ES2707152T3 - Diacuerpos covalentes y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Una molécula de diacuerpo que comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, en la que: (a) dicha primera cadena polipeptídica comprende, en la dirección desde N terminal hacia C terminal: (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de la cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de la cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo, y (hi) un tercer dominio que comprende la secuencia de aminoácidos FNRGEC (la SEQ ID NO: 23), la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 79) o la mutación V215A de las mismas que tiene la secuencia AEPKSC (residuos de aminoácidos 245-350 de SEQ ID NO: 18); y en la que dicho primer dominio y segundo dominio están unidos covalentemente entre sí mediante un conector peptídico de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 15 7, 8 o 9 residuos de aminoácidos, de forma que el primer dominio y el segundo dominio no se asocian para formar un sitio de unión del epítopo; y (b) dicha segunda cadena polipeptídica comprende, en la dirección desde N terminal hacia C terminal: (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de la cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2) (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de la cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1), y (iii) un sexto dominio que comprende la secuencia de aminoácidos FNRGEC (SEQ ID NO: 23), la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 79) o la mutación V215A de las mismas que tiene la secuencia AEPKSC (residuos de aminoácidos 245-350 de SEQ ID NO: 18); y en la que: (1) cuando dicho tercer dominio comprende dicha secuencia de aminoácidos FNRGEC (SEQ ID NO: 23), dicho sexto dominio comprende dicha secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 79) o la mutación V215A de la misma, y cuando dicho tercer dominio comprende dicha secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 79) o la mutación V215A de la misma, dicho sexto dominio comprende dicha secuencia de aminoácidos FNRGEC (SEQ ID NO: 23); (2) dicho cuarto dominio y quinto dominio están unidos covalentemente entre sí mediante un péptido de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 residuos de aminoácidos, de forma que el cuarto dominio y el quinto dominio no se asocian para formar un sitio de unión del epítopo; (3) dicha primera cadena polipeptídica y dicha segunda cadena polipeptídica están unidas covalentemente a 35 través de un puente de disulfuro entre dicho tercer dominio y dicho sexto dominio; (4) dicho primer dominio y dicho quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1) (VH1) que se une a dicho primer epítopo; 5) dicho segundo dominio y dicho cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que se une al segundo epítopo; y (6) dicho primer y segundo epítopo son diferentes; y en la que la molécula de diacuerpo es capaz de unirse simultáneamente al primer y al segundo epítopo.

Description

DESCRIPCIÓN
Diacuerpos covalentes y usos de los mismos
Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de EE.UU. n° 60/671.657 presentada el 15 de abril de 2005.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a moléculas de diacuerpos y a los usos de las mismas en el tratamiento de una enfermedad infecciosa y de cánceres. Las moléculas de diacuerpos de la invención comprenden al menos dos cadenas polipeptídicas que se asocian para formar al menos dos sitios de unión del epítopo, que pueden reconocer el mismo o diferentes epítopos. Adicionalmente, los epítopos pueden ser de la misma o de diferentes moléculas, o estar ubicados en la misma o en diferentes células. Las cadenas polipeptídicas individuales de la molécula del diacuerpo pueden estar unidas covalentemente a través de enlaces covalentes no peptídicos, tales como, pero no se limitan a, un puente de disulfuro de los residuos de cisteína ubicados en cada cadena polipeptídica. En algunas realizaciones en particular, las moléculas de diacuerpos de la presente invención comprenden adicionalmente una región Fc, que permite el diseño de una funcionalidad de tipo anticuerpo en la molécula.
Antecedentes de la invención
El diseño de diacuerpos covalentes se basa en la construcción de un Fv de cadena única (scFv) (Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90: 6444-6448). En una IgG intacta, sin modificar, los dominios VL y VH están ubicados en cadenas polipeptídicas individuales, es decir, en la cadena ligera y en la cadena pesada, respectivamente. La interacción de la cadena ligera de un anticuerpo y de la cadena pesada de un anticuerpo y, en particular, la interacción de los dominios VL y VH, forma uno de los sitios de unión del epítopo del anticuerpo. Por el contrario, la construcción scFv comprende un dominio VL y uno VH de un anticuerpo contenidos en una única cadena polipeptídica en la que los dominios están separados por un conector flexible con una longitud suficiente para permitir el autoensamblaje de los dos dominios en un sitio funcional de unión del epítopo. Cuando el autoensamblaje del es imposible debido a que el conector tiene una longitud insuficiente (menor de aproximadamente 12 residuos de aminoácidos), dos de las construcciones del scFv interactúan entre sí para formar una molécula bivalente, asociándose el VL de una cadena con el VH de la otra (revisado en Marvin et al., 2005, Acta Pharmacol. Sin. 26: 649-658). Además, se ha demostrado que la adición de un residuo de cisteína en el c terminal de la construcción permite la formación de un puente de disulfuro en las cadenas polipeptídicas, lo que estabiliza el dímero resultante sin interferir en las características de unión de la molécula bivalente (véase, por ejemplo, Olafsen et al., 2004, Prot. Engr. Des. Sel. 17: 21-27). Además, cuando se seleccionan unos dominios VL y Vh con una especificidad diferente, puede construirse no sólo una molécula bivalente, sino también una biespecífica. Los diacuerpos bivalentes tienen un amplio abanico de aplicaciones que incluyen la terapia y el inmunodiagnóstico. La bivalencia permite una gran flexibilidad en el diseño y la modificación del diacuerpo en diversas aplicaciones, proporcionando una avidez mejorada por los antígenos multiméricos, la reticulación de diferentes antígenos y un direccionamiento dirigido a unos tipos celulares específicos que se basa en la presencia de ambos antígenos objetivo. Debido al aumento en su valencia, a los bajos índices de disociación y al rápido aclaramiento de la circulación (para los diacuerpos de pequeño tamaño, a o por debajo de ~ 50 kDa), las moléculas de diacuerpos conocidas en la materia también han mostrado un uso en particular en el campo de la obtención de imágenes de tumores (Fitzgerald et al., 1997, Protein Eng. 10: 1221). Es de particular importancia la reticulación de las diferentes células, por ejemplo, la reticulación de los linfocitos T citotóxicos con las células tumorales (Staerz et al., 1985, Nature 314: 628-631 y Holliger et al., 1996, Protein Eng. 9: 299- 305). Los dominios de unión al epítopo del diacuerpo también pueden ser dirigidos a un determinante de la superficie de cualquier célula efectora inmunitaria tal como CD3, CD16, CD32 o CD64, que son expresados en los linfocitos T, en los linfocitos citolíticos naturales (células NK) o en otras células mononucleares. En muchos estudios, también se averiguó que la unión del diacuerpo a los determinantes de la célula efectora, por ejemplo, a los receptores Fcy (FcyR), activa la célula efectora (Holliger et al., 1996, Protein Eng. 9: 299-305; Holliger et al., 1999, Cancer Res. 59: 2909-2916). Normalmente, la activación de la célula efectora es desencadenada por la unión de un anticuerpo unido a un antígeno a una célula efectora a través de la interacción Fc-FcyR; por lo tanto, a este respecto, las moléculas de diacuerpos de la invención pueden mostrar una funcionalidad de tipo Ig independientemente de si comprenden un dominio Fc (por ejemplo, según se ensaya en cualquier ensayo de función efectora conocido en la materia o ejemplificado en el presente documento (por ejemplo, el ensayo de ADCC)). Mediante la reticulación de las células tumorales y de las células efectoras, el diacuerpo no sólo lleva la célula efectora a las proximidades de las células tumorales, sino que da lugar a una destrucción efectiva del tumor (véase, por ejemplo, Cao y Lam, 2003, Adv. Drug. Deliv. Rev. 55: 171-197).
Receptores de las células efectoras y sus papeles en el sistema inmunitario
En la fracción inmunitaria tradicional, la interacción de los complejos anticuerpo-antígeno con las células del sistema inmunitario da como resultado un amplio abanico de respuestas, que varían desde funciones efectoras tales como la citotoxicidad dependiente de anticuerpo, la desgranulación de los mastocitos y la fagocitosis, hasta señales inmunomoduladoras tales como la regulación de la proliferación de los linfocitos y de la secreción de anticuerpos.
Todas estas interacciones son iniciadas a través de la unión del dominio Fc de los anticuerpos o de los complejos inmunitarios a los receptores especializados en la superficie celular de las células hematopoyéticas. La diversidad de respuestas celulares desencadenadas por los anticuerpos y los complejos sin unitarios es el resultado de la heterogeneidad estructural de los receptores Fc. Los receptores Fc comparten unos dominios de unión al antígeno estructuralmente relacionados que posiblemente median en la señalización intracelular.
Los receptores Fcy, miembros de la superfamilia de proteínas de genes de las inmunoglobulinas, son glicoproteínas de la superficie que se unen a la porción Fcy de las moléculas de inmunoglobulina. Cada miembro de la familia reconoce las inmunoglobulinas de uno o más isotipos a través de un dominio de reconocimiento de la cadena alfa del receptor Fcy. Los receptores Fcy se identifican por su especificidad por el subtipo de inmunoglobulina. Los receptores Fcy para la IgG se denominan como FcyR, para la IgE como FceR y para la IgA como FcaR. Diferentes células auxiliares portan los receptores Fcy para los anticuerpos de diferente isotipo, y el isotipo del anticuerpo determina qué células auxiliares estarán implicadas en una respuesta dada (revisado por Ravetch J. V. et al. 1991, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92; Gerber J. S. et al. 2001 Microbes and Infection, 3: 131-139; Billadeau D. D. et al.
2002, The Journal of Clinical Investigation, 2 (109): 161-1681; Ravetch J. V. et al. 2000, Science, 290: 84-89; Ravetch J. V. et al., 2001 Annu. Rev. Immunol. 19: 275-90; Ravetch J. V. 1994, Cell, 78 (4): 553-60). Los diferentes receptores Fcy, las células que los expresan y su especificidad de isotipo, se resumen en la Tabla 1 (adaptada a partir de Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4a ed. 1999, Elsevier Science Ftd/Garland Publishing, Nueva York).
Receptores Fcy
Cada miembro de esta familia es una glicoproteína integral de membrana que posee dominios extracelulares y relacionados con un conjunto de dominios c2 relacionados con la inmunoglobulina, un único dominio que abarca la membrana y un dominio intracitoplasmático de longitud variable. Hay tres FcyR conocidos, denominados FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16). Los tres receptores son codificados por genes distintos; sin embargo, la gran homología entre los tres miembros de la familia sugiere que surgen a partir de un progenitor común, quizás mediante una duplicación génica.
FcyRII (CD32)
Las proteínas FcyRII son glicoproteínas integrales de membrana de 40 kDa que se unen únicamente a la IgG complejada debido a una baja afinidad por la Ig monomérica (106 M'1). Este receptor es el FcyR expresado más ampliamente, presente en todas las células hematopoyéticas, incluyendo monocitos, macrófagos, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales, neutrófilos, mastocitos y plaquetas. El FcyRII tiene únicamente dos regiones de tipo inmunoglobulina en su cadena de unión a la inmunoglobulina, y por lo tanto, una afinidad mucho menor por la IgG que el FcyRI. Hay tres genes humanos para el FcyRII (el FcyRII-A, el FcyRII-B, el FcyRII-C), todos los cuales se unen a la IgG en agregados o complejos inmunitarios.
Las distintas diferencias en los dominios citoplasmáticos del FcyRII-A y del FcyRII-B crean respuestas funcionalmente heterogéneas frente a la ligación del receptor. La diferencia fundamental es que la isoforma A inicia la señalización intracelular dando lugar a la activación celular, tal como la fagocitosis y la explosión respiratoria, mientras que la isoforma B inicia señales inhibidoras, por ejemplo, la inhibición de la activación de los linfocitos B.
FcyRIII (CD16)
Debido a la heterogeneidad en esta clase, el tamaño del FcyRIII varía entre 40 y 80 kDa en el ratón y el hombre. Dos genes humanos codifican dos transcritos, el FcyRIIIA, una glicoproteína integral de membrana, y el FcyRIIIB, una versión unida al glicosilfosfatidil-inositol (GPI). Un gen murino codifica un FcyRIII homólogo del FcyRIIIA humano que abarca la membrana. El FcyRIII comparte características estructurales con cada uno de los otros dos FcyR. Al igual que el FcyRII, el FcyRIII se une a la IgG con una baja afinidad y contiene los dos correspondientes dominios extracelulares de tipo Ig. El FcyRIIIA es expresado en los macrófagos, los mastocitos, y es el único FcyR en los linfocitos citolíticos naturales. Actualmente se sabe que el FcyRIIIB unido al GPI es expresado únicamente en los neutrófilos humanos.
