CN110832070A - 液体肿瘤来源肿瘤浸润淋巴细胞的扩增及其治疗用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了扩增来自血液恶性肿瘤(例如液体肿瘤，包括淋巴瘤和白血病)患者的血液和/或骨髓的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)(包括外周血淋巴细胞和骨髓浸润淋巴细胞)的方法，以及如此扩增的TIL在治疗疾病(例如癌症和血液恶性肿瘤)中的用途。

Description

液体肿瘤来源肿瘤浸润淋巴细胞的扩增及其治疗用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年5月10日提交的美国临时申请号62/504,337；2017年7月10日提交的美国临时申请号62/530,681；2017年8月25日提交的美国临时申请号62/550,398；2017年11月22日提交的美国临时申请号62/590,034；2018年1月24日提交的美国临时申请号62/621,462；2018年1月25日提交的美国临时申请号62/621,798；以及于2018年3月23日提交的美国临时申请号62/647,367的优先权，其全部内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本文公开了扩增来自血液恶性肿瘤(例如液体肿瘤，包括淋巴瘤和白血病)患者的血液和/或骨髓的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，以及包含由此获得的TIL群的组合物。此外，本文公开了从血液恶性肿瘤(例如液体肿瘤)患者的血液或骨髓扩增的TIL的治疗用途，包括在治疗此类血液恶性肿瘤中的用途。
背景技术
使用过继性自体转移的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL，tumor infiltratinglymphocyte)治疗大体积、难治性的癌症代表了一种治疗预后不良患者的有效方法。Gattinoni等，Nat.Rev.I mmunol.，2006，6，383-393。TIL以T细胞为主，基于IL-2的TIL扩增随后进行“快速扩增方法”(REP，rapid expansion process)因其速度和效率已成为TIL扩增的优选方法。Dudley等，Science，2002，298，850-54；Dudley等，J.Clin.Oncol.，2005，23，2346-57；Dudley等，J.Clin.Oncol.，2008，26，5233-39；Riddell等，Science 1992，257，238-41；Dudley等，J.I mmunother.，2003，26，332-42。为改善黑色素瘤对TIL治疗的反应并将TIL疗法扩展到其他肿瘤类型，已对许多方法进行了探索，但取得的成功有限，该领域仍具有挑战性。Goff等，J.Clin.Oncol.，2016，34，2389-97；Dudley等，J.Clin.Oncol.，2008，26，5233-39；Rosenberg等，Clin.Cancer Res.，2011，17，4550-57。从B细胞淋巴瘤扩增TIL的早期方法产生的结果差，培养TIL的12次尝试中仅有2次提供了潜在的抗肿瘤活性。Schwartzentruber等，Blood 1993，82，1204-1211。迫切需要提供更有效的许多血液恶性肿瘤的治疗方法，包括急性髓性白血病(AML，acute myeloid leukemia)和慢性淋巴细胞白血病(CLL，chronic lymphocytic leukemia)。
本发明提供了出人意料的发现：TIL扩增过程可得到从血液恶性肿瘤(例如液体肿瘤，包括淋巴瘤或白血病)获得的有效TIL群。
发明内容
在一个实施方式中，本发明提供了一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，该方法包括以下步骤：
(a)可选地，用包含至少一种激酶抑制剂的方案对患者进行预治疗；
(b)通过切除、活检(biopsy)、针吸(needle aspiration)或单采(apheresis)从患者获得肿瘤，该肿瘤包含第一TIL群；
(c)可选地，碎片化或解离肿瘤，获得肿瘤碎片，并且使肿瘤碎片与第一细胞培养基接触；
(d)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少5倍；其中，第一细胞培养基包含IL-2；并且其中，初始扩增进行21天以下；
(e)在第二细胞培养基中对第二TIL群进行第二次扩增，获得第三TIL群；其中，第二次扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量高至少50倍；其中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)和经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)；并且其中，第二次扩增进行14天以下；
(f)收获第三TIL群；以及
(g)给癌症患者施用治疗有效份的第三TIL群；
其中，肿瘤是液体肿瘤；并且其中，癌症是血液恶性肿瘤。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，该方法包括以下步骤：
(a)可选地，用包含至少一种激酶抑制剂的方案对患者进行预治疗；
(b)通过切除、活检、针吸或单采从患者获得肿瘤，该肿瘤包含第一TIL群；
(c)可选地，碎片化或解离肿瘤，获得肿瘤碎片，并且使肿瘤碎片与第一细胞培养基接触；
(d)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少5倍；其中，第一细胞培养基包含IL-2；并且其中，初始扩增进行21天以下；
(e)在第二细胞培养基中对第二TIL群进行第二次扩增，获得第三TIL群；其中，第二次扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量高至少50倍；其中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)和经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)；并且其中，第二次扩增进行14天以下；
(f)收获第三TIL群；以及
(g)给癌症患者施用治疗有效份的第三TIL群；
其中，肿瘤是液体肿瘤；并且其中，癌症是选自下组的血液恶性肿瘤：急性髓性白血病(AML)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞(ABC)DLBCL、生发中心B细胞(GCB)DLBCL、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞性白血病(SLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、复发性和/或难治性霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、伯基特淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症(WM)、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化、慢性粒细胞白血病、滤泡中心性淋巴瘤、惰性NHL、人类免疫缺陷病毒(HIV)相关性B细胞淋巴瘤，以及EB病毒(EBV)相关性B细胞淋巴瘤。
在本发明的一个实施方式中，该方法还包括添加ITK抑制剂。在一个实施方式中，在步骤(d)和(e)中的至少一个步骤期间，将ITK抑制剂添加到细胞培养基中。在本发明的一个实施方式中，ITK抑制剂是共价且不可逆地结合至ITK的共价ITK抑制剂。在本发明的一个实施方式中，ITK抑制剂是与ITK结合的别构ITK抑制剂。在另一个实施方式中，ITK抑制剂选自：氨基噻唑类ITK抑制剂、苯并咪唑类ITK抑制剂、氨基嘧啶类ITK抑制剂、3-氨基吡啶-2-酮类ITK抑制剂、吲哚基吲唑类ITK抑制剂、吡唑基吲哚类抑制剂、噻吩并吡唑抑制剂，以及靶向ATP口袋(pocket)中半胱氨酸442的ITK抑制剂。在另一个实施方式中，ITK抑制剂是ITK抑制剂是依鲁替尼(ibrutinib)、达沙替尼(dasatinib)、博舒替尼(bosutinib)、尼洛替尼(nilotinib)、厄洛替尼(erlotinib)BMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469((R)-3-(1-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)-N-(3-甲基-4-(1-甲基乙基)苯甲酰胺)及它们的组合。在另一个实施方式中，ITK抑制剂是依鲁替尼。在另一个实施方式中，ITK抑制剂是(R)-3-(1-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)-N-(3-甲基-4-(1-甲基乙基)苯甲酰胺。前述ITK抑制剂可从各种来源商购，包括Tocris Bioscience，Inc.(明尼阿波里斯市，明尼苏达州，美国)、Selleckchem，Inc.(休斯顿，得克萨斯州，美国)和AK Scientific，Inc.(联合市，加利福尼亚州，美国)。在另一个实施方式中，以约0.1nM至约5μM的浓度添加ITK抑制剂。在另一个实施方式中，以约0.1nM至约5μM的浓度添加ITK抑制剂。在另一个实施方式中，以约0.1nM至约100nM的浓度添加ITK抑制剂。在另一个实施方式中，以约0.5nM至约50nM的浓度添加ITK抑制剂。在另一个实施方式中，以约1nM至约10nM的浓度添加ITK抑制剂。在一个实施方式中，以约0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、150nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM和50μM的浓度添加ITK抑制剂。
在本发明的一个实施方式中，一种扩增来自外周血的外周血淋巴细胞(PBL，peripheral blood lymphocyte)的方法包括：
a.从外周血获得外周血单核细胞(PBMC)的样品；其中，可选地冷冻保存所述样品；
b.通过筛选并移出CD19+B细胞从所述样品中分离PBL；
c.可选地，将所述PBL与所述CD19+B细胞共培养；
d.在透气性容器中，用IL-2和抗CD3/抗CD28抗体刺激第一细胞培养基中的所述PBL约2天至约6天的时间；
e.用IL-2和抗CD3/抗CD28抗体培养步骤(d)中的PBL约2天至约6天的时间；
f.从步骤(e)的培养物中分离与抗体结合的PBL；
g.从步骤(e)分离的PBL中除去抗体；以及
h.收获PBL。
在本发明的一个实施方式中，该方法还包括在步骤(d)之后添加IL-2，并将第一培养基更换为第二细胞培养基。在另一个实施方式中，该方法还包括在步骤(e)之后添加IL-2，并将第二培养基更换为第三培养基。在一个实施方式中，第一细胞培养基、第二细胞培养基或第三培养基选自：CM-2、CM-4和AIM-V。在另一个实施方式中，第一细胞培养基和第二细胞培养基相同。在另一个实施方式中，第一细胞培养基和第二细胞培养基不同。在本发明的一个实施方式中，第一细胞培养基、第二细胞培养基和第三细胞培养基中的一种或多种相同。在另一个实施方式中，第一细胞培养基、第二细胞培养基和第三细胞培养基均不相同。
在一个实施方式中，可选的所述PBL与所述CD19+B细胞的共培养进行1小时至3天的时间。
在本发明的一个实施方式中，步骤(c)中T细胞与B细胞的比率为约0.1：1至约10：1(B细胞：T细胞)。在另一个实施方式中，步骤(c)中B细胞与T细胞的比率选自：0.1：1、1：1和10：1(B细胞：T细胞)。
在本发明的一个实施方式中，在步骤(d)开始时，PBL的起始细胞数量为至少约1×105至约10×105个PBL。在另一个实施方式中，在步骤(d)开始时，PBL的起始细胞数量为至少约2.5×105至10×105个PBL。在另一个实施方式中，在步骤(d)开始时，PBL的起始细胞数量为至少5×105个PBL。
在本发明的一个实施方式中，步骤(c)和(d)的每个步骤中使用的IL-2浓度为约1000IU/mL至约6000IU/mL。在另一个实施方式中，步骤(c)和(d)的每个步骤中使用的IL-2浓度为约3000IU/mL。
在本发明的一个实施方式中，抗CD3/抗CD28抗体包被在磁珠(bead)上。在本发明的一个实施方式中，抗CD3/抗CD28抗体是
Figure BDA0002348881650000051
在一个实施方式中，该方法包括在步骤(c)和(d)的每个步骤中，以约1：1的磁珠：PBL比率将抗CD3/抗CD28抗体(偶联)磁珠与PBL共培养。
在本发明的一个实施方式中，该方法包括添加ITK抑制剂。在一个实施方式中，在步骤(c)、(d)和(e)中的至少一个步骤期间添加ITK抑制剂。在本发明的一个实施方式中，ITK抑制剂选自：氨基噻唑类ITK抑制剂、苯并咪唑类ITK抑制剂、氨基嘧啶类ITK抑制剂、3-氨基吡啶-2-酮类ITK抑制剂、吲哚基吲唑类ITK抑制剂、吡唑基吲哚类抑制剂、噻吩并吡唑抑制剂，以及靶向ATP口袋中半胱氨酸442的ITK抑制剂。在另一个实施方式中，ITK抑制剂是依鲁替尼、达沙替尼、博舒替尼、尼洛替尼、厄洛替尼BMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469及它们的组合。在另一个实施方式中，ITK抑制剂是依鲁替尼。
在本发明的一个实施方式中，用于制备PBL的任何前述方法在封闭的无菌系统中进行。
在本发明的一个实施方式中，一种扩增来自外周血的外周血淋巴细胞(PBL)的方法包括：
a.从外周血获得PBMC的样品；其中，可选地冷冻保存所述样品；
b.通过筛选并移出CD19+B细胞从所述样品中分离PBL；
c.将所述PBL与所述CD19+B细胞共培养4天的时间；
d.将约2.5×105至约5×105个细胞添加到透气性容器中的CM-2细胞培养基中，用3000IU/mL浓度的IL-2和固定在磁珠上的抗CD3/抗CD28抗体刺激所述PBL约4天的时间；
e.用AIM-V细胞培养基和另外约3000IU/mL的IL-2更换CM-2；
f.用IL-2和固定在磁珠上的抗CD3/抗CD28抗体培养步骤(e)的PBL另外约3天的时间；
g.从步骤(f)的培养物中分离与抗体结合的PBL；
h.从步骤(g)分离的PBL中除去抗体；以及
i.收获PBL。
在本发明的一个实施方式中，一种治疗血液恶性肿瘤的方法包括：
a.由血液恶性肿瘤患者的外周血获得PBMC的样品；
b.通过筛选并移出CD19+B细胞从所述样品中分离PBL；
c.可选地，将所述PBL与所述CD19+B细胞共培养；
d.在透气性容器中，用IL-2和抗CD3/抗CD28抗体刺激第一细胞培养基中的所述PBL至少约4天的时间；
e.用IL-2和抗CD3/抗CD28抗体培养步骤(d)中的PBL，持续3天的时间；
f.从步骤(e)的培养物中分离与抗体结合的PBL；
g.从步骤(e)分离的PBL中除去抗体；
h.收获PBL；以及
i.给患者施用治疗有效量的PBL，治疗所述血液恶性肿瘤。
在本发明的一个实施方式中，该方法还包括从用ITK抑制剂预治疗的患者获得PBMC样品。在本发明的一个实施方式中，ITK抑制剂选自：氨基噻唑类ITK抑制剂、苯并咪唑类ITK抑制剂、氨基嘧啶类ITK抑制剂、3-氨基吡啶-2-酮类ITK抑制剂、吲哚基吲唑类ITK抑制剂、吡唑基吲哚类抑制剂、噻吩并吡唑抑制剂，以及靶向ATP口袋中半胱氨酸442的ITK抑制剂。在本发明的一个实施方式中，ITK抑制剂是依鲁替尼、BMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469及它们的组合。在另一个实施方式中，ITK抑制剂是依鲁替尼。在另一个实施方式中，患者用至少三轮依鲁替尼方案预治疗。
在本发明的一个实施方式中，血液恶性肿瘤选自：急性髓性白血病(AML)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞(ABC)DLBCL、生发中心B细胞(GCB)DLBCL、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞性白血病(SLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、复发性和/或难治性霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、伯基特淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症(WM)、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化、慢性粒细胞白血病、滤泡中心性淋巴瘤、惰性NHL、人类免疫缺陷病毒(HIV)相关性B细胞淋巴瘤，以及EB病毒(EBV)相关性B细胞淋巴瘤。在另一个实施方式中，血液恶性肿瘤是慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在本发明的一个实施方式中，以约0.1×109至约15×109个PBL的量施用PBL。
在本发明的一个实施方式中，扩增来自骨髓的骨髓浸润淋巴细胞(MIL，marrow-infiltrating lymphocyte)的方法包括：
a.从骨髓获得外周血单核细胞(PBMC)的样品；其中，可选地冷冻保存所述样品；
b.分选CD3+、CD33+、CD20+和CD14+细胞部分(MIL部分)以及非CD3+、非CD33+、非CD20+、非CD14+细胞部分(AML原始细胞部分)；
c.可选地，破碎AML原始细胞(blast cell)部分；
d.以约0.1：1至约10：1的细胞数量比率，将可选地破碎的AML原始细胞部分添加至MIL部分；
e.在透气性容器中，在包含IL-2的第一细胞培养基中培养一个或两个细胞部分；
f.用抗CD3/抗CD28抗体刺激MIL，获得MIL的扩增；
g.用IL-2和抗CD3/抗CD28抗体再刺激MIL另外约2天至约6天的时间；
h.用另外的IL-2培养MIL另外约1至约3天的时间；以及
i.收获所述MIL。
在本发明的一个实施方式中，该方法还包括在步骤(e)之后添加IL-2，并将培养基更换为第二细胞培养基。在一个实施方式中，第一细胞培养基和第二细胞培养基选自：CM-2、CM-4和AIM-V。在另一个实施方式中，第一细胞培养基和第二细胞培养基相同。在另一个实施方式中，第一细胞培养基和第二细胞培养基不同。
在一个实施方式中，在步骤(e)开始时，透气性容器中至少有约2×104至约5×105个MIL。在另一个实施方式中，在步骤(e)开始时，透气性容器中至少有约2.8×104至3.4×105个MIL。在另一个实施方式中，在步骤(e)开始时，透气性容器中至少有5×105个MIL。
在本发明的一个实施方式中，在步骤(e)中，IL-2以1000IU/mL至6000IL/mL的浓度存在。在另一个实施方式中，IL-2以约6000IU/mL的浓度存在。在另一个实施方式中，在步骤(g)中IL-2以约3000IU/mL的浓度存在。在另一个实施方式中，在步骤(h)中IL-2以约3000IU/mL的浓度存在。
在本发明的一个实施方式中，步骤(e)中的培养进行约3天的时间。在一个实施方式中，步骤(f)中的刺激进行约4天的时间。在一个实施方式中，步骤(g)中的刺激进行约7天的时间。
在本发明的一个实施方式中，可选地破碎的细胞部分使用选自下组的方法进行破碎：超声处理(sonication)、均化(homogenization)、涡旋(vortexing)、振动(vibration)和裂解(lysis)。在本发明的一个实施方式中，使用合适的裂解方法来裂解非CD3+、非CD33+、非CD20+、非CD14+细胞部分(AML原始部分)，裂解方法包括：高温裂解、化学裂解(例如有机醇)、酶裂解和本领域已知的其他细胞裂解方法。
在本发明的一个实施方式中，在步骤(f)和(g)的每个步骤中，抗CD3/抗CD28抗体包被在磁珠上，MIL：磁珠的比率为约1：1。
在本发明的一个实施方式中，该方法在封闭的无菌系统中进行。
在本发明的一个实施方式中，扩增来自骨髓的骨髓浸润淋巴细胞(MIL)的方法包括：
a.从骨髓获得外周血单核细胞(PBMC)的样品；其中，可选地冷冻保存所述样品；
b.分选CD3+、CD33+、CD20+和CD14+细胞部分(MIL细胞部分)以及非CD3+、非CD33+、非CD20+、非CD14+细胞部分(AML原始细胞部分)；
c.破碎AML原始细胞部分，并且以约1：1的细胞数量比率，将破碎的AML原始细胞部分添加至MIL细胞部分；
d.在透气性容器中，用包含约6000IU/mL浓度的IL-2的第一细胞培养基培养细胞部分约3天的时间；
e.将固定在磁珠上的抗CD3/抗CD28抗体以约1：1(MIL：磁珠)的比率添加到细胞培养物中，培养MIL和抗体约1天的时间；
f.将第一细胞培养基更换为包含另外的约3000IU/mL浓度的IL-2的第二细胞培养基；
g、培养抗体和MIL另外约3天的时间；
h.用IL-2和固定在磁珠上的抗CD3/抗CD28抗体再刺激MIL至少约4天的时间；
i.将第二细胞培养基更换为包含另外的约3000IU/mL浓度的IL-2的第三细胞培养基，另外进行至少约3天的时间；
j.收获所述MIL。
在本发明的一个实施方式中，一种治疗血液恶性肿瘤的方法包括：
a.从骨髓获得外周血单核细胞(PBMC)的样品；其中，可选地冷冻保存所述样品；
b.分选CD3+、CD33+、CD20+和CD14+细胞部分(MIL部分)以及非CD3+、非CD33+、非CD20+、非CD14+细胞部分(AML原始细胞部分)；
c.可选地，破碎AML原始细胞部分；
d.以约0.1：1至约10：1的细胞数量比率，将可选地破碎的AML原始细胞部分添加到MIL部分；
e.在透气性容器中，在包含IL-2的第一细胞培养基中培养一个或两个细胞部分；
f.用抗CD3/抗CD28抗体刺激所述样品；
g.用IL-2和抗CD3/抗CD28抗体再刺激MIL另外至少约4天的时间；
h.用另外的IL-2培养MIL另外至少约3天的时间；
i.收获所述MIL；以及
j.给患者施用治疗有效量的所述MIL，治疗血液恶性肿瘤。
在本发明的一个实施方式中，血液恶性肿瘤选自：急性髓性白血病(AML)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞(ABC)DLBCL、生发中心B细胞(GCB)DLBCL、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞性白血病(SLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、复发性和/或难治性霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、伯基特淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症(WM)、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化、慢性粒细胞白血病、滤泡中心性淋巴瘤、惰性NHL、人类免疫缺陷病毒(HIV)相关性B细胞淋巴瘤，以及EB病毒(EBV)相关性B细胞淋巴瘤。在另一个实施方式中，血液恶性肿瘤是急性髓性白血病(AML)。在本发明的一个实施方式中，以约4×108至约2.5×109个MIL的量施用MIL。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及下述具体实施方式。
图1显示了淋巴瘤肿瘤的病理信息。
图2显示了淋巴瘤TIL和黑色素瘤TIL的不同亚群的比较，显示淋巴瘤TIL中的效应记忆(EM)亚群显著高于黑色素瘤TIL中的EM亚群。
图3显示了淋巴瘤TIL和黑色素瘤TIL的不同亚群的比较，显示淋巴瘤TIL中的CD28+CD4+亚群显著高于黑色素瘤TIL中的这些亚群。
图4显示了非霍奇金淋巴瘤TIL和黑色素瘤TIL的CD4+ T细胞亚群的比较，显示了分化标志物。图中的红线代表中位数。CM指中枢记忆T细胞，EM指效应记忆T细胞，TEMRA指效应记忆CD45RA+ T细胞。
图5显示了非霍奇金淋巴瘤TIL和黑色素瘤TIL的CD8+ T细胞亚群的比较，显示了分化标志物。图中的红线代表中位数。CM指中枢记忆T细胞，EM指效应记忆T细胞，TEMRA指效应记忆CD45RA+ T细胞。
图6显示了非霍奇金淋巴瘤TIL和黑色素瘤TIL的CD4+ T细胞亚群的比较，显示了耗竭标志物。图中的红线代表中位数。LAG3指淋巴细胞激活基因3，PD1指程序性死亡1，TIGIT指具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体。
图7显示了非霍奇金淋巴瘤TIL和黑色素瘤TIL的CD8+ T细胞亚群的比较，显示了耗竭标志物。图中的红线代表中位数。LAG3指淋巴细胞激活基因3，PD1指程序性死亡1，TIGIT指具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体。
图8显示了非霍奇金淋巴瘤TIL和黑色素瘤TIL的细胞类型的比较。NK指自然杀伤细胞，TCRab指表达具有α和β链的T细胞受体的细胞。
图9显示了生物发光重定向裂解测定(BRLA，bioluminescent redirected lysisassay)结果。
图10显示了淋巴瘤TIL与黑色素瘤TIL的干扰素-γ(IFN-γ)酶联免疫吸附测定(ELISA)结果。
图11显示了淋巴瘤TIL的酶联免疫斑点(ELIspot)测定结果。
图12显示了黑色素瘤TIL的ELIspot测定结果。
图13显示了NANOSTRING NCOUNTER分析的结果，显示与黑色素瘤TIL相比，淋巴瘤TIL表达更高水平的RORC IL17A(TH17表型)和GATA3(Th2表型)。各个基因在热图(heatmap)的红色框中突出显示。
图14显示了TIL扩增和处理过程。步骤1涉及将4个肿瘤碎片添加至10个G-Rex 10烧瓶中。在步骤2，获得约40×106个以上的TIL。在步骤3，(将步骤2所得TIL)分到36个G-Rex100烧瓶中用于REP。在步骤4，通过离心收获TIL。在约43天的总处理时间之后，在步骤5获得新鲜的TIL产物，此时可以将TIL输注到患者体内。
图15显示了本公开的使用从淋巴瘤获得的TIL的治疗方案。手术(和肿瘤切除)在开始时进行，淋巴细胞耗竭化疗指如本文其他地方所述的“采用化疗的非清髓性淋巴细胞耗竭”。
图16显示了如下文实施例4所描述地使用标准表型面板DF2的流式细胞术分析的结果。如实施例4中所描述，使用标准表型面板DF2对淋巴瘤和黑色素瘤TIL进行染色。显示的数据代表TIL中总CD4和CD8 T细胞的不同亚群。图16A显示了幼稚T细胞亚群中CD4和CD8细胞的比例；图16B为中枢记忆T细胞亚群(CM)中CD4和CD8细胞的比例；图16C为效应记忆T细胞亚群(EM)中CD4和CD8细胞的比例，图16D为终末分化(terminally differentiated)的效应记忆T细胞亚群中CD4和CD8细胞的比例。使用双尾曼-惠特尼检验(未配对)计算P值。细胞亚群的平均比例由水平条表示。
图17显示了如下文实施例4所描述地使用标准表型面板DF1的流式细胞术分析的结果。如实施例4中所描述，使用标准表型面板DF1对淋巴瘤和黑色素瘤TIL染色。显示的数据代表TIL中总CD4和CD9 T细胞的不同CD27+(图17A)和CD28+(图17B)亚群，表明淋巴瘤TIL中表达共刺激分子CD28的CD4 T细胞的比例更高。使用双尾曼-惠特尼检验(未配对)计算P值。
图18显示了根据下文实施例4进行的干扰素-γ(IFN-γ)测试的结果。图18A显示了使用ELISpot的结果。ELIspot数据表示为：产生IFN-γ的细胞/106个TIL。图18B显示了使用ELISA的结果。ELISA数据表示为5×105个TIL/孔的TIL培养物上清液中的IFN-γ水平(对数值)。P值使用双尾曼-惠特尼检验(未配对)计算。
图19显示了TIL的裂解潜力。图19A显示了共培养(TIL效应细胞与GFP+P815靶细胞)4小时(图19A)和24小时(图19B)时靶细胞的LU50(相对106个TIL进行归一化)。
图20显示了不同TIL对同种异体和自体肿瘤类型的溶细胞活性(cytolyticactivity)。图20A显示了黑色素瘤TIL对同种异体526靶细胞的溶细胞活性。图20B显示了通过7-AAD摄取确定的淋巴瘤TIL对自体肿瘤细胞的溶细胞活性。图20A和图20B中的数据显示为在效应细胞：靶细胞(E：T)比率为50：1的共培养物中的死细胞百分比。图20C代表黑色素瘤TIL诱导的靶细胞杀伤百分比。图20D代表在不同的E：T比率下由淋巴瘤TIL诱导的靶细胞杀伤百分比。
图21是显示淋巴瘤TIL和黑色素瘤TIL的基因表达谱的热图。表达谱通过来自NanoString的579plex nCounter GX Human Immunology V2 CSO Panel确定。该热图显示了与黑色素瘤TIL相比，淋巴瘤TIL中一组特定基因的表达的倍数变化，表明来自淋巴瘤的TIL中IL-17A和RORC的表达更高。该图显示的癌症包括滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和套细胞淋巴瘤(MCL)。
图22是显示了制备TIL、收获和运输安排的2A过程的示意图。
图23是显示了制备TIL的2A过程的流程图。
图24是显示了扩增外周血淋巴细胞(PBL)的三种不同方法的流程图。
图25A-25C显示扩增来自骨髓的骨髓浸润淋巴细胞(MIL)的三种不同方法。
图26显示从新鲜的外周血单核细胞(PBMC)和冷冻保存的PBMC中分离的PBL的倍数扩增的图。冷冻保存的PBMC来自未曾接受(PreRx PBL)或已经接受(PostRx PBL)依鲁替尼方案治疗的CLL患者。对于图26-34中的各个图，每个点是一个患者。红点患者的PBL使用PBL方法1扩增。绿点患者的PBL使用PBL方法2扩增；黑点患者的PBL使用PBL方法3扩增。
图27显示从新鲜的PBMC和冷冻保存的PBMC分离的PBL的产生IFN-γ的细胞的图。在冷冻保存的PBMC中，还显示了PreRx PBL和PostRx PBL。
图28显示PreRx PBL和PostRx PBL中CD4+和CD8+ T细胞亚群的比例(使用黑色素瘤TIL作为比较物)。
图29A-29D和图30A-30D显示PreRx PBL和PostRx PBL的CD4(图29)和CD8(图30)记忆亚群的比较(使用黑色素瘤TIL作为比较物)。图29A和30A显示了幼稚(CCR7+/CD45RA+)的数据；图29B和30B显示了中枢记忆T细胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)的数据；图29C和30C显示了效应记忆T细胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)的数据；图29D和30D显示了终末分化的效应记忆细胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)的数据。
图31A和31B显示PreRx PBL和PostRx PBL的CD4(图31A)和CD8(图31B)亚群的CD27亚群的比较(使用黑色素瘤TIL作为比较物)。
图32A和32B显示PreRx PBL和PostRx PBL的CD4(图32A)和CD8(图32B)亚群的CD28亚群的比较(使用黑色素瘤TIL作为比较物)。
图33A和33B显示PreRx PBL和PostRx PBL两者的CD4(图33A)和CD8(图33B)群内的LAG3+亚群的比较。
图34A和34B显示PreRx PBL和PostRx PBL两者的CD4(图34A)和CD8(图34B)群内的PD1+亚群的比较。
图35A和35B显示使用自体肿瘤杀伤测定法检测的PreRx PBL(图35A)和PostRxPBL(图35B)的溶细胞活性的结果。细胞毒性以LU50(杀死50％靶细胞所需的PBL数量)来衡量。
图36A和36B显示从AML患者的骨髓(MIL)或外周血(PBL)分离的MIL(图36A)和PBL(图36B)的倍数扩增的图。MIL 1.1使用MIL方法1扩增，MIL1.2使用MIL方法2扩增，MIL1.3使用MIL方法3扩增。MIL2和MIL3使用MIL方法3扩增。所有PBL均使用PBL方法3扩增。MIL1.3的起始细胞数量为138,000个细胞，MIL2的起始细胞数量为62,000个细胞，MIL3的起始细胞数量为28,000个细胞。PBL2的起始细胞数量为338,000个细胞，PBL3的起始细胞数量为336,000个细胞。
图37A和37B显示了MIL(图37A)和PBL(图37B)的产生IFN-γ的细胞。
图38A-38F显示从AML患者分离的MIL(图38A-38C)和PBL(图38D-38F)中T细胞亚群的图。图38A和38D显示了TCRαβ+亚群。图38B和38E显示了CD4+亚群。图38C和38F显示了CD8亚群。在第0天和第14天示出PBL。
图39A-39D显示从AML患者分离的MIL的CD4记忆亚群的图。图39A显示了幼稚(CCR7+/CD45RA+)的数据；图39B显示了中枢记忆T细胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)的数据；图39C显示了效应记忆T细胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)的数据；图39D显示了终末分化的效应记忆细胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)的数据。
图40A-40D显示从AML患者分离的PBL的CD4记忆亚群的图。图40A显示了幼稚(CCR7+/CD45RA+)的数据；图40B显示了中枢记忆T细胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)的数据；图40C显示了效应记忆T细胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)的数据；图40D显示了终末分化的效应记忆细胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)的数据。
图41A-41D显示从AML患者分离的MIL的CD8记忆亚群的图。图41A显示了幼稚(CCR7+/CD45RA+)的数据；图41B显示了中枢记忆T细胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)的数据；图41C显示了效应记忆T细胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)的数据；图41D显示了终末分化的效应记忆细胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)的数据。
图42A-42D显示从AML患者分离的PBL的CD8记忆亚群的图。图42A显示了幼稚(CCR7+/CD45RA+)的数据；图42B显示了中枢记忆T细胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)的数据；图42C显示了效应记忆T细胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)的数据；图42D显示了终末分化的效应记忆细胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)的数据。
