ES2593049T3 - Proteínas de fusión que forman trímeros - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión que comprende (i) un dominio de trimerización de la familia de colectina que comprende (a) un dominio de reconocimiento de carbohidrato de la familia de colectina de la proteína tensioactiva D; y (b) una región de cuello de la familia de colectina de la proteína tensioactiva D; (ii) un elemento enlazador; (iii) el polipéptido efector TRAIL o el dominio de unión a receptor del mismo respectivo, en la que el polipéptido efector está localizado de forma N-terminal de la región de cuello de la familia de colectina, y (iv) un anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla o un fragmento de un anticuerpo o anticuerpo de cadena sencilla fusionado al extremo C-terminal del dominio de reconocimiento de carbohidrato.

Description

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DESCRIPCION

Proteínas de fusión que forman trímeros Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden una región de cuello y dominio de reconocimiento de carbohidrato de un dominio de trimerización de colectina, un elemento enlazador y un polipéptido efector. Las proteínas de fusión son adecuadas como composición farmacéutica o para aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y/o investigación como se describe en este documento.

Antecedentes

Se sabe que las proteínas colectina forman oligómeros estables. Las colectinas son uno de los 18 miembros del grupo que componen la superfamilia de proteínas lectina que contiene un plegamiento proteico estructural llamado dominio de lectina tipo C (Zelensky et al., FEBS Journal 2005, Vol. 272, pág. 6179-6217). Las lectinas son proteínas que se unen a carbohidratos y las lectinas tipo C requieren calcio para la unión. Como el dominio de lectina tipo C está implicado en la unión a carbohidrato, este dominio también se llama el dominio de reconocimiento de carbohidrato (CRD). Las colectinas pertenecen a la inmunidad innata y entre otras funciones neutralizan los patógenos por unión a los carbohidratos, por ejemplo, presentes en virus y bacterias. Además, las colectinas regulan funciones inmunitarias tales como activación del complemento e influyen en la inflamación. Las características estructurales básicas de las colectinas son un dominio colagenoso y un dominio de lectina que son los componentes que dan el nombre de las colectinas. Algunos miembros han demostrado contener características estructurales adicionales, por tanto, contienen los siguientes componentes: i) un dominio de colágeno N-terminal conectado a ii) un segmento alfa-helicoide que también se menciona como región de cuello y iii) el CRD en el extremo C-terminal (Figura 35). Las colectinas trimerizan de forma no covalente mediante el "colágeno triplehelicoide", el "cuello superenrollado" y las regiones CRD. En seres humanos, el grupo colectina contiene una o más proteínas séricas de unión a mañosa, colectinas del hígado, riñones, placenta y pulmón. Se conocen cuatro colectinas pulmonares, incluyendo la proteína tensioactiva pulmonar-A y -D (SP-A y SP-D) que contienen cisteínas N-terminales que están implicadas en la oligomerización mediada por disulfuro de trímeros pre-formados. Por ejemplo, SP-D forma tetrámetros de trímeros y SP-A forma hexámeros de trímeros (Kishore et al., Mol. Immunol. 2006, Vol. 43, 1293- 1315).

En el intento por proporcionar complejos triméricos de citoquinas de la superfamilia de TNF se han sugerido proteínas de fusión recombinantes que comprenden una citoquina TNF y un componente de multimerización como un posible enfoque (por ejemplo, el documento WO 0149866). Las construcciones descritas, sin embargo, mostraban dominios de trimerización con un gran peso molecular y con propiedades ineficaces de trimerización.

Schneider et al. (J Exp Med 187 (1989), 1205-1213) describen que trímeros de citoquinas TNF se estabilizan por motivos de estabilización posicionados de forma N-terminal. En CD95L, la estabilización del trímero del dominio de unión al receptor de CD95L está causada presumiblemente por dominios de aminoácidos N-terminales que están localizados cerca de la membrana citoplasmática.

Shiraishi et al. (Biochem Biophys Res Commun 322 (2004), 197-202) describen que el dominio de unión al receptor de CD95L puede estabilizarse por motivos a-helicoides superenrollados (cremallera de leucina) artificiales posicionados de forma N-terminal. Se descubrió, sin embargo, que la orientación de las cadenas polipeptídicas entre sí, por ejemplo, orientación paralela o anti-paralela, apenas puede predecirse. Además, las cantidades óptimas de repeticiones hepta-d en el motivo de cremallera superenrollada son difíciles de determinar. Además, las estructuras superenrolladas tienen la tendencia a formar agregados macromoleculares después de alteración del pH y/o la fuerza iónica.

Me Alinden et al. (J of Biol Chem, 2002, 277(43):41274-41281) describe la preparación de una proteína de fusión entre una secuencia de aminoácidos de procolágeno de tipo MA humano y una secuencia de 14 aminoácidos correspondiente a las dos primeras repeticiones hepta-d del dominio de cuello de la proteína tensioactiva (SP-D) de rata.

El documento WO 01/42298 describe la preparación de una proteína de fusión entre la proteína-D tensioactiva que comprende la secuencia señal, el dominio de colágeno y el dominio de cuello y CD40L. La desventaja de esas proteínas de fusión es que conducen a agregados multiméricos que son muy inmunogénicos y que no producen ligandos triméricos bioquímicamente definidos.

Evitar los problemas nombrados existentes en la técnica podría conseguirse usando dominios de trimerización de colectina como una herramienta para formar trímeros controlados. Se han realizado en la técnica intentos para esto. Sin embargo, solamente se ha usado la región de cuello superenrollado de los dominios de trimerización de colectina (CRD) en dichos intentos. La región de cuello de tipo superenrollado de SP-D puede usarse en sí misma como dominio de trimerización, fusionada N- o C-terminal a dominios proteicos como se describe en el documento

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WO95/31540.

Sin embargo, si se usa únicamente la región de cuello superenrollado, la cantidad óptima de repeticiones hepta-d para conseguir un trímero estable (la longitud global) es difícil de determinar. La parte presentada de la región de cuello de SP-D no forma trímeros suficientemente estables por sí mismos y necesita optimizarse con respecto a su longitud o grado de repetición para generar proteínas de fusión trlmérlcas establecidas. Además, las estructuras superenrolladas tienden a forma agregados macromoleculares después de la alteración del pH y/o la fuerza Iónica. Por consiguiente, un haz a-helicoide de la región de cuello de colectlna existe solamente como una molécula trlmérica en condiciones que imitan o se aproximan a las condiciones fisiológicas. Esto Implica que las estrategias de purificación que emplean desplazamientos de pH y/o la alteración de la fuerza Iónica podrían tener un efecto negativo sobre el estado trimérico de proteínas de fusión basadas únicamente en el cuello.

Además, se ha intentado la oligomerización de fragmentos de anticuerpo usando dominios de trlmerlzaclón de colectina. Por ejemplo, se han investigado proteínas de fusión que comprenden un Fab antl-CD89 o un Fab antl- CD64 fusionado al fragmento SP-D humano recombinante (cuello+domlnlo CRD) y se ha descubierto que son eficaces en el direccionamiento de patógenos hacia neutrófilos. Las proteínas de fusión presentadas se habían generado por reticulación química produciendo una mezcla de productos proteicos con la necesidad de un régimen complejo de purificación para conseguir la especie de proteína deseada.

Para SP-D humana se ha descrito un muíante en que el aminoácido fenllalanlna 335 (correspondiente al aminoácido 355 de la SEQ ID NO: 21) se ha mutado en alanina (SPD_F335A, Crouch et al., JBC 281: 18008-18014). Este mutante mostró unión muy débil a carbohidrato.

Para permitir un proceso de fabricación eficaz para proteínas de fusión basadas en Fab-SP-D, sería deseable un proceso que no necesite procedimientos laboriosos de purificación, pero permita una producción controlada de productos definidos en lugar de mezclas en bruto.

Los inventores descubrieron que las proteínas de fusión descritas en este documento superan los problemas presentes en la técnica y permiten una generación controlada de trímeros de diferentes pollpéptidos efectores tales como citoquinas de las superfamllla de TNF o también de fragmentos de anticuerpo o anticuerpos de cadena sencilla. Un objetivo de la presente Invención fue proporcionar proteínas de fusión formadoras de trímeros que permiten la fabricación recombinante y eficaz combinada con buenas propiedades de trimerlzaclón y propiedades farmacéuticas mejoradas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende

(i) un dominio de trimerización de la familia de colectina que comprende

a. un dominio de reconocimiento de carbohidrato de la familia de colectina de la proteína tensioactiva D; y

b. una región de cuello de la familia de colectina de la proteína tensioactiva D;

(ii) un elemento enlazador;

(iii) el polipéptido efector TRAIL o el dominio de unión a receptor del mismo respectivo, donde el polipéptido efector está localizado de forma N-terminal de la región de cuello de la familia de colectina, y

(iv) un anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla o un fragmento de un anticuerpo o anticuerpo de cadena sencilla, fusionado al extremo C-terminal del dominio de reconocimiento de carbohidrato.

El documento describe adicionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión como se describe en este documento y un trastorno proliferativo de células o un organismo no humano asociado con disfunción de citoquinas TNF que comprende tumores, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias, enfermedades metabólicas, trastornos autoinmunitarios, enfermedades degenerativas y rechazos de trasplante.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende como agente activo una proteína de fusión como se describe en este documento. La proteína de fusión como se describe en este documento puede usarse para la preparación de una composición farmacéutica en el tratamiento de trastornos proliferativos asociados con disfunción de citoquinas TNF que comprenden tumores, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias, enfermedades metabólicas, trastornos autoinmunitarios, enfermedades degenerativas y rechazos de trasplante.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: SEC de CD95L-ASPD purificada por afinidad

Figura 2: Gel de plata de las fracciones SEC A1-A11 de CD95L-ASPD purificada por afinidad

Figura 3: Actividad caspasa en células Jurkat inducida por las fracciones SEC A1-A15 de CD95L-ASPD

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Figura 4: Figura 5: Figura 6: Figura 7:

Figura 8: Figura 9: Figura 10: Figura 11: Figura 12: Figura 13:

Figura 14:

Figura 15: Figura 16: Figura 17:

Figura 18:

Figura 19: Figura 20:

Figura 21:

Figura 22:

Figura 23: Figura 24: Figura 25: Figura 26: Figura 27: Figura 28: Figura 29: Figura 30: Figura 31: Figura 32: Figura 33:

Figura 34: Figura 35:

Figura 36:

Figura 37:

Figura 38:

Figura 39: Figura 40:

purificada por afinidad

Citotoxicidad de CD95L-ASPD sobre células WM35, HT1080y HeLa SEC de LIGHT-ASPD purificada por afinidad Unión de HVEM-Fc a LIGHT-ASPD inmovilizada

Transferencia de Western de células HEK transfectadas de forma transitoria con construcciones de TRAIL

Actividad caspasa en células Jurkat T

Cromatografía por exclusión de tamaño de TRAIL-ASPD

Actividad citotóxica de TRAIL-ASPD contra células cancerosas humanas

Actividad caspasa inducida por TRAIL-ASPD en Jurkat

Ensayo de citotoxicidad con TRAIL-ASPD o TRAIL-DSPD sobre células HT1080

Transferencia de Western de células HEK transfectadas de forma transitoria con construcciones de

TRAIL-SPD o construcciones de TRAIL-receptor selectivo SPD.

Ligandos selectivos del receptor de TRAIL (TRAILRImut y TRAILR2mut) inmovilizados en placas de

estreptactina, se detectan de forma diferencial por receptor 1 de TRAIL-Fc o receptor 2 de TRAIL-Fc

Unión de receptores de TRAIL a ligandos de "mutelna" selectivos de ligando

Cromatografía por exclusión de tamaño de TRAILR1mut-ASPD purificada por afinidad

SDS-PAGE teñido con plata de las secciones SEC A1-A14 de TRAILR1mut-ASPD purificada por

afinidad

Actividad caspasa de las fracciones SEC A1-A14 de TRAILR1mut-ASPD purificada por afinidad sobre células Jurkat

Cromatografía por exclusión de tamaño de TRAILR2mut-ASPD purificada por afinidad

SDS-PAGE teñido con plata de las fracciones SEC A1-A14 de TRAILR2mut-ASPD purificada por

afinidad

Ensayo de eliminación de Jurkat de las fracciones SEC A1-A14 de TRAILR2mut-ASPD purificada por afinidad

Actividad citotóxica de TRAIL-ASPD, TRAILR1mut-ASPD y TRAILR2mut-ASPD sobre células cancerosas humanas.

Proteínas TRAIL-SPD selectivas de receptor son muy solubles

SEC de TRAIL-ASPD_F335A purificada por afinidad

SDS-PAGE teñido con plata de las fracciones SEC A1-A13

Efecto cltotóxico de TRAIL-ASPD_F335A sobre células cancerosas humanas

SEC de TRAIL-ASPD_F335D purificada por afinidad

SDS-PAGE teñido con plata de SEC de TRAIL-ASPD_F335D purificada por afinidad Efecto cltotóxico de TRAIL-SPD_F335D sobre células cancerosas humanas Unión de proteína de fusión TRAIL-ASPD a carbohidratos

Farmacoclnétlca de proteínas de fusión TRAIL-ASPD (A) o TRAIL-ASPD_F335D (B)

Actividad caspasa en hepatocltos humanos primarios

Transferencia de Western de sobrenadantes de células HEK293 transfectadas de forma transitoria con construcciones APRIL trlmehzadas TACI-Fc se une a APRIL-ASPD

Dibujo esquemático de la organización de dominios de la colectina SP-D. Las regiones de colágeno y cuello trlmerlzan las colectlnas y el extremo N-terminal ollgomerlza adicionalmente los trímeros en tetrámero o hexámeros de trímeros. El CRD media la unión a carbohidratos y también está implicado en la trlmerlzaclón.

Imagen esquemática que representa la estructura general de proteínas TNF-SF. "■ ■ ■" designa membrana celular; extremo N-termlnal localizado dentro de la célula, 1. plegamiento (3 anti-paralelo del dominio de unión a receptor (RBD), 2. superficie de contacto de RBD y membrana celular, 3. Sitio de escisión de proteasa.

Imagen esquemática que representa la estructura del trímero TNF SF nativo. Las estructuras cilindricas (1) representan RBD, extremos N-terminales (2) que forman el tronco y que conectan el RBD con la membrana celular.

Imagen esquemática que representa la modificación introducida para minimizar el TNF-SF-RBD. El tronco N-terminal está deleclonado. 1. plegamiento (3 anti-paralelo del dominio de unión a receptor (RBD), 2. superficie de contacto de RBD y membrana celular.

Gel de plata de Sp-sc006-ASPD-St purificada por afinidad

Cromatografía por exclusión de tamaño de Sp-sc006-ASPD-St purificada por afinidad.

Descripción detallada de la invención

La proteína de fusión descrita en este documento puede ser una proteína monomérica o una proteína multimérica. Preferiblemente, la proteína de fusión está presente como un complejo trimérico que consiste en tres unidades monoméricas que pueden ser iguales o diferentes. Preferiblemente, un complejo trimérico consiste en tres proteínas de fusión idénticas. En una realización preferida adicional, el complejo se forma por enlace covalente entre tres de las proteínas de fusión descritas en este documento, por ejemplo, un enlace covalente de puentes disulfuro entre cisteínas del dominio de trimerización de colectina como se describe en este documento.

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El complejo trimérico tal cual muestra actividad biológica. Se descubrió, sin embargo, que oligómeros del complejo trimérico, por ejemplo, complejos definidos donde la estructura trimérica básica está presente 2, 3 o 4 veces, también tienen actividad biológica. Por tanto, también se prefiere un oligómero del complejo trimérico.

La proteína de fusión comprende los siguientes elementos:

(i) un dominio de trimerización de la familia de colectina que comprende

a. un dominio de reconocimiento de carbohidrato de la familia de colectina de la proteína tensioactiva D; y

b. una región de cuello de la familia de colectina de la proteína tensioactiva D;

(ii) un elemento enlazador;

(iii) el polipéptido efector TRAIL o el dominio de unión a receptor del mismo respectivo, donde el efector está localizado de forma N-terminal de la región de cuello de la familia de colectina, y

(iv) un anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla o un fragmento de un anticuerpo o anticuerpo sencilla, fusionado al extremo C-terminal del dominio de reconocimiento de carbohidrato.

Un dominio de trimerización de colectina como se usa en este documento se obtiene generalmente de la parte C- terminal de la proteína tensioactiva D. El dominio de trimerización como se usa en este documento comprende una región superenrollada (en ciertas realizaciones mencionada como región de cuello) y un dominio de reconocimiento de carbohidrato (mencionado en este documento también como CRD).

Los miembros de colectina y sus estructuras se resumen en, por ejemplo, Hakansson et al. (Protein Science, 2000, 9:1607-1617) y pueden comprender proteína tensioactiva D (ace. n.°: P35247), proteína tensioactiva A 1 (ace. n.°: Q8IWL2), proteína tensioactiva A 2 (ace. n.°: Q8IWL1), proteína C de unión a manano (n.° de acceso: P11226), colectina hepática 1 (ace. n.°: Q9Y6Z7), colectina placentaria 1 (ace. n.°: Q5KU26) o colectina-11 (ace. n.°: Q9BWP8). De acuerdo con la invención, tanto la región superenrollada (región de cuello) como el CRD son de la proteína tensioactiva D.

El dominio de trimerización de colectina como se describe en este documento puede ser de una especie diferente que la citoquina de la superfamilia de TNF o un dominio de unión a receptor de la misma como se describe en este documento. Como alternativa, el dominio de trimerización de colectina como se describe en este documento puede ser de la misma especie que la citoquina TRAIL o un dominio de unión a receptor de la misma como se describe en este documento. En una realización preferida, el dominio de colectina como se describe en este documento es de ser humano y la citoquina TRAIL o un dominio de unión a receptor de la misma como se describe en este documento es de ser humano.