Señalización a través de los FcyR
Las señales tanto de activación como de inhibición son transducidas a través de los FcyR después de la ligación. Estas funciones diametralmente opuestas son el resultado de las diferencias estructurales entre las diferentes isoformas de los receptores. Dos dominios característicos en los dominios de señalización citoplasmáticos del receptor, denominados motivos de activación del inmunorreceptor basados en tirosina (ITAM) o motivos de inhibición del inmunorreceptor basados en tirosina (ITIM), justifican las diferentes respuestas. El reclutamiento de las diferentes enzimas citoplasmáticas a estas estructuras dicta el resultado de las respuestas celulares mediadas por el FcyR. Los complejos del FcyR que contienen los ITAM incluyen el FcyRI, el FcyRiIA, el FcyRIIIA, mientras que los complejos que contienen los ITlM incluyen únicamente el FcyRIIB.
Los neutrófilos humanos expresan el gen FcyRIIA. El agolpamiento del FcyRIIA a través de complejos inmunitarios o de una reticulación específica del anticuerpo sirve para agregar los ITAM junto con las cinasas asociadas al receptor, lo que facilita la fosforilación del ITAm . La fosforilación del ITAM sirve como sitio de anclaje para la cinasa Syk, cuya activación da como resultado la activación de los sustratos cascada abajo (por ejemplo, la PI3K). La activación celular da lugar a la liberación de mediadores proinflamatorios.
El gen FcyRIIB es expresado en los linfocitos B; su dominio extracelular es idéntico en un 96 % al FcyRIIA y se une a los complejos de IgG de una forma indistinguible. La presencia de un ITIM en el dominio citoplasmático del FcyRIIB define esta subclase inhibidora del FcyR. Recientemente se ha establecido la base molecular de esta inhibición. Cuando se co-liga junto con un FcyR de activación, el ITIM del FcyRIIB queda fosforilado y atrae el dominio SH2 de la inosital polifosfato 5'-fosfatasa (SHIP), que hidroliza los mensajeros de fosfoinositol liberados como consecuencia de la activación de la cinasa de tirosina mediada por el FcyR que contiene el ITAM, impidiendo consecuentemente el flujo de entrada de Ca++ intracelular. Por lo tanto, la reticulación del FcyRIIB amortigua la respuesta de activación frente a la ligación del FcyR e inhibe la sensibilidad celular. Por lo tanto, se aborta la activación del linfocito B, la proliferación del linfocito B y la secreción del anticuerpo.
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Sumario de la invención
Según un primer aspecto de la presente invención se proporciona una molécula de diacuerpo según la reivindicación 1 del presente documento. La presente invención se refiere a diacuerpos covalentes y/o a moléculas covalentes de diacuerpos y a su uso en el tratamiento de una diversidad de enfermedades y de trastornos que incluyen el cáncer y las enfermedades infecciosas causadas por bacterias, hongos o virus. Preferiblemente, el diacuerpo de la presente invención puede unirse a dos epítopos diferentes de dos células diferentes, en las que el primer epítopo es expresado en un tipo de célula diferente al del segundo epítopo, de forma que el diacuerpo puede juntar las dos células.
El primer epítopo, el segundo epítopo y cuando sea aplicable, el tercer epítopo y el cuarto epítopo pueden ser diferentes entre sí. En ciertos aspectos de la invención que comprenden un tercer dominio de unión al epítopo, el primer epítopo y el tercer epítopo pueden ser el mismo. En ciertos aspectos de la invención que comprenden un cuarto dominio de unión al epítopo, el primer epítopo y el cuarto epítopo pueden ser el mismo. En ciertos aspectos de la invención que comprenden un tercer dominio de unión al epítopo, el segundo epítopo y el tercer epítopo pueden ser el mismo. En ciertos aspectos de la invención que comprenden un cuarto dominio de unión al epítopo, el segundo epítopo y el cuarto epítopo pueden ser el mismo. El primer eptitopo y el segundo epítopo son diferentes. En otros aspectos más de la invención que comprenden un tercer dominio de unión al epítopo y un cuarto dominio de unión al epítopo, el tercer epítopo y el cuarto epítopo pueden ser diferentes. Debe entenderse que cualquier combinación de lo anterior está englobada en la presente invención.
En algunos aspectos en particular de la invención, el primer dominio y el quinto dominio del diacuerpo o de la molécula de diacuerpo pueden derivar de la misma inmunoglobulina. En otro aspecto, el segundo dominio y el cuarto dominio del diacuerpo o de la molécula de diacuerpo pueden derivar de la misma inmunoglobulina. En otro aspecto más, el primer dominio y el quinto dominio del diacuerpo o de la molécula de diacuerpo pueden derivar de una inmunoglobulina diferente. En otro aspecto más, el segundo dominio y el cuarto dominio del diacuerpo o de la molécula de diacuerpo pueden derivar de una inmunoglobulina diferente. Debe entenderse que cualquier combinación de lo anterior está englobada en la presente invención.
En ciertos aspectos de la invención, el enlace covalente entre la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica del diacuerpo o de la molécula de diacuerpo puede ser a través de un puente de disulfuro entre al menos un residuo de cisteína de la primera cadena polipeptídica y al menos un residuo de cisteína de la segunda cadena polipeptídica. El primer, el segundo, el cuarto y el quinto dominio se corresponden con las regiones variables y responsables de la unión. En las realizaciones preferidas, los residuos de cisteína responsables de la formación de los puentes de disulfuro entre la primera y la segunda cadena polipeptídica están ubicados en el tercer y en el sexto dominio, respectivamente. En un aspecto en particular de esta realización, el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos C terminales de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (la SEQ ID NO: 23), que pueden estar codificados por la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 17). En otro aspecto de esta realización, el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos C terminales de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (la SEQ ID NO: 23), que pueden estar codificados por la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 17). En otro aspecto más de esta realización, el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (la SEQ ID NO: 79), derivada del dominio de bisagra de una IgG humana y que pueden estar codificados por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 80). En otro aspecto de esta realización, el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (la SEQ ID NO: 79), derivada del dominio de bisagra de una IgG humana y que pueden estar codificados por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 80). En ciertos aspectos de esta realización, el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos C terminales de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (la SEQ ID NO: 23); y el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (la SEQ ID NO: 79). En otros aspectos de esta realización, el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos C terminales de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (la SEQ ID NO: 23); y el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (la SEQ ID NO: 79). En otros aspectos más de esta realización, el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos C terminales de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (la SEQ iD NO: 23); y el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica comprende un dominio de bisagra. En otros aspectos de esta realización, el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos C terminales de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (la SEQ ID NO: 23); y el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende el dominio de bisagra. En otros aspectos más de esta realización, el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos C terminales de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (la SEQ ID NO: 23); y el sexto dominio de la primera cadena polipeptídica comprende un dominio Fc, o una porción del mismo. Todavía en otros aspectos de esta realización, el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos C terminales de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (la SEQ ID NO: 23); y el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende un dominio Fc, o una porción del mismo.
En algunas realizaciones específicas de la invención descritas supra, el diacuerpo covalente de la invención engloba los dímeros de las moléculas de diacuerpos, en los que cada molécula de diacuerpo comprende una primera y una segunda cadena polipeptídica. En ciertos aspectos de esta realización, las moléculas de diacuerpos pueden estar unidas covalentemente para formar el dímero, con la condición de que el enlace covalente no sea un enlace peptídico. En algunos aspectos preferidos de esta realización, el enlace covalente es un puente de disulfuro entre al menos un residuo de cisteína de la primera cadena polipeptídica de cada una de las moléculas de diacuerpos del dímero. En algunos aspectos referidos más de esta invención, el enlace covalente es un puente de disulfuro entre al menos un residuo de cisteína de la primera cadena polipeptídica de cada una de las moléculas de diacuerpos que forman el dímero, en el que dicho al menos un residuo de cisteína está ubicado en el tercer dominio de cada primera cadena polipeptídica.
También se describe un diacuerpo biespecífico covalente, diacuerpo que es un dímero de moléculas de diacuerpos, comprendiendo cada molécula de diacuerpo una primera y una segunda cadena polipeptídica, primera cadena polipeptídica que comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de la cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de la cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fc o una porción del mismo, primer y segundo dominios que están unidos covalentemente de tal forma que el primer y el segundo dominio no se asocian para formar un sitio de unión del epítopo y en el que el tercer dominio está ubicado N terminal con respecto al primer dominio y al segundo dominio; y segunda cadena polipeptídica que comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de la cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de la cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1) y (iii) un sexto dominio que comprende al menos un residuo de cisteína, cuarto y quinto dominios que están unidos covalentemente de tal forma que el cuarto y el quinto dominio no se asocian para formar un sitio de unión del epítopo; y en el que la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica de cada molécula de diacuerpo están unidas covalentemente, con la condición de que el enlace covalente no sea un enlace peptídico; en el que el primer dominio y el quinto dominio de cada molécula de diacuerpo se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1) (VH1) que se une al primer epítopo; en el que segundo dominio y el cuarto dominio de cada molécula de diacuerpo se asocian para formar un sitio de unión (VL2) (VH2) que se une al segundo epítopo.
También se describe un diacuerpo tetraespecífico covalente, diacuerpo que es un dímero de moléculas de diacuerpos, comprendiendo la primera molécula de diacuerpo una primera y una segunda cadena polipeptídica, primera cadena polipeptídica que comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de la cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de la cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fc o una porción del mismo, primer y segundo dominios que están unidos covalentemente de tal forma que el primer y el segundo dominio no se asocian para formar un sitio de unión del epítopo y en el que el tercer dominio está ubicado N terminal con respecto al primer y al segundo dominio; y segunda cadena polipeptídica que comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de la cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de la cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1) y (iii) un sexto dominio que comprende al menos un residuo de cisteína, cuarto y quinto dominios que están unidos covalentemente de tal forma que el cuarto y el quinto dominio no se asocian para formar un sitio de unión del epítopo; y en el que la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están unidas covalentemente, con la condición de que el enlace covalente no sea un enlace peptídico; en el que el primer y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1) (VH1) que se une al primer epítopo; en el que el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que se une al segundo epítopo; y la segunda molécula de diacuerpo comprende una primera y una segunda cadena polipeptídica, primera cadena polipeptídica que comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de la cadena ligera de una tercera inmunoglobulina (VL3) específica para un tercer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de la cadena pesada de una cuarta inmunoglobulina (VH4) específica para un cuarto epítopo y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fc o una porción del mismo, primer y segundo dominios que están unidos covalentemente de tal forma que el primer y el segundo dominio no se asocian para formar un sitio de unión del epítopo y en el que el tercer dominio está ubicado N terminal con respecto al primer dominio y al segundo dominio; y segunda cadena polipeptídica que comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de la cadena ligera de la cuarta inmunoglobulina (VL4), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de la cadena pesada de la tercera inmunoglobulina (VH3) y (iii) un sexto dominio que comprende al menos un residuo de cisteína, cuarto y quinto dominios que están unidos covalentemente de tal forma que el cuarto y quinto dominio no se asocian para formar un sitio de unión del epítopo; y en el que la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están unidas covalentemente, con la condición de que el enlace covalente no sea un enlace peptídico; en el que el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL3) (VH3) que se une al tercer epítopo; en el que el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL4) (VH4) que se une al cuarto epítopo.
Como se ha analizado anteriormente, los dominios de las cadenas polipeptídicas individuales están unidos covalentemente. En algunos aspectos específicos, el enlace covalente entre el primer y el segundo dominio, el primer y el tercer dominio, el segundo y el tercer dominio, el cuarto y el quinto dominio, el cuarto y el sexto dominio y/o el quinto y el sexto dominio puede ser un enlace peptídico. En particular, el primer y el segundo dominio, y el cuarto y el quinto dominio, pueden estar separados por el tercer dominio y el sexto dominio, respectivamente, o por residuos de aminoácidos adicionales, siempre que el primer y el segundo, y el cuarto y el quinto dominio, no se asocien para formar un sitio de unión. El número de residuos de aminoácidos puede ser de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 residuos de aminoácidos. En un aspecto preferido, el número de residuos de aminoácidos entre los dominios es de 8.