图43A和43B显示MIL(图43A)和PBL(图43B)的CD4和CD8细胞群的CD27亚群的图。
图44A和44B显示MIL(图44A)和PBL(图44B)的CD4和CD8细胞群的CD28亚群的图。
图45A和45B显示MIL(图45A)和PBL(图45B)的CD4和CD8细胞群的PD1+亚群的图。
图46A和46B显示MIL(图46A)和PBL(图46B)的CD4和CD8细胞群的LAG3+亚群的图。
图47示出了PBL方法1和PBL方法3的示例性实施方式的时间线。在该图中，IL-2的添加可以发生在过程期间的任何时间点；在示例性实施方式中，IL-2的添加可以在括出的区域中进行。
图48示出了MIL方法3的示例性实施方式的时间线。在该图中，IL-2的添加可以发生在示出了期间的任何时间点；在示例性实施方式中，IL-2的添加可以在括出的区域中进行。
序列表的简要说明
SEQ ID NO：1是莫罗单抗(muromonab)的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2是莫罗单抗的轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是重组人IL-2蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4是阿地白介素的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是重组人IL-4蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6是重组人IL-7蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是重组人IL-15蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8是重组人IL-21蛋白的氨基酸序列。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。本文提及的所有专利和出版物均通过引用整体并入本文。
定义
如本文所用，术语“共同施用(co-administration)”、“共同施用(co-administering)”、“与……组合施用(administered in combination with)”、“与……组合施用(administering in combination with)”、“同时(simultaneous)”和“共同(concurrent)”包括向受试者施用两种以上活性药物成分，使得活性药物成分和/或它们的代谢物同时存在于受试者体内。共同施用包括：同时施用不同的组合物、在不同时间施用不同的组合物，或施用其中存在两种以上活性药物成分的组合物。优选同时施用不同的组合物和施用其中存在两种药剂的组合物。
术语“体内”指发生在哺乳动物受试者体内的事件。
术语“离体”指在人工环境中发生在哺乳动物受试者体外的事件。
术语“体外”指发生在检测系统中的事件。体外实验包括可以采用活细胞或死细胞的基于细胞的实验，还可以包括不采用完整细胞的无细胞检测。
术语“快速扩增”指在一周的时间内抗原特异性TIL的数量增加至少约3倍(或4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或9倍)，更优选在一周的时间内增加至少约10倍(或20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍或90倍)，或最优选在一周的时间内增加至少约100倍。本文描述了许多快速扩增方案。
本文用于描述破碎肿瘤的方法的术语“碎片化”(fragmenting)、“碎片”(fragment)和“碎片化的”(fragmented)包括机械破碎方法，例如破碎、切片、分割和粉碎肿瘤组织，以及任何其他破碎肿瘤组织的物理结构的方法。
术语“外周血单核细胞”和“PBMC”指具有圆形细胞核的外周血细胞，包括淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)和单核细胞。可选地，外周血单核细胞是经辐照的同种异体外周血单核细胞，是抗原呈递细胞。术语“PBL”指外周血淋巴细胞，是从外周血扩增的T细胞。术语PBL和TIL在本文可互换使用。
术语“抗CD3抗体”指抗体或它的变体(例如单克隆抗体)，包括：针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中CD3受体的人、人源化、嵌合或鼠抗体。抗CD3抗体包括OKT-3(也称为莫罗单抗)和UCHT-1。其他抗CD3抗体包括例如奥特昔珠单抗(otelixizumab)、特普利珠单抗(teplizumab)和威司利珠单抗(visilizumab)。
术语“OKT-3”(在本文中也称为“OKT3”)指单克隆抗体或其生物仿制药或变体，包括针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中CD3受体的人、人源化、嵌合或鼠抗体，还包括市售形式，如OKT-3(30ng/mL，纯MACS GMP CD3，Miltenyi Biotech，Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)和莫罗单抗或其变体、保守性氨基酸取代、糖形(glycoform)或生物仿制药。莫罗单抗的重链和轻链的氨基酸序列在表1中给出(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)。能够产生OKT-3的杂交瘤保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC，American Type CultureCollection)，其分配的ATCC登录号为CRL 8001。能够产生OKT-3的杂交瘤也保藏在欧洲认证细胞培养物保藏中心(ECACC，European Collection of Authenticated CellCultures)中，其分配的目录号为86022706。
表1：莫罗单抗的氨基酸序列
Figure BDA0002348881650000161
术语“IL-2”(在本文中也称为“IL2”)指称为白细胞介素-2的T细胞生长因子，包括所有形式的IL-2，包括人和哺乳动物形式，保守氨基酸取代、糖形、生物仿制药及其变体。IL-2描述于例如Nelson,J.I mmunol.2004,172,3983-88和Malek,Annu.Rev.Immunol.2008,26,453-79，其公开内容通过引用并入本文。适用于本发明的重组人IL-2的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：3)。例如，术语IL-2包括人类重组形式的IL-2，例如，阿地白介素(PROLEUKIN，可从多个供应商商购，每个单独使用的小瓶2200万IU)，以及可从CellGenix，Inc.，Portsmouth，NH，美国(CELLGRO GMP)或ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.，东布朗士维克，新泽西，美国(目录号CYT-209-b)商购的重组形式的IL-2和其他供应商的其他商业等价物。阿地白介素(des-alanyl-1，丝氨酸-125人IL-2)是IL-2的非糖基化人重组形式，分子量约为15kDa。适用于本发明的阿地白介素的氨基酸序列在表2中给出(SEQ IDNO：4)。术语IL-2还包括如本文所述的聚乙二醇化形式的IL-2，包括聚乙二醇化的IL2前药NKTR-214，可从Nektar Therapeutics，南旧金山,加利福尼亚州，美国商购。适用于本发明的NKTR-214和聚乙二醇化IL-2描述于美国专利申请公开号US2014/0328791A1和国际专利申请公开号WO2012/065086A1中，其公开内容通过引用并入本文。适用于本发明的缀合的IL-2的替代形式描述于美国专利4,766,106、5,206,344、5,089,261和4,902,502中，其公开内容通过引用并入本文。适用于本发明的IL-2制剂描述于美国专利号6,706,289中，其公开内容通过引用并入本文。
表2：白细胞介素的氨基酸序列
Figure BDA0002348881650000171
术语“IL-4”(在本文中也称为“IL4”)指称为白细胞介素4的细胞因子，其由Th2 T细胞和嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞产生。IL-4调节幼稚辅助性T细胞(Th0细胞)向Th2T细胞的分化。Steinke和Borish,Respir.Res.2001,2,66-70。在被IL-4激活后，Th2 T细胞随后在正反馈环中产生另外的IL-4。IL-4还刺激B细胞增殖和II类MHC表达，并诱导B细胞类别转换为IgE和IgG1表达。适用于本发明的重组人IL-4可从多个供应商商购，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.，东布朗士维克，新泽西，美国(目录号CYT-211)和ThermoFisher Scientific，Inc.，沃尔瑟姆，马萨诸塞，美国(人IL-15重组蛋白，目录号Gibco CTP0043)。适用于本发明的重组人IL-4的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：5)。
术语“IL-7”(在本文中也称为“IL7”)指称为白细胞介素7的糖基化组织衍生细胞因子，其可以从基质细胞和上皮细胞以及树突状细胞中获得。Fry和Mackall,Blood 2002,99,3892-904。IL-7可以刺激T细胞的生长。IL-7与IL-7受体结合，IL-7受体是由IL-7受体α和常见γ链受体(common gamma chain receptor)组成的异二聚体，其在一系列信号中对胸腺内的T细胞发育和外周存活具有重要作用。适用于本发明的重组人IL-4可从多个供应商商购，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.，东布朗士维克，新泽西，美国(目录号CYT-254)和ThermoFisher Scientific，Inc.，沃尔瑟姆，马萨诸塞，美国(人IL-7重组蛋白，目录号Gibco PHC0071)。适用于本发明的重组人IL-7的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：6)。
术语“IL-15”(在本文中也称为“IL15”)指称为白细胞介素-15的T细胞生长因子，并且包括所有形式的IL-15，包括人和哺乳动物形式，保守氨基酸取代、糖形、生物仿制药及其变体。IL-15描述于例如Fehniger和Caligiuri,Blood 2001,97,14-32中，其公开内容通过引用并入本文。IL-15与IL-2共享β和γ信号传导受体亚单位。重组人IL-15是单链的非糖基化的多肽链，含有114个氨基酸(和N-末端甲硫氨酸)，分子量为12.8kDa。重组人IL-15可从多个供应商商购，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.，东布朗士维克，新泽西，美国(目录号CYT-230-b)和ThermoFisher Scientific，Inc.，沃尔瑟姆，马萨诸塞，美国(人IL-15重组蛋白，目录号34-8159-82)。适用于本发明的重组人IL-15的氨基酸序列在表2中给出(SEQID NO：7)。
术语“IL-21”(在本文中也称为“IL21”)指称为白细胞介素-21的多效细胞因子蛋白，并且包括所有形式的IL-21，包括人和哺乳动物形式，保守氨基酸取代、糖形、生物仿制药及其变体。IL-21描述于例如Spolski和Leonard,Nat.Rev.Drug.Disc.2014,13,379-95，其公开内容通过引用并入本文。IL-21主要由自然杀伤T细胞和活化的人CD4+ T细胞产生。重组人IL-21是单链的非糖基化的多肽链，含有132个氨基酸，分子量为15.4kDa。重组人IL-21可从多个供应商商购，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.，东布朗士维克，新泽西，美国(目录号CYT-408-b)和ThermoFisher Scientific，Inc.，沃尔瑟姆，马萨诸塞，美国(人IL-21重组蛋白，目录号14-8219-80)。适用于本发明的重组人IL-21的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：8)。
术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”旨在包括任何和所有的溶剂、分散培养基、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂，以及惰性成分。这些药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂对活性药物成分的用途是本领域熟知的。除非任何常规的药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂与活性药物成分不相容，否则可预期其在本发明的治疗组合物中的应用。其他活性药物成分(例如其他药物)也可以掺入所描述的组合物和方法中。
术语“抗体(antibody)”及其复数形式的“抗体(antibodies)”指完整的免疫球蛋白及其任何抗原结合片段(“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”还指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)，并且可以散布有更为保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原表位相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
术语“抗原”指诱导免疫应答的物质。在一些实施方式中，抗原是如果由主要组织相容性复合物(MHC，major histocompatibility complex)分子呈递则能够与抗体或TCR结合的分子。如本文所用，术语“抗原”还包括T细胞表位。抗原还能够被免疫系统识别。在一些实施方式中，抗原能够诱导导致B淋巴细胞和/或T淋巴细胞活化的体液免疫应答或细胞免疫应答。在某些情况下，这可能需要抗原包含或连接Th细胞表位。抗原也可以具有一个或多个表位(例如，B-和T-表位)。在一些实施方式中，抗原优选与其相应的抗体或TCR反应(通常以高度特异性和选择性的方式)，而不与可以由其他抗原诱导的多种其他抗体或TCR反应。
术语“单克隆抗体”、“mAb”、“单克隆抗体组合物”或其复数形式指制备的单分子组合物的抗体分子。单克隆抗体组合物显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。可以使用本领域知识和技术来制备对某些受体具有特异性的单克隆抗体：用合适的抗原注射测试受试者，然后分离表达(具有所需序列或功能特征的)抗体的杂交瘤。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规方法分离和测序(例如，通过使用寡核苷酸探针，该探针能够与编码单克隆抗体重链和轻链的基因特异性结合)。杂交瘤细胞作为此种DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将表达载体转染到宿主细胞(如不产生免疫球蛋白的大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中获得合成的单克隆抗体。下文将更详细地描述抗体的重组产生。
如本文所用，抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简称“抗体部分”或“片段”)术语指保留与抗原特异性结合能力的抗体的一个以上片段。已显示，全长抗体的片段可以执行抗体的抗原结合功能。抗体的“抗原结合部分”术语内包含的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，该片段是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，该片段是包含两个Fab片段的二价片段，这两个Fab片段在铰链区通过二硫键连接；(iii)Fd片段，该片段由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，该片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(v)结构域抗体(dAb)片段(Ward等，Nature，1989，341，544-546)，该片段可以由VH或VL结构域组成；(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL和VH)由不同的基因编码，但它们可以通过重组方法通过合成接头连接，该合成接头使得它们能够作为蛋白质单链被制备；其中，VL和VH区配对形成单价分子，该单价分子称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等，Science，1988，242，423-426；以及Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，1988，85，5879-5883。也旨在将此类scFv抗体包含在术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整抗体相同的方式筛选这些片段的效用。
如本文所用，术语“人抗体(human antibody)”旨在包含具有可变区的抗体，可变区中的框架区和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也来自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括这样的抗体：该抗体中来源于另一个哺乳动物物种(如小鼠)种系的CDR序列被移植到了人类框架序列上。
术语“人单克隆抗体”指表现出单一结合特异性的具有可变区的抗体，可变区中的框架区和CDR区均来自人种系免疫球蛋白序列。在一个实施方式中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包含从转基因非人动物(例如，转基因小鼠)获得的与无限增殖化细胞融合的B细胞，该B细胞的基因组包含人重链转基因和人轻链转基因。
如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如：(a)从动物(如小鼠)分离的抗体，该动物是人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物或由其制备的杂交瘤(下文进一步描述)；(b)从宿主细胞(如转染瘤)分离的抗体，该宿主细胞被转化以表达人抗体；(c)从重组、组合人源抗体文库(combinatorialhuman antibody library)分离的抗体；以及(d)通过任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体，该其他手段涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列。此类重组人抗体具有可变区，可变区中的框架区和CDR区来自人种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方式中，可以对此种重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用针对人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此，重组抗体VH和VL区的氨基酸序列(尽管来源于并且与人种系VH和VL序列有关)可能并非天然存在于体内的人抗体种系库(human antibody germlinerepertoire)中。
如本文所用，“同种型(isotype)”指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。
术语“人抗体衍生物”指人抗体的任何修饰形式，包括抗体与另一种活性药物成分或抗体的缀合物。术语“缀合物”、“抗体-药物缀合物”、“ADC”或“免疫缀合物”指与另一治疗性部分缀合的抗体或它的片段，可以使用本领域可获得的方法将该治疗性部分与本文所述抗体缀合。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”、“人源化抗体(humanizedantibodies)”和“人源化”意指这样的抗体：该抗体中来源于另一种哺乳动物物种(如小鼠)种系的CDR序列被移植到了人类框架序列上。可以在人类框架序列内进行另外的框架区修饰。人源化形式的非人(例如，鼠)抗体是嵌合抗体，它含有来自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，该抗体中来自受体高变区的残基被来自非人物种(例如，小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)(供体抗体)的具有所需特异性、亲和力和能力的15个高变区的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个(通常是两个)可变结构域，在该可变结构域中，所有或基本上所有高变环(hypervariable loop)对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有FR区域是人免疫球蛋白序列的那些。可选地，人源化抗体还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。进一步细节参见Jones等，Nature，1986，321，522-525；Riechmann等，Nature，1988，332，323-329；以及Presta等，Curr.Op.Struct.Biol.，1992，2，593-596。还可以对本文所述抗体进行修饰，以使用已知在效应子功能和/或FcR结合方面具有改善(例如，减少)的任何Fc变体。例如，Fc变体可以包括：国际专利申请公开号WO1988/07089A1、WO1996/14339Al、WO1998/05787A1、WO1998/23289A1、WO1999/51642A1、WO99/58572A1、WO2000/09560A2、WO2000/32767A1、WO2000/42072A2、WO2002/44215A2、WO2002/060919A2、WO2003/074569A2、WO2004/016750A2、WO2004/029207A2、WO2004/035752A2、WO2004/063351A2、WO2004/074455A2、WO2004/099249A2、WO2005/040217A2、WO2005/070963A1、WO2005/077981A2、WO2005/092925A2、WO2005/123780A2、WO2006/019447A1、WO2006/047350A2和WO2006/085967A2公开的任何一个氨基酸取代；以及美国专利号5,648,260、5,739,277、5,834,250、5,869,046、6,096,871、6,121,022、6,194,551、6,242,195、6,277,375、6,528,624、6,538,124、6,737,056、6,821,505、6,998,253和7,083,784公开的任何一个氨基酸取代；其公开内容通过引用并入本文。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”意指这样的抗体：该抗体中可变区序列来源于一个物种而恒定区序列来源于另一个物种，例如可变区序列来源于小鼠抗体而恒定区序列来源于人抗体的抗体。
“双抗体(diabody)”是具有两个抗原结合位点的小抗体片段。该片段包含与同一多肽链中的轻链可变结构域(VL)相连的重链可变结构域(VH)(VH-VL或VL-VH)。通过使用接头(该接头太短而不允许同一链上的两个结构域配对)，使结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。例如，欧洲专利号EP404,097、国际专利公开号WO93/11161和Bolliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，1993，90，6444-6448中更全面地描述了双抗体。
术语“糖基化”指修饰的抗体衍生物。非糖基化(aglycoslated)的抗体没有糖基化。例如，可以改变糖基化以增加抗体对抗原的亲和力。例如，可以通过改变抗体序列内的一个以上糖基化位点来实现此种碳水化合物修饰。例如，可以进行一个以上氨基酸取代，它导致一个以上可变区框架糖基化位点的消除，从而消除该位点的糖基化。如美国专利号5,714,350和6,350,861中所述，糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。另外地或可选地，可以制备糖基化类型改变的抗体，例如，岩藻糖残基量减少的低岩藻糖基化(hypofucosylated)抗体，或平分型(bisecting)GlcNac结构增加的抗体。已证明，此种改变的糖基化模式增加了抗体的能力。例如，可以通过在宿主细胞(具有改变的糖基化机制)中表达该抗体来实现此种碳水化合物修饰。本领域已描述过具有改变的糖基化机制的细胞，此种细胞可用作宿主细胞，该宿主细胞表达本发明的重组抗体，从而产生糖基化改变的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1,6)岩藻糖基转移酶)，使得Ms704，Ms705和Ms709细胞系表达的抗体的碳水化合物上缺乏岩藻糖。通过使用两个置换型载体(replacement vector)靶向地破碎CHO/DG44细胞的FUT8基因，从而产生Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系(参见例如，美国专利公开号2004/0110704或Yamane-Ohnuki等，Biotechnol.Bioeng.，2004，87，614-622)。作为另一个例子，欧洲专利号EP1,176,195描述了具有被功能性破碎的FUT8基因的细胞系，该FUT8基因编码岩藻糖基转移酶，使得此种细胞系表达的抗体表现出低岩藻糖基化(通过减少或消除α1,6键相关的酶)；该专利还描述了对于将岩藻糖添加至与抗体Fc区结合的N-乙酰葡糖胺具有低酶活性或不具有酶活性的细胞系，例如，大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。国际专利公开号WO03/035835描述了变体CHO细胞系Lec13细胞，它将岩藻糖附加到Asn(297)连接的碳水化合物上的能力降低，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化(也参见Shields等，J.Biol.Chem.,2002，277，26733-26740)。国际专利公开号WO99/54342描述了经工程化以表达糖蛋白修饰糖基转移酶(例如，β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在工程细胞系中表达的抗体表现出增加的平分型GlcNac结构，导致抗体的ADCC活性增加(参见Umana等，Nat.Biotech.，1999，17，176-180)。或者，可以使用岩藻糖苷酶切割抗体的岩藻糖残基。例如，如Tarentino等，BioChem.,1975，14，5516-5523所描述的，岩藻糖苷酶(α-L-岩藻糖苷酶)除去抗体的岩藻糖残基。
“聚乙二醇化”指，在一个以上PEG基团与抗体或抗体片段连接的条件下，修饰的抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(如PEG的活性酯或醛衍生物)典型地发生反应。聚乙二醇化可以例如增加抗体的生物学(例如血清)半衰期。优选地，通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行聚乙二醇化。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已被用于衍生其他蛋白质的任何形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-聚乙二醇或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。待聚乙二醇化的抗体可以是非糖基化抗体。聚乙二醇化的方法是本领域已知的并且可以应用于本发明所述的抗体，如欧洲专利号EP0154316和EP 0401384以及美国专利号5,824,778中所述，其公开内容通过引用并入本文。
术语“融合蛋白”或“融合多肽”指结合两种以上单个蛋白质的性质的蛋白质。此类蛋白质具有至少两个直接或通过氨基酸接头(linker)共价连接的异源多肽。形成融合蛋白的多肽通常是C-末端被连接至N-末端，尽管它们也可以是C-末端被连接至C-末端、N-末端被连接至N-末端或N-末端被连接至C-末端。融合蛋白的多肽可以是任何顺序，并且可以包括一种以上的组成多肽(constituent polypeptide)或两种组成多肽均包括在内。该术语包括构成融合蛋白的保守修饰的变体、多态变体、等位基因、突变体、子序列、种间同系物和抗原的免疫原性片段。本公开的融合蛋白还可以包含组分抗原或它的免疫原性片段的另外拷贝。融合蛋白可以含有连接在一起并进一步连接至Fc结构域(例如IgG Fc结构域)的一个以上结合结构域。融合蛋白可以进一步连接在一起以模拟单克隆抗体并提供六个以上的结合结构域。可以通过本领域已知的重组方法产生融合蛋白。融合蛋白的制备是本领域已知的，并且描述于例如国际专利申请公开号WO1995/027735A1、WO2005/103077A1、WO2008/025516A1、WO2009/007120A1、WO2010/003766A1、WO2010/010051A1、WO2010/078966A1、美国专利申请公开号US2015/0125419A1和US2016/0272695A1以及美国专利号8,921,519，其各自的公开内容均通过引用并入本文。
当涉及核酸或蛋白质部分使用时，术语“异源”表示核酸或蛋白质包含两个以上在自然界中彼此不存在相同关系的子序列。例如核酸通常是重组产生的，具有来自无关基因的两个以上序列，该序列被排列以产生新的功能性核酸，例如来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区，或来自不同来源的编码区。类似地，异源蛋白质表示该蛋白质包含两个以上在自然界中彼此不存在相同关系的子序列(例如融合蛋白)。
术语“保守性氨基酸取代”指不破坏抗体或融合蛋白对抗原的结合的氨基酸序列修饰。保守性氨基酸取代包括用同一类的氨基酸取代这一类中的氨基酸；其中，类由常见的物理化学氨基酸侧链性质和在自然界中发现的同源蛋白质中(如通过例如标准的Dayhoff频率交换矩阵或BLOSUM矩阵所测定的)的高取代频率定义。氨基酸侧链分为六大类，包括：I类(Cys)；II类(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)；III类(Asn、Asp、Gln、Glu)；IV类(His、Arg、Lys)；V类(Ile、Leu、Val、Met)；和VI类(Phe、Tyr、Trp)。例如，将Asp替换为另一种III类残基(例如Asn、Gln或Glu)是保守性取代。因此，抗体中预期的非必需氨基酸残基优选被来自相同类的另一种氨基酸残基替换。识别不破坏抗原结合的氨基酸保守性取代的方法是本领域熟知的(参见例如Brummell等，Biochemistry 1993，32，1180-1187；Kobayashi等，ProteinEng.1999，12，879-884；以及Burks等，Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，1997，94，412-417)。
在两个以上核酸或多肽的情况下，术语“序列同一性”、“百分比同一性”和“序列百分比同一性”(或其同义词，例如“99％相同”)指，当进行最大对应性的比较和比对(如果需要的话，引入空位)时，两个以上序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，不考虑任何保守氨基酸取代作为序列同一性的一部分。可以使用序列比较软件或算法或通过目视检查，来测量同一性百分比。本领域已知各种算法和软件可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对。确定序列同一性百分比的合适程序包括，例如可从美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站获得的BLAST程序套件。可以使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。ALIGN、ALIGN-2(Genentech，南旧金山，加利福尼亚州)或可从DNASTAR获得的MegAlign是可用于比对序列的其他公共可用软件程序。本领域技术人员可以通过特定的比对软件确定用于最大比对的适当参数。在某些实施方式中，使用比对软件的默认参数。
如本文所用，术语“变体”包括但不限于如下的抗体或融合蛋白：其通过在参考抗体的氨基酸序列内或附近的某些位置处的一个以上取代、缺失和/或添加而包含与参考抗体的氨基酸序列不同的氨基酸序列。与参考抗体的氨基酸序列相比，变体在其氨基酸序列中可包含一个以上保守取代。保守取代可涉及例如取代相似带电荷或不带电荷的氨基酸。变体保留了特异性结合参考抗体的抗原的能力。术语“变体”还包括聚乙二醇化的抗体或蛋白质。
核酸序列隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体地，可以通过产生此类序列(该序列中一个以上选定(或所有)密码子的第三位点被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代)，来实现简并密码子取代。Batzer等，Nucleic Acid Res.，1991，19，5081；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.,1985，260，2605-2608；Rossolini等，Mol.Cell.Probes，1994，8，91-98。术语核酸可与cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。
