ES2560871T3 - Proteínas de fusión de colectina de la superfamilia de TNF - Google Patents

Proteínas de fusión de colectina de la superfamilia de TNF Download PDF

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Abstract

Una proteína de fusión que comprende (i) TRAIL o un dominio de unión a receptor del mismo, y (ii) un dominio de trimerización de colectina que comprende el dominio de cuello o el dominio de cuello y de unión a carbohidrato de la proteína tensioactiva D, en la que (i) comprende los aminoácidos 120-281 de la SEC ID N.º 10, y en la que (ii) comprende los aminoácidos 219-375 o 219-257 de la proteína tensioactiva humana D de la SEC ID N.º 21, y en la que (ii) está localizado de forma C-terminal de (i).

Description

Proteínas de fusión de colectina de la superfamilia de TNF
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende (i) TRAIL o un dominio de unión a receptor del mismo, y (ii) un dominio de trimerización de colectina que comprende el dominio de cuello o el dominio de cuello y de unión a carbohidrato de la proteína tensioactiva D, donde (i) comprende los aminoácidos 120-281 de la SEC ID N.º 10, y donde (ii) comprende los aminoácidos 219-375 o 219-257 de la proteína tensioactiva humana D de la SEC ID N.º 21, y donde (ii) está localizado de manera C-terminal de (i), a una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión, y a una célula que comprende la molécula de ácido nucleico. La proteína de fusión está presente como un complejo trimérico o como un oligómero del mismo. La proteína de fusión, el ácido nucleico, y la célula son adecuados como composición farmacéutica o para aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y/o investigación como se describe en este documento.
Estado de la técnica
Los ligandos de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF) cumplen papeles cruciales en el sistema inmune, pero también se han implicado en el desarrollo de estructuras epiteliales y endoteliales.1 Los ligandos de la familia de TNF se expresan principalmente como proteínas transmembrana de tipo II triméricas y a menudo se procesan en variantes solubles que también se organizan como trímeros.1,2 Aunque el desprendimiento de algunos ligandos de TNF no interfiere con su capacidad de activar sus receptores correspondientes y podría ser incluso importante para su función fisiológica, otros ligados de TNF quedan activados por procesamiento proteolítico.2 Los ligandos de TNF solubles que no son activos o son solamente escasamente activos aún interaccionan con sus receptores afines. Por ejemplo, las formas solubles de TNF, CD95L, TRAIL y CD40L interaccionan con TNFR2, CD95, TRAILR2 y CD40, respectivamente, pero no activan o solamente activan escasamente la señalización por estos receptores.3-6 De forma notable, los ligandos de TNF solubles inactivos o escasamente activos pueden convertirse en moléculas altamente activas aumentando artificialmente su avidez. Por ejemplo, variantes solubles marcadas con indicador de TNF, CD95L, TRAIL y CD40L estimulan una robusta señalización por TNFR2, CD95, TRAILR2 y CD40, respectivamente, dado que se entrecruzaron con el mAb específico de indicador M2. Asimismo, proteínas de fusión hexaméricas y dodecaméricas de CD95L soluble y CD40L soluble así como preparaciones no agregadas específicamente de ligandos de TNF producidas en E. coli presentan alta actividad.6-8
La característica estructural de los ligandos de la familia de TNF es el "dominio de homología de TNF 2" (THD) o "dominio de unión a receptor" (RBD) carboxi-terminal, usadas ambas expresiones por igual en este documento, que es parte tanto de la forma transmembrana como soluble de los ligandos de TNF.1-2 Los THD de los diversos ligandos de TNF están compuestos por un esqueleto de restos aromáticos e hidrófobos que adoptan un plegamiento terciario casi idéntico y que causa auto-asociación en trímeros.1-2 El THD también media la unión al receptor. En general, los ligandos triméricos de la familia de TNF se unen a tres moléculas de su correspondiente receptor o receptores. Esta interacción en solitario no es necesariamente suficiente para activar las rutas de señalización intracelular asociadas a receptor. Varias líneas de evidencia sugieren que la formación inicial de complejos triméricos competentes en señalización de ligando y receptor va seguida de multimerización secundaria en grupos supramoleculares.9-11 Estas dos etapas en la activación del receptor de TNF (1, unión de ligando; 2, agregación secundaria de los complejos de receptor y ligando) dependen en un grado variable de varios factores incluyendo la localización de balsas lipídicas, soporte de citoesqueleto, autoagregación de receptores, proteínas adaptadoras asociadas a receptor, pero también de la afinidad y avidez de la interacción del ligando y el receptor y el modo en que el ligando se presenta al receptor (ligando de membrana o ligando inmovilizado frente a ligando soluble, trímeros frente a agregados superiores).
Se sabe que los complejos triméricos de citoquinas de la superfamilia de TNF son difíciles de preparar a partir de unidades monoméricas recombinantes.
Por ejemplo, el documento WO 01/49866 describe proteínas de fusión recombinantes que comprenden una citoquina de TNF y un componente de multimerización. Una desventaja de estas proteínas de fusión es, sin embargo, que el dominio de trimerización habitualmente tiene un peso molecular grande y/o que la trimerización es más bien ineficaz.
Schneider et al. (J Exp Med 187 (1989), 1205-1213) describe que los trímeros de citoquinas de TNF se estabilizan mediante motivos de estabilización posicionados de forma N-terminal. En CD95L, la estabilización del trímero del dominio de unión a receptor de CD95L está causada presumiblemente por dominios de aminoácidos N-terminales que están localizados cerca de la membrana citoplasmática.
Shiraishi et al. (Biochem Biophys Res Commun 322 (2004), 197-202) describe que el dominio de unión a receptor de CD95L puede estabilizarse por motivos superenrollados de -hélice (cremallera de leucina) artificiales posicionados de forma N-terminal. Se descubrió, sin embargo, que la orientación de las cadenas polipeptídicas entre sí, por ejemplo, orientación paralela o antiparalela, apenas puede predecirse. Además, la cantidad óptima de repeticiones
hepta-d en el motivo de cremallera superenrollada es difícil de determinar. Además, las estructuras superenrolladas tienen tendencia a formar agregados macromoleculares después de alteración del pH y/o la fuerza iónica.
Mc Alinden et al. (J of Biol Chem, 2002, 277(43):41274-41281) describe la preparación de una proteína de fusión entre una secuencia de aminoácidos de procolágeno tipo IIA humano y una secuencia de 14 aminoácidos correspondiente a las dos primeras repeticiones hepta-d del dominio de cuello de la proteína tensioactiva de rata (SP-D).
El documento WO 01/42298 describe la preparación de una proteína de fusión entre la proteína tensioactiva D que comprende la secuencia señal, el dominio de colágeno y el dominio de cuello y CD40L. La desventaja de esas proteínas de fusión es que conducen a agregados multiméricos que son altamente inmunogénicos y que no producen ligandos triméricos funcionalmente definidos.
El documento US 2004/247563 describe un método para el tratamiento de un individuo que padece o está en riesgo de una enfermedad infecciosa. También se describen proteínas oligoméricas basadas en la proteína tensioactiva D.
El documento WO 02/090553 describe proteínas de fusión recombinantes que tienen una función de ligando y un dominio para trimerización. El dominio para trimerización puede comprender la proteína tensioactiva D.
El documento WO 97/01633 describe la fusión de TRAIL y SPD. La fusión puede suceder como fusión N-terminal o C-terminal.
Un objeto de la presente invención fue proporcionar proteínas de fusión que comprendan una citoquina de TNF o una proteína de unión a receptor, que permitan fabricación recombinante eficaz combinada con buenas propiedades de trimerización y propiedades farmacéuticas mejoradas.
Sumario de la invención
También se describe en este documento una proteína de fusión que comprende (i) una citoquina de la superfamilia de TNF o un dominio de unión a receptor de la misma, y (ii) un dominio de trimerización de colectina.
La presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende (i) TRAIL o un dominio de unión a receptor del mismo, y (ii) un dominio de trimerización de colectina que comprende el dominio de cuello o el dominio de cuello y de unión a carbohidrato de la proteína tensioactiva D, donde (i) comprende los aminoácidos 120-281 de la SEC ID N.º 10, y donde (ii) comprende los aminoácidos 219-375 o 219-257 de la proteína tensioactiva humana D de la SEC ID N.º 21, y donde (ii) está localizado de manera C-terminal de (i).
La invención se refiere adicionalmente a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión como se describe en este documento y a una célula o un organismo no humano transformado o transfectado con una molécula de ácido nucleico como se describe en este documento.
La invención también se refiere a una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende como agente activo una proteína de fusión, una molécula de ácido nucleico, o una célula como se describe en este documento.
La invención también se refiere a una proteína de fusión, una molécula de ácido nucleico, o una célula como se describe en este documento para su uso en terapia, por ejemplo, el uso de una proteína de fusión, una molécula de ácido nucleico, o una célula como se describe en este documento para la preparación de una composición farmacéutica en la profilaxis y/o tratamiento de trastornos proliferativos, particularmente trastornos causados por, asociados con y/o acompañados por disfunción de citoquinas de TNF, tales como tumores, por ejemplo, tumores sólidos o linfáticos, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias, enfermedades metabólicas, trastornos autoinmunes, por ejemplo, enfermedades reumatoides y/o artríticas, enfermedades degenerativas, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas tales como esclerosis múltiple, enfermedades asociadas a apoptosis y rechazo de trasplantes.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se describe por las reivindicaciones 1-16.
La proteína de fusión puede ser una proteína monomérica o una proteína multimérica. Preferiblemente, la proteína de fusión está presente como un complejo trimérico que consiste en tres unidades monoméricas que pueden ser iguales o diferentes. Preferiblemente, un complejo trimérico consiste en tres proteínas de fusión idénticas. En una realización preferida adicional, el complejo se forma por enlace covalente entre tres de las proteínas de fusión descritas en este documento, por ejemplo, un enlace covalente de puentes disulfuro entre cisteínas del dominio de trimerización de colectina (ii) como se describe en este documento. El complejo trimérico tal cual muestra actividad biológica. Se descubrió, sin embargo, que oligómeros del complejo trimérico, por ejemplo, complejos definidos donde la estructura trimérica básica está presente 2, 3 o 4 veces, también tienen actividad biológica. Por tanto,
también se prefiere un oligómero del complejo trimérico.
También se describe en este documento un componente (i) de la proteína de fusión que es una citoquina de la superfamilia de TNF o un dominio de unión a receptor de la misma. Preferiblemente, el componente (i) es una citoquina de mamífero, particularmente humana o un dominio de unión a receptor de la misma incluyendo variantes alélicas y/o derivados del mismo. Además, se prefiere que la citoquina de TNF sea un dominio de unión a receptor de la misma capaz de unirse al correspondiente receptor de citoquinas y preferiblemente con capacidad de activación del receptor, mediante la cual puede causarse actividad apoptótica o proliferativa. La citoquina puede seleccionarse, por ejemplo, entre miembros de la superfamilia de TNF, por ejemplo TNFSF-1 a 18 humano como se indica en la Tabla 1, preferiblemente entre LTA (SEC ID N.º 1), TNF (SEC ID N.º 2), LTB (SEC ID N.º 3), OX40L (SEC ID N.º 4), CD40L (SEC ID N.º 5), CD95L (SEC ID N.º 6), CD27L (SEC ID N.º 7), CD30L (SEC ID N.º 8), CD137L (SEC ID N.º 9), TRAIL (SEC ID N.º 10), RANKL (SEC ID N.º 11), TWEAK (SEC ID N.º 12), APRIL 1 (SEC ID N.º 13), APRIL 2 (SEC ID N.º 14), BAFF (SEC ID N.º 15), LIGHT (SEC ID N.º 16), TL1A (SEC ID N.º 17), GITRL (SEC ID N.º 18), EDA-A1 (SEC ID N.º 19), EDA-A2 (SEC ID N.º 20), o un dominio de unión a receptor de los mismos. Los dominios preferidos de unión a receptor de las proteínas respectivas se indican en la Tabla 1 (NH2-aa a COOH-aa) y comprenden, por ejemplo, los aminoácidos 59-205 o 60-205 de LTA (SEC ID N.º 1), 86-233 de TNF (SEC ID N.º 2), 82-244 o 86-244 de LTB (SEC ID N.º 3), 52-183 o 55-183 de OX40L (SEC ID N.º 4), 112-261 o 117261 de CD40L (SEC ID N.º 5), 51-193 o 56-193 de CD27L (SEC ID N.º 7), 97-234, 98-234 o 102-234 de CD30L (SEC ID N.º 8), 86-254 de CD137L (SEC ID N.º 9), 161-317 de RANKL (SEC ID N.º 11), 103-249, 104-249 o 105249 de TWEAK (SEC ID N.º 12), 112-247 o 113-247 de APRIL 1 (SEC ID N.º 13), 112-250 o 113-250 de APRIL 2 (SEC ID N.º 14), 140-285 de BAFF (SEC ID N.º 15), 91-240 de LIGHT (SEC ID N.º 16), 91-251 o 93-251 de TL1A (SEC ID N.º 17), 52-177 de GITRL (SEC ID N.º 18), 245-391 de EDA-A1 (SEC ID N.º 19), 245-389 de EDA-A2 (SEC ID N.º 20).
En particular, la citoquina descrita en este documento de la superfamilia de TNF o un dominio de unión a receptor de la misma se selecciona entre CD95L o TRAIL o un dominio de unión a receptor de los mismos. En una realización especialmente preferida, la citoquina de la superfamilia de TNF o un dominio de unión a receptor de la misma comprende la parte extracelular de una citoquina de TNF incluyendo el dominio de unión a receptor sin dominios localizados en membrana.
Además, la citoquina descrita de la superfamilia de TNF o un dominio de unión a receptor de la misma de la proteína de fusión se selecciona de CD95L humano (SEC ID N.º 6), particularmente los aminoácidos 142-281 o 144-281 de CD95L humano.
En una realización preferida, la citoquina de la superfamilia de TNF o un dominio de unión a receptor de la misma de la proteína de fusión se selecciona de TRAIL humano (SEC ID N.º 10), particularmente los aminoácidos 95-281, 116281, 117-281, 118-281, 119-281 o 120-281 de TRAIL humano. En otra realización preferida, TRAIL humano comprende cualquier aminoácido de 95-120 como aminoácido inicial -aminoácido 281 de la SEC ID N.º 10.
