JP2023182601A - 液性腫瘍からの腫瘍浸潤リンパ球の拡大培養及びその治療的使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】液性腫瘍からの腫瘍浸潤リンパ球の拡大培養及びその治療的使用の提供。【解決手段】末梢血リンパ球及び骨髄浸潤リンパ球を含む腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を、リンパ腫及び白血病を含む液性腫瘍などの血液悪性腫瘍を有する患者の血液及び/又は骨髄から拡大培養する方法並びにそのような拡大培養されたTILの、癌及び血液悪性腫瘍などの疾患の処置における使用が本明細書に開示される。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
[0001] 本願は、2017年5月10日に提出された米国仮特許出願第62/504,337号;2017年7月10日に提出された米国仮特許出願第62/530,681号;2017年8月25日に提出された米国仮特許出願第62/550,398号;2017年11月22日に提出された米国仮特許出願第62/590,034号;2018年1月24日に提出された米国仮特許出願第62/621,462号;2018年1月25日に提出された米国仮特許出願第62/621,798号;及び2018年3月23日に提出された米国仮特許出願第62/647,367号に対する優先権を主張し、これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[0001] 本願は、2017年5月10日に提出された米国仮特許出願第62/504,337号;2017年7月10日に提出された米国仮特許出願第62/530,681号;2017年8月25日に提出された米国仮特許出願第62/550,398号;2017年11月22日に提出された米国仮特許出願第62/590,034号;2018年1月24日に提出された米国仮特許出願第62/621,462号;2018年1月25日に提出された米国仮特許出願第62/621,798号;及び2018年3月23日に提出された米国仮特許出願第62/647,367号に対する優先権を主張し、これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
[0002] リンパ腫及び白血病を含む液性腫瘍などの血液悪性腫瘍を有する患者の血液及び/又は骨髄に由来する腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を拡大培養する方法並びにそれから入手されるTILの集団を含む組成物が本明細書に開示される。更に、そのような血液悪性腫瘍の処置を含む、液性腫瘍などの血液悪性腫瘍を有する患者の血液又は骨髄から拡大培養されたTILの治療的使用が本明細書に開示される。
[0002] リンパ腫及び白血病を含む液性腫瘍などの血液悪性腫瘍を有する患者の血液及び/又は骨髄に由来する腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を拡大培養する方法並びにそれから入手されるTILの集団を含む組成物が本明細書に開示される。更に、そのような血液悪性腫瘍の処置を含む、液性腫瘍などの血液悪性腫瘍を有する患者の血液又は骨髄から拡大培養されたTILの治療的使用が本明細書に開示される。
発明の背景
[0003] 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の養子自己移植を用いた、かさ高い難治性の癌の処置は、予後不良の患者に対する治療への強力なアプローチとなる。Gattinoni, et al, Nat.Rev. Immunol.2006, 6, 383-393。TILは、T細胞が優勢であり、IL-2に基づくTIL拡大培養とそれに続く「急速拡大培養プロセス」(REP)は、そのスピード及び効率のためにTIL拡大培養のための好ましい方法となっている。Dudley, et al, Science 2002, 298, 850-54;Dudley, et al, J. Clin.Oncol.2005, 23, 2346-57;Dudley, et al, J. Clin.Oncol.2008, 26, 5233-39;Riddell, et al, Science 1992, 257, 238-41;Dudley, et al, J. Immunother.2003, 26, 332-42。黒色腫におけるTIL療法に対する応答を改善し、TIL療法を他の種類の腫瘍に拡大培養するためのいくつかのアプローチが探求されているが、成功が限られており、この分野は、依然として課題となっている。Goff, et al., J. Clin.Oncol.2016, 34, 2389-97;Dudley, et al, J. Clin.Oncol.2008, 26, 5233-39;Rosenberg, et al, Clin.Cancer Res.2011, 17, 4550-57。B細胞リンパ腫からのTILの拡大培養への以前のアプローチは、TIL増殖の12の試みの2つのみが腫瘍に対する潜在的な活性を提供するという不十分な結果を得た。Schwartzentruber, et al, Blood 1993, 82, 1204-1211。急性骨髄性白血病(AML)及び慢性リンパ性白血病(CLL)を含む多くの血液悪性腫瘍により効果的な治療を提供する緊急の必要性が存在する。
[0003] 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の養子自己移植を用いた、かさ高い難治性の癌の処置は、予後不良の患者に対する治療への強力なアプローチとなる。Gattinoni, et al, Nat.Rev. Immunol.2006, 6, 383-393。TILは、T細胞が優勢であり、IL-2に基づくTIL拡大培養とそれに続く「急速拡大培養プロセス」(REP)は、そのスピード及び効率のためにTIL拡大培養のための好ましい方法となっている。Dudley, et al, Science 2002, 298, 850-54;Dudley, et al, J. Clin.Oncol.2005, 23, 2346-57;Dudley, et al, J. Clin.Oncol.2008, 26, 5233-39;Riddell, et al, Science 1992, 257, 238-41;Dudley, et al, J. Immunother.2003, 26, 332-42。黒色腫におけるTIL療法に対する応答を改善し、TIL療法を他の種類の腫瘍に拡大培養するためのいくつかのアプローチが探求されているが、成功が限られており、この分野は、依然として課題となっている。Goff, et al., J. Clin.Oncol.2016, 34, 2389-97;Dudley, et al, J. Clin.Oncol.2008, 26, 5233-39;Rosenberg, et al, Clin.Cancer Res.2011, 17, 4550-57。B細胞リンパ腫からのTILの拡大培養への以前のアプローチは、TIL増殖の12の試みの2つのみが腫瘍に対する潜在的な活性を提供するという不十分な結果を得た。Schwartzentruber, et al, Blood 1993, 82, 1204-1211。急性骨髄性白血病(AML)及び慢性リンパ性白血病(CLL)を含む多くの血液悪性腫瘍により効果的な治療を提供する緊急の必要性が存在する。
[0004] 本発明は、TIL拡大培養プロセスが、リンパ腫又は白血病を含む液性腫瘍などの血液悪性腫瘍から入手される有効なTIL集団をもたらし得るという驚くべき発見を提供する。
発明の概要
[0005] 一実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の集団を用いて癌を処置する方法であって、
(a)任意選択により、少なくとも1つのキナーゼ阻害剤を含むレジメンで患者を前処置するステップ;
(b)切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、TILの第1の集団を含む、ステップ;
(c)任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、且つ腫瘍断片を第1の細胞培養培地と接触させるステップ;
(d)第1の細胞培養培地中でTILの第1の集団の初期拡大培養を行ってTILの第2の集団を入手するステップであって、TILの第2の集団は、数においてTILの第1の集団よりも少なくとも5倍多く、第1の細胞培養培地は、IL-2を含み、初期拡大培養は、21日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;
(e)第2の細胞培養培地中でTILの第2の集団の第2の拡大培養を行ってTILの第3の集団を入手するステップであって、TILの第3の集団は、第2の拡大培養の開始から7日後、数においてTILの第2の集団よりも少なくとも50倍多く、第2の細胞培養培地は、IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及び照射同種異系末梢血単核細胞(PBMC)を含み、第2の拡大培養は、14日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;
(f)TILの第3の集団を回収するステップ;及び
(g)TILの第3の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
[0005] 一実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の集団を用いて癌を処置する方法であって、
(a)任意選択により、少なくとも1つのキナーゼ阻害剤を含むレジメンで患者を前処置するステップ;
(b)切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、TILの第1の集団を含む、ステップ;
(c)任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、且つ腫瘍断片を第1の細胞培養培地と接触させるステップ;
(d)第1の細胞培養培地中でTILの第1の集団の初期拡大培養を行ってTILの第2の集団を入手するステップであって、TILの第2の集団は、数においてTILの第1の集団よりも少なくとも5倍多く、第1の細胞培養培地は、IL-2を含み、初期拡大培養は、21日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;
(e)第2の細胞培養培地中でTILの第2の集団の第2の拡大培養を行ってTILの第3の集団を入手するステップであって、TILの第3の集団は、第2の拡大培養の開始から7日後、数においてTILの第2の集団よりも少なくとも50倍多く、第2の細胞培養培地は、IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及び照射同種異系末梢血単核細胞(PBMC)を含み、第2の拡大培養は、14日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;
(f)TILの第3の集団を回収するステップ;及び
(g)TILの第3の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
[0006] 一実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の集団を用いて癌を処置する方法であって、
(a)任意選択により、少なくとも1つのキナーゼ阻害剤を含むレジメンで患者を前処置するステップ;
(b)切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、TILの第1の集団を含む、ステップ;
(c)任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、且つ腫瘍断片を第1の細胞培養培地と接触させるステップ;
(d)第1の細胞培養培地中でTILの第1の集団の初期拡大培養を行ってTILの第2の集団を入手するステップであって、TILの第2の集団は、数においてTILの第1の集団よりも少なくとも5倍多く、第1の細胞培養培地は、IL-2を含み、初期拡大培養は、21日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;
(e)第2の細胞培養培地中でTILの第2の集団の第2の拡大培養を行ってTILの第3の集団を入手するステップであって、TILの第3の集団は、第2の拡大培養の開始から7日後、数においてTILの第2の集団よりも少なくとも50倍多く、第2の細胞培養培地は、IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及び照射同種異系末梢血単核細胞(PBMC)を含み、第2の拡大培養は、14日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;
(f)TILの第3の集団を回収するステップ;及び
(g)TILの第3の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、急性骨髄性白血病(AML)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、活性化B細胞(ABC)DLBCL、胚中心B細胞(GCB)DLBCL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ球性白血病(SLL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、ホジキンリンパ腫、再発性及び/又は難治性ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症(WM)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性NHL、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)関連B細胞リンパ腫並びにエプスタイン-バーウイルス(EBV)関連B細胞リンパ腫からなる群から選択される血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
(a)任意選択により、少なくとも1つのキナーゼ阻害剤を含むレジメンで患者を前処置するステップ;
(b)切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、TILの第1の集団を含む、ステップ;
(c)任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、且つ腫瘍断片を第1の細胞培養培地と接触させるステップ;
(d)第1の細胞培養培地中でTILの第1の集団の初期拡大培養を行ってTILの第2の集団を入手するステップであって、TILの第2の集団は、数においてTILの第1の集団よりも少なくとも5倍多く、第1の細胞培養培地は、IL-2を含み、初期拡大培養は、21日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;
(e)第2の細胞培養培地中でTILの第2の集団の第2の拡大培養を行ってTILの第3の集団を入手するステップであって、TILの第3の集団は、第2の拡大培養の開始から7日後、数においてTILの第2の集団よりも少なくとも50倍多く、第2の細胞培養培地は、IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及び照射同種異系末梢血単核細胞(PBMC)を含み、第2の拡大培養は、14日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;
(f)TILの第3の集団を回収するステップ;及び
(g)TILの第3の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、急性骨髄性白血病(AML)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、活性化B細胞(ABC)DLBCL、胚中心B細胞(GCB)DLBCL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ球性白血病(SLL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、ホジキンリンパ腫、再発性及び/又は難治性ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症(WM)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性NHL、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)関連B細胞リンパ腫並びにエプスタイン-バーウイルス(EBV)関連B細胞リンパ腫からなる群から選択される血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
[0007] 本発明の一実施形態において、方法は、ITK阻害剤の添加を更に含む。一実施形態において、ITK阻害剤は、ステップ(d)及び(e)の少なくとも1つ中に細胞培養培地に添加される。本発明の一実施形態において、ITK阻害剤は、共有結合的及び不可逆的にITKに結合する共有結合ITK阻害剤である。本発明の一実施形態において、ITK阻害剤は、ITKに結合するアロステリックITK阻害剤である。別の実施形態において、ITK阻害剤は、アミノチアゾール系ITK阻害剤、ベンズイミダゾール系ITK阻害剤、アミノピリミジン系ITK阻害剤、3-アミノピリド-2-オン系ITK阻害剤、インドリルンダゾール系ITK阻害剤、ピラゾリル-インドール系阻害剤、チエノピラゾール阻害剤及びATPポケット内のシステイン-442を標的とするITK阻害剤からなる群から選択される。別の実施形態において、ITK阻害剤は、イブルチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、ニロチニブ、エルロチニブBMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469((R)-3-(1-(1-アクリロイルピペリジン-3-イル)-4-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-N-(3-メチル-4-(1-メチルエチル))ベンズアミド)及びそれらの組み合わせである。別の実施形態において、ITK阻害剤は、イブルチニブである。別の実施形態において、ITK阻害剤は、(R)-3-(1-(1-アクリロイルピペリジン-3-イル)-4-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-N-(3-メチル-4-(1-メチルエチル))ベンズアミドである。前述のITK阻害剤は、Tocris Bioscience, Inc.(Minneapolis, MN, USA)、Selleckchem, Inc.(Houston, TX, USA)及びAK Scientific, Inc.(Union City, CA, USA)を含むさまざまな供給元から市販されている。別の実施形態において、ITK阻害剤は、約0.1nM~約5μMの濃度で添加される。別の実施形態において、ITK阻害剤は、約0.1nM~約5μMの濃度で添加される。別の実施形態において、ITK阻害剤は、約0.1nM~約100nMの濃度で添加される。別の実施形態において、ITK阻害剤は、約0.5nM~約50nMの濃度で添加される。別の実施形態において、ITK阻害剤は、約1nM~約10nMの濃度で添加される。別の実施形態において、ITK阻害剤は、約0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、150nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM及び50μMの濃度で添加される。
[0008] 本発明の一実施形態において、末梢血から末梢血リンパ球(PBL)を拡大培養する方法は、
a.末梢血から末梢血単核細胞(PBMC)のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること;
b.CD19+B細胞を選択及び取り出すことにより、前記サンプルからPBLを分離すること;
c.任意選択により、前記PBLを前記CD19+B細胞と共培養すること;
d.第1の細胞培養培地中の前記PBLをガス透過性容器内において約2日間~約6日間の期間にわたってIL-2及び抗CD3/抗CD28抗体で刺激すること;
e.IL-2及び抗CD3/抗CD28抗体と共に約2日間~約6日間の期間にわたってステップ(d)からのPBLを培養すること;
f.ステップ(e)からの培養物から抗体結合PBLを分離すること;
g.ステップ(e)で分離されたPBLから抗体を取り出すこと;及び
h.PBLを回収すること
を含む。
a.末梢血から末梢血単核細胞(PBMC)のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること;
b.CD19+B細胞を選択及び取り出すことにより、前記サンプルからPBLを分離すること;
c.任意選択により、前記PBLを前記CD19+B細胞と共培養すること;
d.第1の細胞培養培地中の前記PBLをガス透過性容器内において約2日間~約6日間の期間にわたってIL-2及び抗CD3/抗CD28抗体で刺激すること;
e.IL-2及び抗CD3/抗CD28抗体と共に約2日間~約6日間の期間にわたってステップ(d)からのPBLを培養すること;
f.ステップ(e)からの培養物から抗体結合PBLを分離すること;
g.ステップ(e)で分離されたPBLから抗体を取り出すこと;及び
h.PBLを回収すること
を含む。
[0009] 本発明の一実施形態において、方法は、ステップ(d)後にIL-2を添加することと、第1の培地を第2の細胞培地に交換することとを更に含む。別の実施形態において、方法は、ステップ(e)後にIL-2を添加することと、第2の培地を第3の細胞培地に交換することとを更に含む。一実施形態において、第1の細胞培養培地、第2の細胞培養培地又は第3の培養培地は、CM-2、CM-4及びAIM-Vからなる群から選択される。別の実施形態において、第1及び第2の細胞培養培地は、同一である。別の実施形態において、第1及び第2の細胞培養培地は、異なる。本発明の一実施形態において、第1、第2及び第3の細胞培養培地の1つ以上は、同一ある。別の実施形態において、第1、第2及び第3の細胞培養培地は、全て異なる。
[0010] 一実施形態において、前記PBLと前記CD19+B細胞との任意選択による共培養は、1時間~3日間の期間にわたって行われる。
[0011] 本発明の一実施形態において、ステップ(c)におけるT細胞とB細胞との比は、約0.1:1~約10:1である(B細胞:T細胞)。別の実施形態において、ステップ(c)におけるB細胞とT細胞との比は、0.1:1、1:1及び10:1(B細胞:T細胞)からなる群から選択される。
[0012] 本発明の一実施形態において、ステップ(d)の開始時のPBLの開始細胞数は、少なくとも約1×105~約10×105個のPBLである。別の実施形態において、ステップ(d)の開始時のPBLの開始細胞数は、少なくとも約2.5×105~10×105個のPBLである。別の実施形態において、ステップ(d)の開始時のPBLの開始細胞数は、少なくとも5×105個のPBLである。
[0013] 本発明の一実施形態において、ステップ(c)及び(d)のそれぞれにおけるIL-2は、約1000IU/mL~約6000IU/mLの濃度で使用される。別の実施形態において、ステップ(c)及び(d)のそれぞれにおけるIL-2は、約3000IU/mLの濃度で使用される。
[0014] 本発明の一実施形態において、抗CD3/抗CD28抗体は、ビーズ上にコーティングされる。本発明の一実施形態において、抗CD3/抗CD28抗体は、DynaBeads(登録商標)である。一実施形態において、方法は、ステップ(c)及び(d)のそれぞれにおいて約1:1のビーズ:PBL比で抗CD3/抗CD28抗体ビーズをPBLと共培養することを含む。
[0015] 本発明の一実施形態において、方法は、ITK阻害剤を添加することを含む。一実施形態において、ITK阻害剤は、ステップ(c)、(d)及び(e)の少なくとも1つ中に添加される。本発明の一実施形態において、ITK阻害剤は、アミノチアゾール系ITK阻害剤、ベンズイミダゾール系ITK阻害剤、アミノピリミジン系ITK阻害剤、3-アミノピリド-2-オン系ITK阻害剤、インドリルンダゾール系ITK阻害剤、ピラゾリル-インドール系阻害剤、チエノピラゾール阻害剤及びATPポケット内のシステイン-442を標的とするITK阻害剤からなる群から選択される。別の実施形態において、ITK阻害剤は、イブルチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、ニロチニブ、エルロチニブBMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469及びそれらの組み合わせである。別の実施形態において、ITK阻害剤は、イブルチニブである。
[0016] 本発明の実施形態において、PBLを調製するための前述の方法のいずれかは、閉鎖滅菌系で行われる。
[0017] 本発明の一実施形態において、末梢血から末梢血リンパ球(PBL)を拡大培養する方法は、
a.末梢血からPBMCのサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること;
b.CD19+B細胞を選択及び取り出すことにより、前記サンプルからPBLを分離すること;
c.前記PBLを前記CD19+B細胞と4日間の期間にわたって共培養すること;
d.CM-2細胞培養培地中のガス透過性容器に約2.5×105~約5×105個の細胞を添加し、且つ約4日間の期間にわたり、3000IU/mlのIL-2及びビーズに固定化された抗CD3/抗CD28抗体で前記PBLを刺激すること;
e.CM-2をAIM-V細胞培養培地及び約3000IU/mlの追加のIL-2と交換すること;
f.IL-2及びビーズに固定化された抗CD3/抗CD28抗体と共に約3日間の追加の期間にわたってステップ(e)からのPBLを培養すること;
g.ステップ(f)の培養物から抗体結合PBLを分離すること;
h.ステップ(g)で分離されたPBLから抗体を取り出すこと;及び
i.PBLを回収すること
を含む。
a.末梢血からPBMCのサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること;
b.CD19+B細胞を選択及び取り出すことにより、前記サンプルからPBLを分離すること;
c.前記PBLを前記CD19+B細胞と4日間の期間にわたって共培養すること;
d.CM-2細胞培養培地中のガス透過性容器に約2.5×105~約5×105個の細胞を添加し、且つ約4日間の期間にわたり、3000IU/mlのIL-2及びビーズに固定化された抗CD3/抗CD28抗体で前記PBLを刺激すること;
e.CM-2をAIM-V細胞培養培地及び約3000IU/mlの追加のIL-2と交換すること;
f.IL-2及びビーズに固定化された抗CD3/抗CD28抗体と共に約3日間の追加の期間にわたってステップ(e)からのPBLを培養すること;
g.ステップ(f)の培養物から抗体結合PBLを分離すること;
h.ステップ(g)で分離されたPBLから抗体を取り出すこと;及び
i.PBLを回収すること
を含む。
[0018] 本発明の一実施形態において、血液悪性腫瘍を処置する方法は、
a.血液悪性腫瘍に罹患している患者の末梢血からPBMCのサンプルを入手すること;
b.CD19+B細胞を選択及び取り出すことにより、前記サンプルからPBLを分離すること;
c.任意選択により、前記PBLを前記CD19+B細胞と共培養すること;
d.第1の細胞培養培地中の前記PBLをガス透過性容器内において少なくとも約4日間の期間にわたってIL-2及び抗CD3/抗CD28抗体で刺激すること;
e.IL-2及び抗CD3/抗CD28抗体と共に3日間の期間にわたってステップ(d)からのPBLを培養すること;
f.ステップ(e)の培養物から抗体結合PBLを分離すること;
g.ステップ(e)で分離されたPBLから抗体を取り出すこと;及び
h.PBLを回収すること;及び
i.前記血液悪性腫瘍を処置するためにPBLを治療有効量で患者に投与すること
を含む。
a.血液悪性腫瘍に罹患している患者の末梢血からPBMCのサンプルを入手すること;
b.CD19+B細胞を選択及び取り出すことにより、前記サンプルからPBLを分離すること;
c.任意選択により、前記PBLを前記CD19+B細胞と共培養すること;
d.第1の細胞培養培地中の前記PBLをガス透過性容器内において少なくとも約4日間の期間にわたってIL-2及び抗CD3/抗CD28抗体で刺激すること;
e.IL-2及び抗CD3/抗CD28抗体と共に3日間の期間にわたってステップ(d)からのPBLを培養すること;
f.ステップ(e)の培養物から抗体結合PBLを分離すること;
g.ステップ(e)で分離されたPBLから抗体を取り出すこと;及び
h.PBLを回収すること;及び
i.前記血液悪性腫瘍を処置するためにPBLを治療有効量で患者に投与すること
を含む。
[0019] 本発明の一実施形態において、方法は、ITK阻害剤で前処置された患者からPBMCサンプルを入手することを更に含む。本発明の一実施形態において、ITK阻害剤は、アミノチアゾール系ITK阻害剤、ベンズイミダゾール系ITK阻害剤、アミノピリミジン系ITK阻害剤、3-アミノピリド-2-オン系ITK阻害剤、インドリルンダゾール系ITK阻害剤、ピラゾリル-インドール系阻害剤、チエノピラゾール阻害剤及びATPポケット内のシステイン-442を標的とするITK阻害剤からなる群から選択される。本発明の一実施形態において、ITK阻害剤は、イブルチニブ、BMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469及びそれらの組み合わせである。別の実施形態において、ITK阻害剤は、イブルチニブである。別の実施形態において、患者は、イブルチニブレジメンの少なくとも3つのラウンドで前処置される。
[0020] 本発明の一実施形態において、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病(AML)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、活性化B細胞(ABC)DLBCL、胚中心B細胞(GCB)DLBCL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ球性白血病(SLL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、ホジキンリンパ腫、再発性及び/又は難治性ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症(WM)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性NHL、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)関連B細胞リンパ腫並びにエプスタイン-バーウイルス(EBV)関連B細胞リンパ腫からなる群から選択される。別の実施形態において、血液悪性腫瘍は、慢性リンパ球性白血病(CLL)である。本発明の一実施形態において、PBLは、約0.1×109~約15×109個のPBLの量で投与される。
[0021] 本発明の一実施形態において、骨髄から骨髄浸潤リンパ球(MIL)を拡大培養する方法は、
a.骨髄から末梢血単核細胞(PBMC)のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること;
b.CD3+、CD33+、CD20+及びCD14+細胞画分(MIL画分)並びに非CD3+、非CD33+、非CD20+、非CD14+細胞画分(AML芽細胞画分)を選別すること;
c.任意選択により、AML芽細胞画分を破砕すること;
d.任意選択により破砕されたAML芽細胞画分をMIL画分に約0.1:1~約10:1の細胞数比で添加すること;
e.IL-2を含む第1の細胞培養培地においてガス透過性容器内で1つ又は両方の細胞画分を培養すること;
f.抗CD3/抗CD28抗体でMILを刺激してMILの拡大培養を入手すること;
g.約2~約6日間の追加の期間にわたってIL-2及び抗CD3/抗CD28抗体でMILを再刺激すること;
h.約1~約3日間の追加の期間にわたって追加のIL-2と共にMILを培養すること;及び
i.前記MILを回収すること
を含む。
a.骨髄から末梢血単核細胞(PBMC)のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること;
b.CD3+、CD33+、CD20+及びCD14+細胞画分(MIL画分)並びに非CD3+、非CD33+、非CD20+、非CD14+細胞画分(AML芽細胞画分)を選別すること;
c.任意選択により、AML芽細胞画分を破砕すること;
d.任意選択により破砕されたAML芽細胞画分をMIL画分に約0.1:1~約10:1の細胞数比で添加すること;
e.IL-2を含む第1の細胞培養培地においてガス透過性容器内で1つ又は両方の細胞画分を培養すること;
f.抗CD3/抗CD28抗体でMILを刺激してMILの拡大培養を入手すること;
g.約2~約6日間の追加の期間にわたってIL-2及び抗CD3/抗CD28抗体でMILを再刺激すること;
h.約1~約3日間の追加の期間にわたって追加のIL-2と共にMILを培養すること;及び
i.前記MILを回収すること
を含む。
[0022] 本発明の一実施形態において、方法は、ステップ(e)後にIL-2を添加することと、培地を第2の細胞培地に交換することとを更に含む。一実施形態において、第1の細胞培養培地及び第2の細胞培養培地は、CM-2、CM-4及びAIM-Vからなる群から選択される。別の実施形態において、第1及び第2の細胞培養培地は、同一である。別の実施形態において、第1及び第2の細胞培養培地は、異なる。
[0023] 一実施形態において、ステップ(e)の開始時、ガス透過性容器内に少なくとも約2×104~約5×105個のMILがある。別の実施形態において、ステップ(e)の開始時、ガス透過性容器内に少なくとも約2.8×104~3.4×105個のMILがある。別の実施形態において、ステップ(e)の開始時、ガス透過性容器内に少なくとも5×105個のMILがある。
[0024] 本発明の一実施形態において、IL-2は、ステップ(e)において1000IU/ml~6000IL/mlの濃度で存在する。別の実施形態において、IL-2は、約6000IU/mlの濃度で存在する。別の実施形態において、IL-2は、ステップ(g)において約3000IU/mlの濃度で存在する。別の実施形態において、IL-2は、ステップ(h)において約3000IU/mlの濃度で存在する。
[0025] 一実施形態において、ステップ(e)における培養は、約3日間の期間にわたって行われる。一実施形態において、ステップ(f)における刺激は、約4日間の期間にわたって行われる。一実施形態において、ステップ(g)における刺激は、約7日間の期間にわたって行われる。
[0026] 本発明の一実施形態において、任意選択により破砕された細胞画分は、超音波処理、均質化、ボルテックス、振動及び溶解からなる群から選択される方法を使用して破砕される。本発明の一実施形態において、非CD3+、非CD33+、非CD20+、非CD14+細胞画分(AML芽球画分)は、高温溶解、化学溶解(有機アルコールなど)、酵素溶解及び当技術分野で公知の他の細胞溶解方法を含む適切な溶解方法を使用して溶解される。
[0027] 本発明の一実施形態において、抗CD3/抗CD28抗体は、ビーズ上にコーティングされ、及びMIL:ビーズ比は、ステップ(f)及び(g)のそれぞれにおいて約1:1である。
[0028] 本発明の一実施形態において、方法は、閉鎖滅菌系で行われる。
[0029] 本発明の一実施形態において、骨髄から骨髄浸潤リンパ球(MIL)を拡大培養する方法は、
a.骨髄から末梢血単核細胞(PBMC)のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること;
b.CD3+、CD33+、CD20+及びCD14+細胞画分(MIL細胞画分)並びに非CD3+、非CD33+、非CD20+、非CD14+細胞画分(AML芽細胞画分)を選別すること;
c.AML芽細胞画分を破砕し、且つ破砕されたAML芽細胞画分を約1:1の細胞数比でMIL細胞画分に添加すること;
d.約6000IU/mlのIL-2を含む第1の細胞培養培地を有するガス透過性容器内で細胞画分を約3日間の期間にわたって培養すること;
e.ビーズに固定化された抗CD3/抗CD28抗体を約1:1(MIL:ビーズ)の比率で細胞培養物に添加し、且つ約1日間の期間にわたってMIL及び抗体を培養すること;
f.第1の細胞培養培地を、約3000IU/mlの追加のIL-2を含む第2の細胞培養培地に交換すること;
g.約3日間の追加の期間にわたって抗体及びMILを培養すること;
h.少なくとも約4日間の追加の期間にわたり、IL-2及びビーズに固定化された抗CD3/抗CD28抗体でMILを再刺激すること;
i.少なくとも約3日間の追加の期間にわたり、第2の細胞培養培地を、約3000IU/mlの追加のIL-2を含む第3の細胞培養培地に交換すること;
j.前記MILを回収すること
を含む。
a.骨髄から末梢血単核細胞(PBMC)のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること;
b.CD3+、CD33+、CD20+及びCD14+細胞画分(MIL細胞画分)並びに非CD3+、非CD33+、非CD20+、非CD14+細胞画分(AML芽細胞画分)を選別すること;
c.AML芽細胞画分を破砕し、且つ破砕されたAML芽細胞画分を約1:1の細胞数比でMIL細胞画分に添加すること;
d.約6000IU/mlのIL-2を含む第1の細胞培養培地を有するガス透過性容器内で細胞画分を約3日間の期間にわたって培養すること;
e.ビーズに固定化された抗CD3/抗CD28抗体を約1:1(MIL:ビーズ)の比率で細胞培養物に添加し、且つ約1日間の期間にわたってMIL及び抗体を培養すること;
f.第1の細胞培養培地を、約3000IU/mlの追加のIL-2を含む第2の細胞培養培地に交換すること;
g.約3日間の追加の期間にわたって抗体及びMILを培養すること;
h.少なくとも約4日間の追加の期間にわたり、IL-2及びビーズに固定化された抗CD3/抗CD28抗体でMILを再刺激すること;
i.少なくとも約3日間の追加の期間にわたり、第2の細胞培養培地を、約3000IU/mlの追加のIL-2を含む第3の細胞培養培地に交換すること;
j.前記MILを回収すること
を含む。
[0030] 本発明の一実施形態において、血液悪性腫瘍を処置する方法は、
a.骨髄から末梢血単核細胞(PBMC)のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること;
b.CD3+、CD33+、CD20+及びCD14+細胞画分(MIL画分)並びに非CD3+、非CD33+、非CD20+、非CD14+細胞画分(AML芽細胞画分)を選別すること;
c.任意選択により、AML芽細胞画分を破壊すること;
d.任意選択により破砕されたAML芽細胞画分をMIL画分に約0.1:1~約10:1の細胞数比で添加すること;
e.IL-2を含む第1の細胞培養培地においてガス透過性容器内で1つ又は両方の細胞画分を培養すること;
f.抗CD3/抗CD28抗体で前記サンプルを刺激すること;
g.少なくとも約4日間の追加の期間にわたってIL-2及び抗CD3/抗CD28抗体でMILを再刺激すること;
h.少なくとも約3日間の追加の期間にわたって追加のIL-2と共にMILを培養すること;
i.前記MILを回収すること;及び
j.血液悪性腫瘍を処置するために前記MILを治療有効量で患者に投与すること
を含む。
a.骨髄から末梢血単核細胞(PBMC)のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること;
b.CD3+、CD33+、CD20+及びCD14+細胞画分(MIL画分)並びに非CD3+、非CD33+、非CD20+、非CD14+細胞画分(AML芽細胞画分)を選別すること;
c.任意選択により、AML芽細胞画分を破壊すること;
d.任意選択により破砕されたAML芽細胞画分をMIL画分に約0.1:1~約10:1の細胞数比で添加すること;
e.IL-2を含む第1の細胞培養培地においてガス透過性容器内で1つ又は両方の細胞画分を培養すること;
f.抗CD3/抗CD28抗体で前記サンプルを刺激すること;
g.少なくとも約4日間の追加の期間にわたってIL-2及び抗CD3/抗CD28抗体でMILを再刺激すること;
h.少なくとも約3日間の追加の期間にわたって追加のIL-2と共にMILを培養すること;
i.前記MILを回収すること;及び
j.血液悪性腫瘍を処置するために前記MILを治療有効量で患者に投与すること
を含む。
[0031] 本発明の一実施形態において、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病(AML)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、活性化B細胞(ABC)DLBCL、胚中心B細胞(GCB)DLBCL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ球性白血病(SLL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、ホジキンリンパ腫、再発性及び/又は難治性ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症(WM)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性NHL、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)関連B細胞リンパ腫並びにエプスタイン-バーウイルス(EBV)関連B細胞リンパ腫からなる群から選択される。別の実施形態において、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病(AML)である。本発明の一実施形態において、MILは、約4×108~約2.5×109個のMILの量で投与される。
図面の簡単な説明
[0032] 前述の概要及び以下の発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでよりよく理解されるであろう。
[0032] 前述の概要及び以下の発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでよりよく理解されるであろう。
配列表の簡単な説明
[0080] 配列番号1は、ムロモナブの重鎖のアミノ酸配列である。
[0081] 配列番号2は、ムロモナブの軽鎖のアミノ酸配列である。
[0082] 配列番号3は、組換えヒトIL-2タンパク質のアミノ酸配列である。
[0083] 配列番号4は、アルデスロイキンのアミノ酸配列である。
[0084] 配列番号5は、組換えヒトIL-4タンパク質のアミノ酸配列である。
[0085] 配列番号6は、組換えヒトIL-7タンパク質のアミノ酸配列である。
[0086] 配列番号7は、組換えヒトIL-15タンパク質のアミノ酸配列である。
[0087] 配列番号8は、組換えヒトIL-21タンパク質のアミノ酸配列である。
[0080] 配列番号1は、ムロモナブの重鎖のアミノ酸配列である。
[0081] 配列番号2は、ムロモナブの軽鎖のアミノ酸配列である。
[0082] 配列番号3は、組換えヒトIL-2タンパク質のアミノ酸配列である。
[0083] 配列番号4は、アルデスロイキンのアミノ酸配列である。
[0084] 配列番号5は、組換えヒトIL-4タンパク質のアミノ酸配列である。
[0085] 配列番号6は、組換えヒトIL-7タンパク質のアミノ酸配列である。
[0086] 配列番号7は、組換えヒトIL-15タンパク質のアミノ酸配列である。
[0087] 配列番号8は、組換えヒトIL-21タンパク質のアミノ酸配列である。
発明の詳細な説明
[0088] 他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[0088] 他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
定義
[0089] 本明細書で使用される「共投与」、「共投与すること」、「~と組み合わせて投与される」、「~と組み合わせて投与すること」、「同時(simultaneous)」及び「同時(concurrent)」という用語は、両方の活性医薬成分及び/又はそれらの代謝産物が同時に対象内に存在するための、対象への2つ以上の活性医薬成分の投与を包含する。共投与には、別々の組成物中での同時投与、別々の組成物中での異なる時点における投与又は2つ以上の活性医薬成分が存在する組成物での投与が含まれる。別々の組成物での同時投与及び両方の薬剤が存在する組成物での投与が好ましい。
[0089] 本明細書で使用される「共投与」、「共投与すること」、「~と組み合わせて投与される」、「~と組み合わせて投与すること」、「同時(simultaneous)」及び「同時(concurrent)」という用語は、両方の活性医薬成分及び/又はそれらの代謝産物が同時に対象内に存在するための、対象への2つ以上の活性医薬成分の投与を包含する。共投与には、別々の組成物中での同時投与、別々の組成物中での異なる時点における投与又は2つ以上の活性医薬成分が存在する組成物での投与が含まれる。別々の組成物での同時投与及び両方の薬剤が存在する組成物での投与が好ましい。
[0090] 「インビボ」という用語は、哺乳動物対象の体内で起こる事象を指す。
[0091] 「エクスビボ」という用語は、人工環境において哺乳動物対象の体の外側で起こる事象を指す。
[0092] 「インビトロ」という用語は、試験系で起こる事象を指す。インビトロアッセイは、生存細胞又は死細胞が使用され得る細胞ベースのアッセイを包含し、無傷細胞が使用されない無細胞アッセイも包含し得る。
[0093] 「急速拡大培養」という用語は、1週間の期間にわたって少なくとも約3倍(又は4倍、5倍、6倍、7倍、8倍若しくは9倍)、より好ましくは1週間の期間にわたって少なくとも約10倍(又は20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍若しくは90倍)又は最も好ましくは1週間の期間にわたって少なくとも約100倍の抗原特異的TILの数の増加を意味する。いくつかの急速拡大培養プロトコルが本明細書に記載されている。