术语“生物仿制药”指生物制品，包括单克隆抗体或蛋白，尽管临床上非活性成分存在微小差异，它与美国许可的参考生物产品高度相似，并且就产品的安全性、纯度和效力而言，该生物制品和参考产品之间在临床上没有有意义的差异。此外，生物类似或“生物仿制”药是一种生物制药，其与已经被欧洲药品管理局授权使用的另一种生物制药类似。“生物仿制药”一词也被其他国家和地区监管机构同义使用。生物制品或生物制药是由生物源(例如细菌或酵母)制造或衍生的药物。它们可以由相对小的分子组成，例如人胰岛素或促红细胞生成素，或复杂分子例如单克隆抗体。例如，如果参考IL-2蛋白是阿地白介素(PROLEUKIN)，则由药物监管机构批准的关于阿地白介素的蛋白“生物相似于”阿地白介素或是阿地白介素的“生物仿制药”。在欧洲，生物类似或“生物仿制”药是一种生物制药，它类似于已经被欧洲药品管理局(EMA)授权使用的另一种生物制药。经修订，欧洲用于类似生物应用的相关法律依据是法规(EC)第726/2004号第6条和指令第2001/83/EC号第10(4)条，因此在欧洲，根据法规(EC)第726/2004号第6条和指令第2001/83/EC号第10(4)条的规定，生物仿制药可以被授权或允许进行授权或作为用于授权的申请主题。已经授权的原始生物医药产品在欧洲可称为“参考药物产品”。CHMP生物仿制药产品指南中概述了将产品视为生物仿制药的一些要求。此外，产品具体指南(包括与单克隆抗体生物仿制药有关的指南)由EMA以产品为基础提供，并在其网站上公布。在质量特征、生物活性、作用机制、安全性和/或功效方面，本文所述的生物仿制药可以与参考药物产品类似。另外，生物仿制药可以用于或旨在用于治疗与参考药物产品相同的病症。因此，可以认为如本文所述的生物仿制药具有与参考药物产品类似或高度相似的质量特征。或者，或另外，可以认为如本文所述的生物仿制药具有与参考药物产品类似或高度相似的生物活性。或者，或另外，可以认为如本文所述的生物仿制药具有与参考药物产品类似或高度相似的安全性。或者，或另外，可以认为如本文所述的生物仿制药具有与参考药物产品类似或高度相似的功效。如本文所述，将欧洲的生物仿制药与已经由EMA授权的参考药物产品进行比较。然而，在某些情况下，在某些研究中可以将生物仿制药与已经在欧洲经济区之外授权的生物医药产品(非欧洲经济区授权的“比较物”)进行比较。这些研究包括例如某些临床和体内非临床研究。如本文所用，术语“生物仿制药”还涉及已经或可以与非EEA授权的比较物比较的生物医药产品。某些生物仿制药是蛋白质，例如抗体、抗体片段(例如，抗原结合部分)和融合蛋白。蛋白质生物仿制药可具有在氨基酸结构中具有不显著影响多肽功能的微小修饰(包括例如氨基酸的缺失、添加和/或取代)的氨基酸序列。生物仿制药可包含与其参考药物产品的氨基酸序列具有97％以上序列同一性的氨基酸序列，例如97％、98％、99％或100％。生物仿制药可包含一种以上与参考药物产品的翻译后修饰不同的翻译后修饰，例如但不限于，糖基化、氧化、脱酰胺和/或截短，条件是该不同不会导致药品的安全性和/或功效发生变化。生物仿制药可具有与参考药物产品相同或不同的糖基化模式。特别地，尽管不是唯一的，如果差异涉及或旨在解决与参考药物产品相关的安全问题，则生物仿制药可具有不同的糖基化模式。另外，生物仿制药可以在例如其强度、药物形式、制剂、赋形剂和/或呈递方面偏离参考药物产品，条件是不损害药品的安全性和功效。与参考药物产品相比，生物仿制药可包括例如药代动力学(PK)和/或药效学(PD)概况的差异，但仍被认为与参考药物产品足够相似，以获得授权或认为适合授权。在某些情况下，与参考药物产品相比，生物仿制药表现出不同的结合特性；其中，管理机构如EMA认为不同的结合特性不是生物类似产品授权的障碍。术语“生物仿制药”也被其他国家和地区监管机构同义使用。
术语“血液恶性肿瘤”指造血和淋巴组织(包括但不限于血液、骨髓、淋巴结和淋巴系统的组织)的哺乳动物癌症和肿瘤。血液恶性肿瘤可能导致“液体肿瘤”的形成。血液恶性肿瘤包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞淋巴瘤(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、急性髓性白血病(AML)、慢性粒细胞白血病(CML)、急性单核细胞白血病(AMoL)、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。术语“B细胞血液恶性肿瘤”指影响B细胞的血液恶性肿瘤。
术语“液体肿瘤”指本质上为流体的异常细胞团。液体肿瘤癌症包括但不限于白血病、骨髓瘤和淋巴瘤，以及其他血液恶性肿瘤。从液体肿瘤(包括驻留在骨髓中的液体肿瘤)获得的TIL在本文中也可称为骨髓浸润淋巴细胞(MIL)。从液体肿瘤(包括在外周血中循环的液体肿瘤)获得的TIL在本文中也可以称为PBL。术语MIL、TIL和PBL在本文中可互换使用，它们仅基于细胞所来源的组织类型而不同。
术语“活检”指用于获得癌细胞的任何医学程序，包括骨髓活检。
术语“急性髓性白血病”或“AML”指骨髓血细胞系的癌症，其在本领域中也称为急性骨髓性白血病和急性非淋巴细胞白血病。尽管AML是液体肿瘤，AML的某些表现(包括髓外表现，例如绿色癌(chloroma))呈现实体瘤的特性，但AML在本文中被归类为液体肿瘤。
如本文所用，术语“微环境”可以指整个实体或血液肿瘤微环境，或指微环境内的单个细胞亚群。如本文所用，肿瘤微环境指“促进肿瘤转化、支持肿瘤生长和侵袭、保护肿瘤免受宿主免疫、促进治疗抗性并为显性转移灶的繁殖提供壁龛(niche)的细胞、可溶性因子、信号分子、细胞外基质和机械信号(mechanical cue)”的复杂混合物，如Swartz等，Cancer Res.，2012，72，2473中所述。尽管肿瘤表达应被T细胞识别的抗原，但由于微环境的免疫抑制，免疫系统很少清除肿瘤。
术语“有效量”或“治疗有效量”指如本文所述的化合物或化合物组合的量足够实现预期应用，包括但不限于疾病治疗。治疗有效量可根据预期应用(体外或体内)或所治疗的受试者和疾病状况(例如受试者的体重、年龄和性别)、疾病状况的严重程度或施用方式而变化。该术语还适用于将在靶细胞中诱导特定应答(例如血小板粘附和/或细胞迁移的减少)的剂量。具体剂量将取决于所选择的具体化合物、要遵循的施用方案、化合物是否与其他化合物联合施用、施用时间、施用组织以及携带化合物的物理递送系统。
本文使用的术语“治疗效果”包括治疗性益处和/或预防性益处。预防性效果包括：延迟或消除疾病或病症的出现，延迟或消除疾病或病症的症状发作，减缓、停止或逆转疾病或病症的进展，或它们的任何组合。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”等指获得期望的药理学和/或生理学作用。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该作用可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的不良反应而言，该作用可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”包括哺乳动物，特别是人类中疾病的任何治疗，包括：(a)在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中防止疾病发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展或进展；以及(c)缓解疾病，即引起疾病消退和/或缓解一种以上疾病症状。“治疗”还意味着包括递送药剂以提供药理学作用，即使在没有疾病或病症的情况下也是如此。例如，“治疗”包括递送可在没有疾病的情况下引发免疫应答或赋予免疫力的组合物，例如在疫苗的情况下。
术语“QD”、“qd”或“q.d.”表示每日一次(quaque die)、一日一次(once a day)或每天一次(once daily)。术语“BID”、“bid”或“b.i.d.”表示每日两次(bis in die)、一日两次(twice a day)或每天两次(twice daily)。术语“TID”、“tid”或“t.i.d.”表示每日三次(ter in die)、一日三次(three times a day)或每天三次(three times daily)。术语“QID”、“qid”或“q.i.d.”表示每日四次(quater in die)、一日四次(four times a day)或每天四次(four times daily)。
本文的“肿瘤浸润淋巴细胞”或“TIL”指最初作为白细胞获得的细胞群，它们已经离开受试者的血流并迁移至肿瘤。TIL包括但不限于CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4+ T细胞、天然杀伤细胞、树突状细胞和M1巨噬细胞。TIL包括原代TIL和次代TIL。“原代TIL”是如本文所述从患者组织样品中获得的那些(有时称为“新鲜收获的”)，“次代TIL”是如本文所讨论的已经扩增或增殖的任何TIL细胞群，包括但不限于如本文所讨论的大量TIL(bulk TIL)和扩增的TIL(“REP TIL”)以及”reREP TIL”。
TIL通常可以利用细胞表面标志物在生物化学上定义，或通过其浸润肿瘤和影响治疗的能力在功能上来定义。TIL通常可以通过表达以下生物标志物中的一种以上来分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。另外或可选地，TIL可以通过在重新引入患者后其浸润实体瘤的能力而在功能上定义。TIL还可以通过效价强度(potency)来表征——例如，如果例如干扰素(IFN)的释放大于约50pg/mL、大于约100pg/mL、大于约150pg/mL或大于约200pg/mL，则TIL可被认为是有效力的。
本文的“冷冻保存的TIL”(或冷冻保存的MIL或PBL)指在约-150℃至-60℃范围内处理和储存的原代、大量或扩增的TIL(REP TIL)。用于冷冻保存的一般方法也在本文其他地方(包括实施例)描述。为清楚起见，“冷冻保存的TIL”能够与可用作原代TIL来源的冷冻组织样品区分开。
本文的“解冻的冷冻保存的TIL”(或解冻的MIL或PBL)指先前被冷冻保存然后被处理以恢复至室温或更高温度(包括但不限于细胞培养温度或TIL可被施用于患者的温度)的TIL群。
本文的“细胞群”(包括TIL群)指具有共同特征的若干细胞。通常，群的数量大体为1×106至1×1010，不同的TIL群包含不同的数量。例如，原代TIL在IL-2存在下的初始增长产生约1×108个细胞的大量TIL群。通常，进行REP扩增以提供用于输注的1.5×109至1.5×1010个细胞的群。
通常，TIL最初从患者肿瘤样品(“原代TIL”)中获得，然后被扩增成更大的群以用于本文所述的进一步操作，可选地被冷冻保存，如本文中所概述地再刺激，并且可选地进行表型和代谢参数的评估作为TIL健康的指标。
通常，将收获的细胞悬浮液称为“原代细胞群”或“新鲜收获的”细胞群。
通常，如本文所述，通过从如本文所述的患者切除的肿瘤中获得TIL的原代群(“原代细胞群”或“第一细胞群”)来初步制备TIL。在这之后利用IL-2培养细胞进行初始大量扩增，形成第二细胞群(本文有时称为“大量TIL群”或“第二群”)。
术语“细胞毒性淋巴细胞”包括：细胞毒性T(CTL)细胞(包括CD8+细胞毒性T淋巴细胞和CD4+辅助性T淋巴细胞)、自然杀伤T(NKT)细胞和自然杀伤(NK)细胞。例如，细胞毒性淋巴细胞可包括：由肿瘤相关抗原激活和/或由肿瘤特异性嵌合抗原受体或T细胞受体转导的外周血来源的αβTCR阳性或γδTCR阳性T细胞，以及肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
术语“中枢记忆T细胞”指CD45RO+并且组成性地表达CCR7(CCR7高)和CD62L(CD62高)的人类T细胞亚群。中枢记忆T细胞的表面表型还包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中枢记忆T细胞的转录因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2和BMII。在TCR触发后，中枢记忆T细胞主要分泌IL-2和CD40L作为效应分子。中枢记忆T细胞主要存在于血液的CD4区室(compartment)，并且在人体中按比例富集在淋巴结和扁桃体。
术语“效应记忆T细胞”指人类或哺乳动物T细胞的亚群，其与中枢记忆T细胞一样，为CD45R0+，但丧失CCR7的组成型表达(CCR7低)，并且CD62L的表达异质性或低(CD62L低)。中枢记忆T细胞的表面表型还包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中枢记忆T细胞的转录因子包括BLIMP1。效应记忆T细胞在抗原刺激后迅速分泌高水平的炎性细胞因子，包括干扰素-γ、IL-4和IL-5。效应记忆T细胞主要存在于血液的CD8区室，并且在人体中按比例富集在肺、肝和肠。CD8+效应记忆T细胞携带大量的穿孔素。术语“封闭系统”指的是对外部环境封闭的系统。适用于细胞培养方法的任何封闭系统均可用于本发明的方法。封闭系统包括例如但不限于封闭的G容器。一旦肿瘤碎片被加入到封闭系统中，系统就不会向外部环境开放，直至TIL准备好施用于患者。
在一些实施方式中，本公开的方法还包括“pre-REP”阶段，其中肿瘤组织或来自肿瘤组织的细胞在标准实验室培养基(包括但不限于RPMI)中生长，并用试剂(例如经辐照的饲养细胞和抗CD3抗体)处理以达到期望效果，例如TIL数量的增加和/或包含期望细胞表面标志物或其他结构、生化或功能特征的细胞群的富集。pre-REP阶段可以使用实验室级试剂(假设实验室级试剂在后续REP阶段被稀释)，使得更易采用替代策略来提高TIL的产生。因此，在一些实施方式中，在pre-REP阶段期间，公开的TLR激动剂和/或肽或拟肽可以包含在培养基中。在一些实施方式中，pre-REP培养物可以包含IL-2。在优选的方面，本发明涉及用一种以上另外的再刺激方案(本文也称为“再刺激快速扩增方案”或”“reREP”)扩增TIL的新方法，其出乎意料地得到了扩增的记忆T细胞亚群(包括记忆效应T细胞亚群)和/或使再刺激的TIL(本文有时称为“reTIL”)的糖酵解呼吸标志物与新鲜收获的TIL或解冻的冷冻保存的TIL相比得到增强。换言之，通过对冷冻保存的TIL使用reREP程序，患者可以接受高代谢活性、健康的TIL，从而获得更良好的结果。
当提及“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医生确定，考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度以及患者(受试者)状况的个体差异。通常而言，包含本文所述的经基因修饰的细胞毒性淋巴细胞的药物组合物可以以104至1011个细胞/kg体重(例如105至106、105至1010、105至1011、106至1010、106至1011、107至1011、107至1010、108至1011、108至1010、109至1011或109至1010个细胞/kg体重)的剂量施用，包括这些范围内的所有整数值。经基因修饰的细胞毒性淋巴细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。经基因修饰的细胞毒性淋巴细胞可以通过使用免疫治疗中熟知的输注技术来施用(参见例如Rosenberg等，New Eng.J.Med.319：1676，1988)。通过监测患者的疾病迹象并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
为避免疑义，本文旨在将结合本发明的特定方面、实施方式或实施例描述的特定特征(例如整数、特征、值、用途、疾病、配方、化合物或组)理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施方式或实施例，除非与其不相容。因此，这些特征可以在适当时与本文所定义的任何定义、权利要求或实施方式结合使用。本说明书中公开的所有特征(包括任何所附权利要求、摘要和附图)和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤可以以任何组合进行组合，除了其中至少一些特征和/或步骤互斥的组合。本发明不限于任何公开的实施方式的任何细节。本发明延伸到本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中所公开的任何新特征或特征的新组合，或延伸到如此公开的任何方法或过程的任何新步骤或任何步骤的新组合。
术语“约”和“大约”表示在统计上有意义的数值范围内。这样的范围可以在给定值或范围的一个数量级内，优选在50％内，更优选在20％内，更优选在10％内，甚至更优选在5％内。术语“约”或“大约”所包含的可允许变化取决于所研究的特定系统，并且本领域普通技术人员可以容易地理解。此外，如本文所用，术语“约”和“大约”表示大小、尺寸、配方、参数、形状和其他性质和特性不是、也不必是精确的，但可以视需要是近似的和/或更大的或更小的，反映公差、转换因子、四舍五入、测量误差等，以及本领域技术人员已知的其他因素。通常，大小、尺寸、配方、参数、形状或其他性质或特性是“约”或“近似”的，无论是否明确说明如此。应注意，具有非常不同的尺寸、形状和大小的实施方式可采用所述安排。
当在所附权利要求中以原始和修改的形式使用时，转变术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”定义了关于被排除在权利要求的范围之外的未列举的另外的权利要求要素或步骤(如果有的话)的权利要求范围。术语“包含”旨在是包含性的或开放式的，并且不排除任何另外的、未列举的要素、方法、步骤或材料。术语“由……组成”不包括除权利要求中所述那些之外的任何元素、步骤或材料，并且在材料的情况下，术语“由……组成”不包括与指定材料相关的普通杂质。术语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制为指定的元素、步骤或材料以及不会实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的那些。在替代实施方式中，本文所述的体现本发明的所有组合物、方法和试剂盒可以更具体地由任意转变术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”定义。
扩增包括外周血(PBL)和/或骨髓(MIL)的治疗性T细胞的方法的实施方式
扩增来自外周血的外周血淋巴细胞(PBL)的方法
PBL方法1。在本发明的一个实施方式中，使用本文所述的方法扩增PBL。在本发明的一个实施方式中，该方法包括从全血中获得PBMC样品。在一个实施方式中，该方法包括通过使用非CD19+部分的负筛选(negative selection)从PBMC中分离纯T细胞来富集T细胞。在第0天，用1：1比率(磁珠：细胞)的抗CD3/抗CD28抗体
Figure BDA0002348881650000311
和3000IU/mL IL-2培养纯T细胞。在第4天，将另外的3000IU/mL IL-2添加到培养物中。在第7天，用1：1比率(磁珠：细胞)的抗CD3/抗CD28抗体
Figure BDA0002348881650000321
再次刺激培养物，向培养物中添加另外的3000IU/mL IL-2。在第14天，收获PBL，除去磁珠，对PBL进行计数和表型分析。在一个实施方式中，该方法包括通过使用基于磁珠的非CD19+部分的负筛选从PBMC中分离纯T细胞来富集T细胞。
在本发明的一个实施方式中，PBL方法1如下进行：在第0天，对冷冻保存的PBMC样品进行解冻，对PBMC进行计数。使用Human Pan T细胞分离试剂盒和LS柱(MiltenyiBiotec)分离T细胞。对分离的T细胞进行计数，并按照5×105个细胞/孔(GRex 24孔板)接种T细胞，T细胞以1：1的比率与
Figure BDA0002348881650000322
(抗CD3/抗CD28)和3000IU/mL IL-2共培养，每个孔总共8mL的CM2培养基。在第4天，各个孔中的培养基由CM2更换为含有3000IU/mL IL-2的新鲜AIM-V。在第7天，扩增的细胞被收获、计数，然后以15×106个细胞/烧瓶的密度，在装有3000IU/mL IL-2和1：1比率(磁珠：细胞)的
Figure BDA0002348881650000323
的GRex 10M烧瓶中进行培养，总共100ml的AIM-V培养基。在第11天，将培养基更换为补充有3000IU/mL IL-2的新鲜CM-4培养基。在第14天，使用DynaMag Magnet(DynaMagTM-15)移除
Figure BDA0002348881650000324
并对细胞进行计数。
在本发明的一个实施方式中，PBL方法1如下进行：在第0天，对冷冻保存的PBMC样品进行解冻，对PBMC进行计数。使用Human Pan T细胞分离试剂盒和LS柱(MiltenyiBiotec)分离T细胞。对分离的T细胞进行计数，并按照5×105个细胞/孔(GRex 24孔板)接种T细胞，T细胞以1：1的比率与
Figure BDA0002348881650000325
(抗CD3/抗CD28)和3000IU/mL IL-2共培养，每个孔总共8mL CM2培养基。在第4天，各个孔中的培养基由CM2更换为含有3000IU/mL IL-2的新鲜AIM-V。在第7天，PBL被收获、计数，然后以1×106个细胞/孔的密度接种在装有3000IU/mLIL-2和1：1比率(磁珠：细胞)的
Figure BDA0002348881650000326
的新GRex-24孔板中，总共8mL AIM-V培养基。在第11天，将培养基更换为补充有3000IU/mL IL-2的新鲜CM-4培养基。在第14天，使用DynaMag Magnet(DynaMagTM-15)移除
Figure BDA0002348881650000327
并对细胞进行计数。
PBL方法2。在本发明的一个实施方式中，使用PBL方法2扩增PBL，该方法包括从全血中获得PBMC样品。通过在37℃下孵育PBMC至少三个小时然后分离出非贴壁细胞，从PBMC富集T细胞。与PBL方法1类似地扩增非贴壁细胞，即，在第0天，用1：1比率(磁珠：细胞)的抗CD3/抗CD28抗体
Figure BDA0002348881650000328
和3000IU/mL IL-2培养非贴壁细胞。在第4天，将另外的3000IU/mL IL-2添加到培养物中。在第7天，用1：1比率(磁珠：细胞)的抗CD3/抗CD28抗体
Figure BDA0002348881650000331
再次刺激培养物，向培养物中添加另外的3000IU/mL IL-2。在第14天，收获PBL，除去磁珠，对PBL计数和表型分析。
在本发明的一个实施方式中，PBL方法2如下进行：在第0天，对冷冻保存的PMBC样品进行解冻，以6×106个细胞/孔的密度，将PBMC细胞接种在装有CM-2培养基中的6孔板中，在37℃下孵育3小时。3小时后，非贴壁细胞(即PBL)被取出并计数。用1：1比率(磁珠：细胞)的抗CD3/抗CD28抗体
Figure BDA0002348881650000332
和3000IU/mL IL-2培养PBL，1×106个细胞/孔，GRex24孔板的每个孔中总共7ml CM-2培养基。在第4天，用AIM-V培养基和新鲜的3000IU/mL IL-2更换各个孔中的培养基。在第7天，收获扩增的细胞，计数，然后以15×106个细胞/烧瓶的密度，在装有1：1比率(T细胞：磁珠)的
Figure BDA0002348881650000333
和3000IU/mL IL-2的GRex 10M烧瓶中进行培养，总共100mL AIM-V培养基。在第11天，将培养基更换为CM-4培养基并补充新鲜的IL-2(3000IU/mL)。在第14天，使用DynaMagTM Magnet(DynaMagTM-15)去除DynaBeads，并对细胞进行计数。
在本发明的一个实施方式中，PBL方法2如下进行：在第0天，对冷冻保存的PMBC样品进行解冻，以6×106个细胞/孔的密度将PBMC细胞接种在装有CM-2培养基中的6孔板中，在37℃下孵育3小时。3小时后，取出非贴壁细胞(即PBL)，计数。用1：1比率(磁珠：细胞)的抗CD3/抗CD28
Figure BDA0002348881650000334
和3000IU/mL IL-2培养PBL，1×106个细胞/孔，GRex 24孔板的每个孔中总共7ml CM-2培养基。在第4天，用AIM-V培养基和新鲜的3000IU/mL IL-2更换各个孔中的培养基。在第7天，收获扩增的细胞，计数，然后以1×106个细胞/孔的密度，在装有3000IU/mL IL-2和1：1比率(T细胞：磁珠)的
Figure BDA0002348881650000335
的新GRex-24孔板中进行接种，总共8mL AIM-V培养基。在第11天，将培养基更换为CM-4培养基，培养基补充有新鲜的IL-2(3000IU/mL)。在第14天，使用DynaMagTM Magnet(DynaMagTM-15)去除DynaBeads，并对细胞进行计数。
PBL方法3。在本发明的一个实施方式中，使用PBL方法3扩增PBL，该方法包括从外周血中获得PBMC样品。使用CD19+筛选分离B细胞，使用PBMC样品的非CD19+部分的负筛选来筛选T细胞。在第0天，T细胞和B细胞与1：1比率(磁珠：细胞)的抗CD3/抗CD28抗体
Figure BDA0002348881650000336
和3000IU/mL IL-2共培养。在第4天，将另外的3000IU/mL IL-2添加到培养物中。在第7天，用1：1比率(磁珠：细胞)的抗CD3/抗CD28抗体
Figure BDA0002348881650000337
再次刺激培养物，并向培养物中添加另外的3000IU/mL IL-2。在第14天，收获PBL，除去磁珠，对PBL进行计数和表型分析。
在本发明的一个实施方式中，PBL方法3如下进行：在第0天，对来源于外周血的冷冻保存的PBMC进行解冻并计数。使用CD19 Multisort Kit，Human(Miltenyi Biotec)对CD19+B细胞进行分选。在非CD19+细胞部分中，使用Human Pan T细胞分离试剂盒和LS色谱柱(Miltenyi Biotec)纯化T细胞。在约3000IU/mL IL-2的存在下，在装有约8mL CM2培养基的Grex 24孔板中，以不同比率共培养T细胞(PBL)和B细胞。B细胞：T细胞的比率为0.1：1、1：1和10：1。用1：1比率(磁珠：细胞)的抗CD3/抗CD28抗体
Figure BDA0002348881650000341
刺激T细胞/B细胞共培养物。在第4天，培养基由CM2更换为AIM-V培养基，向培养物中添加另外的3000IU/mL IL-2。在第7天，收获细胞，计数，然后以约1.5×105至约4×105个细胞/孔的密度，在装有AIM-V培养基的新Grex 24孔板上重新接种细胞，用1：1比率(磁珠：细胞)的抗CD3/抗CD28抗体
Figure BDA0002348881650000342
进行刺激，加有另外的3000IU/mL IL-2。在第14天，使用DynaMagTM Magnet(DynaMagTM-15)去除DynaBeads，对细胞进行计数。
在一个实施方式中，从全血样品中分离PBMC。在一个实施方式中，PBMC样品用作扩增PBL的起始材料。在一个实施方式中，在扩增过程之前对样品进行冷冻保存。在另一个实施方式中，新鲜样品用作扩增PBL的起始材料。在本发明的一个实施方式中，使用本领域已知的方法从PBMC中分离T细胞。在一个实施方式中，使用Human Pan T细胞分离试剂盒和LS柱分离T细胞。在本发明的一个实施方式中，使用本领域已知的抗体筛选方法(例如，CD19负筛选)从PBMC中分离T细胞。
在本发明的一个实施方式中，该过程进行约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天。在另一个实施方式中，该过程进行约7天。在另一个实施方式中，该过程进行约14天。
在本发明的一个实施方式中，用抗CD3/抗CD28抗体对PBMC进行培养。在一个实施方式中，任何可用的抗CD3/抗CD28产品可用于本发明。在本发明的一个实施方式中，使用的市售产品是
Figure BDA0002348881650000343
在一个实施方式中，与PBMC以1：1(磁珠：细胞)的比率进行培养。在另一个实施方式中，抗体是以1.5：1、2：1、2.5：1、3：1、3.5：1、4：1、4.5：1或5：1的比率(磁珠：细胞)与PBMC一起培养的在本发明的一个实施方式中，抗体培养步骤和/或用抗体再刺激细胞的步骤进行约2至约6天、约3至约5天，或约4天的时间。在本发明的一个实施方式中，抗体培养步骤进行约2天、3天、4天、5天或6天的时间。
在一个实施方式中，用IL-2培养PBMC样品。在本发明的一个实施方式中，用于从PBMC中扩增PBL的细胞培养基包含IL-2，IL-2的浓度选自：约100IU/mL、约200IU/mL、约300IU/mL、约400IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约500IU/mL、约600IU/mL、约700IU/mL、约800IU/mL、约900IU/mL、约1,000IU/mL、约1,100IU/mL、约1,200IU/mL、约1,300IU/mL、约1,400IU/mL、约1,500IU/mL、约1,600IU/mL、约1,700IU/mL、约1,800IU/mL、约1,900IU/mL、约2,000IU/mL、约2,100IU/mL、约2,200IU/mL、约2,300IU/mL、约2400IU/mL、约2500IU/mL、约2600IU/mL、约2700IU/mL、约2800IU/mL、约2900IU/mL、约3000IU/mL、约3100IU/mL、约3200IU/mL、约3,300IU/mL、约3,400IU/mL、约3,500IU/mL、约3,600IU/mL、约3,700IU/mL、约3,800IU/mL、约3,900IU/mL、约4,000IU/mL约4,100IU/mL、约4,200IU/mL、约4,300IU/mL、约4,400IU/mL、约4,500IU/mL、约4,600IU/mL、约4,700IU/mL、约4,800IU/mL、约4,900IU/mL、约5,000IU/mL、约5,100IU/mL、约5,200IU/mL、约5300IU/mL、约5400IU/mL、约5500IU/mL、约5600IU/mL、约5700IU/mL、约5,800IU/mL、约5,900IU/mL、约6,000IU/mL、约6,500IU/mL、约7,000IU/mL、约7,500IU/mL、约8,000IU/mL、约8,500IU/mL、约9,000IU/mL、约9,500IU/mL以及约10,000IU/mL。
在本发明的一个实施方式中，用于扩增过程的PBMC的起始细胞数量为约25,000至约1,000,000、约30,000至约900,000、约35,000至约850,000、约40,000至约800,000约45,000至约800,000、约50,000至约750,000、约55,000至约700,000、约60,000至约650,000、约65,000至约600,000、约70,000至约550,000，优选约75,000至约500,000约80,000至约450,000、约85,000至约400,000、约90,000至约350,000、约95,000至约300,000、约100,000至约250,000、约105,000至约200,000或约110,000至约150,000。在本发明的一个实施方式中，PBMC的起始细胞数量为约138,000、140,000、145,000或更多。在另一个实施方式中，PBMC的起始细胞数量为约28,000。在另一个实施方式中，PBMC的起始细胞数量为约62,000。在另一个实施方式中，PBMC的起始细胞数量为约338,000。在另一个实施方式中，PBMC的起始细胞数量为约336,000。
在本发明的一个实施方式中，在GRex 24孔板中培养细胞。在本发明的一个实施方式中，使用可比较的孔板。在一个实施方式中，扩增的起始材料是约5×105个T细胞/孔。在本发明的一个实施方式中，有1×106个细胞/孔。在本发明的一个实施方式中，每孔的细胞数量足以接种该孔和扩增T细胞。
在本发明的一个实施方式中，PBL的倍数扩增为约20％至约100％、25％至约95％、30％至约90％、35％至约85％、40％至约80％、45％至约75％、50％至约100％或25％至约75％。在本发明的一个实施方式中，倍数扩增为约25％。在本发明的另一个实施方式中，倍数扩增为约50％。在另一个实施方式中，倍数扩增为约75％。
在本发明的一个实施方式中，可以在整个过程的一天或更多天将另外的IL-2添加到培养物中。在本发明的一个实施方式中，在第4天添加另外的IL-2。在本发明的一个实施方式中，在第7天添加另外的IL-2。在本发明的一个实施方式中，在第11天添加另外的IL-2。在另一个实施方式中，在第4天、第7天和/或第11天添加另外的IL-2。在本发明的一个实施方式中，可以在整个细胞培养过程的一天或更多天更换细胞培养基。在一个实施方式中，在该过程的第4天、第7天和/或第11天更换细胞培养基。在本发明的一个实施方式中，用另外的IL-2培养PBL 1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天的时间。在本发明的一个实施方式中，每次添加IL-2后，培养PBL持续3天的时间。
在一个实施方式中，在该方法期间，至少更换一次细胞培养基。在一个实施方式中，在添加另外的IL-2的同时更换细胞培养基。在另一个实施方式中，在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天或第14天中的至少一天更换细胞培养基。在本发明的一个实施方式中，在整个方法中使用的细胞培养基可以相同或不同。在本发明的一个实施方式中，细胞培养基是CM-2、CM-4或AIM-V。
在本发明的一个实施方式中，可以在整个14天的扩增过程中的一天或更多天，用抗CD3/抗CD28抗体对T细胞进行再刺激。在一个实施方式中，在第7天再刺激T细胞。在一个实施方式中，GRex 10M烧瓶被用于再刺激步骤。在本发明的一个实施方式中，使用可比较的烧瓶。
在本发明的一个实施方式中，如在下文实施例中进一步描述的，使用DynaMagTMMagnet去除
Figure BDA0002348881650000361
对细胞进行计数，使用表型和功能分析法分析细胞。在本发明的一个实施方式中，使用本领域已知的方法分离抗体与PBL或MIL。在任何前述实施方式中，使用了基于磁珠的TIL、PBL或MIL的筛选。
在本发明的一个实施方式中，在期望温度下孵育PBMC样品一段时间以有效地鉴定非贴壁细胞。在本发明的一个实施方式中，孵育时间为约3小时。在本发明的一个实施方式中，温度为约37℃。然后使用上述过程扩增非贴壁细胞。