En ciertos aspectos de la invención, los dominios de la primera y la segunda cadena polipeptídica que comprenden un dominio Fc, es decir, opcionalmente, el tercer y el sexto dominio, respectivamente, pueden comprender adicionalmente un dominio de bisagra de forma que el dominio comprenda una región Fc de bisagra. En algunas realizaciones alternativas, la primera cadena polipeptídica o la segunda cadena polipeptídica pueden comprender un dominio de bisagra sin que también comprenda un dominio Fc. Las cadenas pesadas, las cadenas ligeras, las regiones de bisagra, los dominios Fc y/o los dominios Fc de bisagra para su uso en la invención pueden derivar de cualquier tipo de inmunoglobulina, incluyendo la IgA, la IgD, la IgE, la IgG o la IgM. En un aspecto preferido, el tipo de inmunoglobulina es la IgG, o cualquier subtipo de la misma, es decir, la IgGi, la IgG2, la IgG3 o la IgG4. En otros aspectos, la inmunoglobulina a partir de la cual derivan la cadena ligera y la cadena está humanizada o quimerizada.
Además, el primer epítopo y el segundo epítopo, y, cuando sea aplicable, el tercer epítopo y el cuarto epítopo, a los que se une el diacuerpo o la molécula de diacuerpo, pueden ser diferentes epítopos del mismo antígeno o pueden ser diferentes epítopos de diferentes antígenos. Los antígenos pueden ser cualquier molécula a partir de la cual pueda generarse un anticuerpo. Por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, toxinas bacterianas, marcadores de la superficie celular, marcadores autoinmunes, proteínas víricas, fármacos, etc. En algunos aspectos en particular, al menos un sitio de unión del epítopo del diacuerpo es específico para un antígeno de una célula en particular, tal como un linfocito B, un linfocito T, una célula fagocítica, un linfocito citolítico natural (NK) o una célula dendrítica.
En ciertos aspectos de la presente realización, al menos un sitio de unión del epítopo del diacuerpo o de la molécula de diacuerpo es específico para un receptor Fc, receptor Fc que puede ser un receptor Fc de activación o un receptor Fc de inhibición. En algunos aspectos en particular, el receptor Fc es un receptor Fcy, y el receptor Fcy es un receptor FcyRI, FcyRII o FcyRIII. En algunos aspectos más preferidos, el receptor FcyRIII es el receptor FcyRIIIA (CD16A) o el receptor FcyRIIIB (CD16B), y, más preferentemente, el receptor FcyRIII es el receptor FcyRIIIA (CD16A). En otro aspecto preferido, el receptor FcyRII es el receptor FcyRiIA (CD32A) o el receptor FcyRIIB (CD32B), y más preferentemente el receptor FcyRIIB (CD32B). En un aspecto particularmente preferido, un sitio de unión del diacuerpo es específico para la CD32B y el otro sitio de unión es específico para la CD16A. En una realización específica de la invención, al menos un sitio de unión del epítopo del diacuerpo o de la molécula de diacuerpo es específico para un receptor Fc de activación y al menos otro sitio es específico para un receptor Fc de inhibición. En ciertos aspectos de esta realización, el receptor Fc de activación es la CD32a y el receptor Fc de inhibición es la CD32B. En otros aspectos de esta realización, el receptor Fc de activación es el BCR y el receptor Fc de inhibición es la CD32B. En otros aspectos más de esta realización, el receptor Fc de activación es la IgERI y el receptor Fc de inhibición es la CD32B.
En los casos en los que un sitio de unión del epítopo es específico para la CD16A, los dominios VL y VH pueden ser los mismos que, o similares a, los dominios VL y VH del anticuerpo 3G8 de ratón, cuya secuencia ha sido clonada y se establece en el presente documento. En otros casos en los que un sitio de unión del epítopo es específico para la CD32A, los dominios VL y VH pueden ser los mismos que, o similares a, los dominios Vl y VH del anticuerpo IV.3 de ratón. En otros casos más en los que un sitio de unión del epítopo es específico para la CD32B, los dominios VL y VH pueden ser los mismos que, o similares a, los dominios VL y VH del anticuerpo 2B6 de ratón, cuya secuencia ha sido clonada y se establece en el presente documento. Debe entenderse que cualquiera de los dominios VL o VH de los anticuerpos 3G8, 2B6 e IV.3 pueden usarse en cualquier combinación. La presente invención también se refiere a un diacuerpo biespecífico o a una molécula de diacuerpo en los que el primer epítopo es específico para la CD32B y el segundo epítopo es específico para la CD16A.
En otros aspectos, un sitio de unión del epítopo puede ser específico para un antígeno patógeno. Según se usa en el presente documento, un antígeno patógeno es un antígeno implicado en una enfermedad patógena específica, incluyendo un cáncer, una infección y una enfermedad autoinmune. Por lo tanto, el antígeno patógeno puede ser un antígeno tumoral, un antígeno bacteriano, un antígeno vírico un antígeno autoinmune. Algunos ejemplos de antígenos patógenos incluyen, pero no se limitan a, lipopolisacárido, antígenos víricos seleccionados entre el grupo que consiste en los antígenos víricos del virus de la inmunodeficiencia humana, de un adenovirus, del virus respiratorio sincitial, del virus del Nilo occidental (por ejemplo, los antígenos E16 y/o E53) y del virus de la hepatitis, ácidos nucleicos (ADN y ARN) y colágeno. Preferiblemente, el antígeno patógeno es un antígeno neutralizante. En un aspecto preferido, en el que un sitio de unión del epítopo es específico para la CD16A o la CD32A, el otro sitio de unión del epítopo es específico para el antígeno patógeno excluyendo los antígenos autoinmunes. En otro aspecto preferido más, cuando un sitio de unión del epítopo es específico para la CD32B, el otro sitio de unión del epítopo es específico para cualquier antígeno patógeno. En algunas realizaciones específicas, la molécula de diacuerpo de la invención se une a dos antígenos diferentes de la misma célula, por ejemplo, un sitio de unión del antígeno es específico para el receptor Fc de activación, mientras que el otro es específico para el receptor Fc de inhibición. En otras realizaciones, la molécula de diacuerpo se une a dos epítopos neutralizantes víricos distintos, por ejemplo, pero no se limita a, el E16 y el E53 del virus del Nilo occidental.
Los diacuerpos de la invención pueden usarse para el tratamiento de una diversidad de enfermedades y trastornos. Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona la molécula de diacuerpo para el uso según la reivindicación 26 del presente documento. También se describe un método para el tratamiento de una enfermedad o de un trastorno que comprende la administración a un paciente en necesidad de la misma de una cantidad eficaz de un diacuerpo o de una molécula de diacuerpo covalente de la invención en los que al menos un sitio de unión es específico para un antígeno patógeno, tal como un antígeno expresado en la superficie de una célula cancerosa o en la superficie de una bacteria o de un virión, y al menos otro sitio de unión es específico para un receptor Fc, por ejemplo, la CD16A.
También se describe un método para el tratamiento de una enfermedad o de un trastorno que comprende la administración a un paciente en necesidad de la misma de una cantidad eficaz de un diacuerpo o de una molécula de diacuerpo de la invención, en los que al menos un sitio de unión es específico para la CD32B y al menos otro sitio de unión es específico para la CD16A.
También se describe un método para la inducción de tolerancia inmunitaria frente a un antígeno patógeno que comprende la administración a un paciente en necesidad de una cantidad eficaz de un diacuerpo covalente o de una molécula de diacuerpo divalente de la invención, en los que al menos un sitio de unión es específico para la CD32B y al menos otro sitio de unión es específico para dicho antígeno patógeno. El antígeno patógeno puede ser un alergeno u otra molécula frente a la que se desee una tolerancia inmunitaria, tal como una proteína expresada sobre un tejido trasplantado.
También se describe un método de desintoxicación que comprende la administración a un paciente en necesidad de la misma de una cantidad eficaz de un diacuerpo covalente o de una molécula de diacuerpo de la invención, en los que al menos un sitio de unión es específico para un marcador de la superficie de una célula, y al menos otro sitio de unión es específico para una toxina. El diacuerpo de la invención administrado puede ser aquel en el que un sitio de unión es específico para un marcador de la superficie de una célula, tal como un Fc, y el otro sitio de unión es específico para una toxina bacteriana o un fármaco. El marcador de la superficie de la célula puede no encontrarse en los glóbulos rojos sanguíneos.
Definiciones
Salvo que se defina de otro modo, todos los términos de la técnica, anotaciones y otros términos científicos o terminología usada en el presente documento pretenden tener los significados comprendidos habitualmente por los expertos en la materia a la que pertenece esta invención. En algunos casos, los términos con los significados comprendidos habitualmente son definidos en el presente documento por claridad y/o para facilitar la lectura, y la inclusión de dichas definiciones en el presente documento no debería interpretarse necesariamente como que representa una diferencia sustancial sobre lo que se entiende de forma general en la materia. La práctica de la presente invención empleará, salvo que se indique de otro modo, las técnicas convencionales de la biología molecular (incluyendo las técnicas recombinantes), de la microbiología, de la biología celular, de la bioquímica, de la química de ácidos nucleicos y de la inmunología, que están ampliamente en la pericia de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía, tal como, Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1999, incluyendo los suplementos hasta 2001); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, incluyendo los suplementos hasta 2001); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición (Sambrook y Russel, 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994); Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson, ed., Academic Press, 1996); Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W. H. Albert, y N. A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993), Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999; y Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 2000).
Según se usa en el presente documento, los términos “anticuerpo” y “anticuerpos” se refieren a anticuerpos monoclonales, a anticuerpos multiespecíficos, a anticuerpos humanos, a anticuerpos humanizados, a anticuerpos sintéticos, a anticuerpos quiméricos, a anticuerpos policlonales, a anticuerpos camelizados, a Fv de cadena única (scFv), a anticuerpos de cadena única, a fragmentos Fab, a fragmentos F(ab'), a Fv biespecíficos unidos por disulfuro (sdFv), a intracuerpos y a anticuerpos anti-idiotípicos (anti-id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-id y anti-anti-Id contra los anticuerpos de la invención) y los fragmentos de unión al epítopo de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen inmunoglobulina moléculas y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión del antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, la IgG, la IgE, la IgM, la IgD, la IgA y la IgY), clase (por ejemplo, la IgG-i, la IgG2 , la IgG3 , la IgG4, IgA1 y la IgA2) o subclase.
Según se usa en el presente documento, los términos “se une inmunoespecíficamente”, “reconoce inmunoespecíficamente”, “se une específicamente”, “reconoce específicamente” y los términos análogos se refieren a moléculas que se unen específicamente a un antígeno (por ejemplo, a un eptíopo o a un complejo inmunitario) y no se unen específicamente a otra molécula. Una molécula que se une específicamente a un antígeno puede unirse a otros péptidos o polipéptidos con una afinidad menor, según se determina, por ejemplo, mediante inmunoensayos, BIAcore u otros ensayos conocidos en la materia. Preferiblemente, las moléculas que se unen específicamente a un antígeno no presentan reactividad cruzada con otras proteínas. Las moléculas que se unen específicamente a un antígeno pueden ser identificadas, por ejemplo, mediante inmunoensayos, BIAcore u otras técnicas conocidas por los expertos en la materia.
Según se usa en el presente documento, un complejo inmunitario se refiere a una estructura que se forma cuando al menos una molécula objetivo y al menos un polipéptido heterólogo que contiene una región Fcy se unen entre sí formando un complejo de mayor peso molecular. Algunos ejemplos de complejos inmunitarios son los complejos antígeno-anticuerpo que pueden ser solubles o particulados (por ejemplo, un complejo antígeno/anticuerpo en la superficie de una célula).
Según se usa en el presente documento, los términos “cadena pesada”, “cadena ligera”, “región variable”, “región en marco”, “dominio constante”, y similares, tienen su significado habitual en la técnica de la inmunología y se refieren a los dominios que aparecen de forma natural en las inmunoglobulinas y a los correspondientes dominios de las proteínas de unión sintéticas (por ejemplo, recombinantes) (por ejemplo, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena única, anticuerpos quiméricos, etc.). La unidad estructural básica de las inmunoglobulinas naturales (por ejemplo, de la IgG) es un tetrámero que tiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, expresado habitualmente en forma de una glicoproteína de aproximadamente 150.000 Da. La porción amino terminal (“N”) de cada cadena incluye una región variable de entre aproximadamente 100 y 110 o más aminoácidos, responsable fundamentalmente del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi terminal (“C”) de cada cadena define una región constante, teniendo las cadenas ligeras un único dominio constante, y teniendo habitualmente las cadenas pesadas tres dominios constantes y una región de bisagra. Por lo tanto, la estructura de las cadenas ligeras de una molécula de IgG es n-VL-CL-c, y la estructura de las cadenas pesadas de una IgG es n-VH-Cm-H-CH2-CH3-c (en la que H es la región de bisagra). Las regiones variables de una molécula de IgG consisten en las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), que contienen los residuos en contacto con el antígeno y segmentos no CDR, denominados segmentos en marco, que en general mantienen la estructura y determinan el posicionamiento de los bucles de las CDR (aunque algunos residuos en marco también pueden estar en contacto con el antígeno). Por lo tanto, los dominios Vl y Vh tienen la estructura n-FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4-c.
