TW201904578A - 源自液體腫瘤之腫瘤浸潤性淋巴細胞的擴增和該經擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之治療用途 - Google Patents

源自液體腫瘤之腫瘤浸潤性淋巴細胞的擴增和該經擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之治療用途

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Abstract

本發明揭示源自血液惡性腫瘤(例如液體腫瘤，包括淋巴瘤與白血病)病患的血液及/或骨髓之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之擴增方法，以及該等經擴增TIL於治療例如癌症與血液惡性腫瘤等疾病之用途。

Description

源自液體腫瘤之腫瘤浸潤性淋巴細胞的擴增和該經擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之治療用途
本發明揭示衍生自患有血液惡性腫瘤(諸如液體腫瘤，包括淋巴瘤與白血病)病患的血液及/或骨髓之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之擴增方法，且包含從其獲得的TIL群之組成物。此外，本發明揭示從患有血液惡性腫瘤(例如液體腫瘤)病患的血液或骨髓擴增的TIL之治療用途，其包括治療該等血液惡性腫瘤之用途。
使用過繼性自體轉移腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)治療體積大、難治性癌症係治療患有預後不良病患的強效方法之代表。Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393。TIL受T細胞支配，隨後為“迅速擴增方法”(REP)之IL-2系TIL擴增由於其速度與效率，已成為用於TIL擴增之較佳方法。Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54；Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57；Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39；Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41；Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。業界對於改善TIL療法於黑色瘤中之反應及將TIL療法擴展至其他腫瘤類型的許多方法已有探索惟成功有限，此領域仍具挑戰性。Goff, et al., J. Clin. Oncol. 2016, 34, 2389-97；Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39；Rosenberg, et al., Clin. Cancer Res. 2011, 17, 4550-57。衍生自B細胞淋巴瘤之擴增TIL的早期方法得到不良結果，12次嘗試TIL生長中只有2次提供對抗腫瘤之潛在活性。Schwartzentruber, et al., Blood 1993, 82, 1204-1211。業界對於在許多血液惡性腫瘤[包括急性類骨髓性白血病(AML)與慢性淋巴球性白血病(CLL)]中提供更有效之療法存在迫切需求。
本發明提供令人驚奇的發現：TIL擴增方法可以產生得自血液惡性疾病(諸如液體腫瘤，包括淋巴瘤或白血病)之有效TIL群(TIL populations)。
發明概述
於一具體實例中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含以下步驟： 　　(a)視需要以包含至少一種激酶抑制劑之療法預治療病患； 　　(b)利用切除、活組織檢查、針穿刺、或血球分離從該病患獲得腫留，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(c)視需要碎斷或解離該腫瘤以得到腫瘤碎體並使該等腫瘤碎體與第一細胞培養液接觸； 　　(d)於該第一細胞培養液中進行該第一TIL群之初始擴增以得到第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上比該第一TIL群多至少5倍，其中該第一細胞培養液包含IL-2，且其中該初始擴增進行21天或少於21天之期間； 　　(e)第二細胞培養液中進行該第二TIL群之二次擴增以得到第三TIL群，其中自該二次擴增開始7天後該第三TIL群於數量上比該第二TIL群多至少50倍，其中該第二細胞培養液包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經照射之同種異體周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中該二次擴增進行14天或少於14天之期間； 　　(f)收獲該第三TIL群；及 　　(g)給予癌症病患治療有效份量之該第三TIL群； 　　其中該腫瘤係液體腫瘤，且其中該癌症係血液惡性腫瘤。
於一具體實例中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含以下步驟： 　　(a)視需要以包含至少一種激酶抑制劑之療法預治療病患； 　　(b)利用切除、活組織檢查、針穿刺、或血球分離從該病患獲得腫留，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(c)視需要碎斷或解離該腫瘤以得到腫瘤碎體並使該等腫瘤碎體與第一細胞培養液接觸； 　　(d)於該第一細胞培養液中進行該第一TIL群之初始擴增以得到第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上比該第一TIL群多至少5倍，其中該第一細胞培養液包含IL-2，且其中該初始擴增進行21天或少於21天之期間； 　　(e)於第二細胞培養液中進行該第二TIL群之二次擴增以得到第三TIL群，其中自該二次擴增開始7天後該第三TIL群於數量上比該第二TIL群多至少50倍，其中該第二細胞培養液包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經照射之同種異體周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中該二次擴增進行14天或少於14天之期間； 　　(f)收獲該第三TIL群；及 　　(g)給予癌症病患治療有效份量之該第三TIL群； 　　其中該腫瘤係液體腫瘤，且其中該癌症係選自包括下述組群之血液惡性腫瘤：急性類骨髓性白血病(AML)、外膜細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)、活化型B細胞(ABC)DLBCL、生發中心型B細胞(GCB)DLBCL、慢性淋巴球性白血病(CLL)、小淋巴球性白血病(SLL)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)(NHL)、霍奇金氏淋巴瘤、復發性及/或難治性霍奇金氏淋巴瘤、B細胞急性淋巴胚細胞白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、柏基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenström’s macroglobulinemia)(WM)、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、骨髓纖維化、慢性骨髓性白血病、濾泡中心性淋巴瘤、無痛性NHL、人類免疫缺失症病毒(HIV)相關之B細胞淋巴瘤及艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr virus)(EBV)相關之B細胞淋巴瘤。
於本發明之一具體實例中，該方法進一步包含添加ITK抑制劑。一具體實例中，係於步驟(d)與(e)之至少一者添加ITK抑制劑至該細胞培養液。於另一具體實例中，ITK抑制劑係選自包括胺基噻唑系ITK抑制劑、苯并咪唑系ITK抑制劑、胺基嘧啶系ITK抑制劑、3-胺基吡啶-2-酮系ITK抑制劑、吲哚基吲唑系ITK抑制劑、吡唑基吲哚系抑制劑、噻吩并吡唑抑制劑及靶向ATP囊袋中半胱胺酸442之ITK抑制劑之群組。於另一具體實例中，ITK抑制劑為依魯替尼(ibrutinib)、達沙替尼(dasatinib)、博舒替尼(bosutinib)、尼羅替尼(nilotinib)、厄洛替尼(erlotinib)、BMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469及彼等之組合。於另一具體實例中，ITK抑制劑為依魯替尼。於另一具體實例中，ITK抑制劑以約0.1nM至約5 µM之濃度添加。於另一具體實例中，ITK抑制劑以約0.1 nM至約5 µM之濃度添加。於另一具體實例中，ITK抑制劑以約0.1 nM至約100 nM之濃度添加。於另一具體實例中，ITK抑制劑以約0.5 nM至約50 nM之濃度添加。於另一具體實例中，ITK抑制劑以約1 nM至約10 nM之濃度添加。於一具體實例中，ITK抑制劑以約0.01 nM、0.05 nM、0.1 nM、0.5 nM、1 nM、2 nM、5 nM、10 nM、20 nM、30 nM、40 nM、50 nM、60 nM、70 nM、80 nM、90 nM、100 nM、150 nM、200 nM、300 nM、400 nM、500 nM、600 nM、700 nM、800 nM、900 nM、1 µM、2 µM、3 µM、4 µM、5 µM、10 µM、20 µM、30 µM、40 µM及50 µM之濃度添加。
於本發明之一具體實例中，擴增源自周邊血液的周邊血液淋巴細胞(PBL)之方法包含： 　　a. 取得源自周邊血液的周邊血液單核細胞(PBMC)試樣，其中視需要冷凍保存該試樣； 　　b. 經由篩選與移除CD19+ B細胞單離源自該試樣之PBL； 　　c. 視需要使該PBL與該CD19+ B細胞共培養； 　　d. 於透氣容器中，在具有IL-2與抗CD3/抗CD28抗體之第一細胞培養液中，刺激該PBL約2天至約6天之期間； 　　e. 使得自步驟(d)之該PBL及IL-2與抗CD3/抗CD28抗體培養約2天至約6天之期間； 　　f. 從步驟(e)之培養物單離結合抗體之該PBL； 　　g. 從步驟(e)單離之該PBL移除該等抗體；及 　　h. 收獲該PBL。
於本發明之一具體實例中，該方法進一步包含於步驟(d)之後添加IL-2，且將第一培養液換成第二細胞培養液。於另一具體實例中，該方法進一步包含於步驟(e)之後添加IL-2，且將第二培養液換成第三細胞培養液。於一具體實例中，該第一細胞培養液、第二細胞培養液、或第三細胞培養液係選自由CM-2、CM-4及AIM-V所組成之群組。於另一具體實例中，該第一與第二細胞培養液相同。於另一具體實例中，該第一與第二細胞培養液不同。於本發明之一具體實例中，該第一、第二與第三細胞培養液之一或多者相同。於另一具體實例中，該第一、第二及第三細胞培養液都不相同。
於一具體實例中，上述PBL與上述CD19+ B細胞之共培養係進行1小時至3天之期間。
於本發明之一具體實例中，步驟(c)B細胞與PBL之比例為約0.1：1至約10：1(B細胞：PBL)。於另一具體實例中，B細胞與PBL之比例係選自包括0.1：1、1：1及10：1(B細胞：PBL)之群組。
於本發明之一具體實例中，步驟(d)開始時之起始細胞數為至少約1×105 至約10×105 個PBL。於另一具體實例中，步驟(d)開始時之起始細胞數為至少約2.5×105 至約10×105 個PBL。於另一具體實例中，步驟(d)開始時之起始細胞數為至少5×105 個PBL。
於本發明之一具體實例中，各步驟(c)與(d)中之該IL-2以約1000 IU/mL至約6000 IU/mL之濃度使用。於另一具體實例中，各步驟(c)與(d)中之該IL-2以約3000 IU/mL之濃度使用。
於本發明之一具體實例中，該等抗CD3/抗CD28抗體係被覆於珠粒上。於本發明之一具體實例中，該等抗CD3/抗CD28抗體為DynaBeads® 。於一具體實例中，該方法包含於各步驟(c)與(d)中，使該等抗CD3/抗CD28抗體珠粒與PBL以約1：1之珠粒：PBL比例共培養。
於本發明之一具體實例中，該方法包含添加ITK抑制劑。於一具體實例中，ITK抑制劑係於步驟(c)、步驟(d)及步驟(e)之至少一者中添加。於本發明之一具體實例中，ITK抑制劑係選自包括胺基噻唑系ITK抑制劑、苯并咪唑系ITK抑制劑、胺基嘧啶系ITK抑制劑、3-胺基吡啶-2-酮系ITK抑制劑、吲哚基吲唑系ITK抑制劑、吡唑基吲哚系抑制劑、噻吩并吡唑抑制劑及靶向ATP囊袋中半胱胺酸442之ITK抑制劑之群組。於另一具體實例中，ITK抑制劑為依魯替尼、達沙替尼、博舒替尼、尼羅替尼、厄洛替尼、BMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469及彼等之組合。於另一具體實例中，ITK抑制劑為依魯替尼。
於本發明之一具體實例中，用於製備PBL之任一前述方法係於封閉之無菌系統中進行。
於本發明之一具體實例中，擴增源自周邊血液的周邊血液淋巴細胞(PBL)之方法包含： 　　a. 取得源自周邊血液之PBMC試樣，其中視需要冷凍保存該試樣； 　　b. 經由篩選與移除CD19+ B細胞單離源自該試樣之PBL； 　　c. 使該PBL與該CD19+ B細胞共培養4天之期間； 　　d. 添加約2.5×105 至約5×105 個細胞至透氣容器之第一細胞培養液中，且以3000 IU/mL IL-2與固定於珠粒上之抗CD3/抗CD28抗體刺激該PBL約4天之期間； 　　e. 以第二細胞培養液更換該第一細胞培養液並添加濃度約3000 IU/mL之追加IL-2； 　　f. 使得自步驟(e)之PBL與IL-2和固定於珠粒上之抗CD3/抗CD28抗體培養約3天之追加期； 　　g. 從步驟(f)之培養物單離結合抗體之該PBL； 　　h. 從步驟(g)單離之該PBL移除該等抗體；及 　　i. 收獲該PBL。
於本發明之一具體實例中，治療血液惡性腫瘤之方法包含： 　　a. 取得源自罹患血液惡性腫瘤之病患的周邊血液之PBMC試樣； 　　b. 經由篩選與移除CD19+ B細胞單離源自該試樣之PBL； 　　c. 視需要使該PBL與該CD19+ B細胞共培養； 　　d. 於透氣容器中，在具有IL-2與抗CD3/抗CD28抗體之第一細胞培養液中，刺激該PBL至少約4天之期間； 　　e. 使得自步驟(d)之該PBL及IL-2與抗CD3/抗CD28抗體培養3天之期間； 　　f. 從步驟(e)之培養物單離結合抗體之該PBL； 　　g. 從步驟(e)單離之該PBL移除該等抗體； 　　h. 收獲該PBL；及 　　i. 將該PBL以有效治療量給予該病患，以治療上述血液惡性腫瘤。
於本發明之一具體實例中，該方法進一步包含取得源自以ITK抑制劑預治療的病患之PBMC試樣。於本發明之一具體實例中，ITK抑制劑係選自包括胺基噻唑系ITK抑制劑、苯并咪唑系ITK抑制劑、胺基嘧啶系ITK抑制劑、3-胺基吡啶-2-酮系ITK抑制劑、吲哚基吲唑系ITK抑制劑、吡唑基吲哚系抑制劑、噻吩并吡唑抑制劑及靶向ATP囊袋中半胱胺酸442之ITK抑制劑之群組。於本發明之一具體實例中，ITK抑制劑為依魯替尼、BMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469及彼等之組合。於另一具體實例中，ITK抑制劑為依魯替尼。於另一具體實例中，病患經至少3輪之依魯替尼療法預治療。
於本發明之一具體實例中，該血液惡性腫瘤係選自包括急性類骨髓性白血病(AML)、外膜細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)、活化型B細胞(ABC)DLBCL、生發中心型B細胞(GCB)DLBCL、慢性淋巴球性白血病(CLL)、小淋巴球性白血病(SLL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、霍奇金氏淋巴瘤、復發性及/或難治性霍奇金氏淋巴瘤、B細胞急性淋巴胚細胞白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、柏基特氏淋巴瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(WM)、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、骨髓纖維化、慢性骨髓性白血病、濾泡中心性淋巴瘤、無痛性NHL、人類免疫缺失症病毒(HIV)相關之B細胞淋巴瘤及艾司坦氏-巴爾氏病毒(EBV)相關之B細胞淋巴瘤之群組。於另一具體實例中，血液惡性腫瘤為慢性淋巴球性白血病(CLL)。於本發明之一具體實例中，PBL係以約0.1×109 至約15×109 個PBL之量給予。
於本發明之一具體實例中，用於擴增源自骨髓之骨髓浸潤性淋巴細胞(MILs)之方法包含： 　　a. 取得源自骨髓之周邊血液單核細胞(PBMC)試樣，其中視需要冷凍保存該試樣； 　　b. 分選整理CD3+、CD33+、CD20+及CD14+細胞區分(MIL區分)與非CD3+、非CD33+、非CD20+及非CD14+細胞區分(AML胚細胞區分)； 　　c. 視需要崩解該AML胚細胞區分； 　　d. 以約0.1：1至約10：1之細胞數比例添加該視需要經崩解之AML胚細胞區分至該MIL區分； 　　e. 於包含IL-2之第一細胞培養液之透氣容器中，培養一或兩種該等細胞區分； 　　f. 以抗CD3/抗CD28抗體刺激該MILs以獲得MILs之擴增； 　　g. 以IL-2與抗CD3/抗CD28抗體再刺激該MILs約2至約6天之追加期； 　　h. 使該MILs與追加之IL-2培養約1至約3天之追加期；及 　　i. 收獲該MILs。
於本發明之一具體實例中，該方法進一步包含於步驟(e)之後添加IL-2，且將培養液換成第二細胞培養液。於一具體實例中，該第一細胞培養液與第二細胞培養液係選自包括CM-2、CM-4及AIM-V之群組。於另一具體實例中，該第一與第二細胞培養液相同。於另一具體實例中，該第一與第二細胞培養液不同。
於一具體實例中，步驟(e)開始時，該透氣容器中有至少約2×104 至約5×105 個MILs。於另一具體實例中，步驟(e)開始時，該透氣容器中有至少約2.8×104 至3.4×105 個MILs。於另一具體實例中，步驟(e)開始時，該透氣容器中有至少5×105 個MILs。
於本發明之一具體實例中，該IL-2於步驟(e)中以介於1000 IU/ml與6000 IU/ml間之濃度存在。於另一具體實例中，該IL-2以約6000 IU/ml之濃度存在。於另一具體實例中，該IL-2於步驟(g)中以約3000 IU/ml之濃度存在。於另一具體實例中，該IL-2於步驟(h)中以約3000 IU/ml之濃度存在。
於本發明之一具體實例中，步驟(e)之該培養進行約3天之期間。。於一具體實例中，步驟(f)之該刺激進行約4天之期間。於一具體實例中，步驟(g)之該刺激進行約7天之期間。
於本發明之一具體實例中，該視需要經崩解之細胞區分係使用選自包括音波振動處理、均質化、渦動、振動及分解之群組之方法崩解。於本發明之一具體實例中，非CD3+、非CD33+、非CD20+、非CD14+細胞區分(AML胚細胞區分)係使用適當分解方法[包括高溫分解、化學分解(例如有機醇類)、酵素分解及此項技藝中已知之其他細胞分解方法]分解。
於本發明之一具體實例中，各步驟(f)與(g)中之該等抗CD3/抗CD28抗體係以約1：1之珠粒：MILs比例被覆於珠粒上。
於本發明之一具體實例中，該方法係於封閉之無菌系統中進行。
於本發明之一具體實例中，用於擴增源自骨髓之骨髓浸潤性淋巴細胞(MILs)之方法包含： 　　a. 取得源自骨髓之周邊血液單核細胞(PBMC)試樣，其中視需要冷凍保存該試樣； 　　b. 分選整理CD3+、CD33+、CD20+及CD14+細胞區分(MIL細胞區分)與非CD3+、非CD33+、非CD20+及非CD14+細胞區分(AML胚細胞區分)； 　　c. 崩解該AML胚細胞區分及以約1：1之細胞數比例添加該經崩解之AML胚細胞區分至MIL細胞區分； 　　d. 以包含約6000 IU/ml IL-2之第一細胞培養液，於透氣容器中培養該等細胞區分； 　　e. 以約1：1(MILs：珠粒)之比例，添加固定於珠粒上之抗CD3/抗CD28抗體至該細胞培養液中，並培養該MILs與抗體約1天之期間； 　　f. 交換該第一細胞培養液為包含約3000 IU/mL追加IL-2之第二細胞培養液； 　　g. 培養該等抗體與MILs約3天之追加期； 　　h. 以IL-2與固定在珠粒上之抗CD3/抗CD28抗體再刺激該MILs至少約4天之追加期； 　　i. 將該第二細胞培養液換成包含約3000 IU/mL追加IL-2之第三細胞培養液，且進行至少約3天之追加期； 　　j. 收獲該MILs。
於本發明之一具體實例中，治療血液惡性腫瘤之方法包含： 　　a. 取得源自骨髓之周邊血液單核細胞(PBMC)試樣，其中視需要冷凍保存該試樣； 　　b. 分選整理CD3+、CD33+、CD20+及CD14+細胞區分(MIL區分)與非CD3+、非CD33+、非CD20+及非CD14+細胞區分(AML胚細胞區分)； 　　c. 視需要崩解該AML胚細胞區分； 　　d. 以約0.1：1至約10：1之細胞數比例添加該視需要經崩解之AML胚細胞區分至該MIL區分； 　　e 於包含IL-2之第一細胞培養液之透氣容器中，培養一或兩種該等細胞區分； 　　f. 以抗CD3/抗CD28抗體刺激該試樣； 　　g. 以IL-2與抗CD3/抗CD28抗體再刺激該MILs至少約4天之追加期； 　　h. 使該MILs與追加之IL-2培養至少約3天之追加期； 　　i. 收獲該MILs；及 　　j. 以有效治療量之該MILs給予病患以治療該血液惡性腫瘤。
於本發明之一具體實例中，血液惡性腫瘤係選自包括急性類骨髓性白血病(AML)、外膜細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)、活化型B細胞(ABC)DLBCL、生發中心型B細胞(GCB)DLBCL、慢性淋巴球性白血病(CLL)、小淋巴球性白血病(SLL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、霍奇金氏淋巴瘤、復發性及/或難治性霍奇金氏淋巴瘤、B細胞急性淋巴胚細胞白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、柏基特氏淋巴瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(WM)、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、骨髓纖維化、慢性骨髓性白血病、濾泡中心性淋巴瘤、無痛性NHL、人類免疫缺失症病毒(HIV)相關之B細胞淋巴瘤及艾司坦氏-巴爾氏病毒(EBV)相關之B細胞淋巴瘤之群組。於另一具體實例中，該血液惡性腫瘤為急性類骨髓性白血病(AML)。於本發明之一具體實例中，MILs係以約4×108 至約2.5×109 個MILs之量給予。
發明詳細說明
除非另行界定，否則本文所用之所有技術與科學術語具有熟習本發明所屬技藝者通常理解之相同意義。本文提及之所有專利與公告案其全部內容均併入本文以資參考。 界定
本文所用之“共同給藥”、“共同給予”、“組合給藥”、“組合給予”、“同時”及“同步”等詞涵蓋對個體給予兩種或兩種以上活性藥物成分俾使活性藥物成分及/或其代謝物二者同時存在個體中。共同給藥包括不同組成物之同時給藥、不同組成物之不同時間給藥、或其中存在兩種或兩種以上活性藥物成分之組成物之給藥。較佳為不同組成物之同時給藥及其中兩種藥劑皆存在之組成物之給藥。
“活體內”一詞係指發生於哺乳動物個體體內之事件。
“擬體內”一詞係指在人為環境中發生於哺乳動物個體體外之事件。
“活體外”一詞係指在測試系統中發生之事件。活體外分析涵蓋其中可使用活或死細胞之細胞系分析法及亦可涵蓋其中無完整細胞被使用之無細胞分析法。
“迅速擴增”一詞意指抗原特異性TIL之數量於一週期間增加至少約3倍(或4、5、6、7、8、或9倍)，更佳為於一週期間至少約10倍(或20、30、40、50、60、70、80、或90倍)，或最佳為於一週期間至少約100倍。本文中敘述許多迅速擴增實驗方法。
本文中用於敘述崩解腫瘤方法所用之“碎斷”、“碎體”及“經碎斷”等詞包括機械碎斷方法例如壓碎、切割、分開及分割腫瘤組織以及任何用於崩解腫瘤組織實體結構之其他方法。
“周邊血液單核細胞”與“PBMC”等詞係指具有圓形核之周邊血液細胞，包括淋巴細胞(T細胞、B細胞、NK細胞)與單核白血球。視需要，周邊血液單核細胞係經照射之同種異體周邊血液單核細胞；為抗原呈現細胞。“PBL”一詞係指周邊血液淋巴細胞，為從周邊血液擴增之T細胞。PBL與TIL等詞於本文中可互換使用。
“抗CD3抗體”一詞係指抗體或其變異體，例如單株抗體及包括針對成熟T細胞之T細胞抗原受體中之CD3受體之人類、擬人化、嵌合或鼠源性抗體。抗CD3抗體包括OKT-3，亦稱為莫羅單抗及UCHT-1。其他抗CD3抗體包括，舉例而言，奧昔珠單抗(otelixizumab)、替普珠單抗(teplizumab)及維西珠單抗(visilizumab)。
“OKT-3”(本文中亦稱為“OKT3”)一詞係指針對成熟T細胞之T細胞抗原受體中之CD3受體之單株抗體或其生物模擬藥或變異體，包括人類、擬人化、嵌合或鼠源性抗體，及包括商購獲得形式，例如OKT-3(30 ng/mL, MACS GMP CD3 pure, Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA)與莫羅單抗或其變異體、保守性胺基酸置換、醣型、或生物模擬藥。莫羅單抗重鏈與輕鏈之胺基酸序列提供於表1(SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2)。能產生OKT-3之融合瘤已寄存於美國標準菌種保存中心並指派ATCC登錄編號CRL 8001。能產生OKT-3之融合瘤亦已寄存在歐洲認證細胞株保存中心(ECACC)並指派Catalogue No. 86022706。
“IL-2”(本文中亦稱為“IL2”)一詞係指稱為介白素2之T細胞生長因子，且包含所有形式之IL-2包括人類與哺乳動物形式、保守性胺基酸置換、醣型、生物模擬藥及其變異體。IL-2見述於，例如Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88與Malek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79中，該等揭示內容併入本文以資參考。適用於本發明重組人類IL-2之胺基酸序列提供於表2(SEQ ID NO：3)。舉例而言，IL-2一詞涵蓋IL-2之人類、重組形式例如阿地介白素(PROLEUKIN，可從許多供應商購得，每單一使用小瓶2,200萬IU)，以及由CellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA(CELLGRO GMP)或ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(Cat. No. CYT-209-b)商業供應之重組IL-2形式及得自其他供應商之其他商業性等效物。阿地介白素[去丙胺酸(des-alanyl)-1、絲胺酸-125人類IL-2]為非醣基化之人類重組形式之IL-2，分子量大約15 kDa。適用於本發明的阿地介白素之胺基酸序列提供於表2(SEQ ID NO：4)。IL-2一詞亦涵蓋如本文中所述之聚乙二醇化形式之IL-2，包括聚乙二醇化之IL2前驅藥NKTR-214，可從Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USA得到。適用於本發明之NKTR-214與聚乙二醇化IL-2見述於美國專利申請公告案No. US 2014/0328791 A1與國際專利申請公告案No. WO 2012/065086 Al，該等揭示內容併入本文以資參考。適用於本發明之結合IL-2之替代形式見述於美國專利案Nos. 4,766,106、5,206,344、5,089,261與4,902,502，該等揭示內容併入本文以資參考。適用於本發明之IL-2調配物見述於美國專利案No. 6,706,289，該揭示內容併入本文以資參考。
“IL-4”(本文中亦稱為“IL4”)一詞係指稱為介白素4之細胞介素，其係由Th2 T細胞及由嗜酸性白血球、嗜鹼性白血球及肥大細胞產生。IL-4調節初始輔助T細胞(Th0細胞)成為Th2 T細胞之分化。Steinke and Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70。經由IL-4活化後，Th2 T細胞接著於正向回饋迴路中產生附加之IL-4。IL-4亦刺激B細胞增殖與第二類MHC表現，並誘導從B細胞類型轉換為IgE與IgG1 表現。適用於本發明之重組人類IL-4可從許多供應商購得，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(Cat. No. CYT-211)與ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人類IL-15重組蛋白，Cat. No. Gibco CTP0043)。適用於本發明的重組人類IL-4之胺基酸序列提供於表2(SEQ ID NO：5)。
“IL-7”(本文中亦稱為“IL7”)一詞係指稱為介白素7之衍生自醣基化組織之細胞介素，其可得自基質與上皮細胞以及樹突狀細胞。Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904。IL-7可刺激T細胞之發育。IL-7結合IL-7受體，IL-7受體為由IL-7受體α與共用γ鏈受體構成之異二聚體，其一系列信號對T細胞在胸腺內之發育與周邊區域內之存活相當重要。適用於本發明之重組人類IL-7可從許多供應商購得，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(Cat. No. CYT-254)與ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人類IL-7重組蛋白，Cat. No. Gibco PHC0071)。適用於本發明之重組人類IL-7之胺基酸序列提供於表2(SEQ ID NO：6)。
“IL-15”(本文中亦稱為“IL15”)一詞係指稱為介白素15之T細胞生長因子，並包括所有形式之IL-15包括人類與哺乳動物形式、保守性胺基酸置換、醣型、生物模擬藥及其變異體。IL-15見述於，例如Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32中，該揭示內容併入本文以資參考。IL-15與IL-2分享β與γ傳訊受體次單元。重組人類IL-15為含有114個胺基酸(及N-端甲硫胺酸)之單一非醣基化多肽鏈，分子質量12.8 kDa。重組人類IL-15可從許多供應商購得，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(Cat. No. CYT-230-b)與ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人類IL-15重組蛋白，Cat. No. 34-8159-82)。適用於本發明的重組人類IL-15之胺基酸序列提供於表2(SEQ ID NO：7)。
“IL-21”(本文中亦稱為“IL21”)一詞係指稱為介白素21之多效性細胞介素蛋白，並包含所有形式之IL-21，包括人類與哺乳動物形式、保守性胺基酸置換、醣型、生物模擬藥及其變異體。IL-21見述於，例如Spolski and Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95中，該揭示內容併入本文以資參考。IL-21主要由自然殺手T細胞與活化之人類CD4+ T細胞產生。重組人類IL-21為含有132個胺基酸之單一非醣基化多肽鏈，分子質量15.4 kDa。重組人類IL-21可從許多供應商購得，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(Cat. No. CYT-408-b)與ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人類IL-21重組蛋白，Cat. No. 14-8219-80)。適用於本發明的重組人類IL-21之胺基酸序列提供於表2(SEQ ID NO：8)。
“醫藥上可接受之載劑”或“醫藥上可接受之賦形劑”等詞擬包含任何及所有溶劑、分散介質、包衣物、抗細菌與抗真菌劑、等滲與吸收遲滯劑及惰性成分。該等醫藥上可接受載劑或醫藥上可接受賦形劑於活性藥物成分上之用途為此項技藝中已悉知。除非任何習知醫藥上可接受載劑或醫藥上可接受賦形劑與活性藥物成分不相容，否則將考慮其於本發明治療組成物中之用途。附加之活性藥物成分，例如其他藥物，亦可併入所述之組成物與方法中。
“抗體”與其複數形式等詞係指整個免疫球蛋白與任何抗原結合片段(“抗原結合部分”)或其單鏈。“抗體”另外係指包含經由雙硫鍵相互連接之至少兩條重(H)鏈與兩條輕(L)鏈之醣蛋白或其抗原結合部分。每條重鏈由重鏈可變區(本文縮寫為VH )與重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個功能區CH1、CH2與CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文縮寫為VL )與輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個功能區CL 組成。抗體之VH 與VL 區進一步細分為高度可變區，其被稱為互補決定區(CDR)或高度可變區(HVR)，其可穿插更保守之區域，稱為架構區(FR)。各個VH 與VL 由三個CDRs與四個FRs組成，從胺基端到羧基端以下述順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈與輕鏈之可變區含有與一或多個抗原決定區交互作用之結合功能區。抗體之恆定區可媒介免疫球蛋白與宿主組織或因子[包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)與經典補體系統之第一成分(Clq)]之結合。
