JP5844158B2 - 三量体形成融合タンパク質 - Google Patents
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Description
(発明の分野)
本発明は、コレクチン三量体化ドメインのネック領域および糖質認識ドメイン、リンカーエレメント、ならびにエフェクターポリペプチドを含む融合タンパク質に言及する。さらに、本発明は、前記融合タンパク質をコードする核酸に言及する。本明細書に記載されるように、この融合タンパク質、核酸および細胞は、薬学的組成物として、または治療、診断および/もしくは研究に応用するために、好適である。
コレクチンタンパク質は、安定なオリゴマーを形成することが知られている。コレクチンは、C型レクチンドメインと呼ばれる構造タンパク質の折りたたみを含むタンパク質レクチンスーパーファミリーを構築する18個の群メンバーのうちの1つである(Zelenskyら,FEBS Journal 2005,Vol 272,p 6179−6217)。レクチンは、糖質に結合するタンパク質であり、C型レクチンは、結合にカルシウムを必要とする。C型レクチンドメインは、糖質結合に関与することから、このドメインは、糖質認識ドメイン(CRD)とも呼ばれる。コレクチンは、生得免疫に関係し、数ある機能の中で、(例えば、ウイルスおよび細菌上に存在する)糖質に結合することによって、病原体を中和する。加えて、コレクチンは、補体の活性化および炎症への影響等の免疫機能を調節する。コレクチンの基本的な構造的特徴は、コラーゲン様ドメインおよびレクチンドメインであり、これらは、コレクチンの名称を示す構成要素である。いくつかのメンバーは、追加の構造的特徴を含むことが示されており、従って、それらは以下の構成要素を含む:i)N末端コラーゲンドメイン、ii)このN末端コラーゲンドメインに接続された、ネック領域とも呼ばれるアルファへリックスセグメント、およびiii)C末端のCRD(図35)。コレクチンは、「三重らせんコラーゲン」領域、「コイルドコイルネック」領域およびCRD領域を介して非共有結合的に三量体化する。ヒトにおいて、コレクチン群は、血清マンノース結合タンパク質、肝臓、腎臓、胎盤および肺のコレクチンを含む。予め形成された三量体のジスルフィド媒介(mediatet)オリゴマー化に関与するN末端システインを含む、肺サーファクタントタンパク質−Aおよび−D(SP−AおよびSP−D)を包含する4種の肺コレクチンが公知である。例えば、SP−Dは、三量体の四量体を形成し、SP−Aは、三量体の六量体を形成する(Kishoreら,Mol.Immunol.2006,Vol.43,1293−1315)。
本発明は、
(i)a.コレクチンファミリー糖質認識ドメイン;および
b.コレクチンファミリーネック領域
を含むコレクチンファミリー三量体化ドメイン;
(ii)リンカーエレメント;ならびに
(iii)エフェクターポリペプチド(ここで、そのエフェクターポリペプチドは、コレクチンファミリーネック領域のN末端に配置される)
を含む融合タンパク質に関する。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
(i)a.コレクチンファミリー糖質認識ドメイン;および
b.コレクチンファミリーネック領域
を含むコレクチンファミリー三量体化ドメイン;
(ii)リンカーエレメント;ならびに
(iii)該コレクチンファミリーネック領域のN末端に配置される、エフェクターポリペプチド
を含む、融合タンパク質。
(項目2)
上記糖質認識ドメインが、サーファクタントタンパク質−D、サーファクタントタンパク質−A1、サーファクタントタンパク質−A2、マンナン結合タンパク質−C、肝臓コレクチン1、胎盤コレクチン1またはコレクチン−11の糖質認識ドメインである、項目1に記載の融合タンパク質。
(項目3)
上記糖質認識ドメインが、1つ以上のアミノ酸の変異または置換を含む、項目1または2のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目4)
上記糖質認識ドメインが、サーファクタントタンパク質Dの糖質認識ドメインであり、上記置換が、配列番号21のフェニルアラニン355の置換であり、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよびグルタミンから選択される極性アミノ酸に変異される、項目3に記載の融合タンパク質。
(項目5)
上記コレクチンファミリーネック領域が、サーファクタントタンパク質−D、サーファクタントタンパク質−A1、サーファクタントタンパク質−A2、マンナン結合タンパク質−C、肝臓コレクチン1、胎盤コレクチン1またはコレクチン−11のネック領域である、項目1〜4のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目6)
