ES2300113T3 - Un procedimiento para inhibir toxicidad inducida por inmunoglobulinas que resulta del uso de inmunoglobulinas en terapia y diagnostico in vivo. - Google Patents
Un procedimiento para inhibir toxicidad inducida por inmunoglobulinas que resulta del uso de inmunoglobulinas en terapia y diagnostico in vivo. Download PDFInfo
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN PROCEDIMIENTO PARA INHIBIR LA TOXICIDAD INDUCIDA POR INMUNOGLOBULINAS, PRODUCIDA POR INMUNOTERAPIA EN UN SUJETO. DICHO PROCEDIMIENTO CONSISTE EN ADMINISTRAR UNA IG O UNA MOLECULA PROTEINICA DE FUSION DE IG AL SUJETO, ESTANDO CONSTITUIDA DICHA MOLECULA DE IG POR UNA REGION VARIABLE Y UNA REGION CONSTANTE, SIENDO MODIFICADA DICHA MOLECULA ANTES DE SU ADMINISTRACION, MEDIANTE INACTIVACION DE AL MENOS UNA PARTE DE LA REGION CONSTANTE.
Description
Un procedimiento para inhibir toxicidad inducida
por inmunoglobulinas que resulta del uso de inmunoglobulinas en
terapia y diagnóstico in vivo.
La presente invención se refiere a
procedimientos para inhibir o reducir toxicidad inducida por
inmunoglobulinas que resulta de terapia o diagnóstico in
vivo. Específicamente, en vez de usar anticuerpos no modificados
o proteínas de unión recombinantes para usar in vivo, la
invención proporciona el uso de anticuerpos modificados o proteínas
de unión recombinantes que se han alterado estructuralmente en el
dominio constante tal que tras administración la toxicidad inducida
por inmunoglobulinas se reduce o inhibe.
A lo largo de los años investigadores han
intentado endurecer el sistema inmune para uso terapéutico. Las
moléculas de inmunoglobulinas (Ig) que constituyen una parte
importante del sistema inmune son de gran interés porque (1)
reaccionan con una familia diversa de ligandos, (2) poseen
diferentes funciones efectoras y (3) son de gran importancia
biológica. A pesar de su potencial, un problema persistente con la
inmunoterapia de inmunoglobulinas ha sido, entre otros problemas,
el efecto tóxico para células normales de usar anticuerpos que
reconocen tanto células normales como enfermas. Este problema es de
largo alcance porque la mayoría de los anticuerpos actualmente
disponibles reconocen un objetivo localizado tanto en células
normales como en células enfermas (Slavin-Chiorini,
y col., Int. J. Cancer 53: 97-103 (1993)).
La región constante puede promover muerte
celular a través de citotoxicidad mediada por células dependiente
de anticuerpos (ADCC) o mediante citotoxicidad dependiente del
complemento (CDC). A pesar de la deleción de partes de su región
constante, particularmente el dominio CH_{2}, la función de unión
al antígeno se puede retener (D. Yelton, M. Scharf, Mutant
monoclonal antibody with alterations in
\hbox{biológical
functions, J Exp. Methods. 156: 1131-1148
(1982)).}
Otros han generado un anticuerpo con CH_{2}
delecionado (Mueller y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87:
5702-5705 (1990)). Sus hallazgos proporcionan que el
anticuerpo con CH_{2} delecionado, designado ch14.189DCH2, es un
reactivo potencialmente útil para radioinmunodetección de tumores
humanos debido a su inmunogenicidad reducida, su especificidad de
objetivo incrementada, y la rápida evacuación desde la circulación
(Mueller y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87:
5702-5705 (1990)).
G. J. Schreiber y col., Cancer Research, vol.
52, 1992, p. 3262-3666 describe el polipéptido de
IgG3 F(ab')_{2} de anticuerpo BR96 murino
anticarcinogénico y una variante cambiada de clase IgG1 del
anticuerpo original BR96 IgG3 que no tenía ninguna citotoxicidad
celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y no tenía ninguna función
efectora de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). S. D.
Gillies y col., Human Antibodies and Hibridomas, vol. 1, 1990, p.
47-54 describe unión de antígeno y actividades
biológicas de anticuerpos quiméricos mutantes manipulados con
especificidades por tumores humanos. La región constante de la
cadena IgG se alteró estructuralmente bien delecionando el dominio
CH2 o bien mediante mutación puntual de dos cisteínas en la región
de bisagra de la molécula IgG. La deleción de CH2 condujo a
actividades ADCC y CDC drásticamente reducidas. La mutación de
cisteína dio como resultado una actividad ADCC grandemente reducida,
y una reducida, pero aún significativa, capacidad para mediar CDC.
G. J. Weiner y col., Journal of Immunology, vol. 152, 1994, p.
2385-2392 describe un anticuerpo de anti CD3 x
F(ab')_{2} antitumor biespecífico que se usa para terapia
inmune. La parte F_{c} del anticuerpo se ha eliminado para
reducir los efectos secundarios tóxicos encontrados en estudios de
pacientes preliminares, tales como ADCC y activación de células T
no específica. A. R. Duncan y col., Nature, vol. 332, 1988, p.
738-740 describe que ciertas mutaciones puntuales en
los residuos 318 (Glu), 320 (Lys) y 322 (Lys) en el dominio CH2 de
los diferentes isotipos IgG reducen CDC y que hay isotipos IgG tales
como IgG4 que son no líticos y por lo tanto no inducen una
respuesta CDC. Y. Xu y col., The Journal of Biological Chemistry,
vol. 269, 1994, p. 3469-3474 describe que la región
C-terminal del dominio CH2 (residuos
292-340) parecer ser responsable de las diferencias
específicas de isotipo en unión al complemento e inducción de la
respuesta CDC. Además, el residuo en la posición 331 se analizó y
se encontró que es importante para unión de Cq1 y activación de
complemento en IgG1 humana. Una mutación puntual de Pro^{331} a
Ser^{331} abolió esta actividad mientras que una mutación puntual
Pro^{331} en el isotipo IgG4 que está usualmente inactivo restauró
la actividad lítica de dicho isotipo. J. Lund y col., The Journal
of Immunology, vol. 147, 1991, p. 2657-2662
describe los sitios de unión Fc\gammaRI y Fc\gammaRII en el
dominio CH2 en el isotipo IgG3 humano que es responsable de la
respuesta de ADCC tóxica en sujetos tratados con anticuerpos. Los
sitios de unión se solapan parcialmente en la región de los
residuos 234 a 239 en isotipos humanos IgG1 e IgG3. Una unión a IgG2
humana no se puede detectar. Además, una mutación puntual en la
posición 235 dio como resultado la reducción más grande de unión a
Fc\gammaRI y mutaciones puntuales en las posiciones 234 y 237
dieron como resultado la reducción más grande de unión a
Fc\gammaRII. A. Morgan y col., Immunology, 1995, vol. 86, p.
319-324 describe que cambiar la leucina 235 en la
región CH2 de IgG1 abolió la lisis del complemento humano y cambiar
la glicina en 237 a alanina de IgG1 redujo la lisis del complemento
humano. Intercambiar la región completa 233-236 con
la secuencia encontrada en IgG2 humana abolió la lisis del
complemento humano reducido. En contraste, un cambio en el resto de
unión a Clq descrito previamente, de lisina en 320 a alanina, no
tuvo ningún efecto en la lisis de complemento mediada por IgG1. S.
M. Canfield y col., J. Exp. Med., vol. 173, junio 1991, p.
1483-1491 describe un anticuerpo IgG que tiene dos
mutaciones en posiciones 234 y 331 que tienen una actividad de
unión a receptor FCy reducida y por lo tanto una respuesta a ADCC
reducida.
Generalmente, las moléculas de anticuerpo
completas se componen de dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas
ligeras (L) que se mantienen juntas mediante enlaces covalentes
(disulfuro) e interacciones no covalentes. Cada cadena contiene una
región variable (V) y una región constante (C). Las regiones
variables en los extremos aminoterminales de las dos cadenas forman
la región de unión al antígeno. La región constante de la cadena H
tiene tres componentes o dominios. Ocasionalmente, el primer
dominio de región constante (CH_{1}) interacciona con la región C
de la cadena L a través de interacciones hidrófobas y generalmente a
través de un puente disulfuro, dependiendo del isotipo. El
siguiente tramo de la región C es el puente disulfuro que actúa en
la bisagra introducido de forma estable entre dos cadenas H. El
segundo dominio de la región constante (CH_{2}) está adyacente a
la región de bisagra. CH_{2} contiene secuencias importantes para
las funciones efectoras del anticuerpo, tales como las secuencias
responsables de la fijación del complemento, y la unión al receptor
de Fc. El tercer dominio de región constante (CH_{3}) está
localizado en el extremo carboxiterminal de la cadena H, y se
considera que juega un papel importante en el ensamblaje de la
cadena H así como algunas funciones de la región C.
Hoy muchos anticuerpos en ensayos clínicos se
dirigen contra antígenos asociados a tumores. La mayoría de los
antígenos asociados a tumores no son específicos de tumor pero se
encuentran también generalmente en la superficie celular de algunas
células normales, no tumorogénicas. El uso clínico de algunos
anticuerpos dirigidos contra antígenos asociados a tumores está
limitado debido a la toxicidad asociada con su uso. Por lo tanto,
hay una necesidad de procedimientos para inhibir o reducir toxicidad
a células normales generalmente asociada con inmunoterapia de
inmunoglobulinas que se usan en el campo de la terapia para las
enfermedades (por ejemplo, terapia para tumores, enfermedades del
riñón y similares) y diagnosis in vivo.
Hemos tratado esta necesidad mediante el
descubrimiento de métodos para inhibir o reducir toxicidad a las
células normales que se asocian normalmente con la inmunoterapia de
inmunoglobulina o con la diagnosis in vivo, en las que la
inmunoglobulina reconoce tanto células enfermas como normales.
Nuestro descubrimiento implica generar moléculas de
inmunoglobulinas o proteínas de condensación Ig que tienen regiones
constantes alteradas que inhiben o reducen toxicidad inducida por
inmunoglobulinas.
En el presente documento se describen
procedimientos para inhibir toxicidad inducida por inmunoglobulinas
usando moléculas de inmunoglobulina conocidas o proteínas de
condensación Ig que están estructuralmente alteradas en sus
regiones constantes de tal forma que la inmunoglobulina alterada
estructuralmente resultante o moléculas de proteínas de
condensación Ig presentan citotoxicidad inhibida o reducida in
vivo en comparación con sus contrapartidas no modificadas
originales.
La presente invención proporciona primero un
anticuerpo BR96 que tiene una región constante IgG1 humana que se
ha alterado estructuralmente en el dominio CH2 en el que la leucina
en la posición aminoacídica 235 está mutada a alanina, la glicina
en la posición aminoacídica 237 está mutada a alanina, y la prolina
en posición 331 está mutada a alanina.
La presente invención proporciona también un
anticuerpo BR96 que tiene una región constante IgG1 humana que se
ha alterado estructuralmente en el dominio CH2 en el que la leucina
en la posición aminoacídica 235 está mutada a alanina, la glicina
en la posición aminoacídica 237 está mutada a alanina; y la prolina
en la posición 331 está mutada a alanina.
Además, la presente invención proporciona un
anticuerpo BR96 que tiene una región constante IgG1 humana que se
ha alterado estructuralmente en el dominio CH2 en el que la leucina
en la posición aminoacídica 235 está mutada a alanina, la glicina
en la posición aminoacídica 237 está mutada a alanina, el ácido
glutámico en la posición aminoacídica 318 está mutado a serina; la
lisina en la posición aminoacídica 320 está mutada a serina; y la
prolina en la posición aminoacídica 331 está mutada a alanina.
Otros aspectos de la invención se reivindican en
las reivindicaciones adjuntas 4-18. Las
realizaciones adicionales no comprendidas por la invención
reivindicada se describen también en la presente memoria
descriptiva.
La alteración estructural de la región constante
se puede llevar a cabo en un número de formas tan grande como
resulten en reducir o inhibir toxicidad inducida por
inmunoglobulinas.
La alteración estructural de la región constante
se lleva a cabo mediante deleción de la región constante completa.
En otra realización, sólo aquella parte del dominio CH_{2} que une
al receptor Fc se deleciona. En aún otra realización, sólo aquella
parte del dominio CH_{2} que une al componente C1q del complemento
se deleciona. Alternativamente, en otra realización, se efectúan
deleciones múltiples en receptor de Fc discreto y dominios de unión
al componente del complemento.
Alternativamente, se efectuó alteración
estructural mediante mutaciones individuales o múltiples en el
dominio CH_{2} tales como inserciones y sustituciones de
aminoácidos. La mutación o mutaciones deben dar como resultado
inhibir toxicidad inducida por inmunoglobulina. A modo de ejemplo,
los aminoácidos en dominios asociados de toxicidad múltiple en la
región constante se pueden alterar tal como para volver a la región
constante incapaz de mediar una respuesta de ADCC o activar
complemento inhibiendo por lo tanto toxicidad inducida por
inmunoglobulina resultante de inmunoterapia. Alternativamente, se
pueden alterar aminoácidos múltiples en un dominio asociado de
toxicidad simple en la región constante.
Alternativa y adicionalmente, la alteración
estructural se puede llevar a cabo mediante cambio de isotipo dando
como resultado una molécula de inmunoglobulina alterada que bien no
induce toxicidad o bien induce alguna toxicidad limitada pero no
causa un efecto dañino. Por ejemplo, el cambio de isotipo puede
resultar en la región constante siendo incapaz de mediar una
respuesta de CDC o ADCC o alguna otra actividad que media
toxicidad.
La figura 1 es un gráfico lineal que muestra
aclaramiento del plasma en perros que expresan Le^{Y} alta usando
BR96 quimérico contra mutante de región constante de
cBR96-2.
La figura 2 es un diagrama esquemático de un
plásmido designado pTWD-cJVK.L1 que incluye la
cadena de (c)BR96 quimérico (SEQ ID Nº.: 11).
La figura 3 es un diagrama esquemático de un
plásmido, designado pD16hJ1.L1 que incluye la cadena de
(h)BR96 ligero humano (SEQ ID Nº.: 13).
