TW202300014A - 腫瘤儲存及細胞培養組成物 - Google Patents

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Abstract

本文提供可用於製造TIL治療劑之腫瘤儲存組成物、細胞培養基及腫瘤洗滌緩衝液。該等試劑允許製造高品質TIL治療劑，同時降低微生物生物負荷並在TIL製造製程中提供無菌保障。

Description

腫瘤儲存及細胞培養組成物
本文係關於可用於製造TIL治療劑之腫瘤儲存組成物、細胞培養基及腫瘤洗滌緩衝液。
利用藉由快速擴增方案(REP)離體培養之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)進行的授受性細胞療法已在癌症患者之宿主免疫抑制之後產生成功的授受性細胞療法。然而，當前的TIL製造及治療程序受到持續時間、成本、無菌性問題及本文所描述之其他因素的限制，使得治療癌症患者之潛力受到嚴重限制。
無菌性係TIL成功生長的一個重要屬性。舉例而言，必須經由手術切除小心地維持樣品之無菌性以限制微生物污染之風險。亦必須確保在腫瘤樣品輸送至TIL處理設備、在處理之前腫瘤樣本儲存以及在處理腫瘤樣本以產生高級治療性TIL期間的無菌性。因此，需要在TIL治療劑製造中提供無菌保障的試劑。
本文提供可用於製造TIL治療劑之腫瘤儲存組成物、細胞培養基及腫瘤洗滌緩衝液。該等試劑允許製造高品質TIL治療劑，同時降低微生物生物負荷並在TIL製造製程中提供無菌保障。具體言之，本文所提供之腫瘤儲存組成物有利地使細菌(例如革蘭氏陰性(gram-negative)及革蘭氏陽性細菌物種)及真菌污染減到最少，同時不會明顯影響細胞存活率。另外，在所主張之細胞培養基中培養的淋巴球能夠在具有極少細菌(例如革蘭氏陽性及革蘭氏陰性細菌)及/或真菌污染情況下進行分化、耗竭及/或活化。
在一個態樣中，本文提供一種用於低溫儲存腫瘤樣本之組成物。該組成物包括：a)無血清、無動物組分之冷凍保存培養基；及b)抗生素組分，該抗生素組分包括：1)抗生素組合，該抗生素組合選自：i)建它黴素(gentamicin)及萬古黴素(vancomycin)；及ii)建它黴素及克林達黴素(clindamycin)；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，萬古黴素之濃度係約50-600 µg/mL。在某些實施例中，克林達黴素之濃度係約400-600 µg/mL。在一些實施例中，建它黴素之濃度係約50 µg/mL。
在例示性實施例中，該抗生素組分包括約50 µg/mL建它黴素及約400-600 µg/mL克林達黴素。在某些實施例中，該抗生素組分包括約50 µg/mL建它黴素及約50-600 µg/mL萬古黴素。在某些實施例中，該抗生素組分包括約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL萬古黴素。
在一些實施例中，該抗生素組分進一步包括抗真菌性抗生素。在某些實施例中，該抗真菌性抗生素係兩性黴素B(amphotericin B)。在一些實施例中，該兩性黴素B之濃度係約2.5-10 µg/mL。
在例示性實施例中，該冷凍保存培養基包括：i)一或多種選自鉀離子、鈉離子、鎂離子及鈣離子之電解質；及ii)在生理條件及低溫條件下有效之生物pH緩衝液。在一些實施例中，該等鉀離子之濃度係在約35-45 mM範圍內，該等鈉離子之濃度係在約80-120 mM範圍內，該等鎂離子之濃度係在約2-10 mM範圍內，且該等鈣離子之濃度係在約0.01-0.1 mM範圍內。
在一些實施例中，該組成物進一步包括營養有效量之至少一種單糖。在某些實施例中，該組成物進一步包括不可透過細胞膜且在冷暴露期間有效抵抗細胞膨脹的不透過性陰離子，該陰離子選自由以下組成之群組：乳糖酸根、葡糖酸根、檸檬酸根及甘油磷酸根。在一些實施例中，該組成物進一步包括對ATP再生有效之受質，該受質係至少一個選自由以下組成之群組的成員：腺苷、果糖、核糖及腺嘌呤。在某些實施例中，該組成物進一步包括至少一種選自由EDTA或維生素E組成之群組的調節凋亡誘導之細胞死亡的試劑。
在一些實施例中，該冷凍保存培養基包括10% DMSO。
在另一態樣中，本文提供一種腫瘤樣本組成物，其包括：a)包括複數個腫瘤細胞及複數個腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之腫瘤樣本；及b)低溫儲存培養基。該儲存培養基包含：i)無血清、無動物組分之冷凍保存培養基；及ii)抗生素，該抗生素包括：1)抗生素組合，該抗生素組合選自：i)建它黴素及萬古黴素；及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，該腫瘤樣本係實體腫瘤樣本。在某些實施例中，該腫瘤樣本為以下癌症類型之一：乳癌、胰臟癌、前列腺癌、結腸直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌、皮膚癌(包含但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑素瘤)、子宮頸癌、頭頸癌、神經膠母細胞瘤、卵巢癌、肉瘤、膀胱癌及神經膠母細胞瘤。
在一些實施例中，該腫瘤組織樣本係液體腫瘤樣本。在一些實施例中，該液體腫瘤樣本係來自血液惡性病之液體腫瘤樣本。
在一些實施例中，該腫瘤樣本係自原發性腫瘤獲得。在某些實施例中，該腫瘤樣本係自侵襲性腫瘤獲得。在一些實施例中，該腫瘤樣本係自轉移性腫瘤獲得。在某些實施例中，該腫瘤樣本係自惡性黑素瘤獲得。
在一些實施例中，該複數個TIL包括至少90%的活細胞。
在某些實施例中，萬古黴素之濃度係約50-600 µg/mL。在某些實施例中，萬古黴素之濃度係約100 µg/mL。在一些實施例中，克林達黴素之濃度係約400-600 µg/mL。在某些實施例中，建它黴素之濃度係約50 µg/mL。在一些實施例中，該抗生素組分包括約50 µg/mL建它黴素及約400-600 µg/mL克林達黴素。在一些實施例中，該抗生素組分包括約50 µg/mL建它黴素及約50-600 µg/mL萬古黴素。在一些實施例中，該抗生素組分包括約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL萬古黴素。
在一些實施例中，該抗生素組分進一步包括抗真菌性抗生素。在一些實施例中，該抗真菌性抗生素係兩性黴素B。在某些實施例中，該兩性黴素B之濃度係約2.5-10 µg/mL。
在一些實施例中，該冷凍保存培養基包括：i)一或多種選自鉀離子、鈉離子、鎂離子及鈣離子之電解質；及ii)在生理條件及低溫條件下有效之生物pH緩衝液。
在一些實施例中，該等鉀離子之濃度在約35-45 mM範圍內，該等鈉離子之濃度在約80-120 mM範圍內，該等鎂離子之濃度在約2-10 mM範圍內，且該等鈣離子之濃度在約0.01-0.1 mM範圍內。
在一些實施例中，該組成物進一步包括營養有效量之至少一種單糖。
在某些實施例中，該組成物進一步包括不可透過細胞膜且在冷暴露期間有效抵抗細胞膨脹的不透過性陰離子，其中該陰離子係選自由以下組成之群組：乳糖酸根、葡糖酸根、檸檬酸根及甘油磷酸根。
在一些實施例中，該組成物進一步包括對ATP再生有效之受質，該受質係至少一個選自由以下組成之群組的成員：腺苷、果糖、核糖及腺嘌呤。
在一些實施例中，該組成物進一步包括至少一種選自由EDTA或維生素E組成之群組的調節凋亡誘導之細胞死亡的試劑。
在某些實施例中，該冷凍保存培養基包括10% DMSO。
在另一態樣中，本文提供一種細胞培養基組成物，其包含：a)基礎培養基；b)麩醯胺酸或麩醯胺酸衍生物；c)血清；及d)抗生素組分。該基礎培養基包括：i)葡萄糖、ii)複數種鹽，以及複數種胺基酸及維生素。該抗生素組分選自：包括以下之抗生素組分：1)抗生素組合，該抗生素組合選自：i)建它黴素及萬古黴素，以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在另一態樣中，本文提供一種細胞培養基，其包含：a)基礎培養基；b)血清白蛋白；c)膽固醇NF；d)視情況選用之麩醯胺酸或麩醯胺酸衍生物；及d)抗生素組分。該基礎培養基包括：i)葡萄糖、ii)複數種鹽，以及iii)複數種胺基酸及維生素。該抗生素包括：1)抗生素組合，其選自：i)建它黴素萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在另一態樣中，本文提供一種細胞培養基，其包括：a)合成培養基或無血清培養基；b)視情況選用之轉鐵蛋白；c)視情況選用之胰島素；d)視情況選用之白蛋白；e)膽固醇NF；f)視情況選用之麩醯胺酸或麩醯胺酸衍生物；及g)抗生素組分。該合成培養基或無血清培養基包括：i)葡萄糖、ii)複數種鹽，以及iii)複數種胺基酸及維生素。該抗生素組分包括：1)抗生素組合，其選自：i)建它黴素萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，細胞培養基包括(視情況重組之)轉鐵蛋白、(視情況重組之)胰島素及(視情況重組之)白蛋白。
在一些實施例中，該合成培養基或無血清培養基包括基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清替代物。
在某些實施例中，該基礎細胞培養基包括CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無外源物質培養基、杜爾貝科氏改良型伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(Basal Medium Eagle，BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(Glasgow's Minimal Essential Medium，G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良型杜爾貝科氏培養基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)。
在一些實施例中，血清補充劑或血清替代物係選自由以下組成之群組：CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑及CTS™免疫細胞血清替代物。
在某些實施例中，該合成培養基或無血清培養基包括一或多種白蛋白或白蛋白代用品。在一些實施例中，該合成培養基或無血清培養基包括一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白代用品。
在某些實施例中，該合成培養基或無血清培養基包括一或多種胰島素或胰島素代用品。在一些實施例中，該合成培養基或無血清培養基包括一或多種抗氧化劑。在一些實施例中，該合成培養基或無血清培養基包括一或多種膠原蛋白前驅物及一或多種微量元素。在某些實施例中，該合成培養基或無血清培養基包括一或多種選自由以下組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素以及含有微量元素部分Ag +、Al 3+、Ba 2+、Cd 2+、Co 2+、Cr 3+、Ge 4+、Se 4+、Br、T、Mn 2+、P、Si 4+、V 5+、Mo 6+、Ni 2+、Rb +、Sn 2+及Zr 4+之化合物。在某些實施例中，該合成培養基或無血清培養基進一步包括L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰基乙醇。
在一些實施例中，萬古黴素之濃度係約50-600 µg/mL。在一些實施例中，萬古黴素之濃度係約100 µg/mL。在某些實施例中，克林達黴素之濃度係約400-600 µg/mL。在一些實施例中，建它黴素之濃度係約50 µg/mL。在某些實施例中，該抗生素組分包括約50 µg/mL建它黴素及約400-600 µg/mL克林達黴素。在一些實施例中，該抗生素組分包括約50 µg/mL建它黴素及約50-600 µg/mL萬古黴素。在一些實施例中，該抗生素組分包括約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL萬古黴素。
在某些實施例中，該基礎培養基係RPMI 1640培養基、DMEM培養基或其組合。在一些實施例中，該基礎培養基係DMEM培養基。在一些實施例中，該麩醯胺酸衍生物係L-丙胺酸-L-麩醯胺酸(GutaMAX)。在某些實施例中，該麩醯胺酸係L-麩醯胺酸。
在一些實施例中，該血清係人類AB血清。
在一些實施例中，細胞培養基進一步包括IL-2。在某些實施例中，IL-2之濃度係3,000-6,000 IU/mL IL-2。
在一些實施例中，細胞培養基進一步包括抗CD3抗體。在某些實施例中，抗CD3抗體係30 ng/mL濃度之OKT-3。
在一些實施例中，細胞培養基進一步包括抗原呈現飼養細胞。
在某些實施例中，細胞培養基進一步包括6,000 IU/mL IL-2。
在一些實施例中，細胞培養基進一步包括3,000 IU/mL IL-2及30 ng/mL OKT-3。在一些實施例中，細胞培養基進一步包括3,000 IU/mL IL-2、30 ng/mL OKT-3及抗原呈現飼養細胞。
在某些實施例中，細胞培養基進一步包括6,000 IU/mL IL-2、30 ng/mL OKT-3及抗原呈現飼養細胞。
在一些實施例中，細胞培養基進一步包括3,000 IU/mL IL-2。
在另一態樣中，本文提供一種腫瘤浸潤淋巴球組成物，其包含複數個腫瘤浸潤淋巴球及本文所提供之任何細胞培養基。在一些實施例中，該複數個TIL展現出至少90%的活細胞。在某些實施例中，該複數個TIL展現出與不含萬古黴素及克林達黴素之對照腫瘤浸潤淋巴球組成物類似的記憶性TIL群體。在一些實施例中，該複數個TIL展現出與不含萬古黴素及克林達黴素之對照腫瘤浸潤淋巴球組成物類似的分化CD3+/CD4+、活化CD3+/CD4+及耗竭CD3+/CD4+ TIL群體。在某些實施例中，該複數個TIL展現出與不含萬古黴素及克林達黴素之對照腫瘤浸潤淋巴球組成物類似的分化CD3+/CD8+、活化CD3+/CD8+及耗竭CD3+/CD8+ TIL群體。
在另一態樣中，本文提供一種用於擴增T細胞之方法，其包括藉由在包括抗生素組分之培養基中培養獲自個體之腫瘤樣本中的第一T細胞群體以實現該第一T細胞群體之生長來擴增該第一T細胞群體，其中該抗生素組分包括：1)抗生素組合，該抗生素組合選自i)建它黴素及萬古黴素，以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，該培養基包括IL-2。在一些實施例中，將該第一T細胞群體培養約7至14天之時段。
在另一態樣中，本文提供一種用於快速擴增T細胞之方法，其包括使第一T細胞群體與包括IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)、抗原呈現細胞(APC)及抗生素組分之細胞培養基接觸以實現該第一T細胞群體之快速生長，由此產生第二T細胞群體，其中該快速擴增係進行約7至14天時段，且其中該抗生素包括1)抗生素組合，其選自：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。在一些實施例中，該培養基進一步包括IL-15及IL-21。在某些實施例中，萬古黴素之濃度係約50-600 µg/mL。在某些實施例中，萬古黴素之濃度係約100 µg/mL。在一些實施例中，克林達黴素之濃度係約400-600 µg/mL。在一些實施例中，建它黴素之濃度係約50 µg/mL。在某些實施例中，該抗生素組分包括約50 µg/mL建它黴素及約400-600 µg/mL克林達黴素。在一些實施例中，該抗生素組分包括約50 µg/mL建它黴素及約50-600 µg/mL萬古黴素。在一些實施例中，該抗生素組分包括約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL萬古黴素。
在另一態樣中，本文提供用於將腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其包括：a)提供自切除個體之腫瘤獲得的包括複數個腫瘤細胞及TIL之樣本；b)藉由將該樣本處理成多個片段而獲得第一TIL群體；c)將該等片段添加至密閉系統中；d)藉由在第一細胞培養基一培養該第一TIL群體來進行第一次擴增以產生第二TIL群體，其中該第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中該第一次擴增係進行約3-14天以獲得該第二TIL群體，其中自步驟c)至步驟d)之轉變係在不打開系統之情況下發生，其中該第一細胞培養基包括IL-2及第一抗生素組分；e)藉由在第二細胞培養基中培養第二TIL群體來進行第二次擴增以產生第三TIL群體，其中該第二次擴增係進行約7-14天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體係治療性TIL群體，其中該第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中自步驟d)至步驟e)之轉變係在不打開系統之情況下發生，其中該第二細胞培養基包括IL-2、OKT-3、抗原呈現細胞(APC)及視情況選用之第二抗生素組分；f)收集自步驟e)獲得的治療性TIL群體，其中自步驟e)至步驟f)之轉變係在不打開系統之情況下發生；及g)將自步驟f)收集之TIL群體之治療性群體轉移至輸注袋中，其中自步驟f)至步驟g)之轉移係在不打開系統之情況下發生，其中該第一抗生素組分及視情況選用之第二抗生素組分包括：1)抗生素組合，其選自：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，在步驟(d)之前，該方法進一步包括進行以下步驟：(i)在包括IL-2及視情況選用之第一抗生素組分的培養基中培養該第一TIL群體以獲得自多個腫瘤片段釋放之TIL；(ii)自該多個腫瘤片段分離至少複數個在步驟(i)中自該多個腫瘤片段釋放之TIL以獲得該多個腫瘤片段、該多個腫瘤片段中殘留之TIL及自該多個腫瘤片段釋放且在該分離之後與其一起保留之任何TIL的混合物；及(iii)視情況消化該多個腫瘤片段、該多個腫瘤片段中殘留之TIL及自該多個腫瘤片段釋放且在該分離之後與其一起保留之任何TIL的混合物以產生混合物之消化物，其中在步驟(d)中，將該混合物或該混合物之消化物在該第一細胞培養基中培養以獲得該第二TIL群體。
在一些實施例中，在步驟(d)中進行之第一次擴增包括：(i)在第一細胞培養基中培養該第一TIL群體約3-14天，以獲得自該等腫瘤片段釋放之TIL；(ii)自該等腫瘤片段分離至少複數個在步驟(i)中自該等腫瘤片段釋放之TIL以獲得呈該等腫瘤片段、該等腫瘤片段中殘留之TIL及自該等腫瘤片段釋放且在該分離之後與其一起保留之任何TIL之混合物形式的第二TIL群體；及(iii)視情況消化該等腫瘤片段、該等腫瘤片段中殘留之TIL及自該等腫瘤片段釋放且在該分離之後與其一起保留之任何TIL之混合物以產生該混合物之消化物，其中在步驟(e)中，第二次擴增係藉由在第二培養基中擴增呈該混合物或該混合物之消化物形式之第二TIL群體約7-14天來進行以產生第三TIL群體。
在另一態樣中，本文提供一種用於將腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其包括：a)提供自手術切除、穿刺活體組織切片檢查、粗針活體組織切片檢查、小型活體組織切片檢查或用於自個體獲得含有腫瘤及TIL之第一混合物之樣本的其他方式獲得的第一TIL群體；b)在第一細胞培養基中進行該第一TIL群體之初始第一次擴增以獲得第二TIL群體，其中該第一細胞培養基包括IL-2、視情況選用之OKT-3(抗CD3抗體)且視情況包括抗原呈現細胞(APC)，及第一抗生素組分，其中該初始第一次擴增在約1至7或8天之時段內進行，其中該第二TIL群體之數目大於該第一TIL群體之數目；c)在第二細胞培養基中進行該第二TIL群體之快速第二次擴增以獲得治療性TIL群體，其中該第二細胞培養基包括IL-2、OKT-3、視情況選用之第二抗生素組分及APC；且其中該快速擴增係在約1至11天之時段內進行；及d)收集該治療性TIL群體，其中該第一抗生素組分及該第二抗生素組分包括：1)抗生素組合，其選自：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，該快速第二次擴增係在約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天之時段內進行。在一些實施例中，在步驟b)中，該第一細胞培養基進一步包括APC，且步驟c)中該第二培養基中APC之數目大於步驟b)中該第一培養基中APC之數目。
在一些實施例中，其中在步驟(d)之前，該方法進一步包括進行以下步驟：(i)在包括IL-2及視情況選用之第一抗生素組分的培養基中培養該第一TIL群體以獲得自該樣本釋放之TIL；(ii)自該樣本分離至少複數個在步驟(i)中自該樣本釋放之TIL以獲得該樣本、該樣本中殘留之TIL及自該樣本釋放且在該分離之後與其一起保留之任何TIL的第二混合物；及(iii)視情況消化該樣本、該樣本中殘留之TIL及自該樣本釋放且在該分離之後與其一起保留之任何TIL的第二混合物以產生該第二混合物之消化物；其中步驟(b)包括在該第一細胞培養基中進行呈該第二混合物或該第二混合物之消化物形式之第一TIL群體的初始第一次擴增以獲得該第二TIL群體。
在一些實施例中，步驟(a)包括藉由自該個體之腫瘤切除樣本並將該樣本處理成含有來自該個體之腫瘤及TIL之混合物的多個腫瘤片段，提供該第一TIL群體。
在某些實施例中，在步驟(b)之前，該方法進一步包括進行以下步驟：(i)在包括IL-2及視情況選用之第一抗生素組分的培養基中培養該第一TIL群體以獲得自該多個腫瘤片段釋放之TIL；(ii)自該多個腫瘤片段分離至少複數個在步驟(i)中自該樣本釋放之TIL以獲得該樣本、該多個腫瘤片段中殘留之TIL及自該多個腫瘤片段釋放且在該分離之後與其一起保留之任何TIL的第二混合物；及(iii)視情況消化該多個腫瘤片段、該多個腫瘤片段中殘留之TIL及自該多個腫瘤片段釋放且在該分離之後與其一起保留之任何TIL的第二混合物以產生該第二混合物之消化物；且其中步驟(b)包括在該第一細胞培養基中進行呈該第二混合物或該第二混合物之消化物形式之第一TIL群體的初始第一次擴增以產生該第二TIL群體。
在另一態樣中，本文提供一種擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之方法，其包括：a)藉由在包括第一抗生素組分之第一培養基中培養自手術切除、穿刺活體組織切片檢查、粗針活體組織切片檢查、小型活體組織切片檢查或用於自個體獲得含有腫瘤及TIL之混合物之樣本的其他方式獲得的第一TIL群體以實現該第一TIL群體之生長並起始其活化來進行該第一TIL群體之初始第一次擴增；b)在步驟(a)中起始該第一TIL群體之活化之後，藉由在視情況包括第二抗生素組分之第二培養基中培養該第一TIL群體以實現該第一TIL群體之生長並增強其活化，來進行該第一TIL群體之快速第二次擴增以獲得第二TIL群體，其中該第二TIL群體係治療性TIL群體；及c)收集該治療性TIL群體，其中該第一抗生素組分及該第二抗生素組分包括：1)抗生素組合，其選自：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，在步驟(a)中，該第一培養基進一步包括IL-2及OKT-3(抗CD3抗體)，以及視情況選用之抗原呈現細胞(APC)，且其中在步驟(b)中，該第二培養基進一步包括IL-2、OKT-3及APC。
在另一態樣中，本文提供一種用於將腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其包括：a)提供自手術切除、穿刺活體組織切片檢查、粗針活體組織切片檢查、小型活體組織切片檢查或用於自個體獲得含有腫瘤及TIL之第一混合物之樣本的其他方式獲得的第一TIL群體；b)在第一細胞培養基中進行該第一TIL群體之第一次擴增以獲得第二TIL群體，其中該第一細胞培養基包括IL-2及第一抗生素組分，其中該第一次擴增係在約3至14天之時段內進行，其中該第二TIL群體之數目大於該第一TIL群體之數目；c)在第二細胞培養基中進行該第二TIL群體之第二次擴增以獲得治療性TIL群體，其中該第二細胞培養基包括IL-2、OKT-3、視情況選用之第二抗生素組分及抗原呈現細胞(APC)；且其中該第二次擴增係在約7至14天之時段內進行；及d)收集該治療性TIL群體，其中該第一抗生素組分及該第二抗生素組分包括：1)抗生素組合，其選自：i)建它黴素及萬古黴素；以及建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，該第一次擴增係在約11天之時段內進行。在某些實施例中，該第二次擴增係在約11天之時段內進行。在一些實施例中，該第一次擴增及該第二次擴增係在約22天之時段內進行。在某些實施例中，在步驟b)之前，該方法進一步包括進行以下步驟：(i)在包括IL-2及視情況選用之第一抗生素組分的培養基中培養該第一TIL群體以獲得自該樣本釋放之TIL；(ii)自該樣本分離至少複數個在步驟(i)中自該樣本釋放之TIL以獲得該樣本、該樣本中殘留之TIL及自該樣本釋放且在該分離之後與其一起保留之任何TIL的第二混合物；及(iii)視情況消化該樣本、該樣本中殘留之TIL及自該樣本釋放且在該分離之後與其一起保留之任何TIL的第二混合物以產生該第二混合物之消化物；其中步驟b)包括在該第一細胞培養基中進行呈該第二混合物或該第二混合物之消化物形式之第一TIL群體的初始第一次擴增以獲得該第二TIL群體。
在一些實施例中，在步驟b)中進行之第一次擴增包括：(i)在該第一細胞培養基中培養該第一TIL群體約3-14天以獲得自該樣本釋放之TIL；(ii)自該樣本分離至少複數個在步驟(i)中自該樣本釋放之TIL以獲得呈該樣本、該樣本中殘留之TIL及自該樣本釋放且在該分離之後與其一起保留之任何TIL之第二混合物形式的第二TIL群體；及(iii)視情況消化該樣本、該樣本中殘留之TIL及自該樣本釋放且在該分離之後與其一起保留之任何TIL的第二混合物以產生該第二混合物之消化物；且其中在步驟c)中，第二次擴增係藉由在該第二細胞培養基中擴增呈該第二混合物或該第二混合物之消化物形式之第二TIL群體約7-11天來進行以產生治療性TIL群體。
在一些實施例中，步驟a)包括藉由自該個體之腫瘤切除樣本並將該樣本處理成含有來自該個體之腫瘤及TIL之混合物的多個腫瘤片段，提供該第一TIL群體。
在一些實施例中，其中在步驟b)之前，該方法進一步包括進行以下步驟：(i)在包括IL-2及視情況選用之第一抗生素組分的培養基中培養該第一TIL群體以獲得自該多個腫瘤片段釋放之TIL；(ii)自該多個腫瘤片段分離至少複數個在步驟(i)中自該樣本釋放之TIL以獲得該樣本、該多個腫瘤片段中殘留之TIL及自該多個腫瘤片段釋放且在該分離之後與其一起保留之任何TIL的第二混合物；及(iii)視情況消化該多個腫瘤片段、該多個腫瘤片段中殘留之TIL及自該多個腫瘤片段釋放且在該分離之後與其一起保留之任何TIL的第二混合物以產生該第二混合物之消化物；且其中步驟b)包括在該第一細胞培養基中進行呈該第二混合物或該第二混合物之消化物形式之第一TIL群體的第一次擴增以產生該第二TIL群體。
在一些實施例中，在步驟b)中進行之第一次擴增包括：(i)在第一細胞培養基中培養該第一TIL群體約3-14天，以獲得自該等腫瘤片段釋放之TIL；(ii)自該等腫瘤片段分離至少複數個在步驟(i)中自該等腫瘤片段釋放之TIL以獲得呈該等腫瘤片段、該等腫瘤片段中殘留之TIL及自該等腫瘤片段釋放且在該分離之後與其一起保留之任何TIL之第二混合物形式的第二TIL群體；及(iii)視情況消化該等腫瘤片段、該等腫瘤片段中殘留之TIL及自該等腫瘤片段釋放且在該分離之後與其一起保留之任何TIL之第二混合物以產生該第二混合物之消化物；且其中在步驟c)中，第二次擴增係藉由在第二培養基中擴增呈該第二混合物或該混合物之消化物形式之第二TIL群體約7-14天來進行以產生治療性TIL群體。
在一些實施例中，該第一細胞培養基及/或該第二細胞培養基進一步包括IL-15及IL-21。
在一些實施例中，萬古黴素之濃度係約500-600 µg/mL。在一些實施例中，萬古黴素之濃度係約100 µg/mL。在某些實施例中，克林達黴素之濃度係約400-600 µg/mL。在例示性實施例中，建它黴素之濃度係約50 µg/mL。在一些實施例中，建它黴素之濃度係約50 µg/mL。在某些實施例中，該抗生素組分包括約50 µg/mL建它黴素及約400-600 µg/mL克林達黴素。在一些實施例中，該抗生素組分包括約50 µg/mL建它黴素及約50-600 µg/mL萬古黴素。在一些實施例中，該抗生素組分包括約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL萬古黴素。
在一些實施例中，由在該第一細胞培養基中進行第一次擴增獲得的TIL群體展現出至少90%的活細胞。
在某些實施例中，由在該第一細胞培養基中進行第一次擴增獲得的TIL群體展現出與由在不含萬古黴素及克林達黴素之對照細胞培養基中進行TIL擴增獲得的TIL群體類似之記憶性TIL群體。
在一些實施例中，由在該第一細胞培養基中進行該第一次擴增獲得的TIL群體展現出與由在不含萬古黴素及克林達黴素之對照細胞培養基中進行TIL擴增獲得的TIL群體類似之分化CD3+/CD4+、活化CD3+/CD4+及耗竭CD3+/CD4+ TIL群體。在一些實施例中，由在該第一細胞培養基中進行該第一次擴增獲得的TIL群體展現出與由在不含萬古黴素及克林達黴素之對照細胞培養基中進行TIL擴增獲得的TIL群體類似之分化CD3+/CD8+、活化CD3+/CD8+及耗竭CD3+/CD8+ TIL群體。
在某些實施例中，該第一細胞培養基包括6,000 IU/mL IL-2。
在一些實施例中，該第一細胞培養基進一步包括OKT-3及抗原呈現飼養細胞。在某些實施例中，該第一細胞培養基包括6,000 IU/mL IL-2及30 ng/mL OKT-3。在一些實施例中，第二細胞培養基包括3,000 IU/mL IL-2及30 ng/mL OKT-3。在某些實施例中，第二細胞培養基包括6,000 IU/mL IL-2及30 ng/mL OKT-3。
在一些實施例中，該樣本係提供於低溫儲存培養基中，該低溫儲存培養基包括：a)無血清、無動物組分之冷凍保存培養基；及b)抗生素組分，該抗生素組分包括：1)抗生素組合，其選自：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在某些實施例中，該第一TIL群體係自該個體之樣本獲得，其中該樣本係提供於低溫儲存培養基中，該低溫儲存培養基包括：a)無血清、無動物組分之冷凍保存培養基；及b)抗生素，該抗生素包括：1)抗生素組合，其選自：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，萬古黴素在低溫儲存培養基中之濃度係約50-600 µg/mL。在一些實施例中，萬古黴素在低溫儲存培養基中之濃度為約100 μg/mL。在一些實施例中，克林達黴素在低溫儲存培養基中之濃度為約400-600 μg/mL。在某些實施例中，建它黴素在低溫儲存培養基中之濃度為約50 μg/mL。在一些實施例中，抗生素組分包括約50 μg/mL建它黴素及約400-600 μg/mL克林達黴素。在一些實施例中，抗生素組分包括約50 μg/mL建它黴素及約50-600 μg/mL萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分包括約50 μg/mL建它黴素及約100 μg/mL萬古黴素。在某些實施例中，兩性黴素B在低溫儲存培養基中之濃度為約2.5-10 μg/mL。
在一些實施例中，低溫儲存培養基中之抗生素組分包括約50 μg/mL建它黴素、約2.5-10 μg/mL兩性黴素B及約400-600 μM克林達黴素。在某些實施例中，低溫儲存培養基中之抗生素組分包括約50 μg/mL建它黴素、約2.5-10 μg/mL兩性黴素B及約50-600 μg/mL萬古黴素。在某些實施例中，低溫儲存培養基中之抗生素組分包括約50 μg/mL建它黴素、約2.5-10 μg/mL兩性黴素B及約100 μg/mL萬古黴素。
在另一態樣中，本文提供一種根據本文所提供之方法中之任一種產生的治療性TIL群體。
在一個態樣中，本文提供一種用於將腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其包括：a)藉由將自個體獲得之腫瘤樣本消化成腫瘤消化物而獲得及/或接受來自該個體所切除之腫瘤的第一TIL群體；b) 自步驟a)中呈該腫瘤消化物形式之第一TIL群體選擇PD-l陽性TIL，以獲得富含PD-l之TIL群體；c)藉由在包括IL-2、OKT-3、第一抗生素組分及抗原呈現細胞(APC)之第一細胞培養基中培養該富含PD-l之TIL群體來進行初始第一次擴增，以產生第二TIL群體，其中該初始第一次擴增係在包括第一透氣表面區域之容器中進行，其中該初始第一次擴增係進行約1至7/8天之第一時段以獲得該第二TIL群體，其中該第二TIL群體之數目大於該第一TIL群體之數目；d)藉由在包括IL-2、OKT-3、第二抗生素組分及APC之第二培養基中培養該第二TIL群體來進行快速第二次擴增，以產生治療性TIL群體，其中在該快速第二次擴增中添加之APC的數目係在步驟b)中添加之APC之數目的至少兩倍，其中該快速第二次擴增係進行約1至11天之第二時段以獲得該治療性TIL群體，其中該快速第二次擴增係在包括第二透氣表面區域之容器中進行；e)收集自步驟d)獲得之治療性TIL群體；以及f)將自步驟e)收集之TIL群體轉移至輸注袋，其中該第一抗生素組分及該第二抗生素組分包括：1)抗生素組合，其選自：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，萬古黴素之濃度為約50-600 μg/mL。在一些實施例中，萬古黴素之濃度為約100 μg/mL。在某些實施例中，克林達黴素之濃度為約400-600 μg/mL。在一些實施例中，抗生素組分包括約50 μg/mL建它黴素及約400-600μg/mL克林達黴素。在一些實施例中，抗生素組分包括約50μg/mL建它黴素及約50-600μg/mL萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分包括約50 μg/mL建它黴素及約100 μg/mL萬古黴素。在一些實施例中，建它黴素之濃度為約50 μg/mL。在某些實施例中，第二TIL群體展示出至少90%的活細胞。
在一些實施例中，該第二TIL群體展現出與在不含萬古黴素及克林達黴素之對照第一細胞培養基中自該第一TIL群體擴增之第二TIL群體類似之記憶性TIL群體。
在一些實施例中，該第二TIL群體展現出與在不含萬古黴素及克林達黴素之對照第一細胞培養基中自該第一TIL群體擴增的第二TIL群體類似之分化CD3+/ CD4+、活化CD3+/CD4+及耗竭CD3+/CD4+ TIL群體。
在一些實施例中，該第二TIL群體展現出與在不含萬古黴素及克林達黴素之對照第一細胞培養基中自該第一TIL群體擴增的第二TIL群體類似之分化CD3+/ CD8+、活化CD3+/CD8+及耗竭CD3+/CD8+ TIL群體。
在某些實施例中，第一細胞培養基包括6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一細胞培養基包括6,000 IU/mL IL-2及30 ng/mL OKT-3。
在某些實施例中，第二細胞培養基包括6,000 IU/mL IL-2及30 ng/mL OKT-3。
在一些實施例中，步驟a)中之腫瘤樣本係提供於低溫儲存培養基中，該低溫儲存培養基包括：a)無血清、無動物組分之冷凍保存培養基；及b)抗生素組分，該抗生素組分包括：1)抗生素組合，其選自：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，萬古黴素在低溫儲存培養基中之濃度為約50-600 μg/mL。在一些實施例中，萬古黴素在低溫儲存培養基中之濃度為約100 μg/mL。在一些實施例中，克林達黴素在低溫儲存培養基中之濃度為約400-600 μg/mL。在某些實施例中，建它黴素在低溫儲存培養基中之濃度為約50 μg/mL。在某些實施例中，抗生素組分進一步包括兩性黴素B。在例示性實施例中，兩性黴素B在低溫儲存培養基中之濃度為約2.5-10 μg/mL。
在一些實施例中，低溫儲存培養基中之抗生素組分包括約50 μg/mL建它黴素、約2.5-10 μg/mL兩性黴素B及約400-600 μM克林達黴素。在某些實施例中，低溫儲存培養基中之抗生素組分包括約50 μg/mL建它黴素、約2.5-10 μg/mL兩性黴素B及約50-600 μg/mL萬古黴素。在某些實施例中，低溫儲存培養基中之抗生素組分包括約50 μg/mL建它黴素、約2.5-10 μg/mL兩性黴素B及約100 μg/mL萬古黴素。
在另一態樣中，本文提供一種根據本文所提供之方法中之任一種產生的治療性TIL群體。
在一個態樣中，本文提供一種用於擴增來自周邊血液之周邊血液淋巴球(PBL)之方法，該方法包括以下步驟：a)自患者之周邊血液獲得周邊血液單核細胞(PBMC)之樣本；b)在包括第一細胞培養基之培養物中培養該等PBMC選自由以下組成之群組的時段：約9天、約10天、約11天、約12天、約13天及約14天，由此實現來自該等PBMC之周邊血液淋巴球(PBL)之擴增，該第一細胞培養基具有IL-2、抗CD3/抗CD28抗體及第一抗生素組分；及c)自步驟b)中該培養物收集該等PBL，其中該第一抗生素組分包括：i)抗生素組合，其選自：1)建它黴素及萬古黴素，以及2)建它黴素及克林達黴素；或ii)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，患者用依魯替尼(ibrutinib)或另一種介白素-2誘導性T細胞激酶(ITK)抑制劑預治療。在某些實施例中，患者難以用依魯替尼或該另一種ITK抑制劑治療。
在一些實施例中，萬古黴素在低溫儲存培養基中之濃度為約50-600 µg/mL。在一些實施例中，萬古黴素在低溫儲存培養基中之濃度為約100 μg/mL。在一些實施例中，克林達黴素在低溫儲存培養基中之濃度為約400-600 μg/mL。在某些實施例中，建它黴素在低溫儲存培養基中之濃度為約50 μg/mL。在某些實施例中，兩性黴素B在低溫儲存培養基中之濃度為約2.5-10 μg/mL。
在一些實施例中，低溫儲存培養基中之抗生素組分包括約50 μg/mL建它黴素、約2.5-10 μg/mL兩性黴素B及約400-600 μM克林達黴素。在某些實施例中，低溫儲存培養基中之抗生素組分包括約50 μg/mL建它黴素、約2.5-10 μg/mL兩性黴素B及約50-600 μg/mL萬古黴素。在某些實施例中，低溫儲存培養基中之抗生素組分包括約50 μg/mL建它黴素、約2.5-10 μg/mL兩性黴素B及約100 μg/mL萬古黴素。
在一些實施例中，自步驟c)中之培養物收集的PBL展現出至少90%的活細胞。
在某些實施例中，自步驟c)中該培養物收集的PBL展現與在不含萬古黴素及克林達黴素之對照細胞培養基中自PBMC群體擴增之PBL群體類似的分化CD3+/CD4+、活化CD3+/CD4+及耗竭CD3+/CD4+ TIL群體。在一些實施例中，自步驟c)中該培養物收集之PBL展現與在不含萬古黴素及克林達黴素之對照細胞培養基中自PBMC群體擴增之PBL群體類似的分化CD3+/CD8+、活化CD3+/CD8+及耗竭CD3+/CD8+ TIL群體。
在某些實施例中，該第一細胞培養基包括3,000 IU/mL IL-2。
在一些實施例中，抗CD3抗體及抗CD28抗體與珠粒結合。在一些實施例中，該等珠粒與該等PBMC以3個珠粒：1個PMBC細胞之比率混合於該培養物中。
在某些實施例中，步驟(b)包括將PBMC及珠粒之混合物以約25,000個細胞/平方公分至約50,000個細胞/平方公分之密度接種於透氣表面上；在第一細胞培養基中培養約4天；將IL-2添加至第一細胞培養基中；及培養約5天至約7天以獲得擴增之PBL。
在一些實施例中，步驟a)中之PBMC係提供於低溫儲存培養基中，該低溫儲存培養基包括：a)無血清、無動物組分之冷凍保存培養基；及b)抗生素組分，該抗生素組分包括：1)抗生素組合，其選自：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在某些實施例中，萬古黴素在低溫儲存培養基中之濃度為約50-600 µg/mL。在某些實施例中，萬古黴素在低溫儲存培養基中之濃度為約100 μg/mL。在一些實施例中，克林達黴素在低溫儲存培養基中之濃度為約400-600 μg/mL。在某些實施例中，建它黴素在低溫儲存培養基中之濃度為約50 μg/mL。在一些實施例中，低溫儲存培養基進一步包括兩性黴素B。在例示性實施例中，兩性黴素B在低溫儲存培養基中之濃度為約2.5-10 μg/mL。
在某些實施例中，低溫儲存培養基中之抗生素組分包括約50 μg/mL建它黴素、約2.5-10 μg/mL兩性黴素B及約400-600 μg/mL克林達黴素。
在一些實施例中，低溫儲存培養基中之抗生素組分包括約50 μg/mL建它黴素、約2.5-10 μg/mL兩性黴素B及約50-600 μg/mL萬古黴素。在一些實施例中，低溫儲存培養基中之抗生素組分包括約50 μg/mL建它黴素、約2.5-10 μg/mL兩性黴素B及約100 μg/mL萬古黴素。
在一些實施例中，第一TIL群體之培養將樣本在腫瘤洗滌緩衝液中洗滌至少一次，該腫瘤洗滌緩衝液包含抗生素組分，該抗生素組分包括：1)抗生素組合，其選自：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，該抗生素組分包括在該洗滌緩衝液中濃度為約100-600 µg/ml之萬古黴素。在某些實施例中，該抗生素組分包括在該洗滌緩衝液中濃度為約400-600 µg/ml之克林達黴素。在一些實施例中，抗生素組分包括在該洗滌緩衝液中濃度為約100 µg/ml之萬古黴素。在例示性實施例中，抗生素組分係在該洗滌緩衝液中濃度為約100 µg/ml之萬古黴素。在例示性實施例中，該抗生素組分包括在該洗滌緩衝液中濃度為約50-600 µg/ml之萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分包括在該洗滌緩衝液中濃度為約50 µg/ml之建它黴素。.在一些實施例中，抗生素組分包括在該洗滌緩衝液中濃度為約2.5-10 µg/ml之兩性黴素B。在一些實施例中，抗生素組分包括在洗滌緩衝液中之抗生素組合，該抗生素組合包括約100 µg/ml萬古黴素及約50 µg/ml建它黴素。在一些實施例中，抗生素組分包括在洗滌緩衝液中之抗生素組合，該抗生素組合包括約50 μg/ml建它黴素、約2.5-10 μg/ml兩性黴素B及約400-600 μg/ml克林達黴素。在一些實施例中，抗生素組分包括在洗滌緩衝液中之抗生素組合，該抗生素組合包括約50 μg/ml建它黴素、約2.5-10 μg/ml兩性黴素B及約100-600 μg/ml萬古黴素。在例示性實施例中，將樣本在該洗滌緩衝液中洗滌至少三次。
在一些實施例中，第一抗生素組分與洗滌緩衝液之抗生素組分相同。在一些實施例中，第一抗生素組分與洗滌緩衝液之抗生素組分不同。在一些實施例中，第一抗生素組分與第二抗生素組分相同。在一些實施例中，第一抗生素組分與第二抗生素組分不同。在一些實施例中，第一抗生素組分與低溫儲存培養基之抗生素組分相同。在一些實施例中，第一抗生素組分與低溫儲存培養基之抗生素組分不同。
在另一態樣中，本文提供腫瘤樣本，其包括複數個腫瘤細胞及複數個腫瘤浸潤淋巴球(TIL)；及腫瘤洗滌緩衝液，其包括：i)一或多種選自鉀離子、鈉離子、鎂離子及鈣離子之電解質；ii)在生理條件下有效之pH緩衝液；及iii)抗生素組分，該抗生素組分包括：1)抗生素組合，其選自：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。在一些實施例中，腫瘤洗滌緩衝液在維持生理滲透壓方面有效。在例示性實施例中，pH緩衝液係磷酸鹽緩衝液。在一些實施例中，腫瘤洗滌緩衝液係漢克氏平衡鹽溶液(Hank's Balanced Salt Solution，HBSS)。
在某些實施例中，腫瘤洗滌緩衝液進一步包括營養有效量之至少一種單糖。在一些實施例中，該單糖係葡萄糖。
在一些實施例中，該腫瘤樣本係實體腫瘤樣本。在例示性實施例中，腫瘤樣本係以下癌症類型之一：乳癌、胰臟癌、前列腺癌、結腸直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌、皮膚癌(包含但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑素瘤)、子宮頸癌、頭頸癌、神經膠母細胞瘤、卵巢癌、肉瘤、膀胱癌及神經膠母細胞瘤。在一些實施例中，腫瘤樣本係液體腫瘤樣本。在例示性實施例中，該液體腫瘤樣本係來自血液惡性病之液體腫瘤樣本。在一些實施例中，該腫瘤樣本係自原發性腫瘤獲得。在某些實施例中，該腫瘤樣本係自侵襲性腫瘤獲得。在一些實施例中，該腫瘤樣本係自轉移性腫瘤獲得。在一些實施例中，該腫瘤樣本係自惡性黑素瘤獲得。
在某些實施例中，該抗生素組分包括濃度為約50-600 µg/ml之萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分包括濃度為約100 µg/ml之萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分包括濃度為約400-600 µg/ml之克林達黴素。在一些實施例中，抗生素組分包括濃度為約50 μg/ml之建它黴素。在一些實施例中，抗生素組分係濃度為約100 μg/ml之萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 μg/ml建它黴素及約400-600 μg/ml克林達黴素。在一些實施例中，抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 μg/ml建它黴素及約100-600 μg/ml萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/ml建它黴素及約100 µg/ml萬古黴素。
在一些實施例中，該抗生素組分進一步包括抗真菌性抗生素。在一些實施例中，該抗真菌性抗生素係兩性黴素B。在一些實施例中，該兩性黴素B之濃度係約2.5-10 µg/ml。
在另一態樣中，本文提供一種用於洗滌腫瘤樣本之組成物，該組成物包括：i)一或多種選自鉀離子、鈉離子、鎂離子及鈣離子之電解質；ii)在生理條件下有效之pH緩衝液；及iii)抗生素組分，該抗生素組分包括：1)抗生素組合，其選自：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。在一些實施例中，腫瘤洗滌緩衝液在維持生理滲透壓方面有效。在例示性實施例中，pH緩衝液係磷酸鹽緩衝液。在一些實施例中，腫瘤洗滌緩衝液係漢克氏平衡鹽溶液(HBSS)。
在某些實施例中，腫瘤洗滌緩衝液進一步包括營養有效量之至少一種單糖。在一些實施例中，該單糖係葡萄糖。
在某些實施例中，該抗生素組分包括濃度為約50-600 µg/ml之萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分包括濃度為約100μg/ml的萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分包括濃度為約400-600 μg/ml之克林達黴素。在一些實施例中，抗生素組分包括濃度為約50 μg/ml之建它黴素。在一些實施例中，抗生素組分係濃度為約100 μg/ml之萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 μg/ml建它黴素及約400-600 μg/ml克林達黴素。在一些實施例中，抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 μg/ml建它黴素及約100-600 μg/ml萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 μg/ml建它黴素及約100 μg/ml萬古黴素。
在一些實施例中，該抗生素組分進一步包括抗真菌性抗生素。在一些實施例中，該抗真菌性抗生素係兩性黴素B。在一些實施例中，該兩性黴素B之濃度係約2.5-10 µg/mL。
在另一態樣中，本文提供一種根據本文所提供之方法中之任一種產生的PBL。
序列表的簡要說明
SEQ ID NO:1係莫羅單抗(muromonab)之重鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO:2係莫羅單抗之輕鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO:3係重組人類IL-2蛋白之胺基酸序列。
SEQ ID NO:4係阿地介白素(aldesleukin)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:5係一種IL-2形式。
SEQ ID NO:6係內維介白素α(nemvaleukin alfa)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:7係一種IL-2形式。
SEQ ID NO:8係黏蛋白域多肽。
SEQ ID NO:9係重組人類IL-4蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:10係重組人類IL-7蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:11係重組人類IL-15蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:12係重組人類IL-21蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:13係IL-2序列。
SEQ ID NO:14係IL-2突變蛋白序列。
SEQ ID NO:15係IL-2突變蛋白序列。
SEQ ID NO:16係IgG.IL2R67A.H1之HCDR1_IL-2。
SEQ ID NO:17係IgG.IL2R67A.H1之HCDR2。
SEQ ID NO:18係IgG.IL2R67A.H1之HCDR3。
SEQ ID NO:19係IgG.IL2R67A.H1之HCDR1_IL-2 kabat。
SEQ ID NO:20係IgG.IL2R67A.H1之HCDR2 kabat。
SEQ ID NO:21係IgG.IL2R67A.H1之HCDR3 kabat。
SEQ ID NO:22係IgG.IL2R67A.H1之HCDR1_IL-2 clothia。
SEQ ID NO:23係IgG.IL2R67A.H1之HCDR2 clothia。
SEQ ID NO:24係IgG.IL2R67A.H1之HCDR3 clothia。
SEQ ID NO:25係IgG.IL2R67A.H1之HCDR1_IL-2 IMGT。
SEQ ID NO:26係IgG.IL2R67A.H1之HCDR2 IMGT。
SEQ ID NO:27係IgG.IL2R67A.H1之HCDR3 IMGT。
SEQ ID NO:28係IgG.IL2R67A.H1之VH鏈。
SEQ ID NO:29係IgG.IL2R67A.H1之重鏈。
SEQ ID NO:30係IgG.IL2R67A.H1之LCDR1 kabat。
SEQ ID NO:31係IgG.IL2R67A.H1之LCDR2 kabat。
SEQ ID NO:32係IgG.IL2R67A.H1之LCDR3 kabat。
SEQ ID NO:33係IgG.IL2R67A.H1之LCDR1 chothia。
SEQ ID NO:34係IgG.IL2R67A.H1之LCDR2 chothia。
SEQ ID NO:35係IgG.IL2R67A.H1之LCDR3 chothia。
SEQ ID NO:36係VL鏈。
SEQ ID NO:37係輕鏈。
SEQ ID NO:38係輕鏈。
SEQ ID NO:39係輕鏈。
SEQ ID NO:40係人類4-1BB之胺基酸序列。
SEQ ID NO:41係鼠類4-1BB之胺基酸序列。
SEQ ID NO:42係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(utomilumab)(PF-05082566)之重鏈。
SEQ ID NO:43係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈。
SEQ ID NO:44係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:45係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:46係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:47係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:48係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:49係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:50係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:51係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:52係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(urelumab)(BMS-663513)之重鏈。
SEQ ID NO:53係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈。
SEQ ID NO:54係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:55係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:56係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:57係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:58係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:59係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:60係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:61係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:62係TNFRSF促效劑融合蛋白之Fc域。
SEQ ID NO:63係TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO:64係TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO:65係TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO:66係TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO:67係TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO:68係TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO:69係TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO:70係TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO:71係TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO:72係TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO:73係TNFRSF促效劑融合蛋白之Fc域。
SEQ ID NO:74係TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO:75係TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO:76係TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子。
SEQ ID NO:77係4-1BB配體(4-1BBL)胺基酸序列。
SEQ ID NO:78係4-1BBL多肽之可溶部分。
SEQ ID NO:79係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1型式1之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:80係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1型式1之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:81係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1型式2之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:82係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1型式2之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:83係4-1BB促效劑抗體H39E3-2之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:84係4-1BB促效劑抗體H39E3-2之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:85係人類OX40之胺基酸序列。
SEQ ID NO:86係鼠類OX40之胺基酸序列。
SEQ ID NO:87係OX40促效劑單株抗體塔沃西單抗(tavolixizumab)(MEDI-0562)之重鏈。
SEQ ID NO:88係OX40促效劑單株抗體塔沃西單抗(MEDI-0562)之輕鏈。
SEQ ID NO:89係OX40促效劑單株抗體塔沃西單抗(MEDI-0562)之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:90係OX40促效劑單株抗體塔沃西單抗(MEDI-0562)之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:91係OX40促效劑單株抗體塔沃西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:92係OX40促效劑單株抗體塔沃西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:93係OX40促效劑單株抗體塔沃西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:94係OX40促效劑單株抗體塔沃西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:95係OX40促效劑單株抗體塔沃西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:96係OX40促效劑單株抗體塔沃西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:97係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈。
SEQ ID NO:98係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈。
SEQ ID NO:99係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:100係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:101係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:102係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:103係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:104係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:105係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:106係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:107係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈。
SEQ ID NO:108係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈。
SEQ ID NO:109係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:110係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:111係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:112係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:113係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:114係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:115係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:116係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:117係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:118係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:119係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:120係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:121係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:122係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:123係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:124係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:125係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:126係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:127係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:128係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:129係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:130係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:131係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:132係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:133係OX40配體(OX40L)胺基酸序列。
SEQ ID NO:134係OX40L多肽之可溶部分。
SEQ ID NO:135係OX40L多肽之替代性可溶部分。
SEQ ID NO:136係OX40促效劑單株抗體008之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:137係OX40促效劑單株抗體008之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:138係OX40促效劑單株抗體011之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:139係OX40促效劑單株抗體011之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:140係OX40促效劑單株抗體021之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:141係OX40促效劑單株抗體021之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:142係OX40促效劑單株抗體023之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:143係OX40促效劑單株抗體023之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:144係OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:145係OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:146係OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:147係OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:148係人類化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:149係人類化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:150係人類化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:151係人類化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:152係人類化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:153係人類化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:154係人類化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:155係人類化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:156係OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:157係OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:158係PD-1抑制劑納武單抗(nivolumab)之重鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO:159係PD-1抑制劑納武單抗之輕鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO:160係PD-1抑制劑納武單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列。
SEQ ID NO:161係PD-1抑制劑納武單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
SEQ ID NO:162係PD-1抑制劑納武單抗之重鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO:163係PD-1抑制劑納武單抗之重鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO:164係PD-1抑制劑納武單抗之重鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO:165係PD-1抑制劑納武單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO:166係PD-1抑制劑納武單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO:167係PD-1抑制劑納武單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO:168係PD-1抑制劑帕博利珠單抗(pembrolizumab)之重鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO:169係PD-1抑制劑帕博利珠單抗之輕鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO:170係PD-1抑制劑帕博利珠單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列。
SEQ ID NO:171係PD-1抑制劑帕博利珠單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
SEQ ID NO:172係PD-1抑制劑帕博利珠單抗之重鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO:173係PD-1抑制劑帕博利珠單抗之重鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO:174係PD-1抑制劑帕博利珠單抗之重鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO:175係PD-1抑制劑帕博利珠單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO:176係PD-1抑制劑帕博利珠單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO:177係PD-1抑制劑帕博利珠單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO:178係PD-L1抑制劑德瓦魯單抗(durvalumab)之重鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO:179係PD-L1抑制劑德瓦魯單抗之輕鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO:180係PD-L1抑制劑德瓦魯單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列。
SEQ ID NO:181係PD-L1抑制劑德瓦魯單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
SEQ ID NO:182係PD-L1抑制劑德瓦魯單抗之重鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO:183係PD-L1抑制劑德瓦魯單抗之重鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO:184係PD-L1抑制劑德瓦魯單抗之重鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO:185係PD-L1抑制劑德瓦魯單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO:186係PD-L1抑制劑德瓦魯單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO:187係PD-L1抑制劑德瓦魯單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO:188係PD-L1抑制劑阿維魯單抗(avelumab)之重鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO:189係PD-L1抑制劑阿維魯單抗之輕鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO:190係PD-L1抑制劑阿維魯單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列。
SEQ ID NO:191係PD-L1抑制劑阿維魯單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
SEQ ID NO:192係PD-L1抑制劑阿維魯單抗之重鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO:193係PD-L1抑制劑阿維魯單抗之重鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO:194係PD-L1抑制劑阿維魯單抗之重鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO:195係PD-L1抑制劑阿維魯單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO:196係PD-L1抑制劑阿維魯單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO:197係PD-L1抑制劑阿維魯單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO:198係PD-L1抑制劑阿替利珠單抗(atezolizumab)之重鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO:199係PD-L1抑制劑阿替利珠單抗之輕鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO:200係PD-L1抑制劑阿替利珠單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列。
SEQ ID NO:201係PD-L1抑制劑阿替利珠單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
SEQ ID NO:202係PD-L1抑制劑阿替利珠單抗之重鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO:203係PD-L1抑制劑阿替利珠單抗之重鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO:204係PD-L1抑制劑阿替利珠單抗之重鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO:205係PD-L1抑制劑阿替利珠單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO:206係PD-L1抑制劑阿替利珠單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO:207係PD-L1抑制劑阿替利珠單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO:208係CTLA-4抑制劑伊匹木單抗(ipilimumab)之重鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO:209係CTLA-4抑制劑伊匹木單抗之輕鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO:210係CTLA-4抑制劑伊匹木單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列。
SEQ ID NO:211係CTLA-4抑制劑伊匹木單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
SEQ ID NO:212係CTLA-4抑制劑伊匹木單抗之重鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO:213係CTLA-4抑制劑伊匹木單抗之重鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO:214係CTLA-4抑制劑伊匹木單抗之重鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO:215係CTLA-4抑制劑伊匹木單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO:216係CTLA-4抑制劑伊匹木單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO:217係CTLA-4抑制劑伊匹木單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO:218係CTLA-4抑制劑曲美單抗(tremelimumab)之重鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO:219係為CTLA-4抑制劑曲美單抗之輕鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO:220係CTLA-4抑制劑曲美單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列。
SEQ ID NO:221係CTLA-4抑制劑曲美單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
SEQ ID NO:222係CTLA-4抑制劑曲美單抗之重鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO:223係CTLA-4抑制劑曲美單抗之重鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO:224係CTLA-4抑制劑曲美單抗之重鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO:225係CTLA-4抑制劑曲美單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO:226係CTLA-4抑制劑曲美單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO:227係CTLA-4抑制劑曲美單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO:228係CTLA-4抑制劑澤弗利單抗(zalifrelimab)之重鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO:229係CTLA-4抑制劑澤弗利單抗之輕鏈胺基酸序列。
SEQ ID NO:230係CTLA-4抑制劑澤弗利單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列。
SEQ ID NO:231係CTLA-4抑制劑澤弗利單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
SEQ ID NO:232係CTLA-4抑制劑澤弗利單抗之重鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO:233係CTLA-4抑制劑澤弗利單抗之重鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO:234係CTLA-4抑制劑澤弗利單抗之重鏈CDR3胺基酸序列。
SEQ ID NO:235係CTLA-4抑制劑澤弗利單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列。
SEQ ID NO:236係CTLA-4抑制劑澤弗利單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列。
SEQ ID NO:237係CTLA-4抑制劑澤弗利單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列。 I. 引言
利用藉由快速擴增方案(REP)而離體培養之TIL的授受性細胞療法已在患有癌症之患者的宿主免疫抑制之後產生成功的授受性細胞療法。當前輸注接受參數依賴於TIL之組成的讀數(例如CD28、CD8或CD4陽性率)以及REP產物之擴增倍數及存活率。
當前REP方案幾乎不瞭解將輸注至患者體內之TIL的健康狀況。T細胞在其自初始T細胞至效應T細胞的成熟過程中經歷了深刻的代謝轉變(參見Chang等人, 《自然·免疫學( Nat.Immunol.)》 2016, 17,364特此以全文明確地併入，且尤其是關於厭氧及好氧代謝之論述及標記物)。舉例而言，初始T細胞依賴於粒線體呼吸來產生ATP，而成熟、健康的效應T細胞，諸如TIL，則為高度糖酵解的，依賴於好氧性糖酵解來提供其增殖、遷移、活化及抗腫瘤功效所需的生物能量基質。
當前的TIL製造及治療方法受到持續時間、成本、無菌性問題及本文所描述之其他因素的限制，使得治療癌症患者之潛力受到嚴重限制。迫切需要提供TIL製造方法及基於此類方法的療法，此類方法適合用於治療有極少或無可行之治療選擇方案的患者。
本文提供可用於製造TIL治療劑之腫瘤儲存組成物及細胞培養基。該等試劑允許製造高品質TIL治療劑，同時降低微生物生物負荷並在TIL製造製程中提供無菌保障。具體言之，本文所提供之腫瘤儲存組成物有利地使細菌(例如革蘭氏陰性及革蘭氏陽性細菌物種)及真菌污染減到最少，同時不會明顯影響細胞存活率。另外，在所主張之細胞培養基中培養的淋巴球能夠在具有極少細菌(例如革蘭氏陽性及革蘭氏陰性細菌)及/或真菌污染情況下進行分化、耗竭及/或活化。 II. 定義
除非另有定義，否則本文所用的所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域的技術人員通常所理解的含義相同的含義。本文所提及之所有專利及公開案均以全文引用的方式併入本文中。
如本文所使用，術語「共同投與(co-administration)」、「共同投與(co-administering)」、「與……組合投與(administered in combination with)」、「與……組合投與(administering in combination with)」、「同時」及「並行」涵蓋向個體投與兩種或多於兩種活性醫藥成分(在本發明之一些實施例中，例如複數個TIL)以使得兩種活性醫藥成分及/或其代謝物同時存在於該個體內。共同投與包含以分開的組成物形式同時投與、以分開的組成物形式在不同時間投與或以存在兩種或多於兩種活性醫藥成分之組成物形式投與。以分開的組成物形式同時投與及以存在兩種試劑之組成物形式投與係較佳的。
術語「活體內」係指在個體身體內發生之事件。
術語「活體外」係指在個體身體外發生之事件。活體外分析涵蓋採用活細胞或死細胞的基於細胞之分析，且亦可涵蓋不採用完整細胞的不含細胞之分析。
術語「離體」係指涉及對已自個體身體取出的細胞、組織及/或器官進行治療或進行程序的事件。適當地，細胞、組織及/或器官可利用手術或治療方法返回至個體內。
術語「快速擴增」意謂抗原特異性TIL之數目在一週時段內增加至少約3倍(或4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或9倍)，更佳地在一週時段內增加至少約10倍(或20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍或90倍)，或最佳在一週時段內增加至少約100倍。本文中描述多種快速擴增方案。
「腫瘤浸潤淋巴球」或「TIL」在本文中意謂最初作為白血球獲得的已離開個體血流且遷移至腫瘤中之細胞群體。TIL包括(但不限於)CD8 +細胞毒性T細胞(淋巴球)、Th1及Th17 CD4 +T細胞、自然殺手細胞、樹突狀細胞及M1巨噬細胞。TIL包括初代TIL及繼代TIL兩者。「初代TIL」係自如本文所概述之患者組織樣本獲得(有時稱為「新鮮收集」)的細胞，且「繼代TIL」係如本文所論述的經擴增或增殖之任何TIL細胞群體，包含但不限於主體TIL及經擴增之TIL(「REP TIL」)或「post-REP TIL」)以及如本文所論述之「reREP TIL」。reREP TIL可包含例如第二次擴增TIL或第二次額外擴增TIL(諸如圖8之步驟D中所描述之TIL，包含稱為reREP TIL之TIL)。該等細胞群體可包含經遺傳修飾之TIL。
TIL一般可使用細胞表面標記物以生物化學方式定義，或根據其浸潤腫瘤及實現治療之能力，以功能定義。TIL一般可藉由表現以下生物標記物中之一或多者分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。另外及替代地，TIL可根據其在重新引入患者體內後浸潤實體腫瘤之能力，以功能定義。TIL可進一步藉由效力表徵，例如，若例如干擾素(IFN)釋放量大於約50 pg/mL、大於約100 pg/mL、大於約150 pg/mL或大於約200 pg/mL，則可將TIL視為強效的。若例如干擾素(IFNγ)釋放量大於約50 pg/mL、大於約100 pg/mL、大於約150 pg/mL或大於約200 pg/mL、大於約300 pg/mL、大於約400 pg/mL、大於約500 pg/mL、大於約600 pg/mL、大於約700 pg/mL、大於約800 pg/mL、大於約900 pg/mL、大於約1000 pg/mL，則可將TIL視為強效的。
「細胞群體」(包括TIL)在本文中意思指許多共有共同特質之細胞。一般而言，群體一般數目在1×10 6至1×10 10之範圍內，且不同TIL群體包含不同數目。舉例而言，初代TIL在IL-2存在下之初始生長產生大約1×10 8個細胞之主體TIL群體。一般進行REP擴增以提供1.5×10 9至1.5×10 10個細胞群體用於輸注。
本文中「冷凍保存之TIL」意謂在約-150℃至-60℃之範圍內處理且儲存TIL，無論係初代的、主體的還是經擴增的(REP TIL)。用於冷凍保存之通用方法亦描述於本文別處，包含在實例中描述。為了清楚起見，「冷凍保存之TIL」可與可用作初代TIL來源之冷凍組織樣本區分。
本文中「解凍之冷凍保存之TIL」意謂先前經冷凍保存且隨後處理以恢復至室溫或更高溫度(包含但不限於細胞培養溫度或可向患者投與TIL之溫度)的TIL群體。
TIL一般可使用細胞表面標記物，以生物化學方式定義，或根據其浸潤腫瘤及實現治療之能力，以功能定義。TIL一般可藉由表現以下生物標記物中之一或多者分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。另外及替代地，TIL可根據其在重新引入患者體內後浸潤實體腫瘤之能力，以功能定義。
術語「冷凍保存培養基(cryopreservation media/cryopreservation medium)」係指可用於冷凍保存細胞之任何培養基。此類培養基可包含包括7%至10% DMSO之培養基。例示性培養基包含CryoStor CS10、HypoThermosol以及其組合。術語「CS10」係指獲自Stemcell Technologies或Biolife Solutions之冷凍保存培養基。CS10培養基可以商品名「CryoStor® CS10」來指代。CS10培養基係包括DMSO的無血清、無動物組分之培養基。
術語「中央記憶T細胞」係指在人類體內為CD45R0+且組成性表現CCR7 (CCR7 hi)及CD62L (CD62 hi)之T細胞子集。中央記憶T細胞之表面表型亦包含TCR、CD3、CD127(IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞之轉錄因子包含BCL-6、BCL-6B、MBD2及BMI1。中央記憶T細胞在TCR引發之後主要分泌IL-2及CD40L作為效應分子。中央記憶T細胞主要存在於血液的CD4隔室中，且在人體中按比例富集於淋巴結及扁桃體中。
術語「效應記憶T細胞」係指人類或哺乳動物T細胞之子集，如中央記憶T細胞，為CD45R0+，但已經失去對CCR7之組成性表現(CCR7 lo)且對於CD62L表現而言為異質的或低的(CD62L lo)。中央記憶T細胞的表面表型亦包含TCR、CD3、CD127(IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞之轉錄因子包含BLIMP1。效應記憶T細胞在抗原刺激之後快速分泌高含量的發炎性細胞介素，包含干擾素-γ、IL4-及IL-5。效應記憶T細胞主要存在於血液的CD8隔室中，且在人體中按比例富集於肺、肝臟及腸道中。CD8+效應記憶T細胞攜帶大量的穿孔素。
術語「密閉系統」係指對外部環境密閉之系統。適用於細胞培養方法之任何密閉系統均可用於本發明之方法。密閉系統包含例如但不限於密閉G容器。一旦將腫瘤區段添加至密閉系統中，該系統不對外部環境開放，直至TIL準備好向患者投與為止。
如本文所使用，術語「碎斷(fragmenting)」、「片段(fragment)」及「碎斷的(fragmented)」描述將腫瘤破壞之程序，包含機械碎斷方法，諸如壓碎、切片、分割及粉碎腫瘤組織，以及任何其他用於破壞腫瘤組織之物理結構的方法。
術語「周邊血液單核細胞」及「PBMC」係指具有圓形細胞核之周邊血液細胞，包含淋巴球(T細胞、B細胞、NK細胞)及單核球。當用作抗原呈現細胞(PBMC為一種類型之抗原呈現細胞)時，周邊血液單核細胞較佳地係經照射之同種異體周邊血液單核細胞。
術語「周邊血液淋巴球」及「PBL」係指自周邊血液擴增的T細胞。在一些實施例中，PBL係與來自供體之全血或血球分離術產物分離。在一些實施例中，PBL係藉由正向或負向選擇T細胞表型(諸如CD3+ CD45+之T細胞表型)而與來自供體之全血或血球分離術產物分離。
術語「抗CD3抗體」係指針對成熟T細胞之T細胞抗原受體中之CD3受體的抗體或其變體，例如單株抗體，且包含人類、人類化、嵌合、鼠類或哺乳動物抗體。抗CD3抗體包含OKT-3，又稱為莫羅單抗(muromonab)。抗CD3抗體亦包含UHCT1選殖株，又稱為T3及CD3ε。其他抗CD3抗體包含例如奧昔珠單抗(otelixizumab)、替利珠單抗(teplizuma)及維西珠單抗(visilizumab)。
術語「OKT-3」(在本文中又稱作「OKT3」)係指針對成熟T細胞之T細胞抗原受體中之CD3受體的單株抗體或其生物類似物或變體，包含人類、人類化、嵌合或鼠類抗體，且包含市售形式，諸如OKT-3(30 ng/mL，MACS GMP CD3純，美國加利福尼亞州聖地亞哥(San Diego, CA, USA)之Miltenyi Biotech,Inc.)，及莫羅單抗或其變體、保守胺基酸取代、糖化形式或生物類似物。莫羅單抗之重鏈及輕鏈之胺基酸序列在表1中給出(SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2)。能夠產生OKT-3之融合瘤寄存於美國菌種保藏中心(美國菌種保藏中心)且所指定之ATCC寄存號為CRL 8001。能夠產生OKT-3之融合瘤亦寄存於歐洲認證細胞培養物保藏中心(European Collection of Authenticated Cell Cultures；ECACC)且所指派之目錄號為86022706。
Figure 02_image001
術語「IL-2」(在本文中亦稱為「IL2」)係指稱為介白素-2之T細胞生長因子，且包含所有形式之IL-2，包含人類及哺乳動物形式、保守胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及其變體。IL-2係描述於例如Nelson, 《免疫學雜誌( J . Immunol.)》 2004, 172,3983-88；及Malek, 《免疫學年度評論( Annu. Rev. Immunol.)》 2008, 26,453-79，其揭示內容以引用之方式併入本文中。適用於本發明之重組人類IL-2之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO:3)。舉例而言，術語IL-2涵蓋人類重組形式之IL-2，諸如阿地介白素(PROLEUKIN，可購自多個供應商，每個單次使用小瓶含2200萬IU)以及由美國新罕布什爾州次茅斯的CellGenix, Inc.或美國新澤西州東不倫瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目錄號CYT-209-b)供應的重組IL-2形式及來自其他供應商的其他商業等效物。阿地介白素(去丙胺醯基-1,絲胺酸-125人類IL-2)係分子量為約15 kDa的非糖基化人類重組形式之IL-2。適用於本發明之阿地介白素之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO:4)。術語IL-2亦涵蓋如本文所描述之聚乙二醇化形式的IL-2，包括聚乙二醇化IL2前藥貝培阿地介白素(bempegaldesleukin) (NKTR-214，如同SEQ ID NO:4之聚乙二醇化人類重組IL-2，其中平均6個離胺酸殘基係經[(2,7-雙{[甲基聚(氧乙烯)]胺基甲醯基}-9H-茀-9-基)甲氧基]羰基取代的N 6)，其可購自美國加利福尼亞州南舊金山的Nektar Therapeutics，或可藉由本領域中已知之方法製備，諸如國際專利申請公開案第WO 2018/132496 A1號之實例19中描述之方法或美國專利申請公開案第US 2019/0275133 A1號之實例1中描述之方法，該等公開案之揭示內容以引用之方式併入本文中。適用於本發明之貝培阿地白介素(Bempegaldesleukin)(NKTR-214)及其他聚乙二醇化IL2分子描述於美國專利申請公開案第US 2014/0328791 A1號及國際專利申請公開案第WO 2012/065086 A1號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。適用於本發明的替代形式之經結合IL-2描述於美國專利第4,766,106號、第5,206,344號、第5,089,261號及第4,902,502號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。適用於本發明之IL-2調配物描述於美國專利第6,706,289號中，其揭示內容以引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為可購自Synthorx,Inc.之THOR-707。THOR-707及適用於本發明之另外替代形式之IL-2的製備及特性描述於美國專利申請公開案第US 2020/0181220 A1號及第US 2020/ 0330601 A1號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為介白素2(IL-2)結合物，其包括：經分離及純化之IL-2多肽；及在選自以下之胺基酸位置結合至經分離及純化之IL-2多肽的結合部分：K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72及Y107，其中胺基酸殘基之編號對應於SEQ ID NO:5。在一些實施例中，胺基酸位置選自T37、R38、T41、F42、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72及Y107。在一些實施例中，胺基酸位置選自T37、R38、T41、F42、F44、Y45、E61、E62、E68、P65、V69、L72及Y107。在一些實施例中，胺基酸位置選自T37、T41、F42、F44、Y45、P65、V69、L72及Y107。在一些實施例中，胺基酸位置選自R38及K64。在一些實施例中，胺基酸位置選自E61、E62及E68。在一些實施例中，胺基酸位置在E62。在一些實施例中，選自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72及Y107之胺基酸殘基進一步突變成離胺酸、半胱胺酸或組胺酸。在一些實施例中，胺基酸殘基突變成半胱胺酸。在一些實施例中，胺基酸殘基突變成離胺酸。在一些實施例中，選自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72及Y107之胺基酸殘基進一步突變成非天然胺基酸。在一些實施例中，非天然胺基酸包括N6-疊氮基乙氧基-L-離胺酸(AzK)、N6-炔丙基乙氧基-L-離胺酸(PraK)、BCN-L-離胺酸、降冰片烯離胺酸、TCO-離胺酸、甲基四
Figure 02_image003
離胺酸、烯丙氧基羰基離胺酸、2-胺基-8-側氧基壬酸、2-胺基-8-側氧基辛酸、對乙醯基-L-苯丙胺酸、對疊氮基甲基-L-苯丙胺酸(pAMF)、對碘-L-苯丙胺酸、間乙醯基苯丙胺酸、2-胺基-8-側氧基壬酸、對炔丙基氧基苯丙胺酸、對炔丙基-苯丙胺酸、3-甲基-苯丙胺酸、L-多巴(L-Dopa)、氟化苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、對疊氮基-L-苯丙胺酸、對醯基-L-苯丙胺酸、對苯甲醯基-L-苯丙胺酸、對溴苯丙胺酸、對胺基-L-苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、O-烯丙基酪胺酸、O-甲基-L-酪胺酸、O-4-烯丙基-L-酪胺酸、4-丙基-L-酪胺酸、膦醯基酪胺酸、三-O-乙醯基-GlcNAcp-絲胺酸、L-磷酸絲胺酸、膦醯基絲胺酸、L-3-(2-萘基)丙胺酸、2-胺基-3-((2-((3-(苯甲氧基)-3-側氧基丙基)胺基)乙基)硒烷基)丙酸、2-胺基-3-(苯基硒烷基)丙酸或硒代半胱胺酸。在一些實施例中，相對於野生型IL-2多肽，IL-2結合物與IL-2受體α(IL-2Rα)次單元之親和力降低。在一些實施例中，相對於野生型IL-2多肽，降低之親和力係與IL-2Rα之結合親和力降低約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或大於99%。在一些實施例中，相對於野生型IL-2多肽，降低之親和力係約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、30倍、50倍、100倍、200倍、300倍、500倍、1000倍或更大。在一些實施例中，結合部分削弱或阻斷IL-2與IL-2Rα之結合。在一些實施例中，結合部分包括水溶性聚合物。在一些實施例中，額外結合部分包括水溶性聚合物。在一些實施例中，水溶性聚合物各自獨立地包括聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇及丙二醇之共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯啶酮)、聚(羥烷基甲基丙烯醯胺)、聚(羥烷基甲基丙烯酸酯)、聚(醣)、聚(α-羥基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷氮烯、聚
Figure 02_image005
唑啉(POZ)、聚(N-丙烯醯基
Figure 02_image007
啉)或其組合。在一些實施例中，水溶性聚合物各自獨立地包括PEG。在一些實施例中，PEG係線性PEG或分支鏈PEG。在一些實施例中，水溶性聚合物各自獨立地包括多醣。在一些實施例中，多醣包括聚葡萄糖、聚唾液酸(PSA)、玻尿酸(HA)、直鏈澱粉、肝素、硫酸乙醯肝素(HS)、糊精或羥乙基澱粉(HES)。在一些實施例中，水溶性聚合物各自獨立地包括聚醣。在一些實施例中，水溶性聚合物各自獨立地包括多元胺。在一些實施例中，結合部分包括蛋白質。在一些實施例中，額外結合部分包括蛋白質。在一些實施例中，蛋白質各自獨立地包括白蛋白、轉鐵蛋白(transferrin)或運甲狀腺素蛋白(transthyretin)。在一些實施例中，蛋白質各自獨立地包括Fc部分。在一些實施例中，蛋白質各自獨立地包括IgG之Fc部分。在一些實施例中，結合部分包括多肽。在一些實施例中，額外結合部分包括多肽。在一些實施例中，多肽各自獨立地包括XTEN肽、富甘胺酸高胺基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、彈性蛋白樣多肽(ELP)、CTP肽或明膠樣蛋白質(GLK)聚合物。在一些實施例中，經分離及純化之IL-2多肽藉由麩胺醯化修飾。在一些實施例中，結合部分直接結合至經分離及純化之IL-2多肽。在一些實施例中，結合部分經由連接子間接結合至經分離及純化之IL-2多肽。在一些實施例中，連接子包括同型雙官能連接子。在一些實施例中，同型雙官能連接子包括羅曼特氏試劑(Lomant's reagent)二硫代雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)DSP、3′3′-二硫代雙(丙酸磺基琥珀醯亞胺酯)(DTSSP)、辛二酸二琥珀醯亞胺酯(DSS)、辛二酸雙(磺基琥珀醯亞胺酯)(BS)、酒石酸二琥珀醯亞胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀醯亞胺酯(磺基DST)、糖基雙(琥珀醯亞胺基丁二酸)伸乙酯(EGS)、戊二酸二琥珀醯亞胺酯(DSG)、碳酸N,N′-二琥珀醯亞胺酯(DSC)、二亞胺代二酸二甲酯(DMA)、庚二亞胺酸二甲酯(DMP)、辛二亞胺酸二甲酯(DMS)、二甲基-3,3′-二硫代雙丙醯亞胺酸酯(DTBP)、1,4-二(3′-(2′-吡啶基二硫基)丙醯胺基)丁烷(DPDPB)、雙順丁烯二醯亞胺基己烷(BMH)、含有芳基鹵化物之化合物(DFDNB)(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯)、4,4′-二氟-3,3′-二硝基苯基碸(DFDNPS)、雙-[β-(4-疊氮基柳基醯胺基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二縮水甘油醚、己二酸二醯肼、碳醯肼、鄰甲苯胺、3,3′-二甲基聯苯胺、聯苯胺、α,α′-對二胺基聯苯、二碘-對二甲苯磺酸、N,N′-伸乙基-雙(碘乙醯胺)或N,N′-六亞甲基-雙(碘乙醯胺)。在一些實施例中，連接子包括異型雙官能連接子。在一些實施例中，異型雙官能連接子包括3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(sPDP)、長鏈3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(LC-sPDP)、水溶性長鏈3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(磺基-LC-sPDP)、琥珀醯亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯(sMPT)、磺基琥珀醯亞胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯醯胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(sMCC)、磺基琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBs)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-MBs)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯(sIAB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-sIAB)、琥珀醯亞胺基-4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基琥珀醯亞胺基-4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基)琥珀醯亞胺酯(GMBs)、N-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基)磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-GMBs)、6-((碘乙醯基)胺基)己酸琥珀醯亞胺酯(sIAX)、6-[6-(((碘乙醯基)胺基)己醯基)胺基]己酸琥珀醯亞胺酯(sIAXX)、4-(((碘乙醯基)胺基)甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(sIAC)、6-(((((4-碘乙醯基)胺基)甲基)環己烷-1-羰基)胺基)己酸琥珀醯亞胺酯(sIACX)、碘乙酸對硝苯酯(NPIA)、羰基反應性及硫氫基反應性交聯劑，諸如4-(4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸醯肼(MPBH)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧基-醯肼-8(M2C2H)、3-(2-吡啶基二硫基)丙醯基醯肼(PDPH)、N-羥基琥珀醯亞胺基-4-迭氮柳酸(NHs-AsA)、N-羥基磺基琥珀醯亞胺基-4-迭氮水楊酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀醯亞胺基-(4-迭氮柳基醯胺基己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀醯亞胺基-2-(對迭氮柳基醯胺基)乙基-1,3′-二硫丙酸酯(sAsD)、N-羥基琥珀醯亞胺基-4-迭氮苯甲酸酯(HsAB)、N-羥基磺基琥珀醯亞胺基-4-迭氮苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀醯亞胺基-6-(4′-疊氮基-2′-硝基苯基胺基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀醯亞胺基-6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-疊氮基-2-硝基苯甲醯氧基丁二醯亞胺(ANB-NOs)、磺基琥珀醯亞胺基-2-(間疊氮基-鄰硝基苯甲醯胺基)-乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAND)、N-琥珀醯亞胺基-4(4-迭氮苯基)1,3'-二硫丙酸酯(sADP)、(4-迭氮苯基)-1,3'-二硫丙酸N-磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-sADP)、4-(對迭氮苯基)丁酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-sAPB)、2-(7-疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙醯胺)乙基-1,3'-二硫丙酸磺基琥珀醯亞胺酯(sAED)、7-疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-sAMCA)、重氮丙酮酸對硝苯酯(ρNPDP)、對硝苯基-2-重氮-3,3,3-三氟丙酸酯(PNP-DTP)、1-(對疊氮基柳基醯胺基)-4-(碘乙醯胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(對疊氮基柳基醯胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫基)丙醯胺(APDP)、二苯甲酮-4-碘乙醯胺、對疊氮基苯甲醯基醯肼(ABH)、4-(對疊氮基柳基醯胺基)丁胺(AsBA)或對迭氮苯基乙二醛(APG)。在一些實施例中，連接子包括可裂解連接子，視情況包括二肽連接子。在一些實施例中，二肽連接子包括Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala或Val-Lys。在一些實施例中，連接子包括不可裂解連接子。在一些實施例中，連接子包括順丁烯二醯亞胺基，視情況包括順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)、琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(sMCC)或磺基琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)。在一些實施例中，連接子進一步包括間隔子。在一些實施例中，間隔子包括對胺基苯甲基醇(PAB)、對胺基苯甲氧基羰基(PABC)、其衍生物或類似物。在一些實施例中，結合部分能夠延長IL-2結合物之血清半衰期。在一些實施例中，額外結合部分能夠延長IL-2結合物之血清半衰期。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為本文所描述之任一種IL-2形式的片段。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式係如美國專利申請公開案US 2020/0181220 A1號及美國專利申請公開案US 2020/0330601 A1號中所揭示般聚乙二醇化。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為IL-2結合物，其包括：IL-2多肽，其包括N6-疊氮基乙氧基-離胺酸(AzK)，其共價連接於包括聚乙二醇(PEG)之結合部分，其中：IL-2多肽包括與SEQ ID NO:5具有至少80%序列一致性之胺基酸序列；及參照SEQ ID NO:5中的胺基酸位置對於位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72處的胺基酸的AzK取代物。在一些實施例中，IL-2多肽包括相對於SEQ ID NO:5的一個殘基之N端缺失。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式缺乏IL-2R α鏈接合，但保持與中間親和力IL-2R β-γ信號傳導複合物的正常結合。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為IL-2結合物，其包括：IL-2多肽，其包括N6-疊氮基乙氧基-離胺酸(AzK)，其共價連接至包括聚乙二醇(PEG)之結合部分，其中：IL-2多肽包括與SEQ ID NO:5具有至少90%序列一致性之胺基酸序列；及參照SEQ ID NO:5中的胺基酸位置對於位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72處之胺基酸的AzK取代物。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為IL-2結合物，其包括：IL-2多肽，其包括N6-疊氮基乙氧基-離胺酸(AzK)，其共價連接於包括聚乙二醇(PEG)之結合部分，其中：IL-2多肽包括與SEQ ID NO:5具有至少95%序列一致性之胺基酸序列；及參照SEQ ID NO:5中的胺基酸位置對於位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72處的胺基酸的AzK取代物。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為IL-2結合物，其包括：IL-2多肽，其包括N6-疊氮基乙氧基-離胺酸(AzK)，其共價連接於包括聚乙二醇(PEG)之結合部分，其中：IL-2多肽包括與SEQ ID NO:5具有至少98%序列一致性之胺基酸序列；及參照SEQ ID NO:570中的胺基酸位置對於位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72處的胺基酸的AzK取代物。
在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式之內維介白素α(亦稱為ALKS-4230(SEQ ID NO:571)，其購自阿爾凱默斯公司(Alkermes, Inc.))。內維介白素α亦被稱為人類介白素2片段(1-59)變體(Cys 125＞Ser 51)，其經由肽基連接子( 60GG 61)融合至人類介白素2片段(62-132)，經由肽基連接子( 133GSGGGS 138)融合至人類介白素2受體α鏈片段(139-303)，在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生，經糖基化；人類介白素2(IL-2)(75-133)-肽[Cys 125(51)＞Ser]-突變體(1-59)，其經由G 2肽連接子(60-61)融合至人類介白素2(IL-2)(4-74)-肽(62-132)且經由GSG 3S肽連接子(133-138)融合至人類介白素2受體α鏈(IL2R次單位α、IL2Rα、IL2RA)(1-165)-肽(139-303)，在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生，糖化形式α。內維介白素α之胺基酸序列係SEQ ID NO:571中所載。在一些實施例中，內維介白素α展現以下轉譯後修飾：在以下位置處之雙硫鍵：31-116、141-285、184-242、269-301、166-197或166-199、168-199或168-197(使用SEQ ID NO: 571中之編號)，及使用SEQ ID NO: 571中之編號在位置N187、N206、T212處之糖基化位點。內維介白素α以及適用於本發明之另外替代形式的IL-2之製備及特性描述於美國專利申請公開案第US 2021/ 0038684 A1號及美國專利第10,183,979號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為與SEQ ID NO: 571具有至少80%、至少90%、至少95%或至少90%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式具有SEQ ID NO: 571中所載之胺基酸序列或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為包括SEQ ID NO:572之胺基酸24-452或其變體、片段或衍生物的融合蛋白。在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為包括與SEQ ID NO: 572之胺基酸24-452或其變體、片段或衍生物具有至少80%、至少90%、至少95%或至少90%序列一致性之胺基酸序列的融合蛋白。適合用於本發明之其他IL-2形式描述於美國專利第10,183,979號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。視情況，在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式為包括第一融合搭配物之融合蛋白，該第一融合搭配物藉由黏蛋白域多肽連接子與第二融合搭配物連接，其中該第一融合搭配物為IL-1Rα或與IL-1Rα具有至少98%胺基酸序列一致性並且具有IL-Rα的受體拮抗劑活性的蛋白質，並且其中該第二融合搭配物包括全部或部分包括Fc區的免疫球蛋白，其中該黏蛋白域多肽連接子包括SEQ ID NO:573或與SEQ ID NO:573具有至少90%序列一致性的胺基酸序列，並且其中融合蛋白的半衰期與第一融合搭配物在沒有黏蛋白域多肽連接子的情況下與第二融合搭配物的融合相比有所改良。
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在一些實施例中，適用於本發明之IL-2形式包含抗體細胞介素移植蛋白，該抗體細胞介素移植蛋白包括：重鏈可變區(V H)，其包括互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3；輕鏈可變區(V L)，其包括LCDR1、LCDR2、LCDR3；及IL-2分子或其片段，其移植至V H或V L之CDR中，其中該抗體細胞介素移植蛋白優先於調節性T細胞擴增T效應細胞。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括重鏈可變區(V H)，其包括互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3；輕鏈可變區(V L)，其包括LCDR1、LCDR2、LCDR3；及IL-2分子或其片段，其移植至V H或V L之CDR中，其中該IL-2分子為突變蛋白，並且其中該抗體細胞介素移植蛋白優先於調節性T細胞擴增T效應細胞。在一些實施例中，IL-2方案包括投與美國專利申請公開案第US 2020/0270334 A1號中所描述之抗體，該公開案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括：重鏈可變區(VH)，其包括互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3；輕鏈可變區(VL)，其包括LCDR1、LCDR2、LCDR3；及IL-2分子或其片段，其移植至V H或V L之CDR中；其中該IL-2分子係突變蛋白(mutein)，其中相對於調節性T細胞，該抗體細胞介素移植蛋白優先擴增T效應細胞，且其中該抗體進一步包括IgG類重鏈及IgG類輕鏈，其選自由以下組成之群組：包括SEQ ID NO: 39之IgG類輕鏈及包括SEQ ID NO: 38之IgG類重鏈；包括SEQ ID NO: 37之IgG類輕鏈及包括SEQ ID NO:29之IgG類重鏈；包括SEQ ID NO: 39之IgG類輕鏈及包括SEQ ID NO: 29之IgG類重鏈；以及包括SEQ ID NO: 37之IgG類輕鏈及包括SEQ ID NO: 38之IgG類重鏈。
在一些實施例中，IL-2分子或其片段移植至V H之HCDR1中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，IL-2分子或其片段移植至V H之HCDR2中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，IL-2分子或其片段移植至V H之HCDR3中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，IL-2分子或其片段移植至V L之LCDR1中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，IL-2分子或其片段移植至V L之LCDR2中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，IL-2分子或其片段移植至V L之LCDR3中，其中IL-2分子為突變蛋白。
IL-2分子之插入可在CDR之N端區處或附近，在CDR之中間區中，或在CDR之C端區處或附近。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白質包括併入CDR中之IL-2分子，其中IL2序列不會將CDR序列框移。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括併入CDR中之IL-2分子，其中IL-2序列置換CDR序列之全部或一部分。IL-2分子置換可在CDR之N端區處，在CDR之中間區中，或在CDR之C端區處或附近。IL-2分子置換可少至CDR序列或整個CDR序列之一或兩個胺基酸。
在一些實施例中，IL-2分子直接移植至無肽連接子之CDR中，其中在CDR序列與IL-2序列之間沒有額外胺基酸。在一些實施例中，IL-2分子間接移植至具有肽連接子之CDR中，其中CDR序列與IL-2序列之間存在一或多個額外胺基酸。
在一些實施例中，本文所描述之IL-2分子為IL-2突變蛋白。在一些情況下，IL-2突變蛋白包括R67A取代。在一些實施例中，IL-2突變蛋白包括胺基酸序列SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15。在一些實施例中，IL-2突變蛋白包括美國專利申請公開案第US 2020/0270334 A1號中表1中的胺基酸序列，該公開案之揭示內容以引用之方式併入本文。
在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括選自由SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 22及SEQ ID NO: 25組成之群組的HCDR1。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白質包括選自由SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 543及SEQ ID NO: 16組成之群組的HCDR1。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括HCDR1，其選自由以下組成之群組：選自由SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23及SEQ ID NO: 26組成之群組的HCDR2。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括選自由SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 24及SEQ ID NO: 27組成之群組的HCDR3。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括V H區，其包括SEQ ID NO:28之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括重鏈，其包括SEQ ID NO: 29之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括V L區，其包括SEQ ID NO: 36之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括輕鏈，其包括SEQ ID NO: 37之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括V H區，其包括SEQ ID NO: 28之胺基酸序列；及V L區，其包括SEQ ID NO: 36之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括重鏈區，其包括SEQ ID NO: 29之胺基酸序列；及輕鏈區，其包括SEQ ID NO: 37之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括重鏈區，其包括SEQ ID NO: 29之胺基酸序列；及輕鏈區，其包括SEQ ID NO: 39之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括重鏈區，其包括SEQ ID NO: 38之胺基酸序列；及輕鏈區，其包括SEQ ID NO: 37之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括重鏈區，其包括SEQ ID NO: 38之胺基酸序列；及輕鏈區，其包括SEQ ID NO: 39之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括美國專利申請公開案第2020/0270334 A1號之IgG.IL2F71A.H1或IgG.IL2R67A.H1或其變體、衍生物或片段，或其保守胺基酸取代，或與其具有至少80%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性的蛋白質。在一些實施例中，本文所描述之抗體細胞介素移植蛋白之抗體組分包括帕利珠單抗之免疫球蛋白序列、構架序列或CDR序列。在一些實施例中，本文所描述之抗體細胞介素移植蛋白的血清半衰期比野生型IL-2分子(諸如但不限於阿地介白素或可比分子)長。在一些實施例中，本文所描述之抗體細胞介素移植蛋白具有如表3中所列的序列。
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術語「IL-4」(在本文中亦稱為「IL4」)係指被稱為介白素4之細胞介素，其由Th2 T細胞及嗜酸性球、嗜鹼性球及肥大細胞產生。IL-4調節初始輔助T細胞(Th0細胞)分化成Th2 T細胞。Steinke及Borish，《呼吸研究( Respir. Res.)》 2001, 2,66-70。在由IL-4活化後，Th2 T細胞隨後以正回饋迴路產生另外IL-4。IL-4亦刺激B細胞增殖及II類MHC表現，且誘導來自B細胞之類別轉換至IgE及IgG1表現。適用於本發明之重組人類IL-4可購自多個供應商，包含美國新澤西州東不倫瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目錄號CYT-211)及美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆的ThermoFisher Scientific，Inc.(人類IL-15重組蛋白，目錄號Gibco CTP0043)。適用於本發明之重組人類IL-4之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO:5)。
術「IL-7」(在本文中亦稱為「IL7」)係指稱為介白素7的經糖基化之組織源性細胞介素，其可獲自基質及上皮細胞以及樹突狀細胞。Fry及Mackall ,《血液( Blood)》 2002 ， 99 ，3892-904。IL-7可以刺激T細胞的發育。IL-7與IL-7受體(一種由IL-7受體α及共同γ鏈受體組成之異二聚體)結合，其屬於對於T細胞在胸腺內之發育及在周邊內之存活而言重要之一系列信號。適用於本發明之重組人類IL-7可購自多個供應商，包含美國新澤西州東不倫瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目錄號CYT-254)及美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆的ThermoFisher Scientific, Inc.(人類IL-15重組蛋白，目錄號Gibco PHC0071)。適用於本發明之重組人類IL-7之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO:6)。
術語「IL-15」(在本文中亦稱為「IL15」)係指稱為介白素-15之T細胞生長因子，且包含所有形式之IL-2，包含人類及哺乳動物形式、保守胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及其變體。IL-15描述於例如Fehniger及Caligiuri的《血液》 2001, 97, 14-32中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。IL-15與IL-2共用β及γ信號傳導受體次單元。重組人類IL-15為 分子質量為12.8 kDa的含有114個胺基酸(及N端甲硫胺酸)的單一非糖基化多肽鏈。重組人類IL-15可購自多個供應商，包含美國新澤西州東不倫瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目錄號CYT-230-b)及美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆的ThermoFisher Scientific, Inc.(人類IL-15重組蛋白，目錄號34-8159-82)。適用於本發明之重組人類IL-15之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO:7)。
術語「IL-21」(在本文中亦稱為「IL21」)係指稱為介白素-21之多效性細胞介素蛋白，且包含所有形式之IL-21，包含人類及哺乳動物形式、保守胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及其變體。IL-21描述於例如Spolski及Leonard，《自然綜述：藥物發現( Nat. Rev. Drug.Disc.)》 2014, 13,379-95，其揭示內容以引用之方式併入本文中。IL-21主要藉由自然殺手T細胞及經活化之人類CD4 +T細胞產生。重組人類IL-21係分子質量為15.4 kDa的含有132個胺基酸之單一非糖基化多肽鏈。重組人類IL-21可購自多個供應商，包含美國新澤西州東不倫瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目錄號CYT-408-b)及美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆的ThermoFisher Scientific, Inc.(人類IL-21重組蛋白，目錄號14-8219-80)。適用於本發明之重組人類IL-21之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO: 8)。
當指示「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，本發明組成物待投與的精確量可由醫師考慮患者(個體)之年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移程度及病狀的個別差異來確定。一般可說明本文所描述的包括腫瘤浸潤淋巴球(例如繼代TIL或經遺傳修飾之細胞毒性淋巴球)之醫藥組成物可以10 4至10 11個細胞/公斤體重(例如10 5至10 6、10 5至10 10、10 5至10 11、10 6至10 10、10 6至10 11、10 7至10 11、10 7至10 10、10 8至10 11、10 8至10 10、10 9至10 11或10 9至10 10個細胞/公斤體重)的劑量投與，包含在該等範圍內之所有整數值。腫瘤浸潤淋巴球(在一些情況下包含經遺傳修飾之細胞毒性淋巴球)組成物亦可以此等劑量多次投與。腫瘤浸潤淋巴球(在一些情況下包含經基因)可藉由使用免疫療法中通常已知之輸注技術投與(參見例如Rosenberg等人，《新英格蘭醫學雜誌( New Eng. J. of Med.)》319: 1676, 1988)。特定患者之最佳劑量及治療方案可容易由所屬醫藥領域的技術人員藉由監測患者之疾病病徵且相應地調整治療來確定。
術語「血液惡性病(hematological malignancy/hematologic malignancy)」或有相關意義之術語係指哺乳動物造血及淋巴組織(包含但不限於血液、骨髓、淋巴結及淋巴系統之組織)的癌症及腫瘤。血液惡性病亦稱為「液體腫瘤」。血液惡性病包含但不限於急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴球性淋巴瘤(CLL)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性單核球性白血病(AMoL)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤。術語「B細胞血液惡性病」係指影響B細胞之血液惡性病。
術語「液體腫瘤」係指流體性異常細胞團塊。液體腫瘤癌症包含但不限於白血病、骨髓瘤及淋巴瘤，以及其他血液惡性病。獲自液體腫瘤之TIL在本文中亦可稱為骨髓浸潤淋巴球(MIL)。獲自液體腫瘤(包含在周邊血液中循環之液體腫瘤)之TIL在本文中亦可稱為PBL。術語MIL、TIL及PBL在本文中可互換使用且僅基於衍生細胞之組織類型而有所不同。
如本文所使用，術語「微環境」可指作為整體之實體或血液腫瘤微環境或可指在微環境內之個別細胞子集。如本文所使用，腫瘤微環境係指以下之複雜混合物：「促進贅生性轉化、支援腫瘤生長及侵襲、保護腫瘤不受宿主免疫力影響、鼓勵治療抗性且提供顯性轉移茁壯成長之生態棲位(niche)之細胞、可溶因子、信號傳導分子、細胞外基質及機械信號」，如Swartz等人，《癌症研究( Cancer Res.)》, 2012, 72, 2473中所描述。儘管腫瘤表現應由T細胞識別之抗原，但由於微環境之免疫抑制，免疫系統清除腫瘤的情況係罕見的。
在一些實施例中，本發明包含一種用TIL群體治療癌症之方法，其中患者在輸注根據本發明之TIL之前經非骨髓清除式化療預治療。在一些實施例中，可提供TIL群體，其中患者在輸注根據本發明之TIL之前經非骨髓清除式化療預治療。在一些實施例中，非骨髓清除式化療為環磷醯胺60 mg/kg/d持續2天(在TIL輸注前第27天及第26天)及氟達拉濱(fludarabine)25 mg/m2/d持續5天(在TIL輸注前第27天至第23天)。在一些實施例中，非骨髓清除式化療為環磷醯胺60 mg/kg/d持續2天(在TIL輸注前第27天及第26天)及氟達拉濱25 mg/m2/d持續3天(在TIL輸注前第27至25天)。在一些實施例中，非骨髓清除式化療為環磷醯胺60 mg/kg/d持續2天(在TIL輸注前第27天及第26天)，隨後氟達拉濱25 mg/m2/d持續3天(在TIL輸注前第25天至第23天)。在一些實施例中，非骨髓清除式化療為環磷醯胺60 mg/kg/d持續2天(在TIL輸注前第27天及第26天)及氟達拉濱25 mg/m2/d持續3天(在TIL輸注前第27天至第25天)。在一些實施例中，非骨髓清除式化療為環磷醯胺60 mg/kg/d持續2天(在TIL輸注前第27天及第26天)，隨後氟達拉濱25 mg/m2/d持續3天(在TIL輸注前第25天至第23天)。在一些實施例中，在根據本發明之非骨髓清除式化療及TIL輸注之後(第0天)，患者每8小時以720,000 IU/kg靜脈內接受IL-2的靜脈內輸注以達到生理耐受。
實驗發現表明，在過繼性轉移腫瘤特異性T淋巴球之前，淋巴球耗盡藉由消除調節性T細胞且競爭免疫系統之元件(「細胞介素庫」)在增強治療功效方面發揮關鍵作用。因此，本發明之一些實施例在引入本發明之rTIL之前在患者身上採用淋巴球耗盡步驟(有時亦稱為「免疫抑制性調節」)。
術語「有效量」或「治療有效量」係指如本文所描述之化合物或化合物組合之量，其足以實現所預期應用，包含但不限於疾病治療。治療有效量可視預期應用(活體外或活體內)或所治療之個體及疾病病狀(例如，個體之體重、年齡及性別)、疾病病狀之嚴重程度或投給、予方式而變化。該術語亦適用於將誘發目標細胞中之特定反應(例如血小板黏附及/或細胞遷移減少)之劑量。特定劑量將視以下而變化：所選特定化合物、所依循之給藥方案、化合物是否與其他化合物組合投與、投與時序、其所投與之組織及其中攜帶化合物之物理遞送系統。
術語「治療(treatment/treating/treat)」及其類似術語係指獲得所要的藥理學及/或生理學效應。該效應就完全或部分預防疾病或其症狀而言可具預防性，及/或就部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之不良影響而言可具治療性。如本文所使用，「治療」涵蓋哺乳動物、尤其是人類之疾病之任何治療，且包含：(a)預防可能易患疾病但尚未診斷出患有該疾病之個體中出現該疾病；(b)抑制疾病，亦即停滯其發展或進展；及(c)緩解疾病，亦即使疾病消退及/或緩解一或多種疾病症狀。「治療」亦意欲涵蓋遞送試劑以便提供藥理學效應，即使在不存在疾病或病狀之情況下亦如此。舉例而言，「治療」涵蓋可在不存在疾病病狀之情況下(例如在疫苗之情況下)引發免疫反應或賦予免疫性的組成物之遞送。
當參考核酸或蛋白質之部分使用時，術語「異源」指示核酸或蛋白質包括兩個或多於兩個在自然界中發現彼此之間沒有相同關係的子序列。舉例而言，通常以重組方式產生核酸，其具有兩個或多於兩個來自無關基因的經佈置以製造新的功能性核酸序列的序列，例如來自一個來源之啟動子及來自另一來源之編碼區或來自不同來源之編碼區。類似地，異源蛋白指示蛋白質包括兩個或多於兩個在自然界中未發現彼此呈相同關係之子序列(例如融合蛋白)。
在兩個或多於兩個核酸或多肽之上下文中，術語「序列一致性(sequence identity)」、「一致性百分比(percent identity)」及「序列一致性百分比(sequence percent identity)」(或其同義詞，例如「99%一致」)係指兩個或多於兩個序列或子序列在進行比較及排比(需要時引入間隔)以達到最大對應性且不將任何保守胺基酸取代視為序列一致性之部分時，該兩個或多於兩個序列或子序列係相同的或具有相同的特定百分比之核苷酸或胺基酸殘基。一致性百分比可使用序列比較軟體或演算法或藉由目視檢查來量測。所屬領域中已知可用於獲得胺基酸或核苷酸序列之排比的各種演算法及軟體。用以判定序列一致性百分比之適合的程式包含例如可購自美國政府的國家生物技術資訊中心(U.S. Government's National Center for Biotechnology Information)BLAST網站之BLAST套裝程式。兩個序列之間的比較可使用BLASTN或BLASTP演算法進行。BLASTN用於比較核酸序列，而BLASTP用於比較胺基酸序列。ALIGN、ALIGN-2(美國加利福尼亞州南舊金山的基因泰克(Genentech))或MegAlign(可購自DNASTAR)係另外的可用於排比序列之可供大眾使用的軟體程式。熟習此項技術者可以藉由特定的比對軟體來判定用於最大比對的適當參數。在某些實施例中，使用排比軟體的預設參數。
如本文所使用，術語「變體」涵蓋(但不限於)包括與參考抗體之胺基酸序列不同之胺基酸序列的抗體或融合蛋白，不同之處在於在參考抗體之胺基酸序列之內或相鄰的某些位置有一或多個取代、缺失及/或添加。與參考抗體之胺基酸序列相比，變體可以在其胺基酸序列中包括一個或多個保守取代。保守取代可涉及例如類似帶電或不帶電胺基酸之取代。變體保留與參考抗體之抗原特異性結合的能力。術語變體亦包含聚乙二醇化抗體或蛋白質。
術語「去氧核糖核苷酸」涵蓋天然的及合成的、未經修飾的及經修飾的去氧核糖核苷酸。修飾包含改變糖部分、鹼基部分及/或寡核苷酸中各去氧核糖核苷酸之間的連接。
術語「RNA」定義包括至少一個核糖核苷酸殘基的分子。術語「核糖核苷酸」定義在b-D-呋喃核糖部分之2'位具有羥基的核苷酸。術語RNA包含雙股RNA；單股RNA；經分離之RNA，諸如部分純化之RNA、基本上純RNA、合成RNA、以重組方式產生之RNA；以及藉由添加、缺失、取代及/或改變一或多個核苷酸而不同於天然存在之RNA的經改變之RNA。本文所描述之RNA分子中之核苷酸亦可包括非標準核苷酸，諸如非天然存在之核苷酸或化學合成之核苷酸或去氧核苷酸。此等改變之RNA可稱為類似物或天然存在之RNA的類似物。
術語「醫藥學上可接受之載劑」或「醫藥學上可接受之賦形劑」意欲包含任何及所有溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑，以及惰性成分。此類醫藥學上可接受之載劑或醫藥學上可接受之賦形劑用於活性醫藥成分之用途為本領域中所熟知。除非任何習知醫藥學上可接受之載劑或醫藥學上可接受之賦形劑與活性醫藥成分不相容，否則考慮其在本發明之治療組成物中之用途。額外活性醫藥成分，諸如其他藥物亦可併入所描述之組成物及方法中。
術語「約」或「大約」意指在值之統計學上有意義的範圍內。此範圍可在既定值或範圍之一數量級內，較佳地50%內，更佳地20%內，再更佳地10%內，且甚至更佳地5%內。由術語「約」或「大約」涵蓋之允許差異取決於研究下之特定系統，且可由所屬領域中具有通常知識者容易地理解。此外，如本文所使用，術語「約」及「大約」意指尺寸、大小、調配物、參數、形狀及其他數量(quantity)及特徵並不精確且不需要精確，而是可以視需要為近似值及/或較大或較小的，反映出公差、轉換因子、四捨五入、量測誤差等，以及本領域的技術人員已知的其他因素。一般而言，無論是否如此明確說明，尺寸、大小、調配物、參數、形狀或其他數量或特徵皆為「約」或「大約」的。應注意，大小、形狀及尺寸非常不同之實施例可採用所描述之佈置。
當以原始及修改形式用於所附申請專利範圍中時，過渡術語「包括(comprising)」、「基本上由…組成(consisting essentially of)」及「由…組成(consisting of)」相對於哪些未敍述之另外的請求項要素或步驟(若存在)被排除在申請專利範圍之範疇之外來定義請求項範疇。術語「包括」意欲為包括性的或開放性的，且不排除任何另外的、未敍述之要素、方法、步驟或材料。術語「由…組成」不包括除申請專利範圍中指定之要素、步驟或材料以外的任何要素、步驟或材料，且在後一情況中排除與指定材料一般相關之雜質。術語「基本上由…組成」將請求項之範疇限於所指定要素、步驟或材料及實質上不影響所主張發明之基礎及新穎特徵的要素、步驟或材料。在替代實施例中，本文所描述的體現本發明之所有組成物、方法及套組可由任何過渡術語「包括」、「基本上由…組成」及「由…組成」更具體地定義。
術語「抗體(antibody)」及其複數形式「抗體(antibodies)」係指完整的免疫球蛋白及任何抗原結合片段(「抗原結合部分」)或其單鏈。「抗體」亦指包括藉由二硫鍵互相連接之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈的糖蛋白，或其抗原結合部分。每條重鏈包括重鏈可變區(本文縮寫為V H)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包括三個域，即CH1、CH2及CH3。每條輕鏈包括輕鏈可變區(本文中縮寫為V L)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包括一個域，即C L。抗體之V H及V L區可進一步細分成高變區，稱為互補決定區(CDR)或高變區(HVR)，且其可穿插有較為保守之區域，稱為構架區(FR)。每個V H及V L由三個CDR及四個FR構成，自胺基端至羧基端按以下次序佈置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與一或多個抗原決定基相互作用之結合域。抗體恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合，該等宿主組織或因子包含免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(Clq)。
術語「抗原」係指誘導免疫反應之物質。在一些實施例中，若藉由主要組織相容複合體(MHC)分子呈現，則抗原係能夠被抗體或TCR結合之分子。如本文所使用，術語「抗原」亦涵蓋T細胞抗原決定基。另外，抗原能夠被免疫系統識別。在一些實施例中，抗原能夠誘導體液免疫反應或細胞免疫反應，引起B淋巴球及/或T淋巴球活化。在一些情況下，此可能需要抗原含有或連接至Th細胞抗原決定基。抗原亦可具有一或多個抗原決定基(例如B抗原決定基及T抗原決定基)。在一些實施例中，抗原較佳將典型地以高度特異性且選擇性方式與其相應抗體或TCR反應，且不與可由其他抗原誘導之多種其他抗體或TCR反應。
術語「單株抗體」、「mAb」、「單株抗體組成物」或其複數形式係指單分子組成物之抗體分子的製劑。單株抗體組成物針對特定抗原決定基展示出單一結合特異性及親和力。對某些受體具有特異性之單株抗體可使用以下技術中之知識及技術製得，即對測試個體注射適合抗原，且接著分離表現具有所需序列或功能特徵之抗體的融合瘤。編碼單株抗體之DNA係使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合至編碼該單株抗體抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)容易地分離及定序。融合瘤細胞充當此類DNA之較佳來源。分離後，即可將DNA置放於表現載體中，接著將該等表現載體轉染至不另外產生免疫球蛋白蛋白質之宿主細胞，諸如大腸桿菌( E. coli)細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞中，以在重組宿主細胞中合成單株抗體。抗體之重組產生將在下文更詳細地描述。
如本文所使用，術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」(或簡言之「抗體部分」或「片段」)係指保持特異性結合至抗原之能力的抗體之一或多個片段。經顯示，抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段來進行。術語抗體之「抗原結合部分」範圍內所涵蓋之結合片段的實例包含(i)Fab片段，即由V L、V H、C L及CH1域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，即一種二價片段，其包括在鉸鏈區藉由二硫橋鍵連接的兩個Fab片段；(iii)由V H及CH1域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂之V L及V H域組成的Fv片段；(v)域抗體(dAb)片段(Ward等人, 《自然( Nature)》, 1989, 341, 544-546),其可由一個V H或一個V L域組成；及(vi)分離之互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個域V L及V H係由獨立基因編碼，但其可使用重組方法，藉由合成連接子接合，該合成連接子能夠將其製造成V L與V H區配對形成單價分子之單一蛋白質鏈，稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等人, 《科學( Science)》 1988, 242, 423-426；及Huston等人, 《美國國家科學院院刊( Proc. Natl. Acad. Sci. USA)》 1988, 85, 5879-5883)。此類scFv抗體亦意欲涵蓋在術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」內。此等抗體片段係使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且以與完整抗體相同之方式來篩選供使用的片段。
如本文所使用，術語「人類抗體」意欲包含具有可變區之抗體，其中構架區及CDR區皆來源於人類生殖系免疫球蛋白序列。另外，若抗體含有恆定區，則該恆定區亦來源於人類生殖系免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體可包含並非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由在活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由在活體內體細胞突變引入的突變)。如本文所使用，術語「人類抗體」並不意欲包含來源於另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列已移植至人類構架序列上之抗體。
術語「人類單株抗體」係指展示單一結合特異性且具有可變區之抗體，其中構架區與CDR區均來源於人類生殖系免疫球蛋白序列。在一些實施例中，人類單株抗體係由融合瘤產生，該融合瘤包含與永生化細胞融合的自轉殖基因非人類動物(例如轉殖基因小鼠)獲得之B細胞，其具有包括人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因之基因體。
如本文所使用，術語「重組人類抗體」包含藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，該等人類抗體諸如(a)自對於人類免疫球蛋白基因而言為轉殖基因或轉染色體之動物(諸如小鼠)或由其製備之融合瘤(在下文進一步描述)分離的抗體；(b)自經轉型以表現人類抗體之宿主細胞，例如自轉染瘤分離的抗體；(c)自重組、組合人類抗體庫分離的抗體；及(d)藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之任何其他方式製備、表現、產生或分離的抗體。此類重組人類抗體具有可變區，其中構架區及CDR區來源於人類生殖系免疫球蛋白序列。然而，在某些實施例中，此類重組人類抗體可經歷活體外突變誘發(或當使用人類Ig序列之轉殖基因動物時為活體內體細胞突變誘發)，且因此，重組抗體之V H及V L區之胺基酸序列係這樣一類序列，該等序列雖然來源於人類生殖系V H及V L序列且與其相關，但可能並非在活體內天然存在於人類抗體生殖系譜系內之序列。
如本文所使用，「同型」係指由重鏈恆定區基因編碼之抗體類別(例如IgM或IgG1)。
片語「識別抗原之抗體」及「對抗原具有特異性之抗體」在本文中可與術語「特異性結合至抗原之抗體」互換使用。
術語「人類抗體衍生物」係指人類抗體之任何經修飾形式，包含抗體與另一活性醫藥成分或抗體之結合物。術語「結合物」、「抗體-藥物結合物」、「ADC」或「免疫結合物」係指與另一治療部分結合之抗體或其片段，該治療部分可使用本領域中可用之方法與本文所描述之抗體結合。
術語「人類化抗體(humanized antibody/ humanized antibodies)」及「人類化」意欲指來源於另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列已移植至人類構架序列上的抗體。可在人類框架序列內進行額外框架區修飾。非人類(例如鼠類)抗體之「人類化」形式係含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。在大多數情況下，人類化抗體係來自接受者之高變區的殘基經來自具有所需特異性、親和力及能力之非人類物種(供體抗體)，諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物之15高變區之殘基置換的人類免疫球蛋白(受體抗體)。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基經相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包括在接受體抗體中或供體抗體中未發現之殘基。進行此等修飾以進一步優化抗體效能。一般而言，人類化抗體將包括至少一個且典型地兩個可變域之實質上全部，其中所有或實質上所有高變環對應於非人類免疫球蛋白之該等區域且所有或實質上所有FR區係人類免疫球蛋白序列之該等區域。人類化抗體視情況亦將包括免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，典型地人類免疫球蛋白恆定區之至少一部分。關於其他細節，參見Jones等人, 《自然》 1986, 321, 522-525；Riechmann等人, 《自然》 1988, 332, 323-329；以及Presta, 《結構生物學新見( Curr. Op.Struct.Biol.)》 1992, 2,593-596。本文所描述之抗體亦可經修飾以採用已知賦予效應功能及/或FcR結合改良(例如降低)之任何Fc變體。Fc變體可包含例如以下所揭示之胺基酸取代中之任一者：國際專利申請公開案第WO 1988/07089 A1號、第WO 1996/14339 A1、第WO 1998/05787 A1、第WO 1998/23289 A1、第WO 1999/51642 A1、第WO 99/58572 A1、第WO 2000/09560 A2、第WO 2000/32767 A1、第WO 2000/42072 A2、第WO 2002/44215 A2、第WO 2002/060919 A2、第WO 2003/074569 A2、第WO 2004/016750 A2、第WO 2004/029207 A2、第WO 2004/035752 A2、第WO 2004/063351 A2、第WO 2004/074455 A2、第WO 2004/099249 A2、第WO 2005/040217 A2、第WO 2005/070963 A1、第WO 2005/077981 A2、第WO 2005/092925 A2、第WO 2005/123780 A2、第WO 2006/019447 A1、第WO 2006/047350 A2及第WO 2006/085967 A2；及美國專利第5,648,260號；第5,739,277號；第5,834,250號；第5,869,046號；第6,096,871號；第6,121,022號；第6,194,551號；第6,242,195號；第6,277,375號；第6,528,624號；第6,538,124號；第6,737,056號；第6,821,505號；第6,998,253號；及第7,083,784號；其揭示內容以引用之方式併入本文中。
術語「嵌合抗體」意欲指可變區序列來源於一個物種且恆定區序列來源於另一物種之抗體，諸如可變區序列來源於小鼠抗體且恆定區序列來源於人類抗體之抗體。
「雙功能抗體」係具有兩個抗原結合位點之小抗體片段。片段包括連接至同一多肽鏈(V H-V L或V L-V H)中之輕鏈可變域(V L)的重鏈可變域(V H)。藉由使用過短而使得同一鏈上之兩個可變域之間不能配對的連接子，迫使該等可變域與另一條鏈之互補域配對，且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更完整地描述於例如歐洲專利第EP 404,097號；國際專利公開案第WO 93/11161號；及Bolliger等人, 《美國國家科學院院刊》 1993, 90, 6444-6448中。
術語「糖基化」係指抗體之經修飾衍生物。非糖基化抗體缺乏糖基化。糖基化可經改變以例如增加抗體對抗原之親和力。此類碳水化合物修飾可藉由例如改變抗體序列內之一或多個糖基化位點來完成。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，以消除一或多個可變區構架糖基化位點，由此消除該位點之糖基化。如美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中所描述，去糖基化可增加抗體對抗原之親和力。另外或可替代地，可以製備糖基化類型改變之抗體，諸如具有減少量之岩藻醣基殘基之低岩藻醣基化抗體或具有增加之等分GlcNAc結構之抗體。經展示，此類經改變之糖基化模式可增加抗體之能力。此類碳水化合物修飾可藉由例如在糖基化機制改變之宿主細胞中表現抗體來實現。糖基化機制改變之細胞在本領域中已有描述且可用作表現本發明之重組抗體以由此產生糖基化改變之抗體的宿主細胞。舉例而言，細胞株Ms704、Ms705及Ms709缺乏岩藻醣基轉移酶基因、FUT8(α(1,6)岩藻醣基轉移酶)，使得Ms704、Ms705及Ms709細胞株中表現之抗體在其碳水化合物上缺乏岩藻醣。Ms704、Ms705及Ms709 FUT8−/−細胞株係藉由使用兩種置換載體靶向破壞CHO/DG44細胞中之FUT8基因而產生(參見例如美國專利公開案第2004/0110704號或Yamane-Ohnuki等人, 《生物技術與生物工程( Biotechnol. Bioeng.)》, 2004, 87, 614-622)。作為另一實例，歐洲專利第EP 1,176,195號描述一種具有功能破壞的編碼岩藻醣基轉移酶之FUT8基因的細胞株，使得此類細胞株中表現之抗體因減少或消除α1,6鍵相關酶而展現出低岩藻醣基化，且亦描述如下細胞株，該等細胞株具有較低的用於將岩藻醣添加至結合至抗體Fc區之N-乙醯基葡糖胺的酶活性或不具有該酶活性，例如大鼠骨髓瘤細胞株YB2/0(ATCC CRL 1662)。國際專利公開案WO 03/035835描述一種變體CHO細胞株，即Lec 13細胞，其具有減弱的將岩藻醣連接至Asn(297)連接之碳水化合物的能力，亦導致該宿主細胞中表現之抗體的低岩藻醣基化(亦參見Shields等人, 《生物化學雜誌( J. Biol. Chem.)》 2002, 277, 26733-26740。國際專利公開案WO 99/54342描述經工程改造成表現醣蛋白修飾型醣基轉移酶(例如β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII))之細胞株，使得經工程改造之細胞株中所表現之抗體展現增加之等分GlcNac結構，由此增加抗體之ADCC活性(亦參見Umana等人, 《自然·生物技術( Nat. Biotech.)》 1999, 17, 176-180)。替代地，抗體之岩藻醣殘基可使用岩藻糖苷酶裂解。舉例而言，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶自抗體中移除岩藻醣基殘基，如Tarentino等人, 《生物化學( Biochem.)》 1975, 14,5516-5523中所描述。
「聚乙二醇化」係指經修飾之抗體或其片段，其典型地在一或多個PEG基團連接至抗體或抗體片段之條件下與聚乙二醇(PEG)，諸如PEG之反應性酯或醛衍生物反應。聚乙二醇化可例如增加抗體之生物(例如血清)半衰期。較佳地，聚乙二醇化係經由與反應性PEG分子(或類似反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷基化反應來進行。如本文所使用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋用於使其他蛋白質衍生化之任何PEG形式，諸如單(C 1-C 10)烷氧基-聚乙二醇或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。欲聚乙二醇化之抗體可為去糖基化抗體。聚乙二醇化方法係本領域中已知的且可應用於本發明之抗體，如例如歐洲專利第EP 0154316號及歐洲專利第EP 0401384號以及美國專利第5,824,778號中所描述，各案之揭示內容以引用的方式併入本文中。
術語「生物類似物」意謂這樣一種生物產品，包含單株抗體或蛋白質，儘管其無臨床活性組分存在少量差異，但其與美國核准之參考生物產品極其類似，且生物產品與參考產品之間在產品之安全性、純度及效力方面不存在有臨床意義的差異。此外，類似生物或「生物類似」藥物係一種與已被歐洲藥物管理局(European Medicines Agency)許可使用之另一生物藥物類似的生物藥物。術語「生物類似物」亦被其他國家及地區監管機構以同義使用。生物產品或生物藥物係由生物來源(諸如細菌或酵母)製成或衍生的藥物。其可由相對較小分子(諸如人類胰島素或紅血球生成素)或複雜分子(諸如單株抗體)組成。舉例而言，若參考IL-2蛋白係阿地介白素(PROLEUKIN)，則藥物監管機構參照阿地介白素批准之蛋白質與阿地介白素「生物類似」或為阿地介白素之「生物類似物」。在歐洲，類似生物或「生物類似」藥物係一種與已被歐洲藥物管理局許可使用之另一生物藥物類似的生物藥物。歐洲類似生物應用之相關法律依據係法規(EC)第726/2004號第6條及經修訂的指令2001/83/EC第10(4)條，且因此在歐洲，生物類似物可根據法規(EC)第726/2004號第6條及指令2001/83/EC第10(4)條授權、批准授權或作為授權申請的對象。已授權之原始生物醫藥產品在歐洲可稱為「參考醫藥產品」。CHMP關於類似生物醫藥產品(Similar Biological Medicinal Products)之指南中概述了有關被視為生物類似物之產品的一些要求。此外，特定產品指南，包含與單株抗體生物類似物相關的指南，將由EMA逐項產品提供，且在其網站上發佈。如本文所描述，生物類似物可在品質特徵、生物活性、作用機制、安全概況及/或功效方面與參考醫藥產品類似。另外，生物類似物可用於或意欲用於治療與參考醫藥產品相同之病況。因此，可認為如本文所描述之生物類似物具有與參考醫藥產品類似或高度類似之品質特徵。替代地或另外，可認為如本文所描述之生物類似物具有與參考醫藥產品類似或高度類似之生物活性。替代地或另外，可認為如本文所描述之生物類似物具有與參考醫藥產品類似或高度類似之安全概況。替代地或另外，可認為如本文所描述之生物類似物具有與參考醫藥產品類似或高度類似之功效。如本文所描述，將歐洲的生物類似物與已被EMA許可之參考醫藥產品相比較。然而，在一些情況下，生物類似物在某些研究中可與在歐洲經濟區以外許可之生物醫藥產品(非EEA許可之「比較物」)相比較。此類研究包含例如某些臨床及活體內非臨床研究。如本文所使用，術語「生物類似物」亦關於已與或可與非EEA許可之比較物比較之生物醫藥產品。某些生物類似物係蛋白質，諸如抗體、抗體片段(例如抗原結合部分)及融合蛋白。蛋白質生物類似物可具有在胺基酸結構中具有少量修飾(包括例如胺基酸之缺失、添加及/或取代)之胺基酸序列，該等修飾不會顯著影響多肽之功能。生物類似物可包括與其參考醫藥產品之胺基酸序列具有97%或更高(例如97%、98%、99%或100%)序列一致性之胺基酸序列。生物類似物可包括一或多個轉譯後修飾，例如但不限於糖基化、氧化、去醯胺及/或截短，其不同於參考醫藥產品之轉譯後修飾，只要差異不會引起醫藥產品之安全性及/或功效變化即可。生物類似物可具有與參考醫藥產品相同或不同的糖基化模式。詳言之，雖然並非排他性地，但若差異解決或意欲解決與參考醫藥產品相關之安全問題，則生物類似物可具有不同糖基化模式。另外，生物類似物可在例如其強度、醫藥形式、調配物、賦形劑及/或呈現方式等方面不同於參考醫藥產品，只要該醫藥產品之安全性及功效不受影響。相較於參考醫藥產品，生物類似物可包括在例如藥物動力學(PK)及/或藥效學(PD)曲線方面之差異，但仍被認為與參考醫藥產品充分類似，可被許可或視為適合於許可。在某些情況下，生物類似物展現出與參考醫藥產品不同之結合特徵，其中該等不同結合特徵被監管機構(諸如EMA)認為並非類似生物產品獲得許可的障礙。術語「生物類似物」亦被其他國家及地區監管機構以同義使用。 III. 腫瘤儲存組成物
在一個態樣中，本文提供可用於儲存及運送腫瘤樣品進行腫瘤浸潤淋巴球(TIL)製造之腫瘤儲存組成物。來源於該等組成物中所儲存之腫瘤的TIL可用於任何適合方法中，例如本文所提供之TIL製造方法及例如以下中所描述之方法：美國專利第10,166,257號；美國專利第10,130,659號；美國專利第10,272,113號；美國專利第10,420,799號；美國專利第10,398,734號；美國專利第10,463,697號；美國專利第10,363,273號；美國專利申請公開案第2018/0325954號；美國專利申請公開案第2020/ 0224161號；及WO 2020/096986，各案以全文引用的方式併入本文中且特別是與TIL製造方法相關之所有教導內容。
本文所提供之儲存組成物使細菌(例如革蘭氏陰性及革蘭氏陽性細菌物種)及真菌污染減到最少，同時不會明顯影響TIL存活率，由此有利地允許在TIL處理之前將該腫瘤樣本在無菌環境中運送及低溫儲存較長時段。此類腫瘤儲存組成物一般包含無血清、無動物組分之冷凍保存培養基及抗生素組分。
在一些實施例中，腫瘤儲存組成物中儲存之腫瘤在該腫瘤儲存組成物中儲存6-48小時之後展現出至少或至少約50%-100%的細胞存活率。在一些實施例中，該腫瘤儲存組成物中儲存之腫瘤在該腫瘤儲存組成物中儲存6-48小時之後展現出至少或至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、、95%、97%、98%或99%的細胞存活率。在一些實施例中，該腫瘤儲存組成物中儲存之腫瘤在該腫瘤儲存組成物中儲存6、12、18、24、32、36或48小時之後展現出至少或至少約50%-100%的細胞存活率。在某些實施例中，該腫瘤儲存組成物中儲存之腫瘤在自或自約-10℃至10℃、-10℃至5℃、-5℃至0℃、0℃至5℃、2℃至8℃或5℃至10℃之溫度下於該腫瘤儲存組成物中儲存6-48小時之後展現出至少約50%-100%的細胞存活率。細胞存活率可使用任何適合分析量測，包含例如染料排斥分析(例如錐蟲藍、溴化乙錠、碘化丙錠、SYTOX及YO-PRO)、DNA濃縮分析(Hoechst 33258及吖啶橙)、氧化還原反應分析(MTT及XTT、阿爾瑪藍(Alamar Blue))、酯酶受質分析(例如鈣黃綠素AM及細胞示蹤劑(Cell Tracker))、蛋白酶受質分析(例如CellTiter-Fluor)、ATP量測(例如CellTiter Glo)及酶釋放分析(例如CytoTox-ONE)。
主題腫瘤儲存組成物中儲存之腫瘤樣本的無菌性可使用任何適合之方法評定。例示性方法包含但不限於直接接種法、膜方法(例如敞開式及密閉式膜過濾系統)、ATP-發光分析、比色生長偵測分析、自體螢光偵測分析及細胞計數系統。
本文所提供之腫瘤儲存培養基中儲存的腫瘤樣本隨後可經歷處理以得到TIL進行使用任何適合處理方案之基礎研究或治療用途。在一些實施例中，將主題腫瘤儲存培養基中儲存之腫瘤樣本隨後用於本文所提供的用於產生治療性淋巴球(例如TIL、周邊血液淋巴球及骨髓浸潤淋巴球)之方法中。
下文進一步論述腫瘤儲存組成物之態樣。 A. 抗生素
本文所揭示之腫瘤儲存組成物包含抗生素組分。本文所提供的儲存組成物中使用之抗生素使細菌及/或真菌污染之量減到最少，同時有利地對TIL展現低細胞毒性作用。在一些實施例中，該等抗生素使儲存培養基中革蘭氏陰性及/或革蘭氏陽性細菌污染物之量減到最少。有用的抗生素包含但不限於兩性黴素B、克林達黴素及萬古黴素。在一些實施例中，腫瘤儲存組成物培養基進一步包含建它黴素。
在一些實施例中，儲存組成物包含克林達黴素。在一些實施例中，包含的克林達黴素之濃度為至少或至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000 µg/mL。在某些實施例中，包含的克林達黴素之濃度係自或自約0.1-1 µg/mL、0.25-1 µg/mL、0.1-0.5 µg/mL、0.5-2 µg/mL、2-8 µg/mL、1-10 µg/mL、4-12 µg/mL、5-15 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL、40-50 µg/mL、50-60 µg/mL、60-70 µg/mL、70-80 µg/mL、80-90 µg/mL、90-100 µg/mL、100-110 µg/mL、110-120 µg/mL、120-130 µg/mL、130-140 µg/mL、140-150 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、10-90 µg/mL、20-80 µg/mL、30-70 µg/mL、40-60 µg/mL、45-55 µg/mL、50-100 µg/mL、100-150 µg/mL、150-200 µg/mL、200-250 µg/mL、250-300 µg/mL、300-350 µg/mL、350-400 µg/mL、400-450 µg/mL、450-500 µg/mL、500-550 µg/mL、550-600 µg/mL、600-650 µg/mL、650-700 µg/mL、700-750 µg/mL、750-800 µg/mL、800-850 µg/mL、850-900 µg/mL或950-1,000 µg/mL。在一些實施例中，包含的克林達黴素之濃度係自或自約0.1-100 µg/mL、1-50 µg/mL、1-100 µg/mL、1-250 µg/mL、1-500 µg/mL、250-750 µg/mL、350-450 µg/mL、450-550 µg/mL、550-650 µg/mL、400-600 µg/mL、350-650 µg/mL、300-700 µg/mL、200-800 µg/mL、500-1,000 µg/mL、750-1,250 µg/mL、1,000-1,500 µg/mL、1,250-1,750 µg/mL或1,500-2,000 µg/mL。在例示性實施例中，克林達黴素之濃度係或係約400-600 µg/mL。
在某些實施例中，該儲存組成物包含萬古黴素。在一些實施例中，包含的萬古黴素之濃度係至少或至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30 、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000 µg/mL。在某些實施例中，包含的萬古黴素之濃度係自或自約0.1-1 µg/mL、0.25-1 µg/mL、0.1-0.5 µg/mL、0.5-2 µg/mL、2-8 µg/mL、1-10 µg/mL、4-12 µg/mL、5-15 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL、40-50 µg/mL、50-60 µg/mL、60-70 µg/mL、70-80 µg/mL、80-90 µg/mL、90-100 µg/mL、100-110 µg/mL、110-120 µg/mL、120-130 µg/mL、130-140 µg/mL、140-150 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、10-90 µg/mL、20-80 µg/mL、30-70 µg/mL、40-60 µg/mL、45-55 µg/mL、50-100 µg/mL、100-150 µg/mL、150-200 µg/mL、200-250 µg/mL、250-300 µg/mL、300-350 µg/mL、350-400 µg/mL、400-450 µg/mL、450-500 µg/mL、500-550 µg/mL、550-600 µg/mL、600-650 µg/mL、650-700 µg/mL、700-750 µg/mL、750-800 µg/mL、800-850 µg/mL、850-900 µg/mL或950-1,000 µg/mL。在一些實施例中，包含的萬古黴素之濃度係自或自約0.1-100 µg/mL、1-50 µg/mL、1-100 µg/mL、1-250 µg/mL、1-500 µg/mL、100-200 µg/mL、150-250 µg/mL、200-400 µg/mL、350-450 µg/mL、400-600 µg/mL、550-650 µg/mL、50-650 µg/mL、100-600 µg/mL、250-750 µg/mL、500-1,000 µg/mL、750-1,250 µg/mL、1,000-1,500 µg/mL、1,250-1,750 µg/mL或1,500-2,000 µg/mL。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係或係約50-600 µg/mL。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係或係約100 µg/mL。
在一些實施例中，該儲存組成物包含萬古黴素及建它黴素。在某些實施例中，該儲存組成物包含克林達黴素及建它黴素。在一些實施例中，包含的建它黴素之濃度係至少或至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30 、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000 µg/mL。在某些實施例中，包含的建它黴素之濃度係自或自約0.1-1 µg/mL、0.25-1 µg/mL、0.1-0.5 µg/mL、0.5-2 µg/mL、2-8 µg/mL、1-10 µg/mL、4-12 µg/mL、5-15 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL、40-50 µg/mL、50-60 µg/mL、60-70 µg/mL、70-80 µg/mL、80-90 µg/mL、90-100 µg/mL、100-110 µg/mL、110-120 µg/mL、120-130 µg/mL、130-140 µg/mL、140-150 µg/mL、150-160 µg/mL、160-170 µg/mL、170-180 µg/mL、180-190 µg/mL、190-200 µg/mL、10-90 µg/mL、20-80 µg/mL、30-70 µg/mL、40-60 µg/mL、45-55 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、50-100 µg/mL、100-150 µg/mL、150-200 µg/mL、200-250 µg/mL、250-300 µg/mL、300-350 µg/mL、350-400 µg/mL、400-450 µg/mL、450-500 µg/mL、500-550 µg/mL、550-600 µg/mL、600-650 µg/mL、650-700 µg/mL、700-750 µg/mL、750-800 µg/mL、800-850 µg/mL、850-900 µg/mL或950-1,000 µg/mL。在一些實施例中，包含的建它黴素之濃度係自或自約0.1-100 µg/mL、1-50 µg/mL、25-75 µg/mL、1-100 µg/mL、1-250 µg/mL、1-500 µg/mL、250-750 µg/mL、500-1,000 µg/mL、750-1,250 µg/mL、1,000-1,500 µg/mL、1,250-1,750 µg/mL或1,500-2,000 µg/mL。在例示性實施例中，建它黴素之濃度係或係約50 µg/mL。
在一些實施例中，腫瘤儲存培養基進一步包含一或多種抗真菌性抗生素。用於主題腫瘤儲存培養基之抗真菌性抗生素包含但不限於多烯類、唑類、咪唑類、三唑類、噻唑類、烯丙胺類及棘白菌素(echinocandin)。例示性多烯類包含但不限於：兩性黴素B、殺念珠菌素(candicidin)、非律平(filipin)、哈黴素(hamycin)、遊黴素(natamycin)、耐絲菌素(nystatin)及龜裂黴素(rimocidin)。例示性咪唑類包含但不限於聯苯苄唑(bifonazole)、布康唑(butoconazole)、克氯黴唑(clotrimazole)、益康唑(econazole)、芬替康唑(fenticonazole)、異康唑(isoconazole)、酮康唑(ketoconazole)、盧立康唑(luliconazole)、咪康唑(miconazole)、奧莫康唑(omoconazole)、奧昔康唑(oxiconazole)、舍他康唑(sertaconazole)、硫康唑(sulconazole)及噻康唑(tioconazole)。有用的三唑類包含但不限於：阿巴康唑(albaconazole)、艾菲康唑(efinaconazole)、環氧康唑(epoxiconazole)、氟康唑(fluconazole)、艾沙康唑(isavuconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、泊沙康唑(posaconazole)、丙環唑(propiconazole)、拉夫康唑(ravuconazole)、特康唑(terconazole)及伏立康唑(voriconazole)。例示性棘白菌素包含但不限於：阿尼芬淨(anidulafungin)、卡泊芬淨(caspofungin)、米卡芬淨(micafungin)。可包含在本文所揭示之腫瘤儲存組成物中的額外抗真菌性抗生素包含但不限於：橙酮(aurone)、苯甲酸、環吡酮(ciclopirox)、氟胞嘧啶(flucytosine)、灰黃黴素(griseofulvin)、鹵苯炔醚(haloprogin)、托萘酯(tolnaflate)、十一碳烯酸、三醋精、結晶紫、奧羅地美(orotomide)、米替福新(milteofosine)、碘化鉀、日光黴素(nikkomycin)、硫酸銅、二硫化硒、硫代硫酸鈉、吡羅克酮乙醇胺鹽(prioctone olamine)、碘喹醇(iodoquinol)、吖啶瑣辛(acrisorcin)、吡啶硫酮鋅(zinc pyrithione)及硫。
在一些實施例中，腫瘤儲存組成物包含兩性黴素B。在某些實施例中，該兩性黴素B之濃度係至少或至少約0.1 µg/mL、0.2 µg/mL、0.3 µg/mL、0.4 µg/mL、0.5 µg/mL、0.6 µg/mL、0.7 µg/mL、0.8 µg/mL、0.9 µg/mL、1 µg/mL、2 µg/mL、3 µg/mL、4 µg/mL、5 µg/mL、6 µg/mL、7 µg/mL、8 µg/mL、9 µg/mL、10 µg/mL、15 µg/mL、20 µg/mL、25 µg/mL、30 µg/mL、35 µg/mL、40 µg/mL、45 µg/mL及50 µg/mL。在某些實施例中，該兩性黴素B之濃度係至少或至少約0.1-0.5 µg/mL、0.5-1 µg/mL、0.25-2 µg/mL、0.1-1 µg/mL、1-5 µg/mL、1-3 µg/mL、2-4 µg/mL、3-5 µg/mL、4-6 µg/mL、5-7 µg/mL、6-8 µg/mL、7-9 µg/mL、8-10 µg/mL、9-11 µg/mL、1-2 µg/mL、2-3 µg/mL、3-4 µg/mL、4-5 µg/mL、5-6 µg/mL、6-7 µg/mL、7-8 µg/mL、8-9 µg/mL、9-10 µg/mL、10-11 µg/mL、1-10 µg/mL、2-10.5 µg/mL、5-15 µg/mL、2-12 µg/mL、1-11 µg/mL、5-10 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL或40-50 µg/mL。在例示性實施例中，該兩性黴素B之濃度係或係約2.5-10 µg/mL。 B. 冷凍保存培養基
本文所提供之腫瘤儲存組成物包含冷凍保存培養基。任何適合的冷凍保存培養基均可包含在該儲存組成物中。在一些實施例中，該冷凍保存培養基包含一或多種電解質；及在生理及低溫條件下有效之生物pH緩衝液。適用於本文所描述之組成物中的例示性冷凍保存培養基包含例如美國專利第6,045,990號中所描述者，該案以全文引用的方式併入本文中且尤其是與冷凍保存培養基有關之相關部分。
該冷凍保存培養基包含一或多種電解質。在一些實施例中，該一或多種電解質包含鉀離子、鈉離子及/或鈣離子。在一些實施例中，該一或多種電解質包含鉀離子。在特定實施例中，包含的鉀離子之濃度係自或自約0.1-1 mM、1-50 mM、50-100 mM、100-150 mM、150-200 mM。在某些實施例中，包含的鉀離子之濃度係自或自約1-20 mM、20-40 mM、40-60 mM、60-80 mM或80-100 mM。在特定實施例中，包含的鉀離子之濃度係自或自約35-45 mM。
在一些實施例中，該一或多種電解質包含鈉離子。在特定實施例中，包含的鉀離子之濃度係自或自約1-50 mM、50-100 mM、100-150 mM、150-200 mM、200-250 mM或250-300 mM。在某些實施例中，包含的鉀離子之濃度係自或自約1-20 mM、20-40 mM、40-60 mM、60-80 mM或80-100 mM、100-120 mM、120-140 mM、140-160 mM、160-180 mM或180-200 mM。在特定實施例中，包含的鉀離子之濃度係自或自約80-120 mM。
在一些實施例中，該一或多種電解質包含鈣離子。在特定實施例中，包含的鉀離子之濃度係自或自約0.001-0.005 mM、0.005-0.01 mM、0.01-0.05 mM、0.05-0.10 mM、0.010-0.15 mM、0.15-0.20 mM、0.20-0.25 mM、0.25-0.50 mM、0.50-1.0 mM、1-5 mM或5-10 mM。在一些實施例中，包含的鈣離子之濃度係或係約0.01-0.1 mM。
冷凍保存培養基包含在生理及低溫條件下皆有效之生物pH緩衝液。可用於冷凍保存之例示性生物pH緩衝液包含但不限於MES緩衝液、Bis-Tris緩衝液、ADA緩衝液、ACES緩衝液、PIPES緩衝液、MOPSO緩衝液、Bis-6 Tris Propare緩衝液、BES緩衝液、MOPS緩衝液、TES緩衝液、HEPES緩衝液、DIPSO緩衝液、MOBS緩衝液、TAPSO緩衝液、HEPPSO緩衝液、POPSO緩衝液、EPPS(HEPPS)緩衝液、麥黃酮緩衝液、Gly-Gly緩衝液、N,N-二(羥乙基)甘胺酸(Bicine)緩衝液、TAPS緩衝液、AMPD緩衝液、TABS緩衝液、AMPSO緩衝液、CHES緩衝液、CAPSO緩衝液、AMP緩衝液、CAPS緩衝液及CABS緩衝液。在例示性實施例中，pH緩衝液係HEPES緩衝液。
在一些實施例中，冷凍保存培養基包含膠體滲透劑(oncotic agent)。在例示性實施例中，膠體滲透劑的大小足夠大以限制自循環系統漏出且有效維持與血漿相等之膠體滲透壓。在例示性實施例中，膠體滲透劑係人類血清白蛋白、多醣及膠狀澱粉。
在一些實施例中，冷凍保存培養基包含營養有效量之單糖。在例示性實施例中，該單糖係果糖、葡萄糖或乳糖。
在例示性實施例中，冷凍保存培養基包含不可透過細胞膜且在冷暴露期間有效抵抗細胞膨脹之不透過性陰離子。在一些實施例中，不透過性陰離子係乳糖酸根、葡糖酸根、檸檬酸根及甘油磷酸根。
在一些實施例中，冷凍保存培養基包含對ATP再生有效之受質。在某些實施例中，該受質係腺苷、果糖、核糖或腺嘌呤。
在一些實施例中，冷凍保存培養基包含HYPOTHERMOSOL®或改良型HYPOTHERMOSOL®。HYPOTHERMOSOL®係包含以下之無細胞溶液： (a)一或多種選自由以下組成之群組的電解質：鉀離子、鈉離子及鈣離子。在例示性實施例中，鉀離子之濃度在或在約35-45 mM範圍內，鈉離子之濃度係約80-120 mM，鎂離子之濃度在或在約2-10 mM範圍內，且鈣離子之濃度在或在約0.01-0.1 mM範圍內。 (b)大小足夠大以限制自循環系統漏出且有效維持與血漿相等之膠體滲透壓的巨分子膠體滲透劑，其選自由以下組成之群組：人類血清白蛋白、多醣及膠狀澱粉； (c)在生理條件及低溫條件下有效之生物pH緩衝液； (d)營養有效量之至少一種單糖； (e)不透過性且羥基自由基清除有效量之甘露糖醇； (f)不可透過細胞膜且在冷暴露期間有效抵抗細胞膨脹之不透過性陰離子，該不透過性離子係至少一個選自由以下組成之群組的成員：乳糖酸根、葡糖酸根、檸檬酸根及甘油磷酸根； (g)對ATP再生有效之受質，該受質係至少一個選自由以下組成之群組的成員：腺苷、果糖、核糖及腺嘌呤；及 (h)麩胱甘肽。
在一些實施例中，冷凍保存培養基包含一或多種調節凋亡誘導之細胞死亡的試劑。在一些實施例中，該調節凋亡誘導之細胞死亡的試劑係一或多種凋亡蛋白酶(caspase)蛋白酶之抑制劑。在一些實施例中，凋亡蛋白酶抑制劑係凋亡蛋白酶1、2、3、4、5、6、7、8、9或10抑制劑。凋亡蛋白酶抑制劑包含但不限於貝納卡杉(belnacasan)(VX-765)、普那卡生(Pralnacasan)及IDN6556。可用於本文所揭示之主題儲存組成物中的其他凋亡蛋白酶抑制劑係Callas及Vaux, 《細胞死亡與分化(Cell Death & Differentiation)》14:73-78(2007)；Poreba等人, 《冷泉港實驗室生物學展望(Cold Spring Harb Perspect Biol.)》5(8):a008680(2013)；以及Howley及Fearnhead, 《細胞與分子醫學雜誌(J Cell Mol Med)》12(5a):1502-1516(2008)，各自併入與凋亡蛋白酶抑制劑有關之相關部分中。在一些實施例中，調節凋亡性細胞死亡之試劑係維生素E或EDTA。
在一些實施例中，冷凍保存培養基包含DMSO。在一些實施例中，冷凍保存培養基包含至少或至少約5%、10%、15%、20%、25%或30% DMSO。在例示性實施例中，冷凍保存培養基包含10% DMSO。 C. 例示性腫瘤儲存組成物
在一些實施例中，腫瘤儲存組成物包含： (a)抗生素組分，其選自以下：(i)萬古黴素及建它黴素；(ii)克林達黴素萬古黴素及建它黴素；及(iii)萬古黴素； (b)一或多種選自鉀離子、鈉離子、鎂離子及鈣離子之電解質； (c)大小足夠大以限制自循環系統漏出且有效維持與血漿相等之膠體滲透壓的巨分子膠體滲透劑，其選自由以下組成之群組：人類血清白蛋白、多醣及膠狀澱粉； (d)在生理條件及低溫條件下有效之生物pH緩衝液； (e)營養有效量之至少一種單糖； (f)不透過性且羥基自由基清除有效量之甘露糖醇； (g)不可透過細胞膜且在冷暴露期間有效抵抗細胞膨脹之不透過性陰離子，該不透過性離子係至少一個選自由以下組成之群組的成員：乳糖酸根、葡糖酸根、檸檬酸根及甘油磷酸根； (h)對ATP再生有效之受質，該受質係至少一個選自由以下組成之群組的成員：腺苷、果糖、核糖及腺嘌呤；及 (i)麩胱甘肽。
在一些實施例中，腫瘤儲存組成物包含： (a)抗生素組分，其選自以下：：1)抗生素組合，該抗生素組合選自：(i)濃度為或為約50至650 µg/mL之萬古黴素及濃度為或為約1至100 µg/mL之建它黴素；(ii)濃度為或為約450至650 µg/mL之克林達黴素及濃度為或為約1至100 µg/mL之建它黴素；或2)(iii)濃度為或為約100 µg/mL之萬古黴素； (b)一或多種電解質，其選自：濃度在或在約35-45 mM範圍內之鉀離子、濃度在或在約80-120 mM範圍內之鈉離子、在或在約2-10 mM範圍內之鎂離子及在或在約0.01-0.1 mM範圍內之鈣離子； (c)大小足夠大以限制自循環系統漏出且有效維持與血漿相等之膠體滲透壓的巨分子膠體滲透劑，其選自由以下組成之群組：人類血清白蛋白、多醣及膠狀澱粉； (d)在生理條件及低溫條件下有效之生物pH緩衝液； (e)營養有效量之至少一種單糖； (f)不透過性且羥基自由基清除有效量之甘露糖醇； (g)不可透過細胞膜且在冷暴露期間有效抵抗細胞膨脹之不透過性陰離子，該不透過性離子係至少一個選自由以下組成之群組的成員：乳糖酸根、葡糖酸根、檸檬酸根及甘油磷酸根； (h)對ATP再生有效之受質，該受質係至少一個選自由以下組成之群組的成員：腺苷、果糖、核糖及腺嘌呤；及 (i)麩胱甘肽。
在一些實施例中，所提供之腫瘤儲存組成物包含濃度為或為約2.0 µg/mL-10.5 µg/mL之兩性黴素B。
在一些實施例中，本文所提供之腫瘤儲存組成物包含一或多種調節凋亡誘導之細胞死亡的試劑。在一些實施例中，該調節凋亡誘導之細胞死亡的試劑係一或多種凋亡蛋白酶蛋白酶之抑制劑。在一些實施例中，調節凋亡性細胞死亡之試劑係維生素E或EDTA。
在一些實施例中，腫瘤儲存培養基包含10% DMSO。
在一些實施例中，主題腫瘤儲存培養基中儲存之腫瘤樣本隨後用於本文所提供的用於產生治療性淋巴球(例如TIL、周邊血液淋巴球及骨髓浸潤淋巴球)之方法中。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之腫瘤儲存組成物，該腫瘤儲存組成物經改良以包含濃度為至少或至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000 µg/mL之克林達黴素。在某些實施例中，包含的克林達黴素之濃度係自或自約0.1-1 µg/mL、0.25-1 µg/mL、0.1-0.5 µg/mL、0.5-2 µg/mL、2-8 µg/mL、1-10 µg/mL、4-12 µg/mL、5-15 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL、40-50 µg/mL、50-60 µg/mL、60-70 µg/mL、70-80 µg/mL、80-90 µg/mL、90-100 µg/mL、100-110 µg/mL、110-120 µg/mL、120-130 µg/mL、130-140 µg/mL、140-150 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、10-90 µg/mL、20-80 µg/mL、30-70 µg/mL、40-60 µg/mL、45-55 µg/mL、50-100 µg/mL、100-150 µg/mL、150-200 µg/mL、200-250 µg/mL、250-300 µg/mL、300-350 µg/mL、350-400 µg/mL、400-450 µg/mL、450-500 µg/mL、500-550 µg/mL、550-600 µg/mL、600-650 µg/mL、650-700 µg/mL、700-750 µg/mL、750-800 µg/mL、800-850 µg/mL、850-900 µg/mL或950-1,000 µg/mL。在一些實施例中，包含的克林達黴素之濃度係自或自約0.1-100 µg/mL、1-50 µg/mL、1-100 µg/mL、1-250 µg/mL、1-500 µg/mL、250-750 µg/mL、350-450 µg/mL、450-550 µg/mL、550-650 µg/mL、400-600 µg/mL、350-650 µg/mL、300-700 µg/mL、200-800 µg/mL、500-1,000 µg/mL、750-1,250 µg/mL、1,000-1,500 µg/mL、1,250-1,750 µg/mL或1,500-2,000 µg/mL。在例示性實施例中，克林達黴素之濃度係或係約400-600 µg/mL。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之腫瘤儲存組成物，該腫瘤儲存組成物經改良以包含濃度為至少或至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30 、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000 µg/mL的萬古黴素。在某些實施例中，包含的萬古黴素之濃度係自或自約0.1-1 µg/mL、0.25-1 µg/mL、0.1-0.5 µg/mL、0.5-2 µg/mL、2-8 µg/mL、1-10 µg/mL、4-12 µg/mL、5-15 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL、40-50 µg/mL、50-60 µg/mL、60-70 µg/mL、70-80 µg/mL、80-90 µg/mL、90-100 µg/mL、100-110 µg/mL、110-120 µg/mL、120-130 µg/mL、130-140 µg/mL、140-150 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、10-90 µg/mL、20-80 µg/mL、30-70 µg/mL、40-60 µg/mL、45-55 µg/mL、50-100 µg/mL、100-150 µg/mL、150-200 µg/mL、200-250 µg/mL、250-300 µg/mL、300-350 µg/mL、350-400 µg/mL、400-450 µg/mL、450-500 µg/mL、500-550 µg/mL、550-600 µg/mL、600-650 µg/mL、650-700 µg/mL、700-750 µg/mL、750-800 µg/mL、800-850 µg/mL、850-900 µg/mL或950-1,000 µg/mL。在一些實施例中，包含的萬古黴素之濃度係自或自約0.1-100 µg/mL、1-50 µg/mL、1-100 µg/mL、1-250 µg/mL、1-500 µg/mL、100-200 µg/mL、150-250 µg/mL、200-400 µg/mL、350-450 µg/mL、400-600 µg/mL、550-650 µg/mL、50-650 µg/mL、100-600 µg/mL、250-750 µg/mL、500-1,000 µg/mL、750-1,250 µg/mL、1,000-1,500 µg/mL、1,250-1,750 µg/mL或1,500-2,000 µg/mL。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係或係約50-600 µg/mL。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係或係約100 µg/mL。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之腫瘤儲存組成物，該腫瘤儲存組成物經改良以包含濃度為至少或至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30 、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000 µg/mL的建它黴素。在某些實施例中，包含的建它黴素之濃度係自或自約0.1-1 µg/mL、0.25-1 µg/mL、0.1-0.5 µg/mL、0.5-2 µg/mL、2-8 µg/mL、1-10 µg/mL、4-12 µg/mL、5-15 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL、40-50 µg/mL、50-60 µg/mL、60-70 µg/mL、70-80 µg/mL、80-90 µg/mL、90-100 µg/mL、100-110 µg/mL、110-120 µg/mL、120-130 µg/mL、130-140 µg/mL、140-150 µg/mL、150-160 µg/mL、160-170 µg/mL、170-180 µg/mL、180-190 µg/mL、190-200 µg/mL、10-90 µg/mL、20-80 µg/mL、30-70 µg/mL、40-60 µg/mL、45-55 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、50-100 µg/mL、100-150 µg/mL、150-200 µg/mL、200-250 µg/mL、250-300 µg/mL、300-350 µg/mL、350-400 µg/mL、400-450 µg/mL、450-500 µg/mL、500-550 µg/mL、550-600 µg/mL、600-650 µg/mL、650-700 µg/mL、700-750 µg/mL、750-800 µg/mL、800-850 µg/mL、850-900 µg/mL或950-1,000 µg/mL。在一些實施例中，包含的建它黴素之濃度係自或自約0.1-100 µg/mL、1-50 µg/mL、25-75 µg/mL、1-100 µg/mL、1-250 µg/mL、1-500 µg/mL、250-750 µg/mL、500-1,000 µg/mL、750-1,250 µg/mL、1,000-1,500 µg/mL、1,250-1,750 µg/mL或1,500-2,000 µg/mL。在例示性實施例中，建它黴素之濃度係或係約50 µg/mL。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之腫瘤儲存組成物，該腫瘤儲存組成物經改良以包含濃度為至少或至少約0.1 µg/mL、0.2 µg/mL、0.3 µg/mL、0.4 µg/mL、0.5 µg/mL、0.6 µg/mL、0.7 µg/mL、0.8 µg/mL、0.9 µg/mL、1 µg/mL、2 µg/mL、3 µg/mL、4 µg/mL、5 µg/mL、6 µg/mL、7 µg/mL、8 µg/mL、9 µg/mL、10 µg/mL、15 µg/mL、20 µg/mL、25 µg/mL、30 µg/mL、35 µg/mL、40 µg/mL、45 µg/mL及50 µg/mL的兩性黴素B。在某些實施例中，該兩性黴素B之濃度係至少或至少約0.1-0.5 µg/mL、0.5-1 µg/mL、0.25-2 µg/mL、0.1-1 µg/mL、1-5 µg/mL、1-3 µg/mL、2-4 µg/mL、3-5 µg/mL、4-6 µg/mL、5-7 µg/mL、6-8 µg/mL、7-9 µg/mL、8-10 µg/mL、9-11 µg/mL、1-2 µg/mL、2-3 µg/mL、3-4 µg/mL、4-5 µg/mL、5-6 µg/mL、6-7 µg/mL、7-8 µg/mL、8-9 µg/mL、9-10 µg/mL、10-11 µg/mL、1-10 µg/mL、2-10.5 µg/mL、5-15 µg/mL、2-12 µg/mL、1-11 µg/mL、5-10 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL或40-50 µg/mL。在例示性實施例中，該兩性黴素B之濃度係或係約2.5-10 µg/mL。
在一些實施例中，該抗生素組分包含約50-600 µg/ml萬古黴素。在一些實施例中，該抗生素組分包含約100 µg/ml萬古黴素。
在一些實施例中，該抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約400-600 µg/ml克林達黴素。
在一些實施例中，該抗生素組分包含抗生素組合，該抗生素組合包含約50 µg/ml建它黴素及約50-600 µg/ml萬古黴素。在一些實施例中，該抗生素組分包含抗生素組合，該抗生素組合包含約50 µg/ml建它黴素及約100 µg/ml萬古黴素。 D. 腫瘤樣本
在一個態樣中，本文提供包含腫瘤樣本及任何本文所描述之腫瘤儲存組成物的組成物。
該等組成物包含任何適合的腫瘤樣本，包含用於得到TIL以用於如本文所描述之癌症療法的腫瘤樣本。在一些實施例中，腫瘤樣本係以下癌症類型之一：乳癌(包含三陰性乳癌)、胰臟癌、前列腺癌、結腸直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌、皮膚癌(包含但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑素瘤)、子宮頸癌、頭頸癌、卵巢癌、肉瘤、膀胱癌、甲狀腺癌及神經膠母細胞瘤。
在一些實施例中，該腫瘤組織樣本係液體腫瘤樣本。在特定實施例中，該液體腫瘤樣本係來自血液惡性病之液體腫瘤樣本。在一些實施例中，該樣本係血液樣本或骨髓樣本。在一些實施例中，該樣本係來自全血或骨髓之PBMC樣本。
在某些實施例中，該腫瘤樣本係自原發性腫瘤獲得。在一些實施例中，該腫瘤樣本係自侵襲性腫瘤獲得。在某些實施例中，該腫瘤樣本係自轉移性腫瘤獲得。在一些實施例中，該腫瘤樣本係自惡性黑素瘤獲得。 IV. 細胞培養基
本文提供用於本文所提供的製備治療性淋巴球之方法的細胞培養基，其包含抗生素組分。在主題細胞培養基中培養的淋巴球能夠在具有極少細菌(例如革蘭氏陽性及革蘭氏陰性細菌)及/或真菌污染情況下進行分化、耗竭及/或活化。在一些實施例中，細胞培養基中之細胞在培養基中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22天之後展現出至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的細胞存活率。在一些實施例中，細胞培養基可用於部分VI中擴增治療性T細胞(例如周邊血液淋巴球及骨髓浸潤淋巴球)之方法中。在某些實施例中，細胞培養基可用於部分VIII-X中所揭示之TIL製造方法中。以下更詳細地論述培養基之態樣。在一些實施例中，將細胞培養基用於本文所提供之Gen 2及Gen 3 TIL製造方法的第一次擴增或第二次擴增中。 A. 抗生素
本文所揭示之細胞培養基包含抗生素組分。本文所提供之細胞培養基中使用的抗生素使細菌及/或真菌污染之量減到最少，同時有利地對TIL展現低細胞毒性作用。在一些實施例中，該等抗生素使培養基中革蘭氏陰性及/或革蘭氏陽性細菌污染物之量減到最少。有用的抗生素包含但不限於兩性黴素B、克林達黴素及萬古黴素。在一些實施例中，腫瘤儲存組成物培養基進一步包含建它黴素。
在一些實施例中，細胞培養基包含克林達黴素。在一些實施例中，包含的克林達黴素之濃度係至少或至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30 、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000 µg/mL。在某些實施例中，包含的克林達黴素之濃度係自或自約0.1-1 µg/mL、0.25-1 µg/mL、0.1-0.5 µg/mL、0.5-2 µg/mL、2-8 µg/mL、1-10 µg/mL、4-12 µg/mL、5-15 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL、40-50 µg/mL、50-60 µg/mL、60-70 µg/mL、70-80 µg/mL、80-90 µg/mL、90-100 µg/mL、100-110 µg/mL、110-120 µg/mL、120-130 µg/mL、130-140 µg/mL、140-150 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、10-90 µg/mL、20-80 µg/mL、30-70 µg/mL、40-60 µg/mL、45-55 µg/mL、50-100 µg/mL、100-150 µg/mL、150-200 µg/mL、200-250 µg/mL、250-300 µg/mL、300-350 µg/mL、350-400 µg/mL、400-450 µg/mL、450-500 µg/mL、500-550 µg/mL、550-600 µg/mL、600-650 µg/mL、650-700 µg/mL、700-750 µg/mL、750-800 µg/mL、800-850 µg/mL、850-900 µg/mL或950-1,000 µg/mL。在一些實施例中，包含的克林達黴素之濃度係自或自約0.1-100 µg/mL、1-50 µg/mL、1-100 µg/mL、1-250 µg/mL、1-500 µg/mL、250-750 µg/mL、350-450 µg/mL、450-550 µg/mL、550-650 µg/mL、400-600 µg/mL、350-650 µg/mL、300-700 µg/mL、200-800 µg/mL、250-750 µg/mL、500-1,000 µg/mL、750-1,250 µg/mL、1,000-1,500 µg/mL、1,250-1,750 µg/mL或1,500-2,000 µg/mL。在例示性實施例中，克林達黴素之濃度係或係約400-600 µg/mL。
在某些實施例中，細胞培養基包含萬古黴素。在例示性實施例中，細胞培養基包含萬古黴素且不含額外抗生素。在一些實施例中，包含的萬古黴素之濃度係至少或至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30 、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000 µg/mL。在某些實施例中，包含的萬古黴素之濃度係自或自約1-10 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL、40-50 µg/mL、50-60 µg/mL、60-70 µg/mL、70-80 µg/mL、80-90 µg/mL、90-100 µg/mL、100-110 µg/mL、110-120 µg/mL、120-130 µg/mL、130-140 µg/mL、140-150 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、10-90 µg/mL、20-80 µg/mL、30-70 µg/mL、40-60 µg/mL、45-55 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、50-100 µg/mL、100-150 µg/mL、150-200 µg/mL、200-250 µg/mL、250-300 µg/mL、300-350 µg/mL、350-400 µg/mL、400-450 µg/mL、450-500 µg/mL、500-550 µg/mL、550-600 µg/mL、600-650 µg/mL、650-700 µg/mL、700-750 µg/mL、750-800 µg/mL、800-850 µg/mL、850-900 µg/mL或950-1,000 µg/mL。在一些實施例中，包含的萬古黴素之濃度係自或自約0.1-100 µg/mL、1-50 µg/mL、1-100 µg/mL、1-250 µg/mL、1-500 µg/mL、100-200 µg/mL、150-250 µg/mL、250-350 µg/mL、200-400 µg/mL、350-450 µg/mL、400-600 µg/mL、550-650 µg/mL、50-650 µg/mL、100-600 µg/mL、250-750 µg/mL、500-1,000 µg/mL、750-1,250 µg/mL、1,000-1,500 µg/mL、1,250-1,750 µg/mL或1,500-2,000 µg/mL。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係或係約50-600 µg/mL。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係或係約100 µg/mL。
在一些實施例中，細胞培養基包含萬古黴素及建它黴素。在某些實施例中，該儲存組成物包含克林達黴素及建它黴素。在一些實施例中，包含的建它黴素之濃度係至少或至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30 、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000 µg/mL。在某些實施例中，包含的建它黴素之濃度係自或自約1-10 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL、40-50 µg/mL、50-60 µg/mL、60-70 µg/mL、70-80 µg/mL、80-90 µg/mL、90-100 µg/mL、100-110 µg/mL、110-120 µg/mL、120-130 µg/mL、130-140 µg/mL、140-150 µg/mL、150-160 µg/mL、160-170 µg/mL、170-180 µg/mL、180-190 µg/mL、190-200 µg/mL、10-90 µg/mL、20-80 µg/mL、30-70 µg/mL、40-60 µg/mL、45-55 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、50-100 µg/mL、100-150 µg/mL、150-200 µg/mL、200-250 µg/mL、250-300 µg/mL、300-350 µg/mL、350-400 µg/mL、400-450 µg/mL、450-500 µg/mL、500-550 µg/mL、550-600 µg/mL、600-650 µg/mL、650-700 µg/mL、700-750 µg/mL、750-800 µg/mL、800-850 µg/mL、850-900 µg/mL或950-1,000 µg/mL。在一些實施例中，包含的建它黴素之濃度係自或自約0.1-100 µg/mL、1-50 µg/mL、25-75 µg/mL、1-100 µg/mL、1-250 µg/mL、1-500 µg/mL、250-750 µg/mL、500-1,000 µg/mL、750-1,250 µg/mL、1,000-1,500 µg/mL、1,250-1,750 µg/mL或1,500-2,000 µg/mL。在例示性實施例中，建它黴素之濃度係或係約50 µg/mL。
在一些實施例中，細胞培養基進一步包含一或多種抗真菌性抗生素。用於主題腫瘤儲存培養基之抗真菌性抗生素包含但不限於多烯類、唑類、咪唑類、三唑類、噻唑類、烯丙胺類及棘白菌素。例示性多烯類包含但不限於：兩性黴素B、殺念珠菌素、非律平、哈黴素、遊黴素、耐絲菌素及龜裂黴素。例示性咪唑類包含但不限於聯苯苄唑、布康唑、克氯黴唑、益康唑、芬替康唑、異康唑、酮康唑、盧立康唑、咪康唑、奧莫康唑、奧昔康唑、舍他康唑、硫康唑及噻康唑。有用的三唑類包含但不限於：阿巴康唑、艾菲康唑、環氧康唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、丙環唑、拉夫康唑、特康唑及伏立康唑。例示性棘白菌素包含但不限於：阿尼芬淨、卡泊芬淨、米卡芬淨。可包含在本文所揭示之細胞培養基中的額外抗真菌性抗生素包含但不限於：橙酮、苯甲酸、環吡酮、氟胞嘧啶、灰黃黴素、鹵苯炔醚、托萘酯、十一碳烯酸、三醋精、結晶紫、奧羅地美、米替福新、碘化鉀、日光黴素、硫酸銅、二硫化硒、硫代硫酸鈉、吡羅克酮乙醇胺鹽、碘喹醇、吖啶瑣辛、吡啶硫酮鋅及硫。
在一些實施例中，細胞培養基包含兩性黴素B。在某些實施例中，該兩性黴素B之濃度係至少或至少約0.1 µg/mL、0.2 µg/mL、0.3 µg/mL、0.4 µg/mL、0.5 µg/mL、0.6 µg/mL、0.7 µg/mL、0.8 µg/mL、0.9 µg/mL、1 µg/mL、2 µg/mL、3 µg/mL、4 µg/mL、5 µg/mL、6 µg/mL、7 µg/mL、8 µg/mL、9 µg/mL、10 µg/mL、15 µg/mL、20 µg/mL、25 µg/mL、30 µg/mL、35 µg/mL、40 µg/mL、45 µg/mL及50 µg/mL。在某些實施例中，該兩性黴素B之濃度係至少或至少約0.1-0.5 µg/mL、0.5-1 µg/mL、0.25-2 µg/mL、0.1-1 µg/mL、1-5 µg/mL、1-3 µg/mL、2-4 µg/mL、3-5 µg/mL、4-6 µg/mL、5-7 µg/mL、6-8 µg/mL、7-9 µg/mL、8-10 µg/mL、9-11 µg/mL、1-2 µg/mL、2-3 µg/mL、3-4 µg/mL、4-5 µg/mL、5-6 µg/mL、6-7 µg/mL、7-8 µg/mL、8-9 µg/mL、9-10 µg/mL、10-11 µg/mL、1-10 µg/mL、2-10.5 µg/mL、5-15 µg/mL、2-12 µg/mL、1-11 µg/mL、5-10 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL或40-50 µg/mL。在例示性實施例中，該兩性黴素B之濃度係或係約2.5-10 µg/mL。 B. 基礎培養基
本文所提供之細胞培養基包含基礎培養基。在特定實施例中，該基礎培養基係合成(亦即，所有化學組分已知)或無血清培養基。在一些實施例中，該基礎培養基包含：a)葡萄糖、b)複數種鹽；及c)複數種胺基酸及維生素。在一些實施例中，該基礎培養基包含以下培養基之一：CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無外源物質培養基、杜爾貝科氏改良型伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良型杜爾貝科氏培養基。
在例示性實施例中，該基礎培養基係RPMI 1640培養基、DMEM培養基或其組合。在一些實施例中，基礎培養基包含RPMI1 640 RPMI。在一些實施例中，基礎培養基包含伊格爾氏基礎培養基(BME)。在一些實施例中，基礎培養基包含AIM V培養基。在一些實施例中，基礎培養基包含RPMI1640及BME。在例示性實施例中，基礎培養基包含RMPI1640、BME及AIM V培養基。 C. 額外組分
除基礎培養基及抗生素外，本文所提供之細胞培養基可進一步包含以下一或多種組分。
在一些實施例中，細胞培養基包含麩醯胺酸或麩醯胺酸衍生物。在一些實施例中，該麩醯胺酸係L-麩醯胺酸。在某些實施例中，該麩醯胺酸係D-麩醯胺酸。在某些實施例中，該麩醯胺酸衍生物係L-丙胺酸-L-麩醯胺酸(GutaMax)。
在一些實施例中，細胞培養基包含轉鐵蛋白或轉鐵蛋白代用品。在一些實施例中，該轉鐵蛋白係重組轉鐵蛋白。
在一些實施例中，細胞培養基包含一或多種胰島素或胰島素代用品。在某些實施例中，該胰島素係重組胰島素。
在一些實施例中，細胞培養基包含一或多種白蛋白或白蛋白代用品。在某些實施例中，該血清係人類血清。在特定實施例中，該血清係人類AB血清。
在一些實施例中，細胞培養基包含膽固醇NF。
在一些實施例中，細胞培養基包含一或多種抗氧化劑。
在例示性實施例中，細胞培養基包含血清補充劑及/或血清替代物。在某些實施例中，血清補充劑或血清替代物包含但不限於以下之一或多者：CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑、CTS™免疫細胞血清替代物、一或多種白蛋白或白蛋白代用品、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白代用品、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素代用品、一或多種膠原蛋白前驅物、抗生素組分及一或多種微量元素。在一些實施例中，無血清或合成培養基中之總血清替代物濃度(vol%)為總無血清或合成培養基之體積的約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或合成培養基之總體積的約3%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或合成培養基之總體積的約5%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或合成培養基之總體積的約10%。
在一些實施例中，該合成培養基或無血清培養基包含一或多種選自由以下組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素以及含有微量元素部分Ag +、Al 3+、Ba 2+、Cd 2+、Co 2+、Cr 3+、Ge 4+、Se 4+、Br、T、Mn 2+、P、Si 4+、V 5+、Mo 6+、Ni 2+、Rb +、Sn 2+及Zr 4+之化合物。
在一些實施例中，該合成培養基或無血清培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰基乙醇。
在一些實施例中，細胞培養基包含IL-2。在特定實施例中，IL-2之濃度係3,000-6,000 IU/mL。
在一些實施例中，細胞培養基包含抗CD3抗體。在特定實施例中，抗CD3抗體係OKT-3抗體。在一些實施例中，OKT之濃度係30 ng/ml。
在一些實施例中，細胞培養基包含抗原呈現飼養細胞。
在一些實施例中，細胞培養基進一步包含IL-7及/或IL-15及/或IL-12。 D. 例示性細胞培養基
在例示性實施例中，本文所提供之細胞培養基包含a)基礎培養基；b) IL-2；c)抗CD3抗體；d)抗原呈現細胞；及e)抗生素組分，其選自：i)萬古黴素；ii)建它黴素及萬古黴素；以及iii)建它黴素及克林達黴素。在一些實施例中，抗CD3抗體係OKT-3。
在一些實施例中，本文所提供之TIL細胞培養基被配製用於TIL製造製程中，包含例如本文所描述之任何TIL製造製程。
在一些實施例中，使用TIL細胞培養基將TIL擴增成治療性TIL群體。在某些實施例中，TIL細胞培養基包含：a)基礎培養基；b) IL-2；c)抗CD3抗體；及d)抗生素組分，其選自：i)萬古黴素；ii)建它黴素及萬古黴素；以及iii)建它黴素及克林達黴素。在一些實施例中，抗CD3抗體係OKT-3。在例示性實施例中，TIL細胞培養基中所包含之抗生素係萬古黴素。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係或係約50-600 µg/mL。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係或係約100 µg/mL。