在本发明的一个实施方式中，从已用依鲁替尼或另一种ITK或激酶抑制剂(如本文其他地方所述的此类ITK和激酶抑制剂)治疗的患者获得PBMC。在本发明的一个实施方式中，ITK抑制剂是共价且不可逆地结合至ITK的共价ITK抑制剂。在本发明的一个实施方式中，ITK抑制剂是与ITK结合的别构ITK抑制剂。在本发明的一个实施方式中，在获得用于任何前述方法(包括PBL方法1、PBL方法2或PBL方法3)的PBMC样品之前，从已用依鲁替尼或其他ITK抑制剂(包括本文其他地方所述的ITK抑制剂)治疗的患者获得PBMC。在本发明的一个实施方式中，ITK抑制剂治疗已被进行了至少1次、至少2次或至少3次或更多次。在本发明的一个实施方式中，与未用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者相比，从用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者中扩增的PBL包含更少的LAG3+、PD-1+细胞。在本发明的一个实施方式中，与未用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者相比，从用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者中扩增的PBL包含增加的IFNγ产生水平。在本发明的一个实施方式中，与未用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者相比，从用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者中扩增的PBL在更低的效应细胞：靶细胞比率下包含增加的溶解活性。在本发明的一个实施方式中，与未治疗的患者相比，用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者具有更高的倍数扩增。
在本发明的一个实施方式中，该方法包括将ITK抑制剂添加到细胞培养物中的步骤。在一个实施方式中，在该过程的第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天或第14天中的一天或多天，添加ITK抑制剂。在一个实施方式中，在更换细胞培养基的天数的方法期间，添加ITK抑制剂。在一个实施方式中，在第0天和当更换细胞培养基时，添加ITK抑制剂。在一个实施方式中，在该方法添加IL-2时的期间，添加ITK抑制剂。在一个实施方式中，在该方法的第0天、第4天、第7天和可选地在第11天，添加ITK抑制剂。在本发明的一个实施方式中，在该方法的第0天和第7天，添加ITK抑制剂。在本发明的一个实施方式中，ITK抑制剂是本领域已知的ITK抑制剂。在本发明的一个实施方式中，ITK抑制剂是本文其他地方所述的ITK抑制剂。
在本发明的一个实施方式中，该方法中使用的ITK抑制剂浓度为约0.1nM至约5μM。在一个实施方式中，该方法中使用的ITK抑制剂浓度为约0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、550nM、600nM、650nM、700nM、750nM、800nM、850nM、900nM、950nM、1μM、2μM、3μM、4μM或5μM。
在本发明的一个实施方式中，当PBMC来自先前未曾接受过ITK抑制剂(如依鲁替尼)治疗的患者，该方法包括添加ITK抑制剂的步骤。
在一些实施方式中，PBMC样品来自受试者或患者，该受试者或患者已可选地用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行了预治疗。在一些实施方式中，肿瘤样品来自受试者或患者，该受试者或患者已用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行了预治疗。在一些实施方式中，PBMC样品来自受试者或患者，该受试者或患者已用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行了预治疗，已经历了至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或1年或更长时间的治疗。在另一个实施方式中，PBMC来自当前正在进行ITK抑制剂(例如依鲁替尼)方案的患者。
在一些实施方式中，PBMC样品来自受试者或患者，该受试者或患者已用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行了预治疗，并且该该受试者或患者对用激酶抑制剂或ITK抑制剂(例如依鲁替尼)的治疗来说是难治性的。
在一些实施方式中，PBMC样品来自受试者或患者，该受试者或患者已用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行了预治疗，但该受试者或患者不再接受激酶抑制剂或ITK抑制剂的治疗。在一些实施方式中，PBMC样品来自受试者或患者，该受试者或患者已用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行了预治疗，但该受试者或患者不再接受激酶抑制剂或ITK抑制剂的治疗，并且未经历至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或至少1年或更长时间的治疗。在另一个实施方式中，PBMC来自先前接触过ITK抑制剂但有至少3个月、至少6个月、至少9个月或至少1年未接受过治疗的患者。
在本发明的一个实施方式中，在第0天，选择CD19+的细胞，相应地进行分选。在本发明的一个实施方式中，使用结合抗体的磁珠进行筛选。在本发明的一个实施方式中，在第0天从PBMC中分离出纯的T细胞。在本发明的一个实施方式中，在第0天，将CD19+B细胞和纯T细胞与抗CD3/抗CD28抗体共培养至少4天。在本发明的一个实施方式中，在第4天，将IL-2添加到培养物中。在本发明的一个实施方式中，在第7天，用抗CD3/抗CD28抗体和另外的IL-2再刺激培养物。在本发明的一个实施方式中，在第14天，收获PBL。
在本发明的一个实施方式中，对于未用依鲁替尼或其他ITK抑制剂进行预治疗的患者，10-15mL的血沉棕黄层(Buffy Coat)将产生约5×109个PBMC，其继而将产生约5.5×107个起始细胞材料和扩增过程结束时的约11×109个PBL。在本发明的一个实施方式中，约54×106个PBMC将产生约6×105个起始材料和约1.2×108个MIL(约205倍的扩增)。
在本发明的一个实施方式中，对于用依鲁替尼或其他ITK抑制剂进行预治疗的患者，扩增过程将产生约20×109个PBL。在本发明的一个实施方式中，40.3×106个PBMC将产生约4.7×105个起始细胞材料和约1.6×108个PBL(约338倍的扩增)。
在本发明的一个实施方式中，本发明中对慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者有用的PBL的临床剂量为约0.1×109至约15×109个PBL、约0.1×109至约15×109个PBL、约0.12×109至约12×109个PBL、约0.15×109至约11×109个PBL、约0.2×109至约10×109个PBL、约0.3×109至约9×109个PBL、约0.4×109至约8×109个PBL、约0.5×109至约7×109个PBL、约0.6×109至约6×109个PBL、约0.7×109至约5×109个PBL、约0.8×109至约4×109个PBL、约0.9×109至约3×109个PBL或约1×109至约2×109个PBL。
在任何前述实施方式中，PBMC可以来自全血样品、单采(apheresis)、血沉棕黄层或来自本领域已知的获得PBMC的任何其他方法。
从源自骨髓的PBMC扩增骨髓浸润淋巴细胞(MIL)的方法
MIL方法1.在本发明的一个实施方式中，描述了一种从源自骨髓的PBMC扩增MIL的方法。在本发明的一个实施方式中，该方法进行14天。在一个实施方式中，该方法包括获取骨髓PBMC和冷冻保存PBMC。在第0天，用1：1比率(磁珠：细胞)的抗CD3/抗CD28抗体
Figure BDA0002348881650000391
和3000IU/mL IL-2培养PBMC。在第4天，将另外的3000IU/mL IL-2添加到培养物中。在第7天，用1：1比率(磁珠：细胞)的抗CD3/抗CD28抗体
Figure BDA0002348881650000392
再次刺激培养物，向培养物中添加另外的3000IU/mL IL-2。在第14天，收获MIL，除去磁珠，可选地对MIL进行计数和表型分析。
在本发明的一个实施方式中，MIL方法1如下进行：在第0天，对来自骨髓的冷冻保存的PBMC样品进行解冻，对PBMC进行计数。在3000IU/mL IL-2存在下，以5×105个细胞/孔将PBMC与1：1比率的抗CD3/抗CD28抗体
Figure BDA0002348881650000393
在每孔装有约8mL CM-2细胞培养基(包括RPMI-1640、人AB血清、1-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、硫酸庆大霉素、AIM-V培养基)的GRex24孔板中进行共培养。在第4天，用补充有另外的3000IU/mL IL-2的AIM-V更换细胞培养基。在第7天，对扩增的MIL进行计数。将1×106个细胞/孔转移到新的GRex 24孔板中，在3000IU/mL IL-2存在下，在约8mL AIM-V培养基/孔中，用1：1比率的抗CD3/抗CD28抗体
Figure BDA0002348881650000394
对细胞进行培养。在第11天，将细胞培养基由AIM-V更换为CM-4(包括AIM-V培养基、2mM Glutamax和3000IU/mL IL2)。在第14天，使用DynaMag Magnet(DynaMagTM15)移除
Figure BDA0002348881650000401
对MIL进行计数。
MIL方法2.在本发明的一个实施方式中，该方法进行7天。在一个实施方式中，该方法包括获得来自骨髓的PMBC，冷冻保存PBMC。在第0天，用3：1的比率(磁珠：细胞)的抗CD3/抗CD28抗体和3000IU/mL IL-2培养PBMC。在第7天，收获MIL，除去磁珠，可选地对MIL进行计数和表型分析。
在本发明的一个实施方式中，MIL方法2如下进行：在第0天，将冷冻保存的PBMC样品解冻，对PBMC计数。在3000IU/mL的IL-2存在下，以5×105个细胞/孔将PBMC与1：1比率的抗CD3/抗CD28抗体
Figure BDA0002348881650000403
在每孔装有约8mL的CM-2细胞培养基(包括RPMI-1640、人AB血清、1-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、硫酸庆大霉素、AIM-V培养基)的GRex 24孔板中进行共培养。在第7天，使用DynaMag Magnet(DynaMagTM15)移除对MIL进行计数。
MIL方法3.在本发明的一个实施方式中，该方法包括从骨髓获得PBMC。在第0天，筛选CD3+/CD33+/CD20+/CD14+的PBMC，并对PBMC进行分选，对非CD3+/CD33+/CD20+/CD14+细胞部分进行超声处理，将超声处理的细胞部分的一部分加回到所筛选出的细胞部分中。将3000IU/mL IL-2添加到细胞培养物中。在第3天，用1：1比率(磁珠：细胞)的抗CD3/抗CD28抗体
Figure BDA0002348881650000405
和3000IU/mL IL-2培养PBMC。在第4天，将另外的3000IU/mL IL-2添加到培养物中。在第7天，用1：1比率(磁珠：细胞)的抗CD3/抗CD28抗体
Figure BDA0002348881650000406
再次刺激培养物，向培养物中添加另外的3000IU/mL IL-2。在第11天，将3000IU/mL IL-2添加到培养物中。在第14天，收获MIL，除去磁珠，可选地对MIL进行计数和表型分析。
在本发明的一个实施方式中，MIL方法3如下进行：在第0天，对冷冻保存的PBMC样品进行解冻，对PBMC进行计数。用CD3、CD33、CD20和CD14抗体对细胞进行染色，使用S3eCell Sorter(Bio-Rad)进行分选。将细胞分为两部分——免疫细胞部分(或MIL部分)(CD3+CD33+CD20+CD14+)和AML原始细胞部分(非CD3+CD33+CD20+CD14+)。将一定数量的来自AML原始细胞部分的细胞(约等于要接种在Grex 24孔板上的免疫细胞部分(或MIL部分)的细胞数量)悬浮在100μL培养基中并超声处理。在本实施例中，从AML原始细胞部分中取出约2.8×104至约3.38×105个细胞，将其悬浮在100μL CM2培养基中，然后超声处理30秒。将100μL超声处理的AML原始细胞部分添加到Grex 24孔板中的免疫细胞部分中。在6000IU/mL IL-2存在下，免疫细胞以约2.8×104至约3.38×105个细胞/孔的量存在于约8mL CM-2细胞培养基/孔中，用该部分的AML原始细胞部分培养免疫细胞约3天。在第3天，将1：1比率的抗CD3/抗CD28抗体
Figure BDA0002348881650000411
加入各个孔中，培养约1天。在第4天，用补充有另外的3000IU/mLIL-2的AIM-V更换细胞培养基。在第7天，对扩增的MIL进行计数。将约1.5×105至4×105个细胞/孔转移到新的GRex 24孔板中，在3000IU/mL IL-2存在下，在约8mL AIM-V培养基/孔中用1：1比率的抗CD3/抗CD28抗体对其进行培养。在第11天，将细胞培养基由AIM-V更换为CM-4(补充有3000IU/mL的IL-2)。在第14天，使用DynaMag Magnet(DynaMagTM15)移除
Figure BDA0002348881650000413
可选地对MIL进行计数。
在本发明的一个实施方式中，从骨髓获得PBMC。在一个实施方式中，通过单采、抽吸(aspiration)、穿刺活检或本领域已知的其他类似方法，从骨髓获得PBMC。在一个实施方式中，PBMC是新鲜的。在另一个实施方式中，PBMC是冷冻保存的。
在本发明的一个实施方式中，该方法进行约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天。在另一个实施方式中，该方法进行约7天。在另一个实施方式中，该方法进行约14天。
在本发明的一个实施方式中，用抗CD3/抗CD28抗体培养PBMC。在一个实施方式中，任何可用的抗CD3/抗CD28产品可用于本发明。在本发明的一个实施方式中，使用的市售产品是
Figure BDA0002348881650000414
在一个实施方式中，
Figure BDA0002348881650000415
与PBMC以1：1(磁珠：细胞)的比率进行培养。在另一个实施方式中，抗体是与PBMC以1.5：1、2：1、2.5：1、3：1、3.5：1、4：1、4.5：1或5：1(磁珠：细胞)的比率培养的
Figure BDA0002348881650000416
在任何前述实施方式中，使用基于磁珠的免疫细胞部分(或MIL部分)(CD3+CD33+CD20+CD14+)或AML原始细胞部分(非CD3+CD33+CD20+CD14+)的筛选。在本发明的一个实施方式中，抗体培养步骤和/或用抗体再刺激细胞的步骤进行约2至约6天、约3至约5天或约4天的时间。在本发明的一个实施方式中，抗体培养步骤进行约2天、3天、4天、5天或6天的时间。
在本发明的一个实施方式中，来自AML原始细胞部分的细胞数量与来自免疫细胞部分(或MIL部分)的细胞数量之比为约0.1：1至约10：1。在另一个实施方式中，该比率为约0.1：1至约5：1、约0.1：1至约2：1或约1：1。在本发明的一个实施方式中，可选地破碎AML原始细胞部分以破坏细胞聚集。在一个实施方式中，使用超声、均质化、细胞裂解、涡旋或振动来破碎AML原始细胞部分。在另一个实施方式中，使用超声破碎AML原始细胞部分。在本发明的一个实施方式中，使用合适的裂解方法裂解非CD3+、非CD33+、非CD20+、非CD14+细胞部分(AML原始细胞部分)，包括高温裂解、化学裂解(例如有机醇)、酶裂解和本领域已知的其他细胞裂解方法。
在本发明的一个实施方式中，以约0.2×105至约2×105个细胞/100μL的浓度悬浮来自AML原始细胞部分的细胞，并将其与免疫细胞部分一起添加至细胞培养物中。在另一个实施方式中，浓度为约0.5×105至约2×105个细胞/100μL、约0.7×105至约2×105个细胞/100μL、约1×105至约2×105个细胞/100μL或约1.5×105至约2×105个细胞/100μL。
在一个实施方式中，用IL-2培养PBMC样品。在本发明的一个实施方式中，用于扩增MIL的细胞培养基包含IL-2，IL-2的浓度选自：约100IU/mL、约200IU/mL、约300IU/mL、约400μL IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约500IU/mL、约600IU/mL、约700IU/mL、约800IU/mL、约900IU/mL、约1,000IU/mL、约1,100IU/mL、约1,200IU/mL、约1,300IU/mL、约1,400IU/mL、约1,500IU/mL、约1,600IU/mL、约1,700IU/mL、约1,800IU/mL、约1,900IU/mL、约2,000IU/mL、约2,100IU/mL、约2,200IU/mL、约2,300IU/mL、约2,400IU/mL、约2500IU/mL、约2600IU/mL、约2700IU/mL、约2800IU/mL、约2900IU/mL、约3000IU/mL、约3100IU/mL、约3200IU/mL、约3,300IU/mL、约3,400IU/mL、约3,500IU/mL、约3,600IU/mL、约3,700IU/mL、约3,800IU/mL、约3,900IU/mL、约4,000IU/mL、约4,100IU/mL、约4,200IU/mL、约4,300IU/mL、约4,400IU/mL、约4,500IU/mL、约4,600IU/mL、约4,700IU/mL、约4,800IU/mL、约4,900IU/mL、约5,000IU/mL、约5,100IU/mL、约5,200IU/mL、约5,300IU/mL、约5,400IU/mL、约5,500IU/mL、约5,600IU/mL、约5,700IU/mL、约5,800IU/mL、约5,900IU/mL、约6,000IU/mL、约6,500IU/mL、约7,000IU/mL、约7,500IU/mL、约8,000IU/mL、约8,500IU/mL、约9,000IU/mL、约9,500IU/mL和约10,000IU/mL。
在本发明的一个实施方式中，可以在整个方法的一天或更多天将另外的IL-2添加到培养物中。在本发明的一个实施方式中，在第4天添加另外的IL-2。在本发明的一个实施方式中，在第7天添加另外的IL-2。在本发明的一个实施方式中，在第11天添加另外的IL-2。在另一个实施方式中，在第4天、第7天和/或第11天添加另外的IL-2。在本发明的一个实施方式中，用另外的IL-2培养MIL 1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天的时间。在本发明的一个实施方式中，每次添加IL-2后，培养MIL持续3天的时间。
在一个实施方式中，在该方法期间，至少更换一次细胞培养基。在一个实施方式中，在添加另外的IL-2的同时更换细胞培养基。在另一个实施方式中，在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天或第14天中的至少一天更换细胞培养基。在本发明的一个实施方式中，在整个方法中使用的细胞培养基可以相同或不同。在本发明的一个实施方式中，细胞培养基是CM-2、CM-4或AIM-V。在本发明的一个实施方式中，在第11天的细胞培养基更换步骤是可选的。在本发明的一个实施方式中，用于扩增过程的PBMC的起始细胞数量为约25,000至约1,000,000、约30,000至约900,000、约35,000至约850,000、约40,000至约800,000、约45,000至约800,000、约50,000至约750,000、约55,000至约700,000、约60,000至约650,000、约65,000至约600,000、约70,000至约550,000，优选约75,000至约500,000、约80,000至约450,000、约85,000至约400,000、约90,000至约350,000、约95,000至约300,000、约100,000至约250,000、约105,000至约200,000，或约110,000至约150,000。在本发明的一个实施方式中，PBMC的起始细胞数量为约138,000、140,000、145,000或更多。在另一个实施方式中，PBMC的起始细胞数量为约28,000。在另一个实施方式中，PBMC的起始细胞数量为约62,000。在另一个实施方式中，PBMC的起始细胞数量为约338,000。在另一个实施方式中，PBMC的起始细胞数量为约336,000。
在本发明的一个实施方式中，MIL的倍数扩增为约20％至约100％、25％至约95％、30％至约90％、35％至约85％、40％至约80％、45％至约75％、50％至约100％或25％至约75％。在本发明的一个实施方式中，倍数扩增为约25％。在本发明的另一个实施方式中，倍数扩增为约50％。在另一个实施方式中，倍数扩增为约75％。
在本发明的一个实施方式中，从10-50ml的骨髓抽吸物中扩增MIL。在本发明的一个实施方式中，从患者获得10ml的骨髓抽吸物。在另一个实施方式中，从患者获得20ml的骨髓抽吸物。在另一个实施方式中，从患者获得30ml的骨髓抽吸物。在另一个实施方式中，从患者获得40ml的骨髓抽吸物。在另一个实施方式中，从患者获得50ml的骨髓抽吸物。
在本发明的一个实施方式中，从约10-50ml的骨髓抽吸物中产生的PBMC的数量为约5×107至约10×107个PBMC。在另一个实施方式中，产生的PMBC的数量为约7×107个PBMC。
在本发明的一个实施方式中，约5×107至约10×107个PBMC产生约0.5×106至约1.5×106个扩增起始细胞材料。在本发明的一个实施方式中，产生约1×106个扩增起始细胞材料。
在本发明的一个实施方式中，在扩增期结束时收获的MIL的总数为约0.01×109至约1×109、约0.05×109至约0.9×109、约0.1×109至约0.85×109、约0.15×109至约0.7×109、约0.2×109至约0.65×109、约0.25×109至约0.6×109、约0.3×109至约0.55×109、约0.35×109至约0.5×109或约0.4×109至约0.45×109。
在本发明的一个实施方式中，来自骨髓抽吸物的12×106个PBMC产生约1.4×105个起始细胞材料，其在扩增过程结束时产生约1.1×107个MIL。
在本发明的一个实施方式中，与使用MIL方法1或MIL方法2扩增的MIL相比，使用上述MIL方法3从骨髓PBMC扩增的MIL包含高比例的CD8+细胞和更低数量的LAG3+和PD1+细胞。在本发明的一个实施方式中，与使用MIL方法1或MIL方法2扩增的PBL相比，使用上述MIL方法3从血液PBMC扩增的PBL包含高比例的CD8+细胞和增加的IFNγ产生水平。
在本发明的一个实施方式中，对急性髓性白血病(AML)患者有用的MIL的临床剂量为约4×108至约2.5×109个MIL。在另一个实施方式中，本发明的药物组合物中提供的MIL的数量为9.5×108个MIL。在另一个实施方式中，本发明的药物组合物中提供的MIL的数量为4.1×108。在另一个实施方式中，本发明的药物组合物中提供的MIL的数量为2.2×109。
在任何前述实施方式中，PBMC可以来自全血样品、骨髓、单采、血沉棕黄层或本领域已知的用于获得PBMC的任何其他方法。
使用“2A过程”扩增TIL的方法
在本发明的一个实施方式中，本发明提供了扩增来自骨髓和/或外周血的T细胞的装置和方法。在本发明的一个实施方式中，T细胞以多克隆但高度肿瘤特异性的方式具有来自骨髓微环境的增强的肿瘤特异性。在一个实施方式中，骨髓微环境用于维持和扩增T细胞。在本发明的一个实施方式中，在7天或14天的扩增过程中，TIL扩增约25至100倍。在一个实施方式中，TIL的倍数扩增为约30-90倍。在一个实施方式中，倍数扩增为约35-85倍。在一个实施方式中，倍数扩增为约40-80倍。在一个实施方式中，倍数扩增为约45-75倍。在另一个实施方式中，倍数扩增为约40-70倍。在另一个实施方式中，倍数扩增为约45-65倍。在另一个实施方式中，倍数扩增为约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍、约50倍、约55倍、约60倍、约65倍、约70倍、约75倍、约80倍、约85倍、约90倍、约95倍或约100倍扩增。
在本发明的一个实施方式中，T细胞制备过程不需要任何干预来选择肿瘤特异性。在本发明的一个实施方式中，T细胞制备过程在T细胞扩增时不需要骨髓和/或外周血中存在肿瘤。在一个实施方式中，在几乎完整骨髓的存在下扩增T细胞。
在一个实施方式中，本发明提供了一种如实施例所述的从骨髓和/或外周血中提取T细胞的方法，阐述于WO2010/062742中(特别是实施例21)，其内容通过引用并入本文。在一个实施方式中，本发明提供了一种从骨髓和/或外周血中提取T细胞的方法，例如如Noonan等，2005，Cancer Res.65：2026-2034中所述，其内容通过引用并入本文。
在一个实施方式中，本领域技术人员已知的用于获得骨髓和/或外周血的方法可用于本发明。在本发明的一个实施方式中，使用针吸获得骨髓和/或外周血。在本发明的一个实施方式中，将来自患者的骨髓吸进含有肝素的注射器中，在室温下储存过夜。在本发明的一个实施方式中，在储存之后，将注射器的内容物一起合并到无菌容器中并进行质量检测。使用淋巴细胞分离液(LSM，lymphocyte separation media)并用COBE Spectra进行离心，使骨髓中的单核细胞(MNC)富集。收集梯度中的细胞直到红细胞，并用HBSS进行洗涤。使用补充有2％HSA和5％DMSO的羟乙基淀粉类防冻剂对MNC进行冷冻保存，保留一些MNC用于质量控制。对QC小瓶进行解冻，测定MNC产品的CD3+和CD38+/138+细胞含量。重要的是请注意，骨髓的收集不构成对本发明的限制。
在本发明的一个实施方式中，吸取骨髓，使骨髓在“淋巴细胞分离液”的密度梯度中分级，收集几乎快到红细胞沉淀层的细胞。在一个实施方式中，此种级分分离方法基本上去除了红细胞和中性粒细胞，提供了几乎完整的骨髓。在一个实施方式中，所得的分级物质是T细胞和肿瘤细胞。在本发明的一个实施方式中，可在无T细胞特异性分离步骤和无肿瘤细胞分离步骤的情况下进行所述方法，例如，无需用抗体或其他细胞类型特异性可检测标记物标记T细胞，且无需使用荧光激活细胞分选术(FACS，fluorescence activated cellsorting)进行分选。
在本发明的一个实施方式中，对获得的骨髓进行Ficoll，或将外周血以1×106个细胞/mL在无血清条件下悬浮于200μL/孔的AIM-V培养基中。
在本发明的一个实施方式中，从未完全缓解的受试者收集骨髓。在本发明的一个实施方式中，从完全缓解的受试者收集骨髓。
在本发明的一个实施方式中，可以获得骨髓并将其冷冻。在一个实施方式中，可获得骨髓并立即将其用于提取T细胞。
在其他实施方式中，并且根据以上任一项，本发明提供了一种扩增TIL的方法，该方法包括使包含至少一种从液体肿瘤获得的TIL的TIL群接触。本文关于扩增TIL的所有讨论都适用于扩增从骨髓、外周血和/或血液恶性肿瘤(包括液体肿瘤)获得的TIL。
在一个实施方式中，本发明提供了一种从肿瘤制备肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，该方法包括以下步骤：
(a)使碎片化的肿瘤与第一细胞培养基接触；
(b)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增(pre-REP)，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少5倍；其中，第一细胞培养基包含IL-2；
(c)在第二细胞培养基中对第二TIL群进行第二次扩增，获得第三TIL群；其中，第二次扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量高至少50倍；其中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)、经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)；并且其中，第二次扩增进行14天以下；
(d)收获第三TIL群；并且
其中，肿瘤是液体肿瘤；并且其中，癌症是血液恶性肿瘤。
在一个实施方式中，本发明提供了一种扩增TIL群的方法，该方法包括第一次预快速扩增(pre-REP)过程和然后的第二次扩增过程(其可以是快速扩增过程——REP)；其中，用于扩增的细胞培养基包含IL-2，IL-2的浓度选自：100IU/mL至10,000IU/mL、200IU/mL至5,000IU/mL、300IU/mL至4,800IU/mL、400IU/mL和4,600IU/mL、500IU/mL至4,400IU/mL、600IU/mL至4,200IU/mL、700IU/mL至4,000IU/mL、800IU/mL至3,800IU/mL、900IU/mL至3,600IU/mL、1,000IU/mL至3,400IU/mL、1,100IU/mL至3,200IU/mL、1,200IU/mL至3,000IU/mL、1,300IU/mL至2,800IU/mL、1,400IU/mL至2,600IU/mL、1,500IU/mL至2,400IU/mL、1,600IU/mL至2,200IU/mL、1,700IU/mL至2,000IU/mL、5,500IU/mL至9,500IU/mL、6,000IU/mL至9,000IU/mL、6500IU/mL至8,500IU/mL、7,000IU/mL至8,000IU/mL，以及7,500IU/mL至8,000IU/mL。
在一个实施方式中，本发明提供了扩增TIL群的方法，该方法包括预快速扩增(pre-REP)过程和快速扩增过程(REP)；其中，用于扩增的细胞培养基包含IL-2，IL-2的浓度选自：约100IU/mL、约200IU/mL、约300IU/mL、约400IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约500IU/mL、约600IU/mL、约700IU/mL、约800IU/mL、约900IU/mL、约1,000IU/mL、约1100IU/mL、约1200IU/mL、约1300IU/mL、约1400IU/mL、约1500IU/mL、约1600IU/mL、约1700IU/mL、约1800IU/mL、约1900IU/mL、约2,000IU/mL、约2,100IU/mL、约2,200IU/mL、约2300IU/mL、约2400IU/mL、约2500IU/mL、约2600IU/mL、约2700IU/mL、约2,800IU/mL、约2,900IU/mL、约3,000IU/mL、约3,100IU/mL、约3,200IU/mL、约3,300IU/mL，ab出3400IU/mL、约3500IU/mL、约3600IU/mL、约3700IU/mL、约3800IU/mL、约3900IU/mL、约4000IU/mL、约4100IU/mL、约4200IU/mL、约4,300IU/mL、约4,400IU/mL、约4,500IU/mL、约4,600IU/mL、约4,700IU/mL、约4,800IU/mL、约4,900IU/mL、约5,000IU/mL、约5,100IU/mL、约5,200IU/mL、约5,300IU/mL、约5,400IU/mL、约5,500IU/mL、约5,600IU/mL、约5,700IU/mL、约5,800IU/mL、约5,900IU/mL、约6,000IU/mL、约6,500IU/mL、约7,000IU/mL、约7,500IU/mL、约8,000IU/mL、约8,500IU/mL、约9,000IU/mL、约9,500IU/mL，以及约10,000IU/mL。
在一个实施方式中，本发明提供了一种扩增TIL群的方法，该方法包括预快速扩增(pre-REP)过程。在一个实施方式中，本发明提供了扩增TIL群的pre-REP过程，该pre-REP过程包括使获得自液体肿瘤的TIL群与细胞培养基接触的步骤；其中，细胞培养基还包含初始浓度为1000IU/mL至6000IU/mL的IL-2。
在一个实施方式中，本发明提供了扩增TIL群的pre-REP过程，该过程包括使获得自液体肿瘤的TIL群与细胞培养基接触的步骤；其中，细胞培养基还包含初始浓度为约6000IU/mL的IL-2。
在一个实施方式中，可以通过任何合适的方法，使用根据本公开从液体肿瘤获得的TIL在透气性容器中进行REP。例如，可以在白细胞介素2(IL-2)或白细胞介素-15(IL-15)存在下，使用非特异性T细胞受体刺激快速扩增TIL。非特异性T细胞受体刺激可包括，例如，约30ng/mL的OKT-3(一种单克隆抗CD3抗体，可从Ortho-McNeil，Raritan，新泽西或Miltenyi Biotech，奥本，加利福尼亚商购)。可选地在T细胞生长因子如300IU/mL IL-2或IL-15存在下，可以通过在体外用一种以上癌症抗原(包括其抗原性部分，例如表位)进一步刺激TIL来快速扩增TIL，该抗原可以可选地由载体表达，例如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μΜMART-1：26-35(27L)或gpl 00：209-217(210M)。其他合适的抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2，或其抗原性部分。也可以通过用表达HLA-A2的抗原呈递细胞脉冲的相同癌症抗原再刺激，来快速扩增TIL。或者，可以用例如经辐照的自体淋巴细胞或用经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2进一步再刺激TIL。
在一个实施方式中，用于扩增TIL的方法可包括使用约5000mL至约25000mL的细胞培养基、约5000mL至约10000mL的细胞培养基，或约5800mL至约8700mL的细胞培养基。在一个实施方式中，用于扩增TIL的方法可包括使用约1000mL至约2000mL的细胞培养基、约2000mL至约3000mL的细胞培养基、约3000mL至约4000mL的细胞培养基、约4000mL至约5000mL的细胞培养基、约5000mL至约6000mL的细胞培养基、约6000mL至约7000mL的细胞培养基、约7000mL至约8000mL的细胞培养基、约8000mL至约9000mL的细胞培养基、约9000mL至约10000mL的细胞培养基、约10000mL至约15000mL的细胞培养基、约15000mL至约20000mL的细胞培养基，或约20000mL至约25000mL的细胞培养基。在一个实施方式中，使用不超过一种类型的细胞培养基扩增TIL的数量。可以使用任何合适的细胞培养基，例如AIM-V细胞培养基(L-谷氨酰胺、50μM硫酸链霉素和10μM硫酸庆大霉素)细胞培养基(Invitrogen,CarlsbadCA)。在这方面，本发明的方法有利地减少了扩增TIL数量所需的培养基的量和培养基类型的数量。在一个实施方式中，扩增TIL的数量可以包括以不超过每三天一次或每四天一次的频率饲养细胞。用透气性容器扩增细胞数量通过降低扩增细胞所需的饲养频率，简化了扩增细胞数量所需的步骤。
