CN108289928A - 改进的微生物-结合分子和其用途 - Google Patents

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Abstract

本文描述了改造的微生物‑靶向分子、微生物‑靶向制品、包含其的试剂盒和其用途。这样的微生物‑靶向分子、微生物‑靶向制品或包含其的试剂盒可不仅结合或捕获微生物或其微生物物质，而且它们具有改进的检测微生物或微生物物质的能力(例如，提高的灵敏性或信号强度)。因此，本文所述的微生物‑靶向分子、微生物‑靶向制品和/或试剂盒可用于各种应用，例如但不限于用于检测微生物或微生物物质的测定法、用于诊断和/或治疗在受试者或任何环境表面中由微生物引起的感染的诊断和/或治疗剂、和/或用于从流体中除去微生物或微生物物质的装置。

Description

改进的微生物-结合分子和其用途
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求2015年8月6日提交的美国临时申请号62/201,745的权益，其内容通过引用以其整体结合到本文中。
政府支持
本发明在由Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA)授予的资助号N66001-11-1-4180下在政府支持下进行。政府对本发明具有一定权利。
序列表
本申请包含序列表，其以ASCII格式电子提交，和通过引用以其整体结合到本文中。所述ASCII副本创建于2016年8月3日，名称为002806-084581-PCT_SL.txt和大小为102,798字节。
技术领域
本公开内容总体上涉及用于检测和/或除去在样品或靶区域(包括受试者的体液例如血液和组织、食品、水和环境表面)中的微生物的分子、产品、试剂盒和方法。
背景
败血症是人和其它动物中发病率和死亡率的主要原因。在美国，败血症是在重病看护病房中具有非创伤性疾病的患者的第二大死亡原因。其还是幼小家畜的主要死亡原因，影响7.5-29%的新生小牛，并且在新生马驹中是常见的医学问题。尽管过去几十年在治疗严重感染中取得重大进展，但败血症导致的发生率和死亡率持续上升。
败血症由微生物系统性侵入血液产生，和可产生两个不同的问题。第一，微生物的生长可直接破坏组织、器官和血管功能。第二，微生物的毒性组分可导致快速的系统性炎性反应，其可迅速破坏重要器官和导致循环衰竭(即，败血病性休克)，和经常导致死亡。
存在由感染生物的类型表征的三种主要类型的败血症。例如，革兰氏阴性败血症最经常被分离(病例致死率为约35%)。大多数这些感染由大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)引起。革兰氏阳性病原体例如葡萄球菌属(Staphylococci)和链球菌(Streptococci)是败血症的第二主要原因。主要的第三组包括真菌，其中真菌感染引起相对小的百分比的败血症病例，但具有高死亡率；这些类型的感染还在免疫受损的患者中具有较高的发生率。
许多具有败血症或疑似败血症的患者在24-48小时内显示快速衰弱。已报道，为了从抗微生物疗法中获益，具有败血病性休克的患者需要在小于6小时内适应性治疗。因此，快速、可靠和灵敏的诊断和治疗方法对于有效的患者护理而言是必需的。此外，除了医学应用(例如，用于预防人群感染和败血症)之外，对于非医学应用，例如食品、水和/或环境测试，以高灵敏性快速检测病原体的能力也将具有极大价值。因此，对改进的试剂和技术仍存在需要，其不仅可提供高亲和力结合以捕获微生物(例如，病原体)和/或微生物物质，而且可提供高-灵敏性检测能力以检测微生物(例如，病原体)和/或微生物物质的存在。
简述
本文描述的实施方案至少部分地基于改造微生物-靶向分子或微生物-结合分子，其不仅提供对微生物和/或微生物物质的高亲和力结合，而且提供微生物和/或微生物物质的高-灵敏性检测。例如，本发明人已改造了FcMBL的改进变体，其显示更高的灵敏性以在ELISA测定法中检测微生物和/或微生物物质(例如，微生物细胞壁组分和内毒素)，并且还比通常难以制备的全长MBL蛋白更容易地表达蛋白。本文所述的改造的微生物-靶向分子为各种应用提供了有价值的组成部件，所述应用包括但不限于诊断或治疗由微生物或病原体引起的疾病，从样品(包括受试者的体液和组织、食品、水或环境表面)除去微生物或病原体；和开发靶向药物递送装置。
一般而言，微生物-结合分子包含(i)胶原结构域；(ii) Fc结构域；和(iii) 包含螺旋结构域和碳水化合物识别结构域(CRD)的微生物-结合结构域。在一些实施方案中，Fc结构域可将胶原结构域连接至微生物-表面结合结构域。在一些实施方案中，胶原结构域可将Fc结构域连接至微生物-表面结合结构域，和在胶原结构域和Fc结构域之间没有半胱氨酸-富集交联结构域。在一些实施方案中，微生物-表面结合结构域可将胶原结构域连接至Fc结构域，和不连接至微生物-结合结构域的胶原结构域不包含半胱氨酸-富集交联结构域。
不希望受理论的约束，添加胶原结构域至微生物-结合分子增加使用微生物-结合分子作为检测剂的灵敏性(例如，提供更高的可检测信号)，部分是因为胶原结构域可提供多聚化功能，其能够从多个各个本文描述作为单体的微生物-结合分子形成更大的多聚体，因此多聚体可产生与各个单体相比更高的可检测信号。微生物-结合分子的多聚化还可提供各个单体结合微生物和/或微生物物质的增加的亲合力，由此增加微生物检测的灵敏性。备选地或另外，胶原结构域可适合于提供对可检测标记的更多结合位点，其能够产生更高的可检测信号，而不形成较大的多聚体。在一些实施方案中，胶原结构域还可适合于提供补体信号转导能力，其可用作提供补体依赖性细胞毒性(CDC)能力的治疗剂。因此，添加胶原结构域至微生物-结合分子可提供各种设计灵活性，和赋予满足不同应用的需求的各种益处。
由于其提高的灵敏性和设计灵活性，本文描述的改造的微生物-结合分子可用于作为微生物和/或微生物物质的检测剂之外的各种应用。例如，改造的微生物-结合分子还可用作微生物和/或微生物物质的捕获剂。在一些实施方案中，改造的微生物-结合分子可作为可溶性蛋白提供，例如，在治疗性组合物中，或固定至载体支架用于各种应用，从微生物感染或疾病的诊断和/或治疗，到微生物-清除组合物或装置，到药物递送。
其它方面还描述了用于在试验样品或环境表面中检测微生物的存在或不存在，和/或区分不同微生物或病原体的试剂盒和测定法。这样的试剂盒可用于分析，例如通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)、荧光免疫吸附测定法(FLISA)、免疫荧光显微术、荧光原位杂交(FISH)、磁和/或电化学检测或任何其它放射学、化学、酶学或光学检测测定法。在一些实施方案中，本文所述的试剂盒和测定法可适合用于抗生素易感性测试，例如，测定试验样品中微生物对一种或多种抗生素的易感性，而不管微生物的身份是否是已知的。
附图简述
图1A-1B显示根据本文所述的一个实施方案的微生物-结合分子的构建体的示意图(图1A)和相应的氨基酸和核苷酸序列(图1B)。图1A的插图显示在还原和非还原条件下微生物-结合分子的蛋白表达。微生物-结合分子包含FcMBL81 (SEQ ID NO: 34)以及替换Fc部分的铰链区的MBL的胶原部分(SEQ ID NO: 29的残基22-79或等同于SEQ ID NO: 28的残基42-99) (本文亦称为"MBLStem58")。用胶原部分替换Fc部分的铰链区可提供较刚性的构象。图1B以出现的顺序分别公开了SEQ ID NO: 44和17。
图2A-2B显示根据本文所述的另一个实施方案的微生物-结合分子的构建体的示意图(图2A)和相应的氨基酸和核苷酸序列(图2B)。微生物-结合分子包含FcMBL81 (SEQ IDNO: 34)以及与FcMBL81分子的N-末端融合的MBL的胶原部分(SEQ ID NO: 29的残基48-79或等同于SEQ ID NO: 28的残基68-99) (本文亦称为"MBLStem32")。在此实施方案中，MBL胶原部分的纽结(kink)和电荷区被除去。用Fc部分分开MBL的胶原部分和碳水化合物识别结构域可增加对MASP (甘露糖-相关丝氨酸蛋白酶)的可及性和降低胶原结构域和碳水化合物识别结构域之间的更多柔性。图2B以出现的顺序分别公开了SEQ ID NO: 45和21。
图3A-3B显示使用rhMBL和本文所述的微生物-结合分子的不同实施方案作为检测试剂，甘露聚糖检测ELISA的实例。图3A是显示检测在缓冲液中的甘露聚糖的线图。图3B是显示检测在人血液中的甘露聚糖的线图。在两个图中，FcMBL (例如，如国际专利公开号WO2013/012924和WO 2011/090954中所述，其各自的内容通过引用以其整体结合到本文中)用作捕获剂，和rhMBL-HRP和本文所述的微生物-结合分子的指定实施方案分别用作检测剂。
图4是SDS PAGE凝胶的图，其显示在还原和非还原条件下根据本文所述的一些实施方案的微生物-结合分子。微生物-结合分子的相应的氨基酸序列分别由SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 26定义。微生物-结合分子单体形成多聚体，如通过在还原条件下检测的较低分子量蛋白(对应于单体)所证明的。R = 还原条件；NR= 非-还原条件。
图5A-5B是凝胶图，显示在还原和非还原条件下根据本文所述的一些实施方案的微生物-结合分子。微生物-结合分子的相应的氨基酸序列根据指定的标识符，例如"FcStemMBL_A"，见于序列表。微生物-结合分子单体形成多聚体，如通过在还原条件下检测的较低分子量蛋白(对应于单体)所证明的。图5A是SDS-PAGE凝胶图。在SDS-PAGE上观察到二聚体和更高级二硫键键合结构-样结构。图5B是Fc结构域的蛋白质印迹的凝胶图，显示在非-还原条件下形成二聚体的Fc结构域。R = 还原条件；NR= 非-还原条件。
图6是SDS PAGE凝胶的图，显示在还原和非还原条件下根据本文所述的一些实施方案的微生物-结合分子。微生物-结合分子(标记为"StemFcMBL_Ntrimmed"和"StemFcMBL_Ctrimmed")的相应的氨基酸序列分别由SEQ ID NO: 26和SEQ ID NO: 25定义。标记为"SpAStem-FcMBL"的微生物-结合分子的相应的氨基酸序列由SEQ ID NO: 27定义。标记为"MBLstem-Fc-SpAneck-MBLCrd"的微生物-结合分子对应于从N-末端至C-末端包含以下的分子：(i) MBL的胶原结构域，(ii) Fc结构域，(iii) 源自表面活性蛋白A (SP-A)的颈(neck)或螺旋结构域，和(iv) 甘露聚糖-结合凝集素(MBL)的碳水化合物识别结构域。标记为"MBLstem-Fc-SpDneck-SpDCrd"的微生物-结合分子对应于从N-末端至C-末端包含以下的分子：(i) MBL的胶原结构域，(ii) Fc结构域，(iii) 源自表面活性蛋白D (SP-D)的颈或螺旋结构域，和(iv) SP-D的碳水化合物识别结构域。该图显示一些微生物-结合分子单体更容易形成多聚体，如通过在还原条件下检测的较低分子量蛋白(对应于单体)所证明的。R =还原条件；NR= 非-还原条件。
图7是显示用不同量的根据本文所述的一些实施方案的微生物-结合分子检测甘露聚糖的图。
图8是显示根据本文所述的两个实施方案的一些微生物-结合分子的蛋白特征的表格。
图9显示不同的构型和相关特征的示例性微生物-结合分子。例如，在一些实施方案中，微生物-结合分子可具有包含Fc结构域的N-末端结构域、包含碳水化合物识别结构域的C-末端结构域和在N-末端结构域和C-末端结构域之间的胶原结构域。在一些实施方案中，微生物-结合分子可具有包含胶原结构域的N-末端结构域、包含碳水化合物识别结构域的C-末端结构域和在N-末端结构域和C-末端结构域之间的Fc结构域。在一些实施方案中，微生物-结合分子可具有包含胶原结构域的N-末端结构域、包含Fc结构域的C-末端结构域和在N-末端结构域和C-末端结构域之间的碳水化合物识别结构域。根据微生物-结合分子的构型，从微生物-结合分子单体形成的多聚体的大小可改变。
图10是显示使用本文所述的微生物-结合分子的大的多聚体，ELISA检测甘露聚糖的线图。
图11是显示具有不同的组分和构型的各种微生物-结合分子的表格。
图12A-12B显示表明指示的各种微生物-结合分子构建体的特征的实验数据。图12A是显示指示的各种微生物-结合分子构建体的表达产量的表格。图12B是显示通过HPLC和DLS，指示的各种微生物-结合分子构建体的多聚化分析的表格。
图13A-13D显示根据本文所述的一些实施方案的各种微生物-结合分子的构建体的示意图。图13A的插图显示在还原和非还原条件下具有单体Fc结构域的微生物-结合分子的蛋白表达。一些微生物-结合分子作为单体保留(在插图中通过箭头指示)。
图14是示例性的微生物捕获和检测过程或诊断过程的示意图。
图15是包含根据本文所述的一个或多个实施方案的与可检测标记(例如，HRP)偶联的改造的微生物-结合分子的示例性的ELISA测定法的示意图。ELISA测定法可用于任何诊断应用，例如，用于败血症测试。尽管显示FcMBL捕获微生物，但根据本文所述的一个或多个实施方案的微生物-结合分子也可用于捕获微生物或微生物物质。
图16是显示用于微生物检测的浸渍片测定法的一个或多个实施方案的示意图。根据本文所述的一个或多个实施方案的微生物-结合分子和/或任何公认的微生物-捕获分子可附着至膜(例如Biodyne膜)。膜可与试验样品(例如，血液样品)混合，洗涤，与所需的检测剂(例如，酶-连接的微生物-结合分子或对某些微生物例如细菌或真菌的特异性抗体)一起孵育，洗涤和加入用于比色显色的读出试剂。浸渍片测定法可手动进行，或经修改用于自动化。
图17是显示用于微生物检测的基于ELISA的测试的一个或多个实施方案的示意图。试验样品(例如，血液样品)可加入包含微生物-捕获分子包被的磁性粒子(例如，公认的微生物-捕获分子包被的磁性粒子，例如FcMBL包被的磁性粒子和/或用本文所述的一个或多个实施方案的微生物-结合分子包被的磁性粒子)的单管(例如，血液收集容器，例如EDTAVACUTAINER®)。基于ELISA的测试可手动进行，或经修改用于自动化。在一些实施方案中，基于单管的ELISA测定法可用于检测微生物或病原体。
发明详述
对开发具有至少一种或多种以下特征的微生物-结合分子存在需要：(i) 对微生物的高结合亲和力和对检测微生物的高灵敏性的组合；(ii) 凝集素途径活化的能力；(iii) 对血清半衰期的Fc再循环；和(iv) 亲合力、功能性/活化和以高表达纯化和保留在血清中的能力的组合。本文所述的各个方面至少部分地基于本发明人产生FcMBL的改进变体，其显示在ELISA测定法中检测微生物和/或微生物物质(例如，微生物细胞壁组分和内毒素)的更高的灵敏性，并且还比通常难以制备的全长MBL蛋白更容易地表达蛋白。
不同于FcMBL的改进变体，原始FcMBL分子缺少MBL的胶原结构域和半胱氨酸-富集结构域，这二者负责天然MBL的笼-样结构、MASP结合或补体活化、和提高的多聚化。本文使用的术语"FcMBL"是指包含Fc结构域和源自MBL的碳水化合物识别结构域，但不含MBL的胶原结构域或半胱氨酸-富集结构域的融合分子。FcMBL分子的其它信息可见于例如国际专利公开号WO 2013/012924和WO 2011/090954，其各自的内容通过引用以其整体结合到本文中。
尽管FcMBL的改进变体各自包含胶原结构域，但改进变体显著不同于全长MBL分子，部分是因为改进变体不具有MBL的半胱氨酸-富集结构域，和/或改进变体中存在的MBL的胶原结构域被截短和/或通过Fc结构域与MBL的碳水化合物识别结构域分开。因此，本文所述的一些方面涉及改进FcMBL，同时保留FcMBL被纯化和保留在血清中的能力。
MBL是胶原凝集素的一个实例，其形成胶原性Ca2+-依赖性凝集素家族。胶原凝集素家族的每个成员，像MBL，通常由四部分构成：在N-末端的半胱氨酸-富集结构域、胶原结构域、螺旋结构域(例如，卷曲螺旋颈结构域)和碳水化合物识别结构域。因此，本发明人发现的FcMBL的改进变体的设计构型和规则可延伸至其它类型的胶原凝集素，包括例如但不限于表面活性蛋白A (SP-A)、表面活性蛋白D (SP-D)、胶原凝集素肝脏1 (CL-L1)、胶原凝集素胎盘1 (CL-P1)、胶固素胶原凝集素43 kDa (CL-43)、胶原凝集素46 kDa (CL-46)、胶原凝集素肾1 (CL-K1)和胶固素。此外，已预期FcMBL的改进变体的结构设计可适用于修饰非-胶原凝集素微生物-结合蛋白，例如但不限于DC-SIGN、巨噬细胞甘露糖受体和/或糖结合凝集素，以获得本文所述的微生物-结合分子的需要的功能，例如，为提高作为捕获剂的结合亲和力和/或增加作为检测剂的灵敏性，单个微生物-结合分子多聚化形成较大的多聚体。因此，本文所述的各个方面涉及微生物-靶向分子或微生物-结合分子，其不仅提供对微生物和/或微生物物质的高亲和力结合，而且提供微生物和/或微生物物质的高-灵敏性检测。此外，本文所述的微生物-结合分子由于其高蛋白表达，可容易地产生。
由于其提高的灵敏性和设计灵活性，本文所述的改造的微生物-结合分子为各种应用提供有价值的组成部件。在一些实施方案中，本文所述的改造的微生物-结合分子可用作微生物和/或微生物物质的检测剂。在一些实施方案中，改造的微生物-结合分子还可用作捕获剂以从样品(包括受试者的体液和组织、食品、水)或环境表面除去微生物或病原体。在一些实施方案中，改造的微生物-结合分子可作为可溶性蛋白提供，例如，在治疗性组合物中，或固定至载体支架用于各种应用，从诊断和/或治疗微生物感染或疾病，到微生物-清除组合物或装置，到药物递送。包含与其缀合的微生物-靶向分子的载体支架在本文亦称为微生物-靶向制品。因此，本文所述的其它方面涉及使用微生物-结合分子或组合物用于各种应用的方法，以及用于在试验样品或环境表面中检测微生物的存在或不存在，和/或区分不同的微生物或病原体的试剂盒和测定法。这样的试剂盒可用于分析，例如通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)、荧光免疫吸附测定法(FLISA)、免疫荧光显微术、荧光原位杂交(FISH)、磁和/或电化学检测或任何其它放射学、化学、酶学或光学检测测定法。在一些实施方案中，本文所述的试剂盒和测定法可适合用于抗生素易感性测试，例如确定试验样品中的微生物对一种或多种抗生素的易感性，不管微生物的身份是否是已知的。
本文所述的一些方面涉及微生物-结合分子。本文可互换使用的术语“微生物-结合”和“微生物-靶向”是指分子或组合物不仅结合和/或捕获微生物和/或微生物物质，而且当分子或组合物用作检测剂时在检测微生物和/或微生物物质中提供高灵敏性的能力。本文使用的术语"微生物"是指完整或整个微生物，或从微生物衍生、来源或分泌的任何物质或组分。从微生物衍生、来源或分泌的任何物质或组分在文本亦称为"微生物物质"。因此，本文公开的微生物-结合分子可结合/捕获以及检测完整或整个微生物或从微生物衍生、来源或分泌的微生物物质。可结合微生物-靶向分子的示例性的微生物物质可包括但不限于细胞壁组分、外膜、质膜、核糖体、微生物荚膜、纤毛或鞭节、前述微生物组分的任何片段、源自微生物的任何核酸(例如，DNA，包括16S核糖体DNA，和RNA)、微生物内毒素(例如，脂多糖)等。此外，微生物物质可包括可对宿主或环境产生不良影响(例如，毒性)的非存活的微生物物质。
在一些实施方案中，本文所述的微生物-结合分子或组合物可显示对微生物和/或微生物物质的结合亲和力和/或亲合力比参考分子高至少约10%或更多，包括例如，至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或更多。在一些实施方案中，本文所述的微生物-结合分子或组合物可显示对微生物和/或微生物物质的结合亲和力和/或亲合力是参考分子的至少约1.1倍或更大，包括例如，至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约100倍或更多，包括例如，至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或更多。在其中本文所述的微生物-结合分子的碳水化合物识别结构域源自MBL的一些实施方案中，参考分子可以是FcMBL或全长MBL。
在一些实施方案中，本文所述的微生物-结合分子或组合物当用作检测剂时，可显示在检测微生物和/或微生物物质中的灵敏性(例如，对存在的相同量的靶标提供的可检测信号)比参考分子高至少约10%或更多，包括例如，至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或更多。在一些实施方案中，本文所述的微生物-结合分子或组合物当用作检测剂时，可显示在检测微生物和/或微生物物质中的灵敏性(例如，对存在的相同量的靶标提供的可检测信号)是参考分子的至少约1.1倍或更高，包括例如，至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约100倍或更高。在其中本文所述的微生物-结合分子的碳水化合物识别结构域源自MBL的一些实施方案中，参考分子可以是FcMBL或全长MBL。测量试剂作为检测剂的灵敏性的方法是本领域已知的。实施例1显示比较用于检测微生物物质例如甘露聚糖的不同检测剂的灵敏性的示例性的方法。
如本文使用的，术语"检测剂"是指包含以下的分子或组合物：(i) 用于特异性结合待检测的靶标分子的部分或结构域；和(ii) 用于至少一种可检测标记或用于足够量的可检测标记以产生可检测信号的结合部分或结构域。因此，检测剂可结合靶标分子(例如，微生物和/或微生物物质)和至少一种可检测标记。例如，本文所述的微生物-结合分子或组合物可用作检测剂，因为它们可结合微生物和/或微生物物质，并且还结合至少一种可检测标记。不希望受到限制，本文所述的微生物-结合分子或组合物还可用作捕获剂。如本文使用的，术语“捕获剂” 是指包含用于特异性结合待检测的靶标分子的部分或结构域，但不必然包含用于至少一种可检测标记以产生可检测信号的结合部分或结构域的分子或组合物。
一般而言，本文所述的微生物-结合分子包含(i) 胶原结构域；(ii) Fc结构域；和(iii) 包含螺旋结构域和碳水化合物识别结构域(CRD)的微生物-结合结构域。这三个结构域可以任何构型排列，只要得到的微生物-结合分子保留每个结构域的功能。
在一些实施方案中，Fc结构域可将胶原结构域连接至微生物-表面结合结构域。因此，在一个方面，本文描述了微生物-结合分子，其包含：(i) 胶原结构域；(ii) Fc结构域；和(iii) 包含螺旋结构域和碳水化合物识别结构域(CRD)的微生物-结合结构域；其中Fc结构域将胶原结构域连接至微生物-表面结合结构域。
在一些实施方案中，胶原结构域可将Fc结构域连接至微生物-表面结合结构域，并且在胶原结构域和Fc结构域之间没有半胱氨酸-富集交联结构域。因此，在另一方面，本文描述了微生物-结合分子，其包含：(i) 胶原结构域；(ii) Fc结构域；和(iii) 包含螺旋结构域和碳水化合物识别结构域(CRD)的微生物-结合结构域，其中胶原结构域将Fc结构域连接至微生物-表面结合结构域，和其中在胶原结构域和Fc结构域之间不存在半胱氨酸-富集交联结构域。
在该方面和本文描述的其它方面的一些实施方案中，碳水化合物识别结构域可形成微生物-结合分子的C-末端。
在一些实施方案中，微生物-表面结合结构域可将胶原结构域连接至Fc结构域，和不连接至微生物-结合结构域的胶原结构域不包含半胱氨酸-富集交联结构域。因此，在另一方面，本文描述了微生物-结合分子，其包含：(i) 胶原结构域；(ii) Fc结构域；和(iii)包含螺旋结构域和碳水化合物识别结构域(CRD)的微生物-结合结构域；其中微生物-表面结合结构域将胶原结构域连接至Fc结构域，和其中不连接至微生物-结合结构域的胶原结构域不包含半胱氨酸-富集交联结构域。
在该方面和本文所述的其它方面的一些实施方案中，微生物-结合分子可不包括半胱氨酸-富集结构域。如本文使用的，术语"半胱氨酸-富集结构域"是指包含半胱氨酸残基的结构域，所述半胱氨酸残基构成所述结构域的至少10%或更高，包括所述结构域的至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%或更高。在一个实施方案中，半胱氨酸-富集结构域可包含构成所述结构域的约10%至约20%的半胱氨酸残基。例如，MBL的半胱氨酸-富集结构域通常具有ETVTCEDAQKTCPAVIACSSP (SEQ ID NO: 41)的氨基酸序列，其中在24个氨基酸的序列中存在三个半胱氨酸残基。因此，MBL的半胱氨酸-富集结构域包含14%的半胱氨酸残基。通常，半胱氨酸-富集结构域能够与另一个分子的另一个半胱氨酸-富集结构域形成二硫键，从而交联至少两个分子以形成二聚体或更高级的多聚体。在这些实施方案中，不是作为单体存在的多个本文所述的微生物-结合分子在半胱氨酸-富集结构域处通过二硫键共价连接以形成多聚体，微生物-结合分子单体可彼此相互作用，例如，在胶原结构域处通过非共价相互作用，例如疏水和/或氢键相互作用，以形成多聚体。
胶原结构域：如本文使用的，术语"胶原结构域"是包含能够与至少两个或更多个多肽链(例如，其它微生物-结合分子的胶原结构域)形成螺旋结构的多肽链的结构域。在一些实施方案中，胶原结构域是包含能够形成胶原-样三股螺旋的多肽链的结构域。术语"胶原-样三股螺旋"是指由胶原或胶原-样分子的三个多肽链形成的螺旋结构。例如通过保守置换修饰胶原结构域，也在本文所述的范围内。
在一些实施方案中，胶原结构域可包含多个(例如，至少两个或更多个)甘氨酸(Gly)-Xaa1-Xaa2三联体或Xaa1-Xaa2-Gly三联体，基本上由其组成或由其组成，其中Xaa1和Xaa2各自独立地是氨基酸残基。在一些实施方案中，胶原结构域可包含至少5个或更多个(包括例如，至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20个或更多个) Gly-Xaa1-Xaa2三联体，基本上由其组成或由其组成，其中Xaa1和Xaa2各自独立地是氨基酸残基。在一些实施方案中，任何两个相邻的Gly-Xaa1-Xaa2三联体或Xaa1-Xaa2-Gly三联体可通过下文详细定义的接头连接在一起，包括例如，但不限于化学键、氨基酸残基和一组氨基酸残基。
在一些实施方案中，Xaa1和Xaa2可独立地是选自以下的氨基酸残基：丙氨酸；精氨酸；天冬酰胺；天冬氨酸；半胱氨酸；谷氨酸；谷氨酰胺；甘氨酸；组氨酸；异亮氨酸；亮氨酸；赖氨酸；甲硫氨酸；苯丙氨酸；脯氨酸；丝氨酸；苏氨酸；色氨酸；酪氨酸；缬氨酸；同型半胱氨酸；磷酸丝氨酸；磷酸苏氨酸；磷酸酪氨酸；羟基脯氨酸；γ-羧基谷氨酸；马尿酸；八氢吲哚-2-甲酸；抑胃酶氨酸(statine)；1,2,3,4,-四氢异喹啉-3-甲酸；青霉胺(3-巯基-D-缬氨酸)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸；α-甲基-丙氨酸；对苯甲酰基苯丙氨酸；对氨基苯丙氨酸；对氟苯丙氨酸；苯基甘氨酸；炔丙基甘氨酸；N-甲基甘氨酸(肌氨酸, Sar)；和叔丁基甘氨酸；二氨基丁酸；7-羟基-四氢异喹啉甲酸；萘基丙氨酸；联苯基丙氨酸；环己基丙氨酸；氨基-异丁酸(Aib)；正缬氨酸；正亮氨酸(Nle)；叔-亮氨酸；四氢异喹啉甲酸；哌可酸；苯基甘氨酸；同型苯丙氨酸；环己基甘氨酸；去氢亮氨酸；2,2-二乙基甘氨酸；1-氨基-l-环戊烷甲酸；1-氨基-l-环己烷甲酸；氨基-苯甲酸；氨基-萘酸；γ-氨基丁酸；二氟苯丙氨酸；哌啶酸；N-α-咪唑乙酸(IMA)；噻吩基-丙氨酸；叔丁基甘氨酸；去氨基-Tyr；氨基戊酸(Ava)；焦谷氨酸(<Glu)；α-氨基异丁酸(αAib)；γ-氨基丁酸(γAbu)；α-氨基丁酸(αAbu)；αγ-氨基丁酸(αγAbu)；3-吡啶基丙氨酸(Pal)；异丙基-α-Nε赖氨酸(ILys)；萘基丙氨酸(Nal)；α-萘基丙氨酸(α-Nal)；β-萘基丙氨酸(β-Nal)；乙酰基-β-萘基丙氨酸(Ac-β-萘基丙氨酸)；α,β-萘基丙氨酸；Nε –皮考基-赖氨酸(PicLys)；4-卤代-苯基；4-吡咯烷基丙氨酸；异哌啶甲酸(inip)；β-氨基酸；和其异构体、类似物和衍生物。本领域技术人员将知道，该定义包括D-和L-氨基酸；α-, β-和γ-氨基酸；化学修饰的氨基酸；天然存在的非-蛋白源性氨基酸；稀有氨基酸；和具有本领域已知是氨基酸特有的性质的化学合成的化合物。另外，每个实施方案可包括这些组的任何组合。
此外，如本文使用的，术语"氨基酸"包括脱离天然存在的氨基酸的结构，但基本上具有氨基酸的结构的化合物或分子，使得它们可用于置换肽中的天然存在的氨基酸，之后仍保持肽的活性，例如，形成螺旋结构的活性。因此，例如，在一些实施方案中氨基酸还可包括具有侧链修饰或取代的氨基酸，并且还包括相关的有机酸、酰胺等。不受限制，氨基酸可以是蛋白质性或非-蛋白质性氨基酸。如本文使用的，术语"蛋白质性"表示氨基酸可在细胞中通过众所周知的代谢途径掺入蛋白。
在一些实施方案中，Gly-Xaa1-Xaa2三联体或Xaa1-Xaa2-Gly三联体的Xaa1残基可以是脯氨酸和相应的Xaa2残基可以是羟基脯氨酸。甘氨酸和脯氨酸各自的独特大小和骨架角度能够实现紧密的螺旋结构，称为"胶原螺旋"。该标准的三联体可以被高度置换，但如果甘氨酸间隔不存在或省略，则在线性链中引入纽结，如MBL中的"GQG" (SEQ ID NO: 29的aa43-45)。
Gly-Xaa1-Xaa2三联体或Xaa1-Xaa2-Gly三联体不限于胶原，和该段短的基序也存在于免疫系统的许多固有蛋白中，例如但不限于巨噬细胞清道夫(scavenger)受体A、补体蛋白C1q和甘露聚糖-结合凝集素(MBL)。因此，在一些实施方案中，胶原结构域可源自含胶原分子的胶原结构域或其片段。含胶原分子的实例包括但不限于胶原凝集素(例如，但不限于甘露糖结合凝集素、表面活性蛋白)、纤维胶凝蛋白、补体蛋白C1q、巨噬细胞清道夫受体A、天然存在的胶原-样肽(例如，但不限于任何胶原类型(例如，类型I、II、III、IV、V、XI等)、合成的胶原-样肽、其变体和其任何组合。含胶原分子的变体包括但不限于被修饰的突变体，例如，以除去MASP结合，提高补体依赖性细胞毒性(CDC)能力和/或为可检测标记提供另外的结合位点。仅通过实例的方式，MBL (SEQ ID NO: 28)的氨基酸残基75的赖氨酸(在胶原结构域内)对于MASP结合是重要的。当MASP结合对于目标应用是不需要的时，可将氨基酸残基从赖氨酸突变为不同的残基(例如，谷氨酰胺(Q))以除去MASP结合功能。
在一些实施方案中，胶原结构域可包含甘露糖结合凝集素的胶原-样茎、其片段或其变体，基本上由之组成或由之组成。
如本文使用的，术语"片段"一般是指具有与参考分子或蛋白结构域(例如，野生型或亲本分子)具有约20%或更多(包括约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约90%、直至小于100%)同一性或同源性的氨基酸序列，并能够保留(例如，至少50%或更多)参考分子或蛋白结构域的功能的分子或蛋白结构域。例如，当用于提及含胶原分子的胶原结构域时，术语"片段"是指具有与野生型或亲本含胶原分子的胶原结构域具有约20%或更多(包括约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约90%，直至小于100%)同一性或同源性的氨基酸序列，并能够导致本文所述的微生物-结合分子(单体)的多聚化的分子或蛋白结构域。例如，在一些实施方案中，胶原结构域可包含甘露糖结合凝集素的胶原-样茎，其不含电荷区(SEQ ID NO: 28的K49-E61或等同于SEQ ID NO: 29的K29-E41)和/或SEQ ID NO: 28的残基Q64处或等同于SEQ ID NO: 29的Q44处的纽结。
如本文使用的，术语"多聚化"是指例如，通过非共价相互作用例如疏水和/或氢键相互作用保持在一起以形成较大的聚集体(亦称为多聚体)的单体的组合(例如，至少两个单体或更多个)。在一些实施方案中，多聚体可包含例如，通过非共价相互作用保持在一起的至少约10个或更多个(包括例如，至少约15、至少约20或更多个)单体。测定多聚化是否发生的方法是本领域已知的，例如，通过晶体学、蛋白的凝胶电泳、柱色谱(例如，高效液相色谱)、大小排阻色谱(SEC)、动态光散射和其两种或更多种的组合。例如，如图5A显示的，可在还原(变性)条件和非还原(天然)条件下对许多候选微生物-结合分子进行凝胶电泳。在还原(变性)条件下，多聚体将变性为最初形成多聚体的多个单体。因此，通过比较在还原(变性)条件和非还原(天然条件)下测定的蛋白条带的分子量，可确定微生物-结合分子是否形成多聚体。例如，在天然(非还原)条件下，当在凝胶上存在对应于在变性(还原)条件下检测的蛋白条带的分子量的约2倍或更大的分子量的蛋白条带时，表明微生物-结合分子可能形成二聚体或更高级的多聚体。相比之下，如果在还原和非-还原条件之间没有显著差异，表明微生物-结合分子可能作为单体保留，而不是形成多聚体。
在一些实施方案中，胶原结构域可包含选自SEQ ID NO: 7-16的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一个实施方案中，胶原结构域可包含SEQ ID NO: 7或SEQ IDNO: 8的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，胶原结构域可包含选自SEQ ID NO: 7-10和13-16的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成，其中至少一个或一组氨基酸残基(例如，至少2个氨基酸残基、至少3个氨基酸残基、至少4个氨基酸残基、至少5个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少15个氨基酸残基、至少20个氨基酸残基、至少25个氨基酸残基、至少30个氨基酸残基或更多)独立地从选择的序列的C-末端和/或N-末端除去。
尽管胶原结构域可具有任何长度，只要其不显著干扰或妨碍微生物-结合分子与微生物或微生物物质的结合，但在一些实施方案中，胶原结构域可以是至少约15个氨基酸或更大长度。在一些实施方案中，胶原结构域可以是至少约20个氨基酸或更大长度，包括例如，至少约25个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约35个氨基酸、至少约40个氨基酸、至少约50个氨基酸或更大长度。在一些实施方案中，胶原结构域可具有约10个氨基酸至约80个氨基酸的长度。在一些实施方案中，胶原结构域可具有约15个氨基酸至80个氨基酸的长度。在一些实施方案中，胶原结构域可具有约20个氨基酸至60个氨基酸的长度。
不希望受理论的约束，添加胶原结构域可使得到的微生物-结合分子结构更伸长，而不是形成球状结构，这可增加本文所述的微生物-结合分子的亲合力。此外，添加胶原结构域可增加使用微生物-结合分子作为检测剂的灵敏性(例如，提供更高的可检测信号)，部分地因为胶原结构域可提供多聚化功能，其能够从多个本文所述的单个微生物-结合分子作为单体形成更大的多聚体，因此与单个单体相比，多聚体可产生更高的可检测信号。微生物-结合分子的多聚化还可提供单个单体结合微生物和/或微生物物质的增加的亲合力，从而增加微生物检测的灵敏性。
备选地或另外，胶原结构域可适合于为可检测标记提供更多结合位点，这能够产生更高的可检测信号强度，而不必形成较大的多聚体。例如，预期添加胶原结构域可为辣根过氧化物酶(HRP)提供空间有利的结合位点，其不干扰蛋白的功能位点。在该方面和本文所述的其它方面的一些实施方案中，胶原结构域可包含赖氨酸-富集结构域。如本文使用的，术语"赖氨酸-富集结构域"是指包含构成结构域的至少10%或更多(包括结构域的至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%或更多)的赖氨酸残基的结构域。在一个实施方案中，赖氨酸富集结构域可包含至少约10%或更多的赖氨酸残基。不希望受理论的约束，胶原结构域中存在的赖氨酸残基可为可检测标记，例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶(AP)、萤光素酶和/或β-半乳糖苷酶提供结合位点。赖氨酸具有伯胺，其可用于胺反应性偶联化学，以允许偶联各种荧光团、其它标记和/或标记中间体。胶原结构域中存在的赖氨酸残基还可允许用这些蛋白和/或本文所述的微生物-结合分子将表面官能化。
在一些实施方案中，胶原结构域还可适合于提供补体信号转导能力，其可用作提供补体依赖性细胞毒性(CDC)能力的治疗剂。在一些情况下，取决于各种应用例如体内给予用于治疗败血症，补体或凝固活化可能是不需要的。在这样的实施方案中，胶原结构域可适合于除去补体信号转导能力。通过实例的方式，当胶原结构域源自甘露糖-结合凝集素或其片段时，SEQ ID NO: 28的氨基酸残基K75或L76 (或等同于SEQ ID NO: 29的氨基酸残基K55或L56)周围并包括它们的至少约1个氨基酸残基(包括例如，至少约2个氨基酸残基、至少约3个氨基酸残基、至少约4个氨基酸残基、至少约5个氨基酸残基、至少约6个氨基酸残基、至少约7个氨基酸残基、至少约8个氨基酸残基、至少约9个氨基酸残基、至少约10个氨基酸残基或更多)可被突变、除去或插入。在一些实施方案中，SEQ ID NO: 28的残基75 (或等同于SEQ ID NO: 29的氨基酸残基55)处的氨基酸残基赖氨酸(K)可被突变为谷氨酰胺(Q)。甚至在没有MASP结合位点的突变的情况下，预期在一些实施方案中，胶原结构域可失去天然的MASP结合能力，这是因为Fc结构域的存在，其可干扰该功能。因此，添加胶原结构域至微生物-结合分子可提供各种设计灵活性和赋予各种益处以满足不同应用的需求。
Fc结构域：如本文使用的，术语"Fc结构域"是包含免疫球蛋白的天然片段结晶(Fc)区或其Fc变体的至少一部分的结构域。术语"天然Fc"是指包含源自完整抗体的非抗原结合片段的序列的分子或序列，无论是单体还是多聚体形式。天然Fc通常由单体多肽组成，其可通过共价(即，二硫键)和非共价缔合连接成二聚体或多聚体形式。天然Fc分子的单体亚基之间的分子间二硫键的数量范围可以是1-4，取决于类型(例如，IgG、IgA、IgE)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgGA2)。本文使用的术语"天然Fc"是单体、二聚体和多聚体形式的总称。
术语"Fc变体"是指从天然Fc修饰但仍至少包含用于FcRn结合或蛋白A结合的位点的分子或序列。可使用国际申请WO 97/34631和WO 96/32478 (其内容通过引用并入本文)中描述的Fc变体，其包括在Fc结构域中。在一些实施方案中，Fc变体可包含从非-人天然Fc人源化的分子或序列。在一些实施方案中，Fc变体可包含通过保守置换而具有至少一个或多个修饰的分子或序列。在一些实施方案中，Fc变体可包含天然Fc，其中为各种目的而除去至少一个或多个位点。例如，从天然Fc除去的那些位点提供对于本文所述的微生物-结合分子不需要的结构特征或生物学活性。因此，在一些实施方案中，Fc变体可包含缺少一个或多个天然Fc位点或残基的分子或序列，所述天然Fc位点或残基影响或参与例如，(1) 二硫键形成，(2) 与选择的宿主细胞不相容，(3) 在选择的宿主细胞中表达时N-末端异质性，(4)糖基化，(5) 与补体相互作用，(6) 与并非清道夫受体的Fc受体结合，例如，FcRn，(7) 抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)，或其两种或更多种的组合。对天然Fc结构域进行修饰，例如，通过保守置换，也在本文所述的范围内。
术语"Fc结构域"包括单体或多聚体形式的分子。术语"多聚体"在应用于Fc结构域或包含Fc结构域的分子时是指具有共价、非共价或通过共价和非共价相互作用二者缔合的两个或更多个多肽链的分子。例如，IgG分子的Fc结构域可形成二聚体；IgM，五聚体；IgD，二聚体；和IgA，单体、二聚体、三聚体或四聚体。术语"二聚体"在应用于Fc结构域或包含Fc结构域的分子时是指具有共价或非共价缔合的两个多肽链的分子。
仅通过实例的方式，IgG1可以单体形式(例如，相对于与其偶联的微生物-结合结构域，Fc分子是单体的)或二聚体形式(例如，相对于与其偶联的微生物-结合结构域，Fc分子是二聚体的)存在。单体IgG1 Fc的氨基酸序列或信息可见于例如，Ying 等人 "SolubleMonomeric IgG1 Fc." Journal of Biological Chemistry (2012) 287: 19399-19408；和Dumont 等人 "Monomeric Fc fusions: impact on pharmacokinetic and biologicalactivity of protein therapeutics." BioDrugs (2006) 20(3): 151-60。在一个实施方案中，具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的来自IgG1的单体Fc或其变体可包括在Fc结构域中。在此实施方案中，Fc结构域不形成多聚体，和每个单体Fc结构域直接或间接偶联至本文所述的微生物-结合结构域。在另一个实施方案中，具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的来自IgG1的二聚体Fc或其变体可包括在Fc结构域中。在此实施方案中，Fc结构域形成二聚体和二聚体Fc结构域间接或直接偶联至本文所述的微生物-结合结构域。
在一些实施方案中，Fc结构域可包含选自铰链结构域、CH2结构域、CH3结构域和其任何组合的至少一个区域。通过实例的方式，在一些实施方案中，Fc结构域可包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，铰链结构域可不包括在Fc结构域中。
Fc结构域可源自任何免疫球蛋白，包括例如，但不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括它们的亚类(例如，IgG1)或其修饰的分子或重组体。在一个实施方案中，Fc结构域可源自IgG。在一些实施方案中，Fc结构域可源自任何物种。在一个实施方案中，Fc结构域可源自哺乳动物来源(例如，人来源)。在一个实施方案中，IgG可源自哺乳动物IgG (包括例如，但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)或其部分。
在一些实施方案中，Fc结构域可包含选自SEQ ID NO: 1-6的氨基酸序列或其变体，基本上由之组成或由之组成。
在一些实施方案中，Fc结构域可经配置或用于促进和/或增强本文所述的改造的微生物-结合分子的表达和纯化。已表明N末端Fc改进融合配偶体的表达水平、蛋白折叠和分泌。此外，Fc具有葡萄球菌蛋白A结合位点，其可用于一步纯化蛋白A亲和色谱。参见Lo KM等人 (1998) Protein Eng. 11: 495-500。此外，蛋白A结合位点可用于促进在不存在钙离子的情况下表达蛋白A或表达蛋白G的微生物的结合。这样的结合能力可用于开发区分试验样品中存在的表达蛋白A的微生物(例如，金黄色葡萄球菌)与不表达蛋白A或不表达蛋白G的微生物(例如，大肠杆菌)的方法。
在一些实施方案中，相对于天然序列，例如，本文定义的天然Fc，Fc结构域可包含至少一个突变，例如，以改变改造的微生物-结合分子的性能。例如，在一些实施方案中，Fc结构域以及由此本文所述的微生物-结合分子的效应子功能(例如细胞介导的补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC))可降低，例如，通过突变SEQ ID NO: 4、5或6的残基107处的氨基酸赖氨酸(K)为丙氨酸(A)。使用源自人IgG1的编号，该突变亦称为K322A。在一些实施方案中，Fc结构域的糖基化可被除去，例如，通过SEQ ID NO: 4、5或6的残基82处天冬氨酸(D)置换(其中野生型残基82是天冬酰胺(N))。使用源自人IgG1的编号，该突变亦称为N297D。其它突变，例如位于CH2和CH3结构域之间的界面处，显示于Hinton 等人 (2004) J Biol Chem. 279:6213-6216和Vaccaro C. 等人 (2005) Nat Biotechnol.23: 1283-1288，还可用于增加IgG1和由此改造的微生物-结合分子的半衰期。在一些实施方案中，Fc结构域中的突变可适合于修饰重链和/或更低的铰链-Cγ2结构域，突变CH2/CH3接点，调节糖基化，优化融合配偶体，增加化合价或其两种或更多种的组合。关于这样的修饰的实例的其它信息可见于例如，Czajkowsky 等人 "Fc-fusion proteins: newdevelopments and future persepctives" (2012) EMBO Mol Med. 4(10):1015-1028(包括增补信息)，其各自的内容通过引用以其整体结合到本文中。用于所需应用的各种Fc修饰是本领域已知的。对于任何已知的Fc序列，本领域技术人员可修饰Fc序列以进行或除去功能。
尽管Fc结构域在本文所述的微生物-结合分子的不同的实施方案中举例说明，但预期任何其它分子(例如，蛋白、肽、肽模拟物、核酸、适体和抗体)，其可(i)促进本文所述的微生物-结合分子的表达和/或纯化，和/或增加其半衰期，和/或形成多聚体(例如，至少二聚体或更高级的多聚体)，也可用于替换Fc结构域。可用于替换Fc结构域的分子的实例包括但不限于C1q、亮氨酸拉链基序、toll-样受体、白细胞介素、胶原凝集素颈结构域(包括例如，纤维胶凝蛋白、表面活性蛋白A和D)、IgM或其它免疫球蛋白、亲和标签(包括例如，MYC、HA、His和/或FLAG)和其任何组合。
Fc结构域可以任何长度提供，以满足应用的需要。在一些实施方案中，Fc结构域可具有约15个氨基酸至约80个氨基酸，或约19个氨基酸至约60个氨基酸，或约30个氨基酸至约50个氨基酸的长度。
包含螺旋结构域和碳水化合物识别结构域的微生物-结合结构域：本文使用的术语"微生物-结合结构域"是指可特异性结合微生物或病原体的表面(例如，微生物或病原体的表面上存在的任何组分，或从微生物或病原体衍生、来源或分泌的任何物质或组分/片段)的任何分子或其片段。因此，不需要整个微生物-结合结构域能够特异性结合微生物或微生物物质。可用于微生物-结合结构域的分子可包括例如，但不限于，肽、多肽、蛋白、肽模拟物、抗体、抗体片段(例如，抗体的抗原结合片段)、碳水化合物-结合蛋白例如凝集素、糖蛋白、糖蛋白-结合分子、氨基酸、碳水化合物(包括单糖、二糖、三糖和多糖)、脂质、类固醇、激素、脂质-结合分子、辅因子、核苷、核苷酸、核酸(例如，DNA或RNA，核酸的类似物和衍生物，或适体)、肽聚糖、脂多糖、小分子和其任何组合。在一些实施方案中，微生物-结合结构域可包含模拟可特异性结合微生物或病原体的表面或微生物物质的分子或其片段的肽模拟物。例如，微生物-结合结构域可包含模拟螺旋结构域和碳水化合物识别结构域或其片段(例如，MBL的螺旋结构域和碳水化合物识别结构域或其片段)的肽模拟物。
本文所述的微生物-结合分子的微生物-结合结构域包含螺旋结构域和碳水化合物识别结构域。如本文使用的，术语"螺旋结构域"是指包含在溶液中单独或与本文所述的碳水化合物识别结构域结合能够采取螺旋结构(例如，平行三聚体三股螺旋结构)的多肽链的结构域。在一些实施方案中，螺旋结构域可与其它螺旋肽形成螺旋的卷曲螺旋结构(例如，α-螺旋的卷曲螺旋结构)。螺旋肽可卷曲在一起。在一些实施方案中，至少两个或更多个，包括例如，至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或更多个螺旋结构域可卷曲在一起，形成卷曲螺旋结构。因此，螺旋结构域可促进微生物-结合结构域的多聚化。在一些实施方案中，螺旋结构域还可促进碳水化合物-识别结构域与微生物或微生物物质的亲和结合，例如，至少约30%或更高，包括例如，至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或更高。在一些实施方案中，螺旋结构域可促进碳水化合物-识别结构域与微生物或微生物物质的亲和结合，例如，至少约1.1倍或更高，包括例如，至少约1.5倍、至少约2倍、至少3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约100倍或更高。
可形成卷曲螺旋的蛋白或肽以及从蛋白序列预测卷曲螺旋结构的方法是本领域已知的。例如，Spiricoil数据库可用于预测对于任何测序的生物的卷曲螺旋存在。CC+是在Protein Data Bank (PDB)中发现的卷曲螺旋的相关数据库。STRAP是从氨基酸序列预测卷曲螺旋的算法。本领域技术人员可使用任何公认的数据库和算法以设计螺旋结构域的氨基酸序列。为了确定设计的螺旋结构域序列是否影响多个微生物-结合结构域的多聚化，可在还原和非还原条件下进行蛋白的凝胶电泳或早期论述的关于鉴定能够诱导多聚体形成的胶原结构域的其它方法。为了确定设计的螺旋结构域序列是否影响碳水化合物识别结构域的亲和结合，可进行功能测定法以测定与参考序列相比的微生物和/或微生物物质的结合效率。
在一些实施方案中，螺旋结构域可源自含螺旋分子，其选自胶原凝集素(例如，甘露糖结合凝集素)、甘露糖-结合蛋白、表面活性蛋白凝集素(例如，表面活性蛋白D)、纤维胶凝蛋白、天然存在的或合成的螺旋肽，和其任何组合。
在一个实施方案中，螺旋结构域可包含PDGDSSLAASERKALQTEMARIKKWLTFSLGKQ(SEQ ID NO: 40)的氨基酸序列或其部分，基本上由之组成或由之组成，例如，其中几个氨基酸残基(例如，1、2、3个氨基酸残基)从任一端或两端除去。在一个实施方案中，螺旋结构域可包含PDGDSSLAASERKALQTEMARIKKWLTFSLGKQ (SEQ ID NO: 40)的氨基酸序列或其部分，基本上由之组成或由之组成，例如，其中几个氨基酸残基(例如，1、2、3个氨基酸残基)从序列的N-末端除去。
在一些实施方案中，螺旋结构域和碳水化合物识别结构域二者可源自相同的下文所述的微生物-结合分子或碳水化合物-结合蛋白。例如，在一个实施方案中，微生物-结合结构域可包含：MBL的螺旋结构域(亦称为MBL的颈区)，例如，具有SEQ ID NO: 40的氨基酸序列；和MBL的碳水化合物识别结构域，例如，具有SEQ ID NO: 32的氨基酸序列。在一个实施方案中，微生物-结合结构域可包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，螺旋结构域和碳水化合物结构域可各自源自不同的下文所述的微生物-结合分子和/或碳水化合物-结合蛋白。仅通过实例的方式，螺旋结构域可源自第一微生物-结合分子(例如，表面活性蛋白A)，而碳水化合物识别结构域可源自第二微生物-结合分子(例如，MBL)，只要与偶联至源自相同来源的螺旋结构域的碳水化合物识别结构域相比，碳水化合物识别结构域保留至少50%或更多的结合微生物或微生物物质的能力。
螺旋结构域和碳水化合物识别结构域可通过下文详细定义的接头连接在一起，包括例如，但不限于化学键、氨基酸残基和一组氨基酸残基。
本文可互换使用的术语"碳水化合物识别结构域"或"CRD"是指这样的结构域，其至少一部分可结合微生物或病原体的表面上的碳水化合物，或从微生物或病原体衍生、来源或分泌的任何物质或组分/片段，例如，微生物物质。在一些实施方案中，碳水化合物识别结构域可包含全长CRD的至少约50%，包括至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或更多，其能够结合微生物表面上的碳水化合物和/或微生物物质。在一些实施方案中，100%的碳水化合物识别结构域可用于结合微生物或病原体。在其它实施方案中，碳水化合物识别结构域可包含不能进行碳水化合物结合，但可具有其它特征或实现其它功能，例如当与微生物或病原体相互作用时提供对碳水化合物识别结构域的灵活性的另外的区域。
