另一个特定实施方式中，双抗体分子包含至少两条多肽链，其中一条包含序列FNRGEC(SEQ ID NO：23)而另一条包含铰链结构域(包含至少一个半胱氨酸残基)，其中所述至少两条多肽链通过FNRGEC(SEQ ID NO：23)中的半胱氨酸残基和铰链结构域的半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接。在特别的方面，促成位于铰链结构域中的二硫键的半胱氨酸残基是Cys-128(如根据Kabat EU编号的；位于未修饰的完整IgG重链的铰 链结构域中)且SEQ ID NO：23中的相应半胱氨酸残基是Cys-214(如根据Kabat EU编号的；位于未修饰的完整IgG轻链的C末端)(Elkabetz等人(2005)“Cysteines In CH1Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains，”J.Biol.Chem.280：14402-14412；在此通过引用将其全部并入本文)。又在其他实施方式中，该至少一个半胱氨酸残基被构建为出现在氨基酸链的N末端。又在其他实施方式中，该至少一个半胱氨酸残基被构建为出现在双抗体分子的多肽链的接头部分中。在另外的实施方式中，VH或VL结构域被构建为相对于亲本VH或VL结构域包含至少一种氨基酸修饰，使得所述氨基酸修饰包含半胱氨酸对亲本氨基酸的置换。
本发明包括包含Fc结构域或其部分(例如，CH2结构域或CH3结构域)的双抗体分子。Fc结构域或其部分可衍生自任何免疫球蛋白同种型或同种异型，包括但不限于IgA、IgD、IgG、IgE和IgM。在优选的实施方式中，Fc结构域(或其部分)衍生自IgG。在特定实施方式中，IgG同种型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其同种异型。在一个实施方式中，双抗体分子包含Fc结构域，该Fc结构域包含独立地选自任何免疫球蛋白同种型的CH2结构域和CH3结构域(即，Fc结构域包含衍生自IgG的CH2结构域和衍生自IgE的CH3结构域或衍生自IgG1的CH2结构域和衍生自IgG2的CH3结构域等)。所述Fc结构域可在相对于构成本发明的双抗体分子的多肽链的其他结构域或部分的任何位置被构建到所述多肽链中(例如，Fc结构域或其部分可处于该多肽链的VL和VH结构域的c-末端；可处于VL和VH结构域的n-末端；或可处于一个结构域的N末端和另一个的c-末端(即，在该多肽链的两个结构域之间))。
本发明还包括包含铰链结构域的分子。铰链结构域可衍生自任何免疫球蛋白同种型或同种异型，包括IgA、IgD、IgG、IgE和IgM。在优选的实施方式中，铰链结构域衍生自IgG，其中IgG同种型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其同种异型。所述铰链结构域可与Fc结构域一起被构建到构成双抗体分子的多肽链中使得该双抗体分子包含铰链-Fc结构域。在某些实施方式中，铰链结构域和Fc结构域独立地选自本领域已知或本文例示的任何免疫球蛋白同种型。在其他实施方式中，铰链结构域和Fc结构域被 多肽链的至少一个其他结构域例如VL结构域隔开。铰链结构域或任选地铰链-Fc结构域可在相对于本发明多肽链的其他结构域或部分的任何位置被构建到所述多肽链中。在某些实施方式中，本发明的多肽链包含铰链结构域，该铰链结构域位于多肽链的C末端，其中所述多肽链不包含Fc结构域。又在其他实施方式中，本发明的多肽链包含铰链-Fc结构域，该铰链-Fc结构域位于多肽链的C末端。在另外的实施方式中，本发明的多肽链包含铰链-Fc结构域，该铰链-Fc结构域位于多肽链的N末端。
如以上讨论的，本发明包括多肽链的多聚体，这些多肽链中的每一条包含VH和VL结构域。在某些方面，所述多聚体中的多肽链还包含Fc结构域。Fc结构域的二聚化导致形成显示出免疫球蛋白样功能，即Fc介导的功能(例如，Fc-FcγR相互作用，补体结合等)的双抗体分子。在某些实施方式中，构成每条多肽链的VL和VH结构域具有相同的特异性，且所述双抗体分子是二价且单特异性的。在其他实施方式中，构成每条多肽链的VL和VH结构域具有不同的特异性，且所述双抗体是二价且双特异性的。
又在其他实施方式中，本发明的双抗体分子包括多肽链的四聚体，每一条多肽链包含VH和VL结构域。在某些实施方式中，四聚体的两条多肽链还包含Fc结构域。因此四聚体由各自包含VL、VH和Fc结构域的两条‘较重的’多肽链和包含VL和VH结构域的两条‘较轻的’多肽链构成。较重的链和较轻的链形成二价单体的相互作用结合所述单体通过较重的链的Fc结构域的二聚化将导致形成四价的免疫球蛋白样分子(如实施例6.2和实施例6.3中例示的)。在某些方面，单体是相同的，且四价的双抗体分子是单特异性或双特异性的。在其他方面，单体是不同的，且四价分子是双特异性或四特异性的。
如上文所述的四特异性的双抗体分子的形成需要四条不同多肽链的相互作用。由于可能的链错误配对的许多变体，这些相互作用难以在单细胞重组生产系统中有效地实现。针对增加错误配对的概率的一种解决方案是将“旋钮入孔(knobs-into-holes)”型突变构建到期望的多肽链对中。较同二聚化而言，这些突变偏爱异二聚化。例如，关于Fc-Fc相互作用，可将氨基酸置换(优选地用包含形成‘旋钮’的大体积的侧基的氨基酸，例如色氨 酸置换)引入到CH2或CH3结构域使得立体干扰将阻止与相似地突变的结构域的相互作用并将迫使突变的结构域与其中已构建互补或容纳性突变，即“孔”(例如，用甘氨酸置换)的结构域配对。这些突变组可被构建到构成双抗体分子的任何成对的多肽对中，且还可被构建到所述成对多肽链的任何部分中。特别是关于免疫球蛋白样分子的构建，偏爱异二聚化胜过同二聚化的蛋白质工程方法是本领域熟知的，并包括在本文内(参见例如Ridgway等人(1996)“′Knobs-Into-Holes′Engineering Of Antibody CH3Domains For Heavy Chain Heterodimerization，”Protein Engr.9：617-621，Atwell等人(1997)“Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library，”J.Mol.Biol.270：26-35，和Xie等人(2005)“A New Format Of Bispecific Antibody：Highly Efficient Heterodimerization，Expression And Tumor Cell Lysis，”J.Immunol.Methods296：95-101；在此通过引用将其每一个全部被并入本文。
本发明还包括包含变体Fc结构域或变体铰链-Fc结构域(或其部分)的双抗体分子，该变体Fc结构域相对于可比较的野生型Fc结构域或铰链-Fc结构域(或其部分)包含至少一种氨基酸修饰(例如，置换、插入、缺失)。包含变体Fc结构域或铰链-Fc结构域(或其部分)的分子(例如，抗体)相对于包含野生型Fc结构域或铰链-Fc结构域或其部分的分子通常具有改变的表型。变体的表型可被表示为如在NK依赖性或巨噬细胞依赖性的测定中测定的改变的血清半衰期，改变的稳定性，改变的对细胞的酶的敏感性或改变的效应功能。被鉴定为改变效应功能的Fc结构域的变体被公开在本发明人的并行申请，国际申请WO04/063351、美国专利申请公布2005/0037000和2005/0064514、2004年11月10日递交的美国临时申请60/626,510、2004年12月15日递交的60/636,663和2006年3月10日递交的60/781,564以及2005年11月10日递交的美国专利申请11/271,140和2005年12月15日递交的11/305,787中，其每一个被通过引用全部并入。
本发明的双特异性双抗体可同时结合两个隔开且不同的表位。在某些实施方式中，这些表位来自同一抗原。在其他实施方式中，这些表位来自 不同的抗原。在优选的实施方式中，至少一个表位结合位点是对表达在免疫效应细胞上的决定簇(例如，CD3、CD16、CD32、CD64等)特异性的，这些决定簇表达在T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞或其他单核细胞上。在一个实施方式中，双抗体分子结合效应细胞决定簇且还活化所述效应细胞。就这一点而言，本发明的双抗体分子可表现出Ig-样功能而不依赖于其是否包含Fc结构域(例如，如在本领域已知或本文例示的任何效应功能测定(例如，ADCC测定)中测定的)。在某些实施方式中，本发明的双特异性双抗体结合肿瘤细胞上的癌症抗原和效应细胞决定簇同时活化所述细胞。如上文所述的(参见，背景部分)，在替代实施方案中，本发明的双特异性双抗体或双抗体分子可通过同时结合同一细胞上的活化性和抑制性受体且因而连接这些受体(例如，结合CD32A和CD32B、BCR和CD32B或IgERI和CD32B)来抑制靶，例如效应细胞的活化。在该实施方式的另一方面，双特异性双抗体可通过同时结合病毒上的两个中和表位(例如RSV表位；WNV表位例如E16和E53)表现出抗病毒性质。
在某些实施方式中，本发明的双特异性双抗体分子提供靶向特定细胞类型的唯一机会。例如，本发明的双特异性双抗体或双抗体分子可被构建成包含识别靶细胞或靶组织类型所特有的一组抗原的表位结合位点的组合。另外，如果单独抗原中的任何一个或两个分别非常普遍存在于其他组织和/或细胞类型中，则低亲合力结合结构域可用来构建双抗体或双抗体分子。这种低亲和力结合结构域将不能够以足以用于治疗性目的的亲合力结合单独的表位或抗原。然而，如果这两种表位或抗原都存在于单一的靶细胞或靶组织上，则相对于仅表达抗原之一的细胞或组织，该双抗体或双抗体分子对所述细胞或组织的亲合力将增加使得所述细胞或组织可被本发明有效地靶向。相对于只对抗原之一具有特异性的单特异性双抗体或抗体，该双特异性分子可表现出增强地结合表达两种所述抗原的细胞上的其靶抗原之一或两者。
优选地，本发明的双抗体的结合性质通过用于确定结合活性和/或一种或多种FcγR介导效应细胞功能(通过Fc-FcγR相互作用或通过双抗体分子与FcγR的免疫特异性结合介导)(参见5.4.2和5.4.3部分)的体外功能测定 来表征。可使用本领域已知的用于确定结合结构域-抗原或Fc-FcγR相互作用，即分别为抗原与结合结构域的特异性结合或Fc区与FcγR的特异性结合的体外测定(基于生化或免疫学的测定)，包括但不限于ELISA测定、表面等离子体共振测定、免疫沉淀测定(参见5.4.2部分)来测定本发明的分子例如双抗体对FcγR的亲和力和结合性质。在最优选的实施方式中，本发明的分子在体内模型(例如本文描述并公开的模型)中具有与基于体外的测定中相似的结合性质。然而，本发明不排除在基于体外的测定中未表现出期望的表型而在体内表现出期望的表型的本发明的分子。
在某些实施方式中，本发明的分子被构建成相对于模板分子的可比较部分包含改变的糖基化方式或改变的糖形。所构建的糖形可用于多种目的，包括但不限于增强效应功能。所构建的糖形可通过本领域技术人员已知的任何方法产生，例如，通过使用所构建的表达菌株或变体表达菌株，通过与一种或多种酶例如DI N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTI11)共表达，通过在多种生物体或来自多种生物体的细胞系中表达本发明的双抗体，或通过在已表达和纯化双抗体之后修饰碳水化合物。用于产生改造糖形的方法是本领域已知的，且包括但不限于在Umana等人(1999)“Engineered Glycoforms Of An Antineuroblastoma IgG1With Optimized Antibody-Dependent Cellular Cytotoxic Activity，”Nat.Biotechnol17：176-180；Davies等人(2001)“Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20CHO Production Cell Line：Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In Adcc Through Higher Affinity For Fc Gamma RIII，”Biotechnol Bioeng74：288-294；Shields等人.(2002)“Lack Of Fucose On Human IgG1N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity，”J Biol Chem277：26733-26740；Shinkawa等人(2003)“The Absence Of Fucose But Not The Presence Of Galactose Or Bisecting N-Acetylglucosamine Of Human IgG1Complex-Type Oligosaccharides Shows The Critical Role Of Enhancing Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity，”J Biol Chem278：3466-3473)US6,602,684；USSN10/277,370；USSN10/113,929；PCT WO00/61739A1；PCT WO01/292246A1；PCT WO02/311140A1；PCT WO02/30954A1中描 述的方法；PotillegentTM技术(Biowa，Inc.Princeton，NJ)；GlycoMAbTM糖基化工程技术(GLYCART biotechnology AG，Zurich，Switzerland)；其每一个被通过引用全部并入本文。参见，例如WO00061739；EA01229125；US20030115614；Okazaki等人(2004)“Fucose Depletion From Human IgG1Oligosaccharide Enhances Binding Enthalpy And Association Rate Between IgG1And FcGammaRIILA，”JMB，336：1239-49，其每一个被通过引用全部并入本文。
本发明还包括并入非天然氨基酸以产生本发明的双抗体。这些方法是本领域技术人员已知的，例如使用允许将非天然氨基酸并入到蛋白质中的天然的生物合成机制的方法，参见，例如Wang等人(2002)“Expanding The Genetic Code，”Chem.Comm.1：1-11；Wang等人(2001)“Expanding The Genetic Code Of Escherichia coli，”Science，292：498-500；van Hest等人(2001)“Protein-Based Materials，Toward A New Level Of Structural Control，”Chem.Comm.19：1897-1904，其每一个被通过引用全部并入本文。替代策略集中在负责生物合成氨酰-tRNA的酶，参见，例如Tang等人(2001)“Biosynthesis Of A Highly Stable Coiled-Coil Protein Containing Hexafluoroleucine In An Engineered Bacterial Host，”J.Am.Chem.Soc.123(44)：11089-11090；Kiick等人(2001)“Identification Of An Expanded Set Of Translationally Active Methionine Analogues In Escherichia coli，”FEBS Lett.502(1-2)：25-30；其每一个被通过引用全部并入本文。
在某些实施方式中，本发明包括通过添加或缺失糖基化位点修饰本发明的分子的VL、VH或Fc结构域的方法。用于修饰蛋白质的碳水化合物的方法是本领域熟知的并被包括在本发明中，参见例如美国专利第6,218,149号；EP0359096B1；美国公布第US2002/0028486号；WO03/035835；美国公布第2003/0115614号；美国专利第6,218,149号；美国专利第6,472,511号；其都被通过引用全部并入本文。
本发明的双抗体分子可被构建成包含为针对自然杀伤群2D(NKG2D)受体的结合配体的结构域。这些结合配体，且特别是正常细胞上不表达的结合配体包括组织相容性60(H60)分子，视黄酸早期诱导基因-1(RAE-1)和 小鼠UL16-结合蛋白样转录物1(MULT1)的产物(Raulet D.H.(2003)“Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands，”Nature Rev.Immunol.3：781-790；Coudert，J.D.等人(2005)“Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells，”Blood106：1711-1717)。与人NKG2D反应的另外的配体包括多态性MHC I类链-有关的分子MICA和MICB(Diefenbach，A.等人(1999)“Natural Killer Cells：Stress Out，Turn On，Tune In，”Curr.Biol.9(22)：R851-R8533；Bauer，S.等人(1999)“Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D，A Receptor For Stress-Inducible MICA，”Science285(5428)：727-729；Stephens，H.A.(2001)“MICA and MICB genes：can the enigma of their polymorphism be resolved？，”Trends Immunol.22：378-385)。
MICA的序列为SEQ ID NO：311：
MGLGPVFLLL AGIFPFAPPG AAAEPHSLRY NLTVLSWDGS VQSGFLTEVH 
LDGQPFLRCD RQKCRAKPQG QWAEDVLGNK TWDRETRDLT GNGKDLRMTL 
AHIKDQKEGL HSLQEIRVCE IHEDNSTRSS QHFYYDGELF LSQNLETKEW 
TMPQSSRAQT LAMNVRNFLK EDAMKTKTHY HAMHADCLQE LRRYLKSGVV 
LRRTVPPMVN VTRSEASEGN ITVTCRASGF YPWNITLSWR QDGVSLSHDT 
QQWGDVLPDG NGTYQTWVAT RICQGEEQRF TCYMEHSGNH STHPVPSGKV 
LVLQSHWQTF HVSAVAAAAI FVIIIFYVRC CKKKTSAAEG PELVSLQVLD 
QHPVGTSDHR DATQLGFQPL MSDLGSTGST EGA
MICB的序列是SEQ ID NO：312：
PHSLRYNLMV LSQDGSVQSG FLAEGHLDGQ PFLRYDRQKR RAKPQGQWAE 
DVLGAKTWDT ETEDLTENGQ DLRRTLTHIK DQKGGLHSLQ EIRVCEIHED 
SSTRGSRHFY YDGELFLSQN LETQESTVPQ SSRAQTLAMN VTNFWKEDAM 
KTKTHYRAMQ ADCLQKLQLP PMVNVICSEV SEGNITVTCR ASSFYPRNIT 
LTWRQDGVSL SHNTQQWGDV LPDGNGTYQT WVATRIRQGE EQRFTCYMEH 
SGNHGTHPVP SGKALVLQSQ RTDFPYVSAA MPCFVIIIIL CVPCCKKKTS 
AAEGP
特异性结合T细胞受体的抗体包括抗TCR抗体BMA031(Kurrle，R.等人(1989)“BMA031-ATCR-Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application，”Transplant Proc.21(1Pt1)：1017-1019；Nashan，B.等人(1987)“Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3Complex，”Transplant Proc.19(5)：4270-4272；Shearman，C.W.等人(1991)“Construction，Expression，And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies  With Specificity For The Humanα/βT Cell，”J.Immunol.146(3)：928-935；Shearman，C.W.等人(1991)“Construction，Expression And Characterization of Humanized Antibodies Directed Against The Humanα/βT Cell Receptor，”J.Immunol.147(12)：4366-4373)。特异性结合NKG2D受体的抗体包括KYK-2.0(Kwong，KY等人(2008)“Generation，Affinity Maturation，And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity，”J.Mol.Biol.384：1143-1156；和PCT/US09/54911)。
通过使用该双抗体，靶细胞现将被再导向为可被陈列(NKG2D)受体的细胞结合的细胞。NKG2D受体表达在所有的人(和其他哺乳动物)的自然杀伤细胞(Bauer，S.等人(1999)“Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D，A Receptor For Stress-Inducible MICA，”Science285(5428)：727-729；Jamieson，A.M.等人(2002)“The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing，”Immunity17(1)：19-29)以及所有的CD8+T细胞(Groh，V.等人(2001)“Costimulation Of CD8αβT Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells，”Nat.Immunol.2(3)：255-260；Jamieson，A.M等人(2002)“The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing，”Immunity17(1)：19-29)上。
可选择地，本发明的双抗体分子可被构建成包含为针对T细胞受体(“TCR”)的结合配体的结构域。TCR由CD4+或CD8+T-细胞天然地表达，并允许这些细胞识别被抗原递呈细胞的I类或II类MHC蛋白质结合并递呈的抗原肽。TCR对pMHC(肽-MHC)复合体的识别引发细胞免疫反应的蔓延，所述细胞免疫反应导致细胞因子的产生和抗原递呈细胞的裂解(参见，例如Armstrong，K.M等人(2008)“Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide-MHC Complexes，”Biochem.J.415(Pt2)：183-196；Willemsen，R.(2008)“Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy，”Cytometry A.73(11)：1093-1099；Beier，K.C.等人(2007) “Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation，”Eur.Respir.J.29：804-812；Mallone，R.等人(2005)“Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes，”Am.J.Ther.12(6)：534-550)。
通过将这些双抗体分子构建成还包含能够结合，例如靶细胞表面上存在的受体的至少一个表位结合结构域，这些双抗体分子将成为DART分子且因此能够结合靶细胞且从而促使靶细胞展示针对自然杀伤群2D(NKG2D)受体或TCR的结合配体(无论哪一种存在于结合了靶细胞的双抗体上)(参见，例如Germain，C.等人(2008)“Redirecting NK Cells Mediated Tumor Cell Lysis By A New Recombinant Bifunctional Protein，”Prot.Engineer.Design Selection21(11)：665-672)。
这些双抗体可用于将任何期望的靶细胞再导向到为NK细胞介导的细胞裂解或T-细胞介导的细胞毒性的靶的细胞。在一个实施方式中，双抗体的能够结合靶细胞表面上存在的受体的表位结合结构域是结合肿瘤相关抗原以将这些癌细胞再导向到NK细胞介导的细胞裂解或T-cell细胞介导的细胞毒性的作用物的表位。特别感兴趣的是肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原为乳腺癌抗原、卵巢癌抗原、前列腺癌抗原、宫颈癌抗原、胰腺癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、结肠癌抗原、睾丸癌抗原、成胶质细胞瘤癌抗原、与B细胞恶性肿瘤有关的抗原、与多发性骨髓瘤相关的抗原、与非霍奇金淋巴瘤有关的抗原或与慢性淋巴细胞白血病有关的抗原。
用于该用途的合适的肿瘤相关抗原包括A33(一种结肠直肠癌抗原；Almqvist，Y.2006，Nucl Med Biol.Nov；33(8)：991-998)、B1(Egloff，A.M.等人2006，Cancer Res.66(1)：6-9)、BAGE(Bodey，B.2002Expert Opin Biol Ther.2(6)：577-84)、β-连环蛋白(Prange W.等人2003J Pathol.201(2)：250-9)、CA125(Bast，R.C.Jr.等人2005Int J Gynecol Cancer15增刊3：274-81)、CD5(Calin，G.A.等人2006Semin Oncol.33(2)：167-73)、CD19(Troussard，X.等人1998Hematol Cell Ther.40(4)：139-48)、CD20(Thomas，DA.等人2006Hematol Oncol Clin North Am.20(5)：1125-36)、CD22(Kreitman，R.J.2006AAPS J.18；8(3)：E532-51)、CD23(Rosati，S.等人2005Curr Top Microbiol  Immunol.5；294：91-107)、CD25(Troussard，X.等人1998Hematol Cell Ther.40(4)：139-48)、CD27(Bataille，R.2006Haematologica91(9)：1234-40)、CD28(Bataille，R.2006Haematologica91(9)：1234-40)、CD36(Ge，Y.2005Lab Hematol.11(1)：31-7)、CD40/CD154(Messmer，D.等人2005Ann N Y Acad Sci.1062：51-60)、CD45(Jurcic，J.G.2005Curr Oncol Rep.7(5)：339-46)、CD56(Bataille，R.2006Haematologica91(9)：1234-40)、CD79a/CD79b(Troussard，X.等人1998Hematol Cell Ther.40(4)：139-48；Chu，P.G.等人2001Appl Immunohistochem Mol Morphol.9(2)：97-106)、CD103(Troussard，X.等人1998Hematol Cell Ther.40(4)：139-48)、CDK4(Lee，Y.M.等人2006Cell Cycle5(18)：2110-4)、CEA(癌胚抗原；Mathelin，C.2006Gynecol Obstet Fertil.34(7-8)：638-46；Tellez-Avila，F.I.等人2005Rev Invest Clin.57(6)：814-9)、CTLA4(Peggs，K.S.等人2006Curr Opin Immunol.18(2)：206-13)、EGF-R(表皮生长因子受体；Adenis，A.等人2003Bull Cancer.90Spec No：S228-32)；Erb(ErbB1、ErbB3、ErbB4；Zhou，H.等人2002Oncogene21(57)：8732-40；Rimon，E等人2004Int J Oncol.24(5)：1325-38)；GAGE(GAGE-1、GAGE-2；Akcakanat，A.等人2006Int J Cancer.118(1)：123-8)、GD2/GD3/GM2(Livingston，P.O.等人2005Cancer Immunol Immunother.54(10)：1018-25)、gp100(Lotem，M.等人2006J Immunother.29(6)：616-27)、HER-2/neu(Kumar，Pal S等人2006Semin Oncol.33(4)：386-91)、人乳头瘤病毒-E6/人乳头瘤病毒-E7(DiMaio，D.等人2006Adv VirusRes.66：125-59；KSA(17-1A)(Ragupathi，G.2005Cancer TreatRes.123：157-80)、MAGE(MAGE-1、MAGE-3；(Bodey，B.2002Expert Opin Biol Ther.2(6)：577-84)、MART(Kounalakis，N.等人2005Curr Oncol Rep.7(5)：377-82)、MUC-1(Mathelin，C.2006Gynecol Obstet Fertil.34(7-8)：638-46)、MUM-1(Castelli，C.等人2000J Cell Physiol.182(3)：323-31)、N-乙酰葡糖胺基转移酶(Dennis，J.W.1999Biochim Biophys Acta.6；1473(1)：21-34)、p15(Gil，J.等人2006Nat Rev Mol Cell Biol.7(9)：667-77)、PSA(前列腺特异性抗原；Cracco，C.M.等人2005Minerva Urol Nefrol.57(4)：301-11)、PSMA(Ragupathi，G.2005Cancer Treat Res.123：157-80)、sTn(Holmberg，L.A.2001Expert Opin Biol Ther.1(5)：881-91)、 TNF-受体(TNF-α受体、TNF-β受体或TNF-γ受体；van Horssen，R.等人2006Oncologist.11(4)：397-408；Gardnerova，M.等人2000Curr Drug Targets.1(4)：327-64)或VEGF受体(O’Dwyer.P.J.2006Oncologist.11(9)：992-8)。
用于该用途的另外的肿瘤相关抗原(及公开了针对这些抗原的特异反应性的抗体的出版物)包括ADAM-9(美国专利公布第2006/0172350号；PCT公布第WO06/084075号)、ALCAM(PCT公布第WO03/093443号)、羧肽酶M(美国专利公布第2006/0166291号)、CD46(美国专利第7,148,038号；PCT公布第WO03/032814号)、细胞角蛋白8(PCT公布第WO03/024191号)、肝配蛋白受体(且特别是EphA2(美国专利第7,569,672号；PCT公布第WO06/084226号)；整联蛋白α-V-β-6(PCT公布第WO03/087340号)；JAM-3(PCT公布第WO06/084078号)；KID3(PCT公布第WO05/028498号)；KID31(PCT公布第WO06/076584号)；LUCA-2(美国专利公开第2006/0172349号；PCT公布第WO06/083852号)、制瘤素M(制瘤素受体β)(美国专利第7,572,896号；PCT公布第WO06/084092号)；PIPA(美国专利第7,405,061号；PCT公布第WO04/043239号)；RAAG10(美国专利第7,527,969号；PCT公布第WO04/001381号)；ROR1(美国专利第5,843,749号)、TES7(PCT公布第WO08/066691号)；和转铁蛋白受体(美国专利第7,572,895号；PCT公布第WO05/121179号)。
还感兴趣的是对特定传染原特异性的抗原，所述传染原例如，病毒病原包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、流感、人乳头状瘤病毒(HPV)、足口病(柯萨奇病毒)、狂犬病毒、单纯疱疹病毒(HSV)和肠胃炎的病原体，包括轮状病毒、腺病毒、杯状病毒、星状病毒和诺沃克病毒；细菌病原包括但不限于大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella thyphimurium)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、真菌病原和寄生虫例如贾第虫属(Giardi)。
可选择地，该表位可结合Fc受体(例如，FcγRI或FcγRII)以例如将急性单核细胞性白血病细胞再导向到针对NK细胞介导的细胞裂解的作用物。
5.1.双抗体结合结构域
本发明的双抗体包含通常衍生自免疫球蛋白或抗体的抗原结合结构域。用于本发明的方法中的结合结构域所来源的抗体可来自任何动物来源包括鸟类和哺乳动物(例如，人、非人灵长类、鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡)。优选地，这些抗体是人的或人源化的单克隆抗体。如本文所用的，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体且包括从人免疫球蛋白文库或合成的人免疫球蛋白编码序列的文库或从表达来自人类基因的抗体的小鼠中分离到的抗体。
本发明设想了使用本领域已知的用于治疗和/或预防癌症、自身免疫病、炎性疾病或传染病的任何抗体作为本发明的双抗体的结合结构域的来源。5.7.1节提供了已知的癌症抗体的非限制性实例以及5.6.1节列出了对所列出的靶抗原特异性的其他抗体和针对癌症抗原的抗体；5.7.2节提供了用于治疗和/或预防自身免疫病和炎性疾病的已知抗体的非限制性实例以及针对所列出的靶抗原的抗体和针对5.6.2节列出的抗原的抗体；在其他实施方式中，可使用针对与5.6.3节列出的传染病有关的表位的抗体。在某些实施方式中，这些抗体包含含有一个或多个氨基酸置换的变体Fc区，这些抗体已被本发明的方法鉴定为相对于包含野生型Fc区的可比较的分子具有被赋予的效应功能和/或增强的对FcγRIIB的亲和力以及降低的对FcγRIIIA的亲和力。表9中展现了可根据本发明构建的用于治疗或预防炎性疾患的抗体的非限制性实例，而表10中展现了用于疗或预防自身免疫疾患的抗体的非限制性实例。
对于某些用途，包括抗体在人类中的体内用途和在体外检测测定中的用途，可优选使用具有衍生自人、嵌合或人源化抗体的可变结构域的抗体。来自完全人抗体的可变结构域对于人受治疗者的治疗性治疗是特别期望的。人抗体可通过本领域技术人员已知的多种方法制备，包括上文所述的使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库噬菌体展示方法。另外参见美国 专利第4,444,887和4,716,111号；以及国际公布第WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735和WO91/10741号；其每一个被通过引用全部并入本文。
人源化抗体是能够结合预定抗原且包含基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的框架区和基本上具有非人的免疫球蛋白的氨基酸序列的CDR的抗体，其变体或片段。人源化抗体可包含基本上所有的至少一个，且通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区域对应于非人免疫球蛋白(即，供体抗体)的CDR区域且所有或基本上所有的框架区对应于人免疫球蛋白共有序列的框架区。
人源化抗体的框架区和CDR区域不需要准确地对应亲本序列，例如供体CDR或共有框架可通过至少一个残基的置换、插入或缺失而被诱变使得该位点处的CDR和框架残基不对应共有区或供体抗体。但是，优选这些突变不是大量的。通常至少75％的人源化抗体的残基将对应于亲本框架区(FR)和CDR序列的残基，更通常地90％，且最优选地大于95％。人源化抗体可使用本领域已知的多种技术产生，包括但不限于CDR-嫁接(欧洲专利第EP239,400号；国际公布第WO91/09967号；以及美国专利第5,225,539、5,530,101，和5,585,089号)、镶饰(veneering)或表面重构(resurfacing)(欧洲专利第EP592,106和EP519,596号；Padlan(1991)“A Possible Procedure For Reducing The Immunogenicity Of Antibody Variable Domains While Preserving Their Ligand-Binding Properties，”Molecular Immunology28(4/5)：489-498；Studnicka等人(1994)“Human-Engineered Monoclonal Antibodies Retain Full Specific Binding Activity By Preserving Non-CDR Complementarity-Modulating Residues，”Protein Engineering7(6)：805-814；和Roguska等人(1994)“Humanization Of Murine Monoclonal Antibodies Through Variable Domain Resurfacing，”Proc Natl Acad Sci USA91：969-973)、链改组(美国专利第5,565,332号)以及例如美国专利第6,407,213、5,766,886、5,585,089号、国际公布第WO9317105号、Tan等人(2002)“’Superhumanized’Antibodies：Reduction Of Immunogenic Potential By Complementarity-Determining Region Grafting With Human Germline  Sequences：Application To An Anti-CD28，”J.Immunol.169：1119-25；Caldas等人(2000)“Design And Synthesis Of Germline-Based Hemi-Humanized Single-Chain Fv Against The CD18Surface Antigen，”Protein Eng.13：353-60，Morea等人(2000)“Antibody Modeling：Implications For Engineering And Design，”Methods20：267-79，Baca等人(1997)“Antibody Humanization Using Monovalent Phage Display，”J.Biol.Chem.272：10678-84，Roguska等人(1996)“A Comparison Of Two Murine Monoclonal Antibodies Humanized By CDR-Grafting And Variable Domain Resurfacing，”Protein Eng.9：895-904，Couto等人(1995)“Designing Human Consensus Antibodies With Minimal Positional Templates，”Cancer Res.55(23增刊)：5973s-5977s，Couto等人(1995)“Anti-BA46Monoclonal Antibody Mc3：Humanization Using A Novel Positional Consensus And In Vivo And In Vitro Characterization，”Cancer Res.55：1717-22，Sandhu(1994)“A Rapid Procedure For The Humanization Of Monoclonal Antibodis，”Gene150：409-10，Pedersen等人(1994)“Comparison Of Surface Accessible Residues In Human And Murine Immunoglobulin Fv Domains.Implication For Humanization Of Murine Antibodies，”J.Mol.Biol.235：959-973，Jones等人(1986)“Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse，”Nature321：522-525，Riechmann等人(1988)“Reshaping Human Antibodies For Therapy，”Nature332：323-327以及Presta(1992)“Antibody Engineering，”Curr.Op.Biotech.3(4)：394-398中公开的技术。通常，框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基置换以改变，优选地提高抗原结合。这些框架置换通过本领域熟知的方法鉴定，例如通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对于抗原结合重要的框架残基以及序列比较以鉴定特定位置处的不常见的框架残基。(参见，例如Queen等人，美国专利第5,585,089号；美国公布第2004/0049014和2003/0229208号；美国专利第6,350,861；6,180,370；5,693,762；5,693,761；5,585,089和5,530,101号和Riechmann等人(1988)“Reshaping Human Antibodies For Therapy，”Nature332：323-327，其都被通过引用全部并入本文)。
在最优选的实施方式中，人源化的结合结构域特异性结合与供体鼠抗体相同的表位。本领域技术人员将应理解本发明通常包括抗体的CDR嫁接。因此，供体和接受体抗体可衍生自同一种类的动物且甚至相同的抗体类或亚类。但是，最通常地，供体和接受体抗体衍生自不同种类的动物。通常供体抗体是非人的抗体，例如啮齿动物的mAb，而接受体抗体是人抗体。
在某些实施方式中，来自供体抗体的至少一个CDR被嫁接到人抗体上。在其他实施方式中，每条重链和/或轻链可变区的至少两个且优选地所有三个CDR被嫁接到人抗体上。这些CDR可包含Kabat CDR，结构环CDR或其组合。在某些实施方式中，本发明包括包含嫁接了至少一个CDR的重链和嫁接了至少一个CDR的轻链的人源化的FcγRIIB抗体。
用于本发明的方法中的双抗体包括被修饰的衍生物，所述修饰即通过将任何类型的分子共价连接到该双抗体。例如但非限制性地，双抗体衍生物包括已例如，通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封端基团衍生、蛋白酶裂解、连接到细胞内配体或其他蛋白质等而被修饰的双抗体。众多化学修饰中的任一种可通过已知技术，包括但不限于特定的化学裂解、乙酰化、甲酰化、代谢合成衣霉素等进行。另外，衍生物可包含一种或多种非典型氨基酸。
嵌合抗体是其中抗体的不同部分衍生自不同免疫球蛋白分子的分子，例如具有衍生自非人抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。用于制备嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见，例如Morrison(1985)“Transfectomas Provide Novel Chimeric Antibodies，”Science229：1202-1207；Oi等人(1986)“Chimeric Antibodies，”BioTechniques4：214-221；Gillies等人(1989)“High-Level Expression Of Chimeric Antibodies Using Adapted cDNA Variable Region Cassettes，”J.Immunol.Methods125：191-202；以及美国专利第6,311,415、5,807,715、4,816,567和4,816,397号，其被通过引用全部并入本文。
通常，框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基置换以改变，优选地提高抗原结合。这些框架置换通过本领域熟知的方法鉴定， 例如通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对于抗原结合重要的框架残基以及序列比较以鉴定特定位置处的不常见的框架残基。(参见例如美国专利第5,585,089号；和Riechmann等人(1988)“Reshaping Human Antibodies For Therapy，”Nature332：323-327，其被通过引用全部并入本文。)
本发明的双抗体的结合结构域所来源的单克隆抗体可使用本领域已知的各种各样的技术，包括使用杂交瘤、重组技术和噬菌体展示技术或其组合来制备。例如，可使用杂交瘤技术，包括本领域已知的技术和例如在Harlow等人Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版1988)；Hammerling，等人，在：Monoclonal  Antibodies and T-Cell Hybridomas，第563-681页(Elsevier，N.Y.，1981)(其都被通过引用全部并入)中教导的技术制备。如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指衍生自单一克隆，包括任何真核、原核或噬菌体克隆的抗体而不是其被产生的方法。
使用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是常规的且是本领域已知的。在非限制性实例中，可用目的抗原或表达该抗原的细胞免疫小鼠。一旦检测到免疫反应，例如，在小鼠血清中检测到对该抗原特异性的抗体，就采集小鼠的脾并分离脾细胞。然后通过熟知的技术将这些脾细胞融合到任何合适的骨髓瘤细胞。通过有限稀释选择和克隆杂交瘤。然后通过本领域已知的方法测定杂交瘤克隆中分泌能够结合所述抗原的抗体的细胞。通常包含高水平抗体的腹水液可通过对小鼠腹膜内接种阳性杂交瘤克隆产生。目的抗原包括但不限于与5.8.1节提供的癌症有关的抗原、与5.8.2节提供的自身免疫病和炎性疾病有关的抗原、与5.8.3节提供的传染病有关的抗原以及5.8.4节提供的毒素。
还可使用本领域已知的各种噬菌体展示方法产生抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体的结构域被展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。在特别的实施方式中，该噬菌体可用来展示从整套或组合的抗体文库(例如，人或鼠的)表达的抗原结合结构域例如Fab和Fv或二硫键稳定的Fv。表达结合目的抗原的抗原结合结构域的噬菌体可用抗原，例如使用标记的抗原或被结合或捕获到固体表面或磁珠上的抗原来选 择或鉴定。用于这些方法中的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括fd和M13。抗原结合结构域作为与噬菌体基因III或基于VIII蛋白质的重组融合蛋白质而表达。可用来制备本发明的免疫球蛋白或其片段的噬菌体展示方法的实例包括在下列文献中公开的方法：Brinkmann等人(1995)“Phage Display Of Disulfide-Stabilized Fv Fragments，”J.Immunol.Methods，182：41-50；Ames等人(1995)“Conversion Of Murine Fabs Isolated From A Combinatorial Phage Display Library To Full Length Immunoglobulins，”J.Immunol.Methods，184：177-186；Kettleborough等人(1994)“Isolation Of Tumor Cell-Specific Single-Chain Fv From Immunized Mice Using Phage-Antibody Libraries And The Re-Construction Of Whole Antibodies From These Antibody Fragments，”Eur.J.Immunol.，24：952-958；Persic等人(1997)“An Integrated Vector System For The Eukaryotic Expression Of Antibodies Or Their Fragments After Selection From Phage Display Libraries，”Gene，187：9-18；Burton等人(1994)“Human Antibodies From Combinatorial Libraries，”Advances in Immunology，57：191-280；PCT申请第PCT/GB91/01134号；PCT公布WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；和美国专利第5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108号；其每一个被通过引用全部并入本文。
噬菌体展示技术可用来增加抗体对其抗原的亲和力。该技术将被用于获得高亲和力的抗体。被称为亲和力成熟的技术采用了诱变或CDR步移和重新选择，使用同源抗原以鉴定与初始或亲本抗体相比时以更高的亲和力结合所述抗原的抗体(参见，例如，Glaser等人(1992)“Dissection Of The Combming Site In A Humanized Anti-Tac Antibody，”J.Immunology149：2607-2614)。对全部密码子而不是单个核苷酸诱变导致半随机的整套氨基酸突变。可构建由变体克隆的集组成的文库，每一个变体克隆因单一CDR中的单一氨基酸改变而不同且包含展现了对于每一个CDR残基的每种可能的氨基酸置换的变体。具有针对抗原的增加的结合亲和力的突变体可通过使固定的突变体与标记的抗原接触来筛选。本领域已知的任何筛选 方法(例如，ELISA)可用来鉴定具有对抗原的增加的亲合力的突变抗体(参见Wu等人(1998)“Stepwise In Vitro Affinity Maturation Of Vitaxin，An Alphav Beta3-Specific Humanized mAb，”Proc Natl.Acad Sci.USA95：6037-6042；Yelton等人(1995)“Affinity Maturation Of The Br96Anti-Carcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis，”J.Immunology155：1994-2004)。使轻链随机化的CDR步移也是可能的(参见Schier等人(1996)“Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-ErbB-2Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site，”J.Mol.Bio.263：551-567)。
本发明还包括使用在框架或CDR区域中具有突变(例如，一种或多种氨基酸置换)的本文描述的或本领域已知的任何一种结合结构域的氨基酸序列的结合结构域。优选地，这些结合结构域中的突变保持或增强了这些结合结构域对其免疫特异性地结合的FcγRIIB的亲合力和/或亲和力。本领域已知的标准技术(例如，免疫测定)可用来测定抗体对特定抗原的亲和力。
本领域技术人员已知的标准技术可用来将突变引入到编码抗体或其片段的核苷酸序列中，包括，例如产生氨基酸置换的定点诱变和PCR介导的诱变。优选地，相对于原始抗体或其片段，这些衍生物包括少于15个氨基酸的置换、少于10个氨基酸的置换、少于5个氨基酸的置换、少于4个氨基酸的置换、少于3个氨基酸的置换、或少于2个氨基酸的置换。在优选的实施方式中，这些衍生物具有在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行的保守氨基酸置换。
5.1.1.包含免疫特异性结合FcγRIIB的表位结合位点的双抗体
在特定的实施方式中，本发明的双抗体的至少一个结合结构域激动FcγRIIB的至少一种活性。在本发明的一个实施方式中，所述活性是抑制B细胞受体介导的信号传导。在另一个实施方式中，所述结合结构域抑制B细胞的活化、B细胞的增殖、抗体产生、B细胞的细胞内钙内流、细胞周期进展或FcγRIIB信号转导通路中一种或多种下游信号传导分子的活性。又在另一个实施方式中，所述结合结构域增强FcγRIIB的磷酸化或SHIP召集。在本发明的另一个实施方式中，所述结合结构域抑制B细胞 受体介导的信号传导通路中的MAP激酶活性或Akt召集。在另一个实施方式中，所述结合结构域激动FcγRIIB-介导的对FcεRI信号传导的抑制。在特别的实施方式中，所述结合结构域抑制FcεRI-诱导的肥大细胞活化、钙动员、脱粒、细胞因子产生或血清素释放。在另一个实施方式中，本发明的结合结构域刺激FcγRIIB的磷酸化，刺激SHIP召集，刺激SHIP磷酸化及其与Shc的缔合，或抑制MAP激酶家族成员(例如，Erk1、Erk2、JN、p38等)的活化。又在另一个实施方式中，本发明的结合结构域增强p62dok的酪氨酸磷酸化及其与SHIP和rasGAP的缔合。在另一个实施方式中，本发明的结合结构域抑制单核细胞或巨噬细胞中FcγR-介导的吞噬作用。
在另一个实施方式中，所述结合结构域拮抗FcγRIIB的至少一种活性。在一个实施方式中，所述活性是激活B细胞受体介导的信号传导。在特别的实施方式中，所述结合结构域增强B细胞活性、B细胞的增殖、抗体产生、细胞内钙内流或FcγRIIB信号转导通路中一种或多种下游信号传导分子的活性。又在另一个特定实施方式中，所述结合结构域减少FcγRIIB的磷酸化或SHIP召集。在本发明的另一个实施方式中，所述结合结构域增强B细胞受体介导的信号传导通路中的MAP激酶活性或Akt召集。在另一个实施方式中，所述结合结构域拮抗FcγRIIB-介导的对FcεRI信号传导的抑制。在特别的实施方式中，所述结合结构域增强FcεRI-诱导的肥大细胞活化、钙动员、脱粒、细胞因子产生或血清素释放。在另一个实施方式中，所述结合结构域抑制FcγRIIB的磷酸化，抑制SHIP的召集，抑制SHIP磷酸化及其与Shc的结合，增强MAP激酶家族成员(例如，Erk1、Erk2、JNK、p38等)的活化。又在另一个实施方式中，所述结合结构域抑制p62dok的酪氨酸磷酸化及其与SHIP和rasGAP的缔合。在另一个实施方式中，所述结合结构域增强单核细胞或巨噬细胞中FcγR-介导的吞噬作用。在另一个实施方式中，所述结合结构域阻止脾巨噬细胞对被调理的颗粒的吞噬、清除。
在其他实施方式中，至少一个结合结构域可用来将本发明的双抗体靶向到表达FcγRIIB的细胞。
在一个特定的实施方式中，一个结合结构域衍生自由分别具有ATCC登记号PTA-4591和PTA-4592的克隆2B6或3H7产生的小鼠单克隆抗体。根据国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯条约的规定，产生抗体2B6和3H7的杂交瘤已在2002年8月13日通过美国模式培养物保藏中心(10801University Blvd.，Manassas，VA.20110-2209)保藏，并分别被给予登记号PTA-4591(产生2B6的杂交瘤)和PTA-4592(产生3H7的杂交瘤)并被通过引用并入本文。在优选的实施方式中，所述结合结构域是人的或已被人源化，优选地衍生自由克隆3H7或2B6产生的人源化形式的抗体。
本发明还包括来自特异性结合FcγRIIB、优选地人FcγRIIB，更优选地天然的人FcγRIIB的结合结构域，所述结合结构域衍生自包括但不限于分别具有ATCC登记号PTA-5958、PTA-5961、PTA-5962、PTA-5960和PTA-5959的1D5、2E1、2H9、2D11和1F2的克隆。根据布达佩斯条约的规定，产生以上鉴定的克隆的杂交瘤已在2004年5月7日通过美国模式培养物保藏所(10801University Blvd.，Manassas，VA.20110-2209)保藏并被通过引用并入本文。在优选的实施方式中，来自上述抗体的结合结构域被人源化。
在特定实施方式中，用于本发明的双抗体中的结合结构域来自抗体或其抗原结合片段(例如，包含由克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的抗体的一个或多个互补决定区(CDR)，优选地所有6个CDR)。在另一个实施方式中，所述结合结构域结合与分别由克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的小鼠单克隆抗体相同的表位和/或如在例如，ELISA测定或其他合适的竞争性免疫测定中确定的，与由克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的小鼠单克隆抗体竞争，并且还以比该结合结构域结合FcγRIIA大的亲和力结合FcγRIIB。
本发明还包括具有包含与由克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的小鼠单克隆抗体的可变重链和/或轻链的氨基酸序列至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的可变重链和/或可变轻链的氨基酸序列的结合结构域的双抗体。本发明还包括具有以比 所述抗体或其片段结合FcγRIIA大的亲和力特异性结合FcγRIIB，且包含与由克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的小鼠单克隆抗体的一个或多个CDR的氨基酸序列至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的一个或多个CDR的氨基酸序列的结合结构域的双抗体。确定两种氨基酸序列的同一性百分比可通过本领域技术人员已知的任何方法，包括BLAST蛋白质搜索确定。
本发明还包括使用包含以比结合结构域结合FcγRIIA更大的亲和力特异性结合FcγRIIB的结合结构域的双抗体，所述结合结构域由在严格条件下与由克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的小鼠单克隆抗体的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码。在优选的实施方式中，该结合结构域以比结合FcγRIIA大的亲和力特异性结合FcγRIIB，且包含由在严格条件下与由克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的小鼠单克隆抗体的可变轻链和/或可变重链的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的可变轻链和/或可变重链。在另一个优选的实施方式中，该结合结构域以比结合FcγRIIA大的亲和力特异性结合FcγRIIB，且包含由在严格条件下与由克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的小鼠单克隆抗体的一个或多个CDR的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的一个或多个CDR。严格杂交条件包括但不限于在约45℃下与6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中的过滤器结合的DNA杂交，接下来在约50-65℃的0.2X SSC/0.1％SDS中洗涤一次或多次，极为严格的条件，例如在约45℃下与6X SSC中的过滤器结合的DNA杂交，接下来在约60℃下的0.1X SSC/0.2％SDS中洗涤一次或多次，或本领域技术人员已知的任何其他严格杂交条件(参见，例如，Ausubel，F.M.等人，编辑1989Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，Green Publishing Associates，Inc.和John Wiley and Sons，Inc.，NY在6.3.1至6.3.6和2.10.3页，被通过引用并入本文)。
本发明还包括在框架或CDR区域中使用包含上述的具有突变(例如，一种或多种氨基酸置换)的任何一种结合结构域的氨基酸序列的结合结构域。优选地，这些结合结构域中的突变保持或增强了结合结构域对其免疫 特异性地结合的FcγRIIB的亲合力和/或亲和力。本领域已知的标准技术(例如，免疫测定)可用来测定抗体对特定抗原的亲和力。
本领域技术人员已知的标准技术可用来将突变引入到编码抗体或其片段的核苷酸序列中，包括例如产生氨基酸置换的定点诱变和PCR介导的诱变。优选地，相对于原始抗体或其片段，这些衍生物包括少于15个氨基酸的置换、少于10个氨基酸的置换、少于5个氨基酸的置换、少于4个氨基酸的置换、少于3个氨基酸的置换、或少于2个氨基酸的置换。在优选的实施方式中，这些衍生物具有在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行的保守氨基酸置换。
在优选的实施方式中，结合结构域衍生自人源化的抗体。人源化的FcγRIIB特异性抗体可包含基本上所有的至少一个，且通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区域对应于非人免疫球蛋白(即，供体抗体)的CDR区域且所有或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白共有序列的框架区。
本发明的双抗体包含对FcγRIIB特异性的人源化可变结构域，其中人抗体(接受体抗体)的重链和/或轻链可变区的一个或多个CDR的一个或多个区域已被以比结合FcγRIIA大的亲和力特异性结合FcγRIIB的供体单克隆抗体，例如由克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的单克隆抗体的一个或多个CDR的相似部分置换。在其他实施方式中，人源化抗体分别结合与2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2相同的表位。
在优选的实施方式中，人源化FcγRIIB结合结构域的CDR区域衍生自对FcγRIIB特异性的鼠抗体。在某些实施方式中，本文所述的人源化抗体包含改变，包括但不限于接受体抗体即人重链和/或轻链可变结构域的框架区对于保持供体单克隆抗体的结合特异性所必需的氨基酸缺失、插入、修饰。在某些实施方式中，本文所述的人源化抗体的框架区不一定由天然存在的人抗体可变区的框架区的准确氨基酸序列组成，而是包含各种改变，包括但不限于改变了人源化抗体的性质，例如提高对与鼠FcγRIIB特异性抗体相同的靶特异性的人源化抗体区域的结合性质的氨基酸缺失、插入、修饰。在最优选的实施方式中，为了避免大规模的引入非人框架残基 并且为保证人源化抗体在人体内的最小免疫原性而对框架区进行最小数目的改变。供体单克隆优选地是由克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的单克隆抗体。
在特定实施方式中，该结合结构域包括以比所述抗体结合FcγRIIA大的亲和力特异性结合FcγRIIB的CDR嫁接的抗体的可变结构域，其中所述CDR嫁接的抗体包含含有接受体抗体的框架残基和来自供体单克隆抗体的残基的重链可变区结构域，所述供体单克隆抗体以比所述抗体结合FcγRIIA大的亲和力特异性结合FcγRIIB，例如由克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的单克隆抗体。在另一个特定实施方式中，本发明的双抗体包含以比所述抗体结合FcγRIIA大的亲和力特异性结合FcγRIIB的CDR嫁接的抗体的可变结构域，其中所述CDR嫁接的抗体包含含有接受体抗体的框架残基和来自供体单克隆抗体的残基的轻链可变区结构域，所述供体单克隆抗体以比所述抗体结合FcγRIIA大的亲和力特异性结合FcγRIIB，例如由克隆2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2产生的单克隆抗体。
用于本发明的人源化的抗-FcγRIIB可变结构域可具有包含CDR1(SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25)和/或CDR2(SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27)和/或CDR3(SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29)的氨基酸序列的重链可变区和/或包含CDR1(SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31)和/或CDR2(SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35)和/或CDR3(SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37)的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个特定实施方式中，双抗体包含来自人源化的2B6抗体的可变结构域，其中VH区域由来自人种系VH区段VH1-18(Matsuda等人(1998)“The Complete Nucleotide Sequence Of The Human Immunoglobulin Heavy Chain Variable Region Locus，”J.Exp.Med.188：2151-2162)和JH6(Ravetch等人(1981)“Structure Of The Human Immunoglobulin Mu Locus：Characterization Of Embryonic And Rearranged J And D Genes，”Cell27(3Pt.2)：583-91)的FR区段以及2B6VH的一个或多个CDR区域组成， 具有氨基酸序列SED ID NO：24、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：28。在一个实施方式中，2B6VH具有氨基酸序列SEQ ID NO：38。在另一个实施方式中，2B6VH结构域具有Hu2B6VH的氨基酸序列，SEQ ID NO：85，且可由核苷酸序列SEQ ID NO：86编码。在另一个特定实施方式中，双抗体还包含VL区域，其由人种系VL区段VK-A26(Lautner-Rieske等人(1992)“The Human Immunoglobulin Kappa Locus.Characterization Of The Duplicated A Regions，”Eur.J.Immunol.22：1023-1029)和JK4(Hieter等人(1982)“Evolution Of Human Immunoglobulin Kappa J Region Genes，”J.Biol.Chem.257：1516-22)的FR区段和的2B6VL的一个或多个CDR区域组成，具有氨基酸序列SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：36。在一个实施方式中，2B6VL具有氨基酸序列SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：41。在特定实施方式中，2R6VL具有Hu2B6VL的氨基酸序列SEQ ID NO：87)，且可由SEQ ID NO：88中提供的核苷酸序列编码。
在另一个特定实施方式中，双抗体具有来自人源化的3H7抗体的可变结构域，其中VH区域由来自人种系VH区段的FR区段和3H7VH的CDR区域组成，具有氨基酸序列SEQ ID NO.35。在另一个特定实施方式中，人源化的3H7抗体还包含VL区域，所述VL区域由人种系VL区段的FR区段和3H7VL的CDR区域组成，具有氨基酸序列SEQ ID NO：42。
特别地，结合结构域免疫特异性地结合天然人FcγRIIB的胞外结构域，且以下列组合中的任何一种包含2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11或1F2的CDR序列(或可选择地，由其组成)：VH CDR1和VL CDR1；VH CDR1和VL CDR2；VH CDR1和VL CDR3；VH CDR2和VL CDR1；VH CDR2和VL CDR2；VH CDR2和VL CDR3；VH CDR3和VH CDR1；VH CDR3和VL CDR2；VH CDR3和VL CDR3；VH1CDR1、VH CDR2和VL CDR1；VH CDR1、VH CDR2和VL CDR2；VH CDR1、VH CDR2和VL CDR3；VH CDR2、VH CDR3和VL CDR1、VH CDR2、VH CDR3和VL CDR2；VH CDR2、VH CDR2和VL CDR3；VH CDR1、VL CDR1和VL CDR2；VH CDR1、VL CDR1和VL CDR3；VH CDR2、VL CDR1和VL CDR2； VH CDR2、VL CDR1和VL CDR3；VH CDR3、VL CDR1和VL CDR2；VH CDR3、VL CDR1和VL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3和VL CDR1；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3和VL CDR2；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3和VL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1和VL CDR2；VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1和VL CDR3；VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1和VL CDR2；VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1和VL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1和VL CDR2；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1和VL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR2和VL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1和VL CDR2；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1和VL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；或本文公开的VH CDR和VL CDR的其任何组合。
用来衍生待包括在本发明的双抗体中的结合结构域的抗体还可通过表位作图来表征，使得可选择与FcγRIIA相比具有对FcγRIIB的最大特异性的抗体。抗体的表位作图方法是本领域熟知的且被包括在本发明的方法中。在某些实施方式中，包含FcγRIIB的一个或多个区域的融合蛋白可用于对本发明的抗体的表位作图。在特定实施方式中，融合蛋白包含被融合到人IgG2的Fc部分的FcγRIIB的某个区域的氨基酸序列。每种融合蛋白还可包含氨基酸置换和/或用来自如下表2中所示的同源受体，例如FcγRIIA的对应区域取代受体的某些区域。pMGX125和pMGX132包含FcγRIIB受体的IgG结合位点，前者具有FcγRIIB的C末端且后者具有FcγRIIA的C末端且可被用来区分C末端结合。其他的在IgG结合位点具有FcγRIIA置换和FcγIIA或FcγIIB的N-末端。这些分子可帮助确定受体分子结合抗体的部分。
表2 可用来研究抗FcγRIIB单克隆抗体的表位的融合蛋白列表。残基172至180属于FcγRIIA和B的IgG结合位点。来自FcγRIIA序列的具体氨基酸为粗体。
融合蛋白可用在用于确定与本发明的抗FcγRIIB抗体结合的任何生化测定，例如ELISA中。在其他实施方式中，可通过使用特定残基被来自FcγRIIA序列的残基取代的肽进行表位特异性的进一步确认。
这些抗体可使用用于确定本发明的抗体的功能，特别是调节FcγRiIB信号传导的活性的测定来表征。例如，本发明的表征测定可测量FcγRIIB的ITIM基序中酪氨酸残基的磷酸化，或测量对B细胞受体产生的钙动员的抑制。本发明的表征测定可以是基于细胞的测定或是无细胞测定。
本领域已充分确信在肥大细胞中，FcγRIIB与高亲和力IgE受体FcεRI的共聚集产生对抗原诱导的脱粒、钙动员和细胞因子产生的抑制(Metcalfe D.D.等人(1997)“Mast Cells，”Physiol.Rev.77：1033-1079；Long E.O.(1999)“Regulation Of Immune Responses Through Inhibitory Receptors.”Annu.Rev.Immunol.17：875-904)。最近已阐明了该信号传导通路的分子细节(Ott V.L.(2002)“Downstream Of Kinase，p62(dok)，Is A Mediator Of FcgammaIIB Inhibition Of Fc Epsilon RI Signaling，”J.Immunol.162(9)：4430-4439)。一旦与FcεRI共聚集，FcγRIIB在其ITIM基序中的酪氨酸被快速磷酸化，并然后召集包含Src同源性-2的肌醇-5-磷酸酶(SHIP)(一种包含SH2结构域的肌醇多磷酸5-磷酸酶)，其进而被磷酸化并与Shc和p62dok缔合(p62dok是衔接子分子家族的原型，其包括信号传导结构域例如氨基末端的普列克底物蛋白(pleckstrin)同源结构域(PH结构域)、PTB结构域和包含PXXP基序和许多磷酸化位点的羧基末端区域(Carpino等人(1997)“p62(dok)：A Constitutively Tyrosine-Phosphorylated，GAP-Associated Protein In Chronic Myelogenous Leukemia Progenitor Cells，”Cell，88：197-204；Yamanshi等人(1997)“Identification Of The Abl-And rasGAP-Associated62kDa Protein As A Docking Protein，Dok，”Cell，88：205-211)。
可同样地表征用于本发明的抗-FcγRIIB抗体调节一种或多种IgE介导的反应的能力。优选地，共表达针对IgE的高亲和力受体和针对FcγRIIB的低亲和力受体的细胞系将被用于表征抗FcγRIIB抗体调节IgE介导的反应。在特定实施方式中，将使用来自大鼠嗜碱性粒细胞的白血病细胞系的转染了全长人FcγRIIB的细胞(RBL-H23；Barsumian E.L.等人(1981)“IgE-Induced Histamine Release From Rat Basophilic Leukemia Cell Lines：Isolation Of Releasing And Nonreleasing Clones，”Eur.J.Immunol.11：317-323，其被通过引用全部并入本文)。RBL-2H3是被充分表征的已被广泛地用于研究IgE-介导的细胞活化之后的信号传导机制的大鼠细胞系。当表达在RBL-2H3细胞中并与FcεRI共聚集时，FcγRIIB抑制FcεRI-诱导的钙动员、脱粒和细胞因子产生(Malbec等人(1998)“Fc Epsilon Receptor I-Associated Lyn-Dependent Phosphorylation Of Fc Gamma Receptor IIB During Negative Regulation Of Mast Cell Activation，”J.Immunol.160：1647-1658；Daeron等人(1995)″Reguulation Of High-Affinity IgE Receptor-Mediated Mast Cell Activation By Murine Low-Affinity IgG Receptors，″J.Clin.Invest.95：577；Ott V.L.(2002)“Downstream Of Kinase，p62(dok)，Is A Mediator Of FcgammaIIB Inhibition Of Fc Epsilon RI Signaling，”J.Immunol.162(9)：4430-4439)。
还可表征用于本发明的抗体对FcεRI诱导的肥大细胞活化的抑制。例如,来自大鼠嗜碱性粒细胞的白血病细胞系的已转染了FcγRIIB的细胞(RBL-H23；Barsumian E.L.等人(1981)“IgE-Induced Histamine Release From Rat Basophilic Leukemia Cell Lines：Isolation Of Releasing And Nonreleasing Clones，”Eur.J.Immunol.11：317-323)用IgE致敏并用兔抗小鼠IgG的F(ab’)2片段刺激以聚集单独的FcεRI或用完整的兔抗小鼠IgG刺激以共聚集FcγRIIB和FcεRI。在该系统中，对下游信号传导分子的间接调节可在将本发明的抗体加至被致敏和刺激的细胞后测定。例如，可测定FcγRIIB的酪氨酸磷酸化和SHIP的召集和磷酸化、包括但不限于Erk1、Erk2、JNK或p38的MAP激酶家族成员的活化；以及p62dok的酪氨酸磷酸化及其与SHIP和RasGAP的结合。
用于确定本发明的抗体对FcεRI诱导的肥大细胞活化的抑制的一种示例性测定可由下列步骤构成：用人FcγRIIB转染RBL-H23细胞；用IgE使RBL-H23细胞致敏；用兔抗小鼠IgG的任意一个F(ab’)2刺激RBL-H23细胞(以聚集单独的FcεRI并引发FcεRI-介导的信号传导，作为对照)或用完整的兔抗小鼠IgG刺激RBL-H23细胞(以共聚集FcγRIIB和FcεRI，产生对FcεRI-介导的信号传导的抑制)。还可用本发明的抗体预孵育已用完整的兔抗小鼠IgG刺激的细胞。测量已用本发明的抗体预孵育的细胞和未用本发明的抗体预孵育的细胞的FcεRI-依赖性活性并比较这些细胞中的FcεRI-依赖性活性的水平，将表明本发明的抗体对FcεRI-依赖性活性的调节。
上述示例性测定可例如用来鉴定阻断配体(IgG)结合FcγRIIB受体并通过阻止FcγRIIB和FcεRI的共聚集来拮抗FcγRIIB-介导的对FcεRI信号传导的抑制的抗体。该测定同样地鉴定增强FcγRIIB和FcεRI的共聚集并通过促进FcγRIIB和FcεRI的共聚集来激动FcγRIIB-介导的对FcεRI信号传导的抑制的抗体。
在某些实施方式中，通过优选地在基于细胞的测定中监控和/或测量肥大细胞或嗜碱性粒细胞的脱粒表征了包含本文所述的或本领域已知的鉴定到的抗FcγRIIB抗体的表位结合结构域的本发明的抗FcγRIIB的双抗体调节IgE介导的反应的能力。优选地，已使用本领域技术人员已知的标准重组方法将用于这些测定中的肥大细胞或嗜碱性粒细胞构建为包含人FcγRIIB。在特定实施方式中，在基于细胞的β-己糖胺酶(颗粒中包含的酶)释放测定中表征了本发明的抗FcγRIIB抗体调节IgE介导的反应的能力。β-己糖胺酶从肥大细胞和嗜碱性粒细胞中的释放是急性过敏和炎性病症中的主要事件(Aketani等人(2001)“Correlation Between Cytosolic Calcium Concentration And Degranulation In RBL-2H3Cells In The Presence Of Various Concentrations Of Antigen-Specific IgEs，”Immunol.Lett.75：185-189；Aketani等人(2000)“A Screening Method For Antigen-Specific IgE Using Mast Cells Based On Intracellular Calcium Signaling，”Anal.Chem.72：2653-2658)。其他炎症调节因子包括但不限于血清素和组胺的释放可被测定以根据本发明的方法测量IgE介导的反应。虽然不期望被特定的作用 机制束缚，但是颗粒例如包含β-己糖胺酶的颗粒从肥大细胞和嗜碱性粒细胞的释放是由FcγRI与多价抗原的交联引发的依赖细胞内钙浓度的过程。
研究人肥大细胞的能力因不存在合适的长期人肥大细胞培养物而被限制。近来从来自患肥大细胞肉瘤/白血病的患者的骨髓吸出物中确定了被指定为LAD1和LAD2的两种新型干细胞因子依赖性的人肥大细胞系(Kirshenbaum等人(2003)“Characterization Of Novel Stem Cell Factor Responsive Human Mast Cell Lines LAD1And2Established From A Patient With Mast Cell Sarcoma/Leukemia；Activation Following Aggregation Of FcRI Or FcγRI，”Leukemia research，27：677-82，其被通过引用全部并入本文)。这两种细胞系已被描述为表达FcεRI和多种人肥大细胞标志。LAD1和2细胞可用于评价本发明的抗体对IgE介导的反应的作用。在特定实施方式中，基于细胞的β-己糖胺酶释放测定例如上文描述的测定可用于LAD细胞以确定本发明的抗FcγRIIB抗体对IgE介导的反应的任何调节。在示例性测定中，用嵌合的人IgE抗硝基苯酚(NP)激发并用多价抗原BSA-NP刺激人肥大细胞，例如LAD1并通过测量释放到上清液中的β-己糖胺酶来监测细胞脱粒(Kirshenbaum等人(2003)“Characterization Of Novel Stem Cell Factor Responsive Human Mast Cell Lines LAD1And2Established From A Patient With Mast Cell Sarcoma/Leukemia；Activation Following Aggregation Of FcRI Or FcγRI，”Leukemia research，27：677-82，其被通过引用全部并入本文)。
在某些实施方式中，如果人肥大细胞具有如使用本领域已知的标准方法，例如FACS染色确定的低的内源性FcγRIIB表达，则可能难以监测和/或检测由本发明的抗FcγRIIB双抗体介导的抑制性通路的活化的差异。因此本发明包括替代方法，其中可使用细胞因子和特定的生长条件上调FcγRIIB的表达。FcγRIIB已被描述为在人单核细胞系，例如THP1和U937(Tridandapani等人(2002)“Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells，”J.Biol.Chem.，277(7)：5082-5089)和在原代人单核细胞(Pricop等人(2001)“Differential Modulation Of Stimulatory And Inhibitory Fc Gamma Receptors On Human  Monocytes By Th1And Th2Cytokines，”J.of Immunol.，166：531-537)中被IL-4高度上调。用联丁酰基环状AMP分化U937细胞已被描述为增加FcγRII的表达(Cameron等人(2002)“Differentiation Of The Human Monocyte Cell Line，U937，With Dibutyryl CyclicAMP Induces The Expression Of The Inhibitory Fc Receptor，FcgammaRIIB，”Immunology Letters83，171-179)。因此可使用细胞因子例如，IL-4、IL-13上调用于本发明的方法中的人肥大细胞中内源性FcγRIIB的表达以增强检测的灵敏度。
还可测定抗FcγRIIB抗体对B细胞受体(BCR)介导的信号传导的抑制。BCR-介导的信号传导可包括至少一种或多种下游生物学反应，例如B细胞的活化和增殖、抗体产生等。FcγRIIB与BCR的共聚集导致对细胞周期进展和细胞存活的抑制。另外，FcγRIIB与BCR的共聚集导致对BCR介导的信号传导的抑制。
特别地，BCR介导的信号传导包括下列中的至少一种或多种：调节下游信号传导分子(例如，FcγRIIB的磷酸化状态、SHIP召集、Btk和/或PLCγ的定位、MAP激酶活性、Akt(抗凋亡信号)的召集、钙动员、细胞周期进展以及细胞增殖。
虽然FcγRIIB-介导的对BCR信号传导的抑制的许多效应功能通过SHIP介导，但是最近已表明来自SHIP缺陷型小鼠的脂多糖(LPS)-活化的B细胞表现出明显的FcγRIIB-介导的对钙动员、Ins(1，4，5)P3产生和Erk及Akt磷酸化的抑制(Brauweiler等人(2001)“Partially Distinct Molecular Mechanisms Mediate Inhibitory FcgammaRIIB Signaling In Resting And Activated B Cells，”Journal of Immunology，167(1)：204-211)。因此，来自SHIP缺陷型小鼠的活体外B细胞可用来表征本发明的抗体。用于通过本发明的抗体确定FcγRIIB-介导的对BCR信号传导的抑制的一种示例性测定可包括下列步骤：从SHIP缺陷型小鼠分离脾B细胞，用脂多糖活化所述细胞，并用F(ab’)2抗-IgM刺激所述细胞以聚集BCR或用抗-IgM刺激所述细胞以共聚集BCR与FcγRIIB。还可用本发明的抗体预孵育为了共聚集BCR与FcγRIIB而用完整的抗-IgM刺激的细胞。可通过本领域已知的标准技术测量细胞的FcγRIIB-依赖性活性。比较已用所述抗体预孵育的细胞和未被预 孵育的细胞的FcγRIIB-依赖性活性水平，并且比较这些水平将表明所述抗体对FcγRIIB-依赖性活性的调节。
测量FcγRIIB-依赖性活性可包括例如，通过流式细胞术测量细胞内钙动员，测量Akt和/或Erk的磷酸化，测量BCR-介导的PI(3，4，5)P3的积累，或测量FcγRIIB-介导的B细胞增殖。
这些测定可用来例如鉴定用于本发明的双抗体或抗FcγRIIB抗体，所述本发明的双抗体或抗-FcγRIIB抗体通过阻断针对FcγRIIB受体的配体(IgG)结合位点来调节FcγRIIB-介导的对BCR信号传导的抑制并通过阻止FcγRIIB和BCR的共聚集来拮抗FcγRIIB-介导的对BCR信号传导的抑制。该测定还可用来鉴定增强FcγRIIB和BCR的共聚集并激动FcγRIIB-介导的对BCR信号传导的抑制的抗体。
还可在人单核细胞/巨噬细胞中测定抗FcγRIIB抗体的FcγRIIB介导的信号传导。使用SHIP作为其效应子，FcγRIIB与具有免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)的受体的共聚集起到下调FcγR-介导的吞噬作用的功能(Tridandapani等人(2002)“Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells，”J.Biol.Chem.，277(7)：5082-5089)。FcγRIIA与FcγRIIB的共聚集导致FcγRIIB的ITIM基序上酪氨酸残基的快速磷酸化，导致SHIP磷酸化的增强、SHIP与Shc的缔合，以及具有120和60-65kDa的分子量的蛋白质的磷酸化。另外，FcγRIIA与FcγRIIB的共聚集导致Akt磷酸化的下调，Akt是参与细胞调控并用来抑制凋亡的丝氨酸-苏氨酸激酶。
还可在人单核细胞/巨噬细胞中测定抗FcγRIIB双抗体对FcγR介导的吞噬作用的抑制。例如，可用针对FcγRII的小鼠单克隆抗体IV.3的Fab片段和山羊抗小鼠抗体(以单独聚集FcγRIIA)或用完整的IV.3小鼠单克隆抗体和山羊抗小鼠抗体(以共聚集FcγRIIA和FcγRIIB)刺激来自人单核细胞系的细胞THP-1。在该系统中，对下游信号传导分子的调节，例如FcγRIIB的酪氨酸磷酸化、SHIP的磷酸化、SHIP与Shc的结合、Akt的磷酸化和具有120和60-65kDa的分子量的蛋白质的磷酸化可在向被刺激的细胞加入本发明的分子后测定。另外，单核细胞系的FcγRIIB-依赖性吞噬效率可在存在和不存在本发明的抗体下直接测量。
用于在单核细胞/巨噬细胞中确定本发明的抗体对FcγR-介导的吞噬作用的抑制的另一种示例性测定可包括下列步骤：用IV.3小鼠抗-FcγRII抗体的Fab和山羊抗小鼠抗体(以单独聚集FcγRIIA并引发FcγRIIA介导的信号传导)或用小鼠抗-FcγRII抗体和山羊抗小鼠抗体(以共聚集FcγRIIA和FcγRIIB并抑制FcγRIIA介导的信号传导)刺激THP-1细胞。已用小鼠抗-FcγRII抗体和山羊抗小鼠抗体刺激的细胞还可用本发明的分子预孵育。测量已用本发明的分子预孵育的被刺激的细胞和未用本发明的抗体预孵育的细胞的FcγRIIA-依赖性活性并比较这些细胞中FcγRIIA-依赖性活性水平将表明本发明的抗体对FcγRIIA-依赖性活性的调节。
所描述的示例性测定可用来例如鉴定阻断FcγRIIB受体的配体结合并通过阻止FcγRIIB和FcγRIIA的共聚集来拮抗FcγRIIB-介导的对FcγRIIA信号传导的抑制的结合结构域。该测定同样地鉴定增强FcγRIIB和FcγRIIA的共聚集并激动FcγRIIB-介导的对FcγRIIA信号传导的抑制的结合结构域。
可测定目的FcγRIIB结合结构域，通过之前描述的方法测量THP-1细胞吞噬荧光素化的IgG-调理的绵羊红细胞(SRBC)的能力(Tridandapani等人(2000)“The Adapter Protein LAT Enhances Fcgamma Receptor-Mediated Signal Transduction In Myeloid Cells，”J.Biol.Chem.275：20480-7)。例如，用于测量吞噬作用的示例性测定包括：用本发明的抗体或用不结合FcγRII的对照抗体处理THP-1细胞，比较所述细胞的活性水平，其中细胞活性(例如，玫瑰花结玫瑰花结活性(结合IgG-包被的SRBC的THP-1细胞的数目)、黏附活性(结合到THP-1细胞的SRBC的总数)和吞噬速度方面的差异)将表明本发明的抗体对FcγRIIA-依赖性的活性的调节。该测定可用来鉴定例如阻断配体对FcγRIIB受体的配体结合并拮抗FcγRIIB-介导的对吞噬作用的抑制的抗体。该测定还可鉴定增强FcγRIIB-介导的对FcγRIIA信号传导的抑制的抗体。
在优选的实施方式中，这些结合结构域以下列方式中的至少一种或多种在单核细胞/巨噬细胞中调节FcγRIIB-依赖性的活性：调节下游信号传导分子(例如，调节FcγRIIB的磷酸化状态、调节SHIP磷酸化、调节SHIP和Shc的缔合、调节Akt磷酸化、调节约120和60-65kDa的另外的蛋白质的磷酸化)和调节吞噬作用。
5.1.2.CD16A结合结构域 
以下部分讨论了可用作产生共价双抗体的轻链和重链可变区的来源的CD16A结合蛋白。在本发明中，CD16A结合蛋白包括包含抗-CD16A抗体的VL和VH结构域的分子的抗体，该VL和VH结构域被用于产生本发明的双抗体。
多种CD16A结合蛋白可结合本发明使用。合适的CD16A结合蛋白包括人或人源化的单克隆抗体以及结合CD16A的抗体片段(例如，scFv或单链抗体、Fab片段、小型抗体)和通过与轻链可变区结构域、重链可变区结构域或二者相互作用而结合CD16A的另一种抗体样蛋白质。
在某些实施方式中，根据本发明使用的CD16A结合蛋白包含VL和/或VH结构域，其具有序列衍生自非人抗CD16A抗体，例如小鼠抗-CD16A抗体的一个或多个CDR以及衍生自一种或多种人免疫球蛋白的框架序列的一个或多个框架区。可获得CDR和其他序列的几种非人抗CD16A单克隆抗体是已知的(参见，例如Tamm等人(1996)“The Binding Epitopes Of Human CD16(Fc gamma RIII)Monoclonal Antibodies.Implications For Ligand Binding，”J.Imm.157：1576-81；Fleit等人(1989)159页；LEUKOCYTE TYPING II：HUMAN MYELOID AND HEMATOPOIETIC CELLS，Reinherz等人，编辑New York：Springer-Verlag；(1986)；LEUCOCYTE TYPING III：WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS McMichael A J，编辑，Oxford：Oxford University Press，1986)；LEUKOCYTE TYPING IV：WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS，Kapp等人，编辑.Oxford Univ.Press，Oxford；LEUKOCYTE TYPING V：WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS，Schlossman等人，编辑.Oxford Univ.Press，Oxford；LEUKOCYTE TYPING VI：WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS，Kishimoto，编辑Taylor&Francis)。另外，如实施例中展现的，识别细胞上表达的人CD16A的新型CD16A结合 蛋白可使用用于产生和选择单克隆抗体或相关结合蛋白的熟知方法(例如，杂交瘤技术、噬菌体展示及类似技术)获得。参见，例如O′Connell等人(2002)“Phage Versus Phagemid Libraries For Generation Of Human Monoclonal Antibodies，”J.Mol.Biol.321：49-56；Hoogenboom等人(2000)“Natural And Designer Binding Sites Made By Phage Display Technology，”Imm.Today21：371078；Krebs等人(2001)“High-Throughput Generation And Engineering Of Recombinant Human Antibodies，”J.Imm.Methods254：67-84；和本文提到的其他文献。使用本领域已知的抗体人源化技术，来自非人物种的单克隆抗体可被嵌合或被人源化。
可选择地，针对CD16A的完整人抗体可使用具有人免疫系统元件的转基因动物(参见，例如美国专利第5,569,825和5,545,806号)，使用人外周血细胞(Casali等人(1986)“Human Monoclonals From Antigen-Specific Selection Of B Lymphocytes And Transformation By EBV，”Science234：476-479)，通过根据由Huse等人(1989)“Generation Of A Large Combinatorial Library Of The Immunoglobulin Repertoire In Phage Lambda，”Science246：1275-1281概括的一般方案筛选来自人B细胞的DNA文库，和通过其他方法产生。
在优选的实施方式中，该结合供体来自3G8抗体或其人源化形式，例如，诸如被通过引用全部并入本文的美国专利申请公布2004/0010124中公开的抗体或其人源化形式。为了某些目的设想：使用在被3G8结合的相同表位或至少足以接近该表位结合CD16A受体以阻断被3G8结合的CD16A蛋白质可能是有利的。鉴定具有期望的结合性质的表位作图和结合蛋白的竞争性结合实验的方法是实验免疫学领域的技术人员所熟知的。参见，例如，上文提到的Harlow和Lane，等人(1983)“Distinction Of Epitopes By Monoclonal Antibodies，”Methods in Enzymology92：242-253；Kirkland等人(1986)“Analysis Of The Fine Specificity And Cross-Reactivity Of Monoclonal Anti-Lipid A Antibodies，”J.Immunol.137：3614-3619；Morel等人(1988)“Monoclonal Antibodies To Bovine Serum Albumin：Affinity And Specificity Determinations，”Molec.Immunol.25：7-15；Cheung等人(1990) “Epitope-Specific Antibody Response To The Surface Antigen Of Duck Hepatitis B Virus In Infected Ducks，”Virology176：546-552；和Moldenhauer等人(1990)“Identity Of HML-1Antigen On Intestinal Intraepithelial T Cells And Of B-ly7Antigen On Hairy Cell Leukaemia，”Scand.J.Immunol.32：77-82。例如，通过使用两种抗体中的一种来捕捉ELISA平板上的抗原并然后测量第二抗体结合所捕捉的抗原的能力来确定这两种抗体是否结合同一位点是可能的。表位比较还可通过用酶、放射性核素或荧光团来直接或间接标记第一抗体并测量未被标记的第二抗体抑制第一抗体与溶液中或固相上的细胞上的抗原结合的能力来实现。
测量抗体阻断CD16A受体与ELISA平板上形成的免疫复合体的结合的能力也是可能的。这些免疫复合体通过先用抗原例如荧光素包被平板，然后对平板应用特定抗荧光素抗体形成。然后该免疫复合体用作可溶性Fc受体例如sFcRIIIa的配体。可选择地，可溶性免疫复合体可被形成并用酶、放射性核素或荧光团直接或间接标记。然后可测量抗体抑制这些标记的免疫复合体与溶液中或固相上的细胞上的Fc受体结合的能力。
本发明的CD16A结合蛋白可以或可以不包含人免疫球蛋白的Fc区。例如，scFv结合蛋白中不存在Fc区。例如，人或人源化的四聚体IgG单克隆抗体中存在Fc区。如上文描述的，在本发明的某些实施方式中，CD16A结合蛋白包括与未改变的Fc区(例如，天然存在的IgG1蛋白质的Fc)相比具有改变的效应功能，例如，对效应配体例如Fc受体或补体的C1组分的亲和力降低的Fc区。在一个实施方式中，Fc区在该Fc区的对应于位置297的氨基酸处未被糖基化。这些抗体缺乏Fc效应功能。
因此，CD16A结合蛋白可由于该结合蛋白中不存在Fc结构域而不表现出Fc介导的对效应配体例如Fc受体或补体的C1组分的结合，然而在其他实例中，结合或效应功能的缺乏是由于抗体恒定区中的改变引起的。
5.1.2.1 包含与mAb3G8CDR序列相似的CDR序列的CD16A结合蛋白。 
可用于本发明的实践的CD16A结合蛋白包括含有衍生自(即，具有与之相同或相似的序列)小鼠单克隆抗体3G8的CDR的CDR序列的蛋白质。 如所描述的对编码小鼠3G8单克隆抗体的重链和轻链可变区、包括CDR编码序列的互补cDNA克隆和测序。以下提供了3G8的核酸和蛋白质序列。使用小鼠可变区和CDR序列，制备了包含衍生自3G8CDR的互补决定区的大量嵌合和人源化单克隆抗体并分析了它们的性质。为了鉴定以高的亲和力结合CD16A并具有其他期望性质的人源化抗体，制备了包含具有衍生自3G8的VH区域的抗体重链并将其与包含具有衍生自3G8的CDR的抗体轻链的VL区域的抗体轻链组合(通过共表达)以制备待分析的四聚体抗体。如下所述地确定所得的四聚体抗体的性质。如下所述，可根据本发明使用包含3G8CDR的CD16A结合蛋白例如本文所述的人源化抗体蛋白质。
5.1.2.1.1 VH区域
一方面，本发明的CD16A结合蛋白可包含重链可变结构域，其中至少一个CDR(且通常是三个CDR)具有小鼠单克隆抗体3G8的重链的CDR(且更通常地所有三个CDR)的序列且该结合蛋白的剩余部分基本上是人的(衍生自与一种或多种人抗体的重链可变区或与之基本上相似)。
一方面，本发明提供了人源化3G8抗体或包含衍生自该3G8抗体的CDR的处于基本上人源的框架中的抗体片段，但是其中重链可变结构域的至少一个CDR在序列上不同于对应的小鼠抗体3G8的重链CDR。例如，在一个实施方式中，如本领域已知的或在表3和4A-H中公开的，所述CDR至少因具有本领域已知的被表明影响3G8与CD16A的结合的一种或多种CDR置换而不同于3G8CDR序列。合适的CD16结合蛋白可包含这些置换中的0、1、2、3或4种或更多种(且通常具有这些置换中的1至4种)且任选地还可具有另外的置换。
表3.VH结构域置换 
表4A.衍生自3G8VH的VH序列＊
  FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
3G8VH A A A A A A A
Ch3G8VH A A A A A A B
HxC B A B A A A B
CxH A A A A B A B
Hu3G8VH-1 B A B A B A B
Hu3G8VH-2 C A B A B A B
Hu3G8VH-3 D A B A B A B
Hu3G8VH-4 B A B A C B B
Hu3G8VH-5 B A B A C A B
Hu3G8VH-6 B B B A B B B
Hu3G8VH-7 B B B A B A B
Hu3G8VH-8 B A B A B C B
Hu3G8VH-9 B A B B B B B
Hu3G8VH-10 B A B A B B B
Hu3G8VH-11 B A B B B A B
Hu3G8VH-12 B A B C B A B
Hu3G8VH-13 B A B D B A B
Hu3G8VH-14 B A B E B A B
Hu3G8VH-15 B A B A D A B
Hu3G8VH-16 B A B A E A B
Hu3G8VH-17 B A B A F A B
Hu3G8VH-18 B A B A G A B
Hu3G8VH-19 B A B A C C B
Hu3G8VH-20 B B B C B A B
Hu3G8VH-21 B A B A D B B
Hu3G8VH-22 B B B C B C B
Hu3G8VH-23 B B B C E C B
Hu3G8VH-24 B B B C F C B
Hu3G8VH-25 B B B C G C B
Hu3G8VH-26 B B B C C C B
Hu3G8VH-27 B B B C E D B
Hu3G8VH-28 B B B C F D B
Hu3G8VH-29 B B B C G D B
Hu3G8VH-30 B B B C C D B
Hu3G8VH-31 E B B C B A B
Hu3G8VH-32 E B B H B A B
[0318] 
  FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
Hu3G8VH-33 E B B H B A B
Hu3G8VH-34 E B B C B C B
Hu3G8VH-35 E B B C C C B
Hu3G8VH-36 E B B H C D B
Hu3G8VH-37 E B B H E C B
Hu3G8VH-38 E B B F B A B
Hu3G8VH-39 E B B I B A B
Hu3G8VH-40 E B B G B A B
Hu3G8VH-41 E B B J B A B
Hu3G8VH-42 E B B C H A B
Hu3G8VH-43 E B B C H C B
Hu3G8VH-44 E B B C I D B
Hu3G8VH-45 E B B C J D B
*表4A中的字母指表4B-H中的序列。
表4B：FR1
A B C D E   残基
             