在某些實施例中，TIL細胞培養基包含：a)基礎培養基，其包含葡萄糖、複數種鹽及複數種胺基酸及/或維生素；b)麩醯胺酸或麩醯胺酸衍生物；c)血清；及d)抗生素組分，其選自：i)萬古黴素；ii)建它黴素及萬古黴素；以及iii)建它黴素及克林達黴素。基礎培養基可為本文所描述之基礎培養基中的任一種。在一些實施例中，基礎培養基包含RPMI 1640。在一些實施例中，基礎培養基包含伊格爾氏基礎培養基(BME)。在一些實施例中，基礎培養基包含AIM V培養基。在一些實施例中，基礎培養基包含RPMI 1640及BME。在例示性實施例中，基礎培養基包含RMPI 1640、BME及AIM V培養基。在一些實施例中，血清係人類血清(例如人類AB血清)。在一些實施例中，該麩醯胺酸係L-麩醯胺酸。在一些實施例中，TIL細胞培養基包含如本文所描述之CM1培養基(參見例如實例1)及抗生素組分，該抗生素組分選自：i)萬古黴素；ii)建它黴素及萬古黴素；以及iii)建它黴素及克林達黴素。在一些實施例中，TIL細胞培養基包含如本文所描述之CM2培養基(參見例如實例1)及抗生素組分，該抗生素組分選自：i)萬古黴素；ii)建它黴素及萬古黴素；以及iii)建它黴素及克林達黴素。在一些實施例中，TIL細胞培養基進一步包含IL-7及/或IL-15及/或IL-12及/或IL-21。在一些實施例中，TIL細胞培養基包含IL-2、飼養細胞及抗CD抗體(例如OKT-3)。在特定實施例中，細胞培養基包含a) CM1或CM2培養基(實例1)；b)抗生素組分，其選自：i)萬古黴素；ii)建它黴素及萬古黴素；以及iii)建它黴素及克林達黴素；c) IL-2；d)抗原呈現飼養細胞；及e)抗CD3抗體(例如OKT-3)。在一些實施例中，TIL細胞培養基包含3,000 IU/mL IL2或6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，TIL細胞培養基包含30 ng/mL OKT-3。此類組織培養基可用於例如本文所描述之TIL製造製程中之任一種。
在某些實施例中，細胞培養基包含：a)基礎培養基，其包含葡萄糖、複數種鹽及複數種胺基酸及/或維生素；b)血清白蛋白；c)膽固醇NF；及d)抗生素組分，其選自：i)萬古黴素；ii)建它黴素及萬古黴素；以及iii)建它黴素及克林達黴素。在一些實施例中，TIL細胞培養基亦包含麩醯胺酸或麩醯胺酸衍生物。在某些實施例中，該麩醯胺酸衍生物係G1utaMAX TM。在某些實施例中，細胞培養基包含：a)AIM V培養基；及b)抗生素組分，其選自：i)萬古黴素；ii)建它黴素及萬古黴素；以及iii)建它黴素及克林達黴素。在一些實施例中，細胞培養基包含CM3培養基(參見實例1)及抗生素組分，該抗生素組分選自：i)萬古黴素；ii)建它黴素及萬古黴素；以及iii)建它黴素及克林達黴素。在一些實施例中，細胞培養基包含CM4培養基(參見實例1)及抗生素組分，該抗生素組分選自：i)萬古黴素；ii)建它黴素及萬古黴素；以及iii)建它黴素及克林達黴素。在例示性實施例中，TIL細胞培養基包含IL-2。在例示性實施例中，細胞培養基包含濃度為3,000 IU/mL之IL-2。此類組織培養基可用於例如本文所描述之TIL製造製程中之任一種。
在某些實施例中，TIL細胞培養基包含：a)基礎培養基；b) IL-2；及c)抗生素組分，其選自：i)萬古黴素；ii)建它黴素及萬古黴素；以及iii)建它黴素及克林達黴素。在一些實施例中，抗CD3抗體係OKT-3。在一些實施例中，TIL細胞培養基包含：a)基礎培養基；b) IL-2；c)抗CD3抗體(例如OKT-3)；d)抗生素組分，其選自：i)萬古黴素；ii)建它黴素及萬古黴素；以及iii)建它黴素及克林達黴素；及e)周邊血液單核細胞(PBMC)。如本文所描述，此類培養基可用於例如將TIL擴增成治療性TIL群體。
在某些實施例中，TIL細胞培養基包含：a)基礎培養基；b) IL-2；c)抗CD3/抗CD28抗體；以及c)抗生素組分，其選自：i)萬古黴素；ii)建它黴素及萬古黴素；以及iii)建它黴素及克林達黴素。如本文所描述，此類培養基可用於例如擴增來自周邊血液之周邊血液淋巴球(PBL)。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之細胞培養基，該細胞培養基經改良以包含濃度為至少或至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000 µg/mL之克林達黴素。在某些實施例中，包含的克林達黴素之濃度係自或自約0.1-1 µg/mL、0.25-1 µg/mL、0.1-0.5 µg/mL、0.5-2 µg/mL、2-8 µg/mL、1-10 µg/mL、4-12 µg/mL、5-15 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL、40-50 µg/mL、50-60 µg/mL、60-70 µg/mL、70-80 µg/mL、80-90 µg/mL、90-100 µg/mL、100-110 µg/mL、110-120 µg/mL、120-130 µg/mL、130-140 µg/mL、140-150 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、10-90 µg/mL、20-80 µg/mL、30-70 µg/mL、40-60 µg/mL、45-55 µg/mL、50-100 µg/mL、100-150 µg/mL、150-200 µg/mL、200-250 µg/mL、250-300 µg/mL、300-350 µg/mL、350-400 µg/mL、400-450 µg/mL、450-500 µg/mL、500-550 µg/mL、550-600 µg/mL、600-650 µg/mL、650-700 µg/mL、700-750 µg/mL、750-800 µg/mL、800-850 µg/mL、850-900 µg/mL或950-1,000 µg/mL。在一些實施例中，包含的克林達黴素之濃度係自或自約0.1-100 µg/mL、1-50 µg/mL、1-100 µg/mL、1-250 µg/mL、1-500 µg/mL、250-750 µg/mL、350-450 µg/mL、450-550 µg/mL、550-650 µg/mL、400-600 µg/mL、350-650 µg/mL、300-700 µg/mL、200-800 µg/mL、500-1,000 µg/mL、750-1,250 µg/mL、1,000-1,500 µg/mL、1,250-1,750 µg/mL或1,500-2,000 µg/mL。在例示性實施例中，克林達黴素之濃度係或係約400-600 µg/mL。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之細胞培養基，該細胞培養基經改良以包含濃度為至少或至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30 、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000 µg/mL之萬古黴素。在某些實施例中，包含的萬古黴素之濃度係自或自約0.1-1 µg/mL、0.25-1 µg/mL、0.1-0.5 µg/mL、0.5-2 µg/mL、2-8 µg/mL、1-10 µg/mL、4-12 µg/mL、5-15 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL、40-50 µg/mL、50-60 µg/mL、60-70 µg/mL、70-80 µg/mL、80-90 µg/mL、90-100 µg/mL、100-110 µg/mL、110-120 µg/mL、120-130 µg/mL、130-140 µg/mL、140-150 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、10-90 µg/mL、20-80 µg/mL、30-70 µg/mL、40-60 µg/mL、45-55 µg/mL、50-100 µg/mL、100-150 µg/mL、150-200 µg/mL、200-250 µg/mL、250-300 µg/mL、300-350 µg/mL、350-400 µg/mL、400-450 µg/mL、450-500 µg/mL、500-550 µg/mL、550-600 µg/mL、600-650 µg/mL、650-700 µg/mL、700-750 µg/mL、750-800 µg/mL、800-850 µg/mL、850-900 µg/mL或950-1,000 µg/mL。在一些實施例中，包含的萬古黴素之濃度係自或自約0.1-100 µg/mL、1-50 µg/mL、1-100 µg/mL、1-250 µg/mL、1-500 µg/mL、100-200 µg/mL、150-250 µg/mL、200-400 µg/mL、350-450 µg/mL、400-600 µg/mL、550-650 µg/mL、50-650 µg/mL、100-600 µg/mL、250-750 µg/mL、500-1,000 µg/mL、750-1,250 µg/mL、1,000-1,500 µg/mL、1,250-1,750 µg/mL或1,500-2,000 µg/mL。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係或係約50-600 µg/mL。在一些實施例中，經改良之細胞培養基包含濃度為或為約100 µg/mL之萬古黴素。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之細胞培養基，該細胞培養基經改良以包含濃度為至少或至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30 、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000 µg/mL之建它黴素。在某些實施例中，包含的建它黴素之濃度係自或自約0.1-1 µg/mL、0.25-1 µg/mL、0.1-0.5 µg/mL、0.5-2 µg/mL、2-8 µg/mL、1-10 µg/mL、4-12 µg/mL、5-15 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL、40-50 µg/mL、50-60 µg/mL、60-70 µg/mL、70-80 µg/mL、80-90 µg/mL、90-100 µg/mL、100-110 µg/mL、110-120 µg/mL、120-130 µg/mL、130-140 µg/mL、140-150 µg/mL、150-160 µg/mL、160-170 µg/mL、170-180 µg/mL、180-190 µg/mL、190-200 µg/mL、10-90 µg/mL、20-80 µg/mL、30-70 µg/mL、40-60 µg/mL、45-55 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、50-100 µg/mL、100-150 µg/mL、150-200 µg/mL、200-250 µg/mL、250-300 µg/mL、300-350 µg/mL、350-400 µg/mL、400-450 µg/mL、450-500 µg/mL、500-550 µg/mL、550-600 µg/mL、600-650 µg/mL、650-700 µg/mL、700-750 µg/mL、750-800 µg/mL、800-850 µg/mL、850-900 µg/mL或950-1,000 µg/mL。在一些實施例中，包含的建它黴素之濃度係自或自約0.1-100 µg/mL、1-50 µg/mL、25-75 µg/mL、1-100 µg/mL、1-250 µg/mL、1-500 µg/mL、250-750 µg/mL、500-1,000 µg/mL、750-1,250 µg/mL、1,000-1,500 µg/mL、1,250-1,750 µg/mL或1,500-2,000 µg/mL。在例示性實施例中，建它黴素之濃度係或係約50 µg/mL。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之細胞培養基，該細胞培養基經改良以包含濃度為至少或至少約0.1 µg/mL、0.2 µg/mL、0.3 µg/mL、0.4 µg/mL、0.5 µg/mL、0.6 µg/mL、0.7 µg/mL、0.8 µg/mL、0.9 µg/mL、1 µg/mL、2 µg/mL、3 µg/mL、4 µg/mL、5 µg/mL、6 µg/mL、7 µg/mL、8 µg/mL、9 µg/mL、10 µg/mL、15 µg/mL、20 µg/mL、25 µg/mL、30 µg/mL、35 µg/mL、40 µg/mL、45 µg/mL及50 µg/mL之兩性黴素B。在某些實施例中，該兩性黴素B之濃度係至少或至少約0.1-0.5 µg/mL、0.5-1 µg/mL、0.25-2 µg/mL、0.1-1 µg/mL、1-5 µg/mL、1-3 µg/mL、2-4 µg/mL、3-5 µg/mL、4-6 µg/mL、5-7 µg/mL、6-8 µg/mL、7-9 µg/mL、8-10 µg/mL、9-11 µg/mL、1-2 µg/mL、2-3 µg/mL、3-4 µg/mL、4-5 µg/mL、5-6 µg/mL、6-7 µg/mL、7-8 µg/mL、8-9 µg/mL、9-10 µg/mL、10-11 µg/mL、1-10 µg/mL、2-10.5 µg/mL、5-15 µg/mL、2-12 µg/mL、1-11 µg/mL、5-10 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL或40-50 µg/mL。在例示性實施例中，該兩性黴素B之濃度係或係約2.5-10 µg/mL。
在一些實施例中，該抗生素組分包含約50-600 µg/ml萬古黴素。在一些實施例中，該抗生素組分包含約100 µg/ml萬古黴素。
在一些實施例中，該抗生素組分包含約50 µg/ml建它黴素及約400-600 µg/ml克林達黴素。
在一些實施例中，該抗生素組分包含抗生素組合，該抗生素組合包含約50 µg/ml建它黴素及約50-600 µg/ml萬古黴素。在一些實施例中，該抗生素組分包含抗生素組合，該抗生素組合包含約50 µg/ml建它黴素及約100 µg/ml萬古黴素。 E. 細胞組成物
在另一態樣中，本發明提供一種細胞組成物，其包含任何前述段落中描述的經改良以包含細胞之細胞培養基。在一些實施例中，細胞係來源於腫瘤樣本之TIL。在一些實施例中，TIL係來源於以下癌症類型之一的樣本：乳癌(包含三陰性乳癌)、胰臟癌、前列腺癌、結腸直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌、皮膚癌(包含但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑素瘤)、子宮頸癌、頭頸癌、卵巢癌、肉瘤、膀胱癌及神經膠母細胞瘤。
在一些實施例中，TIL係來源於液體腫瘤樣本。在特定實施例中，該液體腫瘤樣本係來自血液惡性病之液體腫瘤樣本。
在一些實施例中，細胞係來源於血液樣本或骨髓樣本。在一些實施例中，細胞包含周邊血液淋巴球及/或骨髓浸潤淋巴球。在一些實施例中，該樣本係來自全血或骨髓之PBMC樣本。
在某些實施例中，細胞係自腫瘤樣本，即原發性腫瘤獲得。在一些實施例中，該腫瘤樣本係自侵襲性腫瘤獲得。在某些實施例中，該腫瘤樣本係自轉移性腫瘤獲得。在一些實施例中，該腫瘤樣本係自惡性黑素瘤獲得。
在一些實施例中，細胞組成物中之細胞之培養基中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天之後展現出至少或至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的細胞存活率。
在一些實施例中，細胞組成物中所包含之TIL包含記憶TIL、CD3+/CD4+及/或CD3+/CD8+細胞。本文所提供之細胞培養基有利地允許CD3+/CD4+及/或CD3+/CD8+細胞之分化，同時使細菌及/或真菌污染物減到最少。在一些實施例中，組成物中所包含之TIL展現與不含抗生素(例如萬古黴素及克林達黴素)之組成物類似的記憶TIL群體。在例示性實施例中，組成物中所包含之TIL展現出與不含抗生素(例如萬古黴素及克林達黴素)之對照組成物類似的分化CD3+/CD4+、活化CD3+/CD4+及/或耗竭CD3+/CD4+ TIL群體。在某些實施例中，TIL展現出與不含抗生素(例如萬古黴素及克林達黴素)之對照組成物類似的分化CD3+/CD8+、活化CD3+/CD8+及/或耗竭CD3+/ CD8+ TIL群體。 V. 腫瘤洗滌緩衝液
在另一態樣中，本文提供包含抗生素組分之腫瘤洗滌緩衝液。此類洗滌緩衝液適用於本文所提供之方法，特別是用於在碎斷或消化之前洗滌腫瘤樣本、或在獲得供擴增之T細胞及TIL群體之前洗滌腫瘤片段。本文所提供之洗滌緩衝液中使用之抗生素使細菌及/或真菌污染之量減到最少，同時有利地對TIL展現低細胞毒性作用。在一些實施例中，抗生素使在本文所提供之方法中經歷進一步處理的腫瘤及腫瘤片段中革蘭氏陰性及/或革蘭氏陽性細菌污染物之量減到最少。有用的抗生素包含但不限於兩性黴素B、克林達黴素及萬古黴素。
在一些實施例中，細胞培養基包含克林達黴素。在一些實施例中，包含的克林達黴素之濃度係至少或至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30 、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000 µg/mL。在某些實施例中，包含的克林達黴素之濃度係自或自約0.1-1 µg/mL、0.25-1 µg/mL、0.1-0.5 µg/mL、0.5-2 µg/mL、2-8 µg/mL、1-10 µg/mL、4-12 µg/mL、5-15 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL、40-50 µg/mL、50-60 µg/mL、60-70 µg/mL、70-80 µg/mL、80-90 µg/mL、90-100 µg/mL、100-110 µg/mL、110-120 µg/mL、120-130 µg/mL、130-140 µg/mL、140-150 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、10-90 µg/mL、20-80 µg/mL、30-70 µg/mL、40-60 µg/mL、45-55 µg/mL、50-100 µg/mL、100-150 µg/mL、150-200 µg/mL、200-250 µg/mL、250-300 µg/mL、300-350 µg/mL、350-400 µg/mL、400-450 µg/mL、450-500 µg/mL、500-550 µg/mL、550-600 µg/mL、600-650 µg/mL、650-700 µg/mL、700-750 µg/mL、750-800 µg/mL、800-850 µg/mL、850-900 µg/mL或950-1,000 µg/mL。在一些實施例中，包含的克林達黴素之濃度係自或自約0.1-100 µg/mL、1-50 µg/mL、1-100 µg/mL、1-250 µg/mL、1-500 µg/mL、250-750 µg/mL、350-450 µg/mL、450-550 µg/mL、550-650 µg/mL、400-600 µg/mL、350-650 µg/mL、300-700 µg/mL、200-800 µg/mL、250-750 µg/mL、500-1,000 µg/mL、750-1,250 µg/mL、1,000-1,500 µg/mL、1,250-1,750 µg/mL或1,500-2,000 µg/mL。在例示性實施例中，克林達黴素之濃度係或係約400-600 µg/mL。
在某些實施例中，洗滌緩衝液包含萬古黴素。在例示性實施例中，洗滌緩衝液包含萬古黴素且不含額外抗生素。在一些實施例中，包含的萬古黴素之濃度係至少或至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30 、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000 µg/mL。在某些實施例中，包含的萬古黴素之濃度係自或自約1-10 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL、40-50 µg/mL、50-60 µg/mL、60-70 µg/mL、70-80 µg/mL、80-90 µg/mL、90-100 µg/mL、100-110 µg/mL、110-120 µg/mL、120-130 µg/mL、130-140 µg/mL、140-150 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、10-90 µg/mL、20-80 µg/mL、30-70 µg/mL、40-60 µg/mL、45-55 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、50-100 µg/mL、100-150 µg/mL、150-200 µg/mL、200-250 µg/mL、250-300 µg/mL、300-350 µg/mL、350-400 µg/mL、400-450 µg/mL、450-500 µg/mL、500-550 µg/mL、550-600 µg/mL、600-650 µg/mL、650-700 µg/mL、700-750 µg/mL、750-800 µg/mL、800-850 µg/mL、850-900 µg/mL或950-1,000 µg/mL。在一些實施例中，包含的萬古黴素之濃度係自或自約0.1-100 µg/mL、1-50 µg/mL、1-100 µg/mL、1-250 µg/mL、1-500 µg/mL、100-200 µg/mL、150-250 µg/mL、250-350 µg/mL、200-400 µg/mL、350-450 µg/mL、400-600 µg/mL、550-650 µg/mL、50-650 µg/mL、100-600 µg/mL、250-750 µg/mL、500-1,000 µg/mL、750-1,250 µg/mL、1,000-1,500 µg/mL、1,250-1,750 µg/mL或1,500-2,000 µg/mL。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係或係約50-600 µg/mL。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係或係約100 µg/mL。
在一些實施例中，洗滌緩衝液包含萬古黴素及建它黴素。在某些實施例中，該儲存組成物包含克林達黴素及建它黴素。在一些實施例中，包含的建它黴素之濃度係至少或至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30 、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000 µg/mL。在某些實施例中，包含的建它黴素之濃度係自或自約1-10 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL、40-50 µg/mL、50-60 µg/mL、60-70 µg/mL、70-80 µg/mL、80-90 µg/mL、90-100 µg/mL、100-110 µg/mL、110-120 µg/mL、120-130 µg/mL、130-140 µg/mL、140-150 µg/mL、150-160 µg/mL、160-170 µg/mL、170-180 µg/mL、180-190 µg/mL、190-200 µg/mL、10-90 µg/mL、20-80 µg/mL、30-70 µg/mL、40-60 µg/mL、45-55 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、50-100 µg/mL、100-150 µg/mL、150-200 µg/mL、200-250 µg/mL、250-300 µg/mL、300-350 µg/mL、350-400 µg/mL、400-450 µg/mL、450-500 µg/mL、500-550 µg/mL、550-600 µg/mL、600-650 µg/mL、650-700 µg/mL、700-750 µg/mL、750-800 µg/mL、800-850 µg/mL、850-900 µg/mL或950-1,000 µg/mL。在一些實施例中，包含的建它黴素之濃度係自或自約0.1-100 µg/mL、1-50 µg/mL、25-75 µg/mL、1-100 µg/mL、1-250 µg/mL、1-500 µg/mL、250-750 µg/mL、500-1,000 µg/mL、750-1,250 µg/mL、1,000-1,500 µg/mL、1,250-1,750 µg/mL或1,500-2,000 µg/mL。在例示性實施例中，建它黴素之濃度係或係約50 µg/mL。
主題洗滌緩衝液中之額外組分包含電解質(例如鉀離子、鈉離子、鎂離子及鈣離子)。在一些實施例中，洗滌緩衝液包含在生理條件下有效之pH緩衝液。在一些實施例中，洗滌緩衝液進一步包含單糖(例如葡萄糖。
在一些實施例中，腫瘤洗滌緩衝液包含以下緩衝液之一：磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、杜爾貝科氏磷酸鹽緩衝鹽水(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline，DPBS)、伊格爾氏最低必需培養基(EMEM)、杜爾貝科氏改良型伊格爾氏培養基(DMEM)、伊斯科夫氏改良型伊格爾氏培養基(MEM)、洛斯維·帕克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)、哈姆氏F12(Ham's F12)、1:1 DMEM/F12或M199。 A. 例示性腫瘤洗滌緩衝液
在例示性實施例中，本文所提供之腫瘤洗滌緩衝液包含：(i)一或多種電解質；(ii)在生理條件下有效之pH緩衝液；及(iii)抗生素組分。在一些實施例中，該一或多種電解質選自鉀離子、鈉離子、鎂離子及鈣離子。在一些實施例中，pH緩衝液係磷酸鹽緩衝液。在一些實施例中，洗滌緩衝液在維持生理滲透壓方面有效。在一些實施例中，洗滌緩衝液進一步包含單糖(例如葡萄糖)。
在一些實施例中，腫瘤洗滌緩衝液包含以下緩衝液之一：磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、杜爾貝科氏磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)、伊格爾氏最低必需培養基(EMEM)、杜爾貝科氏改良型伊格爾氏培養基(DMEM)、伊斯科夫氏改良型伊格爾氏培養基(MEM)、洛斯維·帕克紀念研究所(RPMI)、哈姆氏F12、1:1 DMEM/F12或M199，及抗生素組分。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之細胞培養基，該細胞培養基經改良以包含濃度為至少或至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000 µg/mL之克林達黴素。在某些實施例中，包含的克林達黴素之濃度係自或自約0.1-1 µg/mL、0.25-1 µg/mL、0.1-0.5 µg/mL、0.5-2 µg/mL、2-8 µg/mL、1-10 µg/mL、4-12 µg/mL、5-15 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL、40-50 µg/mL、50-60 µg/mL、60-70 µg/mL、70-80 µg/mL、80-90 µg/mL、90-100 µg/mL、100-110 µg/mL、110-120 µg/mL、120-130 µg/mL、130-140 µg/mL、140-150 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、10-90 µg/mL、20-80 µg/mL、30-70 µg/mL、40-60 µg/mL、45-55 µg/mL、50-100 µg/mL、100-150 µg/mL、150-200 µg/mL、200-250 µg/mL、250-300 µg/mL、300-350 µg/mL、350-400 µg/mL、400-450 µg/mL、450-500 µg/mL、500-550 µg/mL、550-600 µg/mL、600-650 µg/mL、650-700 µg/mL、700-750 µg/mL、750-800 µg/mL、800-850 µg/mL、850-900 µg/mL或950-1,000 µg/mL。在一些實施例中，包含的克林達黴素之濃度係自或自約0.1-100 µg/mL、1-50 µg/mL、1-100 µg/mL、1-250 µg/mL、1-500 µg/mL、250-750 µg/mL、350-450 µg/mL、450-550 µg/mL、550-650 µg/mL、400-600 µg/mL、350-650 µg/mL、300-700 µg/mL、200-800 µg/mL、500-1,000 µg/mL、750-1,250 µg/mL、1,000-1,500 µg/mL、1,250-1,750 µg/mL或1,500-2,000 µg/mL。在例示性實施例中，克林達黴素之濃度係或係約400-600 µg/mL。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之洗滌緩衝液，該洗滌緩衝液經改良以包含濃度為至少或至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30 、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000 µg/mL之萬古黴素。在某些實施例中，包含的萬古黴素之濃度係自或自約0.1-1 µg/mL、0.25-1 µg/mL、0.1-0.5 µg/mL、0.5-2 µg/mL、2-8 µg/mL、1-10 µg/mL、4-12 µg/mL、5-15 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL、40-50 µg/mL、50-60 µg/mL、60-70 µg/mL、70-80 µg/mL、80-90 µg/mL、90-100 µg/mL、100-110 µg/mL、110-120 µg/mL、120-130 µg/mL、130-140 µg/mL、140-150 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、10-90 µg/mL、20-80 µg/mL、30-70 µg/mL、40-60 µg/mL、45-55 µg/mL、50-100 µg/mL、100-150 µg/mL、150-200 µg/mL、200-250 µg/mL、250-300 µg/mL、300-350 µg/mL、350-400 µg/mL、400-450 µg/mL、450-500 µg/mL、500-550 µg/mL、550-600 µg/mL、600-650 µg/mL、650-700 µg/mL、700-750 µg/mL、750-800 µg/mL、800-850 µg/mL、850-900 µg/mL或950-1,000 µg/mL。在一些實施例中，包含的萬古黴素之濃度係自或自約0.1-100 µg/mL、1-50 µg/mL、1-100 µg/mL、1-250 µg/mL、1-500 µg/mL、100-200 µg/mL、150-250 µg/mL、200-400 µg/mL、350-450 µg/mL、400-600 µg/mL、550-650 µg/mL、50-650 µg/mL、100-600 µg/mL、250-750 µg/mL、500-1,000 µg/mL、750-1,250 µg/mL、1,000-1,500 µg/mL、1,250-1,750 µg/mL或1,500-2,000 µg/mL。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係或係約50-600 µg/mL。在一些實施例中，經改良之細胞培養基包含濃度為或為約100 µg/mL之萬古黴素。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之洗滌緩衝液，該洗滌緩衝液經改良以包含濃度為至少或至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30 、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000 µg/mL之建它黴素。在某些實施例中，包含的建它黴素之濃度係自或自約0.1-1 µg/mL、0.25-1 µg/mL、0.1-0.5 µg/mL、0.5-2 µg/mL、2-8 µg/mL、1-10 µg/mL、4-12 µg/mL、5-15 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL、40-50 µg/mL、50-60 µg/mL、60-70 µg/mL、70-80 µg/mL、80-90 µg/mL、90-100 µg/mL、100-110 µg/mL、110-120 µg/mL、120-130 µg/mL、130-140 µg/mL、140-150 µg/mL、150-160 µg/mL、160-170 µg/mL、170-180 µg/mL、180-190 µg/mL、190-200 µg/mL、10-90 µg/mL、20-80 µg/mL、30-70 µg/mL、40-60 µg/mL、45-55 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、50-100 µg/mL、100-150 µg/mL、150-200 µg/mL、200-250 µg/mL、250-300 µg/mL、300-350 µg/mL、350-400 µg/mL、400-450 µg/mL、450-500 µg/mL、500-550 µg/mL、550-600 µg/mL、600-650 µg/mL、650-700 µg/mL、700-750 µg/mL、750-800 µg/mL、800-850 µg/mL、850-900 µg/mL或950-1,000 µg/mL。在一些實施例中，包含的建它黴素之濃度係自或自約0.1-100 µg/mL、1-50 µg/mL、25-75 µg/mL、1-100 µg/mL、1-250 µg/mL、1-500 µg/mL、250-750 µg/mL、500-1,000 µg/mL、750-1,250 µg/mL、1,000-1,500 µg/mL、1,250-1,750 µg/mL或1,500-2,000 µg/mL。在例示性實施例中，建它黴素之濃度係或係約50 µg/mL。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之洗滌緩衝液，該洗滌緩衝液經改良以包含濃度為至少或至少約0.1 µg/mL、0.2 µg/mL、0.3 µg/mL、0.4 µg/mL、0.5 µg/mL、0.6 µg/mL、0.7 µg/mL、0.8 µg/mL、0.9 µg/mL、1 µg/mL、2 µg/mL、3 µg/mL、4 µg/mL、5 µg/mL、6 µg/mL、7 µg/mL、8 µg/mL、9 µg/mL、10 µg/mL、15 µg/mL、20 µg/mL、25 µg/mL、30 µg/mL、35 µg/mL、40 µg/mL、45 µg/mL及50 µg/mL之兩性黴素B。在某些實施例中，該兩性黴素B之濃度係至少或至少約0.1-0.5 µg/mL、0.5-1 µg/mL、0.25-2 µg/mL、0.1-1 µg/mL、1-5 µg/mL、1-3 µg/mL、2-4 µg/mL、3-5 µg/mL、4-6 µg/mL、5-7 µg/mL、6-8 µg/mL、7-9 µg/mL、8-10 µg/mL、9-11 µg/mL、1-2 µg/mL、2-3 µg/mL、3-4 µg/mL、4-5 µg/mL、5-6 µg/mL、6-7 µg/mL、7-8 µg/mL、8-9 µg/mL、9-10 µg/mL、10-11 µg/mL、1-10 µg/mL、2-10.5 µg/mL、5-15 µg/mL、2-12 µg/mL、1-11 µg/mL、5-10 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL或40-50 µg/mL。在例示性實施例中，該兩性黴素B之濃度係或係約2.5-10 µg/mL。
在一些實施例中，該抗生素組分包含約50-600 µg/ml萬古黴素。在一些實施例中，該抗生素組分包含約100 µg/ml萬古黴素。
在一些實施例中，該抗生素組分包含約50 µg/ml建它黴素及約400-600 µg/ml克林達黴素。
在一些實施例中，該抗生素組分包含抗生素組合，該抗生素組合包含約50 µg/ml建它黴素及約50-600 µg/ml萬古黴素。在一些實施例中，該抗生素組分包含抗生素組合，該抗生素組合包含約50 µg/ml建它黴素及約100 µg/ml萬古黴素。 VI. 使用細胞儲存、細胞培養基及洗滌緩衝液組成物之例示性方法
如本文所揭示，本文所提供之主題細胞儲存及細胞培養基組成物可用於任何適合TIL製造方法中。以下提供使用該等主題組成物之例示性TIL製造方法。
在一個態樣中係一種用於擴增T細胞之方法，其包含以下步驟：藉由使用任何前述段落中描述之細胞培養基培養自個體獲得之腫瘤樣本之T細胞群體以實現第一T細胞群體之生長來擴增該T細胞群體。在一些實施例中，細胞培養基包含抗生素組分，該抗生素組分包括本文所揭示之任何濃度的：1)抗生素組合，其選自：i)建它黴素及萬古黴素；及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。在一些實施例中，該培養基進一步包含IL-2。在一些實施例中，該培養基進一步包含IL-7及/或IL-15及/或IL-21。在某些實施例中，將該T細胞群體培養約3至14天之時段。在一些實施例中，將腫瘤樣本預先儲存於任何前述段落中描述的腫瘤儲存組成物中。
在另一態樣中，本文提供一種用於快速擴增T細胞之方法，其包括使第一T細胞群體與任何前述段落中描述之細胞培養基接觸以實現該第一T細胞群體之快速生長，由此產生第二T細胞群體，其中該快速擴增進行約7至14天之時段。在一些實施例中，細胞培養基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)、抗原呈現細胞(APC)及抗生素組分，且其中該抗生素組分包含：1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。在一些實施例中，該培養基進一步包含IL-7及/或IL-15及/或IL-21。
在另一態樣中，本文提供一種用於將TIL擴增成治療性TIL群體之方法。在此方法之步驟a)中，提供樣本，該樣本包含複數個來自手術切除、至少一次穿刺活體組織切片檢查、至少一次粗針活體組織切片檢查、至少一次小型活體組織切片檢查或用於自個體獲得含有腫瘤及TIL之混合物之腫瘤樣本的其他方式獲得之腫瘤樣本的腫瘤細胞及TIL。在一些實施例中，將腫瘤樣本儲存於任何前述段落中描述的腫瘤儲存組成物中。在步驟b)中，第一TIL群體係藉由將腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得。在步驟c)中，接著將腫瘤片段引入密閉系統中。在步驟d)中，藉由在第一細胞培養基中培養該第一TIL群體來進行第一次擴增以產生第二TIL群體，其中該第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中該第一次擴增進行約3-14天以獲得該第二TIL群體，其中自步驟c)至步驟d)之轉變係在不打開該系統之情況下發生，其中該第一細胞培養基包含IL-2及第一抗生素組分。在步驟e)中，接著，藉由在第二細胞培養基中培養該第二TIL群體進行第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二次擴增係進行約7 -14天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體係治療性TIL群體，其中第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中自步驟d)至步驟e)之轉變係在不打開該系統之情況下發生。第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3、抗原呈現細胞(APC)及第二抗生素組分。在步驟f)中，收集自步驟e)獲得的治療性TIL群體，其中自步驟e)至步驟f)之轉變係在不打開系統之情況下發生。另外，在步驟g)中，將自步驟f)收集之治療性TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟f)至步驟g)之轉移係在不打開系統之情況下發生。在例示性實施例中，第一抗生素組分與第二抗生素組分相同或不同。在一些實施例中，第一抗生素組分及第二抗生素組分獨立地包含：1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。在其他實施例中，第一次擴增及第二次擴增可進行總計約22天或更短。在其他實施例中，第一次擴增可在約11天內進行。在其他實施例中，第二次擴增可在約11天內進行。在其他實施例中，第一次擴增可在約11天內進行，且第二次擴增可在約11天內進行。在其他實施例中，第二次擴增可分成第一時段及第二時段，其中第二次擴增之第一時段係藉由在補充有IL-2、OKT-3、抗原呈現細胞(APC)及第二抗生素組分之第二培養基中培養第二細胞群體約5天來進行，且其中該第二次擴增之第二時段係藉由在補充有額外IL-2之額外第二培養基中培養第二細胞群體約6天來進行。在一些實施例中，在第二次擴增之第一時段之後且在第二次擴增之第二時段開始之前，將第二細胞群體自在第二次擴增之第一時段期間培養第二群體細胞的具有第一氣體可透過表面區域之第一容器轉移至將第二細胞群體培養第二次擴增之第二時段的具有第二氣體可透過表面區域之第二容器，其中該第二氣體可透過表面區域大於該第一氣體可透過表面區域，且其中該第二細胞群體自第一容器轉移至第二容器係在不打開該系統之情況下進行。在一些實施例中，該第二氣體可透過表面區域比該第一氣體可透過表面區域要大至少約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更高倍數。在一些實施例中，第一培養基進一步包含IL-7及/或IL-15及/或IL-21。在一些實施例中，第二培養基進一步包含IL-7及/或IL-15及/或IL-21。
在一個態樣中，本文提供一種用於將TIL擴增成治療性TIL群體之方法。在此方法之步驟a)中，提供自手術切除、至少一次穿刺活體組織切片檢查、至少一次粗針活體組織切片檢查、至少一次小型活體組織切片檢查或用於自個體獲得含有腫瘤及TIL之混合物之樣本的其他方式獲得之第一TIL群體。在步驟b)中，使第一TIL群體與第一細胞培養基接觸。在步驟c)中，第一TIL群體之第一次擴增(或初始第一次擴增)係在第一細胞培養基中進行以獲得第二TIL群體，其中該第一細胞培養基包含IL-2、視情況選用之抗CD3抗體(例如OKT-3)、視情況選用之抗原呈現細胞(例如經照射之同種異體周邊血液單核細胞(PBMC))及第一抗生素組分，視情況其中該第一次擴增係在約8天或更短時段內發生，視情況第一次TIL擴增可進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。在步驟c)中，第二TIL群體之第二次擴增(或快速第二次擴增)係在第二細胞培養基中進行以獲得治療性TIL群體，其中該第二細胞培養基包含IL-2、抗CD3抗體(例如OKT-3)、第二抗生素組分及視情況選用之抗原呈現細胞(例如經照射之同種異體周邊血液單核細胞(PBMC))；且其中第二次擴增係在10天或更短時段內進行，視情況該第二次擴增可在第二次擴增起始之後進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。在步驟e)中，收集治療性TIL群體。在一些實施例中，第一培養基與第二培養基中所包含之抗生素相同或不同。在一些實施例中，第一培養基與第二培養基中所包含之抗生素獨立地包含本文所揭示之任何濃度的：1)建它黴素及萬古黴素、2)建它黴素及克林達黴素、3)或抗生素萬古黴素。在一些實施例中，第一次擴增可在約7天內進行。在一些實施例中，第二次擴增可在約9天內進行。在一些實施例中，第一次擴增及第二次擴增可進行總計約16天。在一些實施例中，將第二次擴增分成第一時段及第二時段，其中第二次擴增之第一時段係藉由在補充有IL-2、OKT-3、抗原呈現細胞(APC)及第二抗生素組分之第二培養基中培養第二細胞群體約3天來進行，且其中該第二次擴增之第二時段係藉由在補充有額外IL-2之額外第二培養基中培養第二細胞群體約6天來進行。在一些實施例中，在第二次擴增之第一時段之後且在第二次擴增之第二時段開始之前，將第二細胞群體自在第二次擴增之第一時段期間培養第二群體細胞的具有第一氣體可透過表面區域之第一容器轉移至將第二細胞群體培養第二次擴增之第二時段的具有第二氣體可透過表面區域之第二容器，其中該第二氣體可透過表面區域大於該第一氣體可透過表面區域，且其中該第二細胞群體自第一容器轉移至第二容器係在不打開該系統之情況下進行。在一些實施例中，該第二氣體可透過表面區域比該第一氣體可透過表面區域要大至少約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更高倍數。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之的用於擴增TIL之方法，該方法經改良以使得在第二次擴增之第一時段之後且在第二次擴增之第二時段開始之前，第二細胞群體自在第二次擴增之第一時段期間培養第二細胞群體的具有第一氣體可透過表面區域之第一容器轉移至用補充有IL-2及視情況選用之第二抗生素組分之額外第二培養基培養第二細胞群體第二次擴增之第二時段的具有第二氣體可透過表面區域之第二容器，其中該第二氣體可透過表面區域大於該第一氣體可透過表面區域，且其中該第二細胞群體自該第一容器轉移至該第二容器係在不打開該系統之情況下進行。在一些實施例中，該第二氣體可透過表面區域比該第一氣體可透過表面區域要大至少約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更高倍數。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的用於擴增TIL之方法，該方法經改良以使得在第一次擴增之第1天至第3天中之任一天，第一培養基補充有OKT-3。
在另一態樣中，本文提供一種擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之方法。在此方法之步驟a)中，第一TIL群體之初始第一次擴增係藉由在第一培養基中培養第一T細胞群體進行以實現第一TIL群體生長及起始其活化，該第一培養基包含IL-2、視情況選用之抗CD3抗體(例如OKT-3)、視情況選用之抗原呈現細胞(例如經照射之同種異體周邊血液單核細胞(PBMC))及第一抗生素組分。TIL係自手術切除、至少一次穿刺活體組織切片檢查、至少一次粗針活體組織切片檢查、至少一次小型活體組織切片檢查或用於自個體獲得含有腫瘤及TIL之混合物之樣本的其他方式獲得。在步驟b)中，第一TIL群體之快速第二次擴增係在步驟(a)中起始的第一TIL群體之活化開始衰退之後進行。在此擴增步驟中，將第一TIL群體培養於包含IL-2、視情況選用之抗CD3抗體(例如OKT-3)、第二抗生素組分及視情況選用的經照射之同種異體周邊血液單核細胞(PBMC)之第二培養基中以實現第一TIL群體之生長且增強其活化，由此獲得第二TIL群體，其中該第二TIL群體係治療性TIL群體。在步驟c)中，收集治療性TIL群體。在一些方法中，第一培養基與第二培養基中所包含之抗生素相同或不同。在一些實施例中，第一培養基及第二培養基中所包含之抗生素包含1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。在一些實施例中，將第二次擴增分成第一時段及第二時段，其中第二次擴增之第一時段係藉由在補充有IL-2、OKT-3、抗原呈現細胞(APC)及第二抗生素組分之第二培養基中培養第二細胞群體約3天來進行，且其中該第二次擴增之第二時段係藉由在補充有額外IL-2之額外第二培養基中培養第二細胞群體約6天來進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的用於擴增TIL之方法，該方法經改良以使得在第二次擴增之第一時段之後且在第二次擴增之第二時段開始之前，第二細胞群體自在第二次擴增之第一時段期間培養第二細胞群體的具有第一氣體可透過表面區域之第一容器轉移至用補充有IL-2及視情況選用之第二抗生素組分之額外第二培養基培養第二細胞群體第二次擴增之第二時段的具有第二氣體可透過表面區域之第二容器，其中該第二氣體可透過表面區域大於該第一氣體可透過表面區域，且其中該第二細胞群體自該第一容器轉移至該第二容器係在不打開該系統之情況下進行。在一些實施例中，該第二氣體可透過表面區域比該第一氣體可透過表面區域要大至少約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更高倍數。
在另一態樣中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的用於擴增TIL之方法，該方法經改良以使得在第一次擴增起始之前，PD-1陽性TIL係選自第一TIL群體以獲得富集PD-1之TIL群體且第一次擴增係用該富集PD-1之TIL群體進行。在一些實施例中，第一TIL群體係藉由消化自獲自手術切除、至少一次穿刺活體組織切片檢查、至少一次粗針活體組織切片檢查、至少一次小型活體組織切片檢查或用於自個體獲得含有腫瘤及TIL之混合物之樣本的其他方式的腫瘤片段或樣本，視情況對消化物進行機械解聚集，而自此類腫瘤片段或樣本獲得，且該富集PD-1之TIL群體係藉由自該消化物選擇PD-1陽性TIL來獲得。在一些實施例中，該消化物係使用一或多膠原蛋白酶進行。在其他實施例中，該消化物係使用膠原蛋白酶及去氧核糖核酸酶進行。在其他實施例中，該消化物係使用膠原蛋白酶、去氧核糖核酸酶I及中性蛋白酶進行。可使用任何適合的PD-1富集方法獲得PD-1陽性TIL，包含本文所提供之方法中之任一種。
在另一態樣中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的用於擴增TIL之方法，該方法經改良以使得在第一次擴增起始之前，針對PD-1、CD39、CD38、CD103、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性對第一TIL群體進行選擇以獲得呈PD-1、CD39、CD38、CD103、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性的經富集TIL群體，且第一次擴增係用該經富集TIL群體進行。在一些實施例中，第一TIL群體係藉由消化自獲自手術切除、至少一次穿刺活體組織切片檢查、至少一次粗針活體組織切片檢查、至少一次小型活體組織切片檢查或用於自個體獲得含有腫瘤及TIL之混合物之樣本的其他方式的腫瘤片段或樣本，視情況對消化物進行機械解聚集，而自此類腫瘤片段或樣本獲得，且該經富集TIL群體係藉由自該消化物選擇PD-1、CD39、CD38、CD103、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL來獲得。在一些實施例中，該消化物係使用一或多膠原蛋白酶進行。在其他實施例中，該消化物係使用膠原蛋白酶及去氧核糖核酸酶進行。在其他實施例中，該消化物係使用膠原蛋白酶、去氧核糖核酸酶I及中性蛋白酶進行。可使用任何適合的PD-1、CD39、CD38、CD103、LAG3、TIM3及/或TIGIT富集方法獲得PD-1、CD39、CD38、CD103、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL，包含本文所提供之方法中之任一種。在一些實施例中，經富集TIL群體係藉由自該消化物選擇PD-1、LAG3、TIM3及/或TIGIT陽性TIL來獲得。
在又另一態樣中，本文提供一種用於擴增來自周邊血液之周邊血液淋巴球(PBL)的方法。在此方法之步驟a)中，周邊血液單核細胞(PBMC)之樣本係自視情況用依魯替尼或另一種介白素-2誘導性T細胞激酶(ITK)抑制劑預治療且難以用依魯替尼或此另一種ITK抑制劑治療之患者的周邊血液獲得。在步驟b)中，將PBMC在包括含IL-2、抗CD3/抗CD28抗體及第一抗生素組分之第一細胞培養基的培養物中培養選自由以下組成之群組的時段：約9天、約10天、約11天、約12天、約13天及約14天，由此實現來自該等PBMC之周邊血液淋巴球(PBL)的擴增。在步驟c)中，自步驟b)中之培養物收集PBL。在此方法中，第一抗生素組分包含：1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在又另一態樣中，本文提供一種用於擴增來自患者之周邊血液之周邊血液淋巴球(PBL)的方法。在一些實施例中，該方法包括(a)自患者之周邊血液獲得周邊血液單核細胞(PBMC)之樣本，其中該樣本視情況經冷凍保存且患者視情況用ITK抑制劑預治療；(b)視情況藉由離心洗滌PBMC；(c)將對CD3及CD28具有選擇性之磁性珠粒添加至PBMC中；(d)將PBMC接種至透氣容器中並與該等PBMC一起在包括約3000 IU/mL IL-2及第一抗生素組分之第一細胞培養基中培養約4至約6天；(e)使用包括約3000 IU/mL IL-2之第一細胞培養基飼養該等PBMC，並共培養該等PBMC約5天，由此使步驟(d)及步驟(e)之總共培養時段係約9至約11天；(f)自培養基收集PBMC；(g)使用磁體移除該等對CD3及CD28具有選擇性之磁性珠粒；(h)使用磁性活化細胞分選術及CD19+珠粒移除殘餘B細胞以提供PBL產物；(i)使用細胞收集器洗滌並濃縮PBL產物；及(j)調配且視情況冷凍保存該PBL產物。在此方法中，第一抗生素組分包含：1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。在一些實施例中，ITK抑制劑視情況為共價結合至ITK之ITK抑制劑。在一些實施例中，ITK抑制劑係依魯替尼。
在又另一態樣中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的擴增來自周邊血液之周邊血液淋巴球(PBL)的方法，該方法經改良以使得PBMC之樣本係自或自約10 mL至或至約50 mL患者之周邊血液獲得。
在又另一態樣中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的擴增來自周邊血液之周邊血液淋巴球(PBL)的方法，該方法經改良以使得接種至該透氣容器中的PBMC之接種密度相對於透氣容器之表面區域係或係約2×10 5個/平方公分至或至約1.6×10 3個/平方公分。
在又另一態樣中，本發明提供一種用於製備來自全血樣品之周邊血液淋巴球(PBL)的方法，其包括以下步驟：(a)自具有液體腫瘤之患者的小於或等於約50 mL全血獲得周邊血液單核細胞(PBMC)，其中該患者視情況用ITK抑制劑預治療；(b)將對CD3及CD28具有選擇性之珠粒與PBMC混合，其中該等珠粒係以3個珠粒：1個細胞之比率添加，形成PBMC與珠粒之混合物；(c)將PBMC與珠粒之混合物在一或多個含有第一細胞培養基、IL-2及第一抗生素組分之容器的透氣表面上以每平方公分為或為約25,000個細胞至每平方公分約50,000個細胞的密度培養約4天時段；(d)將IL-2、與第一細胞培養基相同或不同之第二細胞培養基及視情況選用的與第一抗生素組分相同或不同之第二抗生素組分添加至各容器中，並培養約5天至約7天之時段以形成經擴增之PBL群體；及(e)自各容器收集經擴增之PBL群體。在此方法中，第一抗生素組分包含：1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素，且視情況選用之第二抗生素組分包含：1)抗生素組合，其選自：i)建它黴素萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。在一些實施例中，ITK抑制劑係結合至ITK之ITK抑制劑。在一些實施例中，ITK抑制劑係依魯替尼。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以在第一細胞培養基及/或第二細胞培養基中包含濃度為至少或至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000 µg/mL之克林達黴素。在某些實施例中，包含的克林達黴素之濃度係自或自約0.1-1 µg/mL、0.25-1 µg/mL、0.1-0.5 µg/mL、0.5-2 µg/mL、2-8 µg/mL、1-10 µg/mL、4-12 µg/mL、5-15 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL、40-50 µg/mL、50-60 µg/mL、60-70 µg/mL、70-80 µg/mL、80-90 µg/mL、90-100 µg/mL、100-110 µg/mL、110-120 µg/mL、120-130 µg/mL、130-140 µg/mL、140-150 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、10-90 µg/mL、20-80 µg/mL、30-70 µg/mL、40-60 µg/mL、45-55 µg/mL、50-100 µg/mL、100-150 µg/mL、150-200 µg/mL、200-250 µg/mL、250-300 µg/mL、300-350 µg/mL、350-400 µg/mL、400-450 µg/mL、450-500 µg/mL、500-550 µg/mL、550-600 µg/mL、600-650 µg/mL、650-700 µg/mL、700-750 µg/mL、750-800 µg/mL、800-850 µg/mL、850-900 µg/mL或950-1,000 µg/mL。在一些實施例中，包含的克林達黴素之濃度係自或自約0.1-100 µg/mL、1-50 µg/mL、1-100 µg/mL、1-250 µg/mL、1-500 µg/mL、250-750 µg/mL、350-450 µg/mL、450-550 µg/mL、550-650 µg/mL、400-600 µg/mL、350-650 µg/mL、300-700 µg/mL、200-800 µg/mL、500-1,000 µg/mL、750-1,250 µg/mL、1,000-1,500 µg/mL、1,250-1,750 µg/mL或1,500-2,000 µg/mL。在例示性實施例中，克林達黴素之濃度係或係約400-600 µg/mL。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以在第一細胞培養基及/或第二細胞培養基中包含濃度為至少或至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000 µg/mL之萬古黴素。在某些實施例中，包含的萬古黴素之濃度係自或自約0.1-1 µg/mL、0.25-1 µg/mL、0.1-0.5 µg/mL、0.5-2 µg/mL、2-8 µg/mL、1-10 µg/mL、4-12 µg/mL、5-15 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL、40-50 µg/mL、50-60 µg/mL、60-70 µg/mL、70-80 µg/mL、80-90 µg/mL、90-100 µg/mL、100-110 µg/mL、110-120 µg/mL、120-130 µg/mL、130-140 µg/mL、140-150 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、10-90 µg/mL、20-80 µg/mL、30-70 µg/mL、40-60 µg/mL、45-55 µg/mL、50-100 µg/mL、100-150 µg/mL、150-200 µg/mL、200-250 µg/mL、250-300 µg/mL、300-350 µg/mL、350-400 µg/mL、400-450 µg/mL、450-500 µg/mL、500-550 µg/mL、550-600 µg/mL、600-650 µg/mL、650-700 µg/mL、700-750 µg/mL、750-800 µg/mL、800-850 µg/mL、850-900 µg/mL或950-1,000 µg/mL。在一些實施例中，包含的萬古黴素之濃度係自或自約0.1-100 µg/mL、1-50 µg/mL、1-100 µg/mL、1-250 µg/mL、1-500 µg/mL、100-200 µg/mL、150-250 µg/mL、200-400 µg/mL、350-450 µg/mL、400-600 µg/mL、550-650 µg/mL、50-650 µg/mL、100-600 µg/mL、250-750 µg/mL、500-1,000 µg/mL、750-1,250 µg/mL、1,000-1,500 µg/mL、1,250-1,750 µg/mL或1,500-2,000 µg/mL。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係或係約50-600 µg/mL。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係或係約100 µg/mL。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以在第一細胞培養基及/或第二細胞培養基中包含濃度為至少或至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000 µg/mL之建它黴素。在某些實施例中，包含的建它黴素之濃度係自或自約0.1-1 µg/mL、0.25-1 µg/mL、0.1-0.5 µg/mL、0.5-2 µg/mL、2-8 µg/mL、1-10 µg/mL、4-12 µg/mL、5-15 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL、40-50 µg/mL、50-60 µg/mL、60-70 µg/mL、70-80 µg/mL、80-90 µg/mL、90-100 µg/mL、100-110 µg/mL、110-120 µg/mL、120-130 µg/mL、130-140 µg/mL、140-150 µg/mL、150-160 µg/mL、160-170 µg/mL、170-180 µg/mL、180-190 µg/mL、190-200 µg/mL、10-90 µg/mL、20-80 µg/mL、30-70 µg/mL、40-60 µg/mL、45-55 µg/mL、50-150 µg/mL、60-140 µg/mL、70-130 µg/mL、80-120 µg/mL、90-110 µg/mL、95-105 µg/mL、50-100 µg/mL、100-150 µg/mL、150-200 µg/mL、200-250 µg/mL、250-300 µg/mL、300-350 µg/mL、350-400 µg/mL、400-450 µg/mL、450-500 µg/mL、500-550 µg/mL、550-600 µg/mL、600-650 µg/mL、650-700 µg/mL、700-750 µg/mL、750-800 µg/mL、800-850 µg/mL、850-900 µg/mL或950-1,000 µg/mL。在一些實施例中，包含的建它黴素之濃度係自或自約0.1-100 µg/mL、1-50 µg/mL、25-75 µg/mL、1-100 µg/mL、1-250 µg/mL、1-500 µg/mL、250-750 µg/mL、500-1,000 µg/mL、750-1,250 µg/mL、1,000-1,500 µg/mL、1,250-1,750 µg/mL或1,500-2,000 µg/mL。在例示性實施例中，建它黴素之濃度係或係約50 µg/mL。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以在第一細胞培養基及/或第二細胞培養基中包含濃度為至少或至少約0.1 µg/mL、0.2 µg/mL、0.3 µg/mL、0.4 µg/mL、0.5 µg/mL、0.6 µg/mL、0.7 µg/mL、0.8 µg/mL、0.9 µg/mL、1 µg/mL、2 µg/mL、3 µg/mL、4 µg/mL、5 µg/mL、6 µg/mL、7 µg/mL、8 µg/mL、9 µg/mL、10 µg/mL、15 µg/mL、20 µg/mL、25 µg/mL、30 µg/mL、35 µg/mL、40 µg/mL、45 µg/mL及50 µg/mL之兩性黴素B。在某些實施例中，該兩性黴素B之濃度係至少或至少約0.1-0.5 µg/mL、0.5-1 µg/mL、0.25-2 µg/mL、0.1-1 µg/mL、1-5 µg/mL、1-3 µg/mL、2-4 µg/mL、3-5 µg/mL、4-6 µg/mL、5-7 µg/mL、6-8 µg/mL、7-9 µg/mL、8-10 µg/mL、9-11 µg/mL、1-2 µg/mL、2-3 µg/mL、3-4 µg/mL、4-5 µg/mL、5-6 µg/mL、6-7 µg/mL、7-8 µg/mL、8-9 µg/mL、9-10 µg/mL、10-11 µg/mL、1-10 µg/mL、2-10.5 µg/mL、5-15 µg/mL、2-12 µg/mL、1-11 µg/mL、5-10 µg/mL、10-20 µg/mL、20-30 µg/mL、30-40 µg/mL或40-50 µg/mL。在例示性實施例中，該兩性黴素B之濃度係或係約2.5-10 µg/mL。
在一些實施例中，在將腫瘤樣本解離或碎斷成腫瘤片段之前，將其在包括抗生素組分之洗滌緩衝液中洗滌至少一次。本文所描述之任何腫瘤洗滌緩衝液均可用於洗滌腫瘤樣本。在一些實施例中，抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。在例示性實施例中，洗滌緩衝液包括萬古黴素。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度為50 µg/mL-600 µg/mL。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係或係約100 µg/mL。在例示性實施例中，將腫瘤樣本在洗滌緩衝液中洗滌3次或更多次。
在一些實施例中，在冷凍保存或第一次擴增之前，將腫瘤樣本在包括抗生素組分之洗滌緩衝液中洗滌至少一次。本文所描述之任何腫瘤洗滌緩衝液均可用於洗滌腫瘤片段。在一些實施例中，抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。在例示性實施例中，洗滌緩衝液包括萬古黴素。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度為50 µg/mL-600 µg/mL。。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係100 µg/mL。在例示性實施例中，將腫瘤樣本在洗滌緩衝液中洗滌3次或更多次。 VII. 擴增包含周邊血液 (PBL) 及 / 或骨髓 (MIL) 之治療性 T 細胞之方法的實施例 A. 擴增來自周邊血液之周邊血液淋巴球 (PBL) 之方法
PBL方法1. 在本發明之一些實施例中，PBL係使用本文所描述之方法擴增。在本發明之一些實施例中，該方法包括獲得來自全血之PBMC樣本。在一些實施例中，該方法包括藉由使用CD3+/CD28+級分之正向選擇自PBMC分離純T細胞來富集T細胞。在37℃水浴中將冷凍保存之PBMC解凍。將解凍之PBMC轉移至50 mL錐形管中並充分混合。將細胞懸浮液分成兩等份，置放於兩個經標記之15 mL聚苯乙烯錐形管中。在15 mL管中，經由在24℃下以400×g離心5分鐘(加速度=9，減速度=9)使細胞沈澱。在離心期間，藉由將CTS Dynabeads(CD3/CD28)在搖臂上置放至少5分鐘進行混合。將細胞自離心機移出並抽吸所有培養基。封蓋各管並沿粗糙表面(諸如管架)刮擦該管以幫助破碎細胞沈澱物。計算並記錄標為方法#1之管中CD3+活細胞之數目：CD3+活細胞之數目= CD3+細胞% * TVC(總活細胞)。使用洗滌緩衝液(無菌磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、1%人類血清白蛋白、10 U/mL去氧核糖核酸酶)使細胞再懸浮於標為 方法 #1之管中以使得活T細胞之濃度為1e7個/毫升。藉由轉移如以上所計算之體積，以3個珠粒：1個T細胞之比率添加經洗滌之CTS DynaBeads (CD3/28)。在經箔覆蓋之微管中，將樣本與Dynabeads一起在搖臂(1-3 RPM端至端)上在室溫下於暗處培育30分鐘。在培育30分鐘後，將樣本置放於15 mL錐形管中，用1 mL CM2+IL-2(3000 IU/mL)沖洗該微管並將其轉移至15 mL管中。使用CM2+IL-2使體積達到10 mL並使用移液器充分混合。將該管在DynaMag-15上置放一至兩分鐘以進行珠粒結合之CD3+細胞的正向選擇。將細胞懸浮液(陰性部分)傾析至經標記(方法#1—無T細胞級分)之50 mL錐形管中。將10 mL含IL-2(3000 IU/mL)之CM2培養基立即添加至含有珠粒結合之細胞的15 mL管中並混合。將該管置放於Dynamag-15上，保持一至兩分鐘。將細胞懸浮液(殘餘陰性部分)傾析至經標記(方法#1-無T細胞級分)之50 mL錐形管中。將5 mL含IL-2(3000 IU/mL)之CM2培養基立即添加至含有珠粒結合之細胞的15 mL管中並混合。將該管重新標記為(方法#1-T細胞級分)。對陰性及陽性部分計數。自陰性及陽性部分中之每一個獲得約5e5個細胞用於新鮮樣本之流動式分析(CD3/4/8/19/14)。冷凍保存殘餘的陰性部分。繼續培養富集陽性T細胞之部分與Dynabeads。
在第0天，分別向兩個G-REX5M培養瓶中置放1e6個活T細胞。適當標記培養瓶(例如「方法#1」)。替代地，向每個G-REX 10M中置放最少2e6個活T細胞。緩慢使各G-REX5M培養瓶中培養基之體積達到20 mL補充有3000 IU/mL IL-2之CM2或在各G-REX10M中達到40 mL。將培養瓶置放於培育箱(37℃、5% CO 2)中。
在第4天，添加培養基。若在G-REX 5M中培養，則添加20 mL CM4+IL-2(3000 IU/mL)。若在G-REX 10M中培養，則添加40 mL CM4+IL-2(3000 IU/mL)。
在第7天，添加培養基。若在G-REX 5M中培養，則添加10 mL CM4+IL-2(3000 IU/mL)。若在G-REX 10M中培養，則添加20 mL CM4+IL-2(3000 IU/mL)。
可在第9天或第11天收集細胞。
在收集當天，自每一富集條件收集一個G-REX培養瓶。在不破壞細胞的情況下，將培養基體積縮減至約10%。將兩份1 mL樣本儲存於-20℃冷凍器中用於代謝物分析。使細胞再懸浮並收集於適當標記(例如「方法#1」)之50 mL錐形管中。將約10 mL血漿溶解液+1% HSA添加至各50 mL管中。將錐形管置放於Dynamag-50中，保持一至兩分鐘，以移除珠粒。使用5或10 mL移液管，將細胞懸浮液移至標記為方法#1最終之另一個50mL錐形管中。將10 mL血漿溶解液+1% HSA立即添加至管中之Dynamag-50中。將其自磁體移開並混合，接著將其放回磁體。將50 mL錐形管再置放於DynaMag-50上，保持2分鐘進行沖洗。使用5或10 mL移液管，將細胞懸浮液移至適當標記(例如「方法#1最終」)之50 mL錐形管中。取出樣本進行細胞計數及存活率分析以及珠粒殘餘計數。使用冷卻之冷凍培養基(例如49.9%血漿溶解液-A、0.5% HSA及50% CS10)在小瓶中冷凍保存最終產物。
在一些實施例中，本發明提供一種用於擴增來自周邊血液之周邊血液淋巴球(PBL)之方法，其包括： a. 自患者之周邊血液獲得周邊血液單核細胞(PBMC)之樣本，其中該樣本視情況經冷凍保存且患者視情況用ITK抑制劑預治療； b. 視情況藉由離心洗滌PBMC； c. 將對CD3及CD28具有選擇性之磁性珠粒添加至PBMC中； d. 將PBMC接種至透氣容器中並將該等PBMC在包括約3000 IU/mL IL-2及第一抗生素組分之培養基中共培養約4至約6天； e. 使用包括約3000 IU/mL IL-2及視情況選用之第二抗生素組分之培養基飼養該等PBMC，並將該等PBMC共培養約5天，由此使步驟d及步驟e之總共培養時段為約9至約11天； f. 自培養基收集PBMC； g. 使用磁體移除對CD3及CD28具有選擇性之磁性珠粒； h. 使用磁性活化細胞分選術及CD19 +珠粒移除殘餘B細胞以提供PBL產物； i. 使用細胞收集器洗滌並濃縮PBL產物；及 j. 調配並視情況冷凍保存該PBL產物， 其中ITK抑制劑視情況為共價結合至ITK之ITK抑制劑。在一些實施例中，第一抗生素組分與第二抗生素組分相同或不同。在一些實施例中，第一抗生素組分及第二抗生素組分獨立地包含：1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，PBMC係自全血樣本分離。在一些實施例中，使用PBMC樣本作為擴增PBL之起始物質。在一些實施例中，樣本在擴增程序之前經冷凍保存。在其他實施例中，使用新鮮樣本作為擴增PBL之起始物質。在本發明之一些實施例中，使用本領域中已知之方法自PBMC分離T細胞。在一些實施例中，使用人類泛T細胞分離套組及LS管柱分離T細胞。在本發明之一些實施例中，使用本領域中已知之抗體選擇方法(例如CD19負向選擇)自PBMC分離T細胞。
在本發明之一些實施例中，該方法係在約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天或約14天內進行。在一些實施例中，該方法係在約7天內進行。在一些實施例中，該方法係在約14天內進行。
在本發明之一些實施例中，將PBMC與抗CD3/抗CD28抗體一起培養。在一些實施例中，任何可用的抗CD3/抗CD28產物均可用於本發明中。在本發明之一些實施例中，所使用之可商購產品係DynaBeads ®。在一些實施例中，將DynaBeads ®與PBMC以1:1(珠粒:細胞)之比率一起培養。在其他實施例中，抗體係與PBMC以1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1或5:1(珠粒:細胞)之比率一起培養的DynaBeads ®。在本發明之一些實施例中，抗體培養步驟及/或用抗體再刺激細胞之步驟係在約2至約6天、約3至約5天或約4天之時段內進行。在本發明之一些實施例中，抗體培養步驟係在約2天、3天、4天、5天或6天之時段內進行。
在一些實施例中，將PBMC樣本與IL-2一起培養。在本發明之一些實施例中，用於擴增來自PBMC之PBL的細胞培養基包括選自由以下組成之群組之濃度的IL-2：約100 IU/mL、約200 IU/mL、約300 IU/mL、約400 IU/mL、約100 IU/mL、約100 IU/mL、約100 IU/mL、約100 IU/mL、約100 IU/mL、約500 IU/mL、約600 IU/mL、約700 IU/mL、約800 IU/mL、約900 IU/mL、約1,000 IU/mL、約1,100 IU/mL、約1,200 IU/mL、約1,300 IU/mL、約1,400 IU/mL、約1,500 IU/mL、約1,600 IU/mL、約1,700 IU/mL、約1,800 IU/mL、約1,900 IU/mL、約2,000 IU/mL、約2,100 IU/mL、約2,200 IU/mL、約2,300 IU/mL、約2,400 IU/mL、約2,500 IU/mL、約2,600 IU/mL、約2,700 IU/mL、約2,800 IU/mL、約2,900 IU/mL、約3,000 IU/mL、約3,100 IU/mL、約3,200 IU/mL、約3,300 IU/mL、約3,400 IU/mL、約3,500 IU/mL、約3,600 IU/mL、約3,700 IU/mL、約3,800 IU/mL、約3,900 IU/mL、約4,000 IU/mL、約4,100 IU/mL、約4,200 IU/mL、約4,300 IU/mL、約4,400 IU/mL、約4,500 IU/mL、約4,600 IU/mL、約4,700 IU/mL、約4,800 IU/mL、約4,900 IU/mL、約5,000 IU/mL、約5,100 IU/mL、約5,200 IU/mL、約5,300 IU/mL、約5,400 IU/mL、約5,500 IU/mL、約5,600 IU/mL、約5,700 IU/mL、約5,800 IU/mL、約5,900 IU/mL、約6,000 IU/mL、約6,500 IU/mL、約7,000 IU/mL、約7,500 IU/mL、約8,000 IU/mL、約8,500 IU/mL、約9,000 IU/mL、約9,500 IU/mL及約10,000 IU/mL。
在本發明之一些實施例中，用於擴增方法之PBMC的起始細胞數目係約25,000至約1,000,000、約30,000至約900,000、約35,000至約850,000、約40, 000至約800,000、約45,000至約800,000、約50,000至約750,000、約55,000至約700,000、約60,000至約650,000、約65,000至約600,000、約70,000至約550,000, preferably from about 75,000至約500,000、約80,000至約450,000、約85,000至約400,000、約90,000至約350,000、約95,000至約300,000、約100,000至約250,000、約105,000至約200,000、或約110,000至約150,000。在本發明之一些實施例中，PBMC之起始細胞數目係約138,000、140,000、145,000或更多個。在其他實施例中，PBMC之起始細胞數目係約28,000個。在其他實施例中，PBMC之起始細胞數目係約62,000個。在其他實施例中，PBMC之起始細胞數目係約338,000個。在其他實施例中，PBMC之起始細胞數目係約336,000個。
在本發明之一些實施例中，使細胞在GRex 24孔盤中生長。在本發明之一些實施例中，使用相當的孔盤。在一些實施例中，用於擴增之起始物質係約5×10 5個T細胞/孔。在本發明之一些實施例中，存在1×10 6個細胞/孔。在本發明之一些實施例中，每孔之細胞數目足以接種該孔並擴增T細胞。
在本發明之一些實施例中，使細胞在GRex100MCS容器中生長。在本發明之一些實施例中，使用相當的容器。在一些實施例中，用於擴增之起始物質係以每平方公分約25,000至約50,000個T細胞之密度接種。
在本發明之一些實施例中，PBL之擴增倍數係約20%至約100%、25%至約95%、30%至約90%、35%至約85%、40%至約80%、45%至約75%、50%至約100%或25%至約75%。在本發明之一些實施例中，擴增倍數係約25%。在本發明之其他實施例中，擴增倍數係約50%。在其他實施例中，擴增倍數係約75%。
在本發明之一些實施例中，可在整個方法之一或多天將額外IL-2添加至培養物中。在本發明之一些實施例中，額外IL-2係在第4天添加。在本發明之一些實施例中，額外IL-2係在第7天添加。在本發明之一些實施例中，額外IL-2係在第11天添加。在其他實施例中，額外IL-2係在第4天、第7天及/或第11天添加。在本發明之一些實施例中，可在細胞培養程序中之一或多天更換細胞培養基。在一些實施例中，在該程序之第4天、第7天及/或第11天更換細胞培養基。在本發明之一些實施例中，將PBL與額外IL-2一起培養1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天之時段。在本發明之一些實施例中，在每次添加IL-2之後，將PBL培養3天之時段。
在一些實施例中，在該方法期間，將細胞培養基更換至少一次。在一些實施例中，在添加額外IL-2之同時，更換細胞培養基。在其他實施例中，在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天或第14天中之至少一天，更換細胞培養基。在本發明之一些實施例中，在整個方法中使用的細胞培養基可以相同或不同。在本發明之一些實施例中，細胞培養基係CM-2、CM-4或AIM-V。
在本發明之一些實施例中，T細胞可在整個14天擴增程序之一或多天用抗CD3/抗CD28抗體再刺激。在一些實施例中，在第7天再刺激T細胞。在一些實施例中，將GRex 10M培養瓶用於再刺激步驟。在本發明之一些實施例中，使用相當的培養瓶。
在本發明之一些實施例中，使用DynaMag™磁體移除DynaBeads ®，對細胞計數，並使用如以下實例中進一步描述的表型及功能分析來分析細胞。在本發明之一些實施例中，使用本領域中已知之方法將抗體自PBL或MIL分離。在前述實施例中之任一個中，使用基於磁珠進行的TIL、PBL或MIL選擇。
在本發明之一些實施例中，將PBMC樣本在有效鑑別非附著細胞所需之溫度下培育一段時間。在本發明之一些實施例中，培育時間為約3小時。在本發明之一些實施例中，溫度為約37℃。接著，使用以上方法擴增非附著細胞。
在本發明之一些實施例中，PBMC係自已用依魯替尼或另一種ITK或激酶抑制劑治療之患者獲得，此類及激酶抑制劑如本文中別處所描述。在本發明之一些實施例中，ITK抑制劑係共價且不可逆地結合至ITK之共價ITK抑制劑。在本發明之一些實施例中，ITK抑制劑係結合至ITK之異位性ITK抑制劑。在本發明之一些實施例中，PBMC係在獲得PBMC樣本用於包含PBL方法1之任何前述方法之前，自已用依魯替尼或其他ITK抑制劑(包含如本文中別處所描述之ITK抑制劑)治療的患者獲得。在本發明之一些實施例中，ITK抑制劑治療已投與至少1次、至少2次或至少3次或更多次。在本發明之一些實施例中，來自用依魯替尼或其他ITK抑制劑預治療之患者的經擴增之PBL包括的LAG3+、PD-1+細胞要少於來自未用依魯替尼或其他ITK抑制劑預治療之患者的經擴增之PBL。在本發明之一些實施例中，來自用依魯替尼或其他ITK抑制劑預治療之患者的經擴增之PBL包括的IFNγ產生之量相較於來自未用依魯替尼或其他ITK抑制劑預治療之患者的經擴增之PBL增加。在本發明之一些實施例中，相較於來自未用依魯替尼或其他ITK抑制劑預治療之患者的經擴增之PBL，來自用依魯替尼或其他ITK抑制劑預治療之患者的經擴增之PBL包括在較低的效應物:目標細胞比率下增加之溶解活性。在本發明之一些實施例中，用依魯替尼或其他ITK抑制劑預治療之患者相較於未治療患者具有較高的擴增倍數。
在本發明之一些實施例中，該方法包含將ITK抑制劑添加至細胞培養物中之步驟。在一些實施例中，ITK抑制劑係在該程序之第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天或第14天中之一或多天添加。在一些實施例中，ITK抑制劑係在該方法期間更換細胞培養基之日添加。在一些實施例中，ITK抑制劑係在第0天且在更換細胞培養基時添加。在一些實施例中，ITK抑制劑係在該方法期間添加IL-2時添加。在一些實施例中，ITK抑制劑係在該方法之第0天、第4天、第7天及視情況第11天添加。在本發明之一些實施例中，ITK抑制劑係在該方法之第0天及第7天添加。在本發明之一些實施例中，ITK抑制劑係本領域中已知者。在本發明之一些實施例中，ITK抑制劑係本文中別處描述者。
在本發明之一些實施例中，將濃度為約0.1 nM至約5 μM之ITK抑制劑用於該方法中。在一些實施例中，用於該方法中之ITK抑制劑的濃度為約0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、550nM、600nM、650nM、700nM、750nM、800nM、850nM、900nM、950nM、1μM、2μM、3μM、4μM或5μM。
在本發明之一些實施例中，當PBMC係來源於先前未暴露於ITK抑制劑治療，諸如依魯替尼之患者時，該方法包含添加ITK抑制劑之步驟。
在一些實施例中，PBMC樣本係來自視情況已經用包括激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案進行預治療之個體或患者。在一些實施例中，腫瘤樣本係來自已經用包括激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案進行預治療之個體或患者。在一些實施例中，PBMC樣本係來自已經用包括激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案進行預治療之個體或患者，其已進行治療至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月或1年或更長時間。在其他實施例中，PBMC係來源於當前進行ITK抑制劑方案(諸如依魯替尼)之患者。
在一些實施例中，PBMC樣本係來自已用包括激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案進行預治療且難以用激酶抑制劑或ITK抑制劑(諸如依魯替尼)治療之個體或患者。
在一些實施例中，PBMC樣本係來自已經用包括激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案進行預治療但不再進行激酶抑制劑或ITK抑制劑治療之個體或患者。在一些實施例中，PBMC樣本係來自已經用包括激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案進行預治療但不再進行激酶抑制劑或ITK抑制劑治療且尚未進行治療達至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月或至少1年或更長時間之個體或患者。在一些實施例中，PBMC係來源於先前暴露於ITK抑制劑但尚未治療至少3個月、至少6個月、至少9個月或至少1年的患者。
在本發明之一些實施例中，在第0天，針對CD19+選擇細胞且據此分選。在本發明之一些實施例中，使用抗體結合珠粒進行選擇。在本發明之一些實施例中，在第0天自PBMC分離純T細胞。在本發明之一些實施例中，在第0天，將CD19+ B細胞及純T細胞與抗CD3/抗CD28抗體共培養最少4天。在本發明之一些實施例中，在第4天，將IL-2添加至培養物中。在本發明之一些實施例中，在第7天，用抗CD3/抗CD28抗體及額外IL-2再刺激培養物。在本發明之一些實施例中，在第14天，收集PBL。
在本發明之一些實施例中，對於未用依魯替尼或其他ITK抑制劑預治療之患者，10-15 ml之白血球層將得到約5×10 9個PBMC，在擴增程序結束時又將得到約5.5×10 7個起始細胞材料及約11×10 9個PBL。在本發明之一些實施例中，約54×10 6個PBMC將得到約6×10 5個起始物質及約1.2×10 8個MIL(約205倍擴增)。
在本發明之一些實施例中，對於用依魯替尼或其他ITK抑制劑預治療之患者，擴增程序將得到約20×10 9個PBL。在本發明之一些實施例中，40.3×10 6個PBMC將得到約4.7×10 5個起始細胞材料及約1.6×10 8個PBL(約338倍擴增)。
在本發明之一些實施例中，對於慢性淋巴球性白血病(CLL)患者，可用於本發明中之PBL的臨床劑量係約0.1×10 9至約15×10 9個PBL、約0.1×10 9至約15×10 9個PBL、約0.12×10 9至約12×10 9個PBL、約0.15×10 9至約11×10 9個PBL、約0.2×10 9至約10×10 9個PBL、約0.3×10 9至約9×10 9個PBL、約0.4×10 9至約8×10 9個PBL、約0.5×10 9至約7×10 9個PBL、約0.6×10 9至約6×10 9個PBL、約0.7×10 9至約5×10 9個PBL、約0.8×10 9至約4×10 9個PBL、約0.9×10 9至約3×10 9個PBL、或約1×10 9至約2×10 9個PBL。
在任何前述實施例中，PBMC可自全血樣本，藉由血球分離術獲得，來源於白血球層，或自本領域中已知的用於獲得PBMC之任何其他方法獲得。
在一些實施例中，本發明提供一種用於製備周邊血液淋巴球(PBL)之方法，其包括以下步驟： a. 自患者之周邊血液獲得周邊血液單核細胞(PBMC)之樣本，其中該樣本視情況經冷凍保存且患者視情況用ITK抑制劑預治療； b. 視情況藉由離心洗滌PBMC； c. 將對CD3及CD28具有選擇性之磁性珠粒混合至PBMC中以形成珠粒及PBMC之混合物； d. 將珠粒與PBMC之混合物接種至透氣容器中並在包括約3000 IU/mL IL-2及第一抗生素組分之培養基中共培養該等PBMC約4至約6天； e. 使用包括約3000 IU/mL IL-2及視情況選用之第二抗生素組分之培養基飼養該等PBMC，並將該等PBMC共培養約5天，由此使步驟d及步驟e之總共培養時段為約9至約11天； f. 自培養基收集PBMC； g. 使用磁體自經收集之PBMC移除對CD3及CD28具有選擇性之磁性珠粒； h. 使用磁性活化細胞分選術及對CD19具有選擇性之磁性珠粒自經收集之PBMC移除殘餘B細胞以提供PBL產物； i. 使用細胞收集器洗滌並濃縮PBL產物；及 j. 調配並視情況冷凍保存該PBL產物， 其中ITK抑制劑視情況為共價結合至ITK之ITK抑制劑。在一些實施例中，第一抗生素組分與第二抗生素組分相同或不同。在一些實施例中，第一抗生素組分及第二抗生素組分獨立地包含：1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，本發明提供一種用於自全血樣本製備周邊血液淋巴球(PBL)之方法，該方法包括以下步驟： (a) 自來自具有液體腫瘤之患者的小於或等於約50 mL全血獲得周邊血液單核細胞(PBMC)，其中該患者視情況用ITK抑制劑預治療； (b) 將對CD3及CD28具有選擇性之珠粒與PBMC混合，其中該等珠粒係以3個珠粒:1個細胞之比率添加，形成PBMC與珠粒之混合物； (c) 將PBMC與珠粒之混合物以每平方公分約25,000個細胞至每平方公分約50,000個細胞之密度在一或多個含有第一細胞培養基、IL-2及第一抗生素組分之容器的透氣表面上培養約4天之時段； (d)將IL-2、視情況選用之第二抗生素組分及與第一細胞培養基相同或不同之第二細胞培養基添加至步驟(c)之每個容器中並培養約5至約7天之時段以形成經擴增之PBL群體；及 (e) 自每個容器收集經擴增之PBL群體。 在一些實施例中，第一抗生素組分與第二抗生素組分相同或不同。在一些實施例中，第一抗生素組分及第二抗生素組分獨立地包含：1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，本發明提供一種用於自全血樣本製備周邊血液淋巴球(PBL)之方法，該方法包括以下步驟： (a) 自來自具有液體腫瘤之患者的小於或等於約50 mL全血獲得周邊血液單核細胞(PBMC)，其中該患者視情況用ITK抑制劑預治療； (b) 藉由針對CD19進行選擇，自PBMC移除B細胞，以提供B細胞耗盡之PBMC； (c) 將對CD3及CD28具有選擇性之珠粒與PBMC混合，其中該等珠粒係以3個珠粒:1個細胞之比率添加，形成PBMC與珠粒之混合物； (d) 將PBMC與珠粒混合物以每平方公分約25,000個細胞至每平方公分約50,000個細胞之密度在一或多個含有第一細胞培養基、IL-2及第一抗生素組分之容器的透氣表面上培養約4天之時段； (e) 將IL-2、視情況選用之第二抗生素組分及與第一細胞培養基相同或不同之第二細胞培養基添加至步驟(d)之每個容器中並培養約5天至約7天之時段，以形成經擴增之PBL群體；及 (f) 自每個容器收集經擴增之PBL群體。 在一些實施例中，第一抗生素組分與第二抗生素組分相同或不同。在一些實施例中，第一抗生素組分及第二抗生素組分獨立地包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。
在一些實施例中，本發明提供一種用於自全血樣本製備周邊血液淋巴球(PBL)之方法，該方法包括以下步驟： (a) 自來自具有液體腫瘤之患者的小於或等於約50 mL全血獲得周邊血液單核細胞(PBMC)，其中該患者視情況用ITK抑制劑預治療； (b) 測定由B細胞構成之PMBC的比例作為B細胞百分比； (c) 若在步驟(b)中測定的B細胞百分比係至少約百分之七十(70%)，則藉由針對CD19進行選擇而自PBMC移除B細胞，提供B細胞耗盡之PBMC； (d) 將對CD3及CD28具有選擇性之珠粒與PBMC混合，其中該等珠粒係以3個珠粒:1個細胞之比率添加，形成PBMC與珠粒之混合物； (e) 將PBMC與珠粒之混合物以每平方公分約25,000個細胞至每平方公分約50,000個細胞之密度在一或多個含有第一細胞培養基、IL-2及第一抗生素組分之容器的透氣表面上培養約4天之時段； (f) 將IL-2、視情況選用之第二抗生素組分及與第一細胞培養基相同或不同之第二細胞培養基添加至步驟(d)之每個容器中並培養約5天至約7天之時段，以形成經擴增之PBL群體；及 (g) 自每個容器收集經擴增之PBL群體。 在一些實施例中，第一抗生素組分與第二抗生素組分相同或不同。在一些實施例中，第一抗生素組分及第二抗生素組分獨立地包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。
在本發明之一些實施例中，B細胞移除或B細胞耗盡(BCD)係在9天擴增程序之第0天或第9天發生。在一些實施例中，BCD係在9天擴增程序之第0天及第9天發生。在本發明之一些實施例中，BCD係在11天擴增程序之第0天或第11天發生。在一些實施例中，BCD係在11天擴增程序之第0天及第11天發生。
在本發明之一些實施例中，BCD步驟係對來自具有較高初始B細胞計數之患者的PBMC樣本進行。在一些實施例中，較高的初始B細胞計數係初始PBMC樣本中約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多的B細胞。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得在B細胞百分比為至少約70%時，進行B細胞移除步驟或BCD步驟。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得在B細胞百分比為至少約75%時，進行B細胞移除步驟。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得在B細胞百分比為至少約80%時，進行B細胞移除步驟。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得在B細胞百分比為至少約85%時，進行B細胞移除步驟。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得在B細胞百分比為至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多時，進行B細胞移除步驟。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得PBMC係自或自約50 mL患者之周邊血液獲得。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得PBMC係自或自約10 mL至或至約50 mL患者之周邊血液獲得。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得PBMC係自或自約10 mL、自或自約20 mL、自或自約30 mL、自或自約40 mL或自或自約50 mL患者之周邊血液獲得。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得PBMC係自或自約10 mL至或至約100 mL患者之周邊血液獲得。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得PBMC係自或自約10 mL、自或自約20 mL、自或自約30 mL、自或自約40 mL、自或自約50 mL、自或自約60 mL、自或自約70 mL、自或自約80 mL、自或自約90 mL或自或自約100 mL患者之周邊血液獲得。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得將PBMC以每平方公分為或為約12,500個細胞至或至每平方公分約50,000個細胞之密度接種於每個透氣容器中。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得將PBMC以每平方公分為或為約6,250個細胞至或至每平方公分約25,000個細胞之密度接種於每個透氣容器中。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得將PBMC以每平方公分為或為約6,250個細胞至或至每平方公分約50,000個細胞之密度接種於每個透氣容器中。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得將PBMC以每平方公分為或為約25,000個細胞至或至每平方公分約50,000個細胞之密度接種於每個透氣容器中。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得將PBMC以每平方公分為或為約6,250個細胞、每平方公分為或為約9,375個細胞、每平方公分為或為約12,500個細胞、每平方公分為或為約15,625個細胞、每平方公分為或為約18,750個細胞、每平方公分為或為約21,875個細胞、每平方公分為或為約25,000個細胞、每平方公分為或為約28,125個細胞、每平方公分為或為約31,250個細胞、每平方公分為或為約34,375個細胞、每平方公分為或為約37,500個細胞、每平方公分為或為約40,625個細胞、每平方公分為或為約43,750個細胞、每平方公分為或為約47,875個細胞或每平方公分約50,000個細胞之密度接種於每個透氣容器中。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得將對CD3及CD28具有選擇性之珠粒與PBMC混合以形成珠粒與PBMC之混合物的步驟經將對CD3及CD28具有選擇性之珠粒與PBMC混合以形成呈珠粒與PBMC之混合物形式的珠粒與PBMC之複合物置換，且其中培養混合物之步驟經自該混合物分離珠粒與PBMC之複合物及將PBMC與珠粒之複合物以每平方公分約25,000個細胞至每平方公分約50,000個細胞之密度在一或多個含有第一細胞培養基及IL-2之容器中的透氣表面上培養約4天之時段的步驟置換。在其他實施例中，對CD3及CD28具有選擇性之珠粒係磁性珠粒，且自該混合物分離珠粒與PBMC之複合物的步驟係藉由使用磁體自該混合物移除該複合物進行。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得對CD3及CD28具有選擇性之珠粒係與抗CD3抗體及抗CD28抗體結合之珠粒。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得自PBMC移除B細胞係藉由使PBMC與對CD19具有選擇性之珠粒接觸以形成珠粒-CD19+細胞複合物及移除該等複合物以提供耗盡B細胞之PBMC進行。在其他實施例中，對CD19具有選擇性之珠粒係磁性珠粒且使用磁體自PBMC移除磁珠-CD19+細胞複合物。在其他實施例中，對CD19具有選擇性之珠粒係與抗CD19抗體結合之珠粒。在其他實施例中，與抗CD19抗體結合之珠粒係CliniMACS TM抗CD19珠粒(Miltenyi)。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得在收集經擴增之PBL群體之步驟之後，該方法包括進行選擇以自經擴增之PBL群體移除任何殘餘B細胞的步驟。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得進行選擇以自經擴增之PBL群體移除任何殘餘B細胞係藉由將對CD19具有選擇性之珠粒與經擴增之PBL群體混合以形成珠粒及任何殘餘B細胞之複合物並自經擴增之PBL群體移除該等複合物來進行。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得進行選擇以自經擴增之PBL群體移除任何殘餘B細胞係藉由將對CD19具有選擇性之磁性珠粒與經擴增之PBL群體混合以形成磁性珠粒及任何殘餘B細胞之複合物並使用磁體自經擴增之PBL群體移除該等複合物來進行。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得對CD19具有選擇性之珠粒係與抗CD19抗體結合之珠粒。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得患者用ITK抑制劑預治療。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得患者用ITK抑制劑預治療且難以用ITK抑制劑治療。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得患者用依魯替尼預治療。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得患者用依魯替尼預治療且難以用依魯替尼治療。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得患者罹患白血病。
在一些實施例中，本發明提供以上所描述之方法中之任一種，該等方法在適當時經改良以使得患者罹患慢性淋巴球性白血病。 B. 擴增來自骨髓源性 PBMC 之骨髓浸潤淋巴球 (MIL) 的方法
MIL方法1. 在本發明之一些實施例中，描述一種用於擴增來源於骨髓之PBMC中之MIL的方法。在本發明之一些實施例中，該方法在14天內進行。在一些實施例中，該方法包括獲得骨髓PBMC及冷凍保存PBMC。第0天，將PBMC與抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1:1比率(珠粒：細胞)及3000 IU/mL IL-2一起培養。第4天，將3000 IU/mL之額外IL-2添加至培養物中。第7天，再用抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1:1比率(珠粒：細胞)刺激培養物，並將3000 IU/mL額外IL-2添加至培養物中。在第14天收集MIL，移除珠粒，並視情況對MIL進行計數及表型分析。
在本發明之一些實施例中，MIL方法1如下進行：在第0天，將冷凍保存的來源於骨髓之PBMC樣本解凍且對PBMC計數。將在GRex24孔盤中5×10 5個細胞/孔之PBMC與抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1:1比率於每孔約8 ml CM-2細胞培養基(包括RPMI-1640、人類AB血清、L-麩醯胺酸、2-巰基乙醇、硫酸建它黴素、AIM-V培養基)中在3000 IU/mL IL-2存在下共培養。第4天，將細胞培養基更換為補充有3000 IU/mL額外IL-2之AIM-V。第7天，對經擴增之MIL計數。將1×10 6個細胞/孔轉移至新GRex24孔盤中並在3000 IU/mL IL-2存在下，與抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1:1比率於每孔約8 ml AIM-V培養基一起培養。第11天，將細胞培養基自AIM-V更換為CM-4(包括AIM-V培養基、2mM Glutamax及3000 IU/mL IL2)。第14天，使用DynaMag磁體(DynaMag™15)移除DynaBeads ®並對MIL計數。
MIL方法2. 在本發明之一些實施例中，該方法在7天內進行。在一些實施例中，該方法包括獲得來源於骨髓之PBMC及冷凍保存PBMC。第0天，將PBMC與抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以3:1比率(珠粒：細胞)及3000 IU/mL IL-2一起培養。在第7天收集MIL，移除珠粒，並視情況對MIL進行計數及表型分析。
在本發明之一些實施例中，MIL方法2如下進行：在第0天，將冷凍保存之PBMC樣本解凍且對PBMC計數。將在GRex24孔盤中5×10 5個細胞/孔之PBMC與抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1:1比率於每孔約8 ml CM-2細胞培養基(包括RPMI-1640、人類AB血清、l-麩醯胺酸、2-巰基乙醇、硫酸建它黴素、AIM-V培養基)中在3000 IU/mL IL-2存在下共培養。第7天，使用DynaMag磁體(DynaMag™15)移除DynaBeads ®並對MIL計數。
MIL方法3. 在本發明之一些實施例中，該方法包括獲得來自骨髓之PBMC。第0天，針對CD3+/CD33+/ CD20+/CD14+選擇PBMC並進行分選，且對非CD3+/ CD33+/CD20+/CD14+細胞級分進行音波處理且將一部分經音波處理之細胞級分添加回至所選細胞級分中。將3000 IU/mL IL-2添加至細胞培養物中。第3天，將PBMC與抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1:1比率(珠粒：細胞)及3000 IU/mL IL-2一起培養。第4天，將3000 IU/mL之額外IL-2添加至培養物中。第7天，再用抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1:1比率(珠粒：細胞)刺激培養物，並將3000 IU/mL額外IL-2添加至培養物中。第11天，將3000 IU/mL之IL-2添加至培養物中。在第14天收集MIL，移除珠粒，並視情況對MIL進行計數及表型分析。
在本發明之一些實施例中，MIL方法3如下進行：在第0天，將冷凍保存之PBMC樣本解凍且對PBMC計數。將細胞用CD3、CD33、CD20及CD14抗體染色且使用S3e細胞分選器(Bio-Rad)分選。將細胞分選成兩種級分：免疫細胞級分(或MIL級分)(CD3+CD33+CD20+CD14+)及AML胚細胞級分(非CD3+CD33+CD20+CD14+)。將接種於Grex 24孔盤上的數目大致等於來自免疫細胞級分(或MIL級分)之細胞之數目的來自AML胚細胞級分之細胞懸浮於100 ul培養基中並進行音波處理。在此實例中，獲取約2.8×10 4至約3.38×10 5個來自AML胚細胞級分之細胞並使其懸浮於100 ul CM2培養基中，且接著音波處理30秒。在Grex 24孔盤中，將100 ul經音波處理之AML胚細胞級分添加至免疫細胞級分中。免疫細胞在6000 IU/mL IL-2存在下以約2.8×10 4至約3.38×10 5個細胞/孔之量存在於每孔約8 ml CM-2細胞培養基中，並與AML胚細胞級分之部分一起培養約3天。第3天，將抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1:1比率添加至各孔中並培養約1天。第4天，將細胞培養基更換為補充有3000 IU/mL額外IL-2之AIM-V。第7天，對經擴增之MIL計數。將約1.5×10 5至4×10 5個細胞/孔轉移至新GRex 24孔盤中並在3000 IU/mL IL-2存在下，與抗CD3/抗CD28抗體(DynaBeads®)以1:1比率於每孔約8ml AIM-V培養基一起培養。第11天，將細胞培養基自AIM-V更換為CM-4(補充有3000 IU/mL IL-2)。第14天，使用DynaMag磁體(DynaMag™15)移除DynaBeads ®並視情況對MIL計數。
在本發明之一些實施例中，PBMC係自骨髓獲得。在一些實施例中，PBMC係經由血球分離術、抽吸、穿刺活體組織切片檢查或本領域中已知之其他類似方式自骨髓獲得。在一些實施例中，PBMC係新鮮的。在一些實施例中，PBMC係冷凍保存的。
在本發明之一些實施例中，該方法係在約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天或約14天內進行。在一些實施例中，該方法係在約7天內進行。在一些實施例中，該方法係在約14天內進行。
在本發明之一些實施例中，將PBMC與抗CD3/抗CD28抗體一起培養。在一些實施例中，任何可用抗CD3/抗CD28產物均可用於本發明中。在本發明之一些實施例中，所使用之可商購產品係DynaBeads ®。在一些實施例中，將DynaBeads ®與PBMC以1:1(珠粒:細胞)之比率一起培養。在一些實施例中，抗體係與PBMC以1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1或5:1(珠粒:細胞)之比率培養的DynaBeads ®。在任何前述實施例中，使用基於磁珠進行的免疫細胞級分(或MIL級分)(CD3+CD33+CD20+CD14+)或AML胚細胞級分(非CD3+CD33+CD20+CD14+)之選擇。在本發明之一些實施例中，抗體培養步驟及/或用抗體再刺激細胞之步驟係在約2至約6天、約3至約5天或約4天之時段內進行。在本發明之一些實施例中，抗體培養步驟係在約2天、3天、4天、5天或6天之時段內進行。
在本發明之一些實施例中，來自AML胚細胞級分之細胞之數目與來自免疫細胞級分(或MIL級分)之細胞之數目的比率係約0.1:1至約10:1。在一些實施例中，該比率係約0.1:1至約5:1、約0.1:1至約2:1、或約1:1。在本發明之一些實施例中，AML胚細胞級分視情況經破壞以破碎細胞聚集。在一些實施例中，使用音波處理、均質化、細胞溶解、渦旋或振動來破壞AML胚細胞級分。在一些實施例中，使用音波處理破壞AML胚細胞級分。在本發明之一些實施例中，使用適合溶解方法，包含高溫溶解、化學溶解(諸如有機醇)、酶溶解及本領域中已知之其他細胞溶解方法，將非CD3+、非CD33+、非CD20+、非CD14+細胞級分(AML胚細胞級分)溶解。
在本發明之一些實施例中，使每100 uL濃度為約0.2×10 5至約2×10 5個細胞的來自AML胚細胞級分之細胞懸浮並添加至含免疫細胞級分之細胞培養物中。在一些實施例中，濃度係每100 uL約0.5×10 5至約2×10 5個細胞、每100 uL約0.7×10 5至約2×10 5個細胞、每100 uL約1×10 5至約2×10 5個細胞或每100 uL約1.5×10 5至約2×10 5個細胞。
在一些實施例中，將PBMC樣本與IL-2一起培養。在本發明之一些實施例中，用於擴增MIL之細胞培養基包括選自由以下組成之群組之濃度的IL-2：約100 IU/mL、約200 IU/mL、約300 IU/mL、約400 IU/mL、約100 IU/mL、約100 IU/mL、約100 IU/mL、約100 IU/mL、約100 IU/mL、約500 IU/mL、約600 IU/mL、約700 IU/mL、約800 IU/mL、約900 IU/mL、約1,000 IU/mL、約1,100 IU/mL、約1,200 IU/mL、約1,300 IU/mL、約1,400 IU/mL、約1,500 IU/mL、約1,600 IU/mL、約1,700 IU/mL、約1,800 IU/mL、約1,900 IU/mL、約2,000 IU/mL、約2,100 IU/mL、約2,200 IU/mL、約2,300 IU/mL、約2,400 IU/mL、約2,500 IU/mL、約2,600 IU/mL、約2,700 IU/mL、約2,800 IU/mL、約2,900 IU/mL、約3,000 IU/mL、約3,100 IU/mL、約3,200 IU/mL、約3,300 IU/mL、約3,400 IU/mL、約3,500 IU/mL、約3,600 IU/mL、約3,700 IU/mL、約3,800 IU/mL、約3,900 IU/mL、約4,000 IU/mL、約4,100 IU/mL、約4,200 IU/mL、約4,300 IU/mL、約4,400 IU/mL、約4,500 IU/mL、約4,600 IU/mL、約4,700 IU/mL、約4,800 IU/mL、約4,900 IU/mL、約5,000 IU/mL、約5,100 IU/mL、約5,200 IU/mL、約5,300 IU/mL、約5,400 IU/mL、約5,500 IU/mL、約5,600 IU/mL、約5,700 IU/mL、約5,800 IU/mL、約5,900 IU/mL、約6,000 IU/mL、約6,500 IU/mL、約7,000 IU/mL、約7,500 IU/mL、約8,000 IU/mL、約8,500 IU/mL、約9,000 IU/mL、約9,500 IU/mL及約10,000 IU/mL。
在本發明之一些實施例中，可在整個方法之一或多天將額外IL-2添加至培養物中。在本發明之一些實施例中，額外IL-2係在第4天添加。在本發明之一些實施例中，額外IL-2係在第7天添加。在本發明之一些實施例中，額外IL-2係在第11天添加。在一些實施例中，額外IL-2係在第4天、第7天及/或第11天添加。在本發明之一些實施例中，將MIL與額外IL-2一起培養1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天之時段。在本發明之一些實施例中，在每次添加IL-2之後，將MIL培養3天之時段。
在一些實施例中，在該方法期間，將細胞培養基更換至少一次。在一些實施例中，在添加額外IL-2之同時，更換細胞培養基。在一些實施例中，在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天或第14天中之至少一天，更換細胞培養基。在本發明之一些實施例中，在整個方法中使用的細胞培養基可以相同或不同。在本發明之一些實施例中，細胞培養基係CM-2、CM-4或AIM-V。在本發明之一些實施例中，在第11天進行之細胞培養基更換步驟係視情況選用的。在本發明之一些實施例中，用於擴增程序之PBMC的起始細胞數目係約25,000至約1,000,000、約30,000至約900,000、約35,000至約850,000、約40,000至約800,000、約45,000至約800,000、約50,000至約750,000、約55,000至約700,000、約60,000至約650,000、約65,000至約600,000、約70,000至約550,000，較佳地為約75,000至約500,000、約80,000至約450,000、約85,000至約400,000、約90,000至約350,000、約95,000至約300,000、約100,000至約250,000、約105,000至約200,000、或約110,000至約150,000。在本發明之一些實施例中，PBMC之起始細胞數目係約138,000、140,000、145,000或更多個。在一些實施例中，PBMC之起始細胞數目係約28,000個。在一些實施例中，PBMC之起始細胞數目係約62,000個。在一些實施例中，PBMC之起始細胞數目係約338,000個。在一些實施例中，PBMC之起始細胞數目係約336,000個。
在本發明之一些實施例中，MIL之擴增倍數約20%至約100%、25%至約95%、30%至約90%、35%至約85%、40%至約80%、45%至約75%、50%至約100%或25%至約75%。在本發明之一些實施例中，擴增倍數係約25%。在本發明之一些實施例中，擴增倍數係約50%。在一些實施例中，擴增倍數係約75%。
在本發明之一些實施例中，MIL係自10-50 mL骨髓抽吸物擴增。在本發明之一些實施例中，自患者獲得10 mL骨髓抽吸物。在一些實施例中，自患者獲得20 mL骨髓抽吸物。在一些實施例中，自患者獲得30 mL骨髓抽吸物。在一些實施例中，自患者獲得40 mL骨髓抽吸物。在一些實施例中，自患者獲得50 mL骨髓抽吸物。
在本發明之一些實施例中，自約10-50 ml骨髓抽吸物得到的PBMC之數目係約5×10 7至約10×10 7個PBMC。在一些實施例中，得到的PMBC之數目係約7×10 7個PBMC。
在本發明之一些實施例中，約5×10 7至約10×10 7個PBMC得到約0.5×10 6至約1.5×10 6個擴增起始細胞材料。在本發明之一些實施例中，得到約1×10 6個擴增起始細胞材料。
在本發明之一些實施例中，在擴增時段結束時收集之MIL的總數目係約0.01×10 9至約1×10 9、約0.05×10 9至約0.9×10 9、約0.1×10 9至約0.85×10 9、約0.15×10 9至約0.7×10 9、約0.2×10 9至約0.65×10 9、約0.25×10 9至約0.6×10 9、約0.3×10 9至約0.55×10 9、約0.35×10 9至約0.5×10 9或約0.4×10 9至約0.45×10 9。
在本發明之一些實施例中，12×10 6個來源於骨髓抽吸物之PBMC得到約1.4×10 5個起始細胞材料，該起始細胞材料在擴增程序結束時得到約1.1×10 7個MIL。
在本發明之一些實施例中，相較於使用方法1或MIL方法2擴增之MIL，使用以上描述之MIL方法3自骨髓PBMC擴增之MIL包括較高比例的CD8+細胞以及較少數目之LAG3+及PD1+細胞。在本發明之一些實施例中，相較於使用MIL方法1或MIL方法2擴增之PBL，使用以上描述之MIL方法3自血液PBMC擴增之PBL包括較高比例之CD8+細胞及增加之IFNγ製造量。
在本發明之一些實施例中，可用於急性骨髓性白血病(AML)患者之MIL的臨床劑量在約4×10 8至約2.5×10 9個MIL範圍內。在一些實施例中，本發明之醫藥組成物中所提供之MIL的數目係9.5×10 8個MIL。在一些實施例中，本發明之醫藥組成物中所提供之MIL的數目係4.1×10 8個。在一些實施例中，本發明之醫藥組成物中所提供之MIL的數目係2.2×10 9個。
在任何前述實施例中，PBMC可來源於全血樣本、骨髓、藉由血球分離術獲得，來源於白血球層，或自本領域中已知的用於獲得PBMC之任何其他方法獲得。 VIII. Gen 2 TIL 製造方法 -2A
圖1及圖2中描繪一個例示性TIL程序系列，稱為Gen 2(又稱為程序2A)，其含有此等特徵中之一些。Gen 2之一個實施例示於圖2中。
如本文所論述，本發明可包含與再刺激冷凍保存之TIL以增加其代謝活性且因此在移植至患者體內之前增加相對健康相關的步驟，及測試該代謝健康之方法。如本文大體上概述，TIL一般係獲自患者樣本且在移植至患者體內之前進行操作以擴增其數目。在一些實施例中，TIL可視情況如下文所論述經基因操作。
在一些實施例中，TIL可經冷凍保存。解凍後，其亦可經再刺激以在輸注至患者體內之前增加其代謝。
在一些實施例中，將第一次擴增(包含稱為pre-REP之程序以及圖1中顯示為步驟A之程序)縮短至3至14天，且將第二次擴增(包含稱為REP之程序以及圖1中顯示為步驟B之程序)縮短至7至14天，如下文以及實例及圖式中詳細論述的。在一些實施例中，將第一次擴增(例如圖1中步驟B所描述之擴增)縮短至11天，且將第二次擴增(例如圖1中步驟D中所描述之擴增)縮短至11天。在一些實施例中，將第一次擴增及第二次擴增之組合(例如圖1中描述為步驟B及步驟D之擴增)縮短至22天，如下文以及實施例及圖式中詳細論述的。在一些實施例中，pre-REP及/或REP步驟係使用包含第一抗生素組分之培養基進行。在例示性實施例中，一或多種抗生素係萬古黴素。在例示性實施例中，pre-REP及/或REP步驟中所使用之培養基包含萬古黴素且不含額外抗生素。
以下「步驟」名稱A、B、C等參照圖1且參照本文所描述之某些實施例。以下步驟及圖1中之步驟次序為例示性的，且本申請案及本文所揭示之方法涵蓋步驟之任何組合或次序，以及額外步驟、步驟重複及/或步驟省略。 A. 步驟 A ：獲得患者腫瘤樣本
一般而言，TIL最初獲自患者腫瘤樣本且接著擴增成較大群體以用於如本文所描述之進一步操作，視情況如本文所概述進行冷凍保存、再刺激，且視情況評估作為TIL健康之指標的表型及代謝參數。
患者腫瘤樣本可使用本領域中已知之方法獲得，一般經由手術切除、穿刺活體組織切片檢查、粗針活體組織切片檢查、小型活體組織切片檢查或用於獲得含有腫瘤與TIL細胞之混合物之樣本的其他方式獲得。在一些實施例中，使用多病灶取樣。在一些實施例中，手術切除、穿刺活體組織切片檢查、粗針活體組織切片檢查、小型活體組織切片檢查或用於獲得含有腫瘤與TIL細胞之混合物之樣本的其他方式包含多病灶取樣(亦即，自患者之一或多個腫瘤部位及/或位置以及在同一位置或緊密相鄰的一或多個腫瘤處獲得樣本)。一般而言，腫瘤樣本可來自任何實體腫瘤，包含原發性腫瘤、侵襲性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣本亦可為液體腫瘤，諸如獲自血液惡性病之腫瘤。實體腫瘤可為肺組織。在一些實施例中，有用的TIL係自非小細胞肺癌(NSCLC)獲得。實體腫瘤可為皮膚組織。在一些實施例中，有用的TIL係自黑素瘤獲得。
收集後，可將腫瘤樣本儲存於含有抗生素組分之儲存組成物中。在一些實施例中，抗生素組分係萬古黴素。在一些實施例中，儲存培養基中所包含之抗生素由萬古黴素組成。在一些實施例中，該抗生素組分包含：1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。在一些實施例中，儲存組成物係本文所描述之低溫儲存組成物中之任一種。
獲得後，腫瘤樣本一般使用銳器分割碎斷成在1至約8 mm 3之間的小塊，其中約2-3 mm 3特別有用。在一些實施例中，使用酶腫瘤消化物培養來自此等片段之TIL。此類腫瘤消化物可藉由在酶培養基(例如洛斯維·帕克紀念研究所(RPMI)1640緩衝液、2 mM麩胺酸、10 mcg/mL建它黴素、30個單位/毫升去氧核糖核酸酶及1.0 mg/mL膠原蛋白酶)中培育，隨後進行機械解離(例如使用組織解離器)來產生。腫瘤消化物可藉由以下產生：將腫瘤置放於酶培養基中且機械解離腫瘤大約1分鐘，隨後在37℃下於5% CO 2中培育30分鐘，隨後在前述條件下重複機械解離及培育循環，直至僅存在小組織塊。在此程序結束時，若細胞懸浮液含有大量紅血球或死細胞，則可使用FICOLL分支鏈親水性多醣進行密度梯度分離以移除此等細胞。可使用本領域中已知之替代方法，諸如美國專利申請公開案第2012/0244133 A1號中所描述之方法，該公開案之揭示內容以引用之方式併入本文中。任何前述方法均可用於本文所描述之任何實施例中擴增TIL之方法或治療癌症之方法。
腫瘤解離酶混合物可包含一或多種解離(消化)酶，諸如但不限於膠原蛋白酶(包含任何摻合或類型之膠原蛋白酶)、Accutase™、Accumax™、玻尿酸酶(hyaluronidase)、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain)、胰蛋白酶(trypsin)、酪蛋白酶(caseinase)、彈性蛋白酶(elastase)、木瓜酶(papain)、XIV型蛋白酶(鏈蛋白酶(pronase))、去氧核糖核酸酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制劑、任何其他解離或蛋白分解酶，及其任何組合。
在一些實施例中，解離酶係自凍乾酶重構。在一些實施例中，凍乾酶係在一定量之無菌緩衝液(諸如HBSS)中重構。
在一些情況下，膠原蛋白酶(諸如無動物源1型膠原蛋白酶)係在10 mL無菌HBSS或另一緩衝液中重構。凍乾之儲備酶的濃度可為每小瓶2892 PZ U。在一些實施例中，膠原蛋白酶係在5 mL至15 mL緩衝液中重構。在一些實施例中，在重構之後，膠原蛋白酶儲備液之範圍為約100 PZ U/mL-約400 PZ U/mL，例如為約100 PZ U/mL-約400 PZ U/mL、約100 PZ U/mL-約350 PZ U/mL、約100 PZ U/mL-約300 PZ U/mL、約150 PZ U/mL-約400 PZ U/mL、約100 PZ U/mL、約150 PZ U/mL、約200 PZ U/mL、約210 PZ U/mL、約220 PZ U/mL、約230 PZ U/mL、約240 PZ U/mL、約250 PZ U/mL、約260 PZ U/mL、約270 PZ U/mL、約280 PZ U/mL、約289.2 PZ U/mL、約300 PZ U/mL、約350 PZ U/mL或約400 PZ U/mL。
在一些實施例中，中性蛋白酶係在1 mL無菌HBSS或另一緩衝液中重構。凍乾之儲備酶的濃度可為每小瓶175 DMC U。在一些實施例中，在重構後，中性蛋白酶儲備液之範圍為約100 DMC/mL-約400 DMC/mL，例如為約100 DMC/mL-約400 DMC/mL、約100 DMC/mL-約350 DMC/mL、約100 DMC/mL-約300 DMC/mL、約150 DMC/mL-約400 DMC/mL、約100 DMC/mL、約110 DMC/mL、約120 DMC/mL、約130 DMC/mL、約140 DMC/mL、約150 DMC/mL、約160 DMC/mL、約170 DMC/mL、約175 DMC/mL、約180 DMC/mL、約190 DMC/mL、約200 DMC/mL、約250 DMC/mL、約300 DMC/mL、約350 DMC/mL或約400 DMC/mL。
在一些實施例中，去氧核糖核酸酶I係在1 mL無菌HBSS或另一緩衝液中重構。凍乾之儲備酶的濃度為每小瓶4 KU。在一些實施例中，在重構後，去氧核糖核酸酶I儲備液之範圍為約1 KU/mL -10 KU/mL，例如為約1 KU/mL、約2 KU/mL、約3 KU/mL、約4 KU/mL、約5 KU/mL、約6 KU/mL、約7 KU/mL、約8 KU/mL、約9 KU/mL或約10 KU/mL。
在一些實施例中，酶之儲備液係可變的且可能需要測定濃度。在一些實施例中，可確證凍乾儲備液之濃度。在一些實施例中，添加至消化物混合液中的酶之最終量係基於所測定之儲備液之濃度調節。
在一些實施例中，酶混合物包含在約4.7 mL無菌HBSS中的約10.2 μl中性蛋白酶(0.36 DMC U/mL)、21.3 µL膠原蛋白酶(1.2 PZ/mL)及250 μl去氧核糖核酸酶I(200 U/mL)。
如上文所指出，在一些實施例中，TIL係來源於實體腫瘤。在一些實施例中，實體腫瘤未經碎斷。在一些實施例中，實體腫瘤未經碎斷且以全腫瘤形式進行酶消化。在一些實施例中，腫瘤係在包括膠原蛋白酶、去氧核糖核酸酶及玻尿酸酶之酶混合物中消化。在一些實施例中，腫瘤係在包括膠原蛋白酶、去氧核糖核酸酶及玻尿酸酶之酶混合物中消化1-2小時。在一些實施例中，腫瘤係在37℃、5% CO 2下在包括膠原蛋白酶、去氧核糖核酸酶及玻尿酸酶之酶混合物中消化1至2小時。在一些實施例中，腫瘤係在37℃、5% CO 2、旋轉下在包括膠原蛋白酶、去氧核糖核酸酶及玻尿酸酶之酶混合物中消化1至2小時。在一些實施例中，腫瘤係在恆定旋轉下消化隔夜。在一些實施例中，腫瘤係在37℃、5% CO 2且恆定旋轉下消化隔夜。在一些實施例中，將整個腫瘤與酶組合以形成腫瘤消化反應混合物。
在一些實施例中，在無菌緩衝液中用凍乾酶重構腫瘤。在一些實施例中，緩衝液為無菌HBSS。
在一些實施例中，酶混合物包括膠原蛋白酶。在一些實施例中，膠原蛋白酶為膠原蛋白酶IV。在一些實施例中，膠原蛋白酶之工作儲備液為100 mg/mL 10×工作儲備液。
在一些實施例中，酶混合物包括去氧核糖核酸酶。在一些實施例中，去氧核糖核酸酶之工作儲備液為10,000 IU/mL 10×工作儲備液。
在一些實施例中，酶混合物包括玻尿酸酶。在一些實施例中，玻尿酸酶之工作儲備液為10 mg/mL 10×工作儲備液。
在一些實施例中，酶混合物包括10 mg/mL膠原蛋白酶、1000 IU/mL去氧核糖核酸酶及1 mg/mL玻尿酸酶。
在一些實施例中，酶混合物包括10 mg/mL膠原蛋白酶、500 IU/mL去氧核糖核酸酶及1 mg/mL玻尿酸酶。
一般而言，經收集之細胞懸浮液被稱為「初代細胞群體」或「新鮮收集的」細胞群體。
在一些實施例中，碎斷包含物理碎斷，包含例如分割以及消化。在一些實施例中，碎斷為物理碎斷。在一些實施例中，碎斷為分割。在一些實施例中，碎斷係藉由消化實現。在一些實施例中，TIL最初可由獲自消化或碎斷自患者獲得之腫瘤樣本的酶腫瘤消化物及腫瘤片段培養。
在一些實施例中，在腫瘤係實體腫瘤時，腫瘤在例如步驟A(如圖1中所提供)中獲得腫瘤樣本之後經歷物理碎斷。在一些實施例中，碎斷發生在冷凍保存之前。在一些實施例中，碎斷發生在冷凍保存之後。在一些實施例中，碎斷係在獲得腫瘤之後且在不進行任何冷凍保存的情況下發生。在一些實施例中，將腫瘤碎斷且將10、20、30、40或更多個片段或小塊置於每個容器中進行第一次擴增。在一些實施例中，將腫瘤碎斷且將30或40個片段或小塊置於每個容器中進行第一次擴增。在一些實施例中，將腫瘤碎斷且將40個片段或小塊置於每個容器中進行第一次擴增。在一些實施例中，多個片段包括約4至約50個片段，其中每個片段之體積為約27 mm 3。在一些實施例中，多個片段包括約30至約60個片段，其總體積為約1300 mm 3至約1500 mm 3。在一些實施例中，多個片段包括約50個片段，其總體積為約1350 mm 3。在一些實施例中，多個片段包括約50個片段，其總質量為約1公克至約1.5公克。在一些實施例中，多個片段包括約4個片段。
[0029][0026]在一些實施例中，TIL係自腫瘤片段獲得。在一些實施例中，腫瘤片段係藉由銳器分割獲得。在一些實施例中，腫瘤片段在約1 mm 3與10 mm 3之間。在一些實施例中，腫瘤片段在約1 mm 3與8 mm 3之間。在一些實施例中，腫瘤片段為約1 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約2 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約3 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約4 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約5 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約6 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約7 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約8 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約9 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約10 mm 3。在一些實施例中，腫瘤係1-4 mm×1-4 mm×1-4 mm。在一些實施例中，腫瘤係1 mm × 1 mm × 1 mm。在一些實施例中，腫瘤係2 mm × 2 mm × 2 mm。在一些實施例中，腫瘤係3 mm × 3 mm × 3 mm。在一些實施例中，腫瘤係4 mm × 4 mm × 4 mm。
在一些實施例中，將腫瘤切除以便使各小塊上出血、壞死及/或脂肪組織之量減到最少。在一些實施例中，將腫瘤切除以便使各小塊上出血組織之量減到最少。在一些實施例中，將腫瘤切除以便使各小塊上壞死組織之量減到最少。在一些實施例中，將腫瘤切除以便使各小塊上脂肪組織之量減到最少。
在一些實施例中，進行腫瘤碎斷以便維持腫瘤內部結構。在一些實施例中，腫瘤碎斷係在不使用解剖刀進行鋸切動作的情況下進行。在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤消化物。在一些實施例中，藉由在酶培養基(例如但不限於RPMI 1640、2 mM GlutaMAX、10 mg/mL建它黴素、30 U/mL 去氧核糖核酸酶及1.0 mg/mL膠原蛋白酶)中培育，隨後進行機械解離(GentleMACS，加利福尼亞州奧本之Miltenyi Biotec)來產生腫瘤消化物。在將腫瘤置於酶培養基中之後，可以機械方式將腫瘤解離大約1分鐘。接著，可將溶液在37℃下於5% CO 2中培育30分鐘，且接著再次機械破壞大約1分鐘。在37℃下在5% CO 2中再培育30分鐘之後，可將腫瘤第三次機械破壞大約1分鐘。在一些實施例中，在第三次機械破壞後，若仍存在大片組織，則對樣本再施加1或2次機械解離，不論是否再在37℃下於5% CO 2中培育30分鐘。在一些實施例中，在最終培育結束時，若細胞懸浮液含有大量紅血球或死細胞，則可使用Ficoll進行密度梯度分離以移除此等細胞。
在一些實施例中，在第一次擴增步驟之前收集的細胞懸浮液稱為「初代細胞群體」或「新鮮收集的」細胞群體。
在一些實施例中，細胞可視情況在樣本收集之後冷凍且在進入步驟B中所描述之擴增之前冷凍儲存，該步驟在下文進一步詳細描述以及在圖1以及圖8中所例示。
在一些實施例中，在將腫瘤樣本解離或碎斷成腫瘤片段之前，將其在包括抗生素組分之洗滌緩衝液中洗滌至少一次。本文所描述之任何腫瘤洗滌緩衝液均可用於洗滌腫瘤樣本。在一些實施例中，抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。在例示性實施例中，洗滌緩衝液包括萬古黴素。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度為50 µg/mL-600 µg/mL。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係100 µg/mL。在例示性實施例中，將腫瘤樣本在洗滌緩衝液中洗滌3次或更多次。
在一些實施例中，在冷凍保存或第一次擴增之前，將腫瘤樣本在包括抗生素組分之洗滌緩衝液中洗滌至少一次。本文所描述之任何腫瘤洗滌緩衝液均可用於洗滌腫瘤片段。在一些實施例中，抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。在例示性實施例中，洗滌緩衝液包括萬古黴素。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度為50 µg/mL-600 µg/mL。。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係100 µg/mL。在例示性實施例中，將腫瘤樣本在洗滌緩衝液中洗滌3次或更多次。 1.胸膜滲出液TIL
在一些實施例中，樣本係胸膜液樣本。在一些實施例中，用於根據本文所描述之程序擴增之T細胞或TIL的來源為胸膜液樣本。在一些實施例中，樣本係胸膜滲出液源性樣本。在一些實施例中，根據本文所描述之程序的用於擴增之T細胞或TIL的來源為胸膜滲出液源性樣本。參見例如美國專利公開案US 2014/0295426中所描述之方法，其以全文引用之方式併入本文中用於所有目的。
在一些實施例中，可以採用疑似含有及/或含有TIL之任何胸膜液或胸膜滲出液。此類樣本可來源於原發性或轉移性肺癌，諸如NSCLC或SCLC。在一些實施例中，樣品可來源於起源自另一器官(例如乳房、卵巢、結腸或前列腺)之繼發性轉移性癌細胞。在一些實施例中，用於本文所描述之擴增方法中之樣本為胸膜滲出物(pleural exudate)。在一些實施例中，用於本文所描述之擴增方法中之樣本為胸膜溢出物(pleural transudate)。其他生物樣本可包括含有TIL之其他漿液，包含例如來自腹部之腹水液或胰囊腫液。腹水液及胸膜液涉及非常類似的化學系統；腹部及肺兩者在相同的惡性腫瘤事件中於胸腔及腹腔中皆具有間皮細胞株及流體形式，且在一些實施例中，此類流體含有TIL。在所揭示之方法利用胸膜液的一些實施例中，可使用含有TIL之腹水或其他囊腫液進行相同的方法，得到類似結果。
在一些實施例中，胸膜液呈未處理形式，即呈直接自患者取出形式。在一些實施例中，在進一步處理步驟之前，將未處理之胸膜液置放於標準血液收集管，諸如EDTA或肝素管中。在一些實施例中，在進一步處理步驟之前，將未經處理之胸膜液置放於標準CellSave®管(Veridex)中。在一些實施例中，在自患者收集之後立即將樣本置於CellSave管中，以避免活TIL之數目減少。若保留在未經處理之胸膜液中，則即使在4℃下，活TIL之數目亦可能在24小時內顯著降低。在一些實施例中，樣本係在自患者移除之後1小時、5小時、10小時、15小時或至多24小時內置於適當收集管中。在一些實施例中，樣本係在4℃下自患者移除之後1小時、5小時、10小時、15小時或至多24小時內置於適當收集管中。
在一些實施例中，可以稀釋來自所選個體之胸膜液樣本。在一些實施例中，稀釋度為1:10胸膜液比稀釋劑。在其他實施例中，稀釋度為1:9胸膜液比稀釋劑。在其他實施例中，稀釋度為1:8胸膜液比稀釋劑。在其他實施例中，稀釋度為1:5胸膜液比稀釋劑。在其他實施例中，稀釋度為1:2胸膜液比稀釋劑。在其他實施例中，稀釋度為1:1胸膜液比稀釋劑。在一些實施例中，稀釋劑包含鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、另一緩衝液或生理學上可接受之稀釋劑。在一些實施例中，樣本係在自患者收集及稀釋之後立即置於CellSave管中，以避免活TIL減少，若保留在未經處理之胸膜液中，則即使在4℃下，活TIL可能在24至48小時內顯著減少。在一些實施例中，胸膜液樣本係在自患者移除且稀釋之後1小時、5小時、10小時、15小時、24小時、36小時、至多48小時內置於適當收集管中。在一些實施例中，胸膜液樣本係在自患者移除且在4℃下稀釋之後1小時、5小時、10小時、15小時、24小時、36小時、至多48小時內置於適當收集管中。
在又其他實施例中，在進一步的處理步驟之前，藉由習知方式濃縮胸膜液樣本。在一些實施例中，在胸膜液必須冷凍保存以便運送至進行該方法之實驗室或用於後續分析(例如在收集後24至48小時之後)之情形下，此胸膜液之預處理較佳。在一些實施例中，藉由在將胸膜液樣本自個體中取出後將其離心並將離心液或沈澱物再懸浮於緩衝液中來製備胸膜液樣本。在一些實施例中，對胸膜液樣本進行多次離心及再懸浮，隨後將其冷凍保存以用於運輸或以後的分析及/或處理。
在一些實施例中，在進一步的處理步驟之前，藉由使用過濾方法濃縮胸膜液樣本。在一些實施例中，在進一步處理中使用之胸膜液樣本係藉由將流體經含有已知且實質上均一之孔徑的過濾器過濾而製備，該孔徑允許胸膜液通過膜，但保留腫瘤細胞。在一些實施例中，膜中各孔之直徑可為至少4 μM。在其他實施例中，孔徑可為5 μM或更大，且在其他實施例中可為6 μM、7 μM、8 μM、9 μM或10 μM中之任一者。過濾之後，可將被膜保留之細胞(包含TIL)自膜上衝出至適合的生理學上可接受之緩衝液中。接著，可將以此方式濃縮之細胞(包含TIL)用於該方法之其他處理步驟中。
在一些實施例中，使胸膜液樣本(包含例如未經處理之胸膜液)、經稀釋之胸膜液或再懸浮之細胞沈澱物與溶解試劑接觸，該溶解試劑差異性地溶解樣本中存在之無核紅血球。在一些實施例中，在胸膜液含有大量RBC之情形下，此步驟係在進一步的處理步驟之前進行。適合的溶解試劑包含單一溶解試劑、或溶解試劑及淬滅試劑，或溶解試劑、淬滅試劑及固定試劑。適合的溶解系統為可商購的，且包含BD Pharm Lyse™系統(Becton Dickenson)。其他溶解系統包含Versalyse™系統、FACSlyse™系統(Becton Dickenson)、Immunoprep™系統或Erythrolyse II系統(Beckman Coulter, Inc.)或氯化銨系統。在一些實施例中，溶解試劑可隨主要需求而變化，該等需求為紅血球之有效溶解，以及TIL之保持及胸膜液中TIL之表型特性。除採用單一試劑進行溶解之外，可用於本文所描述之方法的溶解系統可包含第二試劑，例如在該方法之剩餘步驟期間淬滅或延遲溶解試劑之作用的第二試劑，例如Stabilyse™試劑(Beckman Coulter, Inc.)。取決於溶解試劑之選擇或該方法之較佳實施，亦可採用習知固定試劑。
在一些實施例中，在約-140℃之溫度下冷凍保存如上文所描述的未經處理、稀釋或多次離心或處理的胸膜液樣本，隨後如本文所提供進行進一步處理及/或擴增。 B. 步驟 B ：第一次擴增
在一些實施例中，本發明方法提供獲得年輕TIL，其能夠在投與個體/患者時提供增加之複製循環且因此可提供優於較老TIL(亦即，在投與個體/患者之前進一步經歷更多輪複製之TIL)之額外治療益處。年輕TIL之特徵已描述於文獻中，例如於Donia等人,《斯堪的納維亞免疫學雜誌( Scand. J. Immunol.)》 2012, 75,157-167；Dudley等人, 《臨床癌症研究( Clin.Cancer Res.)》 2010, 16,6122-6131；Huang等人, 《免疫療法雜誌( J. Immunother.)》 2005, 28, 258-267；Besser等人, 《臨床癌症研究》 2013, 19, OF1-OF9；Besser等人, 《免疫療法雜誌》 2009, 32:415-423；Robbins等人, 《免疫學雜誌( J. Immunol.)》 2004, 173,7125-7130；Shen等人, 《免疫療法雜誌》, 2007, 30,123-129；Zhou等人, 《免疫療法雜誌》 2005, 28,53-62；及Tran等人, 《免疫療法雜誌》, 2008, 31, 742-751，其各自以引用的方式併入本文中。
T淋巴球及B淋巴球之多種抗原受體係藉由有限但大量的基因區段之體細胞重組產生。此等基因區段：V(可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)之結合特異性及下游應用。本發明提供一種用於產生展現且增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施例中，藉由本發明方法獲得之TIL展現T細胞貯庫多樣性增加。在一些實施例中，相較於新鮮收集之TIL及/或使用除本文所提供之方法以外之其他方法，包含例如除圖1中實施之方法以外的方法製備的TIL，藉由本發明方法獲得的TIL展現T細胞貯庫多樣性增加。在一些實施例中，相較於新鮮收集之TIL及/或使用如圖5及/或圖6中例示的稱為方法1C之方法製備的TIL，藉由本發明方法獲得的TIL展現T細胞貯庫多樣性增加。在一些實施例中，在第一次擴增中獲得之TIL展現T細胞貯庫多樣性增加。在一些實施例中，多樣性增加係免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性增加。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在於選自由α、β、γ及δ受體組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α及/或β之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)β之表現增加。在一些實施例中，TCRab(亦即，TCRα/β)之表現增加。
在例如圖1之步驟A中所描述的腫瘤片段之分割或消化之後，將所得到的細胞在含有IL-2之血清中在相對於腫瘤及其他細胞有利於TIL生長之條件下培養。在一些實施例中，在2 mL孔中的包括含6000 IU/mL IL-2之不活化人類AB血清之培養基中培育腫瘤消化物。將此初代細胞群體培養數天之時段，一般為3至14天，產生主體TIL群體，一般為約1×10 8個主體TIL細胞。在一些實施例中，將此初代細胞群體培養7至14天之時段，產生主體TIL群體，一般為約1×10 8個主體TIL細胞。在一些實施例中，將此初代細胞群體培養10至14天之時段，產生主體TIL群體，一般為約1×10 8個主體TIL細胞。在一些實施例中，將此初代細胞群體培養約11天之時段，產生主體TIL群體，一般為約1×10 8個主體TIL細胞。
在一些實施例中，TIL之擴增可使用如下文及本文所描述之初始主體TIL擴增步驟(諸如圖1步驟B中所描述之步驟，其可包含稱為pre-REP之程序)進行，隨後進行如下文在步驟D下及本文所描述之第二次擴增(步驟D，包含稱為快速擴增方案(REP)步驟之程序)，隨後視情況進行冷凍保存，且隨後進行如下文及本文所描述之第二步驟D(包含稱為再刺激REP步驟之程序)。獲自此程序的TIL可視情況針對如本文所描述之表型特徵及代謝參數進行表徵。
在24孔盤中，例如使用Costar 24孔平底細胞培養板(Corning Incorporated，Corning，NY)起始TIL培養之實施例中，各孔可接種在含有IL-2(6000 IU/mL；加利福尼亞州愛莫利維爾市(Emeryville, CA)之Chiron Corp.)之2 mL完全培養基(CM)中的1×10 6個腫瘤消化物細胞或一個腫瘤片段。在一些實施例中，腫瘤片段在約1 mm 3與10 mm 3之間。
在一些實施例中，第一次擴增培養基稱為「CM」(培養基之縮寫)。在一些實施例中，步驟B之CM由含GlutaMAX且補充有10%人類AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素之RPMI 1640組成。在具有40 mL容量及10 cm 2透氣矽底的透氣性培養瓶(例如G-REX10；明尼蘇達州新布萊頓市(New Brighton, MN)之Wilson Wolf Manufacturing)中起始培養之實施例中，各培養瓶裝載有在10-40 mL含IL-2之CM中的10-40×10 6個活腫瘤消化物細胞或5-30個腫瘤片段。G-REX10及24孔盤皆在含濕氣培育箱中在37℃及5% CO 2下培育且在培養起始後5天，移除一半培養基且更換為新鮮的CM及IL-2，且在第5天之後，每2-3天更換一半培養基。
在一些實施例中，本文所揭示之擴增程序中使用的培養基為無血清培養基或合成培養基。在一些實施例中，無血清或合成培養基包括基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清替代物。在一些實施例中，無血清或合成培養基用於防止及/或減少部分因含血清培養基之批次間變化所致之實驗變化。
在一些實施例中，無血清或合成培養基包括基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清替代物。在一些實施例中，基礎細胞培養基包含但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無外源物質培養基、杜爾貝科氏改良型伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良型杜爾貝科氏培養基。
在一些實施例中，血清補充劑或血清替代物包含但不限於以下一或多者：CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑、CTS™免疫細胞血清替代物、一或多種白蛋白或白蛋白代用品、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白代用品、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素代用品、一或多種膠原蛋白前驅物、抗生素組分及一或多種微量元素。在一些實施例中，合成培養基包括白蛋白及一或多種選自由以下組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素以及含有微量元素部分Ag +、Al 3+、Ba 2+、Cd 2+、Co 2+、Cr 3+、Ge 4+、Se 4+、Br、T、Mn 2+、P、Si 4+、V 5+、Mo 6+、Ni 2+、Rb +、Sn 2+及Zr 4+之化合物。在一些實施例中，合成培養基進一步包括L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰基乙醇。
在一些實施例中，將CTS™OpTmizer™ T細胞免疫細胞血清替代物與習知生長培養基一起使用，該等生長培養基包含但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CST™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無外源物質培養基、杜爾貝科氏改良型伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良型杜爾貝科氏培養基。
在一些實施例中，無血清或合成培養基中總血清替代物之濃度(vol%)為總無血清或合成培養基體積之約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或合成培養基之總體積的約3%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或合成培養基之總體積的約5%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或合成培養基之總體積的約10%。
在一些實施例中，無血清或合成培養基為CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM為1 L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑之組合，該基礎培養基與該補充劑係在使用前混合在一起。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55 mM的2-巰基乙醇。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)，且2-巰基乙醇於培養基中之最終濃度為55 µM。
[0054][0051] 在一些實施例中，合成培養基為CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM為1 L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑之組合，該基礎培養基與該補充劑係在使用前混合在一起。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55 mM 2-巰基乙醇。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包括約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包括約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包括約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包括約1000 IU/mL至約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包括約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包括約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)，且2-巰基乙醇於培養基中之最終濃度為55 µM。
在一些實施例中，無血清培養基或合成培養基補充有濃度為約0.1 mM至約10 mM、0.5 mM至約9 mM、1 mM至約8 mM、2 mM至約7 mM、3 mM至約6 mM或4 mM至約5 mM的麩醯胺酸(亦即，GlutaMAX®)。在一些實施例中，無血清培養基或合成培養基補充有濃度為約2 mM之麩醯胺酸(亦即，GlutaMAX®)。
在一些實施例中，無血清培養基或合成培養基補充有濃度為約5 mM至約150 mM、10 mM至約140 mM、15 mM至約130 mM、20 mM至約120 mM、25 mM至約110 mM、30 mM至約100 mM、35 mM至約95 mM、40 mM至約90 mM、45 mM至約85 mM、50 mM至約80 mM、55 mM至約75 mM、60 mM至約70 mM或約65 mM之2-巰基乙醇。在一些實施例中，無血清培養基或合成培養基補充有濃度為約55 mM之2-巰基乙醇。在一些實施例中，2-巰基乙醇於培養基中之最終濃度為55 µM。
在一些實施例中，以引用之方式併入本文中的國際PCT公開案第WO/1998/030679號中所描述之合成培養基可用於本發明。在該公開案中，描述無血清真核細胞培養基。無血清真核細胞培養基包含補充有能夠支持細胞在無血清培養中生長之無血清補充劑的基礎細胞培養基。無血清真核細胞培養基補充劑包括一或多種選自由以下組成之群組的成分，或藉由組合一或多種選自由以下組成之群組的成分而獲得：一或多種白蛋白或白蛋白代用品、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白代用品、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素代用品、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種微量元素及抗生素組分。在一些實施例中，合成培養基進一步包括L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或β-巰基乙醇。在一些實施例中，合成培養基包括白蛋白或白蛋白代用品及一或多種選自由以下組成之群組的成分：一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白代用品、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素代用品、一或多種膠原蛋白前驅物及一或多種微量元素。在一些實施例中，合成培養基包括白蛋白及一或多種選自由以下組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素以及含有微量元素部分Ag +、Al 3+、Ba 2+、Cd 2+、Co 2+、Cr 3+、Ge 4+、Se 4+、Br、T、Mn 2+、P、Si 4+、V 5+、Mo 6+、Ni 2+、Rb +、Sn 2+及Zr 4+之化合物。在一些實施例中，基礎細胞培養基係選自由以下組成之群組：杜爾貝科氏改良型伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良型杜爾貝科氏培養基。
在一些實施例中，合成培養基中甘胺酸之濃度在約5-200 mg/L之範圍內，L-組胺酸之濃度為約5-250 mg/L，L-異白胺酸之濃度為約5-300 mg/L，L-甲硫胺酸之濃度為約5-200 mg/L，L-苯丙胺酸之濃度為約5-400 mg/L，L-脯胺酸之濃度為約1-1000 mg/L，L-羥基脯胺酸之濃度為約1-45 mg/L，L-絲胺酸之濃度為約1-250 mg/L，L-蘇胺酸之濃度為約10-500 mg/L，L-色胺酸之濃度為約2-110 mg/L，L-酪胺酸之濃度為約3-175 mg/L，L-纈胺酸之濃度為約5-500 mg/L，硫胺素之濃度為約1-20 mg/L，還原麩胱甘肽之濃度為約1-20 mg/L，L-抗壞血酸-2-磷酸鹽之濃度為約1-200 mg/L，鐵飽和轉鐵蛋白之濃度為約1-50 mg/L，胰島素之濃度為約1-100 mg/L，亞硒酸鈉之濃度為約0.000001-0.0001 mg/L，且白蛋白(例如AlbuMAX® I)之濃度為約5000-50,000 mg/L。
在一些實施例中，合成培養基中甘胺酸之濃度在約5-200 mg/L之範圍內，L-組胺酸之濃度為約5-250 mg/L，L-異白胺酸之濃度為約5-300 mg/L，L-甲硫胺酸之濃度為約5-200 mg/L，L-苯丙胺酸之濃度為約5-400 mg/L，L-脯胺酸之濃度為約1-1000 mg/L，L-羥基脯胺酸之濃度為約1-45 mg/L，L-絲胺酸之濃度為約1-250 mg/L，L-蘇胺酸之濃度為約10-500 mg/L，L-色胺酸之濃度為約2-110 mg/L，L-酪胺酸之濃度為約3-175 mg/L，L-纈胺酸之濃度為約5-500 mg/L，硫胺素之濃度為約1-20 mg/L，還原麩胱甘肽之濃度為約1-20 mg/L，L-抗壞血酸-2-磷酸鹽之濃度為約1-200 mg/L，鐵飽和轉鐵蛋白之濃度為約1-50 mg/L，胰島素之濃度為約1-100 mg/L，亞硒酸鈉之濃度為約0.000001-0.0001 mg/L，且白蛋白(例如AlbuMAX® I)之濃度為約5000-50,000 mg/L。
在一些實施例中，合成培養基中之非微量元素部分成分係以下表4中標題「在1X培養基中之濃度範圍」欄中列出之濃度範圍存在。在其他實施例中，合成培養基中之非微量元素部分成分係以表4中標題「1X培養基之較佳實施例」欄中列出之最終濃度存在。在其他實施例中，合成培養基為包括無血清補充劑之基礎細胞培養基。在一些此等實施例中，無血清補充劑包括下表4中的類型及標題「補充劑之較佳實施例」欄中列出之濃度的非微量部分成分。
Figure 02_image015
在一些實施例中，合成培養基之滲透壓介於約260與350 mOsmol之間。在一些實施例中，滲透壓介於約280與310 mOsmol之間。在一些實施例中，合成培養基補充有至多約3.7 g/L或約2.2 g/L碳酸氫鈉。合成培養基可進一步補充有L-麩醯胺酸(最終濃度為約2 mM)、抗生素組分、非必需胺基酸(NEAA；最終濃度為約100 μM)、2-巰基乙醇(最終濃度為約100 μM)。
在一些實施例中，Smith等人,《臨床與轉化免疫學( Clin Transl Immunology)》, 4(1) 2015(doi: 10.1038/ cti.2014.31)中所描述的合成培養基可用於本發明中。簡言之，使用RPMI或CTS™ OpTmizer™作為基礎細胞培養基且補充有0、2%、5%或10% CTS™免疫細胞血清替代物。
在一些實施例中，第一透氣容器及/或第二透氣容器中之細胞培養基為未經過濾的。使用未經過濾之細胞培養基可簡化擴增細胞數目所需之程序。在一些實施例中，第一透氣容器及/或第二透氣容器中之細胞培養基缺乏β-巰基乙醇(BME或βME；又稱為2-巰基乙醇，CAS 60-24-2)。
在一些實施例中，第一次擴增培養基進一步包含抗生素。在一些實施例中，抗生素包括萬古黴素。在例示性實施例中，培養基中所包含之抗生素由萬古黴素組成。
在製備腫瘤片段之後，將所得到的細胞(亦即，片段)在相對於腫瘤及其他細胞有利於TIL生長之條件下於含有IL-2及抗生素組分之血清中培養。在例示性實施例中，抗生素組分包含萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分由萬古黴素組成且不含額外抗生素。在一些實施例中，該抗生素組分包含：1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。在一些實施例中，將所得到的細胞在2 mL孔中包括不活化人類AB血清(或在一些情況下，如本文所概述，在APC細胞群體存在下)且含6000 IU/mL IL-2之培養基中培育。將此初代細胞群體培養數天之時段，一般為10至14天，產生主體TIL群體，一般為約1×10 8個主體TIL細胞。在一些實施例中，生長培養基在第一次擴增期間包括IL-2或其變體。在一些實施例中，IL-2為重組人類IL-2(rhIL-2)。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有20-30×10 6IU/mg之比活性。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有20×10 6IU/mg之比活性。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有25×10 6IU/mg之比活性。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有30×10 6IU/mg之比活性。在一些實施例中，IL-2儲備液具有4-8×10 6IU/mg IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備液具有5-7×10 6IU/mg IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備液具有6×10 6IU/mg IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備液係如實例5中所描述來製備。在一些實施例中，第一次擴增培養基包括約10,000 IU/mL IL-2、約9,000 IU/mL IL-2、約8,000 IU/mL IL-2、約7,000 IU/mL IL-2、約6000 IU/mL IL-2或約5,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一次擴增培養基包括約9,000 IU/mL IL-2至約5,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一次擴增培養基包括約8,000 IU/mL IL-2至約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一次擴增培養基包括約7,000 IU/mL IL-2至約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一次擴增培養基包括約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基進一步包括IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基進一步包括IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包括約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包括在1000與2000 IU/mL之間、在2000與3000 IU/mL之間、在3000與4000 IU/mL之間、在4000與5000 IU/mL之間、在5000與6000 IU/mL之間、在6000與7000 IU/mL之間、在7000與8000 IU/mL之間、或約8000 IU/mL之IL-2。
在一些實施例中，第一次擴增培養基包括約500 IU/mL IL-15、約400 IU/mL IL-15、約300 IU/mL IL-15、約200 IU/mL IL-15、約180 IU/mL IL-15、約160 IU/mL IL-15、約140 IU/mL IL-15、約120 IU/mL IL-15或約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第一次擴增培養基包括約500 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第一次擴增培養基包括約400 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第一次擴增培養基包括約300 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第一次擴增培養基包括約200 IU/mL IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包括約180 IU/mL IL-15。在一些實施例中，細胞培養基進一步包括IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包括約180 IU/mL IL-15。
在一些實施例中，第一次擴增培養基包括約20 IU/mL IL-21、約15 IU/mL IL-21、約12 IU/mL IL-21、約10 IU/mL IL-21、約5 IU/mL IL-21、約4 IU/mL IL-21、約3 IU/mL IL-21、約2 IU/mL IL-21、約1 IU/mL IL-21或約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一次擴增培養基包括約20 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一次擴增培養基包括約15 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一次擴增培養基包括約12 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一次擴增培養基包括約10 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一次擴增培養基包括約5 IU/mL IL-21至約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第一次擴增培養基包括約2 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包括約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包括約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基進一步包括IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包括約1 IU/mL IL-21。
在一些實施例中，細胞培養基包括抗CD3促效劑，例如OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括約30 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括在0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、在1 ng/mL與5 ng/mL之間、在5 ng/mL與10 ng/mL之間、在10 ng/mL與20 ng/mL之間、在20 ng/mL與30 ng/mL之間、在30 ng/mL與40 ng/mL之間、在40 ng/mL與50 ng/mL之間及在50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基不包括OKT-3抗體。在一些實施例中，OKT-3抗體為莫羅單抗。參見例如表1。
在一些實施例中，細胞培養基在細胞培養基中包括一或多種TNFRSF促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑包括4-1BB促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑為4-1BB促效劑，且該4-1BB促效劑選自由以下組成之群組：烏瑞魯單抗、烏圖木單抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、變體、生物類似物及組合。在一些實施例中，添加的TNFRSF促效劑之濃度足以在細胞培養基中達成在0.1 µg/mL與100 µg/mL之間之濃度。在一些實施例中，添加的TNFRSF促效劑之濃度足以在細胞培養基中達成在20 µg/mL與40 µg/mL之間之濃度。
在一些實施例中，除一或多種TNFRSF促效劑之外，細胞培養基進一步包括初始濃度為約3000 IU/mL之IL-2及初始濃度為約30 ng/mL之OKT-3抗體，且其中該一或多種TNFRSF促效劑包括4-1BB促效劑。
在一些實施例中，第一次擴增培養基稱為「CM」(培養基之縮寫)。在一些實施例中，其稱為CM1 (培養基1)。在一些實施例中，CM由含GlutaMAX且補充有10%人類AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素之RPMI 1640組成。在具有40 mL容量及10 cm 2透氣矽底的透氣性培養瓶(例如G-REX10；明尼蘇達州新布萊頓市的Wilson Wolf Manufacturing)中起始培養之實施例中，各培養瓶裝載有在10-40 mL含IL-2之CM中的10-40×10 6個活腫瘤消化物細胞或5-30個腫瘤片段。G-REX10及24孔盤皆在含濕氣培育箱中在37℃及5% CO 2下培育且在培養起始後5天，移除一半培養基且更換為新鮮的CM及IL-2，且在第5天之後，每2-3天更換一半培養基。在一些實施例中，CM為實例中所描述之CM1，參見實例1。在一些實施例中，CM(例如CM1)包含抗生素組分。在某些例示性實施例中，抗生素組分包括萬古黴素。在例示性實施例中，CM(例如CM1)由萬古黴素組成。在一些實施例中，第一次擴增發生於初始細胞培養基或第一細胞培養基中。在一些實施例中，初始細胞培養基或第一細胞培養基包括IL-2。在一些實施例中，初始細胞培養基或第一細胞培養基包括抗生素組分。在例示性實施例中，一或多種抗生素由萬古黴素組成。
在一些實施例中，第一次擴增培養基包含抗生素組分。在一些實施例中，該抗生素組分包含：1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，初始細胞培養基或第一細胞培養基包含抗生素組分。在一些實施例中，該抗生素組分包含：1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約100 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素。在例示性實施例中，抗生素組分由約50 µg mL至約600 µg/mL萬古黴素組成。在例示性實施例中，抗生素組分由約100 µg/mL萬古黴素組成。
在一些實施例中，抗生素組分包含約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約50 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL萬古黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素、約100 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素及約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素、約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素及約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，第一次擴增(包含諸如描述於圖1之步驟B中之程序，其可包含有時稱為pre-REP之程序)程序縮短至3-14天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，第一次擴增((包含諸如圖1之步驟B中所描述之程序，其可包含有時稱為pre-REP之程序)縮短至7至14天，如實例中所論述以及圖4及圖5中所展示，以及包含例如圖1之步驟B中所描述之擴增。在一些實施例中，步驟B之第一次擴增縮短至10-14天。在一些實施例中，如例如圖1之步驟B中所描述之擴增中所論述，第一次擴增縮短至11天。
在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行1天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行2天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行3天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行4天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行5天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行6天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行7天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行8天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行9天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行10天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行11天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行12天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行13天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行1天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行2天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行3天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行4天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行5天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行6天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行7天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行8天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行9天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行10天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行11天。
在一些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第一次擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及其任何組合可包含在第一次擴增期間，包含例如在根據圖1以及本文所描述之步驟B程序期間。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在第一次擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-15及IL-21以及其任何組合可包含在根據圖1以及如本文所描述之步驟B程序期間。
在一些實施例中，如實例及圖式中所論述，第一次擴增(包含稱為pre-REP之程序；例如根據圖1之步驟B)程序縮短到3至14天。在一些實施例中，步驟B之第一次擴增縮短到7至14天。在一些實施例中，步驟B之第一次擴增縮短到10至14天。在一些實施例中，第一次擴增縮短至11天。
在一些實施例中，第一次擴增，例如根據圖1之步驟B係在密閉系統生物反應器中進行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器為單一生物反應器。 1.細胞介素及其他添加劑
如本領域中已知，本文所描述之擴增方法一般使用具有高劑量細胞介素，尤其是IL-2之培養基。
替代地，使用細胞介素之組合進行TIL之快速擴增及或第二擴增亦係可能的，如美國專利申請公開案第US 2017/0107490 A1號中所描述，使用IL-2、IL-15及IL-21中兩種或多於兩種的組合，該案揭示內容以引用之方式併入本文中。因此，可能的組合包含IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2，或IL-15及IL-21，其中後者在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於產生淋巴球，且特別是如其中所描述的T細胞。
在一些實施例中，步驟B亦可包含向培養基中添加OKT-3抗體或莫羅單抗，如本文別處所描述。在一些實施例中，步驟B亦可包含向培養基中添加4-1BB促效劑，如本文別處所描述。在一些實施例中，步驟B亦可包含向培養基中添加OX-40促效劑，如本文別處所描述。在其他實施例中，可在步驟B期間在培養基中使用添加劑，諸如過氧化物酶體增殖物活化受體γ共活化劑I-α促效劑，包含增殖物活化受體(PPAR)-γ促效劑，諸如噻唑啶二酮化合物，如在美國專利申請公開案第US 2019/0307796 A1號中所描述，其揭示內容以引用的方式併入本文中。 C. 步驟 C ：第一次擴增至第二次擴增之轉變
在一些情況下，自第一次擴增獲得的主體TIL群體，包含例如自例如圖1中所示之步驟B獲得的TIL群體，可使用下文所論述之方案立即冷凍保存。替代地，自第一次擴增獲得的TIL群體，稱為第二TIL群體，可經歷第二次擴增(其可包含有時稱為REP之擴增)且接著如下文所論述冷凍保存。類似地，在將經遺傳修飾之TIL用於療法的情況下，第一TIL群體(有時稱為主體TIL群體)或第二TIL群體(在一些實施例中，其可包含稱為REP TIL群體之群體)可在擴增之前或在第一次擴增之後且在第二次擴增之前進行遺傳修飾以用於適合治療。
在一些實施例中，將自第一次擴增(例如來自如圖1中所指示之步驟B)獲得的TIL儲存直至進行表型分析以供選擇。在一些實施例中，自第一次擴增(例如來自如圖1中所指示之步驟B)獲得的TIL未經儲存且直接進行至第二次擴增。在一些實施例中，自第一次擴增獲得的TIL在第一次擴增之後且在第二次擴增之前未經冷凍保存。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後約3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後約3天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後約4天至14天發生。在一些實施例中，第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後約4天至10天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後約7天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後約14天發生。
在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後1天至14天發生。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行2天至14天。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後3天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後4天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後5天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後6天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後7天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後8天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後9天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後10天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後11天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後12天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後13天至14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後14天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後1天至11天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後2天至11天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後3天至11天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後4天至11天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後5天至11天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後6天至11天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後7天至11天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後8天至11天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後9天至11天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後10天至11天發生。在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變係在碎斷發生後11天發生。
在一些實施例中，TIL在第一次擴增之後且在第二次擴增之前未經儲存，且TIL直接進行第二次擴增(例如在一些實施例中，在如圖1中所示之步驟B至步驟D之轉變期間未經歷儲存)。在一些實施例中，轉變在如本文所描述之密閉系統中發生。在一些實施例中，來自第一次擴增之TIL，即第二TIL群體，在無轉變時段之情況下直接進行第二次擴增。
在一些實施例中，自第一次擴增至第二次擴增之轉變，例如根據圖1之步驟C，係在密閉系統生物反應器中進行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器為單一生物反應器。 1. 細胞介素
如本領域中已知，本文所描述之擴增方法一般使用具有高劑量細胞介素，尤其是IL-2的培養基。
替代地，使用細胞介素組合進行TIL之快速擴增及/或第二次擴增亦為可能的，如國際公開案第WO 2015/189356號及W國際公開案第WO 2015/189357號中大體上概述，使用IL-2、IL-15及IL-21中兩種或多於兩種之組合，該等公開案特此以全文引用的方式明確併入本文中。因此，可能的組合包含IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於產生淋巴球，且特別是如其中所描述的T細胞。參見表2。 2. 抗生素
本文所描述之第一次或初始擴增方法一般使用包含抗生素組分之培養基。
在一些實施例中，抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分包含約100 µg/mL萬古黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約50 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL萬古黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素、約100 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素及約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素、約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素及約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。 D. 步驟 D ：第二次擴增
在一些實施例中，在收集及初始整體處理之後，例如在步驟A及步驟B，以及稱為步驟C之轉變之後，TIL細胞群體的數目擴增，如圖1中所指示)。此進一步擴增在本文中稱為第二次擴增，其可包含在本領域中一般稱為快速擴增程序(REP；以及如圖1之步驟D中所指示之程序)之擴增程序。第二次擴增一般係使用包括多種組分之培養基在透氣容器中完成，該多種組分包含飼養細胞、細胞介素源、視情況選用之抗生素組分及抗CD3抗體。在一些實施例中，該視情況選用之抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。
在一些實施例中，第二次擴增或第二次TIL擴增(其可包含有時稱為REP之擴增；以及如圖1之步驟D中所指示之程序)可使用本領域中熟習此項技術者已知之任何TIL培養瓶或容器進行。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約7天至約14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約8天至約14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約9天至約14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約10天至約14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約11天至約14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約12天至約14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約13天至約14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約14天。
在一些實施例中，第二次擴增可在透氣容器中使用本揭示案之方法(包含例如稱為REP之擴增；以及如圖1之步驟D中所指示之程序)進行。舉例而言，TIL可在介白素-2(IL-2)或介白素-15(IL-15)存在下使用非特異性T細胞受體刺激進行快速擴增。非特異性T細胞受體刺激物可包含例如抗CD3抗體，諸如約30 ng/mL OKT3、小鼠單株抗CD3抗體(可商購自新澤西州拉里坦市的Ortho-McNeil或加利福尼亞州奧本市的Miltenyi Biotech)或UHCT-1(可商購自美國加利福尼亞州聖地亞哥市的BioLegend)。TIL可藉由在第二次擴增期間包含一或多種癌症抗原(包含其抗原性部分，諸如抗原決定基)來擴增以在活體外誘導進一步TIL刺激，該等抗原可視情況在T細胞生長因子(諸如300 IU/mL IL-2或IL-15)存在下視情況自載體表現，該載體諸如人類白血球抗原A2(HLA-A2)結合肽，例如0.3 μM MART-1:26-35(27 L)或gpl 00:209-217(210M)。其他適合抗原可包含例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2，或其抗原部分。TIL亦可藉由用脈衝至表現HLA-A2之抗原呈現細胞上的相同癌症抗原再刺激而快速擴增。替代地，TIL可進一步用例如實例經照射之自體淋巴球或用經照射之HLA-A2+同種異體淋巴球及IL-2再刺激。在一些實施例中，再刺激作為第二次擴增之一部分發生。在一些實施例中，第二次擴增係在經照射之自體淋巴球或經照射之HLA-A2+同種異體淋巴球及IL-2存在下發生。
在一些實施例中，第二次擴增中之細胞培養基視情況包含抗生素組分。在一些實施例中，抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約100 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素、約100 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素及約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素、約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素及約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，細胞培養基進一步包括IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包括約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包括在1000與2000 IU/mL之間、在2000與3000 IU/mL之間、在3000與4000 IU/mL之間、在4000與5000 IU/mL之間、在5000與6000 IU/mL之間、在6000與7000 IU/mL之間、在7000與8000 IU/mL之間、或8000 IU/mL之IL-2。
在一些實施例中，細胞培養基包括OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括約30 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括在0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、在1 ng/mL與5 ng/mL之間、在5 ng/mL與10 ng/mL之間、在10 ng/mL與20 ng/mL之間、在20 ng/mL與30 ng/mL之間、在30 ng/mL與40 ng/mL之間、在40 ng/mL與50 ng/mL之間及在50 ng/mL與100 ng/mL之間之OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基不包括OKT-3抗體。在一些實施例中，OKT-3抗體為莫羅單抗。
在一些實施例中，細胞培養基包括一或多種TNFRSF促效劑於細胞培養基中。在一些實施例中，TNFRSF促效劑包括4-1BB促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑為4-1BB促效劑，且該4-1BB促效劑選自由以下組成之群組：烏瑞魯單抗、烏圖木單抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、變體、生物類似物及組合。在一些實施例中，添加的TNFRSF促效劑之濃度足以在細胞培養基中達成在0.1 µg/mL與100 µg/mL之間之濃度。在一些實施例中，添加的TNFRSF促效劑之濃度足以在細胞培養基中達成在20 µg/mL與40 µg/mL之間之濃度。
在一些實施例中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，細胞培養基進一步包括初始濃度為約3000 IU/mL之IL-2及初始濃度為約30 ng/mL之OKT-3抗體，且其中該一或多種TNFRSF促效劑包括4-1BB促效劑。
在一些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第二次擴增期間之組合。在一些實施例中，在第二次擴增期間，包含例如在根據圖1以及本文所描述之步驟D程序期間，可包含IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及其任何組合。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在第二次擴增期間之組合。在一些實施例中，在根據圖1及如本文所描述之步驟D程序期間可包含IL-2、IL-15及IL-21以及其任何組合。
在一些實施例中，第二次擴增可在包括IL-2、OKT-3、抗原呈現飼養細胞且視情況包括TNFRSF促效劑之經補充細胞培養基中進行。在一些實施例中，第二次擴增係在經補充細胞培養基中發生。在一些實施例中，經補充細胞培養基包括IL-2、OKT-3及抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，第二細胞培養基包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC；亦稱為抗原呈現飼養細胞)。在一些實施例中，第二次擴增係在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現飼養細胞(亦即，抗原呈現細胞)之細胞培養基中發生。
在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約500 IU/mL IL-15、約400 IU/mL IL-15、約300 IU/mL IL-15、約200 IU/mL IL-15、約180 IU/mL IL-15、約160 IU/mL IL-15、約140 IU/mL IL-15、約120 IU/mL IL-15或約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約500 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約400 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約300 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約200 IU/mL IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包括約180 IU/mL IL-15。在一些實施例中，細胞培養基進一步包括IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包括約180 IU/mL IL-15。
在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約20 IU/mL IL-21、約15 IU/mL IL-21、約12 IU/mL IL-21、約10 IU/mL IL-21、約5 IU/mL IL-21、約4 IU/mL IL-21、約3 IU/mL IL-21、約2 IU/mL IL-21、約1 IU/mL IL-21或約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約20 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約15 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約12 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約10 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約5 IU/mL IL-21至約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約2 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包括約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包括約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基進一步包括IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包括約1 IU/mL IL-21。
在一些實施例中，抗原呈現飼養細胞(APC)為PBMC。在一些實施例中，在快速擴增及/或第二次擴增中TIL與PBMC及/或抗原呈現細胞之比率為約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一些實施例中，在快速擴增及/或第二次擴增中TIL與PBMC之比率介於1比50與1比300之間。在一些實施例中，在快速擴增及/或第二次擴增中TIL與PBMC之比率介於1比100與1比200之間。
在一些實施例中，REP及/或第二次擴增係在培養瓶中進行，其中主體TIL與100倍或200倍過量之不活化飼養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體及3000 IU/mL IL-2混合於150 mL培養基中。進行培養基更換(一般用新鮮培養基經由抽吸更換2/3培養基)，直至細胞轉移至替代生長箱室。替代生長箱室包含G-REX培養瓶及透氣容器，如下文更完整地論述。
在一些實施例中，第二次擴增(其可包含稱為REP程序之程序)縮短至7-14天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，第二次擴增縮短至11天。
在一些實施例中，REP及/或第二次擴增可以使用先前描述的T-175培養瓶及透氣袋(Tran等人, 《免疫療法雜誌》 2008, 31,742-51；Dudley等人, 《免疫療法雜誌》 2003, 26,332-42)或透氣培養皿(G-Rex培養瓶)進行。在一些實施例中，第二次擴增(包含稱為快速擴增之擴增)係在T-175培養瓶中進行，且可將懸浮於150 mL培養基中的約1×10 6個TIL添加至各T-175培養瓶中。TIL可在補充有3000 IU/mL IL-2及30 ng/ml抗CD3的CM與AIM-V培養基之1:1混合物中培養。T-175培養瓶可在37℃下於5% CO 2中培育。可在第5天使用具有3000 IU/mL IL-2的50/50培養基更換一半培養基。在一些實施例中，在第7天，可將來自兩個T-175培養瓶之細胞組合在一個3 L袋中，並將300 mL含5%人類AB血清及3000 IU/mL IL-2之AIM V添加至300 mL TIL懸浮液中。每天或每兩天對每個袋中之細胞數目計數，並添加新鮮培養基以使細胞計數保持在0.5與2.0×10 6個細胞/毫升之間。
在一些實施例中，第二次擴增(其可包含稱為REP之擴增，以及在圖1之步驟D中提及之擴增)可在具有100 cm透氣矽底的500 mL容量之透氣培養瓶(G-Rex 100，可商購自美國明尼蘇達州新布萊頓市的Wilson Wolf Manufacturing Corporation)中進行，可將5×10 6或10×10 6個TIL與PBMC在400 mL補充有5%人類AB血清、3000 IU/mL IL-2及30 ng/mL抗CD3(OKT3)之50/50培養基中培養。G-Rex 100培養瓶可在37℃下於5% CO 2中培育。第5天，可取出250 mL上清液且置放於離心機瓶中且以1500 rpm(491 × g)離心10分鐘。TIL沈澱物可用150 mL含5%人類AB血清、3000 IU/mL IL-2之新鮮培養基再懸浮，且添加回原來的G-Rex 100培養瓶中。當在G-Rex 100培養瓶中連續擴增TIL時，在第7天，可使各G-Rex 100中之TIL懸浮於各培養瓶中存在之300 mL培養基中，且細胞懸浮液可分成3份100 mL等分試樣，該等分試樣可用於接種3個G-Rex 100培養瓶。接著，可將150 mL含5%人類AB血清及3000 IU/mL IL-2之AIM-V添加至各培養瓶中。可將G-Rex 100培養瓶在37℃下於5% CO 2中培育且在4天之後，可將150 mL含3000 IU/mL IL-2之AIM-V添加至各G-Rex 100培養瓶中。可在培養第14天收集細胞。
在一些實施例中，第二次擴增(包含稱為REP之擴增)係在培養瓶中進行，其中將主體TIL與100倍或200倍過量之不活化飼養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體及3000 IU/mL IL-2混合於150 mL培養基中。在一些實施例中，更換培養基直至細胞轉移至替代生長箱室。在一些實施例中，用新鮮培養基藉由抽吸來更換2/3的培養基。在一些實施例中，替代生長箱室包含G-REX培養瓶及透氣容器，如下文更完整論述。
在一些實施例中，進行第二次擴增(包含被稱為REP之擴增)，且其進一步包括選擇具有優良異腫瘤反應性之TIL的步驟。可使用本領域中已知之任何選擇方法。舉例而言，可使用美國專利申請公開案第2016/ 0010058 A1號(其揭示內容以引用之方式併入本文中)中所描述之方法選擇具有優良腫瘤反應性之TIL。
視情況，可在第二次擴增(包含稱為REP擴增之擴增)之後，使用本領域中已知之標準分析進行細胞存活率分析。舉例而言，可對主體TIL樣本進行錐蟲藍排除分析，錐蟲藍選擇性標記死亡細胞且允許進行存活率評定。在一些實施例中，TIL樣本可使用Cellometer K2自動化細胞計數器(馬薩諸塞州勞倫斯市的Nexcelom Bioscience)計數及測定存活率。在一些實施例中，存活率係根據標準Cellometer K2 Image Cytometer自動細胞計數器方案測定。
在一些實施例中，TIL之第二次擴增(包含稱為REP之擴增)可使用如先前所描述之T-175培養瓶及透氣袋(Tran K Q, Zhou J, Durflinger K H等人, 2008, 《免疫療法雜誌》, 31:742-751，及Dudley ME, Wunderlich J R, Shelton TE等人, 2003, 《免疫療法雜誌》, 26:332-342)或透氣G-Rex培養瓶進行。在一些實施例中，第二次擴增係使用培養瓶進行。在一些實施例中，第二次擴增係使用透氣G-Rex培養瓶進行。在一些實施例中，第二次擴增係在T-175培養瓶中進行，並將約1×10 6個TIL懸浮於約150 mL培養基中且將其添加至各T-175培養瓶中。將TIL與作為「飼養」細胞的經照射(50 Gy)同種異體PBMC以1:100之比率一起培養並將細胞在補充有3000 IU/mL IL-2及30 ng/mL抗CD3的CM與AIM-V培養基之1:1混合物(50/50培養基)中培養。將T-175培養瓶在37℃下於5% CO 2中培育。在一些實施例中，在第5天使用含3000 IU/mL IL-2之50/50培養基更換一半培養基。在一些實施例中，在第7天，將來自2個T-175培養瓶之細胞在3 L袋中合併並將300 mL含5%人類AB血清及3000 IU/mL IL-2之AIM-V添加至300 mL TIL懸浮液中。可每天或每兩天對各袋中之細胞數目計數，且可添加新鮮培養基以使細胞計數保持在約0.5與約2.0×10 6個細胞/毫升之間。
在一些實施例中，第二次擴增(包含稱為REP之擴增)係在具有100 cm 2透氣矽底之500 mL容量培養瓶(G-Rex 100，Wilson Wolf)中進行(圖1)，將約5×10 6或10×10 6個TIL與經照射同種異體PBMC在400 mL補充有3000 IU/mL IL-2及30 ng/mL抗CD3之50/50培養基中以1:100之比率培養。G-Rex 100培養瓶係在37℃下於5% CO 2中培育。在一些實施例中，在第5天，取出250 mL上清液並置放於離心機瓶中且以1500 rpm(491 g)離心10分鐘。接著，可用150 mL含3000 IU/mL IL-2之新鮮50/50培養基使TIL沈澱物再懸浮且添加回原來的G-Rex 100培養瓶中。在G-Rex 100培養瓶中連續擴增TIL之實施例中，在第7天，使各G-Rex 100中之TIL懸浮於各培養瓶中存在之300 mL培養基中，且將細胞懸浮液分成三份100 mL等分試樣，使用該等分試樣接種3個G-Rex 100培養瓶。接著，將150 mL含5%人類AB血清及3000 IU/mL IL-2之AIM-V添加至各培養瓶中。將G-Rex 100培養瓶在37℃下於5% CO 2中培育且在4天之後，將150 mL含3000 IU/mL IL-2之AIM-V添加至各G-Rex 100培養瓶中。在培養之第14天收集細胞。
T淋巴球及B淋巴球之多樣抗原受體係藉由有限但大量基因區段之體細胞重組產生。此等基因區段：V(可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)之結合特異性及下游應用。本發明提供一種用於產生展現且增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施例中，藉由本發明方法獲得之TIL展現T細胞貯庫多樣性增加。在一些實施例中，在第二次擴增中獲得之TIL展現T細胞貯庫多樣性增加。在一些實施例中，多樣性增加係免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性增加。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在於選自由α、β、γ及δ受體組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α及/或β之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)β之表現增加。在一些實施例中，TCRab(亦即，TCRα/β)之表現增加。
在一些實施例中，第二次擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包括IL-2、OKT-3以及抗原呈現飼養細胞(APC)，如下文更詳細論述。
在一些實施例中，第二次擴增，例如根據圖1之步驟D係在密閉系統生物反應器中進行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器為單一生物反應器。 1. 飼養細胞及抗原呈現細胞
在一些實施例中，本文所描述之第二次擴增程序(例如包含諸如圖1之步驟D中所描述之擴增以及稱為REP之擴增)在REP TIL擴增期間及/或在第二次擴增期間需要過量的飼養細胞。在許多實施例中，飼養細胞係獲自健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC係使用標準方法，諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。
一般而言，同種異體PBMC經由照射或熱處理而不活化，且如實例中所描述用於REP程序中，其提供用於評估經照射同種異體PBMC之無複製能力的例示性方案。
在一些實施例中，若第14天活細胞總數小於在REP第0天及/或第二次擴增第0天(亦即，第二次擴增之起始日)放入培養物中的初始活細胞數目，則認為PBMC無複製能力且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。
在一些實施例中，若第7天及第14天在OKT3及IL-2存在下培養的活細胞之總數與在REP第0天及/或第二次擴增第0天(亦即，第二次擴增之起始日)放入培養物中的初始活細胞數目相比並未增加，則認為PBMC無複製能力且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC係在30 ng/ml OKT3抗體及3000 IU/ml IL-2存在下培養。
在一些實施例中，若第7天及第14天在OKT3及IL-2存在下培養的活細胞之總數與在REP第0天及/或第二次擴增第0天(亦即，第二次擴增之起始日)放入培養物中的初始活細胞數目相比並未增加，則認為PBMC無複製能力且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC係在5-60 ng/mL OKT3抗體及1000-6000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC係在10-50 ng/mL OKT3抗體及2000-5000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC係在20-40 ng/mL OKT3抗體及2000-4000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC係在25-35 ng/mL OKT3抗體及2500-3500 IU/mL IL-2存在下培養。
在一些實施例中，抗原呈現飼養細胞為PBMC。在一些實施例中，抗原呈現飼養細胞為人工抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，在第二次擴增中TIL與抗原呈現飼養細胞之比率為約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一些實施例中，在第二次擴增中TIL與抗原呈現飼養細胞之比率介於1比50與1比300之間。在一些實施例中，在第二次擴增中TIL與抗原呈現飼養細胞之比率介於1比100與1比200之間。
在一些實施例中，本文所描述之第二次擴增程序需要約2.5×10 9個飼養細胞比約100 × 10 6個TIL之比率。在一些實施例中，本文所描述之第二次擴增程序需要約2.5×10 9個飼養細胞比約50 × 10 6個TIL之比率。在一些實施例中，本文所描述之第二次擴增程序需要約2.5×10 9個飼養細胞比約25 × 10 6個TIL之比率。
在一些實施例中，本文所描述之第二次擴增程序在第二次擴增期間需要過量飼養細胞。在許多實施例中，飼養細胞係自健康血液供體之標準全血單位獲得的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC係使用標準方法，諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一些實施例中，使用人工抗原呈現細胞(aAPC)代替PBMC。
一般而言，同種異體PBMC經由照射或熱處理而不活化，且用於本文所描述之TIL擴增程序，包含圖式及實例中所描述之例示性程序。
在一些實施例中，在第二次擴增中使用人工抗原呈現細胞來代替PBMC或與PBMC組合使用。 2. 細胞介素
如本領域中已知，本文所描述之擴增方法一般使用具有高劑量細胞介素，尤其是IL-2的培養基。
替代地，使用細胞介素組合進行TIL之快速擴增及/或第二次擴增亦為可能的，如國際公開案第WO 2015/189356號及W國際公開案第WO 2015/189357號中大體上概述，使用IL-2、IL-15及IL-21中兩種或多於兩種之組合，該等公開案特此以全文引用的方式明確併入本文中。因此，可能的組合包含IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於產生淋巴球，且特別是如其中所描述的T細胞。 3. 抗生素
本文所描述之第二次擴增方法一般使用包含抗生素組分之培養基。
在一些實施例中，抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。
在一些實施例中，該一或多種抗生素包含約100 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素。在一些實施例中，該一或多種抗生素由約100 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素組成且無額外抗生素。
在一些實施例中，該一或多種抗生素包含約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素。
在一些實施例中，該一或多種抗生素包含約50 µg/mL建它黴素。
在一些實施例中，該一或多種抗生素包含約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，該一或多種抗生素包含約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素。
在一些實施例中，該一或多種抗生素包含約50 µg/mL建它黴素及約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素。
在一些實施例中，該一或多種抗生素包含約50 µg/mL建它黴素、約100 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素及約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，該一或多種抗生素包含約50 µg/mL建它黴素、約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素及約2.5至約10 µg/mL兩性黴素B。 E. 步驟 E ：收集 TIL
在第二次擴增步驟之後，可收集細胞。在一些實施例中，在一、二、三、四個或更多個擴增步驟之後收集TIL，如例如圖1中所提供。在一些實施例中，在兩個擴增步驟之後收集TIL，如例如圖1中所提供。
可以任何適當且無菌之方式，包含例如藉由離心，收集TIL。用於收集TIL之方法為本領域中熟知的且任何此類已知方法均可與本發明程序一起使用。在一些實施例中，使用自動化系統收集TIL。
細胞收集器及/或細胞處理系統可購自各種來源，包含例如Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer及Inotech Biosystems International, Inc.。本發明方法可採用任何基於細胞之收集器。在一些實施例中，細胞收集器及/或細胞處理系統係基於膜之細胞收集器。在一些實施例中，細胞收集係經由細胞處理系統，諸如LOVO系統(由Fresenius Kabi製造)進行。術語「LOVO細胞處理系統」亦係指由任何供應商製造之任何可在無菌及/或密閉系統環境中將包括細胞之溶液泵送通過膜或過濾器(諸如旋轉膜或旋轉過濾器)的儀器或裝置，從而允許連續流動及細胞處理以移除上清液或細胞培養基而不發生沈澱。在一些實施例中，細胞收集器及/或細胞處理系統可在密閉無菌系統中進行細胞分離、洗滌、流體交換、濃縮及/或其他細胞處理步驟。
在一些實施例中，收集，例如根據圖1之步驟B係在密閉系統生物反應器中進行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器為單一生物反應器。
在一些實施例中，根據圖1之步驟E係根據本文所描述之程序進行。在一些實施例中，密閉系統係在無菌條件下經由注射器接取以維持該系統之無菌性及密閉性質。在一些實施例中，採用如實例中所描述之密閉系統。
在一些實施例中，根據實例中所描述之方法收集TIL。在一些實施例中，使用如本文所提及之步驟中所描述的方法在第1天與第11天之間收集TIL，諸如在實例中在第11天收集TIL。在一些實施例中，使用如本文所提及之步驟中所描述的方法在第12天與第24天之間收集TIL，諸如在實例中在第22天收集TIL。在一些實施例中，使用如本文所提及之步驟中所描述的方法在第12天與第22天之間收集TIL，諸如在實例中在第22天收集TIL。 F. 步驟 F ：最終調配及轉移至輸注容器
在如圖1中以例示性次序提供且如上文及本文中詳細概述的步驟A至步驟E完成之後，將細胞轉移至容器中以用於向患者投與，諸如輸注袋或無菌小瓶。在一些實施例中，在使用上文所描述之擴增方法獲得治療足夠數目之TIL後，立即將其轉移至容器中以用於向患者投與。
在一些實施例中，使用本揭示案之APC擴增之TIL係以醫藥組成物形式投與患者。在一些實施例中，醫藥組成物係TIL於無菌緩衝液中之懸浮液。使用本揭示案之PBMC擴增的TIL可藉由本領域中已知的任何適合途徑投與。在一些實施例中，T細胞係以單一動脈內或靜脈內輸注之形式投與，其較佳持續大約30至60分鐘。其他適合之投與途徑包含腹膜內、鞘內及淋巴管內投與。 IX. Gen 3 TIL 製造程序