CRD可从中衍生的示例性的碳水化合物-结合蛋白包括但不限于，凝集素、胶原凝集素、表面活性蛋白(例如，表面活性蛋白D)、纤维胶凝蛋白、甘露糖-结合凝集素(MBL)、麦芽糖-结合蛋白、阿拉伯糖-结合蛋白和葡萄糖-结合蛋白。CRD可从中衍生的另外的碳水化合物-结合蛋白可包括但不限于，源自植物的凝集素(lectin或agglutinin)，例如，来自雪花属(Galanthus) (雪花莲)植物的雪花凝集素(GNA)，和花生凝集素。在一些实施方案中，五聚环蛋白家族成员(例如，C-反应蛋白)或其片段也可用于CRD。五聚环蛋白家族成员通常可结合有荚膜的微生物。不受限制，碳水化合物-结合蛋白可以是野生型、重组或融合蛋白。这样的碳水化合物-结合蛋白的相应的碳水化合物识别结构域是本领域已知的，和可经修饰用于本文所述的改造的微生物-结合分子的各种实施方案。
任何公认的重组碳水化合物-结合蛋白或碳水化合物识别结构域可用于改造的微生物-结合分子。例如，重组甘露糖-结合凝集素，例如但不限于公开于美国专利号5,270,199、6,846,649、美国专利申请号US 2004/0229212和2011年1月19日提交的PCT公开号WO2011/090954 (其所有的内容通过引用并入本文)中的那些，可用于构建本文所述的微生物-靶向分子。
在一些实施方案中，CRD源自MBL，后者为胶原凝集素蛋白家族的成员。天然MBL是由亚基构成的多聚体结构(例如，约650 kDa)，每个亚基包含三个相同的多肽链。每个MBL多肽链(包含248个氨基酸残基长度，具有信号序列：SEQ ID NO: 28)包含N-末端半胱氨酸富集区、胶原-样区、颈区和碳水化合物识别结构域(CRD)。每个区的序列已被鉴定，并且是本领域众所周知的。SEQ ID NO: 29是MBL的全长氨基酸序列，不含信号序列。在一些实施方案中，信号序列对应于SEQ ID NO: 28的氨基酸1-20，即SEQ ID NO: 30。
MBL的碳水化合物识别结构域(CRD)的全长氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 32。在一些实施方案中，改造的MBL分子的碳水化合物识别结构域可包含SEQ ID NO: 32或37的氨基酸序列或其片段，例如，截短形式的SEQ ID NO: 32或37，其中约1-3个氨基酸从C-末端和N-末端的一端或两端被独立地除去。在一些实施方案中，碳水化合物识别结构域可包含SEQID NO: 32或37的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成，其中至少一个或一组氨基酸残基(例如，至少2个氨基酸残基、至少3个氨基酸残基、至少4个氨基酸残基、至少5个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少15个氨基酸残基、至少20个氨基酸残基、至少25个氨基酸残基、至少30个氨基酸残基或更多)从选择的序列的C-末端和/或N-末端被独立地除去或添加。在一些实施方案中，碳水化合物识别结构域可包含SEQ ID NO: 32或37的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成，其中至少一个或一组氨基酸残基(例如，至少2个氨基酸残基、至少3个氨基酸残基、至少4个氨基酸残基、至少5个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少15个氨基酸残基、至少20个氨基酸残基、至少25个氨基酸残基、至少30个氨基酸残基或更多)从选择的序列的C-末端除去或添加。
在一些实施方案中，本文所述的微生物-结合分子的CRD可包含"KQ"氨基酸残基，例如，在CRD结构域的N-末端。参见例如，SEQ ID NO: 37。
在一些实施方案中，微生物-结合结构域可包含通过"KQ"氨基酸残基偶联在一起的螺旋结构域和CRD。
在一些实施方案中，用于本文所述的改造的微生物-结合分子的MBL的碳水化合物识别结构域或其片段可以是野生型分子或重组分子。对本文所述的CRD片段的修饰，例如通过保守置换，也在本文所述的范围内。
在一些实施方案中，本文所述的微生物-结合分子的CRD可源自糖-结合分子，其选自糖结合凝集素(例如，甘露糖结合凝集素、胶原凝集素、表面活性蛋白)、DC-SIGN、巨噬细胞甘露糖受体和其任何组合。
在一些实施方案中，本文所述的微生物-结合分子的CRD可包含甘露糖结合凝集素2 (MBL2)的CRD或其片段。
在一些实施方案中，微生物-结合结构域可包含选自SEQ ID NO: 28-29、31和33-36的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
本文所述的不同结构域，例如胶原结构域、Fc结构域、螺旋结构域和/或碳水化合物识别结构域，是本文所述的微生物-结合分子的组成部件，和可以不同的顺序排列，只要得到的微生物-结合分子保留结合和检测微生物和/或微生物物质的能力。图1A-2B和图13A-13D显示根据本文所述的一些实施方案的微生物-结合分子的示意图。在本领域技术人员范围内对这些实施方案的修改也在本文所述的范围内。
图1A显示微生物-结合分子，从N-末端至C-末端包含MBL的胶原结构域、Fc结构域和MBL的微生物-结合结构域。胶原结构域在N-末端不包含半胱氨酸-富集结构域。尽管图1A-1B说明了胶原结构域包含电荷区、纽结和MASP结合位点，但不解释为限制性的。在一些实施方案中，电荷区和纽结可从胶原结构域除去，例如，如图2A-2B所示。此外，在图1A-1B和图2A-2B中的Fc结构域可按上所述修饰，例如，含或不含铰链结构域和/或含Fc结构域中的突变，例如以除去糖基化。
图13A显示微生物-结合分子，从N-末端至C-末端包含Fc结构域、MBL的胶原结构域和微生物-结合结构域(包含MBL的颈和CRD结构域)，其中在胶原结构域和Fc结构域之间没有半胱氨酸-富集结构域。MBL的胶原结构域中的Q64得到保留。在此实施方案中，当微生物-结合分子形成多聚体时，当微生物-表面-结合结构域与目标微生物或微生物物质结合时在多聚体的顶点的Fc位点可以是高度可接近的。在一些实施方案中，Fc结构域可以是二聚体Fc。在一些实施方案中，Fc结构域可以是单体Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域可包含铰链。在一些实施方案中，Fc结构域可不包含铰链。
图13B显示微生物-结合分子，从N-末端至C-末端包含Fc结构域、MBL的胶原结构域和微生物-结合结构域(包含MBL的颈和CRD结构域)，其中在胶原结构域和Fc结构域之间没有半胱氨酸-富集结构域。在此实施方案中，负责结合MASP的结构域(例如，K75Q)被突变。
图13C显示微生物-结合分子，从N-末端至C-末端包含具有纽结和电荷区的MBL的胶原结构域、Fc结构域和微生物-结合结构域(包含MBL的颈和CRD结构域)。在此实施方案中，微生物-结合分子可允许提高表达，同时恢复MASP结合区。
图13D显示微生物-结合分子，从N-末端至C-末端包含没有纽结和电荷区的MBL的胶原结构域、微生物-结合结构域(包含MBL的颈和CRD结构域)和Fc结构域。
在一些实施方案中，微生物-结合分子可从N-末端至C-末端包含Fc结构域、没有纽结和电荷区的MBL的胶原结构域、和微生物-结合结构域(包含MBL的颈和CRD结构域)，其中在胶原结构域和Fc结构域之间没有半胱氨酸-富集结构域。在一个实施方案中，微生物-结合分子可进一步包含第二胶原结构域，其保留结合MASP和激活凝集素途径所需的最小序列。
在其中胶原结构域包含MBL的胶原茎的电荷区的一些实施方案中，Fc结构域可不包括铰链区。
在其中Fc结构域包含铰链的一些实施方案中，胶原结构域可不包括MBL的胶原茎的电荷区。
在一些实施方案中，微生物-结合分子可包含选自SEQ ID NO: 17-27的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
因为本文所述的微生物-结合分子可用作检测试剂，在本文所述的微生物-结合分子的任何实施方案中，微生物-结合分子可进一步包含与其偶联的可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记可与本文所述的微生物-结合分子的Fc结构域和/或胶原结构域融合，从而形成重组融合蛋白。在一些实施方案中，通过共价或非共价相互作用，例如疏水相互作用和/或氢键，可检测标记可结合Fc结构域和/或胶原结构域上可利用的可检测标记-结合位点或与其相互作用。例如，在一个实施方案中，本文所述的微生物-结合分子可用作第二抗体，例如，在免疫测定法例如ELISA中，例如，在图15中。
如本文使用的，术语"可检测标记"是指能够产生指示靶标存在的可检测信号的组分。可检测标记包括通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段可检测的任何组分。合适的标记包括生物素、荧光分子、放射性同位素、核苷酸发色团、酶、底物、化学发光部分、生物发光部分等。因此，标记是通过本文所述的方法和装置所需的光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段可检测的任何组分。
在一些实施方案中，可检测标记可以是成像剂或造影剂。如本文使用的，术语"成像剂"是指分子中允许检测、成像和/或监测病况、病理学病症和/或疾病的存在和/或进展的元素或官能团。成像剂可以是发生回波的物质(液体或气体)、非金属同位素、光学报告子(reporter)、硼中子吸收剂、顺磁金属离子、铁磁金属、γ-发射放射性同位素、正电子-发射放射性同位素或x-射线吸收剂。如本文使用的，术语"造影剂"是指改变包含分子的组织或器官的光学性质的任何分子。可改变的光学性质包括但不限于吸光度、反射率、荧光、双折射率、光散射等。在一些实施方案中，可检测标记还包括可促进受试者的组织或器官的成像或可视化的任何成像剂(例如但不限于气泡、脂质体、球体、造影剂或本文所述的任何可检测标记)，例如用于诊断感染。
合适的光学报告子包括但不限于，荧光报告子和化学发光基团。各种荧光报告染料是本领域已知的。通常，荧光团是芳族或杂芳族化合物，和可以是芘、蒽、萘、吖啶、芪、吲哚、苯并吲哚、噁唑、噻唑、苯并噻唑、花青、羰花青、水杨酸酯、邻氨基苯甲酸酯、香豆素、荧光素、若丹明或其它类似的化合物。
示例性的荧光团包括但不限于：1,5 IAEDANS；1,8-ANS；4-甲基伞形酮；5-羧基-2,7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-FAM)；5-羧基萘基荧光素(pH 10)；5-羧基四甲基若丹明(5-TAMRA)；5-FAM (5-羧基荧光素)；5-羟基色胺(HAT)；5-ROX (羧基-X-若丹明)；5-TAMRA(5-羧基四甲基若丹明)；6-羧基若丹明6G；6-CR 6G；6-JOE；7-氨基-4-甲基香豆素；7-氨基放射菌素D (7-AAD)；7-羟基-4-甲基香豆素；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶；ABQ；酸性品红；ACMA (9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)；吖啶橙；吖啶红；吖啶黄；锥虫黄；锥虫黄FeulgenSITSA；水母发光蛋白(发光蛋白)；Alexa Fluor 350™；Alexa Fluor 430™；Alexa Fluor488™；Alexa Fluor 532™；Alexa Fluor 546™；Alexa Fluor 568™；Alexa Fluor 594™；Alexa Fluor 633™；Alexa Fluor 647™；Alexa Fluor 660™；Alexa Fluor 680™；茜素络合酮；茜素红；别藻蓝蛋白(APC)；AMC、AMCA-S；AMCA (氨基甲基香豆素)；AMCA-X；氨基放射菌素D；氨基香豆素；苯胺蓝；Anthrocyl stearate；APC-Cy7；APTS；AstrazonBrilliant Red 4G；Astrazon Orange R；Astrazon Red 6B；Astrazon Yellow 7 GLL；米帕林；ATTO-TAG™ CBQCA；ATTO-TAG™ FQ；金胺；Aurophosphine G；Aurophosphine；BAO 9(双氨基苯基噁二唑)；BCECF (高pH)；BCECF (低pH)；硫酸黄连素；β-内酰胺酶；BFP蓝色偏移GFP (Y66H)；BG-647；Bimane；双苯甲酰胺；Blancophor FFG；Blancophor SV；BOBO™ -1；BOBO™ -3；Bodipy 492/515；Bodipy 493/503；Bodipy 500/510；Bodipy 505/515；Bodipy530/550；Bodipy 542/563；Bodipy 558/568；Bodipy 564/570；Bodipy 576/589；Bodipy581/591；Bodipy 630/650-X；Bodipy 650/665-X；Bodipy 665/676；Bodipy Fl；Bodipy FLATP；Bodipy Fl-神经酰胺；Bodipy R6G SE；Bodipy TMR；Bodipy TMR-X缀合物；BodipyTMR-X, SE；Bodipy TR；Bodipy TR ATP；Bodipy TR-X SE；BO-PRO™ -1；BO-PRO™ -3；Brilliant Sulphoflavin FF；钙黄绿素；钙黄绿素蓝；钙Crimson™；钙绿；钙绿-1 Ca2+染料；钙绿-2 Ca2+；钙绿-5N Ca2+；钙绿-C18 Ca2+；钙橙；卡尔科弗卢尔白；羧基-X-若丹明(5-ROX)；瀑布蓝™；瀑布黄；儿茶酚胺；CFDA；CFP - 氰基荧光蛋白；叶绿素；色霉素A；色霉素A；CMFDA；Coelenterazine；Coelenterazine cp；Coelenterazine f；Coelenterazinefcp；Coelenterazine h；Coelenterazine hcp；Coelenterazine ip；Coelenterazine O；香豆素鬼笔环肽；CPM甲基香豆素；CTC；Cy2™；Cy3.1 8；Cy3.5™；Cy3™；Cy5.1 8；Cy5.5™；Cy5™；Cy7™；氰基GFP；环AMP荧光传感器(FiCRhR)；d2；Dabcyl；丹酰；丹酰胺；丹酰尸胺；丹酰氯；丹酰DHPE；丹酰氟；DAPI；Dapoxyl；Dapoxyl 2；Dapoxyl 3；DCFDA；DCFH (二氯二氢荧光素二乙酸酯)；DDAO；DHR (二氢若丹明123)；Di-4-ANEPPS；Di-8-ANEPPS (non-ratio)；DiA (4-Di-16-ASP)；DIDS；二氢若丹明123 (DHR)；DiO (DiOC18(3))；DiR；DiR (DiIC18(7))；多巴胺；DsRed；DTAF；DY-630-NHS；DY-635-NHS；EBFP；ECFP；EGFP；ELF 97；伊红；藻红；藻红ITC；乙啡啶同型二聚体-1 (EthD-1)；Euchrysin；氯化铕(III)；铕；EYFP；Fast Blue；FDA；Feulgen (副蔷薇苯胺)；FITC；FL-645；Flazo Orange；Fluo-3；Fluo-4；荧光素二乙酸酯；Fluoro-Emerald；Fluoro-Gold (羟基芪脒)；Fluor-Ruby；FluorX；FM 1-43™；FM 4-46；Fura Red™ (高pH)；Fura-2, 高钙；Fura-2, 低钙；Genacryl Brilliant Red B；GenacrylBrilliant Yellow 10GF；Genacryl Pink 3G；Genacryl Yellow 5GF；GFP (S65T)；GFP红移(rsGFP)；GFP野生型, 非-UV激发(wtGFP)；GFP野生型, UV激发(wtGFP)；GFPuv；GloxalicAcid；粒状蓝；血卟啉；Hoechst 33258；Hoechst 33342；Hoechst 34580；HPTS；羟基香豆素；羟基芪脒(FluoroGold)；羟基色胺；碘二羰花青(DiD)；碘三羰花青(DiR)；Intrawhite Cf；JC-1；JO-JO-1；JO-PRO-1；LaserPro；Laurodan；LDS 751；Leucophor PAF；Leucophor SF；Leucophor WS；丽丝胺若丹明；丽丝胺若丹明B；LOLO-1；LO-PRO-1；萤光黄；Mag Green；Magdala Red (根皮红B)；镁绿；镁橙；孔雀绿；Marina Blue；Maxilon Brilliant Flavin10 GFF；Maxilon Brilliant Flavin 8 GFF；部花青；甲氧基香豆素；Mitotracker GreenFM；Mitotracker Orange；Mitotracker Red；光神霉素；Monobromobimane；Monobromobimane (mBBr-GSH)；Monochlorobimane；MPS (甲基绿派若宁芪)；NBD；NBDAmine；尼罗河红；硝基苯并噁二唑；去甲肾上腺素；Nuclear Fast Red；Nuclear Yellow；Nylosan Brilliant Iavin E8G；Oregon Green™；Oregon Green 488-X；Oregon Green™488；Oregon Green™ 500；Oregon Green™ 514；太平洋蓝；副蔷薇苯胺(Feulgen)；PE-Cy5；PE-Cy7；PerCP；PerCP-Cy5.5；PE-TexasRed (Red 613)；根皮红B (Magdala Red)；Phorwite AR；Phorwite BKL；Phorwite Rev；Phorwite RPA；Phosphine 3R；光致抗蚀剂；藻红蛋白B [PE]；藻红蛋白R [PE]；PKH26 ；PKH67；PMIA；Pontochrome Blue Black；POPO-1；POPO-3；PO-PRO-1；PO-PRO-3；樱草灵；Procion Yellow；Propidium Iodi (PI)；PyMPO；芘；派若宁；派若宁B；Pyrozal Brilliant Flavin 7GF；QSY 7；芥奎吖因；试卤灵；RH 414；Rhod-2；若丹明；若丹明110；若丹明123；若丹明5 GLD；若丹明6G；若丹明B 540；若丹明B200 ；若丹明B extra；若丹明BB；若丹明BG；若丹明绿；若丹明Phallicidine；若丹明鬼笔环肽；若丹明红；若丹明WT；玫瑰红；R-藻红蛋白(PE)；红移GFP (rsGFP, S65T)；S65A；S65C；S65L；S65T；蓝宝石GFP；血清素；Sevron Brilliant Red 2B；Sevron Brilliant Red 4G；Sevron Brilliant Red B；Sevron Orange；Sevron Yellow L；sgBFP™；sgBFP™ (superglow BFP)；sgGFP™；sgGFP™ (super glow GFP)；SITS；SITS (樱草灵)；SITS (芪异硫代磺酸)；SPQ (6-甲氧基-N-(3-磺基丙基)-喹啉鎓)；芪；磺基若丹明B can C；磺基若丹明GExtra；四环素；四甲基若丹明；Texas Red™；Texas Red-X™缀合物；硫代二羰花青(DiSC3)；噻嗪红R；噻唑橙；硫磺素5；硫磺素S；硫磺素TCN；Thiolyte；Thiozole Orange；Tinopol CBS (卡尔科弗卢尔白)；TMR；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；TriColor (PE-Cy5)；TRITC (四甲基若丹明异硫代氰酸酯)；True Blue；TruRed；Ultralite；Uranine B；Uvitex SFC；wt GFP；WW 781；XL665；X-若丹明；XRITC；二甲苯橙；Y66F；Y66H；Y66W；黄GFP；YFP；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1；和YOYO-3。可获得和可使用许多合适形式的这些荧光化合物。
在一些实施方案中，荧光团可与本文所述的微生物-结合分子的Fc结构域和/或胶原结构域融合，从而形成重组融合蛋白。在一些实施方案中，通过共价或非共价相互作用例如疏水相互作用和/或氢键，荧光团可结合Fc结构域和/或胶原结构域上可利用的可检测标记-结合位点或与其相互作用。
其它示例性的可检测标记包括发光和生物发光标志物(例如，生物素、萤光素酶(例如，细菌、萤火虫、叩头虫等)、萤光素和水母发光蛋白)、放射性标记(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如，半乳糖苷酶、葡糖苷酸酶、磷酸酶(例如，碱性磷酸酶)、过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶)和胆碱酯酶)和量热标记，例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯和胶乳)珠。教导使用这样的标记的专利包括美国专利号3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241，其各自通过引用结合到本文中。
合适的发生回波的气体包括但不限于：六氟化硫或全氟化碳气体，例如全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟环丁烷、全氟戊烷或全氟己烷。合适的非金属同位素包括但不限于11C、14C、13N、18F、123I、124I和125I。合适的放射性同位素包括但不限于99mTc、95Tc、111In、62Cu、64Cu、Ga、68Ga和153Gd。合适的顺磁金属离子包括但不限于Gd(III)、Dy(III)、Fe(III)和Mn(II)。合适的X-射线吸收剂包括但不限于Re、Sm、Ho、Lu、Pm、Y、Bi、Pd、Gd、La、Au、Au、Yb、Dy、Cu、Rh、Ag和Ir。
在一些实施方案中，放射性核素与连接至微生物-结合分子的螯合剂或螯合剂-接头结合。用于直接缀合的合适的放射性核素包括，而不限于，18F、124I、125I、131I和其混合物。与螯合剂一起使用的合适的放射性核素包括，而不限于，47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、105Rh、111Ag、111In、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At、212Bi和其混合物。合适的螯合剂包括但不限于DOTA、BAD、TETA、DTPA、EDTA、NTA、HDTA、它们的膦酸酯类似物和其混合物。本领域技术人员熟悉用于连接放射性核素、螯合剂和螯合剂-接头至分子例如本文公开的微生物-靶向分子和载体支架的方法。
检测这样的标记的手段是本领域技术人员众所周知的。因此，例如，放射性标记可使用照相胶片或闪烁计数器检测，荧光标志物可使用光检测器检测，以检测发射的光。酶标记通常通过提供酶底物给酶，和检测由酶对酶底物的作用产生的反应产物进行检测，和量热标记可通过使有色标记可视化检测。用于可检测标记的体内检测或成像的示例性的方法包括但不限于放射照相术、磁共振成象(MRI)、正电子发射断层照相术(PET)、单光子发射计算体层摄影术(SPECT，或较不常用，SPET)、闪烁照相术、超声、CAT扫描、光声成像、热相图、直线断层摄影、复式体层照相术、厚层体层照相术、全景断层摄影(OPT或OPG)和计算机体层摄影术(CT)或计算机轴向体层摄影术(CAT扫描)。
在一些实施方案中，可检测标记可包括酶。用作可检测标记的示例性的酶包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、萤光素酶、β-半乳糖苷酶和其任何组合。在一些实施方案中，酶可与本文所述的微生物-结合分子的Fc结构域和/或胶原结构域融合，从而形成重组融合蛋白。在这些实施方案中，酶的氨基酸序列可对于目标物种(例如哺乳动物物种)进行优化。例如，哺乳动物-优化的HRP的氨基酸序列由SEQ ID NO: 38定义，和相应的核苷酸序列由SEQ ID NO: 39定义。在一些实施方案中，通过共价或非共价相互作用例如疏水相互作用和/或氢键，酶可结合Fc结构域和/或胶原结构域上可利用的可检测标记-结合位点或与其相互作用。
在一些实施方案中，可检测标记可包括与可检测剂缀合的微生物酶底物。例如，可检测剂可以是任何部分，其当通过微生物具有或分泌的酶从微生物酶底物裂解时形成可检测部分，但在其缀合状态时不可检测。微生物酶底物是对于待检测的一种或多种类型的微生物特异性的底物，和其可根据微生物具有或分泌的酶进行选择。对于使用这样的可检测标记来检测微生物，参见例如国际专利申请WO 2011/103144，其内容通过引用结合到本文中。
在一些实施方案中，可检测标记是荧光团或量子点。不希望受理论的约束，使用荧光试剂可减少成像/读出中的信噪比，从而维持灵敏性。因此，在一些实施方案中，检测之前，从微生物-结合基底分离或保持结合在微生物-结合基底上的微生物可用至少一种染色剂染色，例如，包含微生物-结合分子的至少一种荧光染色试剂，其中微生物-结合分子包含荧光团或量子点。荧光染色剂的实例包括但不限于与荧光团或量子点缀合的任何微生物-结合分子，和用于本文所述的检测的任何荧光染色剂。
在一些实施方案中，可检测标记可用于检测和增强技术。例如，在用可检测标记标记的微生物-结合分子上结合的微生物可经分离以富集含微生物的样品，以增强信号检测。在一些实施方案中，可检测标记可包含金属粒子。金属粒子的实例可包括任何金属的粒子，包括例如，但不限于例如，金粒子和/或银粒子。在一些实施方案中，可检测标记可包含磁性粒子。在这些实施方案中，可在检测微生物之前进行磁性分离。
在一些实施方案中，可检测标记可经配置以包括"智能标记(smart label)"，其当与微生物-结合分子缀合时不可检测，但当在微生物酶的存在下从改造的分子释放时产生颜色改变。因此，当微生物结合改造的微生物-结合分子时，微生物释放酶，其从改造的分子释放可检测标记。观察到颜色改变表明样品中存在微生物。
在一些实施方案中，可检测标记可以是生色或生荧光微生物酶底物，使得当微生物结合改造的微生物-靶向分子时，微生物释放的酶可与可检测标记相互作用以产生颜色变化。这样的微生物酶底物的实例可包括但不限于吲哚酚丁酸酯、吲哚酚葡糖苷、七叶灵、magneta葡糖苷、red- -葡萄糖醛酸苷、2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基-D-吡喃葡萄糖苷、2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基-D-cetamindo-2-脱氧吡喃葡萄糖苷和任何其它公认的微生物酶底物。这样的实施方案可用作微生物或病原体的存在的指示物。
如先前论述的，在一个方面，本发明人已开发了微生物-结合分子，其可形成较大的聚集体，或称为多聚体，其不仅可促进本文所述的单个微生物-结合分子结合微生物和/或微生物物质的亲合力结合，而且可增加微生物-结合分子作为检测剂的灵敏性限制。因此，在一个方面，本文提供了微生物-结合多聚体分子。微生物-结合多聚体分子包含根据本文所述的任何实施方案的第一微生物-结合分子；和根据本文所述的任何实施方案的第二微生物-结合分子，其中第一微生物-结合分子的螺旋结构域与第二微生物-结合分子的螺旋结构域形成卷曲结构；和第一微生物-结合分子的胶原结构域与第二微生物-结合分子的胶原结构域或本文所述的第三微生物-结合分子的胶原结构域形成螺旋结构。在一些实施方案中，第一微生物-结合分子的胶原结构域可与第二微生物-结合分子的胶原结构域或本文所述的第三微生物-结合分子的胶原结构域形成三股螺旋结构。
在一些实施方案中，第一、第二和第三微生物-结合分子可具有相同的类型。在一些实施方案中，第一、第二和第三微生物-结合分子中的至少两个或全部可具有不同的类型。
微生物-结合多聚体分子可包含任何数量的作为单体存在的本文所述的微生物-结合分子。例如，通过以不同的构型排列微生物-结合结构域、Fc结构域和胶原结构域，微生物-结合多聚体分子可包含至少10个或更多(包括例如，至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、23、至少24个或更多)作为单体的微生物-结合分子。
在一些实施方案中，作为单体的微生物-结合分子可不包括本文定义的半胱氨酸-富集结构域。在这些实施方案中，不是具有在半胱氨酸-富集结构域处通过二硫键共价连接以形成多聚体的多个作为单体存在的本文所述的微生物-结合分子，微生物-结合分子单体可彼此相互作用，例如在胶原结构域处，通过非共价相互作用(例如疏水和/或氢键相互作用)，以形成多聚体。
本文所述的微生物-结合分子还可用作捕获剂。为各种应用和/或目的，改造的微生物-结合分子可固定或缀合到任何基底上。例如，为在使用期间容易操作，改造的微生物-结合分子可固定在固体基底上，例如，用于分离、观察或显微镜成像。
因此，本文提供的另一方面是用于靶向或结合微生物的制品或产品，其包含与载体支架或其表面缀合的至少1种(包括至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少10种、至少25种、至少50种、至少100种、至少250种、至少500种或更多)改造的微生物-结合分子。“载体支架”在本文亦称为“载体基底”。在一些实施方案中，载体支架的表面可用本文公开的微生物-结合分子包被。如本文使用的，术语“制品”是指任何明显的物理微尺度或大尺度物体。包含与载体支架缀合的微生物-结合分子的制品在本文亦称为“微生物-结合制品”或“微生物-结合制品”。
不受限制，载体支架可选自各种材料和呈各种形式。例如，载体支架可以珠或粒子(包括纳米粒子、微粒、聚合物微珠、磁性微珠等)、滤纸、纤维、筛、网、管、中空纤维、支架、板、槽、金粒子、磁性材料、平面形状(例如矩形条或圆盘，或弯曲表面例如棍)、通常以测定格式使用的其它基底和其任何组合的形式使用。
载体支架的实例包括但不限于：核酸支架、蛋白支架、脂质支架、树状聚体、微粒或微珠、纳米管、微量滴定板、医疗器械(例如，针或导管)或移植物、浸渍片或试纸条、微芯片、过滤装置或膜、膜、诊断条、中空纤维反应器、微流体装置、活细胞和生物组织或器官、身体外装置、混合元件(例如，螺旋式混合器)等。在一些实施方案中，载体支架可呈连续的卷状物的形式，在其上存在呈连续的线或一系列斑点的形式的试验区域和任选的参考区域。
载体支架可由任何材料制成，包括但不限于金属、金属合金、聚合物、塑料、纸、玻璃、织物、包装材料、生物材料例如细胞、组织、水凝胶、蛋白、肽、核酸和其任何组合。
在一些实施方案中，本文公开的微生物-结合制品可用于捕获、检测或除去来自任何来源或在任何流体例如生物流体(例如，血液样品)、环境流体或表面(例如，废水、建筑或机械表面)或可食用物质或流体(例如，食品、水)中的微生物污染物。在其中流体是血液的一些实施方案中，在用微生物-结合磁性微珠从自受试者收集的血液除去微生物/病原体后，血液可作为治疗性干预循环回到同一受试者。在一些实施方案中，本文公开的微生物-结合制品可作为收集用于鉴定的潜在病原体的工具，用于诊断；不仅用于疾病的诊断，而且用于水或食品携带的病原体、颗粒或其它污染物的鉴定。或者，载体支架可包含中空纤维反应器或任何其它血液过滤膜或流动装置(例如，简单的透析管、螺旋式混合器或静态混合器)或其它树脂、纤维或片，以选择性结合和隔离生物病原体。
本文公开的微生物-结合制品还可用作用于微生物或病原体检测的现场诊断工具。仅通过实例的方式，微生物-结合制品可与来自患者或受试者的试验样品(例如，血液样品)接触，和孵育一段时间，例如，至少约15秒、至少约30秒、至少约1分钟、至少约2分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时或更久。在一些实施方案中，孵育的浸渍片或试纸条然后可在封闭剂(例如，BSA、正常血清、酪蛋白、脱脂奶粉和/或任何市售可得的封闭剂以使非特异性结合最小化)中孵育。根据改造的微生物-结合分子的不同的实施方案，在一些实施方案中，微生物-结合浸渍片或试纸条在与试验样品(例如，血液样品)接触后可进一步与至少一种另外的试剂接触以促进病原体的检测，和/或增加病原体检测的特异性。例如，一些实施方案的浸渍片或试纸条在与试验样品(例如，血液样品)接触后可进一步与缀合至结合微生物和/或微生物物质的分子的可检测标记接触。这样的分子的实例可包括但不限于：本文所述的改造的微生物-结合分子的一个或多个实施方案，对待检测的微生物或病原体特异性的抗体，被待检测的微生物或病原体识别的蛋白、肽、碳水化合物或核酸，和其任何组合。
在一些实施方案中，微生物-结合制品的读出可在系统或装置(例如，便携式装置)中进行。系统或装置可显示信号，其表明在试验样品中微生物感染的存在或不存在，和/或微生物感染的程度。
载体支架的具体格式或材料取决于具体的使用或应用，例如，用于测定应用的分离/检测方法。在一些实施方案中，载体支架的格式或材料可经选择或修改以使信噪比最大化，例如，使背景结合最小化，或为容易分离试剂和成本。例如，载体支架可用表面化学处理或修改，以使化学凝集和非特异性结合最小化。在一些实施方案中，与试验样品接触的载体支架表面的至少一部分可经处理，以变得较不粘附试验样品中存在的任何分子(包括微生物，如果有的话)。仅通过实例的方式，与试验样品接触的载体支架表面可经硅烷化或用聚合物涂布，使得表面对试验样品中存在的分子惰性，所述分子包括但不限于细胞或其片段(包括血液细胞和血液组分)、蛋白、核酸、肽、小分子、治疗剂、微生物、微生物和其任何组合。在其它实施方案中，载体支架表面可用憎一切(omniphobic)层处理，其可允许改造的微生物-结合分子结合微生物，而无随后在微生物和载体支架表面之间的疏水结合。对于产生光滑载体支架表面的方法，参见例如Wong TS 等人, "Bioinspired self-repairingslippery surfaces with pressure-stable omniphobicity." (2011) Nature 477(7365): 443-447和国际申请号PCT/US12/21928，其内容通过引用结合到本文中。因此，来自试验样品(包括微生物和/或微生物物质)的分子与基底表面的非特异性结合可被降低，由此增加微生物检测的灵敏性。
在一些实施方案中，载体支架可从生物相容性材料制造或用生物相容性材料涂布。如本文使用的，术语“生物相容性材料”是指当植入或置于受试者的生物组织附近时随时间变化而不显著损害和不引起明显的免疫反应或有害的组织反应(例如毒性反应或明显的刺激)，或当其与血液接触时不引起血液凝固或凝结的任何材料。合适的生物相容性材料包括例如聚酰亚胺、聚(乙二醇)、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺和聚乙烯胺、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚酯、聚碳酸酯和聚苯乙烯的衍生物和共聚物。在一些实施方案中，生物相容性材料可包括金属，例如钛和不锈钢，或用于医学移植物的任何生物相容性金属。在一些实施方案中，生物相容性材料可包括纸基底，例如作为载体支架用于诊断条。在一些实施方案中，生物相容性材料可包括肽或核酸分子，例如，核酸支架例如2-D DNA片或3-D DNA支架。
可用于制造或涂布载体支架的另外的材料包括，而不限于，聚二甲基硅氧烷、聚酰亚胺、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氨酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、聚碳酸酯、聚甲基戊烯、聚丙烯、聚偏氟乙烯、多晶硅、聚四氟乙烯、聚砜、丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚(对苯二甲酸丁二醇酯)、聚(醚砜)、聚(醚醚酮)、聚(乙二醇)、苯乙烯-丙烯腈树脂、聚(对苯二甲酸三亚甲基酯)、聚乙烯基丁缩醛、聚偏氟乙烯、聚(乙烯吡咯烷酮)和其任何组合。
在一些实施方案中，载体支架可从生物可降解材料制造或用生物可降解材料涂布。如本文使用的，术语“生物可降解”是指组合物体内侵蚀或降解以形成较小化学片段的能力。降解可例如通过酶、化学或物理过程而发生。可用于本文提供的各方面的生物可降解聚合物的非限制性实例包括聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、丙交酯-乙交酯共聚物、聚酐、聚原酸酯、聚已酸内酯、聚酯酰胺、聚碳酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚氨酯、聚丙烯酸酯、其共混物和共聚物。
其它另外的生物可降解聚合物包括生物可降解聚醚酯共聚物。一般而言，聚醚酯共聚物是两亲性嵌段共聚物，其包括亲水(例如，聚烷二醇，例如聚乙二醇)和疏水嵌段(例如，聚对苯二甲酸乙二醇酯)。示例性的嵌段共聚物是但不限于，基于聚(乙二醇)和基于聚(对苯二甲酸丁二醇酯)的嵌段(PEG/PBT聚合物)。PEG/PBT聚合物可市售获自OctoPlus Inc的商品名PolyActive™。生物可降解共聚物或多嵌段共聚物的非限制性实例包括描述于美国专利号5,980,948和5,252,701中的那些，其内容通过引用结合到本文中。
其它生物可降解聚合物材料包括生物可降解对苯二甲酸酯共聚物，其包括含磷的连键。具有磷酸酯键的聚合物称为聚(磷酸酯)、聚(膦酸酯)和聚(亚磷酸酯)，是本领域已知的。参见例如，Penczek 等人, Handbook of Polymer Synthesis, Chapter 17: "Phosphorus-Containing Polymers," 1077-1 132 (Hans R. Kricheldorf ed., 1992)以及美国专利号6,153,212; 6,485,737; 6,322,797; 6,600,010; 6,419,709; 6,419,709;6,485,737; 6,153,212; 6,322,797和6,600,010，其内容通过引用结合到本文中。
生物可降解多元醇酯也可用作载体支架(例如，微粒)的材料(参见美国专利号6,592,895，其通过引用结合到本文中)。在一些实施方案中，生物可降解聚合物可以是三维交联聚合物网络，其包含疏水和亲水组分，其形成具有交联聚合物结构的水凝胶，例如描述于美国专利号6,583,219。在又一个实施方案中，生物可降解聚合物可包含基于α-氨基酸的聚合物(例如弹性体共聚酯酰胺或共聚酯尿烷，描述于美国专利号6,503,538，其通过引用结合到本文中)。
在一些实施方案中，载体支架可包含纸、硝酸纤维素、玻璃、塑料、聚合物、膜材料、尼龙和其任何组合。这对于使用制品作为浸渍片的试纸条是有用的。
如本文使用的，"涂层"或“涂布的”通常意指在表面的最外层或暴露层上形成的分子或材料层。关于在载体支架上的改造的微生物-结合分子的涂层，术语“涂层”或“涂布的”是指在载体支架表面的最外层或暴露层上形成的改造的微生物-结合分子层。在一些实施方案中，载体支架表面可包括外表面或内表面，例如关于中空结构。例如，针或导管的内表面可用本文所述的改造的微生物-结合分子涂布。这可用于除去来自流体的任何潜在的微生物污染物，然后将流体给予受试者。
与载体支架缀合或在载体支架上涂布的改造的微生物-结合分子的量可随许多因素而改变，例如表面面积、缀合/涂层密度、改造的微生物-结合分子的类型和/或结合性能。技术人员可使用本领域已知的任何方法测定改造的微生物-结合分子在载体支架上的最佳密度。仅通过实例的方式，对于磁性微粒作为载体支架(如下文详细描述的)，用于缀合或涂布磁性微粒的改造的微生物-结合分子的量可从约1 wt %至约30 wt %或从约5 wt %至约20 wt%而变化。在一些实施方案中，根据具体的需要，用于缀合或涂布磁性微粒的改造的微生物-结合分子的量可更高或更低。然而应注意，如果用于缀合或涂布磁性微粒的改造的微生物-结合分子的量太低，磁性微粒可显示与病原体/微生物较低的结合性能。相反，如果用于缀合或涂布磁性微粒的改造的微生物-结合分子的量太高，改造的微生物-结合分子的致密层可对磁性微珠的磁性性质产生不利影响，其进而可降低利用磁场梯度分离磁性微珠与流体的效率。
在一些实施方案中，载体支架可进一步包含适合用作参考区域的至少一个区域。仅通过实例的方式，参考区域可适合用作阳性对照、阴性对照、参考或其任何组合。在一些实施方案中，载体支架可进一步包含至少两个区域，其中一个区域适合用于阳性对照和另一个区域适合用于阴性对照。
在一些实施方案中，载体支架可进一步包含至少一个参考区域或对照区域，用于与从试验区域测定的读出信号比较。参考区域通常不包括改造的微生物-结合分子，例如以说明任何背景信号。在一些实施方案中，参考区域可包括一个或多个已知量的在试验区域中改造的微生物-结合分子包含的可检测标记。在这样的实施方案中，参考区域可用于计算，使得可估算或量化试验样品中微生物的量。
在一些实施方案中，载体支架可进一步包含可检测标记。可检测标记可与缀合至载体支架的微生物-结合分子分开，或连接至与载体支架缀合的本文所述的微生物-结合分子。
微生物-结合微粒：在一些实施方案中，载体支架是微粒。因此，本文所述的一些实施方案提供了微生物-结合微粒，其在表面上包含至少一种改造的微生物-结合分子。本文使用的术语“微粒”是指具有约0.001 μm至约1000 μm、约 0.005 μm至约50 μm、约 0.01 μm至约25 μm、约 0.05 μm至约10 μm或约0.05 μm至约5 μm的粒径的颗粒。在一个实施方案中，微粒具有约0.05 μm至约1 μm的粒径。在一个实施方案中，微粒大小是约0.09 μm – 约0.2 μm。
在一些实施方案中，微粒大小范围可以是1 nm至1 mm、约2.5 nm至约500 μm或约5nm至约250 µm。在一些实施方案中，微粒大小可以是约5 nm至约100 µm。在一些实施方案中，微粒大小可以是约0.01 µm至约10 µm。在一些实施方案中，微粒大小可以是约0.05 µm至约5 µm。在一些实施方案中，微粒大小可以是约0.08 µm至约1 µm。在一个实施方案中，微粒大小可以是约10 nm至约10 μm。在一些实施方案中，微粒可以是约1 nm至约1000 nm、约10 nm至约500 nm、约25 nm至约300 nm、约40 nm至约250 nm或约50 nm至约200 nm。在一个实施方案中，微粒可以是约50 nm至约200 nm。
本领域普通技术人员将理解，微粒通常显示大约指定“大小”的粒径分布。除非另外指明，本文使用的术语“大小”是指微粒的大小分布方式，即，在大小分布中最频繁出现的值。用于测量微粒大小的方法是技术人员已知的，例如，通过动态光散射(例如光相关光谱、激光衍射、低角度激光光散射(LALLS)和中角度激光光散射(MALLS))、不透光度方法(例如Coulter分析方法)或其它技术(例如流变学，和光或电子显微术)。
不受限制，微粒可具有任何形状。因此，微粒可以是但不限于，球、杆、椭圆、圆柱、圆盘等。在一些实施方案中，本文使用的术语“微粒”可包括微球。本文使用的术语“微球”是指具有基本上球形形式的微粒。基本上球形的微粒是最小半径和最大半径之间的差异通常不大于最小半径的约40%，和更通常小于约30%或小于20%的微粒。
在一些实施方案中，具有基本上球形形状和定义的表面化学的微粒可用于使化学凝集和非特异性结合最小。
在一个实施方案中，本文使用的术语“微粒”包括微囊。本文使用的术语“微囊”是指包含活性成分例如治疗剂或成像剂的微型胶囊。因此，在一些实施方案中，在表面上包含改造的微生物-结合分子的微粒可在其中封装至少一种活性成分，例如治疗感染的治疗剂，并用作细胞-靶向药物递送装置。在这样的实施方案中，微粒可包含本文所述的生物相容性聚合物。在一些实施方案中，微粒可进一步包含生物可降解聚合物，例如用于释放包封的药物。
一般而言，本领域众所周知的用于制造微粒的任何生物相容性材料可用于本文所述的微粒的实施方案。因此，包含脂质微粒核心的微粒也在本文所述的范围内。示例性的脂质微粒核心是但不限于脂质体。脂质体通常定义为包含包封内部例如水性内部的一个或多个脂质双层的颗粒。在一个实施方案中，脂质体可以是通过双层脂质膜形成的囊泡。本领域充分描述了用于制备脂质体的方法，例如Szoka和Papahadjopoulos (1980) Ann. Rev.Biophys. Bioeng. 9: 467, Deamer和Uster (1983) Pp. 27-51 In: Liposomes, ed. M.J. Ostro, Marcel Dekker, New York。
微生物-结合磁性微粒：在一些实施方案中，微粒是磁性微粒。因此，在一些实施方案中，本文提供了“微生物-结合磁性微粒”，其中磁性微粒在表面上包含至少一种改造的微生物-结合分子。不受限制，这样的微生物-结合磁性微粒可用于从试验样品(例如但不限于任何流体，包括生物流体例如血液)分离微生物或病原体。在一些实施方案中，微生物-结合磁性微粒可用于除去活的微生物或病原体。使用磁性微粒作为基底可能是有利的，因为微生物-结合的磁性微粒可使用磁场梯度容易地从样品流体分离、检查微生物的存在和/或用于传递收集的微生物至常规病原体培养和灵敏度检验测定法。因此，在一些实施方案中，微生物-结合磁性微粒可用于捕获、检测或除去任何来源或任何流体例如生物流体(例如，血液样品)、环境流体或表面(例如，废水、建筑或机械表面)或可食用物质或流体(例如，食品、水)中的微生物污染物。在其中流体是血液的一些实施方案中，在用微生物-结合磁性微珠从自受试者收集的血液除去微生物/病原体后，血液可循环回到同一受试者作为治疗性干预。在一些实施方案中，微生物-结合磁性微珠可用于诊断，作为收集用于鉴定的潜在病原体的工具；不仅用于诊断疾病，而且用于鉴定水或食品携带的病原体、颗粒或其它污染物。或者，固体基底可包含中空纤维反应器或任何其它血液过滤膜或流动装置(例如，简单的透析管、螺旋式混合器或静态混合器)或其它树脂、纤维或片，以选择性结合和隔离生物病原体。
磁性微粒可使用磁场或磁场梯度操纵。这样的粒子通常由磁性元素组成，例如铁、镍和钴和它们的氧化物化合物。磁性微粒是众所周知的，本领域已描述了它们的制备方法。参见例如美国专利号6,878,445、5,543,158、5,578,325、6,676,729、6,045,925和7,462,446；和美国专利公开号2005/0025971、2005/0200438、2005/0201941、2005/0271745、2006/0228551、2006/0233712、2007/01666232和2007/0264199，其内容通过引用结合到本文中。
磁性微粒还是广泛和市售可得的，含或不含能够与本文公开的微生物-结合分子缀合的官能团。用各种官能团例如氨基、羧酸基、环氧基、甲苯磺酰基或二氧化硅-样基团官能化的磁性微粒也是广泛和市售可得的。合适的磁性微粒可市售获自例如AdemTech,Miltenyi, PerSeptive Diagnostics, Inc. (Cambridge, MA); Invitrogen Corp.(Carlsbad, CA); Cortex Biochem Inc. (San Leandro, CA)；和Bangs Laboratories(Fishers, IN)。在具体的实施方案中，根据基底表面化学，本文可使用的磁性微粒可以是任何DYNABEADS®磁性微珠(Invitrogen Inc.)。
微生物-结合细胞：在一些实施方案中，改造的微生物-结合分子结合的载体支架可以是活细胞或生物组织或器官。例如，活细胞可与免疫反应有关，和这样的细胞包括但不限于吞噬细胞(巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞)、肥大细胞、嗜曙红细胞、嗜碱性细胞和/或自然杀伤细胞。或者，活细胞可以是免疫系统的生物组织或器官的细胞，所述组织或器官例如脾、淋巴结、淋巴管、扁桃体、胸腺、骨髓、派伊尔斑、结缔组织、粘膜、网状内皮组织系统等。在一些实施方案中，改造的微生物-结合分子结合的表面还可以是一种或多种这些组织或器官的细胞外基质。
微生物-结合微量滴定板：在一些实施方案中，微量滴定孔的底表面可用本文所述的改造的微生物-结合分子涂布，例如用于检测和/或测定样品中微生物的量。在样品中的微生物或病原体结合至与微孔表面结合的改造的微生物-结合分子后，可除去剩余的样品。也可结合至微生物或病原体的可检测分子(例如，与本文所述的可检测分子缀合的改造的微生物-结合分子)然后可加入含微生物/病原体的微孔，以检测微生物/病原体。用不同的可检测分子(例如使用酶联免疫吸附测定法(ELISA))测定蛋白的量的各种信号检测方法在本领域中已经充分建立，和本文也可使用这些信号检测方法以促进由改造的微生物-结合分子上的微生物/病原体结合引起的信号的检测。
微生物-结合浸渍片/试纸条：在一些实施方案中，具有其上缀合的微生物-结合分子的载体支架可为浸渍片和/或试纸条的形式，用于捕获、检测或清除微生物或病原体。例如，浸渍片和/或试纸条可包括至少一个试验区域，其包含本文所述的一种或多种改造的微生物-结合分子。浸渍片和/或试纸条可为任何形状和/或任何格式，例如，平面形状例如矩形条或圆盘，或弯曲表面例如棍。或者，可使用连续卷形物，而不是不连续的试纸条，其中试验区域和任选地参考区域以连续线或一系列斑点的形式存在。在一些实施方案中，本文所述的微生物-结合浸渍片或试纸条可用作微生物或病原体检测的现场诊断工具。
在一些实施方案中，浸渍片或试纸条形式的载体支架可由任何材料制成，包括，而不限于，纸、硝酸纤维素、玻璃、塑料、聚合物、膜材料、尼龙和其任何组合。在一个实施方案中，浸渍片或试纸条形式的载体支架可包括纸。在一个实施方案中，浸渍片或试纸条形式的载体支架可包括尼龙。
在一些实施方案中，浸渍片或试纸条可进一步包含至少一个参考区域或对照区域，以与从试验区域测定的读出信号比较。参考区域通常不包括改造的微生物-结合分子，例如以说明任何背景信号。在一些实施方案中，参考区域可包括一种或多种已知量的试验区域中的改造的微生物-结合分子包括的可检测标记。在这样的实施方案中，参考区域可用于计算，使得可估算或量化试验样品中微生物的量。
在一些实施方案中，浸渍片/试纸条可进一步包含本文所述的可检测标记。可检测标记可连接至与浸渍片/试纸条缀合的本文所述的微生物-结合分子，或与缀合至浸渍片/试纸条的微生物-结合分子分开。
在一个实施方案中，约1 μg至约100 μg本文所述的微生物-结合分子可涂布或连接至浸渍片或膜表面。在另一个实施方案中，约3 μg至约60 μg微生物-结合分子可涂布或连接至浸渍片或膜表面。在一些实施方案中，约0.1 mg/mL至约50 mg/mL、约0.5 mg/mL至约40 mg/mL、约1 mg/mL至约30 mg/mL、约5 mg/mL至约20 mg/mL微生物-结合分子可涂布或连接至浸渍片或膜表面。在一个实施方案中，约11.5 mg/mL微生物-结合分子可涂布或连接至浸渍片或膜表面。
在一些实施方案中，微生物-结合分子的任何两个结构域(例如，胶原结构域、Fc结构域、螺旋结构域和碳水化合物识别结构域)可通过接头连接在一起。此外，微生物-结合分子可通过接头缀合至载体支架。因此，如本公开内容中使用的，术语“接头”意指连接两个部分的化合物或分子的部分。接头通常包含：直接的键；或原子例如氧或硫；单元例如NR1、C(O)、C(O)O、OC(O)O、C(O)NH、NHC(O)O、NH、SS、SO、SO2、SO3和SO2NH；或原子链，例如取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基、烯基杂环基炔基、炔基杂环基烷基、炔基杂环基烯基、炔基杂环基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中一个或多个亚甲基可被O、S、S(O)、SO2、NH、C(O)N(R1)2、C(O)、可裂解连接基团、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环基中断或终止；其中R1是氢、酰基、脂族或取代的脂族。在一些实施方案中，接头可以是缀合在一起的两个部分的分子的非共价缔合(例如，通过非共价相互作用)。一些示例性的非共价包括离子相互作用、范德华相互作用、偶极-偶极相互作用、氢键、静电相互作用和/或形状识别相互作用。用于缀合的接头或官能团的一些其它实例包括但不限于氨基、N-取代的氨基、羧基、羰基、酸酐基、醛基、羟基、环氧基、硫醇基、二硫基、烯基、肼基、酰肼基、氨基脲基、氨基硫脲基、结合对的一个配偶体、酰胺基、芳基、酯基、醚基、缩水甘油基、卤代基、氢基、异氰酸酯基、脲基、尿烷基和其任何组合。