La figura 4 es un diagrama esquemático de un
plásmido, designado
pD17-hJm14-dCH2.H1, de
hBR96-2A (es decir, BR96 mutante humano que tiene
las mutaciones H1, H2, y H3 y la deleción de CH_{2} (Solicitud de
PCT Nº.: 95/305444, publicada el 6 de marzo de 1996).
La figura 5 es un diagrama esquemático de un
plásmido, designado pD17-cJ-dCH2.H1,
de cBR96-A (SEQ ID Nº.: 10) (es decir, BR96
quimérico que tiene la deleción de CH_{2} (Solicitud de PCT Nº.:
95/305444, publicada el 6 de marzo de 1996).
La figura 6 es un diagrama esquemático de un
plásmido, designado pD17-cJ.H1, de cBR96.
La figura 7 es una gráfica lineal que muestra
los resultados de un ensayo de ELISA de (1)
hBR96-A-Dox a Le^{y} (diamante
sólido), (2) chiBR96 a Le^{y} (96:0006A2 R/A)(cuadrado sólido),
(3) cBR96-A a Le^{y} (96:0003 R/A)(triángulo
sólido), y BR96-Dox a Le^{y} (X).
La figura 8 es una gráfica lineal que muestra
los resultados de un ensayo de ELISA de (1)
BR96-A-Dox a Le^{y} (diamante
sólido), (2) chiBR96 a Le^{y} (cuadrado sólido), (3)
cBR96-A a Le^{y} (96:0003 R/A)(triángulo sólido),
y BR96-Dox a Le^{y} (X).
Las figuras 9a-c son diagramas
esquemáticos que muestran las etapas para delecionar un dominio
CH_{2}.
Las figuras 10a-c son diagramas
esquemáticos que muestran la construcción de mutaciones puntuales de
dominio CH_{2} de IgG1 BR96.
La figura 11 es un diagrama esquemático que
muestra la construcción del vector pNgI/14.
La figura 12 es un diagrama esquemático que
muestra la construcción de
pD17-hBR96-2.
La figura 13 es un diagrama esquemático que
muestra la construcción de
pD17-hJm14-dCH2.H1.
Las figuras 14A-J son la
secuencia de aminoácidos de
pD17-cJ-dCH2H1, el plásmido mostrado
en la figura 5, BR96 quimérico que tiene la deleción CH_{2}.
La figura 15 es una gráfica lineal que muestra
los resultados de un ensayo de ELISA que compara el chiBR96 total y
el chiBR96 al que le han eliminado CH_{2} en Le^{y}.
La figura 16 es una descripción de las siete
alteraciones estructurales.
La figura 17 es un diagrama esquemático de un
plásmido designado pD I 7-hG 1 b.
Las figuras 18A-F son la
secuencia de ácidos nucleicos de pD 17-hJm 14.H
1.
Las figuras 19A-N son la
secuencia de ácidos nucleicos de pD17-hG1b.
La figura 20 es una gráfica lineal que muestra
citotoxicidad dependiente de complemento. En la leyenda, el
cuadrado sólido es hBR96-1; el diamante sólido es
hBR96-2B; el círculo sólido es
hBR96-2C; el triángulo sólido es
hBR96-2D; el cuadrado hueco es
hBR96-2H; el círculo hueco es
hBR96-2A y el triángulo hueco es 2B8, mAb tipo b
anti-flagelos de Pseudomonas aeruginosa,
control negativo.
\newpage
La figura 21 es una gráfica lineal que muestra
citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos. En la
leyenda, el cuadrado sólido es hBR96-1; el diamante
sólido es hBR96-2B; el círculo sólido es
hBR96-2C, el triángulo sólido es
hBR96-2D; el cuadrado hueco es
hBR96-2H; el círculo hueco es
hBR96-2A y el triángulo hueco es 2B8, anticuerpos
monoclonales (mAb) tipo b anti-flagelos de
Pseudomonas aeruginosa, control negativo.
La figura 22 es una gráfica lineal que muestra
actividad de unión de mutantes de región constante
hBR96-2 en LeY-HSA. En la leyenda,
el diamante sólido es hBR96-1; el cuadrado sólido es
hBR96-2A (deleción de CH2); el triángulo sólido es
hBr96-2B (mutaciones 235, 237), el cuadrado hueco es
hBR96-2C (mutaciones 318, 320, 322); círculo hueco
es hBR96-2D (mutación 331); y
\hbox{triángulo
hueco es hBR96-2H (mutaciones 235, 237, 318, 320,
322, 331).}
La figura 23 es una gráfica lineal que muestra
actividad de unión de mutantes de región constante
hBR96-2 en LNFPIII-BSA. LNFPIII es
una lacto-N-fucopentasosa, un
trisacárido de Lewis X con un espaciador de lactosa adicional (V
Labs, Covington, LA). En la leyenda, el diamante sólido es
hBR96-1; cuadrado sólido es hBR96-2A
(deleción de CH2); triángulo sólido es hBR96-2B
(mutaciones 235, 237); cuadrado hueco es hBR96-2C
(mutaciones 318, 320, 322); el círculo hueco es
hBR96-2D (mutación 331); y el triángulo hueco es
hBR96-2H (mutaciones 235, 237, 318, 320, 322,
331).
Las figuras 24A y 24B proporcionan una
estrategia para introducir mutaciones múltiples mediante RPCR. (A)
Diagrama de la región de cadena pesada de IgG he de 1,4 kpb que
muestra los dominios CH2 y CH3 de bisagra como regiones en cajas.
Mutaciones específicas de sitio a introducirse dentro de posiciones
de CH_{2} L1, L2 y L3 están codificadas por series
complementarias de cebadores de PCR mutantes (A1 y A2; B1 y B2; y C1
y C2). Los asteriscos (*) indican el número de cambios de
aminoácidos introducidos en cada posición L. Los dos cebadores de
PCR, Rs (recombinación en el sentido normal) y Ra (recombinación
antisentido), flanquean los sitios de restricción y median la
recombinación homóloga con extremos de vectores. Los extremos 3' de
los oligonucleótidos se representan mediante puntas de flecha. (B)
Un evento de recombinación homóloga de tres modos entre fragmentos
RsA2, AIRa y el vector linearizado produce el mutante de IgG L. Dos
series de mutaciones localizadas distalmente (L y L2) se introducen
simultáneamente incrementando el número de PCR recombinantes
producidos como se muestra en la recombinación de cuatro formas de
RsA2, A1B2, B1Ra con vector.
La figura 25 es un gel que muestra análisis por
endonucleasas de restricción Eco-47 III de DNA
preparados a partir de colonias generadas mediante RPCR de
fragmentos de PRC múltiples. Carril M: marcador de DNA en escalera
de 1 kb (GIBCO/BRL Life Science Technology). Carriles
1-12: se usan doce colonias seleccionadas
aleatoriamente que resultan de eventos de recombinación homóloga
cuádruple para preparar plásmido y se digieren con
Eco47-III. Clones 1, 2, 6 y 9 contienen el inserto
de 1,4 kpb totalmente ensamblado.
La figura 26 proporciona la secuencia de
aminoácidos para región variable de cadena pesada
hBR96-2 y la región constante de la IgG1
humana.
La figura 27 proporciona la secuencia de
aminoácidos para región variable de cadena pesada
hBr96-2A y la región constante de la IgG1 humana
sin el dominio CH_{2.}
La figura 28 proporciona la secuencia de
aminoácidos para región variable de cadena pesada chi hBr96 y la
región constante de la IgG1 humana sin el dominio CH_{2.}
Como se usa en el presente documento el término
"inhibir toxicidad inducida por inmunoglobulinas" significa
reducir o aliviar síntomas asociados generalmente con toxicidad
causada por inmunoglobulina o terapia de proteína de condensación
Ig, por ejemplo, toxicidad mediada por funciones efectoras del
receptor de Fc. Por ejemplo, el anticuerpo BR96 reconoce y une
antígeno BR96 que se encuentra en algunos niveles en el tracto
gastrointestinal y a niveles elevados en tumores (según se comparan
con el tracto gastrointestinal de tejidos normales). La unión de
anticuerpo BR96 al antígeno BR96 in vivo causa síntomas
asociados con toxicidad gastrointestinal. Estos síntomas incluyen
rápida aparición de vómitos, a menudo con sangre, y náuseas. En
humanos el sangrado se limita al fondo del estómago, causando
erosión en la mucosa superficial del estómago.
La patología de la herida se limita y se
resuelve. Sin embargo, la naturaleza extrema de las náuseas y
vómitos, no aliviados por antieméticos, define la toxicidad
limitante de dosis. Para niveles altamente elevados de otros
antígenos encontrados en el sistema nervioso central (SNC), hígado,
y otras localizaciones, la toxicidad se caracterizará mediante
síntomas distintos de aquellos descritos anteriormente.
Como se usa en el presente documento el término
"molécula de inmunoglobulina" se puede producir por células B
o generarse a través de ingeniería recombinante o medios sintéticos
químicos. Ejemplos de moléculas de inmunoglobulinas incluyen (1)
anticuerpos, por ejemplo anticuerpos policlonales y monoclonales,
quiméricos o humanizados, y (2) Ig recombinante que contiene
proteínas de unión, por ejemplo, proteínas de condensación Ig. Las
proteínas de unión que contienen Ig recombinante incluyen proteínas
de superficie celular, por ejemplo, antígenos CD (en una
realización, CTLA4), a las que está unida una cola de poli A.
Como se usan generalmente los términos
"estructuralmente alterados" o "alteración estructural"
significa manipular la región constante de tal forma que la
molécula resultante o proteína resultante presenta una capacidad
disminuida para inducir toxicidad. La alteración de la estructura
puede ser mediante modificación química, alteración proteolítica, o
mediante medios genéticos recombinantes. Los medios genéticos
recombinantes pueden incluir, pero no se limitan a, la deleción,
inserción o sustitución de restos aminoácidos.
Como se usan en el presente documento los
términos "dominios asociados con toxicidad múltiple" significan
más de un dominio asociado de toxicidad discreta. Como parece haber
al menos dos dominios asociados con toxicidad en la molécula de
inmunoglobulina., alguien localizó aproximadamente a los aminoácidos
231- 238 y otra persona localizó a los aminoácidos
330-331, un ejemplo de la alteración estructural de
los dominios asociados con toxicidad múltiple comprende la
inserción, sustitución o deleción de los residuos de aminoácidos en
ambos de estos dominios. Esta definición excluye alteraciones
estructurales que señalan como objetivo un dominio asociado de
toxicidad individual.
Meramente a modo de ejemplo, la región constante
de la molécula de inmunoglobulina puede alterarse estructuralmente
de tal forma que la molécula no medie más una respuesta CDC o ADCC.
Sin embargo, los procedimientos de la invención comprenden el uso
de moléculas de inmunoglobulina estructuralmente alteradas a pesar
de si median una respuesta CDC o ADCC. El requerimiento subyacente
es que la molécula alterada debe inhibir toxicidad inducida por
inmunoglobulina.
La presente invención proporciona primero un
anticuerpo BR96 que tiene una región constante de IgG1 humana que
se ha alterado estructuralmente en el dominio CH2 en el que leucina
en la posición aminoacídica 235 está mutada a alanina; glicina en
la posición aminoacídica 237 está mutada a alanina; ácido glutámico
en la posición aminoacídica 318 está mutado a serina; lisina en la
posición aminoacídica 320 está mutada a serina; y lisina en
posición aminoacídica 322 está mutada a serina.
La presente invención también proporciona un
anticuerpo BR96 que tiene una región constante de IgGI que se ha
alterado estructuralmente en el dominio CH2 en el que leucina en la
posición aminoacídica 235 está mutada a alanina; glicina en la
posición aminoacídica 237 está mutada a alanina; y prolina en la
posición aminoacídica 331 está mutada a alanina.
Además, la presente invención proporciona un
anticuerpo BR96 que tiene una región constante de IgGI humana que
se ha alterado estructuralmente en el dominio CH2 en el que leucina
en la posición aminoacídica 235 está mutada a alanina; glicina en
la posición aminoacídica 237 está mutada a alanina; ácido glutámico
en la posición aminoacídica 318 está mutado a serina; lisina en la
posición aminoacídica 320 está mutada a serina; lisina en posición
aminoacídica 322 está mutada a serina; y prolina en la posición
aminoacídica 331 está mutada a alanina.
Otros aspectos de la invención se reivindican en
las reivindicaciones adjuntas 4-18. Las
realizaciones adicionales no comprendidas por la por la invención
reivindicada se describen también en la presente especificación.
La alteración estructural se puede llevar a cabo
en un número de formas. Por ejemplo, la alteración estructural se
puede llevar a cabo mediante deleción de la región constante
completa.
Alternativamente, la alteración estructural se
puede llevar a cabo mediante deleción del dominio CH_{2} entero
de la región constante. En este caso, la deleción del dominio
CH_{2} entero puede volver a la molécula incapaz de (1) unir un
receptor de Fc eliminando de este modo la posibilidad de la molécula
de mediar citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC),
(2) unir C1q, o (3) activar complemento.
Alternativamente, la alteración estructural se
puede llevar a cabo mediante deleción de sólo aquella parte del
dominio CH_{2} que une al receptor Fc o al complemento.
Adicional y alternativamente, una mutación
individual o mutaciones múltiples tales como sustituciones e
inserciones en el dominio CH_{2} se pueden hacer. El
requerimiento subyacente de cualesquiera mutaciones es que deben
inhibir, disminuir, o bloquear toxicidad inducida por
inmunoglobulina. Por ejemplo, esto se puede lograr mutando la
región constante de tal forma que la molécula alterada se vuelve
incapaz de mediar una respuesta CDC o una respuesta ADCC, o para
activar el complemento.
Alternativamente, se puede llevar a cabo
alteración estructural mediante cambo de isotipo (también conocido
como cambio de clase) de tal forma que la molécula alterada no puede
inducir toxicidad en el sujeto. En una realización, la región
constante de la inmunoglobulina está estructuralmente alterada de
tal forma que no une más el receptor de Fc o un componente del
complemento, por ejemplo, cambiando un isotipo de IgG original de
molécula de IgG1 a IgG4. El cambio de isotipo se puede llevar a cabo
sin tener en cuenta la especie, es decir, un isotipo de un ser no
humano se puede cambiar con un isotipo de un ser humano (E.D.