En una realización preferida adicional de la invención, la citoquina de la superfamilia de TNF o un dominio de unión a receptor de la misma de la proteína de fusión como se describe en este documento comprende un mutante de la citoquina de la superfamilia de TNF o un dominio de unión a receptor de la misma que se une y/o activa el receptor 1 de TRAIL (TRAILR1) y/o el receptor 2 de TRAIL (TRAILR2). La unión y/o actividad del mutante puede determinarse, por ejemplo, por los ensayos descritos en este documento, por ejemplo, en los Ejemplos o por los ensayos descritos en van der Sloot et al. (PNAS, 2006, 103:8634-8639), Kelley et al. (J. Biol. Chem., 2005, 280:2205-2215), o MacFarlane et al. (Cancer Res., 2005, 65: 11265-11270).
El mutante puede generarse mediante cualquier técnica y es conocida por los expertos en la materia, por ejemplo, las técnicas descritas en an der Sloot et al. (PNAS, 2006, 103:8634-8639), Kelley et al. (J. Biol. Chem., 2005, 280:2205-2215), o MacFarlane et al. (Cancer Res., 2005, 65: 11265-11270) y puede comprender cualquier tipo de mutaciones estructurales, por ejemplo, sustitución, deleción, duplicación y/o inserción de un aminoácido. Una realización preferida es la generación de sustituciones. La sustitución puede afectar a al menos un aminoácido de la citoquina de la superfamilia de TNF o un dominio de unión a receptor de la misma como se describe en este documento. En una realización preferida, la sustitución puede afectar a al menos uno de los aminoácidos de TRAIL, por ejemplo, TRAIL humano (por ejemplo, la SEC ID N.º 10). Sustituciones preferidas a este respecto afectan a al menos uno de los siguientes aminoácidos de TRAIL humano de la SEC ID N.º 10: R130, G160, Y189, R191, Q193, E195, N199, K201, Y213, T214, S215, H264, I266, D267, D269. Las sustituciones preferidas de aminoácido de TRAIL humano de la SEC ID N.º 10 son al menos una de las siguientes sustituciones: R130E, G160M, Y189A, Y189Q, R191K, Q193S, Q193R, E195R, N199V, N199R, K201R, Y213W, T214R, S215D, H264R, I266L, D267Q, D269H, D269R, o D269K.
La sustitución o sustituciones de aminoácidos pueden afectar a la unión y/o actividad de TRAIL, por ejemplo, TRAIL humano, a o sobre cualquiera de TRAILR1 o TRAILR2. Como alternativa, la sustitución o sustituciones de aminoácido pueden afectar a la unión y/o actividad de TRAIL, por ejemplo, TRAIL humano, a o sobre ambos, TRAILR1 y TRAILR2. La unión y/o actividad de TRAILR1 y/o TRAILR2 puede verse afectada positivamente, es decir, unión más fuerte, más selectiva o específica y/o más activación del receptor. Como alternativa, la unión y/o
actividad de TRAILR1 y/o TRAILR2 puede verse afectada negativamente, es decir, unión más débil, menos selectiva
o específica y/o menos activación o ausencia de activación del receptor.
Ejemplos de mutantes de TRAIL con una o más sustituciones de aminoácido que afectan a la unión y/o actividad tanto de TRAILR1 como de TRAILR2 pueden encontrarse, por ejemplo, en la Tabla 1 de MacFarlane et al. (cf. anteriormente) y pueden comprender mutantes de TRAIL humano con las dos siguientes sustituciones de aminoácido de la SEC ID N.º 10 Y213W y S215D o la siguiente sustitución única de aminoácido Y189A.
Ejemplos de mutantes de TRAIL con una o más sustituciones de aminoácido que afectan a la unión y/o actividad de TRAILR1 pueden encontrarse, por ejemplo, en la Tabla 1 de MacFarlane et al. (cf. anteriormente) y pueden comprender mutantes de TRAIL humano con las cuatro siguientes sustituciones de aminoácido de la SEC ID N.º 10 N199V, K201R, Y213W y S215D o las cinco siguientes sustituciones de aminoácido Q193S, N199V, K201R, Y213W y S215D o en la Tabla 2 de Kelley et al. (cf. anteriormente) y pueden comprender mutantes de TRAIL humano con las seis siguientes sustituciones de aminoácido Y213W, S215D, Y189A, Q193S, N199V, y K201R o Y213W, S215D, Y189A, Q193S, N199R, y K201R.
Ejemplos de mutantes de TRAIL con una o más sustituciones de aminoácido que afectan a la unión y/o actividad de TRAILR2 pueden encontrarse, por ejemplo, en la Tabla 1 de MacFarlane et al. (cf. anteriormente) o en la Tabla 2 de Kelley et al. (cf. anteriormente) y pueden comprender mutantes de TRAIL humano con las seis siguientes sustituciones de aminoácido de la SEC ID N.º 14 Y189Q, R191K, Q193R, H264R, I266L, y D267Q o en la Tabla 2 de van der Sloot et al. (cf. anteriormente) y pueden comprender mutantes de TRAIL humano con la siguiente sustitución única de aminoácido D269H, las dos siguientes sustituciones de aminoácido D269H y E195R o D269H y T214R.
También se describe que la parte citoquina de la proteína de fusión se obtiene de LIGHT humano (SEC ID N.º 16), particularmente los aminoácidos 91-240 de la SEC ID N.º 16.
También se describe que la parte citoquina de la proteína de fusión se obtiene de APRIL humano (SEC ID N.º 13 o 14), particularmente los aminoácidos 112-247 o 113-247 de la SEC ID N.º 13, o 112-250 o 113-250 de la SEC ID N.º
14.
Un elemento enlazador flexible puede estar adicionalmente localizado entre la citoquina de la superfamilia de TNF o un dominio de unión a receptor de la misma (i) y el dominio de trimerización de colectina como se describe en este documento (ii). El elemento enlazador flexible preferiblemente tiene una longitud de 3-20 aminoácidos, particularmente una longitud de 3, 6, 9, 10, 12, 15 o 18 aminoácidos. Más preferiblemente, la longitud del enlazador es de 9-15 aminoácidos. El elemento enlazador es preferiblemente un enlazador de glicina/serina, es decir, un enlazador peptídico que consiste sustancialmente en los aminoácidos glicina y serina. En una realización especialmente preferida, el enlazador tiene la secuencia de aminoácidos (GSS)a(SSG)b(GSG)c donde a, b, c es cada uno 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Está claro para los expertos que en casos en que la citoquina de la superfamilia de TNF o un dominio de unión a receptor de la misma ya termina con una G, por ejemplo TRAIL humano (SEC ID N.º 10) dicha G puede formar la primera G del enlazador en la secuencia enlazadora (GSS)a(SSG)b(GSG)c.
El dominio de trimerización de colectina (ii) puede comprender cualquier miembro de la familia de colectina. Dichos miembros y sus estructuras se resumen en, por ejemplo, Hakansson et al. (Protein Science, 2000, 9:1607-1617) y pueden comprender proteína tensioactiva D, proteína tensioactiva A, proteína de unión a mananos A, proteína de unión a mananos C, colectina del hígado 1, colectina de placenta 1, o colectina-11. El dominio de trimerización de colectina como se describe en este documento puede ser de una especie diferente que la citoquina de la superfamilia de TNF o un dominio de unión a receptor de la misma como se describe en este documento. Como alternativa, el dominio de trimerización de colectina como se describe en este documento puede ser de la misma especie que la citoquina de la superfamilia de TNF o un dominio de unión a receptor de la misma como se describe en este documento. En una realización preferida, el dominio de colectina como se describe en este documento es de ser humano y la citoquina de la superfamilia de TNF o un dominio de unión a receptor de la misma como se describe en este documento es de ser humano. En una realización preferida, el dominio de trimerización de colectina comprende el dominio de cuello y de unión a carbohidrato (CRD) de la proteína tensioactiva D, particularmente los aminoácidos 217-375, 218-375, 219-375, 220-375, 221-375, 222-375, 223-375, 224-375, 225-375 de la proteína tensioactiva humana D de la SEC ID N.º 21. En otra realización preferida, el dominio de trimerización de colectina comprende el dominio de cuello de la proteína tensioactiva D, particularmente los aminoácidos 217-257, 218-257, 219-257, 220-257, 221-257, 222-257, 223-257, 224-257, o 225-257 de la proteína tensioactiva humana D de la SEC ID N.º 21. También se describe que el dominio de trimerización de colectina comprende el dominio de cuello y de unión a carbohidrato (CRD) de colectina-11, particularmente los aminoácidos 110-271, 116-271, o 121-271 de colectina-11 humana de la SEC ID N.º 22. También se describe que el dominio de trimerización de colectina comprende el dominio de cuello de colectina-11, particularmente los aminoácidos 110-147, 110-148, 110-149, 110150, 110-151, 116-147, 116-148, 116-149, 116-150, 116-151, 121-147, 121-148, 121-149, 121-150, o 121-151 de colectina-11 humana de la SEC ID N.º 22.
El dominio de trimerización de colectina (ii) puede comprender un mutante, por ejemplo, un mutante de proteína tensioactiva D o colectina-11, que no se une a manosa. Dichos mutantes pueden identificarse por métodos
conocidos para los expertos, por ejemplo, los métodos descritos en Crouch et al. (J Biol Chem, 2006, 281(26): 18008-18014). El dominio de trimerización de colectina (ii) puede comprender adicionalmente un mutante que comprende al menos una sustitución de aminoácido como se describe en este documento y puede generarse como se describe en este documento. Dichas sustituciones de aminoácido pueden modificar la unión del dominio de trimerización de colectina a su ligando manosa y conducir a una alteración de la tasa de eliminación de una proteína de fusión como se describe en este documento cuando se usa en terapia y/o como composición farmacéutica. La modificación puede provocar una unión disminuida o ausencia de unión a manosa y una baja tasa de eliminación. Dichas modificaciones pueden conseguirse por, por ejemplo, sustitución de aminoácido que afecte a la posición de aminoácido F355 de la proteína tensioactiva humana D de la SEC ID N.º 21, particularmente por las sustituciones de aminoácido F355A, F355S, F355T, F355E, F355D, F355K, o F355R. Es especialmente preferida la sustitución F355D. Como alternativa, la modificación puede provocar una unión aumentada a manosa y una alta tasa de eliminación. Dichas modificaciones pueden conseguirse por, por ejemplo, sustitución de aminoácido que afecte a la posición de aminoácido F355 de la proteína tensioactiva humana D de la SEC ID N.º 21, particularmente por las sustituciones de aminoácido F355L, F355Y, o F355W.
En la proteína de fusión de la invención como se describe en este documento, el dominio de trimerización de colectina (ii) está localizado de forma C-terminal de la citoquina de la superfamilia de TNF o un dominio de unión a receptor de la misma (i). Por tanto, la proteína de fusión puede comprender una citoquina de la superfamilia de TNF
o un dominio de unión a receptor de la misma como se describe en este documento y un dominio de trimerización de colectina que comprende el dominio de cuello solamente o el dominio de cuello y CRD, por ejemplo, el dominio de cuello y el dominio CRD y/o de cuello de la proteína tensioactiva D o el dominio de cuello y el dominio CRD y/o de cuello de colectina-11, ambos, como se describe en este documento donde esos dominios están localizados de forma C-terminal de la superfamilia de TNF o un dominio de unión a receptor de la misma (i). En esta realización, se prefiere que el dominio de trimerización de colectina comprende el dominio de cuello y el CRD.
En una realización preferida, la proteína de fusión comprende TRAIL, particularmente TRAIL humano o un dominio de unión a receptor del mismo o un mutante de TRAIL como se describe en este documento, preferiblemente 95281, 116-281, 117-281, 118-281, 119-281 o 120-281 de TRAIL humano (SEC ID N.º 10) y un dominio de trimerización de colectina o mutante del mismo como se describe en este documento, particularmente el dominio CRD y de cuello de la proteína tensioactiva D, preferiblemente los aminoácidos 217-375, 218-375, 219-375, 220375, 221-375, 222-375, 223-375, 224-375, 225-375 de la proteína tensioactiva humana D de la SEC ID N.º 21 donde el dominio de trimerización de colectina está localizado de forma C-terminal de TRAIL o TRAIL mutante como se describe en este documento. Son proteínas preferidas de fusión a este respecto las SEC ID N.º 26 o 27. Como alternativa, la proteína de fusión anterior puede comprender adicionalmente un enlazador como se describe en este documento, por ejemplo, un enlazador con la secuencia de aminoácidos (GSS)a(SSG)b(GSG)c donde a, b, c es cada uno 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Preferiblemente, el enlazador tiene una longitud de 9-15 aminoácidos.
En una realización preferida, la proteína de fusión comprende TRAIL, particularmente TRAIL humano o un dominio de unión a receptor del mismo o un mutante de TRAIL como se describe en este documento, preferiblemente 95281, 116-281, 117-281, 118-281, 119-281 o 120-281 de TRAIL humano (SEC ID N.º 10) y un dominio de trimerización de colectina o mutante del mismo como se describe en este documento, particularmente el dominio de cuello de la proteína tensioactiva D, preferiblemente los aminoácidos 217-257, 218-257, 219-257, 220-257, 221-257, 222-257, 223-257, 224-257, o 225-257 de la proteína tensioactiva humana D de la SEC ID N.º 21 donde el dominio de trimerización de colectina está localizado de forma C-terminal de TRAIL o TRAIL mutante como se describe en este documento. Una proteína preferida de fusión a este respecto es la SEC ID N.º 28. Como alternativa, la proteína de fusión anteriormente puede comprender adicionalmente un enlazador como se describe en este documento, por ejemplo, un enlazador con la secuencia de aminoácidos (GSS)a(SSG)b(GSG)c donde a, b, c es cada uno 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Preferiblemente, el enlazador tiene una longitud de 9-15 aminoácidos.
En otra realización preferida, la proteína de fusión comprende TRAIL, particularmente TRAIL humano o un dominio de unión a receptor del mismo o un mutante de TRAIL como se describe en este documento, preferiblemente 95281, 116-281, 117-281, 118-281, 119-281 o 120-281 de TRAIL humano (SEC ID N.º 10) y un dominio de trimerización de colectina o mutante del mismo como se describe en este documento, particularmente el dominio CRD y de cuello de colectina-11, preferiblemente los aminoácidos 110-271, 116-271, o 121-271 de colectina-11 humana de la SEC ID N.º 22 donde el dominio de trimerización de colectina está localizado de forma C-terminal de TRAIL o TRAIL mutante como se describe en este documento. Son proteínas preferidas de fusión a este respecto las SEC ID N.º 29 o 30. Como alternativa, la proteína de fusión anterior puede comprender adicionalmente un enlazador como se describe en este documento, por ejemplo, un enlazador con la secuencia de aminoácidos (GSS)a(SSG)b(GSG)c donde a, b, c es cada uno 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Preferiblemente, el enlazador tiene una longitud de 9-15 aminoácidos.