在一些实施方案中，接头可包含至少一个可裂解连接基团。可裂解连接基团是在一组条件下足够稳定，但在不同组条件下被裂解以释放被接头保持在一起的两个部分的基团。在一些实施方案中，在第一参考条件下(其可例如经选择以模拟或代表微生物-感染条件，例如微生物-感染的组织或体液或环境中存在的微生物生物膜)可裂解连接基团的裂解速度是第二参考条件(其可例如经选择以模拟或代表非感染条件，例如存在于非感染的血液或血清或非感染的环境中的)的至少10倍或更大，例如至少100倍。
可裂解连接基团对裂解因素例如水解、pH、氧化还原电位或降解性分子的存在易感。通常，裂解因素以比非感染区域更高的水平或活性更流行或存在于目的部位(例如微生物感染)。这样的降解剂的实例包括：氧化还原剂，其对特定底物选择或其没有底物特异性，包括例如存在于细胞中的氧化或还原酶或还原剂(例如硫醇)，其可通过还原降解氧化还原可裂解连接基团；酯酶；酰胺酶；内体或可产生酸性环境的试剂，例如产生5或更低的pH的那些；可通过作为一般的酸起作用以水解或降解酸可裂解连接基团的酶、肽酶(其可以是底物特异性的)和蛋白酶，和磷酸酶。
接头可包括可裂解连接基团，其可被特定的酶裂解。掺入接头的可裂解连接基团的类型可取决于靶向的细胞、器官或组织。在一些实施方案中，在第一参考条件下(或在经选择以模拟微生物-感染条件的体外条件下，例如微生物-感染组织或体液或在环境中或在工作表面上存在的微生物生物膜)可裂解连接基团的裂解速度是第二参考条件(或经选择以模拟非感染条件的体外条件，例如存在于非感染血液或血清或非感染环境中的)的至少1.25、1.5、1.75、2、3、4、5、10、25、50或100倍。在一些实施方案中，与微生物-感染条件(例如微生物-感染组织或体液或在环境中或在工作表面上存在的微生物生物膜)相比，在非感染条件(例如，存在于非感染血液或血清中或非感染环境中的)中，可裂解连接基团被裂解少于90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或1%。
示例性的可裂解连接基团包括但不限于：可水解的接头、氧化还原可裂解连接基团(例如，-S-S-和-C(R)2-S-S-，其中R是H或C1-C6烷基和至少一个R是C1-C6烷基，例如CH3或CH2CH3)；基于磷酸酯的可裂解连接基团(例如，-O-P(O)(OR)-O-, -O-P(S)(OR)-O-, -O-P(S)(SR)-O-, -S-P(O)(OR)-O-, -O-P(O)(OR)-S-, -S-P(O)(OR)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-,-S-P(S)(OR)-O-, -O-P(O)(R)-O-, -O-P(S)(R)-O-, -S-P(O)(R)-O-, -S-P(S)(R)-O-, -S-P(O)(R)-S-, -O-P(S)( R)-S-, .-O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-和-O-P(S)(H)-S-，其中R是任选取代的直链或支链C1-C10烷基)；酸可裂解连接基团(例如，腙、酯和氨基酸的酯、-C=NN-和-OC(O)-)；基于酯的可裂解连接基团(例如，-C(O)O-)；基于肽的可裂解连接基团(例如，通过细胞中的酶例如肽酶和蛋白酶可裂解的连接基团，例如，- NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB是两个相邻氨基酸的R基团)。基于肽的可裂解连接基团包含两个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，基于肽的可裂解连键包含作为肽酶或蛋白酶的底物的氨基酸序列。在一些实施方案中，酸可裂解连接基团在pH为约6.5或更低(例如，约6.5、6.0、5.5、5.0或更低)的酸性环境下，或通过试剂例如可作为一般的酸起作用的酶可裂解。
在一些实施方案中，接头可以是肽或核酸。在一些实施方案中，肽接头可从约1至约1000个氨基酸长、从约10至约500个氨基酸长、从约30至约300个氨基酸长或从约50至约150个氨基酸长变化。在一些实施方案中，肽基接头为约1个氨基酸至约20个氨基酸长。在一些实施方案中，核酸接头可从约1至约1000个核苷酸长、从约10至约500个核苷酸长、从约30至约300个核苷酸长或从约50至约150个核苷酸变化。更长或更短的接头序列也可用于本文所述的改造的微生物-结合分子。
肽基接头可经配置以具有包含选自甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)、苏氨酸(Thr)、甲硫氨酸(Met)或丙氨酸(Ala)的至少一个氨基酸的序列。这样的氨基酸通常用于提供接头的柔性。然而在一些实施方案中，其它不带电荷的极性氨基酸(例如，Gln、Cys或Tyr)、非极性氨基酸(例如，Val、Leu、Ile、Pro、Phe和Trp)。在备选的实施方案中，极性氨基酸可加入以调节接头的柔性。本领域技术人员可通过改变接头中残基的类型和数量，控制接头的柔性。参见例如Perham, 30 Biochem. 8501 (1991); Wriggers 等人, 80Biopolymers 736 (2005)。
在一些实施方案中，肽基接头可包含1至约25个氨基酸，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。
在一些实施方案中，接头是键。
在一些实施方案中，将微生物-结合分子缀合至载体支架的接头是聚乙二醇。用作接头的示例性的PEG包括但不限于PEG-2K、PEG-5K、PEG-10K、PEG-12K、PEG-15K、PEG-20K、PEG-40K等。
在一些实施方案中，接头可以是白蛋白、转铁蛋白或其片段。不受限制，这样的接头可用于延长改造的微生物-结合分子的血浆半衰期。因此，改造的微生物-结合分子可用于体内给予。参见Schmidt SR (2009) Curr Opin Drug Discov Devel. 12: 284。在一些实施方案中，接头可以是物理基底，例如微粒或磁性微生物。
接头可具有任何形状。例如，接头可以是线性、折叠、分支的。在一些实施方案中，接头可采用载体支架的形状。在一些实施方案中，接头可以是线性的。在一些实施方案中，接头可以是折叠的。在一些实施方案中，接头可以是分支的。对于分支的接头，微生物-结合结构域的每个分支可包含至少一个微生物-结合结构域。在其它实施方案中，接头采用物理基底的形状。
在一些实施方案中，接头可进一步包含可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记可以是生色或生荧光微生物酶底物，使得当微生物结合至改造的微生物-结合分子时，微生物释放的酶可与可检测标记相互作用以引起颜色变化。这样的微生物酶底物的实例可包括但不限于吲哚酚丁酸酯、吲哚酚葡糖苷、七叶灵、magneta葡糖苷、red-β-葡萄糖醛酸苷、2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-D-吡喃葡萄糖苷、2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-D-cetamindo-2-脱氧吡喃葡萄糖苷和任何其它公认的微生物酶底物。这样的实施方案可作为微生物或病原体的存在的指示剂起作用。
前述用于连接本文所述的微生物-结合分子的任何两个结构域的接头还可用于将本文所述的微生物-结合分子缀合至载体支架。另外地或备选地，将本文公开的改造的微生物-结合分子连接至载体支架的表面可用多种方法进行，例如通过直接交联改造的微生物-结合分子至载体支架表面；通过核酸基质(例如，DNA基质或DNA/寡核苷酸折叠结构)交联改造的微生物-结合分子至载体支架表面以定向和浓缩来增加检测灵敏性；通过树状聚体-样结构(例如，PEG/壳多糖-结构)交联微生物-结合分子至载体支架表面以增加检测灵敏性；用施加给载体支架表面的聚焦磁场梯度吸引微生物-结合分子涂布的磁性微珠至载体支架表面，通过生物素-亲和素或生物素-亲和素-样相互作用吸引改造的微生物-结合分子至载体支架，或任何其它公认的方法。
不受限制，本领域已知用于缀合两个分子或组合物的不同部分在一起的任何缀合化学可用于缀合至少一个改造的微生物-结合分子至载体支架。用于缀合至少一个改造的微生物-结合分子至基底的示例性的偶联分子和/或官能团包括但不限于：聚乙二醇(PEG,NH2-PEGX-COOH，其可具有各种长度X的PEG间隔臂，其中1 < X < 100，例如，PEG-2K, PEG-5K, PEG-10K, PEG-12K, PEG-15K, PEG-20K, PEG-40K等)、马来酰亚胺缀合剂、PAS化、HES化、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯缀合剂、DNA缀合剂、肽缀合剂、硅烷缀合剂、多糖缀合剂、可水解缀合剂和其任何组合。
对于固定到或缀合至载体支架的改造的微生物-结合分子，本文所述的微生物-结合分子可进一步包含适合定向本文所述的微生物-结合分子远离载体支架表面的至少1个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个)结构域。在一些实施方案中，载体支架表面可用偶联分子官能化，以促进改造的微生物-结合分子与固体表面的缀合。适合缀合微生物-结合分子至载体支架的结构域在本文亦称为“缀合结构域”。如本文使用的，术语“缀合结构域”是指促进本文所述的改造的分子缀合至载体支架的任何分子或其部分。
在一些实施方案中，缀合结构域的长度可从1个氨基酸残基至约10个氨基酸残基、或约2个氨基酸残基至约5个氨基酸残基变化。与不同的载体支架结合的缀合结构域的合适的氨基酸序列的确定完全在本领域技术人员的范围内。例如，根据一个或多个实施方案，缀合结构域可包含丙氨酸-赖氨酸-苏氨酸(A-K-T) (SEQ ID NO: 35)的氨基酸序列，其提供随后与链霉亲和素结合的单个生物素化位点。优选地，A-K-T在微生物-结合分子的末端或接近末端(例如，在距末端少于10个氨基酸内)。在一些实施方案中，缀合结构域包含用于缀合或连接微生物-结合分子至载体支架的官能团。用于缀合的一些示例性的官能团包括但不限于氨基、N-取代的氨基、羧基、羰基、酸酐基、醛基、羟基、环氧基、硫醇基、二硫基、烯基、肼基、酰肼基、氨基脲基、氨基硫脲基、结合对的一个配偶体、酰胺基、芳基、酯基、醚基、缩水甘油基、卤代基、氢基、异氰酸酯基、脲基、尿烷基和其任何组合。
活化剂可用于活化待缀合在一起的组分。不受限制，可使用本领域已知用于缀合活化的任何方法和/或试剂。示例性的活化方法或试剂包括但不限于1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC或EDAC)、羟基苯并三唑(HOBT)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)--1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸甲铵(HATU)、硅烷化、通过等离子体处理的表面活化等。
在一些实施方案中，缀合结构域可包含可与载体支架上的官能团非-共价或共价偶联的至少一个氨基。例如，氨基酸残基(例如，赖氨酸或半胱氨酸残基)的伯胺可用于缀合微生物-结合分子与载体支架。在一些实施方案中，微生物-结合分子的N-末端的氨基可用于缀合微生物-结合分子与载体支架。
不受限制，改造的微生物-结合分子可通过共价或非共价相互作用或共价和非共价相互作用的任何组合缀合至载体-支架。此外，缀合可通过本领域技术人员已知的任何方法实现。例如，共价固定可通过例如硅烷偶联实现。参见例如，Weetall, 15 Adv. Mol.Cell Bio. 161 (2008); Weetall, 44 Meths. Enzymol. 134 (1976)。在改造的微生物-结合分子和/或偶联分子和表面之间的共价相互作用还可通过其它公认的化学反应，例如NHS反应或缀合剂介导。在改造的微生物-结合分子和/或偶联分子和表面之间的非共价相互作用可基于离子相互作用、范德华相互作用、偶极-偶极相互作用、氢键、静电相互作用和/或形状识别相互作用形成。
不受限制，缀合可包括稳定或易变(例如可裂解)的键或缀合剂。示例性的缀合包括但不限于共价键、酰胺键、加成至碳-碳多键、叠氮炔Huisgen环加成、Diels-Alder反应、二硫键、酯键、Michael加成、硅烷键、尿烷、亲核开环反应：环氧化物、非醛醇羰基化学、环加成反应：1,3-二极性环加成、温度敏感性、辐射(IR、近-IR、UV)敏感性键或缀合剂、pH-敏感性键或缀合剂、非共价键(例如，离子电荷复合物形成、氢键合、π-π相互作用、主体-客体相互作用，例如环糊精/牢固的主体客体相互作用)等。
在一些实施方案中，改造的微生物-结合分子可通过偶联分子对缀合至载体支架。本文可互换使用的术语“偶联分子对”和“偶联对”是指彼此特异性结合的第一和第二分子。结合对的一个成员与载体支架缀合，而第二个成员与微生物-结合分子缀合。如本文使用的，词语"彼此特异性结合的第一和第二分子”是指偶联对的第一成员以比其它分子更大的亲和力和特异性与偶联对的第二成员结合。示例性的偶联分子对包括，而不限于，任何半抗原或抗原化合物与相应的抗体或结合部分或其片段的组合(例如，洋地黄毒苷和抗-洋地黄毒苷；小鼠免疫球蛋白和山羊抗小鼠免疫球蛋白)和非免疫结合对(例如，生物素-亲和素、生物素-链霉亲和素)、激素(例如，甲状腺素和皮质醇-激素结合蛋白)、受体-受体激动剂、受体-受体拮抗剂(例如，乙酰氯受体-乙酰氯或其类似物)、IgG-蛋白A、凝集素-碳水化合物、酶-酶辅因子、酶-酶抑制剂和能够形成核酸双链体的互补的寡核苷酸对)。偶联分子对还可包括带负电荷的第一分子和带正电荷的第二分子。
使用偶联对缀合的一个实例是生物素-亲和素或生物素-链霉亲和素缀合。在此方法中，待缀合在一起的分子的一个成员(例如，改造的微生物-结合分子或载体支架)被生物素化，另一个与亲和素或链霉亲和素缀合。许多市售试剂盒可用于将分子例如蛋白生物素化。例如，氨基氧基-生物素(AOB)可用于共价连接生物素至具有醛或酮基团的分子。在一些实施方案中，AOB连接至改造的微生物-结合分子。此外，如本文他处所述的，改造的微生物-结合分子的N-末端的AKT序列可允许改造的微生物-结合分子在单一位点处生物素化和进一步缀合至链霉亲和素-涂布的固体表面。此外，微生物-结合分子可与生物素受体肽例如AviTag或受体肽(称为AP; Chen 等人, 2 Nat. Methods 99 (2005))偶联。受体肽序列允许通过大肠杆菌酶生物素连接酶(BirA; Id.)位点特异性生物素化。因此，在一些实施方案中，缀合结构域包含生物素受体肽的氨基酸序列。
使用与偶联分子对的缀合的另一个非限制性实例是生物素-夹心方法。参见例如，Davis 等人, 103 PNAS 8155 (2006)。在此方法中，待缀合在一起的两个分子被生物素化，然后使用四价链霉亲和素缀合在一起。缀合的另一个实例是使用PLP –介导的生物缀合。参见例如，Witus 等人, 132 JACS 16812 (2010)。使用偶联对缀合的又一个实例是双链核酸缀合。
在此方法中，待缀合在一起的分子的一个成员用双链核酸的第一链缀合和第二个用双链核酸的第二链缀合。核酸可包括，而不限于，确定的序列区段和序列，其包含核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物、修饰的核苷酸和包含骨架修饰、分支点和非核苷酸残基、基团或桥的核苷酸。
载体支架还可经官能化以包括用于与本文所述的微生物-结合分子缀合的官能团。在一些实施方案中，载体支架可经官能化以包括偶联分子或其功能片段，其能够与本文所述的改造的微生物-结合分子选择性结合。如本文使用的，术语“偶联分子”是指能够与本文所述的改造的微生物-结合结构域选择性结合的任何分子或任何官能团。偶联分子的代表性的实例包括但不限于：抗体、抗原、凝集素、蛋白、肽、核酸(DNA, RNA, PNA和作为其混合物或包括核苷酸衍生物或类似物的核酸)；受体分子，例如胰岛素受体；受体的配体(例如，对于胰岛素受体的胰岛素)；和具有对另一分子的亲和力的生物学、化学或其它分子。
在一些实施方案中，偶联分子是适体。如本文使用的，术语“适体”是指单链、部分单链、部分双链或双链核苷酸序列，其能够通过并非Watson-Crick碱基配对或三链体形成的机制，特异性识别选择的非-寡核苷酸分子或分子组。适体可包括，而不限于，确定的序列区段和序列，其包含核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物、修饰的核苷酸和包含骨架修饰、分支点和非核苷酸残基、基团或桥的核苷酸。用于选择与分子结合的适体的方法是本领域广泛已知的，且是本领域普通技术人员容易获得的。适体可具有任何长度，例如，约1个核苷酸至约100个核苷酸、约5个核苷酸至约50个核苷酸或约10个核苷酸至约25个核苷酸。
本文描述了在试验样品中检测微生物和/或微生物物质的示例性的方法。如图14所示，方法1200包含任选步骤1202 (预处理样品)、步骤1204 (处理样品)、包含1208 (微生物捕获)和1210 (微生物分离)的步骤1206、和1212 (微生物检测)。尽管这些作为分开的方法描述，但预处理、处理、捕获、微生物分离和检测中的一项或多项可在微流体装置中进行。使用微流体装置可使分析方法自动化，和/或允许同时分析多个样品。本领域技术人员知道本领域中收集、操作和处理生物流体的方法，其可用于本公开内容的实践。本文所述的方法可允许短时间内的样品分析。例如，该方法可在小于6小时、小于5小时、小于4小时、小于3小时、小于2小时、小于1小时、小于30分钟内进行。在一些实施方案中，在样品中微生物的存在和鉴定可在开始该方法的10分钟至60分钟内进行。
在一些实施方案中，样品可以是生物流体，例如血液、血浆、血清、泌乳产物、羊水、痰、唾液、尿、精液、脑脊液、支气管抽吸液、汗、粘液、液化粪便样品、滑液、淋巴液、泪液、气管抽吸液和其任何混合物。例如，样品可以是从受试者获得的完全血液样品。
本文所述的方法可用于检测在任何给定体积的样品中微生物的存在。在一些实施方案中，样品体积是约0.25ml至约50ml、约0.5ml至约25ml、约1ml至约15ml、约2 ml至约10ml。在一些实施方案中，样品体积是约5ml。在一个实施方案中，样品体积是约5ml至约10ml。
1202 (样品预处理)：试验样品例如全血在本文所述的微生物检测之前用例如预处理试剂进行预处理，可能是必需的或需要的。甚至在其中预处理是不需要的情况下，仅为方便，预处理也可任选地进行(例如作为商业平台的方案的一部分)。预处理试剂可以是适合用于本文所述的测定法或方法的任何试剂。
样品预处理步骤通常包含添加一种或多种试剂至样品。该预处理可为许多不同的目的，包括但不限于溶解血液细胞、稀释样品等。在样品加入样品容器之前，预处理试剂可存在于样品容器中，或预处理试剂可加入已经存在于样品容器中的样品。当样品是生物流体时，样品容器可以是VACUTAINER®，例如肝素化的VACUTAINER®。
预处理试剂包括但不限于表面活性剂和去垢剂、盐、细胞裂解试剂、抗凝血剂、降解酶(例如，蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、脂肪酶、胶原酶、纤维素酶、淀粉酶等)和溶剂，例如缓冲溶液。在一些实施方案中，预处理试剂是表面活性剂或去垢剂。在一个实施方案中，预处理试剂是Triton X100。
加入的预处理试剂的量可取决于许多因素。通常，预处理试剂加入至终浓度为约0.1mM至约10mM。如果是液体，预处理试剂可加入以稀释样品至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少60%、至少80%、至少90%、至少1倍、至少2倍、至少3倍或至少5倍。
加入预处理试剂后，试剂可混合至样品。这可通过搅拌样品，例如，摇动或涡旋样品和/或旋转移动样品(如果其在微流体装置中)，简单地进行。
加入预处理试剂后，样品混合物可孵育一段时间。例如，样品混合物可孵育至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少45分钟或至少1小时。在一些实施方案中，孵育约5秒至约60秒。在一些实施方案中，孵育约10至约20分钟。在一个实施方案中，孵育约15分钟。在一些实施方案中，不孵育和样品混合物直接用于样品处理步骤。
不受限制，孵育可以在任何合适的温度。例如，孵育可以在室温(约16oC至约30oC)、低温(约16oC或更低，例如，约-4oC至约16oC)或高温(约30oC或更高，例如，约25oC至约95oC)。在一些实施方案中，样品在室温孵育约15分钟。
1204 (样品处理)：任选的预处理步骤后，样品可任选地通过向样品加入一种或多种处理试剂进行处理。这些处理试剂可用于裂解细胞，降解样品中存在的不需要的分子和/或稀释样品以进一步处理。这些处理试剂包括但不限于表面活性剂和去垢剂、盐、细胞裂解试剂、抗凝血剂、降解酶(例如蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、脂肪酶、胶原酶、纤维素酶、淀粉酶等)和溶剂，例如缓冲溶液。加入的处理试剂的量可取决于分析的具体样品、样品分析需要的时间、待检测的微生物的身份或待分析的样品中存在的微生物的量。
没有必要，但如果加入一种或多种试剂，它们可以适当的浓度存在于混合物中(例如，在溶液中，“处理缓冲液”)。处理缓冲液的各种组分的量可改变，取决于样品、检测的微生物、样品中微生物的浓度或分析的时间限制。
通常，加入处理缓冲液可增加样品的体积达5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。在一些实施方案中，对于每ml的样品加入约50µl至约5000µl的处理缓冲液。在一些实施方案中，对于每ml的样品加入约100µl至约250 µl的处理缓冲液。在一个实施方案中，对于每200µl样品加入约800µl的处理缓冲液。
在一些实施方案中，去垢剂或表面活性剂包含约5%至约20%的处理缓冲液体积。在一些实施方案中，去垢剂或表面活性剂包含约5%至约15%的处理缓冲液体积。在一个实施方案中，去垢剂或表面活性剂包含约10%的处理缓冲液体积。
示例性的表面活性剂和去垢剂包括但不限于：硫酸盐，例如月桂基硫酸铵、十二烷基硫酸钠(SDS)和月桂基醚硫酸钠(SLES)、肉豆蔻基醚硫酸钠；磺酸盐，例如十六烷基磺基琥珀酸钠(Docusates)、全氟辛烷磺酸盐(PFOS)、全氟丁烷磺酸盐、烷基苯磺酸盐和3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)；3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)；磷酸盐，例如烷基芳基醚磷酸盐和烷基醚磷酸盐；羧酸盐，例如脂肪酸盐、硬脂酸钠、月桂基肌氨酸钠、全氟壬酸盐和全氟辛酸盐(PFOA或PFO)；奥替尼啶二盐酸盐；烷基三甲基铵盐，例如溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)和氯化十六烷基三甲基铵(CTAC)；西氯吡铵(CPC)；聚乙氧基化牛脂胺(POEA)；苯扎氯铵(BAC)；苄索氯铵(BZT)；5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷；二甲基双十八烷基氯化铵；双十八烷基二甲基溴化铵(DODAB)；磺化甜菜碱，例如椰油酰胺丙基羟基磺化甜菜碱；鲸蜡醇；硬脂醇；鲸蜡硬脂醇(主要由鲸蜡醇和硬脂醇组成)；油醇；聚氧乙二醇烷基醚(Brij)例如八乙二醇单十二烷基醚和五乙二醇单十二烷基醚；聚氧丙二醇烷基醚；葡糖苷烷基醚，例如癸基葡糖苷、月桂基葡糖苷和辛基葡糖苷；聚氧乙二醇辛基苯酚醚，例如Triton X-100；聚氧乙二醇烷基苯酚醚，例如Nonoxynol-9；甘油烷基醚，例如月桂酸甘油酯；聚氧乙二醇去水山梨糖醇烷基醚，例如Polysorbate 20 (聚氧乙烯(20)去水山梨糖醇单月桂酸酯)、Polysorbate 40 (聚氧乙烯(20)去水山梨糖醇单棕榈酸酯)、Polysorbate 60 (聚氧乙烯(20)去水山梨糖醇单硬脂酸酯)和Polysorbate 80 (聚氧乙烯(20)去水山梨糖醇单油酸酯)；椰油酰胺ME；椰油酰胺DEA；十二烷基二甲基氧化胺；泊洛沙姆；DOC；壬基苯氧基聚乙氧基乙醇NP-40 (Tergitol-型NP-40)；辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Noidet P-40)；鲸蜡基三甲基溴化铵；和其任何混合物。
在一些实施方案中，1 ml的处理缓冲液可包含约0.1U至约100U的降解酶。在一些实施方案中，1 ml的处理缓冲液包含约5U至约50U的降解酶。在一个实施方案中，1 ml的处理缓冲液包含约10U的降解酶。酶单位(U)是本领域已知对于每分钟催化1 µmol的底物转化的特定酶的量的术语。
在一些实施方案中，1 ml的处理缓冲液可包含约1µg至约10µg的抗凝剂。在一些实施方案中，1 ml的处理缓冲液可包含约1µg至约5µg的抗凝剂。在一个实施方案中，1 ml的处理缓冲液包含约4.6µg的抗凝剂。
在一些实施方案中，1 ml的处理缓冲液可包含约1mg至约10mg的抗凝剂。在一些实施方案中，1 ml的处理缓冲液可包含约1mg至约5mg的抗凝剂。在一个实施方案中，1 ml的处理缓冲液包含约4.6mg的抗凝剂。
示例性的抗凝剂包括但不限于，肝素、肝素替代物、水杨酸、D-苯基丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸氯甲基酮(PPACK)、水蛭素、安克洛酶(蛇毒, Vipronax)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、链激酶、纤溶酶、prothrombopenic抗凝血剂、血小板磷酸二酯酶抑制剂、葡聚糖、凝血酶拮抗剂/抑制剂、乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸葡萄糖(ACD)、柠檬酸钠、柠檬酸磷酸葡萄糖(CPD)、氟化钠、草酸钠、草酸钾、草酸锂、碘醋酸钠、碘醋酸锂和其混合物。
合适的肝素抗凝血剂包括来自天然、合成或生物合成来源的肝素或其活性片段和部分。肝素和肝素替代物的实例包括但不限于，肝素钙例如calciparin；低-分子量肝素，例如依诺肝素和lovenox；肝素钠，例如肝素、lipo-hepin、liquaemin sodium和panheprin；肝素钠二氢麦角胺甲磺酸盐；肝素锂；和肝素铵。
合适的prothrombopenic抗凝血剂包括但不限于茴茚二酮、双香豆素、华法林钠等。
适合本文使用的磷酸二酯酶抑制剂的实例包括但不限于阿那格雷、双嘧达莫、pentoxifyllin和茶碱。
合适的葡聚糖包括但不限于：葡聚糖70，例如HYSKONTM (CooperSurgical, Inc.,Shelton, Conn, U.S.A.)和MACRODEXTM (Pharmalink, Inc., Upplands Vasby, Sweden)，和葡聚糖75, 例如GENTRANTM 75 (Baxter Healthcare Corporation)。
合适的凝血酶拮抗剂包括但不限于水蛭素、比伐卢定、来匹卢定、地西卢定、阿加曲班、美拉加群、ximelagatran和达比加群。
如本文使用的，抗凝血剂还可包括因子Xa抑制剂、因子Ha抑制剂和其混合物。各种直接的因子Xa抑制剂是本领域已知的，包括描述于Hirsh和Weitz, Lancet, 93:203-241,(1999); Nagahara 等人 Drugs of the Future, 20: 564-566, (1995); Pinto 等人,44: 566-578, (2001); Pruitt 等人, Biorg. Med. Chem. Lett., 10: 685-689,(2000); Quan 等人, J. Med. Chem. 42: 2752-2759, (1999); Sato 等人, Eur. J.Pharmacol, 347: 231 -236, (1998); Wong 等人, J. Pharmacol. Exp. Therapy, 292:351-357, (2000)中的那些。示例性的因子Xa抑制剂包括但不限于DX-9065a、RPR-120844、BX-807834和SEL系列Xa抑制剂。DX-9065a是合成的非-肽丙酸衍生物、571 D选择性因子Xa抑制剂。其以竞争方式直接抑制因子Xa，抑制常数在纳摩尔范围内。参见例如，Herbert 等人, J. Pharmacol. Exp. Ther. 276:1030-1038 (1996)和Nagahara 等人, Eur. J.Med. Chem. 30(suppl):140s-143s (1995)。作为非-肽、合成的因子Xa抑制剂，RPR-120844(Rhone-Poulenc Rorer)是一系列新型抑制剂之一，其掺有3-(S)-氨基-2-吡咯烷酮作为中央模板。SEL系列的新型因子Xa抑制剂(SEL1915, SEL-2219, SEL-2489, SEL-2711:Selectide)是基于通过组合化学产生的L-氨基酸的五肽。它们具有对因子Xa的高度选择性和在pM范围内的效力。
因子Ha抑制剂包括DUP714、水蛭肽、水蛭素、melgatran和其组合。Melagatran为前药ximelagatran的活性形式，描述于Hirsh和Weitz, Lancet, 93:203-241, (1999)和Fareed 等人 Current Opinion in Cardiovascular, pulmonary and renalinvestigational drugs, 1:40-55, (1999)。
一般而言，处理缓冲液的盐浓度范围可以是约10mM至约100mM。在一些实施方案中，处理缓冲液包含浓度为约25mM至约75mM的盐。在一些实施方案中，处理缓冲液包含浓度为约45mM至约55mM的盐。在一个实施方案中，处理缓冲液包含浓度为约43mM至约45mM的盐。
处理缓冲液可在技术人员已知的任何合适的缓冲溶液中制备。这样的缓冲溶液包括但不限于TBS、PBS、BIS-TRIS、BIS-TRIS丙烷、HEPES、HEPES钠盐、MES、MES钠盐、MOPS、MOPS钠盐、氯化钠、乙酸铵溶液、甲酸铵溶液、磷酸二氢铵溶液、酒石酸氢二铵溶液、BICINE缓冲溶液、碳酸氢盐缓冲溶液、柠檬酸盐浓溶液、甲酸溶液、咪唑缓冲溶液、MES溶液、乙酸镁溶液、甲酸镁溶液、乙酸钾溶液、乙酸钾溶液、乙酸钾溶液、柠檬酸三钾溶液、甲酸钾溶液、磷酸氢二钾溶液、磷酸氢二钾溶液、酒石酸钾钠溶液、丙酸溶液、STE缓冲溶液、STET缓冲溶液、乙酸钠溶液、甲酸钠溶液、磷酸氢二钠溶液、磷酸二氢钠溶液、酒石酸氢二钠溶液、TNT缓冲溶液、TRIS甘氨酸缓冲溶液、TRIS乙酸盐-EDTA缓冲溶液、三乙基磷酸铵溶液、三甲基乙酸铵溶液、三甲基磷酸铵溶液、Tris-EDTA缓冲溶液、TRIZMA®碱和TRIZMA® HCL。或者，处理缓冲液可在水中制备。
在一些实施方案中，处理缓冲液包含Trirton-X、DNA酶I、人纤溶酶、CaCl2和Tween-20的混合物。在一个实施方案中，处理缓冲液由Trirton-X、DNA酶I、人纤溶酶、CaCl2和Tween-20在TBS缓冲液中的混合物组成。
在一个实施方案中，1 ml的处理缓冲液包含100µl的Triton-X100、10µl的DNA酶(1U/1µl)、10µl的4.6mg/ml人纤溶酶和870µl的TBS、0.1% Tween-20和50mM CaCl2的混合物。
测定前用于处理血液的试剂和处理也是本领域众所周知的，例如，用于在AbbottTDx, AxSYM®,和ARCHITECT®分析仪(Abbott Laboratories)上的测定法，如文献中所述(参见例如，Yatscoff 等人, Abbott TDx Monoclonal Antibody Assay Evaluated forMeasuring Cyclosporine in Whole Blood, Clin. Chem. 36: 1969-1973 (1990)和Wallemacq 等人, Evaluation of the New AxSYM Cyclosporine Assay: Comparisonwith TDx Monoclonal Whole Blood and EMIT Cyclosporine Assays, Clin. Chem. 45:432-435 (1999))，和/或如市售可得的。另外，预处理可如Abbott的美国专利号5,135,875、欧洲专利公开号0 471 293和美国专利申请公开号2008/0020401中所述进行，其所有的内容通过引用结合到本文中。还应理解，除了本文所述的样品处理之外或备选地，可使用一种或多种这些已知的试剂和/或处理。
在一些实施方案中，在加入处理缓冲液后，除了样品中已经存在的组分外，样品还包含1% Triton-X、10U的DNA酶、4.6mg/ml的纤溶酶、5mM钙、0.01%的Tween 20、2.5mM的Tris、150mM的NaCl和0.2mM的KCl。
在加入处理缓冲液后，样品可经过混合。这可通过搅拌样品，例如，摇动或涡旋样品和/或旋转移动样品(如果其在微流体装置中)，简单地进行。在其中微生物-结合制品为浸渍片或膜的形式的一些实施方案中，微生物-结合浸渍片或膜可浸入一定体积的试验样品中和以摇摆运动轻轻搅动。
在加入处理试剂后，样品可孵育一段时间，例如至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少45分钟或至少1小时。这样的孵育可在任何合适的温度，例如室温(例如，约16oC至约30oC)、低温(例如约0oC至约16oC)或高温(例如，约30oC至约95oC)。在一些实施方案中，样品在室温下孵育约15分钟。
1206 (1208 (微生物捕获)和1210 (微生物分离))：在处理样品后，样品可经过微生物捕获过程。在微生物捕获过程期间，加入试验样品的微生物-结合制品(含公认的微生物-捕获分子或本文所述的微生物-结合分子)可捕获试验样品中存在的一种或多种微生物。在一些实施方案中，微生物捕获过程可重复和/或进行足够的时间，以允许浓缩和/或净化试验样品，然后微生物检测。因此，本文所述的微生物捕获和分离过程可用于浓缩和/或净化样品，然后分析样品中的靶标组分。
在一些实施方案中，微生物捕获过程可包括混合微生物-结合制品(含公认的微生物-捕获分子或本文所述的微生物-结合分子)与试验样品。在一些实施方案中，微生物-结合制品可已经存在于处理缓冲液中。加入样品的微生物-结合制品的量可取决于许多不同的因素，例如在各制品上微生物-结合分子的数量、制品大小、制品形状、微生物-结合分子与微生物的结合亲和力和样品中的微生物浓度。另外，样品中的微生物-结合制品的量可经调节以优化微生物的捕获。在一些实施方案中，样品中的微生物-结合制品的量使得一个微生物-结合制品结合一个微生物。然而，每个微生物可结合超过一个微生物-结合制品。这可减少多个微生物一起交联，所述交联可导致这样的交联的微生物从样品中凝结和/或沉淀。
在其中微生物-结合分子用作本文所述的制品中的捕获剂的一些实施方案中，与试验样品接触的微生物-结合分子的总量范围可以是约0.01 μg至约1 mg、约0.1 μg至约500 μg、约0.5 μg至约250 μg、约1 μg至约100 μg或约3 μg至约60 μg。在一些实施方案中，与试验样品接触的微生物-结合分子的总量范围可以是约500 μg至约1000 mg、约1 mg至约750mg、约5 mg至约500 mg、约10 mg至约250 mg或约25 mg至约100 mg。
在一些实施方案中，多个微生物-结合制品(含公认的微生物-捕获分子或本文所述的微生物-结合分子)可与试验样品接触。多个微生物-结合制品可包含至少两个亚组(例如，2、3、4、5或更多个亚组)，其中每个亚组的微生物-结合制品具有预定的尺寸。在一些实施方案中，多个微生物-结合制品可包含第一亚组的微生物-结合制品和第二亚组的微生物-结合制品。在这样的实施方案中，第一亚组的微生物-结合制品各自具有第一预定的尺寸；和第二亚组的微生物-结合制品各自具有第二预定的尺寸。另外，每个亚组的微生物-结合制品可在表面上包含基本上相同密度或不同密度的本文所述的微生物-结合分子。
不同亚组的多个微生物-结合制品(含公认的微生物-捕获分子或本文所述的微生物-结合分子)可以任何方式与试验样品接触。例如，在一些实施方案中，多个微生物-结合制品可作为包含至少两个亚组的微生物-结合制品的单一混合物提供，以加入试验样品。在一些实施方案中，为了区分不同亚组的微生物-结合制品，每个亚组的微生物-结合制品可具有不同的检测标记。例如，每个亚组的微生物-结合制品可具有不同的-荧光标记，其可之后被分选，例如，通过流式细胞术。
在其它实施方案中，多个微生物-结合制品(含公认的微生物-捕获分子或本文所述的微生物-结合分子)可以序贯方式与试验样品接触。例如，试验样品可与第一亚组的微生物-结合制品接触，接着与至少一个另外亚组的微生物-结合制品接触。前面亚组的微生物-结合制品可从试验样品除去，然后加入另一亚组的微生物-结合制品至试验样品。
仅通过实例的方式，当微生物-结合制品是微生物-结合分子涂布的微粒(亦称为涂布-微粒)时，通常约100至约109个微粒可与每ml样品接触。在一些实施方案中，约104至约5x106个涂布-微粒可与每ml样品接触。在一些实施方案中，微粒可用公认的微生物-捕获分子或本文所述的微生物-结合分子涂布。
如上所述，在一些实施方案中，多个微生物-结合制品可与试验样品接触。因此，在一些实施方案中，多个涂布-微粒可与试验样品接触。多个涂布-微粒可包含至少两个亚组(例如，2、3、4、5或更多亚组)，其中每个亚组的涂布-微粒具有预定的尺寸。在一些实施方案中，多个涂布-微粒可包含第一亚组的涂布-微粒和第二亚组的涂布-微粒。在这样的实施方案中，第一亚组的涂布-微粒各自具有第一预定尺寸；和第二亚组的涂布-微粒各自具有第二预定尺寸。涂布-微粒的预定尺寸部分地取决于改造的微生物-结合分子缀合的本文所述的微粒的尺寸。例如，在一些实施方案中，微粒可具有约10 nm-10 μm、约20 nm-约5 μm、约40 nm-约1 μm、约50 nm-约500 nm或约50 nm-约200 nm的尺寸。另外，每个亚组的涂布-微粒可在表面上包含基本上相同密度或不同密度的本文公开的微生物-结合分子。
不同亚组的多个涂布-微珠可以任何方式与试验样品接触。例如，在一些实施方案中，多个涂布-微珠可作为包含至少两个亚组的涂布-微珠的单一混合物提供，以加入试验样品。在一些实施方案中，为了区分不同亚组的涂布-微珠，在每个亚组中涂布-微珠可具有不同的检测标记，例如，不同-荧光标记，其可之后被分选，例如，通过流式细胞术。
在一些实施方案中，涂布-微粒可存在于处理缓冲液中。在一个实施方案中，1 ml的处理缓冲液包含100µl的Triton-X100、10µl的包含约25百万个涂布-微粒的溶液、10µl的DNA酶(1U/1µl)、10µl的4.6mg/ml人纤溶酶和870µl的TBS、0.1% Tween-20的混合物。在一些实施方案中，处理缓冲液可包括钙盐，例如，CaCl2 (例如，~50 mM CaCl2)。在一些实施方案中，处理或捕获缓冲液可不包括钙盐，例如，CaCl2。
在加入微生物-结合制品后，微生物-结合制品可在样品中混合以允许微生物结合微生物-捕获分子(例如，本文所述的微生物-结合分子或公认的微生物-捕获分子)。这可通过搅拌样品，例如，摇动或涡旋样品和/或在微流体装置中旋转移动样品，简单地实现。在其中微生物-结合制品是浸渍片或膜形式的一些实施方案中，微生物-结合浸渍片或膜可浸入一定体积的试验样品中，和以摇摆运动轻轻搅动。
接触微生物-结合制品所需的试验样品的体积可随例如微生物-结合制品的选择(例如，微珠、纤维、滤膜、滤器、纤维、筛、网、管、中空纤维)、试验样品中存在的微生物浓度、用于进行测定的平台(例如，微流体装置、血液收集管、微量滴定板等)而改变。例如，如果测定在微流体装置中进行，用于进行测定的试验样品体积范围可以是约1 μL至约500 μL、约5μL至约250 μL或约10 μL至约100 μL。在一些实施方案中，如果测定在试管中进行，试验样品体积范围可以是约0.05 mL至约50 mL、约0.25 ml至约50 ml、约0.5 ml至约25 ml、约1ml至约15 ml或约2 ml至约10 ml。在一些实施方案中，用于进行本文所述的测定的试验样品体积可以是约1mL至约5 ml。在一个实施方案中，用于进行本文所述的测定的试验样品体积是约5 ml至约10 mL。
在使试验样品与本文所述的微生物-结合分子或公认的微生物-捕获分子(例如，微生物-结合制品)接触后，样品混合物可孵育一段时间以允许目的微生物结合到微生物-结合制品的微生物-结合或微-捕获分子上。这样的孵育可持续任何需要的时间，以允许足够量的微生物结合微生物-结合分子和/或微生物-捕获分子。例如，孵育可持续至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少约20分钟、至少30分钟、至少45分钟或至少1小时。在一个实施方案中，样品混合物可孵育约10-20分钟的时间。此外，这样的孵育可在任何合适的温度下进行，例如，室温(例如，约16℃至约30℃)、低温(例如约0℃至约16℃)或高温(例如，约30℃至约95℃)。在一些实施方案中，孵育可在范围为约室温至约37℃的温度下进行。在一些实施方案中，样品可在室温孵育约10分钟至约20分钟。在一些实施方案中，样品在室温孵育约15分钟。
在从样品分离微生物期间为了预防或减少凝集(或非特异性结合)，可加入另外的试剂至样品混合物。这样的试剂在本文亦称为封闭试剂。例如，这些封闭试剂可包含涂布-微珠上的亲和力分子的配体。加入这样的封闭试剂可通过与亲和分子上的任何空配体结合位点结合减少凝集。因此，当微生物-结合磁性微珠用于捕获微生物时，封闭试剂可以是碳水化合物，例如甘露糖。另外的试剂的量可取决于加入样品的微珠的量。通常，试剂加入至终浓度为约0.1mM至约10mM。需要的封闭剂的量可至少部分地随与试验样品接触的微生物-结合基底的量和/或表面面积而改变。在一些实施方案中，封闭试剂可加入至终浓度为约0.1 % (w/v)至约10 % (w/v)、约0.5 % (w/v)至约7.5 % (w/v)或约1 % (w/v)至约5 %(w/v)。在一些实施方案中，在本文所示的测定中约1%酪蛋白可用作封闭剂。
在加入封闭试剂后，样品混合物可孵育一段时间以允许封闭试剂结合微生物-结合分子，例如，持续至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少45分钟或至少1小时。这样的孵育可以在任何合适的温度，例如，室温(例如，约16℃至约30℃)、低温(例如约0℃至约16℃)或高温(例如，约30℃至约95℃)。在一些实施方案中，样品在室温孵育约15分钟。在一些实施方案中，孵育持续约5秒至约60秒。在一些实施方案中，孵育可在范围为约室温至约37 ℃的温度下进行。在一些实施方案中，样品在室温下孵育约15分钟。
为了在微生物-结合基底和试验样品之间接触期间预防或减少非特异性结合，在一些实施方案中，微生物-结合制品(例如，涂布-微粒)或试验样品可在彼此接触之前用不与微生物反应的封闭剂预处理。示例性的封闭剂包括但不限于酪蛋白、正常血清、BSA、脱脂奶粉和任何公认的封闭剂。任选地，封闭后微生物-结合制品可用任何公认的缓冲液洗涤以除去任何剩余的封闭剂。洗涤步骤的次数范围可以是1至许多，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次洗涤步骤。在一个实施方案中，封闭后微生物-结合基底可用缓冲液例如TBST洗涤约至少1-3次。
孵育后，然后可按下文所述分析微生物-结合制品(含公认的微生物-捕获分子或本文所述的微生物-结合分子)中结合的微生物的存在或不存在。
对1208 (微生物捕获)的示例性的任选修改：根据本文所述的一个方面，试验样品可在螯合剂的存在下与微生物-结合分子接触。不希望受理论的约束，将螯合剂加入试验样品和/或处理缓冲液可减少试验样品中任何蛋白A-和蛋白G-阴性微生物结合至少一种微生物-结合分子的可能性，但不减少表达蛋白A或蛋白G的微生物结合至少一种微生物-结合分子的可能性。因此，在螯合剂的存在下检测本文所述的微生物-结合基底上结合的任何微生物可确定在试验样品中表达蛋白A或蛋白G的微生物的存在或不存在。
螯合剂可加入包含试验样品的处理缓冲液中。螯合剂的量足以螯合游离的二价离子(例如，钙离子)，因此防止或减少与微生物的二价离子依赖性(例如，钙离子依赖性)碳水化合物识别结构域结合(例如，甘露糖-结合凝集素)。防止或减少与微生物的钙依赖性碳水化合物识别结构域结合(例如，甘露糖-结合凝集素)所需的螯合剂的量可取决于例如，试验样品和任选地捕获缓冲液(例如，用于稀释螯合剂和/或试验样品)中存在的游离二价离子(例如，钙离子)的浓度。因此，在一些实施方案中，螯合剂的浓度可高于试验样品和捕获缓冲液的合并溶液中存在的游离二价离子(例如，钙离子)的总浓度。例如，在一些实施方案中，螯合剂的浓度可以是比试验样品和捕获缓冲液的合并溶液中存在的游离钙离子的总浓度高至少约30%，包括至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、直至和包括100%，或约30%和约100%之间的任何百分比。在其它实施方案中，螯合剂的浓度可以是试验样品和捕获缓冲液的合并溶液中存在的游离钙离子的总浓度的至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍或更多。在一个实施方案中，螯合剂的浓度可以是试验样品和捕获缓冲液的合并溶液中存在的游离钙离子的总浓度的至少约5倍至约50倍或至少约7倍至约25倍。
在一些实施方案中，试验样品和任选地处理或捕获缓冲液(例如，用于稀释螯合剂或试验样品)中存在的螯合剂的浓度范围可以是约0.1 mM至约1 M、约10 mM至约500 mM、约20 mM至约250 mM或约25 mM至约125 mM。在一个实施方案中，试验样品和任选地捕获缓冲液中存在的螯合剂的浓度可以是约25 mM至约125 mM。
在一些实施方案中，包含微生物-结合基底的试验样品中存在的螯合剂的浓度可足以减少蛋白A-和蛋白G-阴性微生物(如果存在于试验样品中)结合至少一种微生物-结合分子的可能性。例如，与在螯合剂不存在时微生物结合分子上结合的蛋白A-和蛋白G-阴性微生物的数量相比，存在于含微生物-结合基底的试验样品中的螯合剂的浓度可足以减少结合至少一种微生物-结合分子的蛋白A-和蛋白G-阴性微生物(如果存在于试验样品中)的数量达至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少80%或更高。在一些实施方案中，与在螯合剂不存在时微生物-结合分子上结合的蛋白A-和蛋白G-阴性微生物的数量相比，含微生物-结合基底的试验样品中存在的螯合剂的浓度可足以减少结合至少一种微生物-结合分子的蛋白A-和蛋白G-阴性微生物(如果存在于试验样品中)的数量达至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、直至和包括100%或约85%和约100%之间的任何值。
表达蛋白A和表达蛋白G的微生物通常可通过两种独立(但加和)机制结合微生物-结合分子：Fc-介导的结合和微生物-结合结构域介导的结合。不希望受理论的约束，尽管在存在螯合剂时表达蛋白A和表达蛋白G的微生物可仍被捕获在微生物-结合分子上，但游离二价离子(例如，钙离子)的存在可进一步增加结合微生物-结合分子的表达蛋白A和表达蛋白G的微生物的数量，因为存在二价离子(例如，钙离子)时的总体结合强度可以是不存在钙离子时的几乎2倍。
因此，在一些实施方案中，包含微生物-结合制品的试验样品中存在的螯合剂的浓度可减少结合到微生物-结合基底上的表达蛋白A的微生物或表达蛋白G的微生物的数量，但与蛋白A-和蛋白G-阴性微生物相比这样的作用小得多，例如小至少约30%、小至少约40%、至少约50%、小至少约60%、小至少约70%或小至少约80%。
在一些实施方案中，用于本文所述的测定法的螯合剂的浓度可足够高，以阻止至少约80%或更高、包括至少约90%、至少约95%、直至和包括100%的蛋白A-和蛋白G-阴性微生物免于结合微生物-结合基底，但足够低，以允许至少约30%或更高、包括至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%或更高的表达蛋白A的微生物或表达蛋白G的微生物结合微生物-结合基底。在一个实施方案中，用于本文所述的测定法的螯合剂的浓度可足够高，以阻止至少约90%或更高的蛋白A-和蛋白G-阴性微生物(如果有存在于试验样品中)免于结合微生物-结合基底，但足够低，以允许至少约50%的表达蛋白A的微生物或表达蛋白G的微生物(如果有存在于试验样品中)结合微生物-结合基底。
二价离子(例如，钙离子)-螯合剂的实例可包括但不限于1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)；乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N’,N’-四乙酸；乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸(EGTA)、1,2-双(o-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、包含柠檬酸盐的缓冲液、N,N-双(2-(双-(羧基甲基)氨基)乙基)-甘氨酸(DTPA)、次氮基-2,2',2''-三乙酸(NTA)、从试验样品沉淀钙离子的缓冲液(包括例如，磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和碳酸氢盐缓冲液)、低pH缓冲液(例如，小于pH 7或小于pH 6的pH缓冲液)、柠檬酸和其盐、葡糖酸和其盐、碱金属焦磷酸盐、碱金属多磷酸盐、六偏磷酸钠、三亚乙基四胺、二亚乙基三胺、o-菲咯啉、草酸和其任何组合。
螯合剂可直接加入试验样品或在处理或捕获缓冲液中制备，其然后加入与微生物-结合基底接触的试验样品。处理或捕获缓冲液可以是任何缓冲溶液，例如具有范围为约6至约10的pH。在一些实施方案中，处理或捕获缓冲液可包括但不限于tris-缓冲盐水、磷酸缓冲盐水或其组合。在一些实施方案中，处理或捕获缓冲液可包括表面活性剂，例如，以阻止微生物与微生物-结合基底的微生物-表面-结合结构域的非特异性结合，和/或饱和微生物-结合基底中存在的非特异性结合位点(如果有的话)。表面活性剂或去垢剂，例如，如先前描述的，可以任何量溶于缓冲溶液，例如范围为约0.001 % (v/v)至约5% (v/v)、约0.01%(v/v)至约2.5% (v/v)或约0.05% (v/v)至约1% (v/v)。在一些实施方案中，加入处理或捕获缓冲液的表面活性剂可包括浓度为约0.01 %至约0.1%的Tween 80或聚山梨醇酯80。在一个实施方案中，加入处理或捕获缓冲液的表面活性剂可包括浓度为约0.05%的Tween 80或聚山梨醇酯80。
孵育后，然后可按下文所述分析微生物-结合制品(含公认的微生物-捕获分子和/或本文所述的微生物-结合分子)中结合的微生物的存在或不存在。在不存在微生物-结合制品-结合的微生物时，在一些实施方案中，先前体积的试验样品或新体积的试验样品可在存在游离二价离子(例如，钙离子)时与新的微生物-结合基底接触，例如，以确定蛋白A-和蛋白G-阴性微生物的存在或不存在。在一些实施方案中，游离二价离子(例如，钙离子)可通过在试验样品中加入足够量的二价离子盐(例如，钙盐)产生。如果螯合剂已存在于试验样品中，通常需要较高量的二价离子盐(例如，钙盐)以获得游离钙离子。