Q Q Q Q Q   1
V V V V I   2
T T T T T   3
L L L L L   4
K R K R K   5
E E E E E   6
S S S S S   7
G G G G G   8
P P P P P   9
G A A A T   10
I L L L L   11
L V V V V   12
Q K K K K   13
P P P P P   14
S T T T T   15
Q Q Q Q Q   16
T T T T T   17
L L L L L   18
S T T T T   19
L L L L L   20
T T T T T   21
C C C C C   22
S T T T T   23
F F F F F   24
S S S S S   25
G G G G G   26
F F F F F   27
S S S S S   28
L L L L L   29
R S S R S   30
103 104 105 106 107   SEQ ID NO.
SEQ ID NO. 序列
103 QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLR
104 QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLS
105 QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLS
[0323] 
106 QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLR
107 QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLS
表4C：CDR1
A B   残基
       
T T   31
S S   32
G G   33
M V   34
G G   35
V V   35A
G G   35B
108 109   SEQ ID NO.
SEQ ID NO. 序列
108 TSGMGVG
109 TSGVGVG
表4D：FR2
A B   残基
       
W W   36
I I   37
R R   38
Q Q   39
P P   40
S P   41
G G   42
K K   43
G A   44
L L   45
E E   46
W W   47
L L   48
A A   49
110 111   SEQ ID NO.
SEQ ID NO. 序列
110 WIRQPSGKGLEWLA
111 WIRQPPGKALEWLA
表4E：CDR2
A B C D E F G H I J 残基
                     
H H H H H L H L H L 50
I I I I I I I I I I 51
W Y W Y W D F W D W 52
W W W W W W W W W W 53
D N D D N D D D D N 54
D D D D D D D D D D 55
D D D D D D D D D D 56
K K K K K K K K K K 57
R R R R R R R R R R 58
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 59
[0332] 
N N S N N S S S S S 60
P P P P P P P P P P 61
A A S A A S S S S S 62
L L L L L L L L L L 63
K K K K K K K K K K 64
S S S S S S S S S S 65
112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 SEQ ID NO
SEQ ID NO. 序列
112 HWWDDDKRYNPALKS
113 HIYWNDDKRYNPALKS
114 HIWWDDDKRYSPSLKS
115 HIYWDDDKRYNPALKS
116 HIWWNDDKRYNPALKS
117 LIDWDDDKRYSPSLKS
118 HIFWDDDKRYSPSLKS
119 LIWWDDDKRYSPSLKS
120 HIDWDDDKRYSPSLKS
121 LIWWNDDKRYSPSLKS
表4F：FR3
SEQ ID NO. 序列
122 RLTISKDTSSNQVFLKIDTADTATYYCAQ
123 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAR
124 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAQ
125 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAT
126 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAK
127 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAA
128 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAH
129 RLTITKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAR
130 RLTITKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAH
131 RLTITKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAQ
132 RLTISKDTSSNQVFLKADTADTATYYCAQ
133 RLTISKDTSKNQVVLTTDPVDTATYYCAR
134 RLTISKDTSKNQVVLTTDPVDTATYYCAQ
135 RLTISKDTSKNQVVLTTDPVDTATYYCAT
136 RLTISKDTSKNQVVLTTDPVDTATYYCAK
137 RLTISKDTSKNQVVLTTDPVDTATYYCAA
138 RLTISKDTSKNQVVLTTDPVDTATYYCAH
139 RLTITKDTSKNQVVLTTDPVDTATYYCAR
140 RLTITKDTSKNQVVLTTDPVDTATYYCAH
141 RLTITKDTSKNQVVLTTDPVDTATYYCAQ
142 RLTISKDTSSNQVFLKSDTADTATYYCAQ
143 RLTISKDTSKNQVVLTNDPVDTATYYCAR
144 RLTISKDTSKNQVVLTNDPVDTATYYCAQ
145 RLTISKDTSKNQVVLTNDPVDTATYYCAT
146 RLTISKDTSKNQVVLTNDPVDTATYYCAK
147 RLTISKDTSKNQVVLTNDPVDTATYYCAA
148 RLTISKDTSKNQVVLTNDPVDTATYYCAH
149 RLTITKDTSKNQVVLTNDPVDTATYYCAR
150 RLTITKDTSKNQVVLTNDPVDTATYYCAH
151 RLTITKDTSKNQVVLTNDPVDTATYYCAQ
152 RLTISKDTSSNQVFLKVDTADTATYYCAQ
153 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAR
154 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAQ
155 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAT
156 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAK
157 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAA
158 RLTISKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAH
159 RLTITKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAR
160 RLTITKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAH
161 RLTITKDTSKNQVVLTMDPVDTATYYCAQ
表4G：CDR3
A B C D 残基
         
I I I I 95
N N N N 96
[0340] 
P P P P 97
A A A A 98
W W Y Y 99
F F F F 100
A D A D 101
Y Y Y Y 102
162 163 164 165 SEQ ID NO
SEQ ID NO. 序列
162 INPAWFAY
163 INPAWFDY
164 INPAYFAY
165 INPAYFDY
表4H：FR4
A B   残基
       
W W   103
G G   104
Q Q   105
G G   106
T T   107
L L   108
V V   109
T T   110
V V   111
S S   112
A S   113
166 167   SEQ ID NO
SEQ ID NO. 序列
166 WGQGTLVTVSA
167 WGQGTLVTVSS
在一个实施方式中，CD16A结合蛋白可包含与序列被提供在SEQ ID NO：68中的Hu3G8VH-1构建体的VH结构域相同或相似的重链可变结构域序列。例如，本发明提供了包含具有如下序列的VH结构域的CD16A结合蛋白，所述序列(1)因表1中列出的0、1或多于1种的CDR置换而不同于Hu3G8VH-1的VH结构域(SEQ ID NO：68)；(2)因表1中列出的0、1或多于1种的框架置换而不同于Hu3G8VH-1的VH结构域；以及(3)在剩余位置与Hu3G8VH-1的VH序列至少约80％相同，经常至少约90％且有时约至少95％相同或甚至至少约98％相同。
本发明的CD16结合蛋白的示例性VH结构域具有3G8VH、Hu3G8VH-5和Hu3G8VH-22的序列(分别是SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：70)。编码3G8VH和Hu3G8VH-5的序列(分别是SEQ  ID NO79和SEQ ID NO：69)的示例性核苷酸序列分别由SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：81提供。
VH结合结构域可具有因表3中所示的至少一种、至少两种、至少三种、至少4种、至少5种或至少6种置换而不同于Hu3G8VH-1的序列(SEQ ID NO：68)的序列。这些置换被认为导致增加的对CD16A的亲和力和/或减少CD16A结合蛋白对人施用时的免疫原性。在某些实施方式中，在剩余位置与Hu3G8VH-1的VH结构域的序列同一性的度为至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％。
为了例示而非限制地，表4中示出了几种CD16A构建蛋白的VH结构域的序列。包含被融合到人Cγ1恒定区的这些序列的重链与hu3G8VL-1轻链共表达(下文描述的)以形成四聚体抗体，并测量抗体与CD16A的结合以评价与hu3G8VH-1VH结构域相比氨基酸置换的作用。VH结构域具有hu3G8VH-1、2、3、4、5、8、12、14、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、42、43、44和45的序列的构建体表现出高亲和力的结合，hu3G8VH-6和hu3G8VH-40VH结构域表现出中度结合。包含Hu3G8VH-5和hu3G8VH-22的VH结构域(分别是SEQ ID NO69和SEQ ID NO：70)的CD16A结合蛋白被认为具有特别有利的结合性质。
5.1.2.2 VL区域
进行了相似的研究以鉴定具有有利的结合性质的轻链可变结构域序列。一方面，本发明提供了包含轻链可变结构域的CD16A结合蛋白，其中至少一个CDR(且通常是三个CDR)具有小鼠单克隆抗体3G8轻链的CDR(且更通常地所有三个CDR)的序列且该结合蛋白的剩余部分基本上是人的(衍生自一种或多种人抗体的重链可变区或与之基本上相似)。
一方面，本发明提供了包含衍生自3G8抗体的CDR的处于基本上人源的框架中的人源化3G8抗体的片段，但是其中轻链可变结构域的至少一个CDR在序列上不同于小鼠单克隆抗体3G8轻链CDR。在一个实施方式中，所述CDR至少由于具有CDR中的一个或多个氨基酸置换例如，表2中所示的一个或多个置换(例如，CDR1中的位置24处的精氨酸；CDR1 中的位置25处的丝氨酸；CDR1中的位置32处的酪氨酸；CDR1中的位置33处的亮氨酸；CDR2中位置50处的天冬氨酸、色氨酸或丝氨酸；CDR2位置53处的丝氨酸；CDR2位置55处的丙氨酸或谷氨酰胺；CDR2位置56处的苏氨酸；CDR3中位置93处的丝氨酸；和/或CDR3中位置94处的苏氨酸)而不同于3G8序列。在多个实施方式中，可变结构域可具有这些置换中的0、1、2、3、4、5或更多种(且通常具有这些置换中的1至4种)且任选地还可具有另外的置换。
在一个实施方式中，合适的CD16A结合蛋白可包含与Hu3G8VH-1构建体的VL结构域(SEQ ID NO：71)相同或相似的轻链可变结构域序列，表6中提供了所述轻链可变结构域的序列。例如，本发明提供了包含具有如下序列的VL结构域的CD16A结合蛋白，所述序列(1)因表5中列出的0、1或更多种的CDR置换而不同于Hu3G8VL-1的VL结构域(SEQ ID NO：71)；(2)因表5中列出的0、1或更多种框架置换而不同于Hu3G8VL-1的VL结构域；以及(3)在剩余位置与Hu3G8VL-1的VL序列(SEQ ID NO：71)至少约80％相同，经常至少约90％且有时约至少95％相同或甚至至少约98％相同。
表5.3G8VL结构域置换 
编号 Kabat位置 区域 置换
1 24 CDR1 Arg
2 25 CDR1 Ser
3 32 CDR1 Tyr
4 33 CDR1 Leu
5 50 CDR2 Asp或Trp或Ser
6 51 CDR2 Ala
7 53 CDR2 Ser
8 55 CDR2 Ala或G1n
9 56 CDR2 Thr
10 93 CDR3 Ser
11 94 CDR3 Thr
表6.衍生自3G8VL的VL序列＊
  FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
3G8VL A A A A A A A
Ch3G8VL A A A A A A A
Hu3G8VL-1 B A A A B A B
Hu3G8VL-2 B B A A B A B
Hu3G8VL-3 B C A A B A B
Hu3G8VL-4 B D A A B A B
Hu3G8VL-5 B E A A B A B
Hu3G8VL-6 B F A A B A B
[0357] 
  FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
Hu3G8VL-7 B G A A B A B
Hu3G8VL-8 B A A B B A B
Hu3G8VL-9 B A A C B A B
Hu3G8VL-10 B A A D B A B
Hu3G8VL-11 B A A E B A B
Hu3G8VL-12 B A A F B A B
Hu3G8VL-13 B A A G B A B
Hu3G8VL-14 B A A A B B B
Hu3G8VL-15 B A A A B C B
Hu3G8VL-16 B A A A B D B
Hu3G8VL-17 B A A A B E B
Hu3G8VL-18 B B A D B A B
Hu3G8VL-19 B B A D B D B
Hu3G8VL-20 B B A D B E B
Hu3G8VL-21 B C A D B A B
Hu3G8VL-22 B C A D B D B
Hu3G8VL-23 B C A D B E B
Hu3G8VL-24 B D A D B A B
Hu3G8VL-25 B D A D B D B
Hu3G8VL-26 B D A D B E B
Hu3G8VL-27 B E A D B A B
Hu3G8VL-28 B E A D B D B
Hu3G8VL-29 B E A D B E B
Hu3G8VL-30 B A A D B D B
Hu3G8VL-31 B A A D B E B
Hu3G8VL-32 B A A H B A B
Hu3G8VL-33 B A A I B A B
Hu3G8VL-34 B A A J B A B
Hu3G8VL-35 B B A H B D B
Hu3G8VL-36 B C A H B D B
Hu3G8VL-37 B E A H B D B
Hu3G8VL-38 B B A I B D B
Hu3G8VL-39 B C A I B D B
Hu3G8VL-40 B E A I B D B
Hu3G8VL-41 B B A J B D B
Hu3G8VL-42 B C A J B D B
Hu3G8VL-43 B E A J B D B
Hu3G8VL-44 B A A K B A B
*表6A中的字母表示表6B-H中的序列。
表6B：FR1
A B 残基
     
D D 1
T I 2
V V 3
L M 4
T T 5
Q Q 6
S S 7
P P 8
A D 9
S S 10
L L 11
[0361] 
A B 残基
A A 12
V V 13
S S 14
L L 15
G G 16
Q E 17
R R 18
A A 19
T T 20
I I 21
S N 22
C C 23
168 169 SEQ ID NO
SEQ ID NO. 序列
168 DTVLTQSPASLAVSL
169 DIVMTQSPDSLAVSL
表6C：CDR1
A B C D E F G 残基
               
K R K K K K K 24
A A S A A A A 25
S S S S S S S 26
Q Q Q Q Q Q Q 27
S S S S S S S 27A
V V V V V V V 27B
D D D D D D D 27C
F F F F F F F 27D
D D D D D D D 28
G G G G G G G 29
D D D D D D D 30
S S S S S S S 31
F F F Y F F Y 32
M M M M L M L 33
N N N N N A A 34
170 171 172 173 174 175 176 27SEQ ID NO
177 178 179 180 181 182 183 27A SEQ ID NO
184 185 186 187 188 189 190 27B SEQ ID NO
191 192 193 194 195 196 197 27C SEQ ID NO
198 199 200 201 202 203 204 27D SEQ ID NO
SEQ ID NO. 序列
170 KASQDGDSFMN
171 RASQDGDSFMN
172 KSSQDGDSFMN
173 KASQDGDSYMN
174 KASQDGDSFLN
175 KASQDGDSFMA
176 KASQDGDSYLA
177 KASSDGDSFMN
178 RASSDGDSFMN
[0366] 
SEQ ID NO. 序列
179 KSSSDGDSFMN
180 KASSDGDSYMN
181 KASSDGDSFLN
182 KASSDGDSFMA
183 KASSDGDSYLA
184 KASVDGDSFMN
185 RASVDGDSFMN
186 KSSVDGDSFMN
187 KASVDGDSYMN
188 KASVDGDSFLN
189 KASVDGDSFMA
190 KASVDGDSYLA
191 KASDDGDSFMN
192 RASDDGDSFMN
193 KSSDDGDSFMN
194 KASDDGDSYMN
195 KASDDGDSFLN
196 KASDDGDSFMA
197 KASDDGDSYLA
198 KASFDGDSFMN
199 RASFDGDSFMN
200 KSSFDGDSFMN
201 KASFDGDSYMN
202 KASFDGDSFLN
203 KASFDGDSFMA
204 KASFDGDSYLA
表6D：FR2
A 残基
   