El CRD puede comprender un mutante, es decir, un muíante de la proteína tensioactiva D que no se une a mañosa. Dichos mutantes pueden identificarse por métodos conocidos para los expertos en la materia, por ejemplo, los métodos descritos en Crouch et al. (J Biol Chem, 2006, 281 (26): 18008-18014). El dominio de trimerización de colectina (ii) puede comprender adicionalmente un mutante que comprende al menos una sustitución de aminoácido como se describe en este documento y puede generarse como se describe en este documento. Dichas sustituciones de aminoácidos pueden modificar la unión del dominio de trimerización de colectina a su ligando mañosa y conducir a una alteración de la tasa de eliminación de una proteína de fusión como se describe en este documento cuando se usa en terapia y/o como composición farmacéutica. La modificación puede provocar una unión disminuida o ausente a mañosa y una baja tasa de eliminación. Dichas modificaciones pueden conseguirse por, por ejemplo, sustitución de aminoácido que afecta a la posición de aminoácido F355 de la proteína tensioactiva D humana de la SEQ ID NO: 21, particularmente por las sustituciones de aminoácidos F355A, F355S, F355T, F355E, F355D, F355K o F355R.

Es especialmente preferida la sustitución F355D. Como alternativa, la modificación puede provocar una unión aumentada a mañosa y una alta tasa de eliminación. Dichas modificaciones pueden conseguirse por, por ejemplo, sustitución de aminoácido que afecta a la posición de aminoácido F355 de la proteína tensioactiva D humana de la SEQ ID NO: 21, particularmente por las sustituciones de aminoácidos F355L, F355Y o F355W.

Una región de cuello como se usa en este documento puede comprender una estructura superenrollada. El cuello puede estar localizado adyacente al CRD de colectinas o puede estar localizado, en ciertos casos, remoto del CRD.

De acuerdo con la invención, el dominio de trimerización de colectina comprende el dominio de cuello y el dominio de unión a carbohidrato (CRD) de la proteína tensioactiva D, particularmente los aminoácidos 217-375, 218-375, 219-375, 220-375, 221-375, 222-375, 223-375, 224-375, 225-375 de la proteína tensioactiva D humana de la SEQ ID NO: 21.

Un elemento enlazador flexible está localizado entre el dominio de trimerización de colectina como se describe en este documento y el polipéptido efector TRAIL o un dominio de unión a receptor del mismo. El elemento enlazador flexible preferiblemente tiene una longitud de 25 aminoácidos o menos. En ciertas realizaciones el elemento

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enlazador tiene una longitud de 3-30 aminoácidos, particularmente una longitud de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 30 aminoácidos. En una realización, la longitud del elemento enlazador es de 5-25 aminoácidos, 8-20 aminoácidos o 10-20 aminoácidos. Más preferiblemente, la longitud del enlazador es de 9-15 aminoácidos. Generalmente el elemento enlazador usado en este documento puede estar compuesto de cualquier aminoácido conocido o de derivados artificiales de aminoácido. En ciertas realizaciones los elementos enlazadores se componente de aminoácidos no cargados pequeños e hidrófilos. Generalmente, el elemento enlazador de acuerdo con la invención puede comprender aminoácidos seleccionados de G, S, A y T. El elemento enlazador es preferiblemente un enlazador de glicina/serina, es decir, un enlazador peptídico que consiste sustancialmente en los aminoácidos glicina y serina. En una realización especialmente preferida, el enlazador tiene la secuencia de aminoácidos (GSS)a(SSG)b(GSG)c donde a, b, c es cada uno 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Está claro para los expertos en la materia que en casos en que la citoquina TRAIL o un dominio de unión a receptor de la misma ya termina con una G, por ejemplo, TRAIL humano (SEQ ID NO: 10) dicha G puede formar la primera G del enlazador en la secuencia enlazadora (GSS)a(SSG)b(GSG)c. Debe entenderse que, en principio, los elementos básicos para los elementos enlazadores pueden estar compuestos de 1, 2, 3, 4 o más aminoácidos de modo que los enlazadores útiles en este documento no están restringidos a enlazadores hechos de elementos básicos de 3 elementos. Generalmente, un elemento enlazador como se usa en este documento puede estar compuesto de elementos básicos o también de una secuencia de aminoácidos.

El polipéptido efector como se usa en este documento es TRAIL o el dominio de unión a receptor del mismo respectivo. TRAIL puede ser de cualquier origen y puede seleccionarse de, por ejemplo, polipéptidos de mamífero, polipéptidos de vertebrado, polipéptidos de Insecto, polipéptidos bacterianos, polipéptidos vegetales, polipéptidos de levadura. Los polipéptidos de mamífero pueden comprender polipéptidos de ratón, rata, ser humano, caballo, cabra, perro, conejo, gato, oveja, hámster, burro, mono y otros polipéptidos. En ciertas realizaciones, los polipéptidos son polipéptidos humanos o polipéptidos humanizados.

Preferiblemente, TRAIL es una citoquina de mamífero, particularmente humana, o un dominio de unión a receptor de la misma incluyendo variantes aléllcas y/o derivados de la misma, por ejemplo, o un dominio de unión a receptor de la misma. Los dominios de unión a receptor de diferentes proteínas se indican en la Tabla 1 (NH2-aa a COOH-aa) y comprenden, por ejemplo, los aminoácidos 59-205 o 60-205 de LTA (SEQ ID NO: 1), 86-233 de TNFa (SEQ ID NO: 2), 82-244 o 86-244 de LTB (SEQ ID NO: 3), 52-183 o 55-183 de OX40L (SEQ ID NO: 4), 112-261 o 117-261 de CD40L (SEQ ID NO: 5), 51-193 o 56-193 de CD27L (SEQ ID NO: 7), 97-234, 98-234 o 102-234 de CD30L (SEQ ID NO: 8), 86-254 de CD137L (SEQ ID NO: 9), 161-317 de RANKL (SEQ ID NO: 11), 103-249, 104-249 o 105-249 de TWEAK (SEQ ID NO: 12), 112-247 o 113-247 de APRIL 1 (SEQ ID NO: 13), 112-250 o 113-250 de APRIL2(SEQ ID NO: 14), 140-285 de BAFF (SEQ ID NO: 15), 91-240 de LIGHT (SEQ ID NO: 16), 91-251 o 93-251 de TL1A (SEQ ID NO: 17), 52-177 de GITRL (SEQ ID NO: 18), 245-391 de EDA-A1 (SEQ ID NO: 19), 245-389 de EDA-A2 (SEQ ID NO: 20).

En una realización especialmente preferida, TRAIL o un dominio de unión a receptor del mismo comprende la parte extracelular de TRAIL Incluyendo el dominio de unión a receptor sin dominios localizados en membrana.

En una realización preferida adicional, TRAIL o un dominio de unión a receptor del mismo de la proteína de fusión es TRAIL humano (SEQ ID NO: 10), particularmente los aminoácidos 95-281, 116-281, 117-281, 118-281, 119-281 o 120-281 de TRAIL humano. En otra realización preferida, TRAIL humano comprende cualquier aminoácido de 95- 120 como aminoácido Inicial - aminoácido 281 de la SEQ ID NO: 10.

En una realización preferida adicional de la Invención, TRAIL o un dominio de unión a receptor del mismo de la proteína de fusión como se describe en este documento comprende un mutante de TRAIL o un dominio de unión a receptor del mismo que se una a y/o activa el receptor 1 de TRAIL (TRAILR1) y/o receptor 2 de TRAIL (TRAILR2). La unión y/o actividad del mutante puede determinarse, por ejemplo, por los ensayos descritos en este documento, por ejemplo, en los Ejemplos o por los ensayos descritos en van der Sloot et al. (PNAS, 2006, 103: 8634-8639), Kelley etal. (J. Biol. Chem., 2005, 280: 2205-2215), o MacFarlane etal. (Cáncer Res., 2005, 65: 11265-11270).

El mutante puede generarse por cualquier técnica y se sabe por los expertos en la materia, por ejemplo, las técnicas descritas en van der Sloot et al. (PNAS, 2006, 103:8634-8639), Kelley et al. (J. Biol. Chem., 2005, 280:2205-2215), o MacFarlane et al. (Cáncer Res., 2005, 65: 11265-11270) que cualquiera puede comprender cualquier tipo de mutaciones estructurales, por ejemplo, sustitución, deleción, duplicación y/o inserción de un aminoácido. Una realización preferida es la generación de sustituciones. La sustitución puede afectar a al menos un aminoácido de TRAIL o un dominio de unión a receptor del mismo como se describe en este documento. En una realización preferida, la sustitución puede afectar a al menos uno de los aminoácidos de TRAIL humano (por ejemplo, SEQ ID NO: 10). Las sustituciones preferidas a este respecto afectan a al menos uno de los siguientes aminoácidos de TRAIL humano de la SEQ ID NO: 10: R130, G160, Y189, R191, Q193, E195, N199, K201, Y213, T214, S215, H264, I266, D267, D269, Las sustituciones preferidas de aminoácidos de TRAIL humano de la SEQ ID NO: 10 son al menos una de las siguientes sustituciones: R130E, G160M, Y189A, Y189Q, R191K, Q193S, Q193R, E195R, N199V, N199R, K201R, Y213W, T214R, S215D, H264R, I266L, D267Q, D269H, D269R o D269K.

La sustitución o sustituciones de aminoácidos pueden afectar a la unión y/o actividad de TRAIL, por ejemplo, TRAIL

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humano, a o sobre cualquiera de TRAILR1 o TRAILR2. Como alternativa, la sustitución o sustituciones de aminoácidos pueden afectar a la unión y/o actividad de TRAIL, por ejemplo, TRAIL humano, a o sobre ambos, TRAILR1 y TRAILR2. La unión y/o actividad de TRAILR1 y/o TRAILR2 puede verse afectada de forma positiva, es decir, unión más fuerte, más selectiva o específica y/o más activación del receptor. Como alternativa, la unión y/o actividad de TRAILR1 y/o TRAILR2 puede verse afectada de forma negativa, es decir, unión más débil, menos selectiva o específica y/o activación menor o ausente del receptor.

Ejemplos de mutantes de TRAIL con sustituciones de aminoácidos que afectan a la unión y/o actividad de TRAILR1 y TRAILR2 pueden encontrarse, por ejemplo, en la Tabla 1 de MacFarlane et al. (cf. anteriormente) y pueden comprender mutantes de TRAIL humano con las dos siguientes sustituciones de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 Y213W y S215D o la siguiente sustitución única de aminoácido Y189A.

Ejemplos de mutantes de TRAIL con sustituciones de aminoácidos que afectan a la unión y/o actividad de TRAILR1 pueden encontrarse, por ejemplo, en la Tabla 1 de MacFarlane et al. (cf. anteriormente) y pueden comprender mutantes de TRAIL humano con las cuatro siguientes sustituciones de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 N199V, K201R, Y213W y S215D o las cinco siguientes sustituciones de aminoácidos Q193S, N199V, K201R, Y213W y S215D o en la Tabla 2 de Kelley et al. (cf. anteriormente) y pueden comprender mutantes de TRAIL humano con las seis siguientes sustituciones de aminoácidos Y213W, S215D, Y189A, Q193S, N199V, y K201R o Y213W, S215D, Y189A, Q193S, N199R, y K201R.

Ejemplos de mutantes de TRAIL con sustituciones de aminoácidos que afectan a la unión y/o actividad de TRAILR2 pueden encontrarse, por ejemplo, en la Tabla 1 de MacFarlane et al. (cf. anteriormente) o en la Tabla 2 de Kelley et al. (cf. anteriormente) y pueden comprender mutantes de TRAIL humano con las seis siguientes sustituciones de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 Y189Q, R191K, Q193R, H264R, I266L, y D267Q o en la Tabla 2 de van derSIoot et al. (cf. anteriormente) y pueden comprender mutantes de TRAIL humano con la siguiente sustitución única de aminoácido D269H, las dos siguientes sustituciones de aminoácidos D269H y E195R o D269H y T214R.

La citoquina TRAIL de la superfamilia de TNF usada como polipéptido efector en este documento puede estar truncada, en ciertas realizaciones, en el lado N-terminal. El truncamiento, como se usa a este respecto, se referirá a la omisión de todos los aminoácidos de la región de tronco, o a la omisión de parte de los aminoácidos de la región de tronco. Las proteínas de la superfamilia de TNF están ancladas a la membrana mediante una porción N-terminal de 15-30 aminoácidos, la llamada región de tronco. La región de tronco contribuye a la trimerización y proporciona una cierta distancia hasta la membrana celular. Sin embargo, la región de tronco no forma parte del dominio de unión a receptor (RBD).

De forma importante, el RBD se caracteriza por una localización particular de su isla de aminoácidos C-terminales. Dichos aminoácidos están inmediatamente adyacentes y están localizados centrales a los ejes de los trímeros. Los primeros aminoácidos N-terminales del RBD forman una hebra beta anti-paralela con los aminoácidos C-terminales del RBD (Fig. 36 y 38).

Por tanto, la hebra beta anti-paralela del RBD forma una superficie de contacto con la membrana celular, que está conectada a y anclada dentro de la membrana celular mediante los aminoácidos de la región de tronco.

En ciertas realizaciones de la invención, la región de tronco de la citoquina TRAIL de la superfamilia de TNF usada como polipéptido efector está omitida. Esto tiene la ventaja particular de que puede evitarse la impedancia estérica entre la región de tronco y el enlazador-colectina. De lo contrario, el enlazadorque conecta el extremo C-terminal de uno del domino RBD de TRAIL con el extremo N-terminal del dominio de colectina estaría impedido estéricamente por el tronco, lo que podría provocar la inestabilidad y/o formación de agregados. En ciertas realizaciones, el truncamiento de la citoquina TRAIL omitiendo la región de tronco del extremo N-terminal es un requisito previo para el posicionamiento C-terminal del dominio de trimerización de colectina.

En ciertas realizaciones, es muy preferido que la proteína de fusión trimérica basada en colectina comprenda un dominio de unión a receptor de la citoquina TRAIL que carezca de cualquier aminoácido de la región de tronco.

La capacidad del polipéptido de fusión de TRAIL trimérico basado en colectina, donde TRAIL o el dominio de unión a receptor del mismo respectivo está posicionado de forma N-terminal del dominio de trimerización de colectina, de formar una estructura trimérica ordenada que comprende al menos un sitio de unión funcional para el receptor respectivo de citoquina, está asociado, en ciertas realizaciones de la invención, de forma crucial con la omisión total o parcial de la región de tronco de TRAIL o el dominio de unión a receptor del mismo.

En la proteína de fusión de la invención como se describe en este documento, el dominio de trimerización de colectina está localizado de forma C-terminal del polipéptido efector TRAIL o el dominio de unión a receptor del mismo. Por tanto, la proteína de fusión puede comprender un polipéptido efector como se describe en este documento y un dominio de trimerización de colectina que comprende un dominio de cuello de la familia de colectina y un dominio CRD de la familia de colectina, es decir, el dominio de cuello y el CRD de la proteína tensioactiva D como se describe en este documento, donde esos dominios están localizados de forma C-terminal del polipéptido

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efector.

Las proteínas de fusión descritas en este documento comprenden el polipéptido efector de forma N-terminal al dominio de trimerización de colectina. Los inventores descubrieron que la formación controlada de trímeros puede lograrse solamente si se obedece esta orientación. Solamente las construcciones que tienen el polipéptido efector de forma N-terminal del dominio de trimerización de colectina conducen a trímeros estables controlados y son mínimamente propensos a formar agregados más grandes durante la manipulación y purificación. A partir de la estructura cristalina publicada (Shrive, A.K., et al., 2003, J. Mol. Biol. 331: 509-523) de la parte de cuello-CRD de la SP-D humana recombinante, puede obtenerse la posición relativa del aminoácido N- y C-terminal de cada monómero. Mientras los aminoácidos amino-terminales (A205[A225]<*>) del trímeros están expuestos al disolvente y localizados en proximidad directa al principio de la estructura superenrollada paralela, la cadena lateral de los aminoácidos C-terminales (F355[F375]<*>) del trímero están enterrados dentro del dominio CRD y posicionados en una simetría distante triangular entre sí. Los grupos COOH de F355[F375]<*> están formando un triángulo isósceles con aproximadamente 23 angstrom de longitud lateral. De forma importante, el núcleo proteico del trímero de cuello- CRD están dentro de este triángulo, por tanto, solamente el espacio radial al núcleo de cuello-CRD es accesible para los compañeros de fusión.

Puede concluirse que, por su posición relativa entre sí, los aminoácidos N-y C-terminales en la parte de cuello-CRD del trímero de SP-D no son equivalente con respecto a su uso como punto de unión para la construcción de proteínas de fusión.

Como desventaja en el caso de proteínas TNF-SF, una fusión C-terminal (esto significa fusionar el fragmento TRAIL hacia el aminoácido C-terminal del cuello-CRD; F355[F375]*) que comprende la región extracelular con la región de tronco provocaría un agregado molecular grande debido a la fuerza de trimerización del propio fragmento TRAIL *Los números dados en [ ] se refieren a la SEQ ID NO: 21.

Por lo tanto, fusionar un dominio TRAIL con su tronco endógeno C-terminal a la construcción de cuello-CRD no provocaría un ensamblaje trimérico definido. Por consiguiente, en ciertas realizaciones de la invención, se usan polipéptidos truncados del RBD de TRAIL (dominio de unión a receptor de TRAIL) que carecen de la región de tronco como polipéptidos efectores.

De acuerdo con la invención, la proteína de fusión comprende TRAIL, particularmente TRAIL humano o un dominio de unión a receptor del mismo o un muíante de TRAIL como se describe en este documento, preferiblemente 95- 281, 116-281, 117-281, 118-281, 119-281 o 120-281 de TRAIL humano (SEQ ID NO: 10) y un dominio de trimerización de colectina o muíante del mismo como se describe en este documento, concretamente el CRD y el dominio de cuello de la proteína tensioactiva D, preferiblemente los aminoácidos 217-375, 218-375, 219-375, 220- 375, 221-375, 222-375, 223-375, 224-375, 225-375 de la proteína tensioactiva D humana de la SEQ ID NO: 21 donde el dominio de trimerización de colectina está localizado de forma C-terminal de TRAIL o TRAIL muíante como se describe en este documento. Las proteínas de fusión preferidas a este respecto son las SEQ ID NO: 26 o 27. La proteína de fusión anterior comprende adicionalmente un enlazador como se describe en este documento, por ejemplo, un enlazador con la secuencia de aminoácidos (GSS)a(SSG)b(GSG)c donde a, b, c es cada uno 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6. Preferiblemente, el enlazador tiene una longitud de 9-15 aminoácidos.