[0094] 腫瘍を破砕するプロセスを説明するために本明細書で使用される「断片化」、「断片」及び「断片化された」という用語には、腫瘍組織の破砕、スライス、分割及び細切並びに腫瘍組織の物理的構造を破砕する他の方法などの機械的断片化方法が含まれる。
[0095] 「末梢血単核細胞」及び「PBMC」という用語は、リンパ球(T細胞、B細胞、NK細胞)及び単球を含む、円形核を有する末梢血細胞を指す。任意選択により、末梢血単核細胞は、照射同種異系末梢血単核細胞である。抗原提示細胞である。「PBL」という用語は、末梢血リンパ球を指し、末梢血から拡大培養したT細胞である。PBL及びTILという用語は、本明細書において互換的に使用される。
[0096] 「抗CD3抗体」という用語は、抗体又はその変異体、例えばモノクローナル抗体を指し、成熟T細胞のT細胞抗原受容体中のCD3受容体に対して指向されたヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含む。抗CD3抗体には、ムロモナブとしても知られるOKT-3及びUCHT-1が含まれる。他の抗CD3抗体には、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ及びビジリズマブが含まれる。
[0097] 「OKT-3」(本明細書では「OKT3」とも称される)という用語は、成熟T細胞のT細胞抗原受容体中のCD3受容体に対して指向されたヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含むモノクローナル抗体又はそのバイオシミラー若しくは変異体を指し、OKT-3(30ng/mL、MACS GMP CD3 pure、Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA)及びムロモナブ又はその変異体、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム若しくはバイオシミラーなどの市販の形態を含む。ムロモナブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を表1に示す(配列番号1及び配列番号2)。OKT-3を産生することができるハイブリドーマは、American Type Culture Collectionに寄託されており、ATCC受託番号CRL 8001が割り当てられている。OKT-3を産生することができるハイブリドーマもEuropean Collection of Authenticated Cell Cultures(ECACC)に寄託されており、カタログ番号86022706が割り当てられている。
[0098] 「IL-2」(本明細書では「IL2」とも称される)という用語は、インターロイキン-2として知られるT細胞増殖因子を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、その保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及び変異体を含む全ての形態のIL-2を含む。IL-2は、例えば、Nelson, J. Immunol.2004, 172, 3983-88及びMalek, Annu.Rev. Immunol.2008, 26, 453-79に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明における使用に適した組換えヒトIL-2のアミノ酸配列を表2に示す(配列番号3)。例えば、IL-2という用語は、アルデスロイキン(PROLEUKIN、1単回使用バイアルあたり2200万IUで複数の供給元から市販されている)並びにCellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA(CELLGRO GMP)又はProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(カタログ番号CYT-209-b)から市販で供給される組換えIL-2の形態及び他の販売業者からの他の市販の均等物などのIL-2のヒト組換え型を包含する。アルデスロイキン(デス-アラニル-1、セリン-125ヒトIL-2)は、およそ15kDaの分子量の非グリコシル化ヒト組換え型IL-2である。本発明における使用に適したアルデスロイキンのアミノ酸配列を表2に示す(配列番号4)。IL-2という用語は、本明細書に記載されているように、Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USAから入手可能なペグ化IL2プロドラッグNKTR-214を含む、ペグ化形態のIL-2も包含する。本発明での使用に好適なNKTR-214及びペグ化IL-2が米国特許出願公開第2014/0328791A1号及び国際公開第2012/065086A1号(これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。本発明での使用に適したコンジュゲートIL-2の代替形態は、米国特許第4,766,106号、同第5,206,344号、同第5,089,261号及び同第4,902,502号に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明における使用に適したIL-2の製剤は、米国特許第6,706,289号に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[0099] 「IL-4」(本明細書では「IL4」とも称される)という用語は、インターロイキン4として知られるサイトカインを指し、これは、Th2 T細胞により、且つ好酸球、好塩基球及び肥満細胞により産生される。IL-4は、ナイーブヘルパーT細胞(Th0細胞)のTh2 T細胞への分化を調節する。Steinke and Borish, Respir.Res.2001, 2, 66-70。IL-4によって活性化されると、Th2 T細胞は、続いて、ポジティブフィードバックループにおいて更なるIL-4を産生する。IL-4はまた、B細胞増殖及びクラスII MHC発現を刺激し、B細胞からのIgE及びIgG1発現へのクラス切り替えを誘導する。本発明における使用に適した組換えヒトIL-15は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(カタログ番号CYT-211)及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (ヒトIL-4組換えタンパク質、カタログ番号Gibco CTP0043)を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトIL-4のアミノ酸配列を表2に示す(配列番号5)。
[00100] 「IL-7」(本明細書では「IL7」とも称される)という用語は、インターロイキン7として知られるグリコシル化組織由来サイトカインを指し、これは、間質及び上皮細胞並びに樹状細胞から入手され得る。Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904。IL-7は、T細胞の発現を刺激することができる。IL-7は、胸腺内のT細胞発生及び末梢内での生存に重要な一連のシグナルにおいて、IL-7受容体アルファ及び一般的なガンマ鎖受容体からなるヘテロ二量体であるIL-7受容体に結合する。本発明における使用に適した組換えヒトIL-7は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(カタログ番号CYT-254)及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (ヒトIL-7組換えタンパク質、カタログ番号Gibco PHC0071)を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトIL-7のアミノ酸配列を表2に示す(配列番号6)。
[00101] 「IL-15」(本明細書では「IL15」とも称される)という用語は、インターロイキン-15として知られるT細胞増殖因子を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、その保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及び変異体を含む全ての形態のIL-15を含む。IL-15は、例えば、Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。IL-15は、β及びγシグナル伝達受容体サブユニットをIL-2と共有する。組換えヒトIL-15は、分子量12.8kDaの114個のアミノ酸(及びN末端メチオニン)を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトIL-15は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(カタログ番号CYT-230-b)及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (ヒトIL-15組換えタンパク質、カタログ番号34-8159-82)を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトIL-15のアミノ酸配列を表2に示す(配列番号7)。
[00102] 「IL-21」(本明細書では「IL21」とも称される)という用語は、インターロイキン-21として知られる多面発現性サイトカインタンパク質を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、その保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及び変異体を含む全ての形態のIL-21を含む。IL-21は、例えば、Spolski and Leonard, Nat.Rev. Drug.Disc.2014, 13, 379-95に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。IL-21は、主にナチュラルキラーT細胞及び活性化ヒトCD4+T細胞によって産生される。組換えヒトIL-21は、15.4kDaの分子量の、132個のアミノ酸を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトIL-21は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(カタログ番号CYT-408-b)及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (ヒトIL-21組換えタンパク質、カタログ番号14-8219-80)を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトIL-21のアミノ酸配列を表2に示す(配列番号8)。
[00103] 「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤並びに不活性成分を含むことを意図している。活性医薬成分のためのそのような薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤が活性医薬成分と適合しない場合を除いて、本発明の治療用組成物におけるその使用が企図される。他の薬物などの追加の活性医薬成分も記載の組成物及び方法に組み込むことができる。
[00104] 1つ及び複数の「抗体」という用語は、免疫グロブリン全体及び任意の抗原結合断片(「抗原結合部分」)又はそれらの単鎖を指す。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも2つの重(H)鎖及び2つの軽(L)鎖を含む糖タンパク質又はその抗原結合部分を更に指す。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではVHと略す)及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2及びCH3で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではVLと略す)及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLで構成される。抗体のVH及びVL領域は、相補性決定領域(CDR)又は超可変領域(HVR)と称され、より保存された領域(フレームワーク領域(FR)と呼ばれる)に分散することができる、超可変性を有する領域に更に細分化され得る。各VH及びVLは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かってFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置された3つのCDR及び4つのFRで構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、1つ又は複数の抗原エピトープと相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)及び古典的補体系の第1の成分(Clq)を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
[00105] 「抗原」という用語は、免疫応答を誘導する物質を指す。一部の実施形態において、抗原は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子によって提示される場合、抗体又はTCRによって結合され得る分子である。本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、T細胞エピトープも包含する。抗原は、免疫系によって更に認識され得る。一部の実施形態において、抗原は、Bリンパ球及び/又はTリンパ球の活性化をもたらす体液性免疫応答又は細胞性免疫応答を誘導することができる。一部の場合、これは、抗原がTh細胞エピトープを含有するか又はそれに結合していることを要し得る。抗原は、1つ以上のエピトープ(例えば、Bエピトープ及びTエピトープ)も有し得る。一部の実施形態において、抗原は、好ましくは、典型的には高度に特異的且つ選択的な態様でその対応する抗体又はTCRと反応し、他の抗原によって誘導され得る多数の他の抗体又はTCRと反応しない。
[00106] 「モノクローナル抗体」、「mAb」、「モノクローナル抗体組成物」という用語又はそれらの複数形は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。特定の受容体に特異的なモノクローナル抗体は、試験対象に適切な抗原を注射し、次いで所望の配列又は機能的特徴を有する抗体を発現するハイブリドーマを分離するという当技術分野における知識及び技術を用いて作製することができる。モノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手順を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)容易に分離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの好ましい供給源としての役割を果たす。DNAは、分離されると発現ベクター中に入れられ得、次いで、これを、大腸菌(E. coli)細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又は他の方法では免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を入手する。抗体の組換え産生は、以下により詳細に記載される。
[00107] 本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」(又は単に「抗体部分」若しくは「断片」)という用語は、特異的に抗原に結合する能力を保持する抗体の1つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって行われ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、(i)VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる一価断片であるFab断片、(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された2つのFab断片を含む二価断片であるF(ab’)2断片、(iii)VH及びCH1ドメインからなるFd断片、(iv)抗体の単一アームのVL及びVHドメインからなるFv断片、(v)VH又はVLドメインからなり得るドメイン抗体(dAb)断片(Ward, et al, Nature, 1989, 341, 544-546)、及び(vi)分離された相補性決定領域(CDR)が含まれる。更に、Fv断片の2つのドメイン、VL及びVHは、別々の遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え法を用いて、VL及びVH領域ペアが単鎖Fv(scFv)として知られる一価分子を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらが作製されることを可能にする合成リンカーによって連結され得る;例えば、Bird, et al., Science 1988, 242, 423-426;及びHuston, et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988, 85, 5879-5883を参照されたい)。そのようなscFv抗体は、抗体の「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」という用語内に包含されることも意図している。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を使用して入手され、断片は、無傷の抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
[00108] 本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域及びCDR領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図している。更に、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的変異誘発によって又はインビボでの体細胞変異によって導入された変異)を含み得る。本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図しない。
[00109] 「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワーク領域及びCDR領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を指す。一実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから入手され、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するB細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
[00110] 本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、(a)ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニック若しくはトランス染色体である動物(マウスなど)又はそれから調製されたハイブリドーマ(以下で更に説明する)から分離された抗体、(b)ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから分離された抗体、(c)組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから分離された抗体、及び(d)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、生成又は分離された抗体など、組換え手段によって調製、発現、生成又は分離された全てのヒト抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域及びCDR領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、特定の実施形態において、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発(又はヒトIg配列についてトランスジェニックな動物を使用する場合、インビボ体細胞変異誘発)に供することができ、従って、組換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のVH及びVL配列に由来し、それらに関係している一方、インビボでのヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に天然に存在し得ない配列である。
[00111] 本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス(例えば、IgM又はIgG1)を指す。
[00112] 「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という句は、本明細書において「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。
[00113] 「ヒト抗体誘導体」という用語は、抗体と別の活性医薬成分又は抗体とのコンジュゲートを含む、ヒト抗体の任意の変異形態を指す。「コンジュゲート」、「抗体-薬物コンジュゲート」、「ADC」又は「イムノコンジュゲート」という用語は、別の治療部分にコンジュゲートされた抗体又はその断片を指し、これは、当技術分野で利用可能な方法を使用して本明細書に記載の抗体にコンジュゲートすることができる。
[00114] 1つの「ヒト化抗体」、複数の「ヒト化抗体」及び「ヒト化」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を指すことを意図する。ヒトフレームワーク配列内で更なるフレームワーク領域の改変がなされ得る。ヒト化形態の非ヒト(例えば、マウス)抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有する、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種の15個の超可変領域(ドナー抗体)由来の残基によって置換されているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含み得る。これらの改変は、抗体性能を更に改良するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意選択により、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含む。更なる詳細については、Jones, et al, Nature 1986, 321, 522-525;Riechmann, et al, Nature 1988, 332, 323-329;及びPresta, Curr.Op.Struct.Biol 1992, 2, 593-596を参照されたい。本明細書に記載の抗体は、エフェクター機能及び/又はFcR結合に改善(例えば、減少)を付与することも知られている、任意のFc変異体を使用するように改変され得る。Fc変異体は、例えば、国際公開第1988/07089A1号、同第1996/14339A1号、同第1998/05787A1号、同第1998/23289A1号、同第1999/51642A1号、同第99/58572A1号、同第2000/09560A2号、同第2000/32767A1号、同第2000/42072A2号、同第2002/44215A2号、同第2002/060919A2号、同第2003/074569A2号、同第2004/016750A2号、同第2004/029207A2号、同第2004/035752A2号、同第2004/063351A2号、同第2004/074455A2号、同第2004/099249A2号、同第2005/040217A2号、同第2005/070963A1号、同第2005/077981A2号、同第2005/092925A2号、同第2005/123780A2号、同第2006/019447A1号、同第2006/047350A2号及び同第2006/085967A2号;及び米国特許第5,648,260号;同第5,739,277号;同第5,834,250号;同第5,869,046号;同第6,096,871号;同第6,121,022号;同第6,194,551号;同第6,242,195号;同第6,277,375号;同第6,528,624号;同第6,538,124号;同第6,737,056号;同第6,821,505号;同第6,998,253号;及び同第7,083,784号に開示されるアミノ酸置換のいずれか1つを含み得、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[00115] 「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体など、可変領域配列が1つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体を指すことを意図する。
[00116] 「ダイアボディ」は、2つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片である。断片は、同じポリペプチド鎖(VH-VL又はVL-VH)内の軽鎖可変ドメイン(VL)に接続された重鎖可変ドメイン(VH)を含む。同一鎖上の2つのドメイン間で対形成させるには短すぎるリンカーを使用することにより、そのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成し、2つの抗原結合部位を生成することを強いられる。ダイアボディは、例えば、欧州特許第404,097号、国際公開第93/11161号;及びBolliger, et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993, 90, 6444-6448に更に十分に記載されている。
[00117] 「グリコシル化」という用語は、抗体の改変誘導体を指す。アグリコシル化抗体は、グリコシル化を欠く。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるために改変することができる。そのような炭水化物改変は、例えば、抗体配列内の1つ以上のグリコシル化部位を変えることによって達成することができる。例えば、1つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらし、それによってその部位でのグリコシル化を除去する、1つ以上のアミノ酸置換を行うことができる。米国特許第5,714,350号及び同第6,350,861号に記載されているように、アグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。追加的又は代替的に、減少したフコシル残基の量を有する低フコシル化抗体又は増加したバイセクティング(bisecting)GlcNac構造を有する抗体など、グリコシル化の種類が変更された抗体を作製することができる。そのような改変されたグリコシル化パターンは、抗体の能力を増大させることが実証されている。そのような炭水化物改変は、例えば、グリコシル化機構を変えて宿主細胞中で抗体を発現させることによって達成することができる。グリコシル化機構が改変された細胞は、当技術分野において記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ、それによって改変されたグリコシル化を有する抗体を産生するための宿主細胞として使用することができる。例えば、細胞株Ms704、Ms705及びMs709は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、FUT8(アルファ(1,6)フコシルトランスフェラーゼ)を欠いているため、Ms704、Ms705及びMs709細胞株で発現される抗体は、それらの炭水化物上でフコースを欠いている。Ms704、Ms705及びMs709 FUT8-/-細胞株は、2つの置換ベクターを使用して、CHO/DG44細胞中のFUT8遺伝子を標的とした破壊によって生成された(例えば、米国特許出願公開第2004/0110704号又はYamane-Ohnuki, et al, Biotechnol.Bioeng., 2004, 87, 614-622)。別の例として、欧州特許第1,176,195号には、そのような細胞株で発現される抗体が、アルファ1,6結合関連酵素を減少させるか又は排除することにより低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的に破壊されたFUT8遺伝子を有する細胞株が記載され、また抗体のFc領域に結合するN-アセチルグルコサミンにフコースを加える酵素活性が低いか又は酵素活性を有しない細胞株、例えばラット骨髄腫細胞株YB2/0(ATCC CRL 1662)も記載される。国際公開第03/035835号には、Asn(297)が連結した炭水化物にフコースを結合する能力が低下し、またその宿主細胞で発現した抗体の低フコシル化をもたらす変異体CHO細胞株、Lec13細胞が記載される(Shields, et al, J. Biol Chem.2002, 277, 26733-26740も参照されたい。国際公開第99/54342号には、操作された細胞株で発現された抗体が、抗体のADCC活性の増加をもたらす増加したバイセクティングGlcNac構造を示すように、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼを発現するよう操作された細胞株(例えば、ベータ(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII))が記載される(Umana, et al., Nat.Biotech.1999, 77, 176-180も参照されたい)。代わりに、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を使用して切断し得る。例えば、フコシダーゼであるアルファ-L-フコシダーゼは、Tarentino, et al., Biochem.1975, 14, 5516-5523に記載されるように、抗体由来のフコシル残基を除去する。
[00118] 「ペグ化」とは、1つ以上のPEG基が抗体又は抗体断片に結合するようになる条件下において、典型的には、ポリエチレングリコール(PEG)の反応性エステル又はアルデヒド誘導体などのPEGと反応する修飾抗体又はその断片を指す。ペグ化は、例えば、抗体の生物学的(例えば、血清)半減期を増加させ得る。好ましくは、ペグ化は、反応性PEG分子(又は類似の反応性水溶性ポリマー)とのアシル化反応又はアルキル化反応を介して行われる。本明細書で使用される場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ(C1-C10)アルコキシ-若しくはアリールオキシ-ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール-マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用されているPEGの形態のいずれも包含することを意図する。ペグ化される抗体は、アグリコシル化抗体であり得る。ペグ化の方法は、当技術分野において公知であり、例えば欧州特許第0154316号及び同第0401384号並びに米国特許第5,824,778号に記載されているように、本発明の抗体に適用することができ、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[00119] 「融合タンパク質」又は「融合ポリペプチド」という用語は、2つ以上の個々のタンパク質の特性を組み合わせたタンパク質を指す。そのようなタンパク質は、直接又はアミノ酸リンカーを介して共有結合した少なくとも2つの異種ポリペプチドを有する。融合タンパク質を形成するポリペプチドは、典型的にはC末端からN末端に連結しているが、C末端からC末端、N末端からN末端又はN末端からC末端に連結することもできる。融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序であり得、構成ポリペプチドのいずれか2つ以上又は両方を含み得る。この用語は、融合タンパク質を構成する抗原の、保存的に改変された変異体、多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、部分配列、種間同族体及び免疫原性断片を包含する。本開示の融合タンパク質は、成分抗原又はその免疫原性断片の更なるコピーも含み得る。融合タンパク質は、互いに結合し、IgG FcドメインなどのFcドメインに更に結合した1つ以上の結合ドメインを含み得る。融合タンパク質は、モノクローナル抗体を模倣し、6つ以上の結合ドメインを提供するために共に更に連結され得る。融合タンパク質は、当技術分野において公知であるように、組換え法によって産生され得る。融合タンパク質の調製は、当技術分野で公知であり、例えば国際公開第1995/027735A1号、同第2005/103077A1号、同第2008/025516A1号、同第2009/007120A1号、同第2010/003766A1号、同第2010/010051A1号、同第2010/078966A1号、米国特許出願公開第2015/0125419A1号及び同第2016/0272695A1号並びに米国特許第8,921,519号に記載され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[00120] 核酸又はタンパク質の部分に関して使用される場合の「異種」という用語は、その核酸又はタンパク質が、天然に互いに同じ関係で見出されない2つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には組換え的に産生され、新しい機能性核酸を作成するように配置された無関係の遺伝子由来の2つ以上の配列、例えば1つの供給源からのプロモーター及び別の供給源からのコーディング領域又は異なる供給源からのコーディング領域を有する。同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が、天然に互いに同じ関係で見出されない2つ以上の部分配列を含むことを示す(例えば、融合タンパク質)。
[00121] 「保存的アミノ酸置換」という用語は、抗体又は融合タンパク質の抗原への結合を無効にしないアミノ酸配列改変を意味する。保存的アミノ酸置換には、あるクラスのアミノ酸の同じクラスのアミノ酸での置換が含まれ、ここで、クラスは、例えば、標準Dayhoff頻度交換行列又はBLOSUM行列によって決定されるように、一般的な物理化学的アミノ酸側鎖特性及び天然に見られる相同タンパク質における高い置換頻度によって定義される。6つの一般的なクラスのアミノ酸側鎖が分類されており、クラスI(Cys);クラスII(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly);クラスIII(Asn、Asp、Gln、Glu);クラスIV(His、Arg、Lys);クラスV(Ile、Leu、Val、Met);及びクラスVI(Phe、Tyr、Trp)を含む。例えば、Asn、Gln又はGluなど、別のクラスIII残基へのAspの置換は、保存的置換である。従って、抗体中の予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じクラスからの別のアミノ酸残基で置換される。抗原結合を排除しないアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当技術分野において周知である(例えば、Brummell, et al., Biochemistry 1993, 32, 1180-1187;Kobayashi, et al., Protein Eng.1999, 12, 879-884 (1999);及びBurks, et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997, 94, 412-417を参照されたい。
[00122] 2つ以上の核酸又はポリペプチドに関連して、「配列同一性」、「パーセント同一性」及び「配列パーセント同一性」(又はそれらの同義語、例えば「99%同一」)という用語は、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を考慮せずに、最大限の対応について比較し、整合させた場合(必要に応じてギャップを導入する)、同じであるか、又は同じヌクレオチド若しくはアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する2つ以上の配列又は部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェア若しくはアルゴリズムを使用するか又は目視検査によって測定することができる。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを入手するために使用することができる様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当技術分野において公知である。パーセント配列同一性を決定するための適切なプログラムには、例えば、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センターのBLASTウェブサイトから入手可能なBLASTプログラム一式が含まれる。2つの配列間の比較は、BLASTN又はBLASTPアルゴリズムのいずれかを使用して実施することができる。BLASTNは、核酸配列を比較するために使用される一方、BLASTPは、アミノ酸配列を比較するために使用される。ALIGN、ALIGN-2(Genentech, South San Francisco, California)又はDNASTARから入手可能なMegAlignは、配列を整合するために使用することができる、公に入手可能な更なるソフトウェアプログラムである。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアによって最大アラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。特定の実施形態において、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
[00123] 本明細書で使用される「変異体」という用語は、参照抗体のアミノ酸配列内又はそれに隣接する特定の位置での1つ以上の置換、欠失及び/又は付加により、参照抗体のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む抗体又は融合タンパク質を包含するが、これに限定されるものではない。変異体は、参照抗体のアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列中に1つ以上の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様に荷電又は非荷電であるアミノ酸の置換を含み得る。変異体は、参照抗体の抗原に特異的に結合する能力を保持している。変異体という用語は、ペグ化抗体又はタンパク質も含む。
[00124] 核酸配列は、明示的に示される配列と同様に、その保存的に改変された変異体(例えば、縮重コドン置換)及び相補的配列も非明示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つ以上の選択された(又は全ての)コドンの第3の位置が混合塩基及び/又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る。Batzer, et al, Nucleic Acid Res.1991, 79, 5081;Ohtsuka, et al, J. Biol.Chem.1985, 260, 2605-2608;Rossolini, et al., Mol.Cell.Probes 1994, 8, 91-98。核酸という用語は、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドと互換的に使用される。
[00125] 「バイオシミラー」という用語は、モノクローナル抗体又はタンパク質を含む生物学的産物を意味し、これは、臨床的に不活性な成分におけるわずかな違いにかかわらず、米国の認可された参照生物学的製品と高度に類似しており、製品の安全性、純度及び効力の点で生物学的製品と参照製品との間に臨床的に有意義な違いはない。更に、類似の生物学的又は「バイオシミラー」医薬は、欧州医薬品庁により使用がすでに認可されている、別の生物学的医薬と類似の生物学的医薬である。「バイオシミラー」という用語は、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に使用される。生物学的製剤又は生物学的医薬品は、細菌又は酵母などの生物学的供給源によって作製されるか又はそれに由来する医薬品である。それらは、ヒトインスリン又はエリスロポエチンなどの比較的小さい分子又はモノクローナル抗体などの複雑な分子からなり得る。例えば、参照IL-2タンパク質がアルデスロイキン(PROLEUKIN)である場合、アルデスロイキンに関して医薬品規制当局によって承認されたタンパク質は、アルデスロイキン「に対するバイオシミラー」又はアルデスロイキンの「そのバイオシミラー」である。欧州では、類似の生物学的又は「バイオシミラー」医薬は、欧州医薬品庁(EMA)により使用がすでに認可されている、別の生物学的医薬と類似の生物学的医薬である。ヨーロッパにおける同様の生物学的用途の関連法的根拠は、改正された規則(EC)No726/2004の第6条及び指令2001/83/ECの第10条(4)であり、従って、ヨーロッパでは、バイオシミラーは、規則(EC)No726/2004の第6条及び指令2001/83/ECの第10(4)条の下で認可され得、認可が承認され得るか又は認可申請の対象であり得る。ヨーロッパでは、すでに認可されている元の生物学的医薬品は、「参照医薬品」と呼ばれることがある。バイオシミラーと見なされる製品の要件のいくつかは、類似生物学的医薬品におけるCHMPガイドラインに概説されている。更に、モノクローナル抗体バイオシミラーに関するガイドラインを含む製品固有のガイドラインは、EMAによって製品ごとに提供され、そのウェブサイトに公開されている。本明細書に記載のバイオシミラーは、品質特性、生物学的活性、作用機序、安全性プロファイル及び/又は有効性として参照医薬品と類似し得る。更に、バイオシミラーは、参照医薬品と同じ状態を処置するために使用されるか又は使用を意図され得る。従って、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似した又は非常に類似した品質特性を有すると見なし得る。代わりに又は更に、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似した又は非常に類似した生物学的活性を有すると見なし得る。代わりに又は更に、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似した又は非常に類似した安全性プロファイルを有すると見なし得る。代わりに又は更に、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似した又は非常に類似した有効性を有すると見なし得る。本明細書に記載されるように、ヨーロッパにおけるバイオシミラーは、EMAによって認可されている参照医薬品と比較される。しかしながら、一部の場合、バイオシミラーは、特定の研究において欧州経済地域外で認可されている生物学的医薬品(EEA非認可の「コンパレータ」)と比較され得る。そのような試験には、例えば、特定の臨床試験及びインビボ非臨床試験が含まれる。本明細書で使用される場合、「バイオシミラー」という用語は、非EEA認可コンパレータと比較された又は比較され得る生物学的医薬品にも関する。特定のバイオシミラーは、抗体、抗体断片(例えば、抗原結合部分)及び融合タンパク質などのタンパク質である。タンパク質バイオシミラーは、ポリペプチドの機能に有意に影響を及ぼさない、アミノ酸構造にわずかな改変(例えば、アミノ酸の欠失、付加及び/又は置換を含む)を有するアミノ酸配列を有し得る。バイオシミラーは、その参照医薬品のアミノ酸配列に対して97%以上、例えば97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。バイオシミラーは、相違が医薬品の安全性及び/又は有効性において変化をもたらさないことを条件として、参照医薬品の翻訳後改変と異なる1つ以上の翻訳後改変、例えば、限定されるものではないが、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び/又は切断を含み得る。バイオシミラーは、参照医薬品と同一又は異なるグリコシル化パターンを有し得る。排他的ではないが、特に相違が参照医薬品に関する安全性の懸念に対処するか又は対処することを意図している場合、バイオシミラーは、異なるグリコシル化パターンを有し得る。更に、バイオシミラーは、医薬品の安全性及び有効性が損なわれない場合、例えばその強度、医薬形態、製剤、賦形剤及び/又は提示において参照医薬品から逸脱し得る。バイオシミラーは、例えば、参照医薬品と比較した場合の薬物動態(PK)及び/又は薬力学(PD)プロファイルにおける相違を含み得るが、依然として承認されるか又は承認に適していると見なされるために、参照医薬品と十分に類似していると認められる。特定の状況において、バイオシミラーは、参照医薬品と比較して異なる結合特性を示し、ここで、異なる結合特性は、EMAなどの規制当局により、類似の生物学的製品としての認可に対する障壁ではないと見なされる。「バイオシミラー」という用語は、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に使用される。