上記リンカーエレメントが、25以下のアミノ酸長を有する、項目1〜5のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目7)
上記リンカーエレメントが、アラニン、トレオニン、グリシンおよびセリンから選択されるアミノ酸で構築される、項目1〜6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目8)
上記エフェクターポリペプチドが、TNFスーパーファミリーのサイトカイン、その受容体結合ドメインまたはサイトカインに対する受容体である、項目1〜7のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目9)
上記エフェクターポリペプチドが、TNFスーパーファミリーのサイトカイン、その受容体結合ドメインまたはサイトカインに対する受容体の変異体である、項目1〜7のうちの1項に記載の融合タンパク質。
(項目10)
上記エフェクタータンパク質が、TNFスーパーファミリーのサイトカイン、その受容体結合ドメインまたは変異体であり、そのようなサイトカインのN末端ストーク領域が、上記融合タンパク質中に包含されない、項目8または9のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目11)
上記TNFスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインが、TRAIL、CD95L、APRIL、LIGHTおよびRANK−Lまたはそれらのそれぞれの受容体結合ドメインから選択される、項目1〜10のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目12)
サイトカインに対する上記受容体が、TRAIL−R1、TRAIL−R2、LTベータR、TNFRSF13B、TNFRSF17およびIL−4R−アルファから選択される、項目1〜10のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目13)
上記エフェクターポリペプチドが、抗体、1本鎖抗体または抗体もしくは1本鎖抗体のフラグメントである、項目1〜7のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目14)
上記抗体、1本鎖抗体または抗体もしくは1本鎖抗体のフラグメントが、TNFスーパーファミリーのサイトカイン、その受容体結合ドメインまたはサイトカインに対する受容体に対して作製されている、項目13に記載の融合タンパク質。
(項目15)
サイトカインに対する上記受容体が、IL4R−アルファである、項目14に記載の融合タンパク質。
(項目16)
上記コレクチンファミリー糖質認識ドメインのC末端に、抗体、1本鎖抗体または抗体もしくは1本鎖抗体のフラグメントを含む、上記項目のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目17)
医薬品として使用するための、項目1〜16のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
(項目18)
腫瘍、感染症、炎症性疾患、代謝性疾患、自己免疫障害、変性疾患および移植拒絶を含む、TNFサイトカインの機能障害に関連する増殖性障害の処置のための、項目8〜12または項目14および15のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
本明細書において開示されるような融合タンパク質は、単量体タンパク質または多量体タンパク質であり得る。好ましくは、その融合タンパク質は、同一であっても異なっていてもよい3つの単量体単位からなる三量体複合体として存在する。好ましくは、その三量体複合体は、3つの同一の融合タンパク質からなる。さらに好ましい実施態様において、その複合体は、本明細書に記載される3つの融合タンパク質間の共有結合(例えば、本明細書に記載されるような、コレクチン三量体化ドメインのシステイン間のジスルフィド架橋の共有結合)によって形成される。
(i)a.コレクチンファミリー糖質認識ドメイン;および
b.コレクチンファミリーネック領域;]
を含むコレクチンファミリー三量体化ドメイン
(ii)リンカーエレメント;ならびに
(iii)エフェクターポリペプチド(ここで、そのエフェクターポリペプチドは、コレクチンファミリーネック領域のN末端に配置される)。
*[]内に提示される数字は、配列番号21を参照する。
以下において、本発明の組換えタンパク質の基本構造を、本明細書に記載されるようなTNF−スーパーファミリーサイトカインに関して例証して示す。この例証は、本発明の一般的な範囲を限定することを意図するのではなく、融合タンパク質に存在する構成要素の全体的な印象を与えるものである。
(i)a.コレクチンファミリー糖質認識ドメイン;および