En otra realización preferida, la proteína de fusión comprende TRAIL, particularmente TRAIL humano o un dominio de unión a receptor del mismo o mutante de TRAIL como se describe en este documento, por ejemplo, los aminoácidos 21-181 de la SEQ ID NO: 43 (TRAIL de tipo silvestre), los aminoácidos 21-181 de la SEQ ID NO: 47 (TRAILRImut) o los aminoácidos 21-181 de la SEQ ID NO: 48 (TRAILR2mut). Además, la proteína de fusión comprende un dominio de trimerización de colectina que comprende el dominio de cuello y el CRD de SP-D humana, por ejemplo, los aminoácidos 193-230 y 231-384 de la SEQ ID NO: 43, respectivamente, o un mutante de la misma como se describe en este documento, por ejemplo, los mutantes mostrados en la SEQ ID NO: 49 o 50. El polipéptido de fusión comprende tanto la región de cuello como el CRD de SP-D humana. La citoquina y el dominio de colectina se conectan mediante un enlazador, por ejemplo, un enlazador de glicina/serina como se describe en este documento. Preferiblemente, el enlazador tiene una longitud de 9-15 aminoácidos.

Las proteínas de fusión preferidas a este respecto comprenden (i) la SEQ ID NO: 43, particularmente los aminoácidos 21-348 de la SEQ ID NO: 43, (ii) la SEQ ID NO: 44, particularmente los aminoácidos 21-230 de la SEQ ID NO: 44, (iii) la SEQ ID NO: 47, particularmente los aminoácidos 21-348 de la SEQ ID NO: 47, (iv) la SEQ ID NO: 48, particularmente los aminoácidos 21-348 de la SEQ ID NO: 48, (v) la SEQ ID NO: 49, particularmente los aminoácidos 21-348 de la SEQ ID NO: 49 o (vi) la SEQ ID NO: 50 particularmente los aminoácidos 21-348 de la SEQ ID NO: 50.

La proteína de fusión como se describe en este documento puede comprender adicionalmente un dominio de péptido señal N-terminal, que permite el procesamiento, por ejemplo, secreción extracelular, en una célula hospedadora adecuada. Preferiblemente, el dominio de péptido señal N-terminal comprende un sitio de escisión por proteasa, por ejemplo, una peptidasa señal y por tanto puede retirarse después de o durante la expresión para obtener la proteína madura. En una realización preferida, el dominio de péptido señal N-terminal comprende la

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secuencia SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25.

Además, la proteína de fusión puede comprender un dominio de reconocimiento/purificación, por ejemplo, un dominio de marca estrep. y/o un dominio poli-His, que puede estar localizado en el extremo N-terminal o C-terminal.

La proteína de fusión puede comprender adicionalmente un elemento flexible C-terminal, que tiene una longitud de, por ejemplo, 1-50, preferiblemente 10-30 aminoácidos que pueden incluir y/o conectar con un dominio de reconocimiento/purificación como se describe en este documento.

De acuerdo con la invención, la proteína de fusión comprende adicionalmente un anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla o un fragmento de un anticuerpo o anticuerpo de cadena sencilla fusionado al extremo C-terminal del CRD. Dicho anticuerpo puede servir, en ciertas realizaciones para, por ejemplo, dirigir la proteína de fusión a ciertas moléculas o sitios. Además, dichas construcciones pueden ofrecer una oportunidad de crear polipéptidos de fusión con al menos dos especificidades diferentes de antígeno.

Se describe adicionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión como se describe en este documento. La molécula de ácido nucleico puede ser una molécula de ADN, por ejemplo, una molécula de ADN bicatenario o monocatenario, o una molécula de ARN. La molécula de ácido nucleico puede codificar la proteína de fusión o un precursor de la misma, por ejemplo, una pro- o pre-proforma de la proteína de fusión que puede comprender una secuencia señal como se describe en este documento u otras partes heterólogas de aminoácidos para la secreción o purificación que están localizadas preferiblemente en el extremo N- y/o C-terminal de la proteína de fusión como se describe en este documento. La molécula de ácido nucleico puede codificar la proteína de fusión donde las partes heterólogas de aminoácidos pueden ligarse al primero y/o segundo dominio mediante un sitio de escisión por proteasa, por ejemplo, un sitio de escisión por Factor X3, trombina o proteasa de IgA.

La molécula de ácido nucleico puede unirse de forma funcional a una secuencia de control de la expresión, por ejemplo, una secuencia de control de la expresión que permite la expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula hospedadora deseada. La molécula de ácido nucleico puede estar localizada en un vector, por ejemplo, un plásmido, un bacteriófago, un vector vírico, un vector de integración cromosómica, etc. Ejemplos de secuencias de control de la expresión y vectores adecuados se describen, por ejemplo, por Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Press, y Ausubel et al. (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons o ediciones más recientes de los mismos.

Pueden usarse diversos sistemas de vector de expresión/célula hospedadora para expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión de la presente invención. Las células hospedadoras adecuadas incluyen, aunque sin limitación, células procariotas tales como bacterias, por ejemplo E. coli, células hospedadoras eucariotas tales como células de levadura, células de insecto, células vegetales o células animales, preferiblemente células de mamífero y, más preferiblemente, células humanas. La molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión como se describe en este documento puede optimizarse en vista de su uso de codones para la expresión en células hospedadoras adecuadas, por ejemplo, E. coli, células de levadura, células vegetales, células de insecto, células animales, por ejemplo, células de mamífero o células humanas.

Se describe adicionalmente un organismo no humano, por ejemplo, ratón o rata, transformado o transfectado con una molécula de ácido nucleico como se describe en este documento. Dichos organismos pueden comprender organismos knock-out, generados por métodos conocidos de transferencia genética incluyendo recombinación homologa. Como alternativa, dichos organismos pueden comprender organismos transgénicos que comprenden varias copias de la molécula de ácido nucleico como se describe en este documento. La generación de organismos transgénicos es conocida en la técnica.

La proteína de fusión, así como los complejos triméricos u oligómeros de los complejo triméricos, todos como se describe en este documento, pueden usarse para aplicaciones farmacéuticas, de diagnóstico y/o investigación. Para estas aplicaciones, se prefieren usar proteínas de fusión en que tanto el polipéptido efector como se describe en este documento como el dominio de trimerización de colectina como se describe en este documento son de la misma especie para minimizar los efectos ¡nmunológicos, por ejemplo, de ser humano cuando se aplican dichas proteínas a seres humanos. Además, la fusión de un polipéptido efector como se describe en este documento a un dominio de trimerización de colectina de cuello y CRD como se describe en este documento, es decir, el dominio de cuello y CRD de la proteína tensioactiva D, puede conducir a baja eliminación. El uso de mutantes del dominio de trimerización de colectina como se describe en este documento puede modificar la tasa de eliminación de la proteína de fusión de un modo como se describe en este documento.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende como agente activo al menos una proteína de fusión, así como los complejos triméricos u oligómeros de los complejos triméricos, todos como se describe en este documento.

Al menos una proteína de fusión, así como los complejos triméricos u oligómeros de los complejos triméricos, todos como se describe en este documento pueden usarse en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de trastornos

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seleccionados de trastornos proliferativos asociados con disfunción de citoquinas TNF, tales como tumores, por ejemplo, tumores sólidos o linfáticos, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias, enfermedades metabólicas, trastornos autoinmunitarios, por ejemplo, enfermedades reumatoides y/o artríticas, enfermedades degenerativas, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas tales como esclerosis múltiple, enfermedades asociadas a apoptosis y rechazos de trasplante.

La proteína de fusión como se describe en este documento puede usarse en terapia de enfermedades, por ejemplo, como un medicamento o para la preparación de una composición farmacéutica en el tratamiento de enfermedades neoplásicas, inflamatorias, infecciosas, degenerativas, genéticas, proliferativas y vasculares, y de afecciones cancerosas premalignas y malignas, cáncer y errores congénitos.

En ciertas realizaciones de la invención, las enfermedades degenerativas pueden comprender enfermedades degenerativas de diferentes tejidos u órganos tales como enfermedades neurodegenerativas, enfermedades degenerativas de huesos y el esqueleto, enfermedades degenerativas de la piel, del epitelio mucoso y pueden comprender, por ejemplo, osteoporosis, osteopenia, enfermedad de Alzheimer y similares.

En una realización, las enfermedades proliferativas son tumores. Los tumores pueden comprender tumores de la cabeza y el cuello, tumores del tracto respiratorio, tumores del tracto anogenital, tumores del tracto gastrointestinal, tumores del sistema urinario, tumores del sistema reproductor, tumores del sistema endocrino, tumores del sistema nervioso central y periférico, tumores de la piel y sus apéndices, tumores de los tejidos blandos y huesos, tumores del sistema linfopoyétlco y hematopoyétlco, etc. Los tumores pueden comprender, por ejemplo, neoplasias tales como tumores benignos y malignos, carcinomas, sarcomas, leucemias, llnfomas o displasias. En una realización particular, el tumor es, por ejemplo, cáncer de la cabeza y el cuello, cáncer del tracto respiratorio, cáncer del tracto anogenital, cáncer del tracto gastrointestinal, cáncer de la piel y sus apéndices, cáncer del sistema nervioso central y periférico, cáncer del sistema urinario, cáncer del sistema reproductor, cáncer del sistema endocrino, cáncer de los tejidos blandos y huesos, cáncer del sistema hematopoyético y linfopoyético.

La composición puede administrarse como monoterapia o como terapia de combinación con medicamentos adicionales, por ejemplo, agentes citostáticos o quimioterapéuticos, corticosteroides y/o antibióticos. Preferiblemente, la composición se administra junto con agentes sensibilizantes y/o inductores de apoptosis selectiva de tumor, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2.8.

La proteína de fusión se administra a un sujeto que lo necesita, particularmente un paciente humano, en una dosis suficiente para el tratamiento de las afecciones específicas por medios adecuados. Por ejemplo, la proteína de fusión puede formularse como una composición farmacéutica junto con vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables. La eficacia terapéutica y toxicidad puede determinarse de acuerdo con protocolos convencionales. La composición farmacéutica puede administrarse de forma sistémica, por ejemplo, por vía intraperitoneal, intramuscular o intravenosa o local, por ejemplo, por vía intranasal, subcutánea o intratecal. Se prefiere administración intravenosa.

La dosis de la proteína de fusión administrada dependerá, por supuesto, del sujeto a tratarse, del peso del sujeto, el tipo y gravedad de la enfermedad, el modo de administración y el criterio del médico a cargo. Para la administración de proteínas de fusión, es adecuada una dosis diaria de 0,001 a 100 mg/kg.

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Estructura básica de una proteína de fusión

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A continuación, se muestra la estructura básica de las proteínas recombinantes descritas en este documento ejemplificada para las citoquinas de la superfamilia de TNF como se describe en este documento.

Como estructura básica la proteína de fusión comprende los siguientes elementos:

(i) un dominio de trimerización de la familia de colectina que comprende

a. un dominio de reconocimiento de carbohidrato de la familia de colectina; y

b. una región de cuello de la familia de colectina;

(ii) un elemento enlazador; y

(i¡¡) un polipéptido efector, donde el polipéptido efector está localizado de forma N-terminal de la región de cuello de la familia de colectina.

El tema de la invención es solamente esas proteínas de fusión definidas en las reivindicaciones.

1.1 Secuencias de los péptidos señal

MNFGFSLIFLVLVLKGVQC (SEQ ID NO: 23)

METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 24)

METDTLLLWVLLLWVPAGNG (SEQ ID NO: 25)

1.2 Marca-epítopo/sitio de procesamiento de enteroauinasa DYKDDDDKD

1.3 Colectinas humanas

Proteína tensioactiva D (SEQ ID NO: 21)

1 MLLFLLSALV LLTQPLGYLE AEMKTYSHRT TPSACTLVMC SSVESGLPGR DGRDGREGPR

61 GEKGDPGLPG AAGGAGMPGQ AGPVGPKGDN GSVGEPGPKG DTGPSGPPGP PGVPGPAGRE

121.GPLGKQGNIG PQGKPGPKGE AGPKGEVGAP GMQGSAGARG LAGPKGERGV PGERGVPGNA

181 GAAGSAGAMG PQGSPGARGP PGLKGDKGIP GDKGAKGESG LPDVASLRQQ VEALQGQVQH

241 LQAAFSQYKK VELFPNGQSV GEKIFKTAGF VKPFTEAQLL CTQAGGQLAS PRSAAENAAL

301 QQLWAKNEA AFLSMTDSKT EGKFTYPTGE SLVYSNWAPG EPNDDGGSED CVEIFTNGKW

361 NDRACGEKRL WCEF

Colectina-11 (SEQ ID NO: 22)

1 MRGNLALVGV LISLAFLSLL PSGHPQPAGD DACSVQILVP GLKGDAGEKG

DKGAPGRPGR

61 VGPTGEKGDM GDKGQKGSVG RHGKIGPIGS KGEKGDSGDI GPPGPNGEPG

LPCECSQLRK

121 AIGEMDNQVS QLTSELKFIK NAVAGVRETE SKIYLLVKEE KRYADAQLSC

QGRGGTLSMP

181 KDEAANGLMA AYLAQAGLAR VFIGINDLEK EGAFVYSDHS PMRTFNKWRS

GEPNNAYDEE

241 DCVEMVASGG WNDVACHTTM YFMCEFDKEN M

Son concebibles diversos fragmentos de las colectivas humanas proteína tensioactiva D y colectina 11 como dominios de trimerización como se describe en este documento.

1.4 Elemento enlazador flexible

(GSS)a(SSG)b(GSG)c donde a, b, c es cada uno 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

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1.5 Citoauina de la superfamilia de TNF/dominio de unión a receptor de la misma Ivéase también la Tabla 11 SEQ-ID-01

SEQ NP_000586_TNFSF1 LTA PALABRA CLAVE PROTEÍÑA CARACTERÍSTICAS ORIGEN

1 MTPPERLF1P RVCGTTLHLL LLGLLLVLLP GAQGLPGVGL TPSAAQTARQ

HPKMHLAHST

61 LKPAAHLIGD PSKQNSLLWR ANTDRAFLQD GFSLSNNSLL VPTSGIYF/Y

SQWFSGKAY

121 SPKATSSPLY LAHEVQLFSS QYPFHVPLLS SQKMVYPGLQ EPWLHSMYHG

AAFQLTQGDQ

181 LSTHTDGIPH LVLSPSTVFF GAFAL

SEQ-ID-02

SEQ NP_000585_TNFSF2_TNFa PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN

1 MSTESMIRDV ELAEEALPKK TGGPQGSRRC LFLSLFSFLI VAGATTLFCL

LHFGVIGPQR

61 EEFPRDLSLI SPLAQAVRSS SRTPSDKPVA HWANPQAEG QLQWLNRRAN

ALLANGVELR

121 DNQLWPSEG LYLIYSQVLF KGQGCPSTHV LLTHTISRIA VSYQTKVNLL

SAIKSPCQRE

181 TPEGAEAKPW YEPIYLGGVF QLEKGDRLSA EINRPDYLDF AESGQVYFGI IAL

SEQ-ID-03

SEQ NP_002332_TNFSF3_LTB PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN

1 MGALGLEGRG GRLQGRGSLL LAVAGATSLV TLLLAVPITV LAVLALVPQD

QGGLVTETAD

61 PGAQAQQG1G FQKLPEEEPE TDLSPGLPAA HLIGAPLKGQ GLGWETTKEQ

AFLTSGTQFS

121 daeglalpqd glyylyclvg yrgrappggg dpqgrsvtlr sslyraggay

GPGTPELLLE

181 GAETVTPV1D PARRQGYGPL KYTSVGFGGL VQLRRGERVY VNISHPDMVD

FARGKTFFGA

241 VMVG

SEQ-ID-04

SEQ NP_003317_TNFSF4 OX40L PALABRA CLAVE PROTEÍÑA ORIGEN

1 MERVQPLEEN VGNAARPRFE RNKLLLVASV IQGLGLLLCF TYICLHFSAL

QVSHRYPRIQ

61 SIKVQFTEYK KEKGFILT3Q KEDEIMKVQN NSVIINCDGF YLISLKGYFS

QEVNISLHYQ

121 KDEEPLFQLK KVRSVNSLMV ASLTYKDKVY LNVTTDNTSL DDFHVNGGEL

ILIHQNPGEF

181 CVL

SEQ-ID-05

SEQ NP_000065_TNFSF5 CD40L PALABRA CLAVE PROTEÍÑA ORIGEN

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1 MIETYNQTSP RSAATGLPIS MKIFMYLLTV FLITQMIGSA LFAVYLHRRL

DKIEDERN1H

61 EDFVFMKTIQ RCNTGERSLS LLNCEEIKSQ FEGFVKDIML NKEETKKENS

FEMQKGDQNP

121 QIAAHVISEA SSKTTSVLQVJ AEKGYYTMSN NLVTLENGKQ LTVKRQGLYY

IYAQVTFCSN

181 REASSQAPFI ASLCLKSPGR FERILLRAAN THSSAKPCGQ QSIHLGGVFE

LQPGASVFVN

241 VTDPSQVSHG TGFTSFGLLK L

SEQ-ID-06

SEQ NP_000630_TNFSF6 CD95L PALABRA CLAVE PROTEÍÑA ORIGEN

1 MQQPFNYPYP QIYWVDSSAS SPWAPPGTVL PCPTSVPRRP GQRRPPPPPP

PPPLPPPPPP

61 PPLPPLPLPP LKKRGNHSTG LCLLVMFFMV LVALVGLGLG MFQLFHLQKE

LAELRESTSQ

121 MHTASSLEKQ IGHPSPPPEK KELRKVAHLT GKSNSRSMPL EWEDTYGIVL

LSGVKYKKGG

181 LVINETGLYF VYSKVYFRGQ SCNNLPLSHK VYMRNSKYPQ DLVMMEGKMM

SYCTTGQMWA

241 RSSYLGAVFN LTSADHLYVN VSELSLVNFE ESQTFFGLYK L

SEQ-ID-07

SEQ NP_001243_TNFSF7_CD27L PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN

1 MPEEGSGCSV RRRPYGCVLR AALVPLVAGL VICLWCIQR FAQAQQQLPL

ESLGWDVAEL

61 QLNHTGPQQD PRLYWQGGPA LGRSFLHGPE LDKGQLRIHR DGIYMVHIQV

TLAICSSTTA

121 SRHHPTTLAV GICSPASRSI SLLRLSFHQG CTIASQRLTP LARGDTLCTN

LTGTLLPSRN

181 TDETFFGVQW VRP

SEQ-ID-08

SEQ NP_001235_TNFSF8 CD30L PALABRA CLAVE PROTEÍÑA ORIGEN

1 MDPGLQQALN GMAPPGDTAM HVPAGSVASE LGTTSRSYFY LTTATLALCL

VFTVATIMVL

61 WQRTDSIPN SPDNVPLKGG NCSEDLLCIL KRAPFKKSWA YLQVAKHLNK

TKLSWNKDGI

121 LHGVRYQDGN LVIQFPGLYF IICQLQFLVQ CPNNSVDLKL ELLINKHIKK

QALVTVCESG

181 MQTKHVYQNL SQFLLDYLQV NTTISVNVDT FQYIDTSTFP LENVLSIFLY SNSD

SEQ-ID-09

SEQ NP_003802_TNFSF9 CD137L PALABRA CLAVE PROTEÍÑA ORIGEN

1 MEYASDASLD peapwppapr aracrvlpwa lvagllllll laaacavfla

CPWAVSGARA

61 SPGSAASPRL regpelspdd paglldlrqg mfaqlvaqnv llidgplswy

SDPGLAGVSL

121 TGGLSYKEDT KELWAKAGV YYVFFQLELR RWAGEGSGS vslalhlqpl

rsaagaaala

181 LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAüíQLTQ

GATVLGLFRV

241 TPEIPAGLPS PRSE

SEQ-ID-10

SEQ NP 003801 TNFSF10 TRAIL

5

10

15

20

25

30

PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN

1 MAMMEVQGGP SLGQTCVLIV iftvllqslc vavtyvyftn elkqmqdkys

KSGIACFLKE

61 DDSYWDPNDE ESMNSPCWQV KWQLRQLVRK MILRTSEETI STVQEKQQNI

SPLVRERGPQ

121 RVAAHITGTR GRSNTLSSPN SKNEKALGRK INSWESSRSG H3FLSNLHLR

NGELVIHEKG

181 FYYIYSQTYF RFQEEIKENT KNDKQMVQYI YKYTSYPDPI LLMKSARNSC

WSKDAEYGLY

241 SIYQGGIFEL KENDRIFVSV TNEHLIDMDH EASFFGAFLV G

SEQ-ID-11

SEQ NP_003692_TNFSF11_a_RANKL PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN

1 MRRASRDYTK ylrgseemgg gpgaphegpl happppaphq ppaasrsmfv

ALLGLGLGQV

61 VCSVALFFYF raqmdpnris EDGTHCIYRI lrlhenadfq dttlesqdtk

LIPDSCRRIK

121 QAFQGAVQKE LQHIVGSQHI RAEKAMVDGS WLDLAKRSKL EAQPFAHLTI

NATDIPSGSH

181 KVSLSSWYHD RGWAKISNMT FSNGKLIVNQ DGFYYLYANI CFRHHETSGD

LATEYLQLMV

241 YVTKTSIKIP SSHTLMKGGS TKYWSGNSEF HFYSINVGGF FKLRSGEEIS

IEVSNPSLLD

301 PDQDATYFGA FKVRDID

SEQ-ID-12

SEQ NP_003800_TNFSF12_TWEAK PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN

1 MAARRSQRRR GRRGEPGTAL LVPLALGLGL A.LACLGLLLA WSLGSRASL

SAQEPAQEEL

61 VAEEDQDPSE LMPQTEESQD PAPFLNRLVR PRRSAPKGRK TRARRAIAAH

YEVHPRPGQD

121 GAQAGVDGTV SGWEEARINS SSPLRYNRQI GEFIVTRAGL YYLYCQVHFD

EGKAVYLKLD

181 LLVDGVLALR CLEEFSATAA SSLGPQLRLC QVSGLLALRP GSSLRIRTLP

WAHLKAAPFL

241 TYFGLFQVH

SEQ-ID-13

SEQ NP_742085_TNFSF13_APRIL_ver1 PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN

1 MPASSPFLLA PKGPPGNMGG PVREPALSVA LWLSWGAALG AVACAMALLT

QQTELQSLRR

61 EVSRLQGTGG PSQNGEGYPW QSLPEQSSDA LEAWEMGERS RKRRAVLTQK

QKKQHSVLHL

121 VPINATSKDD SDVTEVMWQP ALRRGRGLQA QGYGVRIQDA GVYLLYSQVL

FQDVTFTMGQ

181 WSREGQGRQ ETLFRCIRSM PSHPDRAYNS CYSAGVFHLH QGDILSVIIP

RARAKLNLSP

241 HGTFLGL

SEQ-ID-14

SEQ NP_003799_TNFSF13_APRIL_ver2 PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN

5

10

15

20

25

30

1 MPASSPFLLA PKGPPGNMGG PVREPALSVA LWLSWGAALG AVACAMALLT

QQTELQSLRR

61 EVSRLQGTGG PSQNGEGYPW QSLPEQSSDA LEAWEMGERS RKRRAVLTQK

QKKQHSVLHL

121 VPINATSKDD SDVTEVMWQP ALRRGRGLQA QGYGVRIQDA GVYLLYSQVL

FQDVTFTMGQ

181 WSREGQGRQ ETLFRCIRSM PSHPDRAYNS CYSAGVFHLH QGDILSVIIP

RARAKLNLSP

241 HGTFLGFVKL

SEQ-ID-15

SEQ NP_006564_TNFSF13b_BAFF PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN

1 MDDSTEREQS RLTSCLKKRE EMKLKECVSI LPRKESPSVR SSKDGKLLAA

TLLLALLSCC

61 LTWSFYQVA ALQGDLASLR AELQGHHAEK LPAGAGAPKA GLEEAPAVTA

GLKIFEPPAP

121 GEGNSSQNSR NKRAVQGPEE TVTQDCLQLI ADSETPTIQK GSYTFVPWLL

SFKRGSALEE

181 KENKILVKET GYFFIYGQVL YTDKTYAMGH LIQRKKVHVF GDELSLVTLF

RCIQNMPETL

241 PNNSCYSAGI AKLEEGDELQ LAIPRENAQI SLDGDVTFFG ALKLL

SEQ-ID-16

SEQ NP_003798_TNFSF14_LIGHT PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN

1 MEESWRPSV FWDGQTDIP FTRLGRSHRR QSCSVARVGL GLLLLLMGAG

LAVQGWFLLQ

61 LHWRLGEMVT RLPDGPAGSW EQLIQERRSH EVNPAAHLTG ANSSLTGSGG

PLLWETQLGL

121 AFLRGLSYED GALWTKAGY YYIYSKVQLG GVGCPLGLAS TITHGLYKRT

PRYPEELELL

181 VSQQSPCGRA TSSSRVWWDS SFLGGWHLE AGEKVWRVL DERLVRLRDG

TRSYFGAFMV

SEQ-ID-17

SEQ NP_005109_TNFSF15_TL1A PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN

1 MAEDLGLSFG ETASVEMLPE HGSCRPKARS SSARWALTCC LVLLPFLAGL

TTYLLVSQLR

61 AQGEACVQFQ ALKGQEFAPS HQQVYAPLRA DGDKPRAHLT WRQTPTQHF

KNQFPALHWE

121 HELGLAFTKN RMMYTNKFLL IPESGDYFIY SQVTFRGMTS ECSEIRQAGR

PNKPDSITW

181 ITKVTDSYPE PTQLLMGTKS VCEVGSNWFQ PIYLGAMFSL QEGDKLMVNV

SDISLVDYTK

241 EDKTFFGAFL L

SEQ-ID-18

SEQ NP_005083_TNFSF18_GITRL PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN

1 MCLSHLENMP LSHSRTQGAQ RSSWKLWLFC SIVMLLFLCS FSWLIFIFLQ

LETAKEPCMA

61 KFGPLPSKWQ MASSEPPCVN KVSDWKLEIL QNGLYLIYGQ VAPNANYNDV

APFEVRLYKN

121 KDMIQTLTNK SKIQNVGGTY ELHVGDTIDL IFNSEHQVLK MNTYWGIILL

ANPQFIS

SEQ-ID-19

SEQ NP_001390_EDA-A1 PALABRA CLAVE PROTEÍNA

ORIGEN

1 MGYPEVERRE LLPAAAPRER GSQGCGCGGA PARAGEGNSC LLFLGFFGLS

LALHLLTLCC

61 YLELRSELRR ERGAESRLGG SGTPGTSGTL SSLGGLDPDS PITSHLGQPS

PKQQPLEPGE

121 AALHSDSQDG HQMALLNFFF PDEKPYSEEE SRRVRRNKRS KSNEGADGPV

KNKKKGKKAG

181 PPGPNGPPGP PGPPGPQGPP GIPGIPGIPG TTVMGPPGPP GPPGPQGPPG

LQGPSGAADK

241 AGTRENQPAV VHLQGQGSAI QVKNDLSGGV LNDWSRITMN PKVFKLHPRS

GELEVLVDGT

301 YFIYSQVEVY YINFTDFASY EWVDEKPFL QCTRSIETGK TNYNTCYTAG

VCLLKARQKI

361 AVKMVHADIS INMSKHTTFF GAIRLGEAPA S

5 SEQ-ID-20

SEQ NP_001005609_EDA-A2 PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN

1 MGYPEVERRE LLPAAAPRER GSQGCGCGGA PARAGEGNSC LLFLGFFGLS

LALHLLTLCC

61 YLELRSELRR ERGAESRLGG SGTPGTSGTL SSLGGLDPDS PITSHLGQPS

PKQQPLEPGE

121 AALHSDSQDG HQMALLNFFF PDEKPYSEEE SRRVRRNKRS KSNEGADGPV

KNKKKGKKAG

181 PPGPNGPPGP PGPPGPQGPP GIPGIPGIPG TTVMGPPGPP GPPGPQGPPG

LQGPSGAADK

241 AGTRENQPAV VHLQGQGSAI QVKNDLSGGV LNDWSRITMN PKVFKLHPRS

GELEVLVDGT

301 YFIYSQVYYI NFTDFASYEV WDEKPFLQC TRSIETGKTN YNTCYTAGVC

LLKARQKIAV

10 361 KMVHADISIN MSKHTTFFGA IRLGEAPAS

Son concebibles diversos fragmentos, por ejemplo, dominios de unión a receptor, de citoquinas de la superfamilia de TNF como se describe en este documento.

15 1.6 Ejemplos de proteínas de fusión

SEQ ID NO: 26 SP-hsTrailsyn-SPD-Konstrukt-1_PRO.PRO

PALABRA CLAVE PROTEÍNA

ORIGEN

20

1 METDTLLLWV LLLWVPAGNG QRVAAHITGT RGRSNTLSSP NSKNEKALGR

KINSWESSRS

61 GHSFLSNLHL RNGELVIHEK GFYYIYSQTY FRFQEEIKEN TKNDKQMVQY

IYKYTSYPDP

121 ILLMKSARNS CWSKDAEYGL YSIYQGGIFE LKENDRIFVS VTNEHLIDMD

HEASFFGAFL

181 VGSGLPDVAS LRQQVEALQG QVQHLQAAFS QYKKVELFPN GQSVGEKIFK

TAGFVKPFTE

241 AQLLCTQAGG QLASPRSAAE NAALQQLWA KNEAAFLSMT DSKTEGKFTY

PTGESLVYSN

301 WAPGEPNDDG GSEDCVEIFT NGKWNDRACG EKRLWCEF

SEQ ID NO: 27 SP-hsTrailsyn-SPD-Konstrukt-2_PRO.PRO PALABRA CLAVE PROTEÍNA 25 ORIGEN

5

10

15

20

25

1 METDTLLLWV LLLWVPGSTG ERGPQRVAAH ITGTRGRSNT LSSPNSKNEK

ALGRKINSWE

61 SSRSGHSFLS NLHLRNGELV IHEKGFYYIY SQTYFRFQEE IKENTKNDKQ

MVQYIYKYTS

121 YPDPILLMKS ARNSCWSKDA EYGLYSIYQG GIFELKENDR IFVSVTNEHL

IDMDHEASFF

181 GAFLVGSGLP DVASLRQQVE ALQGQVQHLQ AAFSQYKKVE LFPNGQSVGE

KIFKTAGFVK

241 PFTEAQLLCT QAGGQ1ASPR SAAENAALQQ LWAKNEAAF LSMTDSKTEG

KFTYPTGESL

301 VYSNWAPGEP NDDGGSEDCV EIFTNGKWND RACGEKRLW CEF

SEQ ID NO: 28

ORIGEN

1 METDTLLLWV LLLWVPGSTG ERGPQRVAAH ITGTRGRSNT LSSPNSKNEK

ALGRKINSWE

61 SSRSGHSFLS NLHLRNGELV IHEKGFYYIY SQTYFRFQEE IKENTKNDKQ

MVQYIYKYTS

121 YPDPILLMKS ARNSCWSKDA EYGLYSIYQG GIFELKENDR IFVSVTNEHL

IDMDHEASFF

181 GAFLVGSGLP DVASLRQQVE ALQGQVQHLQ AAFSQYKKVE LFPNG

SEQ ID NO: 29 SP-hsTra¡lsyn-collll-Konstrukt-1.pro

PALABRA CLAVE PROTEÍNA

ORIGEN

1 METDTLLLWV LLLWVPAGNG QRVAAHITGT RGRSNTLSSP NSKNEKALGR

KINSWESSRS

61 GHSFLSNLHL RNGELVIHEK GFYYIYSQTY FRFQEEIKEN TKNDKQMVQY

IYKYTSYPDP

121 ILLMKSARNS CWSKDAEYGL YSIYQGGIFE LKENDRIFVS VTNEHLIDMD

HEASFFGAFL

181 VGSQLRKAIG EMDNQVSQLT SELKFIKNAV AGVRETESKI YLLVKEEKRY

ADAQLSCQGR

241 GGTLSMPKDE AANGLMAAYL AQAGLARVFI GINDLEKEGA FVYSDHSPMR

TFNKWRSGEP

301 NNAYDEEDCV EMVASGGWND VACHTTMYFM CEFDKENM

SEQ ID NO: 30 SP-hsTrailsyn-coll-11-Konstrukt-2.pro

PALABRA CLAVE PROTEÍNA

ORIGEN

1 METDTLLLWV LLLWVPGSTG ERGPQRVAAH ITGTRGRSNT LSSPNSKNEK

ALGRKINSWE

61 SSRSGHSFLS NLHLRNGELV IHEKGFYYIY SQTYFRFQEE IKENTKNDKQ

MVQYIYKYTS

121 YPDPILLMKS ARNSCWSKDA EYGLYSIYQG GIFELKENDR IFVSVTNEHL

IDMDHEASFF

181 GAFLVGSQLR KAIGEMDNQV SQLTSELKFI KNAVAGVRET ESKIYLLVKE

EKRYADAQLS

241 CQGRGGTLSM PKDEAANGLM AAYLAQAGLA RVFIGINDLE KEGAFVYSDH

SPMRTFNKWR

301 SGEPNNAYDE EDCVEMVASG GWNDVACHTT MYFMCEFDKE NM

SEQ ID NO: 31 SP-hsTrailsyn-coll-11-Konstrukt-3.pro

PALABRA CLAVE PROTEÍNA

ORIGEN

1 METDTLLLWV LLLWVPGSTG ERGPQRVAAH ITGTRGRSNT LSSPNSKNEK

ALGRKINSWE

61 SSRSGHSFLS NLHLRNGELV IHEKGFYYIY SQTYFRFQEE IKENTKNDKQ

MVQYIYKYTS

121 YPDPILLMKS ARNSCWSKDA EYGLYSIYQG GIFELKENDR IFVSVTNEHL

IDMDHEASFF

181 GAFLVGSQLR KAIGEMDNQV SQLTSELKFI KNAVAGVRET ES

Ejemplos

1.1 Construcción de proteínas TNF-SF estabilizadas por un dominio de trimerización derivado de colectina posicionado C-terminal

Los motivos de trimerización (Tablas 2, y 3) derivados de colectina-11 humana (Col 11), el "superenrollamiento" de 5 colectlna-11 (CC11), proteína tensloactlva D pulmonar humana (SP-D), el "superenrollamiento" de SP-D (CCSPD) se fusionaron de forma C-terminal al dominio de unión a receptor (RBD) de CD95L humano ("CD95L-RBD"; Glu142- Leu281), RBD de TRAIL humano (Gln120-Gly281), RBD de LIGHT humano (Glu91-Val240) y RBD de APRIL humano (Lys113-Leu250), respectivamente.

10

Tabla 2: Lista de las reglones usadas de secuencias de tipo silvestre (wt) para la construcción de motivos de

trimerización.

Motivo de trimerización

Aminoácidos de las secuencias wt no procesadas usadas para la construcción del motivo Entrada Swiss- Prot

SPD

220 - 375 P35247

SPD F335A

220 - 375; Phe355 -> Ala355 P35247

SPD F335D

220 - 375; Phe355 -> Asp355 P35247

CCSPD

220 - 257 P35247

con 1

117-271 Q9BWP8

CC11

116-151 Q9BWP8

15 Tabla 3: Explicación de motivos de trimerización C-termlnales usados para generar proteínas de fusión TNFSF

estables.