W 35
Y 36
Q 37
Q 38
K 39
P 40
G 41
Q 42
P 43
P 44
K 45
L 46
L 47
I 48
Y 49
205 SEQ ID NO
SEQ ID NO. 序列
205 WYQQKAPGQPPKLLIY
表6E：CDR2
A B C D E F G H I J K 残基
                       
T D W T D D S S S T T 50
[0372] 
T A A T A A A T T T T 51
S S S S S S S S S S S 52
N N N N N N N N N N S 53
L L L L L L L L L L L 54
E E E E E A Q E Q Q Q 55
S S S T T T S S S S S 56
206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 SEQ ID NO
SEQ ID NO. 序列
206 TTSNLES
207 DASNLES
208 WASNLES
209 TTSNLET
210 DASNLET
211 DASNLAT
212 SASNLQS
213 STSNLES
214 STSNLQS
215 TTSNLQS
216 TTSSLQS
表6F：FR3
A B 残基
     
G G 57
I V 58
P P 59
A D 60
R R 61
F F 62
S S 63
A G 64
S S 65
G G 66
S S 67
G G 68
T T 69
D D 70
F F 71
T T 72
L L 73
N T 74
I I 75
H S 76
P S 77
V L 78
E Q 79
E A 80
E E 81
D D 82
T V 83
A A 84
T V 85
Y Y 86
[0376] 
A B 残基
     
Y Y 87
C C 88
217 218 SEQ ID NO
SEQ ID NO. 序列
217 GIPARFSASGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYC
218 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC
表6G：CDR3
A B C D E 残基
           
Q Q Q Q Q 89
Q Q Q Q Q 90
S S S S S 91
N Y Y N N 92
E S E S E 93
D T D D T 94
P P P P P 95
Y Y Y Y Y 96
T T T T T 97
219 220 221 222 223 SEQ ID NO
SEQ ID NO. 序列
219 QQSNEDPYT
220 QQSYSTPYT
221 QQSYEDPYT
222 QQSNSDPYT
223 QQSNETPYT
表6H：FR4
A B 残基
     