En otra realización preferida, la proteína de fusión comprende TRAIL, particularmente TRAIL humano o un dominio de unión a receptor del mismo o un mutante de TRAIL como se describe en este documento, preferiblemente 95281, 116-281, 117-281, 118-281, 119-281 o 120-281 de TRAIL humano (SEC ID N.º 10) y un dominio de trimerización de colectina o mutante del mismo como se describe en este documento, particularmente el dominio de cuello de colectina-11, preferiblemente los aminoácidos 110-147, 110-148, 110-149, 110-150, 110-151, 116-147,
116-148, 116-149, 116-150, 116-151, 121-147, 121-148, 121-149, 121-150, o 121-151 de colectina-11 humana de la SEC ID N.º 22 donde el dominio de trimerización de colectina está localizado de forma C-terminal de TRAIL o TRAIL mutante como se describe en este documento. Una proteína preferida de fusión a este respecto es la SEC ID N.º 31. Como alternativa, la proteína de fusión anterior puede comprender adicionalmente un enlazador como se describe en este documento, por ejemplo, un enlazador con la secuencia de aminoácidos (GSS)a(SSG)b(GSG)c donde a, b, c es cada uno 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Preferiblemente, el enlazador tiene una longitud de 9-15 aminoácidos. Son proteínas preferidas de fusión a este respecto las SEC ID N.º 36 o 37.
En una realización preferida, la proteína de fusión comprende TRAIL, particularmente TRAIL humano o un dominio de unión a receptor del mismo o un mutante de TRAIL como se describe en este documento, preferiblemente 95281, 116-281, 117-281, 118-281, 119-281 o 120-281 de TRAIL humano (SEC ID N.º 10) y un dominio de trimerización de colectina o mutante del mismo como se describe en este documento, particularmente el dominio de cuello de la proteína tensioactiva D, preferiblemente los aminoácidos 217-257, 218-257, 219-257, 220-257, 221-257, 222-257, 223-257, 224-257, o 225-257 de la proteína tensioactiva humana D de la SEC ID N.º 21 donde el dominio de trimerización de colectina está localizado de forma N-terminal de TRAIL o TRAIL mutante como se describe en este documento. Como alternativa, la proteína de fusión anterior puede comprender adicionalmente un enlazador como se describe en este documento, por ejemplo, un enlazador con la secuencia de aminoácidos (GSS)a(SSG)b(GSG)c donde a, b, c es cada uno 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Preferiblemente, el enlazador tiene una longitud de 9-15 aminoácidos.
En otra realización preferida, la proteína de fusión comprende TRAIL, particularmente TRAIL humano o un dominio de unión a receptor del mismo o un mutante de TRAIL como se describe en este documento, preferiblemente 95281, 116-281, 117-281, 118-281, 119-281 o 120-281 de TRAIL humano (SEC ID N.º 10) y un dominio de trimerización de colectina o mutante del mismo como se describe en este documento, particularmente el dominio de cuello de colectina-11, preferiblemente los aminoácidos 110-147, 110-148, 110-149, 110-150, 110-151, 116-147, 116-148, 116-149, 116-150, 116-151, 121-147, 121-148, 121-149, 121-150, o 121-151 de colectina-11 humana de la SEC ID N.º 22 donde el dominio de trimerización de colectina está localizado de forma N-terminal de TRAIL o TRAIL mutante como se describe en este documento. Son proteínas preferidas de fusión a este respecto las SEC ID N.º 32-34. Como alternativa, la proteína de fusión anterior puede comprender adicionalmente un enlazador como se describe en este documento, por ejemplo, un enlazador con la secuencia de aminoácidos (GSS)a(SSG)b(GSG)c donde a, b, c es cada uno 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Preferiblemente, el enlazador tiene una longitud de 9-15 aminoácidos. Una proteína preferida de fusión a este respecto es la SEC ID N.º 35.
Se describe en este documento que la proteína de fusión comprende CD95L, particularmente CD95L humano, o un dominio de unión a receptor del mismo como se describe en este documento, por ejemplo los aminoácidos 21-160 de la SEC ID N.º 40, y un dominio de trimerización de colectina que comprende el dominio de cuello y opcionalmente el CRD de SP-D humana, por ejemplo los aminoácidos 172-209 y 210-327 de la SEC ID N.º 40, respectivamente, o un mutante del mismo como se describe en este documento. Preferiblemente, la proteína de fusión puede comprender un enlazador, por ejemplo un enlazador flexible, más preferiblemente un enlazador de glicina/serina como se describe en este documento que tiene una longitud de preferiblemente 9-15 aminoácidos. Una proteína preferida de fusión a este respecto comprende la SEC ID N.º 40, particularmente los aminoácidos 21-327 de la SEC ID N.º 40.
También se describe en este documento que la proteína de fusión comprende LIGHT, particularmente LIGHT humano o un dominio de unión a receptor del mismo como se describe en este documento, preferiblemente los aminoácidos 21-170 de la SEC ID N.º 41, y un dominio de trimerización de colectina que comprende el dominio de cuello y opcionalmente el CRD de SP-D humana, por ejemplo los aminoácidos 182-219, y 220-337 de la SEC ID N.º 41, respectivamente, o un mutante del mismo como se describe en este documento. Preferiblemente, la citoquina y el dominio de colectina están conectados por un enlazador, por ejemplo un enlazador de glicina/serina como se describe en este documento, que tiene una longitud de preferiblemente 9-15 aminoácidos. Una proteína preferida de fusión a este respecto comprende la SEC ID N.º 41, particularmente los aminoácidos 21-327 de la SEC ID N.º 41.
En otra realización preferida, la proteína de fusión comprende TRAIL, particularmente TRAIL humano o un dominio de unión a receptor del mismo o mutante de TRAIL como se describe en este documento, por ejemplo los aminoácidos 21-181 de la SEC ID N.º 43 (TRAIL de tipo silvestre), los aminoácidos 21-181 de la SEC ID N.º 47 (TRAILR1mut) o los aminoácidos 21-181 de la SEC ID N.º 48 (TRAILR2mut). Además, la proteína de fusión comprende un dominio de trimerización de colectina seleccionado entre el dominio de cuello y opcionalmente el CRD de SP-D humana, por ejemplo los aminoácidos 193-230, y 231-384 de la SEC ID N.º 43, respectivamente, o un mutante del mismo como se describe en este documento, por ejemplo mutantes mostrados en las SEC ID N.º 49 o
50. Preferiblemente, el polipéptido de fusión comprende tanto la región de cuello como el CRD de SP-D humana. La citoquina y el dominio de colectina están preferiblemente conectados por un enlazador, por ejemplo un enlazador de glicina/serina como se describe en este documento. Preferiblemente, el enlazador tiene una longitud de 9-15 aminoácidos. Las proteínas preferidas de fusión a este respecto comprenden (i) la SEC ID N.º 43, particularmente los aminoácidos 21-348 de la SEC ID N.º 43, (ii) la SEC ID N.º 44, particularmente los aminoácidos 21-230 de la SEC ID N.º 44, (iii) la SEC ID N.º 47, particularmente los aminoácidos 21-348 de la SEC ID N.º 47, (iv) la SEC ID N.º 48, particularmente los aminoácidos 21-348 de la SEC ID N.º 48, (v) la SEC ID N.º 49, particularmente los
aminoácidos 21-348 de la SEC ID N.º 49 o (vi) la SEC ID N.º 50, particularmente los aminoácidos 21-348 de la SEC ID N.º 50.
En otra realización preferida, la proteína de fusión comprende TRAIL, particularmente TRAIL humano o un dominio de unión a receptor del mismo o un mutante de TRAIL como se describe en este documento anteriormente, y un dominio de trimerización de colectina, que es el dominio de cuello de colectina-11 humana, y opcionalmente el CRD de colectina-11 humana, por ejemplo los aminoácidos 193-224 y 225-347 de la SEC ID N.º 45, respectivamente. Preferiblemente, el CRD está presente. Preferiblemente, la citoquina y el dominio de colectina están conectados por un enlazador, por ejemplo un enlazador de glicina/serina como se ha descrito anteriormente en este documento, preferiblemente que tiene una longitud de 9-15 aminoácidos. Las proteínas preferidas de fusión a este respecto comprenden la SEC ID N.º 45 y la SEC ID N.º 46, particularmente, los aminoácidos 21-347 de la SEC ID N.º 45 o los aminoácidos 21-229 de la SEC ID N.º 46.
Se describe en este documento que la proteína de fusión comprende APRIL, particularmente APRIL humano o un dominio de unión a receptor del mismo como se describe en este documento, por ejemplo los aminoácidos 21-158 de la SEC ID N.º 51 y un dominio de trimerización de colectina como se describe en este documento, particularmente el dominio de cuello y opcionalmente el CRD de SP-D humana o un mutante del mismo, como se describe en este documento, por ejemplo los aminoácidos 170-207 y 208-325 de la SEC ID N.º 51, respectivamente. La citoquina y el dominio de colectina están conectados preferiblemente por un enlazador, por ejemplo un enlazador de glicina/serina como se describe en este documento, preferiblemente que tiene una longitud de 9-15 aminoácidos. La proteína preferida de fusión a este respecto comprende la SEC ID N.º 51, particularmente los aminoácidos 21325 de la SEC ID N.º 51.
La proteína de fusión como se describe en este documento puede comprender adicionalmente un dominio peptídico señal N-terminal, que permite el procesamiento, por ejemplo, secreción extracelular, en una célula hospedadora adecuada. Preferiblemente, el dominio peptídico señal N-terminal comprende una proteasa, por ejemplo, un sitio de escisión por peptidasa señal y por tanto puede retirarse después de o durante la expresión para obtener la proteína madura. En una realización preferida, el dominio peptídico señal N-terminal comprende la secuencia SEC ID N.º 23, SEC ID N.º 24, o SEC ID N.º 25.
Además, la proteína de fusión puede comprender un dominio de reconocimiento/purificación, por ejemplo, un dominio de marca Estrep y/o un dominio poli-His, que pueden estar localizados en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal.
La proteína de fusión puede comprender adicionalmente un elemento flexible C-terminal, que tiene una longitud de, por ejemplo, 1-50, preferiblemente 10-30 aminoácidos que pueden incluir y/o conectarse a un dominio de reconocimiento/purificación como se describe en este documento.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión como se describe en este documento. La molécula de ácido nucleico puede ser una molécula de ADN, por ejemplo, una molécula de ADN bicatenario o monocatenario, o una molécula de ARN. La molécula de ácido nucleico puede codificar la proteína de fusión o un precursor de la misma, por ejemplo, una pro-o pre-proforma de la proteína de fusión que puede comprender una secuencia señal como se describe en este documento u otras partes de aminoácidos heterólogos para la secreción o purificación que están preferiblemente localizadas en el extremo N-y/o C-terminal de la proteína de fusión como se describe en este documento. La molécula de ácido nucleico puede codificar la proteína de fusión donde las partes de aminoácidos heterólogos pueden estar unidas al primer y/o segundo dominio mediante un sitio de escisión por proteasa, por ejemplo, un sitio de escisión por proteasa de Factor Xa, trombina o IgA.
Ejemplos de ácidos nucleicos que comprenden la secuencia codificante de una proteína de fusión como se describe en este documento son las SEC ID N.º 38, 39 o 42.
La molécula de ácido nucleico puede estar unida de forma funcional a una secuencia de control de la expresión, por ejemplo una secuencia de control de la expresión que permite la expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula hospedadora deseada. La molécula de ácido nucleico puede estar localizada en un vector, por ejemplo un plásmido, un bacteriófago, un vector viral, un vector de integración cromosómica, etc. Se describen ejemplos de secuencias adecuadas de control de la expresión y vectores, por ejemplo, por Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, y Ausubel et al. (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons o ediciones más recientes del mismo.
Pueden usarse diversos sistemas de vector de expresión/célula hospedadora para expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión de la presente invención. Las células hospedadoras adecuadas incluyen, aunque sin limitación, células procariotas tales como bacterias, por ejemplo E. coli, células hospedadoras eucariotas tales como células de levadura, células de insecto, células vegetales o células animales, preferiblemente células de mamífero y, más preferiblemente, células humanas. La molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión como se describe en este documento puede optimizarse en vista de su uso de codones para la
expresión en células hospedadoras adecuadas, por ejemplo E. coli, células de levadura, células vegetales, células de insecto, células animales, por ejemplo, células de mamífero o células humanas.
Además, la invención se refiere a un organismo no humano, por ejemplo, ratón o rata, transformado o transfectado con una molécula de ácido nucleico como se describe en este documento. Dichos organismos pueden comprender organismos knock-out, generados por métodos conocidos de transferencia genética incluyendo recombinación homóloga. Como alternativa, dichos organismos pueden comprender organismos transgénicos que comprenden varias copias de la molécula de ácido nucleico como se describe en este documento. La generación de organismos transgénicos es conocida en la técnica.
La proteína de fusión, el ácido nucleico que codifica la misma, la célula transformada o transfectada así como los complejos triméricos u oligómeros de los complejos triméricos, todos como se describe en este documento pueden usarse para aplicaciones farmacéuticas, de diagnóstico y/o investigación. Para estas aplicaciones se prefiere usar proteínas de fusión en que tanto la citoquina de la superfamilia de TNF o dominio de unión a receptor de la misma como se describe en este documento como el dominio de trimerización de colectina como se describe en este documento son de la misma especie para minimizar los efectos inmunológicos, por ejemplo, de ser humano cuando se aplican dichas proteínas a seres humanos. Además, la fusión de una citoquina de la superfamilia de TNF o dominio de unión a receptor de la misma como se describe en este documento a un dominio de trimerización de colectina de cuello como se describe en este documento, por ejemplo, dominio de cuello de la proteína tensioactiva D o colectina-11, puede conducir a una rápida eliminación. Como alternativa, la fusión de una citoquina de la superfamilia de TNF o dominio de unión a receptor de la misma como se describe en este documento a un dominio de trimerización de colectina de cuello y CRD como se describe en este documento, por ejemplo, dominio de cuello y CRD de la proteína tensioactiva D o colectina-11, puede conducir a baja eliminación. El uso de mutantes del dominio de trimerización de colectina como se describe en este documento puede modificar la tasa de eliminación de la proteína de fusión de un modo como se describe en este documento.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende como agente activo al menos una proteína de fusión, el ácido nucleico que codifica la misma, la célula transformada o transfectada así como los complejos triméricos u oligómeros de los complejos triméricos, todos como se describe en este documento.