Finkelman y col. (1990) Annu. Rev. Immunol. 8:
303-333; T. Honjo y col. (1979) Cell 18:
559-568; T. Honjo y col. en "Immunoglobulin
Genes", páginas 124-129 Academic Press,
Londres)).
Como se usa en el presente documento el término
"proteína de condensación Ig" significa cualquier antígeno
recombinantemente producido o dominio de unión a ligando que tiene
una región constante que puede alterarse estructuralmente.
Como se usa en el presente documento "agente
citotóxico" incluye antimetabolitos, agentes alquilantes,
antraciclinas, antibióticos, agentes antimitóticos, y agentes
quimioterapéuticos. Los ejemplos específicos dentro de estos grupos
incluyen pero no se limitan a ricino, doxorrubicina, daunorrubicina,
taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido,
vincristina, vinblastina, colchicina, supporina, gelonina, PE40,
briodina, dihidroxiantracina diona, actinomicina D, y
1-dehidrotestosterona.
Como se usa en el presente documento el término
"BR96" se refiere a (1) el anticuerpo monoclonal de BR96
completo descrito en PCT Nº. 95/305444, publicado el 6 de marzo de
1996, (2) el anticuerpo monoclonal BR96 quimérico descrito en PCT
Nº.: 95/305444, publicado el 6 de marzo de 1996, o (3) las moléculas
mutantes de BR96 descritas en PCT Nº. 95/305444, publicado el 6 de
marzo de 1996.
Como se usa en el presente documento,
"tratar" significa (1) proporcionar regresión de tumor de tal
forma que el tumor no sea palpable durante un periodo de tiempo (se
pueden seguir procedimientos de medida de tumor estándar (A.B.
Miller y col. "Reporting results of cancer treatment" Cancer
47: 207-214 (1981))); (2) estabilizar la
enfermedad; o (3) cualesquiera efectos clínicamente
beneficiosos.
Como se usa en el presente documento,
"cantidad efectiva" es una cantidad del anticuerpo,
inmunoconjugado, o molécula recombinante que mata células o inhibe
la proliferación de las mismas.
Como se usa en el presente documento,
"administrar" significa administración oral, administración
como un supositorio, administración de contacto tópico,
intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o subcutánea, o la
implantación de un dispositivo de liberación lenta tal como una
bomba miniosmótica, al sujeto.
Como se usa en el presente documento,
"vehículo farmacéuticamente efectivo" incluye cualquier
material que cuando se combina con el anticuerpo retiene la
especificidad o eficacia del anticuerpo y no es reactiva con el
sistema inmune del sujeto. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a,
cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar, tales como una
solución salina tamponada de fosfato, agua, emulsiones tales como
emulsión de aceite en agua, y diversos tipos de agentes
humectantes. Otros vehículos pueden incluir soluciones estériles,
comprimidos que incluyen comprimidos recubiertos y cápsulas.
Típicamente tales vehículos contienen
excipientes tales como almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de
arcilla, gelatina, ácido esteárico o sales del mismo, magnesio o
estearato de calcio, talco, grasas vegetales o aceites, cauchos,
glicoles, u otros excipientes conocidos. Tales vehículos pueden
también incluir aditivos de aroma y color u otros ingredientes.
Composiciones que comprenden tales vehículos se formulan mediante
procedimientos convencionales bien conocidos.
Como se usa en el presente documento,
"mutación" significa un aminoácido individual o mutación de
ácido nucleico o mutaciones múltiples mediante cualesquiera medios,
por ejemplo, recombinación homóloga, PRC propensa a error, o
mutagénesis dirigida a sitio.
Con el fin de que la invención descrita en el
presente documento pueda entenderse más plenamente, se expone la
siguiente descripción.
Se describe en el presente documento un
procedimiento para inhibir toxicidad inducida por inmunoglobulina
que resulta del uso de inmunoglobulina durante terapia o diagnosis
in vivo. Por ejemplo, los procedimientos de la invención
serían útiles para minimizar la toxicidad asociada con exposición
clínica prolongada a uso de inmunoglobulinas durante o después de
formarse la imagen de tumor con anticuerpos radiomarcados.
De acuerdo con la práctica de esta invención,
los sujetos incluyen, pero no se limitan a, sujetos humanos,
equinos, porcinos, bovinos, murinos, caninos, felinos y avianos.
Otros animales de sangre caliente se incluyen también en esta
invención.
Este procedimiento comprende administrar una
molécula de inmunoglobulina al sujeto. La inmunoglobulina puede ser
IgG, IgM, o IgA. Se prefiere IgG.
En una realización de la invención, la molécula
de inmunoglobulina reconoce y une Le^{y}. En otra realización, la
inmunoglobulina reconoce y une Le^{x}. En una realización
adicional, la inmunoglobulina es un anticuerpo monoclonal BR96
producido por el hibridoma depositado en el 22 de febrero de 1989
con la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn
Drive, Rockville, MD 20852 y de acuerdo con un Nº. de acceso de
ATCC: HB 10036. En aún otra realización, la inmunoglobulina es un
anticuerpo monoclonal ChiBR96 producido por el hibridoma depositado
en el 23 de marzo de 1990, con la ATCC, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, MD 20852 y de acuerdo con el número de acceso de ATCC:
HB 10460.
De acuerdo con la práctica de la invención, la
inmunoglobulina puede ser un anticuerpo quimérico biespecífico con
una especificidad de unión para dos antígenos diferentes, siendo uno
de los antígenos aquel con el que el anticuerpo monoclonal BR96
producido por el hibridoma tiene las características identificadoras
de HB 10036 según se deposita con las uniones de ATCC. Además, de
acuerdo con la práctica de la invención, la inmunoglobulina puede
ser un anticuerpo antiidiotípico.
Según se requiere por la invención, al menos una
parte de la región constante de la molécula de inmunoglobulina está
estructuralmente alterada. La alteración estructural se puede llevar
a cabo mediante un número de medios. En una realización, la región
constante entera, es decir, dominios CH_{1}, CH_{2} y CH_{3},
se puede delecionar.
En otra realización, sólo se deleciona el
dominio CH_{2} de la molécula de inmunoglobulina (por ejemplo,
cBR96-A (figura 5), hBR96-2A (figura
4)). En esta realización, la deleción de CH_{2} puede dar como
resultado una molécula incapaz de unir el receptor Fc o un
componente de complemento.
En otra realización, sólo se deleciona aquella
parte del dominio CH_{2} que une el componente C1q del
complemento. En aún otra realización, se hacen mutaciones en partes
específicas del dominio CH_{2}. Por ejemplo, la molécula de
inmunoglobulina se puede modificar alterando estructuralmente
dominios asociados a toxicidad múltiple en la región constante de
tal forma que se inhibe la toxicidad inducida por inmunoglobulina.
Se encuentra adicionalmente una discusión de tales mutaciones más
adelante en este documento.
Sin importar los medios, el requerimiento
subyacente para cualquier alteración estructural de la región
constante es que la toxicidad inducida por inmunoglobulina está
sustancialmente reducida o inhibida. En una realización, la
toxicidad inducida por inmunoglobulina se inhibe alterando
estructuralmente la región constante tal que la capacidad de la
molécula para mediar una respuesta de CDC o ADCC y/o activar la
cascada del complemento se previene o evita. Los procedimientos
para determinar si la molécula es capaz de inhibir una respuesta de
CDC se conocen bien, por ejemplo, un procedimiento implica una
prueba de liberación de ^{51}Cr (H. Garrigues y col. Int J.
Cancer 29: 51 (1982); I. Hëllström y col. PNAS 82: 1499 (1985)). Se
conocen bien los procedimientos para determinar si la molécula es
capaz de inhibir una respuesta de ADCC (I. Hëllström y col. PNAS 82:
1499 (1985)). Se conocen bien los procedimientos para determinar si
la molécula es capaz de activar una cascada del complemento.
Se describe en el presente documento un
procedimiento que comprende administrar al sujeto una proteína de
condensación lg que tiene una región constante alterada
estructuralmente. La alteración estructural de la región constante
puede incluir la supresión de la región C entera o porciones de la
misma, por ejemplo alteración del dominio CH_{2} de forma que la
molécula alterada ya no une al receptor F o a un componente del
complemento.
Se describe en el presente documento un
procedimiento para inhibir toxicidad inducida por inmunoglobulinas
que resulta de inmunoterapia en un sujeto. El procedimiento
comprende administrar al sujeto un anticuerpo que se ha modificado
de forma que al menos una parte de la región constante se ha
alterado estructuralmente como se discute en una parte anterior del
documento. En una realización, el anticuerpo reconoce y une
Le^{y}. En otra realización, el anticuerpo reconoce y une a
Le^{x}.
El anticuerpo puede ser anticuerpo monoclonal
BR96 producido mediante el hibridoma que tiene las características
de identificación de HB 10036 según se depositan con la ATCC.
Alternativamente, el anticuerpo puede ser anticuerpo quimérico
ChiBR96 producido por el hibridoma que tiene las características
identificadoras de HB 10460 según se depositan con la ATCC.
Adicionalmente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico
con una especificidad de unión para dos antígenos diferentes,
siendo uno de los antígenos aquel con el que se une el anticuerpo
monoclonal BR96 producido por el hibridoma que tiene las
características identificadoras de HB 10036 según se deposita con
las uniones de ATCC.
Adicionalmente, se describe en el presente
documento un procedimiento para inhibir toxicidad inducida por
inmunoglobulinas que resulta de inmunoterapia para una enfermedad en
un sujeto. La enfermedad variará con la ayuda del antígeno a
unirse. Ejemplos de enfermedades incluyen paro no se limitan a
enfermedades inmunológicas, cáncer, enfermedades cardiovasculares,
enfermedades neurológicas, enfermedades dermatológicas o enfermedad
renal.
Este procedimiento comprende las etapas
siguientes. La etapa uno proporciona seleccionar un anticuerpo para
un objetivo. Generalmente, el objetivo está asociado con la
enfermedad y se conoce el anticuerpo dirigido al objetivo. Por
ejemplo, el objetivo puede se el antígeno BR96 y el anticuerpo
seleccionado es BR96.
La etapa dos de este procedimiento proporciona
alterar estructuralmente la región constante del anticuerpo así
seleccionado de tal forma que se inhibe la toxicidad inducida por
inmunoglobulina. La inactivación puede incluir cualquiera de los
procedimientos discutidos anteriormente. Por ejemplo, la
inactivación se puede llevar a cabo alterando estructuralmente
dominios asociados con toxicidad múltiple en el dominio CH_{2} de
la región constante de la proteína Ig así seleccionada.
La etapa tres de este procedimiento proporciona
administrar el anticuerpo estructuralmente alterado de la etapa dos
al sujeto bajo condiciones que el anticuerpo estructuralmente
alterado reconoce y une el objetivo y que tal unión directa o
indirectamente alivia síntomas asociados con la enfermedad.
En una etapa de realización alguien proporciona
seleccionar una proteína de condensación Ig para un objetivo.
Adicionalmente, el procedimiento proporciona mutar la proteína de
condensación Ig así seleccionada alterando estructuralmente el
dominio CH_{2} de la región
\hbox{constante de la proteína de
Ig mediante el mismo medio discutido anteriormente.}
Se describen en el presente documento
procedimientos para tratar carcinoma humano. Por ejemplo, la
inmunoglobulina, anticuerpo, o proteína de condensación Ig
discutida anteriormente se puede usar en combinación con
procedimientos de tratamiento estándar o convencionales tales como
quimioterapia, terapia de radiación o pueden estar conjugados o
unidos a un fármaco terapéutico, o toxina, así como a una linfoquina
o a un factor de crecimiento inhibidor de tumores, para
administración del agente terapéutico al sitio del carcinoma.
Se conocen bien técnicas para conjugar a gentes
terapéuticos a inmunoglobulinas (véase, por ejemplo, Arnon y col.,
"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs In Cancer
Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld
y col. (eds.), páginas 243-46 (Alan R. Liss, Inc.
1985); Hellstrom y col., "Antibodies For Drug Delivery", en
Controlled Drug Delivery (2ª edición), Robinson y col. (eds.),
páginas 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe,
"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A
Review", en Monoclonal Antibodies `84: -Biological And Clinical
Applications, Pinchera y col. (eds.), páginas
475-506 (1985); y Thorpe y col., "The Preparation
And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin
Conjugates", Immunol Rev., 62: 19-58
(1982)).
(1982)).
Alternativamente, el anticuerpo estructuralmente
alterado o proteína de condensación Ig se puede acoplar a agentes
de alta energía radiactiva, por ejemplo, un radioisótopo tal como
^{131}I; que, cuando se localiza en el sitio del tumor, da como
resultado una matanza de diversos diámetros de células (véase, por
ejemplo, Orden, "Analysis, Results, And Future Prospective Of The
Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en
Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin y
col. (eds), pp. 303-16 (Academic Press 1985)). De
acuerdo con aún otra realización, el anticuerpo BR96
estructuralmente alterado puede estar conjugado a un segundo
anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo para el
tratamiento de células tumorales como se describe por Segal en la
Patente de los Estados Unidos 4.676.980.
Aún otras aplicaciones terapéuticas para el
anticuerpo alterado estructuralmente o proteína de condensación Ig
de la invención incluyen conjugación o engarce, por ejemplo,
mediante técnicas de DNA recombinante o técnicas químicas de
proteínas, a una enzima capaz de convertir un profármaco en un
fármaco citotóxico y el uso de ese conjugado
anticuerpo-enzima en combinación con el profármaco
para convertir el profármaco en un agente citotóxico en el sitio
tumoral (véase, por ejemplo, Senter y col.,
"Anti-Tumor Effects Of
Antibody-alkaline Phosphatase", Proc. Natl.
Acad. Sci. EE.UU., 85: 4842-46 (1988);
"Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor
Activities of Phosphorilated Mitomycin C and Etoposide Derivatives
by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase
Conjugates", Cancer Research 49: 5789-5792
(1989); y Senter, "Activation of Prodrugs by
Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to
Cancer Therapy", FASEB J. 4: 188-193 (1990)).