“抗原”一詞係指誘導免疫反應之物質。於若干具體實例中，抗原係能被抗體或若由主要組織相容性複合體(MHC)分子所呈現之TCR結合之分子。本文所用之“抗原”一詞亦涵蓋T細胞抗原決定區。此外，抗原能被免疫系統辨識。於若干具體實例中，抗原能誘導体液性免疫反應或細胞性免疫反應，導致B淋巴細胞及/或T淋巴細胞之活化。於若干情況下，此可能需要該抗原包含或係連接至Th細胞抗原決定區。抗原亦可具有一或多個抗原決定區(例如B-與T-抗原決定區)。於若干具體實例中，抗原較佳為通常以高度特異性與選擇性之方式與其相對應之抗體或TCR反應，而不與可能由其他抗原誘導之許多其他抗體或TCR反應。
“單株抗體”、“mAb”、“單株抗體組成物”等詞或其複數形式係指單分子組成物抗體分子之製備。單株抗體組成物展現對特定抗原決定區之單一結合特異性與親和性。可使用此項技藝中之知識與技術以適當抗原注射測試個體，然後單離表現具有期望序列或功能特性的抗體之融合瘤，以製造對特定受體具特異性之單株抗體。編碼該等單株抗體之DNA可容易地使用習知程序(例如，使用能特異性地結合編碼單株抗體重鏈與輕鏈基因之寡核苷酸探針)單離與定序。融合瘤細胞作為該等DNA之較佳來源。一旦單離，可將該DNA置入表現載體中，然後將其轉染至宿主細胞例如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或否則不產生免疫球蛋白之骨髓瘤細胞中，以於重組宿主細胞中獲得單株抗體之合成。抗體之重組產生將於下文更具細節地說明。
本文所用抗體之“抗原結合部分”或“抗原結合片段”(或僅為“抗體部分”或“片段”)等詞係指抗體之一或多個片段，其保留特異性結合抗原之能力。已顯示抗體之抗原結合功能可經由全長抗體之諸片段進行。涵蓋於抗體之“抗原結合部分”一詞範圍內之結合片段之實例，包括(i)Fab片段，由VL 、VH 、CL 與CH1功能區構成之單價片段；(ii)F(ab′)2片段，包含兩個在絞鏈區經由雙硫鍵連接之Fab片段之雙價片段；(iii)由VH 與CH1功能區構成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL 與VH 功能區構成之Fv片段；(v)功能區抗體(dAb)片段(Ward, et al., Nature, 1989, 341, 544-546)，其可由VH 或VL 功能區構成；及(vi)單離之互補決定區(CDR)。再者，儘管Fv片段的兩個功能區，VL 與VH ，係由分離基因所編碼，惟其可經由合成連接子使用重組方法連結，俾使其能呈單一蛋白鏈製造，其中VL 與VH 區配對形成稱為單鏈Fv(scFv)之單價分子(參見，例如，Bird, et al., Science 1988, 242, 423-426；與Huston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 5879-5883)。該等scFv抗體亦擬涵蓋於抗體之“抗原結合部分”或“抗原結合片段”等詞之範圍內。此等抗體片段係使用熟習此項技藝人士已知之習知技術獲得，並以和完整抗體相同之方式篩選片段之效用。
本文所用之“人類抗體”一詞擬包括具有可變區之抗體，其中架構區與CDR區二者皆衍生自人類生殖細胞系免疫球蛋白序列。再者，若抗體含恆定區，則該恆定區亦衍生自人類生殖細胞系免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體可包括非由人類生殖細胞系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，經由活體外之隨機或定位突變或活體內之體細胞突變所誘導之突變)。本文所用之“人類抗體”一詞不擬包括其中衍生自另外哺乳動物物種(例如小鼠)生殖細胞系之CDR序列已被移植入人類架構序列之抗體。
“人類單株抗體”一詞係指展現單一結合特異性之抗體，其具有其中架構區與CDR區二者皆衍生自人類生殖細胞系免疫球蛋白序列之可變區。於一具體實例中，人類單株抗體係由包含得自基因轉殖非人類動物(例如基因轉殖小鼠)B細胞之融合瘤產生，其具有包含人類重鏈轉殖基因與輕鏈轉殖基因融合不朽細胞之基因體。
本文所用之“重組人類抗體”一詞包括經由重組方法製備、表現、產生或單離之所有人類抗體，例如(a)從基因轉殖或染色體轉殖人類免疫球蛋白基因之動物(例如小鼠)或由此製備之融合瘤(進一步見述於下文)所單離之抗體；(b)從經轉形以表現人類抗體之宿主細胞單離之抗體，例如源自轉染瘤；(c)從重組、組合人類抗體庫單離之抗體；及(d)經由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA 序列之任何其他方法製備、表現、產生或單離之抗體。該等重組人類抗體具有其中架構區與CDR區係衍生自人類生殖細胞系免疫球蛋白序列之可變區。然而，於特定具體實例中，該等重組人類抗體可進行活體外誘變(或，於使用基因轉殖人類Ig序列之動物時，活體內體細胞誘變)，因此該等重組抗體VH 與VL 區之胺基酸序列，儘管衍生自人類生殖細胞系VH 與VL 序列且與其有關，惟可能不是天然存在活體內人類抗體生殖細胞系譜系中。
本文所用之“同型”係指經由重鏈恆定區基因編碼之抗體類型(例如，IgM或IgG1)。
“辨識抗原之抗體”與“對抗原具特異性之抗體”等詞於本文中可和“特異性結合抗原之抗體”一詞互換使用。
“人類抗體衍生物”一詞係指人類抗體之任何經修飾形式，包括抗體與另一活性藥物成分或抗體之共軛物。“共軛物”、“抗體-藥物共軛物”、“ADC”、或“免疫共軛物”等詞係指共軛接合另一療效成分之抗體或其片段，其可使用此項技藝中可利用之方法共軛接合於本文所述抗體。
“擬人化抗體”與“擬人化”等詞擬意指其中衍生自另一哺乳動物物種(例如小鼠)生殖細胞系之CDR序列已被移植至人類架構序列上之抗體。該等人類架構序列內可進行附加之架構區修飾。擬人化形式之非人類(例如，鼠源性)抗體為含有衍生自非人類免疫球蛋白最小序列之嵌合抗體。大多數情況下，擬人化抗體係人類免疫球蛋白(受體抗體)中源自受體高度可變區之殘基被源自非人類物種例如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物具有期望特異性、親和性及接受能力之15個高度可變區之殘基(供體抗體)置換。於若干情況中，人類免疫球蛋白之Fv架構區(FR)殘基被對應之非人類殘基置換。再者，擬人化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中未發現之殘基。進行此等修飾以進一步提升抗體性能。通常，擬人化抗體將實質上包含全部至少一個及通常為兩個可變功能區，其中所有或實質上所有高度可變環狀區相當於彼等之非人類免疫球蛋白及所有或實質上所有FR區為彼等之人類免疫球蛋白序列。擬人化抗體視需要亦將包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常為人類免疫球蛋白之恆定區。關於進一步細節，參見 Jones, et al., Nature 1986, 321, 522-525；Riechmann, et al., Nature 1988, 332, 323-329及Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 1992, 2, 593-596。本文敘述之抗體亦可經修飾以使用已知賦予增進(例如，減少)效應物功能及/或FcR結合之任何Fc變異體。Fc變異體可包括，舉例而言，揭示於國際專利申請公告案Nos. WO 1988/07089 A1、WO 1996/14339 A1、WO 1998/05787 A1、WO 1998/23289 A1、WO 1999/51642 A1、WO 99/58572 A1、WO 2000/09560 A2、WO 2000/32767 A1、WO 2000/42072 A2、WO 2002/44215 A2、WO 2002/060919 A2、WO 2003/074569 A2、WO 2004/016750 A2、WO 2004/029207 A2、WO 2004/035752 A2、WO 2004/063351 A2、WO 2004/074455 A2、WO 2004/099249 A2、WO 2005/040217 A2、WO 2005/070963 A1、WO 2005/077981 A2、WO 2005/092925 A2、WO 2005/123780 A2、WO 2006/019447 A1、WO 2006/047350 A2及WO 2006/085967 A2；與美國專利案Nos. 5,648,260、5,739,277、5,834,250、5,869,046、6,096,871、6,121,022、6,194,551、6,242,195、6,277,375、6,528,624、6,538,124、6,737,056、6,821,505、6,998,253及7,083,784中之任一胺基酸置換；該等揭示內容併入本文以資參考。
“嵌合抗體”一詞擬意指其中可變區序列衍生自一種物種而恆定區序列衍生自其他物種之抗體，例如其中可變區序列衍生自小鼠抗體而恆定區序列衍生自人類抗體之抗體。
“雙功能抗體”為具有兩個抗原結合部位之小抗體片段。該等片段包含連接於相同多肽鏈(VH -VL 或VL -VH )中之輕鏈可變功能區(VL )之重鏈可變功能區(VH )。經由使用太短而不容許相同鏈上兩個功能區間配對之連接子，該等功能區被迫與另一鏈之互補功能區配對且產生兩個抗原結合部位。雙功能抗體更完整地見述於例如歐洲專利案No. EP 404,097、國際專利公告案No. WO 93/11161及Bolliger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 6444-6448。
“醣基化”一詞係指抗體經修飾之衍生物。無醣基化之抗體缺少醣基化。可改變醣基化以例如增加抗體對抗原之親和性。該等碳水化合物修飾可經由例如改變該抗體序列內一或多個部位之糖基化完成。舉例而言，可進行一或多個胺基酸置換導致排除一或多個可變區架構之醣基化部位從而排除該部位之醣基化。如美國專利案Nos. 5,714,350與6,350,861所述，無醣基化可增加抗體對抗原之親和性。此外或替代地，可製造具有改變的醣基化類型之抗體，例如具有減少量之岩藻糖基殘基之低岩藻糖基化抗體或具有增加之二等分GlcNac結構之抗體。該等改變之醣基化模式已被證明增強抗體能力。該等碳水化合物修飾可經由，例如，於具有改變醣基化機制之宿主細胞中表現該抗體而完成。具有改變的醣基化機制之細胞已見述於此項技藝中，並可使用作為宿主細胞於其中表現本發明之重組抗體從而產生具有改變的醣基化之抗體。舉例而言，Ms704、Ms705及Ms709等細胞株缺少岩藻糖基轉移酶基因，FUT8 [α(1,6)岩藻糖基轉移酶]，因此於Ms704、Ms705及Ms709細胞株中表現之抗體於其碳水化合物上缺少岩藻糖。該等Ms704、Ms705及Ms709 FUT8−/−細胞株係經由使用兩種替換載體於CHO/DG44細胞中靶向崩解FUT8基因而產生(參見例如美國專利公告案No. 2004/0110704或Yamane-Ohnuki, et al., Biotechnol. Bioeng., 2004, 87, 614-622)。作為另一實例，歐洲專利案 No. EP 1,176,195敘述具功能性崩解編碼岩藻糖基轉移酶FUT8基因之細胞株，使得該等細胞株中表現之抗體由於減少或排除α1,6鍵結相關酵素而展現低岩藻糖基化，亦敘述具有用於添加岩藻糖至與抗體Fc 區結合之N-乙醯葡萄糖胺之低酵素活性或不具酵素活性之細胞株，例如大鼠骨髓瘤細胞株YB2/0(ATCC CRL 1662)。國際專利公告案WO 03/035835敘述變異體CHO細胞株、Lec 13細胞，其將岩藻糖連結於與Asn(297)連接的碳水化合物之能力降低，亦導致於該宿主細胞中表現的抗體之低岩藻糖基化(亦參見Shields, et al., J. Biol. Chem. 2002, 277, 26733-26740)。國際專利公告案WO 99/54342敘述經工程處理以表現醣蛋白修飾之醣基轉移酶[例如，β(1,4)-N-乙醯葡糖胺基轉移酶III(GnTIII)]之細胞株，使得於經工程處理細胞株中表現之抗體展現增加之二等分GlcNac結構，導致抗體增強之ADCC活性(亦參見Umana, et al., Nat. Biotech. 1999, 17, 176-180)。替代地，可使用岩藻糖苷酶酵素割開抗體之岩藻糖殘基。舉例而言，岩藻糖苷酶，如見述於Tarentino, et al., Biochem. 1975, 14, 5516-5523中之α-L-岩藻糖苷酶從抗體移除岩藻糖基之殘基。
“聚乙二醇化”係指經修飾之抗體或其片段，其通常中一或多個PEG基團成為連接抗體或抗體片段之情況下和聚乙二醇(PEG)(例如PEG之反應性酯或醛衍生物)反應。聚乙二醇化可，例如，增加抗體之生物(例如血清)半衰期。較佳為，聚乙二醇化經由與反應性PEG分子(或類似之反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷化反應進行。本文所用之“聚乙二醇”一詞擬涵蓋已用以衍生化其他蛋白質之任何形式之PEG，例如單(C1 -C10 )烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。欲聚乙二醇化之抗體可為無醣基化抗體。聚乙二醇化之方法為此項技藝中已知且可適用於本發明抗體，例如歐洲專利案Nos. EP 0154316與EP 0401384及美國專利案No. 5,824,778中所述，其中各者之揭示內容均併入本文以資參考。
“融合蛋白”或“融合多肽”等詞係指結合兩種或兩種以上個別蛋白質特性之蛋白質。該等蛋白質具有直接或經由胺基酸連接子共價連接之至少兩個異源多肽。形成融合蛋白之多肽通常將C端連接至N端，然而其亦可連接C端至C端、N端至N端、或N端至C端。融合蛋白之多肽可呈任何順序排列且可包括多於一或兩種之構成多肽。該術語涵蓋保守性經修飾之變異體、多形型性變異體、對偶基因、突變體、次序列、種間同源物及組成融合蛋白的抗原之免疫原性片段。本揭示內容之融合蛋白亦可包含成分抗原或其免疫原性片段之額外複製物。融合蛋白可含有一或多個一起連接且進一步連接於Fc功能區(例如IgG Fc功能區)之結合功能區。融合蛋白可進一步一起連接以模擬單株抗體且提供六個或六個以上結合功能區。融合蛋白可利用此項技藝中已知之重組方法產生。融合蛋白之製備為此項技藝中已知且見述於，例如，國際專利申請公告案Nos. WO 1995/027735 A1、WO 2005/103077 A1、WO 2008/025516 A1、WO 2009/007120 A1、WO 2010/003766 A1、WO 2010/010051 A1、WO 2010/078966 A1、美國專利申請公告案Nos. US 2015/0125419 A1與US 2016/0272695 A1及美國專利案No. 8,921,519，各者之揭示內容均併入本文以資參考。
“異源”一詞於提及使用核酸或蛋白質部分時表示該核酸或蛋白質包含自然界中找不到彼此間相同關係之兩種或兩種以上次序列。例如，核酸通常重組產生，安排源自無關聯基因的兩種或兩種以上序列(例如源自一種來源之啓動子及源自另一來源之編碼區，或源自不同來源之編碼區)以建造新的功能性核酸。同樣地，異源蛋白質表示該蛋白質包含自然界中找不到彼此間相同關係之兩種或兩種以上次序列(例如融合蛋白)。
“保守性胺基酸置換”一詞意指不廢止抗體或融合蛋白與抗原結合之胺基酸序列修飾。保守性胺基酸胺基酸置換包括一類型胺基酸被相同類型胺基酸之置換，其中類型係由常見之物理化學胺基酸側鏈性質與自然界中發現之同源蛋白質中，例如由標準戴霍芙(Dayhoff)頻率交換矩陣或BLOSUM矩陣測定之高置換頻率界定。已對胺基酸側鏈之六種普遍類型進行分類及包括：類型I(Cys)、類型II(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)、類型III(Asn、Asp、Gln、Glu)、類型IV(His、Arg、Lys)、類型V(Ile、Leu、Val、Met)及類型VI(Phe、Tyr、Trp)。舉例而言，以Asp置換另一類型III殘基例如Asn、Gln、或Glu為保守性置換。因此，抗體中經預測之非必需胺基酸殘基較佳為以源自相同類型之其他胺基酸殘基取代。鑑定不排除抗原結合之胺基酸保守性置換之方法於此項技藝中為眾所周知(參見，例如，Brummell, et al., Biochemistry 1993, 32, 1180-1187；Kobayashi, et al., Protein Eng. 1999, 12, 879-884(1999)及Burks, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 412-417)。
“序列同一性”、“同一性百分比”及“序列同一性百分比”(或其同義詞，例如“99%完全相同”)等詞，於兩種或兩種以上核酸或多肽之情況下，係指兩種或兩種以上序列或次序列相同或當比較與序列排比(必要時引入缺口)以得到最大對應性時具有相同核苷酸或胺基酸殘基之指定百分比，而不考慮任何保守性胺基酸置換作為序列同一性之一部分。同一性百分比可使用序列比較軟體或演算法或經由目視檢查測量。可用以得到胺基酸或核苷酸序列之序列排比之多種演算法與軟體為此項技藝中已知。決定序列同一性百分比之適當程式包括例如可從美國政府之國家生物技術資訊中心BLAST網站得到BLAST程式套。可使用BLASTN或BLASTP演算法進行兩個序列間之比較。BLASTN用以比較核酸序列，而BLASTP則用以比較胺基酸序列。ALIGN、ALIGN-2(Genentech, South San Francisco, California)或MegAlign可得自DNASTAR，為可用以排比序列之追加公開可用之軟體程式。任何熟習此項技藝者可利用特定序列排比軟體，決定用於最大序列排比之適當參數。於特定具體實例中，使用序列排比軟體之系統內定參數。
本文所用之“變異體”一詞涵蓋惟不限於抗體或融合蛋白，其包含經由在參照抗體之胺基酸序列內或鄰近之特定位置處之一或多個置換、缺失及/或加成而與參照抗體之胺基酸序列不同之胺基酸序列。相較於參照抗體之胺基酸序列，變異體可於其胺基酸序列中包含一或多個保守性置換。保守性置換可包含，例如，同樣荷電或未荷電胺基酸之置換。該變異體保留與參照抗體之抗原特異性結合之能力。變異體一詞亦包括聚乙二醇化之抗體或蛋白質。
核酸序列隱含地涵蓋其經保守性修飾之變異體(例如，簡併密碼子置換)與互補序列及明確指出之序列。具體而言，簡併密碼子置換可經由產生其中一或多個挑選(或所有)密碼子之第三位置被混合鹼基及/或去氧肌苷殘基置換之序列達成。Batzer, et al., Nucleic Acid Res. 1991, 19, 5081；Ohtsuka, et al., J. Biol. Chem. 1985, 260, 2605-2608；Rossolini, et al., Mol. Cell. Probes 1994, 8, 91-98。核酸一詞與cDNA、mRNA、寡核苷酸及多核苷酸互換使用。
“生物模擬藥”一詞意指包括單株抗體或蛋白質之生物產品，儘管在臨床上無活性成分之不重要差異，其高度類似美國特許之參照生物產品，且就產品之安全性、純度及效價而論，在生物產品與參照產品間無臨床上有意義之差異。再者，類似之生物或“生物模擬藥”藥品為生物藥品，其類似已被歐洲藥品管理局認可使用之另一生物藥品。“生物模擬藥”一詞亦被其他國家與地方性監管機構同義使用。生物產品或生物藥品為經由或衍生自生物來源(例如細菌或酵母)製造之藥品；其可由相對小之分子(例如人類胰島素或紅血球生成素)或複雜分子(例如單株抗體)構成。舉例而言，若該參照IL-2蛋白質為阿地介白素(PROLEUKIN)，則由藥物監管機構批准涉及阿地介白素之蛋白質為“生物性類似於”阿地介白素或為阿地介白素之“生物模擬藥”。在歐洲，類似之生物性或“生物模擬藥”藥品為生物藥品，其類似於已經歐洲藥品管理局(EMA)認可使用之另一生物藥品。在歐洲類似生物應用之相關法律依據是法規(EC)No 726/2004第6條與指令2001/83/EC第10(4)條，已經修訂，因此於歐洲，生物模擬藥可根據法規(EC)No 726/2004第6條與指令2001/83/EC第10(4)條授權、批准授權或主題之申請授權。已授權之原始生物醫藥產品在歐洲可稱為“參照醫藥產品”。將產品視為生物模擬藥之若干必要條件概述於CHMP Guideline on Similar Biological Medicinal Product中。此外，產品之特定規範，包括有關單株抗體生物模擬藥之規範，由EMA以產品對產品之基礎上提供並在其網站上發表。經由品質特性、生物活性、作用機制、安全相關概況及/或效力，本文敘述之生物模擬藥可與參照醫藥產品類似。此外，生物模擬藥可用於或旨在用以治療與參照醫藥產品相同之症狀。因此，本文所述之生物模擬藥可被認為具有與參照醫藥產品類似或高度類似之品質特性。替代地，或此外，本文所述之生物模擬藥可被認為具有與參照醫藥產品類似或高度類似之生物活性。替代地，或此外，本文所述之生物模擬藥可被認為具有與參照醫藥產品類似或高度類似之安全相關概況。替代地，或此外，本文所述之生物模擬藥可被認為具有與參照醫藥產品類似或高度類似之效力。如本文所述，比較歐洲之生物模擬藥與已經EMA授權之參照醫藥產品。然而，於若干情況中，可將該生物模擬藥與在特定研究中已被歐洲經濟區範圍外(非EEA授權之“比較組”)授權之生物醫藥產品進行比較。該等研究包括例如特定臨床與活體內之非臨床研究。本文所用“生物模擬藥”一詞亦有關已經或可與非EEA授權之比較組比較之生物醫藥產品。某些生物模擬藥為蛋白質，例如抗體、抗體片段(例如抗原結合部分)與融合蛋白。蛋白質生物模擬藥可具胺基酸序列，其胺基酸結構中具有不顯著影響該多肽功能之較小之修飾(包括例如胺基酸之缺失、加成、及/或置換)。該生物模擬藥可包含與其參照醫藥產品之胺基酸序列具有97%或更大(例如97%、98%、99%或100%)序列同一性之胺基酸序列。該生物模擬藥可包含一或多種轉譯後修飾，例如，惟不限於，醣基化、氧化、脫醯胺化、及/或截短，其等不同於參照醫藥產品之轉譯後修飾，只要該差異不導致醫藥產品安全性及/或效力上之變化即可。該生物模擬藥可具有相同或不同於參照醫藥產品之醣基化模式。特別是，惟非排外地，若該差異提出或旨在提出與參照醫藥產品關聯之安全性問題，則該生物模擬藥可具有不同之醣基化模式。此外，若不危及醫藥產品之安全性與效力，該生物模擬藥可於其例如強度、醫藥形式、調配、賦形劑及/或呈現上偏離參照醫藥產品。相較於參照醫藥產品，該生物模擬藥可能包含於例如藥物動力學(PK)及/或藥效動力學(PD)概況上之差異，惟仍被認為與參照醫藥產品充分類似，以被授權或認為適合授權。於特定環境下，相較於參照醫藥產品，該生物模擬藥展現不同之結合特性，其中例如EMA之監管機構認為不同結合特性不會成為類似生物產品授權之障礙。“生物模擬藥”一詞亦被其他國家與地方性監管機構同義使用。
“血液惡性腫瘤”一詞係指哺乳動物癌症與造血及類淋巴組織之腫瘤，包括，惟不限於，血液、骨髓、淋巴結及淋巴系統組織。血液惡性腫瘤可能導致形成“液體腫瘤”。血液惡性腫瘤包括，惟不限於，急性淋巴胚細胞白血病(ALL)、慢性淋巴球性淋巴瘤(CLL)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、急性類骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性單核細胞性白血病(AMoL)、霍奇金氏淋巴瘤及非霍奇金氏淋巴瘤。“B細胞血液惡性腫瘤”一詞係指影響B細胞之血液惡性腫瘤。
“液體腫瘤”一詞係指本質上為流體之異常細胞塊。液體腫瘤癌包括，惟不限於，白血病、骨髓瘤及淋巴瘤、以及其他血液惡性腫瘤。得自液體腫瘤之TIL，包括駐留在骨髓中之液體腫瘤，於本文中亦可稱為骨髓浸潤性淋巴細胞(MILs)。得自液體腫瘤之TIL，包括在周邊血液中循環之液體腫瘤，於本文中亦可稱為PBL。MIL、TIL及PBL等詞在本文中可互換使用，並僅根據該細胞所衍生組織類型而有所不同。
“活體組織切片檢查”一詞係指用以得到癌細胞之任何醫療程序，包括骨髓活體組織切片檢查。
“急性類骨髓性白血病”或“AML”等詞係指類骨髓性血液細胞株之癌症，於此項技藝中亦稱為急性骨髓性白血病及急性非淋巴球性白血病。儘管AML為液體腫瘤，惟AML之若干症狀(包括髓外症狀例如綠色瘤)展現實體腫瘤之性質，於本文中被歸類為液體腫瘤。
本文所用之“微環境”一詞可指為整體之實體或血液腫瘤微環境，或於微環境內的細胞之個別子集。本文所用之腫瘤微環境係指“細胞、可溶性因子、傳訊分子、細胞外基質及促進腫瘤性轉形、支撐腫瘤生長與侵襲、保護腫瘤免受宿主免疫傷害、培植治療抗性等之機械信號、及為優勢轉移茁壯成長提供之利基”之複雜混合物，如於Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473中所述。雖然腫瘤表現應被T細胞辨識之抗原，惟因微環境之免疫抑制，經由免疫系統之腫瘤清除很罕見。
“有效量”或“有效治療量”一詞係指本文所述化合物或化合物組合之量足以實現預期應用，包括，惟不限於，疾病治療。有效治療量可視預期之應用(活體外或活體內)、或所治療之個體與疾病症狀(例如個體體重、年齡與性別)、疾病症狀之嚴重度、或給藥方式而變更。該術語亦適用於將在標靶細胞中誘發特定反應(例如，血小板黏附及/或細胞移動之下降)之劑量。具體劑量將視所選擇特定化合物、欲遵循之給藥方案、該化合物是否與其他化合物組合給藥、給藥時間、給藥之組織及運送化合物之實體遞送系統而不同。
本文所用之“治療效果”一詞涵蓋治療效益及/或預防效益。預防效果包括延緩或排除疾病或症狀出現、延緩或排除疾病或症狀病徵開始、遲緩、終止、或逆轉疾病或症狀進展或彼等之任何組合。
“治療”等詞係指獲得期望之藥理及/或生理作用。該作用，就完全或部分預防疾病或其病徵而言可為預防性，及/或就部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之有害作用而言可為治療性。本文所用之“治療”包含哺乳動物特別是人類疾病之任何治療及包括：(a)預防疾病發生於可能易感染該疾病惟尚未被診斷為患有該疾病之個體；(b)抑制疾病，即，阻止其形成或進展及(c)緩和疾病，即，引起疾病消退及/或緩和一或多種疾病病徵。“治療”亦意欲涵蓋遞送藥劑俾使提供藥理作用，即使於無疾病或症狀存在下。舉例而言，“治療”涵蓋遞送可於無疾病症狀存在下，引出免疫反應或賦予免疫力之組成物，例如疫苗之情形。
“QD”、“qd”、或“q.d.”等詞意指每天一次(quaque die)。“BID”、“bid”、或“b.i.d.”等詞意指每天兩次(bis in die)。“TID”、“tid”、或“t.i.d.”等詞意指每天三次(ter in die)。“QID”、“qid”、或“q.i.d.”等詞意指每天四次(quater in die)。
本文之“腫瘤浸潤性淋巴細胞”或“TIL”意指最初得到之為白血球細胞之細胞群，其已離開個體血流並移至腫瘤中。TIL包括，惟不限於，CD8+細胞毒性T細胞(淋巴細胞)、Th1及Th17 CD4+ T細胞、自然殺手細胞、樹突狀細胞與M1巨噬細胞。TIL包括初代與繼代TIL二者。“初代TIL”為得自如本文概述之病患組織試樣(有時稱為“經新鮮收獲”)者及“繼代TIL”為如本文論述之已經擴增或增殖之任何TIL細胞群，包括，惟不限於，如本所論述之原液TIL、擴增TIL(“REP TIL”)以及“reREP TIL”。
TIL通常可生化性地使用細胞表面標記或功能性地經由其浸潤腫瘤及達到治療之能力界定。TIL通常可經由表現一或多個下述生物標記進行分類：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。此外及替代地，TIL可經由其再引入病患體內後，浸潤實體腫瘤之能力功能性地界定。TIL可經由效價進一步表徵，舉例而言，如果，例如，干擾素(IFN)之釋放大於約50 pg/mL、大於約100 pg/mL、大於約150 pg/mL、或大於約200 pg/mL，則TIL可被認為具效力。
本文中“經冷凍保存之TIL”(或經冷凍保存之MILs或PBL)意指不論初代、原液、或擴增(REP TIL)，TIL係於約-150℃至-60℃之範圍內進行處理與貯存。用於冷凍保存之一般方法亦於本文別處(包括實施例中)敘述。為清楚起見，“經冷凍保存之TIL”與可作為初代TIL來源之冷凍組織試樣有所區分。
本文中之“經解凍之冷凍保存TIL”(或經解凍之MILs或PBL)意指先前經冷凍保存然後經處理以返回室溫或更高溫度(包括，惟不限於，細胞培養溫度或其中TIL可能給予病患之溫度)之TIL群。
本文中之“細胞群”(包括TIL)意指共有共同特徵之一些細胞。一般而言，該等群之數量通常在1×106 至1×1010 個之範圍，不同TIL群包含不同數量。舉例而言，於IL-2存在下，初代TIL之初始生長導使原液TIL群大約為1×108 個細胞。通常進行REP擴增以提供1.5×109 至1.5×1010 個細胞供輸注用。
通常，TIL最初從病患腫瘤試樣(“初代TIL”)獲得，然後擴增成為較大群供如本文所述之進一步操作用，視需要如本文概述予以冷凍保存、再刺激，及視需要評估為TIL健康指標之表現型與代謝參數。
通常，所收獲之細胞懸浮液稱為“初代細胞群”或“新鮮收獲之”細胞群。
通常，如本文所論述，該等TIL最初經由如本文論述之源自從病患切除之腫瘤獲得TIL之初代群(“初代細胞群”或“第一細胞群”)製備。隨後以利用該等細胞與IL-2培養之初始原液擴增，形成第二細胞群(本文中有時稱為“原液TIL群”或“第二群”)。
“細胞毒性淋巴細胞”一詞包括細胞毒性T(CTL)細胞(包括CD8+ 細胞毒性T淋巴細胞及CD4+ T輔助淋巴細胞)、自然殺手T(NKT)細胞及自然殺手(NK)細胞。細胞毒性淋巴細胞可包括，例如，經由腫瘤關聯抗原活化及/或用腫瘤專一性嵌合抗原受體或T細胞受體轉導之衍生自周邊血液之αβ TCR陽性或γδ TCR陽性T細胞及腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。
“中央記憶型T細胞”一詞係指CD45RO+且構成性表現CCR7(CCR7hi)與CD62L(CD62 hi)之人類T細胞子集。中央記憶型T細胞之表面表現型亦包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)及IL-15R。中央記憶型T細胞之轉錄因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2及BMII。於TCR觸發後，中央記憶型T細胞主要分泌為效應分子之IL-2與CD40L。中央記憶型T細胞主要在血液之CD4腔室中，且於人類中係成比例地於淋巴結與扁桃腺中富集。
“效應記憶型T細胞”一詞係指人類或哺乳動物T細胞之子集，如中央記憶型T細胞，為CD45RO+，惟已失去CCR7(CCR7lo)之構成性表現，且為異質或低CD62L表現(CD62Llo)。中央記憶型T細胞之表面表現型亦包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)及IL-15R。中央記憶型T細胞之轉錄因子包括BLIMP1。效應記憶型T細胞在抗原刺激後迅速分泌高量發炎性細胞介素，包括干擾素-γ、IL-4及IL-5。效應記憶型T細胞主要在血液之CD8腔室中，且於人體中係成比例於肺、肝及腸中富集。CD8+效應記憶型T細胞攜帶大量穿孔素。“封閉式系統”一詞係指對外部環境封閉之系統。適用於細胞培養法之任何封閉式系統均可與本發明方法一起使用。封閉式系統包括，例如，惟不限於封閉之G容器。一旦腫瘤區段被添加至封閉式系統中，在準備好TIL對病患給藥之前，該系統不會對外部環境開放。
於若干具體實例中，本揭示內容方法進一步包括“前REP”階段，其中係使腫瘤組織或源自腫瘤組織之細胞於標準實驗室培養液(包括，惟不限於，RPMI)中生長，且以例如經輻照之滋養層細胞及抗CD3抗體等試劑處理以達到期望之效應，例如增加TIL數量及/或富集含有期望細胞表面標記或其他結構性、生化或功能性特徵之細胞群。前REP階段可利用實驗級試劑(假設實驗級試劑於後REP階段期間被稀釋)，使得更容易併入替代策略以增進TIL生產。因此，於若干具體實例中，所揭示之TLR促效劑及/或胜肽或胜肽模擬物可於前REP階段期間包含於培養液中。於若干具體實例中，前REP培養可包含IL-2。於較佳態樣中本發明係有關以一或多種追加之再刺激實驗方法增強REPs之新穎方法，於本文中亦稱為“再刺激迅速擴增實驗方法”或“reREP”，相較於用於經再刺激的TIL(本文中有時稱為“reTIL”)之新鮮收獲TIL或經融化之冷凍保存TIL，其令人驚奇地導致擴增之記憶型T細胞子集(包括記憶型效應T細胞子集)及/或使醣解呼吸增強。亦即，經由針對經冷凍保存之TIL使用reREP程序，病患可得到高度代謝活性之健康TIL，導致更有利之結果。
當指示“抗腫瘤有效量”、“腫瘤抑制有效量”、或“治療量”時，要給予之本發明組成物之確切量可由醫生考慮該病患(個體)在年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移程度及症狀上之個別差異決定。通常可指定包含本文所述經基因改造的細胞毒性淋巴細胞之醫藥組成物可以104 至1011 個細胞/公斤體重(例如，105 至106 、105 至1010 、105 至1011 、106 至1010 、106 至1011 、107 至1011 、107 至1010 、108 至1011 、108 至1010 、109 至1011 、或109 至1010 個細胞/公斤體重)之劑量給予，包括在彼等範圍內之所有整數值。經基因改造細胞毒性淋巴細胞之組成物亦可以此等劑量多次給予。該經基因改造細胞毒性淋巴細胞可經由使用免疫療法中一般已知之輸注技術給予(參見，例如Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319：1676, 1988)。特定病患之最適劑量與療法可由熟習醫學技藝人士經由監測病患之疾病症候並相應調整治療容易地決定。