Cuando se hace referencia a proteínas o a anticuerpos de unión (según se define ampliamente en el presente documento), la asignación de los aminoácidos a cada dominio es según las definiciones de Rabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 y 1991). Los aminoácidos de las regiones variables de las cadenas maduras ligera y pesada de las inmunoglobulinas se designan mediante la posición de un aminoácido en la cadena. Rabat describió numerosas secuencias de aminoácidos para anticuerpos, identificó una secuencia consenso de aminoácidos para cada subgrupo y asignó un número de residuos a cada aminoácido. El esquema de numeración de Kabat es extensible a los anticuerpos que no están incluidos en su compendio mediante la alineación del anticuerpo en cuestión con una de las secuencias consenso de Rabat mediante la referencia a los aminoácidos conservados. Este método para la asignación de miembros de residuos se ha convertido en convencional en el campo e identifica con facilidad los aminoácidos en las posiciones equivalentes de diferentes anticuerpos, incluyendo variantes quiméricas o humanizadas. Por ejemplo, un aminoácido en la posición 50 de la cadena ligera de un anticuerpo humano ocupa la posición equivalente a un aminoácido en la posición 50 de la cadena ligera de un anticuerpo de ratón.
Según se usa en el presente documento, el término “cadena pesada” se usa para definir la cadena pesada de un anticuerpo de una IgG. En una IgG intacta natural, la cadena pesada comprende los dominios de la inmunoglobulina VH, CH1, bisagra, CH2 y CH3. A lo largo de la presente memoria descriptiva, la numeración de los residuos de la cadena pesada de la IgG es la del índice EU como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest.
5a Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991). El “índice EU como en Kabat” se refiere a la numeración del anticuerpo IgG1 humana EU. Algunos ejemplos de las secuencias de aminoácidos que contienen los dominios de la IgG1 humana, de la bisagra, CH2 y CH3, se muestran en las FIGS. 1A y 1B según se describe, infra. Las FIGS. 1A y 1B también establecen secuencias de aminoácidos de los dominios de la bisagra, CH2 y CH3 de las cadenas pesadas de la IgG2, de la IgG3 y de la IgG4. Las secuencias de aminoácidos los isotipos IgG2, IgG3 y IgG4 se alinean con la secuencia de la IgG1 mediante la colocación de los primeros y los últimos residuos de cisteína de las respectivas regiones de bisagra, que forman los enlaces de S-S entre las cadenas pesadas, en las mismas posiciones. Para la región de bisagra de la IgG2 y de la IgG3, no todos los residuos están numerados según el índice Eu.
La “región de bisagra” o “dominio de bisagra” se define generalmente como que se extiende desde la Glu216 hasta la Pro230 de la IgG1 humana. Un ejemplo de la secuencia de aminoácidos de la región de bisagra de la IgG1 humana se muestra en la FIG. 1A (los residuos de aminoácidos de la FIG. 1A están numerados según el sistema de Kabat). Las regiones de bisagra de otros isotipos de la IgG pueden ser alineadas con la secuencia de la IgG1 mediante la colocación de los primeros y los últimos residuos de cisteína que forman los enlaces de S-S entre las cadenas pesadas en las mismas posiciones a las mostradas en la FIG. 1A.
Según se usa en el presente documento, el término “región Fc”, “dominio Fc” o los términos análogos se usan para definir una región C terminal de una cadena pesada de una IgG. Un ejemplo de la secuencia de aminoácidos que contiene la IgG1 humana se muestra en la FIG. 1B. Aunque los límites pueden variar ligeramente, según se enumeran siguiendo el sistema de Kabat, el dominio Fc se extiende desde el aminoácido 231 hasta el aminoácido 447 (los residuos de aminoácidos en la FIG. 1B están numerados según el sistema de Kabat). La FIG. 1B también proporciona ejemplos de las secuencias de aminoácidos de las regiones Fc de los isotipos de la IgG, la IgG2, la IgG3 y la IgG4.
La región Fc de una IgG comprende dos dominios constantes, CH2 y CH3. El dominio CH2 de la región Fc de una IgG humana habitualmente se extiende desde los aminoácidos 231 hasta el aminoácido 341 según el sistema de numeración de Kabat (FIG. 1B). El dominio CH3 de una región Fc de una IgG humana habitualmente se extiende desde los aminoácidos 342 hasta el 447 según el sistema de numeración de Kabat (FIG. 1B). El dominio CH2 de la región Fc de una IgG (denominado también dominio “Cy2”) es único ya que no está estrechamente emparejado con otro dominio. Más bien hay interpuestas dos cadenas de carbohidrato ramificadas unidas por N entre los dos dominios CH2 de una IgG nativa intacta.
Según se usa en el presente documento, los términos “proteína de unión al FcyR”, “anticuerpo FcyR” y “anticuerpo anti-FcyR”, se usan de forma intercambiable y se refieren a una diversidad de proteínas de tipo inmunoglobulina o derivadas de una inmunoglobulina. Las “proteínas de unión al FcyR” se unen al FcyR a través de una interacción con los dominios Vl y/o Vh (de una forma distinta a la unión mediada por la Fcy). Algunos ejemplos de proteínas de unión al FcyR incluyen anticuerpos completamente humanos, policlonales, quiméricos y humanizados (por ejemplo, que comprenden 2 cadenas pesadas y 2 ligeras), fragmentos de los mismos (por ejemplo, Fab, los fragmentos Fab', F(ab' ) 2 y Fv), anticuerpos bifuncionales o multifuncionales (véase, por ejemplo, Fanzavecchia et al., 1987, Eur. J. Immunol. 17: 105), anticuerpos de cadena única (véase, por ejemplo, Bird et al., 1988, Science 242: 423-26), proteínas de fusión (por ejemplo, proteínas de fusión de expresión en fago), “minicuerpos” (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n° 5.837.821) y otras proteínas de unión al antígeno que comprenden un dominio Vl y/o Vh o un fragmento del mismo. En un aspecto, la proteína de unión al FcyRIIIA es un “anticuerpo tetramérico” es decir, que generalmente tiene la estructura de una IgG natural y que comprende dominios variables y constantes, es decir, dos cadenas ligeras que comprenden un dominio Vl y un dominio constante de la cadena ligera, y dos cadenas pesadas que comprenden un dominio Vh y la bisagra de una cadena pesada y los dominios constantes.
Según se usa en el presente documento el término “antagonistas FcyR” y los términos análogos se refieren a sustancias proteicas y no proteicas, incluyendo moléculas pequeñas que antagonizan al menos una actividad biológica de un FcyR, por ejemplo, una señalización de bloqueo. Por ejemplo, las moléculas de la invención bloquean la señalización mediante el bloqueo de la unión de las IgG a un FcyR.
Según se usa en el presente documento, el término “derivado” en el contexto de polipéptidos o de proteínas se refiere a un polipéptido o a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que ha sido alterada mediante la introducción de sustituciones, deleciones o adiciones en residuos de aminoácidos. El término “derivado” según se usa en el presente documento también se refiere a un polipéptido o a una proteína que ha sido modificado, es decir, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al polipéptido o a la proteína. Por ejemplo, pero no como limitación, un anticuerpo puede ser modificado, por ejemplo, mediante una glicosilación, una acetilación, una pegilación, una fosforilación, una amidación, una derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, una escisión proteolítica, la unión a un antígeno celular o a otra proteína, etc. Un derivado de un polipéptido o de una proteína puede producirse mediante modificaciones químicas usando técnicas conocidas por los expertos en la materia, que incluyen, pero no se limitan a, una escisión química específica, una acetilación, una formilación, la síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, un derivado de un polipéptido o un derivado de una proteína posee una función similar o idéntica a la del polipéptido o de la proteína a partir de la cual deriva.
Según se usa en el presente documento, el término “derivado” en el contexto de un derivado no proteico se refiere a una segunda molécula orgánica o inorgánica que se forma basándose en la estructura de una primera molécula orgánica o inorgánica. Un derivado de una molécula orgánica incluye, pero no se limita a, una molécula modificada, por ejemplo, mediante la adición o la deleción de un grupo hidroxilo, metilo, etilo, carboxilo o amino. Una molécula orgánica también puede ser esterificada, alquilada y/o fosforilada.
Según se usa en el presente documento, el término “molécula de diacuerpo” se refiere a un complejo de dos o más cadenas polipeptídicas o proteínas, comprendiendo cada una al menos un dominio VL y un VH o un fragmento de los mismos, en la que ambos dominios están comprendidos en una única cadena polipeptídica. En ciertas realizaciones, la “molécula de diacuerpo” incluye moléculas que comprenden un dominio Fc o un dominio Fc de bisagra. Dichas cadenas polipeptídicas del complejo pueden ser iguales o diferentes, es decir, la molécula de diacuerpo puede ser un homomultímero o un heteromultímero. En algunos aspectos específicos, la “molécula de diacuerpo” incluye dímeros o tetrámeros, o dichas cadenas polipeptídicas contienen, ambas, un dominio VL y un VH. Las cadenas polipeptídicas individuales que comprenden las proteínas multiméricas pueden estar unidas covalentemente a, al menos, otro péptido del multímero mediante puentes de disulfuro intercatenarios.
Según se usa en el presente documento, los términos “trastorno” y “enfermedad” se usan de forma intercambiable para referirse a una afección en un sujeto. En particular, el término “enfermedad autoinmune” se usa de forma intercambiable con el término “trastorno autoinmune” para referirse a una afección en un sujeto caracterizada por una lesión celular, en tejidos y/o en órganos causada por una reacción inmunológica del sujeto contra sus propias células, tejidos y/u órganos. El término “enfermedad inflamatoria” se usa de forma intercambiable con el término “trastorno inflamatorio” para referirse a una afección en un sujeto caracterizada por una inflamación, preferentemente una inflamación crónica. Los trastornos autoinmunes pueden estar asociados o no a una inflamación. Además, la inflamación puede estar causada o no por un trastorno autoinmune. Por lo tanto, algunos trastornos pueden caracterizarse tanto como trastornos autoinmunes como trastornos inflamatorios.
“Cadenas polipeptídicas idénticas” según se usa en el presente documento también se refiere a las cadenas polipeptídicas que tienen una secuencia de aminoácidos prácticamente idéntica, por ejemplo, que incluyen cadenas que tienen diferencias en uno o más aminoácidos, preferentemente sustituciones conservativas de aminoácidos, de forma que la actividad de las dos cadenas polipeptídicas no es significativamente diferente.
Según se usa en el presente documento, el término “cáncer” se refiere a un neoplasma o a un tumor resultante de un crecimiento anormal descontrolado de las células. Según se usa en el presente documento, un cáncer incluye explícitamente leucemias y linfomas. En algunas realizaciones, un cáncer se refiere a un tumor benigno que ha permanecido localizado. En otras realizaciones, un cáncer se refiere a un tumor maligno que ha invadido y destruido las estructuras corporales vecinas y se ha diseminado a sitios distantes. En algunas realizaciones, el cáncer está asociado con un antígeno específico del cáncer.
Según se usa en el presente documento, el término “agente inmunomodulador” y las variaciones del mismo se refieren a un agente que modula el sistema inmunitario de un hospedador. En ciertas realizaciones, un agente inmunomodulador es un agente inmunosupresor. En algunas otras realizaciones, un agente inmunomodulador es un agente inmunoestimulante. Algunos agentes inmunomoduladores incluyen, pero no se limitan a, moléculas pequeñas, péptidos, polipéptidos, proteínas de fusión, anticuerpos, moléculas inorgánicas, agentes miméticos y moléculas orgánicas.
Según se usa en el presente documento, el término “epítopo” se refiere a un fragmento de un polipéptido o de una proteína o de una molécula no proteica que tiene actividad antigénica o inmunogénica en un animal, preferentemente en un mamífero, y lo más preferentemente en un ser humano. Un epítopo que tiene actividad inmunogénica es un fragmento de un polipéptido o de una proteína que desencadena una respuesta de anticuerpos en un animal. Un epítopo que tiene actividad antigénica es un fragmento de un polipéptido o de una proteína al que se une un anticuerpo inmunoespecíficamente según se determina mediante cualquier método bien conocido por el experto en la materia, por ejemplo, mediante inmunoensayos. Los epítopos antigénicos no son necesariamente inmunogénicos.