在不受任何特定理論限制的情況下，咸信如本發明方法中所描述的起始T細胞活化之初始第一次擴增及隨後的加強T細胞活化之快速第二次擴增，允許製備保留「較年輕」表型之經擴增T細胞，且因此預期本發明之經擴增T細胞相較於藉由其他方法擴增之T細胞可對癌細胞展現較高細胞毒性。具體言之，咸信如本發明方法所教示的藉由暴露於抗CD3抗體(例如OKT-3)、IL-2及視情況選用之抗原呈現細胞(APC)起始且接著藉由隨後暴露於額外抗CD-3抗體(例如OKT-3)、IL-2及APC加強的T細胞之活化限制或避免培養物中T細胞之成熟，由此產生表型不太成熟之T細胞群體，該等T細胞因在培養物中擴增而耗竭較少且對癌細胞展現較高細胞毒性。在一些實施例中，快速第二次擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下達成培養規模縱向擴大(scaling up)：(a)藉由在第一容器，例如G-REX-100 MCS容器中以小規模培養物培養T細胞約3至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(b)實現將小規模培養物中的T細胞轉移至比第一容器要大的第二容器，例如G-REX-500 MCS容器中，並在該第二容器中以較大規模培養物來培養來自小規模培養物之T細胞約4至7天之時段。在一些實施例中，將快速擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大(scaling out)：(a)藉由在第一容器，例如G-REX-100 MCS容器中以第一小規模培養物培養T細胞約3至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(b)將來自第一小規模培養物之T細胞轉移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小與第一容器相同的第二容器之中，其中在各第二容器中，將轉移至此類第二容器的來自第一小規模培養物之T細胞部分以第二小規模培養物培養約4至7天之時段。在一些實施例中，將快速擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器，例如G-REX-100 MCS容器中以小規模培養物培養T細胞約3至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(b)將來自小規模培養物之T細胞轉移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器要大的第二容器，例如G-REX-500MCS容器之中，其中在各第二容器中，將轉移至此類第二容器的來自小規模培養物之T細胞部分以較大規模培養物培養約4至7天之時段。在一些實施例中，將快速擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器，例如G-REX-100 MCS容器中以小規模培養物培養T細胞約4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(b)將來自小規模培養物之T細胞轉移且分配至2、3或4個大小比第一容器要大的第二容器，例如G-REX-500 MCS容器之中，其中在各第二容器中，將轉移至此類第二容器的來自小規模培養物之T細胞部分以較大規模培養物培養約5天之時段。
在一些實施例中，在快速擴增分瓶後，各第二容器包括至少10 8個TIL。在一些實施例中，在快速擴增分瓶時，各第二容器包括至少10 8個TIL、至少10 9個TIL或至少10 10個TIL。在一個例示性實施例中，各第二容器包括至少10 10個TIL。
在一些實施例中，將第一小規模TIL培養物分配成複數個亞群。在一些實施例中，將第一小規模TIL培養物分配成複數個約2至5個亞群。在一些實施例中，將第一小規模TIL培養物分配成複數個約2、3、4或5個亞群。
在一些實施例中，在完成快速擴增後，該複數個亞群包括治療有效量之TIL。在一些實施例中，在完成快速擴增後，將一或多個TIL亞群彙集在一起以產生治療有效量之TIL。在一些實施例中，在完成快速擴增後，每個TIL亞群包括治療有效量之TIL。
在一些實施例中，在分成複數個步驟之前，將快速擴增進行約1至5天之時段。在一些實施例中，快速擴增之分瓶係在快速擴增起始後約第1天、第2天、第3天、第4天或第5天發生。
在一些實施例中，快速擴增之分瓶係在第一次擴增(亦即，pre-REP擴增)起始後約第8天、第9天、第10天、第11天、第12天或第13天發生。在一個例示性實施例中，快速擴增之分瓶係在初始第一次擴增起始後約第10天發生。在另一例示性實施例中，快速擴增之分瓶係在初始第一次擴增起始後約第11天發生。
在一些實施例中，在分瓶之後，快速擴增進一步進行約4至11天之時段。在一些實施例中，該快速擴增在分瓶之後進一步進行約3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天之時段。
在一些實施例中，在用於分瓶前快速擴增之細胞培養基包括與用於分瓶後快速擴增之細胞培養基相同的組分。在一些實施例中，用於分瓶前快速擴增之細胞培養基包括與用於分瓶後快速擴增之細胞培養基不同的組分。
在一些實施例中，用於分瓶前快速擴增之細胞培養基包括含IL-2、視情況選用之OKT-3且進一步視情況包括APC。在一些實施例中，用於分瓶前快速擴增之細胞培養基包括IL-2、OKT-3且進一步視情況包括APC。在一些實施例中，用於分瓶前快速擴增之細胞培養基包括IL-2、OKT-3及APC。
在一些實施例中，用於分瓶前快速擴增之細胞培養基係藉由用包括IL-2、視情況選用之OKT-3及進一步視情況選用之APC的新鮮培養基補充第一次擴增中之細胞培養基來產生。在一些實施例中，用於分瓶前快速擴增之細胞培養基係藉由用包括IL-2、OKT-3及APC之新鮮培養基補充第一次擴增中之細胞培養基來產生。在一些實施例中，用於分瓶前快速擴增之細胞培養基係藉由用包括IL-2、視情況選用之OKT-3及進一步視情況選用之APC的新鮮細胞培養基替換第一次擴增中之細胞培養基來產生。在一些實施例中，用於分瓶前快速擴增之細胞培養基係藉由用包括IL-2、OKT-3及APC之新鮮細胞培養基替換第一次擴增中之細胞培養基來產生。
在一些實施例中，用於分瓶後快速擴增之細胞培養基包括IL-2及視情況選用之OKT-3。在一些實施例中，用於分瓶後快速擴增之細胞培養基包括IL-2及OKT-3。在一些實施例中，用於分瓶後快速擴增之細胞培養基係藉由用包括IL-2及視情況選用之OKT-3的新鮮培養基替換用於分瓶前快速擴增之細胞培養基來產生。在一些實施例中，用於分瓶後快速擴增之細胞培養基係藉由用包括IL-2及OKT-3之新鮮細胞培養基替換用於分瓶前快速擴增之細胞培養基來產生。
在一些實施例中，快速擴增之分瓶係在密閉系統中發生。
在一些實施例中，在快速擴增期間TIL培養之規模縱向擴大包括將新鮮細胞培養基添加至TIL培養物中(又稱為飼養TIL)。在一些實施例中，飼養包括頻繁地將新鮮細胞培養基添加至TIL培養物中。在一些實施例中，飼養包括以規律的時間間隔將新鮮細胞培養基添加至TIL培養物中。在一些實施例中，將新鮮細胞培養基經由恆定流量供應至TIL。在一些實施例中，使用自動細胞擴增系統，諸如Xuri W25進行快速擴增及飼養。
在一些實施例中，快速第二次擴增係在藉由初始第一次擴增實現之T細胞活化開始減弱、趨緩、衰退或消退之後進行。
在一些情況下，快速第二次擴增係在藉由初始第一次擴增實現之T細胞活化減弱或減弱約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%之後進行。
在一些實施例中，快速第二次擴增係在藉由初始第一次擴增所實現之T細胞活化已減弱在或在約1%至100%範圍內的百分比之後進行。
在一些實施例中，快速第二次擴增係在藉由初始第一次擴增實現之T細胞活化已減弱在或在約1%至10%、10%至20%、20%至30%、30%至40%、40%至50%、50%至60%、60%至70%、70%至80%、80%至90%或90%至100%範圍內之百分比之後進行。
在一些實施例中，快速第二次擴增係在藉由初始第一次擴增實現之T細胞活化已減弱至少或至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%之後進行。
在一些情況下，快速第二次擴增係在藉由初始第一次擴增實現之T細胞活化已減弱至多或至多約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%之後進行。
在一些實施例中，藉由初始第一次擴增實現之T細胞活化的減弱係藉由T細胞回應於抗原刺激而釋放之干擾素γ之量減少來測定。
在一些實施例中，T細胞之初始第一次擴增係在至多或至多約7天或約8天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之初始第一次擴增係在至多或至多約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之初始第一次擴增係在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之快速第二次擴增係在至多或至多約11天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之快速第二次擴增係在至多或至多約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之快速第二次擴增係在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之初始第一次擴增係在或在約1天至或至約7天之時段內進行且T細胞之快速第二次擴增係在或在約1天至或至約11天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之初始第一次擴增係在至多或至多約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天之時段內進行且T細胞之快速第二次擴增係在至多或至多約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之初始第一次擴增係在或在約1天至或至約8天之時段內進行且T細胞之快速第二次擴增係在或在約1天至或至約9天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之初始第一次擴增係在8天之時段內進行且T細胞之快速第二次擴增係在9天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之初始第一次擴增係在或在約1天至或至約7天之時段內進行且T細胞之快速第二次擴增係在或在約1天至或至約9天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞之初始第一次擴增係在7天之時段內進行且T細胞之快速第二次擴增係在9天之時段內進行。
在一些實施例中，T細胞為腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。
在一些實施例中，T細胞為骨髓浸潤淋巴球(MIL)。
在一些實施例中，T細胞為周邊血液淋巴球(PBL)。
在一些實施例中，T細胞係自罹患癌症之供體獲得。
在一些實施例中，T細胞係自罹患癌症之患者所切除之腫瘤獲得的TIL。
在一些實施例中，T細胞係自罹患血液惡性病之患者之骨髓獲得的MIL。
在一些實施例中，T細胞係自供體之周邊血液單核細胞(PBMC)獲得的PBL。在一些實施例中，供體罹患癌症。在一些實施例中，癌症係癌症係選自由以下組成之群組：黑素瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(包含GBM)、胃腸癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群組：黑素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(包含GBM)、胃腸癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，供體罹患腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為液體腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為實體腫瘤。在一些實施例中，供體罹患血液惡性病。
在本揭示案之某些態樣中，免疫效應細胞(例如T細胞)可使用熟習此項技術者已知之多種技術(諸如FICOLL分離)自收集自個體之血液單元獲得。在一個較佳態樣中，藉由血球分離術自個體之循環血液獲得細胞。血球分離術產物典型地含有淋巴球，包含T細胞、單核球、顆粒球、B細胞、其他成核白血球、紅血球及血小板。在一個態樣中，藉由血球分離術收集之細胞可經洗滌以移除血漿級分且視情況將細胞置於適當緩衝液或培養基中以用於後續處理步驟。在一些實施例中，細胞係用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌。在一個替代實施例中，洗滌溶液缺乏鈣，且可能缺乏鎂或可能缺乏許多(若並非全部)二價陽離子。在一個態樣中，藉由溶解紅血球及例如藉由經PERCOLL梯度離心或藉由逆流離心淘析耗盡單核球，自周邊血液淋巴球分離T細胞。
在一些實施例中，T細胞係自供體之全血或富含淋巴球之血球分離術產物分離的PBL。在一些實施例中，供體罹患癌症。在一些實施例中，癌症係癌症係選自由以下組成之群組：黑素瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(包含GBM)、胃腸癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群組：黑素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(包含GBM)、胃腸癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，供體罹患腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為液體腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為實體腫瘤。在一些實施例中，供體罹患血液惡性病。在一些實施例中，PBL係藉由使用正向或負向選擇方法，亦即使用T細胞表型標記物(例如CD3+ CD45+)移除PBL，或移除非T細胞表型細胞而留下PBL，自全血或富含淋巴球之血球分離術產物分離。在其他實施例中，PBL係藉由梯度離心分離。在自供體組織分離PBL後，PBL之初始第一次擴增可根據本文所描述之任何方法之初始第一次擴增步驟，藉由將適合數目之經分離PBL(在一些實施例中，約1×107個PBL)接種於初始第一次擴增培養物中來起始。
含有一些此等特徵的稱為程序3(在本文中又稱為Gen 3)之例示性TIL程序描繪於圖8(特別是例如圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中，且本發明之此實施例相對於Gen 2的一些優勢描述於圖1、圖2、圖8、圖30及圖31(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中。Gen 3之實施例示於圖1、圖8及圖30(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中。程序2A或Gen 2或Gen 2A亦描述於美國專利公開案第2018/0280436號中，其以全文引用之方式併入本文中。Gen 3程序亦描述於國際專利公開案WO 2020/096988中。
如本文所論述及大體上概述，TIL係取自患者樣本且在移植至患者體內之前，使用本文所描述且稱為Gen 3之TIL擴增程序擴增其數目。在一些實施例中，TIL可視情況如下文所論述經基因操作。在一些實施例中，TIL可在擴增之前或之後經冷凍保存。解凍後，其亦可經再刺激以在輸注至患者體內之前增加其代謝。
在一些實施例中，初始第一次擴增(包含本文中稱為預快速擴增(Pre-REP)的程序，以及圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中顯示為步驟B之程序)縮短到1至8天，且快速第二次擴增(包含在本文中稱為快速擴增方案(REP)的程序，以及圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中顯示為步驟D的程序)縮短到1至9天，如以下以及實例及圖式中詳細論述。在一些實施例中，初始第一次擴增(包含本文中稱為預快速擴增(Pre-REP)的程序，以及圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中顯示為步驟B之程序)縮短到1至8天，且快速第二次擴增(包含在本文中稱為快速擴增方案(REP)的程序，以及圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中顯示為步驟D的程序)縮短到1至8天，如以下及實例及圖式中詳細論述。在一些實施例中，初始第一次擴增(包含本文中稱為預快速擴增(Pre-REP)的程序，以及圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中顯示為步驟B之程序)縮短到1至7天，且快速第二次擴增(包含在本文中稱為快速擴增方案(REP)的程序，以及圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中顯示為步驟D的程序)縮短到1至9天，如以下以及實例及圖式中詳細論述。在一些實施例中，初始第一次擴增(包含本文中稱為預快速擴增(Pre-REP)的程序，以及圖8(特別是例如圖1B及/或圖8C)中顯示為步驟B之程序)係1至7天，且快速第二次擴增(包含在本文中稱為快速擴增方案(REP)的程序，以及圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中顯示為步驟D的程序)係1至10天，如以下以及實例及圖式中詳細論述。在一些實施例中，初始第一次擴增(例如在圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中描述為步驟B之擴增)縮短至8天，且快速第二次擴增(例如在圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中之步驟D中所描述的擴增)係7至9天。在一些實施例中，初始第一次擴增(例如在圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中描述為步驟B之擴增)係8天，且快速第二次擴增(例如在圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中之步驟D中所描述的擴增)係8至9天。在一些實施例中，初始第一次擴增(例如在圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中描述為步驟B之擴增)縮短至7天，且快速第二次擴增(例如在圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中之步驟D中所描述的擴增)係7至8天。在一些實施例中，初始第一次擴增(例如在圖8(特別是例如圖8B及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中描述為步驟B之擴增)縮短至8天，且快速第二次擴增(例如在圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中之步驟D中所描述的擴增)係8天。在一些實施例中，初始第一次擴增(例如在圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中描述為步驟B之擴增)係8天，且快速第二次擴增(例如在圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中之步驟D中所描述的擴增)係9天。在一些實施例中，初始第一次擴增(例如在圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中描述為步驟B之擴增)係8天，且快速第二次擴增(例如在圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中之步驟D中所描述的擴增)係10天。在一些實施例中，初始第一次擴增(例如在圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中描述為步驟B之擴增)係7天，且快速第二次擴增(例如在圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中之步驟D中所描述的擴增)係7至10天。在一些實施例中，初始第一次擴增(例如在圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中描述為步驟B之擴增)係7天，且快速第二次擴增(例如在圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中之步驟D中所描述的擴增)係8至10天。在一些實施例中，初始第一次擴增(例如在圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中描述為步驟B之擴增)係7天，且快速第二次擴增(例如在圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中之步驟D中所描述的擴增)係9至10天。在一些實施例中，初始第一次擴增(例如在圖8(特別是例如圖8B及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中描述為步驟B之擴增)縮短至7天，且快速第二次擴增(例如在圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中之步驟D中所描述的擴增)係7至9天。在一些實施例中，初始第一次擴增與快速第二次擴增(例如在圖8(特別是例如圖1B及/或圖8C)中描述為步驟B及步驟D之擴增)之組合係14-16天，如以下及實例及圖式中詳細論述。詳言之，認為本發明之某些實施例包括初始第一次擴增步驟，其中TIL藉由在IL-2存在下暴露於抗CD3抗體(例如OKT-3)或在至少IL-2及抗CD3抗體(例如OKT-3)存在下暴露於抗原而活化。在某些實施例中，在如上文所描述之初始第一次擴增步驟中活化之TIL為第一TIL群體，亦即，其為初代細胞群體。
以下的「步驟」名稱A、B、C等參照圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中之非限制性實例且參照本文所描述之某些非限制性實施例。以下及圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中之步驟次序為例示性的，且本申請案及本文所揭示之方法涵蓋步驟之任何組合或次序，以及額外步驟、步驟重複及/或步驟省略。 A. 步驟 A ：獲得患者腫瘤樣本
一般而言，TIL最初係獲自患者腫瘤樣本(「初代TIL」)或獲自循環淋巴球，諸如周邊血液淋巴球，包含具有TIL樣特徵之周邊血液淋巴球，且接著將其擴增成較大群體以進行如本文中所描述之進一步操作，視情況經冷凍保存且視情況評估表型及作為TIL健康指標之代謝參數。
患者腫瘤樣本可使用本領域中已知之方法獲得，一般經由手術切除、穿刺活體組織切片檢查或用於獲得含有腫瘤與TIL細胞之混合物之樣本的其他方式獲得。一般而言，腫瘤樣本可來自任何實體腫瘤，包含原發性腫瘤、侵襲性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣本亦可為液體腫瘤，諸如獲自血液惡性病之腫瘤。實體腫瘤可為任何癌症類型，包含但不限於乳癌、胰臟癌、前列腺癌、結腸直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌及皮膚癌(包含但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑素瘤)。在一些實施例中，癌症係選自子宮頸癌、頭頸癌(包含例如頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(GBM)、胃腸癌、卵巢癌、肉瘤、胰臟癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌。在一些實施例中，癌症係黑素瘤。在一些實施例中，有用的TIL係獲自惡性黑素瘤腫瘤，因為報告指出此等腫瘤具有特別高的TIL含量。
收集後，可將腫瘤樣本儲存於含有抗生素組分之儲存組成物中。在一些實施例中，抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。在一些實施例中，儲存組成物係本文所描述之低溫儲存組成物中之任一種。
獲得後，腫瘤樣本一般使用銳器分割而碎斷成在1至約8 mm 3之間的小塊，其中約2-3 mm 3特別有用。TIL係自此等片段使用酶腫瘤消化物培養。此類腫瘤消化物可藉由在酶培養基(例如洛斯維·帕克紀念研究所(RPMI)1640緩衝液、2 mM麩胺酸、10 mcg/mL建它黴素、30個單位/毫升去氧核糖核酸酶及1.0 mg/mL膠原蛋白酶)中培育，隨後進行機械解離(例如使用組織解離器)來產生。腫瘤消化物可藉由以下產生：將腫瘤置放於酶培養基中且機械解離腫瘤大約1分鐘，隨後在37℃下於5% CO 2中培育30分鐘，隨後在前述條件下重複機械解離及培育循環，直至僅存在小組織塊。在此程序結束時，若細胞懸浮液含有大量紅血球或死細胞，則可使用FICOLL分支鏈親水性多醣進行密度梯度分離以移除此等細胞。可使用本領域中已知之替代方法，諸如美國專利申請公開案第2012/0244133 A1號中所描述之方法，該公開案之揭示內容以引用之方式併入本文中。任何前述方法均可用於本文所描述之任何實施例中擴增TIL之方法或治療癌症之方法。
腫瘤解離酶混合物可包含一或多種解離(消化)酶，諸如但不限於膠原蛋白酶(包含任何摻合或類型之膠原蛋白酶)、Accutase™、Accumax™、玻尿酸酶、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain)、胰蛋白酶(trypsin)、酪蛋白酶(caseinase)、彈性蛋白酶(elastase)、木瓜酶(papain)、XIV型蛋白酶(鏈蛋白酶(pronase))、去氧核糖核酸酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制劑、任何其他解離或蛋白分解酶，及其任何組合。
在一些實施例中，解離酶係自凍乾酶重構。在一些實施例中，凍乾酶係在一定量之無菌緩衝液(諸如HBSS)中重構。
在一些情況下，膠原蛋白酶(諸如無動物源1型膠原蛋白酶)係在10 mL無菌HBSS或另一緩衝液中重構。凍乾之儲備酶的濃度可為每小瓶2892 PZ U。在一些實施例中，膠原蛋白酶係在5 mL至15 mL緩衝液中重構。在一些實施例中，在重構後，膠原蛋白酶儲備液之範圍為約100 PZ U/mL-約400 PZ U/mL，例如為約100 PZ U/mL-約400 PZ U/mL、約100 PZ U/mL-約350 PZ U/mL、約100 PZ U/mL-約300 PZ U/mL、約150 PZ U/mL-約400 PZ U/mL、約100 PZ U/mL、約150 PZ U/mL、約200 PZ U/mL, 約210 PZ U/mL、約220 PZ U/mL、約230 PZ U/mL、約240 PZ U/mL、約250 PZ U/mL、約260 PZ U/mL、約270 PZ U/mL、約280 PZ U/mL、約289.2 PZ U/mL、約300 PZ U/mL、約350 PZ U/mL或約400 PZ U/mL。
在一些實施例中，中性蛋白酶係在1 mL無菌HBSS或另一緩衝液中重構。凍乾之儲備酶的濃度可為每小瓶175 DMC U。凍乾之儲備酶的濃度可為175 DMC/mL。在一些實施例中，在重構後，中性蛋白酶儲備液之範圍為約100 DMC/mL-約400 DMC/mL，例如為約100 DMC/mL-約400 DMC/mL、約100 DMC/mL-約350 DMC/mL、約100 DMC/mL-約300 DMC/mL、約150 DMC/mL-約400 DMC/mL、約100 DMC/mL、約110 DMC/mL、約120 DMC/mL、約130 DMC/mL、約140 DMC/mL、約150 DMC/mL、約160 DMC/mL、約170 DMC/mL、約175 DMC/mL、約180 DMC/mL、約190 DMC/mL、約200 DMC/mL、約250 DMC/mL、約300 DMC/mL、約350 DMC/mL或約400 DMC/mL。
在一些實施例中，去氧核糖核酸酶I係在1 mL無菌HBSS或另一緩衝液中重構。凍乾之儲備酶的濃度為每小瓶4 KU。在一些實施例中，在重構後，去氧核糖核酸酶I儲備液的範圍為約1 KU/ml-10 KU/mL，例如約1 KU/mL、約2 KU/mL、約3 KU/ml、約4 KU/mL、約5 KU/mL、約6 KU/mL、約7 KU/mL、約8 KU/mL、約9 KU/mL或約10 KU/mL。
在一些實施例中，酶儲備液可發生變化，因此確證凍乾儲備液之濃度且相應地修改添加至消化物混合液中酶之最終量。
在一些實施例中，酶混合物包含在約4.7 mL無菌HBSS中的約10.2 μl中性蛋白酶(0.36 DMC U/mL)、21.3 μl膠原蛋白酶(1.2 PZ/mL)及250 μl去氧核糖核酸酶I(200 U/mL)。
如上文所指出，在一些實施例中，TIL係來源於實體腫瘤。在一些實施例中，實體腫瘤未經碎斷。在一些實施例中，實體腫瘤未經碎斷且以全腫瘤形式進行酶消化。在一些實施例中，腫瘤係在包括膠原蛋白酶、去氧核糖核酸酶及玻尿酸酶之酶混合物中消化。在一些實施例中，腫瘤係在包括膠原蛋白酶、去氧核糖核酸酶及玻尿酸酶之酶混合物中消化1-2小時。在一些實施例中，腫瘤係在37℃、5% CO 2下在包括膠原蛋白酶、去氧核糖核酸酶及玻尿酸酶之酶混合物中消化1-2小時。在一些實施例中，腫瘤係在37℃、5% CO 2下且在旋轉下在包括膠原蛋白酶、去氧核糖核酸酶及玻尿酸酶之酶混合物中消化1-2小時。在一些實施例中，腫瘤係在恆定旋轉下消化隔夜。在一些實施例中，腫瘤係在37℃、5% CO 2下且在恆定旋轉下消化隔夜。在一些實施例中，將整個腫瘤與酶組合以形成腫瘤消化反應混合物。
在一些實施例中，在無菌緩衝液中用凍乾酶重構腫瘤。在一些實施例中，緩衝液為無菌HBSS。
在一些實施例中，酶混合物包括膠原蛋白酶。在一些實施例中，膠原蛋白酶為膠原蛋白酶IV。在一些實施例中，膠原蛋白酶之工作儲備液為100 mg/mL 10×工作儲備液。
在一些實施例中，酶混合物包括去氧核糖核酸酶。在一些實施例中，去氧核糖核酸酶之工作儲備液為10,000 IU/mL 10×工作儲備液。
在一些實施例中，酶混合物包括玻尿酸酶。在一些實施例中，玻尿酸酶之工作儲備液為10 mg/mL 10×工作儲備液。
在一些實施例中，酶混合物包括10 mg/mL膠原蛋白酶、1000 IU/mL去氧核糖核酸酶及1 mg/mL玻尿酸酶。
在一些實施例中，酶混合物包括10 mg/mL膠原蛋白酶、500 IU/mL去氧核糖核酸酶及1 mg/mL玻尿酸酶。
一般而言，獲自腫瘤之細胞懸浮液稱為「初代細胞群體」或「新鮮獲得的」或「新鮮分離的」細胞群體。在某些實施例中，使新鮮獲得的TIL細胞群體暴露於包括抗原呈現細胞、IL-12及OKT-3之細胞培養基。
在一些實施例中，碎斷包含物理碎斷，包含例如分割以及消化。在一些實施例中，碎斷為物理碎斷。在一些實施例中，碎斷為分割。在一些實施例中，碎斷係藉由消化實現。在一些實施例中，TIL最初可自獲自患者之酶腫瘤消化物及腫瘤片段培養。在一些實施例中，TIL最初可自獲自患者之酶腫瘤消化物及腫瘤片段培養。
在一些實施例中，當腫瘤為實體腫瘤時，在例如步驟A(如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中所提供)中獲得腫瘤樣本之後，對腫瘤進行物理碎斷。在一些實施例中，碎斷發生在冷凍保存之前。在一些實施例中，碎斷發生在冷凍保存之後。在一些實施例中，碎斷在獲得腫瘤之後且在不進行任何冷凍保存的情況下發生。在一些實施例中，碎斷步驟係活體外或離體程序。在一些實施例中，將腫瘤碎斷且將10、20、30、40或更多個片段或小塊置於各容器中進行初始第一次擴增。在一些實施例中，將腫瘤碎斷且將30或40個片段或小塊置於各容器中進行初始第一次擴增。在一些實施例中，將腫瘤碎斷且將40個片段或小塊置於各容器中進行初始第一次擴增。在一些實施例中，多個片段包括約4至約50個片段，其中每個片段之體積為約27 mm3。在一些實施例中，多個片段包括約30至約60個片段，其總體積為約1300 mm3至約1500 mm3。在一些實施例中，多個片段包括約50個片段，其總體積為約1350 mm3。在一些實施例中，多個片段包括約50個片段，其總質量為約1公克至約1.5公克。在一些實施例中，多個片段包括約4個片段。
在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤片段。在一些實施例中，腫瘤片段係藉由銳器分割獲得。在一些實施例中，腫瘤片段在約1 mm 3與10 mm 3之間。在一些實施例中，腫瘤片段在約1 mm 3與8 mm 3之間。在一些實施例中，腫瘤片段為約1 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約2 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約3 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約4 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約5 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約6 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約7 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約8 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約9 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約10 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為1-4 mm×1-4 mm×1-4 mm。在一些實施例中，腫瘤片段為1 mm×1 mm×1 mm。在一些實施例中，腫瘤片段為2 mm×2 mm×2 mm。在一些實施例中，腫瘤片段為3 mm×3 mm×3 mm。在一些實施例中，腫瘤片段為4 mm×4 mm×4 mm。
在一些實施例中，腫瘤經碎斷以使各小塊上出血、壞死及/或脂肪組織之量減至最小。在一些實施例中，腫瘤經碎斷以使各小塊上出血組織之量減至最小。在一些實施例中，腫瘤經碎斷以使各小塊上壞死組織之量減至最小。在一些實施例中，腫瘤經碎斷以使各小塊上脂肪組織之量減至最小。在某些實施例中，腫瘤碎斷步驟係活體外或離體方法。
在一些實施例中，進行腫瘤碎斷以便維持腫瘤內部結構。在一些實施例中，腫瘤碎斷係在不使用解剖刀進行鋸切動作的情況下進行。在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤消化物。在一些實施例中，藉由在酶培養基(例如但不限於RPMI 1640、2 mM GlutaMAX、10 mg/mL建它黴素、30 U/mL 去氧核糖核酸酶及1.0 mg/mL膠原蛋白酶)中培育，隨後進行機械解離(GentleMACS，加利福尼亞州奧本的Miltenyi Biotec)來產生腫瘤消化物。在將腫瘤置於酶培養基中之後，可以機械方式將腫瘤解離大約1分鐘。接著，可將溶液在37℃下在5% CO 2中培育30分鐘，且接著再次機械破壞大約1分鐘。在37℃下在5% CO 2中再培育30分鐘之後，可將腫瘤第三次機械破壞大約1分鐘。在一些實施例中，在第三次機械破壞後，若仍存在大片組織，則對樣本再施加1或2次機械解離，不論是否再在37℃下在5% CO 2中培育30分鐘。在一些實施例中，在最終培育結束時，若細胞懸浮液含有大量紅血球或死細胞，則可使用Ficoll進行密度梯度分離以移除此等細胞。
在一些實施例中，將初始第一次擴增步驟之前的細胞懸浮液稱為「初代細胞群體」或「新鮮獲得的」或「新鮮分離的」細胞群體。
在一些實施例中，細胞可視情況在樣本分離之後(例如在獲得腫瘤樣本後及/或在自腫瘤樣本獲得細胞懸浮液後)冷凍，且在進入步驟B中所描述之擴增之前冷凍儲存，該步驟B進一步詳細描述於下文且於圖8(特別是例如圖8B)中例示。
在一些實施例中，在將腫瘤樣本解離或碎斷成腫瘤片段之前，將其在包括抗生素組分之洗滌緩衝液中洗滌至少一次。本文所描述之任何腫瘤洗滌緩衝液均可用於洗滌腫瘤樣本。在一些實施例中，抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。在例示性實施例中，洗滌緩衝液包括萬古黴素。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係50 µg/mL-600 µg/mL。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係100 µg/mL。在例示性實施例中，將腫瘤樣本在洗滌緩衝液中洗滌3次或更多次。
在一些實施例中，在冷凍保存或第一次擴增之前，將腫瘤片段在包括抗生素組分之洗滌緩衝液中洗滌至少一次。本文所描述之任何腫瘤洗滌緩衝液均可用於洗滌腫瘤片段。在一些實施例中，抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。在例示性實施例中，洗滌緩衝液包括萬古黴素。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度為50 µg/mL-600 µg/mL。。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係100 µg/mL。在例示性實施例中，將腫瘤樣本在洗滌緩衝液中洗滌3次或更多次。 1. 粗針活體組織切片檢查 / 小型活體組織切片檢查衍生之 TIL
在一些實施例中，TIL最初係獲自藉由粗針活體組織切片檢查或類似程序獲得之患者腫瘤樣本(「初代TIL」)且接著擴增成較大群體以進行如本文所描述之進一步操作，視情況經冷凍保存且視情況評估表型及代謝參數。
在一些實施例中，患者腫瘤樣本可使用本領域中已知之方法獲得，一般經由小型活體組織切片檢查、粗針活體組織切片檢查、穿刺活體組織切片檢查或用於獲得含有腫瘤與TIL細胞之混合物之樣本的其他方式獲得。一般而言，腫瘤樣本可來自任何實體腫瘤，包含原發性腫瘤、侵襲性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣本亦可為液體腫瘤，諸如獲自血液惡性病之腫瘤。在一些實施例中，樣本可來自多個小腫瘤樣本或活體組織切片檢查樣本。在一些實施例中，樣本可包括來自同一患者之單一腫瘤的多個腫瘤樣本。在一些實施例中，樣本可包括來自同一患者之一個、兩個、三個或四個腫瘤的多個腫瘤樣本。在一些實施例中，樣本可包括來自同一患者之多個腫瘤的多個腫瘤樣本。實體腫瘤可為肺癌及/或非小細胞肺癌(NSCLC)。
一般而言，獲自腫瘤核心或片段之細胞懸浮液稱為「初代細胞群體」或「新鮮獲得的」或「新鮮分離的」細胞群體。在某些實施例中，使新鮮獲得之TIL細胞群體暴露於包括抗原呈現細胞、IL-2及OKT-3之細胞培養基。
在一些實施例中，若腫瘤為轉移性腫瘤且在過去已有效治療/移除原發性病灶，則可能需要移除一個轉移性病灶。在一些實施例中，若可用，微創方法係移除皮膚病灶或頸部或腋窩區域上的淋巴結。在一些實施例中，移除皮膚病灶或移除其小活體組織切片。在一些實施例中，移除淋巴結或其小活體組織切片。在一些實施例中，腫瘤為黑素瘤。在一些實施例中，黑素瘤之小活體組織切片包括黑痣或其一部分。
在一些實施例中，小活體組織切片為穿孔活體組織切片。在一些實施例中，穿孔活體組織切片係以圓形刀片壓入皮膚中獲得。在一些實施例中，穿孔活體組織切片係以圓形刀片壓入可疑黑痣周圍的皮膚中獲得。在一些實施例中，穿孔活體組織切片係以圓形刀片壓入皮膚中獲得，並且移除一片圓形皮膚。在一些實施例中，小活體組織切片為穿孔活體組織切片且移除圓形部分的腫瘤。
在一些實施例中，小活體組織切片為切除式活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片為切除式活體組織切片且移除整個黑痣或生長物。在一些實施例中，小活體組織切片為切除式活體組織切片且連同小邊緣之正常外觀皮膚移除整個黑痣或生長物。
在一些實施例中，小活體組織切片為切開式活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片為切開式活體組織切片且僅採集最不規則部分之黑痣或生長物。在一些實施例中，小活體組織切片為切開式活體組織切片，且該切開式活體組織切片係在其他技術無法完成時使用，諸如當可疑黑痣非常大時使用。
在一些實施例中，小活體組織切片為肺活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係藉由支氣管鏡檢獲得。一般而言，支氣管鏡檢係在患者麻醉下使小工具通過鼻或口、下至咽喉且進入支氣管通道，其中小工具係用於移除一些組織。在一些實施例中，在無法經由支氣管鏡檢達到腫瘤或生長物的情況下，可以採用經胸穿刺活體組織切片檢查。一般而言，對於經胸穿刺活體組織切片檢查，患者亦處於麻醉下且將針穿過皮膚直接插入可疑位點以移除小樣本的組織。在一些實施例中，經胸穿刺活體組織切片檢查可能需要介入性放射線學(例如使用x射線或CT掃描引導針頭)。在一些實施例中，小活體組織切片係藉由穿刺活體組織切片獲得。在一些實施例中，小活體組織切片係經內視鏡超音波獲得(例如內視鏡附燈且經口置於食道中)。在一些實施例中，小活體組織切片係經手術獲得。
在一些實施例中，小活體組織切片為頭頸活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片為切開式活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片為切開式活體組織切片，其中自外觀異常區域切除一小塊組織。在一些實施例中，若容易接近異常區，則無需住院即可採集樣本。在一些實施例中，若腫瘤在口腔或咽喉內部較深處，則活體組織切片可能需要在手術室全身麻醉進行。在一些實施例中，小活體組織切片為切除式活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片為切除式活體組織切片，其中移除整個區域。在一些實施例中，小活體組織切片為細針抽吸(FNA)。在一些實施例中，小活體組織切片為細針抽吸(FNA)，其中使用附接至注射器之非常細的針頭自腫瘤或腫塊抽取(抽吸)細胞。在一些實施例中，小活體組織切片為穿孔活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片為穿孔活體組織切片，其中使用穿孔鑷移除一塊可疑區域。
在一些實施例中，小活體組織切片為子宮頸活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係經由陰道鏡獲得。通常，陰道鏡方法採用附接至雙目放大鏡的附燈放大儀器(陰道鏡)，接著用於對一小部分之子宮頸進行活體組織切片檢查。在一些實施例中，小活體組織切片為子宮頸錐狀切除/錐狀活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片為子宮頸錐狀切除/錐狀活體組織切片，其中可能需要門診手術以自子宮頸移除較大塊組織。在一些實施例中，除了有助於確診之外，錐狀活體組織切片亦可以用作初始治療。
術語「實體腫瘤」係指通常不含囊腫或液體區域的異常組織團塊。實體腫瘤可為良性或惡性的。術語「實體腫瘤癌症」係指惡性、贅生性或癌性實體腫瘤。實體腫瘤癌症包含肺癌。在一些實施例中，癌症為黑素瘤。在一些實施例中，癌症係非小細胞肺癌(NSCLC)。實體腫瘤之組織結構包含相互相依組織隔室，包含實質(癌細胞)及有癌細胞分散其中且可提供支援性微環境之支援性基質細胞。
在一些實施例中，來自腫瘤之樣本係以細針抽吸物(FNA)、粗針活體組織切片、小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)形式獲得。在一些實施例中，首先將樣本置放於G-REX-10中。在一些實施例中，當有1個或2個粗針活體組織切片及/或小活體組織切片樣本時，首先將樣本置放於G-REX-10中。在一些實施例中，當有3個、4個、5個、6個、8個、9個或10個或更多個粗針活體組織切片及/或小活體組織切片樣本時，首先將樣本置放於G-REX-100中。在一些實施例中，當有3個、4個、5個、6個、8個、9個或10個或更多個粗針活體組織切片及/或小活體組織切片樣本時，首先將樣本置放於G-REX-500中。
FNA可獲自皮膚腫瘤，包含例如黑素瘤。在一些實施例中，FNA係獲自皮膚腫瘤，諸如來自患有轉移性黑素瘤之患者的皮膚腫瘤。在一些情況下，黑素瘤患者先前已經歷外科治療。
FNA可獲自肺腫瘤，包含例如NSCLC。在一些實施例中，FNA係獲自肺腫瘤，諸如來自非小細胞肺癌(NSCLC)患者的肺腫瘤。在一些情況下，NSCLC患者先前已經歷外科治療。
本文所描述之TIL可獲自FNA樣本。在一些情況下，FNA樣本係使用在18號針頭至25號針頭範圍中的細號規針頭自患者獲得或分離。細號規針頭可為18號、19號、20號、21號、22號、23號、24號或25號。在一些實施例中，來自患者之FNA樣本可含有至少400,000個TIL，例如400,000個TIL、450,000個TIL、500,000個TIL、550,000個TIL、600,000個TIL、650,000個TIL、700,000個TIL、750,000個TIL、800,000個TIL、850,000個TIL、900,000個TIL、950,000個TIL或更多。
在一些情況下，本文所描述之TIL係獲自粗針活體組織切片樣本。在一些情況下，粗針活體組織切片樣本係使用在11號針頭至16號針頭範圍中的外科或醫用針頭自患者獲得或分離。針頭可為11號、12號、13號、14號、15號或16號。在一些實施例中，來自患者之粗針活體組織切片樣本可含有至少400,000個TIL，例如400,000個TIL、450,000個TIL、500,000個TIL、550,000個TIL、600,000個TIL、650,000個TIL、700,000個TIL、750,000個TIL、800,000個TIL、850,000個TIL、900,000個TIL、950,000個TIL或更多。
一般而言，經收集之細胞懸浮液被稱為「初代細胞群體」或「新鮮收集的」細胞群體。
在一些實施例中，TIL並非獲自腫瘤消化物。在一些實施例中，實體腫瘤核心未經碎斷。
在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤消化物。在一些實施例中，藉由在酶培養基(例如但不限於RPMI 1640、2 mM GlutaMAX、10 mg/mL建它黴素、30 U/mL 去氧核糖核酸酶及1.0 mg/mL膠原蛋白酶)中培育，隨後進行機械解離(GentleMACS，加利福尼亞州奧本的Miltenyi Biotec)來產生腫瘤消化物。在將腫瘤置於酶培養基中之後，可以機械方式將腫瘤解離大約1分鐘。接著，可將溶液在37℃下在5% CO 2中培育30分鐘，且接著再次機械破壞大約1分鐘。在37℃下在5% CO 2中再培育30分鐘之後，可將腫瘤第三次機械破壞大約1分鐘。在一些實施例中，在第三次機械破壞後，若仍存在大塊組織，則對樣本再施加1或2次機械解離，不論是否再在37℃下在5% CO 2中培育30分鐘。在一些實施例中，在最終培育結束時，若細胞懸浮液含有大量紅血球或死細胞，則可使用Ficoll進行密度梯度分離以移除此等細胞。
在一些實施例中，獲得第一TIL群體包括多病灶取樣方法。
腫瘤解離酶混合物可包含一或多種解離(消化)酶，諸如但不限於膠原蛋白酶(包含任何摻合或類型之膠原蛋白酶)、Accutase™、Accumax™、玻尿酸酶、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、酪蛋白酶、彈性蛋白酶、木瓜酶、XIV型蛋白酶(鏈蛋白酶)、去氧核糖核酸酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制劑、任何其他解離或蛋白分解酶，及其任何組合。
在一些實施例中，解離酶係自凍乾酶重構。在一些實施例中，凍乾酶係在一定量之無菌緩衝液(諸如HBSS)中重構。
在一些實施例中，解離酶係自凍乾酶重構。在一些實施例中，凍乾酶係在一定量之無菌緩衝液(諸如漢克氏平衡鹽溶液(HBSS))中重構。
在一些情況下，膠原蛋白酶(諸如無動物源1型膠原蛋白酶)係在10 mL無菌HBSS或另一緩衝液中重構。凍乾之儲備酶的濃度可為每小瓶2892 PZ U。在一些實施例中，膠原蛋白酶係在5 mL至15 mL緩衝液中重構。在一些實施例中，在重構後，膠原蛋白酶儲備液之範圍為約100 PZ U/mL-約400 PZ U/mL，例如為約100 PZ U/mL-約400 PZ U/mL、約100 PZ U/mL-約350 PZ U/mL、約100 PZ U/mL-約300 PZ U/mL、約150 PZ U/mL-約400 PZ U/mL、約100 PZ U/mL、約150 PZ U/mL, 約200 PZ U/mL、約210 PZ U/mL、約220 PZ U/mL、約230 PZ U/mL、約240 PZ U/mL、約250 PZ U/mL、約260 PZ U/mL、約270 PZ U/mL、約280 PZ U/mL、約289.2 PZ U/mL、約300 PZ U/mL、約350 PZ U/mL或約400 PZ U/mL。
在一些實施例中，中性蛋白酶係在1 mL無菌HBSS或另一緩衝液中重構。凍乾之儲備酶的濃度可為每小瓶175 DMC U。在一些實施例中，在重構後，中性蛋白酶儲備液之範圍為約100 DMC/mL-約400 DMC/mL，例如為約100 DMC/mL-約400 DMC/mL、約100 DMC/mL-約350 DMC/mL、約100 DMC/mL-約300 DMC/mL、約150 DMC/mL-約400 DMC/mL、約100 DMC/mL、約110 DMC/mL、約120 DMC/mL、約130 DMC/mL、約140 DMC/mL、約150 DMC/mL、約160 DMC/mL、約170 DMC/mL、約175 DMC/mL、約180 DMC/mL、約190 DMC/mL、約200 DMC/mL、約250 DMC/mL、約300 DMC/mL、約350 DMC/mL或約400 DMC/mL。
在一些實施例中，去氧核糖核酸酶I係在1 mL無菌HBSS或另一緩衝液中重構。凍乾之儲備酶的濃度為每小瓶4 KU。在一些實施例中，在重構後，去氧核糖核酸酶I儲備液之範圍為約1 KU/mL至10 KU/mL，例如為約1 KU/mL、約2 KU/mL、約3 KU/mL、約4 KU/mL、約5 KU/mL、約6 KU/mL、約7 KU/mL、約8 KU/mL、約9 KU/mL或約10 KU/mL。
在一些實施例中，酶儲備液可發生變化，因此確證凍乾儲備液之濃度且相應地修改添加至消化物混合液中酶之最終量。
在一些實施例中，酶混合物包含在約4.7 mL無菌HBSS中的約10.2 ul中性蛋白酶(0.36 DMC U/mL)、21.3 ul膠原蛋白酶(1.2 PZ/mL)及250 ul去氧核糖核酸酶I(200 U/mL)。 2. 胸膜滲出液 T 細胞及 TIL
在一些實施例中，樣本係胸膜液樣本。在一些實施例中，用於根據本文所描述之程序擴增的T細胞或TIL之來源為胸膜液樣本。在一些實施例中，樣本為胸膜滲出液源性樣本。在一些實施例中，用於根據本文所描述之程序擴增的T細胞或TIL之來源為胸膜滲出液源性樣本。參見例如美國專利公開案US 2014/0295426中所描述之方法，其以全文引用之方式併入本文中用於所有目的。
在一些實施例中，可以採用疑似含有及/或含有TIL之任何胸膜液或胸膜滲出液。此類樣本可來源於原發性或轉移性肺癌，諸如NSCLC或SCLC。在一些實施例中，樣本可為來源於另一器官(例如乳房、卵巢、結腸或前列腺)之繼發轉移性癌細胞。在一些實施例中，用於本文所描述之擴增方法中之樣本為胸膜滲出物。在一些實施例中，用於本文所描述之擴增方法中之樣本為胸膜溢出物。其他生物樣本可包括含有TIL之其他漿液，包含例如來自腹部之腹水液或胰囊腫液。腹水液及胸膜液涉及非常類似的化學系統；腹部及肺兩者在相同的惡性腫瘤事件中於胸腔及腹腔中皆具有間皮細胞株及流體形式，且在一些實施例中，此類流體含有TIL。在本揭示案例示胸膜液的一些實施例中，可以使用含有TIL之腹水或其他囊腫液進行相同的方法以得到類似結果。
在一些實施例中，胸膜液呈未經處理之形式，即呈直接自患者取出之形式。在一些實施例中，在接觸步驟之前，將未經處理之胸膜液置於標準血液收集管(諸如EDTA或肝素管)中。在一些實施例中，在接觸步驟之前，將未經處理之胸膜液置於標準CellSave®管(Veridex)中。在一些實施例中，在自患者收集之後立即將樣本置於CellSave管中，以避免活TIL之數目減少。若保留在未經處理之胸膜液中，則即使在4℃下，活TIL之數目可能在24小時內顯著降低。在一些實施例中，樣本係在自患者移除之後1小時、5小時、10小時、15小時或至多24小時內置於適當收集管中。在一些實施例中，樣本係在4℃下自患者移除之後1小時、5小時、10小時、15小時或至多24小時內置於適當收集管中。
在一些實施例中，可以稀釋來自所選個體之胸膜液樣本。在一些實施例中，稀釋度為1:10胸膜液比稀釋劑。在其他實施例中，稀釋度為1:9胸膜液比稀釋劑。在其他實施例中，稀釋度為1:8胸膜液比稀釋劑。在其他實施例中，稀釋度為1:5胸膜液比稀釋劑。在其他實施例中，稀釋度為1:2胸膜液比稀釋劑。在其他實施例中，稀釋度為1:1胸膜液比稀釋劑。在一些實施例中，稀釋劑包含鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、另一緩衝液或生理學上可接受之稀釋劑。在一些實施例中，樣本係在自患者收集及稀釋之後立即置於CellSave管中，以避免活TIL減少，若保留在未經處理之胸膜液中，則即使在4℃下，活TIL可能在24至48小時內顯著減少。在一些實施例中，胸膜液樣本係在自患者移除且稀釋之後1小時、5小時、10小時、15小時、24小時、36小時、至多48小時內置於適當收集管中。在一些實施例中，胸膜液樣本係在自患者移除且在4℃下稀釋之後1小時、5小時、10小時、15小時、24小時、36小時、至多48小時內置於適當收集管中。
在又另一實施例中，在進一步的處理步驟之前，藉由習知方式濃縮胸膜液樣本。在一些實施例中，在胸膜液必須冷凍保存以便運送至進行該方法之實驗室或用於後續分析(例如在收集後24至48小時之後)之情形下，此胸膜液之預處理較佳。在一些實施例中，藉由在將胸膜液樣本自個體中取出後將其離心並將離心液或沈澱物再懸浮於緩衝液中來製備胸膜液樣本。在一些實施例中，對胸膜液樣本進行多次離心及再懸浮，隨後將其冷凍保存以用於運輸或以後的分析及/或處理。
在一些實施例中，在進一步的處理步驟之前，藉由使用過濾方法濃縮胸膜液樣本。在一些實施例中，在接觸步驟中使用之胸膜液樣本係藉由將流體經由含有已知且基本均勻的孔徑的過濾器過濾而製備的，該孔徑允許胸膜液通過膜但保留腫瘤細胞。在一些實施例中，膜中各孔之直徑可為至少4 μM。在其他實施例中，孔徑可為5 μM或更大，且在其他實施例中，可為6、7、8、9或10 μM中之任一者。過濾之後，可將被膜保留之細胞(包含TIL)自膜上衝出至適合的生理學上可接受之緩衝液中。然後可以將以此方式濃縮之細胞(包含TIL)用於該方法之接觸步驟中。
在一些實施例中，使胸膜液樣本(包含例如未經處理之胸膜液)、經稀釋之胸膜液或再懸浮之細胞沈澱物與溶解試劑接觸，該溶解試劑係差異性地溶解樣本中存在之無核紅血球。在一些實施例中，在胸膜液含有大量RBC之情形下，此步驟係在進一步的處理步驟之前進行。適合的溶解試劑包含單一溶解試劑、或溶解試劑及淬滅試劑，或溶解試劑、淬滅試劑及固定試劑。適合的溶解系統為可商購的，且包含BD Pharm Lyse™系統(Becton Dickenson)。其他溶解系統包含Versalyse™系統、FACSlyse™系統(Becton Dickenson)、Immunoprep™系統或Erythrolyse II系統(Beckman Coulter, Inc.)或氯化銨系統。在一些實施例中，溶解試劑可隨主要需求而變化，該等需求為紅血球之有效溶解及TIL之保持及胸膜液中TIL之表型特性。除採用單一試劑進行溶解之外，可用於本文所描述之方法的溶解系統可包含第二試劑，例如在該方法之剩餘步驟期間淬滅或延遲溶解試劑之作用的第二試劑，例如Stabilyse™試劑(Beckman Coulter, Inc.)。取決於溶解試劑之選擇或該方法之較佳實施，亦可採用習知固定試劑。
在一些實施例中，在約-140℃之溫度下冷凍保存如上文所描述之未經處理、稀釋或多次離心或處理的胸膜液樣本，隨後如本文所提供進行進一步處理及/或擴增。 3. 擴增來自周邊血液之周邊血液淋巴球 (PBL) 之方法
PBL方法1. 在本發明之一些實施例中，PBL係使用本文所描述之方法擴增。在本發明之一些實施例中，該方法包括獲得來自全血之PBMC樣本。在一些實施例中，該方法包括藉由使用非CD19+級分之負向選擇以自PBMC中分離純T細胞來富集T細胞。在一些實施例中，該方法包括藉由使用非CD19+級分之基於磁珠之負向選擇以自PBMC中分離純T細胞來富集T細胞。
在本發明之一些實施例中，PBL方法1如下進行：在第0天，將冷凍保存之PBMC樣本解凍且計算PBMC之數目。使用人類泛T細胞分離套組與LS管柱(Miltenyi Biotec)分離T細胞。
PBL方法2. 在本發明之一些實施例中，PBL係使用PBL方法2擴增，該方法包括獲得來自全血之PBMC樣本。藉由在37℃下培育PBMC至少三小時且接著分離非附著細胞來富集來自PBMC之T細胞。
在本發明之一些實施例中，PBL方法2如下進行：在第0天，將經冷凍保存之PMBC樣本解凍，且將PBMC細胞以每孔6百萬個細胞接種於CM-2培養基中之6孔盤中並且在37℃下培育3小時。3小時後，移除非附著細胞，即PBL，且計算其數目。
PBL方法3. 在本發明之一些實施例中，PBL係使用PBL方法3擴增，該方法包括獲得來自周邊血液之PBMC樣本。B細胞係使用CD19+選擇分離且T細胞係使用負向選擇PBMC樣本之非CD19+級分來選擇。
在本發明之一些實施例中，PBL方法3如下進行：在第0天，將來源於周邊血液的冷凍保存之PBMC解凍且計算其數目。使用CD19多分選人類套組(Miltenyi Biotec)分選CD19+ B細胞。在非CD19+細胞級分中，使用人類泛T細胞分離套組及LS管柱(Miltenyi Biotec)純化T細胞。
在一些實施例中，PBMC係自全血樣本分離。在一些實施例中，使用PBMC樣本作為擴增PBL之起始物質。在一些實施例中，樣本在擴增程序之前經冷凍保存。在另一實施例中，使用新鮮樣本作為擴增PBL之起始物質。在本發明之一些實施例中，使用本領域中已知之方法自PBMC分離T細胞。在一些實施例中，使用人類泛T細胞分離套組及LS管柱分離T細胞。在本發明之一些實施例中，使用本領域中已知之抗體選擇方法(例如CD19負向選擇)自PBMC分離T細胞。
在本發明之一些實施例中，PBMC樣本係在有效鑑別非附著細胞之所需溫度下培育一段時間。在本發明之一些實施例中，培育時間為約3小時。在本發明之一些實施例中，溫度為約37℃。接著，使用上述程序擴增非附著細胞。
在一些實施例中，PBMC樣本係來自視情況已經用包括激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案進行預治療之個體或患者。在一些實施例中，腫瘤樣本係來自已經用包括激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案進行預治療之個體或患者。在一些實施例中，PBMC樣本係來自已經用包括激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案進行預治療之個體或患者，其已進行治療至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月或1年或更長時間。在另一實施例中，PBMC係來源於當前進行ITK抑制劑方案(諸如依魯替尼)之患者。
在一些實施例中，PBMC樣本係來自已用包括激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案進行預治療且難以用激酶抑制劑或ITK抑制劑(諸如依魯替尼)治療之個體或患者。
在一些實施例中，PBMC樣本係來自已經用包括激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案進行預治療但不再進行激酶抑制劑或ITK抑制劑治療之個體或患者。在一些實施例中，PBMC樣本係來自已經用包括激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案進行預治療但不再進行激酶抑制劑或ITK抑制劑治療且尚未進行治療達至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月或至少1年或更長時間之個體或患者。在另一個實施例中，PBMC來源於先前暴露於ITK抑制劑但在至少3個月、至少6個月、至少9個月或至少1年內未經治療之患者。
在本發明之一些實施例中，在第0天，針對CD19+選擇細胞且據此分選。在本發明之一些實施例中，使用抗體結合珠粒進行選擇。在本發明之一些實施例中，在第0天自PBMC分離純T細胞。
在本發明之一些實施例中，對於未經依魯替尼或其他ITK抑制劑預治療之患者，10-15 mL白血球層將產生約5×10 9個PBMC，該等PBMC又將產生約5.5×10 7個PBL。
在本發明之一些實施例中，對於經依魯替尼或其他ITK抑制劑預治療之患者，擴增程序將產生約20×10 9個PBL。在本發明之一些實施例中，40.3×10 6個PBMC將產生約4.7×10 5個PBL。
在任何前述實施例中，PBMC可自全血樣本，藉由血球分離術獲得，來源於白血球層，或自本領域中已知之用於獲得PBMC之任何其他方法獲得。
在一些實施例中，PBL係使用美國專利申請公開案第US 2020/0347350 A1號中所描述之方法製備，該公開案之揭示內容以引用之方式併入本文中。 4. 擴增來自骨髓源性 PBMC 之骨髓浸潤淋巴球 (MIL) 的方法
MIL方法3. 在本發明之一些實施例中，該方法包括獲得來自骨髓之PBMC。在第0天，針對CD3+/ CD33+/CD20+/CD14+選擇PBMC且分選，並將非CD3+/ CD33+/CD20+/CD14+細胞級分進行音波處理且將一部分經音波處理之細胞級分添加回至所選細胞級分中。
在本發明之一些實施例中，MIL方法3係如下進行：在第0天，將冷凍保存之PBMC樣本解凍且對PBMC計數。將細胞用CD3、CD33、CD20及CD14抗體染色且使用S3e細胞分選器(Bio-Rad)分選。將細胞分選成兩種級分：免疫細胞級分(或MIL級分)(CD3+CD33+CD20+ CD14+)及AML胚細胞級分(非CD3+CD33+CD20+CD14+)。
在本發明之一些實施例中，PBMC係自骨髓獲得。在一些實施例中，PBMC係經由血球分離術、抽吸、穿刺活體組織切片檢查或本領域中已知之其他類似方式，自骨髓獲得。在一些實施例中，PBMC係新鮮的。在其他實施例中，PBMC經冷凍保存。
在本發明之一些實施例中，MIL係自10-50 mL骨髓抽吸物擴增。在本發明之一些實施例中，自患者獲得10 mL骨髓抽吸物。在另一實施例中，自患者獲得20 mL骨髓抽吸物。在另一實施例中，自患者獲得30 mL骨髓抽吸物。在另一實施例中，自患者獲得40 mL骨髓抽吸物。在另一實施例中，自患者獲得50 mL骨髓抽吸物。
在本發明之一些實施例中，自約10-50 mL骨髓抽吸物得到的PBMC之數目為約5×10 7至約10×10 7個PBMC。在另一實施例中，得到的PMBC之數目為約7×10 7個PBMC。
在本發明之一些實施例中，約5×10 7至約10×10 7個PBMC得到約0.5×10 6至約1.5×10 6個MIL。在本發明之一些實施例中，得到約1×10 6個MIL。
在本發明之一些實施例中，來源於骨髓抽吸物之12×10 6個PBMC得到大約1.4×10 5個MIL。
在任何前述實施例中，PBMC可來源於全血樣本、骨髓、藉由血球分離術獲得，來源於白血球層，或自本領域中已知用於獲得PBMC之任何其他方法獲得。
在一些實施例中，PBL係使用美國專利申請公開案第US US 2020/0347350 A1號中所描述之方法製備，該公開案之揭示內容以引用之方式併入本文中。 5. PD1 之預選 ( 如圖 8 之步驟 A2 中所例示 )
根據本發明之一些方法，在初始第一次擴增之前，預選出呈PD-1陽性(PD-1+)之TIL。
在一些實施例中，需要將最少3,000個TIL接種至初始第一次擴增中。在一些實施例中，預選步驟產生最少3,000個TIL。在一些實施例中，需要將最少4,000個TIL接種至初始第一次擴增中。在一些實施例中，預選步驟產生最少4,000個TIL。在一些實施例中，需要將最少5,000個TIL接種至初始第一次擴增中。在一些實施例中，預選步驟產生最少5,000個TIL。在一些實施例中，需要將最少6,000個TIL接種至初始第一次擴增中。在一些實施例中，預選步驟產生最少6,000個TIL。在一些實施例中，需要將最少7,000個TIL接種至初始第一次擴增中。在一些實施例中，預選步驟產生最少7,000個TIL。在一些實施例中，需要將最少8,000個TIL接種至初始第一次擴增中。在一些實施例中，預選步驟產生最少8,000個TIL。在一些實施例中，需要將最少9,000個TIL接種至初始第一次擴增中。在一些實施例中，預選步驟產生最少9,000個TIL。在一些實施例中，需要將最少10,000個TIL接種至初始第一次擴增中。在一些實施例中，預選步驟產生最少10,000個TIL。在一些實施例中，細胞生長或擴增至200,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至200,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二次擴增。在一些實施例中，細胞生長或擴增至150,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至150,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二次擴增。在一些實施例中，細胞生長或擴增至250,000之密度。在一些實施例中，細胞生長或擴增至250,000之密度，以提供約2e8個TIL來起始快速第二次擴增。在一些實施例中，最小細胞密度為10,000個細胞，以給出10e6來起始快速第二次擴增。在一些實施例中，用於起始快速第二次擴增之10e6接種密度可產生大於1e9的TIL。
在一些實施例中，用於初始第一次擴增之TIL為PD-1陽性(PD-1+)(例如在預選之後且在初始第一次擴增之前)。在一些實施例中，用於初始第一次擴增之TIL為至少75% PD-1陽性、至少80% PD-1陽性、至少85% PD-1陽性、至少90% PD-1陽性、至少95% PD-1陽性、至少98% PD-1陽性或至少99% PD-1陽性(例如在預選之後且在初始第一次擴增之前)。在一些實施例中，PD-1群體為PD-1high。在一些實施例中，用於初始第一次擴增之TIL為至少25% PD-1high、至少30% PD-1high、至少35% PD-1high、至少40% PD-1high、至少45% PD-1high、至少50% PD-1high、至少55% PD-1high、至少60% PD-1high、至少65% PD-1high、至少70% PD-1high、至少75% PD-1high、至少80% PD-1high、至少85% PD-1high、至少90% PD-1high、至少95% PD-1high、至少98% PD-1high或至少99% PD-1high(例如在預選之後且在初始第一次擴增之前)。
在一些實施例中，藉由用抗PD-1抗體染色初代細胞群體、全腫瘤消化物及/或全腫瘤細胞懸浮液TIL進行PD-1陽性TIL之預選。在一些實施例中，抗PD-1抗體為多株抗體，例如小鼠抗人類PD-1多株抗體、山羊抗人類PD-1多株抗體等。在一些實施例中，抗PD-1抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體包含例如但不限於：EH12.2H7、PD1.3.1、M1H4、納武單抗(BMS-936558，Bristol-Myers Squibb；Opdivo®)、帕博利珠單抗(蘭立珠單抗(lambrolizumab)、MK03475或MK-3475，Merck；Keytruda®)、H12.1、PD1.3.1、NAT 105、人類化抗PD-1抗體JS001(ShangHai JunShi)、單株抗PD-1抗體TSR-042(Tesaro, Inc.)、皮立珠單抗(抗PD-1 mAb CT-011，Medivation)、抗PD-1單株抗體BGB-A317(BeiGene)，及/或抗PD-1抗體SHR-1210(ShangHai HengRui)、人類單株抗體REGN2810(Regeneron)、人類單株抗體MDX-1106(Bristol-Myers Squibb)，及/或人類化抗PD-1 IgG4抗體PDR001(Novartis)。在一些實施例中，PD-1抗體係來自選殖株：RMP1-14(大鼠IgG)-BioXcell目錄號BP0146。其他用於預選用於根據本發明之方法(如本文所描述之步驟A至步驟F所例示)擴增TIL之PD-1陽性TIL的適合抗體係美國專利第8,008,449號中所揭示之抗PD-1抗體，該美國專利以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與納武單抗(BMS-936558，Bristol-Myers Squibb；Opdivo®)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與帕博利珠單抗(蘭立珠單抗、MK03475或MK-3475，Merck；Keytruda®)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與人類化抗PD-1抗體JS001(ShangHai JunShi)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與單株抗PD-1抗體TSR-042(Tesaro, Inc.)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與皮立珠單抗(抗PD-1 mAb CT-011，Medivation)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與抗PD-1單株抗體BGB-A317(BeiGene)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與抗PD-1抗體SHR-1210(ShangHai HengRui)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與人類單株抗體REGN2810(Regeneron)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與人類單株抗體MDX-1106(Bristol-Myers Squibb)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與人源化抗PD-1 IgG4抗體PDR001(Novartis)結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與RMP1-14(大鼠IgG)- BioXcell目錄號BP0146結合至不同抗原決定基。納武單抗結合及帕博利珠單抗與PD-1結合之結構係已知的且已描述於例如Tan, S.等人(Tan、S.等人，《自然通訊》 8:14369 | DOI: 10.1038/ncomms14369(2017)；其以全文引用之方式併入本文中用於所有目的)。在一些實施例中，抗PD-1抗體為EH12.2H7。在一些實施例中，抗PD-1抗體為PD1.3.1。在一些實施例中，抗PD-1抗體並非PD1.3.1。在一些實施例中，抗PD-1抗體為M1H4。在一些實施例中，抗PD-1抗體並非M1H4。
在一些實施例中，用於預選之抗PD-1抗體與至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少100%之表現PD-1之細胞結合。
在一些實施例中，患者已用抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，個體未接受過抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，個體尚未用抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，個體先前已用化學治療劑治療。在一些實施例中，個體先前已用化學治療劑治療，但目前不再用該化學治療劑治療。在一些實施例中，個體接受過化學治療劑治療，或接受過抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，個體接受過化學治療劑治療且接受過抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，患者未接受過抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，個體的癌症未接受過治療或接受過化學治療劑治療，但未接受過抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，個體未接受過治療且接受過化學治療劑治療，但未接受過抗PD-1抗體治療。
在患者先前已用第一抗PD-1抗體治療之一些實施例中，藉由用第二抗PD-1抗體對初代細胞群體、全腫瘤消化物及/或全腫瘤細胞懸浮液TIL染色來進行預選，該第二抗PD-1抗體與初代細胞群體TIL之表面上PD-1之結合不會被第一抗PD-1抗體阻斷。
在患者先前已用抗PD-1抗體治療之一些實施例中，藉由用抗體(「抗Fc抗體」)對初代細胞群體TIL染色來進行預選，該抗Fc抗體與初代細胞群體TIL之表面上未溶解之抗PD-1抗體的Fc區結合。在一些實施例中，抗Fc抗體為多株抗體，例如小鼠抗人類Fc多株抗體、山羊抗人類Fc多株抗體等。在一些實施例中，抗Fc抗體為單株抗體。在一些實施例中，患者先前已用抗PD-1人類或人類化IgG抗體治療，且初代細胞群體TIL經抗人類IgG抗體染色。在患者先前已用抗PD-1人類或人類化IgG1抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG1抗體染色。在患者先前已用抗PD-1人類或人類化IgG2抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG2抗體染色。在患者先前已用抗PD-1人類或人類化IgG3抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG3抗體染色。在患者先前已用抗PD-1人類或人類化IgG4抗體治療的一些實施例中，初代細胞群體TIL係經抗人類IgG4抗體染色。
在患者先前已用抗PD-1抗體治療之一些實施例中，藉由使初代細胞群體TIL與相同抗PD-1抗體接觸且接著用抗Fc抗體對初代細胞群體TIL染色來進行預選，該抗Fc抗體與初代細胞群體TIL之表面上未溶解之抗PD-1抗體的Fc區結合。
在一些實施例中，預選係使用細胞分選方法進行。在一些實施例中，細胞分選方法為流動式細胞測量術方法，例如流動式活化細胞分選(FACS)。在一些實施例中，使用第一群體及PBMC群體中螢光團之強度設定FACS圈選以建立分別對應於PD-1陰性TIL、PD-1中等TIL及PD-1陽性TIL的低、中及高強度水準。在一些實施例中，進行細胞分選方法，以便使用PBMC、FMO對照及樣本自身將圈選設定為高、中(亦稱為中間)及低(亦稱為陰性)以區分三個群體。在一些實施例中，PBMC係用作圈選對照。在一些實施例中，PD-1high群體係定義為超過在PBMC中觀察到之PD-1陽性之細胞群體。在一些實施例中，TIL中之中間PD-1+群體涵蓋PBMC中之PD-1+細胞。在一些實施例中，陰性的圈選係基於FMO。在一些實施例中，FACS圈選係在藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL群體之步驟之後設定。在一些實施例中，圈選係經設定用於各分選。在一些實施例中，圈選係經設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選係經設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選模板係每10天、20天、30天、40天、50天或60天自PBMC設定。在一些實施例中，圈選模板係每60天自PBMC設定。在一些實施例中，圈選模板係每10天、20天、30天、40天、50天或60天設定用於各PBMC樣本。在一些實施例中，圈選模板係每60天設定用於各PBMC樣本。
在一些實施例中，預選涉及自第一TIL群體選擇PD-1陽性TIL以獲得富含PD-1之TIL群體，包括自第一TIL群體選擇至少11.27%至74.4%呈PD-1陽性TIL之TIL群體。在一些實施例中，第一TIL群體為至少20%至80% PD-1陽性TIL、至少20%至80% PD-1陽性TIL、至少30%至80% PD-1陽性TIL、至少40%至80% PD-1陽性TIL、至少50%至80% PD-1陽性TIL、至少10%至70% PD-1陽性TIL、至少20%至70% PD-1陽性TIL、至少30%至70% PD-1陽性TIL、或至少40%至70% PD-1陽性TIL。
在一些實施例中，選擇步驟(例如預選及/或選擇PD-1陽性細胞)包括以下步驟：
(i)使第一TIL群體及PBMC群體暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該抗體經由在PD-1之IgV域外部的N端環與PD-1結合，
(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體，
(iii)基於如藉由螢光活化細胞分選(FACS)進行的第一TIL群體中PD-1陽性TIL之螢光團的強度與在PBMC群體中的強度的比較，獲得富含PD-1之TIL群體。
在一些實施例中，PD-1陽性TIL為PD-1high TIL。
在一些實施例中，至少70%富含PD-1之TIL群體為PD-1陽性TIL。在一些實施例中，至少80%富含PD-1之TIL群體為PD-1陽性TIL。在一些實施例中，至少90%富含PD-1之TIL群體為PD-1陽性TIL。在一些實施例中，至少95%富含PD-1之TIL群體為PD-1陽性TIL。在一些實施例中，至少99%富含PD-1之TIL群體為PD-1陽性TIL。在一些實施例中，100%富含PD-1之TIL群體為PD-1陽性TIL。
不同的抗PD-1抗體展現與PD-1內之不同抗原決定基的不同結合特徵。在一些實施例中，抗PD-1抗體與帕博利珠單抗結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，抗PD1抗體與PD-1之IgV域外部之N端環中之抗原決定基結合。在一些實施例中，抗PD1抗體經由PD-1之IgV域外部之N端環結合。在一些實施例中，抗PD-1抗體為抗PD-1抗體，其經由在PD-1之IgV域外部的N端環與PD-1結合。在一些實施例中，抗PD-1抗體為單株抗PD-1抗體，其經由在PD-1之IgV域外部之N端環與PD-1結合。在一些實施例中，單株抗PD-1抗體為抗PD-1 IgG4抗體，其經由在PD-1之IgV域外部的N端環與PD-1結合。參見例如Tan, S.《自然通訊》第8卷，Argicle 14369：1-10 (2017)。
在一些實施例中，圖8之步驟A2所例示之選擇步驟包括以下步驟：(i)使第一TIL群體暴露於過量之單株抗PD-1 IgG4抗體，該抗體經由在PD-1之IgV域外部之N端環與PD-1結合；(ii)添加過量的與螢光團結合之抗IgG4抗體；及(iii)基於螢光團進行流動式細胞分選以獲得富含PD-1之TIL群體。在一些實施例中，單株抗PD-1 IgG4抗體為納武單抗或其變體、片段或結合物。在一些實施例中，抗IgG4抗體為抗人類IgG4選殖株，即HP6023選殖株。在一些實施例中，用於步驟(b)中之選擇的抗PD-1抗體與EH12.2H7或納武單抗結合至相同的抗原決定基。
在一些實施例中，採用WO2019156568之PD-1圈選方法。為了確定來源於腫瘤樣本之TIL是否為PD-1high，熟習此項技術者可利用對應於獲自一或多名健康人類個體之血液樣本的周邊T細胞中之PD-1表現量的參考值。參考樣本中之PD-1陽性細胞可使用螢光減一對照及相匹配的同型對照來定義。在一些實施例中，PD-1表現量係於來自健康個體之CD3+/PD-1+周邊T細胞(例如參考細胞)中量測且用於建立獲自腫瘤之TIL中PD-1之免疫染色強度的臨限值或截止值。臨限值可定義為PD-1high T細胞之PD-1免疫染色的最小強度。因此，PD-1表現等於或高於臨限值之TIL可被視為PD-1high細胞。在一些情況下，PD-1high TIL表示具有最高PD-1免疫染色強度的TIL，對應於最多1%或少於1%之總CD3+細胞。在其他情況下，PD-1high TIL表示具有最高PD-1免疫染色強度之TIL，對應於最多0.75%或少於0.75%之總CD3+細胞。在一些情況下，PD-1high TIL表示具有最高PD-1免疫染色強度的TIL，對應於最多0.50%或少於0.50%之總CD3+細胞。在一種情況下，PD-1high TIL表示具有最高PD-1免疫染色強度之TIL，對應於最多0.25%或少於0.25%之總CD3+細胞。 a. 螢光團
在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含與螢光團連接之抗PD-1抗體及與螢光團連接之抗CD3抗體的混合物染色。在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含與螢光團(例如PE、活/死紫色)連接之抗PD-1抗體及抗CD3-FITC的混合液染色。在一些實施例中，初代細胞群體TIL係經包含抗PD-1-PE、抗CD3-FITC及活/死藍色染料(馬薩諸塞州的ThermoFisher，目錄號L23105)的混合液染色。在一些實施例中，在與抗PD1抗體培育之後，選擇PD-1陽性細胞以根據本文例如在步驟B中所描述之初始第一次擴增進行擴增。 在一些實施例中，螢光團包含但不限於PE(藻紅素)、APC(別藻藍蛋白)、PerCP(甲藻黃素葉綠素蛋白質)、DyLight 405、Alexa Fluor 405、Pacific Blue、Alexa Fluor 488、FITC(螢光異硫氰酸鹽)、DyLight 550、Alexa Fluor 647、DyLight 650及Alexa Fluor 700。在一些實施例中，螢光團包含但不限於PE-Alexa Fluor® 647、PE-Cy5、PerCP-Cy5.5、PE-Cy5.5、PE-Alexa Fluor® 750、PE-Cy7及APC-Cy7。在一些實施例中，螢光團包含但不限於螢光素染料。螢光素染料之實例包含但不限於5-羧基螢光素、螢光素-5-異硫氰酸酯及6-羧基螢光素、5,6-二羧基螢光素、5-(及6)-磺酸基螢光素、碸螢光素、琥珀醯基螢光素、5-(及6)-羧基SNARF-1、羧基螢光素磺酸鹽、羧基螢光素兩性離子、羧基螢光素四級銨、羧基螢光素膦酸鹽、羧基螢光素GABA、5'(6')-羧基螢光素、羧基螢光素-cys-Cy5及螢光素麩胱甘肽。在一些實施例中，螢光部分為玫瑰紅染料。玫瑰紅染料之實例包含但不限於四甲基玫瑰紅-6-異硫氰酸酯、5-羧基四甲基玫瑰紅、5-羧基對甲胺基酚衍生物、羧基玫瑰紅110、四甲基及四乙基玫瑰紅、二苯基二甲基及二苯基二乙基玫瑰紅、二萘基玫瑰紅、玫瑰紅101磺醯氯(以商品名TEXAS RED®出售)。在一些實施例中，螢光部分為花青染料。花青染料之實例包含但不限於Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5及Cy 7。 B. 步驟 B ：初始第一次擴增
在一些實施例中，本發明方法提供較年輕TIL，該等TIL相較於較老TIL(亦即，在投與個體/患者之前已進一步進行較多輪複製的TIL)可能提供額外治療益處。年輕TIL之特徵已描述於文獻中，例如於Donia等人,《斯堪的納維亞免疫學雜誌》 2012, 75,157-167；Dudley等人, 《臨床癌症研究》 2010, 16,6122-6131；Huang等人, 《免疫療法雜誌》 2005, 28, 258-267；Besser等人, 《臨床癌症研究》 2013, 19, OF1-OF9；Besser等人, 《免疫療法雜誌》 2009, 32,415-423；Robbins等人, 《免疫學雜誌》 2004, 173,7125-7130；Shen等人, 《免疫療法雜誌》, 2007, 30,123-129；Zhou等人, 《免疫療法雜誌》 2005, 28,53-62；及Tran等人, 《免疫療法雜誌》, 2008, 31, 742-751，其各自以引用的方式併入本文中。
在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖8C)之步驟A中所描述進行腫瘤片段及/或腫瘤片段之分割或消化之後，將所得細胞在相對於腫瘤及其他細胞而有利於TIL生長的條件下培養於含有抗生素組分、IL-2、OKT-3及飼養細胞(例如抗原呈現飼養細胞)的血清中。在一些實施例中，在培養起始時添加一或多種抗生素、IL-2、OKT-3及飼養細胞，以及腫瘤消化物及/或腫瘤片段(例如第0天)。在一些實施例中，抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。在一些實施例中，腫瘤消化物及/或腫瘤片段在容器中以每個容器至多60個片段且在6000 IU/mL IL-2存在下培育。在一些實施例中，將此初代細胞群體培養數天時段，一般為1至8天，產生主體TIL群體，一般為約1×10 8個主體TIL細胞。在一些實施例中，將此初代細胞群體培養數天時段，一般為1至7天，產生主體TIL群體，一般為約1×10 8個主體TIL細胞。在一些實施例中，初始第一次擴增發生1至8天之時段，產生主體TIL群體，一般為約1 × 10 8個主體TIL細胞。在一些實施例中，初始第一次擴增發生1至7天之時段，產生主體TIL群體，一般為約1 × 10 8個主體TIL細胞。在一些實施例中，此初始第一次擴增發生5至8天之時段，產生主體TIL群體，一般為約1 × 10 8個主體TIL細胞。在一些實施例中，此初始第一次擴增發生5至7天之時段，產生主體TIL群體，一般為約1 × 10 8個主體TIL細胞。在一些實施例中，此初始第一次擴增發生約6至8天之時段，產生主體TIL群體，一般為約1 × 10 8個主體TIL細胞。在一些實施例中，此初始第一次擴增發生約6至7天之時段，產生主體TIL群體，一般為約1 × 10 8個主體TIL細胞。在一些實施例中，此初始第一次擴增發生約7至8天之時段，產生主體TIL群體，一般為約1 × 10 8個主體TIL細胞。在一些實施例中，此初始第一次擴增發生約7天之時段，產生主體TIL群體，一般為約1 × 10 8個主體TIL細胞。在一些實施例中，此初始第一次擴增發生約8天之時段，產生主體TIL群體，一般為約1 × 10 8個主體TIL細胞。
在一些實施例中，TIL之擴增可使用如下文及本文所描述之初始第一次擴增步驟(例如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之步驟)進行，其可包含稱為pre-REP或初始REP之程序且自第0天及/或自培養起始含有飼養細胞；隨後進行如下文在步驟D中及本文中所描述之快速第二次擴增(步驟D，包含稱為快速擴增方案(REP)步驟之程序)；隨後視情況進行冷凍保存，且隨後進行如下文及本文所描述之第二步驟D(包含稱為再刺激REP步驟之程序)。獲自此程序之TIL可視情況針對如本文所描述之表型特徵及代謝參數進行表徵。在一些實施例中，腫瘤片段在約1 mm 3與10 mm 3之間。
在一些實施例中，第一次擴增培養基稱為「CM」(培養基之縮寫)。在一些實施例中，步驟B之CM由含GlutaMAX且補充有10%人類AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素之RPMI 1640組成。
在一些實施例中，有少於或等於240個腫瘤片段。在一些實施例中，有少於或等於240個腫瘤片段被置放於少於或等於4個容器中。在一些實施例中，容器為GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，少於或等於60個腫瘤片段被置放於1個容器中。在一些實施例中，各容器包括每容器少於或等於500 mL培養基。在一些實施例中，培養基包括IL-2。在一些實施例中，培養基包括6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，培養基包括抗原呈現飼養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)。在一些實施例中，培養基包括每個容器2.5 × 10 8個抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，培養基包括OKT-3。在一些實施例中，培養基包括每個容器30 ng/mL OKT-3。在一些實施例中，容器為GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，培養基包括6000 IU/mL IL-2、30 ng OKT-3及2.5 × 10 8個抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，培養基包括每個容器6000 IU/mL IL-2、30 ng/mL OKT-3及2.5 × 10 8個抗原呈現飼養細胞。
在製備腫瘤片段之後，將所得細胞(亦即，作為初代細胞群體之片段)在相對於腫瘤及其他細胞而有利於TIL生長的條件下培養於含有抗生素組分、IL-2、抗原呈現飼養細胞及OKT-3之培養基中，且其允許自第0天起始培養來進行TIL激發及加速生長。在一些實施例中，抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。在一些實施例中，將腫瘤消化物及/或腫瘤片段與6000 IU/mL IL-2以及抗原呈現飼養細胞及OKT-3一起培育。將此初代細胞群體培養數天之時段，一般為1至8天，產生主體TIL群體，一般為約1×10 8個主體TIL細胞。在一些實施例中，在初始第一次擴增期間的生長培養基包括IL-2或其變體以及抗原呈現飼養細胞及OKT-3。在一些實施例中，將此初代細胞群體培養數天之時段，一般1至7天，產生主體TIL群體，一般為約1×10 8個主體TIL細胞。
在一些實施例中，在初始第一次擴增期間的生長培養基包括抗生素組分、IL-2或其變體，以及抗原呈現飼養細胞及OKT-3。在一些實施例中，抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素在一些實施例中，IL-2為重組人類IL-2(rhIL-2)。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有20-30×10 6IU/mg之比活性。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有20×10 6IU/mg之比活性。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有25×10 6IU/mg之比活性。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有30×10 6IU/mg之比活性。在一些實施例中，IL-2儲備液具有4-8×10 6IU/mg IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備液具有5-7×10 6IU/mg IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備液具有6×10 6IU/mg IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備液係如實例中所描述來製備。在一些實施例中，初始第一次擴增培養基包括約10,000 IU/mL IL-2、約9,000 IU/mL IL-2、約8,000 IU/mL IL-2、約7,000 IU/mL IL-2、約6000 IU/mL IL-2或約5,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，初始第一次擴增培養基包括約9,000 IU/mL IL-2至約5,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，初始第一次擴增培養基包括約8,000 IU/mL IL-2至約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，初始第一次擴增培養基包括約7,000 IU/mL IL-2至約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，初始第一次擴增培養基包括約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基進一步包括IL-2。在一些實施例中，初始第一次擴增細胞培養基包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，初始第一次擴增細胞培養基進一步包括IL-2。在一些實施例中，初始第一次擴增細胞培養基包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，初始第一次擴增細胞培養基包括約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，初始第一次擴增細胞培養基包括1000至2000 IU/mL、2000至3000 IU/mL、3000至4000 IU/mL、4000至5000 IU/mL、5000至6000 IU/mL、6000至7000 IU/mL、7000至8000 IU/mL或約8000 IU/mL IL-2。
在一些實施例中，初始第一次擴增培養基包括約500 IU/mL IL-15、約400 IU/mL IL-15、約300 IU/mL IL-15、約200 IU/mL IL-15、約180 IU/mL IL-15、約160 IU/mL IL-15、約140 IU/mL IL-15、約120 IU/mL IL-15或約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，初始第一次擴增培養基包括約500 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，初始第一次擴增培養基包括約400 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，初始第一次擴增培養基包括約300 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，初始第一次擴增培養基包括約200 IU/mL IL-15。在一些實施例中，初始第一次擴增細胞培養基包括約180 IU/mL IL-15。在一些實施例中，初始第一次擴增細胞培養基進一步包括IL-15。在一些實施例中，初始第一次擴增細胞培養基包括約180 IU/mL IL-15。
在一些實施例中，初始第一次擴增培養基包括約20 IU/mL IL-21、約15 IU/mL IL-21、約12 IU/mL IL-21、約10 IU/mL IL-21、約5 IU/mL IL-21、約4 IU/mL IL-21、約3 IU/mL IL-21、約2 IU/mL IL-21、約1 IU/mL IL-21或約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，初始第一次擴增培養基包括約20 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，初始第一次擴增培養基包括約15 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，初始第一次擴增培養基包括約12 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，初始第一次擴增培養基包括約10 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，初始第一次擴增培養基包括約5 IU/mL IL-21至約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，初始第一次擴增培養基包括約2 IU/mL IL-21。在一些實施例中，初始第一次擴增細胞培養基包括約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，初始第一次擴增細胞培養基包括約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基進一步包括IL-21。在一些實施例中，初始第一次擴增細胞培養基包括約1 IU/mL IL-21。
在一些實施例中，初始第一次擴增細胞培養基包括OKT-3抗體。在一些實施例中，初始第一次擴增細胞培養基包括約30 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，初始第一次擴增細胞培養基包括約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括在0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、在1 ng/mL與5 ng/mL之間、在5 ng/mL與10 ng/mL之間、在10 ng/mL與20 ng/mL之間、在20 ng/mL與30 ng/mL之間、在30 ng/mL與40 ng/mL之間、在40 ng/mL與50 ng/mL之間及在50 ng/mL與100 ng/mL之間之OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括在15 ng/mL與30 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括30 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，OKT-3抗體為莫羅單抗。參見例如上表1。
在一些實施例中，初始第一次擴增細胞培養基在細胞培養基中包括一或多種TNFRSF促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑包括4-1BB促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑為4-1BB促效劑，且該4-1BB促效劑選自由以下組成之群組：烏瑞魯單抗、烏圖木單抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、變體、生物類似物及組合。在一些實施例中，添加的TNFRSF促效劑之濃度足以在細胞培養基中達成在0.1 µg/mL與100 µg/mL之間之濃度。在一些實施例中，添加的TNFRSF促效劑之濃度足以在細胞培養基中達成在20 µg/mL與40 µg/mL之間之濃度。
在一些實施例中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，初始第一次擴增細胞培養基進一步包括初始濃度為約3000 IU/mL之IL-2及初始濃度為約30 ng/mL之OKT-3抗體，且其中該一或多種TNFRSF促效劑包括4-1BB促效劑。在一些實施例中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，初始第一次擴增細胞培養基進一步包括初始濃度為約6000 IU/mL之IL-2及初始濃度為約30 ng/mL之OKT-3抗體，且其中該一或多種TNFRSF促效劑包括4-1BB促效劑。
在一些實施例中，初始第一次擴增培養基稱為「CM」(培養基之縮寫)。在一些實施例中，其稱為CM1(培養基1)。在一些實施例中，CM由含GlutaMAX且補充有10%人類AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素之RPMI 1640組成。在一些實施例中，CM係實例中所描述之CM1。在一些實施例中，初始第一次擴增在初始細胞培養基或第一細胞培養基中發生。在一些實施例中，初始第一次擴增培養基或初始細胞培養基或第一細胞培養基包括IL-2、OKT-3及抗原呈現飼養細胞(在本文中又稱為飼養細胞)。
在一些實施例中，本文所揭示之擴增程序中使用的培養基為無血清培養基或合成培養基。在一些實施例中，無血清或合成培養基包括基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清替代物。在一些實施例中，無血清或合成培養基用於防止及/或減少部分因含血清培養基之批次間變化所致之實驗變化。
在一些實施例中，無血清或合成培養基包括基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清替代物。在一些實施例中，基礎細胞培養基包含但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無外源物質培養基、杜爾貝科氏改良型伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良型杜爾貝科氏培養基。
在一些實施例中，血清補充劑或血清替代物包含但不限於以下一或多者：CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑、CTS™免疫細胞血清替代物、一或多種白蛋白或白蛋白代用品、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白代用品、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素代用品、一或多種膠原蛋白前驅物、抗生素組分及一或多種微量元素。在一些實施例中，合成培養基包括白蛋白及一或多種選自由以下組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素以及含有微量元素部分Ag +、Al 3+、Ba 2+、Cd 2+、Co 2+、Cr 3+、Ge 4+、Se 4+、Br、T、Mn 2+、P、Si 4+、V 5+、Mo 6+、Ni 2+、Rb +、Sn 2+及Zr 4+之化合物。在一些實施例中，合成培養基進一步包括L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰基乙醇。
在一些實施例中，將CTS™OpTmizer™ T細胞免疫細胞血清替代物與習知生長培養基一起使用，該習知生長培養基包含但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CST™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無外源物質培養基、杜爾貝科氏改良型伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良型杜爾貝科氏培養基。
在一些實施例中，無血清或合成培養基中之總血清替代物濃度(vol%)為總無血清或合成培養基之體積的約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或合成培養基之總體積的約3%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或合成培養基之總體積的約5%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或合成培養基之總體積的約10%。
在一些實施例中，無血清或合成培養基為CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1 L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基與26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑之組合，該基礎培養基與該補充劑在使用前混合在一起。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55 mM的2-巰基乙醇。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)，且2-巰基乙醇於培養基中之最終濃度為55 µM。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55 µM 2-巰基乙醇。
在一些實施例中，合成培養基為CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1 L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基與26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑之組合，該基礎培養基與該補充劑在使用前混合在一起。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55 mM 2-巰基乙醇。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包括約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包括約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包括約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包括約1000 IU/mL至約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包括約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包括約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)，且2-巰基乙醇於培養基中之最終濃度為55 µM。
在一些實施例中，無血清培養基或合成培養基補充有濃度為約0.1 mM至約10mM、0.5 mM至約9 mM、1 mM至約8 mM、2 mM至約7 mM、3 mM至約6 mM、或4 mM至約5 mM的麩醯胺酸(亦即，GlutaMAX®)。在一些實施例中，無血清培養基或合成培養基補充有濃度為約2 mM之麩醯胺酸(亦即，GlutaMAX®)。
在一些實施例中，無血清培養基或合成培養基補充有濃度為約5 mM至約150 mM、10 mM至約140 mM、15 mM至約130 mM、20 mM至約120 mM、25 mM至約110 mM、30 mM至約100 mM、35 mM至約95 mM、40 mM至約90 mM、45 mM至約85 mM、50 mM至約80 mM、55 mM至約75 mM、60 mM至約70 mM或約65 mM的2-巰基乙醇。在一些實施例中，無血清培養基或合成培養基補充有濃度為約55 mM之2-巰基乙醇。在一些實施例中，2-巰基乙醇於培養基中之最終濃度為55 µM。
在一些實施例中，以引用之方式併入本文中的國際PCT公開案第WO/1998/030679號中所描述之合成培養基可用於本發明。在該公開案中，描述無血清真核細胞培養基。無血清真核細胞培養基包含補充有能夠支持細胞在無血清培養物中生長之無血清補充劑的基礎細胞培養基。無血清真核細胞培養基補充劑包括一或多種選自由以下組成之群組的成分，或藉由組合一或多種選自由以下組成之群組的成分而獲得：一或多種白蛋白或白蛋白代用品、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白代用品、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素代用品、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種微量元素及一或多種抗生素。在一些實施例中，合成培養基進一步包括L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或β-巰基乙醇。在一些實施例中，合成培養基包括白蛋白或白蛋白代用品及一或多種選自由以下組成之群組的成分：一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白代用品、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素代用品、一或多種膠原蛋白前驅物及一或多種微量元素。在一些實施例中，合成培養基包括白蛋白及一或多種選自由以下組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素以及含有微量元素部分Ag +、Al 3+、Ba 2+、Cd 2+、Co 2+、Cr 3+、Ge 4+、Se 4+、Br、T、Mn 2+、P、Si 4+、V 5+、Mo 6+、Ni 2+、Rb +、Sn 2+及Zr 4+之化合物。在一些實施例中，基礎細胞培養基選自由以下組成之群組：杜爾貝科氏改良型伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良型杜爾貝科氏培養基。
在一些實施例中，合成培養基中甘胺酸之濃度在約5-200 mg/L之範圍內，L-組胺酸之濃度為約5-250 mg/L，L-異白胺酸之濃度為約5-300 mg/L，L-甲硫胺酸之濃度為約5-200 mg/L，L-苯丙胺酸之濃度為約5-400 mg/L，L-脯胺酸之濃度為約1-1000 mg/L，L-羥基脯胺酸之濃度為約1-45 mg/L，L-絲胺酸之濃度為約1-250 mg/L，L-蘇胺酸之濃度為約10-500 mg/L，L-色胺酸之濃度為約2-110 mg/L，L-酪胺酸之濃度為約3-175 mg/L，L-纈胺酸之濃度為約5-500 mg/L，硫胺素之濃度為約1-20 mg/L，還原麩胱甘肽之濃度為約1-20 mg/L，L-抗壞血酸-2-磷酸鹽之濃度為約1-200 mg/L，鐵飽和轉鐵蛋白之濃度為約1-50 mg/L，胰島素之濃度為約1-100 mg/L，亞硒酸鈉之濃度為約0.000001-0.0001 mg/L，且白蛋白(例如AlbuMAX® I)之濃度為約5000-50,000 mg/L。
在一些實施例中，合成培養基中之非微量元素部分成分係以表4中標題「1X培養基中之濃度範圍」欄中列出之濃度範圍存在。在其他實施例中，合成培養基中之非微量元素部分成分係以表4中標題「1X培養基之較佳實施例」欄中列出之最終濃度存在。在其他實施例中，合成培養基為包括無血清補充劑之基礎細胞培養基。在一些此等實施例中，無血清補充劑包括表4中的類型及標題「補充劑之較佳實施例」欄中列出之濃度的非微量部分成分。
在一些實施例中，合成培養基之滲透壓介於約260與350 mOsmol之間。在一些實施例中，滲透壓介於約280與310 mOsmol之間。在一些實施例中，合成培養基補充有至多約3.7 g/L或約2.2 g/L碳酸氫鈉。合成培養基可進一步補充有L-麩醯胺酸(最終濃度為約2 mM)、抗生素組分、非必需胺基酸(NEAA；最終濃度為約100 μM)、2-巰基乙醇(最終濃度為約100 μM)。
在一些實施例中，Smith等人, 《臨床與轉化免疫學( Clin.Transl. Immunology)》, 4(1), 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31)中所描述之合成培養基可用於本發明中。簡言之，使用RPMI或CTS™ OpTmizer™作為基礎細胞培養基且補充有0、2%、5%或10% CTS™免疫細胞血清替代物。
在一些實施例中，第一透氣容器及/或第二透氣容器中之細胞培養基為未經過濾的。使用未經過濾之細胞培養基可簡化擴增細胞數目所需之程序。在一些實施例中，第一透氣容器及/或第二透氣容器中之細胞培養基缺乏β-巰基乙醇(BME或βME；亦稱為2-巰基乙醇，CAS 60-24-2)。
在一些實施例中，初始第一次擴增程序(包含諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之程序，其可包含有時稱為pre-REP或初始REP之程序)為1至8天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，初始第一次擴增程序(包含諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之程序，其可包含有時稱為pre-REP或初始REP之程序)為2至8天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，初始第一次擴增程序(包含諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之程序，其可包含有時稱為pre-REP或初始REP之程序)為3至8天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，初始第一次擴增程序(包含諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之程序，其可包含有時稱為pre-REP或初始REP之程序)為4至8天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，初始第一次擴增程序(包含諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之程序，其可包含有時稱為pre-REP或初始REP之程序)為5至8天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，初始第一次擴增程序(包含諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之程序，其可包含有時稱為pre-REP或初始REP之程序)為6至8天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，初始第一次擴增程序(包含諸如圖1(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之程序，其可包含有時稱為pre-REP或初始REP之程序)為7至8天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，初始第一次擴增程序(包含諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之程序，其可包含有時稱為pre-REP或初始REP之程序)為8天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，初始第一次擴增程序(包含諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之程序，其可包含有時稱為pre-REP或初始REP之程序)為1至7天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，初始第一次擴增程序(包含諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之程序，其可包含有時稱為pre-REP或初始REP之程序)為2至7天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，初始第一次擴增程序(包含諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之程序，其可包含有時稱為pre-REP或初始REP之程序)為3至7天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，初始第一次擴增程序(包含諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之程序，其可包含有時稱為pre-REP或初始REP之程序)為4至7天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，初始第一次擴增程序(包含諸如圖8(特別是例如圖8B及/或圖8C)之步驟B中所描述之程序，其可包含有時稱為pre-REP或初始REP之程序)為5至7天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，初始第一次擴增程序(包含諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之程序，其可包含有時稱為pre-REP或初始REP之程序)為6至7天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，初始第一次擴增程序(包含諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之程序，其可包含有時稱為pre-REP或初始REP之程序)為7天，如實例及圖式中所論述。
在一些實施例中，初始第一次TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後進行1天至8天。在一些實施例中，初始第一次TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後進行1天至7天。在一些實施例中，初始第一次TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後進行2天至8天。在一些實施例中，初始第一次TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後進行2天至7天。在一些實施例中，初始第一次TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後進行3天至8天。在一些實施例中，初始第一次TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後進行3天至7天。在一些實施例中，初始第一次TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後進行4天至8天。在一些實施例中，初始第一次TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後進行4天至7天。在一些實施例中，初始第一次TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後進行5天至8天。在一些實施例中，初始第一次TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後進行5天至7天。在一些實施例中，初始第一次TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後進行6天至8天。在一些實施例中，初始第一次TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後進行6天至7天。在一些實施例中，初始第一次TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後進行7至8天。在一些實施例中，初始第一次TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後進行8天。在一些實施例中，初始第一次TIL擴增可在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後進行7天。
在一些實施例中，初始第一次TIL擴增可進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行1天至8天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行1天至7天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行2天至8天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行2天至7天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行3天至8天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行3天至7天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行4天至8天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行4天至7天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行5天至8天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行5天至7天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行6天至8天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行6天至7天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行7天至8天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行8天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行7天。
在一些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在初始第一次擴增期間之組合。在一些實施例中，在初始第一次擴增期間，包含例如在根據圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)以及本文所描述之步驟B程序期間可包含IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及其任何組合。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在初始第一次擴增期間之組合。在一些實施例中，在根據圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)以及如本文所描述之步驟B程序期間可包含IL-2、IL-15及IL-21以及其任何組合。
在一些實施例中，初始第一次擴增，例如根據圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B，係在密閉系統生物反應器中進行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用生物反應器。在一些實施例中，採用生物反應器作為容器。在一些實施例中，所採用的生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，所採用的生物反應器為G-REX-100。在一些實施例中，所採用的生物反應器為G-REX-10。
在一些實施例中，初始第一次擴增培養基(例如CM或CM1)包含抗生素組分。在一些實施例中，抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分包含約100 µg/mL萬古黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL萬古黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素、約100 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素及約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素、約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素及約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。 1. 飼養細胞及抗原呈現細胞
在一些實施例中，本文所描述之初始第一次擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖1(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之擴增，以及稱為pre-REP或初始REP之擴增)在TIL擴增起始時不需要飼養細胞(在本文中又稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一次擴增期間添加。在一些實施例中，本文所描述之初始第一次擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之擴增，以及稱為pre-REP或初始REP之擴增)在TIL擴增起始時不需要飼養細胞(在本文中又稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一次擴增期間第4-8天期間的任何時間添加。在一些實施例中，本文所描述之初始第一次擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之擴增，以及稱為pre-REP或初始REP之擴增)在TIL擴增起始時不需要飼養細胞(在本文中又稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一次擴增期間第4-7天期間的任何時間添加。在一些實施例中，本文所描述之初始第一次擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之擴增，以及稱為pre-REP或初始REP之擴增)在TIL擴增起始時不需要飼養細胞(在本文中又稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一次擴增期間第5-8天期間的任何時間添加。在一些實施例中，本文所描述之初始第一次擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之擴增，以及稱為pre-REP或初始REP之擴增)在TIL擴增起始時不需要飼養細胞(在本文中又稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一次擴增期間第5-7天期間的任何時間添加。在一些實施例中，本文所描述之初始第一次擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之擴增，以及稱為pre-REP或初始REP之擴增)在TIL擴增起始時不需要飼養細胞(在本文中又稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一次擴增期間第6-8天期間的任何時間添加。在一些實施例中，本文所描述之初始第一次擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之擴增，以及稱為pre-REP或初始REP之擴增)在TIL擴增起始時不需要飼養細胞(在本文中又稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一次擴增期間在第6-7天期間的任何時間添加。在一些實施例中，本文所描述之初始第一次擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之擴增，以及稱為pre-REP或初始REP之擴增)在TIL擴增起始時不需要飼養細胞(在本文中又稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一次擴增期間第7天或第8天期間的任何時間添加。在一些實施例中，本文所描述之初始第一次擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之擴增，以及稱為pre-REP或初始REP之擴增)在TIL擴增起始時不需要飼養細胞(在本文中又稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一次擴增期間第7天期間的任何時間添加。在一些實施例中，本文所描述之初始第一次擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中所描述之擴增，以及稱為pre-REP或初始REP之擴增)在TIL擴增起始時不需要飼養細胞(在本文中又稱為「抗原呈現細胞」)，而是在初始第一次擴增期間第8天期間的任何時間添加。
在一些實施例中，本文所描述之初始第一次擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖8(特別是例如圖8B)之步驟B中所描述之擴增，以及稱為pre-REP或初始REP之擴增)在TIL擴增起始時及在初始第一次擴增期間需要飼養細胞(在本文中又稱為「抗原呈現細胞」)。在許多實施例中，飼養細胞係獲自同種異體健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC係使用標準方法，諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一些實施例中，在初始第一次擴增期間使用2.5 × 10 8個飼養細胞。在一些實施例中，在初始第一次擴增期間使用每個容器2.5 × 10 8個飼養細胞。在一些實施例中，在初始第一次擴增期間每個GREX-10使用2.5 × 10 8個飼養細胞。在一些實施例中，在初始第一次擴增期間每個GREX-100使用2.5 × 10 8個飼養細胞。
一般而言，同種異體PBMC經由照射或熱處理而不活化，且如實例中所描述用於REP程序中，其提供用於評估經照射同種異體PBMC之無複製能力的例示性方案。
在一些實施例中，若第14天活細胞總數小於在初始第一次擴增第0天放入培養物中的初始活細胞數目，則認為PBMC無複製能力且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。
在一些實施例中，若第7天在OKT3及IL-2存在下培養的活細胞總數與在初始第一次擴增第0天放入培養物中的初始活細胞數目相比並未增加，則認為PBMC無複製能力且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC係在30 ng/mL OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC係在30 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下培養。
在一些實施例中，若第7天在OKT3及IL-2存在下培養的活細胞總數與在初始第一次擴增第0天放入培養物中的初始活細胞數目相比並未增加，則認為PBMC無複製能力且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC係在5-60 ng/mL OKT3抗體及1000-6000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC係在10-50 ng/mL OKT3抗體及2000-5000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC係在20-40 ng/mL OKT3抗體及2000-4000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC係在25-35 ng/mL OKT3抗體及2500-3500 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC係在30 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC係在15 ng/ml OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC係在15 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下培養。
在一些實施例中，抗原呈現飼養細胞為PBMC。在一些實施例中，抗原呈現飼養細胞為人工抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，在第二次擴增中TIL與抗原呈現飼養細胞之比率為約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一些實施例中，在第二次擴增中TIL與抗原呈現飼養細胞之比率介於1比50與1比300之間。在一些實施例中，在第二次擴增中TIL與抗原呈現飼養細胞之比率介於1比100與1比200之間。
在一些實施例中，本文所描述之初始第一次擴增程序需要約2.5 × 10 8個飼養細胞比約100 × 10 6個TIL之比率。在一些實施例中，本文所描述之初始第一次擴增程序需要約2.5 × 10 8個飼養細胞比約50 × 10 6個TIL之比率。在又一實施例中，本文所描述之初始第一次擴增需要約2.5 × 10 8個飼養細胞比約25 × 10 6個TIL。在又一實施例中，本文所描述之初始第一次擴增需要約2.5 × 10 8個飼養細胞。在又一實施例中，初始第一次擴增需要四分之一、三分之一、十二分之五或二分之一的用於快速第二次擴增之飼養細胞數目。
在一些實施例中，初始第一次擴增中之培養基包括IL-2。在一些實施例中，初始第一次擴增中之培養基包括6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，初始第一次擴增中之培養基包括抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，初始第一次擴增中之培養基包括每個容器2.5 × 10 8個抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，初始第一次擴增中之培養基包括OKT-3。在一些實施例中，培養基包括每個容器30 ng OKT-3。在一些實施例中，容器為GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，培養基包括6000 IU/mL IL-2、30 ng/mL OKT-3及2.5 × 10 8個抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，培養基包括每個容器6000 IU/mL IL-2、30 ng/mL OKT-3及2.5 × 10 8個抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，培養基包括每個容器每2.5 × 10 8個抗原呈現飼養細胞500 mL培養基及15 µg OKT-3。在一些實施例中，培養基包括每個容器500 mL培養基及15 µg OKT-3。在一些實施例中，容器為GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，培養基包括500 mL培養基、6000 IU/mL IL-2、30 ng/mL OKT-3及2.5 × 10 8個抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，培養基包括每個容器500 mL培養基、6000 IU/mL IL-2、15 µg OKT-3及2.5 × 10 8個抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，培養基包括每個容器每2.5 × 10 8個抗原呈現飼養細胞500 mL培養基及15 µg OKT-3。
在一些實施例中，本文所描述之初始第一次擴增程序在第二次擴增期間需要多於TIL的過量飼養細胞。在許多實施例中，飼養細胞係獲自同種異體健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC係使用標準方法，諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一些實施例中，使用人工抗原呈現細胞(aAPC)代替PBMC。
一般而言，同種異體PBMC經由照射或熱處理而不活化，且用於本文所描述之TIL擴增程序，包含圖式及實例中所描述之例示性程序。
在一些實施例中，在初始第一次擴增中使用人工抗原呈現細胞來代替PBMC或與PBMC組合使用。 2. 細胞介素及其他添加劑
如本領域中已知，本文所描述之擴增方法一般使用具有高劑量細胞介素，尤其是IL-2的培養基。
替代地，使用細胞介素之組合進行TIL之初始第一次擴增亦為可能的，如美國專利申請公開案第US 2017/0107490 A1號中所描述，使用IL-2、IL-15及IL-21中兩種或多於兩種之組合，該案揭示內容以引用之方式併入本文中。因此，可能的組合包含IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於產生淋巴球，且特別是如其中所描述的T細胞。參見例如表2。
在一些實施例中，步驟B亦可包含向培養基中添加OKT-3抗體或莫羅單抗，如本文別處所描述。在一些實施例中，步驟B亦可包含向培養基中添加4-1BB促效劑，如本文別處所描述。在一些實施例中，步驟B亦可包含向培養基中添加OX-40促效劑，如本文別處所描述。此外，可在步驟B期間在培養基中使用添加劑，諸如過氧化物酶體增殖物活化受體γ共活化劑I-α促效劑，包含增殖物活化受體(PPAR)-γ促效劑，諸如噻唑啶二酮化合物，如在美國專利申請公開案第US 2019/0307796 A1號中所描述，其揭示內容以引用的方式併入本文中。 3. 抗生素
本文所描述之初始第一次擴增方法一般使用包含抗生素組分之培養基。
在一些實施例中，抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分包含約100 µg/mL萬古黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素、約100 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素及約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素、約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素及約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。 C. 步驟 C ：初始第一次擴增至快速第二次擴增之轉變
在一些情況下，獲自初始第一次擴增(其可包含有時稱為pre-REP之擴增)之主體TIL群體，包含例如獲自例如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中所指示之步驟B的TIL群體，可經歷快速第二次擴增(其可包含有時稱為快速擴增方案(REP)之擴增)且接著如下文所論述進行冷凍保存。類似地，在將經遺傳修飾之TIL用於療法的情況下，來自初始第一次擴增之經擴增TIL群體或來自快速第二次擴增之經擴增TIL群體可在擴增步驟之前或在初始第一次擴增之後且在快速第二次擴增之前進行遺傳修飾以用於適合治療。
在一些實施例中，獲自初始第一次擴增(例如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中所指示之步驟B)之TIL經儲存直至進行表型分析用於選擇。在一些實施例中，獲自初始第一次擴增(例如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中所指示之步驟B)之TIL未經儲存且直接進行快速第二次擴增。在一些實施例中，獲自初始第一次擴增之TIL在初始第一次擴增之後且在快速第二次擴增之前未經冷凍保存。在一些實施例中，初始第一次擴增至第二次擴增之轉變在腫瘤碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後約2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至快速第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後約3天至7天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至快速第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後約3天至8天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後約4天至7天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後約4天至8天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後約5天至7天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後約5天至8天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後約6天至7天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後約6天至8天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後約7天至8天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後約7天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後約8天發生。
在一些實施例中，初始第一次擴增至快速第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至快速第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後1天至7天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至快速第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後1天至8天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後2天至7天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後2天至8天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後3天至7天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後3天至8天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至快速第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後4天至7天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至快速第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後4天至8天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至快速第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後5天至7天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至快速第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後5天至8天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至快速第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後6天至7天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至快速第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後6天至8天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至快速第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後7天至8天發生。在一些實施例中，初始第一次擴增至快速第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後7天發生在一些實施例中，初始第一次擴增至快速第二次擴增之轉變在碎斷發生後及/或第一次初始擴增步驟起始後8天發生。
在一些實施例中，TIL在初級第一次擴增之後且在快速第二次擴增之前未經儲存，且TIL直接進行快速第二次擴增(例如在一些實施例中，在如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中所顯示之步驟B至步驟D之轉變期間不進行儲存)。在一些實施例中，轉變在如本文所描述之密閉系統中發生。在一些實施例中，來自初始第一次擴增之TIL，即第二TIL群體，直接進行快速第二次擴增而無轉變期。
在一些實施例中，初始第一次擴增至快速第二次擴增之轉變，例如根據圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟C係在密閉系統生物反應器中進行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器為例如GREX-10或GREX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器為單一生物反應器。在一些實施例中，初始第一次擴增至快速第二次擴增之轉變涉及容器大小之規模縱向擴大。在一些實施例中，與快速第二次擴增相比，初始第一次擴增係在較小容器中進行。在一些實施例中，初始第一次擴增係在GREX-100中進行且快速第二次擴增在GREX-500中進行。 D. 步驟 D ：快速第二次擴增
在一些實施例中，使TIL細胞群體在收集及初始第一次擴增之後，在步驟A及步驟B，以及稱為步驟C之轉變(如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中所指示)之後進一步擴增。此進一步擴增在本文中稱為快速第二次擴增或快速擴增，其可包含在本領域中一般稱為快速擴增程序(快速擴增方案或REP)之擴增程序；以及如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟D中所指示之程序)。該快速第二次擴增一般使用包括多種組分(包含飼養細胞、細胞介素來源、視情況選用之抗生素組分及抗CD3抗體)之培養基在透氣容器中完成。在一些實施例中，在快速第二次擴增起始後1天、2天、3天或4天(亦即，在整體Gen 3程序之第8天、第9天、第10天或第11天)，將TIL轉移至較大體積容器。在一些實施例中，抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。在例示性實施例中，抗生素組分由本文所揭示之任何濃度的萬古黴素組成。
在一些實施例中，TIL之快速第二次擴增(其可包含有時稱為REP之擴增；以及如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟D中所指示之程序)可使用熟習此項技術者已知之任何TIL培養瓶或容器進行。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約1天至約9天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約1天至約10天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約2天至約9天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約2天至約10天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約3天至約9天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約3天至約10天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約4天至約9天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約4天至約10天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約5天至約9天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約5天至約10天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約6天至約9天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約6天至約10天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約7天至約9天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約7天至約10天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約8天至約9天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約8天至約10天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約9天至約10天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約1天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約2天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約3天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約4天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約5天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約6天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約7天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約8天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約9天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可在快速第二次擴增起始後進行約10天。
在一些實施例中，快速第二次擴增可在透氣容器中使用本揭示案之方法(包含例如稱為REP之擴增；以及如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟D中所指示之程序)進行。在一些實施例中，TIL在快速第二次擴增中係在IL-2、抗生素組分、OKT-3及飼養細胞(本文中又稱為「抗原呈現細胞」)存在下擴增。在一些實施例中，TIL在快速第二次擴增中係在IL-2、OKT-3及飼養細胞存在下擴增，其中添加飼養細胞達到最終濃度，該最終濃度為初始第一次擴增中存在之飼養細胞之濃度的兩倍、2.4倍、2.5倍、3倍、3.5倍或4倍。舉例而言，TIL可在介白素-2(IL-2)或介白素-15(IL-15)存在下使用非特異性T細胞受體刺激進行快速擴增。非特異性T細胞受體刺激物可包含例如抗CD3抗體，諸如約30 ng/mL OKT3、小鼠單株抗CD3抗體(可商購自新澤西州拉里坦市的Ortho-McNeil或加利福尼亞州奧本市的Miltenyi Biotech)或UHCT-1(可商購自美國加利福尼亞州聖地亞哥市的BioLegend)。TIL可藉由在第二次擴增期間包含一或多種癌症抗原(包含其抗原部分，諸如抗原決定基)來擴增以在活體外誘導進一步TIL刺激，該等抗原可視情況在T細胞生長因子(諸如300 IU/mL IL-2或IL-15)存在下視情況自載體表現，該載體諸如人類白血球抗原A2(HLA-A2)結合肽，例如0.3 μM MART-1:26-35(27 L)或gpl 00:209-217 (210M)。其他適合抗原可包含例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2，或其抗原部分。TIL亦可藉由用脈衝至表現HLA-A2之抗原呈現細胞上的相同癌症抗原再刺激而快速擴增。替代地，TIL可進一步用例如實例經照射之自體淋巴球或用經照射之HLA-A2+同種異體淋巴球及IL-2再刺激。在一些實施例中，再刺激係作為第二次擴增之一部分發生。在一些實施例中，第二次擴增係在經照射之自體淋巴球或經照射之HLA-A2+同種異體淋巴球及IL-2存在下發生。在一些實施例中，抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。在例示性實施例中，抗生素組分由本文所揭示之任何濃度的萬古黴素組成。
在一些實施例中，細胞培養基進一步包括IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包括約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包括1000至2000 IU/mL、2000至3000 IU/mL、3000至4000 IU/mL、4000至5000 IU/mL、5000至6000 IU/mL、6000至7000 IU/mL、7000至8000 IU/mL、或8000 IU/mL IL-2。
在一些實施例中，細胞培養基包括OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括約30 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括在0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、在1 ng/mL與5 ng/mL之間、在5 ng/mL與10 ng/mL之間、在10 ng/mL與20 ng/mL之間、在20 ng/mL與30 ng/mL之間、在30 ng/mL與40 ng/mL之間、在40 ng/mL與50 ng/mL之間及在50 ng/mL與100 ng/mL之間之OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括在15 ng/mL與30 ng/mL之間之OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括在30 ng/mL與60 ng/mL之間之OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括約30 ng/mL OKT-3。在一些實施例中，細胞培養基包括約60 ng/mL OKT-3。在一些實施例中，OKT-3抗體為莫羅單抗。
在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包括IL-2。在一些實施例中，培養基包括6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包括抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包括每個容器7.5 × 10 8個抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包括OKT-3。在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包括每個容器500 mL培養基及30 µg OKT-3。在一些實施例中，容器為G-REX-100 MCS培養瓶。在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包括6000 IU/mL IL-2、60 ng/mL OKT-3及7.5 × 10 8個抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，培養基包括每個容器500 mL培養基及6000 IU/mL IL-2、30 µg OKT-3及7.5 × 10 8個抗原呈現飼養細胞。
在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包括IL-2。在一些實施例中，培養基包括6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包括抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，培養基包括每個容器在5 × 10 8與7.5 × 10 8個之間的抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包括OKT-3。在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包括每個容器500 mL培養基及30 µg OKT-3。在一些實施例中，容器為G-REX-100 MCS培養瓶。在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包括6000 IU/mL IL-2、60 ng/mL OKT-3及在5 × 10 8與7.5 × 10 8個之間的抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，快速第二次擴增中之培養基包括每個容器500 mL培養基及6000 IU/mL IL-2、30 µg OKT-3及在5 × 10 8與7.5 × 10 8個之間的抗原呈現飼養細胞。
在一些實施例中，細胞培養基在細胞培養基中包括一或多種TNFRSF促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑包括4-1BB促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑為4-1BB促效劑，且該4-1BB促效劑選自由以下組成之群組：烏瑞魯單抗、烏圖木單抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、變體、生物類似物及組合。在一些實施例中，添加的TNFRSF促效劑之濃度足以在細胞培養基中達成在0.1 µg/mL與100 µg/mL之間之濃度。在一些實施例中，添加的TNFRSF促效劑之濃度足以在細胞培養基中達成在20 µg/mL與40 µg/mL之間之濃度。
在一些實施例中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，細胞培養基進一步包括初始濃度為約3000 IU/mL之IL-2及初始濃度為約30 ng/mL之OKT-3抗體，且其中該一或多種TNFRSF促效劑包括4-1BB促效劑。
在一些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第二次擴增期間之組合。在一些實施例中，在第二次擴增期間，包含例如在根據圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)以及本文所描述之步驟D程序期間可包含IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21，以及其任何組合。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在第二次擴增期間之組合。在一些實施例中，在根據圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)以及如本文所描述之步驟D程序期間可包含IL-2、IL-15及IL-21以及其任何組合。
在一些實施例中，第二次擴增可在包括IL-2、OKT-3、抗原呈現飼養細胞且視情況包括TNFRSF促效劑之經補充細胞培養基中進行。在一些實施例中，第二次擴增係在經補充細胞培養基中發生。在一些實施例中，經補充細胞培養基包括IL-2、OKT-3及抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，第二細胞培養基包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC；又稱為抗原呈現飼養細胞)。在一些實施例中，第二次擴增係在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現飼養細胞(亦即，抗原呈現細胞)之細胞培養基中發生。
在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約500 IU/mL IL-15、約400 IU/mL IL-15、約300 IU/mL IL-15、約200 IU/mL IL-15、約180 IU/mL IL-15、約160 IU/mL IL-15、約140 IU/mL IL-15、約120 IU/mL IL-15或約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約500 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約400 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約300 IU/mL IL-15至約100 IU/mL IL-15。在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約200 IU/mL IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包括約180 IU/mL IL-15。在一些實施例中，細胞培養基進一步包括IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包括約180 IU/mL IL-15。
在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約20 IU/mL IL-21、約15 IU/mL IL-21、約12 IU/mL IL-21、約10 IU/mL IL-21、約5 IU/mL IL-21、約4 IU/mL IL-21、約3 IU/mL IL-21、約2 IU/mL IL-21、約1 IU/mL IL-21或約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約20 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約15 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約12 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約10 IU/mL IL-21至約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約5 IU/mL IL-21至約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，第二次擴增培養基包括約2 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包括約1 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包括約0.5 IU/mL IL-21。在一些實施例中，細胞培養基進一步包括IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包括約1 IU/mL IL-21。
在一些實施例中，抗原呈現飼養細胞(APC)為PBMC。在一些實施例中，在快速擴增及/或第二次擴增中TIL與PBMC及/或抗原呈現細胞之比率為約1比10、約1比15、約1比20、約1比25、約1比30、約1比35、約1比40、約1比45、約1比50、約1比75、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400、或約1比500。在一些實施例中，在快速擴增及/或第二次擴增中TIL與PBMC之比率介於1比50與1比300之間。在一些實施例中，在快速擴增及/或第二次擴增中TIL與PBMC之比率介於1比100與1比200之間。
在一些實施例中，REP及/或快速第二次擴增係在培養瓶中進行，其中主體TIL與100倍或200倍過量的不活化飼養細胞、30 ng/mL OKT3抗CD3抗體及6000 IU/mL IL-2混合於150 mL培養基中，其中飼養細胞濃度係初始第一次擴增中之飼養細胞濃度的至少1.1倍(1.1X)、1.2X、1.3X、1.4X、1.5X、1.6X、1.7X、1.8X、1.8X、2X、2.1X、2.2X、2.3X、2.4X、2.5X、2.6X、2.7X、2.8X、2.9X、3.0X、3.1X、3.2X、3.3X、3.4X、3.5X、3.6X、3.7X、3.8X、3.9X或4.0X。更換培養基(一般經由抽吸2/3用過的培養基且用相等體積的新鮮培養基更換來更換2/3培養基)直至細胞轉移至替代生長箱室。替代生長箱室包含G-REX培養瓶及透氣容器，如下文更完整地論述。
在一些實施例中，快速第二次擴增(其可包含稱為REP程序之程序)為7至9天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，第二次擴增為7天。在一些實施例中，第二次擴增為8天。在一些實施例中，第二次擴增為9天。
在一些實施例中，第二次擴增(其可包含稱為REP之擴增，以及在圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟D中提及之擴增)可在500 mL容量的具有100 cm透氣矽底之透氣培養瓶(G-Rex 100，可商購自美國明尼蘇達州新布萊頓市的Wilson Wolf Manufacturing Corporation)中進行，5×10 6或10×10 6個TIL可與PBMC一起在400 mL的補充有5%人類AB血清、3000 IU/mL IL-2及30 ng/ml 抗CD3(OKT3)之50/50培養基中培養。G-REX-100培養瓶可在37℃下於5% CO 2中培育。第5天，可取出250 mL上清液且置放於離心機瓶中且以1500 rpm(491 × g)離心10分鐘。可將TIL沈澱物用150 mL的含有5%人類AB血清、6000 IU/mL IL-2之新鮮培養基再懸浮，且添加回原來的GREX-100培養瓶中。當TIL在G-REX-100培養瓶中連續擴增時，在第10天或第11天可將TIL移至較大培養瓶，諸如GREX-500。細胞可在培養的第14天收集。細胞可在培養的第15天收集。細胞可在培養的第16天收集。在一些實施例中，更換培養基直至細胞轉移至替代生長箱室。在一些實施例中，藉由抽吸用過的培養基且用相等體積的新鮮培養基更換來更換2/3培養基。在一些實施例中，替代生長箱室包含GREX培養瓶及透氣容器，如下文更完整地論述。
在一些實施例中，快速第二次擴增培養基視情況包含抗生素組分。在一些實施例中，抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。在一些實施例中，快速擴增培養基中之抗生素組分與初始第一次擴增培養基中之抗生素組分相同。在其他實施例中，快速擴增培養基中之抗生素組分與初始第一次擴增培養基中之抗生素組分不同。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分包含約100 µg/mL萬古黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約50 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL萬古黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素、約50 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素及約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素、約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素及約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，本文所揭示之擴增程序中使用的培養基為無血清培養基或合成培養基。在一些實施例中，無血清或合成培養基包括基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清替代物。在一些實施例中，無血清或合成培養基用於防止及/或減少部分因含血清培養基之批次間變化所致之實驗變化。
在一些實施例中，無血清或合成培養基包括基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清替代物。在一些實施例中，基礎細胞培養基包含但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無外源物質培養基、杜爾貝科氏改良型伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良型杜爾貝科氏培養基。
在一些實施例中，血清補充劑或血清替代物包含但不限於以下一或多者：CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑、CTS™免疫細胞血清替代物、一或多種白蛋白或白蛋白代用品、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白代用品、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素代用品、一或多種膠原蛋白前驅物、抗生素組分及一或多種微量元素。在一些實施例中，合成培養基包括白蛋白及一或多種選自由以下組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素以及含有微量元素部分Ag +、Al 3+、Ba 2+、Cd 2+、Co 2+、Cr 3+、Ge 4+、Se 4+、Br、T、Mn 2+、P、Si 4+、V 5+、Mo 6+、Ni 2+、Rb +、Sn 2+及Zr 4+之化合物。在一些實施例中，合成培養基進一步包括L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰基乙醇。
在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞免疫細胞血清替代物與習知生長培養基一起使用，該習知生長培養基包含但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CST™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無外源物質培養基、杜爾貝科氏改良型伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良型杜爾貝科氏培養基。
在一些實施例中，無血清或合成培養基中之總血清替代物濃度(vol%)為總無血清或合成培養基之體積的約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或合成培養基之總體積的約3%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或合成培養基之總體積的約5%。在一些實施例中，總血清替代物濃度為無血清或合成培養基之總體積的約10%。
在一些實施例中，無血清或合成培養基為CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1 L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基與26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑之組合，該基礎培養基與該補充劑在使用前混合在一起。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55 mM 2-巰基乙醇。
在一些實施例中，合成培養基為CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1 L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基與26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑之組合，該基礎培養基與該補充劑在使用前混合在一起。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55 mM 2-巰基乙醇。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包括約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55 mM 2-巰基乙醇及2 mM L-麩醯胺酸，且進一步包括約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包括約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55 mM 2-巰基乙醇，且進一步包括約1000 IU/mL至約6000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包括約1000 IU/mL至約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3% CTS™免疫細胞血清替代物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2 mM麩醯胺酸，且進一步包括約6000 IU/mL IL-2。
在一些實施例中，無血清培養基或合成培養基補充有濃度為約0.1 mM至約10 mM、0.5 mM至約9 mM、1 mM至約8 mM、2 mM至約7 mM、3 mM至約6 mM或4 mM至約5 mM之麩醯胺酸(亦即，GlutaMAX®)。在一些實施例中，無血清培養基或合成培養基補充有濃度為約2 mM之麩醯胺酸(亦即，GlutaMAX®)。
在一些實施例中，無血清培養基或合成培養基補充有濃度為約5 mM至約150 mM、10 mM至約140 mM、15 mM至約130 mM、20 mM至約120 mM、25 mM至約110 mM、30 mM至約100 mM、35 mM至約95 mM、40 mM至約90 mM、45 mM至約85 mM、50 mM至約80 mM、55 mM至約75 mM、60 mM至約70 mM或約65 mM之2-巰基乙醇。在一些實施例中，無血清培養基或合成培養基補充有濃度為約55 mM之2-巰基乙醇。
在一些實施例中，以引用之方式併入本文中的國際專利申請公開案第WO 1998/030679號及美國專利申請公開案第US 2002/0076747 A1號中所描述之合成培養基可用於本發明中。在該公開案中，描述無血清真核細胞培養基。無血清真核細胞培養基包含補充有能夠支持細胞在無血清培養物中生長之無血清補充劑的基礎細胞培養基。無血清真核細胞培養基補充劑包括一或多種選自由以下組成之群組的成分，或藉由組合一或多種選自由以下組成之群組的成分而獲得：一或多種白蛋白或白蛋白代用品、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白代用品、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素代用品、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種微量元素及抗生素組分。在一些實施例中，合成培養基進一步包括L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或β-巰基乙醇。在一些實施例中，合成培養基包括白蛋白或白蛋白代用品及一或多種選自由以下組成之群組的成分：一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白代用品、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素代用品、一或多種膠原蛋白前驅物及一或多種微量元素。在一些實施例中，合成培養基包括白蛋白及一或多種選自由以下組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素以及含有微量元素部分Ag +、Al 3+、Ba 2+、Cd 2+、Co 2+、Cr 3+、Ge 4+、Se 4+、Br、T、Mn 2+、P、Si 4+、V 5+、Mo 6+、Ni 2+、Rb +、Sn 2+及Zr 4+之化合物。在一些實施例中，基礎細胞培養基係選自由以下組成之群組：杜爾貝科氏改良型伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良型杜爾貝科氏培養基。
在一些實施例中，合成培養基中甘胺酸之濃度在約5-200 mg/L之範圍內，L-組胺酸之濃度為約5-250 mg/L，L-異白胺酸之濃度為約5-300 mg/L，L-甲硫胺酸之濃度為約5-200 mg/L，L-苯丙胺酸之濃度為約5-400 mg/L，L-脯胺酸之濃度為約1-1000 mg/L，L-羥基脯胺酸之濃度為約1-45 mg/L，L-絲胺酸之濃度為約1-250 mg/L，L-蘇胺酸之濃度為約10-500 mg/L，L-色胺酸之濃度為約2-110 mg/L，L-酪胺酸之濃度為約3-175 mg/L，L-纈胺酸之濃度為約5-500 mg/L，硫胺素之濃度為約1-20 mg/L，還原麩胱甘肽之濃度為約1-20 mg/L，L-抗壞血酸-2-磷酸鹽之濃度為約1-200 mg/L，鐵飽和轉鐵蛋白之濃度為約1-50 mg/L，胰島素之濃度為約1-100 mg/L，亞硒酸鈉之濃度為約0.000001-0.0001 mg/L，且白蛋白(例如AlbuMAX® I)之濃度為約5000-50,000 mg/L。
在一些實施例中，合成培養基中之非微量元素部分成分係以表4中標題「1X培養基中之濃度範圍」欄中列出之濃度範圍存在。在其他實施例中，合成培養基中之非微量元素部分成分係以表4中標題「1X培養基之較佳實施例」欄中列出之最終濃度存在。在其他實施例中，合成培養基為包括無血清補充劑之基礎細胞培養基。在一些此等實施例中，無血清補充劑包括表4中的類型及標題「補充劑之較佳實施例」欄中列出之濃度的非微量部分成分。
在一些實施例中，合成培養基之滲透壓介於約260與350 mOsmol之間。在一些實施例中，滲透壓介於約280與310 mOsmol之間。在一些實施例中，合成培養基補充有至多約3.7 g/L或約2.2 g/L碳酸氫鈉。合成培養基可進一步補充有L-麩醯胺酸(最終濃度為約2 mM)、抗生素組分、非必需胺基酸(NEAA；最終濃度為約100 μM)、2-巰基乙醇(最終濃度為約100 μM)。
在一些實施例中，Smith等人, 《臨床與轉化免疫學》, 4(1), 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31)中所描述之合成培養基可用於本發明中。簡言之，使用RPMI或CTS™ OpTmizer™作為基礎細胞培養基且補充有0、2%、5%或10% CTS™免疫細胞血清替代物。
在一些實施例中，第一透氣容器及/或第二透氣容器中之細胞培養基為未經過濾的。使用未經過濾之細胞培養基可簡化擴增細胞數目所需之程序。在一些實施例中，第一透氣容器及/或第二透氣容器中之細胞培養基缺乏β-巰基乙醇(BME或βME；又稱為2-巰基乙醇，CAS 60-24-2)。
在一些實施例中，進行快速第二次擴增(包含稱為REP之擴增)，且其進一步包括其中選擇具有優良腫瘤反應性之TIL之步驟。可使用本領域中已知之任何選擇方法。舉例而言，可使用美國專利申請公開案第2016/ 0010058 A1號(其揭示內容以引用之方式併入本文中)中所描述之方法選擇具有優良腫瘤反應性之TIL。
視情況，可在快速第二次擴增(包含稱為REP擴增之擴增)之後使用本領域中已知之標準分析來進行細胞存活率分析。舉例而言，可對主體TIL樣本進行錐蟲藍排除分析，錐蟲藍選擇性標記死細胞且允許存活率評定。在一些實施例中，TIL樣本可使用Cellometer K2自動化細胞計數器(馬薩諸塞州勞倫斯市的Nexcelom Bioscience)計數及測定存活率。在一些實施例中，存活率係根據標準Cellometer K2 Image Cytometer自動細胞計數器方案測定。
T淋巴球及B淋巴球之多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段之體細胞重組產生。此等基因區段：V(可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)之結合特異性及下游應用。本發明提供一種用於產生展現且增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施例中，藉由本發明方法獲得之TIL展現T細胞貯庫多樣性增加。在一些實施例中，在第二次擴增中獲得之TIL展現T細胞貯庫多樣性增加。在一些實施例中，多樣性增加係免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性增加。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在於選自由α、β、γ及δ受體組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α及/或β之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)β之表現增加。在一些實施例中，TCRab(亦即，TCRα/β)之表現增加。
在一些實施例中，快速第二次擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包括IL-2、OKT-3以及抗原呈現飼養細胞(APC)，如下文更詳細論述。在一些實施例中，快速第二次擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包括6000 IU/mL IL-2、30微克/培養瓶OKT-3以及7.5 × 10 8個抗原呈現飼養細胞(APC)，如下文更詳細論述。在一些實施例中，快速第二次擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包括IL-2、OKT-3以及抗原呈現飼養細胞(APC)，如下文更詳細論述。在一些實施例中，快速第二次擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包括6000 IU/mL IL-2、30微克/培養瓶OKT-3以及5 × 10 8個抗原呈現飼養細胞(APC)，如下文更詳細論述。
在一些實施例中，快速第二次擴增，例如根據圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟D，係在密閉系統生物反應器中進行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用生物反應器。在一些實施例中，採用生物反應器作為容器。在一些實施例中，所採用的生物反應器為例如G-REX-100或G-REX-500。在一些實施例中，所採用的生物反應器為G-REX-100。在一些實施例中，所採用的生物反應器為G-REX-500。
在一些實施例中，將快速第二次擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器，例如G-REX-100 MCS容器中以小規模培養物培養T細胞約3至7天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(b)實現將小規模培養物中的T細胞轉移至比第一容器要大的第二容器，例如G-REX-500-MCS容器中，並在該第二容器中以較大規模培養物來培養來自小規模培養物之T細胞約4至7天之時段。
在一些實施例中，將快速第二次擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(a)藉由在第一容器，例如G-REX-100 MCS容器中以第一小規模培養物培養T細胞約3至7天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(b)將來自第一小規模培養物之T細胞轉移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小與第一容器相同的第二容器之中，其中在各第二容器中，將轉移至此類第二容器的來自第一小規模培養物之T細胞部分以第二小規模培養物培養約4至7天之時段。
在一些實施例中，將第一小規模TIL培養物分配成複數個約2至5個TIL亞群。
在一些實施例中，將快速第二次擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器，例如G-REX-100 MCS容器中以小規模培養物培養TIL約3至7天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(b)將來自小規模培養物之TIL轉移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器要大的第二容器，例如G-REX-500MCS容器之中，其中在各第二容器中，將轉移至此類第二容器的來自小規模培養物之TIL部分以較大規模培養物培養約4至7天之時段。
在一些實施例中，將快速第二次擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器，例如G-REX-100 MCS容器中以小規模培養物培養TIL約5天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(b)將來自小規模培養物之T細胞轉移且分配至2、3或4個大小比第一容器要大的第二容器，例如G-REX-500 MCS容器之中，其中在各第二容器中，將轉移至此類第二容器的來自小規模培養物之TIL部分以較大規模培養物培養約6天之時段。
在一些實施例中，在快速第二次擴增分瓶時，各第二容器包括至少10 8個TIL。在一些實施例中，在快速或第二次擴增分瓶時，各第二容器包括至少10 8個TIL、至少10 9個TIL或至少10 10個TIL。在一個例示性實施例中，各第二容器包括至少10 10個TIL。
在一些實施例中，將第一小規模TIL培養物分配成複數個亞群。在一些實施例中，將第一小規模TIL培養物分配成複數個約2至5個亞群。在一些實施例中，將第一小規模TIL培養物分配成複數個約2、3、4或5個亞群。
在一些實施例中，在完成快速第二次擴增後，該複數個亞群包括治療有效量之TIL。在一些實施例中，在完成快速或第二次擴增後，將一或多個TIL亞群彙集在一起以產生治療有效量之TIL。在一些實施例中，在完成快速擴增後，每個TIL亞群包括治療有效量之TIL。
在一些實施例中，在分成複數個步驟之前，將快速第二次擴增進行約3至7天之時段。在一些實施例中，快速第二次擴增之分瓶係在快速或第二次擴增起始後約第3天、第4天、第5天、第6天第7天發生。
在一些實施例中，快速第二次擴增之分瓶係在第一次擴增(亦即，pre-REP擴增)起始後約第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天或第16天、第17天或第18天發生。在一個例示性實施例中，快速或第二次擴增之分瓶係在第一次擴增起始後約第16天發生。
在一些實施例中，在分瓶之後，快速第二次擴增進一步進行約7至11天之時段。在一些實施例中，該快速第二次擴增在分瓶之後進一步進行約5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天之時段。
在一些實施例中，用於分瓶前快速第二次擴增之細胞培養基包括與用於分瓶後快速第二次擴增之細胞培養基相同的組分。在一些實施例中，用於分瓶前快速第二次擴增之細胞培養基包括與用於分瓶後快速第二次擴增之細胞培養基不同的組分。
在一些實施例中，用於分瓶前快速第二次擴增之細胞培養基包括含IL-2、視情況選用之OKT-3且進一步視情況包括APC。在一些實施例中，用於分瓶前快速第二次擴增之細胞培養基包括IL-2、OKT-3及進一步視情況選用之APC。在一些實施例中，用於分瓶前快速第二次擴增之細胞培養基包括IL-2、OKT-3及APC。
在一些實施例中，用於分瓶前快速第二次擴增之細胞培養基係藉由用包括IL-2、視情況選用之OKT-3及進一步視情況選用之APC的新鮮培養基補充第一次擴增中之細胞培養基來產生。在一些實施例中，用於分瓶前快速第二次擴增之細胞培養基係藉由用包括IL-2、OKT-3及APC之新鮮培養基補充第一次擴增中之細胞培養基來產生。在一些實施例中，用於分瓶前快速第二次擴增之細胞培養基係藉由用包括IL-2、視情況選用之OKT-3及進一步視情況選用之APC的新鮮細胞培養基替換第一次擴增中之細胞培養基來產生。在一些實施例中，用於分瓶前快速第二次擴增之細胞培養基係藉由用包括IL-2、OKT-3及APC之新鮮細胞培養基替換第一次擴增中之細胞培養基來產生。
在一些實施例中，用於分瓶後快速第二次擴增之細胞培養基包括IL-2及視情況選用之OKT-3。在一些實施例中，用於分瓶後快速第二次擴增之細胞培養基包括IL-2及OKT-3。在一些實施例中，用於分瓶後快速第二次擴增之細胞培養基係藉由用包括IL-2及視情況選用之OKT-3的新鮮培養基替換用於分瓶前快速第二次擴增之細胞培養基來產生。在一些實施例中，用於分瓶後快速第二次擴增之細胞培養基係藉由用包括IL-2及OKT-3之新鮮細胞培養基替換用於分瓶前快速第二次擴增之細胞培養基來產生。 1. 飼養細胞及抗原呈現細胞
在一些實施例中，本文所描述之快速第二次擴增程序(例如包含如下擴增，諸如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟D中所描述之擴增，以及稱為REP之擴增)在REP TIL擴增期間及/或在快速第二次擴增期間需要過量之飼養細胞。在許多實施例中，飼養細胞係獲自健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC係使用標準方法，諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。
一般而言，同種異體PBMC經由照射或熱處理而不活化，且如實例中所描述用於REP程序中，其提供用於評估經照射同種異體PBMC之無複製能力的例示性方案。
在一些實施例中，若第7天或第14天活細胞總數小於在REP第0天及/或第二次擴增第0天(亦即，第二次擴增之起始日)放入培養物中的初始活細胞數目，則認為PBMC無複製能力且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。
在一些實施例中，若第7天及第14天在OKT3及IL-2存在下培養的活細胞總數與在REP第0天及/或第二次擴增第0天(亦即，第二次擴增之起始日)放入培養物中的初始活細胞數目相比並未增加，則認為PBMC無複製能力且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC係在30 ng/mL OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC係在60 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/mLlIL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC係在60 ng/mL OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC係在30 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下培養。
在一些實施例中，若第7天及第14天在OKT3及IL-2存在下培養的活細胞總數與在REP第0天及/或第二次擴增第0天(亦即，第二次擴增之起始日)放入培養物中的初始活細胞數目相比並未增加，則認為PBMC無複製能力且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC係在30-60 ng/mL OKT3抗體及1000至6000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC係在30-60 ng/mL OKT3抗體及2000-5000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC係在30-60 ng/mL OKT3抗體及2000-4000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC係在30-60 ng/mL OKT3抗體及2500-3500 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30-60 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下培養。
在一些實施例中，抗原呈現飼養細胞為PBMC。在一些實施例中，抗原呈現飼養細胞為人工抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，第二次擴增中TIL與抗原呈現飼養細胞之比率為約1比10、約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一些實施例中，在第二次擴增中TIL與抗原呈現飼養細胞之比率介於1比50與1比300之間。在一些實施例中，在第二次擴增中TIL與抗原呈現飼養細胞之比率介於1比100與1比200之間。
在一些實施例中，本文所描述之第二次擴增程序需要約5 × 10 8個飼養細胞比約100 × 10 6個TIL之比率。在一些實施例中，本文所描述之第二次擴增程序需要約7.5 × 10 8個飼養細胞比約100 × 10 6個TIL之比率。在一些實施例中，本文所描述之第二次擴增程序需要約5 × 10 8個飼養細胞比約50 × 10 6個TIL之比率。在一些實施例中，本文所描述之第二次擴增程序需要約7.5 × 10 8個飼養細胞比約50 × 10 6個TIL之比率。在又一實施例中，本文所描述之第二次擴增程序需要約5 × 10 8個飼養細胞比約25 × 10 6個TIL。在又一實施例中，本文所描述之第二次擴增程序需要約7.5 × 10 8個飼養細胞與約25 × 10 6個TIL。在又一實施例中，快速第二次擴增需要快速第二次擴增的兩倍數目的飼養細胞。在又一實施例中，當本文所描述之初始第一次擴增需要約2.5 × 10 8個飼養細胞時，快速第二次擴增需要約5 × 10 8個飼養細胞。在又一實施例中，當本文所描述之初始第一次擴增需要約2.5 × 10 8個飼養細胞時，快速第二次擴增需要約7.5 × 10 8個飼養細胞。在又一實施例中，快速第二次擴增需要初始第一次擴增的兩倍(2.0X)、2.5X、3.0X、3.5X或4.0X數目的飼養細胞。
在一些實施例中，本文所描述之快速第二次擴增程序在快速第二次擴增期間需要過量的飼養細胞。在許多實施例中，飼養細胞係獲自同種異體健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC係使用標準方法，諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一些實施例中，使用人工抗原呈現細胞(aAPC)代替PBMC。在一些實施例中，PBMC係以添加至初始第一次擴增之PBMC濃度的兩倍添加至快速第二次擴增。
一般而言，同種異體PBMC經由照射或熱處理而不活化，且用於本文所描述之TIL擴增程序，包含圖式及實例中所描述之例示性程序。
在一些實施例中，快速第二次擴增中使用人工抗原呈現細胞來代替PBMC或與PBMC組合使用。 2. 細胞介素及其他添加劑
如本領域中已知，本文所描述之第二次擴增方法一般使用具有高劑量細胞介素，尤其是IL-2的培養基。
替代地，使用細胞介素之組合進行TIL之快速第二次擴增亦為可能的，如美國專利申請公開案第US 2017/0107490 A1號中所描述，使用IL-2、IL-15及IL-21中兩種或多於兩種的組合，該案揭示內容以引用之方式併入本文中。因此，可能的組合包含IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於產生淋巴球，且特別是如其中所描述的T細胞。
在一些實施例中，步驟D(特別是來自例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)亦可包含將OKT-3抗體或莫羅單抗添加至培養基中，如本文別處所描述。在一些實施例中，步驟D亦可包含向培養基中添加4-1BB促效劑，如本文別處所描述。在一些實施例中，步驟D(特別是來自例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)亦可包含將OX-40促效劑添加至培養基中，如本文別處所描述。此外，可在步驟D(特別是來自例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)期間在培養基中使用添加劑，諸如過氧物酶體增殖物活化受體γ共活化劑I-α促效劑，包含增殖物活化受體(PPAR)-γ促效劑，諸如噻唑啶二酮化合物，如在美國專利申請公開案第US 2019/0307796 A1號中所描述，其揭示內容以引用的方式併入本文中。 3. 抗生素
本文所描述之快速第二次擴增方法一般使用包含抗生素組分之培養基。在一些實施例中，快速第二次擴增中之抗生素組分與初始第一次擴增中之抗生素組分相同。在其他實施例中，快速第二次擴增中之抗生素組分與初始第一次擴增中之抗生素組分不同。
在一些實施例中，抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約100 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分包含約100 µg/mL萬古黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素。在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL萬古黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素、約100 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素及約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素、約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素及約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。 E. 步驟 E ：收集 TIL
在快速第二次擴增步驟之後，可收集細胞。在一些實施例中，在例如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中所提供之一、二、三、四個或更多個擴增步驟之後收集TIL。在一些實施例中，在例如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中所提供之兩個擴增步驟之後收集TIL。在一些實施例中，在例如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中所提供之兩個擴增步驟，即一個初始第一次擴增及一個快速第二次擴增之後收集TIL。
可以任何適當且無菌之方式，包含例如藉由離心，收集TIL。用於收集TIL之方法為本領域中熟知的且任何此類已知方法均可與本發明程序一起使用。在一些實施例中，使用自動化系統收集TIL。
細胞收集器及/或細胞處理系統可購自各種來源，包含例如Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer及Inotech Biosystems International, Inc.。本發明方法可採用任何基於細胞之收集器。在一些實施例中，細胞收集器及/或細胞處理系統為基於膜之細胞收集器。在一些實施例中，細胞收集係經由細胞處理系統，諸如LOVO系統(由Fresenius Kabi製造)進行。術語「LOVO細胞處理系統」亦係指由任何供應商製造之任何可在無菌及/或密閉系統環境中將包括細胞之溶液泵送通過膜或過濾器(諸如旋轉膜或旋轉過濾器)的儀器或裝置，從而允許連續流動及細胞處理以移除上清液或細胞培養基而不發生沈澱。在一些實施例中，細胞收集器及/或細胞處理系統可在密閉無菌系統中進行細胞分離、洗滌、流體交換、濃縮及/或其他細胞處理步驟。
在一些實施例中，快速第二次擴增，例如根據圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟D，係在密閉系統生物反應器中進行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用生物反應器。在一些實施例中，採用生物反應器作為容器。在一些實施例中，所採用的生物反應器為例如G-REX-100或G-REX-500。在一些實施例中，所採用的生物反應器為G-REX-100。在一些實施例中，所採用的生物反應器為G-REX-500。
在一些實施例中，根據圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟E係根據本文中所描述之程序進行。在一些實施例中，密閉系統係在無菌條件下經由注射器接取以維持系統之無菌性及密閉性質。在一些實施例中，採用如本文所描述之密閉系統。
在一些實施例中，根據本文所描述之方法收集TIL。在一些實施例中，使用如本文所描述之方法收集在第14天與第16天之間的TIL。在一些實施例中，使用如本文所描述之方法在第14天收集TIL。在一些實施例中，使用如本文所描述之方法在第15天收集TIL。在一些實施例中，使用如本文所描述之方法在第16天收集TIL。 F. 步驟 F ：最終調配及轉移至輸注容器
在如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中以例示性次序提供且如上文及本文中所概述之步驟A至步驟E完成之後，將細胞轉移至容器中以用於向患者投與，諸如輸注袋或無菌小瓶。在一些實施例中，在使用上文所描述之擴增方法獲得治療足夠數目之TIL後，立即將其轉移至容器中以用於向患者投與。
在一些實施例中，使用本揭示案之方法擴增之TIL係以醫藥組成物之形式投與患者。在一些實施例中，醫藥組成物為TIL於無菌緩衝液中之懸浮液。本文所揭示擴增之TIL可藉由如本領域中已知之任何適合途徑投與。在一些實施例中，TIL係以單一動脈內或靜脈內輸注之形式投與，其較佳持續大約30至60分鐘。其他適合之投與途徑包含腹膜內、鞘內及淋巴管內投與。 X. 其他 Gen 2 、 Gen 3 及其他 TIL 製造程序 實施例 A. PBMC 飼養細胞比
在一些實施例中，用於本文所描述之擴增方法(參見例如圖8(特別是例如圖8A及/或圖B及/或圖8C及/或圖8D))中的培養基包含抗CD3抗體，例如OKT-3。抗CD3抗體與IL-2之組合在TIL群體中誘導T細胞活化及細胞分裂。此效應可見於全長抗體以及Fab及F(ab')2片段，前者一般較佳；參見例如Tsoukas等人, 《免疫學雜誌》1985, 135, 1719，特此以全文引用之方式併入。
在一些實施例中，PBMC飼養細胞層之數目係如下計算： A. T細胞體積(直徑10 µm)： V= (4/3) πr 3=523.6 µm 3B. 具有40 µm(4個細胞)高度之G-REX-100(M)管柱： V= (4/3) πr 3= 4×10 12µm 3C. 填滿管柱B所需的細胞數目：4×10 12µm 3/523.6 µm 3= 7.6×10 8µm 3* 0.64 = 4.86×10 8D. 可在4D空間中最佳地活化的細胞數目：4.86×10 8/24 = 20.25×10 6E. 外推至G-REX-500之飼養細胞及TIL的數目：TIL：100×10 6及飼養細胞：2.5×10 9
在此計算中，使用在具有100 cm 2基底的圓柱體中提供TIL活化之二十面體幾何學所需的單核細胞近似數目。計算導出的T細胞臨界值活化之實驗結果為約5×10 8，其與NCI實驗資料密切相關，如Jin等人, 《免疫療法雜誌》2012, 35,283-292。在(C)中，乘數(0.64)係等效球體的隨機填充密度，由Jaeger及Nagel, 《科學( Science)》, 1992, 255, 1523-3計算得出。在(D)中，除數24係4維空間中可接觸類似物體的等效球體的數目或「牛頓數(Newton number)」，如Musin, 《俄羅斯數學調查( Russ.Math.Surv.)》 ,2003, 58,794-795中所描述。
在一些實施例中，在初始第一次擴增期間外源供應的抗原呈現飼養細胞數目大約為在快速第二次擴增期間外源供應的抗原呈現飼養細胞數目的一半。在某些實施例中，該方法包括在包括比快速第二次擴增之細胞培養基少大約50%之抗原呈現細胞的細胞培養基中進行初始第一次擴增。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的抗原呈現飼養細胞(APC)數目大於在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約20:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約10:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約9:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約8:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約7:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約6:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約5:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約4:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約3:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約2.9:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約2.8:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約2.7:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約2.6:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約2.5:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約2.4:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約2.3:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約2.2:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約2.1:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約2:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約2:1至或至約10:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約2:1至或至約5:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約2:1至或至約4:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約2:1至或至約3:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約2:1至或至約2.9:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約2:1至或至約2.8:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約2:1至或至約2.7:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約2:1至或至約2.6:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約2:1至或至約2.5:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約2:1至或至約2.4:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約2:1至或至約2.3:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約2:1至或至約2.2:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係選自在或在約2:1至或至約2.1:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係或係約2:1。
在其他實施例中，在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目與在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目之比率係或係約1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在其他實施例中，在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目係或係約1×10 8、1.1×10 8、1.2×10 8、1.3×10 8、1.4×10 8、1.5×10 8、1.6×10 8、1.7×10 8、1.8×10 8、1.9×10 8、2×10 8、2.1×10 8、2.2×10 8、2.3×10 8、2.4×10 8、2.5×10 8、2.6×10 8、2.7×10 8、2.8×10 8、2.9×10 8、3×10 8、3.1×10 8、3.2×10 8、3.3×10 8、3.4×10 8或3.5×10 8個APC，且在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目係或係約3.5×10 8、3.6×10 8、3.7×10 8、3.8×10 8、3.9×10 8、4×10 8、4.1×10 8、4.2×10 8、4.3×10 8、4.4×10 8、4.5×10 8、4.6×10 8、4.7×10 8、4.8×10 8、4.9×10 8、5×10 8、5.1×10 8、5.2×10 8、5.3×10 8、5.4×10 8、5.5×10 8、5.6×10 8、5.7×10 8、5.8×10 8、5.9×10 8、6×10 8、6.1×10 8、6.2×10 8、6.3×10 8、6.4×10 8、6.5×10 8、6.6×10 8、6.7×10 8、6.8×10 8、6.9×10 8、7×10 8、7.1×10 8、7.2×10 8、7.3×10 8、7.4×10 8、7.5×10 8、7.6×10 8、7.7×10 8、7.8×10 8、7.9×10 8、8×10 8、8.1×10 8、8.2×10 8、8.3×10 8、8.4×10 8、8.5×10 8、8.6×10 8、8.7×10 8、8.8×10 8、8.9×10 8、9×10 8、9.1×10 8、9.2×10 8、9.3×10 8、9.4×10 8、9.5×10 8、9.6×10 8、9.7×10 8、9.8×10 8、9.9×10 8或1×10 9個APC。
在其他實施例中，在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目係選自在或在約1.5×10 8個APC至或至約3×10 8個APC的範圍，且在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目係選自在或在約4×10 8個APC至或至約7.5×10 8個APC的範圍。
在其他實施例中，在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目係選自在或在約2×10 8個APC至或至約2.5×10 8個APC的範圍，且在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目係選自在或在約4.5×10 8個APC至或至約5.5×10 8個APC的範圍。
在其他實施例中，在初始第一次擴增期間外源供應的APC數目係或係約2.5×10 8個APC，且在快速第二次擴增期間外源供應的APC數目係或係約5×10 8個APC。
在一些實施例中，在初始第一次擴增第0天添加的APC(包含例如PBMC)數目係在初始第一次擴增第7天(例如該方法之第7天)添加的PBMC數目的大約一半。在某些實施例中，該方法包括在初始第一次擴增第0天將抗原呈現細胞添加至第一TIL群體中且在第7天將抗原呈現細胞添加至第二TIL群體中，其中在第0天添加之抗原呈現細胞的數目係在初始第一次擴增第7天(例如該方法之第7天)添加之抗原呈現細胞數目的大約50%。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目大於在初始第一次擴增第0天外源供應的PBMC數目。