為避免疑慮，本文旨在理解所述特定特徵(例如整數、特性、數值、用途、疾病、配方、化合物或群組)與本發明特定態樣、具體實例或實施例之結合，除非不相容，否則可應用於本文所述之任何其他態樣、具體實例或實施例。因此，該等特徵可於適當情況下結合本文所界定之任何界定、申請專利範圍或具體實例使用。本說明書中所揭示之所有特徵(包括任何所附申請專利範圍、摘要與圖式)及/或如此所揭示之任何方法或方法之所有步驟，除其中至少若干特徵及/或步驟相互排斥之組合外，可於任何組合中結合。本發明不侷限於所揭示任何具體實例之任何細節。本發明延伸至本說明書(包括隨附任何申請專利範圍、摘要與圖式)中所揭示特徵之任何新穎或新穎之組合者，或如此揭示之任何方法或方法之步驟之任何新穎或任何新穎之組合者。
“約”與“大約”等詞意指在統計上有意義之數值範圍內。該等範圍可在特定值或範圍之數量級內，較佳為於50%內，更佳為於20%內，尚更佳為於10%內及又更佳為於5%內。“約”或“大約”等詞所涵蓋之可容許變異視所研究之特定系統而定，且一般熟習此項技藝人士可容易地理解。此外，本文所用之“約”與“大約”等詞意指尺度、大小、配方、參數、形狀、及其他數量與特性不精確也不需要精確，惟如所期望可為大約及/或更大或更小之反射耐量(reflecting tolerance)、轉換係數、捨入、測量誤差等，以及熟習此項技藝人士已知之其他因子。通常，無論是否明確如此說明，尺度、大小、配方、參數、形狀或其他數量或特性為“約”或“大約”。應注意的是，具非常不同之大小、形狀與尺度之具體實例可使用所述之安排。
於隨附之申請專利範圍中，以原始及修訂形式使用時，“包含”、“本質上由...構成”及“由...構成”等過渡詞界定有關未詳述之追加申請專利範圍要素或步驟之申請專利範圍，若存在，將被排除於本申請專利範圍之外。“包含”一詞旨在包括或無限制，且不排除任何追加之未詳述要素、方法、步驟或材料。“由...構成”一詞除於申請專利範圍中指定者外，不包括任何要素、步驟或材料，及於後一情況下之通常與指定材料關聯之雜質。“本質上由...構成”一詞限制申請專利範圍於指定之要素、步驟或材料及彼等不實質上影響本發明申請專利範圍之基本與新穎特性者。本文所述具體化本發明之所有組成物、方法及套組，可用交替之具體實例，經由“包含”、“本質上由...構成”及“由...構成”任一過渡詞更具體界定。 包括周邊血液(PBL)及/或骨髓(MILs)等治療性T細胞的擴增方法之具體實例 源自周邊血液的周邊血液淋巴細胞(PBL)之擴增方法
PBL方法1。於本發明之一具體實例中，係使用本文所述之方法擴增PBL。於本發明之一具體實例中，該方法包含取得源自全血之PBMC試樣。於一具體實例中，該方法包含經由使用負向選擇非CD19+區分單離源自PBMC之純T細胞以富集T細胞。第0天，使該等純T細胞與抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1：1比例(珠粒：細胞)和3000 IU/ml之IL-2一起培養。第4天，添加追加之3000 IU/ml IL-2於該培養物。第7天，該培養物用抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1：1比例(珠粒：細胞)再刺激，並添加追加之3000 IU/ml IL-2於該培養物。第14天收獲PBL，移除珠粒，對該等PBL進行計數與表現型分析。於一具體實例中，該方法包含經由使用磁珠系負向選擇非CD19+區分單離源自PBMC之純T細胞以富集T細胞。
於本發明之一具體實例中，PBL方法1進行如下：第0天，使冷凍保存之PBMC試樣解凍，進行PBMC計數。使用Human Pan T細胞Isolation Kit與LS管柱(Miltenyi Biotec, Inc., San Diego, CA, USA)單離T細胞。對單離之T細胞進行計數，並以每槽5×105 個細胞接種於GRex 24槽盤，且與Dyna珠粒® (抗CD3/抗CD28抗體)以1：1比例和3000 IU/ml之IL-2於每槽總共8ml CM2培養液中共培養。第4天，各槽中之培養液從CM2換成具有3000 IU/ml新鮮IL-2之AIM-V。第7天，收獲經擴增之細胞，計數，然後於具有3000 IU/ml IL-2之GRex I0M燒瓶中，以每個燒瓶15×106 個細胞與DynaBeads® 以1：1比例(珠粒：細胞)於總共100ml AIM-V培養液中培養。第11天，將培養液換成補充3000 IU/ml新鮮IL-2之CM-4培養液。第14天，使用DynaMag Magnet(DynaMag™-15)移除DynaBeads® ，進行細胞計數。
於本發明之一具體實例中，PBL方法1進行如下：第0天，使冷凍保存之PBMC試樣解凍，進行PBMC計數。使用Human Pan T細胞Isolation Kit與LS管柱(Miltenyi Biotec, Inc., San Diego, CA, USA)單離T細胞。對單離之T細胞進行計數，並以每槽5×105 個細胞接種於GRex 24槽盤，且與Dyna珠粒® (抗CD3/抗CD28抗體)以1：1比例和3000 IU/ml之IL-2於每槽總共8ml CM2培養液中共培養。第4天，各槽中之培養液從CM2換成具有3000 IU/ml新鮮IL-2之AIM-V。第7天，收獲該等PBL，計數，然後以每槽1×106 個細胞再接種於新的GRex-24槽盤，與3000 IU/ml IL-2和1：1比例(珠粒：細胞)之DynaBeads® 於總共8ml AIM-V培養液中共培養。第11天，將培養液換成補充3000 IU/ml新鮮IL-2之CM-4培養液。第14天，使用DynaMag Magnet(DynaMag™-15)移除DynaBeads® ，進行細胞計數。
PBL方法2。於本發明之一具體實例中，係使用PBL方法2擴增PBL，該方法包含取得源自全血之PBMC試樣。利用於37o C培育該等PBMC至少三小時富集源自該等PBMC之T細胞，接著單離非黏附細胞。然後與PBL方法1類似地擴增該等非黏附細胞，亦即，第0天，使非黏附細胞與抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1：1比例(珠粒：細胞)和3000 IU/ml之IL-2一起培養。第4天，添加追加之3000 IU/ml IL-2於該培養物。第7天，該培養物用抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1：1比例(珠粒：細胞)再刺激，並添加追加之3000 IU/ml IL-2於該培養物。第14天收獲PBL，移除珠粒，對該等PBL進行計數與表現型分析。
於本發明之一具體實例中，PBL方法2進行如下：第0天，使冷凍保存之PMBC試樣解凍，以每槽6百萬個細胞接種該等PBMC細胞於6槽盤之CM-2培養液中，於37o C培育3小時。3小時後，移除為PBL之非黏附細胞並計數。該等PBL以每槽1×106 個細胞，與珠粒：細胞1：1比例之抗CD3/抗CD28 DynaBeads® 和3000 IU/ml之IL-2於每槽總共7ml CM-2培養液之GRex 24槽盤中培養。第4天，以AIM-V培養液和3000 IU/ml新鮮IL-2交換各槽中之培養液。第7天，收獲經擴增之細胞，計數，然後於具有3000 IU/ml IL-2之GRex I0M燒瓶中，以每個燒瓶15×106 個細胞與DynaBeads® 以1：1比例(T細胞：珠粒)於總共100ml AIM-V培養液中培養。第11天，將培養液換成CM-4培養液並補充新鮮IL-2(3000 IU/ml)。第14天，使用DynaMag™ Magnet(DynaMag™-15)移除該等DynaBeads並進行細胞計數。
於本發明之一具體實例中，PBL方法2進行如下：第0天，使冷凍保存之PMBC試樣解凍，以每槽6百萬個細胞接種該等PBMC細胞於6槽盤之CM-2培養液中於37o C培育3小時。3小時後，移除為PBL之非黏附細胞並計數。該等PBL以每槽1×106 個細胞，與珠粒：細胞1：1比例之抗CD3/抗CD28 DynaBeads® 和3000 IU/ml之IL-2於每槽總共7ml CM-2培養液之GRex 24槽盤中培養。第4天，以AIM-V培養液和3000 IU/ml新鮮IL-2交換各槽中之培養液。第7天，收獲經擴增之細胞，計數，然後以每槽1×106 個細胞於新的Grex 24槽盤，與3000 IU/ml IL-2和1：1比例(T細胞：珠粒)之DynaBeads® 於總共8ml AIM-V培養液中培養。第11天，將培養液換成CM-4培養液並補充新鮮IL-2(3000 IU/ml)。第14天，使用DynaMag™ Magnet(DynaMag™-15)移除該等DynaBeads並進行細胞計數。
PBL方法3。於本發明之一具體實例中，係使用PBL方法3擴增PBL，該方法包含取得源自周邊血液之PBMC試樣。使用CD19+選擇單離B細胞並使用負向選擇PBMC試樣之非CD19+區分以選擇T細胞。第0天，使T細胞和B細胞與抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1：1比例(珠粒：細胞)和3000 IU/ml之IL-2共培養。第4天，添加追加之3000 IU/ml IL-2於該培養物。第7天，該培養物用抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1：1比例(珠粒：細胞)再刺激，並添加追加之3000 IU/ml IL-2於該培養物。第14天收獲PBL，移除珠粒，對該等PBL進行計數與表現型分析。
於本發明之一具體實例中，PBL方法3進行如下：第0天，使冷凍保存之衍生自周邊血液之PBMC解凍並計數。使用CD19 Multisort Kit, Human(Miltenyi Biotec, Inc., San Diego, CA, USA)分選CD19+ B細胞。於非CD19+細胞區分中，使用Human Pan T細胞Isolation Kit與LS Columns(Miltenyi Biotec, Inc., San Diego, CA, USA)純化T細胞。約3000IU/mL IL-2存在下，於Grex 24槽盤中，以不同比例使T細胞(PBL)與B細胞於約8ml CM2培養液中共培養。B細胞：T細胞比例為0.1：1、1：1及10：1。該T細胞/B細胞共培養物用抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1：1比例(珠粒：細胞)刺激。第4天，培養液從CM2換成AIM-V培養液，添加追加之3000 IU/ml IL-2於該培養物。第7天，收獲該等細胞並計數，每槽以細胞範圍約1.5×105 至約4×105 個細胞再接種於新Grex 24槽盤上之追加3000 IU/ml IL-2之AIM-V培養液中，並用抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1：1比例(珠粒：細胞)刺激。第14天，使用DynaMag™ Magnet(DynaMag™-15)移除該等DynaBeads並進行細胞計數。
於一具體實例中，從全血試樣單離PBMC。於一具體實例中，使用PBMC試樣作為起始物料以擴增該等PBL。於一具體實例中，於擴增方法之前，冷凍保存該試樣。於另一具體實例中，使用新鮮試樣作為起始物料以擴增該等PBL。於本發明之一具體實例中，使用此項技藝中已知之方法單離源自PBMC之T細胞。於一具體實例中，使用Human Pan T細胞Isolation Kit與LS管柱單離T細胞。於本發明之一具體實例中，使用此項技藝中已知之抗體選擇法(例如，CD19負向選擇)單離源自PBMC之T細胞。
於本發明之一具體實例中，該方法進行約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、或約14天。於另一具體實例中，該方法進行約7天。於另一具體實例中，該方法進行約14天。
於本發明之一具體實例中，該等PBMC與抗CD3/抗CD28抗體一起培養。於一具體實例中，任何可用之抗CD3/抗CD28產品皆可用於本發明。於本發明之一具體實例中，所用商購獲得產品為DynaBeads® 。於一具體實例中，DynaBeads® 與PBMC以1：1比例(珠粒：細胞)培養。於另一具體實例中，抗體為與比例1.5：1、2：1、2.5：1、3：1、3.5：1、4：1、4.5：1、或5：1(珠粒：細胞)之PBMC培養之DynaBeads® 。於本發明之一具體實例中，抗體培養步驟及/或以抗體再刺激細胞之步驟進行約2至約6天、約3至約5天、或約4天之期間。於本發明之一具體實例中，該抗體培養步驟進行約2天、3天、4天、5天、或6天之期間。
於一具體實例中，該PBMC試樣與IL-2一起培養。於本發明之一具體實例中，用於擴增源自PBMC的PBL之細胞培養液包含濃度為選自包括下述組群之IL-2：約100 IU/mL、約200 IU/mL、約300 IU/mL、約400 IU/mL、約100 IU/mL、約100 IU/mL、約100 IU/mL、約100 IU/mL、約100 IU/mL、約500 IU/mL、約600 IU/mL、約700 IU/mL、約800 IU/mL、約900 IU/mL、約1,000 IU/mL、約1,100 IU/mL、約1,200 IU/mL、約1,300 IU/mL、約1,400 IU/mL、約1,500 IU/mL、約1,600 IU/mL、約1,700 IU/mL、約1,800 IU/mL、約1,900 IU/mL、約2,000 IU/mL、約2,100 IU/mL、約2,200 IU/mL、約2,300 IU/mL、約2,400 IU/mL、約2,500 IU/mL、約2,600 IU/mL、約2,700 IU/mL、約2,800 IU/mL、約2,900 IU/mL、約3,000 IU/mL、約3,100 IU/mL、約3,200 IU/mL、約3,300 IU/mL、約3,400 IU/mL、約3,500 IU/mL、約3,600 IU/mL、約3,700 IU/mL、約3,800 IU/mL、約3,900 IU/mL、約4,000 IU/mL、約4,100 IU/mL、約4,200 IU/mL、約4,300 IU/mL、約4,400 IU/mL、約4,500 IU/mL、約4,600 IU/mL、約4,700 IU/mL、約4,800 IU/mL、約4,900 IU/mL、約5,000 IU/mL、約5,100 IU/mL、約5,200 IU/mL、約5,300 IU/mL、約5,400 IU/mL、約5,500 IU/mL、約5,600 IU/mL、約5,700 IU/mL、約5,800 IU/mL、約5,900 IU/mL、約6,000 IU/mL、約6,500 IU/mL、約7,000 IU/mL、約7,500 IU/mL、約8,000 IU/mL、約8,500 IU/mL、約9,000 IU/mL、約9,500 IU/mL及約10,000 IU/mL。
於本發明之一具體實例中，用於擴增方法的PBMC之起始細胞數為約25,000至約1,000,000、約30,000至約900,000、約35,000至約850,000、約40,000至約800,000、約45,000至約800,000、約50,000至約750,000、約55,000至約700,000、約60,000至約650,000、約65,000至約600,000、約70,000至約550,000個，較佳為約75,000至約500,000、約80,000至約450,000、約85,000至約400,000、約90,000至約350,000、約95,000至約300,000、約100,000至約250,000、約105,000至約200,000、或約110,000至約150,000個。於本發明之一具體實例中，PBMC之起始細胞數為約138,000、140,000、145,000個或更多。於另一具體實例中，PBMC之起始細胞數為約28,000個。於另一具體實例中，PBMC之起始細胞數為約62,000個。於另一具體實例中，PBMC之起始細胞數為約338,000個。於另一具體實例中，PBMC之起始細胞數為約336,000個。
於本發明之一具體實例中，該等細胞於GRex 24槽盤中生長。於本發明之一具體實例中，使用可相較之槽盤。於一具體實例中，用於擴增之起始物料為每槽約5×105 個T細胞。於本發明之一具體實例中，每槽有1×106 個細胞。於本發明之一具體實例中，每槽之細胞數足以接種該槽與擴增該等T細胞。
於本發明之一具體實例中，PBL之倍數擴增為約20%至約100%、25%至約95%、30%至約90%、35%至約85%、40%至約80%、45%至約75%、50%至約100%、或25%至約75%。於本發明之一具體實例中，倍數擴增為約25%。於本發明之另一具體實例中，倍數擴增為約50%。於另一具體實例中，倍數擴增為約75%。
於本發明之一具體實例中，可於整個方法之一或多天添加追加之IL-2於培養物。本發明之一具體實例中，於第4天添加追加之IL-2。本發明之一具體實例中，於第7天添加追加之IL-2。本發明之一具體實例中，於第11天添加追加之IL-2。另一具體實例中，於第4天、第7天、及/或第11天添加追加之IL-2。於本發明之一具體實例中，細胞培養液可於整個細胞培養方法期間之1天或多天更換。於一具體實例中，細胞培養液可於該方法之第4天、第7天及/或第11天更換。於本發明之一具體實例中，PBL與追加之IL-2培養1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天之期間。於本發明之一具體實例中，PBL於每次添加IL-2後，培養3天之期間。
一具體實例中，於該方法期間，更換細胞培養液至少一次。一具體實例中，於添加追加IL-2之相同時間更換細胞培養液。另一具體實例中，於第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13、或第14天之至少一天更換細胞培養液。於本發明之一具體實例中，整個方法所用細胞培養液可相同或不同。於本發明之一具體實例中，細胞培養液為CM-2、CM-4、或AIM-V。
本發明之一具體實例中，可於整個14天擴增方法中之一或多天，以抗CD3/抗CD28抗體再刺激T細胞。一具體實例中，於第7天再刺激T細胞。於一具體實例中，再刺激步驟係使用GRex 10M燒瓶。於本發明之一具體實例中，使用可相較之燒瓶。
於本發明之一具體實例中，使用DynaMag™ Magnet移除DynaBeads® ，進行細胞計數，使用如下文實施例中進一步敘述之表現型與功能性分析分析該等細胞。於本發明之一具體實例中，使用此項技藝中已知之方法使抗體與PBL或MILs分離。於前述任一具體實例中，使用TIL、PBL、或MILs之磁珠系選擇。
於本發明之一具體實例中，PBMC試樣於鑑定非黏附細胞有效之所需溫度下培育一段時間。於本發明之一具體實例中，該培育時間為約3小時。於本發明之一具體實例中，該溫度為約攝氏37o 。然後使用上述方法擴增非黏附細胞。
於本發明之一具體實例中，PBMC係得自已使用依魯替尼或其他ITK抑制劑治療之病患，該等如本文別處所述之ITK抑制劑。於本發明之一具體實例中，在獲得PBMC試樣以供前述包括PBL方法1、PBL方法2、或PBL方法3任一方法使用之前，該等PBMC係得自已使用依魯替尼或其他ITK抑制劑(包括如本文別處所述之ITK抑制劑)治療之病患。於本發明之一具體實例中，該ITK抑制劑治療已給藥至少1次、至少2次、或至少3次或更多次。於本發明之一具體實例中，源自以依魯替尼或其他ITK抑制劑預治療之病患擴增之PBL比源自未以依魯替尼或其他ITK抑制劑預治療之病患擴增者包含較少之LAG3+、PD-1+細胞。於本發明之一具體實例中，源自以依魯替尼或其他ITK抑制劑預治療之病患擴增之PBL比源自未以依魯替尼或其他ITK抑制劑預治療之病患擴增者包含增加量之IFN生產。於本發明之一具體實例中，於較低效應細胞：標靶細胞比例時，源自以依魯替尼或其他ITK抑制劑預治療之病患擴增之PBL比源自未以依魯替尼或其他ITK抑制劑預治療之病患擴增者包含增加之溶解活性。於本發明之一具體實例中，相較於未經治療之病患，以依魯替尼或其他ITK抑制劑預治療之病患具有較高之倍數擴增。
於本發明之一具體實例中，該方法包含於細胞培養中添加ITK抑制劑之步驟。於一具體實例中，ITK抑制劑係於該方法之第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、或第14天之一或多天添加。於一具體實例中，ITK抑制劑於該方法中更換細胞培養液那天添加。於一具體實例中，ITK抑制劑於更換細胞培養液之第0天添加。於一具體實例中，ITK抑制劑於該方法期間添加IL-2時添加。於一具體實例中，ITK抑制劑於該方法之第0天、第4天、第7天及視需要於第11天添加。於本發明之一具體實例中，ITK抑制劑於該方法之第0天及第7天添加。於本發明之一具體實例中，ITK抑制劑為此項技藝中已知者。於本發明之一具體實例中，ITK抑制劑為本文別處所述者。
於本發明之一具體實例中，該方法所用ITK抑制劑濃度為約0.1nM至約0.5μM。於一具體實例中，該方法所用ITK抑制劑濃度為約0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、550nM、600nM、650nM、700nM、750nM、800nM、850nM、900nM、950nM、1μM、2μM、3μM、4μM、或5μM。
於本發明之一具體實例中，當PBMC係衍生自先前未暴露於ITK抑制劑(例如依魯替尼)治療之病患時，該方法包含添加ITK抑制劑之步驟。於另一具體實例中，PBMC係衍生自先前已暴露於ITK抑制劑，惟已至少3個月、至少6個月、至少9個月、或至少1年未治療之病患。於另一具體實例中，PBMC係衍生自目前正進行ITK抑制劑(例如依魯替尼)療法之病患。
於本發明之一具體實例中，第0天，選擇CD19+之細胞並相應地分選。於本發明之一具體實例中，使用抗體結合珠粒進行選擇。於本發明之一具體實例中，第0天，單離源自PBMC之純T細胞。於本發明之一具體實例中，第0天，使該等CD19+ B細胞和純T細胞與抗CD3/抗CD28抗體共培養最少4天。於本發明之一具體實例中，第4天，添加IL-2於該培養物。於本發明之一具體實例中，第7天，以抗CD3/抗CD28抗體與追加之IL-2再刺激該培養物。於本發明之一具體實例中，第14天，收獲該等PBL。
於本發明之一具體實例中，就未以依魯替尼或其他ITK抑制劑預治療之病患而言，10-15ml 膚色血球層將產生約5×109 個PBMC，進而，將產生約5.5×107 個起始細胞物料及於擴增方法結束時產生約11×109 個PBL。於本發明之一具體實例中，約54×106 個PBMC將產生約6×105 起始物料及約1.2×108 個MIL(約205倍擴增)。
於本發明之一具體實例中，就以依魯替尼或其他ITK抑制劑預治療之病患而言，該擴增方法將產生約20×109 個PBL。於本發明之一具體實例中，40.3×106 個PBMC將產生約4.7×105 起始細胞物料及約1.6×108 個PBL(約338倍擴增)。
於本發明之一具體實例中，對於患有慢性淋巴球性白血病(CLL)之病患，本發明所用PBL之臨床劑量為約0.1×109 至約15×109 個PBL、約0.1×109 至約15×109 個PBL、約0.12×109 至約12×109 個PBL、約0.15×109 至約11×109 個PBL、約0.2×109 至約10×109 個PBL、約0.3×109 至約9×109 個PBL、約0.4×109 至約8×109 個PBL、約0.5×109 至約7×109 個PBL、約0.6×109 至約6×109 個PBL、約0.7×109 至約5×109 個PBL、約0.8×109 至約4×109 個PBL、約0.9×109 至約3×109 個PBL、或約1×109 至約2×109 個PBL。
於前述任一具體實例中，PBMC可衍生自全血試樣、經由血球分離、源自膚色血球層、或從此項技藝中已知之任何其他方法獲得PBMC。 從衍生自骨髓的PBMC擴增骨髓浸潤性淋巴細胞(MILs)之方法
MIL方法1。於本發明之一具體實例中，敘述從衍生自骨髓的PBMC擴增MILs之方法。於本發明之一具體實例中，該方法進行超過14天。於一具體實例中，該方法包含獲得骨髓PBMC並冷凍保存該等PBMC。第0天，該等PBMC與抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1：1比例(珠粒：細胞)和3000 IU/ml之IL-2一起培養。第4天，添加追加之3000 IU/ml IL-2於該培養物。第7天，該培養物用抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1：1比例(珠粒：細胞)再刺激，並添加追加之3000 IU/ml IL-2於該培養物。第14天，收獲MILs，移除珠粒，視需要進行MILs計數與表現型分析。
於本發明之一具體實例中，MIL方法1進行如下：第0天，使冷凍保存之衍生自骨髓之PBMC試樣解凍，進行PBMC計數。該等PBMC於3000IU/ml IL-2存在下，在GRex 24槽盤中，以每槽5×105 個細胞與抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1：1比例於每槽約8ml之CM-2細胞培養液(由RPMI-1640、人類AB血清、l-麩胺醯胺、2-巰基乙醇、硫酸健大黴素、AIM-V培養基組成)中共培養。第4天，以補充追加3000IU/ml IL-2之AIM-V更換細胞培養液。第7天，經擴增之MILs進行計數。於3000IU/ml IL-2存在下，以每槽1×106 個細胞轉移至新Grex 24槽盤，且與抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1：1比例於每槽約8ml之AIM-V培養液中培養。第11天，細胞培養液從AIM-V更換為CM-4(由AIM-V培養基、2mM Glutamax及3000IU/ml IL-2組成)。第14天，使用DynaMag Magnet(DynaMag™15)移除DynaBeads® 並進行MILs計數。
MIL方法2。於本發明之一具體實例中，該方法進行7天。於一具體實例中，該方法包含獲得衍生自骨髓之PMBCs並冷凍保存該等PBMC。第0天，該等PBMC與抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads® )以3：1比例(珠粒：細胞)和3000 IU/ml IL-2一起培養。第7天收獲MILs，移除珠粒，視需要進行MILs計數與表現型分析。
於本發明之一具體實例中，MIL方法2進行如下：第0天，使冷凍保存之PBMC試樣解凍，進行PBMC計數。該等PBMC於3000IU/ml IL-2存在下，在GRex 24槽盤中，以每槽5×105 個細胞與抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1：1比例於每槽約8ml之CM-2細胞培養液(由RPMI-1640、人類AB血清、l-麩胺醯胺、2-巰基乙醇、硫酸健大黴素、AIM-V培養基組成)中共培養。第7天，使用DynaMag Magnet(DynaMag™15)移除DynaBeads® 並進行MILs計數。
MIL方法3。於本發明之一具體實例中，該方法包含取得源自骨髓之PMBCs。第0天，針對CD3+/CD33+/CD20+/CD14+選擇該等PBMC並分選，非CD3+/非CD33+/非CD20+/非CD14+細胞區分進行音波處理，將一部分經音波處理之細胞區分加回經選擇之細胞區分中。添加3000 IU/ml IL-2於細胞培養物。第3天，該等PBMC與抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1：1比例(珠粒：細胞)和3000 IU/ml IL-2一起培養。第4天，添加追加之3000 IU/ml IL-2於該培養物。第7天，該培養物用抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1：1比例(珠粒：細胞)再刺激，並添加追加之3000 IU/ml IL-2於該培養物。添加3000 IU/ml IL-2於該培養物。第14天，收獲MILs，移除珠粒，視需要進行MILs計數與表現型分析。
於本發明之一具體實例中，MIL方法3進行如下：第0天，使冷凍保存之PBMC試樣解凍，進行PBMC計數。以CD3、CD33、CD20及CD14抗體將該等細胞染色及使用S3e細胞分選儀(Bio-Rad)進行分選。將細胞分選為兩個區分-免疫細胞區分(或MIL區分)(CD3+CD33+ CD20+CD14+)與AML胚細胞區分(非CD3+、非CD33+、非CD20+、非CD14+)。使欲接種於Grex 24槽盤上之約等於源自免疫細胞區分(或MIL區分)細胞數之源自AML胚細胞區分之細胞懸浮於100μl培養液中及進行音波處理。於此實施例中，取約2.8×104 至約3.38×105 個源自AML胚細胞區分之細胞，使其懸浮於100μl CM2培養液中，然後音波處理30秒。添加該100μl經音波處理之AML胚細胞區分於Grex 24槽盤中之免疫細胞區分。於6000IU/ml IL-2存在下，該等免疫細胞以每槽約2.8×104 至約3.38×105 個細胞之量存在每槽約8ml之CM-2細胞培養液中，且與部分AML胚細胞區分培養約3天。第3天，於各槽添加1：1比例之抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)及培養約1天。第4天，以補充追加3000IU/ml IL-2之AIM-V更換細胞培養液。第7天，經擴增之MILs進行計數。於3000IU/ml IL-2存在下，以每槽約1.5×105 至4×105 個細胞轉移至新Grex 24槽盤，與抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1：1比例於每槽約8ml之AIM-V培養液中培養。第11天，細胞培養液從AIM-V更換為CM-4(補充3000IU/ml IL-2)。第14天，使用DynaMag Magnet(DynaMag™15)移除DynaBeads® ，視需要進行MILs計數。
於本發明之一具體實例中，PBMC係得自骨髓。於一具體實例中，該等PBMC係經由血球分離、穿刺、針吸活檢、或此項技藝中已知之其他類似方法得自骨髓。於一具體實例中，該等PBMC是新鮮的。於另一具體實例中，該等PBMC經冷凍保存。
於本發明之一具體實例中，該方法進行約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、或約14天。於另一具體實例中，該方法進行約7天。於另一具體實例中，該方法進行約14天。
於本發明之一具體實例中，該等PBMC與抗CD3/抗CD28抗體一起培養。於一具體實例中，任何可獲得之抗CD3/抗CD28產品均可用於本發明。於本發明之一具體實例中，所用商購獲得產品為DynaBeads® 。於一具體實例中，DynaBeads® 與PBMC以1：1比例(珠粒：細胞)培養。於另一具體實例中，抗體為以1.5：1、2：1、2.5：1、3：1、3.5：1、4：1、4.5：1、或5：1比例(珠粒：細胞)與PBMC一起培養之DynaBeads® 。於前述任一具體實例中，係使用磁珠系選擇免疫細胞區分(或MIL區分)(CD3+CD33+CD20+CD14+)或AML胚細胞區分(非CD3+、非CD33+、非CD20+、非CD14+)。於本發明之一具體實例中，抗體培養步驟及/或以抗體再刺激細胞之步驟進行約2至約6天、約3至約5天、或約4天之期間。於本發明之一具體實例中，抗體培養步驟進行約2天、3天、4天、5天、或6天之期間。
於本發明之一具體實例中，源自AML胚細胞區分的細胞數與源自免疫細胞區分(或MIL區分)的細胞數之比例為約0.1：1至約10：1。於另一具體實例中，該比例為約0.1：1至約5：1、約0.1：1至約2：1、或約1：1。於本發明之一具體實例中，視需要崩解AML胚細胞區分打破細胞聚集。於一具體實例中，使用音波振動處理、均質化、細胞分解、渦動、或振動崩解AML胚細胞區分。於另一具體實例中，AML胚細胞區分使用音波振動處理予以崩解。於本發明之一具體實例中，非CD3+、非CD33+、非CD20+、非CD14+細胞區分(AML胚細胞區分)係使用適當分解方法[包括高溫分解、化學分解(例如有機醇類)、酵素分解及此項技藝中已知之其他細胞分解方法]分解。
於本發明之一具體實例中，係使源自AML胚細胞區分的細胞以每100μl約0.2×105 至約2×105 個細胞之濃度懸浮及添加於具有免疫細胞區分之細胞培養液。於另一具體實例中，該濃度為每100μl約0.5×105 至約2×105 個細胞、每100μl約0.7×105 至約2×105 個細胞、每100μl約1×105 至約2×105 個細胞、或每100μl約1.5×105 至約2×105 個細胞。
於一具體實例中，PBMC試樣與IL-2一起培養。於本發明之一具體實例中，用於擴增MILs之細胞培養液包含濃度為選自包括下述組群之IL-2：約100 IU/mL、約200 IU/mL、約300 IU/mL、約400 IU/mL、約100 IU/mL、約100 IU/mL、約100 IU/mL、約100 IU/mL、約100 IU/mL、約500 IU/mL、約600 IU/mL、約700 IU/mL、約800 IU/mL、約900 IU/mL、約1,000 IU/mL、約1,100 IU/mL、約1,200 IU/mL、約1,300 IU/mL、約1,400 IU/mL、約1,500 IU/mL、約1,600 IU/mL、約1,700 IU/mL、約1,800 IU/mL、約1,900 IU/mL、約2,000 IU/mL、約2,100 IU/mL、約2,200 IU/mL、約2,300 IU/mL、約2,400 IU/mL、約2,500 IU/mL、約2,600 IU/mL、約2,700 IU/mL、約2,800 IU/mL、約2,900 IU/mL、約3,000 IU/mL、約3,100 IU/mL、約3,200 IU/mL、約3,300 IU/mL、約3,400 IU/mL、約3,500 IU/mL、約3,600 IU/mL、約3,700 IU/mL、約3,800 IU/mL、約3,900 IU/mL、約4,000 IU/mL、約4,100 IU/mL、約4,200 IU/mL、約4,300 IU/mL、約4,400 IU/mL、約4,500 IU/mL、約4,600 IU/mL、約4,700 IU/mL、約4,800 IU/mL、約4,900 IU/mL、約5,000 IU/mL、約5,100 IU/mL、約5,200 IU/mL、約5,300 IU/mL、約5,400 IU/mL、約5,500 IU/mL、約5,600 IU/mL、約5,700 IU/mL、約5,800 IU/mL、約5,900 IU/mL、約6,000 IU/mL、約6,500 IU/mL、約7,000 IU/mL、約7,500 IU/mL、約8,000 IU/mL、約8,500 IU/mL、約9,000 IU/mL、約9,500 IU/mL及約10,000 IU/mL。