如本文使用的，术语“游离钙离子”是指不与任何分子或化合物络合的钙离子，所述分子或化合物例如螯合剂，其可阻碍钙离子与其它分子或离子反应以介导微生物细胞表面上的碳水化合物模式与改造的微生物-结合分子的微生物-结合结构域(例如，MBL)的结合。因此，在一些实施方案中，游离钙离子可在不存在螯合剂时存在。在一些实施方案中，游离钙离子可在包含螯合剂和钙离子的溶液中存在。在一些实施方案中，溶液中存在的钙离子的量超过足以与溶液中存在的基本上所有螯合剂分子反应以形成螯合剂复合物的量至少约30%。例如，在一些实施方案中，为了获得游离钙离子，溶液中存在的钙离子的量可以超过足以与溶液中存在的基本上所有螯合剂分子反应以形成螯合剂复合物的量至少约30%、包括至少约40%、至少约50%、至少约60 %、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、直至和包括100%和30%和100%之间的任何百分比。在一些实施方案中，为了获得游离钙离子，溶液中存在的钙离子的量可以是足以与溶液中存在的基本上所有螯合剂分子反应以形成螯合剂复合物的量的至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约500倍、至少约1000倍。在一些实施方案中，当溶液中钙离子的浓度为同一溶液中存在的螯合剂的浓度的至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约20倍或更高时，游离钙离子可存在于溶液中。
在一些实施方案中，钙离子可从水溶性钙盐获得。术语“水溶性钙盐”意指在水中在室温下具有明显的溶解度的钙盐，例如至少1克/100 ml水、至少10克/100 ml水或至少25克/100 ml水或更高。钙盐的实例包括，而不限于，氯化钙、氟化钙、溴化钙、碘化钙、硝酸钙、柠檬酸钙、甲酸钙、乙酸钙、葡萄糖酸钙、抗坏血酸钙、乳酸钙、甘氨酸钙和其混合物。在一些实施方案中，氯化钙可用作钙离子的来源。
游离钙离子可以足以介导钙-依赖性碳水化合物识别结构域与微生物表面结合的浓度或量存在。在一些实施方案中，游离钙离子可以至少约1 μM、至少约10 μM、至少约25 μM、至少约50 μM、至少约100 μM、至少约250 μM、至少约500 μM或至少约1 mM或更高的浓度存在。在一些实施方案中，游离钙离子可以至少约1 mM、至少约2.5 mM、至少约5 mM、至少约10 mM、至少约25 mM、至少约50 mM、至少约75 mM、至少约100 mM或更高的浓度存在。在其它实施方案中，游离钙离子可以至少约100 mM、至少约150 mM、至少约200 mM、至少约300 mM、至少约400 mM、至少约500 mM、至少约600 mM、至少约700 mM、至少约800 mM、至少约900mM、至少约1 M或更高的浓度存在。在一个实施方案中，游离钙离子可以约1 mM至约10 mM的浓度存在。在一个实施方案中，游离钙离子可以至少约5 mM的浓度存在。
尽管螯合剂可在微生物-结合基底上初始捕获微生物期间加入，但螯合剂也可首先不包括在内以允许在微生物-结合基底上在存在游离钙离子时初始捕获任何微生物，包括蛋白A-和蛋白G-阴性微生物，但在捕获后加入以从微生物-结合基底除去任何捕获的蛋白A-或蛋白G-阴性微生物。
因此，在一些实施方案中，微生物捕获可包括(i) 在存在游离钙离子时使至少第一体积的试验样品与本文所述的微生物-结合基底接触，和(ii) 使本文所述的微生物-结合基底的微生物-结合分子在与试验样品接触后，与包含螯合剂的溶液接触。
当在存在本文所述的游离钙离子下微生物-结合基底与试验样品接触时，除了与Fc-介导的结合有关的微生物例如表达蛋白A的微生物(例如，金黄色葡萄球菌)和表达蛋白G的微生物之外，主要取决于钙-依赖性MBL-介导的结合的微生物例如蛋白A-和蛋白G-阴性微生物，例如，大肠杆菌也可结合微生物-靶标基底。
为了从微生物-结合基底洗脱或除去捕获的主要取决于钙-依赖性MBL-介导的结合的微生物，例如蛋白A-和蛋白G-阴性微生物，例如，大肠杆菌，微生物-结合基底上的微生物-结合分子可与包含足够量的本文所述的螯合剂的溶液接触。包含螯合剂的溶液可与上述捕获缓冲液相同。在这样的实施方案中，微生物-结合基底可与包含螯合剂的溶液孵育一段时间，以允许通过钙-依赖性MBL-介导的结合主要结合微生物-结合分子的微生物从微生物-结合基底洗脱，例如孵育至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少45分钟或至少1小时。这样的孵育可在任何合适的温度下进行，例如室温(例如，约16℃至约30℃)、低温(例如约0℃至约16℃)或高温(例如，约30℃至约95℃)。在一些实施方案中，微生物-结合基底可与包含螯合剂的溶液在室温下孵育至少约5分钟至约15分钟。
在这些实施方案中，用于本文描述的测定法的螯合剂的浓度足以从微生物-结合基底洗脱或除去至少约30%的结合的蛋白A-和蛋白G-阴性微生物(例如，大肠杆菌)。例如，用于本文描述的测定法的螯合剂的浓度足以从微生物-结合基底洗脱或除去至少约30%的结合的蛋白A-和蛋白G-阴性微生物(例如，大肠杆菌)，包括至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少80%或更高的结合的蛋白A-和蛋白G-阴性微生物(例如，大肠杆菌)。在一些实施方案中，用于本文描述的测定法的螯合剂的浓度足以从微生物-结合基底洗脱或除去至少约85%的结合的蛋白A-和蛋白G-阴性微生物(例如，大肠杆菌)，包括至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、直至和包括100%或约85%和约100%之间的任何值的结合的蛋白A-和蛋白G-阴性微生物(例如，大肠杆菌)。
如上所述，表达蛋白A和表达蛋白G的微生物可通过Fc-介导的和钙离子-依赖性MBL-介导的结合，结合微生物-结合分子。不希望受理论的约束，用于本文所述的测定法的螯合剂的浓度还可从微生物-结合基底洗脱或除去至少一部分的表达蛋白A和/或表达蛋白G的微生物。例如，用于从微生物-结合基底洗脱或除去蛋白A-和蛋白G-阴性微生物的螯合剂的浓度可足以洗脱或除去不超过60%、不超过50%、不超过40%、不超过30%、不超过20%、不超过10%或更低的结合的表达蛋白A或表达蛋白G的微生物。在一些实施方案中，用于从微生物-结合基底洗脱或除去至少约80%或更多、包括至少约90%或更多的结合的蛋白A-和蛋白G-阴性微生物的螯合剂的浓度可足以洗脱或除去不超过50 %或不超过40%的结合的表达蛋白A和/或表达蛋白G的微生物。
如本领域普通技术人员可理解的，本文所述的测定法可进一步包括在使其基底表面上的微生物-结合分子与包含本文所述的螯合剂的溶液接触前，例如，按下文所述分离微生物-结合基底与试验样品。
1210 (从样品分离微生物)：样品混合物然后可进行微生物分离过程。在一些实施方案中，因为微生物与一个或多个磁性微粒结合，磁铁可用于分离结合的微生物与试验样品。技术人员将知道用于进行磁性分离的方法。通常，可施加磁场梯度以指导磁性微珠的捕获。任选地，结合的微生物可用缓冲液洗涤以除去任何剩余的样品和未结合的组分。洗涤步骤的次数范围可以是1至许多，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次洗涤步骤。不希望受理论的约束，结合的微生物从样品的捕获和分离可浓缩微生物，还从试验样品除去可干扰测定或过程的组分。
磁场源可以是经放置以产生磁场梯度的任何磁铁装置，其用于从样品拉出捕获的微生物。电磁控制器可用于控制和调整磁场和其梯度，和控制磁性结合的微生物的迁移、分离和定向。磁场梯度可通过永久磁铁或通过电磁性信号发生器产生。电磁性信号发生器可包括电磁铁或可电极化的元件，或至少一种永久磁铁。磁场梯度可至少部分地根据预编程的模式产生。磁场梯度可具有定义的磁场强度和/或空间取向。在一些实施方案中，磁场梯度具有定义的磁场强度。本文使用的术语“磁场梯度”是指磁场相对于位置的变化。仅通过实例的方式，一维磁场梯度是磁场相对于一个方向的变化，而二维磁场梯度是磁场相对于两个方向的变化。
如本文使用的，术语“磁场”是指产生流过组合物的局部磁性流的磁性影响，和可指场幅度、平方幅度或时间平均的平方幅度。应理解，磁场可以是直流(DC)磁场或交流(AC)磁场。磁场强度范围可以是约0.00001特斯拉/米(T/m)至约105 T/m。在一些实施方案中，磁场强度范围可以是约0.0001 T/m至约104 T/m。在一些其它实施方案中，磁场强度范围可以是约0.001 T/m至约103 T/m。
在一些实施方案中，微生物捕获和/或微生物-结合基底分离可通过快速微生物诊断测定法或装置进行，如描述于2011年1月19日提交的国际专利申请号WO 2011/091037，其内容通过引用结合到本文中。描述于2011年1月19日提交的国际专利申请号WO 2011/091037的快速微生物诊断装置可经改良以用s-形流程替换捕获室或捕获和可视化室。磁铁可然后用于捕获结合的微生物到流程壁，以分离结合的微生物与剩余样品。
在一些实施方案中，微生物捕获和/或分离通过描述于美国专利申请公开号2009/0220932、2009/007861、2010/0044232、2007/0184463、2004/0018611、2008/0056949、2008/0014576、2007/0031819、2008/0108120和2010/0323342的装置或方法进行，其内容全部通过引用结合到本文中。
在一些实施方案中，微生物捕获、分离或检测通过描述于以下的装置或方法进行：2013年2月28日提交的PCT公开号PCT/US2013/028409、2012年2月4日提交的PCT/US2012/031864和2011年1月19日提交的PCT/US2011/021718；2013年6月14日提交的美国专利申请号13/918,193；和2013年3月15日提交的美国临时申请号61/788570、2013年3月4日提交的61/772,436、2013年3月4日提交的61/772,360和2013年7月18日提交的61/673,071，其内容全部通过引用结合到本文中。
不受限制，如果微生物-结合基底不具有磁性特性，从试验样品分离微生物-结合基底(例如，粒子、柱、纤维、浸渍片、膜、滤器、毛细管等)可通过非-磁性方式进行，例如离心和过滤。在其中微生物-结合基底为浸渍片或膜形式的一些实施方案中，微生物-结合浸渍片或膜可简单地从试验样品除去，其中试验样品中的微生物(如果存在)保持结合与浸渍片或膜基底缀合的改造的微生物-结合分子。
任选地，从试验样品或处理缓冲液分离后微生物-结合基底可用缓冲液(例如，TBST)洗涤以除去任何残留的试验样品、包含螯合剂的溶液或任何未结合的微生物。洗涤步骤的次数范围可以是1至许多，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次洗涤步骤。在一个实施方案中，从包含螯合剂的溶液和/或试验样品分离后微生物-结合基底可用缓冲液(例如，TBST)洗涤约至少1-3次。
1212 (微生物检测/分析)：检测元件、装置或系统可用于检测和/或分析分离的微生物的存在，例如通过光谱、电化学检测、多核苷酸检测、荧光各向异性、荧光共振能量转移、电子转移、酶测定法、磁学、电导率、等电聚焦、色谱、免疫沉淀、免疫分离、适体结合、过滤、电泳、使用CCD相机、免疫测定、ELISA、革兰氏染色、免疫染色、显微术、免疫荧光、蛋白质印迹、聚合酶链反应(PCR)、RT-PCR、荧光原位杂交、测序、质谱或基本上其任何组合。分离的微生物可在检测和/或分析期间保持结合在微生物-结合基底上，或在检测和/或分析之前从微生物-结合基底分离。
如本文所述，微生物-结合分子可用作检测剂。因此，在一些实施方案中，偶联至至少一种可检测标记的本文所述的微生物-结合分子可用于检测微生物捕获的微生物和/或微生物物质。在一些实施方案中，其它公认的微生物-捕获分子，包括例如，但不限于麦胚凝集素、凝集素、抗体(例如，革兰氏阴性抗体或革兰氏阳性抗体、针对特定微生物菌株或物种的抗生素)、抗体的抗原结合片段、适体、细胞-表面受体的配体(激动剂或拮抗剂)等，可用于检测微生物。检测剂也可以是非特异性染色样品中的所有活细胞的非特异性标记分子。
本领域已知用于检测特定标记的任何方法可用于检测。示例性的方法包括但不限于光谱测定、荧光测定、显微成像、免疫测定等。尽管微生物捕获步骤可特异性捕获微生物，但可能有利的是，使用可提高该特异性的标记分子。如果成像例如显微成像用于检测标记，可在微生物安排用于显微成像之前或之后进行染色。另外，成像分析可通过自动化图获取和分析进行。
对于光学检测，包括荧光检测，超过一种染色剂或染料可用于增强微生物的检测或鉴定。例如，可使用第一染料或染色剂，其可与某个属的微生物结合，且可使用第二染料或染色剂，其可与特定的微生物结合。两种染料的共区域化然后通过减少微生物的假阳性检测，提供增强的微生物检测或鉴定。
在一些实施方案中，显微成像可用于检测来自检测剂上的标记的信号。一般而言，子样品中的微生物用染色试剂染色，和获得一个或多个图，从这些图技术人员可容易地计数视野中存在的细胞数。
在具体的实施方案中，微生物可通过使用一种或多种酶测定法例如酶联测定法(ELISA)检测。许多酶测定法可用于提供检测。这样的酶测定法的实例包括但不限于β-半乳糖苷酶测定法、过氧化物酶测定法、过氧化氢酶测定法、碱性磷酸酶测定法等。在一些实施方案中，酶测定法可经配置，使得酶催化涉及产生荧光产物的酶底物的反应。酶和荧光酶底物是已知的和市售可得的(例如，Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.)。在一些实施方案中，酶测定法可配置为结合测定法，其提供微生物的检测。例如，在一些实施方案中，本文所述的微生物-结合分子可与酶测定法中使用的酶缀合。酶底物然后可引入一种或多种固定的酶，使得酶能够催化涉及酶底物的反应以产生可检测信号。类似地，可使用各种酶以及比色或生荧光底物。在一些实施方案中，报告子-酶产生热量变化，其可测量为在特定波长下的吸光度。示例性的酶包括但不限于β-半乳糖苷酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶等。在一些实施方案中，酶是辣根过氧化物酶(HRP)、碱性过氧化物酶(AP)、萤光素酶和/或β-半乳糖苷酶。
在一些实施方案中，酶联测定法(ELISA)可用于检测来自用作检测剂的本文所述的微生物-结合分子的信号。在ELISA中，微生物-结合分子可包含酶作为可检测标记。每个微生物-结合分子可包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)酶。另外，每个微生物-结合分子可包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)与微生物结合的位点。不希望受理论的约束，通过多个(例如，至少10个或更多个)本文所述的微生物-结合分子形成的多聚体分子的存在可增强ELISA信号。
本文所述的微生物-结合分子和可检测标记可通过接头彼此连接。在一些实施方案中，在微生物-结合分子和可检测标记之间的接头是酰胺键。在一些实施方案中，在微生物-结合分子和可检测标记之间的接头是二硫键(S-S)。当微生物-结合分子是肽、多肽或蛋白时，可检测标记可在微生物-结合分子的N-末端、C-末端或内部位置连接。类似地，当可检测标记是酶时，酶可通过其N-末端、C-末端或内部位置连接。
在一些实施方案中，从微生物-结合基底分离或保持结合在微生物-结合基底上的微生物可用酶标记的微生物-结合分子孵育一段时间，例如，至少约5分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、至少约20分钟、至少约25分钟、至少约30分钟。用于ELISA测定法的酶-标记分子的典型浓度范围可以是约1: 500至约1:20,000稀释度。在一个实施方案中，酶-标记微生物-结合分子的浓度可以是约1:1000至约1:10000稀释度。
用ELISA探针分子孵育后，样品可用洗涤缓冲液洗涤一次或多次(例如，1、2、3、4、5或更多次)以除去任何未结合的探针。酶(例如，HRP或AP)的任何底物可加入以使测定显色。酶(例如，HRP或AP)的生色底物是本领域技术人员已知的。技术人员可选择对于酶合适的生色底物,例如对于HRP酶的TMB底物或对于AP酶的BCIP/NBT。在一些实施方案中，用ELISA探针分子孵育后使用的洗涤缓冲液可包含浓度为约至少约0.01 mM、至少约0.05 mM、至少约0.1 mM、至少约0.5 mM、至少约1 mM、至少约2.5 mM、至少约5 mM、至少约10 mM、至少约20mM、至少约30 mM、至少约40 mM、至少约50 mM或更多的钙离子。在备选的实施方案中，用ELISA探针分子孵育后使用的洗涤缓冲液可不包含钙离子。在一些实施方案中，用ELISA探针分子孵育后使用的洗涤缓冲液可包含螯合剂。洗涤缓冲液可以是用于在用抗体和/或标记分子孵育之间洗涤的任何公认的缓冲液。示例性的洗涤缓冲液可包括但不限于TBST。
在一些实施方案中，不希望受理论的约束，对于添加生色底物之前的最后一次洗涤，可能需要使用不含表面活性剂或去垢剂的洗涤缓冲液，因为表面活性剂或去垢剂可对含生色底物的酶促反应具有不利影响。
基于ELISA的方法的一个益处是在结合第二试剂前微生物-结合制品不需要从微生物分散或解离。这与其中过量的残余固体基底在成像期间可能掩盖微生物的显微技术相反。此外，ELISA的光学读出元件可能比显微术的情况更便宜，和不存在对于聚焦或对于样品位于同一焦平面上的要求的需要。基于ELISA的方法的进一步的益处是其可利用市售可得的实验室设备。特别是，当固体基底是磁性的时，磁性分离可使用KINGFISHER®系统自动进行，可使用气升发酵罐进行简单培养，和可使用标准读板器获得比色/荧光读出。
在一些实施方案中，微生物可通过使用免疫测定法检测。许多类型的检测方法可与基于免疫测定法的方法组合使用。
在一些实施方案中，样品中的微生物的检测也可使用光显微术与基于不同于所有正常血液细胞的靶标组分例如微生物的特征性大小(5 um直径)、形状(球形至椭圆)和折射特征的相差成像进行。使用光学成像与对所有微生物或特定亚类特异的荧光或细胞化学染色剂可获得较大的特异性(例如，用于真菌壳多糖的卡尔科弗卢尔(calcofluor) (1 µM至100 µM)、针对真菌表面分子的荧光抗体、革兰氏染色剂、耐酸染色剂、荧光微生物-结合分子等。
微生物检测还可使用外荧光显微镜进行以鉴定微生物的特征性大小(5 um直径)、形状(球形至椭圆)和染色特征。例如，真菌染色不同于所有正常血液细胞，其强结合卡尔科弗卢尔(1 µM至100 µM)和具有在任何其它正常血液细胞中不存在的刚性椭球形状。
在一些实施方案中，微生物可通过使用光谱检测。可使用许多类型的光谱方法。这样的方法的实例包括但不限于紫外光谱、可见光光谱、红外光谱、x-射线光谱、荧光光谱、质谱、等离子体共振(例如，Cherif 等人, Clinical Chemistry, 52:255-262 (2006)和美国专利号7,030,989；通过引用并入本文)、核磁共振光谱、Raman光谱、荧光猝灭、荧光共振能量转移、固有荧光、配体荧光等。
在一些实施方案中，微生物可通过使用荧光各向异性检测。荧光各向异性基于测量以共焦排列成像的样品荧光的稳态极化。线性极化的激光激发源优先激发荧光靶标分子，其中跃迁矩与入射极化矢量平行对齐。收集得到的荧光并导入测量与激发光束平行和垂直极化的荧光的强度的两个通道。用这两种测量，荧光各向异性r可根据以下方程确定：r= (平行强度-垂直强度)/ (平行强度+2(垂直强度))，其中I术语表示平行和垂直于入射极化的强度测量。已描述了荧光分子的荧光各向异性检测。因此，荧光各向异性可结合许多荧光标记，如本文已经描述的和如本领域已经描述的。
在一些实施方案中，微生物可通过使用荧光共振能量转移(FRET)检测。荧光共振能量转移是指两个荧光分子之间的能量转移机制。荧光供体在其荧光激发波长下被激发。该激发状态然后非放射性转移至第二分子即荧光受体。荧光共振能量转移可在许多配置内使用以检测捕获的微生物。例如，在一些实施方案中，第一标记分子可用荧光供体标记，和第二标记分子可用荧光受体标记。因此，这样的标记第一和第二标记分子可在竞争测定法中用于检测样品中微生物的存在和/或浓度。荧光供体和荧光受体的许多组合可用于检测。
在一些实施方案中，微生物可通过使用多核苷酸分析检测。这样的方法的实例包括但不限于基于多核苷酸杂交、多核苷酸连接、多核苷酸扩增、多核苷酸降解等的那些。利用嵌入染料、荧光共振能量转移、电容性脱氧核糖核酸检测和核酸扩增的方法已经描述于例如美国专利号7,118, 910和6,960,437；通过引用并入本文)。这样的方法可适合于提供一种或多种微生物核酸的检测。在一些实施方案中，荧光猝灭、分子信标、电子转移、电导率等可用于分析多核苷酸相互作用。这样的方法是已知的，和已描述于例如：Jarvius, DNATools and Microfluidic Systems for Molecular Analysis, Digital ComprehensiveSummaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Medicine 161, ACTAUNIVERSITATIS UPSALIENSIS UPPSALA 2006, ISBN: 91-554-6616-8; Singh-Zocchi 等人, Proc. Natl. Acad. Sci, 100:7605-7610 (2003); Wang 等人 Anal. Chem, 75:3941-3945 (2003)；和Fan 等人, Proc. Natl. Acad. Sci, 100:9134-9137 (2003)和美国专利No. 6,958,216; No. 5,093,268；和6,090,545，其所有的内容通过引用结合到本文中。在一些实施方案中，多核苷酸分析通过聚合酶链反应(PCR)进行。PCR的原理是技术人员众所周知的，参见例如McPherson, 等人, PCR, A Practical Approach, IRL Press,Oxford, Eng. (1991)，通过引用并入本文。
在一些实施方案中，代谢测定法用于测定样品中的微生物与对照相比的相对数量。如本领域普通技术人员显而易见的，可使用可与细胞有关的任何代谢指示剂，例如但不限于浊度、荧光染料和氧化还原指示剂，例如但不限于Alamar Blue、MTT、XTT、MTS和WST。代谢指示剂可以是细胞的固有组分或加入细胞的环境的组分。在一些实施方案中，代谢指示剂或其状态的变化可导致包含样品的介质吸收或反射特定辐射波长的能力改变。
示例性的代谢测定法包括但不限于ATP发光、活性氧物类(ROS)测定法、刃天青测定法、鲁米诺、MTT-代谢测定法等。此外，如本领域技术人员知道的，用于进行代谢测定法的试剂盒和方法是市售可得的。例如，2-(N-(7-硝基苯并-2-噁-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)、ATP测定试剂盒、AMPLEX® Red半乳糖⁄半乳糖氧化酶测定试剂盒、AMPLEX® Red葡萄糖⁄葡萄糖氧化酶测定试剂盒、AMPLEX® Red谷氨酸⁄谷氨酸氧化酶测定试剂盒、AMPLEX® Red过氧化氢⁄过氧化物酶测定试剂盒、AMPLEX® Red单胺氧化酶测定试剂盒、AMPLEX® Red神经氨酸酶(唾液酸酶)测定试剂盒、AMPLEX® Red磷脂酰胆碱-特异性磷酸脂肪酶C测定试剂盒、AMPLEX® Red鞘磷脂酶测定试剂盒、AMPLEX® Red尿酸⁄尿酸酶测定试剂盒、AMPLEX® Red黄嘌呤⁄黄嘌呤氧化酶测定试剂盒、THIOLTRACKER™Violet (谷胱甘肽检测试剂)、THIOLTRACKER™ Violet (谷胱甘肽检测试剂)和VYBRANT®细胞代谢测定试剂盒，来自Invitrogen；腺苷5’-三磷酸(ATP)发光测定试剂盒(ENLITEN®，来自Promega；ATPLITETM，来自PerkinElmer Life Sciences；ATP生物发光测定试剂盒HSII，来自Boehringer Mannheim, Germany；腺苷5'-三磷酸(ATP)发光测定试剂盒，来自EMDMillipore；活性氧物类(ROS)测定法，来自Cell BioLabs, Inc.；细胞活性氧物类检测测定试剂盒，来自ABCAM®；hROS检测试剂盒，来自Cell Technology, Inc.；和ABTS抗氧化测定试剂盒、ORAC抗氧化测定试剂盒、OxiSelect HORAC活性测定试剂盒、OxiSelect体外ROS/RNS测定试剂盒(绿色荧光)、OxiSelect细胞内ROS测定试剂盒(绿色荧光)、OxiSelect ORAC活性测定试剂盒、OxiSelect总抗氧化能力(TAC)测定试剂盒和总抗氧化能力测定试剂盒，来自BioCat。
在一些实施方案中，从微生物-结合制品分离或保持结合在微生物-结合制品上的微生物可用核酸条码标记，用于随后检测和/或多路检测。用于检测样品中的一种或多种分析物的核酸条码方法是本领域众所周知的。
在其它实施方案中，捕获的微生物可在快速微生物诊断装置的捕获室或捕获和可视化室中分析和/或检测，其描述于2011年1月19日提交的国际专利申请号WO 2011/091037。或者，捕获的微生物可被回收(即，取出)和分析和/或检测。
在一些实施方案中，捕获的微生物在膜测定法上使用颗粒而被回收和分析和/或检测，如描述于美国专利号7,781,226，其内容通过引用结合到本文中。描述于美国专利号7,781,226的膜测定法上的颗粒可与国际专利申请号WO 2011/091037的快速微生物诊断装置可操作连接，以减少样品操作步骤的数量，使方法自动化和/或整合捕获、分离和分析/检测步骤至微流体装置。
在一些实施方案中，微生物捕获、分离和分析可使用混合微流体SPR和分子成像装置进行，如描述于美国专利申请公开号US 2011/0039280。
在一些实施方案中，使用本文公开的微生物-结合分子的微生物捕获、分离和分析可通过描述于例如以下的测定法或装置进行：2011年1月19日提交的PCT公开号PCT/US2011/021603、2011年1月19日年7月18日提交的PCT/US2012/047201和2013年2月28日提交的 PCT/US2013/028409，和2013年3月15日提交的美国临时申请号61/788570、2013年3月4日提交的61/772,436、2013年7月18日提交的61/673,071和2013年3月4日提交的61/772,360，其所有的内容通过引用结合到本文中。
在一些实施方案中，本文所述的方法或测定法可在小于24小时、小于12小时、小于10小时、小于8小时、小于6小时、小于4小时、小于3小时、小于2小时、小于1小时或更短内，在试验样品中检测微生物的存在或不存在和/或鉴定微生物。在一些实施方案中，本文所述的方法或测定法可在小于6小时、小于4小时、小于3小时、小于2小时、小于1小时或更短内，在试验样品中检测微生物的存在或不存在和/或鉴定微生物。
任选的另外分析或处理 - 培养：在本文所述的任何方面的一些实施方案中，测定法或方法可进一步包含培养微生物-结合制品(例如，微生物-结合微粒)上结合的任何微生物一段时间。在这样的实施方案中，在微生物-结合制品上结合的微生物可在培养一段时间后群体扩增至少约10%。
在一些实施方案中，在微生物-结合制品(例如，微生物-结合微粒)上结合的微生物可培养一段时间，例如，至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约6小时、至少约9小时、至少约12小时、至少约18小时、至少约24小时或更长。在一些实施方案中，微生物-结合制品上结合的微生物可培养至少约30分钟至至少约3小时。
在一些实施方案中，与初始结合在微生物-结合制品上的微生物的数量相比，在培养一段时间后微生物-结合制品上结合的微生物的数量可增加或扩增至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约100%。在一些实施方案中，与初始结合在微生物-结合制品上的微生物的数量相比，在培养一段时间后结合在微生物-结合制品上的微生物的数量可增加或扩增至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约500倍、至少约1000倍、至少约10000倍、至少约100000倍。
在一些实施方案中，结合在微生物-结合制品上的微生物可在微生物-相容性培养基上培养，例如，铺板到琼脂板上或在LB肉汤中培养。本领域技术人员将容易知道微生物培养技术，包括但不限于，使用培养箱和/或用于提供温和搅动的设备，例如，旋转器平台和振荡器，如果需要，例如以防止细胞免于聚集，而不使它们经受明显的剪切应力和提供气体搅动。
在本文所述的检测或其它分析期间微生物可保持结合在微生物-制品上，或在本文所述的检测或其它分析之前它们可从微生物-结合制品解离、洗脱或除去。在其中需要结合的微生物从微生物-结合制品解离、洗脱或除去的一些实施方案中，微生物-结合制品的微生物-结合分子可进一步与低pH缓冲液，例如小于6、小于5、小于4、小于3、小于2、小于1或更低的pH缓冲液接触。在一些实施方案中，可使用不引起螯合剂(如果存在)沉淀的低pH缓冲液。在一个实施方案中，低pH缓冲液可以是精氨酸。在另一个实施方案中，低pH缓冲液可以是焦磷酸盐。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，微生物-结合制品的微生物-结合分子可进一步与低pH缓冲液和螯合剂接触。在一些实施方案中，微生物-结合制品的微生物-结合分子与低pH缓冲液和螯合剂接触可同时或序贯进行。在一个实施方案中，微生物-结合基底的微生物-结合分子可进一步与含EDTA或EGTA pH 4.4的精氨酸(例如，2 M)接触。
分离的微生物然后可用于早期所述的分析或其它处理，例如培养物扩增、抗生素灵敏性测试、测序和/或DNA或RNA分析。
任选的其它分析或处理- 抗生素灵敏性或易感性测试：在本文所述的任何方面的一些实施方案中，本文所述的方法或测定法可进一步包括使结合在微生物-结合制品上的微生物或从微生物-结合制品分离的微生物的扩增培养物经受一种或多种抗生素。微生物对抗生素的反应可然后用本领域的任何已知方法进行评价，例如通过测量微生物的成活力。因此，可鉴定合适的抗生素以治疗由微生物引起的感染，即使结合到微生物-结合基底上的微生物的具体物种是初始未知的。在抗生素灵敏性测试中使用本文所述的改造的微生物-结合分子的其它细节可见于例如2012年2月29日提交的美国临时申请号61/604,878和2012年5月16日提交的61/647,860，和2013年2月28日提交的PCT公开号PCT/US2013/028409，其所有的内容通过引用以其整体结合到本文中。
本文所述的任何方法或步骤可通过组件或装置进行。尽管这些作为离散方法进行描述，但本文所述的一个或多个方法或步骤可组合为一个系统，用于进行本文所述的任何方面的测定法。
一般而言，本文所述的任何方面的测定法或方法的实施方案可用于检测试验样品或原位(例如，其中微生物实际残留于例如水储库中或工作表面上)的微生物或微生物物质的存在或不存在。例如，在一些实施方案中，试验样品(例如获自受试者或环境来源或环境表面)可与本文所述的改造的微生物-结合分子或改造的微生物-结合制品接触，使得试验样品中或环境表面上任何微生物如果存在，可被改造的微生物-结合分子或改造的微生物-结合制品捕获，例如使用上述示例性的方法的任何实施方案。在一些实施方案中，捕获的在改造的微生物-结合分子或微生物-结合制品上结合的微生物然后可进行上文所述的不同分析，例如用于鉴定微生物属或种，例如通过免疫测定法(例如，使用抗特定微生物的抗体)、质谱测定、PCR等。在其中改造的微生物-结合分子包含成像剂(例如，气泡、脂质体、球、诊断造影剂或本文所述的可检测标记)的备选的实施方案中，微生物与改造的微生物-结合分子的结合可原位检测以鉴定局部微生物感染或污染，还允许局部治疗感染或污染。
在一些实施方案中，本文所述的测定法或方法可用于在受试者中原位诊断或定位微生物感染。例如，包含成像剂的改造的微生物-结合微珠(例如，改造的微生物-结合微珠可连接至成像剂，例如，气泡、脂质体、球、诊断造影剂或本文所述的可检测标记)可经系统(例如，通过注射)或局部给予受试者。在这样的实施方案中，包含成像剂的改造的微生物-结合微珠可用于鉴定和/或定位受试者的局部微生物感染口袋(例如，在组织中)和任选地允许局部治疗微生物感染，其描述于下文章节“用于治疗和/或预防微生物感染的示例性组合物和方法”中。
在一些实施方案中，当受试者被检测具有感染时，方法可进一步包括给予受试者或为受试者处方抗微生物剂。一些示例性的抗微生物剂包括但不限于青霉素、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、万古霉素和其任何组合。
不希望受理论的约束，改造的微生物-结合分子的一些实施方案可用于使微生物受调理素作用，其然后通过先天免疫反应而被清除。在一些实施方案中，微生物-结合分子可以是较有效的微生物调理素。因此，在一些实施方案中，当使用本文所述的方法，受试者被诊断具有微生物感染时，受试者可给予或处方包含本文所述的至少一种改造的微生物-结合分子的组合物。不受限制，本文所述的任何方面的方法可用于诊断对至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或更多抗生素有抗性的微生物。
在一些实施方案中，本文公开的测定法可使用“浸渍片”格式进行。仅通过实例的方式，微生物-结合浸渍片或试纸条可与来自患者或受试者的试验样品(例如，血液样品)接触，和孵育一段时间，例如，至少约15秒、至少约30秒、至少约1分钟、至少约2分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时或更久。在一些实施方案中，孵育的浸渍片或试纸条然后可在封闭剂(例如，BSA、正常血清、酪蛋白、脱脂奶粉和/或任何市售可得的封闭剂以最小化非特异性结合)中孵育。根据改造的微生物-结合分子的不同的实施方案，在一些实施方案中，微生物-结合浸渍片或试纸条在与试验样品(例如，血液样品)接触后可进一步与至少一种另外的试剂接触以促进病原体的检测，和/或增加病原体检测的特异性。例如，浸渍片或试纸条的一些实施方案在与试验样品(例如，血液样品)接触后可进一步与可检测标记接触，所述可检测标记缀合至结合微生物和/或微生物物质的分子。这样的分子的实例可包括但不限于，本文所述的改造的微生物-结合分子的一个或多个实施方案、对待检测的微生物或病原体特异性的抗体、待检测的微生物或病原体识别的蛋白、肽、碳水化合物或核酸，和其任何组合。
在一些实施方案中，微生物-结合浸渍片和/或试纸条的读出可在系统或装置中进行，例如便携式装置。系统或装置可显示信号，表明试验样品中存在或不存在微生物感染，和/或微生物感染的程度。
在一个实施方案中，测定法可用于体内检测或成像感染病灶。例如，受试者可给予本文公开的微生物-结合分子，其中微生物-结合分子包含可检测标记；和使用诊断成像扫描受试者。不受限制，诊断成像选自放射照相术、磁共振成象(MRI)、正电子发射断层照相术(PET)、单光子发射计算体层摄影术(SPECT或较不常用，SPET)、闪烁照相术、超声、CAT扫描、光声成像、热相图、直线断层摄影、复式体层照相术、厚层体层照相术、全景断层摄影(OPT或OPG)、计算机体层摄影术(CT)或计算机轴向体层摄影术(CAT扫描)和其任何组合。
由于本文所述的微生物-结合分子的提高的灵敏性，与参考分子相比，较低剂量(例如，降低至少10%或更多，包括例如，至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%或更多)的所述微生物-结合分子可为相同治疗作用而用于治疗中。在一些实施方案中，参考分子可以是描述于国际专利公开号WO 2013/012924和WO 2011/090954中的分子，其各自的内容通过引用以其整体结合到本文中。在一些实施方案中，当本文所述的微生物-结合分子包含源自MBL的碳水化合物识别结构域时，参考分子可以是本文所述的FcMBL。
微生物与改造的微生物-结合分子的结合可利于从感染区域分离和除去微生物和/或微生物物质。因此，本文提供的另一方面涉及用于治疗和/或预防微生物感染或微生物污染的组合物，其包含本文所述的一种或多种改造的微生物-结合分子或微生物-结合基底(例如，微生物-结合磁性微珠)。
在一些实施方案中，组合物可经配制以治疗和/或预防环境表面中存在的微生物感染或微生物污染。本文使用的术语“环境表面”是指环境或物体的任何表面和/或主体。环境物体可以是非活的物体或活的物体，例如植物。环境表面的实例可包括但不限于医疗装置、可移植装置、医院或诊所的表面(例如，手术室或加强护理病房)、用于生产或处理食品或药品(例如，药物、治疗剂或成像剂)的机器或工作表面、细胞培养物、水处理厂、水储库和植物。
在一些实施方案中，组合物可经配制用于治疗和/或预防受试者的体液例如血液中的微生物感染。尽管在一些实施方案中，本文所述的组合物的改造的微生物-结合分子可捕获在循环体液例如血液中的微生物和/或微生物物质，但在其它实施方案中，改造的微生物-结合分子可使微生物和/或微生物物质受调理素作用，使得微生物和/或微生物物质可被先天免疫系统识别以清除。
或者，改造的微生物-结合分子可使微生物局部化，因此可阻止其例如向伤口更深处扩散。在一些实施方案中，改造的微生物-结合分子可用于使微生物载荷局部化，其然后可容易地从感染区域除去。在一些实施方案中，微珠可被标记用于感染位点的特异性成像。对于SPECT成像，可使用通常使用的示踪剂放射性同位素例如碘-123、锝-99m、氙-133、铊-201和氟-18。锝99m可用于闪烁扫描测定法。碘-衍生或其它不透射线的造影剂也可掺入珠中用于放射照相或CT-扫描成像。使用顺磁或超顺磁微珠作为造影剂可用于磁共振成象，以改变感染病灶内的原子的弛豫时间。在另一个实施方案中，微球可经荧光染色和应用于手术伤口，以确定感染过程的范围。这可用于在对于骨髓炎、蜂窝织炎或筋膜炎的清创手术期间辅助外科医生区分感染和健康组织。
因此，本文提供的另一方面涉及用于在受试者的组织中治疗和/或预防微生物感染的组合物。在一些实施方案中，组合物包含至少一种本文所述的改造的微生物-结合分子。在一些实施方案中，组合物中存在的改造的微生物-结合分子和/或微生物-结合基底的量足以减少微生物在受试者的组织中的生长和/或扩散。本文使用的词语“减少微生物在组织中的生长和/或扩散”是指减少微生物菌落数量，和/或组织中的微生物的移动。在一些实施方案中，改造的微生物-结合分子可捕获和使组织中存在的微生物局部化，使得与不存在改造的微生物-结合分子时相比，组织中的微生物菌落数量可减少至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、直至和包括100%。在一些实施方案中，改造的微生物-结合分子可捕获和使组织中存在的微生物局部化，使得与不存在改造的微生物-结合分子时相比，组织中的微生物菌落数量可减少至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍或更多。在一个实施方案中，在至少约12小时、至少约16小时或至少约24小时的时间后，与不存在改造的微生物-结合分子时相比，改造的微生物-结合分子与微生物(例如，金黄色葡萄球菌)的结合减少菌落数量至少约4倍至至少约6倍(例如，至少约5倍)。
在其它实施方案中，改造的微生物-结合分子可捕获和使组织中存在的微生物局部化，使得与不存在改造的微生物-结合分子时相比，组织内的微生物的移动(例如，关于向组织更深处进行的距离，和/或从感染部位的扩散面积)可减少至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、直至和包括100%。在一些实施方案中，改造的微生物-结合分子可捕获和使组织中存在的微生物局部化，使得与不存在改造的微生物-结合分子时相比，组织内的微生物的移动(例如，关于向组织更深处进行的距离，和/或从感染部位的扩散面积)可减少至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍或更多。
在一些实施方案中，组合物可进一步包含至少一种抗微生物剂和药物递送媒介。例如，在一些实施方案中，组合物可进一步包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或更多种抗微生物剂。在一些实施方案中，组合物可进一步包含1或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000或更多)递送媒介。在一些实施方案中，组合物可进一步包含至少1种(包括至少2、至少3、至少4、至少5或更多)抗微生物剂和至少1种(包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000或更多)药物递送媒介的组合。如本文使用的，术语“药物递送媒介”通常是指可用于携带活性剂至靶标部位的任何材料。药物递送媒介的实例包括但不限于细胞、肽颗粒、聚合物颗粒、树状聚体、囊泡、脂质体、水凝胶、核酸支架、适体和其任何组合。
在其中包括药物递送媒介的一些实施方案中，改造的微生物-结合分子和/或抗微生物剂可分散(例如，包封或埋入)在药物递送媒介中和/或涂布在药物递送媒介的表面上。
在其中组合物包括至少一种抗微生物剂的一些实施方案中，抗微生物剂可作为与改造的微生物-结合分子分开的实体存在，和/或其可与至少一种改造的微生物-结合分子融合，例如通过遗传修饰和/或化学缀合。
本文使用的术语"抗微生物剂"是指与不存在抗微生物剂时相比，具有抗微生物活性，即抑制或减少生长和/或杀死微生物，例如，至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约75%、至少约90%或更多的能力的任何实体。抗微生物剂可以是例如但不限于银纳米颗粒、小分子、肽、肽模拟物、抗体或其片段、核酸、酶(例如，抗微生物金属内肽酶例如溶葡萄球菌素)、适体、药物、抗生素、化学品或可抑制生长和/或杀死微生物的任何实体。可包括在本文所述的组合物中的抗微生物肽的实例包括但不限于甲氟喹、杀黑星菌素A、抗霉素、myxothiazol、stigmatellin、敌草隆、碘乙酰胺、水合亚碲酸钾、aDL-乙烯基甘氨酸、N-乙基马来酰亚胺、L-烯丙基甘氨酸、二芳基喹啉、甜菜碱醛氯、acivcin、psicofuraine、buthionine sulfoximine、二氨基pemelic acid、4-磷酸-D-红细胞系异羟肟酸、莫特沙芬钆和/或xycitrin或其修饰形式或类似物。
在一些实施方案中，组合物中包括的抗微生物剂可以是抗生素。如本文使用的，术语"抗生素"是本领域公认的，和包括由微生物例如细菌(包括杆菌物种)、放线菌(包括链霉菌属)或真菌天然产生的抗微生物剂(其抑制其它微生物的生长或破坏其它微生物)，或其遗传改造形式和从这样的天然来源分离的形式。类似结构和作用方式的物质可经化学合成，或天然化合物可仅修饰以产生半-合成的抗生素。示例性的抗生素类型包括但不限于：(1) β-内酰胺，包括青霉素、头孢菌素类、单环β-内酰胺类、甲氧西林和碳青霉烯类；(2) 氨基氨基糖苷类，例如，庆大霉素、卡那霉素、新霉素、妥布霉素、netilmycin、巴龙霉素和阿米卡星；(3) 四环素，例如，多西环素、米诺环素、土霉素、四环素和地美环素；(4) 磺胺类(例如，磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶和柳氮磺吡啶)和甲氧苄啶；(5) 喹诺酮类，例如，环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星；(6) 糖肽(例如，万古霉素、telavancin、替考拉宁)；(7) 大环内酯类，其包括例如，红霉素、阿奇霉素和克拉霉素；(8) 碳青霉烯类(例如，ertapenem、多利培南、美罗培南和亚胺培南)；(9) 头孢菌素类(例如，头孢羟氨苄、头孢吡肟和ceftobiprole)；(10) 林可酰胺类抗生素(例如，克林霉素和林可霉素)；(11) 单环β-内酰胺类(例如，氨曲南)；(12) 呋喃类药物(例如，呋喃唑酮和呋喃妥因)；(13) 青霉素(例如，阿莫西林和青霉素G)；(14) 多肽(例如，杆菌肽、多粘菌素E和多粘菌素B)；和(15) 其它抗生素，例如，安莎霉素类、多霉素类、碳头孢烯、氯霉素、脂肽和针对分支杆菌(例如，引起哺乳动物疾病的那些，包括结核病(结核分支杆菌)和麻风病(麻风分枝杆菌))的药物，和其任何组合。
其他示例性的抗微生物剂可包括但不限于抗细菌剂、抗真菌剂、抗原虫剂、抗病毒剂和其任何混合物。
示例性的抗细菌剂包括但不限于罗索沙星、Amifioxacin、阿莫西林、氨苄西林、阿扑西林、阿度西林、阿奇霉素、氨曲南、巴洛沙星、lc青霉素、比阿培南、溴莫普林、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢曲秦、头孢卡品、头孢地尼、头孢他美、头孢美唑、头孢丙烯、头孢沙定、头孢布烯、头孢呋辛、头孢氨苄、头孢烟酰、头孢噻啶、头孢羟唑、头孢唑林、头孢霉定、氯喹那多、金霉素、环己西林、西诺沙星、环丙沙星、克拉霉素、克拉维酸、克林霉素、氯法齐明、氯唑西林、达氟沙星、氨苯砜、地美环素、双氯西林、二氟沙星、多西环素、依诺沙星、恩氟沙星、红霉素、氟罗沙星、氟氧头孢、氟氯西林、氟甲喹、磷霉素、异烟肼、左氧氟沙星、扁桃酸、美西林、甲硝唑、米诺环素、莫匹罗星、那氟沙星、萘啶酸、Nifuirtoinol、呋喃妥因、硝羟喹啉、诺氟沙星、氧氟沙星、土霉素、帕尼培南、培氟沙星、苯氧基甲基青霉素、吡哌酸、吡咯米酸、匹氨西林、匹美西林、普卢利沙星、芦氟沙星、司帕沙星、舒巴坦、磺胺苯酰、磺胺乙胞嘧啶、磺胺林、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲基异噁唑、氨苯磺胺、磺胺索嘧啶、磺胺噻唑、替马沙星(Temafioxacin)、四环素、四氧普林、替硝唑、托氟沙星、甲氧苄啶和其药学上可接受的盐或酯。
示例性的抗真菌剂包括但不限于，联苯苄唑、布康唑、氯海因、氯苯甘醚、环吡酮胺、克霉唑、依柏康唑、益康唑、氟康唑、氟曲马唑、异康唑、伊曲康唑、酮康唑、咪康唑、硝呋醛肟、噻康唑、特康唑、十一烯酸和其药学上可接受的盐或酯。
示例性的抗原虫剂包括但不限于，乙酰胂胺、阿扎硝唑、氯喹、甲硝唑、硝呋太尔、尼莫唑、氯醇硝唑、普罗硝唑、塞克硝唑、Sineflngin、替诺尼唑、特硝唑、替硝唑和其药学上可接受的盐或酯。
示例性的抗病毒剂包括但不限于阿昔洛维、溴夫定、西多福韦、姜黄、地昔洛韦、1-二十二烷醇、依度尿苷、gQ Fameyclovir、非西他滨、伊巴他滨、咪喹莫特、拉米夫定、喷昔洛韦、伐昔洛韦、缬更昔洛韦和其药学上可接受的盐或酯。
在一些实施方案中，抗微生物剂可包括任何形式存在的银，例如，纳米颗粒、胶体、混悬液、粉末和其任何组合。
在一些实施方案中，组合物可用于治疗和/或预防由本文所述的任何微生物引起的感染。在一个实施方案中，组合物可用于治疗和/或预防由金黄色葡萄球菌引起的感染。
在一些实施方案中，组合物可用于治疗和/或预防由对至少1种、至少2种、至少3种、至少4种或更多种本文所述的抗微生物剂有抗性的微生物引起的感染。在一个实施方案中，组合物可用于治疗和/或预防由对至少1种、至少2种、至少3种、至少4种或更多种本文所述的抗生素有抗性的微生物引起的感染。例如，在一个实施方案中，组合物可用于治疗和/或预防由甲氧西林-耐药性金黄色葡萄球菌引起的感染。在另一个实施方案中，组合物可用于治疗和/或预防由万古霉素-耐药性金黄色葡萄球菌引起的感染。
示例性的抗微生物应用和/或产品：本文所述的组合物可经配制或配置用于不同的应用和/或抗微生物产品。在一些实施方案中，本文所述的组合物可配制为药物组合物，如下文所述，例如，作为抗生素或防腐剂用于治疗性治疗。
伤口敷料：在一些实施方案中，本文所述的组合物可经配制用于例如，在伤口、损伤或脓疮中局部施用。仅通过实例的方式，在一些实施方案中，多种改造的微生物-结合分子可与伤口敷料共混，与其结合或在其上涂布，所述伤口敷料例如但不限于绷带、胶粘剂、纱布、薄膜、凝胶、泡沫、水胶体、藻酸盐、水凝胶、糊剂(例如，多糖糊剂)、喷雾剂、颗粒剂和珠。
在一些实施方案中，伤口敷料可包括本文所述的另外的抗微生物剂和/或防腐化学品，例如含硼麻布和/或医用蓖麻油。
在一个实施方案中，多种改造的微生物-结合分子(例如，微生物-结合微粒或微生物-结合磁性微珠)可结合或涂布到伤口敷料上，例如绷带或胶粘剂。当这样的伤口敷料应用于伤口或损伤时，伤口或损伤中存在的任何微生物(例如，金黄色葡萄球菌)和/或微生物物质可结合和定位于伤口敷料。因此，定期更换伤口敷料可从伤口或损伤除去微生物，因此防止微生物移动更深入伤口或损伤以进一步感染。
在一个实施方案中，多种改造的微生物-结合分子(例如，微生物-结合微粒或微生物-结合磁性微珠)可配制到伤口敷料喷雾剂，其可以是方便的和用于任何地方，例如，在救护车上运送期间使用。当伤口敷料喷雾剂包含微生物-结合磁性微珠时，具有结合的微生物(例如，金黄色葡萄球菌)的微生物-结合磁性微珠可用磁场梯度从伤口除去，然后再次施用喷雾剂。
清创流体或喷雾剂：在一些实施方案中，本文所述的组合物可配制为清创流体的一部分(任选地含悬浮的微粒，其对损伤区域具有磨蚀性)。在一些实施方案中，本文所述的组合物可配制为清创喷雾剂的一部分。如本文使用的，术语“清创”一般是指完全或部分除去受试者的死亡、破坏和/或感染的组织，以改进剩余的健康和/或非感染组织的愈合潜力。仅通过实例的方式，多个改造的微生物-结合分子(例如，微生物-结合微粒或磁性微珠)可悬浮于清创流体或喷雾剂中，例如，用于整形外科手术。包含改造的微生物-结合分子的清创流体或喷雾剂可应用于损伤、脓疮或伤口，其中改造的微生物-结合微粒或磁性微珠可从损伤、脓疮或伤口捕获微生物(例如，金黄色葡萄球菌)和/或微生物物质。清创流体或喷雾剂然后可通过真空或抽吸从应用部位除去。在一些实施方案中，包含改造的微生物-结合磁性微珠的清创流体或喷雾剂还可通过将应用部位暴露于磁场梯度从应用部位除去，磁场梯度可从应用部位拖出或吸引应用的微生物-结合磁性微珠。
医疗装置涂层：在一些实施方案中，本文所述的组合物可涂布到医疗装置的表面，所述装置例如身体外装置的流体递送装置例如中空纤维、管或螺旋式混合器，或可植入装置例如内在导管、芯片或支架。仅通过实例的方式，多个改造的微生物-结合分子可涂布或缀合至流体递送装置的表面，使得当流体(例如，血液)流过用改造的微生物-结合分子涂布的流体递送装置时，流体(例如，血液)中存在的任何微生物(例如，金黄色葡萄球菌)和/或微生物物质可从中提取，从而减少微生物感染的机会。在另一个实施方案中，在医疗装置上涂布的多个改造的微生物-结合分子可包含可检测标记，例如，本文所述的“智能标记”，当任何微生物(例如，金黄色葡萄球菌)结合至医疗装置的表面时其可提供可检测信号，表明医疗装置已被污染和/或感染，因此不适合使用或移植。
本公开内容进一步提供用于从靶区域除去微生物和/或微生物物质的方法，包括使靶区域与本文所述的至少一种组合物接触。因为从感染区域除去微生物和/或微生物物质可治疗和/或预防微生物感染或微生物污染，本文还提供了用于治疗和/或预防靶区域的微生物感染或微生物污染的方法。示例性的方法包括使靶区域与包含本文公开的改造的微生物-结合分子的组合物接触。靶区域可以是任何地方，例如，环境表面或受试者的身体内(例如，体液和/或组织)。在一些实施方案中，所述方法包括使受试者的组织与本文所述的组合物的任何实施方案接触。在一些实施方案中，组织可具有打开的伤口、损伤或脓疮。
在一个实施方案中，组合物可经配制用作本文所述的伤口敷料。
因为改造的微生物-结合分子可使微生物(例如，金黄色葡萄球菌)局部化以更容易从组织除去微生物，在一些实施方案中，所述方法可进一步包括在一段时间后用新的组合物替换之前应用的与组织接触的组合物。例如，根据微生物感染的情况和/或特定的组合物，之前应用的组合物可每1小时、每2小时、每3小时、每4小时、每5小时、每6小时、每8小时、每10小时、每12小时、每16小时、每24小时或更长进行替换。
在一些实施方案中，所述方法可进一步包括给予组织另外的处理。示例性的另外处理可包括但不限于负压治疗、真空辅助清创、给予抗微生物剂或其任何组合。
不受限制，本文所述的任何方面的组合物和/或方法可用于体外、原位或体内治疗和/或预防微生物感染或污染。在一些实施方案中，本文所述的任何方面的组合物和/或方法可用于治疗和/或预防在流体中或在任何表面上的微生物感染或污染，包括但不限于，组织表面、固体基底表面例如医疗装置表面、环境表面或食品。