[00126] 「血液悪性腫瘍」という用語は、血液、骨髄、リンパ節及びリンパ系の組織を含むが、これらに限定されない、哺乳動物の癌及び造血系及びリンパ系組織の腫瘍を指す。血液悪性腫瘍は、「液性腫瘍」の形成をもたらし得る。血液悪性腫瘍には、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ性リンパ腫(CLL)、小リンパ性リンパ腫(SLL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性単球性白血病(AMoL)、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫が含まれるが、これらに限定されるものではない。「B細胞血液悪性腫瘍」という用語は、B細胞に影響を及ぼす血液悪性腫瘍を指す。
[00127] 「液性腫瘍」という用語は、本来流動性である異常な細胞塊を指す。液性腫瘍癌としては、白血病、骨髄腫及びリンパ腫並びに他の血液悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されるものではない。骨髄内に存在する液性腫瘍を含む、液性腫瘍から入手したTILは、本明細書では骨髄浸潤リンパ球(MIL)とも称され得る。末梢血中を循環する液性腫瘍を含む液性腫瘍から入手したTILは、本明細書ではPBLとも称され得る。MIL、TIL及びPBLという用語は、本明細書において互換的に使用され、細胞が由来する組織タイプによってのみ異なる。
[00128] 「生検」という用語は、骨髄生検を含む、癌細胞を入手するために使用されるあらゆる医療処置を指す。
[00129] 「急性骨髄性(myeloid)白血病」又は「AML」という用語は、当技術分野で急性骨髄性(myelogenous)白血病及び急性非リンパ性白血病としても知られている骨髄性血液細胞株の癌を指す。AMLは、液性腫瘍であるが、緑色腫などの髄外所見を含むAMLの一部の所見は、固形腫瘍の特性を示すが、本明細書では液性腫瘍として分類される。
[00130] 本明細書で使用される「微小環境」という用語は、全体としての固形又は血液腫瘍微小環境又は微小環境内の細胞の個々のサブセットを指し得る。本明細書で使用される腫瘍微小環境は、Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473に記載されているように、「新生物性形質転換を促進し、腫瘍の成長及び浸潤をサポートし、腫瘍を宿主の免疫から保護し、治療抵抗性を培い、優勢な転移を成功させるニッチを提供する細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス及び機械的手がかり」の複合的な混合物を指す。腫瘍は、T細胞によって認識されるべき抗原を発現するが、免疫系による腫瘍の排除は、微小環境による免疫抑制のために希少である。
[00131] 「有効量」又は「治療有効量」という用語は、疾患処置を含むが、これに限定されない、意図された用途を達成するのに十分である、本明細書に記載の化合物又は化合物の組み合わせの量を指す。治療有効量は、意図される用途(インビトロ又はインビボ)又は処置されている対象及び疾患状態(例えば、対象の体重、年齢及び性別)、疾患状態の重症度又は投与方法によって変動し得る。この用語は、標的細胞において特定の応答(例えば、血小板接着及び/又は細胞遊走の減少)を誘発する用量にも適用される。特定の用量は、選択された特定の化合物、従うべき投与レジメン、化合物が他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、それが投与される組織及び化合物が運ばれる物理的送達システムによって変動する。
[00132] 「治療効果」は、その用語が本明細書で使用される場合、治療上の利益及び/又は予防上の利益を包含する。予防効果は、疾患若しくは状態の出現を遅らせるか若しくは排除すること、疾患若しくは状態の症状の発症を遅らせるか若しくは排除すること、疾患若しくは状態の進行を遅らせること、停止させること若しくは逆行させること又はそれらの任意の組み合わせを含む。
[00133] 「治療」、「治療している」、「治療する」などの用語は、所望の薬理学的及び/又は生理学的効果を達成することを指す。効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に防ぐという意味で予防的であり得、及び/又は疾患及び/又は疾患に起因する有害作用を部分的に又は完全に治癒するという意味で治療的であり得。「治療」は、本明細書で使用されるとき、哺乳類、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、(a)疾患の素因があり得るが、依然としてそれを有すると診断されてない対象において疾患の発生を防ぐこと;(b)疾患を阻害すること、即ちその発症又は進行を止めること;及び(c)疾患を軽減すること、即ち疾患の退縮を生じさせること及び/又は1つ以上の疾患症状を軽減することが含まれる。「治療」は、疾患又は病態がない場合でも、薬理学的効果を提供するための薬剤の送達を包含することも意図される。例えば、「治療」は、例えば、ワクチンの場合、疾患状態がないなかで免疫応答を誘発するか又は免疫を付与することのできる組成物の送達を包含する。
[00134] 「QD」、「qd」又は「q.d.」という用語は、1日に1回、1日1回又は毎日1回を意味する。「BID」、「bid」又は「b.i.d.」という用語は、1日に2回、1日2回又は毎日2回を意味する。「TID」、「tid」又は「t.i.d.」という用語は、1日に3回、1日3回又は毎日3回を意味する。「QID」、「qid」又は「q.i.d.」という用語は、1日に4回、1日4回又は毎日4回を意味する。
[00135] 本明細書における「腫瘍浸潤リンパ球」又は「TIL」とは、対象の血流を離れて腫瘍に遊走した、白血球として元来入手される細胞の集団を意味する。TILとしては、限定されないが、CD8+細胞傷害性T細胞(リンパ球)、Th1及びTh17 CD4+ T細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びM1マクロファージが挙げられる。TILは、初代及び二次TILの両方を含む。「初代TIL」は、本明細書に概説される通り患者組織サンプルから入手されるものであり(「新鮮に採取された」と称されることもある)及び「二次TIL」は、限定されないが、バルクTIL、拡大培養TIL(「REP TIL」)並びに本明細書で考察する通りの「reREP TIL」を含め、本明細書で考察する通り拡大培養された又は増殖された任意のTIL細胞集団である。
[00136] TILは、一般的に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に、又は腫瘍に浸潤し処置に影響を及ぼすそれらの能力によって機能的に定義することができる。TILは、一般的に、次のバイオマーカー:CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及びCD25の1つ以上を発現することによって分類することができる。追加的及び代替的に、TILは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するそれらの能力によって機能的に定義することができる。TILは、更に効力によって特徴付けられ得る - 例えば、TILは、例えば、インターフェロン(IFN)遊離が約50pg/mLより高い、約100pg/mLより高い、約150pg/mLより高い又は約200pg/mLより高い場合に効力があると見なすことができる。
[00137] 本明細書において「凍結保存されたTIL」(又は凍結保存されたMIL若しくはPBL)とは、初代、バルク又は拡大培養(REP TIL)のいずれかのTILが約-150℃~-60℃の範囲で処置及び保存されることを意味する。凍結保存のための一般的な方法も、実施例を含む本明細書の他の箇所に記載されている。明確性のために、「凍結保存TIL」は、初代TILの供給源として使用され得る凍結組織サンプルと区別可能である。
[00138] 本明細書において「解凍した凍結保存TIL」(又は解凍したMIL若しくはPBL)とは、以前に凍結保存され、次いで細胞培養温度又はTILが患者に投与され得る温度を含むが、これらに限定されない室温以上に戻るように処置されたTILの集団を意味する。
[00139] 本明細書における「細胞の集団」(TILを含む)とは、共通の形質を共有するいくつかの細胞を意味する。一般的に、集団は、一般に1×106~1×1010の数の範囲であり、異なるTIL集団は、異なる数を含む。例えば、IL-2の存在下での初代TILの初期増殖は、およそ1×108細胞のバルクTILの集団をもたらす。REP拡大培養は、一般的に、注入のために1.5×109~1.5×1010個の細胞の集団を提供するために行われる。
[00140] 一般に、TILは、最初に患者腫瘍サンプルから入手され(「初代TIL」)、次に本明細書に記載される通りの更なる操作のためより大きい集団に拡大培養され、任意選択により凍結保存され、本明細書に概説される通り再刺激され、且つ任意選択によりTILの健康の指標として表現型及び代謝パラメータが判定される。
[00141] 一般に、採取された細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に採取した」細胞集団と呼ばれる。
[00142] 一般に、本明細書で考察する通り、TILは、最初に、本明細書で考察する通り患者から切除された腫瘍から初代TIL集団を入手することにより調製される(「初代細胞集団」又は「第1の細胞集団」)。これに続き、細胞をIL-2と培養することを利用した初期バルク拡大培養が行われ、第2の細胞集団が形成される(本明細書において「バルクTIL集団」又は「第2の集団」と称されることもある)。
[00143] 「細胞傷害性リンパ球」という用語には、細胞傷害性T(CTL)細胞(CD8+細胞傷害性Tリンパ球及びCD4+T-ヘルパーリンパ球を含む)、ナチュラルキラーT(NKT)細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。細胞傷害性リンパ球には、例えば、末梢血由来αβTCR陽性T細胞又は腫瘍関連抗原によって活性化され、及び/又は腫瘍特異的キメラ抗原受容体又はT細胞受容体で形質導入されたγδTCR陽性T細胞並びに腫瘍浸潤リンパ球(TIL)が含まれ得る。
[00144] 「セントラルメモリーT細胞」という用語は、ヒトではCD45RO+であり、且つCCR7(CCR7hi)及びCD62L(CD62hi)を構成的に発現するT細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーT細胞の表面表現型は、TCR、CD3、CD127(IL-7R)及びIL-15Rも含む。セントラルメモリーT細胞の転写因子は、BCL-6、BCL-6B、MBD2及びBMI1を含む。セントラルメモリーT細胞は、TCRトリガー後にエフェクター分子として主にIL-2及びCD40Lを分泌する。セントラルメモリーT細胞は、血中のCD4区画において優勢であり、ヒトではリンパ節及び扁桃腺において比例的に濃縮されている。
[00145] 「エフェクターメモリーT細胞」という用語は、セントラルメモリーT細胞と同様にCD45R0+であるが、CCR7の構成的発現が欠損しており(CCR7lo)、且つCD62L発現が不均一であるか又は低い(CD62Llo)、ヒト又は哺乳類T細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーT細胞の表面表現型は、TCR、CD3、CD127(IL-7R)及びIL-15Rも含む。セントラルメモリーT細胞の転写因子は、BLIMP1を含む。エフェクターメモリーT細胞は、抗原刺激後、インターフェロン-γ、IL-4及びIL-5を含む、高レベルの炎症性サイトカインを急速に分泌する。エフェクターメモリーT細胞は、血中のCD8区画において優勢であり、ヒトでは肺、肝臓及び腸において比例的に濃縮されている。CD8+エフェクターメモリーT細胞は、大量のパーフォリンを保有する。「閉鎖系」という用語は、外部環境に対して閉鎖された系を指す。細胞培養方法に適した任意の閉鎖系を本発明の方法と共に使用することができる。閉鎖系としては、例えば、密閉G容器が挙げられるが、これに限定されるものではない。腫瘍セグメントが閉鎖系に添加されると、TILが患者に投与される準備ができるまで、系は、外部環境に対して開放されない。
[00146] 一部の実施形態において、本開示の方法は、腫瘍組織又は腫瘍組織からの細胞を標準的な実験用培地(限定なしにRPMIを含む)で成長させて、照射フィーダー細胞及び抗CD3抗体などの試薬で処理することにより、TIL数の増加及び/又は所望の細胞表面マーカー又は他の構造的、生化学的若しくは機能的特徴を含む細胞に関する集団のエンリッチメントなど、所望の効果を実現する「プレREP」段階を更に含む。プレREP段階は、TIL産生を改善するための代替戦略を取り入れ易くなるように、実験グレードの試薬を(実験グレードの試薬が後のREP段階中に希釈されるという仮定の下に)利用し得る。従って、一部の実施形態において、プレREP段階中、開示されるTLRアゴニスト及び/又はペプチド又はペプチドミメティクスが培養培地中に含まれ得る。プレREP培養は、一部の実施形態においてIL-2を含み得る。本発明は、好ましい態様において、新鮮に採取したTIL又は再刺激TIL(本明細書において「reTIL」と称されることもある)のための解凍した凍結保存TILと比較したとき、意外にもメモリーエフェクターT細胞サブセットを含めたメモリーT細胞サブセットの拡大につながり、及び/又は解糖系呼吸の著しい亢進につながる、本明細書において「再刺激急速拡大培養プロトコル」又は「reREP」とも称される、1つ以上の追加的な再刺激プロトコルでREPを増強する新規方法に関する。即ち、凍結保存TILに対してreREP手順を用いることにより、患者は、高度に代謝的に活性で健康なTILを受け取ることができ、より良好な転帰につながり得る。
[00147] 「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」又は「治療量」が示されている場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度及び患者(対象)の状態の個人差を考慮して医師によって決定され得る。一般的に、本明細書に記載される遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球を含む医薬組成物は、104~1011細胞/kg体重(例えば、105~106、105~1010、105~1011、106~1010、106~1011、107~1011、107~1010、108~1011、108~1010、109~1011又は109~1010細胞/kg体重)(これらの範囲内にある全ての整数値を含む)の投薬量で投与され得ると言うことができる。遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球組成物は、これらの投薬量でも複数回投与され得る。遺伝子修飾された細胞傷害性リンパ球は、免疫療法で一般に公知の注入技法を用いることにより投与され得る(例えば、Rosenberg et al., New Eng.J.of Med.319: 1676, 1988を参照されたい)。特定の患者に対する最適な投与量及び処置レジメンは、疾患の徴候について患者をモニターし、それに応じて処置を調整することにより、医学の当業者によって容易に決定され得る。
[00148] 疑義を回避するために、本明細書では、本発明の特定の態様、実施形態又は例と併せて記載された特定の特徴(例えば、整数、特性、値、使用、疾患、式、化合物又は基)は、不適合でない限り、本明細書に記載の任意の他の態様、実施形態又は例にも適用可能であると理解されるべきであることを意図する。従って、そのような特徴は、必要に応じて、本明細書で定義された定義、特許請求の範囲又は実施形態のいずれかと共に使用することができる。本明細書に開示されている全ての特徴(添付の請求項、要約及び図面を含む)及び/又はそのように開示されている任意の方法若しくはプロセスの全てのステップは、少なくとも一部の特徴及び/又はステップが相互に排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わされ得る。本発明は、開示された実施形態のいかなる詳細にも限定されるものではない。本発明は、本明細書に開示されている特徴(添付の請求項、要約及び図面を含む)の任意の新規なもの若しくは新規な組み合わせ又はそのように開示された任意の方法若しくはプロセスのステップの任意の新規なもの若しくは任意の新規な組み合わせに及ぶ。
[00149] 「約」及び「およそ」という用語は、統計的に有意義な値の範囲内を意味する。そのような範囲は、所与の値又は範囲の一桁以内、好ましくは50%以内、より好ましくは20%以内、更に好ましくは10%以内、更により好ましくは5%以内であり得る。「約」又は「およそ」という用語によって包含される許容される変動は、研究下の特定のシステムに依存し、当業者によって容易に理解され得る。更に、本明細書で使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状並びに他の量及び特性が正確でなく且つ正確である必要がないが、公差、換算係数、四捨五入、測定誤差など、及び当業者に知られている他の要因を反映して、必要に応じて、近似及び/又はより大きいか若しくはより小さくてもよいことを意味する。一般的に、寸法、サイズ、処方、パラメータ、形状又は他の量若しくは特徴は、そうであると明示的に述べられているかどうかにかかわらず、「約」又は「およそ」である。非常に異なるサイズ、形状及び寸法の実施形態が、記載された機構を採用し得ることに留意されたい。
[00150] 元の形式及び修正された形式において、添付の特許請求の範囲で使用される場合、「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という移行的な用語は、記載されていない特許請求の範囲の更なる要素又はステップが存在する場合、特許請求の範囲の対象から除外されるものに関し、特許請求の範囲の対象を定義する。「含む」という用語は、包含的であるか又はオープンエンドであることが意図されており、いかなる追加の列挙されていない要素、方法、ステップ又は材料も排除するものではない。「からなる」という用語は、特許請求の範囲に明記されたもの及び材料の場合には明記された材料に関連する通常の不純物以外のいかなる要素、ステップ又は材料も排除する。「から本質的になる」という用語は、特許請求の範囲を、特定の要素、ステップ又は材料並びに特許請求の範囲に記載された発明の基本的及び新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。本発明を具体化する本明細書に記載された全ての組成物、方法及びキットは、代替性の実施形態において、「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という移行的な用語のいずれかにより、より具体的に定義することができる。
末梢血(PBL)及び/又は骨髄(MIL)を含む治療用T細胞を拡大培養する方法の実施形態
末梢血から末梢血リンパ球(PBL)を拡大培養する方法
[00151] PBL方法1.本発明の一実施形態において、本明細書で説明するプロセスを使用してPBLを拡大培養する。本発明の一実施形態において、方法は、全血からPBMCサンプルを入手することを含む。一実施形態において、方法は、非CD19+画分のネガティブ選択を使用してPBMCから純粋なT細胞を分離することにより、T細胞を濃縮することを含む。0日目に、純粋T細胞を1:1の比率(ビーズ:細胞)の抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))及び3000IU/mlのIL-2と共に培養する。4日目に、追加のIL-2を3000IU/mlで培養物に添加する。7日目に、培養物を再び1:1比(ビーズ:細胞)の抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))で刺激し、3000IU/mlの追加のIL-2を培養物に添加する。14日目にPBLを回収し、ビーズを取り出し、PBLをカウントし、フェノタイピングする。一実施形態において、方法は、非CD19+画分の磁気ビーズに基づくネガティブ選択を使用してPBMCから純粋なT細胞を分離することにより、T細胞を濃縮することを含む。
末梢血から末梢血リンパ球(PBL)を拡大培養する方法
[00151] PBL方法1.本発明の一実施形態において、本明細書で説明するプロセスを使用してPBLを拡大培養する。本発明の一実施形態において、方法は、全血からPBMCサンプルを入手することを含む。一実施形態において、方法は、非CD19+画分のネガティブ選択を使用してPBMCから純粋なT細胞を分離することにより、T細胞を濃縮することを含む。0日目に、純粋T細胞を1:1の比率(ビーズ:細胞)の抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))及び3000IU/mlのIL-2と共に培養する。4日目に、追加のIL-2を3000IU/mlで培養物に添加する。7日目に、培養物を再び1:1比(ビーズ:細胞)の抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))で刺激し、3000IU/mlの追加のIL-2を培養物に添加する。14日目にPBLを回収し、ビーズを取り出し、PBLをカウントし、フェノタイピングする。一実施形態において、方法は、非CD19+画分の磁気ビーズに基づくネガティブ選択を使用してPBMCから純粋なT細胞を分離することにより、T細胞を濃縮することを含む。
[00152] 本発明の一実施形態において、PBL方法1は、以下のように実施される:0日目に、凍結保存されたPBMCサンプルが解凍され、PBMCがカウントされる。T細胞は、Human PanT細胞分離キット及びLSカラム(Miltenyi Biotec)を使用して分離される。分離したT細胞をカウントし、GRex 24ウェルプレートの1ウェルあたり5×105個の細胞を播種し、1ウェルあたり合計8mlのCM2培地中、3000IU/mlのIL-2と1:1の比率で、DynaBeads(登録商標)(抗CD3/抗CD28)と共培養する。4日目に、各ウェル中の培地を、CM2から、3000IU/mlの新鮮なIL-2を含むAIM-Vに交換する。7日目に、拡大培養した細胞を回収し、カウントし、次いで3000IU/mlのIL-2及び1:1の比率(ビーズ:細胞)のDynaBeads(登録商標)と共に、合計100mlのAIM-V培地中、GRex 10Mフラスコにおいて1フラスコあたり15×106個の細胞で培養する。11日目に、培地を新鮮なIL-2を3000IU/mlで補充したCM-4培地に交換する。14日目に、DynaMag Magnet(DynaMag(商標)-15)を使用してDynaBeads(登録商標)が取り出され、細胞がカウントされる。
[00153] 本発明の一実施形態において、PBL方法1は、以下のように実施される:0日目に、凍結保存されたPBMCサンプルが解凍され、PBMCがカウントされる。T細胞は、Human PanT細胞分離キット及びLSカラム(Miltenyi Biotec)を使用して分離される。分離したT細胞をカウントし、GRex 24ウェルプレートの1ウェルあたり5×105個の細胞を播種し、1ウェルあたり合計8mlのCM2培地中、3000IUのIL-2と1:1の比率でDynaBeads(登録商標)(抗CD3/抗CD28)と共培養する。4日目に、各ウェル中の培地を、CM2から、3000IU/mlの新鮮なIL-2を含むAIM-Vに交換する。7日目に、PBLを回収し、カウントし、次いで3000IU/mlのIL-2及び1:1の比率(ビーズ:細胞)のDynaBeads(登録商標)と共に、合計8mlのAIM-V培地中、GRex 24ウェルプレートの1ウェルあたり1×106個の細胞で再播種する。11日目に、培地を新鮮なIL-2を3000IU/mlで補充したCM-4培地に交換する。14日目に、DynaMag Magnet(DynaMag(商標)-15)を使用してDynaBeads(登録商標)が取り出され、細胞がカウントされる。
[00154] PBL方法2.本発明の一実施形態において、PBLは、全血からPBMCサンプルを入手することを含むPBL方法2を使用して拡大培養される。PBMCからのT細胞は、PBMCを37℃で少なくとも3時間インキュベートし、次いで非接着細胞を分離することにより、濃縮される。非接着細胞は、PBL方法1と同様に拡大培養し、即ち0日目に、非接着細胞を1:1の比率(ビーズ:細胞)の抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))及び3000IU/mlのIL-2と共に培養する。4日目に、追加のIL-2を3000IU/mlで培養物に添加する。7日目に、培養物を再び1:1比(ビーズ:細胞)の抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))で刺激し、3000IU/mlの追加のIL-2を培養物に添加する。14日目にPBLを回収し、ビーズを取り出し、PBLをカウントし、フェノタイピングする。
[00155] 本発明の一実施形態において、PBL方法2は、以下のように実施される:0日目に、凍結保存したPMBCサンプルを解凍し、PBMC細胞をCM-2培地中の6ウェルプレートに1ウェルあたり600万細胞で播種し、37℃で3時間インキュベートする。3時間後、PBLである非接着細胞を取り出し、カウントする。PBLは、1ウェルあたり1×106細胞、1:1のビーズ:細胞比の抗CD3/抗CD28DynaBeads(登録商標)及び3000IU/mlのIL-2と共に、GRex 24ウェルプレートの各ウェル中、合計7mlのCM-2培地で培養する。4日目に、各ウェル中の培地を、AIM-V培地及び3000IU/mlの新鮮なIL-2と交換する。7日目に、拡大培養した細胞を回収し、カウントし、次いで3000IU/mlのIL-2及び1:1の比率(T細胞:ビーズ)のDynaBeads(登録商標)と共に、合計100mlのAIM-V培地中、GRex 10Mフラスコにおいて1フラスコあたり15×106個の細胞で培養する。11日目に、培地をCM-4培地に交換し、新鮮なIL-2(3000IU/ml)を補充する。14日目に、DynaMag(商標)Magnet(DynaMag(商標)-15)を使用してDynaBeads(登録商標)が取り出され、細胞がカウントされる。
[00156] 本発明の一実施形態において、PBL方法2は、以下のように実施される:0日目に、凍結保存したPMBCサンプルを解凍し、PBMC細胞をCM-2培地中の6ウェルプレートに1ウェルあたり600万細胞で播種し、37℃で3時間インキュベートする。3時間後、PBLである非接着細胞を取り出し、カウントする。PBLは、1ウェルあたり1×106細胞、1:1のビーズ:細胞比の抗CD3/抗CD28DynaBeads(登録商標)及び3000IU/mlのIL-2と共に、GRex 24ウェルプレートの各ウェル中、合計7mlのCM-2培地で培養する。4日目に、各ウェル中の培地を、AIM-V培地及び3000IU/mlの新鮮なIL-2と交換する。7日目に、拡大培養した細胞を回収し、カウントし、次いで3000IU/mlのIL-2及び1:1の比率(T細胞:ビーズ)のDynaBeads(登録商標)と共に、合計8mlのAIM-V培地中、GRex 24ウェルプレートの1ウェルあたり1×106個の細胞で培養する。11日目に、培地をCM-4培地に交換し、新鮮なIL-2(3000IU/ml)を補充する。14日目に、DynaMag(商標)Magnet(DynaMag(商標)-15)を使用してDynaBeads(登録商標)が取り出され、細胞がカウントされる。
[00157] PBL方法3.本発明の一実施形態において、PBLは、末梢血からPBMCサンプルを入手することを含むPBL方法3を使用して拡大培養される。B細胞は、CD19+選択を使用して分離され、T細胞は、PBMCサンプルの非CD19+画分のネガティブ選択を使用して選択される。0日目に、T細胞及びB細胞を、1:1の比率(ビーズ:細胞)の抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))及び3000IU/mlのIL-2と共培養する。4日目に、追加のIL-2を3000IU/mlで培養物に添加する。7日目に、培養物を再び1:1比(ビーズ:細胞)の抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))で刺激し、3000IU/mlの追加のIL-2を培養物に添加する。14日目にPBLを回収し、ビーズを取り出し、PBLをカウントし、フェノタイピングする。
[00158] 本発明の一実施形態において、PBL方法3は、以下のように実施される:0日目に、末梢血に由来する凍結保存されたPBMCを解凍し、カウントする。CD19+B細胞は、CD19 Multisort Kit, Human(Miltenyi Biotec)を使用して選別される。非CD19+細胞画分のうち、T細胞は、Human PanT細胞分離キット及びLSカラム(Miltenyi Biotec)を使用して精製される。T細胞(PBL)及びB細胞は、約3000IU/mlのIL-2の存在下で約8mlのCM2培地中、Grex 24ウェルプレートで異なる比率で共培養される。B細胞:T細胞の比率は、0.1:1、1:1及び10:1である。T細胞/B細胞共培養は、抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))により1:1の比率(ビーズ:細胞)で刺激される。4日目に、培地をCM2からAIM-V培地に交換し、追加のIL-2を3000IU/mlで培養物に添加する。7日目に、細胞を回収し、カウントし、AIM-V培地の新しいGrex 24ウェルプレートに、1ウェルあたり約1.5×105~約4×105個の細胞の細胞範囲で再播種し、3000IU/mLの追加のIL-2と共に、1:1の比率(ビーズ:細胞)の抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))により刺激する。14日目に、DynaMag(商標)Magnet(DynaMag(商標)-15)を使用してDynaBeads(登録商標)が取り出され、細胞がカウントされる。
[00159] 一実施形態において、PBMCは、全血サンプルから分離される。一実施形態において、PBMCサンプルは、PBLを拡大培養するための出発材料として使用される。一実施形態において、サンプルは、拡大培養プロセス前に凍結保存される。別の実施形態において、新鮮なサンプルは、PBLを拡大培養するための出発材料として使用される。本発明の一実施形態において、T細胞は、当技術分野で公知の方法を使用してPBMCから分離される。一実施形態において、T細胞は、Human PanT細胞分離キット及びLSカラムを使用して分離される。本発明の一実施形態において、T細胞は、当技術分野で公知の抗体選択方法、例えばCD19ネガティブ選択を使用してPBMCから分離される。
[00160] 本発明の実施形態において、プロセスは、約7日間、約8日間、約9日間、約10日間、約11日間、約12日間、約13日間又は約14日間にわたって実施される。別の実施形態において、プロセスは、約7日間にわたって実施される。別の実施形態において、プロセスは、約14日間にわたって実施される。
[00161] 本発明の一実施形態において、PBMCは、抗CD3/抗CD28抗体と共に培養される。一実施形態において、任意の利用可能な抗CD3/抗CD28製品が本発明において有用である。本発明の一実施形態において、使用される市販の製品は、DynaBeads(登録商標)である。一実施形態において、DynaBeads(登録商標)は、1:1の比(ビーズ:細胞)のPBMCと共に培養される。別の実施形態において、抗体は、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1又は5:1の比率(ビーズ:細胞)でPBMCと共に培養されたDynaBeads(登録商標)である。本発明の一実施形態において、抗体培養ステップ及び/又は抗体で細胞を再刺激するステップは、約2~約6日間、約3~約5日間又は約4日間の期間にわたって実施される。本発明の一実施形態において、抗体培養ステップは、約2日間、3日間、4日間、5日間又は6日間の期間にわたって実施される。
[00162] 一実施形態において、PBMCサンプルは、IL-2と共に培養される。本発明の一実施形態において、PBMCからのPBLの拡大培養に使用される細胞培養培地は、約100IU/mL、約200IU/mL、約300IU/mL、約400IU/mL、約100IU/mL、約100IU/mL、約100IU/mL、約100IU/mL、約100IU/mL、約500IU/mL、約600IU/mL、約700IU/mL、約800IU/mL、約900IU/mL、約1,000IU/mL、約1,100IU/mL、約1,200IU/mL、約1,300IU/mL、約1,400IU/mL、約1,500IU/mL、約1,600IU/mL、約1,700IU/mL、約1,800IU/mL、約1,900IU/mL、約2,000IU/mL、約2,100IU/mL、約2,200IU/mL、約2,300IU/mL、約2,400IU/mL、約2,500IU/mL、約2,600IU/mL、約2,700IU/mL、約2,800IU/mL、約2,900IU/mL、約3,000IU/mL、約3,100IU/mL、約3,200IU/mL、約3,300IU/mL、約3,400IU/mL、約3,500IU/mL、約3,600IU/mL、約3,700IU/mL、約3,800IU/mL、約3,900IU/mL、約4,000IU/mL、約4,100IU/mL、約4,200IU/mL、約4,300IU/mL、約4,400IU/mL、約4,500IU/mL、約4,600IU/mL、約4,700IU/mL、約4,800IU/mL、約4,900IU/mL、約5,000IU/mL、約5,100IU/mL、約5,200IU/mL、約5,300IU/mL、約5,400IU/mL、約5,500IU/mL、約5,600IU/mL、約5,700IU/mL、約5,800IU/mL、約5,900IU/mL、約6,000IU/mL、約6,500IU/mL、約7,000IU/mL、約7,500IU/mL、約8,000IU/mL、約8,500IU/mL、約9,000IU/mL、約9,500IU/mL及び約10,000IU/mLからなる群から選択される濃度のIL-2を含む。
[00163] 本発明の一実施形態において、拡大培養プロセスのためのPBMCの開始細胞数は、約25,000~約1,000,000、約30,000~約900,000、約35,000~約850,000、約40,000~約800,000、約45,000~約800,000、約50,000~約750,000、約55,000~約700,000、約60,000~約650,000、約65,000~約600,000、約70,000~約550,000、好ましくは約75,000~約500,000、約80,000~約450,000、約85,000~約400,000、約90,000~約350,000、約95,000~約300,000、約100,000~約250,000、約105,000~約200,000又は約110,000~約150,000である。本発明の一実施形態において、PBMCの開始細胞数は、約138,000、140,000、145,000又はそれを超える数である。別の実施形態において、PBMCの開始細胞数は、約28,000である。別の実施形態において、PBMCの開始細胞数は、約62,000である。別の実施形態において、PBMCの開始細胞数は、約338,000である。別の実施形態において、PBMCの開始細胞数は、約336,000である。
[00164] 本発明の一実施形態において、細胞は、GRex 24ウェルプレートで増殖される。本発明の一実施形態において、同等のウェルプレートが使用される。一実施形態において、拡大培養のための出発材料は、1ウェルあたり約5×105個のT細胞である。本発明の一実施形態において、1ウェルあたり1×106個の細胞が存在する。本発明の実施形態において、1ウェルあたりの細胞数は、ウェルに播種し、T細胞を拡大培養するのに十分な数である。
[00165] 本発明の一実施形態において、PBLの拡大倍数は、約20%~約100%、25%~約95%、30%~約90%、35%~約85%、40%~約80%、45%~約75%、50%~約100%又は25%~約75%である。本発明の一実施形態において、拡大倍数は、約25%である。本発明の別の実施形態において、拡大倍数は、約50%である。別の実施形態において、拡大倍数は、約75%である。
[00166] 本発明の一実施形態において、追加のIL-2は、プロセス全体を通して1日以上培養物に添加され得る。本発明の一実施形態において、追加のIL-2は、4日目に追加される。本発明の一実施形態において、追加のIL-2は、7日目に追加される。本発明の一実施形態において、追加のIL-2は、11日目に追加される。他の実施形態において、追加のIL-2は、4日目、7日目及び/又は11日目に追加される。本発明の一実施形態において、細胞培養培地は、細胞培養プロセスを通して1日以上で交換され得る。一実施形態において、細胞培養培地は、プロセスの4日目、7日目及び/又は11日目に交換される。本発明の一実施形態において、PBLは、追加のIL-2と共に、1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間又は14日間培養される。本発明の実施形態において、PBLは、IL-2の各添加後3日間の期間にわたって培養される。
[00167] 一実施形態において、細胞培養培地は、方法中に少なくとも一度交換される。一実施形態において、細胞培養培地は、追加のIL-2が加えられるのと同時に交換される。別の実施形態において、細胞培養培地は、1日目、2日目、3日目、4日目、5日目、6日目、7日目、8日目、9日目、10日目、11日目、12日目、13日目又は14日目の少なくとも1日で交換される。本発明の一実施形態において、方法全体で使用される細胞培養培地は、同じであるか又は異なり得る。本発明の一実施形態において、細胞培養培地は、CM-2、CM-4又はAIM-Vである。
[00168] 本発明の一実施形態において、T細胞は、14日間の拡大培養プロセスを通して1日以上、抗CD3/抗CD28抗体で再刺激され得る。一実施形態において、T細胞は、7日目に再刺激される。一実施形態において、GRex 10Mフラスコが再刺激ステップに使用される。本発明の一実施形態において、同等のフラスコが使用される。
[00169] 本発明の一実施形態において、DynaMag(商標)Magnetを使用してDynaBeads(登録商標)が取り出され、細胞がカウントされ、細胞は、以下の実施例で更に説明する表現型及び機能分析を使用して分析される。本発明の一実施形態において、抗体は、当技術分野で公知の方法を使用してPBL又はMILから分離される。前述の実施形態のいずれにおいても、TIL、PBL又はMILの磁気ビーズベースの選択が使用される。
[00170] 本発明の一実施形態において、PBMCサンプルは、非接着細胞を識別するのに有効な所望の温度で一定期間インキュベートされる。本発明の一実施形態において、インキュベーション時間は、約3時間である。本発明の一実施形態において、温度は、摂氏約37度である。次いで、非接着細胞は、上記のプロセスを使用して拡大培養される。
[00171] 本発明の一実施形態において、PBMCは、イブルチニブ又は本明細書の他の箇所に記載のITK及びキナーゼ阻害剤などの別のITK若しくはキナーゼ阻害剤で処置された患者から入手される。本発明の一実施形態において、ITK阻害剤は、共有結合的及び不可逆的にITKに結合する共有結合ITK阻害剤である。本発明の一実施形態において、ITK阻害剤は、ITKに結合するアロステリックITK阻害剤である。本発明の一実施形態において、PBMCは、PBL方法1、PBL方法2又はPBL方法3を含む前述の方法のいずれかで使用するPBMCサンプルを入手する前に、イブルチニブ又は本明細書の他の箇所に記載のITK阻害剤を含む他のITK阻害剤で処置された患者から入手される。本発明の一実施形態において、ITK阻害剤処置は、少なくとも1回、少なくとも2回又は少なくとも3回又はそれを超えて投与されている。本発明の一実施形態において、イブルチニブ又は他のITK阻害剤で前処置された患者から拡大培養されたPBLは、イブルチニブ又は他のITK阻害剤で前処置されなかった患者から拡大培養された細胞より少ないLAG3+、PD-1+細胞を含む。本発明の一実施形態において、イブルチニブ又は他のITK阻害剤で前処置された患者から拡大培養されたPBLは、イブルチニブ又は他のITK阻害剤で前処置されなかった患者から拡大培養された細胞より増加したレベルのIFNγ産生を含む。本発明の一実施形態において、イブルチニブ又は他のITK阻害剤で前処置された患者から拡大培養されたPBLは、イブルチニブ又は他のITK阻害剤で前処置されなかった患者から拡大培養された細胞より低いエフェクター:標的細胞比で増加した溶解活性を含む。本発明の一実施形態において、イブルチニブ又は他のITK阻害剤で前処置された患者は、未処置の患者と比較してより高い拡大倍数を有する。
[00172] 本発明の一実施形態において、方法は、細胞培養にITK阻害剤を添加するステップを含む。一実施形態において、ITK阻害剤は、プロセスの0日目、1日目、2日目、3日目、4日目、5日目、6日目、7日目、8日目、9日目、10日目、11日目、12日目、13日目又は14日目の1日以上で添加される。一実施形態において、細胞培養培地が交換される方法中の日にITK阻害剤が添加される。一実施形態において、ITK阻害剤は、0日目及び細胞培養培地が交換されるときに添加される。一実施形態において、ITK阻害剤は、IL-2が添加される方法中に添加される。一実施形態において、ITK阻害剤は、方法の0日目、4日目、7日目及び任意選択により11日目に添加される。本発明の一実施形態において、ITK阻害剤は、方法の0日目及び7日目に添加される。本発明の一実施形態において、ITK阻害剤は、当技術分野で公知のものである。本発明の一実施形態において、ITK阻害剤は本明細書の他の部分に記載されているものである。
[00173] 本発明の一実施形態において、ITK阻害剤は、約0.1nM~約5uMの濃度で本方法に使用される。一実施形態において、ITK阻害剤は、約0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、550nM、600nM、650nM、700nM、750nM、800nM、850nM、900nM、950nM、1uM、2uM、3uM、4uM又は5uMの濃度で本方法に使用される。
[00174] 本発明の一実施形態において、方法は、PBMCが、イブルチニブなどのITK阻害剤処置への以前の曝露を有しない患者に由来する場合、ITK阻害剤を添加するステップを含む。
[00175] 一部の実施形態において、PBMCサンプルは、キナーゼ阻害剤又はITK阻害剤を含むレジメンで任意選択により前処置された対象又は患者からのものである。一部の実施形態において、腫瘍サンプルは、キナーゼ阻害剤又はITK阻害剤を含むレジメンで前処置された対象又は患者からのものである。一部の実施形態において、PBMCサンプルは、キナーゼ阻害剤又はITK阻害剤を含むレジメンで前処置され、少なくとも1ヶ月、少なくとも2ヶ月、少なくとも3ヶ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも5ヶ月、少なくとも6ヶ月又は1年又はそれを超えて処置を受けた対象又は患者からのものである。別の実施形態において、PBMCは、イブルチニブなどのITK阻害剤レジメンを現在受けている患者に由来する。
[00176] 一部の実施形態において、PBMCサンプルは、キナーゼ阻害剤又はITK阻害剤を含むレジメンで前処置されており、キナーゼ阻害剤又はイブルチニブなどのITK阻害剤での処置に抵抗性である対象又は患者からのものである。
[00177] 一部の実施形態において、PBMCサンプルは、キナーゼ阻害剤又はITK阻害剤を含むレジメンで前処置されているが、キナーゼ阻害剤又はITK阻害剤での処置をもはや受けていない対象又は患者からのものである。一部の実施形態において、PBMCサンプルは、キナーゼ阻害剤又はITK阻害剤を含むレジメンで前処置されているが、キナーゼ阻害剤又はITK阻害剤での処置をもはや受けておらず、少なくとも1ヶ月、少なくとも2ヶ月、少なくとも3ヶ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも5ヶ月、少なくとも6ヶ月若しくは少なくとも1年又はそれを超えて処置を受けていない対象又は患者からのものである。別の実施形態において、PBMCは、ITK阻害剤への以前の曝露を有するが、少なくとも3ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも9ヶ月又は少なくとも1年処置されていない患者に由来する。
[00178] 本発明の実施形態において、0日目に、CD19+について細胞が選択され、適宜選別される。本発明の一実施形態において、選択は、抗体結合ビーズを使用して行われる。本発明の一実施形態において、純粋T細胞は、PBMCから0日目に分離される。本発明の一実施形態において、0日目に、CD19+B細胞及び純粋T細胞を最低4日間にわたって抗CD3/抗CD28抗体と共培養する。本発明の一実施形態において、4日目に、培養物にIL-2が添加される。本発明の一実施形態において、7日目に、培養物は、抗CD3/抗CD28抗体及び追加のIL-2で再刺激される。本発明の一実施形態において、14日目にPBLが回収される。
[00179] 本発明の一実施形態において、イブルチニブ又は他のITK阻害剤で前処置されていない患者について、10~15mlのバフィーコートは、約5×109個のPBMCを生成し、これは、約5.5×107個の出発細胞材料及び拡大培養プロセスの終了時に約1.1×109個のPBLを生成する。本発明の一実施形態において、約54×106個のPBMCは、約6×105個の出発材料及び約1.2×108個のMIL(約205倍の拡大倍数)を生成する。
[00180] 本発明の一実施形態において、イブルチニブ又は他のITK阻害剤で前処置された患者について、拡大培養プロセスは、約20×109個のPBLを生成する。本発明の一実施形態において、40.3×106個のPBMCは、約4.7×105個の出発細胞材料及び約1.6×108個のPBL(約338倍の拡大倍数)を生成する。