於本發明之一具體實例中，可於整個方法之一或多天添加追加之IL-2於培養液。於本發明之一具體實例中，第4天添加追加之IL-2。於本發明之一具體實例中，第7天添加追加之IL-2。於本發明之一具體實例中，第11天添加追加之IL-2。於另一具體實例中，第4天、第7、及/或第11天添加追加之IL-2。於本發明之一具體實例中，MILs與追加之IL-2培養1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天之期間。於本發明之一具體實例中，每次添加IL-2後，培養MILs 3天之期間。
於一具體實例中，於該方法期間，更換細胞培養液至少一次。一具體實例中，於添加追加IL-2之相同時間更換細胞培養液。另一具體實例中，於第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、或第14天之至少一天更換細胞培養液。於本發明之一具體實例中，整個方法所用細胞培養液可相同或不同。於本發明之一具體實例中，該細胞培養液為CM-2、CM-4、或AIM-V。於本發明之一具體實例中，細胞培養液更換步驟視需要於第11天進行。於本發明之一具體實例中，用於擴增方法的PBMC之起始細胞數為約25,000至約1,000,000、約30,000至約900,000、約35,000至約850,000、約40,000至約800,000、約45,000至約800,000、約50,000至約750,000、約55,000至約700,000、約60,000至約650,000、約65,000至約600,000、約70,000至約550,000個，較佳為約75,000至約500,000、約80,000至約450,000、約85,000至約400,000、約90,000至約350,000、約95,000至約300,000、約100,000至約250,000、約105,000至約200,000、或約110,000至約150,000個。於本發明之一具體實例中，PBMC之起始細胞數為約138,000、140,000、145,000、或更多個。於另一具體實例中，PBMC之起始細胞數為約28,000個。於另一具體實例中，PBMC之起始細胞數為約62,000個。於另一具體實例中，PBMC之起始細胞數為約338,000個。於另一具體實例中，PBMC之起始細胞數為約336,000個。
於本發明之一具體實例中，MILs之倍數擴增為約20%至約100%、25%至約95%、30%至約90%、35%至約85%、40%至約80%、45%至約75%、50%至約100%、或25%至約75%。於本發明之一具體實例中，該倍數擴增為約25%。於本發明之另一具體實例中，該倍數擴增為約50%。於另一具體實例中，該倍數擴增為約75%。
於本發明之一具體實例中，MILs係從10-50 ml骨髓抽出物擴增。於本發明之一具體實例中，10ml骨髓抽出物得自病患。於另一具體實例中，20ml骨髓抽出物得自病患。於另一具體實例中，30ml骨髓抽出物得自病患。於另一具體實例中，40ml骨髓抽出物得自病患。於另一具體實例中，50ml骨髓抽出物得自病患。
於本發明之一具體實例中，從約10-50ml骨髓抽出物產生約5×107 至約10×107 個PBMC。於另一具體實例中，產生約7×107 個PBMC。
於本發明之一具體實例中，約5×107 至約10×107 個PBMC，產生約0.5×106 至約1.5×106 個擴增起始細胞物料。於本發明之一具體實例中，產生約1×106 個擴增起始細胞物料。
於本發明之一具體實例中，於擴增期結束時，收獲之MILs總數為約0.01×109 至約1×109 、約0.05×109 至約0.9×109 、約0.1×109 至約0.85×109 、約0.15×109 至約0.7×109 、約0.2×109 至約0.65×109 、約0.25×109 至約0.6×109 、約0.3×109 至約0.55×109 、約0.35×109 至約0.5×109 、或約0.4×109 至約0.45×109 個。
於本發明之一具體實例中，衍生自骨髓抽出物之12×106 個PBMC產生大約1.4×105 個起始細胞物料，其於擴增方法結束時產生約1.1×107 個MILs。
於本發明之一具體實例中，相較於使用MIL方法1或MIL方法2擴增之MILs，使用上述MIL方法3從骨髓PBMC擴增之MILs含有高比例之CD8+細胞及數量較少之LAG3+與PD1+細胞。於本發明之一具體實例中，相較於使用MIL方法1或MIL方法2擴增之PBL，使用上述MIL方法3從血液PBMC擴增之PBL含有高比例之CD8+細胞與增加量之IFNγ產生。
於本發明之一具體實例中，用於患有急性類骨髓性白血病(AML)病患之MILs臨床劑量在約4×108 至約2.5×109 個MILs之範圍內。於另一具體實例中，本發明醫藥組成物中所提供MILs之數量為9.5×108 個MILs。於另一具體實例中，本發明醫藥組成物中所提供MILs之數量為4.1×108 個。於另一具體實例中，本發明醫藥組成物中所提供MILs之數量為2.2×109 個。
於前述任一具體實例中，PBMC可衍生自全血試樣、源自骨髓、經由血球分離、源自膚色血球層、或從此項技藝中已知之任何其他方法獲得PBMC。 使用“2A方法”擴增TIL之方法
於本發明之一具體實例中，本發明提供擴增衍生自骨髓及/或周邊血液的T細胞之裝置與方法。於本發明之一具體實例中，該等T細胞以多株惟高度腫瘤特異性方式具有源自骨髓微環境之更顯著腫瘤特異性。於一具體實例中，該骨髓微環境用以支撐及擴增T細胞。於本發明之一具體實例中，於7天或14天擴增方法中，TIL擴增大約25至100倍。於一具體實例中，TIL之倍數擴增為約30-90倍。於一具體實例中，倍數擴增為約35-85倍。於一具體實例中，倍數擴增為約40-80倍。於一具體實例中，倍數擴增為約45-75倍。於另一具體實例中，倍數擴增為約40-70倍。於另一具體實例中，倍數擴增為約45-65倍。於另一具體實例中，倍數擴增為約25倍、約30倍、約35倍、約40倍、約45倍及50倍、約55倍、約60倍、約65倍、約70倍、約75倍、約80倍、約85倍、約90倍、約95倍、或約100倍擴增。
於本發明之一具體實例中，該T細胞製造方法不需要選擇腫瘤特異性之任何干預。於本發明之一具體實例中，T細胞擴增時，該T細胞製造方法不需要腫瘤存在骨髓及/或周邊血液中。於一具體實例中，幾乎完全於骨髓存在下擴增T細胞。
於一具體實例中，本發明提供如實施例中所述之從骨髓及/或周邊血液提取T細胞之方法(特別是於WO2010/062742實施例21中闡述者，將其併入本文以資參考)。於一具體實例中，本發明提供見述於，例如，Noonan, et al., 2005, Cancer Res. 65：2026-2034(將其併入本文以資參考)之從骨髓及/或周邊血液提取T細胞之方法。
於一具體實例中，為熟習此項技藝者已知之獲得骨髓及/或周邊血液之方法可用於本發明。於本發明之一具體實例中，使用針穿刺得到骨髓及/或周邊血液。於本發明之一具體實例中，將源自病患的骨髓吸引入含肝素之注射器中並於室溫貯存過夜。於本發明之一具體實例中，貯存後，將注射器之內容物一起匯集至無菌容器中並測試品質。使用淋巴細胞分離培養液(LSM)及以COBE Spectra離心，使骨髓富集單核細胞(MNCs)。收集梯度中之細胞至紅血球中並用HBSS洗滌。使用補充2% HSA與5% DMSO之羥乙基澱粉系低溫保護劑冷凍保存MNCs，保留一些用於品質管制。融化QC小瓶以測定MNC產物之CD3+ 與CD38+ /138+ 細胞含量。重要的是要注意收集骨髓並非對本發明之限制。
於本發明之一具體實例中，將骨髓吸出並在淋巴細胞分離培養液之密度梯度上分劃，然後收集細胞至幾乎到紅血球沈澱物之程度。於一具體實例中，此分劃方法實質上移除紅血球與嗜中性白血球，提供幾乎完整之骨髓。於一具體實例中，產生之分劃物料為T細胞與腫瘤細胞。於本發明之一具體實例中，該方法可於無T細胞特異性分離步驟，且無腫瘤細胞分離步驟[例如，舉例而言，未以抗體或其他細胞類型特異性可檢測標誌標記T細胞，且未使用螢光激發細胞分選(FACS)進行分選整理]情況下實施。
於本發明之一具體實例中，使所得骨髓進行密度梯度分離(Ficolled)或使周邊血液於無血清狀況下，以200μL/槽、1×106 個細胞/mL懸浮於AIM-V培養液中。
於本發明之一具體實例中，從未完全緩解的個體收集骨髓。於本發明之一具體實例中，從完全緩解的個體收集骨髓。
於本發明之一具體實例中，可獲得並冷凍骨髓。於一具體實例中，可獲得骨髓並立即用以提取T細胞。
於進一步及根據上述任何具體實例中，本發明提供擴增TIL之方法，該方法包含接觸包含得自液體腫瘤之至少一種TIL之TIL群。本文中擴增TIL之所有論述皆可應用於擴增得自骨髓、周邊血液、及/或血液惡性腫瘤(包括液體腫瘤)之TIL。
於一具體實例中，本發明提供用於製備源自腫瘤之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含以下步驟： 　　(a)使成碎體之腫瘤與第一細胞培養液接觸； 　　(b)於該第一細胞培養液中進行該第一TIL群之初始擴增(前REP)以得到第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上比該第一TIL群多至少5倍，其中該第一細胞培養液包含IL-2； 　　(c)第二細胞培養液中進行該第二TIL群之二次擴增以得到第三TIL群，其中自該二次擴增開始7天後該第三TIL群於數量上比該第二TIL群多至少50倍，其中該第二細胞培養液包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經照射之同種異體周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中該二次擴增進行14天或少於14天之期間； 　　(d)收獲該第三TIL群；及 　　其中該腫瘤係液體腫瘤，且其中該癌症係血液惡性腫瘤。
於一具體實例中，本發明提供用於擴增TIL群之方法包括首次前迅速擴增(前REP)方法及隨後之二次擴增方法(其可為迅速擴增方法 - REP)，其中用於擴增之細胞培養液包含濃度為選自包括下述組群之IL-2：介於100 IU/mL與10,000 IU/mL之間、介於200 IU/mL與5,000 IU/mL之間、介於300 IU/mL與4,800 IU/mL之間、介於400 IU/mL與4,600 IU/mL之間、介於500 IU/mL與4,400 IU/mL之間、介於600 IU/mL與4,200 IU/mL之間、介於700 IU/mL與4,000 IU/mL之間、介於800 IU/mL與3,800 IU/mL之間、介於900 IU/mL與3,600 IU/mL之間、介於1,000 IU/mL與3,400 IU/mL之間、介於1,100 IU/mL與3,200 IU/mL之間、介於1,200 IU/mL與3,000 IU/mL之間、介於1,300 IU/mL與2,800 IU/mL之間、介於1,400 IU/mL與2,600 IU/mL之間、介於1,500 IU/mL與2,400 IU/mL之間、介於1,600 IU/mL與2,200 IU/mL之間、介於1,700 IU/mL與2,000 IU/mL之間、介於5,500 IU/mL與9,500 IU/mL之間、介於6,000 IU/mL與9,000 IU/mL之間、介於6500 IU/mL與8,500 IU/mL之間、介於7,000 IU/mL與8,000 IU/mL之間、及介於7,500 IU/mL與8,000 IU/mL之間。
於一具體實例中，本發明提供用於擴增TIL群之方法包括前迅速擴增(前REP)方法及迅速擴增方法(REP)，其中用於擴增之細胞培養液包含濃度為選自包括下述組群之IL-2：約100 IU/mL、約200 IU/mL、約300 IU/mL、約400 IU/mL、約100 IU/mL、約100 IU/mL、約100 IU/mL、約100 IU/mL、約100 IU/mL、約500 IU/mL、約600 IU/mL、約700 IU/mL、約800 IU/mL、約900 IU/mL、約1,000 IU/mL、約1,100 IU/mL、約1,200 IU/mL、約1,300 IU/mL、約1,400 IU/mL、約1,500 IU/mL、約1,600 IU/mL、約1,700 IU/mL、約1,800 IU/mL、約1,900 IU/mL、約2,000 IU/mL、約2,100 IU/mL、約2,200 IU/mL、約2,300 IU/mL、約2,400 IU/mL、約2,500 IU/mL、約2,600 IU/mL、約2,700 IU/mL、約2,800 IU/mL、約2,900 IU/mL、約3,000 IU/mL、約3,100 IU/mL、約3,200 IU/mL、約3,300 IU/mL、約3,400 IU/mL、約3,500 IU/mL、約3,600 IU/mL、約3,700 IU/mL、約3,800 IU/mL、約3,900 IU/mL、約4,000 IU/mL、約4,100 IU/mL、約4,200 IU/mL、約4,300 IU/mL、約4,400 IU/mL、約4,500 IU/mL、約4,600 IU/mL、約4,700 IU/mL、約4,800 IU/mL、約4,900 IU/mL、約5,000 IU/mL、約5,100 IU/mL、約5,200 IU/mL、約5,300 IU/mL、約5,400 IU/mL、約5,500 IU/mL、約5,600 IU/mL、約5,700 IU/mL、約5,800 IU/mL、約5,900 IU/mL、約6,000 IU/mL、約6,500 IU/mL、約7,000 IU/mL、約7,500 IU/mL、約8,000 IU/mL、約8,500 IU/mL、約9,000 IU/mL、約9,500 IU/mL及約10,000 IU/mL。
於一具體實例中，本發明提供用於擴增TIL群之方法包括前迅速擴增(前REP)方法。於一具體實例中，本發明提供擴增TIL群之前REP方法，該前REP方法包含使得自液體腫瘤之TIL群與細胞培養液接觸之步驟，其中該細胞培養液進一步包含初始濃度介於1000 IU/mL與6000 IU/mL間之IL-2。
於一具體實例中，本發明提供用於擴增TIL群之前REP方法，該方法包含使得自液體腫瘤之TIL群與細胞培養液接觸之步驟，其中該細胞培養液進一步包含初始濃度約6000 IU/mL之IL-2。
於一具體實例中，REP可於透氣容器中使用根據本揭示內容利用任何適當方法得自液體腫瘤之TIL進行。舉例而言，TIL可於介白素-2(IL-2)或介白素-15(IL-15)存在下，使用非特異性T細胞受體刺激迅速擴增。非特異性T細胞受體刺激可包括，例如，約30 ng/mL OKT-3、單株抗CD3抗體(可從Ortho-McNeil, Raritan, NJ或Miltenyi Biotech, Auburn, CA商購獲得)。TIL可視需要於T細胞生長因子(例如300 IU/mL IL-2或IL-15)存在下，利用於活體外以可視需要由載體表現之一或多種該癌症之抗原[包括其抗原性部分，例如抗原決定部位，例如人類白血球抗原A2(HLA-A2)結合肽，例如，0.3 μΜ MART-1 ：26-35(27 L)或gpl 00：209-217(210M)]進一步刺激TIL而迅速擴增。其他適當抗原可包括，例如，NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2、或其抗原性部分。TIL亦可利用以表現HLA-A2的抗原呈現細胞上脈衝之該癌症之相同抗原再刺激而迅速擴增。替代地，該等TIL可進一步以，例如，經輻照之自體淋巴細胞或以經輻照之HLA-A2+淋巴細胞與IL-2再刺激。
於一具體實例中，用於擴增TIL之方法可包括使用約5000 mL至約25000 mL細胞培養液、約5000 mL至約10000 mL細胞培養液、或約5800 mL至約8700 mL細胞培養液。於一具體實例中，用於擴增TIL之方法可包括使用約1000 mL至約2000 mL細胞培養液、約2000 mL至約3000 mL細胞培養液、約3000 mL至約4000 mL細胞培養液、約4000 mL至約5000 mL細胞培養液、約5000 mL至約6000 mL細胞培養液、約6000 mL至約7000 mL細胞培養液、約7000 mL至約8000 mL細胞培養液、約8000 mL至約9000 mL細胞培養液、約9000 mL至約10000 mL細胞培養液、約10000 mL至約15000 mL細胞培養液、約15000 mL至約20000 mL細胞培養液、或約20000 mL至約25000 mL細胞培養液。於一具體實例中，擴增TIL數量使用不超過一種細胞培養液。可使用任何適當細胞培養液，例如，AIM-V細胞培養液(L-麩胺醯胺、50 μM硫酸鏈黴素及10 μM硫酸健大黴素)細胞培養液(Invitrogen, Carlsbad CA)。就此而論，本發明方法有利地減少培養液用量與需要擴增TIL數量的培養液種類數量。於一具體實例中，擴增TIL數量可包括不比每隔三天或四天一次更頻繁餵養細胞。於透氣容器中擴增細胞數量經由減少需要擴增細胞之餵養頻率而簡化需要擴增細胞數量之程序。
於一具體實例中，二次擴增使用透氣容器進行。該等具體實例容許細胞群從約5×105 個細胞/cm2 擴增至10×106 與30×106 個細胞/cm2 之間。於一具體實例中，此擴增於無饋料下發生。於一具體實例中，只要透氣燒瓶中培養液位於約10 cm高度，則此擴增可於無饋料下發生。於一具體實例中，此擴增不需饋料惟需添加一或多種細胞介素。於一具體實例中，細胞介素可呈推注劑添加而無使細胞介素與培養液混合之需要。該等容器、裝置及方法為此項技藝中已知且已用於擴增TIL，包括見述於美國專利申請公告案No. US 2014/0377739 A1、國際專利申請公告案No. WO 2014/210036 A1、美國專利申請公告案No. US 2013/0115617 A1、國際公告案No. WO 2013/188427 A1、美國專利申請公告案No. US 2011/0136228 A1、美國專利案No. 8,809,050、國際專利申請公告案No. WO 2011/072088 A2、美國專利申請公告案No. US 2016/0208216 A1、美國專利申請公告案No. US 2012/0244133 A1、國際專利申請公告案No. WO 2012/129201 A1、 美國專利申請公告案No. US 2013/0102075 A1、美國專利案No. 8,956,860、國際專利申請公告案No. WO 2013/173835 A1及美國專利申請公告案No. US 2015/0175966 A1者，其揭示內容皆併人本文以資參考。該等方法亦見述於Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292，其揭示內容併入本文以資參考。
於一具體實例中，透氣容器為G-Rex 10燒瓶(Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)。於一具體實例中，透氣容器包括10 cm2 透氣培養表面。於一具體實例中，透氣容器包括40 mL細胞培養液容量。於一具體實例中，透氣容器於更換2次培養液後提供1至3億個TIL。
於一具體實例中，透氣容器為G-Rex 100燒瓶(Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)。於一具體實例中，透氣容器包括100 cm2 透氣培養表面。於一具體實例中，透氣容器包括450 mL細胞培養液容量。於一具體實例中，透氣容器於更換2次培養液後提供10至30億個TIL。
於一具體實例中，透氣容器為G-Rex 100M燒瓶(Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)。於一具體實例中，透氣容器包括100 cm2 透氣培養表面。於一具體實例中，透氣容器包括1000 mL細胞培養液容量。於一具體實例中，透氣容器於不更換培養液下提供10至30億個TIL。
於一具體實例中，透氣容器為G-Rex 100L燒瓶(Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)。於一具體實例中，透氣容器包括100 cm2 透氣培養表面。於一具體實例中，透氣容器包括2000 mL細胞培養液容量。於一具體實例中，透氣容器於不更換培養液下提供10至30億個TIL。
於一具體實例中，透氣容器為G-Rex 24槽盤(Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)。於一具體實例中，透氣容器包括具多槽之盤，其中各槽包括2 cm2 透氣培養表面。於一具體實例中，透氣容器包括具多槽之盤，其中各槽包括8 mL細胞培養液容量。於一具體實例中，透氣容器於更換2次培養液後每槽提供2至6千萬個細胞。
於一具體實例中，透氣容器為G-Rex 6槽盤(Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)。於一具體實例中，透氣容器包括具多槽之盤，其中各槽包括10 cm2 透氣培養表面。於一具體實例中，透氣容器包括具多槽之盤，其中各槽包括40 mL細胞培養液容量。於一具體實例中，透氣容器於更換2次培養液後每槽提供1至3億個細胞。
於一具體實例中，第一及/或第二透氣容器中之細胞培養液未經過濾。使用未經過濾之細胞培養液可簡化需要擴增細胞數量之程序。於一具體實例中，第一及/或第二透氣容器中之細胞培養液缺少β-巰基乙醇(BME)。
於一具體實例中，該方法(包括取得源自哺乳動物之腫瘤組織試樣；於其中含有細胞培養液之第一透氣容器中培養該腫瘤組織試樣；取得源自該腫瘤組織試樣之TIL；於其中含有細胞培養液之第二透氣容器中擴增TIL數量)持續時間為期約14至約42天，例如，約28天。
於一具體實例中，該細胞培養液包含IL-2。於較佳具體實例中，該細胞培養液包含約3000 IU/mL IL-2。於一具體實例中，該細胞培養液包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL、或約8000 IU/mL之IL-2。於一具體實例中，該細胞培養液包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間、或8000 IU/mL間之IL-2。
於一具體實例中，該細胞培養液包含OKT-3抗體。於較佳具體實例中，該細胞培養液包含約30 ng/mL OKT-3抗體。於一具體實例中，該細胞培養液包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL、及約1 µg/mL之OKT-3抗體。於一具體實例中，該細胞培養液包含介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL之間、介於40 ng/mL與50 ng/mL、及介於50 ng/mL與100 ng/mL之間之OKT-3抗體。
一具體實例中，於透氣容器中擴增TIL。已使用透氣容器，使用此項技藝中已知之方法、組成物及裝置，使用PBMC擴增TIL，包括見述於美國專利申請公告案號美國專利申請公告案號2005/0106717 A1者，其揭示內容皆併人本文以資參考。一具體實例中，於透氣袋中擴增TIL。於一具體實例中，係使用於透氣袋中擴增TIL之細胞擴增系統[例如Xuri Cell Expansion System W25(GE Healthcare)]擴增TIL。於一具體實例中，係使用於透氣袋中擴增TIL之細胞擴增系統[例如WAVE Bioreactor System，亦為所謂Xuri Cell Expansion System W5(GE Healthcare)]擴增TIL。於一具體實例中，該細胞擴增系統包括容量為選自包括下述組群之透氣細胞袋：約100 mL、約200 mL、約300 mL、約400 mL、約500 mL、約600 mL、約700 mL、約800 mL、約900 mL、約1 L、約2 L、約3 L、約4 L、約5 L、約6 L、約7 L、約8 L、約9 L、約10 L、約11 L、約12 L、約13 L、約14 L、約15 L、約16 L、約17 L、約18 L、約19 L、約20 L、約25 L及約30 L。於一具體實例中，該細胞擴增系統包括容量範圍為選自包括下述組群之透氣細胞袋：介於50與150 mL之間、介於150與250 mL之間、介於250與350 mL之間、介於350與450 mL之間、介於450與550 mL之間、介於550與650 mL之間、介於650與750 mL之間、介於750與850 mL之間、介於850與950 mL及介於950與1050 mL之間。於一具體實例中，該細胞擴增系統包括容量範圍為選自包括下述組群之透氣細胞袋：介於1 L與2 L之間、介於2 L與3 L之間、介於3 L與4 L之間、介於4 L與5 L之間、介於5 L與6 L之間、介於6 L與7 L之間、介於7 L與8 L之間、介於8 L與9 L之間、介於9 L與10 L之間、介於10 L與11 L之間、介於11 L與12 L之間、介於12 L與13 L之間、介於13 L與14 L之間、介於14 L與15 L之間、介於15 L與16 L之間、介於16 L與17 L之間、介於17 L與18 L之間、介於18 L與19 L、及介於19 L與20 L之間。於一具體實例中，該細胞擴增系統包括容量範圍為選自包括下述組群之透氣細胞袋：介於0.5 L與5 L之間、介於5 L與10 L之間、介於10 L與15 L之間、介於15 L與20 L之間、介於20 L與25 L之間、及介於25 L與30 L之間。於一具體實例中，該細胞擴增系統使用約30分鐘、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約24小時、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約15天、約16天、約17天、約18天、約19天、約20天、約21天、約22天、約23天、約24天、約25天、約26天、約27天及約28天之搖動時間。於一具體實例中，該細胞擴增系統使用介於30分鐘與1小時之間、介於1小時與12小時之間、介於12小時與1天之間、介於1天與7天之間、介於7天與14天之間、介於14天與21天之間及介於21天與28天之間之搖動時間。於一具體實例中，該細胞擴增系統使用約2次/分鐘、約5次/分鐘、約10次/分鐘、約20次/分鐘、約30次/分鐘及約40次/分鐘之搖動率。於一具體實例中，該細胞擴增系統使用介於2次/分鐘與5次/分鐘之間、5次/分鐘與10次/分鐘之間、10次/分鐘與20次/分鐘之間、20次/分鐘與30次/分鐘之間、及30次/分鐘與40次/分鐘之間之搖動率。於一具體實例中，該細胞擴增系統使用約2°、約3°、約4°、約5°、約6°、約7°、約8°、約9°、約10°、約11°及約12°之搖動角度。於一具體實例中，該細胞擴增系統使用介於2°與3°之間、介於3°與4°之間、介於4°與5°之間、介於5°與6°之間、介於6°與7°之間、介於7°與8°之間、介於8°與9°之間、介於9°與10°之間、介於10°與11°之間、及介於11°與12°之間之搖動角度。
於一具體實例中，得自液體腫瘤之擴增TIL之方法進一步包含選擇TIL以得到優異腫瘤反應性之步驟。可使用此項技藝中已知之任何選擇方法。例如，可使用見述於美國專利申請公告案No. 2016/0010058 A1(其揭示內容併入本文以資參考)之方法選擇TIL以得到優異之腫瘤反應性。
於一具體實例中，本發明提供源自液體腫瘤的TIL群之擴增方法，該方法包含如見述於Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292(其揭示內容併入本文以資參考)之步驟。例如，可將腫瘤或其部分置於酵素培養液中並機械式崩解大約1分鐘。隨後於37℃，在5% CO2 中培育此混合物30分鐘，然後再機械式崩解大約1分鐘。於37℃，在5% CO2 中培育30分鐘後，可第三次機械式崩解該腫瘤或其部分大約1分鐘。第三次機械式崩解後，若存在大片組織，則於有或無於37℃，在5% CO2 中培育追加30分鐘下，對該試樣施加1或2次追加之機械式解離。於最終培育終止時，若細胞懸浮液含有大量紅血球或死細胞，則可使用Ficoll進行密度梯度分離去除這些細胞。TIL培養從24槽盤(Costar 24槽細胞培養簇，平底；Corning Incorporated, Corning, NY)開始，各槽可接種於具有IL-2(6000 IU/mL；Chiron Corp., Emeryville, CA)之2 mL完全培養液(CM)中之1×106 個腫瘤水解細胞或大約1至8 mm3 大小之一腫瘤碎體。CM包含補充10%人類AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL健大黴素之具有GlutaMAX之Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640緩衝劑。培養可於具40 mL容量與10 cm2 透氣矽底之透氣燒瓶(G-Rex 10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton)中開始，各燒瓶可裝載於具有IL-2之10至40 mL CM中之10-40×106 個活腫瘤水解細胞或5至30個腫瘤碎體。G-Rex 10與24槽盤可於37℃，5% CO2 下的潮濕培養箱中培育，開始培養5天後，一半培養液可移除，以新鮮CM與IL-2替換及第5天後，每隔2-3天可更換一半培養液。TIL之二次擴增實驗方法(REP)可使用得自本揭示內容液體腫瘤之TIL，使用T-175燒瓶與透氣袋或如本文別處所述之透氣G-Rex燒瓶進行。關於T-175燒瓶中之REP，可使1×106 個TIL懸浮於各燒瓶之150 mL培養液中。該TIL可於補充3000 IU/mL IL-2與30 ng/ml抗CD3抗體(OKT-3)之CM與AIM-V培養液1比1混合物(50/50培養液)中培養。T-175燒瓶可於37℃，在5% CO2 中培育。第5天，可使用具3000 IU/mL IL-2之50/50培養液更換一半培養液。第7天，得自2個T-175燒瓶之細胞可於3L袋中結合及可添加具5%人類AB血清與3000 IU/mL IL-2 之300 mL AIM-V於該300 mL TIL懸浮液。每隔一或兩天可計算各個袋中之細胞數，且可添加新鮮培養液以保持細胞計數介於0.5與2.0×106 個細胞/mL之間。至於具有100 cm2 透氣矽底之500 mL容量燒瓶(例如，G-Rex 100，Wilson Wolf Manufacturing，如本文別處所述)中之REP，5×106 或10×106 個TIL可培養於補充3000 IU/mL IL-2與30 ng/ml抗CD3抗體(OKT-3)之400 mL 50/50培養液中。該G-Rex 100燒瓶可於37℃，在5% CO2 中培育。第五天，可移出250 mL上清液置於離心管中，並以1500 rpm(491 g)離心10分鐘。所得TIL片狀沉澱物可用150 mL具3000 IU/mL IL-2之50/50新鮮培養液使其再懸浮，並加回G-Rex 100燒瓶。當TIL於G-Rex 100燒瓶中連續擴增時，第七天，使各G-Rex100燒瓶中之TIL懸浮於存在各燒瓶中的300 mL培養液中，可使該細胞懸浮液分成可用以接種3個G-Rex 100燒瓶之三個100 mL等分試樣。然後可添加具5%人類AB血清與3000 IU/mL IL-2之約150 mL AIM-V於各燒瓶。接著可使該等G-Rex 100燒瓶於37℃，在5% CO2 中培育，四天後，可添加具3000 IU/mL IL-2之150 mL AIM-V於各G-Rex 100燒瓶。之後，可於培養之第14天回收細胞完成該REP。
於一具體實例中，擴增或治療癌症之方法包含從病患腫瘤試樣獲得TIL之步驟。病患腫瘤試樣可使用此項技藝中已知之方法獲得。舉例而言，TIL可從得自尖銳解剖的酵素性腫瘤水解物與腫瘤碎體(約1至約8 mm3 大小)培養。該等腫瘤水解物可於酵素培養液(例如，Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640緩衝劑、2 mM麩胺酸鹽、10 mcg/mL健大黴素、30單位/mL Dnase與1.0 mg/mL膠原酶)中培育，隨後機械式解離(例如，使用組織解離器)而產生。腫瘤水解物之產生可利用將腫瘤置於酵素培養液中及機械式分離該腫瘤大約1分鐘，隨後於37℃，在5% CO2 中培育30分鐘，隨後於前述條件下，進行機械式解離與培育之重複循環，直到只存在小組織碎體。此方法終止時，若細胞懸浮液含有大量紅血球或死細胞，則可使用FICOLL分支鏈之親水性多醣進行密度梯度分離去除這些細胞。可使用此項技藝中已知之替代方法，例如見述於美國專利申請公告案No. 2012/0244133 A1中者，其揭示內容併入本文以資參考。任一前述方法可用於本文所述任何具體實例中用於擴增TIL之方法或治療癌症之方法。
於一具體實例中，用於TIL之該第二/REP擴增方法可使用T-175燒瓶與如先前所述之透氣袋(Tran, et al., J. Immunother. 2008, 31, 742-51；Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42)或透氣培養器皿(G-Rex燒瓶，可從Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA商購獲得)進行。有關於T-175燒瓶中之TIL擴增，可添加懸浮於150 mL培養液中之1×106 個TIL於各T-175燒瓶。該等TIL可於補充3000 IU(國際單位)/mL IL-2與30 ng/ml抗CD3(例如，OKT-3)的CM與AIM-V培養液之1比1混合物中培養。該等T-175燒瓶可於37℃，在5% CO2 中培育。第5天，可使用具3000 IU/mL IL-2之50/50培養液更換一半培養液。第7天，可於3 L袋中使得自兩個T-175燒瓶的細胞結合，添加具5%人類AB血清與3000 IU/mL IL-2之300 mL AIM V於該300 ml TIL懸浮液。每隔一或兩天計算各袋中之細胞數，添加新鮮培養液使細胞計數保持於0.5與2.0×106 個細胞/mL之間。