Al menos una proteína de fusión, el ácido nucleico que codifica la misma, la célula transformada o transfectada así como los complejos triméricos u oligómeros de los complejos triméricos, todos como se describe en este documento pueden usarse en terapia, por ejemplo, en la profilaxis y/o tratamiento de trastornos seleccionados entre trastornos proliferativos, particularmente trastornos causados por, asociados con y/o acompañados por disfunción de citoquinas de TNF, tales como tumores, por ejemplo tumores sólidos o linfáticos, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias, enfermedades metabólicas, trastornos autoinmunes, por ejemplo enfermedades reumatoides y/o artríticas, enfermedades degenerativas, por ejemplo enfermedades neurodegenerativas tales como esclerosis múltiple, enfermedades asociadas a apoptosis y rechazo de trasplantes.
La composición puede administrarse como monoterapia o como terapia de combinación con medicamentos adicionales, por ejemplo, agentes citostáticos o quimioterapéuticos, corticosteroides y/o antibióticos. Preferiblemente, la composición se administra junto con agentes sensibilizantes y/o inductores de apoptosis selectiva de tumor, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 2.8.
La proteína de fusión se administra a un sujeto que lo necesita, particularmente un paciente humano, en una dosis suficiente para el tratamiento de las afecciones específicas por medios adecuados. Por ejemplo, la proteína de fusión puede formularse como una composición farmacéutica junto con vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables. La eficacia terapéutica y toxicidad pueden determinarse de acuerdo con protocolos convencionales. La composición farmacéutica puede administrarse de forma sistémica, por ejemplo por vía intraperitoneal, intramuscular o intravenosa o de forma local, por ejemplo por vía intranasal, subcutánea o intratecal. Se prefiere administración intravenosa.
La dosis de la proteína de fusión administrada dependerá, por supuesto, del sujeto a tratar, del peso del sujeto, el tipo y gravedad de la enfermedad, el modo de administración y el criterio del médico que prescribe. Para la administración de proteínas de fusión, es adecuada una dosis diaria de 0,001 a 100 mg/kg.
La Tabla 1 muestra una lista de citoquinas de la superfamilia de TNF que pueden usarse en la presente invención.
Tabla 1 Símbolo aprobado del gen Número TNFSF Sinónimo Acceso NH2-aa COOH-aa Longitud
LTA TNFSF-1 LTA gi|6806893|ref|NP_000586.2| Ser59 Leu205 147aa Thr60 Leu205 146aa
TNF TNFSF-2 TNF-alfa gi|25952111|ref|NP_000585.2| Asp86 Leu233 148aa
LTB TNFSF-3 LTB gi|4505035|ref|NP_002332.11 Asp82 Gly244 163aa Gly86 Gly244 159aa
TNFSF4 TNFSF-4 OX40L/GP34 gi|4507603|ref|NP_003317.11 Val52 Leu183 132aa Arg55 Leu183 129aa
CD40LG TNFSF-5 CD40L gi|4557433|ref|NP_000065.1| Asp117 Leu261 150aa Glu112 Leu261 145aa
FASLG TNFSF-6 CD95L/APO-L/FAS-L gi|4557329|ref|NP_000630.1| Glu142 Leu281 140aa Arg144 Leu281 138aa
TNFSF7 TNFSF-7 CD27L gi|4507605|ref|NP_001243.11 Glu51 Pro193 143aa Asp56 Pro193 138aa
TNFSF8 TNFSF-8 CD30L gi|4507607|ref|NP_001235.1| Lys97 Asp234 138aa Ser98 Asp234 137aa Leu102 Asp234 133aa
TNFSF9 TNFSF-9 4-1BB/CD137L gi|4507609|ref|NP_003802.1| Asp86 Glu254 169aa
TNFSF10 TNFSF-10 TRAIL gi|4507593|ref|NP_003801.1| Glu116 Gly281 166aa Gly118 Gly281 164aa
TNFSF11 TNFSF-11 TRANCE/RANK L gi|4507595|ref|NP_003692.1| Glu161 Asp317 157aa
TNFSF12 TNFSF-12 TWEAK/Apo-3 gi|4507597|ref|NP_003800.1| Ala103 His249 147aa Arg104 His249 146aa Arg105 His249 145aa
TNFSF13 TNFSF-13 APRIL/TALL-2/TRDL-1 gi|26051248|ref|NP_742085.1| Lys112 Leu247 136aa
TNFSF13 TNFSF-13 APRIL/TALL-2/TRDL-1 gi|4507599|ref|NP_003799.1| Lys112 Leu250 139aa
(continuación)
Símbolo aprobado del gen Número TNFSF Sinónimo Acceso NH2-aa COOH-aa Longitud
TNFSF13B TNFSF-13B BAFF/Blys gi|5730097|ref|NP_006564.1| Glu140 Leu285 146aa TNFSF714 TNFSF-14 LIGHT gi|25952144|ref|NP_003798.21 Glu91 Val240 150aa TNFSF15 TNFSF-15 TL1A/VEGI gi|23510445|ref|NP_005109.2| Asp91 Leu251 161aa Asp93 Leu251 159aa TNFSF18 TNFSF-18 GITRL gi|4827034|ref|NP_005083.1| Glu52 Ser177 126aa EDA EDA-A1 gi|4503449|ref|NP_001390.1| Glu245 Ser391 147aa EDA EDA-A2 gi|54112101|ref|NP_001005609.1| Glu245 Ser389 145aa
En un aspecto diferente, la presente invención se refiere a nuevas variantes de sustitución de aminoácido de la proteína tensioactiva humana D (SP-D) que comprenden un dominio de reconocimiento de carbohidrato con capacidad reducida de unión a carbohidrato, opcionalmente fusionado a al menos un polipéptido o dominio polipeptídico heterólogo así como moléculas de ácido nucleico que codifican dichos polipéptidos de fusión. 5 Preferiblemente, los polipéptidos SP-D mutados de la presente invención tienen una sustitución de aminoácido en la posición F355 de la proteína tensioactiva humana D de la SEC ID N.º 21, particularmente una sustitución de aminoácido por aminoácido hidrófilo o cargado, por ejemplo F355S, F355T, F355E, F355D, F355H o F355R, particularmente F355D. El polipéptido o dominio polipeptídico heterólogo es preferiblemente de mamífero, por ejemplo de origen humano, por ejemplo un dominio de citoquina de TNSF como se ha descrito anteriormente. Los
10 polipéptidos SP-D mutados preferiblemente comprenden un dominio de cuello de SP-D como se ha descrito anteriormente. El polipéptido heterólogo puede fusionarse al extremo N-y/o C-terminal del dominio SP-D. Preferiblemente, está presente un enlazador, por ejemplo un enlazador como se ha descrito en este documento anteriormente, entre la SP-D y el dominio polipeptídico heterólogo.
15 Estructura básica de una proteína de fusión
A continuación se muestra la estructura básica de las proteínas recombinantes descritas en este documento (incluyendo las proteínas recombinantes de la invención) ejemplificada para las citoquina de la superfamilia de TNF como se describe en este documento.
1.1 Secuencias de los péptidos señal
MNFGFSLIFLVLVLKGVQC (SEC ID N.º 23) METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEC ID N.º 24)
25 METDTLLLWVLLLWVPAGNG (SEC ID N.º 25)
1.2 Indicador-epítopo/sitio de procesamiento por enteroquinasa
DYKDDDDKD 30
1.3 Colectinas humanas
Proteína tensioactiva D (SEC ID N.º 21)
Colectina-11 (SEC ID N.º 22)
40
Son concebibles diversos fragmentos de las colectinas humanas proteína tensioactiva D y colectina-11 dominios de trimerización como se describe en este documento. como
45
1.4 Elemento enlazador flexible (GSS)a(SSG)b(GSG)c donde a, b, c es cada uno 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6
1.5 Citoquina de la superfamilia de TNF/dominio de unión a receptor de la misma (véase también la Tabla 1)
SEC-ID-01 SEC NP_000586_TNFSF1_LTA PALABRA CLAVE PROTEÍNA CARACTERÍSTICAS ORIGEN
SEC-ID-02
15 SEC NP_000585_TNFSF2_TNFa PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN
20 SEC-ID-03 SEC NP_002332_TNFSF3_LTB PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN
SEC-ID-04 SEC NP_003317_TNFSF4_0X40L 30 PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN
35 SEC-ID-05 SEC NP_000065_TNFSF5_CD40L PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN
SEC-ID-06 SEC NP_000630_TNFSF6_CD95L PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN
10 SEC-ID-07 SEC NP_001243_TNFSF7_CD27L PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN
SEC-ID-08 SEC NP_001235_TNFSF8_CD30L PALABRA CLAVE PROTEÍNA
20 ORIGEN
SEC-ID-09
25 SEC NP_003802_TNFSF9_CD137L PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN
SEC-ID-10
SEC NP_003801_TNFSF10_TRAIL PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN
SEC-ID-11 SEC NP_003692_TNFSF11_a_RANKL PALABRA CLAVE PROTEÍNA
10 ORIGEN
SEC-ID-12
15 SEC NP_003800_TNFSF12_TWEAK PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN
20 SEC-ID-13 SEC NP_742085_TNFSF13_APRIL_ver1 PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN
SEC-ID-14
SEC NP_003799_TNFSF13_APRIL_ver2 30 PALABRA CLAVE PROTEÍNA
ORIGEN
SEC-ID-15 SEC NP_006564_TNFSF13b_BAFF PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN
SEC-ID-16 SEC NP_003798_TNFSF14_LIGHT PALABRA CLAVE PROTEÍNA
15 ORIGEN
SEC-ID-17
20 SEC NP_005109_TNFSF15_TL1A PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN
25 SEC-ID-18 SEC NP_005083_TNFSF18_GITRL PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN
SEC-ID-19 SEC NP_001390_EDA-A1 PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN
SEC-ID-20
10 SEC NP_001005609_EDA-A2 PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN
15 Son concebibles diversos fragmentos, por ejemplo, dominios de unión a receptor, de citoquinas de la superfamilia de TNF como se describe en este documento.
1.6 Ejemplos de proteínas de fusión
20 SEC ID N.º 26 SP-hsTrailsin-SPD-Construcción-1_PRO.PRO PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN
EC ID N.º 27 SP-hsTrailsin-SPD-Construcción-2_PRO.PRO PALABRA CLAVE PROTEÍNA
30 ORIGEN
SEC ID N.º 28 ORIGEN
SEC ID N.º 29 SP-hsTrailsin-coli-Construcción-1.proPALABRA CLAVE PROTEÍNA
10 ORIGEN
SEC ID N.º 30 SP-hsTrailsin-coli-11-Construcción-2.pro15 PALABRA CLAVE PROTEÍNA
ORIGEN
SEC ID N.º 31 SP-hsTrailsin-coli-11-Construcción-3.proPALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN
SEC ID N.º 32 INDICADOR-hCol11-hTRAIL_Glu116_Gly281.proPALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN
SEC ID N.º 33 INDICADOR-hCol11s-hTRAIL_Glu116_Gly281.pro10 PALABRA CLAVE PROTEÍNA
ORIGEN
15 SEC ID N.º 34 hCol11s-hTRAIL_Glu116_Gly281.pro PALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN
SEC ID N.º 35 INDICADOR-hCol11-GSS-hTRAIL_Glul16_Gly281.proPALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN
SEC ID N.º 36 Sp1-hTRAIL_Glu116_Gly281-GSS-coll11.proPALABRA CLAVE PROTEÍNA
30 ORIGEN
SEC ID N.º 37 Sp3-hTRAIL_Glu116_Gly281-GSS-coll11.proPALABRA CLAVE PROTEÍNA ORIGEN
S SEC ID N.º 38 SP-hsTrailsin-SPD-Construcción-1_ADN.sec: 1045 pb PALABRA CLAVE ADN (la secuencia 10 codificante de ADN correspondiente a la SEC ID N.º 26 empieza en la posición de la base 16)
ORIGEN
SEC ID N.º 39 SP-hsTrailsin-SPD-Construcción-2_ADN.sec: 1057 pb PALABRA CLAVE ADN (la secuencia codificante de ADN correspondiente a la SEC ID N.º 27 empieza en la posición de la base 16) ORIGEN
Ejemplos
1. Materiales y métodos
1.1 Construcción de proteínas TNF-SF estabilizadas por un dominio de trimerización derivado de colectina posicionado C-terminal
10 Los motivos de trimerización (Tablas 2 y 3) derivados de colectina-11 (Col11) humana, la "hélice superenrollada" de colectina-11 (CC11), proteína tensioactiva pulmonar humana D (SP-D), la "hélice superenrollada" de SP-D (CCSPD) se fusionaron de forma C-terminal al dominio de unión a receptor (RBD) humano de CD95L ("CD95L-RBD"; Glu142-Leu281), RBD de TRAIL humano (Gln120-Gly281), RBD de LIGHT humano (Glu91-Val240) y RBD de APRIL
15 humano (Lys113-Leu250), respectivamente.
Tabla 2: Lista de las regiones usadas de secuencias de tipo silvestre (wt) para la construcción de motivos de timerización.
Motivo de trimerización
Aminoácidos de las secuencias wt no procesadas para la construcción del motivo Entrada Swiss-Prot
SPD
220 -375 P35247
SPD_F335A
220 -375; Phe355 -> Ala355 P35247
SPD_F335D
220 -375; Phe355 -> Asp355 P35247
CCSPD
220 -257 P35247
Col11
117 -271 Q9BWP8
CC11
116 -151 Q9BWP8
Tabla 3: Aclaración de los motivos de trimerización C-terminales usados para generar proteínas de fusión TNFSF estables.