[00181] 本発明の一実施形態において、慢性リンパ性白血病(CLL)を有する患者に対する本発明において有用なPBLの臨床用量は、約0.1×109~約15×109個のPBL、約0.1×109~約15×109個のPBL、約0.12×109~約12×109個のPBL、約0.15×109~約11×109個のPBL、約0.2×109~約10×109個のPBL、約0.3×109~約9×109個のPBL、約0.4×109~約8×109個のPBL、約0.5×109~約7×109個のPBL、約0.6×109~約6×109個のPBL、約0.7×109~約5×109個のPBL、約0.8×109~約4×109個のPBL、約0.9×109~約3×109個のPBL又は約1×109~約2×109個のPBLである。
[00182] 前述の実施形態のいずれにおいても、PBMCは、全血サンプルから、アフェレーシスにより、バフィーコートから、又はPBMCを入手するための当技術分野で公知の任意の他の方法から得られ得る。
骨髄由来のPBMCから骨髄浸潤リンパ球(MIL)を拡大培養する方法
[00183] MIL方法1.本発明の一実施形態において、骨髄由来のPBMCからMILを拡大培養する方法が記載される。本発明の一実施形態において、方法は、14日間にわたって実施される。一実施形態において、方法は、骨髄PBMCを入手し、且つPBMCを凍結保存することを含む。0日目に、PBMCを1:1の比率(ビーズ:細胞)の抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))及び3000IU/mlのIL-2と共に培養する。4日目に、追加のIL-2を3000IU/mlで培養物に添加する。7日目に、培養物を再び1:1比(ビーズ:細胞)の抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))で刺激し、3000IU/mlの追加のIL-2を培養物に添加する。14日目にMILを回収し、ビーズを取り出し、任意選択によりMILをカウントし、フェノタイピングする。
[00183] MIL方法1.本発明の一実施形態において、骨髄由来のPBMCからMILを拡大培養する方法が記載される。本発明の一実施形態において、方法は、14日間にわたって実施される。一実施形態において、方法は、骨髄PBMCを入手し、且つPBMCを凍結保存することを含む。0日目に、PBMCを1:1の比率(ビーズ:細胞)の抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))及び3000IU/mlのIL-2と共に培養する。4日目に、追加のIL-2を3000IU/mlで培養物に添加する。7日目に、培養物を再び1:1比(ビーズ:細胞)の抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))で刺激し、3000IU/mlの追加のIL-2を培養物に添加する。14日目にMILを回収し、ビーズを取り出し、任意選択によりMILをカウントし、フェノタイピングする。
[00184] 本発明の一実施形態において、MIL方法1は、以下のように実施される:0日目に、骨髄由来の凍結保存されたPBMCサンプルが解凍され、PBMCがカウントされる。PBMCは、GRex 24ウェルプレートで、3000IU/mlのIL-2の存在下、1ウェルあたり約8mlのCM-2細胞培養培地(RPMI-1640、ヒトAB血清、1-グルタミン、2-メルカプトエタノール、硫酸ゲンタマイシン、AIM-V培地から構成される)中、1ウェルあたり5×105個の細胞で1:1の比率の抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))と共培養される。4日目に、細胞培養培地を、3000IU/mlの追加のIL-2を添加したAIM-Vと交換する。7日目に、拡大培養したMILをカウントする。1ウェルあたり1×106個の細胞を新しいGRex 24ウェルプレートに移し、3000IU/mlのIL-2の存在下、1ウェルあたり約8mlのAIM-V培地中、1:1の比率の抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))と共に培養する。11日目に、細胞培養培地をAIM-VからCM-4(AIM-V培地、2mMのGlutamax及び3000IU/mlのIL2から構成される)に交換する。14日目に、DynaMag Magnet(DynaMag(商標)15)を使用してDynaBeads(登録商標)が取り出され、MILがカウントされる。
[00185] MIL方法2.本発明の一実施形態において、方法は、7日間にわたって実施される。一実施形態において、この方法は、骨髄に由来するPMBCを入手し、且つPBMCを凍結保存することを含む。0日目に、PBMCを3:1の比率(ビーズ:細胞)の抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))及び3000IU/mlのIL-2と共に培養する。7日目にMILを回収し、ビーズを取り出し、任意選択によりMILをカウントし、フェノタイピングする。
[00186] 本発明の一実施形態において、MIL方法2は、以下のように実施される:0日目に、凍結保存されたPBMCサンプルが解凍され、PBMCがカウントされる。PBMCは、GRex 24ウェルプレートで、3000IU/mlのIL-2の存在下、1ウェルあたり約8mlのCM-2細胞培養培地(RPMI-1640、ヒトAB血清、1-グルタミン、2-メルカプトエタノール、硫酸ゲンタマイシン、AIM-V培地から構成される)中、1ウェルあたり5×105個の細胞で1:1の比率の抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))と共培養される。7日目に、DynaMag Magnet(DynaMag(商標)15)を使用してDynaBeads(登録商標)が取り出され、MILがカウントされる。
[00187] MIL方法3.本発明の一実施形態において、方法は、骨髄からPBMCを入手することを含む。0日目に、CD3+/CD33+/CD20+/CD14+についてPBMCが選択され、選別され、非CD3+/CD33+/CD20+/CD14+細胞画分が超音波処理され、超音波処理された細胞画分の一部が選択された細胞画分に戻して添加される。IL-2を3000IU/mlで細胞培養物に添加する。3日目に、PBMCを1:1の比率(ビーズ:細胞)の抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))及び3000IU/mlのIL-2と共に培養する。4日目に、追加のIL-2を3000IU/mlで培養物に添加する。7日目に、培養物を再び1:1比(ビーズ:細胞)の抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))で刺激し、3000IU/mlの追加のIL-2を培養物に添加する。11日目に、IL-2を3000IU/mlで培養物に添加する。14日目にMILを回収し、ビーズを取り出し、任意選択によりMILをカウントし、フェノタイピングする。
[00188] 本発明の一実施形態において、MIL方法3は、以下のように実施される:0日目に、凍結保存されたPBMCのサンプルが解凍され、PBMCがカウントされる。細胞をCD3、CD33、CD20及びCD14抗体で染色し、S3e細胞選別(Bio-Rad)を使用して選別する。細胞は、免疫細胞画分(又はMIL画分)(CD3+CD33+CD20+CD14+)と、AML芽細胞画分(非CD3+CD33+CD20+CD14+)との2つの画分に選別される。Grex 24ウェルプレートに播種される免疫細胞画分(又はMIL画分)からの細胞数とほぼ等しいAML芽細胞画分からの細胞数を100ulの培地に懸濁し、超音波処理する。この例では、AML芽細胞画分から約2.8×104~約3.38×105個の細胞を取り、100ulのCM2培地に懸濁し、30秒間超音波処理する。超音波処理したAML芽細胞画分の100ulをGrex24ウェルプレートの免疫細胞画分に添加する。免疫細胞は、6000IU/mlのIL-2の存在下、1ウェルあたり約8mlのCM-2細胞培養培地中に1ウェルあたり約2.8×104~約3.38×105個の細胞の量で存在し、AML芽細胞画分の一部と共に約3日間培養される。3日目に、1:1の比率の抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))を各ウェルに加え、約1日間培養する。4日目に、細胞培養培地を、3000IU/mlの追加のIL-2を添加したAIM-Vと交換する。7日目に、拡大培養したMILをカウントする。1ウェルあたり約1.5×105~4×105個の細胞を新しいGRex 24ウェルプレートに移し、3000IU/mlのIL-2の存在下、1ウェルあたり約8mlのAIM-V培地中、1:1の比率の抗CD3/抗CD28抗体(DynaBeads(登録商標))と共に培養する。11日目に、細胞培養培地をAIM-VからCM-4(3000IU/mlのIL-2を補充)に交換する。14日目に、DynaMag Magnet(DynaMag(商標)15)を使用してDynaBeads(登録商標)が取り出され、任意選択によりMILがカウントされる。
[00189] 本発明の一実施形態において、PBMCは、骨髄から入手される。一実施形態において、PBMCは、アフェレーシス、吸引、針生検又は当技術分野で公知の他の同様の手段を通じて骨髄から入手される。一実施形態において、PBMCは、新鮮である。別の実施形態において、PBMCは、凍結保存されている。
[00190] 本発明の一実施形態において、方法は、約7日間、約8日間、約9日間、約10日間、約11日間、約12日間、約13日間又は約14日間にわたって実施される。別の実施形態において、方法は、約7日間にわたって実施される。別の実施形態において、方法は、約14日間にわたって実施される。
[00191] 本発明の一実施形態において、PBMCは、抗CD3/抗CD28抗体と共に培養される。一実施形態において、任意の利用可能な抗CD3/抗CD28製品が本発明において有用である。本発明の一実施形態において、使用される市販の製品は、DynaBeads(登録商標)である。一実施形態において、DynaBeads(登録商標)は、1:1の比(ビーズ:細胞)のPBMCと共に培養される。別の実施形態において、抗体は、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1又は5:1の比率(ビーズ:細胞)でPBMCと共に培養されたDynaBeads(登録商標)である。前述の実施形態のいずれにおいても、免疫細胞画分(又はMIL画分)(CD3+CD33+CD20+CD14+)又はAML芽細胞画分(非CD3+CD33+CD20+CD14+)の磁気ビーズベースの選択が使用される。本発明の一実施形態において、抗体培養ステップ及び/又は抗体で細胞を再刺激するステップは、約2~約6日間、約3~約5日間又は約4日間の期間にわたって実施される。本発明の一実施形態において、抗体培養ステップは、約2日間、3日間、4日間、5日間又は6日間の期間にわたって実施される。
[00192] 本発明の一実施形態において、AML芽細胞画分にからの細胞数と免疫細胞画分(又はMIL画分)からの細胞数との比は、約0.1:1~約10:1である。別の実施形態において、比率は、約0.1:1~約5:1、約0.1:1~約2:1又は約1:1である。本発明の一実施形態において、AML芽細胞画分は、細胞凝集を破壊するために任意選択により破砕される。一実施形態において、AML芽細胞画分は、超音波処理、均質化、細胞溶解、ボルテックス又は振動を使用して破砕される。別の実施形態において、AML芽細胞画分は、超音波処理を使用して破砕される。本発明の一実施形態において、非CD3+、非CD33+、非CD20+、非CD14+細胞画分(AML芽球画分)は、高温溶解、化学溶解(有機アルコールなど)、酵素溶解及び当技術分野で公知の他の細胞溶解方法を含む適切な溶解方法を使用して溶解される。
[00193] 本発明の一実施形態において、AML芽細胞画分からの細胞は、100uLあたり約0.2×105~約2×105個の細胞の濃度で懸濁され、免疫細胞画分と共に細胞培養物に添加される。別の実施形態において、濃度は、100uLあたり約0.5×105~約2×105個の細胞、100uLあたり約0.7×105~約2×105個の細胞、100uLあたり約1×105~約2×105個の細胞又は100uLあたり約1.5×105~約2×105個の細胞である。
[00194] 一実施形態において、PBMCサンプルは、IL-2と共に培養される。本発明の一実施形態において、MILの拡大培養に使用される細胞培養培地は、約100IU/mL、約200IU/mL、約300IU/mL、約400IU/mL、約100IU/mL、約100IU/mL、約100IU/mL、約100IU/mL、約100IU/mL、約500IU/mL、約600IU/mL、約700IU/mL、約800IU/mL、約900IU/mL、約1,000IU/mL、約1,100IU/mL、約1,200IU/mL、約1,300IU/mL、約1,400IU/mL、約1,500IU/mL、約1,600IU/mL、約1,700IU/mL、約1,800IU/mL、約1,900IU/mL、約2,000IU/mL、約2,100IU/mL、約2,200IU/mL、約2,300IU/mL、約2,400IU/mL、約2,500IU/mL、約2,600IU/mL、約2,700IU/mL、約2,800IU/mL、約2,900IU/mL、約3,000IU/mL、約3,100IU/mL、約3,200IU/mL、約3,300IU/mL、約3,400IU/mL、約3,500IU/mL、約3,600IU/mL、約3,700IU/mL、約3,800IU/mL、約3,900IU/mL、約4,000IU/mL、約4,100IU/mL、約4,200IU/mL、約4,300IU/mL、約4,400IU/mL、約4,500IU/mL、約4,600IU/mL、約4,700IU/mL、約4,800IU/mL、約4,900IU/mL、約5,000IU/mL、約5,100IU/mL、約5,200IU/mL、約5,300IU/mL、約5,400IU/mL、約5,500IU/mL、約5,600IU/mL、約5,700IU/mL、約5,800IU/mL、約5,900IU/mL、約6,000IU/mL、約6,500IU/mL、約7,000IU/mL、約7,500IU/mL、約8,000IU/mL、約8,500IU/mL、約9,000IU/mL、約9,500IU/mL及び約10,000IU/mLからなる群から選択される濃度のIL-2を含む。
[00195] 本発明の一実施形態において、追加のIL-2は、方法全体を通して1日以上培養物に添加され得る。本発明の一実施形態において、追加のIL-2は、4日目に追加される。本発明の一実施形態において、追加のIL-2は、7日目に追加される。本発明の一実施形態において、追加のIL-2は、11日目に追加される。別の実施形態において、追加のIL-2は、4日目、7日目及び/又は11日目に追加される。本発明の一実施形態において、MILは、追加のIL-2と共に、1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間又は14日間の期間、培養される。本発明の一実施形態において、MILは、IL-2の各添加後3日間の期間にわたって培養される。
[00196] 一実施形態において、細胞培養培地は、方法中に少なくとも一度交換される。一実施形態において、細胞培養培地は、追加のIL-2が加えられるのと同時に交換される。別の実施形態において、細胞培養培地は、1日目、2日目、3日目、4日目、5日目、6日目、7日目、8日目、9日目、10日目、11日目、12日目、13日目又は14日目の少なくとも1日で交換される。本発明の一実施形態において、方法全体で使用される細胞培養培地は、同じであるか又は異なり得る。本発明の一実施形態において、細胞培養培地は、CM-2、CM-4又はAIM-Vである。本発明の一実施形態において、11日目の細胞培養培地交換ステップは、任意選択による。本発明の一実施形態において、拡大培養プロセスのためのPBMCの開始細胞数は、約25,000~約1,000,000、約30,000~約900,000、約35,000~約850,000、約40,000~約800,000、約45,000~約800,000、約50,000~約750,000、約55,000~約700,000、約60,000~約650,000、約65,000~約600,000、約70,000~約550,000、好ましくは約75,000~約500,000、約80,000~約450,000、約85,000~約400,000、約90,000~約350,000、約95,000~約300,000、約100,000~約250,000、約105,000~約200,000又は約110,000~約150,000である。本発明の一実施形態において、PBMCの開始細胞数は、約138,000、140,000、145,000又はそれを超える数である。別の実施形態において、PBMCの開始細胞数は、約28,000である。別の実施形態において、PBMCの開始細胞数は、約62,000である。別の実施形態において、PBMCの開始細胞数は、約338,000である。別の実施形態において、PBMCの開始細胞数は、約336,000である。
[00197] 本発明の一実施形態において、MILの拡大倍数は、約20%~約100%、25%~約95%、30%~約90%、35%~約85%、40%~約80%、45%~約75%、50%~約100%又は25%~約75%である。本発明の一実施形態において、拡大倍数は、約25%である。本発明の別の実施形態において、拡大倍数は、約50%である。別の実施形態において、拡大倍数は、約75%である。
[00198] 本発明の一実施形態において、MILは、10~50mlの骨髄吸引液から拡大培養される。本発明の一実施形態において、10mlの骨髄吸引液が患者から入手される。別の実施形態において、20mlの骨髄吸引液が患者から入手される。別の実施形態において、30mlの骨髄吸引液が患者から入手される。別の実施形態において、40mlの骨髄吸引液が患者から入手される。別の実施形態において、50mlの骨髄吸引液が患者から入手される。
[00199] 本発明の一実施形態において、約10~50mlの骨髄吸引液から得られるPBMCの数は、約5×107~約10×107個のPBMCである。別の実施形態において、得られるPMBCの数は、約7×107個のPBMCである。
[00200] 本発明の一実施形態において、約5×107~約10×107個のPBMCから約0.5×106~約1.5×106個の拡大培養開始細胞材料が得られる。本発明の一実施形態において、約1×106個の拡大培養開始細胞材料が得られる。
[00201] 本発明の一実施形態において、拡大培養期間の終わりに回収されるMILの総数は、約0.01×109個~約1×109個、約0.05×109個~約0.9×109個、約0.1×109個~約0.85×109個、約0.15×109個~約0.7×109個、約0.2×109個~約0.65×109個、約0.25×109個~約0.6×109個、約0.3×109個~約0.55×109個、約0.35×109個~約0.5×109個又は約0.4×109個~約0.45×109個である。
[00202] 本発明の一実施形態において、骨髄吸引液に由来する12×106個のPBMCは、およそ1.4×105個の出発細胞材料を生成し、これは、拡大培養プロセスの終わりに約1.1×107個のMILを生成する。
[00203] 本発明の一実施形態において、上記のMIL方法3を使用して骨髄PBMCから拡大培養されたMILは、MIL方法1又はMIL方法2を使用して拡大培養されたMILと比較して高い割合のCD8+細胞並びにより少ない数のLAG3+及びPD1+細胞を含む。本発明の一実施形態において、上記のMIL方法3を使用して血液PBMCから拡大培養されたPBLは、MIL方法1又はMIL方法2を使用して拡大培養されたPBLと比較して高い割合のCD8+細胞及び増加したレベルのIFNγ産生を含む。
[00204] 本発明の一実施形態において、急性骨髄性白血病(AML)を有する患者に有用なMILの臨床用量は、約4×108~約2.5×109個のMILの範囲内である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるMILの数は、9.5×108個のMILである。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるMILの数は、4.1×108である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるMILの数は、2.2×109である。
[00205] 前述の実施形態のいずれにおいても、PBMCは、全血サンプルから、骨髄から、アフェレーシスにより、バフィーコートから、又はPBMCを入手するための当技術分野で公知の任意の他の方法から得られ得る。
「2Aプロセス」を使用したTILの拡大培養方法
[00206] 本発明の一実施形態において、本発明は、骨髄及び/又は末梢血に由来するT細胞を拡大培養するための装置及び方法を提供する。本発明の一実施形態において、T細胞は、ポリクローナルであるが、高度に腫瘍特異的な様式で、骨髄微小環境からの高められた腫瘍特異性を有する。一実施形態において、骨髄微小環境は、T細胞を維持及び拡大培養するために使用される。本発明の一実施形態において、7日間又は14日間の拡大培養プロセスでTILのおよそ25~100倍の拡大培養がある。一実施形態において、TILの拡大倍数は、約30~90倍である。一実施形態において、拡大倍数は、約35~85倍である。一実施形態において、拡大倍数は、約40~80倍である。一実施形態において、拡大倍数は、約45~75倍である。別の実施形態において、拡大倍数は、約40~70倍である。別の実施形態において、拡大倍数は、約45~65倍である。別の実施形態において、拡大倍数は、約25倍、約30倍、約35倍、約40倍、約45倍及び50倍、約55倍、約60倍、約65倍、約70倍、約75倍、約80倍、約85倍、約90倍、約95倍又は約100倍の拡大倍数である。
[00206] 本発明の一実施形態において、本発明は、骨髄及び/又は末梢血に由来するT細胞を拡大培養するための装置及び方法を提供する。本発明の一実施形態において、T細胞は、ポリクローナルであるが、高度に腫瘍特異的な様式で、骨髄微小環境からの高められた腫瘍特異性を有する。一実施形態において、骨髄微小環境は、T細胞を維持及び拡大培養するために使用される。本発明の一実施形態において、7日間又は14日間の拡大培養プロセスでTILのおよそ25~100倍の拡大培養がある。一実施形態において、TILの拡大倍数は、約30~90倍である。一実施形態において、拡大倍数は、約35~85倍である。一実施形態において、拡大倍数は、約40~80倍である。一実施形態において、拡大倍数は、約45~75倍である。別の実施形態において、拡大倍数は、約40~70倍である。別の実施形態において、拡大倍数は、約45~65倍である。別の実施形態において、拡大倍数は、約25倍、約30倍、約35倍、約40倍、約45倍及び50倍、約55倍、約60倍、約65倍、約70倍、約75倍、約80倍、約85倍、約90倍、約95倍又は約100倍の拡大倍数である。
[00207] 本発明の一実施形態において、T細胞製造プロセスは、腫瘍特異性を選択するための介入を必要としない。本発明の一実施形態において、T細胞製造プロセスは、T細胞拡大培養時に骨髄及び/又は末梢血中に腫瘍が存在することを必要としない。一実施形態において、T細胞は、ほぼ完全な骨髄の存在下で拡大培養される。
[00208] 一実施形態において、本発明は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2010/062742号に記載の実施例、特に実施例21に記載の骨髄及び/又は末梢血からT細胞を抽出する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるNoonan, et al., 2005, Cancer Res.65:2026-2034に記載されるように、骨髄及び/又は末梢血からT細胞を抽出する方法を提供する。
[00209] 一実施形態において、当業者に知られている骨髄及び/又は末梢血を入手するための方法は、本発明において有用である。本発明の一実施形態において、骨髄及び/又は末梢血は、針吸引を使用して入手される。本発明の一実施形態において、患者からの骨髄がヘパリン含有シリンジに吸引され、室温で一晩保存される。本発明の一実施形態において、保存後、シリンジの内容物を一緒に滅菌容器にプールし、品質を試験する。骨髄は、リンパ球分離培地(LSM)及びCOBE Spectraによる遠心分離を使用して、単核細胞(MNC)が濃縮されている。勾配内の細胞は、赤血球まで収集され、HBSSを使用して洗浄される。MNCは、2%HSA及び5%DMSOが添加されたヘタスターチ系凍結保護剤を使用して凍結保存され、品質管理のためにMNCの一部が確保されている。QCバイアルを解凍して、MNC製品のCD3+及びCD38+/138+の細胞含有量を測定する。骨髄の収集が本発明を限定するものではないことに留意することが重要である。
[00210] 本発明の一実施形態において、骨髄を吸引及びリンパ球分離培地密度勾配で分画し、細胞をほぼ赤血球ペレットのレベルまで収集する。一実施形態において、この分画法は、赤血球及び好中球を実質的に除去し、ほぼ完全な骨髄を提供する。一実施形態において、結果として生じる分画された材料は、T細胞及び腫瘍細胞である。本発明の一実施形態において、方法は、T細胞特異的分離ステップなしで且つ腫瘍細胞分離ステップなしで、例えば、抗体又は他の細胞タイプ特異的検出可能標識でT細胞を標識することなしで且つ蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用した選別なしで実施され得る。
[00211] 本発明の一実施形態において、入手した骨髄がフィコールされるか、又は末梢血が200uL/ウェルのAIM-V培地中に1×106個/mLの細胞で無血清条件において懸濁される。
[00212] 本発明の一実施形態において、骨髄は、完全寛解にない対象から収集される。本発明の一実施形態において、骨髄は、完全寛解にある対象から収集される。
[00213] 本発明の一実施形態において、骨髄を入手し、凍結し得る。一実施形態において、骨髄を入手し、直ちに使用してT細胞を抽出し得る。
[00214] 更なる実施形態において且つ上記のいずれかに従って、本発明は、TILを拡大培養する方法であって、液性腫瘍から入手した少なくとも1つのTILを含むTILの集団を接触させることを含む方法を提供する。本明細書におけるTILの拡大培養に関する全ての議論は、骨髄、末梢血及び/又は液性腫瘍を含む血液悪性腫瘍から入手したTILの拡大培養に適用可能である。
[00215] 一実施形態において、本発明は、腫瘍から腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の集団を調製するためのプロセスであって、
(a)断片化した腫瘍を第1の細胞培養培地と接触させるステップ;
(b)第1の細胞培養培地中でTILの第1の集団の初期拡大培養(プレREP)を行ってTILの第2の集団を入手するステップであって、TILの第2の集団は、数においてTILの第1の集団よりも少なくとも5倍多く、第1の細胞培養培地は、IL-2を含む、ステップ;
(c)第2の細胞培養培地中でTILの第2の集団の第2の拡大培養を行ってTILの第3の集団を入手するステップであって、TILの第3の集団は、第2の拡大培養の開始から7日後、数においてTILの第2の集団よりも少なくとも50倍多く、第2の細胞培養培地は、IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及び照射同種異系末梢血単核細胞(PBMC)を含み、第2の拡大培養は、14日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;
(d)TILの第3の集団を回収するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、血液悪性腫瘍である、プロセスを提供する。
(a)断片化した腫瘍を第1の細胞培養培地と接触させるステップ;
(b)第1の細胞培養培地中でTILの第1の集団の初期拡大培養(プレREP)を行ってTILの第2の集団を入手するステップであって、TILの第2の集団は、数においてTILの第1の集団よりも少なくとも5倍多く、第1の細胞培養培地は、IL-2を含む、ステップ;
(c)第2の細胞培養培地中でTILの第2の集団の第2の拡大培養を行ってTILの第3の集団を入手するステップであって、TILの第3の集団は、第2の拡大培養の開始から7日後、数においてTILの第2の集団よりも少なくとも50倍多く、第2の細胞培養培地は、IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及び照射同種異系末梢血単核細胞(PBMC)を含み、第2の拡大培養は、14日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;
(d)TILの第3の集団を回収するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、血液悪性腫瘍である、プロセスを提供する。
[00216] 一実施形態において、本発明は、第1のプレ急速拡大培養(プレREP)プロセス、次いで第2の拡大培養プロセス(急速拡大培養プロセス-REPであり得る)を含む、TILの集団を拡大培養させるためのプロセスであって、拡大培養に使用される細胞培養培地は、100IU/mL~10,000IU/mL、200IU/mL~5,000IU/mL、300IU/mL~4,800IU/mL、400IU/mL~4,600IU/mL、500IU/mL~4,400IU/mL、600IU/mL~4,200IU/mL、700IU/mL~4,000IU/mL、800IU/mL~3,800IU/mL、900IU/mL~3,600IU/mL、1,000IU/mL~3,400IU/mL、1,100IU/mL~3,200IU/mL、1,200IU/mL~3,000IU/mL、1,300IU/mL~2,800IU/mL、1,400IU/mL~2,600IU/mL、1,500IU/mL~2,400IU/mL、1,600IU/mL~2,200IU/mL、1,700IU/mL~2,000IU/mL、5,500IU/mL~9,500IU/mL、6,000IU/mL~9,000IU/mL、6500IU/mL~8,500IU/mL、7,000IU/mL~8,000IU/mL及び7,500IU/mL~8,000IU/mLからなる群から選択される濃度のIL-2を含む、プロセスを提供する。
[00217] 一実施形態において、本発明は、プレ急速拡大培養(プレREP)プロセス及び急速拡大培養プロセス(REP)を含む、TILの集団を拡大培養させるためのプロセスであって、拡大培養に使用される細胞培養培地は、約100IU/mL、約200IU/mL、約300IU/mL、約400IU/mL、約100IU/mL、約100IU/mL、約100IU/mL、約100IU/mL、約100IU/mL、約500IU/mL、約600IU/mL、約700IU/mL、約800IU/mL、約900IU/mL、約1,000IU/mL、約1,100IU/mL、約1,200IU/mL、約1,300IU/mL、約1,400IU/mL、約1,500IU/mL、約1,600IU/mL、約1,700IU/mL、約1,800IU/mL、約1,900IU/mL、約2,000IU/mL、約2,100IU/mL、約2,200IU/mL、約2,300IU/mL、約2,400IU/mL、約2,500IU/mL、約2,600IU/mL、約2,700IU/mL、約2,800IU/mL、約2,900IU/mL、約3,000IU/mL、約3,100IU/mL、約3,200IU/mL、約3,300IU/mL、約3,400IU/mL、約3,500IU/mL、約3,600IU/mL、約3,700IU/mL、約3,800IU/mL、約3,900IU/mL、約4,000IU/mL、約4,100IU/mL、約4,200IU/mL、約4,300IU/mL、約4,400IU/mL、約4,500IU/mL、約4,600IU/mL、約4,700IU/mL、約4,800IU/mL、約4,900IU/mL、約5,000IU/mL、約5,100IU/mL、約5,200IU/mL、約5,300IU/mL、約5,400IU/mL、約5,500IU/mL、約5,600IU/mL、約5,700IU/mL、約5,800IU/mL、約5,900IU/mL、約6,000IU/mL、約6,500IU/mL、約7,000IU/mL、約7,500IU/mL、約8,000IU/mL、約8,500IU/mL、約9,000IU/mL、約9,500IU/mL及び約10,000IU/mLからなる群から選択される濃度のIL-2を含む、プロセスを提供する。
[00218] 一実施形態において、本発明は、プレ急速拡大培養(プレREP)プロセスを含む、TILの集団を拡大培養させるためのプロセスを提供する。一実施形態において、本発明は、TILの集団を拡大培養させるプレREPプロセスであって、液性腫瘍から入手したTILの集団を細胞培養培地と接触させるステップを含み、細胞培養培地は、初期濃度1000IU/mL~6000IU/mLのIL-2を更に含む、プレREPプロセスを提供する。
[00219] 一実施形態において、本発明は、TILの集団を拡大培養するためのプレREPプロセスであって、液性腫瘍から入手したTILの集団を細胞培養培地と接触させるステップを含み、細胞培養培地は、初期濃度約6000IU/mLのIL-2を更に含む、プレREPプロセスを提供する。
[00220] 一実施形態において、REPは、任意の適切な方法によって本開示による液性腫瘍から入手したTILを使用して、ガス透過性容器中で実施することができる。例えば、TILは、インターロイキン-2(IL-2)又はインターロイキン-15(IL-15)の存在下での非特異的T細胞受容体刺激を用いて急速に拡大培養することができる。非特異的T細胞受容体刺激は、例えば、約30ng/mLのOKT-3、モノクローナル抗CD3抗体(Ortho-McNeil, Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech, Auburn, CAから市販)を含み得る。TILは、任意選択により300IU/mLのIL-2又はIL-15などのT細胞成長因子の存在下において、任意選択によりヒト白血球抗原A2(HLA-A2)結合ペプチド、例えば0.3μM MART-1:26-35(27L)又はgpl 00:209-217(210M)などのベクターから発現させることができる、癌のエピトープなどのその抗原部分を含む1つ以上の抗原を用いてインビトロでTILを更に刺激することによって急速に拡大培養させることができる。他の適切な抗原としては、例えば、NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、チロシナーゼ癌抗原、MAGE-A3、SSX-2及びVEGFR2又はそれらの抗原部分が挙げられ得る。TILは、HLA-A2発現抗原提示細胞にパルスした癌の同じ抗原による再刺激によっても急速に拡大培養し得る。代わりに、TILは、例えば、例として照射自己リンパ球により、又は照射HLA-A2+同種異系リンパ球及びIL-2により更に再刺激することができる。
[00221] 一実施形態において、TILを拡大培養させるための方法は、約5000mL~約25000mLの細胞培養培地、約5000mL~約10000mLの細胞培養培地又は約5800mL~約8700mLの細胞培養培地を使用することを含み得る。一実施形態において、TILを拡大培養させるための方法は、約1000mL~約2000mLの細胞培地、約2000mL~約3000mLの細胞培養培地、約3000mL~約4000mLの細胞培養培地、約4000mL~約5000mLの細胞培養培地、約5000mL~約6000mLの細胞培養培地、約6000mL~約7000mLの細胞培養培地、約7000mL~約8000mLの細胞培養培地、約8000mL~約9000mLの細胞培養培地、約9000mL~約10000mLの細胞培養培地、約10000mL~約15000mLの細胞培養培地、約15000mL~約20000mLの細胞培養培地又は約20000mL~約25000mLの細胞培養培地を使用することを含み得る。一実施形態において、TILの数を拡大するには、1種類以下の細胞培養培地を使用する。任意の適切な細胞培養培地、例えばAIM-V細胞培地(L-グルタミン、50μM硫酸ストレプトマイシン及び10μM硫酸ゲンタマイシン)細胞培養培地(Invitrogen, Carlsbad CA)が使用され得る。これに関して、本発明の方法は、TILの数を拡大するために必要とされる培地の量及び培地の種類の数を有利に減少させる。一実施形態において、TILの数を拡大することは、3日又は4日に1回以下の頻度で細胞にフィードすることを含み得る。ガス透過性容器内の細胞数を増やすことは、細胞を拡大培養するのに必要なフィード頻度を減らすことによって細胞数を拡大するのに必要な手順を単純化する。
[00222] 一実施形態において、第2の拡大培養は、ガス透過性容器を使用して行われる。そのような実施形態は、細胞集団が約5×105細胞/cm2から10×106~30×106細胞/cm2に拡大培養することを可能にする。一実施形態において、この拡大培養は、フィードなしで発生する。一実施形態において、この拡大培養は、培地がガス透過性フラスコ内で約10cmの高さにある限り、フィードなしで発生する。一実施形態において、これは、フィードなしであるが、1つ以上のサイトカインの添加を伴う。一実施形態において、サイトカインを培地と混合する必要なく、サイトカインをボーラスとして添加することができる。そのような容器、装置及び方法は、当技術分野において公知であり、TILの拡大培養に使用されており、米国特許出願公開第2014/0377739A1号、国際公開第2014/210036A1号、米国特許出願公開第2013/0115617A1号、国際公開第2013/188427A1号、米国特許出願公開第2011/0136228A1号、米国特許第8,809,050号、国際公開第2011/072088A2号、米国特許出願公開第2016/0208216A1号、米国特許出願公開第2012/0244133A1号、国際公開第2012/129201A1号、米国特許出願公開第2013/0102075A1号、米国特許第8,956,860号、国際公開第2013/173835A1号及び米国特許出願公開第2015/0175966A1号に記載されているものを含み、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。そのようなプロセスは、Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292にも記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
[00223] 一実施形態において、ガス透過性容器は、G-Rex 10フラスコ(Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)である。一実施形態において、ガス透過性容器は、10cm2のガス透過性培養表面を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、40mLの細胞培養培地容量を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、2回の培地交換後に1億~3億個のTILを提供する。
[00224] 一実施形態において、ガス透過性容器は、G-Rex 100フラスコ(Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)である。一実施形態において、ガス透過性容器は、100cm2のガス透過性培養表面を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、450mLの細胞培養培地容量を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、2回の培地交換後に10億~30億個のTILを提供する。
[00225] 一実施形態において、ガス透過性容器は、G-Rex 100Mフラスコ(Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)である。一実施形態において、ガス透過性容器は、100cm2のガス透過性培養表面を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、1000mLの細胞培養培地容量を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、培地交換なしで10億~30億個のTILを提供する。
[00226] 一実施形態において、ガス透過性容器は、G-Rex 100Lフラスコ(Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)である。一実施形態において、ガス透過性容器は、100cm2のガス透過性培養表面を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、2000mLの細胞培養培地容量を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、培地交換なしで10億~30億個のTILを提供する。
[00227] 一実施形態において、ガス透過性容器は、G-Rex 24ウェルプレート(Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)である。一実施形態において、ガス透過性容器は、ウェルを有するプレートを含み、各ウェルは、2cm2のガス透過性培養表面を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、ウェルを有するプレートを含み、各ウェルは、8mLの細胞培養培地容量を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、2回の培地交換後に1ウェルあたり2000万~6000万個の細胞を提供する。
[00228] 一実施形態において、ガス透過性容器は、G-Rex 6ウェルプレート(Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)である。一実施形態において、ガス透過性容器は、ウェルを有するプレートを含み、各ウェルは、10cm2のガス透過性培養表面を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、ウェルを有するプレートを含み、各ウェルは、40mLの細胞培養培地容量を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、2回の培地交換後に1ウェルあたり1億~3億個の細胞を提供する。
[00229] 一実施形態において、第1及び/又は第2のガス透過性容器内の細胞培地は、濾過されていない。濾過されていない細胞培地の使用は、細胞数を拡大培養させるために必要な手順を単純化し得る。一実施形態において、第1及び/又は第2のガス透過性容器内の細胞培地は、ベータ-メルカプトエタノール(BME)を欠いている。
[00230] 一実施形態において、哺乳類から腫瘍組織サンプルを入手すること;細胞培地が中に入った第1のガス透過性容器内で腫瘍組織サンプルを培養すること;腫瘍組織サンプルからTILを入手すること;細胞培地が中に入った第2のガス透過性容器内でTIL数を約14~約42日間、例えば約28日間拡大することを含む、本方法の所要期間である。
[00231] 一実施形態において、細胞培養培地は、IL-2を含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約3000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約1000IU/mL、約1500IU/mL、約2000IU/mL、約2500IU/mL、約3000IU/mL、約3500IU/mL、約4000IU/mL、約4500IU/mL、約5000IU/mL、約5500IU/mL、約6000IU/mL、約6500IU/mL、約7000IU/mL、約7500IU/mL又は約8000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、1000~2000IU/mL、2000~3000IU/mL、3000~4000IU/mL、4000~5000IU/mL、5000~6000IU/mL、6000~7000IU/mL、7000~8000IU/mL又は8000IU/mLのIL-2を含む。
[00232] 一実施形態において、細胞培養培地は、OKT-3抗体を含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約30ng/mLのOKT-3抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約0.1ng/mL、約0.5ng/mL、約1ng/mL、約2.5ng/mL、約5ng/mL、約7.5ng/mL、約10ng/mL、約15ng/mL、約20ng/mL、約25ng/mL、約30ng/mL、約35ng/mL、約40ng/mL、約50ng/mL、約60ng/mL、約70ng/mL、約80ng/mL、約90ng/mL、約100ng/mL、約200ng/mL、約500ng/mL及び約1μg/mLのOKT-3抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、0.1ng/mL~1ng/mL、1ng/mL~5ng/mL、5ng/mL~10ng/mL、10ng/mL~20ng/mL、20ng/mL~30ng/mL、30ng/mL~40ng/mL、40ng/mL~50ng/mL及び50ng/mL~100ng/mLのOKT-3抗体を含む。