Es patente por lo tanto que la presente
invención comprende composiciones farmacéuticas que incluyen
moléculas de inmunoglobulinas, anticuerpos, y proteínas de
condensación Ig que tienen todas dominios CH_{2} estructuralmente
alterados, y su uso en procedimientos para tratar carcinomas
humanos. Por ejemplo, la invención incluye composiciones
farmacéuticas para usar en el tratamiento de carcinomas humanos que
comprenden una cantidad farmacéuticamente efectiva de un BR96
estructuralmente alterado y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
Las composiciones pueden contener el anticuerpo
o proteína de condensación Ig o fragmentos de anticuerpo
estructuralmente alterados, cualquiera de no modificados,
conjugados para tratar carcinomas (por ejemplo, fármaco, toxina,
enzima, o segundo anticuerpo). Las composiciones pueden incluir
adicionalmente otros anticuerpos o conjugados para tratar
carcinomas (por ejemplo, un cóctel de anticuerpos).
Las composiciones de la invención se pueden
administrar usando modos convencionales de administración que
incluyen, pero no se limitan a, administración intratecal,
intravenosa, intraperitoneal, oral, intralinfática o administración
directamente dentro del tumor. Se prefiere la administración
intravenosa.
La composición de la invención puede estar en
una diversidad de formas de dosificación que incluyen, pero no se
limitan a, soluciones o suspensiones líquidas, comprimidos,
píldoras, polvos, supositorios, microcápsulas poliméricas o
microvesículas poliméricas, liposomas, y soluciones inyectables o
infundibles. La forma preferida depende del modo de administración
y la aplicación terapéutica.
Las composiciones de la invención también
incluyen preferiblemente vehículos y coadyuvantes farmacéuticamente
aceptables convencionales conocidos en la técnica tales como
seroalbúmina humana, intercambiadores de iones, alúmina, lecitina,
sustancias tamponantes tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico,
sorbato de potasio, y sales o electrolitos tales como sulfato de
protamina.
De acuerdo con la práctica de la invención, el
vehículo farmacéutico puede ser un vehículo lipídico. El vehículo
lipídico puede ser un fosfolípido. Adicionalmente, el vehículo
lipídico puede ser un ácido graso. Además, el vehículo lipídico
puede ser un detergente. Como se usa en el presente documento, un
detergente es cualquier sustancia que altera la tensión superficial
de un líquido, generalmente disminuyéndola.
En un ejemplo de la invención, el detergente
puede ser un detergente no iónico. Ejemplos de detergentes no
iónicos incluyen, pero no se limitan a, polisorbato 80 (también
conocidos como Tween®80 o (monooleato de polioxietilenosorbitán),
Brij®, y Triton® (por ejemplo Triton®WR-1339 y
Triton®A-20).
Alternativamente, el detergente puede ser un
detergente iónico. Un ejemplo de un detergente iónico incluye, pero
no se limita a, bromuro de alquiltrimetilamonio.
Adicionalmente, de acuerdo con la invención, el
vehículo lipídico puede ser un liposoma. Como se usa en esta
solicitud, un "liposoma" es una vesícula unida a membrana que
contiene cualesquiera moléculas de la invención o combinaciones de
las mismas.
El modo más efectivo de administración y régimen
de dosificación para las composiciones de esta invención depende de
la gravedad y el curso de la enfermedad, la salud del paciente y la
respuesta al tratamiento y el juicio del médico que trata.
La interrelación de dosificaciones para animales
de varios tamaños y especies y seres humanos en base a mg/m^{2}
de área de superficie se describe por Freireich, E.J. y col., Cancer
Chemother., Rep. 50 (4): 219-244 (1996). Se pueden
hacer ajustes en el régimen de dosificación para optimizar la
inhibición del crecimiento de las células tumorales y la respuesta
asesina, por ejemplo, las dosis pueden dividirse y administrarse en
una base diaria o la dosis proporcionalmente reducida que depende
de la situación (por ejemplo, varias dosis divididas se pueden
administrar diariamente o se pueden reducir proporcionalmente
dependiendo de la situación terapéutica específica).
La presente invención proporciona primero un
anticuerpo BR96 que tiene una región constante de IgG1 humana que
se ha alterado estructuralmente en el dominio CH2 en el que leucina
en posición aminoacídica 235 está mutada a alanina; glicina en la
posición aminoacídica 237 está mutada a alanina; ácido glutámico en
la posición aminoacídica 318 está mutado a serina; lisina en la
posición aminoacídica 320 está mutada a serina; y lisina en la
posición aminoacídica 322 está mutada a serina.
La presente invención proporciona también un
anticuerpo BR96 que tiene una región constante de IgG1 humana que
se ha alterado estructuralmente en el dominio de CH2 en el que
leucina en la posición aminoacídica 235 está mutada a alanina;
glicina en la posición aminoacídica 237 está mutada a alanina; y
prolina en la posición aminoacídica 331 está mutada a alanina.
Además, la presente invención proporciona un
anticuerpo BR96 que tiene una región constante de IgG humana que se
ha alterado estructuralmente en el dominio CH2 en el que leucina en
la posición aminoacídica 235 está mutada a alanina; glicina en la
posición aminoacídica 237 está mutada a alanina; ácido glutámico en
la posición aminoacídica 318 está mutado a serina; lisina en la
posición aminoacídica 320 está mutada a serina; lisina en la
posición aminoacídica 322 está mutada a serina; y prolina en la
posición aminoacídica 331 está mutada a
alanina.
alanina.
Otros aspectos de la invención se reivindican en
las reivindicaciones adjuntas 4-18. Las
realizaciones adicionales no comprendidas por la invención
reivindicada se describen también en la presente memoria
descriptiva.
Los BR96 estructuralmente alterados o las
proteínas de condensación Ig BR96 se describen en el presente
documento. Los anticuerpos BR96 estructuralmente alterados o las
proteínas de condensación Ig tienen la región variable de BR96 y
una región constante modificada. Esta modificación proporciona
anticuerpos BR96 estructuralmente alterados o proteínas de
condensación Ig con la capacidad de inhibir toxicidad inducida por
inmunoglobulinas.
Se han hecho diversas realizaciones de BR96
estructuralmente alterados o proteínas de condensación Ig BR96.
En una realización, designada
cBR96-A, se eliminó el dominio CH_{2} entero.
cBR96-A se expresa mediante el plásmido que tiene
la secuencia mostrada en SEQ ID Nº. 10. cBR96 se expresa mediante el
plásmido que tiene la secuencia en SEQ ID Nº. 9.
En otra realización, designada
hBR96-2A, se eliminó el dominio CH_{2} entero de
hBR96. hBR96-2A se expresa mediante el plásmido que
tiene la secuencia mostrada en SEQ ID Nº. 12. hBR96 es un BR96
mutante que tiene las mutaciones H1, H2 y H3 descritas en Solicitud
de PCT Nº.: 95/305444, publicada el 6 de marzo de 1996.
En aún otra realización, designada
hBR96-2B, el residuo de leucina localizado en la
posición aminoacídica 235 está mutado a alanina. Adicionalmente, el
residuo de glicina localizado en la posición aminoacídica 237 está
mutado a alanina. La numeración de posición aminoacídica usada se
describe en Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological
Interest 5ª Edición (1991) United States Department of Health and
Human Services.
En una realización adicional, designada
hBR96-2C, el residuo de ácido glutámico en posición
318 está mutado a serina; el residuo de lisina localizado en la
posición 320 está mutado a serina; y el residuo de lisina
localizado en la posición 322 está mutado a serina usando protocolos
estándar (Alexander R. Duncan y Greg Winter "The binding site for
C1q on IgG" Nature 332: 738 (1988)).
En otra realización, designada
hBR96-2D, el residuo de prolina en la posición 331
está mutado a alanina (M-H. Y Tao y col.
"Structural features of human immunoglobulin G that determine
isotype-specific differences in complement
activation" J. Exp. Med. 178: 661-667 (1993) Y.
Xu y col., "Residue at position 331 in the IgG1 and IgG4 domains
contributes to their diferential ability to bind and activate
complement" J. Biol. Chem. 269: 3469-3474
(1994)).
En una realización adicional, designada
hBR96-2E, el residuo de leucina localizado en la
posición aminoacídica 235 está mutado a alanina; el residuo de
glicina localizado en posición 237 está mutado a alanina; el residuo
de ácido glutámico localizado en posición 318 está mutado a serina;
el residuo de lisina localizado en la posición 320 está mutado a
serina; y el residuo de lisina localizado en la posición 322 está
mutado a serina (A. Morgan y col., "The
N-terminal end of the CH2 domain of chimeric human
IgG1 anti-HLA-DR is necessary for
C1q, Fc(gamma)RI and Fc(gamma)RIII
binding" Immunol. 86: 319-324 (1995)).
En aún una realización adicional, designada
hBR96-2F, el residuo de leucina localizado en la
posición 235 está mutado a alanina, el residuo de glicina
localizado en la posición 237 está mutado a alanina; y el residuo
de prolina localizado en la posición 331 está mutado a alanina.
En aún otra realización adicional, designada
hBR96-2G, el residuo de ácido glutámico localizado
en posición 318 está mutado a serina; el residuo de lisina
localizado en la posición 320 está mutado a serina; el residuo de
lisina localizado en la posición 322 está mutado a serina; y el
residuo de prolina en la posición 331 está mutado a
alanina.
alanina.
En otra realización, designada
hBR96-2H, el residuo de leucina localizado en la
posición aminoacídica 235 está mutado a alanina; el residuo de
glicina localizado en la posición aminoacídica 237 está mutado a
alanina; el residuo de ácido glutámico en posición 318 está mutado
a serina; el residuo de lisina localizado en la posición 320 está
mutado a serina; el residuo de lisina localizado en la posición 322
está mutado a serina; y el residuo de prolina localizado en la
posición 331 está mutado a alanina.
Dependiendo de su forma, un anticuerpo BR96
estructuralmente alterado o una proteína de condensación BR96 puede
ser un anticuerpo monofuncional, tal como un anticuerpo monoclonal,
o un anticuerpo bifuncional, tal como un anticuerpo específico o
heteroanticuerpo. Los usos de BR66 estructuralmente alterado, es
decir, como un agente terapéutico o diagnóstico, determinarán las
diferentes formas de BR96 estructuralmente alterado que se
fabrican.
Existen varias opciones para la expresión de
anticuerpos. Las bibliotecas de inmunoexpresión se pueden combinar
con tecnología de transfectoma, es decir, los genes para las
moléculas de Fab derivados de la biblioteca de expresión de genes
de inmunoglobulina se pueden conectar a los expones de dominio
constante deseados. Estos genes recombinantes pueden transfectarse
después y expresarse en un transfectoma que segregaría una molécula
de
anticuerpo.
anticuerpo.
Una vez producidos, los polipéptidos de la
invención se pueden modificar, es decir, mediante modificaciones de
aminoácidos dentro de la molécula, tales como para producir
moléculas derivadas. Tales moléculas derivadas retendrían la
propiedad funcional del polipéptido, a saber la molécula que tiene
tales sustituciones permitirá aún la unión del polipéptido al
antígeno de BR96 o partes del mismo.
Es un principio bien establecido de la química
de proteínas que ciertas sustituciones aminoacídicas llamadas
"sustituciones aminoacídicas conservadoras" pueden hacerse
frecuentemente en una proteína sin alterar ni la conformación ni la
función de la proteína.
Las sustituciones aminoacídicas incluyen, pero
no se limitan necesariamente a, sustituciones aminoacídicas
conocidas en la técnica como "conservadoras".
Tales cambios incluyen sustituir cualesquiera de
isoleucina (I), valina (V), y leucina (L) por cualquier otro de
estos aminoácidos hidrófobos; ácido aspártico (D) por ácido
glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) por asparragina (N) y
viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa.
Otras sustituciones pueden considerarse también
conservadoras, dependiendo del ambiente del aminoácido particular y
su papel en la estructura tridimensional de la proteína. Por
ejemplo, glicina (G) y alanina (A) pueden ser frecuentemente
intercambiables, como pueden serlo alanina y valina (V).
Metionina (M), que es relativamente hidrófoba,
puede frecuentemente intercambiarse con leucina e isoleucina, y
algunas veces con valina. La lisina (K) y la arginina (R) son
frecuentemente intercambiables en localizaciones en las que la
característica significativa del residuo de aminoácido es su carga y
los pK que difieren de estos dos residuos de aminoácido no son
significativos. Aun otros cambios se pueden considerar
"conservadores" en ambientes
particulares.
particulares.
En una realización de la presente invención, el
polipéptido está sustancialmente puro, es decir, libre de otros
residuos de aminoácidos que inhibirían o disminuirían unión del
polipéptido a su objetivo e inhibirían o reducirían toxicidad
gastrointestinal que se presenta normalmente durante o después de
terapia de anticuerpos.
Se conocen las secuencias de nucleótidos y las
secuencias de aminoácidos de las regiones variables y constantes de
BR96. Se conoce la secuencia de la región constante de
inmunoglobulina y se proporciona en la figura 18. Se hicieron las
mutaciones específicas en la región constante del anticuerpo BR96.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican los siete mutantes
descritos anteriormente (hBR96-2B a
hBR96-H) son como sigue.
En hBR96-2B, la alanina en
posiciones aminoacídicas 235 y 237 está codificada por los codones
GCU, GCC, GCA, o GCG.
En hBR96-2C, la serina en
posiciones 318, 320, y 322 está codificada por UCU, UCC, UCA, o
UGG.
En hBR96-2D, la alanina en
posición 331 está codificada por los codones GCU, GCC, GCA, o
GCG.
En hBR96-2E, la alanina en
posiciones 235 y 237 está codificada por los codones GCU, GCC, GCA,
o GCG. La serina en posiciones 318, 320, y 322 está codificada por
UCU, UCC, UCA, o UGG.
En hBR96-2F, la alanina en
posiciones 235, 237, y 331 está codificada por los codones GCU, GCC,
GCA o GCG.
En hBR96-2G, la serina en
posiciones 318, 320, 322 está codificada por UCU, UCC, UCA, o UGG.
Adicionalmente, la alanina en posición 331 está codificada por
codones GCU, GCC, GCA, o GCG.
En hBR96-2H, la alanina en
posiciones 235, 237, y 331 está codificada por los codones GCU, GCC,
GCA o GCG. Adicionalmente, la serina en posiciones 318, 320, y 322
está codificada por UCU, UCC, UCA, o UGG.