Motivo de trimerización
Aclaración
SPD
Proteína tensioactiva humana D ("cuello" superenrollado + dominio de reconocimiento de carbohidrato, CRD)
SPD_F335A
Como en 1, pero con la mutación Phe -> Ala en la posición 335 (numeración referida a SP-D de tipo silvestre procesada)
SPD_F335D
Como en 1, pero con la mutación Phe -> Asp en la posición 335 (numeración referida a SP-D de tipo silvestre procesada)
CCSPD
"Cuello" superenrollado de SP-D humana
Col11
Colectina-11 humana ("cuello" superenrollado + CRD de colectina-11 humana)
CC11
"Cuello" superenrollado de colectina-11 humana
T4
Proteína Whisker de bacteriófago T4 (documento WO2008025516)
69
Proteína Whisker de bacteriófago 69 (documento WO2008025516)
Entre el TNFSF-RBD y el dominio de trimerización, se colocó un elemento enlazador flexible con longitudes
variables (Tabla 4):
Tabla 4: Nombres de enlazadores y secuencia de aminoácidos (G = glicina; S = serina)
Nombre del enlazador
Secuencia de aminoácidos
A
GSS GSS GSS GS
B
GSS GSS GS
C
GSS GS
D
GS
1.2 Generación de construcciones de expresión
10 La molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión como se describe en este documento puede clonarse en un vector adecuado para expresar la proteína de fusión. Las herramientas moleculares necesarias para generar dicho vector con conocidas para los expertos y comprenden enzimas de restricción, vectores, y hospedadores adecuados para propagar los vectores.
15 Para purificación y estrategias analíticas, se añadió una marca Estrep II (secuencia de aminoácidos WSHPQFEK) de forma C-terminal. Esta marca de afinidad se unión al dominio de trimerización mediante un elemento enlazador flexible (secuencia de aminoácidos PSSSSSSA). Para permitir la expresión basada en secreción, se fusionaron péptidos señal derivados de Ig humana a los extremos N-terminales de dichas proteínas. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fusión se retradujeron y se optimizó su uso de codones para expresión basada en
20 células de mamífero. La síntesis génica se hizo por ENTELECHON GmbH (Regensburg, Alemania). Los casetes de expresión final se subclonaron en la estructura pCDNA4-HisMax, usando sitios únicos Hind-III y Not-I del plásmido. Todos los casetes de expresión se verificaron de forma rutinaria por secuenciación de ADN.
Se presentarán datos en este documento para las siguientes construcciones (Tabla 5a y 5b): 25
TRAIL (tipo silvestre)
Muteína de específica) TRAIL (R1- Muteína de específica) TRAIL (R2-
Enlazador Motivo
A B C D A B C D A B C D
SPD
● ● ● ● ● n.s. n.s. ● ● n.s. n.s. ●
SPD_F335A
● n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.
SPD_F335D
● n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.
CCSPD
● ● ● ● ● n.s. n.s. ● ● n.s. n.s. ●
Col11
● ● ● ● n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.
CC11
● ● ● ● n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.
T4
● ● ● ● n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.
69
● ● ● ● n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.
Tabla 5a: Resumen de las proteínas de fusión de TRAIL con datos mostrados. Los círculos rellenos indican que se presentan los datos. N.s., no mostrado.
LIGHT
APRIL CD95L
Enlazador Motivo
A A A
SPD
● ● ●
CCSPD
● ● n.s.
Col11
● ● n.s.
69
● ● n.s.
Tabla 5b: Resumen de las construcciones de LIGHT, APRIL y CD95L con datos mostrados. Los círculos rellenos indican que se presentan los datos. N.s., no mostrado.
1.3 Expresión y purificación de ligandos modificados por ingeniería de la superfamilia de TNF
Se transfectaron de forma transitoria células Hek 293T cultivadas en DMEM + GlutaMAX (GibCo) suplementado con FBS al 10 %, 100 unidades/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina con plásmidos que codificaban una proteína de fusión como se describe en este documento. El sobrenadante de cultivo celular que contenía proteínas recombinantes se recogió tres días post transfección y se aclaró por centrifugación a 300xg seguido de filtración a través de un filtro estéril de 0,22 m. Para purificación de afinidad, se compactaron 4 ml de Streptactin Sepharose al 50 % (IBA GmbH, Göttingen, Alemania) en una columna de 2 ml y se equilibraron con 30 ml de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 (PBS; Invitrogen Cat. 10010) o tampón W (Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM pH 8,0). El sobrenadante de cultivo celular se aplicó a la columna a 4 ºC con un caudal de 2 ml/min. Posteriormente, la columna se lavó con PBS o tampón W y se eluyeron las proteínas unidas específicamente por etapas mediante la adición de 5 x 2 ml de tampón E (PBS o tampón W con destiobiotina 2,5 mM, pH 7,4). El contenido de proteína de las fracciones de eluato se analizó por espectroscopía de absorción y por SDS-PAGE con tinción con plata. Las fracciones positivas se concentraron posteriormente por ultrafiltración (Sartorius, Vivaspin, 10.000 Da de punto de corte) y se analizó adicionalmente por cromatografía por exclusión de tamaño (SEC).
Se realizó SEC en una columna Superdex 200 usando un sistema de cromatografía Äkta (GE-Healthcare). La columna se equilibró con PBS (Invitrogen Cat. 10010) y las proteínas concentradas, purificadas con streptactin se cargaron en la columna SEC a un caudal de 0,5 ml/min. La elución se controló por absorbancia a 280 nm. El peso molecular aparente de las proteínas purificadas se determinó en base a la calibración de la columna Superdex 200 con proteínas convencionales de filtración en gel (Bio-Rad GmbH, Múnich, Alemania).
1.4. Ensayos de muerte celular
Para analizar la activación de caspasas, se usó un ensayo celular con la línea de células T humanas permanente Jurkat A3 (n.º cat. CRL2570, ATCC). Las células Jurkat se cultivaron en matraces con medio RPMI 1640 + GlutaMAX (GibCo) suplementado con FBS al 10 % (Biochrom), 100 unidades/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina (GibCo). Antes del ensayo, se sembraron 100.000 células por pocillo en una placa de microtitulación de 96 pocillos. La adición de diferentes soluciones que contenían la proteína con o sin un anticuerpo de entrecruzamiento a los pocillos (volumen final: 200 l) estuvo seguida de una incubación de 3 horas a 37 ºC. Las células se lisaron añadiendo 20 l de tampón de lisis (HEPES 250 mM, MgCl2 50 mM, EGTA 10 mM, Triton-X-100 al 5 %, DTT 100 mM, AEBSF 10 mM, pH 7,5) y las placas se incubaron en hielo durante 30 minutos hasta 2 horas. La apoptosis coincide con una actividad aumentada de caspasas. Por tanto, se usó la escisión del sustrato de caspasa específico Ac-DEVD-AFC (Biomol) para determinar el grado de apoptosis. Para el ensayo de actividad caspasa, se transfirieron 20 l de lisado celular a una placa de microtitulación negra de 96 pocillos. Después de la adición de 80 l de tampón que contenía HEPES 50 mM, sacarosa al 1 %, CHAPS al 0,1 %, Ac-DEVD-AFC 50 M, y DTT 25 mM, pH 7,5, la placa se transfirió a un lector de placa de microtitulación Tecan Infinite F500 y se controló el aumento en la intensidad de fluorescencia (longitud de onda de excitación de 400 nm, longitud de onda de emisión de 505 nm).
Para la determinación de la muerte celular en fibrosarcoma HT1080, carcinoma de cuello uterino HeLa y células de melanoma WM35, se sembraron 15.000 células en placas de 96 pocillos durante una noche en medio RPMI 1640 + GlutaMAX (GibCo) suplementado con FBS al 10 % (Biochrom). Para células Colo205, se sembraron 50.000 células durante una noche. Las células se estimularon el siguiente día con el ligando indicado y se incubaron durante 18 horas adicionales. Para células HeLa y HT1080, se usó cicloheximida (Sigma) a una concentración final de 2,5 g/ml durante la estimulación con ligandos. La muerte celular de HT1080, HeLa y WM35 se cuantificó tiñendo con tampón KV (violeta cristal al 0,5 %, metanol al 20 %). Después de la tinción, los pocillos se lavaron con agua y se secaron al aire. El colorante se eluyó con metanol y se midió la densidad óptica a 595 nm con un lector ELISA. La viabilidad de
las células Colo205 se cuantificó por ensayo MTS (Promega).
1.5 Ensayo de citotoxicidad hepatocelular
Para determinar el efecto de proteínas de fusión de TRAIL, se prepararon hepatocitos humanos primarios a partir de donantes sanos y se cultivaron en medio Williams E usando 25.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. En el día dos, se cambió el medio a DMEM-F12 suplementado con FCS al 10 %, insulina humana, Pen/Estrep, medio esencial mínimo (MEM), piruvato sódico y Hepes 10 mM y se cultivaron durante otro día. Las células se estimularon en el día tres con concentraciones variables de las proteínas indicadas en presencia o ausencia de anticuerpos de entrecruzamiento (StrepMablmmo, IBA GmbH). Para evaluar el efecto hepatotóxico potencial de un cotratamiento de ligandos con agentes quimioterapéuticos, se coincubó TRAIL-ASPD_F335D a concentraciones variables junto con doxorrubicina 5 mM o gemcitabina 5 mM. Las células se incubaron durante 5 o 24 horas a 37 ºC y CO2 al 5 % y después se lisaron para la determinación de la actividad caspasa como se ha descrito en la sección "ensayos de muerte celular".
1.6 Streptactin-ELISA
Para determinar la unión de receptores a ligandos construidos, se usaron microplacas de 96 pocillos recubiertas con streptactin. Por lo tanto, se inmovilizaron sobrenadantes de células HEK293 transfectadas de forma transitoria, sueros de ratón o proteínas purificadas en las placas streptactin (IBA GmbH) durante 1-3 horas en PBS. Las muestras se diluyeron en tampón de unión/bloqueo ELISA (PBS, Tween-20 al 0,1 %, SuperBlock T20-PBS al 20 % (Pierce)). Las placas se lavaron con PBS + Tween-20 al 0,1 % y se incubaron con anticuerpo de ratón anti-TRAIL (Pharmingen, clon RIK-2), TRAIL-Receptor 1-Fc (R&D Systems), TRAIL-Receptor 2-Fc (R&D Systems), TACl-Fc (R&D Systems) o HVEM-Fc (R&D Systems) durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo y se detectaron las proteínas Fc con anticuerpos conjugados con peroxidasa específicos anti-Fc humano o anti-Fc de ratón (Sigma). Se hizo una reacción de color mediante la adición de 100 l por pocillo de sustrato TMB (Kem-En-Tec Diagnostics) y se determinó la absorbancia a 450 nm y 630 nm con un lector ELISA después de la adición de 25 l de H2SO4 al 25 % como solución de parada. Los valores se calcularon como 450 nm -630 nm con MS Excel.
1.7 Ensayo de unión a manano
Se incubaron placas ELISA (Nunc Maxisorp) durante una noche a 4 ºC con 10 g/pocillos de manano de levadura (Sigma) en tampón estéril de recubrimiento (Na2CO3 15 mM, NaHCO3 35 mM, NaN3 al 0,025 %, pH 9,6). Las placas primero se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con tampón BB (Tris 20 mM, NaCl 140 mM, CaCl2 5 mM, BSA al 0,1 % y SuperBlock T20-PBS al 20 % (Pierce)) y en segundo lugar durante 90 minutos adicionales con concentraciones variables de los ligandos indicados en tampón BB. Las placas se lavaron con tampón WB (Tris 20 mM, NaCl 140 mM, CaCl2 5 mM, Tween-20 al 0,05 %) y se hizo la detección usando streptactin-HRP (IBA GmbH) en tampón BB. Las placas se lavaron y revelaron con sustrato TMB (Kem-En-Tec Diagnostics). Se determinó la absorción a 450 nm y 630 nm con un lector ELISA después de la adición de 25 l de H2SO4 al 25 % como solución de parada. Los valores se calcularon como 450 nm -630 nm con MS Excel.
1.8 Farmacocinética de proteínas de fusión TRAIL-SPD
A ratones CD1 macho (Charles River) se les inyectó por vía intravenosa 10 g de proteína disuelta en 300 l de PBS (Invitrogen). Se recogió sangre después de 0 min (predosis), 5 min, 30 min, 2 horas, 6 horas y 24 horas. Para cada punto temporal, se recogieron dos muestras. Las muestras de sangre se procesaron para obtener suero y se almacenaron a -15 ºC. La concentración de proteínas de fusión de TRAIL se determinó usando un ELISA como se describe a continuación (sección 1.9) y se calcularon las semi-vidas (GraphPad Prism v4.0).
1.9 ELISA para la cuantificación de construcciones de TRAIL en sueros de ratón
Para cuantificar la concentración de proteínas de TRAIL en sueros de ratón (originarios de estudios farmacocinéticos), se usó un método ELISA empleando microplacas de 96 pocillos.
Se recubrieron placas ELISA durante 1 h a 37 ºC con 2 g/ml de anticuerpo de ratón anti-TRAIL (clon RIK-2; Pharmingen). Después de lavar con PBS + Tween-20 al 0,1 % y bloquear la placa durante 30 min a 37 ºC con StartingBlock™ (Pierce), se añadieron muestras de suero a una concentración del 0,2 % y 5 %, muestras de calibración y muestras de control y se incubaron durante 1 h a 37 ºC. Las muestras de calibración y control se prepararon a partir del lote respectivo de TRAIL (TRAIL-ASPD o TRAIL-ASPD-F335A o TRAIL-ASPD-F335D) y se suplementaron con suero al 0,2 % o 5 % de ratón CD1 combinado sin tratar para justificar los efectos potenciales de la matriz. Las muestras de control (concentración alta, media y baja de la construcción de TRAIL) se añadieron como controles de calidad para asegurar la precisión y exactitud de la cuantificación de TRAIL en la ventana de ensayo dada. Las placas se lavaron de nuevo y se detectaron las construcciones de TRAIL que contenían la marca Estrep con StrepTactin-POD (IBA) diluido 1:1000. Todas las muestras y proteínas se diluyeron con tampón ELISA (PBS,
Tween-20 al 0,1 %, Starting Block al 5 % (Pierce)). La reacción de color se inició después de la adición de 100 l por pocillo de sustrato TMB (Kem-En-Tec Diagnostics). Se determinó la absorbancia a 450 nm y 630 nm con un lector ELISA después de la adición de 25 l de H2SO4 al 25 % como solución de parada. Los valores se calcularon como 450 nm -630 nm con MS Excel.
2. Resultados
2.1 Caracterización de proteína de fusión de CD95L (CD95L-ASPD)
10 De la CD95L-ASPD purificada por afinidad con Streptactin se cargaron 0,5 ml (0,86 mg de proteína) con un caudal de 0,5 ml/min en una columna Superdex200 usando PBS como tampón de ejecución. Se recogieron fracciones de 0,5 ml (se indican A1 a A11). El volumen de retención del pico principal a 11,92 ml correspondía a 170 kDa como se determina a partir del patrón de exclusión por tamaño. Esto indicó que la proteína es un trímero compuesto de monómeros glucosilados. El peso molecular calculado del polipéptido monomérico es de 38 kDa. Se usó una
15 alícuota de las fracciones A1 a A11 para SDS-PAGE y la actividad caspasa. Solamente el pico trimérico definido (fracciones A7 a A10) se usó para los análisis finales. Los resultados se muestran en la Fig. 1.