Motivo de trimerización

Explicación

SPD

proteína tensloactlva D humana ("cuello" superenrollado + dominio de reconocimiento de carbohidrato, CRD)

SPD_F335A

Como en 1, pero con la mutación Phe -> Ala en la posición 335 (numeración referida a SP- D de tipo silvestre procesada)

SPD_F335D

como en 1, pero con la mutación Phe -> Asp en la posición 335 (numeración referida a SP- D de tipo silvestre procesada)

CCSPD

"cuello" superenrollado de SP-D humana

Col 11

colectina-11 humana ("cuello" superenrollado + CRD de colectina-11 humana)

CC11

"cuello" superenrollado de colectina-11 humana

T4

proteína Whisker de bacteriófago T4 (documento W02008025516)

69

proteína Whisker de bacteriófago 69 (documento W02008025516)

Entre el RBD de TNFSF y el dominio de trimerización, se colocó un elemento enlazador flexible con longitudes variables (Tabla 4):

Tabla 4: Nombres de enlazador y secuencias de aminoácidos (G = glicina; S = serina)

Nombre del enlazador

Secuencia de aminoácidos

A

GSS GSS GSS GS

B

GSS GSS GS

C

GSS GS

D

GS

1.2 Generación de construcciones de expresión

25 La molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión como se describe en este documento puede clonarse en un vector adecuado para expresar la proteína de fusión. Las herramientas moleculares necesarias para generar dicho vector son conocidas para los expertos en la materia y comprenden enzimas de restricción, vectores y hospedadores adecuados para propagar los vectores.

30 Para estrategias de purificación y analíticas, se añadió una marca estrep. II (secuencia de aminoácidos WSHPQFEK) de forma C-terminal. Esta marca de afinidad se ligó al dominio de trimerización mediante un elemento enlazador flexible (secuencia de aminoácidos PSSSSSSA). Para permitir la expresión basada en secreción, los péptidos señal derivados de IgK humana se fusionaron a los extremos N-terminales de dichas proteínas. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fusión se retraducen y se optimiza su uso de codones para

35 expresión basada en células de mamífero. La síntesis génica se hace por ENTELECHON GmbH (Regensburg, Alemania). Los casetes de expresión final se subclonaron en la estructura pCDNA4-HisMax, usando sitios únicos Hind-lll y Not-I del plásmido. Todos los casetes de expresión se verificaron de forma rutinaria por secuenciación de ADN.

5

10

15

20

25

30

35

40

Los datos se presentarán en este documento para las siguientes construcciones (Tabla 5a y 5b):

TRAIL (tipo silvestre) Muteína de TRAIL (R1- específica) Muteína de TRAIL (R2- específlca)

Enlazador: Motivo

A B C D A B c D A B C D

SPD

• • • • • n.s. n.s. • • n.s. n.s. •

SPD F335A

• n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

SPD F335D

• n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

CCSPD

• • • • • n.s. n.s. • • n.s. n.s. •

Col 11

• • • • n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

CC11

• • • • n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

T4

• • • • n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

69

• • • • n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

Tabla 5a: Visión global de proteínas de fusión de TRAIL con datos mostrados. Los círculos rellenos indican que se presentan los datos. N.s., no mostrado.

LIGHT APRIL CD95L

Enlazador: Motivo

A A A

SPD

• • •

CCSPD

• • n.s.

Col 11

• • n.s.

69

• • n.s.

Tabla 1

5b: Visión global de construcciones de LIGHT, APRIL, y CD95L con datos mostrados. Los círculos rellenos indican que se presentan los datos. N.s., no mostrado.

1.3 Expresión y purificación de ligandos modificados por ingeniería de la superfamilia de TNF

Se transfectaron de forma transitoria células Hek 293T cultivadas en DMEM + GlutaMAX (GibCo) suplementado con FBS al 10%, 100 unidades/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina con plásmidos que codificaban una proteína de fusión como se describe en este documento. Se recogió el sobrenadante de cultivo celular que contenía proteínas recombinantes tres días después de la transfección y se aclaró por centrifugación a 300 xg seguido de filtración a través de un filtro estéril de 0,22 pm. Para la purificación por afinidad, se compactaron 4 mi de Sepharose de estreptactina al 50% (IBA GmbH, Góttingen, Alemania) en una columna de 2 mi y se equilibró con 30 mi de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 (PBS; Invitrogen Cat. 10010) o tampón W (Tris-HCI 100 mM, NaCI 150 mM pH 8,0). El sobrenadante de cultivo celular se aplicó a la columna a 4°C con un caudal de 2 ml/min. Posteriormente, la columna se lavó con PBS o tampón W y las proteínas unidas específicamente se eluyeron por etapas mediante la adición de 5 x 2 mi de tampón E (PBS o tampón W con Destiobiotina 2,5 mM, pH 7,4). El contenido de proteínas de las fracciones de eluato se analizó por espectroscopia de absorción y por SDS-PAGE teñido de plata. Las fracciones positivas se concentraron posteriormente por ultrafiltración (Sartorius, Vivaspin, 10.000 Da de punto de corte) y se analizaron adicionalmente por cromatografía por exclusión de tamaño (SEC).

Se realizó SEC en una columna Superdex 200 usando un sistema de cromatografía Ákta (GE-Healthcare). La columna se equilibró con PBS (Invitrogen Cat. 10010) y las proteínas concentradas, purificadas por estreptactina se cargaron en la columna de SEC a un caudal de 0,5 ml/min. La elución se controló por absorbancia a 280 nm. El peso molecular aparente de las proteínas purificadas se determinó basándose en la calibración de la columna Superdex 200 con proteínas patrón de filtración en gel (Bio-Rad GmbH, München, Alemania).

1.4 Ensayos de muerte celular

Para analizar la activación de caspasa, se usó un ensayo celular con la línea de células T humanas permanente Jurkat A3 (n.° cat. CRL2570, ATCC). Las células Jurkat se cultivaron en matraces con medio RPMI 1640 + GlutaMAX (GibCo) suplementado con FBS al 10% (Biochrom), 100 unidades/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina (GibCo). Antes del ensayo, se sembraron 100.000 células por pocilio en una placa de microtitulación de 96 pocilios. La adición de diferentes soluciones que contenían la proteína con o sin un anticuerpo de entrecruzamiento a los pocilios (volumen final: 200 pl) estuvo seguida de a 3 horas de incubación a 37°C. Las

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

células se Usaron añadiendo 20 |jl de tampón de lisis (HEPES 250 mM, MgCI2 50 mM, EGTA 10 mM, Triton-X-100 al 5%, DTT 100 mM, AEBSF 10 mM, pH 7,5) y las placas se incubaron en hielo durante 30 minutos hasta 2 horas. La apoptosis se equiparó por una actividad aumentada de caspasas. Por tanto, se usó la escisión del sustrato de caspasa específico Ac-DEVD-AFC (Biomol) para determinar el grado de apoptosis. Para el ensayo de actividad caspasa, se transfirieron 20 pl de lisado celular a una placa negra de microtitulación de 96 pocilios. Después de la adición de 80 pl de tampón que contenía HEPES 50 mM, sacarosa al 1%, CHAPS al 0,1%, Ac-DEVD-AFC 50 pM y DTT 25 mM, pH 7,5, la placa se transfirió a un lector de placa de microtitulación Tecan Infinite F500 y se controló el aumento en la intensidad de fluorescencia (longitud de onda de excitación 400 nm, longitud de onda de emisión 505 nm).

Para la determinación de la muerte celular en células de fibrosarcoma HT1080, carcinoma de cuello del útero HeLa y melanoma WM35, se sembraron 15.000 células en placas de 96 pocilios durante una noche en medio RPMI 1640 + GlutaMAX (GibCo) suplementado con FBS al 10% (Biochrom). Para células Colo205, se sembraron 50.000 células en placa durante una noche. Las células se estimularon el siguiente día con el ligando indicado y se incubaron durante 18 horas adicionales. Para células HeLa y HT1080, se usó cicloheximida (Sigma) a una concentración final de 2,5 pg/ml durante la estimulación con ligandos. La muerte celular de HT1080, HeLa y WM35 se cuantificó por tinción con tampón KV (violeta cristal al 0,5%, metanol al 20%). Después de la tinción, los pocilios se lavaron con agua y se secaron al aire. El colorante se eluyó con metanol y se midió la densidad óptica a 595 nm con un lector ELISA. La viabilidad de las células Colo205 se cuantificó por ensayo MTS (Promega).

1.5 Ensayo de citotoxicidad hepatocelular

Para determinar el efecto de las proteínas de fusión de TRAIL, se prepararon hepatocitos humanos primarios a partir de donantes sanos y se cultivaron en medio Williams E usando 25.000 células por pocilio en placas de 96 pocilios. En el día dos, se cambió el medio a DMEM-F12 suplementado con FCS al 10%, insulina humana, pen./estrep., medio esencial mínimo (MEM), piruvato sódico y Hepes 10 mM y se cultivó durante otro día. Las células se estimularon en el día tres con concentraciones variables de las proteínas indicadas en presencia o ausencia de anticuerpos de entrecruzamiento (StrepMablmmo, IBA GmbH). Para evaluar el efecto hepatotóxico potencial de un cotratamiento de ligandos con agentes quimioterapéuticos, se coincubó TRAIL-ASPD_F335D a concentraciones variables junto con doxorrubicina 5 mM o gemcitabina 5 mM. Las células se incubaron durante 5 o 24 horas a 37°C y CO2 al 5% y después se lisaron para la determinación de la actividad caspasa como se describe en la sección de "ensayos de muerte celular".

1.6 ELISA de estreptactina

Para determinar la unión de receptores a ligandos construidos, se usaron microplacas de 96 pocilios recubiertos con estreptactina. Por lo tanto, se inmovilizaron sobrenadantes de células HEK293 transfectadas de forma transitoria, suero de ratón o proteínas purificadas en placas de estreptactina (IBA GmbH) durante 1-3 horas en PBS. Las muestras se diluyeron en tampón de unión/bloqueo de ELISA (PBS, Tween-20 al 0,1%, SuperBIock T20-PBS al 20% (Pierce)). Las placas se lavaron con PBS + Tween-20 al 0,1% y se incubaron con anticuerpo de ratón anti-TRAIL (Pharmingen, clon RIK-2), receptor 1 de TRAIL-Fc (R&D Systems), receptor 2 de TRAIL-Fc (R&D Systems), TACI-Fc (R&D Systems) o HVEM-Fc (R&D Systems) durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo y se detectaron las proteínas Fe con anticuerpos específicos anti-Fc humano o anti-Fc de ratón conjugados con peroxidasa (Sigma). La reacción de color se hizo mediante la adición de 100 pl por pocilio de sustrato TMB (Kem-En-Tec Diagnostics) y se determinó la absorbancia a 450 nm y 630 nm con un lector ELISA después de la adición de 25 pl de H2SO4 al 25% como solución de parada. Los valores se calcularon como 450 nm - 630 nm con MS Excel.

1.7 Ensayo de unión a manano

Se incubaron placas ELISA (Nunc Maxisorp) durante una noche a 4°C con 10 pg/pocillo de manano de levadura (Sigma) en tampón de recubrimiento estéril (Na2C03 15 mM, NaHC03 35 mM, NaN3 al 0,025%, pH 9,6). Las placas se incubaron primero durante una hora a temperatura ambiente con tampón BB (Tris 20 mM, NaCI 140 mM, CaCI2 5 mM, BSA al 0,1% y SuperBIock T20-PBS al 20% (Pierce)) y en segundo lugar durante 90 minutos adicionales con concentraciones variables de los ligandos indicados en tampón BB. Las placas se lavaron con tampón WB (Tris 20 mM, NaCI 140 mM, CaCI2 5 mM, Tween-20 al 0,05%) y la detección se hizo usando estreptactina-HRP (IBA GmbH) en tampón BB. Las placas se lavaron y se revelaron con sustrato TMB (Kem-En-Tec Diagnostics). Se determinó la absorción a 450 nm y 630 nm con un lector ELISA después de la adición de 25 pl de H2SC>4 al 25% como solución de parada. Los valores se calcularon como 450 nm - 630 nm con MS Excel.

1.8 Farmacocinética de proteínas de fusión TRAIL-SPD

A ratones CD1 macho (Charles River) se les inyectó por vía intravenosa 10 pg de proteína disuelta en 300 pl de PBS (Invitrogen). Se recogió sangre después de 0 min (predosis), 5 min, 30 min, 2 horas, 6 horas y 24 horas. Para cada punto temporal, se recogieron dos muestras. Las muestras de sangre se procesaron para obtener suero y se almacenaron a -15°C. La concentración de proteínas de fusión de TRAIL se determinó usando un ELISA como se

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describe a continuación (capítulo 1,9) y se calcularon las semividas (GraphPad Prism v4.0).

1.9 ELISA para la cuantificación de construcciones de TRAIL en sueros de ratón

Para cuantificar la concentración de proteínas TRAIL en sueros de ratón (originarios de los estudios de farmacocinética), se usó un método ELISA empleando microplacas de 96 pocilios.

Se recubrieron placas ELISA durante 1 h a 37°C con 2 pg/ml de anticuerpo de ratón anti-TRAIL (clon RIK-2; Pharmingen). Después de lavar con PBS + Tween-20 al 0,1% y bloquear la placa durante 30 min a 37°C con StartingBlock™ (Pierce), se añadieron muestras de suero a una concentración del 0,2% y el 5%, muestras de calibración y muestras de control y se incubaron durante 1 h a 37°C. Se prepararon muestras de calibración y de control a partir del lote respectivo de TRAIL (TRAIL-ASPD o TRAIL-ASPD-F335A o TRAIL-ASPD-F335D) y se suplementaron con suero de ratón CD1 combinado no tratado al 0,2% o al 5% para justificar los efectos potenciales de la matriz. Se añadieron muestras de control (concentración alta, media y baja de la construcción de TRAIL) como controles de calidad para asegurar la precisión y exactitud de la cuantificación de TRAIL en la ventana de ensayo dada. Las placas se lavaron de nuevo y se detectaron las construcciones de TRAIL que contenían la marca estrep. con estreptactina-POD diluido 1:1000 (IBA). Todas las muestras y proteínas se diluyeron con tampón ELISA (PBS, Tween-20 al 0,1%, StartingBlock al 5% (Pierce)). La reacción de color empezó después de la adición de 100 pl por pocilio de sustrato TMB (Kem-En-Tec Diagnostics). Se determinó la absorbancia a 450 nm y 630 nm con un lector ELISA después de la adición de 25 pl de H2S04 al 25% como solución de parada. Los valores se calcularon como 450 nm - 630 nm con MS Excel.

2. Resultados

2.1 Caracterización de la proteína de fusión de CD95L (CD95L-ASPD)

De la CD95L-ASPD purificada por afinidad por estreptactina se cargaron 0,5 mi (0,86 mg de proteína) con un caudal de 0,5 ml/min en una columna Superdex200 usando PBS como tampón de ejecución. Se recogieron fracciones de 0,5 mi (se indican A1 a A11). El volumen de retención del pico principal a 11,92 mi correspondía a 170 kDa, determinado a partir del patrón de exclusión por tamaño. Esto indicó que la proteína es un trímero compuesto de monómeros glucosilados. El peso molecular calculado del polipéptido monomérico es de 38 kDa. Se usó una alícuota de las fracciones A1 a A11 para SDS-PAGE y la actividad caspasa. Solamente el pico trimérico definido (fracciones A7 a A10) se usó para los análisis finales. Los resultados se muestran en la Fig. 1.

Se usó una alícuota de la cromatografía por exclusión de tamaño de CD95L-ASPD purificada por afinidad para SDS- PAGE reductora seguida de tinción con plata. La banda detectada a aproximadamente 40-45 kDa (indicado por una flecha) correspondía a CD95L-ASPD. La especie trimérica estaba presente en las fracciones A7 a A10. Los resultados se muestran en la Fig. 2.

Se incubaron células Jurkat con alícuotas a una dilución final de factor 8 de las fracciones A1 a A15 de SEC con CD95L-ASPD purificada por afinidad. Las células se lisaron después de 3 h de incubación y se determinó la actividad caspasa con un ensayo fluorogénico. Las fracciones correspondientes al pico trimérico (fracciones A7-A10) inducían actividad caspasa clara pero débil en Jurkat ya que se sabe que estas células requieren ligando extensivamente entrecruzado. La especie agregada e indefinida en las fracciones A1-A6 es, por lo tanto, un potente inductor de activación de caspasa (no usado adicionalmente). De forma importante, se recogió solamente la especie trimérica definida (A7 a A10) y se usó para los análisis finales. Los resultados se muestran en la Fig. 3.

Las líneas celulares de cáncer humano HT1080 (A), HeLa (B) o WM35 (C) se incubaron con las concentraciones indicadas de CD95L-ASPD trimérica purificada en presencia o ausencia de anticuerpo de entrecruzamiento (2,5 microgramos/ml de anti-marca estrep. II). Las células se incubaron durante 18 h y se analizó la citotoxicidad por tinción con violeta cristal. Como resultado, CD95L-ASPD inducía muerte celular en células de carcinoma de cuello del útero HeLa y de fibrosarcoma HT1080, pero no en células de melanoma WM35. Los resultados se muestran en la Fig. 4.

La secuencia de aminoácidos de CD95L-ASPD se muestra a continuación.