於一具體實例中，關於在具100 cm2 透氣矽底(G-Rex 100，可從Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA商購獲得)的500 mL容量透氣燒瓶中之二次/REP TIL擴增，可使5×106 或10×106 個TIL於補充5%人類AB血清、3000 IU/mL IL-2與30 ng/ml抗CD3(OKT-3)之400 mL 50/50培養液中培養。該G-Rex 100燒瓶可於37℃，在5% CO2 中培育30分鐘。第5天，可移出250 mL上清液置於離心管中，並以1500 rpm(每分鐘之轉數；491×g)離心10分鐘。TIL片狀沉澱物可使用具有5%人類AB血清、3000 IU/mL IL-2之150 mL新鮮培養液使其再懸浮，並加回原來的G-Rex 100燒瓶中。當TIL於G-Rex 100燒瓶中連續擴增時，第7天，可使各G-Rex 100燒瓶中之該等TIL懸浮於存在各燒瓶中的300 mL培養液中，將該細胞懸浮液分成可用以接種3個G-Rex 100燒瓶之3個100 mL等分試樣。然後可添加具5%人類AB血清與3000 IU/mL IL-2之150 mL AIM-V於各燒瓶。該等G-Rex 100燒瓶可於37℃，在5% CO2 中保溫，4天後，添加具3000 IU/mL IL-2之150 mL AIM-V至各G-Rex 100燒瓶。於培養之第14天可回收細胞。
於一具體實例中，TIL可如下製備。使2 mm3 腫瘤碎體於由補充2 mM 麩胺醯胺(Mediatech, Inc. Manassas, VA)、100 U/mL青黴素(Invitrogen Life Technologies)、100 μg/mL鏈黴素(Invitrogen Life Technologies)、5%加熱失活之人類AB血清(Valley Biomedical, Inc. Winchester, VA)與600 IU/mL rhIL-2(Chiron, Emeryville, CA)的AIM-V培養基(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)組成之完全培養液(CM)中培養。為了液體腫瘤之酵素性分解，將腫瘤樣品切入RPMI-1640中，洗滌，15-22℃下，於800 rpm離心5分鐘，並再懸浮於酵素性分解緩衝液中(0.2 mg/mL膠原酶與30單位/ml Dnase於RPMI-1640中)，隨後於室溫旋轉過夜。由碎體建立之TIL可於CM中生長3-4週，新鮮擴增或於具10%二甲基亞碸(DMSO)之加熱失活HAB血清中冷凍保存，於-180℃貯存到研究時。得自腹水收集物之腫瘤相關淋巴細胞(TAL)以3×106 個細胞/槽接種於24槽盤之CM中。約每隔一天使用低功率倒立顯微鏡TIL生長檢查。 TIL製造方法(“2A方法”)之例示具體實例
圖22中綱要性地說明所謂方法2A之例示TIL製造/擴增方法。於特定態樣中，本發明方法產生給予個體/病患後能增加複製週期之TIL，如此可提供超越較老TIL(即，給予個體/病患之前已進一步經歷更多回合複製之TIL)之追加治療優勢。年輕TIL之特徵已見述於文獻，例如Donia, at al., Scandinavian Journal of Immunology, 75：157-167(2012)；Dudley et al., Clin Cancer Res, 16：6122-6131(2010)；Huang et al., J Immunother, 28(3)：258-267(2005)；Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17)：OF1-OF9(2013)；Besser et al., J Immunother 32：415-423(2009)；Robbins, et al., J Immunol 2004；173：7125-7130；Shen et al., J Immunother, 30：123-129(2007)；Zhou, et al., J Immunother, 28：53-62(2005)；與Tran, et al., J Immunother, 31：742-751(2008)；所有這些文獻全部內容均併入本文以資參考。
如本文所論述，本發明可包括有關移植至病患體內之前，再刺激經冷凍保存的TIL，以增加其代謝活性因而相對健康之步驟及測試上述代謝健康之方法。如本文一般概述，TIL通常取自病患試樣，於移植至病患體內之前，操作以擴增其數量。於若干具體實例中，該等TIL可視需要如下文所論述進行基因操作。
於若干具體實例中，可冷凍保存該等TIL。一旦解凍，亦可將其再刺激以於輸入病患體內之前增加其新陳代謝。
於若干具體實例中，如下文以及實施例與圖式中所述，相較於習知擴增方法，將首次擴增(包括稱為preREP之方法)縮短至7-14天及將二次擴增(包括稱為REP之方法)縮短至7-14天。
圖23說明例示之2A方法。如圖23及下文之進一步詳細說明，於若干具體實例中，首次擴增(步驟B)縮短至11天及二次擴增(步驟D)縮短至11天。於若干具體實例中，如下文所詳述，首次與二次擴增(步驟B與步驟D)之組合縮短至22天。一般將察知，於圖23中說明及下文敘述之方法為例示性，本文所述之方法涵蓋對所述步驟以及任何組合之變更與添加。此方法之例示具體實例見述於PCT申請案No. PCT/US2018/012633，其全部內容併入本文以資參考。 A. 步驟A：獲得病患腫瘤試樣
通常，TIL最初從病患腫瘤試樣獲得(“初代TIL”)，然後擴增為較大群用於如本文所述之進一步操作，視需要如本文概述經冷凍保存、再刺激及視需要評估為TIL健康指標之表現型與代謝參數。
病患腫瘤試樣可使用此項技藝中已知之方法獲得，通常經由外科手術切除、針吸活檢、血球分離或用於獲得含有腫瘤與TIL細胞混合物試樣之其他方式。通常，腫瘤試樣可源自任何固態腫瘤，包括原發性腫瘤、侵入性腫瘤或轉移性腫瘤腫瘤。腫瘤試樣亦可為液體腫瘤，例如得自血液惡性腫瘤之腫瘤。固態腫瘤可為任何癌症類型，包括，惟不限於，乳癌、胰臟癌、前列腺癌、結腸直腸癌、肺癌、腦癌、腎臟癌、胃癌及皮膚癌(包括惟不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑色素瘤)。於若干具體實例中，有用之TIL係得自惡性黑色素瘤腫瘤，因據報導其具有特別高量之TIL。於若干具體實例中，該腫瘤大於約1.5 cm惟小於約4 cm。於若干具體實例中，該腫瘤小於4 cm。
一旦獲得，通常使用鋒利切割將腫瘤試樣碎斷成1至約8 mm3 間之小碎體，其中以約2-3 mm3 特別有用。TIL係使用酵素性腫瘤水解物從這些小碎體培養。該等腫瘤水解物可於酵素培養液[例如，Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640緩衝劑、2 mM麩胺酸鹽、10 mcg/mL健大黴素、30單位/mL Dnase與1.0 mg/mL膠原酶]中培育，隨後機械式解離(例如，使用組織解離器)而產生。腫瘤水解物之產生可利用將腫瘤置於酵素培養液中及機械式分離該腫瘤大約1分鐘，隨後於37℃，在5% CO2 中培育30分鐘，隨後於前述條件下，進行機械式解離與培育之重複循環，直到只存在小組織碎體。此方法終止時，若細胞懸浮液含有大量紅血球或死細胞，則可使用FICOLL分支鏈之親水性多醣進行密度梯度分離去除這些細胞。可使用此項技藝中已知之替代方法，例如見述於美國專利申請公告案No. 2012/0244133 A1中者，其揭示內容併入本文以資參考。任一前述方法可用於本文所述任何具體實例中用於擴增TIL之方法或治療癌症之方法。
通常，所收獲之細胞懸浮液稱為“初代細胞群”或“新鮮收獲之”細胞群。
於一具體實例中，TIL最初可從得自病患之酵素性腫瘤水解物與腫瘤碎體培養。
於若干具體實例中，TIL係從腫瘤碎體獲得。於若干具體實例中，該腫瘤碎體係尖銳解剖獲得。於若干具體實例中，腫瘤碎體在約1 mm3 與10 mm3 之間。於若干具體實例中，腫瘤碎體在約1 mm3 與8 mm3 之間。於若干具體實例中，腫瘤碎體為約1 mm3 。於若干具體實例中，腫瘤碎體為約2 mm3 。於若干具體實例中，腫瘤碎體為約3 mm3 。於若干具體實例中，腫瘤碎體為約4 mm3 。於若干具體實例中，腫瘤碎體為約5 mm3 。於若干具體實例中，腫瘤碎體為約6 mm3 。於若干具體實例中，腫瘤碎體為約7 mm3 。於若干具體實例中，腫瘤碎體為約8 mm3 。於若干具體實例中，腫瘤碎體為約9 mm3 。於若干具體實例中，腫瘤碎體為約10 mm3 。於若干具體實例中，腫瘤碎體為約8-27 mm3 。於若干具體實例中，腫瘤碎體為約10-25 mm3 。於若干具體實例中，腫瘤碎體為約15-25 mm3 。於若干具體實例中，腫瘤碎體為約8-20 mm3 。於若干具體實例中，腫瘤碎體為約15-20 mm3 。於若干具體實例中，腫瘤碎體為約8-15 mm3 。於若干具體實例中，腫瘤碎體為約8-10 mm3 。
於若干具體實例中，腫瘤碎體數為約40至約50個腫瘤碎體。於若干具體實例中，腫瘤碎體數為約40個腫瘤碎體。於若干具體實例中，腫瘤碎體數為約50個腫瘤碎體。於若干具體實例中，少於約50個腫瘤碎體之腫瘤碎體大小為約8-27 mm3 。
於若干具體實例中，TIL係得自腫瘤水解物。於若干具體實例中，腫瘤水解物係利用於酵素培養液(例如惟不限於RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10 mg/mL健大黴素、30 U/mL Dnase及1.0 mg/mL膠原酶)中培育，隨後機械式解離(GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)而產生。將腫瘤置於酵素培養液中後，可使腫瘤機械式解離大約1分鐘。使該溶液於37℃，在5% CO2 中培育30分鐘，然後使其再機械式崩解大約1分鐘。再於37℃，在5% CO2 中培育30分鐘後，可使該腫瘤第三次機械式崩解大約1分鐘。若干具體實例中，第三次機械式崩解後，若存在大片組織，則於有或無於37℃，在5% CO2 中培育追加30分鐘下，對該試樣施加1或2次追加之機械式解離。於若干具體實例中，於最後培育終止時，若細胞懸浮液含有大量紅血球或死細胞，則可使用Ficoll進行密度梯度分離去除這些細胞。 B. 步驟B：首次擴增
腫瘤碎體於步驟A中切割或分解後，在相對於腫瘤與其他細胞有利於TIL生長的條件下，於含有IL-2之血清中培養所得細胞。於若干具體實例中，使腫瘤水解物在包含失活人類血清與6000 IU/mL IL-2的培養液之2 mL槽中培育。培養此原發性腫瘤細胞群數天之期間，通常為3至14天，產生原液TIL群，通常約1×108 個原液TIL細胞。於若干具體實例中，培養此原發性腫瘤細胞群7至14天之期間，產生原液TIL群，通常約1×108 個原液TIL細胞。於若干具體實例中，培養此原發性腫瘤細胞群之期間10至14天，產生原液TIL群，通常約1×108 個原液TIL細胞。於若干具體實例中，培養此原發性腫瘤細胞群之期間約11天，產生原液TIL群，通常約1×108 個原液TIL細胞。於若干具體實例中，培養此初代細胞群約11天之期間，產生原液TIL群，通常小於或等於約200×106 個原液TIL細胞。
於較佳具體實例中，擴增TIL可使用如下文及於此所述之初始原液TIL擴增步驟(圖23中所示之步驟B，可包括稱為前REP之方法)、隨後如下文於步驟D及於此所述之二次擴增[步驟D，包括稱為迅速擴增實驗方法(REP)步驟之諸方法]、隨後視需要冷凍保存、及隨後如下文及於此所述之第二步驟D(包括稱為再刺激REP步驟之諸方法)進行。由此方法獲得之TIL可視需要表徵如本文所述之表現型特徵與代謝參數。
TIL培養物於24槽盤[例如，使用Costar 24槽細胞培養簇、平底(Corning Incorporated，Corning, NY)]啓動之具體實例中，各槽可接種於具有IL-2(6000 IU/mL；Chiron Corp., Emeryville, CA)之2mL完全培養液中之1×106 個腫瘤水解細胞或一個腫瘤碎體。於若干具體實例中，該腫瘤碎體係介於約1 mm3 與10 mm3 之間。
於若干具體實例中，用於步驟B之CM由補充10%人類AB血清、25mM HEPES及10 mg/mL健大黴素之RPMI 1640與GlutaMAX一起組成。於培養物在具40 mL容量與10cm2 透氣矽底之透氣燒瓶(例如，G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing，New Brighton，MN)中啓動之具體實例(圖1)中，各燒瓶裝載於具有IL-2之10-40 mL CM中之10-40×106 個活腫瘤水解細胞或5-30個腫瘤碎體。37℃下，於5% CO2 中，使G-Rex10以及24槽盤在潮濕培養箱中培育，開始培養5天後，移除一半培養液，以新鮮CM與IL-2替換，第5天後，每2-3天更換一半培養液。
於一具體實例中，該細胞培養液進一步包含IL-2。於較佳具體實例中，該細胞培養液包含約3000 IU/mL之IL-2。於一具體實例中，該細胞培養液包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL、或約8000 IU/mL IL-2。於一具體實例中，該細胞培養液包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間、或8000 IU/mL之間之IL-2。
於若干具體實例中，如實施例與圖式中所論述，首次擴增(包括稱為前REP之方法；步驟B)方法縮短至3-14天。於若干具體實例中，如實施例中所論述及圖4與圖5中所示，步驟B之首次擴增縮短至7-14天。於若干具體實例中，如實施例中所論述，步驟B之首次擴增縮短至10-14天。於若干具體實例中，如實施例中所論述，步驟B之首次擴增縮短至11天。
於若干具體實例中，如本文所述之步驟B方法中可包括IL-2、IL-7、IL-15及IL-21以及彼等之組合。
於若干具體實例中，步驟B於密閉系生物反應器中進行。於若干具體實例中，如本文所述，使用密閉系統進行TIL擴增。於若干具體實例中，使用單一生物反應器。於若干具體實例中，所用單一生物反應器為例如GREX-10或GREX-100。 C. 步驟C：首次擴增至二次擴增轉換
於若干具體實例中，得自步驟B之原液TIL群可使用此項技藝中已知及本文敘述之方法，立即冷凍保存。替代地，該原液TIL群可進行二次擴增(REP)，然後如下文所論述冷凍保存。
於若干具體實例中，未貯存步驟B TIL，且步驟B TIL直接繼續進行步驟D。於若干具體實例中，如本文進一步所述，該轉換發生於密閉系。 D. 步驟D：二次擴增
於若干具體實例中，收獲及初始原液處理之後(即，步驟A與步驟B之後)，擴增TIL細胞群數量。此於本文中稱為二次擴增，其可包括此項技藝中通常稱為迅速擴增方法(REP)之擴增方法。二次擴增通常使用包含許多成分(包括飼養細胞、細胞介素來源及抗CD3抗體)之培養基，於透氣容器中完成。於若干具體實例中，二次擴增可包括按比例擴大俾使增加二次擴增中獲得之TIL數。
於一具體實例中，REP及/或二次擴增可使用本揭示內容之方法於透氣容器中進行。舉例而言，TIL可於介白素-2(IL-2)或介白素-15(IL-15)存在下，使用非特異性T細胞受體刺激迅速擴增。非特異性T細胞受體刺激可包括，例如，約30 ng/mL OKT3、小鼠單株抗CD3抗體(可從Ortho-McNeil, Raritan, NJ或Miltenyi Biotech, Auburn, CA商購獲得)。TIL可視需要於T細胞生長因子(例如300 IU/mL IL-2或IL-15)存在下，利用於活體外以可視需要由載體表現之一或多種該癌症之抗原[包括其抗原性部分，例如抗原決定部位，例如人類白血球抗原A2(HLA-A2)結合肽，例如，0.3 μΜ MART-1：26-35(27 L)或gpl 00：209-217(210M)]進一步刺激該等TIL而迅速擴增。其他適當抗原可包括，例如，NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2、或其抗原性部分。TIL亦可利用以表現HLA-A2的抗原呈現細胞上脈衝之該癌症之相同抗原再刺激而迅速擴增。替代地，該等TIL可進一步以，例如，經輻照之自體淋巴細胞或以經輻照之HLA-A2+淋巴細胞與IL-2再刺激。
於一具體實例中，該細胞培養液進一步包含IL-2。於較佳具體實例中，該細胞培養液包含約3000 IU/mL IL-2。於一具體實例中，該細胞培養液包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL、或約8000 IU/mL之IL-2。於一具體實例中，該細胞培養液包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間、或介於8000 IU/mL之間之IL-2。
於一具體實例中，該細胞培養液包含OKT3抗體。於較佳具體實例中，該細胞培養液包含約30 ng/mL OKT3抗體。於一具體實例中，該細胞培養液包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL OKT3抗體。於一具體實例中，該細胞培養液包含介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL、介於40 ng/mL與50 ng/mL之間、及介於50 ng/mL與100 ng/mL之間之OKT3抗體。
於若干具體實例中，如本文所述步驟D方法中之二次擴增期間可包括IL-2、IL-7、IL-15及IL-21以及彼等之組合。
於若干具體實例中，二次擴增可於包含IL-2、OKT-3及抗原呈現飼養細胞之補充細胞培養液中進行。
於若干具體實例中，抗原呈現飼養細胞(APCs)為PBMC。於一具體實例中，TIL對PBMC及/或抗原呈現細胞在迅速擴增及/或二次擴增中之比例為約1至25、約1至50、約1至100、約1至125、約1至150、約1至175、約1至200、約1至225、約1至250、約1至275、約1至300、約1至325、約1至350、約1至375、約1至400、或約1至500。於一具體實例中，TIL對PBMC在迅速擴增及/或二次擴增中之比例介於1至50與1至300之間。於一具體實例中，TIL對PBMC在迅速擴增及/或二次擴增中之比例介於1至100與1至200之間。
於一具體實例中，REP及/或二次擴增於燒瓶中進行，其中原液TIL與在150 ml培養液中之100或200倍過量之失活飼養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體和3000 IU/mL IL-2混合。直到細胞轉移至另一生長室，才進行培養液更換(通常經由呼吸作用以新鮮培養液更換2/3培養液)。另一生長室包含如下文更充分論述之GRex燒瓶與透氣容器。
於若干具體實例中，如實施例與圖式中所論述，二次擴增(亦稱為REP方法)縮短至7-14天。於若干具體實例中，二次擴增縮短至11天。
於一具體實例中，REP及/或二次擴增可使用T-175燒瓶與如先前所述之透氣袋(Tran, et al., J. Immunother. 2008, 31, 742-51；Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42)或透氣培養器皿(G-Rex燒瓶)進行。關於TIL於T-175燒瓶中之迅速擴增及/或二次擴增，可添加懸浮於150 mL培養液中之1×106 個TIL於各T-175燒瓶。該等TIL可於補充3000 IU/mL IL-2與30 ng/ml抗CD3的CM與AIM-V培養液之1比1混合物中培養。該等T-175燒瓶可於37℃，在5% CO2 中培育。第5天，可使用具3000 IU/mL IL-2之50/50培養液更換一半培養液。第7天，可於3 L袋中使得自兩個T-175燒瓶的細胞結合，添加具5%人類AB血清與3000 IU/mL IL-2之300 mL AIM V於該300 ml TIL懸浮液。每隔一或兩天計算各袋中之細胞數，添加新鮮培養液使細胞計數保持於0.5與2.0×106 個細胞/mL之間。
於一具體實例中，REP及/或二次擴增可於具100 cm2 透氣矽底之500 mL容量透氣燒瓶(G-Rex 100，可從Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA商購獲得)中進行，可使5×106 或10×106 個TIL與PBMC於補充5%人類AB血清、3000 IU/mL IL-2與30 ng/ml抗CD3(OKT3)之400 mL 50/50培養液中培養。該等G-Rex 100燒瓶可於37℃，在5% CO2 中培育30分鐘。第5天，可移出250 mL上清液置於離心管中，並以1500 rpm(491×g)離心10分鐘。TIL片狀沉澱物可使用具有5%人類AB血清、3000 IU/mL IL-2之150 mL新鮮培養液使其再懸浮，並加回原來的G-Rex 100燒瓶中。當TIL於G-Rex 100燒瓶中連續擴增時，第7天，可使各G-Rex 100燒瓶中之TIL懸浮於存在各燒瓶中的300 mL培養液中，將該細胞懸浮液分成可用以接種3個G-Rex 100燒瓶之3個100 mL等分試樣。然後可添加具5%人類AB血清與3000 IU/mL IL-2之150 mL AIM-V於各燒瓶。該等G-Rex 100燒瓶可於37℃，在5% CO2 中培育，4天後，添加具3000 IU/mL IL-2之150 mL AIM-V至各G-Rex 100燒瓶。於培養之第14天可回收細胞。
於一具體實例中，EP及/或二次擴增於燒瓶中進行，其中原液TIL與於150 ml培養液中之100或200倍過量之失活飼養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體和3000 IU/mL IL-2混合。直到細胞轉移至另一生長室，才進行培養液更換(通常經由呼吸作用以新鮮培養液更換2/3培養液)。另一生長室包含如下文更充分論述之GRex燒瓶與透氣容器。
於一具體實例中，進行REP及/或二次擴增並進一步包括選擇TIL以得到優異腫瘤反應性之步驟。可使用此項技藝中已知之任何選擇方法。舉例而言，可使用美國專利申請公告案No. 2016/0010058 A1(其揭示內容併入本文以資參考)中敘述之方法選擇TIL以得到優異之腫瘤反應性。
TIL之REP及/或二次擴增可使用如先前所述(Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31：742-751；與Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Immunother., 26：332-342)之T-175燒瓶與透氣袋或透氣G-Rex燒瓶進行。於若干具體實例中，REP及/或二次擴增使用燒瓶進行。於若干具體實例中，REP使用透氣G-Rex燒瓶進行。關於T-175燒瓶中TIL之REP及/或二次擴增，係使約1×106 個TIL懸浮於約150 mL培養液中並將其添加於各T-175燒瓶。該TIL以1至100之比例與經輻照(50 Gy)之同種異體PBMC一起培養作為“飼養”細胞，使該等細胞於補充3000 IU/mL IL-2與30 ng/ml抗CD3之CM與AIM-V培養液之1比1混合物(50/50培養液)中培養。該等T-175燒瓶於37℃，在5% CO2 中培育。於若干具體實例中，第5天，使用具3000 IU/mL IL-2之50/50培養液更換一半培養液。於若干具體實例中，第7天，於3 L袋中使得自兩個T-175燒瓶的細胞結合，添加具5%人類AB血清與3000 IU/mL IL-2之300 mL AIM-V於該300 ml TIL懸浮液。每隔一或兩天計算各袋中之細胞數，可添加新鮮培養液使細胞計數保持於0.5與2.0×106 個細胞/mL之間。
有關在具100 cm2 透氣矽底(G-Rex100，Wilson Wolf)的500 mL容量燒瓶中之TIL REP及/或二次擴增，係使約5×106 或10×106 個TIL以1至100之比例與經輻照之同種異體PBMC於補充3000 IU/mL IL-2與30 ng/ mL抗CD3之400 mL 50/50培養液中培養。該等G-Rex100燒瓶於37℃，在5% CO2 中培育。於若干具體實例中，第5天，移出250mL上清液置於離心管中，並以1500 rpm(491g)離心10分鐘。然後該TIL片狀沉澱物可使用具有3000 IU/mL IL-2之150 mL新鮮培養液使其再懸浮，並加回原來的G-Rex100燒瓶中。於TIL在G-Rex100燒瓶中連續擴增之具體實例中，第7天，使各G-Rex100燒瓶中之TIL懸浮於存在各燒瓶中的300 mL培養液中，將該細胞懸浮液分成可用以接種3個G-Rex100燒瓶之三個100mL等分試樣。然後可添加具5%人類AB血清與3000 IU/mL IL-2之150 mL AIM-V於各燒瓶。該等G-Rex100燒瓶於37℃，在5% CO2 中培育，4天後，添加具3000 IU/mL IL-2之150 mL AIM-V至各G-Rex100燒瓶。於培養之第14天回收細胞。 1. 飼養細胞與抗原呈現細胞
於一具體實例中，本文所述之二次擴增程序(步驟D，包括REP)於REP TIL擴增及/或二次擴增期間需要過量之飼養細胞。許多具體實例中，飼養細胞係從健康捐血者的標準全血單元取得之周邊血液單核細胞(PBMC)。該等PBMC係使用標準方法例如Ficoll-Paque密度梯度分離獲得。
通常，經由照射或者熱處理使同種異體PBMC失活，用於如實施例中所述之REP程序，特別是提供用於評估經照射的同種異體PBMC複製不適當的例示實驗方法之實施例14。
於若干具體實例中，如果第14天之活細胞總數小於進行培養REP第0天及/或二次擴增第0天(即，二次擴增開始當天)之初始活細胞數，則PBMC被認為複製不適當而被接受用於本文所述之TIL擴增程序。
於若干具體實例中，如果於OKT3與IL-2存在下培養之活細胞總數，第7天與第14天相較於進行培養REP第0天及/或二次擴增第0天(即，二次擴增開始當天)之初始活細胞數未增加，則PBMC被認為複製不適當而被接受用於本文所述之TIL擴增程序。若干具體實例中，係於30 ng/mL OKT3抗體與3000 IU/mL IL-2存在下培養PBMC。
於若干具體實例中，如果於OKT3與IL-2存在下培養之活細胞總數，第7天與第14天相較於進行培養REP第0天及/或二次擴增第0天(即，二次擴增開始當天)之初始活細胞數未增加，則PBMC被認為複製不適當而被接受用於本文所述之TIL擴增程序。若干具體實例中，係於5-60 ng/mL OKT3抗體與1000-6000 IU/mL IL-2存在下培養PBMC。若干具體實例中，係於10-50 ng/mL OKT3抗體與2000-5000 IU/mL IL-2存在下培養PBMC。若干具體實例中，係於20-40 ng/mL OKT3抗體與2000-4000 IU/mL IL-2存在下培養PBMC。若干具體實例中，係於於25-35 ng/mL OKT3抗體與2500-3500 IU/mL IL-2存在下培養PBMC。
於一具體實例中，人工抗原呈現細胞於REP期作為PBMC替代物或與PBMC組合。 2. 細胞介素
本文所述之擴增方法通常使用具有高劑量細胞介素(特別是如此項技藝中已知之IL-2)之培養液。
替代地，另外亦可能以細胞介素組合供TIL迅速擴增及/或二次擴增用，使用如通常概述於美國專利申請公告案No. US 2017/0107490 A1、國際公告案No. WO 2015/189356、美國專利申請公告案No. US 2017/0107490 A1及國際公告案No. WO 2015/189357(各者全部內容均併入本文以資參考)之IL-2、IL-15與IL-21二或多者之組合。因此，可能的組合包括IL-2與IL-15、IL-2與IL-21、IL-15與IL-21與IL-2、IL-15與IL-21，後項發現特別於許多具體實例中使用。使用細胞介素組合特別有利於淋巴細胞之產生，特別是如其中所述之T細胞。 3. 抗CD3抗體
於若干具體實例中，本文所述擴增方法(包括REP)中所用培養液亦包括抗CD3抗體。抗CD3抗體組合IL-2誘導TIL群中之T細胞活化與細胞分裂。此效應可從全長抗體以及Fab與F(ab’)2片段看出，以前者通常較佳；參見，例如，Tsoukas et al., J. Immunol. 1985, 135, 1719，其全部內容併入本文以資參考。
如此項技藝者將察知，許多適當抗人類CD3抗體可用於本發明，包括源自各種哺乳動物之抗人類CD3多株與單株抗體，包括，惟不限於，鼠類、人類、靈長類、大鼠及犬抗體。於特定具體實例中，使用OKT3抗CD3抗體(可從Ortho-McNeil, Raritan, NJ或Miltenyi Biotech, Auburn, CA商購獲得)。 E. 步驟E：收獲TIL
二次擴增步驟後，可收獲細胞。若干具體實例中，係於一、二、三、四或更多次二次擴增步驟後收獲該等TIL。
TIL可以任何適當及無菌方式收獲，包括例如利用離心法。用於收獲TIL之方法為此項技藝中悉知，任何該等已知方法皆可與本發明方法一起使用。於若干具體實例中，使用自動化系統收獲TIL。於若干具體實例中，使用半自動化系統收獲TIL。於若干具體實例中，使用半自動化系統收獲TIL。於若干具體實例中，使用半自動化機器收獲得自二次擴增之該等TIL。於若干具體實例中，利用LOVO系統(可從例如Benchmark Electronics商購獲得)。於若干具體實例中，收獲步驟包括洗滌TIL、調配TIL、及/或等分TIL。於若干具體實例中，收獲後視需要冷凍細胞或為收獲之一部分。 F. 步驟F：最終調配/轉移至輸液袋
步驟A至E完成後，將細胞轉移至給藥於病患用之容器。
於一具體實例中，使用本揭示內容APCs擴增之TIL呈醫藥組成物給予病患。於一具體實例中，該醫藥組成物為TIL於無菌緩衝劑中之懸浮液。使用本揭示內容PBMC擴增之TIL可利用如此項技藝中已知之任何適當途徑給藥。於若干具體實例中，該T細胞較佳為呈持續大約30至60分鐘之單次動脈內或靜脈內輸注給藥。其他適當給藥途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴管內給藥。 G. 追加之擴增步驟
一般將察知，上述A至F任一步驟可重複任何次數，此外可以不同於上述之順序進行。
於若干具體實例中，可重複步驟F最終調配前之一或多個擴增步驟。該等追加之擴增步驟可包含上述首次及/或二次擴增步驟之元素(例如，包括該細胞培養液中所述成分)。追加之擴增步驟可進一步包含追加之元素，包括追加擴增步驟之前及/或期間補充到細胞培養液中之細胞培養液中之追加成分。
於進一步具體實例中，圖23與上述各節中所述任何擴增步驟可於冷凍保存步驟(其中使用此項技藝中已知之方法保存擴增步驟期間產生的細胞)之前或之後貯存至其餘製造/擴增方法步驟需要時。 醫藥組成物、劑量、及TIL、MILs及PBL之給藥方案
於一具體實例中，使用本揭示內容方法擴增之TIL呈醫藥組成物給予病患。於一具體實例中，該醫藥組成物為TIL於無菌緩衝劑中之懸浮液。使用本揭示內容方法擴增之TIL可利用如此項技藝中已知之任何適當途徑給藥。較佳為，該等TIL較佳為呈持續大約30至60分鐘之單次動脈內或靜脈內輸注給藥。其他適當給藥途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴管內給藥。
可給予任何適當劑量之TIL。較佳為，給予約2.3×1010 至約13.7×1010 個TIL，平均大約7.8×1010 個TIL，特別是如果該癌症係血液惡性腫瘤。於一具體實例中，大約給予1.2×1010 至約4.3×1010 個TIL。
於若干具體實例中，本發明醫藥組成物中所提供該等TIL之數量為約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、2×1012 、3×1012 、4×1012 、5×1012 、6×1012 、7×1012 、8×1012 、9×1012 、1×1013 、2×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、7×1013 、8×1013 及9×1013 個。於一具體實例中，本發明醫藥組成物中所提供該等TIL之數量在1×106 至5×106 、5×106 至1×107 、1×107 至5×107 、5×107 至1×108 、1×108 至5×108 、5×108 至1×109 、1×109 至5×109 、5×109 至1×1010 、1×1010 至5×1010 、5×1010 至1×1011 、5×1011 至1×1012 、1×1012 至5×1012 及5×1012 至1×1013 個之範圍內。於本發明之一具體實例中，本發明醫藥組成物中所提供TIL之數量在約4×108 至約2.5×109 個之範圍內。於另一具體實例中，本發明醫藥組成物中所提供TIL之數量為9.5×108 個。於另一具體實例中，本發明醫藥組成物中所提供TIL之數量為4.1×108 個。於另一具體實例中，TIL數 本發明醫藥組成物中所提供TIL之數量為2.2×109 個。
於本發明之一具體實例中，本發明醫藥組成物中所提供TIL數在約0.1×109 至約15×109 TIL、約0.1×109 至約15×109 TIL、約0.12×109 至約12×109 TIL、約0.15×109 至約11×109 TIL、約0.2×109 至約10×109 TIL、約0.3×109 至約9×109 TIL、約0.4×109 至約8×109 TIL、約0.5×109 至約7×109 TIL、約0.6×109 至約6×109 TIL、約0.7×109 至約5×109 TIL、約0.8×109 至約4×109 TIL、約0.9×109 至約3×109 TIL、或約1×109 至約2×109 個TIL之範圍內。
於若干具體實例中，本發明醫藥組成物中所提供該等TIL之濃度小於該醫藥組成物之，例如，100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v。