F F 98
G G 99
G Q 100
G G 101
T T 102
K K 103
L L 104
E E 105
I I 106
K K 107
224 225 SEQ ID NO
SEQ ID NO. 序列
224 FGGGTKLEIK
225 FGQGTKLEIK
如表5和6中所示，本发明的CD16结合蛋白的示例性VL结构域具有3G8VL、Hu3G8VL-1或Hu3G8VL-43的序列(分别为SEQ ID NO：82、 SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72)。编码3G8VL(SEQ ID NO：82)和Hu3G8VL-1(SEQ ID NO：71)的示例性核苷酸序列分别被提供在SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：84中。
VL结构域可具有因表2中所示的0、1、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种或至少9种置换而不同于Hu3G8VL-1的序列(SEQ ID NO：71)的序列。这些置换被认为导致增加的对CD16A的亲和力和/或减少CD16A结合蛋白对人施用时的免疫原性。在某些实施方式中，在剩余位置的序列同一性的度为至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％。
为了例示而非限制地，表6中示出了几种CD16A结合蛋白的VL结构域的序列。包含被融合到人Cκ恒定结构域的这些序列的轻链与hu3G8VH重链(上文描述的)共表达以形成四聚体抗体，并测量抗体与CD16A的结合以评价与hu3G8VL-1VL结构域(SEQ ID NO：71)相比氨基酸置换的作用。VL结构域具有hu3G8VL-1、2、3、4、5、10、16、18、19、21、22、24、27、28、32、33、34、35、36、37和42的序列的构建体表现出高亲和力的结合，且hu3G8VL-15、17、20、23、25、26、29、30、31、38、39、40和41表现出中级结合。包含Hu3G8VL-1、hu3G8VL-22和hu3G8VL-43的VL结构域(分别是SEQ ID NO71、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：72)的CD16A结合蛋白被认为具有特别有利的结合性质。
5.1.2.2.1 VL和/或VH结构域的组合
如本领域中已知和本文在其他地方描述的，免疫球蛋白的轻链和重链可在其缔合而产生双抗体的条件下被重组表达，或可被体外组合。因此将应理解本文所述的3G8衍生的VL结构域可与本文所述的3G8衍生的VH结构域组合以产生结合CD16A的双抗体并设想了所有这类组合。
为了例示而非限制地，有用的CD16A双抗体的实例是包含至少一个VH结构域和至少一个VL结构域的双抗体，其中VH结构域来自hu3G8VH-1、hu3G8VH-22或hu3G8VH-5(分别是SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：69)而VL结构域来自hu3G8VL-1，hu3G8VL-22或hu3G8VL-43(分别是SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：41)。 特别地，包含hu3G8VH-22(SEQ ID NO：22)和hu3G8VL-1、hu3G8VL-22或hu3G8VL-43(分别是SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：72)或hu3G8VH-5(SEQ ID NO：69)和hu3G8VL-1(SEQ ID NO：71)的人源化抗体具有有利的性质。
技术人员将应理解，此处描述的VL和VH结构域的序列还可通过本领域已知方法例如亲和力成熟来修饰(参见Schier等人(1996)“Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-ErbB-2Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site，”J.Mol.Biol.263：551-567；Daugherty等人(1998)“Antibody Affinity Maturation Using Bacterial Surface Display，”Protein Eng.11：825-832；Boder等人(1997)“Yeast Surface Display For Screening Combinatorial Polypeptide Libraries，”Nat.Biotechnol.15：553-557；Boder等人(2000)“Directed Evolution Of Antibody Fragments With Monovalent Femtomolar Antigen-Binding Affinity，”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A97：10701-10705；Hudson等人(2003)“Engineered Antibodies，”Nature Medicine9：129-39)。例如，CD16A结合蛋白可使用亲和力成熟技术修饰以鉴定具有增加的对CD16A的亲和力和/或减少的对CD16B的亲和力的蛋白质。
一种示例性的CD16结合蛋白是小鼠3G8抗体。包含人源化的3G8的VH和VL结构域的氨基酸序列被描述在图2、9、14中并被列出在SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72中。
5.2 包含Fc区或其部分的双抗体
本发明包括包含Fc结构域或其部分(例如，CH2或CH3结构域)的双抗体分子。在某些实施方式中，Fc结构域或其部分包含IgG2、IgG3或IgG4的Fc区的一个或多个恒定结构域(例如，CH2或CH3)。在其他实施方式中，本发明包括包含Fc结构域或其部分的分子，其中所述Fc结构域或其部分 相对于可比较的野生型Fc结构域或其部分包含至少一种氨基酸修饰(例如，置换)。变体Fc结构域是本领域熟知的，且如在本领域熟知的任何一种结合活性或效应功能测定，例如ELISA、SPR分析或ADCC中测定的，主要用来改变包含所述变体Fc结构域的抗体的表型。这些变体Fc结构域或其部分通过赋予或改变由包含Fc结构域(或其部分)的本发明的双抗体分子所显示的效应功能而在本发明中具备用途，如功能地测定的，例如在NK依赖性或巨噬细胞依赖性测定中。被鉴定为改变效应功能的Fc结构域的变体被公开在本发明人的并行申请，国际申请WO04/063351、美国专利申请公布2005/0037000和2005/0064514、2004年11月10日递交的美国临时申请60/626,510、2004年12月15日递交的60/636,663和2006年3月10日递交的60/781,564以及2005年11月10日递交的美国专利申请11/271,140和2005年12月15日递交的11/305,787中，其每一个被通过引用全部并入。
在其他实施方式中，本发明包括使用本领域已知的任何Fc变体例如，在Duncan等人(1988)“Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG，”Nature332：563-564；Lund等人(1991)“Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG，”J.Immunol.147：2657-2662；Lund等人(1992)“Multiple Binding Sites On The CH2Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma RII，”Mol.Immunol.29：53-59；Alegre等人(1994)“A Non-Activating″Humanized″Anti-CD3Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo，”Transplantation57：1537-1543；Hutchins等人(1995)“Improved Biodistribution，Tumor Targeting，And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma4Variant Of Campath-1H，”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A92：11980-11984；Jefferis等人(1995)“Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors：The Role Of Glycosylation，”Immunol.Lett.44：111-117；Lund等人(1995)“Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors，”FASEB J.9：115-119；Jefferis等人(1996)“Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions，”Immunol.Lett. 54：101-104；Lund等人(1996)“Multiple Interactions Of Igg With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains，”J.Immunol.157：4963-4969；Armour等人(1999)“Recombinant Human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities，”Eur.J.Immunol.29：2613-2624；Idusogie等人(2000)“Mapping Of The C1Q Binding Site On Rituxan，A Chimeric Antibody With A Human IgG1Fc，”J.Immunol.164：4178-4184；Reddy等人(2000)“Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4Monoclonal Antibody To Human CD4，”J.Immunol.164：1925-1933；Xu等人(2000)“In Vitro Characterization Of Five Humanized OKT3Effector Function Variant Antibodies，”Cell.Immunol.200：16-26；Idusogie等人(2001)“Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement，”J.Immunol.166：2571-2575；Shields等人(2001)“High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1For Fc gamma RI，Fc gamma RII，Fc gamma RIII，And FcRn And Design Of IgG1Variants With Improved Binding To The Fc gamma R，”J.Biol.Chem.276：6591-6604；Jefferis等人(2002)“Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR：Current Models，”Immunol.Lett82：57-65；Presta等人(2002)“Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function，”Biochem.Soc.Trans.30：487-490)；US5,624,821；US5,885,573；US6,194,551；PCT WO00/42072；PCT WO99/58572中公开的Fc变体；上述文献每一个被通过引用全部并入本文。
在某些实施方式中，对Fc区的氨基酸的所述一种或多种氨基酸修饰减弱了该Fc区并因此减弱了本发明的双抗体分子对一种或多种FcγR受体的亲和力和亲合力。在特定的实施方式中，本发明包括包含变体Fc区或其部分的双抗体，其中相对于野生型Fc区所述变体Fc区包含至少一种氨基酸修饰，该变体Fc区只结合一种FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIIA。在另一个特定实施方式中，本发明包括包含变体Fc区或其部分的双抗体，其中相对于野生型Fc区所述变体Fc区包含至少一种氨基酸修饰，该变体Fc区只结合一种FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIA。在另一个特定实施方 式中，本发明包括包含变体Fc区或其部分的双抗体，其中相对于野生型Fc区所述变体Fc区包含至少一种氨基酸修饰，该变体Fc区只结合一种FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIB。在某些实施方式中，本发明包括包含变体Fc结构域的分子，其中如使用本领域技术人员已知的方法和本文例示的方法测量的，相对于不包含Fc结构域或包含野生型Fc结构域的分子，所述变体给予或介导增加的ADCC活性和/或增加的与FcγRIIA(CD32A)的结合。在替代实施方式中，本发明包括包含变体Fc结构域的分子，其中如使用本领域技术人员已知的方法和本文例示的方法测量的，相对于不包含Fc结构域或包含野生型Fc结构域的分子，所述变体给予或介导减少的ADCC活性(或其他效应功能)和/或增加的与FcγRIIB(CD32B)的结合。
本发明还包括使用包含来自两种或更多种IgG同种型的结构域或区域的Fc结构域。如本领域已知的，Fc区的氨基酸修饰可深刻地影响Fc-介导的效应功能和/或结合活性。然而，当在所选IgG同种型的背景下实施时，功能特征方面的这些改变可进一步被改善和/或操控。相似地，同种型Fc的天然特征可通过一种或多种氨基酸修饰操控。由于其铰链和/或Fc结构域的氨基酸序列的差异，多种IgG同种型(即，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)显示出不同的物理和功能性质包括血清半衰期、补体结合、FcγR结合亲和力及效应功能活性(例如，ADCC、CDC)。在某些实施方式中，基于其各自的、分别的结合和/或效应功能活性独立地选择氨基酸修饰和IgG Fc区以构建具有期望特征的双抗体。在大多数实施方式中，如在IgG1的背景下本文所描述的或本领域已知的，分别地测定了所述氨基酸修饰和IgG铰链/Fc区的结合和/或效应功能活性。在某些实施方式中，当在双抗体分子或其他包含Fc的分子(例如，以及免疫球蛋白)的背景下分别地测定FcγR结合或效应功能时，所述氨基酸修饰和IgG铰链/Fc区显示出相似的功能性，例如增加的对FcγRIIA的亲和力。然后所述氨基酸修饰和所选IgG Fc区的组合可加和地或更优选协同地以相对于包含野生型Fc区的本发明的双抗体分子改变本发明的双抗体分子的所述功能性。在其他实施方式中，当在包含本文描述的或本领域已知的野生型Fc区的双抗体分子或其他含有Fc的分子(例如，免疫球蛋白)的背景下分别地测定FcγR结合和/或效应功能时，所述氨基酸修饰和IgG Fc区显示出相反的功能性，例如分别增加 和减少对FcγRIIA的亲和力；随后所述“相反的”氨基酸修饰和所选IgG区域的组合相对于不包含Fc区或包含同一同种型的野生型Fc区的本发明的双抗体起到选择性地缓和或降低本发明的双抗体的特定功能性的作用。可选择地，本发明包括包含本领域已知的氨基酸修饰和所选择的IgG区域的组合、显示出新的性质的变体Fc区，当如本文所述地单独测试所述修饰和/或区域时，这些性质不能被检测到。
多种IgG同种型或其结构域的功能特征是本领域熟知的。IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的氨基酸序列呈现在图1A-1B中。来自用于本发明的方法中的特定IgG同种型的两个或更多个结构域的选择和/或组合可基于亲本同种型的任何已知参数包括对FcγR的亲和力(表7；Flesch等人(2000)“Functions Of The Fc Receptors For Immunoglobulin G，”J.Clin.Lab.Anal.14：141-156；Chappel等人(1993)“Identification Of A Secondary Fc Gamma RI Binding Site Within A Genetically Engineered Human IgG Antibody，”J.Biol.Chem.33：25124-25131；Chappel等人(1991)“Identification Of The Fc Gamma Receptor Class I Binding Site In Human IgG Through The Use Of Recombinant IgG1/IgG2Hybrid And Point-Mutated Antibodies，”Proc.Nat1.Acad.Sci.USA88：9036-9040，在此通过引用将其每一个全部并入本文)。例如，如果双抗体被期望构建成将对活化性受体的结合最大化并将对抑制性受体的结合最小化，则使用显示出有限地结合或不结合FcγRIIB的IgG同种型，例如IgG2或IgG4的区域或结构域可具备特定用途。相似地，来自已知优先结合C1q或FcγRIIIA的IgG同种型，例如IgG3的Fc区或结构域(Brüggemann等人(1987)“Comparison Of The Effector Functions Of Human Immunoglobulins Using A Matched Set Of Chimeric Antibodies，”J.Exp.Med.166：1351-1361)的使用可与本领域已知增强ADCC的Fc氨基酸修饰组合以构建使得效应功能活性，例如，补体活化或ADCC被最大化的双抗体分子。
表7.结合FcγR的IgG的一般特征，改编自Flesch和Neppert，1999，J.Clin.Lab.Anal.14：141-156
A只结合复合的IgG
5.3分子偶联物 
本发明的双抗体分子可被重组融合或化学偶联到(包括共价和非共价偶联)异源多肽(即，无关多肽；或其部分，优选地至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个氨基酸的多肽)以产生融合蛋白。融合不一定必须是直接的，而是可通过接头序列产生。
另外，本发明的双抗体分子(即，多肽)可被偶联到改变了特定生物学反应的治疗剂或药物部分。作为直接偶联的替代方案，由于多价，例如四价的本发明的双抗体分子上的多个表位结合位点，该双抗体的至少一个结合区域可被设计为结合治疗剂或期望的药物部分而不影响双抗体结合。
治疗剂或药物部分不应被解释为局限于典型的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有期望的生物学活性的蛋白质或多肽。这些蛋白质可包括例如，毒素例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素(即，PE-40)或白喉毒素、蓖麻毒素、多花白树毒蛋白和美洲商陆抗病毒蛋白，蛋白质例如肿瘤坏死因子，干扰素包括但不限于α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、组织纤溶酶原激活物(TPA)、凋亡剂(例如，PCT公布第WO97/33899号中公开的TNF-α、TNF-β、AIM I)、AIMII(参见，PCT公布第WO97/34911号)、Fas配体和VEGI(PCT公布第WO99/23105号)、血栓剂或抗血管生成剂(例如，制管张素或内皮抑制素)或生物学反应改良剂例如，诸如淋巴因子(例如，白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)、巨噬细胞集落刺激因子(“M-CSF”)或生长因子(例如，生长激素(“GH”)；蛋白酶或核糖核酸酶。
本发明的双抗体分子(即，多肽)可被融合到标志序列例如肽上以促进纯化。在优选的实施方式中，标志氨基酸序列是六组氨酸肽，例如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)中提供的标签，除了其他以外，这些载体中的许多是市售的。如在Gentz等人(1989)“Bioassay For Trans-Activation Using Purified Human Immunodeficiency Virus TAT-Encoded Protein：Trans-Activation Requires mRNA Synthesis，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：821-824中所述的，例如，六组氨酸提供了方便的融合蛋白纯化。对纯化有用的其他肽标签包括但不限于对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位的血凝素“HA”标签(Wilson等人(1984)“The Structure Of An Antigenic Determinant In A Protem，”Cell，37：767-778)和“flag”标签(Knappik等人(1994)“An Improved Affinity Tag Based On The FLAG Peptide For The Detection And Purification Of Recombinant Antibody Fragments，”Biotechniques，17(4)：754-761)。
另外的融合蛋白可通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)的技术产生。DNA改组可用来改变本发明的分子的活性(例如，具有更高亲和力和更低的离解速率的表位结合位点)。通常，参见，美国专利第5,605,793；5,811,238；5,830,721；5,834,252和5,837,458号，以及Patten等人(1997)“Applications Of DNA Shuffling To Pharmaceuticals And Vaccines，”Curr.Opinion Biotechnol.8：724-733；Harayama(1998)“Artiffcial Evolution By DNA Shuffling，”Trends Biotechnol.16：76-82；Hansson等人(1999)“Evolution Of Differential Substrate Specificities In Mu Class Glutathione Transferases Probed By DNA Shuffling，”J.Mol.Biol.287：265-276；以及Lorenzo等人(1998)“PCR-Based Method For The Introduction Of Mutations In Genes Cloned And Expressed In Vaccinia Virus，”BioTechniques24：308-313(这些专利和出版物中的每一个在此被通过引用全部并入本文)。本发明的双抗体分子或编码本发明的分子的核酸还可通过易错PCR、随机核酸插入或其他重组之前的方法进行随机突变来改变。编码本发明的分子的多核苷酸的一个或多个部分可与一种或多种异源分子的一个或多个部件、基序、区段、部分、结构域、片段等重组。
本发明还包括被偶联到或免疫特异性地识别期望增加/减少和血清半衰期和/或被靶向到特定亚群的细胞的诊断剂或治疗剂或任何其他分子的本发明的双抗体分子。本发明的分子可在诊断上使用，例如，作为例如确定特定治疗方案的疗效的临床测试程序的一部分来监控疾病、疾患或感染的发展或进展。将本发明的分子偶联到可检测物质或通过免疫特异性地识别所述可检测物质的分子可促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、发射正电子的金属以及非放射性顺磁金属离子。可检测物质可被直接地或使用本领域已知的技术通过中间产物(例如，诸如，本领域已知的连接子)间接地耦合或偶联到本发明的分子，或所述分子可免疫特异性地识别所述可检测物质：免疫特异性地结合所述物质。参见，例如美国专利第4,741,900号的金属离子，其可被偶联到抗体以用作根据本发明的诊断剂。这种诊断和检测可通过设计免疫特异性地识别所述可检测物质的分子或通过将本发明的分子偶联到可检测物质上实现，所述可检测物质包括但不限于各种酶，酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基复合物，例如但不限于链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；荧光材料例如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料例如但不限于鲁米诺；生物发光材料例如但不限于荧光素酶、萤光素和水母蛋白；放射材料例如但不限于铋(213Bi)、碳(14C)、铬(51Cr)、钴(57Co)、氟(18F)、钆(153Gd、159Gd)、镓(68Ga、67Ga)、锗(68Ge)、钬(166Ho)、铟(115In、113In、112In、 111In)、碘(131I、125I、123I、121I)、镧(140La)、镥(177Lu)、锰(54Mn)、钼(99Mo)、钯(103Pd)、磷(32P)、镨(142Pr)、钷(149Pm)、铼(186Re、188Re)、铑(105Rh)、钌(97Ru)、钐(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、锶(85Sr)、硫(35S)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、锡(113Sn， 117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、镱(169Yb、175Yb)、钇(90Y)、锌(65Zn)；使用各种发射正电子的线断层摄影术的发射正电子的金属，以及非放射性顺磁金属离子。
本发明的双抗体分子可免疫特异性地识别或被偶联到治疗部分例如细胞毒素(例如，细胞抑制剂或杀细胞剂)、治疗剂或放射性元素(例如，α-发射体、γ-发射体等)。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何剂。 实例包括紫衫醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、鬼臼噻吩甙、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安(propranolol)和嘌呤霉素以及其类似物或同源物。治疗剂包括但不限于抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟脲嘧啶、达卡巴嗪)、烷化剂(例如，二氯甲基二乙胺、塞替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐霉素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环霉素(例如，柔红霉素(以前的道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，放线菌素D(之前的放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC)以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春花碱)。
此外，本发明的双抗体分子可被偶联到治疗部分或被设计为免疫特异性地识别治疗部分，例如放射性材料或对偶联放射性金属离子有用的大环螯合剂(参见以上放射性材料的实例)。在某些实施方式中，大环螯合剂是可通过接头分子连接到多肽的1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N”’-四乙酸(DOTA)。这些接头分子是本领域普遍已知的且被描述在Denardo等人(1998)“Comparison Of1，4，7，10-Tetraazacyclododecane-N，N′，N″，N″′-Tetraacetic Acid(DOTA)-Peptide-ChL6，A Novel Immunoconjugate With Catabolizable Linker，To2-Iminothiolane-2-[p-(bromoacetamido)benzyl]-DOTA-ChL6In Breast Cancer Xenografts，”Clin.Cancer Res.4：2483-2490；Peterson等人(1999)“Enzymatic Cleavage Of Peptide-Linked Radiolabels From Immunoconjugates，”Bioconjug.Chem.10：553-；和Zimmerman等人(1999)“A Triglycine Linker Improves Tumor Uptake And Biodistributions Of67-Cu-Labeled Anti-Neuroblastoma mAb chCE7F(ab′)2Fragments，”Nucl.Med.Biol.26：943-950中，其每一个被通过引用全部并入本文。
用于将这些治疗部分偶联到多肽包括例如，Fc结构域的技术是熟知的；参见，例如Arnon等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of  Drugs In Cancer Therapy”，在Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy中，Reisfeld等人(编辑)，1985，第243-56页，Alan R.Liss，Inc.)；Hellstrom等人，“Antibodies For Drug Delivery”，在Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等人(编辑)，1987，第623-53页，Marcel Dekker，Inc.)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，在 Monoclonal Antibodies‘84：Biological And Clinical Applications中，Pinchera等人(编辑)，1985，第475-506页)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，在 Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy中，Baldwin等人(编辑)，1985，第303-16页，Academic Press；及Thorpe等人(1982)“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates，”Immunol.Rev.，62：119-158。
本发明的双抗体分子可在含或不含有与之偶联的治疗部分下施用、单独地施用或与用作治疗性治疗的细胞毒性因子和/或细胞因子组合施用。如果被单独施用，多价，例如四价双抗体分子的至少一个表位可被设计成免疫特异性识别可与本发明的分子同时或在其之后施用的治疗剂，例如细胞毒性因子和/或细胞因子。以这种方式，双抗体分子可以以类似于直接偶联的方式特异性地靶向所述治疗剂。可选择地，本发明的分子可被偶联到抗体上以形成如Segal在美国专利第4,676,980号中所述的抗体异轭合物，该专利被通过引用全部并入本文。本发明的双抗体分子还可被连接到对免疫测定或靶抗原的纯化特别有用的固相载体。该固相载体包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
5.4 对双抗体分子的结合的表征
本发明的双抗体分子可以以多种方式表征。特别地，可测定本发明的分子免疫特异性结合抗原，例如FcRIIIA或FcRIIB的能力，或如果该分子包含Fc结构域(或其部分)的话，可测定其显示出Fc-FcγR相互作用，即，Fc结构域(或其部分)与FcγR的特异性结合的能力。该测定可在溶液中(例如，Houghten(1992)“The Use Of Synthetic Peptide Combinatorial Libraries For The Identification Of Bioactive Peptides，”BioTechniques，13：412-421)，在 磁珠上(Lam(1991)“A New Type Of Synthetic Peptide Library For Identifying Ligand-Binding Activity，”Nature，354：82-84)，在芯片上(Fodor(1993)“Multiplexed Biochemical Assays With Biological Chips，”Nature，364：555-556)，在细菌上(美国专利第5,223,409号)，在孢子上(美国专利第5,571,698；5,403,484和5,223,409号)，在质粒上(Cull等人(1992)“Screening For Receptor Ligands Using Large Libraries Of Peptides Linked To The C Terminus Of The Lac Repressor，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：1865-1869)或在噬菌体上(Scott等人(1990)“Searching For Peptide Ligands With An Epitope Library，”Science，249：386-390；Devlin(1990)“Random Peptide Libraries：A Source Of Specific Protein Binding Molecules，”Science，249：404-406；Cwirla等人(1990)“Peptides On Phage：A Vast Library Of Peptides For Identifying Ligands，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6378-6382；及Felici(1991)“Selection Of Antibody Ligands From A Large Library Of Oligopeptides Expressed On A Multivalent Exposition Vector，”J.Mol.Biol.，222：301-310)(这些参考文献中的每一个通过引用全文被并入本文)进行。然后可测定已被鉴定为免疫特异性结合抗原，如FcγRIIIA的分子的针对所述抗原的特异性和亲和力。
可测定已被构建为包含多个表位结合结构域的本发明的分子对一种或多种抗原(例如，癌症抗原以及与其他抗原(例如，FcγR)的交叉反应性)的免疫特异性结合，或如果这些分子包含Fc结构域(或其部分)的话，通过本领域已知的任何方法测定Fc-FcγR相互作用。可用来分析免疫特异性结合、交叉反应性和Fc-FcγR相互作用的免疫测定包括但不限于使用如下技术的竞争性和非竞争性测定系统：例如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定，仅举几个例子。这些测定是常规的且是本领域熟知的(参见，例如Ausubel等人，编辑，1994，Current  Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley&Sons，Inc.，New York，其被通过引用全部并入本文)。
抗原-结合结构域相互作用或Fc-FcγR相互作用的结合亲和力以及解离速率可通过竞争性结合测定来确定。竞争性结合测定的一个实例是放射免疫测定，其包括在渐增量的未标记的表位，例如四聚体FcγR(参见5.4.1节)的存在下用目的分子(例如，包含多个表位结合结构域的本发明的分子)孵育标记的抗原，例如四聚体FcγR(例如，3H或125I，参见5.4.1节)，并检测结合到被标记的抗原的分子。本发明的分子对抗原的亲和力和结合解离速率可通过Scatchard分析根据饱和数据确定。
可使用本领域已知的用于抗原-结合结构域或Fc-FcγR相互作用的体外测定(基于生化或免疫学的测定)，包括但不限于ELISA测定、表面等离子体共振测定、免疫沉淀测定来最初确定本发明的分子对抗原或FcγR的亲和力和结合性质。优选地，如5.4.2部分所述，本发明的分子的结合性质还通过用于确定一种或多种FcγR介导的效应细胞功能的体外功能测定来表征。在最优选的实施方式中，本发明的分子在体内模型(例如本文描述并公开的模型)中具有与基于体外的测定中的结合性质相似的结合性质。然而，本发明不排除在基于体外的试验中未表现出期望的表型而在体内表现出期望的表型的本发明的分子。
在某些实施方式中，优选地以高通量的方式在基于功能的测定中进行包含多个表位结合结构域和任选地，Fc结构域(或其部分)的分子的筛选和鉴定。基于功能的测定可以是本领域已知的用于表征一种或多种FcγR介导的效应细胞功能的任何测定，例如本文在5.4.2和5.4.3节中描述的测定。可用于根据本发明的方法使用的效应细胞功能的非限制性实例包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性吞噬作用、吞噬作用、调理作用、调理吞噬、细胞结合、玫瑰花结、C1q结合以及补体依赖的细胞介导的细胞毒性。
在优选的实施方式中，BIAcore动力学分析用来确定本发明的分子对抗原或和FcγR的结合和解离速率。BIAcore动力学分析包括分析抗原或FcγR从表面上具有被固定的分子(例如，分别包含表位结合结构域或Fc结构域(或其部分)的分子)的芯片上的结合或解离。5.4.3节中描述了BIAcore分析。
优选地，使用本领域技术人员已知的任何一种技术的荧光活化细胞分选(FACS)被用于基于免疫学或功能的测定以表征本发明的分子。流动分选器能够快速地检测已被本发明的分子结合例如调理的大量的单个细胞(例如，每小时1千万至1亿个细胞)(Shapiro等人(1995)Practical Flow  Cytometry)。另外，用于优化双抗体行为的特定参数包括但不限于抗原浓度(即，FcγR四聚体复合体，参见5.4.1节)、动力学竞争时间或FACS严格性，其每一种可被改变以选择双抗体分子，包括显示出特定的结合性质，例如同时结合多个表位的本发明的分子。用于分选和检测生物细胞的流式细胞仪是本领域熟知的。例如在美国专利第4,347,935；5,464,581；5,483,469；5,602,039；5,643,796和6,211,477号中描述了已知的流式细胞仪；其全部内容被通过引用并入本文。其他已知的流式细胞仪是由Becton Dickinson and Company制造的FACS VantageTM系统和由Union Biometrica制造的COPASTM系统。
对靶抗原的结合亲和力或Fc-FcγR结合亲和力的表征，以及对细胞表面上靶抗原或FcγR密度的评价可通过本领域熟知的方法，例如Scatchard分析或通过使用例如QuantumTM Simply(Bangs Laboratories，Inc.，Fishers，IN)的试剂盒按照厂家说明进行。如本领域技术人员已知的或本文描述的，所述一种或多种功能测定可以是本领域已知的用于表征一种或多种FcγR介导的效应细胞功能的任何测定。在特定实施方式中，在ELISA测定中测定包含多个表位结合结构域和任选地，以及Fc结构域(或其部分)的本发明的分子对一种或多种靶抗原或一种或多种FcγR，例如FcγRIIIA、FcγRIIA、FcγRIIA的结合；然后进行一种或多种ADCC测定。在某些实施方式中，还使用基于表面等离子体共振的测定，例如BIAcore测定了本发明的分子。基于表面等离子体共振的测定是本领域熟知的，且在5.4.3节被进一步讨论并被本文例示在例如实施例6.1中。
在最优选的实施方式中，还在动物模型中表征了包含多个表位结合结构域和任选地，以及Fc结构域(或其部分)的本发明的分子与靶抗原(例如，FcγR)的相互作用或Fc-FcγR相互作用。如果Fc-FcγR相互作用待被评价，则优选的用于本发明的方法中的动物模型为，例如表达人FcγR的转基因 小鼠，例如被通过引用全部并入本文的美国专利第5,877,397和6,676,927号中描述的任何小鼠模型。用于这些方法中的另外的转基因小鼠包括但不限于携带人FcγRIIIA的敲除了FcγRIIIA的裸鼠；携带人FcγRIIA的敲除了FcγRIIIA的裸鼠；携带人FcγRIIB和人FcγRIIIA的敲除了FcγRIIIA的裸鼠；携带人FcγRIIB和人FcγRIIA的敲除了FcγRIIIA的裸鼠；携带人FcγRIIIA和FcγRIIA的敲除了FcγRIIIA和FcγRIIA的裸鼠以及携带人FcγRIIIA、FcγRIIA和FcγRIIB的敲除了FcγRIIIA、FcγRIIA和FcγRIIB的裸鼠。
5.4.1 包含FcγR的结合测定
对包含Fc结构域(或其部分)和/或包含对FcγR特异性的表位结合结构域的分子对FcγR的结合的表征可使用任何FcγR，包括但不限于FcγR的多态变体进行。在某些实施方式中，使用在位置158处包含苯丙氨酸的FcγRIIIA的多态变体。在其他实施方式中，使用在位置158处包含缬氨酸的FcγRIIIA的多态变体进行表征。FcγRIIIA158V显示出比158F高的对IgG1的亲和力和增加的ADCC活性(参见，例如Koene等人(1997)“Fc gammaRIIIa-158V/F Polymorphism Influences The Binding Of IgG By Natural Killer Cell Fc gammaRIIIa，Independently Of The Fc gammaRIIIa-48L/R/H Phenotype，”Blood，90：1109-14；Wu等人(1997)“A Novel Polymorphism Of FcgammaRIIIa(CD16)Alters Receptor Function And Predisposes To Autoimmune Disease，”J.Clin.Invest.100：1059-70，其二者都被通过引用全部并入本文)；如最近通过IgG1-FcγRIIIA共结晶研究表明的，该残基实际上与IgG1的较低铰链区直接相互作用，参见，例如Sondermann等人(2000)“The3.2-A Crystal Structure Of The Human IgG1Fc Fragment-Fc gammaRIII complex，”Nature，406(6793)：267-273，其被通过引用全部并入本文。研究已表明在某些实例中，治疗性抗体在FcγRIIIA-158V纯合患者中具有提高的功效。例如，与FcγRIIIA158F纯合患者相比，人源化的抗-CD20单克隆抗体利妥昔单抗在治疗上在FcγRIIIA158V纯合的患者中更有效(参见，例如，Cartron等人(2002)“Therapeutic Activity Of Humanized Anti-CD20Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcgammaRIIIA  Gene，”Blood，99(3)：754-758)。在其他实施方式中，包含该区域的治疗性分子在FcγRIIIA-158V和FcγRIIIA-158F杂合的患者中，和在具有FcγRIIA-131H的患者中可能也是更有效的。虽然不期望被特定的作用机制所束缚，但是用替代的同种异型选择本发明的分子可提供这样的变体，所述变体一旦被构建成治疗性双抗体，将在临床上对所述同种异型纯合的患者更有效。
开发了用于确定本发明的分子与FcγR的结合，且特别是用于确定Fc结构域与FcγR的结合的FcγR结合测定。尽管受体对其配体的固有地弱的亲和力，例如对于FcγRIIB和FcγRIIA在微摩尔范围内，但是该测定允许Fc-FcγR相互作用的检测和定量。在国际申请WO04/063351和美国专利申请公布2005/0037000和2005/0064514中详细地描述了该方法，其每一个在此被通过引用全部并入本文。简单地讲，该方法包括形成可用于本领域已知的任何标准免疫测定，例如FACS、ELISA、表面等离子体共振等的FcγR复合体。另外，该FcγR复合体相对于未复合的FcγR具有提高的对Fc区的亲合力。根据本发明，优选的分子复合体是四聚体免疫复合体，包括：(a)FcγR的可溶性区域(例如，FcγRIIIA、FcγRIIA或FcγRIIB的可溶性区域)；(b)可操作地连接到FcγR的可溶性区域(例如，FcγRIIIA、FcγRIIA或FcγRIIB的可溶性区域)的C末端的生物素化的15个氨基酸的AVITAG序列(AVITAG)；以及(c)链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；以形成四聚体FcγR复合体的摩尔比(优选地以5∶1的摩尔比)。使用例如，大肠杆菌的BirA酶，一种特异性地生物素化15个氨基酸的AVITAG序列中的赖氨酸残基的生物素连接酶酶促地生物素化融合蛋白。然后将生物素化的可溶性FcγR蛋白质与SA-PE以1X SA-PE∶5X生物素化的可溶性FcγR的摩尔比混合以形成四聚体FcγR复合体。
已表明包含Fc区的多肽以比单体的、未复合的FcγR至少高8倍的亲和力结合四聚体FcγR复合体。包含Fc区的多肽与四聚体FcγR复合体的结合可使用本领域技术人员已知的标准技术，例如诸如荧光激活细胞分选(FACS)、放射免疫测定、ELISA测定等确定。
本发明包括使用包含本发明的分子并根据上述方法形成的免疫复合 体以在基于细胞的测定或无细胞测定中确定包含Fc区的分子的功能性。
为了方便起见，这些试剂可被提供在测定药盒，即被包装的用于测定包含Fc区的分子结合FcγR四聚体复合体的能力的试剂的组合。用于确定Fc-FcγR相互作用的其他形式的分子复合体，也被设想为用于本发明的方法中，例如按在2003年1月13日递交的美国临时申请60/439,709中的描述形成的融合蛋白；该申请被通过引用全部并入本文。
5.4.2 具有变体重链的分子的功能测定
本发明包括使用本领域技术人员已知的用于鉴定分子的效应细胞功能的测定来表征包含多个表位结合结构域和任选地，Fc结构域(或其部分)的本发明的分子。特别地，本发明包括表征本发明的分子的FcγR-介导的效应细胞功能。另外，如果本发明的双抗体分子的至少一个靶抗原是FcγR，则该双抗体分子对FcγR的结合可用来活化与通过FcγR-Fc结合活化的通路相似的FcγR-介导的通路，因此，如果该双抗体分子的至少一个表位结合结构域识别FcγR，则双抗体分子可引发FcγR-介导的效应细胞功能而不包含Fc结构域(或其部分)或没有同时的Fc-FcγR结合。可根据本发明测定的效应细胞功能的实例包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、吞噬作用、调理作用、调理吞噬、C1q结合以及补体依赖性细胞介导的细胞毒性。可使用本领域技术人员已知的用于确定效应细胞活性的任何基于细胞的测定或无细胞的测定(对于效应细胞测定，参见Perussia等人(2000)“Assays For Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity(ADCC)And Reverse ADCC(Redirected Cytotoxicity)In Human Natural Killer Cells，”Methods Mol.Biol.121：179-92；Baggiolini等人(1988)“Cellular Models For The Detection And Evaluation Of Drugs That Modulate Human Phagocyte Activity，”Experientia，44(10)：841-848；Lehmann等人(2000)“Phagocytosis：Measurement By Flow Cytometry，”J.Immunol.Methods，243(1-2)：229-42；Brown(1994)“In Vitro Assays Of Phagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes：Receptor Modulation And Signal Transduction，”Methods Cell Biol.，45：147-64；Munn等人(1990)“Phagocytosis Of Tumor Cells By Human Monocytes Cultured In Recombinant  Macrophage Colony-Stimulating Factor，”J.Exp.Med.，172：231-237，Abdul-Majid等人(2002)“Fc Receptors Are Critical For Autoimmune Inflammatory Damage To The Central Nervous System In Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，”Scand.J.Immunol.55：70-81；Ding等人(1998)“Two Human T Cell Receptors Bind In A Similar Diagonal Mode To The HLA-A2/Tax Peptide Complex Using Different TCR Amino Acids，”Immunity8：403-411，其每一个被通过引用全部并入本文)。
在一个实施方式中，可在人单核细胞中测定本发明的分子的FcγR介导的吞噬作用。可选择地，可在可使用本领域技术人员已知的标准程序获得的其他吞噬细胞，例如中性白细胞(多形核白细胞；PMN)；人外周血单核细胞、单核细胞来源的巨噬细胞中测定本发明的分子的FcγR-介导的吞噬作用(例如，参见Brown(1994)“In Vitro Assays Of Phagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes：Receptor Modulation And Signal Transduction，”Methods Cell Biol.，45：147-164)。在一个实施方式中，本发明的分子的功能通过由之前描述的方法测量THP-1细胞吞噬荧光素化的IgG-调理的绵羊红细胞(SRBC)的能力表征(Tridandapani等人(2000)“The Adapter Protein LAT Enhances Fcgamma Receptor-Mediated Signal Transduction In Myeloid Cells，”J.Biol.Chem.275：20480-20487)。
用于确定本发明的分子的吞噬作用的另一种示例性测定是抗体依赖的调理吞噬测定(ADCP)，其可包括下列步骤：用(i)野生型4-4-20抗体，一种针对荧光素的抗体(参见Bedzyk等人(1989)“Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti-Fluorescein Idiotype Family，”J.Biol.Chem，264(3)：1565-1569，其被通过引用全部并入本文)，作为对于FcγR-依赖性ADCP的对照抗体；或(ii)具有敲除了对FcγRIII的结合的D265A突变的4-4-20抗体，作为对于FcγR-依赖性的ADCP的背景对照；(iii)包含4-4-20的表位结合结构域和Fc结构域和/或对FcγRIII特异性的表位结合结构域的双抗体包被靶生物颗粒，例如大肠杆菌(Escherichia coli)标记的FITC(Molecular Probes)或金黄色葡萄球菌-FITC；并形成被调理的颗粒；以1∶1、10∶1、30∶1、60∶1、75∶1或100∶1的比例向THP-1效应细胞(可 从ATCC获得的单核细胞系)中加入(i-iii)所述的任何一种被调理的颗粒以允许发生FcγR-介导的吞噬作用；优选地在37℃下孵育细胞和大肠杆菌-FITC/抗体1.5小时；孵育后向细胞中加入台盼蓝(优选地在室温下持续2-3min)以猝灭粘附到细胞表面外部而未被内化的细菌的荧光；将细胞转移到FACS缓冲液(例如，PBS中的0.1％BSA、0.1％叠氮钠)中，使用FACS(例如，BD FACS Calibur)分析THP1细胞的荧光。优选地，通过FACS分析用于该测定中的THP-1细胞的细胞表面上FcγR的表达。THP-1细胞表达CD32A和CD64。CD64是在根据本发明的方法进行ADCP测定时被封闭的高亲和力FcγR。优选地用100μg/mL的可溶性IgG1或10％的人血清封闭THP-1细胞。为分析ADCP的程度，优选地将门(gate)设置在THP-1细胞上并测定中值荧光强度。计算对于单独的突变体的ADCP活性并报告为针对所获得的野生型chMab4-4-20的标准化值。将调理的颗粒加至THP-1细胞使得调理的颗粒与THP-1细胞的比例是30∶1或60∶1。在最优选的实施方式中，用对照，例如培养基中的大肠杆菌-FITC、大肠杆菌-FITC和THP-1细胞(用作FcγR-独立性的ADCP活性)、大肠杆菌-FITC、THP-1细胞和野生型4-4-20抗体(用作FcγR-依赖性的ADCP活性)、大肠杆菌-FITC、THP-1细胞、4-4-20D265A(用作FcγR-依赖性的ADCP活性的背景对照)进行ADCP测定。
在另一个实施方式中，可使用本领域技术人员已知的任何一种标准方法测定本发明的分子在效应细胞，例如自然杀伤细胞中的FcγR-介导的ADCC活性(参见，例如Perussia等人(2000)“Assays For Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity(ADCC)And Reverse ADCC(Redirected Cytotoxicity)In Human Natural Killer Cells，”Methods Mol.Biol.121：179-92；Weng等人(2003)“Two Immunoglobulin G Fragment C Receptor Polymorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma，”J.Clin.Oncol.21：3940-3947；Ding等人(1998)“Two Human T Cell Receptors Bind In A Similar Diagonal Mode To The HLA-A2/Tax Peptide Complex Using Different TCR Amino Acids，”Immunity8：403-411)。用于确定本发明的分子的ADCC活性的示例性测定基于51Cr释放测定，其包括：用[51Cr]Na2CrO4(该细胞膜通透性分子通常被用于标记， 因为其结合胞质蛋白质，并且虽然以慢性动力学自发地从细胞释放，但是其在靶细胞坏死后被大量释放)标记靶细胞；用包含变体重链的本发明的分子调理靶细胞；以靶细胞与效应细胞的合适比例将调理的放射标记的靶细胞与效应细胞组合在微量滴定板中；在37℃下孵育细胞混合物16-18小时；收集上清液；并分析放射性。然后可例如使用下列公式确定本发明的分子的细胞毒性：％裂解＝(实验cpm-靶渗漏cpm)/(去污剂裂解cpm-靶渗漏cpm)x100％。可选择地，％裂解＝(ADCC-AICC)/(最大释放-自发释放)。特异性裂解可使用公式计算：特异性裂解＝存在本发明的分子下的％裂解-无本发明的分子存在下的％裂解。曲线可通过改变靶：效应细胞比或抗体浓度产生。
优选地用于本发明的ADCC测定中的效应细胞是使用本领域技术人员已知的标准方法，例如使用Ficoll-Paque密度梯度离心优选地从正常的人血液纯化的外周血单核细胞(PBMC)。用于本发明的方法中的优选的效应细胞表达不同的FcγR活化性受体。本发明包括表达FcγRI、FcγRIIA和FcγRIIB的效应细胞THP-1和表达FcγRIIIA和FcγRIIB的从人全血获得的单核细胞来源的原代巨噬细胞，以确定重链抗体突变体是否相对于野生型IgG1抗体表现出增加的ADCC活性和吞噬作用。
人单核细胞系THP-1，通过表达高亲和力受体FcγRI和低亲和力受体FcγRIIA激活吞噬作用(Fleit等人(1991)“The Human Monocyte-Like Cell Line THP-1Expresses Fc Gamma RI And Fc Gamma RII，”J.Leuk.Biol.49：556-565)。THP-1细胞不组成性地表达FcγRIIA或FcγRIIB。用细胞因子刺激这些细胞影响FcR的表达方式(Pricop等人(2001)“Differential Modulation Of Stimulatory And Inhibitory Fc Gamma Receptors On Human Monocytes By Th1And Th2Cytokines，”J.of Immunol.，166：531-537)。THP-1细胞在细胞因子IL4的存在下的生长引起FcγRIIB表达并导致FcγRIIA和FcγRI表达的减少。FcγRIIB表达还可通过增加的细胞密度增强(Tridandapani等人(2002)“Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells，”J.Biol.Chem.，277(7)：5082-5089)。相比而言，已报道IFNγ可导致FcγRIIIA表达(Pearse 等人(1993)“Interferon Gamma-Induced Transcription Of The High-Affinity Fc Receptor For IgG Requires Assembly Of A Complex That Includes The91-kDa Subunit Of Transcription Factor ISGF3，”Proc.Nat.Acad.Sci.USA90：4314-4318)。细胞表面上受体的存在或不存在可使用本领域技术人员已知的常用方法通过FACS确定。细胞因子引起的FcγR在细胞表面上的表达提供了测试FcγRIIB存在下的活化和抑制的系统。如果THP-1细胞不能表达FcγRIIB，则本发明还包括另一种人单核细胞系U937。已表明这些细胞在IFNγ和TNF存在下最终分化成巨噬细胞(Koren等人(1979)“In Vitro Activation Of A Human Macrophage-Like CellLine，”Nature279：328-331)。
在小鼠肿瘤模型中由巨噬细胞和NK细胞介导FcγR依赖性的肿瘤细胞杀伤(Clynes等人(1998)“Fc Receptors Are Required In Passive And Active Immunity To Melanoma，”Proc.Nat.Acad.Sci.USA95：652-656)。本发明包括使用来自供体的淘析的单核细胞作为效应细胞来分析Fc突变体在吞噬作用和ADCC测定中激发靶细胞的细胞毒性的效率。FcγRI、FcγRIIIA和FcγRIIB的表达方式受不同生长条件的影响。可使用本领域技术人员已知的常见方法确定来自冷冻的淘析的单核细胞、新鲜淘析的单核细胞、被维持在10％FBS中的单核细胞和培养在FBS+GM-CSF和或人血清中的单核细胞的FcγR表达。例如，可用FcγR特异性抗体对细胞染色并通过FACS分析以确定FcR分布型(profile)。然后将最佳地模拟巨噬细胞的体内FcγR表达的条件用在本发明的方法中。
在某些实施方式中，尤其当不能获得具有正确的FcγR分布型的人细胞时，本发明包括使用小鼠细胞。在某些实施方式中，本发明包括可用人FcγRIIIA转染的小鼠巨噬细胞系RAW264.7(ATCC)和使用本领域已知的方法分离到的稳定的转染子，参见，例如Ralph等人(1977)“Antibody-Dependent Killing Of Erythrocyte And Tumor Targets By Macrophage-Related Cell Lines：Enhancement By PPD And LPS，”J.Immunol.119：950-4)。可使用常规的实验通过FACS分析对转染子的FcγRIIIA表达进行定量且高表达子可用于本发明的ADCC测定中。在其他实施方式中，本发明包括从敲除的转基因小鼠例如本文公开的转基因小鼠中分离表达 人FcγR的脾腹膜巨噬细胞。
可使用Ficoll-Paque梯度(Pharmacia)从供体的外周血(PBM)中收集淋巴细胞。在分离的单核细胞群中，大多数的ADCC活性通过在其表面上包含FcγRIIIA而不是FcγRIIB的自然杀伤(NK)细胞发生。这些细胞的结果表明这些突变体在激发NK细胞的ADCC方面的功效并确定了用淘析的单核细胞测试的试剂。
用于本发明的ADCC测定中的靶细胞包括但不限于乳腺癌细胞系，例如具有ATCC登记号HTB-30的SK-BR-3(参见，例如Tremp等人(1976)“Human Breast Cancer In Culture，”Recent Results Cancer Res.33-41)；B-淋巴细胞；来源于伯基特淋巴瘤的细胞，例如，具有ATCC登记号CCL-86的Raji细胞(参见，例如Epstein等人(1965)“Characteristics And Mode Of Growth Of Tissue Culture Strain(EB1)Of Human Lymphoblasts From Burkitt′s Lymphoma，”J.Natl.Cancer Inst.34：231-240)，以及具有ATCC登记号CCL-213的Daudi细胞(参见，例如Klein等人(1968)“Surface IgM-Kappa Specificity On A Burkitt Lymphoma Cell In Vivo And In Derived Culture Lines，”Cancer Res.28：1300-1310)。靶细胞必须被待测定的双抗体分子的抗原结合位点识别。
ADCC测定基于NK细胞通过凋亡通路介导细胞死亡的能力。NK细胞通过FcγRIIIA对结合到细胞表面上的抗原的IgG Fc结构域的识别来部分地介导细胞死亡。用于根据本发明的方法的ADCC测定可以是基于放射活性的测定或基于荧光的测定。用来表征包含变体Fc区的本发明的分子的ADCC测定包括标记靶细胞，例如SK-BR-3、MCF-7、OVCAR3、Raji、Daudi细胞，用通过其抗原结合位点识别靶细胞上的细胞表面受体的抗体调理靶细胞；以可由常规实验确定的合适比例组合被标记的调理的靶细胞和效应细胞；收集这些细胞；基于所使用的标记使用合适的检测方案检测裂解的靶细胞的上清液中的标记。可用放射标记或荧光标记使用本领域已知的标准方法标记靶细胞。例如，这些标记包括但不限于[51Cr]Na2CrO4；以及荧光增强型配体2，2’：6’，2”-四吡啶-6-6”二羧酸(TDA)的乙酰氧基甲酯。
在特定的优选实施方式中，时间分辨荧光测定被用于测量针对已用荧光增强型配体2，2’：6’，2”-四吡啶-6-6”二羧酸(TDA)的乙酰氧基甲酯标记的靶细胞的ADCC活性。这些荧光测定是本领域普遍已知的，例如，参见Blomberg等人(1996)“Time-Resolved Fluorometric Assay For Natural Killer Activity Using Target Cells Labelled With A Fluorescence Enhancing Ligand，”Journal of Immunological Methods，193：199-206，其通过引用被全部并入本文。简单地，用穿过活细胞的细胞膜快速扩散的膜通透性TDA的乙酰氧基甲基二酯(双(乙酰氧基甲基)2，2’：6’，2”-四吡啶-6-6”二羧酸(BATDA)标记靶细胞。细胞内酯酶剥除酯基且再生的膜不通透性TDA分子被捕捉在细胞内部。在37℃下，在5％CO2下孵育效应细胞和靶细胞例如持续至少两小时，最多3.5小时后，用Eu3+螯合从裂解的靶细胞中释放的TDA并在时间分辨荧光计(例如，Victor1420，Perkin Elmer/Wallace)中对所形成的Europium-TDA螯合物的荧光定量。
在另一个特定实施方式中，用来表征包含多个表位结合位点和任选地，Fc结构域(或其部分)的本发明的分子的ADCC测定包括下列步骤：优选地，用双(乙酰氧基甲基)2，2’：6’，2”-四吡啶-叔-6”二羧酸(DELFIA BATDA Reagent，Perkin Elmer/Wallac)标记4-5x106的靶细胞(例如，SK-BR-3、MCF-7、OVCAR3、Raji细胞)。为了最佳标记效率，用于ADCC中的靶细胞的数目应优选地不超过5x106。向细胞中加入BATDA试剂并在37℃下，优选地在5％CO2下孵育混合物至少30分钟。然后用生理缓冲液，例如具有0.125mM亚磺吡唑的PBS以及包含0.125mM亚磺吡唑的培养基洗涤细胞。然后用包含对FcγRIIA特异性的表位结合结构域和任选地，Fc结构域(或其部分)的本发明的分子调理(包被)被标记的靶细胞。在优选的实施方式中，用于ADCC测定中的分子也是对细胞表面受体、肿瘤抗原或癌症抗原特异性的。本发明的双抗体分子可特异性地结合任何癌症或肿瘤抗原，例如在5.6.1节列出的抗原。ADCC测定中的靶细胞根据被构建到本发明的双抗体中的表位结合位点选择，使得该双抗体特异性地结合靶细胞的细胞表面受体。
向效应细胞，例如PBMC中加入靶细胞以产生约1∶1、10∶1、30∶1、50∶1、 75∶1或100∶1的效应子：靶比。在37℃下，在5％CO2下孵育效应细胞和靶细胞至少两小时，最多3.5小时。收集细胞上清液并加入到酸性铕溶液(例如，DELFIA铕溶液，Perkin Elmer/Wallac)中。在时间分辨的荧光计(例如，Victor1420，Perkin Elmer/Wallac)中对所形成的铕TDA螯合物的荧光定量。最大释放(MR)和自发释放(SR)通过分别用1％TX-100和单独的培养基孵育靶细胞确定。通过在无受试分子，例如，本发明的双抗体存在下孵育靶细胞和效应细胞测量抗体独立性细胞毒性(AICC)。优选一式三份地进行每种测定。特异性裂解的平均百分比被计算为：实验释放(ADCC)-AICC/(MR-SR)x100。
本发明包括本领域已知和本文例示的测定来表征包含Fc结构域(或其部分)的本发明的分子对C1q的结合和对补体依赖性细胞毒性(CDC)的介导。为测定C1q结合，可进行Clq结合ELISA。示例性的测定可包含以下：在4℃下用包被缓冲液中的包含本发明的分子的多肽或起始多肽(对照)过夜包被测定平板。然后洗涤并封闭这些平板。洗涤后，可向每个孔中加入小份的人C1q并在室温下孵育2小时。进一步洗涤后，可向每个孔中加入100uL的绵羊抗补体C1q过氧物酶偶联的抗体并在室温下孵育1小时。可再次用漂洗缓冲液洗涤平板并可向每个孔中加入100ul的包含OPD(O-苯二胺二氢氯化物(Sigma))的底物缓冲液。可允许通过呈现黄颜色而被观察到的氧化反应进行30分钟并通过加入100ul的4.5NH2SO4而终止。然后可在(492-405)nm下读取吸光度。
为评价补体活化，可按照例如在Gazzano-Santoro等人(1997)“A Non-Radioactive Complement-Dependent Cytotoxicity Assay For Anti-CD20Monoclonal Antibody，”J.Immunol.Methods202：163-171中描述的进行补体依赖性的细胞毒性(CDC)测定，该文献被通过引用全部并入本文。简单地，可用缓冲液稀释各种浓度的包含(变体)Fc结构域(或其部分)的分子和人补体。表达双抗体分子所结合的抗原的细胞可被稀释到约1x106细胞/ml的密度。包含(变体)Fc结构域(或其部分)的双抗体分子、稀释的人补体和表达抗原的细胞的混合物可被加至平底组织培养96孔板中并允许在37℃和5％CO2下孵育2小时以促进补体介导的细胞裂解。然后可向每个孔中加入50 uL的阿尔玛蓝(Accumed International)并在37℃下孵育过夜。使用96-孔荧光计通过在530nm下激发和在590nm下发射测量吸光度。可将结果表示成相对荧光单位(RFU)。可从标准曲线计算样品浓度并报告与非变体分子，即，不包含Fc结构域或包含非变体Fc结构域的分子相比，目的变体的百分比活性。
5.4.3其他测定
可使用本领域已知的用于表征抗原-结合结构域或Fc-FcγR结合的动力学参数的任何基于表面等离子体共振的测定来测定包含多个表位结合结构域和任选地，Fc结构域的本发明的分子。市售的任何SPR设备，包括但不限于可从Biacore AB(Uppsala，Sweden)获得的BIAcore设备；可从Affinity Sensors(Franklin，MA.)获得的IAsys设备；可从Windsor Scientific Limited(Berks，UK)获得的IBIS系统、可从Nippon Laser and Electronics Lab(Hokkaido，Japan)获得的SPR-CELLIA系统以及可从Texas Instruments(Dallas，TX)获得的SPR Detector Spreeta可用于本发明。对于基于SPR技术的综述，参见Mullet等人(2000)“Surface Plasmon Resonance-Based Immunoassays，”Methods22：77-91；Dong等人(2002)“Some new aspects in biosensors，”Reviews in Mol.Biotech.82：303-23；Fivash等人(1998)“BIAcore For Macromolecular Interaction，”Current Opinion in Biotechnology9：97-101；Rich等人(2000)“Advances In Surface Plasmon Resonance Biosensor Analysis，”Current Opinion in Biotechnology11：54-61；其全部被通过引用全文并入本文。另外，在美国专利第6,373,577；6,289,286；5,322,798；5,341,215；6,268,125号中描述的用于测量蛋白质-蛋白质相互作用的任何一种SPR设备和基于SPR的方法被设想在本发明的方法中，所有这些专利被通过引用全部并入本文。
简单地，基于SPR的测定包括将结合对的一个成员固定在某个表面上，并实时地监测其与该结合对的另一个成员在溶液中的相互作用。SPR基于测量在发生复合体形成或解离的表面附近的溶剂折射率的变化。在其上发生固定的表面是传感器的芯片，该芯片是SPR技术的核心；其由用一薄层金涂覆的玻璃表面组成，并形成用于被设计为优化分子与表面的结合 的一系列特殊表面的基底。各种传感器芯片是市售的，尤其是由上文列出的公司市售的，所有这些芯片可用于本发明的方法中。传感器芯片的实例包括从BIAcore AB，Inc.获得的芯片，例如传感器芯片CM5，SA，NTA和HPA。可使用本领域已知的任何一种固定方法和化学作用将本发明的分子固定到传感器芯片的表面上，包括但不限于通过胺基的直接共价偶联、通过巯基的直接共价偶联、生物素与亲和素包被的表面的连接、醛与碳水化合物的基团的偶联以及通过组氨酸标签与NTA芯片连接。
在某些实施方式中，包含多个表位结合位点和任选地Fc结构域的本发明的分子与抗原或FcγR结合的动力学参数可使用BIAcore设备(例如，BIAcore设备1000，BIAcore Inc.，Piscataway，NJ)确定。如上文讨论的，参见5.4.1节，任何FcγR可用来评价其中双抗体分子的至少一个表位结合位点免疫特异性地识别FcγR和/或其中双抗体分子包含Fc结构域(或其部分)的本发明的分子的结合。在特定实施方式中，FcγR是FcγRIIIA，更优选地可溶性的单体FcγRIIIA。例如，在一个实施方式中，可溶性的单体FcγRIIIA是连接到接头-AVITAG序列的FcγRIIIA的胞外区(参见2003年1月9日递交的美国临时申请第60/439,498号和2003年3月19日递交的美国临时申请第60/456,041号，其被通过引用全部并入本文)。在另一个特定实施方式中，FcγR是FcγRIIB，优选地可溶性的二聚FcγRIIB。例如，在一个实施方式中，可溶性的二聚FcγRIIB蛋白根据被通过引用全部并入本文的2003年1月13日递交的美国临时申请第60/439,709号中描述的方法制备。
对于所有免疫学测定，本发明的分子对FcγR的识别/结合可通过多个结构域实现：在某些实施方式中，本发明的分子通过所述多个表位结合结构域中的一个免疫特异性地识别FcγR；又在其中本发明的分子包含Fc结构域(或其部分)的其他实施方式中，该双抗体分子可通过Fc-FcγR相互作用免疫特异性地识别FcγR；又在其中本发明的分子包含Fc结构域(或其部分)和免疫特异性地识别FcγR的表位结合位点的另外的实施方式中，该双抗体分子可通过表位结合结构域和Fc结构域(或其部分)中的一者或二者识别FcγR。使用BIAcore设备来确定包含多个表位结合结构域和任选地，Fc结构域(或其部分)的分子对抗原和/或FcγR的动力学参数的示例性测定包 括下列步骤：优选地通过胺偶联化学法将第一抗原固定在传感器芯片表面的四个流动池中的一个上，使得约5000响应单位(RU)的所述第一抗原被固定在所述表面上。一旦制备了合适的表面，优选地通过以5μL/mL的流速注射20μg/mL的溶液一分钟使免疫特异性地识别所述第一抗原的本发明的分子在所述表面上经过。在该阶段结合到所述表面的本发明的分子的水平通常在400和700RU之间的范围内。接下来，将系列稀释在HBS-P缓冲液(20mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、pH7.5)中的第二抗原(例如，FcγR)或FcγR受体以100μL/min注射到所述表面上。优选地通过5秒的单次注射100mM NaHCO3pH9.4；3M NaCl进行分子在不同的第二抗原或受体稀释液之间的再生。本领域已知的任何再生技术被设想在本发明的方法中。
一旦收集到整套数据，使用由SPR设备制造商，例如BIAcore，Inc.(Piscataway，NJ)提供的计算机算法对所得到的结合曲线全局拟合。这些算法计算了K结合和K解离，从其推断出作为两个速率常数的比(即，K解高/K结合)的表观平衡结合常数Kd。对如何获得单独的速率常数的更详细的处理可在BIAevaluaion Software Handbook(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)中发现。对所产生的数据的分析可使用本领域已知的任何方法进行。对于解释所产生的动力学数据的各种方法的综述，参见Myszka(1997)“Kinetic Analysis Of Macromolecular Interactions Using Surface Plasmon Resonance Biosensors，”Current Opinion in Biotechnology8：50-7；Fisher等人(1994)“Surface Plasmon Resonance Based Methods For Measuring The Kinetics And Binding Affinities Of Biomolecular Interactions，”Current Opinion in Biotechnology5：389-95；O’Shannessy(1994)“Determination Of Kinetic Rate And Equilibrium Binding Constants For Macromolecular Interactions：A Critique Of The Surface Plasmon Resonance Literature.”Current Opinion in Biotechnology，5：65-71；Chaiken等人(1992)“Analysis Of Macromolecular Interactions Using Immobilized Ligands，”Analytical Biochemistry，201：197-210；Morton等人(1995)“Interpreting Complex Binding Kinetics From Optical Biosensors：A Comparison Of Analysis By Linearization，The Integrated Rate Equation，And Numerical Integration，”Analytical  Biochemistry227：176-85；O’Shannessy等人，1996，Analytical Biochemistry236：275-83；其都被通过引用全文并入本文。
在优选的实施方式中，使用SPR分析，例如BIAcore确定的动力学参数可用作对本发明的分子将如何在功能测定，例如ADCC中发挥功能的预测性量度。基于从SPR分析获得的动力学参数预测本发明的分子的功效的示例性方法可包括下列步骤：确定本发明的分子结合FcγRIIIA和FcγRIIB(通过表位结合结构域和/或Fc结构域(或其部分))的K解离值；针对ADCC数据绘制(1)对于FcγRIIIA的K解离(wt)/K解离(mut)；(2)对于FcγRIIB的K解离(mut)/K解离(wt)。高于1的数字表明相对于野生型，FcγRIIIA的离解速率减小而FcγRIIB的离解速率增加；并拥有增强的ADCC功能。
5.5 产生本发明的双抗体分子的方法
本发明的双抗体分子可使用本领域熟知的各种方法产生，包括蛋白质的从头合成和编码结合蛋白的核酸的重组表达。期望的核酸序列可通过重组方法(例如，较早制备的期望多核苷酸的变体的PCR诱变)或通过固相DNA合成产生。通常使用重组表达方法。一方面，本发明提供了包含编码CD16A VH和/或VL的序列的多核苷酸；另一方面，本发明提供了包含编码CD32B VH和/或VL的序列的多核苷酸。由于遗传密码子的简并性，多种核酸序列编码各种免疫球蛋白的氨基酸序列，且本发明包括编码本文描述的结合蛋白的所有核酸。
5.5.1 编码本发明的分子的多核苷酸
本发明还包括编码本发明的分子，包括多肽和抗体的多核苷酸。编码本发明的分子的多核苷酸可通过本领域已知的任何方法获得，且该多核苷酸的核苷酸序列可通过本领域已知的任何方法测定。
一旦由本发明的方法鉴定的分子的核苷酸序列被确定，就可使用本领域熟知的方法，例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等(参见，例如在Sambrook等人，2001，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第3版.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY；和Ausubel等人，编辑，1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY中描述 的技术，其都被通过引用全部并入本文)操纵该核苷酸序列，以通过例如产生氨基酸置换、缺失和/或插入产生例如具有不同氨基酸序列的抗体。
在一个实施方式中，可通过本领域已知的标准技术筛选本领域可用的人文库或任何其他文库以克隆编码本发明的分子的核酸。
5.5.2 本发明的分子的重组表达
一旦获得了编码本发明的分子(即，抗体)的核酸序列，可使用本领域熟知的技术通过重组DNA技术产生用于产生这些分子的载体。可使用本领域技术人员熟知的方法来构建包含用于本发明的分子的编码序列和合适的转录及翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如，体外重组DNA技术，合成技术以及体内基因重组。(参见，例如，在Sambrook等人，1990， Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY和Ausubel等人编辑，1998，Current  Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY中描述的技术)。
可通过常规技术(例如，电穿孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀法)将包含通过本发明的方法鉴定的分子的核苷酸序列的表达载体转移到宿主细胞并然后通过常规技术培养被转染的细胞以产生本发明的分子。在特定实施方式中，本发明的分子的表达由组成型、诱导型或组织特异性启动子调控。
尤其是对于完整重组免疫球蛋白分子的表达，用来表达被本发明的方法鉴定的分子的宿主细胞可以是细菌细胞例如大肠杆菌，或优选地，真核细胞。特别地，哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)与载体例如来自人巨细胞病毒的主要中间型早期基因启动子元件的结合是免疫球蛋白的有效表达系统(Foecking等人(1986)“Powerful And Versatile Enhancer-Promoter Unit For Mammalian Expression Vectors，”Gene45：101-106；Cockett等人(1990)“High Level Expression Of Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases In Chinese Hamster Ovary Cells Using Glutamine Synthetase Gene Amplification，”Biotechnology8：662-667)。
各种宿主表达载体系统可用来表达被本发明的方法鉴定的分子。这些宿主表达系统代表可产生和顺序性地纯化本发明的分子的编码序列的工 具，而且代表当被合适的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本发明的分子的细胞。这些包括但不限于转化了包含被本发明的方法鉴定的分子的编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒DNA表达载体的微生物例如细菌(例如大肠杆菌和枯草杆菌(B.subtilis))；转化了包含编码被本发明的方法鉴定的分子的序列的酵母重组表达载体的酵母(例如，酿酒毕赤酵母(Saccharomyces pichia))；感染了包含编码被本发明的方法鉴定的分子的序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)的昆虫细胞系统；感染了包含编码被本发明的方法鉴定的分子的序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV))或转化了包含编码被本发明的方法鉴定的分子的序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)的植物细胞系统；或具有包含来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、293T、3T3细胞、淋巴细胞(参见U.S.5,807,715)、Per C.6细胞(由Crucell发育而来的人视网膜细胞)。
在细菌系统中，可根据待表达的分子期望的用途来有利地选择几种表达载体。例如，当待产生大量的该类蛋白时，对于产生抗体的药物组合物来讲，指导表达高水平的易于纯化的融合蛋白产物的载体可能是期望的。这些载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Rüther等人(1983)“Easy Identification Of cDNA Clones，”EMBO J.2：1791-1794)，其中抗体编码序列可被单独地连接到载体中，与lac Z编码区处于一个读码框中以产生融合蛋白；pIN载体(Inouye等人(1985)“Up-Promoter Mutations In The lpp Gene Of Escherichia Coli，”Nucleic Acids Res.13：3101-3110；Van Heeke等人(1989)“Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia Coli，”J.Biol.Chem.24：5503-5509)；及类似载体。pGEX载体还可用来将外源多肽表达为具有谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。一般地，这些融合蛋白是可溶的且可易于通过吸附和结合基质谷胱甘肽-琼脂糖磁珠，接下来在游离谷胱甘肽的存在下洗脱而得以从裂解的细胞中纯化出来。pGEX载体被设计为包括凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位点使得被克隆的靶基因产物可从GST部分释放出来。
在昆虫系统中，苜蓿尺蠖(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)用作表达外源基因的载体。病毒在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。抗体编码序列可被单独地克隆到病毒的非必需区域(例如，多角体蛋白基因)并被置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制之下。
在哺乳动物宿主细胞中，可利用几种基于病毒的表达系统。在其中腺病毒用作表达载体的实例中，目的抗体编码序列可被连接到腺病毒转录/翻译控制复合体，例如晚期启动子和三重前导序列上。然后可通过体外或体内重组将该嵌合基因插入到腺病毒基因组中。插入到病毒基因组的非必需区域(例如，E1或E3区域)将产生在被感染的宿主中成活且能够表达免疫球蛋白分子的重组病毒(例如，参见Logan等人(1984)“Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：3655-3659)。还可需要特定的起始信号以有效地翻译所插入的抗体编码序列。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与期望的编码序列的读码框相符以保证整个插入物的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可具有天然和合成的多种来源。表达效率可通过包括合适的转录增强元件，转录终止子等增强(参见Bitter等人(1987)“Expression And Secretion Vectors For Yeast，”Methods in Enzymol.153：516-544)。
另外，可选择调节插入序列的表达或以所期望的特定方式修饰和处理基因产物的宿主细胞株。对蛋白质产物的这些修饰(例如，糖基化)和处理(例如，裂解)对于该蛋白质的功能可能是重要的。例如，在某些实施方式中，构成本发明的双抗体分子的多肽可被表达为单基因产物(例如，作为单一多肽链，即，作为多蛋白前体)，需要通过天然或重组细胞机制的蛋白酶裂解以形成本发明的双抗体分子的单独多肽。因此本发明包括构建编码包含本发明的多肽的多蛋白前体分子的核酸序列，该核酸序列包括能够指导所述多蛋白前体的翻译后裂解的编码序列。多蛋白前体的翻译后裂解产生本发明的多肽。包含本发明的多肽的前体分子的翻译后裂解可发生在体内(即，在宿主细胞内，通过天然或重组细胞系统/机制，例如合适位点处的 弗林蛋白酶裂解)或可发生在体外(例如，在包含具有已知活性的蛋白酶或肽酶的组合物中和/或在包含已知培养期望的蛋白酶作用的条件或试剂的组合物中孵育所述多肽链)。对重组蛋白的纯化和修饰是本领域熟知的，使得所述多蛋白前体的设计可包括易于被技术工作者容易理解的几种实施方式。任何本领域已知的蛋白酶或肽酶可用于所描述的对前体分子的修饰，例如凝血酶(其识别氨基酸序列LVPR^GS(SEQ ID NO：89))，或Xa因子(其识别氨基酸序列I(E/D)GR^(SEQ ID NO：90)(Nagai等人(1985)“Oxygen Binding Properties Of Human Mutant Hemoglobins Synthesized In Escherichia Coli，”Proc.Nat.Acad.Sci.USA82：7252-7255，以及在Jenny等人(2003)“A Critical Review Of The Methods For Cleavage Of Fusion Proteins With Thrombin And Factor Xa，”Protein Expr.Purif.31：1-11中综述的，其每一个被通过引用全部并入本文))、肠激酶(其识别氨基酸序列DDDDK^(SEQ ID NO：91)(Collins-Racie等人(1995)“Production Of Recombinant Bovine Enterokinase Catalytic Subunit In Escherichia Coli Using The Novel Secretory Fusion Partner DsbA，”Biotechnology13：982-987，在此其被通过引用全部并入本文))、弗林蛋白酶(其识别氨基酸序列RXXR^，优先识别RX(K/R)R^(分别是SEQ ID NO：92和SEQ ID NO：93)(位置P6处的额外的R表现出增强裂解))以及AcTEV(其识别氨基酸序列ENLYFQ^G(SEQ ID NO：94)(Parks等人(1994)“Release Of Proteins And Peptides From Fusion Proteins Using A Recombinant Plant Virus Proteinase，”Anal.Biochem.216：413-417，在此其被通过引用全部并入本文))和足口病病毒蛋白酶C3。参见，例如上文的6.4部分。
不同的宿主细胞具有用于蛋白质和基因产物的翻译后处理和修饰的特征性和特异性机制。可选择合适的细胞系或宿主系统以保证对所表达的外源蛋白的正确修饰和处理。为了这个目的，可使用具有用于初级转录物的适当处理、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞器的真核宿主细胞。这些哺乳动物细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、CRL7030以及Hs578Bst。
对于重组蛋白的长期、高产量产生，稳定表达是优选的。例如，可构建稳定地表达本发明的抗体的细胞系。不使用包含病毒复制起点的表达载体，可用被合适的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷化位点等)控制的DNA和选择性标记转化宿主细胞。在引入外源DNA后，可允许所构建的细胞在富集培养基中生长1-2天，并然后转换到选择性培养基中。重组质粒载体中的选择性标记提供选择抗性并允许细胞将质粒稳定地整合到其染色体中并生长为形成进而可被克隆和扩增成细胞系的集落(foci)。该方法可有利地用来构建表达本发明的抗体的细胞系。所构建的这些细胞系在筛选和评价与本发明的分子直接或间接相互作用的化合物方面可能是特别有用的。
可使用几种选择系统，包括但不限于单纯性疱疹病毒的胸苷激酶(Wigler等人(1977)“Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells，”Cell11：223-232)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska等人(1992)“Use Of The HPRT Gene And The HAT Selection Technique II DNA-Mediated Transformation Of Mammalian Cells：First Steps Toward Developing Hybridoma Techniques And Gene Therapy，”Bioessays14：495-500)，以及腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人(1980)“Isolation Of Transforming DNA：Cloning The Hamster aprt Gene，”Cell22：817-823)基因可被分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞中。另外，抗代谢物抗性可用作针对下列基因的选择基础：dhfr，其提供对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等人(1980)“Transformation Of Mammalian Cells With An Amplifiable Dominant-Acting Gene，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：3567-3570；O’Hare等人(1981)“Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：1527-1531)；gpt，其提供对霉酚酸的抗性(Mulligan等人(1981)“Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：2072-2076)；neo，其提供对氨基糖苷G-418的抗性(Tolstoshev(1993)“Gene Therapy，Concepts，Current Trials And Future Directions，”Ann.Rev.Pharmacol. Toxicol.32：573-596；Mulligan(1993)“The Basic Science Of Gene Therapy，”Science260：926-932；以及Morgan等人(1993)“Human Gene Therapy，”Ann.Rev.Biochem.62：191-217)和hygro，其提供对潮霉素的抗性(Santerre等人(1984)“Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells.”Gene30：147-156)。可使用的重组DNA技术领域通常已知的方法被描述在Ausubel等人(编辑)，1993，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY；Kriegler，1990，Gene Transfer and Expression，ALaboratory Manual，Stockton Press，NY；以及在第12和13章中，Dracopoli等人(编辑)，1994，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley&Sons，NY.；Colberre-Garapin等人(1981)“A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells，”J.Mol.Biol.150：1-14中。
可通过载体扩增增加本发明的分子的表达水平(对于综述，参见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for  the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，第3卷(Academic Press，New York，1987)。当表达抗体的载体系统中的标记可扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标记基因的拷贝数。因为被扩增的区域与双抗体分子的多肽的核苷酸序列连接，所以多肽的产生也将增加(Crouse等人(1983)“Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes，”Mol.Cell.Biol.3：257-266)。
可用本发明的两种表达载体共转染宿主细胞，第一载体编码双抗体分子的第一多肽链，而第二载体编码双抗体分子的第二多肽链。这两种载体可包含使得能够等量表达两种多肽的相同的选择性标记。可选择地，可使用编码两条多肽的单一载体。根据本发明的分子的多肽的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
一旦本发明的分子(即，双抗体)已被重组表达，则其通过本领域已知的用于多肽、多蛋白或双抗体纯化的任何方法(例如，与基于抗原选择性的抗体纯化方案相似)纯化，例如通过层析(例如，离子交换、亲和法，特别 地通过针对特定抗原的亲和法(任选地在蛋白质A选择后，其中双抗体分子包含Fc结构域(或其部分))以及尺寸柱层析)、离心、差异溶解或通过用于纯化多肽、多蛋白或双抗体的任何其他标准技术。
5.6 预防性和治疗性方法
本发明的分子对于治疗和/或预防其中期望由FcγR介导的效应细胞功能(例如，ADCC)的疾病、疾患或感染(例如，癌症，传染病)是特别有用的。如上文所讨论的，本发明的双抗体可在引发效应功能方面显示出抗体样功能，尽管该双抗体分子并不包含Fc结构域。通过包含免疫特异性地识别FcγR的至少一个表位结合结构域，双抗体分子可显示出FcγR结合和与Fc-FcγR相互作用相似的活性。例如，本发明的分子可结合细胞表面抗原和免疫效应细胞(例如，NK细胞)上的FcγR(例如，FcγRIIIA)，刺激针对所述细胞的效应功能(例如，ADCC、CDC、吞噬作用、调理作用等)。
在其他实施方式中，本发明的双抗体分子包含Fc结构域(或其部分)。在这些实施方式中，所述Fc结构域还可包含相对于野生型Fc结构域(或其部分)的至少一种氨基酸修饰和/或可包含来自一种或多种IgG同种型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的结构域。包含变体Fc结构域的本发明的分子相对于包含野生型Fc结构域的分子可显示出被赋予的或被改变的表型，诸如改变的或赋予的效应物功能活性(例如，如在NK依赖性或巨噬细胞依赖性测定中测定的)。在所述实施方式中，具有被赋予的或被改变的效应功能活性的本发明的分子对于治疗和/或预防其中期望效应功能活性的增强功效的疾病、疾患或感染是特别有用的。在某些实施方式中，包含Fc结构域(或其部分)的本发明的双抗体分子介导补体依赖性的级联。被鉴定为改变效应功能的Fc结构域变体被公开在本发明人的并存申请，国际申请WO04/063351、美国专利申请公布2005/0037000和2005/0064514、2004年11月10日递交的美国临时申请60/626,510、2004年12月15日递交的60/636,663和2006年3月10日递交的60/781,564以及2005年11月10日递交的美国专利申请11/271,140和2005年12月15日递交的11/305,787中，其每一个被通过引用全部并入。
本发明包括用于治疗、预防或控制受治疗者的癌症的方法和组合物， 该方法包括对所述受治疗者施用治疗有效量的根据本发明构建的包含一个或多个表位结合位点和任选地，Fc结构域(或其部分)的一种或多种分子，所述分子还结合癌症抗原。本发明的分子对于预防、抑制、减少原代肿瘤的生长或退化、癌细胞的转移和传染病是特别有用的。虽然不期望被特定的作用机制所束缚，但是本发明的分子介导导致肿瘤清除、肿瘤衰退或其组合的效应功能。在替代实施方式中，本发明的双抗体通过细胞表面抗原和/或受体的交联以及增强的凋亡或负生长调控信号传导介导治疗活性。
虽然不期望被特定的作用机制所束缚，本发明的双抗体分子相对于本领域已知的治疗性抗体表现出增强的治疗功效，部分地由于双抗体免疫特异性地结合以减少的水平表达特定抗原(例如，FcγR)的靶细胞的能力，例如，借助由于该双抗体-表位相互作用的提高的亲合力而更长久地保持在靶细胞上的能力。
具有增强的对抗原(例如，FcγR)的亲和力和亲合力的本发明的双抗体对于治疗、预防或控制受治疗者的癌症或另一种疾病或疾患是特别有用的，其中FcγR低水平地在靶细胞群体中表达。如本文所用的，细胞中FcγR的表达根据如使用本领域技术人员已知的常见方法测量的每个细胞中这类分子的密度定义。包含多个表位结合位点和任选地，FcγR(或其部分)的本发明的分子在以30,000至20,000分子/细胞的密度，以20,000至10,000分子/细胞的密度，以10,000分子/细胞或更小的密度，以5000分子/细胞或更小的密度，或以1000分子/细胞或更小的密度表达靶抗原，例如癌症抗原的细胞中优选地也具有被赋予的或增强的亲合力和亲和力和/或效应功能。本发明的分子在治疗、预防或控制亚群体的疾病或疾患，例如癌症方面具有特定的实用性，其中靶抗原以低水平在靶细胞群体中表达。
本发明的分子还可有利地与本领域已知的用于治疗或预防疾病，例如癌症、自身免疫病、炎性疾患和传染病的其他治疗剂组合使用。在特定实施方式中，本发明的分子可与例如用来增加与所述分子的相互作用的效应细胞的数目或活性并增强免疫反应的单克隆抗体或嵌合抗体、淋巴因子或造血生长因子(诸如例如，IL-2、IL-3和IL-7)组合使用。本发明的分子还可有利地与用来治疗疾病、疾患或感染的一种或多种药物，例如诸如在5.7 节详述的抗癌剂、抗炎剂或抗病毒剂组合使用。
5.6.1 癌症
本发明包括用于治疗或预防受治疗者的癌症的方法和组合物，所述方法包括对所述受治疗者施用治疗有效量的包含多个表位结合结构域的一种或多种分子。在某些实施方式中，本发明包括用于在具有FcγR多态性的受治疗者例如对FcγRIIIA-158V或FcγRIIIA-158F等位基因为纯合的受治疗者中治疗或预防癌症的方法和组合物。在某些实施方式中，本发明包括将双抗体分子的至少一个表位结合结构域构建成免疫特异性地结合FcγRIIIA(158F)。在其他实施方式中，本发明包括将双抗体分子的至少一个表位结合结构域构建成免疫特异性地结合FcγRIIIA(158V)。
标准单克隆抗体治疗的功效取决于受治疗者的FcγR多态性(Cartron等人(2002)“Therapeutic Activity Of Humanized Anti-CD20Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcRIIIa Gene，”Blood99：754-758；Weng等人(2003)“Two Immunoglobulin G Fragment C Receptor Polymorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma，”J Clin Oncol.21(21)3940-3947，其二者都被通过引用全部并入本文)。这些受体被表达在效应细胞表面上并介导ADCC。低亲和力活化性受体的高亲和力的等位基因提高了效应细胞介导ADCC的能力。与依赖Fc-FcγR相互作用来实现效应功能相比，本发明的方法包括构建免疫特异性地识别低亲和力活化性受体的分子，允许这些分子被设计为用于特定的多态性。可选择地或另外地，本发明的分子可被构建成包含对效应细胞上的FcγR表现出增加的亲和力的变体Fc结构域(日对于野生型Fc结构域)。所构建的本发明的分子为患者提供了更好的免疫治疗试剂，而不考虑患者的FcγR多态性。
使用培养的细胞系或来自患者的PMBC细胞通过ADCC测试根据本发明构建的双抗体分子以确定Fc突变增强ADCC的能力。使用本文公开的方法进行标准的ADCC。使用Ficoll-Paque梯度仪(Pharmacia)从外周血中收集淋巴细胞。对靶细胞，即培养的细胞系或来自患者的细胞加载铕(PerkinElmer)并在37℃下与效应子孵育4小时。使用荧光读板机(Wallac) 检测所释放的铕。所得的ADCC数据表明本发明的分子激发NK细胞介导的细胞毒性的功效并确定哪些分子可用患者样品和淘析的单核细胞测试。然后在ADCC测定中使用来自患者的PBMC测试表现出引发ADCC活性的最大潜力的双抗体分子。来自健康供体的PBMC用作效应细胞。
因此，本发明提供了预防或治疗以癌症抗原为特征的癌症的方法，通过根据本发明构建免疫特异性地识别所述癌症抗原的双抗体分子，使得该双抗体分子本身是有细胞毒性的(例如，通过表面受体的交联，导致凋亡增加或增殖信号下调)和/或包含Fc结构域，和/或介导一种或多种效应功能(例如，ADCC、吞噬作用)。已根据本发明构建的双抗体对于预防或治疗癌症是有用的，因为其具有细胞毒性活性(例如，增加的对肿瘤细胞的杀伤和/或例如，增强的ADCC活性或CDC活性)。
与癌症抗原有关的癌症可通过施用双抗体来治疗或预防，所述双抗体结合癌症抗原且是有细胞毒性的，和/或已被根据本发明的方法构建为显示效应功能。例如，而非限制性地，与以下癌症抗原有关的癌症可通过本发明的方法和组合物治疗或预防。KS1/4泛癌抗原(Perez等人(1989)“Isolation And Characterization Of A Cdna Encoding The Ks1/4Epithelial Carcinoma Marker，”J.Immunol.142：3662-3667；等人(1991)“Bispecific-Monoclonal-Antibody-Directed Lysis Of Ovarian Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes，”Cancer Immunol.Immunother.33(4)：210-216)、卵巢癌抗原(CA125)(Yu等人(1991)“Coexpression Of Different Antigenic Markers On Moieties That Bear CA125Determinants，”Cancer Res.51(2)：468-475)、前列腺酸性磷酸酶(Tailor等人(1990)“Nucleotide Sequence Of Human Prostatic Acid Phosphatase Determined From A Full-Length cDNA Clone，”Nucl.Acids Res.18(16)：4928)、前列腺特异性抗原(Henttu等人(1989)“cDNA Coding For The Entire Human Prostate Specific Anrigen Shows High Homologies To The Human Tissue Kallikrein Genes，”Biochem.Biophys.Res.Comm.10(2)：903-910；Israeli等人(1993)“Molecular Cloning Of A Complementary DNA Encoding A Prostate-Specific Membrane Antigen，”Cancer Res.53：227-230)、黑色素瘤相关抗原p97(Estin 等人(1989)“Transfected Mouse Melanoma Lines That Express Various Levels Of Human Melanoma-Associated Antigen p97，”J.Natl.Cancer Res.81(6)：445-454)，黑色素瘤抗原gp75(Vijayasardahl等人(1990)“The Melanoma Antigen Gp75Is The Human Homologue Of The Mouse B(Brown)Locus Gene Product，”J.Exp.Med.171(4)：1375-1380)，高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)(Natali等人(1987)“Immunohistochemical Detection Of Antigen In Human Primary And Metastatic Melanomas By The Monoclonal Antibody140.240And Its Possible Prognostic Significance，”Cancer59：55-63；Mittelman等人(1990)“Active Specific Immunotherapy In Patients With Melanoma.A Clinical Trial With Mouse Antiidiotypic Monoclonal Antibodies Elicited With Syngeneic Anti-High-Molecular-Weight-Melanoma-Associated Antigen Monoclonal Antibodies，”J.Clin.Invest.86：2136-2144))、前列腺特异性膜抗原、癌胚抗原(CEA)(Foon等人(1995)“Immune Response To The Carcinoembryonic Antigen In Patients Treated With An Anti-Idiotype Antibody Vaccine，”J.Clin.Invest.96(1)：334-42)、多态上皮黏蛋白抗原、人乳脂肪球抗原、结肠直肠肿瘤相关抗原例如：CEA、TAG-72(Yokota等人(1992)“Molecular Cloning Of A Complementary DNA Encoding A ProstateSpecific Membrane Antigen，”Cancer Res.52：3402-3408)、CO17-1A(Ragnhammar等人(1993)“Effect Of Monoclonal Antibody17-1A And GM-CSF In Patients With Advanced Colorectal Carcinoma-Long-Lasting，Complete Remissions Can Be Induced，”Int.J.Cancer53：751-758)；GICA19-9(Herlyn等人(1982)“Monoclonal Antibody Detection Of A Circulating Tumor-Associated Antigen.I.Presence Of Antigen In Sera Of Patients With Colorectal，Gastric，And Pancreatic Carcinoma，”J.Clin.Immunol.2：135-140)、CTA-1和LEA、伯基特淋巴瘤抗原-38.13、CD19(Ghetie等人(1994)“Anti-CD19Inhibits The Growth Of Human B-Cell Tumor Lines In Vitro And Of Daudi Cells In SCID Mice By Inducing Cell Cycle Arrest，”Blood83：1329-1336)、人B淋巴瘤抗原-CD20(Reff等人(1994)“Depletion Of B Cells In Vivo By A Chimeric Mouse Human Monoclonal Antibody To CD20，”Blood83：435-445)、CD33(Sgouros等人(1993)“Modeling And Dosimetry Of Monoclonal Antibody M195 (Anti-CD33)In Acute Myelogenous Leukemia，”J.Nucl.Med.34：422-430)、黑色素瘤特异性抗原例如神经节苷脂GD2(Saleh等人(1993)“Generation Of A Human Anti-Idiotypic Antibody That Mimics The GD2Antigen，”J.Immunol.，151，3390-3398)、神经节苷脂GD3(Shitara等人(1993)“A Mouse/Human Chimeric Anti-(Ganglioside GD3)Antibody With Enhanced Antitumor Activities，”Cancer Immunol.Immunother.36：373-380)、神经节苷脂GM2(Livingston等人(1994)“Improved Survival In Stage III Melanoma Patients With GM2Antibodies：A Randomized Trial Of Adjuvant Vaccination With GM2Ganglioside，”J.Clin.Oncol.12：1036-1044)、神经节苷脂GM3(Hoon等人(1993)“Molecular Cloning Of A Human Monoclonal Antibody Reactive To Ganglioside GM3Antigen On Human Cancers，”Cancer Res.53：5244-5250)、肿瘤特异性移植型细胞表面抗原(TSTA)例如病毒诱生的肿瘤抗原包括DNA肿瘤病毒的T-抗原和RNA肿瘤病毒的包膜抗原、癌胚抗原(oncofetal antigen)-α-胎蛋白例如结肠的CEA、膀胱肿瘤癌胚抗原(等人(1985)“Monoclonal Antibodies To Cell Surface Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas，”Cancer.Res.45：2210-2188)、分化抗原例如人肺癌抗原L6、L20(等人(1986)“Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma，”Cancer Res.46：3917-3923)、纤维肉瘤抗原、人白血病T细胞抗原-Gp37(Bhattacharya-Chatterjee等人(1988)“Idiotype Vaccines Against Human T Cell Leukemia.II.Generation And Characterization Of A Monoclonal Idiotype Cascade(Ab1，Ab2，andAb3)，”J.Immunol.141：1398-1403)、新糖蛋白、鞘脂、乳腺癌抗原例如EGFR(表皮生长因子受体)、HER2抗原(p185HER2)、多态上皮黏蛋白(PEM)(Hilkens等人(1992)“Cell Membrane-Associated Mucins And Their Adhesion-Modulating Property，”Trends in Biochem.Sci.17：359-363)、恶性人淋巴细胞抗原-APO-1(Trauth等人(1989)“Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis，”Science245：301-304)、分化抗原(Feizi(1985)“Demonstration By Monoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins And Glycolipids Are Onco-Developmental Antigens，”Nature314：53-57)例如在胚 胎红细胞和原内胚层中发现的I抗原、在胃腺癌中发现的I(Ma)、在乳腺上皮中发现的M18和M39、在骨髓细胞中发现的SSEA-1、在结肠直肠癌中发现的VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5和D156-22、TRA-1-85(血型H)、在结肠腺癌中发现的C14、在肺腺癌中发现的F3、在胃癌中发现的AH6、Y半抗原、在胚胎性癌细胞中发现的Ley、TL5(血型A)、在A431细胞中发现的EGF受体、在胰腺癌中发现的E1系列(血型B)、在胚胎性癌细胞、胃腺癌中发现的FC10.2、在腺癌中发现的CO-514(血型Lea)、在腺癌中发现的NS-10、在结肠腺癌中发现的CO-43(血型Leb)、G49、EGF受体(血型ALeb/Ley)、在结肠癌中发现的19.9、胃癌黏蛋白、在骨髓细胞中发现的T5A7、在黑色素瘤中发现的R24、在胚胎性癌细胞中发现的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、M1：22：25：8以及在4-8-细胞阶段的胚胎中发现的SSEA-3、SSEA-4。在另一个实施方式中，抗原是来自皮肤T细胞淋巴瘤的T细胞受体衍生的肽(参见Edelson(1998)“Cutaneous T-Cell Lymphoma：A Model For Selective Immunotherapy，”Cancer J Sci Am.4：62-71)。