[00233] 一実施形態において、TILは、ガス透過性容器内で拡大培養する。米国特許出願公開第2005/0106717A1号に記載されているものを含む、当技術分野で公知の方法、組成物及び装置を使用して、PBMCを使用してTILを拡大培養するためにガス透過性容器が使用されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、TILは、ガス透過性バッグ内で拡大培養する。一実施形態において、TILは、Xuri Cell Expansion System W25(GE Healthcare)など、ガス透過性バッグ内でTILを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、TILは、Xuri Cell Expansion System W5(GE Healthcare)としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でTILを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、約100mL、約200mL、約300mL、約400mL、約500mL、約600mL、約700mL、約800mL、約900mL、約1L、約2L、約3L、約4L、約5L、約6L、約7L、約8L、約9L、約10L、約11L、約12L、約13L、約14L、約15L、約16L、約17L、約18L、約19L、約20L、約25L及び約30Lからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、50~150mL、150~250mL、250~350mL、350~450mL、450~550mL、550~650mL、650~750mL、750~850mL、850~950mL及び950~1050mLからなる群から選択される範囲の容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、1L~2L、2L~3L、3L~4L、4L~5L、5L~6L、6L~7L、7L~8L、8L~9L、9L~10L、10L~11L、11L~12L、12L~13L、13L~14L、14L~15L、15L~16L、16L~17L、17L~18L、18L~19L及び19L~20Lからなる群から選択される範囲の容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、0.5L~5L、5L~10L、10L~15L、15L~20L、20L~25L及び25L~30Lからなる群から選択される範囲の容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、約30分、約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約24時間、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、約13日、約14日、約15日、約16日、約17日、約18日、約19日、約20日、約21日、約22日、約23日、約24日、約25日、約26日、約27日及び約28日の揺動時間を用いる。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、30分~1時間、1時間~12時間、12時間~1日、1日~7日、7日~14日、14日~21日及び21日~28日の揺動時間を用いる。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、約2揺動/分、約5揺動/分、約10揺動/分、約20揺動/分、約30揺動/分及び約40揺動/分の揺動速度を用いる。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、2揺動/分~5揺動/分、5揺動/分~10揺動/分、10揺動/分~20揺動/分、20揺動/分~30揺動/分及び30揺動/分~40揺動/分の揺動速度を用いる。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、約2°、約3°、約4°、約5°、約6°、約7°、約8°、約9°、約10°、約11°及び約12°の揺動角を用いる。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、2°~3°、3°~4°、4°~5°、5°~6°、6°~7°、7°~8°、8°~9°、9°~10°、10°~11°及び11°~12°の揺動角を用いる。
[00234] 一実施形態において、液性腫瘍から入手したTILを拡大培養する方法は、TILが優れた腫瘍反応性について選択されるステップを更に含む。当技術分野で公知の任意の選択方法が使用され得る。例えば、米国特許出願公開第2016/0010058A1号(この開示は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載される方法が、優れた腫瘍応答性に関するTILの選択に用いられ得る。
[00235] 一実施形態において、本発明は、液性腫瘍からTILの集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292に記載されているようなステップを含み、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、腫瘍又はその一部を酵素培地に入れ、およそ1分間機械的に分離させ得る。次いで、混合物を5%CO2中37℃で30分間インキュベートし、次いでおよそ1分間再び機械的に破砕し得る。5%CO2中、37℃で30分間インキュベートした後、腫瘍又はその一部を3回目におよそ1分間機械的に破砕し得る。3回目の機械的破砕後、大きい組織片が存在する場合、5%CO2中、37℃で更に30分のインキュベーションを伴って又は伴わず、1回又は2回の更なる機械的分離をサンプルに適用し得る。最終インキュベーションの終わりに細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、これらの細胞を除去するためにフィコールを用いた密度勾配分離を行うことができる。TIL培養は、24ウェルプレート(Costar24ウェル細胞培養クラスター、平底;Corning Incorporated, Corning, NY)で開始され、各ウェルに、IL-2(6000IU/mL;Chiron Corp., Emeryville, CA)を含む2mLの完全培地(CM)中、1×106個の腫瘍消化細胞又はおよそ1~8mm3のサイズの1つの腫瘍断片が播種され得る。CMは、10%ヒトAB血清、25mM Hepes及び10mg/mLゲンタマイシンを添加した、GlutaMAXを含むRoswell Park Memorial Institute(RPMI)1640緩衝液を含む。培養は、40mL容量及び10cm2のガス透過性シリコン底を有するガス透過性フラスコ(G-Rex 10;Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton内で開始され得、各フラスコに、IL-2を含む10~40mLのCM中、10~40×106個の生存可能な腫瘍消化細胞又は5~30個の腫瘍断片が充填され得る。G-Rex 10及び24ウェルプレートは、5%CO2中37℃において加湿インキュベーター内でインキュベートされ得、培養開始の5日後、培地の半分は、取り出され、新鮮なCM及びIL-2と交換され得、5日後、培地の半分は、2~3日ごとに交換され得る。本開示の液性腫瘍から入手したTILを使用して、本明細書の他の箇所に記載されるように、T-175フラスコ及びガス透過性バッグ又はガス透過性G-Rexフラスコを使用して、TILの第2の拡大培養プロトコル(REP)が行われ得る。T-175フラスコ中のREPでは、1×106個のTILが各フラスコ中の150mLの培地に懸濁され得る。TILは、3000IU/mLのIL-2及び30ng/mLの抗CD3抗体(OKT-3)を添加したCM及びAIM-V培地(50/50培地)の1対1の混合物で培養され得る。T-175フラスコは、5%CO2中37℃でインキュベートされ得る。培地の半分は、5日目に、3000IU/mLのIL-2を含む50/50培地を用いて交換され得る。7日目に、2つのT-175フラスコからの細胞を3Lバッグ中で混合し、5%ヒトAB血清を含む300mLのAIM-V及び3000IU/mLのIL-2を300mLのTIL懸濁液に添加し得る。各バッグ中の細胞数を毎日又は隔日でカウントし得、新鮮な培地を添加して細胞数を0.5~2.0×106細胞/mLに保ち得る。100cm2のガス透過性シリコン底を有する500mL容量のフラスコ(例えば、本明細書の他の箇所に記載されるように、G-Rex 100, Wilson Wolf Manufacturing)中のREPでは、5×106又は10×106個のTILは、3000IU/mLのIL-2及び30ng/mLの抗CD3抗体(OKT-3)を添加した、400mLの50/50培地中で培養され得る。G-Rex 100フラスコは、5%CO2下37℃でインキュベートし得る。5日目に、250mLの上清を取り出して遠心分離ボトルに入れ、1500rpm(491g)で10分間遠心分離し得る。入手したTILペレットを3000IU/mLのIL-2を含む150mLの新鮮な50/50培地に再懸濁し、G-Rex 100フラスコに戻して添加し得る。TILをG-Rex 100フラスコ中で連続的に拡大培養する場合、7日目に各G-Rex 100中のTILは各フラスコに存在する300mLの培地に懸濁され、細胞懸濁液は、3つのG-Rex 100フラスコに接種するために使用され得る3つの100mLアリコートに分割され得る。次いで、5%ヒトAB血清を含む約150mLのAIM-V及び3000IU/mLのIL-2を各フラスコに添加し得る。次いで、G-Rex 100フラスコを5%CO2中37℃でインキュベートし、4日後に、3000IU/mLのIL-2を有する150mLのAIM-Vを各G-Rex 100フラスコに加え得る。この後、培養14日目に細胞を回収することによってREPが完了され得る。
[00236] 一実施形態において、癌を拡大培養又は処置する方法は、TILが患者の腫瘍サンプルから入手されるステップを含む。患者の腫瘍サンプルは、当技術分野において公知の方法を使用して入手され得る。例えば、TILは、酵素的腫瘍消化物及び鋭的切開による腫瘍断片(サイズ約1~約8mm3)から培養され得る。そのような腫瘍消化物は、酵素培地(例えば、Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640緩衝液、2mMグルタメート、10mcg/mLゲンタマイシン、30単位/mLのDNase及び1.0mg/mLのコラゲナーゼ)中でのインキュベーション、続いて機械的分離(例えば、組織分離剤を使用)によって産生され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地中に置き、腫瘍をおよそ1分間機械的に分離した後、続いて5%CO2下37℃で30分間インキュベートし、続いてごく小さい組織片のみが存在するまで前述の条件下で機械的分離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことにより作製され得る。このプロセスの終わりに細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、これらの細胞を除去するためにFICOLL分岐親水性多糖を用いた密度勾配分離を行うことができる。米国特許出願公開第2012/0244133A1号に記載されているものなど、当技術分野で公知の代替的方法を使用し得、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の任意の方法は、TILを拡大培養する方法又は癌を処置する方法のために、本明細書に記載の任意の実施形態において使用され得る。
[00237] 一実施形態において、前述のように、T-175フラスコ及びガス透過性バッグを使用して(Tran, et al, J. Immunother.2008, 31, 742-51;Dudley, et al, J. Immunother.2003, 26, 332-42)又はガス透過性培養器具(G-Rexフラスコ、Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USAから市販)を使用して、TILの第2の/REP拡大培養プロセスが実施され得る。T-175フラスコ中のTIL拡大培養では、150mLの培地中に懸濁した1×106個のTILが各T-175フラスコに添加され得る。TILは、IL-2の1mLあたり3000IU(国際単位)及び抗CD3抗体(例えば、OKT-3)の1mLあたり30ngを添加したCM及びAIM-V培地の1対1の混合物で培養され得る。T-175フラスコは、5%CO2中37℃でインキュベートされ得る。培地の半分は、5日目に、1mLあたり3000IUのIL-2を含む50/50培地を用いて交換され得る。7日目に、2つのT-175フラスコからの細胞を3Lバッグ中で混合し、5%ヒトAB血清を含む300mLのAIM-V及び1mLあたり3000IUのIL-2を300mLのTIL懸濁液に添加した。各バッグ中の細胞数を毎日又は隔日でカウントし、新鮮な培地を添加して細胞数を0.5~2.0×106細胞/mLに保った。
[00238] 一実施形態において、100cm2のガス透過性シリコン底を有する500mL容量のガス透過性フラスコ(G-Rex 100, Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USAから市販)中の第2の/REP TIL拡大培養では、5×106又は10×106個のTILは、5%ヒトAB血清、1mLあたり3000IUのIL-2及び1mLあたり30ngの抗CD3(OKT-3)を添加した、400mLの50/50培地中で培養され得る。G-Rex 100フラスコは、5%CO2下37℃でインキュベートし得る。5日目に、250mLの上清を取り出して遠心分離ボトルに入れ、1500rpm(毎分回転数;491×g)で10分間遠心分離し得る。TILペレットを、5%ヒトAB血清、1mLあたり3000IUのIL-2を含む150mLの新鮮培地で再懸濁し、元のG-Rex 100フラスコに戻して添加し得る。TILをG-Rex 100フラスコ中で連続的に拡大培養する場合、7日目に各G-Rex 100フラスコ中のTILは各フラスコに存在する300mLの培地に懸濁され得、細胞懸濁液は、3つのG-Rex 100フラスコに播種するために使用され得る3つの100mLアリコートに分割され得る。次に、5%ヒトAB血清及び1mLあたり3000IUのIL-2を含む150mLのAIM-Vを各フラスコに加え得る。G-Rex 100フラスコを5%CO2中37℃でインキュベートし、4日後に、1mLあたり3000IUのIL-2を有する150mLのAIM-Vを各G-Rex 100フラスコに加え得る。細胞は、培養14日目に回収され得る。
[00239] 一実施形態において、TILは、以下のように調製され得る。2mm3の腫瘍断片を、2mMグルタミン(Mediatech, Inc.Manassas, VA)、100U/mLペニシリン(Invitrogen Life Technologies)、100μg/mLストレプトマイシン(Invitrogen Life Technologies)、5%熱不活性化ヒトAB血清(Valley Biomedical, Inc.Winchester, VA)及び600IU/mL rhIL-2(Chiron, Emeryville, CA)を添加したAIM-V培地(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)を含む完全培地(CM)中で培養する。液性腫瘍の酵素的消化のために、腫瘍標本をさいの目に切りRPMI-1640へ入れ、洗浄し、15~22℃で5分間、800rpmで遠心分離し、酵素的消化緩衝液(RPMI-1640中0.2mg/mLコラゲナーゼ及び30単位/mlのDNase)に再懸濁し、続いて室温で一晩回転させる。断片から作製されたTILをCM中で3~4週間増殖させ、新鮮に拡大培養させるか、又は10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む熱不活性化HAB血清中で凍結保存し、研究時まで-180℃で保存し得る。腹水採取から入手した腫瘍関連リンパ球(TAL)をCM中24ウェルプレートの3×106細胞/ウェルで播種した。低倍率倒立顕微鏡を使用して、TILの増殖を隔日で検査した。
TIL製造プロセス(「2Aプロセス」)の例示的な実施形態
[00169] プロセス2Aとして知られる例示的なTIL製造/拡大培養プロセスは、図22に概略的に示されている。特定の態様において、本方法は、対象/患者への投与時に複製サイクルを増加させることができるTILを産生し、従って成熟TIL(即ち対象/患者への投与前に更に多くの回数の複製を受けたTIL)を超える追加の治療上の利点を提供し得る。幼若TILの特徴が文献に記載されている。例えば、Donia, at al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012);Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010)、Huang et al., J Immunother, 28(3):258-267 (2005)、Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013)、Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009)、Robbins, et al., J Immunol 2004;173:7125-7130、Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007)、Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005)及びTran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008)であり、これらの全ては、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
[00169] プロセス2Aとして知られる例示的なTIL製造/拡大培養プロセスは、図22に概略的に示されている。特定の態様において、本方法は、対象/患者への投与時に複製サイクルを増加させることができるTILを産生し、従って成熟TIL(即ち対象/患者への投与前に更に多くの回数の複製を受けたTIL)を超える追加の治療上の利点を提供し得る。幼若TILの特徴が文献に記載されている。例えば、Donia, at al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012);Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010)、Huang et al., J Immunother, 28(3):258-267 (2005)、Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013)、Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009)、Robbins, et al., J Immunol 2004;173:7125-7130、Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007)、Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005)及びTran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008)であり、これらの全ては、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
[00170] 本明細書において考察される通り、本発明は、患者への移植前に凍結保存TILを再刺激することによりその代謝活性、従って相対的健康を増加させ、且つ前記代謝的健康の試験方法に関するステップを含み得る。一般的に本明細書に概説される通り、TILは、一般的に患者サンプルから採取し、操作することにより、患者への移植前にその数が拡大される。一部の実施形態において、TILは、任意選択により、以下に考察する通り遺伝的に操作され得る。
[00171] 一部の実施形態において、TILは、凍結保存され得る。解凍後、TILは、患者への注入前に、その代謝を高めるために再刺激され得る。
[00172] 一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察する通り、第1の拡大培養(プレREPと称されるプロセスを含む)は、従来の拡大培養法と比較して7~14日に短縮され、第2の拡大培養(REPと称されるプロセスを含む)は、7~14日間に短縮される。
[00173] 図23は、例示的な2Aプロセスを示す。図23で示すように且つ以下で更に詳細に説明されるように、一部の実施形態において、第1の拡大培養(ステップB)は、11日間に短縮され、第2の拡大培養(ステップD)は、11日間に短縮される。一部の実施形態において、本明細書で詳細に考察されるように、第1及び第2の拡大培養(ステップB及びステップD)の組み合わせは、22日間に短縮される。理解されるように、図23に示され且つ以下に説明されるプロセスは、例示的なものであり、本明細書で説明する方法は、説明したステップへの変更及び追加並びに任意の組み合わせを包含する。このプロセスの例示的な実施形態は、PCT出願番号PCT/米国特許出願公開第2018/012633号に記載されており、その全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
A.ステップA:患者腫瘍サンプルの入手
[00174] 一般に、TILは、最初に患者腫瘍サンプルから入手され(「初代TIL」)、次に本明細書に記載される通りの更なる操作のためより大きい集団に拡大培養され、任意選択により凍結保存され、本明細書に概説される通り再刺激され、且つ任意選択によりTILの健康の指標として表現型及び代謝パラメータが判定される。
[00174] 一般に、TILは、最初に患者腫瘍サンプルから入手され(「初代TIL」)、次に本明細書に記載される通りの更なる操作のためより大きい集団に拡大培養され、任意選択により凍結保存され、本明細書に概説される通り再刺激され、且つ任意選択によりTILの健康の指標として表現型及び代謝パラメータが判定される。
[00175] 患者腫瘍サンプルは、当技術分野において公知の方法を用いて、一般的に、外科的切除、針生検、アフェレーシス又はその他の、腫瘍とTIL細胞との混合物を含むサンプルを入手するための手段によって入手され得る。一般に、腫瘍サンプルは、原発腫瘍、浸潤性腫瘍又は転移性腫瘍を含めた任意の固形腫瘍からであり得る。腫瘍サンプルは、血液悪性腫瘍から入手された腫瘍など、液性腫瘍でもあり得る。固形腫瘍は、限定されないが、乳癌、膵癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、腎癌、胃癌及び皮膚癌(限定されないが、扁平上皮癌、基底細胞癌及び黒色腫を含む)を含めた任意の癌型のものであり得る。一部の実施形態において、有用なTILは、特に高レベルのTILを有すると報告されていることに伴い悪性黒色腫腫瘍から入手される。一部の実施形態において、腫瘍は、約1.5cmより大きく、約4cmより小さい。一部の実施形態において、腫瘍は、4cmより小さい。
[00176] 入手後、腫瘍サンプルは、一般的に鋭的剥離を用いて1~約8mm3の小片に断片化され、約2~3mm3が特に有用である。TILは、酵素的腫瘍消化物を使用してこれらの断片から培養される。そのような腫瘍消化物は、酵素培地(例えば、Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640緩衝液、2mMグルタメート、10mcg/mLゲンタマイシン、30単位/mLのDNase及び1.0mg/mLのコラゲナーゼ)中でのインキュベーション、続いて機械的分離(例えば、組織分離剤を使用)によって産生され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地中に置き、腫瘍を約1分間機械的に分離した後、続いて5%CO2下37℃で30分間インキュベートし、続いてごく小さい組織片のみが存在するまで前述の条件下で機械的分離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことにより作製され得る。このプロセスの終わりに細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、これらの細胞を除去するためにFICOLL分岐親水性多糖を用いた密度勾配分離を行うことができる。米国特許出願公開第2012/0244133A1号に記載されているものなど、当技術分野で公知の代替的方法を使用し得、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の任意の方法は、TILを拡大培養する方法又は癌を処置する方法のために、本明細書に記載の任意の実施形態において使用され得る。
[00177] 一般に、採取された細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に採取した」細胞集団と呼ばれる。
[00178] 一実施形態において、TILは、最初に、患者から入手された酵素的腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養することができる。
[00179] 一部の実施形態において、TILは、腫瘍断片から入手される。一部の実施形態において、腫瘍断片は、鋭的剥離で入手される。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約1mm3~10mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約1mm3~8mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約1mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約2mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約3mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約4mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約5mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約6mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約7mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約8mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約9mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約10mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約8~27mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約10~25mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約15~25mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約8~20mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約15~20mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約8~15mm3である。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約8~10mm3である。
[00180] 一部の実施形態において、腫瘍断片の数は、約40個~約50個の腫瘍断片である。一部の実施形態において、腫瘍断片の数は、約40個の腫瘍断片である。一部の実施形態において、腫瘍断片の数は、約50個の腫瘍断片である。一部の実施形態において、腫瘍断片サイズは、約8~27mm3であり、約50未満の腫瘍断片が存在する。
[00181] 一部の実施形態において、TILは、腫瘍消化物から入手される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、酵素培地中、例えば、限定されないが、RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mLゲンタマイシン、30U/mL DNアーゼ及び1.0mg/mLコラゲナーゼ中におけるインキュベーションと、それに続く機械的分離(GentleMACS、Miltenyi Biotec、Auburn, CA)によって作成した。腫瘍を酵素培地に置いた後、腫瘍を約1分間機械的に分離し得る。次に、溶液を5%CO2下37℃で30分間インキュベートし、次にそれを再び約1分間機械的に破壊し得る。再び5%CO2下37℃で30分間インキュベートした後、腫瘍を3度目に約1分間機械的に破壊し得る。一部の実施形態において、3度目の機械的破壊後に大型の組織片が存在した場合、5%CO2下37℃での更に30分間のインキュベーションを伴う又は伴わない1回又は2回の更なる機械的分離をサンプルに適用した。一部の実施形態において、最終回のインキュベーションの終了時に細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有した場合、フィコールを使用した密度勾配分離を実施して、そうした細胞を除去し得る。
B.ステップB:第1の拡大培養
[00182] ステップAにおける腫瘍断片の剥離又消化後、得られた細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもTILの成長に有利な条件下で血清含有IL-2において培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、2mLウェルにおいて、不活性化ヒトAB血清を6000IU/mLのIL-2と共に含む培地中でインキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、一般的に3~14日間の期間にわたって培養され、それによりバルクTIL集団、一般的に約1×108個のバルクTIL細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、7~14日間の期間にわたって培養され、それによりバルクTIL集団、一般的に約1×108個のバルクTIL細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、10~14日間の期間にわたって培養され、それによりバルクTIL集団、一般的に約1×108個のバルクTIL細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、約11日間の期間にわたって培養され、それによりバルクTIL集団、一般的に約1×108個のバルクTIL細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、約11日間の期間にわたって培養され、それによりバルクTIL集団、一般的に約200×106個以下のバルクTIL細胞が得られる。
[00182] ステップAにおける腫瘍断片の剥離又消化後、得られた細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもTILの成長に有利な条件下で血清含有IL-2において培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、2mLウェルにおいて、不活性化ヒトAB血清を6000IU/mLのIL-2と共に含む培地中でインキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、一般的に3~14日間の期間にわたって培養され、それによりバルクTIL集団、一般的に約1×108個のバルクTIL細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、7~14日間の期間にわたって培養され、それによりバルクTIL集団、一般的に約1×108個のバルクTIL細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、10~14日間の期間にわたって培養され、それによりバルクTIL集団、一般的に約1×108個のバルクTIL細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、約11日間の期間にわたって培養され、それによりバルクTIL集団、一般的に約1×108個のバルクTIL細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、約11日間の期間にわたって培養され、それによりバルクTIL集団、一般的に約200×106個以下のバルクTIL細胞が得られる。
[00183] 好ましい実施形態において、以下及び本明細書で説明するように、初期バルクTIL拡大培養ステップ(例えば、プレREPと称されるプロセスを含み得る図23に示されるステップB)、その後の、以下でステップDの下及び本明細書に記載されているように、第2の拡大培養(ステップD、高速拡大培養プロトコル(REP)ステップと称されるプロセスを含む)、その後の、任意選択の凍結保存及びその後の第2ステップD(再刺激REPステップと称されるプロセスを含む)を使用してTILの拡大培養を実施することができる。このプロセスによって入手したTILは、任意選択により、本明細書に記載される通り表現型特徴及び代謝パラメータが特徴付けられ得る。
[00184] 実施形態において、TIL培養が24ウェルプレートで例えばCostar24ウェル細胞培養クラスター、平底(Corning Incorporated、Corning, NYを使用して開始される場合、各ウェルには、IL-2(6000IU/mL;Chiron Corp.、Emeryville, CA)を含む2mLの完全培地(CM)中、1×106個の腫瘍消化物細胞又は1個の腫瘍断片を播種することができる。一部の実施形態において、腫瘍断片は、約1mm3~10mm3である。
[00185] 一部の実施形態において、ステップBのCMは、10%のヒトAB血清、25mMのHEPES及び10mg/mLのゲンタマイシンを添加したGlutaMAX含有RPMI 1640からなる。培養が、40mL容量及び10cm2ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ(例えば、G-Rex10;Wilson Wolf Manufacturing、New Brighton, MN)内で開始される実施形態において(図1)、各フラスコに、10~40mLのIL-2含有CM中の10~40×106個の腫瘍消化物生細胞又は5~30個の腫瘍断片をロードした。G-Rex10及び24ウェルプレートのいずれも、加湿インキュベーターにおいて5%CO2下37℃でインキュベートし、培養開始から5日後に培地の半分を取り出して、新鮮なCM及びIL-2を補充し、5日目以降では2~3日毎に培地の半分を交換した。
[00186] 一実施形態において、細胞培養培地は、IL-2を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約3000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約1000IU/mL、約1500IU/mL、約2000IU/mL、約2500IU/mL、約3000IU/mL、約3500IU/mL、約4000IU/mL、約4500IU/mL、約5000IU/mL、約5500IU/mL、約6000IU/mL、約6500IU/mL、約7000IU/mL、約7500IU/mL又は約8000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、1000~2000IU/mL、2000~3000IU/mL、3000~4000IU/mL、4000~5000IU/mL、5000~6000IU/mL、6000~7000IU/mL、7000~8000IU/mL又は8000IU/mLのIL-2を含む。
[00187] 一部の実施形態において、実施例及び図で考察されているように、第1の拡大培養(プレREPと称されるプロセスを含む;ステップB)プロセスは3~14日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図4及び5に示すように、ステップBの第1の拡大培養は、7~14日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察するように、ステップBの第1の拡大培養は、10~14日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察するように、ステップBの第1の拡大培養は、11日間に短縮される。
[00188] 一部の実施形態において、IL-2、IL-7、IL-15及びIL-21並びにそれらの組み合わせは、本明細書に記載のように、ステップBプロセス中に含められ得る。
[00189] 一部の実施形態において、ステップBは、閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、TIL拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。
C.ステップC:第1の拡大培養から第2の拡大培養への移行
[00190] 一部の実施形態において、ステップBからのバルクTIL集団は、当技術分野で公知であり且つ本明細書に記載される方法を使用して直ちに凍結保存することができる。代わりに、バルクTIL集団は、以下で考察する通り、第2の拡大培養(REP)に供し、次に凍結保存することができる。
[00190] 一部の実施形態において、ステップBからのバルクTIL集団は、当技術分野で公知であり且つ本明細書に記載される方法を使用して直ちに凍結保存することができる。代わりに、バルクTIL集団は、以下で考察する通り、第2の拡大培養(REP)に供し、次に凍結保存することができる。
[00191] 一部の実施形態において、ステップBのTILは、貯蔵されず、ステップBのTILは、ステップDに直接進む。一部の実施形態において、本明細書に更に記載される通り、移行は、閉鎖系で行われる。
D.ステップD:第2の拡大培養
[00192] 一部の実施形態において、TIL細胞集団は、採取及び初期バルク処理後(即ちステップA及びステップB後)に数が拡大される。これは、本明細書において一般的に第2の拡大培養と称され、当技術分野では一般的に急速拡大培養プロセス(REP)と称される拡大培養プロセスを含み得る。第2の拡大培養は、一般的に、フィーダー細胞、サイトカイン源及び抗CD3抗体を含め、いくつもの成分を含むガス透過性容器内の培養培地を使用して達成することができる。一部の実施形態において、第2の拡大培養は、第2の拡大培養で入手されるTILの数を増加させるためにスケールアップすることを含み得る。
[00192] 一部の実施形態において、TIL細胞集団は、採取及び初期バルク処理後(即ちステップA及びステップB後)に数が拡大される。これは、本明細書において一般的に第2の拡大培養と称され、当技術分野では一般的に急速拡大培養プロセス(REP)と称される拡大培養プロセスを含み得る。第2の拡大培養は、一般的に、フィーダー細胞、サイトカイン源及び抗CD3抗体を含め、いくつもの成分を含むガス透過性容器内の培養培地を使用して達成することができる。一部の実施形態において、第2の拡大培養は、第2の拡大培養で入手されるTILの数を増加させるためにスケールアップすることを含み得る。
[00193] 一実施形態において、REP及び/又は第2の拡大培養は、本開示の方法を使用してガス透過性容器中で行うことができる。例えば、TILは、インターロイキン-2(IL-2)又はインターロイキン-15(IL-15)の存在下で非特異的T細胞受容体刺激を用いて急速に拡大培養することができる。非特異的T細胞受容体刺激としては、例えば、約30ng/mlのOKT3、マウスモノクローナル抗CD3抗体(Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている)を挙げることができる。TILは、任意選択により、300IU/mL IL-2又はIL-15など、T細胞成長因子の存在下において、ヒト白血球抗原A2(HLA-A2)結合ペプチド、例えば0.3μM MART-1:26-35(27L)又はgpl 00:209-217(210M)など、任意選択によりベクターから発現させることのできる、エピトープなど、その抗原性部分を含めた癌の1つ以上の抗原によるインビトロでのTILの更なる刺激により、急速に拡大培養することができる。他の適切な抗原としては、例えば、NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、チロシナーゼ癌抗原、MAGE-A3、SSX-2及びVEGFR2又はそれらの抗原部分が挙げられ得る。TILは、HLA-A2発現抗原提示細胞にパルスした癌の同じ抗原による再刺激によっても急速に拡大培養し得る。代わりに、TILは、例えば、照射自己リンパ球により、又は照射HLA-A2+同種異系リンパ球及びIL-2により更に再刺激することができる。
[00194] 一実施形態において、細胞培養培地は、IL-2を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約3000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約1000IU/mL、約1500IU/mL、約2000IU/mL、約2500IU/mL、約3000IU/mL、約3500IU/mL、約4000IU/mL、約4500IU/mL、約5000IU/mL、約5500IU/mL、約6000IU/mL、約6500IU/mL、約7000IU/mL、約7500IU/mL又は約8000IU/mLのIL-2を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、1000~2000IU/mL、2000~3000IU/mL、3000~4000IU/mL、4000~5000IU/mL、5000~6000IU/mL、6000~7000IU/mL、7000~8000IU/mL又は8000IU/mLのIL-2を含む。
[00195] 一実施形態において、細胞培養培地は、OKT3抗体を含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約30ng/mLのOKT-3抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約0.1ng/mL、約0.5ng/mL、約1ng/mL、約2.5ng/mL、約5ng/mL、約7.5ng/mL、約10ng/mL、約15ng/mL、約20ng/mL、約25ng/mL、約30ng/mL、約35ng/mL、約40ng/mL、約50ng/mL、約60ng/mL、約70ng/mL、約80ng/mL、約90ng/mL、約100ng/mL、約200ng/mL、約500ng/mL及び約1μg/mLのOKT3抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、0.1ng/mL~1ng/mL、1ng/mL~5ng/mL、5ng/mL~10ng/mL、10ng/mL~20ng/mL、20ng/mL~30ng/mL、30ng/mL~40ng/mL、40ng/mL~50ng/mL及び50ng/mL~100ng/mLのOKT3抗体を含む。
[00196] 一部の実施形態において、IL-2、IL-7、IL-15及びIL-21並びにそれらの組み合わせは、本明細書に記載のように、ステップDプロセスにおける第2の拡大培養中に含められ得る。
[00197] 一部の実施形態において、第2の拡大培養は、IL-2、OKT-3及び抗原提示フィーダー細胞を含む添加細胞培養培地で実施され得る。
[00198] 一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞(APC)は、PBMCである。一実施形態において、急速拡大培養及び/又は第2の拡大培養におけるTILとPBMC及び/又は抗原提示細胞との比は、約1:25、約1:50、約1:100、約1:125、約1:150、約1:175、約1:200、約1:225、約1:250、約1:275、約1:300、約1:325、約1:350、約1:375、約1:400又は約1:500である。一実施形態において、急速拡大培養及び/又は第2の拡大培養におけるTILとPBMCとの比は、1:50~1:300である。一実施形態において、急速拡大培養及び/又は第2の拡大培養におけるTILとPBMCとの比は、1:100~1:200である。
[00199] 一実施形態において、REP及び/又は第2の拡大培養は、バルクTILを150ml培地中の100倍又は200倍過剰の不活性化フィーダー細胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体及び3000IU/mL IL-2と混合してフラスコ内で実施される。細胞を別の成長チャンバに移すまで培地補充が行われる(一般的に新鮮培地による呼吸を介した3分の2の培地補充)。別の成長チャンバには、以下に更に十分に考察する通りのGRexフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
[00200] 一部の実施形態において、第2の拡大培養(REPプロセスとも称される)は、実施例及び図で考察されるように、7~14日間に短縮される。一部の実施形態において、第2の拡大培養は、11日間に短縮される。
[00201] 一実施形態において、REP及び/又は第2の拡大培養は、前述のように(Tran, et al., J. Immunother.2008, 31, 742-51;Dudley, et al., J. Immunother.2003, 26, 332-42)T-175フラスコ及びガス透過性バッグ又はガス透過性培養器具(G-Rexフラスコ)を使用して実施され得る。T-175フラスコ中のTIL急速拡大培養及び/又は第2の拡大培養では、150mLの培地中に懸濁した1×106個のTILが各T-175フラスコに添加され得る。TILは、IL-2の1mLあたり3000IU及び抗CD3の1mLあたり30ngを添加したCM及びAIM-V培地の1対1の混合物で培養され得る。T-175フラスコは、5%CO2中37℃でインキュベートされ得る。培地の半分は、5日目に、1mLあたり3000IUのIL-2を含む50/50培地を用いて交換され得る。7日目に、2つのT-175フラスコからの細胞を3Lバッグ中で混合し、5%ヒトAB血清を含む300mLのAIM-V及び1mLあたり3000IUのIL-2を300mLのTIL懸濁液に添加した。各バッグ中の細胞数を毎日又は隔日でカウントし、新鮮な培地を添加して細胞数を0.5~2.0×106細胞/mLに保った。