b.コレクチンファミリーネック領域;]
を含むコレクチンファミリー三量体化ドメイン
(ii)リンカーエレメント;ならびに
(iii)エフェクターポリペプチド(ここで、そのエフェクターポリペプチドは、コレクチンファミリーネック領域のN末端に配置される)。
(GSS)a(SSG)b(GSG)c(式中、a、b、cはそれぞれ、0、1、2、3、4、5または6である。)
(1.1 C末端に位置するコレクチン由来三量体化ドメインによって安定化されるTNF−SFタンパク質の構築)
ヒトコレクチン−11(Col11)、コレクチン−11の「コイルドコイル」(CC11)、ヒト肺サーファクタントタンパク質−D(SP−D)、SP−Dの「コイルドコイル」(CCSPD)から得られた三量体化モチーフ(表2および3)を、CD95Lのヒト受容体結合ドメイン(RBD)(「CD95L−RBD」;Glu142〜Leu281)、ヒトTRAIL−RBD(Gln120〜Gly281)、ヒトLIGHT−RBD(Glu91〜Val240)およびヒトAPRIL−RBD(Lys113〜Leu250)のC末端にそれぞれ融合した。
本明細書に記載されるような融合タンパク質をコードする核酸分子は、融合タンパク質を発現するための好適なベクター中にクローニングされ得る。そのようなベクターを作製するために必要な分子ツールは、当業者に公知であり、そのツールには、制限酵素、ベクターおよびベクターを増やすための好適な宿主が含まれる。
10%FBS、100単位/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンが補充されたDMEM+GlutaMax(GibCo)中で育成されたHek293T細胞を、本明細書に記載されるような融合タンパク質をコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトした。組換えタンパク質を含有する細胞培養上清をトランスフェクトの3日後に収集し、300×gでの遠心分離により不純物を除去した後、0.22μmの滅菌フィルターに通して濾過した。親和性精製のために、4mlの50%Streptactin Sepharose(IBA GmbH,Goettingen,Germany)を2mlカラムに詰め、30mlのリン酸緩衝生理食塩水,pH7.4(PBS;Invitrogen Cat.10010)または緩衝液W(100mM Tris−HCl、150mM NaCl pH8.0)で平衡化した。上記細胞培養上清を4℃において2ml/分の流速でカラムに注いだ。その後、カラムをPBSまたは緩衝液Wで洗浄し、特異的に結合したタンパク質を5×2ml緩衝液E(2.5mMのデスチオビオチン,pH7.4を含むPBSまたは緩衝液W)の添加によって段階的に溶出した。溶出画分のタンパク質内容物を吸光分光法および銀染色SDS−PAGEによって分析した。陽性画分をその後、限外濾過(Sartorius,Vivaspin,10,000Daカットオフ)によって濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によってさらに分析した。
カスパーゼ活性化を分析するために、JurkatA3永久ヒトT細胞株(cat.no.CRL2570,ATCC)による細胞アッセイを使用した。Jurkat細胞を、10%FBS(Biochrom)、100単位/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン(GibCo)が補充されたRPMI1640培地+GlutaMAX(GibCo)を用いてフラスコ中で育成した。アッセイ前に、各ウェルについて100,000個の細胞を96ウェルのマイクロタイタープレートに播種した。架橋抗体ありまたはなしで上記タンパク質を含有する種々の溶液をウェルに添加した(最終容量:200μl)後、37℃で3時間のインキュベーションを行った。20μlの溶解緩衝液(250mM HEPES、50mM MgCl2、10mM EGTA、5%Triton−X−100、100mM DTT、10mM AEBSF,pH7.5)を添加することによって細胞を溶解し、プレートを氷上で30分〜2時間インキュベートした。アポトーシスは、カスパーゼ活性の増加と並行して起こる。それゆえに、特異的なカスパーゼ基質Ac−DEVD−AFC(Biomol)の切断を用いることにより、アポトーシスの程度を測定した。カスパーゼ活性アッセイのために、20μlの細胞溶解物を黒色の96ウェルマイクロタイタープレートに移した。50mM HEPES、1%ショ糖、0.1%CHAPS、50μM Ac−DEVD−AFCおよび25mM DTT,pH7.5を含有する80μlの緩衝液の添加の後、プレートをTecan Infinite F500マイクロタイタープレートリーダーに移し、蛍光強度の増加をモニターした(励起波長400nm、発光波長505nm)。