在一个实施方式中，使用透气性容器进行第二次扩增。此类实施方式允许细胞群从约5×105个细胞/cm2扩增至10×106至30×106个细胞/cm2。在一个实施方式中，此种扩增不进行进料。在一个实施方式中，只要培养基在透气烧瓶中位于约10cm的高度，此种扩增就不进行进料。在一个实施方式中，不进行进料但是添加一种以上细胞因子。在一个实施方式中，细胞因子可以作为丸剂(bolus)添加而无需将细胞因子与培养基混合。此种容器、装置和方法在本领域中是已知的并且已经用于扩增TIL，并且包括在美国专利申请公开号US2014/0377739A1、国际专利申请公开号WO2014/210036A1、美国专利申请公开号US2013/0115617Al、国际公开号WO2013/188427A1、美国专利申请公开号US2011/0136228A1、美国专利号8,809,050、国际专利申请公开号WO2011/072088A2、美国专利申请公开号US2016/0208216A1、美国专利申请公开号US2012/0244133A1、国际专利申请公开号WO2012/129201A1、美国专利申请公开号US2013/0102075A1、美国专利号8,956,860、国际专利申请公开号WO2013/173835A1和美国专利申请公开号US2015/0175966Al所述的那些，其公开内容通过引用并入本文。此类方法也描述于Jin等，J.I mmunotherapy 2012，35，283-292，其公开内容通过引用并入本文。
在一个实施方式中，透气性容器是G-Rex 10烧瓶(Wilson Wolf ManufacturingCorporation，新布莱顿(New Brighton)，明尼苏达州，美国)。在一个实施方式中，透气性容器具有10cm2的透气性培养表面。在一个实施方式中，透气性容器具有40mL的细胞培养基容量。在一个实施方式中，透气性容器在2次培养基更换后提供1亿至3亿个TIL。
在一个实施方式中，透气性容器是G-Rex 100烧瓶(Wilson Wolf ManufacturingCorporation，新布莱顿，明尼苏达州，美国)。在一个实施方式中，透气性容器具有100cm2的透气性培养表面。在一个实施方式中，透气性容器具有450mL的细胞培养基容量。在一个实施方式中，透气性容器在2次培养基更换后提供10亿至30亿个TIL。
在一个实施方式中，透气性容器是G-Rex 100M烧瓶(Wilson Wolf ManufacturingCorporation，新布莱顿，明尼苏达州，美国)。在一个实施方式中，透气性容器具有100cm2的透气性培养表面。在一个实施方式中，透气性容器具有1000mL细胞培养基容量。在一个实施方式中，透气性容器在不更换培养基的情况下提供10亿至30亿个TIL。
在一个实施方式中，透气性容器是G-Rex 100L烧瓶(Wilson Wolf ManufacturingCorporation，新布莱顿，明尼苏达州，美国)。在一个实施方式中，透气性容器具有100cm2的透气性培养表面。在一个实施方式中，透气性容器具有2000mL细胞培养基容量。在一个实施方式中，透气性容器在不更换培养基的情况下提供10亿至30亿个TIL。
在一个实施方式中，透气性容器是G-Rex 24孔板(Wilson Wolf ManufacturingCorporation，新布莱顿，明尼苏达州，美国)。在一个实施方式中，透气性容器包括具有孔的板，其中各个孔具有2cm2的透气性培养表面。在一个实施方式中，透气性容器包括具有孔的板，其中各个孔具有8mL细胞培养基容量。在一个实施方式中，透气性容器在2次培养基更换后每孔提供2千万至6千万个细胞。
在一个实施方式中，透气性容器是G-Rex 6孔板(Wilson Wolf ManufacturingCorporation，新布莱顿，明尼苏达州，美国)。在一个实施方式中，透气性容器包括具有孔的板，其中各个孔具有10cm2的透气性培养表面。在一个实施方式中，透气性容器包括具有孔的板，其中各个孔具有40mL细胞培养基容量。在一个实施方式中，透气性容器在2次培养基更换后每孔提供1亿至3亿个细胞。
在一个实施方式中，第一透气性容器和/或第二透气性容器中的细胞培养基未经过滤。使用未经过滤的细胞培养基可以简化扩增细胞数量所需步骤。在一个实施方式中，第一透气性容器和/或第二透气性容器中的细胞培养基没有β-巯基乙醇(BME)。
在一个实施方式中，该方法的持续时间包括：从哺乳动物获得肿瘤组织样品；在含有细胞培养基的第一透气性容器中培养肿瘤组织样品；从肿瘤组织样品获得TIL；在含有细胞培养基的第二透气性容器中扩增TIL的数量约14天至约42天，例如约28天。
在一个实施方式中，细胞培养基包含IL-2。在一个优选的实施方式中，细胞培养基包含约3000IU/mL的IL-2。在一个实施方式中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL的IL-2。在一个实施方式中，细胞培养基包含1000至2000IU/mL、2000至3000IU/mL、3000至4000IU/mL、4000至5000IU/mL、5000至6000IU/mL、6000至7000IU/mL、7000至8000IU/mL或8000IU/mL的IL-2。
在一个实施方式中，细胞培养基包含OKT-3抗体。在一个优选的实施方式中，细胞培养基包含约30ng/mL的OKT-3抗体。在一个实施方式中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL的OKT-3抗体。在一个实施方式中，细胞培养基包含0.1ng/mL至1ng/mL、1ng/mL至5ng/mL、5ng/mL至10ng/mL、10ng/mL至20ng/mL、20ng/mL至30ng/mL、30ng/mL至40ng/mL、40ng/mL至50ng/mL或50ng/mL至100ng/mL的OKT-3抗体。
在一个实施方案中，在透气容器中扩增TIL。使用本领域已知的方法、组成和装置，包括在美国专利申请公开号US2005/0106717A1中描述的那些(其公开内容通过引用并入本文)，使用透气性容器，用PBMC来扩增TIL。在一个实施方案中，TIL在透气袋中扩增。在一个实施方案中，使用细胞扩增系统扩增TIL，所述细胞扩增系统在透气袋中扩增TIL，例如Xuri细胞扩增系统W25(Xuri Cell Expansion System W25)(GE Healthcare)。在一个实施方案中，使用细胞扩增系统扩增TIL，所述细胞扩增系统在透气袋中扩增TIL，例如WAVE生物反应器系统，也称为Xuri细胞扩增系统W5(GE Healthcare)。在一个实施方案中，细胞扩增系统包括透气性细胞袋，该透气性细胞袋的体积选自：约100mL、约200mL、约300mL、约400mL、约500mL、约600mL、约700mL、约800mL、约900mL、约1L、约2L、约3L、约4L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L、约10L、约11L、约12L、约13L、约14L、约15L、约16L、约17L、约18L、约19L、约20L、约25L和约30L。在一个实施方式中，细胞扩增系统包括透气性细胞袋，该透气性细胞袋的体积选自：50至150mL、150至250mL、250至350mL、350至450mL、450至550mL、550至650mL、650至750mL、750至850mL、850至950mL，以及950至1050mL。在一个实施方式中，细胞扩增系统包括透气性细胞袋，该透气性细胞袋的体积选自：1L至2L、2L至3L、3L至4L、4L至5L、5L至6L、6L至7L、7L至8L、8L至9L、9L至10L、10L至11L、11L至12L、12L至13L、13L至14L、14L至15L、15L至16L、16L至17L、17L至18L、18L至19L，以及19L至20L。在一个实施方式中，细胞扩增系统包括透气性细胞袋，该透气性细胞袋的体积选自：0.5L至5L、5L至10L、10L至15L、15L至20L、20L至25L，以及25L至30L。在一个实施方式中，细胞扩增系统使用的摇摆时间(rocketingtime)为约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天和约28天。在一个实施方式中，细胞扩增系统使用的摇摆时间为30分钟至1小时、1小时至12小时、12小时至1天、1天至7天、7天至14天、14天至21天，以及21天至28天。在一个实施方式中，细胞扩增系统使用的摇摆速率(rocketing rate)为约2次摇摆(rocks)/分钟、约5次摇摆/分钟、约10次摇摆/分钟、约20次摇摆/分钟、约30次摇摆/分钟和约40次摇摆/分钟。在一个实施方式中，细胞扩增系统使用的摇摆速率为2次摇摆/分钟至5次摇摆/分钟、5次摇摆/分钟至10次摇摆/分钟、10次摇摆/分钟至20次摇摆/分钟、20次摇摆/分钟至30次摇摆/分钟、30次摇摆/分钟至40次摇摆/分钟。在一个实施方式中，细胞扩增系统使用的摇摆角度为约2°、约3°、约4°、约5°、约6°、约7°、约8°、约9°、约10°、约11°和约12°。在一个实施方式中，细胞扩增系统使用的摇摆角度为2°至3°、3°至4°、4°至5°、5°至6°、6°至7°、7°至8°、8°至9°、9°至10°、10°至11°、11°至12°。
在一个实施方式中，扩增从液体肿瘤获得的TIL的方法还包括选择肿瘤反应性优异的TIL的步骤。可以使用本领域已知的任何选择方法。例如，美国专利申请公开号2016/0010058A1所述的方法(其公开内容通过引用并入本文)可用于选择肿瘤反应性优异的TIL。
在一个实施方式中，本发明提供了一种从液体肿瘤扩增TIL群的方法，该方法包括如Jin等，J.Immunotherapy 2012，35，283-292所述的步骤，其公开内容通过引用并入本文。例如，可将肿瘤或其部分置于酶培养基中并机械解离约1分钟。然后可将混合物在37℃、5％CO2中孵育30分钟，然后再次机械破碎约1分钟。在37℃、5％CO2中孵育30分钟后，可以第三次机械破碎肿瘤或其部分约1分钟。如果在第三次机械破碎后存在大块组织，可以对样品施加1或2次另外的机械解离，进行或不进行在37℃、5％CO2中的另外30分钟孵育。在最终孵育结束时，如果细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，可以使用Ficoll进行密度梯度分离以移除这些细胞。在24孔板(Costar 24孔细胞培养簇，平底；Corning Incorporated，康宁，纽约)中开始TIL培养，各个孔可以接种含有IL-2(6000IU/mL；Chiron Corp.，埃默里维尔，加利福尼亚)的2mL完全培养基(CM)中的1×106个肿瘤消化细胞或大小约1-8mm3的一个肿瘤碎片。CM包含加有GlutaMAX的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640缓冲液，培养基补充有10％人AB血清、25mM Hepes和10mg/mL庆大霉素。可以在具有40mL容量和10cm2透气性硅底的透气性烧瓶(G-Rex 10；Wilson Wolf Manufacturing，新布莱顿)中开始培养，各个烧瓶可以在10-40mL含有IL-2的CM中装载10-40×106个活肿瘤消化细胞或5至30个肿瘤碎片。G-Rex 10和24孔板可以在37℃、5％CO2的湿润培养箱中培养，在培养开始后5天，可以移除一半的培养基并用新鲜的CM和IL-2替换，在第5天之后，可以每2至3天更换一半培养基。如本文其他地方所述，可以使用从本公开的液体肿瘤获得的TIL，使用T-175烧瓶和透气袋或透气性G-Rex烧瓶进行TIL的第二次扩增方案(REP)。对于T-175烧瓶中的REP，可以将1×106个TIL悬浮于各个烧瓶中的150mL培养基中。可以在CM和AIM-V培养基的1：1混合物(50/50培养基)中培养TIL，培养基补充有3000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3抗体(OKT-3)。T-175烧瓶可以在37℃、5％CO2中孵育。可以在第5天用含有3000IU/mL IL-2的50/50培养基更换一半培养基。在第7天，可以将来自2个T-175烧瓶的细胞合并在一个3L袋中，可以将300mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V添加至300mL TIL悬浮液中。可以每天或每两天对各个袋中的细胞数量进行计数，可以添加新鲜培养基以使细胞计数保持在0.5至2×106个细胞/mL。对于具有100cm2透气性硅底的500mL容量烧瓶(例如G-Rex 100，WilsonWolf Manufacturing，如本文其他地方所述)中的REP，可以在400mL的50/50培养基中培养5×106或10×106个TIL，培养基补充有3000IU/mL IL-2和30ng/mL抗CD3抗体(OKT-3)。G-Rex100烧瓶可以在37℃、5％CO2中孵育。在第5天，可以取出250mL上清液并置于离心瓶中并以1500rpm(491g)离心10分钟。可以用150mL含有3000IU/mL IL-2的新鲜50/50培养基重新悬浮获得的TIL沉淀，并加回到G-Rex 100烧瓶中。当用G-Rex 100烧瓶连续扩增TIL时，在第7天，将各个G-Rex 100中的TIL悬浮于各个烧瓶中存在的300mL培养基中，并将细胞悬浮液分成三个100mL等分试样，其可以用于接种3个G-Rex 100烧瓶。然后可以向各个烧瓶中添加约150mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V。然后可以使G-Rex 100烧瓶在37℃、5％CO2下孵育，在4天后，可以向各个G-Rex 100烧瓶中添加150mL含有3000IU/mL IL-2的AIM-V。此后，可以在培养的第14天收获细胞，完成REP。
在一个实施方式中，扩增或治疗癌症的方法包括从患者肿瘤样品获得TIL的步骤。可以使用本领域已知的方法获得患者肿瘤样品。例如，可以从酶促肿瘤消化液和锐器解剖的肿瘤碎片(大小为约1至约8mm3)来培养TIL。此种肿瘤消化液可以通过在酶培养基(例如Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640缓冲液、2mM谷氨酸盐、10mcg/mL庆大霉素、30U/mL DNase和1.0mg/mL胶原酶)中孵育然后机械解离(例如使用组织解离剂)来产生。可以通过将肿瘤置于酶培养基中并将肿瘤机械解离约1分钟，然后在37℃、5％CO2中孵育30分钟，然后在上述条件下进行机械解离和孵育的重复循环，直至仅存在小的组织碎片，来产生肿瘤消化液。在该过程结束时，如果细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可以使用FICOLL分支亲水性多糖进行密度梯度分离以除去这些细胞。可以使用本领域已知的替代方法，例如美国专利申请公开号2012/0244133A1所述的那些，其公开内容通过引用并入本文。任何前述方法都可以用于本文所述扩增TIL的方法或治疗癌症的方法的任何实施方式中。
在一个实施方式中，TIL的第二次/REP扩增过程可以使用如前所述的T-175烧瓶和透气袋(Tran等，J.Immunother.2008，31，742-51；Dudley等，J.Immunother.2003，26，332-42)或透气性培养器皿(G-Rex烧瓶，可从Wilson Wolf Manufacturing Corporation，新布莱顿，明尼苏达州，美国商购)进行。对于T-175烧瓶中的TIL扩增，可以将悬浮于150mL培养基中的1×106个TIL添加至各个T-175烧瓶中。可以在CM与AFM-V培养基的1：1混合物中培养TIL，该混合物补充有3000IU(国际单位)/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3抗体(例如，OKT-3)。T-175烧瓶可以在37℃、5％CO2中孵育。可以在第5天使用含有3000IU/mL IL-2的50/50培养基更换一半培养基。在第7天，将来自两个T-175烧瓶的细胞合并在3L袋中，并将300mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM V添加至300mL的TIL悬浮液中。每天或每两天对各个袋中的细胞数量进行计数，并添加新鲜培养基以使细胞计数保持为0.5×106至2.0×106个细胞/mL。
在一个实施方式中，对于在具有100cm2透气性硅底的500mL容量透气性烧瓶(G-Rex100，可从Wilson Wolf Manufacturing Corporation，新布莱顿，明尼苏达州，美国商购)中的第二次/REP TIL扩增，可以在400mL的50/50培养基中培养5×106或10×106个TIL，该培养基补充有5％人AB血清、3000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3(OKT-3)。可在37℃、5％CO2中孵育G-Rex 100烧瓶。在第5天，可以取出250mL上清液置于离心瓶中并以1500rpm(每分钟转数；491×g)离心10分钟。然后可以用150mL含有5％人AB血清、3000IU/mL IL-2的新鲜培养基重新悬浮浮TIL沉淀物，并将其加回到原G-Rex 100烧瓶中。当TIL在G-Rex 100烧瓶中连续扩增时，在第7天，将各个G-Rex 100烧瓶中的TIL悬浮于各个烧瓶中存在的300mL培养基中，并且可以将细胞悬浮液分成三个100mL等分试样，可用于接种三个G-Rex 100烧瓶。然后可以向各个烧瓶中加入150mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V。G-Rex100烧瓶可以在37℃、5％CO2中孵育，4天后，可以向各个G-Rex 100烧瓶中加入150mL含有3000IU/mL IL-2的AIM-V。可以在培养的第14天收获细胞。
在一个实施方式中，TIL可以按如下制备。在完全培养基(CM)中培养2mm3肿瘤碎片，该CM包含AIM-V培养基(Invitrogen Life Technologies，卡尔斯巴德，加利福尼亚)，该AIM-V培养基补充有2mM谷氨酰胺(Mediatech，Inc.，马纳萨斯，弗吉尼亚州)、100U/mL青霉素(Invitrogen Life Technologies)、100μg/mL链霉素(Invitrogen LifeTechnologies)、5％热灭活的人AB血清(Valley Biomedical，Inc.，温彻斯特，弗吉尼亚州)和600IU/mL rhIL-2(Chiron，埃默里维尔，加利福尼亚)。对于液体肿瘤的酶消化，将肿瘤标本切成小块后加至RPMI-1640培养基中，洗涤，在15～22℃下以800rpm离心5分钟，并重新悬浮于酶消化缓冲液(含有0.2mg/mL胶原酶和30U/mL DNase的RPMI-1640培养基)中，然后在室温下旋转过夜。由碎片产生的TIL可以在CM中生长3至4周，并在加有10％二甲基亚砜(DMSO)的热灭活的HAB血清中新鲜扩增或冷冻保存，并储存于-180℃下直至研究时。将从腹水收集物获得的肿瘤相关淋巴细胞(TAL)以3×106个细胞/孔接种于24孔板的CM中。每隔一天使用低功率倒置显微镜检查TIL生长情况。
TIL制备过程(“2A过程”)的示例性实施方式
图22中示意性地显示了称为过程2A的示例性TIL制备/扩增过程。在某些方面，本方法产生TIL，该TIL在施用给受试者/患者后能够增加复制周期，因此本方法产生的TIL相对于较老的TIL(即，在施用给受试者/患者之前还经历了更多轮复制的TIL)可提供另外的治疗性益处。文献中已描述了较年轻TIL的特征，例如Donia等，Scandinavian JournalofImmunology，75：157-167(2012)；Dudley等，Clin Cancer Res，16：6122-6131(2010)；Huang等，J Immunother，28(3)：258-267(2005)；Besser等，Clin Cancer Res，19(17)：OF1-OF9(2013)；Besser等，J Immunother，32：415-423(2009)；Bunds等，J Immunother，32：415-423(2009)；Robbins等，J Immunol，2004；173：7125-7130；Shen等，J Immunother，30：123-129(2007)；Zhou等，J Immunother，28：53-62(2005)和Tran等，J Immunother，31：742-751(2008)，其全部内容通过引用整体并入本文。
如本文所讨论的，本发明可以包括与冷冻保存的TIL的再刺激有关的步骤，以在移植入患者之前增加其代谢活性并因此增加相对健康，以及测试所述代谢健康的方法。如本文一般概述的，TIL通常取自患者样品，并在移植入患者之前进行操作以扩大其数量。在一些实施方式中，TIL可以可选地进行如下所述的基因操作。
在一些实施方式中，可以冷冻保存TIL。一旦解冻，在输注给患者之前，也可以对它们进行再刺激以增加它们的代谢作用。
在一些实施方式中，如下文以及实施例和附图中详细讨论的那样，与常规扩增方法相比，第一次扩增(包括称为pre-REP的过程)缩短为7至14天，并且第二次扩增(包括称为REP的过程)缩短为7至14天。
图23显示了示例性的2A过程。如图23所示和在下文进一步详细说明，在一些实施方式中，第一次扩增(步骤B)缩短至11天，第二次扩增(步骤D)缩短至11天。在一些实施方式中，如此处详细讨论的，第一次扩增和第二次扩增的组合(步骤B和步骤D)缩短至22天。可以理解，图23所示和下文所述的过程是示例性的，并且本文所述方法包括对所述步骤的改变和添加以及任何组合。该方法的示例性实施方式在PCT申请号PCT/US2018/012633中描述，其内容通过引用整体并入本文。
A、步骤A：获得患者肿瘤样品
通常，TIL最初从患者肿瘤样品获得(“原代TIL”)，然后如本文所述地扩增为更大的群用于进一步操作，可选地如本文所概述的冷冻保存、再刺激，并可选地评估表型和代谢参数作为TIL健康的指标。
可以使用本领域已知的方法获得患者肿瘤样品，通常通过手术切除、穿刺活检、单采或用于获得含有肿瘤和TIL细胞混合物的样品的其他手段。通常，肿瘤样品可以来自任何实体瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样品也可以是液体肿瘤，例如，从血液恶性肿瘤获得的肿瘤。实体瘤可以是任何癌症类型，包括但不限于乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌和皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤)。在一些实施方式中，有用的TIL获得自恶性黑色素瘤肿瘤，因为据报道这些恶性黑色素瘤肿瘤具有特别高水平的TIL。在一些实施方式中，肿瘤大于约1.5cm但小于约4cm。在一些实施方式中，肿瘤小于4cm。
一旦获得肿瘤样品，通常使用锐器解剖法(sharp dissection)将肿瘤样品切成1mm3至约8mm3的小块；其中，约2mm3至3mm3是特别有用的。使用酶促肿瘤消化液从这些碎片培养TIL。此种肿瘤消化液可以通过在酶培养基(例如Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640缓冲液、2mm谷氨酸盐、10mcg/mL庆大霉素、30U/mL DNase和1.0mg/mL胶原酶)中孵育然后机械解离(例如使用组织解离剂)来产生。肿瘤消化液可以通过将肿瘤置于酶培养基中并将肿瘤机械解离约1分钟来产生，然后在37℃、5％CO2中孵育30分钟，然后在上述条件下进行机械解离和孵育的重复循环，直至仅存在小的组织碎片。在该过程结束时，如果细胞悬液含有大量红细胞或死细胞，则可以使用FICOLL分支亲水性多糖进行密度梯度分离以除去这些细胞。可以使用本领域已知的替代方法，例如美国专利申请公开号2012/0244133A1中描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。任何前述方法都可以用于本文所述扩增TIL的方法或治疗癌症的方法的任何实施方式中。
通常，收获的细胞悬液称为“原代细胞群”或“新鲜收获的”细胞群。
在一个实施方式中，可从获自患者的酶促肿瘤消化液和肿瘤碎片来对TIL进行初始培养。
在一些实施方式中，TIL获自肿瘤碎片。通过锐器解剖法获得肿瘤碎片。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约1mm3至10mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约1mm3至8mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约1mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约2mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约3mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约4mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约5mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约6mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约7mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约8mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约9mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约10mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约8-27mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约10-25mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约15-25mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约8-20mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约15-20mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约8-15mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约8-10mm3。
在一些实施方式中，肿瘤碎片的数量为约40至约50个肿瘤碎片。在一些实施方式中，肿瘤碎片的数量为约40个肿瘤碎片。在一些实施方式中，肿瘤碎片的数量为约50个肿瘤碎片。在一些实施方式中，肿瘤碎片大小为约8-27mm3并且肿瘤碎片少于约50个。
在一些实施方式中，TIL获得自肿瘤消化液。在一些实施方式中，通过在酶培养基(例如但不限于RPMI 1640、2mm GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNase和1.0mg/mL胶原酶)中孵育，然后机械解离(GentleMACS，MiltenyiBiotec，奥本，加利福尼亚)，来产生肿瘤消化液。将肿瘤置于酶培养基中后，可以机械解离肿瘤约1分钟。然后将溶液在37℃、5％CO2中孵育30分钟，然后再次机械破碎约1分钟。在37℃、5％CO2中再次孵育30分钟后，可以第三次机械破碎肿瘤约1分钟。在一些实施方式中，在第三次机械破碎后，如果存在大块组织，则对样品施加1或2次另外的机械解离，进行或不进行在37℃、5％CO2中的另外30分钟孵育。在一些实施方式中，在最终孵育结束时，如果细胞悬液含有大量红细胞或死细胞，则可以使用Ficoll进行密度梯度分离以除去这些细胞。
B、步骤B：第一次扩增
在步骤A中解剖或消化肿瘤碎片之后，在(相对于肿瘤和其他细胞)有利于TIL生长的条件下，在含有IL-2的血清中培养所得细胞。在一些实施方式中，在2mL孔中包含灭活的人AB血清和6000IU/mL IL-2的培养基中孵育肿瘤消化液。培养此原代细胞群一段时间，通常为3至14天，产生大量TIL群，通常为约1×108个大量TIL细胞。在一些实施方式中，培养该原代细胞群7至14天，产生大量TIL群，通常约1×108个大量TIL细胞。在一些实施方式中，培养该原代细胞群10至14天，产生大量TIL群，通常约1×108个大量TIL细胞。在一些实施方式中，培养该原代细胞群约11天，产生大量TIL群，通常约1×108个大量TIL细胞。在一些实施方式中，培养该原代细胞群约11天，产生大量TIL群，通常小于或等于约200×106个大量TIL细胞。
在一个优选的实施方式中，TIL的扩增可以进行如下：使用如下文和此处所述的初始大量TIL扩增步骤(图23中所示的步骤B，其可以包括称为pre-REP的过程)，然后进行如下文步骤D和此处所述的第二次扩增(步骤D，包括称为快速扩增方案(REP)步骤的过程)，随后可选地进行冷冻保存，然后进行如下文和此处所述的第二次步骤D(包括称为再刺激REP步骤的过程)。可选地，可以对从该过程获得的TIL进行如本文所述的表型特征和代谢参数的表征。
在用24孔板开始TIL培养的实施方式中，例如，使用Costar 24孔细胞培养板、平底(Corning Incorporated，康宁，纽约)，各个孔可以接种2mL含有IL-2(6000IU/mL；ChironCorp.，埃默里维尔，加利福尼亚)的完全培养基(CM)中的1×106个肿瘤消化细胞或一个肿瘤碎片。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约1mm3至10mm3。
在一些实施方式中，步骤B的CM由含有GlutaMAX的RPMI 1640组成，培养基补充有10％人AB血清、25mm HEPES和10mg/mL庆大霉素。在用容量为40mL、透气性硅底为10cm2的透气性烧瓶(例如，G-RE×10；Wilson Wolf Manufacturing，新布莱顿，明尼苏达州)开始培养的实施方式中(图1)，各个烧瓶装有在10至40mL含有IL-2的CM中的10×106至40×106个活肿瘤消化细胞或5至30个肿瘤碎片。在37℃、5％CO2的潮湿培养箱中孵育G-RE×10和24孔板，培养开始5天后，移除一半培养基，换上新鲜的CM和IL-2，在第5天后，每2至3天更换一半的培养基。
在一个实施方式中，细胞培养基还包含IL-2。在一个优选的实施方式中，细胞培养基包含约3000IU/mL的IL-2。在一个实施方式中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL的IL-2。在一个实施方式中，细胞培养基包含1000至2000IU/mL、2000至3000IU/mL、3000至4000IU/mL、4000至5000IU/mL、5000至6000IU/mL、6000至7000IU/mL、7000至8000IU/mL或8000IU/mL的IL-2。
在一些实施方式中，如实施例和附图中所讨论的，第一次扩增(包括称为pre-REP；步骤B的过程)过程缩短为3至14天。在一些实施方式中，如实施例所讨论和图4和图5所示，步骤B的第一次扩增缩短为7至14天。在一些实施方式中，如实施例所讨论，步骤B的第一次扩增缩短为10至14天。在一些实施方式中，如实施例所讨论，步骤B的第一次扩增缩短为11天。
在一些实施方式中，在如本文所述的步骤B过程期间，IL-2、IL-7、IL-15和IL-21以及它们的组合可以包括在内。
在一些实施方式中，在封闭系统生物反应器中进行步骤B。在一些实施方式中，如此处所述，采用封闭系统进行TIL扩增。在一些实施方式中，采用单个生物反应器。在一些实施方式中，例如，采用的单个生物反应器是G-REX-10或G-REX-100。
C、步骤C：第一次扩增向第二次扩增的转变
在一些实施方式中，可以使用本领域已知的和本文所述的方法，将来自步骤B的大量TIL群立即冷冻保存。或者，可以对大量TIL群进行第二次扩增(REP)，然后如下所述冷冻保存。
在一些实施方式中，不对步骤B的TIL进行保存，步骤B的TIL直接进行步骤D。在一些实施方式中，如本文进一步所述，转变发生在封闭系统中。
D、步骤D：第二次扩增
在一些实施方式中，在收获和初始大量过程后(即，在步骤A和步骤B之后)，TIL细胞群数量扩大。这在本文中称为第二次扩增，它可以包括本领域通常称为快速扩增过程(REP)的扩增过程。通常在透气性容器中，使用包含若干组分(包括饲养细胞、细胞因子源和抗CD3抗体)的培养基，来完成第二次扩增。在一些实施方式中，第二次扩增可以包括按比例扩增(scaling-up)以增加第二次扩增所得TIL的数量。
在一个实施方式中，可以使用本公开的方法在透气性容器中进行REP和/或第二次扩增。例如，可以在白细胞介素2(IL-2)或白细胞介素-15(IL-15)的存在下，使用非特异性T细胞受体刺激来快速扩增TIL。非特异性T细胞受体刺激可包括，例如约30ng/mL的OKT-3，一种小鼠单克隆抗CD3抗体(可从Ortho-McNeil，力登，新泽西州或Miltenyi Biotech，奥本，加利福尼亚商购)。可选地在T细胞生长因子如300IU/mL IL-2或IL-15存在下，可以通过在体外用一种以上癌症抗原(包括其抗原性部分，例如表位)进一步刺激TIL来快速扩增TIL，该抗原可可选地由载体表达，例如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μM MART-L26-35(27L)或gp 100：209-217(210M)。其他合适的抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2，或其抗原性部分。也可以通过用表达HLA-A2的抗原呈递细胞脉冲的相同癌症抗原再刺激，来快速扩增TIL。或者，可以用例如经辐照的自体淋巴细胞或用经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2进一步再刺激TIL。
在一个实施方式中，细胞培养基还包含IL-2。在一个优选的实施方式中，细胞培养基包含约3000IU/mL的IL-2。在一个实施方式中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL，或约8000IU/mL的IL-2。在一个实施方式中，细胞培养基包含1000至2000IU/mL、2000至3000IU/mL、3000至4000IU/mL、4000至5000IU/mL、5000至6000IU/mL、6000至7000IU/mL、7000至8000IU/mL，或8000IU/mL的IL-2。
在一个实施方式中，细胞培养基包含OKT3抗体。在一个优选的实施方式中，细胞培养基包含约30ng/mL的OKT3抗体。在一个实施方式中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL的OKT3抗体。在一个实施方式中，细胞培养基包含0.1ng/mL至1ng/mL、1ng/mL至5ng/mL、5ng/mL至10ng/mL、10ng/mL至20ng/mL，20ng/mL至30ng/mL、30ng/mL至40ng/mL、40ng/mL至50ng/mL、50ng/mL至100ng/mL的OKT3抗体。
在一些实施方式中，在如本文所述的步骤D过程的第二次扩增期间，IL-2、IL-7、IL-15和IL-21以及它们的组合可以包括在内。
在一些实施方式中，第二次扩增可在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞的补充细胞培养基中进行。