於若干具體實例中，本發明醫藥組成物中所提供該等TIL之濃度大於該醫藥組成物之90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25%、19%、18.75%、18.50%、18.25%、18%、17.75%、17.50%、17.25%、17%、16.75%、16.50%、16.25%、16%、15.75%、15.50%、15.25%、15%、14.75%、14.50%、14.25%、14%、13.75%、13.50%、13.25%、13%、12.75%、12.50%、12.25%、12%、11.75%、11.50%、11.25%、11%、10.75%、10.50%、10.25%、10%、9.75%、9.50%、9.25%、9%、8.75%、8.50%、8.25%、8%、7.75%、7.50%、7.25%、7%、6.75%、6.50%、6.25%、6%、5.75%、5.50%、5.25%、5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、1.25%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v、或v/v。
於若干具體實例中，本發明醫藥組成物中所提供該等TIL之濃度在該醫藥組成物之約0.0001%至約50%、約0.001%至約40%、約0.01%至約30%、約0.02%至約29%、約0.03%至約28%、約0.04%至約27%、約0.05%至約26%、約0.06%至約25%、約0.07%至約24%、約0.08%至約23%、約0.09%至約22%、約0.1%至約21%、約0.2%至約20%、約0.3%至約19%、約0.4%至約18%、約0.5%至約17%、約0.6%至約16%、約0.7%至約15%、約0.8%至約14%、約0.9%至約12%或約1%至約10% w/w、w/v或v/v之範圍內。
於若干具體實例中，本發明醫藥組成物中所提供該等TIL之濃度在該醫藥組成物之約0.001%至約10%、約0.01%至約5%、約0.02%至約4.5%、約0.03%至約4%、約0.04%至約3.5%、約0.05%至約3%、約0.06%至約2.5%、約0.07%至約2%、約0.08%至約1.5%、約0.09%至約1%、約0.1%至約0.9% w/w、w/v或v/v之範圍內。
於若干具體實例中，本發明醫藥組成物中所提供該等TIL之量等於或小於10 g、9.5 g、9.0 g、8.5 g、8.0 g、7.5 g、7.0 g、6.5 g、6.0 g、5.5 g、5.0 g、4.5 g、4.0 g、3.5 g、3.0 g、2.5 g、2.0 g、1.5 g、1.0 g、0.95 g、0.9 g、0.85 g、0.8 g、0.75 g、0.7 g、0.65 g、0.6 g、0.55 g、0.5 g、0.45 g、0.4 g、0.35 g、0.3 g、0.25 g、0.2 g、0.15 g、0.1 g、0.09 g、0.08 g、0.07 g、0.06 g、0.05 g、0.04 g、0.03 g、0.02 g、0.01 g、0.009 g、0.008 g、0.007 g、0.006 g、0.005 g、0.004 g、0.003 g、0.002 g、0.001 g、0.0009 g、0.0008 g、0.0007 g、0.0006 g、0.0005 g、0.0004 g、0.0003 g、0.0002g、或0.0001 g。
於若干具體實例中，本發明醫藥組成物中所提供該等TIL之量大於0.0001 g、0.0002 g、0.0003 g、0.0004 g、0.0005 g、0.0006 g、0.0007 g、0.0008 g、0.0009 g、0.001 g、0.0015 g、0.002 g、0.0025 g、0.003 g、0.0035 g、0.004 g、0.0045 g、0.005 g、0.0055 g、0.006 g、0.0065 g、0.007 g、0.0075 g、0.008 g、0.0085 g、0.009 g、0.0095 g、0.01 g、0.015 g、0.02 g、0.025 g、0.03 g、0.035 g、0.04 g、0.045 g、0.05 g、0.055 g、0.06 g、0.065 g、0.07 g、0.075 g、0.08 g、0.085 g、0.09 g、0.095 g、0.1 g、0.15 g、0.2 g、0.25 g、0.3 g、0.35 g、0.4 g、0.45 g、0.5 g、0.55 g、0.6 g、0.65 g、0.7 g、0.75 g、0.8 g、0.85 g、0.9 g、0.95 g、1 g、1.5 g、2 g、2.5、3 g、3.5、4 g、4.5 g、5 g、5.5 g、6 g、6.5 g、7 g、7.5 g、8 g、8.5 g、9 g、9.5 g、或10 g。
本發明醫藥組成物中所提供之該等TIL在寬廣劑量範圍內有效。確切劑量取決於給藥途徑、所投予化合物形式、待治療個體性別與年齡、待治療個體體重，與主治醫師之偏好與經驗。適當時亦可使用該等TIL之臨床確立劑量。使用本文方法給予醫藥組成物之量，例如TIL之劑量，將取決於所治療人類或哺乳動物、疾患或症狀嚴重性、給藥率、活性醫藥成分之配置與處方醫師之裁量權。
於若干具體實例中，TIL可以單次劑量給藥。該等給藥可利用注射，例如，靜脈內注射。於若干具體實例中，TIL可以多次劑量給予。給藥可為每年一次、兩次、三次、四次、五次、六次、或大於六次。給藥可為每個月一次、每兩週一次、每週一次、或每隔一天一次。只要有需要，TIL給藥可持續進行。
於若干具體實例中，TIL之有效劑量為約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、2×1012 、3×1012 、4×1012 、5×1012 、6×1012 、7×1012 、8×1012 、9×1012 、1×1013 、2×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、7×1013 、8×1013 及9×1013 個。於若干具體實例中，TIL之有效劑量在1×106 至5×106 、5×106 至1×107 、1×107 至5×107 、5×107 至1×108 、1×108 至5×108 、5×108 至1×109 、1×109 至5×109 、5×109 至1×1010 、1×1010 至5×1010 、5×1010 至1×1011 、5×1011 至1×1012 、1×1012 至5×1012 及5×1012 至1×1013 個之範圍內。
於本發明之一具體實例中，用於患有急性類骨髓性白血病(AML)病患之MILs臨床劑量在約4×108 至約2.5×109 個MILs之範圍內。於另一具體實例中，本發明醫藥組成物中所提供MILs之數量為9.5×108 個MILs。於另一具體實例中，本發明醫藥組成物中所提供MILs之數量為4.1×108 個。於另一具體實例中，本發明醫藥組成物中所提供MILs之數量為2.2×109 個。
於若干具體實例中，TIL之有效劑量在約0.01 mg/kg至約4.3 mg/kg、約0.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約0.3 mg/kg至約3.2 mg/kg、約0.35 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.15 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.3 mg至約2.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1.7 mg/kg、約0.15 mg/kg至約1.3 mg/kg、約0.3 mg/kg至約1.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1 mg/kg、約0.55 mg/kg至約0.85 mg/kg、約0.65 mg/kg至約0.8 mg/kg、約0.7 mg/kg至約0.75 mg/kg、約0.7 mg/kg至約2.15 mg/kg、約0.85 mg/kg至約2 mg/kg、約1 mg/kg至約1.85 mg/kg、約1.15 mg/kg至約1.7 mg/kg、約1.3 mg/kg mg至約1.6 mg/kg、約1.35 mg/kg至約1.5 mg/kg、約2.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約2.3 mg/kg至約3.4 mg/kg、約2.4 mg/kg至約3.3 mg/kg、約2.6 mg/kg至約3.15 mg/kg、約2.7 mg/kg至約3 mg/kg、約2.8 mg/kg至約3 mg/kg、或約2.85 mg/kg至約2.95 mg/kg之範圍內。
於若干具體實例中，TIL之有效劑量在約1 mg至約500 mg、約10 mg至約300 mg、約20 mg至約250 mg、約25 mg至約200 mg、約1 mg至約50 mg、約5 mg至約45 mg、約10 mg至約40 mg、約15 mg至約35 mg、約20 mg至約30 mg、約23 mg至約28 mg、約50 mg至約150 mg、約60 mg至約140 mg、約70 mg至約130 mg、約80 mg至約120 mg、約90 mg至約110 mg、或約95 mg至約105 mg、約98 mg至約102 mg、約150 mg至約250 mg、約160 mg至約240 mg、約170 mg至約230 mg、約180 mg至約220 mg、約190 mg至約210 mg、約195 mg至約205 mg、或約198至約207 mg之範圍內。
有效量之該等TIL可利用具類似效用製劑任何可接受之給藥方式(包括鼻內與經皮途徑，經由動脈內注射、靜脈內、腹膜內、非經腸、肌內、皮下、局部、經由移植或直接注射至腫瘤內、或經由吸入法)以單劑量或多劑量給藥。 治療癌症之方法
上述TIL、PBL、及/或MILs(與其群)之組成物與組合物可於治療過度增生性疾患之方法中使用。於較佳具體實例中，彼等係用於治療癌症。於較佳具體實例中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症係血液惡性腫瘤，例如液體腫瘤。於較佳具體實例中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症係選自包括下述組群之血液惡性腫瘤：急性類骨髓性白血病(AML)、外膜細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)、活化型B細胞(ABC)DLBCL、生發中心型B細胞(GCB)DLBCL、慢性淋巴球性白血病(CLL)、小淋巴球性白血病(SLL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、霍奇金氏淋巴瘤、復發性及/或難治性霍奇金氏淋巴瘤、B細胞急性淋巴胚細胞白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、柏基特氏淋巴瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(WM)、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、骨髓纖維化、慢性骨髓性白血病、濾泡中心性淋巴瘤、無痛性NHL、人類免疫缺失症病毒(HIV)相關之B細胞淋巴瘤及艾司坦氏-巴爾氏病毒(EBV)相關之B細胞淋巴瘤。
於一具體實例中，本發明提供治療癌症之方法，其中該癌症係血液惡性腫瘤，其對以包括派姆單抗(pembrolizumab)、納武單抗(nivolumab)、度伐單抗(durvalumab)、阿維單抗(avelumab)、或阿替珠單抗(atezolizumab)等PD-1及/或PD-L1抑制劑之治療有反應。
於一具體實例中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含以下步驟： 　　(a)利用切除、活組織檢查、針穿刺、或血球分離從病患獲得腫留，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b)視需要碎斷或解離該腫瘤以得到腫瘤碎體並使該等腫瘤碎體與第一細胞培養液接觸； 　　(c)於該第一細胞培養液中進行該第一TIL群之初始擴增以得到第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上比該第一TIL群多至少5倍，其中該第一細胞培養液包含IL-2； 　　(d)於第二細胞培養液中進行該第二TIL群之二次擴增以得到第三TIL群，其中自該二次擴增開始7天後該第三TIL群於數量上比該第二TIL群多至少50倍，其中該第二細胞培養液包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經照射之同種異體周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中該二次擴增進行14天或少於14天之期間； 　　(e)收獲該第三TIL群；及 　　(f)給予癌症病患治療有效份量之該第三TIL群； 　　其中該腫瘤係液體腫瘤，且其中該癌症係血液惡性腫瘤。
於一具體實例中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含以下步驟： 　　(a)利用切除、活組織檢查、針穿刺、或血球分離從病患獲得腫留，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(b)視需要碎斷或解離該腫瘤以得到腫瘤碎體並使該等腫瘤碎體與第一細胞培養液接觸； 　　(c)於該第一細胞培養液中進行該第一TIL群之初始擴增以得到第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上比該第一TIL群多至少5倍，其中該第一細胞培養液包含IL-2； 　　(d)第二細胞培養液中進行該第二TIL群之二次擴增以得到第三TIL群，其中自該二次擴增開始7天後該第三TIL群於數量上比該第二TIL群多至少50倍，其中該第二細胞培養液包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經照射之同種異體周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中該二次擴增進行14天或少於14天之期間； 　　(e)收獲該第三TIL群；及 　　(f)給予癌症病患治療有效份量之該第三TIL群； 　　其中該腫瘤係液體腫瘤，且其中該癌症係選自包括下述組群之血液惡性腫瘤：急性類骨髓性白血病(AML)、外膜細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)、活化型B細胞(ABC)DLBCL、生發中心型B細胞(GCB)DLBCL、慢性淋巴球性白血病(CLL)、小淋巴球性白血病(SLL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、霍奇金氏淋巴瘤、復發性及/或難治性霍奇金氏淋巴瘤、B細胞急性淋巴胚細胞白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、柏基特氏淋巴瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(WM)、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、骨髓纖維化、慢性骨髓性白血病、濾泡中心性淋巴瘤、無痛性NHL、人類免疫缺失症病毒(HIV)相關之B細胞淋巴瘤及艾司坦氏-巴爾氏病毒(EBV)相關之B細胞淋巴瘤。
於一具體實例中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含以下步驟： 　　(a)以包含激酶抑制劑或ITK抑制劑之療法預治療病患； 　　(b)利用切除、活組織檢查、針穿刺、或血球分離從病患獲得腫留，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(c)視需要碎斷或解離該腫瘤以得到腫瘤碎體並使該等腫瘤碎體與第一細胞培養液接觸； 　　(d)於該第一細胞培養液中進行該第一TIL群之初始擴增以得到第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上比該第一TIL群多至少5倍，其中該第一細胞培養液包含IL-2； 　　(e)第二細胞培養液中進行該第二TIL群之二次擴增以得到第三TIL群，其中自該二次擴增開始7天後該第三TIL群於數量上比該第二TIL群多至少50倍，其中該第二細胞培養液包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經照射之同種異體周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中該二次擴增進行14天或少於14天之期間； 　　(f)收獲該第三TIL群；及 　　(g)給予癌症病患治療有效份量之該第三TIL群； 　　其中該腫瘤係液體腫瘤，且其中該癌症係血液惡性腫瘤。
於一具體實例中，本發明提供以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療癌症之方法，該方法包含以下步驟： 　　(a)以包含激酶抑制劑或ITK抑制劑之療法預治療病患； 　　(b)利用切除、活組織檢查、針穿刺、或血球分離從病患獲得腫留，該腫瘤包含第一TIL群； 　　(c)視需要碎斷或解離該腫瘤以得到腫瘤碎體並使該等腫瘤碎體與第一細胞培養液接觸； 　　(d)於該第一細胞培養液中進行該第一TIL群之初始擴增以得到第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上比該第一TIL群多至少5倍，其中該第一細胞培養液包含IL-2； 　　(e)第二細胞培養液中進行該第二TIL群之二次擴增以得到第三TIL群，其中自該二次擴增開始7天後該第三TIL群於數量上比該第二TIL群多至少50倍，其中該第二細胞培養液包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經照射之同種異體周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中該二次擴增進行14天或少於14天之期間； 　　(f)收獲該第三TIL群；及 　　(g)給予癌症病患治療有效份量之該第三TIL群； 　　其中該腫瘤係液體腫瘤，且其中該癌症係選自包括下述組群之血液惡性腫瘤：急性類骨髓性白血病(AML)、外膜細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)、活化型B細胞(ABC)DLBCL、生發中心型B細胞(GCB)DLBCL、慢性淋巴球性白血病(CLL)、小淋巴球性白血病(SLL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、霍奇金氏淋巴瘤、復發性及/或難治性霍奇金氏淋巴瘤、B細胞急性淋巴胚細胞白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、柏基特氏淋巴瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(WM)、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、骨髓纖維化、慢性骨髓性白血病、濾泡中心性淋巴瘤、無痛性NHL、人類免疫缺失症病毒(HIV)相關之B細胞淋巴瘤及艾司坦氏-巴爾氏病毒(EBV)相關之B細胞淋巴瘤。
於本發明之一具體實例中，TIL係使用根據本發明之MIL方法1擴增且給予病患。
於本發明之一具體實例中，TIL係使用根據本發明之MIL方法2擴增且給予病患以治療癌症。
於本發明之一具體實例中，TIL係使用根據本發明之MIL方法3擴增且給予病患以治療癌症。
於本發明之一具體實例中，根據本發明給予病患使用MIL方法1、MIL方法2、或MIL方法3擴增之TIL以治療AML。
於本發明之一具體實例中，TIL係使用根據本發明之PBL方法1擴增且給予病患以治療癌症。
於本發明之一具體實例中，TIL係使用根據本發明之PBL方法2擴增且給予病患以治療癌症。
於本發明之一具體實例中，TIL係使用根據本發明之PBL方法3擴增且給予病患以治療癌症。
於本發明之一具體實例中，根據本發明給予病患使用PBL方法1、PBL方法2、或PBL方法3擴增之TIL以治療CLL。
於本發明前述任一具體實例中，敘述以激酶抑制劑預治療。於一具體實例中，該激酶抑制劑係選自由下列者所組成之群組：依馬替尼(imatinib)、達沙替尼、依魯替尼、博舒替尼、尼羅替尼、厄洛替尼、或此項技藝中已知之其他激酶抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、或絲胺酸/蘇胺酸激酶抑制劑。於一具體實例中，使用激酶抑制劑之預治療方案如此項技藝中已知及/或如醫師所指定。
於本發明前述任一具體實例中，敘述以IL-2-誘導式T細胞激酶(ITK)抑制劑預治療。介白素-2-誘導式T細胞激酶(ITK)係於T細胞中表現之非受體酪胺酸激酶，且調控各種途徑。此項技藝中已知之任何ITK抑制劑均可於本發明具體實例中使用[參見，例如，Lo, et al., Expert Opinion on Therapeutic Patents, 20：459-469(2010)；Vargas, et al., Scandinavian Journal of Immunology, 78(2)：130-139(2013)；WO2015112847；WO2016118951；WO2007136790；與US20120058984A1；所有這些文獻全部內容均併入本文以資參考]。於本發明之一具體實例中，ITK抑制劑係選自包括胺基噻唑系ITK抑制劑、5-胺甲基苯并咪唑系ITK抑制劑、3-胺基吡啶-2-酮系ITK抑制劑、(4或5-芳基)吡唑基吲哚系ITK抑制劑、苯并咪唑系ITK抑制劑、胺基苯并咪唑系ITK抑制劑、胺基嘧啶系ITK抑制劑、胺基吡啶系ITK抑制劑、二唑并二嗪系ITK抑制劑、三唑系ITK抑制劑、3-胺基吡啶-2-酮系ITK抑制劑、吲哚基吲唑系ITK抑制劑、吲哚系ITK抑制劑、氮雜-吲哚系ITK抑制劑、吡唑基吲哚系抑制劑、噻吩并吡唑系ITK抑制劑、雜環族ITK抑制劑及靶向ATP囊袋中半胱胺酸442之ITK抑制劑(例如依魯替尼)、氮雜-苯并咪唑系ITK抑制劑、苯并噻唑系ITK抑制劑、吲哚系ITK抑制劑、吡啶酮系ITK抑制劑、經磺醯亞胺取代之嘧啶ITK抑制劑、芳基吡啶酮系ITK抑制劑及此項技藝中已知之任何其他ITK抑制劑之群組。於本發明之一具體實例中，使用ITK抑制劑之預治療方案如此項技藝中已知及/或如醫師所指定。於本發明之一具體實例中，ITK抑制劑係選自由下列者所組成之群組：依魯替尼、BMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469、
及彼等之組合。於本發明之一具體實例中，ITK抑制劑係選自由下列者所組成之群組：依馬替尼、達沙替尼(BMS-354825)、Sprycel [N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-(6-(4-(2-羥乙基)-哌嗪-1-基)-2-甲基嘧啶-4-基胺基)噻唑-5-羧醯胺)、依魯替尼((1-{(3R)-3-[4-胺基-3-(4-苯氧苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基}丙-2-烯-1-酮)、博舒替尼、尼羅替尼、厄洛替尼、1H-吡唑并[4,3-c]噌啉-3-醇、CTA056(7-苄基-1-(3-(哌啶-1-基)丙基)-2-(4-(吡啶-4-基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-g]喹噁啉-6(5H)-酮)、Compound 10 [Boehringer Ingelheim from Moriarty, et al., Bioorg Med Chem Lett, 18：5537-40(2008)]、Compound 19 [Boehringer Ingelheim from Moriarty, et al., Bioorg Med Chem Lett., 18：5537-40(2008)]、Compound 27 [Boehringer Ingelheim from Moriarty, et al., Bioorg Med Chem Lett., 18：5537-40(2008)]、Compound 26 [Boehringer Ingelheim from Winters, et al., Bioorg Med Chem Lett., 18：5541-4(2008)]、Compound 37 [Boehringer Ingelheim from Cook, et al., Bioorg Med Chem Lett., 19：773-7(2009)]、Compound 41 [Boehringer Ingelheim from Cook, et al., Bioorg Med Chem Lett., 19：773-7(2009)]、Compound 48 [Boehringer Ingelheim from Cook, et al., Bioorg Med Chem Lett., 19：773-7(2009)]、Compound 51 [Boehringer Ingelheim from Cook, et al., Bioorg Med Chem Lett., 19：773-7(2009)]、Compound 10n [Boehringer Ingelheim from Riethe, et al., . Bioorg Med Chem Lett., 19：1588-91(2009)]、Compound 10o [Boehringer Ingelheim from Riethe, et al., . Bioorg Med Chem Lett., 19：1588-91(2009)]、Compound 7v [Vertex from Charrier, et al., J Med Chem., 54：2341-50(2011)]、Compound 7w [Vertex from Charrier, et al., J Med Chem., 54：2341-50(2011)]、Compound 7x [Vertex from Charrier, et al., J Med Chem., 54：2341-50(2011)]、Compound 7y [Vertex from Charrier, et al., J Med Chem., 54：2341-50(2011)]、Compound 44 [Bayer Schering Pharma from vonBonin, et al., Exp Dermatol., 20：41-7(2011)]、Compound 13 [Nycomed from Velankar, et al., Bioorg Med Chem., 18：4547-59(2010)]、Compound 24 [Nycomed fromVelankar, et al., Bioorg Med Chem., 18：4547-59(2010)]、Compound 34 [Nycomed fromVelankar, et al., Bioorg Med Chem., 18：4547-59(2010)]、Compound 10o [Nycomed from Herdemann, et al., Bioorg Med Chem Lett., 21：1852-6(2011)]、Compound 3 [Sanofi US from McLean, et al., Bioorg Med Chem Lett., 22：3296-300(2012)]、Compound 7 [Sanofi US from McLean, et al., Bioorg Med Chem Lett., 22：3296-300(2012)]、及/或此項技藝中已知之其他激酶抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、或絲胺酸/蘇胺酸激酶抑制劑、以及其任何組合。
於前述任一具體實例中，包含依魯替尼{為商購獲得之IMBRUVICA，化學名1-[(3R)-3-[4-胺基-3-(4-苯氧苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮}之預治療方案可包括每日一次口服給予一個140 mg膠囊、每日一次口服給予兩個140 mg膠囊、每日一次口服給予三個140 mg膠囊、或每日一次口服給予四個140 mg膠囊為期約一天、兩天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、兩週、三週、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、或六個月。於前述具體實例中，包含依魯替尼之預治療方案亦可包括口服給予選自包括25 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、175 mg、200 mg、225 mg、250 mg、275 mg、300 mg、325 mg、350 mg、375 mg、400 mg、425 mg、450 mg及500 mg的群組之依魯替尼劑量，其中該給藥次數為每天一次、每天兩次、每天三次、或每天四次，且其中給藥持續時間係選自包括約一天、兩天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、兩週、三週、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月及六個月之群組。
於前述任一具體實例中，該欲治療之癌症係選自包括下述組群之血液惡性腫瘤：急性類骨髓性白血病(AML)、外膜細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)、活化型B細胞(ABC)DLBCL、生發中心型B細胞(GCB)DLBCL、慢性淋巴球性白血病(CLL)、小淋巴球性白血病(SLL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、霍奇金氏淋巴瘤、復發性及/或難治性霍奇金氏淋巴瘤、B細胞急性淋巴胚細胞白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、柏基特氏淋巴瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(WM)、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、骨髓纖維化、慢性骨髓性白血病、濾泡中心性淋巴瘤、無痛性NHL、人類免疫缺失症病毒(HIV)相關之B細胞淋巴瘤及艾司坦氏-巴爾氏病毒(EBV)相關之B細胞淋巴瘤。
本文所述方法與組成物於治療、預防及/或控制所示疾病或疾患上之功效可使用此項技藝中已知之各種動物模式測試。 使用化學療法之非清髓性淋巴細胞清除
於一具體實例中，本發明提供以TIL群治療癌症之方法，其中於輸注根據本揭示內容TIL之前，以非清髓性化學療法預治療病患。於一具體實例中，該清髓性化學療法為一或多種化學治療劑。於一具體實例中，該清髓性化學療法係環磷醯胺60 mg/kg/d為期2天(TIL輸注前第27與26天)及氟達拉濱(fludarabine)25 mg/m2 /d為期5天(TIL輸注前第27至23天)。一具體實例中，於非清髓性化學療法及根據本揭示內容之TIL輸注(第0天)後，病患接受IL-2之靜脈內輸注，每隔8小時靜脈注射720,000 IU/kg至達生理耐受量。
實驗發現指出，過繼性轉移腫瘤特異性T淋巴細胞前之淋巴細胞清除，經由根除調控性T細胞與免疫系統競爭元件(“細胞介素沉降”)，於增強治療功效中起關鍵作用。因此，本發明之若干具體實例於引入本發明該等TIL之前，針對病患使用淋巴細胞清除步驟(有時亦稱為“免疫抑制性調節”)。
通常，淋巴細胞清除係使用給予氟達拉濱或環磷醯胺(其活性型稱為馬磷醯胺)及彼等之組合而達成。該等方法見述於Gassner, et al., Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85；Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681；Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239；與Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357；所有這些文獻全部內容均併入本文以資參考。
於若干具體實例中，氟達拉濱以濃度0.5 μg/mL -10 μg/mL給藥。於若干具體實例中，氟達拉濱以濃度1 μg/mL給藥。於若干具體實例中，氟達拉濱治療給藥1天、2天、3天、4天、5天、6天、或7天或7天以上。於若干具體實例中，氟達拉濱以10 mg/kg/天、15 mg/kg/天、20 mg/kg/天¸ 25 mg/kg/天、30 mg/kg/天、35 mg/kg/天、40 mg/kg/天、或45 mg/kg/天之劑量給藥。於若干具體實例中，氟達拉濱治療以35 mg/kg/天給藥2-7天。於若干具體實例中，氟達拉濱治療以35 mg/kg/天給藥4-5天。於若干具體實例中，氟達拉濱治療以25 mg/kg/天給藥4-5天。
於若干具體實例中，經由環磷醯胺給藥得到濃度0.5 μg/mL -10 μg/mL之馬磷醯胺，環磷醯胺之活性型。於若干具體實例中，經由環磷醯胺給藥得到濃度1 μg/mL之馬磷醯胺，環磷醯胺之活性型。於若干具體實例中，環磷醯胺治療給藥1天、2天、3天、4天、5天、6天、或7天或7天以上。於若干具體實例中，環磷醯胺以100 mg/m2 /天、150 mg/m2 /天、175 mg/m2 /天、200 mg/m2 /天、225 mg/m2 /天、250 mg/m2 /天、275 mg/m2 /天、或300 mg/m2 /天之劑量給藥。於若干具體實例中，環磷醯胺係靜脈內(即，i.v.)給藥。於若干具體實例中，環磷醯胺治療以35 mg/m2 /天給藥2-7天。於若干具體實例中，環磷醯胺治療以250 mg/m2 /天 i.v給藥4-5天。於若干具體實例中，環磷醯胺治療以250 mg/m2 /天i.v給藥4天。