Se purificó una alícuota de la cromatografía por exclusión de tamaño de la CD95L-ASPD purificada por afinidad para SDS-PAGE reductora seguida de tinción con plata. La banda detectada a aproximadamente 40-45 kDa (indicada por
20 una flecha) correspondía a CD95L-ASPD. La especie trimérica estaba presente en las fracciones A7 a A10. Los resultados se muestran en la Fig. 2.
Se incubaron células Jurkat con alícuotas a una dilución final de factor 8 de las fracciones A1 a A15 de SEC con CD95L-ASPD purificada por afinidad. Las células se lisaron después de 3 h de incubación y se determinó la
25 actividad caspasa con un ensayo fluorogénico. Las fracciones correspondientes al pico trimérico (fracciones A7-A10) indujeron actividad caspasa clara pero débil en células Jurkat ya que se sabe que estas células requieren ligando extensivamente entrecruzado. La especie agregada e indefinida en las fracciones A1-A6 es, por lo tanto, un potente inductor de la activación de caspasas (no usado adicionalmente). De forma importante, solamente se recogió la especie trimérica definida (A7 a A10) y se usó para análisis finales. Los resultados se muestran en la Fig. 3.
30 Se incubaron las líneas celulares de cáncer humano HT1080 (A), HeLa (B) o WM35 (C) con concentraciones indicadas de CD95L-ASPD trimérica purificada en presencia o ausencia de anticuerpo de entrecruzamiento (2,5 microgramos/ml de anti-marca Estrep II). Las células se incubaron durante 18 h y se analizó la citotoxicidad por tinción con violeta cristal. Como resultado, CD95L-ASPD indujo muerte celular en carcinoma de cuello uterino HeLa
35 y fibrosarcoma HT1080, pero no en células de melanoma WM35. Los resultados se muestran en la Fig. 4.
La secuencia de aminoácidos de CD95L-ASPD se muestra a continuación.
SEC ID 40 Sp-CD95L-ASPD
40 Cantidad total de aminoácidos: 346, PM=37682 ORIGEN
45 1 -20: Péptido señal de secreción (Sp; subrayado) 21 -160: CD95L-dominio de unión a receptor 161 -171: Elemento enlazador flexible (enlazador A; cursiva) 172 -209: Región superenrollada de "cuello" de SP-D humana
50 210 -327: Dominio de lectina tipo C de SP-D humana 328 -338: Elemento enlazador (GGSPSSSSSSA) 339 -346: Marca Estrep II (WSHPQFEK)
2.2 Caracterización de proteínas de fusión de LIGHT (LIGHT-ASPD)
55 De la LIGHT-ASPD purificada por afinidad se cargaron 0,5 ml (1,56 mg) en una columna Superdex 200 y se reveló a 0,5 ml/min usando PBS como tampón de ejecución. El pico principal detectado a 11,96 ml correspondía a un tamaño
de 170-180 kDa que indica que LIGHT-ASPD es un trímero compuesto por tres monómeros glucosilados. Se recogió el pico trimérico (fracciones A7 a A10) y se usó para análisis finales. El recuadro muestra la SDS-PAGE teñida con placa de dos lotes independientes de LIGHT-ASPD purificados y triméricos (denominados 0917 y 0918). Los resultados se muestran en la Fig. 5.
5 Se usaron concentraciones variables (0 -10 microgramos/ml) de LIGHT-ASPD trimérica purificada por afinidad y SEC, para inmovilizarlas mediante la marca Estrep II en microplacas recubiertas con Streptactin. Después se detectó LIGHT-ASPD en una configuración ELISA usando 100 ng/ml de proteínas de fusión Fc de los receptores HVEM y receptor 1 de TRAIL, respectivamente. Mientras la señal ELISA aumentaba para HVEM-Fc con cantidades
10 crecientes de ligando inmovilizado, no se detectaba señal para receptor 1 de TRAIL-Fc sobre el intervalo completo analizado. Esto indicó que LIGHT-ASPD es una molécula funcional que podría unirse a su receptor HVEM. Estos resultados se muestran en la Fig. 6.
La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión LIGHT-ASPD se muestra a continuación: 15
SEC ID 41 Sp-LIGHT-ASPD
Cantidad total de aminoácidos: 356, PM=37931
ORIGEN
1 -20: Péptido señal de secreción (Sp; subrayado) 21 -170: LIGHT-dominio de unión a receptor 171 -181: Elemento enlazador flexible (enlazador A; cursiva)
25 182 -219: Región superenrollada de "cuello" de SP-D humana 220 -337: Dominio de lectina tipo C de SP-D humana 338 -348: Elemento enlazador (GGSPSSSSSSA) 349 -356: Marca Estrep II (WSHPQFEK)
30 2.3 Caracterización de proteínas de fusión de TRAIL
Se transfectaron de forma transitoria células HEK293 con 24 diferentes vectores de expresión que codificaban proteínas de fusión de TRAIL (Tabla 6).
35 Tabla 6: Resumen de proteínas de fusión producidas por transfección transitoria de vectores de expresión. El ligando TRAIL se transfectó como proteínas de fusión que comprenden uno de seis motivos de trimerización estabilizantes y el elemento enlazador (enlazador A, B, C y D).
n.º
Ligando Enlazador Motivo de trimerización
1
TRAIL A/B/C/D 69
2
TRAIL A/B/C/D T4
3
TRAIL A/B/C/D SPD
4
TRAIL A/B/C/D CCSPD
5
TRAIL A/B/C/D Col11
6
TRAIL A/B/C/D CC11
Se usaron sobrenadantes para SDS-PAGE y las construcciones de TRAIL se detectaron por análisis de 40 transferencia de Western empleando un anticuerpo específico para la marca Estrep II.
Las bandas específicas detectadas se indican por una flecha. La fuerza de expresión dependió del tipo del motivo de trimerización empleado para la construcción (SPD> 69/T4/Colectina11/CCSPD/CC11) así como de la longitud del elemento enlazador (A>B>C>D). Los resultados se muestran en la Fig. 7.
Se incubaron células Jurkat durante tres horas en presencia (barras rellenas, anti-marca Estrep II) o ausencia (barras transparentes) de un anticuerpo de entrecruzamiento (2,5 microgramos/ml de anti-marca Estrep II) con sobrenadantes de células HEK transfectadas de forma transitoria. Los sobrenadantes contenían proteínas de fusión de TRAIL con diferentes motivos de trimerización (T4, 69, SPD, CCSPD, Col11, CC11) fusionados a través de elementos enlazadores variables (enlazador A, B, C y D). Como control negativo, se usó sobrenadante celular de células no transfectadas. Se lisaron y analizaron células Jurkat para la actividad caspasa con un ensayo fluorogénico.
Como resultado, la actividad caspasa disminuía con el tipo de elemento enlazador empleado (A>B>C>D) y con el plegamiento empleado. Se expresan construcciones de TRAIL de contenían colectina-11 o hélice superenrollada de colectina-11 (CCCol11) (mostradas por análisis de transferencia de Western), sin embargo, no fueron funcionales, mientras que los motivos de plegamiento derivados de SPD produjeron ligandos TRAIL funcionales. Los resultados se muestran en la Fig. 8.
TRAIL-ASPD purificada por afinidad se sometió a SEC cargando 0,5 ml (0,4 mg de proteína) a una columna Superdex200 a 0,5 ml/min con PBS como tampón de ejecución. La elución de la proteína se controló por absorción a 280 nm y se recogieron fracciones de 0,5 ml. El volumen de retención de 12,28 ml corresponde a 135-140 kDa determinada a partir del patrón de exclusión por tamaño. Esto indicó que TRAIL-ASPD es un homotrímero, ya que el peso molecular calculado del polipéptido monomérico es 40 kDa. De forma importante, para todas las proteínas de fusión analizadas por SEC que consisten en la secuencia TRAIL-RBD de tipo silvestre, se observó un pico adicional a aproximadamente 8 ml que corresponde a proteínas de fusión de TRAIL agregadas y no activas. De las fracciones recogidas A1-A14 solamente se usó el pico trimérico (A8 -A10) para análisis adicionales. Los resultados se muestran en la Fig. 9.
Se incubaron las líneas celulares de cáncer humano HeLa, HT1080, Colo205 o WM35 durante 18 horas con las concentraciones indicadas de TRAIL-ASPD trimérica purificada en presencia o ausencia de anticuerpo de entrecruzamiento (2,5 microgramos/ml de anti-marca Estrep II). La muerte celular se cuantificó por tinción con violeta cristal (HeLa, WM35 y HT1080) o por ensayo MTS (Colo205). El aumento en la viabilidad de células Colo205 a alta concentración de ligando se debe probablemente a la limitación del anticuerpo de entrecruzamiento. Los resultados se muestran en la Fig. 10.
Se usó una concentración variable (A) o constante (B) de TRAIL-ASPD trimérica purificada por afinidad y SEC para inmovilización en placas de 96 pocillos recubiertas con Streptactin. Las placas después se incubaron durante 5 h con 100.000 células Jurkat por pocillo a 37 ºC, CO2 al 5 % y se determinó la actividad caspasa con un ensayo fluorogénico. Para analizar la especificidad, la placa (B) se incubó durante 30 minutos con las concentraciones variables indicadas de un anticuerpo antagonista anti-TRAIL (clon RIK-2, Pharmingen) antes de la adición de las células. Los resultados se muestran en la Fig. 11.
Se incubaron células HT1080 en la misma placa de 96 pocillos con TRAIL-ASPD o TRAIL-DSPD purificada y trimérica a las concentraciones indicadas. La muerte celular se cuantificó el siguiente día por tinción con violeta cristal. El uso del enlazador D redujo la bioactividad aproximadamente 4,5 veces, como se indica por los valores de CE50 de 27 ng/ml y 6 ng/ml para TRAIL-DSPD y TRAIL-ASPD, respectivamente. Los resultados se muestran en la Fig. 12.
Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de los polipéptidos de fusión de TRAIL se muestran a continuación.
SEC ID 42: Casete de expresión de Sp-TRAIL-ASPD
Los sitios de restricción con endonucleasa están subrayados (HindIII, AAGCTT; BamHI, GGATCC; NotI, GCGGCCGC). El codón de inicio de la traducción está en negrita. ORIGEN
SEC ID 43 Sp-TRAIL-ASPD
Cantidad total de aminoácidos: 367, PM=40404 ORIGEN
1 -20: Péptido señal de secreción (Sp; subrayado)
10 21 -181: TRAIL-dominio de unión a receptor 182 -192: Elemento enlazador flexible (enlazador A; cursiva) 193 -230: Región superenrollada de "cuello" de SP-D humana 231 -348: Dominio de lectina tipo C de SP-D humana 349 -359: Elemento enlazador (GGSPSSSSSSA)
15 360 -367: Marca Estrep II (WSHPQFEK)
SEC ID 44 Sp-TRAIL-ACCSPD
Cantidad total de aminoácidos: 246, PM=27534 ORIGEN 20
1 -20: Péptido señal de secreción (Sp; subrayado) 21 -181: TRAIL-dominio de unión a receptor
5 182 -192: Elemento enlazador flexible (enlazador A; cursiva) 193 -230: Región superenrollada de "cuello" de SP-D humana 231 -238: Elemento enlazador (PSSSSSSA) 239 -246: Marca Estrep II (WSHPQFEK)
10 SEC ID 45 Sp-TRAIL-ACol11 Cantidad total de aminoácidos: 365, PM=40806 ORIGEN
1 -20: Péptido señal de secreción (Sp; subrayado)
21 -181: TRAIL-dominio de unión a receptor
182 -192: Elemento enlazador flexible (enlazador A; cursiva)
193 -224: Región superenrollada de "cuello" de colectina-11 humana 20 225 -347: Dominio de lectina tipo C de colectina-11 humana
348 -357: Elemento enlazador (GSPSSSSSSA)
358 -365: Marca Estrep II (WSHPQFEK)
SEC ID 46 Sp-TRAIL-ACC11
25 Cantidad total de aminoácidos: 246, PM=27431 ORIGEN
30 1 -20: Péptido señal de secreción (subrayado) 21 -181: TRAIL-dominio de unión a receptor 182 -193: Elemento enlazador flexible (enlazador A; GSS GSS GSS GSG cursiva) 194 -229: Región superenrollada de "cuello" de colectina-11 humana
35 230 -238: Elemento enlazador (GPSSSSSSA) 239 -246: Marca Estrep II (WSHPQFEK)
2.4 Caracterización de proteínas de fusión de TRAIL selectivas de receptor ('muteína')
40 Se transfectaron de forma transitoria células HEK293 con plásmidos de expresión que codificaban diferentes
construcciones de SPD selectivas de receptor de TRAIL:
n.º
Vector de expresión transfectado
1
TRAILR1mut-A-SPD
2
TRAILR1mut-A-CCSPD
3
TRAILR1mut-D-SPD
4
TRAILR1mut-D-CCSPD
5
TRAILR2mut-A-SPD
6
TRAILR2mut-A-CCSPD
7
TRAILR2mut-D-SPD
8
TRAILR2mut-D-CCSPD
9
TRAIL-A-SPD
10
TRAIL-A-CCSPD
11
TRAIL-D-SPD
12
TRAIL-D-CCSPD
Se recogieron sobrenadantes tres días post-transfección y se usó una alícuota para SDS-PAGE y transferencia de Western empleando un anticuerpo específico para la marca Estrep II. Se detectaron bandas específicas a aproximadamente 38 kDa (proteínas de fusión de SPD) y 28 kDa (proteínas de fusión de hélice superenrollada-SPD). La cantidad de proteína expresada dependió del propio ligando (TRAILR1muteína>TRAILR2muteína>TRAIL), en segundo lugar de la longitud del enlazador usado (A>D) y en tercer lugar del motivo de trimerización usado (SPD>CCSPD). Los pesos moleculares aparentes fueron como se esperaba a partir de los tamaños calculados (40 kDa y 27 kDa para proteínas de fusión de SPD y CCSPD, respectivamente). Los resultados se muestran en la Fig.
13.