Cualquiera de las anteriores puede ser ácido
desoxirribonucleico (DNA), por ejemplo, DNA complementario
(cDNA), o ácido ribonucleico (RNA).
(cDNA), o ácido ribonucleico (RNA).
Los inmunoconjugados (que tienen anticuerpos
enteros o proteínas de condensación Ig enteras) se pueden construir
usando una amplia variedad de agentes quimioterapéuticos tales como
ácido fólico y antraciclinas (Peterson y col., "Transport And
Storage Of Anthracyclines In Experimental Systems and Human
Leukemia", en Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy,
Muggia y col. (eds.), p. 132 (Martinus Nijhoff Publishers (1982));
Smyth y col., "Specific Targeting of Chlorambucil to Tumors With
the Use of Monoclonal Antibodies"., J. Natl. Cancer Inst., 76:
503-510 (1986)), incluyendo doxorrubicina (DOX)
(Yang and Reiseld "Doxorribicin Conjugated with a Monoclonal
Antibody Directed to a Human Melanoma-Associated
Proteoglycan Supresses Growth of Established Tumor xenografts in
Nude Mice PNAS (USA)" 85: 1189-1193 (1988)),
Daunomicina (Arnon y Sela "In Vitro and in vivo
Efficacy of Conjugates of Daunomycin With Anti-Tumor
Antibodies" Immunol. Rev., 65: 5-27 (1982)), y
morfolinodoxorrubicina (Mueller y col., "Antibody Conjugates With
Morfolinodoxorubicin and Acid-Cleavable
Linkers", Bioconjute Chem., 1: 325-330
(1990)).
BR96 se ha conjugado a doxorrubicina y se ha
mostrado que es efectivo en terapia de ciertos cánceres o carcinomas
(Trail, P.A., Willner, D., Lasch, S.J., Henderson, A.J., Casazza,
A.M. Firestone, R.A. Hellström, I., y Hellström, K.E. Cure of
xenografted human carcinomas by BR96-doxorubicin
immunoconjugates. Science, 261: 212-215,
1993).
1993).
De acuerdo con la práctica de la invención, BR96
estructuralmente alterado se puede usar en formas que incluyen IgG
no reducida, IgG estructuralmente alterada reducida, y proteínas de
fusión (Solicitud de PCT Nº.: 95/305444, publicada el 6 de marzo de
1996).
Agentes terapéuticos apropiados para usar en
fabricar los inmunoconjugados incluyen exotoxina A de
Pseudomonas (PE) bien en la forma de PE nativa o bien en la
forma LysPE40. LysPE40 es una forma truncada que contiene un
extremo aminoterminal genéticamente modificado que incluye un
residuo de lisina para propósitos de conjugación. Doxorrubicina es
también un agente terapéutico adecuado.
Ejemplos adicionales de agentes terapéuticos
incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos, agentes
alquilantes, antraciclinas, antibióticos, y agentes
antimitóticos.
Los antimetabolitos incluyen metotrexato,
6-mercaptopurina, 6-tioguanina,
citarabina, 5-fluorouracildecarbacina.
Los agentes alquilantes incluyen mecloretamina,
tiotepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina
(CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozocina,
mitomicina C, y cis-diclorodiamina platino (II)
(DPP) cisplatino.
Las antraciclinas incluyen daunorrubicina
(anteriormente daunomicina) y doxorrubicina (también referida en el
documento actual como adriamicina). Ejemplos adicionales incluyen
mitozantrona y bisantreno.
Los antibióticos incluyen dactinomicina
(anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina
(AMC).
Los agentes antimitóticos incluyen vincristina y
vinblastina (que se refieren comúnmente como alcaloides vinca).
Otros agentes citotóxicos incluyen procarbazina,
hidroxiurea, asparraginasa, corticosteroides, mitotano (O,
P'-(DDD)), interferones.
Ejemplos adicionales de agentes citotóxicos
incluyen, pero no se limitan a, ricino, briodina, gelonina,
supporin, doxorrubicina, taxol, citocalasina B, gramicidina D,
bromuro de etidio, etopósido, tenopósido, colchicina,
dihidroxiantracinadiona, 1-dehidrotestosterona, y
glucocorticoide.
Claramente análogos y homólogos de tales agentes
terapéuticos y citotóxicos están comprendidos por la presente
invención. Por ejemplo, el agente quimioterapéutico aminopterina
tiene un análogo mejorado correlativo concretamente
metotrexato.
Adicionalmente, el análogo mejorado de
doxorrubicina es un quelato de hierro. También, el análogo mejorado
para 1-metilnitrosourea es lomustina.
Adicionalmente, el análogo mejorado de vinblastina es vincristina.
Además, el análogo incrementado de mecloretamina es
ciclofosfamida.
Hay múltiples aproximaciones para fabricar
mutaciones específicas de sitio en el dominio CH_{2} de una
molécula de inmunoglobulina. Una aproximación supone amplificación
de PCR del dominio CH_{2} con las mutaciones seguidas por
recombinación homóloga del CH_{2} mutado dentro del vector que
contiene la inmunoglobulina deseada, por ejemplo,
hBR96-2. Por ejemplo, hBR96-2B y
hBR96-2D se han fabricado mediante este
procedimiento.
Otra aproximación sería introducir mutaciones
mediante mutagénesis dirigida a sitio de DNA de cadena simple. Por
ejemplo, el vector pD 17-hG 1 b, que contiene sólo
la región constante de IgG1 y no el dominio V de hBr96, tiene el
origen fl de replicación. Esto da al vector las propiedades de un
fagémido y se pueden llevar a cabo experimentos de mutagénesis
dirigida a sitio de acuerdo con los procedimientos de Kunkel, y col.
(Kunkel, T.A., J.D. Roberts, y R.A. Zakour, 1987 Methods Enzymol.,
154: 154: 367-383) como se proporcionan en el kit
de mutagénesis in vitro del fagémido Bio-Rad
Muta-Gene®, versión 2. Por ejemplo,
hBR96-2B, -C, -D, -E, -F, -G, y -H se fabrican
mediante este procedimiento.
Con el fin de que la invención descrita en el
presente documento pueda entenderse más plenamente, se exponen los
siguientes ejemplos. Se entendería que estos ejemplos son sólo para
propósitos ilustrativos y no son para constituirse de forma que
limiten el alcance de la invención en cualquier manera.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se usó el siguiente protocolo de ELISA
estándar.
Materiales: placas de 96 pocillos
Immulon2 y Concentrado de Diluyente de Especímenes de Genetic
Systems (10x); el conjugado de anticuerpo fue Cabra
Anti-humano Kappa-Adsorbido a HRP de
Ratón, Southern Biotech. a 1:10.000 en Diluyente de Conjugado de
Genetic Systems (1x); Reactivo de Cromógeno de Genetic Systems EIA
(TMB) (1:100); Sustrato Tamponado de Genetic Systems EIA (1x);
anticuerpo primario o antígeno fueron Fragmento F(ab')_{2}
de Cabra Anti-Fragmento Fc de IgG Humano específico
de AffiniPure (Jackson Immuno Research), Cabra
Anti-Humano Kappa-UNLB (Southern
Biotechonogy Associates), Le^{y}-HSA (Alberta
Research Council).
Procedimientos: diluir anticuerpo
primario o antígeno a 1,0 \mug/ml en tampón Carb./Bicarb. 0,05 M.
Añadir 100 \mul de la solución diluida por pocillo en 2 placas de
Immulon. Las placas se sellaron y se incubaron durante toda una
noche a 4ºC.
Bloquear placas moviéndolas rápidamente y
realizando una prueba de bandas en toallas de papel. Añadir 200
\mul/pocillo de Genetic Systems, Concentrado Diluyente de
Espécimen (1x). Incubar al menos 1 hora a temperatura ambiente y
después verter los contenidos de las placas. Lavar las placas 3x en
solución salina/Tween. Realizar una prueba de bandas hasta secar.
Permitir a las placas secar a temperatura ambiente (a 45 minutos a 1
hora). Sellar y almacenar las placas a 4ºC.
Las muestras de prueba son como sigue. Diluir
muestras y estándares en Diluyente de Espécimen a 1:10. Llevar a
cabo diluciones en serie en placas de fondo redondo separadas.
Transferir 100 \mul/pocillo de diluciones finales a placas de
ensayo recubiertas de antígeno; incubar después durante toda una
noche a 4ºC. Lavar placas 3x con solución salina/Tween.
Para conjugación añadir 100 \mul/pocillo de
conjugado anticuerpo-HRP en Diluyente de Conjugado
de Genetic Systems (1x). Incubar placas a temperatura ambiente
durante 60 minutos. Lavar placas 3x en solución salina/Tween.
Añadir 100 \mul/pocillo de Reactivo Cromógeno
de Genetic Systems EIA (TBM) 1:100 en Sustrato Tamponado de EIA
(1x). Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos y parar con
100 \mul/pocillo de H_{2}SO_{4} 1N. Leer la placa a 450/630
nm en lector de placa EIA.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Estrategia para Delecionar Dominios CH_{2}:
para construir moléculas de BR96 con CH_{2} delecionado, la
bisagra, los dominios CH_{3} y CH_{2} se eliminaron de moléculas
de BR96 quiméricas y moléculas de BR9696-2 IgG1
humanizadas mediante una digestión de restricción con
Eco47-III en regiones no codificantes. La bisagra y
los dominios CH_{3} se amplificaron mediante reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) a partir de una molécula de IgG1 humana
(pN\gamma1.14) que carecía del dominio CH_{2}. Se sintetizaron
dos oligonucleótidos (en sentido correcto 49mer, antisentido 50mer)
homólogos a las secuencias de la región constante de IgG1 en ambos
lados que preservan sitios E.co47-III. Los
fragmentos de PCR de bisagra y del dominio CH_{3} amplificados se
añadieron en sitios Eco47-III en moléculas de IgG1
BR96 mediante recombinación homóloga in vivo (P. Bubeck y
col., Nucleic Acid Research (1993) 21: 3601-3602).
Las nuevas moléculas IgG1 BR96 se verificaron mediante mapeado y
secuenciación de
restricción.
restricción.
Se usó una estrategia de costura de PCR para la
construcción de IgG1 humana con CH_{2} delecionado
(pN\gamma1.14) (Robert M. Horton, y col. (1990) Biotech 8
(5)P, 528).
El dominio CH_{1} se amplificó como un
fragmento de 580 pares de bases con un oligonucleótido en sentido
correcto (5' TGG CAC CGA AAG CTT TCT GGG GCA GGC CAG GCC TGA
3') (cebador A) y un oligonucleótido antisentido (5' TCC GAG CAT
GTT GGT ACC CAC GTG GTG GTG GAC GTC GAG CCT GGC TTC GAG CAG ACA
3') (cebador B) a partir de un vector de región constante IgG1
humano linearizado (pN\gamma1.7). El fragmento de PCR se extiende
desde el extremo 5' del sitio Hind-III (en negrita)
a través de los sitios Cel-II,
Sal-I, Dra-III,
Kpn-I, espaciador de 6 pares de bases y
Mro-I (en negrita) al extremo 3' del dominio
CH_{1}.
El dominio CH_{3} se amplificó parcialmente
después (hasta el sitio Xba-I) con un cebador en el
sentido habitual (5' GTC GAC CAC CAC GTG GGT ACC AAC ATG TCC
GGA GCC ACA TGG ACA GAG GCC GGC T 3') (cebador C) y un cebador
antisentido (5' GTG GTT CTT GTT CAT CTC CTC TCT AGA TGG 3')
(cebador D) a partir de un vector de región constante IgGI humano
linealizado (pN\gamma1.7). Un fragmento de PCR (aproximadamente
150 pb) con sitios Sal-I, Dra-III,
Kpn-I, espaciador de 6 pares de bases y
Mro-I (en negrita) en su extremo 5', se extiende
sólo a través del sitio XBa-1 (en negrita) dentro
del dominio CH_{3}.
Los fragmentos de PCR parciales CH_{1} y
CH_{2} se combinaron en una PCR sin ningún cebador. La reacción
se llevó a cabo a través de dos ciclos completos de
desnaturalización y refusión permitiendo a los fragmentos
combinarse en la región homóloga en los extremos 3'. Los cebadores A
y D (anteriormente descritos) se añadieron a la reacción y se
completó el ciclo de PCR. La polimerasa extiende el DNA con cebador
A y cebador D, proporcionando un fragmento de PCR de longitud total
(660 pares de bases). El fragmento de PCR extendido recientemente se
dispone del extremo 5' al extremo 3' en el siguiente orden:
Hind-III -CH_{1} - Cel-II -
Sal-I - Dra - III - Kpn I - espaciador de 6 pares
de bases - Mro-I - CH_{3} parcial -
Xba-1.
El fragmento de PCR combinado, con los dominios
CH_{1} y CH_{3} parcial, se clonó después mediante una ligazón
de extremos romos dentro de un sitio Sma-I en un
vector pEMBL 18 y se confirmó la secuencia mediante secuenciación
dideoxi (Sanger y col. (1977) PNAS (EE.UU.) 74:
5463-5466).
Para transferir el CH_{1} y el CH_{3}
parcial dentro de un vector de expresión de mamíferos, tanto el
vector pEMBL 18 como el pN\gamma1.7 se digirieron con
Hind-III y Xba-I. El fragmento de
Hind-III y el fragmento de Xba-I se
ligaron en los mismos sitios en un vector linealizado pN\gamma1.7.
El constructo nuevo, con CH_{1} y un dominio CH_{3} entero, fue
designado el vector pN\gamma1.10.
El fragmento bisagra se amplificó a partir de un
vector pN\gamma1.7 digerido con Hind-III con los
cebadores diseñados para flanquear el exón de bisagra con un sitio
de clonación Sal-1 y Dra-III en cada
extremo. Estos sitios también existen entre los dominios CH_{1} y
CH_{3} del pN\gamma1.10. El oligonucleótido en el sentido
habitual (5' ACC ATG GTC GAC CTC AGA CCT GCC AAG AGC CAT ATC
3') con un espaciador de 6 pares de bases y un sitio de clonación
Sal-I (en negrita) y el oligonucleótido antisentido
(5' CAT GGT CAC GTG GTG TGT CCC TGG ATG CAG GCT ACT CTA G
3') con un espaciador de 6 pares de bases y un sitio de clonación
Dra-III (en negrita) se usaron para la
amplificación del fragmento bisagra (250 pares de bases). El
fragmento PCR de la región de bisagra se clonó en un sitio
SMa-I en pEMBL18 mediante ligazón de extremos romos.