另外，在其中组合物包含缀合至本文所述的可检测标记或成像剂的至少一种改造的微生物-结合分子的一些实施方案中，可用于原位成像感染，例如，在受试者中或在环境表面上。
本公开内容还提供了用于在感染病灶处递送或浓缩抗-微生物剂的方法。通常，病灶与包含本文公开的至少一种微生物-结合分子和抗-微生物剂的组合物接触。微生物剂可与微生物-结合分子共价或非-共价连接。在一些实施方案中，抗-微生物剂可包括在与微生物-结合分子共价或非-共价连接的颗粒中。
改造的微生物-结合分子的一些实施方案可用于治疗目的。为给予有需要的受试者，本文所述的改造的微生物-结合分子可在药学上可接受的组合物中提供。因此，在又一方面，本文提供了包含本文所述的至少一种改造的微生物-结合分子和药学上可接受的载体的药物组合物。
当改造的微生物-结合分子用作体内治疗剂时，胶原结构域和/或Fc结构域可经进一步修饰以调节效应子功能，例如抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。仅通过实例的方式，Fc结构域可介导ADCC和CDC。在ADCC中Fc结构域通常可结合免疫效应细胞例如自然杀伤细胞和巨噬细胞的表面上的Fc受体，导致靶细胞的吞噬或溶解。在CDC中Fc结构域通常可在细胞表面触发补体级联，以杀死靶细胞。因此，调节效应子功能可通过改造Fc结构域以增加或降低它们与免疫效应细胞的表面上的Fc受体或补体因子的结合实现。例如，Fc区内用于调节ADCC和CDC的许多突变是技术人员众所周知的，例如，参见Armour KL. 等人 (1999) Eur J Immmunol 29: 2613-2624; Shields RL. 等人 (2001)J Biol Chem. 276: 6591-6604; Idusogie EE. 等人 (2001) J Immunol. 166: 2571-2575; Idusogie EE. 等人 (2000) J Immunol. 155: 1165-1174；和Steurer W. 等人(1995) J Immunol. 155: 1165-1674。在一个实施方案中，Fc结构域可经修饰以除去Fc的糖基化，因此进而降低ADCC和CDC功能。例如，SEQ ID NO: 5的残基82处的氨基酸天冬酰胺(N)可突变为天冬氨酸(D)。在一个实施方案中，Fc结构域可包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列或其片段或其变体，基本上由之组成或由之组成。
根据选择的给予途径，组合物或制剂可为任何形式，例如，片剂、锭剂、混悬剂、自由流动散剂、气雾剂和胶囊剂。如本文使用的术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内其适合用于与人类和动物的组织接触，没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相当的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文使用的，术语“药学上可接受的载体”是指用于给予本文所述的活性剂的药学上可接受的材料、组合物或溶媒。药学上可接受的载体包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，其与活性剂的活性相容并且对受试者是生理学上可接受的。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(i) 糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(ii) 淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(iii) 纤维素和其衍生物，例如羧基甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(iv) 粉状西黄蓍胶；(v) 麦芽；(vi) 明胶；(vii) 润滑剂，例如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石粉；(viii)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(ix) 油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(x) 二醇，例如丙二醇；(xi) 多元醇，例如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(xii) 酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯;(xiii) 琼脂；(xiv) 缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(xv) 藻酸；(xvi) 无热原水；(xvii) 等渗盐水；(xviii) 林格溶液；(xix) 乙基醇；(xx) pH缓冲溶液；(xxi) 聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；(xxii) 膨胀剂，例如多肽和氨基酸；(xxiii) 血清组分，例如血清白蛋白、HDL和LDL；(xxiv) C2-C12醇，例如乙醇；和(xxv) 药物制剂中使用的其它无毒相容物质。湿润剂、着色剂、释放剂、涂布剂、甜味剂、矫味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于制剂中。对于本文所述的经口服给予的组合物或制剂，药学上可接受的载体包括但不限于药学上可接受的赋形剂，例如惰性稀释剂、崩解剂、结合剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂。合适的惰性稀释剂包括碳酸钠和钙、磷酸钠和钙、和乳糖，而玉米淀粉和藻酸是合适的崩解剂。结合剂可包括淀粉和明胶，而润滑剂如果存在，通常是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。如果需要，片剂可用材料例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯包衣，以延迟在胃肠道内的吸收。
根据给予途径和制剂，药学上可接受的载体可在本文所述的制剂中不同。本文所述的组合物和制剂可通过技术人员已知的任何给予方式递送。例如，本文所述的组合物和制剂可通过给予途径例如但不限于(口服和胃肠外，包括静脉内、肌内、腹膜内、皮内和皮下)以系统方式递送。在一些实施方案中，本文所述的组合物和制剂为适合注射的形式。在其它实施方案中，本文所述的组合物和制剂经配制用于口服给予。
当胃肠外给予时，本文所述的组合物和制剂通常可以单位剂量注射形式(溶液、混悬液、乳液)配制。适合注射的组合物和制剂包括无菌水性溶液或分散液。载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、细胞培养基、缓冲液(例如，磷酸缓冲盐水)、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其合适的混合物。在一些实施方案中，药用载体可以是缓冲溶液(例如PBS)。
口服组合物可以任何口服可接受的剂型制备，包括但不限于片剂、胶囊剂、乳剂和水性混悬剂、分散剂和溶液剂。对于片剂，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。润滑剂例如硬脂酸镁也通常加入片剂。对于以胶囊形式口服给予，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当口服给予水性混悬剂或乳剂时，活性成分可与乳化剂或助悬剂组合悬浮或溶于油相。如果需要，可加入某些甜味剂、矫味剂或着色剂。用于口服给予的液体制剂还可以干粉形式制备，在使用前用合适的溶剂复溶。
组合物还可包含辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、着色剂等，取决于给予途径和需要的制剂。可参考标准教科书例如“REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE”, 17th edition, 1985(通过引用结合到本文中)，以制备合适的制剂，而无需过度实验。关于本文所述的组合物，然而，使用的任何溶媒、稀释剂或添加剂应必须是与本文所述的活性剂生物相容的。本领域技术人员将认识到，组合物的各组分应经选择以与活性剂生物相容。这在化学和药学原理方面对技术人员是没有问题的，或通过参考标准科教书或通过简单实验(不涉及过度实验)问题可容易避免。
在一些实施方案中，本文所述的组合物和制剂可以乳剂或凝胶配制。这样的凝胶组合物和制剂可局部植入受试者的疾病组织区。
对于体内给予，本文所述的组合物和制剂可用递送装置例如注射器给予。因此，本文所述的其它方面提供包含具有出口的至少一个室的递送装置，其中至少一个室包含预定量的本文所述的任何组合物和出口提供室内包封的组合物的出口。在一些实施方案中，本文所述的递送装置可进一步包含传动器以控制组合物通过出口的释放。这样的递送装置可以是促进本文所述的任何组合物给予受试者的任何装置，例如注射器、干粉注射器、鼻喷雾器、雾化器或移植物例如微芯片，例如，用于本文所述的任何组合物的持续释放或控制释放。
在本文所述的产品的一些实施方案中，本文所述的微生物-结合微粒本身可经修饰以控制其降解，因此控制活性剂的释放。在一些实施方案中，本文所述的改造的微生物-结合分子、微生物-结合微粒和/或微生物-结合细胞可与本领域普通技术人员可用和已知的其它类型的递送系统组合。它们包括例如基于聚合物的系统，例如聚乳酸和/或聚乙醇酸、聚酐、聚已酸内酯、共聚草酸酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羟基丁酸和/或其组合。包含药物的前述聚合物的微囊描述于例如美国专利5,075,109。其它实例包括基于脂质的非聚合物系统，包括固醇例如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或neuka1脂肪，例如单、二和三甘油酯；水凝胶释放系统；基于脂质体的系统；基于磷酸脂质的系统；硅橡胶系统；基于肽的系统；或部分融合的移植物。具体实例包括但不限于：侵蚀系统，其中组合物以一定形式包含在基质中(例如，描述于美国专利号4,452, 775、4,675,189、5,736,152、4,667,014、4,748,034和-29 5,239,660)；或扩散系统，其中活性组分控制释放速率(例如，描述于美国专利号3,832,253、3,854、480、5,133,974和5,407,686)。制剂可以是例如微球、水凝胶、聚合物储库、胆固醇基质或聚合物系统。在一些实施方案中，系统可允许组合物的持续或控制释放发生，例如，通过控制包含组合物的制剂的扩散或侵蚀/降解速率。此外，基于泵的硬件递送系统可用于递送本文所述的组合物和制剂的一个或多个实施方案。使用长期持续释放制剂或移植物可特别适合于治疗一些感染。本文使用的长期释放意指制剂或移植物经制备和安排，以递送治疗水平的本文所述的组合物或制剂至少30天或至少60天。在一些实施方案中，长期释放是指制剂或移植物配置为在数个月内递送治疗水平的活性剂。
本文还提供了用于捕获和检测和/或确定在样品中微生物和/或微生物物质的存在或不存在的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可包含：(a) 一个或多个容器，其包含本文所述的微生物-结合分子群；和(b) 至少一种试剂。在一些实施方案中，本文所述的微生物-结合分子可各自包含与其偶联的可检测标记。因此，微生物-结合分子作为即用型检测剂提供。在其它实施方案中，可提供不含与其融合的可检测标记的微生物-结合分子。事实上，用户可偶联他们自己选择的可检测标记至本文所述的微生物-结合分子。在一些实施方案中，试剂盒可进一步包含含有至少一种可检测标记的一个或多个容器。
根据检测方法的选择，每个不同亚组的微生物-结合分子可包含独特的检测标记或相同的检测标记。例如，如果每个不同亚组的微生物-结合分子用于不同的采样孔，相同的检测标记可用于微生物-结合分子。然而，如果需要在同一孔中使用多种不同的微生物-结合分子，优选地每个不同亚组的微生物-结合分子包含不同的检测标记(例如，独特的荧光分子)。
适合用于本文提供的任何试剂盒的可检测标记包括通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方式可检测的任何组分。任何公认的可检测标记或本文描述的那些可包括在本文所述的试剂盒中。
检测这样的标记的方法是本领域技术人员众所周知的，和本文描述了示例性的检测方法。例如，放射性标记可使用照相胶片或闪烁计数器检测，荧光标志物可使用检测发射光的光检测器检测。酶标记通常通过提供酶底物给酶和检测由酶对酶底物作用产生的反应产物检测，和量热标记可通过使显色标记可视化检测。
在一些实施方案中，试剂盒可进一步包含微生物-捕获装置或微生物-结合制品。本文可互换使用的，术语"微生物-捕获装置"和"微生物-结合制品"是指能够捕获微生物和/或微生物物质的装置或制品。微生物-捕获装置的实例包括但不限于核酸支架、蛋白支架、脂质支架、树状聚体、微粒或微珠、纳米管、微量滴定板、医疗器械或移植物、微芯片、过滤装置、膜、诊断条、浸渍片、身体外装置、螺旋式混合器和中空纤维反应器。在一些实施方案中，微生物-捕获装置可包含固体表面和与其偶联的微生物-捕获分子。在一些实施方案中，微生物-捕获分子可包含描述于国际专利公开号WO 2013/012924和WO 2011/090954的分子的任何实施方案，其各自的内容通过引用以其整体结合到本文中。在一些实施方案中，微生物-捕获分子可以是本文所述的微生物-结合分子。本文所述的微生物-结合分子可用作检测剂以及捕获剂。
在这些实施方案中，用户可通过缀合微生物-捕获分子至他们需要的基底或制品产生其自己的微生物-结合制品，例如，使用任何公认的缀合化学和/或本文描述的方法。在这样的实施方案中，试剂可包括但不限于用于缀合微生物-捕获分子至基底的偶联剂。在一些实施方案中，试剂盒可进一步包含微生物-捕获分子所缀合的一种或多种基底(例如，微珠，例如磁性微珠)。在这样的实施方案中，在缀合微生物-捕获分子至基底之前，用户可进一步修饰提供的基底的表面化学。
在其它实施方案中，试剂盒可提供即用型的微生物-结合基底。在一些实施方案中，微生物-结合基底可包括一种或多种微生物-结合浸渍片，例如本文所述的。在其它实施方案中，微生物-结合基底可包括一群微生物-结合微珠(包括但不限于聚合物微珠和磁性微珠)。在一些实施方案中，微生物-结合基底可包括微生物-结合磁性微珠群。如果需要，微生物-结合微珠或微生物-结合磁性微珠可在一个或多个单独的容器中提供。在一些实施方案中，在一个或多个容器中包含的该群微生物-结合微珠或磁性微珠可被冻干。
在本文描述的试剂盒的任何方面的一些实施方案中，该群微珠或微生物-结合微珠可分别包含至少一个不同亚组的微珠或微生物-结合微珠。例如，每个不同亚组的微珠或微生物-结合微珠可在单独的容器中提供。在一些实施方案中，不同亚组的微珠或微生物-结合微珠可具有一定大小。在一些实施方案中，不同亚组的微生物-结合微珠可在表面上包含与群体的剩余部分不同密度的微生物-捕获分子。在这些实施方案中，具有不同的大小和/或不同的涂布密度的微生物-捕获分子的两个或更多个亚组的微生物-捕获分子可用于检测和区分不同类型和/或大小的微生物，例如使用本文描述的方法。在一些实施方案中，不同亚组的微生物-结合基底例如微生物-结合微珠可包含彼此不同的碳水化合物识别结构域。
在一个实施方案中，试剂盒中提供的微生物-结合制品可包括包含一种或多种微生物-捕获分子的浸渍片或试纸条或膜，例如，本文所述的微生物-结合浸渍片或膜。在此实施方案中，试剂盒可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、150、200或更多个本文所述的微生物-结合浸渍片或试纸条。包含微生物-结合浸渍片或试纸条的这些试剂盒可用作用于任何地方(例如家中、诊所或医院、救护车、户外环境、食品处理厂和需要微生物捕获和/或检测的任何地方)的微生物的诊断或探针。
在一些实施方案中，本文所述的各微生物-结合制品(例如各微生物-结合浸渍片或膜)可单独包装，以维持其无菌性。在一些实施方案中，两个或更多个产品(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50或更多个产品例如微生物-结合浸渍片或膜)可包装至一个单一单元。在这样的实施方案中，用户可在打开前灭菌任何未使用的产品，例如用UV辐射、高温、γ-辐射、环氧乙烷灭菌或不显著影响改造的微生物-结合分子对微生物检测的活性的任何其它已知的方法。
在其它实施方案中，试剂盒中提供的微生物-结合制品可包括微生物-结合微粒群。在一些实施方案中，微生物-结合微粒可被冻干。
在一些实施方案中，试剂盒可进一步包含至少一个血液收集容器或任何等同的样品容器或室，包括至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20个血液收集容器或等同的样品容器或室。在一些实施方案中，该群微生物-结合微珠或磁性微珠可预装载在至少一个血液收集容器中。在一些实施方案中，血液收集容器可进一步包含本文所述的抗凝剂。在一些实施方案中，血液样品可直接加入包含微生物-结合制品群的这样的血液收集容器用于进行微生物检测测定，例如，如本文所述的。普通技术人员将容易知道，本文所述的微生物-结合制品的一些实施方案(没有磁性特性)也可适用于测定。例如，在与试验样品(例如，血液样品)接触后，不是使用磁铁来收集微生物-结合磁性微粒，而是也可例如通过过滤、离心或本领域已知的任何其它方法，收集微生物-结合制品(没有磁性特性)。
在其中试剂盒包含微生物-结合磁性微珠的一些实施方案中，试剂盒可进一步包含适用于测定法的磁铁，用于从试验样品分离微生物-结合磁性微珠。例如，如果测定法在血液收集管中进行，磁铁可适用于血液收集管，例如，磁铁可被设计为围绕血液收集管的磁铁环以固定或分离来自试验样品或测定缓冲液的微生物-结合磁性微珠。
在本文提供的试剂盒的任何方面，试剂盒可进一步包含便携式读出机器或装置，例如，以测定和显示从用试剂盒进行的测定法产生的信号。例如，读出机器或装置可检测从用本文所述的试剂盒进行的病原体检测的测定法产生的比色信号和/或荧光信号。
在本文所述的试剂盒的任何方面，试剂盒可进一步包括用于与从试验样品测定的读出比较的参考。示例性的参考可以是显示不同的颜色对应于各种范围或程度的微生物感染的带或图表。
根据试剂盒提供的改造的微生物-结合分子和/或产品的不同的实施方案，本文所述的试剂盒的任何方面的一些实施方案可进一步包含另外的试剂。例如，在其中基底上存在的改造的微生物-结合分子未被标记的一些实施方案中，试剂盒可进一步包含一个或多个包含先前描述的可检测标记群的容器，所述可检测标记各自缀合至对微生物特性的靶向剂，例如，而不限于，改造的微生物-结合分子或其片段的一个或多个实施方案、对至少一种微生物特异性的抗体(例如，对革兰氏阳性微生物特异性的抗体，例如抗-LTA抗体，对革兰氏阴性微生物特异性的抗体，例如抗-LPS抗体，或对真菌特异性的抗体，和其任何组合)，或在存在合适的酶底物(例如，HRP或AP)时引起颜色变化的酶。
在本文提供的试剂盒的任何方面，当检测标记包括酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和通常用于比色检测的任何其它酶)时，试剂盒可进一步包含一个或多个包含在存在酶时产生颜色变化的酶底物的容器。本领域技术人员可容易知道用于比色检测的任何公认的酶的合适的酶底物。仅通过实例的方式，碱性磷酸酶的示例性的底物可包括BCIP/NBT或PNPP (p-硝基苯基磷酸二钠盐)； 辣根过氧化物酶的示例性的底物可包括TMB。
在本文提供的试剂盒的任何方面，至少一种试剂可以是洗涤缓冲液、稀释缓冲液、终止缓冲液(例如，终止显色)、包含本文所述的螯合剂的缓冲溶液，或其任何组合。在一个实施方案中，试剂盒提供的至少一种试剂可包括包含螯合剂的至少一种缓冲溶液。螯合剂可用于螯合试验样品或测定缓冲液中存在的任何离子(例如，二价离子)，例如，用于抑制某些微生物而非其它微生物与本文所述的微生物-结合分子的一些实施方案的钙-依赖性结合。因此，这样的试剂盒可用于区分试验样品中的一种微生物(例如，金黄色葡萄球菌)与另一种(例如，大肠杆菌)，例如使用本文所述的方法的一些实施方案。
在本文提供的试剂盒的任何方面，试剂盒可进一步包含至少一个微量滴定板，例如，用于进行反应和检测。
除了上述组分外，本文所述的试剂盒的任何实施方案还可包括信息材料。信息材料可以是与本文所述的方法和/或用于本文所述的方法的聚集体的用途有关的描述性、指导性、销售性或其它材料。例如，信息材料可描述使用本文提供的试剂盒进行病原体或微生物捕获和/或检测的测定法的方法。试剂盒还可包括空容器和/或递送装置，例如，其可用于递送试验样品至测试容器。
试剂盒的信息材料不限于其形式。在许多情况下，信息材料例如说明书以印刷材料提供，例如，印刷正文、图片和/或照片，例如，标签或印刷页。然而，信息材料也可以其它形式提供，例如盲文、计算机可读材料、录像或录音。在另一个实施方案中，试剂盒的信息材料是链接或联系信息，例如，物理地址、电子邮件地址、超链接、网址或电话号码，其中试剂盒的用户可获得关于制剂和/或其用于本文所述的方法的实质信息。当然，信息材料也可以任何形式组合提供。
在一些实施方案中，试剂盒可包含各组分和信息材料的单独容器、分配器或隔室。例如，各不同的组分可包含在瓶、小瓶或注射器中，和信息材料可包含在塑料套或袋中。在其它实施方案中，试剂盒的各个元件包含在单一的未分开的容器内。例如，全部磁性微珠包含在瓶、小瓶或注射器中，其上附接有标签形式的信息材料。
一般而言，本文所述的试剂盒可用于分离、除去和/或检测试验样品中存在的微生物。在一些实施方案中，通过使用本文所述的方法和/或测定法，试剂盒可用于区分不同的微生物物种、类型和/或大小。仅通过实例的方式，试剂盒的一些实施方案可用于检测试验样品中革兰氏阳性微生物的存在或不存在。因此，本文所述的试剂盒的一些实施方案可用于检测或测定试验样品中至少一种革兰氏阳性微生物的存在或不存在。
在一些实施方案中，本文所述的试剂盒可用于筛选药用产品(例如，药物、治疗剂或成像剂)或医疗装置(包括但不限于，可移植装置)中微生物物质(包括但不限于，由微生物分泌的内毒素)的存在或不存在。
根据本文所述的一些方面，试验样品或样品(包括任何流体或样本(处理或未处理的)，其疑似包含微生物和/或微生物物质)可进行本文所述的测定法或方法、试剂盒和系统。试验样品或流体可以是液体、超临界流体、溶液、悬浮液、气体、凝胶、浆液和其组合。试验样品或流体可以是水性的或非水性的。
在一些实施方案中，试验样品可以是水性流体。如本文使用的，术语“水性流体”是指任何可移动的含水材料，其疑似包含微生物和/或微生物物质。
在一些实施方案中，试验样品可包括从受试者获得的生物流体。获自受试者的示例性的生物流体可包括但不限于血液(包括全血、血浆、脐带血和血清)、泌乳产物(例如，乳)、羊水、痰、唾液、尿、精液、脑脊液、支气管抽吸液、汗、粘液、液化粪便、滑液、淋巴液、泪液、气管抽吸液和其级分。在一些实施方案中，生物流体可包括来自受试者的组织样本(例如，活检)的匀浆物。
在一些实施方案中，获自受试者(例如哺乳动物受试者例如人受试者或家养宠物例如猫或狗)的生物流体样品可包含来自受试者的细胞。在其它实施方案中，生物流体样品可包含非细胞生物材料，例如血液、唾液或尿的非细胞级分，其可用于测量血浆/血清生物标志物表达水平。
生物流体样品可从受试者新鲜收集，或是之前收集的样品。在一些实施方案中，用于本文所述的测定法和/或方法的生物流体样品可从受试者收集不超过24小时、不超过12小时、不超过6小时、不超过3小时、不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟或更短。
在一些实施方案中，在用于本文所述的测定法和/或方法之前，本文所述的生物流体样品或任何流体样品可用本文所述的化学和/或生物学试剂处理。在一些实施方案中，在流体样品加入样品容器之前，至少一种化学和/或生物学试剂可存在于样品容器中。例如，血液可收集至血液收集管，例如VACUTAINER®，其已经包含肝素。化学和/或生物学试剂的实例可包括，而不限于，表面活性剂和去垢剂、盐、细胞裂解试剂、抗凝血剂、降解酶(例如，蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、胶原酶、纤维素酶、淀粉酶)和溶剂例如缓冲溶液。
在一些实施方案中，试验样品可包括获自环境来源的流体或样本，例如，但不限于，供水(包括废水)、池塘、河流、水库、游泳池、土壤、食品处理和/或包装厂、农业场所、溶液培养厂(包括溶液培养食品农场)、药物生产厂、动物聚居设施和其任何组合。
在一些实施方案中，试验样品可包括来自生物培养的流体(例如，培养基)。获自生物培养的流体(例如，培养基)的实例包括获自例如，单细胞或多细胞生物(包括原核生物细胞(例如，细菌)和真核生物细胞(例如，动物细胞、植物细胞、酵母、真菌))的培养或发酵的那些，和包括其级分。在一些实施方案中，试验样品可包括来自血液培养的流体。在一些实施方案中，培养基可获自任何来源，例如，而不限于，研究实验室、药物生产厂、溶液培养厂(例如，溶液培养食品农场)、诊断测试设施、临床设施和其任何组合。
在一些实施方案中，试验样品可包括用于实验室或临床设施，例如用于生物医学和分子生物学应用的培养基或试剂溶液。如本文使用的，术语"培养基"是指用于维持组织、生物或细胞群的培养基，或是指用于培养组织、生物或细胞群的培养基，其包含维持组织、生物或细胞群的成活力和支持增殖和生长的营养素。
如本文使用的，术语"试剂"是指用于实验室或临床设施，用于生物医学和分子生物学应用的任何溶液。试剂包括但不限于盐水溶液、PBS溶液、缓冲溶液例如磷酸盐缓冲液、EDTA、Tris溶液和其任何组合。试剂溶液可用于产生其它试剂溶液。例如，Tris溶液和EDTA溶液以特定比例合并以产生“TE”试剂，用于分子生物学应用。
在一些实施方案中，试验样品可以是非-生物流体。如本文使用的，术语“非-生物流体”是指并非如本文定义的术语的生物流体的任何流体。示例性的非-生物流体包括但不限于水、盐水、卤水、缓冲溶液、盐水溶液、糖溶液、碳水化合物溶液、脂质溶液、核酸溶液、烃(例如液体烃)、酸、汽油、石油、液化样品(例如，液化样品)和其混合物。
如本文使用的，术语“微生物”或“微生物”通常是指微生物，包括细菌、真菌、原虫、古生物、原生生物例如藻和其组合，以及微生物物质。术语“微生物”包括活的和死的微生物。术语“微生物”还包括病原微生物或病原体，例如，引起疾病例如瘟疫、结核病和炭疽热的细菌；引起疾病例如疟疾、昏睡病和弓形体病的原虫；引起疾病例如癣、念珠菌病或组织胞浆菌病的真菌；和引起疾病例如败血症的细菌。在一些实施方案中，微生物是革兰氏阳性微生物。
微生物-引起的疾病：在一些其它实施方案中，本文所述的改造的微生物-结合分子或制品、测定法、产品和试剂盒可用于检测或结合革兰氏阳性微生物或相关的微生物物质。一些示例性的革兰氏阳性微生物包括但不限于气球菌属(Aerococcus)、杆菌属(Bacillus)、双歧杆菌属(Bifdobacterium)、Carcina、梭菌属(Clostridium)、Corprococcus、棒状杆菌(Corynebacterium)、Deinobacter、Deinococcus、肠球菌属(Enterococcus)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、真杆菌属(Eubacterium)、兼性双球菌属(Gemella)、乳酸菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、李斯特菌属(Listeria)、Marinococcus、细球菌属(Micrococcus)、片球菌属(Pediococcus)、消化球菌(Peptococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、动性球菌属(Planococcus)、丙酸菌属(Propionibacterium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、Saccharococcus、Salinococcus、葡萄球菌属(Staphylococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、口腔球菌属(Stomatococcus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、Trichococcus和Vagococcus。一些具体的革兰氏阳性微生物物种包括但不限于放线菌(Actinomyces spp.)、Bacillus alkalophilus、解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短杆菌(Bacillus brevis)、环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)、Bacillus clausii、凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)、坚硬芽胞杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽胞杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽胞杆菌(Bacillus lentus)、藓样芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、Bacillus stearothennophilus、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、苏芸金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)、双岐杆菌(Bifidobacteriumspp.)、梭菌样梭状芽胞杆菌(Clostridium clostridiiforme)、艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)、无害梭状芽孢杆菌(Clostridium innocuum)、产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens)、多枝梭状芽胞杆菌(Clostridium ramosum)、杰氏棒状杆菌(Corynebacterium jeikeium)、E. lentum、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)、产气真细菌(Eubacterium aerofaciens)、干酪乳杆菌(L. casei)、植物乳杆菌(L. plantarum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳球菌(Lactococcus spp.)、明串珠菌(Leuconostoc spp.)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、莫拉菌(Moraxella spp.) (包括粘膜炎莫拉菌(M. catarrhalis))、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、P.asaccarolyticus、大消化链球菌(P. magnus)、微小消化链球菌(P. micros)、普氏消化链球菌(P. prevotii)、产生消化链球菌(P. productus)、片球菌(Pediococcus)、厌氧消化链球菌(Peptostreptococcus anaerobius)、短小棒状杆菌(Propionibacterium acnes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、溶血性葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)、溶血性葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、Staphylococcuslugdunensis、Staphylococcus saprophytics、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、鸟链球菌(Streptococcus avium)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、乳链球菌(Streptococcus lactis)、轻型链球菌(Streptococcus mitis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、Streptococcussangius、草绿色链球菌(Streptococcus viridans)和Streptomyces lividans。
在一些实施方案中，通过使用本文描述的方法或测定法，本文所述的改造的微生物-结合分子或制品、产品和试剂盒可用于区分革兰氏阳性微生物与革兰氏阴性微生物。
本领域技术人员可理解，本文所述的改造的微生物-结合分子或基底、产品和试剂盒可用于利用本文所述的对各目的微生物进行修饰的微生物-结合结构域靶向任何微生物。使用本领域已知的任何微生物学技术，技术人员可确定各目的微生物的细胞-表面蛋白或碳水化合物。
生物膜：因此，在一些实施方案中，本文的微生物-结合分子或基底、产品和试剂盒可用于检测生物膜中存在的微生物和/或相关的微生物物质，或处理设备表面以防止或抑制生物膜的形成。例如，单核细胞增多性李斯特菌可在用于食品处理设备的各种材料和其它食品和非-食品接触表面上形成生物膜(Blackman, J Food Prot 1996; 59:827-31;Frank, J Food Prot 1990; 53:550-4; Krysinski, J Food Prot 1992; 55:246-51;Ronner, J Food Prot 1993; 56:750-8)。生物膜可广泛定义为连接表面，并埋入由微生物产生的细胞外聚合物物质的基质中的微生物细胞。生物膜已知在许多环境中出现，和经常导致各种各样的不利影响。例如，生物膜引起工业设备例如热交换器、管道和船体的污垢，导致降低热传递、能量损失、增加流体摩擦阻力和加速腐蚀。在牙齿和牙龈、泌尿和肠道和植入的医疗装置例如导管和假体上的生物膜集聚经常导致感染(Characklis W G.Biofilm processes. In: Characklis W G和Marshall K C eds. New York: John Wiley& Sons, 1990:195-231; Costerton 等人, Annu Rev Microbiol 1995; 49:711-45)。在一些实施方案中，改造的微生物-结合微粒(例如，包封用于处理生物膜的药物或化学品)可喷到污染的设备表面上。生物膜上存在的细菌结合于微生物-结合微粒，其释放药物以处理细菌用于靶向药物递送。
此外，单核细胞增多性李斯特菌结合至表面例如不锈钢和橡胶，常用于食品处理环境的材料，可长时间存活(Helke和Wong, J Food Prot 1994; 57:963-8)。这部分地解释了其在加工厂中持续存在的能力。在加工设施中单核细胞增多性李斯特菌的常见来源包括设备、输送机、产品接触表面、工具、清洁用具、地板、沟渠、墙壁和冷凝液(Tomkin 等人,Dairy, Food Environ Sanit 1999; 19:551-62; Welbourn和Williams, Dairy, FoodEnviron Sanit 1999; 19:399-401)。在一些实施方案中，改造的微生物-结合分子可经配置以包括“智能标记”，其当缀合至改造的微生物-结合分子时不可检测，但当在存在微生物酶下从改造的分子释放时产生颜色变化。因此，当微生物结合至改造的微生物-结合分子时，微生物释放酶，其从改造的分子释放可检测标记。颜色变化的观察结果表明在特定表面上细菌污染的风险，和因此改造的微生物-结合分子和产品的一些实施方案可用于早期检测生物膜形成。
植物微生物：在仍其它的实施方案中，本文所述的改造的微生物-结合分子或基底和产品可用于靶向植物微生物和/或相关的微生物物质。植物真菌引起重大流行病，具有巨大的社会影响。植物真菌的实例包括但不限于Phytophthora infestans、Crinipellisperniciosa、frosty pod (Moniliophthora roreri)、oomycete Phytophthora capsici、Mycosphaerella fijiensis、Fusarium Ganoderma spp真菌和疫霉属(Phytophthora)。示例性的植物细菌包括Burkholderia cepacia。示例性的植物病毒包括但不限于大豆花叶病病毒、豆荚斑点病毒、烟草环斑病病毒、大麦黄矮病病毒、小麦细长条纹病病毒、土壤负荷花叶病病毒、玉米的小麦条纹病病毒、玉米矮花叶病病毒、玉米萎黄矮病病毒、黄瓜花叶病病毒、烟草花叶病病毒、苜蓿花叶病病毒、马铃薯病毒X、马铃薯病毒Y、马铃薯卷叶病病毒和番茄金黄花叶病病毒。
军事和生物恐怖应用：在仍其它的实施方案中，改造的微生物-结合分子和包含其的产品可用于检测或对抗生物恐怖病原体(例如，B. Anthracis和天花)。
根据本文所述的一些实施方案，改造的微生物-结合分子或微生物-结合基底可经修饰以结合任何微生物，例如，本文描述的那些，包括相关的微生物物质(例如，但不限于，细胞壁的片段、微生物核酸和内毒素)。
制备改造的微生物-结合分子的任何实施方案的通用方法是本领域已知的(Ashkenazi, A.和S. M. Chamow (1997), "Immunoadhesins as research tools andtherapeutic agents," Curr. Opin. Immunol. 9(2): 195-200, Chamow, S. M.和A.Ashkenazi (1996). "Immunoadhesins: principles and applications," TrendsBiotechnol. 14(2):52-60)。
尽管本文提供的示例性的序列源自人种，但来自其它物种例如小鼠、大鼠、猪、牛、猫和犬的相同或功能等同的结构域的氨基酸序列是本领域已知的和在本文所述的范围内。此外，技术人员可容易修饰鉴定的序列以调节它们的定向或结合性能，例如，通过理论建模或体外结合实验。此外，基于天然序列的晶体结构，可选择性模拟至少给定结构域的片段的肽模拟物也可用作本文所述的改造的微生物-结合分子的第一或第二结构域。使用本领域已知的任何方法和已知的晶体结构，本领域技术人员可容易确定这样的肽模拟物结构，无需过度实验。
在定向进化的另一个策略中，目的蛋白经过随机诱变，并筛选得到的蛋白的所需品质。这是一种用于噬菌体展示抗体的亲和力成熟的特别有用的技术，其中抗体互补决定区(CDR)通过饱和诱变进行突变，和6个CDR的成功变体改组在一起，以形成最高亲和力抗体。
定向进化范例可应用于本文所述的任何结构域以选择具有所需性质的变体，例如特异性结合至例如但不限于酵母、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性、凝固酶阴性和需氧细菌。然而，为使之有效，这些靶标微生物上的靶标糖的模式和性质或相关的表面特征可在类型或物种之间不同。
具有特定特异性的衍生物可被分离，例如通过以下方法，其是一种标准的噬菌体展示策略：首先，从噬菌粒载体表达一组变体；然后使该文库结合至目的靶标和进行一轮或两轮选择；然后针对相关靶标进行一轮阴性选择，取得不能结合的噬菌粒。这些阳性和阴性选择的循环然后重复进行，直到产生总体上结合靶标和不结合非靶标的一群噬菌体。该方法可应用于需要差别结合的任何微生物菌株对，例如对给定的抗生素抵抗和敏感的细菌。这种阳性/阴性富集策略还可用于抗体-噬菌体展示文库，其是一种甚至更标准的分离这样的特异性结合剂的方法。
用于本文所述的微生物-结合分子的构建体可插入载体。如本文使用的，术语“载体”是指合适于转移转基因至宿主细胞的多核苷酸序列。术语“载体”包括质粒、微-染色体、噬菌体、裸DNA等。参见例如，美国专利号4,980,285、5,631,150、5,707,828、5,759,828、5,888,783和5,919,670，以及Sambrook 等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Press (1989)。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，另外的DNA区段连接至其中。另一类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段连接至病毒基因组。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点和附加体哺乳动物载体的细菌载体)。此外，某些载体能够指导与它们可操作连接的基因的表达。这样的载体在本文被称为“表达载体”。一般而言，用于重组DNA技术的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意图包括所述其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，其发挥同等功能。
克隆载体是能够自主复制或整合至宿主细胞的基因组的载体，并且其进一步通过一个或多个内切核酸酶限制位点表征，在所述内切核酸酶限制位点处所述载体可以可确定的方式切割，并且需要的DNA序列可连接至其中，使得新的重组载体保留其在宿主细胞中复制的能力。在质粒的情况下，随着在宿主细胞例如宿主细菌内质粒拷贝数增加，需要的序列的复制可发生许多次，或在宿主通过有丝分裂繁殖之前每个宿主仅发生一次。在噬菌体的情况下，复制可在溶解期内主动发生或在致溶解期内被动发生。
表达载体是通过限制切割和连接，需要的DNA序列可插入其中，使得其可操作连接至调节序列和可表达为RNA转录物的载体。载体可进一步包含适合用于鉴定细胞的一个或多个标志物序列，所述细胞已被载体转化或转染，或未被载体转化或转染。标志物包括例如，编码增加或降低对抗生素或其它化合物的抗性或灵敏性的蛋白的基因、编码其活性可通过本领域已知的标准测定法检测的酶(例如，β-半乳糖苷酶、萤光素酶或碱性磷酸酶)的基因和明显影响转化或转染的细胞、宿主、菌落或菌斑表型的基因(例如，绿色荧光蛋白)。在某些实施方案中，本文使用的载体能够自主复制和表达它们可操作连接的DNA区段中存在的结构基因产物。
如本文使用的，编码序列和调节序列当以将编码序列的表达或转录置于调节序列的影响或控制下的方式共价连接时，被认为是“可操作”连接的。如果需要编码序列翻译成功能蛋白，两个DNA序列如果在5′调节序列中的启动子的诱导导致编码序列的转录和如果在两个DNA序列之间连接的性质不(1) 导致引入移码突变，(2) 干扰启动子区指导编码序列转录的能力，或(3) 干扰相应的RNA转录物翻译成蛋白的能力，则被认为是可操作连接的。因此，如果启动子区能够实现DNA序列的转录，使得得到的转录物可翻译成需要的蛋白或多肽，则启动子区可操作连接至编码序列。
当编码本文所述的微生物-结合分子的任何实施方案的核酸分子在细胞中表达时，各种转录控制序列(例如，启动子/增强子序列)可用于指导其表达。启动子可以是天然启动子，即，在其内源背景中的基因的启动子，其提供基因表达的正常调节。在一些实施方案中启动子可以是组成型的，即，启动子不受调节，允许其相关基因的持续转录。还可使用各种条件启动子，例如通过分子的存在或不存在控制的启动子。
基因表达需要的调节序列的精确性质可在物种或细胞类型之间不同，但总体上可包括(按需要)分别涉及转录和翻译起始的5′非转录和5′非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。特别地，这样的5′非转录调节序列将包括启动子区，其包括用于可操作连接的基因的转录控制的启动子序列。调节序列还可按需要包括增强子序列或上游激活子序列。本发明的载体可任选地包括5′前导或信号序列。合适的载体的选择和设计在本领域普通技术人员的能力和判断范围内。
包含表达的所有必需元件的表达载体是市售可得的，且是本领域技术人员已知的。参见例如，Sambrook 等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, SecondEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。细胞通过将异源DNA (RNA)引入细胞进行遗传改造。异源DNA (RNA)被置于转录元件的可操作控制下以允许在宿主细胞中表达异源DNA。
编码本文所述的微生物-结合分子的任何实施方案的核酸分子可使用本领域标准方法和技术引入一种或多种细胞。例如，核酸分子可通过标准方案例如转化包括化学转化和电穿孔、转导、粒子轰击等引入。表达编码本发明的酶的核酸分子还可通过整合核酸分子至基因组实现。
本文所述的另一方面涉及方法，其包括在细胞中重组表达编码根据本文公开的一个或多个实施方案的微生物-结合分子的一个或多个构建体。本文提供的一些方面涉及从培养表达本文所述的一个或多个核酸的细胞收集的细胞培养基或上清液。本文提供的其它方面涉及方法，其包括在细胞培养基中培养表达本文所述的一个或多个核酸的细胞。
改造的微生物-结合分子可包含来自相同物种或来自不同物种的序列。例如，物种间杂合微生物-结合分子的公开的结构域(例如，胶原结构域、Fc结构域、螺旋结构域和碳水化合物识别结构域)之一可来自鼠物种，而其它来自人。本文所述的改造的微生物-结合分子也可包括完全从鼠来源的序列或完全人制备的那些。
除非另外说明，或从上下文暗示，以下术语和短语包括下文提供的含义。除非另外明确说明，或从上下文显而易见，下文的术语和短语不排除该术语或短语在其所述领域中已获得的含义。提供定义以帮助描述本文所述的方面的具体实施方案，和不意图限制本发明，因为本发明的范围仅由权利要求来限定。此外，除非上下文另外要求，单数术语应包括复数，和复数术语应包括单数。
如本文使用的，术语“包含”或“包括”用于对本发明是必需的组合物、方法和其相应的组分，但对于包括未指明的要素是开放式的，无论是否是必需的。
如本文使用的，术语“基本上由……组成”是指对于给定的实施方案需要的那些要素。该术语允许存在另外的要素，其不实质影响本发明的实施方案的基本和新的或功能特征。
术语“由……组成”是指本文所述的组合物、方法和其相应的组分，其排除在实施方案的描述中未提及的任何要素。
除了在有效实施例中之外，或在另外指明的情况下，表示本文所用的成分数量或反应条件的所有数字应理解为在所有情况下被术语“约”修饰。术语“约”当结合百分数使用时可意指±1%。
单数术语“一个”、“种”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另外清楚说明。类似地，词语“或”意图包括“和”，除非上下文另外清楚说明。因此，例如，提及“所述方法”包括本文所述的一种或多种方法，和/或类型的步骤，和/或其对本领域技术人员而言在阅读本公开内容时是显而易见的，等等。
尽管类似于或等同于本文所述的那些的方法和材料可用于实施或测试本公开内容，但下文描述了合适的方法和材料。术语“包含”意指“包括”。缩写“e.g.”源自拉丁语exempli gratia，和在本文用于表示非限制性实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如”同义。
如本文使用的，术语"StemFcMBL"是指根据本文所述的一个或多个实施方案的微生物-结合分子。一般而言，微生物-结合分子包含胶原结构域、Fc结构域、包含螺旋结构域和碳水化合物-识别结构域的微生物-结合结构域。在一些实施方案中，Fc结构域可连接胶原结构域至微生物-结合结构域。在一些实施方案中，胶原结构域可连接Fc结构域至微生物-结合结构域，且在Fc结构域和胶原结构域之间不存在半胱氨酸-富集结构域。在一些实施方案中，微生物-结合分子可偶联至可检测标记。
如本文使用的，术语“亲合力”是描述在分子(例如，微生物-结合分子)和其靶标(例如，微生物和/或微生物物质)之间结合的总体强度的特征，考虑到它们彼此在多个位点处的相互作用。在一些情况下，在分子(例如，微生物-结合分子)和其靶标(例如，微生物和/或微生物物质)之间结合的总体强度大于各个键亲和力的总和。举例说明，对于具有同时与单个靶标相互作用的多个靶标结合位点(例如，对于微生物和/或微生物物质)的分子(例如，微生物-结合分子)，每个单独的结合相互作用本身可容易断裂。然而当分子(例如，微生物-结合分子)和其靶标(例如，微生物和/或微生物物质)在多个位点处结合时，总效果是协同的，因为当在分子上单一结合位点与靶标的瞬时分离存在时，这样的分子(例如，微生物-结合分子)与其靶标(例如，微生物和/或微生物物质)的结合可通过其它结合相互作用的存在而被加强。
如本文使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分(包含特异性结合抗原的抗原结合位点的分子)，包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体和单链抗体(scFv)。
术语“肽”是指氨基酸或氨基酸类似物的聚合物，不管其大小或功能如何。在一些实施方案中，术语“肽”是指小的多肽，例如，约15-25个氨基酸的聚合物。
如本文使用的术语“寡核苷酸”是指短的核酸聚合物，通常具有20个或更少的碱基。
如本文使用的，“受试者”意指人或动物。通常，动物是脊椎动物例如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蛛猴和猕猴，例如，恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、旱獭、白鼬、兔和仓鼠。家畜和狩猎动物包括：牛、马、猪、鹿、野牛、水牛，猫科动物物种例如家猫，犬科动物物种例如狗、狐狸、狼，鸟类物种例如鸡、鸸鹋、鸵鸟，和鱼例如鲑鱼、鲶鱼和鲑鱼。患者或受试者包括前述的任何亚组，例如所有上述动物，但排除一个或多个组或物种，例如人、灵长类动物或啮齿动物。在本文所述的方面的某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。术语“患者”和“受试者”在本文可互换使用。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非-人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。非人的哺乳动物可有利地用作受试者，其提供疾病的动物模型。
受试者可以是之前诊断患有或鉴定为患有或具有由本文所述的任何微生物或病原体引起的疾病或病症的受试者。仅通过实例的方式，受试者可诊断患有败血症、炎性疾病或感染。