SEQ ID 40 Sp-CD95L-ASPD

Cantidad total de aminoácidos: 346, PM=37682 ORIGEN

5

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45

1 METDTLLLWV LLLWVPGSTG ELRKVAHLTG KSNSRSMPLE WEDTYGIVLL SGVKYKKGGL

61 VINETGLYFV YSKVYFRGQS CNNLPLSHKV YMRNSKYPQD LVMMEGKMMS YCTTGQMWAR

121 SSYVGAVFML TSADHLYVNV SEL5LVNFEE SQTFFGLYKL GSSGSSGSSG SGLPDVASLR

181 QQVEALQGQV QHLQAAFSQY KKVELFPNGQ SVGEKIFKTA GFVKPFTEAQ

LLCTQAGGQL

241 ASPRSAAENA ALQQLWAKN EAAFLSMTDS KTEGKFTYPT GESLVYSNWA

PGEPNDDGGS

301 EDCVEIFTNG KWNDRACGEK RLWCEFGGS PSSSSSSAWS HPQFEK

1 - 20: Péptido señal de secreción (Sp; subrayado)

21 -160: Dominio de unión a receptor de CD95L

161 -171: Elemento enlazador flexible (enlazador A; cursiva)

172 - 209: Región superenrollada de "cuello" de SP-D humana 210 - 327: Dominio de lectina tipo C de SP-D humana 328 - 338: Elemento enlazador (GGSPSSSSSSA)

339 - 346: Marca estrep. II (WSHPQFEK)

2.2 Caracterización de proteínas de fusión de LIGHT (LIGHT-ASPD)

De la LIGHT-ASPD purificada por afinidad se cargaron 0,5 mi (1,56 mg) en una columna Superdex 200 y se resolvieron a 0,5 ml/min usando PBS como tampón de ejecución. El pico principal detectado a 11,96 mi correspondía a un tamaño de 170-180 kDa que indica que LIGHT-ASPD es un trímero compuesto de tres monómero glucosilados. El pico trimérico (fracciones A7 a A10) se recogió y se usó para análisis finales. El recuadro muestra la SDS-PAGE teñida con placa de dos lotes independientes purificados y triméricos de LIGHT-ASPD (denominados 0917 y 0918). Los resultados se muestran en Fig. 5.

Se usaron concentraciones variables (0-10 microgramos/ml) de LIGHT-ASPD trimérica purificada por afinidad y SEC, para inmovilizarse mediante la marca estrep. II en microplacas recubiertas con estreptactina. LIGHT-ASPD se detectó entonces en una configuración ELISA usando 100 ng/ml de proteínas de fusión con Fe de los receptores HVEM y receptor 1 de TRAIL, respectivamente. Mientras la señal ELISA aumentaba para HVEM-Fc con cantidades crecientes de ligando inmovilizado, no se detectaba señal para receptor 1 de TRAIL-Fc sobre el intervalo completo analizado. Esto indicó que LIGHT-ASPD es una molécula funcional que podría unirse a su receptor HVEM. Los resultados se muestran en la Fig. 6.

La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión LIGHT-ASPD se muestra a continuación:

SEQ ID 41 Sp-LIGHT-ASPD

Cantidad total de aminoácidos: 356, PM=37931 ORIGEN

1 AFLRGLSYHD

METDTLLLWV LLLWVPGSTG EVNPAAHLTG ANSSLTGSGG PLLWETQLGL

61 VSQQSPCGRA

GALWTKAGY YYIYSKVQLG GVGCPLGLAS TITHGLYKRT PRYPEELELL

121 GSSGSSGSSG

TSSSRVWWDS SFLGGWHLE AGEEVWRVL DERLVRLRDG TRSYFGAFMV

181 GFVKPFTEAQ

SGLPDVASLR QQVEALQGQV QHLQAAFSQY KKVELFPNGQ SVGEKIFKTA

241 GESLVYSNWA

LLCTQAGGQL ASPRSAAENA ALQQLWAKN EAAFLSMTDS KTEGKFTYPT

301 HPQFEK

PGEPNDDGGS EDCVEIFTNG KWNDRACGEK RLWCEFGGS PSSSSSSAWS

1 - 20: Péptido señal de secreción (Sp; subrayado)

21 -170: Dominio de unión a receptor de LIGHT

171 -181: Elemento enlazador flexible (enlazador A; cursiva)

182 - 219: Región superenrollada de "cuello" de SP-D humana 220 - 337: Dominio de lectina tipo C de SP-D humana 338 - 348: Elemento enlazador (GGSPSSSSSSA)

349 - 356: Marca estrep. II (WSHPQFEK)

2.3 Caracterización de proteínas de fusión de TRAIL

Se transfectaron de forma transitoria células HEK293 con 24 vectores de expresión diferentes que codificaban proteínas de fusión de TRAIL (Tabla 6).

5

10

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55

Tabla 6: Visión global de las proteínas de fusión producidas por transfección transitoria de vectores de expresión. El ligando TRAIL se transfectó como proteínas de fusión que comprenden uno de seis motivos de trimerización de _____________________estabilización y el elemento enlazador (enlazador A, B, C y D)._____________________

N.°

Ligando Enlazador Motivo de trimerización

1

TRAIL A/B/C/D 69

2

TRAIL A/B/C/D T4

3

TRAIL A/B/C/D SPD

4

TRAIL A/B/C/D CCSPD

5

TRAIL A/B/C/D Col11

6

TRAIL A/B/C/D CC11

Se usaron los sobrenadantes para SDS-PAGE y las construcciones de TRAIL se detectaron por análisis de transferencia de Western empleando un anticuerpo específico para la marca estrep. II.

Las bandas específicas detectadas se indican por una flecha. La fuerza de expresión dependía del tipo del motivo de trimerización empleado para la construcción, (SPD> 69/T4/Colectina11/CCSPD/CC11) así como de la longitud del elemento enlazador (A>B>C>D). Los resultados se muestran en la Fig. 7.

Se incubaron células Jurkat durante tres horas en presencia (barras rellenas, anti-marca estrep. II) o ausencia (barras claras) de un anticuerpo de entrecruzamiento (2,5 microgramos/ml de anti-marca estrep. II) con sobrenadantes de células HEK transfectadas de forma transitoria. Los sobrenadantes contenían proteínas de fusión de TRAIL con diferentes motivos de trimerización (T4, 69, SPD, CCSPD, Col11, CC11) fusionados a través de elementos enlazadores variados (enlazador A, B, C y D). Como control negativo, se usó el sobrenadante celular de células no transfectadas. Las células Jurkat se lisaron y analizaron para la actividad caspasa con un ensayo fluorogénico.

Como resultado, la actividad caspasa disminuyó con el tipo de elemento enlazador empleado (A>B>C>D) y sobre el plegamiento empleado. Las construcciones de TRAIL que contienen colectina-11 o el superenrollamlento de colectina-11 (CCCol11) se expresan (mostrado por análisis de transferencia de Western), sin embargo, eran no funcionales, mientras que los motivos de plegamiento derivados de SPD producían ligandos TRAIL funcionales. Los resultados se muestran en la Fig. 8.

TRAIL-ASPD purificada por afinidad se sometió a SEC cargando 0,5 mi (0,4 mg de proteína) a una columna Superdex200 a 0,5 ml/min con PBS como tampón de ejecución. La elución de la proteína se controló por absorción a 280 nm y se recogieron fracciones de 0,5 mi. El volumen de retención de 12,28 mi corresponde a 135-140 kDa determinado a partir del patrón de exclusión por tamaño. Esto indicó que TRAIL-ASPD es un homotrímero, ya que el peso molecular calculado del polipéptido monomérico es de 40 kDa. D forma importante, para todas las proteínas de fusión analizadas por SEC que consisten en la secuencia de RBD de TRAIL de tipo silvestre, se observaba un pico adicional a aproximadamente 8 mi correspondiente a proteína de fusión de TRAIL agregada y no activa. De las fracciones recogidas A1-A14 solamente el pico trimérico (A8-A10) se usó para análisis adicionales. Los resultados se muestran en la Fig. 9.

Las líneas celulares de cáncer humano HeLa, HT1080, Colo205 o WM35 se incubaron durante 18 horas con las concentraciones indicadas de TRAIL-ASPD trimérica purificada en presencia o ausencia de anticuerpo de entrecruzamiento (2,5 microgramos/ml de anti-marca estrep. II). La muerte celular se cuantificó por tinción con violeta cristal (HeLa, WM35 y HT1080) o por ensayo MTS (Colo205). La elevación en la viabilidad de las células Colo205 a alta concentración de ligando se debe probablemente a la limitación del anticuerpo de entrecruzamiento. Los resultados se muestran en la Fig. 10.

Se usó una concentración variable (A) o a constante (B) de TRAIL-ASPD trimérica purificada por afinidad y SEC para su inmovilización en placas de 96 pocilios recubiertas con estreptactina. Las placas entonces se incubaron durante 5 h con 100,000 células Jurkat por pocilio a 37°C, C02 al 5% y se determinó la actividad caspasa con un ensayo fluorogénico. Para analizar la especificidad, la placa (B) se incubó durante 30 minutos con las concentraciones variables indicadas de un anticuerpo antagonista anti-TRAIL (clon RIK-2, Pharmingen) antes de la adición de las células. Los resultados se muestran en la Fig. 11.

Se incubaron células HT1080 en la misma placa de 96 pocilios con TRAIL-ASPD o TRAIL-DSPD trimérica y purificada a las concentraciones indicadas. La muerte celular se cuantificó el siguiente día por tinción con violeta cristal. El uso del enlazador D redujo la bioactividad aproximadamente 4,5 veces, como se indica por los valores de CE50 de 27 ng/ml y 6 ng/ml para TRAIL-DSPD y TRAIL-ASPD, respectivamente. Los resultados se muestran en la Fig. 12.

Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de polipéptidos de fusión de TRAIL se muestran a continuación.

SEQ ID 42: Casete de expresión de Sp-TRAIL-ASPD

Los sitios de restricción de endonucleasa están subrayados (Hindlll, AAGCTT; BamHI, GGATCC; Notl, GCGGCCGC). El codón de inicio de la traducción está en negrita.

5 ORIGEN

1

AAGCTTGCCG CCACCATGGA GACCGATACA CTGCTCTTGT GGGTGCTCTT

GCTGTGGGTT 61

CCTGCAGGTA ATGGTCAAAG AGTCGCAGCT CACATCACTG GGACTAGAGG

CAGGAGTAAC 121

ACCCTGAGTT CTCCCAATTC CAAGAACGAG AAAGCCCTGG GTAGGAAGAT

CAACTCCTGG 181

GAAAGCTCCA GAAGCGGCCA TAGCTTTCTT AGCAACCTCC ACTTGAGGAA

TGGCGAACTT 241

GTGATCCATG AGAAGGGCTT CTACTACATC TACAGCCAGA CGTACTTCAG

GTTCCAGGAG 301

GAAATCAAGG AGAACACCAA GAACGACAAG CAGATGGTGC AATACATCTA

CAAGTACACG 361

TCATACCCTG ATCCTATACT GCTGATGAAG TCCGCCAGAA ACAGTTGCTG

GAGCAAAGAC 421

GCTGAATACG GCCTGTATTC CATCTATCAG GGCGGTATCT TTGAACTCAA

GGAGAACGAC 481

AGGATCTTCG TGTCTGTGAC AAACGAGCAT CTGATCGACA TGGACCATGA

AGCGTCTTTC 541

TTCGGTGCCT TCTTGGTGGG ATCCTCTGGT TCGAGTGGTT CGAGTGGTTC

TGGATTGCCA 601

GACGTTGCTT CTTTGAGACA ACAGGTTGAG GCTTTGCAGG GTCAAGTCCA

GCACTTGCAG 661

GCTGCTTTCT CTCAATACAA GAAGGTTGAG TTGTTCCCAA ACGGTCAATC

TGTTGGCGAA 721

AAGATTTTCA AGACTGCTGG TTTCGTCAAA CCATTCACGG AGGCACAATT

ATTGTGTACT 781

CAGGCTGGTG GACAGTTGGC CTCTCCACGT TCTGCCGCTG AGAACGCCGC

CTTGCAACAG 841

TTGGTCGTAG CTAAGAACGA GGCTGCTTTC TTGAGCATGA CTGATTCCAA

GACAGAGGGC 901

AAGTTCACCT ACCCAACAGG AGAATCCTTG GTCTATTCTA ATTGGGCACC

TGGAGAGCCC 961

AACGATGATG GCGGCTCAGA GGACTGTGTG GAAATCTTCA CCAATGGCAA

GTGGAATGAC 1021

AGAGCTTGTG GAGAGAAGCG TTTGGTGGTC TGTGAGTTCG GAGGCAGTCC

TTCATCTTCA 1081 TCTAGCTCTG CCTGGTCGCA TCCACAATTC GAGAAATAAT AGCGGCCGC

10

SEQ ID 43 Sp-TRAIL-ASPD

Cantidad total de aminoácidos: 367, PM=40404 ORIGEN

1 KINSWESSRS

METDTLLLWV LLLWVPAGNG QRVAAHITGT RGRSNTLSSP NSKNEKALGR

61 IYKYTSYPDP

GHSFLSNLHL RNGELVIHEK GFYYIYSQTY FRFQEEIKEN TKNDKQMVQY

121 HEASFFGAFL

ILLMKSARNS CWSKDAEYGL YSIYQGGIFE LKENDRIFVS VTNEHLIDMD

181 QSVGEKIFKT

VGSSGSSGSS GSGLPDVASL RQQVEALQGQ VQHLQAAFSQ YKKVELFPNG

241 SKTEGKFTYP

AGFVKPFTEA QLLCTQAGGQ LASPRSAAEN AALQQLWAK NEAAFLSMTD

301 SPSSSSSSAW

TGESLVYSNW APGEPNDDGG SEDCVEIFTN GKWNDRACGE KRLWCEFGG

15 361 SHPQFEK

1 -20: Péptldo señal de secreción (Sp; subrayado)

21 -181: Dominio de unión a receptor de TRAIL 182 -192: Elemento enlazador flexible (enlazador A; cursiva) 20 193 - 230: Región superenrollada de "cuello" de SP-D humana

231 - 348: Dominio de lectina tipo C de SP-D humana 349 - 359: Elemento enlazador (GGSPSSSSSSA)

360 - 367: Marca estrep. II (WSHPQFEK)

5

10

15

20

25

30

35

40

SEQ ID 44 Sp-TRAIL-ACCSPD

Cantidad total de aminoácidos: 246, PM=27534 ORIGEN

1

METDTLLLWV LLLWVPAGNG QRVAAHITGT RGRSNTLSSP NSKNEKALGR

KINSWESSRS

61 GHSFLSNLHL RNGELVIHEK GFYYIYSQTY FRFQEEIKEN TKNDKQMVQY

IYKYTSYPDP

121 ILLMKSARNS CWSKDAEYGL YSIYQGGIFE LKENDRIFVS VTNEHLIDMD

HEASFFGAFL

181 VGSSGSSGSS GSGLPDVASL RQQVEALQGQ VQHLQAAFSQ YKKVELFPMG

PSSSSSSAWS

241 HPQFEK

1 - 20: Péptido señal de secreción (Sp; subrayado)

21 -181: Dominio de unión a receptor de TRAIL

182 -192: Elemento enlazador flexible (enlazador A; cursiva)

193 - 230: Región superenrollada de "cuello" de SP-D humana 231 - 238: Elemento enlazador (PSSSSSSA)

239 - 246: Marca estrep. II (WSHPQFEK)

SEQ ID 45 Sp-TRAIL-ACol11

Cantidad total de aminoácidos: 365, PM=40806 ORIGEN

1 KINSWESSRS

METDTLLLWV LLLWVPAGNG QRVAAHITGT RGRSNTLSSP NSKNEKALGR

61 IYKYTSYPDP

GHSFLSNLHL RNGELVIHEK GFYYIYSQTY FRFQEEIKEN TKNDKQMVQY

121 HEASFFGAFL

ILLMKSARNS CWSKDAEYGL YSIYQGGIFE LKENDRIFVS VTNEHLIDMD

181 LLVKEEKRYA

VGSSGSSGSS GSQLRKAIGE MDNQVSQLTS ELKFIKNAVA GVRETESKIY

241 VYSDHSPMRT

DAQLSCQGRG GTLSMPKDEA ANGLMAAYLA QAGLARVFIG INDLEKEGAF

301 SSSSSSAWSH

FNKWRSGEPN NAYDEEDCVE MVAS GGWNDV ACHTTMYFMC EFDKENMGSP

361 PQFEK

1 - 20: Péptido señal de secreción (Sp; subrayado)

21 -181: Dominio de unión a receptor de TRAIL

182 - 192: Elemento enlazador flexible (enlazador A; cursiva)

193 - 224: Región superenrollada de "cuello" de colectina-11 humana 225 - 347: Dominio de lectina tipo C de colectina-11 humana 348 - 357: Elemento enlazador (GSPSSSSSSA)

358 - 365: Marca estrep. II (WSHPQFEK)

SEQ ID 46 Sp-TRAIL-ACC11

Cantidad total de aminoácidos: 246, PM=27431 ORIGEN

1 METDTLLLWV LLLWVPAGNG QRVAAHITGT RGRSNTLSSP NSKNEKALGR

KINSWESSRS

61 GHSFLSNLHL RNGELVIHEK GFYYIYSQTY FRFQEEIKEN TKNDKQMVQY

IYKYTSYPDP

121 ILLMKSARNS CWSKDAEYGL YSIYQGGIFE LKENDRIFVS VTNEHLIDMD

HEASFFGAFL

181 VGSSGSSGSS GSGSQLRKAI GEMDNQVSQL TSELKFIKNA VAGVRETESG

PSSSSSSAWS

241 HPQFEK

1 - 20: Péptido señal de secreción (subrayado)

21 -181: Dominio de unión a receptor de TRAIL

182 - 193: Elemento enlazador flexible (enlazador A; GSS GSS GSS GSG cursiva) 194 - 229: Región superenrollada de "cuello" de colectina-11 humana

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

230 - 238: Elemento enlazador (GPSSSSSSA)

239 - 246: Marca estrep. II (WSHPQFEK)

2.4 Caracterización de proteínas de fusión de TRAIL selectivas de receptor ('muteína')

Se transfectaron de forma transitoria células HEK293 con plásmldos de expresión que codificaban diferentes construcciones de SPD selectivas del receptor de TRAIL:

N.°

Vector de expresión transfectado

1

TRAILR1 mut-A-SPD

2

TRAILR1 mut-A-CCSPD

3

TRAILR1 mut-D-SPD

4

TRAILR1 mut-D-CCSPD

5

TRAILR2mut-A-SPD

6

TRAILR2mut-A-CCSPD

7

TRAILR2mut-D-SPD

8

TRAILR2mut-D-CCSPD

9

TRAIL-A-SPD

10

TRAIL-A-CCSPD

11

TRAIL-D-SPD

12

TRAIL-D-CCSPD

Se recogieron los sobrenadantes tres días posteriores a la transfecclón y se usó una alícuota para SDS-PAGE y transferencia de Western empleando un anticuerpo específico para la marca estrep. II. Se detectaron bandas específicas a aproximadamente 38 kDa (proteínas de fusión de SPD) y 28 kDa (proteínas de fusión de superenrollamlento de SPD). La cantidad de proteína expresada dependía del propio ligando (TRAILR1muteína>TRAILR2muteína>TRAIL), en segundo lugar, de la longitud del enlazador usado (A>D) y en tercer lugar del motivo de trlmerlzaclón usado (SPD>CCSPD). Los pesos moleculares aparentes fueron los esperados de los tamaños calculados (40 kDa y 27 kDa para proteínas de fusión de SPD y CCSPD, respectivamente). Los resultados se muestran en la Fig. 13.