在一些实施方式中，抗原呈递饲养细胞(APC)是PBMC。在一个实施方式中，在快速扩增和/或第二次扩增中，TIL比PBMC和/或抗原呈递细胞的比率为约1：25、约1：50、约1：100、约1：125、约1：150、约1：175、约1：200、约1：225、约1：250、约1：275、约1：300、约1：325、约1：350、约1：375、约1：400，或约1：500。在一个实施方式中，在快速扩增和/或第二次扩增中，TIL比PBMC的比率为1：50至1：300。在一个实施方式中，在快速扩增和/或第二次扩增中，TIL比PBMC的比率为1：100至1：200。
在一个实施方式中，REP和/或第二次扩增在烧瓶中进行，其中，大量TIL与100或200倍过量的灭活饲养细胞、30mg/mL的OKT3抗CD3抗体和3000IU/mL的IL-2混合于150mL培养基中。进行培养基更换(通常通过吸入新鲜培养基替换2/3培养基)，直至细胞转移至替代生长室。如下文更充分讨论的，替代生长室包括G-REX烧瓶和透气性容器。
在一些实施方式中，如实施例和附图中所讨论的，第二次扩增(也称为REP过程)缩短为7至14天。在一些实施方式中，第二次扩增缩短为11天。
在一个实施方式中，REP和/或第二次扩增可以使用如前所述的T-175烧瓶和透气袋(Tran等，J.I mmunother.，2008，31，742-51；Dudley等，J.I mmunother.，2003，26，332-42)或透气性培养器具(G-REX烧瓶)进行。对于T-175烧瓶中的快速扩增和/或第二次扩增，可以将悬浮于150mL培养基中的1×106个TIL添加至各个T-175烧瓶中。TIL可以在CM和AFM-V培养基的1：1混合物中培养，培养基补充有3000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3。T-175烧瓶可以在37℃、5％CO2中孵育。在第5天，可以使用含有3000IU/mL IL-2的50/50培养基更换一半培养基。在第7天，可以将来自两个T-175烧瓶的细胞合并在3L袋中，将300mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM V添加至300mL TIL悬液中。每天或每2天对各个袋中的细胞数量进行计数，并添加新鲜培养基以使细胞计数保持为0.5×106至2.0×106个细胞/mL。
在一个实施方式中，可以在容量为500mL、透气性硅底为100cm2的透气性烧瓶(G-REX 100，可从Wilson Wolf Manufacturing Corporation，新布莱顿，明尼苏达州，美国商购)中进行REP和/或第二次扩增，5×106或10×106个TIL可以与PBMC一起培养在400mL的50/50培养基中，培养基补充有5％人AB血清、3000IU/mL IL-2和30ng/mL抗CD3(OKT3)。G-REX100烧瓶可以在37℃、5％CO2中孵育。在第5天，可以取出250mL上清液并置于离心瓶中并以1500rpm(491×g)离心10分钟。可以用150mL含有5％人AB血清、3000IU/mL的IL-2的新鲜培养基重新悬浮TIL沉淀，并加回到原来的G-REX 100烧瓶中。当TIL在G-REX 100烧瓶中连续扩增时，在第7天，可以将各个G-REX 100中的TIL悬浮于各个烧瓶中存在的300mL培养基中，并且可以将细胞悬液分成可用于接种3个G-REX 100烧瓶的3个100mL等分试样。然后可以向各个烧瓶中添加150mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V。G-REX 100烧瓶可以在37℃、5％CO2中孵育，4天后，可以向各个G-REX 100烧瓶中添加150mL含有3000IU/mL IL-2的AIM-V。可以在培养的第14天收获细胞。
在一个实施方式中，REP和/或第二次扩增在烧瓶中进行，其中，大量TIL与100或200倍过量的灭活饲养细胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体和3000IU/mL IL-2混合于150mL培养基中。进行培养基更换(通常通过吸入新鲜培养基替换2/3培养基)，直至细胞转移至替代生长室。如下文更充分讨论的，替代生长室包括GRex烧瓶和透气性容器。
在一个实施方式中，进行REP和/或第二次扩增，还包括选择肿瘤反应性优异的TIL的步骤。可以使用本领域已知的任何选择方法。例如，美国专利申请公开号2016/0010058A1所述的方法(其公开内容通过引用并入本文)可用于选择肿瘤反应性优异的TIL。
可以使用如前所述的T-175烧瓶和透气袋(Tran KQ、Zhou J、Durflinger KH等，2008，J.I mmunother.，31：742-751和Dudley ME、Wunderlich JR、Shelton TE等，2003，J.Immunother.，26：332-342)或透气性G-REX烧瓶，进行TIL的REP和/或第二次扩增。在一些实施方式中，使用烧瓶进行REP和/或第二次扩增。在一些实施方式中，使用透气的G-Rex烧瓶进行REP。对于T-175烧瓶中的TIL REP和/或第二次扩增，将约1×106个TIL悬浮于约150mL培养基中，将它加至各个T-175烧瓶中。将TIL与经辐照的(50Gy)同种异体PBMC(作为“饲养”细胞)以1：100比率一起培养，将细胞在CM和AIM-V培养基的1：1混合物(50/50培养基)中培养，培养基补充有3000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3。将T-175烧瓶在37℃、5％CO2中孵育。在一些实施方式中，在第5天，使用含有3000IU/mL IL-2的50/50培养基更换一半培养基。在一些实施方式中，在第7天，将来自2个T-175烧瓶的细胞合并于3L袋中，将300mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V添加至300mL TIL悬液中。可以每天或每2天对各个袋中的细胞数量进行计数，并且可以添加新鲜培养基以使细胞计数保持为约0.5×106至约2.0×106个细胞/mL。
对于在具有100cm2透气性硅底的500mL容量的烧瓶(G-REX 100，WilsonWolf)中的TIL REP和/或第二次扩增，将约5×106或10×106个TIL与经辐照同种异体PBMC以1：100的比率在400mL的50/50培养基中培养，该50/50培养基补充有3000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3。将G-REX 100烧瓶在37℃、5％CO2中孵育。在一些实施方式中，在第5天，取出250mL上清液并置于离心瓶中并以1500rpm(491g)离心10分钟。然后可以用150mL含有3000IU/mL的IL-2的新鲜50/50培养基重新悬浮浮TIL沉淀，并加回到原来的G-REX 100烧瓶中。在TIL在G-REX 100烧瓶中连续扩增的实施方式中，在第7天，将各个G-REX 100中的TIL悬浮于各个烧瓶中存在的300mL培养基中，将细胞悬液分成用于接种3个G-REX 100烧瓶的3个100mL等分试样。然后向各个烧瓶中添加150mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V。G-REX100烧瓶在37℃、5％CO2中孵育，4天后，向各个G-REX 100烧瓶中添加150mL含有3000IU/mLIL-2的AIM-V。在培养的第14天收获细胞。
1、饲养细胞和抗原呈递细胞
在一个实施方式中，在REP TIL扩增期间和/或在第二次扩增期间，本文所述的第二次扩增程序(步骤D，包括REP)需要过量的饲养细胞。在许多实施方式中，饲养细胞是从健康献血者的标准全血单位获得的外周血单核细胞(PBMC)。使用标准方法(如Ficoll-Paque梯度分离)获得PBMC。
通常，同种异体PBMC通过辐照或热处理被灭活并用于REP步骤，如实施例(特别是实施例14)所述，它提供了评估经辐照的同种异体PBMC的复制机能不全(replicationincompetence)的示例性方案。
在一些实施方式中，如果第14天的活细胞总数小于在REP的第0天和/或第二次扩增的第0天(即第二次扩增的开始日)投入培养的初始活细胞数，则认为PBMC复制机能不全并接受PBMC用于本文所述的TIL扩增步骤。
在一些实施方式中，如果与REP的第0天和/或第二次扩增的第0天(即第二次扩增的开始日)投入培养的初始活细胞数相比，在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数在第7天和第14天没有增加，则认为PBMC复制机能不全，并接受PBMC用于本文所述的TIL扩增步骤。在一些实施方式中，在30ng/mL OKT3抗体和3000IU/mL IL-2的存在下培养PBMC。
在一些实施方式中，如果与REP的第0天和/或第二次扩增的第0天(即第二次扩增的开始日)投入培养的初始活细胞数相比，在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数在第7天和第14天没有增加，则认为PBMC复制机能不全，并接受PBMC用于本文所述的TIL扩增步骤。在一些实施方式中，在5-60ng/mL OKT3抗体和1000-6000IU/mL IL-2的存在下培养PBMC。在一些实施方式中，在10-50ng/mL的OKT3抗体和2000-5000IU/mL的IL-2的存在下培养PBMC。在一些实施方式中，在20-40ng/mL OKT3抗体和2000-4000IU/mL IL-2的存在下培养PBMC。在一些实施方式中，在25-35ng/mL OKT3抗体和2500-3500IU/mL IL-2的存在下培养PBMC。
在一个实施方式中，在REP阶段中，人工抗原呈递细胞用作PBMC的替代物或与PBMC组合。
2、细胞因子
如本领域已知，本文所述的扩增方法通常使用含有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基。
或者，另外可以使用细胞因子的组合进行TIL的快速扩增和/或第二次扩增；其中，IL-2、IL-15和IL-21中的两种以上的组合如美国专利申请公开号US 2017/0107490 A1、国际公开号WO 2015/189356、美国专利申请公开号US 2017/0107490 A1和国际公开号WO2015/189357中概述的那样，其各自的全部内容通过引用明确并入本文。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21，以及IL-2、IL-15和IL-21，发现后者在许多实施方式中特别有用。使用细胞因子的组合特别有利于淋巴细胞(特别是如本文所述的T细胞)的产生。
3、抗CD3抗体
在一些实施方式中，本文所述的扩增方法(包括REP)中使用的培养基还包含抗CD3抗体。与IL-2组合的抗CD3抗体诱导TIL群的T细胞活化和细胞分裂。用全长抗体以及Fab和F(ab′)2片段可以看到此种效果，前者通常是优选的；例如，参见Tsoukas等，J.I mmunol.，1985，135，1719，其全部内容通过引用并入本文。
如本领域技术人员将理解的，有许多可用于本发明的合适的抗人CD3抗体，包括抗人CD3多克隆和来自各种哺乳动物的单克隆抗体，包括但不限于鼠、人类、灵长类动物、大鼠和犬类抗体。在具体实施方式中，使用OKT3抗CD3抗体(可从Ortho-McNeil，力登，新泽西州或Miltenyi Biotech，奥本，加利福尼亚商购)。
E、步骤E：收获TIL
在第二次扩增步骤之后，可以收获细胞。在一些实施方式中，在1、2、3、4或更多个第二次扩增步骤之后收获TIL。
可以以任何适当且无菌的方式收获TIL，包括例如通过离心。收获TIL的方法是本领域熟知的，并且任何这样的已知方法可以与本发明方法一起使用。在一些实施方式中，使用自动化系统收获TIL。在一些实施方式中，TIL是使用半自动系统的收获物。在一些实施方式中，使用半自动系统收获TIL。在一些实施方式中，使用半自动化机器收获第二次扩增的TIL。在一些实施方式中，使用LOVO系统(例如，可从Benchmark Electronics商购)。在一些实施方式中，收获步骤包括洗涤TIL、配制TIL和/或等分TIL。在一些实施方式中，可选地，细胞在收获后或作为收获的一部分进行冷冻。
F、步骤F：最终制剂/转移至输液袋
在步骤A至E完成后，将细胞转移至容器中以用于给患者施用。
在一个实施方式中，使用本公开的APC扩增的TIL作为药物组合物施用于患者。在一个实施方式中，药物组合物是TIL在无菌缓冲液中的悬液。使用本公开的PBMC扩增的TIL可以通过本领域已知的任何合适的途径施用。在一个实施方式中，T细胞以单次动脉内输注或静脉内输注的方式给药，输注优选持续约30至60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内。
G、另外的扩增步骤
可以理解，上述步骤A至F中的任何步骤可以重复任何次数，并且可以另外以与上述不同的顺序进行。
在一些实施方式中，可以在最终配制步骤F之前重复一个以上的扩增步骤。这些另外的扩增步骤可以包括上述第一次扩增和/或第二次扩增步骤中的要素(例如，包括在细胞培养基中所描述的组分)。另外的扩增步骤可以进一步包括另外的要素，包括细胞培养基中另外的组分，所述另外的组分在另外的扩增步骤之前和/或期间补充到细胞培养基中。
在其他实施方式中，可以在图23和上述段落中所述的任何扩增步骤之前或之后进行冷冻保存步骤，在该冷冻保存步骤中使用本领域已知的储存方法来保存扩增步骤中产生的细胞，直至制备/扩增过程的剩余步骤需要。
TIL、MIL和PBL的药物组合物、剂量和给药方案
在一个实施方式中，将使用本公开方法扩增的TIL作为药物组合物施用于患者。在一个实施方式中，药物组合物是无菌缓冲液中的TIL悬液。使用本公开的方法扩增的TIL可以通过本领域已知的任何合适途径施用。优选地，TIL以单次动脉内输注或静脉内输注的方式施用，输注优选持续约30至60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
可以施用任何合适剂量的TIL。优选地，特别是当癌是血液恶性肿瘤时，施用约2.3×1010至约13.7×1010个TIL，平均约7.8×1010个TIL。在一个实施方式中，施用约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的数量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013，以及9×1013。在一个实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL数量为1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012，以及5×1012至1×1013。在本发明的一个实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的数量为约4×108至约2.5×109。在另一个实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的数量为9.5×108。在另一个实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的数量为4.1×108。在另一个实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的数量为2.2×109。
在本发明的一个实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的数量为：约0.1×109至约15×109个TIL、约0.1×109至约15×109个TIL、约0.12×109至约12×109个TIL、约0.15×109至约11×109个TIL、约0.2×109至约10×109个TIL、约0.3×109至约9×109个TIL、约0.4×109至约8×109个TIL、约0.5×109至约7×109个TIL、约0.6×109至约6×109个TIL、约0.7×109至约5×109个TIL、约0.8×109至约4×109个TIL、约0.9×109至约3×109个TIL或约1×109至约2×109个TIL。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度小于药物组合物的例如100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度大于药物组合物的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19.75％、19.50％、19.25％、19％、18.75％、18.50％、18.25％、18％、17.75％、17.50％、17.25％、17％、16.75％、16.50％、16.25％、16％、15.75％、15.50％、15.25％、15％、14.75％、14.50％、14.25％、14％、13.75％、13.50％、13.25％13％、12.75％、12.50％、12.25％、12％、11.75％、11.50％、11.25％、11％、10.75％、10.50％、10.25％、10％、9.75％、9.50％、9.25％、9％、8.75％、8.50％、8.25％、8％、7.75％、7.50％、7.25％、7％、6.75％、6.50％、6.25％、6％、5.75％、5.50％、5.25％、5％、4.75％、4.50％、4.25％、4％、3.75％、3.50％、3.25％、3％、2.75％、2.50％、2.25％、2％、1.75％、1.50％、125％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度范围为药物组合物的约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％或约1％至约10％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度范围为药物组合物的约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、约0.1％至约0.9％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的量等于或小于10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g或0.0001g。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的量大于0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5g、3g、3.5g、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g或10g。
本发明的药物组合物中提供的TIL在宽的剂量范围内有效。精确的剂量取决于施用途径、施用化合物的形式、待治疗对象的性别和年龄、待治疗对象的体重，以及主治医师的偏好和经验。如果合适，也可以使用临床确定的TIL剂量。使用本文方法施用的药物组合物的量，例如TIL的剂量，将取决于所治疗的人或哺乳动物、病症或病症的严重程度、施用率、活性药物成分的配置和处方医生的自由裁量权。
在一些实施方式中，TIL可以单剂量施用。此种施用可以通过注射，例如静脉内注射。在一些实施方式中，TIL可以多剂量施用。剂量可以是每年一次、两次、三次、四次、五次、六次或超过六次。剂量可以是每月一次、每两周一次、每周一次或每2天一次。只要有必要，TIL的施用可以继续。
在一些实施方式中，TIL的有效剂量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013，以及9×1013。在一些实施方式中，TIL的有效剂量的范围为1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012，以及5×1012至1×1013。
在本发明的一个实施方式中，对急性髓性白血病(AML)患者有用的MIL的临床剂量为约4×108至约2.5×109个MIL。在另一个实施方式中，本发明的药物组合物中提供的MIL的数量为9.5×108个MIL。在另一个实施方式中，本发明的药物组合物中提供的MIL的数量为4.1×108。在另一个实施方式中，本发明的药物组合物中提供的MIL的数量为2.2×109。
在一些实施方式中，TIL的有效剂量的范围为约0.01mg/kg至约4.3mg/kg、约0.15mg/kg至约3.6mg/kg、约0.3mg/kg至约3.2mg/kg、约0.35mg/kg至约2.85mg/kg、约0.15mg/kg至约2.85mg/kg、约0.3mg至约2.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1.7mg/kg、约0.15mg/kg至约1.3mg/kg、约0.3mg/kg至约1.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1mg/kg、约0.55mg/kg至约0.85mg/kg、约0.65mg/kg至约0.8mg/kg、约0.7mg/kg至约0.75mg/kg、约0.7mg/kg至约2.15mg/kg、约0.85mg/kg至约2mg/kg、约1mg/kg至约1.85mg/kg、约1.15mg/kg至约1.7mg/kg、约1.3mg/kg至约1.6mg/kg、约1.35mg/kg至约1.5mg/kg、约2.15mg/kg至约3.6mg/kg、约2.3mg/kg至约3.4mg/kg、约2.4mg/kg至约3.3mg/kg、约2.6mg/kg至约3.15mg/kg、约2.7mg/kg至约3mg/kg、约2.8mg/kg至约3mg/kg，或约2.85mg/kg至约2.95mg/kg。
在一些实施方式中，TIL的有效剂量的范围为约1mg至约500mg、约10mg至约300mg、约20mg至约250mg、约25mg至约200mg、约1mg至约50mg、约5mg至约45mg、约10mg至约40mg、约15mg至约35mg、约20mg至约30mg、约23mg至约28mg、约50mg约150mg、约60mg至约140mg、约70mg至约130mg、约80mg至约120mg、约90mg至约110mg、约95mg至约105mg、约98mg至约102mg、约150mg至约250mg、约160mg至约240mg、约170mg至约230mg、约180mg至约220mg、约190mg至约210mg、约195mg至约205mg，或约198至约207mg。
有效量的TIL可以通过具有类似用途的药剂的任何可接受的施用方式以单剂量或多剂量施用，包括鼻内和透皮途径，通过动脉内注射、静脉内、腹膜内、肠胃外、肌内、皮下、局部，通过移植或直接注射到肿瘤中或通过吸入。
治疗癌症的方法
上述TIL、PBL和/或MIL(及它们的群)的组合物和组合可用于治疗过度增殖性疾病的方法。在一个优选的实施方式中，它们用于治疗癌症。在一个优选的实施方式中，本发明提供了一种治疗癌症的方法，其中，癌症是血液恶性肿瘤，例如液体肿瘤。在一个优选的实施方式中，本发明提供了一种治疗癌症的方法，其中，癌症是选自下组的血液恶性肿瘤：急性髓性白血病(AML)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞(ABC)DLBCL、生发中心B细胞(GCB)DLBCL、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞性白血病(SLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、复发性和/或难治性霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、伯基特淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症(WM)、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化、慢性粒细胞白血病、滤泡中心性淋巴瘤、惰性NHL、人类免疫缺陷病毒(HIV)相关性B细胞淋巴瘤，以及EB病毒(EBV)相关性B细胞淋巴瘤。
在一个实施方式中，本发明提供了一种治疗癌症的方法，其中，癌症是对PD-1和/或PD-L1抑制剂(包括派姆单抗(pembrolizumab)、尼沃鲁单抗(nivolumab)、度伐鲁单抗(durvalumab)、阿维鲁单抗(avelumab)或阿特利珠单抗(atezolizumab))的治疗有反应的血液恶性肿瘤。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，该方法包括以下步骤：
(a)通过切除、活检、针吸或单采从患者获得肿瘤，该肿瘤包含第一TIL群；
(b)可选地，碎片化或解离肿瘤，获得肿瘤碎片，并且使肿瘤碎片与第一细胞培养基接触；
(c)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少5倍；其中，第一细胞培养基包含IL-2；
(d)在第二细胞培养基中对第二TIL群进行第二次扩增，获得第三TIL群；其中，第二次扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量高至少50倍；其中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)和经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)；并且其中，第二次扩增进行14天以下；
(e)收获第三TIL群；以及
(f)给癌症患者施用治疗有效份的第三TIL群；
其中，肿瘤是液体肿瘤；并且其中，癌症是血液恶性肿瘤。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，该方法包括以下步骤：
(a)通过切除、活检、针吸或单采从患者获得肿瘤，该肿瘤包含第一TIL群；
(b)可选地，碎片化或解离肿瘤，获得肿瘤碎片，并且使肿瘤碎片与第一细胞培养基接触；
(c)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少5倍；其中，第一细胞培养基包含IL-2；
(d)在第二细胞培养基中对第二TIL群进行第二次扩增，获得第三TIL群；其中，第二次扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量高至少50倍；其中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)和经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)；并且其中，第二次扩增进行14天以下；
(e)收获第三TIL群；以及
(f)给癌症患者施用治疗有效份的第三TIL群；
其中，肿瘤是液体肿瘤；并且其中，癌症是选自下组的血液恶性肿瘤：急性髓性白血病(AML)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞(ABC)DLBCL、生发中心B细胞(GCB)DLBCL、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞性白血病(SLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、复发性和/或难治性霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、伯基特淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症(WM)、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化、慢性粒细胞白血病、滤泡中心性淋巴瘤、惰性NHL、人类免疫缺陷病毒(HIV)相关性B细胞淋巴瘤，以及EB病毒(EBV)相关性B细胞淋巴瘤。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，该方法包括以下步骤：
(a)用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案对患者进行预治疗；
(b)通过切除、活检、针吸或单采从患者获得肿瘤，该肿瘤包含第一TIL群；
(c)可选地，碎片化或解离肿瘤，获得肿瘤碎片，并且使肿瘤碎片与第一细胞培养基接触；
(d)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少5倍；其中，第一细胞培养基包含IL-2；
(e)在第二细胞培养基中对第二TIL群进行第二次扩增，获得第三TIL群；其中，第二次扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量高至少50倍；其中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)和经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)；并且其中，第二次扩增进行14天以下；
(f)收获第三TIL群；以及
(g)给癌症患者施用治疗有效份的第三TIL群；
其中，肿瘤是液体肿瘤；并且其中，癌症是血液恶性肿瘤。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗癌症的方法，该方法包括以下步骤：
(a)用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案对患者进行预治疗；
(b)通过切除、活检、针吸或单采从患者获得肿瘤，该肿瘤包含第一TIL群；
(c)可选地，碎片化或解离肿瘤，获得肿瘤碎片，并且使肿瘤碎片与第一细胞培养基接触；
(d)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群；其中，第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少5倍；其中，第一细胞培养基包含IL-2；
(e)在第二细胞培养基中对第二TIL群进行第二次扩增，获得第三TIL群；其中，第二次扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量高至少50倍；其中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)和经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)；并且其中，第二次扩增进行14天以下；
(f)收获第三TIL群；以及
(g)给癌症患者施用治疗有效份的第三TIL群；
其中，肿瘤是液体肿瘤；并且其中，癌症是选自下组的血液恶性肿瘤：急性髓性白血病(AML)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞(ABC)DLBCL、生发中心B细胞(GCB)DLBCL、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞性白血病(SLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、复发性和/或难治性霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、伯基特淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症(WM)、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化、慢性粒细胞白血病、滤泡中心性淋巴瘤、惰性NHL、人类免疫缺陷病毒(HIV)相关性B细胞淋巴瘤，以及EB病毒(EBV)相关性B细胞淋巴瘤。
在本发明的一个实施方式中，根据本发明，TIL使用MIL方法1扩增并施用于患者。
在本发明的一个实施方式中，根据本发明，TIL使用MIL方法2扩增并施用于患者以治疗癌症。
在本发明的一个实施方式中，根据本发明，TIL使用MIL方法3扩增并施用于患者以治疗癌症。
在本发明的一个实施方式中，根据本发明，给患者施用使用MIL方法1、MIL方法2或MIL方法3扩增的TIL以治疗AML。
在本发明的一个实施方式中，根据本发明，TIL使用PBL方法2扩增并施用于患者以治疗癌症。
在本发明的一个实施方式中，根据本发明，TIL使用PBL方法2扩增并施用于患者以治疗癌症。
在本发明的一个实施方式中，根据本发明，TIL使用PBL方法2扩增并施用于患者以治疗癌症。
在本发明的一个实施方式中，根据本发明，给患者施用使用PBL方法1、PBL方法2或PBL方法3扩增的TIL以治疗CLL。
在本发明的任何前述实施方式中，描述了使用激酶抑制剂的预治疗。在一个实施方式中，激酶抑制剂选自：伊马替尼(imatinib)、达沙替尼、依鲁替尼、博舒替尼、尼洛替尼、厄洛替尼或本领域已知的其他激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂或丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂。在一个实施方式中，使用激酶抑制物的预治疗方案是本领域已知的和/或由医师所处方的。
在本发明的任何前述实施方式中，描述了使用IL-2诱导型T细胞激酶(ITK)抑制剂的预治疗。白介素2诱导型T细胞激酶(ITK)是在T细胞中表达的非受体酪氨酸激酶，它调节多种通路。本领域已知的任何ITK抑制剂均可用于本发明的实施方式中(参见例如，Lo等，Expert Opinion on Therapeutic Patents，20：459-469(2010)；Vargas等，ScandinavianJournal of Immunology，78(2)：130-139(2013)；WO2015112847；WO2016118951；WO2007136790；US20120058984A1，以及美国专利号9,531,689和9,695,200；其全部内容通过引用并入本文)。在本发明的一个实施方式中，ITK抑制剂是共价且不可逆地结合至ITK的共价ITK抑制剂。在本发明的一个实施方式中，ITK抑制剂是与ITK结合的别构ITK抑制剂。在本发明的一个实施方式中，ITK抑制剂选自：氨基噻唑类ITK抑制剂、5-氨甲基苯并咪唑类ITK抑制剂、3-氨基吡啶-2-酮类ITK抑制剂、(4-或5-芳基)吡唑基吲哚类ITK抑制剂、苯并咪唑类ITK抑制剂、氨基苯并咪唑类ITK抑制剂、氨基嘧啶类ITK抑制剂、氨基吡啶类ITK抑制剂、重氮唑二嗪(diazolodiazine)类ITK抑制剂、三唑类ITK抑制剂、3-氨基吡啶-2-酮类ITK抑制剂、吲哚基吲唑类ITK抑制剂、吲哚类ITK抑制剂、氮杂吲哚类TK抑制剂、吡唑基吲哚类抑制剂、噻吩并吡唑类ITK抑制剂、杂环ITK抑制剂，以及靶向ATP口袋中半胱氨酸442的ITK抑制剂(例如依鲁替尼)、氮杂苯并咪唑类ITK抑制剂、苯并噻唑类ITK抑制剂、吲哚类ITK抑制剂、吡啶酮类ITK抑制剂、亚磺酰亚胺(sulfoximine)取代的嘧啶类ITK抑制剂、芳基吡啶酮类ITK抑制剂，以及本领域已知的任何其他ITK抑制剂。在本发明的一个实施方式中，使用ITK抑制剂的预治疗方案是本领域已知的和/或如医师所处方的。在本发明的一个实施方式中，ITK抑制剂选自：