TRAIL融合タンパク質の影響を測定するため、初代ヒト肝細胞を健常ドナーから調製し、96ウェルプレートにおいて1ウェル当たり25,000個の細胞を使用してWilliams E培地中で培養した。2日目に、培地を10%FCS、ヒトインスリン、Pen/Strep、最小必須培地(MEM)、ピルビン酸ナトリウムおよび10mM Hepesが補充されたDMEM−F12に変更し、もう1日培養した。3日目に、架橋抗体(StrepMabImmo、IBA GmbH)の存在下または非存在下で、様々な濃度の示されるタンパク質によって細胞を刺激した。リガンドと化学療法剤との共処置(cotreatment)の潜在的な肝毒性の影響を評価するために、様々な濃度のTRAIL−ASPD_F335Dを、5mMのドキソルビシンまたは5mMのゲムシタビンと共に共インキュベートした。細胞を37℃かつ5%CO2で5または24時間インキュベートし、その後、「細胞死アッセイ」欄に記載されるようにカスパーゼ活性の測定のために溶解した。
構築されたリガンドへの受容体の結合を測定するために、streptactinでコーティングされた96ウェルマイクロプレートを使用した。従って、一過性にトランスフェクトされたHEK293細胞からの上清、マウス血清または精製タンパク質を、PBS中で1〜3時間、streptactinプレート(IBA GmbH)上に固定化した。試料を、ELISA結合/ブロッキング緩衝液(PBS、0.1%Tween−20、20%SuperBlock T20−PBS(Pierce))中に希釈した。プレートをPBS+0.1%Tween−20で洗浄し、マウス抗TRAIL抗体(Pharmingen、クローンRIK−2)、TRAIL受容体1−Fc(R&D Systems)、TRAIL受容体2−Fc(R&D Systems)、TACI−Fc(R&D Systems)またはHVEM−Fc(R&D Systems)と共に室温で1時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、Fcタンパク質を抗ヒト−または抗マウス−Fc特異的ペルオキシダーゼ結合体化抗体(Sigma)で検出した。呈色反応は1ウェル当たり100μlのTMB基質(Kem−En−Tec Diagnostics)の添加により行われ、停止溶液として25μlの25%H2SO4を添加した後、450nmおよび630nmでの吸光度を、ELISAリーダーを用いて測定した。MS Excelを用いて450nm−630nmとして値を計算した。
ELISAプレート(Nunc Maxisorp)を、滅菌コーティング緩衝液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3、0.025%NaN3,pH9.6)中で、10μg/ウェルの酵母マンナン(Sigma)と共に4℃で一晩インキュベートした。プレートを、最初に緩衝液BB(20mM Tris、140mM NaCl、5mM CaCl2、0.1%BSAおよび20%SuperBlock T20−PBS(Pierce))と共に室温で1時間インキュベートし、次に様々な濃度の示されるリガンドと共に緩衝液BB中でさらに90分間インキュベートした。プレートを緩衝液WB(20mM Tris、140mM NaCl、5mM CaCl2、0.05%Tween−20)で洗浄し、緩衝液BB中においてstreptactin−HRP(IBA GmbH)を使用して検出を行った。プレートを洗浄し、TMB基質(Kem−En−Tec Diagnostics)を用いて発色させた。停止溶液として25μlの25%H2SO4を添加した後、450nmおよび630nmにおける吸光度を、ELISAリーダーを用いて測定した。MS Excelを用いて450nm−630nmとして値を計算した。
雄性CD1マウス(Charles River)に、300μlのPBS(Invitrogen)に溶解された10μgのタンパク質を静脈注射した。0分後(投与前)、5分後、30分後、2時間後、6時間後および24時間後に血液を採取した。各時点について2試料を採取した。血液試料を処理して血清を得、−15℃で保存した。TRAIL融合タンパク質の濃度を、以下(1.9章)に記載されるようにELISAを用いて測定し、半減期を計算した(GraphPad Prism v4.0)。
マウス血清中のTRAILタンパク質(薬物動態研究起源)の濃度を定量するため、96ウェルマイクロプレートを使用するELISA法を使用した。
(2.1 CD95L融合タンパク質(CD95L−ASPD)の特徴づけ)