在其他實施例中，在初始第一次擴增中外源供應的APC係以選自在或在約1.0×10 6個APC/cm 2至或至約4.5×10 6個APC/cm 2的範圍之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在初始第一次擴增中外源供應的APC係以選自在或在約1.5×10 6個APC/cm 2至或至約3.5×10 6個APC/cm 2的範圍之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在初始第一次擴增中外源供應的APC係以選自在或在約2×10 6個APC/cm 2至或至約3×10 6個APC/cm 2的範圍之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在初始第一次擴增中外源供應的APC係或係約2×10 6個APC/cm 2之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在初始第一次擴增中外源供應的APC係或係約1.0×10 6、1.1×10 6、1.2×10 6、1.3×10 6、1.4×10 6、1.5×10 6、1.6×10 6、1.7×10 6、1.8×10 6、1.9×10 6、2×10 6、2.1×10 6、2.2×10 6、2.3×10 6、2.4×10 6、2.5×10 6、2.6×10 6、2.7×10 6、2.8×10 6、2.9×10 6、3×10 6、3.1×10 6、3.2×10 6、3.3×10 6、3.4×10 6、3.5×10 6、3.6×10 6、3.7×10 6、3.8×10 6、3.9×10 6、4×10 6、4.1×10 6、4.2×10 6、4.3×10 6、4.4×10 6或4.5×10 6個APC/cm 2之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在快速第二次擴增中外源供應的APC係以選自在或在約2.5×10 6個APC/cm 2至或至約7.5×10 6個APC/cm 2的範圍之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在快速第二次擴增中外源供應的APC係以選自在或在約3.5×10 6個APC/cm 2至或至約6.0×10 6個APC/cm 2的範圍之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在快速第二次擴增中外源供應的APC係以選自在或在約4.0×10 6個APC/cm 2至或至約5.5×10 6個APC/cm 2的範圍之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在快速第二次擴增中外源供應的APC係以選自在或在約4.0×10 6個APC/cm 2的範圍之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在快速第二次擴增中外源供應的APC係或係約2.5×10 6個APC/cm 2、2.6×10 6個APC/cm 2、2.7×10 6個APC/cm 2、2.8×10 6、2.9×10 6、3×10 6、3.1×10 6、3.2×10 6、3.3×10 6、3.4×10 6、3.5×10 6、3.6×10 6、3.7×10 6、3.8×10 6、3.9×10 6、4×10 6、4.1×10 6、4.2×10 6、4.3×10 6、4.4×10 6、4.5×10 6、4.6×10 6、4.7×10 6、4.8×10 6、4.9×10 6、5×10 6、5.1×10 6、5.2×10 6、5.3×10 6、5.4×10 6、5.5×10 6、5.6×10 6、5.7×10 6、5.8×10 6、5.9×10 6、6×10 6、6.1×10 6、6.2×10 6、6.3×10 6、6.4×10 6、6.5×10 6、6.6×10 6、6.7×10 6、6.8×10 6、6.9×10 6、7×10 6、7.1×10 6、7.2×10 6、7.3×10 6、7.4×10 6或7.5×10 6個APC/cm 2之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在初始第一次擴增中外源供應的APC係以或以約1.0×10 6、1.1×10 6、1.2×10 6、1.3×10 6、1.4×10 6、1.5×10 6、1.6×10 6、1.7×10 6、1.8×10 6、1.9×10 6、2×10 6、2.1×10 6、2.2×10 6、2.3×10 6、2.4×10 6、2.5×10 6、2.6×10 6、2.7×10 6、2.8×10 6、2.9×10 6、3×10 6、3.1×10 6、3.2×10 6、3.3×10 6、3.4×10 6、3.5×10 6、3.6×10 6、3.7×10 6、3.8×10 6、3.9×10 6、4×10 6、4.1×10 6、4.2×10 6、4.3×10 6、4.4×10 6或4.5×10 6個APC/cm 2之密度接種於培養瓶中，且在快速第二次擴增中外源供應的APC係以或以約2.5×10 6個APC/cm 2、2.6×10 6個APC/ cm 2、2.7×10 6個APC/cm 2、2.8×10 6、2.9×10 6、3×10 6、3.1×10 6、3.2×10 6、3.3×10 6、3.4×10 6、3.5×10 6、3.6×10 6、3.7×10 6、3.8×10 6、3.9×10 6、4×10 6、4.1×10 6、4.2×10 6、4.3×10 6、4.4×10 6、4.5×10 6、4.6×10 6、4.7×10 6、4.8×10 6、4.9×10 6、5×10 6、5.1×10 6、5.2×10 6、5.3×10 6、5.4×10 6、5.5×10 6、5.6×10 6、5.7×10 6、5.8×10 6、5.9×10 6、6×10 6、6.1×10 6、6.2×10 6、6.3×10 6、6.4×10 6、6.5×10 6、6.6×10 6、6.7×10 6、6.8×10 6、6.9×10 6、7×10 6、7.1×10 6、7.2×10 6、7.3×10 6、7.4×10 6或7.5×10 6個APC/cm 2之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在初始第一次擴增中外源供應的APC係以選自在或在約1.0×10 6個APC/cm 2至或至約4.5×10 6個APC/cm 2的範圍之密度接種於培養瓶中，且在快速第二次擴增中外源供應的APC係以選自在或在約2.5×10 6個APC/cm 2至或至約7.5×10 6個APC/cm 2的範圍之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在初始第一次擴增中外源供應的APC係以選自在或在約1.5×10 6個APC/cm 2至或至約3.5×10 6個APC/cm 2的範圍之密度接種於培養瓶中，且在快速第二次擴增中外源供應的APC係以選自在或在約3.5×10 6個APC/cm 2至或至約6×10 6個APC/cm 2的範圍之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在初始第一次擴增中外源供應的APC係以選自在或在約2×10 6個APC/cm 2至或至約3×10 6個APC/cm 2的範圍之密度接種於培養瓶中，且在快速第二次擴增中外源供應的APC係以選自在或在約4×10 6個APC/cm 2至或至約5.5×10 6個APC/cm 2的範圍之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在初始第一次擴增中外源供應的APC係以剛好或大約2×10 6個APC/cm 2之密度接種於培養瓶中，且在快速第二次擴增中外源供應的APC係以剛好或大約4×10 6個APC/cm 2之密度接種於培養瓶中。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的PBMC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約20:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的PBMC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約10:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的PBMC數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約9:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約8:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約7:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約6:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約5:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約4:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約3:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約2.9:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約2.8:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約2.7:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約2.6:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約2.5:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約2.4:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約2.3:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約2.2:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約2.1:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約1.1:1至或至約2:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約2:1至或至約10:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約2:1至或至約5:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約2:1至或至約4:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約2:1至或至約3:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約2:1至或至約2.9:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約2:1至或至約2.8:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約2:1至或至約2.7:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約2:1至或至約2.6:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約2:1至或至約2.5:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約2:1至或至約2.4:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約2:1至或至約2.3:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約2:1至或至約2.2:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係選自在或在約2:1至或至約2.1:1的範圍。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係或係約2:1。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目與在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目之比率係或係約1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在其他實施例中，在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係或係約1×10 8、1.1×10 8、1.2×10 8、1.3×10 8、1.4×10 8、1.5×10 8、1.6×10 8、1.7×10 8、1.8×10 8、1.9×10 8、2×10 8、2.1×10 8、2.2×10 8、2.3×10 8、2.4×10 8、2.5×10 8、2.6×10 8、2.7×10 8、2.8×10 8、2.9×10 8、3×10 8、3.1×10 8、3.2×10 8、3.3×10 8、3.4×10 8或3.5×10 8個APC(包含例如PBMC)，且在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係或係約3.5×10 8、3.6×10 8、3.7×10 8、3.8×10 8、3.9×10 8、4×10 8、4.1×10 8、4.2×10 8、4.3×10 8、4.4×10 8、4.5×10 8、4.6×10 8、4.7×10 8、4.8×10 8、4.9×10 8、5×10 8、5.1×10 8、5.2×10 8、5.3×10 8、5.4×10 8、5.5×10 8、5.6×10 8、5.7×10 8、5.8×10 8、5.9×10 8、6×10 8、6.1×10 8、6.2×10 8、6.3×10 8、6.4×10 8、6.5×10 8、6.6×10 8、6.7×10 8、6.8×10 8、6.9×10 8、7×10 8、7.1×10 8、7.2×10 8、7.3×10 8、7.4×10 8、7.5×10 8、7.6×10 8、7.7×10 8、7.8×10 8、7.9×10 8、8×10 8、8.1×10 8、8.2×10 8、8.3×10 8、8.4×10 8、8.5×10 8、8.6×10 8、8.7×10 8、8.8×10 8、8.9×10 8、9×10 8、9.1×10 8、9.2×10 8、9.3×10 8、9.4×10 8、9.5×10 8、9.6×10 8、9.7×10 8、9.8×10 8、9.9×10 8或1×10 9個APC(包含例如PBMC)。
在其他實施例中，在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係選自在或在約1×10 8個APC(包含例如PBMC)至或至約3.5×10 8個APC(包含例如PBMC)的範圍，且在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係選自在或在約3.5×10 8個APC(包含例如PBMC)至或至約1×10 9個APC(包含例如PBMC)的範圍。
在其他實施例中，在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係選自在或在約1.5×10 8個APC至或至約3×10 8個APC(包含例如PBMC)的範圍，且在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係選自在或在約4×10 8個APC(包含例如PBMC)至或至約7.5×10 8個APC(包含例如PBMC)的範圍。
在其他實施例中，在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係選自在或在約2×10 8個APC(包含例如PBMC)至或至約2.5×10 8個APC(包含例如PBMC)的範圍，且在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係選自在或在約4.5×10 8個APC(包含例如PBMC)至或至約5.5×10 8個APC(包含例如PBMC)的範圍。
在其他實施例中，在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係或係約2.5×10 8個APC(包含例如PBMC)，且在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)數目係或係約5×10 8個APC(包含例如PBMC)。
在一些實施例中，在初始第一次擴增第0天添加的APC(包含例如PBMC)層數係在快速第二次擴增第7天添加的APC(包含例如PBMC)層數的大約一半。在某些實施例中，該方法包括在初始第一次擴增第0天將抗原呈現細胞層添加至第一TIL群體中且在第7天獎抗原呈現細胞層添加至第二TIL群體中，其中在第0天添加之抗原呈現細胞層之數目係在第7天添加之抗原呈現細胞層之數目的大約50%。
在其他實施例中，在快速第二次擴增第7天外源供應的APC(包含例如PBMC)層數大於在初始第一次擴增第0天外源供應的APC(包含例如PBMC)層數。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在平均厚度為或為約2個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在平均厚度為或為約4個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在平均厚度為或為約一個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在平均厚度為或為約3個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在平均厚度為或為約1.5個細胞層至或至約2.5個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在平均厚度為或為約3個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在平均厚度為或為約一個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在平均厚度為或為約2個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在平均厚度為或為約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在平均厚度為或為約3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在平均厚度為或為約1個細胞層至或至約2個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在平均厚度為或為約3個細胞層至或至約10個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在平均厚度為或為約2個細胞層至或至約3個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在平均厚度為或為約4個細胞層至或至約8個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在平均厚度為或為約2個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在平均厚度為或為約4個細胞層至或至約8個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在平均厚度為或為約1、2或3個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在平均厚度為或為約3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自在或在約1:1.1至或至約1:10的範圍。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自在或在約1:1.1至或至約1:8的範圍。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自在或在約1:1.1至或至約1:7的範圍。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自在或在約1:1.1至或至約1:6的範圍。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自在或在約1:1.1至或至約1:5的範圍。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自在或在約1:1.1至或至約1:4的範圍。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自在或在約1:1.1至或至約1:3的範圍。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自在或在約1:1.1至或至約1:2的範圍。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自在或在約1:1.2至或至約1:8的範圍。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自在或在約1:1.3至或至約1:7的範圍。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自在或在約1:1.4至或至約1:6的範圍。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自在或在約1:1.5至或至約1:5的範圍。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自在或在約1:1.6至或至約1:4的範圍。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自在或在約1:1.7至或至約1:3.5的範圍。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自在或在約1:1.8至或至約1:3的範圍。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自在或在約1:1.9至或至約1:2.5的範圍。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係或係約1:2。
在其他實施例中，初始第一次擴增的第0天係在具有等於第一APC(包含例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，且快速第二次擴增的第7天係在具有等於第二APC(包含例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包含例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包含例如PBMC)層數與第二APC(包含例如PBMC)層數之比率係選自在或在約1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。
在一些實施例中，初始第一次擴增中之APC數目係選自約1.0×10 6個APC/cm 2至約4.5×10 6個APC/cm 2的範圍，且快速第二次擴增中之APC數目係選自約2.5×10 6個APC/cm 2至約7.5×10 6個APC/cm 2的範圍。
在一些實施例中，初始第一次擴增中之APC數目係選自約1.5×10 6個APC/cm 2至約3.5×10 6個APC/cm 2的範圍，且快速第二次擴增中之APC數目係選自約3.5×10 6個APC/cm 2至約6.0×10 6個APC/cm 2的範圍。
在一些實施例中，初始第一次擴增中之APC數目係選自約2.0×10 6個APC/cm 2至約3.0×10 6個APC/cm 2的範圍，且快速第二次擴增中之APC數目係選自約4.0×10 6個APC/cm 2至約5.5×10 6個APC/cm 2的範圍。 B. 視情況選用之 細胞培養基組分 1.抗CD3抗體
在一些實施例中，本文所描述之擴增方法(參見例如圖1及圖8(特別是例如圖8B))中使用的培養基包含抗CD3抗體。抗CD3抗體與IL-2之組合在TIL群體中誘導T細胞活化及細胞分裂。此效應可見於全長抗體以及Fab及F(ab')2片段，前者一般較佳；參見例如Tsoukas等人, 《免疫學雜誌》1985, 135, 1719，特此以全文引用之方式併入。
如本領域中熟習此項技術者將瞭解，一些適合的抗人類CD3抗體可用於本發明，包含來自各種哺乳動物之抗人類CD3多株及單株抗體，包含但不限於鼠類、人類、靈長類動物、大鼠及犬科動物抗體。在一些實施例中，使用OKT3抗CD3抗體莫羅單抗(可購自新澤西州拉里坦市的Ortho-McNeil或加利福尼亞州奧本市的Miltenyi Biotech)。參見表1。
如本領域中熟習此項技術者將瞭解，一些適合的抗人類CD3抗體可用於本發明，包含來自各種哺乳動物之抗人類CD3多株及單株抗體，包含但不限於鼠類、人類、靈長類動物、大鼠及犬科動物抗體。在一些實施例中，使用OKT3抗CD3抗體莫羅單抗(可購自新澤西州拉里坦市的Ortho-McNeil或加利福尼亞州奧本市的Miltenyi Biotech)。 2.4-1BB(CD137)促效劑
在一些實施例中，初始第一次擴增及/或快速第二次擴增之細胞培養基包括TNFRSF促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑為4-1BB(CD137)促效劑。4-1BB促效劑可為本領域中已知之任何4-1BB結合分子。4-1BB結合分子可為能夠與人類或哺乳動物4-1BB結合之單株抗體或融合蛋白。4-1BB促效劑或4-1BB結合分子可包括免疫球蛋白分子之任何同型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類之免疫球蛋白重鏈。4-1BB促效劑或4-1BB結合分子可具有重鏈及輕鏈。如本文所使用，術語結合分子亦包含抗體(包含全長抗體)；單株抗體(包含全長單株抗體)；多株抗體；多特異性抗體(例如雙特異性抗體)；人類、人類化或嵌合抗體；以及抗體片段，例如Fab片段、F(ab')片段、由Fab表現文庫產生的片段、任何上述者之抗原決定基結合片段，以及與4-1BB結合之抗體之經工程改造形式，例如scFv分子。在一些實施例中，4-1BB促效劑為一種完全人類抗體之抗原結合蛋白。在一些實施例中，4-1BB促效劑為一種人類化抗體之抗原結合蛋白。在一些實施例中，用於本發明所揭示之方法及組成物中之4-1BB促效劑包含抗4-1BB抗體、人類抗4-1BB抗體、小鼠抗4-1BB抗體、哺乳動物抗4-1BB抗體、單株抗4-1BB抗體、多株抗4-1BB抗體、嵌合抗4-1BB抗體、抗4-1BB阿德奈汀(adnectin)、抗4-1BB域抗體、單鏈抗4-1BB片段、重鏈抗4-1BB片段、輕鏈抗4-1BB片段、抗4-1BB融合蛋白，及其片段、衍生物、結合物、變體或生物類似物。已知促效性抗4-1BB抗體誘導強烈免疫反應。Lee等人, 《公共科學圖書館·綜合( PLOS One)》 2013, 8,e69677。在一些實施例中，4-1BB促效劑為促效性抗4-1BB人類化或完全人類單株抗體(亦即，來源於單一細胞株之抗體)。在一些實施例中，4-1BB促效劑為EU-101(Eutilex Co. Ltd.)、烏圖木單抗或烏瑞魯單抗或其片段、衍生物、結合物、變體或生物類似物。在一些實施例中，4-1BB促效劑為烏圖木單抗或烏瑞魯單抗或其片段、衍生物、結合物、變體或生物類似物。
在一些實施例中，4-1BB促效劑或4-1BB結合分子亦可為融合蛋白。在一些實施例中，相較於典型地具有兩個配體結合域之促效性單株抗體，多聚4-1BB促效劑，諸如三聚或六聚4-1BB促效劑(具有三個或六個配體結合域)可誘導優良受體(4-1BBL)聚類及內部細胞信號傳導複合物形成。包括三個TNFRSF結合域及IgG1-Fc且視情況進一步連接兩個或多於兩個此等融合蛋白之三聚(三價)或六聚(或六價)或更大融合蛋白描述於例如Gieffers等人, 《分子癌症治療學》 2013, 12, 2735-47中。
已知促效性4-1BB抗體及融合蛋白誘導強烈免疫反應。在一些實施例中，4-1BB促效劑係以足以減少毒性之方式與4-1BB抗原特異性結合的單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，4-1BB促效劑係消除抗體依賴性細胞毒性(ADCC)(例如NK細胞細胞毒性)之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，4-1BB促效劑係消除抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，4-1BB促效劑係消除補體依賴性細胞毒性(CDC)之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，4-1BB促效劑係消除Fc區功能性之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白。
在一些實施例中，4-1BB促效劑之特徵為以高親和力及促效活性與人類4-1BB(SEQ ID NO: 40)結合。在一些實施例中，4-1BB促效劑為與人類4-1BB(SEQ ID NO: 40)結合之結合分子。在一些實施例中，4-1BB促效劑為與鼠類4-1BB(SEQ ID NO: 41)結合之結合分子。4-1BB促效劑或結合分子所結合之4-1BB抗原的胺基酸序列概述於表5中。
Figure 02_image017
在一些實施例中，所描述之組成物、程序及方法包含4-1BB促效劑，該4-1BB促效劑以約100 pM或更低之K D結合人類或鼠類4-1BB、以約90 pM或更低之K D結合人類或鼠類4-1BB、以約80 pM或更低之K D結合人類或鼠類4-1BB、以約70 pM或更低之K D結合人類或鼠類4-1BB、以約60 pM或更低之K D結合人類或鼠類4-1BB、以約50 pM或更低之K D結合人類或鼠類4-1BB、以約40 pM或更低之K D結合人類或鼠類4-1BB、或以約30 pM或更低之K D結合人類或鼠類4-1BB。
在一些實施例中，所描述之組成物、程序及方法包含以約7.5 × 10 51/M·s或更快之k assoc與人類或鼠類4-1BB結合、以約7.5 × 10 51/M·s或更快之k assoc與人類或鼠類4-1BB結合、以約8 × 10 5l/M·s或更快之k assoc與人類或鼠類4-1BB結合、以約8.5 × 10 51/M·s或更快之k assoc與人類或鼠類4-1BB結合、以約9 × 10 51/M·s或更快之k assoc與人類或鼠類4-1BB結合、以約9.5 × 10 51/M·s或更快之k assoc與人類或鼠類4-1BB結合、或以約1 × 10 61/M·s或更快之k assoc與人類或鼠類4-1BB結合的4-1BB促效劑。
在一些實施例中，所描述之組成物、程序及方法包含以約2 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類4-1BB結合、以約2.1 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類4-1BB結合、以約2.2 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類4-1BB結合、以約2.3 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類4-1BB結合、以約2.4 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類4-1BB結合、以約2.5 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類4-1BB結合、以約2.6 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類4-1BB結合、或以約2.7 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類4-1BB結合、以約2.8 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類4-1BB結合、以約2.9 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類4-1BB結合、或以約3 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類4-1BB結合的4-1BB促效劑。
在一些實施例中，所描述之組成物、程序及方法包含4-1BB促效劑，該4-1BB促效劑以約10 nM或更低之IC 50與人類或鼠類4-1BB結合、以約9 nM或更低之IC 50與人類或鼠類4-1BB結合、以約8 nM或更低之IC 50與人類或鼠類4-1BB結合、以約7 nM或更低之IC 50與人類或鼠類4-1BB結合、以約6 nM或更低之IC 50與人類或鼠類4-1BB結合、以約5 nM或更低之IC 50與人類或鼠類4-1BB結合、以約4 nM或更低之IC 50與人類或鼠類4-1BB結合、以約3 nM或更低之IC 50與人類或鼠類4-1BB結合、以約2 nM或更低之IC 50與人類或鼠類4-1BB結合、或以約1 nM或更低之IC 50與人類或鼠類4-1BB結合。
在一些實施例中，4-1BB促效劑為烏圖木單抗(又稱為PF-05082566或MOR-7480)或其片段、衍生物、變體或生物類似物。烏圖木單抗可購自Pfizer, Inc.。烏圖木單抗為免疫球蛋白G2-λ抗[ 智人TNFRSF9(腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員9，4-1BB，T細胞抗原ILA，CD137)] 智人(完全人類)單株抗體。烏圖木單抗之胺基酸序列闡述於表6中。烏圖木單抗包括位於Asn59及Asn292之糖基化位點；位於位置22-96(V H-V L)、143-199(C H1-CL)、256-316(C H2)及362-420(C H3)之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置22'-87'(V H-V L)及136'-195'(C H1-CL)之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於IgG2A異型體位置218-218、219-219、222-222及225-225、位於IgG2A/B異型體位置218-130、219-219、222-222及225-225及位於IgG2B異型體位置219-130(2)、222-222及225-225之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；以及位於IgG2A異型體位置130-213'(2)、IgG2A/B異型體位置218-213'及130-213'及位於IgG2B異型體位置218-213'(2)之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。烏圖木單抗以及其變體及片段之製備及性質描述於美國專利第8,821,867、8,337,850及9,468,678號及國際專利申請公開案第WO 2012/032433 A1號中，其各自之揭示內容以引用之方式併入本文中。烏圖木單抗之臨床前特徵描述於Fisher等人, 《癌症免疫學及免疫治療( Cancer Immunolog. & Immunother.)》 2012 , 61,1721-33中。當前烏圖木單抗用於多種血液及實體腫瘤適應症之臨床試驗包含美國國家衛生研究院(U.S. National Institutes of Health) clinicaltrials.gov識別號NCT02444793、NCT01307267、NCT02315066及NCT02554812。
在一些實施例中，4-1BB促效劑包括SEQ ID NO: 42所列之重鏈及SEQ ID NO: 43所列之輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括分別具有SEQ ID NO: 42及SEQ ID NO: 43中所示序列之重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 42及SEQ ID NO: 43中所示序列至少99%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 42及SEQ ID NO: 43中所示序列至少98%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 42及SEQ ID NO: 43中所示序列至少97%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 42及SEQ ID NO: 43中所示序列至少96%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 42及SEQ ID NO: 43中所示序列至少95%一致之重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，4-1BB促效劑包括烏圖木單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，4-1BB促效劑重鏈可變區(V H)包括SEQ ID NO: 44中所示之序列，且4-1BB促效劑輕鏈可變區(V L)包括SEQ ID NO:45中所示之序列，及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括V H及V L區，其各自分別與SEQ ID NO:44及SEQ ID NO: 45中所示之序列至少99%一致。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括V H及V L區，其各自分別與SEQ ID NO: 44及SEQ ID NO: 45中所示之序列至少98%一致。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括V H及V L區，其各自分別與SEQ ID NO: 44及SEQ ID NO: 45中所示之序列至少97%一致。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括V H及V L區，其各自分別與SEQ ID NO:44及SEQ ID NO: 45中所示之序列至少96%一致。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括V H及V L區，其各自分別與SEQ ID NO:44及SEQ ID NO: 45中所示之序列至少95%一致。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括scFv抗體，該scFv抗體包括各自與SEQ ID NO: 44及SEQ ID NO: 45中所示序列至少99%一致之V H及V L區。
在一些實施例中，4-1BB促效劑包括分別具有SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47及SEQ ID NO: 48中所示序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；以及分別具有SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50及SEQ ID NO:51中所示序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。
在一些實施例中，4-1BB促效劑為藥物管理機構參考烏圖木單抗批准之4-1BB促效劑生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物單株抗體包括4-1BB抗體，該4-1BB抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其與該參考藥品或參考生物產品相比包括一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為烏圖木單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾選自以下中之一者或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之4-1BB促效劑抗體，其中該4-1BB促效劑抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為烏圖木單抗。4-1BB促效劑抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包括之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為烏圖木單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包括之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為烏圖木單抗。
Figure 02_image019
在一些實施例中，4-1BB促效劑為單株抗體烏瑞魯單抗(又稱為BMS-663513及20H4.9.h4a)或其片段、衍生物、變體或生物類似物。烏瑞魯單抗可購自Bristol-Myers Squibb, Inc.及Creative Biolabs, Inc.。烏瑞魯單抗為免疫球蛋白G4-κ抗[ 智人TNFRSF9(腫瘤壞死因子受體超家族成員9，4-1BB，T細胞抗原ILA，CD137)] 智人(完全人類)單株抗體。烏瑞魯單抗之胺基酸序列闡述於表7中。烏瑞魯單抗包括位於位置298(及298'')之N-糖基化位點；位於位置22-95(V H-V L)、148-204(C H1-CL)、262-322(C H2)及368-426(C H3)(及位於位置22''-95''、148''-204''、262''-322''及368''-426'')之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置23'-88'(V H-V L)及136'-196'(C H1-CL)(及位於位置23'''-88'''及136'''-196''')之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於位置227-227''及230-230''之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及位於135-216'及135''-216'''之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。烏瑞魯單抗以及其變體及片段之製備及性質描述於美國專利第7,288,638及8,962,804號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。烏瑞魯單抗之臨床前及臨床特徵描述於Segal等人, 《臨床癌症研究》2016, 請訪問http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272。當前烏瑞魯單抗用於多種血液及實體腫瘤適應症之臨床試驗包含美國國家衛生研究院clinicaltrials.gov識別號NCT01775631、NCT02110082、NCT02253992及NCT01471210。
在一些實施例中，4-1BB促效劑包括SEQ ID NO: 52所示之重鏈及SEQ ID NO: 53所示之輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括分別具有SEQ ID NO: 52及SEQ ID NO: 53中所示序列之重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 52及SEQ ID NO: 53中所示序列至少99%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 52及SEQ ID NO: 53中所示序列至少98%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 52及SEQ ID NO: 53中所示序列至少97%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 52及SEQ ID NO: 53中所示序列至少96%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 52及SEQ ID NO: 53中所示序列至少95%一致之重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，4-1BB促效劑包括烏瑞魯單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，4-1BB促效劑重鏈可變區(V H)包括SEQ ID NO: 54中所示之序列，且4-1BB促效劑輕鏈可變區(V L)包括SEQ ID NO:55中所示之序列，及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括V H及V L區，其各自分別與SEQ ID NO: 54及SEQ ID NO: 55中所示之序列至少99%一致。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括V H及V L區，其各自分別與SEQ ID NO: 54及SEQ ID NO: 55中所示之序列至少98%一致。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括V H及V L區，其各自分別與SEQ ID NO: 54及SEQ ID NO: 55中所示之序列至少97%一致。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括V H及V L區，其各自分別與SEQ ID NO: 54及SEQ ID NO: 55中所示之序列至少96%一致。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括V H及V L區，其各自分別與SEQ ID NO: 54及SEQ ID NO: 55中所示之序列至少95%一致。在一些實施例中，4-1BB促效劑包括scFv抗體，該scFv抗體包括各自與SEQ ID NO: 54及SEQ ID NO: 55中所示序列至少99%一致之V H及V L區。
在一些實施例中，4-1BB促效劑包括分別具有SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57及SEQ ID NO: 58中所示序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；以及分別具有SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60及SEQ ID NO: 61中所示序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。
在一些實施例中，4-1BB促效劑為藥物管理機構參考烏瑞魯單抗核准之4-1BB促效劑生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物單株抗體包括4-1BB抗體，該4-1BB抗體包括與參考藥品或參考生物學產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為烏瑞魯單抗。在一些實施例中，一或多個轉譯後修飾係選自以下中之一者或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之4-1BB促效劑抗體，其中該4-1BB促效劑抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為烏瑞魯單抗。4-1BB促效劑抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為烏瑞魯單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為烏瑞魯單抗。
Figure 02_image021
在一些實施例中，4-1BB促效劑係選自由以下組成之群組：1D8、3Elor、4B4(BioLegend 309809)、H4-1BB-M127(BD Pharmingen 552532)、BBK2(Thermo Fisher MS621PABX)、145501(Leinco Technologies B591)、藉由寄存為ATCC第HB-11248號之細胞株產生且美國專利第6,974,863號中揭示之抗體、5F4(BioLegend 31 1503)、C65-485(BD Pharmingen 559446)、美國專利申請公開案第US 2005/0095244號中揭示之抗體、美國專利第7,288,638號中揭示之抗體(諸如20H4.9-IgGl(BMS-663031))、美國專利第6,887,673號中揭示之抗體(諸如4E9或BMS-554271)、美國專利第7,214,493號中揭示之抗體、美國專利第6,303,121號中揭示之抗體、美國專利第6,569,997號中揭示之抗體、美國專利第6,905,685號中揭示之抗體(諸如4E9或BMS-554271)、美國專利第6,362,325號中揭示之抗體(諸如1D8或BMS-469492；3H3或BMS-469497；或3El)、美國專利第6,974,863號中揭示之抗體(諸如53A2)；美國專利第6,210,669號中揭示之抗體(諸如1D8、3B8或3El)、美國專利第5,928,893號中描述之抗體、美國專利第6,303,121號中揭示之抗體、美國專利第6,569,997號中揭示之抗體、國際專利申請公開案第WO 2012/177788、WO 2015/119923及WO 2010/042433號中揭示之抗體，及其片段、衍生物、結合物、變體或生物類似物，其中前述專利或專利申請公開案中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，4-1BB促效劑為以下中描述之4-1BB促效融合蛋白：國際專利申請公開案第WO 2008/025516 A1號、第WO 2009/007120 A1號、第WO 2010/003766 A1號、第WO 2010/010051 A1號及第WO 2010/078966 A1號；美國專利申請公開案第US 2011/0027218 A1號、第US 2015/0126709 A1號、第US 2011/0111494 A1號、第US 2015/0110734 A1號及第US 2015/0126710 A1號；及美國專利第9,359,420號、第9,340,599, 8,921,519號及第8,450,460號，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，4-1BB促效劑為如結構I-A(C端Fc抗體片段融合蛋白)或結構I-B(N端Fc抗體片段融合蛋白)中所描繪之4-1BB促效融合蛋白，或其片段、衍生物、結合物、變體或生物類似物(參見圖18)。在結構I-A及結構I-B中，圓柱體係指個別多肽結合域。結構I-A及I-B包括三個線性連接的TNFRSF結合域，該等TNFRSF結合域衍生自例如4-1BBL(4-1BB配體、CD137配體(CD137L)或腫瘤壞死因子超家族成員9(TNFSF9)或結合4-1BB之抗體，該等TNFRSF結合域摺疊形成三價蛋白質，接著該三價蛋白質經由IgG1-Fc(包含C H3及C H2域)與兩個三價蛋白質連接，隨後該IgG1-Fc用於經由二硫鍵(細長小橢圓)將兩個三價蛋白質連接在一起，從而使結構穩定且提供能夠將六個受體之細胞內信號傳導域放在一起且信號傳導蛋白質以形成信號傳導複合物的促效劑。表示為圓柱體之TNFRSF結合域可為包括例如由連接子連接之V H及V L鏈的scFv域，該連接子可包括親水性殘基及提供柔性之Gly與Ser序列以及提供溶解性的Glu與Lys。可使用任何scFv域設計，諸如以下中描述之scFv域：de Marco, 《微生物細胞工廠( Microbial Cell Factories)》, 2011, 10, 44；Ahmad等人, 《臨床及發育免疫學( Clin.& Dev.Immunol.)》2012, 980250；Monnier等人, 《抗體( Antibodies)》, 2013, 2, 193-208；或本文中別處併入之參考文獻。此形式之融合蛋白結構描述於美國專利第9,359,420號、第9,340,599號、第8,921,519號及第8,450,460號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
圖18中所提供之結構I-A之其他多肽域的胺基酸序列見於表8中。Fc域較佳包括完整恆定域(SEQ ID NO: 62之胺基酸17-230)、完整鉸鏈域(SEQ ID NO: 62之胺基酸1-16)或鉸鏈域之一部分(例如SEQ ID NO: 62之胺基酸4-16)。用於連接C端Fc抗體之較佳連接子可選自SEQ ID NO: 63至SEQ ID NO: 72中所提供之實施例，包含適合於融合額外多肽之連接子。
Figure 02_image023
圖18中所提供之結構I-B之其他多肽域的胺基酸序列見於表9中。若Fc抗體片段如在結構I-B中與TNRFSF融合蛋白之N端融合，則Fc模組之序列較佳為SEQ ID NO: 73中所示之序列，且連接子序列較佳係選自SED ID NO:74至SEQ ID NO:76中所示之實施例。
Figure 02_image025
在一些實施例中，根據結構I-A或結構I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包括一或多個選自由以下組成之群組之4-1BB結合域：烏圖木單抗之可變重鏈及可變輕鏈、烏瑞魯單抗之可變重鏈及可變輕鏈、烏圖木單抗之可變重鏈及可變輕鏈、選自表10中描述之可變重鏈及可變輕鏈的可變重鏈及可變輕鏈、前述可變重鏈及可變輕鏈之任何組合，及其片段、衍生物、結合物、變體及生物類似物。
在一些實施例中，根據結構I-A或結構I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包括一或多個包括4-1BBL序列的4-1BB結合域。在一些實施例中，根據結構I-A或結構I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包括一或多個包括根據SEQ ID NO: 77之序列的4-1BB結合域。在一些實施例中，根據結構I-A或結構I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包括一或多個包括可溶性4-1BBL序列的4-1BB結合域。在一些實施例中，根據結構I-A或結構I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包括一或多個包括根據SEQ ID NO:78之序列的4-1BB結合域。
在一些實施例中，根據結構I-A或結構I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包括一或多個4-1BB結合域，該等結合域係包括各自分別與SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 45中所示序列至少95%一致之V H及V L區的scFv域，其中V H及V L域經連接子連接。在一些實施例中，根據結構I-A或結構I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包括一或多個4-1BB結合域，該等結合域係包括各自分別與SEQ ID NO: 54及SEQ ID NO: 55中所示序列至少95%一致之V H及V L區的scFv域，其中V H及V L域經連接子連接。在一些實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白包含一或多個4-1BB結合域，該等結合域係包括各自與表10中給出之V H及V L序列至少95%一致之V H及V L區的scFv域，其中V H及V L域經連接子連接。
Figure 02_image027
在一些實施例中，4-1BB促效劑為4-1BB促效單鏈融合多肽，其包括(i)第一可溶性4-1BB結合域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性4-1BB結合域、(iv)第二肽連接子，及(v)第三可溶性4-1BB結合域，進一步包括在N端及/或C端之額外域，且其中該額外域為Fab或Fc片段域。在一些實施例中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性單鏈融合多肽，其包括(i)第一可溶性4-1BB結合域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性4-1BB結合域、(iv)第二肽連接子，及(v)第三可溶性4-1BB結合域，進一步包括在N端及/或C端之額外域，且其中該額外域為Fab或Fc片段域，其中該等可溶性4-1BB域各自缺乏莖區(其促成三聚作用且提供與細胞膜之某一距離，但不為4-1BB結合域之一部分)且該第一肽連接子及該第二肽連接子獨立地具有3-8個胺基酸的長度。
在一些實施例中，4-1BB促效劑為4-1BB促效性單鏈融合多肽，其包括(i)第一可溶性腫瘤壞死因子(TNF)超家族細胞介素域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性TNF超家族細胞介素域、(iv)第二肽連接子，及(v)第三可溶性TNF超家族細胞介素域，其中該等可溶性TNF超家族細胞介素域各自均缺少莖區，且第一肽連接子及第二肽連接子獨立地具有3-8個胺基酸的長度，且其中每個TNF超家族細胞介素域均為4-1BB結合域。
在一些實施例中，4-1BB促效劑為4-1BB促效性scFv抗體，其包括連接至任何前述V L域之任何前述V H域。
在某些實施例中，4-1BB促效劑為BPS Bioscience 4-1BB促效劑抗體目錄號79097-2，可商購自美國加利福尼亞州聖地亞哥的BPS Bioscience。在某些實施例中，4-1BB促效劑為Creative Biolabs 4-1BB促效劑抗體目錄號MOM-18179，可商購自美國紐約州雪利市(Shirley, NY, USA)的Creative Biolabs。 1.OX40(CD134)促效劑
在一些實施例中，TNFRSF促效劑為OX40(CD134)促效劑。OX40促效劑可為本領域中已知的任何OX40結合分子。OX40結合分子可為能夠與人類或哺乳動物OX40結合之單株抗體或融合蛋白。OX40促效劑或OX40結合分子可包括免疫球蛋白分子之任何同型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類之免疫球蛋白重鏈。OX40促效劑或OX40結合分子可具有重鏈及輕鏈。如本文所使用，術語結合分子亦包含抗體(包含全長抗體)、單株抗體(包含全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人類抗體、人類化或嵌合抗體及抗體片段，例如Fab片段、F(ab′)片段、由Fab表現文庫產生之片段、任何上述之抗原決定基-結合片段及與OX40結合之抗體之經工程改造形式，例如scFv分子。在一些實施例中，OX40促效劑為一種完全人類抗體之抗原結合蛋白。在一些實施例中，OX40促效劑為一種人類化抗體之抗原結合蛋白。在一些實施例中，用於本揭示方法及組成物中之OX40促效劑包含抗OX40抗體、人類抗OX40抗體、小鼠抗OX40抗體、哺乳動物抗OX40抗體、單株抗OX40抗體、多株抗OX40抗體、嵌合抗OX40抗體、抗OX40阿德奈汀(adnectin)、抗OX40域抗體、單鏈抗OX40片段、重鏈抗OX40片段、輕鏈抗OX40片段、抗OX40融合蛋白，及其片段、衍生物、結合物、變體或生物類似物。在一些實施例中，OX40促效劑為促效性抗OX40人類化或完全人類單株抗體(亦即，來源於單個細胞株的抗體)。
在一些實施例中，OX40促效劑或OX40結合分子亦可為融合蛋白。包括與OX40L融合之Fc域之OX40融合蛋白描述於例如Sadun等人, 《免疫療法雜誌》2009, 182, 1481-89。在一些實施例中，相較於通常具有兩個配體結合域之促效性單株抗體，多聚OX40促效劑，諸如三聚或六聚OX40促效劑(具有三個或六個配體結合域)可誘導優良受體(OX40L)聚類及內部細胞信號傳導複合物形成。包括三個TNFRSF結合域及IgG1-Fc且視情況進一步連接兩個或多於兩個此等融合蛋白之三聚(三價)或六聚(或六價)或更大融合蛋白描述於例如Gieffers等人, 《分子癌症治療學》2013, 12, 2735-47中。
已知促效性OX40抗體及融合蛋白可誘導強烈免疫反應。Curti等人, 《癌症研究》 2013, 73, 7189-98。在一些實施例中，OX40促效劑為以足夠減少毒性之方式與OX40抗原特異性結合之單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，OX40促效劑為消除抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，例如NK細胞細胞毒性之促效性OX40單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，OX40促效劑為消除抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之促效性OX40單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，OX40促效劑為消除補體依賴性細胞毒性(CDC)之促效性OX40單株抗體或融合蛋白。在一些實施例中，OX40促效劑為消除Fc區功能之促效性OX40單株抗體或融合蛋白。
在一些實施例中，OX40促效劑之特徵為以高親和力及促效性活性與人類OX40(SEQ ID NO: 85)結合。在一些實施例中，OX40促效劑為與人類OX40(SEQ ID NO: 85)結合之結合分子。在一些實施例中，OX40促效劑為與鼠類OX40(SEQ ID NO: 86)結合之結合分子。表11中概述與OX40促效劑或結合分子結合之OX40抗原之胺基酸序列。
Figure 02_image029
在一些實施例中，所描述組成物、程序及方法包含如下OX40促效劑，該OX40促效劑以約100 pM或更低之K D結合人類或鼠類OX40、以約90 pM或更低之K D結合人類或鼠類OX40、以約80 pM或更低之K D結合人類或鼠類OX40、以約70 pM或更低之K D結合人類或鼠類OX40、以約60 pM或更低之K D結合人類或鼠類OX40、以約50 pM或更低之K D結合人類或鼠類OX40、以約40 pM或更低之K D結合人類或鼠類OX40或以約30 pM或更低之K D結合人類或鼠類OX40。
在一些實施例中，所描述之組成物、程序及方法包含如下OX40促效劑，該OX40促效劑以約7.5 × 10 51/M·s或更快之k assoc與人類或鼠類OX40結合、以約7.5 × 10 51/M·s或更快之k assoc與人類或鼠類OX40結合、以約8 × 10 51/M·s或更快之k assoc與人類或鼠類OX40結合、以約8.5 × 10 51/M·s或更快之k assoc與人類或鼠類OX40結合、以約9 × 10 51/M·s或更快之k assoc與人類或鼠類OX40結合、以約9.5 × 10 51/M·s或更快之k assoc與人類或鼠類OX40結合或以約1 × 10 61/M·s或更快之k assoc與人類或鼠類OX40結合。
在一些實施例中，所描述之組成物、程序及方法包含如下OX40促效劑，該OX40促效劑以約2 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類OX40結合、以約2.1 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類OX40結合、以約2.2 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類OX40結合、以約2.3 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類OX40結合、以約2.4 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類OX40結合、以約2.5 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類OX40結合、以約2.6 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類OX40結合、以約2.7 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類OX40結合、以約2.8 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類OX40結合、以約2.9 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類OX40結合或以約3 × 10 -51/s或更慢之k dissoc與人類或鼠類OX40結合。
在一些實施例中，所描述之組成物、程序及方法包含如下OX40促效劑，該OX40促效劑以約10 nM或更低之IC 50與人類或鼠類OX40結合、以約9 nM或更低之IC 50與人類或鼠類OX40結合、以約8 nM或更低之IC 50與人類或鼠類OX40結合、以約7 nM或更低之IC 50與人類或鼠類OX40結合、以約6 nM或更低之IC 50與人類或鼠類OX40結合、以約5 nM或更低之IC 50與人類或鼠類OX40結合、以約4 nM或更低之IC 50與人類或鼠類OX40結合、以約3 nM或更低之IC 50與人類或鼠類OX40結合、以約2 nM或更低之IC 50與人類或鼠類OX40結合或以約1 nM或更低之IC 50與人類或鼠類OX40結合。
在一些實施例中，OX40促效劑為塔沃西單抗，又稱為MEDI0562或MEDI-0562。塔沃西單抗可獲自AstraZeneca公司之MedImmune子公司。塔沃西單抗為免疫球蛋白G1-κ抗[智人TNFRSF4(腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員4，OX40，CD134)]人類化及嵌合單株抗體。塔沃西單抗之胺基酸序列闡述於表12中。塔沃西單抗包括在位置301及301''處之N-糖基化位點，具有岩藻糖基化複合物二觸角CHO型聚醣；在位置22-95(V H-V L)、148-204((C H1-C L)、265-325(C H2)及371-429(C H3)處(及在位置22''-95''、148''-204''、265''-325''及371''-429''處)之重鏈鏈內雙硫鍵；在位置23'-88'(V H-V L)及134'-194'(C H1-C L)處(及在位置23'''-88'''及134'''-194'''處)之輕鏈鏈內雙硫鍵；在位置230-230''及233-233''處之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及在224-214'及224''-214'''處之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。當前塔沃西單抗用於各種實體腫瘤適應症中之臨床試驗包含美國國家衛生研究院clinicaltrials.gov識別號NCT02318394及NCT02705482。
在一些實施例中，OX40促效劑包括SEQ ID NO:87所示之重鏈及SEQ ID NO:88所示之輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括分別具有SEQ ID NO:87及SEQ ID NO:88中所示序列的重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:87及SEQ ID NO:88中所示序列至少99%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:87及SEQ ID NO:88中所示序列至少98%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:87及SEQ ID NO:88中所示之序列至少97%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:87及SEQ ID NO:88中所示序列至少96%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:87及SEQ ID NO:88中所示之序列至少95%一致的重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，OX40促效劑包括塔沃西單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(V H)包括SEQ ID NO:89中所示序列，且OX40促效劑輕鏈可變區(V L)包括SEQ ID NO:90中所示序列，及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:90中所示之序列至少99%一致的V H及V L區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:90中所示序列至少98%一致之V H及V L區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:90中所示之序列至少97%一致的V H及V L區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:90中所示之序列至少96%一致的V H及V L區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:90中所示之序列至少95%一致的V H及V L區。在一些實施例中，OX40促效劑包括scFv抗體，該scFv抗體包括各自分別與SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:90中所示序列至少99%一致的V H及V L區。
在一些實施例中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92及SEQ ID NO:93中所示之序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；以及分別具有SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95及SEQ ID NO:96中所示之序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。
在一些實施例中，OX40促效劑為藥物監管機構參考塔沃西單抗核准之OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物單株抗體包括OX40抗體，該OX40抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為塔沃西單抗。在一些實施例中，一或多個轉譯後修飾係選自以下中之一者或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。在某些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之OX40促效劑抗體，其中OX40促效劑抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為塔沃西單抗。OX40促效劑抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為塔沃西單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為塔沃西單抗。
Figure 02_image031
在一些實施例中，OX40促效劑為11D4，其為可獲自Pfizer, Inc之完全人類抗體。11D4之製備及特性描述於美國專利第7,960,515號、第8,236,930號及第9,028,824號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。11D4之胺基酸序列闡述於表13中。
在一些實施例中，OX40促效劑包括SEQ ID NO:97所示之重鏈及SEQ ID NO:98所示之輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括分別具有SEQ ID NO:97及SEQ ID NO:98中所示序列的重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:97及SEQ ID NO:98中所示序列至少99%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:97及SEQ ID NO:98中所示序列至少98%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:97及SEQ ID NO:98中所示序列至少97%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:97及SEQ ID NO:98中所示序列至少96%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:97及SEQ ID NO:98中所示序列至少95%一致之重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，OX40促效劑包括11D4之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(V H)包括SEQ ID NO:99中所示序列，且OX40促效劑輕鏈可變區(V L)包括SEQ ID NO:100中所示序列，及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:99及SEQ ID NO:100中所示之序列至少99%一致的V H及V L區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:99及SEQ ID NO:100中所示序列至少98%一致之V H及V L區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:99及SEQ ID NO:100中所示之序列至少97%一致的V H及V L區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:99及SEQ ID NO:100中所示之序列至少96%一致的V H及V L區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:99及SEQ ID NO:100中所示之序列至少95%一致的V H及V L區。
在一些實施例中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102及SEQ ID NO :103中所示之序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；以及分別具有SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105及SEQ ID NO:106中所示之序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。
在一些實施例中，OX40促效劑為藥物管理機構參考11D4核准之OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物單株抗體包括OX40抗體，該OX40抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為11D4。在一些實施例中，一或多個轉譯後修飾係選自以下中之一者或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之OX40促效劑抗體，其中OX40促效劑抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為11D4。OX40促效劑抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為11D4。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為11D4。
Figure 02_image033
在一些實施例中，OX40促效劑為18D8，其為可獲自Pfizer, Inc之完全人類抗體。18D8之製備及特性描述於美國專利第7,960,515號、第8,236,930號及第9,028,824號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。18D8之胺基酸序列闡述於表14中。
在一些實施例中，OX40促效劑包括SEQ ID NO:107所示之重鏈及SEQ ID NO:108所示之輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括分別具有SEQ ID NO:107及SEQ ID NO:108中所示序列的重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:107及SEQ ID NO:108中所示序列至少99%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:107及SEQ ID NO:108中所示序列至少98%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:107及SEQ ID NO:108中所示序列至少97%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:107及SEQ ID NO:108中所示序列至少96%一致之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:107及SEQ ID NO:108中所示序列至少95%一致之重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，OX40促效劑包括18D8之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(V H)包括SEQ ID NO: 109中所示序列，且OX40促效劑輕鏈可變區(V L)包括SEQ ID NO: 110中所示序列，及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 109及SEQ ID NO: 110中所示之序列至少99%一致的V H及V L區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 109及SEQ ID NO: 110中所示序列至少98%一致之V H及V L區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 109及SEQ ID NO: 110中所示之序列至少97%一致的V H及V L區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 109及SEQ ID NO: 110中所示之序列至少96%一致的V H及V L區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO: 109及SEQ ID NO: 110中所示之序列至少95%一致的V H及V L區。
在一些實施例中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112及SEQ ID NO :113中所示之序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；以及分別具有SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115及SEQ ID NO:116中所示之序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。
在一些實施例中，OX40促效劑為藥物管理機構參考18D8核准之OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物單株抗體包括OX40抗體，該OX40抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為18D8。在一些實施例中，一或多個轉譯後修飾係選自以下中之一者或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之OX40促效劑抗體，其中OX40促效劑抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為18D8。OX40促效劑抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為18D8。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為18D8。
Figure 02_image035
在一些實施例中，OX40促效劑為Hu119-122，其為可獲自GlaxoSmithKline plc之人源化抗體。Hu119-122之製備及特性描述於美國專利第9,006,399號及第9,163,085號以及國際專利公開案第WO 2012/027328號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。Hu119-122之胺基酸序列闡述於表15中。
在一些實施例中，OX40促效劑包括Hu119-122之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(V H)包括SEQ ID NO: 117中所示序列，且OX40促效劑輕鏈可變區(V L)包括SEQ ID NO: 118中所示序列，及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:117及SEQ ID NO:118中所示之序列至少99%一致的V H及V L區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:117及SEQ ID NO:118中所示序列至少98%一致之V H及V L區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:117及SEQ ID NO:118中所示之序列至少97%一致的V H及V L區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:117及SEQ ID NO:118中所示之序列至少96%一致的V H及V L區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:117及SEQ ID NO:118中所示之序列至少95%一致的V H及V L區。
在一些實施例中，OX40促效劑包括分別具有SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120及SEQ ID NO:121中所示之序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；以及分別具有SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123及SEQ ID NO:124中所示之序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。
在一些實施例中，OX40促效劑為藥物管理機構參考Hu119-122核准之OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物單株抗體包括OX40抗體，該OX40抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為Hu119-122。在一些實施例中，一或多個轉譯後修飾係選自以下中之一者或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之OX40促效劑抗體，其中OX40促效劑抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為Hu119-122。OX40促效劑抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為Hu119-122。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為Hu119-122。
Figure 02_image037
在一些實施例中，在一些實施例中，OX40促效劑為Hu106-222，其為可獲自GlaxoSmithKline plc之人類化抗體。Hu106-222之製備及特性描述於美國專利第9,006,399號及第9,163,085號以及國際專利公開案第WO 2012/027328號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。Hu106-222之胺基酸序列闡述於表16中。
在一些實施例中，OX40促效劑包括Hu106-222之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(V H)包括SEQ ID NO: 125中所示序列，且OX40促效劑輕鏈可變區(V L)包括SEQ ID NO: 126中所示序列，及其保守胺基酸取代。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:125及SEQ ID NO:126中所示之序列至少99%一致的V H及V L區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:125及SEQ ID NO:126中所示序列至少98%一致之V H及V L區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:125及SEQ ID NO:126中所示之序列至少97%一致的V H及V L區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:125及SEQ ID NO:126中所示之序列至少96%一致的V H及V L區。在一些實施例中，OX40促效劑包括各自分別與SEQ ID NO:125及SEQ ID NO:126中所示之序列至少95%一致的V H及V L區。
在一些實施例中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO:128及SEQ ID NO:129所示之序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；以及分別具有SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO:131及SEQ ID NO:132中所示之序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。
在一些實施例中，OX40促效劑為藥物管理機構參考Hu106-222核准之OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物單株抗體包括OX40抗體，該OX40抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為Hu106-222。在一些實施例中，一或多個轉譯後修飾係選自以下中之一者或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之OX40促效劑抗體，其中OX40促效劑抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為Hu106-222。OX40促效劑抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為Hu106-222。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為Hu106-222。
Figure 02_image039
在一些實施例中，OX40促效劑抗體為MEDI6469(又稱為9B12)。MEDI6469為鼠類單株抗體。Weinberg等人,《免疫療法雜誌》2006, 29, 575-585 。在一些實施例中，OX40促效劑係由9B12雜交瘤產生，由Biovest Inc.(美國馬薩諸塞州馬爾文(Malvern, MA, USA))寄存的抗體，如Weinberg等人,《免疫療法雜誌》2006, 29, 575-585中所描述，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，抗體包括MEDI6469之CDR序列。在一些實施例中，抗體包括MEDI6469之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。
在一些實施例中，OX40促效劑為L106 BD(Pharmingen，產品號340420)。在一些實施例中，OX40促效劑包括抗體L106(BD Pharmingen，產品號340420)之CDR。在一些實施例中，OX40促效劑包括抗體L106(BD Pharmingen，產品號340420)之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。在一些實施例中，OX40促效劑為ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目錄號20073)。在一些實施例中，OX40促效劑包括抗體ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目錄號20073)之CDR。在一些實施例中，OX40促效劑包括抗體ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目錄號20073)之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。在一些實施例中，OX40促效劑為鼠類單株抗體抗mCD134/mOX40(選殖株OX86)，可購自新罕布什爾州西黎巴嫩之BioXcell Inc之InVivoMAb。
在一些實施例中，OX40促效劑係選自以下中描述之OX40促效劑：國際專利申請公開案第WO 95/12673號、第WO 95/21925號、第WO 2006/121810號、第WO 2012/027328號、第WO 2013/028231號、第WO 2013/038191號及第WO 2014/148895號；歐洲專利申請案EP 0672141；美國專利申請公開案第US 2010/136030號、第US 2014/377284號、第US 2015/190506號及第US 2015/132288號(包含選殖株20E5及12H3)；及美國專利第7,504,101號、第7,550,140號、第7,622,444號、第7,696,175號、第7,960,515號、第7,961,515號、第8,133,983號、第9,006,399號及第9,163,085號，其各自之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，OX40促效劑為如結構I-A(C端Fc抗體片段融合蛋白)或結構I-B(N端Fc抗體片段融合蛋白)中所描繪之OX40促效性融合蛋白，或其片段、衍生物、結合物、變體或生物類似物。結構I-A及結構I-B之特性已在上文及美國專利第9,359,420號、第9,340,599號、第8,921,519號及第8,450,460號中描述，其揭示內容以引用之方式併入本文中。圖18中所提供之結構I-A之多肽域的胺基酸序列見於表8中。Fc域較佳包括完整恆定域(SEQ ID NO: 62之胺基酸17-230)、完整鉸鏈域(SEQ ID NO: 62之胺基酸1-16)或鉸鏈域之一部分(例如SEQ ID NO: 62之胺基酸4-16)。用於連接C端Fc抗體之較佳連接子可選自SEQ ID NO: 63至SEQ ID NO: 72中所提供之實施例，包含適合於融合額外多肽之連接子。同樣，圖18中所提供之結構I-B之多肽域的胺基酸序列見於表9中。若Fc抗體片段如在結構I-B中與TNRFSF融合蛋白之N端融合，則Fc模組之序列較佳為SEQ ID NO: 73中所示之序列，且連接子序列較佳係選自SED ID NO:74至SEQ ID NO:76中所示之實施例。
在一些實施例中，根據結構I-A或結構I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一或多個選自由以下組成之群組之OX40結合域：塔沃西單抗之可變重鏈及可變輕鏈、11D4之可變重鏈及可變輕鏈、18D8之可變重鏈及可變輕鏈、Hu119-122之可變重鏈及可變輕鏈、Hu106-222之可變重鏈及可變輕鏈、選自表17中描述之可變重鏈及可變輕鏈的可變重鏈及可變輕鏈、前述之可變重鏈及可變輕鏈的任何組合，及其片段、衍生物、結合物、變體及生物類似物。
在一些實施例中，根據結構I-A或結構I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一或多個包括OX40L序列之OX40結合域。在一些實施例中，根據結構I-A或結構I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一或多個包括根據SEQ ID NO:133之序列的OX40結合域。在一些實施例中，根據結構I-A或結構I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一或多個包括可溶性OX40L序列之OX40結合域。在一些實施例中，根據結構I-A或結構I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一或多個包括根據SEQ ID NO:134之序列的OX40結合域。在一些實施例中，根據結構I-A或結構I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一或多個包括根據SEQ ID NO:135之序列的OX40結合域。
在一些實施例中，根據結構I-A或結構I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一或多個OX40結合域，該一或多個OX40結合域為scFv域，該scFv域包括各自分別與SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:90中所示序列至少95%一致之V H及V L區，其中V H及V L域經連接子連接。在一些實施例中，根據結構I-A或結構I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一或多個OX40結合域，該一或多個OX40結合域為scFv域，該scFv域包括各自分別與SEQ ID NO:99及SEQ ID NO:100中所示序列至少95%一致之V H及V L區，其中V H及V L域經連接子連接。在一些實施例中，根據結構I-A或結構I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一或多個OX40結合域，該一或多個OX40結合域為scFv域，該scFv域包括各自分別與SEQ ID NO:109及SEQ ID NO:110中所示序列至少95%一致之V H及V L區，其中V H及V L域經連接子連接。在一些實施例中，根據結構I-A或結構I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一或多個OX40結合域，該一或多個OX40結合域為scFv域，該scFv域包括各自分別與SEQ ID NO:117及SEQ ID NO:118中所示序列至少95%一致之V H及V L區，其中V H及V L域經連接子連接。在一些實施例中，根據結構I-A或結構I-B之OX40促效劑融合蛋白包括一或多個OX40結合域，該一或多個OX40結合域為scFv域，該scFv域包括各自分別與SEQ ID NO:125及SEQ ID NO:126中所示序列至少95%一致之V H及V L區，其中V H及V L域經連接子連接。在一些實施例中，根據結構I-A或結構I-B之OX40促效劑融合蛋白質包括一或多個OX40結合域，該一或多個結合域為scFv域，該scFv域包含各自與表17中所提供之V H及V L序列至少95%一致之V H及V L區，其中V H及V L域經連接子連接。
Figure 02_image041
在一些實施例中，OX40促效劑為OX40促效性單鏈融合多肽，其包括：(i)第一可溶性OX40結合域；(ii)第一肽連接子；(iii)第二可溶性OX40結合域；(iv)第二肽連接子；及(v)第三可溶性OX40結合域，其進一步包括在N端及/或C端處之額外域，且其中該額外域為Fab或Fc片段域。在一些實施例中，OX40促效劑為OX40促效性單鏈融合多肽，其包括：(i)第一可溶性OX40結合域；(ii)第一肽連接子；(iii)第二可溶性OX40結合域；(iv)第二肽連接子；及(v)第三可溶性OX40結合域，其進一步包括在N端及/或C端處之額外域，其中該額外域為Fab或Fc片段域，其中可溶性OX40結合域各自缺乏莖區(其促成三聚作用且提供與細胞膜之某一距離，但不為OX40結合域之一部分)且該第一肽連接子及該第二肽連接子獨立地具有3-8個胺基酸的長度。
在一些實施例中，OX40促效劑為OX40促效性單鏈融合多肽，其包括：(i)第一可溶性腫瘤壞死因子(TNF)超家族細胞介素域；(ii)第一肽連接子；(iii)第二可溶性TNF超家族細胞介素域；(iv)第二肽連接子；及(v)第三可溶性TNF超家族細胞介素域，其中可溶性TNF超家族細胞介素域各自缺乏莖區且該第一肽連接子及該第二肽連接子獨立地具有3-8個胺基酸的長度，且其中TNF超家族細胞介素域為OX40結合域。
在一些實施例中，OX40促效劑為MEDI6383。MEDI6383為OX40促效性融合蛋白且可如美國專利第6,312,700號中所描述來製備，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，OX40促效劑為OX40促效性scFv抗體，其包括與任何前述V L域連接之任何前述V H域。
在一些實施例中，OX40促效劑為Creative Biolabs OX40促效劑單株抗體MOM-18455，可購自美國紐約州雪莉市之Creative Biolabs，Inc.。
在一些實施例中，OX40促效劑為OX40促效性抗體選殖株Ber-ACT35，可購自美國加利福尼亞州聖地亞哥之BioLegend, Inc.。 C. 視情況進行之 細胞存活率分析
視情況，在初始第一次擴增(有時稱為初始主體擴增(initial bulk expansion))之後，可使用此項技術已知之標準分析進行細胞存活率分析。因此，在某些實施例中，該方法包括在初始第一次擴增之後進行細胞存活率分析。舉例而言，可在主體TIL樣本上進行錐蟲藍排除分析，錐蟲藍選擇性標記死細胞且允許存活率評定。其他用於測試存活性之分析可包含但不限於阿爾瑪藍(Alamar blue)分析及MTT分析。 2.細胞計數、存活性、流動式細胞測量術
在一些實施例中，量測細胞計數及/或存活性。標記物(諸如但不限於CD3、CD4、CD8及CD56以及本文所揭示或描述之任何其他標記物)之表現可藉由流動式細胞測量術，使用FACSCanto TM流動式細胞儀(BD Biosciences)，用抗體，例如但不限於可購自BD Bio-sciences者(BD Biosciences，加利福尼亞州聖荷西)量測。細胞可使用拋棄式c-晶片血球計(VWR，伊利諾伊州巴達維亞)手動計數，且存活性可使用本領域中已知之任何方法，包含但不限於錐蟲藍染色評定。細胞存活性亦可基於美國專利申請公開案第2018/0282694號分析，其以全文引用之方式併入本文中。細胞存活性亦可基於美國專利申請公開案第2018/0280436號或國際專利申請公開案第WO/2018/081473號分析，兩者全文均併入本文中用於所有目的。
在一些情況下，主體TIL群體可使用下文論述之方案立即冷凍保存。替代地，主體TIL群體可進行REP且接著如下文所論述冷凍保存。類似地，在將經遺傳修飾的TIL用於療法中之情況下，主體或REP TIL群體可進行遺傳修飾以用於適合治療。 3.細胞培養
在一些實施例中，用於擴增TIL之方法(包含上文所論述以及圖1及圖8，特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D中例示之方法)可包含使用約5,000 mL至約25,000 mL之細胞培養基、約5,000 mL至約10,000 mL之細胞培養基或約5,800 mL至約8,700 mL之細胞培養基。在一些實施例中，培養基為不含血清之培養基。在一些實施例中，初始第一次擴增中之培養基不含血清。在一些實施例中，第二次擴增中之培養基不含血清。在一些實施例中，初始第一次擴增及第二次擴增(亦稱為快速第二次擴增)中之培養基均不含血清。在一些實施例中，擴增TIL數目使用不超過一種類型之細胞培養基。可使用任何適合的細胞培養基，例如AIM-V細胞培養基(L-麩醯胺酸、50 μM鏈黴素硫酸鹽及10 μM建它黴素硫酸鹽)細胞培養基(Invitrogen，加利福尼亞州喀斯巴德(Carlsbad CA))。就此而言，本發明方法有利地減少擴增TIL數目所需之培養基的量及培養基類型的數目。在一些實施例中，擴增TIL數目可包括頻率不超過每三或四天一次地餵養細胞。在透氣容器中擴增細胞數目藉由減少擴增細胞所需之餵養頻率，簡化擴增細胞數目所需之程序。
在一些實施例中，第一透氣容器及/或第二透氣容器中之細胞培養基為未經過濾的。使用未經過濾之細胞培養基可簡化擴增細胞數目所需之程序。在一些實施例中，第一透氣容器及/或第二透氣容器中之細胞培養基缺乏β-巰基乙醇(BME)。
在一些實施例中，該方法期間包括自哺乳動物獲得腫瘤組織樣本；在第一透氣容器中將腫瘤組織樣本培養約1至8天之持續時間，例如培養約7天作為初始第一次擴增或培養約8天作為初始第一次擴增，該第一透氣容器含有包含IL-2、1X抗原呈現飼養細胞及OKT-3之細胞培養基；將TIL轉移至第二透氣容器中並在第二透氣容器中擴增TIL數目，持續約7至9天，例如約7天、約8天或約9天，該第二透氣容器含有包含IL-2、2X抗原呈現飼養細胞及OKT-3之細胞培養基。
在一些實施例中，該方法期間包括自哺乳動物獲得腫瘤組織樣本；在第一透氣容器中將腫瘤組織樣本培養約1至7天(例如約7天)之持續時間作為初始第一次擴增，該第一透氣容器含有包含IL-2、1X抗原呈現飼養細胞及OKT-3之細胞培養基；將TIL轉移至第二透氣容器中並在第二透氣容器中擴增TIL數目，持續約7至14天或約7至9天，例如約7天、約8天或約9天、約10天或約11天，該第二透氣容器含有包含IL-2、2X抗原呈現飼養細胞及OKT-3之細胞培養基。
在一些實施例中，該方法期間包括自哺乳動物獲得腫瘤組織樣本；在第一透氣容器中將腫瘤組織樣本培養約1至7天(例如約7天)之持續時間作為初始第一次擴增，該第一透氣容器含有包含IL-2、1X抗原呈現飼養細胞及OKT-3之細胞培養基；將TIL轉移至第二透氣容器中並在第二透氣容器中擴增TIL數目，持續約7至11天，例如約7天、約8天、約9天、約10天或約11天，該第二透氣容器含有包含IL-2、2X抗原呈現飼養細胞及OKT-3之細胞培養基。
在一些實施例中，TIL係在透氣容器中擴增。已使用透氣容器來擴增TIL，使用PBMC，使用本領域中已知之方法、組成物及裝置，包含美國專利申請案公開案第2005/0106717 A1號中描述者，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，TIL係在透氣袋中擴增。在一些實施例中，TIL係使用在透氣袋中擴增TIL之細胞擴增系統，諸如Xuri細胞擴增系統W25(GE Healthcare)擴增。在一些實施例中，TIL係使用在透氣袋中擴增TIL之細胞擴增系統，諸如WAVE生物反應器系統，又稱為Xuri細胞擴增系統W5(GE Healthcare)擴增。在一些實施例中，細胞擴增系統包含透氣細胞袋，該透氣細胞袋之容積選自由以下組成之群組：約100 mL、約200 mL、約300 mL、約400 mL、約500 mL、約600 mL、約700 mL、約800 mL、約900 mL、約1 L、約2 L、約3 L、約4 L、約5 L、約6 L、約7 L、約8 L、約9 L及約10 L。
在一些實施例中，TIL可在G-Rex培養瓶(可商購自Wilson Wolf Manufacturing)中擴增。此類實施例允許細胞群體自約5×10 5個細胞/平方公分擴增至在10×10 6與30×10 6個細胞/平方公分之間。在一些實施例中，此係未進行飼養。在一些實施例中，此係未進行飼養，只要G-Rex培養瓶中之培養基駐留在約10 cm之高度。在一些實施例中，此係未進行飼養但添加一或多種細胞介素。在一些實施例中，細胞介素可作為推注添加，不需要將細胞介素與培養基混合。此類容器、裝置及方法為本領域中已知的且已用於擴增TIL，且包含以下中描述者：美國專利申請公開案第US 2014/0377739A1號、國際公開案第WO 2014/210036 A1號、美國專利申請公開案第us 2013/ 0115617 A1號、國際公開案第WO 2013/188427 A1號、美國專利申請公開案第US 2011/0136228 A1號、美國專利第US 8,809,050 B2號、國際公開案第WO 2011/072088 A2號、美國專利申請公開案第US 2016/0208216 A1號、美國專利申請公開案第US 2012/0244133 A1號、國際公開案第WO 2012/129201 A1號、美國專利申請公開案第US 2013/0102075 A1號、美國專利第US 8,956,860 B2號、國際公開案第WO 2013/173835 A1號、美國專利申請公開案第US 2015/0175966 A1號，其揭示內容以引用之方式併入本文中。此類程序亦描述於Jin等人, 《免疫療法雜誌》, 2012, 35:283-292中。 D.視情況進行的TIL中基因之減弱或剔除
在一些實施例中，本發明之經擴增之TIL在擴增步驟之前、期間或之後，包含在密閉無菌製造程序期間(各自如本文所提供)經進一步操作，以暫時性方式改變蛋白質表現。在一些實施例中，暫時性改變的蛋白質表現係因為暫時性基因編輯。在一些實施例中，本發明之經擴增之TIL用轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變TIL中之蛋白質表現的分子處理。在一些實施例中，TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現之分子提供TIL群體中改變的腫瘤抗原表現及/或改變腫瘤抗原特異性T細胞之數目。
在某些實施例中，該方法包括基因編輯TIL群體。在某些實施例中，該方法包括基因編輯第一TIL群體、第二TIL群體及/或第三TIL群體。
在一些實施例中，本發明包含經由核苷酸插入，諸如經由核糖核酸(RNA)插入，包含插入信使RNA(mRNA)或小(或短)干擾RNA(siRNA)至TIL群體中進行基因編輯，以促進一或多種蛋白質之表現或抑制一或多種蛋白質之表現以及同時促進一組蛋白質與抑制另一組蛋白質之組合。
在一些實施例中，本發明之經擴增之TIL經歷暫時性改變蛋白質表現。在一些實施例中，蛋白質表現之暫時性改變發生在第一次擴增之前的主體TIL群體，包含例如獲自例如圖8(特別是圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中所指示之步驟A的TIL群體。在一些實施例中，蛋白質表現之暫時性改變發生在第一次擴增期間，包含例如獲自例如圖8(例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中所指示之步驟B的TIL群體。在一些實施例中，蛋白質表現之暫時性改變發生在第一次擴增之後，包含例如在第一次擴增與第二次擴增之間轉變的TIL群體(例如本文所描述之第二TIL群體)，即獲自例如圖8中所指示之步驟B且包含在步驟C中的TIL群體。在一些實施例中，蛋白質表現之暫時性改變發生在第二次擴增之前的主體TIL群體，包含例如在獲自例如圖8中所指示之步驟C且在步驟D中擴增之前的TIL群體。在一些實施例中，蛋白質表現之暫時性改變發生在第二次擴增期間，包含例如在例如圖8中所指示之步驟D中擴增之TIL群體(例如第三TIL群體)。在一些實施例中，蛋白質表現之暫時性改變發生在第二次擴增之後，包含例如在獲自例如圖8中所指示之步驟D中之擴增的TIL群體。
在一些實施例中，暫時性改變TIL群體中之蛋白質表現之方法包含電穿孔之步驟。電穿孔方法為本領域中已知的，且描述於例如以下中：Tsong, 《生物物理學雜誌( Biophys. J.)》1991, 60, 297-306及美國專利申請公開案第2014/0227237 A1號，其各自之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，暫時性改變TIL群體中之蛋白質表現之方法包含磷酸鈣轉染之步驟。磷酸鈣轉染方法(磷酸鈣DNA沈澱、細胞表面包覆及胞吞作用)為本領域中已知的且描述於以下中：Graham及van der Eb, 《病毒學( Virology)》 1973, 52, 456-467；Wigler等人, 《美國國家科學院院刊( Proc. Natl. Acad. Sci.)》 1979, 76, 1373-1376；以及Chen及Okayarea, 《分子細胞生物學( Mol. Cell.Biol.)》 1987, 7, 2745-2752；及美國專利第5,593,875號，其各自之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，暫時性改變TIL群體中之蛋白質表現之方法包含脂質體轉染之步驟。脂質體轉染方法，諸如採用陽離子脂質 N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]- n,n,n-三甲基氯化銨(DOTMA)及二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)於過濾水中之1: 1(w/w)脂質體調配物之方法為本領域中已知的且描述於以下中：Rose等人, 《生物技術( Biotechniques)》 1991, 10,520-525及Felgner等人, 《美國國家科學院院刊》, 1987, 84,7413-7417，以及美國專利第5,279,833號、第5,908,635號、第6,056,938號、第6,110,490號、第6,534,484號及第7,687,070號，其各自之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，暫時性改變TIL群體中之蛋白質表現之方法包含使用以下中描述之方法之轉染步驟：美國專利第5,766,902號、第6,025,337號、第6,410,517號、第6,475,994 號及第7,189,705號，其各自之揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現使得幹細胞記憶T細胞(Stem Memory T cell；TSCM)增加。TSCM為抗原經歷之中樞記憶T細胞的早期前驅細胞。TSCM一般呈現定義幹細胞之長期存活、自我更新及多效能能力，且一般為產生有效TIL產物所需的。與授受性細胞轉移小鼠模型中的其他T細胞亞群相比，TSCM顯示出增強的抗腫瘤活性。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現產生具有包括較高TSCM比例之組成的TIL群體。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現使得TSCM百分比增加至少5%、至少10%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現使得TIL群體中之TSCM增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一些實施例中，蛋白質表現之暫時性產生具有至少至少5%、至少10%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95% TSCM之TIL群體。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現產生具有至少至少5%、至少10%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95% TSCM之治療性TIL群體。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現使得抗原經歷T細胞回春(rejuvenation)。在一些實施例中，回春包含例如增加增殖、增加T細胞活化及/或增加抗原識別。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現改變大部分T細胞之表現，以保留腫瘤源性TCR貯庫。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現不改變腫瘤源性TCR貯庫。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現維持腫瘤源性TCR貯庫。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質引起特定基因之表現改變。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向包含但不限於以下之基因：PD-1(又稱為PDCD1或CC279)、TGFBR2、CCR4/5、CBLB(CBL-B)、CISH、嵌合共刺激受體(chimeric co-stimulatory receptor；CCR)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、CTLA-4、TIM3、LAG3、TIGIT、TET2、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、胸腺細胞選擇相關高遷移率群組(high mobility group；HMG)盒(TOX)、錨蛋白重複域11(ANKRD11)、BCL6共抑制子(BCOR)及/或cAMP蛋白激酶A(PKA)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向選自由以下組成之群組之基因：PD-1、TGFBR2、CCR4/5、CTLA-4、CBLB(CBL-B)、CISH、嵌合共刺激受體(CCR)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TET2、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2 (MCP-1)、CCL3 (MIP-1α)、CCL4 (MIP1-β)、CCL5 (RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、胸腺細胞選擇相關高遷移率群組(HMG)盒(TOX)、錨蛋白重複域11(ANKRD11)、BCL6共抑制子(BCOR)及/或cAMP蛋白激酶A(PKA)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向PD-1。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向TGFBR2。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR4 / 5。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CTLA-4。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CBLB。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CISH。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR(嵌合共刺激受體)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-2。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-12。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-15。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-21。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向NOTCH 1/2 ICD。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向TIM3。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向LAG3。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向TIGIT。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向TET2。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向TGFβ。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR1。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR2。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR4。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR5。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCR1。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCR2。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CSCR3。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL2(MCP-1)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL3(MIP-1α)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL4(MIP1-β)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL5(RANTES)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCL1。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCL8。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL22。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL17。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向VHL。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CD44。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向PIK3CD。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向SOCS1。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向胸腺細胞選擇相關之高遷移率群組(HMG)盒(TOX)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向錨蛋白重複域11(ANKRD11)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向BCL6輔抑制物(BCOR)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向cAMP蛋白激酶A(PKA)。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起趨化激素受體增加及/或過度表現。在一些實施例中，因暫時性蛋白質表現而過度表現之趨化激素受體包含具有配體之受體，該配體包含但不限於CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1、CXCL8、CCL22及/或CCL17。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起PD-1、CTLA-4、CBLB、CISH、TIM-3、LAG-3、TIGIT、TET2、TGFβR2及/或TGFβ之表現降低及/或減少(包含引起例如TGFβ路徑阻斷)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起PD-1之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起CBLB(CBL-B)之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起CISH之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起TIM-3之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起LAG-3之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起TIGIT之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起TET2之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起TGFβR2之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起TGFβ之表現降低及/或減少。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起趨化激素受體增加及/或過度表現，以例如改善TIL運輸或運動至腫瘤部位。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起嵌合共刺激受體(CCR)增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起選自由以下組成之群組之趨化激素受體增加及/或過度表現：CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2及/或CSCR3。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起介白素增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起選自由以下組成之群組之介白素增加及/或過度表現：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18及/或IL-21。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起NOTCH 1/2 ICD增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起VHL增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起CD44增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起PIK3CD增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起SOCS1增加及/或過度表現。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起cAMP蛋白激酶A(PKA)之表現降低及/或減少。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起選自由以下組成之群組之分子之表現降低及/或減少：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及其組合。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起選自由以下組成之群組之兩個分子之表現降低及/或減少：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及其組合。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起PD-1及選自由以下組成之群組之一個分子之表現降低及/或減少：LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及其組合。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起以下之表現降低及/或減少：PD-1、CTLA-4、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3、TIGIT及其組合。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起PD-1及以下之一之表現降低及/或減少：CTLA-4、LAG3、CISH、CBLB、TIM3、TIGIT、TET2及其組合。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起PD-1及CTLA-4之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起PD-1及LAG3之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起PD-1及CISH之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起PD-1及CBLB之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起PD-1及TIM3之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起PD-1及TIGIT之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起PD-1及TET2之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起CTLA-4及LAG3之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起CTLA-4及CISH之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起CTLA-4及CBLB之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起CTLA-4及TIM3之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起CTLA-4及TIGIT之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起CTLA-4及TET2之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起LAG3及CISH之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起LAG3及CBLB之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起LAG3及TIM3之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起LAG3及TIGIT之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起LAG3及TET2之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起CISH及CBLB之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起CISH及TIM3之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起CISH及TIGIT之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起CISH及TET2之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起CBLB及TIM3之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起CBLB及TIGIT之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起CBLB及TET2之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起TIM3及PD-1之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起TIM3及LAG3之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起TIM3及CISH之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起TIM3及CBLB之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起TIM3及TIGIT之表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起TIM3及TET2之表現降低及/或減少。
在一些實施例中，選自由CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及其組合組成之群組之黏著分子藉由γ逆轉錄病毒或慢病毒方法插入第一TIL群體、第二TIL群體或所收集TIL群體中(例如黏著分子之表現增加)。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及其組合組成之群組之分子的表現降低及/或減少，以及CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及其組合的表現增加及/或增強。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現引起選自由PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、CISH、CBLB、TIGIT、TET2及其組合組成之群組之分子的表現降低及/或減少，以及CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及其組合的表現增加及/或增強。
在一些實施例中，表現減少約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約80%。在一些實施例中，表現減少至少約85%。在一些實施例中，表現減少至少約90%。在一些實施例中，表現減少至少約95%。在一些實施例中，表現減少至少約99%。
在一些實施例中，表現增加約5% 、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現增加至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現增加至少約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現增加至少約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現增加至少約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現增加至少約80%。在一些實施例中，表現增加至少約85%。在一些實施例中，表現增加至少約90%。在一些實施例中，表現增加至少約95%。在一些實施例中，表現增加至少約99%。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現藉由用轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變TIL中之蛋白質表現之分子處理TIL來誘導。在一些實施例中，採用無SQZ載體之微流體平台進行轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現之分子的細胞內遞送。展示將包含轉錄因子在內之蛋白質遞送至包含T細胞在內之多種初代人類細胞之能力的該等方法已描述於以下中：美國專利申請公開案第2019/0093073 A1號、第US 2018/0201889 A1號及US 2019/0017072 A1號，其各自之揭示內容以引用之方式併入本文中。此類方法可用於本發明中，以將TIL群體暴露於轉錄因子(TF)及/或其他能夠誘導暫時性蛋白質表現之分子，其中該等TF及/或其他能夠誘導暫時性蛋白質表現之分子使得TIL群體中腫瘤抗原之表現增加及/或腫瘤抗原特異性T細胞之數目增加，由此引起TIL群體重新程式化及重新程式化之TIL群體之治療功效相較於未重新程式化之TIL群體增加。在一些實施例中，重新程式化使得相對於開始或先前TIL群體(亦即，在重新程式化之前)，效應T細胞及/或中樞記憶T細胞亞群增加，如本文所描述。
在一些實施例中，轉錄因子(TF)包含但不限於TCF-1、NOTCH 1/2 ICD及/或MYB。在一些實施例中，轉錄因子(TF)為TCF-1。在一些實施例中，轉錄因子(TF)為NOTCH 1/2 ICD。在一些實施例中，轉錄因子(TF)為MYB。在一些實施例中，轉錄因子(TF)與誘導性富潛能幹細胞培養物(iPSC)，諸如市售KNOCKOUT血清替代品(Gibco/ThermoFisher)一起投與，以誘導另外TIL重新程式化。在一些實施例中，轉錄因子(TF)與iPSC混合物一起投與，以誘導另外TIL重新程式化。在一些實施例中，轉錄因子(TF)不與iPSC混合物一起投與。在一些實施例中，重新程式化使得TSCM之百分比增加。在一些實施例中，重新程式化使得TSCM之百分比增加約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%之TSCM。
在一些實施例中，如上文所描述之暫時性改變蛋白質表現之方法可與遺傳修飾TIL群體之方法組合，包含穩定併入基因以產生一或多種蛋白質之步驟。在某些實施例中，該方法包括遺傳修飾TIL群體之步驟。在某些實施例中，該方法包括遺傳修飾第一TIL群體、第二TIL群體及/或第三TIL群體。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含逆轉錄病毒轉導之步驟。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含慢病毒轉導之步驟。慢病毒轉導系統為本領域中已知的且描述於例如以下中：Levine等人, 《美國國家科學院院刊》2006, 103,17372-77；Zufferey等人, 《自然生物技術學》1997, 15,871-75；Dull等人, 《病毒學雜誌》 1998, 72, 8463-71及美國專利第6,627,442號，其各自之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含γ-逆轉錄病毒轉導之步驟。γ-逆轉錄病毒轉導系統為本領域中已知的且描述於例如Cepko及Pear, 《分子生物學中之當前方案( Cur.Prot.Mol. Biol.)》1996, 9.9.1-9.9.16，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含轉位子介導之基因轉移之步驟。轉位子介導之基因轉移系統為本領域中已知的，且包含其中轉位酶作為DNA表現載體或作為可表現的RNA或蛋白質提供，使得轉位酶之長期表現不發生在轉殖基因細胞中，例如提供為mRNA(例如包括帽及多腺苷酸尾之mRNA)的轉位酶。包含類鮭魚型Tel樣轉位酶(SB或睡美人轉位酶)，諸如SB10、SB11及SB100x；及酶活性增加之經工程改造酶之合適的轉位子介導之基因轉移系統描述於例如以下中：Hackett等人, 《分子療法》2010, 18,674-83及美國專利第6,489,458號，其各自之揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，暫時性改變TIL中之蛋白質表現係由小干擾RNA(siRNA)誘導，該小干擾RNA有時稱為短干擾RNA或靜默RNA，其為雙股RNA分子，長度一般為19-25個鹼基對。siRNA被用於RNA干擾(RNAi)中，其中siRNA干擾具有互補核苷酸序列之特定基因之表現。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現為表現減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現係由自我遞送RNA干擾(sdRNA)誘導，該自我遞送RNA干擾為具有高百分比之2'-OH取代(典型地為氟或-OCH 3)的化學合成之不對稱siRNA雙螺旋，其包括20個核苷酸之反義(引導)股及使用四乙基乙二醇(TEG)連接子在其3'端處與膽固醇結合之13至15個鹼基有義(乘客(passenger))股。小干擾RNA(siRNA)，有時稱為短干擾RNA或靜默RNA，為雙股RNA分子，長度一般為19-25個鹼基對。siRNA被用於RNA干擾(RNAi)中，其中siRNA干擾具有互補核苷酸序列之特定基因之表現。sdRNA係進入細胞不需要遞送媒介之共價且疏水性修飾之RNAi化合物。sdRNA一般為具有極小雙股區之不對稱化學修飾核酸分子。sdRNA分子典型地含有單股區及雙股區，且可在分子之單股及雙股區內含有各種化學修飾。另外，如本文所描述，sdRNA分子可與疏水性結合物，諸如習知及高級固醇型分子連接。sdRNA及製備此類sdRNA之相關方法亦已廣泛描述於例如以下中：美國專利申請公開案第US 2016/0304873 A1號、第US 2019/ 0211337 A1號、第US 2009/0131360 A1號及第US 2019/ 0048341 A1號，及美國專利第10,633,654號及第10,913,948B2號，其各自之揭示內容以引用之方式併入本文中。為了最佳化sdRNA結構、化學性質、靶向位置、序列偏好及類似特性，已開發一種演算法且將其用於sdRNA效力預測。基於此等分析，功能性sdRNA序列一般定義為在1 µM濃度下表現減少超過70%，其中幾率超過40%。
雙股DNA(dsRNA)一般可用以定義包括一對互補RNA股，一般為有義(乘客)及反義(引導)股之任何分子，且可包含單股懸垂臂區。與siRNA不同，術語dsRNA一般係指包含siRNA分子之序列之前驅物分子，該siRNA分子藉由裂解酶系統(包含Dicer)之作用自較大dsRNA分子釋放。
在一些實施例中，該方法包括暫時性改變TIL群體(包含經修飾以表現CCR之TIL)中之蛋白質表現，包括使用自我遞送RNA干擾(sdRNA)，sdRNA係例如具有較高百分比之2'-OH取代(典型地為氟或OCH 3)的化學合成之不對稱siRNA雙螺旋，其包括20個核苷酸之反義(引導)股及使用四乙基乙二醇(TEG)連接子在其3'端處與膽固醇結合的13至15個鹼基有義(乘客)股。使用siRNA及sdRNA之方法已描述於以下中：Khvorova及Watts, 《自然生物技術學( Nat. Biotechnol.)》2017, 35, 238-248；Byrne等人, 《眼藥理學與治療學雜誌( J. Ocul.Pharmacol.Ther.)》 2013, 29,855-864；及Ligtenberg等人, 《分子療法( Mol.Therapy)》2018, 26,1482-93，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一個實施例中，siRNA之遞送係使用電穿孔或細胞膜破壞(諸如擠壓或SQZ方法)來完成。在一些實施例中，將sdRNA遞送至TIL群體無需使用電穿孔、SQZ或其他方法，而是使用1至3天的時間即可完成，其中將TIL群體暴露於在培養基中濃度為1 μM/10,000個TIL的sdRNA。在某些實施例中，該方法包括將siRNA或sdRNA遞送至TIL群體，包括將TIL群體暴露於在培養基中濃度為1 μM/10,000個TIL之sdRNA，保持在1至3天之間的時段。在一些實施例中，將sdRNA遞送至TIL群體係使用1至3天時段完成，其中使TIL群體暴露於在培養基中濃度為10 µM/10,000個TIL之sdRNA。在一些實施例中，將sdRNA遞送至TIL群體係使用1至3天時段完成，其中使TIL群體暴露於在培養基中濃度為50 µM/10,000個TIL之sdRNA。在一些實施例中，將sdRNA遞送至TIL群體係使用1至3天時段完成，其中將TIL群體暴露於在培養基中濃度在0.1 µM/10,000個TIL與50 µM/10,000個TIL之間的sdRNA。在一些實施例中，將sdRNA遞送至TIL群體係使用1至3天時段完成，其中使TIL群體暴露於在培養基中濃度在0.1 µM/10,000個TIL與50 µM/10,000個TIL之間的sdRNA，其中該暴露於sdRNA係藉由將新鮮sdRNA添加至培養基中進行兩次、三次、四次或五次。其他適合程序描述於例如以下中：美國專利申請公開案第US 2011/0039914 A1號、第US 2013/0131141 A1號及第US 2013/0131142 A1號，以及美國專利第9,080,171號，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，在製造期間將siRNA或sdRNA插入TIL群體中。在某些實施例中，sdRNA編碼干擾NOTCH 1/2 ICD、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβ、TGFBR2、cAMP蛋白激酶A(PKA)、BAFF BR3、CISH及/或CBLB之RNA。在一些實施例中，表現減少係基於例如藉由流動式細胞測量術及/或qPCR評定的基因靜默之百分比來測定。在一些實施例中，表現減少約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約80%。在一些實施例中，表現減少至少約85%。在一些實施例中，表現減少至少約90%。在一些實施例中，表現減少至少約95%。在一些實施例中，表現減少至少約99%。
基於siRNA之化學修飾的自我遞送RNAi技術可與本發明之方法一起使用，以將sdRNA成功遞送至如本文所描述之TIL。主鏈修飾與不對稱siRNA結構及疏水性配體之組合(參見例如Ligtenberg等人, 《分子療法》2018, 26, 1482-93及美國專利申請公開案第2016/0304873 A1號，其揭示內容以引用的方式併入本文中)允許sdRNA藉由簡單地添加至培養基中，利用sdRNA之核酸酶穩定性而穿透經培養之哺乳動物細胞，無需額外的調配物及方法。此穩定性允許簡單地藉由維持培養基中sdRNA之活性濃度來支持恆定水準的RNAi介導之目標基因活性降低。儘管不受理論束縛，但sdRNA之主鏈穩定使得基因表現減少效應延長，此在非分裂細胞中可持續數月。
在一些實施例中，TIL的轉染效率超過95%，且出現由各種特定siRNA或sdRNA引起的目標表現減少。在某些實施例中，將含有若干未修飾核糖殘基之siRNA或sdRNA替換為完全修飾的序列，以增加RNAi效應之效力及/或持久性。在一些實施例中，表現減少效應維持12小時、24小時、36小時、48小時、5天、6天、7天或8天或更長時間。在一些實施例中，表現減少效應在siRNA或sdRNA處理TIL後10天或更長時間時降低。在一些實施例中，目標表現維持超過70%之表現減少。在一些實施例中，TIL中之目標表現維持超過70%之表現減少。在一些實施例中，PD-1/PD-L1路徑中之表現減少允許TIL展現更強效的活體內效應，此在一些實施例中係因為避免PD-1/PD-L1路徑之抑制效應。在一些實施例中，由siRNA或sdRNA引起的PD-1表現減少使得TIL增殖增加。
在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列展現目標基因表現之70%減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列展現目標基因表現之75%減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列展現目標基因表現之80%減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列展現目標基因表現之85%減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列展現目標基因表現之90%減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列展現目標基因表現之95%減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列展現目標基因表現之99%減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列當以約0.25 µM至約4 µM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列當以約0.25 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列當以約0.5 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列當以約0.75 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列當以約1.0 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列當以約1.25 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列當以約1.5 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列當以約1.75 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列當以約2.0 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列當以約2.25 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列當以約2.5 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列當以約2.75 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列當以約3.0 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列當以約3.25 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列當以約3.5 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列當以約3.75 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明中使用之sdRNA序列當以約4.0 μM之濃度遞送時展現目標基因表現減少。
在一些實施例中，siRNA或sdRNA寡核苷酸劑包括一或多種增加治療劑之穩定性及/或有效性且實現寡核苷酸至待治療細胞或組織之有效遞送的修飾。此類修飾可包含2'-O-甲基修飾、2'-O-氟修飾、二硫代磷酸酯修飾、2' F修飾之核苷酸、2'-O-甲基修飾之核苷酸及/或2'去氧核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸經修飾成包含一或多個疏水性修飾，包含例如固醇、膽固醇、維生素D、萘基、異丁基、苯甲基、吲哚、色胺酸及/或苯基。在一些實施例中，化學修飾之核苷酸為硫代磷酸酯、2'-O-甲基、2'去氧、疏水性修飾及硫代磷酸酯之組合。在一些實施例中，糖可經修飾且經修飾之糖可包含但不限於D-核糖、2'-O-烷基(包含2'-O-甲基及2'-0-乙基)，亦即2'-烷氧基、2'-胺基、2'-S-烷基、2'-鹵基(包含2'-氟)、T-甲氧基乙氧基、2'-烯丙氧基(-OCH 2CH=CH 2)、2'-炔丙基、2'-丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基及氰基，及類似基團。在一些實施例中，糖部分可為己醣且併入寡核苷酸中，如Augustyns等人, 《核酸研究( Nucl.Acids.Res.)》 1992, 18,4711，其揭示內容以引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之雙股siRNA或sdRNA寡核苷酸在其整個長度上為雙股的，亦即，在分子的任一端處皆無懸垂的單股序列，亦即為鈍端的。在一些實施例中，個別核酸分子可具有不同長度。換言之，本發明之雙股siRNA或sdRNA寡核苷酸在其整個長度上並非雙股的。舉例而言，當使用兩個獨立的核酸分子時，其中一個分子，例如包括反義序列之第一分子，可比與其雜交之第二分子要長(留下一部分之分子為單股的)。在一些實施例中，當使用單個核酸分子時，在任一端處的該分子之一部分可保持單股。
在一些實施例中，本發明之雙股siRNA或sdRNA寡核苷酸含有錯配及/或環或凸起，但在該寡核苷酸之至少約70%長度上為雙股的。在一些實施例中，本發明之雙股寡核苷酸在該寡核苷酸之至少約80%長度上為雙股的。在其他實施例中，本發明之雙股siRNA或sdRNA寡核苷酸在該寡核苷酸之至少約90%-95%長度上為雙股的。在一些實施例中，本發明之雙股siRNA或sdRNA寡核苷酸在該寡核苷酸之至少約96%-98%長度上為雙股的。在一些實施例中，本發明之雙股寡核苷酸含有至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個錯配。
在一些實施例中，siRNA或sdRNA寡核苷酸可例如藉由修飾3'或5'鍵聯而實質上受到保護以免受核酸酶的影響，如美國專利第5,849,902號及WO 98/13526中所描述，其揭示內容以引用的方式併入本文中。舉例而言，寡核苷酸可藉由納入「阻斷基團」而具有抗性。如本文所使用，術語「阻斷基團」係指可作為用於合成之保護基或偶合基團與寡核苷酸或核單體連接之取代基(例如除OH基團以外)(例如FITC、丙基(CH 2-CH 2-CH 3)、二醇(-0-CH 2-CH 2-O-)磷酸根(PO 3 2")、膦酸氫根或胺基亞磷酸酯)。「阻斷基團」亦可包含「末端阻斷基團」或「核酸外切酶阻斷基團」，其保護寡核苷酸之5'及3'端，包含經修飾的核苷酸及非核苷酸核酸外切酶抗性結構。
在一些實施例中，siRNA或sdRNA內之至少一部分連續聚核苷酸藉由取代基鍵聯，例如硫代磷酸酯鍵聯連接。
在一些實施例中，化學修飾可使siRNA或sdRNA之細胞攝取有至少1.5%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、150%、155%、160%、165%、170%、175%、180%、185%、190%、195%、200%、225%、250%、275%、300%、325%、350%、375%、400%、425%、450%、475%、500%增強。在一些實施例中，C或U殘基中之至少一個包含疏水性修飾。在一些實施例中，複數個C及U含有疏水性修飾。在一些實施例中，至少10%、15%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或至少95%之C及U可含有疏水性修飾。在一些實施例中，所有C及U均含有疏水性修飾。
在一些實施例中，siRNA或sdRNA分子經由併入可質子化胺而展現增強的胞內體釋放。在一些實施例中，將可質子化胺併入有義股中(在RISC裝載後捨棄的分子部分中)。在一些實施例中，本發明之siRNA或sdRNA化合物包括不對稱化合物，該不對稱化合物包括雙螺旋區(有效RISC進入所需，10-15個鹼基長)及4-12個核苷酸長之單股區；具有13個核苷酸的雙螺旋。在一些實施例中，採用6個核苷酸的單股區。在一些實施例中，siRNA或sdRNA之單股區包括2-12個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯(稱為硫代磷酸酯修飾)。在一些實施例中，採用6-8個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，本發明之siRNA或sdRNA化合物亦包含獨特的化學修飾模式，其提供穩定性且與RISC進入相容。舉例而言，引導股亦可藉由任何證實穩定性而不干擾RISC進入之化學修飾來修飾。在一些實施例中，引導股中之化學修飾模式包含大部分為2' F修飾且5'端經磷酸化之C及U核苷酸。
在一些實施例中，siRNA或sdRNA中至少30%之核苷酸為經修飾的。在一些實施例中，siRNA或sdRNA中至少30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之核苷酸為經修飾的。在一些實施例中，siRNA或sdRNA中100%之核苷酸為經修飾的。
在一些實施例中，siRNA或sdRNA分子具有極少雙股區。在一些實施例中，分子之雙股區介於8-15個核苷酸長範圍內。在一些實施例中，分子之雙股區為8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸長。在一些實施例中，雙股區為13個核苷酸長。引導股與乘客股之間可有100%互補性，或引導股與乘客股之間可存在一或多個錯配。在一些實施例中，在雙股分子之一端上，分子為鈍端或具有一個核苷酸之懸垂臂。分子之單股區在一些實施例中係介於4-12個核苷酸長。在一些實施例中，單股區可為4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸長。在一些實施例中，單鏈區亦可小於4個核苷酸或大於12個核苷酸長。在某些實施例中，單股區為6或7個核苷酸長。
在一些實施例中，siRNA或sdRNA分子具有增加的穩定性。在一些情況下，化學修飾之siRNA或sdRNA分子在培養基中之半衰期長於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或超過24小時，包含任何中間值。在一些實施例中，siRNA或sd-RNA在培養基中之半衰期長於12小時。
在一些實施例中，對siRNA或sdRNA進行最佳化以增加效力及/或減少毒性。在一些實施例中，引導股及/或乘客股之核苷酸長度及/或引導股及/或乘客股中硫代磷酸酯修飾之數目在一些態樣中可影響RNA分子之效能，而用2'-0-甲基(2'OMe)修飾置換2'-氟(2'F)修飾在一些態樣中可影響分子之毒性。在一些實施例中，預期減少分子之2'F含量將減少分子之毒性。在一些實施例中，RNA分子中硫代磷酸酯修飾之數目可影響攝取分子至細胞中，例如被動攝取分子至細胞中之效率。在一些實施例中，siRNA或sdRNA不具有2' F修飾，但其特徵為細胞攝取與組織滲透方面之功效相等。
在一些實施例中，引導股之長度為大約18-19個核苷酸且具有大約2-14個磷酸酯修飾。舉例而言，引導股可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或超過14個經磷酸酯修飾之核苷酸。引導股可含有一或多個賦予增加的穩定性而不干擾RISC進入之修飾。磷酸酯修飾的核苷酸，諸如硫代磷酸酯修飾的核苷酸，可在3'端、5'端或遍佈於整個引導股中。在一些實施例中，引導股之3'端10個核苷酸含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個硫代磷酸酯修飾的核苷酸。引導股亦可含有2'F及/或2'OMe修飾，其可位於整個分子中。在一些實施例中，引導股中位置一之核苷酸(引導股之最5'位置中之核苷酸)經2'OMe修飾及/或磷酸化。引導股內之C及U核苷酸可經2'F修飾。舉例而言，19個核苷酸之引導股之位置2-10(或不同長度之引導股中之對應位置)中之C及U核苷酸可經2'F修飾。引導股內之C及U核苷酸亦可經2'OMe修飾。舉例而言，l9個核苷酸之引導股之位置11-18(或不同長度之引導股中之對應位置)中之C及U核苷酸可經2'OMe修飾。在一些實施例中，在引導股之最3'端處之核苷酸未經修飾。在某些實施例中，引導股內之大部分C及U經2'F修飾，且引導股之5'端經磷酸化。在其他實施例中，位置1及位置11-18中之C或U經2'OMe修飾，且引導股之5'端經磷酸化。在其他實施例中，位置1及位置11-18中之C或U經2'OMe修飾，引導股之5'端經磷酸化，且位置2-10中之C或U經2'F修飾。
自我可遞送RNAi技術提供一種直接用RNAi劑(無論是siRNA、sdRNA或是其他RNAi劑)轉染細胞而無需另外調配物或技術之方法。轉染難以轉染細胞株之能力、高活體內活性及使用簡單為該等組成物及方法之特徵，其相對於基於siRNA之傳統技術存在顯著的功能優勢，且因此在關於減少本發明之TIL中目標基因表現之方法之若干實施例中採用sdRNA方法。sdRNA方法允許將化學合成之化合物直接遞送至廣泛範圍之離體及活體內初代細胞及組織。在本文中本發明之一些實施例中描述之sdRNA可購自美國馬薩諸塞州伍斯特之Advirna LLC。
siRNA及sdRNA可以形成為疏水性修飾之siRNA-反義寡核苷酸雜合結構，且揭示於例如在Byrne等人, 《眼藥理學與治療學雜誌》2013, 29, 855-864，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，siRNA或sdRNA寡核苷酸可使用無菌電穿孔遞送至本文所描述之TIL。在某些實施例中，該方法包括無菌電穿孔TIL群體以遞送siRNA或sdRNA寡核苷酸。
在一些實施例中，寡核苷酸可與跨膜遞送系統組合遞送至細胞。在一些實施例中，此跨膜遞送系統包括脂質、病毒載體及類似物。在一些實施例中，寡核苷酸劑為不需要任何遞送劑之自我遞送RNAi劑。在某些實施例中，該方法包括使用跨膜遞送系統來遞送siRNA或sdRNA寡核苷酸至TIL群體。
使寡核苷酸及寡核苷酸組成物與本文所描述之TIL接觸(例如使其接觸，在本文中亦稱為投與或遞送至)且被攝入，包含經由TIL被動攝取。sdRNA可在第一次擴增期間(例如步驟B)、在第一次擴增之後(例如在步驟C期間)、在第二次擴增之前或期間(例如在步驟D之前或期間)、在步驟D之後且在步驟E中收集之前、在步驟F中收集期間或之後、在步驟F中最終調配及/或轉移至輸注袋之前或期間，以及在步驟F中任何視情況進行之冷凍保存步驟之前添加至如本文所描述之TIL中。另外，sdRNA可在步驟F中自任何冷凍保存步驟解凍之後添加。在一些實施例中，可將一或多種靶向如本文所描述之基因(包含PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH、CTLA-4、TIGIT、TET2及CBLB)的sdRNA以選自由以下組成之群組的濃度添加至包括TIL及其他試劑之細胞培養基中：100 nM至20 mM、200 nM至10 mM、500 nM至1 mM、1 µM至100 µM及1 µM至100 µM。在一些實施例中，可將一或多個靶向如本文所描述之基因(包含PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH、CTLA-4、TIGIT、TET2及CBLB)的sdRNA以選自由以下組成之群組的量添加至包括TIL及其他試劑之細胞培養基中：0.1 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、0.5 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、0.75 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、1 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、1.25 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、1.5 μM sdRNA/ 10,000個TIL/100 μL培養基、2 μM sdRNA/10,000個TIL/ 100 μL培養基、5 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基或10 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基。在一些實施例中，可將一個或多個靶向如本文中所描述之基因(包含PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH、CTLA-4、TIGIT、TET2CBLB)之sdRNA在pre-REP或REP階段期間一天兩次、一天一次、每兩天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至TIL培養物中。
本發明之寡核苷酸組成物，包含sdRNA，可在擴增程序期間，例如藉由將高濃度sdRNA溶解於細胞培養基中並允許被動攝取足夠時間而與如本文所描述之TIL接觸。在某些實施例中，本發明方法包括使TIL群體與如本文所描述之寡核苷酸組成物接觸。在某些實施例中，該方法包括將寡核苷酸，例如sdRNA，溶解於細胞培養基中，且使細胞培養基與TIL群體接觸。TIL可為如本文所描述之第一群體、第二群體及/或第三群體。
在一些實施例中，將寡核苷酸遞送至細胞中可藉由適合的本領域公認之方法增強，包含磷酸鈣、DMSO、甘油或聚葡萄糖、電穿孔或藉由轉染，例如使用陽離子性、陰離子性或中性脂質組成物或脂質體，使用本領域中已知的方法，諸如描述於以下之方法轉染：美國專利第4,897,355號；第5,459,127號；第5,631,237號；第5,955,365號；第5,976,567號；第10,087,464號；及第10,155,945號；及Bergan等人, 《核酸研究)》1993, 21, 3567，其各自之揭示內容以引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，使用超過一種siRNA或sdRNA來減少目標基因之表現。在一些實施例中，將靶向PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3、CTLA-4、TIGIT、TET2及/或CISH之siRNA或sdRNA中之一或多者一起使用。在一些實施例中，將PD-1 siRNA或sdRNA與TIM-3、CBLB、LAG3、CTLA-4、TIGIT、TET2及/或CISH中之一或多者一起使用，以減少超過一個基因目標之表現。在一些實施例中，將LAG3 siRNA或sdRNA與靶向CISH之siRNA或sdRNA組合使用，以減少兩個目標之基因表現。在一些實施例中，本文中靶向PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3、CTLA-4、TIGIT、TET2及/或CISH中之一或多者的siRNA或sdRNA可商購自美國馬薩諸塞州伍斯特市(Worcester, MA, USA)的Advirna LLC或多個其他供應商。
在一些實施例中，siRNA或sdRNA靶向選自由以下組成之群組之基因：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及其組合。在一些實施例中，siRNA或sdRNA靶向選自由以下組成之群組之基因：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及其組合。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向PD-1且另一種siRNA或sdRNA靶向選自由以下組成之群組之基因：LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及其組合。在一些實施例中，siRNA或sdRNA靶向選自以下之基因：PD-1、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2及其組合。在一些實施例中，siRNA或sdRNA靶向選自PD-1及以下中之一者之基因：LAG3、CISH、CBLB、TIM3及其組合。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向PD-1，且一種siRNA或sdRNA靶向LAG3。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向PD-1，且一種siRNA或sdRNA靶向CISH。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向PD-1，且一種siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向PD-1，且一種siRNA或sdRNA靶向TIM3。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向PD-1，且一種siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向PD-1，且一種siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向PD-1，且一種siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向LAG3，且一種siRNA或sdRNA靶向CISH。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向LAG3，且一種siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向LAG3，且一種siRNA或sdRNA靶向TIM3。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向LAG3，且一種siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向LAG3，且一種siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向LAG3，且一種siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CISH，且一種siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CISH，且一種siRNA或sdRNA靶向TIM3。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CISH，且一種siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CISH，且一種siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CISH，且一種siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CBLB，且一種siRNA或sdRNA靶向TIM3。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CBLB，且一種siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CBLB，且一種siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CBLB，且一種siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向TIM3，且一種siRNA或sdRNA靶向PD-1。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向TIM3，且一種siRNA或sdRNA靶向LAG3。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向TIM3，且一種siRNA或sdRNA靶向CISH。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向TIM3，且一種siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向TIM3，且一種siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向TIM3，且一種siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向TIM3，且一種siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CTLA-4，且一種siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向CTLA-4，且一種siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些實施例中，一種siRNA或sdRNA靶向TIGIT，且一種siRNA或sdRNA靶向TET2。
如本文所論述，本發明之實施例提供已經由基因編輯進行遺傳修飾以增強其治療作用的腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。本發明之實施例涵蓋經由核苷酸插入(RNA或DNA)TIL群體中進行之基因編輯，以促進一或多種蛋白質之表現及抑制一或多種蛋白質之表現以及其組合本發明之實施例亦提供用於將TIL擴增為治療性群體之方法，其中該等方法包括基因編輯TIL。存在若干種可用於遺傳修飾TIL群體之基因編輯技術，該等基因編輯技術適合於根據本發明使用。此類方法包含下文描述的方法以及本文別處描述的病毒及轉位子方法。在一些實施例中，遺傳修飾TIL、MIL或PBL以表現CCR之方法亦可包含經由穩定敲除此類基因或暫時減弱此類基因來抑制基因表現的修飾。
在一些實施例中，該方法包括遺傳修飾如本文所描述之第一群體、第二群體及/或第三群體中之TIL群體的方法。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含穩定併入用於產生或抑制(例如靜默)一或多種蛋白質之基因的步驟。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含電穿孔之步驟。電穿孔方法為本領域中已知的，且描述於例如以下中：Tsong, 《生物物理雜誌( Biophys.J.)》1991, 60, 297-306及美國專利申請公開案第2014/0227237 A1號，其各自之揭示內容以引用之方式併入本文中。可使用本領域中已知之其他電穿孔方法，諸如以下中描述之彼等電穿孔方法：美國專利第5,019,034號、第5,128,257號、第5,137,817號、第5,173,158號、第5,232,856號、第5,273,525號、第5,304,120號、第5,318,514號、第6,010,613號及第6,078,490號，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，電穿孔方法為無菌電穿孔方法。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，其包括用脈衝電場處理TIL以改變、操作或引起TIL中之限定及受控制的永久性或暫時性變化之步驟，包括向TIL施加一系列至少三個單一、操作者控制之獨立程式化的DC電脈衝之步驟，場強度等於或大於100 V/cm，其中該一系列至少三個DC電脈衝具有一個、兩個或三個以下特徵：(1)該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝振幅上彼此不同；(2)該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝寬度上彼此不同；及(3)第一組該至少三個脈衝中兩者的第一脈衝間隔與第二組該至少三個脈衝中兩者的第二脈衝間隔不同。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，其包括用脈衝電場處理TIL以改變、操作或引起TIL中之限定及受控制的永久性或暫時性變化之步驟，包括向TIL施加一系列至少三個單一、操作者控制之獨立程式化的DC電脈衝之步驟，場強度等於或大於100 V/cm，其中該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝振幅上彼此不同。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，其包括用脈衝電場處理TIL以改變、操作或引起TIL中之限定及受控制的永久性或暫時性變化之步驟，包括向TIL施加一系列至少三個單一、操作者控制之獨立程式化的DC電脈衝之步驟，場強度等於或大於100 V/cm，其中該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝寬度上彼此不同。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，其包括用脈衝電場處理TIL以改變、操作或引起TIL中之限定及受控制的永久性或暫時性變化之步驟，包括向TIL施加一系列至少三個單一、操作者控制之獨立程式化的DC電脈衝之步驟，場強度等於或大於100 V/cm，其中第一組該至少三個脈衝中兩者的第一脈衝間隔與第二組該至少三個脈衝中兩者的第二脈衝間隔不同。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，其包括用脈衝電場處理TIL以誘導TIL中孔形成之步驟，包括向TIL施加一系列至少三個DC電脈衝之步驟，場強度等於或大於100 V/cm，其中該一系列至少三個DC電脈衝具有一個、兩個或三個以下特徵：(1)該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝振幅上彼此不同；(2)該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝寬度上彼此不同；及(3)第一組該至少三個脈衝中兩者的第一脈衝間隔與第二組該至少三個脈衝中兩者的第二脈衝間隔不同，使得所誘導的孔持續相對長的時段，及使得維持TIL之存活性。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含磷酸鈣轉染之步驟。磷酸鈣轉染方法(磷酸鈣DNA沈澱、細胞表面包覆及胞吞作用)為本領域中已知的且描述於以下中：Graham及van der Eb, 《病毒學》 1973, 52, 456-467；Wigler等人, 《美國國家科學院院刊》 1979, 76, 1373-1376；及Chen及Okayarea, 《分子細胞生物學》1987, 7, 2745-2752；及美國專利第5,593,875號，其各自之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含脂質體轉染之步驟。脂質體轉染方法，諸如採用陽離子脂質 N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]- n, n,n-三甲基氯化銨(DOTMA)及二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)於過濾水中之1: 1(w/w)脂質體調配物之方法為本領域中已知的且描述於以下中：Rose等人, 《生物技術》 1991, 10, 520-525及Felgner等人, 《美國國家科學院院刊》, 1987, 84, 7413-7417以及美國專利第5,279,833號、第5,908,635號、第6,056,938號、第6,110,490號、第6,534,484號及第7,687,070號，其各自之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，遺傳修飾TIL群體之方法包含使用以下中描述之方法進行轉染之步驟：美國專利第5,766,902號、第6,025,337號、第6,410,517號、第6,475,994號及第7,189,705號，其各自之揭示內容以引用之方式併入本文中。TIL可為如本文所描述之第一TIL群體、第二TIL群體及/或第三TIL群體。
根據一實施例，基因編輯方法可包括使用介導在一或多個免疫檢查點基因處產生雙股或單股斷裂之可程式化核酸酶。此類可程式化核酸酶藉由在特定基因體基因座處引入斷裂而能夠進行精確基因體編輯，亦即其依賴於識別基因體內之特定DNA序列以將核酸酶域靶向此位置且介導在目標序列處產生雙股斷裂。DNA中之雙股斷裂隨後將內源性修復機制募集至斷裂位點，以藉由非同源末端連接(NHEJ)或同源定向修復(HDR)來介導基因體編輯。因此，斷裂之修復可導致引入擾亂(例如靜默、抑制或增強)目標基因產物之插入/缺失突變。
經開發而使得能夠進行位點特異性基因體編輯之核酸酶之主要類別包含鋅指核酸酶(zinc finger nuclease；ZFN)、轉錄活化因子樣核酸酶(transcription activator-like nucleases；TALEN)及CRISPR相關核酸酶(例如CRISPR/Cas9)。此等核酸酶系統可基於其DNA識別模式而大致分類為兩類：ZFN及TALEN經由蛋白質-DNA相互作用達成特定DNA結合，而CRISPR系統，諸如Cas9，藉由與目標DNA直接鹼基配對之短RNA引導分子及藉由蛋白質-DNA相互作用而靶向特定DNA序列。參見例如Cox等人,《自然醫學( Nature Medicine)》, 2015, 第21卷, 第2期。
可根據本發明之TIL擴增方法使用之基因編輯方法之非限制性實例包含CRISPR方法、TALE方法及ZFN方法，該等方法在下文更詳細地描述。根據一個實施例，用於將TIL擴增為治療性群體之方法可根據本文所描述之方法(例如Gen 2)之任何實施例或如美國專利申請公開案第US 2020/0299644 A1號及第US 2020/0121719 A1號以及美國專利第10,925,900號中所描述進行，其揭示內容以引用之方式併入本文中，其中該方法進一步包括藉由CRISPR方法、TALE方法或ZFN方法中之一或多者對至少一部分TIL進行基因編輯，以產生可使治療作用增強的TIL。根據一個實施例，可藉由活體外比較基因編輯的TIL與未經修飾的TIL，例如藉由評估相較於未經修飾的TIL之活體外效應功能、細胞介素概況等，來評估基因編輯的TIL之改善的治療效果。在某些實施例中，方法包括使用CRISPR、TALE及/或ZFN方法來基因編輯TIL群體。
在本發明之一些實施例中，使用電穿孔來遞送基因編輯系統，諸如CRISPR、TALEN及ZFN系統。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統為流式電穿孔系統。適用於本發明之一些實施例之合適的流式電穿孔系統之實例為市售MaxCyte STX系統。有若干種可能適用於本發明之替代性市售電穿孔儀器，諸如可獲自BTX-Harvard Apparatus之AgilePulse系統或ECM 830、Cellaxess Elektra(Cellectricon)、Nucleofector(龍沙(Lonza)/ Amaxa)、GenePulser MXcell(伯樂(BIORAD)、iPorator-96 (Primax)或siPORTer96(Ambion)。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統與TIL擴增方法之其餘部分一起形成密閉無菌系統。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統為如本文中所描述之脈衝電穿孔系統，且與TIL擴增方法之其餘部分一起形成密閉無菌系統。
用於將TIL擴增為治療性群體之方法可根據本文所描述之方法(例如Gen 2)之任何實施例或如美國專利申請公開案第US 2020/0299644 A1號及第US 2020/0121719 A1號以及美國專利第10,925,900號中所描述進行，其揭示內容以引用之方式併入本文中，其中該方法進一步包括藉由CRISPR方法(例如CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1)對至少一部分TIL進行基因編輯。根據特定實施例，在TIL擴增過程期間使用CRISPR方法引起至少一部分之治療性TIL群體中一或多種免疫檢查點基因之表現靜默或減少。替代地，在TIL擴增程序期間使用CRISPR方法引起至少一部分之治療性TIL群體中一或多種免疫檢查點基因之表現增強。
CRISPR代表成簇規律間隔短回文重複序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)。使用CRISPR系統進行基因編輯之方法在本文中亦稱為CRISPR方法。有三種類型之併入RNA及Cas蛋白且可根據本發明使用之CRISPR系統：I、II及III型。II型CRISPR(藉由Cas9例示)為最充分表徵之系統之一。
CRISPR技術係改編自細菌及古菌(單細胞微生物之域)之天然防禦機制。此等生物體使用CRISPR衍生之RNA及各種Cas蛋白(包含Cas9)，藉由切碎及破壞外來入侵者之DNA來阻止病毒及其他外來體的攻擊。CRISPR為具有兩個獨特特徵之DNA特化區：存在核苷酸重複序列及間隔子。核苷酸之重複序列分佈在整個CRISPR區中，其中短外來DNA區段(間隔子)穿插在重複序列中。在II型CRISPR/Cas系統中，間隔子整合於CRISPR基因體基因座內且轉錄並加工成短CRISPR RNA(crRNA)。此等crRNA退火成反式活化crRNA(tracrRNA)，且引導Cas蛋白進行序列特異性裂解及靜默病原性DNA。Cas9蛋白進行之目標識別需要crRNA內之「種子」序列及crRNA結合區上游之含有二核苷酸的保守原間隔序列相鄰模體(PAM)序列。藉此CRISPR/Cas系統可藉由重新設計crRNA而重新靶向以裂解幾乎任何DNA序列。原生系統中之crRNA及tracrRNA可簡化為大約100個核苷酸之單引導RNA(sgRNA)以用於基因工程改造。CRISPR/Cas系統藉由共同遞送表現Cas9核酸內切酶及必需crRNA組分之質體可直接攜帶入人類細胞。可使用不同的Cas蛋白質變體來減少靶向限制(例如Cas9之異種同源物，諸如Cpf1)。
可以藉由用CRISPR方法對TIL進行永久性基因編輯而靜默或抑制之基因的非限制性實例包含PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR 。
可藉由用CRISPR方法對TIL進行永久性基因編輯而增強之基因的非限制性實例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15、IL-18及IL-21。
藉由CRISPR方法來改變目標基因序列之表現且可根據本發明之實施例使用之系統、方法及組成物之實例描述於美國專利第8,697,359號、第8,993,233號、第8,795,965號、第8,771,945號、第8,889,356號、第8,865,406號、第8,999,641號、第8,945,839號、第8,932,814號、第8,871,445號、第8,906,616號及第8,895,308號中，其各自之揭示內容以引用之方式併入本文中。用於進行CRISPR方法之資源，諸如用於表現CRISPR/Cas9及CRISPR/Cpf1之質體，可商購自公司，諸如GenScript。
在一些實施例中，遺傳修飾如本文中所描述之TIL群體可使用如美國專利第US 9790490號中所描述之CRISPR/Cpf1系統進行，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
用於將TIL擴增成治療性群體之方法可根據本文所描述之方法(例如Gen 2)之任何實施例或如美國專利申請公開案第US 2020/0299644 A1號及第US 2020/0121719 A1號以及美國專利第10,925,900號中所描述進行，該等專利之揭示內容以引用之方式併入本文中，其中該方法進一步包括藉由TALE方法對至少一部分TIL進行基因編輯。根據特定實施例，在TIL擴增程序期間使用TALE方法引起至少一部分之治療性TIL群體中一或多種免疫檢查點基因之表現靜默或減少。替代地，在TIL擴增程序期間使用TALE方法引起至少一部分之治療性TIL群體中一或多種免疫檢查點基因之表現增強。
TALE代表轉錄活化因子樣效應蛋白，其包含轉錄活化因子樣效應核酸酶(TALEN)。使用TALE系統進行基因編輯之方法在本文中亦稱為TALE方法。TALE為來自植物病原細菌黃單孢菌屬( Xanthomonas)之天然存在蛋白質，且含有由一系列各自識別單鹼基對之33-35個胺基酸之重複域構成之DNA結合域。TALE特異性係藉由被稱為重複可變二殘基(repeat-variable di-residue；RVD)之兩個高變胺基酸判定。模組化TALE重複序列連接在一起以識別連續DNA序列。DNA結合域中之特異性RVD識別目標基因座中之鹼基，從而提供結構特徵以組裝可預測的DNA結合域。將TALE之DNA結合域與IIS型FokI核酸內切酶之催化域融合，以製備可靶向的TALE核酸酶。為了誘導位點特異性突變，由14-20個鹼基對間隔區域分開之兩個個別TALEN臂將FokI單體拉近以二聚合及產生靶向的雙股斷裂。
若干個利用各種組裝方法之大的系統性研究指示，可併入TALE重複序列以識別幾乎任何使用者定義的序列。定製設計的TALE陣列亦由Cellectis Bioresearch(法國巴黎)、Transposagen Biopharmaceuticals (美國肯塔基州列克星敦(Lexington, KY, USA))及Life Technologies(美國紐約州格蘭德島(Grand Island, NY, USA))商購。適用於本發明之TALE及TALEN方法描述於以下中：美國專利申請公開案第US 2011/0201118 A1號、第US 2013/0117869 A1號、第US 2013/0315884 A1號、第US 2015/0203871 A1號及第US 2016/0120906 A1號，其各自之揭示內容以引用之方式併入本文中。
可以藉由用TALE方法對TIL進行永久性基因編輯而靜默或抑制之基因的非限制性實例包含PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。
可藉由用TALE方法對TIL進行永久性基因編輯而增強之基因的非限制性實例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15、IL-18及IL-21。
藉由TALE方法來改變目標基因序列之表現且可根據本發明之實施例使用之系統、方法及組成物之實例描述於美國專利第8,586,526號中，其以引用之方式併入本文中。
用於將TIL擴增成治療性群體之方法可根據本文中所描述之方法之任何實施例或如美國專利申請公開案第US 2020/0299644 A1號及第US 2020/0121719 A1號以及美國專利第10,925,900號中所描述進行，該等專利之揭示內容以引用之方式併入本文中，其中該方法進一步包含藉由鋅指或鋅指核酸酶方法對至少一部分TIL進行基因編輯。根據特定實施例，在TIL擴增程序期間使用鋅指方法引起至少一部分之治療性TIL群體中一或多種免疫檢查點基因之表現靜默或減少。替代地，在TIL擴增程序期間使用鋅指方法引起至少一部分之治療性TIL群體中一或多種免疫檢查點基因之表現增強。
呈保守ββα組態之個別鋅指含有大約30個胺基酸。α-螺旋表面上之幾個胺基酸通常以不同的選擇性水準接觸DNA主溝槽中的3 bp。鋅指具有兩個蛋白域。第一域為DNA結合域，其包含真核轉錄因子且含有鋅指。第二域為核酸酶域，其包含FokI限制酶且負責催化裂解DNA。
個別ZFN之DNA結合域通常含有介於三個與六個之間的個別鋅指重複且各自可識別介於9個與18個之間的鹼基對。若鋅指域對其預期目標位點具有特異性，則甚至一對識別總共18個鹼基對之3指ZFN理論上可靶向哺乳動物基因體中之單個基因座。一個產生新的鋅指陣列之方法為組合具有已知特異性之較小鋅指「模組」。最常見的模組組裝過程涉及組合三個分開的可各自識別3個鹼基對DNA序列之鋅指，以產生可識別9個鹼基對目標位點之3指陣列。替代地，可使用基於選擇之方法，諸如寡聚池工程改造(oligomerized pool engineering；OPEN)，來自隨機分組文庫選擇新的鋅指陣列，該等隨機分組文庫考慮介於鄰近指之間的上下文依賴性相互作用(context-dependent interaction)。工程改造之鋅指可商購自Sangamo Biosciences(美國加利福尼亞州里奇蒙(Richmond, CA, USA))及Sigma-Aldrich(美國密蘇里州聖路易斯(St.Louis, MO, USA))。
可以藉由用鋅指方法對TIL進行永久性基因編輯而靜默或抑制之基因的非限制性實例包含PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2 (TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11及BCOR。
可藉由用鋅指方法對TIL進行永久性基因編輯而增強之基因的非限制性實例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15、IL-18及IL-21。
藉由鋅指方法來改變目標基因序列之表現且可根據本發明之實施例使用之系統、方法及組成物之實例描述於以下中：美國專利第6,534,261號、第6,607,882號、第6,746,838號、第6,794,136號、第6,824,978號、第6,866,997號、第6,933,113號、第6,979,539號、第7,013,219號、第7,030,215號、第7,220,719號、第7,241,573號、第7,241,574號、第7,585,849號、第7,595,376號、第6,903,185號及第6,479,626號，其各自以引用之方式併入本文中。
藉由鋅指方法來改變目標基因序列之表現且可根據本發明之其他實施例使用之系統、方法及組成物之其他實例描述於Beane等人, 《分子療法》, 2015, 23,1380-1390中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，TIL視情況經基因工程改造以包含額外功能，該等功能包含但不限於高親和力TCR，例如靶向腫瘤相關抗原，諸如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1之TCR；或與腫瘤相關細胞表面分子(例如間皮素)或譜系限制性細胞表面分子(例如CD19)結合的嵌合抗原受體(CAR)。在某些實施例中，該方法包括對TIL群體進行基因工程改造以包含高親和力TCR，例如靶向腫瘤相關抗原，諸如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1之TCR；或與腫瘤相關細胞表面分子(例如間皮素)或譜系限制性細胞表面分子(例如CD19)結合的嵌合抗原受體(CAR)。適當地，TIL群體可為如本文所描述之第一群體、第二群體及/或第三群體。 E.用於TIL製造之密閉系統
本發明提供在TIL培養程序期間使用密閉系統。此類密閉系統允許預防及/或減少微生物污染、允許使用較少培養瓶且允許成本降低。在一些實施例中，密閉系統使用兩個容器。
此類密閉系統為本領域中熟知的且可見於例如http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm及https://www. fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm處。
無菌連接裝置(Sterile connecting device；STCD)在兩件相容性管之間產生無菌熔接部分(weld)。此程序允許無菌連接多個容器及管直徑。在一些實施例中，密閉系統包含如實例中所描述的魯爾鎖(luer lock)及熱密封系統。在一些實施例中，密閉系統係在無菌條件下經由注射器接取以維持系統之無菌性及密閉性質。在一些實施例中，採用如實例中所描述之密閉系統。在一些實施例中，根據本文在實例中所描述之方法，將TIL調配至最終產物調配容器中。
在一些實施例中，自獲得腫瘤片段之時間至準備向患者投與TIL或冷凍保存為止，密閉系統使用一個容器。在一些實施例中，當使用兩個容器時，第一容器為密閉G容器，且在不打開第一密閉G容器之情況下離心TIL群體且將其轉移至輸注袋。在一些實施例中，當使用兩個容器時，輸注袋為含有HypoThermosol之輸注袋。密閉系統或密閉TIL細胞培養系統之特徵在於，一旦已添加腫瘤樣本及/或腫瘤片段，則系統自外部緊密密封以形成密閉環境，不受細菌、真菌及/或任何其他微生物污染入侵。
在一些實施例中，微生物污染減少介於約5%與約100%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約5%與約95%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約5%與約90%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約10%與約90%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約15%與約85%之間。在一些實施例中，微生物污染減少為約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%、約99%或約100%。
密閉系統允許TIL在不存在微生物污染下及/或在微生物污染顯著減少下生長。
此外，TIL細胞培養環境之pH、二氧化碳分壓及氧氣分壓各自隨細胞培養而變化。因此，即使適合於細胞培養之培養基經循環，但密閉環境仍需要不斷地維持為TIL增殖之最佳環境。為了此目的，合乎需要的是，藉助於感測器監測密閉環境之培養液內之pH、二氧化碳分壓及氧氣分壓之物理因素，其訊號用於控制安設在培養環境之入口處的氣體交換器，及根據培養液中之變化實時調整密閉環境之氣體分壓以便最佳化細胞培養環境。在一些實施例中，本發明提供密閉細胞培養系統，其在至密閉環境之入口處併入配備有量測密閉環境之pH、二氧化碳分壓及氧氣分壓之監測裝置的氣體交換器，且藉由基於來自監測裝置之訊號自動調整氣體濃度來最佳化細胞培養環境。
在一些實施例中，連續地或間歇地控制密閉環境內之壓力。亦即，密閉環境中之壓力可藉助於例如壓力維持裝置來改變，從而確保空間在正壓力狀態下適合於TIL生長或促進在負壓力狀態下滲出流體且因此促進細胞增殖。此外，藉由間歇性施加負壓力，有可能藉助於暫時性縮小密閉環境之容積而均勻且有效地置換密閉環境中之循環液體。
在一些實施例中，可替換或添加TIL增殖之最佳培養物組分，且可添加包含諸如IL-2及/或OKT3以及組合之因子。 F. 視情況進行的 TIL 之冷凍保存
主體TIL群體(例如第二TIL群體)或擴增之TIL群體(例如第三TIL群體)可視情況進行冷凍保存。在一些實施例中，冷凍保存發生於治療性TIL群體。在一些實施例中，冷凍保存發生於在第二次擴增後收集之TIL。在一些實施例中，冷凍保存發生於圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之例示性步驟F中之TIL。在一些實施例中，TIL係冷凍保存於輸注袋中。在一些實施例中，TIL係在置於輸注袋中之前冷凍保存。在一些實施例中，冷凍保存TIL且不將其置於輸注袋中。在一些實施例中，使用冷凍保存培養基進行冷凍保存。在一些實施例中，冷凍保存培養基含有二甲基亞碸(DMSO)。此一般藉由將TIL群體放置於冷凍溶液(例如85%補體去活化AB血清及15%二甲基亞碸(DMSO))中來完成。將溶液中之細胞置放於低溫小瓶中且儲存在-80℃ 24小時，其中視情況轉移至氣態氮冷凍器用於冷凍保存。參見Sadeghi等人, 《腫瘤學報( Acta Oncologica)》2013, 52,978-986。
在適當時，自冷凍器取出細胞且在37℃水浴中解凍直至大約4/5之溶液解凍。一般將細胞再懸浮於完全培養基中且視情況洗滌一次或多次。在一些實施例中，可計算解凍的TIL且如本領域中已知的來評定存活性。
在一些實施例中，TIL群體係使用CS10冷凍保存培養基(CryoStor 10，BioLife Solutions)冷凍保存。在一些實施例中，TIL群體係使用含有二甲基亞碸(DMSO)之冷凍保存培養基冷凍保存。在一些實施例中，TIL群體係使用1:1(vol:vol)比率之CS10與細胞培養基冷凍保存。在一些實施例中，TIL群體係使用約1:1(vol:vol)比率之CS10與細胞培養基(進一步包括另外IL-2)冷凍保存。
如上文所論述且如圖1及/或圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中所提供之步驟A至步驟E中所例示，冷凍保存可發生在TIL擴增程序中的多個時間點。在一些實施例中，在第一次擴增後擴增之TIL群體(如例如根據步驟B所提供)或在根據圖1或圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟D的一或多次第二次擴增後擴增的TIL群體可進行冷凍保存。冷凍保存一般可藉由將TIL群體置放於冷凍溶液(例如85%補體去活化AB血清及15%二甲基亞碸(DMSO))中來完成。將溶液中之細胞置放於低溫小瓶中且儲存在-80℃ 24小時，其中視情況轉移至氣態氮冷凍器用於冷凍保存。參見Sadeghi等人, 《腫瘤學報》2013, 52, 978-986。在一些實施例中，TIL係冷凍保存於5% DMSO中。在一些實施例中，TIL係冷凍保存於細胞培養基加5% DMSO中。在一些實施例中，TIL係根據實例6中提供之方法冷凍保存。
在適當時，自冷凍器取出細胞且在37℃水浴中解凍直至大約4/5之溶液解凍。一般將細胞再懸浮於完全培養基中且視情況洗滌一次或多次。在一些實施例中，可計算解凍的TIL且如本領域中已知的來評定存活性。
在某些情況下，圖1或圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B的TIL群體可使用下文論述之方案立即冷凍保存。替代地，主體TIL群體可經歷圖1或圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟C及步驟D，且接著在圖1或圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟D之後經歷冷凍保存。類似地，在將遺傳修飾之TIL用於療法中之情況下，圖1或圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B或步驟D的TIL群體可經歷遺傳修飾以用於適合的治療。 B.經擴增之TIL之表型特徵
在一些實施例中，分析TIL在擴增後多種表型標記物之表現，該等標記物包含本文及實例中所描述者。在一些實施例中，檢查一或多種表型標記物之表現。在一些實施例中，在圖1或圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟B中的第一次擴增之後分析TIL的表型特徵。在一些實施例中，在圖1或圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟C中的轉變期間分析TIL的表型特徵。在一些實施例中，在根據圖1或圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟C的轉變期間且在冷凍保存之後分析TIL的表型特徵。在一些實施例中，在根據圖1或圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟D中的第二次擴增之後分析TIL的表型特徵。在一些實施例中，在根據圖1或圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)之步驟D的兩次或多於兩次擴增之後分析TIL的表型特徵。
在一些實施例中，標記物係選自由CD8及CD28組成之群組。在一些實施例中，檢查CD8之表現。在一些實施例中，檢查CD28之表現。在一些實施例中，相較於其他程序(例如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中提供之Gen 3程序)，相較於如例如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中提供之2A程序)，根據本發明程序產生之TIL的CD8及/或CD28之表現量較高。在一些實施例中，相較於其他程序(例如圖8(特別是例如圖8B)中所提供之Gen 3程序，相較於如例如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中所提供之2A程序)，根據本發明程序產生之TIL的CD8表現量較高。在一些實施例中，相較於其他程序(例如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中所提供之Gen 3程序)，相較於如例如圖8(特別是例如圖8A)中所提供之2A程序)，根據本發明程序產生之TIL的CD28表現量較高。在一些實施例中，高CD28表現量指示較年輕、較持久的TIL表型。在一些實施例中，量測一或多種調節標記物之表現。
在一些實施例中，在用於擴增本文所描述之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之方法的任何步驟期間，未基於CD8及/或CD28表現選擇第一TIL群體、第二TIL群體、第三TIL群體或所收集TIL群體。
在一些實施例中，相較於其他程序(例如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中提供之Gen 3程序，相較於如例如圖8(特別是例如圖8A)中提供之2A程序)，根據本發明程序產生之TIL的中樞記憶細胞之百分比較高。在一些實施例中，中樞記憶細胞之記憶標記物係選自由CCR7及CD62L組成之群組。
在一些實施例中，CD4+及/或CD8+ TIL記憶亞群可分為不同記憶亞群。在一些實施例中，CD4+及/或CD8+ TIL包括初始(CD45RA+CD62L+)TIL。在一些實施例中，CD4+及/或CD8+ TIL包括中樞記憶(central memory，CM；CD45RA-CD62L+)TIL。在一些實施例中，CD4+及/或CD8+ TIL包括效應記憶(EM；CD45RA-CD62L-)TIL。在一些實施例中，CD4+及/或CD8+ TIL包括RA+效應記憶/效應(TEMRA/TEFF；CD45RA+CD62L+)TIL。
在一些實施例中，TIL表現一或多種選自由以下組成之群組之標記物：顆粒酶B、穿孔蛋白及顆粒溶解素。在一些實施例中，TIL表現顆粒酶B。在一些實施例中，TIL表現穿孔蛋白。在一些實施例中，TIL表現顆粒溶解素。
在一些實施例中，亦可使用細胞介素釋放分析，評估再刺激的TIL之細胞介素釋放。在一些實施例中，可評估TIL之干擾素-γ(IFN-γ)分泌。在一些實施例中，IFN-γ分泌係藉由ELISA分析量測。在一些實施例中，IFN-γ分泌係在快速第二次擴增步驟之後，在如例如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)所提供之步驟D之後藉由ELISA分析量測。在一些實施例中，TIL健康係藉由IFN-γ(IFN-γ)分泌量測。在一些實施例中，IFN-γ分泌指示活性TIL。在一些實施例中，採用針對IFN-γ產生之效力分析。IFN-γ產生為細胞毒性潛力的另一種量度。IFN-γ產生可藉由測定經抗CD3、CD28及CD137/4-1BB之抗體刺激之TIL培養基中之細胞介素IFN-γ之含量來量測。來自此等受刺激TIL之培養基中之IFN-γ含量可藉由量測IFN-γ釋放測定。在一些實施例中，在例如圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中所提供之Gen 3程序中的步驟D TIL的IFN-γ產生相較於例如圖8(特別是例如圖8A)中所提供之2A程序中步驟D增加，指示步驟D TIL之細胞毒性潛力增加。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加一倍、兩倍、三倍、四倍或五倍或更多。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加一倍。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加兩倍。在一些實施例中，IFN-γ之分泌增加三倍。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加四倍。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加五倍。在一些實施例中，使用Quantikine ELISA套組量測IFN-γ。在一些實施例中，離體量測TIL中之IFN-γ。在一些實施例中，離體量測TIL中之IFN-γ，包含藉由本發明之方法(包含例如圖8B方法)產生之TIL。
在一些實施例中，能夠分泌至少一倍、兩倍、三倍、四倍或五倍或更多倍IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌高至少一倍之IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌高至少兩倍之IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌高至少三倍之IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌高至少四倍之IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌高至少五倍之IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。
在一些實施例中，能夠分泌至少100 pg/mL至約1000 pg/mL或更多IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少200 pg/mL、至少250 pg/mL、至少300 pg/mL、至少350 pg/mL、至少400 pg/mL、至少450 pg/mL、至少500 pg/mL、至少550 pg/mL、至少600 pg/mL、至少650 pg/mL、至少700 pg/mL、至少750 pg/mL、至少800 pg/mL、至少850 pg/mL、至少900 pg/mL、至少950 pg/mL或至少1000 pg/mL或更多IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少200 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少200 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少300 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少400 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少500 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少600 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少700 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少800 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少900 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少1000 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少2000 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少3000 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少4000 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少5000 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少6000 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少7000 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少8000 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少9000 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少10,000 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少15,000 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少20,000 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少25,000 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少30,000 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少35,000 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少40,000 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少45,000 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少50,000 pg/mL IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。
在一些實施例中，能夠分泌至少100 pg/mL/5e5個細胞至約1000 pg/mL/5e5個細胞或更多IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少200 pg/mL/5e5個細胞、至少250 pg/mL/5e5個細胞、至少300 pg/mL/5e5個細胞、至少350 pg/mL/5e5個細胞、至少400 pg/mL/5e5個細胞、至少450 pg/mL/5e5個細胞、至少500 pg/mL/5e5個細胞、至少550 pg/mL/5e5個細胞、至少600 pg/mL/5e5個細胞、至少650 pg/mL/5e5個細胞、至少700 pg/mL/5e5個細胞、至少750 pg/mL/5e5個細胞、至少800 pg/mL/5e5個細胞、至少850 pg/mL/5e5個細胞、至少900 pg/mL/5e5個細胞、至少950 pg/mL/5e5個細胞或至少1000 pg/mL/5e5個細胞或更多IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少200 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少200 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少300 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少400 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少500 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少600 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少700 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少800 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少900 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少1000 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少2000 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少3000 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少4000 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少5000 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少6000 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少7000 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少8000 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少9000 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少10,000 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少15,000 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少20,000 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少25,000 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少30,000 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少35,000 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少40,000 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少45,000 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少50,000 pg/mL/5e5個細胞IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。