Según se usa en el presente documento, el término “fragmento” se refiere a un péptido o a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 5 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 60 residuos amino contiguos, de al menos 70 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 80 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 90 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 100 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos contiguos 125 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 150 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 175 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 200 residuos de aminoácidos contiguos o de al menos 250 residuos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido. En una realización específica, un fragmento de un polipéptido conserva al menos una función del polipéptido.
Según se usa en el presente documento, los términos “ácidos nucleicos” y “secuencias de nucleótidos” incluyen moléculas de ADN (por ejemplo, de ADNc o de ADN genómico), moléculas de ARN (por ejemplo, de ARNm), combinaciones de moléculas de ADN y de ARN o moléculas híbridas de ADN/ARN y análogos de moléculas de ADN o de ARN. Dichos análogos pueden generarse usando, por ejemplo, análogos de nucleótidos que incluyen, pero no se limitan a, bases de inosina o tritiladas. Dichos análogos también pueden comprender moléculas de ADN o de ARN que comprenden esqueletos modificados que proporcionan unos atributos beneficiosos a las moléculas, tales como, por ejemplo, resistencia a la nucleasa o un aumento en la capacidad para atravesar las membranas celulares. Los ácidos nucleicos o las secuencias de nucleótidos pueden ser monocatenarias, bicatenarias, pueden contener porciones tanto monocatenarias como bicatenarias y pueden contener porciones de triple hélice, pero preferentemente es un ADN bicatenario.
Según se usa en el presente documento, una “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a la cantidad del agente terapéutico suficiente para tratar o atender una enfermedad o un trastorno. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede referirse a la cantidad del agente terapéutico suficiente para retrasar o minimizar la aparición de una enfermedad, por ejemplo, para retrasar o minimizar la diseminación de un cáncer. Una cantidad terapéuticamente eficaz también puede referirse a la cantidad del agente terapéutico que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o en la atención de una enfermedad. Además, una cantidad terapéuticamente eficaz con respecto al agente terapéutico de la invención significa la cantidad del agente terapéutico, solo o junto con otras terapias, que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o en la atención de una enfermedad.
Según se usa en el presente documento, los términos “agente profiláctico” y “agentes profilácticos” se refieren a cualquier agente que pueda usarse en la prevención de un trastorno, o en la prevención de la reaparición o de la diseminación de un trastorno. Una cantidad profilácticamente eficaz puede referirse a la cantidad de un agente profiláctico suficiente para prevenir la reaparición o la diseminación de una enfermedad hiperproliferativa, particularmente un cáncer, o la aparición de ésta en un paciente, incluyendo, pero no se limitan a, aquellos predispuestos a una enfermedad hiperproliferativa, por ejemplo, aquellos predispuestos genéticamente al cáncer o previamente expuestos a carcinógenos. Una cantidad profilácticamente eficaz también puede referirse a la cantidad de un agente profiláctico que proporciona un beneficio profiláctico en la prevención de la enfermedad. Además, una cantidad profilácticamente eficaz con respecto a un agente profiláctico de la invención significa la cantidad de agente profiláctico solo, o junto con otros agentes, que proporciona un beneficio profiláctico en la prevención de la enfermedad.
Según se usa en el presente documento, los términos “prevenir” y “prevención” se refieren a la prevención de la reaparición o de la aparición de uno o más síntomas de un trastorno en un sujeto como resultado de la administración de un agente profiláctico o terapéutico.
Según se usa en el presente documento, el término “en combinación” se refiere al uso de más de un profiláctico y/o terapéutico. El uso del término “en combinación” no restringe el orden en el que el agente profiláctico y/o el agente terapéutico son administrados al sujeto con un trastorno. Un primer agente profiláctico o terapéutico puede ser administrado antes de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), junto con, o después de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas después) de la administración de un segundo agente profiláctico o terapéutico a un sujeto con un trastorno.
Se entiende que "función efectora" según se usa en el presente documento, es un acontecimiento bioquímico resultante de la interacción de la región Fc de un anticuerpo con un receptor Fc o un antígeno. Algunas funciones efectoras incluyen, pero no se limitan a, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), la fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Las funciones efectoras incluyen tanto aquellas que operan después de la unión de un antígeno como aquellas que operan independientemente de la unión del antígeno.
Se entiende que “célula efectora" según se usa en el presente documento, es una célula del sistema inmunitario que expresa uno o más receptores Fc y media en una o más funciones efectoras. Algunas células efectoras incluyen, pero no se limitan a, monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastocitos, plaquetas, linfocitos B, linfocitos granulares grandes de Langerhans, linfocitos citolíticos naturales (NK), y pueden proceder de cualquier organismo incluyendo, pero no se limitan a, seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos.
Según se usa en el presente documento, el término “se une específicamente a un complejo inmunitario” y los términos análogos se refieren a moléculas que se unen específicamente a un complejo inmunitario y que no se unen específicamente a otra molécula. Una molécula que se une específicamente a un complejo inmunitario puede unirse a otros péptidos o polipéptidos con una afinidad menor según se determina, por ejemplo, mediante inmunoensayos, BIAcore u otros ensayos conocidos en la materia. Preferiblemente, las moléculas que se unen específicamente a un complejo inmunitario no presentan reactividad cruzada con otras proteínas. Las moléculas que se unen específicamente a un complejo inmunitario pueden ser identificadas, por ejemplo, mediante inmunoensayos, BIAcore u otras técnicas conocidas por los expertos en la materia.
Una “proteína de fusión estable”, según se usa en el presente documento, se refiere a una proteína de fusión que experimenta un nivel de degradación entre mínimo y no detectable durante su producción y/o almacenamiento según se evalúa usando los habituales ensayos bioquímicos y funcionales conocidos por los expertos en la materia, y puede ser almacenada durante un periodo de tiempo prolongado sin ninguna pérdida en su actividad biológica, por ejemplo, la unión a un FcyR.
Breve descripción de los dibujos
FIGS. 1 A-B SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE LAS REGIONES CH1, BISAGRA Y Fc DE LA IgG HUMANA
La Figura 1 proporciona las secuencias de aminoácidos de los dominios de bisagra (A) y Fc (B) de la IgG1, de la IgG2, de la IgG3 y de la IgG4 humanas (el dominio de bisagra de la IgG1 (la SEQ ID NO: 1); el dominio de bisagra de la IgG2 (la SEQ ID NO: 2); el dominio de bisagra de la IgG3 (la SEQ ID NO: 3); el dominio de bisagra de la IgG4 (la SEQ ID NO: 4); el dominio Fc de la IgG1 (la SEQ ID NO: 5); el dominio Fc de la IgG2 (la SEQ ID NO: 6); el dominio Fc de la IgG3 (la SEQ ID NO: 7); el dominio Fc de la IgG1 (la SEQ ID NO: 8)). Los residuos de aminoácidos mostrados en la FIGS. 1A y 1B están numerados según el sistema de numeración de Kabat EU. Las secuencias de isotipo se alinean con la secuencia de la IgG1 colocando los primeros y los últimos residuos de cisteína de las respectivas regiones de bisagra que forman los enlaces de S-S entre las cadenas pesadas, en las mismas posiciones. Para la figura 1B, los residuos del dominio CH2 están indicados por , mientras que los residuos del dominio CH3 están indicados por ~.
FIG. 2 REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LAS CADENAS POLIPEPTÍDICAS DE LOS DIACUERPOS BIFUNCIONALES COVALENTES
Los polipéptidos de un diacuerpo bifuncional covalente consisten en un dominio VL de un anticuerpo y un dominio VH de un anticuerpo separados por un conector peptídico corto. El conector de 8 residuos de aminoácidos impide el autoensamblaje de una cadena única polipeptídica en las construcciones scFv, y en su lugar predominan las interacciones entre los dominios VL y VH de las diferentes cadenas polipeptídicas. Se crearon 4 construcciones (cada construcción se describe a partir del amino terminal (“n”), lado izquierdo de la construcción, hacia el carboxi terminal (“c”), lado derecho de la figura): construcción (1) (la SEQ ID NO: 9) comprendía n - el dominio VL Hu2B6 - el conector (GGGSGGGG (la SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu3G8 - y una secuencia C terminal (LGGC) - c; construcción (2) (la SEQ ID NO: 11) comprendía n - el dominio VL de Hu3G8 - el conector (GGGSGGGG (la SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - y una secuencia C terminal (LGGC) - c; construcción (3) (la SEQ ID NO: 12) comprendía n - el dominio v L de Hu3G8 - el conector (GGGSGGGG (la SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu3G8 - y una secuencia C terminal (LGGC) - c; construcción (4) (la SEQ ID NO: 13) comprendía n - el dominio VL de Hu2B6 - el conector (GGGSGGGG (la SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - y una secuencia C terminal (LGGC) - c.
FIG. 3 ANÁLISIS MEDIANTE UNA SDS-PAGE DE LOS DIACUERPOS PURIFICADOS POR AFINIDAD Los diacuerpos purificados por afinidad se sometieron a un análisis mediante una SDS-PAGE en unas condiciones reductoras (carriles 1-3) o no reductoras (carriles 4-6). Se indican los pesos moleculares aproximados de los patrones (entre los carriles 3 y 4). Carriles 1 y 4, el CMD h3G8; carriles 2 y 5, el CMD h2B6; y carriles 3 y 6, el c Bd h2B6-hi3G8.
FIGS. 4 A-B ANÁLISIS MEDIANTE UNA SEC DE LOS DIACUERPOS PURIFICADOS POR AFINIDAD Los diacuerpos purificados por afinidad se sometieron a un análisis mediante una SEC. (A) Perfil de elución de los patrones conocidos: la IgG de longitud completa (~ 150 kDa), el fragmento Fab de la IgG (~ 50 kDa) y el scFv (~ 30 kDa); (B) Perfil de elución del CMD h2b6, del CMD h3G8 y del CMD h2B6-h3G8.
FIG. 5 UNIÓN DEL CBD h2B6-h3G8 A LA sCD32B Y A LA sCD16A
Se ensayó la unión del CMD h2B6-h3G8 a la sCD32B y a la sCD16A en un ELISA en sándwich. Se usó la sCD32B como la proteína objetivo. La sonda secundaria era la sCD16A conjugada con HRP. Como control se usó el CMD h3G8, que se une a la CD16A.
FIGS. 6 A-C ANÁLISIS DE BIACORE DE LA UNIÓN DEL DIACUERPO A LA sCD16A, LA sCD32B Y LA sCD32B
Se ensayó la unión del CMD h2B6-h3G8, del CMD h2B6 y del CMD h3G8 a la sCD16A, la sCD32B y la sCD32A (control negativo) mediante un análisis de SPR. También se probó el scFv h3G8 como control. (A) Unión a la sCD16; (B) Unión a la sCD32B y (C) Unión a la sCD32A. Los diacuerpos se inyectaron a una concentración de 100 NM y el scFv a una concentración de 200 nM, en las superficies del receptor con un caudal de 50 ml/min durante 60 s.
FIGS. 7 A-C ANÁLISIS DE BIACORE DE LA UNIÓN DEL DIACUERPO A LA sCD16A Y A LA sCD32B Se ensayó la unión del CMD h2B6-h3G8, del CMD h2B6 y del CMD h3G8 a la sCD16A y la sCD32B mediante un análisis de SPR. También se probó el scFv h3G8 como control. (A) Unión del CMD h3G8 a la sCD16A; (B) Unión del CMD h2B6-h3G8 a la sCD16A; (C) Unión del scFv h3G8 a la sCD16A; (D) Unión del CMD h2B6 a la sCD32B; y (E) Unión del CMD h2B6-h3G8 a la sCD32B. Los diacuerpos se inyectaron a unas concentraciones de 6,25-200 nM en las superficies del receptor con un caudal de 70 ml/min durante 180 s.
FIG. 8 REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LA INTERACCIÓN DE LAS CADENAS POLIPEPTÍDICAS QUE COMPRENDEN LOS DOMINIOS VL Y VH PARA FORMAR UNA MOLÉCULA DE UN DIACUERPO BIESPECÍFICO COVALENTE NH2 y COOH representan el amino terminal y el carboxi terminal, respectivamente, de cada cadena polipeptídica.