La selectividad del receptor 1 de TRAIL o receptor 2 de TRAIL hacia proteínas de fusión de SPD/ccSPD y TRAIL, TRAILRImut y TRAILR2mut se demostró por ELISA con estreptactina. Por lo tanto, se inmovilizaron proteínas de fusión TRAIL-SPD en sobrenadantes de células HEK293 transfectadas de forma transitoria sobre microplacas recubiertas con estreptactina. El sobrenadante celular de células no transfectadas sirvió como control negativo. Los resultados se muestran en la Fig. 14. Se detectaron proteínas unidas específicamente con concentraciones constantes (A, B) o variables (C, D) de receptor 1 de TRAIL-Fc o receptor 2 de TRAIL-Fc. Como se muestra en (A), el ligando TRAILRImut fusionado a variantes de SPD se detecta por el receptor 1 de TRAIL, mientras que el ligando TRAILR2mut no. Como se muestra en (B), el ligando TRAILR2mut se detecta preferentemente por el receptor 2 de TRAIL, mientras que las construcciones de TRAILRImut y de TRAIL de tipo silvestre se detectan igual de bien. Como se muestra en C, el receptor 1 de TRAIL-Fc se unía a TRAIL-R1mut-ASPD y TRAIL-ASPD igual de bien sobre el intervalo complejo de titulación del receptor, mientras que TRAIL-R2mut-ASPD no se detecta. Como se muestra en D, el receptor 2 de TRAIL-Fc se unía a TRAIL-R2mut-ASPD y TRAIL-ASPD igual de bien sobre el intervalo completo de titulación del receptor analizado, mientras que la señal para TRAIL-R1mut-ASPD disminuía rápidamente con concentraciones decrecientes del receptor.

Se usó un microgramo/ml de TRAIL-ASPD, TRAILR1mut-ASPD o TRAILR2mut-ASPD trimérica purificada por afinidad en 100 microlitros de PBS para inmovilización mediante la marca estrep. II sobre microplacas recubiertas con estreptactina. Los ligandos unidos se detectaron en una configuración ELISA usando proteínas de fusión con Fe de receptor 1 de TRAIL (A) o receptor 2 de TRAIL (B). Como se muestra en (A), el receptor 1 de TRAIL se unía preferentemente a TRAILR1mut-ASPD selectiva de receptor en comparación con TRAILR2mut-ASPD. Como se muestra en (B), el receptor 2 de TRAIL se unía preferentemente a TRAILR2mut-ASPD en comparación con TRAILR1mut-ASPD. En conclusión, las variantes de TRAIL construidas fusionadas a SPD son selectivas de receptor. Los resultados se muestran en la Fig. 15.

TRAILR1mut-ASPD purificada por afinidad se sometió a SEC cargando 0,5 mi (0,95 mg de proteína) en una columna Superdex200. Los resultados se muestran en la Fig. 16. Las proteínas se resolvieron a 0,5 ml/mmuto con PBS como tampón de ejecución y se recogieron fracciones de 0,5 mi (se indican las fracciones A1 a A14). El volumen de retención de 12,46 mi correspondía a 140-145 kDa determinado por el patrón de exclusión por tamaño. Un pico minoritario a 10,83 mi indicó algunas especies agregadas, de forma Importante, sin embargo, no se detectó ningún pico en el frente de la ejecución (8 mi) lo que Indica que esta molécula es mucho más soluble en comparación con proteínas que contienen partes de la secuencia de aminoácidos de TRAIL de tipo silvestre.

Se usó una alícuota de la cromatografía por exclusión de tamaño de TRAILR1mut-ASPD purificada por afinidad para SDS-PAGE no reductora (A) o reductora (B) seguido de tinción con plata como se muestra en la Fig. 17. En condiciones no reductoras, se detectaron dos bandas a 35 y 70 kDa, mientras que se detectó una única banda de 40

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

kDa (indicada por una flecha) en condiciones reductoras. Esto indicaba la formación de moléculas unidas por puentes disulfuro. Las especies triméricas estaban presentes en las fracciones A8 a A11 y se usaron para análisis posteriores.

Se incubaron células Jurkat en ausencia (barras abiertas) o presencia (barras rellenas) de 2,5 microgramos/ml de anticuerpo de entrecruzamiento con alícuotas a una dilución final de factor 80 de las fracciones A1 a A14 de SEC de TRAILR1mut-ASPD purificada por afinidad. Los resultados se muestran en la Fig. 18. Como control negativo, se incubaron células Jurkat con medio solamente. Se lisaron las células Jurkat después de 3 h de incubación y se determinó la actividad caspasa con un ensayo fluorogénico. Como las células Jurkat han demostrado expresar principalmente el receptor 2 de TRAIL, ninguna fracción indujo actividad caspasa significativa, incluso cuando TRAILR1mut-ASPD se entrecruzaba por el anticuerpo específico de marca estrep. II. Esto indicó que TRAILRImut- ASPD no se une al receptor 2 de TRAIL,

TRAILR2mut-ASPD purificada por afinidad se sometió a cromatografía por exclusión de tamaño cargando 0,5 mi (0,5 mg de proteína) a una columna Superdex 200 como se muestra en la Fig. 19. Las proteínas se resolvieron a 0,5 ml/minuto con PBS como tampón de ejecución y se recogieron fracciones de 0,5 mi (se indican las fracciones A1 a A14). El volumen de retención de 12,60 mi corresponde to 130-135 kDa determinado a partir del patrón de exclusión por tamaño. Esto indicó que TRAILR2mut-ASPD es un homotrímero según lo calculado a partir del peso monomérico esperado de 40 kDa. De forma importante, más del 95% estaba presente en la fracción de pico trimérico y no se detectaron agregados. El pico trimérico se usó para análisis posteriores.

Se usó una alícuota de la cromatografía por exclusión de tamaño de TRAILR2mut-ASPD purificada por afinidad para SDS-PAGE no reductora (A) o reductora (B) seguido de tinción con plata como se muestra en la Fig. 20. En condiciones no reductoras, se detectaron dos bandas a 35 y 70 kDa, mientras que se detectó una única banda de aproximadamente 40 kDa (indicada por una flecha) en condiciones reductoras. Esto indicó la formación de moléculas unidas por puentes disulfuro. La especie trimérica estaba presente en las fracciones A9 a A11 y se usó para análisis posteriores.

Los resultados de un ensayo de eliminación de células Jurkat con TRAILR2-mut-ASPD se muestran en la Fig. 21. Se incubaron células Jurkat en ausencia (barras claras) o presencia (barras rellenas) de anticuerpos de entrecruzamiento (2,5 microgramos/ml de anti-marca estrep. II) con alícuotas de las fracciones A1 a A14 de SEC de TRAILR2mut-ASPD purificada por afinidad. Las muestras se usaron a una dilución final de factor 640. Las células se lisaron después de 3 h de incubación y se determinó la actividad caspasa con un ensayo fluorogénico. Como las células Jurkat han demostrado expresar principalmente el receptor 2 de TRAIL que requiere formas multimerizadas de ligando para una señalización eficaz, TRAILR2mut-ASPD inducía actividad caspasa cuando se entrecruzaba. Esto indicó que TRAILR2mut-ASPD es una molécula funcional.

La actividad citotóxica de TRAIL-ASPD, TRAILR1mut-ASPD y TRAILR2mut-ASPD sobre diferentes células cancerosas humanas se muestra en la Fig. 22. Las líneas celulares indicadas HT1080 (A y B), Hela (C y D) o Colo205 (E y F) se trataron con concentraciones variables de TRAIL-ASPD, TRAILR1mut-ASPD o TRAILR2mut- ASPD purificada y trimérica en ausencia (A, C y E) o presencia (B, D y F) de anticuerpo de entrecruzamiento (antimarca estrep. II). Las células se incubaron durante 18 horas con las concentraciones indicadas de ligandos y se cuantificó la muerte celular mediante tinción con violeta cristal (HT1080 y HeLa) o ensayo MTS (Colo205). Como resultado, el ligando TRAIL-ASPD indujo muerte celular sobre las tres líneas celulares ensayadas y TRAILR2mut- ASPD mostró superior actividad de eliminación celular. En contraste, TRAILR1mut-ASPD selectiva del receptor 1 de TRAIL no fue activa sobre ninguna línea celular ensayada.

TRAILR2mut-ASPD purificada por afinidad se concentró 20 veces en PBS por centrifugación a través de una membrana de 10 kDa para dar una solución de 2,5 mg/ml. Del concentrado, 0,1 mi se sometieron a cromatografía por exclusión de tamaño. Como resultado, solamente se detectó el pico trimérico y ningún agregado, lo que indica que esta composición tiene capacidades mejoradas de producción (Fig. 23). Se consiguieron resultados similares para TRAILR1mut-ASPD, donde una solución concentrada de incluso 5,4 mg/ml no mostró signos de agregación (no mostrado). En contraste, todas las proteínas de fusión ensayadas que contenían el dominio de unión a receptor compuestos de la secuencia de TRAIL de tipo silvestre mostraron agregación con un 40% de agregados a concentraciones tan bajas como de 0,4 mg/ml.

Las secuencias de aminoácidos de polipéptidos de fusión de muteína de TRAIL selectiva de receptor se muestran a continuación.

SEQ ID 47 Sp-TRAILR1mut-ASPD

Cantidad total de aminoácidos: 367, PM=40335 ORIGEN

5

10

15

20

25

30

35

40

1

METDTLLLWV LLLWVPAGNG

KINSWESSRS 61

GHSFLSNLHL RNGELVIHEK

IYKWTDYPDP 121

ILLMKSARNS CWSKDAEYGL

HEASFFGAFL 181

VGSSGSSGSS GSGLPDVASL

QSVGEKIFKT 241

AGFVKPFTEA QLLCTQAGGQ

SKTEGKFTYP 301

TGESLVYSNW APGEPNDDGG

SPSSSSSSAW 361 SHPQFEK

QRVAAHITGT

RGRSNTLSSP NSKNEKALGR

GFYYIYSQTA

FRFSEEIKEV TRNDKQMVQY

YSIYQGGIFE

LKENDRIFVS VTNEHLIDMD

RQQVEALQGQ

VQHLQAAFSQ YKKVELFPNG

LASPRSAAEN

AALQQLWAK NEAAFLSMTD

SEDCVEIFTN

GKWNDRACGE KRLWCEFGG

1 - 20: Péptido señal de secreción (Sp; subrayado)

21 -181: Dominio de unión a receptor de TRAILR1 mut 182- 192: Elemento enlazador flexible (enlazador A; cursiva) 193 - 230: Región superenrollada de "cuello" de SP-D humana 231 - 348: Dominio de lectina tipo C de SP-D humana 349 - 359: Elemento enlazador (GGSPSSSSSSA)

360 - 367: Marca estrep. II (WSHPQFEK)

SEQ ID 48 Sp-TRAILR2mut-ASPD

Cantidad total de aminoácidos: 367, PM=40401 ORIGEN

1

METDTLLLWV LLLWVPAGNG

KINSWESSRS 61

GHSFLSNLHL RNGELVIHEK

IYKYTSYPDP 121

ILLMKSARNS CWSKDAEYGL

HEASFFGAFL 181

VGSSGSSGSS GSGLPDVASL

QSVGEKIFKT 241

AGFVKPFTEA QLLCTQAGGQ

SKTEGKFTYP 301

TGESLVYSNW APGEPNDDGG

SPSSSSSSAW 361 SHPQFEK

QRVAAHITGT

RGRSNTLSSP NSKNEKALGR

GFYYIYSQTQ

FKFREEIKEN TKNDKQMVQY

YSIYQGGIFE

LKENDRIFVS VTNERLLQMD

RQQVEALQGQ

VQHLQAAFSQ YKKVELFPNG

LASPRSAAEN

AALQQLWAK NEAAFLSMTD

SEDCVEIFTN

GKWNDRACGE KRLWCEFGG

1 - 20: Péptido señal de secreción (Sp; subrayado)

21 -181: Dominio de unión a receptor de TRAILR2mut 182- 192: Elemento enlazador flexible (enlazador A; cursiva)

193 - 230: Región superenrollada de "cuello" de SP-D humana 231 - 348: Dominio de lectina tipo C de SP-D humana 349 - 359: Elemento enlazador (GGSPSSSSSSA)

360 - 367: Marca estrep. II (WSHPQFEK)

2.5 Caracterización de variantes de carbohidrato de SPD

TRAIL-ASPD_F335A purificada por afinidad se sometió a cromatografía por exclusión de tamaño cargando 0,5 mi de solución de PBS (0,4 mg de proteína) a una columna Superdex 200 como se muestra en la Fig. 24. Las proteínas se resolvieron a 0,5 ml/minuto con PBS como tampón de ejecución y se recogieron fracciones de 0,5 mi (se indican A1 a A13). El volumen de retención de 12,27 mi corresponde a 135-145 kDa determinado a partir del patrón de exclusión por tamaño. Esto indicó que TRAIL-ASPD_F335A es un homotrímero según lo calculado a partir del peso monomérico esperado de 40 kDa. Dos picos adicionales a 8,32 y 10,68 mi indicaron la formación de agregados de TRAIL-ASPD_F335A. Solamente el pico trimérico se usó para análisis posteriores.

De la cromatografía por exclusión de tamaño se resolvió una alícuota de las fracciones recogidas A1 a A13 por SDS- PAGE reductora y el gel se tiñó con plata (Fig. 25). La banda detectada a aproximadamente 40 kDa correspondía al peso molecular calculado de 40 kDa para TRAIL-ASPD_F335A. Las fracciones positivas correspondientes a la molécula trimérica (A8, A9, A10) de la ejecución SEC se combinaron y usaron para análisis adicionales.

Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fusión de TRAIL- variante de carbohidrato de SPD se muestran a continuación.

SEQ ID 49: Sp-TRAIL-ASPD_F335A

5

10

15

20

25

30

35

40

Cantidad total de aminoácidos: 367, PM=40328

ORIGEN 1

METDTLLLWV LLLWVPAGNG QRVAAHITGT RGRSNTLSSP NSKNEKALGR

KINSWESSRS 61

GHSFLSNLHL RNGELVIHEK GFYYIYSQTY FRFQEEIKEN TKNDKQMVQY

IYKYTSYPDP 121

ILLMKSARNS CWSKDAEYGL YSIYQGGIFE LKENDRIFVS VTNEHLIDMD

HEASFFGAFL 181

VGSSGSSGSS GSGLPDVASL RQQVEALQGQ VQHLQAAFSQ YKKVELFPNG

QSVGEKIFKT 241

AGFVKPFTEA QLLCTQAGGQ LASPRSAAEN AALQQLWAK NEAAFLSMTD

SKTEGKFTYP 301

TGESLVYSNW APGEPNDDGG SEDCVEIATN GKWNDRACGE KRLWCEFGG

SPSSSSSSAW

361 SHPQFEK

1 - 20: Péptido señal de secreción (Sp; subrayado)

21 -181: Dominio de unión a receptor de TRAIL

182- 192: Elemento enlazador flexible (enlazador A; cursiva)

193 - 230: Región superenrollada de "cuello" de SP-D humana

231 - 348: Dominio de lectina tipo C de SP-D humana (mutación Phe en negrita)

349 - 359: Elemento enlazador (GGSPSSSSSSA)

360 - 367: Marca estrep. II (WSHPQFEK)

SEQ ID 50: Sp-TRAIL-ASPD_F335D

Cantidad total de aminoácidos: 367, PM=40372 ORIGEN

1 KINSWESSRS

METDTLLLWV LLLWVPAGNG QRVAAHITGT RGRSNTLSSP NSKNEKALGR

61 IYKYTSYPDP

GHSFLSNLHL RNGELVIHEK GFYYIYSQTY FRFQEEIKEN TKNDKQMVQY

121 HEASFFGAFL

ILLMKSARNS CWSKDAEYGL YSIYQGGIFE LKENDRIFVS VTNEHLIDMD

181 QSVGEKIFKT

VGSSGSSGSS GS GLPDVASL RQQVEALQGQ VQHLQAAFSQ YKKVELFPNG

241 SKTEGKFTYP

AGFVKPFTEA QLLCTQAGGQ LASPRSAAEN AALQQLWAK NEAAFLSMTD

301 SPSSSSSSAW

TGESLVYSNW APGEPNDDGG SEDCVEIDTN GKWNDRACGE KRLWCEFGG

361 SHPQFEK

1 - 20: Péptido señal de secreción (Sp; subrayado)

21 -181: Dominio de unión a receptor de TRAIL

182 -192: Elemento enlazador flexible (enlazador A; cursiva)

193 - 230: Región superenrollada de "cuello" de SP-D humana

231 - 348: Dominio de lectina tipo C de SP-D humana (mutación Asp en negrita)

349 - 359: Elemento enlazador (GGSPSSSSSSA)

360 - 367: Marca estrep. II (WSHPQFEK)

El efecto citotóxico de TRAIL-ASPD_F335A sobre células cancerosas humanas se muestra en la Fig. 26. Las líneas celulares de cáncer humano indicadas se incubaron durante una noche con concentraciones variables de TRAIL- ASPD_F335A trimérica purificada por afinidad y SEC en presencia o ausencia de anticuerpo de entrecruzamiento (2,5 microgramos/ml de anti-marca estrep. II). La viabilidad celular se cuantificó por tinción con violeta cristal (HT1080, HeLa y WM35) o MTS (Colo205). La elevación de la viabilidad celular de Colo205 a altas concentraciones de ligando se debe probablemente a la limitación del anticuerpo de entrecruzamiento.