T淋巴球及B淋巴球之多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段之體細胞重組產生。此等基因區段：V(可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)之結合特異性及下游應用。本發明提供一種用於產生展現且增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施例中，藉由本發明方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，相較於新鮮收集的TIL及/或使用除本文所提供之方法以外之其他方法製備的TIL，藉由本發明方法獲得的TIL展現T細胞貯庫多樣性增加，該等其他方法包含例如除圖8(特別是例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)中體現之方法以外的方法。在一些實施例中，相較於新鮮收集的TIL及/或使用如圖8(特別是例如圖8A)中例示的稱為Gen 2之方法製備的TIL，藉由本發明方法獲得的TIL展現T細胞貯庫多樣性增加。在一些實施例中，在第一次擴增中獲得之TIL展現T細胞貯庫多樣性增加。在一些實施例中，多樣性增加係免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性增加。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在於選自由α、β、γ及δ受體組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α及/或β之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)β之表現增加。在一些實施例中，TCRab(亦即，TCRα/β)之表現增加。在一些實施例中，基於樣本內獨特肽CDR之數目，相較於其他程序，例如稱為Gen 2之程序，如本文所描述之程序(例如Gen 3程序)顯示較高的選殖株多樣性。
在一些實施例中，TIL之活化及耗竭可藉由檢查一或多種標記物判定。在一些實施例中，活化及耗竭可使用多色流動式細胞測量術判定。在一些實施例中，標記物之活化及耗竭包含但不限於一或多種選自由以下組成之群組之標記物：CD3、PD-1、2B4/CD244、CD8、CD25、BTLA、KLRG、TIM-3、CD194/CCR4、CD4、TIGIT、CD183、CD69、CD95、CD127、CD103及/或LAG-3)。在一些實施例中，標記物之活化及耗竭包含但不限於一或多種選自由以下組成之群組之標記物：BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG-3、PD-1、TIGIT及/或TIM-3。在一些實施例中，標記物之活化及耗竭包含但不限於一或多種選自由以下組成之群組之標記物：BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG-3、CD103+/CD69+、CD103+/CD69-、PD-1、TIGIT及/或TIM-3。在一些實施例中，可測定及/或分析T細胞標記物(包含活化及耗竭標記物)以檢查T細胞活化、抑制或功能。在一些實施例中，T細胞標記物可包含但不限於一或多種選自由以下組成之群組之標記物：TIGIT、CD3、FoxP3、Tim-3、PD-1、CD103、CTLA-4、LAG-3、BTLA-4、ICOS、Ki67、CD8、CD25、CD45、CD4及/或CD59。
在一些實施例中，展現分泌高於3000 pg/10 6個TIL至300000 pg/10 6個TIL或更多顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於3000 pg/10 6個TIL、高於5000 pg/10 6個TIL、高於7000 pg/10 6個TIL、高於9000 pg/10 6個TIL、高於11000 pg/10 6個TIL、高於13000 pg/10 6個TIL、高於15000 pg/10 6個TIL、高於17000 pg/10 6個TIL、高於19000 pg/10 6個TIL、高於20000 pg/10 6個TIL、高於40000 pg/10 6個TIL、高於60000 pg/10 6個TIL、高於80000 pg/10 6個TIL、高於100000 pg/10 6個TIL、高於120000 pg/10 6個TIL、高於140000 pg/10 6個TIL、高於160000 pg/10 6個TIL、高於180000 pg/10 6個TIL、高於200000 pg/10 6個TIL、高於220000 pg/10 6個TIL、高於240000 pg/10 6個TIL、高於260000 pg/10 6個TIL、高於280000 pg/10 6個TIL、高於300000 pg/10 6個TIL或更多顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於3000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於5000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於7000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於9000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於11000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於13000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於15000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於17000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於19000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於20000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於40000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於60000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於80000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於100000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於120000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於140000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於160000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於180000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於200000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於220000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於240000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於260000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於280000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於300000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於3000 pg/10 6個TIL至300000 pg/10 6個TIL或更多顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於3000 pg/10 6個TIL、高於5000 pg/10 6個TIL、高於7000 pg/10 6個TIL、高於9000 pg/10 6個TIL、高於11000 pg/10 6個TIL、高於13000 pg/10 6個TIL、高於15000 pg/10 6個TIL、高於17000 pg/10 6個TIL、高於19000 pg/10 6個TIL、高於20000 pg/10 6個TIL、高於40000 pg/10 6個TIL、高於60000 pg/10 6個TIL、高於80000 pg/10 6個TIL、高於100000 pg/10 6個TIL、高於120000 pg/10 6個TIL、高於140000 pg/10 6個TIL、高於160000 pg/10 6個TIL、高於180000 pg/10 6個TIL、高於200000 pg/10 6個TIL、高於220000 pg/10 6個TIL、高於240000 pg/10 6個TIL、高於260000 pg/10 6個TIL、高於280000 pg/10 6個TIL、高於300000 pg/10 6個TIL或更多顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於3000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於5000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於7000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於9000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於11000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於13000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於15000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於17000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於19000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於20000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於40000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於60000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於80000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於100000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於120000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於140000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於160000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於180000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於200000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於220000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於240000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於260000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於280000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於300000 pg/10 6個TIL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。
在一些實施例中，展現分泌高於1000 pg/mL至300000 pg/mL或更多顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於1000 pg/mL、高於2000 pg/mL、高於3000 pg/mL、高於4000 pg/mL、高於5000 pg/mL、高於6000 pg/mL，更大之TIL。大於7000 pg/mL、高於8000 pg/mL、高於9000 pg/mL、高於10000 pg/mL、高於20000 pg/mL、高於30000 pg/mL、高於40000 pg/mL、高於50000 pg/mL、高於60000 pg/mL、高於70000 pg/mL、高於80000 pg/mL、高於90000 pg/mL、高於100000 pg/mL或更多顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於1000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於2000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於3000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於4000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於5000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於6000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於7000 pg/mL顆粒酶B之TIL為藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於8000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於9000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於10000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於20000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於30000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於40000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於50000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於60000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於70000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於80000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於90000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現高於100000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於120000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於140000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於160000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於180000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於200000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於220000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於240000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於260000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於280000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。在一些實施例中，展現分泌高於300000 pg/mL顆粒酶B之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D)產生之TIL。
在一些實施例中，本發明之擴增方法產生展現相較於非擴增TIL群體增加的活體外顆粒酶B分泌之經擴增TIL群體，包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D中所提供的TIL。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少一倍至五十倍或更多。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，IFN-γ分泌增加至少一倍、至少兩倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少七倍、至少八倍、至少九倍、至少十倍、至少二十倍、至少三十倍、至少四十倍、至少五十倍或更多。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少一倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少兩倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少三倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少四倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少五倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少六倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少七倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少八倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少九倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少十倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少二十倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少三十倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少四十倍。在一些實施例中，相較於非擴增TIL群體，本發明之擴增TIL群體之顆粒酶B分泌增加至少五十倍。
在一些實施例中，能夠分泌比IFN-γ分泌量低至少一倍、兩倍、三倍、四倍或五倍或更高倍數之TNF-α(亦即，TNF-alpha)量之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌比IFN-γ分泌量低至少一倍之TNF-α量之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌比IFN-γ分泌量低至少兩倍之TNF-α量之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌比IFN-γ分泌量低至少三倍之TNF-α量之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌比IFN-γ分泌量低至少四倍之TNF-α量之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌比IFN-γ分泌量低至少五倍之TNF-α量之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。
在一些實施例中，能夠分泌至少200 pg/mL/ 5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α(亦即，TNF-alpha)之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少500 pg/mL/5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少1000 pg/mL/5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少2000 pg/mL/5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少3000 pg/mL/5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少4000 pg/mL/5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少5000 pg/mL/5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少6000 pg/mL/ 5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少7000 pg/mL/5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少8000 pg/mL/5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少9000 pg/mL/5e5個細胞至約10,000 pg/mL/5e5個細胞或更多TNF-α之TIL係藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL。
在一些實施例中，量測IFN-γ及顆粒酶B含量以測定藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL的表型特徵。在一些實施例中，量測IFN-γ及TNF-α含量以測定藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL的表型特徵。在一些實施例中，量測顆粒酶B及TNF-α量以測定藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL的表型特徵。在一些實施例中，量測IFN-γ、顆粒酶B及TNF-α量以測定藉由本發明之擴增方法(包含例如圖8A及/或圖8B及/或圖8C及/或圖8D方法)產生之TIL的表型特徵。
在一些實施例中，表型特徵係在冷凍保存之後檢查。 G. 額外的程序實施例
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增為治療性TIL群體之方法，其包括：(a)藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該個體切除之腫瘤獲得第一TIL群體；(b)藉由在包括IL-2、抗生素組分及OKT-3之細胞培養基中培養第一TIL群體來進行初始第一次擴增，其中該初始第一次擴增進行約1至7天或約1至8天以獲得第二TIL群體，其中該第二TIL群體的數目大於該第一TIL群體的數目；(c)藉由使該第二TIL群體與包括IL-2、視情況選用之第二抗生素組分、OKT-3及外源抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基接觸來進行快速第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中該快速第二次擴增進行約1至11天或約1至10天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體；及(d)收集獲自步驟(c)之治療性TIL群體，其中該第一抗生素組分及視情況選用之第二抗生素組分獨立地包含：1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。在一些實施例中，將快速第二次擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以小規模培養物培養第二TIL群體約3至4天或約2至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(2)實現將來自小規模培養物之第二TIL群體轉移至比第一容器要大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，其中在該第二容器中，將來自小規模培養物之第二TIL群體以較大規模培養物培養約4至7天或約4至8天之時段。在一些實施例中，將快速擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以第一小規模培養物培養第二TIL群體約3至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養物之第二TIL群體轉移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等之第二容器之中，其中在各第二容器中，將轉移至此類第二容器的來自第一小規模培養物之第二TIL群體部分以第二小規模培養物培養約4至7天或約4至8天之時段。在一些實施例中，將快速擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以小規模培養物培養第二TIL群體約3至4天或約2至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養物之第二TIL群體轉移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器要大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，將自小規模培養物轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分以較大規模培養物培養約4至7天或約4至8天之時段。在一些實施例中，將快速擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以小規模培養物培養第二TIL群體約3至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養物之第二TIL群體轉移且分配到至少2、3或4個大小比第一容器要大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，將自小規模培養物轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分以較大規模培養物培養約5至7天之時段。
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增為治療性TIL群體之方法，其包括：(a)藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該個體切除之腫瘤獲得第一TIL群體；(b)藉由在包括IL-2、第一抗生素組分及OKT-3之細胞培養基中培養第一TIL群體來進行初始第一次擴增，其中該初始第一次擴增進行約1至8天以獲得第二TIL群體，其中該第二TIL群體的數目大於該第一TIL群體的數目；(c)藉由使該第二TIL群體與包括IL-2、視情況選用之第二抗生素組分、OKT-3及外源抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基接觸來進行快速第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中該快速第二次擴增進行約1至8天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體；及(d)收集獲自步驟(c)之治療性TIL群體，其中該第一抗生素組分及視情況選用之第二抗生素組分獨立地包含：1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。在一些實施例中，將快速第二次擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以小規模培養物培養第二TIL群體約2至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(2)實現將來自小規模培養物之第二TIL群體轉移至比第一容器要大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，其中在該第二容器中，將來自小規模培養物之第二TIL群體以較大規模培養物培養約4至8天之時段。在一些實施例中，將快速擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以第一小規模培養物培養第二TIL群體約2至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養物之第二TIL群體轉移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等之第二容器之中，其中在各第二容器中，將轉移至此類第二容器的來自第一小規模培養物之第二TIL群體部分以第二小規模培養物培養約4至6天之時段。在一些實施例中，將快速擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以小規模培養物培養第二TIL群體約2至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養物之第二TIL群體轉移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器要大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，將自小規模培養物轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分以較大規模培養物培養約4至6天之時段。在一些實施例中，將快速擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以小規模培養物培養第二TIL群體約3至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養物之第二TIL群體轉移且分配到至少2、3或4個大小比第一容器要大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，將自小規模培養物轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分以較大規模培養物培養約4至5天之時段。
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增為治療性TIL群體之方法，其包括：(a)藉由將獲自個體之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該個體切除之腫瘤獲得第一TIL群體；(b)藉由在包括IL-2、第一抗生素組分及OKT-3之細胞培養基中培養第一TIL群體來進行初始第一次擴增，其中該初始第一次擴增進行約1至7天以獲得第二TIL群體，其中該第二TIL群體的數目大於該第一TIL群體的數目；(c)藉由使該第二TIL群體與包括IL-2、視情況選用之第二抗生素組分、OKT-3及外源抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基接觸來進行快速第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中該快速第二次擴增進行約1至11天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體；及(d)收集獲自步驟(c)之治療性TIL群體，其中該第一抗生素組分及視情況選用之第二抗生素組分獨立地包含：1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。在一些實施例中，將快速第二次擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以小規模培養物培養第二TIL群體約3至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(2)實現將來自小規模培養物之第二TIL群體轉移至比第一容器要大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，其中在該第二容器中，將來自小規模培養物之第二TIL群體以較大規模培養物培養約4至7天之時段。在一些實施例中，將快速擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以第一小規模培養物培養第二TIL群體約3至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養物之第二TIL群體轉移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等之第二容器之中，其中在各第二容器中，將轉移至此類第二容器的來自第一小規模培養物之第二TIL群體部分以第二小規模培養物培養約4至7天之時段。在一些實施例中，將快速擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以小規模培養物培養第二TIL群體約3至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養物之第二TIL群體轉移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器要大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，將自小規模培養物轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分以較大規模培養物培養約4至7天之時段。在一些實施例中，將快速擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以小規模培養物培養第二TIL群體約4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(2)實現將來自第一小規模培養物之第二TIL群體轉移且分配到至少2、3或4個大小比第一容器要大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，將自小規模培養物轉移至此類第二容器之第二TIL群體部分以較大規模培養物培養約5天之時段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得該第二抗生素組分並非視情況選用的且該第一抗生素組分及該第二抗生素組分獨立地包含：1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一抗生素組分與第二抗生素組分不同。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一抗生素組分與第二抗生素組分相同。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一抗生素組分及/或第二抗生素組分包含濃度為約50 µg/mL至約600 µg/mL之萬古黴素。在例示性實施例中，第一抗生素組分及/或第二抗生素組分包含濃度為約100 µg/mL之萬古黴素。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一抗生素組分及/或第二抗生素組分包含約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一抗生素組分及/或第二抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一抗生素組分及/或第二抗生素組分包含約2.5 µg/mL至約10/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一抗生素組分及/或第二抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素。在例示性實施例中，第一抗生素組分及/或第二抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL萬古黴素。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一抗生素組分及/或第二抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一抗生素組分及/或第二抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素、約50 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素及約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。例示性實施例中，第一抗生素組分及/或第二抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素、約100 µg/mL萬古黴素及約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一抗生素組分及/或第二抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素、約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素及約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，初級第一次擴增係藉由使第一TIL群體與培養基接觸來進行，該培養基進一步包括外源抗原呈現細胞(APC)，其中步驟(c)中之培養基中APC之數目大於步驟(b)中之培養基中APC之數目。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(c)中，該培養基補充有額外的外源APC。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約1.1:1至或至約20:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約1.1:1至或至約10:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約1.1:1至或至約9:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約1.1:1至或至約8:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約1.1:1至或至約7:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約1.1:1至或至約6:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約1.1:1至或至約5:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約1.1:1至或至約4:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約1.1:1至或至約3:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約1.1:1至或至約2.9:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約1.1:1至或至約2.8:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約1.1:1至或至約2.7:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約1.1:1至或至約2.6:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約1.1:1至或至約2.5:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約1.1:1至或至約2.4:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約1.1:1至或至約2.3:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約1.1:1至或至約2.2:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約1.1:1至或至約2.1:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約1.1:1至或至約2:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約2:1至或至約10:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約2:1至或至約5:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約2:1至或至約4:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約2:1至或至約3:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約2:1至或至約2.9:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約2:1至或至約2.8:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約2:1至或至約2.7:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約2:1至或至約2.6:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約2:1至或至約2.5:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約2:1至或至約2.4:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約2:1至或至約2.3:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約2:1至或至約2.2:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率選自在自或自約2:1至或至約2.1:1的範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率係或係約2:1。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目與在步驟(b)中添加的APC之數目的比率係或係約1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在初級第一次擴增中添加的APC之數目係或係約1×10 8個、1.1×10 8個、1.2×10 8個、1.3×10 8個、1.4×10 8個、1.5×10 8個、1.6×10 8個、1.7×10 8個、1.8×10 8個、1.9×10 8個、2×10 8個、2.1×10 8個、2.2×10 8個、2.3×10 8個、2.4×10 8個、2.5×10 8個、2.6×10 8個、2.7×10 8個、2.8×10 8個、2.9×10 8個、3×10 8個、3.1×10 8個、3.2×10 8個、3.3×10 8個、3.4×10 8個或3.5×10 8個APC，且使得在快速第二次擴增中添加的APC之數目係或係約3.5×10 8個、3.6×10 8個、3.7×10 8個、3.8×10 8個、3.9×10 8個、4×10 8個、4.1×10 8個、4.2×10 8個、4.3×10 8個、4.4×10 8個、4.5×10 8個、4.6×10 8個、4.7×10 8個、4.8×10 8個、4.9×10 8個、5×10 8個、5.1×10 8個、5.2×10 8個、5.3×10 8個、5.4×10 8個、5.5×10 8個、5.6×10 8個、5.7×10 8個、5.8×10 8個、5.9×10 8個、6×10 8個、6.1×10 8個、6.2×10 8個、6.3×10 8個、6.4×10 8個、6.5×10 8個、6.6×10 8個、6.7×10 8個、6.8×10 8個、6.9×10 8個、7×10 8個、7.1×10 8個、7.2×10 8個、7.3×10 8個、7.4×10 8個、7.5×10 8個、7.6×10 8個、7.7×10 8個、7.8×10 8個、7.9×10 8個、8×10 8個、8.1×10 8個、8.2×10 8個、8.3×10 8個、8.4×10 8個、8.5×10 8個、8.6×10 8個、8.7×10 8個、8.8×10 8個、8.9×10 8個、9×10 8個、9.1×10 8個、9.2×10 8個、9.3×10 8個、9.4×10 8個、9.5×10 8個、9.6×10 8個、9.7×10 8個、9.8×10 8個、9.9×10 8個或1×10 9個APC。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在初級第一次擴增中添加的APC之數目係選自在或在約1×10 8個APC至或至約3.5×10 8個APC之範圍，且其中在快速第二次擴增中添加的APC之數目係選自在或在約3.5×10 8個APC至或至約1×10 9個APC之範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在初級第一次擴增中添加的APC之數目係選自在或在約1.5×10 8個APC至或至約3×10 8個APC之範圍，且其中在快速第二次擴增中添加的APC之數目係選自在或在約4×10 8個APC至或至約7.5×10 8個APC之範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在初級第一次擴增中添加的APC之數目係選自在或在約2×10 8個APC至或至約2.5×10 8個APC之範圍，且其中在快速第二次擴增中添加的APC之數目係選自在或在約4.5×10 8個APC至或至約5.5×10 8個APC之範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得將或將約2.5×10 8個APC添加至初級第一次擴增中且將或將約5×10 8個APC添加至快速第二次擴增中。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得將多個腫瘤片段分佈至複數個獨立容器中，在每個獨立容器中，第一TIL群體係在步驟(a)中獲得，第二TIL群體係在步驟(b)中獲得，且第三TIL群體係在步驟(c)中獲得，且將在步驟(c)中來自複數個容器之治療性TIL群體合併以得到自步驟(d)收集之TIL群體。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得將多個腫瘤均勻分佈至複數個獨立容器中。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得複數個獨立容器包括至少兩個獨立容器。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得複數個獨立容器包括二至二十個獨立容器。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得複數個獨立容器包括二至十五個獨立容器。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得複數個獨立容器包括二至十個獨立容器。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得複數個獨立容器包括二至五個獨立容器。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得複數個獨立容器包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個獨立容器。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得對於在步驟(b)中對第一TIL群體進行初始第一次擴增的每個容器，在步驟(c)中在同一容器中對自該第一TIL群體產生之第二TIL群體進行快速第二次擴增。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得每個獨立容器包括第一透氣表面區域。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得多個腫瘤片段分佈於單個容器中。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得該單個容器包括第一透氣表面區域。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中，APC以或以約一個細胞層至或至約三個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，APC以或以約1.5個細胞層至或至約2.5個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，APC以或以約2個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，APC以或以約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(c)中，APC以或以約3個細胞層至或至約10個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(c)中，APC以或以約4個細胞層至或至約8個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(c)中，APC以或以約3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(c)中，APC以或以約4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，初始第一次擴增係在包括第一透氣表面區域之第一容器中進行且在步驟(c)中，快速第二次擴增係在包括第二透氣表面區域之第二容器中進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第二容器大於第一容器。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中，APC以或以約一個細胞層至或至約三個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，APC以或以約1.5個細胞層至或至約2.5個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，APC以或以約2個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供適用的任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，APC以或以約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(c)中，APC以或以約3個細胞層至或至約10個細胞層之平均厚度層疊至第二透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(c)中，APC以或以約4個細胞層至或至約8個細胞層之平均厚度層疊至第二透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(c)中，APC以或以約3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層之平均厚度層疊至第二透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供適用的任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(c)中，APC以或以約4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層之平均厚度層疊至第二透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，初始第一次擴增係在包括第一透氣表面區域之第一容器中進行且在步驟(c)中，快速第二次擴增係在第一容器中進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中，APC以或以約一個細胞層至或至約三個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，APC以或以約1.5個細胞層至或至約2.5個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，APC以或以約2個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，APC以或以約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(c)中，APC以或以約3個細胞層至或至約10個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(c)中，APC以或以約4個細胞層至或至約8個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(c)中，APC以或以約3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(c)中，APC以或以約4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層之平均厚度層疊至第一透氣表面區域上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中層疊的APC之平均層數與在步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率選自在或在約1:1.1至或至約1:10之範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中層疊的APC之平均層數與在步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率選自在或在約1:1.1至或至約1:9之範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中層疊的APC之平均層數與在步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率選自在或在約1:1.1至或至約1:8之範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中層疊的APC之平均層數與在步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率選自在或在約1:1.1至或至約1:7之範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中層疊的APC之平均層數與在步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率選自在或在約1:1.1至或至約1:6之範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中層疊的APC之平均層數與在步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率選自在或在約1:1.1至或至約1:5之範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中層疊的APC之平均層數與在步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率選自在或在約1:1.1至或至約1:4之範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中層疊的APC之平均層數與在步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率選自在或在約1:1.1至或至約1:3之範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中層疊的APC之平均層數與在步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率選自在或在約1:1.1至或至約1:2之範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中層疊的APC之平均層數與在步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率選自在或在約1:1.2至或至約1:8之範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中層疊的APC之平均層數與在步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率選自在或在約1:1.3至或至約1:7之範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中層疊的APC之平均層數與在步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率選自在或在約1:1.4至或至約1:6之範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中層疊的APC之平均層數與在步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率選自在或在約1:1.5至或至約1:5之範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中層疊的APC之平均層數與在步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率選自在或在約1:1.6至或至約1:4之範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中層疊的APC之平均層數與在步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率選自在或在約1:1.7至或至約1:3.5之範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中層疊的APC之平均層數與在步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率選自在或在約1:1.8至或至約1:3之範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中層疊的APC之平均層數與在步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率選自在或在約1:1.9至或至約1:2.5之範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中層疊的APC之平均層數與在步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率選自在或在約1:2之範圍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，藉由用額外抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL群體之細胞培養基來進行初級第一次擴增，其中在步驟(c)中添加的APC之數目大於在步驟(b)中添加的APC之數目，且其中在步驟(b)中層疊的APC之平均層數與在步驟(c)中層疊的APC之平均層數的比率選自或選自約1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第二TIL群體中TIL之數目與第一TIL群體中TIL之數目的比率係或係約1.5:1至或至約100:1。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第二TIL群體中TIL之數目與第一TIL群體中TIL之數目的比率係或係約50:1。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第二TIL群體中TIL之數目與第一TIL群體中TIL之數目的比率係或係約25:1。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第二TIL群體中TIL之數目與第一TIL群體中TIL之數目的比率係或係約20:1。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第二TIL群體中TIL之數目與第一TIL群體中TIL之數目的比率係或係約10:1。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第二TIL群體的數目比第一TIL群體要大至少或至少約50倍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第二TIL群體之數目比第一TIL群體之數目要大至少或至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50倍。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(c)中第二時段開始之後剛好或約2天或剛好或約3天，向細胞培養基中補充額外IL-2。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以進一步包括使用冷凍保存程序將在步驟(d)中收集之TIL群體冷凍保存的步驟。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以包括在步驟(d)後進行額外步驟(e)：將自步驟(d)收集之TIL群體轉移至視情況含有HypoThermosol之輸注袋中。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以進一步包括使用冷凍保存程序步驟(e)中包括收集之TIL群體的輸注袋冷凍保存的步驟。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得該冷凍保存程序係使用1:1的收集之TIL群體與冷凍保存培養基之比率進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得PBMC為經照射且同種異體的。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中添加至細胞培養物中的APC之總數目係2.5×10 8。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(c)中添加至物中的APC之總數目係5×10 8。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得APC係PBMC。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得PBMC為經照射且同種異體的。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得抗原呈現細胞為人工抗原呈現細胞。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(d)中的收集係使用基於膜之細胞處理系統進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(d)中的收集係使用LOVO細胞處理系統進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得多個片段包括步驟(b)中每個容器為或為約5至或至約60個片段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得多個片段包括步驟(b)中每個容器為或為約10至或至約60個片段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得多個片段包括步驟(b)中每個容器為或為約15至或至約60個片段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得多個片段包括步驟(b)中每個容器為或為約20至或至約60個片段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得多個片段包括步驟(b)中每個容器為或為約25至或至約60個片段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得多個片段包括步驟(b)中每個容器為或為約30至或至約60個片段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得多個片段包括步驟(b)中每個容器為或為約35至或至約60個片段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得多個片段包括步驟(b)中每個容器為或為約40至或至約60個片段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得多個片段包括步驟(b)中每個容器為或為約45至或至約60個片段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得多個片段包括步驟(b)中每個容器為或為約50至或至約60個片段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得多個片段包括步驟(b)中每個容器為或為約50至或至約100個片段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得多個片段包括步驟(b)中每個容器為或為約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個片段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得多個片段包括步驟(b)中每個容器為或為約50、60、70、80、90或100個片段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得多個片段包括步驟(b)中每個容器100個或更多個片段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得每個片段之體積為或為約27 mm 3。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得每個片段之體積為或為約20 mm 3至或至約50 mm 3。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得每個片段之體積為或為約21 mm 3至或至約30 mm 3。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得每個片段之體積為或為約22 mm 3至或至約29.5 mm 3。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得每個片段之體積為或為約23 mm 3至或至約29 mm 3。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得每個片段之體積為或為約24 mm 3至或至約28.5 mm 3。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得每個片段之體積為或為約25 mm 3至或至約28 mm 3。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得每個片段之體積為或為約26.5 mm 3至或至約27.5 mm 3。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得每個片段之體積為或為約21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 mm 3。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得多個片段包括或包括約30至或至約60個片段，其中總體積為或為約1300 mm 3至或至約1500 mm 3。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得多個片段包括或包括約50個片段，其中總體積為或為約1350 mm 3。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得多個片段包括或包括約100個片段，其中總體積為或為約2700 mm 3。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得多個片段包括或包括約50個片段，其中總質量為或為約1公克至或至約1.5公克。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得多個片段包括或包括約100個片段，其中總質量為或為約2公克至或至約3公克。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得細胞培養基提供於容器中，該容器為G容器或Xuri細胞袋。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得細胞培養基中之IL-2濃度為約10,000 IU/mL至約5,000 IU/mL。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得細胞培養基中之IL-2濃度為約6,000 IU/mL。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得冷凍保存培養基包括二甲基亞碸(DMSO)。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得冷凍保存培養基包括7%至10% DMSO。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(b)中之第一時段係在或在約1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天之時段內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(c)中之第二時段係在或在約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天之時段內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(b)中之第一時段及步驟(c)中之第二時段各自獨立地在或在約1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天之時段內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(b)中之第一時段及步驟(c)中之第二時段各自獨立地在或在約5天、6天或7天之時段內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(b)中之第一時段及步驟(c)中之第二時段各自獨立地在或在約7天之時段內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)至步驟(d)係在總計或總計約14天至或至約18天內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)至步驟(d)係在總計或總計約15天至或至約18天內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)至步驟(d)係在總計或總計約16天至或至約18天內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)至步驟(d)係在總計或總計約17天至或至約18天內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)至步驟(d)係在總計或總計約14天至或至約17天內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)至步驟(d)係在總計或總計約15天至或至約17天內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)至步驟(d)係在總計或總計約16天至或至約17天內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)至步驟(d)係在總計或總計約14天至或至約16天內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)至步驟(d)係在總計或總計約15天至或至約16天內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)至步驟(d)係在總計或總計約14天內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)至步驟(d)係在總計或總計約15天內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)至步驟(d)係在總計或總計約16天內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)至步驟(d)係在總計或總計約17天內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)至步驟(d)係在總計或總計約18天內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)至步驟(d)係在總計或總計約14天或更短時間內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)至步驟(d)係在總計或總計約15天或更短時間內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)至步驟(d)係在總計或總計約16天或更短時間內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)至步驟(d)係在總計或總計約18天或更短時間內進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(d)中收集之治療性TIL群體包括足以提供治療有效劑量之TIL的TIL。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得足以提供治療有效劑量的TIL之數目係自或自約2.3×10 10至或至約13.7×10 10。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(c)中之第三TIL群體提供增加之功效、增加之干擾素-γ產生及/或增加之多株性。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(c)中之第三TIL群體提供相較於藉由長於16天之程序製備的TIL至少一倍至五倍或更高倍數的干擾素-γ產生。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(c)中之第三TIL群體提供相較於藉由長於17天之程序製備的TIL至少一倍至五倍或更高倍數的干擾素-γ產生。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(c)中之第三TIL群體提供相較於藉由長於18天之程序製備的TIL至少一倍至五倍或更高倍數的干擾素-γ產生。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得獲自步驟(c)之第三TIL群體的效應T細胞及/或中樞記憶T細胞展現相對於獲自步驟(b)之第二細胞群體的效應T細胞及/或中樞記憶T細胞增加之CD8及CD28表現。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得該方法中敍述之每個容器均為密閉容器。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得該方法中敍述之每個容器均為G容器。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得該方法中敍述之每個容器均為GREX-10。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得該方法中敍述之每個容器均為GREX-100。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得該方法中敍述之每個容器均為GREX-500。
在一些實施例中，本發明提供藉由以上適用的任何前述段落中描述之方法製備的治療性腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體。
在一些實施例中，本發明提供一種自患者之腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體，其中相較於藉由在無任何添加之抗原呈現細胞(APC)或OKT3之情況下進行TIL之第一次擴增的程序製備的TIL，該治療性TIL群體提供增加的功效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
在一些實施例中，本發明提供一種自患者之腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體，其中相較於藉由在無任何添加之抗原呈現細胞(APC)之情況下進行TIL之第一次擴增的程序製備的TIL，該治療性TIL群體提供增加的功效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
在一些實施例中，本發明提供一種自患者之腫瘤組織製備之治療性腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體，其中相較於藉由在無任何添加之OKT3之情況下進行TIL之第一次擴增的程序製備的TIL，該治療性TIL群體提供增加的功效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
在一些實施例中，本發明提供一種自患者之腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體，其中相較於藉由在不添加抗原呈現細胞(APC)且不添加OKT3之情況下進行TIL之第一次擴增的程序製備的TIL，該治療性TIL群體提供增加的功效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
在一些實施例中，本發明提供一種自患者之腫瘤組織製備之治療性腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體，其中相較於藉由程序藉由長於16天之程序製備的TIL，該治療性TIL群體提供增加的功效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
在一些實施例中，本發明提供一種自患者之腫瘤組織製備之治療性腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體，其中相較於藉由程序藉由長於17天之程序製備的TIL，該治療性TIL群體提供增加的功效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
在一些實施例中，本發明提供一種自患者之腫瘤組織製備之治療性腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體，其中相較於藉由程序藉由長於18天之程序製備的TIL，該治療性TIL群體提供增加的功效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
在一些實施例中，本發明提供如以上適用的任何前述段落中描述的治療性TIL群體，其提供增加的干擾素-γ產生。
在一些實施例中，本發明提供如以上適用的任何前述段落中描述的治療性TIL群體，其提供增加的多株性。
在一些實施例中，本發明提供如以上適用的任何前述段落中描述的治療性TIL群體，其提供增加的功效。
在一些實施例中，本發明提供如上適用的任何前述段落中描述之治療性TIL群體，該治療性TIL群體經改良以使得該治療性TIL群體能夠產生比藉由長於16天之程序製備的TIL高至少一倍的干擾素-γ。在一些實施例中，本發明提供如上適用的任何前述段落中描述之治療性TIL群體，該治療性TIL群體經改良以使得該治療性TIL群體能夠產生比藉由長於17天之程序製備的TIL高至少一倍的干擾素-γ。在一些實施例中，本發明提供如上適用的任何前述段落中描述之治療性TIL群體，該治療性TIL群體經改良以使得該治療性TIL群體能夠產生比藉由長於18天之程序製備的TIL高至少一倍的干擾素-γ。在一些實施例中，歸因於本文所描述之擴增程序，例如以上步驟A至步驟F中所描述或根據以上步驟A至步驟F(亦如例如圖8中(特別是例如圖8B及/或圖8C)所示)，TIL呈現為能夠產生高至少一倍之干擾素-γ。
在一些實施例中，本發明提供如上適用的任何前述段落中描述之治療性TIL群體，該治療性TIL群體經改良以使得該治療性TIL群體能夠產生比藉由長於16天之程序製備的TIL高至少兩倍的干擾素-γ。在一些實施例中，本發明提供如上適用的任何前述段落中描述之治療性TIL群體，該治療性TIL群體經改良以使得該治療性TIL群體能夠產生比藉由長於17天之程序製備的TIL高至少兩倍的干擾素-γ。在一些實施例中，本發明提供如上適用的任何前述段落中描述之治療性TIL群體，該治療性TIL群體經改良以使得該治療性TIL群體能夠產生比藉由長於18天之程序製備的TIL高至少兩倍的干擾素-γ。在一些實施例中，歸因於本文所描述之擴增程序，例如以上步驟A至步驟F中所描述或根據以上步驟A至步驟F(亦如例如圖8中(特別是例如圖8B及/或圖8C)所示)，TIL呈現為能夠產生高至少兩倍之干擾素-γ。
在一些實施例中，本發明提供如上適用的任何前述段落中描述之治療性TIL群體，該治療性TIL群體經改良以使得該治療性TIL群體能夠產生比藉由長於16天之程序製備的TIL高至少三倍的干擾素-γ。在一些實施例中，本發明提供如上適用的任何前述段落中描述之治療性TIL群體，該治療性TIL群體經改良以使得該治療性TIL群體能夠產生比藉由長於17天之程序製備的TIL高至少三倍的干擾素-γ。在一些實施例中，本發明提供如上適用的任何前述段落中描述之治療性TIL群體，該治療性TIL群體經改良以使得該治療性TIL群體能夠產生比藉由長於18天之程序製備的TIL高至少三倍的干擾素-γ。在一些實施例中，歸因於本文所描述之擴增程序，例如以上步驟A至步驟F中所描述或根據以上步驟A至步驟F(亦如例如圖8中(特別是例如圖8B及/或圖8C)所示)，TIL呈現為能夠產生高至少三倍之干擾素-γ。
在一些實施例中，本發明提供治療性腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體，其能夠產生比藉由在無任何添加之抗原呈現細胞(APC)之情況下進行TIL之第一次擴增的程序所製備之TIL高至少一倍的干擾素-γ。在一些實施例中，歸因於本文所描述之擴增程序，例如以上步驟A至步驟F中所描述或根據以上步驟A至步驟F(亦如例如圖8中(特別是例如圖8B及/或圖8C)所示)，TIL呈現為能夠產生高至少一倍之干擾素-γ。
在一些實施例中，本發明提供一種治療性腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體，其能夠產生比藉由在無任何添加之OKT3之情況下進行TIL之第一次擴增的程序所製備之TIL高至少一倍的干擾素-γ。在一些實施例中，歸因於本文所描述之擴增程序，例如以上步驟A至步驟F中所描述或根據以上步驟A至步驟F(亦如例如圖8中(特別是例如圖8B及/或圖8C)所示)，TIL呈現為能夠產生高至少一倍之干擾素-γ。
在一些實施例中，本發明提供一種治療性TIL群體，其能夠產生相較於藉由在無任何添加之APC之情況下進行TIL之第一次擴增的程序所製備之TIL高至少兩倍的干擾素-γ。在一些實施例中，歸因於本文所描述之擴增程序，例如以上步驟A至步驟F中所描述或根據以上步驟A至步驟F(亦如例如圖8中(特別是例如圖8B及/或圖8C)所示)，TIL呈現為能夠產生高至少兩倍之干擾素-γ。
在一些實施例中，本發明提供一種治療性TIL群體，其能夠產生相較於藉由在無任何添加之OKT3之情況下進行TIL之第一次擴增的程序所製備之TIL高至少兩倍的干擾素-γ。在一些實施例中，歸因於本文所描述之擴增程序，例如以上步驟A至步驟F中所描述或根據以上步驟A至步驟F(亦如例如圖8中(特別是例如圖8B及/或圖8C)所示)，TIL呈現為能夠產生高至少兩倍之干擾素-γ。
在一些實施例中，本發明提供一種治療性TIL群體，其能夠產生相較於藉由在無任何添加之APC之情況下進行TIL之第一次擴增的程序所製備之TIL高至少三倍的干擾素-γ。在一些實施例中，歸因於本文所描述之擴增程序，例如以上步驟A至步驟F中所描述或根據以上步驟A至步驟F(亦如例如圖8中(特別是例如圖8B及/或圖8C)所示)，TIL呈現為能夠產生高至少一倍之干擾素-γ。
在一些實施例中，本發明提供一種治療性TIL群體，其能夠產生相較於藉由在無任何添加之OKT3之情況下進行TIL之第一次擴增的程序所製備之TIL高至少三倍的干擾素-γ。在一些實施例中，歸因於本文所描述之擴增程序，例如以上步驟A至步驟F中所描述或根據以上步驟A至步驟F(亦如例如圖8中(特別是例如圖8B及/或圖8C)所示)，TIL呈現為能夠產生高至少三倍之干擾素-γ。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得腫瘤片段係小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片、粗針穿刺活體組織切片或細針抽吸物。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得腫瘤片段係粗針活體組織切片。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得腫瘤片段係細針抽吸物。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得腫瘤片段係小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得腫瘤片段係粗針穿刺活體組織切片。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得(i)該方法包括自來自個體之腫瘤組織的一或多個小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片、粗針穿刺活體組織切片或細針抽吸物獲得第一TIL群體，(ii)該方法包括在進行初始第一次擴增步驟之前，進行在包括IL-2及第一抗生素組分之細胞培養基中培養該第一TIL群體約3天之時段的步驟，(iii)該方法包括進行該初始第一次擴增約8天之時段，及(iv)該方法包括進行快速第二次擴增約11天之時段。在一些前述實施例中，該方法之步驟係在約22天內完成。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得(i)該方法包括自來自個體之腫瘤組織的一或多個小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片、粗針穿刺活體組織切片或細針抽吸物獲得第一TIL群體，(ii)該方法包括在進行初始第一次擴增步驟之前，進行在包括IL-2及第一抗生素組分之細胞培養基中培養該第一TIL群體約3天之時段的步驟，(iii)該方法包括進行該初始第一次擴增約8天之時段，及(iv)該方法包括藉由培養該第二TIL群體之培養物約5天，將該培養物分成至多5份繼代培養物並培養該等繼代培養物約6天來進行快速第二次擴增。在一些前述實施例中，在大小與在快速第二次擴增中開始第二TIL群體之培養之容器相同或更大的容器中，分別培養該至多5份繼代培養物。在一些前述實施例中，第二TIL群體之培養物均等地分在至多5份繼代培養物中。在一些前述實施例中，該方法之步驟係在約22天內完成。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一TIL群體係自來自個體之腫瘤組織的1至約20個小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片、粗針穿刺活體組織切片或細針抽吸物獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一TIL群體係自來自個體之腫瘤組織的1至約10個小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片、粗針穿刺活體組織切片或細針抽吸物獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一TIL群體係自來自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片、粗針穿刺活體組織切片或細針抽吸物獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一TIL群體係自來自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片、粗針穿刺活體組織切片或細針抽吸物獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一TIL群體係自來自個體之腫瘤組織的1至約20個粗針活體組織切片獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一TIL群體係自來自個體之腫瘤組織的1至約10個粗針活體組織切片獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一TIL群體係自來自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個粗針活體組織切片獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一TIL群體係自來自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個粗針活體組織切片獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一TIL群體係自來自個體之腫瘤組織的1至約20個細針抽吸物獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一TIL群體係自來自個體之腫瘤組織的1至約10個細針抽吸物獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一TIL群體係自來自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個細針抽吸物獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一TIL群體係自來自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個細針抽吸物獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一TIL群體係自來自個體之腫瘤組織的1至約20個粗針穿刺活體組織切片獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一TIL群體係自來自個體之腫瘤組織的1至約10個粗針穿刺活體組織切片獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一TIL群體係自來自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個粗針穿刺活體組織切片獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一TIL群體係自來自個體之腫瘤組織的 1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個粗針穿刺活體組織切片獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一TIL群體係自來自個體之腫瘤組織的1至約20個小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一TIL群體係自來自個體之腫瘤組織的1至約10個小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一TIL群體係自來自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一TIL群體係自來自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得(i)該方法包括自來自個體之腫瘤組織的1至約10個粗針活體組織切片獲得第一TIL群體；(ii)該方法包括在進行初始第一次擴增步驟之前，進行在包括IL-2及第一抗生素組分之細胞培養基中培養該第一TIL群體約3天之時段的步驟；(iii)該方法包括藉由在包括IL-2、第一抗生素組分、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之培養基中培養該第一TIL群體約8天之時段來進行初始第一次擴增步驟以獲得第二TIL群體；及(iv)該方法包括藉由在包括IL-2、視情況選用之第二抗生素組分、OKT-3及APC之培養基中培養該第二TIL群體約11天之時段來進行快速第二次擴增。在一些前述實施例中，該方法之步驟係在約22天內完成。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得(i)該方法包括自來自個體之腫瘤組織的1至約10個粗針活體組織切片獲得第一TIL群體；(ii)該方法包括在進行初始第一次擴增步驟之前，進行在包括IL-2及第一抗生素組分之細胞培養基中培養第一TIL群體約3天之時段的步驟；(iii)該方法包括藉由在包括IL-2、第一抗生素組分、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之培養基中培養第一TIL群體約8天之時段來進行初始第一次擴增步驟，以獲得第二TIL群體；及(iv)該方法包括藉由在包括IL-2、視情況選用之第二抗生素組分、OKT-3及APC之培養基中培養第二TIL群體之培養物約5天，將培養物分成至多5份繼代培養物，並在包括IL-2及視情況選用之第二抗生素組分之培養基中培養各繼代培養物約6天來進行快速第二次擴增。在一些前述實施例中，在大小與在快速第二次擴增中開始第二TIL群體之培養之容器相同或更大的容器中，分別培養該至多5份繼代培養物。在一些前述實施例中，第二TIL群體之培養物均等地分在至多5份繼代培養物中。在一些前述實施例中，該方法之步驟係在約22天內完成。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得(i)該方法包括自來自個體之腫瘤組織的1至約10個粗針活體組織切片獲得第一TIL群體；(ii)該方法包括在進行初始第一次擴增步驟之前進行以下步驟：在G-Rex 100M培養瓶中，在0.5 L CM1培養基中包括第一抗生素組分及6000 IU IL-2/mL之細胞培養基中培養第一TIL群體約3天之時段；(iii)該方法包括藉由以下方式進行初始第一次擴增：添加含有6000 IU/ml IL-2、第一抗生素組分、30 ng/mL OKT-3及約10 8個飼養細胞之0.5 L CM1培養基，並培養約8天之時段；及(iv)該方法包括藉由以下方式進行快速第二次擴增：(a)將第二TIL群體轉移至含有具有3000 IU/ml IL-2、視情況選用之第二抗生素組分、30 ng/mL OKT-3及5×10 9個飼養細胞之5 L CM2培養基的G-Rex 500MCS培養瓶中，並培養約5天；(b)藉由將10 9個TIL轉移至含有具有3000 IU/ml IL-2及視情況選用之第二抗生素組分之5 L AIM-V培養基的至多5個G-Rex 500MCS培養瓶中之每一者中而將培養物分成至多5份繼代培養物，並培養該等繼代培養物約6天。在一些前述實施例中，該方法之步驟係在約22天內完成。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在初始第一次擴增之前，將腫瘤片段或樣本中之第一TIL群體消化以產生腫瘤消化物，該消化物經歷PD-1陽性預選以產生預選的第一TIL群體，且使用預選之第一TIL群體進行初始第一次擴增。在一些實施例中，預選用於初始第一次擴增之第一TIL群體為至少75% PD-1陽性、至少80% PD-1陽性、至少85% PD-1陽性、至少90% PD-1陽性、至少95% PD-1陽性、至少98% PD-1陽性或至少99% PD-1陽性(例如在預選之後且在初始第一次擴增之前)。在一些實施例中，預選的第一TIL群體係PD-1high。在一些實施例中，預選用於初始第一次擴增之第一TIL群體為至少25% PD-1high、至少30% PD-1high、至少35% PD-1high、至少40% PD-1high、至少45% PD-1high、至少50% PD-1high、至少55% PD-1high、至少60% PD-1high、至少65% PD-1high、至少70% PD-1high、至少75% PD-1high、至少80% PD-1high、至少85% PD-1high、至少90% PD-1high、至少95% PD-1high、至少98% PD-1high或至少99% PD-1high(例如在預選之後且在初始第一次擴增之前)。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得(a)在初始第一次擴增之前，(i)在含有IL-2及視情況選用之第一抗生素組分之細胞培養基中培養腫瘤片段或樣本中之主體TIL或第一TIL群體，以產生自該等腫瘤片段或樣本釋放之TIL，(ii)將至少複數個自該等腫瘤片段或樣本釋放之TIL自該等腫瘤片段或樣本分離以產生該等腫瘤片段或樣本、該等腫瘤片段或樣本中殘留之TIL及自該等腫瘤片段或樣本釋放且在分離之後與其保持在一起之任何TIL的混合物，及(iii)視情況，將該等腫瘤片段或樣本、該等腫瘤片段或樣本中之殘留TIL及自該等腫瘤片段或樣本釋放且在分離之後與其保持在一起之任何TIL的混合物消化以產生此類混合物之消化物；及(b)使用該混合物或該混合物之消化物進行初始第一次擴增。在一些實施例中，將至少約1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或更高百分比的自腫瘤片段或樣本釋放之TIL自該等腫瘤片段或樣本分離以產生混合物。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在初始第一次擴增之前進行的培養步驟係進行約1天至約3天之時段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在初始第一次擴增之前進行的培養步驟係進行約1、2、3、4、5、6或7天之時段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得(a)在初始第一次擴增之前進行的PD-1預選步驟之前，(i)在含有IL-2及視情況選用之第一抗生素組分之細胞培養基中培養腫瘤片段或樣本中之主體TIL或第一TIL群體，以產生自該等腫瘤片段或樣本釋放之TIL，(ii)將至少複數個自該等腫瘤片段或樣本釋放之TIL自該等腫瘤片段或樣本分離以產生該等腫瘤片段或樣本、該等腫瘤片段或樣本中殘留之TIL及自該等腫瘤片段或樣本釋放且在分離之後與其保持在一起之任何TIL的混合物，及(iii)將該等腫瘤片段或樣本、該等腫瘤片段或樣本中之殘留TIL及自該等腫瘤片段或樣本釋放且在分離之後與其保持在一起之任何TIL的混合物消化以產生此類混合物之消化物；及(b)使用該混合物之消化物進行PD-1預選步驟以產生PD-1預選的第一TIL群體。在一些實施例中，將至少約1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或更高百分比的自腫瘤片段或樣本釋放之TIL自該等腫瘤片段或樣本分離以產生混合物。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在PD-1預選步驟之前進行的培養步驟係進行約1天至約3天之時段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在PD-1預選步驟之前進行的培養步驟係進行約1、2、3、4、5、6或7天之時段。
在一些實施例中，本發明提供一種擴增T細胞之方法，其包括：(a)藉由在第一抗生素組分存在下培養獲自供體之第一T細胞群體以實現該第一T細胞群體之生長且起始其活化來進行該第一T細胞群體之初始第一次擴增；(b)在步驟(a)中起始之第一T細胞群體活化開始衰退之後，藉由視情況在第二抗生素組分存在下培養該第一T細胞群體以實現該第一T細胞群體之生長並加強其活化來進行該第一T細胞群體的快速第二次擴增以獲得第二T細胞群體；及(c)收集該第二T細胞群體，其中該第一抗生素組分及視情況選用之第二抗生素組分獨立地包含：1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。在一些實施例中，將快速第二次擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以小規模培養物培養第一T細胞群體約3至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(b)實現將來自小規模培養物之第一T細胞群體轉移至比第一容器要大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，並在該第二容器中，將來自小規模培養物之第一T細胞群體以較大規模培養物培養約4至7天之時段。在一些實施例中，將快速擴增步驟分成複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以第一小規模培養物培養第一T細胞群體約3至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(b)實現將來自第一小規模培養物之第一T細胞群體轉移並分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小與第一容器相等的第二容器中，其中在各第二容器中，將轉移至此類第二容器的來自第一小規模培養物之第一T細胞群體部分以第二小規模培養物培養約4至7天之時段。在一些實施例中，將快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以小規模培養物培養第一T細胞群體約3至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(b)實現將來自小規模培養物之第一T細胞群體轉移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器要大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，將轉移至此類第二容器的來自小規模培養物之第一T細胞群體部分以較大規模培養物培養約4至7天之時段。在一些實施例中，將快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以小規模培養物培養第一T細胞群體約4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(b)實現將來自小規模培養物之第一T細胞群體轉移且分配到至少2、3或4個大小比第一容器要大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，將轉移至此類第二容器的來自小規模培養物之第一T細胞群體部分以較大規模培養物培養約5天的時段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得將快速第二次擴增之步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以小規模培養物培養第一T細胞群體約2至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(b)實現將來自小規模培養物之第一T細胞群體轉移至比第一容器要大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，並在該第二容器中，將來自小規模培養物之第一T細胞群體以較大規模培養物培養約5至7天之時段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得將快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以第一小規模培養物培養第一T細胞群體約2至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(b)實現將來自第一小規模培養物之第一T細胞群體轉移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小與第一容器相等之第二容器之中，其中在各第二容器中，將轉移至此類第二容器的來自第一小規模培養物之第一T細胞群體部分以第二小規模培養物培養約5至7天之時段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得將快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以小規模培養物培養第一T細胞群體約2至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(b)實現將來自小規模培養物之第一T細胞群體轉移且分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器要大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，將轉移至此類第二容器的來自小規模培養物之第一T細胞群體部分以較大規模培養物培養約5至7天之時段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得將快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以小規模培養物培養第一T細胞群體約3至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(b)實現將來自小規模培養物之第一T細胞群體轉移且分配到至少2、3或4個大小比第一容器要大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，將轉移至此類第二容器的來自小規模培養物之第一T細胞群體部分以較大規模培養物培養約5至6天的時段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得將快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以小規模培養物培養第一T細胞群體約3至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(b)實現將來自小規模培養物之第一T細胞群體轉移且分配到至少2、3或4個大小比第一容器要大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，將轉移至此類第二容器的來自小規模培養物之第一T細胞群體部分以較大規模培養物培養約5天的時段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得將快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以小規模培養物培養第一T細胞群體約3至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(b)實現將來自小規模培養物之第一T細胞群體轉移且分配到至少2、3或4個大小比第一容器要大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，將轉移至此類第二容器的來自小規模培養物之第一T細胞群體部分以較大規模培養物培養約6天的時段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得將快速擴增步驟分為複數個步驟以藉由以下方式達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中以小規模培養物培養第一T細胞群體約3至4天之時段來進行快速第二次擴增；且接著(b)實現將來自小規模培養物之第一T細胞群體轉移且分配到至少2、3或4個大小比第一容器要大之第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，將轉移至此類第二容器的來自小規模培養物之第一T細胞群體部分以較大規模培養物培養約7天的時段。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)之初始第一次擴增係在至多7天之時段期間進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(b)之第二次擴增係在至多8天之時段期間進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(b)之快速第二次擴增係在至多9天之時段期間進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(b)之快速第二次擴增係在至多10天之時段期間進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(b)之快速第二次擴增係在至多11天之時段期間進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)中之初始第一次擴增係在7天之時段期間進行且步驟(b)之快速第二次擴增係在至多9天之時段期間進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)中之初始第一次擴增係在7天之時段期間進行進行且步驟(b)之快速第二次擴增係在至多10天之時段期間進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)中之初始第一次擴增係在7天或8天之時段期間進行且步驟(b)之快速第二次擴增係在至多9天之時段期間進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)中之初始第一次擴增係在7天或8天之時段期間進行且步驟(b)之快速第二次擴增係在至多10天之時段期間進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)中之初始第一次擴增係在8天之時段期間進行且步驟(b)之快速第二次擴增係在至多9天之時段期間進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得步驟(a)中之初始第一次擴增係在8天之時段期間進行且步驟(b)之快速第二次擴增係在至多8天之時段期間進行。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(a)中，將第一T細胞群體在包括OKT-3及IL-2之第一培養基中培養。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一培養基包括4-1BB促效劑、OKT-3及IL-2。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一培養基包括OKT-3、IL-2及抗原呈現細胞(APC)。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一培養基包括4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及抗原呈現細胞(APC)。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，將第一T細胞群體在包括OKT-3、IL-2及抗原呈現細胞(APC)之第二培養基中培養。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第二培養基包括4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及抗原呈現細胞(APC)。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(a)中，將第一T細胞群體在包括第一透氣表面之容器中的第一培養基中培養，其中第一培養基包括OKT-3、第一抗生素組分、IL-2及第一抗原呈現細胞(APC)群體，其中第一APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的，且第一APC群體層疊至第一透氣表面上，其中在步驟(b)中，將第一T細胞群體在容器中的第二培養基中培養，其中第二培養基包括OKT-3、視情況選用之第二抗生素組分、IL-2及第二APC群體，其中第二APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的，且第二APC群體層疊至第一透氣表面上，且其中第二APC群體比第一APC群體要大。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(a)中，將第一T細胞群體在包括第一透氣表面之容器中的第一培養基中培養，其中第一培養基包括4-1BB促效劑、第一抗生素組分、OKT-3、IL-2及第一抗原呈現細胞(APC)群體，其中第一APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的，且第一APC群體層疊至第一透氣表面上，其中在步驟(b)中，將第一T細胞群體在容器中的第二培養基中培養，其中第二培養基包括OKT-3、視情況選用之第二抗生素組分、IL-2及第二APC群體，其中第二APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的，且第二APC群體層疊至第一透氣表面上，且其中第二APC群體比第一APC群體要大。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(a)中，將第一T細胞群體在包括第一透氣表面之容器中的第一培養基中培養，其中第一培養基包括OKT-3、第一抗生素組分、IL-2及第一抗原呈現細胞(APC)群體，其中第一APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的，且第一APC群體層疊至第一透氣表面上，其中在步驟(b)中，將第一T細胞群體在容器中的第二培養基中培養，其中第二培養基包括4-1BB促效劑、OKT-3、視情況選用之第二抗生素組分、IL-2及第二APC群體，其中第二APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的，且第二APC群體層疊至第一透氣表面上，且其中第二APC群體比第一APC群體要大。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(a)中，將第一T細胞群體在包括第一透氣表面之容器中的第一培養基中培養，其中第一培養基包括4-1BB促效劑、OKT-3、第一抗生素組分、IL-2及第一抗原呈現細胞(APC)群體，其中第一APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的，且第一APC群體層疊至第一透氣表面上，其中在步驟(b)中，將第一T細胞群體在容器中的第二培養基中培養，其中第二培養基包括4-1BB促效劑、OKT-3、視情況選用之第二抗生素組分、IL-2及第二APC群體，其中第二APC群體對於第一T細胞群體之供體為外源性的，且第二APC群體層疊至第一透氣表面上，且其中第二APC群體比第一APC群體要大。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第二APC群體中APC之數目與第一APC群體中APC之數目的比率係約2:1。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一APC群體中APC之數目係約2.5×10 8且第二APC群體中APC之數目係約5×10 8。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(a)中，將第一APC群體以2層APC之平均厚度層疊至第一透氣表面上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，將第二APC群體以選自4至8層APC之範圍的平均厚度層疊至第一透氣表面上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中層疊至第一透氣表面上之APC之平均層數與在步驟(a)中層疊至第一透氣表面上之APC之平均層數的比率係2:1。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(a)中，將第一APC群體以選自在或在約1.0×10 6個APC/cm 2至或至約4.5×10 6個APC/cm 2範圍之密度接種於第一透氣表面上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(a)中，將第一APC群體以選自在或在約1.5×10 6個APC/cm 2至或至約3.5×10 6個APC/cm 2範圍之密度接種於第一透氣表面上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(a)中，將第一APC群體以選自在或在約2.0×10 6個APC/cm 2至或至約3.0×10 6個APC/cm 2範圍之密度接種於第一透氣表面上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(a)中，將第一APC群體以或以約2.0×10 6個APC/cm 2之密度接種於第一透氣表面上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，將第二APC群體以選自在或在約2.5×10 6個APC/cm 2至或至約7.5×10 6個APC/cm 2範圍之密度接種於第一透氣表面上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，將第二APC群體以選自在或在約3.5×10 6個APC/cm 2至或至約6.0×10 6個APC/cm 2範圍之密度接種於第一透氣表面上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，將第二APC群體以選自在或在約4.0×10 6個APC/cm 2至或至約5.5×10 6個APC/cm 2範圍之密度接種於第一透氣表面上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(b)中，將第二APC群體以或以約4.0×10 6個APC/cm 2之密度接種於第一透氣表面上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(a)中，將第一APC群體以選自在或在約1.0×10 6個APC/cm 2至或至約4.5×10 6個APC/cm 2範圍之密度接種於第一透氣表面上，且在步驟(b)中，將第二APC群體以選自在或在約2.5×10 6個APC/cm 2至或至約7.5×10 6個APC/cm 2範圍之密度接種於第一透氣表面上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(a)中，第一APC群體以選自在或在約1.5×10 6個APC/cm 2至或至約3.5×10 6個APC/cm 2範圍之密度接種於第一透氣表面上，且在步驟(b)中，第二APC群體以選自在或在約3.5×10 6個APC/cm 2至或至約6.0×10 6個APC/cm 2範圍之密度接種於第一透氣表面上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(a)中，第一APC群體以選自在或在約2.0×10 6個APC/cm 2至或至約3.0×10 6個APC/cm 2範圍之密度接種於第一透氣表面上，且在步驟(b)中，第二APC群體以選自在或在約4.0×10 6個APC/cm 2至或至約5.5×10 6個APC/cm 2範圍之密度接種於第一透氣表面上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(a)中，第一APC群體以或以約2.0×10 6個APC/cm 2之密度接種於第一透氣表面上，且在步驟(b)中，第二APC群體以或以約4.0×10 6個APC/cm 2之密度接種於第一透氣表面上。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得APC係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得PBMC經照射且對於第一T細胞群體之供體為外源性的。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得T細胞係腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得T細胞係骨髓浸潤淋巴球(MIL)。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得T細胞係周邊血液淋巴球(PBL)。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係藉由自供體之全血分離而獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係藉由自供體之血球分離術產物分離而獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係藉由T細胞表型之正向或負向選擇而自供體之全血或血球分離術產物分離。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得T細胞表型係CD3+及CD45+。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在進行第一T細胞群體之初始第一次擴增之前，將T細胞與NK細胞分離。在一些實施例中，藉由自第一T細胞群體移除CD3-CD56+細胞，將第一T細胞群體中之T細胞與NK細胞分離。在一些實施例中，藉由使用移除CD3-CD56+細胞級份且回收陰性級份之圈選策略對第一T細胞群體進行細胞分選，自第一T細胞群體移除CD3-CD56+細胞。在一些實施例中，利用前述方法擴增以高百分比NK細胞為特徵之第一T細胞群體中的T細胞。在一些實施例中，利用前述方法擴增以高百分比CD3-CD56+細胞為特徵之第一T細胞群體中的T細胞。在一些實施例中，利用前述方法擴增以存在大量NK細胞為特徵之腫瘤組織中的T細胞。在一些實施例中，利用前述方法擴增以大量CD3-CD56+細胞為特徵之腫瘤組織中的T細胞。在一些實施例中，利用前述方法擴增自患有以存在大量NK細胞為特徵之腫瘤之患者獲得的腫瘤組織中之T細胞。在一些實施例中，利用前述方法擴增自患有以存在大量CD3-CD56+細胞為特徵之腫瘤之患者獲得的腫瘤組織中之T細胞。在一些實施例中，利用前述方法擴增自患有卵巢癌之患者獲得的腫瘤組織中之T細胞。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得將來自第一T細胞群體之剛好或約1×10 7個T細胞接種於容器中以起始在該容器中的初級第一次擴增培養。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得將第一T細胞群體分佈至複數個容器中，且在各容器中接種來自第一T細胞群體之剛好或約1×10 7個T細胞以起始在該容器中之初級第一次擴增培養。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在步驟(c)中收集的第二T細胞群體係治療性TIL群體。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的一或多個小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片、粗針穿刺活體組織切片或細針抽吸物獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的1至約20個小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片、粗針穿刺活體組織切片或細針抽吸物獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的1至10個小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片、粗針穿刺活體組織切片或細針抽吸物獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片、粗針穿刺活體組織切片或細針抽吸物獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片、粗針穿刺活體組織切片或細針抽吸物獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的一或多個粗針活體組織切片獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的1至20個粗針活體組織切片獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的1至10個粗針活體組織切片獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個粗針活體組織切片獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個粗針活體組織切片獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的一或多個細針抽吸物獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的1至20個細針抽吸物獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的1至10個細針抽吸物獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個細針抽吸物獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個細針抽吸物獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的一或多個小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的1至20個小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的1至10個小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個小活體組織切片(包含例如穿孔活體組織切片)獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的一或多個粗針穿刺活體組織切片獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的1至20個粗針穿刺活體組織切片獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的1至10個粗針穿刺活體組織切片獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個粗針穿刺活體組織切片獲得。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一T細胞群體係自來自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個粗針穿刺活體組織切片獲得。
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其包括：i)藉由在包括IL-2及第一抗生素組分之第一細胞培養基中培養獲自個體之腫瘤之一或多個小活體組織切片、粗針活體組織切片或穿刺活體組織切片的腫瘤樣本約3天，自該腫瘤樣本獲得及/或接受第一TIL群體；(ii)藉由在包括IL-2、第一抗生素組分、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之第二細胞培養基中培養該第一TIL群體來進行初始第一次擴增以產生第二TIL群體，其中該初始第一次擴增係在包括第一透氣表面區域之容器中進行，其中該初始第一次擴增係進行約7或8天之第一時段以獲得第二TIL群體，其中該第二TIL群體的數目大於第一TIL群體的數目；(iii)藉由用額外IL-2、視情況選用之第二抗生素組分、OKT-3及APC補充第二TIL群體之第二細胞培養基來進行快速第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中在快速第二次擴增中添加的APC之數目係在步驟(ii)中添加的APC之數目的至少兩倍，其中該快速第二次擴增係進行約11天之第二時段以獲得第三TIL群體，其中該第三TIL群體係治療性TIL群體，其中該快速第二次擴增係在包括第二透氣表面區域之容器中進行；(iv)收集獲自步驟(iii)之治療性TIL群體；及(v)將自步驟(iv)收集之TIL群體轉移至輸注袋中，其中抗生素的第一抗生素組分及視情況選用之第二抗生素組分獨立地包含：1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其包括：(i)藉由在包括IL-2及第一抗生素組分之第一細胞培養基中培養獲自個體之腫瘤之一或多個小活體組織切片、粗針活體組織切片或穿刺活體組織切片的腫瘤樣本約3天，自該腫瘤樣本獲得及/或接受第一TIL群體；(ii)藉由在包括IL-2、第一抗生素組分、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之第二細胞培養基中培養該第一TIL群體來進行初始第一次擴增以產生第二TIL群體，其中該初始第一次擴增係進行約7或8天之第一時段以獲得第二TIL群體，其中該第二TIL群體的數目大於第一TIL群體的數目；(iii)藉由使第二TIL群體與包括IL-2、視情況選用之第二抗生素組分、OKT-3及APC之第三細胞培養基接觸來進行快速第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中該快速第二次擴增係進行約11天之第二時段以獲得第三TIL群體，其中該第三TIL群體係治療性TIL群體；及(iv)收集獲自步驟(iii)之治療性TIL群體，其中第一抗生素組分及視情況選用之第二抗生素組分獨立地包含：1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在第二時段之第5天後，將培養物分成2份或多於2份繼代培養物，且各繼代培養物補充有額外數量之第三培養基且培養約6天。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在第二時段之第5天後，將培養物分成2份或多於2份繼代培養物，且各繼代培養物補充有包括IL-2之第四培養基且培養約6天。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得在第二時段之第5天之後，將培養物分成至多5份繼代培養物。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得該方法中之所有步驟均在約22天內完成。
在一些實施例中，本發明提供一種擴增T細胞之方法，其包括：(i)藉由在第一抗生素組分存在下培養來自供體之腫瘤的一或多個小活體組織切片、粗針活體組織切片或穿刺活體組織切片獲得的腫瘤樣本之第一T細胞群體以實現該第一T細胞群體之生長且起始其活化來進行該第一T細胞群體之初始第一次擴增；(ii)在步驟(a)中起始之第一T細胞群體活化開始衰退之後，藉由在第二抗生素組分存在下培養第一T細胞群體以實現該第一T細胞群體之生長且加強其活化來進行該第一T細胞群體之快速第二次擴增，以獲得第二T細胞群體；及(iv)收集第二T細胞群體。在一些實施例中，該腫瘤樣本係自複數個粗針活體組織切片獲得。在一些實施例中，該複數個粗針活體組織切片係選自由2、3、4、5、6、7、8、9及10個粗針活體組織切片組成的群組，其中第一抗生素組分及視情況選用之第二抗生素組分獨立地包含：1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得T細胞或TIL係獲自腫瘤消化物。。在一些實施例中，藉由在酶培養基，例如但不限於RPMI 1640、2 mM GlutaMAX、10 mg/mL建它黴素、30 U/mL去氧核糖核酸酶及1.0 mg/mL膠原蛋白酶培育腫瘤，隨後進行機械解離(GentleMACS，加利福尼亞州奧本的Miltenyi Biotec)來產生腫瘤消化物。在一些實施例中，將腫瘤置放於腫瘤解離酶混合物中，該腫瘤解離酶混合物包含一或多種解離(消化)酶，諸如但不限於膠原蛋白酶(包含任何摻合物或類型之膠原蛋白酶)、Accutase™、Accumax™、玻尿酸酶、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、酪蛋白酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶型XIV(鏈蛋白酶)、去氧核糖核酸酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制劑、任何其他解離或蛋白分解酶，及其任何組合。在其他實施例中，將腫瘤置放於腫瘤解離酶混合物中，該腫瘤解離酶混合物包含膠原蛋白酶(包含任何摻合物或類型之膠原蛋白酶)、中性蛋白酶(分散酶)及去氧核糖核酸酶I(DNA酶)。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第二抗生素組分並非視情況選用的，且第一抗生素組分及第二抗生素組分獨立地包含：1)抗生素組合，其選自本文所揭示之任何濃度的：i)建它黴素及萬古黴素；以及ii)建它黴素及克林達黴素；或2)抗生素萬古黴素。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一抗生素組分與第二抗生素組分不同。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一抗生素組分與第二抗生素組分相同。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一抗生素組分及/或第二抗生素組分包含濃度為約50 µg/mL至約600 µg/mL之抗生素萬古黴素。在例示性實施例中，第一抗生素組分及/或第二抗生素組分包含濃度為約100 µg/mL之萬古黴素。在例示性實施例中，第一抗生素組分及/或抗生素組分不包含任何額外抗生素。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一抗生素組分及/或第二抗生素組分包含約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一抗生素組分及/或第二抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一抗生素組分及/或第二抗生素組分包含約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一抗生素組分及/或第二抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素。在例示性實施例中，第一抗生素組分及/或第二抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL萬古黴素。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一抗生素組分及/或第二抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素及約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一抗生素組分及/或第二抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素、約100 µg/mL至約600 µg/mL萬古黴素及約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述之方法，該方法經改良以使得第一抗生素組分及/或第二抗生素組分包含約50 µg/mL建它黴素、約400 µg/mL至約600 µg/mL克林達黴素及約2.5 µg/mL至約10 µg/mL兩性黴素B。
在一些實施例中，在將腫瘤樣本解離或碎斷成腫瘤片段之前，將其在包括抗生素組分之洗滌緩衝液中洗滌至少一次。本文所描述之任何腫瘤洗滌緩衝液均可用於洗滌腫瘤樣本。在一些實施例中，抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。在例示性實施例中，洗滌緩衝液包括萬古黴素。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度為50 µg/mL-600 µg/mL。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係100 µg/mL。在例示性實施例中，將腫瘤樣本在洗滌緩衝液中洗滌3次或更多次。
在一些實施例中，在冷凍保存或第一次擴增之前，將腫瘤片段在包括抗生素組分之洗滌緩衝液中洗滌至少一次。本文所描述之任何腫瘤洗滌緩衝液均可用於洗滌腫瘤片段。在一些實施例中，抗生素組分包含本文所揭示之任何濃度的：1)萬古黴素；2)建它黴素及萬古黴素；或3)建它黴素及克林達黴素。在例示性實施例中，洗滌緩衝液包括萬古黴素。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度為50 µg/mL-600 µg/mL。。在例示性實施例中，萬古黴素之濃度係100 µg/mL。在例示性實施例中，將腫瘤樣本在洗滌緩衝液中洗滌3次或更多次。 XI. 治療患者之方法
治療方法始於原始TIL收集及TIL培養。此類方法已在本領域中有描述，例如以全文引用之方式併入本文中的Jin等人, 《免疫療法雜誌》, 2012, 35(3):283-292。以下整個各個部分，包含實例，描述了治療方法之實施例。
根據本文所描述之方法，包含例如以上步驟A至步驟F中所描述或根據以上步驟A至步驟F(亦如例如圖1及或圖8中所示)產生的經擴增之TIL特別適用於治療癌症患者(例如Goff等人, 《臨床腫瘤學雜誌( J. Clinical Oncology)》, 2016, 34(20):2389-239以及補充內容中所描述；以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，如先前所描述，自經切除的轉移性黑素瘤寄存物生長TIL(參見Dudley等人, 《免疫療法雜誌》, 2003, 26:332-342；以全文引用之方式併入本文中)。可在無菌條件下分割新鮮腫瘤。可收集代表樣本以用於正式病理分析。可使用2 mm 3至3 mm 3之單個片段。在一些實施例中，自每位患者獲得5、10、15、20、25或30個樣本。在一些實施例中，自每位患者獲得20、25或30個樣本。在一些實施例中，自每位患者獲得20、22、24、26或28個樣本。在一些實施例中，自每位患者獲得24個樣本。可將樣本置於24孔盤之個別孔中，維持於含高劑量IL-2(6,000 IU/mL)之生長培養基中，並監測腫瘤破壞及/或TIL增殖。如本文所描述，可將在處理後剩餘活細胞之任何腫瘤酶碎解成單細胞懸浮液並冷凍保存。
在一些實施例中，可對成功生長之TIL進行取樣以用於表型分析(CD3、CD4、CD8及CD56)，並在可用時針對自體腫瘤進行測試。若隔夜共培養產生之干擾素-γ(IFN-γ)含量˃ 200 pg/mL且為背景之兩倍，則可認為TIL具反應性。(Goff等人, 《免疫療法雜誌》, 2010, 33:840-847；以全文引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，可選擇證明具有自體反應性或充足生長模式的培養物用於第二次擴增(例如根據圖1及/或圖8之步驟D中所提供之第二次擴增)，包含有時稱為快速擴增(REP)之第二次擴增。在一些實施例中，選擇具有高自體反應性(例如在第二次擴增期間具有較高增殖)的經擴增TIL用於額外的第二次擴增。在一些實施例中，選擇具有高自體反應性(例如在如圖1及/或圖8之步驟D中所提供之第二次擴增期間具有較高增殖)之TIL用於根據圖1及/或圖8之步驟D之額外第二次擴增。
可藉由針對表面標記物CD3、CD4、CD8、CCR7及CD45RA之流動式細胞測量術(例如FlowJo)(BD BioSciences)以及藉由任何本文所描述之方法分析輸注袋TIL之冷凍保存樣本之細胞表型。藉由使用標準酶聯免疫吸附分析技術量測血清細胞介素。血清IFN-g之升高定義為˃100 pg/mL及大於4 3之基線水準。
在一些實施例中，藉由本文所提供之方法，例如圖1及/或圖8中例示之方法產生的TIL實現TIL之臨床功效的意外改善。在一些實施例中，與藉由除本文所描述之方法以外之方法(包含例如除圖1中及/或圖8中例示之方法以外的方法)產生的TIL相比，藉由本文所提供之方法，例如圖1及/或圖8中例示之方法產生的TIL展現增加之臨床功效。在一些實施例中，除本文所描述之方法外的方法包含稱為程序1C及/或第1代(Gen 1)之方法。在一些實施例中，藉由DCR、ORR及/或其他臨床反應量測增加之功效。在一些實施例中，與藉由除本文所描述之方法以外之方法(包含例如除圖1中及/或圖8中例示之方法以外的方法)產生的TIL相比，藉由本文所提供之方法，例如圖1中例示之方法產生之TIL展現類似的反應時間及安全性概況。
在一些實施例中，IFN-γ指示治療功效及/或增加之臨床功效。在一些實施例中，用TIL治療的個體之血液中之IFN-γ指示活性TIL。在一些實施例中，採用針對IFN-γ產生之效力分析。IFN-γ產生為細胞毒性潛力的另一種量度。藉由測定由本發明方法製備之TIL治療的個體之血液、血清或離體TIL中之細胞介素IFN-γ含量，可量測IFN-γ產生，該等方法包含如例如圖1及/或圖8中所描述之方法。在一些實施例中，IFN-γ增加指示對用藉由本發明方法產生之TIL治療的患者之治療功效。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之方法外的方法(包含例如除圖1及/或圖8中體現之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ增加一倍、兩倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之方法外的方法(包含例如除圖1及/或圖8中體現之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供之方法外的方法(包含例如除圖1及/或圖8中體現之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加兩倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供方法外的方法(包含例如除圖1及/或圖8中體現之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加三倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供方法外的方法(包含例如除圖1及/或圖8中體現之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加四倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供方法外的方法(包含例如除圖1及/或圖8中體現之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加五倍。在一些實施例中，IFN-γ係使用Quantikine ELISA套組量測。在一些實施例中，IFN-γ係在用藉由本發明方法，包含如例如圖1及/或圖8中所描述之方法製備之TIL治療的個體之離體TIL中量測。在一些實施例中，IFN-γ係在用藉由本發明方法，包含如例如圖1及/或圖8中所描述之方法製備之TIL治療的個體之血液中量測。在一些實施例中，IFN-γ係在用藉由本發明方法，包含如例如圖1及/或圖8中所描述之方法製備之TIL治療的個體之TIL血清中量測。在一些實施例中，IFN-γ(IFN-gamma)指示在癌症治療方面之治療功效及/或增加之臨床功效。
在一些實施例中，藉由本發明之方法，包含如例如圖1中所描述之方法製備的TIL在一些實施例中，IFN-γ(IFN-gamma)指示治療功效及/或增加之臨床功效。在一些實施例中，用TIL治療的個體之血液中之IFN-γ指示活性TIL。在一些實施例中，採用針對IFN-γ產生之效力分析。IFN-γ產生為細胞毒性潛力的另一種量度。藉由測定由本發明方法製備之TIL治療的個體之血液、血清或離體TIL中之細胞介素IFN-γ含量，可量測IFN-γ產生，該等方法包含如例如圖1及/或圖8中所描述之方法。在一些實施例中，IFN-γ增加指示對用藉由本發明方法產生之TIL治療的患者之治療功效。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文所提供方法外的方法(包含例如圖1及/或圖8中體現之方法外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ增加一倍、兩倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。
在一些實施例中，相較於藉由其他方法(包含未在圖1及/或圖8中例示之方法，包含例如稱為程序1C方法之方法)產生之TIL，藉由本發明之方法(包含如例如圖1及/或圖8中所描述之方法)製備之TIL展現增加之多株性。在一些實施例中，顯著改善之多株性及/或增加之多株性指示治療功效及/或增加之臨床功效。在一些實施例中，多株性係指T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，多株性增加可指示關於投與藉由本發明方法產生之TIL的治療功效。在一些實施例中，相較於使用除本文中提供之方法以外之方法(包含例如除圖1及/或圖8中體現之方法以外之方法)製備之TIL，多株性增加一倍、兩倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文中提供之方法以外之方法(包含例如除圖1及/或圖8中體現之方法以外之方法)製備之TIL治療之患者，多株性增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文中提供之方法以外之方法(包含例如除圖1及/或圖8中體現之方法以外之方法)製備之TIL治療之患者，多株性增加兩倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文中提供之方法以外之方法(包含例如除圖1及/或圖8中體現之方法以外之方法)製備之TIL治療之患者，多株性增加十倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文中提供之方法以外之方法(包含例如除圖1及/或圖8中體現之方法以外之方法)製備之TIL治療之患者，多株性增加100倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文中提供之方法以外之方法(包含例如除圖1及/或圖8中體現之方法以外之方法)製備之TIL治療之患者，多株性增加500倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文中提供之方法以外之方法(包含例如除圖1及/或圖8中體現之方法以外之方法)製備之TIL治療之患者，多株性增加1000倍。
如本領域已知以及本文所描述，功效之量度可包含疾病控制率(DCR)以及總反應率(ORR)。 A. 治療癌症之方法
本文所描述之組成物及方法可用於治療疾病之方法中。在一些實施例中，其用於治療成年患者或兒科患者之過度增生性病症，諸如癌症。其亦可用於治療如本文及以下段落中所描述之其他病症。
在一些實施例中，過度增生性病症為癌症。在一些實施例中，過度增生性病症為實體腫瘤癌症。在一些實施例中，實體腫瘤癌症係選自由以下組成之群組：肛門癌、膀胱癌、乳癌(包含三陰性乳癌)、骨癌、由人類乳頭狀瘤病毒(HPV)引起的癌症、中樞神經系統相關癌症(包含室管膜瘤、神經管母細胞瘤、神經母細胞瘤、松果體母細胞瘤及原始神經外胚層腫瘤)、子宮頸癌(包含鱗狀細胞子宮頸癌、腺鱗狀子宮頸癌及子宮頸腺癌)、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、食管胃交界處癌症、胃癌、胃腸癌、胃腸基質瘤、神經膠母細胞瘤、神經膠質瘤、頭頸癌(包含頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌及咽癌)、腎癌、肝癌、肺癌(包含非小細胞肺癌(NSCLC)及小細胞肺癌)、黑素瘤(包含葡萄膜黑素瘤、脈絡膜黑素瘤、睫狀體黑素瘤或虹膜黑素瘤)、間皮瘤(包含惡性胸膜間皮瘤)、卵巢癌、胰臟癌(包含胰管腺癌)、陰莖癌、直腸癌、腎癌、腎細胞癌、肉瘤(包含尤文氏肉瘤、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤以及其他骨及軟組織肉瘤)、甲狀腺癌(包含退行性甲狀腺癌)、子宮癌及陰道癌。
在一些實施例中，過度增生性病症係血液惡性病。在一些實施例中，血液惡性病係選自由以下組成的群組：慢性淋巴球性白血病、急性淋巴母細胞白血病、彌漫性大B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤及多發性骨髓瘤。在一些實施例中，本發明包含一種治療患有癌症之患者的方法，其中該癌症係血液惡性病。在一些實施例中，本發明包含一種使用經修飾以表現一或多種CCR之TIL、MIL或PBL治療患有癌症之患者的方法，其中該癌症係血液惡性病。在一些實施例中，本發明包含一種使用經修飾以表現一或多種CCR之MIL或PBL治療患有癌症之患者的方法，其中該癌症係血液惡性病。
在一些實施例中，癌症係對用至少一種先前療法(包含化學療法、放射療法或免疫療法)治療為復發性或難治性的前述癌症之一，包含實體腫瘤癌症及血液惡性病。在一些實施例中，癌症係對用至少兩種先前療法(包含化學療法、放射療法及/或免疫療法)治療為復發性或難治性的前述癌症之一。在一些實施例中，癌症係對用至少三種先前療法(包含化學療法、放射療法及/或免疫療法)治療為復發性或難治性的前述癌症之一。
在一些實施例中，癌症為高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷型(dMMR)癌症。MSI-H及dMMR癌症以及其測試已描述於Kawakami等人，《當前腫瘤學之治療選擇( Curr. Treat.Options Oncol.)》 2015, 16,30，其揭示內容皆以引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明包含一種使用經修飾以表現一或多種CCR之TIL、MIL或PBL治療患有癌症之患者的方法，其中該患者係人類。在一些實施例中，本發明包含一種使用經修飾以表現一或多種CCR之TIL、MIL或PBL治療患有癌症之患者的方法，其中該患者係非人類。在一些實施例中，本發明包含一種使用經修飾以表現一或多種CCR之TIL、MIL或PBL治療患有癌症之患者的方法，其中該患者係伴侶動物。
在一些實施例中，本發明包含一種治療患有癌症之患者的方法，其中該癌症難以用BRAF抑制劑及/或MEK抑制劑治療。在一些實施例中，本發明包含一種治療患有癌症之患者的方法，其中該癌症難以用選自由以下組成之群組的BRAF抑制劑治療：維羅非尼、達拉非尼、恩拉非尼、索拉非尼及其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物。在一些實施例中，本發明包含一種治療患有癌症之患者的方法，其中該癌症難以用選自由以下組成之群組的MEK抑制劑治療：曲美替尼、考比替尼、貝美替尼、司美替尼、匹馬色替尼(pimasertinib)、瑞法替尼及其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物。在一些實施例中，本發明包含一種治療患有癌症之患者的方法，其中該癌症難以用選自由以下組成之群組的BRAF抑制劑治療：維羅非尼、達拉非尼、恩拉非尼、索拉非尼及其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物；且難以用選自由以下組成之群組的MEK抑制劑治療：曲美替尼、考比替尼、貝美替尼、司美替尼、匹馬色替尼、瑞法替尼及其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物。
在一些實施例中，本發明包含一種治療患有癌症之患者的方法，其中該癌症係兒科癌症。
在一些實施例中，本發明包含一種治療患有癌症之患者的方法，其中該癌症係葡萄膜黑素瘤。
在一些實施例中，本發明包含一種治療患有癌症之患者的方法，其中該葡萄膜黑素瘤係脈絡膜黑素瘤、睫狀體黑素瘤或虹膜黑素瘤。
在一些實施例中，本發明包含一種治療患有癌症之患者的方法，其中該兒科癌症係神經母細胞瘤。
在一些實施例中，本發明包含一種治療患有癌症之患者的方法，其中該兒科癌症係肉瘤。
在一些實施例中，本發明包含一種治療患有癌症之患者的方法，其中該肉瘤係骨肉瘤。
在一些實施例中，本發明包含一種治療患有癌症之患者的方法，其中該肉瘤係軟組織肉瘤。
在一些實施例中，本發明包含一種治療患有癌症之患者之方法，其中該軟組織肉瘤係橫紋肌肉瘤、尤文氏肉瘤或原始神經外胚層腫瘤(PNET)。
在一些實施例中，本發明包含一種治療患有癌症之患者的方法，其中該兒科癌症係中樞神經系統(CNS)相關癌症。在一些實施例中，兒科癌症難以用化學療法治療。在一些實施例中，兒科癌症難以用放射療法治療。在一些實施例中，兒科癌症難以用迪奴圖單抗(dinutuximab)治療。
在一些實施例中，本發明包含一種治療患有癌症之患者之方法，其中CNS相關癌症係神經管母細胞瘤、松果體母細胞瘤、神經膠質瘤、室管膜瘤或神經膠母細胞瘤。
本文所描述之組成物及方法可用於治療癌症之方法中，其中癌症難以用抗PD-1或抗PD-L1抗體之先前治療或對該先前治療具有抗性。在一些實施例中，患者係抗PD-1或抗PD-L1抗體難治的原發性患者。在一些實施例中，患者未顯示出對抗PD-1或抗PD-L1抗體的先前反應。在一些實施例中，患者顯示出對抗PD-1或抗PD-L1抗體的先前反應，隨後患者之癌症進展。在一些實施例中，癌症難以用抗CTLA-4抗體及/或抗PD-1或抗PD-L1抗體與至少一種化學治療劑之組合治療。在一些實施例中，先前化學治療劑為卡鉑、太平洋紫杉醇、培美曲塞及/或順鉑。在一些先前實施例中，化學治療劑係鉑雙藥化學治療劑。在一些實施例中，鉑雙藥療法包括選自由順鉑及卡鉑組成之群組的第一化學治療劑，以及選自由長春瑞濱、吉西他濱及紫杉烷(包含例如太平洋紫杉醇、多西他賽或白蛋白結合型太平洋紫杉醇)組成之群組的第二化學治療劑。在一些實施例中，將鉑雙藥化學治療劑與培美曲塞組合。
在一些實施例中，NSCLC為PD-L1陰性及/或來自患有表現PD-L1且腫瘤比例評分(TPS)＜1%之癌症的患者，如本文別處所描述。
在一些實施例中，NSCLC難以用包括抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體及鉑雙藥療法之組合療法治療，其中該鉑雙藥療法包括： i)第一化學治療劑，其選自由順鉑及卡鉑組成之群組， ii)及第二化學治療劑，其選自由以下組成之群組：長春瑞濱、吉西他濱及紫杉烷(包含例如太平洋紫杉醇、多西他賽或白蛋白結合型太平洋紫杉醇)。
在一些實施例中，NSCLC難以用包括抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體、培美曲塞及鉑雙藥療法之組合療法治療，其中該鉑雙藥療法包括： i)第一化學治療劑，其選自由順鉑及卡鉑組成之群組， ii)及第二化學治療劑，其選自由以下組成之群組：長春瑞濱、吉西他濱及紫杉烷(包含例如太平洋紫杉醇、多西他賽或白蛋白結合型太平洋紫杉醇)。
在一些實施例中，NSCLC已用抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，NSCLC已用抗PD-L1抗體治療。在一些實施例中，NSCLC患者未曾接受治療。在一些實施例中，NSCLC未用抗PD-1抗體治療。在一些實施例中，NSCLC未用抗PD-L1抗體治療。在一些實施例中，NSCLC先前曾用化學治療劑治療。在一些實施例中，NSCLC先前曾用化學治療劑治療，但不再用該化學治療劑治療。在一些實施例中，NSCLC患者未接受抗PD-1/PD-L1治療。在一些實施例中，NSCLC患者具有低PD-L1表現。在一些實施例中，NSCLC患者未經NSCLC治療或在化學治療劑治療後，但未經抗PD-1/PD-L1治療。在一些實施例中，NSCLC患者未經治療或接受化學治療劑治療後但未經抗PD-1/PD-L1治療，且具有低PD-L1表現。在一些實施例中，NSCLC患者在基線時患有大病灶疾病。在一些實施例中，個體在基線時患有大病灶疾病且具有低PD-L1表現。在一些實施例中，NSCLC患者無可偵測之PD-L1表現。在一些實施例中，NSCLC患者未經治療或接受化學治療劑治療後但未經抗PD-1/PD-L1治療，且無可偵測之PD-L1表現。在一些實施例中，患者在基線時患有大病灶疾病且無可偵測之PD-L1表現。在一些實施例中，NSCLC患者患有未經治療的NSCLC或接受化學療法後(例如化學治療劑後)但未經抗PD-1/PD-L1治療，且該患者具有低PD-L1表現及/或在基線時具有大病灶疾病。在一些實施例中，當最大腫瘤在橫向或冠狀面中量測的直徑大於7 cm時指示為大病灶疾病。在一些實施例中，當存在短軸直徑為20 mm或更大的腫脹淋巴結時指示為大病灶疾病。在一些實施例中，化學治療劑包含NSCLC的標準護理治療劑。
在一些實施例中，PD-L1表現係藉由腫瘤比例評分測定。在一些實施例中，患有難治性NSCLC腫瘤之個體具有＜1%的腫瘤比例評分(TPS)。在一些實施例中，患有難治性NSCLC腫瘤之個體具有≥1%的TPS。在一些實施例中，患有難治性NSCLC之個體先前曾用抗PD-1抗體及/或抗PD-L1抗體治療且腫瘤比例評分係在該抗PD-1抗體及/或抗PD-L1抗體治療之前測定。在一些實施例中，患有難治性NSCLC之個體先前曾用抗PD-L1抗體治療且腫瘤比例評分係在該抗PD-L1抗體治療之前測定。
在一些實施例中，相較於藉由其他方法(包含未在圖1或圖8中例示之方法，諸如稱為程序1C方法之方法)產生之TIL，藉由本發明之方法(包含如例如圖1或圖8中所描述之方法)製備之TIL展現增加的多株性。在一些實施例中，顯著改善之多株性及/或增加之多株性指示癌症治療之治療功效及/或增加之臨床功效。在一些實施例中，多株性係指T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，多株性增加可指示關於投與藉由本發明方法產生之TIL的治療功效。在一些實施例中，相較於使用除本文中提供之方法以外之方法(包含例如除圖1或圖8中體現之方法外的方法)製備之TIL，多株性增加一倍、兩倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文中提供之方法以外之方法(包含例如除圖1或圖8中體現之方法以外之方法)製備之TIL治療之患者，多株性增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文中提供之方法以外之方法(包含例如除圖1或圖8中體現之方法以外之方法)製備之TIL治療之患者，多株性增加兩倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文中提供之方法以外之方法(包含例如除圖1或圖8中體現之方法以外之方法)製備之TIL治療之患者，多株性增加十倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文中提供之方法以外之方法(包含例如除圖1或圖8中體現之方法以外之方法)製備之TIL治療之患者，多株性增加100倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文中提供之方法以外之方法(包含例如除圖1或圖8中體現之方法以外之方法)製備之TIL治療之患者，多株性增加500倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於用使用除本文中提供之方法以外之方法(包含例如除圖1或圖8中體現之方法以外之方法)製備之TIL治療之患者，多株性增加1000倍。
在一些實施例中，PD-L1表現係使用如本文所描述之一或多種測試方法，藉由腫瘤比例評分確定。在一些實施例中，患有NSCLC腫瘤之個體或患者具有＜1%的腫瘤比例評分(TPS)。在一些實施例中，NSCLC腫瘤具有≥1%的TPS。在一些實施例中，患有NSCLC之個體或患者先前曾用抗PD-1抗體及/或抗PD-L1抗體治療且腫瘤比例評分係在該抗PD-1抗體及/或抗PD-L1抗體治療之前測定。在一些實施例中，患有NSCLC之個體或患者先前曾用抗PD-L1抗體治療且腫瘤比例評分係在該抗PD-L1抗體治療之前測定。在一些實施例中，患有難治性或耐藥性NSCLC腫瘤之個體或患者具有＜1%的腫瘤比例評分(TPS)。在一些實施例中，患有難治性或耐藥性NSCLC腫瘤之個體或患者具有≥1%的TPS。在一些實施例中，患有難治性或耐藥性NSCLC之個體或患者先前曾用抗PD-1抗體及/或抗PD-L1抗體治療且腫瘤比例評分係在該抗PD-1抗體及/或抗PD-L1抗體治療之前測定。在一些實施例中，患有難治性或耐藥性NSCLC之個體或患者先前曾用抗PD-L1抗體治療且腫瘤比例評分係在該抗PD-L1抗體治療之前測定。
在一些實施例中，NSCLC係展現腫瘤比例評分(TPS)，或在抗PD-1或抗PD-L1療法之前自患者獲取之活腫瘤細胞百分比的NSCLC，在任何強度下針對PD-L1蛋白質顯示低於1%(TPS＜1%)的部分或完全膜染色。在一些實施例中，NSCLC係展現選自由以下組成之群組之TPS的NSCLC：＜50%、＜45%、＜40%、＜35%、＜30%、＜25%、＜20%、＜15%、＜10%、＜9%、＜8%、＜7%、＜6%、＜5%、＜4%、＜3%、＜2%、＜1%、＜0.9%、＜0.8%、＜0.7%、＜0.6%、＜0.5%、＜0.4%、＜0.3%、＜0.2%、＜0.1%、＜0.09%、＜0.08%、＜0.07%、＜0.06%、＜0.05%、＜0.04%、＜0.03%、＜0.02%及＜0.01%。在一些實施例中，NSCLC係展現選自由以下組成之群組之TPS的NSCLC：約50%、約45%、約40%、約35%、約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%、約2%、約1%、約0.9%、約0.8%、約0.7%、約0.6%、約0.5%、約0.4%、約0.3%、約0.2%、約0.1%、約0.09%、約0.08%、約0.07%、約0.06%、約0.05%、約0.04%、約0.03%、約0.02%及約0.01%。在一些實施例中，NSCLC係展現出在0%與1%之間之TPS的NSCLC。在一些實施例中，NSCLC係展現出在之間之TPS的NSCLC0%與0.9%.在一些實施例中，NSCLC係展現出在0%與0.8%之間之TPS的NSCLC。在一些實施例中，NSCLC係展現出在0%與0.7%之間之TPS的NSCLC。在一些實施例中，NSCLC係展現出在0%與0.6%之間之TPS的NSCLC。在一些實施例中，NSCLC係展現出在0%與0.5%之間之TPS的NSCLC。在一些實施例中，NSCLC係展現出在0%與0.4%之間之TPS的NSCLC。在一些實施例中，NSCLC係展現出在0%與0.3%之間之TPS的NSCLC。在一些實施例中，NSCLC係展現出在0%與0.2%之間之TPS的NSCLC。在一些實施例中，NSCLC係展現出在0%與0.1%之間之TPS的NSCLC。TPS可藉由本領域中已知之方法量測，諸如描述於Hirsch等人, 《胸腫瘤學雜誌( J. Thorac.Oncol.)》 2017, 12,208-222中之方法或用於在使用帕博利珠單抗或其他抗PD-1或抗PD-L1療法治療前測定TPS之方法。亦可使用經美國食品與藥物管理局批准的用於量測TPS之方法。在一些實施例中，PD-L1係外泌體PD-L1。在一些實施例中，PD-L1見於循環腫瘤細胞上。
在一些實施例中，部分膜染色包含1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更高百分比。在一些實施例中，完全膜染色包含約100%膜染色。
在一些實施例中，針對PD-L1之測試可涉及量測患者血清中PD-L1之含量。在此等實施例中，患者血清中PD-L1之量測消除腫瘤異質性之不確定性及患者進行連續活體組織切片之不適。
在一些實施例中，相較於基線或標準水準升高之可溶性PD-L1與NSCLC的惡化之預後相關。參見例如Okuma等人, 《臨床肺癌( Clinical Lung Cancer)》, 2018, 19, 410-417；Vecchiarelli等人, 《腫瘤標靶( Oncotarget)》, 2018, 9, 17554-17563。在一些實施例中，PD-L1係外泌體PD-L1。在一些實施例中，PD-L1在循環腫瘤細胞上表現。
在一些實施例中，本發明提供一種藉由向有需要之個體或患者投與腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體來治療非小細胞肺癌(NSCLC)之方法，其中該個體或患者具有以下之至少一者： i. PD-L1之預定腫瘤比例評分(TPS)＜1%， ii. PD-L1之TPS評分為1%-49%，或 iii. 一或多個驅動突變之預定缺失，
其中驅動突變選自由以下組成的群組：EGFR突變、EGFR插入、EGFR外顯子20突變、KRAS突變、BRAF突變、ALK突變、c-ROS突變(ROS1突變)、ROS1融合、RET突變、RET融合、ERBB2突變、ERBB2擴增、BRCA突變、MAP2K1突變、PIK3CA、CDKN2A、PTEN突變、UMD突變、NRAS突變、KRAS突變、NF1突變、MET突變、MET剪接及/或改變之MET信號傳導、TP53突變、CREBBP突變、KMT2C突變、KMT2D突變、ARID1A突變、RB1突變、ATM突變、SETD2突變、FLT3突變、PTPN11突變、FGFR1突變、EP300突變、MYC突變、EZH2突變、JAK2突變、FBXW7突變、CCND3突變及GNA11突變，且其中該方法包括： (a) 藉由將自個體獲得之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該個體或患者所切除之腫瘤獲得及/或接受第一TIL群體； (b) 將第一TIL群體添加至密閉系統中； (c) 藉由在包括IL-2之細胞培養基中培養第一TIL群體來進行第一次擴增，以產生第二TIL群體，其中第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中第一次擴增係進行約3-14天以獲得第二TIL群體，且其中自步驟(b)至步驟(c)之轉變係在不打開系統之情況下發生； (d) 藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充第二TIL群體之細胞培養基來進行第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中第二次擴增係進行約7-14天以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體係治療性TIL群體，其中第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中自步驟(c)至步驟(d)之轉變係在不打開系統之情況下發生； (e) 收集自步驟(d)獲得的治療性TIL群體，其中自步驟(d)至步驟(e)之轉變係在不打開系統之情況下發生；及 (f) 將自步驟(e)收集之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(e)至步驟(f)之轉移係在不打開系統之情況下發生； (g) 使用冷凍保存程序冷凍保存來自步驟(f)的包括所收集之TIL群體之輸注袋； (h) 向該個體或患者投與治療有效劑量的來自步驟(g)中之輸注袋的第三TIL群體。
在一些實施例中，本發明提供一種藉由向有需要之患者投與腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體來治療非小細胞肺癌(NSCLC)之方法，其中該方法包括： (a) 測試患者之腫瘤中的PD-L1表現及PD-L1之腫瘤比例評分(TPS)， (b) 測試患者體內一或多個驅動突變之缺失，其中該驅動突變選自由以下組成的群組：EGFR突變、EGFR插入、EGFR外顯子20突變、KRAS突變、BRAF突變、ALK突變、c-ROS突變(ROS1突變)、ROS1融合、RET突變、RET融合、ERBB2突變、ERBB2擴增、BRCA突變、MAP2K1突變、PIK3CA、CDKN2A、PTEN突變、UMD突變、NRAS突變、KRAS突變、NF1突變、MET突變、MET剪接及/或改變之MET信號傳導、TP53突變、CREBBP突變、KMT2C突變、KMT2D突變、ARID1A突變、RB1突變、ATM突變、SETD2突變、FLT3突變、PTPN11突變、FGFR1突變、EP300突變、MYC突變、EZH2突變、JAK2突變、FBXW7突變、CCND3突變及GNA11突變， (c) 確定該患者之PD-L1之TPS評分為約1%至約49%且確定該患者亦無驅動突變， (d) 藉由將自個體獲得之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該個體或患者所切除之腫瘤獲得及/或接受第一TIL群體； (e) 將第一TIL群體添加至密閉系統中； (f) 藉由在包括IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體來進行第一次擴增以產生第二TIL群體，其中該第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中該第一次擴增係進行約3-14天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(e)至步驟(f)之轉變係在不打開系統的情況下發生； (g) 藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)補充該第二TIL群體之細胞培養基來進行第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二次擴增係進行約7-14天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體係治療性TIL群體，其中該第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中自步驟(f)至步驟(g)之轉變係在不打開系統的情況下發生； (h) 收集自步驟(d)獲得的治療性TIL群體，其中自步驟(d)至步驟(e)之轉變係在不打開系統之情況下發生；及 (i) 將自步驟(e)收集之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(e)至步驟(f)之轉移係在不打開系統之情況下發生； (j) 使用冷凍保存程序冷凍保存來自步驟(f)的包括所收集之TIL群體之輸注袋；及 (k) 向該個體或患者投與治療有效劑量的來自步驟(g)中之輸注袋的第三TIL群體。
在一些實施例中，本發明提供一種藉由向有需要之患者投與腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體來治療非小細胞肺癌(NSCLC)之方法，其中該方法包括： (a) 測試患者之腫瘤中的PD-L1表現及PD-L1之腫瘤比例評分(TPS)， (b) 測試患者體內一或多個驅動突變之缺失，其中該驅動突變選自由以下組成的群組：EGFR突變、EGFR插入、EGFR外顯子20突變、KRAS突變、BRAF突變、ALK突變、c-ROS突變(ROS1突變)、ROS1融合、RET突變、RET融合、ERBB2突變、ERBB2擴增、BRCA突變、MAP2K1突變、PIK3CA、CDKN2A、PTEN突變、UMD突變、NRAS突變、KRAS突變、NF1突變、MET突變、MET剪接及/或改變之MET信號傳導、TP53突變、CREBBP突變、KMT2C突變、KMT2D突變、ARID1A突變、RB1突變、ATM突變、SETD2突變、FLT3突變、PTPN11突變、FGFR1突變、EP300突變、MYC突變、EZH2突變、JAK2突變、FBXW7突變、CCND3突變及GNA11突變， (c) 確定該患者之PD-L1之TPS評分小於約1%且確定該患者亦無驅動突變， (d) 藉由將自個體獲得之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該個體或患者所切除之腫瘤獲得及/或接受第一TIL群體； (e) 將第一TIL群體添加至密閉系統中； (f) 藉由在包括IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體來進行第一次擴增以產生第二TIL群體，其中該第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中該第一次擴增係進行約3-14天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(e)至步驟(f)之轉變係在不打開系統的情況下發生； (g) 藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)補充該第二TIL群體之細胞培養基來進行第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二次擴增係進行約7-14天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體係治療性TIL群體，其中該第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中自步驟(f)至步驟(g)之轉變係在不打開系統的情況下發生； (h) 收集自步驟(d)獲得的治療性TIL群體，其中自步驟(d)至步驟(e)之轉變係在不打開系統之情況下發生；及 (i) 將自步驟(e)收集之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(e)至步驟(f)之轉移係在不打開系統之情況下發生； (j) 使用冷凍保存程序冷凍保存來自步驟(f)的包括所收集之TIL群體之輸注袋； (k) 向該個體或患者投與治療有效劑量的來自步驟(g)中之輸注袋的第三TIL群體。
在一些實施例中，本發明提供一種藉由向有需要之患者投與腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體來治療非小細胞肺癌(NSCLC)之方法，其中該方法包括： (a) 測試患者之腫瘤中的PD-L1表現及PD-L1之腫瘤比例評分(TPS)， (b) 測試該患者體內一或多個驅動突變之缺失，其中該驅動突變選自由以下組成的群組：EGFR突變、EGFR插入、KRAS突變、BRAF突變、ALK突變、c-ROS突變(ROS1突變)、ROS1融合、RET突變或RET融合， (c) 確定該患者之PD-L1之TPS評分為約1%至約49%且確定該患者亦無驅動突變， (d) 藉由將自個體獲得之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該個體或患者所切除之腫瘤獲得及/或接受第一TIL群體； (e) 將第一TIL群體添加至密閉系統中； (f) 藉由在包括IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體來進行第一次擴增以產生第二TIL群體，其中該第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中該第一次擴增係進行約3-14天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(e)至步驟(f)之轉變係在不打開系統的情況下發生； (g) 藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)補充該第二TIL群體之細胞培養基來進行第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二次擴增係進行約7-14天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體係治療性TIL群體，其中該第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中自步驟(f)至步驟(g)之轉變係在不打開系統的情況下發生； (h) 收集自步驟(d)獲得的治療性TIL群體，其中自步驟(d)至步驟(e)之轉變係在不打開系統之情況下發生；及 (i) 將自步驟(e)收集之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(e)至步驟(f)之轉移係在不打開系統之情況下發生； (j) 使用冷凍保存程序冷凍保存來自步驟(f)的包括所收集之TIL群體之輸注袋； (k) 向該個體或患者投與治療有效劑量的來自步驟(g)中之輸注袋的第三TIL群體。
在一些實施例中，本發明提供一種藉由向有需要之患者投與腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體來治療非小細胞肺癌(NSCLC)之方法，其中該方法包括： (a) 測試患者之腫瘤中的PD-L1表現及PD-L1之腫瘤比例評分(TPS)， (b) 測試該患者體內一或多個驅動突變之缺失，其中該驅動突變選自由以下組成的群組：EGFR突變、EGFR插入、KRAS突變、BRAF突變、ALK突變、c-ROS突變(ROS1突變)、ROS1融合、RET突變或RET融合， (c) 確定該患者之PD-L1之TPS評分小於約1%且確定該患者亦無驅動突變， (d) 藉由將自個體獲得之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而自該個體或患者所切除之腫瘤獲得及/或接受第一TIL群體； (e) 將第一TIL群體添加至密閉系統中； (f) 藉由在包括IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體來進行第一次擴增以產生第二TIL群體，其中該第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中該第一次擴增係進行約3-14天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(e)至步驟(f)之轉變係在不打開系統的情況下發生； (g) 藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈遞細胞(APC)補充該第二TIL群體之細胞培養基來進行第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二次擴增係進行約7-14天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體係治療性TIL群體，其中該第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中自步驟(f)至步驟(g)之轉變係在不打開系統的情況下發生； (h) 收集自步驟(d)獲得的治療性TIL群體，其中自步驟(d)至步驟(e)之轉變係在不打開系統之情況下發生；及 (i) 將自步驟(e)收集之TIL群體轉移至輸注袋，其中自步驟(e)至步驟(f)之轉移係在不打開系統之情況下發生； (j) 使用冷凍保存程序冷凍保存來自步驟(f)的包括所收集之TIL群體之輸注袋；及 (k) 向該個體或患者投與治療有效劑量的來自步驟(g)中之輸注袋的第三TIL群體。
在其他實施例中，本發明提供一種用於治療患有癌症之個體之方法，其包括向該個體投與治療有效劑量的本文所描述之治療性TIL群體。
在其他實施例中，本發明提供一種用於治療患有癌症之個體之方法，其包括向該個體投與治療有效劑量的本文所描述之TIL組成物。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得在分別投與治療有效劑量的本文所描述之治療性TIL群體及TIL組成物之前，已向個體投與非骨髓清除式淋巴球耗盡方案。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：每天投與60 mg/m2劑量之環磷醯胺持續兩天，隨後每天投與25 mg/m2劑量之氟達拉濱，持續五天。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以進一步包括在向個體投與TIL細胞之後當天開始用高劑量IL-2方案治療個體的步驟。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得高劑量IL-2方案包括每八小時以15分鐘推注靜脈內輸注投與600,000或720,000 IU/kg，直至產生耐受性。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為實體腫瘤。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為黑素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(包含GBM)、胃腸癌、腎癌或腎細胞癌。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為黑素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠母細胞瘤(包含GBM)及胃腸癌。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為黑素瘤。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為HNSCC。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為子宮頸癌。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為NSCLC。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為神經膠母細胞瘤(包含GBM)。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為胃腸癌。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為高突變癌症。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為兒科高突變癌症。
在其他實施例中，本發明提供一種用於治療患有癌症之個體之方法中的本文所描述之治療性TIL群體，其包含向該個體投與治療有效劑量之治療性TIL群體。
在其他實施例中，本發明提供一種用於治療患有癌症之個體之方法中的本文所描述之TIL組成物，該方法包括向該個體投與治療有效劑量的TIL組成物。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述之治療性TIL群體或本文所描述之TIL組成物，該治療性TIL群體或TIL組成物經改良以使得在向該個體投與治療有效劑量的本文所描述之治療性TIL群體或本文所描述之TIL組成物之前，已向個體投與非骨髓清除式淋巴球耗盡方案。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述之治療性TIL群體或TIL組成物，該治療性TIL群體或TIL組成物經改良以使得非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：每天投與60 mg/m2劑量之環磷醯胺，持續兩天，隨後每天投與25 mg/m2劑量之氟達拉濱，持續五天。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述之治療性TIL群體或TIL組成物，該治療性TIL群體或TIL組成物經改良以進一步包括在向患者投與TIL細胞之後當天開始，用高劑量IL-2方案治療患者的步驟。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述之治療性TIL群體或TIL組成物，該治療性TIL群體或TIL組成物經改良以使得高劑量IL-2方案包括每八小時以15分鐘推注靜脈內輸注形式投與600,000或720,000 IU/kg，直至產生耐受性。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述之治療性TIL群體或TIL組成物，該治療性TIL群體或TIL組成物經改良以使得癌症為實體腫瘤。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述之治療性TIL群體或TIL組成物，該治療性TIL群體或TIL組成物經改良以使得癌症為黑素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(包含GBM)、胃腸癌、腎癌或腎細胞癌。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述之治療性TIL群體或TIL組成物，該治療性TIL群體或TIL組成物經改良以使得癌症為黑素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠母細胞瘤(包含GBM)及胃腸癌。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述之治療性TIL群體或TIL組成物，該治療性TIL群體或TIL組成物經改良以使得癌症為黑素瘤。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述之治療性TIL群體或TIL組成物，該治療性TIL群體或TIL組成物經改良以使得癌症為HNSCC。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述之治療性TIL群體或TIL組成物，該治療性TIL群體或TIL組成物經改良以使得癌症為子宮頸癌。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述之治療性TIL群體或TIL組成物，該治療性TIL群體或TIL組成物經改良以使得癌症為NSCLC。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述之治療性TIL群體或TIL組成物，該治療性TIL群體或TIL組成物經改良以使得癌症為神經膠母細胞瘤。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述之治療性TIL群體或TIL組成物，該治療性TIL群體或TIL組成物經改良以使得癌症為胃腸癌。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述之治療性TIL群體或TIL組成物，該治療性TIL群體或TIL組成物經改良以使得癌症為高突變癌症。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述之治療性TIL群體或TIL組成物，該治療性TIL群體或TIL組成物經改良以使得癌症為兒科高突變癌症。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述之治療性TIL群體在治療個體之癌症之方法中的用途，該方法包括向該個體投與治療有效劑量之治療性TIL群體。
在其他實施例中，本發明提供任何前述段落中描述之組成物在治療個體之癌症之方法中的用途，該方法包括向該個體投與治療有效劑量之TIL組成物。
在其他實施例中，本發明提供本文所描述之治療性TIL群體或本文所描述之TIL組成物在治療患者之癌症之方法中的用途，該方法包括向患者投與非骨髓清除式淋巴球耗盡方案，且接著向該個體投與治療有效劑量的任何前述段落中描述之治療性TIL群體或治療有效劑量的本文所描述之TIL組成物。 1.與PD-1及PD-L1抑制劑之組合
在一些實施例中，向癌症患者提供之TIL療法可包含單獨用治療性TIL群體治療，或可包含組合治療，該組合治療包含TIL及一或多種PD-1及/或PD-L1抑制劑。
計劃性死亡蛋白1(PD-1)係由T細胞、B細胞、自然殺手(NK)T細胞、活化單核球及樹突狀細胞表現的288個胺基酸之跨膜免疫檢查點受體蛋白。PD-1，又稱為CD279，屬於CD28家族，且在人體中係由2號染色體上之Pdcd1基因編碼。PD-1由一個免疫球蛋白(Ig)超家族域、跨膜區及細胞內域組成，該細胞內域含有免疫受體酪胺酸抑制模體(ITIM)及免疫受體酪胺酸轉換模體(ITSM)。已知PD-1及其配體(PD-L1及PD-L2)在免疫耐受性中起到重要作用，如Keir等人, 《免疫學年度評論( Annu. Rev. Immunol.)》 2008, 26, 677-704中所描述。PD-1提供負向調節T細胞免疫反應的抑制信號。PD-L1(又稱為B7-H1或CD274)及PD-L2(又稱為B7-DC或CD273)在腫瘤細胞及基質細胞上表現，其可能遇到表現PD-1之活化T細胞，導致對T細胞之免疫抑制。PD-L1係由人類9號染色體上之Cd274基因編碼的290個胺基酸之跨膜蛋白。使用PD-1抑制劑、PD-L1抑制劑及/或PD-L2抑制劑阻斷PD-1與其配體PD-L1及PD-L2之間的相互作用，可克服免疫抗性，如近期臨床研究，諸如Topalian等人, 《新英格蘭醫學雜誌( N. Eng. J. Med.)》 2012, 366, 2443-54中所描述之研究所展示。PD-L1表現於許多腫瘤細胞株上，而PD-L2表現於主要地表現於樹突狀細胞及一些腫瘤株上。除T細胞(其在活化後誘導性表現PD-1)以外，PD-1亦表現於B細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、活化單核球及樹突狀細胞上。
在一些實施例中，TIL及PD-1抑制劑係作為組合療法或輔助療法投與以用於治療NSCLC。
在一些實施例中，NSCLC未經歷先前療法。在一些實施例中，PD-1抑制劑係作為一線療法或初始療法投與。在一些實施例中，PD-1抑制劑係作為一線療法或初始療法與如本文所描述之TIL組合投與。
在一些實施例中，PD-1抑制劑可為本領域已知的任何PD-1抑制劑或PD-1阻斷劑。詳言之，其為在以下段落中更詳細描述的PD-1抑制劑或阻斷劑之一。關於PD-1抑制劑，術語「抑制劑」、「拮抗劑」及「阻斷劑」在本文中可互換使用。為了避免疑問，本文中提及的作為抗體之PD-1抑制劑可指化合物或其抗原結合片段、變體、結合物或生物類似物。為了避免疑問，本文中提及的PD-1抑制劑時亦可指小分子化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯、溶劑合物、水合物、共晶體或前藥。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為抗體(亦即，抗PD-1抗體)、其片段，包含其Fab片段或單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中，PD-1抑制劑為多株抗體。在一些實施例中，PD-1抑制劑為單株抗體。在一些實施例中，PD-1抑制劑競爭結合PD-1，及/或結合至PD-1上之抗原決定基。在一些實施例中，抗體競爭結合PD-1，及/或結合至PD-1上之抗原決定基。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為如下PD-1抑制劑，該PD-1抑制劑以約100 pM或更低之KD結合人類PD-1、以約90 pM或更低之KD結合人類PD-1、以約80 pM或更低之KD結合人類PD-1、以約70 pM或更低之KD結合人類PD-1、以約60 pM或更低之KD結合人類PD-1、以約50 pM或更低之KD結合人類PD-1、以約40 pM或更低之KD結合人類PD-1、以約30 pM或更低之KD結合人類PD-1、以約20 pM或更低之KD結合人類PD-1、以約10 pM或更低之KD結合人類PD-1，或以約1 pM或更低之KD結合人類PD-1。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為如下PD-1抑制劑，該PD-1抑制劑以約7.5×10 5l/M·s或更快之k assoc結合至人類PD-1、以約7.5×10 51/M·s或更快之k assoc結合至人類PD-1、以約8×10 51/M·s或更快之k assoc結合至人類PD-1、以約8.5×10 51/M·s或更快之k assoc結合至人類PD-1、以約9×10 51/M·s或更快之k assoc結合至人類PD-1、以約9.5×10 5l/M·s或更快之k assoc結合至人類PD-1，或以約1×10 6l/M·s或更快之k assoc結合至人類PD-1。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為如下PD-1抑制劑，該PD-1抑制劑以約2×10 -51/s或更慢之k dissoc結合至人類PD-1、以約2.1×10 -51/s或更慢之k dissoc結合至人類PD-1、以約2.2×10 -51/s或更慢之k dissoc結合至人類PD-1、以約2.3×10 -51/s或更慢之k dissoc結合至人類PD-1、以約2.4×10 -51/s或更慢之k dissoc結合至人類PD-1、以約2.5×10 -51/s或更慢之k dissoc結合至人類PD-1、以約2.6×10 -51/s或更慢之k dissoc結合至人類PD-1，或以約2.7×10 -51/s或更慢之k dissoc結合至人類PD-1、以約2.8×10 -51/s或更慢之k dissoc結合至人類PD-1、以約2.9×10 -51/s或更慢之k dissoc結合至人類PD-1，或以約3×10 -51/s或更慢之k dissoc結合至人類PD-1。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為如下PD-1抑制劑，該PD-1抑制劑以約10 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約9 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約8 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約7 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約6 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約5 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約4 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約3 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約2 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合，或以約1 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為納武單抗(可自Bristol-Myers Squibb Co.以OPDIVO商購)或其生物類似物、抗原結合片段、結合物或變體。納武單抗為阻斷PD-1受體之完全人類IgG4抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體為免疫球蛋白G4κ抗(人類CD274)抗體。納武單抗被指定化學文摘社(CAS)登記號946414-94-4且亦稱為5C4、BMS-936558、MDX-1106及ONO-4538。納武單抗之製備及特性描述於美國專利第8,008,449號及國際專利公開案第WO 2006/121168號中，該等專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。納武單抗在各種形式癌症中的臨床安全性及功效已描述於Wang等人, 《癌症免疫學研究( Cancer Immunol Res.)》 2014, 2,846-56；Page等人 ,《醫學年度評論( Ann. Rev. Med.)》, 2014, 65, 185-202；及Weber等人, 《臨床腫瘤學雜誌( J. Clin.Oncology)》, 2013, 31, 4311-4318中，該等文獻之揭示內容以引用之方式併入本文中。納武單抗之胺基酸序列闡述於表18中。納武單抗在22-96、140-196、254-314、360-418、22''-96''、140''-196''、254''-314''及360''-418''處具有重鏈內雙硫鍵；在23'-88'、134'-194'、23'''-88'''及134'''-194'''處具有輕鏈內雙硫鍵；在127-214'、127''-214'''處具有重鏈-輕鏈間雙硫鍵；在219-219''及222-222''處具有重鏈-重鏈間雙硫鍵；且在290、290''處具有N-糖基化位點(H CH2 84.4)。
在一些實施例中，PD-1抑制劑包括SEQ ID NO:158所示之重鏈及SEQ ID NO: 159所示之輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:158及SEQ ID NO:159中所示之序列的重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:158及SEQ ID NO:159中所示之序列至少99%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO: 158及SEQ ID NO: 159中所示之序列至少98%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO: 158及SEQ ID NO: 159中所示之序列至少97%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO: 158及SEQ ID NO: 159中所示之序列至少96%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO: 158及SEQ ID NO: 159中所示之序列至少95%一致的重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，PD-1抑制劑包括納武單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，PD-1抑制劑重鏈可變區(V H)包括SEQ ID NO:160中所示之序列，且PD-1抑制劑輕鏈可變區(V L)包括SEQ ID NO:161中所示之序列，或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:160及SEQ ID NO:161中所示之序列至少99%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:160及SEQ ID NO:161中所示之序列至少98%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:160及SEQ ID NO:161中所示之序列至少97%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:160及SEQ ID NO:161中所示之序列至少96%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:160及SEQ ID NO:161中所示之序列至少95%一致的V H區及V L區。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163及SEQ ID NO:164中所示之序列及其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166及SEQ ID NO:167中所示之序列及其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。在一些實施例中，抗體競爭以與以下結合及/或結合至以下：PD-1上與任何前述抗體相同之抗原決定基。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為藥物管理機構參考納武單抗核准之抗PD-1生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物包括抗PD-1抗體，該抗PD-1抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為納武單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自以下之一者或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之抗PD-1抗體，其中該抗PD-1抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為納武單抗。抗PD-1抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為納武單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為納武單抗。
Figure 02_image043
在一些實施例中，PD-1抑制劑為納武單抗或其生物類似物，且納武單抗係以約0.5 mg/kg至約10 mg/kg之劑量投與。在一些實施例中，PD-1抑制劑為納武單抗或其生物類似物，且納武單抗係以如下劑量投與：約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約1.5 mg/kg、約2 mg/kg、約2.5 mg/kg、約3 mg/kg、約3.5 mg/kg、約4 mg/kg、約4.5 mg/kg、約5 mg/kg、約5.5 mg/kg、約6 mg/kg、約6.5 mg/kg、約7 mg/kg、約7.5 mg/kg、約8 mg/kg、約8.5 mg/kg、約9 mg/kg、約9.5 mg/kg或約10 mg/kg。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始納武單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始納武單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與納武單抗。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為納武單抗或其生物類似物，且納武單抗係以約200 mg至約500 mg之劑量投與。在一些實施例中，PD-1抑制劑為納武單抗或其生物類似物，且納武單抗係以如下劑量投與：約200 mg、約220 mg、約240 mg、約260 mg、約280 mg、約300 mg、約320 mg、約340 mg、約360 mg、約380 mg、約400 mg、約420 mg、約440 mg、約460 mg、約480 mg或約500 mg。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始納武單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始納武單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與納武單抗。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為納武單抗或其生物類似物，且每2週、每3週、每4週、每5週或每6週投與納武單抗。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始納武單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始納武單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與納武單抗。
在一些實施例中，投與納武單抗以治療不可切除性或轉移性黑素瘤。在一些實施例中，投與納武單抗以治療不可切除性或轉移性黑素瘤，且每2週以約240 mg進行投與。在一些實施例中，投與納武單抗以治療不可切除性或轉移性黑素瘤，且每4週以約480 mg進行投與。在一些實施例中，投與納武單抗以治療不可切除性或轉移性黑素瘤，且每3週於同一天投與約1 mg/kg納武單抗，隨後投與3 mg/kg伊匹木單抗，持續4次劑量，隨後每2週投與240 mg或每4週投與480 mg納武單抗。
在一些實施例中，投與納武單抗以輔助治療黑素瘤。在一些實施例中，每2週以約240 mg投與納武單抗以輔助治療黑素瘤。在一些實施例中，每4週以約480 mg投與納武單抗以輔助治療黑素瘤。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始納武單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始納武單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與納武單抗。
在一些實施例中，投與納武單抗以治療轉移性非小細胞肺癌。在一些實施例中，每2週以約3 mg/kg投與納武單抗且每6週以約1 mg/kg投與伊匹木單抗，以治療轉移性非小細胞肺癌。在一些實施例中，每3週以約360 mg投與納武單抗，加上每6週1 mg/kg伊匹木單抗與2個週期之含鉑雙重化療，以治療轉移性非小細胞肺癌。在一些實施例中，每2週以約240 mg或每4週以480 mg投與納武單抗以治療轉移性非小細胞肺癌。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始納武單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始納武單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與納武單抗。
在一些實施例中，投與納武單抗以治療小細胞肺癌。在一些實施例中，每2週以約240 mg投與納武單抗以治療小細胞肺癌。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始納武單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始納武單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與納武單抗。
在一些實施例中，每3週以約360 mg投與納武單抗且每6週投與1 mg/kg伊匹木單抗，以治療惡性胸膜間皮瘤。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始納武單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始納武單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與納武單抗。
在一些實施例中，投與納武單抗以治療晚期腎細胞癌。在一些實施例中，每2週以約240 mg投與納武單抗以治療晚期腎細胞癌。在一些實施例中，每4週以約480 mg投與納武單抗以治療晚期腎細胞癌。在一些實施例中，以約3 mg/kg投與納武單抗，隨後每3週在同一天以約1 mg/kg投與伊匹木單抗達4次劑量，隨後每2週投與240 mg納武單抗，以治療晚期腎細胞癌。在一些實施例中，以約3 mg/kg投與納武單抗，隨後每3週在同一天以約1 mg/kg投與伊匹木單抗達4次劑量，隨後每2週投與240 mg、每4週投與480 mg納武單抗，以治療晚期腎細胞癌。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始納武單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始納武單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與納武單抗。