可通过本发明的方法和组合物治疗或预防的癌症和相关疾患包括但不限于下列：白血病，包括但不限于急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病例如成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、骨髓单核细胞白血病、单核细胞白血病、红白血病和骨髓增生异常综合征、慢性白血病例如但不限于慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病；真性红细胞增多症；淋巴瘤，例如但不限于霍奇金病、非霍奇金病；多发性骨髓瘤例如但不限于郁积型多发性骨髓瘤、非分泌型骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；影响未定的单克隆丙种球蛋白病；良性单克隆丙种球蛋白病；重链病；骨骼和结缔组织肉瘤例如但不限于骨肉瘤、成骨肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤(血管内皮瘤)、纤维肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘膜瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；脑肿瘤，包括但不限于胶质瘤、星形细胞瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、少突胶质细胞瘤、非胶质瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、 松果体细胞瘤、松果体母细胞瘤、原发脑淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于腺癌、小叶(小细胞)癌、导管内癌、乳腺髓样癌、粘液性乳腺癌、乳腺小管癌、乳头癌、佩吉特病，和炎性乳腺癌；肾上腺癌，包括但不限于嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌；甲状腺癌，例如但不限于乳头状或滤泡状甲状腺癌、甲状腺髓样癌和甲状腺未分化癌；胰腺癌，包括但不限于胰岛素瘤、胃泌素瘤、胰高血糖素瘤、血管活性肠肽瘤、生长抑素分泌性肿瘤和良性肿瘤或胰岛细胞肿瘤；垂体癌，包括但不限于库欣病、催乳素分泌性肿瘤、肢端肥大症和尿崩症；眼癌，包括但不限于眼黑色素瘤例如虹膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤和睫状体黑色素瘤和视网膜母细胞瘤；阴道癌，包括但不限于鳞状细胞癌、腺癌、和黑色素瘤；外阴癌包括但不限于鳞状细胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤、和佩吉特病；宫颈癌，包括但不限于鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌，包括但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌，包括但不限于卵巢上皮癌、交界性肿瘤、生殖细胞肿瘤和基质肿瘤；食管癌包括但不限于鳞状细胞癌、腺癌、腺样囊性癌、黏液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑色素瘤、浆细胞瘤、疣状癌、和燕麦(小细胞)细胞癌；胃癌包括但不限于腺癌、真菌样生长(息肉样)、形成溃疡、浅表扩散、扩散性蔓延的恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤；结肠癌；直肠癌；肝癌，包括但不限于肝细胞癌和肝母细胞瘤，胆囊癌包括但不限于腺癌；胆管癌包括但不限于乳头状、结节的和弥散的；肺癌包括但不限于非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌；睾丸癌，包括但不限于胚组织瘤、精原细胞瘤、退行发育的、经典的(典型)的、精母细胞性非精原细胞瘤、胚胎性癌、畸胎瘤癌、绒毛膜癌(卵黄囊肿瘤)，前列腺癌，包括但不限于腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤；阴茎癌；口腔癌，包括但不限于鳞状细胞癌；基底癌；唾液腺癌症，包括但不限于腺癌、粘液表皮样癌和腺样囊性癌；咽癌，包括但不限于鳞状细胞癌和疣状癌；皮肤癌，包括但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑色素瘤、表面扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、雀斑样恶性黑色素瘤、肢端雀斑样黑色素瘤；肾癌，包括但不限于，肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、移行细胞癌(肾盂和/或输尿管(uterer))；维尔姆斯肿瘤；膀胱癌，包括但不限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。另外、癌症包括黏液肉瘤、成 骨肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、血管母细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌(对于这些疾患的综述，参见Fishman等人(1985)Medicine，2d Ed.，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia；和Murphy等人(1997)Informed  Decisions：The Complete Book of Cancer Diagnosis，Treatment，and Recovery，Viking Penguin，Penguin Books U.S.A.，Inc.，United States of America)。
因此，本发明的方法和组合物在治疗和预防包括(但不限于)下列的各种癌症或其他异常增生性疾病中也是有用的：癌，包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌；包括鳞状细胞癌；造血性淋巴系肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burketts lymphoma)；造血性髓系肿瘤，包括急性和慢性骨髓白血病和早幼粒细胞白血病；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、神经母细胞瘤和胶质瘤；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤和施旺细胞瘤；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和成骨肉瘤；及其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎瘤。还设想了由凋亡中的畸变引起的癌症也将通过本发明的方法和组合物治疗。这些癌症可包括但不限于滤泡性淋巴瘤、具有p53突变的癌、乳腺、前列腺癌和卵巢的激素依赖性肿瘤和癌前病变，例如家族性腺瘤性息肉和骨髓增生异常综合征。在特定实施方式中，通过本发明的方法和组合物治疗或预防卵巢、膀胱、乳腺、结肠、肺、皮肤、胰或子宫中的恶性肿瘤或异常增生变化(例如，组织转化和发育异常)或高度增生性疾患。在其他特定实施方式中，通过本发明的方法和组合物治疗肉瘤、黑色素瘤或白血病。
在特定实施方式中，相对于癌细胞在无本发明的分子存在下的生长，本发明的分子(例如，包含多个表位结合结构域和任选地，Fc结构域(或其部分)的双抗体)将癌细胞的生长抑制或减少至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、 至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％或至少10％。
在特定实施方式中，本发明的分子(例如，包含多个表位结合结构域和任选地，Fc结构域(或其部分)的双抗体)比亲本分子更好地杀伤细胞或将癌细胞生长抑制或减少至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。
5.6.2 自身免疫病和炎性疾病
在某些实施方式中，本发明的分子包含根据本发明的方法构建的对FcγRIIB特异性的表位结合结构域和/或变体Fc结构域(或其部分)，所述Fc结构域相对于野生型Fc结构域表现出对FcγRIIB更大的亲和力和对FcγRIIIA和/或FcγRIIA减小的亲和力。具有这些结合特征的本发明的分子在调控免疫反应，例如在抑制与自身免疫病或炎性疾病有关的免疫反应方面是有用的。虽然不期望被任何作用机制所束缚，但是具有对FcγRIIB的亲和力和/或包含具有增加的对FcγRIIB的亲和力和减少的对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲和力的Fc结构域的本发明的分子可导致减弱对FcγR的活化反应并抑制细胞反应性，且因此对于治疗和/或预防自身免疫疾患具有治疗功效。
本发明还提供可了用于预防、治疗或控制与受治疗者的炎性疾患有关的一种或多种症状的方法，该方法还包括对所述受治疗者施用治疗或预防有效量的一种或多种抗炎剂。本发明还提供了用于预防、治疗或控制与受治疗者的自身免疫病有关的一种或多种症状的方法，该方法还包括对所述受治疗者施用治疗或预防有效量的一种或免疫调节剂。5.7节提供了抗炎剂和免疫调节剂的非限制性实例。
可通过施用本发明的分子治疗的自身免疫疾患的实例包括但不限于斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生病、肾上腺的自身免疫病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少症、白塞病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻性皮炎、慢性疲劳免疫功能疾患综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘 性多发性神经病、Churg-Strauss综合征、瘢痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克罗恩病、盘状红斑、特发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-肌纤维组织炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格-巴二氏病(Guillain-Barre)、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA神经病变、幼年型关节炎、扁平苔藓、红斑狼疮、梅尼尔病、混合性结缔组织病、多发性硬化、1型糖尿病或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性丙种球蛋白缺乏症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺现象、瑞特综合征、类风湿关节炎、结节病、硬皮病、综合征、僵人综合征、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、多发性大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎(vasculitides)例如疱疹样皮炎、脉管炎(vasculitis)、白癜风和韦格纳肉芽肿。炎性疾患的实例包括但不限于哮喘、脑炎、炎性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性疾患、感染性休克、肺纤维化、未分化脊柱关节病、未分化关节病、关节炎、炎性骨溶解症以及由慢性病毒或细菌感染而导致的慢性炎症。如本文在2.2.2节描述的，某些自身免疫疾患与炎性病症有关。因此，在被认为是自身免疫疾患和炎性疾患之间存在重叠。因此，某些自身免疫疾患还可被表征为炎性疾患。根据本发明的方法可预防、治疗或控制的炎性疾患的实例包括但不限于哮喘、脑炎、炎性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性疾患、感染性休克、肺纤维化、未分化脊柱关节病、未分化关节病、关节炎、炎性骨溶解以及由慢性病毒或细菌感染而导致的慢性炎症。
包含对FcγRIIB特异性的至少一个表位结合结构域和/或具有增强的对FcγRIIB的亲和力和减少的对FcγRIIIA的亲和力的变体Fc结构域的本发明的分子还可用来减轻患炎性疾患的动物，特别是哺乳动物所经历的炎症。在特定实施方式中，相对于未被施用本发明的分子的动物的炎症，所述分子将所述动物的炎症减少至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％或至少10％。
包含对FcγRIIB特异性的至少一个表位结合结构域和/或具有增强的对FcγRIIB的亲和力和减少的对FcγRIIIA的亲和力的变体Fc结构域的本发明的分子还可用来防止排斥移植物。
5.6.3 传染病
本发明还包括用于治疗或预防受治疗者的传染病的方法，包括施用治疗或预防有效量的包含对与所述传染病相关的传染原特异性的至少一个表位结合结构域的一种或多种本发明的分子。在某些实施方式中，相对于无本发明的分子存在下的免疫反应，所述分子对于所述传染原是毒性的，增强针对所述物质的免疫反应或增强针对所述传染原的效应功能。本发明的分子可治疗或预防的传染病是由传染原，包括但不限于病毒、细菌、真菌、原生动物和病毒引起的。
可使用本发明的分子结合本发明的方法治疗或预防的病毒性疾病包括但不限于由甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、水痘病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒I型(HSV-I)、单纯疱疹病毒II型(HSV-II)、牛瘟病毒、鼻病毒、埃可病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒、巨细胞病毒、埃可病毒、虫媒病毒、汉坦病毒、柯萨奇病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、天花、埃巴病毒(Epstein Barr virus)、I型人免疫缺陷病毒(HIV-I)、II型人免疫缺陷病毒(HIV-II)、和病毒性疾病例如病毒性脑膜炎、脑炎、登革热或天花的病原体引起的病毒性疾病。
可使用本发明的分子结合本发明的方法治疗或预防由细菌引起的细菌性疾病，所述细菌包括但不限于分枝杆菌、立克次氏体、支原体、奈瑟氏球菌(neisseria)、肺炎链球菌(S.pneumonia)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)(莱姆病)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)(炭疽)、破伤风、链球菌(streptococcus)、葡萄球菌(staphylococcus)、分枝杆菌(mycobacterium)、破伤风、百日咳、霍乱、瘟疫、白喉、衣原体、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和军团菌(legionella)。
可使用本发明的分子结合本发明的方法治疗或预防的由原生动物引起的原生动物病包括但不限于，利什曼原虫病、球虫病、锥虫病或疟疾。
可使用本发明的分子结合本发明的方法治疗或预防的由寄生虫引起的寄生虫病包括但不限于，衣原体和立克次氏体。
根据本发明的一个方面，包含对传染原特异性的至少一个表位结合结构域的本发明的分子对所述传染原例如，致病蛋白质表现出抗体效应功能。传染原的实例包括但不限于细菌(例如，大肠杆菌、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌(Enterococcus faecials)、白色念珠菌(Candida albicans)、变形杆菌(Proteus vulgaris)、绿色葡萄球菌(Staphylococcus viridans)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))，病原体(例如，B嗜淋巴细胞乳多空病毒(LPV)；百日咳杆菌(Bordatella pertussis)；博尔纳病病毒(BDV)；牛冠状病毒；脉络丛脑膜炎病毒；登革热病毒；病毒，大肠杆菌；埃博拉病毒；埃可病毒-1；埃柯病毒-11(EV)；内毒素(LPS)；肠细菌；肠孤儿病毒；肠病毒；猫白血病病毒；口蹄疫病毒；长臂猿白血病病毒(GALV)；革兰氏阴性菌；幽门螺杆菌；乙型肝炎病毒(HBV)；单纯疱疹病毒；HIV-1；人巨细胞病毒；人冠状病毒；甲、乙和丙型流感；军团菌；墨西哥利什曼原虫；单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)；麻疹病毒(Measles virus)；脑膜炎球菌；麻疹病毒(Morbillivirus)；小鼠肝炎病毒；鼠白血病病毒；鼠γ疱疹病毒；鼠逆转录病毒；鼠冠状病毒；小鼠肝炎病毒；鸟分枝杆菌-M(Mycobacterium avium-M)；淋病奈瑟氏球菌；纽卡斯尔病病毒；细小病毒B19；恶性疟原虫；痘病毒；假单胞菌；轮状病毒；鼠伤寒沙门氏菌；志贺氏菌属(Shigella)；链球菌属(Streptococci)；T细胞嗜淋巴细胞病毒1；牛痘病毒)。
5.6.4 解毒作用
本发明还包对被暴露于毒素(例如，毒性药物分子)的受治疗者解毒的方法，包括施用治疗或预防有效量的包含对所述毒性药物分子特异性的至少一个表位结合结构域的一种或多种本发明的分子。在某些实施方式中，本发明的分子与所述毒素结合减少或消除了所述毒素的不利生理作用。又在其他实施方式中，本发明的双抗体与所述毒素的结合相对于无所述双抗体存在下的消除、降解或中和增加或增强了对所述毒素的消除、降解或中和。根据本发明的方法的免疫毒性协同疗法可用来治疗对包括但不限于地 高辛、PCP、可卡因、秋水仙碱以及三环抗抑郁药用药过多或对其的暴露。
5.7 组合治疗
本发明还包括施用与本领域技术人员已知的用于治疗或预防癌症、自身免疫病、传染病或中毒的其他治疗，包括但不限于当前的标准化疗和实验性化疗、激素治疗、生物治疗、免疫治疗、放射治疗或手术组合的本发明的分子。在某些实施方式中，本发明的分子可与治疗或预防有效量的本领域技术人员已知的用于治疗和/或预防癌症、自身免疫病、传染病或中毒的一种或多种剂、治疗性抗体或其他剂组合施用。
在某些实施方式中，一种或多种本发明的分子与对治疗癌症有用的一种或多种其他治疗剂被同时施用给哺乳动物，优选地人。术语“同时地”不限于在完全相同的时间施用预防或治疗剂，而是意味着本发明的分子和其他剂被顺序性地且在某个时间间隔内施用给哺乳动物，使得本发明的分子可与所述其他剂一起起到提供比如果它们被以其他方式施用时增加的益处。例如，每种预防或治疗剂(例如，化疗、放射治疗、激素治疗或生物治疗)可同时施用或在不同的时间点顺序性地以任何顺序施用；但是，如果不同时施用的话，其被施用的时间应足够接近以提供期望的治疗或预防效果。每种治疗剂可单独地、以任何合适的形式和通过任何适合的途径施用。在多种实施方式中，所述预防或治疗剂被以间隔小于1小时，间隔约1小时，间隔约1小时至约2小时，间隔约2小时至约3小时，间隔约3小时至约4小时，间隔约4小时至约5小时，间隔约5小时至约6小时，间隔约6小时至约7小时，间隔约7小时至约8小时，间隔约8小时至约9小时，间隔约9小时至约10小时，间隔约10小时至约11小时，间隔约11小时至约12小时，间隔不大于24小时，或间隔不大于48小时地施用。在优选的实施方式中，在患者同一次就诊时施用两种或更多种组分。
在其他实施方式中，预防或治疗剂被以间隔约2至4天、间隔约4至6天、间隔约1周、间隔约1至2周或间隔不大于2周地施用。在优选的实施方式中，预防或治疗剂在其中两种剂仍都有活性的时间范围内施用。本领域技术人员将能够通过确定所施用的剂的半衰期来确定该时间范围。
在某些实施方式中，本发明的预防或治疗剂被周期性地施用给受治疗 者。周期性治疗包括施用第一剂持续一段时间，接下来施用第二剂和/或第三剂持续一段时间并重复该顺序性施用。周期性治疗可减少对一种或多种治疗的抗性的发展，避免或减少治疗之一的副作用，和/或提高治疗功效。
在某些实施方式中，以小于约3周、约每两周一次、约每10天一次或约每周一次的周期施用预防或治疗剂。一个周期可包含通过每个周期约90分钟，每个周期约1小时，每个周期约45分钟内的输注施用治疗或预防剂。每个周期可包含静止至少1周、静止至少2周、静止至少3周。所施用的周期的数目为从约1至约12个周期，更通常地约2至约10个周期，且更通常地约2至约8个周期。
又在其他实施方式中，本发明的治疗和预防剂以有规律的给药方案通过没有延长的静止期的连续输注或频繁施用而被施用。该有规律的施用可包括以没有静止期的恒定的间隔给药。通常，治疗剂特别是细胞毒性剂以较低的剂量使用。这些用药方案包括长期的每天施用相对低剂量，持续延长的时期。在优选的实施方式中，使用较低剂量可最小化毒性副作用并消除静止期。在某些实施方式中，治疗和预防剂通过从约24小时至约2天、至约1周、至约2周、至约3周、至约1个月、至约2个月、至约3个月、至约4个月、至约5个月、至约6个月范围内的长期的低剂量或连续输注递送。熟练的肿瘤学家可优化该用药方案的时间安排。
在其他实施方式中，同时对哺乳动物施用多个疗程，即，分别地但仍在一定时间间隔内施用单次剂量的治疗剂，使得本发明的分子可与一种或多种其他剂一起发挥作用。例如，每周一次的一种组分可与可每两周一次或每三周一次地施用的其他组分组合施用。换句话说，即使未同时或在患者同一次就诊时施用治疗剂，也并行地执行该治疗剂的给药方案。
当与其他预防和/或治疗剂组合使用时，本发明的分子和所述预防和/或治疗剂可加和地或更优选地，协同地起作用。在一个实施方式中，本发明的分子与一种或多种治疗剂在同一药物组合物中并行施用。在另一个实施方式中，本发明的分子与一种或多种其他治疗剂在不同的药物组合物中并行施用。又在另一个实施方式中，本发明的分子在施用另一种治疗或预防剂之前或之后施用。本发明设想了通过相同或不同的施用途径，例如， 经口服和肠胃外与其他预防或治疗剂组合施用本发明的分子。在某些实施方式中，当本发明的分子与可能产生包括但不限于毒性的副作用的另一种预防或治疗剂并行施用时，可以以下降到引发副作用的阈值以下的剂量有利地施用所述预防或治疗剂。
本文提供的用药量和施用频率被术语治疗有效和预防有效所包括。取决于所施用的特定治疗或预防剂、癌症的严重度和类型、施用途径、以及年龄、体重、患者的反应和过往的医疗史，所述剂量和频率通常还将根据每个患者所特有的因素变化。本领域技术人员可通过考虑这些因素并通过遵循例如在文献中报道以及Physician’s Desk Reference(第56版，2002)中推荐的剂量来选择合适的方案。
5.7.1 抗癌剂
在特定实施方式中，本发明的方法包括与用于治疗和/或预防癌症的一种或多种治疗剂一起施用一种或多种本发明的分子。在一个实施方式中，血管生成抑制剂可与本发明的分子组合施用。可用于本发明的方法和组合物中的血管生成抑制剂包括但不限于下列：制管张素(纤溶酶原片段)；抗血管生成抗凝血酶III；Angiozyme；ABT-627；Bay12-9566；倍尼芬；贝伐珠单抗；BMS-275291；软骨来源的抑制剂(CDI)；CAI；CD59补体片段；CEP-7055；Col3；康普立停A-4；内皮抑制素(胶原XVIII片段)；纤连蛋白片段；Gro-β；卤夫酮；肝素酶；肝素六糖片段；HMV833；人绒毛膜促性腺激素(hCG)；IM-862；干扰素α/β/γ；干扰素诱导蛋白(IP-10)；白介素-12；Kringle5(纤溶酶原片段)；马立马司他；金属蛋白酶抑制剂(TIMP)；2-甲氧基雌二醇；MMI270(CGS27023A)；MoAb IMC-1C11；新伐司他；NM-3；Panzem；PI-88；胎盘核糖核酸酶抑制剂；纤溶酶原活化剂抑制剂；血小板因子-4(PF4)；普马司他；催乳素16kDa片段；增殖蛋白-相关蛋白(PRP)；PTK787/ZK222594；类视黄醇；索利司他；角鲨胺；SS3304；SU5416；SU6668；SU11248；四氢皮质醇-S；四硫钼酸盐；萨力多胺；血小板反应蛋白-1(TSP-1)；TNP-470；转化生长因子-β(TGF-b)；Vasculostatin；Vasostatin(钙网蛋白片段)；ZD6126；ZD6474；法呢基转移酶抑制剂(FTI)；以及二膦酸盐。
可与本发明的分子在本发明的多个实施方式，包括本发明的药物组合物和剂型和药盒中组合使用的抗癌剂包括但不限于：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美坦醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；天冬酰胺酶；阿司匹林；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苄替哌；比卡鲁胺；盐酸比生群；双萘法德二甲磺酸盐；比折来新；硫酸博莱霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；平阳霉素；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎呱宁；甲磺酸地扎呱宁；地吖醌；多西紫杉醇；阿霉素；盐酸阿霉素；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；屈他椎酮丙酸酯；达佐霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌氮芥；雌氮芥磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；艾托卜宁；盐酸法倔唑；法扎拉滨；维甲酰酚胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；白介素II(包括重组白介素II或rIL2)、干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-Ia；干扰素γ-Ib；异丙铂；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿罗唑；洛美曲索钠；洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美法仑；美诺立尔；巯嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶(metoprine)；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星；丝裂红素；米托洁林；米托马星；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑；诺加霉素；奥马铂；亚磺酰吡啶；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；嗪消安；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟非尔钠；泊非霉素；泼尼氮芥；盐酸丙卡巴肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠(sparfosate sodium)；稀疏霉素；盐酸螺旋锗；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲菌素；磺氯苯脲；泰莱霉索 (talisomycin)；替可加兰钠；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硝咪硫鸟嘌呤(thiamiprine)；硫鸟嘌呤；噻替哌；噻唑呋林；替拉扎明；柠檬酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；葡萄糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸九布洛唑；尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；乌瑞替哌；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春花碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；碱硫长春罗新；酒石酸长春瑞滨；硫酸异长春碱；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他汀(zinostatin)；盐酸佐柔比星。其他抗癌药物包括但不限于：20-差向异构-1，25-二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；腺环戊醇；阿多来新；白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；桉巴氮芥；amidox；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯(antarelix)；抗-背部形态发生蛋白-1；抗雄激素物质，前列腺癌；抗雌激素；抗瘤酮；反义寡核苷酸；阿非迪霉素甘氨酸酯；凋亡基因调节剂；凋亡调控因子；脱嘌呤核酸；阿糖胞苷-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；asulacrine；阿他美坦；阿莫司汀；axinastatin1；axinastatin2；axinastatin3；阿扎司琼；阿扎毒素(azatoxin)；氮杂酪氨酸；巴卡亭III衍生物；balanol；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟吩；苯甲酰星孢菌素；β-内酰胺衍生物；β-alethine；β克拉霉素B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双氮杂环丙烯基精胺；双萘法德；双枸橼酸环己噻卓酯A(bistratene A)；比折来新；breflate；溴匹立明；布朵替坦；丁硫氨酸亚砜胺；卡泊三醇；钙感光蛋白C(Calphostin C)；喜树碱衍生物；金丝雀痘IL-2；卡培他滨；甲酰胺-氨基-三唑；羧胺三唑；CaRest M3；CARN700；软骨衍生的抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；栗树精胺；抗菌肽B；西曲瑞克；chlorlns；氯代喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺式卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；柯林斯霉菌素A；柯林斯霉菌素B；康普立停A4；康普立停类似物；conagenin；crambescidin816；克立那托(crisnatol)；cryptophycin8；cryptophycin A衍生物；curacin A；环戊蒽醌；cycloplatam；cypemycin；阿糖胞苷烷磷酯；细胞裂解因子；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；达昔单抗；地西他滨；dehydrodidemnin B；地 洛瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺；右丙亚胺；右维拉帕米；亚丝醌；代代宁B(Didemnin B)；didox；二乙基正精胺；二氢-5-氮杂胞苷；9-二氢紫杉醇；dioxamycin；二苯螺莫司汀；多西他赛；二十二醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；duocarmycin SA；依布硒；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；爱普列特；雌氮芥类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；维甲酰酚胺；非格司亭；非那雄胺；flavopiridol；氟卓斯汀；fluasterone；氟达拉滨；盐酸氟代柔红霉素；福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫司汀；钆替沙林(gadolinium texaphyrin)；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；hepsulfam；调蛋白；六亚甲基二乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫费新；伊洛马司他；咪唑并吖啶酮；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；碘苄胍；碘阿霉素；4-甘薯醇；伊罗普拉；伊索拉定；isobengazole；isohomohalicondrin B；伊他司琼；jasplakinolide；kahalalide F；片螺素-N三乙酸酯；兰瑞肽；leinamycin；来格司亭；硫酸香菇多糖；leptolstatin；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+雌激素+孕酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；线性多胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；lissoclinamide7；洛铂；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛索立宾；勒托替康；镥替沙林(lutetium texaphyrin)；lysofylline；裂解肽；美坦辛；mannostatin A；马立马司他；马索罗酚；乳腺丝抑蛋白；基质裂解蛋白抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；merbarone；美替瑞林；蛋氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；错配的双链RNA；丙脒腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；米托毒素成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；单克隆抗体，人绒毛膜促性腺激素；单磷酸类脂A+分枝杆菌细胞壁的sk；单哌潘生丁；多药耐药基因抑制剂；基于多肿瘤抑制基因1的治疗；芥子抗癌剂；mycaperoxide B；分枝杆菌细胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰地那林；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；那瑞替喷；纳洛酮+喷他佐辛； napavin；naphterpin；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性内肽酶；尼鲁米特；nisamycin；一氧化氮调节剂；一氧化二氮抗氧化剂；nitrullyn；O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮；奥坦西隆；奥坦西隆；oracin；口腔细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；oxaunomycin；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；palauamine；棕榈酰基根霉素；帕米膦酸；人参三醇；帕诺米芬；parabactin；帕折普汀；培门冬酶；培得星；戊聚糖聚硫酸钠；喷司他丁；pentrozole；全氟溴烷；过磷酰胺；紫苏醇；phenazinomycin；乙酸苯酯；磷酸酶抑制剂；picibanil；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；placetin A；placetin B；纤溶酶原活化剂抑制剂；铂络合物；铂化合物；铂-三胺络合物；卟非尔钠；泊非霉素；泼尼松；丙二-吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；微藻蛋白激酶C抑制剂；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素；吡唑啉吖啶；吡哆酰基化血红蛋白聚氧乙烯偶联物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法尼基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；去甲基化的瑞替普汀；羟乙膦酸铼Re186；根霉素；核酶；RII维甲酰酚胺；罗谷亚胺；rohitukine；罗莫肽；罗喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；sarcophytol A；沙格司亭；Sdi1模拟物；司莫司汀；衰老衍生抑制剂1；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；乙酸苯酯钠；solverol；促生长因子结合蛋白；索纳明；膦门冬酸；spicamycin D；螺莫司汀；splenopentin；海绵素(spongistatin)1；角鲨胺；干细胞抑制剂；干细胞分裂抑制剂；stipiamide；基质裂解蛋白抑制剂；sulfinosine；强效的血管活性肠肽受体拮抗剂；suradista；苏拉明；苦马豆碱；合成的糖胺聚糖；他莫司汀；三苯氧胺甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟；tellurapyrylium；端粒酶抑制剂；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷；四氯十氧化物；tetrazomine；thaliblastine；噻可拉林；血小板生成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；本紫红素乙酯锡；替拉扎明；二氯化换戊二烯钛；topsentin；托瑞米芬；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维甲酸；三乙酰尿苷；曲西立 滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托吡西隆；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；tyrphostin；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦-来源的生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；variolin B；红细胞基因治疗的载体系统；维拉雷琐；藜芦明；verdin；维替泊芬；长春瑞滨；vinxaltine；vitaxin；伏氯唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C和净司他丁激动剂。优选的另外的抗癌药物是5-氟尿嘧啶和亚叶酸。
可用于本发明的方法的治疗性抗体的实例包括但不限于为免疫抑制性的(达利珠单抗)(Roche Pharmaceuticals，Switzerland)、用于预防急性肾移植排斥的人源化的抗-CD25单克隆抗体；为鼠抗-17-IA细胞表面抗原IgG2a抗体的PANOREXTM(Glaxo Wellcome/Centocor)；为鼠抗独特型(GD3表位)IgG抗体的BEC2(ImClone System)；为嵌合抗EGFR IgG抗体的IMC-C225(ImClone System)；为人源化抗-αVβ3整联蛋白抗体的VITAXINTM(Applied Molecular Evolution/MedImmune)；为人源化抗-CD33IgG抗体的Smart M195(Protein Design Lab/Kanebo)；为人源化抗-CD22IgG抗体的LYMPHOCIDETM(Immunomedics)；ICM3为人源化抗-ICAM3抗体(ICOS Pharm)；IDEC-114为灵长类化的抗-CD80抗体(IDEC Pharm/Mitsubishi)；IDEC-131为人源化抗-CD40L抗体(IDEC/Eisai)；IDEC-151为灵长类化的抗-CD4抗体(IDEC)；IDEC-152为灵长类化的抗-CD23抗体(IDEC/Seikagaku)；SMART抗-CD3为人源化抗-CD3IgG(Protein Design Lab)；5G1.1为人源化抗-补体因子5(C5)抗体(Alexion Pharm)；D2E7为人源化抗-TNF-α抗体(CAT/BASF)；CDP870为人源化抗-TNF-αFab片段(Celltech)；IDEC-151为灵长类化的抗-CD4IgG1抗体(IDEC Pharm/SmithKline Beecham)；MDX-CD4为人抗-CD4IgG抗体(Medarex/Eisai/Genmab)；CDP571为人源化抗-TNF-αIgG4抗体(Celltech)；LDP-02为人源化抗-α4β7抗体(LeukoSite/Genentech)；OrthoClone OKT4A为人源化抗-CD4IgG抗体(Ortho Biotech)；ANTOVATM为人源化抗-CD40L IgG抗体(Biogen)；ANTEGRENTM为人源化抗-VLA-4IgG抗体(Elan)；且CAT-152为人抗-TGF-β2抗体(Cambridge Ab Tech)。表8中呈现了可根据本发明使用的治疗性抗体的其他实例。
表8：抗癌症治疗性抗体
5.7.2 免疫调节剂和抗炎剂
本发明提供了治疗自身免疫病和炎性疾病的方法，包括结合其他治疗剂施用本发明的分子。免疫调节剂的实例包括但不限于甲氨蝶呤、ENBREL、REMICADETM、来氟米特、环磷酰胺、环孢菌素A和大环内脂抗生素(例如，FK506(他克莫司))、甲基强的松龙(MP)、皮质甾类、类固醇、霉酚酸酯、雷帕霉素(西罗莫司)、咪唑立宾、脱氧精胍菌素、布喹那、malononitriloaminde(例如，来氟米特)、T细胞受体调节剂和细胞因子受体调节剂。
抗炎剂已在治疗炎性疾患和自身免疫疾患方面表现出成功并且现在为用于这类疾患的常用且标准的治疗。本领域技术人员熟知的任何抗炎剂可用于本发明的方法中。抗炎剂的非限制性实例包括非类固醇抗炎药物(NSAID)、类固醇抗炎药物、β-激动剂、抗胆碱能剂和甲基黄嘌呤。NSAID的实例包括但不限于阿司匹林、布洛芬、塞来考昔(CELEBREXTM)、双氯芬酸(VOLTARENTM)、依托度酸(LODINETM)、非诺洛芬(NALFONTM)、吲哚美辛(INDOCINTM)、酮咯酸(TORADOLTM)、噁丙嗪(DAYPROTM)、萘丁美酮(RELAFENTM)、舒林酸(CLINORILTM)、托美丁(TOLECTINTM)、罗非考昔(VIOXXTM)、萘普生(ALEVETM、NAPROSYNTM)、酪洛芬(ACTRONTM)以及萘丁美酮(RELAFENTM)。这些NSAID通过抑制环氧化酶(例如，COX-1和/或COX-2)发挥功能。类固醇抗炎药物的实例包括但不限于糖皮质激素、地塞米松(DECADRONTM)、可的松、氢化可的松、强的松(DELTASONETM)、强的松龙、去炎松、柳氮磺吡啶和类二十烷酸例如前列腺素、凝血噁烷和白三烯。
表9中展现了可结合本发明的分子用于治疗或预防炎性疾患的抗体的非限制性实例，而表10中展现了可用于疗或预防自身免疫疾患的抗体的非限制性实例。
表9：用于治疗炎性疾病的治疗性抗体
表10：用于治疗自身免疫疾患的治疗性抗体
5.7.3 用于治疗传染病的剂
在某些实施方式中，本发明的分子可与治疗或预防有效量的本领域技术人员已知的用于治疗和/或预防传染病的一种或另外的治疗剂组合施用。本发明设想了与本领域技术人员已知的用于治疗和或预防传染病的抗生素组合地使用本发明的分子。可与本发明的分子组合使用的抗生素包括但不限于大环内酯类(例如，妥布霉素)、头孢菌素(例如，头孢氨苄 头孢拉啶头孢呋辛头孢罗齐头孢克洛头孢克肟或头孢羟氨苄)、克拉仙霉素(例如，克拉仙霉素)、红霉素(例如，红霉素)、青霉素(例如，青霉素V(V-Cillin或Pen Vee))或喹诺酮(例如，氧氟沙星环丙沙星或氟哌酸(诺氟沙星))、氨基葡糖苷类抗生素(例如，安普霉素、阿贝卡星、黄霉素、布替罗星、地贝卡星、新霉素、新霉素、十一烯酸酯、奈替米星、巴龙霉素、核糖霉素、西索霉素和大观霉素)、胺酰醇抗生素(例如，叠氮氯霉素、氯霉素、氟苯尼考、和甲砜霉素)、安莎霉素抗生素(例如利福酰胺和利福平)、碳头孢烯(例如，氯拉卡比)、碳青霉烯(例如，比阿培南和亚胺培南)、头孢菌素(例如，头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢三嗪、头孢吡酮、头孢唑兰、头孢咪唑、头孢匹胺、和头孢匹罗)、头霉素(例如头孢拉宗、头孢美唑和头孢米诺钠)、单环内酰胺(例如，氨曲南、卡卢莫南、和替吉莫南)、氧头孢烯(例如，氟氧头孢和拉氧头孢)、青霉素(例如，氮卓西林、匹伏氮卓西林、阿莫西林、巴氨西林、苄基青霉素酸、苄基青霉素钠、依匹西林、芬贝西林、氟氯西林、培那西林、氢碘酸喷沙西林、苯乙苄胺青霉素O、青霉素O、青霉素V、苄星青霉素V、海巴青霉素V、青四环素、和苯氧乙基青霉素钾)、林 可酰胺(例如，克林霉素和林可霉素)、安福霉素、杆菌肽、卷曲霉素、粘菌素、持久杀霉素、恩维霉素、四环素(例如，阿匹四环素、氯四环素、氯莫环素和脱甲金霉素)、2，4-二氨基嘧啶(例如，溴莫普林)、硝基呋喃类(例如，呋喃唑酮、和呋唑氯铵)、喹诺酮及其类似物(例如，西诺沙星、克林沙星、氟甲喹、和格雷沙星)、磺胺类(例如，乙酰磺胺甲氧吡嗪、苄磺胺、诺丙磺胺、酞磺醋胺、磺胺柯定、和磺胺乙胞嘧啶)、砜(例如，地百里砜、葡胺苯砜钠、和苯丙砜)、环丝氨酸、莫匹罗星和马铃薯球蛋白。
在某些实施方式中，本发明的分子可与治疗或预防有效量的一种或多种抗真菌剂组合施用。可与本发明的分子组合使用的抗真菌剂包括但不限于两性霉素B、伊曲康唑、酮康唑、氟康唑、鞘内氟胞嘧啶、咪康唑、布托康唑、克霉唑、制霉菌素、特康唑、噻康唑、环吡司、益康唑、卤丙烷、萘替芬、特比萘芬、十一烯酸酯和灰黄霉素。
在某些实施方式中，本发明的分子可与治疗或预防有效量的一种或多种抗病毒剂组合施用。可与本发明的分子组合使用的有用的抗病毒剂包括但不限于蛋白酶抑制剂，核苷逆转录酶抑制剂，非核苷逆转录酶抑制剂和核苷类似物。抗病毒剂的实例包括但不限于齐多夫定、阿昔洛韦、更昔洛韦、阿糖腺苷、碘苷、三氟尿苷、和利巴韦林、以及膦甲酸钠、金刚烷胺、金刚乙胺、沙奎那韦、茚地那韦、安泼那韦、洛匹那韦、利托那韦、α干扰素；阿德福韦、克拉夫定、恩替卡韦、普来可那立。
5.8 疫苗治疗
本发明还包括使用本发明的组合物来引发针对抗原性或免疫原性物质，包括但不限于癌症抗原和传染病抗原(下文中公开了其实例)的免疫反应。本发明的疫苗组合物包含一种或多种抗原性或免疫原性物质，针对它们的免疫反应是期望的，其中所述一种或多种抗原性或免疫原性物质涂覆有具有增强的对FcγRIIIA的亲和力的本发明的变体抗体。本发明的疫苗组合物在引发免疫反应，优选地针对所述抗原性或免疫原性物质的保护性免疫反应方面是特别有效的。
在某些实施方式中，本发明的疫苗组合物中的抗原性或免疫原性物质包含病毒，针对所述病毒的免疫反应是期望的。这些病毒可以是重组或嵌 合的，且优选是减活的。可使用本领域技术人员已知的标准方法进行重组、嵌合以及减活病毒的制备。本发明包括待根据本发明配制的活重组病毒疫苗或灭活的重组病毒疫苗。活疫苗可能是优选的因为在宿主体内的增殖产生与自然感染中存在的相似的种类和强度的延长的刺激，并因此提供大量的、持久的免疫性。这些活重组病毒疫苗制剂的产生可使用常规方法实现，所述常规方法包括在细胞培养物或在鸡胚的尿囊中繁殖病毒，接下来纯化。
在特定的实施方式中，重组病毒对其被施用的受治疗者是无致病性的。就这一点而言，为疫苗目的而使用遗传工程化的病毒可能需要这些毒株中存在减活特征。向用于转染的模板中引入适当的突变(例如，缺失)可提供具有减活特征的新型病毒。例如，可以使与温度敏感性或冷适应有关的特定错义突变成为缺失突变。这些突变应比与寒冷或温度敏感性突变体有关的点突变更稳定且逆转频率应非常低。用于构建重组病毒的重组DNA技术是本领域已知的且被包括在本发明中。例如，用于修饰负链RNA病毒的技术是本领域已知的，参见，例如，被通过引用全部并入本文的美国专利第5,166,057号。
可选择地，具有“自杀”特征的嵌合病毒可被构建为用于本发明的皮内疫苗制剂中。这些病毒在宿主体内将仅经历一轮或几轮复制。当用作疫苗时，该重组病毒将经历有限的复制循环并引发足够水平的免疫反应但是它不会在人宿主中走得更远并导致疾病。可选择地，可根据本发明配制灭活的(被杀死的)的病毒。灭活的疫苗制剂可使用“杀死”嵌合病毒的常规技术制备。在其感染力被破坏的意义上说，灭活的疫苗是“死亡”的。理想地，病毒的感染力被破坏而不影响其免疫原性。为了制备灭活疫苗，可将嵌合病毒培养在细胞培养物或鸡胚的尿囊中，通过带状超速离心纯化，通过甲醛或β-丙内酯灭活并收集。
在某些实施方式中，完全外源的表位，包括衍生自其他病毒或非病毒病原体的抗原可被构建到用于本发明的皮内疫苗制剂的病毒中。例如，无关病毒例如HIV的抗原(gp160、gp120、gp41)、寄生虫抗原(例如疟疾)、细菌或真菌抗原或肿瘤抗原可被构建到减活毒株中。
几乎任何异源基因序列可被构建到用于皮内疫苗制剂的本发明的嵌合病毒中。优选地，异源基因序列是充当生物学反应修饰物的部分和肽。优选地，引发针对多种病原体，或结合中和抗体的抗原中的任何一种的保护性免疫反应的表位可被嵌合病毒的一部分表达或被表达为嵌合病毒的一部分。例如，可被构建到本发明的嵌合病毒中的异源基因序列包括但不限于，流感和副流感血凝素神经氨酸酶和融合糖蛋白例如人PIV3的HN和F基因。在又一个实施方式中，可被构建到所述嵌合病毒中的异源基因序列包括编码具有免疫调节活性的蛋白质的序列。免疫调节蛋白的实例包括但不限于细胞因子、1型干扰素、γ干扰素、集落刺激因子、白介素-1、白介素-2、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-12和这些物质的拮抗剂。
又在其他实施方式中，本发明包括在其表面上表达变体抗体的致病性细胞或病毒，优选地减活病毒。
在替代实施方式中，本发明的疫苗组合物包含融合多肽，其中抗原性或免疫原性物质被可操作地连接到具有增强的对FcγRIIIA的亲和力的本发明的变体抗体。构建用于本发明的疫苗组合物的融合多肽使用常规的重组DNA技术方法进行且在普通技术水平之内。
本发明还包括通过施用本发明的组合物引发受治疗者的耐受的方法。优选地，适合引发受治疗者的耐受的组合物包含涂覆有本发明的变体抗体的抗原性或免疫原性物质，其中所述变体抗体具有更高的对FcγRIIB的亲和力。虽然不期望被特定的作用机制所束缚，但是这些组合物在通过激活FcγRIIB介导的抑制型通路来引发耐受方面是有效的。
5.9 组合物和施用方法
本发明提供了包含含有多个表位结合结构域和任选地，Fc结构域(或其部分)的本发明的分子(即，双抗体)的方法和药物组合物。本发明还提供了通过对受治疗者施用有效量的本发明的融合蛋白或偶联分子，或包含本发明的融合蛋白或偶联分子的药物组合物来治疗、预防和改善与疾病、疾患或感染有关的一种或多种症状的方法。在优选的方面，抗体、融合蛋白或偶联分子是基本上纯化的(即，基本上不含限制其作用或产生不期望的副 作用的物质)。在特定实施方式中，受治疗者是动物，优选地是哺乳动物例如非灵长类(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)和灵长类(例如，猴例如食蟹猴和人)。在优选的实施方式中，受治疗者是人。又在另一个优选的施方式中，本发明的抗体来自与受治疗者相同的物种。
各种递送方法是已知的且可用来施用包含本发明的分子的组合物，例如，包封在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达该抗体或融合蛋白的重组细胞中，受体介导的内吞(参见，例如Wu等人(1987)“Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System，”J.Biol.Chem.262：4429-4432)，将核酸构建成逆转录载体或其他载体的一部分等。施用本发明的分子的方法包括但不限于肠胃外施用(例如，皮内、粘膜内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬脑膜外和经粘膜(例如，鼻内和口腔途径)。在特定实施方式中，本发明的分子被肌肉内、静脉内或皮下施用。这些组合物可通过任何方便的途径，例如输注或弹丸注射，通过经上皮或粘膜与皮肤的衬层(例如，口腔粘膜、结肠和肠粘膜等)吸收施用，且可与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。另外，还可采用肺部施用，例如，通过使用吸入器或雾化器以及具有气溶胶化剂的制剂。参见例如，美国专利第6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078号，以及PCT公布第WO92/19244、WO97/32572、WO97/44013、WO98/31346和WO99/66903号，其各自通过引用被全部并入本文。
本发明还提出将本发明的分子包装在气密性密封的容器例如指示抗体量的安瓿瓶或小袋中。在一个实施方式中，本发明的分子被提供为在气密性密封的容器中的干燥无菌的冻干粉末或无水浓缩物且可例如用水和盐水重配成用于对受治疗者施用的合适浓度。优选地，本发明的分子被以至少5mg，更优选地至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg或至少75mg的单位剂量提供为气密性密封的容器中的干燥无菌的冻干粉末。应将本发明的冻干分子储存在2和8℃之间的其初始容器中且所述分子应在重配后12小时内，优选地6小时内、5小时内、3小时内或1小时内施用。在替代实施方式中，本发明的分子被以 液体形式提供在指示所述分子、融合蛋白或偶联分子的量和浓度的气密性密封容器中。优选地，液体形式的本发明的分子被以至少1mg/ml，更优选地至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/kg、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少100mg/ml、至少150mg/ml、至少200mg/ml的分子提供在气密性密封容器中。
在治疗、预防或改善与疾患有关的一种或多种症状方面有效的本发明的组合物的量可通过标准临床技术确定。待在制剂中采用的准确剂量还将取决于施用途径，和病症的严重性且应根据医师的判断和每个患者的情况决定。有效剂量还可从体外或动物模型测试系统获得的剂量-反应曲线中外推得到。
对于本发明所包括的抗体，对患者施用的剂量通常为0.0001mg/kg至100mg/kg患者体重。优选地，对患者施用的剂量在0.0001mg/kg和20mg/kg、0.0001mg/kg和10mg/kg、0.0001mg/kg和5mg/kg、0.0001和2mg/kg、0.0001和1mg/kg、0.0001mg/kg和0.75mg/kg、0.0001mg/kg和0.5mg/kg、0.0001mg/kg至0.25mg/kg、0.0001至0.15mg/kg、0.0001至0.10mg/kg、0.001至0.5mg/kg、0.01至0.25mg/kg或0.01至0.10mg/kg患者体重之间。通过借助修饰诸如例如脂质化来增强双抗体的吸收和组织渗透，本发明的双抗体的剂量和施用频率可被减少或改变。
在一个实施方式中，当作为单独的剂治疗使用时，对患者施用的本发明的分子的剂量可从0.01mg至1000mg/天。在另一个实施方式中，本发明的分子与其他治疗性组合物组合使用且对患者施用的剂量比所述分子用作单独的剂治疗时低。
在特定实施方式中，可能期望对需要治疗的区域局部施用本发明的药物组合物；这可通过例如，而非限制性地，局部输注、通过注射或通过植入物实现，所述植入物是多孔、无孔材料或胶质材料，包括膜，例如硅氧烷膜或纤维。优选地，当施用本发明的分子时，必须小心地使用不吸收所述分子的材料。
在另一个实施方式中，可在介质，特别是脂质体中递送组合物(参见Langer(1990)“New Methods Of Drug Delivery，”Science249：1527-1533)； Treat等人，在Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein和Fidler(编辑)，Liss，New York，第353-365页(1989)中；Lopez-Berestein，ibid，第317-327页；一般地参见同上)。
又在另一个实施方式中，可在控释或缓释系统中递送所述组合物。本领域技术人员已知的任何技术可用来产生包含一种或多种本发明的分子的缓释制剂。参见，例如美国专利第4,526,938号；PCT公布WO91/05548；PCT公布WO96/20698；Ning等人(1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel，”Radiotherapy&Oncology39：179-189，Song等人(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions，”PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology50：372-397；Cleek等人(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application，”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854；以及Lam等人(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery，”Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760，其每一个被通过引用全部并入本文。在一个实施方式中，泵可用于控释系统中(参见Langer，上文；Sefton，(1987)“Implantable Pumps，”CRC Crit.Rev.Biomed.Eng.14：201-240；Buchwald等人(1980)“Long-Term，Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis，”Surgery88：507-516；和Saudek等人(1989)“A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery，”N.Engl.J.Med.321：574-579)。在另一个实施方式中，聚合物材料可用来实现抗体的控释(参见，例如Medical  Applications of Controlled Release，Langer和Wise(编辑)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design  and Performance，Smolen和Ball(编辑)，Wiley，New York(1984)；Levy等人(1985)“Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate，”Science228：190-192；During等人(1989)“Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant：In Vivo  Characterization，”Ann.Neurol.25：351-356；Howard等人(1989)“Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits，”J.Neurosurg.7(1)：105-112)；美国专利第5,679,377号；美国专利第5,916,597号；美国专利第5,912,015号；美国专利第5,989,463号；美国专利第5,128,326号；PCT公布第WO99/15154号；以及PCT公布第WO99/20253号)。用于缓释制剂中的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-醋酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。又在另一个实施方式中，控释系统可邻近治疗靶(例如，肺)放置，从而只需要全身剂量的一部分(参见，例如Goodson，在Medical  Applications of Controlled Release，上文，第2卷，第115-138页(1984)中)。在另一个实施方式中，根据Dunn等人(参见U.S.5,945,155)使用作为控释植入物有用的聚合物组合物。这种特别的方法基于生物活性材料从聚合物系统中的原位控释的治疗作用。植入通常可发生在需要治疗性治疗的患者身体的任何地方。在另一个实施方式中，使用了非聚合物持续递送系统，其中受治疗者身体内的非聚合物植入物用作药物递送系统。经植入到体内后，植入物的有机溶剂将从组合物中消散、分散或浸出到周围组织液中，且非聚合物材料将逐渐聚集或沉淀形成固体、微孔基质(参见U.S.5,888,533)。
Langer的综述(1990，“New Methods Of Drug Delivery，”Science249：1527-1533)中讨论了控释系统。本领域技术人员已知的任何技术可用来产生包含一种或多种本发明的治疗剂的缓释制剂。参见，例如美国专利第4,526,938号；国际公布第WO91/05548和WO96/20698号；Ning等人(1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel，”Radiotherapy&Oncology39：179-189，Song等人(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions，”PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology50：372-397；Cleek等人(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application，”Pro.Int’l.Symp.Control. Rel.Bioact.Mater.24：853-854；以及Lam等人(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery，”Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760，其每一个被通过引用全部并入本文。
在其中本发明的组合物是编码本发明的双抗体的核酸的特定实施方式中，所述核酸可以体内施用来促进它编码的双抗体的表达，通过将所述核酸构建为合适的核酸表达载体的一部分并施用它使得其成为细胞内的，例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利第4,980,286号)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)，或涂覆脂质或细胞表面受体或转染剂，或通过将其连接到已知进入核的同源盒样肽来施用(参见，例如Joliot等人(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：1864-1868)等。可选择地，核酸可被引入到细胞内并被整合到宿主细胞DNA内以通过同源重组表达。
用治疗或预防有效量的本发明的分子治疗受治疗者可包括单次治疗或优选地，可包括系列治疗。在优选的实例中，用约0.1至30mg/kg体重范围内的本发明的分子每周一次地治疗受治疗者，持续约1至10周之间，优选地2至8周之间，更优选地约3至7周之间，且甚至更优选地持续约4、5或6周。在其他实施方式中，一天一次、一天两次或一天三次地施用本发明的药物组合物。在其他实施方式中，一周一次、一周两次、每两周一次、一月一次、每六周一次、每两月一次、一年两次或一年一次地施用该药物组合物。还将理解用于治疗的分子的有效剂量可随特定的治疗进程增加或减少。
5.9.1 药物组合物 
本发明的组合物包括在制造药物组合物方面有用的原料药组合物(bulk drug composition)(例如，不纯的或非无菌组合物)和可用于制备单位剂型的药物组合物(即，适合对受治疗者或患者施用的组合物)。这些组合物包含预防或治疗有效量的本文公开的预防和/或治疗剂或这些剂的组合以及药学上可接受的载体。优选地，本发明的组合物包含预防或治疗有效量 的一种或多种本发明的分子以及药学上可接受的载体。
本发明还包括包含本发明的双抗体分子和对特定癌症抗原特异性的治疗性抗体(即，肿瘤特异性单克隆抗体)以及药学上可接受的载体的药物组合物。
在特定实施方式中，术语“药学上可接受的”意思是被美国联邦或州政府的监管局所批准的或在美国药典或用于动物且更特别是人的其他公认的药典中列出的。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全的和不完全的))、赋形剂或媒介物。这些药物载体可以是无菌液体例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油及类似的油。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。特别是对于可注射溶液，盐溶液和含水葡萄糖以及甘油溶液也可用作液体载体。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂乳、甘油、丙二醇、水、乙醇及类似物。如期望的话，组合物还可包含少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂及类似物的形式。
通常，本发明的组合物的成分被单独或混合在一起地提供在单位剂型中，例如，在指示活性剂的量的气密性密封容器例如安瓿瓶或小袋中作为冻干粉末或无水浓缩物。如组合物待通过输注施用的话，则其可用包含药物级无菌水或盐水的输注瓶分配。如通过注射施用组合物的话，则可提供一安瓿的用于注射用无菌水或盐水使得这些成分可在施用前被混合。
本发明的组合物可被配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括但不限于与阴离子例如衍生自盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等的阴离子形成的盐，以及与阳离子例如衍生自氢氧化钠、钾、铵、钙、铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组胺、普鲁卡因等的阳离子形成的盐。
5.9.2 基因治疗
在特定实施方式中，施用包含编码本发明的分子的序列的核酸以通过 基因治疗的方式治疗、预防或改善与疾病、疾患或感染有关的一种或多种症状。基因治疗是指通过对受治疗者施用表达的或可表达的核酸而进行的治疗。在本发明的该实施方式中，核酸产生其所编码的介导治疗或预防作用的抗体或融合蛋白。
可根据本发明使用本领域中可获得的用于基因治疗的任何方法。以下描述了示例性的方法。
对于基因治疗方法的概括性综述，参见Goldspiel等人(1993)“Human Gene Therapy，”Clinical Pharmacy12：488-505；Wu等人(1991)“Delivery Systems For Gene Therapy，”Biotherapy3：87-95；Tolstoshev(1993)“Gene Therapy，Concepts，Current Trials And Future Directions，”Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan(1993)“The Basic Science Of Gene Therapy，”Science260：926-932；以及Morgan等人(1993)“Human Gene Therapy，”Ann.Rev.Biochem.62：191-217。可使用的重组DNA技术领域通常已知的方法被描述在Ausubel等人(编辑)，Current Protocols in Molecular  Biology，John Wiley&Sons，NY(1993)；和Kriegler，Gene Transfer and  Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)中。
在优选的方面，本发明的组合物包含编码本发明的双抗体的核酸，所述核酸为在合适的宿主中表达所述抗体的表达载体的一部分。特别地，这些核酸具有可操作地连接到抗体编码区域的启动子，优选地异源启动子，所述启动子是诱导型或组成型的，且任选地，是组织特异性的。在另一个特定的实施方式中，使用了核酸分子，在所述核酸分子中抗体编码序列和任何其他期望序列的旁侧是促进在基因组的期望位点处的同源重组的区域，从而提供抗体编码核酸的染色体内表达(Koller等人(1989)“Inactivating The Beta2-Microglobulin Locus In Mouse Embryonic Stem Cells By Homologous Recombination，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：8932-8935；和Zijlstra等人(1989)“Germ-Line Transmission Of A Disrupted Beta2-Microglobulin Gene Produced By Homologous Recombination In Embryonic Stem Cells，”Nature342：435-438)。
在另一个优选的方面，本发明的组合物包含编码融合蛋白的核酸，所 述核酸为在合适的宿主中表达所述融合蛋白的表达载体的一部分。特别地，这些核酸具有可操作地连接到融合蛋白的编码区域的启动子，优选地异源启动子，所述启动子是诱导型或组成型的，且任选地，是组织特异性的。在另一个特定的实施方式中，使用了核酸分子，在所述核酸分子中融合蛋白的编码序列和任何其他期望序列的旁侧是促进在基因组的期望位点处的同源重组的区域，从而提供融合蛋白的染色体内表达。
向受治疗者递送核酸可以是直接的，在这种情况下，受治疗者被直接暴露于核酸或携带核酸的载体，或是间接的，在这种情况下，先用核酸体外转化细胞，然后移植到受治疗者体内。这两种方法分别作为体内或活体外基因治疗是已知的。
在特定实施方式中，核酸序列被直接体内施用到其被表达以产生所编码产物的地方。这可通过本领域已知的许多方法中的任何一种实现，例如，通过将其构建为合适的核酸表达载体的一部分并施用它使得其成为细胞内的，例如，通过使用缺陷性或减活的逆转录病毒或其他病毒载体进行感染(参见美国专利第4,980,286号)，或通过直接注射裸露的DNA，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)或涂覆脂质或细胞表面受体或转染剂，包封在脂质体，微粒或微胶囊中，或通过将其连接到已知进入核的肽来施用，通过将其连接到经受受体介导的内吞作用的抗原来施用(参见，例如Wu等人(1987)“Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System，”J.Biol.Chem.262：4429-4432)(其可用来靶向特异性表达受体的细胞类型)等。在另一个实施方式中，可形成核酸-抗原复合体，其中抗原包含融合病毒肽以破坏内体，允许核酸避免被溶酶体降解。又在另一个实施方式中，通过靶向特异性受体，所述核酸可被体内靶向以便细胞特异性摄取和表达(参见，例如PCT公布WO92/06180；WO92/22635；W092/20316；W093/14188；WO93/20221)。可选择地，核酸可被引入到细胞内并被整合到宿主细胞DNA内以通过同源重组表达(Koller等人(1989)“Inactivating The Beta2-Microglobulin Locus In Mouse Embryonic Stem Cells By Homologous Recombination，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：8932-8935；Zijlstra等人(1989) “Germ-Line Transmission Of A Disrupted Beta2-Microglobulin Gene Produced By Homologous Recombination In Embryonic Stem Cells，”Nature342：435-438)。
在特定实施方式中，使用包含编码本发明的分子(即，双抗体或融合蛋白)的核酸序列的病毒载体。例如，可使用逆转录病毒载体(参见Miller等人(1993)“Use Of Retroviral Vectors For Gene Transfer And Expression，”Meth.Enzymol.217：581-599)。这些逆转录病毒载体包含病毒基因组的正确包装和整合到宿主细胞DNA所必需的组分。待用于基因治疗的编码所述抗体或融合蛋白的核酸序列被克隆到一种或多种载体中，这促进对受治疗者递送该核苷酸序列。关于逆转录病毒载体的更多细节可在Boesen等人(1993)“Circumvention Of Chemotherapy-Induced Myelosuppression By Transfer Of The Mdr1Gene，”Biotherapy6：291-302中发现，其描述了使用逆转录病毒载体来将mdr1基因递送至造血干细胞以制备对化疗抗性更大的干细胞。阐述了在基因治疗中使用逆转录病毒载体的其他参考文献是：Clowes等人(1994)“Long-Term Biological Response Of Injured Rat Carotid Artery Seeded With Smooth Muscle Cells Expressing Retrovirally Introduced Human Genes，”J.Clin.Invest.93：644-651；Keim等人(1994)“Retrovirus-Mediated Gene Transduction Into Canine Peripheral Blood Repopulating Cells，”Blood83：1467-1473；Salmons等人(1993)“Targeting Of Retroviral Vectors For Gene Therapy，”Human Gene Therapy4：129-141；和Grossman等人(1993)“Retroviruses：Delivery Vehicle To The Liver，”Curr.Opin.Genetics and Devel.3：110-114。
腺病毒是可用于基因治疗的其他病毒载体。腺病毒是用于向呼吸上皮递送基因的尤其有吸引力的工具。腺病毒天然地感染呼吸上皮，其在呼吸上皮中导致轻微的疾病。用于基于腺病毒的递送系统的其他靶是肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优点。Kozarsky等人(1993，“Gene Therapy：Adenovirus Vectors，”Current Opinion in Genetics and Development3：499-503)提供了基于腺病毒的基因治疗的综述。Bout等人(1994，“Lung Gene Therapy：In Vivo Adenovirus-Mediated Gene  Transrer To Rhesus Monkey Airway Epithelium，”Human Gene Therapy，5：3-10)阐述了使用腺病毒载体来将基因转移到猕猴的呼吸上皮中。在基因治疗中使用腺病毒的其他实例可在Rosenfeld等人(1991)“Adenovirus-Mediated Transfer Of A Recombinant Alpha1-Antitrypsin Gene To The Lung Epithelium In Vivo，”Science252：431-434；Rosenfeld等人(1992)“In Vivo Transfer Of The Human Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene To The Airway Epithelium，”Cell68：143-155；Mastrangeli等人(1993)“Diversity Of Airway Epithelial CellTargets For In Vivo Recombinant Adenovirus-Mediated Gene Transfer，”J.Clin.Invest.91：225-234；PCT公布W094/12649和Wang等人(1995)“A Packaging Cell Line For Propagation Of Recombinant Adenovirus Vectors Containing Two Lethal Gene-Region Deletions，”Gene Therapy2：775-783中发现。在优选的实施方式中，使用腺病毒载体。
已提出腺相关病毒(AAV)用于基因治疗(参见，例如Walsh等人(1993)“Gene Therapy For Human Hemoglobinopathies，”Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300和美国专利第5,436,146号)。
针对基因治疗的另一种方法包括通过这些方法如电穿孔、脂质体转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染来将基因转移到组织培养中的细胞中。通常，转移方法包括将选择性标记转移到细胞。然后可对细胞进行选择以分离已摄取并表达所转移的基因的那些细胞。然后将那些细胞递送至受治疗者。
在该实施方式中，在体内施用所得的重组细胞之前将核酸引入到细胞中。该引入可通过本领域已知的任何方法进行，包括但不限于转染、电穿孔、微注射、用包含核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。用于将外源基因引入到细胞的许多技术是本领域已知的(参见，例如Loeffler等人(1993)“Gene Transfer Into Primary And Established Mammalian Cell Lines With Lipopolyamine-Coated DNA，”Meth.Enzymol.217：599-618，Cotten等人(1993)“Receptor-Mediated Transport Of DNA Into Eukaryotic Cells，”Meth. Enzymol.217：618-644且可根据本发明使用，条件是接受体细胞的必要的发育和生理功能不受破坏。该技术应提供核酸被稳定转移至细胞，使得该核酸可被该细胞表达且优选地可被其细胞后代遗传和表达。
所得的重组细胞可通过本领域已知的多种方法被递送至受治疗者。优选地静脉内施用重组的血液细胞(例如，造血干细胞或祖细胞)。被预期使用的细胞的量取决于所期望的作用、患者的状态等，且可由本领域技术人员确定。
为了基因治疗的目的可引入核酸的细胞包括任何期望的、可获得的细胞类型且包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性白细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞，粒细胞；各种干细胞或祖细胞，尤其是例如，从骨髓，脐带血，外周血，胎肝等获得的造血干细胞或祖细胞。
在优选的施方式中，用于基因治疗的细胞对于受治疗者是自体的。
在其中重组细胞被用于基因治疗的实施方式中，编码抗体或融合蛋白的核酸序列被引入细胞使得其可由细胞或其后代表达，且然后这些重组细胞可被体内施用以获得治疗作用。在特定实施方式中，使用了干细胞或祖细胞。可被分离并体外维持的任何干细胞和/或祖细胞可被潜在地用于根据本发明的该实施方式(参见，例如PCT公布WO94/08598；Stemple等人(1992)“Isolation Of A Stem Cell For Neurons And Glia From The Mammalian Neural Crest，”Cell71：973-985；Rheinwald(1980)“Serial Cultivation Of Normal Human Epidermal Keratinocytes，”Meth.Cell Bio.21A：229-254；以及Pittelkow等人(1986)“New Techniques For The In Vitro Culture Of Human Skin Keratinocytes And Perspectives On Their Use For Grafting Of Patients With Extensive Burns，”Mayo Clinic Proc.61：771-777)。
在特定实施方式中，为了基因治疗的目的待引入的核酸包含可操作地连接至编码区域的诱导型启动子，使得通过控制合适的转录诱导剂的存在或不存在，核酸表达可被控制。
5.9.3 药盒
本发明提供了包含装有本发明的分子的一种或多种容器的药物包装或药盒。另外，对治疗疾病有用的一种或多种其他预防或治疗剂也可被包括在所述药物包装或药盒中。本发明还提供了包含装有本发明的药物组合物的一种或多种成分的一种或多种容器的药物包装或药盒。任选地这些容器带有可以是由监管药物或生物学产品的生产、使用或销售的政府部门规定形式的通知，该通知反映生产、使用或销售的监管部门对人类施用的许可。
本发明提供了可用于上述方法中的药盒。在一个实施方式中，药盒包含一种或多种本发明的分子。在另一个实施方式中，药盒还包含对治疗癌症有用的位于一种或多种容器中的一种或多种其他预防或治疗剂。在另一个实施方式中，药盒还包含结合与癌症有关的一种或多种癌症抗原的一种或多种细胞毒性抗体。在某些实施方式中，所述其他预防或治疗剂是化疗剂。在其他实施方式中，所述预防或治疗剂是生物治疗剂或激素治疗剂。
5.10 治疗效用的表征和证实
优选地在用于人类之前，在细胞培养系统和在动物模型生物体，例如啮齿动物模型系统中体外测试本发明的药物组合物、预防或治疗剂的多个方面以获得期望的治疗活性。例如，可用来确定特定药物组合物的施用是否是期望的测定包括细胞培养测定，其中患者的组织样品被培养在培养物中，并被暴露于本发明的药物组合物或以其他方式与之接触，并观察该组合物对所述组织样品的作用。该组织样品可通过来自患者的组织活检获得。该测试允许鉴定在治疗上对于各个单独的患者最有效的预防或治疗性分子。在多个特定实施方式中，体外测定可用参与自身免疫或炎性疾患的细胞类型的代表性细胞(例如，T细胞)进行以确定本发明的药物组合物是否对这些细胞类型具有期望的作用。
可在用于人类之前在合适的动物模型系统中测试预防和/或治疗剂的组合。这些动物模型系统包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、猪、狗、兔等。可使用本领域熟知的任何动物系统。在本发明的特定实施方式中，在小鼠模型系统中测试预防和/或治疗剂的组合。这些模型系统被广泛使用 且是技术人员所熟知的。预防和/或治疗剂可被重复施用。程序的各个方面可变化。所述方面包括施用预防和/或治疗剂的时间方案，以及这些剂是被单独施用还是作为混合物施用。
用于本发明的方法中的优选动物模型是，例如在小鼠效应细胞上表达人FcγR的转基因小鼠，例如，U.S.5,877,396(其被通过引用全部并入本文)中描述的任何小鼠模型可用于本发明中。用于本发明的方法中的转基因小鼠包括但不限于携带人FcγRIIIA的小鼠；携带人FcγRIIA的小鼠；携带人FcγRIIB和人FcγRIIIA的小鼠；携带人FcγRIIB和人FcγRIIA的小鼠。优选地，将测试在上述功能测定中表现出最高活性水平的突变在用于人类之前用于动物模型研究中。使用上文描述的方法，例如使用本文公开和例示的哺乳动物表达系统及纯化方法，可制备用于动物模型中的足够量的抗体。
可基于本发明的双抗体分子的表位结合结构域的亲和力和特异性以及所述双抗体引发免疫反应的能力使用小鼠异种移植模型来检验针对肿瘤特异性靶所产生的小鼠抗体的功效(Wu等人(2001)“Mouse Models For Multistep Tumorigenesis，”Trends Cell Biol.11：S2-9)。在小鼠效应细胞上表达人FcγR的转基因小鼠是独特的且是测试人Fc-FcγR相互作用的特制的动物模型。可使用在Dr.Jeffrey Ravetch的实验室中产生的数对FcγRIIIA、FcγRIIIB和FcγRIIA转基因小鼠品系(经过Rockefeller U.和Sloan Kettering Cancer center的许可)，例如下表11中所列出的。
表11：小鼠品系
品系背景 人FcR
裸鼠/CD16AKO 无
裸鼠/CD16AKO FcγRIIIA
裸鼠/CD16AKO FcγRIIA
裸鼠/CD16AKO FcγRIIA和IIIA
裸鼠/CD32B KO 无
裸鼠/CD32B KO FcγR IIB
本发明的组合治疗的抗炎活性可通过使用本领域已知和在Crofford L.J.和Wilder R.L.，“Arthritis and Autoimmunity in Animals”，在Arthritis and  Allied Conditions：A Textbook of Rheumatology中，McCarty等人(编辑)，第30章(Lee和Febiger，1993)中描述的炎性关节炎的多种实验动物模型来确定。炎性关节炎和自身免疫风湿性疾病的实验的和天然的动物模型也可被用来评价本发明的组合治疗的抗炎活性。以下是作为实例而非限制性地提供的一些测定。
本领域已知且被广泛使用的用于关节炎或炎性疾病的主要动物模型包括：佐剂引发的关节炎大鼠模型、胶原引发的关节炎大鼠和小鼠模型以及抗原引发的关节炎大鼠、兔和仓鼠模型都被描述在Crofford L.J.和Wilder R.L.“Arthritis and Autoimmunity in Animals”在Arthritis and  Allied Conditions：A Textbook of Rheumatology中，McCarty等人(编辑)，第30章(Lee和Febiger，1993)，其被通过引用全部被并入本文。
本发明的组合治疗的抗炎活性可使用角叉菜聚糖引发的关节炎大鼠模型评价。在对慢性关节炎或炎症的研究中，角叉菜聚糖引发的关节炎还可在兔、狗和猪中使用。定量组织形态学评价用来确定治疗功效。使用该角叉菜聚糖引发的关节炎模型的方法被描述在Hansra P.等人(2000)“Carrageenan-Induced Arthritis In The Rat，”Inflammation，24(2)：141-155中。如本领域已知和描述的，另外通常使用的是酵母聚糖引发的炎症动物模型。
使用对在Winter C.A.等人(1962)“Carrageenan-Induced Edema In Hind Paw Of The Rat As An Assay For Anti-Inflammatory Drugs”Proc.Soc.Exp.Biol Med.111，544-547中描述的方法的修改，本发明的组合治疗的抗炎活性还可通过在大鼠中测量对角叉菜聚糖引发的爪水肿的抑制来评价。该测定已被用作对大多数NSAID的抗炎活性的初级体内筛选，且被认为是对人的功效的预测。受试预防或治疗剂的抗炎活性被表示为测试组相对于媒介物用药的对照组对后爪重量的增加的抑制百分比。
另外，用于炎性肠病的动物模型也可用来评价本发明的组合治疗的功效(Kim等人(1992)“Experimental Colitis In Animal Models，”Scand.J.Gastroentrol.27：529-537；Strober(1985)“Animal Models Of Inflammatory Bowel Disease-An Overview，”Dig.Dis.Sci.30(12增刊)：3S-10S)。溃疡性气 管炎和克罗恩病是可在动物中诱导的人类炎性肠病。可对动物口服施用硫酸化的多糖包括但不限于支链淀粉、角叉菜、硫酸支链淀粉以及硫酸葡聚糖或化学刺激物包括但不限于三硝基苯磺酸(TNBS)和乙酸以诱导炎性肠病。
用于自身免疫疾患的动物模型也可用来评价本发明的组合治疗的功效。已研发出用于自身免疫疾患例如1型糖尿病、甲状腺自身免疫病、系统性红斑狼疮和肾小球性肾炎的动物模型(Flanders等人(1999)“Prevention Of Type1Diabetes From Laboratory To Public Health，”Autoimmunity29：235-246；Rasmussen等人(1999)“Models To Study The Pathogenesis Of Thyroid Autoimmunity，”Biochimie81：511-515；Foster(1999)“Relevance Of Systemic Lupus Erythematosus Nephritis Animal Models To Human Disease，”Semin.Nephrol.19：12-24)。
此外，本领域技术人员已知的任何测定可用来评价本文公开的组合治疗对自身免疫病和/或炎性疾病的预防和/或治疗效用。
本发明的预防和/或治疗方法的毒性和功效可通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中确定，例如以便确定LD50(对50％群体的致死剂量)和ED50(在50％群体中的治疗有效的剂量)。毒性和治疗作用之间的剂量比是治疗指数且其可表示为LD50/ED50比。显示出大的治疗指数的预防和/或治疗剂是优选的。虽然可使用显示出毒性副作用的预防和/或治疗剂，但是应仔细地设计将这些剂靶向到被影响的组织位点的递送系统以将对未被感染的细胞的可能性损害降至最少，并从而减少副作用。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人类的预防和/或治疗剂的剂量范围。这些剂的剂量优选地落在包括ED50的循环浓度的范围内，具有很少或没有毒性。所述剂量可根据所采用的剂型和所使用的施用途径在该范围内变化。对于用于本发明的方法中的任何剂，可先从细胞培养测定估计治疗有效剂量。如在细胞培养中确定的，可将剂量配制在动物模型中以达到包括IC50(即，实现对症状的半数最大抑制的受试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。该信息可用来更准确地确定人中有用的剂量。血浆中的水平可例如通过高效液相层析测量。
根据本发明使用的治疗的抗癌活性还可通过使用本领域已知的和在Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development(1999，编辑Fiebig和Burger)；Contributions to Oncology(1999，Karger)；The Nude Mouse in Oncology Research(1991，编辑.Boven和Winograd)；以及Anticancer Drug Development Guide(1997版.Teicher)中描述的用于研究癌症的各种实验动物模型例如SCID小鼠模型或转基因小鼠或具有人异种移植物的裸鼠、动物模型例如仓鼠、兔等确定，本文通过引用将这些文献全部并入。
用于确定本发明的分子的治疗功效的优选动物模型是小鼠异种移植模型。可用作异种移植肿瘤来源的肿瘤细胞系包括但不限于可从患乳腺癌的患者获得的SKBR3和MCF7细胞。这些细胞具有erbB2和催乳素受体。在本领域中，SKBR3细胞已被常规地用于ADCC和异种移植肿瘤模型。可选择地，从人卵巢腺癌获得的OVCAR3细胞可用作用于异种移植肿瘤的来源。
优选地在用于人类之前体外测试并然后体内测试本发明的方案和组合物的期望的治疗或预防活性。治疗剂和方法可使用肿瘤细胞或恶性细胞系筛选。本领域的许多标准测定可用来评价该存活和/或生长；例如，细胞增殖可通过测量3H-胸腺嘧啶掺入，通过直接的细胞计数，通过检测已知基因例如前原癌基因(例如，fos、myc)或细胞周期标志的转录活性的变化测定；细胞活力可通过台盼蓝染色评价，分化可基于形态学变化、生长减弱和/或软琼脂中的集落形成或三维基膜或细胞外基质制备物中管状网络的形成等肉眼测定。
在人类中检测之前，可在合适的动物模型系统中检测用于治疗的化合物，包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔、仓鼠等，例如上述动物模型。然后可将这些化合物用于合适的临床试验中。
另外，本领域技术人员已知的任何测定可用来评价本文公开的组合治疗对治疗或预防癌症、炎性疾患或自身免疫病的预防和/或治疗效用。
6实施例
6.1 共价双特异性双抗体的设计和表征
构建单特异性共价双抗体和双特异性共价双抗体以评价各自的重组产生、纯化和结合特征。通过SDS-PAGE和SEC分析发现通过本文描述的重组表达系统产生的亲和纯化的双抗体分子由单一的二聚体物质组成。ELISA和SPR分子还表明该共价双特异性双抗体对两种靶抗原都显示出亲和力且可同时结合两种抗原。
材料和方法 
多肽分子的构建和设计：设计核酸表达载体以产生图2中图示地呈现的四种多肽构建体。构建体(1)(SEQ ID NO：9)包含识别FcγRIIB的人源化2B6抗体的VL结构域和识别FcγRIIIA的人源化3G8抗体的VH结构域。构建体(2)(SEQ ID NO：11)包含Hu3G8的VL结构域和Hu2B6的VH结构域。构建体(3)(SEQ ID NO：12)包含Hu3G8的VL结构域和Hu3G8的VH结构域。构建体(4)(SEQ ID NO：13)包含Hu2B6的VL结构域和Hu2B6的VH结构域。
PCR和表达载体的构建：VL或VH结构域的编码序列使用所设计的正向和反向引物从模板DNA扩增使得初始PCR产物将包含重叠序列，允许重叠PCR产生期望的多肽构建体的编码序列。
模板DNA的初始PCR扩增：将约35ng的模板DNA，例如，目的抗体的轻链和重链；1ul的10uM正向和反向引物；2.5ul的10x pfuUltra缓冲液(Stratagene，Inc.)；1ul的10mM dNTP；1ul的2.5单位/ul的pfuUltra DNA聚合酶(Stratagene，Inc.)和蒸馏水至25ul的总体积轻轻地混合在microfuge管中并在微型离心机中短暂地旋转以将反应混合物收集在管的底部。使用GeneAmp PCR System9700(PE Applied Biosystem)和以下设置进行PCR反应：94℃，2分钟；以下的25个循环：94℃，每次15秒；58℃，30秒；和72℃，1分钟。
使用分别为SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56的正向和反向引物从Hu2B6的轻链扩增Hu2B6的VL。使用分别为SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58的正向和反向引物从Hu2B6的重链扩增Hu2B6的VH。使用分别 为SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：59的正向和反向引物从Hu3G8的轻链扩增Hu3G8的VL。使用分别为SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61的正向和反向引物从Hu3G8的重链扩增Hu3G8的VH。
在120伏下在1％琼脂糖凝胶上对PCR产物进行电泳，持续30分钟。从凝胶上切下PCR产物并使用MinElute GE1提取试剂盒(Qiagen，Inc.)纯化。
重叠PCR：如下所述地合并初始PCR产物并使用对模板DNA的初始扩增所描述的相同的PCR条件扩增。另外如上文描述地纯化重叠PCR的产物。
编码构建体1SEQ ID NO：9(图2中图示地示出的)的核酸序列通过合并VL Hu2B6和VH Hu3G8的扩增PCR产物以及分别为SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：61的正向和反向引物扩增。编码构建体2SEQ ID NO：11(图2中图示地示出的)的核酸序列通过合并VL Hu3G8和VH Hu2B6的扩增PCR产物以及分别为SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：58的正向和反向引物扩增。编码构建体3SEQ ID NO：12(图2中图示地示出的)的核酸序列通过合并VL Hu3G8和VH Hu3G8的扩增PCR产物以及分别为SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：61的正向和反向引物扩增。编码构建体4SEQ ID NO：13(图2中图示地示出的)的核酸序列通过合并VL Hu2B6和VH Hu2B6的扩增PCR产物以及分别为SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：58的正向和反向引物扩增。
VL结构域的正向引物(即，SEQ ID NO：55)和VH结构域的反向引物(即，SEQ IDNO：58和SEQ ID NO：61)包含允许将最终产物克隆到表达载体的独特限制性位点。用限制性核酸内切酶NheI和EcoR I消化纯化的重叠PCR产物，并将其克隆到pCIneo哺乳动物表达载体(Promega，Inc.)中。如表12中标示的，命名了编码构建体的质粒：
表12 质粒构建体
编码构建体 质粒名称 插入物
1 pMGX0669 hu2B6VL-hu3G8VH
2 pMGX0667 hu3G8VL-hu2B6VH
[0625] 
3 pMGX0666 hu3G8VL-hu3G8VH
4 pMGX0668 hu2B6VL-hu2B6VH
多肽/双抗体表达：使用Lipofectamine2000根据厂家指导(Invitrogen)将编码构建体1的pMGX0669与编码构建体2的pMGX0667一起共转染到HEK-293细胞中。这两种质粒的共转染被设计成导致对FcγRIIB和FcγRIIIA都具免疫特异性的共价双特异性双抗体(CBD)(h2B6-h3G8双抗体)的表达。将分别编码构建体3和4的pMGX0666和pMGX0668分别转染到HEK-293细胞中以分别表达分别对FcγRIIIA(h3G8双抗体)和FcγRIIB(h2B6双抗体)具免疫特异性的共价单特异性双抗体(CMD)。培养三天后，从条件培养基中纯化所分泌的产物。
纯化：使用偶联到CNBr活化的Sepharose4B的相关抗原从条件培养基中捕获双抗体。在上样前在20mM Tris/HCl，pH8.0中平衡亲和Sepharose树脂。上样后，在洗脱前用平衡缓冲液洗涤树脂。使用50mM甘氨酸pH3.0从所洗涤的树脂中洗脱双抗体。立即用1M Tris/HCl pH8.0中和所洗脱的双抗体并使用离心型浓缩器浓缩。使用在PBS中平衡的Superdex200柱通过尺寸排阻层析进一步纯化所浓缩的双抗体。
SEC：使用尺寸排阻层析分析从柱洗脱的双抗体的大致尺寸和异质性。在用PBS平衡的GE healthcare Superdex200HR10/30柱上进行SEC分析。与全长IgG(～150kDa)的洗脱曲线比较，Fab片段(～50kDa)和单链Fv(～30kDa)用作对照。
ELISA：通过如在5.4.2中描述的ELISA测定表征所洗脱和纯化的双抗体的结合。在碳酸盐缓冲液中，在4℃下将50μl/孔的2μg/ml sCD32B-Ig溶液过夜包被在96-孔Maxisorp平板上。用PBS-T(PBS，0.1％吐温20)洗涤平板三次并在室温下通过PBS-T中的0.5％BSA封闭30分钟。随后，将h2B6-h3G8CBD、h2B6CMD或h3G8CMD以两倍系列稀释稀释到封闭缓冲液中以产生0.5μg/ml至0.001μg/ml范围内的双抗体浓度。然后在室温下孵育平板1小时。用PBS-T洗涤三次后，将50μl/孔的0.2μg/mlsCD16A-生物素加至每个孔。再次在室温下孵育平板1小时。用PBS-T洗涤三次后，将50μl/孔的1∶5000稀释的HRP偶联的链霉亲和素 (Amersham Pharmacia Biotech)用于检测。允许HRP-链霉亲和素在室温下孵育45分钟。用PBS-T洗涤平板三次并用80μl/孔的TMB底物显色。孵育10分钟后，通过加入40μl/孔的1％H2SO4终止HRP-TMB反应。使用96-孔读板机和SOFTmax软件读取OD450nm并使用GraphPadPrism3.03软件对结果作图。
BIAcore测定：使用如5.4.3节中描述的BIAcore测定(BIAcore仪器1000，BIAcore Inc.，Piscataway，N.J.)和相关软件分析所洗脱和纯化的双抗体的结合的动力学参数。
将sCD16A、sCD32B或sCD32A(阴性对照)通过胺偶联化学法(通过用NHS/EDC混合物修饰羧甲基基团)固定在传感器芯片表面的四个流动池中的一个(流动池2)上使得约1000反应单位(RU)的任何一种受体被固定在所述表面上。在这之后，通过注射1M Et-NH2将未反应的活性酯“脱帽”。一旦制备了合适的表面，通过以70mL/min的流速注射6.25-200nM的溶液180秒钟使共价双特异性双抗体(h2B6-h3G8CBD)或共价单特异性双抗体(h2B6CMD或h3G8CMB)在所述表面经过。还测试了h3G8scFv以便比较。
一旦收集到整套数据，使用由制造商BIAcore，Inc.(Piscataway，NJ)提供的计算机算法对所得到的结合曲线全局拟合。这些算法计算了K结合和K解离，从它们推断出表观平衡结合常数，KD被推算为这两个速率常量的比(即，K解离/K结合)。对如何获得各个速率常量的更详细的处理可在BIAevaluaion Software Handbook(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)中发现。
单独地拟合结合和离解阶段。对于180sec离解阶段的间隔32-34sec获得离解速率常数；通过1∶1Langmuir模型获得结合阶段拟合并基于双特异性双抗体和scFv的基础Rmax和χ2标准选择基础拟合；二价分析物拟合被用于CMD结合。
结果
非还原条件下的SDS-PAGE分析表明h3G8CMD、h2B6CMD和h2B6-h3G8CBD表达系统的纯化产物各自是具有约50kDa的估计分子量的单一物质(分别是图3的泳道4、5和6)。在还原条件下，从任何一种CMD 表达系统纯化的产物跑成单一条带(泳道1和2)，而从h2B6-h3G8CBD系统纯化的产物表明是2种单独的蛋白质(图3，泳道3)。从该表达系统中纯化并通过还原条件下的SDS-PAGE观察到的所有多肽迁移至约28kDa。
每种表达系统的产物的SEC分析也表明为单一分子的物质(图4B)，其每一种在与IgG的Fab片段(～50kDa)大致相同的时间被洗脱出来(图4A)。结果表明对于CMD表达系统的情况，亲和纯化的产物为均一的共价同二聚体而对于h2B6-h3G8CBD的情况为均一的共价异二聚体。
使用ELISA夹心测定测试h2B6-h3G8CBD结合CD32B和/或CD16A中的任何一者或二者的特异性(图5)。CD32B用作靶抗原而CD16A用作第二探针。ELIZA中的阳性信号表明异二聚体h2B6-h3G8CBD具有对两种抗原的特异性。h3G8CMD的相似测试(其不应结合CD32B)未显示出信号。
SPR分析表明h3G8CMD免疫特异性地识别sCD16而非sCD32B，h2B6CMD免疫特异性地识别sCD32B而非sCD16，且h2B6-h3G8CBD免疫特异性地识别sCD16和sCD32B二者(图6A-B)。所测试的这些双抗体都不结合对照受体sCD32A(图6C)。
还使用SPR分析来估计CMD和h2B6-h3G8CBD与sCD16和/或sCD32B的动力学常数和平衡常数。将结果与对h3G8scFV计算的相同常数比较。图7A-E示出了SPR分析的图形结果。从图7中所示的结果计算的动力学结合和解离速率以及平衡常数被提供在表13中。
表13 从BIAcore数据计算的动力学常数和平衡常数。
受体/分析物 k-结合 k-解离 Kd
sCD16/h3G8双抗体 2.3x105 0.004 18.0
sCD16/h2B6-h3G8CBD 4.6x105 0.010 22.7
sCD16/h3G8scFv 3.2x105 0.013 38.7
sCD32B/h2B6-h3G8CBD 3.6x105 0.005 15.0
sCD32B/h2B6双抗体 6.2x105 0.013 21.0
结合ELISA分析的结果，这些研究确认了h2B6-h3G8共价异二聚体保留了对CD32B和CD16的特异性且能够同时结合两种抗原。图8中图示地呈现了该分子。
6.2 包含Fc结构域的共价双特异性双抗体的设计和表征
试图制备IgG样分子即，包含Fc结构域的分子时，构成实施例6.1中呈现的异二聚体CBD分子的多肽之一被修饰为还包含Fc结构域(产生与抗体的重链和轻链类似的‘较重’和‘较轻’的链)。然后该异二聚体双特异性分子将包含将与同源分子二聚化的Fc结构域，形成具有四价的四聚IgG样分子(即，通过异二聚体双特异性分子的Fc结构域的二聚化而形成)。有趣的是，使用功能测定未在重组表达系统的条件培养基中检测到这些四聚体分子，所述功能测定例如，测试条件培养基对靶抗原的免疫特异性结合。代替地，仅在这些功能测定中检测到包含由VL、VH和Fc结构域组成的单体的二聚体分子。为测试理论上四聚的结构的稳定性是否是受争议的，将包含Fc结构域的多肽构建为还包含铰链区，同时包含‘较轻的’链的多肽被构建为还包含人κ轻链的恒定结构域的6个C末端氨基酸。当这些重构的‘较重’和‘较轻’的链在重组表达系统中共表达时，功能测定检测到能够免疫特异性地结合靶抗原以及抗Fc抗体二者的双抗体分子。
材料和方法 
多肽分子的构建和设计：设计核酸表达载体以产生实施例6.1中提供的构建体1和2的修饰形式。通过分别构建构建体1和2以还包含Fc结构域来创建构建体5(SEQ ID NO：14)和6(SEQ ID NO：15)。通过构建构建体1以在其C末端还包含序列FNRGEC(SEQ ID NO：23)来创建构建体7(SEQ ID NO：16)。通过构建构建体2以还包含铰链区和Fc结构域(包含V215A突变)来创建构建体8(SEQ ID NO：18)。图9中示出了构建体5-8的图示呈现。
PCR和表达载体的构建：实施例6.1中描述了所有PCR及PCR产物纯化方案。质粒pMGX0669和pMGX0667分别用作构建体1和2的编码序列的模板。HuIgG Fc结构域和/或铰链结构域的编码序列分别为SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5。使用正向和反向引物扩增模板DNA的编码序列使得PCR产物将包含重叠序列，允许重叠PCR产生期望产物的编码序列。
分别使用正向和反向引物SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：62从 pMGX0669扩增构建体1的编码序列。分别使用正向和反向引物SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：63从pMGX0667扩增构建体2的编码序列。分别使用正向和反向引物SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66扩增HuIgG铰链-Fc。使用正向和反向引物SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：67从pMGX0669扩增构建体7(SEQ ID NO：16)。
重叠PCR：如下所述地合并初始PCR产物，如实施例6.1中所述地扩增并纯化。
通过合并扩增构建体1和HuIgG Fc的PCR产物和分别为SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：64的正向和反向引物扩增编码构建体5SEQ ID NO：14(图9中图示地示出的)的核酸序列。通过合并扩增构建体2和HuIgGFc的PCR产物和分别为SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：66的正向和反向引物扩增编码构建体6SEQ ID NO：15(图9中图示地示出的)的核酸序列。通过合并扩增构建体2和HuIgG铰链-Fc的PCR产物和分别为SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：66的正向和反向引物扩增编码构建体8SEQ ID NO：18(图9中图示地示出的)的核酸序列。
如上所述地将最终产物克隆到pCIneo哺乳动物表达载体(Promega，Inc.)中。如表14中标示的，命名了编码构建体的质粒：
表14.质粒构建体
编码构建体 质粒名称 插入物
5 pMGX0676 hu2B6VL-hu3G8VH-huFc
6 pMGX0674 hu3G8VL-hu2B6VH-huFc
7 pMGX0677 Hu2B6VL-hu3G8VH-FNRGEC
8 pMGX0678 Hu3G8VL-hu2B6VH-hu铰链-Fc(A215V)
多肽/双抗体表达：如6.1节所描述的使用Lipofectamine2000对HEK-293细胞进行四次单独的共转染：分别编码构建体1和构建体6的pMGX0669和pMGX0674；分别编码构建体2和构建体5的pMGX0667和pMGX0676；和分别编码构建体7和构建体8的pMGX0677和pMGX0678。
这些质粒的共转染被设计成导致对FcγRIIB和FcγRIIIA二者具免疫特异性的具有IgG样结构的四价双特异性双抗体(CBD)的表达。还进行了另外的共转染：分别编码构建体6和构建体5的pMGX0674和 pMGX0676。培养三天后，收集条件培养基。使用纯化的Fc作为标准通过抗IgG Fc ELISA对条件培养基中分泌产物的量定量。然后基于定量对样品中产物的浓度标准化，并将标准化的样品用于其余的测定。
ELISA：如上文所述地通过夹心ELISA测定分泌到培养基中的双抗体分子的结合。除非被指出，CD32B被用来包被平板，即作为靶蛋白，且HRP-偶联的CD16用作探针。
结果
使用ELISA测定测试来自包含构建体1和6(pMGX669-pMGX674)、构建体2和5(pMGX667-pNGX676)及构建体5和6(pMGX674-pMGX676)的重组表达系统的标准化样品中能够同时结合CD32B和CD16A的双抗体分子的表达(图10)。ELISA数据表明共转染构建体1和6或共转染构建体2和5不能产生能够结合任一种或两种抗原的产物(图10，分别为□和▲)。但是，共转染构建体5和6导致分泌能结合CD32B和CD16抗原二者的产物。后一种产物是包含针对每种抗原的一个结合位点的构建体5和6的二聚体，结构被图示地描绘在图11中。
为了驱使IgG样异四聚体结构的形成，将6个额外的氨基酸的编码序列附接在构建体1的C末端，产生构建体7(SEQ ID NO：16并被图示地示出在图9中)。6个额外的氨基酸，FNRGEC(SEQ ID NO：23)，衍生自κ轻链的C末端，并通常与IgG分子中重链的上铰链结构域相互作用。然后将铰链结构域构建到构建体6中，产生构建体8(SEQ ID NO：18和图9)。构建体8另外在上铰链结构域包含氨基酸突变A215V。然后将分别编码构建体7和构建体8的表达质粒pMGX677和pMGX678共转染到HEK-293细胞中并如所述地表达。
在ELISA测定中比较由包含构建体7和8(pMGX0677+pMGX0678)的重组表达系统产生的双抗体分子与由包含构建体1和6(pMGX669+pMGX674)、构建体2和8(pMGX669+pMGX678)及构建体6和7的(pMGX677+pMGX674)的重组表达系统产生的双抗体分子对CD32B和CD16A的结合(图12)。