Tanto el pEMBL 18 con el fragmento bisagra como el vector
pN\gamma1.10 con los dominios CH_{2} y CH_{3} se digirieron
con Sal-1 y Dra-III. El fragmento
bisagra digerido se clonó dentro de los sitios linealizados
Sal-1 y Dra-III en el vector
pN\gamma1.10. El constructo nuevo, llevando ahora los dominios
CH_{1}, bisagra y CH_{3}, se designó pN\gamma1.11.
Para fabricar el constructo de IgG1 humana de
CH_{2} delecionado, tanto el constructo pN\gamma1.11 como el
vector pN\gamma1.11 se digirieron con BamH1 y HindIII. Se clonó un
fragmento que contenía los dominios CH_{1}, bisagra y CH_{3}
dentro de un vector linealizado pN\gamma1.11. El constructo de
IgG1 de región constante nuevo carece del dominio de CH_{2} y se
designa pN\gamma1.11 (figura 11).
Para la digestión de IgG1 BR96 con
Eco47-III, un fragmento de restricción con bisagra,
se identificaron dominios CH_{2} y CH_{3} en la secuencia de la
región constante del vector IgG1 BR96 tanto en moléculas quiméricas
como en moléculas humanizadas. El extremo 5' de este fragmento yace
dentro del intrón entre CH_{1} y bisagra y el extremo 3' se
localiza dentro del intrón CH_{3} de la molécula IgG1 BR96. La
bisagra, los dominios CH_{2} y CH_{3} (fragmento de 1,398 kb)
se retiraron de las moléculas de IgG1 BR96 mediante digestión de
restricción con Eco47-III. El
Eco-47-III es un cortador de
extremos romos. El DNA de IgG1 de BR96 digerido con esta enzima no
requiere ningún pretratamiento antes de clonar. El DNA de IgG1 BR96
digerido con esta enzima no requiere ningún pretratamiento antes de
clonar. La figura 12 es una representación diagramática del vector
pD17-hBR96-2 mostrando los sitios de
Eco47-III usados en clonación.
La IgG1 BR96 con CH_{2} delecionado se
construyó después como sigue. Los dominios de bisagra y CH_{3} se
amplificaron a partir de un constructo IgG1 L6 con CH_{2}
delecionado (pN\gamma1.14) con un oligonucleótido en el sentido
habitual (5' CGGGGAGGGAGGGTGTCTGCGTGAAGCAGGCTCAGCGCTGACCTCAGA
3') homólogo a secuencia de la región constante de IgGI en el
extremo 5' del sitio Eco47-III (en negrita) y un
oligonucleótido antisentido (5'
GGAAAGAACCATCACAGTCTCTCGCAGGGGCCCAGGGCAGCGCTGGGTGCTT 3')
homólogo a la secuencia de la región constante de IgG1 en el
extremo 3' del sitio Eco47-II (en negrita). El sitio
de Eco47-III en el extremo 3' del constructo de
pN\gamma1.14 se modifica en el procedimiento de clonación. El
sitio Eco47-III se introduce así en un cebador
antisentido y se usa en amplificación de los dominios bisagra y
CH_{3}.
El vector IgG1 pD17-BR96 se
digirió con Eco47-II y se eliminaron los dominios
bisagra, CH_{2} y CH_{3}. El vector IgG1
pD17-BR96 linealizado se mezcló con cantidades
equimoleculares de fragmentos de PCR de bisagra y CH_{3}. La
cotransformación del fragmento de PCR con DNA linealizado en células
competentes de DH5a de E. coli dio como resultado una
molécula recombinante, mediada por recombinación homóloga en
bacterias. Este constructo carece de dominio CH_{2} de moléculas
de_{ }IgG1 BR96, y se designa
pD17-BR96-dCH_{2} (figura
13).
Se obtuvieron 1,9 gramos de BR96 quimérico con
CH_{2} delecionado como un material en bruto de 89L de
sobrenadante de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se probaron toxicidad, localización y
aclaramiento de BR96 quimérico con CH_{2} delecionado in
vivo como sigue.
Tres perros recibieron 400 mg/m^{2} de
cBR96-A, el mutante de deleción de CH_{2} de BR96
quimérico, y dos recibieron BR96 quimérico. Ambas moléculas se
habían reducido y alquilado suavemente. Esto se requiere para
evitar dimerización del mutante de deleción en una forma
tetravalente. Todos los perros de control experimentaron la típica
toxicidad gastrointestinal y ninguno de los tres que recibieron el
mutante presentaron ninguna toxicidad. Los perros control y dos de
los perros de prueba se sacrificaron tras 1 hora obteniendo tejido
duodenal para medir la localización de anticuerpo. Todos los perros
de control tuvieron patología gastrointestinal extremadamente
visible, y los perros de prueba tuvieron tejido GI de apariencia
normal. El tercer perro ha continuado sin mostrar ningún signo de
toxicidad.
Resultados: una cantidad significativa de
localización del cBR96 con CH_{2} delecionado
(cBR96-A) tuvo lugar en el tracto gastrointestinal
en perros tratados con 400 mg/m^{2}, aunque el chiBR96 intacto se
localizó ligeramente mejor. Los niveles de localización indican que
cantidades aproximadamente equivalentes de cBR96 con CH_{2}
delecionado se administraron al tracto gastrointestinal en estos
perros.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando el nivel medio de localización
específica, una cantidad de cBR96-A equivalente a al
menos el 66% de la cantidad de cBR96 se administró al órgano
objetivo, el duodeno. En base a la variación de dosis hecha con
cBR96 en perros (algunos signos clínicos de toxicidad vistos a dosis
de 10 mg/m^{2}), incluso si esta diferencia es real, no pudieron
explicar la diferencia entre toxicidad y no toxicidad, la evaluación
hasta la fecha indica que los perros tratados con
cBR96-A no tuvieron ninguna toxicidad, examen
histopatológico microscópico pendiente. Esta evaluación se basó en
análisis de dos bloques congelados por perro y dos secciones por
bloque. Los replicados fueron bastante buenos. Los inventores
también han examinado tejidos congelados históricos de perros
tratados con cBR96 o F(ab)2/BR96 nativos y los
niveles de localización para estos tejidos fueron 110 y 0,
respectivamente, consistentes con nuestros datos previos.
Asumiendo que no hay toxicidad a dosis
marginalmente más altas (2X) de cBR96-A, estos datos
indican que el dominio CH_{2} está asociado con la inducción de
gastroenteropatía aguda, y que la eliminación de este dominio evita
la inducción de gastroenteropatía mediada por BR96.
Este estudio confirma los resultados que
muestran que F(ab')2 no es tóxico en el modelo del perro y
que la toxicidad está mediada por la región constante. El mutante
de deleción de CH_{2} es un candidato para marcar como objetivos
clínicamente agentes. Debido a la semivida muy larga del BR96
quimérico, cualquier decrecimiento en la semivida de los mutantes
sería aceptable.
La figura 1 muestra la medida del aclarado del
cBR96-A en perros que expresan Le^{Y} alto. El
estudio usó mutante de región constante frente a mutante de región
quimérica de cBR96-2.
CBR96-2 se aclaró más rápido que
el BR96 quimérico. La localización de cBR96-A al
epitelio gastrointestinal no se afectó significativamente mediante
este aclaramiento más rápido. Más que suficiente del
cBR96-A se localiza por haber causado
toxicidad.
Discusión: la región constante de IgG
quimérica es responsable de la toxicidad gastrointestinal vista en
pruebas clínicas, por ejemplo con chiBR96-dox. La
toxicidad gastrointestinal vista en el modelo de perros es muy
similar a la toxicidad clínica. Tanto en hombre como en perro, la
administración del anticuerpo conjugado media una toxicidad
gastrointestinal aguda caracterizada por la aparición rápida de
vómitos, a menudo con sangre.
En el hombre el sangrado se limita al fondo del
estómago, causando erosión de la mucosa superficial del estómago.
Aunque la patología de la herida es limitada y se resuelve, la
naturaleza extrema de la náusea y vómitos, no aliviada por
antieméticos, la define como la toxicidad limitadora de dosis.
Esta toxicidad está mediada en perro y hombre
por la molécula de anticuerpo sola. A dosis más altas del conjugado
de anticuerpo-dox, se ve toxicidad adicional en el
modelo de perros, probablemente debido a doxorrubicina. Aunque el
IgG intacto de BR96 causa toxicidad en perro y hombre, la molécula
de F(ab')2 (divalente y carente sólo en la región constante)
no es tóxica en perros. Este hallazgo ha motivado los intentos de
los inventores a niveles altos, y mejora la afinidad y la
especificidad de BR96 por antígeno tumoral.
El dominio de CH_{2} se conoce por mediar el
complemento y la unión de FcR. No se sabía que la alteración
estructural del dominio de CH_{2} daría como resultado inhibición
de toxicidad inducida por inmunoglobulinas.
El estudio de toxicología de
hBR96-2B en perros que expresan Lewis Y (n=2) mostró
que una dosis de 400 mg/m^{2} no causó hematemesis ni
deposiciones sangrientas, en contraste con BR96 que causa
consistentemente uno o ambos signos. Un perro sacrificado a las 24
horas tuvo apariencia claramente normal del tracto gastrointestinal,
de nuevo en contraste marcado con BR96 quimérico que causa lesiones
hemorrágicas y erosiones de la mucosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es
una técnica ampliamente usada y versátil para la amplificación y
modificación subsiguiente de los genes de inmunoglobulina. La
rapidez y seguridad con la que los genes de anticuerpo se pueden
modificar in vitro ha producido un acortamiento de los genes
de anticuerpos novedosos se pueden modificar in vitro ha
producido un acortamiento de anticuerpos novedosos. Por ejemplo, los
procedimientos de PCR se han usado para manipular anticuerpos con
afinidad incrementada a antígenos, para "humanizar"
anticuerpos, y para modular función efectora (Mark, J.D., A.D.
Griffiths, M. Malmqvist, T. Clackston, J.M. Bye y G. Winter, 1992.
Bypassing Immunization: high affinity human antibodies by chain
shuffling. Bio/Technology 10: 779-783; Rosok, M.J.,
D.E. Yelton, L.J. Harris, J. Bajorath, K.E. Hellstrom, 1. Hellstrom,
G.A., Cruz, K. Kristensson, H. Lin, W.D. Huse y S.M. Glaser. 1996.
A combinatorial library strategy for the rapid humanization of
anticarcinoma BR96 Fab. J. Biol. Chem. 271:
22611-22618; Morgan, A.N, D. Jones, A. M. Nesbitt,
L. Chaplin, M.W. Bodmer y S. Emtage. 1995. The
N-terminal end of the CH2 domain of chimeric human
IgG1 anti-HLA-DR is necessary for
Clq, Fc\gammaRI and FC\gammaRIII-binding.
Immunology. 86: 319-324).
\newpage
Como parte de un estudio más exhaustivo, los
inventores desean introducir diversas mutaciones específicas de
sitio en el dominio constante CH_{2} de IgG1 humana. Seis residuos
de aminoácidos específicos distribuidos por todo el dominio CH2
previamente identificados como que juegan un papel en función
efectora inmune se marcaron como dianas para mutagénesis (Morgan,
A.N., D. Jones, A.M. Nesbitt, L. Chaplin, M.W. Bodmer y S. Emtage,
1995.The N-terminal end of the CH_{2} domain of
chimeric human IgG1 anti-HLA-DR is
necessary for CLq, Fc\gammaRI and Fc\gammaRIII binding.
Immunology. 86: 319-324; Duncan, A.R. y G. Winter.
1988. The binding site for Cq1 on IgG. Nature 332:
738-740; Tao, M.H., R.I.F. Smith y S.L. Morrison.
1993. Structural features of human immunoglobulin G that determine
isotype-specific differences in complement
activation. J. Exp. Med. 178: 661-667). Cinco de
los seis residuos se agruparon en dos racimos-un
racimo constituido por dos residuos, dos aminoácidos aparte
(Localización 1, o L1); y un segundo racimo constituido por tres
residuos que abarcan una secuencia de cinco aminoácidos (L2). La
posición de los aminoácidos restantes (L3) se hace por el total de
los seis residuos. Los inventores están interesados en construir un
panel de IgG de dominio CH_{2} mutante constituido por cada
mutación L por sí misma así como en combinación con otros mutantes
de L (por ejemplo, L1; L1; y L2; L1, L2 y L3; etc.).
Se han descrito diversos procedimientos in
vitro donde PCR se usa para introducir simultáneamente
mutaciones específicas de sitio localizadas distalmente dentro de
una secuencia génica (Ho, S.N., H.D. Hunt, RM. Horton, J.K. Pullen
y L.R. Pesae. 1989. Site-directed mutagenesis by
overlap extension. Gene 77: 51-59; Ge, L. y P.
Rudolpf. 1996. Simultaneous introduction of multiple mutations using
overlap extension PCR BioTechniques 22: 28-30).
Alternativamente, se ha usado exitosamente un procedimiento in
vivo llamado PCR de recombinación (RPCR) para generar
rápidamente y eficientemente mutaciones específicas de sitio
localizadas distalmente (Jones, D.H. y S.C. Winbistorfer. 1993. Use
of polymerase chain reaction for making recombinant constructs. p.
241-250. En B.A. White (Ed.) Methods in Molecular
Biology, vol. 15. Humana Pres Inc., Totowa, NJ, Jones, D.H. And B.H.
Howard. 1991. A rapid method for recombination and
site-specific mutagenesis by placing homologous ends
on DNA using polymerase chain reaction. BioTechniques 10:
62-66). RPCR usa maquinaria de recombinación de
E. coli generando plásmidos recombinantes circulares
intactos a partir de una mezcla transfectada de producto generado
por PCR lineal y vector linealizado. La recombinación in vivo
está mediada a través de la unión de secuencias de nucleótidos
diseñadas dentro de extremos 5' de ambos cebadores de PCR que son
homólogos a secuencias de DNA codificadas por el vector. En esta
comunicación los inventores describen una extensión del
procedimiento de RPCR para introducir simultáneamente combinaciones
complejas de mutaciones dentro de un dominio CH_{2} de
anticuerpo.