Streptactinで親和性精製されたCD95L−ASPDから、0.5ml(0.86mgのタンパク質)を、ランニング緩衝液(running buffer)としてPBSを用いて流速0.5ml/分でSuperdex200カラムに充填した。0.5mlの画分を採取した(A1〜A11が示される)。11.92mlにおける主要なピークの保持容量は、サイズ排除標準(size exclusion standard)から決定された170kDaに対応した。これは、そのタンパク質がグリコシル化された単量体で構成される三量体であることを示した。単量体ポリペプチドの計算された分子量は、38kDaである。画分A1〜A11のアリコートをSDS−PAGEおよびカスパーセ活性のために使用した。一定の三量体のピーク(画分A7〜A10)のみを最終分析に使用した。結果を図1に示す。
21〜160:CD95L受容体結合ドメイン
161〜171:可撓性リンカーエレメント(A−リンカー;イタリック)
172〜209:ヒトSP−Dのコイルドコイル「ネック」領域
210〜327:ヒトSP−DのC型レクチンドメイン
328〜338:リンカーエレメント(GGSPSSSSSSA)
339〜346:Strep−tagII(WSHPQFEK)。
親和性精製されたLIGHT−ASPDから、0.5ml(1.56mg)をSuperdex200カラムに充填し、ランニング緩衝液としてPBSを用いて、0.5ml/分で分離した。11.96mlで検出される主要なピークは、170〜180kDaのサイズに対応したことから、LIGHT−ASPDが3つのグリコシル化された単量体で構成される三量体であることが示された。三量体のピーク(画分A7〜A10)を採取し、最終的な分析に使用した。挿入図は、2つの独立する精製された三量体LIGHT−ASPDバッチ(0917および0918と命名される)の銀染色SDS−PAGEを示す。結果を図5に示す。
21〜170:LIGHT受容体結合ドメイン
171〜181:可撓性リンカーエレメント(A−リンカー;イタリック)
182〜219:ヒトSP−Dのコイルドコイル「ネック」領域
220〜337:ヒトSP−DのC型レクチンドメイン
338〜348:リンカーエレメント(GGSPSSSSSSA)
349〜356:Strep−tagII(WSHPQFEK)。
HEK293細胞を、TRAIL融合タンパク質をコードする24個の異なる発現ベクターで一過性にトランスフェクトした(表6)。
エンドヌクレアーゼ制限部位に下線を付している(HindIII,AAGCTT;BamHI,GGATCC;NotI,GCGGCCGC)。翻訳開始コドンは太字である。
21〜181:TRAIL受容体結合ドメイン
182〜192:可撓性リンカーエレメント(A−リンカー;イタリック)
193〜230:ヒトSP−Dのコイルドコイル「ネック」領域
231〜348:ヒトSP−DのC型レクチンドメイン
349〜359:リンカーエレメント(GGSPSSSSSSA)
360〜367:Strep−tagII(WSHPQFEK)
21〜181:TRAIL受容体結合ドメイン
182〜192:可撓性リンカーエレメント(A−リンカー;イタリック)
193〜230:ヒトSP−Dのコイルドコイル「ネック」領域
231〜238:リンカーエレメント(PSSSSSSA)
239〜246:Strep−tagII(WSHPQFEK)
21〜181:TRAIL受容体結合ドメイン
182〜192:可撓性リンカーエレメント(A−リンカー;イタリック)
193〜224:ヒトコレクチン−11のコイルドコイル「ネック」領域
225〜347:ヒトコレクチン−11のC型レクチンドメイン
348〜357:リンカーエレメント(GSPSSSSSSA)
358〜365:Strep−tagII(WSHPQFEK)
21〜181:TRAIL受容体結合ドメイン
182〜193:可撓性リンカーエレメント(A−リンカー;GSS GSS GSS GSGイタリック)
194〜229:ヒトコレクチン11のコイルドコイル「ネック」領域
230〜238:リンカーエレメント(GPSSSSSSA)
239〜246:Strep−tagII(WSHPQFEK)。
HEK293細胞を、種々のTRAIL受容体選択的SPDコンストラクトをコードする発現プラスミドで一過性にトランスフェクトした。
21〜181:TRAILR1mut受容体結合ドメイン
182〜192:可撓性リンカーエレメント(A−リンカー;イタリック)
193〜230:ヒトSP−Dのコイルドコイル「ネック」領域
231〜348:ヒトSP−DのC型レクチンドメイン
349〜359:リンカーエレメント(GGSPSSSSSSA)
360〜367:Strep−tagII(WSHPQFEK)
21〜181:TRAILR2mut受容体結合ドメイン
182〜192:可撓性リンカーエレメント(A−リンカー;イタリック)
193〜230:ヒトSP−Dのコイルドコイル「ネック」領域
231〜348:ヒトSP−DのC型レクチンドメイン
349〜359:リンカーエレメント(GGSPSSSSSSA)
360〜367:Strep−tagII(WSHPQFEK)。