术语“治疗剂”是公认的，和是指作为生物学、生理学或药理学上有活性的物质的任何化学部分，其在受试者中局部或全身地起作用。治疗剂(亦称为“药物”)的实例描述于众所周知的文献资料，例如Merck Index、Physicians Desk Reference和ThePharmacological Basis of Therapeutics，并且它们包括，而不限于，医药；维生素；矿物质补充剂；用于治疗、预防、诊断、治愈或减轻疾病或病的物质；影响身体的结构或功能的物质；或前药，在它们置于生理环境下后变成生物学活性的或更具活性。可使用各种形式的治疗剂，在给予受试者后其能够从主题组合物释放至附近组织或流体。实例包括类固醇和类固醇的酯(例如，雌激素、黄体酮、睾酮、雄酮、胆固醇、炔诺酮、洋地黄毒苷、胆酸、脱氧胆酸和鹅脱氧胆酸)、含硼化合物(例如，碳硼烷)、化学治疗性核苷酸、药物(例如，抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂)、烯二炔类(例如，卡奇霉素、esperamicins、dynemicin、新制癌菌素发色团和kedarcidin发色团)、重金属络合物(例如，顺铂)、激素拮抗剂(例如，他莫昔芬)、非特异性(非-抗体)蛋白(例如，糖寡聚物)、寡核苷酸(例如，结合靶标核酸序列(例如，mRNA序列)的反义寡核苷酸)、肽、蛋白、抗体、光力学剂(例如，若丹明123)、放射性核素(例如，I-131、Re-186、Re-188、Y-90、Bi-212、At-211、Sr-89、Ho-166、Sm-153、Cu-67和Cu-64)、毒素(例如，蓖麻毒蛋白)和基于转录的药物。
如本文使用的，术语“肽模拟物"意指具有结构上基于的肽的活性的肽-样分子。这样的肽模拟物包括化学修饰的肽、包含非-天然存在的氨基酸的肽-样分子和拟肽，并具有肽模拟物所来源的肽的活性例如微生物-结合特异性(参见例如，Goodman和Ro,Peptidomimetics for Drug Design, in “Burger’s Medicinal Chemistry and DrugDiscovery", Vol. 1 (ed. M.E. Wolff; John Wiley & Sons 1995), 第803-861页)。
各种肽模拟物是本领域已知的，并可包括在本文所述的实施方案内，包括例如包含限定氨基酸的肽-样分子、模拟肽二级结构的非-肽组分或酰胺键电子等排体。包含限定的非-天然存在的氨基酸的肽模拟物可包括例如：α-甲基化氨基酸；α,α –二烷基甘氨酸或α-氨基环烷羧酸；Nα-Cα环化氨基酸；Nα -甲基化氨基酸；αβ-或γ-氨基环烷羧酸；α,β –不饱和氨基酸；β,β -二甲基或β-甲基氨基酸；αβ-取代的-2,3-亚甲基氨基酸；N-Cδ或Cα-Cδ环化氨基酸；取代的脯氨酸或另外的氨基酸模拟物。模拟肽二级结构的肽模拟物可包含例如：非肽β-转角模拟物；γ-转角模拟物；β-片结构的模拟物；或螺旋结构的模拟物，其各自是本领域众所周知的。肽模拟物也可以是肽-样分子，其包含例如：酰胺键电子等排体，例如逆-反(retro- inverso)修饰；还原的酰胺键；亚甲基硫醚或亚甲基-亚砜键；亚甲基醚键；亚乙基键；硫酰胺键；反式烯烃或氟烯烃键；1,5-二取代的四唑环；酮亚甲基或氟酮亚甲基键或其它酰胺电子等排体。本领域技术人员理解，这些和其它肽模拟物包括在本文使用的术语"肽模拟物"的含义内。
鉴定肽模拟物的方法是本领域众所周知的，包括例如筛选包含潜在的肽模拟物的文库的数据库。例如，Cambridge Structural Database包含大于300,000种具有已知的晶体结构的化合物的集合(Allen 等人, Acta Crystallogr. Section B, 35:2331(1979))。随着新的晶体结构被测定，该结构库持续更新，和可对其筛选具有合适形状(例如，与本文所述的肽相同形状)以及针对相关受体的潜在几何学和化学互补性的化合物。在不可获得本文描述的肽的晶体结构时，可使用例如程序CONCORD产生结构(Rusinko 等人,J. Chem. Inf. Comput. Sci. 29:251 (1989))。另一个数据库Available ChemicalsDirectory (Molecular Design Limited, Informations Systems; San LeandroCalif.)包含约100,000种市售可得的化合物，和也可经检索以鉴定本文所述的肽的潜在肽模拟物，例如，具有对微生物的特异性的潜在肽模拟物。
如本文使用的术语"同源性"是指在两个肽之间或在两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可通过比较每个序列中的位置来测定，所述位置可为比较目的而对齐。当在比较的序列中的等同位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置处是同一的；当等同位点被相同或类似的氨基酸残基(例如，在空间和/或电子性质方面类似)占据时，则分子可被称为在该位置处同源的(类似的)。作为同源性百分比的表示是指在被比较的序列共有的位置处相同或类似的氨基酸的数量的函数。"不相关"或"非同源"的序列共有小于40%同一性。技术人员可容易地确定本文所述的基因或肽的同系物的确定。
当描述多肽时，术语"保守置换"是指不实质改变多肽的活性的多肽氨基酸组成的变化，例如，保守置换是指置换氨基酸残基为具有类似化学性质的不同氨基酸残基。保守氨基酸置换包括替换亮氨酸为异亮氨酸或缬氨酸，替换天冬氨酸为谷氨酸，或替换苏氨酸为丝氨酸。"保守氨基酸置换"由替换一个氨基酸为具有类似的结构和/或化学性质的另一个氨基酸产生，例如替换亮氨酸为异亮氨酸或缬氨酸，替换天冬氨酸为谷氨酸，或替换苏氨酸为丝氨酸。因此，特定氨基酸序列的"保守置换"是指置换对多肽活性不重要的那些氨基酸或置换氨基酸为具有类似的性质(例如，酸性、碱性、正电荷或负电荷、极性或非极性等)的其它氨基酸，使得甚至重要氨基酸的置换不显著改变活性。提供功能类似的氨基酸的保守置换表是本领域众所周知的。例如，以下6组各自包含彼此保守置换的氨基酸：1) 丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2) 天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3) 天冬酰胺 (N)、谷氨酰胺(Q)；4) 精氨酸 (R)、赖氨酸(K)；5) 异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6) 苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。(亦参见Creighton, Proteins, W. H. Freemanand Company (1984))。此外，在编码序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸的各个置换、缺失或添加也是"保守置换"。插入或缺失通常在约1至5个氨基酸的范围内。
术语“减少”、“降低”、“减轻”、“减弱”或“抑制”在本文通常全部用于指减少统计学显著量。然而，为避免疑惑，“降低”、“减轻”、“减弱”或“抑制”意指与参考水平相比减少至少10%，例如与参考水平相比减少至少约20%、或至少约30%、或至少约40%、或至少约50%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%或直至和包括100%减少(例如，与参考样品相比水平不存在)，或10-100%之间的任何减少。
术语“增加”、“增多”或“提高”或“激活”在本文通常全部用于指增加统计学显著量；为避免任何疑惑，术语“增加”、“增多”或“提高”或“激活”是指与参考水平相比增加至少10%，例如与参考水平相比增加至少约20%、或至少约30%、或至少约40%、或至少约50%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%或直至和包括100%增加或10-100%之间的任何增加，或与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍增加，或2倍和10倍之间或更大的任何增加。
术语“统计学显著的”或“显著地”是指统计学显著性和通常意指离参考水平至少2个标准偏差(2SD)。该术语是指存在差异的统计学证据。其定义为当零假说实际是真实的时，作出拒绝零假说的决定的概率。
如本文使用的，"可操作连接"是指邻近，使得可实现组分的正常功能。因此，"可操作连接"至控制序列的编码序列是指其中编码序列可在这些序列的控制下表达的配置。这样的控制可以是直接的，即单基因与单启动子相关，或间接的，如其中多顺反子转录物从单启动子表达的情况。参见例如美国专利号4,980,285、5,631,150、5,707,828、5,759,828、5,888,783和5,919,670，和Sambrook 等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Press (1989)。
如本文使用的，"表达"是指基因表达。基因和基因产物可被表达。这样的基因产物包括RNA和蛋白。
如本文使用的，术语"启动子"具有其公认的含义，表示包含提供RNA聚合酶的结合和转录起始的DNA序列的基因的一部分。启动子序列通常(但不总是)存在于基因的5'非编码区。启动子内用于起始转录的序列元件通常通过共有核苷酸序列表征。有用的启动子包括组成型和诱导型启动子。许多这样的启动子序列是本领域已知的。参见例如美国专利号4,980,285、5,631,150、5,707,828、5,759,828、5,888,783、5,919,670，和Sambrook 等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press(1989)。其它有用的启动子包括不是组成型也不对特定(或已知)的诱导剂分子响应的启动子。这样的启动子可包括响应发育信号(例如培养的生长阶段或细胞分化阶段)或环境信号(例如pH、渗透压、热或细胞密度)的那些。异源启动子是不与基因天然连接的启动子。异源启动子可来自相同或不同的物种。例如，异源启动子可以是来自与基因相同生物但天然与不同基因连接的启动子。
如本文使用的，术语"转基因"当关于多核苷酸序列使用时，是指天然不存在于细胞中的多核苷酸序列。因此，术语"转基因"包括例如，当A和B基因来自相同生物时，可操作连接至结构基因B的基因A的启动子，以及其中一个物种的多核苷酸序列被转移至不同物种的细胞(或菌株)的情况。术语"转基因"还包括已经如此修饰的转基因的克隆。参见美国专利号4,980,285、5,631,150、5,707,828、5,759,828、5,888,783和5,919,670。
如本文使用的，术语"培养基"和"细胞培养基"是指适合支持体外细胞(即，细胞培养物)生长的培养基。不预期该术语限于任何特定的细胞培养基。例如，预期该定义包括生长以及维持培养基。事实上，预期该术语包括适合目的细胞培养物生长的任何培养基。
如本文使用的，术语"细胞类型"是指任何细胞，不管其来源或特征如何。
如本文使用的，术语“分离"意指从天然状态"被人工"改变。"分离"的组合物或物质是已经从其原始环境改变或除去或兼有的那些。例如，天然存在于细胞或活的动物中的多核苷酸或多肽不是"分离的"，但是从其天然状态的共存材料分开的相同多核苷酸或多肽是"分离的"，如该术语在本文所使用。
尽管本文已经详细地描写和描述了优选的实施方案，但对于相关领域的技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的精神的情况下可进行各种修饰、添加、置换等，因此这些被视为在如随附权利要求定义的本发明的范围内。此外，在未已指明的程度，本领域普通技术人员将理解本文所述和举例说明的各种实施方案的任何一个可进一步修改，以结合在本文公开的任何一个其它实施方案中显示的特征。
应理解，本发明不限于本文描述的具体方法、方案和试剂等，因此可改变。本文使用的术语仅为描述特定实施方案的目的，和不意图限制仅由权利要求定义的本发明范围。
如本文和权利要求中使用的，单数形式包括复数指代物，反之亦然，除非上下文另外清楚指明。除了在有效实施例中之外，或在另外指明的情况下，表示本文使用的成分数量或反应条件的所有数字应理解为在所有情况下被术语“约”修饰。
为描述和公开例如在所有确定的专利和其它出版物中描述的可结合本发明使用的方法的目的，这些出版物明确通过引用结合到本文中。这些出版物仅为其在本申请的提交日之前的公开内容而提供。在该方面，不应解释为承认本发明人由于在先发明或为任何其它理由而没有资格先于这样的公开内容。关于这些文献的日期的所有声明或关于这些文献的内容的陈述基于申请人可获得的信息，且不构成关于这些文献的日期或内容的正确性的任何承认。
本文所述的技术的一些实施方案可根据任何以下编号的段落来定义：
1. 微生物-结合分子，包含：
(i) 胶原结构域；
(ii) Fc结构域；和
(iii) 包含螺旋结构域和碳水化合物识别结构域(CRD)的微生物-结合结构域，
其中Fc结构域将胶原结构域连接至微生物-表面结合结构域。
2. 段落1的微生物-结合分子，其中微生物-结合分子不包括半胱氨酸-富集结构域。
3. 微生物-结合分子，包含：
(i) 胶原结构域；
(ii) Fc结构域；和
(iii) 包含螺旋结构域和碳水化合物识别结构域(CRD)的微生物-结合结构域，
其中胶原结构域将Fc结构域连接至微生物-表面结合结构域，和其中微生物-结合分子不包括半胱氨酸-富集交联结构域。
4. 段落1-3中任一个的微生物-结合分子，其中碳水化合物识别结构域形成微生物-结合分子的C-末端。
5. 微生物-结合分子，包含：
(i) 胶原结构域；
(ii) Fc结构域；和
(iii) 包含螺旋结构域和碳水化合物识别结构域(CRD)的微生物-结合结构域，
其中微生物-表面结合结构域将胶原结构域连接至Fc结构域，和其中微生物-结合分子不包括半胱氨酸-富集交联结构域。
6. 段落1-5中任一个的微生物-结合分子，其中胶原结构域是至少约15个氨基酸或至少约20个氨基酸长。
7. 段落1-6中任一个的微生物-结合分子，其中胶原结构域是15-60个氨基酸长。
8. 段落1-7中任一个的微生物-结合分子，其中胶原结构域与第二微生物-结合分子的第二胶原结构域形成胶原-样三股螺旋。
9. 段落1-8中任一个的微生物-结合分子，其中胶原结构域包含多个Gly-Xaa1-Xaa2三联体，其中Xaa1和Xaa2各自独立地是氨基酸残基。
10. 段落1-9中任一个的微生物-结合分子，其中胶原结构域源自含胶原分子，其选自胶原凝集素(例如，甘露糖结合凝集素、表面活性蛋白)、纤维胶凝蛋白、天然存在的或合成的胶原-样肽和其任何组合。
11. 段落1-9的微生物-结合分子，其中胶原结构域包含甘露糖结合凝集素的胶原结构域或其片段。
12. 段落11的微生物-结合分子，其中胶原结构域基本上由选自SEQ ID NO: 7-16的氨基酸序列组成。
13. 段落1-12中任一个的微生物-结合分子，其中Fc结构域包含IgG CH2结构域和IgG CH3结构域，和任选地包含IgG微生物-结合分子的铰链结构域。
14. 段落13的微生物-结合分子，其中IgG是哺乳动物IgG (例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)或其片段。
15. 段落1-12中任一个的微生物-结合分子，其中Fc结构域包含CH2结构域和CH3结构域，和任选地包含哺乳动物IgA、IgD、IgE或IgM微生物-结合分子的铰链结构域。
16. 段落1-15中任一个的微生物-结合分子，其中Fc结构域包含相对于天然序列的突变。
17. 段落16的微生物-结合分子，其中突变经选择以：(i) 增加重组微生物-结合分子的生物学半衰期；(ii) 调节抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；和/或(iii) 调节补体依赖性细胞毒性；和/或(iv) 除去Fc结构域的糖基化(例如，N297D)。
18. 段落1-17中任一个的微生物-结合分子，其中螺旋结构域源自含螺旋分子，其选自胶原凝集素(例如，甘露糖结合凝集素、表面活性蛋白)、纤维胶凝蛋白、合成的螺旋肽和其任何组合。
19. 段落1-18中任一个的微生物-结合分子，其中CRD源自糖-结合分子，其选自：糖结合凝集素(例如，甘露糖结合凝集素；胶原凝集素、表面活性蛋白)、DC-SIGN、巨噬细胞甘露糖受体和其任何组合。
20. 段落19的微生物-结合分子，其中CRD包含甘露糖结合凝集素2 (MBL2)的CRD或其片段。
21. 段落1-20中任一个的微生物-结合分子，其中微生物-结合分子具有选自SEQID NO: 17-27的氨基酸序列，或与选择的氨基酸序列具有至少90%同源性的氨基酸序列。
22. 段落1-21中任一个的微生物-结合分子，进一步包含与其偶联的可检测标记。
23. 段落22的微生物-结合分子，其中可检测标记选自：生物素、荧光团、发光或生物发光标志物、放射性标记、酶、酶底物、量子点、成像剂、金属粒子(例如，金粒子和/或银粒子)、磁性粒子和其任何组合。
24. 段落23的微生物-结合分子，其中酶选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、萤光素酶和β-半乳糖苷酶。
25. 段落1-21中任一个的微生物-结合分子，进一步包含与Fc结构域或胶原结构域融合的可检测分子。
26. 段落25的微生物-结合分子，其中可检测分子包含HRP、AP、萤光素酶、β-半乳糖苷酶或荧光团。
27. 微生物-结合多聚体分子，包含：
(i) 段落1-26中任一个的第一微生物-结合分子；
(ii) 段落1-26中任一个的第二微生物-结合分子，
其中：
第一微生物-结合分子的螺旋结构域与第二微生物-结合分子的螺旋结构域形成卷曲结构；和
第一微生物-结合分子的胶原结构域与第二微生物-结合分子的胶原结构域或段落1-26中任一个的第三微生物-结合分子的胶原结构域形成三股螺旋结构。
28. 段落27的微生物-结合多聚体分子，包含段落1-26中任一个的至少10个微生物-结合分子。
29. 用于检测微生物物质的试剂盒，包含：
(i) 包含段落22-28中任一个的一种或多种微生物-结合分子的容器，其中微生物-结合分子各自包含可检测标记；和
(ii) 至少一种试剂。
30. 段落29的试剂盒，进一步包含微生物-捕获装置，所述微生物-捕获装置包含固体表面和与其偶联的微生物-捕获分子。
31. 段落30的试剂盒，其中微生物-捕获装置选自核酸支架、蛋白支架、脂质支架、树状聚体、微粒或微珠、纳米管、微量滴定板、医疗器械或移植物、微芯片、过滤装置、膜、诊断条、浸渍片、身体外装置、螺旋式混合器和中空纤维反应器。
32. 段落29-31中任一个的试剂盒，其中可检测标记是酶，且试剂盒进一步包含含有在酶的存在下改变颜色的酶底物的容器。
33. 段落29-31中任一个的试剂盒，其中可检测标记包含荧光分子。
34. 段落29-33中任一个的试剂盒，其中至少一种试剂是洗涤缓冲液、稀释缓冲液、终止缓冲液、包含螯合剂的缓冲溶液或其任何组合。
35. 微生物-结合制品，包含固体表面和与固体表面偶联的段落1-26中任一个的至少一种微生物-结合分子。
36. 段落35的微生物-结合制品，其中固体表面是固体基底的表面，所述固体基底选自核酸支架、蛋白支架、脂质支架、树状聚体、微粒或微珠、纳米管、微量滴定板、医疗器械或移植物、微芯片、过滤装置、膜、诊断条、浸渍片、身体外装置、螺旋式混合器和中空纤维。
37. 药物组合物，包含段落1-26中任一个的至少一种微生物-结合分子和药学上可接受的载体。
38. 段落37的药物组合物，其中胶原结构域、Fc结构域和微生物-表面结合结构域源自人氨基酸序列。
实施例
以下实施例说明本发明的一些实施方案和方面。对于相关领域的技术人员将显而易见的是，可进行各种修饰、添加、置换等，而不改变本发明的精神或范围，和这样的修饰和变化包括在如随后权利要求书定义的本发明范围内。以下实施例绝不限制本发明。
实施例1：使用本文所述的微生物-结合分子的一个或多个实施方案作为检测剂检测微生物或微生物物质。
在微生物ELISA检测测定法中检测和捕获微生物(例如，病原体)和/或微生物物质可基于FcMBL捕获剂和重组人全长MBL检测试剂。对于FcMBL的详细信息，请参考国际专利公开号WO 2013/012924和WO 2011/090954，其各自的内容通过引用以其整体结合到本文中。尽管人全长MBL是极好的试剂，但它是不可再生的来源，和难以制备。尽管FcMBL可用作检测剂，但对改造改进的微生物-结合分子存在需要，所述分子在检测ELISA中显示更大的灵敏性来识别微生物和/或微生物物质(例如，微生物细胞壁组分)。本发明人已特别改造了至少两种新的微生物-结合蛋白(在本文称为"StemFcMBL-2"和"StemFcMBL-3")，其均显示作为检测试剂比FcMBL更高的灵敏性，和均比全长MBL更容易生产。StemFcMBL-2的氨基酸序列和核苷酸序列显示在图1B。StemFcMBL-3的氨基酸序列和核苷酸序列显示在图2B。
使用根据本文所述的一些实施方案的微生物-结合分子(例如，StemFcMBL-2或StemFcMBL-3)的示例性的检测测定法如下所述：
1. 微生物-结合珠：FcMBL与超顺磁珠偶联(实例：FcMBL被生物素化和偶联至链霉亲和素涂布的1µM MyONE珠)。或者，本文所述的微生物-结合分子也可用作微生物-捕获剂和偶联至超顺磁珠。
2. 捕获：将微生物-结合珠加入试验样品(例如，感染的血液)，混合(捕获步骤)，取出和洗涤用于测定。
3. 检测：珠/微生物复合物通过使珠/微生物复合物与本文所述的微生物-结合分子的一个或多个实施方案接触来检测。在一些实施方案中，本文所述的微生物-结合分子可偶联至可检测标记，例如，荧光团或辣根过氧化物酶。
图3A-3B显示使用rhMBL (全长MBL)、StemFcMBL-2和StemFcMBL-3作为检测试剂，甘露聚糖检测ELISA的实例。StemFcMBL-2和StemFcMBL-3用辣根过氧化物酶(HRP)标记，并在甘露聚糖检测ELISA中用作检测剂。FcMBL 1 µM珠用于捕获甘露聚糖，洗涤，与指定的检测剂混合。测定各检测剂检测微生物组分的灵敏性。图3B表明StemFcMBL-2和StemFcMBL-3显示在检测复杂流体(例如血液样品)的甘露聚糖中比重组全长MBL更高的灵敏性，因此是更好的检测试剂。
实施例2：本文所述的微生物-结合分子的一个或多个实施方案的合成和表达
在逆转录启动子的下游，将本文所述的微生物-结合分子的各种构建体克隆至哺乳动物表达载体。将载体转染至宿主细胞，例如HEK 293F细胞。收获来自转染细胞的上清液以收集微生物-结合蛋白分子。例如，来自转染细胞的上清液运行通过纯化柱，其中微生物-结合蛋白分子在钙的存在下与其结合，并使用包含EDTA的缓冲液洗脱。在一些实施方案中，用于纯化FcMBL的方法可用于StemFcMBL-2和/或StemFcMBL-3纯化。
实施例3：一种或多种本文所述的微生物-结合分子的结合强度的表征
可进行甘露聚糖ELISA以评价本文所述的微生物-结合分子的结合强度。例如，将甘露聚糖吸附到96-孔微量滴定板上，其随后被封闭。然后将板用指定量的StemFcMBL孵育，用TBS-T洗涤和使用HRP-缀合的抗-人IgG-Fc抗体和TMB底物测定。如图7显示的，吸光度越高，StemFcMBL的保留越大且其结合强度越好。
实施例4：本文所述的一种或多种多聚体微生物-结合分子的结合强度的表征
可进行甘露聚糖ELISA以评价本文所述的多聚体微生物-结合分子的结合强度。例如，将甘露聚糖吸附到96-孔微量滴定板上，其随后被封闭。然后将板用指定量的FcMBL单体或各种大小(例如，六聚体对比约13-15聚体)的多聚体孵育，用TBS-T洗涤，和使用HRP-缀合的抗-人IgG-Fc抗体和TMB底物测定。如图10显示的，吸光度越高，较大多聚体的保留越大且其结合强度越好。
Fc序列的实例
人IgG2 Fc (SEQ ID NO: 1)
VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGMEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG3 Fc (SEQ ID NO: 2)
DTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
人IgG4 Fc (SEQ ID NO: 3)
PPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
来自IgG1的单体Fc (SEQ ID NO: 4)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVNLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLNSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGA
来自IgG1的二聚体Fc (SEQ ID NO: 5)包括铰链区(下划线)的人IgG-Fc结构域
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGA
具有Asn82Asp (N82D)修饰的实例Fc序列。修饰也常称为N297D (源自人IgG的编号)(SEQ ID NO: 6)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
胶原结构域的示例性序列
MBLStem58: MBL残基42-99:(SEQ ID NO: 7)
GINGFPGKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPPGKLGPPGNPGPSGSPGPKGQKGDPGK
MBLStem32: MBL残基68-99: (SEQ ID NO: 8)
GLQGPPGKLGPPGNPGPSGSPGPKGQKGDPGK
MBLStem32(K_至_S): MBL残基68-99，赖氨酸被丝氨酸替换: (SEQ ID NO: 9)
GLQGPPGSLGPPGNPGPSGSPGPSGQSGDPGS
StemA_K75Q: MBL残基42-99, K75Q突变: (SEQ ID NO: 10)
GINGFPGKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPPGQLGPPGNPGPSGSPGPKGQKGDPGK
MBLStem20_Ctrim: MBL残基68-87: (SEQ ID NO: 11)
GLQGPPGKLGPPGNPGPSGS
MBLStem20_Ntrim: MBL残基80-99: (SEQ ID NO: 12)
GNPGPSGSPGPKGQKGDPGK
SpA_Stem: 血清蛋白A残基28-98: (SEQ ID NO: 13)
GSPGIPGTPGSHGLPGRDGRDGVKGDPGPPGPMGPPGETPCPPGNNGLPGAPGVPGERGEKGEAGERGPPG
纤维胶凝蛋白-L或纤维胶凝蛋白-2残基51-92: (SEQ ID NO: 14)
GCPGLPGAPGPKGEAGTNGKRGERGPPGPPGKAGPPGPNGAP
胶原凝集素-11残基44-107: (SEQ ID NO: 15)
GDAGEKGDKGAPGRPGRVGPTGEKGDMGDKGQKGSVGRHGKIGPIGSKGEKGDSGDIGPPGPN
胶原III型(残基891-942): (SEQ ID NO: 16)
GPPGPSGSPGKDGPPGPAGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPG
具有MBLStem58作为胶原结构域的示例性微生物-结合分子
StemFcMBL-2: (SEQ ID NO: 17) –具有铰链区，未被糖基化
GINGFPGKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPPGKLGPPGNPGPSGSPGPKGQKGDPGKSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGASPDGDSSLAASERKALQTEMARIKKWLTFSLGKQVGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQASVATPRNAAENGAIQNLIKEEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWNEGEPNNAGSDEDCVLLLKNGQWNDVPCSTSHLAVCEFPI
FcStemMBL_A: (SEQ ID NO: 18) – 无MBL的Cys-富集结构域
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGINGFPGKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPPGKLGPPGNPGPSGSPGPKGQKGDPGKSPDGDSSLAASERKALQTEMARIKKWLTFSLGKQVGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQASVATPRNAAENGAIQNLIKEEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWNEGEPNNAGSDEDCVLLLKNGQWNDVPCSTSHLAVCEFPI
FcStemMBL_A_单体: (SEQ ID NO: 19) – 无MBL的Cys-富集结构域
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVNLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLNSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGINGFPGKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPPGKLGPPGNPGPSGSPGPKGQKGDPGKSPDGDSSLAASERKALQTEMARIKKWLTFSLGKQVGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQASVATPRNAAENGAIQNLIKEEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWNEGEPNNAGSDEDCVLLLKNGQWNDVPCSTSHLAVCEFPI
StemFcMBL-1: (SEQ ID NO: 20)
GINGFPGKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPPGKLGPPGNPGPSGSPGPKGQKGDPGKSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGASPDGDSSLAASERKALQTEMARIKKWLTFSLGKQVGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQASVATPRNAAENGAIQNLIKEEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWNEGEPNNAGSDEDCVLLLKNGQWNDVPCSTSHLAVCEFPI
具有MBLStem 32作为胶原结构域的示例性微生物-结合分子
StemFcMBL-3: (SEQ ID NO: 21) –具有铰链区，未被糖基化
GLQGPPGKLGPPGNPGPSGSPGPKGQKGDPGKSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGASPDGDSSLAASERKALQTEMARIKKWLTFSLGKQVGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQASVATPRNAAENGAIQNLIKEEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWNEGEPNNAGSDEDCVLLLKNGQWNDVPCSTSHLAVCEFPI
StemMBLFc_D: (SEQ ID NO: 22)
GLQGPPGKLGPPGNPGPSGSPGPKGQKGDPGKSPDGDSSLAASERKALQTEMARIKKWLTFSLGKQVGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQASVATPRNAAENGAIQNLIKEEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWNEGEPNNAGSDEDCVLLLKNGQWNDVPCSTSHLAVCEFPIEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGA
具有MBLStem32(K至S)作为胶原结构域的示例性微生物-结合分子
StemFcMBL-3(S):(SEQ ID NO: 23)
GLQGPPGSLGPPGNPGPSGSPGPSGQSGDPGSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGASPDGDSSLAASERKALQTEMARIKKWLTFSLGKQVGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQASVATPRNAAENGAIQNLIKEEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWNEGEPNNAGSDEDCVLLLKNGQWNDVPCSTSHLAVCEFPI
具有StemA_K75Q作为胶原结构域的示例性微生物-结合分子
FcStemMBL_K75Q: (SEQ ID NO: 24)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGINGFPGKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPPGQLGPPGNPGPSGSPGPKGQKGDPGKSPDGDSSLAASERKALQTEMARIKKWLTFSLGKQVGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQASVATPRNAAENGAIQNLIKEEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWNEGEPNNAGSDEDCVLLLKNGQWNDVPCSTSHLAVCEFPI
具有MBLStem20_Ctrim作为胶原结构域的示例性微生物-结合分子
StemFcMBL_Ctrimmed: (SEQ ID NO: 25)
GLQGPPGKLGPPGNPGPSGSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGASPDGDSSLAASERKALQTEMARIKKWLTFSLGKQVGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQASVATPRNAAENGAIQNLIKEEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWNEGEPNNAGSDEDCVLLLKNGQWNDVPCSTSHLAVCEFPI
具有MBLStem20_Ntrim作为胶原结构域的示例性微生物-结合分子
StemFcMBL_Ntrimmed: (SEQ ID NO: 26)
GNPGPSGSPGPKGQKGDPGKSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGASPDGDSSLAASERKALQTEMARIKKWLTFSLGKQVGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQASVATPRNAAENGAIQNLIKEEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWNEGEPNNAGSDEDCVLLLKNGQWNDVPCSTSHLAVCEFPI
具有SpA茎作为胶原结构域的示例性微生物-结合分子
SpAStem-FcMBL: (SEQ ID NO: 27)
GSPGIPGTPGSHGLPGRDGRDGVKGDPGPPGPMGPPGETPCPPGNNGLPGAPGVPGERGEKGEAGERGPPGSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYDSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAKSPDGDSSLAASERKALQTEMARIKKWLTFSLGKQVGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQASVATPRNAAENGAIQNLIKEEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWNEGEPNNAGSDEDCVLLLKNGQWNDVPCSTSHLAVCEFPI
其它序列
具有信号序列的全长MBL (SEQ ID NO: 28)；DNA序列作为SEQ ID NO: 42公开：
没有信号序列的MBL (SEQ ID NO: 29)；DNA序列作为SEQ ID NO: 43公开：
MBL信号序列(SEQ ID NO: 30)
MSLFPSLPLLLLSMVAASYS
截短的MBL (SEQ ID NO: 31)
AASERKALQTEMARIKKWLTFSLGKQVGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQASVATPRNAAENGAIQNLIKEEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWNEGEPNNAGSDEDCVLLLKNGQWNDVPCSTSHLAVCEFPI
MBL的碳水化合物识别结构域(CRD) (SEQ ID NO: 32)
VGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQASVATPRNAAENGAIQNLIKEEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWNEGEPNNAGSDEDCVLLLKNGQWNDVPCSTSHLAVCEFPI
MBL的颈+碳水化合物识别结构域(SEQ ID NO: 33)
PDGDSSLAASERKALQTEMARIKKWLTFSLGKQVGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQASVATPRNAAENGAIQNLIKEEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWNEGEPNNAGSDEDCVLLLKNGQWNDVPCSTSHLAVCEFPI
FcMBL.81 (SEQ ID NO: 34)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAPDGDSSLAASERKALQTEMARIKKWLTFSLGKQVGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQASVATPRNAAENGAIQNLIKEEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWNEGEPNNAGSDEDCVLLLKNGQWNDVPCSTSHLAVCEFPI
AKT-FcMBL (SEQ ID NO: 35)
AKTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAPDGDSSLAASERKALQTEMARIKKWLTFSLGKQVGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQASVATPRNAAENGAIQNLIKEEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWNEGEPNNAGSDEDCVLLLKNGQWNDVPCSTSHLAVCEFPI
FcMBL.111 (SEQ ID NO: 36)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGATSKQVGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQASVATPRNAAENGAIQNLIKEEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWNEGEPNNAGSDEDCVLLLKNGQWNDVPCSTSHLAVCEFPI
CRD序列的变体(SEQ ID NO: 37)
KQVGNKFFLTNGEIMTFEKVKALCVKFQASVATPRNAAENGAIQNLIKEEAFLGITDEKTEGQFVDLTGNRLTYTNWNEGEPNNAGSDEDCVLLLKNGQWNDVPCSTSHLAVCEFPI
哺乳动物-优化的HRP的蛋白序列(SEQ ID NO: 38)
QLTPTFYDNSCPNVSNIVRDTIVNELRSDPRIAASILRLHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFRTEKDAFGNANSARGFPVIDRMKAAVESACPRTVSCADLLTIAAQQSVTLAGGPSWRVPLGRRDSLQAFLDLANANLPAPFFTLPQLKDSFRNVGLNRSSDLVALSGGHTFGKNQCRFIMDRLYNFSNTGLPDPTLNTTYLQTLRGLCPLNGNLSALVDFDLRTPTIFDNKYYVNLEEQKGLIQSDQELFSSPNATDTIPLVRSFANSTQTFFNAFVEAMDRMGNITPLTGTQGQIRLNCRVVNSNS
哺乳动物-优化的HRP的核苷酸序列(SEQ ID NO: 39)
CAGTTAACCCCTACATTCTACGACAATAGCTGTCCCAACGTGTCCAACATCGTTCGCGACACAATCGTCAACGAGCTCAGATCCGATCCCAGGATCGCTGCTTCAATATTACGTCTGCACTTCCATGACTGCTTCGTGAATGGTTGCGACGCTAGCATATTACTGGACAACACCACCAGTTTCCGCACTGAAAAGGATGCATTCGGGAACGCTAACAGCGCCAGGGGCTTTCCAGTGATCGATCGCATGAAGGCTGCCGTTGAGTCAGCATGCCCACGAACAGTCAGTTGTGCAGACCTGCTGACTATAGCTGCGCAACAGAGCGTGACTCTTGCAGGCGGACCGTCCTGGAGAGTGCCGCTCGGTCGACGTGACTCCCTACAGGCATTCCTAGATCTGGCCAACGCCAACTTGCCTGCTCCATTCTTCACCCTGCCCCAGCTGAAGGATAGCTTTAGAAACGTGGGTCTGAATCGCTCGAGTGACCTTGTGGCTCTGTCCGGAGGACACACATTTGGAAAGAACCAGTGTAGGTTCATCATGGATAGGCTCTACAATTTCAGCAACACTGGGTTACCTGACCCCACGCTGAACACTACGTATCTCCAGACACTGAGAGGCTTGTGCCCACTGAATGGCAACCTCAGTGCACTAGTGGACTTTGATCTGCGGACCCCAACCATCTTCGATAACAAGTACTATGTGAATCTAGAGGAGCAGAAAGGCCTGATACAGAGTGATCAAGAACTGTTTAGCAGTCCAAACGCCACTGACACCATCCCACTGGTGAGAAGTTTTGCTAACTCTACTCAAACCTTCTTTAACGCCTTCGTGGAAGCCATGGACCGTATGGGTAACATTACCCCTCTGACGGGTACCCAAGGCCAGATTCGTCTGAACTGCAGAGTGGTCAACAGCAACTCTTAATGA
MBL的颈序列(SEQ ID NO: 40)
PDGDSSLAASERKALQTEMARIKKWLTFSLGKQ
<110> PRESIDENT AND FELLOWS OF HARVARD COLLEGE
<120> 改进的微生物-结合分子和其用途
<130> 002806-084581-PCT
<140>
<141>
<150> 62/201,745
<151> 2015-08-06
<160> 45
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 223
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Met Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 2
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 3
<211> 224
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215 220
<210> 4
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 4
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Asn Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Asn
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala
225 230
<210> 5
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 5
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala
225 230
<210> 6
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 6
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 7
<211> 58
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly
1 5 10 15
Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro
20 25 30
Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly
35 40 45
Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro Gly Lys
50 55
<210> 8
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly
1 5 10 15
Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro Gly Lys
20 25 30
<210> 9
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 9
Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Ser Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly
1 5 10 15
Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Ser Gly Gln Ser Gly Asp Pro Gly Ser
20 25 30
<210> 10
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 10
Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly
1 5 10 15
Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro
20 25 30
Gly Gln Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly
35 40 45
Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro Gly Lys
50 55
<210> 11
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly
1 5 10 15
Pro Ser Gly Ser
20
<210> 12
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Gly Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly
1 5 10 15
Asp Pro Gly Lys
20
<210> 13
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 13
Gly Ser Pro Gly Ile Pro Gly Thr Pro Gly Ser His Gly Leu Pro Gly
1 5 10 15
Arg Asp Gly Arg Asp Gly Val Lys Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Pro
20 25 30
Met Gly Pro Pro Gly Glu Thr Pro Cys Pro Pro Gly Asn Asn Gly Leu
35 40 45
Pro Gly Ala Pro Gly Val Pro Gly Glu Arg Gly Glu Lys Gly Glu Ala
50 55 60
Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly
65 70
<210> 14
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 14
Gly Cys Pro Gly Leu Pro Gly Ala Pro Gly Pro Lys Gly Glu Ala Gly
1 5 10 15
Thr Asn Gly Lys Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys
20 25 30
Ala Gly Pro Pro Gly Pro Asn Gly Ala Pro
35 40
<210> 15
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 15
Gly Asp Ala Gly Glu Lys Gly Asp Lys Gly Ala Pro Gly Arg Pro Gly
1 5 10 15
Arg Val Gly Pro Thr Gly Glu Lys Gly Asp Met Gly Asp Lys Gly Gln
20 25 30
Lys Gly Ser Val Gly Arg His Gly Lys Ile Gly Pro Ile Gly Ser Lys
35 40 45
Gly Glu Lys Gly Asp Ser Gly Asp Ile Gly Pro Pro Gly Pro Asn
50 55 60
<210> 16
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 16
Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Pro Ala Gly Asn Thr Gly Ala Pro Gly Ser Pro Gly Val Ser Gly Pro