La selectividad del receptor 1 der TRAIL o el receptor 2 de TRAIL hacia las proteínas de fusión de SPD/ccSPD y TRAIL, TRAILR1mut y TRAILR2mut se demostró por Streptactin-ELISA. Por lo tanto, se inmovilizaron las proteínas de fusión de TRAIL-SPD en los sobrenadantes de células HEK293 transfectadas de forma transitoria en microplacas recubiertas con Streptactin. El sobrenadante celular de células no transfectadas sirvió como control negativo. Los resultados se muestran en la Fig. 14. Se detectaron proteínas unidas específicamente con concentraciones constantes (A, B) o variables (C, D) de receptor 1 de TRAIL-Fc o receptor 2 de TRAIL-Fc. Como se muestra en (A), el ligando TRAILR1mut fusionado a variantes de SPD se detecta por el receptor 1 de TRAIL, mientras que el ligando TRAILR2mut no. Como se muestra en (B), el ligando TRAILR2mut se detecta preferentemente por el receptor 2 de TRAIL, mientras que las construcciones de TRAILR1mut y TRAIL de tipo silvestre se detectan igual de bien. Como se muestra en C, el receptor 1 de TRAIL-Fc se unió a TRAIL-R1mut-ASPD y TRAIL-ASPD igual de bien sobre el intervalo completo de titulación del receptor, mientras que TRAIL-R2mut-ASPD no se detecta. Como se muestra en D, el receptor 2 de TRAIL-Fc se unió a TRAIL-R2mut-ASPD y TRAIL-ASPD igual de bien sobre el intervalo de titulación del receptor analizado, mientras que la señal para TRAIL-R1mut-ASPD disminuyó rápidamente con concentraciones decrecientes de receptor.
Se usó un microgramo/ml de TRAIL-ASPD, TRAILR1mut-ASPD o TRAILR2mut-ASPD trimérica purificada por afinidad en 100 microlitros de PBS para inmovilización mediante la marca Estrep II en microplacas recubiertas con Streptactin. Los ligandos unidos se detectaron en una configuración ELISA usando proteínas de fusión con Fc del receptor 1 de TRAIL (A) o receptor 2 de TRAIL (B). Como se muestra en (A), el receptor 1 de TRAIL se unió preferentemente a la TRAILR1mut-ASPD selectiva de receptor en comparación con TRAILR2mut-ASPD. Como se muestra en (B), el receptor 2 de TRAIL se unión preferentemente a TRAILR2mut-ASPD en comparación con TRAILR1mut-ASPD. En conclusión, las variantes de TRAIL construidas fusionadas a SPD son selectivas de receptor. Los resultados se muestran en la Fig. 15.
TRAILR1mut-ASPD purificada por afinidad se sometió a SEC cargando 0,5 ml (0,95 mg de proteína) en una columna Superdex200. Los resultados se muestran en la Fig. 16. Las proteínas se resolvieron a 0,5 ml/minuto con PBS como tampón de ejecución y se recogieron fracciones de 0,5 ml (se indican las fracciones A1 a A14). El volumen de retención de 12,46 ml correspondió a 140 -145 kDa determinado por el patrón de exclusión por tamaño. Un pico minoritario en 10,83 ml indicó alguna especie agregada, de forma importante sin embargo, no se detectó ningún pico en el frente de ejecución (8 ml) lo que indica que esta molécula es mucho más soluble en comparación con proteínas que contienen partes de la secuencia de aminoácidos de TRAIL de tipo silvestre.
Se usó una alícuota de cromatografía por exclusión de tamaño de TRAILR1mut-ASPD purificada por afinidad para SDS-PAGE no reductora (A) o reductora (B) seguida de tinción con plata como se muestra en la Fig. 17. En
condiciones no reductoras, se detectaron dos bandas a 35 y 70 kDa, mientras que se detectó una única banda de 40kDa (indicada por una flecha) en condiciones reductoras. Esto indicó la formación de moléculas unidas por puente disulfuro. La especie trimérica estuvo presente en las fracciones A8 a A11 y se usó para análisis posteriores.
Se incubaron células Jurkat en ausencia (barras abiertas) o presencia (barras rellenas) de 2,5 microgramos/ml de anticuerpo de entrecruzamiento con alícuotas a una dilución final de factor 80 de las fracciones A1 a A14 de la SEC de TRAILR1mut-ASPD purificada por afinidad. Los resultados se muestran en la Fig. 18. Como control negativo, se incubaron células Jurkat con medio solamente. Las células Jurkat se lisaron después de 3 h de incubación y se determinó la actividad caspasa con un ensayo fluorogénico. Como las células Jurkat han demostrado expresar principalmente el receptor 2 de TRAIL, ninguna fracción indujo actividad caspasa significativa, incluso cuando se entrecruzaba TRAILR1mit-ASPD por el anticuerpo específico de marca Estrep II. Esto indicó que TRAILR1 mut-ASPD no se une al receptor 2 de TRAIL.
TRAILR2mut-ASPD purificada por afinidad se sometió a cromatografía por exclusión de tamaño cargando 0,5 ml (0,5 mg de proteína) a una columna Superdex 200 como se muestra en la Fig. 19. Las proteínas se resolvieron a 0,5 ml/minuto con PBS como tampón de ejecución y se recogieron fracciones de 0,5 ml (se indican las fracciones A1 a A14). El volumen de retención de 12,60 ml corresponde a 130-135 kDa determinado a partir del patrón de exclusión por tamaño. Esto indicó que TRAILR2mut-ASPD es un homotrímero calculado a partir del peso monomérico esperado de 40 kDa. De forma importante, más del 95 % estaba presente en la fracción del pico trimérico y no se detectaron agregados. El pico trimérico se usó para análisis posteriores.
Se usó una alícuota de la cromatografía por exclusión de tamaño de TRAILR2mut-ASPD purificada por afinidad para SDS-PAGE no reductora (A) o reductora (B) seguida de tinción con plata como se muestra en la Fig. 20. En condiciones no reductoras, se detectaron dos bandas a 35 y 70 kDa, mientras que se detectó una única banda de aproximadamente 40 kDa (indicada por una flecha) en condiciones reductoras. Esto indicó la formación de moléculas unidas por puente disulfuro. La especie trimérica estuvo presente en las fracciones A9 a A11 y se usó para análisis posteriores.
Los resultados de un ensayo de muerte de células Jurkat con TRAILR2-mut-ASPD se muestran en la Fig. 21. Se incubaron células Jurkat en ausencia (barras transparentes) o presencia (barras rellenas) de anticuerpos de entrecruzamiento (2,5 microgramos/ml de anti-marca Estrep II) con alícuotas de las fracciones A1 a A14 de la SEC de TRAILR2mut-ASPD purificada por afinidad. Las muestras se usaron a una dilución final de factor 640. Las células se lisaron después de 3 h de incubación y se determinó la actividad caspasa con un ensayo fluorogénico. Como las células Jurkat han demostrado expresar principalmente el receptor 2 de TRAIL que requiere formas multimerizadas de ligando para una señalización eficaz, TRAILR2mut-ASPD indujo actividad caspasa cuando se entrecruzaba. Esto indicó que TRAILR2mut-ASPD es una molécula funcional.
La actividad citotóxica de TRAIL-ASPD, TRAILR1mut-ASPD y TRAILR2mut-ASPD sobre diferentes células cancerosas humanas se muestra en la Fig. 22. Las líneas celulares indicadas HT1080 (A y B), Hela (C y D) o Colo205 (E y F) se trataron con concentraciones variables de TRAIL-ASPD, TRAILR1mut-ASPD o TRAILR2mut-ASPD purificada y trimérica en ausencia (A, C y E) o presencia (B, D y F) de anticuerpo de entrecruzamiento (antimarca Estrep II). Las células se incubaron durante 18 horas con las concentraciones indicadas de ligandos y se cuantificó la muerte celular por tinción con violeta cristal (HT1080 y HeLa) o ensayo MTS (Colo205). Como resultado, el ligando TRAIL-ASPD indujo muerte celular sobre las tres líneas celulares ensayadas y TRAILR2mut-ASPD mostró actividad superior de eliminación celular. En contraste, TRAILR1mut-ASPD selectiva del receptor 1 de TRAIL no fue activa sobre ninguna línea celular ensayada.
TRAILR2mut-ASPD purificada por afinidad se concentró 20 veces en PBS por centrifugación a través de una membrana de 10 kDa para dar una solución de 2,5 mg/ml. Del concentrado, 0,1 ml se sometieron a cromatografía por exclusión de tamaño. Como resultado, se detectó solamente el pico trimérico y ningún agregado, lo que indica que esta composición tiene capacidades mejoradas de producción (Fig. 23). Se consiguieron resultados similares para TRAILR1mut-ASPD, donde una solución concentrada de incluso 5,4 mg/ml no mostró signos de agregación (no mostrado). En contraste, todas las proteínas de fusión ensayadas que contenían el dominio de unión a receptor compuesto por la secuencia de TRAIL de tipo silvestre mostraron agregación con un 40 % de agregados a concentraciones tan bajas como de 0,4 mg/ml.
Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de fusión de muteína TRAIL selectiva de receptor se muestran a continuación.
SEC ID 47 Sp-TRAILR1mut-ASPD
Cantidad total de aminoácidos: 367, PM=40335 ORIGEN
1 -20: Péptido señal de secreción (Sp; subrayado) 21 -181: TRAILR1mut-dominio de unión a receptor 182 -192: Elemento enlazador flexible (enlazador A; cursiva) 193 -230: Región superenrollada de "cuello" de SP-D humana 231 -348: Dominio de lectina tipo C de SP-D humana 349 -359: Elemento enlazador (GGSPSSSSSSA) 360 -367: Marca Estrep II (WSHPQFEK)
SEC ID 48 Sp-TRAILR2mut-ASPD
Cantidad total de aminoácidos: 367, PM=40401 ORIGEN
1 -20: Péptido señal de secreción (Sp; subrayado) 21 -181: TRAILR2mut-dominio de unión a receptor 182 -192: Elemento enlazador flexible (enlazador A; cursiva) 193 -230: Región superenrollada de "cuello" de SP-D humana 231 -348: Dominio de lectina tipo C de SP-D humana 349 -359: Elemento enlazador (GGSPSSSSSSA) 360 -367: Marca Estrep II (WSHPQFEK)
2.5 Caracterización de variantes de carbohidrato de SPD
TRAIL-ASPD_F335A purificada por afinidad se sometió a cromatografía por exclusión de tamaño cargando 0,5 ml de solución de PBS (0,4 mg de proteína) a una columna Superdex 200 como se muestra en la Fig. 24. Las proteínas se resolvieron a 0,5 ml/minuto con PBS como tampón de ejecución y se recogieron fracciones de 0,5 ml (se indican A1 a A13). El volumen de retención de 12,27 ml corresponde a 135-145 kDa determinado a partir del patrón de exclusión por tamaño. Esto indicó que TRAIL-ASPD_F335A es un homotrímero calculado a partir del peso monomérico esperado de 40 kDa. Dos picos adicionales a 8,32 y 10,68 ml indicaron la formación de agregados de TRAIL-ASPD_F335A. Se usó solamente el pico trimérico para análisis posteriores.
De la cromatografía por exclusión de tamaño se resolvió una alícuota de las fracciones recogidas A1 a A13 por SDS-PAGE reductora y el gel se tiñó con plata (Fig. 25). La banda detectada a aproximadamente 40 kDa correspondía al peso molecular calculado de 40 kDa para TRAIL-ASPD_F335A. Las fracciones positivas correspondientes a la molécula trimérica (A8, A9, A10) de la ejecución de SEC se combinaron y usaron para análisis adicionales.
Las secuencias de aminoácidos de proteínas de fusión de TRAIL-variante de carbohidrato de SPD se muestran a continuación.
SEC ID 49: Sp-TRAIL-ASPD_F335A
Cantidad total de aminoácidos: 367, PM=40328 ORIGEN
1 -20: Péptido señal de secreción (Sp; subrayado) 21 -181: TRAIL-dominio de unión a receptor 182 -192: Elemento enlazador flexible (enlazador A; cursiva) 193 -230: Región superenrollada de "cuello" de SP-D humana 231 -348: Dominio de lectina tipo C de SP-D humana (mutación Phe en negrita) 349 -359: Elemento enlazador (GGSPSSSSSSA) 360 -367: Marca Estrep II (WSHPQFEK)
SEC ID 50: Sp-TRAIL-ASPD_F335D
Cantidad total de aminoácidos: 367, PM=40372 ORIGEN
1 -20: Péptido señal de secreción (Sp; subrayado) 21 -181: TRAIL-dominio de unión a receptor 182 -192: Elemento enlazador flexible (enlazador A; cursiva) 193 -230: Región superenrollada de "cuello" de SP-D humana 231 -348: Dominio de lectina tipo C de SP-D humana (mutación Asp en negrita) 349 -359: Elemento enlazador (GGSPSSSSSSA) 360 -367: Marca Estrep II (WSHPQFEK)
El efecto citotóxico de TRAIL-ASPD_F335A sobre células cancerosas humanas se muestra en la Fig. 26. Se incubaron las líneas celulares cancerosas humanas indicadas durante una noche con concentraciones variables de TRAIL-ASPD_F335A trimérica purificada por afinidad y SEC en presencia o ausencia de anticuerpo de entrecruzamiento (2,5 microgramos/ml de anti marca Estrep II). La viabilidad celular se cuantificó por tinción con violeta cristal (HT1080, HeLa y WM35) o MTS (Colo205). El aumento de la viabilidad celular de Colo205 a altas concentraciones de ligando probablemente se debe a la limitación del anticuerpo de entrecruzamiento.
TRAIL-ASPD_F335D purificada por afinidad se sometió a cromatografía por exclusión de tamaño cargando 0,5 ml (0,2 mg de proteína) a una columna Superdex 200 como se muestra en la Fig. 27. Las proteínas se resolvieron a 0,5 ml/minuto con PBS como tampón de ejecución y se recogieron fracciones de 0,5 ml (se indican A1 a A13). El volumen de retención de 12,29 ml corresponde a 135-145 kDa determinado a partir del patrón de exclusión por tamaño. Esto indicó que TRAIL-ASPD_F335D es un homotrímero calculado a partir del peso monomérico esperado de 40 kDa. El pico a 8,35 correspondía a agregados de TRAIL-ASPD_F335D inactiva típicamente encontrados para todas las proteínas de fusión que contienen partes de la secuencia de aminoácidos de TRAIL de tipo silvestre.