親和性精製されたTRAIL−ASPD_F335Aを、図24に示されるように、Superdex200カラムに0.5mlのPBS溶液(0.4mgのタンパク質)を充填することによってサイズ排除クロマトグラフィーに供した。タンパク質を、ランニング緩衝液としてPBSを用いて0.5ml/分で分離し、0.5mlの画分を採取した(A1〜A13が示される)。12.27mlの保持容量は、サイズ排除標準から決定された135〜145kDaに対応する。これは、40kDaという予測される単量体重量から計算されるように、TRAIL−ASPD_F335Aがホモ三量体であることを示した。8.32および10.68mlにおける2つの追加的ピークは、TRAIL−ASPD_F335A凝集物の形成を示した。三量体ピークのみを後の分析に使用した。
21〜181:TRAIL受容体結合ドメイン
182〜192:可撓性リンカーエレメント(A−リンカー;イタリック)
193〜230:ヒトSP−Dのコイルドコイル「ネック」領域
231〜348:ヒトSP−DのC型レクチンドメイン(Phe変異(太字))
349〜359:リンカーエレメント(GGSPSSSSSSA)
360〜367:Strep−tagII(WSHPQFEK)
21〜181:TRAIL受容体結合ドメイン
182〜192:可撓性リンカーエレメント(A−リンカー;イタリック)
193〜230:ヒトSP−Dのコイルドコイル「ネック」領域
231〜348:ヒトSP−DのC型レクチンドメイン(Asp変異(太字))
349〜359:リンカーエレメント(GGSPSSSSSSA)
360〜367:Strep−tagII(WSHPQFEK)。
いくつかの種由来の野生型の完全長オリゴマーSP−Dタンパク質ならびにヒトSP−Dの三量体ネック+CRDは、いくつかの異なる糖質に結合することが示されている。加えて、ヒトSP−Dのネック+CRDはまた、好中球等の免疫細胞に対する走化性因子として働くことによって、免疫調節効果を発揮することが示されている(Caiら,1999,Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 276:131−136)。他の細胞も、SP−Dによってリクルートされ得る。マルトースの添加が走化性機能を阻害したので、ヒトSP−Dのネック+CRDの走化性作用は、糖結合機能に依存することが示された。従って、SP−D媒介走化性機能を有するTNFSFのリガンドは、天然アミノ酸配列を有するリガンドまたはそのコンストラクトに比べて、より優れた活性を有し得る。例えば、がんの処置等の細胞効果が望ましいシナリオでは、そのような記載されるリガンドが望ましいことがある。
TRAIL−SPD融合タンパク質の半減期を測定するために、10マイクログラムのTRAIL−ASPD(A)またはTRAIL−ASPD_F335D(B)を雄性CD1マウスに静脈注射し、いくつかの時点の後(投与前、5分後、30分後、2時間後、6時間後および24時間後)、血清試料を採取した。マウス血清中のTRAILタンパク質をELISAによって定量し、そのデータを使用して半減期を計算した。結果を図31に示す。分析された2種のタンパク質については、TRAIL−ASPD(A)およびTRAIL−ASPD_F335D(B)に対して7〜14時間という半減期が計算された。観察期間中、動物は死亡せず、不耐性の徴候も示さなかった。このデータは、げっ歯類において3〜5分の範囲の半減期を有すると報告されている野生型TRAIL(Kelleyら2001)に比べ、少なくとも80倍の血清半減期の改良を示す。
TRAIL−ASPD、TRAIL−ASPD_F335AまたはTRAIL−ASPD_F335Dの潜在的な肝毒性の影響を分析するために、初代ヒト肝細胞(PHH)を、架橋抗体(抗Strep−tagII)有りまたは無しで、様々な濃度の示されるTRAIL−SPD融合タンパク質と共にインキュベートした。コントロールとして、CD95Lの安定化された改変体であるCD95L−T4(WO2008/025516に記載される)を使用した。結果を図32に示す。
HEK293細胞を、APRIL−A69(WO2008025516)、APRIL−ASPD、APRIL−ACCSPDまたはAPRIL−ACol11をコードする発現ベクターで一過性にトランスフェクトした。3日後、上清をウェスタンブロッティングによって分泌タンパク質について分析した。結果を図33に示す。APRIL融合タンパク質の検出のために、Strep−tagIIに特異的な抗体を使用した。矢印は、40kDa付近で検出された特異的バンド(それぞれ、APRIL−ASPDおよびAPRIL−ACol11を示す)ならびに25kDa付近で検出された特異的バンド(それぞれ、APRIL−A69およびAPRIL−ACCSPD)を示している。従って、APRIL発現カセットは、機能的であり、タンパク質の分泌は、タンパク質が適切に折り畳まれていることを示した。分析された他のTNFSFタンパク質については、最も高い分泌タンパク質のレベルが、ヒトSP−Dのコイルドコイル「ネック」+CRDで構成される三量体化モチーフに融合されたAPRILに対して見出された(APRIL−ASPD、レーン番号2)。APRIL−ASPDを、受容体TACIへの結合を分析するために使用した。