Genes de cadena pesada y ligera de la región
variable de BR96 humanizado, previamente clonados y coexpresados
como un fragmento Fab activo en un vector de expresión de fago M13,
proporcionaron el material de partida (Rosok, M.J., D.E. Yelton,
L.J. Harris, J. Bajorath, K.E. Hellstrom, I. Hellstrom, G.A. Cruz,
K. Kistensson, H. Lin, W.D. Huse y S.M. Glaser. 1996. A
combinatorial library strategy for the rapid humanization of
anticarcinoma BR96 Fab. J. Biol. Chem. 271:
2261-22618). Los genes V de cadena pesada y ligera
se amplificaron mediante PCR a partir de una plantilla de DNA M 13
de cadena simple y se subclonaron mediante recombinación in
vivo (Jones, D.H. y B.H. Howard. 1991. A rapid method for
recombination and site-specific mutagenesis by
placing homologous ends on DNA using polymerase chain reaction.
BioTechniques 10: 62-66) dentro de vectores
pD17-hG1 y pD16-hC_{\kappa}, para
formar pB96-hG1a y pB96-hC\kappa
respectivamente. pD17-hGla y
pD16-hC_{\kappa} son vectores de expresión de
inmunoglobulina eucariotas derivados de pcDNA3 (Invitrogen, San
Diego, CA). El plásmido pB96-hG1a se modificó
adicionalmente mediante mutagénesis dirigida de sitio introduciendo
dos sitios de restricción de Eco47-III que
flanquean los dominios
bisagra-CH_{2}-CH_{3} de
inmunoglobulina usando procedimientos estándar. El vector receptor
se preparó después digiriendo pBR96-HG 1 a con
Eco47-III; aislando el armazón del vector mediante
electroforesis en gel de agarosa seguida por extraer el DNA del
vector de la loncha del gel escindida usando el kit de Extracción
de Gel de Quiagen (Quiagen, Chatsworth, CA).
La estrategia para inducir mutaciones múltiples
dentro del gen CH_{2} de inmunoglobulina, mostrada en figura 24,
ayuda a la recombinación homóloga in vivo de varios productos
de PCR amplificados independientemente el uno con el otro así como
con el DNA del vector pBR96-HG1. Para introducir
mutaciones en dos localizaciones distales se sintetizan dos
productos de PCR (figura 24B). Un extremo de cada producto de PCR es
para recombinar con un extremo homólogo del vector lineal, y el
otro extremo, que codifica la mutación/las mutaciones de interés,
es para recombinar con el producto de PCR vecino. Como se muestra en
la figura 24B, las mutaciones localizadas distalmente adicionales
se pueden introducir dentro de una secuencia señal incrementando el
número de productos de PCR proporcionalmente. La recombinación de
productos de PCR vecinos siempre ocurre a través de las regiones
que contienen las mutaciones deseadas, por lo tanto los cebadores de
oligonucleótidos que codifican estos extremos (por ejemplo, A1, A2)
contienen residuos mutantes complementarios. Los cebadores de PCR
mutagénicos contienen al menos 15 nucleótidos de secuencia de tipo
salvaje que flanquean cada lado de los residuos mutantes bien
cebando la reacción de polimerización o bien mediando recombinación.
Dos cebadores en el sentido habitual y antisentido de PCR de 49
nucleótidos de largo (Rs y Ra) contienen secuencias para recombinar
con las regiones de extremos del vector pBR96-HG1a
digerido por Eco47-III.
Cada mutación L se amplificó en una reacción de
PCR separada. Las condiciones de reacción fueron una plantilla de
DNA de pBR96-HG1a intacta de 250 ng, 10 \mumoles
de tampón de Pfu 1X (Stratagene, Inc. San Diego, CA), 10
nmoles de dNTP, 200 ng cada uno de los cebadores de PCR apropiados,
dimetilsulfóxido al 10% (ATCC, Rockville, MD) y 2,5 unidades
clonadas de DNA polimerasa de Pfu en un volumen de reacción
de 100 \mul. Las muestras se desnaturalizaron primero a 95ºC, se
enfriaron a 45ºC durante 5 minutos, y se prolongaron a 72ºC durante
1 minuto seguido de 25 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 45
segundos, fusionando a 45ºC durante 45 segundos, extensión a 72ºC
durante 1 min/kb, seguida por una extensión final a 72ºC durante 7
minutos en un Ciclador Térmico de DNA de
Perkin-Elmer (Norwalk, CT). Los productos
amplificados se purificaron a partir de un gel de agarosa al 1%, se
extrajeron con kit de Extracción de Gel de Qiagen y el DNA
recuperado se cuantificó, 50 ng de cada producto de PCR se
mezclaron con 25 ng del vector pBR-961a digerido con
Eco47-III, transfectado dentro de E. coli
DH5\alpha competente Max de acuerdo con el procedimiento del
fabricante (GIBCO BRL/Life Technologies, Gaithersburg, MD), y la
reacción de transfección entera se plaqueó sobre placas de agar LB
selectivas que contenían 100 \mug/ml de ampicilina.
Los resultados de varios experimentos de
clonación se resumen en la tabla que sigue. Típicamente las
transformaciones produjeron de 80 a 200 colonias bacterianas. Las
colonias individuales se seleccionaron y crecieron durante toda una
noche en cultivos de 2 ml de líquido para aislamiento de DNA de
plásmido por miniprep (Qiagen) y análisis por mapeo mediante la
endonucleasa de restricción Eco47-II. Se analizaron
entre 24 transformantes independientes a partir de eventos de
recombinación homóloga triple (dos productos de PCR más vector) 11
clones que contienen el inserto de DNA de 1.4 kpb pronosticado.
La figura 25 muestra una restricción del
diagnóstico de la muestra mediante un análisis de DNA que se ha
preparado con clones derivados de la recombinación cuádruple
homóloga (tres productos de PCR más vector). La toma de muestras
adicional de clones que resultó de recombinación cuádruple produjo
una eficiencia de clonación del 29% (7 clones que contienen
insertos/24 clones de los que se toman muestras). En este punto,
debido a los pequeños tamaños de muestra, los inventores no saben
si las diferencias en las eficiencias de clonación observadas entre
los eventos de clonación triple y cuádruple son significativas.
Para evaluar la expresión de actividad de unión
de de Le^{\gamma} de las IgG mutantes en CH_{2}, se aislaron
los DNA de las minipreps a partir de 6 clones derivados de la
reacción de recombinación triple y 6 clones derivados de la
reacción de recombinación cuádruple que presentan los patrones de
restricción con Eco47-III diagnósticos predichos,
se mezclaron con DNA de pBR96-hC_{\kappa} y se
usaron para cotransfectar células COS7. Pasadas 48 horas los
sobrenadantes de cultivos de 3 ml se sometieron a ensayo para la
producción de IgG total y para la actividad de unión a Le\gamma
mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (EIA) según se
describe (Yelton, D.E., M.J. Rosoc, G.A. Cruz, W.L. Cosand, J.
Bajorath, I. Hellstom, K.E. Hellstom, W.D. Huse y S.M. Glaser.
1995. Affinity maturation of the BR96 anti-carcinoma
antibody by codon-based mutagenesis. J. Immunol.
155: 1994-2004). Todos los doce cultivos se
encontraban segregando aproximadamente 2-3 \mug/ml
de IgG reactiva con Le\gamma. El espectro de actividades de unión
a Le\gamma fue en todo similar a aquel de IgG BR96 humanizada
nativa indicando que los anticuerpos recombinados homólogamente no
adquieren cualesquiera mutaciones patentes que podrían afectar
unión a antígeno. Para confirmar que se han incorporado las
mutaciones de CH_{2} deseadas, y para evaluar los genes
recombinados por nucleótidos incorporados de forma errónea, cuatro
de los clones que producen anticuerpo funcional se secuenciaron
usando Kit de Secuenciación de DNA de Secuenasa Versión 2 (United
States Biochemical). Se encontró un clon que contiene un cambio
nucleotídico único dentro del cebador de PCR delantero usado para
mediar recombinación con DNA de vector. Los inventores no están
seguros de si este error tuvo lugar durante la síntesis química del
cebador oligonucleotídico o de si es un resultado de mala
incorporación durante la reacción de PCR, a pesar del hecho de que
los inventores usaron una polimerasa termoestable con actividad de
comprobación de lectura.
Se describe un procedimiento de RPCR para
recombinar homólogamente hasta tres productos de secuencia de
anticuerpos mutados generados por PCR dentro de un vector de
expresión eucariota para la construcción rápida de moléculas de IgG
manipuladas en el presente documento. La ventaja de esta
aproximación es la capacidad de introducir simultáneamente
mutaciones situadas distalmente múltiples con productos de PCR
sintetizados mediante una ronda simple de PCR. Los DNA
recombinantes se producen con una eficiencia de clonación
razonablemente elevada y con una fidelidad razonablemente elevada
de secuencias de nucleótidos correctas. La capacidad para reempalmar
eficientemente varios productos de PCR distintos permitiría
estrategias combinatorias para construir dominios de proteína
mutados de forma compleja así como para ampliar el número y
localización de las mutaciones elevadas.
Ejemplo
5
Este ejemplo proporciona dos procedimientos para
introducir mutaciones específicas de sitio dentro del dominio
CH_{2} de la región constante de la IgG1 humana que contiene
vectores.
Un procedimiento implica amplificación mediante
PCR de un segmento o segmentos de la región constante, en la que se
introducen mutaciones usando oligonucleótidos construidos
apropiadamente. El vector que recibe el fragmento o los fragmentos
se digiere con una enzima de restricción linearizando el vector. Los
cebadores de amplificación de PCR se diseñan de tal forma que los
extremos 5' de los fragmentos de PCR pueden hibridar a la secuencia
de DNA de los vectores. Si se amplifica más de un fragmento de PCR,
después las secuencias comunes a los dos fragmentos se introducen
mediante oligonucleótidos. Las bacterias se transfectan con los
fragmentos de PCR y con el vector digerido. Los fragmentos y el
vector pueden recombinar mediante recombinación homóloga usando la
maquinaria de recombinación de bacterias. Se seleccionaron las
colonias de bacterias y el DNA se analizó por tamaño y mapa de
restricción como una determinación preliminar de que el vector y el
fragmento o los fragmentos recombinaron correctamente. La inserción
correcta de fragmentos con las mutaciones se confirma mediante
análisis de secuencia de dideoxinucleótidos. El DNA se introdujo
después dentro de las células de mamíferos como se describe
mediante el anticuerpo delecionado en CH_{2}, y el anticuerpo
expresado analizado para unir y la actividad
funcional.
funcional.
A modo de ejemplo, se introdujeron las
mutaciones de Leu a Ala en residuo 235 en CH_{2} y de Gly a Ala en
el residuo 237 mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 4.
El vector de cadena pesada usado para este procedimiento fue
pD17-hG1a, similar a vector
pD17-BR96 descrito en el presente documento excepto
en que se sustituyeron regiones V humanizadas (Rosok, M.J., D.E.
Yelton, L.J. Harris, J. Bajorath, K.E. Hellstrom, I. Hellstrom,
G.A. Cruz, K. Kristensson, H. Lin, W.D. Huse, y S.M. Glaser, 1996.
J. Biol. Chem. 271 37: 22611-22618) con tres
mutaciones de afinidad (H1, H2, y H3). pBR96-hG1a
contiene dos sitios de restricción Eco47-III que
flanquean los dominios
bisagra-CH_{2}-CH_{3} de Ig. El
vector receptor se preparó (1) digiriendo pBR96-hG1a
con Eco47-III, (2) aislando el vector mediante
electroforesis en gel de agarosa, y (3) extrayendo el DNA del
vector de la loncha de gel escindida usando el kit de Extracción de
Gel de Qiagen (Qiagen, Chatswort, CA). Para introducir mutaciones
en una localización individual, tal como para posiciones 235 y 237,
se sintetizaron dos productos de PCR.
Para introducir dos mutaciones localizadas
distalmente, tales como para mutante F (también referido en el
presente documento como hBR96-2F) con mutaciones en
235, 237, 331, se requieren 3 productos de OCR. La recombinación de
productos de PCR vecinos tiene lugar a través de las regiones que
contienen las mutaciones deseadas, por lo tanto los cebadores
oligonucleotídicos que codifican estos extremos contienen residuos
mutantes complementarios. Los cebadores de PCR mutágenos contienen
al menos 15 nucleótidos de secuencia de tipo salvaje que flanquean
cada lado de los residuos mutantes bien cebando la reacción de
polimerización o bien mediando recombinación. Dos cebadores sentido
y antisentido de PCR de 49 nucleótidos de largo contienen secuencias
recombinando con las regiones de los extremos del vector
pBR96-hG1a digerido con
Eco47-III.
La amplificación por PCR usó 250 ng de plantilla
de DNA de pBR96-hG1a intacta, 10 \mul de tampón de
Pfu 10X (Stratagene, INc., San Diego, CA), dNTP 10 nm, 200
ng de cada uno de los cebadores de PCR apropiados, dimetilsulfóxido
al 10% (ATCC, Rockville, MD) y 2,5 unidades de DNA polimerasa de
Pfu clonada (Stratagene, Inc., San Diego, CA) en 100 \mul
de reacción. Las muestras se desnaturalizaron a 95ºC durante 5
minutos, se fusionaron a 45ºC durante 5 minutos, y se prolongaron a
72ºC durante 1 minuto seguido por 25 ciclos de desnaturalización a
94ºC durante 45 segundos, fusionando a 45ºC durante 45 segundos,
prolongación a 72ºC durante 1 min/kb, y una prolongación final a
72ºC durante 7 minutos. Los productos amplificados se purificaron a
partir de un gel de agarosa al 1%, se extrajeron con el kit de
Extracción de Gel de Qiagen y se cuantificaron. Se mezclaron 50 mg
de cada producto de PCR con 25 ng del vector
pBR96-hG1a digerido con
Eco47-III y se transfectaron en E.
coli MAX Efficiency D5\alpha^{TM} de acuerdo con las
instrucciones del fabricante (GIBCO/BRL Life Technologies;
Gaithersburg, MD). La reacción de transfección completa se plaqueó
sobre agar LB plaqueado que contenía 100 \mug/ml de
ampicilina.