20 25 30
Lys Gly Asp Ala Gly Gln Pro Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Gln
35 40 45
Gly Pro Pro Gly
50
<210> 17
<211> 425
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 17
Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly
1 5 10 15
Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro
20 25 30
Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly
35 40 45
Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro Gly Lys Ser Ala Pro Glu Leu Leu
50 55 60
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
65 70 75 80
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
85 90 95
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
100 105 110
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr
115 120 125
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
130 135 140
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
145 150 155 160
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
165 170 175
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
180 185 190
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
195 200 205
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
210 215 220
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
245 250 255
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
260 265 270
Ser Pro Gly Ala Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu
275 280 285
Arg Lys Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr
290 295 300
Phe Ser Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly
305 310 315 320
Glu Ile Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln
325 330 335
Ala Ser Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln
340 345 350
Asn Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr
355 360 365
Glu Gly Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn
370 375 380
Trp Asn Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val
385 390 395 400
Leu Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser
405 410 415
His Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile
420 425
<210> 18
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 18
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly Lys
225 230 235 240
Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln Gly
245 250 255
Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn
260 265 270
Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro
275 280 285
Gly Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys
290 295 300
Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser
305 310 315 320
Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile
325 330 335
Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser
340 345 350
Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu
355 360 365
Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly
370 375 380
Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn
385 390 395 400
Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu
405 410 415
Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu
420 425 430
Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile
435
<210> 19
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 19
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Asn Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Asn
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly Lys
225 230 235 240
Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln Gly
245 250 255
Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn
260 265 270
Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro
275 280 285
Gly Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys
290 295 300
Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser
305 310 315 320
Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile
325 330 335
Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser
340 345 350
Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu
355 360 365
Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly
370 375 380
Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn
385 390 395 400
Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu
405 410 415
Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu
420 425 430
Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile
435
<210> 20
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 20
Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly
1 5 10 15
Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro
20 25 30
Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly
35 40 45
Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro Gly Lys Ser Glu Pro Lys Ser Ser
50 55 60
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
65 70 75 80
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
85 90 95
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
100 105 110
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
115 120 125
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr
130 135 140
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
145 150 155 160
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
165 170 175
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
180 185 190
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
195 200 205
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
210 215 220
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
225 230 235 240
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
245 250 255
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
260 265 270
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
275 280 285
Pro Gly Ala Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg
290 295 300
Lys Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe
305 310 315 320
Ser Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu
325 330 335
Ile Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala
340 345 350
Ser Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn
355 360 365
Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu
370 375 380
Gly Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp
385 390 395 400
Asn Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu
405 410 415
Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His
420 425 430
Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile
435 440
<210> 21
<211> 414
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 21
Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly
1 5 10 15
Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro Gly Lys
20 25 30
Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
35 40 45
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
50 55 60
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
65 70 75 80
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
85 90 95
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
100 105 110
Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
115 120 125
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
130 135 140
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
145 150 155 160
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
165 170 175
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
180 185 190
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
195 200 205
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
210 215 220
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
225 230 235 240
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
245 250 255
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser
260 265 270
Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile
275 280 285
Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe
290 295 300
Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu
305 310 315 320
Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu
325 330 335
Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile
340 345 350
Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg
355 360 365
Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser
370 375 380
Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val
385 390 395 400
Pro Cys Ser Thr Ser His Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile
405 410
<210> 22
<211> 413
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 22
Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly
1 5 10 15
Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro Gly Lys
20 25 30
Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys Ala Leu
35 40 45
Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser Leu Gly
50 55 60
Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met Thr
65 70 75 80
Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser Val Ala
85 90 95
Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile Lys
100 105 110
Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln Phe
115 120 125
Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu Gly
130 135 140
Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu Lys
145 150 155 160
Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu Ala Val
165 170 175
Cys Glu Phe Pro Ile Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
180 185 190
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
195 200 205
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
210 215 220
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
225 230 235 240
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
245 250 255
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
260 265 270
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
275 280 285
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
290 295 300
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
305 310 315 320
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
325 330 335
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
340 345 350
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
355 360 365
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
370 375 380
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
385 390 395 400
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala
405 410
<210> 23
<211> 414
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 23
Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Ser Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly
1 5 10 15
Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Ser Gly Gln Ser Gly Asp Pro Gly Ser
20 25 30
Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
35 40 45
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
50 55 60
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
65 70 75 80
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
85 90 95
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
100 105 110
Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
115 120 125
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
130 135 140
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
145 150 155 160
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
165 170 175
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
180 185 190
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
195 200 205
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
210 215 220
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
225 230 235 240
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
245 250 255
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser
260 265 270
Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile
275 280 285
Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe
290 295 300
Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu
305 310 315 320
Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu
325 330 335
Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile
340 345 350
Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg
355 360 365
Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser
370 375 380
Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val
385 390 395 400
Pro Cys Ser Thr Ser His Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile
405 410
<210> 24
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 24
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly Lys
225 230 235 240
Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln Gly
245 250 255
Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Gln Leu Gly Pro Pro Gly Asn
260 265 270
Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro
275 280 285
Gly Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys
290 295 300
Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser
305 310 315 320
Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile
325 330 335
Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser
340 345 350
Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu
355 360 365
Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly
370 375 380
Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn
385 390 395 400
Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu
405 410 415
Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu
420 425 430
Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile
435
<210> 25
<211> 402
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 25
Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly
1 5 10 15
Pro Ser Gly Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
20 25 30
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
35 40 45
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
50 55 60
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
65 70 75 80
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
85 90 95
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
100 105 110
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
115 120 125
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
130 135 140
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
145 150 155 160
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
165 170 175
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
180 185 190
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
195 200 205
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
210 215 220
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
225 230 235 240
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Ser Pro Asp
245 250 255
Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys Ala Leu Gln Thr Glu
260 265 270
Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser Leu Gly Lys Gln Val
275 280 285
Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met Thr Phe Glu Lys
290 295 300
Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser Val Ala Thr Pro Arg
305 310 315 320
Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile Lys Glu Glu Ala
325 330 335
Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln Phe Val Asp Leu
340 345 350
Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu Gly Glu Pro Asn
355 360 365
Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu Lys Asn Gly Gln
370 375 380
Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu Ala Val Cys Glu Phe
385 390 395 400
Pro Ile
<210> 26
<211> 402
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 26
Gly Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly
1 5 10 15
Asp Pro Gly Lys Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
20 25 30
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
35 40 45
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
50 55 60
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
65 70 75 80
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
85 90 95
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
100 105 110
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
115 120 125
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
130 135 140
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
145 150 155 160
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
165 170 175
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
180 185 190
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
195 200 205
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
210 215 220
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
225 230 235 240
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Ser Pro Asp
245 250 255
Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys Ala Leu Gln Thr Glu
260 265 270
Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser Leu Gly Lys Gln Val
275 280 285
Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met Thr Phe Glu Lys
290 295 300
Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser Val Ala Thr Pro Arg
305 310 315 320
Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile Lys Glu Glu Ala
325 330 335
Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln Phe Val Asp Leu
340 345 350
Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu Gly Glu Pro Asn
355 360 365
Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu Lys Asn Gly Gln
370 375 380
Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu Ala Val Cys Glu Phe
385 390 395 400
Pro Ile
<210> 27
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 27
Gly Ser Pro Gly Ile Pro Gly Thr Pro Gly Ser His Gly Leu Pro Gly
1 5 10 15
Arg Asp Gly Arg Asp Gly Val Lys Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Pro
20 25 30
Met Gly Pro Pro Gly Glu Thr Pro Cys Pro Pro Gly Asn Asn Gly Leu
35 40 45
Pro Gly Ala Pro Gly Val Pro Gly Glu Arg Gly Glu Lys Gly Glu Ala
50 55 60
Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
65 70 75 80
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
85 90 95
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
100 105 110
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
115 120 125
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val
130 135 140
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
145 150 155 160
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
165 170 175
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
180 185 190
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
195 200 205
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
210 215 220
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
225 230 235 240
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
245 250 255
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
260 265 270
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
275 280 285
Ala Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys
290 295 300
Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser
305 310 315 320
Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile
325 330 335
Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser
340 345 350
Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu
355 360 365
Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly
370 375 380
Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn
385 390 395 400
Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu
405 410 415
Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu
420 425 430
Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile
435
<210> 28
<211> 248
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Met Ser Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Val Ala
1 5 10 15
Ala Ser Tyr Ser Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys
20 25 30
Pro Ala Val Ile Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly
35 40 45
Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly
65 70 75 80
Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp
85 90 95
Pro Gly Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg
100 105 110
Lys Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe
115 120 125
Ser Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu
130 135 140
Ile Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala
145 150 155 160
Ser Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn
165 170 175
Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu
180 185 190
Gly Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp
195 200 205
Asn Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu
210 215 220
Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His
225 230 235 240
Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile
245
<210> 29
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys Pro Ala Val Ile
1 5 10 15
Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly Lys Asp Gly Arg
20 25 30
Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln Gly Leu Arg Gly
35 40 45
Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly Pro
50 55 60
Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro Gly Lys Ser
65 70 75 80
Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys Ala Leu Gln
85 90 95
Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser Leu Gly Lys
100 105 110
Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met Thr Phe
115 120 125
Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser Val Ala Thr
130 135 140
Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile Lys Glu
145 150 155 160
Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln Phe Val
165 170 175
Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu Gly Glu
180 185 190
Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu Lys Asn
195 200 205
Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu Ala Val Cys
210 215 220
Glu Phe Pro Ile
225
<210> 30
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
Met Ser Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Val Ala
1 5 10 15
Ala Ser Tyr Ser
20
<210> 31
<211> 141
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Ala Ala Ser Glu Arg Lys Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys
1 5 10 15
Lys Trp Leu Thr Phe Ser Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe
20 25 30
Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys
35 40 45
Val Lys Phe Gln Ala Ser Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn
50 55 60
Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr
65 70 75 80
Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu
85 90 95
Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp
100 105 110
Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro
115 120 125
Cys Ser Thr Ser His Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile
130 135 140
<210> 32
<211> 115
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met Thr Phe Glu
1 5 10 15
Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser Val Ala Thr Pro
20 25 30
Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile Lys Glu Glu
35 40 45
Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln Phe Val Asp
50 55 60
Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu Gly Glu Pro
65 70 75 80
Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu Lys Asn Gly
85 90 95
Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu Ala Val Cys Glu
100 105 110
Phe Pro Ile
115
<210> 33
<211> 148