[00202] 一実施形態において、REP及び/又は第2の拡大培養は、100cm2のガス透過性シリコン底を有する500mL容量のガス透過性フラスコ(G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USAから市販)中で実施され得、5×106又は10×106個のTILは、5%人AB血清、1mLあたり3000IUのIL-2及び1mLあたり30ngの抗CD3(OKT-3)を添加した、400mLの50/50培地中でPBMCと共に培養され得る。G-Rex 100フラスコは、5%CO2下37℃でインキュベートし得る。5日目に、250mLの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、1500rpm(491×g)で10分間遠心し得る。TILペレットを、5%ヒトAB血清、1mLあたり3000IUのIL-2を含む150mLの新鮮培地で再懸濁し、元のG-Rex 100フラスコに戻して添加し得る。G-Rex 100フラスコ内でTILを連続的に拡大培養するとき、7日目に各G-Rex 100のTILを各フラスコ内に存在する300mLの培地に懸濁し得、且つ細胞懸濁液を3つの100mLアリコートに分割し得、それらを3つのG-Rex 100フラスコの播種に使用し得る。次に、5%ヒトAB血清及び1mLあたり3000IUのIL-2を含む150mLのAIM-Vを各フラスコに加え得る。G-Rex 100フラスコは、5%CO2下37℃でインキュベートされ得、4日後、各G-Rex 100フラスコに1mLあたり3000IUのIL-2を含む150mLのAIM-Vを加え得る。細胞は、培養14日目に回収され得る。
[00203] 一実施形態において、REP及び/又は第2の拡大培養は、バルクTILを150ml培地中の100倍又は200倍過剰の不活性化フィーダー細胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体及び3000IU/mL IL-2と混合してフラスコ内で実施される。細胞を別の成長チャンバに移すまで培地補充が行われる(一般的に新鮮培地による呼吸を介した3分の2の培地補充)。別の成長チャンバには、以下に更に十分に考察する通りのGRexフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
[00204] 一実施形態において、REP及び/又は第2の拡大培養が実施され、これは、優れた腫瘍応答性に関してTILを選択するステップを更に含む。当技術分野で公知の任意の選択方法が使用され得る。例えば、米国特許出願公開第2016/0010058A1号(この開示は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載される方法が、優れた腫瘍応答性に関するTILの選択に用いられ得る。
[00205] TILのREP及び/又は第2の拡大培養は、先述の通りT-175フラスコ及びガス透過性バッグ(Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751及びDudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Immunother., 26:332-342)又はガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施することができる。一部の実施形態において、REP及び/又は第2の拡大培養は、フラスコを使用して実施される。一部の実施形態において、REPは、ガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施される。T-175フラスコにおけるTIL REP及び/又は第2の拡大培養について、約1×106個のTILを約150mLの培地中に懸濁し、これを各T-175フラスコに加える。TILは、「フィーダー」細胞としての照射(50Gy)された同種異系PBMCと1対100の比で培養し、及び細胞は、3000IU/mLのIL-2及び30ng/mLの抗CD3を添加したCMとAIM-V培地との1対1混合物(50/50培地)で培養した。T-175フラスコは、5%CO2下37℃でインキュベートする。一部の実施形態において、培地の半分は、5日目に3000IU/mLのIL-2を含む50/50培地を使用して交換される。一部の実施形態において、7日目に、2つのT-175フラスコからの細胞を3Lバッグに合わせ、その300mLのTIL懸濁液に、5%ヒトAB血清及び3000IU/mLのIL-2を含む300mLのAIM-Vを加える。毎日又は2日毎に各バッグの細胞数をカウントし得、新鮮培地を加えて細胞数を約0.5~約2.0×106細胞/mLに保ち得る。
[00206] 100cm2ガス透過性シリコン底の500mL容量フラスコ(G-Rex 100, Wilson Wolf)中でのTIL REP及び/又は第2の拡大培養について、3000IU/mLのIL-2及び30ng/mLの抗CD3を添加した400mLの50/50培地中において、約5×106又は10×106個のTILを照射同種異系PBMCと1対100の比で培養する。G-Rex 100フラスコは、5%CO2下37℃でインキュベートされる。一部の実施形態において、5日目に、250mLの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、1500rpm(491g)で10分間遠心する。次に、3000IU/mLのIL-2を含む150mLの新鮮50/50培地にTILペレットを再懸濁し、元のG-Rex 100フラスコに戻して添加し得る。TILがG-Rex 100フラスコ内で連続的に拡大培養される実施形態において、7日目に各G-Rex 100内のTILを各フラスコ内に存在する300mLの培地に懸濁し、且つ細胞懸濁液を3つの100mLアリコートに分割しており、それらを3つのG-Rex 100フラスコの播種に使用される。次に、5%ヒトAB血清及び3000IU/mLのIL-2を含む150mLのAIM-Vを各フラスコに加える。G-Rex 100フラスコは、5%CO2下37℃でインキュベートされ、4日後、各G-Rex 100フラスコに3000IU/mLのIL-2を含む150mLのAIM-Vを加える。細胞は培養14日目に回収される。
1.フィーダー細胞及び抗原提示細胞
[00207] 一実施形態において、本明細書に記載される第2の拡大培養手順(ステップD、REPを含む)には、REP TIL拡大培養中及び/又は第2の拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞が必要である。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球(PBMC)である。PBMCは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。
[00207] 一実施形態において、本明細書に記載される第2の拡大培養手順(ステップD、REPを含む)には、REP TIL拡大培養中及び/又は第2の拡大培養中に過剰量のフィーダー細胞が必要である。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球(PBMC)である。PBMCは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。
[00208] 一般に、同種異系PBMCは、照射又は熱処理のいずれかにより不活性化され、実施例、特に同種異系PBMCの複製能力を評価するための例示的なプロトコルを提供する実施例14に記載されるように、REP手順で使用される。
[00209] 一部の実施形態において、14日目の生細胞の総数がREPの0日目及び/又は第2の拡大培養の0日目に培養(即ち第2の拡大培養の開始日)に移行した初期生細胞数より少ない場合、PBMCは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のTIL拡大培養手順での使用が認められる。
[00210] 一部の実施形態において、OKT3及びIL-2の存在下で培養された生細胞の総数が、7日目及び14日目に、REPの0日目及び/又は第2の拡大培養の0日目(即ち第2の拡大培養の開始日)に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、PBMCは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のTIL拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、PBMCは、30ng/mlのOKT3抗体及び3000IU/mlのIL-2の存在下で培養される。
[00211] 一部の実施形態において、OKT3及びIL-2の存在下で培養された生細胞の総数が、7日目及び14日目に、REPの0日目及び/又は第2の拡大培養の0日目(即ち第2の拡大培養の開始日)に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、PBMCは、複製不能と見なされ、本明細書に記載のTIL拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、PBMCは、5~60ng/mlのOKT3抗体及び1000~6000IU/mlのIL-2の存在下で培養される。一部の実施形態において、PBMCは、10~50ng/mlのOKT3抗体及び2000~5000IU/mlのIL-2の存在下で培養される。一部の実施形態において、PBMCは、20~40ng/mlのOKT3抗体及び2000~4000IU/mlのIL-2の存在下で培養される。一部の実施形態において、PBMCは、25~35ng/mlのOKT3抗体及び2500~3500IU/mlのIL-2の存在下で培養される。
[00212] 一実施形態において、人工抗原提示細胞は、PBMCの代替として又はそれと組み合わせてREP段階で使用される。
2.サイトカイン
[00213] 本明細書に記載の拡大培養方法は、一般に、当技術分野において公知の通り、高用量のサイトカイン、特にIL-2を含む培養培地を使用する。
[00213] 本明細書に記載の拡大培養方法は、一般に、当技術分野において公知の通り、高用量のサイトカイン、特にIL-2を含む培養培地を使用する。
[00214] 代わりに、TILの急速拡大培養又は第2の拡大培養にサイトカインの組み合わせを使用することが更に可能であり、IL-2、IL-15及びIL-21の2つ以上の組み合わせについて、一般的に米国特許出願公開第2017/0107490A1号、国際公開第2015/189356号、米国特許出願公開第2017/0107490A1号及び国際公開第2015/189357号(それぞれ本明細書に全体として参照により明示的に組み込まれる)に概説される通りである。従って、可能な組み合わせとしては、IL-2とIL-15、IL-2とIL-21、IL-15とIL-21とIL-2、IL-15とIL-21が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載される通り、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはT細胞の生成に有利である。
3.抗CD3抗体
[00215] 一部の実施形態において、本明細書に記載の拡大培養方法で使用される培養培地(REPを含む)は、抗CD3抗体も含む。抗CD3抗体をIL-2と併用すると、TIL集団においてT細胞活性化及び細胞分裂が誘導される。この効果は、完全長抗体並びにFab及びF(ab’)2断片で見ることができ、前者が一般的に好ましい;例えば、Tsoukas et al., J.Immunol.1985, 135, 1719(本明細書によって全体として参照により組み込まれる)を参照されたい。
[00215] 一部の実施形態において、本明細書に記載の拡大培養方法で使用される培養培地(REPを含む)は、抗CD3抗体も含む。抗CD3抗体をIL-2と併用すると、TIL集団においてT細胞活性化及び細胞分裂が誘導される。この効果は、完全長抗体並びにFab及びF(ab’)2断片で見ることができ、前者が一般的に好ましい;例えば、Tsoukas et al., J.Immunol.1985, 135, 1719(本明細書によって全体として参照により組み込まれる)を参照されたい。
[00216] 当業者が理解するであろう通り、本発明において使用が見出される好適な抗ヒトCD3抗体は、限定されないが、ネズミ科動物、ヒト、霊長類、ラット及びイヌ科動物抗体を含めた、様々な哺乳類からの抗ヒトCD3ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含め、いくつも存在する。詳細な実施形態において、OKT3抗CD3抗体が使用される(Ortho-McNeil、Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech、Auburn, CAから市販されている)。
E.ステップE:TILの回収
[00217] 第2の拡大培養ステップ後、細胞は、回収することができる。一部の実施形態において、TILは、1、2、3、4回又はそれを超える第2の拡大培養ステップ後に回収される。
[00217] 第2の拡大培養ステップ後、細胞は、回収することができる。一部の実施形態において、TILは、1、2、3、4回又はそれを超える第2の拡大培養ステップ後に回収される。
[00218] TILは、例えば、遠心によることを含め、任意の適切な且つ無菌の方法で回収することができる。TIL回収方法は、当技術分野において周知であり、本プロセスと共に任意のかかる公知の方法を用いることができる。一部の実施形態において、TILは、自動化系を使用して回収する。一部の実施形態において、TILは、半自動化系を使用して回収する。一部の実施形態において、TILは、半自動化系を使用して回収される。一部の実施形態において、第2の拡大培養からのTILは、半自動化装置を使用して回収される。一部の実施形態において、LOVOシステムが使用される(例えば、Benchmark Electronicsから市販)。一部の実施形態において、回収ステップは、TILを洗浄すること、TILを配合すること及び/又はTILを分取することを含む。一部の実施形態において、細胞は、任意選択により、回収後又は回収の一部として凍結される。
F.ステップF:最終的な製剤化及び/又は輸注バッグへの移動
[00219] ステップA~Eが完了した後、細胞は、患者への投与における使用のために容器に移される。
[00219] ステップA~Eが完了した後、細胞は、患者への投与における使用のために容器に移される。
[00220] 一実施形態において、本開示のAPCを使用して拡大培養したTILは、医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は、滅菌緩衝液中のTILの懸濁液である。本開示のPBMCを使用して拡大培養したTILは、当技術分野において公知の通りの任意の好適な経路によって投与され得る。一部の実施形態において、T細胞は、単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは、好ましくは、約30~60分間継続される。他の好適な投与経路としては、腹腔内、髄腔内及びリンパ内が挙げられる。
G.追加の拡大培養ステップ
[00221] 理解されるように、上記のステップA~Fのいずれも、何度でも繰り返すことができ、更に上記と異なる順序で実施され得る。
[00221] 理解されるように、上記のステップA~Fのいずれも、何度でも繰り返すことができ、更に上記と異なる順序で実施され得る。
[00222] 一部の実施形態において、1つ以上の拡大培養ステップを最終製剤ステップF前に繰り返し得る。そのような追加の拡大培養ステップは、上記の第1及び/又は第2の拡大培養ステップの要素を含み得る(例えば、細胞培養培地に記載の成分を含む)。追加の拡大培養ステップは、追加の拡大培養ステップ前及び/又は中に細胞培養培地に補充される細胞培養培地中の追加の成分を含む追加の要素を更に含み得る。
[00223] 更なる実施形態において、図23及び上記の段落に記載されたいずれかの拡大培養ステップに、拡大培養ステップ中に生成された細胞が、製造/拡大培養プロセスの残りのステップに必要になるまで、保存のために当技術分野で公知の方法を使用して保存される、凍結保存ステップが先行又は後続し得る。
TIL、MIL及びPBLの医薬組成物、投与量及び投与レジメン
[00240] 一実施形態において、本開示の方法を使用して拡大培養させたTILは、医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は、滅菌緩衝液中のTILの懸濁液である。本開示の方法を使用して拡大培養されたTILは、当技術分野において公知の任意の適切な経路によって投与され得る。好ましくは、TILは、単一の動脈内又は静脈内注入として投与され、これは、好ましくは、およそ30~60分続く。他の適切な投与経路には、腹腔内投与、髄腔内投与及びリンパ管内投与が含まれる。
[00240] 一実施形態において、本開示の方法を使用して拡大培養させたTILは、医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は、滅菌緩衝液中のTILの懸濁液である。本開示の方法を使用して拡大培養されたTILは、当技術分野において公知の任意の適切な経路によって投与され得る。好ましくは、TILは、単一の動脈内又は静脈内注入として投与され、これは、好ましくは、およそ30~60分続く。他の適切な投与経路には、腹腔内投与、髄腔内投与及びリンパ管内投与が含まれる。
[00241] 任意の適切な用量のTILを投与することができる。特に癌が血液悪性腫瘍である場合、好ましくは平均が約7.8×1010TILである約2.3×1010~約13.7×1010TILが投与される。一実施形態において、約1.2×1010~約4.3×1010のTILが投与される。
[00242] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの数は、約1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013及び9×1013個である。一実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの数は、1×106~5×106、5×106~1×107、1×107~5×107、5×107~1×108、1×108~5×108、5×108~1×109、1×109~5×109、5×109~1×1010、1×1010~5×1010、5×1010~1×1011、5×1011~1×1012、1×1012~5×1012及び5×1012~1×1013個の範囲である。本発明の一実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの数は、約4×108~約2.5×109の範囲内である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの数は、9.5×108である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの数は、4.1×108である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの数は、2.2×109である。
[00243] 本発明の一実施形態において、本発明の医薬組成物で提供されるTILの数は、約0.1×109~約15×109個のTIL、約0.1×109~約15×109個のTIL、約0.12×109~約12×109個のTIL、約0.15×109~約11×109個のTIL、約0.2×109~約10×109個のTIL、約0.3×109~約9×109個のTIL、約0.4×109~約8×109個のTIL、約0.5×109~約7×109個のTIL、約0.6×109~約6×109個のTIL、約0.7×109~約5×109個のTIL、約0.8×109~約4×109個のTIL、約0.9×109~約3×109個のTIL又は約1×109~約2×109個のTILの範囲である。
[00244] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの濃度は、例えば、医薬組成物の100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%又は0.0001%w/w、w/v又はv/vより低い。
[00245] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの濃度は、医薬組成物の90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25%、19%、18.75%、18.50%、18.25%、18%、17.75%、17.50%、17.25%、17%、16.75%、16.50%、16.25%、16%、15.75%、15.50%、15.25%、15%、14.75%、14.50%、14.25%、14%、13.75%、13.50%、13.25%、13%、12.75%、12.50%、12.25%、12%、11.75%、11.50%、11.25%、11%、10.75%、10.50%、10.25%、10%、9.75%、9.50%、9.25%、9%、8.75%、8.50%、8.25%、8%、7.75%、7.50%、7.25%、7%、6.75%、6.50%、6.25%、6%、5.75%、5.50%、5.25%、5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、125%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%又は0.0001%w/w、w/v又はv/vより高い。
[00246] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの濃度は、医薬組成物の約0.0001%~約50%、約0.001%~約40%、約0.01%~約30%、約0.02%~約29%、約0.03%~約28%、約0.04%~約27%、約0.05%~約26%、約0.06%~約25%、約0.07%~約24%、約0.08%~約23%、約0.09%~約22%、約0.1%~約21%、約0.2%~約20%、約0.3%~約19%、約0.4%~約18%、約0.5%~約17%、約0.6%~約16%、約0.7%~約15%、約0.8%~約14%、約0.9%~約12%又は約1%~約10%w/w、w/v又はv/vの範囲内である。
[00247] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの濃度は、医薬組成物の約0.001%~約10%、約0.01%~約5%、約0.02%~約4.5%、約0.03%~約4%、約0.04%~約3.5%、約0.05%~約3%、約0.06%~約2.5%、約0.07%~約2%、約0.08%~約1.5%、約0.09%~約1%、約0.1%~約0.9%w/w、w/v又はv/vの範囲内である。
[00248] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの量は、10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g又は0.0001g以下である。
[00249] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるTILの量は、0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5、3g、3.5、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g又は10g超である。
[00250] 本発明の医薬組成物において提供されるTILは、広い投与量範囲にわたって有効である。正確な投与量は、投与経路、化合物が投与される形態、処置されるべき対象の性別及び年齢、処置されるべき対象の体重並びに担当医の選好及び経験に依存するであろう。臨床的に確立されたTILの投与量も適切な場合に使用され得る。TILの投与量など、本明細書の方法を使用して投与される医薬組成物の量は、処置されるヒト又は哺乳動物、疾患又は状態の重症度、投与速度、活性医薬成分の性質及び処方医の裁量に依存するであろう。
[00251] 一部の実施形態において、TILは、単回投与で投与され得る。そのような投与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、TILは、複数回投与で投与され得る。投与は、1年に1回、2回、3回、4回、5回、6回又は6回を超え得る。投与は、月に1回、2週間に1回、週に1回又は隔日に1回であり得る。TILの投与は、必要な限り継続し得る。
[00252] 一部の実施形態において、TILの有効投与量は、約1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013及び9×1013個である。一部の実施形態において、TILの有効投与量は、1×106~5×106、5×106~1×107、1×107~5×107、5×107~1×108、1×108~5×108、5×108~1×109、1×109~5×109、5×109~1×1010、1×1010~5×1010、5×1010~1×1011、5×1011~1×1012、1×1012~5×1012及び5×1012~1×1013個の範囲である。
[00253] 本発明の一実施形態において、急性骨髄性白血病(AML)を有する患者に有用なMILの臨床用量は、約4×108~約2.5×109個のMILの範囲内である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるMILの数は、9.5×108MILである。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるMILの数は、4.1×108である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるMILの数は、2.2×109である。
[00254] 一部の実施形態において、TILの有効投与量は、約0.01mg/kg~約4.3mg/kg、約0.15mg/kg~約3.6mg/kg、約0.3mg/kg~約3.2mg/kg、約0.35mg/kg~約2.85mg/kg、約0.15mg/kg~約2.85mg/kg、約0.3mg~約2.15mg/kg、約0.45mg/kg~約1.7mg/kg、約0.15mg/kg~約1.3mg/kg、約0.3mg/kg~約1.15mg/kg、約0.45mg/kg~約1mg/kg、約0.55mg/kg~約0.85mg/kg、約0.65mg/kg~約0.8mg/kg、約0.7mg/kg~約0.75mg/kg、約0.7mg/kg~約2.15mg/kg、約0.85mg/kg~約2mg/kg、約1mg/kg~約1.85mg/kg、約1.15mg/kg~約1.7mg/kg、約1.3mg/kgmg~約1.6mg/kg、約1.35mg/kg~約1.5mg/kg、約2.15mg/kg~約3.6mg/kg、約2.3mg/kg~約3.4mg/kg、約2.4mg/kg~約3.3mg/kg、約2.6mg/kg~約3.15mg/kg、約2.7mg/kg~約3mg/kg、約2.8mg/kg~約3mg/kg又は約2.85mg/kg~約2.95mg/kgの範囲内である。
[00255] 一部の実施形態において、TILの有効投与量は、約1mg~約500mg、約10mg~約300mg、約20mg~約250mg、約25mg~約200mg、約1mg~約50mg、約5mg~約45mg、約10mg~約40mg、約15mg~約35mg、約20mg~約30mg、約23mg~約28mg、約50mg~約150mg、約60mg~約140mg、約70mg~約130mg、約80mg~約120mg、約90mg~約110mg又は約95mg~約105mg、約98mg~約102mg、約150mg~約250mg、約160mg~約240mg、約170mg~約230mg、約180mg~約220mg、約190mg~約210mg、約195mg~約205mg又は約198~約207mgの範囲内である。
[00256] 有効量のTILは、鼻腔内及び経皮経路、動脈内注射、静脈内、腹腔内、非経口、筋肉内、皮下、局所、移植若しくは腫瘍への直接注射又は吸入を含む、同様の有用性を有する薬剤の許容される投与様式のいずれかにより、単回投与又は複数回投与のいずれかで投与され得る。
癌を処置する方法
[00257] 上記のTIL、PBL及び/又はMIL(及びそれらの集団)の組成物及び組み合わせは、過剰増殖性障害を処置するための方法において使用することができる。好ましい一実施形態において、それらは、癌の処置に使用するためのものである。好ましい実施形態において、本発明は、癌が液性腫瘍などの血液悪性腫瘍である、癌の処置方法を提供する。好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法を提供し、癌は、急性骨髄性白血病(AML)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、活性化B細胞(ABC)DLBCL、胚中心B細胞(GCB)DLBCL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ球性白血病(SLL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、ホジキンリンパ腫、再発性及び/又は難治性ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症(WM)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性NHL、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)関連B細胞リンパ腫並びにエプスタイン-バーウイルス(EBV)関連B細胞リンパ腫からなる群から選択される血液悪性腫瘍である。
[00257] 上記のTIL、PBL及び/又はMIL(及びそれらの集団)の組成物及び組み合わせは、過剰増殖性障害を処置するための方法において使用することができる。好ましい一実施形態において、それらは、癌の処置に使用するためのものである。好ましい実施形態において、本発明は、癌が液性腫瘍などの血液悪性腫瘍である、癌の処置方法を提供する。好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法を提供し、癌は、急性骨髄性白血病(AML)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、活性化B細胞(ABC)DLBCL、胚中心B細胞(GCB)DLBCL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ球性白血病(SLL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、ホジキンリンパ腫、再発性及び/又は難治性ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症(WM)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性NHL、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)関連B細胞リンパ腫並びにエプスタイン-バーウイルス(EBV)関連B細胞リンパ腫からなる群から選択される血液悪性腫瘍である。
[00258] 一実施形態において、本発明は、癌の処置方法であって、癌は、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、デュルバルマブ、アベルマブ又はアテゾリズマブを含むPD-1及び/又はPD-L1阻害剤による治療に応答する血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
[00259] 一実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の集団を用いて癌を処置する方法であって、
(a)切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、TILの第1の集団を含む、ステップ;
(b)任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、且つ腫瘍断片を第1の細胞培養培地と接触させるステップ;
(c)第1の細胞培養培地中でTILの第1の集団の初期拡大培養を行ってTILの第2の集団を入手するステップであって、TILの第2の集団は、数においてTILの第1の集団よりも少なくとも5倍多く、第1の細胞培養培地は、IL-2を含む、ステップ;
(d)第2の細胞培養培地中でTILの第2の集団の第2の拡大培養を行ってTILの第3の集団を入手するステップであって、TILの第3の集団は、第2の拡大培養の開始から7日後、数においてTILの第2の集団よりも少なくとも50倍多く、第2の細胞培養培地は、IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及び照射同種異系末梢血単核細胞(PBMC)を含み、第2の拡大培養は、14日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;
(e)TILの第3の集団を回収するステップ;及び
(f)TILの第3の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
(a)切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、TILの第1の集団を含む、ステップ;
(b)任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、且つ腫瘍断片を第1の細胞培養培地と接触させるステップ;
(c)第1の細胞培養培地中でTILの第1の集団の初期拡大培養を行ってTILの第2の集団を入手するステップであって、TILの第2の集団は、数においてTILの第1の集団よりも少なくとも5倍多く、第1の細胞培養培地は、IL-2を含む、ステップ;
(d)第2の細胞培養培地中でTILの第2の集団の第2の拡大培養を行ってTILの第3の集団を入手するステップであって、TILの第3の集団は、第2の拡大培養の開始から7日後、数においてTILの第2の集団よりも少なくとも50倍多く、第2の細胞培養培地は、IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及び照射同種異系末梢血単核細胞(PBMC)を含み、第2の拡大培養は、14日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;
(e)TILの第3の集団を回収するステップ;及び
(f)TILの第3の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
[00260] 一実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の集団を用いて癌を処置する方法であって、
(a)切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、TILの第1の集団を含む、ステップ;
(b)任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、且つ腫瘍断片を第1の細胞培養培地と接触させるステップ;
(c)第1の細胞培養培地中でTILの第1の集団の初期拡大培養を行ってTILの第2の集団を入手するステップであって、TILの第2の集団は、数においてTILの第1の集団よりも少なくとも5倍多く、第1の細胞培養培地は、IL-2を含む、ステップ;
(d)第2の細胞培養培地中でTILの第2の集団の第2の拡大培養を行ってTILの第3の集団を入手するステップであって、TILの第3の集団は、第2の拡大培養の開始から7日後、数においてTILの第2の集団よりも少なくとも50倍多く、第2の細胞培養培地は、IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及び照射同種異系末梢血単核細胞(PBMC)を含み、第2の拡大培養は、14日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;
(e)TILの第3の集団を回収するステップ;及び
(f)TILの第3の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、急性骨髄性白血病(AML)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、活性化B細胞(ABC)DLBCL、胚中心B細胞(GCB)DLBCL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ球性白血病(SLL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、ホジキンリンパ腫、再発性及び/又は難治性ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症(WM)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性NHL、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)関連B細胞リンパ腫並びにエプスタイン-バーウイルス(EBV)関連B細胞リンパ腫からなる群から選択される血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
(a)切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、TILの第1の集団を含む、ステップ;
(b)任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、且つ腫瘍断片を第1の細胞培養培地と接触させるステップ;
(c)第1の細胞培養培地中でTILの第1の集団の初期拡大培養を行ってTILの第2の集団を入手するステップであって、TILの第2の集団は、数においてTILの第1の集団よりも少なくとも5倍多く、第1の細胞培養培地は、IL-2を含む、ステップ;
(d)第2の細胞培養培地中でTILの第2の集団の第2の拡大培養を行ってTILの第3の集団を入手するステップであって、TILの第3の集団は、第2の拡大培養の開始から7日後、数においてTILの第2の集団よりも少なくとも50倍多く、第2の細胞培養培地は、IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及び照射同種異系末梢血単核細胞(PBMC)を含み、第2の拡大培養は、14日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;
(e)TILの第3の集団を回収するステップ;及び
(f)TILの第3の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、急性骨髄性白血病(AML)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、活性化B細胞(ABC)DLBCL、胚中心B細胞(GCB)DLBCL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ球性白血病(SLL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、ホジキンリンパ腫、再発性及び/又は難治性ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症(WM)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性NHL、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)関連B細胞リンパ腫並びにエプスタイン-バーウイルス(EBV)関連B細胞リンパ腫からなる群から選択される血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
[00261] 一実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の集団を用いて癌を処置する方法であって、
(a)キナーゼ阻害剤又はITK阻害剤を含むレジメンで患者を前処置するステップ;
(b)切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、TILの第1の集団を含む、ステップ;
(c)任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、且つ腫瘍断片を第1の細胞培養培地と接触させるステップ;
(d)第1の細胞培養培地中でTILの第1の集団の初期拡大培養を行ってTILの第2の集団を入手するステップであって、TILの第2の集団は、数においてTILの第1の集団よりも少なくとも5倍多く、第1の細胞培養培地は、IL-2を含む、ステップ;
(e)第2の細胞培養培地中でTILの第2の集団の第2の拡大培養を行ってTILの第3の集団を入手するステップであって、TILの第3の集団は、第2の拡大培養の開始から7日後、数においてTILの第2の集団よりも少なくとも50倍多く、第2の細胞培養培地は、IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及び照射同種異系末梢血単核細胞(PBMC)を含み、第2の拡大培養は、14日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;
(f)TILの第3の集団を回収するステップ;及び
(g)TILの第3の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
(a)キナーゼ阻害剤又はITK阻害剤を含むレジメンで患者を前処置するステップ;
(b)切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、TILの第1の集団を含む、ステップ;
(c)任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、且つ腫瘍断片を第1の細胞培養培地と接触させるステップ;
(d)第1の細胞培養培地中でTILの第1の集団の初期拡大培養を行ってTILの第2の集団を入手するステップであって、TILの第2の集団は、数においてTILの第1の集団よりも少なくとも5倍多く、第1の細胞培養培地は、IL-2を含む、ステップ;
(e)第2の細胞培養培地中でTILの第2の集団の第2の拡大培養を行ってTILの第3の集団を入手するステップであって、TILの第3の集団は、第2の拡大培養の開始から7日後、数においてTILの第2の集団よりも少なくとも50倍多く、第2の細胞培養培地は、IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及び照射同種異系末梢血単核細胞(PBMC)を含み、第2の拡大培養は、14日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;
(f)TILの第3の集団を回収するステップ;及び
(g)TILの第3の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
[00262] 一実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の集団を用いて癌を処置する方法であって、
(a)キナーゼ阻害剤又はITK阻害剤を含むレジメンで患者を前処置するステップ;
(b)切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、TILの第1の集団を含む、ステップ;
(c)任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、且つ腫瘍断片を第1の細胞培養培地と接触させるステップ;
(d)第1の細胞培養培地中でTILの第1の集団の初期拡大培養を行ってTILの第2の集団を入手するステップであって、TILの第2の集団は、数においてTILの第1の集団よりも少なくとも5倍多く、第1の細胞培養培地は、IL-2を含む、ステップ;
(e)第2の細胞培養培地中でTILの第2の集団の第2の拡大培養を行ってTILの第3の集団を入手するステップであって、TILの第3の集団は、第2の拡大培養の開始から7日後、数においてTILの第2の集団よりも少なくとも50倍多く、第2の細胞培養培地は、IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及び照射同種異系末梢血単核細胞(PBMC)を含み、第2の拡大培養は、14日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;
(f)TILの第3の集団を回収するステップ;及び
(g)TILの第3の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、急性骨髄性白血病(AML)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、活性化B細胞(ABC)DLBCL、胚中心B細胞(GCB)DLBCL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ球性白血病(SLL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、ホジキンリンパ腫、再発性及び/又は難治性ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症(WM)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性NHL、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)関連B細胞リンパ腫並びにエプスタイン-バーウイルス(EBV)関連B細胞リンパ腫からなる群から選択される血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
(a)キナーゼ阻害剤又はITK阻害剤を含むレジメンで患者を前処置するステップ;
(b)切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、TILの第1の集団を含む、ステップ;
(c)任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、且つ腫瘍断片を第1の細胞培養培地と接触させるステップ;
(d)第1の細胞培養培地中でTILの第1の集団の初期拡大培養を行ってTILの第2の集団を入手するステップであって、TILの第2の集団は、数においてTILの第1の集団よりも少なくとも5倍多く、第1の細胞培養培地は、IL-2を含む、ステップ;