Se seleccionaron las colonias bacterianas y se
cultivaron durante toda una noche a 37ºC en cultivos líquidos de 2
ml. El DNA se aisló y se analizó por mapeo de endonucleasa de
restricción Eco47-III. Se secuenciaron clones con
el tamaño de inserto correcto (Secuenasa Versión 2, U.S. Biochemical
Corp., Cleveland, OH).
El segundo procedimiento para introducir
mutaciones específicas de sitio dentro del dominio CH_{2} de IgG1
humana implicó el procedimiento de Kuntel (1987 Methods Enzymology,
supra). Para este procedimiento se introdujo DNA de
pD17-hG1b con el origen de replicación F1 dentro de
E. coli CJ236 dut-ung- electrocompetente
(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) mediante
electroporación de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
PD17-hGIb es un vector que tiene una región
constante pero no tiene ninguna región variable. El sitio F1 ori
permite tratamiento de este vector como un fagémido.
Las bacterias que contienen el plásmido se
seleccionaron mediante resistencia a ampicilina. El DNA de cadena
simple uridinilado se preparó usando el protocolo de Mutagénesis
In Vitro del Fagémido Muta-Gene Versión 2
(Bio-Rad). Las mutaciones se introdujeron mediante
mutagénesis dirigida a sitio con el oligonucleótido antisentido
apropiado. Para moléculas con mutaciones en más de una localización,
las mutaciones se introdujeron mediante cualquiera de los dos
procedimientos discutidos anteriormente. Un procedimiento sería (1)
preparar un mutante, por ejemplo, mutante 2C (también referido en
el presente documento como BR96-2C) con las
mutaciones en los residuos 318, 320, 322, (2) aislar DNAss, y (3)
introducir una segunda serie de mutaciones con el oligonucleótido
antisentido apropiado. El segundo procedimiento sería fusionar dos
oligonucleótidos antisentido con el mismo DNAss uridinilado y
rastrear en busca de mutantes con ambas series de cambios. Se
preparó también mutante 2H (hBR96-2H) mediante una
combinación de estos procedimientos.
La región V de cadena pesada de
BR96-2 humanizada se introdujo mediante el
procedimiento de recombinación homóloga descrito anteriormente en
pD 17-hJm 14.H 1. El plásmido pD
17-hJm 14.H 1 contiene la región variable
humanizada BR96 con las mutaciones H1/H2/H3 y se usó el plásmido
transfectando secuencias mutantes dentro de células de mamíferos.
El vector pD17GIb que contenía la mutación o mutaciones de Fc se
digirió con NheI durante 3 horas a 37ºC y el DNA se aisló mediante
procedimientos descritos anteriormente. Se determinó la inserción
de la región V dentro del vector mediante tamaño y mapeo por enzima
de restricción y se confirmó mediante análisis de secuencia.
La expresión transitoria de anticuerpos
completos se llevó a cabo mediante transfección de células COS. Para
producción de anticuerpos, se llevaron a cabo transfecciones
estables de células CHO (véase descripción de mutante delecionado
en CH2). Todos los mutantes se purificaron a partir de sobrenadantes
de cultivo de CHO mediante cromatografía de proteína A.
Los cebadores de oligonucleótidos homólogos al
vector y usados introduciendo las mutaciones de regiones constantes
fueron como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
Oligonucleótidos homólogos a las secuencias de
vectores:
- \quad
- Sens(en el sentido habitual)CH2 E47-3-5: CAG GGA GGG AGG GTG TCT GCT GGA AGC CAG GCT CAG CGC TGA CCT CAGA
- \quad
- D CH2 E47-3 A (antisentido): GGA AAG AAC CAT CAC AGT CTC GCA GGG GCC CAG GGC AGC GCT GGG TGC TT
\vskip1.000000\baselineskip
Oligonucleótidos para mutar Leu235 a Ala y
Gly237 Ala (secuencias subrayadas muestran sitios de mutación):
- \quad
- CH2 L235-G237/aa: GAA GAG GAA GAC TGA CGG \underbar{TGC} CCC \underbar{CGC} GAG TTC AGG TGC TGA GG
- \quad
- SensCH2 L235-G237/AA: CCT CAG CAC CTG AAC TG\underbar{C}\underbar{CG}G GG\underbar{G}\underbar{CA}C CGT CAG TCT TCC TCT TC
\vskip1.000000\baselineskip
Oligonucleótidos para mutar Glu318, Lys320,
Lys322 a Ser
- \quad
- Antis(antisentido)CH2 EKK/SSS-2: CTG GGA GGG CTT TGT AGA C\underbar{CG}\underbar{A}GC A\underbar{CG}\underbar{A}GT A\underbar{CG}\underbar{A}CT TGC CAT TCA GCC
\vskip1.000000\baselineskip
Oligonucleótidos para mutar Pro331 a Ala:
- \quad
- Antis CH2 P331/A/3: GAT GGT TTT CTC GAT GGC \underbar{GGC} TGG GAG GGC
- \quad
- Sense P33/A: GCC CTC CCA \underbar{GCC} GCC ATC GAG AAA ACC ATC
\vskip1.000000\baselineskip
Oligo antisentido alternativo para introducir
Ala en 331 mediante mutación dirigida a sitio:
- \quad
- CH2P331A: GAT GGT TTT CTC GAT \underbar{AGC} GGC TGG GAG GGC TTT G
\vskip1.000000\baselineskip
Oligonucleótidos para mutar Glu318 a Ser, Lys320
a Ser, Lys322 a Ser, y Pro331 a Ala.
- \quad
- Antis CH2 EKKP/SSA-6: GAT GGT TTT CTC GAT \underbar{GGC} GGC TGG GAG GGC TTT GTT GGA GAC \underbar{CGA} GCA \underbar{CGA} CTT GCC ATT CAG CCA GTC CTG GTG
- \quad
- Sense CH2 EKKP/SSA-6: CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG \underbar{TCG} TAC \underbar{TCG} TGC \underbar{TCG} GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA \underbar{GCC} GCC ATC GAG AAA ACC ATC
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados del CDC demuestran que el mutante
hBR96-2B tiene aproximadamente 10 veces menos
actividad que el control hBR96-1 (dos mutaciones de
afinidad, una en H2 y una en H3, se refieren a patente previa
(figura 20)). Los mutantes que tienen la menor capacidad para matar
células en presencia del complemento son hBR96-2C
con las mutaciones triples en las posiciones 318, 320 y 322 y el
mutante hBR96-2H (anticuerpos menos citotóxicos en
el panel) que contienen todas las seis mutaciones en las tres
localizaciones diferentes. La actividad ADCC se afectó más por la
molécula hBR96-2 con CH2 delecionado (figura 21).
hBR96-2B y -2H pierden entre 100 y 1000 veces de
actividad para matar en presencia de células efectoras. En el ensayo
de ADCC la molécula de hBR96-2B pierde también
aproximadamente 10 veces su actividad (figura 21).
Las figuras 26-28 proporcionan
las secuencias de aminoácidos para la región variable de cadena
pesada tanto para BR96 quimérico como para BR96 humanizado que
tiene las mutaciones H1, H2 y H3. Se conoce la secuencia de
aminoácidos para la región variable de cadena ligera y los
procedimientos para generarla se encuentran en la Solicitud PCT
Nº.: 95/305444. Se proporciona adicionalmente la secuencia de
aminoácidos para la región constante de IgG1. Las mutaciones en la
región constante están marcadas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Bristol-Myers Squibb Co.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: UN PROCEDIMIENTO PARA INHIBIR TOXICIDAD INDUCIDA POR INMUNOGLOBULINA QUE RESULTA DEL USO DE INMUNOGLOBULINAS EN TERAPIA Y DIAGNÓSTICO IN VIVO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 13
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DOMICILIO DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Merchant & Gould
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 11150 de Santa Monica Blvd., Suite 400
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Los Ángeles
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 90025
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: FastSEQ Versión 2.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US97/_____.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 1-AGOSTO-1997
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 60/023.033
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 2-AGOSTO-1996
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- REPRESENTANTE/AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Adriano, Sarah B.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 34.470
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 30436.43WOU1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 310-445-1140
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 310-445-9031
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº.: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGCACCGAA AGCTTTCTGG GGCAGGCCAG GCCTGA
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº.: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCGGACATG TTGGTACCCA CGTGGTGGTC GACGC
\hfill
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGAGC CTGGCTTCGA GCAGACA
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº.: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- LONGITUD: 55 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCGACCACC ACGTGGGTAC CAACATGTCC GGAGC
\hfill
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACAT GGACAGAGGC CGGCT
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº.: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (i)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (J)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (L)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGGTTCTTG TTCATCTCCT CTCTAGATGG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº.: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCATGGTCG ACCTCAGACC TGCCAAGAGA CATATC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº.: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATGGTCACG TGGTGTGTCC CTGGATGCAG GCTACTCTA
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº.: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGGGAGGGA GGGTGTCTGC TGGAAGCCAG GCTCA
\hfill
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGCT GACCTCAGA
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº.: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAAAGAACC ATCACAGTCT CGCAGGGGCC CAGGG
\hfill
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGCG CTGGGTGCTT
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº.: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8691 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº.: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8327 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº.: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8897 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº.: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8321 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº.: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8897 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (18)
1. Un anticuerpo BR96 que tiene una región
constante de IgG1 humana que ha sido alterada estructuralmente en
el dominio CH2 en el que la leucina en la posición aminoacídica 235
está mutada a alanina; la glicina en posición aminoacídica 237 está
mutada a alanina; el ácido glutámico en posición aminoacídica 318
está mutado a serina; la lisina en posición aminoacídica 320 está
mutada a serina; y la lisina en posición aminoacídica 322 está
mutada a serina.
2. Un anticuerpo BR96 que tiene una región
constante de IgG1 humana que ha sido alterada estructuralmente en
el dominio CH2 en el que la leucina en la posición aminoacídica 235
está mutada a alanina; la glicina en posición aminoacídica 237 está
mutada a alanina; y la prolina en posición aminoacídica 331 está
mutada a alanina.
3. Un anticuerpo BR96 que tiene una región
constante de IgG1 humana que ha sido alterada estructuralmente en
el dominio CH2 en el que la leucina en la posición aminoacídica 235
está mutada a alanina; la glicina en posición aminoacídica 237 está
mutada a alanina; el ácido glutámico en posición aminoacídica 318
está mutado a serina; la lisina en posición aminoacídica 320 está
mutada a serina; la lisina en posición 322 está mutada a serina; y
la prolina en posición aminoacídica 331 está mutada a alanina.
4. Una molécula de ácido nucleico que codifica
un anticuerpo seleccionado de los anticuerpos BR96 de las
reivindicaciones 1-3.
5. Un cDNA de la reivindicación 4.
6. Un plásmido que comprende la molécula de
ácido nucleico de la reivindicación 4.
7. Un sistema vector huésped que comprende un
plásmido de la Reivindicación 6 en una célula huésped adecuada.
8. Un procedimiento para producir una proteína
que comprende cultivar dicha célula huésped de la reivindicación 7
que contiene dicho plásmido tal como para producir la proteína en el
huésped y recuperar la proteína así producida.
9. Una composición farmacéutica que comprende un
vehículo aceptable y una cantidad farmacéuticamente efectiva de una
molécula de inmunoglobulina que tiene una región variable y una
región constante, estando la molécula de inmunoglobulina modificada
alterando estructuralmente los dominios asociados a toxicidad
múltiple en el dominio CH2 de la región constante de un anticuerpo
monoclonal BR96 y dichos dominios asociados a toxicidad múltiple se
alteran de tal forma que la toxicidad de otro modo inducida por
dicho anticuerpo monoclonal BR96 está inhibida, en la que dicha
molécula de inmunoglobulina modificada se selecciona de los
anticuerpos de las reivindicaciones
1-3.
1-3.
10. La composición de la reivindicación 9 en la
que dicha molécula de inmunoglobulina estructuralmente alterada
reconoce y une un objetivo asociado con cáncer.
11. Uso de la composición de la reivindicación
10 para fabricar un medicamento para usar en un procedimiento de
tratar carcinomas in vivo comprendiendo administrar una
cantidad farmacéuticamente efectiva de dicha composición a un
sujeto.
12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11
en el que la molécula de inmunoglobulina estructuralmente alterada
en la composición está marcada tal como para producir directa o
indirectamente una señal detectable con un compuesto seleccionado
del grupo constituido por una marca radiactiva, una enzima, un
cromóforo, un quimioluminiscente y un fluorescente.
13. Uso de un compuesto de la reivindicación 10
para fabricar un medicamento para tratar un paciente que sufre de
un cáncer, estando caracterizado el cáncer como un grupo de
células que tienen un antígeno asociado a tumor en la superficie
celular, mediante administración al sujeto de una cantidad que mata
el cáncer de dicha composición que comprende inmunoglobulina unida
a un agente citotóxico bajo condiciones que permiten a la molécula
así unida unirse al antígeno asociado al tumor en la superficie
celular tal como para matar las células así unidas tratando de este
modo al sujeto.
14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13
en el que dicha inmunoglobulina está conjugada a doxorrubicina.
15. Uso de una molécula de inmunoglobulina que
tiene una región variable y una región constante, estando la
molécula de inmunoglobulina modificada alterando estructuralmente
dominios asociados a toxicidad múltiple en el dominio CH2 de la
región constante de un anticuerpo monoclonal BR96 y dichos dominios
asociados a toxicidad múltiple están alterados de tal forma que la
toxicidad de otro modo por dicho anticuerpo monoclonal BR96 está
inhibida, para fabricar un medicamento para inhibir toxicidad
inducida por inmunoglobulinas resultante de inmunoterapia con
inmunoglobulinas en un sujeto, en el que dicha molécula de
inmunoglobulina modificada se selecciona de los anticuerpos de las
reivindicaciones 1 a 3.
16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15
en el que dicha molécula estructuralmente alterada no interviene
más en la mediación de la citotoxicidad dependiente de complemento o
citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
17. El uso de acuerdo con la reivindicación 15
en el que la molécula de inmunoglobulina reconoce y une
Le^{y}.
18. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 9 para usar como un agente terapéutico.
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|---|---|---|---|
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