於若干具體實例中，淋巴細胞清除係經由使氟達拉濱與環磷醯胺一起給予病患進行。於若干具體實例中，氟達拉濱以25 mg/m2 /天i.v.及環磷醯胺以250 mg/m2 /天i.v.給藥4天以上。
於一具體實例中，淋巴細胞清除係經由以每天60 mg/m2 劑量之環磷醯胺給藥兩天並隨後以每天25 mg/m2 劑量之氟達拉濱給藥五天進行。本文中敘述擴增得自骨髓或周邊血液的TIL之數種方法。於本發明之一具體實例中，淋巴細胞清除係經由以每天60 mg/m2 劑量之環磷醯胺給藥兩天並隨後以每天25 mg/m2 劑量之氟達拉濱給藥五天進行。本文中敘述擴增得自骨髓或周邊血液的TIL之數種方法。 [實施例]
茲參照下述實施例，敘述本文所包含之具體實例。此等實施例之提供僅供說明之目的，且本文所包含之揭示內容決不擬對此等實施例構成侷限，而應被解釋為涵蓋由於本文所提供教示而變得明顯之任何及所有變異)。 實施例1 - 源自非霍奇金氏淋巴瘤的TIL之擴增
TIL乃從具有圖1所示病變之5個非霍奇金氏淋巴瘤腫瘤(一個外膜細胞淋巴瘤腫瘤、三個濾泡性淋巴瘤腫瘤及一個ABC型瀰漫性大型B細胞淋巴瘤腫瘤)擴增，於前REP期使用IL-2達11至14天，接著隨後之REP使用IL-2、促有絲分裂之抗CD3抗體及經照射之同種異體周邊血液單核細胞(PBMC)滋養層達14天。從所有5個淋巴瘤腫瘤成功地產生TIL，最大擴增指數為680倍，顯著高於使用其他方法先前所觀察者。Schwartzentruber, et al., Blood 1993, 82, 1204-1211。此外，平均CD3+ T細胞群為95%(相對於使用Schwartzentruber, et al., Blood 1993, 82, 1204-1211之方法為75%)。
使用Becton, Dickinson & Co.(BD)FACS CANTO II系統進行細胞分選與流式細胞測量術。經由流式細胞測量術分析，觀察到效應記憶型細胞之顯著相對增加，其與黑色素瘤TIL中者相當(圖2)。相較於黑色素瘤TIL培養物，在淋巴瘤中觀察到效應記憶型CD45RA+ (TEMRA)細胞(p=0.0013；CD4, CD8)與CD28+CD4+(p= 0.008)子集之顯著增加(圖3)。
CD4+ 與CD8+ 子集中T細胞分化表現型標記之比較分別顯示於圖4與圖5。CD4+ 與CD8+ 子集中T細胞衰竭表現型標記之比較分別顯示於圖6與圖7中。
圖8說明非霍奇金氏淋巴瘤TIL與黑色素瘤TIL間細胞類型之比較。相較於黑色素瘤TIL，淋巴瘤TIL中CD4+ T細胞數量顯示增加之趨勢。
圖9說明生物發光重定向溶解分析(BRLA)結果。相較於黑色素瘤TIL(11-75 LU50 ，4小時)，利用BRLA測量淋巴瘤TIL中TIL之最小細胞溶解活性，以LU50 /106 計，於4小時之範圍為＜1-6 LU50 及於24小時為1-39 LU50 。
圖10說明淋巴瘤TIL相對於黑色素瘤TIL之干擾素-γ(IFN-γ)酶聯免疫吸附法(ELISA)結果，顯示可相較之結果。淋巴瘤TIL之ELIspot分析結果示於圖11，且於圖12中與黑色素瘤TIL之相同分析結果進行比較。於ELIspot分析中，以佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯/離子黴素、抗CD3抗體、或CD3/CD28/4-1BB珠粒刺激時，觀察到淋巴瘤TIL產生廣範圍之IFN-γ，且於此等條件下，若干淋巴瘤TIL所產生之IFN-γ與黑色素瘤TIL產生之IFN-γ相當，惟於數個案例中，淋巴瘤TIL之IFN-γ產量更高許多。
圖13說明NANOSTRING NCOUNTER分析(Nanostring Technologies, Inc., Seattle, WA)之結果，顯示相較於黑色素瘤TIL，淋巴瘤TIL表現更高量之RORC IL17A(TH17表現型)與GATA3(Th2表現型)。此發現與淋巴瘤反應性T細胞主要為TH2與TH17之觀察結果一致。
整體而言，該等結果提供TIL細胞療法可用於治療淋巴瘤病患之證據。 實施例2 - 從AML病患骨髓長成之骨髓浸潤性淋巴細胞(MIL)與從AML病患周邊血液長成之周邊血液淋巴細胞(PBL)之表現型與功能性特性分析
從急性類骨髓性白血病(AML)病患得到骨髓試樣與可用之相關血液試樣，其中病患包括以至少三輪包含依魯替尼(1-[(3R)-3-[4-胺基-3-(4-苯氧苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮)之治療方案預處理之病患，並附有關於病患之年齡、性別、階段、腫瘤類型、癌症部位、治療史、去識別之病理報告及任何已進行之分子測試(例如，MSI表現與Raf/Ras表現)之資訊。使用MIL方法1、MIL方法2、或MIL方法3，或PBL方法1、PBL方法2、或PBL方法3中之一種擴增MILs與PBL，並進行MIL與PBL之表現型與功能性特性分析。
圖36A與36B說明MILs與PBL之倍數擴增。圖36A顯示3名病患(MIL1、MIL2、MIL3)之倍數擴增，圖36B顯示病患2與3經匹配之PBL(PBL2、PBL3)之倍數擴增。MIL1.1使用MIL方法1擴增，MIL1.2使用MIL方法2擴增，MIL1.3使用MIL方法3擴增及使用PBL方法3擴增PBL。MIL1中之各個試樣顯示MIL1之倍數擴增增加25(MIL1.1)、50(MIL1.2)及75(MIL1.3)倍。此初步展示MIL方法3可能為較佳之擴增方法。MIL2與MIL3之倍數擴增數據似顯得較差，可能由於較低之起始細胞數。供比較用，病患MIL1試樣3(MIL1.3)之起始細胞數為138,000個細胞，而MIL2與MIL3之起始細胞數分別為62,000與28,000個。PBL倍數擴增示於圖36B，用相似之起始細胞數(PBL2為338,000與PBL3為336,000)，MIL2與MIL3分別為約10倍與40倍。
圖37A與37B說明MIL(圖37A)與經匹配之PBL(圖37B)產生IFN-γ細胞之數量。MIL1.3、MIL2及MIL3顯示IFN-γ分泌顯著增加，指示MIL方法3為較佳之擴增方法。PBL之數據則尚無結論。
圖38A至38F顯示MILs與PBL之TCRαβ+、CD4+及CD8+子集。圖38A與38D顯示使用所有3種方法(MIL1.1、MIL1.2、MIL1.3)擴增MILs(圖38A)與使用PBL方法3擴增PBL(圖38D)之TCRab+子集。數據顯示所有MILs與PBL之TCRαβ+子集幾乎都是100%，指示該擴增方法成功地擴增幾乎所有T細胞。圖38B與38E顯示經由MIL方法3擴增MIL減少CD4子集(其與圖38C中CD8子集之增加相關)。圖38E與38F中之PBL數據似與MIL1.3數據一致。
圖39A-D與40 A-D顯示MIL(圖39)與PBL(圖40)中CD4子集之數據。圖39A與40A顯示初始(CCR7+/CD45RA+)之數據；圖39B與40B顯示中央記憶型t細胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)之數據；圖39C與40C顯示效應記憶型T細胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)之數據；及圖39D與40D顯示終末分化效應記憶型細胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)之數據。使用MIL方法3(MIL1.3)及PBL方法3(PBL2與PBL3)擴增之所有試樣與比較組(黑色素瘤TIL)之CD4子集一致。
圖41A-D與42A-D顯示MIL(圖41)與PBL(圖42)中CD8子集之數據。圖41A與42A顯示初始(CCR7+/CD45RA+)之數據；圖41B與42B顯示中央記憶型t細胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)之數據；圖41C與42C顯示效應記憶型T細胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)之數據；及圖41D與42D顯示終末分化效應記憶型細胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)之數據。使用MIL方法3(MIL1.3)擴增之試樣與比較組(黑色素瘤TIL)之CD4子集一致。PBL2與PBL3之數據作為對照用。
圖43A與43B顯示MIL(圖43A)與PBL(圖43B)之CD4CD27與CD8CD27子集之數據。圖44A與44B顯示MIL(圖44A)與PBL(圖44B)之CD4CD28與CD8CD28子集之數據。PBL之數據係顯示各試樣擴增方法在第0天與第14天與黑色素瘤TIL之比較。MIL之數據僅顯示MIL1.3在第0天和第14天與黑色素瘤TIL之比較。MIL與PBL中之CD28子集與黑色素瘤TIL類似。
圖45A與45B表示MILs(圖45A)與PBL(圖45B)之各CD4與CD8子集內PD1+細胞之比較。圖46A與46B表示MILs(圖46A)與PBL(圖46B)之各CD4與CD8子集內LAG3+細胞之比較。第0天測量中，MIL1.3試樣中PD1+與LAG3+二者之數據皆顯示大量減少，而第0天，MIL1.1與MIL1.2中之PD1與LAG3二者似乎趨向於增加。PBL數據作為對照用。
由此實施例之實驗展示，以MIL方法3擴增之MILs具有較高之倍數擴增、高度功能性、較高比率之CD8子集、及較少之LAG3+與PD1+T細胞子集。數據亦顯示記憶型子集與黑色素瘤TIL類似。數據亦顯示，相較於新鮮試樣，冷凍保存之試樣似具較高之倍數擴增。PBL試樣之許多數據似乎不足以使人信服，可能基於試樣量少。 實施例3 - 擴增TIL之方法及以經擴增之TIL治療癌症之方法
使用針穿刺得到骨髓。將骨髓試樣吸引入含肝素之注射器中並於室溫貯存過夜。貯存後，將注射器之內容物一起匯集至無菌容器中並測試品質。使用淋巴細胞分離培養液(LSM)及以COBE Spectra離心，使骨髓富集單核細胞(MNCs)。收集梯度中之細胞至紅血球中並用HBSS洗滌。使用補充2% HSA與5% DMSO之羥乙基澱粉系低溫保護劑冷凍保存MNCs，保留一些用於品質管制。融化QC小瓶以測定MNC產物之CD3+ 與CD38+ /138+ 細胞含量。
將骨髓吸出並於淋巴細胞分離培養液之密度梯度上分劃，然後收集細胞至幾乎到紅血球沈澱物之程度。此分劃方法實質上移除紅血球與嗜中性白血球，提供幾乎完整之骨髓。產生之分劃物料為T細胞與腫瘤細胞。將骨髓菲科爾化(Ficolled)並使用此項技藝中已知之方法及任何本文所述之方法擴增TIL。舉例而言，用於擴增TIL之例示性方法表示於圖14中。圖15中顯示用於擴增TIL及使用經擴增之TIL治療癌症病患之例示性方法。 實施例4 - 從非霍奇金氏淋巴瘤腫瘤長成之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之表現型與功能性特性分析
本實施例中所述實驗之目標包括確定是否可從NHL腫瘤單離且培養具治療潛力之TIL，並比較NHL衍生的TIL與黑色素瘤衍生的TIL之特性。
用於提取與擴增源自病患的TIL之材料與方法如本文所述。經由外科切除之病灶(於此情形下，淋巴組織)，從抑制性腫瘤之微環境中提取源自病患之TIL。使用本文揭示之擴增方法擴增TIL以產生109 至1011 個TIL。
使用流式細胞測量術分析NHL衍生之TIL [1個外膜細胞淋巴瘤(MCL)、3個濾泡性淋巴瘤(FL)、3個瀰漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)]對黑色素瘤衍生的TIL之分化標記。分析TIL之抗CD56、抗TCRab、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD27與抗CD28抗體。此等抗體作為分化評判小組1(DF1)用。抗CD3、抗CD4、抗CD9、抗CD38及抗HLA-DR、抗CCR7、及抗CD45RA抗體作為分化評判小組2(DF2)用。DF2用於鑑定下述T細胞子集：初始(CCR7+/CD45RA+)；中央記憶型t細胞(CM) (CCR7+/CD45RA-)；效應記憶型T細胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)；與終末分化效應記憶型細胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)。
圖16顯示不同癌症類型中不同細胞亞群中之CD4與CD8 T細胞。測試黑色素瘤(黑色)、外膜細胞淋巴瘤(紅色)、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤(藍色)與濾泡性淋巴瘤(紫色)之癌症類型。大體而言，圖16A至16D展示淋巴瘤TIL有更高度增生之趨勢，因此相較於黑色素瘤TIL具有較高之抗腫瘤活性。同樣地，圖17B顯示表現CD4/CD28之淋巴瘤T細胞比表現CD4/CD28之黑色素瘤T細胞具有更高之增生能力。
經由以被覆mAB之Dynabeads™(CD3、CD28及CD137)刺激TIL，然後使用ELIspot™(Immunospot CTL)及使用Immunospot™ S6酶聯免疫斑點分析儀(entry analyzer)計數，且亦使用DuoSet™ ELISA套組(R&D系統)遵循廠商使用說明書利用ELISA測量TIL之γ干擾素(IFNγ)產量。
圖18A與18B展示NHL TIL與黑色素瘤TIL之IFNγ產量相近，指示兩種TIL類型間相似之細胞毒性功能性。
使用生物發光重定向溶解分析(BRLA)測定TIL之溶解潛力。使用以編碼eGFP與螢火蟲螢光素酶之慢病毒載體轉導之P815細胞作為標靶細胞。於OKT3存在下，使TIL與標靶細胞共培養4小時/24小時。然後添加螢光素並使細胞培育5分鐘。使用光亮度計測量生物發光。存活百分比與細胞毒性百分比計算如下： 存活% =(實驗存活-最小信號)/(最大信號-最小信號)×100 　　細胞毒性% = 100 -(存活%)
TIL之溶解潛力以溶解單位(LU50)表示，其代表由效應細胞誘導的標靶細胞之50%細胞毒性。
分析TIL以測定其對自體與同種異體腫瘤二者之腫瘤殺傷能力。於不同效應細胞對標靶細胞比例(E：T比例)- 10：1、20：1、50：1、或100：1下，使TIL與自體淋巴瘤細胞或同種異體黑色素瘤細胞株(526個黑色素瘤細胞株)混合。共培養之前，以CellTrace Violet染料(ThermoFisher)標識腫瘤細胞。24小時後，以7-AAD染色該等細胞，以確定細胞死亡。被TIL殺死之腫瘤細胞比例以7-AAD陽性腫瘤細胞表示，其在淋巴瘤細胞之CellTrace Violet染料對照CD19及黑色素瘤細胞之CellTrace Violet染料對照MCSP上進行門控。
圖19顯示NHL TIL與黑色素瘤TIL於4小時(圖19A)與24小時(圖19B)對同種異體腫瘤與自體腫瘤二者具有類似之細胞毒性功能。
亦使用nCounter GX Human Immunology V2小組(NanoString, Seattle)對TIL進行基因表現分析。按照廠商指示分析100 ng總RNA。經由以各試樣內建對照基因探針之幾何平均值依一定比例標準化數據。將數據對黑色素瘤之基因表現作圖並進行比較。
圖21展示基因表現分析之結果。熱圖顯示基因表現在黑色素瘤TIL上之倍數變化。相較於黑色素瘤衍生之TIL，從淋巴瘤衍生TIL之IL17A與RORC表現具有較高之表現。
整體而言，此實驗結果證明淋巴瘤衍生的TIL之功能性特性與黑色素瘤衍生的TIL類似，指示使用淋巴瘤衍生的TIL可成功地治療淋巴瘤癌症。 實施例5 - 從患有慢性淋巴球性白血病(CLL)病患之周邊血液長成之周邊血液淋巴細胞(PBL)之表現型與功能性特性分析
收集源自以依魯替尼治療3輪前後CLL病患之PBMC。
使用如圖24與本文別處所述三種不同方法，PBL方法1、PBL方法2及PBL方法3擴增T細胞。特定試樣衍生自新鮮PBMC及特定試樣衍生自冷凍保存之PBMC。細胞一經擴增與收獲，即以上文實施例4與本文別處所述方法進行表現型分析與功能表徵。此實施例之目的在於確定PBL之最適擴增方法及確定源自依魯替尼治療試樣擴增之PBL是否比源自未治療試樣擴增之PBL更具效力。
PBL倍數擴增示於圖26。使用PBL方法1、PBL方法2及PBL方法3顯示擴增PBL之結果。未經治療之PBL(PreRx PBL)顯示平均179倍之擴增而經依魯替尼治療之PBL(PostRx PBL)顯示平均306倍之擴增。衍生自新鮮PBMC(PBL)之PBL僅顯示平均82倍之擴增。就PBL與PostRx PBL間而言，p=0.006。就PBL與PreRx PBL間而言，p=0.3；及就PreRx PBL與PostRx PBL間而言，p=0.1。整體而言，可看到所有PostRx PBL組之平均倍數擴增之增加超過PBL與PreRx PBL二者之所有組。
圖27展示在PBL、PreRx PBL及PostRx PBL中產生干擾素-γ(IFN-γ)之細胞。關於PBL，產生IFN-γ細胞之平均數約1864個。關於PreRx PBL，產生IFN-γ細胞之平均數約7530個及關於PostRx PBL，產生IFN-γ細胞之平均數約11984個。就PBL與PostRx PBL間而言，p=0.006。就PBL與PreRx PBL間而言，p=0.006；及就PreRx PBL與PostRx PBL間而言，p=0.01。整體而言，可看到所有PostRx PBL組產生IFN-γ細胞之平均數顯著增加超過PBL與PreRx PBL二者之所有組。
針對各試樣進行表現型特性分析。圖28表示PreRx PBL與PostRx PBL中CD4+與CD8+T細胞子集之比例，並使用黑色素瘤TIL作為比較組。於此，數據顯示無論使用哪一種方法擴增細胞，PreRx PBL與PostRx PBL二者間CD4子集(左側所示)可相較。PreRx PBL與PostRx PBL中之CD4子集顯示高於黑色素瘤TIL(各為p=0.0006)。無論用以擴增細胞之方法如何，PreRx PBL與PostRx PBL二者中之CD8子集(右側所示)皆較低。PreRx PBL與PostRx PBL中之CD8子集顯示低於黑色素瘤TIL(各為p=0.0006)。據推測，該等較低之CD8子集只是癌症類型之衍生物(即，於CLL中，CD4子集通常經擴增)。
圖29A至29D表示使用黑色素瘤TIL作為比較組之PreRx PBL與PostRx PBL之CD4記憶型子集間之比較。圖29A顯示初始(CCR7+/CD45RA+)之數據；圖29B顯示中央記憶型T細胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)之數據，圖29C顯示效應記憶型T細胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)之數據；與圖29D顯示終末分化效應記憶型細胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)之數據。圖29展示，PreRx PBL與PostRx PBL之CD4記憶型子集與於黑色素瘤TIL中所見可相較。
圖30A至30D表示使用黑色素瘤TIL作為比較組之PreRx PBL與PostRx PBL之CD8記憶型子集間之比較。圖30A顯示初始(CCR7+/CD45RA+)之數據；圖30B顯示中央記憶型T細胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)之數據；圖30C顯示效應記憶型T細胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)之數據；與圖30D顯示終末分化效應記憶型細胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)之數據。圖30展示，PreRx PBL與PostRx PBL之CD8記憶型子集與於黑色素瘤TIL中所見可相較。
圖31A與31B表示使用黑色素瘤TIL作為比較組之CD4細胞(圖31A)與CD8細胞(圖31B)之CD27子集之比較。相較於黑色素瘤TIL，PreRx PBL(p=0.03)與PostRx PBL(p=0.02)二者中之CD4CD27細胞子集皆顯著較高。相較於黑色素瘤TIL，PreRx PBL(p=0.002)與PostRx PBL(p=0.001)二者中之CD8CD27細胞子集皆顯著較高。
圖32A與32B表示使用黑色素瘤TIL作為比較組之CD4細胞(圖32A)與CD8細胞(圖32B)之CD28子集之比較。相較於黑色素瘤TIL，CD4CD28細胞子集與CD8CD28細胞子集於PreRx PBL與PostRx PBL二者中顯示可相較。
圖33A與33B表示在PreRx PBL與PostRx PBL之CD4+(圖33A)與CD8+(圖33B)群內LAG3+子集之比較。數據顯示在PostRx PBL中CD4+(p=0.06)與CD8+(p=0.01)群二者中之LAG3+子集皆顯著平均減少。
圖34A與34B表示在PreRx PBL與PostRx PBL之CD4+(圖34A)與CD8+(圖34B)群內PD1+子集之比較。數據顯示在PostRx PBL中CD4+與CD8+群二者中之PD1+子集皆平均減少，惟減少不顯著。
圖35A與35B顯示使用生物發光重定向溶解分析(BRLA)測量PreRx PBL(圖35A)與PostRx PBL(圖35B)之細胞溶解活性結果。該分析使用CelllTrace™ Violet Cell Proliferation Kit(Invitrogen)進行如下：以羧基螢光黃琥珀醯亞胺基酯(CFSE)標識為PBL之效應細胞。使標靶細胞(自體之CD19+腫瘤細胞)與米托塞因C(mitocyin C)一起培育，然後依照CellTrace Vioet Cell Proliferation Kit之用法說明，以CellTrace™ Violet(CTV)進行標識。效應細胞與標靶細胞以2：1、5：1與20：1(E：T細胞)之比例培育24小時。添加CountBright珠粒，以Annexin V - PI將細胞染色，然後分析CTV+/Annexin-V PI+細胞(其提供死細胞之數量)。PostRx PBL似乎更具效力，因為要殺死50%標靶腫瘤細胞需要較少之細胞(即，PostRx PBL之LU50 比PreRx PBL低)。
此實施例中進行之實驗展示下述結果：相較於從冷凍保存之PBMC(PreRx PBL與PostRx PBL)擴增之PBL，從新鮮CLL PBMC擴增之PBL顯示較低之倍數擴增與顯著較少之IFN-γ產量；相較於PreRx PBL，PostRx PBL顯示持續較高之倍數擴增與顯著增加之IFN-γ產量；且儘管PostRx PBL具有比PreRx PBL低之LU50 ，PreRx PBL與PostRx PBL二者皆顯示對自體(CD19+)腫瘤細胞之溶解活性。
提供上文闡述之實施例以給予一般熟習此項技藝者如何製造及使用本發明組成物、系統與方法之完整揭示內容與說明，惟不擬限制發明人等視為其發明之範圍。為熟習此項技藝人士顯而易見之為了實施本發明之上述方法之修飾，亦擬隸屬下述申請專利範圍之內。說明書中述及之所有專利案與公告案象徵本發明所屬熟習此項技藝者之技藝層次。
所有標題與段落編號僅供清楚與參考用途，而不得以任何方式視為限制。舉例而言，熟習此項技藝人士應理解，根據本文所述本發明之精神及範圍，適當結合不同標題與段落之各態樣之有效性。
本文所引用之所有參考文獻，其全部內容均併入本文以資參考，並且為了所有用途都達到相同程度，猶如各個別公告案或專利案或專利申請案係具體且分別指出其全部內容均併入以資所有用途之參考。
於不脫離其精神與範圍之情況下，可對本申請案進行許多修飾與變異，這對熟習此項技藝人士將是顯而易見。本文所述之特定具體實例與實施例係僅提供作為實例，且本申請案僅受隨附之申請專利範圍之條款以及此等申請專利範圍授權之同等物之全部範圍之限制。
前面概述以及下文本發明詳細說明，於結合隨附圖式閱讀時將更容易理解。
圖1說明淋巴瘤腫瘤之病理資訊。
圖2說明淋巴瘤與黑色素瘤TIL不同子集之比較，顯示於淋巴瘤TIL中之效應記憶型(EM)子集顯著高於黑色素瘤TIL中之EM子集。
圖3說明淋巴瘤與黑色素瘤TIL不同子集之比較，顯示於淋巴瘤TIL中之CD28+ CD4+ 子集顯著高於黑色素瘤TIL中之此等子集。
圖4說明非霍奇金氏淋巴瘤TIL與黑色素瘤TIL之CD4+ T細胞子集之比較，顯示分化標記。圖中紅線表示中位值。CM係指中央記憶型T細胞，EM係指效應記憶型T細胞及TEMRA係指效應記憶型CD45RA+ T細胞。
圖5說明非霍奇金氏淋巴瘤TIL與黑色素瘤TIL之CD8+ T細胞子集之比較，顯示分化標記。圖5圖中紅線表示中位值。CM係指中央記憶型T細胞，EM係指效應記憶型T細胞及TEMRA係指效應記憶型CD45RA+ T細胞。
圖6說明非霍奇金氏淋巴瘤TIL與黑色素瘤TIL之CD4+ T細胞子集之比較，顯示衰竭標記。圖中紅線表示中位值。LAG3係指淋巴細胞活化基因3，PD1係指方法性死亡1及TIGIT係指具有Ig與ITIM功能區之T細胞免疫受體。
圖7說明非霍奇金氏淋巴瘤TIL與黑色素瘤TIL之CD8+ T細胞子集之比較，顯示衰竭標記。圖中紅線表示中位值。LAG3係指淋巴細胞活化基因3，PD1係指方法性死亡1及TIGIT係指具有Ig與ITIM功能區之T細胞免疫受體。
圖8說明非霍奇金氏淋巴瘤TIL與黑色素瘤TIL間細胞類型之比較。NK係指自然殺手細胞及TCRab係指表現具有α與β鏈之T細胞受體之細胞。
圖9說明生物發光重定向溶解分析(BRLA)結果。
圖10說明淋巴瘤TIL對照黑色素瘤TIL之干擾素-γ(IFN-γ)酶聯免疫吸附分析(ELISA)結果。
圖11說明淋巴瘤TIL之酶聯免疫斑點(ELIspot)分析結果。
圖12說明黑色素瘤TIL之ELIspot分析結果。
圖13說明NANOSTRING NCOUNTER之分析結果，相較於黑色素瘤TIL，顯示淋巴瘤TIL表現更多量之RORC IL17A(TH17表現型)與GATA3(Th2表現型)。各個基因在熱圖中之紅色框中醒目顯示。
圖14說明TIL擴增與治療方法。步驟1係指添加4個腫瘤碎體至10個G-Rex 10容器中。步驟2，得到大約40×106 或更多個TIL。步驟3，將其分割至36個G-Rex 100燒瓶中供REP用。步驟4，離心收集TIL。經約43天之總處理時間後，於步驟5得到新鮮TIL產物，此時可輸注TIL至病患體內。
圖15說明使用本揭示內容得自淋巴瘤之TIL之治療方案。開始時進行手術(與腫瘤切除)，化學之淋巴細胞消減(lymphodepletion chemo)係指如本文別處所述具化療之非骨髓清除性淋巴細胞消減。
圖16展示使用如見述於實施例4之標準表現型評判小組DF2之流式細胞測量術分析結果。使用如見述於實施例4之標準表現型評判小組DF2染色淋巴瘤與黑色素瘤之TIL。所顯示數據表示TIL中總CD4與CD8 T細胞之不同亞族群。圖16A展示初始T細胞子集之CD4與CD8細胞比例；圖16B為中央記憶型T細胞子集(CM)；圖16C為效應記憶型T細胞子集(EM)及圖16D為終末分化效應記憶型(TEMRA)T細胞子集。使用雙尾曼-惠特尼(Mann-Whitney)檢定(未配對)計算P值。細胞子集之平均比例以橫條表示。
圖17展示使用如見述於下文實施例4之標準表現型評判小組DF1之流式細胞測量術分析之結果。使用如見述於實施例4之標準表現型評判小組DF1之流式細胞測量術染色淋巴瘤與黑色素瘤TIL。所顯示數據表示TIL中總CD4與CD9 T細胞之不同CD27+(圖17A)與CD28+(圖17B)亞族群，其指示淋巴瘤TIL中表現共刺激分子CD28之CD4 T細胞比例較高。P值係使用雙尾曼-惠特尼檢定(未配對)計算。
圖18展示根據下文實施例4進行之干擾素 -γ(IFN-γ)測試結果。圖18A展示使用ELIspot之結果。ELIspot數據以每106 個TIL產生之IFN-γ細胞表示。圖18B展示使用ELISA之結果。ELISA數據以利用ELISA(對數標度)測量之源自5×105 個TIL/槽的TIL培養上清液中之IFN-γ量表示。使用雙尾曼-惠特尼檢定(未配對)計算P值。
圖19展示TIL之溶解潛力。圖19A顯示共培養(TIL效應細胞與GFP+P815標靶細胞)4小時(圖19A)及24小時(圖19B)之標準化至106 個TIL的標靶細胞之LU50 。
圖20展示不同TIL對同種異體與自體腫瘤類型之細胞溶解活性。圖20A顯示黑色素瘤TIL對同種異體526標靶細胞之細胞溶解活性。圖20B顯示經由7-AAD攝取測定之淋巴瘤TIL對自體腫瘤細胞之細胞溶解活性。圖20A與20B之數據顯示以50：1效應細胞：標靶細胞(E：T)比例共培養中之死亡細胞百分比。圖20C表示由黑色素瘤TIL誘發之死滅標靶細胞百分比。圖20D表示不同E：T比例之由淋巴瘤TIL誘發之死滅標靶細胞百分比。
圖21為顯示淋巴瘤與黑色素瘤TIL基因表現概況之熱圖。該表現概況由源自NanoString之579叢(plex)nCounter GX Human Immunology V2 CSO評判小組測定。熱圖顯示淋巴瘤TIL中特定基因組之表現相較於黑色瘤TIL之倍數變化，且提示源自淋巴瘤衍生TIL之IL-17A與RORC較高之表現。此圖式所顯示之癌症包括濾泡性淋巴瘤(FL)、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)與外膜細胞淋巴瘤(MCL)。
圖22為展示製備TIL、收獲與運送排程之方法2A示意圖。
圖23為展示製備TIL之方法2A流程圖。
圖24為展示用於擴增周邊血液淋巴細胞(PBL)的三種不同方法之流程圖。
圖25A至25C表示用於擴增源自骨髓的骨髓浸潤性淋巴細胞(MIL)之三種不同方法。
圖26表示從新鮮周邊血液單核細胞(PBMC)及從冷凍保存PBMC單離的PBL之倍數擴增圖。該冷凍保存之PBMC係衍生自未曾(PreRx PBL)或已經(PostRx PBL)以依魯替尼療法治療之CLL病患。圖26至34各圖中，每個點為一個病患。紅點為其PBL使用PBL方法1擴增之病患；綠點為其PBL使用PBL方法2擴增之病患；黑點為其PBL使用PBL方法3擴增之病患。
圖27表示從新鮮PBMC及冷凍保存PBMC單離的PBL產生IFN-γ細胞之圖式。於經冷凍保存之PBMC中，亦表示PreRx PBL與PostRx PBL。
圖28表示使用黑色素瘤TIL作為比較組，於PreRx PBL與PostRx PBL中CD4+與CD8+ T細胞子集之比例。
圖29A至29D及圖30A至30D表示使用黑色素瘤TIL作為比較組，PreRx PBL與PostRx PBL之CD4(圖29)與CD8(圖30)記憶型子集間之比較。圖29A與30A顯示初始(CCR7+/CD45RA+)之數據；圖29B與30B顯示中央記憶型t細胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)之數據；圖29C與30C顯示效應記憶型T細胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)之數據及圖29D與30D顯示終末分化效應記憶型細胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)之數據。
圖31A與31B表示使用黑色素瘤TIL作為比較組，PreRx PBL與PostRx PBL之CD4(圖31A)與CD8(圖31B)之CD27子集之比較。
圖32A與32B表示使用黑色素瘤TIL作為比較組，PreRx PBL與PostRx PBL之CD4(圖32A)與CD8(圖32B)之CD28子集之比較。
圖33A與33B表示於PreRx PBL與PostRx PBL二者之CD4群(圖33A)與CD8群(圖33B)中LAG3+子集之比較。
圖34A與34B表示於PreRx PBL與PostRx PBL二者之CD4群(圖34A)與CD8群(圖34B)中PD1+子集之比較。
圖35A與35B顯示使用自體腫瘤致死分析所測量PreRx PBL(圖35A)與PostRx PBL(圖35B)之細胞溶解活性結果。細胞毒性係以LU50 (殺死50%標靶細胞所需PBL數)測量。
圖36A與36B表示從AML病患骨髓(MIL)或者周邊血液(PBL)單離之MILs(圖36A)與PBL(圖36B)之倍數擴增圖式。使用MIL方法1擴增MIL 1.1，使用MIL方法2擴增MIL 1.2及使用MIL方法3擴增MIL 1.3。使用MIL方法3擴增MIL2與MIL3。使用PBL方法3擴增所有PBL。MIL1.3之起始細胞數為138,000個細胞，MIL2為62,000個及MIL 3為28,000個細胞。PBL2之起始細胞數為338,000個及PBL3為336,000個。
圖37A與37B說明MILs(圖37A)與PBL(圖37B)各自之產生IFN-γ細胞。
圖38A至38F表示說明從AML病患單離之MILs(圖38A至38C)與PBL(圖38D至38F)中之T細胞子集圖式。圖38A與38D說明TCRαβ+子集，圖38B與38E說明CD4+子集及圖38C與38F說明CD8子集。PBL示於第0天與第14天。
圖39A至39D表示說明從AML病患單離之MILs之CD4記憶型子集圖式。圖39A顯示初始(CCR7+/CD45RA+)之數據；圖39B顯示中央記憶型t細胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)之數據；圖39C顯示效應記憶型T細胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)之數據及圖39D顯示終末分化效應記憶型細胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)之數據。
圖40A至40D表示說明從AML病患單離之PBL之CD4記憶型子集圖式。圖40A顯示初始(CCR7+/CD45RA+)之數據；圖40B顯示中央記憶型T細胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)之數據；圖40C顯示效應記憶型T細胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)之數據及圖40D顯示終末分化效應記憶型細胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)之數據。