像之前一样，由包含构建体1和6(pMGX669+pMGX674)的表达系统产生的分子被证明不能结合CD32A和CD16A(图10和图12)。相比而言，来自构建体7和6(pMGX0677+pMGX0674)的共表达或来自构建体7和8(pMGX0677-pMGX0678)的共表达的产物能够结合CD32B和CD16二者(图12)。值得注意的是除了构建体7包含C末端序列FNRGEC(SEC ID NO：23)之外，构建体7与构建体1类似；并且除了构建体8包含铰链结构域和突变A215V之外，构建体8与构建体6类似。数据表明将来自C-κ轻链的C末端的6个额外的氨基酸(FNRGEC；SEQ ID NO：23)加至不具有Fc的‘较轻’的链有助于稳定四聚体IgG样双抗体分子的形成，无论相应的较重的链是否包含铰链结构域(即，pMGX0677+pMGX0674和pMGX0677-pMGX0678，图12)。将铰链结构域加至具有Fc的‘较重’的多肽，而未将FNRGEC(SEQ ID NO：23)C末端序列加至相应的‘较轻’的链明显地不能实现相似的稳定(即，缺乏构建体2和8(pMGX669+pMGX678)共转染的产物的结合)。图13中图示地示出了四聚体双抗体分子的结构。
6.3结构域顺序和额外的二硫键对四聚体IgG样双抗体的形成的作用
通过用半胱氨酸置换多肽链上所选择的残基研究四聚体IgG样双抗体分子的‘较轻’和‘较重’的多肽链之间的额外的稳定的作用。该额外的半胱氨酸残基提供‘较轻’和‘较重’链之间的额外的二硫键。另外，通过将Fc结构域或铰链-Fc结构域从多肽链的C末端移到N末端研究结构域顺序对结合活力的影响。虽然包含额外的二硫键的分子的结合活力相对于具有这些键的之前构建的双抗体分子没有改变，但是将Fc或铰链-Fc结构域转移到构成双抗体的‘较重’的多肽链的N末端令人惊奇地提高了双特异分子对其靶抗原中之一或二者的结合亲和力或亲合力。
材料和方法 
多肽分子的构建和设计：设计核酸表达载体以产生实施例6.2中提供的构建体5，6和8的修饰形式。除了Fc结构域或铰链-Fc结构域分别被从多肽链的C末端转移到N末端之外，构建体9(SEQ ID NO：19)和构建体10(SEQ ID NO：20)(都被图示地示出在图13中)与构建体8和6类似。 另外，所使用的所有Fc结构域都是野生型IgG1的Fc结构域。除了C末端被设计为还包含序列FNRGEC(SEQ ID NO：23)之外，构建体11SEQ ID NO：21(被图示地示出在图14中)与来自实施例6.1的构建体2类似。除了Fc结构域还包含铰链区之外，构建体12SEQ ID NO：22(被图示地示出在图14中)与来自实施例6.2的构建体5类似。另外，对于构建体11和12，2B6VL结构域和2B6VH结构域包含单氨基酸修饰(分别是G105C和G44C)使得每个结构域中的甘氨酸被半胱氨酸取代。
PCR和表达载体的构建：所有PCR和PCR产物纯化方案如实施例6.1和6.2中所述。
重叠PCR：使用实施例6.1和实施例6.2中描述的方法构建、扩增和纯化最终产物。
如前所述地将最终产物克隆到pCIneo哺乳动物表达载体(Promega，Inc.)中。如表15中标示的，命名了编码构建体的质粒：
表15.质粒构建体
编码构建体 质粒名称 插入物
9 pMGX0719 Hu铰链/Fc-hu3G8VL-hu2B6VH
10 pMGX0718 HuFc-hu2B6VL-hu3G8VH
11 pMGX0716 Hu2B6VL(G/C)-hu3G8VH-hu铰链FC
12 pMGX0717 Hu3G8VL-hu2B6VH(G/C)-FNRGEC
多肽/双抗体的表达：如6.1节中所描述的，使用Lipofectamine2000对HEK-293细胞进行三次单独的共转染：分别编码构建体1和构建体9的pMGX0669和pMGX0719；分别编码构建体1和构建体10的pMGX0669和pMGX0718；和分别编码构建体11和构建体12的pMGX0617和pMGX0717。这些质粒的共转染被设计成导致对FcγRIIB和FcγRIIIA二者具免疫特异性的具有IgG样结构的四价双特异性双抗体(CBD)的表达。培养三天后，收集条件培养基。使用纯化的Fc作为标准通过抗IgG Fc ELISA对条件培养基中分泌产物的量定量。然后基于定量对样品中产物的浓度标准化，并将标准化的样品用于其余的测定。
ELISA：如上文所述地通过夹心ELISA测定分泌到培养基中的双抗体分子的结合。除非被指出，CD32B被用来包被平板，即作为靶蛋白，且HRP-偶联的CD16用作探针。
蛋白质印迹：通过非还原条件下的SDS-PAGE分析来自上述3次共转染的约15ml条件培养基。用Simply Blue Safestain(Invitrogen)对一块凝胶染色并使用标准的转移方法将另一块相同的凝胶转移到PVDF膜(Invitrogen)上。转移后，用1X PBS中的5％脱脂乳封闭膜。然后在温和搅拌下，在10ml的在1XPBS/0.1％吐温20中的2％脱脂乳中的1∶8,000稀释的HRP偶联的山羊抗人IgG1H+L中室温孵育膜1小时。接下来用1XPBS/0.3％吐温20洗涤两次，每次5分钟，然后室温20分钟，用ECL蛋白质印迹检测系统(Amersham Biosciences)根据厂家说明对膜显色。胶片在X射线处理器中显影。
结果
通过SDS-PAGE(在非还原条件下)分析和蛋白质印迹分析(使用抗IgG作为探针)分析来自包含构建体1和9、构建体1和构建体10，以及构建体11和12的重组表达系统的条件培养基。蛋白质印迹表明来自包含构建体11和12或包含构建体9和1的系统的产物主要形成约150kDa的单一分子物质(分别是图14的泳道3和2)。这两种产物都具有在构成双抗体的‘较轻’和‘较重’的链之间的构建的内部二硫键。相比而言，不含在‘较轻’和‘较重’的链之间的构建的内部二硫键的由构建体10和1形成的分子形成至少两种分子量为～75和～100kDa的分子物质(图14，泳道1)。
不管蛋白印迹分析的结果，发现3种产物中的每一个都能够结合CD32A和CD16(图15)。令人惊奇的是，相对于包含C末端铰链-Fc结构域的产物(由构建体11和12形成)，来自其中Fc(或Fc铰链)结构域在包含Fc的多肽链(即，‘较重’的链)的N末端的两种系统的产物(构建体9+1和构建体10+1)表现出增强的对其靶肽中之一或二者(即CD32B和/或CD16)的亲和力和/或亲合力。
6.4内部/外部裂解位点对多蛋白前体的加工和共价双特异双抗体的表达的影响；包含人IgGλ链和铰链结构域的部分的双特异性双抗体的设计和表征
如本文所述，本发明的双抗体或双抗体分子的单条多肽链可表达为单一的多蛋白前体分子。通过构建编码被内部裂解位点，特别地，弗林蛋白 酶裂解位点隔开的CBD的第一和第二多肽链的核酸，测试实施例6.1-6.3中描述的重组系统从该多蛋白前体合适地加工和表达功能性CBD的能力。从包含多蛋白前体分子的重组系统分离功能性CBD。
如在实施例6.3中所讨论的，发现来自人γ轻链的6个C末端氨基酸FNRGEC(SEQ ID NO：23)的添加稳定双抗体的形成-可能通过包含SEQ ID NO：23的结构域和包含Fc结构域或铰链-Fc结构域的那些结构域之间的增强的链间相互作用。在CBD中测试该λ链/Fc样相互作用的稳定作用，其中任一多肽链都不含Fc结构域。双抗体的一条多肽链被构建为在其C末端包含SEQ ID NO：23；其配偶体多肽链被构建为包含衍生自IgG的铰链结构域的氨基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO：77)。该CBD与由构建体1和2(来自实施例6.1)构成的CBD的比较表明包含衍生自铰链结构域和λ链的结构域的CBD显示出稍高的对其靶表位中之一或二者的亲和力。
材料和方法 
多肽分子的构建和设计：多蛋白前体：核酸表达载体被设计为产生都被图示地呈现在图17中的2种多蛋白前体分子。构建体13(SEQ ID NO：95)从多肽链的N末端起包含，3G8的VL结构域、2.4G2(其结合mCD32B)的VH结构域、弗林蛋白酶裂解位点、2.4G2的VL结构域和3G8的VH结构域。编码构建体13的核苷酸序被提供在SEQ ID NO：96中。构建体14(SEQ ID NO：97)(图17)从多肽链的N末端起，包含3G8的VL结构域、2.4G2(其结合mCD32B)的VH结构域、弗林蛋白酶裂解位点、FMD(口蹄疫病毒蛋白酶C3)位点、2.4G2的VL结构域和3G8的VH结构域。编码构建体14的核苷酸序被提供在SEQ ID NO：98中。
设计核酸表达载体以产生实施例6.1中提供的构建体1和2的修饰形式。除了构建体15的C末端包含氨基酸序列FNRGEC(SEQ ID NO：23)之外，构建体15(SEQ ID NO：99)(图17)与实施例6.1中提供的构建体1(SEQ ID NO：9)类似。编码构建体15的核酸序列被提供在SEQ ID NO：100中。除了构建体16的C末端包含氨基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO：77)之外，构建体16(SEQ ID NO：101)(图17)与实施例6.1中提供的构建体2类似。编码构建体16的核酸序列被提供在EQ ID NO：102中。
PCR和表达载体的构建：所有PCR和PCR产物纯化方案如实施例6.1和6.2中所述。
重叠PCR：使用实施例6.1和6.2中描述的方法用合适的引物构建、扩增和纯化最终产物。
如前所述的，将最终产物克隆到pCIneo哺乳动物表达载体(Promega，Inc.)中。如表16中标示的，命名了编码构建体的质粒：
表16.质粒构建体
多肽/双抗体的表达：如6.1节所描述的，使用Lipofectamine2000对HEK-293细胞进行一次转染和一次共转染：单转染：编码构建体13的pMGX0750；和共转染：分别编码构建体15和构建体16的pMGX0752和pMGX0753。培养三天后，收集条件培养基，如所述的亲和纯化分泌的产物。
ELISA：通过如上文描述的夹心ELISA测定分泌到培养基中的双抗体分子的结合。鼠CD32B被用来包被平板，即作为靶蛋白，且HRP-偶联的CD16A用作针对构建体15和16的共转染产物的探针。mCD32B用作靶蛋白，且生物素-偶联的CD16A用作针对包含构建体13的重组系统的探针。
结果
通过夹心ELISA分析来自包含构建体13的重组表达系统的条件培养基。ELISA测定测试CBD结合mCD32B和/或CD16中的任何一种或两种的特异性(图18)。CD32B用作靶抗原而CD16A用作第二探针。ELISA中的阳性信号表明从多蛋白前体产生的异二聚体h2.4G2-h3G8CBD具有针对两种抗原的特异性。
相似地，在ELISA测定中测试通过共转染编码构建体15和16的载体产生的纯化后的产物并与包含构建体1和2的产物比较(实施例6.1)。CD32B用作靶抗原而CD16A用作第二探针。发现与包含构建体1和2的 产物一样，构建体15和16的产物能够同时结合CD32B和CD16A。实际上，构建体15和16的产物显示出稍微增强的对靶抗原即，CD32B或CD16A中的一个或两个的稍微增强的亲和力。这可能是由于通过λ链区域FNRGEC(SEQ ID NO：23)和铰链区VEPKSC(SEQ ID NO：77)的相互作用所提供的链间缔合的增加的稳定性和或保真性(相对于野生型VH-VL结构域的相互作用)，这在包含构建体1和2的产物中不存在。
6.5 使用双亲和力再靶向试剂(“DART”)将多重亲和力联系在一起
本发明的一个方面涉及新型双亲和力再靶向试剂(“DART”)及将多重亲和力联系在一起的新方法。“DART”可以是单特异性、双特异性、三特异性的等，从而能够同时结合一个、两个、三个或更多个不同的表位(其可以是相同或不同抗原的表位)。另外“DART”可以是单价、二价、三价、四价、五价、六价的等，从而能够同时结合一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个分子。如图35所示，DART的这两个属性可以结合到一起，例如以产生为四价的双特异性抗体等等。
一种进展是开发了具有对原型免疫受体huCD32B的亲和力，以及对半抗原荧光素的亲和力的DART。该DART称为“2B6/4420”，用作通用衔接子，能够将huCD32B和与荧光素-偶联的结合配偶体相互作用的分子共连接在一起。CD32B是具有由于与活化信号传导免疫复合体簇集而猝灭活化信号的能力的Fc受体。在其最初的实施中，该技术允许快速地筛选与huCD32B簇集的多种生物靶而不需要产生新的DART构建体。可将2B6/4420与针对细胞表面受体的荧光素化的抗体简单地混合并从而模拟具有对该受体的亲和力的DART的作用(图20)。另外，该试剂允许不易表达或制备的亲和试剂的有效连接，允许人们克服技术缺陷。包含2B6/4420的DART作为研究工具且还作为临床候选药物明显是有用的。从HEK293细胞产生的2B6/4420可在ELISA测定中同时结合CD32B和荧光素。另外，它可通过经与CD79共连接将CD32B召集到BCR复合体来抑制细胞增殖。DART的2B6臂可被不同的抗体序列或具有其他相关特异性的结合序列所取代。
材料和方法： 
质粒构建体：2B6/4420衍生自人源化的2B6Mab(hu2B6，MGA321)和嵌合小鼠Fv/人Fc形式的抗荧光素Mab4420的序列。完整组装的DART由两条多肽链组成，导致两个Fv区域的共价连接。第一个多肽链由以下组成：分泌信号序列，其后面是被产生为与4420VH的融合蛋白的hu2B6VL，4420VH与hu2B6VL被由氨基酸残基GGGSGGGG组成的接头隔开。衍生自κ轻链C末端的序列FNRGEC被附接到该多肽链的C末端。另一条多肽由信号序列-4420VL-GGGSGGGG-hu2B6VH组成，衍生自人IgG1Fd片段的C末端的序列VEPKSC附接在C末端。两条链中的半胱氨酸形成二硫键，将两条多肽链共价连接在一起(图20)。从现有质粒PCR扩增编码所描述的多肽的DNA序列，通过重叠PCR组合并在NheI和EcoRI位点之间克隆到pCIneo(Promega)中。最后，之前使用与上述方法相似的方法构建的具有对huCD32B和huCD16的亲和力的DART(2B6/3G8)用作对照。
抗体：鼠单克隆抗体抗人CD79b、CB3.1和CB3.2(杂交瘤)从Dr.Cooper MD，位于Birmingham的University of Alabama，Birmingham AL.处获得。根据厂家说明(Pierce，Rockford IL)用异硫氰酸荧光素(FITC)标记CB3.1和CB3.2。Fc片段特异性的山羊抗小鼠(GAM)IgG的F(ab’)2片段从Jackson Laboratories(West Grove，PA)获得。抗huCD32B小鼠Mab即3H7在内部制备并纯化。山羊抗2B6Fv通过用hu2B6完整抗体免疫山羊并针对hu2B6的Fv区域亲和纯化产生。HuIgG、FITC-huIgG和HRP-抗-小鼠IgG从Jackson Immunoresearch获得。HRP-抗山羊从Southern Biotech获得。
DART表达：使用Lipofectamine2000(Invitrogen)根据厂家说明将编码每条链的质粒共转染到293H细胞(Invitrogen)中。以三天为间隔收集分泌的蛋白质3-4次并通过针对固定的CD32B可溶性形式的液相层析进行纯化。
ELISA：2B6/420或2B6/3G8DART被捕获在包被有FITC-标记的蛋白S(Novagen)、人IgG或FITC-huIgG的MaxiSorp平板(Nalge Nunc)上。检测通过结合可溶性CD32B的外结构域，接下来是3H7(CD32B特异性的小鼠单克隆抗体)且最后是抗-小鼠-HRP而进行。可替代地，检测通过结合山 羊抗-2B6Fv多克隆亲和纯化的抗血清，接下来是抗-山羊-HRP而进行。使用比色TMB底物(BioFX)检测HRP活性并在VersaMax ELISA读板机上读数。
B细胞纯化和增殖测定：使用来自健康供体的血液通过Ficoll/Paque Plus(Amersham Pharmacia Biotech，UK)梯度法分离外周血单核细胞。使用Dynal B Cell Negative Isolation Kit(Dynal Biotechnology Inc.，NY)根据厂家说明分离B淋巴细胞。如通过FACS分析估计的，所分离的B细胞(CD20+)的纯度大于90％。对于增殖测定，将纯化的B细胞以每孔1x105个细胞的密度以200μl终体积接种在平底96孔微量滴度板上的完全RPMI1640培养基中并在37℃，5％CO2中，在存在或不存在抗体和双抗体下孵育48小时。然后加入1μCi/孔的[3H]胸苷(Perkin Elmer，Wellesley，MA)并在收获前继续培养另外的16-18小时。通过液体闪烁计数测量[3H]胸苷掺入。
结果
为了证实2B6/4420DART是有活性的且是特异性的，进行了2次ELISA实验。首先，将2B6/4420或2B6/3G8(作为阴性对照)结合到已被包被到ELISA平板上的荧光素-偶联的蛋白(S-蛋白)上。下一步，通过可溶性CD32B接合DART的2B6臂。通过针对CD32B的不与2B6的表位重叠的表位的另一种抗体，接下来是HRP-偶联的二抗来检测结合。2B6/4420DART能够同时结合荧光素和CD32B，2B6/3G8则不能(图21，图A)。当DART被捕获在包被有可溶性CD32B的平板上并通过hu2B6特异性抗体检测结合时，两种DART显示出良好的结合。为证实2B6/4420DART能够结合偶联到人IgG上的荧光素(考虑到这是初步使用该试剂的环境)，未标记或标记了荧光素的HuIgG被结合到ELISA平板上并用来捕获2B6/4420。再一次地，2B6/3G8用作阴性对照。使用Hu2B6Fv特异性抗体检测结合。2B6/4420DART清楚地结合FITC-HuIgG，但是不结合未标记的HuIgG，表明该DART能够结合偶联到抗体的荧光素且不明显地结合单独的抗体。如所预料的，在这些环境中的任一种环境下都没有检测到的2B6/3G8DART的结合。
进行实验以证实2B6/4420DART能够充当可在基于细胞的测定环境 中对信号传导产生影响的双亲和力试剂。已表明CD32B与BCR的共聚集抑制B细胞的活化。探索了2B6/4420DART将CD32B和包被有标记了荧光素的αCD79b抗体的BCR共接合在一起并触发对细胞增殖的抑制的能力。B细胞被从人血中负选择并通过用渐增浓度的小鼠抗-人CD79b-FITC标记的克隆CB3.1和CB3.2处理，并通过加入Fc特异性GAM的F(ab’)2片段作为第二试剂以交联BCR，连同固定浓度(5μg/mL)的2B6/4420DART或等量的2B6/3G8DART(一种不靶向荧光素的分子，因此用作对照)来活化。在不存在DART或存在对照2B6/3G8DART的情况下，被测量为[3H]-胸苷掺入的细胞增殖随着单克隆抗-CD79b-FITC活化剂的浓度的增加而增加。2B6/4420DART的存在在抗人CD79b-FITC的所有浓度下致使B细胞增殖严重减少(图22，图A和B及图23，图A)。
当包被有未标记的CB3.2并使用相同的实验条件激活的B细胞用2B6/4420DART处理时未观察到对增殖的抑制，证明其靶特异性(图23，图B)。这些数据证实2B6/4420DART能够交联CD32B和BCR并传递能够阻断抗原-受体-诱导的细胞活化的抑制信号。
6.6 针对表达CD32B的B细胞恶性肿瘤的DART免疫治疗
目前，B细胞恶性肿瘤使用抗-CD20抗体来治疗。但是一些B细胞恶性肿瘤不表达CD20或变得耐受Rituxan。本发明的DART提供了能够克服与抗-CD20抗体相关的问题的替代免疫治疗。
MGD261是结合hCD32B(通过h2B6抗体)及hCD16A和hCD16B(通过h3G8抗体)的双亲和力再靶向(DART)分子。
在mCD32-/-hCD16A+C57Bl/6、mCD32-/-hCD32B+C57Bl/6和mCD32-/-hCD16A+hCD32B+C57Bl/6中测试MGD261的功效(B细胞去除)和安全性。在该重复剂量实验中，小鼠接受6次IV注射(一周两次持续三周)。通过FACS监测B细胞去除。通过笼边观察监测安全性。
数据表明MGD261能够去除双转基因小鼠中的B细胞而不引起任何明显的副作用。
数据：在第0、3、7、10、14和17天时对来自MacroGenics繁殖群的 mCD32-/-hCD16A+C57Bl/6、mCD32-/-hCD32B+C57Bl/6和mCD32-/-hCD16A+hCD32B+C57Bl/6小鼠IV注射MGD261(10、3、1或0.3mg/kg)或无关抗体(hE1610mg/kg)。在第-19(取血前)、4、11、18、25和32天收集血液以便FACS分析。每周三次地记录动物的健康和活动。
设计：
FACS分析方法：在施用h2B6-h3G8前的第18天和处理后的第4、11、18、25和32天收集全血样品。分析血液样品以通过基于FACS的测定确定h2B6-h3G8对B细胞计数的影响。通过使用从Beckman Coulter获得的FlowCount珠，对B细胞、T细胞、PMN计数使用非洗涤方案。该分析中使用的抗体的组是：对于PMN为1A8-FITC，对于T细胞为CD3-PE，对于B细胞为CD19-APC及对于总的白细胞为CD45-PerCP。
结果
用hE16或MGD261(以任何浓度)处理的小鼠在实验过程中的任何时间没有显示出任何不适的迹象。
在hCD16A和hCD32B双转基因小鼠中观察到B细胞去除。双抗体h2B6-3G8接合表达hCD16A的效应细胞和表达hCD32B的B细胞；这些接合是B细胞杀伤所需要的。未在单转基因小鼠中观察到B细胞去除(图24)。在研究期间没有T细胞和PMN水平的明显变化。
作为对本发明的替代免疫治疗剂的进一步证实，构建了称为“2.4G2-3G8DB”的MGD261的代替物。2.4G2-3G8DB是结合mCD32B(通过2.4G2抗体)及hCD16A和hCD16B(通过h3G8抗体)的双亲和力再靶向(DART)分子。
在mCD16-/-、mCD16-/-hCD16A+C57Bl/6、mCD16-/-hCD16B+和mCD16-/-hCD16A+hCD16B+小鼠中测试2.4G2-3G8DB的功效(B细胞去除)和安全性。在该重复剂量实验中，小鼠接受9次IP注射(一周三次持续三周)。通过FACS监测B细胞去除。通过笼边观察监测安全性。
数据表明2.4G2-3G8DB能够去除hCD16转基因小鼠中的B细胞而不引起任何明显的副作用。
数据：在第0、2、4、7、9、11、14、16和18天时对来自MacroGenics繁殖群的mCD16-/-、mCD16-/-hCD16A+C57B1/6、mCD16-/-hCD16B+和mCD16-/-hCD16A+hCD16B+小鼠IP注射2.4G2-3G8DB(75μg/小鼠)或PBS。在第-10(取血前)、4、11和18天收集血液以便FACS分析。每周三次地记录动物的健康和活动。
FACS分析方法：在施用2.4G2-3G8前的第10天和开始治疗后的第4、11和18天收集全血样品。分析血液样品以通过基于FACS的测定确定2.4G2-3G8对B细胞计数的影响。通过使用从BD Immunocytometry System获得的TruCOUNT管，对B细胞、T细胞、PMN计数使用非洗涤方案。该分析中使用的抗体的组是对于PMN1为1A8-FITC，对于T细胞为CD3-PE，对于B细胞为CD19-APC及对于总的白细胞为CD45-PerCP。
结果
用hE16或2.4G2-3G8DB处理的小鼠在实验过程中的任何时间没有显示出任何不适的迹象。
在mCD16-/-hCD16A+或mCD16-/-hCD16A+hCD16B+小鼠中观察到B细胞去除，但未在mCD16-/-小鼠中观察到。这些数据表明携带hCD16A的效应细胞是B细胞杀伤所需要的(图25)。在研究期间没有T细胞和PMN水平的明显变化。
静脉内(IV)模型：使用人肿瘤细胞系Raji的静脉内(IV)模型测试MGD261的抗肿瘤活性。Raji是表达hCD32B的人伯基特淋巴瘤细胞系。当被静脉注射到mCD16-/-、hCD16A+、RAG1-/-小鼠中时，肿瘤细胞定位到脊柱并导致后腿瘫痪。
数据表明MGD261能够阻碍mCD16-/-、hCD16A+、RAG1-/-小鼠中Raji肿瘤细胞在体内的生长。数据表明MGD261可用于治疗人类的表达CD32B的B细胞恶性肿瘤。
数据：在第0天对来自MacroGenics繁殖群的12-20周龄的mCD16-/-、hCD16A+、RAG1-/-C57Bl/6小鼠IV注射5x106的Raji细胞。在第6、9、13、16、20、23、27和30天时，另外用250、25或2.5ug的MGD261或用PBS(阴性对照)腹膜内(IP)处理小鼠。然后每天观察小鼠并一周两次地记录体重。处死发展后腿瘫痪的小鼠。
结果：用PBS处理的小鼠在25天和50天之间死亡。用MGD261处理的小鼠至少存活到第90天(图26)。增加的存活率是统计学上显著的。使用Logrank检验比较存活曲线得出χ2为96.46(df9；P值＜0.0001)。
6.7 DART在原核细胞中的表达
进行实验以证实在非哺乳动物宿主中产生DART的能力。因此，用DART表达质粒转化大肠杆菌，并检测DART表达。
材料和方法： 
质粒构建：3G8是针对HuCD16的人源化单克隆抗体。此处描述的DART由两条共价连接的链组成，其每条具有VL，后面为分隔物，然后是VH，后面为处于良好的环境中以与相对的链形成二硫键的Cys。从现有的真核细胞表达构建体PCR扩增编码3G8VL-GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly(SEQ ID NO：10)-3G8VH-LeuGlyGlyCys的 DART序列并用Nco I和EcoR I消化。靶载体是pET25b(+)(Novagen)，其包含待分泌在大肠杆菌中的pelB前导序列。在插入3G8/3G8DART序列之前，对所述载体作了如下修饰：首先，T7启动子被较低活性的lac启动子取代以有利于蛋白质在其控制下的虽然水平较低但可溶性的表达。另外，引入2个点突变以去除存在于多克隆位点(MCS)的起点处的两个内部Met密码子，以利于在存在于pelB前导序列开始处的Met起始。通过该构建体产生的DART由具有相同特异性，即HuCD16的两个V-区臂组成。
表达：用pET25b(+)T7-lac+3G8/3G8质粒转化BL21DE3细胞(Novagen)并使用amp-抗性的集落接种肉汤培养物。当培养物达到0.5OD600单位时，加入0.5mM IPTG来诱导表达。使培养物在30℃下生长2小时并收集无细胞培养基。
纯化：用亲和层析和尺寸排阻层析在两步骤方法中纯化3G8/3G8DART。使用亲和层析从条件培养基中捕获DART。特别地，CD16A被偶联到CNBr活化的Sepharose4B(GE Healthcare)上。在上样前将CD16A-Sepharose树脂在20mM Tris/HCl，pH8.0中平衡。上样完成后，用平衡缓冲液洗涤树脂，然后用50mM甘氨酸pH3.0洗脱结合的DART之前。立即用1M Tris/HCl pH8.0中和所洗脱的DART并使用离心型浓缩器(Vivaspin20，10k MWCO PES，VivaScience Inc.)浓缩。使用平衡在PBS中的Superdex200柱(GE Healthcare)通过尺寸排阻层析进一步纯化所浓缩的DART。
结果
通过CD16A Sepharose柱处理1.7升的培养大肠杆菌的条件培养基。DART的产量是0.12mg。通过SDS-PAGE和SEC对纯化的DART的分析表明与哺乳细胞(CHO)表达的对照DART的可比性(图27)。
大肠杆菌表达的h3G8-h3G8DART结合ELISA：使用ELISA测量h3G8-h3G8DART在大肠杆菌中的表达。在碳酸盐缓冲液中，在4℃下将50μl/孔的2μg/ml的抗-h3G8Fv特异性抗体2C11过夜包被在96-孔Maxisorp平板上。在加入受试DART前，用PBS-T(PBS，0.1％吐温20)洗涤平板三次并然后在室温下通过PBS-T中的0.5％BSA封闭30分钟。在 封闭期间，大肠杆菌表达的h3G8-h3G8DART、h2B6-h3G8DART和h2B6-h2B6DART(阴性对照)在PBST/BSA中被稀释到1μg/ml和0.3μg/ml。将50μl/孔的稀释的DART加至每个孔。在室温下孵育平板1小时。用PBS-T洗涤三次后，将50μl/孔0.1μg/ml生物素化的sCD16-Fc融合蛋白加入平板。在室温孵育平板1小时。用PBS-T洗涤三次后，使用50ul/孔的1∶5000稀释的HRP偶联的链霉亲和素(Amersham Pharmacia Biotech)检测并室温孵育1小时。用PBS-T洗涤平板三次并用80μl/孔的TMB底物显色。孵育5分钟后，通过40μl/孔的1％H2SO4终止反应。使用96-孔读板机和SOFTmax软件读取OD450nm。使用GraphPadPrism3.03软件对读出值作图(图28)。
6.8 DART-诱导的人B-细胞死亡
将人PBMC与以下分子一起孵育过夜：CD16-CD32B-hu3G8-hu2b6(如上所述)；ch2B6-aglyc-去糖基化的嵌合2B6抗体(被描述在共同待决的美国专利申请序列号11/108,135，被公布为US2005/0260213，通过引用并入本文)和CD16-CD79。CD16-CD79的DNA和所编码的蛋白质序列如下：
H3G8VL-CB3.1VH
核苷酸序列(SEQ ID NO：226)：
gacatcgtga tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga  50 
gagggccacc atcaactgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg 100 
atagttttat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc 150 
ctcatctata ctacatccaa tctagaatct ggggtcccag acaggtttag 200 
tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcagc agcctgcagg 250 
ctgaggatgt ggcagtttat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300 
acgttcggac aggggaccaa gcttgagatc aaaggaggcg gatccggagg 350 
cggaggccag gtccaactgc agcagcctgg ggctgagctg gtgaggcctg 400 
gggcttcagt gaagctgtcc tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc 450 
tactggatga actgggtgaa gcagaggcct ggacaaggcc ttgaatggat 500 
tggtatggtt gatccttcag acagtgaaac tcactacaat caaatgttca 550 
aggacaaggc cacattgact gttgacaaat cctccagcac agcctacatg 600 
cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag 650 
agctatgggc tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctcagttg 700 
agcccaaatc ttgt                                        714 
氨基酸序列(SEQ ID NO：227)：
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL  50 
LIYTTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSNEDPY 100 
TFGQGTKLEI KGGGSGGGGQ VQLQQPGAEL VRPGASVKLS CKASGYTFTS 150 
YWMNWVKQRP GQGLEWIGMV DPSDSETHYN QMFKDKATLT VDKSSSTAYM 200 
QLSSLTSEDS AVYYCARAMG YWGQGTSVTV SSVEPKSC              238 
CB3.1VL-h3G8VH
核苷酸序列(SEQ ID NO：228)：
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca  50 
accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100 
gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150 
cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200 
cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250 
aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300 
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350 
aggcggaggc caggttaccc tgagagagtc tggccctgcg ctggtgaagc 400 
ccacacagac cctcacactg acttgtacct tctctgggtt ttcactgagc 450 
acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt cagcctcccg ggaaggctct 500 
agagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgacaagcgc tataatccag 550 
ccctgaagag ccgactgaca atctccaagg atacctccaa aaaccaggta 600 
gtcctcacaa tgaccaacat ggaccctgtg gatactgcca catactactg 650 
tgctcaaata aaccccgcct ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg 700 
tcactgtgag ctcattcaac aggggagagt gt                    732 
氨基酸序列(SEQ ID NO：229)：
DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN  50 
RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100 
LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS 150 
TSGMGVGWIR QPPGKALEWL AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSKNQV 200 
VLTMTNMDPV DTATYYCAQI NPAWFAYWGQ GTLVTVSSFN RGEC       244 
通过FACS分析测定凋亡，表示为B细胞的PI+膜联蛋白-V+群(CD20+细胞)占总的FSC/SSC未门控的群的百分比(图29)。
6.9 8B5-CB3.1DART
8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC
通过使用H9和lgh630R作为引物，ch8B5Lc作为模板扩增8B5VL。通过使用lgh628F和lgh630R作为引物，ch8B5Hc作为模板扩增CB3.1VH。在引物lgh630R和lgh628F中并入接头序列。c末端接头和终止密码子被并入到lgh629R引物中。凝胶纯化PCR产物用并以等摩尔比混合在一起，然后通过使用H9和lgh629R作为引物扩增。然后用NheI/EcoRI限制性内切酶消化重叠PCR产物，并克隆到pCIneo载体中。
CB3.1VL-8B5VH-FNRGEC
通过使用在FR4处与8B5VL共有相同的序列的H9和lgh630R作为引 物，和chCB3.1Lc作为模板扩增CB3.1VL。通过使用lgh631F和lgh640R作为引物，和ch8B5Hc作为模板扩增8B5VH。在引物lgh630R和lgh631F中并入接头序列。C末端接头和终止密码子被并入到lgh640R引物中。凝胶纯化PCR产物并以等摩尔比混合在一起，然后通过使用H9和lgh640R作为引物扩增。然后用NdeI/EcoRI限制性核酸内切酶消化重叠PCR产物，并克隆到pCIneo载体中。
抗-Flag标签-8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC
通过重叠PCR将抗-Flag标签插入到信号序列和8B5VL之间。通过使用H9和lgh647R作为引物和ch8B5Lc作为模板扩增信号序列和Flag标签。通过使用lgh647F和lgh629R作为引物，和8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC作为模板重新扩增8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC。凝胶纯化PCR产物并以等摩尔比混合在一起，然后通过使用H9和lgh629R作为引物扩增。然后用NdeI/EcoRI限制性核酸内切酶消化重叠PCR产物，并克隆到pCIneo载体中。
8B5VL-CB3.1VH-LGGC
为在8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC构建体中产生不同的C末端接头，通过使用H9和lgh646R作为引物重新扩增该构建体。C末端LGGC接头被整合到lgh646R引物中。然后用NdeI/EcoRI限制性核酸内切酶消化PCR产物，并克隆到pCIneo载体中。
CB3.1VL-8B5VH-LGGC
同样的策略用来创建CB3.1VL-8B5VH-LGGC。C末端LGGC接头被整合到lgh648R引物中且CB3.1VL-8B5VH-FNRGEC被用作模板。然后用NdeI/EcoRI限制性核酸内切酶消化PCR产物，并克隆到pCIneo载体中。
抗-Flag标签-8B5VL-CB3.1VH-LGGC
同样的策略用来创建抗-Flag标签-8B5VL-CB3.1VH-LGGC。C末端LGGC接头被整合到lgh648R引物中且抗-Flag标签-8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC被用作模板。然后用NdeI/EcoRI限制性核酸内切酶消化PCR产物，并克隆到pCIneo载体中。
8B5-CB3.1-VEPKSC核苷酸序列(SEQ ID NO：230)：
gacattcaga tgacacagtc tccatcctcc ctacttgcgg cgctgggaga  50 
aagagtcagt ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 
gctggcttca gcagaaacca gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc 150 
gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa aggttcagtg gcagtgagtc 200 
tgggtcagat tattctctca ccatcagcag tcttgagtct gaagattttg 250 
cagactatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggtgct 300 
gggaccaagc tggagctgaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 
ccaactgcag cagcctgggg ctgagctggt gaggcctggg gcttcagtga 400 
agctgtcctg caaggcttct ggctacacct tcaccagcta ctggatgaac 450 
tgggtgaagc agaggcctgg acaaggcctt gaatggattg gtatggttga 500 
tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacaaggcca 550 
cattgactgt tgacaaatcc tccagcacag cctacatgca gctcagcagc 600 
ctgacatctg aggactctgc ggtctattac tgtgcaagag ctatgggcta 650 
ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcagttgag cccaaatctt 700 
gt                                                     702 
8B5-CB3.1-VEPKSC氨基酸序列(SEQ ID NO：231)：
DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEIS GYLSWLQQKP DGTIKRLIYA  50 
ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYCLQ YFSYPLTFGA 100 
GTKLELKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWMN 150 
WVKQRPGQGL EWIGMVDPSD SETHYNQMFK DKATLTVDKS SSTAYMQLSS 200 
LTSEDSAVYY CARAMGYWGQ GTSVTVSSVE PKSC                  234 
CB3.1-8B5-FNRGEC核苷酸序列(SEQ ID NO：232)：
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca  50 
accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100 
gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150 
cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200 
cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250 
aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300 
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350 
aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 
ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450 
gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500 
ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 
agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600 
gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650 
ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700 
tctcctcgtt caacagggga gagtgt                           726 
CB3.1-8B5-FNRGEC氨基酸序列(SEQ ID NO：233)：
DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN 50 
RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100 
LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEASGFTFS 150 
DAWMDWVRQS PEKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDSKSS 200 
VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA LGLDYWGQGT TLTVSSFNRG EC         242 
8B5VL-CB3.1VH-LGGC
通过使用H9和gh694R作为引物，ch8B5Lc作为模板扩增8B5VL。 通过使用lgh695F和lgh696R作为引物，ch8B5Hc作为模板扩增8B5VH。在引物lgh694R和lgh695F中并入接头序列。通过使用lgh355F和lgh366R作为引物，ch8B5Hc作为模板扩增HuIgG1Fc。凝胶纯化PCR产物并以等摩尔比混合在一起，然后通过使用H9和lgh366R作为引物扩增。然后用NdeI/EcoRI限制性核酸内切酶消化重叠PCR产物，并克隆到pCIneo载体中。
8B5VL-CB3.1VH-LGGC核苷酸序列(SEQ ID NO：234)：
gacattcaga tgacacagtc tccatcctcc ctacttgcgg cgctgggaga  50 
aagagtcagt ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 
gctggcttca gcagaaacca gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc 150 
gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa aggttcagtg gcagtgagtc 200 
tgggtcagat tattctctca ccatcagcag tcttgagtct gaagattttg 250 
cagactatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggtgct 300 
gggaccaagc tggagctgaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 
ccaactgcag cagcctgggg ctgagctggt gaggcctggg gcttcagtga 400 
agctgtcctg caaggcttct ggctacacct tcaccagcta ctggatgaac 450 
tgggtgaagc agaggcctgg acaaggcctt gaatggattg gtatggttga 500 
tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacaaggcca 550 
cattgactgt tgacaaatcc tccagcacag cctacatgca gctcagcagc 600 
ctgacatctg aggactctgc ggtctattac tgtgcaagag ctatgggcta 650 
ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcactggga ggctgc     696 
8B5VL-CB3.1VH-LGGC氨基酸序列(SEQ ID NO：235)：
DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEIS GYLSWLQQKP DGTIKRLIYA  50 
ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYCLQ YFSYPLTFGA 100 
GTKLELKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWMN 150 
WVKQRPGQGL EWIGMVDPSD SETHYNQMFK DKATLTVDKS SSTAYMQLSS 200 
LTSEDSAVYY CARAMGYWGQ GTSVTVSSLG GC                    232 
CB3.1-8B5-LGGC核苷酸序列(SEQ ID NO：236)：
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca  50 
accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100 
gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150 
cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200 
cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250 
aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300 
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350 
aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 
ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450 
gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500 
ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 
agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600 
gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650 
ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700 
tctcctcgct gggaggctgc                                  720 
CB3.1-8B5-LGGC氨基酸序列(SEQ ID NO：237)：
DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN  50 
RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100 
LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEASGFTFS 150 
DAWMDWVRQS PEKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDSKSS 200 
VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA LGLDYWGQGT TLTVSSLGGC            240 
引物：
Lgh628F(SEQ ID NO：238)：
ggaggcggat ccggaggcgg aggccaggtc caactgcagc agcctgg    47 
Lgh629R(SEQ ID NO：239)：
tttgaattct aacaagattt gggctcaact gaggagacgg tgactgagg  49 
Lgh630R(SEQ ID NO：240)：
gcctccgcct ccggatccgc ctcctttcag ctccagcttg gtccc      45 
Lgh631F(SEQ ID NO：241)：
ggaggcggat ccggaggcgg aggcgaagtg aagcttgagg agtctgg    47 
Lgh640R(SEQ ID NO：242)：
tttgaattct aacactctcc cctgttgaac gaggagactg tgagagtgg  49 
Lgh644R(SEQ ID NO：243)：
tttgtcgtca tcatcgtctt tgtagtcgga gtggacacct gtggagag   48 
Lgh646R(SEQ ID NO：244)：
tttgaattct agcagcctcc cagtgaggag acggtgactg ag         42 
Lgh647F(SEQ ID NO：245)：
caaagacgat gatgacgaca aagacattca gatgacacag tctcc      45 
Lgh648R(SEQ ID NO：246)：
tttgaattct agcagcctcc cagcgaggag actgtgagag tgg        43 
表达：使用Lipofectamine2000(Invitrogen)将编码构建体5和6，或6和7，或8和9，或9和10的表达质粒(图30)共转染到HEK-293细胞中以表达含有或不含抗flag标签的8B5-CB3.1DART。每三天收集条件培养基，持续三次。然后使用CD32B亲和柱纯化条件培养基。
ELISA：如下进行ELISA：在碳酸盐缓冲液中，在4℃下将50μl/孔的2μg/ml的CD32B-Fc过夜包被在96-孔Maxisorp板上。在加入受试单链 Fc融合蛋白前，用PBS-T(PBS，0.1％吐温20)洗涤平板三次并然后在室温下通过PBS-T中的0.5％BSA封闭30分钟。封闭期间，将8B5-CB3.1DART稀释为从2μg/ml开始的2倍系列稀释液。将与25μl/孔的50ng/ml ch8B5混合的25μl/孔的稀释的DART从稀释平板转移到ELISA平板。室温下孵育平板1小时。用PBS-T洗涤三次后，将50μl/孔的1∶10,000稀释的HRP偶联的F(ab’)2山羊抗人IgG F(ab’)2(Jackson ImmunoResearch)加至平板。室温下孵育平板1小时。用PBS-T洗涤平板三次并用80μl/孔的TMB底物显色。孵育5分钟后，通过40μl/孔的1％H2SO4终止反应。使用96-孔读板机和SOFTmax软件读取OD450。使用GraphPadPrism3.03软件对读出值作图(图31)。
6.10 Ig样四价DART的设计和表征 
使用4条多肽链来制备具有四价抗原结合位点的Ig-样DART物质(图32；图33)。Ig样DART物质具有独特的性质，因为其结构域可被设计为结合相同表位(以形成能够结合4个相同抗原分子的四价、单表位特异性的Ig样DART)，或结合不同的表位或抗原。例如，其结构域可被设计成结合同一抗原的两个表位(以形成四价、单抗原特异性、双表位特异性的Ig样DART)，或结合不同抗原分子的表位以形成具有对第一抗原特异性的一对结合位点和对第二个抗原特异性的第二对结合位点的四价Ig样DART。可容易地产生具有这些属性的组合的杂交分子。
为展示该Ig样DART物质的特征，制备了具有对CD32特异性的一对结合位点和对CD16A特异性的第二对结合位点的示例性四价Ig样DART物质。使用下述4条多肽链来制备该Ig样DART物质：
2.4G2-3G8-hκ核苷酸序列(SEQ ID NO：247)：
gatgtccaga tgacccagtc tccatctaat cttgctgcct ctcctggaga   50 
aagtgtttcc atcaattgca aggcaagtga gagcattagc aagtatttag  100 
cctggtatct acagaaacct gggaaagcaa ataagcttct tatgtacgat  150 
gggtcaactt tgcaatctgg aattccatcg aggttcagtg gcagtggatc  200 
tggtacagat ttcactctca ccatcagaag cctggagcct gaagattttg  250 
gactctatta ctgtcaacag cattatgaat atccagccac gttcggttct  300 
gggaccaagc tggagatcaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt  350 
taccctgaaa gagtctggcc ctgggatatt gcagccctcc cagaccctca  400 
gtctgacttg ttctttctct gggttttcac tgaggacttc tggtatgggt  450 
gtaggctgga ttcgtcagcc ttcagggaag ggtctagagt ggctggcaca  500 
catttggtgg gatgatgaca agcgctataa tccagccctg aagagccgac  550 
tgacaatctc caaggatacc tccagcaacc aggtattcct caaaatcgcc  600 
agtgtggaca ctgcagatac tgccacatac tactgtgctc aaataaaccc  650 
cgcctggttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtgagctcac  700 
tgggaggctg cggcggaggg agccgtacgg tggctgcacc atcggtcttc  750 
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt  800 
gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg  850 
tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag  900 
gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa  950 
agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg 1000 
gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt       1044 
2.4G2-3G8-hκ编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：248)：
DVQMTQSPSN LAASPGESVS INCKASESIS KYLAWYLQKP GKANKLLMYD  50 
GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTIRSLEP EDFGLYYCQQ HYEYPATFGS 100 
GTKLEIKGGG SGGGGQVTLK ESGPGILQPS QTLSLTCSFS GFSLRTSGMG 150 
VGWIRQPSGK GLEWLAHIWW DDDKRYNPAL KSRLTISKDT SSNQVFLKIA 200 
SVDTADTATY YCAQINPAWF AYWGQGTLVT VSSLGGCGGG SRTVAAPSVF 250 
IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ 300 
DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC   350 
3G8-2.4G2-hG1核苷酸序列(SEQ ID NO：249)：
gacactgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca   50 
gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg  100 
atagttttat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc  150 
ctcatctata ctacatccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag  200 
tgccagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg  250 
aggaggatac tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac  300 
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaaggaggcg gatccggagg  350 
cggaggcgag gtggagctag tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg  400 
gaaggtccct gaaactctcg tgtgcagcct caggattcac tttcagtgac  450 
tattacatgg cctgggtccg gcaggctcca acgacgggtc tggagtgggt  500 
cgcatccatt agttatgatg gtggtgacac tcactatcga gactccgtga  550 
agggccgatt tactatttcc agagataatg caaaaagcag cctatacctg  600 
caaatggaca gtctgaggtc tgaggacacg gccacttatt actgtgcaac  650 
agagactacg ggaataccta caggtgttat ggatgcctgg ggtcaaggag  700 
tttcagtcac tgtctcctca ctgggaggct gcggcggagg gagcgcctcc  750 
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc  800 
tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac  850 
cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc  900 
ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt  950 
gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga 1000 
atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct 1050 
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg 1100 
gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 1150 
tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 1200 
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa 1250 
tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg 1300 
tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1350 
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat 1400 
ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc 1450 
catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1500 
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca 1550 
gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct 1600 
ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1650 
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta 1700 
cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa                  1734 
3G8-2.4G2-hG1编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：250)：
DTVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL  50 
LIYTTSNLES GIPARFSASG SGTDFILNIH PVEEEDTATY YCQQSNEDPY 100 
TFGGGTKLEI KGGGSGGGGE VELVESGGGL VQPGRSLKLS CAASGFTFSD 150 
YYMAWVRQAP TTGLEWVASI SYDGGDTHYR DSVKGRFTIS RDNAKSSLYL 200 
QMDSLRSEDT ATYYCATETT GIPTGVMDAW GQGVSVTVSS LGGCGGGSAS 250 
TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT 300 
FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS 350 
CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE 400 
DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY 450 
KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV 500 
KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ 550 
GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK                         578 
具有上述序列的Ig样DART分子的制剂从不同质粒分离物获得并命名为“Ig DART1”和“Ig DART2”。将ELISA中这些Ig样DART物质结合 mCD32-hCD16A的能力与单独的培养基、具有单一CD32结合位点和单一CD16A结合位点的DART(“DART”)及对照抗-ch-mCD32mAb的能力进行比较(图34)。发现本发明的Ig样DART具有比任一种DART或对照抗体高得多的抗原结合亲和力。
6.11 CD32B-CD79-1和CD32B-CD79-2双特异性双抗体的设计和表征
编码CD79VL-CD32BVH(序列1)、CD32BVL-CD79VH-1(序列2)和CD32BVL-CD79VH-2(序列3)的基因被克隆到表达载体pEE13中，分别产生表达构建体1，2，和3。将构建体1表达质粒与表达质粒2或3一起共转染到HEK-293细胞中以分别制备CD32B-CD79-1和CD32B-CD79-2双特异性双抗体。每三天收集条件培养基，持续三次。然后使用CD32B亲和柱纯化条件培养基。
在碳酸盐缓冲液中，在4℃下将50μl/孔的2μg/ml的CD32B-Fc过夜包被在96-孔Maxisorp板上。在加入受试单链Fc融合蛋白前，用PBS-T(PBS，0.1％吐温20)洗涤平板三次并然后在室温下通过PBS-T中的0.5％BSA封闭30分钟。封闭期间，将CD32B-CD79-1或CD32B-CD79-2双特异性双抗体稀释为从2μg/ml开始的2倍系列稀释液。将25μl/孔的稀释的双特异性双抗体与25μl/孔的50ng/ml抗-CD32B抗体混合并加至ELISA平板。室温下孵育平板1小时。用PBS-T洗涤三次后，将50μl/孔的1：10,000稀释的HRP偶联的F(ab’)2山羊抗人IgG F(ab’)2(Jackson ImmunoResearch)加至平板。室温下孵育平板1小时。用PBS-T洗涤平板三次并用80μl/孔的TMB底物显色。孵育5分钟后，通过40μl/孔的1％H2SO4终止反应。使用96-孔读板机和SOFTmax软件读取OD450nm。使用GraphPadPrism3.03软件对读出值作图。实验揭示CD32B-CD79-1和CD32B-CD79-2双特异性双抗体能够以与抗CD32B对照抗体的亲和力相等的亲和力免疫特异性地结合CD32-Fc。上述构建体的核苷酸序列和所编码的氨基酸序列如下：
序列1-CD79VL-CD32BVH核苷酸序列(SEQ ID NO：251)：
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca  50 
gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100 
gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150 
cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200 
cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250 
aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300 
ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350 
aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 
ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450 
gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500 
ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 
agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600 
gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650 
ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700 
tctcctcgct gggaggctgc                                  720 
序列2-CD79VL-CD32BVH氨基酸序列(SEQ ID NO：252)：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN  50 
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100 
LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150 
DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200 
LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC            240 
序列3-CD32BVL-CD79VH-1核苷酸序列(SEQ ID NO：253)：
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga  50 
tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 
gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150 
gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200 
tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 
caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 
gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 
tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400 
aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450 
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500 
tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacagagtca 550 
ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 
ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 
ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc     696 
序列4-CD32BVL-CD79VH-1氨基酸序列(SEQ ID NO：254)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA  50 
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100 
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150 
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQMFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200 
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC                    232 
序列5-CD32BVL-CD79VH-2核苷酸序列(SEQ ID NO：255)：
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga  50 
tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 
gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150 
gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200 
tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 
caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 
gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 
tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400 
aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450 
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500 
tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca 550 
ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 
ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 
ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc     696 
序列6-CD32BVL-CD79VH-2氨基酸序列(SEQ ID NO：256)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA  50 
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100 
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150 
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200 
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC                    232 
6.12 H8B5-HBCRC生物功能性双抗体的构建和优化
构建了包含能够结合CD32和B细胞受体复合体(“BCRC”)的可变区的双抗体。
克隆.使用标准PCR/重叠PCR构建构建体： 
h8B5VL-G3SG4-hBCRCVH M48I-LGGC：
通过使用lgh321F和lgh788R作为引物扩增完全人源化的8B5VL(，识别CD32)。通过使用lgh784F和lgh386R作为引物扩增hBCRCVH M48I。凝胶纯化PCR产物并混合在一起，并然后通过使用lgh321F和lgh386R扩增。然后将重叠PCR片段在XbaI-EcoRI位点处克隆到pEE6中。“G3SG4”是具有序列：GGGSGGGG(SEQ ID NO：10)的接头。
hBCRCVL R45N-G3SG4-h8B5VH-LGGC
通过使用lgh321F和lgh785R作为引物扩增hBCRCVL R45N。通过使用lgh787F和lgh786R作为引物扩增h8B5VH。凝胶纯化PCR产物并混合在一起，并然后通过使用引物lgh321F和lgh786R扩增。然后将重叠PCR片段在XbaI-EcoRI位点处克隆到pEE13中。
单一载体的构建。pEE6hHBCRCVL R45N-h8B5VH在Bgl II-Sal I位点 处被消化，并纯化3.3kb片段并在BamHI-SalI位点处插入到pEE13hHBCRCVL45N-h8B5VH中。Bgl II和BamH I共有相容性的粘性末端。以下描绘了DART和用于构建DART的引物的序列：
hHBCRCVL.R45N-h8B5VH-LGGC核苷酸序列(SEQ ID NO：257)：
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca  50 
gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100 
gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150 
cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200 
cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250 
aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300 
ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350 
aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 
ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450 
gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500 
ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 
agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600 
gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650 
ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700 
tctcctcgct gggaggctgc                                  720 
hHBCRCVL.R45N-h8B5VH-LGGC氨基酸序列(SEQ ID NO：258)：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN  50 
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100 
LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150 
DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200 
LYLOMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC            240 
H8B5VL-hHBCRCVH M48I-LGGC核苷酸序列(SEQ ID NO：259)：
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga  50 
tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 
gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150 
gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200 
tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 
caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 
gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 
tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400 
aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450 
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500 
tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacagagtca 550 
ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 
ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 
ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc     696 
H8B5VL-HBCRCVH M48I-LGGC氨基酸序列(SEQ ID NO：260)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA  50 
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100 
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150 
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQMFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200 
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC                    232 
Lgh321F引物(SEQ ID NO：261)：
cgagctagct ctagatgaga tcacagttct ctctac                36Lgh386R引物(SEQ ID NO：262)：
tttgaattct agcagcctcc cagtgaggag acggtgaccg tggtc      45 
Lgh784F引物(SEQ ID NO：263)：
ggcggatccg gaggcggagg ccaggttcag ctggtgcag             39 
Lgh785R引物(SEQ ID NO：264)：
cctccggatc cgcctccttt gatctcaagc ttggtccc              38 
Lgh786R引物(SEQ ID NO：265)：
tttgaattct agcagcctcc caggctggag acggtcacca gg         42 
Lgh787F引物(SEQ ID NO：266)：
ggaggcggat ccggaggcgg aggcgaagtg cagcttgtgg agtc       44 
将Hu3G8VL1-G3SG4-Hu2B6VH4-LGGC表达质粒与Hu2B6VL5-G3SG4-Hu3G8VH5-LGGC一起共转染到HEK-293细胞中以制备识别CD32和CD79的Hu2B64.5-Hu3G85.1双特异性双抗体。同时，将Hu2B6VL5-G3SG4-Hu2B6VH4-LGGC和Hu3G8VL1-G3SG4-Hu3G8VH5-LGGC单独地转染到HEK-293细胞中以制备Hu2B6 4.5和Hu3G8 5.1双抗体。培养三天后，收集条件培养基并通过结合ELISA表征。图36中描绘了该实验的结果。
实验设计：在碳酸盐缓冲液中，在40℃下将100ng/孔的可溶性FcRIIb-G2-Agly过夜包被在96-孔Maxisorp板上。在加入双抗体前，用PBS/0.1％吐温20洗涤平板三次并在室温下通过PBS/0.1％吐温20中的0.5％BSA封闭30分钟。从25ng/孔开始的Hu2B64.5-Hu3G8 5.1双特异性双抗体、Hu2B6 4.5双抗体和hu3G8 5.1双抗体的一系列两倍稀释液被加至每个孔。室温孵育平板1小时。用PBS/0.1％吐温20洗涤三次后，将10ng/孔的FcRIIIa-G2-生物素加至平板。室温孵育平板1小时。用PBS/0.1％吐温洗涤三次后，使用50ul的1∶5000稀释的HRP偶联的链霉亲和素(Amersham Pharmacia Biotech)检测。室温孵育45分钟后，用PBS/0.1％吐 温洗涤平板三次并使用TMB底物显色。孵育10分钟后，通过1％H2SO4终止反应。通过SOFTmax程序读取OD450nm。使用GraphPadPrism3.03软件对读出值作图。
6.13 IgDART双抗体的构建
构建了包含能够结合CD32和B细胞受体复合体(“BCRC”)的可变区的IgDART双抗体。第一双抗体在分子的VH序列和Fc序列之间采用LGGCGGGS(SEQ ID NO：267)接头。第二双抗体采用具有序列LEIK(SEQ ID NO：268)的LEIK接头或具有序列TVSS(SEQ ID NO：269)的TVSS接头。以下展示了这些双抗体的链的序列和编码多核苷酸：
H8B5VL-hBCRCVH M48I，M62K_LGGCG3S_hκ(SEQ ID NO：270)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA  50 
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100 
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150 
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200 
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GCGGGSRTVA APSVFIFPPS 250 
DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS 300 
TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC        343 
通过位于位置108-115处的接头GGGSGGGG(SEQ ID NO：10)，H8B5VL序列被融合到hBCRCVH序列。通过位于位置229-236处的接头LGGCGGGS(SEQ ID NO：267)，hBCRCVH序列被融合到Fc序列(两种接头显示为以上的下划线部分)。编码H8B5VL-hBCRCVH M48I、M62K_LGGCG3S_hκ序列的多核苷酸是：
(SEQ ID NO：271)：
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga   50 
tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa  100 
gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc  150 
gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc  200 
tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg  250 
caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg  300 
gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt  350 
tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga  400 
aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac  450 
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga  500 
tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca  550 
ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc  600 
ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta  650 
ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgcggcg  700 
gagggagccg aactgtggct gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct  750 
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa  800 
cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc  850 
aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc  900 
acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa 1000 
acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg 1050 
tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag                    1082 
其中编码接头：GGGSGGGG(SEQ ID NO：10)和LGGCGGGS(SEQ ID NO：267)的序列分别位于位置322-345和685-708处(两种接头显示为以上的下划线部分)。
HBCRCVL R45N-h8B5VH_LGGCGGGS-hG1(SEQ ID NO：272)：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN  50 
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100 
LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150 
DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200 
LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC GGGSASTKGP 250 
SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV 300 
LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK RVEPKSCDKT 350 
HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV 400 
KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV 450 
SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY 500 
PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF 550 
SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK                             574 
通过位于位置113-120处的接头GGGSGGGG(SEQ ID NO：10)，hBCRCVL序列被融合到H8B5VH序列。通过位于位置237-244处的接头LGGCGGGS(SEQ ID NO：267)，H8B5VH序列被融合到Fc序列(两种接头显示为以上的下划线部分)。编码HBCRCVL R45N-h8B5VH_LGGCGGGS-hG1序列的多核苷酸是：
(SEQ ID NO：273)：
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca   50 
gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg  100 
gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac  150 
cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt  200 
cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg  250 
aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg  300 
ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg  350 
aggcggaggc gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac  400 
ctggaggatc cctgagactc tcttgtgccg cctctggatt cacttttagt  450 
gacgcctgga tggactgggt ccgtcaggcc ccaggcaagg ggcttgagtg  500 
ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg  550 
agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgacgc caaaaacagt  600 
ctgtacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg ccgtgtatta  650 
ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc ctggtgaccg  700 
tctccagcct gggaggctgc ggcggaggga gcgcctccac caagggccca  750 
tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc  800 
ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt  850 
cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc  900 
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc  950 
cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca 1000 
gcaacaccaa ggtggacaag agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 1050 
cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt 1100 
cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc 1150 
ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 1200 
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa 1250 
gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca 1300 
ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1350 
tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa 1400 
agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg 1450 
agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1500 
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa 1550 
ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct 1600 
acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1650 
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag 1700 
cctctccctg tctccgggta aa                               1722 
其中编码接头：GGGSGGGG(SEQ ID NO：10)和LGGCGGGS(SEQ ID NO：267)的序列分别位于位置337-360和709-732处(两种接头显示为以上的下划线部分)。
H8B5VL-HBCRCVH M48I，M62K_(-4)LEIK_hκ(SEQ ID NO：274)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA  50 
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100 
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAFVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150 
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200 
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVLEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT 250 
ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL 300 
TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC                 335 
通过位于位置108-115处的接头GGGSGGGG(SEQ ID NO：10)，H8B5VL序列被融合到HBCRCVH序列。通过位于位置225-228处的接头LEIK(SEQ ID NO：268)，HBCRCVH序列被融合到Fc序列(两种接头显 示为以上的下划线部分)。编码H8B5VL-HBCRCVH M48I、M62K_(-4)LEIK_hκ序列的多核苷酸是：
(SEQ ID NO：275)：
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga   50 
tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa  100 
gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc  150 
gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc  200 
tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg  250 
caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg  300 
gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt  350 
tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga  400 
aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac  450 
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga  500 
tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca  550 
ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc  600 
ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta  650 
ctgggggcaa gggaccacgg tcctggagat caagcgaact gtggctgcac  700 
catcggtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact  750 
gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt  800 
acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg  850 
tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg  900 
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt  950 
cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag 1000 
agtgt                                                  1005 
其中编码接头：GGGSGGGG(SEQ ID NO：10)和LEIK(SEQ ID NO：268)的序列分别位于322-345和673-684(两种接头显示为以上的下划线部分)。
HBCRCVL R45N-h8B5VH_(-4)TVSS-hG1＝HBCRCVL R45N-h8B5VH_-hG1 
(SEQ ID NO：276)：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN  50 
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100 
LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSIRL SCAASGFTFS 150 
DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200 
LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSASTK GPSVFPLAPS 250 
SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS 300 
LSSVVTVPSS SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKRVEPKSCD KTHTCPPCPA 350 
PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG 400 
VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP 450 
IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW 500 
ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA 550 
LHNHYTQKSL SLSPGK                                      566 
通过位于位置113-120处的接头GGGSGGGG(SEQ ID NO：10)，HBCRCVL序列被融合到H8B5VH序列。通过位于位置233-236处的接头 TVSS(SEQ ID NO：269)，h8B5VH序列被融合到Fc序列(两种接头显示为以上的下划线部分)。编码HBCRCVL R45N-h8B5VH_(-4)TVSS-hG1的多核苷酸是：
(SEQ ID NO：277)：
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca   50 
gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg  100 
gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac  150 
cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt  200 
cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg  250 
aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg  300 
ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg  350 
aggcggaggc gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac  400 
ctggaggatc cctgagactc tcttgtgccg cctctggatt cacttttagt  450 
gacgcctgga tggactgggt ccgtcaggcc ccaggcaagg ggcttgagtg  500 
ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg  550 
agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgacgc caaaaacagt  600 
ctgtacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg ccgtgtatta  650 
ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc ctggtgaccg  700 
tctccagcgc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc  750 
tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga  800 
ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca  850 
gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc  900 
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta  950 
catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag 1000 
ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 1050 
cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa 1100 
ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg 1150 
acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 1200 
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag 1250 
cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga 1300 
atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1350 
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt 1400 
gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc 1450 
tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1500 
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct 1550 
agactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga 1600 
gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1650 
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa   1698 
其中编码接头：GGGSGGGG(SEQ ID NO：10)和TVSS(SEQ ID NO：269)的序列分别位于位置337-360和697-708处(两种接头显示为以上的下划线部分)。
6.14 接头的优化 
如以上所讨论的，本发明的IgDART双抗体优选地在分子的VH序列 和Fc序列之间包含接头。进行优化接头的实验以使产量和活性最大化。使用了下列接头。
SEQ ID NO 接头
278 FNRGECGGGS
279 FNRGECLQVYYRM
280 LEGEEG
281 LEGEEGC
282 LEIK
283 LGEEG
284 LGEEGC
285 LGGCGGGS
286 LGKKG
287 LGKKGC
288 LKGKKG
289 LKGKKGC
290 LQVYYRM
291 LQVYYRMC
292 TVSS
293 VEPKSCGGGS
294 VEPKSCYLYLRARV
295 VQVHYRM
296 VQVHYRMC
297 YLYLRARV
298 YLYLRARVC
将上述接头引入到质粒中以制备具有不同的接头组合的一组IgDART双抗体：
确定了所产生的IgDART的聚集性质。 
IgDART接头 总蛋白(mg) 低聚体％ 单体％ 片段％ SB排序
           