S representa el residuo de cisteína C terminal de cada cadena polipeptídica. El VL y el VH indican el dominio ligero variable y el dominio pesado variable, respectivamente. Las líneas de puntos y las líneas discontinuas son para distinguir entre las dos cadenas polipeptídicas y, en particular, representan las porciones del conector de dichas cadenas. El Fv h2B6 y el Fv h3G8 indican un sitio de unión del epítopo específico para la CD32B y la CD16, respectivamente.
FIG. 9 REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LAS CADENAS POLIPEPTÍDICAS QUE CONTIENEN LOS DOMINIOS Fc DE LOS DIACUERPOS BIESPECÍFICOS COVALENTES
Representación de las construcciones polipeptídicas de las moléculas de diacuerpos de la invención (cada construcción se describe a partir del amino terminal (“n”), lado izquierdo de la construcción, hacia el carboxi terminal (“c”), lado derecho de la figura). La construcción (5) (la SEQ ID NO: 14) comprendía n - el dominio VL Hu2B6 - un primer conector (GGGSGg Gg (la SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu3G8 - un segundo conector (LGGC) - y un dominio Fc C terminal de la IgG1 humana - c; la construcción (6) (la SEQ ID NO: 15) comprendía n - el dominio VL de Hu3G8 - el conector (GGGSGGGG (la SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2b6 - y un segundo conector (LGGC) - y un dominio Fc C terminal de la IgG1 humana - c; la construcción (7) (la SEQ ID NO: 16) comprendía n - el dominio VL de Hu2B6 - un primer conector (GGGSGGGG (la SEQ iD NO: 10)) - el dominio VH de Hu3G8 - y una secuencia C terminal (LGGCFNRGEC) (la SEQ ID NO: 17) - c; la construcción (8) (la SEQ ID NO: 18) comprendía n - el dominio VL de Hu3G8 - el conector (GGGSGGGG (la SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - y un segundo conector (LGGC) - y un dominio de bisagra/Fc C terminal de la IgG1 humana (con la sustitución de aminoácido A215V) - c.
FIG. 10 UNIÓN DE LAS MOLÉCULAS DE DIACUERPOS QUE COMPRENDEN LOS DOMINIOS Fc A LA sCD32B YA LA sCD16A
Se ensayó la unión de las moléculas de diacuerpos que comprenden los dominios Fc a la sCD32B y a la sCD16A en un ELISA en sándwich. Los diacuerpos ensayados fueron producidos mediante 3 sistemas de expresión recombinantes: la cotransfección de pMGX669 y de pMGX674, que expresan las construcciones 1 y 6, respectivamente; la cotransfección de pMGX667 y de pMGX676, que expresan las construcciones 2 y 5, respectivamente; y la cotransfección de pMGX674 y de pMGX676, que expresan las construcciones 5 y 6, respectivamente. Se usó la sCD32B como la proteína objetivo. La sonda secundaria era la sCD16A conjugada con HRP.
FIG. 11 REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LA INTERACCIÓN DE DOS CADENAS POLIPEPTÍDICAS QUE COMPRENDEN CADA UNA UN DOMINIO Fc PARA FORMAR UN DIACUERPO COVALENTE BIVALENTE NH2 y COOH representan el amino terminal y el carboxi terminal, respectivamente de cada cadena polipeptídica. S representa el al menos un puente de disulfuro entre un residuo de cisteína de la secuencia del segundo conector de cada cadena polipeptídica. El VL y el VH indican el dominio ligero variable y el dominio pesado variable, respectivamente. Las líneas de puntos y las líneas discontinuas son para distinguir entre las dos cadenas polipeptídicas y, en particular, representan las porciones del conector de dichas cadenas. El CH2 y el CH3 representan los dominios constantes CH2 y CH3 de un dominio Fc. El Fv h2B6 y el Fv h3G8 indican un sitio de unión del epítopo específico para la CD32B y la CD16, respectivamente.
FIG. 12 UNIÓN DE LAS MOLÉCULAS DE DIACUERPOS QUE COMPRENDEN LOS DOMINIOS DE BISAGRA/Fc A LA sCD32B Y A LA sCD16A
Se ensayó la unión de las moléculas de diacuerpos que comprenden los dominios Fc a la sCD32B y a la sCD16A en un ELISA en sándwich. Los diacuerpos ensayados fueron producidos mediante 4 sistemas de expresión recombinantes: la cotransfección de pMGX669 pMGX674, que expresan las construcciones 1 y 6, respectivamente; la cotransfección de pMGX669 pMGX678, que expresan las construcciones 2 y 8, respectivamente; la cotransfección de pMGX677 pMGX674, que expresan las construcciones 7 y 6, respectivamente; y la cotransfección de pMGX677 pMGX678, que expresan las construcciones 7 y 8, respectivamente. Se usó la sCD32B como la proteína objetivo. La sonda secundaria era la sCD16A conjugada con HRP.
FIG. 13 REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LA INTERACCIÓN DE LAS CADENAS POLIPEPTÍDICAS PARA FORMAR UNA MOLÉCULA DE DIACUERPO TETRAMÉRICA NH2 y COOH representan el amino terminal y el carboxi terminal, respectivamente de cada cadena polipeptídica. S representa al menos un puente de disulfuro entre un residuo de cisteína de la secuencia de la cadena polipeptídica del segundo conector portador del Fc, 'más pesada', y un residuo de cisteína de la secuencia C terminal de la cadena polipeptídica no portadora del Fc, 'más ligera'. El VL y el VH indican el dominio ligero variable y el dominio pesado variable, respectivamente. Las líneas de puntos y las líneas discontinuas son para distinguir entre las dos cadenas polipeptídicas y, en particular, representan las primeras porciones del conector de dichas cadenas más pesadas o el conector de dichas cadenas más ligeras. El CH2 y el CH3 representan los dominios constantes CH2 y CH3 de un dominio Fc. El Fv h2B6 y el Fv h3G8 indican un sitio de unión del epítopo específico para la CD32B y la CD16, respectivamente.
FIG. 14 REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LAS CADENAS POLIPEPTÍDICAS QUE CONTIENEN LOS DOMINIOS Fc QUE FORMAN LOS DIACUERPOS BIESPECÍFICOS COVALENTES
Representación de las construcciones polipeptídicas que forman las moléculas de diacuerpos de la invención (cada construcción se describe a partir del amino terminal (“n”), lado izquierdo de la construcción, hacia el carboxi terminal (“c”), lado derecho de la figura). La construcción (9) (la SEQ ID NO: 19) comprendía n - un dominio de bisagra/Fc de la IgG1 humana - el dominio VL de Hu3G8 - el conector (GGGSg Gg G (la SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - el conector (GGGSGGGG (la SEQ ID NO: 10)) - y una secuencia C terminal LGGC - c; la construcción (10) (la SEQ ID NO: 20) comprendía n - un dominio Fc de la IgG1 humana - el dominio VL de Hu3G8 - el conector (GGGSGGGG (la SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - el conector (GGGSGGGG (la SEQ ID NO: 10)) - y una secuencia C terminal lGg C - c; la construcción (11) (la SEQ ID NO: 21) comprendía n - el dominio v L de Hu2B6 (G105C) - el conector (GGGSGGGG (la SEQ iD NO: 10)) - el dominio VH de Hu3G8 - y un dominio de bisagra/Fc C terminal de la IgG1 humana con la sustitución de aminoácido A215V - c; la construcción (12) (la SEQ ID NO: 22) comprendía n - el dominio VL de Hu3G8 - el conector (GGGSGGGG (la SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 (G44C) - y una FNRGEC C terminal (la SEQ ID NO: 23) secuencia - c.
FIG. 15 A-B ANÁLISIS MEDIANTE UNA SDS-PAGE Y UNA INMUNOTRANSFERENCIA WESTERN DE LOS DIACUERPOS TETRAMÉRICOS DE AFINIDAD
Los diacuerpos producidos mediante los sistemas de expresión recombinantes cotransfectados con los vectores que expresan las construcciones 10 y 1, las construcciones 9 y 1 y las construcciones 11 y 12, fueron sometidos a un análisis mediante una SDS-PAGE en condiciones no reductoras (A) y a un análisis mediante una inmunotransferencia Western usando H+L anti-IgG1 humana de cabra como sonda (B). Las proteínas del gel de SDS-PAGE se visualizaron con Simply Blue Safestain (Invitrogen). Para ambos paneles A y B, las moléculas de diacuerpos que comprenden las construcciones 10 y 1, las construcciones 9 y 1 y las construcciones 11 y 12A están en los carriles 1, 2 y 3, respectivamente.
FIG. 16 UNIÓN DE LAS MOLÉCULAS DE DIACUERPO QUE COMPRENDEN LOS DOMINIOS Fc y PUENTES DE DISULFURO INTERCATENARIOS MODIFICADOS A LA sCD32B Y A LA sCD16A
Se ensayó la unión de las moléculas de diacuerpos que comprenden los dominios Fc y puentes de disulfuro modificados entre las cadenas polipeptídicas 'más ligera' y 'más pesada' a la sCD32B y a la sCD16A en un ELISA en sándwich. Los diacuerpos ensayados fueron producidos mediante 3 sistemas de expresión recombinantes: que expresan las construcciones 1 y 10, que expresan las construcciones 1 y 9, y que expresan las construcciones 11 y 12, respectivamente. Se usó la sCD32B como la proteína objetivo. La sonda secundaria era la sCD16A conjugada con HRP. Se usó la unión de h3G8 como control.
FIG. 17 REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DEL PRECURSOR POLIPROTEICO DE LA MOLÉCULA DE DIACUERPO Y REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LAS CADENAS POLIPEPTÍDICAS QUE CONTIENEN LOS DOMINIOS DE LA CADENA LIGERA LAMBDA Y/O DE BISAGRA
Representación de las construcciones polipeptídicas que comprenden las moléculas de diacuerpos de la invención (cada construcción se describe a partir del amino terminal (“n”), lado izquierdo de la construcción, hacia el carboxi terminal (“c”), lado derecho de la figura). La construcción (13) (la SEQ ID NO: 97) comprendía n - el dominio VL de 3G8 - un primer conector (GGGSGGGG (la SEQ ID NO: 10)) - el dominio v H de 2.4G2VH - un segundo conector (LGGC) - un sitio de reconocimiento de furina (RAKR (la SEQ ID NO: 95)) - el dominio VL de 2.4G2 - un tercer conector (GGGSGGG (la SEQ ID NO: 10) - el dominio VH de 3G8 - y un dominio LGGC C terminal; (la secuencia de nucleótidos que codifica la SEQ ID NO: 97 se proporciona en la SEQ ID NO: 98). La construcción (14) (la SEQ ID NO: 99) comprendía n - el dominio VL de 3G8 - un primer conector (GGGSGGGG (la SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de 2.4G2VH - un segundo conector (LGGC) - un sitio de reconocimiento de furina (RAKR (la s Eq ID NO: 95)) - un sitio de la FMD (la proteasa C3 del virus de la glosopeda) - el dominio VL de 2.4G2- un tercer conector (g Gg SGGG (la SEQ ID NO: 10) - el dominio VH de 3G8 - y un dominio LGGC C terminal; (la secuencia de nucleótidos que codifica la SEQ ID NO: 99 se proporciona en la SEQ ID NO: 100). La construcción (15) (la SEQ ID NO: 101) comprendía n - el dominio VL de Hu2b6 - un conector (GGGSGGGG (la SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu3G8 - y un dominio FNRGEC C terminal (la SEQ ID NO: 23); (la secuencia de nucleótidos que codifica la SEQ ID NO: 101 se proporciona en la SEQ ID NO: 102). La construcción (16) (la SEQ ID NO: 103) comprendía n - el dominio v L de Hu3G8 - un conector (GGGSGGGG (la SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - y un dominio VEPKSC C terminal (la SEQ ID NO: 79); (la secuencia de nucleótidos que codifica la SEQ ID NO: 103 se proporciona en la SEQ ID NO: 104).
FIG. 18 UNIÓN DE LAS MOLÉCULAS DE DIACUERPO DERIVADAS DE UNA MOLÉCULA DEL PRECURSOR POLIPROTEICO A LA mCD32B Y ALA sCD16A
Se ensayó la unión de las moléculas de diacuerpos derivadas de la construcción de la molécula del precursor poliproteico 13 (la SEQ ID NO: 97) a la CD32B murina (la mCD32B) y a la CD16A soluble (la sCD16A) en un ELISA en sándwich. Se usó la mCD32B como la proteína objetivo. La sonda secundaria era la sCD16A conjugada con biotina.