Figure BDA0002348881650000731
依鲁替尼、BMS509744、
Figure BDA0002348881650000742
CTA056、
Figure BDA0002348881650000743
GSK2250665A、
Figure BDA0002348881650000751
PF06465469、
Figure BDA0002348881650000752
Figure BDA0002348881650000753
Figure BDA0002348881650000761
Figure BDA0002348881650000771
Figure BDA0002348881650000781
Figure BDA0002348881650000791
Figure BDA0002348881650000821
及它们的组合。在本发明的一个实施方式中，ITK抑制剂选自：伊马替尼、达沙替尼(BMS-354825)、Sprycel(N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-(6-(4-(2-羟乙基)-哌嗪-1-基)-2-甲基-嘧啶-4-基氨基)噻唑-5-羧酰胺)、依鲁替尼(1-{(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-哌啶基}-2-丙烯-1-酮)、博舒替尼、尼洛替尼、厄洛替尼、1H-吡唑并[4,3-c]噌啉-3-醇、CTA056(7-苄基-1-(3-(哌啶-1-基)丙基)-2-(4-(吡啶-4-基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-g]喹喔啉-6(5H)-酮)、化合物10(勃林格殷格翰公司，Moriarty等，Bioorg Med Chem Lett.,18:5537-40(2008))、化合物19(勃林格殷格翰公司，Moriarty等，Bioorg Med Chem Lett.,18:5537-40(2008))、化合物27(勃林格殷格翰公司，Moriarty等，Bioorg Med Chem Lett.,18:5537-40(2008))、化合物26(勃林格殷格翰公司，Winters等，Bioorg Med Chem Lett.,18:5541-40(2008))、化合物37(勃林格殷格翰公司，Cook等，Bioorg Med Chem Lett.,19:773-7(2009))、化合物41(勃林格殷格翰公司，Cook等，BioorgMed Chem Lett.,19:773-7(2009))、化合物48(勃林格殷格翰公司，Cook等，Bioorg MedChem Lett.,19:773-7(2009))、化合物51(勃林格殷格翰公司，Cook等，Bioorg Med ChemLett.,19:773-7(2009))、化合物10n(勃林格殷格翰公司，Riethe等，Bioorg Med ChemLett.,19:1588-91(2009))、化合物10o(勃林格殷格翰公司，Riethe等，Bioorg Med ChemLett.,19:1588-91(2009))、化合物7v(Vertex公司，Charrier等，J Med Chem.,54:2341-50(2011))、化合物7w(Vertex公司，Charrier等，J Med Chem.,54:2341-50(2011))、化合物7x(Vertex公司，Charrier等，J Med Chem.,54:2341-50(2011))、化合物7y(Verrier公司，Charrier等，J Med Chem.,54:2341-50(2011))、化合物44(拜耳先灵医药，vonBonin等，ExpDermatol.,20:41-7(2011))、化合物13(奈科明公司，Velankar等，Bioorg Med Chem.,18:4547-59(2010))、化合物24(奈科明公司，Velankar等，Bioorg Med Chem.,18:4547-59(2010))、化合物34(奈科明公司，Velankar等，Bioorg Med Chem.,18:4547-59(2010))、化合物10o(奈科明公司，Herdemann等，Bioorg Med Chem Lett.,21:1852-6(2011))、化合物3(美国赛诺菲，McLean等，Bioorg Med Chem Lett.,22:3296-300(2012))、化合物7(美国赛诺菲，McLean等，Bioorg Med Chem Lett.,22:3296-300(2012))，和/或本领域已知的其他激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂或丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，以及它们的任何组合。
在任何前述实施方式中，包含依鲁替尼(可作为IMBRUVICA商购，其化学名称为1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮)的预治疗方案可包括：一日一次(q.d.)口服施用1个140mg胶囊、一日一次(q.d.)口服施用2个140mg胶囊、一日一次(q.d.)口服施用3个140mg胶囊口服，或一日一次(q.d.)口服施用4个140mg胶囊，持续时间为约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、2个星期、3个星期、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月。在前述实施方式中，包含依鲁替尼的预治疗方案还可以包括口服施用选自下组剂量的依鲁替尼：25mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg和500mg；其中，施用频率为每天一次、每天两次、每天三次或每天四次；并且其中，施用的持续时间选自约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、2个星期、3个星期、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月和6个月。
在任何前述实施方式中，待治疗癌症是选自下组的血液恶性肿瘤：急性髓性白血病(AML)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞(ABC)DLBCL、生发中心B细胞(GCB)DLBCL、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞性白血病(SLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、复发性和/或难治性霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、伯基特淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症(WM)、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化、慢性粒细胞白血病、滤泡中心性淋巴瘤、惰性NHL、人类免疫缺陷病毒(HIV)相关性B细胞淋巴瘤，以及EB病毒(EBV)相关性B细胞淋巴瘤。
可以使用本领域已知的各种动物模型来检测本文所述方法和组合物在治疗、预防和/或控制所示疾病或病症方面的疗效。
采用化疗的非清髓性淋巴细胞耗竭
在一个实施方式中，本发明提供了用TIL群治疗癌症的方法，其中，根据本公开内容，在输注TIL之前用非清髓性化疗对患者进行预治疗。在一个实施方式中，非清髓性化疗为一种以上的化学治疗剂。在一个实施方式中，非清髓性化疗为施用环磷酰胺60mg/kg/天，持续2天(TIL输注前第27和26天)和氟达拉滨25mg/m2/天，持续5天(TIL输注前第27至23天)。在一个实施方式中，在根据本公开内容的非清髓性化疗和TIL输注(在第0天)后，患者以720,000IU/kg每8小时接受一次IL-2的静脉输注，直至生理耐受。
实验结果表明，过继转移肿瘤特异性T淋巴细胞之前的淋巴细胞耗竭通过消除调节性T细胞和免疫系统的竞争成分(“细胞因子沉降(cytokine sinks)”)而在提高治疗疗效中起关键作用。因此，本发明的一些实施方式在引入本发明的TIL之前对患者使用淋巴细胞耗竭步骤(有时也称为“免疫抑制调节”)。
通常，通过施用氟达拉滨或环磷酰胺(活性形式称为马磷酰胺)及它们的组合来实现淋巴细胞耗竭。此种方法描述于Gassner等，Cancer I mmunol I mmunother.2011，60，75–85；Muranski等，Nat.Clin.Pract.Oncol.，2006，3，668–681、Dudley等；J.Clin.Oncol.2008，26，5233-5239和Dudley等，J.Clin.Oncol.2005，23，2346–2357，所有这些文献都通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，氟达拉滨以0.5μg/mL至10μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方式中，氟达拉滨以1μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方式中，氟达拉滨治疗施用1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更长时间。在一些实施方式中，氟达拉滨以10mg/kg/天、15mg/kg/天、20mg/kg/天、25mg/kg/天、30mg/kg/天、35mg/kg/天、40mg/kg/天或45mg/kg/天的剂量施用。在一些实施方式中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天的剂量施用2至7天。在一些实施方式中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天的剂量施用4至5天。在一些实施方式中，氟达拉滨治疗以25mg/kg/天的剂量施用4至5天。
在一些实施方式中，通过施用环磷酰胺获得0.5μg/mL至10μg/mL浓度的马磷酰胺(环磷酰胺的活性形式)。在一些实施方式中，通过施用环磷酰胺获得1μg/mL浓度的马磷酰胺(活性形式的环磷酰胺)。在一些实施方式中，环磷酰胺治疗施用1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更长时间。在一些实施方式中，环磷酰胺以100mg/m2/天、150mg/m2/天、175mg/m2/天、200mg/m2/天、225mg/m2/天、250mg/m2/天、275mg/m2/天或300mg/m2/天的剂量施用。在一些实施方式中，静脉(即i.v.)施用环磷酰胺。在一些实施方式中，环磷酰胺治疗以35mg/kg/天的剂量施用2至7天。在一些实施方式中，环磷酰胺治疗以250mg/m2/天的剂量静脉施用4至5天。在一些实施方式中，环磷酰胺治疗以250mg/m2/天的剂量静脉施用4天。
在一些实施方式中，通过将氟达拉滨和环磷酰胺一起施用于患者来进行淋巴细胞耗竭。在一些实施方式中，氟达拉滨以25mg/m2/天的剂量静脉施用且环磷酰胺以250mg/m2/天的剂量静脉施用，持续4天。
在一个实施方式中，通过以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨5天来进行淋巴细胞耗竭。本文描述了几种扩增获自骨髓或外周血的TIL的方法。在本发明的一个实施方式中，通过以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨5天来进行淋巴细胞耗竭。本文描述了几种扩增获自骨髓或外周血的TIL的方法。
实施例
现在参考以下实施例描述本文包括的实施方式。提供这些实施例仅用于说明的目的，并且本文包括的公开内容决不应被解释为限于这些实施例，而是应该被解释为包括根据本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化。
实施例1.扩增来自非霍奇金淋巴瘤的TIL
从具有图1所示病理学的5种非霍奇金淋巴瘤肿瘤(1种套细胞淋巴瘤肿瘤、3种滤泡性淋巴瘤肿瘤和1种ABC型弥漫性大B细胞淋巴瘤肿瘤)扩增TIL，其中在pre-REP阶段使用IL-2进行11到14天，然后使用IL-2、促有丝分裂的抗CD3抗体和经辐照的同种异体外周血单核细胞(PBMC)饲养细胞进行随后的REP 14天。从所有5种淋巴瘤肿瘤中都成功产生TIL，其中最大扩增指数为680倍，该扩增倍数显著高于使用其他方法先前所观察到的扩增倍数。Schwartzentruber等，Blood 1993，82，1204-1211。此外，平均CD3+ T细胞群为95％(相对于使用Schwartzentruber等，Blood 1993，82，1204-1211方法的75％)。
使用Becton，Dickinson&Co.(BD)FACS CANTO II系统进行细胞分选和流式细胞术。通过流式细胞术分析观察到了与黑色素瘤TIL中相当的效应记忆细胞的显著相对增加(图2)。与黑色素瘤TIL培养物相比，在淋巴瘤中观察到效应记忆CD45RA+(TEMRA)细胞(p＝0.0013；CD4，CD8)和CD28+CD4+(p＝0.008)亚群的显著增加(图3)。
图4和图5分别显示了CD4+和CD8+亚群中T细胞分化的表型标志物的比较。图6和图7分别显示了CD4+和CD8+亚群中T细胞耗竭的表型标志物的比较。
图8显示了非霍奇金淋巴瘤TIL和黑色素瘤TIL的细胞类型的比较。据显示，与黑色素瘤TIL相比，淋巴瘤TIL中CD4+ T细胞数量呈增加趋势。
图9显示了生物发光重定向裂解测定(BRLA)结果。通过BRLA测量的TIL的最小溶细胞活性LU50/106：与黑色素瘤TIL(11-75LU50，4小时)相比，淋巴瘤TIL在4小时时为<1-6LU50，在24小时时为1-39LU50。
图10显示了淋巴瘤TIL与黑色素瘤TIL的干扰素-γ(IFN-γ)酶联免疫吸附测定(ELISA)结果。显示了可比的结果。淋巴瘤TIL的ELIspot测定结果示于图11，并与图12中黑色素瘤TIL的相同测定的结果进行比较。在ELIspot测定中，在用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯/离子霉素、抗CD3抗体或CD3/CD28/4-1BB磁珠刺激后，观察到淋巴瘤TIL产生了大量的IFN-γ；在这些条件下，一些淋巴瘤TIL产生的IFN-γ与黑色素瘤TIL产生的IFN-γ相当；在一些情况下，淋巴瘤TIL产生的IFN-γ要高很多。
图13显示了NANOSTRING NCOUNTER分析(Nanostring Technologies，Inc.，西雅图市，华盛顿州)的结果，显示与黑色素瘤TIL相比，淋巴瘤TIL表达更高水平的RORC IL17A(TH17表型)和GATA3(Th2表型)。此发现与淋巴瘤反应性T细胞主要是TH2和TH17的观察结果一致。
总言之，这些结果提供了TIL细胞疗法可用于治疗淋巴瘤患者的证据。
实施例2.从AML患者的骨髓生长的骨髓浸润淋巴细胞(MIL)和从AML患者的外周血 生长的外周血淋巴细胞(PBL)的表型和功能表征
从急性髓性白血病(AML)患者获得骨髓样品和相关的血液样品(如果可用)，急性髓性白血病(AML)患者包括经历至少三轮包含依鲁替尼(1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮)的方案预治疗的患者，并附有关于患者的年龄、性别、分期(stage)、肿瘤类型、癌症部位、治疗史、去识别化(de-identified)的病理报告以及进行的任何分子检测(例如，MSI表达和Raf/Ras表达)的信息。使用MIL方法1、MIL方法2或MIL方法3或者PBL方法1、PBL方法2或PBL方法3之一扩增MIL和PBL，并对MIL和PBL进行表型和功能表征。
图36A和36B显示了MIL和PBL的倍数扩增。图36A显示了3位患者(MIL1、MIL2、MIL3)的倍数扩增，图36B显示了患者2和3(PBL2、PBL3)的匹配的PBL的倍数扩增。使用MIL方法1扩增MIL1.1，使用MIL方法2扩增MIL1.2，使用MIL方法3扩增MIL1.3，使用PBL方法3扩增PBL。MIL1倍数扩增显示，MIL1中的各个样品增加：25倍(MIL1.1)、50倍(MIL1.2)和75倍(MIL1.3)。这初步证明，MIL方法3可能是优选的扩增方法。MIL2和MIL3倍数扩增数据似乎较差，可能是由于起始细胞数量低。为了进行比较，患者MIL1(MIL1.3)的样品3的起始细胞数量为138,000个细胞，而MIL2和MIL3的起始细胞数量分别为62,000和28,000。如图36B所示，MIL2和MIL3的PBL倍数扩增分别为约10倍和40倍，它们具有相似的起始细胞数量(PBL2为338,000，PBL3为336,000)。
图37A和37B显示了MIL(图37A)和匹配的PBL(图37B)的产生IFN-γ的细胞的数量。MIL1.3、MIL2和MIL3的IFN-γ分泌显著增加，表明MIL方法3是优选的扩增方法。PBL的数据尚无定论。
图38A-38F显示了MIL和PBL的TCRαβ+、CD4+和CD8+亚群。图38A和38D显示了使用所有3种方法(MIL1.1，MIL1.2，MIL1.3)扩增的MIL(图38A)和使用PBL方法3扩增的PBL(图38D)的TCRab+亚群。数据显示所有MIL和PBL的TCRαβ+亚群几乎占100％，这表明扩增过程成功地扩增了几乎所有T细胞。图38B和38E显示，通过MIL方法3扩增的MIL的CD4亚群减少了(这与图38C中的CD8亚群的增加有关)。图38E和38F中的PBL数据显示与MIL1.3数据一致。
图39A-D和40A-D显示了MIL(图39)和PBL(图40)中CD4亚群的数据。图39A和40A显示了幼稚(CCR7+/CD45RA+)的数据；图39B和40B显示了中枢记忆T细胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)的数据；图39C和40C显示了效应记忆T细胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)的数据；以及图39D和40D显示了终末分化的效应记忆细胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)的数据。使用MIL方法3(MIL1.3)和PBL方法3(PBL2和PBL3)扩增的所有样品均与比较物(黑色素瘤TIL)的CD4亚群一致。
图41A-D和42A-D显示了MIL(图41)和PBL(图42)中CD8亚群的数据。图41A和42A显示了幼稚(CCR7+/CD45RA+)的数据；图41B和图42B显示了中枢记忆T细胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)的数据；图41C和图42C显示了效应记忆T细胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)的数据；以及图41D和42D显示了终末分化的效应记忆细胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)的数据。使用MIL方法3(MIL1.3)扩增的样品与比较物(黑色素瘤TIL)的CD4亚群一致。PBL2和PBL3的数据用作对照。
图43A和43B显示了MIL(图43A)和PBL(图43B)的CD4CD27和CD8CD27亚群的数据。图44A和44B显示了MIL(图44A)和PBL(图44B)的CD4CD28和CD8CD28亚群的数据。显示了与黑色素瘤TIL相比，各个样品在扩增过程的第0天和第14天的PBL数据。仅显示了与黑色素瘤TIL相比，MIL1.3在第0天和第14天的MIL数据。MIL和PBL的CD28亚群与黑色素瘤TIL类似。
图45A和45B表示MIL(图45A)和PBL(图45B)的各个CD4和CD8亚群中的PD1+细胞的比较。图46A和46B表示MIL(图46A)和PBL(图46B)的各个CD4和CD8亚群的LAG3+细胞的比较。PD1+和LAG3+的数据显示，在第0天的测量中，MIL1.3样品显著降低；而在第0天，MIL1.1和MIL1.2显示趋向于PD1和LAG3均增加。PBL数据用作对照。
本实施例的实验表明，用MIL方法3扩增的MIL具有更高的倍数扩增、高功能性、更高比例的CD8亚群以及更少的LAG3+和PD1+T细胞亚群。数据还显示，记忆亚群与黑色素瘤TIL类似。数据还显示，与新鲜样品相比，冷冻保存的样品显示具有更高的倍数扩增。PBL样品的许多数据似乎尚无定论，可能是由于样品量小。
实施例3.扩增TIL和用扩增的TIL治疗癌症的方法
使用针吸法获得骨髓。将骨髓样品吸进含有肝素的注射器中，室温储存过夜。储存后，将注射器的内容物合并到无菌容器内，进行质量检测。使用淋巴细胞分离液(LSM)并用COBE Spectra进行离心，使骨髓中的单核细胞(MNC)富集。收集梯度中的细胞直到红细胞，使用HBSS进行洗涤。使用补充有2％HSA和5％DMSO的羟乙基淀粉类防冻剂对MNC进行冷冻保存，保留了一些MNC用于质量控制。对QC小瓶进行解冻，测定MNC产品的CD3+和CD38+/138+细胞含量。
吸取骨髓，使骨髓在“淋巴细胞分离液”的密度梯度中分级，收集几乎快到红细胞沉淀层的细胞。此种级分分离方法基本上去除了红细胞和中性粒细胞，提供了几乎完整的骨髓。所得的分级物质是T细胞和肿瘤细胞。对骨髓进行Ficoll，使用本领域已知的方法和本文所述的任何方法扩增TIL。例如，图14中描述了扩增TIL的示例性方法。图15显示了扩增TIL和用扩增的TIL治疗癌症患者的示例性方法。
实施例4.从非霍奇金淋巴瘤肿瘤生长的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的表型和功能表 征
本实施例中所述实验的目的包括确定是否可以从NHL肿瘤分离和培养出具有治疗潜力的TIL，以及比较NHL来源的TIL和黑色素瘤来源的TIL的特征。
从患者提取和扩增TIL的材料和方法如本文所述。通过手术切除病灶(在本例中为淋巴组织)从抑制性肿瘤微环境中提取患者的TIL。使用本文公开的扩增方法扩增TIL，以产生109至1011个TIL。
使用流式细胞术分析相对于黑色素瘤来源的TIL，NHL来源的TIL(1种套细胞淋巴瘤(MCL)、3种滤泡性淋巴瘤(FL)、3种弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL))的分化标志物。分析TIL的抗CD56、抗TCRab、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD27和抗CD28抗体。这些抗体用作分化面板(Differentiation Panel)1(DF1)。抗CD3、抗CD4、抗CD9、抗CD38以及抗HLA-DR、抗CCR7和抗CD45RA抗体用作分化面板2(DF2)。DF2用于鉴别以下T细胞亚群：幼稚(CCR7+/CD45RA+)；中枢记忆T细胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)；效应记忆T细胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)；以及终末分化的效应记忆细胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)。
图16显示了不同癌症类型的不同细胞亚群的CD4和CD8 T细胞。检测了黑色素瘤(黑色)、套细胞(红色)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(蓝色)和滤泡性淋巴瘤(紫色)癌症类型。图16A-16D总体表明与黑色素瘤TIL相比，淋巴瘤TIL具有更高增殖性的趋势，因此具有更高的抗肿瘤活性。同样，图17B显示与表达CD4/CD28的黑色素瘤T细胞相比，表达CD4/CD28的淋巴瘤T细胞具有更高的增殖能力。
遵循制造商的说明，通过用mAB包被的DynabeadsTM(CD3，CD28和CD137)刺激TIL，然后使用ELIspotTM(Immunospot CTL)刺激，使用ImmunospotTM S6 Entry分析仪进行计数，还使用DuoSetTM ELISA试剂盒(R&D Systems)进行ELISA，来检测TIL产生的干扰素(IFNγ)。
图18A和18B证明了NHL TIL和黑色素瘤TIL产生的IFNγ相似，表明两种TIL类型具有相似的细胞毒性功能。
使用生物发光重定向裂解测定(BRLA)检测TIL的裂解潜力。用编码eGFP和萤火虫荧光素酶的慢病毒载体转导的P815细胞被用作靶细胞。在OKT3存在下，将TIL和靶细胞共培养4小时/24小时。然后加入荧光素，细胞孵育5分钟。使用光度计检测生物发光。存活百分比和细胞毒性百分比计算如下：
存活率％＝(实验存活率-最小)/(最大信号-最小信号)×100
细胞毒性％＝100–(存活率％)
TIL的裂解潜力表示为裂解单位LU50，它代表由效应细胞诱导的靶细胞的50％细胞毒性。
分析TIL以确定其对自体肿瘤和同种异体肿瘤的肿瘤杀伤能力。以不同的效应细胞比靶细胞比率(E：T比率)——10：1、20：1、50：1或100：1，将TIL与自体淋巴瘤细胞或同种异体黑色素瘤细胞系(526黑色素瘤细胞系)混合。在共培养之前，用CellTrace Violet染料(Thermo Fisher)标记肿瘤细胞。24小时后，用7-AAD对细胞进行染色以确定细胞死亡。被TIL杀死的肿瘤细胞的比例被表示为：由CellTrace Violet染料门控的7-AAD阳性肿瘤细胞vs淋巴瘤细胞的CD19，以及CellTrace Violet vs黑色素瘤细胞的MCSP。
图19显示了在4小时(图19A)和24小时(图19B)时，NHL TIL和黑色素瘤TIL对同种异体肿瘤和自体肿瘤均具有相似的细胞毒性功能。
还使用了nCounter GX Human Immunology V2面板(NanoString，西雅图)对TIL进行基因表达分析。遵循制造商的说明，测定100ng总RNA。通过用各个样品的内置对照基因探针的几何平均值进行换算对数据进行归一化。针对黑色素瘤基因表达，对数据进行绘图，并与黑色素瘤基因表达进行比较。
图21显示了基因表达分析的结果。该热图显示了相对于黑色素瘤TIL的基因表达的倍数变化。与黑色素瘤来源的TIL相比，淋巴瘤来源的TIL的IL17A和RORC表达更高。
总言之，本实验的结果表明，淋巴瘤来源的TIL的功能特征与黑色素瘤来源的TIL相似，这表明使用淋巴瘤来源的TIL会成功治疗淋巴瘤癌症。
实施例5.从慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者的外周血生长的外周血淋巴细胞 (PBL)的表型和功能表征
从使用依鲁替尼进行三轮治疗前后的CLL患者收集PBMC。
如图24和本文其他地方所述，使用三种不同的方法，即PBL方法1、PBL方法2和PBL方法3扩增T细胞。某些样品来自新鲜的PBMC，某些样品来自冷冻保存的PBMC。一旦扩增并收获细胞，就使用上文实施例4以及本文其他地方所述的方法对细胞进行表型鉴定和功能表征。本实施例的目的是确定PBL的最佳扩增过程，并确定从经依鲁替尼处理的样品扩增出的PBL是否比从未经处理的样品扩增出的PBL更有效。
图26显示了PBL的倍数扩增。显示了使用PBL方法1、PBL方法2和PBL方法3扩增的PBL的结果。未经处理的PBL(PreRx PBL)显示出平均179倍的扩增，经依鲁替尼处理的PBL(PostRx PBL)显示出平均306倍的扩增。来自新鲜PBMC(PBL)的PBL仅显示出平均82倍的扩增。在PBL和PostRx PBL之间，p＝0.006。在PBL和PreRx PBL之间，p＝0.3；在PreRx PBL和PostRx PBL之间，p＝0.1。总言之，与PBL和PreRx PBL的所有组相比，所有PostRx PBL组的平均倍数均增加。
图27显示了PBL、PreRx PBL和PostRx PBL中产生干扰素-γ(IFN-γ)的细胞。对于PBL，产生IFN-γ的细胞的平均数量为约1864。对于PreRx PBL，产生IFN-g的细胞的平均数量为约7530；对于PostRx PBL，产生IFN-γ的细胞的平均数量为约11984。在PBL和PostRxPBL之间，p＝0.006。在PBL和PreRx PBL之间，p＝0.006；在PreRx PBL和PostRx PBL之间，p＝0.01。总言之，与PBL和PreRx PBL的所有组相比，所有PostRx PBL组中产生IFN-γ的细胞的平均数量均显著增加。
对各个样品进行表型表征。图28表示PreRx PBL和PostRx PBL中CD4+和CD8+ T细胞亚群的比例，使用黑色素瘤TIL作为比较物。此处，数据表明，无论采用哪种方法扩增细胞，PreRx PBL和PostRx PBL的CD4亚群(左图)都是相当的。据显示，PreRx PBL和PostRxPBL的CD4亚群高于黑色素瘤TIL(各个p＝0.0006)。与扩增细胞所使用的方法无关，PreRXPBL和PostRX PBL的CD8亚群(如右图所示)均更低。据显示，PreRx PBL和PostRx PBL的CD8亚群低于黑色素瘤TIL(各个p＝0.0006)。作为一种假设，更低的CD8亚群仅仅是由于癌症类型(即，通常会扩增CLL的CD4亚群)。
图29A-29D表示PreRx PBL和PostRx PBL的CD4记忆亚群的比较，使用黑色素瘤TIL作为比较物。图29A显示了幼稚(CCR7+/CD45RA+)的数据。图29B显示了中枢记忆T细胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)的数据。图29C显示了效应记忆T细胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)的数据。图29D显示了终末分化的效应记忆细胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)的数据。图29表明，PreRx PBL和PostRx PBL的CD4记忆亚群与黑色素瘤TIL的CD4记忆亚群相当。
图30A-30D表示PreRx PBL和PostRx PBL的CD8记忆亚群的比较，使用黑色素瘤TIL作为比较物。图30A显示了幼稚(CCR7+/CD45RA+)的数据。图30B显示了中枢记忆T细胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)的数据。图30C显示了效应记忆T细胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)的数据。图30D显示了终末分化的效应记忆细胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)的数据。图30表明，PreRx PBL和PostRx PBL的CD8记忆亚群与黑色素瘤TIL的CD8记忆亚群相当。
图31A和31B表示CD4细胞(图31A)和CD8细胞(图31B)的CD27亚群的比较，使用黑色素瘤TIL作为比较物。与黑色素瘤TIL相比，PreRx PBL(p＝0.03)和PostRx PBL(p＝0.02)的CD4CD27细胞亚群显著更高。与黑色素瘤TIL相比，PreRx PBL(p＝0.002)和PostRx PBL(p＝0.001)的CD8CD27细胞亚群显著更高。
图32A和32B表示CD4细胞(图30A)和CD8细胞(图30B)的CD28亚群的比较，使用黑色素瘤TIL作为比较物。显示PreRx PBL和PostRx PBL的CD4CD28细胞亚群和CD8CD28细胞亚群均与黑色素瘤TIL的相当。
图33A和33B表示PreRx PBL和PostRx PBL中CD4+(图33A)和CD8+(图33B)群的LAG3+亚群的比较。数据显示，PostRx PBL中CD4+(p＝0.06)和CD8+(p＝0.01)群的LAG3+亚群的平均值显著降低。
图34A和34B表示PreRx PBL和PostRx PBL中CD4+(图34A)和CD8+(图34B)群的PD1+亚群的比较。数据显示，PostRx PBL中CD4+和CD8+群的PD1+亚群的平均值降低，但该降低并不显著。
图35A和-35B显示了使用生物发光再溶解裂解测定法(BRLA)检测的PreRx PBL(图35A)和PostRx PBL(图35B)的溶细胞活性的结果。使用CelllTraceTM Violet细胞增殖试剂盒(Invitrogen)如下进行测定：用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)对效应细胞(即PBL)进行标记。将靶细胞(自体CD19+肿瘤细胞)与Mitocyin C一起孵育，然后按照CellTraceTMViolet细胞增殖试剂盒的说明，用CellTraceTM Violet(CTV)对靶细胞进行标记。将效应细胞和靶细胞以2：1、5：1和20：1(E：T细胞)的比率孵育24小时。加入CountBright磁珠，用Annexin V-PI对细胞进行染色，然后分析CTV+/Annexin-V PI+细胞(其提供死细胞的数量)。PostRx PBL显示更有效，因为杀死50％的靶肿瘤细胞所需的PostRx PBL细胞更少(即，与PreRx PB相比，PostRx PBL的LU50更低)。
在本实施例中进行的实验证明了以下结果：与从冷冻保存的PBMC扩增的PBL(PreRx PBL和PostRx PBL)相比，从新鲜CLL PBMC扩增的PBL显示出更低的扩增倍数和显著更低的IFN-γ产生；与PreRx PBL相比，PostRx PBL始终显示出更高的扩增倍数和显著增加的IFN-γ产生；尽管PostRx PBL的LU50低于PreRx PBL，PreRx PBL和PostRx PBL均显示出对自体(CD19+)肿瘤细胞的溶解活性。
提供上述实施例是为了给本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的组合物、系统和方法的实施方式的完整公开和描述，它们并不旨在限制发明人所认为其发明的范围。对本领域技术人员显而易见的实施本发明上述模式的修改旨在落入所附权利要求的范围内。说明书中提到的所有专利和出版物指示了本发明所属领域的技术人员的技术水平。
所有标题和章节名称仅用于澄清和参考目的，其不应以任何方式被视为是限制性的。例如，本领域技术人员将理解，根据本文所述的本发明的精神和范围，适当地对不同标题和小节的各个方面进行组合均为有用的。
本文所引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文用于全部目的，达到如同各个单独的出版物或专利或专利申请被明确地且单独地指出通过引用整体入本文用于全部目的的相同程度。
如本领域技术人员将显而易见的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本申请做出许多修改和变化。本文所述的特定实施方式和实施例仅以示例的方式提供，且本申请仅由所附权利要求的条款以及权利要求所赋予的等同物的全部范围来限制。
序列表
<110> 艾欧凡斯生物治疗公司(IOVANCE BIOTHERAPEUTICS, INC.)