圖41A至41D表示說明從AML病患單離之MILs之CD8記憶型子集圖式。圖41A顯示初始(CCR7+/CD45RA+)之數據；圖41B顯示中央記憶型T細胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)之數據；圖41C顯示效應記憶型T細胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)之數據及圖41D顯示終末分化效應記憶型細胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)之數據。
圖42A至42D表示說明從AML病患單離之PBL之CD8記憶型子集圖式。圖42A顯示初始(CCR7+/CD45RA+)之數據；圖42B顯示中央記憶型T細胞(CM)(CCR7+/CD45RA-)之數據；圖42C顯示效應記憶型T細胞(EM)(CCR7-/CD45RA-)之數據及圖42D顯示終末分化效應記憶型細胞(TEMRA)(CCR7-/CD45RA+)之數據。
圖43A與43B表示說明MILs(圖43A)與PBL(圖43B)之CD4與CD8細胞群之CD27子集圖式。
圖44A與44B表示說明MILs(圖44A)與PBL(圖44B)之CD4與CD8細胞群之CD28子集圖式。
圖45A與45B表示說明MILs(圖45A)與PBL(圖45B)之CD4與CD8細胞群之PD1+子集圖式。
圖46A與46B表示說明MILs(圖46A)與PBL(圖46B)之CD4與CD8細胞群之LAG3+子集圖式。 序列簡單說明
SEQ ID NO：1為莫羅單抗(muromonab)重鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO：2為莫羅單抗輕鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO：3為重組人類IL-2蛋白之胺基酸序列。
SEQ ID NO：4為阿地介白素(aldesleukin)之胺基酸序列。
SEQ ID NO：5為重組人類IL-4蛋白之胺基酸序列。
SEQ ID NO：6為重組人類IL-7蛋白之胺基酸序列。
SEQ ID NO：7為重組人類IL-15蛋白之胺基酸序列。
SEQ ID NO：8為重組人類IL-21蛋白之胺基酸序列。

Claims (126)

  1. 一種以腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群治療病患的癌症之方法，該方法包含以下步驟： 　　(a)視需要以包含依魯替尼(ibrutinib)之療法預治療病患； 　　(b)取得液體腫瘤； 　　(c)視需要碎斷或解離該腫瘤以得到腫瘤碎體並使該等腫瘤碎體與第一細胞培養液接觸； 　　(d)於該第一細胞培養液中進行第一TIL群之初始擴增以得到第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上比該第一TIL群多至少5倍，其中該第一細胞培養液包含IL-2，且其中該初始擴增進行21天或少於21天之期間； 　　(e)於第二細胞培養液中進行該第二TIL群之二次擴增以得到第三TIL群，其中自該二次擴增開始7天後該第三TIL群於數量上比該第二TIL群多至少10倍，其中該第二細胞培養液包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經照射之同種異體周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中該二次擴增進行14天或少於14天之期間； 　　(f)收集該第三TIL群；及 　　(g)給予癌症病患治療有效份量之該第三TIL群； 　　其中該癌症係血液惡性腫瘤。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含添加ITK抑制劑。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中於步驟(d)與(e)之至少一者添加ITK抑制劑至該細胞培養液。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該ITK抑制劑係選自包括胺基噻唑系ITK抑制劑、苯并咪唑系ITK抑制劑、胺基嘧啶系ITK抑制劑、3-胺基吡啶-2-酮系ITK抑制劑、吲哚基吲唑系ITK抑制劑、吡唑基吲哚系抑制劑、噻吩并吡唑抑制劑及靶向ATP囊袋中半胱胺酸442之ITK抑制劑之群組。
  5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該ITK抑制劑為依魯替尼、達沙替尼(dasatinib)、博舒替尼(bosutinib)、尼羅替尼(nilotinib)、厄洛替尼(erlotinib)、BMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469及彼等之組合。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該ITK抑制劑為依魯替尼。
  7. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該ITK抑制劑以約0.1 nM至約5 μM之濃度添加。
  8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該初始擴增進行3天至11天之期間。
  9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該二次擴增進行3天至11天之期間。
  10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該IL-2以介於1000 IU/mL與6000 IU/mL間之初始濃度存在於該第一細胞培養液。
  11. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該IL-2以介於1000 IU/mL與6000 IU/mL間之初始濃度與該OKT-3抗體以約30 ng/mL之初始濃度存在於該第二細胞培養液。
  12. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該初始擴增係使用透氣容器進行。
  13. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該二次擴增係使用透氣容器進行。
  14. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該第一細胞培養液進一步包含選自包括下述組群之細胞介素：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及彼等之組合。
  15. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該第二細胞培養液進一步包含選自包括下述組群之細胞介素：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及彼等之組合。
  16. 如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含在給予該病患該第三TIL群之前，以非清髓性消除淋巴細胞療法治療該病患之步驟。
  17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該非清髓性消除淋巴細胞療法包含以每天60 mg/m2 劑量之環磷醯胺給藥兩天並隨後以每天25 mg/m2 劑量之氟達拉濱(fludarabine)給藥五天之步驟。
  18. 如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含在給予該病患該第三TIL群之後當天開始以高劑量IL-2療法治療該病患之步驟。
  19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該高劑量IL-2療法包含每8小時靜脈內推注輸注15分鐘給予600,000或720,000 IU/kg之阿地介白素(aldesleukin)或其生物模擬藥或變異體直到耐受。
  20. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該癌症係選自包括急性類骨髓性白血病(AML)、外膜細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)、活化型B細胞(ABC)DLBCL、生發中心型B細胞(GCB)DLBCL、慢性淋巴球性白血病(CLL)、小淋巴球性白血病(SLL)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)(NHL)、霍奇金氏淋巴瘤、復發性及/或難治性霍奇金氏淋巴瘤、B細胞急性淋巴胚細胞白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、柏基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenström’s macroglobulinemia)(WM)、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、骨髓纖維化、慢性骨髓性白血病、濾泡中心性淋巴瘤、無痛性NHL、人類免疫缺失症病毒(HIV)相關之B細胞淋巴瘤及艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein–Barr virus)(EBV)相關之B細胞淋巴瘤之群組。
  21. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該病患族群係經依魯替尼預治療之病患族群。
  22. 一種製備源自腫瘤之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)群之方法，該方法包含以下步驟： 　　(a)碎斷該腫瘤； 　　(b)於第一細胞培養液中進行第一TIL群之初始擴增以得到第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上比該第一TIL群多至少5倍，其中該第一細胞培養液包含IL-2，且其中該初始擴增進行21天或少於21天之期間； 　　(c)於第二細胞培養液中進行該第二TIL群之二次擴增以得到第三TIL群，其中自該二次擴增開始7天後該第三TIL群於數量上比該第二TIL群多至少50倍，其中該第二細胞培養液包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經照射之同種異體周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中該二次擴增進行14天或少於14天之期間；及 　　(d)收集該第三TIL群； 　　其中該腫瘤係液體腫瘤，且其中該癌症係血液惡性腫瘤。
  23. 如申請專利範圍第22項之方法，其中該第一TIL群係得自腫瘤或其部分。
  24. 如申請專利範圍第23項之方法，其中該腫瘤或其部分已從病患切除。
  25. 如申請專利範圍第22項之方法，其中該初始擴增進行14天或少於14天之期間。
  26. 如申請專利範圍第22項之方法，其中該初始擴增進行11天或少於11天之期間。
  27. 如申請專利範圍第22項之方法，其中該二次擴增進行11天或少於11天之期間。
  28. 一種液體腫瘤於製造用於治療血液惡性腫瘤之TIL群之用途。
  29. 一種擴增得自骨髓或周邊血液之TIL之方法，該方法包含： 　　(a)鑑定源自骨髓或周邊血液試樣之第一TIL群； 　　(b)於第一細胞培養液中進行該第一TIL群之初始擴增以得到第二TIL群，其中該第二TIL群於數量上比該第一TIL群多至少5倍，其中該第一細胞培養液包含IL-2，且其中該初始擴增進行21天或少於21天之期間； 　　(c)於第二細胞培養液中進行該第二TIL群之二次擴增以得到第三TIL群，其中自該二次擴增開始7天後該第三TIL群於數量上比該第二TIL群多至少50倍，其中該第二細胞培養液包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)及經照射之同種異體周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中該二次擴增進行14天或少於14天之期間； 　　(d)收集該第三TIL群；及 　　(e)提供該病患該第三TIL群。
  30. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該初始擴增進行11天或少於11天之期間。
  31. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該二次擴增進行11天或少於11天之期間。
  32. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該IL-2以介於1000 IU/mL與6000 IU/mL間之初始濃度存在於該第一細胞培養液。
  33. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該IL-2以介於1000 IU/mL與6000 IU/mL間之初始濃度與該OKT-3抗體以約30 ng/mL之初始濃度存在於該第二細胞培養液。
  34. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該初始擴增係使用透氣容器進行。
  35. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該二次擴增係使用透氣容器進行。
  36. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該第一細胞培養液進一步包含選自包括下述組群之細胞介素：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及彼等之組合。
  37. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該第二細胞培養液進一步包含選自包括下述組群之細胞介素：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及彼等之組合。
  38. 一種擴增源自周邊血液之周邊血液淋巴細胞(PBL)之方法，其包含： 　　a. 取得源自周邊血液之周邊血液單核細胞(PBMC)試樣，其中視需要將該試樣冷凍保存； 　　b. 經由篩選與移除CD19+ B細胞單離源自該試樣之PBL； 　　c. 視需要使該PBL與該CD19+ B細胞共培養； 　　d. 於透氣容器中，在具有IL-2與抗CD3/抗CD28抗體之第一細胞培養液中，刺激該PBL約2至約6天之期間； 　　e. 使得自步驟(d)之該PBL與IL-2和抗CD3/抗CD28抗體培養約2至約6天之期間； 　　f. 從步驟(e)之培養物單離結合抗體之該PBL； 　　g. 從步驟(e)單離之該PBL移除該等抗體；及 　　h. 收集該PBL。
  39. 如申請專利範圍第38項之方法，其中該第一細胞培養液係選自包括CM-2、CM-4及AIM-V之群組。
  40. 如申請專利範圍第38項之方法，其中於步驟(d)之後，添加追加之IL-2，且以第二細胞培養液交換該第一細胞培養液。
  41. 如申請專利範圍第38項之方法，其中於步驟(e)之後，添加追加之IL-2，且以第三細胞培養液交換該第二細胞培養液。
  42. 如申請專利範圍第40項之方法，其中該第二細胞培養液係選自包括CM-2、CM-4及AIM-V之群組。
  43. 如申請專利範圍第41項之方法，其中該第三細胞培養液係選自包括CM-2、CM-4及AIM-V之群組。
  44. 如申請專利範圍第40項之方法，其中該第一細胞培養液與該第二細胞培養液不同。
  45. 如申請專利範圍第40項之方法，其中該第一細胞培養液與該第二細胞培養液相同。
  46. 如申請專利範圍第38項之方法，其中於步驟(c)中，B細胞與PBL之比例為約0.1：1至約10：1(B細胞：PBL)。
  47. 如申請專利範圍第38項之方法，其中於步驟(c)中，B細胞與PBL之比例係選自包括0.1：1、1：1及10：1(B細胞：PBL)之群組。
  48. 如申請專利範圍第38項之方法，其中於步驟(d)開始時，該透氣容器中至少有約1×105 至約10×105 個PBL。
  49. 如申請專利範圍第38項之方法，其中於步驟(d)開始時，該透氣容器中至少有約2.5×105 至約10×105 個PBL。
  50. 如申請專利範圍第38項之方法，其中於步驟(d)開始時，該透氣容器中至少有5×105 個PBL。
  51. 如申請專利範圍第38項之方法，其中於步驟(c)與(d)中，該IL-2以介於1000 IU/mL與6000 IU/mL間之濃度存在。
  52. 如申請專利範圍第51項之方法，其中該IL-2以約3000 IU/mL之濃度存在。
  53. 如申請專利範圍第38項之方法，其中於各步驟(c)與(d)中，該等抗CD3/抗CD28抗體係被覆於珠粒上，且該PBL：珠粒比例為約1：1。
  54. 如申請專利範圍第38項之方法，其進一步包含添加ITK抑制劑。
  55. 如申請專利範圍第54項之方法，其中ITK抑制劑係於步驟(c)、步驟(d)及步驟(e)之至少一者中添加。
  56. 如申請專利範圍第54項之方法，其中該ITK抑制劑係選自包括胺基噻唑系ITK抑制劑、苯并咪唑系ITK抑制劑、胺基嘧啶系ITK抑制劑、3-胺基吡啶-2-酮系ITK抑制劑、吲哚基吲唑系ITK抑制劑、吡唑基吲哚系抑制劑、噻吩并吡唑抑制劑及靶向ATP囊袋中半胱胺酸442之ITK抑制劑之群組。
  57. 如申請專利範圍第56項之方法，其中該ITK抑制劑為依魯替尼、達沙替尼、博舒替尼、尼羅替尼、厄洛替尼、BMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469及彼等之組合。
  58. 如申請專利範圍第57項之方法，其中該ITK抑制劑為依魯替尼。
  59. 如申請專利範圍第38項之方法，其中該方法係於封閉之無菌系統中進行。
  60. 一種擴增源自周邊血液之周邊血液淋巴細胞(PBL)之方法，其包含： 　　a. 取得源自周邊血液之PBMC試樣，其中視需要將該試樣冷凍保存； 　　b. 經由篩選與移除CD19+ B細胞單離源自該試樣之PBL； 　　c. 使該PBL與該CD19+ B細胞共培養約3天之期間； 　　d. 添加約2.5×105 至約5×105 個細胞至透氣容器之第一細胞培養液中，且以3000 IU/mL IL-2與固定於珠粒上之抗CD3/抗CD28抗體刺激該PBL約4天之期間； 　　e. 以第二細胞培養液和濃度約3000 IU/mL之追加IL-2交換該第一細胞培養液； 　　f. 使得自步驟(e)之PBL與IL-2和固定於珠粒上之抗CD3/抗CD28抗體培養約4天之追加期； 　　g. 以第三細胞培養液交換該第二細胞培養液並添加濃度3000 IU/mL之追加IL-2，且再培養該細胞約3天之追加期； 　　h. 從步驟(g)之培養物單離結合抗體之該PBL； 　　i. 從步驟(h)單離之該PBL移除該等抗體；及 　　j. 收集該PBL。
  61. 一種治療血液惡性腫瘤之方法，該方法包含： 　　a. 取得源自罹患血液惡性腫瘤之病患的周邊血液之PBMC試樣； 　　b. 經由篩選與移除CD19+ B細胞單離源自該試樣之PBL； 　　c. 視需要使該PBL與該CD19+ B細胞共培養； 　　d. 於透氣容器中，在具有IL-2與抗CD3/抗CD28抗體之第一細胞培養液中，刺激該PBL約2至約6天之期間； 　　e. 使得自步驟(d)之該PBL與IL-2和抗CD3/抗CD28抗體培養約2至約6天之期間； 　　f. 從步驟(e)之培養物單離結合抗體之該PBL； 　　g. 從步驟(f)單離之該PBL移除該等抗體； 　　h. 收集該PBL；及 　　i. 將該PBL以有效治療量給予該病患以治療該血液惡性腫瘤。
  62. 如申請專利範圍第61項之方法，其中該病患在取得PBMC試樣前經ITK抑制劑預治療。
  63. 如申請專利範圍第62項之方法，其中該ITK抑制劑係選自包括胺基噻唑系ITK抑制劑、苯并咪唑系ITK抑制劑、胺基嘧啶系ITK抑制劑、3-胺基吡啶-2-酮系ITK抑制劑、吲哚基吲唑系ITK抑制劑、吡唑基吲哚系抑制劑、噻吩并吡唑抑制劑及靶向ATP囊袋中半胱胺酸442之ITK抑制劑之群組。
  64. 如申請專利範圍第62項之方法，其中該ITK抑制劑為依魯替尼、達沙替尼、博舒替尼、尼羅替尼、厄洛替尼、BMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469及彼等之組合。
  65. 如申請專利範圍第64項之方法，其中該ITK抑制劑為依魯替尼。
  66. 如申請專利範圍第62項之方法，其中該病患經至少3輪之依魯替尼療法預治療。
  67. 如申請專利範圍第61項之方法，其中該血液惡性腫瘤係選自包括急性類骨髓性白血病(AML)、外膜細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)、活化型B細胞(ABC)DLBCL、生發中心型B細胞(GCB)DLBCL、慢性淋巴球性白血病(CLL)、小淋巴球性白血病(SLL)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)(NHL)、霍奇金氏淋巴瘤、復發性及/或難治性霍奇金氏淋巴瘤、B細胞急性淋巴胚細胞白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、柏基特氏淋巴瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenström’s macroglobulinemia)(WM)、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、骨髓纖維化、慢性骨髓性白血病、濾泡中心性淋巴瘤、無痛性NHL、人類免疫缺失症病毒(HIV)相關之B細胞淋巴瘤及艾司坦氏-巴爾氏病毒(EBV)相關之B細胞淋巴瘤之群組。
  68. 如申請專利範圍第61項之方法，其中該血液惡性腫瘤係慢性淋巴球性白血病(CLL)。
  69. 如申請專利範圍第61項之方法，其中該第一細胞培養液係選自包括CM-2、CM-4及AIM-V之群組。
  70. 如申請專利範圍第61項之方法，其中於步驟(d)之後，添加追加之IL-2，且以第二細胞培養液交換該第一細胞培養液。
  71. 如申請專利範圍第70項之方法，其中於步驟(e)之後，添加追加之IL-2，且以第三細胞培養液交換該第二細胞培養液。
  72. 如申請專利範圍第70項之方法，其中該第二細胞培養液係選自包括CM-2、CM-4及AIM-V之群組。
  73. 如申請專利範圍第71項之方法，其中該第三細胞培養液係選自包括CM-2、CM-4及AIM-V之群組。
  74. 如申請專利範圍第70項之方法，其中該第一細胞培養液與該第二細胞培養液不同。
  75. 如申請專利範圍第70項之方法，其中該第一細胞培養液與該第二細胞培養液相同。
  76. 如申請專利範圍第61項之方法，其中於步驟(c)中B細胞與PBL之比例為約0.1：1至約10：1(B細胞：PBL)。
  77. 如申請專利範圍第61項之方法，其中於步驟(c)中B細胞與PBL之比例係選自包括0.1：1、1：1及10：1(B細胞：PBL)之群組。
  78. 如申請專利範圍第61項之方法，其中於步驟(d)開始時，該透氣容器中至少有約1×105 至約10×105 個PBL。
  79. 如申請專利範圍第61項之方法，其中於步驟(d)開始時，該透氣容器中至少有約2.5×105 至約10×105 個PBL。
  80. 如申請專利範圍第61項之方法，其中於步驟(d)開始時，該透氣容器中至少有5×105 個PBL。
  81. 如申請專利範圍第61項之方法，其中於步驟(d)與(e)中，該IL-2以介於1000 IU/mL與6000 IU/mL間之濃度存在。
  82. 如申請專利範圍第81項之方法，其中該IL-2以約3000 IU/mL之濃度存在。
  83. 如申請專利範圍第61項之方法，其中於各步驟(d)與(e)中，該等抗CD3/抗CD28抗體係被覆於珠粒上，且該PBL：珠粒比例為約1：1。
  84. 如申請專利範圍第61項之方法，其中該PBL以約0.1×109 至約15×109 個PBL之量給予。
  85. 一種擴增源自骨髓之骨髓浸潤性淋巴細胞(MILs)之方法，其包含： 　　a. 取得源自骨髓之周邊血液單核細胞(PBMC)試樣，其中視需要冷凍保存該試樣； 　　b. 分選整理CD3+、CD33+、CD20+及CD14+細胞區分(MIL區分)及非CD3+、非CD33+、非CD20+及非CD14+細胞區分(AML胚細胞區分)； 　　c. 視需要崩解該AML胚細胞區分； 　　d. 以約0.1：1至約10：1之細胞數比例添加該視需要經崩解之AML胚細胞區分至該MIL細胞區分； 　　e. 於包含IL-2之第一細胞培養液之透氣容器中，培養一或兩種該等細胞區分； 　　f. 以抗CD3/抗CD28抗體刺激該MILs以獲得MILs之擴增； 　　g. 以IL-2與抗CD3/抗CD28抗體再刺激該MILs約2至約6天之追加期； 　　h. 使該MILs與追加之IL-2培養約1至約3天之追加期；及 　　i. 收集該MILs。
  86. 如申請專利範圍第85項之方法，其中該第一細胞培養液係選自包括CM-2、CM-4及AIM-V之群組。
  87. 如申請專利範圍第85項之方法，其中於步驟(e)開始後，添加追加之IL-2，且以第二細胞培養液交換該第一細胞培養液。
  88. 如申請專利範圍第87項之方法，其中該第二細胞培養液係選自包括CM-2、CM-4及AIM-V之群組。
  89. 如申請專利範圍第87項之方法，其中該第一細胞培養液與該第二細胞培養液不同。
  90. 如申請專利範圍第87項之方法，其中該第一細胞培養液與該第二細胞培養液相同。
  91. 如申請專利範圍第85項之方法，其中於步驟(e)開始時，該透氣容器中至少有約2×104 至約5×105 個MILs。
  92. 如申請專利範圍第85項之方法，其中於步驟(e)開始時，該透氣容器中至少有約2.8×104 至約3.4×105 個MILs。
  93. 如申請專利範圍第85項之方法，其中於步驟(e)開始時，該透氣容器中至少有5×105 個MILs。
  94. 如申請專利範圍第85項之方法，其中於步驟(d)中該IL-2以介於1000 IU/mL與6000 IU/mL間之濃度存在。
  95. 如申請專利範圍第94項之方法，其中該IL-2以約6000 IU/mL之濃度存在。
  96. 如申請專利範圍第85項之方法，其中於步驟(f)中，該IL-2以3000 IU/mL之濃度存在。
  97. 如申請專利範圍第85項之方法，其中於步驟(d)中該培養進行約3天之期間。
  98. 如申請專利範圍第85項之方法，其中於步驟(e)中該刺激進行約4天之期間。
  99. 如申請專利範圍第85項之方法，其中於步驟(f)中該刺激進行約7天之期間。
  100. 如申請專利範圍第85項之方法，其中於步驟(g)中該追加之IL-2以約3000 IU/mL之濃度存在。
  101. 如申請專利範圍第85項之方法，其中於各步驟(e)與(f)中，該等抗CD3/抗CD28抗體係被覆於珠粒上，且該MILs：珠粒比例為約1：1。
  102. 如申請專利範圍第85項之方法，其中該視需要經崩解之細胞區分係使用選自包括音波振動處理、渦動、振動及裂解之群組之方法進行崩解。
  103. 如申請專利範圍第85項之方法，其中該AML胚細胞區分對該MIL區分之細胞數比例為約1：1。
  104. 如申請專利範圍第85項之方法，其中該方法係於封閉之無菌系統中進行。
  105. 一種擴增源自骨髓之骨髓浸潤性淋巴細胞(MILs)之方法，其包含： 　　a. 取得源自骨髓之周邊血液單核細胞(PBMC)試樣，其中視需要冷凍保存該試樣； 　　b. 分選整理CD3+、CD33+、CD20+及CD14+細胞區分及非CD3+、非CD33+、非CD20+及非CD14+細胞區分； 　　c. 崩解該AML胚細胞區分，且以約1：1之細胞數比例添加該經崩解之AML胚細胞區分至該MIL細胞區分； 　　d. 於透氣容器中，在包含濃度約6000 IU/mL的IL-2之第一細胞培養液中，培養該AML胚細胞區分與該MIL細胞區分約3天之期間； 　　e. 以約1：1(MILs：珠粒)之比例，添加固定於珠粒上之抗CD3/抗CD28抗體至該細胞培養液中，並培養該MILs與抗體約1天之期間； 　　f. 交換該第一細胞培養液為包含濃度約3000 IU/mL之追加IL-2的第二細胞培養液； 　　g. 培養該等抗體珠粒與MILs約3天之追加期； 　　h. 以IL-2與固定在珠粒上之抗CD3/抗CD28抗體再刺激該MILs至少約4天之追加期； 　　i. 交換該第二細胞培養液為包含濃度約3000 IU/mL之追加IL-2之第三細胞培養液，再進行至少約3天之追加期；及 　　j. 收集該MILs。
  106. 一種治療血液惡性腫瘤之方法，其包含： 　　a. 取得源自骨髓之周邊血液單核細胞(PBMC)試樣，其中視需要冷凍保存該試樣； 　　b. 分選整理CD3+、CD33+、CD20+及CD14+細胞區分(MIL區分)及非CD3+、非CD33+、非CD20+及非CD14+細胞區分(AML胚細胞區分)； 　　c. 視需要崩解該AML胚細胞區分； 　　d. 以約0.1：1至約10：1之細胞數比例添加該視需要經崩解之AML胚細胞區分至該MIL細胞區分； 　　e. 於包含IL-2之第一細胞培養液之透氣容器中，培養一或兩種該等細胞區分； 　　f. 以抗CD3/抗CD28抗體刺激該MILs以獲得MILs之擴增； 　　g. 以IL-2與抗CD3/抗CD28抗體再刺激該MILs約2至約6天之追加期； 　　h. 使該MILs與追加之IL-2培養約1至約3天之追加期； 　　i. 收集該MILs；及 　　j. 以有效治療量之該MILs給予病患以治療該血液惡性腫瘤。
  107. 如申請專利範圍第106項之方法，其中該血液惡性腫瘤係選自包括急性類骨髓性白血病(AML)、外膜細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)、活化型B細胞(ABC)DLBCL、生發中心型B細胞(GCB)DLBCL、慢性淋巴球性白血病(CLL)、小淋巴球性白血病(SLL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、霍奇金氏淋巴瘤、復發性及/或難治性霍奇金氏淋巴瘤、B細胞急性淋巴胚細胞白血病(B-ALL)、成熟B-ALL、柏基特氏淋巴瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(WM)、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、骨髓纖維化、慢性骨髓性白血病、濾泡中心性淋巴瘤、無痛性NHL、人類免疫缺失症病毒(HIV)相關之B細胞淋巴瘤及艾司坦氏-巴爾氏病毒(EBV)相關之B細胞淋巴瘤之群組。
  108. 如申請專利範圍第107項之方法，其中該血液惡性腫瘤係急性類骨髓性白血病(AML)。
  109. 如申請專利範圍第106項之方法，其中該第一細胞培養液係選自包括CM-2、CM-4及AIM-V之群組。
  110. 如申請專利範圍第106項之方法，其中於進行步驟(e)之後，添加追加之IL-2，且以第二細胞培養液交換該第一細胞培養液。
  111. 如申請專利範圍第110項之方法，其中該第二細胞培養液係選自包括CM-2、CM-4及AIM-V之群組。
  112. 如申請專利範圍第110項之方法，其中該第一細胞培養液與該第二細胞培養液不同。
  113. 如申請專利範圍第110項之方法，其中該第一細胞培養液與該第二細胞培養液相同。
  114. 如申請專利範圍第106項之方法，其中於步驟(e)開始時，該透氣容器中至少有約2×104 至約5×105 個MILs。
  115. 如申請專利範圍第106項之方法，其中於步驟(e)開始時，該透氣容器中至少有約2.8×104 至約3.4×105 個MILs。
  116. 如申請專利範圍第106項之方法，其中於步驟(d)開始時，該透氣容器中至少有5×105 個MILs。
  117. 如申請專利範圍第106項之方法，其中於步驟(d)中，該IL-2以介於1000 IU/mL與6000 IU/mL間之濃度存在。
  118. 如申請專利範圍第117項之方法，其中該IL-2以約6000 IU/mL之濃度存在。
  119. 如申請專利範圍第106項之方法，其中於步驟(f)中，該IL-2以約3000 IU/mL之濃度存在。
  120. 如申請專利範圍第106項之方法，其中於步驟(e)中該培養進行約3天之期間。
  121. 如申請專利範圍第106項之方法，其中於步驟(f)中該刺激進行約4天之期間。
  122. 如申請專利範圍第106項之方法，其中於步驟(g)中該刺激進行約7天之期間。
  123. 如申請專利範圍第106項之方法，其包含於步驟(f)之後，進行追加IL-2之補充步驟。
  124. 如申請專利範圍第123項之方法，其中該追加之IL-2以約3000 IU/mL之濃度存在。
  125. 如申請專利範圍第106項之方法，其中於各步驟(f)與(g)中，該等抗CD3/抗CD28抗體係被覆於珠粒上，且該珠粒：MILs比例為約1：1。
  126. 如申請專利範圍第106項之方法，其中係以約4×108 至約2.5×109 個MILs之量給予該MILs。
TW107115951A 2017-05-10 2018-05-10 源自液體腫瘤之腫瘤浸潤性淋巴細胞的擴增和該經擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之治療用途 TW201904578A (zh)

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