FIG. 19 UNIÓN DE LAS MOLÉCULAS DE DIACUERPO QUE COMPRENDEN LOS DOMINIOS DE LA CADENA LAMBDA Y/O DE BISAGRA A LA sCD32B Y A LA sCD16A
Se ensayó la unión de las moléculas de diacuerpos que comprenden los dominios derivados del C terminal de la cadena ligera lambda humana y/o del dominio de bisagra de la IgG a la sCD32B y a la sCD16A y se comparó con las construcciones que comprenden el diacuerpo 1 y 2 (FIG. 5) en un ELISA en sándwich. Los diacuerpos ensayados fueron producidos mediante los sistemas de expresión recombinantes que expresan las construcciones 15 y 16 (la SEQ ID NO: 101 y la SEQ ID NO: 103, respectivamente). Se usó la sCD32B como la proteína objetivo. La sonda secundaria era la sCD16A conjugada con HRP. Las barras con recuadros pequeños representan la combinación de construcción 15/16, mientras que las barras con recuadros grandes representan la combinación de construcción 1/2.
Descripción de las realizaciones preferidas
Cada cadena polipeptídica de la molécula de diacuerpo comprende un dominio VL y un dominio VH, que están unidos covalentemente de forma que los dominios están constreñidos frente a un autoensamblaje. La interacción de dos de las cadenas polipeptídicas producirá dos emparejamientos VL-VH, que forman dos sitios de unión del eptipoe, es decir, una molécula bivalente. Ni el dominio VH ni el VL están constreñidos a ninguna posición en la cadena polipeptídica, es decir, restringidos al amino (N) o carboxi (C) terminal, ni los dominios están restringidos a sus posiciones relativas entre sí, es decir, el dominio VL puede estar N terminal con respecto al dominio VH, y viceversa. La única restricción es que haya disponible una cadena polipeptídica complementaria con objeto de formar un diacuerpo funcional. Cuando los dominios VL y VH derivan del mismo anticuerpo, las dos cadenas polipeptídicas complementarias pueden ser idénticas. Por ejemplo, cuando los dominios de unión derivan de un anticuerpo específico para el epítopo A (es decir, el dominio de unión se forma a partir de una interacción VLa-VHa), cada polipéptido comprenderá un VHa y un VLa. La homodimerización de dos cadenas polipeptídicas del anticuerpo dará como resultado la formación de dos sitios de unión VLa-VHa, dando como resultado un anticuerpo monoespecífico bivalente. Cuando los dominios VL y VH derivan de anticuerpos específicos para diferentes antígenos, la formación de un diacuerpo biespecífico funcional requiere la interacción de dos cadenas polipeptídicas diferentes, es decir, la formación de un heterodímero. Por ejemplo, para un diacuerpo biespecífico, una cadena polipeptídica comprenderá un VLa y un VLb; la homodimerización de dicha cadena dará como resultado la formación de dos sitios de unión VLa-VHb, bien sin unión o bien con una unión impredecible. Por el contrario, cuando se dejan interactuar libremente cadenas polipeptídicas diferentes, por ejemplo, en un sistema de expresión recombinante, una que comprende un VLa y un V v Hb y la otra que comprende un VLb y un VHa , se formarán dos sitios de unión diferentes: VLa-VHa y VLb-VHb. Para todos los pares de cadenas polipeptídicas del diacuerpo, la posibilidad de una mala alineación o de una mala unión de las dos cadenas es una posibilidad, es decir, la interacción de los dominios VL-VL o VH-VH; sin embargo, la purificación de los diacuerpos funcionales se maneja con facilidad basándose en la inmunoespecificidad del sitio de unión apropiadamente dimerizado usando cualquier método basado en afinidad conocido en el son o ejemplificado en el presente documento, por ejemplo, una cromatografía de afinidad.
En otras realizaciones, una o más de las cadenas polipeptídicas del diacuerpo comprende un dominio Fc. Los dominios Fc de las cadenas polipeptídicas de las moléculas de diacuerpos preferentemente dimerizan, dando como resultado la formación de una molécula de diacuerpo que muestra unas propiedades de tipo inmunoglobulina, por ejemplo, interacciones Fc-FcyR. Los diacuerpos que comprenden Fc pueden ser dímeros, por ejemplo, estar comprendidos por dos cadenas polipeptídicas, comprendiendo cada una, un dominio VH, un dominio VL y un dominio Fc. La dimerización de dichas cadenas polipeptídicas da como resultado un diacuerpo bivalente que comprende un dominio Fc, aunque con una estructura distinta de la del anticuerpo bivalente sin modificar (FIG. 11). Dichas moléculas de diacuerpos mostrarán unos fenotipos alterados con respecto a una inmunoglobulina natural, por ejemplo, alteraciones en la semivida sérica, en las propiedades de unión, etc. En otras realizaciones, las moléculas de diacuerpos que comprenden dominios Fc pueden ser tetrámeros. Dichos tetrámeros comprenden dos cadenas polipeptídicas 'más pesadas', es decir, una cadena polipeptídica que comprende un dominio VL, un VH y un Fc, y dos cadenas polipeptídicas 'más ligeras', es decir, una cadena polipeptídica que comprende un VL y un VH. Dichas cadenas más ligeras y más pesadas interactúan para formar un monómero, y dichos monómeros interactúan a través de sus dominios Fc no emparejados para formar una molécula de tipo Ig. Dicho diacuerpo de tipo Ig es tetravalente y puede ser monoespecífico, biespecífico o tetraespecífico.
Los al menos dos sitios de unión de la molécula de diacuerpo pueden reconocer diferentes epítopos. Los diferentes epítopos pueden ser del mismo antígeno o epítopos de antígenos diferentes. En una realización, los epítopos son de células diferentes. En otra realización, los epítopos son antígenos de la superficie celular de la misma célula o virus. Los sitios de unión de epítopos pueden reconocer cualquier antígeno contra el cual pueda generarse un anticuerpo.
Por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, toxinas bacterianas, marcadores de la superficie celular, marcadores autoinmunes, proteínas víricas, fármacos, etc. En algunos aspectos en particular, al menos un sitio de unión del epítopo del diacuerpo es específico para un antígeno de una célula en particular, tal como un linfocito B o un linfocito T, una célula fagocítica, un linfocito citolítico natural (NK) o una célula dendrítica.
Cada dominio de la cadena polipeptídica del diacuerpo, es decir, los dominios VL, VH y FC, pueden estar separados por un conector peptídico. El conector peptídico puede tener 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 aminoácidos. En ciertas realizaciones, la secuencia del conector peptídico es GGGSGGGG (la SEQ ID NO: 10) codificada por la secuencia del ácido nucleico (la SEQ ID NO: 76).
En ciertas realizaciones, cada cadena polipeptídica de la molécula de diacuerpo está modificada para que comprenda al menos un residuo de cisteína que interactuará con un al menos un residuo homólogo de cisteína de una segunda cadena polipeptídica de la invención para formar un puente de disulfuro intercatenario. Dichos puentes de disulfuro intercatenarios sirven para estabilizar la molécula de diacuerpo, mejorando la expresión y la recuperación en sistemas recombinantes, dando como resultado una formulación estable y coherente. así como una mejora en la estabilidad del producto aislado y/o purificado in vivo. Dicho al menos un residuo de cisteína puede ser introducido en forma de un aminoácido individual o como parte de una secuencia de aminoácidos más grande, por ejemplo, un dominio de bisagra, en cualquier porción de la cadena polipeptídica. En una realización específica, dicho al menos un residuo de cisteína está modificado para que aparezca en el C terminal de la cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, dicho al menos un residuo de cisteína en introducido en la cadena polipeptídica en la secuencia de aminoácidos LGGC. En una realización específica, el C terminal de la cadena polipeptídica que comprende la molécula de diacuerpo de la invención comprende la secuencia de aminoácidos lGg C. En otra realización, dicho al menos un residuo de cisteína es introducido en el polipéptido en una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio de bisagra, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 4. En una realización específica, el C terminal de una cadena polipeptídica de la molécula de diacuerpo de la invención comprende la secuencia de aminoácidos de un dominio de bisagra de una IgG, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1. En otra realización, el C terminal de una cadena polipeptídica de una molécula de diacuerpo de la invención comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (la SEQ ID NO: 79), que puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 80). En otras realizaciones, dicho al menos un residuo de cisteína en introducido en la cadena polipeptídica en la secuencia de aminoácidos LGGCFNRGEC (la SEQ ID NO: 17), que puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 78). En una realización específica, el C terminal de una cadena polipeptídica que comprende el diacuerpo de la invención comprende la secuencia de aminoácidos LGGCFNRGEC (la SEQ ID NO: 17), que puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 78). En otras realizaciones más, dicho al menos un residuo de cisteína en introducido en la cadena polipeptídica en la secuencia de aminoácidos FNRGEC (la SEQ ID NO: 23), que puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 77). En una realización específica, el C terminal de una cadena polipeptídica que comprende el diacuerpo de la invención comprende la secuencia de aminoácidos FNRGEC (la SEQ iD NO: 23), que puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 77).
En ciertas realizaciones, la molécula de diacuerpo comprende al menos dos cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales comprende la secuencia de aminoácidos LGGC, y están unidas covalentemente por un puente de disulfuro entre los residuos de cisteína de dichas secuencias LGGC. En otra realización específica, la molécula de diacuerpo comprende al menos dos cadenas polipeptídicas, una de las cuales comprende la secuencia FNRGEC (la SEQ ID NO: 23), mientras que la otra comprende un dominio de bisagra (que contiene al menos un residuo de cisteína), en la que dichas al menos dos cadenas polipeptídicas están unidas covalentemente por un puente de disulfuro entre el residuo de cisteína de la FNRGEC (la s Eq ID NO: 23) y un residuo de cisteína del dominio de bisagra. En algunos aspectos en particular, el residuo de cisteína responsable del puente de disulfuro ubicado en el dominio de bisagra es la Cys-128 (numerado según Kabat EU; ubicado en el dominio de bisagra de una cadena pesada de una IgG intacta sin modificar) y el residuo de cisteína homólogo en la SEQ ID NO: 23 es la Cys-214 (numerado según Kabat EU; ubicado en el C terminal de una cadena ligera de una IgG intacta sin modificar) (Elkabetz et al., 2005, J. Biol. Chem. 280: 14402-14412). En otras realizaciones más, el al menos un residuo de cisteína está modificado para que aparezca en el N terminal de la cadena de aminoácidos. En otras realizaciones más, el al menos un residuo de cisteína está modificado para que aparezca en la porción del conector de la cadena polipeptídica de la molécula de diacuerpo. En algunas formas de realización adicionales, el dominio VH o el Vl está modificado para que comprenda al menos una modificación de aminoácido con respecto al dominio VH o VL parental, de forma que dicha modificación de aminoácido comprenda la sustitución de un aminoácido parental por cisteína.
La invención engloba moléculas de diacuerpos que comprenden un dominio Fc o una porción del mismo (por ejemplo, un dominio CH2 o un dominio CH3). El dominio Fc o una porción del mismo puede derivar de cualquier isotipo o alotipo de inmunoglobulina incluyendo, pero no se limita a, la IgA, la IgD, la IgG, la IgE y la IgM. En algunas realizaciones preferidas, el dominio Fc (o una porción del mismo) deriva de la IgG. En algunas realizaciones específicas, el isotipo de la IgG es la IgG1, la IgG2, la IgG3 o la IgG4 o un alotipo de las mismas. En una realización, la molécula de diacuerpo comprende un dominio Fc, dominio Fc que comprende un dominio CH2 y un dominio CH3 seleccionado independientemente entre cualquier isotipo de inmunoglobulina (es decir, un dominio Fc que comprende el dominio CH2 derivado de la IgG y el dominio CH3 derivado de la IgE, o el dominio CH2 derivado de la IgG1 y el dominio CH3 derivado de la IgG2, etc.). Dicho dominio Fc puede ser modificado en una cadena polipeptídica que comprende la molécula de diacuerpo de la invención en cualquier posición con respecto a otros dominios o porciones de dicha cadena polipeptídica (por ejemplo, el dominio Fc, o una porción del mismo, puede estar c terminal con respecto a los dos dominios VL y VH de la cadena polipeptídica; puede estar n terminal con respecto a los dos dominios VL y VH; o puede estar N terminal con respecto un dominio y c terminal con respecto al otro (es decir, entre los dos dominios de la cadena polipeptídica)).