De la cromatografía por exclusión de tamaño se resolvieron alícuotas de TRAIL-ASPD_F335D purificada por
afinidad de las fracciones recogidas A1 a A13 por SDS-PAGE reductora y el gel se tiñó con plata (Fig. 28). Las bandas detectadas a aproximadamente 40 kDa (indicadas por una flecha) correspondían al peso molecular calculado de 40 kDa para TRAIL-ASPD_F335D. Las fracciones que contenían proteína trimérica (fracciones A8 a A10) se combinaron y usaron para análisis adicionales.
Se incubaron las líneas celulares cancerosas humanas HT1080 (A), HeLa (B), WM35 (C) o Colo205 (D) durante una noche con concentraciones variables de TRAIL-ASPD_F335D trimérica purificada por afinidad en presencia o ausencia de anticuerpos de entrecruzamiento (anti-marca Estrep II). Se cuantificó la viabilidad celular por tinción con violeta cristal (HT1080, HeLa y WM35) o MTS (Colo205). Los datos muestran que TRAIL-ASPD_F335D es capaz de inducir muerte celular en las líneas celulares cancerosas ejemplificadas (Fig. 29). El aumento de la viabilidad celular de Colo205 a altas concentraciones de ligando probablemente se debe a la limitación del anticuerpo de entrecruzamiento.
2.6 Análisis de características de unión a carbohidrato de variantes del motivo de trimerización de SPD
Se ha demostrado que la proteína SP-D de tipo silvestre, de longitud completa y oligomérica de varias especies, así como el trímero de cuello+CRD de SP-D humana se une a varios carbohidratos diferentes. Además, el cuello+CRD de SP-D humana también ha demostrado ejercer efectos inmunomoduladores sirviendo como factor quimiotáctico para células inmunes tales como neutrófilos (Cai et al., 1999, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 276:131-136). Otras células también puede reclutarse por SP-D. El efecto quimiotáctico del cuello+CRD de SP-D humana ha demostrado depender de la función de glucounión, ya que la adición de maltosa inhibía la función quimiotáctica. Por tanto, un ligando de la TNFSF con una función quimiotáctica mediada por SP-D puede ser de actividad superior en comparación con ligandos o construcciones de los mismos con secuencias de aminoácidos naturales. Por ejemplo, en un escenario donde son deseables efectos celulares tal como en tratamiento del cáncer, puede ser deseable dicho ligando descrito.
Además, un ligando donde SP-D no tenga función de carbohidrato puede ser deseable en otro entornos. Para SP-D humana se ha descrito un mutante en que el aminoácido fenilalanina 335 (correspondiente al aminoácido 355 de la SEC ID N.º 21) se ha mutado en alanina (SPD_F335A, Crouch et al., JBC 281: 18008-18014). Este mutante mostró unión muy débil a carbohidrato. Sin embargo, introducir un aminoácido cargado (por ejemplo, un aminoácido ácido) puede ser incluso mejor en comparación con F335A si no se desea unión a carbohidrato. Por lo tanto, el mutante SPD_F335D puede ser superior hacia el mutante F335A.
Para analizar la unión de las proteínas de fusión de TRAIL a carbohidratos, se inmovilizó manano de levadura en microplacas y se detectó la unión de TRAIL-SPD, TRAIL-SPO_F335A o TRAIL-SPD_F335D por ELISA. Los resultados se muestran en la Fig. 30. Como se esperaba, la señal ELISA aumentó con concentraciones crecientes de TRAIL-ASPD. En contraste, la forma mutante de carbohidrato TRAIL-ASPD_F335A mostró una señal ELISA muy baja. Además, la nueva variante construida TRAIL-ASPD_F335D presentó la señal ELISA más baja (véase el recuadro y la flecha). Esto indicó que el mutante F335D tiene una afinidad de unión a manano inferior en comparación con la forma mutante de SP-D descrita previamente F335A.
2.7 Farmacocinética de proteínas de fusión TRAIL-SPD
Para determinar las semi-vidas de la proteína de fusión TRAIL-SPD, se inyectaron diez microgramos de TRAIL-ASPD (A) o TRAIL-ASPD_F335D (B) por vía intravenosa en ratones CD1 macho y se recogieron muestras de suero después de varios puntos temporales (predosis, 5 min, 30 min, 2 h, 6 h y 24 h). Se cuantificaron las proteínas TRAIL en sueros de los ratones por un ELISA y los datos se usaron para calcular las semi-vidas. Los resultados se muestran en la Fig. 31. Para las dos proteínas analizadas, se calculó una semi-vida de 7 a 14 horas para TRAIL-ASPD (A) y TRAIL-ASPD_F335D (B). Ningún animal murió o mostró signos de intolerancia durante el periodo observado. Los datos indican una mejora de al menos 80 veces de la semi-vida en suero en comparación con TRAIL de tipo silvestre que se informó que tenía una semi-vida en el intervalo de tres a cinco minutos en roedores (Kelley et. al 2001).
2.8 Citotoxicidad de proteína de fusión TRAIL-ASPD
Para analizar los potenciales efectos hepatotóxicos de TRAIL-ASPD, TRAIL-ASPD_F335A o TRAIL-ASPD_F335D, se incubaron hepatocitos humanos primarios (PHH) con concentraciones variables de las proteínas de fusión TRAIL-SPD indicadas, con o sin anticuerpos de entrecruzamiento (anti-marca Estrep II). Como control, se usó una variante estabilizada de CD95L, CD95L-T4 (descrita en el documento WO2008/025516). Los resultados se muestran en la Fig. 32.
Además, se analizó el efecto de una incubación simultánea de PHH con fármacos quimioterapéuticos 5 mM para TRAIL-ASPD_F335D. Después de 5 h (A, B y E) o 24 h (C, D y F) de incubación, se lisaron las células y se evaluó la actividad caspasa con un ensayo fluorogénico.
Como resultado, todas las proteínas de fusión TRAIL-SPD analizadas no indujeron efectos hepatotóxicos, incluso si
los ligandos se entrecruzaban de forma secundaria por anticuerpos. En contraste, CD95L-T4 es hepatotóxica como se indica por un aumento de la caspasa activa (A a D). Cinco horas de co-incubación de hepatocitos humanos primarios con TRAIL-ASPD_F335D trimérica junto con fármacos quimioterapéuticos no indujeron actividad caspasa (E). Sin embargo, después de 24 h de co-incubación con doxorrubicina, TRAIL-ASPD_F335D soluble indujo una fuerte señal de actividad caspasa (F).
Esto indica que las proteínas de fusión de TRAIL de la presente invención pueden no mostrar hepatotoxicidad indeseada en uso médico. Por tanto, las proteínas de fusión de TRAIL se administran preferiblemente en combinación con fármacos, que son sensibilizantes a la apoptosis y/o inductores de la apoptosis, por ejemplo un fármaco quimioterapéutico tal como oxaliplatino, cisplatino, 5-fluorouracilo, etopósido, gemcitabina, irinotecano y otros, o moléculas de unión a Bcl2, por ejemplo moléculas o compuestos peptídicos pequeños, que se unen a polipéptidos de la familia de Bcl2, particularmente Bcl2 o Bclxl.
2.9 Caracterización de proteínas de fusión de APRIL
Se transfectaron de forma transitoria células HEK293 con vectores de expresión que codificaban APRIL-A69 (documento WO2008025516), APRIL-ASPD, APRIL-ACCSPD o APRIL-ACol11. Después de tres días se analizaron los sobrenadantes para las proteínas secretadas por transferencia de Western. Los resultados se muestran en la Fig. 33. Para la detección de proteínas de fusión de APRIL se usó un anticuerpo específico para marca Estrep II. Las flechas indican bandas específicas que se detectaron a aproximadamente 40 kDa (APRIL-ASPD y APRIL-ACol11, respectivamente), así como a aproximadamente 25 kDa (APRIL-A69 y APRIL-ACCSPD, respectivamente). Por tanto los casetes de expresión de APRIL son funcionales y la secreción de proteína indicó que las proteínas se pliegan apropiadamente. Como para otras proteínas TNFSF analizadas, los mayores niveles de proteína secretada se encontraron para APRIL fusionado al motivo de trimerización compuestos por la hélice superenrollada de "cuello" + CRD de SP-D humana (APRIL-ASPD, carril n.º 2). Se usó APRIL-ASPD para analizar la unión al receptor TACI.
Para demostrar que la proteína de fusión APRIL-ASPD construida es funcional, se evaluó la unión a un receptor conocido de APRIL, concretamente TACI (Fig. 34). Por lo tanto, se inmovilizó APRIL-ASPD del sobrenadante de células HEK293 transfectadas de forma transitoria en microplacas recubiertas con Streptactin. El sobrenadante celular de células HEK293 no transfectadas sirvió como control negativo. Se detectaron proteínas unidas específicamente con concentraciones variables de TACI-Fc seguido de incubación con un anticuerpo específico anti-Fc humano, conjugado con peroxidasa. Como resultado, la señal ELISA aumentó con concentraciones crecientes de TACI-Fc, lo que indica que APRIL-ASPD es una molécula funcional.
La secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión de APRIL se muestra a continuación.
SEC ID 51: Sp-APRIL-ASPD
Cantidad total de aminoácidos: 344, PM=37120 ORIGEN
1 -20: Péptido señal de secreción (subrayado) 21 -158: APRIL-RBD 159 -169: Elemento enlazador flexible (enlazador A; GSS GSS GSS GS cursiva) 170 -207: Región superenrollada de "cuello" de SP-D humana 208 -325: Dominio de lectina tipo C de SP-D humana 326 -336: Elemento enlazador (GGSPSSSSSSA) 337 -344: Marca Estrep II (WSHPQFEK)
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Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una proteína de fusión que comprende
    5 (i) TRAIL o un dominio de unión a receptor del mismo, y
    (ii) un dominio de trimerización de colectina que comprende el dominio de cuello o el dominio de cuello y de unión a carbohidrato de la proteína tensioactiva D, en la que (i) comprende los aminoácidos 120-281 de la SEC ID N.º 10, y en la que (ii) comprende los aminoácidos 219-375 o 219-257 de la proteína tensioactiva humana D de la SEC ID N.º 21, y
    10 en la que (ii) está localizado de forma C-terminal de (i).
  2. 2. Proteína de fusión de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un elemento enlazador flexible entre (i) y
    (ii), en la que el elemento enlazador flexible preferiblemente tiene una longitud de 3-20 aminoácidos, más 15 preferiblemente una longitud de 3, 6, 9, 10, 12, 15 o 18 aminoácidos.
  3. 3. Proteína de fusión de la reivindicación 1 o 2, en la que el elemento enlazador flexible es un enlazador de glicina/serina, en la que el elemento enlazador flexible preferiblemente tiene la secuencia de aminoácidos (GSS)a(SSG)b(GSG)c en la que a, b, c es cada uno 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
  4. 4. Proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3,
    (a) en la que (i) es TRAIL humano que comprende la SEC ID N.º 10, o un dominio de unión a receptor del mismo,
    o 25 (b) en la que (i) comprende los aminoácidos 95-281, 116-281, 117-281, 118-281, o 119-281 de la SEC ID N.º 10.
  5. 5. Proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que (i) comprende al menos una sustitución de aminoácido, en la que la sustitución de aminoácido preferiblemente afecta a al menos una de las siguientes posiciones de aminoácido de TRAIL humano (SEC ID N.º 10): R130, G160, Y189, R191, Q193, E195, N199, K201,
    30 Y213, T214, S215, H264, I266, D267, D269, y en la que la sustitución de aminoácido es más preferiblemente al menos una de las siguientes: R130E, G160M, Y189A, Y189Q, R191K, Q193S, Q193R, E195R, N199V, N199R, K201R, Y213W, T214R, S215D, H264R, I266L, D267Q, D269H, D269R, o D269K.
  6. 6. Proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, 35
    (a)
    en la que (ii) comprende los aminoácidos 217-375 o 218-375 de la proteína tensioactiva humana D de la SEC ID N.º 21, o
    (b)
    en la que (ii) comprende los aminoácidos 217-257 o 218-257 de la proteína tensioactiva humana D de la SEC
    ID N.º 21. 40
  7. 7. Proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que (ii) comprende al menos una sustitución de aminoácido, en la que la sustitución de aminoácido preferiblemente afecta a la posición de aminoácido F355 de la proteína tensioactiva humana D de la SEC ID N.º 21, y en la que la sustitución de aminoácido es más preferiblemente una de las siguientes: F355A, F355S, F355T, F355E, F355D, F355K, o F355R.
  8. 8. Proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que (ii) comprende un mutante que no se une a manosa.
  9. 9. Proteína de fusión de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de la SEC ID N.º 26, SEC ID N.º 27, o SEC 50 ID N.º 28.
  10. 10. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1
  11. 9.
    55 11. Una célula transformada o transfectada con una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 10.
  12. 12. Un organismo no humano transformado o transfectado con una molécula de ácido nucleico de la reivindicación
  13. 10.
    60 13. Una composición farmacéutica que comprende como agente activo una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 10, o una célula de la reivindicación 11.
  14. 14. Una composición de diagnóstico que comprende como agente activo una proteína de fusión de una cualquiera
    de las reivindicaciones 1-9, una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 10, o una célula de la reivindicación 65 11.
  15. 15. Una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 10, o una célula de la reivindicación 11 para su uso en terapia, preferiblemente para su uso en la profilaxis y/o tratamiento de trastornos proliferativos, particularmente trastornos causados por, asociados con y/o acompañados por disfunción de citoquinas de TNF, tales como tumores, por ejemplo tumores sólidos o linfáticos,
    5 enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias, enfermedades metabólicas, trastornos autoinmunes, por ejemplo enfermedades reumatoides y/o artríticas, enfermedades degenerativas, por ejemplo enfermedades neurodegenerativas tales como esclerosis múltiple, enfermedades asociadas a apoptosis y rechazo de trasplantes.
  16. 16. Uso de una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, una molécula de ácido nucleico de
    10 la reivindicación 10, o una célula de la reivindicación 11 para la preparación de una composición farmacéutica en la profilaxis y/o tratamiento de trastornos proliferativos, particularmente trastornos causados por, asociados con y/o acompañados por disfunción de citoquinas de TNF, tales como tumores, por ejemplo tumores sólidos o linfáticos, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias, enfermedades metabólicas, trastornos autoinmunes, por ejemplo enfermedades reumatoides y/o artríticas, enfermedades degenerativas, por ejemplo enfermedades
    15 neurodegenerativas tales como esclerosis múltiple, enfermedades asociadas a apoptosis y rechazo de trasplantes.
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