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys Ala Leu Gln
1 5 10 15
Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser Leu Gly Lys
20 25 30
Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met Thr Phe
35 40 45
Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser Val Ala Thr
50 55 60
Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile Lys Glu
65 70 75 80
Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln Phe Val
85 90 95
Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu Gly Glu
100 105 110
Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu Lys Asn
115 120 125
Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu Ala Val Cys
130 135 140
Glu Phe Pro Ile
145
<210> 34
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 34
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala
225 230 235 240
Ala Ser Glu Arg Lys Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys
245 250 255
Trp Leu Thr Phe Ser Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu
260 265 270
Thr Asn Gly Glu Ile Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val
275 280 285
Lys Phe Gln Ala Ser Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly
290 295 300
Ala Ile Gln Asn Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp
305 310 315 320
Glu Lys Thr Glu Gly Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr
325 330 335
Tyr Thr Asn Trp Asn Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu
340 345 350
Asp Cys Val Leu Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys
355 360 365
Ser Thr Ser His Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile
370 375 380
<210> 35
<211> 383
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 35
Ala Lys Thr Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
1 5 10 15
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
20 25 30
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
35 40 45
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
50 55 60
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
65 70 75 80
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
85 90 95
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
100 105 110
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
115 120 125
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
130 135 140
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
165 170 175
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
180 185 190
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
195 200 205
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
210 215 220
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Pro Asp Gly Asp Ser
225 230 235 240
Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg
245 250 255
Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys
260 265 270
Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala
275 280 285
Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala
290 295 300
Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly
305 310 315 320
Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn
325 330 335
Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly
340 345 350
Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp
355 360 365
Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile
370 375 380
<210> 36
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 36
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Thr Ser Lys Gln Val Gly Asn Lys
225 230 235 240
Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala
245 250 255
Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala
260 265 270
Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly
275 280 285
Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn
290 295 300
Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly
305 310 315 320
Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp
325 330 335
Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile
340 345 350
<210> 37
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 37
Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met Thr
1 5 10 15
Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser Val Ala
20 25 30
Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile Lys
35 40 45
Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln Phe
50 55 60
Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu Gly
65 70 75 80
Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu Lys
85 90 95
Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu Ala Val
100 105 110
Cys Glu Phe Pro Ile
115
<210> 38
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 38
Gln Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Asp Asn Ser Cys Pro Asn Val Ser Asn
1 5 10 15
Ile Val Arg Asp Thr Ile Val Asn Glu Leu Arg Ser Asp Pro Arg Ile
20 25 30
Ala Ala Ser Ile Leu Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly
35 40 45
Cys Asp Ala Ser Ile Leu Leu Asp Asn Thr Thr Ser Phe Arg Thr Glu
50 55 60
Lys Asp Ala Phe Gly Asn Ala Asn Ser Ala Arg Gly Phe Pro Val Ile
65 70 75 80
Asp Arg Met Lys Ala Ala Val Glu Ser Ala Cys Pro Arg Thr Val Ser
85 90 95
Cys Ala Asp Leu Leu Thr Ile Ala Ala Gln Gln Ser Val Thr Leu Ala
100 105 110
Gly Gly Pro Ser Trp Arg Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Leu Gln
115 120 125
Ala Phe Leu Asp Leu Ala Asn Ala Asn Leu Pro Ala Pro Phe Phe Thr
130 135 140
Leu Pro Gln Leu Lys Asp Ser Phe Arg Asn Val Gly Leu Asn Arg Ser
145 150 155 160
Ser Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Gly His Thr Phe Gly Lys Asn Gln
165 170 175
Cys Arg Phe Ile Met Asp Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Asn Thr Gly Leu
180 185 190
Pro Asp Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Leu Gln Thr Leu Arg Gly Leu
195 200 205
Cys Pro Leu Asn Gly Asn Leu Ser Ala Leu Val Asp Phe Asp Leu Arg
210 215 220
Thr Pro Thr Ile Phe Asp Asn Lys Tyr Tyr Val Asn Leu Glu Glu Gln
225 230 235 240
Lys Gly Leu Ile Gln Ser Asp Gln Glu Leu Phe Ser Ser Pro Asn Ala
245 250 255
Thr Asp Thr Ile Pro Leu Val Arg Ser Phe Ala Asn Ser Thr Gln Thr
260 265 270
Phe Phe Asn Ala Phe Val Glu Ala Met Asp Arg Met Gly Asn Ile Thr
275 280 285
Pro Leu Thr Gly Thr Gln Gly Gln Ile Arg Leu Asn Cys Arg Val Val
290 295 300
Asn Ser Asn Ser
305
<210> 39
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 39
cagttaaccc ctacattcta cgacaatagc tgtcccaacg tgtccaacat cgttcgcgac 60
acaatcgtca acgagctcag atccgatccc aggatcgctg cttcaatatt acgtctgcac 120
ttccatgact gcttcgtgaa tggttgcgac gctagcatat tactggacaa caccaccagt 180
ttccgcactg aaaaggatgc attcgggaac gctaacagcg ccaggggctt tccagtgatc 240
gatcgcatga aggctgccgt tgagtcagca tgcccacgaa cagtcagttg tgcagacctg 300
ctgactatag ctgcgcaaca gagcgtgact cttgcaggcg gaccgtcctg gagagtgccg 360
ctcggtcgac gtgactccct acaggcattc ctagatctgg ccaacgccaa cttgcctgct 420
ccattcttca ccctgcccca gctgaaggat agctttagaa acgtgggtct gaatcgctcg 480
agtgaccttg tggctctgtc cggaggacac acatttggaa agaaccagtg taggttcatc 540
atggataggc tctacaattt cagcaacact gggttacctg accccacgct gaacactacg 600
tatctccaga cactgagagg cttgtgccca ctgaatggca acctcagtgc actagtggac 660
tttgatctgc ggaccccaac catcttcgat aacaagtact atgtgaatct agaggagcag 720
aaaggcctga tacagagtga tcaagaactg tttagcagtc caaacgccac tgacaccatc 780
ccactggtga gaagttttgc taactctact caaaccttct ttaacgcctt cgtggaagcc 840
atggaccgta tgggtaacat tacccctctg acgggtaccc aaggccagat tcgtctgaac 900
tgcagagtgg tcaacagcaa ctcttaatga 930
<210> 40
<211> 33
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys Ala Leu Gln
1 5 10 15
Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser Leu Gly Lys
20 25 30
Gln
<210> 41
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys Pro Ala Val Ile
1 5 10 15
Ala Cys Ser Ser Pro
20
<210> 42
<211> 747
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(744)
<400> 42
atg tcc ctg ttt cca tca ctc cct ctc ctt ctc ctg agt atg gtg gca 48
Met Ser Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Val Ala
1 5 10 15
gcg tct tac tca gaa act gtg acc tgt gag gat gcc caa aag acc tgc 96
Ala Ser Tyr Ser Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys
20 25 30
cct gca gtg att gcc tgt agc tct cca ggc atc aac ggc ttc cca ggc 144
Pro Ala Val Ile Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly
35 40 45
aaa gat ggg cgt gat ggc acc aag gga gaa aag ggg gaa cca ggc caa 192
Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln
50 55 60
ggg ctc aga ggc tta cag ggc ccc cct gga aag ttg ggg cct cca gga 240
Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly
65 70 75 80
aat cca ggg cct tct ggg tca cca gga cca aag ggc caa aaa gga gac 288
Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp
85 90 95
cct gga aaa agt ccg gat ggt gat agt agc ctg gct gcc tca gaa aga 336
Pro Gly Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg
100 105 110
aaa gct ctg caa aca gaa atg gca cgt atc aaa aag tgg ctc acc ttc 384
Lys Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe
115 120 125
tct ctg ggc aaa caa gtt ggg aac aag ttc ttc ctg acc aat ggt gaa 432
Ser Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu
130 135 140
ata atg acc ttt gaa aaa gtg aag gcc ttg tgt gtc aag ttc cag gcc 480
Ile Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala
145 150 155 160
tct gtg gcc acc ccc agg aat gct gca gag aat gga gcc att cag aat 528
Ser Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn
165 170 175
ctc atc aag gag gaa gcc ttc ctg ggc atc act gat gag aag aca gaa 576
Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu
180 185 190
ggg cag ttt gtg gat ctg aca gga aat aga ctg acc tac aca aac tgg 624
Gly Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp
195 200 205
aac gag ggt gaa ccc aac aat gct ggt tct gat gaa gat tgt gta ttg 672
Asn Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu
210 215 220
cta ctg aaa aat ggc cag tgg aat gac gtc ccc tgc tcc acc tcc cat 720
Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His
225 230 235 240
ctg gcc gtc tgt gag ttc cct atc tga 747
Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile
245
<210> 43
<211> 687
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(684)
<400> 43
gaa act gtg acc tgt gag gat gcc caa aag acc tgc cct gca gtg att 48
Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys Pro Ala Val Ile
1 5 10 15
gcc tgt agc tct cca ggc atc aac ggc ttc cca ggc aaa gat ggg cgt 96
Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly Lys Asp Gly Arg
20 25 30
gat ggc acc aag gga gaa aag ggg gaa cca ggc caa ggg ctc aga ggc 144
Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln Gly Leu Arg Gly
35 40 45
tta cag ggc ccc cct gga aag ttg ggg cct cca gga aat cca ggg cct 192
Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly Pro
50 55 60
tct ggg tca cca gga cca aag ggc caa aaa gga gac cct gga aaa agt 240
Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro Gly Lys Ser
65 70 75 80
ccg gat ggt gat agt agc ctg gct gcc tca gaa aga aaa gct ctg caa 288
Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys Ala Leu Gln
85 90 95
aca gaa atg gca cgt atc aaa aag tgg ctc acc ttc tct ctg ggc aaa 336
Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser Leu Gly Lys
100 105 110
caa gtt ggg aac aag ttc ttc ctg acc aat ggt gaa ata atg acc ttt 384
Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met Thr Phe
115 120 125
gaa aaa gtg aag gcc ttg tgt gtc aag ttc cag gcc tct gtg gcc acc 432
Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser Val Ala Thr
130 135 140
ccc agg aat gct gca gag aat gga gcc att cag aat ctc atc aag gag 480
Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile Lys Glu
145 150 155 160
gaa gcc ttc ctg ggc atc act gat gag aag aca gaa ggg cag ttt gtg 528
Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln Phe Val
165 170 175
gat ctg aca gga aat aga ctg acc tac aca aac tgg aac gag ggt gaa 576
Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu Gly Glu
180 185 190
ccc aac aat gct ggt tct gat gaa gat tgt gta ttg cta ctg aaa aat 624
Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu Lys Asn
195 200 205
ggc cag tgg aat gac gtc ccc tgc tcc acc tcc cat ctg gcc gtc tgt 672
Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu Ala Val Cys
210 215 220
gag ttc cct atc tga 687
Glu Phe Pro Ile
225
<210> 44
<211> 1275
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1275)
<400> 44
ggc atc aac ggc ttc cca ggc aaa gat ggg cgt gat ggc acc aag gga 48
Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly
1 5 10 15
gaa aag ggg gaa cca ggc caa ggg ctc aga ggc tta cag ggc ccc cct 96
Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro
20 25 30
gga aag ttg ggg cct cca gga aat cca ggg cct tct ggg tca cca gga 144
Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly
35 40 45
cca aag ggc caa aaa gga gac cct gga aaa agt gca cca gag ctg ctg 192
Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro Gly Lys Ser Ala Pro Glu Leu Leu
50 55 60
ggc gga cca agc gtg ttc ctg ttt cca ccc aag ccc aaa gat act ctg 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
65 70 75 80
atg att tct cga aca ccc gaa gtg act tgc gtg gtc gtg gac gtg agc 288
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
85 90 95
cac gag gat cct gaa gtg aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtc gag 336
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
100 105 110
gtg cat aat gcc aag aca aaa ccc cgg gag gaa cag tac gac tct acc 384
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr
115 120 125
tat cgc gtc gtg agt gtc ctg aca gtg ctg cat cag gat tgg ctg aac 432
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
130 135 140
gga aag gag tat aag tgc aaa gtg tcc aat aag gca ctg cct gcc cca 480
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
145 150 155 160
atc gag aaa act att tct aag gct aaa ggc cag cct aga gaa cca cag 528
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
165 170 175
gtg tac acc ctg cct cca agc cgg gac gag ctg act aag aac cag gtg 576
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
180 185 190
tcc ctg acc tgt ctg gtc aaa ggc ttc tac cct tcc gat atc gca gtg 624
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
195 200 205
gag tgg gaa tct aat ggg cag cca gag aac aat tac aag acc aca ccc 672
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
210 215 220
cct gtg ctg gac tct gat ggc agt ttc ttt ctg tat tca aag ctg acc 720
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
225 230 235 240
gtg gat aaa agc cgg tgg cag cag gga aat gtc ttc agt tgt tca gtg 768
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
245 250 255
atg cac gaa gca ctg cac aac cac tac act cag aaa agc ctg tcc ctg 816
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
260 265 270
tcc cct gga gca agt ccg gat ggt gat agt agc ctg gct gcc tca gaa 864
Ser Pro Gly Ala Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu
275 280 285
aga aaa gct ctg caa aca gaa atg gca cgt atc aaa aag tgg ctc acc 912
Arg Lys Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr
290 295 300
ttc tct ctg ggc aaa caa gtt ggg aac aag ttc ttc ctg acc aat ggt 960
Phe Ser Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly
305 310 315 320
gaa ata atg acc ttt gaa aaa gtg aag gcc ttg tgt gtc aag ttc cag 1008
Glu Ile Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln
325 330 335
gcc tct gtg gcc acc ccc agg aat gct gca gag aat gga gcc att cag 1056
Ala Ser Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln
340 345 350
aat ctc atc aag gag gaa gcc ttc ctg ggc atc act gat gag aag aca 1104
Asn Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr
355 360 365
gaa ggg cag ttt gtg gat ctg aca gga aat aga ctg acc tac aca aac 1152
Glu Gly Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn
370 375 380
tgg aac gag ggt gaa ccc aac aat gct ggt tct gat gaa gat tgt gta 1200
Trp Asn Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val
385 390 395 400
ttg cta ctg aaa aat ggc cag tgg aat gac gtc ccc tgc tcc acc tcc 1248
Leu Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser
405 410 415
cat ctg gcc gtc tgt gag ttc cct atc 1275
His Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile
420 425
<210> 45
<211> 1242
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1242)
<400> 45
ggc tta cag ggc ccc cct gga aag ttg ggg cct cca gga aat cca ggg 48
Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro Gly
1 5 10 15
cct tct ggg tca cca gga cca aag ggc caa aaa gga gac cct gga aaa 96
Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro Gly Lys
20 25 30
agt gaa ccc aag tct agt gac aaa act cac acc tgc cca cct tgt cca 144
Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
35 40 45
gca cca gag ctg ctg ggc gga cca agc gtg ttc ctg ttt cca ccc aag 192
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
50 55 60
ccc aaa gat act ctg atg att tct cga aca ccc gaa gtg act tgc gtg 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
65 70 75 80
gtc gtg gac gtg agc cac gag gat cct gaa gtg aag ttc aac tgg tac 288
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
85 90 95
gtg gac ggc gtc gag gtg cat aat gcc aag aca aaa ccc cgg gag gaa 336
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
100 105 110
cag tac gac tct acc tat cgc gtc gtg agt gtc ctg aca gtg ctg cat 384
Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
115 120 125
cag gat tgg ctg aac gga aag gag tat aag tgc aaa gtg tcc aat aag 432
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
130 135 140
gca ctg cct gcc cca atc gag aaa act att tct aag gct aaa ggc cag 480
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
145 150 155 160
cct aga gaa cca cag gtg tac acc ctg cct cca agc cgg gac gag ctg 528
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
165 170 175
act aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctg gtc aaa ggc ttc tac cct 576
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
180 185 190
tcc gat atc gca gtg gag tgg gaa tct aat ggg cag cca gag aac aat 624
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
195 200 205
tac aag acc aca ccc cct gtg ctg gac tct gat ggc agt ttc ttt ctg 672
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
210 215 220
tat tca aag ctg acc gtg gat aaa agc cgg tgg cag cag gga aat gtc 720
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
225 230 235 240
ttc agt tgt tca gtg atg cac gaa gca ctg cac aac cac tac act cag 768
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
245 250 255
aaa agc ctg tcc ctg tcc cct gga gca agt ccg gat ggt gat agt agc 816
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser
260 265 270
ctg gct gcc tca gaa aga aaa gct ctg caa aca gaa atg gca cgt atc 864
Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile
275 280 285
aaa aag tgg ctc acc ttc tct ctg ggc aaa caa gtt ggg aac aag ttc 912
Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe
290 295 300
ttc ctg acc aat ggt gaa ata atg acc ttt gaa aaa gtg aag gcc ttg 960
Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu
305 310 315 320
tgt gtc aag ttc cag gcc tct gtg gcc acc ccc agg aat gct gca gag 1008
Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu
325 330 335
aat gga gcc att cag aat ctc atc aag gag gaa gcc ttc ctg ggc atc 1056
Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile
340 345 350
act gat gag aag aca gaa ggg cag ttt gtg gat ctg aca gga aat aga 1104
Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg
355 360 365
ctg acc tac aca aac tgg aac gag ggt gaa ccc aac aat gct ggt tct 1152
Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser
370 375 380
gat gaa gat tgt gta ttg cta ctg aaa aat ggc cag tgg aat gac gtc 1200
Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val
385 390 395 400
ccc tgc tcc acc tcc cat ctg gcc gtc tgt gag ttc cct atc 1242
Pro Cys Ser Thr Ser His Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile
405 410

Claims (38)

1.微生物-结合分子，其包含：
(i) 胶原结构域；
(ii) Fc结构域；和
(iii) 包含螺旋结构域和碳水化合物识别结构域(CRD)的微生物-结合结构域，
其中Fc结构域将胶原结构域连接至微生物-表面结合结构域。
2.权利要求1的微生物-结合分子，其中所述微生物-结合分子不包括半胱氨酸-富集结构域。
3.微生物-结合分子，其包含：
(i) 胶原结构域；
(ii) Fc结构域；和
(iii) 包含螺旋结构域和碳水化合物识别结构域(CRD)的微生物-结合结构域，
其中胶原结构域将Fc结构域连接至微生物-表面结合结构域，和其中微生物-结合分子不包括半胱氨酸-富集交联结构域。
4.权利要求1和3中任一项的微生物-结合分子，其中所述碳水化合物识别结构域形成微生物-结合分子的C-末端。
5.微生物-结合分子，其包含：
(i) 胶原结构域；
(ii) Fc结构域；和
(iii) 包含螺旋结构域和碳水化合物识别结构域(CRD)的微生物-结合结构域，
其中微生物-表面结合结构域将胶原结构域连接至Fc结构域，和其中微生物-结合分子不包括半胱氨酸-富集交联结构域。
6.权利要求1、3和5中任一项的微生物-结合分子，其中所述胶原结构域长度为至少约15个氨基酸或至少约20个氨基酸。
7.权利要求1、3和5中任一项的微生物-结合分子，其中所述胶原结构域长度为15-60个氨基酸。
8.权利要求1、3和5中任一项的微生物-结合分子，其中所述胶原结构域与第二微生物-结合分子的第二胶原结构域形成胶原-样三股螺旋。
9.权利要求1、3和5中任一项的微生物-结合分子，其中所述胶原结构域包含多个Gly-Xaa1-Xaa2三联体，其中Xaa1和Xaa2各自独立地是氨基酸残基。
10.权利要求1、3和5中任一项的微生物-结合分子，其中所述胶原结构域源自含胶原分子，所述含胶原分子选自胶原凝集素(例如，甘露糖结合凝集素、表面活性蛋白)、纤维胶凝蛋白、天然存在的或合成的胶原-样肽和其任何组合。
11.权利要求1、3和5中任一项的微生物-结合分子，其中所述胶原结构域包含甘露糖结合凝集素的胶原结构域或其片段。
12. 权利要求11的微生物-结合分子，其中所述胶原结构域基本上由选自SEQ ID NO:7-16的氨基酸序列组成。
13. 权利要求1、3和5中任一项的微生物-结合分子，其中所述Fc结构域包含IgG CH2结构域和IgG CH3结构域，和任选地包含IgG微生物-结合分子的铰链结构域。
14. 权利要求13的微生物-结合分子，其中IgG是哺乳动物IgG (例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)或其片段。
15.权利要求1、3和5中任一项的微生物-结合分子，其中所述Fc结构域包含CH2结构域和CH3结构域，和任选地包含哺乳动物IgA、IgD、IgE或IgM微生物-结合分子的铰链结构域。
16.权利要求1、3和5中任一项的微生物-结合分子，其中所述Fc结构域包含相对于天然序列的突变。
17. 权利要求16的微生物-结合分子，其中所述突变经选择以：(i) 增加重组微生物-结合分子的生物学半衰期；(ii) 调节抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；和/或(iii) 调节补体依赖性细胞毒性；和/或(iv) 除去Fc结构域的糖基化(例如，N297D)。
18.权利要求1、3和5中任一项的微生物-结合分子，其中所述螺旋结构域源自含螺旋分子，所述含螺旋分子选自胶原凝集素(例如，甘露糖结合凝集素、表面活性蛋白)、纤维胶凝蛋白、合成的螺旋肽和其任何组合。
19.权利要求1、3和5中任一项的微生物-结合分子，其中所述CRD源自糖-结合分子，所述糖-结合分子选自：糖结合凝集素(例如，甘露糖结合凝集素、胶原凝集素、表面活性蛋白)、DC-SIGN、巨噬细胞甘露糖受体和其任何组合。
20. 权利要求19的微生物-结合分子，其中所述CRD包含甘露糖结合凝集素2 (MBL2)的CRD或其片段。
21. 权利要求1、3和5中任一项的微生物-结合分子，其中所述微生物-结合分子具有选自SEQ ID NO: 17-27的氨基酸序列，或与选择的氨基酸序列具有至少90%同源性的氨基酸序列。
22.权利要求1、3和5中任一项的微生物-结合分子，进一步包含与其偶联的可检测标记。
23.权利要求22的微生物-结合分子，其中可检测标记选自：生物素、荧光团、发光或生物发光标志物、放射性标记、酶、酶底物、量子点、成像剂、金属粒子(例如，金粒子和/或银粒子)、磁性粒子和其任何组合。
24.权利要求23的微生物-结合分子，其中所述酶选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、萤光素酶和β-半乳糖苷酶。
25.权利要求1、3和5中任一项的微生物-结合分子，进一步包含与Fc结构域或胶原结构域融合的可检测分子。
26.权利要求25的微生物-结合分子，其中所述可检测分子包含HRP、AP、萤光素酶、β-半乳糖苷酶或荧光团。
27.微生物-结合多聚体分子，其包含：
(i) 权利要求1、3和5中任一项的第一微生物-结合分子；
(ii) 权利要求1、3和5中任一项的第二微生物-结合分子，
其中：
第一微生物-结合分子的螺旋结构域与第二微生物-结合分子的螺旋结构域形成卷曲结构；和
第一微生物-结合分子的胶原结构域与第二微生物-结合分子的胶原结构域或权利要求1、3和5中任一项的第三微生物-结合分子的胶原结构域形成三股螺旋结构。
28.权利要求27的微生物-结合多聚体分子，其包含至少10个权利要求1、3和5中任一项的微生物-结合分子。
29. 用于检测微生物物质的试剂盒，其包含：
(iii) 包含权利要求1、3和5中任一项的一种或多种微生物-结合分子的容器，其中所述微生物-结合分子各自包含可检测标记；和
(iv) 至少一种试剂。
30.权利要求29的试剂盒，进一步包含微生物-捕获装置，所述微生物-捕获装置包含固体表面和与其偶联的微生物-捕获分子。
31.权利要求30的试剂盒，其中所述微生物-捕获装置选自核酸支架、蛋白支架、脂质支架、树状聚体、微粒或微珠、纳米管、微量滴定板、医疗器械或移植物、微芯片、过滤装置、膜、诊断条、浸渍片、身体外装置、螺旋式混合器和中空纤维反应器。
32.权利要求29的试剂盒，其中所述可检测标记是酶，和所述试剂盒进一步包含含有酶底物的容器，所述酶底物在酶存在时改变颜色。
33.权利要求29的试剂盒，其中所述可检测标记包含荧光分子。
34.权利要求29的试剂盒，其中所述至少一种试剂是洗涤缓冲液、稀释缓冲液、终止缓冲液、包含螯合剂的缓冲溶液或其任何组合。
35.微生物-结合制品，其包含固体表面和与固体表面偶联的权利要求1、3和5中任一项的至少一种微生物-结合分子。
36.权利要求35的微生物-结合制品，其中所述固体表面是固体基底的表面，所述固体基底选自核酸支架、蛋白支架、脂质支架、树状聚体、微粒或微珠、纳米管、微量滴定板、医疗器械或移植物、微芯片、过滤装置、膜、诊断条、浸渍片、身体外装置、螺旋式混合器和中空纤维。
37.药物组合物，其包含权利要求1、3和5中任一项的至少一种微生物-结合分子和药学上可接受的载体。
38.权利要求37的药物组合物，其中胶原结构域、Fc结构域和微生物-表面结合结构域源自人氨基酸序列。
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