(e)第2の細胞培養培地中でTILの第2の集団の第2の拡大培養を行ってTILの第3の集団を入手するステップであって、TILの第3の集団は、第2の拡大培養の開始から7日後、数においてTILの第2の集団よりも少なくとも50倍多く、第2の細胞培養培地は、IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及び照射同種異系末梢血単核細胞(PBMC)を含み、第2の拡大培養は、14日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;
(f)TILの第3の集団を回収するステップ;及び
(g)TILの第3の集団の治療有効部分を、癌を有する患者に投与するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、急性骨髄性白血病(AML)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、活性化B細胞(ABC)DLBCL、胚中心B細胞(GCB)DLBCL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ球性白血病(SLL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、ホジキンリンパ腫、再発性及び/又は難治性ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症(WM)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性NHL、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)関連B細胞リンパ腫並びにエプスタイン-バーウイルス(EBV)関連B細胞リンパ腫からなる群から選択される血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
[00263] 本発明の一実施形態において、TILは、MIL方法1を使用して拡大培養され、本発明に従って患者に投与される。
[00264] 本発明の一実施形態において、TILは、MIL方法2を使用して拡大培養され、癌を処置するために本発明に従って患者に投与される。
[00265] 本発明の一実施形態において、TILは、MIL方法3を使用して拡大培養され、癌を処置するために本発明に従って患者に投与される。
[00266] 本発明の一実施形態において、MIL方法1、MIL方法2又はMIL方法3を使用して拡大培養されたTILは、AMLを処置するために本発明に従って患者に投与される。
[00267] 本発明の一実施形態において、TILは、PBL方法2を使用して拡大培養され、癌を処置するために本発明に従って患者に投与される。
[00268] 本発明の一実施形態において、TILは、PBL方法2を使用して拡大培養され、癌を処置するために本発明に従って患者に投与される。
[00269] 本発明の一実施形態において、TILは、PBL方法2を使用して拡大培養され、癌を処置するために本発明に従って患者に投与される。
[00270] 本発明の一実施形態において、PBL方法1、PBL方法2又はPBL方法3を使用して拡大培養されたTILは、CLLを処置するために本発明に従って患者に投与される。
[00271] 本発明の前述の実施形態のいずれかにおいて、キナーゼ阻害剤による前処理が記載されている。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、イマチニブ、ダサチニブ、イブルチニブ、ボスチニブ、ニロチニブ、エルロチニブ又は当技術分野で公知の他のキナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤若しくはセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤からなる群から選択される。一実施形態において、キナーゼ阻害剤による前処置レジメンは、当技術分野で知られている通り及び/又は医師によって指示されている通りである。
[00272] 本発明の前述の実施形態のいずれかにおいて、IL-2誘導性T細胞キナーゼ阻害剤(ITK)による前処理が記載されている。インターロイキン-2誘導性T細胞キナーゼ(ITK)は、T細胞で発現する非受容体チロシンキナーゼであり、さまざまな経路を調節する。当技術分野で公知の任意のITK阻害剤が、本発明の実施形態で使用され得る(例えば、Lo, et al., Expert Opinion on Therapeutic Patents, 20:459-469 (2010);Vargas, et al, Scandinavian Journal of Immunology, 78(2):130-139 (2013);国際公開第2015112847号;国際公開第2016118951号;国際公開第2007136790号、米国特許出願公開第20120058984A1号及び米国特許第9,531,689号及び同第9,695,200号;これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。本発明の一実施形態において、ITK阻害剤は、共有結合的及び不可逆的にITKに結合する共有結合ITK阻害剤である。本発明の一実施形態において、ITK阻害剤は、ITKに結合するアロステリックITK阻害剤である。本発明の一実施形態において、ITK阻害剤は、アミノチアゾール系ITK阻害剤、5-アミノメチルベンズイミダゾール系ITK阻害剤、3-アミノピリド-2-オン系ITK阻害剤、(4又は5-アリール)ピラゾリル-インドール系ITK阻害剤、ベンズイミダゾール系ITK阻害剤、アミノベンズイミダゾール系ITK阻害剤、アミノピリミジン系ITK阻害剤、アミノピリジン系ITK阻害剤、ジアゾロジアジン系ITK阻害剤、トリアゾール系ITK阻害剤、3-アミノピリド-2-オン系ITK阻害剤、インドリルインダゾール系ITK阻害剤、インドール系ITK阻害剤、アザインドール系ITK阻害剤、ピラゾリルインドール系阻害剤、チエノピラゾール系ITK阻害剤、複素環ITK阻害剤及びATPポケット内のシステイン-442を標的とするITK阻害剤(イブルチニブなど)、アザベンゾイミダゾール系ITK阻害剤、ベンゾチアゾール系ITK阻害剤、インドール系ITK阻害剤、ピリドン系ITK阻害剤、スルホキシミン置換ピリミジンITK阻害剤、アリールピリジノン系ITK阻害剤及び当技術分野で公知の任意の他のITK阻害剤からなる群から選択される。本発明の一実施形態において、ITK阻害剤による前処置レジメンは、当技術分野で知られている通り及び/又は医師によって指示されている通りである。本発明の一実施形態において、ITK阻害剤は、
及びその組み合わせからなる群から選択される。本発明の一実施形態において、ITK阻害剤は、イマチニブ、ダサチニブ(BMS-354825)、スプリセル[N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-(6-(4-(2-ヒドロキシエチル)-ピペラジン-1-イル)-2-メチルピリミジン-4-イルアミノ)チアゾール-5-カルボキサミド)、イブルチニブ((1-{(3R)-3-[4-アミノ-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル]ピペリジン-1-イル}プロプ-2-エン-1-オン)、ボスチニブ、ニロチニブ、エルロチニブ、1H-ピラゾロ[4,3-c]シンノリン-3-オール、CTA056(7-ベンジル-1-(3-(ピペリジン-1-イル)プロピル)-2-(4-(ピリジン-4-イル)フェニル)-1H-イミダゾ[4,5-g]キノキサリン-6(5H)-オン)、化合物10(Boehringer Ingelheim from Moriarty, et al , Bioorg Med Chem Lett, 18:5537-40 (2008))、化合物19(Boehringer Ingelheim from Moriarty, et al , Bioorg Med Chem Lett, 18:5537-40 (2008))、化合物27(Boehringer Ingelheim from Moriarty, et al , Bioorg Med Chem Lett, 18:5537-40 (2008))、化合物26(Boehringer Ingelheim from Winters, et al, Bioorg Med Chem Lett., 18:5541-4 (2008))、化合物37(Boehringer Ingelheim from Cook, et al, Bioorg Med Chem Lett., 19:773-7 (2009))、化合物41(Boehringer Ingelheim from Cook, et al, Bioorg Med Chem Lett., 19:773-7 (2009))、化合物48(Boehringer Ingelheim from Cook, et al, Bioorg Med Chem Lett., 19:773-7 (2009))、化合物51(Boehringer Ingelheim from Cook, et al, Bioorg Med Chem Lett., 19:773-7 (2009))、化合物10n(Boehringer Ingelheim from Riethe, et al., Bioorg Med Chem Lett., 19: 1588-91 (2009))、化合物10o(Boehringer Ingelheim from Riethe, et al., Bioorg Med Chem Lett., 19: 1588-91 (2009))、化合物7v(Vertex from Charrier, et al., J Med Chem., 54:2341-50 (2011))、化合物7w(Vertex from Charrier, et al., J Med Chem., 54:2341-50 (2011))、化合物7x(Vertex from Charrier, et al., J Med Chem., 54:2341-50 (2011))、化合物7y(Vertex from Charrier, et al., J Med Chem., 54:2341-50 (2011))、化合物44(Bayer Schering Pharma from vonBonin, et al., Exp Dermatol., 20:41-7 (2011))、化合物13(Nycomed from Velankar, et al., Bioorg Med Chem., 18:4547-59 (2010))、化合物24(Nycomed from Velankar, et al., Bioorg Med Chem., 18:4547-59 (2010))、化合物34(Nycomed from Velankar, et al., Bioorg Med Chem., 18:4547-59 (2010))、化合物10o(Nycomed from Herdemann, et al., Bioorg Med Chem Lett., 21:1852-6 (2011))、化合物3(Sanofi US from McLean, et al., Bioorg Med Chem Lett., 22:3296-300 (2012))、化合物7(Sanofi US from McLean, et al., Bioorg Med Chem Lett., 22:3296-300 (2012))及び/又は当技術分野で公知の他のキナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤若しくはセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤並びにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
及びその組み合わせからなる群から選択される。本発明の一実施形態において、ITK阻害剤は、イマチニブ、ダサチニブ(BMS-354825)、スプリセル[N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-(6-(4-(2-ヒドロキシエチル)-ピペラジン-1-イル)-2-メチルピリミジン-4-イルアミノ)チアゾール-5-カルボキサミド)、イブルチニブ((1-{(3R)-3-[4-アミノ-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル]ピペリジン-1-イル}プロプ-2-エン-1-オン)、ボスチニブ、ニロチニブ、エルロチニブ、1H-ピラゾロ[4,3-c]シンノリン-3-オール、CTA056(7-ベンジル-1-(3-(ピペリジン-1-イル)プロピル)-2-(4-(ピリジン-4-イル)フェニル)-1H-イミダゾ[4,5-g]キノキサリン-6(5H)-オン)、化合物10(Boehringer Ingelheim from Moriarty, et al , Bioorg Med Chem Lett, 18:5537-40 (2008))、化合物19(Boehringer Ingelheim from Moriarty, et al , Bioorg Med Chem Lett, 18:5537-40 (2008))、化合物27(Boehringer Ingelheim from Moriarty, et al , Bioorg Med Chem Lett, 18:5537-40 (2008))、化合物26(Boehringer Ingelheim from Winters, et al, Bioorg Med Chem Lett., 18:5541-4 (2008))、化合物37(Boehringer Ingelheim from Cook, et al, Bioorg Med Chem Lett., 19:773-7 (2009))、化合物41(Boehringer Ingelheim from Cook, et al, Bioorg Med Chem Lett., 19:773-7 (2009))、化合物48(Boehringer Ingelheim from Cook, et al, Bioorg Med Chem Lett., 19:773-7 (2009))、化合物51(Boehringer Ingelheim from Cook, et al, Bioorg Med Chem Lett., 19:773-7 (2009))、化合物10n(Boehringer Ingelheim from Riethe, et al., Bioorg Med Chem Lett., 19: 1588-91 (2009))、化合物10o(Boehringer Ingelheim from Riethe, et al., Bioorg Med Chem Lett., 19: 1588-91 (2009))、化合物7v(Vertex from Charrier, et al., J Med Chem., 54:2341-50 (2011))、化合物7w(Vertex from Charrier, et al., J Med Chem., 54:2341-50 (2011))、化合物7x(Vertex from Charrier, et al., J Med Chem., 54:2341-50 (2011))、化合物7y(Vertex from Charrier, et al., J Med Chem., 54:2341-50 (2011))、化合物44(Bayer Schering Pharma from vonBonin, et al., Exp Dermatol., 20:41-7 (2011))、化合物13(Nycomed from Velankar, et al., Bioorg Med Chem., 18:4547-59 (2010))、化合物24(Nycomed from Velankar, et al., Bioorg Med Chem., 18:4547-59 (2010))、化合物34(Nycomed from Velankar, et al., Bioorg Med Chem., 18:4547-59 (2010))、化合物10o(Nycomed from Herdemann, et al., Bioorg Med Chem Lett., 21:1852-6 (2011))、化合物3(Sanofi US from McLean, et al., Bioorg Med Chem Lett., 22:3296-300 (2012))、化合物7(Sanofi US from McLean, et al., Bioorg Med Chem Lett., 22:3296-300 (2012))及び/又は当技術分野で公知の他のキナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤若しくはセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤並びにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
[00273] 前述の実施形態のいずれかにおいて、イブルチニブ(IMBRUVICAとして市販され、化学名1-[(3R)-3-[4-アミノ-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル]-1-ピペリジニル]-2-プロペン-1-オン)を有する)を含む前処置レジメンは、約1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月又は6ヶ月の期間にわたり、140mgカプセル1つを1日4回(q.d.)経口投与すること、140mgカプセル2つを1日4回経口投与すること、140mgカプセル3つを1日4回経口投与すること又は140mgカプセル4つを1日4回経口投与することを含む。前述の実施形態において、イブルチニブを含む前処置レジメンは、25mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg及び500mgからなる群から選択されるイブルチニブ用量を経口投与することも含み得、ここで、投与は、1日1回、1日2回、1日3回又は1日4回行われ、投与期間は、約1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月及び6ヶ月からなる群から選択される。
[00274] 任意の前述の実施形態において、処置される癌は、急性骨髄性白血病(AML)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、活性化B細胞(ABC)DLBCL、胚中心B細胞(GCB)DLBCL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ球性白血病(SLL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、ホジキンリンパ腫、再発性及び/又は難治性ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症(WM)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性NHL、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)関連B細胞リンパ腫並びにエプスタイン-バーウイルス(EBV)関連B細胞リンパ腫からなる群から選択される血液悪性腫瘍である。
[00275] 示された疾患又は障害の処置、予防及び/又は管理における、本明細書に記載の方法及び組成物の有効性は、当技術分野において公知の様々な動物モデルを使用して試験することができる。
化学療法による骨髄非破壊的リンパ球枯渇
[00276] 一実施形態において、本発明は、TIL集団で癌を処置する方法を提供し、ここで、患者は、本開示に係るTILの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、1つ以上の化学療法剤である。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、2日間(TIL注入の27日前及び26日前)のシクロホスファミド60mg/kg/日及び5日間(TIL注入の27~23日前)のフルダラビン25mg/m2/日である。一実施形態において、本開示による骨髄非破壊的化学療法及びTIL注入(0日目)後、患者は、生理学的許容量まで8時間ごとに720,000IU/kgでIL-2の静脈内注入を受ける。
[00276] 一実施形態において、本発明は、TIL集団で癌を処置する方法を提供し、ここで、患者は、本開示に係るTILの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、1つ以上の化学療法剤である。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、2日間(TIL注入の27日前及び26日前)のシクロホスファミド60mg/kg/日及び5日間(TIL注入の27~23日前)のフルダラビン25mg/m2/日である。一実施形態において、本開示による骨髄非破壊的化学療法及びTIL注入(0日目)後、患者は、生理学的許容量まで8時間ごとに720,000IU/kgでIL-2の静脈内注入を受ける。
[00277] 実験的知見は、腫瘍特異的Tリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節性T細胞及び免疫系の競合要素(「サイトカインシンク」)を排除することによって処置効果を高めるのに重要な役割を果たすことを示す。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のTILを導入する前に患者においてリンパ球枯渇ステップ(「免疫抑制調整」とも称される)を利用する。
[00278] 一般的に、リンパ球枯渇はフルダラビン又はシクロホスファミド(活性型はマホスファミドと称される)及びその組み合わせの投与を使用して達成される。そのような方法は、Gassner, et al, Cancer Immunol.Immunother.2011, 60, 75-85、Muranski, et al, Nat.Clin.Pract.Oncol, 2006, 3, 668-681、Dudley, et al, J. Clin.Oncol.2008, 26, 5233-5239及びDudley, et al, J. Clin.Oncol. 2005, 23, 2346-2357に記載されており、これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[00279] 一部の実施形態において、フルダラビンは、0.5μg/mL~10μg/mLフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、1μg/mLフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、1日、2日、3日、4日、5日、6日若しくは7日又はそれを超えて実施される。一部の実施形態において、フルダラビンは、10mg/kg/日、15mg/kg/日、20mg/kg/日、25mg/kg/日、30mg/kg/日、35mg/kg/日、40mg/kg/日又は45mg/kg/日の投与量で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、35mg/kg/日で2~7日間実施される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、35mg/kg/日で4~5日間実施される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、25mg/kg/日で4~5日間実施される。
[00280] 一部の実施形態において、シクロホスファミドの活性型であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により0.5μg/mL~10μg/mLの濃度で入手される。一部の実施形態において、シクロホスファミドの活性型であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により1μg/mLの濃度で入手される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、1日、2日、3日、4日、5日、6日若しくは7日又はそれを超えて実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、100mg/m2/日、150mg/m2/日、175mg/m2/日、200mg/m2/日、225mg/m2/日、250mg/m2/日、275mg/m2/日又は300mg/m2/日の投与量で投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、静脈内(即ちi.v.)投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、35mg/kg/日で2~7日間実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、250mg/m2/日、i.v.で4~5日間実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、250mg/m2/日、i.v.で4日間実施される。
[00281] 一部の実施形態において、リンパ球枯渇は、フルダラビン及びシクロホスファミドを共に患者に投与することによって行われる。一部の実施形態において、4日間にわたり、フルダラビンは、25mg/m2/日、i.v.で投与され、シクロホスファミドは、250mg/m2/日、i.v.で投与される。
[00224] 一実施形態において、リンパ球枯渇は、60mg/m2/日の用量で2日間シクロホスファミドを投与し、続いて25mg/m2/日の用量で5日間フルダラビンを投与することにより行われる。骨髄又は末梢血から入手したTILを拡大培養するいくつかの方法が本明細書に記載される。本発明の一実施形態において、リンパ球枯渇は、60mg/m2/日の用量で2日間シクロホスファミドを投与し、続いて25mg/m2/日の用量で5日間フルダラビンを投与することにより行われる。骨髄又は末梢血から入手したTILを拡大培養するいくつかの方法が本明細書に記載される。
実施例
[00224] 本明細書に包含される実施形態は、以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例は、説明のみを目的として提供され、本明細書に包含される開示は、決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる全ての変形形態を包含すると解釈されるべきである。
[00224] 本明細書に包含される実施形態は、以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例は、説明のみを目的として提供され、本明細書に包含される開示は、決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる全ての変形形態を包含すると解釈されるべきである。
実施例1 - 非ホジキンリンパ腫からのTILの拡大培養
[00282] TILは、図1に示される病態を有する5つの非ホジキンリンパ腫腫瘍(1つのマントル細胞リンパ腫腫瘍、3つの濾胞性リンパ腫腫瘍及び1つのABC型びまん性大細胞型B細胞リンパ腫腫瘍)からプレREP段階でIL-2を11~14日間使用して拡大培養し、続いてIL-2、マイトジェン抗CD3抗体及び照射同種異系末梢血単核細胞(PBMC)フィーダーを使用して14日間REPを行った。TILは、5つのリンパ腫腫瘍全てから成功して生成され、最大拡大培養指数は、680倍であり、これは、他の方法を使用して以前に観察されたものよりも有意に高かった。Schwartzentruber, et al., Blood 1993, 82, 1204-1211。更に、平均CD3+T細胞集団は、95%であった(Schwartzentruber, et al., Blood 1993, 82, 1204-1211の方法を使用した75%に対して)。
[00282] TILは、図1に示される病態を有する5つの非ホジキンリンパ腫腫瘍(1つのマントル細胞リンパ腫腫瘍、3つの濾胞性リンパ腫腫瘍及び1つのABC型びまん性大細胞型B細胞リンパ腫腫瘍)からプレREP段階でIL-2を11~14日間使用して拡大培養し、続いてIL-2、マイトジェン抗CD3抗体及び照射同種異系末梢血単核細胞(PBMC)フィーダーを使用して14日間REPを行った。TILは、5つのリンパ腫腫瘍全てから成功して生成され、最大拡大培養指数は、680倍であり、これは、他の方法を使用して以前に観察されたものよりも有意に高かった。Schwartzentruber, et al., Blood 1993, 82, 1204-1211。更に、平均CD3+T細胞集団は、95%であった(Schwartzentruber, et al., Blood 1993, 82, 1204-1211の方法を使用した75%に対して)。
[00283] 細胞選別及びフローサイトメトリーは、Becton, Dickinson & Co.(BD)FACS CANTO IIシステムを使用して実施した。フローサイトメトリー分析により、黒色腫TILのものと同等のエフェクターメモリー細胞の著しい相対的増加が観察された(図2)。黒色腫TIL培養物と比較して、リンパ腫においてエフェクターメモリーCD45RA+(TEMRA)細胞(p=0.0013;CD4、CD8)及びCD28+CD4+(p=0.008)サブセットの有意な増加が観察された(図3)。
[00284] CD4+及びCD8+サブセットにおけるT細胞分化の表現型マーカーの比較が図4及び図5にそれぞれ示されている。CD4+及びCD8+サブセットにおけるT細胞枯渇の表現型マーカーの比較が図6及び図7にそれぞれ示されている。
[00285] 図8は、非ホジキンリンパ腫TILと黒色腫TILとの間の細胞型の比較を示す。黒色腫TILと比較したリンパ腫TILのCD4+T細胞数の増加傾向が示されている。
[00286] 図9は、生物発光リダイレクト溶解アッセイ(BRLA)の結果を示す。黒色腫TIL(11~75LU50、4時間)と比較して、リンパ腫TILにおいて、LU50/106としてBRLAで測定したTILの最小細胞溶解活性は、4時間で1未満~6LU50及び24時間で1~39LU50の範囲であった。
[00287] 図10は、リンパ腫TIL対黒色腫TILのインターフェロン-γ(IFN-γ)酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)の結果を示す。比較可能な結果を示す。リンパ腫TILのELIspotアッセイの結果を図11に示し、図12の黒色腫TILの同じアッセイの結果と比較する。ELIspotアッセイでは、ホルボール12-ミリステート13-アセテート/イオノマイシン、抗CD3抗体又はCD3/CD28/4-1BBビーズで刺激すると、リンパ腫TILによる広範なIFN-γ産生が観察され、これらの条件下で一部のリンパ腫TILによって産生されるIFN-γは、黒色腫TILによって産生されるIFN-γと同等であり、一部の場合、リンパ腫TILにおけるIFN-γ産生がはるかに高かった。
[00288] 図13は、NANOSTRING NCOUNTER分析(Nanostring Technologies, Inc., Seattle, WA)の結果を示し、これは、リンパ腫TILが、黒色腫TILと比較してより高いレベルのRORC IL17A(TH17表現型)及びGATA3(Th2表現型)を発現することを示す。この発見は、リンパ腫反応性T細胞が主にTH2及びTH17であるという観察と一致している。
[00289] 全体として、結果は、TIL細胞療法がリンパ腫患者の処置に使用され得るという証拠を提供する。
実施例2 - AML患者の骨髄から増殖した骨髄浸潤リンパ球(MIL)及びAML患者の末梢血から増殖した末梢血リンパ球(PBL)の表現型及び機能的特徴付け
[00290] 骨髄のサンプル及び入手可能な関連血液サンプルが、イブルチニブ(1-[(3R)-3-[4-アミノ-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル]-1-ピペリジニル]-2-プロペン-1-オン)を含むレジメンの少なくとも3ラウンドで前処置された患者を含む、急性骨髄性白血病(AML)の患者から、患者の年齢、性別、ステージ、腫瘍タイプ、癌の部位、処置歴、匿名化した病理報告及び実施された分子検査(例えば、MSI発現及びRaf/Ras発現)に関する情報を伴って入手される。MIL及びPBLは、MIL方法1、MIL方法2若しくはMIL方法3又はPBL方法1、PBL方法2若しくはPBL方法3の1つを使用して拡大培養され、MIL及びPBLの表現型及び機能が特徴付けられた。
[00290] 骨髄のサンプル及び入手可能な関連血液サンプルが、イブルチニブ(1-[(3R)-3-[4-アミノ-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル]-1-ピペリジニル]-2-プロペン-1-オン)を含むレジメンの少なくとも3ラウンドで前処置された患者を含む、急性骨髄性白血病(AML)の患者から、患者の年齢、性別、ステージ、腫瘍タイプ、癌の部位、処置歴、匿名化した病理報告及び実施された分子検査(例えば、MSI発現及びRaf/Ras発現)に関する情報を伴って入手される。MIL及びPBLは、MIL方法1、MIL方法2若しくはMIL方法3又はPBL方法1、PBL方法2若しくはPBL方法3の1つを使用して拡大培養され、MIL及びPBLの表現型及び機能が特徴付けられた。
[00291] 図36A及び36Bは、MIL及びPBLの拡大倍数を示す。図36Aは、3人の患者(MIL1、MIL2、MIL3)の拡大倍数を示し、図36Bは、患者2及び3(PBL2、PBL3)の一致したPBLの拡大倍数を示す。MIL1.1は、MIL方法1を使用して拡大培養され、MIL1.2は、MIL方法2を使用して拡大培養され、MIL1.3は、MIL方法3を使用して拡大培養され、PBLは、PBL方法3を使用して拡大培養された。MIL1の拡大倍数は、MIL1内の各サンプルで25(MIL1.1)、50(MIL1.2)及び75(MIL1.3)倍の増加を示す。これは、MIL方法3が好ましい拡大培養方法であり得ることを予備的に示す。MIL2及びMIL3の拡大倍数データは、不十分なようである。これは、開始細胞数が少ないためである可能性がある。比較のため、患者MIL1(MIL1.3)のサンプル3の開始細胞数は、138,000細胞であったのに対し、MIL2及びMIL3の開始細胞数は、それぞれ62,000及び28,000であった。MIL2及びMIL3について図36Bに示されるPBLの拡大倍数は、それぞれ約10倍及び40倍であり、同様の開始細胞数(PBL2について338,000、PBL3について336,000)であった。
[00292] 図37A及び37Bは、MIL(図37A)及び適合PBL(図37B)のIFN-γ産生細胞の数を示す。MIL1.3、MIL2及びMIL3は、IFN-γ分泌の有意な増加を示し、MIL方法3が好ましい拡大培養方法であることを示す。PBLのデータは、不確定である。
[00293] 図38A~38Fは、MIL及びPBLのTCRαβ+、CD4+及びCD8+サブセットを示す。図38A及び38Dは、3つ全ての方法(MIL1.1、MIL1.2、MIL1.3)を使用して拡大培養されたMIL(図38A)及びPBL方法3を使用して拡大培養されたPBL(図38D)のTCRab+サブセットを示す。データは、TCRαβ+サブセットが全てのMIL及びPBLでほぼ100%であることを示し、これは、ほぼ全てのT細胞の拡大培養において拡大培養プロセスが成功したことを示す。図38B及び38Eは、MIL方法3によって拡大培養されたMILについてCD4サブセットが減少することを示す(これは、図38CにおけるCD8サブセットの増加に相関する)。図38E及び38FのPBLデータは、MIL1.3データと一致しているようである。
[00294] 図39A~D及び40A~Dは、MIL(図39)及びPBL(図40)のCD4サブセットのデータを示す。図39A及び40Aは、ナイーブ(CCR7+/CD45RA+)のデータを示し;図39B及び40Bは、セントラルメモリーt細胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)のデータを示し;図39C及び40Cは、エフェクターメモリーT細胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)のデータを示し;図39D及び40Dは、最終分化エフェクターメモリー細胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)のデータを示す。MIL方法3(MIL1.3)及びPBL方法3(PBL2及びPBL3)を使用して拡大培養された全てのサンプルは、コンパレータである黒色腫TILのCD4サブセットと一致している。
[00295] 図41A~D及び42A~Dは、MIL(図41)及びPBL(図42)のCD8サブセットのデータを示す。図41A及び42Aは、ナイーブ(CCR7+/CD45RA+)のデータを示し;図41B及び42Bは、セントラルメモリーt細胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)のデータを示し;図41C及び42Cは、エフェクターメモリーT細胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)のデータを示し;図41D及び42Dは、最終分化エフェクターメモリー細胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)のデータを示す。MIL方法3(MIL1.3)を使用して拡大培養されたサンプルは、コンパレータである黒色腫TILのCD4サブセットと一致している。PBL2及びPBL3のデータを対照として使用した。
[00296] 図43A及び43Bは、MIL(図43A)及びPBL(図43B)のCD4CD27及びCD8CD27サブセットのデータを示す。図44A及び44Bは、MIL(図44A)及びPBL(図44B)のCD4CD28及びCD8CD28サブセットのデータを示す。PBLのデータは、黒色腫TILと比較して各サンプルの拡大培養プロセスの0日目及び14日目に示されている。MILのデータは、黒色腫TILと比較してMIL1.3のみについて0日目及び14日目に示されている。MIL及びPBLのCD28サブセットは、黒色腫TILに類似している。
[00297] 図45A及び45Bは、MIL(図45A)及びPBL(図45B)のCD4及びCD8サブセットのそれぞれの内のPD1+細胞の比較を表す。図46A及び46Bは、MIL(図46A)及びPBL(図46B)のCD4及びCD8サブセットのそれぞれの内のLAG3+細胞の比較を表す。PD1+及びLAG3+の両方のデータは、0日目の測定値に対するMIL1.3サンプルの大幅な減少を示す一方、MIL1.1及びMIL1.2は、0日目に対するPD1及びLAG3の両方が増加傾向にあるようであった。PBLデータを対照として使用した。
[00298] この実施例の実験は、MIL方法3で拡大培養されたMILがより高い拡大倍数を有し、機能性が高く、より高いCD8サブセットの割合を有し、より少ないLAG3+及びPD1+T細胞サブセットを有していたことを示す。データは、メモリーサブセットが黒色腫TILに類似していることも示した。データは、凍結保存されたサンプルが、新鮮なサンプルと比較してより高い拡大倍数を有するようであることも示した。PBLサンプルのデータの多くは、小さいサンプルサイズに基づいているようであり、不確定なもののようである。
実施例3 - TILを拡大培養し、拡大培養したTILを用いて癌を処置する方法
[00299] 骨髄は、針吸引を使用して入手される。骨髄サンプルをヘパリン含有シリンジに吸引し、室温で一晩保存する。貯蔵後、シリンジの内容物を一緒に滅菌容器にプールし、品質を試験する。骨髄は、リンパ球分離培地(LSM)及びCOBE Spectraによる遠心分離を使用して、単核細胞(MNC)が濃縮されている。勾配内の細胞は、赤血球まで収集され、HBSSを使用して洗浄される。MNCは、2%HSA及び5%DMSOが添加されたヘタスターチ系凍結保護剤を使用して凍結保存され、品質管理のためにMNCの一部が確保されている。QCバイアルを解凍して、MNC製品のCD3+及びCD38+/138+の細胞含有量を測定する。
[00299] 骨髄は、針吸引を使用して入手される。骨髄サンプルをヘパリン含有シリンジに吸引し、室温で一晩保存する。貯蔵後、シリンジの内容物を一緒に滅菌容器にプールし、品質を試験する。骨髄は、リンパ球分離培地(LSM)及びCOBE Spectraによる遠心分離を使用して、単核細胞(MNC)が濃縮されている。勾配内の細胞は、赤血球まで収集され、HBSSを使用して洗浄される。MNCは、2%HSA及び5%DMSOが添加されたヘタスターチ系凍結保護剤を使用して凍結保存され、品質管理のためにMNCの一部が確保されている。QCバイアルを解凍して、MNC製品のCD3+及びCD38+/138+の細胞含有量を測定する。
[00300] 骨髄を吸引及びリンパ球分離培地密度勾配で分画し、細胞をほぼ赤血球ペレットのレベルまで収集する。この分画法は、赤血球及び好中球を実質的に除去し、ほぼ完全な骨髄を提供する。結果として生じる分画された材料は、T細胞及び腫瘍細胞である。骨髄は、フィコール処理され(Ficolled)、TILは、当技術分野において公知の方法及び本明細書に記載の任意の方法を用いて拡大培養される。例えば、TILを拡大培養させるための例示的な方法が図14に示される。TILを拡大培養するための及び拡大培養したTILで癌患者を処置するための例示的な方法を図15に示す。
実施例4 - 非ホジキンリンパ腫腫瘍から増殖した腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の表現型及び機能的特徴付け
[00301] この実施例で説明する実験の目標には、治療的有効性を有するTILをNHL腫瘍から分離及び培養できるかどうかを決定し、NHL由来TILの特性を黒色腫由来TILと比較することが含まれる。
[00301] この実施例で説明する実験の目標には、治療的有効性を有するTILをNHL腫瘍から分離及び培養できるかどうかを決定し、NHL由来TILの特性を黒色腫由来TILと比較することが含まれる。
[00302] 患者からのTILの抽出及び拡大培養のための材料及び方法は、本明細書に記載されている通りである。患者のTILは、病変、この場合にはリンパ組織の外科的切除を介して抑制性腫瘍微小環境から抽出された。本明細書に開示される拡大培養プロセスを使用してTILを拡大培養し、109~1011個のTILを得た。
[00303] NHL由来のTIL(1つのマントル細胞リンパ腫(MCL)、3つの濾胞性リンパ腫(FL)、3つのびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL))を、フローサイトメトリーを使用して黒色腫由来のTILに対する分化のマーカーについて分析した。抗CD56、抗TCRab、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD27及び抗CD28抗体についてTILを分析した。これらの抗体は、分化パネル1(DF1)として使用された。抗CD3、抗CD4、抗CD9、抗CD38、抗HLA-DR、抗CCR7及び抗CD45RA抗体を分化パネル2(DF2)として使用した。DF2を使用して、次のT細胞サブセットを特定した。ナイーブ(CCR7+/CD45RA+);セントラルメモリーT細胞(CM)(CCR7+/CD45RA-);エフェクターメモリーT細胞(EM)(CCR7-/CD45RA-);及び最終分化エフェクターメモリー細胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)。
[00304] 図16は、異なる癌タイプでの異なる細胞サブ集団におけるCD4及びCD8T細胞を示す。黒色腫(黒)、マントル細胞(赤)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(青)及び濾胞性リンパ腫(紫)の癌タイプを試験した。図16A~16Dは、黒色腫TILと比較してリンパ腫TILがより増殖性が高く、従ってより高い抗腫瘍活性を有する傾向を一般的に示す。同様に、図17Bは、CD4/CD28発現リンパ腫T細胞がCD4/CD28発現黒色腫T細胞よりも高い増殖能力を有することを示す。
[00305] TILによるインターフェロンガンマ(IFNγ)産生は、mABコーティングされたDynabeads(商標)(CD3、CD28及びCD137)でTILを刺激し、ELIspot(商標)(Immunospot CTL)を使用することによって測定し、Immunospot(商標)S6エントリーアナライザーを使用して、またDuoSet(商標)ELISAキット(製造者の指示に従うR&Dシステムを使用したELISAによって列挙した。
[00306] 図18A及び18Bは、NHL TIL及び黒色腫TILによるIFNγ産生が類似していることを示し、2つのTILタイプ間で同様の細胞傷害性機能を示す。
[00307] TILの溶解能力は、生物発光リダイレクト溶解アッセイ(BRLA)を使用して決定した。eGFP及びホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたP815細胞を標的細胞として使用した。TIL及び標的細胞をOKT3の存在下で4時間/24時間共培養した。次いで、ルシフェリンを添加し、細胞を5分間インキュベートした。生物発光は、ルミノメーターを使用して測定された。パーセント生存率及びパーセント細胞傷害性は次のように計算された。
%生存率=(実験的生存率-最小)/(最大シグナル-最小シグナル)×100
%細胞傷害性=100-(%生存率)
%生存率=(実験的生存率-最小)/(最大シグナル-最小シグナル)×100
%細胞傷害性=100-(%生存率)
[00308] TILの溶解能力は、エフェクター細胞によって誘導される標的細胞の50パーセント細胞傷害性を表す溶解単位LU50として表された。
[00309] 自己腫瘍及び同種異系腫瘍の両方に対する腫瘍殺傷能力を測定するためにTILをアッセイした。TILは、異なるエフェクター細胞対標的細胞比(E:T比)(10:1、20:1、50:1又は100:1のいずれか)で自己リンパ腫細胞又は同種異系黒色腫細胞株(526黒色腫細胞株)と混合された。共培養前にCellTrace Violet色素(ThermoFisher)で腫瘍細胞を標識した。24時間後、細胞を7-AADで染色して細胞死を判定した。TILによって殺傷された腫瘍細胞の割合は、リンパ腫細胞ではCD19に対してCellTrace Violet色素、黒色腫細胞ではMCSPに対してCellTrace Violetでゲートされた7-AAD陽性腫瘍細胞として表された。