21〜158:APRIL−RBD
159〜169:可撓性リンカーエレメント(A−リンカー;GSS GSS GSS GSイタリック)
170〜207:ヒトSP−Dのコイルドコイル「ネック」領域
208〜325:ヒトSP−DのC型レクチンドメイン
326〜336:リンカーエレメント(GGSPSSSSSSA)
337〜344:Strep−tagII(WSHPQFEK)。
1本鎖(sc)Fv−SPD融合タンパク質に関して例となるアミノ酸配列を以下に示す(配列番号52、53)。
21〜140:重鎖可変ドメイン
141〜155:リンカーエレメント
156〜264:軽鎖可変ドメイン
265〜276:A−リンカー
277〜431:SPD−モチーフ(motiv)(ネック+CRD)
432〜441:リンカーエレメント
442〜450:Strep−tagII(WSHPQFEK)
21〜140:重鎖可変ドメイン
141〜155:リンカーエレメント
156〜264:軽鎖可変ドメイン
265〜276:A−リンカー
277〜431:SPD−モチーフ(motiv)(ネック+CRD)
432〜441:リンカーエレメント
442〜450:Strep−tagII(WSHPQFEK)。
Claims (11)
- (i)a.コレクチンファミリー糖質認識ドメイン;および
b.コレクチンファミリーネック領域
を含むコレクチンファミリー三量体化ドメイン;
(ii)リンカーエレメント;
(iii)該コレクチンファミリーネック領域のN末端に配置される、エフェクターポリペプチドであるTRAILまたはその受容体結合ドメイン;ならびに
(iv)該糖質認識ドメインのC末端に融合された、抗体、1本鎖抗体または抗体もしくは1本鎖抗体のフラグメント
を含む、融合タンパク質。 - 前記糖質認識ドメインが、サーファクタントタンパク質−D、サーファクタントタンパク質−A1、サーファクタントタンパク質−A2、マンナン結合タンパク質−C、肝臓コレクチン1、胎盤コレクチン1またはコレクチン−11の糖質認識ドメインである、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記糖質認識ドメインが、1つのアミノ酸の変異または置換を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記糖質認識ドメインが、サーファクタントタンパク質Dの糖質認識ドメインであり、前記置換が、配列番号21のフェニルアラニン355の置換であり、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよびグルタミンから選択される極性アミノ酸に変異される、請求項3に記載の融合タンパク質。
- 前記コレクチンファミリーネック領域が、サーファクタントタンパク質−D、サーファクタントタンパク質−A1、サーファクタントタンパク質−A2、マンナン結合タンパク質−C、肝臓コレクチン1、胎盤コレクチン1またはコレクチン−11のネック領域である、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記リンカーエレメントが、25以下のアミノ酸長を有する、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記リンカーエレメントが、アラニン、トレオニン、グリシンおよびセリンから選択されるアミノ酸で構築される、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記エフェクターポリペプチドが、TRAILまたはその受容体結合ドメインの変異体であり、該TRAILまたはその受容体結合ドメインの変異体が、R130E、G160M、Y189A、Y189Q、R191K、Q193S、Q193R、E195R、N199V、N199R、K201R、Y213W、T214R、S215D、H264R、I266L、D267Q、D269H、D269R、およびD269Kからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記TRAILのN末端ストーク領域が、前記融合タンパク質中に包含されない、請求項8に記載の融合タンパク質。
- 前記受容体結合ドメインが、TRAIL−R1およびTRAIL−R2から選択される受容体に結合する、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 腫瘍、感染症、炎症性疾患、代謝性疾患、自己免疫障害、変性疾患および移植拒絶を含む、TNFサイトカインの機能障害に関連する増殖性障害の処置のための、請求項1に記載の融合タンパク質を含む組成物。
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