TRAIL-ASPD_F335D purificada por afinidad se sometió a cromatografía por exclusión de tamaño cargando 0,5 mi (0,2 mg de proteína) a una columna Superdex 200 como se muestra en la Fig. 27. Las proteínas se resolvieron a 0,5 ml/minuto con PBS como tampón de ejecución y se recogieron fracciones de 0,5 mi (se indican A1 a A13). El volumen de retención de 12,29 mi corresponde a 135-145 kDa determinado a partir del patrón de exclusión por tamaño. Esto indicó que TRAIL-ASPD_F335D es un homotrímero según lo calculado a partir del peso monomérico esperado de 40 kDa. El pico a 8,35 correspondía a agregados inactivos de TRAIL-ASPD_F335D típicamente encontrados para todas las proteínas de fusión que contienen partes de la secuencia de aminoácidos de TRAIL de tipo silvestre.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

De la cromatografía por exclusión de tamaño se resolvieron alícuotas de TRAIL-ASPD_F335D purificada por afinidad de las fracciones recogidas A1 a A13 por SDS-PAGE reductora y el gel se tiñó con plata (Fig. 28). Las bandas detectadas a aproximadamente 40 kDa (indicadas por una flecha) correspondían al peso molecular calculado de 40 kDa para TRAIL-ASPD_F335D. Las fracciones que contenían proteína trimérica (fracciones A8 a A10) se combinaron y usaron para análisis adicionales.

Las líneas celulares de cáncer humano HT1080 (A), HeLa (B), WM35 (C) o Colo205 (D) se incubaron durante una noche con concentraciones variables de TRAIL-ASPD_F335D trimérica purificada por afinidad en presencia o ausencia de anticuerpos de entrecruzamiento (anti-marca estrep. II). La viabilidad celular se cuantificó por tinción con violeta cristal (HT1080, HeLa y WM35) o MTS (Colo205). Los datos muestran que TRAIL-ASPD_F335D es capaz de inducir muerte celular en las líneas celulares de cáncer ejemplificadas (Fig. 29). La elevación de la viabilidad de las células Colo205 a altas concentraciones de ligando se debe probablemente a la limitación del anticuerpo de entrecruzamiento.

2.6 Análisis de características de unión a carbohidrato de las variantes del motivo de trimerización de SPD

Se ha demostrado que la proteína SP-D de tipo silvestre, de longitud completa y oligomérica de varias especies, y también el cuello+CRD trimérico de SP-D humana se une a varios carbohidratos diferentes. Además, el cuello+CRD de SP-D humana también ha demostrado ejercer efectos inmunomoduladores sirviendo como factor quimiotáctico para células del sistema inmunitario tales como neutrófilos (Cai et al., 1999, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 276:131-136). Otras células también pueden reclutarse por SP-D. El efecto quimiotáctico del cuello+CRD de SP-D humana ha demostrado depender de la función de glicounión, ya que la adición de maltosa inhibía la función quimiotáctica. Por tanto, un ligando del TNFSF con una función quimiotáctica mediada por SP-D puede ser de actividad superior en comparación con ligandos o construcciones de los mismos con secuencias naturales de aminoácidos. Por ejemplo, en un escenario donde son deseables efectos celulares tal como en el tratamiento del cáncer dicho ligando descrito puede ser deseable.

Además, un ligando donde SP-D no tiene función de carbohidrato puede ser deseable en otros entornos. Para SP-D humana se ha descrito un mutante en que el aminoácido fenilalanina 335 (correspondiente al aminoácido 355 de la SEQ ID NO: 21) se ha mutado en alanina (SPD_F335A, Crouch et al., JBC 281: 18008-18014,). Este mutante mostró unión muy débil a carbohidrato. Sin embargo, la introducción de un aminoácido cargado (por ejemplo, un aminoácido ácido) puede ser incluso mejor en comparación con F335A si no se desea unión a carbohidrato. Por lo tanto, el mutante SPD_F335D puede ser superior hacia el mutante F335A.

Para analizar la unión de proteínas de fusión de TRAIL a carbohidratos, se inmovilizó manano de levadura en microplacas y se detectó la unión de TRAIL-SPD, TRAIL-SPD_F335A o TRAIL-SPD_F335D por ELISA. Los resultados se muestran en la Fig. 30. Como se esperaba, la señal ELISA aumentó con concentraciones crecientes de TRAIL-ASPD. En contraste, la forma mutante de carbohidrato TRAIL-ASPD_F335A mostró una señal ELISA muy baja. Además, la nueva variante TRAIL-ASPD_F335D construida presentaba la señal ELISA más baja (véase el recuadro y la flecha). Esto indicó que el mutante F335D tiene una menor afinidad de unión a manano en comparación con la mutante de SP-D descrita previamente F335A.

2.7 Farmacocinética de proteínas de fusión TRAIL-SPD

Para determinar las semividas de proteínas de fusión TRAIL-SPD, se inyectaron diez microgramos de TRAIL-ASPD (A) o TRAIL-ASPD_F335D (B) por vía intravenosa en ratones CD1 macho y se recogieron muestras de suero después de varios puntos temporales (predosis, 5 min, 30 min, 2 h, 6 h y 24 h). Las proteínas TRAIL en los sueros de los ratones se cuantificaron por un ELISA y los datos se usaron para calcular las semividas. Los resultados se muestran en la Fig. 31. Para las dos proteínas analizadas, se calculó una semivida de 7 a 14 horas para TRAIL- ASPD (A) y TRAIL-ASPD_F335D (B). Ningún animal murió o mostró signos de intolerancia durante el periodo observado. Los datos indican una mejora de al menos 80 veces en la semivida en suero en comparación con TRAIL de tipo silvestre, que se informó que tenía una semivida en el intervalo de tres a cinco minutos en roedores (Kelley et. al 2001).

2.8 Citotoxicidad de proteínas de fusión TRAIL-ASPD

Para analizar los efectos hepatotóxicos potenciales de TRAIL-ASPD, TRAIL-ASPD_F335A o TRAIL-ASPD_F335D, se incubaron hepatocitos humanos primarios (PHH) con concentraciones variables de las proteínas de fusión TRAIL- SPD indicadas, con o sin anticuerpos de entrecruzamiento (anti-marca estrep. II). Como control, se usó una variante estabilizada de CD95L, CD95L-T4 (descrita en el documento W02008/025516). Los resultados se muestran en la Fig. 32.

Además, se analizó el efecto de una incubación simultánea de PHH con 5 mM de fármacos quimioterapéuticos para TRAIL-ASPD_F335D. Después de 5 h (A, B y E) o 24 h (C, D y F) de incubación, se lisaron las células y se evaluó la actividad caspasa con un ensayo fluorogénico.

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Como resultado, ninguna de las proteínas de fusión TRAIL-SPD analizadas indujo efectos hepatotóxicos, incluso si los ligandos se entrecruzaban de forma secundaria por anticuerpos. En contraste, CD95L-T4 es hepatotóxica, como se indica por un aumento de la caspasa activa (A a D). Cinco horas de coincubación de hepatocitos humanos primarios con TRAIL-ASPD_F335D trimérica junto con fármacos quimioterapéuticos no indujeron actividad caspasa (E). Sin embargo, después de 24 h de coincubación con doxorrubicina, TRAIL-ASPD_F335D soluble indujo una fuerte señal de actividad caspasa (F).

Esto indica que las proteínas de fusión de TRAIL de la presente invención pueden no mostrar hepatotoxicidad indeseada en uso médico. Por tanto, las proteínas de fusión de TRAIL se administran preferiblemente en combinación con fármacos, que son sensibilizantes de la apoptosis y/o inductores de la apoptosis, por ejemplo, un fármaco quimioterapéutico tal como oxaliplatino, cisplatino, 5-fluorouracilo, etopósido, gemcitabina, irinotecán y otros, o moléculas de unión a Bcl2, por ejemplo, moléculas pequeñas o compuestos peptídicos, que se unen a polipéptidos de la familia de Bcl2, particularmente Bcl2 o Bclxl.

2.9 Caracterización de proteínas de fusión de APRIL

Se transfectaron de forma transitoria células HEK293 con vectores de expresión que codificaban APRIL-A69 (documento W02008025516), APRIL-ASPD, APRIL-ACCSPD o APRIL-ACoU 1. Después de tres días, se analizaron los sobrenadantes para las proteínas secretadas por transferencia de Western. Los resultados se muestran en la Fig. 33. Para la detección de proteínas de fusión de APRIL se usó un anticuerpo específico para marca estrep. II. Las flechas indican bandas específicas que se detectaron a aproximadamente 40 kDa (APRIL-ASPD y APRIL- ACoU 1, respectivamente), así como a aproximadamente 25 kDa (APRIL-A69 y APRIL-ACCSPD, respectivamente). Por tanto, los casetes de expresión de APRIL son funcionales y la secreción de la proteína indicaba que las proteínas están plegadas apropiadamente. Como para otras proteínas TNFSF analizadas, los mayores niveles de proteína secretada se encontraron para APRIL fusionada al motivo de trimerización compuesto por el "cuello" superenrollado + CRD de SP-D humana (APRIL-ASPD, carril n.° 2). Se usó APRIL-ASPD para analizar la unión al receptor TACI.

Para demostrar que la proteína de fusión APRIL-ASPD construida es funcional, se evaluó la unión a un receptor conocido de APRIL, concretamente TACI (Fig. 34). Por lo tanto, se inmovilizó APRIL-ASPD en el sobrenadante de células HEK293 transfectadas de forma transitoria en microplacas recubiertas de estreptactina. El sobrenadante celular de las células HEK293 no transfectadas sirvió como control negativo. Las proteínas unidas específicamente se detectaron con concentraciones variables de TACI-Fc seguido de incubación con un anticuerpo específico anti-Fc humano conjugado con peroxidasa. Como resultado, la señal ELISA aumentó con concentraciones crecientes de TACI-Fc, lo que indica que APRIL-ASPD es una molécula funcional.

La secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión de APRIL se muestra a continuación.

SEQ ID 51: Sp-APRIL-ASPD

Cantidad total de aminoácidos: 344, PM=37120 ORIGEN

METDTLLLWV LLLWVPAGNG KQHSVLHLVP INATSKDDSD

RRGRGLQAQG 61

HPDRAYNSCY 121

LPDVASLRQQ 181

CTQAGGQLAS 241 EPNDDGGSED

301 CVEIFTNGKW NDRACGEKRL WCEFGGSPS SSSSSAWSHP QFEK

YGVRIQDAGV YLLYSQVLFQ DVTFTMGQW SREGQGRQET SAGVFHLHQG DILSVIIPRA RAKLNLSPHG TFLGFVKLGS VEALQGQVQH LQAAFSQYKK VELFPNGQSV GEKIFKTAGF PRSAAENAAL QQLWAKNEA AFLSMTDSKT EGKFTYPTGE

VT EVMWQPAL LFRCIRSMPS SGSSGSSCSG VKPFTEAQLL SLVYSNWAPG

1 - 20: Péptido señal de secreción (subrayado)

21 -158: RBD de APRIL

159 - 169: Elemento enlazador flexible (enlazador A; GSS GSS GSS GS cursiva)

170 - 207: Región superenrollada de "cuello" de SP-D humana 208 - 325: Dominio de lectina tipo C de SP-D humana 326 - 336: Elemento enlazador (GGSPSSSSSSA)

337 - 344: Marca estrep. II (WSHPQFEK)

Ejemplo 3 Generación de una proteína de fusión con un anticuerpo de cadena sencilla como polipéptido efector

5

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35

40

Las secuencias de aminoácidos de los ejemplos para proteínas de fusión de Fv de cadena sencilla (sc)-SPD se muestran a continuación (SEQ ID 52, 53)

SEQ ID 52 Sp-sc006-ASPD

Cantidad total de aminoácidos: 449

1 METDTLLLWV LLLWVPAGNG EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFN

TNAMNWVRQA

61 PGKGLEWVAR IRSKSNNYAT YYADSVKDRF TLSRDDSKNT LYLQMNSLKT

EDTAVYYCTR

121 DRGWGAMDYW GQGTTVTVSS GGGGSGGGGS GGGTGDIQMT QSPSSLSASV

GDRVTITCSA

181 SQDINNYLNW YQQKPGKAPK LLIYYTSSLH SGVPSRFSGS GSGTDFTLTI

SSLQPEDFAT

241 YYCQQFSNLP WTFGGGTKLE IKRTGSSGSS GSSGSGLPDV ASLRQQVEAL

QGQVQHLQAA

301 FSQYKKVELF PNGQSVGEKI FKTAGFVKPF TEAQLLCTQA GGQLASPRSA

AENAALQQLV

361 VAKNEAAFLS MTDSKTEGKF TYPTGESLVY SNWAPGEPND DGGSEDCVEI

FTNGKWNDRA

421 CGEKRLWCE FGGSPSSSSS SAWSHPQFEK

1- 20: Péptido señal de secreción (subrayado)

21-140: Dominio variable de cadena pesada

141-155: Elemento enlazador

156-264: Dominio variable de cadena ligera

265-276: Enlazador A

277-431: Motivo SPD (cuello + CRD)

432-441: Elemento enlazador 442-450: Marca estrep. II (WSHPQFEK)

SEQ ID 53 Sp-sc006-ASPD_F335D

Cantidad total de aminoácidos: 449

1 METDTLLLWV LLLWVPAGNG EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFN

TNAMNWVRQA

61 PGKGLEWVAR IRSKSNNYAT YYADSVKDRF TLSRDDSKNT LYLQMNSLKT

EDTAVYYCTR

121 DRGWGAMDYW GQGTTVTVSS GGGGSGGGGS GGGTGDIQMT QSPSSLSASV

GDRVTITCSA

181 SQDINNYLNW YQQKPGKAPK LLIYYTSSLH SGVPSRFSGS GSGTDFTLTI

SSLQPEDFAT

241 YYCQQFSNLP WTFGGGTKLE IKRTGSSGSS GSSGSGLPDV ASLRQQVEAL

QGQVQHLQAA

301 FSQYKKVELF PNGQSVGEKI FKTAGFVKPF TEAQLLCTQA GGQLASPRSA

AENAALQQLV

361 VAKNEAAFLS MTDSKTEGKF TYPTGESLVY SNWAPGEPND DGGSEDCVEI

DTNGKWNDRA

421 CGEKRLWCE FGGSPSSSSS SAWSHPQFEK

1-20: Péptido señal de secreción (subrayado)

21-140: Dominio variable de cadena pesada

141-155: Elemento enlazador

156-264: Dominio variable de cadena ligera

265-276: Enlazador A

277-431: Motivo SPD (cuello + CRD)

432-441: Elemento enlazador 442-450: Marca estrep. II (WSHPQFEK)

La proteína se expresó y se sometió a cromatografía de afinidad como se describe en la sección 1.3. Se resolvió una alícuota del eluato por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras. Puede detectarse una única banda a 40-50 kDa indicada por una flecha (véase la Figura 39) correspondiente a sc006-ASPD-St con un peso molecular esperado de 45,8 kDa.

La proteína se expresó, se purificó por afinidad y se sometió a cromatografía por exclusión de tamaño como se describe en la sección 1.3. Se cargaron cincuenta microgramos de la proteína purificada por afinidad en una columna Superdex200 y se muestra el cromatograma (véase la Figura 40). El pico principal a 12,63 mi corresponde

a un peso molecular de 160 ± 15 kDa que se parece a la especie esperada de tres moléculas scFv organizadas en trímeros mediante SPD. Las moléculas podían ensayarse para la funcionalidad en una configuración ELISA inmovilizando el antígeno y detectando sc006-SPD-St.

5 La proteína de fusión generada en este experimento comprende un anticuerpo de cadena sencilla dirigido contra IL4R-alfa.

Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Una proteína de fusión que comprende

   (i) un dominio de trimerización de la familia de colectina que comprende

   (a) un dominio de reconocimiento de carbohidrato de la familia de colectina de la proteína tensioactiva D; y

   (b) una región de cuello de la familia de colectina de la proteína tensioactiva D;

   (ii) un elemento enlazador;

   (i¡¡) el polipéptido efector TRAIL o el dominio de unión a receptor del mismo respectivo, en la que el polipéptido efector está localizado de forma N-terminal de la reglón de cuello de la familia de colectina, y (iv) un anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla o un fragmento de un anticuerpo o anticuerpo de cadena sencilla fusionado al extremo C-terminal del dominio de reconocimiento de carbohidrato.
2. 2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el dominio de reconocimiento de carbohidrato comprende una o más mutaciones o sustituciones de aminoácido.
3. 3. La proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que el dominio de reconocimiento de carbohidrato es el dominio de reconocimiento de carbohidrato de la proteína tensioactiva D y en la que la sustitución es una sustitución de fenilalanina 355 en la Seq ID 21 en un aminoácido polar seleccionado de ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina y glutamina.
4. 4. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el elemento enlazador tiene una longitud de 25 o menos aminoácidos.
5. 5. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el elemento enlazador está compuesto de aminoácidos seleccionados de alanina, treonina, glicina y serina.
6. 6. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el polipéptido efector es un mutante de TRAIL.
7. 7. La proteína de fusión de la reivindicación 6, en la que la región de tronco N-terminal de TRAIL no está incluida en la proteína de fusión.
8. 8. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el receptor se selecciona entre TRAIL-R1 o TRAIL-R2.
9. 9. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para su uso como medicamento.
10. 10. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para el tratamiento de trastornos proliferativos asociados con disfunción de citoquinas TNF que comprenden tumores, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias, enfermedades metabólicas, trastornos autoinmunitahos, enfermedades degenerativas y rechazos de trasplante.