900A/900B 0.51 12 45 43 4
901A/901B 0.72 5 83 12 1
902A/902B 0.78 21 48 31 4
903A/903B 0.5 3 84 13 1
[1301] 
904A/904B 0.66 16 65 26 4
905A/905B 0.5 20 60 20 3
908A/908B 0.5 13 65 17 2
908A/909B 0.38 22 50 28 3
910A/911B 0.2 45 10 45 5
该数据出乎意料地表明具有接头例如901A/901B、903A/903B和908A/908B中所采用的接头的构建体提供了比具有例如910A/911B的接头的构建体明显更好的结果(更少的低聚化和/或更少的片段产生)。
6.15 E-卷曲/K-卷曲DART
如根据前述内容将理解的，双特异性DART的单独多肽可形成两种同二聚体物质和一种异二聚体物质。在本发明的一个实施方式中，可将带电荷的多肽添加到一条或更优选地，两条DART多肽的C末端。通过对双特异性DART的单独多肽选择具有相反电荷的带电荷的多肽，包括这些带电荷的多肽有利于异二聚体的形成并减少同二聚体的形成。优选地，带正电荷的多肽将包含大含量的精氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和/或赖氨酸(或这些氨基酸的混合物)且带负电荷的多肽将包含大含量的天冬氨酸或谷氨酸(或这些氨基酸的混合物)。包含大量含量的赖氨酸的带正电荷的多肽和包含大含量的谷氨酸的带负电荷的多肽是特别优选的。为了将这些带相反电荷的多肽之间的静电吸引最大化，优选采用能够自发地呈现螺旋构象的多肽。
因此，在优选的实施方式中，带正电荷的“E-卷曲”将附接到待用来形成双特异性DART的一条多肽上，且带负电荷的“K-卷曲”将附接到DART的第二条多肽上(图37)。
特别优选的E卷曲将具有序列：(EVAALKE)4：
SEQ ID NO：299  EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK 
特别优选的K卷曲将具有序列：(KVAALKE)4：
SEQ ID NO：300  KVAALKEKVAALKEgKVAALKEKVAALKE 
具有该E卷曲的优选的DART多肽将具有通用序列：[VL结构域]-[GGGSGGGG]-[VH结构域]-[(EVAALEK)4]-GGGNS，其中VL是DART的可变轻链Ig结构域，GGGSGGGG是SEQ ID NO：10，VH是DART的可变重链Ig结构域，(EVAALEK)4是SEQ ID NO：299，且GGGNS 是SEQ ID NO：301。具有该K卷曲的优选的DART多肽将具有通用序列：[VL结构域]-[GGGSGGGG]-[VH结构域]-[(KVAALKE)4]-GGGNS，其中VL是DART的可变轻链Ig结构域，GGGSGGGG是SEQ ID NO：10，VH是DART的可变重链Ig结构域，(KVAALKE)4是SEQ ID NO：300，且GGGNS是SEQ ID NO：301。
6.16 包含E-卷曲/K-卷曲Fc的DART
在另一个实施方式中，Fc-区可被连接到E卷曲或K卷曲DART的E和/或K卷曲。
更进一步，在包含Fc的DART的Fc区与DART VH结构域之间的分隔在如下情况下是令人期望的：其中这些结构域的较少分隔的排列导致在这些结构域与它们的结合配体之间的相互作用减少，或者以其他方式干扰DART组装。虽然可采用具有任何氨基酸序列的分隔物，但是优选采用形成α螺旋卷曲的分隔物，以使Fc结构域最大化地延伸并突出于可变结构域之外(图37)。因为具有相反电荷的上述卷曲的多肽另外起促进异二聚体形成的作用，所以这些分子是特别优选的分隔物。这种包含卷曲的Fc-DART分子提供了与Fc-DART的益处相似的益处，包括提高的血清半衰期和效应功能召集。对于该目的，上述E卷曲和K卷曲的多肽是特别优选的。
因此，在优选的实施方式中，包含E卷曲Fc的DART将具有通用序列：[VL结构域]-[GGGSGGGG]-[VH结构域]-[(EVAALEK)4]-GGG-始于D234(Kabat编号)的Fc结构域，其中VL是DART的可变轻链Ig结构域，GGGSGGGG是SEQ ID NO：10，VH是DART的可变重链Ig结构域，且(EVAALEK)4是SEQ ID NO：299。
相似地，在优选的实施方式中，包含K卷曲Fc的DART将具有通用序列：[VL结构域]-[GGGSGGGG]-[VH结构域]-[(KVAALEK)4]-GGG-始于D234(Kabat编号)的Fc结构域，其中VL是DART的可变轻链Ig结构域，GGGSGGGG是SEQ ID NO：10，VH是DART的可变重链Ig结构域，且(KVAALEK)4是SEQ ID NO：300。
如以上所指出的，包含卷曲的DART分子或包括包含卷曲的Fc的DART分子可仅包含单一的该卷曲分隔物，或其可包含一个以上的该分隔物(例如，优选地具有相反电荷的两个分隔物，其中一个与DART多肽的每一个VH结构域连接)。通过将Fc区连接到该分隔物分子，增强了通过链交换制备二价、四价等形式的Fc-DART分子的能力(图39)。如图39中所示，可产生Fc-DART分子，其根据Fc结构域被连接到DART VH结构域中的一个还是两个结构域而形成单体或二聚体。
6.17 包含E-卷曲/K-卷曲Fc的DART的功能活性
E-卷曲和/或K-卷曲Fc-DART物质从具有下列的双特异性DART分子产生：(1)CD79b(BCR复合体)-反应性抗体CB3的轻链和重链可变区和(2)CD32B-反应性抗体2B6的低亲和力变体(称为“YA”变体)的轻链和重链可变区。该抗体的轻链可变区与抗体2B6的轻链可变区的不同之处在于包含突变：N50Y和V51A。因此，抗体YA2B6具有轻链可变区序列：
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRTSQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKYASESISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSNTWPFTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：302).
该抗体的重链可变区的序列为：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIHWVRQAPGQGLEWMGVIDPSDTYPNYNKKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARNGDSDYYSGMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：303)
选择低亲和力的抗体是因为其将优先顺式地结合表达CD79b的细胞(B细胞)上的CD32B。这样一来，该构型将减弱与其他表达CD32B的细胞(单核细胞、内皮细胞、肝细胞)的相互作用以及不期望的反式相互作用。
制备了该h2B6YAhCB3DART的E-卷曲和/或K-卷曲衍生物和包含E-卷曲和/或K-卷曲Fc的衍生物。使用尺寸排阻层析分析所产生的分子的大致尺寸和异质性。如图40所示，二聚体由具有被连接到K-卷曲结构域的单一连接的Fc区的E-卷曲/K卷曲DART以及具有被连接到E-卷曲结构域的单一连接的Fc区的E-卷曲/K卷曲DART形成。从其中Fc区被连接到同一DART分子的E卷曲和K卷曲二者的制剂中回收期望的单体，以及 二聚体分子，单体是所形成的大部分产物。图41示出了所产生的二聚体分子的可能结构。
使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析尺寸排阻层析的级分以进一步分析所产生的分子的结构(图42)。E-卷曲/K-卷曲DART衍生物(无Fc区)迁移为各自约28kD的两条主带(对应于包含KFc的多肽和稍小的包含EFc的多肽)和较不明显的约49kD的带(对应于E-卷曲/K-卷曲DART)。来自尺寸排阻层析的包含E-卷曲/K-卷曲Fc的DART衍生物的单体级分仅显示出约28kD的较大或较小分子量的带(对应于所述DART是包含KFc的DART(较大分子量的带)或是包含EFc的DART(较小分子量的带))。物质主要迁移到约49kD处(对应于E-卷曲/K-卷曲DART)。还观察到明显的较高分子量的带。
进行双特异性结合ELISA以表征所产生的分子。CD79被放到ELISA平板。然后DART被结合到平板上。使用sCD32B-生物素，接下来与链霉亲和素-HRP一起孵育来检测DART结合。如图43显示，包含E-卷曲/K-卷曲Fc的h2B6YAhCB3DART衍生物(EFc/K或E/KFc)相对于h2B6YAhCB3DART或EFc/KFc h2B6YAhCB3DART衍生物显示明显增强的结合。
已结合到CD79b的抗体的交联导致B细胞活化(Van Kooten，C.等人(1997)“Cross-Linking Of Antigen Receptor Via Ig-B(B29，CD79b)Can Induce Both Positive And Negative Signals In CD40-Activated Human B Cells，”Clin.Exp.Immunol.110：509-515)。因为h2B6YAhCB3DART分子能够结合CD79b和CD32B抑制性受体，其具有将CD32B“召集”到CD79b的结合位点并从而阻断B细胞增殖的能力。为证实这种能力，将DART与已被暴露于能够交联被结合的抗-CD79b抗体的抗体的B细胞一起孵育。图44中示出了该实验的结果。结果表明只针对CD79b或CD32B的抗体(分别是Ch2B6N297Q和ChCB3.1N297Q)不能抑制B细胞增殖。EFc/KFc h2B6YA x hCB3DART衍生物在抑制B细胞增殖方面明显更有效，h2B6YA x hCB3DART本身和h2B6YA x hCB3VF对照也是如此。发现仅具有单连接的Fc区的E卷曲/K卷曲DART(E/KFc h2B6YA x hCB3DART 衍生物和EFc/K h2B6YA x hCB3DART衍生物)对B细胞增殖发挥最大抑制。
6.18 用于改变体内血清半衰期的DART修饰
如以上所讨论的，小的重组抗体分子例如双特异性单链分子(例如，具有约55kDa的分子量)将从循环中快速清除。在小鼠中对DART分子的体内药物动力学研究展示了预期的约2小时的短的终点半衰期。
在一些实施方式中，例如在治疗急性炎症病症时，该短的半衰期是期望的，但是，在其他实施方式中，例如在治疗癌症和慢性疾病及病症时，显示出更长的半衰期的本发明的DART分子是优选的。
为了提高DART分子用于这些用途的体内药物动力学性质，可将DART分子修饰为在所述DART分子的一个或多个末端包含血清结合蛋白的多肽部分。最优选地，血清结合蛋白的该多肽区部分将被安装在DART分子的C末端。用于该目的的特别优选的血清结合蛋白的多肽部分是来自链球菌G蛋白的白蛋白结合结构域(ABD)。链球菌菌株G418(Streptococcus strain G148)的G蛋白的白蛋白结合结构域3(ABD3)是特别优选的。
来自链球菌菌株G418的G蛋白的白蛋白结合结构域3(ABD3)由形成稳定3-螺旋束的46个氨基酸残基组成且具有广泛的白蛋白结合特异性(Johansson，M.U.等人(2002)“Structure，Specificity，And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules，”J.Biol.Chem.277(10)：8114-8120)。白蛋白是血浆中最丰富的蛋白并在人体内具有19天的半衰期。白蛋白具有允许其非共价地结合其他蛋白质的多个小分子结合位点并从而延长其半衰期。
为证实血清蛋白的多肽部分延长DART半衰期的能力，将链球菌G蛋白的ABD3结构域融合到重组的双特异性DART(与hCD16和hCD32B抗原免疫反应性的)上以产生重组抗体分子hCD16-hCD32B ABD-DART(图45)。该ABD-DART显示出对两种抗原以及与人血清白蛋白(HSA)的特异性结合，并能够在体外再靶向效应细胞。与对照DART相比，该ABD-DART在小鼠中显示出半衰期的强烈增加。这个方法可用作将可能重要的药物如 DART的半衰期增加至大于90分钟，大于2小时，大于5小时，大于10小时，大于20小时，且最优选地，大于30小时的可行途径。
材料和方法： 
ABD DART的设计和构建：使用以下作为链1制备hCD16-hCD32B ABD DART：
hCD16VL-G3SG4-hCD32BVH-K卷曲[(KVAALKE)4]
其中，CD16VL表示3G8CD16VL，G3SG4表示SEQ ID NO：10，hCD32BVH表示2B6CD32BVH，且(KVAALKE)4表示SEQ ID NO：300；
并使用以下作为链2：
hCD32BVL-G3SG4-hCD16VH-GGCGGG-E卷曲[(EVAALEK)4]-GGGNS-ABD
其中CD32BVL表示CD32BVL，G3SG4表示SEQ ID NO：10，hCD16VH表示CD16VH，GGCGGG是SEQ ID NO：267的残基2-7，E卷曲[(EVAALEK)4]是SEQ ID NO：299；GGGNS是SEQ ID NO：301，且ABD为：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLINNAKT VEGVKALID EILAALP(SEQ ID NO：304)
因此，链1(h3G8VL1-G3SG4-h2B6VH4-K卷曲-GGGNS)的序列为：
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL 
LIYTTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSNEDPY 
TFGQGTKLEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN 
YWIHWVRQAP GQGLEWIGVI DPSDTYPNYN KKFKGRVTMT VVVSTSTAYM 
ELRSLRSDDT AVYYCARNGD SDYYSGMDYW GQGTTVTVSS GGCGGGKVAA 
LKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKEGGGNS(SEQ ID NO：305)
编码链1(h3G8VL1-G3SG4-h2B6VH4-K卷曲-GGGNS)的优选的多核苷酸是：
gacatcgtga tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga gagggccacc 
atcaactgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg atagttttat gaactggtac 
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctata ctacatccaa tctagaatct 
ggggtcccag acaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcagc 
agcctgcagg ctgaggatgt ggcagtttat tactgtcagc aaagtaatga agatccgtac 
acgttcggac aggggaccaa gcttgagatc aaaggaggcg gatccggcgg cggaggccag 
gttcagctgg tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 
tgcaaggctt ctggttacac ctttaccaac tactggatac actgggtgcg acaggcccct 
ggacaagggc ttgagtggat tggagtgatt gatccttctg atacttatcc aaattacaat 
aaaaagttca agggcagagt caccatgacc gtagtcgtat ccacgagcac agcctacatg 
gagctgagga gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag aaacggtgat 
tccgattatt actctggtat ggactactgg gggcaaggga ccacggtcac cgtctcctcc 
ggaggatgtg gcggtggaaa agtggccgca ctgaaggaga aagttgctgc tttgaaagag 
aaggtcgccg cacttaagga aaaggtcgca gccctgaaag agggcggcgg gaattct 
(SEQ ID NO：306)
因此，链2(h2B6VL5-G3SG4-h3G8VH5-E卷曲-GGGNS-ABD)的序列为：
EIVLTQSPDF QSVTPKEKVT FTCRTSQSIG TNIHWYQQKP DQSPKLLIKE 
VSESISGVPS RFSGSGSGTD FTLTINSLEA EDAATYYCQQ SNTWPFTFGG 
GTKVEIKGGG SGGGGQVTLR ESGPALVKPT QTLTLTCTFS GFSLSTSGMG 
VGWIRQPPGK ALEWLAHIWW DDDKRYNPAL KSRLTISKDT SKNQVVLTMT 
NMDPVDTATY YCAQINPAWF AYWGQGTLVT VSSGGCGGGE VAALEKEVAA 
LEKEVAALEK EVAALEKGGG NSLAEAKVLA NRELDKYGVS DYYKNLINNA 
KTVEGVKALI DEILAALP(SEQ ID NO：307)
编码链2(h2B6VL5-G3SG4-h3G8VH5-E卷曲-GGGNS-ABD)的优选的多核苷酸是：
gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 
ttcacctgca ggaccagtca gagcattggc acaaacatac actggtacca gcagaaacca 
gatcagtctc caaagctcct catcaaggag gtttctgagt ctatctctgg agtcccatcg 
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct 
gaagatgctg caacgtatta ctgtcaacaa agtaatacct ggccgttcac gttcggcgga 
gggaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt taccctgaga 
gagtctggcc ctgcgctggt gaagcccaca cagaccctca cactgacttg taccttctct 
gggttttcac tgagcacttc tggtatgggt gtaggctgga ttcgtcagcc tcccgggaag 
gctctagagt ggctggcaca catttggtgg gatgatgaca agcgctataa tccagccctg 
aagagccgac tgacaatctc caaggatacc tccaaaaacc aggtagtcct cacaatgacc 
aacatggacc ctgtggatac tgccacatac tactgtgctc aaataaaccc cgcctggttt 
gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtgagctccg gaggatgtgg cggtggagaa 
gtggccgcac tggagaaaga ggttgctgct ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag 
gaggtcgcag ccctggagaa aggcggcggg aattctctgg ccgaagcaaa agtgctggcc 
aaccgcgaac tggataaata tggcgtgagc gattattata agaacctgat taacaacgca 
aagaccgtgg aaggcgtgaa agcactgatt gatgaaattc tggccgccct gcct 
(SEQ ID NO：308)
使用hCD16-hCD32B DART作为模板通过PCR扩增每个VL和VH区段。对于链2，包含E卷曲和ABD的核苷酸序列通过引物二聚体形成，并然后使用限制性消化和连接将其克隆在hCD16的VH区域的C-末端。两 条链在NheI-NotII位点处被克隆到pCIneo载体(Promega，Inc.)中。然后将分别具有在NgoMIV-NheI处被消化的链1表达盒和在BstBI-PmeI处被消化的链2表达盒的单独的质粒克隆到单一质粒中，以转染到CHO细胞中形成稳定的细胞系。
蛋白质的表达和纯化：为了稳定的转染，用hCD16-hCD32B EK ABD-DART质粒DNA转染CHO-S细胞。通过亲和层析使用偶联到CNBr活化的Sepharose4B的可溶形式的FcRIIB抗原纯化ABD-DART蛋白质。使用Superdex200HR10/30通过尺寸排阻层析进一步纯化所浓缩的蛋白质。
通过ELISA的结合测定：对于基于CD16的捕获，在4℃下用浓度为2ug/mL的FcRIIB抗原包被平板过夜。然后用PBS-T中的0.5％蛋白胨封闭平板。在室温下使被稀释在两倍系列稀释液中的纯化的蛋白质结合在平板上，持续1小时。最后，使用生物素化的CD32B(50ng/mL)，接下来HRP偶联的链霉亲和素(1/1000，BD-Pham)进行检测。通过加入TMB测量HRP活性，在OD450nm下在读板机中对平板读数。
对于人血清白蛋白(HSA)的捕获，在4℃下用浓度为2μg/mL的HSA过夜包被平板。在那之后，继续同样的程序以进行双亲和力ELISA。
外周血单核细胞介导的ADCC测定：通过LDH释放测定测量细胞毒性。使用Ficoll-Hypaque(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)密度梯度离心根据厂家说明从人全血(Lonza WalkersVille，Inc，Gaithersburg，MD)中纯化外周血单核细胞(PBMC)。将2x104靶细胞铺板到圆底96孔组织培养板的每个孔中。将1比4系列稀释的不同的DART或抗体分子加至平板中的细胞。在那之后，将6x105PBMC加至相同的孔。然后在37℃和5％CO2下的孵箱中孵育平板过夜。然后在1200rpm下离心平板5分钟，将50μl的上清液转移到平底ELISA平板中。向每个孔加入50μlLDH底物溶液(Promega)，并在暗处室温孵育平板30分钟。然后向每个孔加入50μl终止溶液，并在1小时内在490nim处对平板读数。以O.D.原始读数将每个孔的细胞毒性百分比计算为：
(样品-AICC)/(靶最大值-自发的靶)x100
其中AICC是不依赖抗体的细胞的细胞毒性。使用Prism软件生成剂量反应曲线。
药物动力学研究：以5mg/kg的hCD16-hCD32B DART的单次静脉注射来注射C57B1/6小鼠。在用药前、2min、30min、1h、3h、6h、24h和72h收集小鼠血清。对血清中hCD16-hCD32B DART的浓度定量。hCD16-hCD32B DART的药物动力学计算通过药物动力学软件包WinNonlin Professional5.1(Pharsight Corporation，USA)进行。参数通过无隔分析(NCA)来确定。无隔分析基于需要静脉注射药物的模型(模型201)。线性梯形法用于参数计算。
结果
通过ELISA的表达和结合研究：hCD16-hCD32B ABD-DART以6.5mg每升的浓度在哺乳动物CHO-S细胞中有效地表达。纯化的ABD-DART蛋白对相应抗原的结合活性通过ELISA评价。结果表明hCD16-hCD32BABD-DART同时结合两种抗原，CD16以及CD32B(图46A)。结合曲线与对照hCD16-hCD32B DART蛋白的结合吻合。还通过ELISA证实了纯化的hCD16-hCD32B ABD-DART对人血清白蛋白(HSA)的亲和力(图46B)。结果表明ABD融合的DART与HSA的强烈结合，而没有观察到对照hCD16-hCD32B DART的结合。为证实ABD-DART分子能够同时结合CD32B、CD16A和HSA，将ABD-DART注射到具有固定的HSA的表面上，随后注射2(0nM CD32B和200nM CD16A(F158)(图46C，实线)。在对照实验中(图46C，虚线)，以缓冲液代替抗原。结果表明ABD-DART分子能够同时结合CD32B、CD16A和HSA。
发现hCD16-hCD32B ABD-DART及其ABD融合衍生物显示等效地结合可溶性CD32B(sCD32B)和可溶性CD16A(158F)(sCD16A)；可容易地通过DART-ABD融合体结合人血清白蛋白(HSA)的能力来区分DART(图46D-46I)。在CD16A包被的平板上孵育DART，并在存在或不存在3mg/ml HSA下使用生物素化的sCD32B检测结合(通过PBS-T中的0.5％蛋白胨进行封闭)。发现DART ABD融合体保留了亲本DART的双特异性结合并显示出不受人血清白蛋白的存在影响地结合sCD16A和CD32B(图46J)。
ABD-DART的体外细胞毒性：为证实该双特异性ABD-DART同时结合两种抗原，效应细胞上的一种抗原和靶细胞上的一种抗原，进行了再导向细胞杀伤测定。使用人PBMC作为效应细胞，hCD16-hCD32B ABD-DART诱导对CD32B阳性B细胞系Daudi的强效的、剂量依赖性的细胞毒性(图47A)。结果表明ABD-DART的效力与亲本DART的效力相等。CD16xCD32B DART可结合表达CD16B的效应细胞并因此召集这些细胞(通过再导向杀伤)以杀伤表达CD32B的细胞。因此发现CD16xCD32B DART显示出针对Raji细胞的强效杀伤(图47B)。
ABD-DART的药物动力学性质：在单次剂量静脉注射到C57B1/6小鼠中后，通过对血清样品的ELISA分析hCD16-hCD32B ABD-DART的药物动力学性质(图48)。两种蛋白质DART和ABD-DART都表现出被从循环中双相清除。ABD-DART的PK研究表明延长的循环时间，具有35.1h的增加的终点半衰期，相比之下，常规DART为1.2小时(图48，表17)。还通过比较曲线下面积(AUC)证实了药物动力学性质的改善。对于构建体ABD-DART，在融合到ABD后，AUC增长到几乎30倍(表17)。
ABD-DART的体内生物学活性：为证实hCD16-hCD32B ABD-DART保留了体内生物学活性，对Tg(mCD16-/-hCD16A+32B+)小鼠施用单剂量的ABD-DART或其亲本DART，并监测B细胞、T细胞和PM细胞的浓度。结果表明DART能够抑制B细胞的浓度(图49A)并被解释为表明直到DART被从小鼠循环中清除之前保持对B细胞的靶向的再导向杀伤。DART未抑制T细胞(图49B)和PM细胞(图49C)的浓度，证实了其特异性。
总之，成功地设计和制备了白蛋白结合结构域融合的DART蛋白(称为ABD-DART)。发现hCD16-hCD32B ABD-DART保留了对其识别的两个抗原决定簇：CD16和CD32B的特异性。发现ABD-DART表现出与人血清白蛋白的高亲和力。ABD的融合未减少生物活性(即，DART对再导向肿瘤细胞杀伤的效力)。DART分子与ABD的融合导致其体内半衰期的明 显改善(增加)，并实现了该目标而没有明显地增加其尺寸。保留小的尺寸的能力是有意义和有优势的，因为其有助于DART扩散到肿瘤组织中的能力。
6.19 Her2/B细胞受体DART
构建了包含能够结合Her2/neu和T细胞受体(“TCR”)的可变区的IgDART双抗体。
如以上讨论的，TCR由CD4+或CD8+T-细胞天然地表达并允许这些细胞识别被抗原递呈细胞的I类或II类MHC蛋白质结合并递呈的抗原性肽。TCR对pMHC(肽-MHC)复合体的识别引发细胞免疫反应的传播，该细胞免疫反应导致细胞因子的产生和抗原递呈细胞的裂解。ErbB家族的重要成员HER2/neu由于其在多种人类癌和哺乳动物发育中的作用而被透彻地研究(Hynes和Stem(1994)Biochim.et Biophys.Acta1198：165-184；和Dougall等人(1994)Oncogene9：2109-2123；Lee等人(1995)Nature378：394-398)。Semba等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)82：6497-6501和Yamamoto等人(1986)Nature319：230-234中描述了人HER2/neu基因和HER2/neu蛋白并且序列可在GenBank中以登记号X03363获得。HER2/neu包含4个结构域：配体所结合的胞外结构域；亲脂性跨膜结构域；保守的胞内酪氨酸激酶结构域；以及具有多个可被磷酸化的酪氨酸残基的羧基-末端信号传导结构域。(Plowman等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)90：1746-1750)。Franklin等人(2004)Cancer Cell.5(4)：317-328描述了HER2/neu的胞外(ECD)结构域的序列并可在Protein DataBank Record1S78(2004)中获得。
HER2/neu作为生长因子受体起作用并通常被肿瘤例如乳腺癌、结肠癌、膀胱细胞癌、卵巢癌和肺癌表达。HER2/neu在25-30％的人乳腺和卵巢癌中过表达，并与这些患者的入侵性临床进展和差的预后有关。(Slamon等人(1987)Science235：177-182；Slamon等人(1989)Science244：707-712)。还在包括胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、胰腺癌和膀胱癌的其他癌中观察到HER2/neu的过表达。(参见，例如King等人(1985)Science229：974；McCann等人(1990)Cancer65：88-92；Yonemura 等人(1991)Cancer Research51：1034)。
已经研发了靶向HRE-1或HER2/neu的大量单克隆抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂，包括，特别是，称为4D5(Genentech，Inc.)的鼠单克隆抗体的人源化变体，4D5识别HER2/neu的富含半胱氨酸的结构域II中的胞外表位(氨基酸529至627)，该表位位置非常接近蛋白质的跨膜区。研究已表明在过表达HER2/neu的乳腺癌细胞中，用对HER2/neu特异性的抗体与化疗剂(例如，顺铂、阿霉素、紫杉醇)的组合治疗引发比用单独的化疗剂治疗高的细胞毒性反应。(Hancock等人(1991)Cancer Res.51：4575-4580；Arteaga等人(1994)Cancer54：3758-3765；Pietras等人(1994)Oncogene9：1829-1838)。HER2/neu抗体可增强对化疗剂的反应的一种可能机制是通过调节HER2/neu蛋白的表达或通过干扰DNA修复。(StancoVski等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88：8691-8695；Bacus等人(1992)Cell Growth&Diff.3：401-411；Bacus等人(1993)Cancer Res.53：5251-5261；Klapper等人(1997)Oncogene14：2099-2109；Klapper等人(2000)Cancer Res.60：3384-3388；Arteaga等人(2001)J Clinical Oncology19(18s)：32s-40s。虽然在某些实例中，抗-HER2/neu抗体例如对患者提供治疗性益处，但是大多数的乳腺癌和其他患者对这些抗体表现出难治性反应。这些反应部分地反映了患者的癌细胞过表达HER2/neu的程度方面的差异。
作为包含能够结合Her2/neu和T细胞受体(“TCR”)的可变区的结果，DART具有结合表达HER2的细胞并因此将能够结合T细胞受体的结构域附到这些细胞的能力。当这些T细胞结合到该结构域时，其激活以引发导致杀伤表达HER2的细胞的免疫反应。
以下提供了该DART的氨基酸和核酸序列，以普通文本示出了VL和VH的序列，以加下划线的文本示出了VL-VH接头并以黑体和斜体示出了编码C-末端异二聚化基序(SEQ ID NO：313：GFNRGEC或SEQ ID NO：314：GVEPKSC)的序列。
TCRVL-HER2VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：315)
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT SKLASGVPSR 
FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQLQQ 
SGPELVKPGA SLKLSCTASG FNIKDTYIHW VKQRPEQGLE WIGRIYPTNG YTRYDPKFQD 
KATITADTSS NTAYLQVSRL TSEDTAVYYC SRWGGDGFYA MDYWGQGASV TVSS
编码TCRVL-HER2VH的核酸序列(SEQ ID NO：316)
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 
ctctcctgca gtgccacctc aagtgtaagt tacatgcact ggtatcagca gaaaccaggg 
aaagccccta agcgctggat ctatgacaca tccaaactgg cttctggggt cccatcaagg 
ttcagcggca gtggatctgg gacagaattt actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa 
gattttgcaa cttattactg tcagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt tggccagggg 
accaagcttg agatcaaagg aggcggatcc ggcggcggag gccaggttca gctgcagcag 
tctgggccag agcttgtgaa gccaggggcc tcactcaagt tgtcctgtac agcttctggc 
ttcaacatta aagacaccta tatacactgg gtgaaacaga ggcctgaaca gggcctggaa 
tggattggaa ggatttatcc tacgaatggt tatactagat atgacccgaa gttccaggac 
aaggccacta taacagcaga cacatcctcc aacacagcct acctgcaggt cagccgcctg 
acatctgagg acactgccgt ctattattgt tctagatggg gaggggacgg cttctatgct 
atggactact ggggtcaagg agcctcggtc accgtgagct cc
HER2VL-TCRVH的氨基酸序列(SEQ ID NO：317)
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD 
RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV 
QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYKFTSYVMH WVRQAPGQGL EWIGYINPYN DVTKYNEKFK 
GRVTITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVHY CARGSYYDYD GFVYWGQGTL VTVSS
编码HER2VL-TCRVH的核酸序列(SEQ ID NO：318)
gacatcgtga tgacccagtc ccacaagttc atgtccacct ctgtgggcga tagggtcagc 
atcacctgca aggccagcca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca gcagaaacca 
ggacattctc ccaaactgct gatttactcc gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat 
cgcttcactg gcagcagatc tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg 
ggtaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt tcagctggtg 
cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga aggtctcctg caaggccagc 
ggttacaagt ttaccagcta cgtgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt 
gagtggatcg gatatattaa tccttacaat gatgttacta agtacaatga gaagttcaaa 
ggcagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc 
ctgagatccg aggacacggc cgtgcactac tgtgcgagag ggagctacta tgattacgac 
gggtttgttt actggggcca agggactctg gtcactgtga gctcc
在优选实施方式中，这些构建体被修饰为包含有利于形成异二聚体(即，TCRVL-HER2VH x HER2VL-TCRVH二聚体)的E卷曲或K卷曲结构域。以下提供了用于该DART的氨基酸和核酸序列，以普通文本示出了VL和VH的序列，以加下划线的文本示出了VL-VH接头，并以斜体示出了编码用于二聚化的包含Cys的接头的序列(GGCGGG；SEQ ID NO：267的残基2-7)。E卷曲或K卷曲异二聚化结构域是加双下划线的(优选 的“E-卷曲”序列是七聚EVAALEK的4次重复；SEQ ID NO：299；优选的“K-卷曲”序列是七聚KVAALKE的4次重复(SEQ ID NO：300)。跟在E卷曲或K卷曲后面的序列没有确定的功能。
TCRVL-HER2VH-E卷曲的氨基酸序列(SEQ ID NO：319)
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT SKLASGVPSR 
FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQLQQ 
SGPELVKPGA SLKLSCTASG FNIKDTYIHW VKQRPEQGLE WIGRIYPTNG YTRYDPKFQD 
KATITADTSS NTAYLQVSRL TSEDTAVYYC SRWGGDGFYA MDYWGQGASV TVSS
GG GNS
编码TCRVL-HER2VH-E卷曲的核酸序列(SEQ ID NO：320)
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 
ctctcctgca gtgccacctc aagtgtaagt tacatgcact ggtatcagca gaaaccaggg 
aaagccccta agcgctggat ctatgacaca tccaaactgg cttctggggt cccatcaagg 
ttcagcggca gtggatctgg gacagaattt actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa 
gattttgcaa cttattactg tcagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt tggccagggg 
accaagcttg agatcaaagg aggcggatcc ggcggcggag gccaggttca gctgcagcag 
tctgggccag agcttgtgaa gccaggggcc tcactcaagt tgtcctgtac agcttctggc 
ttcaacatta aagacaccta tatacactgg gtgaaacaga ggcctgaaca gggcctggaa 
tggattggaa ggatttatcc tacgaatggt tatactagat atgacccgaa gttccaggac 
aaggccacta taacagcaga cacatcctcc aacacagcct acctgcaggt cagccgcctg 
acatctgagg acactgccgt ctattattgt tctagatggg gaggggacgg cttctatgct 
atggactact ggggtcaagg agcctcggtc accgtgagct ccggaggatg tggcggtgga 
ggcggc gggaattct
HER2VL-TCRVH-K卷曲的氨基酸序列(SEQ ID NO：321)
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD 
RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV 
QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYKFTSYVME WVRQAPGQGL EWIGYINPYN DVTKYNEKFK 
GRVTITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVHY CARGSYYDYD GFVYWGQGTL VTVSSGGCGG 
GG GGNS
编码HER2VL-TCRVH-K卷曲的核酸序列(SEQ ID NO：322)
gacatcgtga tgacccagtc ccacaagttc atgtccacct ctgtgggcga tagggtcagc 
atcacctgca aggccagcca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca gcagaaacca 
ggacattctc ccaaactgct gatttactcc gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat 
cgcttcactg gcagcagatc tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg 
ggtaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt tcagctggtg 
cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga aggtctcctg caaggccagc 
ggttacaagt ttaccagcta cgtgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt 
gagtggattg gatatattaa tccttacaat gatgttacta agtacaatga gaagttcaaa 
ggcagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc 
ctgagatccg aggacacggc cgtgcactac tgtgcgagag ggagctacta tgattacgac 
gggtttgttt actggggcca agggactctg gtcactgtga gctccggagg atgtggcggt 
gga
ggc ggcgggaatt ct
对具有Her2和T-细胞受体(TCR)结合结构域的DART分子测试了其在多种乳腺癌、结肠癌和膀胱癌细胞系中介导细胞毒性的能力，这些细胞系之前已被表征为显示出低水平的HER2表达(且因此是用抗-Her2/neu抗体的治疗难治的)。所测试的乳腺癌细胞系是ZR75-1(HER22+)(图50A)、MCF-7(HER21+)(图50B)和MDA-MB468(HER2-ve)(图50C)。所测试的非乳腺癌细胞系是HT-29(结肠癌细胞系)(图50D)和SW780(膀胱癌细胞系)(图50E)。如在图49A-E显示的，根据达到等价细胞毒性所需的浓度，并根据所观察到的细胞毒性的最大水平，该DART分子在介导肿瘤来源细胞系的细胞毒性方面明显比更有效。
6.20 DART和ABD通过E卷曲和K卷曲的体外融合
如以上所讨论的，本发明的DART分子可被设计为表现出对NKG2D受体以及对半抗原荧光素的亲和力的双特异性结合，使得其可用作能够共连接NKG2D受体和与荧光素偶联的结合配偶体相互作用的分子的通用衔接子。为进一步证实ABD的用途，使用下列多肽链构建了DART：
(1)KYK2VL-4420VH-GFNRGEC(SEQ ID NO：313)-E卷曲：使用上述KYK2.0抗体(Kwong，KY等人(2008)“Generation，Affinity Maturation.And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity，”J.Mol.Biol.384：1143-1156；以及PCT/US09/54911)的VL结构域和上述抗荧光素MAb4420的VH结构域构建该多肽。
(2)4420VL-KYK2VH-GVEPKSC(SEQ ID NO：314)：使用上述抗荧光素MAb4420的VL结构域和KYK2.0抗体的VH结构域构建该多肽。“E卷曲”表示七聚EVAALEK的4次重复的E卷曲氨基酸序列；SEQ ID NO：299。
将KYK2VL-4420VH-GFNRGEC(SEQ ID NO：313)-E卷曲和4420VL-KYK2VH-GVEPKSC(SEQ ID NO：314)多肽转染到CHO细胞中以表达命名为“KYK24420VF E卷曲”的DART。图51A和51B中示出了这些分子的纯化。KYK24420VF E卷曲DART的亲和力通过用NKG2D Fc012210检测DART与被捕获的FITC抗原的结合来确定。实验结果证实 DART能够结合两种分子(图52)。
另外，制备了K卷曲-GGGNS(SEQ ID NO：301)-ABD融合体，其中“K卷曲”表示七聚EVAALEK的4次重复的K卷曲氨基酸序列(SEQ ID NO：300)。图53提供了质粒pPAL7的限制性图谱，并描绘了质粒pPAL7K卷曲ABD的构建，该质粒使用了有助于纯化的PROFINITY E (Bio-Rad，Hercules，CA)标签表达K卷曲-ABD融合体。将pPAL7K卷曲ABD载体转化到大肠杆菌BL21DE3细胞中。带标签的K卷曲ABD的表达通过加入2mMIPTG来诱导，持续4小时。通过SDS-PAGE或蛋白质印迹验证蛋白的表达。简单来说，PROFINITY E 融合标签系统包括介导细胞裂解，将所释放的蛋白质结合到固定了枯草杆菌蛋白酶的亲和柱上，洗涤柱子以洗脱掉未结合的蛋白质，使用包含氟化物的洗脱缓冲液来激发枯草杆菌蛋白酶快速和精确地在裂解识别位点后面将标签从融合蛋白上裂解下来，这种裂解后从柱上洗下无标签的蛋白质并在PBS中透析所洗脱的蛋白质。图54示出了通过PROFINITY E 纯化树脂纯化(来自10ml培养物的小规模)到的K卷曲ABD蛋白的蛋白质印迹分析。
使用SDS-PAGE进一步纯化从PROFINITY E 纯化树脂得到的K卷曲-AFD蛋白(图55)。250ml大肠杆菌培养物产生6.523mg的纯化的蛋白质(表18)。
KYK24420VF E卷曲DART和K卷曲ABD蛋白在室温下在PBS中孵育30分钟以形成具有改善的性质的E卷曲-K卷曲ABD DART。ELISA结果表明复合体中的所有结构域能够结合其各自的配体(图56A-56C)。如期望的话，可使用抗EK柱实现KYK24420VF E卷曲和K-ABD复合体的进一步纯化。
因为复合体的形成不依赖于DART的特定结合结构域，所以上述方法可用来制备具有其他结合特异性的E卷曲-K卷曲ABD DART(例如，通过 将CD32B(例如，抗体2B6)/CD16A(例如，抗体3G8)VF E DART与K卷曲ABD复合)。
因此，如以上指出的，在本发明的一个实施方式中，DART的两条包含抗原结合结构域的多肽可包含用来驱动异二聚体形成的另外的序列(例如，K卷曲或E卷曲)且任选地这些多肽中的一种可包含能够结合血清蛋白的血清结合蛋白的多肽部分(例如，图45)。在替代实施方式中，DART的包含抗原结合结构域的多肽中的一条，且优选地仅一条，可包含该另外的序列以驱动异二聚体形成(例如，K卷曲或E卷曲)且该DART可包含具有另外(例如，第三条)多肽的复合体，其不包含抗原结合位点，但是包含具有用于驱动异二聚体形成的补充序列的多肽(例如，当DART的包含抗原结合结构域的多肽包含E卷曲时为K卷曲；或当DART的包含抗原结合结构域的多肽包含K卷曲时为E卷曲)和任选地能够结合血清蛋白的血清结合蛋白的多肽部分。该另外(例如，第三条)的多肽的血清结合蛋白的多肽部分可位于具有该补充序列的多肽的N末端或C末端。
如对本领域技术人员将明显的，可对本发明进行许多修改和改变而不偏离其精神和范围。仅通过示例的方式提供了本文描述的具体实施方式，且本发明将仅被所附权利要求的措辞以及这些权利要求被授予的全部等同物的范围所限制。这些修改被期望落在所附权利要求的范围内。本文提及的所有参考文献、专利和非专利通过引用且为所有目的被全部并入本文，其程度如同明确并单独地指明为了所有目的将每个单独的出版物或专利或专利申请通过引用全部并入本文。