<120> 液体肿瘤来源肿瘤浸润淋巴细胞的扩增及其治疗用途
<130> 116983-5030-WO
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 莫罗单抗（muromonab）重链
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 2
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 莫罗单抗轻链
<400> 2
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 3
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人IL-2
<400> 3
Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
1 5 10 15
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro
35 40 45
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
50 55 60
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
65 70 75 80
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
85 90 95
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
100 105 110
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser
115 120 125
Ile Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 4
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿地白介素
<400> 4
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 5
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人IL-4
<400> 5
Met His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn
1 5 10 15
Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp
20 25 30
Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg
35 40 45
Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr
50 55 60
Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu
65 70 75 80
Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly
85 90 95
Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn
100 105 110
Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 6
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人IL-7
<400> 6
Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val
1 5 10 15
Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly
20 25 30
Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys
35 40 45
Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu
50 55 60
Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu
65 70 75 80
Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln
85 90 95
Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys
100 105 110
Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp
115 120 125
Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn
130 135 140
Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 7
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人IL-15
<400> 7
Met Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu
1 5 10 15
Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
20 25 30
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
35 40 45
Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val
50 55 60
Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn
65 70 75 80
Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn
85 90 95
Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile
100 105 110
Asn Thr Ser
115
<210> 8
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IL-21
<400> 8
Met Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val
1 5 10 15
Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro
20 25 30
Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys
35 40 45
Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg
50 55 60
Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr
65 70 75 80
Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp
85 90 95
Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser
100 105 110
Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly
115 120 125
Ser Glu Asp Ser
130

Claims (126)

1.一种用肿瘤浸润淋巴细胞TIL群治疗患者的癌症的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)可选地，用包含依鲁替尼的方案对患者进行预治疗；
(b)获得液体肿瘤；
(c)可选地，碎片化或解离肿瘤，获得肿瘤碎片，并且使肿瘤碎片与第一细胞培养基接触；
(d)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群；第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少5倍；第一细胞培养基包含IL-2；并且，初始扩增进行21天以下；
(e)在第二细胞培养基中对第二TIL群进行第二次扩增，获得第三TIL群；第二次扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量高至少10倍；第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)和经辐照的同种异体外周血单核细胞PBMC；并且，第二次扩增进行14天以下；
(f)收获第三TIL群；以及
(g)给癌症患者施用治疗有效份的第三TIL群；
其中，所述癌症是血液恶性肿瘤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括添加ITK抑制剂；可选地，ITK抑制剂是与ITK共价结合的ITK抑制剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，将ITK抑制剂在步骤(d)期间添加到第一细胞培养基中、在步骤(e)期间添加到第二细胞培养基中，或者在步骤(d)期间添加到第一细胞培养基中且在步骤(e)期间添加到第二细胞培养基中。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述ITK抑制剂选自：氨基噻唑类ITK抑制剂、苯并咪唑类ITK抑制剂、氨基嘧啶类ITK抑制剂、3-氨基吡啶-2-酮类ITK抑制剂、吲哚基吲唑类ITK抑制剂、吡唑基吲哚类抑制剂、噻吩并吡唑抑制剂，以及靶向ATP口袋中半胱氨酸442的ITK抑制剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述ITK抑制剂选自：依鲁替尼、达沙替尼、博舒替尼、尼洛替尼、厄洛替尼BMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469(即(R)-3-(1-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)-N-(3-甲基-4-(1-甲基乙基)苯甲酰胺)及它们的组合。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述ITK抑制剂是依鲁替尼。
7.根据权利要求2所述的方法，其中，所述ITK抑制剂以约0.1nM至约5μM的浓度添加。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述初始扩增进行3天至11天的时间。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二次扩增进行3天至11天的时间。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，IL-2以1000IU/mL至6000IU/mL的初始浓度存在于所述第一细胞培养基中。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，IL-2以1000IU/mL至6000IU/mL的初始浓度存在于所述第二细胞培养基中，并且OKT-3抗体以约30ng/mL的初始浓度存在于所述第二细胞培养基中。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述初始扩增使用透气性容器进行。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二次扩增使用透气性容器进行。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一细胞培养基还包含选自下组的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及它们的组合。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二细胞培养基还包含选自下组的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及它们的组合。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括在给患者施用第三TIL群之前用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者的步骤。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨5天的步骤。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括在给患者施用第三TIL群后第二天开始用高剂量IL-2方案治疗患者的步骤。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述高剂量IL-2方案包括每8小时以15分钟静脉推注方式施用600,000或720,000IU/kg的阿地白介素或它的生物仿制药或变体，直至耐受。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述癌症选自：急性髓性白血病AML、套细胞淋巴瘤MCL、滤泡性淋巴瘤FL、弥漫性大B细胞淋巴瘤DLBCL、活化B细胞ABC DLBCL、生发中心B细胞GCB DLBCL、慢性淋巴细胞白血病CLL、小淋巴细胞性白血病SLL、非霍奇金淋巴瘤NHL、霍奇金淋巴瘤、复发性和/或难治性霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病B-ALL、成熟B-ALL、伯基特淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症WM、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化、慢性粒细胞白血病、滤泡中心性淋巴瘤、惰性NHL、人类免疫缺陷病毒HIV相关性B细胞淋巴瘤，以及EB病毒EBV相关性B细胞淋巴瘤。
21.根据权利要求1所述的方法，其中，患者群是经依鲁替尼预治疗的患者群。
22.一种用肿瘤制备肿瘤浸润淋巴细胞TIL群的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)碎片化肿瘤；
(b)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群；第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少5倍；第一细胞培养基包含IL-2；并且，初始扩增进行21天以下；
(c)在第二细胞培养基中对第二TIL群进行第二次扩增，获得第三TIL群；第二次扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量高至少50倍；第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)、经辐照的同种异体外周血单核细胞PBMC；并且，第二次扩增进行14天以下；以及
(d)收获第三TIL群；
其中，所述肿瘤是液体肿瘤；并且，所述癌症是血液恶性肿瘤。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，第一TIL群从肿瘤或肿瘤的一部分中获得。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，肿瘤或肿瘤的一部分已从患者身上切除。
25.根据权利要求22所述的方法，其中，初始扩增进行14天以下。
26.根据权利要求22所述的方法，其中，初始扩增进行11天以下。
27.根据权利要求22所述的方法，其中，第二次扩增进行11天以下。
28.液体肿瘤在制备用于治疗血液恶性肿瘤的TIL群中的用途。
29.一种扩增获自骨髓或外周血的TIL的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)从骨髓或外周血的样品中鉴定出第一TIL群；
(b)在第一细胞培养基中对第一TIL群进行初始扩增，获得第二TIL群；第二TIL群的数量比第一TIL群的数量高至少5倍；第一细胞培养基包含IL-2；并且，初始扩增进行21天以下；
(c)在第二细胞培养基中对第二TIL群进行第二次扩增，获得第三TIL群；第二次扩增开始7天后，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量高至少50倍；第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)和经辐照的同种异体外周血单核细胞PBMC；并且，第二次扩增进行14天以下；
(d)收获第三TIL群；以及
(e)给所述患者提供所述第三TIL群。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，初始扩增进行11天以下。
31.根据权利要求29所述的方法，其中，第二次扩增进行11天以下。
32.根据权利要求29所述的方法，其中，IL-2以1000IU/mL至6000IU/mL的初始浓度存在于所述第一细胞培养基中。
33.根据权利要求29所述的方法，其中，IL-2以1000IU/mL至6000IU/mL的初始浓度存在于所述第二细胞培养基中，并且OKT-3抗体以约30ng/mL的初始浓度存在于所述第二细胞培养基中。
34.根据权利要求29所述的方法，其中，初始扩增使用透气性容器进行。
35.根据权利要求29所述的方法，其中，第二次扩增使用透气性容器进行。
36.根据权利要求29所述的方法，其中，第一细胞培养基还包含选自下组的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及它们的组合。
37.根据权利要求29所述的方法，其中，第二细胞培养基还包含选自下组的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及它们的组合。
38.一种扩增来自外周血的外周血淋巴细胞PBL的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
a.从外周血获得外周血单核细胞PBMC的样品；可选地，冷冻保存所述样品；
b.通过筛选并移出CD19+B细胞从所述样品中分离PBL；
c.可选地，将所述PBL与所述CD19+B细胞共培养；
d.在透气性容器中，用IL-2和抗CD3/抗CD28抗体刺激第一细胞培养基中的所述PBL约2天至约6天的时间；
e.用IL-2和抗CD3/抗CD28抗体培养步骤(d)中的PBL约2天至约6天的时间；
f.从步骤(e)的培养物中分离与抗体结合的PBL；
g.从步骤(e)分离的PBL中除去抗体；以及
h.收获PBL。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述第一细胞培养基选自：CM-2、CM-4和AIM-V。
40.根据权利要求38所述的方法，其中，在步骤(d)之后，添加另外的IL-2，并且用第二细胞培养基更换第一细胞培养基。
41.根据权利要求38所述的方法，其中，在步骤(e)之后，添加另外的IL-2，并且用第三细胞培养基更换第二细胞培养基。
42.根据权利要求40所述的方法，其中，所述第二细胞培养基选自：CM-2、CM-4和AIM-V。
43.根据权利要求41所述的方法，其中，所述第三细胞培养基选自：CM-2、CM-4和AIM-V。
44.根据权利要求40所述的方法，其中，所述第一细胞培养基和所述第二细胞培养基不同。
45.根据权利要求40所述的方法，其中，所述第一细胞培养基和所述第二细胞培养基相同。
46.根据权利要求38所述的方法，其中，步骤(c)中B细胞与PBL的比率为约0.1：1至约10：1(B细胞：PBL)。
47.根据权利要求38所述的方法，其中，步骤(c)中B细胞与PBL的比率选自：0.1：1、1：1和10：1(B细胞：PBL)。
48.根据权利要求38所述的方法，其中，在步骤(d)开始时，所述透气性容器中有至少约1×105至约10×105个PBL。
49.根据权利要求38所述的方法，其中，在步骤(d)开始时，所述透气性容器中有至少约2.5×105至10×105个PBL。
50.根据权利要求38所述的方法，其中，在步骤(d)开始时，所述透气性容器中有至少5×105个PBL。
51.根据权利要求38所述的方法，其中，在步骤(c)和(d)中，IL-2以1000IU/mL至6000IL/mL的浓度存在。
52.根据权利要求51所述的方法，其中，IL-2以约3000IU/mL的浓度存在。
53.根据权利要求38所述的方法，其中，在步骤(c)和(d)的各个步骤中，抗CD3/抗CD28抗体被包被在磁珠上，并且PBL：磁珠的比率为约1：1。
54.根据权利要求38所述的方法，其中，所述方法还包括添加ITK抑制剂。
55.根据权利要求54所述的方法，其中，在步骤(c)、步骤(d)和步骤(e)中的至少一个步骤期间，添加ITK抑制剂。
56.根据权利要求54所述的方法，其中，ITK抑制剂选自：氨基噻唑类ITK抑制剂、苯并咪唑类ITK抑制剂、氨基嘧啶类ITK抑制剂、3-氨基吡啶-2-酮类ITK抑制剂、吲哚基吲唑类ITK抑制剂、吡唑基吲哚类抑制剂、噻吩并吡唑抑制剂，以及靶向ATP口袋中半胱氨酸442的ITK抑制剂。
57.根据权利要求56所述的方法，其中，ITK抑制剂选自：依鲁替尼、达沙替尼、博舒替尼、尼洛替尼、厄洛替尼BMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469(即(R)-3-(1-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)-N-(3-甲基-4-(1-甲基乙基)苯甲酰胺)及它们的组合。
58.根据权利要求57所述的方法，其中，ITK抑制剂是依鲁替尼。
59.根据权利要求38所述的方法，其中，所述方法在封闭的无菌系统中进行。
60.一种扩增来自外周血的外周血淋巴细胞PBL的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
a.从患者的外周血获得PBMC的样品；可选地，冷冻保存所述样品，并且可选地，用ITK抑制剂对患者进行预治疗；
b.通过筛选并移出CD19+B细胞从所述样品中分离PBL，并且可选地，用0.1nM至200nM浓度的ITK抑制剂对所述PBL进行预处理；
c.将所述PBL与所述CD19+B细胞共培养2至5天的时间；
d.将约2.5×105至约5×105个细胞添加到透气性容器中的第一细胞培养基中，用3000IU/mL IL-2和固定在磁珠上的抗CD3/抗CD28抗体以及可选地浓度为0.1nM至200nM的ITK抑制剂，刺激所述PBL 3至6天的时间；
e.用第二细胞培养基和另外约3000IU/mL浓度的IL-2以及可选地浓度为0.1nM至200nM的ITK抑制剂，更换第一细胞培养基；
f.用IL-2和固定在磁珠上的抗CD3/抗CD28抗体以及可选地浓度为0.1nM至200nM的ITK抑制剂，培养步骤(e)的PBL另外3至6天的时间；
g.用第三细胞培养基更换第二细胞培养基，并添加另外3000IU/mL浓度的IL-2以及可选地浓度为0.1nM至200nM的ITK抑制剂，培养细胞另外2至5天的时间；
h.从步骤(g)的培养物中分离与抗体结合的PBL；
i.从步骤(h)分离的PBL中除去抗体；以及
j.收获PBL；
其中，ITK抑制剂是与ITK共价结合的ITK抑制剂。
61.一种治疗血液恶性肿瘤的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
a.由血液恶性肿瘤患者的外周血获得PBMC的样品；
b.通过筛选并移出CD19+B细胞从所述样品中分离PBL；
c.可选地，将所述PBL与所述CD19+B细胞共培养；
d.在透气性容器中，用IL-2和抗CD3/抗CD28抗体刺激第一细胞培养基中的所述PBL约2天至约6天的时间；
e.用IL-2和抗CD3/抗CD28抗体培养来自步骤(d)的PBL约2天至约6天的时间；
f.从步骤(e)的培养物中分离与抗体结合的PBL；
g.从步骤(f)分离的PBL中除去抗体；
h.收获PBL；以及
i.给患者施用治疗有效量的PBL以治疗所述血液恶性肿瘤。
62.根据权利要求61所述的方法，其中，在获得PBMC的样品之前，用ITK抑制剂对患者进行预治疗。
63.根据权利要求62所述的方法，其中，ITK抑制剂选自：氨基噻唑类ITK抑制剂、苯并咪唑类ITK抑制剂、氨基嘧啶类ITK抑制剂、3-氨基吡啶-2-酮类ITK抑制剂、吲哚基吲唑类ITK抑制剂、吡唑基吲哚类抑制剂、噻吩并吡唑抑制剂，以及靶向ATP口袋中半胱氨酸442的ITK抑制剂。
64.根据权利要求62所述的方法，其中，ITK抑制剂选自：依鲁替尼、达沙替尼、博舒替尼、尼洛替尼、厄洛替尼BMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469(即(R)-3-(1-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)-N-(3-甲基-4-(1-甲基乙基)苯甲酰胺)及它们的组合。
65.根据权利要求64所述的方法，其中，ITK抑制剂是依鲁替尼。
66.根据权利要求62所述的方法，其中，用至少三轮依鲁替尼方案对患者进行预治疗。
67.根据权利要求61所述的方法，其中，所述血液恶性肿瘤选自：急性髓性白血病AML、套细胞淋巴瘤MCL、滤泡性淋巴瘤FL、弥漫性大B细胞淋巴瘤DLBCL、活化B细胞ABC DLBCL、生发中心B细胞GCB DLBCL、慢性淋巴细胞白血病CLL、小淋巴细胞性白血病SLL、非霍奇金淋巴瘤NHL、霍奇金淋巴瘤、复发性和/或难治性霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病B-ALL、成熟B-ALL、伯基特淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症WM、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化、慢性粒细胞白血病、滤泡中心性淋巴瘤、惰性NHL、人类免疫缺陷病毒HIV相关性B细胞淋巴瘤，以及EB病毒EBV相关性B细胞淋巴瘤。
68.根据权利要求61所述的方法，其中，所述血液恶性肿瘤是慢性淋巴细胞白血病CLL。
69.根据权利要求61所述的方法，其中，所述第一细胞培养基选自：CM-2、CM-4和AIM-V。
70.根据权利要求61所述的方法，其中，在步骤(d)之后，添加另外的IL-2，并且用第二细胞培养基更换细胞培养基。
71.根据权利要求70所述的方法，其中，在步骤(e)之后，添加另外的IL-2，并且用第三细胞培养基更换第二细胞培养基。
72.根据权利要求70所述的方法，其中，所述第二细胞培养基选自：CM-2、CM-4和AIM-V。
73.根据权利要求71所述的方法，其中，所述第三细胞培养基选自：CM-2、CM-4和AIM-V。
74.根据权利要求70所述的方法，其中，所述第一细胞培养基和所述第二细胞培养基不同。
75.根据权利要求70所述的方法，其中，所述第一细胞培养基和所述第二细胞培养基相同。
76.根据权利要求61所述的方法，其中，步骤(c)中B细胞与PBL的比率为约0.1：1至约10：1(B细胞：PBL)。
77.根据权利要求61所述的方法，其中，步骤(c)中的B细胞与PBL的比率选自：0.1：1、1：1和10：1(B细胞：PBL)。
78.根据权利要求61所述的方法，其中，在步骤(d)开始时，所述透气性容器中至少有约1×105至约10×105个PBL。
79.根据权利要求61所述的方法，其中，在步骤(d)开始时，所述透气性容器中至少有约2.5×105至10×105个PBL。
80.根据权利要求61所述的方法，其中，在步骤(d)开始时，所述透气性容器中至少有5×105个PBL。
81.根据权利要求61所述的方法，其中，在步骤(d)和(e)中，所述IL-2以1000IU/mL至6000IL/mL的浓度存在。
82.根据权利要求81所述的方法，其中，IL-2以约3000IU/mL的浓度存在。
83.根据权利要求61所述的方法，其中，在步骤(d)和(e)的各个步骤中，抗CD3/抗CD28抗体被包被在磁珠上，并且PBL：磁珠的比率为约1：1。
84.根据权利要求61所述的方法，其中，PBL以约0.1×109至约15×109个PBL的量施用。
85.一种扩增来自骨髓的骨髓浸润淋巴细胞MIL的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
a.从骨髓获得外周血单核细胞PBMC的样品；可选地，冷冻保存所述样品；
b.分选CD3+、CD33+、CD20+和CD14+细胞部分(MIL部分)以及非CD3+、非CD33+、非CD20+和非CD14+细胞部分(AML原始细胞部分)；
c.可选地，破碎AML原始细胞部分；
d.以约0.1：1至约10：1的细胞数量比率，将可选地破碎的AML原始细胞部分添加至MIL细胞部分；
e.在透气性容器中，在包含IL-2的第一细胞培养基中培养一个或两个细胞部分；
f.用抗CD3/抗CD28抗体刺激MIL，获得MIL的扩增；
g.用IL-2和抗CD3/抗CD28抗体再刺激MIL另外约2天至约6天的时间；
h.用另外的IL-2培养MIL另外约1至3天的时间；以及
i.收获所述MIL。
86.根据权利要求85所述的方法，其中，所述第一细胞培养基选自：CM-2、CM-4和AIM-V。
87.根据权利要求85所述的方法，其中，在步骤(e)开始之后，添加另外的IL-2，并且用第二细胞培养基更换第一细胞培养基。
88.根据权利要求87所述的方法，其中，所述第二细胞培养基选自：CM-2、CM-4和AIM-V。
89.根据权利要求87所述的方法，其中，所述第一细胞培养基和所述第二细胞培养基不同。
90.根据权利要求87所述的方法，其中，所述第一细胞培养基和所述第二细胞培养基相同。
91.根据权利要求85所述的方法，其中，在步骤(e)开始时，所述透气性容器中有至少约2×104至约5×105个MIL。
92.根据权利要求85所述的方法，其中，在步骤(e)开始时，所述透气性容器中有至少约2.8×104至3.4×105个MIL。
93.根据权利要求85所述的方法，其中，在步骤(e)开始时，所述透气性容器中有至少5×105个MIL。
94.根据权利要求85所述的方法，其中，在步骤(d)中，IL-2以1000IU/mL至6000IL/mL的浓度存在。
95.根据权利要求94所述的方法，其中，IL-2以约6000IU/mL的浓度存在。
96.根据权利要求85所述的方法，其中，在步骤(f)中，IL-2以约3000IU/mL的浓度存在。
97.根据权利要求85所述的方法，其中，步骤(d)中的培养进行约3天的时间。
98.根据权利要求85所述的方法，其中，步骤(e)中的刺激进行约4天的时间。
99.根据权利要求85所述的方法，其中，步骤(f)中的刺激进行约7天的时间。
100.根据权利要求85所述的方法，其中，步骤(g)中的另外的IL-2以约3000IU/mL的浓度存在。
101.根据权利要求85所述的方法，其中，在步骤(e)和(f)的各个步骤中，抗CD3/抗CD28抗体被包被在磁珠上，并且MIL：磁珠的比率为约1：1。
102.根据权利要求85所述的方法，其中，可选地破碎的细胞部分使用选自下组的方法进行破碎：超声处理、涡旋、振动和裂解。
103.根据权利要求85所述的方法，其中，AML原始细胞部分与MIL部分的细胞数量比率为约1：1。
104.根据权利要求85所述的方法，其中，所述方法在封闭的无菌系统中进行。
105.一种扩增来自骨髓的骨髓浸润淋巴细胞MIL的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
a.从骨髓获得外周血单核细胞PBMC的样品；可选地，冷冻保存所述样品；
b.分选CD3+、CD33+、CD20+和CD14+细胞部分以及非CD3+、非CD33+、非CD20+和非CD14+细胞部分；
c.破碎AML原始细胞部分，以约1：1的细胞数量比率将破碎的AML原始细胞部分添加至MIL细胞部分；
d.在透气性容器中，在包含约6000IU/mL浓度的IL-2的第一细胞培养基中培养AML原始细胞部分和MIL细胞部分约3天的时间；
e.以MIL：磁珠为约1：1的比率，将固定在磁珠上的抗CD3/抗CD28抗体添加到细胞培养物中，培养MIL和抗体约1天的时间；
f.用包含另外的约3000IU/mL浓度的IL-2的第二细胞培养基更换第一细胞培养基；
g.培养抗体磁珠和MIL另外约3天的时间；
h.用IL-2和固定在磁珠上的抗CD3/抗CD28抗体再刺激MIL另外至少约4天的时间；
i.用包含另外的约3000IU/mL浓度的IL-2的第三细胞培养基更换第二细胞培养基，另外进行至少约3天的时间；以及
j.收获所述MIL。
106.一种治疗血液恶性肿瘤的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
a.从骨髓获得外周血单核细胞PBMC的样品；可选地，冷冻保存所述样品；
b.分选CD3+、CD33+、CD20+和CD14+细胞部分(MIL部分)以及非CD3+、非CD33+、非CD20+和非CD14+细胞部分(AML原始细胞部分)；
c.可选地，破碎AML原始细胞部分；
d.以约0.1：1至约10：1的细胞数量比率，将可选地破碎的AML原始细胞部分添加至MIL细胞部分；
e.在透气性容器中，在包含IL-2的第一细胞培养基中培养一个或两个细胞部分；
f.用抗CD3/抗CD28抗体刺激MIL，获得MIL的扩增；
g.用IL-2和抗CD3/抗CD28抗体再刺激MIL另外约2天至约6天的时间；
h.用另外的IL-2培养MIL另外约1至3天的时间；
i.收获所述MIL；以及
j.给患者施用治疗有效量的所述MIL以治疗血液恶性肿瘤。
107.根据权利要求106所述的方法，其中，所述血液恶性肿瘤选自：急性髓性白血病AML、套细胞淋巴瘤MCL、滤泡性淋巴瘤FL、弥漫性大B细胞淋巴瘤DLBCL、活化B细胞ABCDLBCL、生发中心B细胞GCB DLBCL、慢性淋巴细胞白血病CLL、小淋巴细胞性白血病SLL、非霍奇金淋巴瘤NHL、霍奇金淋巴瘤、复发性和/或难治性霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病B-ALL、成熟B-ALL、伯基特淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症WM、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化、慢性粒细胞白血病、滤泡中心性淋巴瘤、惰性NHL、人类免疫缺陷病毒HIV相关性B细胞淋巴瘤，以及EB病毒EBV相关性B细胞淋巴瘤。
108.根据权利要求107所述的方法，其中，所述血液恶性肿瘤是急性髓性白血病AML。
109.根据权利要求106所述的方法，其中，所述第一细胞培养基选自：CM-2、CM-4和AIM-V。
110.根据权利要求106所述的方法，其中，在进行步骤(e)之后，添加另外的IL-2，并且用第二细胞培养基更换第一细胞培养基。
111.根据权利要求110所述的方法，其中，所述第二细胞培养基选自：CM-2、CM-4和AIM-V。
112.根据权利要求110所述的方法，其中，所述第一细胞培养基和所述第二细胞培养基不同。
113.根据权利要求110所述的方法，其中，所述第一细胞培养基和所述第二细胞培养基相同。
114.根据权利要求106所述的方法，其中，在步骤(e)开始时，所述透气性容器中有至少约2×104至约5×105个MIL。
115.根据权利要求106所述的方法，其中，在步骤(e)开始时，所述透气性容器中有至少约2.8×104至3.4×105个MIL。
116.根据权利要求106所述的方法，其中，在步骤(d)开始时，所述透气性容器中有至少5×105个MIL。
117.根据权利要求106所述的方法，其中，在步骤(d)中，IL-2以1000IU/mL至6000IL/mL的浓度存在。
118.根据权利要求117所述的方法，其中，IL-2以约6000IU/mL的浓度存在。
119.根据权利要求106所述的方法，其中，在步骤(f)中，IL-2以约3000IU/mL的浓度存在。
120.根据权利要求106所述的方法，其中，步骤(e)中的培养进行约3天的时间。
121.根据权利要求106所述的方法，其中，步骤(f)中的刺激进行约4天的时间。
122.根据权利要求106所述的方法，其中，步骤(g)中的刺激进行约7天的时间。
123.根据权利要求106所述的方法，其中，所述方法包括在步骤(f)之后进行的补充另外的IL-2的步骤。
124.根据权利要求123所述的方法，其中，另外的IL-2以约3000IU/mL的浓度存在。
125.根据权利要求106所述的方法，其中，在步骤(f)和(g)的各个步骤中，抗CD3/抗CD28抗体被包被在磁珠上，并且磁珠：MIL的比率为约1：1。
126.根据权利要求106所述的方法，其中，MIL以约4×108至约2.5×109个MIL的量施用。
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