[00310] 図19は、NHL TIL及び黒色腫TILが4時間(図19A)及び24時間(図19B)で同種異系腫瘍及び自己腫瘍の両方に対して同様の細胞傷害性機能を有することを示す。
[00311] 遺伝子発現解析は、nCounter GX Human Immunology V2パネル(NanoString, Seattle)を使用してTILでも実行された。製造者の指示に従って、100ngの総RNAをアッセイした。データは、各サンプルの組み込みコントロール遺伝子プローブの幾何平均でスケーリングすることにより正規化された。データは、黒色腫遺伝子発現に対してマッピングされ、比較された。
[00312] 図21は、遺伝子発現解析の結果を示す。ヒートマップは、黒色腫TILにわたる遺伝子発現の倍数変化を示す。リンパ腫由来のTILからのIL17A及びRORCの発現は、黒色腫由来のTILと比較してより高い発現を示した。
[00313] 全体として、この実験の結果は、リンパ腫由来のTILの機能的特徴が黒色腫由来のTILと類似していることを実証し、リンパ腫由来のTILの使用がリンパ腫癌の処置に成功するであろうことを示す。
実施例5 - 慢性リンパ性白血病(CLL)を有する患者の末梢血から増殖した末梢血リンパ球(PBL)の表現型及び機能的特徴付け。
[00314] PBMCは、3ラウンドのイブルチニブによる処置前及び処置後のCLLを有する患者から収集された。
[00314] PBMCは、3ラウンドのイブルチニブによる処置前及び処置後のCLLを有する患者から収集された。
[00315] 図24及び本明細書の他の箇所で説明するように、3つの異なる方法、PBL方法1、PBL方法2及びPBL方法3を使用してT細胞を拡大培養した。特定のサンプルは、新鮮なPBMCから得られ、特定のサンプルは、凍結保存されたPBMCから得られた。細胞が拡大培養及び回収されると、上記の実施例4及び本明細書の他の箇所に記載された方法を使用して、フェノタイピングし、機能的に特徴付けた。この実施例の目標は、PBLの最適な拡大培養プロセスを決定し、イブルチニブ処置サンプルから拡大培養したPBLが未処置サンプルから拡大培養したPBLよりも強力かどうかを決定することであった。
[00316] PBLの拡大倍数を図26に示す。PBL方法1、PBL方法2及びPBL方法3を使用して拡大培養されたPBLの結果が示される。未処理のPBL(プレRx PBL)は、平均179倍の拡大倍数を示し、イブルチニブ処理PBL(ポストRx PBL)は、平均306倍の拡大倍数を示した。新鮮なPBMCに由来するPBL(PBL)は、平均82倍の拡大倍数のみを示した。PBLとポストRx PBLとの間ではp=0.006。PBLとプレRx PBLとの間ではp=0.3及びプレRx PBLとポストRx PBLとの間ではp=0.1。全体として、PBL及びプレRx PBLの両方の全てのグループと比較して全てのポストRx PBLグループで平均拡大倍数の増加が見られる。
[00317] 図27は、PBL、プレRx PBL及びポストRx PBLのインターフェロンガンマ(IFN-γ)産生細胞を示す。PBLについて、IFN-γ産生細胞の平均数は、約1864であった。プレRx PBLについて、IFN-γ産生細胞の平均数は、約7530であり、ポストRx PBLについて、IFN-γ産生細胞の平均数は、約11984であった。PBLとポストRx PBLとの間ではp=0.006。PBLとプレRx PBLとの間ではp=0.006及びプレRx PBLとポストRx PBLとの間ではp=0.01。全体として、PBL及びプレRx PBLの両方の全てのグループと比較して全てのポストRx PBLグループでIFN-γ産生細胞の平均数の有意な増加が見られる。
[00318] 各サンプルで表現型の特徴付けを実施した。図28は、プレRx PBL及びポストRx PBLにおけるCD4+及びCD8+T細胞サブセットの割合を表し、コンパレータとして黒色腫TILを使用する。ここで、データは、CD4サブセット(左に示す)が、いずれの方法が細胞の拡大培養に使用されたかに関係なく、プレRx PBL及びポストRx PBLの両方間で同等であることを示す。プレRx PBL及びポストRx PBLのCD4サブセットは、黒色腫TILよりも高いことが示された(それぞれp=0.0006)。CD8サブセット(右に示す)は、細胞の拡大培養に使用されるプロセスに関係なく、プレRX PBL及びポストRX PBLの両方で低かった。プレRx PBL及びポストRx PBLのCD8サブセットは、黒色腫TILよりも低いことが示された(それぞれp=0.0006)。より低いCD8サブセットは、単に癌のタイプの派生物であると仮定される(即ち、CLLでは、CD4サブセットは、典型的には拡大培養される)。
[00319] 図29A~29Dは、コンパレータとして黒色腫TILを使用した、プレRx PBL及びポストRx PBLのCD4メモリーサブセット間の比較を示す。図29Aは、ナイーブ(CCR7+/CD45RA+)のデータを示し;図29Bは、セントラルメモリーt細胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)のデータを示し;図29Cは、エフェクターメモリーT細胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)のデータを示し;図29Dは、最終分化エフェクターメモリー細胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)のデータを示す。図29は、プレRx PBL及びポストRx PBLのCD4メモリーサブセットが、黒色腫TILで見られるものと同等であることを示す。
[00320] 図30A~30Dは、コンパレータとして黒色腫TILを使用した、プレRx PBL及びポストRx PBLのCD8メモリーサブセット間の比較を示す。図30Aは、ナイーブ(CCR7+/CD45RA+)のデータを示し;図30Bは、セントラルメモリーt細胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)のデータを示し;図30Cは、エフェクターメモリーT細胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)のデータを示し;図30Dは、最終分化エフェクターメモリー細胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)のデータを示す。図30は、プレRx PBL及びポストRx PBLのCD8メモリーサブセットが、黒色腫TILで見られるものと同等であることを示す。
[00321] 図31A及び31Bは、コンパレータとして黒色腫TILを使用した、CD4細胞(図31A)及びCD8細胞(図31B)のCD27サブセットの比較を表す。CD4CD27細胞サブセットは、黒色腫TILと比較してプレRx PBL(p=0.03)及びポストRx PBL(p=0.02)の両方で有意に高かった。CD8CD27細胞サブセットは、黒色腫TILと比較してプレRx PBL(p=0.002)及びポストRx PBL(p=0.001)の両方で有意に高かった。
[00322] 図32A及び32Bは、コンパレータとして黒色腫TILを使用した、CD4細胞(図30A)及びCD8細胞(図30B)のCD28サブセットの比較を表す。CD4CD28細胞サブセット及びCD8CD28細胞サブセットは、黒色腫TILと比較してプレRx PBL及びポストRx PBLの両方で同等であることが示された。
[00323] 図33A及び33Bは、プレRx PBL及びポストRx PBLのCD4+(図33A)及びCD8+(図33B)集団内のLAG3+サブセットの比較を示す。データは、ポストRx PBLのCD4+(p=0.06)及びCD8+(p=0.01)集団の両方でLAG3+サブセットの有意な平均減少を示す。
[00324] 図34A及び34Bは、プレRx PBL及びポストRx PBLのCD4+(図34A)及びCD8+(図34B)集団内のPD1+サブセットの比較を示す。データは、ポストRx PBLのCD4+及びCD8+集団の両方でPD1+サブセットの平均減少を示すが、減少は有意でなかった。
[00325] 図35A及び35Bは、生物発光再溶解アッセイ(BRLA)を使用して測定されたプレRx PBL(図35A)及びポストRx PBL(図35B)の細胞溶解活性の結果を示す。CelllTrace(商標)Violet Cell Proliferation Kit(Invitrogen)を使用して、以下のようにアッセイを実施した。PBLであるエフェクター細胞は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)で標識された。標的細胞(自己CD19+腫瘍細胞)をミトシインCとインキュベートし、CellTrace Vioet Cell Proliferation Kitの指示に従ってCellTrace(商標)Violet(CTV)で標識した。エフェクター細胞及び標的細胞を2:1、5:1、20:1の比率で24時間インキュベートした(E:T細胞)。カウントブライト(countbright)ビーズを加え、細胞をアネキシンV-PIで染色し、CTV+/アネキシン-V PI+細胞(死細胞の数を提供する)を分析した。ポストRx PBLは、標的腫瘍細胞の50%を殺傷するのに必要な細胞がより少ないため(即ち、LU50は、ポストRx PBLの方がプレRx PBLよりも低い)、より強力であると思われる。
[00326] この実施例で実施された実験は、次の結果を示した:新鮮なCLL PBMCから拡大培養されたPBLは、凍結保存されたPBMC(プレRx PBL及びポストRx PBL)から拡大培養されたPBLと比較してより低い拡大倍数及び有意により低いIFN-γ産生を示し;ポストRx PBLは、プレRx PBLと比較して一貫してより高い拡大倍数及びIFN-γ産生の有意な増加を示し;プレRx PBL及びポストRx PBLの両方は、自己(CD19+)腫瘍細胞に対して溶解活性を示したが、ポストRx PBLは、プレRx PBLよりも低いLU50を有していた。
[00327] 上記に示す例は、本発明の組成物、システム及び方法の実施形態をどのように作成及び使用し得るかについて当業者に完全な開示及び説明を付与するために提供され、本発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定することを意図されない。当業者に明らかな本発明を実施するための上述の態様の変形形態は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。本明細書において言及される全ての特許及び刊行物は、本発明が関係する技術分野の当業者の技能水準の指標である。
[00328] 全ての見出し及びセクション表示は、明確にするために、且つあくまでも参考として使用され、決して限定するものと考えられてはならない。例えば、当業者は、異なる見出し及びセクションからの様々な態様を、本明細書に記載される本発明の趣旨及び範囲に従って適宜組み合わせることの有用性を理解するであろう。
[00329] 本明細書に引用する全ての参考文献は、各個別の刊行物、又は特許、又は特許出願があらゆる目的から全体として参照により組み込まれると具体的且つ個別的に指示されたものと見なすのと同程度に、本明細書によって全体として及びあらゆる目的から参照により本明細書に組み込まれる。
[00330] 当業者に明らかであろう通り、本願の多くの改良形態及び変形形態がその趣旨及び範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書に記載される具体的な実施形態及び例は、単に例として提供され、本願は、特許請求の範囲に認められる均等物の全範囲と共に、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。
Claims (126)
- 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の集団を用いて患者における癌を処置する方法であって、
(a)任意選択により、イブルチニブを含むレジメンで患者を前処置するステップ;
(b)液性腫瘍を入手するステップ;
(c)任意選択により、前記腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、且つ前記腫瘍断片を第1の細胞培養培地と接触させるステップ;
(d)前記第1の細胞培養培地中で前記TILの第1の集団の初期拡大培養を行ってTILの第2の集団を入手するステップであって、前記TILの第2の集団は、数において前記TILの第1の集団よりも少なくとも5倍多く、前記第1の細胞培養培地は、IL-2を含み、前記初期拡大培養は、21日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;
(e)第2の細胞培養培地中で前記TILの第2の集団の第2の拡大培養を行ってTILの第3の集団を入手するステップであって、前記TILの第3の集団は、前記第2の拡大培養の開始から7日後、数において前記TILの第2の集団よりも少なくとも10倍多く、前記第2の細胞培養培地は、IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及び照射同種異系末梢血単核細胞(PBMC)を含み、前記第2の拡大培養は、14日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;
(f)前記TILの第3の集団を回収するステップ;及び
(g)前記TILの第3の集団の治療有効部分を、前記癌を有する患者に投与するステップ
を含み、前記癌は、血液悪性腫瘍である、方法。 - ITK阻害剤の添加を更に含み、前記ITK阻害剤は、任意選択により、ITKに共有結合するITK阻害剤である、請求項1に記載の方法。
- ITK阻害剤は、ステップ(d)中に前記第1の細胞培養培地に添加されるか、ステップ(e)中に前記第2の細胞培養培地に添加されるか、又はステップ(d)中に前記第1の細胞培養培地に添加されることと、ステップ(e)中に前記第2の細胞培養培地に添加されることとの両方である、請求項2に記載の方法。
- 前記ITK阻害剤は、アミノチアゾール系ITK阻害剤、ベンズイミダゾール系ITK阻害剤、アミノピリミジン系ITK阻害剤、3-アミノピリド-2-オン系ITK阻害剤、インドリルンダゾール系ITK阻害剤、ピラゾリル-インドール系阻害剤、チエノピラゾール阻害剤及びATPポケット内のシステイン-442を標的とするITK阻害剤からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記ITK阻害剤は、イブルチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、ニロチニブ、エルロチニブBMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469((R)-3-(1-(1-アクリロイルピペリジン-3-イル)-4-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-N-(3-メチル-4-(1-メチルエチル))ベンズアミド)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記ITK阻害剤は、イブルチニブである、請求項5に記載の方法。
- 前記ITK阻害剤は、約0.1nM~約5μMの濃度で添加される、請求項2に記載の方法。
- 前記初期拡大培養は、3日間~11日間の期間にわたって行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の拡大培養は、3日間~11日間の期間にわたって行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記IL-2は、前記第1の細胞培養培地中に1000IU/mL~6000IU/mLの初期濃度で存在する、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の細胞培養培地中において、前記IL-2は、1000IU/mL~6000IU/mLの初期濃度で存在し、及び前記OKT-3抗体は、約30ng/mLの初期濃度で存在する、請求項1に記載の方法。
- 前記初期拡大培養は、ガス透過性容器を使用して行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の拡大培養は、ガス透過性容器を使用して行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の細胞培養培地は、IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の細胞培養培地は、IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記TILの第3の集団を前記患者に投与する前に前記患者を非骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンで処置するステップを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、2日間にわたって60mg/m2/日の用量でシクロホスファミドを投与し、続いて5日間にわたって25mg/m2/日の用量でフルダラビンを投与するステップを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記患者への前記TILの第3の集団の投与の翌日に開始する高用量IL-2レジメンで前記患者を処置するステップを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記高用量IL-2レジメンは、許容量まで8時間ごとに15分のボーラス静脈内注入として投与される600,000又は720,000IU/kgのアルデスロイキン又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記癌は、急性骨髄性白血病(AML)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、活性化B細胞(ABC)DLBCL、胚中心B細胞(GCB)DLBCL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ球性白血病(SLL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、ホジキンリンパ腫、再発性及び/又は難治性ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症(WM)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性NHL、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)関連B細胞リンパ腫並びにエプスタイン-バーウイルス(EBV)関連B細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 患者集団は、イブルチニブで前処置された患者集団である、請求項1に記載の方法。
- 腫瘍から腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の集団を調製するプロセスであって、
(a)前記腫瘍を断片化するステップ;
(b)第1の細胞培養培地中で前記TILの第1の集団の初期拡大培養を行ってTILの第2の集団を入手するステップであって、前記TILの第2の集団は、数において前記TILの第1の集団よりも少なくとも5倍多く、前記第1の細胞培養培地は、IL-2を含み、前記初期拡大培養は、21日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;
(c)第2の細胞培養培地中で前記TILの第2の集団の第2の拡大培養を行ってTILの第3の集団を入手するステップであって、前記TILの第3の集団は、前記第2の拡大培養の開始から7日後、数において前記TILの第2の集団よりも少なくとも50倍多く、前記第2の細胞培養培地は、IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)、照射同種異系末梢血単核細胞(PBMC)を含み、前記第2の拡大培養は、14日間以下の期間にわたって行われる、ステップ;及び
(d)前記TILの第3の集団を回収するステップ
を含み、前記腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、血液悪性腫瘍である、プロセス。 - 前記TILの第1の集団は、腫瘍又はその一部から入手される、請求項22に記載のプロセス。
- 前記腫瘍又はその一部は、患者から切除されたものである、請求項23に記載のプロセス。
- 前記初期拡大培養は、14日間以下の期間にわたって行われる、請求項22に記載のプロセス。
- 前記初期拡大培養は、11日間以下の期間にわたって行われる、請求項22に記載のプロセス。
- 前記第2の拡大培養は、11日間以下の期間にわたって行われる、請求項22に記載のプロセス。
- 血液悪性腫瘍の処置のためのTILの集団の製造における液性腫瘍の使用。
- 骨髄又は末梢血から入手されたTILを拡大培養する方法であって、
(a)骨髄又は末梢血のサンプルからTILの第1の集団を特定すること;
(b)第1の細胞培養培地中で前記TILの第1の集団の初期拡大培養を行ってTILの第2の集団を入手することであって、前記TILの第2の集団は、数において前記TILの第1の集団よりも少なくとも5倍多く、前記第1の細胞培養培地は、IL-2を含み、前記初期拡大培養は、21日間以下の期間にわたって行われる、入手すること;
(c)第2の細胞培養培地中で前記TILの第2の集団の第2の拡大培養を行ってTILの第3の集団を入手することであって、前記TILの第3の集団は、前記第2の拡大培養の開始から7日後、数において前記TILの第2の集団よりも少なくとも50倍多く、前記第2の細胞培養培地は、IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)及び照射同種異系末梢血単核細胞(PBMC)を含み、前記第2の拡大培養は、14日間以下の期間にわたって行われる、入手すること;
(d)前記TILの第3の集団を回収すること;及び
(e)前記TILの第3の集団を前記患者に提供すること
を含む方法。 - 前記初期拡大培養は、11日間以下の期間にわたって行われる、請求項29に記載の方法。
- 前記第2の拡大培養は、11日間以下の期間にわたって行われる、請求項29に記載の方法。
- 前記IL-2は、前記第1の細胞培養培地中に1000IU/mL~6000IU/mLの初期濃度で存在する、請求項29に記載の方法。
- 前記第2の細胞培養培地中において、前記IL-2は、1000IU/mL~6000IU/mLの初期濃度で存在し、及び前記OKT-3抗体は、約30ng/mLの初期濃度で存在する、請求項29に記載の方法。
- 前記初期拡大培養は、ガス透過性容器を使用して行われる、請求項29に記載の方法。
- 前記第2の拡大培養は、ガス透過性容器を使用して行われる、請求項29に記載の方法。
- 前記第1の細胞培養培地は、IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインを更に含む、請求項29に記載の方法。
- 前記第2の細胞培養培地は、IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインを更に含む、請求項29に記載の方法。
- 末梢血から末梢血リンパ球(PBL)を拡大培養する方法であって、
a.末梢血から末梢血単核細胞(PBMC)のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること;
b.CD19+B細胞を選択及び取り出すことにより、前記サンプルからPBLを分離すること;
c.任意選択により、前記PBLを前記CD19+B細胞と共培養すること;
d.第1の細胞培養培地中の前記PBLをガス透過性容器内において約2~約6日間の期間にわたってIL-2及び抗CD3/抗CD28抗体で刺激すること;
e.IL-2及び抗CD3/抗CD28抗体と共に約2~約6日間の期間にわたってステップ(d)からの前記PBLを培養すること;
f.ステップ(e)からの培養物から前記抗体結合PBLを分離すること;
g.ステップ(e)で分離された前記PBLから前記抗体を取り出すこと;及び
h.前記PBLを回収すること
を含む方法。 - 前記第1の細胞培養培地は、CM-2、CM-4及びAIM-Vからなる群から選択される、請求項38に記載の方法。
- ステップ(d)後、追加のIL-2は、添加され、及び前記第1の細胞培養培地は、第2の細胞培養培地と交換される、請求項38に記載の方法。
- ステップ(e)後、追加のIL-2は、添加され、及び第2の培養培地は、第3の細胞培養培地と交換される、請求項38に記載の方法。
- 前記第2の細胞培養培地は、CM-2、CM-4及びAIM-Vからなる群から選択される、請求項40に記載の方法。
- 前記第3の細胞培養培地は、CM-2、CM-4及びAIM-Vからなる群から選択される、請求項41に記載の方法。
- 前記第1の細胞培養培地と前記第2の細胞培養培地とは、異なる、請求項40に記載の方法。
- 前記第1の細胞培養培地と前記第2の細胞培養培地とは、同一である、請求項40に記載の方法。
- ステップ(c)におけるB細胞とPBLとの比は、約0.1:1~約10:1(B細胞:PBL)である、請求項38に記載の方法。
- ステップ(c)におけるB細胞とPBLとの比は、0.1:1、1:1及び10:1(B細胞:PBL)からなる群から選択される、請求項38に記載の方法。
- ステップ(d)の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも約1×105~約10×105個のPBLがある、請求項38に記載の方法。
- ステップ(d)の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも約2.5×105~10×105個のPBLがある、請求項38に記載の方法。
- ステップ(d)の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも5×105個のPBLがある、請求項38に記載の方法。
- 前記IL-2は、ステップ(c)及び(d)において1000IU/ml~6000IL/mlの濃度で存在する、請求項38に記載の方法。
- 前記IL-2は、約3000IU/mlの濃度で存在する、請求項51に記載の方法。
- 前記抗CD3/抗CD28抗体は、ビーズ上にコーティングされ、及びPBL:ビーズ比は、ステップ(c)及び(d)のそれぞれにおいて約1:1である、請求項38に記載の方法。
- ITK阻害剤の添加を更に含む、請求項38に記載の方法。
- ITK阻害剤は、ステップ(c)、ステップ(d)及びステップ(e)の少なくとも1つ中に添加される、請求項54に記載の方法。
- 前記ITK阻害剤は、アミノチアゾール系ITK阻害剤、ベンズイミダゾール系ITK阻害剤、アミノピリミジン系ITK阻害剤、3-アミノピリド-2-オン系ITK阻害剤、インドリルンダゾール系ITK阻害剤、ピラゾリル-インドール系阻害剤、チエノピラゾール阻害剤及びATPポケット内のシステイン-442を標的とするITK阻害剤からなる群から選択される、請求項54に記載の方法。
- 前記ITK阻害剤は、イブルチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、ニロチニブ、エルロチニブBMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469((R)-3-(1-(1-アクリロイルピペリジン-3-イル)-4-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-N-(3-メチル-4-(1-メチルエチル))ベンズアミド)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項56に記載の方法。
- 前記ITK阻害剤は、イブルチニブである、請求項57に記載の方法。
- 閉鎖滅菌系で行われる、請求項38に記載の方法。
- 末梢血から末梢血リンパ球(PBL)を拡大培養する方法であって、
a.患者の末梢血からPBMCのサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存され、及び前記患者は、任意選択により、ITKで前処置される、入手すること;
b.CD19+B細胞を選択及び取り出すことにより、前記サンプルからPBLを分離し、且つ任意選択により、0.1nM~200nMの濃度のITK阻害剤で前記PBLを前処理すること;
c.前記PBLを前記CD19+B細胞と2~5日間の期間にわたって共培養すること;
d.第1の細胞培養培地中のガス透過性容器に約2.5×105~約5×105個の細胞を添加し、且つ3~6日間の期間にわたり、3000IU/mlのIL-2及びビーズに固定化された抗CD3/抗CD28抗体並びに任意選択により0.1nM~200nMの濃度のITK阻害剤で前記PBLを刺激すること;
e.前記第1の細胞培養培地を第2の細胞培養培地及び約3000IU/mlの濃度の追加のIL-2並びに任意選択により0.1nM~200nMの濃度のITK阻害剤に交換すること;
f.IL-2及びビーズに固定化された抗CD3/抗CD28抗体並びに任意選択により0.1nM~200nMの濃度のITK阻害剤と共に3~6日間の追加の期間にわたってステップ(e)からの前記PBLを培養すること;
g.前記第2の細胞培養培地を第3の細胞培養培地に交換し、且つ3000IU/mLの濃度の追加のIL-2及び任意選択により0.1nM~200nMの濃度のITK阻害剤を添加し、且つ2~5日間の追加の期間にわたって前記細胞を培養すること;
h.ステップ(g)の培養物から前記抗体結合PBLを分離すること;
i.ステップ(h)で分離された前記PBLから前記抗体を取り出すこと;及び
j.前記PBLを回収すること
を含み、前記ITK阻害剤は、ITKに共有結合するITK阻害剤である、方法。 - 血液悪性腫瘍を処置する方法であって、
a.血液悪性腫瘍に罹患している患者の末梢血からPBMCのサンプルを入手すること;
b.CD19+B細胞を選択及び取り出すことにより、前記サンプルからPBLを分離すること;
c.任意選択により、前記PBLを前記CD19+B細胞と共培養すること;
d.第1の細胞培養培地中の前記PBLをガス透過性容器内において約2~約6日間の期間にわたってIL-2及び抗CD3/抗CD28抗体で刺激すること;
e.IL-2及び抗CD3/抗CD28抗体と共に約2~約6日間の期間にわたってステップ(d)からの前記PBLを培養すること;
f.ステップ(e)の培養物から前記抗体結合PBLを分離すること;
g.ステップ(f)で分離された前記PBLから前記抗体を取り出すこと;及び
h.前記PBLを回収すること;及び
i.前記血液悪性腫瘍を処置するために前記PBLを治療有効量で前記患者に投与すること
を含む方法。 - 前記患者は、PBMCサンプルを入手する前にITK阻害剤で前処置される、請求項61に記載の方法。
- 前記ITK阻害剤は、アミノチアゾール系ITK阻害剤、ベンズイミダゾール系ITK阻害剤、アミノピリミジン系ITK阻害剤、3-アミノピリド-2-オン系ITK阻害剤、インドリルンダゾール系ITK阻害剤、ピラゾリル-インドール系阻害剤、チエノピラゾール阻害剤及びATPポケット内のシステイン-442を標的とするITK阻害剤からなる群から選択される、請求項62に記載の方法。
- 前記ITK阻害剤は、イブルチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、ニロチニブ、エルロチニブBMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469((R)-3-(1-(1-アクリロイルピペリジン-3-イル)-4-アミノ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-N-(3-メチル-4-(1-メチルエチル))ベンズアミド)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項62に記載の方法。
- 前記ITK阻害剤は、イブルチニブである、請求項64に記載の方法。
- 前記患者は、イブルチニブレジメンの少なくとも3つのラウンドで前処置される、請求項62に記載の方法。
- 前記血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病(AML)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、活性化B細胞(ABC)DLBCL、胚中心B細胞(GCB)DLBCL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ球性白血病(SLL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、ホジキンリンパ腫、再発性及び/又は難治性ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症(WM)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性NHL、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)関連B細胞リンパ腫並びにエプスタイン-バーウイルス(EBV)関連B細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項61に記載の方法。
- 前記血液悪性腫瘍は、慢性リンパ性白血病(CLL)である、請求項61に記載の方法。
- 前記第1の細胞培養培地は、CM-2、CM-4及びAIM-Vからなる群から選択される、請求項61に記載の方法。
- ステップ(d)後、追加のIL-2は、添加され、及び前記細胞培養培地は、第2の細胞培養培地と交換される、請求項61に記載の方法。
- ステップ(e)後、追加のIL-2は、添加され、及び前記第2の細胞培養培地は、第3の細胞培養培地と交換される、請求項70に記載の方法。
- 前記第2の細胞培養培地は、CM-2、CM-4及びAIM-Vからなる群から選択される、請求項70に記載の方法。
- 前記第3の細胞培養培地は、CM-2、CM-4及びAIM-Vからなる群から選択される、請求項71に記載の方法。
- 前記第1の細胞培養培地と前記第2の細胞培養培地とは、異なる、請求項70に記載の方法。
- 前記第1の細胞培養培地と前記第2の細胞培養培地とは、同一である、請求項70に記載の方法。
- ステップ(c)におけるB細胞とPBLとの比は、約0.1:1~約10:1(B細胞:PBL)である、請求項61に記載の方法。
- ステップ(c)におけるB細胞とPBLとの比は、0.1:1、1:1及び10:1(B細胞:PBL)からなる群から選択される、請求項61に記載の方法。
- ステップ(d)の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも約1×105~約10×105個のPBLがある、請求項61に記載の方法。
- ステップ(d)の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも約2.5×105~10×105個のPBLがある、請求項61に記載の方法。
- ステップ(d)の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも5×105個のPBLがある、請求項61に記載の方法。
- 前記IL-2は、ステップ(d)及び(e)において1000IU/ml~6000IL/mlの濃度で存在する、請求項61に記載の方法。
- 前記IL-2は、約3000IU/mlの濃度で存在する、請求項81に記載の方法。
- 前記抗CD3/抗CD28抗体は、ビーズ上にコーティングされ、及びPBL:ビーズ比は、ステップ(d)及び(e)のそれぞれにおいて約1:1である、請求項61に記載の方法。
- 前記PBLは、約0.1×109~約15×109個のPBLの量で投与される、請求項61に記載の方法。
- 骨髄から骨髄浸潤リンパ球(MIL)を拡大培養する方法であって、
a.骨髄から末梢血単核細胞(PBMC)のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること;
b.CD3+、CD33+、CD20+及びCD14+細胞画分(MIL画分)並びに非CD3+、非CD33+、非CD20+及び非CD14+細胞画分(AML芽細胞画分)を選別すること;
c.任意選択により、前記AML芽細胞画分を破砕すること;
d.前記任意選択により破砕されたAML芽細胞画分をMIL細胞画分に約0.1:1~約10:1の細胞数比で添加すること;
e.IL-2を含む第1の細胞培養培地においてガス透過性容器内で1つ又は両方の細胞画分を培養すること;
f.抗CD3/抗CD28抗体で前記MILを刺激してMILの拡大培養を入手すること;
g.約2~約6日間の追加の期間にわたってIL-2及び抗CD3/抗CD28抗体で前記MILを再刺激すること;
h.約1~約3日間の追加の期間にわたって追加のIL-2と共に前記MILを培養すること;及び
i.前記MILを回収すること
を含む方法。 - 前記第1の細胞培養培地は、CM-2、CM-4及びAIM-Vからなる群から選択される、請求項85に記載の方法。
- ステップ(e)が開始された後、追加のIL-2は、添加され、及び前記第1の細胞培養培地は、第2の細胞培養培地と交換される、請求項85に記載の方法。
- 前記第2の細胞培養培地は、CM-2、CM-4及びAIM-Vからなる群から選択される、請求項87に記載の方法。
- 前記第1の細胞培養培地と前記第2の細胞培養培地とは、異なる、請求項87に記載の方法。
- 前記第1の細胞培養培地と前記第2の細胞培養培地とは、同一である、請求項87に記載の方法。
- ステップ(e)の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも約2×104~約5×105個のMILがある、請求項85に記載の方法。
- ステップ(e)の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも約2.8×104~3.4×105個のMILがある、請求項85に記載の方法。
- ステップ(e)の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも5×105個のMILがある、請求項85に記載の方法。
- 前記IL-2は、ステップ(d)において1000IU/ml~6000IL/mlの濃度で存在する、請求項85に記載の方法。
- 前記IL-2は、約6000IU/mlの濃度で存在する、請求項94に記載の方法。
- 前記IL-2は、ステップ(f)において約3000IU/mlの濃度で存在する、請求項85に記載の方法。
- ステップ(d)における前記培養は、約3日間の期間にわたって行われる、請求項85に記載の方法。
- ステップ(e)における前記刺激は、約4日間の期間にわたって行われる、請求項85に記載の方法。
- ステップ(f)における前記刺激は、約7日間の期間にわたって行われる、請求項85に記載の方法。
- ステップ(g)における前記追加のIL-2は、約3000IU/mlの濃度で存在する、請求項85に記載の方法。
- 前記抗CD3/抗CD28抗体は、ビーズ上にコーティングされ、及びMIL:ビーズ比は、ステップ(e)及び(f)のそれぞれにおいて約1:1である、請求項85に記載の方法。
- 前記任意選択により破砕された細胞画分は、超音波処理、ボルテックス、振動及び溶解からなる群から選択される方法を使用して破砕される、請求項85に記載の方法。
- 前記AML芽細胞画分と前記MIL画分との細胞数比は、約1:1である、請求項85に記載の方法。
- 閉鎖滅菌系で行われる、請求項85に記載の方法。
- 骨髄から骨髄浸潤リンパ球(MIL)を拡大培養する方法であって、
a.骨髄から末梢血単核細胞(PBMC)のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること;
b.CD3+、CD33+、CD20+及びCD14+細胞画分並びに非CD3+、非CD33+、非CD20+及び非CD14+細胞画分を選別すること;
c.前記AML芽細胞画分を破砕し、且つ前記破砕されたAML芽細胞画分を約1:1の細胞数比で前記MIL細胞画分に添加すること;
d.約6000IU/mlの濃度のIL-2を含む第1の細胞培養培地においてガス透過性容器内で前記AML芽細胞画分及び前記MIL細胞画分を約3日間の期間にわたって培養すること;
e.ビーズに固定化された抗CD3/抗CD28抗体を約1:1(MIL:ビーズ)の比率で細胞培養物に添加し、且つ約1日間の期間にわたって前記MIL及び抗体を培養すること;
f.前記第1の細胞培養培地を、約3000IU/mlの濃度の追加のIL-2を含む第2の細胞培養培地に交換すること;
g.約3日間の追加の期間にわたって前記抗体ビーズ及びMILを培養すること;
h.少なくとも約4日間の追加の期間にわたり、IL-2及びビーズに固定化された抗CD3/抗CD28抗体で前記MILを再刺激すること;
i.少なくとも約3日間の追加の期間にわたり、前記第2の細胞培養培地を、約3000IU/mlの濃度の追加のIL-2を含む第3の細胞培養培地に交換すること;及び
j.前記MILを回収すること
を含む方法。 - 血液悪性腫瘍を処置する方法であって、
a.骨髄から末梢血単核細胞(PBMC)のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること;
b.CD3+、CD33+、CD20+及びCD14+細胞画分(MIL画分)並びに非CD3+、非CD33+、非CD20+及び非CD14+細胞画分(AML芽細胞画分)を選別すること;
c.任意選択により、前記AML芽細胞画分を破砕すること;
d.前記任意選択により破砕されたAML芽細胞画分を前記MIL細胞画分に約0.1:1~約10:1の細胞数比で添加すること;
e.IL-2を含む第1の細胞培養培地においてガス透過性容器内で1つ又は両方の細胞画分を培養すること;
f.抗CD3/抗CD28抗体で前記MILを刺激してMILの拡大培養を入手すること;
g.約2~約6日間の追加の期間にわたってIL-2及び抗CD3/抗CD28抗体で前記MILを再刺激すること;
h.約1~約3日間の追加の期間にわたって追加のIL-2と共に前記MILを培養すること;
i.前記MILを回収すること;及び
j.前記血液悪性腫瘍を処置するために前記MILを治療有効量で患者に投与すること
を含む方法。 - 前記血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病(AML)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、活性化B細胞(ABC)DLBCL、胚中心B細胞(GCB)DLBCL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ球性白血病(SLL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、ホジキンリンパ腫、再発性及び/又は難治性ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症(WM)、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性NHL、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)関連B細胞リンパ腫並びにエプスタイン-バーウイルス(EBV)関連B細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項106に記載の方法。
- 前記血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病(AML)である、請求項107に記載の方法。
- 前記第1の細胞培養培地は、CM-2、CM-4及びAIM-Vからなる群から選択される、請求項106に記載の方法。
- ステップ(e)が行われた後、追加のIL-2は、添加され、及び前記第1の細胞培養培地は、第2の細胞培養培地と交換される、請求項106に記載の方法。
- 前記第2の細胞培養培地は、CM-2、CM-4及びAIM-Vからなる群から選択される、請求項110に記載の方法。
- 前記第1の細胞培養培地と前記第2の細胞培養培地とは、異なる、請求項110に記載の方法。
- 前記第1の細胞培養培地と前記第2の細胞培養培地とは、同一である、請求項110に記載の方法。
- ステップ(e)の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも約2×104~約5×105個のMILがある、請求項106に記載の方法。
- ステップ(e)の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも約2.8×104~3.4×105個のMILがある、請求項106に記載の方法。
- ステップ(d)の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも5×105個のMILがある、請求項106に記載の方法。
- 前記IL-2は、ステップ(d)において1000IU/ml~6000IL/mlの濃度で存在する、請求項106に記載の方法。
- 前記IL-2は、約6000IU/mlの濃度で存在する、請求項117に記載の方法。
- 前記IL-2は、ステップ(f)において約3000IU/mlの濃度で存在する、請求項106に記載の方法。
- ステップ(e)における前記培養は、約3日間の期間にわたって行われる、請求項106に記載の方法。
- ステップ(f)における前記刺激は、約4日間の期間にわたって行われる、請求項106に記載の方法。
- ステップ(g)における前記刺激は、約7日間の期間にわたって行われる、請求項106に記載の方法。
- ステップ(f)後に行われる追加のIL-2補充ステップを含む、請求項106に記載の方法。
- 前記追加のIL-2は、約3000IU/mlの濃度で存在する、請求項123に記載の方法。
- 前記抗CD3/抗CD28抗体は、ビーズ上にコーティングされ、及びビーズ:MIL比は、ステップ(f)及び(g)のそれぞれにおいて約1:1である、請求項106に記載の方法。
- 前記MILは、約4×108~約2.5×109個のMILの量で投与される、請求項106に記載の方法。
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