在一些實施例中，投與納武單抗以治療典型霍奇金氏淋巴瘤。在一些實施例中，每2週以約240 mg投與納武單抗以治療典型霍奇金氏淋巴瘤。在一些實施例中，每4週以約480 mg投與納武單抗以治療典型霍奇金氏淋巴瘤。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始納武單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始納武單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與納武單抗。
在一些實施例中，投與納武單抗以治療復發性或轉移性頭頸鱗狀細胞癌。在一些實施例中，每2週以約240 mg投與納武單抗以治療復發性或轉移性頭頸鱗狀細胞癌。在一些實施例中，每4週以約480 mg投與納武單抗以治療復發性或轉移性頭頸鱗狀細胞癌。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始納武單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始納武單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與納武單抗。
在一些實施例中，每2週以約240 mg投與納武單抗以治療局部晚期或轉移性尿道上皮癌。在一些實施例中，每4週以約480 mg投與納武單抗以治療局部晚期或轉移性尿道上皮癌。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始納武單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始納武單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前) 1、2或3週投與納武單抗。
在一些實施例中，投與納武單抗以治療高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，投與納武單抗以治療成年及兒科患者之高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷型(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，每2週以約240 mg投與納武單抗以治療≥40 kg之成人及兒科患者之高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷型(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，每4週以約480 mg投與納武單抗以治療≥40 kg之成人及兒科患者之高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷型(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始納武單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始納武單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與納武單抗。
在一些實施例中，每2週以約3 mg/kg投與納武單抗以治療＜40 kg之兒科患者之高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷型(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，以約3 mg/kg投與納武單抗，隨後每3週在同一天投與1 mg/kg伊匹木單抗達4次劑量，隨後每2週投與240 mg納武單抗，以治療≥40 kg之成人及兒科患者之高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷型(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，以約3 mg/kg投與納武單抗，隨後每3週在同一天投與1 mg/kg伊匹木單抗達4次劑量，隨後每4週投與480 mg納武單抗，以治療≥40 kg之成人及兒科患者之高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷型(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始納武單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始納武單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與納武單抗。
在一些實施例中，投與納武單抗以治療肝細胞癌。在一些實施例中，每2週以約240 mg投與納武單抗以治療肝細胞癌。在一些實施例中，每4週以約480 mg投與納武單抗以治療肝細胞癌。在一些實施例中，以約1 mg/kg投與納武單抗，隨後每3週在同一天投與3 mg/kg伊匹木單抗達4次劑量，隨後每2週投與納武單抗240 mg，以治療肝細胞癌。在一些實施例中，以約1 mg/kg投與納武單抗，隨後每3週在同一天投與3 mg/kg伊匹木單抗達4次劑量，隨後每4週投與480 mg納武單抗，以治療肝細胞癌。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始納武單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始納武單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與納武單抗。
在一些實施例中，投與納武單抗以治療食道鱗狀細胞癌。在一些實施例中，每2週以約240 mg投與納武單抗以治療食道鱗狀細胞癌。在一些實施例中，每4週以約480 mg投與納武單抗以治療食道鱗狀細胞癌。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始納武單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始納武單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與納武單抗。
在一些實施例中，PD-1抑制劑包括帕博利珠單抗(可自美國新澤西州凱尼爾沃思(Kenilworth, NJ, USA)之Merck & Co., Inc.以KEYTRUDA商購)或抗原結合片段、結合物或變體。帕博利珠單抗被指定CAS登記號1374853-91-4且亦稱為蘭立珠單抗、MK-3475及SCH-900475。帕博利珠單抗具有免疫球蛋白G4抗(人類蛋白PDCD1(計劃性細胞死亡1))抗體、含(人類家鼷鼠單株重鏈)雙硫鍵與人類家鼷鼠單株輕鏈二聚體結構。帕博利珠單抗之結構亦可描述為免疫球蛋白G4抗(人類計劃性細胞死亡1)抗體；含人類化小鼠單株[228-L-脯胺酸(H10-S＞P)]γ4重鏈(134-218')雙硫鍵與人類化小鼠單株κ輕鏈二聚體(226-226'':229-229'')雙二硫鍵。帕博利珠單抗之特性、用途及製備描述於國際專利公開案第WO 2008/156712 A1號、美國專利第8,354,509號以及美國專利申請公開案第US 2010/0266617 A1號、第US 2013/0108651 A1號及第US 2013/0109843 A2號中，該等專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。帕博利珠單抗在各種形式之癌症中的臨床安全性及功效描述於Fuerst, 《腫瘤學時報( Oncology Times)》, 2014, 36, 35-36；Robert等人, 《柳葉刀( Lancet)》, 2014, 384, 1109-17；及Thomas等人, 《生物治療專家意見( Exp. Opin.Biol. Ther.)》, 2014, 14, 1061-1064中。帕博利珠單抗之胺基酸序列闡述於表19中。帕博利珠單抗包含以下雙硫鍵：22-96、22''-96''、23'-92'、23'''-92'''、134-218'、134''-218'''、138'-198'、138'''-198'''、147-203、147''-203''、226-226''、229-229''、261-321、261''-321''、367-425及367''-425''；以及以下糖基化位點(N)：Asn-297及Asn-297''。帕博利珠單抗為在Fc區中含穩定化S228P突變的IgG4/κ同型；IgG4鉸鏈區中此突變之插入防止形成IgG4抗體通常觀測到之半分子。帕博利珠單抗在各重鏈之Fc域內於Asn297處異質糖基化，使得完整抗體之分子量為大約149 kDa。帕博利珠單抗之主要糖型為岩藻糖基化去半乳糖基雙線聚糖形式(G0F)。
在一些實施例中，PD-1抑制劑包括SEQ ID NO:168所示之重鏈及SEQ ID NO:169所示之輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:168及SEQ ID NO:169中所示之序列的重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:168及SEQ ID NO:169中所示之序列至少99%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO: 168及SEQ ID NO: 169中所示之序列至少98%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO: 168及SEQ ID NO: 169中所示之序列至少97%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO: 168及SEQ ID NO: 169中所示之序列至少96%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO: 168及SEQ ID NO: 169中所示之序列至少95%一致的重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，PD-1抑制劑包括帕博利珠單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，PD-1抑制劑重鏈可變區(V H)包括SEQ ID NO:170中所示之序列，且PD-1抑制劑輕鏈可變區(V L)包括SEQ ID NO:171中所示之序列，或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO: 170及SEQ ID NO:171中所示之序列至少99%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:170及SEQ ID NO:171中所示之序列至少98%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:170及SEQ ID NO:171中所示之序列至少97%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:170及SEQ ID NO:171中所示之序列至少96%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，PD-1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:170及SEQ ID NO:171中所示之序列至少95%一致的V H區及V L區。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173及SEQ ID NO:174中所示之序列或其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176及SEQ ID NO:177中所示之序列或其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。在一些實施例中，抗體競爭以與以下結合及/或結合至以下：PD-1上與任何前述抗體相同之抗原決定基。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為藥物管理機構參考帕博利珠單抗核准之抗PD-1生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物包括抗PD-1抗體，該抗PD-1抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為帕博利珠單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自以下中之一或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之抗PD-1抗體，其中該抗PD-1抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為帕博利珠單抗。抗PD-1抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為帕博利珠單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為帕博利珠單抗。
Figure 02_image045
在一些實施例中，PD-1抑制劑為帕博利珠單抗或其生物類似物，且帕博利珠單抗係以約0.5 mg/kg至約10 mg/kg之劑量投與。在一些實施例中，PD-1抑制劑為帕博利珠單抗或其生物類似物，且帕博利珠單抗係以如下劑量投與：約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約1.5 mg/kg、約2 mg/kg、約2.5 mg/kg、約3 mg/kg、約3.5 mg/kg、約4 mg/kg、約4.5 mg/kg、約5 mg/kg、約5.5 mg/kg、約6 mg/kg、約6.5 mg/kg、約7 mg/kg、約7.5 mg/kg、約8 mg/kg、約8.5 mg/kg、約9 mg/kg、約9.5 mg/kg或約10 mg/kg。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為帕博利珠單抗或其生物類似物，其中帕博利珠單抗係以約200 mg至約500 mg之劑量投與。在一些實施例中，PD-1抑制劑為帕博利珠單抗或其生物類似物，且納武單抗係以如下劑量投與：約200 mg、約220 mg、約240 mg、約260 mg、約280 mg、約300 mg、約320 mg、約340 mg、約360 mg、約380 mg、約400 mg、約420 mg、約440 mg、約460 mg、約480 mg或約500 mg。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為帕博利珠單抗或其生物類似物，其中每2週、每3週、每4週、每5週或每6週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，投與帕博利珠單抗以治療黑素瘤。在一些實施例中，每3週以約200 mg投與帕博利珠單抗以治療黑素瘤。在一些實施例中，每6週以約400 mg投與帕博利珠單抗以治療黑素瘤。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，投與帕博利珠單抗以治療NSCLC。在一些實施例中，每3週以約200 mg投與帕博利珠單抗以治療NSCLC。在一些實施例中，每6週以約400 mg投與帕博利珠單抗以治療NSCLC。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，投與帕博利珠單抗以治療小細胞肺癌(SCLC)。在一些實施例中，每3週以約200 mg投與帕博利珠單抗以治療SCLC。在一些實施例中，每6週以約400 mg投與帕博利珠單抗以治療SCLC。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，投與帕博利珠單抗以治療頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)。在一些實施例中，每3週以約200 mg投與帕博利珠單抗以治療HNSCC。在一些實施例中，每6週以約400 mg投與帕博利珠單抗以治療HNSCC。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投與帕博利珠單抗以治療典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些實施例中，成人每6週以約400 mg投與帕博利珠單抗以治療典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些實施例中，兒科每3週以約2 mg/kg(至多200 mg)投與帕博利珠單抗以治療典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投與帕博利珠單抗以治療尿道上皮癌。在一些實施例中，每6週以約400 mg投與帕博利珠單抗以治療尿道上皮癌。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投與帕博利珠單抗以治療高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)癌。在一些實施例中，成人每6週以約400 mg投與帕博利珠單抗以治療MSI-H或dMMR癌。在一些實施例中，兒科每3週以約2 mg/kg(至多200 mg)投與帕博利珠單抗以治療MSI-H或dMMR癌。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投與帕博利珠單抗以治療高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷結腸直腸癌(dMMR CRC。在一些實施例中，每6週以約400 mg投與帕博利珠單抗以治療MSI-H或dMMR CRC。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投與帕博利珠單抗以治療胃癌。在一些實施例中，每6週以約400 mg投與帕博利珠單抗以治療胃癌。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投與帕博利珠單抗以治療食道癌。在一些實施例中，每6週以約400 mg投與帕博利珠單抗以治療食道癌。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投與帕博利珠單抗以治療子宮頸癌。在一些實施例中，每6週以約400 mg投與帕博利珠單抗以治療子宮頸癌。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投與帕博利珠單抗以治療肝細胞癌(HCC)。在一些實施例中，每6週以約400 mg投與帕博利珠單抗以治療HCC。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，成人每3週以約200 mg投與帕博利珠單抗以治療默克氏細胞癌(Merkel cell carcinoma；MCC)。在一些實施例中，成人每6週以約400 mg投與帕博利珠單抗以治療MCC。在一些實施例中，兒科每3週以約2 mg/kg(至多200 mg)投與帕博利珠單抗以治療MCC。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投與帕博利珠單抗以治療腎細胞癌(RCC)。在一些實施例中，每6週以約400 mg投與帕博利珠單抗且每天兩次經口投與阿西替尼5 mg以治療RCC。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投與帕博利珠單抗以治療子宮內膜癌。在一些實施例中，每6週以約400 mg投與帕博利珠單抗且每天一次經口投與20 mg用於非MSI-H或dMMR腫瘤之樂伐替尼以治療子宮內膜癌。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，成人每3週以約200 mg投與帕博利珠單抗以治療高腫瘤突變負荷(TMB-H)癌症。在一些實施例中，成人每6週以約400 mg投與帕博利珠單抗以治療TMB-H癌症。在一些實施例中，兒科每3週以約2 mg/kg(至多200 mg)投與帕博利珠單抗以治療TMB-H癌症。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投與帕博利珠單抗以治療皮膚鱗狀細胞癌(cSCC)。在一些實施例中，每6週以約400 mg投與帕博利珠單抗以治療cSCC。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，每3週以約200 mg投與帕博利珠單抗以治療三陰性乳癌(TNBC)。在一些實施例中，每6週以約400 mg投與帕博利珠單抗以治療TNBC。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，若患者或個體為成人，亦即治療成人適應症，則可採用額外的每6週400 mg之給藥方案。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2、3、4或5天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，在IL-2投與後1、2或3天開始帕博利珠單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週投與帕博利珠單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週投與帕博利珠單抗。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為可商購抗PD-1單株抗體，諸如抗m-PD-1選殖株J43(目錄號BE0033-2)及RMP1-14(目錄號BE0146)(美國新罕布夏州西黎巴嫩的Bio X Cell, Inc.)。多種可商購抗PD-1抗體為本領域一般熟習此項技術者所知。
在一些實施例中，PD-1抑制劑為揭示於美國專利第8,354,509號或美國專利申請公開案第2010/0266617 A1號、第2013/0108651 A1號、第2013/0109843 A2號中之抗體，該等專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，PD-1抑制劑為描述於美國專利第8,287,856號、第8,580,247號及第8,168,757號以及美國專利申請公開案第2009/0028857 A1號、第2010/0285013 A1號、第2013/0022600 A1號及第2011/0008369 A1號中之抗PD-1抗體，該等專利之教示內容以引用之方式併入本文中。在其他實施例中，PD-1抑制劑為揭示於美國專利第8,735,553 B1號中之抗PD-1抗體，該專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，PD-1抑制劑為皮立珠單抗，亦稱為CT-011，其描述於美國專利第8,686,119號中，該專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，PD-1抑制劑可為小分子或肽或肽衍生物，諸如美國專利第8,907,053號、第9,096,642號及第9,044,442號以及美國專利申請公開案第US 2015/0087581號中所描述之小分子或肽或肽衍生物；1,2,4-
Figure 02_image005
二唑化合物及衍生物，諸如美國專利申請公開案第2015/0073024號中所描述之1,2,4-
Figure 02_image005
二唑化合物及衍生物；環狀肽模擬化合物及衍生物，諸如美國專利申請公開案第US 2015/0073042號中所描述之環狀肽模擬化合物及衍生物；環狀化合物及衍生物，諸如美國專利申請公開案第US 2015/0125491中所描述之環狀化合物及衍生物；1,3,4-
Figure 02_image005
二唑及1,3,4-噻二唑化合物及衍生物，諸如國際專利申請公開案第WO 2015/033301號中所描述之1,3,4-
Figure 02_image005
二唑及1,3,4-噻二唑化合物及衍生物；基於肽之化合物及衍生物，諸如國際專利申請公開案第WO 2015/036927號及第WO 2015/04490號中所描述之基於肽之化合物及衍生物；或基於肽之巨環化合物及衍生物，諸如美國專利申請公開案第US 2014/0294898號中所描述之基於肽之巨環化合物及衍生物；該等專利各自之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，PD-1抑制劑係西普利單抗(cemiplimab)，其可商購自Regeneron, Inc.。
在一些實施例中，TIL及PD-L1抑制劑或PD-L2抑制劑係作為組合療法或輔助療法投與以用於治療NSCLC。
在一些實施例中，NSCLC未經歷先前療法。在一些實施例中，PD-L1抑制劑或PD-L2抑制劑係作為一線療法或初始療法投與。在一些實施例中，PD-L1抑制劑或PD-L2抑制劑係作為一線療法或初始療法與如本文所描述之TIL組合投與。
在一些實施例中，PD-L1或PD-L2抑制劑可為本領域已知的任何PD-L1或PD-L2抑制劑、拮抗劑或阻斷劑。詳言之，其為在以下段落中更詳細描述的PD-L1或PD-L2抑制劑、拮抗劑或阻斷劑之一。關於PD-L1及PD-L2抑制劑，術語「抑制劑」、「拮抗劑」及「阻斷劑」在本文中可互換使用。為了避免疑問，本文中提及的作為抗體之PD-L1或PD-L2抑制劑可指化合物或其抗原結合片段、變體、結合物或生物類似物。為了避免疑問，本文中提及的PD-L1或PD-L2抑制劑亦可指化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯、溶劑合物、水合物、共晶體或前藥。
在一些實施例中，本文所描述之組成物、程序及方法包含PD-L1或PD-L2抑制劑。在一些實施例中，PD-L1或PD-L2抑制劑為小分子。在一些實施例中，PD-L1或PD-L2抑制劑為抗體(亦即，抗PD-1抗體)、其片段，包含其Fab片段或單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中，PD-L1或PD-L2抑制劑為多株抗體。在一些實施例中，PD-L1或PD-L2抑制劑為單株抗體。在一些實施例中，PD-L1或PD-L2抑制劑競爭結合PD-L1或PD-L2及/或結合至PD-L1或PD-L2上之抗原決定基。在一些實施例中，抗體競爭結合PD-L1或PD-L2，及/或結合至PD-L1或PD-L2上之抗原決定基。
在一些實施例中，本文所提供之PD-L1抑制劑對PD-L1具選擇性，因為化合物與PD-L1結合或相互作用之濃度相比其與包含PD-L2受體之其他受體結合或相互作用之濃度低得多。在某些實施例中，化合物以如下結合常數結合至PD-L1受體，該結合常數為相比結合至PD-L2受體之濃度高至少約2倍之濃度、高約3倍之濃度、高約5倍之濃度、高約10倍之濃度、高約20倍之濃度、高約30倍之濃度、高約50倍之濃度、高約100倍之濃度、高約200倍之濃度、高約300倍之濃度或高約500倍之濃度。
在一些實施例中，本文提供之PD-L2抑制劑對PD-L2具選擇性，因為化合物與PD-L2結合或相互作用之濃度相比其與包含PD-L1受體之其他受體結合或相互作用之濃度低得多。在某些實施例中，化合物以如下結合常數結合至PD-L2受體，該結合常數為相比結合至PD-L1受體之濃度高至少約2倍之濃度、高約3倍之濃度、高約5倍之濃度、高約10倍之濃度、高約20倍之濃度、高約30倍之濃度、高約50倍之濃度、高約100倍之濃度、高約200倍之濃度、高約300倍之濃度或高約500倍之濃度。
不受任何理論束縛，咸信腫瘤細胞表現PD-L1，且T細胞表現PD-1。然而，腫瘤細胞對PD-L1之表現不為PD-1或PD-L1抑制劑或阻斷劑之功效所需。在一些實施例中，腫瘤細胞表現PD-L1。在其他實施例中，腫瘤細胞並不表現PD-L1。在一些實施例中，該方法可包含PD-1及PD-L1抗體(諸如本文所描述之PD-1及PD-L1抗體)與TIL之組合。可同時或依序投與PD-1及PD-L1抗體與TIL之組合。
在一些實施例中，PD-L1及/或PD-L2抑制劑為如下PD-L1及/或PD-L2抑制劑，該PD-L1及/或PD-L2抑制劑以約100 pM或更低之KD結合人類PD-L1及/或PD-L2、以約90 pM或更低之KD結合人類PD-L1及/或PD-L2、以約80 pM或更低之KD結合人類PD-L1及/或PD-L2、以約70 pM或更低之KD結合人類PD-L1及/或PD-L2、以約60 pM或更低之KD結合人類PD-L1及/或PD-L2、以約50 pM或更低之KD結合人類PD-L1及/或PD-L2、以約40 pM或更低之KD結合人類PD-L1及/或PD-L2，或以約30 pM或更低之KD結合人類PD-L1及/或PD-L2。
在一些實施例中，PD-L1及/或PD-L2抑制劑為如下PD-L1及/或PD-L2抑制劑，該PD-L1及/或PD-L2抑制劑以約7.5×10 5l/M·s或更快之k assoc結合至人類PD-L1及/或PD-L2、以約8×10 51/M·s或更快之k assoc結合至人類PD-L1及/或PD-L2、以約8.5×10 51/M·s或更快之k assoc結合至人類PD-L1及/或PD-L2、以約9×10 51/M·s或更快之k assoc結合至人類PD-L1及/或PD-L2、以約9.5×10 5l/M·s或更快之k assoc結合至人類PD-L1及/或PD-L2，或以約1×10 61/M·s或更快之k assoc結合至人類PD-L1及/或PD-L2。
在一些實施例中，PD-L1及/或PD-L2抑制劑為如下PD-L1及/或PD-L2抑制劑，該PD-L1及/或PD-L2抑制劑以約2×10 -51/s或更慢之k dissoc結合至人類PD-L1或PD-L2、以約2.1×10 -51/s或更慢之k dissoc結合至人類PD-1、以約2.2×10 -5l/s或更慢之k dissoc結合至人類PD-1、以約2.3×10 -51/s或更慢之k dissoc結合至人類PD-1、以約2.4×10 -5l/s或更慢之k dissoc結合至人類PD-1、以約2.5×10 -51/s或更慢之k dissoc結合至人類PD-1、以約2.6×10 -5l/s或更慢之k dissoc結合至人類PD-1、以約2.7×10 -5l/s或更慢之k dissoc結合至人類PD-L1或PD-L2，或以約3×10 -5l/s或更慢之k dissoc結合至人類PD-L1或PD-L2。
在一些實施例中，PD-L1及/或PD-L2抑制劑為如下PD-L1及/或PD-L2抑制劑，該PD-L1及/或PD-L2抑制劑以約10 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約9 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約8 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約7 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約6 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約5 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約4 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約3 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合、以約2 nM或更低之IC50阻斷或抑制人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合，或以約1 nM或更低之IC50阻斷人類PD-1或阻斷人類PD-L1或人類PD-L2與人類PD-1之結合。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑為德瓦魯單抗，亦稱為MEDI4736(其可自馬里蘭州蓋瑟斯堡(Gaithersburg, Maryland)之AstraZeneca plc.的子公司Medimmune, LLC商購)或其抗原結合片段、結合物或變體。在一些實施例中，PD-L1抑制劑為揭示於美國專利第8,779,108號或美國專利申請公開案第2013/0034559號中之抗體，該等專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。德瓦魯單抗之臨床功效已描述於Page等人, 《醫學年度評論》, 2014, 65, 185-202；Brahmer等人, 《臨床腫瘤學雜誌》2014, 32, 5s(增刊，摘要8021)；及McDermott等人, 《癌症治療評論》, 2014, 40, 1056-64中。德瓦魯單抗之製備及特性描述於美國專利第8,779,108號中，該專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。德瓦魯單抗之胺基酸序列闡述於表20中。德瓦魯單抗單株抗體包含22-96、22''-96''、23'-89'、23'''-89'''、135'-195'、135'''-195'''、148-204、148''-204''、215'-224、215'''-224''、230-230''、233-233''、265-325、265''-325''、371-429及371''-429'處之雙硫鍵；及Asn-301及Asn-301''處之N-糖基化位點。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括SEQ ID NO:178所示之重鏈及SEQ ID NO:179所示之輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:178及SEQ ID NO:179中所示之序列的重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:178及SEQ ID NO:179中所示之序列至少99%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:178及SEQ ID NO:179中所示之序列至少98%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:178及SEQ ID NO:179中所示之序列至少97%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:178及SEQ ID NO:179中所示之序列至少96%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:178及SEQ ID NO:179中所示之序列至少95%一致的重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括德瓦魯單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)在一些實施例中，PD-L1抑制劑重鏈可變區(V H)包括SEQ ID NO:180中所示之序列，且PD-L1抑制劑輕鏈可變區(V L)包括SEQ ID NO:181中所示之序列，或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:180及SEQ ID NO:181中所示之序列至少99%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:180及SEQ ID NO:181中所示之序列至少98%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:180及SEQ ID NO:181中所示之序列至少97%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:180及SEQ ID NO:181中所示之序列至少96%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:180及SEQ ID NO:181中所示之序列至少95%一致的V H區及V L區。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183及SEQ ID NO:184中所示之序列或其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186及SEQ ID NO:187中所示之序列或其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。在一些實施例中，抗體競爭以與以下結合及/或結合至以下：PD-L1上與任何前述抗體相同之抗原決定基。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑為藥物管理機構參考德瓦魯單抗核准之抗PD-L1生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物包括抗PD-L1抗體，該抗PD-L1抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為德瓦魯單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自以下中之一或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之抗PD-L1抗體，其中該抗PD-L1抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為德瓦魯單抗。抗PD-L1抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為德瓦魯單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為德瓦魯單抗。
Figure 02_image050
在一些實施例中，PD-L1抑制劑為阿維魯單抗，亦稱為MSB0010718C(可自Merck KGaA/EMD Serono商購)或其抗原結合片段、結合物或變體。阿維魯單抗之製備及特性描述於美國專利申請公開案第US 2014/ 0341917 A1號中，該專利之揭示內容特別以引用之方式併入本文中。阿維魯單抗之胺基酸序列闡述於表21中。阿維魯單抗具有22-96、147-203、264-324、370-428、22''-96''、147''-203''、264''-324''及370''-428''處之重鏈內雙硫鍵(C23-C104)；22'-90'、138'-197'、22'''-90'''及138'''-197'''處之輕鏈內雙硫鍵(C23-C104)；223-215' 及223''-215'''處之重鏈-輕鏈內雙硫鍵(h 5-CL 126)；229-229''及232-232''處之重鏈-重鏈內雙硫鍵(h 11，h 14)；300、300''處之N-糖基化位點(H CH2 N84.4)；岩藻糖基化複合物雙線CHO類聚糖；及450及450'處之H CHS K2 C端離胺酸裁剪。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括SEQ ID NO:188所示之重鏈及SEQ ID NO:189所示之輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:188及SEQ ID NO:189中所示序列之重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:188及SEQ ID NO:189中所示之序列至少99%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:188及SEQ ID NO:189中所示之序列至少98%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:188及SEQ ID NO:189中所示之序列至少97%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:188及SEQ ID NO:189中所示之序列至少96%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:188及SEQ ID NO:189中所示之序列至少95%一致的重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括阿維魯單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，PD-L1抑制劑重鏈可變區(VH)包括SEQ ID NO:190中所示之序列，且PD-L1抑制劑輕鏈可變區(VL)包括SEQ ID NO:191中所示之序列，或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:190及SEQ ID NO:191中所示之序列至少99%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:190及SEQ ID NO:191中所示之序列至少98%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:190及SEQ ID NO:191中所示之序列至少97%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:190及SEQ ID NO:191中所示之序列至少96%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:190及SEQ ID NO:191中所示之序列至少95%一致的V H區及V L區。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193及SEQ ID NO:194中所示之序列或其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196及SEQ ID NO:197中所保守胺基酸取代示之序列或其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。在一些實施例中，抗體競爭以與以下結合及/或結合至以下：PD-L1上與任何前述抗體相同之抗原決定基。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑為藥物管理機構參考阿維魯單抗核准之抗PD-L1生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物包括抗PD-L1抗體，該抗PD-L1抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為阿維魯單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自以下中之一或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之抗PD-L1抗體，其中該抗PD-L1抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為阿維魯單抗。抗PD-L1抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為阿維魯單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為阿維魯單抗。
Figure 02_image052
在一些實施例中，PD-L1抑制劑為阿特珠單抗，亦稱為MPDL3280A或RG7446(其可自瑞士巴塞爾之Roche Holding AG的子公司Genentech, Inc.以TECENTRIQ商購)或其抗原結合片段、結合物或變體。在一些實施例中，PD-L1抑制劑為揭示於美國專利第8,217,149號中之抗體，該專利之揭示內容特別以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，PD-L1抑制劑為揭示於美國專利申請公開案第2010/0203056 A1號、第2013/0045200 A1號、第2013/ 0045201 A1號、第2013/0045202 A1號或第2014/0065135 A1號中之抗體，該等專利之揭示內容特別以引用之方式併入本文中。阿替利珠單抗之製備及特性描述於美國專利第8,217,149號中，該專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。阿替利珠單抗之胺基酸序列闡述於表22中。阿替利珠單抗具有22-96、145-201、262-322、368-426、22''-96''、145''-201''、262''-322''及368''-426''處之重鏈內雙硫鍵(C23-C104)；23'-88'、134'-194'、23'''-88'''及134'''-194'''處之輕鏈內雙硫鍵(C23-C104)；221-214'及221''-214'''處之重鏈-輕鏈內雙硫鍵(h 5-CL 126)；227-227''及230-230''處之重鏈-重鏈內雙硫鍵(h 11，h 14)；及298及298'處之N-糖基化位點(H CH2 N84.4＞A)。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括SEQ ID NO:198所示之重鏈及SEQ ID NO:199所示之輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:198及SEQ ID NO:199中所示之序列的重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:198及SEQ ID NO:199中所示之序列至少99%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:198及SEQ ID NO:199中所示之序列至少98%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:198及SEQ ID NO:199中所示之序列至少97%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:198及SEQ ID NO:199中所示之序列至少96%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:198及SEQ ID NO:199中所示之序列至少95%一致的重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括阿替利珠單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，PD-L1抑制劑重鏈可變區(V H)包括SEQ ID NO:200中所示之序列，且PD-L1抑制劑輕鏈可變區(V L)包括SEQ ID NO:201中所示之序列，或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:200及SEQ ID NO:201中所示之序列至少99%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:200及SEQ ID NO:201中所示之序列至少98%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:200及SEQ ID NO:201中所示之序列至少97%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:200及SEQ ID NO:201中所示之序列至少96%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:200及SEQ ID NO:201中所示之序列至少95%一致的V H區及V L區。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203及SEQ ID NO:204中所示之序列或其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206及SEQ ID NO:207中所示之序列或其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。在一些實施例中，抗體競爭以與以下結合及/或結合至以下：PD-L1上與任何前述抗體相同之抗原決定基。
在一些實施例中，抗PD-L1抗體為藥物管理機構參考阿替利珠單抗核准之抗PD-L1生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物包括抗PD-L1抗體，該抗PD-L1抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為阿替利珠單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自以下中之一或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之抗PD-L1抗體，其中該抗PD-L1抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為阿替利珠單抗。抗PD-L1抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為阿替利珠單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為阿替利珠單抗。
Figure 02_image054
在一些實施例中，PD-L1抑制劑包含美國專利申請公開案第US 2014/0341917 A1號中所描述之抗體，該專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。在其他實施例中，亦包含與此等抗體中之任一種競爭結合至PD-L1的抗體。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為MDX-1105，亦稱為BMS-935559，其揭示於美國專利第US 7,943,743號中，該專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係選自揭示於美國專利第US 7,943,743號中之抗PD-L1抗體，該專利以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑為可商購單株抗體，諸如INVIVOMAB抗m-PD-L1選殖株10F.9G2(目錄號BE0101，美國新罕布夏州西黎巴嫩的Bio X Cell, Inc.)。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為可商購單株抗體，諸如AFFYMETRIX EBIOSCIENCE(MIH1)。多種可商購抗PD-L1抗體為本領域一般熟習此項技術者所知。
在一些實施例中，PD-L2抑制劑為可商購單株抗體，諸如BIOLEGEND 24F.10C12小鼠IgG2aκ同型(目錄號329602，加利福尼亞聖地亞哥Biolegend, Inc.)、SIGMA抗PD-L2抗體(目錄號SAB3500395，密蘇里州聖路易斯的Sigma-Aldrich Co.)或本領域一般熟習此項技術者已知的其他可商購抗PD-L2抗體。 2.與CTLA-4抑制劑組合
在一些實施例中，提供給癌症患者之TIL療法可包含單獨用治療性TIL群體治療，或可包含組合治療，包含TIL及一或多種CTLA-4抑制劑。
細胞毒性T淋巴球抗原4(CTLA-4)為免疫球蛋白超家族成員且表現於輔助T細胞表面上。CTLA-4為CD28依賴性T細胞活化之負向調節因子且充當適應性免疫反應之檢查點。類似於T細胞共刺激蛋白CD28，CTLA-4結合抗原在細胞上呈遞CD80及CD86。CTLA-4將抑制因子信號遞送至T細胞，而CD28遞送刺激信號。針對人類CTLA-4之人類抗體已描述為許多疾病病狀之免疫刺激調節劑，諸如治療或預防病毒及細菌感染且治療癌症(WO 01/14424及WO 00/37504)。已在臨床試驗中針對治療各種類型之實體腫瘤研究多種完全人類抗人類CTLA-4單株抗體(mAb)，該等抗體包含但不限於伊匹木單抗(MDX-010)及曲美單抗(CP-675,206)。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑可為本領域已知的任何CTLA-4抑制劑或CTLA-4阻斷劑。詳言之，其為在以下段落中更詳細描述的CTLA-4抑制劑或阻斷劑之一。關於CTLA-4抑制劑，術語「抑制劑」、「拮抗劑」及「阻斷劑」在本文中可互換使用。為了避免疑問，本文中提及的作為抗體之CTLA-4抑制劑可指化合物或其抗原結合片段、變體、結合物或生物類似物。為了避免疑問，本文中提及的CTLA-4抑制劑亦可指小分子化合物或其醫藥學上可接受之鹽、酯、溶劑合物、水合物、共晶體或前藥。
適用於本發明之方法的CTLA-4抑制劑包含但不限於抗CTLA-4抗體、人類抗CTLA-4抗體、小鼠抗CTLA-4抗體、哺乳動物抗CTLA-4抗體、人類化抗CTLA-4抗體、單株抗CTLA-4抗體、多株抗CTLA-4抗體、嵌合抗CTLA-4抗體、MDX-010(伊匹木單抗)、曲美單抗、抗CD28抗體、抗CTLA-4阿德奈汀、抗CTLA-4域抗體、單鏈抗CTLA-4片段、重鏈抗CTLA-4片段、輕鏈抗CTLA-4片段、促效共刺激路徑之CTLA-4抑制劑、揭示於PCT公開案第WO 2001/014424號中之抗體、揭示於PCT公開案第WO 2004/035607號中之抗體、揭示於美國公開案第2005/ 0201994號中之抗體及揭示於授與歐洲專利第EP 1212422 B1號中之抗體，該等專利各自之揭示內容以引用之方式併入本文中。額外的CTLA-4抗體描述於美國專利第5,811,097號、第5,855,887號、第6,051,227號及第6,984,720號中；PCT公開案第WO 01/14424號及第WO 00/ 37504號中；及美國公開案第2002/0039581號及第2002/ 086014號中，該等專利各自之揭示內容以引用之方式併入本文中。可用於本發明方法中之其他抗CTLA-4抗體包含例如揭示於以下中之抗體：WO 98/42752；美國專利第6,682,736號及第6,207,156號；Hurwitz等人, 《美國國家科學院院刊》, 95(17):10067-10071 (1998)；Camacho等人,《臨床腫瘤學雜誌》, 22(145): 摘要號2505 (2004)(抗體CP-675206)；Mokyr等人, 《癌症研究》, 58:5301-5304 (1998)；及美國專利第5,977,318號、第6,682,736號、第7,109,003號及第7,132,281號，該等專利中之每一者的揭示內容以引用之方式併入本文中。
額外的CTLA-4抑制劑包含但不限於以下：通常由於經活化而能夠破壞CD28抗原結合至其同源配體之能力、抑制CTLA-4結合至其同源配體之能力、增強經由共刺激路徑之T細胞反應、破壞B7結合至CD28及/或CTLA-4之能力、破壞B7活化共刺激路徑之能力、破壞CD80結合至CD28及/或CTLA-4之能力、破壞CD80活化共刺激路徑之能力、破壞CD86結合至CD28及/或CTLA-4之能力、破壞CD86活化共刺激路徑之能力及破壞共刺激路徑的任何抑制劑。此必定包含：CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路徑之其他成員之小分子抑制劑；針對CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路徑之其他成員的抗體；針對CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路徑之其他成員的反義分子；針對CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路徑之其他成員的阿德奈汀；CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激路徑之其他成員的RNAi抑制劑(單股及雙股)；以及其他CTLA-4抑制劑。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑以如下K d結合至CTLA-4，該K d為約10 -6M或更小、10 -7M或更小、10 -8M或更小、10 -9M或更小、10 -10M或更小、10 -11M或更小、10 -12M或更小，例如在10 -13M與10 -16M之間，或在具有任何兩個前述值作為端點的任何範圍內。在一些實施例中，當使用相同分析比較時，CTLA-4抑制劑結合至CTLA-4的Kd不超過伊匹木單抗之Kd之10倍。在一些實施例中，當使用相同分析比較時，CTLA-4抑制劑結合至CTLA-4的Kd與伊匹木單抗之Kd大致相同或更小(例如低至多10倍或低至多100倍)。在一些實施例中，當使用相同分析比較時，與CTLA-4分別與CD80或CD86結合的伊匹木單抗介導之抑制的IC50值相比，CTLA-4抑制劑抑制CTLA-4與CD80或CD86之結合的IC50值高不超過10倍。在一些實施例中，當使用相同分析比較時，與CTLA-4分別與CD80或CD86結合的伊匹木單抗介導之抑制的IC50值相比，CTLA-4抑制劑抑制CTLA-4與CD80或CD86之結合的IC50值大致相同或更小(例如，低至多10倍或低至多100倍)。
在一些實施例中，使用的CTLA-4抑制劑之量足以將CTLA-4之表現抑制及/或使CTLA-4之生物活性相對於適合對照降低至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%，例如在50%與75%、75%與90%或在90%與100%之間。在一些實施例中，使用的CTLA-4路徑抑制劑之量足以藉由使CTLA-4與CD80、CD86或兩者之結合相對於適合對照減少至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%，例如相對於適合對照減少在50%與75%、在75%與90%或在90%與100%之間來降低CTLA-4之生物活性。在評定或量化所關注之藥劑之效應的上下文中之適合對照通常為尚未暴露於所關注之藥劑(例如CTLA-4路徑抑制劑)或用該藥劑處理的相當之生物系統(例如細胞或個體)(或已暴露於可忽略量或用可忽略量進行處理)。在一些實施例中，生物系統可充當其自身之對照，例如可在暴露於藥劑或用藥劑處理之前評定生物系統並與開始或結束暴露或處理之後的狀態進行比較。在一些實施例中，可使用歷史對照。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為伊匹木單抗(可自Bristol-Myers Squibb Co.以Yervoy商購)或其生物類似物、抗原結合片段、結合物或變體。如本領域中已知，伊匹木單抗係指抗CTLA-4抗體，一種來源於具有編碼重鏈及輕鏈之人類基因以產生功能性人類譜系之轉殖基因小鼠的完全人類IgG1κ抗體。伊匹木單抗亦可藉由其CAS登記號477202-00-9及在PCT公開案第WO 01/14424中提及，該公開案以全文引用之方式併入用於所有目的。其係以抗體10DI揭示。具體言之，伊匹木單抗含有輕鏈可變區及重鏈可變區(具有包括SEQ ID NO:211之輕鏈可變區且具有包括SEQ ID NO:210之重鏈可變區)。伊匹木單抗之醫藥組成物包括含有伊匹木單抗及一或多種稀釋劑、媒劑或賦形劑的所有醫藥學上可接受之組成物。含有伊匹木單抗之醫藥組成物的實例描述於國際專利申請公開案第WO 2007/67959號中。伊匹木單抗可靜脈內(IV)投與。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括SEQ ID NO:208所示之重鏈及SEQ ID NO:209所示之輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:208及SEQ ID NO:209中所示之序列的重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:208及SEQ ID NO:209中所示之序列至少99%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:208及SEQ ID NO:209中所示之序列至少98%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:208及SEQ ID NO:209中所示之序列至少97%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:208及SEQ ID NO:209中所示之序列至少96%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:208及SEQ ID NO:209中所示之序列至少95%一致的重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括伊匹木單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑重鏈可變區(V H)包括SEQ ID NO:210中所示之序列，且CTLA-4抑制劑輕鏈可變區(V L)包括SEQ ID NO:211中所示之序列，或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:210及SEQ ID NO:211中所示之序列至少99%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:210及SEQ ID NO:211中所示之序列至少98%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:210及SEQ ID NO:211中所示之序列至少97%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:210及SEQ ID NO:211中所示之序列至少96%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:210及SEQ ID NO:211中所示之序列至少95%一致的V H區及V L區。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213及SEQ ID NO:214中所示之序列或其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216及SEQ ID NO:217中所示之序列或其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。在一些實施例中，抗體競爭以與以下結合及/或結合至以下：CTLA-4上與任何前述抗體相同之抗原決定基。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為藥物管理機構參考伊匹木單抗核准之CTLA-4生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物包括抗CTLA-4抗體，該抗CTLA-4抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為伊匹木單抗。在一些實施例中，一或多個轉譯後修飾係選自以下中之一或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。伊匹木單抗之胺基酸序列闡述於表23中。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之抗CTLA-4抗體，其中該抗CTLA-4抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為伊匹木單抗。抗CTLA-4抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為伊匹木單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為伊匹木單抗。
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在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為伊匹木單抗或其生物類似物，且伊匹木單抗係以約0.5 mg/kg至約10 mg/kg之劑量投與。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為伊匹木單抗或其生物類似物，且伊匹木單抗係以如下劑量投與：約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約1.5 mg/kg、約2 mg/kg、約2.5 mg/kg、約3 mg/kg、約3.5 mg/kg、約4 mg/kg、約4.5 mg/kg、約5 mg/kg、約5.5 mg/kg、約6 mg/kg、約6.5 mg/kg、約7 mg/kg、約7.5 mg/kg、約8 mg/kg、約8.5 mg/kg、約9 mg/kg、約9.5 mg/kg或約10 mg/kg。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始伊匹木單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始伊匹木單抗投與。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為伊匹木單抗或其生物類似物，其中伊匹木單抗係以約200 mg至約500 mg之劑量投與。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為伊匹木單抗或其生物類似物，且伊匹木單抗係以如下劑量投與：約200 mg、約220 mg、約240 mg、約260 mg、約280 mg、約300 mg、約320 mg、約340 mg、約360 mg、約380 mg、約400 mg、約420 mg、約440 mg、約460 mg、約480 mg或約500 mg。在一些實施例中，在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始伊匹木單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始伊匹木單抗投與。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為伊匹木單抗或其生物類似物，且每2週、每3週、每4週、每5週或每6週投與伊匹木單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始伊匹木單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始伊匹木單抗投與。
在一些實施例中，投與伊匹木單抗以治療不可切除性或轉移性黑素瘤。在一些實施例中，每3週以約mg/kg投與伊匹木單抗，持續最多4次劑量以治療不可切除性或轉移性黑素瘤。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始伊匹木單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始伊匹木單抗投與。
在一些實施例中，投與伊匹木單抗以輔助治療黑素瘤。在一些實施例中，每3週以約10 mg/kg投與伊匹木單抗，持續4次劑量，隨後每12週投與10 mg/kg，持續至多3年，以輔助治療黑素瘤。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始伊匹木單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始伊匹木單抗投與。
在一些實施例中，投與伊匹木單抗以治療晚期腎細胞癌。在一些實施例中，每3週以約1 mg/kg投與伊匹木單抗，緊接著在同一天投與3 mg/kg納武單抗，持續4次劑量，以治療晚期腎細胞癌。在一些實施例中，在完成組合之4次劑量之後，可根據標準給藥方案針對晚期腎細胞癌及/或腎細胞癌以單一試劑形式投與納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始伊匹木單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始伊匹木單抗投與。
在一些實施例中，投與伊匹木單抗以治療高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷型(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，每3週經30分鐘以約1 mg/kg靜脈內投與伊匹木單抗，緊接著在同一天經30分鐘靜脈內投與3 mg/kg納武單抗，持續4次劑量，以治療高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷型(dMMR)轉移性結腸直腸癌。在一些實施例中，在完成組成物之4次劑量之後，如根據標準給藥方案所推薦針對高微衛星不穩定性(MSI-H)或錯配修復缺陷型(dMMR)轉移性結腸直腸癌以單一試劑形式投與納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始伊匹木單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始伊匹木單抗投與。
在一些實施例中，投與伊匹木單抗以治療肝細胞癌。在一些實施例中，每3週經30分鐘靜脈內投與約3 mg/kg伊匹木單抗，緊接著在同一天經30分鐘靜脈內投與1 mg/kg納武單抗，持續4次劑量，以治療肝細胞癌。在一些實施例中，在完成組合之4次劑量之後，根據標準給藥方案針對肝細胞癌以單一試劑形式投與納武單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始伊匹木單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始伊匹木單抗投與。
在一些實施例中，投與伊匹木單抗以治療轉移性非小細胞肺癌。在一些實施例中，每6週投與約1 mg/kg伊匹木單抗且每2週投與3 mg/kg納武單抗，以治療轉移性非小細胞肺癌。在一些實施例中，每6週投與約1 mg/kg伊匹木單抗，加上每3週360 mg納武單抗與2個週期之含鉑雙藥化療，以治療轉移性非小細胞肺癌。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始伊匹木單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始伊匹木單抗投與。
在一些實施例中，投與伊匹木單抗以治療惡性胸膜間皮瘤。在一些實施例中，每6週投與約1 mg/kg伊匹木單抗且每3週投與360 mg納武單抗，以治療惡性胸膜間皮瘤。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始伊匹木單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始伊匹木單抗投與。
曲美單抗(亦稱為CP-675,206)為完全人類IgG2單株抗體且CAS編號為745013-59-6。曲美單抗在美國專利第6,682,736號(以引用之方式併入本文中)中以抗體11.2.1揭示。曲美單抗之重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別闡述於SEQ IND NO: 218及219中。已在臨床試驗中針對治療包含黑素瘤及乳癌之各種腫瘤研究了曲美單抗；其中每4或12週以0.01與15 mg/kg之間的劑量範圍呈單次劑量或多次劑量靜脈內投與曲美單抗。在本發明提供之方案中，局部投與，尤其是皮內或皮下投與曲美單抗。皮內或皮下投與之曲美單抗的有效量通常在每人5-200毫克/劑的範圍內。在一些實施例中，曲美單抗之有效量在每人每劑10-150毫克/劑的範圍內。在一些特定實施例中，曲美單抗之有效量為每人約10、25、37.5、40、50、75、100、125、150、175或200毫克/劑。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括SEQ ID NO:218所示之重鏈及SEQ ID NO:219所示之輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:218及SEQ ID NO:219中所示之序列的重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:218及SEQ ID NO:219中所示之序列至少99%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:218及SEQ ID NO:219中所示之序列至少98%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:218及SEQ ID NO:219中所示之序列至少97%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:218及SEQ ID NO:219中所示之序列至少96%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:218及SEQ ID NO:219中所示之序列至少95%一致的重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括曲美單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑重鏈可變區(V H)包括SEQ ID NO:220中所示之序列，且CTLA-4抑制劑輕鏈可變區(V L)包括SEQ ID NO:221中所示之序列，或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:220及SEQ ID NO:221中所示之序列至少99%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:220及SEQ ID NO:221中所示之序列至少98%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:220及SEQ ID NO:221中所示之序列至少97%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:220及SEQ ID NO:221中所示之序列至少96%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:220及SEQ ID NO:221中所示之序列至少95%一致的V H區及V L區。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223及SEQ ID NO:224中所示之序列或其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226及SEQ ID NO:227中所示之序列或其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。在一些實施例中，抗體競爭以與以下結合及/或結合至以下：CTLA-4上與任何前述抗體相同之抗原決定基。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為藥物管理機構參考曲美單抗核准之抗CTLA-4生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物包括抗CTLA-4抗體，該抗CTLA-4抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為曲美單抗。在一些實施例中，一或多個轉譯後修飾係選自以下中之一或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。曲美單抗之胺基酸序列闡述於表24中。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之抗CTLA-4抗體，其中該抗CTLA-4抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為曲美單抗。抗CTLA-4抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為曲美單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為曲美單抗。
Figure 02_image058
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為曲美單抗或其生物類似物，且曲美單抗係以約0.5 mg/kg至約10 mg/kg之劑量投與。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為曲美單抗或其生物類似物，且曲美單抗係以如下劑量投與：約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約1.5 mg/kg、約2 mg/kg、約2.5 mg/kg、約3 mg/kg、約3.5 mg/kg、約4 mg/kg、約4.5 mg/kg、約5 mg/kg、約5.5 mg/kg、約6 mg/kg、約6.5 mg/kg、約7 mg/kg、約7.5 mg/kg、約8 mg/kg、約8.5 mg/kg、約9 mg/kg、約9.5 mg/kg或約10 mg/kg。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始曲美單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始曲美單抗投與。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為曲美單抗或其生物類似物，其中曲美單抗係以約200 mg至約500 mg之劑量投與。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為曲美單抗或其生物類似物，且曲美單抗係以如下劑量投與：約200 mg、約220 mg、約240 mg、約260 mg、約280 mg、約300 mg、約320 mg、約340 mg、約360 mg、約380 mg、約400 mg、約420 mg、約440 mg、約460 mg、約480 mg或約500 mg。在一些實施例中，在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始曲美單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始曲美單抗投與。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為曲美單抗或其生物類似物，且每2週、每3週、每4週、每5週或每6週投與曲美單抗。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2、3、4或5週開始曲美單抗投與。在一些實施例中，亦可在切除前(亦即，在自個體或患者獲得腫瘤樣本之前)1、2或3週開始曲美單抗投與。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為來自Agenus之澤弗利單抗或其生物類似物、抗原結合片段、結合物或變體。澤弗利單抗為完全人類單株抗體。澤弗利單抗被指定化學文摘社(CAS)登記號2148321-69-9且亦稱為亦稱為AGEN1884。澤弗利單抗之製備及特性描述於美國專利第10,144,779號及美國專利申請公開案第US2020/ 0024350 A1號中，該等專利之揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括SEQ ID NO:228所示之重鏈及SEQ ID NO:229所示之輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:228及SEQ ID NO:229中所示之序列的重鏈及輕鏈，或其抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或結合物。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:228及SEQ ID NO:229中所示之序列至少99%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:228及SEQ ID NO:229中所示之序列至少98%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:228及SEQ ID NO:229中所示之序列至少97%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:228及SEQ ID NO:229中所示之序列至少96%一致的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:228及SEQ ID NO:229中所示之序列至少95%一致的重鏈及輕鏈。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括澤弗利單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑重鏈可變區(V H)包括SEQ ID NO:230中所示之序列，且CTLA-4抑制劑輕鏈可變區(V L)包括SEQ ID NO:231中所示之序列，或其保守胺基酸取代。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:230及SEQ ID NO:231中所示之序列至少99%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:230及SEQ ID NO:231中所示之序列至少98%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:230及SEQ ID NO:231中所示之序列至少97%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:230及SEQ ID NO:231中所示之序列至少96%一致的V H區及V L區。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括各自分別與SEQ ID NO:230及SEQ ID NO:231中所示之序列至少95%一致的V H區及V L區。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑包括分別具有SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:233及SEQ ID NO:234中所示之序列或其保守胺基酸取代的重鏈CDR1、CDR2及CDR3域；及分別具有SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236及SEQ ID NO:237中所示之序列或其保守胺基酸取代的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3域。在一些實施例中，抗體競爭以與以下結合及/或結合至以下：CTLA-4上與任何前述抗體相同之抗原決定基。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為藥物管理機構參考澤弗利單抗核准之CTLA-4生物類似物單株抗體。在一些實施例中，生物類似物包括抗CTLA-4抗體，該抗CTLA-4抗體包括與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性，例如97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包括一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品為澤弗利單抗。在一些實施例中，一或多個轉譯後修飾係選自以下中之一或多者：糖基化、氧化、脫醯胺作用及截短。澤弗利單抗之胺基酸序列闡述於表25中。在一些實施例中，生物類似物為獲得授權或申請授權之抗CTLA-4抗體，其中該抗CTLA-4抗體提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物中，其中該參考藥品或參考生物產品為澤弗利單抗。抗CTLA-4抗體可獲得藥物管理機構，諸如美國FDA及/或歐盟EMA授權。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為澤弗利單抗。在一些實施例中，生物類似物提供為進一步包括一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中包括的賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品為澤弗利單抗。
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額外的抗CTLA-4抗體之實例包含但不限於：AGEN1181、BMS-986218、BCD-145、ONC-392、CS1002、REGN4659及ADG116，其為本領域一般熟習此項技術者所知。
在一些實施例中，抗CTLA-4抗體係以下專利公開案中之任一個中所揭示之抗CTLA-4抗體：US 2019/0048096 A1；US 2020/0223907；US 2019/0201334；US 2019/0201334；US 2005/0201994；EP 1212422 B1；WO 2018/204760；WO 2018/204760；WO 2001/014424；WO 2004/035607；WO 2003/086459；WO 2012/120125；WO 2000/037504；WO 2009/100140；WO 2006/09649；WO2005092380；WO 2007/123737；WO 2006/029219；WO 2010/0979597；WO 2006/12168；及WO1997020574，其各自以引用的方式併入本文中。額外CTLA-4抗體描述於以下中：美國專利第5,811,097號、第5,855,887號、第6,051,227號及第6,984,720號；PCT公開案第WO 01/14424號及第WO 00/37504號；及美國公開案第2002/0039581號及第2002/086014號；及/或美國專利第5,977,318號、第6,682,736號、第7,109,003號及第7,132,281號，其各自以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，抗CTLA-4抗體係例如揭示於以下中之抗體：WO 98/42752；美國專利第6,682,736號及第6,207,156號；Hurwitz等人, 《美國國家科學院院刊》, 1998, 95,10067-10071 (1998)；Camacho等人,《臨床腫瘤學雜誌》, 2004,22, 145(摘要編號2505(2004)(抗體CP-675206)；或Mokyr等人, 《癌症研究》, 1998、 58, 5301-5304(1998)，其各自以引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑係如WO 1996/040915(以引用之方式併入本文中)中所揭示之CTLA-4配體。
在一些實施例中，CTLA-4抑制劑係CTLA-4表現之核酸抑制劑。舉例而言，抗CTLA-4 RNAi分子可呈以下中所描述之分子形式：PCT公開案第WO 1999/032619號及第WO 2001/029058號；美國公開案第2003/0051263號、第2003/0055020號、第2003/0056235號、第2004/265839號、第2005/0100913號、第2006/0024798號、第2008/0050342號、第2008/0081373號、第2008/0248576號及第2008/055443號；及/或美國專利第6,506,559號、第7,282,564號、第7,538,095號及第7,560,438號(以引用之方式併入本文中)。在一些情況下，抗CTLA-4 RNAi分子呈在歐洲專利第EP 1309726號(以引用之方式併入本文中)中描述之雙股RNAi分子形式。在一些情況下，抗CTLA-4 RNAi分子呈在美國專利第7,056,704號及第7,078,196號(以引用之方式併入本文中)中描述之雙股RNAi分子形式。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑係國際專利申請公開案第WO 2004/081021號(以引用之方式併入本文中)中所描述之適體。
在其他實施例中，本發明之抗CTLA-4 RNAi分子係在美國專利第5,898,031號、第6,107,094號、第7,432,249號及第7,432,250號以及歐洲申請案第EP 0928290號(以引用之方式併入本文中)中描述之RNA分子。 3.患者之淋巴球耗盡預調節
在一些實施例中，本發明包含一種用TIL群體治療癌症之方法，其中患者在輸注根據本揭示案之TIL之前經非骨髓清除式化療預治療。在一些實施例中，本發明包含用於治療已用非骨髓清除式化療預治療之患者之癌症的TIL群體。在一些實施例中，TIL群體係藉由輸注投與。在一些實施例中，非骨髓清除式化療為環磷醯胺60 mg/kg/d持續2天(在TIL輸注前第27天及第26天)及氟達拉濱25 mg/m2/d持續5天(在TIL輸注前第27天至第23天)。在一些實施例中，在根據本揭示案之非骨髓清除式化療及TIL輸注(第0天)之後，患者每8小時靜脈內接受720,000 IU/kg IL-2(阿地介白素，可以PROLEUKIN商購)之靜脈內輸注以達到生理耐受。在某些實施例中，TIL群體係用於與IL-2組合治療癌症，其中IL-2係在TIL群體之後投與。
實驗發現表明，在授受性轉移腫瘤特異性T淋巴球之前，淋巴球耗盡藉由消除調節性T細胞且競爭免疫系統之元件(『細胞介素庫』)在增強治療功效方面發揮關鍵作用。因此，本發明之一些實施例在引入本發明之TIL之前在患者身上採用淋巴球耗盡步驟(有時亦稱為「免疫抑制性調節」)。
一般而言，使用氟達拉濱或環磷醯胺(活性形式稱作馬磷醯胺)及其組合之投與實現淋巴球耗盡。此類方法描述於Gassner等人, 《癌症免疫學及免疫治療》 2011, 60, 75-85、Muranski等人, 《自然臨床實踐腫瘤學》 , 2006, 3, 668-681、Dudley等人, 《臨床腫瘤學雜誌》 2008, 26,5233-5239及Dudley等人, 《臨床腫瘤學雜誌》 2005, 23,2346-2357中，所有該等文獻以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，氟達拉濱係以0.5 μg/mL至10 μg/mL氟達拉濱之濃度投與。在一些實施例中，氟達拉濱係以1 μg/mL氟達拉濱之濃度投與。在一些實施例中，投與氟達拉濱治療1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些實施例中，氟達拉濱係以10毫克/公斤/天、15毫克/公斤/天、20毫克/公斤/天、25毫克/公斤/天、30毫克/公斤/天、35毫克/公斤/天、40毫克/公斤/天或45毫克/公斤/天之劑量投與。在一些實施例中，氟達拉濱治療係以35毫克/公斤/天投與2至7天。在一些實施例中，氟達拉濱治療係以35毫克/公斤/天投與4至5天。在一些實施例中，氟達拉濱治療係以25毫克/公斤/天投與4至5天。
在一些實施例中，藉由投與環磷醯胺獲得濃度為0.5 μg/mL至10 μg/mL的環磷醯胺之活性形式馬磷醯胺。在一些實施例中，藉由投與環磷醯胺獲得濃度為1 μg/mL的環磷醯胺之活性形式馬磷醯胺。在一些實施例中，投與環磷醯胺治療1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些實施例中，環磷醯胺係以100毫克/平方公尺/天、150毫克/平方公尺/天、175毫克/平方公尺/天、200毫克/平方公尺/天、225毫克/平方公尺/天、250毫克/平方公尺/天、275毫克/平方公尺/天或300毫克/平方公尺/天之劑量投與。在一些實施例中，環磷醯胺係靜脈內(亦即i.v.)投與。在一些實施例中，環磷醯胺治療係以35毫克/公斤/天投與2至7天。在一些實施例中，環磷醯胺治療係以250毫克/平方公尺/天靜脈內投與4至5天。在一些實施例中，環磷醯胺治療係以250毫克/平方公尺/天靜脈內投與4天。
在一些實施例中，藉由將氟達拉濱及環磷醯胺一起投與給患者進行淋巴球耗盡。在一些實施例中，經4天以25毫克/平方公尺/天靜脈內投與氟達拉濱且以250毫克/平方公尺/天靜脈內投與環磷醯胺。
在一些實施例中，藉由以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱五天來進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱五天來進行淋巴球耗盡，其中在前兩天投與環磷醯胺及氟達拉濱兩者，且其中在總計五天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以約50毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天及以約25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱五天來進行淋巴球耗盡，其中在前兩天投與環磷醯胺及氟達拉濱兩者，且其中在總計五天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以約50毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天及以約20毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱五天來進行淋巴球耗盡，其中在前兩天投與環磷醯胺及氟達拉濱兩者，且其中在總計五天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以約40毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天及以約20毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱五天來進行淋巴球耗盡，其中在前兩天投與環磷醯胺及氟達拉濱兩者，且其中在總計五天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以約40毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天及以約15毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱五天來進行淋巴球耗盡，其中在前兩天投與環磷醯胺及氟達拉濱兩者，且其中在總計五天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由持續兩天以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱三天來進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，環磷醯胺係與美司鈉(mesna)一起投與。在一些實施例中，美司鈉係以15 mg/kg投與。在一些實施例中，輸注美司鈉，且若連續輸注，則歷經24小時，伴隨各自環磷醯胺劑量開始，美司鈉可經大約2小時與環磷醯胺一起輸注(第-5天及/或第-4天)，隨後在剩餘22小時以3毫克/千克/小時之速率輸注。
在一些實施例中，淋巴球耗盡包括以下步驟：始於在向患者投與第三TIL群體之後當天，用IL-2方案治療患者。
在一些實施例中，淋巴球耗盡包括以下步驟：始於向患者投與第三TIL群體當天，用IL-2方案治療患者。
在一些實施例中，淋巴球耗盡包括5天之預調節治療。在一些實施例中，天數指示為第-5天至第-1天，或第0天至第4天。在一些實施例中，該方案包括第-5天及第-4天(亦即第0天及第1天)的環磷醯胺。在一些實施例中，該方案包括第-5天及第-4天(亦即第0天及第1天)的靜脈內環磷醯胺。在一些實施例中，該方案包括第-5天及第-4天(亦即第0天及第1天)的60 mg/kg靜脈內環磷醯胺。在一些實施例中，環磷醯胺係與美司鈉一起投與。在一些實施例中，該方案進一步包括氟達拉濱。在一些實施例中，該方案進一步包括靜脈內氟達拉濱。在一些實施例中，該方案進一步包括25 mg/m 2靜脈內氟達拉濱。在一些實施例中，該方案進一步包括第-5天及第-1天(亦即第0天至第4天)的25 mg/m 2靜脈內氟達拉濱。在一些實施例中，該方案進一步包括第-5天及第-1天(亦即第0天至第4天)的25 mg/m 2靜脈內氟達拉濱。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：持續兩天以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱五天。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱五天。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱三天。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：持續兩天以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱三天。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：持續兩天以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱一天。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱三天。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：持續兩天以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱三天。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案係根據表26投與。
Figure 02_image062
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案係根據表27投與。
Figure 02_image064
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案係根據表28投與。
Figure 02_image066
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案係根據表29投與。
Figure 02_image068
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案係根據表30投與。
Figure 02_image070
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案係根據表31投與。
Figure 02_image072
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案係根據表32投與。
Figure 02_image074
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴球耗盡方案係根據表33投與。
Figure 02_image076
在一些實施例中，與前述骨髓清除式淋巴球耗盡方案之實施例一起使用之TIL輸注可為本文所描述之任何TIL組成物，以及添加IL-2療法及投與如本文所描述的輔助療法(諸如PD-1及PD-L1抑制劑)。 4.IL-2方案
在一些實施例中，IL-2方案包括高劑量IL-2方案，其中高劑量IL-2方案包括阿地介白素或其生物類似物或變體，其在投與治療性TIL群體之治療有效部分之後當天開始靜脈內投與，其中阿地介白素或其生物類似物或變體係每八小時使用15分鐘推注靜脈內輸注以0.037 mg/kg或0.044 mg/kg IU/kg(患者體重)之劑量投與直至發生耐受性，最多為14次劑量。在停藥9天後，可重複此時程再投與14次劑量，最多總計28次劑量。在一些實施例中，IL-2係以1、2、3、4、5或6次劑量投與。在一些實施例中，IL-2係以至多6次劑量之最大劑量投與。
在一些實施例中，IL-2方案包括遞減IL-2方案。遞減IL-2方案已描述於O'Day等人, 《臨床腫瘤學雜誌》 1999, 17, 2752-61及Eton等人, 《癌症》 2000, 88,1703-9，該等文獻之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，遞減IL-2方案包括經6小時靜脈內投與18×10 6IU/m 2阿地介白素或其生物類似物或變體，隨後經12小時靜脈內投與18×10 6IU/m 2，隨後經24小時靜脈內投與18×10 6IU/m 2，隨後經72小時靜脈內投與4.5×10 6IU/m 2。此治療週期可每28天重複，持續最多四個週期。在一些實施例中，遞減IL-2方案包括第1天18,000,000 IU/m 2、第2天9,000,000 IU/m 2以及第3天及第4天4,500,000 IU/m 2。
在一些實施例中，IL-2方案包括低劑量IL-2方案。可使用本領域中已知之任何低劑量IL-2方案，包含Dominguez-Villar及Hafler，《自然免疫學( Nat.Immunology)》 2000, 19,665-673；Hartemann等人, 《柳葉刀糖尿病與內分泌學( Lancet Diabetes Endocrinol.)》 2013, 1, 295-305；及Rosenzwaig等人, 《風濕病年鑒( Ann. Rheum. Dis.)》 2019, 78,209-217中所描述之低劑量IL-2方案，該等文獻之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一實施例中，低劑量IL-2方案包括每24小時18×10 6IU/m 2之阿地介白素或其生物類似物或變體，以連續輸注投與5天；隨後2-6天不投與IL-2療法；視情況隨後再靜脈內投與阿地介白素或其生物類似物或變體5天，以每24小時連續輸注18×10 6IU/m 2；視情況隨後3週不投與IL-2療法，其後可投與額外週期。
在一些實施例中，IL-2係以至多6次劑量之最大劑量投與。在一些實施例中，高劑量IL-2方案適用於兒科用途。在一些實施例中，使用每8-12小時劑量為600,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8-12小時劑量為500,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8-12小時劑量為400,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8-12小時劑量為500,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8-12小時劑量為300,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8-12小時劑量為200,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。在一些實施例中，使用每8-12小時劑量為100,000國際單位(IU)/kg的阿地介白素，達最多6次劑量。
在一些實施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天之劑量投與聚乙二醇化IL-2。在一些實施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天之劑量投與貝培阿地白介素或其片段、變體或生物類似物。
在一些實施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天之劑量投與THOR-707或其片段、變體或生物類似物。
在一些實施例中，IL-2方案包括在投與TIL之後投與內維介白素α或其片段、變體或生物類似物。在某些實施例中，每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天劑量向患者投與內維介白素。
在一些實施例中，IL-2方案包括投與移植至抗體主鏈上之IL-2片段。在一些實施例中，IL-2方案包括投與結合IL-2低親和力受體之抗體細胞介素移植蛋白。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括重鏈可變區(V H)，其包括互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3；輕鏈可變區(V L)，其包括LCDR1、LCDR2、LCDR3；及IL-2分子或其片段，其移植至V H或V L之CDR中，其中該抗體細胞介素移植蛋白優先於調節性T細胞擴增T效應細胞。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括重鏈可變區(V H)，其包括互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3；輕鏈可變區(V L)，其包括LCDR1、LCDR2、LCDR3；及IL-2分子或其片段，其移植至V H或V L之CDR中，其中該IL-2分子為突變蛋白，並且其中該抗體細胞介素移植蛋白優先於調節性T細胞擴增T效應細胞。在一些實施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天之劑量投與抗體或其片段、變體或生物類似物，該抗體包括選自由SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:38組成之群組的重鏈及選自由SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:39組成之群組的輕鏈。
在一些實施例中，本文所描述之抗體細胞介素移植蛋白的血清半衰期比野生型IL-2分子，諸如但不限於阿地介白素(Proleukin®)或相當之分子要長。
在一些實施例中，與前述骨髓清除式淋巴球耗盡方案之實施例一起使用之TIL輸注可為本文所描述之任何TIL組成物且亦可包含代替TIL輸注之MIL及PBL輸注，以及添加IL-2方案及投與如本文所描述之輔助療法(諸如PD-1及/或PD-L1抑制劑及/或CTLA-4抑制劑)。 5.額外治療方法
在其他實施例中，本發明提供一種用於治療患有癌症之個體的方法，其包括向該個體投與治療有效劑量的如上適用之在任何前述段落中描述之治療性TIL群體。
在其他實施例中，本發明提供一種用於治療患有癌症之個體的方法，其包括向該個體投與治療有效劑量的如上適用之在任何前述段落中描述之TIL組成物。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得在投與治療有效劑量的如上適用之在任何前述段落中描述的治療性TIL群體或治療有效劑量的如上適用之在任何前述段落中描述的TIL組成物之前，已向個體投與非骨髓清除式淋巴球耗盡方案。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱五天。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以進一步包括以下步驟：在向個體投與TIL細胞之後當天開始，用高劑量IL-2方案治療個體。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得高劑量IL-2方案包括每八小時以15分鐘推注靜脈內輸注形式投與600,000或720,000 IU/kg直至發生耐受性。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為實體腫瘤。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之在任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為黑素瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(包含GBM)、胃腸癌、腎癌或腎細胞癌。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為黑素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠母細胞瘤(包含GBM)及胃腸癌。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為黑素瘤。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為HNSCC。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為子宮頸癌。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為NSCLC。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為神經膠母細胞瘤(包含GBM)。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為胃腸癌。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為高突變癌症。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症為兒科高突變癌症。
在其他實施例中，本發明提供以上適用之任何前述段落中所描述的用於治療患有癌症之個體的方法，該方法經改良以使得癌症係選自由以下組成之群組：肛門癌、膀胱癌、乳癌(包含三陰性乳癌)、骨癌、由人類乳頭狀瘤病毒(HPV)引起的癌症、中樞神經系統相關癌症(包含室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、神經母細胞瘤、松果體母細胞瘤及原始神經外胚層腫瘤)、子宮頸癌(包含鱗狀細胞子宮頸癌、腺鱗狀子宮頸癌及子宮頸腺癌)、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、食管胃交界處癌症、胃癌、胃腸癌、胃腸基質瘤、神經膠母細胞瘤、神經膠質瘤、頭頸癌(包含頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌及咽癌)、腎癌、肝癌、肺癌(包含非小細胞肺癌(NSCLC)及小細胞肺癌)、黑素瘤(包含葡萄膜黑素瘤、脈絡膜黑素瘤、睫狀體黑素瘤或虹膜黑素瘤)、間皮瘤(包含惡性胸膜間皮瘤)、卵巢癌、胰臟癌(包含胰管腺癌)、陰莖癌、直腸癌、腎癌、腎細胞癌、肉瘤(包含尤文氏肉瘤、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤以及其他骨骼及軟組織肉瘤)、甲狀腺癌(包含間變性甲狀腺癌)、子宮癌及陰道癌。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體，其用於治療患有癌症之個體的方法中，該方法包括向該個體投與治療有效劑量之治療性TIL群體。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物，其用於治療患有癌症之個體的方法中，該方法包括向個體投與治療有效劑量之TIL組成物。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物，其經改良以使得在向個體投與治療有效劑量之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物之前，已向個體投與非骨髓清除式淋巴球耗盡方案。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其經改良以使得非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱五天。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物，其經改良以進一步包括以下步驟：在向患者投與TIL細胞之後當天開始，用高劑量IL-2方案治療患者。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其經改良以使得高劑量IL-2方案包括每八小時以15分鐘推注靜脈內輸注形式投與600,000或720,000 IU/kg直至發生耐受性。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物，其經改良以使得癌症為實體腫瘤。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物，其經改良以使得癌症為黑素瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(包含GBM)、胃腸癌、腎癌或腎細胞癌。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物，其經改良以使得癌症為黑素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠母細胞瘤(包含GBM)及胃腸癌。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物，其經改良以使得癌症為黑素瘤。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其經改良以使得癌症為HNSCC。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其經改良以使得癌症為子宮頸癌。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其經改良以使得癌症為NSCLC。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其經改良以使得癌症為神經膠母細胞瘤(包含GBM)。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其經改良以使得癌症為胃腸癌。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其經改良以使得癌症為高突變癌症。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物，其經改良以使得癌症為兒科高突變癌症。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中所描述之治療性TIL群體或如上適用之任何前述段落中所描述之TIL組成物，其經改良以使得癌症係選自由以下組成之群組：肛門癌、膀胱癌、乳癌(包含三陰性乳癌)、骨癌、由人類乳頭狀瘤病毒(HPV)引起的癌症、中樞神經系統相關癌症(包含室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、神經母細胞瘤、松果體母細胞瘤及原始神經外胚層腫瘤)、子宮頸癌(包含鱗狀細胞子宮頸癌、腺鱗狀子宮頸癌及子宮頸腺癌)、大腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、食管胃交界處癌症、胃癌、胃腸癌、胃腸基質瘤、神經膠母細胞瘤、神經膠質瘤、頭頸癌(包含頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌及咽癌)、腎癌、肝癌、肺癌(包含非小細胞肺癌(NSCLC)及小細胞肺癌)、黑素瘤(包含葡萄膜黑素瘤、脈絡膜黑素瘤、睫狀體黑素瘤或虹膜黑素瘤)、間皮瘤(包含惡性胸膜間皮瘤)、卵巢癌、胰臟癌(包含胰管腺癌)、陰莖癌、直腸癌、腎癌、腎細胞癌、肉瘤(包含尤文氏肉瘤、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤以及其他骨骼及軟組織肉瘤)、甲狀腺癌(包含退行性甲狀腺癌)、子宮癌及陰道癌。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體在治療個體之癌症之方法中的用途，該方法包括向該個體投與治療有效劑量之治療性TIL群體。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物在治療個體之癌症之方法中的用途，該方法包括向個體投與治療有效劑量之TIL組成物。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物在治療個體之癌症之方法中的用途，該方法包括向該個體投與非骨髓清除式淋巴球耗盡方案且隨後向該個體投與治療有效劑量之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或治療有效劑量之如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物，其經改良以使得在向個體投與治療有效劑量之治療性TIL群體或治療有效劑量之TIL組成物之前，已向個體投與非骨髓清除式淋巴球耗盡方案。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其經改良以使得非骨髓清除式淋巴球耗盡方案包括以下步驟：以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱五天。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體的用途或如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物的用途，其經改良以進一步包括以下步驟：始於在向患者投與TIL細胞之後當天，用高劑量IL-2方案治療患者。
在其他實施例中，本發明提供經改良之如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其經改良以使得高劑量IL-2方案包括每八小時以15分鐘推注靜脈內輸注形式投與600,000或720,000 IU/kg直至發生耐受性。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其經改良以使得癌症為實體腫瘤。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或如上適用之任何前述段落中描述的TIL組成物的用途，其經改良以使得癌症為黑素瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠母細胞瘤(包含GBM)、胃腸癌、腎癌或腎細胞癌。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其經改良以使得癌症為黑素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠母細胞瘤(包含GBM)及胃腸癌。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其經改良以使得癌症為黑素瘤。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其經改良以使得癌症為HNSCC。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其經改良以使得癌症為子宮頸癌。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其經改良以使得癌症為NSCLC。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其經改良以使得癌症為神經膠母細胞瘤(包含GBM)。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其經改良以使得癌症為胃腸癌。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其經改良以使得癌症為高突變癌症。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中描述的治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其經改良以使得癌症為兒科高突變癌症。
在其他實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落中所描述之治療性TIL群體或TIL組成物的用途，其經改良以使得癌症係選自由以下組成之群組：肛門癌、膀胱癌、乳癌(包含三陰性乳癌)、骨癌、由人類乳頭狀瘤病毒(HPV)引起的癌症、中樞神經系統相關癌症(包含室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、神經母細胞瘤、松果體母細胞瘤及原始神經外胚層腫瘤)、子宮頸癌(包含鱗狀細胞子宮頸癌、腺鱗狀子宮頸癌及子宮頸腺癌)、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、食管胃交界處癌症、胃癌、胃腸癌、胃腸基質瘤、神經膠母細胞瘤、神經膠質瘤、頭頸癌(包含頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌及咽癌)、腎癌、肝癌、肺癌(包含非小細胞肺癌(NSCLC)及小細胞肺癌)、黑素瘤(包含葡萄膜黑素瘤、脈絡膜黑素瘤、睫狀體黑素瘤或虹膜黑素瘤)、間皮瘤(包含惡性胸膜間皮瘤)、卵巢癌、胰臟癌(包含胰管腺癌)、陰莖癌、直腸癌、腎癌、腎細胞癌、肉瘤(包含尤文氏肉瘤、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤以及其他骨骼及軟組織肉瘤)、甲狀腺癌(包含退行性甲狀腺癌)、子宮癌及陰道癌。 實例
現參考以下實例描述本文中涵蓋之實施例。此等實例僅出於說明之目的提供且本揭示案決不應理解為限於此等實例，而應理解為涵蓋由於本文提供之教示而變得顯而易見的任何及所有變化形式。 實例 1 ：製備用於 PRE-REP 及 REP 程序之培養基
本實例描述用於製備用於涉及來源於包含黑素瘤在內之各種腫瘤類型之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之培養的方案之組織培養基的程序。此培養基可用於製備本申請案及實例中所描述之任何TIL。 製備 CM1
自冷藏庫取出以下試劑並使其在37℃水浴中升溫：(RPMI1640、人類AB血清、200 mM L-麩醯胺酸)。根據下表34，藉由將每一成分添加至適於待過濾體積之0.2 µm過濾器單元的頂部來製備CM1培養基。在4℃下儲存。
Figure 02_image078
使用當天，將所需量之CM1在37℃水浴中預熱並添加6000 IU/ml IL-2。
根據表35的按需要進行額外補充。
Figure 02_image080
製備 CM2
自冰箱取出所製備之CM1或製備新鮮CM1。自冰箱取出AIM-V®，且藉由在無菌培養基瓶中混合所製備之CM1與等體積AIM-V®來製備所需量之CM2。在使用當天向CM2培養基中添加3000 IU/mL IL-2。在使用當天用3000 IU/mL IL-2製成足夠量之CM2。在CM2培養基瓶標記上其名稱、製備者名字縮寫、其過濾/製備日期、兩週之過期日期，且在需要用於組織培養之前於4℃下儲存。 製備 CM3
在需要使用的當天，製備CM3。CM3與AIM-V®培養基相同，但在使用當天補充3000 IU/mL IL-2。藉由向AIM-V瓶或袋中直接添加IL-2儲備液，製備滿足實驗需求之量的CM3。藉由輕微振盪進行充分混合。添加至AIM-V之後，立即將瓶子標記上「3000 IU/mL IL-2」。若存在過量CM3，則將其在瓶中於4℃下儲存，標記上培養基名稱、製備者名字縮寫、製備培養基之日期及其過期日期(製備後7天)。在4℃下儲存7天後，捨棄補充有IL-2之培養基。 製備 CM4
CM4與CM3相同，但另外補充2 mM GlutaMAX TM(最終濃度)。每1L CM3添加10 ml之200 mM GlutaMAX TM。藉由向AIM-V瓶或袋直接添加IL-2儲備液及GlutaMAX TM儲備液，製備滿足實驗需求之量的CM4。藉由輕微振盪進行充分混合。添加AIM-V之後，立即將瓶子標記上「3000 IL/ml IL-2及GlutaMAX」。若存在過量CM4，則將其儲存於處於4℃下之瓶子中，標記上培養基名稱、「GlutaMAX」及其過期日期(製備後7天)。在4℃下儲存7天後，捨棄補充有IL-2之培養基。 實例 2 ： IL-2 、 IL-15 及 IL-21 細胞介素混合液之用途
本實例描述充當額外T細胞生長因子之IL-2、IL-15及IL-21細胞介素與實例A至實例G之TIL程序組合的用途。
使用本文所描述之程序，在起始培養時，在一組實驗中可使來自癌細胞(例如黑素瘤細胞)之TIL在IL-2存在下生長，且在另一組中可使該等TIL在以IL-2、IL-15及IL-21之組合代替IL-2存在下生長。在pre-REP完成時，評定培養物之擴增、表型、功能(CD107a+及IFN-γ)及TCR Vβ譜系。IL-15及IL-21描述於本文中別處及Gruijl等人, IL-21促進具有高細胞毒性潛力及低調節T細胞附帶擴增之CD27+CD28+腫瘤浸潤淋巴球之擴增(IL-21 promotes the expansion of CD27+CD28+ tumor infiltrating lymphocytes with high cytotoxic potential and low collateral expansion of regulatory T cells), Santegoets,S.J., 《轉化醫學雜誌(J Transl Med.)》, 2013, 11:37(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pmc/articles/PMC3626797/)中。
結果可顯示，相對於僅IL-2條件，可觀測到在IL-2、IL-15及IL-21處理條件下，CD4 +及CD8 +細胞中之TIL擴增增強(＞20%)。相對於僅IL-2培養物，在自經IL-2、IL-15及IL-21處理的培養物獲得之TIL中，存在朝向偏向TCR Vβ譜系的以CD8 +為主之群體的偏向。與僅經IL-2處理之TIL相比，經IL-2、IL-15及IL-21處理之TIL中的IFN-γ及CD107a升高。 實例 3 ：對個別批次的經 γ 照射之周邊單核細胞的鑑定
本實例描述用於鑑定在本文所描述之例示性方法中用作同種異體飼養細胞的個別批次之經γ照射之周邊單核細胞(PBMC，又稱為單核細胞或MNC)的簡化程序。
每個經照射之MNC飼養細胞批次均由個別供體製備。針對在經純化抗CD3(選殖株OKT3)抗體及介白素-2(IL-2)存在下在REP中擴增TIL之能力來個別地篩選每個批次或供體。此外，每個批次之飼養細胞均在不添加TIL之情況下進行測試，以確證所接受之γ照射劑量足以使其不能夠複製。
TIL之REP需要經γ照射、生長停滯之MNC飼養細胞。飼養細胞MNC上之膜受體與抗CD3(選殖株OKT3)抗體結合且與REP培養盤中之TIL交聯，刺激TIL擴增。由自個別供體獲得的全血之白血球分離術製備飼養細胞批次。將白血球清除術產物在Ficoll-Hypaque上進行離心、洗滌、照射且在GMP條件下冷凍保存。
重要的是，不對接受TIL療法之患者輸注活飼養細胞，因為此可能會引起移植物抗宿主疾病(GVHD)。因此，飼養細胞因對該等細胞給予γ照射而發生生長停滯，導致雙股DNA斷裂及在再培養時MNC細胞之細胞存活率喪失。
根據兩個準則評估飼養細胞批次：(1)其在共培養物中使TIL擴增＞100倍的能力，及(2)其無複製能力。
利用在立式T25組織培養瓶中生長的兩個主要pre-REP TIL株系，以微型REP型式測試飼養細胞批次。針對兩個不同的TIL細胞株測試飼養細胞批次，因為各TIL株系具有獨特的回應於REP中活化而增殖之能力。作為對照，將在歷史上顯示滿足上述準則的經照射之一批MNC飼養細胞與測試批次一起操作。
可獲得足以測試所有條件及所有飼養細胞批次的相同pre-REP TIL株系之儲備液，以確保在單一實驗中測試的所有批次均接受等效測試。
對於測試的各批次飼養細胞，總共存在六個T25培養瓶：Pre-REP TIL株系#1(2個培養瓶)；Pre-REP TIL株系#2(2個培養瓶)；及飼養細胞對照(2個培養瓶)。含有TIL株系#1及#2之培養瓶用於評估飼養細胞批次擴增TIL之能力。飼養細胞對照培養瓶用於評估飼養細胞批次之無複製能力。 A. 實驗方案
第-2/3天，TIL株系解凍.製備CM2培養基且使CM2在37℃水浴中升溫。製備40 mL補充有3000 IU/mL IL-2之CM2。保持溫熱待用。將20 mL不含IL-2的預溫熱之CM2置放於兩個50 mL錐形管中之每一者中，並用所用TIL株系之名稱標記。自LN2儲存器取出兩個指定的pre-REP TIL株系且將小瓶轉移至組織培養室中。藉由將小瓶於拉鏈密封之儲存袋內置放於37℃水浴中解凍直至保留少量冰。
使用無菌移液管，將各小瓶之內含物立即轉移至準備好的經標記之50 mL錐形管中之20 mL CM2中。使用不含IL-2的CM2補足至40 mL來洗滌細胞，且在400×CF下離心5分鐘。抽吸出上清液且再懸浮於補充有3000 IU/mL IL-2之5 mL溫熱的CM2中。
一式兩份取出小等分試樣(20 µL)，使用自動細胞計數器進行細胞計數。記錄計數。在計數時，將具有TIL細胞之50 mL錐形管置放於潮濕的37℃、5% CO 2培育箱中，並將蓋鬆開以允許氣體交換。測定細胞濃度，且將TIL在補充有3000 IU/mL IL-2之CM2中稀釋至1×106個細胞/毫升。
按需要，在潮濕的37℃培育箱中之24孔組織培養盤中的許多孔中以每孔2 mL進行培養，直至小型REP的第0天。將不同TIL株系在單獨的24孔組織培養盤中培養以避免混淆及潛在的交叉污染。
第0天，起始小型REP.針對待測試之飼養細胞批次之數目製備足夠的CM2培養基。(例如對於一次性測試4個飼養細胞批次，製備800 mL CM2培養基)。將上述製備之CM2之一部分等分，且對其補充3000 IU/mL IL-2用於細胞培養。(例如對於一次性測試4個飼養細胞批次，製備具有3000 IU/mL IL-2之500 mL CM2培養基)。
用各TIL株系獨立地操作以防止交叉污染，自培育箱取出具有TIL培養物之24孔盤，並轉移至BSC。
使用無菌移液管或100-1000 µL移液器及吸頭，自含待使用之TIL之各孔取出約1 mL培養基，並將其置放於24孔組織培養盤之未使用孔中。
使用新鮮的無菌移液管或100-1000 µL移液器及吸頭，將剩餘培養基與孔中的TIL混合以使細胞再懸浮，且接著將細胞懸浮液轉移至標記有TIL批次名稱的50 mL錐形管中且記錄體積。
用保留的培養基洗滌孔且將該體積轉移至相同的50 mL錐形管中。以400×CF旋轉細胞以收集細胞沈澱物。抽取出培養基上清液且將細胞沈澱物再懸浮於2-5 mL含有3000 IU/mL IL-2之CM2培養基中，所使用之體積係基於所收集的孔之數目及沈澱物之大小，亦即，體積應足以確保濃度＞1.3×106個細胞/毫升。
使用血清移液管，將細胞懸浮液充分混合且記錄體積。取出200 µL，使用自動化細胞計數器進行細胞計數。在計數時，將具有TIL細胞之50 mL錐形管置放於潮濕的5% CO2、37℃培育箱中，並將蓋鬆開以允許氣體交換。記錄計數。
自培育箱取出含有TIL細胞之50 mL錐形管，且使其細胞以1.3×106 個細胞/毫升之濃度再懸浮於補充有3000 IU/mL IL-2之溫熱CM2中。將50 mL錐形管放回培育箱中且將蓋鬆開。
對於第二TIL株系重複以上步驟。
在即將TIL接種至T25培養瓶中進行實驗之前，如下所示將TIL按1:10稀釋成最終濃度為1.3×10 5個細胞/毫升。
製備MACS GMP CD3純(OKT3)工作溶液.自4℃冰箱中取出OKT3儲備液(1 mg/mL)且置放於BSC中。在小型REP之培養基中使用最終濃度為30 ng/mL OKT3。
在用於實驗之各T25培養瓶中，每20 mL需要600 ng OKT3；此相當於每20 mL需要60 µL的10 µg/mL溶液，或對於各飼養細胞批次，所測試之全部6個培養瓶需要360 µL。
對於所測試的各飼養細胞批次，對於10 µg/mL之工作濃度，製備400 µL的1 mg/mL OKT3之1:100稀釋液(例如對於一次性測試4個飼養細胞批次，製備1600 µL的1 mg/mL OKT3之1:100稀釋液：16 µL的1 mg/mL OKT3+1.584 mL具有3000 IU/mL IL-2之CM2培養基)。
製備T25培養瓶.在製備飼養細胞之前，標記各培養瓶且用CM2培養基填充培養瓶。將培養瓶置放於37℃潮濕的5% CO2培育箱中以保持培養基溫熱，同時等待添加剩餘組分。在製備飼養細胞後，將各組分添加至各培養瓶中之CM2中。
其他資訊提供於表36中。
Figure 02_image082
製備飼養細胞.對於此方案，所測試之每個批次需要至少78×10 6個飼養細胞。由SDBB冷凍之每個1 mL小瓶在冷凍時具有100×10 6個活細胞。假設自液態N 2儲存解凍後回收率為50%，建議每個批次至少解凍兩個1 mL小瓶之飼養細胞，由此估計各REP有100×10 6個活細胞。替代地，若供應於1.8 mL小瓶中，則僅一個小瓶即提供足夠的飼養細胞。
在將飼養細胞解凍之前，對於待測試之各飼養細胞批次，將約50 mL不含IL-2之CM2預溫熱。自LN2儲存器取出指定飼養細胞批次小瓶，置放於拉鏈儲存袋中，並置放於冰上。將小瓶在封閉的拉鏈儲存袋中藉由浸沒於37℃水浴中來解凍。自拉鏈袋取出小瓶，用70% EtOH噴灑或擦拭，並轉移至BSC。
使用移液管，將飼養細胞小瓶之內容物立即轉移至50 mL錐形管中之30 mL溫熱CM2中。用小體積CM2洗滌小瓶以移除小瓶中之任何殘餘細胞且以400×CF離心5分鐘。抽吸出上清液且再懸浮於4 mL溫熱的CM2加3000 IU/mL IL-2中。取出200 µL，使用自動細胞計數器進行細胞計數。記錄計數。
將細胞以1.3×10 7個細胞/毫升再懸浮於溫熱CM2加3000 IU/mL IL-2中。將TIL細胞自1.3×10 6個細胞/毫升稀釋至1.3×10 5個細胞/毫升。
設置共培養物. 將TIL細胞自1.3×10 6個細胞/毫升稀釋至1.3×10 5個細胞/毫升。將4.5 mL CM2培養基添加至15 mL錐形管中。自培育箱取出TIL細胞且使用10 mL血清移液管使其充分再懸浮。自1.3×10 6個細胞/毫升TIL懸浮液取出0.5 mL細胞且添加至15 mL錐形管中之4.5 mL培養基中。將TIL儲備液小瓶放回培育箱中。充分混合。對第二TIL株系重複上述操作。
將具有用於單一飼養細胞批次之預溫熱培養基之培養瓶自培育箱轉移至BSC。藉由用1 mL移液器吸頭上下移液數次來混合飼養細胞，並將1 mL(1.3×10 7個細胞)轉移至該飼養細胞批次的各培養瓶中。向各培養瓶中添加60 µL OKT3操作儲備液(10 µg/mL)。將兩個對照培養瓶放回培育箱。
將1 mL(1.3×10 5)之各TIL批次轉移至相應標記的T25培養瓶中。將培養瓶放回培育箱中且直立培育。自第5天開始進行干預。對測試的所有飼養細胞批次重複此程序。
第5天，更換培養基. 製備具有3000 IU/mL IL-2之CM2。每個培養瓶需要10 mL。利用10 mL移液管，將具有3000 IU/mL IL-2之10 mL溫熱的CM2轉移至各培養瓶中。將培養瓶放回培育箱中且直立培育至第7天。對測試的所有飼養細胞批次重複操作。
第7天，收集. 自培育箱取出培養瓶且轉移至BSC，注意不要破壞在培養瓶底部上之細胞層。在不破壞在培養瓶底部上生長之細胞的情況下，自各測試培養瓶取出10 mL培養基且自各對照培養瓶取出15 mL培養基。
使用10 mL血清移液管，將細胞再懸浮於中剩餘培養基中且充分混合以打散任何細胞團塊。藉由移液充分混合細胞懸浮液之後，取出200 µL用於細胞計數。使用適當標準操作程序結合自動細胞計數器設備對TIL進行計數。記錄第7天之計數。對測試的所有飼養細胞批次重複此程序。
評估飼養細胞對照培養瓶之無複製能力，且自第0天開始評估含有TIL之培養瓶的擴增倍數。
第7天，繼續飼養細胞對照培養瓶至第14天. 在完成第7天飼養細胞對照培養瓶之計數之後，將15 mL含有3000 IU/mL IL-2之新鮮CM2培養基添加至各對照培養瓶中。將對照培養瓶放回培育箱中且以直立位置培育至第14天。
第14天，飼養細胞對照培養瓶之非增殖期延長. 自培育箱中取出培養瓶且轉移至BSC，注意不要破壞在培養瓶底部上之細胞層。在不破壞在培養瓶底部上生長之細胞的情況下，自各對照培養瓶取出大約17 mL培養基。使用5 mL血清移液管，將細胞再懸浮於中剩餘培養基中且充分混合以打散任何細胞團塊。記錄各培養瓶之體積。
藉由移液充分混合細胞懸浮液之後，取出200 µL用於細胞計數。使用適當標準操作程序結合自動細胞計數器設備對TIL進行計數且記錄下計數。對測試的所有飼養細胞批次重複此程序。 B. 結果及驗收準則方案
結果. γ照射之劑量足以使飼養細胞不能進行複製。預期所有批次均符合評估準則且亦展示與第0天相比，在REP培養之第7天剩餘之活飼養細胞之總數減少。預期所有飼養細胞批次均符合以下評估準則：到REP培養之第7天，TIL之生長擴增100倍。預期飼養細胞對照培養瓶之第14天計數將持續在第7天發現的非增殖趨勢。
驗收準則. 測試的各批次飼養細胞之每個TIL株系複本均滿足以下驗收準則。驗收準則為兩倍，如下文表37中所示。
Figure 02_image084
評估當在30 ng/mL OKT3抗體及3000 IU/mL IL-2存在下培養時，照射劑量是否足以使MNC飼養細胞無複製能力。藉由在REP的第7天及第14天以自動細胞計數測定的總活細胞計數(TVC)來評估無複製能力。
驗收準則為「無生長」，意謂在第7天及第14天，總活細胞數目相對於REP第0天放入培養物中之初始活細胞數目未增加。
評估飼養細胞支持TIL擴增之能力。根據活細胞自REP第0天培養開始至REP第7天的擴增倍數來量測TIL生長。在第7天，如藉由自動細胞計數所評估，TIL培養物達成最小100倍擴增(亦即，超過在REP第0天放入培養物中之總活TIL細胞數目的100倍)。
不符合驗收準則的MNC飼養細胞批次的附帶測試. 在MNC飼養細胞批次不滿足以上概述之驗收準則中之任一者的情況下，將採取以下步驟對該批次進行再測試，以排除造成此情形之簡單實驗者錯誤。
若該批次存在兩個或多於兩個剩餘衛星測試小瓶，則再測試該批次。若該批次存在一個或不存在剩餘衛星測試小瓶，則根據上文所列之驗收準則，該批次不合格。
為進行鑑定，所討論批次及對照批次必須達成以上驗收準則。在符合此等準則之後，將准許使用該批次。 實例 4 ：製備 IL-2 儲備液
本實例描述將經純化之凍乾重組人類介白素-2溶解於適合用於其他組織培養方案(包含本申請案及實例中所描述之所有方案)之儲備液樣本中的程序，包含涉及使用rhIL-2之程序。
程序. 製備0.2%乙酸溶液(HAc)。將29 mL無菌水轉移至50 mL錐形管中。向50 mL錐形管中添加1 mL 1N乙酸。藉由倒轉管2-3次進行充分混合。藉由使用Steriflip過濾器過濾對HAc溶液進行滅菌。
在PBS中製備1% HSA。在150 mL無菌過濾器單元中，向96 mL PBS中添加4 mL之25% HSA儲備液。過濾溶液。在4℃下儲存。針對製備的每一小瓶rhIL-2，填寫表格。
製備rhIL-2儲備液(6×10 6IU/mL最終濃度)。每一批次之rhIL-2不同，且所需資訊見於製造商之分析證書(Certificate of Analysis，COA)，諸如：1)每個小瓶rhIL-2之質量(mg)、2) rhIL-2之比活性(IU/mg)及3)推薦的0.2% HAc復原體積(mL)。
使用以下公式計算rhIL-2批次所需的1% HSA之體積：
Figure 02_image086
舉例而言，根據rhIL-2批次10200121 (Cellgenix)之COA，1 mg小瓶之比活性為25×10 6IU/mg。建議在2 mL之0.2% HAc中復原rhIL-2。
Figure 02_image088
用酒精拭布擦拭IL-2小瓶之橡膠塞。使用連接至3 mL注射器之16G針，將推薦體積之0.2% HAc注射至小瓶中。請小心不要在拔出針頭時移去塞子。將小瓶倒轉3次並旋動直至所有粉末均溶解。小心地取下塞子並擱置於酒精拭布上。向小瓶中添加所計算體積之1% HSA。
儲存rhIL-2溶液。對於短期儲存(＜ 72小時)，將小瓶儲存於4℃。對於長期儲存(＞ 72小時)，將小瓶等分成較小體積，且在冷凍小瓶中於-20℃下儲存待用。避免冷凍/解凍循環。在製備日期之後6個月過期。Rh-IL-2標籤包含供應商及目錄號、批號、過期日期、操作員名字縮寫、濃度及等分體積。 實例 5 ：冷凍保存程序
本實例描述使用7454型CryoMed受控速率冷凍機(Thermo Scientific)，利用實例14中所描述之簡短密閉程序製備的TIL之冷凍保存程序方法。
所用設備如下：鋁製卡盒支架(與CS750冷凍袋相容)、用於750 mL袋的冷凍儲存盒、低壓(22 psi)液氮罐、冰箱、熱電偶感測器(帶式袋)及CryoStore CS750冷凍袋(OriGen Scientific)。
冷凍程序提供自成核以0.5℃速率達到-20℃，且以1℃/min之冷卻速率達到-80℃終點溫度。程式參數如下：步驟1：在4℃下等待；步驟2：以1.0℃/min(樣本溫度)達到-4℃；步驟3：以20.0℃/min(箱室溫度)達到-45℃；步驟4：一10.0℃/min(箱室溫度)達到-10.0℃；步驟5：以0.5℃/min(箱室溫度)達到-20℃；及步驟6：以1.0℃/min(樣本溫度)達到-80℃。 實例 6 ：利用合成培養基之腫瘤擴增程序
上文或下文中所揭示之程序可用相應的合成培養基(例如CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM，ThermoFisher；包含例如DM1及DM2)替代CM1及CM2培養基來進行。 實例 7 ：冷凍保存 TIL 細胞療法之例示性 GEN 2 製造
本實例描述根據現行組織優良操作規範(current Good Tissue Practices)及現行優良製造規範(current Good Manufacturing Practices)在G-REX培養瓶中進行Iovance Biotherapeutics公司之TIL細胞療法程序的cGMP製造。本實例描述根據現行組織優良操作規範及現行優良製造規範在G-REX培養瓶中進行TIL細胞療法程序的例示性cGMP製造。
Figure 02_image090
Figure 02_image092
第0天CM1培養基製備.在BSC中，將試劑添加至RPMI 1640培養基瓶中。添加以下試劑t，每瓶添加：熱不活化人類AB血清(100.0 mL)；GlutaMax™(10.0 mL)；硫酸建它黴素，50 mg/mL(1.0 mL)；2-巰基乙醇(1.0 mL)
自BSC移除不必要之材料。自BSC取出培養基試劑，將硫酸建它黴素及HBSS保留在BSC以用於調配洗滌培養基製劑。
解凍IL-2等分試樣。解凍一份1.1 mL IL-2等分試樣(6×10 6IU/mL)(BR71424)，直至所有冰融化為止。記錄IL-2：批號及有效期
將IL-2儲備液轉移至培養基中。在BSC中，將1.0 mL IL-2儲備液轉移至所製備之CM1第0天培養基瓶中。添加CM1第0天培養基1瓶及IL-2(6×106 IU/mL)1.0 mL。
將G-REX100MCS傳遞至BSC中。將G-REX100MCS(W3013130)無菌傳遞至BSC中。
將所有完全CM1第0天培養基泵吸至G-REX100MCS培養瓶中。組織片段錐形管或GRex100MCS。
第0天腫瘤洗滌培養基製備.在BSC中，將5.0 mL建它黴素(W3009832或W3012735)添加至1×500 mL HBSS培養基(W3013128)瓶中。每瓶添加：HBSS(500.0 mL)；硫酸建它黴素，50 mg/mL(5.0 mL)。經由1L 0.22微米過濾器單元(W1218810)製備含有建它黴素之經過濾HBSS。
第0天腫瘤處理.獲得腫瘤樣品且立即轉移至2-8℃之套件中進行處理。等分腫瘤洗滌培養基。使用8''鑷子(W3009771)進行腫瘤洗滌1。自樣品瓶取出腫瘤且轉移至所製備之「洗滌1」培養皿中。此之後為腫瘤洗滌2及腫瘤洗滌3。量測且評定腫瘤。評定是否觀測到整個腫瘤面積之＞ 30%為壞死及/或脂肪組織。適用時，進行清除性分割。若腫瘤較大且觀測到＞30%組織外表壞死/為脂肪，則藉由使用解剖刀及/或鑷子之組合移除壞死/脂肪組織，同時保留腫瘤內部結構來進行「清除性分割」。分割腫瘤。使用解剖刀及/或鑷子之組合，將腫瘤樣品切割成均勻、適當大小之片段(至多6個中間片段)。轉移中間腫瘤片段。將腫瘤片段分割成大小大約為3×3×3 mm之小塊。儲存中間片段以防脫水。重複中間片段分割。測定所收集之小塊數目。若僅保留所需組織，則自「有利中間片段」6孔盤選擇額外的有利腫瘤小塊來填充丟棄片段，以達到最多50個片段。
準備錐形管。將腫瘤小塊轉移至50 mL錐形管中。準備用於G-REX100MCS之BSC。自培育箱取出G-REX100MCS。將G-REX100MCS培養瓶無菌傳遞至BSC中。將腫瘤片段添加至G-REX100MCS培養瓶中。使小塊均勻分佈。
按以下參數培育G-Rex100MCS：培育G-REX培養瓶：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO 2百分比：5.0±1.5% CO 2。計算：培育時間；下限=培育時間+252小時；上限=培育時間+276小時。
程序完成後，捨棄所有剩餘已升溫培養基並解凍IL-2之等分試樣。
第11天-培養基製備.監測培育箱。培育箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5% CO2。
在培育箱中使3×1000 mL RPMI 1640培養基(W3013112)瓶及3×1000 mL AIM-V(W3009501)瓶升溫≥30分鐘。自培育箱取出RPMI 1640培養基。製備RPMI 1640培養基。過濾培養基。將3×1.1 mL之IL-2等分試樣(6×10 6IU/mL)(BR71424)解凍。自培育箱取出AIM-V培養基。將IL-2添加至AIM-V中。將10 L Labtainer袋及中繼泵轉移裝置無菌轉移至BSC中。
準備10 L Labtainer培養基袋。準備Baxa泵。準備好10L Labtainer培養基袋。將培養基泵吸至10 L Labtainer中。自Labtainer袋取下自動泵吸管。
混合培養基。輕緩地揉按袋子以進行混合。依據取樣計劃對培養基進行取樣。取出20.0 mL培養基並置放於50 mL錐形管中。準備細胞計數稀釋管。在BSC中，向四個15 mL錐形管中添加4.5 mL標記有「用於細胞計數稀釋」及批號之AIM-V培養基。將試劑自BSC轉移至2-8℃。準備1 L轉移包。在BSC外部，將1L轉移包熔接(依據程序註釋5.11)至附接於所準備的「完全CM2第11天培養基」袋的轉移裝置上。準備飼養細胞轉移包。培育完全CM2第11天培養基。
第11天-TIL收集.預處理表格。培育箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO 2百分比：5.0±1.5% CO 2。自培育箱取出G-REX100MCS。準備好300 mL轉移包。將轉移包熔接至G-REX100MCS。
準備用於TIL收集之培養瓶且起始TIL收集。收集TIL。使用GatheRex，經由血液過濾器將細胞懸浮液轉移至300 mL轉移包中。檢查膜上之黏附細胞。
沖洗培養瓶膜。閉合G-REX100MCS上之夾子。確保所有夾子閉合。熱封TIL及「上清液」轉移包。計算TIL懸浮液之體積。準備用於取樣之上清液轉移包。
抽取Bac-T樣本。在BSC中，自1L「上清液」轉移包中抽吸約20.0 mL上清液，並分配至無菌的50 mL錐形管中。
依據取樣計劃接種BacT。使用適當大小之注射器自所準備的標記有BacT之50 mL錐形管取出1.0 mL樣本且接種於厭氧瓶中。
培育TIL。將TIL轉移包置放於培育箱中待用。進行細胞計數及計算。確定所進行之細胞計數的活細胞濃度平均值及存活率平均值。存活率÷2。活細胞濃度÷2。測定計數之上限及下限。下限：活細胞濃度平均值×0.9。上限：活細胞濃度平均值×1.1。確認兩個計數在可接受界限內。根據進行的所有四次計數測定平均活細胞濃度。
調整TIL懸浮液之體積：計算取出細胞計數樣本後TIL懸浮液之經調整體積。總TIL細胞體積(A)。取出的細胞計數樣本之體積(4.0 mL)(B)經調整的TIL細胞總體積C = A - B。
計算活TIL細胞總數。平均活細胞濃度*：總體積；總活細胞數：C = A×B。
流動式細胞測量術之計算：若總活TIL細胞計數≥4.0×10 7，則計算獲得用於流動式細胞測量術樣本之1.0×10 7個細胞的體積。
流動式細胞測量術所需之活細胞總數：1.0×10 7個細胞。流動式細胞測量術所需之細胞體積：活細胞濃度除以1.0×10 7個細胞A。
計算等於2.0×10 8個活細胞的TIL懸浮液之體積。按需要，計算待取出的過量TIL細胞體積，且取出過量TIL並按需要將TIL置於培育箱中。計算按需要取出之過量TIL總量。
計算添加至供冷凍的具有目標細胞濃度之過量TIL細胞的CS-10培養基之量為1.0×10 8個細胞/毫升。按需要，對過量TIL離心。觀測錐形管並添加CS-10。
填充小瓶。將1.0 mL細胞懸浮液等分至適當大小的冷凍小瓶中。將剩餘體積等分至適當大小之冷凍小瓶中。若體積≤0.5 mL，則將CS10添加至小瓶中，直至體積為0.5 mL。
計算獲得供冷凍保存之1×10 7個細胞所需之細胞體積。取出樣本以進行冷凍保存。將TIL置於培育箱中。
樣本之冷凍保存。觀測錐形管，且緩慢添加CS-10並記錄所添加之CS10的體積0.5 mL。
第11天-飼養細胞獲得飼養細胞。自LN2冷凍機獲得至少兩個不同批號的3袋飼養細胞。在準備解凍之前將細胞保存於乾冰上。準備水浴或cryotherm低溫儲存系統。在37.0±2.0℃水浴或cytotherm低溫儲存系統處解凍飼養細胞約3至5分鐘或直至冰剛好消失為止。自培育箱取出培養基。彙集解凍之飼養細胞。將飼養細胞添加至轉移包。將飼養細胞自注射器分配至轉移包中。對彙集之飼養細胞進行混合，且標記轉移包。
計算轉移包中飼養細胞懸浮液之總體積。取出細胞計數樣本。對各樣本使用單獨的3 mL注射器，使用無針注射口自飼養細胞懸浮液轉移包抽吸4×1.0 mL細胞計數樣本。將每個樣本等分至經標記之冷凍小瓶中。進行細胞計數，且確定倍增因子，選定方案並輸入倍增因子。確定所進行之細胞計數的活細胞濃度平均值及存活率平均值。測定計數之上限及下限，並確認其在界限內。
調整飼養細胞懸浮液之體積。計算取出細胞計數樣本後飼養細胞懸浮液之經調整體積。計算活飼養細胞總數。按需要，獲得額外飼養細胞。按需要，解凍額外飼養細胞。將第4個飼養細胞袋置放於拉鏈袋中，且在37.0±2.0℃水浴或cytotherm低溫儲存系統中解凍約3至5分鐘並彙集額外的飼養細胞。量測體積。量測注射器中飼養細胞之體積並記錄在下面(B)。計算飼養細胞之新的總體積。將飼養細胞添加至轉移包。
按需要，製備稀釋液，將4.5 mL AIM-V培養基添加至四個15 mL錐形管中。準備細胞計數。對各樣本使用單獨的3 mL注射器，使用無針注射口自飼養細胞懸浮液轉移包取出4×1.0 mL細胞計數樣本。進行細胞計數及計算。根據進行的所有四次計數測定平均活細胞濃度。調整飼養細胞懸浮液之體積，且計算取出細胞計數樣本後飼養細胞懸浮液之經調整體積。飼養細胞總體積減去取出之4.0 mL。計算獲得5×10 9個活飼養細胞所需的飼養細胞懸浮液之體積。計算過量飼養細胞體積。計算待取出之過量飼養細胞之體積。取出過量飼養細胞。
使用1.0 mL注射器及16G針頭，吸取0.15 mL OKT3且添加OKT3。熱封飼養細胞懸浮液轉移包。
第11天G-REX填充及接種設置G-REX500MCS.自培育箱取出「完全CM2第11天培養基」並將培養基泵吸至G-REX500MCS中。將4.5 L培養基泵吸至G-REX500MCS中，填充至培養瓶上標示之線處。按需要，熱封並培育培養瓶。將飼養細胞懸浮液轉移包熔接至G-REX500MCS。將飼養細胞添加至G-REX500MCS。熱封。將TIL懸浮液轉移包熔接至培養瓶。將TIL添加至G-REX500MCS。熱封。將G-REX500MCS在37.0±2.0℃下培育，CO2百分比：5.0±1.5% CO2。
計算培育範圍。進行計算以確定在第16天自培育箱取出G-REX500MCS的適當時間。下限：培育時間+108小時。上限：培育時間+132小時。
第11天 過量TIL冷凍保存.適用：冷凍過量TIL小瓶。確證在冷凍前已設定CRF。進行冷凍保存。將小瓶自速率受控冷凍機轉移至適當儲存器中。完成冷凍後，將小瓶自CRF轉移至適當儲存容器。將小瓶轉移至適當儲存器中。記錄在LN2中的儲存位置。
第16天 培養基製備預熱AIM-V培養基。計算使培養基袋1、2及3之培養基升溫的時間。確保所有袋子已升溫在12與24小時之間之持續時間。設定用於上清液之10L Labtainer。使用魯爾接頭將流體泵轉移裝置之較大直徑端附接至10L Labtainer袋之一個凹形端口。設定用於上清液之10L Labtainer並進行標記。設定用於上清液之10L Labtainer。確保在自BSC之前取出前閉合所有夾子。注意：在TIL收集期間使用上清液袋，該TIL收集可與培養基製備並行地進行。
解凍IL-2。每袋CTS AIM V培養基解凍5×1.1 mL IL-2等分試樣(6×10 6IU/mL)(BR71424)，直至所有冰融化為止。等分100.0 mLGlutaMax™。將IL-2添加至GlutaMax™中。準備用於調配之CTS AIM V培養基袋。準備用於調配之CTS AIM V培養基袋。多級Baxa泵。準備調配培養基。將GlutaMax + IL-2泵吸至袋子中。監測之參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO 2百分比：5.0±1.5% CO 2。使完全CM4第16天培養基升溫。製備稀釋液。
第16天 REP分瓶監測培育箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO 2百分比：5.0±1.5% CO 2。自培育箱取出G-REX500MCS。準備1L轉移包且標記為TIL懸浮液並稱重為1 L。
G-REX500MCS之體積減少。將約4.5 L培養物上清液自G-REX500MCS轉移至10L Labtainer。
準備用於TIL收集之培養瓶。取出上清液後，閉合通向紅色管線之所有夾子。
起始TIL收集。劇烈敲擊培養瓶並旋動培養基以使細胞剝離，且確保所有細胞剝落。
TIL收集。鬆開通向TIL懸浮液轉移包之所有夾子。使用GatheRex，將細胞懸浮液轉移至TIL懸浮液轉移包中。注意：確保維持邊緣傾斜，直至收集到所有細胞及培養基為止。檢查膜上之黏附細胞。沖洗培養瓶膜。閉合G-REX500MCS上之夾子。熱封含有TIL之轉移包。熱封含有上清液之10L Labtainer。記錄含細胞懸浮液之轉移包的重量並計算懸浮液體積。準備用於樣本取出之轉移包。自細胞上清液取出測試樣本。
無菌性及BacT測試取樣. 自所準備的15 mL標記BacT之錐形管取出1.0 mL樣本。取出細胞計數樣本。在BSC中，針對每個樣本使用單獨的3 mL注射器，自「TIL懸浮液」轉移包取出4×1.0 mL細胞計數樣本。
取出黴漿菌樣本。使用3 mL注射器，自TIL懸浮液轉移包取出1.0 mL並置放於準備的標記有「黴漿菌稀釋劑」之15 mL錐形管中。
準備用於接種之轉移包。將TIL置放於培育箱中。自BSC取出細胞懸浮液，且置放於培育箱中待用。進行細胞計數及計算。首先藉由將0.5 mL細胞懸浮液添加至所製備的4.5 mL AIM-V培養基中來對細胞計數樣本進行稀釋，得到稀釋度為1:10。確定所進行之細胞計數的活細胞濃度平均值及存活率平均值。測定計數之上限及下限。注意：稀釋可以根據預期的細胞濃度進行調整。 由所進行的全部四次計數確定平均活細胞濃度。調整TIL懸浮液之體積。計算取出細胞計數樣本後TIL懸浮液之經調整體積。總TIL細胞體積減去取出的用於測試之5.0 mL。
計算活TIL細胞總數。計算待接種之培養瓶之總數目。注意：待接種的G-REX500MCS培養瓶之最大數目為五。若計算的待接種培養瓶之數目超過五，則使用可用的所有體積之細胞懸浮液接種僅五個培養瓶。
計算用於繼代培養之培養瓶數目。計算除所準備之袋子以外還需要的培養基袋之數目。按計算需要每兩個G-REX-500M培養瓶準備一個10L的「CM4第16天培養基」袋。繼續接種第一個GREX-500M培養瓶，同時製備額外的培養基並使其升溫。準備確定的所計算數目之額外培養基袋並使其升溫。填充G-REX500MCS。準備泵吸培養基並將4.5 L培養基泵吸至G-REX500MCS中。熱封。重複填充。培育培養瓶。計算待添加至新G-REX500MCS培養瓶中的TIL懸浮液之目標體積。若計算之培養瓶數目超過五，則使用所有體積之細胞懸浮液接種僅五個培養瓶。準備用於接種之培養瓶。自培育箱取出G-REX500MCS。準備用於泵吸之G-REX500MCS。除較大過濾器管線外，閉合所有夾子。自培育箱取出TIL。製備用於接種之細胞懸浮液。將「TIL懸浮液」轉移包無菌熔接(依據程序註釋5.11)至泵入口管線。將TIL懸浮液袋置於稱上。
用TIL懸浮液接種培養瓶。將所計算體積之TIL懸浮液泵吸至培養瓶中。熱封。填充剩餘培養瓶。
監測培育箱。培育箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO 2百分比：5.0±1.5% CO 2。培育培養瓶。
測定在第22天自培育箱取出G-REX500MCS的時間範圍。
第22天 洗滌緩衝液製備.準備10L Labtainer袋。在BSC中，經由魯爾接頭將4''血漿轉移裝置附接至10L Labtainer袋。準備10L Labtainer袋。在轉移出BSC之前，閉合所有夾子。注意：為每兩個待收集之G-REX500MCS培養瓶準備一個10L Labtainer袋。將Plasmalyte泵吸至3000 mL袋中，且藉由翻轉泵並操縱袋子之位置而自3000 mL Origen袋移除空氣。將25%的人類白蛋白添加至3000 mL袋中。獲得最終體積為120.0 mL的25%人類白蛋白。
製備IL-2稀釋劑。使用10 mL注射器，在LOVO洗滌緩衝液袋上使用無針注射口取出5.0 mL LOVO洗滌緩衝液。將LOVO洗滌緩衝液分配至50 mL錐形管中。
等分CRF空白袋LOVO洗滌緩衝液。使用100 mL注射器，自無針注入口吸取70.0 mL LOVO洗滌緩衝液。
解凍一份1.1 mL IL-2(6×10 6IU/mL)，直至所有冰融化為止。將50 µL IL-2儲備液(6×10 6IU/mL)添加至標記為「IL-2稀釋劑」的50 mL錐形管中。
冷凍保存準備. 將5個冷凍盒置於2-8℃下，以對其進行預調節，以便用於最終產物冷凍保存。
製備細胞計數稀釋液。在BSC中，向4個單獨的15 mL錐形管中添加4.5 mL已標記批號及「用於細胞計數稀釋液」的AIM-V培養基。準備細胞計數。將4個冷凍小瓶標記上小瓶編號(1-4)。將小瓶保存在BSC以供使用。
第22天 TIL收集.監測培育箱。培育箱參數：溫度LED顯示器：37±2.0℃，CO2百分比：5%±1.5%。自培育箱取出G-REX500MCS培養瓶。準備TIL收集袋並進行標記。封閉額外之接頭。體積減少：將約4.5 L上清液自G-REX500MCS轉移至上清液袋。
準備用於TIL收集之培養瓶。起始TIL收集。劇烈敲擊培養瓶並旋動培養基以剝離細胞。確保所有細胞剝落。起始TIL收集。鬆開通向TIL懸浮液收集袋之所有夾子。TIL收集。使用GatheRex，將TIL懸浮液轉移至3000 mL收集袋中。檢查膜上之黏附細胞。沖洗培養瓶膜。閉合G-Rex500MCS上之夾子，並確保閉合所有夾子。將細胞懸浮液轉移至LOVO來源袋中。閉合所有夾子。熱封。取出4×1.0 mL細胞計數樣本。
進行細胞計數。利用NC-200及程序註釋5.14進行細胞計數及計算。首先藉由將0.5 mL細胞懸浮液添加至所製備的4.5 mL AIM-V培養基中來對細胞計數樣本進行稀釋。由此得到1:10稀釋度。測定進行細胞計數之細胞的平均存活率、活細胞濃度及總成核細胞濃度。測定計數之上限及下限。測定進行細胞計數之細胞的平均存活率、活細胞濃度及總成核細胞濃度。稱量LOVO來源袋。計算活TIL細胞總數。計算成核細胞總數。
製備黴漿菌稀釋劑。經由魯爾樣本口自一個上清液袋取出10.0 mL並置於15 mL錐形管中。
進行「TIL G-REX收集」方案並確定最終產物目標體積。裝載一次性套組。取出濾液袋。輸入濾液容量。將濾液容器置於實驗台上。附接PlasmaLyte。確證已附接PlasmaLyte，且觀測到PlasmaLyte正在移動。將來源容器附接至導管，且確證已附接來源容器。確認PlasmaLyte正在移動。
最終調配及填充。目標體積/袋子計算。計算待調配於空白袋中之CS-10及LOVO洗滌緩衝液的體積。準備CRF空白袋。
計算待添加至最終產物的IL-2之體積。所需最終IL-2濃度(IU/mL)-300 IU/mL。IL-2工作儲備液：6×10 4IU/mL。組裝連接設備。將4S-4M60無菌熔接至CC2單元接頭。將CS750冷凍袋無菌熔接至所製備之線束上。將CS-10袋熔接至4S-4M60之尖端上。在IL-2存在下製備TIL。使用適當大小之注射器，自「IL-2 6×10 4」等分試樣取出確定量之IL-2。標記經調配TIL袋。將經調配TIL袋添加至設備。添加CS10。切換注射器。將約10 mL空氣吸取至100 mL注射器中並更換設備上之60 mL注射器。添加CS10。準備CS-750袋。分配細胞。
自最終產物袋移除空氣並獲得保留物。在填充了最後一個最終產物袋後，即閉合所有夾子。將10 mL空氣吸取至新的100 mL注射器中且更換設備上的注射器。 將保留物分配至50 mL錐形管中，且將管標記為「保留物」及批號。對每個袋子重複空氣移除步驟。
準備用於冷凍保存之最終產物，包含目測檢查。在冷凍保存之前將冷凍袋保存於降溫包上或2-8℃下。
取出細胞計數樣本。使用適當大小之移液管，取出2.0 mL保留物並置放於15 mL錐形管中以用於細胞計數。進行細胞計數及計算。注意：僅將一個樣本稀釋至確證稀釋度足夠的適當稀釋度。將額外的樣本稀釋至適當稀釋因數並繼續進行計數。確定所進行之細胞計數的活細胞濃度平均值及存活率平均值。測定計數之上限及下限。注意：可根據預期細胞濃度調整稀釋度。測定活細胞濃度平均值及存活率平均值。測定計數之上限及下限。計算IFN-γ。熱封最終產物袋。
依據以下例示性取樣計劃標記並收集樣本。
Figure 02_image094
無菌性及BacT測試. 測試取樣。在BSC中，自使用適當大小之注射器收集的保留之細胞懸浮液中取出1.0 mL樣本，並接種厭氧瓶。對好氧瓶重複以上操作。
最終產物冷凍保存.準備受控速率冷凍機(CRF)。確證已設定CRF。設定CRF探針。將最終產物及樣本置於CRF中。測定要達到4℃±1.5℃所需之時間並繼續進行CRF運行。完成CRF並儲存。完成運行後停止CRF。自CRF取出盒子及小瓶。將盒子及小瓶轉移至氣相LN2進行儲存。記錄儲存位置。
最終藥品之後處理及分析包含以下測試：(第22天)藉由流動式細胞測量術確定第22天REP之CD3+細胞；(第22天)革蘭氏染色法(GMP)；(第22天)藉由凝膠凝塊LAL分析(GMP)進行細菌內毒素測試；(第16天)BacT無菌性分析(GMP)；(第16天)藉由TD-PCR(GMP)偵測黴漿菌DNA；可接受之外觀屬性；(第22天)BacT無菌性分析(GMP)(第22天)；(第22天)IFN-γ分析。亦採用如本文所描述之其他效力分析來分析TIL產物。 實例 8 ： GEN 3 擴增平台之例示性實施例 第 0 天
製備腫瘤洗滌培養基。在開始之前使培養基升溫。將5 mL建它黴素(50mg/mL)添加至500 mL HBSS瓶中。將5 mL腫瘤洗滌培養基添加至15 mL錐形瓶中，用於OKT3稀釋。準備飼養細胞袋。將飼養細胞無菌轉移至飼養細胞袋且在37℃下儲存直至使用或冷凍。若在37℃下，則對飼養細胞計數。若冷凍，則解凍且接著對飼養細胞計數。
飼養細胞濃度之最佳範圍在5×10 4與5×10 6個細胞/毫升之間。製備四個具有4.5 mL AIM-V之錐形管。添加0.5 mL細胞級分進行各細胞計數。若總活飼養細胞數≥1×10 9個細胞，則繼續調整飼養細胞濃度。計算自第一個飼養細胞袋取出的飼養細胞體積，以便將1×10 9個細胞添加至第二個飼養細胞袋中。
使用p1000微量移液管，將900 µL的腫瘤洗滌培養基轉移至OKT3等分試樣(100 µL)中。使用注射器及無菌技術，吸取0.6 mL之OKT3且添加至第二個飼養細胞袋中。將培養基體積調整至2 L之總體積。將第二個飼養細胞袋轉移至培育箱中。
OKT3調配物詳情：OKT3可在小瓶中以100 µL等分試樣中之原始儲備液濃度(1 mg/mL)等分且冷凍。每1 mL小瓶約10X等分試樣。在-80℃下儲存。第0天：15微克/培養瓶，亦即，30 ng/mL於500 mL-60 µL中，最多約1個等分試樣。
向標記為過量腫瘤小塊的6孔盤之所有孔中添加5 mL腫瘤洗滌培養基。保持可用腫瘤洗滌培養基，以進一步用於使腫瘤在分割期間保持水合。將50 mL腫瘤洗滌培養基添加至各100 mm皮氏培養皿(petri dish)中。
在分割托盤蓋下用直尺作為參考，將腫瘤分割成27 mm 3之片段(3×3×3 mm)。分割中間片段，直至達到60個片段。根據所產生之最終片段之數目(每個培養瓶一般60個片段)對最終片段之總數目進行計數且製備G-REX-100MCS培養瓶。
在標記為片段管1至片段管4的錐形管中保留有利的組織片段。根據起源片段管之計數要接種飼養細胞懸浮液之G-REX-100MCS培養瓶的數目。
自培育箱中取出飼養細胞袋且接種G-REX-100MCS。Label as D0 (Day 0).
向G-REX-100 MCS中之培養物中添加腫瘤片段. 在無菌條件下，擰開標有腫瘤片段培養物(D0)1之G-REX-100MCS及標有片段管之50 mL錐形管的蓋子。旋動打開的片段管1，且同時輕輕抬起G-REX100MCS的蓋子。在旋動的同時，將帶有片段之培養基添加至G-REX100MCS中。記錄轉移至G-REX100MCS中之片段之數目。
一旦片段位於GREX培養瓶之底部，吸取7 mL培養基且產生七個1 mL等分試樣，5 mL用於擴展表徵且2 mL用於無菌樣本。將5個等分試樣(最終片段培養物上清液)在-20℃下儲存進行擴展表徵，直至需要。
在一個厭氧BacT/Alert瓶及一個好氧BacT/Alert瓶中各接種1 mL最終片段培養物上清液。對進行取樣的各培養瓶重複上述操作。 第 7-8 天
準備飼養細胞袋。在冷凍時，將飼養細胞袋在37℃水浴中解凍3-5分鐘。若冷凍，則對飼養細胞進行計數。飼養細胞濃度之最佳範圍在5×10 4與5×10 6個細胞/毫升之間。製備四個具有4.5 mL AIM-V之錐形管。對於每次細胞計數，將0.5 mL細胞級分添加至新的冷凍小瓶管中。將樣本充分混合且進行細胞計數。
若總活飼養細胞數≥2×10 9個細胞，則進行至下一步驟以調整飼養細胞濃度。計算自第一個飼養細胞袋取出的飼養細胞體積，以便將2×10 9個細胞添加至第二個飼養細胞袋中。
使用p1000微量移液管，將900 µL HBSS轉移至100 µL OKT3等分試樣中。藉由上下移液3次進行混合。製備兩個等分試樣。
OKT3調配物詳情：OKT3可在小瓶中以100 µL等分試樣中之原始儲備液濃度(1 mg/mL)等分且冷凍。每1 mL小瓶約10×等分試樣。在-80℃下儲存。第7/8天：30微克/培養瓶，亦即，60 ng/mL於500 mL-120 µl中，最多約2個等分試樣。
使用注射器及無菌技術，吸取0.6 mL之OKT3且添加至飼養細胞袋中，確保全部添加。將培養基體積調整至2 L之總體積。用第二個OKT3等分試樣重複上述操作且添加至飼養細胞袋中。將第二個飼養細胞袋轉移至培育箱中。
製備具有飼養細胞懸浮液之G-REX100MCS瓶. 根據第0天產生的G-REX培養瓶之數目記錄要處理的G-REX-100MCS培養瓶的數目。自培育箱中取出G-REX培養瓶且自培育箱中取出第二個飼養細胞袋。
在添加飼養細胞懸浮液之前取出上清液.  將一個10 mL注射器連接至G-REX100培養瓶且吸取5 mL培養基。產生五個1 mL等分試樣：5 mL用於擴展表徵，且將用於擴展表徵之5個等分試樣(最終片段培養物上清液)在-20℃下儲存，直至試驗委託者提出要求。對各G-REX100培養瓶進行標記且重複上述操作。
取決於培養瓶的數目，取得5-20×1 mL樣本用於表徵： ●5 mL = 1個培養瓶 ●10 mL  = 2個培養瓶 ●15 mL = 3個培養瓶 ●20 mL =4個培養瓶
繼續將飼養細胞接種至G-REX100 MCS中，且對各G-REX100 MCS培養瓶重複上述操作。使用無菌轉移方法，將500 mL的第二個飼養細胞袋按重量(假設1 g=1 mL)以重力轉移至各G-REX-100MCS培養瓶中且記錄量。標記為第7天培養物並對各G-REX100培養瓶重複操作。將G-REX-100MCS培養瓶轉移至培育箱。 第 10-11 天
取出第一個G-REX-100MCS培養瓶，且使用無菌條件，使用10 mL注射器取出7 mL預處理培養物上清液。產生七個1 mL等分試樣：5 mL用於擴展表徵且2 mL用於無菌樣本。
小心地混合培養瓶並使用新的10 mL注射器取出10 mL上清液，且轉移至標記為D10/11黴漿菌上清液之15 mL管中。
小心地混合培養瓶並使用新的注射器根據待處理的瓶之數量取出以下體積： ●1個培養瓶 = 40 mL ●2個培養瓶= 20毫升/培養瓶 ●3個培養瓶 = 13.3毫升/培養瓶 ●4個培養瓶 = 10毫升/培養瓶
應自所有培養瓶中抽吸總共40 mL，且彙集在標有『第10/11天QC樣本』的50 mL錐形管中，且儲存在培育箱中直至需要。進行細胞計數且分配細胞。
將5個等分試樣(最終片段培養物上清液)在≤-20℃下儲存進行擴展表徵，直至需要。在一個厭氧BacT/Alert瓶及一個好氧BacT/Alert瓶中各接種1 mL預處理培養物上清液。
繼續將細胞懸浮液轉移至G-REX-500MCS且針對各G-REX-100MCS重複操作。使用無菌條件，將各G-REX-100MCS之內容物轉移至G-REX-500MCS中，監測一次約100 mL之流體轉移量。當G-REX-100MCS之體積減小至500 mL時停止轉移。
在轉移步驟期間，使用10 mL注射器且自G-REX-100MCS吸取10 mL細胞懸浮液至注射器中。根據培養中之培養瓶數目，遵循說明書進行操作。若僅有1個培養瓶：使用兩個注射器總共取出20 mL。若有2個培養瓶：每個培養瓶取出10 mL。若有3個培養瓶：每個培養瓶取出7 mL。若有4個培養瓶：每個培養瓶取出5 mL。將細胞懸浮液轉移至一個常見的50 mL錐形管中。保持在培育箱中直至細胞計數步驟及QC樣本。QC所需之細胞總數為約20e6個細胞：4×0.5 mL細胞計數(細胞計數起初未經稀釋)。
分析所需之細胞數量如下： 1. 最少10×10 6個細胞用於效力分析，諸如本文中所描述之分析，或用於IFN-γ或顆粒酶B分析 2. 1×10 6個細胞用於黴漿菌 3. 5×10 6個細胞用於針對CD3+/CD45+之流動式細胞測量術
將G-REX-500MCS培養瓶轉移至培育箱。
製備QC樣本. 在本實施例中，分析需要至少15×10 8個細胞。分析包含：細胞計數及存活率；黴漿菌(1×10 6個細胞/平均活細胞濃度；)流量(5×10 6個細胞/平均活細胞濃度；)及IFN-g分析(5×10 6個細胞-1×10 6個細胞；IFN-γ分析需要8-10×10 6個細胞。
計算以10×10 6個細胞/毫升冷凍保存之細胞級份之體積，且計算需準備之小瓶之數目 第 16-17 天
洗滌緩衝液製備(1% HSA Plasmalyte A)。將HSA及Plasmalyte轉移至5 L袋中以製備LOVO洗滌緩衝液。使用無菌條件，將總體積為125 mL的25% HSA轉移至5 L袋中。取出10 mL或40 mL洗滌緩衝液並轉移至『IL-2 6 × 10 4IU/mL』管中(若預先製備IL-2，則為10 mL，或若新鮮製備IL-2，則為40 mL)。
計算添加至Plasmalyte+1% HSA中的經復原IL-2之體積：經復原之IL-2的體積=(IL-2的最終濃度×最終體積)/IL-2的比活性(基於標準分析)。IL-2之最終濃度為6×10 4IU/mL。最終體積為40 mL。
取出計算的復原IL-2所需之IL-2的初始體積，且轉移至『IL-2 6×10 4IU/mL』管中。將來自預先製備之等分試樣的100 μL之6×10 6IU/mL IL-2添加至含有10 mL LOVO洗滌緩衝液的標記為『IL-2 6×10 4IU/mL』之管中。
自G-REX-500MCS培養瓶取出約4500 mL上清液。旋動剩餘的上清液且將細胞轉移至細胞收集池袋中。對所有G-REX-500MCS培養瓶重複操作。
取出60 mL上清液且添加至上清液管中以用於品質控制分析，包含黴漿菌偵測。在+2-8℃下儲存。
細胞收集.對細胞計數。製備四個具有4.5 mL AIM-V之15 mL錐形管。此等管可預先準備。最佳範圍=介於5×10 4與5×10 6個細胞/毫升之間。(推薦1:10稀釋度)。對於1:10稀釋度，向預先製備之4500 µL AIM V中添加500 µL CF。記錄稀釋因數。
計算LOVO前的TC(總細胞)(存活+死亡)= 平均總細胞 濃度(LOVO前TC濃度) (活+死) × 來源袋之體積
計算LOVO前的TVC(總活細胞)(活)= 平均總活細胞 濃度(LOVO前TVC) (活) × LOVO來源袋之體積
當總細胞(TC)數目＞ 5×10 9時，取出5×10 8個細胞進行冷凍保存，作為MDA保留樣本。5×10 8÷平均TC濃度(步驟14.44)=要取出之體積。
當總細胞(TC)數目≤5×10 9時，取出4×10 6個細胞進行冷凍保存，作為MDA保留樣本。4×10 6÷總TC濃度=要取出之體積。
當確定總細胞數目時，要取出的細胞數目應允許保留150×10 9個活細胞。確認LOVO前TVC為5×10 8或4×10 6或不適用。計算要取出的細胞體積。
計算袋中剩餘的剩餘總細胞數。計算LOVO前的TC(總細胞)。[平均總細胞濃度×剩餘體積=剩餘的LOVO前TC]
根據剩餘的細胞總數目，選擇表48中之對應程序。
Figure 02_image096
選擇對應於所用程序而添加的IL-2之體積。體積計算為：滯留物體積×2×300 IU/mL=所需IL-2的IU。所需IL-2的IU/6×10 4IU/mL=LOVO後之袋中添加的IL-2之體積。記錄添加的所有體積。在冷凍小瓶中獲得樣本用於進一步分析。
將細胞產物充分混合。密封所有袋以用於進一步處理，適當時包含冷凍保存。
按需要對獲得的冷凍小瓶樣本進行內毒素、IFN-γ、無菌及其他分析。 實例 9 ： GEN 2 及 GEN 3 例示性程序
本實例展示Gen 2及Gen 3程序。程序Gen 2及Gen 3 TIL一般由個別患者經由手術切除腫瘤且接著離體擴增得到的自體TIL構成。Gen 3程序之初始第一次擴增步驟係在介白素-2(IL-2)及單株抗體OKT3存在下進行細胞培養，該單株抗體靶向經照射之周邊血液單核細胞(PBMC)之骨架上的T細胞輔助受體CD3。
Gen 2 TIL產物之製造由兩個階段組成：1)預快速擴增(Pre-REP)，及2)快速擴增方案(REP)。在Pre-REP期間，將切除的腫瘤切割成≤50個各尺寸為2-3 mm的片段，將此等片段用含血清培養基(含有補充的10% HuSAB之RPMI 1640培養基)及6,000 IU/mL介白素-2(IL-2)培養11天之時段。在第11天，收集TIL且將其引入大規模二次REP擴增中。REP由以下組成：在5 L體積的補充有3000 IU/mL rhIL-2之CM2中裝載有150 µg單株抗CD3抗體(OKT3)的含5×10 9個經照射之同種異體PBMC飼養細胞之共培養物中活化≤200×10 6個來自pre-REP之活細胞，持續5天。在第16天，將培養物體積減少90%且將細胞級分以≥1×10 9個活淋巴球/培養瓶分至多個G-REX-500培養瓶中，且用CM4補足至5 L。將TIL再培育6天。在第22天收集REP，洗滌，調配且冷凍保存，隨後在-150℃下運送至臨床站點進行輸注。
Gen 3 TIL產物之製造由三個階段組成：1)初始第一次擴增方案；2)快速第二次擴增方案(又稱為快速擴增階段或REP)；及3)繼代培養物分瓶。為了實現初始第一次擴增TIL繁殖，將所切除之腫瘤切割成≤120個各尺寸為2-3 mm的片段。在初始第一次擴增之第0天，在3個100 MCS容器中之每一者中，在大約100 cm 2之表面區域上建立約2.5×10 8個裝載有OKT-3的經照射之同種異體PBMC飼養細胞的飼養細胞層。將腫瘤片段分佈在3個100 MCS容器中並培養7天之時段，各容器含有500 mL含血清CM1培養基以及6,000 IU/mL介白素-2(IL-2)及15 μg OKT-3。在第7天，藉由以下來起始REP：將含約5×10 8個裝載有OKT-3的經照射之同種異體PBMC飼養細胞之額外飼養細胞層併入三個100 MCS容器中之每一者中的腫瘤片段化培養階段中並用500 mL CM2培養基以及6,000 IU/mL IL-2及30 µg OKT-3培養。藉由活化同一容器中的整個初始第一次擴增培養物來增強REP起始，該活化係藉由使用密閉系統流體將裝載OKT3之飼養細胞轉移至100MCS容器中來實現。對於Gen 3，TIL規模縱向擴大或分瓶涉及以下程序步驟：將整個細胞培養物經由密閉系統流體轉移而按比例調整至較大容器且轉移(自100 M培養瓶轉移至500 M培養瓶)且添加額外4 L CM4培養基。在第16天收集REP細胞，洗滌，調配且冷凍保存，隨後在-150℃下運送至臨床站點進行輸注。
總體而言，Gen 3程序係一個較短、可縮放性較高且易於改良之擴增平台，其將適應穩健製造及程序可比較性。
Figure 02_image098
在第0天，對於兩種程序，將腫瘤洗滌3次且將片段隨機分組且分成兩個池；每種程序一個池。對於Gen 2程序，將片段轉移至一個具有含6,000 IU/mL rhIL-2之1 L CM1培養基的GREX 100MCS培養瓶中。對於Gen 3程序，將片段轉移至一個具有含6,000 IU/mL rhIL-2、15 μg OKT-3及2.5 × 10 8個飼養細胞之500 mL CM1培養基的G-REX-100MCS培養瓶中。根據各程序，在不同日進行Rep起始日之TIL的接種。對於Gen 2程序，其中G-REX-100MCS培養瓶的體積減少90%，將收集的細胞懸浮液轉移至新的G-REX-500MCS中，在第11天在含有IL-2(3000 IU/mL)且外加5×10 9個飼養細胞及OKT-3(30 ng/mL)之CM2培養基中開始REP起始。根據方案，將細胞擴增且在第16天分至多個具有CM4培養基及IL-2(3000 IU/mL)之G-REX-500 MCS培養瓶中。接著，根據方案，在第22天收集培養物且冷凍保存。對於Gen 3程序，REP起始在第7天發生，其中使用同一個G-REX-100MCS進行REP起始。簡言之，向各培養瓶中添加500 mL含有IL-2(6000 IU/mL)及5×10 8個飼養細胞及30 μg OKT-3之CM2培養基。第9-11天，將培養物之規模縱向擴大。將整個體積的G-REX100M(1 L)轉移至G-REX-500MCS中，且添加4 L含有IL-2(3000 IU/mL)之CM4。將培養瓶培育5天。在第16天收集培養物且冷凍保存。
比較中包含三種不同的腫瘤，即兩種肺腫瘤(L4054及L4055)及一種黑素瘤(M1085T)。
對於L4054及L4055，預先製備CM1(培養基1)、CM2(培養基2)及CM4(培養基4)培養基並保持在4℃。在不進行過濾之情況下製備CM1及CM2培養基，以比較在進行及不進行培養基過濾之情況下的細胞生長情況。
對於L4055腫瘤，在REP起始及規模縱向擴大時，將培養基在37℃下升溫至多24小時。
結果.對於所達到的總活細胞，Gen 3之結果在Gen 2結果之30%以內。在再刺激之後，Gen 3最終產物展現較高的IFN-γ產量。如藉由存在之總獨特CDR3序列所量測，Gen 3最終產物展現選殖株多樣性增加。Gen 3最終產物展現較長的平均端粒長度。
Gen 2及Gen 3程序之Pre-REP及REP擴增遵循上文所描述之程序。對於每個腫瘤，兩個池含有相等數目之片段。由於腫瘤的大小較小，故無法達成每個培養瓶之最大片段數目。在Gen 2程序的第11天且在Gen 3程序的第7天收集總pre-REP細胞(TVC)並計數。為比較兩個pre-REP組，將細胞計數除以培養物中所提供之片段之數目，以便計算每個片段之活細胞之平均值。如以下表43中所指示，與Gen 3程序相比，Gen 2程序中每個片段始終生長較多的細胞。外推計算第11天Gen 3程序預期的TVC數目，TVC數目係用pre-REP TVC除以7且接著乘以11來計算。
Figure 02_image100
對於Gen 2及Gen 3程序，根據程序條件對TVC進行計數，且在該程序之每天產生活細胞百分比。在收集時，收集第22天(Gen 2)及第16天(Gen 3)細胞且確定TVC計數。接著，用TVC除以第0天提供之片段數目，以計算每個片段的活細胞平均值。藉由用所收集之TVC除以REP起始TVC來計算擴增倍數。如表48中所展現，比較Gen 2與Gen 3，L4054之擴增倍數類似；在L4055之情況下，Gen 2程序的擴增倍數較高。具體而言，在此情況下，在REP起始日之前使培養基升溫24。對於M1085T，在Gen 3中亦觀測到較高擴增倍數。外推計算第22天Gen 3程序預期的TVC數目，該TVC數目係用REP TVC除以16且接著乘以22計算。
Figure 02_image102
表45：TIL最終產物之存活率%：在收集後，針對存活率%之放行準則比較最終TIL REP產物。Gen 2及Gen 3程序之所有條件皆超過70%存活率準則，且在各程序及腫瘤間係相當的。
在收集後，針對存活率百分比之放行準則來比較最終TIL REP產物。Gen 2及Gen 3程序之所有條件皆超過70%存活率準則，且在各程序及腫瘤間係相當的。
Figure 02_image104
由於每個培養瓶之片段數目低於最大所需數目，故計算各腫瘤在收集日之估計細胞計數。該估計係基於以下預期：臨床腫瘤在第0天足夠大以接種2個或3個培養瓶。
Figure 02_image106
免疫表型分析-TIL最終產物之表型標記物比較。三種腫瘤L4054、L4055及M1085T在Gen 2及Gen 3程序中均經歷TIL擴增。在收集後，對REP TIL最終產物進行流動式細胞測量術分析，以測試純度、分化及記憶標記物。對於所有條件，TCR a/b+細胞之百分比超過90%。
與自Gen 2程序收集的TIL相比，自Gen 3程序收集之TIL顯示較高的CD8及CD28表現量。Gen 2程序顯示較高的CD4+百分比。
與自Gen 2程序收集之TIL相比，自Gen 3程序收集之TIL顯示較高的中樞記憶隔室表現量。
在來自兩種腫瘤L4054及L4055之TIL中分析活化及耗竭標記物，以比較來自Gen 2及Gen 3 TIL擴增程序的最終TIL產物。Gen 2與Gen 3程序之活化及耗竭標記物係相當的。
再刺激後的干擾素γ分泌。對於L4054及L4055，在收集日，即Gen 2的第22天及Gen 3的第16天，使用經塗佈之抗CD3盤再刺激TIL隔夜。使用抗CD3、CD28及CD137珠粒對M1085T進行再刺激。在所有條件下再刺激24小時後收集上清液且冷凍上清液。在相同時間，使用相同ELISA盤，藉由ELISA評定來自兩個程序之上清液之IFNγ分析。在所分析之三種腫瘤中觀測到來自Gen 3程序之IFNγ產量較高。
培養基中IL-2含量之量測。為了比較Gen 2與Gen 3程序之IL-2消耗，在REP起始、規模縱向擴大及收集日，對腫瘤L4054及L4055收集細胞上清液。藉由來自R&D之Quantitate ELISA套組量測細胞培養物上清液中之IL-2的量。總體趨勢指示，當與Gen 2程序相比較時，Gen 3程序中保持較高的IL-2濃度。此可能歸因於Gen 3在REP起始時之IL-2濃度較高(6000 IU/mL)以及整個程序中培養基之殘留。
代謝受質及代謝物分析。量測代謝受質諸如D-葡萄糖及L-麩醯胺酸之含量作為整體培養基消耗之代替物。量測其互逆代謝物，諸如乳酸及氨。葡萄糖係培養基中之一種單糖，粒線體利用葡萄糖產生呈ATP形式之能量。當葡萄糖經氧化時，產生乳酸(乳酸係乳酸酯)。在細胞指數生長期間產生大量乳酸酯。較高的乳酸酯含量會對細胞培養程序產生負面影響。
在Gen 2及Gen 3程序之REP起始、規模縱向擴大及收集日收集L4054及L4055的用過的培養基。在Gen 2之第11天、第16天及第22天且在Gen 3之第7天、第11天及第16天收集用過的培養基。在CEDEX生物分析儀上分析上清液中葡萄糖、乳酸、麩醯胺酸、GlutaMax™及氨的濃度。
L-麩醯胺酸係細胞培養基調配物中所需的一種不穩定的必需胺基酸。麩醯胺酸含有胺，且此醯胺結構基團可向細胞輸送及遞送氮。當L-麩醯胺酸氧化時，細胞會產生有毒的氨副產物。為了抵消L-麩醯胺酸的降解，Gen 2及Gen 3程序之培養基補充有GlutaMax™，其在水溶液中較穩定且不會自發降解。在兩個腫瘤株中，Gen 3組在此程序期間顯示L-麩醯胺酸及GlutaMax™減少，以及整個REP中氨的增加。在Gen 2組中，觀測到恆定的L-麩醯胺酸及GlutaMax™濃度，以及氨產量之略微增加。Gen 2及Gen 3程序之氨在收集日時係相當的，且顯示L-麩醯胺酸降解之微小差異。
藉由Flow-FISH量測端粒重複序列。使用Flow-FISH技術量測在Gen 2及Gen 3程序中L4054及L4055上端粒重複序列之平均長度。使用來自DAKO的用於流動式細胞測量術分析的端粒PNA套組/FITC計算相關端粒長度(RTL)之測定結果。Gen 3顯示與Gen 2相當的端粒長度。
CD3分析。為了確定在每個程序中產生的細胞產物之選殖株多樣性，對所收集的L4054及L4055之TIL最終產物進行取樣，且經由T細胞受體CDR3部分之定序進行選殖株多樣性的分析。
表47顯示Gen 2與Gen 3之間在L4054之TIL收集細胞產物上共有獨特CDR3序列百分比的比較。Gen 3與Gen 2最終產物共有199個序列，對應於Gen 2最終產物中前80%之獨特CDR3序列中之97.07%係與Gen 3最終產物共有的。
Figure 02_image108
表48顯示Gen 2與Gen 3之間在L4055之TIL收集細胞產物上共有之獨特CDR3序列百分比的比較。Gen 3與Gen 2最終產物共有1833個序列，對應於Gen 2最終產物中前80%之獨特CDR3序列中之99.45%係與Gen 3最終產物共有的。
Figure 02_image110
CM1及CM2培養基係未過濾情況下預先製備且保持在4℃，直至使用腫瘤L4055以用於Gen 2及Gen 3程序。
對於L4055腫瘤，在REP起始日，使培養基在37℃下升溫24小時以用於Gen 2及Gen 3程序。
在程序中收集的上清液中未量測到LDH。
用K2 cellometer細胞計數器執行M1085T TIL細胞計數。
在腫瘤M1085T上不可得到樣本，諸如用於代謝分析之上清液、用於活化及耗竭標記物分析之TIL產物、端粒長度及CD3-TCR vb分析。
結論.本實例針對功能品質屬性以及Gen 2及Gen 3程序之擴展表型表徵及培養基消耗來比較3種獨立的供體腫瘤組織。
Gen 2及Gen 3 pre-REP及REP擴增比較係根據所產生之總活細胞數及總成核細胞群體之存活率來評估。Gen 2(22天)與Gen 3(16天)在收集日之TVC細胞劑量之間無可比性。Gen 3細胞劑量低於Gen 2，為在收集時所收集的總活細胞數之約40%。
假定在第11天而非第7天進行pre-REP收集且在第22天而非第16天進行REP收集，計算Gen 3程序之外推細胞數目。在此兩種情況下，與Gen 2程序相比，Gen 3顯示比較接近的TVC數目，表明早期活化增進TIL生長。
在外推Gen 3程序中之額外培養瓶(2或3個)之值的情況下，假定所處理之腫瘤的大小較大，且達到如所描述之每個程序所需的最大片段數目。據觀測，與Gen 2程序在第22天時之情形相比，Gen 3程序在第16天收集之TVC可達到類似劑量。此觀測結果很重要，且指示培養物之早期活化使TIL處理時間縮短。
Gen 2及Gen 3 pre-REP及REP擴增比較係根據所產生之總活細胞數及總成核細胞群體之存活率來評估。Gen 2(22天)與Gen 3(16天)在收集日之TVC細胞劑量之間無可比性。Gen 3細胞劑量低於Gen 2，為在收集時所收集的總活細胞數之約40%。
就表型表徵而言，與Gen 2程序相比，觀測到三種腫瘤在Gen 3程序中具有較高的CD8+及CD28+表現量。
與Gen 2程序相比，Gen 3程序顯示出略微較高的中樞記憶隔室。
儘管Gen 3程序的持續時間較短，但Gen 2及Gen 3程序顯示相當的活化及耗竭標記物。
在所分析之三種腫瘤中，Gen 3最終產物之IFNγ(IFN gamma)產量比Gen 2高3倍。此資料表明，與Gen 2程序相比，Gen 3程序產生功能強大且更強效的TIL產物，此可能歸因於Gen 3中CD8及CD28之表現量較高。表現型表徵表明，與Gen 2程序相比，在三種腫瘤上Gen 3之CD8+、CD28+表現量呈陽性趨勢。
Gen 2與Gen 3之TIL最終產物的端粒長度相當。
Gen 2與Gen 3最終產物之葡萄糖及乳酸酯含量相當，表明Gen 3程序之培養基中營養物之含量未受到影響，因為與Gen 2相比，在該程序中之每一天皆未執行體積減小移除且該程序中之整體培養基體積較小。
與Gen 2程序相比，整個Gen 3程序的處理時間減少約兩倍，此將顯著降低藉由Gen 3程序擴增之TIL產物之商品成本(COG)。
IL-2消耗表明Gen 2程序中IL-2消耗之總體趨勢，且在Gen 3程序中，由於未移除舊培養基，故IL-2較高。
藉由CDR3 TCRab序列分析測定，Gen 3程序顯示較高的選殖株多樣性。
在pre-REP第0天添加飼養細胞及OKT-3允許TIL之早期活化且允許使用Gen 3程序進行TIL生長。
表49描述Gen 3程序與當前Gen 2程序相比較之各種實施例及結果。
Figure 02_image112
實例 10 ：例示性 GEN 3 程序 ( 又稱為 GEN3.1)
本實例描述關於「Gen 2與Gen 3程序之間針對TIL擴增的可比較性」的其他研究。Gen 3程序經改良以在該程序早期包含活化步驟，旨在增加最終總活細胞(TVC)輸出，同時維持表型及功能概況。如下文所描述，Gen 3實施例經改良為另一實施例且本文中在本實例中稱為Gen 3.1。
在一些實施例中，Gen 3.1 TIL製造程序具有四個操作員介入： 1.腫瘤片段分離及活化：在該程序之第0天，分割腫瘤且產生各自為約3×3 mm之最終片段(總共至多240個片段)且在1-4個G-REX100MCS培養瓶中培養。各培養瓶含有至多60個片段、500 mL CM1或DM1培養基，且補充有6,000 IU rhIL-2、15 μg OKT3及2.5×10 8個經照射之同種異體單核細胞。將培養物在37℃下培育6-8天。 2.TIL培養物再活化：在第7-8天，在兩種情況下，培養物經由緩慢添加補充有6,000 IU rhIL-2、30 μg OKT3及5×10 8個經照射之同種異體單核細胞之CM2或DM1培養基進行補充。注意不要破壞培養瓶底部之現有細胞。將培養物在37℃下培育3-4天。 3.培養規模縱向擴大：在第10-11天進行。在培養物規模縱向擴大期間，在兩種情況下，將G-REX100MCS之全部內含物轉移至含有4 L補充有3,000 IU/mL IL-2之CM4或DM2的G-REX500MCS培養瓶中。將培養瓶在37℃下培育5-6天直至收集。 4.收集/洗滌/調配：在第16-17天，將培養瓶體積減小且彙集起來。將細胞濃縮且用含有1% HSA之PlasmaLyte A pH 7.4洗滌。將經洗滌之細胞懸浮液與CryoStor10以1:1的比例調配，且補充rhIL-2達到最終濃度為300 IU/mL。
藉由受控速率冷凍將DP冷凍保存且儲存在氣相液氮中。**完全標準TIL培養基1、2或4(CM1、CM2、CM4)可取代CTS™OpTmizer™ T細胞無血清擴增培養基，稱為合成培養基(DM1或DM2)，如上所述。
程序描述。在第0天，將腫瘤洗滌3次，接著碎斷成3×3×3的最終片段。在將整個腫瘤碎斷後，接著將最終片段同等地隨機分組且分成三個池。將一個隨機化片段池引入各組，根據三種實驗基質添加相同數目之片段。
在整個TIL擴增程序中，使用標準培養基進行腫瘤L4063擴增，且使用合成培養基(CTS OpTmizer)進行腫瘤L4064擴增。培養基之組分描述於本文中。
CM1完全培養基1：RPMI+麩醯胺酸，補充有2 mM GlutaMax™、10%人類AB血清、建它黴素(50 μg/mL)、2-巰基乙醇(55 μM)。最終培養基調配物補充有6000 IU/mL IL-2。
CM2完全培養基2：50% CM1培養基+50% AIM-V培養基。最終培養基調配物補充有6000 IU/mL IL-2。
CM4完全培養基4：補充有GlutaMax™(2 mM)之AIM-V。最終培養基調配物補充有3000 IU/mL IL-2。
CTS OpTmizer CTS™OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基補充有CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑(26 mL/L)。
DM1：補充有CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑(26 mL/L)及CTS™免疫細胞SR(3%)以及GlutaMax™(2 mM)之CTS™OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基。最終調配物補充有6,000 IU/mL IL-2。
DM2：補充有CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑(26 mL/L)以及CTS™免疫細胞SR(3%)及GlutaMax™(2 mM)之CTS™OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基。最終調配物補充有3,000 IU/mL IL-2。
所使用的所有類型之培養基，亦即完全培養基(CM)及合成培養基(DM)，保持在4℃直至使用前一天，且在處理日之前，在培育箱中在37℃下預先升溫，持續至多24小時。
在第7天進行兩種腫瘤之TIL培養物再活化。L4063在第10天且L4064在第11天進行規模縱向擴大。在第16天收集兩種培養物且冷凍保存。
達成之結果. 測定Gen 3.0及Gen 3.1程序之細胞計數及存活率百分比。在所有條件下之擴增皆遵循此實例中所描述之細節。
對於每個腫瘤，將片段分成三個數目相等之池。由於腫瘤的大小較小，故無法達成每個培養瓶之最大片段數目。對於三個不同的程序，評定在各條件下的總活細胞數及細胞存活率。細胞計數測定為在第7天用於再活化的TVC、在第10天(L4064)或在第11天(L4063)用於規模縱向擴大的TVC，以及在第16/17天收集的TVC。
第7天及第10/11天之細胞計數視為FIO。藉由將第16/17天收集日TVC除以第7天再活化日TVC來計算擴增倍數。為了比較三個組，用收集日之TVC除以在第0天添加於培養物中之片段的數目，以便計算每個片段之活細胞平均值。
對L4063及L4064進行細胞計數及存活率分析。Gen 3.1—對於兩個腫瘤，測試程序每個片段產生的細胞比Gen 3.0程序要多。
總活細胞計數及擴增倍數；在該程序期間之存活率%。在再活化、規模縱向擴大及收集後，獲得在所有條件下之存活率百分比。在第16/17天收集時，針對存活率%的放行準則比較最終TIL。所有條件皆超過70%存活率準則，且在各程序及腫瘤間係相當的。
免疫表型分析-TIL最終產物之表型表徵。對最終產物進行流動式細胞測量術分析，以測試純度、分化及記憶標記物。在所有條件下，TCRα/β、CD4+及CD8+細胞之群體百分比係恆定的。
進行REP TIL之擴展表型分析。對於兩個腫瘤，TIL產物顯示與Gen 3.0相比，在Gen 3.1條件下具有較高的CD4+細胞百分比，且在兩種條件下，與Gen 3.1條件相比，在Gen 3.0下具有較高的來自CD8+群體之CD28+細胞百分比。
自Gen 3.0及Gen 3.1程序中收集的TIL顯示出相當的表型標記物，如CD4+及CD8+細胞上之CD27及CD56表現，以及CD4+圈選細胞群體上相當的CD28表現。關於TIL最終產物之記憶標記物比較：
對在第16天收集之TIL的冷凍樣本染色以進行分析。Gen 3.0與Gen 3.1程序之TIL記憶狀態係相當的。關於TIL最終產物之活化及耗竭標記物比較：
針對CD4+及CD8+細胞圈選的Gen 3.0與Gen 3.1程序之活化及耗竭標記物係相當的。
再刺激後的干擾素γ分泌。對於L4063及L4064，使用經塗佈之抗CD3盤對所收集之TIL再刺激隔夜。與Gen 3.0程序相比，在所分析之兩個腫瘤中觀測到來自Gen 3.1程序之較高IFNγ產量。
培養基中IL-2含量之量測。為比較所有條件及程序之間的IL-2消耗量，在第7天再活化起始、第10天(L4064)/第11天(L4063)規模縱向擴大及第16天/第17天收集日收集細胞上清液，並冷凍。隨後，將上清液解凍且接著分析。藉由製造商方案量測細胞培養物上清液中之IL-2之量。
在相同培養基條件下評定之整個程序期間，整個Gen 3及Gen 3.1程序之IL-2消耗係相當的。對所收集的L4063及L4064之用過的培養基進行IL-2濃度(pg/mL)分析。
代謝物分析.對於每種條件，在L4063及L4064第7天再活化起始、第10天(L4064)/第11天(L4063)規模縱向擴大及第16天/第17天收集日自L4063及L4064收集用過之培養基上清液。用CEDEX生物分析儀分析上清液中葡萄糖、乳酸酯、麩醯胺酸、GlutaMax™及氨之濃度。
與完全培養基(2 g/L)相比，合成培養基中之葡萄糖濃度較高，為4.5 g/L。總體而言，在各培養基類型中，Gen 3.0及Gen 3.1程序中葡萄糖之濃度及消耗係相當的。
觀測到乳酸酯增加，且乳酸酯增加在Gen 3.0與Gen 3.1條件之間及在用於再活化擴增之兩個培養基(完全培養基與合成培養基)之間相當。
在一些情況下，標準基礎培養基含有2 mM L-麩醯胺酸且補充有2 mM GlutaMax™以補償L-麩醯胺酸在培養條件下天然降解為L-麩胺酸及氨。
在一些情況下，所使用之合成(無血清)培養基與基礎培養基相比不含L-麩醯胺酸，且僅補充有最終濃度為2 mM之GlutaMax™。GlutaMax™係含L-丙胺酸及L-麩醯胺酸之二肽，在水溶液中比L-麩醯胺酸更穩定，且不會自發降解為麩胺酸及氨。實際上，二肽逐漸解離成個別胺基酸，由此維持較低但足夠濃度的L-麩醯胺酸，以保持穩健的細胞生長。
在一些情況下，麩醯胺酸及GlutaMax™之濃度在規模縱向擴大日略有降低，但與再活化日相比，在收集日顯示出增加至類似或更接近的水準。對於L4064，在整個程序期間，麩醯胺酸及GlutaMax™濃度在不同條件之間顯示以類似速率略微降低。
氨濃度在含有2 mM麩醯胺酸+2 mM GlutaMax™的標準培養基中生長之樣本中要比在含有2 mM GlutaMax™的合成培養基中生長的樣本中高。此外，正如預期的，在培養過程中，氨逐漸增加或積聚。在三種不同測試條件下，不存在氨濃度之差異。
藉由Flow-FISH測定端粒重複序列。使用Flow-FISH技術量測在Gen 3及Gen 3.1程序中L4063及L4064上端粒重複序列之平均長度。使用來自DAKO的用於流動式細胞測量術分析的端粒PNA套組/FITC計算相關端粒長度(RTL)之測定結果。進行端粒分析。將樣本中的端粒長度與對照細胞株(1301白血病)相比較。對照細胞株係具有長穩定端粒的四倍體細胞株，其允許計算相對端粒長度。在兩種腫瘤中評定的Gen 3及Gen 3.1程序顯示出相當的端粒長度。 TCR Vβ譜系分析
為了測定在各程序中產生之細胞產物的選殖株多樣性，經由對T細胞受體之CDR3部分進行定序來分析TIL最終產物以進行選殖株多樣性分析。
在三種條件之間比較三個參數： ● 獨特CDR3(uCDR3)之多樣性指數 ● 共有uCDR3百分比 ● 對於前80%的uCDR3： o 比較共有uCDR3複本百分比 o 比較獨特純系型之頻率
對照及Gen 3.1測試，TIL收集細胞產物上共有獨特CDR3序列之百分比：Gen 3與Gen 3.1測試最終產物共有975個序列，相當於Gen 3之前80%的獨特CDR3序列中之88%與Gen 3.1共有。
對照及Gen 3.1測試，TIL收集細胞產物上共有獨特CDR3序列之百分比：Gen 3與Gen 3.1測試最終產物共有2163個序列，相當於Gen 3之前80%的獨特CDR3序列中之87%與Gen 3.1共有。
由在不同程序第16天收集時所收集之1×10 6個細胞鑑別獨特CD3序列之數目。基於樣本內獨特肽CDR之數目，Gen 3.1測試條件顯示相較於Gen 3.0略微較高的選殖株多樣性。
夏儂熵(Shannon entropy)多樣性指數係一個可靠且常用的比較度量，因為兩種腫瘤的Gen 3.1條件顯示出略高於Gen 3程序的多樣性，表明Gen 3.1測試條件的TCRVβ譜系比Gen 3.0程序更具多株性。
此外，對於腫瘤L4063及L4064，Gen 3.1測試條件之TCR Vβ譜系顯示與Gen 3.0程序之相應譜系超過87%的重疊。
在再活化日，用於Gen 3.1測試L4064的用過之培養基的IL-2濃度值低於預期值(與Gen 3.1對照及Gen 3.0條件類似)。
該低值可能歸因於移液誤差，但由於採集的樣本極少，故不可能重複該分析。
結論.與Gen 3.0及Gen 3.1對照相比，Gen 3.1測試條件(包含在第0天的飼養細胞及OKT-3)顯示在第16天收集時細胞劑量的TVC較高。在Gen 3.1測試條件下最終產物之TVC比Gen 3.0要高約2.5倍。
對於所測試之兩個腫瘤樣本，在第0天添加OKT-3及飼養細胞之Gen 3.1測試條件在收集時達到培養瓶的最大容量。在此等條件下，若在第0天起始最多4個培養瓶，則最終細胞劑量可在80-100×10 9個TIL之間。
在Gen 3.1測試與Gen 3.0程序之間維持所有品質屬性，諸如表型表徵，包含最終TIL產物之純度、耗竭、活化及記憶標記物。
在所分析之兩個腫瘤中，在第0天添加飼養細胞及OKT-3之Gen 3.1中最終TIL產物之IFN-γ產量比Gen 3.0高3倍，表明Gen 3.1程序產生強效的TIL產物。
在各測試條件下未觀測到葡萄糖或乳酸酯含量之差異。在各種培養基條件下，未觀測到Gen 3.0與Gen 3.1程序之間麩醯胺酸及氨之差異。培養基中之較低麩醯胺酸含量未限制細胞生長，且表明僅在培養基中添加GlutaMax™便足以提供細胞增殖所需之營養物。
分別在第11天及第10天進行規模縱向擴大，且在該程序之收集日所達到之細胞數目方面未顯示顯著差異，且在兩種情況下，在整個程序期間代謝物消耗係相當的。此觀測結果表明Gen 3.0最佳化程序可在處理天數方面具有靈活性，由此促進製造時程之靈活性。
藉由CDR3 TCRab序列分析所量測，與Gen 3.0相比，在第0天添加飼養細胞及OKT-3之Gen 3.1程序顯示出較高的選殖株多樣性。
圖32描述Gen 3程序(Gen 3最佳化程序)之實施例。可使用標準培養基及CTS Optimizer無血清培養基進行Gen 3最佳化程序TIL擴增。在CTS Optimizer之情況下，建議無血清培養基以將培養基中GlutaMax™之最終濃度增加至4 mM。 實例 11 ：冷凍保存 TIL 細胞療法之例示性製造
本實例描述根據現行組織優良操作規範及現行優良製造規範在G-Rex培養瓶中進行Iovance Biotherapeutics公司之TIL細胞療法過程的cGMP製造。
Figure 02_image114
Figure 02_image116
初級程序資訊 第0天CM1培養基製備
在BSC中，將試劑添加至RPMI 1640培養基瓶中。添加以下試劑t，每瓶添加：熱不活化人類AB血清(100.0 mL)；GlutaMax(10.0 mL)；硫酸建它黴素，50 mg/mL(1.0 mL)；2-巰基乙醇(1.0 mL)
自BSC移除不必要之材料。自BSC取出培養基試劑，將硫酸建它黴素及HBSS保留在BSC中以用於調配洗滌培養基製劑。
解凍IL-2等分試樣。解凍一份1.1 mL IL-2等分試樣(6×10 6IU/mL)(BR71424)，直至所有冰融化為止。記錄IL-2：批號及有效期
將IL-2儲備液轉移至培養基中。在BSC中，將1.0 mL IL-2儲備液轉移至所製備的CM1第0天培養基瓶中。添加CM1第0天培養基1瓶及IL-2(6×10 6IU/mL)1.0 mL。
將G-Rex100MCS傳遞至BSC中。將G-Rex100MCS(W3013130)無菌傳遞至BSC中。
將所有完全CM1第0天培養基泵吸至G-Rex100MCS培養瓶中。組織片段錐形管或GRex100MCS。 第0天 腫瘤洗滌介質製備
在BSC中，將5.0 mL建它黴素(W3009832或W3012735)添加至1×500 mL HBSS培養基(W3013128)瓶中。每瓶添加：HBSS(500.0 mL)；硫酸建它黴素，50 mg/mL(5.0 mL)。經由1L 0.22微米過濾器單元(W1218810)製備含有建它黴素之經過濾HBSS。 第 0 天腫瘤處理
獲得腫瘤。自QAR獲得腫瘤樣品並立即轉移至2-8℃之套件中進行處理。
等分腫瘤洗滌培養基。
腫瘤洗滌1 使用8''鑷子(W3009771)，自樣品瓶取出腫瘤並轉移至所準備之「洗滌1」培養皿中。隨後為腫瘤洗滌2及腫瘤洗滌3。
量測腫瘤。評定腫瘤。評定是否觀測到整個腫瘤面積之＞ 30%為壞死及/或為脂肪組織。若適用：清除性分割。若腫瘤較大且觀測到＞30%組織外表壞死/為脂肪，則藉由使用解剖刀及/或鑷子之組合移除壞死/脂肪組織並同時保留腫瘤內部結構來進行「清除性分割」。
分割腫瘤 使用解剖刀及/或鑷子之組合，將腫瘤樣品切割成一致的適當大小之片段(至多6個中間片段)。轉移中間腫瘤片段。將腫瘤片段分割成大小為3×3×3 mm之小塊。儲存中間片段以防脫水。
重複中間片段分割。測定收集之小塊數目。若僅保留所需組織，則自「有利中間片段」6孔盤選擇另外的有利腫瘤小塊來填充丟棄片段，以達到最多50個小塊。
準備錐形管。將腫瘤小塊轉移至50 mL錐形管中。準備用於G-REX100MCS之BSC。自培育箱取出G-REX100MCS。將G-Rex100MCS培養瓶無菌傳遞至BSC中。將腫瘤片段添加至G-Rex100MCS培養瓶中。使小塊均勻分佈。
按以下參數培育G-Rex100MCS：培育G-Rex培養瓶：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5% CO2。計算：培育時間；下限=培育時間+252小時；上限=培育時間+276小時。
程序完成後，捨棄所有剩餘已升溫培養基並解凍IL-2之等分試樣。 第11天-培養基製備
監測培育箱。監測培育箱。培育箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5% CO2。
在培育箱中使3×1000 mL RPMI 1640培養基(W3013112)瓶及3×1000 mL AIM-V(W3009501)瓶升溫，保持≥30分鐘。自培育箱取出RPMI 1640培養基。製備RPMI 1640培養基。過濾培養基。解凍3×1.1 mL IL-2等分試樣(6×10 6IU/mL)(BR71424)。自培育箱中取出AIM-V培養基。將IL-2添加至AIM-V中。將10L Labtainer袋及雙向精密配液泵(repeater pump)轉移裝置無菌轉移至BSC中。
準備10L Labtainer培養基袋。準備Baxa泵。準備10L Labtainer培養基袋。將培養基泵吸至10L Labtainer中。自Labtainer袋取下自動泵吸管。
混合培養基。輕緩地揉按袋子以進行混合。依據取樣計劃對培養基進行取樣。取出20.0 mL培養基並置於50mL錐形管中。準備細胞計數稀釋管 在BSC中，將4.5 mL已標記有「用於細胞計數稀釋」及批號之AIM-V培養基添加至四個15mL錐形管中。將試劑自BSC轉移至2-8℃。製備1L轉移包。在BSC外部，將1L轉移包熔接(依據程序註釋5.11)至附接於所準備的「完全CM2第11天培養基」袋的轉移裝置上。準備飼養細胞轉移包。培育完全CM2第11天培養基。 第11天-TIL收集
預處理表格。培育箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5% CO2。自培育箱取出G-Rex100MCS。準備300mL轉移包。將轉移包熔接至G-Rex100MCS。
準備用於TIL收集之培養瓶並起始TIL收集。收集TIL。使用GatheRex，透過血液過濾器將細胞懸浮液轉移至300mL轉移包中。檢查膜上之黏附細胞。
沖洗培養瓶膜。閉合G-Rex100MCS上之夾子。確保所有夾子閉合。熱封TIL及「上清液」轉移包。計算TIL懸浮液之體積。準備用於取樣之上清液轉移包。
抽取Bac-T樣本。在BSC中，自1L「上清液」轉移包中吸取約20.0 mL上清液，並分配至無菌的50mL錐形管中。
依據取樣計劃接種BacT。使用適當大小之注射器自準備的標記有BacT之50mL錐形管取出1.0 mL樣本並接種於厭氧瓶。
培育TIL。將TIL轉移包置於培育箱中待用。進行細胞計數及計算。測定進行細胞計數之細胞的活細胞濃度平均值及存活率平均值。存活率÷2。活細胞濃度÷2。測定計數之上限及下限。下限：活細胞濃度平均值×0.9。上限：活細胞濃度平均值×1.1。確認兩個計數在可接受界限內。根據進行的所有四次計數測定平均活細胞濃度。
調整TIL懸浮液之體積 計算取出細胞計數樣本後TIL懸浮液之經調整體積。總TIL細胞體積(A)。以取出的細胞計數樣本之體積(4.0 ml)(B)調整TIL細胞總體積C = A - B。
計算活TIL細胞總數。平均活細胞濃度*：總體積；活細胞總數：C = A×B。
流動式細胞測量術之計算：若活TIL細胞總計數為≥4.0×10 7，則計算獲得用於流動式細胞測量術樣本的1.0×10 7個細胞的體積。
流動式細胞測量術所需之活細胞總數：1.0×10 7個細胞。流動式細胞測量術所需之細胞體積：活細胞濃度除以1.0×10 7個細胞A。
計算等於2.0×10 8個活細胞的TIL懸浮液之體積。按需要，計算待取出的過量TIL細胞體積，且取出過量TIL並按需要將TIL置於培育箱中。計算按需要取出之過量TIL總量。
將以供冷凍之目標細胞濃度添加至過量TIL細胞的CS-10培養基之計算量為1.0×10 8個細胞/毫升。按需要，對過量TIL離心。觀測錐形管 並添加CS-10。
填充小瓶。將 1.0mL細胞懸浮液等分至適當大小的冷凍小瓶中。按照SOP-00242，將剩餘體積等分至適當大小的冷凍小瓶中。若體積≤0.5 mL，則將CS10添加至小瓶，直至體積為0.5 mL為止。
樣本之TIL冷凍保存
計算獲得用於冷凍保存之1×10 7個細胞所需之細胞體積。取出樣本以進行冷凍保存。將TIL置於培育箱中。 樣本之冷凍保存。
觀測錐形管，且緩慢添加CS-10並記錄添加0.5 mL CS10後的體積。 第11天-飼養細胞
獲得飼養細胞。自LN2冷凍機獲得至少兩個不同批號的3袋飼養細胞。在準備解凍之前將細胞保存於乾冰上。準備水浴或Cryotherm。在37.0±2.0℃水浴或cytotherm處解凍飼養細胞約3至5分鐘或直至冰剛好消失為止。自培育箱取出培養基。彙集解凍之飼養細胞。將飼養細胞添加至轉移包。將飼養細胞自注射器分配至轉移包中。對彙集之飼養細胞進行混合，且標記轉移包。
計算轉移包中之飼養細胞懸浮液之總體積。
取出細胞計數樣本。針對每個樣本使用單獨的3mL注射器，使用非必要注入口自飼養細胞懸浮液轉移包抽取4×1.0 mL細胞計數樣本。將每個樣本等分至經標記之冷凍小瓶中。進行細胞計數，且判定乘數選定方案並輸入乘數。測定進行細胞計數之細胞的活細胞濃度平均值及存活率平均值。測定計數之上限及下限，並確認其在界限內。
調整飼養細胞懸浮液之體積。計算取出細胞計數樣本後飼養細胞懸浮液之經調整體積。計算活飼養細胞總數。按需要獲得額外飼養細胞。按需要解凍額外飼養細胞。將第4個飼養細胞袋置於拉鏈袋中，且在37.0±2.0℃水浴或cytotherm低溫儲存系統中解凍約3至5分鐘並彙集額外飼養細胞。量測體積。量測注射器中飼養細胞之體積並記錄在下面(B)。計算飼養細胞之新的總體積。將飼養細胞添加至轉移包。
按需要製備稀釋液，將4.5 mL AIM-V培養基添加至四個15mL錐形管中。準備計算細胞數目。針對每個樣本使用單獨的3mL注射器，使用非必要注入口自飼養細胞懸浮液轉移包取出4×1.0 mL細胞計數樣本。進行細胞計數及計算。根據進行的所有四次計數測定平均活細胞濃度。調整飼養細胞懸浮液之體積，且計算取出細胞計數樣本後飼養細胞懸浮液之經調整體積。飼養細胞總體積減去取出之4.0 mL。計算獲得5×10 9個活飼養細胞所需的飼養細胞懸浮液之體積。計算過量飼養細胞體積。計算待取出之過量飼養細胞之體積。取出過量飼養細胞。
使用1.0mL注射器及16G針頭，吸取0.15 mL OKT3並添加OKT3。熱封飼養細胞懸浮液轉移包。 第11天 G-Rex填充及接種 設定G-Rex500MCS。自培育箱取出「完全CM2第11天培養基」並將培養基泵吸至G-Rex500MCS中。將4.5 L培養基泵吸至G-Rex500MCS中，填充至培養瓶上標示之線處。按需要熱封並培育培養瓶。將飼養細胞懸浮液轉移包熔接至G-Rex500MCS。將飼養細胞添加至G-Rex500MCS。熱封。將TIL懸浮液轉移包熔接至培養瓶。將TIL添加至G-Rex500MCS。熱封。將G-Rex500MCS在37.0±2.0℃下培育，CO2百分比：5.0±1.5% CO2。
計算培育範圍。進行計算以測定在第16天自培育箱取出G-Rex500MCS的適當時間。下限：培育時間+108小時。上限：培育時間+132小時。 第11天 過量TIL冷凍保存
適用：冷凍過量TIL小瓶。確證在冷凍前已設定CRF。進行冷凍保存。將小瓶自速率受控冷凍機轉移至適當儲存器中。完成冷凍後，將小瓶自CRF轉移至適當儲存容器。將小瓶轉移至適當儲存器中。記錄在LN2中的儲存位置。 第16天 培養基製備
預熱AIM-V培養基。計算使培養基袋1、2及3之培養基升溫的時間。確保所有袋子已升溫在12與24小時之間之持續時間。設定用於上清液之10L Labtainer。使用魯爾接頭將流體泵轉移裝置之較大直徑端附接至10L Labtainer袋之一個凹形端口。設定用於上清液之10L Labtainer並進行標記。設定用於上清液之10L Labtainer。確保在自BSC之前取出前閉合所有夾子。注意：在TIL收集期間使用上清液袋，該TIL收集可與培養基製備並行地進行。
解凍IL-2。每袋CTS AIM V培養基解凍5×1.1 mL IL-2等分試樣(6×10 6IU/mL)(BR71424)，直至所有冰融化為止。等分100.0 mL GlutaMax。將IL-2添加至GlutaMax。準備用於調配之CTS AIM V培養基袋。準備用於調配之CTS AIM V培養基袋。多級Baxa泵。準備調配培養基。將GlutaMax + IL-2泵吸至袋子中。監測之參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5% CO2。使完全CM4第16天培養基升溫。製備稀釋液。 第16天 REP分瓶
監測培育箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5% CO2。自培育箱取出G-Rex500MCS。準備1L轉移包且標記為TIL懸浮液並加權為1L。