Claims (20)

1.一种血清蛋白结合双抗体复合体，包含各自包含N末端和C末端的三条多肽链，其中：
(A)所述第一多肽链和第二多肽链彼此共价键合，且各自在N末端至C末端方向包含与重链可变结构域连接的轻链可变结构域，其中：
(1)所述第一多肽链的所述轻链可变结构域与所述第二多肽链的所述重链可变结构域缔合以形成对第一表位特异性的结合位点；且
(2)所述第二多肽链的所述轻链可变结构域与所述第一多肽链的所述重链可变结构域缔合以形成对第二表位特异性的结合位点；
(B)所述第一多肽链包含驱动异二聚体形成的多肽部分，所述驱动异二聚体形成的多肽部分位于所述第一多肽链的所述重链可变结构域的C末端，且所述驱动异二聚体形成的多肽部分是E卷曲或K卷曲；其中所述E卷曲是七聚EVAALEK的4次重复(SEQ ID NO:299)且所述K卷曲是七聚KVAALKE的4次重复(SEQ ID NO:300)；且
(C)所述第三多肽链包含能够与所述血清蛋白结合的血清结合蛋白的多肽部分和驱动异二聚体形成的多肽部分：
(1)如果所述第一多肽链包含K卷曲，则所述第三多肽链包含的所述驱动异二聚体形成的多肽部分为E卷曲，或
(2)如果所述第一多肽链包含E卷曲，则所述第三多肽链包含的所述驱动异二聚体形成的多肽部分为K卷曲；
其中所述第一多肽链的所述驱动异二聚体形成的多肽部分与所述第三多肽链的所述驱动异二聚体形成的多肽部分复合在一起，从而形成所述血清蛋白结合双抗体复合体，且所述血清蛋白结合双抗体复合体能够与所述第一表位、所述第二表位以及所述血清蛋白同时结合。
2.根据权利要求1所述的血清蛋白结合双抗体复合体，其中能够与所述血清蛋白结合的血清结合蛋白的所述多肽部分位于所述驱动异二聚体形成的多肽部分的N末端。
3.根据权利要求1所述的血清蛋白结合双抗体复合体，其中能够与所述血清蛋白结合的血清结合蛋白的所述多肽部分位于所述驱动异二聚体形成的多肽部分的C末端。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的血清蛋白结合双抗体复合体，其中所述血清结合蛋白是白蛋白结合蛋白。
5.根据权利要求4所述的血清蛋白结合双抗体复合体，其中所述白蛋白结合蛋白是链球菌G蛋白且所述多肽是所述链球菌G蛋白的白蛋白结合结构域。
6.根据权利要求5所述的血清蛋白结合双抗体复合体，其中所述链球菌G蛋白的所述白蛋白结合结构域是链球菌菌株G148(Streptococcus strainG148)的G蛋白的白蛋白结合结构域3。
7.根据权利要求1所述的血清蛋白结合双抗体复合体，其中所述双抗体显示出大于2小时的体内血清半衰期。
8.根据权利要求1-3和5-7中任一项所述的血清蛋白结合双抗体复合体，其中所述双抗体结合自然杀伤群2D(NKG2D)受体、T细胞受体(TCR)结合结构域或半抗原。
9.根据权利要求4所述的血清蛋白结合双抗体复合体，其中所述双抗体结合自然杀伤群2D(NKG2D)受体、T细胞受体(TCR)结合结构域或半抗原。
10.根据权利要求8所述的血清蛋白结合双抗体复合体，其中所述双抗体还结合肿瘤相关抗原。
11.根据权利要求9所述的血清蛋白结合双抗体复合体，其中所述双抗体还结合肿瘤相关抗原。
12.根据权利要求10所述的血清蛋白结合双抗体复合体，其中所述肿瘤相关抗原为乳腺癌抗原、卵巢癌抗原、前列腺癌抗原、宫颈癌抗原、胰腺癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、结肠癌抗原、睾丸癌抗原、成胶质细胞瘤癌抗原、与B细胞恶性肿瘤有关的抗原、与多发性骨髓瘤相关的抗原、与非霍奇金淋巴瘤有关的抗原或与慢性淋巴细胞白血病有关的抗原。
13.根据权利要求11所述的血清蛋白结合双抗体复合体，其中所述肿瘤相关抗原为乳腺癌抗原、卵巢癌抗原、前列腺癌抗原、宫颈癌抗原、胰腺癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、结肠癌抗原、睾丸癌抗原、成胶质细胞瘤癌抗原、与B细胞恶性肿瘤有关的抗原、与多发性骨髓瘤相关的抗原、与非霍奇金淋巴瘤有关的抗原或与慢性淋巴细胞白血病有关的抗原。
14.根据权利要求12所述的血清蛋白结合双抗体复合体，其中所述肿瘤相关抗原为A33、ADAM-9、ALCAM、B1、BAGE、β-连环蛋白、CA125、羧肽酶M、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD32B、CD36、CD40、CD45、CD46、CD56、CD79a、CD79b、CD103、CD154、CDK4、CEA、CTLA4、细胞角蛋白8、EGF-R、肝配蛋白受体、ErbB1、ErbB3、ErbB4、GAGE-1、GAGE-2、GD2、GD3、GM2、gp100、HER-2/neu、人乳头瘤病毒-E6、人乳头瘤病毒-E7、整联蛋白α-V-β-6、JAM-3、KID3、KID31、KSA(17-1A)、LUCA-2、MAGE-1、MAGE-3、MART、MUC-1、MUM-1、N-乙酰葡糖胺基转移酶、制瘤素M受体β、p15、PIPA、PSA、PSMA、RAAG10、ROR1、SART、sTn、TES7、TNF-α受体、TNF-β受体、TNF-γ受体、转铁蛋白受体或VEGF受体。
15.根据权利要求13所述的血清蛋白结合双抗体复合体，其中所述肿瘤相关抗原为A33、ADAM-9、ALCAM、B1、BAGE、β-连环蛋白、CA125、羧肽酶M、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD32B、CD36、CD40、CD45、CD46、CD56、CD79a、CD79b、CD103、CD154、CDK4、CEA、CTLA4、细胞角蛋白8、EGF-R、肝配蛋白受体、ErbB1、ErbB3、ErbB4、GAGE-1、GAGE-2、GD2、GD3、GM2、gp100、HER-2/neu、人乳头瘤病毒-E6、人乳头瘤病毒-E7、整联蛋白α-V-β-6、JAM-3、KID3、KID31、KSA(17-1A)、LUCA-2、MAGE-1、MAGE-3、MART、MUC-1、MUM-1、N-乙酰葡糖胺基转移酶、制瘤素M受体β、p15、PIPA、PSA、PSMA、RAAG10、ROR1、SART、sTn、TES7、TNF-α受体、TNF-β受体、TNF-γ受体、转铁蛋白受体或VEGF受体。
16.根据权利要求14所述的血清蛋白结合双抗体复合体，其中所述肿瘤相关抗原为HER-2/neu或CD32B。
17.根据权利要求15所述的血清蛋白结合双抗体复合体，其中所述肿瘤相关抗原为HER-2/neu或CD32B。
18.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求8-11中任一项所述的血清蛋白结合双抗体复合体和药学上可接受的载体。
19.包含根据权利要求10-11中任一项所述的血清蛋白结合双抗体复合体和药学上可接受的载体的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述癌症为乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、睾丸癌、成胶质细胞瘤癌、B细胞恶性肿瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病。
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