G-Rex500MCS之體積減少。按照SOP-01777，將約4.5 L培養物上清液自G-Rex500MCS轉移至10L Labtainer。
準備用於TIL收集之培養瓶。取出上清液後，閉合通向紅色管線之所有夾子。
起始TIL收集。劇烈敲擊培養瓶並旋動培養基以使細胞剝離，以確保所有細胞剝落。
TIL收集。鬆開通向TIL懸浮液轉移包之所有夾子。使用GatheRex，將細胞懸浮液轉移至TIL懸浮液轉移包中。注意：確保維持邊緣傾斜，直至收集到所有細胞及培養基為止。檢查膜上之黏附細胞。沖洗培養瓶膜。閉合G-Rex500MCS上之夾子。熱封含有TIL之轉移包。熱封含有上清液之10L Labtainer。記錄含細胞懸浮液之轉移包的重量並計算懸浮液體積。準備用於樣本取出之轉移包。自細胞上清液取出測試樣本。
無菌性及BacT測試取樣：自準備的標記有BacT之15mL錐形管取出1.0 mL樣本。取出細胞計數樣本。在BSC中，針對每個樣本使用單獨的3mL注射器，自「TIL懸浮液」轉移包取出4×1.0 mL細胞計數樣本。
取出黴漿菌樣本。使用3mL注射器，自TIL懸浮液轉移包取出1.0 mL並置於準備的標記有「黴漿菌稀釋劑」之15mL錐形管中。
準備用於接種之轉移包。將TIL置於培育箱中。自BSC取出細胞懸浮液，且置於培育箱中待用。進行細胞計數及計算。首先藉由將0.5 mL細胞懸浮液添加至準備的4.5 mL AIM-V培養基中來對細胞計數樣本進行稀釋，稀釋度為1:10。測定進行細胞計數之細胞的活細胞濃度平均值及存活率平均值。測定計數之上限及下限。注意：可根據預期細胞濃度調整稀釋度。根據進行的所有四次計數測定平均活細胞濃度。調整TIL懸浮液之體積。計算取出細胞計數樣本後TIL懸浮液之經調整體積。總TIL細胞體積減去取出的用於測試之5.0 mL。
計算活TIL細胞總數。計算待接種之培養瓶之總數目。注意：待接種的G-Rex500MCS培養瓶之最大數目為五。若計算的待接種培養瓶之數目超過五，則使用可用的所有體積之細胞懸浮液接種僅五個培養瓶。
計算用於繼代培養之培養瓶數目。計算除所準備之袋子以外還需要的培養基袋之數目。按計算需要每兩個G-Rex-500M培養瓶準備一個10L 「CM4第16天培養基」袋。繼續接種第一個GREX-500M培養瓶，同時製備額外的培養基並使其升溫。準備測定的所計算數目之額外培養基袋並使其升溫。填充G-Rex500MCS。準備泵吸培養基並將4.5 L培養基泵吸至G-Rex500MCS中。熱封。重複填充。培育培養瓶。計算待添加至新G-Rex500MCS培養瓶中的TIL懸浮液之目標體積。若計算之培養瓶數目超過五，則使用所有體積之細胞懸浮液接種僅五個培養瓶。準備用於接種之培養瓶。自培育箱取出G-Rex500MCS。準備用於泵吸之G-Rex500MCS。除較大過濾器管線外，閉合所有夾子。自培育箱取出TIL。製備用於接種之細胞懸浮液。將「TIL懸浮液」轉移包無菌熔接(依據程序註釋5.11)至泵入口管線。將TIL懸浮液袋置於稱上。
用TIL懸浮液接種培養瓶。將所計算體積之TIL懸浮液泵吸至培養瓶中。熱封。填充剩餘培養瓶。
監測培育箱。培育箱參數：溫度LED顯示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5% CO2。培育培養瓶。
測定在第22天自培育箱取出G-Rex500MCS的時間範圍。 第22天 洗滌緩衝液製備
準備10L Labtainer袋。在BSC中，經由魯爾接頭將4''血漿轉移裝置附接至10L Labtainer袋。準備10L Labtainer袋。在轉移出BSC之前，閉合所有夾子。注意：為每兩個待收集之G-Rex500MCS培養瓶準備一個10L Labtainer袋。將Plasmalyte泵吸至3000mL袋中，且藉由翻轉泵及操控袋子之位置來自3000mL Origen袋移除空氣。將人類白蛋白25%添加至3000mL袋中。獲得最終體積為120.0 mL的25%人類白蛋白。
製備IL-2稀釋劑。使用10mL注射器，使用LOVO洗滌緩衝液袋上之無針注入口取出5.0 mL LOVO洗滌緩衝液。將LOVO洗滌緩衝液分配至50mL錐形管中。
等分CRF空白袋LOVO洗滌緩衝液。使用100mL注射器，自無針注入口吸取70.0 mL LOVO洗滌緩衝液。
解凍IL-2。解凍一份1.1 mL IL-2(6×10 6IU/mL)，直至所有冰融化為止。IL-2製備。將50 µL IL-2儲備液(6×10 6IU/mL)添加至標記有「IL-2稀釋液」之50mL錐形管中。
冷凍保存準備。將5個冷凍盒置於2至8℃下，以對其進行預調節，以便用於最終產物冷凍保存。
製備細胞計數稀釋液。在BSC中，向4個單獨的15mL錐形管中添加4.5 mL已標記有批號及「用於細胞計數稀釋」的AIM-V培養基。準備計算細胞數目。將4個冷凍小瓶標記上小瓶編號(1-4)。將小瓶保存在BSC以供使用。 第22天 TIL收集
監測培育箱。培育箱參數：溫度LED顯示器：37±2.0℃，CO2百分比：5%±1.5%。自培育箱取出G-Rex500MCS培養瓶。準備TIL收集袋並進行標記。封閉額外之接頭。體積減少：將約4.5 L上清液自G-Rex500MCS轉移至上清液袋。
準備用於TIL收集之培養瓶。起始TIL收集。劇烈敲擊培養瓶並旋動培養基以剝離細胞。確保所有細胞剝落。起始TIL收集。鬆開通向TIL懸浮液收集袋之所有夾子。TIL收集。使用GatheRex，將TIL懸浮液轉移至3000mL收集袋中。檢查膜上之黏附細胞。沖洗培養瓶膜。閉合G-Rex500MCS上之夾子，並確保閉合所有夾子。將細胞懸浮液轉移至LOVO來源袋中。閉合所有夾子。熱封。取出4×1.0 mL細胞計數樣本。
進行細胞計數。利用NC-200及程序註釋5.14進行細胞計數及計算。首先藉由將0.5 mL細胞懸浮液添加至準備的4.5 mL AIM-V培養基中來對細胞計數樣本進行稀釋。由此得到1:10稀釋度。測定進行細胞計數之細胞的平均存活率、活細胞濃度及總成核細胞濃度。 測定計數之上限及下限。測定進行細胞計數之細胞的平均存活率、活細胞濃度及總成核細胞濃度。稱量LOVO來源袋。計算活TIL細胞總數。計算成核細胞總數。
製備黴漿菌稀釋劑。經由魯爾樣本口自一個上清液袋取出10.0 mL並置於15mL錐形管中。 LOVO
進行「TIL G-Rex收集」方案並測定最終產物目標體積。裝載一次性套組。取出濾液袋。輸入濾液容量。將濾液容器置於實驗台上。附接PlasmaLyte。確證已附接PlasmaLyte，且觀測到PlasmaLyte正在移動。將來源容器附接至導管，且確證已附接來源容器。確認PlasmaLyte正在移動。 最終調配及填充
目標體積/袋子計算。計算待調配於空白袋中之CS-10及LOVO洗滌緩衝液的體積。準備CRF空白袋。
計算待添加至最終產物的IL-2之體積。所需最終IL-2濃度(IU/mL)-300 IU/mL。IL-2工作儲備液：6×10 4IU/mL。組裝連接設備。將4S-4M60無菌熔接至CC2單元接頭。將CS750冷凍袋無菌熔接(依據程序註釋5.11)至準備之集束上。將CS-10袋熔接至4S-4M60之尖端上。用IL-2製備TIL。使用適當大小之注射器，自「IL-2 6×10 4」等分試樣取出所測定量之IL-2。標記經調配TIL袋。將經調配TIL袋添加至設備。添加CS10。切換注射器。將約10 mL空氣吸取至100mL注射器中並替換設備上之60mL注射器。添加CS10。準備CS-750袋。分配細胞。
自最終產物袋移除空氣並獲得保留物。在填充了最後一個最終產物袋後，即閉合所有夾子。將10 mL空氣吸取至新的100mL注射器中並替換設備上之注射器。將保留物分配至50mL錐形管中並將管標記為「保留物」及批號。對每個袋子重複空氣移除步驟。
準備用於冷凍保存之最終產物，包括目視檢查。在冷凍保存之前將冷凍袋保存於降溫包上或2至8℃下。
取出細胞計數樣本。使用適當大小之吸液管，取出2.0 mL保留物並置於15mL錐形管中以用於細胞計數。進行細胞計數及計算。注意：僅將一個樣本稀釋至確證稀釋度足夠的適當稀釋度。將額外樣本稀釋至適當稀釋因數並繼續進行計數。測定進行細胞計數之細胞的活細胞濃度平均值及存活率平均值。測定計數之上限及下限。注意：可根據預期細胞濃度調整稀釋度。測定活細胞濃度平均值及存活率平均值。測定計數之上限及下限。計算IFN-γ。熱封最終產物袋。
依據以下例示性取樣計劃標記並收集樣本。
Figure 02_image118
無菌性及BacT。測試取樣。在BSC中，自使用適當大小之注射器收集的保留細胞懸浮液中取出1.0 mL樣本，並接種厭氧瓶。對好氧瓶重複以上操作。 最終產物冷凍保存
準備速率受控冷凍機。確證已設定CRF。設定CRF探針。將最終產物及樣本置於CRF中。測定要達至4℃±1.5℃所需的時間並繼續進行CRF運行。 完成CRF並儲存。完成運行後停止CRF。自CRF取出盒子及小瓶。將盒子及小瓶轉移至氣相LN2進行儲存。記錄儲存位置。 後處理概述 後處理：最終藥品
(第22天)在第22天REP中藉由流動式細胞測量術測定CD3+細胞
(第22天)革蘭氏染色法(GMP)
(第22天)藉由凝膠凝塊LAL分析(Gel Clot LAL Assay)進行細菌內毒素測試(GMP)
(第16天)BacT無菌性分析(GMP)
(第16天)藉由TD-PCR進行黴漿菌DNA偵測(GMP)
可接受的外觀屬性
(第22天)BacT無菌性分析(GMP)(第22天)
(第22天)IFN-γ分析
提供上述實例以為本領域中熟習此項技術者提供如何製得並使用本發明之組成物、系統及方法之實施例的完整揭示內容及描述，且並不意欲限制本發明人視為其發明之範圍。本領域中熟習此項技術者顯而易見的進行本發明之上文所描述模式的修改意欲在以下申請專利範圍之範圍內。本說明書中提及之所有專利及公開案指示本領域中熟習本發明所屬領域者之技能水準。
所有標題及章節名稱僅用於清晰及參考目的，且不應視為以任何方式具限制性。舉例而言，本領域中熟習此項技術者應瞭解根據本文所描述之本發明之精神及範圍按需要組合來自不同標題及章節之各種態樣的有用性。
本文中引用之所有參考文獻以全文引用之方式且出於所有目的併入本文中，其引用程度如同各個別公開案或專利或專利申請案經特定且個別地指示出於所有目的以全文引用的方式併入本文中一般。
如本領域中熟習此項技術者將顯而易見，可在不脫離本申請案之精神及範圍的情況下對其進行多種修改及改變。本文所描述之特定實施例及實例僅作為實例提供，且本申請案僅受隨附申請專利範圍之各項以及申請專利範圍授權之等效物之全部範圍限制。 實例 12 ：評估抗生素對 PRE-REP TIL 生長、表型及功能之影響
背景
習知的臨床製造方法可能會受到革蘭氏陽性細菌物種污染，因為一般而言，大多數的運輸及儲存培養基僅針對革蘭氏陰性細菌及真菌物種。為了加強針對腫瘤運輸介質及培養基的抗生素方案，將對具有互補特性之抗生素進行評定。
實驗設計
第 1 階段：如表53及表54中所示，使用2種不同腫瘤就各種抗生素在運輸介質及CM1中之作用進行2輪獨立的小規模評定。在Pre-REP之後，終止培養。在HTS中之所有隔夜培育包括2.5 µg/mL兩性黴素B(或對於「高AmpB濃度」條件為10 µg/mL)及50 µg/mL建它黴素
用於11天Pre-REP之CM1的培養條件不包括兩性黴素B。
所有測試及對照條件均進行四次重複測試。記錄在第11天Pre-REP時的總活細胞及存活率百分比。
Figure 02_image120
第 II 階段- 關於選擇用於腫瘤運輸介質及Pre-REP細胞培養之抗生素條件的全面測試
基於第1階段測試之結果選擇抗生素。腫瘤係自黑素瘤、肺、子宮頸腫瘤類型獲得並記錄詳情。將所接受的腫瘤分成2個相等的部分並以與第I階段測試中隔夜培育類似的方式儲存隔夜。根據第0天Gen 2批料記錄，在全面Pre-REP時相對於硫酸建它黴素對照測試所選擇之抗生素條件。獲得TVC、存活率、身分、功能及擴展表型分析資料。
結果
第 I 階段
如圖43及圖44中所示，萬古黴素及克林達黴素展現出最低細胞毒性且作用不會隨試劑濃度之增加而出現增加。添加較高濃度兩性黴素B並未出現細胞毒性。儘管經由司徒頓氏「t」檢驗未觀察到統計顯著影響，但很明顯，利奈唑胺及阿奇黴素對細胞生長具有負面影響，其中隨著抗生素濃度增加，觀測到細胞毒性增加。所提供之每個誤差條均為存活率百分比之四次重複量測值的平均值+/-標準差。另外，如圖35中所示，當與對照、兩性黴素B、克林達黴素及萬古黴素條件相比較時收集時的存活率。所提供之每個誤差條均為存活率百分比之四次重複量測值的平均值+/-標準差。
基於在第11天收集時Pre-REP TIL之活細胞計數及存活率百分比，對萬古黴素及克林達黴素之對照條件進行全面比較測試。兩種抗生素均在運輸介質及CM1中以100 µg/mL濃度測試。
第 II 階段
擴展表型
如下表55中所示，對於所測試之任何腫瘤，在對照或萬古黴素條件之間觀測到的對Pre-REP分化、耗竭活化狀態之影響極小。在L4162之對照條件以及L4178之兩種條件中，NK細胞濃度較高。如之前所述，此可能因為所表徵之樣本係Pre-REP細胞，該等細胞典型地具有比在REP結束時的最終藥品細胞要高的異質性。
Figure 02_image122
Figure 02_image124
如表56中所示，除在建它黴素萬古黴素條件中IFN-g產生之值較高外，在僅建它黴素條件與建它黴素+萬古黴素條件之間觀察到極小差異，而L4162之身分參數未達到合格準則。各條件之間的值極其類似，表明萬古黴素不具有負面影響。
Post-REP 關鍵屬性
Figure 02_image126
如表57中所示，對於所測試之任何腫瘤，在對照或萬古黴素條件之間觀察到對Post-REP分化、耗竭活化狀態之影響極小。除在L4162腫瘤樣本中觀察到有3%單核球外，非T細胞污染物極少。L4162樣本表現不佳，且未通過Gen 2方法之合格準則，不過，該兩種條件(建它黴素及建它黴素+萬古黴素)仍以類似方式進行。
基於TVC、存活率、身分、功能及擴展表型分析資料，將100 µg/mL萬古黴素添加至腫瘤運輸介質及CM1 Pre-REP培養基中未顯示出對Pre-REP細胞產物之不利影響。
第II階段測試的Post-REP產物之特徵顯示出類似的TVC、存活率、身分、功能及擴展表型。
儘管L4162在技術上不滿足關於身分之規格，但建它黴素與建它黴素+萬古黴素條件之間的值係類似的，表明由添加萬古黴素引起之影響極小。
Figure 02_image128
Figure 02_image130
實例 13 ：評估萬古黴素對腫瘤培養基之影響
進行額外實驗以測試萬古黴素預防培養基中萬古黴素敏感性細菌生長之能力。在此等實驗中，將以下抗生素添加至在低溫保存液(hypothermosol，HTS)中的三種不同細菌濃度之革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球菌( S. aureus)及糞腸球菌( E. faecalis)中： a. 建它黴素(50 µg/mL) b. 建它黴素(50 µg/mL)+ 萬古黴素(100 µg/mL) c. 萬古黴素(100 µg/mL)
將混合物在2-8℃培育24小時，且接著將1 mL各樣本添加至20 mL具有以上相同抗生素濃度之CM1培養基中。將混合物培育11天並目測評定細菌生長情況。結果顯示於下表56中。 表56：評估抗生素對培養基中細菌生長之影響
   抗生素調配物 (CM1)
菌株 無添加 Genta Genta + Vanco Vanco
金黃色葡萄球菌 (菌株1) 生長 生長 不生長 不生長
糞腸球菌 生長 生長 不生長 不生長
如以上所示，萬古黴素添加至CM1培養基中抑制金黃色葡萄球菌及糞腸球菌之生長，表明萬古黴素係本文所提供之方法之培養步驟中抑制革蘭氏陽性生物體的適合抗生素。 實例 14 ：評估萬古黴素對腫瘤培養基之影響
進行額外實驗以測試萬古黴素預防培養基中萬古黴素敏感性細菌生長之能力。在此等實驗中，將組織片段接種於具有三種不同負荷之金黃色葡萄球菌及糞腸球菌細菌及以下抗生素的HTS中： a. 建它黴素(50 µg/mL) b. 建它黴素(50 µg/mL) + 萬古黴素(100 µg/mL) c. 萬古黴素(100 µg/mL)
將所示6種HTS接種物(iHTS)在2-8℃下培育24小時並用具有與以上相同濃度之抗生素的腫瘤洗滌緩衝液洗滌3次。將腫瘤樣本培育11天並目測評定細菌生長情況。
作為初始對照，若在培養基中存在萬古黴素，則經顯示，將經接種之HTS直接添加至CM1中可維持無菌性，與表56中所顯示之結果類似。本實驗之結果示於下表57中。 表57：
實驗培養瓶 細菌 載量 抗生素調配物(CM1)
菌株 無添加 Genta Genta + Vanco Vanco
金黃色葡萄球菌 (菌株1) 低 不生長 不生長 不生長 不生長
金黃色葡萄球菌 (菌株1) 中等 不生長 不生長 不生長 不生長
金黃色葡萄球菌 (菌株1) 高 生長 生長 不生長 不生長
糞腸球菌 低 不生長 不生長 不生長 不生長
糞腸球菌 中等 生長 不生長 不生長 不生長
糞腸球菌 高 不生長 不生長 不生長 不生長
如以上所示，在添加至CM1稀釋之細菌負荷之前進行的腫瘤洗滌步驟足以預防在大多數條件中之生長(6個中之4個，「無」欄)。另外，萬古黴素之存在使得在測試的所有細菌負荷下皆未觀測到金黃色葡萄球菌及糞腸球菌之生長(「vanco」欄)。
提供上述實例以為本領域中熟習此項技術者提供如何製得並使用本發明之組成物、系統及方法之實施例的完整揭示內容及描述，且並不意欲限制本發明人視為其發明之範圍。本領域中熟習此項技術者顯而易見的進行本發明之上文所描述模式的修改意欲在以下申請專利範圍之範圍內。本說明書中提及之所有專利及公開案指示本領域中熟習本發明所屬領域者之技能水準。
所有標題及章節名稱僅用於清晰及參考目的，且不應視為以任何方式具限制性。舉例而言，本領域中熟習此項技術者應瞭解根據本文所描述之本發明之精神及範圍按需要組合來自不同標題及章節之各種態樣的有用性。
本文中引用之所有參考文獻以全文引用之方式且出於所有目的併入本文中，其引用程度如同各個別公開案或專利或專利申請案經特定且個別地指示出於所有目的以全文引用的方式併入本文中一般。
如本領域中熟習此項技術者將顯而易見，可在不脫離本申請案之精神及範圍的情況下對其進行多種修改及改變。本文所描述之特定實施例及實例僅作為實例提供，且本申請案僅受隨附申請專利範圍之各項以及申請專利範圍授權之等效物之全部範圍限制。
[ 圖 1] ：提供步驟A至步驟F之概述的例示性程序2A圖。
[ 圖 2] ：程序2A-2C之程序流程圖。
[ 圖 3] ：顯示冷凍保存之TIL例示性製造程序(約22天)之實施例的圖式。
[ 圖 4]：顯示程序2A之實施例的圖式，該程序係一種用於TIL製造的22天方法。
[ 圖 5]：程序1C與程序2A之例示性實施例中步驟A至步驟F的比較表。
[ 圖 6] ：程序1C之實施例與程序2A之實施例的詳細比較。
[ 圖 7] ：針對腫瘤之例示性GEN 3型程序。
[ 圖 8A-8F] ： A)顯示2A程序(約22天之程序)與用於TIL製造之Gen 3程序之實施例(約14天至16天之程序)之間的比較。 B)例示性Gen3程序圖，其提供步驟A至步驟F之概述(約14天至16天之程序)。 C)提供三種例示性Gen 3程序之圖，其中概述三種程序變化形式各自的步驟A至步驟F(約14天至16天之程序)。 D)例示性經修改之類Gen 2程序，其提供步驟A至步驟F之概述(約22天之程序)。 E)顯示2A程序(約22天之程序)與用於TIL製造之Gen 3程序之實施例(約14天至22天之程序)之間的比較。 F)例示性PD-1 Gen3程序圖，其提供步驟A至步驟F之概述(約14天至22天之程序)。
[ 圖 9] ：提供有關GEN 2(程序2A)與GEN 3之間的可比較性之實驗流程圖。
[ 圖 10] ：顯示各種Gen 2(2A程序)與Gen 3.1程序實施例之間的比較。
[ 圖 11] ：描述Gen 2、Gen 2.1及Gen 3.0程序之實施例之各種特徵的表。
[ 圖 12] ：Gen 3程序(稱為Gen 3.1)之實施例之培養基條件的概述。
[ 圖 13] ：描述Gen 2、Gen 2.1及Gen 3.0程序之實施例之各種特徵的表。
[ 圖 14] ：比較Gen 2與Gen 3.0程序之實施例之各種特徵的表。
[ 圖 15] ：提供所描述之擴增程序之各種實施例中培養基用途的表。
[ 圖 16] ：Gen 3程序(16天之程序)之例示性實施例的示意圖。
[ 圖 17] ：使用Gen 3擴增平台擴增來自造血系統惡性病之T細胞之方法之例示性實施例的示意圖。
[ 圖 18] ：提供結構I-A及I-B，圓柱係指個別多肽結合域。結構I-A及I-B包括三個線性連接的來源於例如4-1BBL或結合4-1BB之抗體的TNFRSF結合域，其摺疊形成三價蛋白質，該三價蛋白質接著經由IgG1-Fc(包含CH3及CH2域)與另一個三價蛋白質連接，該IgG1-Fc接著經由二硫鍵(小細長橢圓形)將兩個三價蛋白質連接在一起，由此使結構穩定並提供能夠將六個受體之細胞內信號傳導域與信號傳導蛋白集合在一起形成信號傳導複合物的促效劑。表示為圓柱體之TNFRSF結合域可為包括例如由連接子連接之VH及VL鏈的scFv域，該連接子可包括親水性殘基及提供柔性的Gly與Ser序列以及提供溶解性的Glu與Lys。
[ 圖 19] ：Gen 3程序(16天之程序)之例示性實施例的示意圖。
[ 圖 20] ：提供Gen 3.1程序(16天之程序)之例示性實施例(Gen 3.1測試)的程序概述。
[ 圖 21] ：Gen 3.1測試(Gen 3.1最佳化)程序(16-17天之方法)之例示性實施例的示意圖。
[ 圖 22] ：Gen 3程序(16天之程序)之例示性實施例的示意圖。
[ 圖 23A-23B] ：例示性Gen 2與例示性Gen 3程序之比較表，其中突出顯示例示性差異。
[ 圖 24] ：Gen 3程序(16天/17天之程序)製備時刻表之例示性實施例的示意圖。
[ 圖 25] ：Gen 3程序(14-16天之程序)之例示性實施例的示意圖。
[ 圖 26A-26B] ：Gen 3程序(16天之程序)之例示性實施例的示意圖。
[ 圖 27] ：Gen 3方法(16天之方法)之例示性實施例的示意圖。
[ 圖 28] ：Gen 2、Gen 2.1與Gen 3程序之實施例(16天之方法)的比較。
[ 圖 29] ：Gen 2、Gen 2.1與Gen 3程序之實施例(16天之程序)的比較。
[ 圖 30] ：Gen 3實施例組分。
[ 圖 31] ：Gen 3實施例流程圖比較(Gen 3.0、Gen 3.1對照、Gen 3.1測試)。
[ 圖 32] ：顯示Gen 3程序(最佳化Gen 3，16-17天之程序)之例示性實施例的組分。
[ 圖 33] ：驗收準則表。
[ 圖 34] ：彙總與各種抗生素一起培育隔夜之腫瘤中之總活細胞的圖。
[ 圖 35] ：彙總在各種抗生素存在下進行之11天Pre-REP程序中培養之腫瘤之總活細胞的圖。 

          <![CDATA[<110>  美商艾歐凡斯生物治療公司 (Iovance Biotherapeutics, Inc.)]]>
          <![CDATA[<120>  腫瘤儲存及細胞培養組成物]]>
          <![CDATA[<130>  116983-5081-WO]]>
          <![CDATA[<140>  TW111108250]]>
          <![CDATA[<141>  2022-03-07]]>
          <![CDATA[<150>  US 63/157,554]]>
          <![CDATA[<151>  2021-03-05]]>
          <![CDATA[<160>  237   ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn 第3.5版]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  450]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  莫羅單抗之重鏈的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr 
                  115                 120                 125             
          Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu 
              130                 135                 140                 
          Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 
                          165                 170                 175     
          Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser 
                      180                 185                 190         
          Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser 
                  195                 200                 205             
          Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Pro Lys Ser Cys Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                      260                 265                 270         
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                  275                 280                 285             
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 
              290                 295                 300                 
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 
                          325                 330                 335     
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                      340                 345                 350         
          Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                  355                 360                 365             
          Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
              370                 375                 380                 
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 
                          405                 410                 415     
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                      420                 425                 430         
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445             
          Gly Lys 
              450 
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  213]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  莫羅單抗之輕鏈的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 
                      20                  25                  30          
          Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 
                  35                  40                  45              
          Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly 
                  115                 120                 125             
          Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn 
              130                 135                 140                 
          Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 
                          165                 170                 175     
          Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 
                      180                 185                 190         
          Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe 
                  195                 200                 205             
          Asn Arg Asn Glu Cys 
              210             
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  134]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重組人類IL-2蛋白之胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu 
          1               5                   10                  15      
          His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu 
              50                  55                  60                  
          Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu 
                          85                  90                  95      
          Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr 
                      100                 105                 110         
          Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser 
                  115                 120                 125             
          Ile Ile Ser Thr Leu Thr 
              130                 
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  132]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  阿地介白素之胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn 
                      20                  25                  30          
          Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro 
              50                  55                  60                  
          Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys 
                          85                  90                  95      
          Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr 
                      100                 105                 110         
          Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile 
                  115                 120                 125             
          Ser Thr Leu Thr 
              130         
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  133]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IL-2形式]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 
                      20                  25                  30          
          Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 
                  35                  40                  45              
          Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 
                          85                  90                  95      
          Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 
                      100                 105                 110         
          Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 
                  115                 120                 125             
          Ile Ser Thr Leu Thr 
              130             
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          <![CDATA[<211>  303]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  內維介白素α之胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn 
          1               5                   10                  15      
          Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Ser Ser Ser 
              50                  55                  60                  
          Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg 
                          85                  90                  95      
          Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys 
                      100                 105                 110         
          His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu 
                  115                 120                 125             
          Asn Leu Ala Gln Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Leu Cys Asp Asp Asp 
              130                 135                 140                 
          Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys 
                          165                 170                 175     
          Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser 
                      180                 185                 190         
          Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr 
                  195                 200                 205             
          Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr 
              210                 215                 220                 
          Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly 
          225                 230                 235                 240 
          His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile 
                          245                 250                 255     
          Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly 
                      260                 265                 270         
          Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr 
                  275                 280                 285             
          His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly 
              290                 295                 300             
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          <![CDATA[<211>  452]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IL-2形式]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ala Val Phe Val Ser Ala Arg Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys 
                      20                  25                  30          
          Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu 
                  35                  40                  45              
          Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn 
              50                  55                  60                  
          Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gly Ile His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly 
                          85                  90                  95      
          Asp Glu Thr Arg Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser 
                      100                 105                 110         
          Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser 
                  115                 120                 125             
          Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu 
              130                 135                 140                 
          Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu Ser 
                          165                 170                 175     
          Gly Ser Gly Gly Ala Ser Ser Glu Ser Ser Ala Ser Ser Asp Gly Pro 
                      180                 185                 190         
          His Pro Val Ile Thr Glu Ser Arg Ala Ser Ser Glu Ser Ser Ala Ser 
                  195                 200                 205             
          Ser Asp Gly Pro His Pro Val Ile Thr Glu Ser Arg Glu Pro Lys Ser 
              210                 215                 220                 
          Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
                          245                 250                 255     
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                      260                 265                 270         
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
                  275                 280                 285             
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 
              290                 295                 300                 
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 
                          325                 330                 335     
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                      340                 345                 350         
          Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 
                  355                 360                 365             
          Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
              370                 375                 380                 
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 
                          405                 410                 415     
          Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 
                      420                 425                 430         
          Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Pro Gly Lys 
              450         
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  黏蛋白域多肽]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Ser Glu Ser Ser Ala Ser Ser Asp Gly Pro His Pro Val Ile Thr Pro 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  130]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重組人類IL-4蛋白之胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Met His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp 
                      20                  25                  30          
          Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg 
                  35                  40                  45              
          Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr 
              50                  55                  60                  
          Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly 
                          85                  90                  95      
          Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn 
                      100                 105                 110         
          Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys 
                  115                 120                 125             
          Ser Ser 
              130 
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  153]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重組人類IL-7蛋白之胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val 
          1               5                   10                  15      
          Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly 
                      20                  25                  30          
          Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys 
                  35                  40                  45              
          Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu 
              50                  55                  60                  
          Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln 
                          85                  90                  95      
          Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys 
                      100                 105                 110         
          Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp 
                  115                 120                 125             
          Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn 
              130                 135                 140                 
          Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 
          145                 150             
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  115]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重組人類IL-15蛋白之胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Met Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val 
                      20                  25                  30          
          His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu 
                  35                  40                  45              
          Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val 
              50                  55                  60                  
          Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn 
                          85                  90                  95      
          Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile 
                      100                 105                 110         
          Asn Thr Ser 
                  115 
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  132]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重組人類IL-21蛋白之胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Met Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val 
          1               5                   10                  15      
          Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro 
                      20                  25                  30          
          Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys 
                  35                  40                  45              
          Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg 
              50                  55                  60                  
          Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp 
                          85                  90                  95      
          Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser 
                      100                 105                 110         
          Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly 
                  115                 120                 125             
          Ser Glu Asp Ser 
              130         
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  153]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IL-2序列]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 
          1               5                   10                  15      
          Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 
                      20                  25                  30          
          Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 
                  35                  40                  45              
          Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 
                          85                  90                  95      
          Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 
                      100                 105                 110         
          Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 
                  115                 120                 125             
          Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 
              130                 135                 140                 
          Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 
          145                 150             
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  133]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IL-2突變蛋白序列]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 
                      20                  25                  30          
          Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 
                  35                  40                  45              
          Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 
                          85                  90                  95      
          Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 
                      100                 105                 110         
          Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 
                  115                 120                 125             
          Ile Ser Thr Leu Thr 
              130             
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  133]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IL-2突變蛋白序列]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 
                      20                  25                  30          
          Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys 
                  35                  40                  45              
          Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 
                          85                  90                  95      
          Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 
                      100                 105                 110         
          Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 
                  115                 120                 125             
          Ile Ser Thr Leu Thr 
              130             
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  145]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  ]]>人工序列(Artificial Sequence)
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>   IgG.IL2R67A.H1之HCDR1_IL-2]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Gly Phe Ser Leu Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 
                      20                  25                  30          
          Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe 
                  35                  40                  45              
          Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 
              50                  55                  60                  
          Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 
                          85                  90                  95      
          Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 
                      100                 105                 110         
          Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 
                  115                 120                 125             
          Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met Ser Val 
              130                 135                 140                 
          Gly 
          145 
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IgG.IL2R67A.H1之HCDR2]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IgG.IL2R67A.H1之HCDR3]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  141]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IgG.IL2R67A.H1之HCDR1_IL-2 kabat]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 
                      20                  25                  30          
          Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 
                  35                  40                  45              
          Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 
                          85                  90                  95      
          Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 
                      100                 105                 110         
          Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 
                  115                 120                 125             
          Ile Ser Thr Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly 
              130                 135                 140     
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IgG.IL2R67A.H1之HCDR2 kabat]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 
          1               5                   10                  15      
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          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IgG.IL2R67A.H1之HCDR3 kabat]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  142]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IgG.IL2R67A.H1之HCDR1_IL-2 clothia]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Gly Phe Ser Leu Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 
                      20                  25                  30          
          Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe 
                  35                  40                  45              
          Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 
              50                  55                  60                  
          Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 
                          85                  90                  95      
          Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 
                      100                 105                 110         
          Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 
                  115                 120                 125             
          Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met 
              130                 135                 140         
          <![CDATA[<210>  23]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IgG.IL2R67A.H1之HCDR2 clothia]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Trp Trp Asp Asp Lys 
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          <![CDATA[<210>  24]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IgG.IL2R67A.H1之HCDR3 clothia]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  143]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<22]]>0>]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  IgG.IL2R67A.H1之HCDR1_IL-2 IMGT]]&gt;
          <br/>
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          <br/>
          <br/><![CDATA[Gly Phe Ser Leu Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 
                      20                  25                  30          
          Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe 
                  35                  40                  45              
          Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 
              50                  55                  60                  
          Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 
                          85                  90                  95      
          Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 
                      100                 105                 110         
          Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 
                  115                 120                 125             
          Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met Ser 
              130                 135                 140             
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Arti]]>ficial Sequence)
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IgG.IL2R67A.H1之HCDR2 IMGT]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys 
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          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IgG.IL2R67A.H1之HCDR3 IMGT]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  253]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IgG.IL2R67A.H1之VH鏈]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ala Pro Thr 
                      20                  25                  30          
          Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys 
              50                  55                  60                  
          Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu 
                          85                  90                  95      
          Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg 
                      100                 105                 110         
          Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser 
                  115                 120                 125             
          Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val 
              130                 135                 140                 
          Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys 
                      180                 185                 190         
          Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr 
                  195                 200                 205             
          Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp 
              210                 215                 220                 
          Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                          245                 250             
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  533]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IgG.IL2R67A.H1之重鏈]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr 
          1               5                   10                  15      
          Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu 
                      20                  25                  30          
          Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val 
                  35                  40                  45              
          Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu 
              50                  55                  60                  
          Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe 
                          85                  90                  95      
          Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 
                      100                 105                 110         
          Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 
                  115                 120                 125             
          Ala Leu Glu Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr 
              130                 135                 140                 
          Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Gln Val Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala 
                          165                 170                 175     
          Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val 
                      180                 185                 190         
          Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 
              210                 215                 220                 
          Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 
                          245                 250                 255     
          Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 
                      260                 265                 270         
          Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 
                  275                 280                 285             
          Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 
              290                 295                 300                 
          Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 
                          325                 330                 335     
          Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val 
                      340                 345                 350         
          Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 
                  355                 360                 365             
          Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 
              370                 375                 380                 
          Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala 
                          405                 410                 415     
          Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 
                      420                 425                 430         
          Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 
                  435                 440                 445             
          Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 
              450                 455                 460                 
          Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 
          465                 470                 475                 480 
          Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 
                          485                 490                 495     
          Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 
                      500                 505                 510         
          Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 
                  515                 520                 525             
          Leu Ser Pro Gly Lys 
              530             
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IgG.IL2R67A.H1之LCDR1 kabat]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          Lys Ala Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met His 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IgG.IL2R67A.H1之LCDR2 kabat]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IgG.IL2R67A.H1之LCDR3 kabat]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IgG.IL2R67A.H1之LCDR1 chothia]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          Gln Leu Ser Val Gly Tyr 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  3]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IgG.IL2R67A.H1之LCDR2 chothia]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          Asp Thr Ser 
          1           
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IgG.IL2R67A.H1之LCDR3 chothia]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          Gly Ser Gly Tyr Pro Phe 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  106]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  VL鏈]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met 
                      20                  25                  30          
          His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
                  35                  40                  45              
          Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105     
          <![CDATA[<210>  37]]>
          <![CDATA[<211>  213]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈]]>
          <![CDATA[<400>  37]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met 
                      20                  25                  30          
          His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
                  35                  40                  45              
          Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 
                  115                 120                 125             
          Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 
              130                 135                 140                 
          Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 
                          165                 170                 175     
          Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 
                      180                 185                 190         
          Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 
                  195                 200                 205             
          Asn Arg Gly Glu Cys 
              210             
          <![CDATA[<210>  38]]>
          <![CDATA[<211>  583]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequ]]>ence)
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈]]>
          <![CDATA[<400>  38]]>
          Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ala Pro Thr 
                      20                  25                  30          
          Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys 
              50                  55                  60                  
          Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu 
                          85                  90                  95      
          Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg 
                      100                 105                 110         
          Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser 
                  115                 120                 125             
          Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val 
              130                 135                 140                 
          Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys 
                      180                 185                 190         
          Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr 
                  195                 200                 205             
          Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp 
              210                 215                 220                 
          Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 
                          245                 250                 255     
          Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 
                      260                 265                 270         
          Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 
                  275                 280                 285             
          Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 
              290                 295                 300                 
          Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 
                          325                 330                 335     
          Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 
                      340                 345                 350         
          Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 
                  355                 360                 365             
          Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 
              370                 375                 380                 
          Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 
                          405                 410                 415     
          Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 
                      420                 425                 430         
          Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 
                  435                 440                 445             
          Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 
              450                 455                 460                 
          Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 
          465                 470                 475                 480 
          Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 
                          485                 490                 495     
          Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 
                      500                 505                 510         
          Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 
                  515                 520                 525             
          Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 
              530                 535                 540                 
          Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 
          545                 550                 555                 560 
          Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 
                          565                 570                 575     
          Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                      580             
          <![CDATA[<210>  39]]>
          <![CDATA[<211>  2]]>13
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈]]>
          <![CDATA[<400>  39]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met 
                      20                  25                  30          
          His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
                  35                  40                  45              
          Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 
                  115                 120                 125             
          Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 
              130                 135                 140                 
          Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 
                          165                 170                 175     
          Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 
                      180                 185                 190         
          Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 
                  195                 200                 205             
          Asn Arg Gly Glu Cys 
              210             
          <![CDATA[<210>  40]]>
          <![CDATA[<211>  255]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人類4-1BB之胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  40]]>
          Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu 
          1               5                   10                  15      
          Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro 
                      20                  25                  30          
          Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile 
              50                  55                  60                  
          Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly 
                          85                  90                  95      
          Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu 
                      100                 105                 110         
          Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln 
                  115                 120                 125             
          Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys 
              130                 135                 140                 
          Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala 
                          165                 170                 175     
          Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu 
                      180                 185                 190         
          Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu 
                  195                 200                 205             
          Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 
              210                 215                 220                 
          Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 
                          245                 250                 255 
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  256]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  鼠類4-1BB之胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          Met Gly Asn Asn Cys Tyr Asn Val Val Val Ile Val Leu Leu Leu Val 
          1               5                   10                  15      
          Gly Cys Glu Lys Val Gly Ala Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln 
                      20                  25                  30          
          Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro 
                  35                  40                  45              
          Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys 
              50                  55                  60                  
          Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr 
          65                  70                  75                  80  
          His Asn Ala Glu Cys Glu Cys Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro 
                          85                  90                  95      
          Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr 
                      100                 105                 110         
          Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn 
                  115                 120                 125             
          Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg 
              130                 135                 140                 
          Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Val Val Ser Phe Ser Pro Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu 
                          165                 170                 175     
          Gly Gly Pro Gly Gly His Ser Leu Gln Val Leu Thr Leu Phe Leu Ala 
                      180                 185                 190         
          Leu Thr Ser Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ile Phe Ile Thr Leu Leu Phe 
                  195                 200                 205             
          Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln 
              210                 215                 220                 
          Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser 
          225                 230                 235                 240 
          Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu 
                          245                 250                 255     
          <![CDATA[<210>  42]]>
          <![CDATA[<211>  441]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗]]>
                 (PF-05082566)之重鏈
          <![CDATA[<400>  42]]>
          Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 
                      100                 105                 110         
          Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 
                  115                 120                 125             
          Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 
              130                 135                 140                 
          Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 
                          165                 170                 175     
          Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe 
                      180                 185                 190         
          Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr 
                  195                 200                 205             
          Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro 
              210                 215                 220                 
          Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
                          245                 250                 255     
          Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 
                      260                 265                 270         
          Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 
                  275                 280                 285             
          Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val 
              290                 295                 300                 
          His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 
                          325                 330                 335     
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 
                      340                 345                 350         
          Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                  355                 360                 365             
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
              370                 375                 380                 
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
                          405                 410                 415     
          Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
                      420                 425                 430         
          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
                  435                 440     
          <![CDATA[<210>  43]]>
          <![CDATA[<211>  214]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促]]>效劑單株抗體烏圖木單抗
                 (PF-05082566)之輕鏈
          <![CDATA[<400>  43]]>
          Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala 
                      20                  25                  30          
          His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 
                  35                  40                  45              
          Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 
              50                  55                  60                  
          Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu 
                          85                  90                  95      
          Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 
                      100                 105                 110         
          Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 
                  115                 120                 125             
          Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 
              130                 135                 140                 
          Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 
                          165                 170                 175     
          Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 
                      180                 185                 190         
          Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 
                  195                 200                 205             
          Ala Pro Thr Glu Cys Ser 
              210                 
          <![CDATA[<210>  44]]>
          <![CDATA[<211>  116]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑單株]]>
                 抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈可變區(VH)。
          <![CDATA[<400>  44]]>
          Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 
                      100                 105                 110         
          Thr Val Ser Ser 
                  115     
          <![CDATA[<210>  45]]>
          <![CDATA[<211>  108]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑單株]]>
                 抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈可變區(VL)。
          <![CDATA[<400>  45]]>
          Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala 
                      20                  25                  30          
          His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 
                  35                  40                  45              
          Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 
              50                  55                  60                  
          Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu 
                          85                  90                  95      
          Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105             
          <![CDATA[<210>  46]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑單株抗體]]>
                 烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR1
          <![CDATA[<400>  46]]>
          Ser Thr Tyr Trp Ile Ser 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  47]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑單株抗體]]>
                 烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR2
          <![CDATA[<400>  47]]>
          Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  48]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑單株抗體]]>
                 烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR3
          <![CDATA[<400>  48]]>
          Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  49]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑單株抗體]]>
                 烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR1
          <![CDATA[<400>  49]]>
          Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala His 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  50]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑單株抗體]]>
                 烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR2
          <![CDATA[<400>  50]]>
          Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  51]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑單株抗體]]>
                 烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR3
          <![CDATA[<400>  51]]>
          Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu Ala Val 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  52]]>
          <![CDATA[<211>  448]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗]]>
                 (BMS-663513)之重鏈
          <![CDATA[<400>  52]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 
                  115                 120                 125             
          Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 
                  195                 200                 205             
          Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 
              210                 215                 220                 
          Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser 
          225                 230                 235                 240 
          Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 
                          245                 250                 255     
          Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 
                      260                 265                 270         
          Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 
                  275                 280                 285             
          Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 
              290                 295                 300                 
          Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 
                          325                 330                 335     
          Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 
                      340                 345                 350         
          Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 
                  355                 360                 365             
          Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 
              370                 375                 380                 
          Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 
                          405                 410                 415     
          Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 
                      420                 425                 430         
          Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 
                  435                 440                 445             
          <![CDATA[<210>  53]]>
          <![CDATA[<211>  216]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗]]>
                 (BMS-663513)之輕鏈
          <![CDATA[<400>  53]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 
                          85                  90                  95      
          Ala Leu Thr Phe Cys Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val 
                      100                 105                 110         
          Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 
                  115                 120                 125             
          Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 
              130                 135                 140                 
          Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 
                          165                 170                 175     
          Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 
                      180                 185                 190         
          Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 
                  195                 200                 205             
          Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 215     
          <![CDATA[<210>  54]]>
          <![CDATA[<211>  120]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑單株]]>
                 抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈可變區(VH)
          <![CDATA[<400>  54]]>
          Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 
          1               5                   10                  15      
          Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys 
                      20                  25                  30          
          Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe 
                  35                  40                  45              
          Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Glu Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 
                          85                  90                  95      
          Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 
                      100                 105                 110         
          Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Pro 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  55]]>
          <![CDATA[<211>  110]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑單株]]>
                 抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈可變區(VL)
          <![CDATA[<400>  55]]>
          Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 
          1               5                   10                  15      
          Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 
                      20                  25                  30          
          Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 
              50                  55                  60                  
          Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 
                          85                  90                  95      
          Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 
                      100                 105                 110 
          <![CDATA[<210>  56]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑單株抗體]]>
                 烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR1
          <![CDATA[<400>  56]]>
          Gly Tyr Tyr Trp Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  57]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑單株抗體]]>
                 烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR2
          <![CDATA[<400>  57]]>
          Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  58]]>
          <![CDATA[<211>  13]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑單株抗體]]>
                 烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR3
          <![CDATA[<400>  58]]>
          Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu 
          1               5                   10              
          <![CDATA[<210>  59]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑單株抗體]]>
                 烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR1
          <![CDATA[<400>  59]]>
          Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  60]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑單株抗體]]>
                 烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR2
          <![CDATA[<400>  60]]>
          Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  61]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑單株抗體]]>
                 烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR3
          <![CDATA[<400>  61]]>
          Gln Gln Arg Ser Asp Trp Pro Pro Ala Leu Thr 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  62]]>
          <![CDATA[<211>  230]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TNFRSF促效劑融合蛋白之Fc域]]>
          <![CDATA[<400>  62]]>
          Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 
                      20                  25                  30          
          Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 
                  35                  40                  45              
          Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 
              50                  55                  60                  
          Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 
                          85                  90                  95      
          Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 
                      100                 105                 110         
          Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 
                  115                 120                 125             
          Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 
              130                 135                 140                 
          Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 
                          165                 170                 175     
          Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 
                      180                 185                 190         
          Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 
                  195                 200                 205             
          Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 
              210                 215                 220                 
          Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
          225                 230 
          <![CDATA[<210>  63]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子]]>
          <![CDATA[<400>  63]]>
          Gly Gly Pro Gly Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 
          1               5                   10                  15      
          Pro Cys Pro Ala Pro Glu 
                      20          
          <![CDATA[<210>  64]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子]]>
          <![CDATA[<400>  64]]>
          Gly Gly Ser Gly Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 
          1               5                   10                  15      
          Pro Cys Pro Ala Pro Glu 
                      20          
          <![CDATA[<210>  65]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子]]>
          <![CDATA[<400>  65]]>
          Gly Gly Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys 
          1               5                   10                  15      
          Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 
                      20                  25          
          <![CDATA[<210>  66]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子]]>
          <![CDATA[<400>  66]]>
          Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys 
          1               5                   10                  15      
          Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 
                      20                  25          
          <![CDATA[<210>  67]]>
          <![CDATA[<211>  29]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子]]>
          <![CDATA[<400>  67]]>
          Gly Gly Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys 
          1               5                   10                  15      
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 
                      20                  25                  
          <![CDATA[<210>  68]]>
          <![CDATA[<211>  29]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子]]>
          <![CDATA[<400>  68]]>
          Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys 
          1               5                   10                  15      
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 
                      20                  25                  
          <![CDATA[<210>  69]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子]]>
          <![CDATA[<400>  69]]>
          Gly Gly Pro Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 
          1               5                   10                  15      
          Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 
                      20              
          <![CDATA[<210>  70]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子]]>
          <![CDATA[<400>  70]]>
          Gly Gly Pro Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 
          1               5                   10                  15      
          Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 
                      20              
          <![CDATA[<210>  71]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子]]>
          <![CDATA[<400>  71]]>
          Gly Gly Pro Ser Ser Ser Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 
          1               5                   10                  15      
          Cys Pro Ala Pro Glu 
                      20      
          <![CDATA[<210>  72]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial]]> Sequence)
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子]]>
          <![CDATA[<400>  72]]>
          Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Asp Lys Thr His 
          1               5                   10                  15      
          Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 
                      20                  25  
          <![CDATA[<210>  73]]>
          <![CDATA[<211>  246]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TNFRSF促效劑融合蛋白之Fc域]]>
          <![CDATA[<400>  73]]>
          Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ala Gly Asn Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 
                      20                  25                  30          
          Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 
                  35                  40                  45              
          Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 
              50                  55                  60                  
          Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 
                          85                  90                  95      
          Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 
                      100                 105                 110         
          Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 
                  115                 120                 125             
          Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 
              130                 135                 140                 
          Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 
                          165                 170                 175     
          Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 
                      180                 185                 190         
          Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 
                  195                 200                 205             
          Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 
              210                 215                 220                 
          Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
                          245     
          <![CDATA[<210>  74]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子]]>
          <![CDATA[<400>  74]]>
          Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  75]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子]]>
          <![CDATA[<400>  75]]>
          Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  76]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TNFRSF促效劑融合蛋白之連接子]]>
          <![CDATA[<400>  76]]>
          Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  77]]>
          <![CDATA[<211>  254]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB配體(4-1BBL)胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  77]]>
          Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro 
          1               5                   10                  15      
          Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val 
                      20                  25                  30          
          Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe 
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser 
              50                  55                  60                  
          Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val 
                          85                  90                  95      
          Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp 
                      100                 105                 110         
          Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu 
                  115                 120                 125             
          Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe 
              130                 135                 140                 
          Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala 
                          165                 170                 175     
          Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala 
                      180                 185                 190         
          Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala 
                  195                 200                 205             
          Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His 
              210                 215                 220                 
          Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 
                          245                 250                 
          <![CDATA[<210>  78]]>
          <![CDATA[<211>  168]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BBL多肽之可溶部分]]>
          <![CDATA[<400>  78]]>
          Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val 
                      20                  25                  30          
          Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg 
              50                  55                  60                  
          Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr 
                          85                  90                  95      
          Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly 
                      100                 105                 110         
          Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val 
                  115                 120                 125             
          His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln 
              130                 135                 140                 
          Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 
                          165             
          <![CDATA[<210>  79]]>
          <![CDATA[<211>  118]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑抗體]]>
                 4B4-1-1型式1之重鏈可變區(VH)
          <![CDATA[<400>  79]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser 
                  115             
          <![CDATA[<210>  80]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑抗體]]>
                 4B4-1-1型式1之輕鏈可變區(VL)
          <![CDATA[<400>  80]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Gln Ser Val Thr Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  81]]>
          <![CDATA[<211>  119]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑抗體]]>
                 4B4-1-1型式2之重鏈可變區(VH)
          <![CDATA[<400>  81]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 
                  115                 
          <![CDATA[<210>  82]]>
          <![CDATA[<211>]]>  108
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑抗體]]>
                 4B4-1-1型式2之輕鏈可變區(VL)
          <![CDATA[<400>  82]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Gln Ser Val Thr Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 
                      100                 105             
          <![CDATA[<210>  83]]>
          <![CDATA[<211>  120]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑抗體]]>
                 H39E3-2之重鏈可變區(VH)
          <![CDATA[<400>  83]]>
          Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ala His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 
                      20                  25                  30          
          Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 
                  35                  40                  45              
          Ser Asp Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Trp Val Ala Asp Ile Lys Asn Asp Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Ser Leu Thr Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 
                      100                 105                 110         
          Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Leu Thr 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  84]]>
          <![CDATA[<211>  109]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4-1BB促效劑抗體]]>
                 H39E3-2之輕鏈可變區(VL)
          <![CDATA[<400>  84]]>
          Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 
          1               5                   10                  15      
          Asp Thr Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 
                      20                  25                  30          
          Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Leu Leu Ser Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Trp Tyr Gln Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 
                          85                  90                  95      
          Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala 
                      100                 105                 
          <![CDATA[<210>  85]]>
          <![CDATA[<211>  277]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人類OX40之胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  85]]>
          Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val 
                      20                  25                  30          
          Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys 
              50                  55                  60                  
          Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys 
                          85                  90                  95      
          Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys 
                  115                 120                 125             
          Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp 
              130                 135                 140                 
          Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro 
                          165                 170                 175     
          Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr 
                      180                 185                 190         
          Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu 
                  195                 200                 205             
          Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val 
              210                 215                 220                 
          Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly 
                          245                 250                 255     
          Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser 
                      260                 265                 270         
          Thr Leu Ala Lys Ile 
                  275         
          <![CDATA[<210>  86]]>
          <![CDATA[<211>  272]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 鼠類OX40之胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  86]]>
          Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Pro Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met 
                  35                  40                  45              
          Val Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu 
              50                  55                  60                  
          Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr 
                          85                  90                  95      
          Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg 
                      100                 105                 110         
          Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro 
                  115                 120                 125             
          Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn 
              130                 135                 140                 
          Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu 
                          165                 170                 175     
          Thr Gln Arg Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Trp Pro Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro 
                  195                 200                 205             
          Glu Gly Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu 
              210                 215                 220                 
          Ala Pro Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Leu Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr 
                          245                 250                 255     
          Pro Ile Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile 
                      260                 265                 270         
          <![CDATA[<210>  87]]>
          <![CDATA[<211>  451]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體]]>
                 塔沃西單抗(MEDI-0562)之重鏈
          <![CDATA[<400>  87]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly 
                      20                  25                  30          
          Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 
                  115                 120                 125             
          Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 
                  195                 200                 205             
          Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 
              210                 215                 220                 
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                          245                 250                 255     
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                      260                 265                 270         
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
                  275                 280                 285             
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
              290                 295                 300                 
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 
                          325                 330                 335     
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                      340                 345                 350         
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 
                  355                 360                 365             
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
              370                 375                 380                 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
                          405                 410                 415     
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                      420                 425                 430         
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro Gly Lys 
              450     
          <![CDATA[<210>  88]]>
          <![CDATA[<211>  214]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體]]>
                 塔沃西單抗(MEDI-0562)之輕鏈
          <![CDATA[<400>  88]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  89]]>
          <![CDATA[<211>  118]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequ]]>ence)
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株 ]]>
                 抗體塔沃西單抗(MEDI-0562)之重鏈可變區(VH)
          <![CDATA[<400>  89]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly 
                      20                  25                  30          
          Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr 
                  115             
          <![CDATA[<210>  90]]>
          <![CDATA[<211>  108]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Seque]]>nce)
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株 ]]>
                 抗體塔沃西單抗(MEDI-0562)之輕鏈可變區(VL)
          <![CDATA[<400>  90]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 
                      100                 105             
          <![CDATA[<210>  91]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體]]>
                 塔沃西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR1
          <![CDATA[<400>  91]]>
          Gly Ser Phe Ser Ser Gly Tyr Trp Asn 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  92]]>
          <![CDATA[<211>  13]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體]]>
                 塔沃西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR2
          <![CDATA[<400>  92]]>
          Tyr Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His 
          1               5                   10              
          <![CDATA[<210>  93]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體]]>
                 塔沃西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR3
          <![CDATA[<400>  93]]>
          Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  94]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體]]>
                 塔沃西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR1
          <![CDATA[<400>  94]]>
          Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  95]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體]]>
                 塔沃西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR2
          <![CDATA[<400>  95]]>
          Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  96]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體]]>
                 塔沃西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR3
          <![CDATA[<400>  96]]>
          Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  97]]>
          <![CDATA[<211>  444]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈]]>
          <![CDATA[<400>  97]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 
                  115                 120                 125             
          Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 
              130                 135                 140                 
          Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 
                          165                 170                 175     
          Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 
                      180                 185                 190         
          Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 
                  195                 200                 205             
          Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys 
              210                 215                 220                 
          Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 
                          245                 250                 255     
          Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 
                      260                 265                 270         
          Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 
                  275                 280                 285             
          Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr 
              290                 295                 300                 
          Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 
                          325                 330                 335     
          Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 
                      340                 345                 350         
          Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 
                  355                 360                 365             
          Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 
              370                 375                 380                 
          Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser 
          385                 390                 395                 400 
          Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 
                          405                 410                 415     
          Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 
                      420                 425                 430         
          Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                  435                 440                 
          <![CDATA[<210>  98]]>
          <![CDATA[<211>  214]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈]]>
          <![CDATA[<400>  98]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  99]]>
          <![CDATA[<211>  118]]>
          <![CDATA[<212>]]>  PRT
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株 ]]>
                 抗體11D4之重鏈可變區(VH)
          <![CDATA[<400>  99]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115             
          <![CDATA[<210>  100]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株 ]]>
                 抗體11D4之輕鏈可變區(VL)
          <![CDATA[<400>  100]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  101]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR1]]>
          <![CDATA[<400>  101]]>
          Ser Tyr Ser Met Asn 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  102]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Art]]>ificial Sequence)
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR2]]>
          <![CDATA[<400>  102]]>
          Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  103]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR3]]>
          <![CDATA[<400>  103]]>
          Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  104]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR1]]>
          <![CDATA[<400>  104]]>
          Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  105]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial]]> Sequence)
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR2]]>
          <![CDATA[<400>  105]]>
          Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  106]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR3]]>
          <![CDATA[<400>  106]]>
          Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  107]]>
          <![CDATA[<211>  450]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈]]>
          <![CDATA[<400>  107]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Lys Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp 
                      100                 105                 110         
          Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 
                  115                 120                 125             
          Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 
              130                 135                 140                 
          Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 
                          165                 170                 175     
          Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 
                      180                 185                 190         
          Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn 
                  195                 200                 205             
          Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg 
              210                 215                 220                 
          Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                      260                 265                 270         
          Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                  275                 280                 285             
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg 
              290                 295                 300                 
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu 
                          325                 330                 335     
          Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                      340                 345                 350         
          Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                  355                 360                 365             
          Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
              370                 375                 380                 
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 
                          405                 410                 415     
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                      420                 425                 430         
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445             
          Gly Lys 
              450 
          <![CDATA[<210>  108]]>
          <![CDATA[<211>  213]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>]]>  人工序列(Artificial Sequence)
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈]]>
          <![CDATA[<400>  108]]>
          Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 
                  115                 120                 125             
          Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 
              130                 135                 140                 
          Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 
                          165                 170                 175     
          Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 
                      180                 185                 190         
          Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 
                  195                 200                 205             
          Asn Arg Gly Glu Cys 
              210             
          <![CDATA[<210>  109]]>
          <![CDATA[<211>  124]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株 ]]>
                 抗體18D8之重鏈可變區(VH)
          <![CDATA[<400>  109]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Lys Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp 
                      100                 105                 110         
          Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 
          <![CDATA[<210>  110]]>
          <![CDATA[<211>  106]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株 ]]>
                 抗體18D8之輕鏈可變區(VL)
          <![CDATA[<400>  110]]>
          Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105     
          <![CDATA[<210>  111]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR1]]>
          <![CDATA[<400>  111]]>
          Asp Tyr Ala Met His 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  112]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR2]]>
          <![CDATA[<400>  112]]>
          Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  113]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR3]]>
          <![CDATA[<400>  113]]>
          Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  114]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR1]]>
          <![CDATA[<400>  114]]>
          Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  115]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR2]]>
          <![CDATA[<400>  115]]>
          Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  116]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR3]]>
          <![CDATA[<400>  116]]>
          Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  117]]>
          <![CDATA[<211>  120]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株 ]]>
                 抗體Hu119-122之重鏈可變區(VH)
          <![CDATA[<400>  117]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His 
                      20                  25                  30          
          Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met 
              50                  55                  60                  
          Glu Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  118]]>
          <![CDATA[<211>  111]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株 ]]>
                 抗體Hu119-122之輕鏈可變區(VL)
          <![CDATA[<400>  118]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 
                          85                  90                  95      
          Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110     
          <![CDATA[<210>  119]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體]]>
                 Hu119-122之重鏈CDR1
          <![CDATA[<400>  119]]>
          Ser His Asp Met Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  120]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體]]>
                 Hu119-122之重鏈CDR2
          <![CDATA[<400>  120]]>
          Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met Glu 
          1               5                   10                  15      
          Arg 
          <![CDATA[<210>  121]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體]]>
                 Hu119-122之重鏈CDR3
          <![CDATA[<400>  121]]>
          His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  122]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑]]>單株抗體
                 Hu119-122之輕鏈CDR1
          <![CDATA[<400>  122]]>
          Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  123]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體]]>
                 Hu119-122之輕鏈CDR2
          <![CDATA[<400>  123]]>
          Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  124]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體]]>
                 Hu119-122之輕鏈CDR3
          <![CDATA[<400>  124]]>
          Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Leu Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  125]]>
          <![CDATA[<211>  122]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株 ]]>
                 抗體Hu106-222之重鏈可變區(VH)
          <![CDATA[<400>  125]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120         
          <![CDATA[<210>  126]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株 ]]>
                 抗體Hu106-222之輕鏈可變區(VL)
          <![CDATA[<400>  126]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  127]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體]]>
                 Hu106-222之重鏈CDR1
          <![CDATA[<400>  127]]>
          Asp Tyr Ser Met His 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  128]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體]]>
                 Hu106-222之重鏈CDR2
          <![CDATA[<400>  128]]>
          Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  129]]>
          <![CDATA[<211>  13]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體]]>
                 Hu106-222之重鏈CDR3
          <![CDATA[<400>  129]]>
          Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 
          1               5                   10              
          <![CDATA[<210>  130]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體]]>
                 Hu106-222之輕鏈CDR1
          <![CDATA[<400>  130]]>
          Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  131]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體]]>
                 Hu106-222之輕鏈CDR2
          <![CDATA[<400>  131]]>
          Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  132]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株抗體]]>
                 Hu106-222之輕鏈CDR3
          <![CDATA[<400>  132]]>
          Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  133]]>
          <![CDATA[<211>  183]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40配體(OX40L)胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  133]]>
          Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg 
          1               5                   10                  15      
          Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln 
                      20                  25                  30          
          Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser 
                  35                  40                  45              
          Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val 
              50                  55                  60                  
          Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn 
                          85                  90                  95      
          Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu 
                      100                 105                 110         
          Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln 
                  115                 120                 125             
          Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr 
              130                 135                 140                 
          Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn 
                          165                 170                 175     
          Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu 
                      180             
          <![CDATA[<210>  134]]>
          <![CDATA[<211>  131]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40L多肽之可溶部分]]>
          <![CDATA[<400>  134]]>
          Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu 
                      20                  25                  30          
          Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe 
                  35                  40                  45              
          Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His 
                      100                 105                 110         
          Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe 
                  115                 120                 125             
          Cys Val Leu 
              130     
          <![CDATA[<210>  135]]>
          <![CDATA[<211>  128]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40L多肽之替代性可溶部分]]>
          <![CDATA[<400>  135]]>
          Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys 
          1               5                   10                  15      
          Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys 
                      20                  25                  30          
          Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg Ser Val 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu 
                          85                  90                  95      
          Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val Asn Gly 
                      100                 105                 110         
          Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu 
                  115                 120                 125             
          <![CDATA[<210>  136]]>
          <![CDATA[<211>  120]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株 ]]>
                 抗體008之重鏈可變區(VH)
          <![CDATA[<400>  136]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Lys Asp Arg Tyr Ser Gln Val His Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  137]]>
          <![CDATA[<211>  108]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株 ]]>
                 抗體008之輕鏈可變區(VL)
          <![CDATA[<400>  137]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ala Gly Gln Ser 
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          Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 
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                      100                 105             
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株 ]]>
                 抗體011之重鏈可變區(VH)
          <![CDATA[<400>  138]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Ser Ile Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Arg Lys Gly 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  139]]>
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                 抗體011之輕鏈可變區(VL)
          <![CDATA[<400>  139]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ala Gly Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 
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          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Arg Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
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              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
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          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
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          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 
                  115                 120 
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株 ]]>
                 抗體021之輕鏈可變區(VL)
          <![CDATA[<400>  141]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 
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          Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 
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                          85                  90                  95      
          Lys Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 
                      100                 105             
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          <![CDATA[<211>  120]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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                 抗體023之重鏈可變區(VH)
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          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
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          Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
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          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 
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                          85                  90                  95      
          Arg Tyr Asp Asn Val Met Gly Leu Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 
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          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<21]]>0>  143]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;211&gt;  108]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;212&gt;  PRT]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;213&gt;  人工序列(Artificial Sequence)]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  OX40促效劑單株 ]]&gt;
          <br/><![CDATA[       抗體023之輕鏈可變區(VL)
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          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 
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                      100                 105             
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株 ]]>
                 抗體之重鏈可變區(VH)
          <![CDATA[<400>  144]]>
          Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
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          Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 
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                 抗體之輕鏈可變區(VL)
          <![CDATA[<400>  145]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 
                      100                 105             
          <![CDATA[<210>  146]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株 ]]>
                 抗體之重鏈可變區(VH)
          <![CDATA[<400>  146]]>
          Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Asn Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Met Gly Tyr His Gly Pro His Leu Asp Phe Asp Val Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Pro 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  147]]>
          <![CDATA[<211>  108]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株 ]]>
                 抗體之輕鏈可變區(VL)
          <![CDATA[<400>  147]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ala Ala 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Leu Thr Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ile Asn Tyr Pro Leu 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 
                      100                 105             
          <![CDATA[<210>  148]]>
          <![CDATA[<211>  122]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人類化OX40促效劑]]>
                 單株抗體之重鏈可變區(VH)
          <![CDATA[<400>  148]]>
          Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly His Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120         
          <![CDATA[<210>  149]]>
          <![CDATA[<211>  122]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人類化OX40促效劑]]>
                 單株抗體之重鏈可變區(VH)
          <![CDATA[<400>  149]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120         
          <![CDATA[<210>  ]]>150
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人類化OX40促效劑]]>
                 單株抗體之輕鏈可變區(VL)
          <![CDATA[<400>  150]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Arg 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  151]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人類化OX40促效劑]]>
                 單株抗體之輕鏈可變區(VL)
          <![CDATA[<400>  151]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Arg 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  152]]>
          <![CDATA[<211>  120]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人類化OX40促效劑]]>
                 單株抗體之重鏈可變區(VH)
          <![CDATA[<400>  152]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ser Asn Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His 
                      20                  25                  30          
          Asp Met Ser Trp Val Arg Lys Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met 
              50                  55                  60                  
          Glu Arg Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  153]]>
          <![CDATA[<211>  120]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人類化OX40促效劑]]>
                 單株抗體之重鏈可變區(VH)
          <![CDATA[<400>  153]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His 
                      20                  25                  30          
          Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met 
              50                  55                  60                  
          Glu Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  154]]>
          <![CDATA[<211>  111]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人類化OX40促效劑]]>
                 單株抗體之輕鏈可變區(VL)
          <![CDATA[<400>  154]]>
          Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 
                          85                  90                  95      
          Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 
                      100                 105                 110     
          <![CDATA[<210>  155]]>
          <![CDATA[<211>  111]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人類化OX40促效劑]]>
                 單株抗體之輕鏈可變區(VL)
          <![CDATA[<400>  155]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 
                          85                  90                  95      
          Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110     
          <![CDATA[<210>  156]]>
          <![CDATA[<211>  138]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株 ]]>
                 抗體之重鏈可變區(VH)
          <![CDATA[<400>  156]]>
          Met Tyr Leu Gly Leu Asn Tyr Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Asn Gly 
          1               5                   10                  15      
          Val Gln Ser Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 
                      20                  25                  30          
          Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 
                  35                  40                  45              
          Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ala Glu Ser Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 
                          85                  90                  95      
          Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 
                      100                 105                 110         
          Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Trp Gly Glu Val Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp 
                  115                 120                 125             
          Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 
              130                 135             
          <![CDATA[<210>  157]]>
          <![CDATA[<211>  126]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  OX40促效劑單株 ]]>
                 抗體之輕鏈可變區(VL)
          <![CDATA[<400>  157]]>
          Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 
                      20                  25                  30          
          Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Asp 
                  35                  40                  45              
          Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro 
              50                  55                  60                  
          Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser 
                          85                  90                  95      
          Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp 
                      100                 105                 110         
          Asn Leu Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 
                  115                 120                 125     
          <![CDATA[<210>  158]]>
          <![CDATA[<211>  440]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-1抑制劑納武單抗之重鏈胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  158]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser 
                      20                  25                  30          
          Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser 
                  115                 120                 125             
          Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 
              130                 135                 140                 
          Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 
                          165                 170                 175     
          Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys 
                      180                 185                 190         
          Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala 
              210                 215                 220                 
          Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 
                          245                 250                 255     
          Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 
                      260                 265                 270         
          Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 
                  275                 280                 285             
          Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 
              290                 295                 300                 
          Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 
                          325                 330                 335     
          Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 
                  355                 360                 365             
          Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 
              370                 375                 380                 
          Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe 
                          405                 410                 415     
          Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 
                      420                 425                 430         
          Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 
                  435                 440 
          <![CDATA[<210>  159]]>
          <![CDATA[<211>  214]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-1抑制劑納武單抗之輕鏈胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  159]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  160]]>
          <![CDATA[<211>  113]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-1 ]]>
                 抑制劑納武單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  160]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser 
                      20                  25                  30          
          Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser 
          <![CDATA[<210>  161]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-1 ]]>
                 抑制劑納武單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  161]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  162]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-1抑制劑]]>
                 納武單抗之重鏈CDR1胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  162]]>
          Asn Ser Gly Met His 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  163]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-1抑制劑]]>
                 納武單抗之重鏈CDR2胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  163]]>
          Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  164]]>
          <![CDATA[<211>  4]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈CDR3胺基酸序列 PD-1抑制劑]]>
                 納武單抗
          <![CDATA[<400>  164]]>
          Asn Asp Asp Tyr 
          1               
          <![CDATA[<210>  165]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-1抑制劑]]>
                 納武單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  165]]>
          Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  166]]>
          <![CDATA[<211]]>>  7]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;212&gt;  PRT]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;213&gt;  人工序列(Artificial Sequence)]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  PD-1抑制劑]]&gt;
          <br/><![CDATA[       納武單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  166]]>
          Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  167]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-1抑制劑]]>
                 納武單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  167]]>
          Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  168]]>
          <![CDATA[<211>  447]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-1抑制劑]]>
                 帕博利珠單抗之重鏈胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  168]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 
                          165                 170                 175     
          Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 
              210                 215                 220                 
          Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 
                          245                 250                 255     
          Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 
                      260                 265                 270         
          Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 
                  275                 280                 285             
          Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 
              290                 295                 300                 
          Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 
                          325                 330                 335     
          Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 
                      340                 345                 350         
          Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 
                  355                 360                 365             
          Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 
              370                 375                 380                 
          Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 
          385                 390                 395                 400 
          Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 
                          405                 410                 415     
          Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 
                      420                 425                 430         
          His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 
                  435                 440                 445         
          <![CDATA[<210>  169]]>
          <![CDATA[<211>  218]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-1抑制劑]]>
                 帕博利珠單抗之輕鏈胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  169]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 
                          85                  90                  95      
          Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 
                      100                 105                 110         
          Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 
                  115                 120                 125             
          Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 
              130                 135                 140                 
          Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 
                          165                 170                 175     
          Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 
                      180                 185                 190         
          His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 
                  195                 200                 205             
          Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 215             
          <![CDATA[<210>  170]]>
          <![CDATA[<211>  120]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-1]]>
                 抑制劑帕博利珠單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  170]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  171]]>
          <![CDATA[<211>  111]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-1]]>
                 抑制劑帕博利珠單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  171]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 
                          85                  90                  95      
          Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110     
          <![CDATA[<210>  172]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-1抑制劑]]>
                 帕博利珠單抗之重鏈CDR1胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  172]]>
          Asn Tyr Tyr Met Tyr 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  173]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-1抑制劑]]>
                 帕博利珠單抗之重鏈CDR2胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  173]]>
          Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  174]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈CDR3胺基酸序列 PD-1抑制劑]]>
                 帕博利珠單抗
          <![CDATA[<400>  174]]>
          Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  175]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-1抑制劑]]>
                 帕博利珠單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  175]]>
          Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  176]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-1抑制劑]]>
                 帕博利珠單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  176]]>
          Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  177]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-1抑制劑]]>
                 帕博利珠單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  177]]>
          Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  178]]>
          <![CDATA[<211>  451]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑德瓦魯單抗之重鏈胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  178]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 
                      20                  25                  30          
          Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 
                  115                 120                 125             
          Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 
                  195                 200                 205             
          Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 
              210                 215                 220                 
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                          245                 250                 255     
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                      260                 265                 270         
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
                  275                 280                 285             
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
              290                 295                 300                 
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile 
                          325                 330                 335     
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                      340                 345                 350         
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 
                  355                 360                 365             
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
              370                 375                 380                 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
                          405                 410                 415     
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                      420                 425                 430         
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro Gly Lys 
              450     
          <![CDATA[<210>  179]]>
          <![CDATA[<211>  265]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑德瓦魯單抗之輕鏈胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  179]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 
                      20                  25                  30          
          Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Asn Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser 
              50                  55                  60                  
          Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 
                          85                  90                  95      
          Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg 
                      100                 105                 110         
          Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg 
                  115                 120                 125             
          Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 
                          165                 170                 175     
          Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 
                      180                 185                 190         
          Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 
                  195                 200                 205             
          Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 
              210                 215                 220                 
          Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 
          225                 230                 235                 240 
          Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 
                          245                 250                 255     
          Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
                      260                 265 
          <![CDATA[<210>  180]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1]]>
                 抑制劑德瓦魯單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  180]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 
                      20                  25                  30          
          Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  181]]>
          <![CDATA[<211>  108]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1]]>
                 抑制劑德瓦魯單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  181]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro 
                          85                  90                  95      
          Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105             
          <![CDATA[<210>  182]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑]]>
                 德瓦魯單抗之重鏈CDR1胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  182]]>
          Arg Tyr Trp Met Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  183]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑]]>
                 德瓦魯單抗之重鏈CDR2胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  183]]>
          Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  184]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑]]>
                 德瓦魯單抗之重鏈CDR3胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  184]]>
          Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  185]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑]]>
                 德瓦魯單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  185]]>
          Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  186]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑]]>
                 德瓦魯單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  186]]>
          Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  187]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213> ]]> 人工序列(Artificial Sequence)
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑]]>
                 德瓦魯單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  187]]>
          Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro Trp Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  188]]>
          <![CDATA[<211>  450]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑阿維魯單抗之重鏈胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  188]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 
                          165                 170                 175     
          Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                      260                 265                 270         
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                  275                 280                 285             
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 
              290                 295                 300                 
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 
                          325                 330                 335     
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                      340                 345                 350         
          Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                  355                 360                 365             
          Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
              370                 375                 380                 
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 
                          405                 410                 415     
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                      420                 425                 430         
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445             
          Gly Lys 
              450 
          <![CDATA[<210>  189]]>
          <![CDATA[<211>  216]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑阿維魯單抗之輕鏈胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  189]]>
          Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 
                  35                  40                  45              
          Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 
                          85                  90                  95      
          Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 
                  115                 120                 125             
          Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 
              130                 135                 140                 
          Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 
                          165                 170                 175     
          Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 
                      180                 185                 190         
          Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 
                  195                 200                 205             
          Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 
              210                 215     
          <![CDATA[<210>  190]]>
          <![CDATA[<211>  120]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1]]>
                 抑制劑阿維魯單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  190]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  191]]>
          <![CDATA[<211>  110]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1]]>
                 抑制劑阿維魯單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  191]]>
          Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 
                  35                  40                  45              
          Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 
                          85                  90                  95      
          Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 
                      100                 105                 110 
          <![CDATA[<210>  192]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑]]>
                 阿維魯單抗之重鏈CDR1胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  192]]>
          Ser Tyr Ile Met Met 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  193]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑]]>
                 阿維魯單抗之重鏈CDR2胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  193]]>
          Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  194]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑]]>
                 阿維魯單抗之重鏈CDR3胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  194]]>
          Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  195]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑]]>
                 阿維魯單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  195]]>
          Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  196]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑]]>
                 阿維魯單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  196]]>
          Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  197]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑]]>
                 阿維魯單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  197]]>
          Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Arg Val 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  198]]>
          <![CDATA[<211>  448]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑]]>
                 阿替利珠單抗之重鏈胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  198]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 
                      20                  25                  30          
          Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 
                  115                 120                 125             
          Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 
              130                 135                 140                 
          Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 
                          165                 170                 175     
          Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 
                      180                 185                 190         
          Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 
                  195                 200                 205             
          Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 
              210                 215                 220                 
          His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 
          225                 230                 235                 240 
          Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 
                          245                 250                 255     
          Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 
                      260                 265                 270         
          Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 
                  275                 280                 285             
          Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val 
              290                 295                 300                 
          Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 
                          325                 330                 335     
          Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 
                      340                 345                 350         
          Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 
                  355                 360                 365             
          Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 
              370                 375                 380                 
          Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 
                          405                 410                 415     
          Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 
                      420                 425                 430         
          Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                  435                 440                 445             
          <![CDATA[<210>  199]]>
          <![CDATA[<211>  214]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑]]>
                 阿替利珠單抗之輕鏈胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  199]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  200]]>
          <![CDATA[<211>  118]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1]]>
                 抑制劑阿替利珠單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  200]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 
                      20                  25                  30          
          Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Leu Val Thr Val Ser Ala 
                  115             
          <![CDATA[<210>  201]]>
          <![CDATA[<211]]>>  108]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;212&gt;  PRT]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;213&gt;  人工序列(Artificial Sequence)]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  PD-L1]]&gt;
          <br/><![CDATA[       抑制劑阿替利珠單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  201]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 
                      100                 105             
          <![CDATA[<210>  202]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑]]>
                 阿替利珠單抗之重鏈CDR1胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  202]]>
          Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  203]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑]]>
                 阿替利珠單抗之重鏈CDR2胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  203]]>
          Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
          1               5                   10                  15      
          Lys Gly 
          <![CDATA[<210>  204]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<22]]>0>]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  PD-L1抑制劑]]&gt;
          <br/><![CDATA[       阿替利珠單抗之重鏈CDR3胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  204]]>
          Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  205]]>
          <![CDATA[<211>  1]]>1
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑]]>
                 阿替利珠單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  205]]>
          Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  206]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑]]>
                 阿替利珠單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  206]]>
          Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  207]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD-L1抑制劑]]>
                 阿替利珠單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  207]]>
          Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  208]]>
          <![CDATA[<211>  225]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑]]>
                 伊匹木單抗之重鏈胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  208]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 
                  115                 120                 125             
          Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 
              130                 135                 140                 
          Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 
                          165                 170                 175     
          Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 
                      180                 185                 190         
          Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 
                  195                 200                 205             
          Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 
              210                 215                 220                 
          His 
          225 
          <![CDATA[<210>  209]]>
          <![CDATA[<211>  215]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑]]>
                 伊匹木單抗之輕鏈胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  209]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 
                          85                  90                  95      
          Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 
                      100                 105                 110         
          Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 
                  115                 120                 125             
          Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 
              130                 135                 140                 
          Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 
                          165                 170                 175     
          Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 
                      180                 185                 190         
          Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 
                  195                 200                 205             
          Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 215 
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          <![CDATA[<211>  118]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<400>  210]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115             
          <![CDATA[<210>  211]]>
          <![CDATA[<211>  108]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 
                          85                  90                  95      
          Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105             
          <![CDATA[<210>  212]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑]]>
                 伊匹木單抗之重鏈CDR1胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  212]]>
          Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr 
          1               5               
          <![CDATA[<210]]>>  213]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;211&gt;  10]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;212&gt;  PRT]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;213&gt;  人工序列(Artificial Sequence)]]&gt;
          <br/>
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          Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys 
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          <![CDATA[<220>]]>
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                 伊匹木單抗之重鏈CDR3胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  214]]>
          Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  215]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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                 伊匹木單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  215]]>
          Gln Ser Val Gly Ser Ser Tyr 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  216]]>
          <![CDATA[<211>  3]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑]]>
                 伊匹木單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  216]]>
          Gly Ala Phe 
          1           
          <![CDATA[<210>  217]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑]]>
                 伊匹木單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  217]]>
          Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  218]]>
          <![CDATA[<211>  451]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑]]>
                 曲美單抗之重鏈胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  218]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 
                      100                 105                 110         
          Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 
                  115                 120                 125             
          Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 
              130                 135                 140                 
          Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 
                          165                 170                 175     
          Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 
                      180                 185                 190         
          Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys 
                  195                 200                 205             
          Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu 
              210                 215                 220                 
          Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                          245                 250                 255     
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                      260                 265                 270         
          Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
                  275                 280                 285             
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe 
              290                 295                 300                 
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile 
                          325                 330                 335     
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                      340                 345                 350         
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 
                  355                 360                 365             
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
              370                 375                 380                 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
                          405                 410                 415     
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                      420                 425                 430         
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro Gly Lys 
              450     
          <![CDATA[<210>  219]]>
          <![CDATA[<211>  214]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑]]>
                 曲美單抗之輕鏈胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  219]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  220]]>
          <![CDATA[<211>  167]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑曲美單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  220]]>
          Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 
          1               5                   10                  15      
          Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro 
                      20                  25                  30          
          Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn 
                  35                  40                  45              
          Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 
              50                  55                  60                  
          Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu 
                          85                  90                  95      
          Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 
                      100                 105                 110         
          Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 
                  115                 120                 125             
          Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 
              130                 135                 140                 
          Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Leu Thr Ser Gly Val His 
                          165         
          <![CDATA[<210>  221]]>
          <![CDATA[<211>  139]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑曲美單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  221]]>
          Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 
          1               5                   10                  15      
          Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys 
                      20                  25                  30          
          Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln 
                  35                  40                  45              
          Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 
              50                  55                  60                  
          Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 
                          85                  90                  95      
          Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 
                  115                 120                 125             
          Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 
              130                 135                 
          <![CDATA[<210>  222]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑]]>
                 曲美單抗之重鏈CDR1胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  222]]>
          Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  223]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑]]>
                 曲美單抗之重鏈CDR2胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  223]]>
          Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  224]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑]]>
                 曲美單抗之重鏈CDR3胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  224]]>
          Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  225]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑]]>
                 曲美單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  225]]>
          Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  226]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑]]>
                 曲美單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  226]]>
          Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  227]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑]]>
                 曲美單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  227]]>
          Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  228]]>
          <![CDATA[<211>  448]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑]]>
                 澤弗利單抗之重鏈胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  228]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Val Gly Leu Met Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 
                  115                 120                 125             
          Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 
              130                 135                 140                 
          Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 
                          165                 170                 175     
          Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 
                      180                 185                 190         
          Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 
                  195                 200                 205             
          Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 
              210                 215                 220                 
          His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 
          225                 230                 235                 240 
          Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 
                          245                 250                 255     
          Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 
                      260                 265                 270         
          Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 
                  275                 280                 285             
          Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 
              290                 295                 300                 
          Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 
                          325                 330                 335     
          Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 
                      340                 345                 350         
          Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 
                  355                 360                 365             
          Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 
              370                 375                 380                 
          Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 
                          405                 410                 415     
          Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 
                      420                 425                 430         
          Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                  435                 440                 445             
          <![CDATA[<210>  229]]>
          <![CDATA[<211>  214]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑]]>
                 澤弗利單抗之輕鏈胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  229]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  230]]>
          <![CDATA[<211>  118]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑澤弗利單抗之重鏈可變區(VH)胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  230]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Val Gly Leu Met Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115             
          <![CDATA[<210>  231]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑澤弗利單抗之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  231]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  232]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑]]>
                 澤弗利單抗之重鏈CDR1胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  232]]>
          Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  233]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑]]>
                 澤弗利單抗之重鏈CDR2胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  233]]>
          Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  234]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑]]>
                 澤弗利單抗之重鏈CDR3胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  234]]>
          Ala Arg Val Gly Leu Met Gly Pro Phe Asp Ile 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  235]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑]]>
                 澤弗利單抗之輕鏈CDR1胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  235]]>
          Gln Ser Val Ser Arg Tyr 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  236]]>
          <![CDATA[<211>  3]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑]]>
                 澤弗利單抗之輕鏈CDR2胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  236]]>
          Gly Ala Ser 
          1           
          <![CDATA[<210>  237]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CTLA-4抑制劑]]>
                 澤弗利單抗之輕鏈CDR3胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  237]]>
          Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr 
          1               5
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Claims (298)

  1. 一種用於低溫儲存腫瘤樣本之組成物，該組成物包括： a) 無血清、無動物組分之冷凍保存培養基；及 b) 抗生素組分，其包括：1)選自以下之抗生素組合： i. 建它黴素及萬古黴素，及 ii. 建它黴素及克林達黴素；或 2)抗生素萬古黴素。
  2. 如請求項1之組成物，其中該抗生素組分包括約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  3. 如請求項1之組成物，其中該抗生素組分包括約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  4. 如請求項1之組成物，其中該抗生素組分包括約400-600 µg/mL濃度之克林達黴素。
  5. 如請求項1之組成物，其中該抗生素組分包括約50 µg/mL濃度之建它黴素。
  6. 如請求項1之組成物，其中該抗生素組分係約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  7. 如請求項1之組成物，其中該抗生素組分係約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  8. 如請求項1之組成物，其中該抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素及約400-600 µg/mL克林達黴素。
  9. 如請求項1之組成物，其中該抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素及約50-600 µg/mL萬古黴素。
  10. 如請求項1之組成物，其中該組成物進一步包括抗真菌性抗生素。
  11. 如請求項8之組成物，其中該抗真菌性抗生素係兩性黴素B。
  12. 如請求項9之組成物，其中該兩性黴素B係約2.5-10 µg/mL濃度。
  13. 如請求項1至12中任一項之組成物，其中該冷凍保存培養基包括： i. 一或多種選自鉀離子、鈉離子、鎂離子及鈣離子之電解質；及 ii. 在生理條件及低溫條件下有效之生物pH緩衝液。
  14. 如請求項13之組成物，其中該等鉀離子之濃度在約35-45mM範圍內，該等鈉離子之濃度在約80-120 mM範圍內，該等鎂離子之濃度在約2-10 mM範圍內，且該等鈣離子之濃度在約0.01-0.1 mM範圍內。
  15. 如請求項13之組成物，其中該組成物進一步包括營養有效量之至少一種單糖。
  16. 如請求項13之組成物，其中該組成物進一步包括不可透過細胞膜且有效抵抗在冷暴露期間之細胞膨脹的不透過性陰離子，該陰離子選自由以下組成之群組：乳糖酸根、葡糖酸根、檸檬酸根及甘油磷酸根。
  17. 如請求項13之組成物，其中該組成物進一步包括對ATP再生有效之受質，該受質係至少一個選自由以下組成之群組的成員：腺苷、果糖、核糖及腺嘌呤。
  18. 如請求項13之組成物，其中該組成物進一步包括至少一種選自由EDTA或維生素E組成之群組的調節凋亡誘導之細胞死亡的試劑。
  19. 如請求項1至12中任一項之組成物，其中該冷凍保存培養基包括10% DMSO。
  20. 一種腫瘤樣本組成物，其包括： a) 包括複數個腫瘤細胞及複數個腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之腫瘤樣本；及 b) 低溫儲存培養基，其包括： i. 無血清、無動物組分之冷凍保存培養基；及 ii. 抗生素組分，其包括：I)選自以下之抗生素組合： 1. 建它黴素及萬古黴素，及 2. 建它黴素及克林達黴素；或 II)抗生素萬古黴素。
  21. 如請求項20之組成物，其中該腫瘤樣本係實體腫瘤樣本。
  22. 如請求項21之組成物，其中該腫瘤樣本係以下癌症類型中之一種：乳癌、胰臟癌、前列腺癌、結腸直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌、皮膚癌(包含但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑素瘤)、子宮頸癌、頭頸癌、神經膠母細胞瘤、卵巢癌、肉瘤、膀胱癌及神經膠母細胞瘤。
  23. 如請求項20之組成物，其中該腫瘤樣本係液體腫瘤樣本。
  24. 如請求項23之組成物，其中該液體腫瘤樣本係來自血液惡性病之液體腫瘤樣本。
  25. 如請求項20之組成物，其中該腫瘤樣本係自原發性腫瘤獲得。
  26. 如請求項20之組成物，其中該腫瘤樣本係自侵襲性腫瘤獲得。
  27. 如請求項20之組成物，其中該腫瘤樣本係自轉移性腫瘤獲得。
  28. 如請求項20之組成物，其中該腫瘤樣本係自惡性黑素瘤獲得。
  29. 如請求項20之組成物，其中該複數個TIL包括至少90%活細胞。
  30. 如請求項20至29中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  31. 如請求項20至29中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  32. 如請求項20至29中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括約400-600 µg/mL濃度之克林達黴素。
  33. 如請求項20至29中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括約50 µg/mL濃度之建它黴素。
  34. 如請求項20至29中任一項之組成物，其中該抗生素組分係約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  35. 如請求項20至29中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素及約400-600 µg/mL克林達黴素。
  36. 如請求項20至29中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素及約50-600 µg/mL萬古黴素。
  37. 如請求項20至29中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL萬古黴素。
  38. 如請求項20至29中任一項之組成物，其中該組成物進一步包括抗真菌性抗生素。
  39. 如請求項38之組成物，其中該抗真菌性抗生素係兩性黴素B。
  40. 如請求項39之組成物，其中該兩性黴素B係約2.5-10 µg/mL濃度。
  41. 如請求項20至40中任一項之組成物，其中該冷凍保存培養基包括： i. 一或多種選自鉀離子、鈉離子、鎂離子及鈣離子之電解質；及 ii. 在生理條件及低溫條件下有效之生物pH緩衝液。
  42. 如請求項41之組成物，其中該等鉀離子之濃度在約35-45mM範圍內，該等鈉離子之濃度在約80-120 mM範圍內，該等鎂離子之濃度在約2-10 mM範圍內，且該等鈣離子之濃度在0.01-0.1 mM範圍內。
  43. 如請求項41之組成物，其中該組成物進一步包括營養有效量之至少一種單糖。
  44. 如請求項41之組成物，其中該組成物進一步包括不可透過細胞膜且有效抵抗在冷暴露期間之細胞膨脹的不透過性陰離子，其中該陰離子選自由以下組成之群組：乳糖酸根、葡糖酸根、檸檬酸根及甘油磷酸根。
  45. 如請求項41之組成物，其中該組成物進一步包括對ATP再生有效之受質，該受質係至少一個選自由以下組成之群組的成員：腺苷、果糖、核糖及腺嘌呤。
  46. 如請求項37之組成物，其中該組成物進一步包括至少一種選自由EDTA或維生素E組成之群組的調節凋亡誘導之細胞死亡的試劑。
  47. 如請求項20至46中任一項之組成物，其中該冷凍保存培養基包括10% DMSO。
  48. 一種細胞培養基組成物，其包括： a. 基礎培養基，其包括： i. 葡萄糖； ii. 複數種鹽； iii. 複數種胺基酸及維生素； b. 麩醯胺酸或麩醯胺酸衍生物； c. 血清；及 d. 抗生素組分，其包括：1)選自以下之抗生素組合： i. 建它黴素及萬古黴素；及 ii. 建它黴素及克林達黴素；或 2)抗生素萬古黴素。
  49. 一種細胞培養基組成物，其包括： a. 基礎培養基，其包括： i. 葡萄糖； ii. 複數種鹽； iii. 複數種胺基酸及維生素； b. 血清白蛋白； c. 膽固醇NF； d. 視情況選用之麩醯胺酸或麩醯胺酸衍生物；以及 e. 抗生素組分，其包括：1)選自以下之抗生素組合： i. 建它黴素及萬古黴素；及 ii. 建它黴素及克林達黴素；或 2)抗生素萬古黴素。
  50. 一種細胞培養基組成物，其包括： a) 合成培養基或無血清培養基，其包括： i. 葡萄糖； ii. 複數種鹽； iii. 複數種胺基酸及維生素； b) 視情況選用之轉鐵蛋白； c) 視情況選用之胰島素； d) 視情況選用之白蛋白； e) 膽固醇NF； f) 視情況選用之麩醯胺酸或麩醯胺酸衍生物；以及 g) 抗生素組分，其包括：1)選自以下之抗生素組合： i. 建它黴素及萬古黴素；及 ii. 建它黴素及克林達黴素；或 2)抗生素萬古黴素。
  51. 如請求項50之細胞培養基，其中該細胞培養基包括(視情況重組之)轉鐵蛋白、(視情況重組之)胰島素及(視情況重組之)白蛋白。
  52. 如請求項50或51之細胞培養基，其中該合成培養基或無血清培養基包括基礎培養基及血清補充劑及/或血清替代物。
  53. 如請求項52之細胞培養基組成物，其中該基礎細胞培養基包括CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無外源物質培養基、杜爾貝科氏改良型伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基或伊斯科夫氏改良型杜爾貝科氏培養基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)。
  54. 如請求項52或53之細胞培養基，其中該血清補充劑或血清替代物係選自由以下組成之群組：CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑及CTS™免疫細胞血清替代物。
  55. 如請求項50至54中任一項之細胞培養基，其中該合成培養基或無血清培養基包括一或多種白蛋白或白蛋白代用品。
  56. 如請求項50至55中任一項之細胞培養基，其中該合成培養基或無血清培養基包括一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白代用品。
  57. 如請求項50至56中任一項之細胞培養基，其中該合成培養基或無血清培養基包括一或多種胰島素或胰島素代用品。
  58. 如請求項50至57中任一項之細胞培養基，其中該合成培養基或無血清培養基包括一或多種抗氧化劑。
  59. 如請求項50至58中任一項之細胞培養基，其中該合成培養基或無血清培養基包括一或多種膠原蛋白前驅物及一或多種微量元素。
  60. 如請求項50至59中任一項之細胞培養基，其中該合成培養基或無血清培養基包括一或多種選自由以下組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素以及含有微量元素部分Ag +、Al 3+、Ba 2+、Cd 2+、Co 2+、Cr 3+、Ge 4+、Se 4+、Br、T、Mn 2+、P、Si 4+、V 5+、Mo 6+、Ni 2+、Rb +、Sn 2+及Zr 4+之化合物。
  61. 如請求項50至60中任一項之細胞培養基，其中該合成培養基或無血清培養基進一步包括L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰基乙醇。
  62. 如請求項48至61中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  63. 如請求項48至61中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  64. 如請求項48至61中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括約400-600 µg/mL濃度之克林達黴素。
  65. 如請求項48至61中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括約50 µg/mL濃度之建它黴素。
  66. 如請求項48至61中任一項之組成物，其中該抗生素組分係約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  67. 如請求項48至61中任一項之組成物，其中該抗生素組分係約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  68. 如請求項48至61中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素及約400-600 µg/mL克林達黴素。
  69. 如請求項48至61中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素及約50-600 µg/mL萬古黴素。
  70. 如請求項48至61中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL萬古黴素。
  71. 如請求項48、49或52至70中任一項之細胞培養基，其中該基礎培養基係RPMI 1640培養基、DMEM培養基或其組合。
  72. 如請求項48、49或52至70中任一項之細胞培養基，其中該基礎培養基係DMEM培養基。
  73. 如請求項48至72中任一項之細胞培養基，其中該細胞培養基包括麩醯胺酸衍生物L-丙胺酸-L-麩醯胺酸(GutaMAX)。
  74. 如請求項48至72中任一項之細胞培養基，其中該細胞培養基包括麩醯胺酸，即L-麩醯胺酸。
  75. 如請求項48之細胞培養基，其中該血清係人類AB血清。
  76. 如請求項48至75中任一項之細胞培養基，其中該細胞培養基進一步包括IL-2。
  77. 如請求項76之細胞培養基，其中該IL-2係約3,000-6,000 IU/mL濃度之IL-2。
  78. 如請求項48至77中任一項之細胞培養基，其中該細胞培養基進一步包括抗CD3抗體。
  79. 如請求項78之細胞培養基，其中該抗CD3抗體係約30 ng/mL濃度之OKT-3。
  80. 如請求項48至79中任一項之細胞培養基，其中該細胞培養基進一步包括抗原呈現飼養細胞。
  81. 如請求項78之細胞培養基，其中該細胞培養基進一步包括約6,000 IU/mL IL-2。
  82. 如請求項78之細胞培養基，其中該細胞培養基進一步包括約3,000 IU/mL IL-2及約30 ng/mL OKT-3。
  83. 如請求項78之細胞培養基，其中該細胞培養基進一步包括約3,000 IU/mL IL-2、約30 ng/mL OKT-3及抗原呈現飼養細胞。
  84. 如請求項78之細胞培養基，其中該細胞培養基進一步包括約6,000 IU/mL IL-2、約30 ng/mL OKT-3及抗原呈現飼養細胞。
  85. 如請求項78之細胞培養基，其中該細胞培養基進一步包括約3,000 IU/mL IL-2。
  86. 一種腫瘤浸潤淋巴球組成物，其包括： a) 複數個腫瘤浸潤淋巴球(TIL)；及 b) 細胞培養基組成物，其包括： i. 基礎培養基，其包括： 1. 葡萄糖， 2. 複數種鹽， 3. 複數種胺基酸及維生素； ii. 麩醯胺酸或麩醯胺酸衍生物； iii. 血清；及 iv. 抗生素組分，其包括：I)選自以下之抗生素組合： 1. 建它黴素及萬古黴素；及 2. 建它黴素及克林達黴素；或 II)抗生素萬古黴素。
  87. 一種腫瘤浸潤淋巴球組成物，其包括： a) 複數個腫瘤浸潤淋巴球(TIL)；及 b) 細胞培養基組成物，該細胞培養基組成物係合成培養基或無血清培養基，該培養基包括： i. 葡萄糖； ii. 複數種鹽； iii. 複數種胺基酸及維生素； c) 視情況選用之轉鐵蛋白； d) 視情況選用之胰島素； e) 視情況選用之白蛋白； f) 膽固醇NF； g) 視情況選用之麩醯胺酸或麩醯胺酸衍生物；以及 h) 抗生素組分，其包括：1)選自以下之抗生素組合： i. 建它黴素及萬古黴素；及 ii. 建它黴素及克林達黴素；或 2)抗生素萬古黴素。
  88. 如請求項87之組成物，其中該組成物包括(視情況重組之)轉鐵蛋白、(視情況重組之)胰島素及(視情況重組之)白蛋白。
  89. 如請求項87或88之細胞培養基，其中該合成培養基或無血清培養基包括基礎培養基及血清補充劑及/或血清替代物。
  90. 如請求項89之組成物，其中該基礎細胞培養基包含但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無外源物質培養基、杜爾貝科氏改良型伊格爾氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及伊斯科夫氏改良型杜爾貝科氏培養基。
  91. 如請求項89或90之組成物，其中該血清補充劑或血清替代物係選自由以下組成之群組：CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑及CTS™免疫細胞血清替代物。
  92. 如請求項87至91中任一項之組成物，其中該合成培養基或無血清培養基包括一或多種白蛋白或白蛋白代用品。
  93. 如請求項87至92中任一項之組成物，其中該合成培養基或無血清培養基包括一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白代用品。
  94. 如請求項87至93中任一項之組成物，其中該合成培養基或無血清培養基包括一或多種胰島素或胰島素代用品。
  95. 如請求項87至94中任一項之組成物，其中該合成培養基或無血清培養基包括一或多種抗氧化劑。
  96. 如請求項87至95中任一項之組成物，其中該合成培養基或無血清培養基包括一或多種膠原蛋白前驅物及一或多種微量元素。
  97. 如請求項87至96中任一項之組成物，其中該合成培養基或無血清培養基包括一或多種選自由以下組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸酯、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素以及含有微量元素部分Ag +、Al 3+、Ba 2+、Cd 2+、Co 2+、Cr 3+、Ge 4+、Se 4+、Br、T、Mn 2+、P、Si 4+、V 5+、Mo 6+、Ni 2+、Rb +、Sn 2+及Zr 4+之化合物。
  98. 如請求項87至97中任一項之細胞培養基，其中該合成培養基或無血清培養基進一步包括L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰基乙醇。
  99. 如請求項86至98中任一項之組成物，其中該複數個TIL展現出至少90%之活細胞。
  100. 如請求項86至99中任一項之組成物，其中該複數個TIL展現出與不含萬古黴素及克林達黴素之對照腫瘤浸潤淋巴球組成物類似的記憶性TIL群體。
  101. 如請求項86至100中任一項之組成物，其中該複數個TIL展現出與不含萬古黴素及克林達黴素之對照腫瘤浸潤淋巴球組成物類似的分化CD3+/CD4+、活化CD3+/CD4+及耗竭CD3+/CD4+ TIL群體。
  102. 如請求項86至100中任一項之組成物，其中該複數個TIL展現出與不含萬古黴素及克林達黴素之對照腫瘤浸潤淋巴球組成物類似的分化CD3+/CD8+、活化CD3+/CD8+及耗竭CD3+/CD8+ TIL群體。
  103. 如請求項86至102中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  104. 如請求項86至102中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  105. 如請求項86至102中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括約400-600 µM濃度之克林達黴素。
  106. 如請求項86至102中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括約50 µg/mL濃度之建它黴素。
  107. 如請求項86至102中任一項之組成物，其中該抗生素組分係約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  108. 如請求項86至102中任一項之組成物，其中該抗生素組分係約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  109. 如請求項86至102中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素及約400-600 µg/mL克林達黴素。
  110. 如請求項86至102中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素及約50-600 µg/mL萬古黴素。
  111. 如請求項86至102中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL萬古黴素。
  112. 如請求項86或89至111中任一項之組成物，其中該基礎培養基係RPMI 1640培養基、DMEM培養基或其組合。
  113. 如請求項86或89至111中任一項之組成物，其中該基礎培養基係DMEM培養基。
  114. 如請求項86至113中任一項之組成物，其中該組成物包括麩醯胺酸衍生物L-丙胺酸-L-麩醯胺酸(GutaMAX)。
  115. 如請求項86至113中任一項之組成物，其中該組成物包括麩醯胺酸，即L-麩醯胺酸。
  116. 如請求項86之組成物，其中該血清係人類AB血清。
  117. 如請求項86至116中任一項之組成物，其中該細胞培養基進一步包括IL-2。
  118. 如請求項117之組成物，其中該IL-2係約3,000-6,000 IU/mL濃度之IL-2。
  119. 如請求項117之組成物，其中該細胞培養基進一步包括抗CD3抗體。
  120. 如請求項119之組成物，其中該抗CD3抗體係約30 ng/mL濃度之OKT-3。
  121. 如請求項86至120中任一項之組成物，其中該細胞培養基進一步包括抗原呈現飼養細胞。
  122. 如請求項86至121中任一項之組成物，其中該細胞培養基包括約6,000 IU/mL IL-2。
  123. 如請求項86至120中任一項之組成物，其中該細胞培養基進一步包括約6,000 IU/mL IL-2、約30 ng/mL OKT-3及抗原呈現飼養細胞。
  124. 如請求項86至123中任一項之組成物，其中該組成物實質上不含革蘭氏陽性細菌。
  125. 一種用於擴增T細胞之方法，其包括藉由在包括抗生素組分之培養基中培養獲自個體之腫瘤樣本中的第一T細胞群體以實現該第一T細胞群體之生長來擴增該第一T細胞群體，其中該抗生素組分包括：i)抗生素組合，該抗生素組合選自1)建它黴素及萬古黴素，以及2)建它黴素及克林達黴素；或ii)抗生素萬古黴素。
  126. 如請求項125之方法，其中該培養基包括IL-2。
  127. 如請求項125之方法，其中將該第一T細胞群體培養約7至14天之時段。
  128. 一種用於快速擴增T細胞之方法，其包括使第一T細胞群體與包括IL-2、OKT-3(抗CD3抗體)、抗原呈現細胞(APC)及抗生素組分之培養基接觸以實現該第一T細胞群體之快速生長，由此產生第二T細胞群體，其中該快速擴增係進行約7至14天之時段，且其中該抗生素組分包括：i)抗生素組合，該抗生素組合選自1)建它黴素及萬古黴素，以及2)建它黴素及克林達黴素；或ii)抗生素萬古黴素。
  129. 如請求項125至128中任一項之方法，其中該培養基進一步包括IL-15及IL-21。
  130. 如請求項125至129中任一項之方法，其中該抗生素組分包括約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  131. 如請求項125至129中任一項之方法，其中該抗生素組分包括約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  132. 如請求項125至129中任一項之方法，其中該抗生素組分係約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  133. 如請求項125至129中任一項之方法，其中該抗生素組分包括約400-600 µg/mL濃度之克林達黴素。
  134. 如請求項125至129中任一項之方法，其中該抗生素組分包括約50 µg/mL濃度之建它黴素。
  135. 如請求項125至129中任一項之方法，其中該抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL濃度之建它黴素及約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  136. 如請求項125至135中任一項之方法，其中該擴增在實質上不含革蘭氏陽性細菌之條件下發生。
  137. 一種用於將腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其包括： a) 提供獲自個體腫瘤切除的包括複數個腫瘤細胞及TIL之樣本； b) 藉由將該樣本處理成多個片段，獲得第一TIL群體； c) 將該等片段添加至密閉系統中； d) 藉由在第一細胞培養基中培養該第一TIL群體來進行第一次擴增以產生第二TIL群體，其中該第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中該第一次擴增進行約3-14天以獲得該第二TIL群體，其中自步驟c)至步驟d)之轉變係在不打開該系統之情況下發生，且其中該第一細胞培養基包括IL-2及第一抗生素組分； e) 藉由在第二細胞培養基中培養該第二TIL群體來進行第二次擴增以產生第三TIL群體，其中該第二次擴增係進行約7-14天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體係治療性TIL群體，其中該第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中自步驟d)至步驟e)之轉變係在不打開該系統之情況下發生，其中該第二細胞培養基包括IL-2、OKT-3、抗原呈現細胞(APC)及視情況選用之第二抗生素組分； f) 收集自步驟e)獲得的治療性TIL群體，其中自步驟e)至步驟f)之轉變係在不打開該系統之情況下發生；及 g) 將自步驟f)收集之TIL群體之治療性群體轉移至輸注袋，其中自步驟f)至步驟g)之轉移係在不打開該系統之情況下發生； 其中該第一抗生素組分及視情況選用之該第二抗生素組分包括：i)抗生素組合，該抗生素組合選自1)建它黴素及萬古黴素，以及2)建它黴素及克林達黴素；或ii)抗生素萬古黴素。
  138. 如請求項137之方法，其中在步驟d)之前，該方法進一步包括進行以下步驟： (i)在包括IL-2及該第一培養基的視情況選用之該第一抗生素組分的培養基中培養該第一TIL群體，以獲得自該多個腫瘤片段釋放之TIL， (ii)自該多個腫瘤片段分離至少複數個在步驟(i)中自該多個腫瘤片段釋放之TIL以獲得該多個腫瘤片段、該多個腫瘤片段中殘留之TIL及自該多個腫瘤片段釋放且在該分離之後與其一起殘留之任何TIL的混合物，以及 (iii) 視情況消化該多個腫瘤片段、該多個腫瘤片段中殘留之TIL及自該多個腫瘤片段釋放且在該分離之後與其一起殘留之任何TIL的混合物，以產生該混合物之消化物；且 其中在步驟d)中，該混合物或該混合物之消化物係在該第一細胞培養基中培養以獲得該第二TIL群體。
  139. 如請求項137之方法，其中在步驟d)中進行的該第一次擴增包括： (i) 在該第一細胞培養基中培養該第一TIL群體約3-14天，以獲得自該等腫瘤片段釋放之TIL， (ii) 自該等腫瘤片段分離至少複數個在步驟(i)中自該等腫瘤片段釋放之TIL以獲得呈該等腫瘤片段、該等腫瘤片段中殘留之TIL及自該等腫瘤片段釋放且在該分離之後與其一起殘留之任何TIL的混合物形式之該第二TIL群體，以及 (iii) 視情況消化該等腫瘤片段、該等腫瘤片段中殘留之TIL及自該等腫瘤片段釋放且在該分離之後與其一起殘留之任何TIL的混合物，以產生該混合物之消化物；且 其中在步驟e)中，該第二次擴增係藉由在該第二培養基中擴增呈該混合物或該混合物之消化物形式的該第二TIL群體約7-14天來進行，由此產生該第三TIL群體。
  140. 一種用於將腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其包括： a) 提供自手術切除、穿刺活體組織切片檢查、粗針活體組織切片檢查、小型活體組織切片檢查或用於自個體獲得含有腫瘤及TIL之第一混合物之樣本的其他方式獲得的第一TIL群體； b) 在第一細胞培養基中進行該第一TIL群體之初始第一次擴增以獲得第二TIL群體，其中該第一細胞培養基包括IL-2、視情況選用之OKT-3(抗CD3抗體)、視情況選用之抗原呈現細胞(APC)及第一抗生素組分，其中該初始第一次擴增進行約1至7或8天時段，且其中該第二TIL群體的數目大於該第一TIL群體之數目； c) 在第二細胞培養基中進行該第二TIL群體之快速第二次擴增以獲得治療性TIL群體，其中該第二細胞培養基包括IL-2、OKT-3、視情況選用之第二抗生素組分及APC；且其中該快速擴增係在約1至11天之時段內進行；以及 d) 收集該治療性TIL群體， 其中該第一培養基之該第一抗生素組分及該第二培養基的視情況選用之該第二抗生素組分包括：i)抗生素組合，該抗生素組合選自：1)建它黴素及萬古黴素，以及2)建它黴素及克林達黴素；或ii)抗生素萬古黴素。
  141. 如請求項140之方法，其中該快速第二次擴增係在約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天之時段內進行。
  142. 如請求項140之方法，其中在步驟b)中，該第一細胞培養基進一步包括APC，且其中步驟c)中的該第二培養基中APC之數目大於步驟b)中的該第一培養基中APC之數目。
  143. 如請求項140之方法，其中在步驟b)之前，該方法進一步包括進行以下步驟： (i)在包括IL-2及視情況選用之該第一抗生素組分的培養基中培養該第一TIL群體以獲得自該樣本釋放之TIL， (ii) 自該樣本分離至少複數個在步驟(i)中自該樣本釋放之TIL以獲得該樣本、該樣本中殘留之TIL及自該樣本釋放且在該分離之後與其一起殘留之任何TIL的第二混合物，以及 (iii) 視情況消化該樣本、該樣本中殘留之TIL及自該樣本釋放且在該分離之後與其一起殘留之任何TIL的第二混合物，以產生該第二混合物之消化物；且 其中步驟b)包括在該第一細胞培養基中進行呈該第二混合物或該第二混合物之消化物形式的該第一TIL群體之初始第一次擴增以獲得該第二TIL群體。
  144. 如請求項140之方法，其中步驟a)包括藉由自該個體之腫瘤切除樣本並將該樣本處理成含有來自該個體之腫瘤及TIL之混合物的多個腫瘤片段，提供該第一TIL群體。
  145. 如請求項144之方法，其中在步驟b)之前，該方法進一步包括進行以下步驟： (i)在包括IL-2及該第一培養基的視情況選用之該第一抗生素組分的培養基中培養該第一TIL群體，以獲得自該多個腫瘤片段釋放之TIL， (ii) 自該多個腫瘤片段分離至少複數個在步驟(i)中自該樣本釋放之TIL以獲得該樣本、該多個腫瘤片段中殘留之TIL及自該多個腫瘤片段釋放且在該分離之後與其一起殘留之任何TIL的第二混合物，以及 (iii) 視情況消化該多個腫瘤片段、該多個腫瘤片段中殘留之TIL及自該多個腫瘤片段釋放且在該分離之後與其一起殘留之任何TIL的第二混合物，以產生該第二混合物之消化物；且 其中步驟(b)包括在該第一細胞培養基中進行呈該第二混合物或該第二混合物之消化物形式的該第一TIL群體之初始第一次擴增以獲得該第二TIL群體。
  146. 一種擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之方法，其包括： a) 藉由在包括第一抗生素組分之第一培養基中培養自手術切除、穿刺活體組織切片檢查、粗針活體組織切片檢查、小型活體組織切片檢查或用於自個體獲得含有腫瘤及TIL之混合物之樣本的其他方式獲得的第一TIL群體以實現該第一TIL群體之生長且起始其活化，進行該第一TIL群體之初始第一次擴增； b) 在步驟a)中起始的該第一TIL群體之活化開始衰退之後，藉由在視情況包括第二抗生素組分之第二培養基中培養該第一TIL群體以實現該第一TIL群體之生長且增強其活化，進行該第一TIL群體之快速第二次擴增以獲得第二TIL群體，其中該第二TIL群體係治療性TIL群體；以及 c) 收集該治療性TIL群體， 其中該第一培養基之該第一抗生素組分及該第二培養基的視情況選用之該第二抗生素組分包括：i)抗生素組合，該抗生素組合選自：1)建它黴素及萬古黴素，以及2)建它黴素及克林達黴素；或ii)抗生素萬古黴素。
  147. 如請求項146之方法，其中在步驟a)中，該第一培養基進一步包括IL-2及OKT-3(抗CD3抗體)，以及視情況選用之抗原呈現細胞(APC)，且其中在步驟(b)中，該第二培養基進一步包括IL-2、OKT-3及APC。
  148. 一種用於將腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其包括： a) 提供自手術切除、穿刺活體組織切片檢查、粗針活體組織切片檢查、小型活體組織切片檢查或用於自個體獲得含有腫瘤及TIL之第一混合物之樣本的其他方式獲得的第一TIL群體； b) 在第一細胞培養基中進行該第一TIL群體之第一次擴增以獲得第二TIL群體，其中該第一細胞培養基包括IL-2及第一抗生素組分，其中該第一次擴增進行約3至14天之時段，其中該第二TIL群體之數目大於該第一TIL群體之數目； c) 在第二細胞培養基中進行該第二TIL群體之第二次擴增以獲得治療性TIL群體，其中該第二細胞培養基包括IL-2、OKT-3、視情況選用之第二抗生素組分及抗原呈現細胞(APC)，且其中該第二次擴增係在約7至14天時段內進行；以及 d) 收集該治療性TIL群體， 其中該第一培養基之該第一抗生素組分及該第二培養基的視情況選用之該第二抗生素組分包括：i)抗生素組合，該抗生素組合選自：1)建它黴素及萬古黴素，以及2)建它黴素及克林達黴素；或ii)抗生素萬古黴素。
  149. 如請求項148之方法，其中該第一次擴增係在約11天時段內進行。
  150. 如請求項148之方法，其中該第二次擴增係在約11天時段內進行。
  151. 如請求項148之方法，其中該第一次擴增及該第二次擴增係在約22天時段內進行。
  152. 如請求項148之方法，其中在步驟b)之前，該方法進一步包括進行以下步驟： (i)在包括IL-2及該第一培養基的視情況選用之該第一抗生素組分的培養基中培養該第一TIL群體，以獲得自該樣本釋放之TIL， (ii) 自該樣本分離至少複數個在步驟(i)中自該樣本釋放之TIL以獲得該樣本、該樣本中殘留之TIL及自該樣本釋放且在該分離之後與其一起殘留之任何TIL的第二混合物，以及 (iii) 視情況消化該樣本、該樣本中殘留之TIL及自該樣本釋放且在該分離之後與其一起殘留之任何TIL的第二混合物，以產生該第二混合物之消化物；且 其中步驟b)包括在該第一細胞培養基中進行呈該第二混合物或該第二混合物之消化物形式的該第一TIL群體之初始第一次擴增以獲得該第二TIL群體。
  153. 如請求項148之方法，其中在步驟b)中進行的該第一次擴增包括： (i) 在該第一細胞培養基中培養該第一TIL群體約3-14天，以獲得自該樣本釋放之TIL， (ii) 自該樣本分離至少複數個在步驟(i)中自該樣本釋放之TIL以獲得呈該樣本、該樣本中殘留之TIL及自該樣本釋放且在該分離之後與其一起殘留之任何TIL的第二混合物形式的第二TIL群體，以及 (iii) 視情況消化該樣本、該樣本中殘留之TIL及自該樣本釋放且在該分離之後與其一起殘留之任何TIL的第二混合物，以產生該第二混合物之消化物；且 其中在步驟c)中，該第二次擴增係藉由在該第二細胞培養基中擴增呈該第二混合物或該第二混合物之消化物形式的該第二TIL群體約7-11天來進行，以產生該治療性TIL群體。
  154. 如請求項148之方法，其中步驟a)包括藉由自該個體之腫瘤切除樣本並將該樣本處理成含有來自該個體之腫瘤及TIL之混合物的多個腫瘤片段，提供該第一TIL群體。
  155. 如請求項154之方法，其中在步驟b)之前，該方法進一步包括進行以下步驟： (i) 在包括IL-2及視情況選用之該第一抗生素組分的培養基中培養該第一TIL群體以獲得自該多個腫瘤片段釋放之TIL， (ii) 自該多個腫瘤片段分離至少複數個在步驟(i)中自該樣本釋放之TIL以獲得該樣本、該多個腫瘤片段中殘留之TIL及自該多個腫瘤片段釋放且在該分離之後與其一起殘留之任何TIL的第二混合物，以及 (iii) 視情況消化該多個腫瘤片段、該多個腫瘤片段中殘留之TIL及自該多個腫瘤片段釋放且在該分離之後與其一起殘留之任何TIL的第二混合物，以產生該第二混合物之消化物， 其中步驟b)包括在該第一細胞培養基中進行呈該第二混合物或該第二混合物之消化物形式的該第一TIL群體之第一次擴增以產生該第二TIL群體。
  156. 如請求項154之方法，其中在步驟b)中進行的該第一次擴增包括： (i) 在該第一細胞培養基中培養該第一TIL群體約3-14天，以獲得自該等腫瘤片段釋放之TIL， (ii) 自該等腫瘤片段分離至少複數個在步驟(i)中自該等腫瘤片段釋放之TIL以獲得呈該等腫瘤片段、該等腫瘤片段中殘留之TIL及自該等腫瘤片段釋放且在該分離之後與其一起殘留之任何TIL的第二混合物形式之該第二TIL群體，以及 (iii) 視情況消化該等腫瘤片段、該等腫瘤片段中殘留之TIL及自該等腫瘤片段釋放且在該分離之後與其一起殘留之任何TIL的第二混合物，以產生該第二混合物之消化物， 其中在步驟c)中，該第二次擴增係藉由在該第二細胞培養基中擴增呈該第二混合物或該混合物之消化物形式的該第二TIL群體約7-14天來進行，以產生該治療性TIL群體。
  157. 如請求項137至156中任一項之方法，其中該第一細胞培養基及/或該第二細胞培養基進一步包括IL-15及IL-21。
  158. 如請求項137至157中任一項之方法，其中該第一抗生素組分包括約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  159. 如請求項137至157中任一項之方法，其中該第一抗生素組分包括約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  160. 如請求項137至157中任一項之方法，其中該第一抗生素組分包括約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  161. 如請求項137至157中任一項之方法，其中該第一抗生素組分係約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  162. 如請求項137至157中任一項之方法，其中該第一抗生素組分包括約400-600 µg/mL濃度之克林達黴素。
  163. 如請求項137至162中任一項之方法，其中該第一抗生素組分包括約50 µg/mL濃度之建它黴素。
  164. 如請求項137至157中任一項之方法，其中該第一抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL濃度之建它黴素及約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  165. 如請求項137至164中任一項之方法，其中由在該第一細胞培養基中進行該第一次擴增獲得的TIL群體展現出至少90%的活細胞。
  166. 如請求項137至165中任一項之方法，其中由在該第一細胞培養基中進行該第一次擴增獲得的TIL群體展現出與由在不含萬古黴素及克林達黴素之對照細胞培養基中進行TIL擴增獲得的TIL群體類似之記憶性TIL群體。
  167. 如請求項137至166中任一項之方法，其中由在該第一細胞培養基中進行該第一次擴增獲得的TIL群體展現出與由在不含萬古黴素及克林達黴素之對照細胞培養基中進行TIL擴增獲得的TIL群體類似之分化CD3+/CD4+、活化CD3+/CD4+及耗竭CD3+/CD4+ TIL群體。
  168. 如請求項137至167中任一項之方法，其中由在該第一細胞培養基中進行該第一次擴增獲得的TIL群體展現出與由在不含萬古黴素及克林達黴素之對照細胞培養基中進行TIL擴增獲得的TIL群體類似之分化CD3+/CD8+、活化CD3+/CD8+及耗竭CD3+/CD8+ TIL群體。
  169. 如請求項137至168中任一項之方法，其中該第一細胞培養基包括約6,000 IU/mL IL-2。
  170. 如請求項137至169中任一項之方法，其中該第一細胞培養基進一步包括OKT-3及抗原呈現飼養細胞。
  171. 如請求項137至170中任一項之細胞培養基，其中該第一細胞培養基包括約6,000 IU/mL IL-2及30 ng/mL OKT-3。
  172. 如請求項137至171中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包括約3,000 IU/mL IL-2及30 ng/mL OKT-3。
  173. 如請求項137至171中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包括6,000 IU/mL IL-2及30 ng/mL OKT-3。
  174. 如請求項137至173中任一項之方法，其中該第一次擴增及該第二次擴增係在實質上不含革蘭氏陽性細菌之條件下發生。
  175. 如請求項137至174中任一項之方法，其中該樣本係提供於低溫儲存培養基中，該低溫儲存培養基包括： a) 無血清、無動物組分之冷凍保存培養基；及 b) 第三抗生素組分，該抗生素組分包括：1)選自以下之抗生素組合： i. 建它黴素、兩性黴素B及萬古黴素，以及 ii. 建它黴素、兩性黴素B及克林達黴素；或 2)抗生素萬古黴素。
  176. 如請求項137至174中任一項之方法，其中該第一TIL群體係自該個體之樣本獲得，其中該樣本係提供於低溫儲存培養基中，該低溫儲存培養基包括： a) 無血清、無動物組分之冷凍保存培養基；及 b) 第三抗生素組分，該抗生素組分包括：1)選自以下之抗生素組合： i. 建它黴素、兩性黴素B及萬古黴素，以及 ii. 建它黴素、兩性黴素B及克林達黴素；或 2)抗生素萬古黴素。
  177. 如請求項175或176之方法，其中該第三抗生素組分包括在該低溫儲存培養基中約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  178. 如請求項175或176之方法，其中該第三抗生素組分包括在該低溫儲存培養基中約400-600 µg/mL濃度之克林達黴素。
  179. 如請求項175或176之方法，其中該第三抗生素組分包括在該低溫儲存培養基中約50 µg/mL濃度之建它黴素。
  180. 如請求項175或176之方法，其中該第三抗生素組分包括在該低溫儲存培養基中約2.5-10 µg/mL濃度之兩性黴素B。
  181. 如請求項175或176之方法，其中該低溫儲存培養基中之該第三抗生素組分包括約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  182. 如請求項175或176之方法，其中該低溫儲存培養基中之該第三抗生素組分包括約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  183. 如請求項175或176之方法，其中該低溫儲存培養基中之該第三抗生素組分係約100 µg/mL萬古黴素濃度之萬古黴素。
  184. 如請求項175或176之方法，其中該低溫儲存培養基中之該第三抗生素組分係抗生素組合，該抗生素組合包括約100 µg/mL萬古黴素濃度之萬古黴素及約50 µg/mL濃度之建它黴素。
  185. 如請求項175或176之方法，其中該低溫儲存培養基中之該第三抗生素組分包括約50 µg/mL建它黴素、約2.5 -10 /mL兩性黴素B及約400-600 µM克林達黴素。
  186. 如請求項175或176之方法，其中該低溫儲存培養基中之該抗生素組分包括約50 µg/mL建它黴素、約2.5 -10 µg/mL兩性黴素B及約50-600 µg/mL萬古黴素。
  187. 一種根據請求項137至186中任一項之方法產生的治療性TIL群體。
  188. 一種用於將腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，其包括： a) 藉由將自個體獲得之腫瘤樣本消化成腫瘤消化物而自該個體切除之腫瘤獲得及/或接受第一TIL群體； b) 自步驟a)中呈該腫瘤消化物形式之該第一TIL群體選擇PD-l陽性TIL，以獲得富含PD-l之TIL群體； c) 藉由在包括IL-2、OKT-3、第一抗生素組分及抗原呈現細胞(APC)之第一細胞培養基中培養該富含PD-l之TIL群體來進行初始第一次擴增，以產生第二TIL群體，其中該初始第一次擴增係在包括第一透氣表面區域之容器中進行，其中該初始第一次擴增係進行約1至7/8天之第一時段以獲得該第二TIL群體，其中該第二TIL群體之數目大於該第一TIL群體之數目； d) 藉由在包括IL-2、OKT-3、視情況選用之第二抗生素組分及APC之第二培養基中培養該第二TIL群體來進行快速第二次擴增，以產生治療性TIL群體，其中在該快速第二次擴增中添加之APC的數目係在步驟b)中添加之APC之數目的至少兩倍，其中該快速第二次擴增係進行約1至11天之第二時段以獲得該治療性TIL群體，其中該快速第二次擴增係在包括第二透氣表面區域之容器中進行； e) 收集自步驟d)獲得之治療性TIL群體；以及 f) 將自步驟e)收集之TIL群體轉移至輸注袋， 其中該第一培養基之該第一抗生素組分及該第二培養基的視情況選用之該第二抗生素組分包括：i)抗生素組合，該抗生素組合選自：1)建它黴素及萬古黴素，以及2)建它黴素及克林達黴素；或ii)抗生素萬古黴素。
  189. 如請求項188之方法，其中該第一抗生素組分包括約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  190. 如請求項188之方法，其中該第一抗生素組分包括約400-600 µg/mL濃度之克林達黴素。
  191. 如請求項188之方法，其中該第一抗生素組分包括約50 µg/mL濃度之建它黴素。
  192. 如請求項188之方法，其中該第一抗生素組分包括約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  193. 如請求項188之方法，其中該第一抗生素組分係約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  194. 如請求項188之方法，其中該第一抗生素組分係抗生素組合，該抗生素組合包括約100 µg/mL濃度之萬古黴素及約50 µg/mL濃度之建它黴素。
  195. 如請求項137至194中任一項之方法，其中該第二TIL群體展現出至少90%的活細胞。
  196. 如請求項137至195中任一項之方法，其中該第二TIL群體展現出與在不含萬古黴素及克林達黴素之對照第一細胞培養基中自該第一TIL群體擴增之第二TIL群體類似之記憶性TIL群體。
  197. 如請求項137至196中任一項之方法，其中該第二TIL群體展現出與在不含萬古黴素及克林達黴素之對照第一細胞培養基中自該第一TIL群體擴增的第二TIL群體類似之分化CD3+/CD4+、活化CD3+/CD4+及耗竭CD3+/CD4+ TIL群體。
  198. 如請求項137至197中任一項之方法，其中該第二TIL群體展現出與在不含萬古黴素及克林達黴素之對照第一細胞培養基中自該第一TIL群體擴增的第二TIL群體類似之分化CD3+/CD8+、活化CD3+/CD8+及耗竭CD3+/CD8+ TIL群體。
  199. 如請求項137至198中任一項之方法，其中該第一細胞培養基包括約6,000 IU/mL IL-2。
  200. 如請求項137至198中任一項之方法，其中該第一細胞培養基包括6,000 IU/mL IL-2及30 ng/mL OKT-3。
  201. 如請求項137至200中任一項之方法，其中該第二細胞培養基包括6,000 IU/mL IL-2及30 ng/mL OKT-3。
  202. 如請求項137至201中任一項之方法，其中步驟a)中之腫瘤樣本係提供於低溫儲存培養基中，該低溫儲存培養基包括： a) 無血清、無動物組分之冷凍保存培養基；及 b) 第三抗生素組分，該抗生素組分包括：1)選自以下之抗生素組合： i. 建它黴素及萬古黴素，及 ii. 建它黴素及克林達黴素；或 2)抗生素萬古黴素。
  203. 如請求項202之方法，其中該第三抗生素組分包括約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  204. 如請求項202之方法，其中該第三抗生素組分包括約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  205. 如請求項202之方法，其中該第三抗生素組分包括約400-600 µg/mL濃度之克林達黴素。
  206. 如請求項202之方法，其中該第三抗生素組分包括約50 µg/mL濃度之建它黴素。
  207. 如請求項202之方法，其中該第三抗生素組分包括約2.5-10 µg/mL濃度之兩性黴素B。
  208. 如請求項202之方法，其中該第三抗生素組分係約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  209. 如請求項202之方法，其中該第三抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素、約2.5-10 µg/mL兩性黴素B及約400-600 µg/mL克林達黴素。
  210. 如請求項202之方法，其中該第三抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素、約2.5-10 µg/mL兩性黴素B及約50-600 µg/mL萬古黴素。
  211. 如請求項202之方法，其中該第三抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL萬古黴素。
  212. 一種根據請求項137至211中任一項之方法產生的治療性TIL群體。
  213. 一種用於擴增來自周邊血液之周邊血液淋巴球(PBL)的方法，該方法包括以下步驟： a) 自患者之周邊血液獲得周邊血液單核細胞(PBMC)之樣本； b) 在包括第一細胞培養基之培養物中培養該等PBMC選自由以下組成之群組的時間段：約9天、約10天、約11天、約12天、約13天及約14天，由此實現來自該等PBMC之周邊血液淋巴球(PBL)之擴增，該第一細胞培養基具有IL-2、抗CD3/抗CD28抗體及第一抗生素組合；及 c) 自步驟(b)中該培養物收集該等PBL，其中該第一抗生素組分包括：i)抗生素組合，該抗生素組合選自1)建它黴素及萬古黴素，以及2)建它黴素及克林達黴素；或ii)抗生素萬古黴素。
  214. 如請求項213之方法，其中該患者用依魯替尼(ibrutinib)或另一種介白素-2誘導性T細胞激酶(ITK)抑制劑預治療。
  215. 如請求項214之方法，其中該患者難以用依魯替尼或該另一種ITK抑制劑治療。
  216. 如請求項213之方法，其中該第一抗生素組分包括約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  217. 如請求項213之方法，其中該第一抗生素組分包括約400-600 µg/mL濃度之克林達黴素。
  218. 如請求項213之方法，其中該第一抗生素組分包括約50 µg/mL濃度之建它黴素。
  219. 如請求項213之方法，其中自步驟(c)中該培養物收集的該等PBL展現出至少90%的活細胞。
  220. 如請求項213之方法，其中自步驟(c)中該培養物收集的該等PBL展現與在不含萬古黴素及克林達黴素之對照細胞培養基中自PBMC群體擴增之PBL群體類似的分化CD3+/CD4+、活化CD3+/CD4+及耗竭CD3+/CD4+ TIL群體。
  221. 如請求項213之方法，其中自步驟(c)中該培養物收集的該等PBL展現與在不含萬古黴素及克林達黴素之對照細胞培養基中自PBMC群體擴增之PBL群體類似的分化CD3+/CD8+、活化CD3+/CD8+及耗竭CD3+/CD8+ TIL群體。
  222. 如請求項213之方法，其中該第一細胞培養基包括約3,000 IU/mL IL-2。
  223. 如請求項213之方法，其中該等抗CD3抗體及該等抗CD28抗體係結合至珠粒。
  224. 如請求項223之方法，其中該等珠粒與該等PBMC以3個珠粒:1個PMBC細胞之比率混合於該培養物中。
  225. 如請求項224之方法，其中步驟b)包括將PBMC及珠粒之混合物以約25,000個細胞/平方公分至約50,000個細胞/平方公分之密度接種於透氣表面上，在該第一細胞培養基中培養約4天，將IL-2添加至該第一細胞培養基中，並培養約5天至約7天以獲得擴增之PBL。
  226. 如請求項213至225中任一項之方法，其中該培養係在實質上不含革蘭氏陽性細菌之條件下條件下進行。
  227. 如請求項213至226中任一項之方法，其中步驟a)中之該等PBMC係提供於低溫儲存培養基中，該低溫儲存培養基包括： a) 無血清、無動物組分之冷凍保存培養基；及 b) 第二抗生素組分，該抗生素組分包括：1)選自以下之抗生素組合： i. 建它黴素及萬古黴素，及 ii. 建它黴素及克林達黴素；或 2)抗生素萬古黴素。
  228. 如請求項227之方法，其中該第二抗生素組分包括在該低溫儲存培養基中約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  229. 如請求項227之方法，其中該第二抗生素組分包括在該低溫儲存培養基中約400-600 µg/mL濃度之克林達黴素。
  230. 如請求項227之方法，其中該第二抗生素組分包括在該低溫儲存培養基中約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  231. 如請求項227之方法，其中該第二抗生素組分係在該低溫儲存培養基中約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  232. 如請求項227之方法，其中該第二抗生素組分包括在該低溫儲存培養基中約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  233. 如請求項227之方法，其中該第二抗生素組分包括在該低溫儲存培養基中約50 µg/mL濃度之建它黴素。
  234. 如請求項227之方法，其中該第二抗生素組分包括在該低溫儲存培養基中約2.5-10 µg/mL濃度之兩性黴素B。
  235. 如請求項227之方法，其中該第二抗生素組分包括在該低溫儲存培養基中之抗生素組合，該抗生素組合包括約100 µg/mL萬古黴素及約50 µg/mL建它黴素。
  236. 如請求項227之方法，其中該第二抗生素組分包括在該低溫儲存培養基中之抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素、約2.5-10 µg/mL兩性黴素B及約400-600 µg/mL克林達黴素。
  237. 如請求項227之方法，其中該第二抗生素組分包括在該低溫儲存培養基中之抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素、約2.5-10 µg/mL兩性黴素B及約50-600 µg/mL萬古黴素。
  238. 一種根據請求項213至237中任一項之方法產生的PBL群體。
  239. 如請求項137至211中任一項之方法，其中在該培養該第一TIL群體之前，將該樣本在腫瘤洗滌緩衝液中洗滌至少一次，該洗滌緩衝液包括第四抗生素組分，該第四抗生素組分包括：1)抗生素組合，該抗生素組合選自： i. 建它黴素及萬古黴素，及 ii. 建它黴素及克林達黴素；或 2)抗生素萬古黴素。
  240. 如請求項239之方法，其中該第四抗生素組分包括在該洗滌緩衝液中約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  241. 如請求項239之方法，其中該第四抗生素組分包括在該洗滌緩衝液中約400-600 µg/mL濃度之克林達黴素。
  242. 如請求項239之方法，其中該第四抗生素組分包括在該洗滌緩衝液中約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  243. 如請求項239之方法，其中該第四抗生素組分係在該洗滌緩衝液中約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  244. 如請求項239之方法，其中該第四抗生素組分包括在該洗滌緩衝液中約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  245. 如請求項239之方法，其中該第四抗生素組分包括在該洗滌緩衝液中約50 µg/mL濃度之建它黴素。
  246. 如請求項239之方法，其中該第四抗生素組分包括在該洗滌緩衝液中約2.5-10 µg/mL濃度之兩性黴素B。
  247. 如請求項239之方法，其中該第四抗生素組分包括在該洗滌緩衝液中之抗生素組合，該抗生素組合包括約100 µg/mL萬古黴素及約50 µg/mL建它黴素。
  248. 如請求項239之方法，其中該第四抗生素組分包括在該洗滌緩衝液中之抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素、約2.5-10 µg/mL兩性黴素B及約400-600 µg/mL克林達黴素。
  249. 如請求項239之方法，其中該第四抗生素組分包括在該洗滌緩衝液中之抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素、約2.5-10 µg/mL兩性黴素B及約50-600 µg/mL萬古黴素。
  250. 如請求項239至249中任一項之方法，其中將該樣本在該洗滌緩衝液中洗滌至少三次。
  251. 一種腫瘤樣本組成物，其包括： a) 包括複數個腫瘤細胞及複數個腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之腫瘤樣本；及 b) 腫瘤洗滌緩衝液，該洗滌緩衝液包括： i. 一或多種選自鉀離子、鈉離子、鎂離子及鈣離子之電解質； ii. 在生理條件下有效之pH緩衝液；及 iii. 抗生素組分，該抗生素組分包括：a)選自以下之抗生素組合： 1. 建它黴素及萬古黴素，及 2. 建它黴素及克林達黴素；或 b)抗生素萬古黴素。
  252. 如請求項251之腫瘤樣本組成物，其中該腫瘤洗滌緩衝液在維持生理滲透壓方面有效。
  253. 如請求項251或252之腫瘤樣本組成物，其中該pH緩衝液係磷酸鹽緩衝液。
  254. 如請求項251之腫瘤樣本組成物，其中該腫瘤洗滌緩衝液係漢克氏平衡鹽溶液(HBSS)。
  255. 如請求項251至254中任一項之腫瘤樣本組成物，其中該腫瘤洗滌緩衝液進一步包括營養有效量之至少一種單糖。
  256. 如請求項255之腫瘤樣本組成物，其中該單糖係葡萄糖。
  257. 如請求項251至256中任一項之腫瘤樣本組成物，其中該腫瘤樣本係實體腫瘤樣本。
  258. 如請求項257之腫瘤樣本組成物，其中該腫瘤樣本係以下癌症類型中之一種：乳癌、胰臟癌、前列腺癌、結腸直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌、皮膚癌(包含但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑素瘤)、子宮頸癌、頭頸癌、神經膠母細胞瘤、卵巢癌、肉瘤、膀胱癌及神經膠母細胞瘤。
  259. 如請求項251至256中任一項之腫瘤樣本組成物，其中該腫瘤樣本係液體腫瘤樣本。
  260. 如請求項259之腫瘤樣本組成物，其中該液體腫瘤樣本係來自血液惡性病之液體腫瘤樣本。
  261. 如請求項251至256中任一項之腫瘤樣本組成物，其中該腫瘤樣本係自原發性腫瘤獲得。
  262. 如請求項251至256中任一項之腫瘤樣本組成物，其中該腫瘤樣本係自侵襲性腫瘤獲得。
  263. 如請求項251至256中任一項之腫瘤樣本組成物，其中該腫瘤樣本係自轉移性腫瘤獲得。
  264. 如請求項251至256中任一項之腫瘤樣本組成物，其中該腫瘤樣本係自惡性黑素瘤獲得。
  265. 如請求項251至264中任一項之腫瘤樣本組成物，其中該抗生素組分包括約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  266. 如請求項251至264中任一項之腫瘤樣本組成物，其中該抗生素組分包括約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  267. 如請求項251至264中任一項之腫瘤樣本組成物，其中該抗生素組分包括約400-600 µg/mL濃度之克林達黴素。
  268. 如請求項251至264中任一項之腫瘤樣本組成物，其中該抗生素組分包括約50 µg/mL濃度之建它黴素。
  269. 如請求項251至264中任一項之腫瘤樣本組成物，其中該抗生素組分係約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  270. 如請求項251至264中任一項之腫瘤樣本組成物，其中該抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素及約400-600 µg/mL克林達黴素。
  271. 如請求項251至264中任一項之腫瘤樣本組成物，其中該抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素及約50-600 µg/mL萬古黴素。
  272. 如請求項251至264中任一項之腫瘤樣本組成物，其中該抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL萬古黴素。
  273. 如請求項251至272中任一項之腫瘤樣本組成物，其中該抗生素組分進一步包括抗真菌性抗生素。
  274. 如請求項273之腫瘤樣本組成物，其中該抗真菌性抗生素係兩性黴素B。
  275. 如請求項274之腫瘤樣本組成物，其中該兩性黴素B係約2.5-10 µg/mL濃度。
  276. 一種用於洗滌腫瘤樣本之組成物，該組成物包括： i. 一或多種選自鉀離子、鈉離子、鎂離子及鈣離子之電解質； ii. 在生理條件下有效之pH緩衝液；及 iii. 抗生素組分，該抗生素組分包括：a)選自以下之抗生素組合： 1. 建它黴素及萬古黴素，及 2. 建它黴素及克林達黴素；或 b)抗生素萬古黴素。
  277. 如請求項276之組成物，其中該腫瘤洗滌緩衝液在維持生理滲透壓方面有效。
  278. 如請求項276或277之組成物，其中該pH緩衝液係磷酸鹽緩衝液。
  279. 如請求項276之組成物，其中該腫瘤洗滌緩衝液係漢克氏平衡鹽溶液(HBSS)。
  280. 如請求項276至279中任一項之組成物，其中該腫瘤洗滌緩衝液進一步包括營養有效量之至少一種單糖。
  281. 如請求項280之組成物，其中該單糖係葡萄糖。
  282. 如請求項276至281中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括約50-600 µg/mL濃度之萬古黴素。
  283. 如請求項276至281中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  284. 如請求項276至281中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括約400-600 µg/mL濃度之克林達黴素。
  285. 如請求項276至281中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括約50 µg/mL濃度之建它黴素。
  286. 如請求項276至281中任一項之組成物，其中該抗生素組分係約100 µg/mL濃度之萬古黴素。
  287. 如請求項276至281中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素及約400-600 µg/mL克林達黴素。
  288. 如請求項276至281中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素及約50-600 µg/mL萬古黴素。
  289. 如請求項276至281中任一項之組成物，其中該抗生素組分包括抗生素組合，該抗生素組合包括約50 µg/mL建它黴素及約100 µg/mL萬古黴素。
  290. 如請求項276至289中任一項之組成物，其中該抗生素組分進一步包括抗真菌性抗生素。
  291. 如請求項290之組成物，其中該抗真菌性抗生素係兩性黴素B。
  292. 如請求項291之組成物，其中該兩性黴素B係約2.5-10 µg/mL濃度。
  293. 如請求項239至250中任一項之方法，其中該第一抗生素組分與該第四抗生素組分相同。
  294. 如請求項239至250中任一項之方法，其中該第一抗生素組分與該第四抗生素組分不同。
  295. 如請求項227至237中任一項之方法，其中該第一抗生素組分與該第二抗生素組分相同。
  296. 如請求項227至237中任一項之方法，其中該第一抗生素組分與該第二抗生素組分不同。
  297. 如請求項202至211中任一項之方法，其中該第一抗生素組分與該第三抗生素組分相同。
  298. 如請求項202至211中任一項之方法，其中該第一抗生素組分與該第三抗生素組分不同。
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