La presente invención también incluye moléculas que comprenden un dominio de bisagra. El dominio de bisagra ser derivado a partir de cualquier isotipo o alotipo de inmunoglobulina incluyendo la IgA, la IgD, la IgG, la IgE y la IgM. En algunas realizaciones preferidas, el dominio de bisagra deriva de la IgG, en la que el isotipo de la IgG es la IgG1, la IgG2, la IgG3 o la IgG4, o un alotipo de las mismas. Dicho dominio de bisagra puede ser modificado en una cadena polipeptídica que comprende la molécula de diacuerpo junto con un dominio Fc, de tal forma que la molécula de diacuerpo comprenda un dominio de bisagra-Fc. En ciertas realizaciones, el dominio de bisagra y el Fc se seleccionan independientemente entre cualquier isotipo de inmunoglobulina conocido en la materia o ejemplificado en el presente documento. En otras realizaciones, el dominio de bisagra y el Fc están separados por al menos otro dominio de la cadena polipeptídica, por ejemplo, el dominio VL. El dominio de bisagra, u opcionalmente el dominio de bisagra-Fc, puede ser modificado a un polipéptido de la invención en cualquier posición con respecto a otros dominios o porciones de dicha cadena polipeptídica. En ciertas realizaciones, una cadena polipeptídica de la invención comprende un dominio de bisagra, dominio de bisagra que está en el C terminal de la cadena polipeptídica, en el que dicha cadena polipeptídica no comprende un dominio Fc. En otras realizaciones más, una cadena polipeptídica de la invención comprende un dominio de bisagra-Fc, dominio de bisagra-Fc que está en el C terminal de la cadena polipeptídica. En algunas formas de realización adicionales, una cadena polipeptídica de la invención comprende un dominio de bisagra-Fc, dominio de bisagra-Fc que está en el N terminal de la cadena polipeptídica.
Como se ha analizado anteriormente, la invención engloba multímeros de cadenas polipeptídicas, comprendiendo cada una de las cadenas polipeptídicas un dominio VH y un VL. En ciertos aspectos, las cadenas polipeptídicas de dichos multímeros comprenden adicionalmente un dominio Fc. La dimerización de los dominios Fc da lugar a la formación de una molécula de diacuerpo que muestra una funcionalidad de tipo inmunoglobulina, es decir, una función mediada por el Fc (por ejemplo, una interacción Fc-FcyR, la unión al complemento, etc.). En ciertas realizaciones, los dominios VL y VH que comprenden cada cadena polipeptídica tienen la misma especificidad, y dicha molécula de diacuerpo es bivalente y monoespecífica. En otras realizaciones, los dominios Vl y VH que comprenden cada cadena polipeptídica tienen una especificidad diferente, y el diacuerpo es bivalente y biespecífico.
En otras realizaciones más, las moléculas de diacuerpos de la invención engloban tetrámeros de cadenas polipeptídicas, comprendiendo cada una de las cadenas polipeptídicas un dominio VH y un VL. En ciertas realizaciones, dos cadenas polipeptídicas del tetrámero comprenden adicionalmente un dominio Fc. Por lo tanto, el tetrámero está comprendido por dos cadenas polipeptídicas 'más pesadas', comprendiendo cada una un dominio VL, un VH y un Fc, y dos cadenas polipeptídicas 'más ligeras', que comprenden un dominio VL y un VH. La interacción de una cadena más pesada y una más ligera en un monómero bivalente, acoplada con la dimerización de dichos monómeros a través de los dominios Fc de las cadenas más pesadas, dará lugar a la formación de una molécula tetravalente de tipo inmunoglobulina (ejemplificada en el Ejemplo 6.2 y en el Ejemplo 6.3). En ciertos aspectos, los monómeros son los mismos y la molécula de diacuerpo tetravalente es monoespecífica o biespecífica. En otros aspectos, los monómeros son diferentes y la molécula tetravalente es biespecífica o tetraespecífica.
La formación de una molécula de diacuerpo tetraespecífica según se describe supra requiere la interacción de cuatro cadenas polipeptídicas diferentes. Dichas interacciones son difíciles de conseguir con eficiencia en un sistema de producción recombinante de célula única, debido a las muchas variantes de los potenciales malemparejamientos de la cadena. Una solución para aumentar la probabilidad de malemparejamientos es diseñar mutaciones de tipo “nudos en orificios" en los pares de cadenas polipeptídicas deseados. Dichas mutaciones favorecen una heterodimerización con respecto a una homodimerización. Por ejemplo, con respecto a las interacciones Fc-Fc, puede introducirse una sustitución de aminoácido (preferentemente una sustitución por un aminoácido que comprende un grupo lateral voluminoso que forma un 'nudo', por ejemplo, triptófano) en el dominio CH2 o CH3, de forma que las interferencias estéricas impedirán la interacción con un dominio mutado de forma similar y obligarán al dominio mutado a emparejarse con un dominio en el que se haya modificado una mutación complementaria o de acomodación, es decir, 'el orificio' (por ejemplo, una sustitución por glicina). Dichos conjuntos de mutaciones pueden ser modificados en cualquier par de polipéptidos que comprenda la molécula de diacuerpo, y además, modificarse en cualquier porción de las cadenas polipeptídicas de dicho par. Los métodos para la modificación de proteínas para favorecer una heterodimerización con respecto a una homodimerización son bien conocidos en la materia, en particular con respecto a la modificación de moléculas de tipo inmunoglobulina, y están englobados en el presente documento (véase, por ejemplo, Ridgway et al., 1996, Protein Engr. 9: 617-621, Atwell et al., 1997, J. Mol. Biol. 270: 26-35, y Xie et al., 2005, J. Immunol. Methods 296: 95-101).
La invención también incluye moléculas de diacuerpos que comprenden dominios Fc variantes o de bisagra-Fc variantes (o una porción de los mismos), dominio Fc variante que comprende al menos una modificación de aminoácido (por ejemplo, una sustitución, una inserción, una deleción) con respecto a un dominio Fc o de bisagra-Fc comparable natural (o una porción del mismo). Las moléculas que comprenden dominios Fc o de bisagra-Fc variantes (o una porción de los mismos) (por ejemplo, anticuerpos) normalmente tienen unos fenotipos alterados con respecto a las moléculas que comprenden dominios Fc o dominios de bisagra-Fc naturales o porciones de los mismos. El fenotipo variante puede ser expresado en forma de una alteración en la semivida sérica, en la estabilidad, en la susceptibilidad a las enzimas celulares o en la función efectora, según se ensaya en un ensayo dependiente de NK o de macrófagos. Los dominios Fc variantes identificados por alterar la función efectora se divulgan en la Solicitud Internacional WO04/063351, en las Publicaciones de Solicitudes de Patentes de Estados Unidos 2005/0037000 y 2005/0064514 y en las Solicitudes de Patentes de Estados Unidos 11/271.140 (Publicación n° US 2006-0134709), presentada el 10 de noviembre de 2005, y 11/305.787 (Publicación n° US 2006-0177439 A1), presentada el 15 de diciembre de 2005, solicitudes concurrentes de los Inventores.
Los diacuerpos biespecíficos de la invención pueden unirse simultáneamente a dos epítopos individuales y distintos. En ciertas realizaciones, los epítopos son del mismo antígeno. En otras realizaciones, los epítopos son de diferentes antígenos. En las realizaciones preferidas, al menos un sitio de unión del epítopo es específico para un determinante expresado en una célula efectora inmunitaria (por ejemplo, CD3, CD16, CD32, CD64, etc.) que son expresados en los linfocitos T, en los linfocitos citolíticos naturales (NK) o en otras células mononucleares. En una realización, la molécula de diacuerpo se une al determinante de la célula efectora y también activa dicha célula efectora. A este respecto, las moléculas de diacuerpos de la invención pueden mostrar una funcionalidad de tipo Ig independientemente de si comprenden adicionalmente un dominio Fc (por ejemplo, según se ensaya en cualquier ensayo de función efectora conocido en la materia o ejemplificado en el presente documento (por ejemplo, el ensayo de ADCC). En ciertas realizaciones, el diacuerpo biespecífico de la invención se une tanto a un oncoantígeno de una célula tumoral como a un determinante de una célula efectora mientras activa dicha célula. En algunas realizaciones alternativas, el diacuerpo biespecífico o la molécula de diacuerpo de la invención puede inhibir la activación de un objetivo, por ejemplo, de una célula efectora, mediante la unión simultánea, y por lo tanto conectando, un receptor de activación y de inhibición de la misma célula (por ejemplo, uniendo ambos de la CD32A y la CD32B, del BCR y la CD32B o del IgER1 y la CD32B) según se ha descrito supra (véase la Sección de Antecedentes). En un aspecto más de esta realización, el diacuerpo biespecífico puede mostrar unas propiedades antivíricas mediante la unión simultánea a dos epítopos neutralizantes de un virus (por ejemplo, epítopos del RSV; epítopos del WNV tales como E16 y E53).
En ciertas realizaciones, las moléculas de diacuerpos biespecíficos de la invención ofrecen oportunidades únicas para dirigirse a unos tipos celulares específicos. Por ejemplo, el diacuerpo biespecífico o la molécula de diacuerpo puede estar modificada para que comprenda una combinación de sitios de unión del epítopo que reconoce un conjunto de antígenos único de una célula o tipo celular objetivo. Adicionalmente, cuando alguno o ambos de los antígenos individuales es/son bastante común(es) por separado en otros tejidos y/o tipos celulares, pueden usarse dominios de unión de baja afinidad para la construcción del diacuerpo o de la molécula de diacuerpo. Dichos dominios de unión de baja afinidad serán incapaces de unirse al epítopo o al antígeno individual con una suficiente avidez para los propósitos terapéuticos. Sin embargo, cuando ambos epítopos o antígenos están presentes en una única célula o tejido objetivo, la avidez del diacuerpo o de la molécula de diacuerpo por la célula o el tejido, con respecto a una célula o tejido que expresa únicamente uno de los antígenos, estará aumentada, de forma que dicha célula o tejido puede ser efectivamente un objetivo de la invención. Dicha molécula biespecífica puede mostrar una unión aumentada a uno o ambos de sus antígenos objetivo en las células que expresan ambos de dichos antígenos con respecto a un diacuerpo monoespecífico o un anticuerpo con especificidad únicamente por uno de los antígenos.
Preferiblemente, las propiedades de unión de los diacuerpos de la invención se caracterizan mediante ensayos funcionales in vitro para la determinación de la actividad de unión y/o de una o más funciones celulares efectoras del mediador FcyR (medidas a través de las interacciones Fc-FcyR o mediante la unión inmunoespecífica de una molécula de diacuerpo a un FcyR) (véase la Sección 5.4.2 y la 5.4.3). Las afinidades y las propiedades de unión de las moléculas, por ejemplo, de los diacuerpos, de la invención, por un FcyR, pueden ser determinadas usando ensayos in vitro (ensayos con una base bioquímica o inmunológica) conocidos en la materia para la determinación de la unión dominio-antígeno o de las interacciones Fc-FcyR, es decir, de la unión específica de un antígeno a un dominio de unión, o de la unión específica de una región Fc a un FcyR, respectivamente, incluyendo, pero no se limitan a, un ensayo de ELISA, un ensayo de resonancia de plasmón superficial, ensayos de inmunoprecipitación (véase la Sección 5.4.2). En las realizaciones más preferidas, las moléculas de la invención tienen unas propiedades de unión similares en los modelos in vivo (tales como los descritos y divulgados en el presente documento) a las de los ensayos con una base in vitro. Sin embargo, la presente invención no excluye las moléculas de la invención que no muestran el fenotipo deseado en los ensayos con una base in vitro pero que sí muestran el fenotipo deseado in vivo.
En algunas realizaciones, las moléculas de la invención están modificadas para que comprendan un patrón de glicosilación alterado o una glicoforma alterada con respecto a la porción comparable de la molécula de molde. Las glicoformas modificadas pueden ser útiles en una diversidad de propósitos que incluyen, pero no se limitan a, una mejora de la función efectora. Las glicoformas modificadas pueden ser generadas mediante cualquier método conocido por los expertos en la materia, por ejemplo mediante el uso de cepas de expresión modificadas o variantes, mediante la coexpresión con una o más enzimas, por ejemplo, la DI N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTI11), mediante la expresión de un diacuerpo de la invención en varios organismos o líneas celulares de varios organismos, o mediante la modificación del (los) carbohidrato(s) después de que el diacuerpo haya sido expresado y purificado. Los métodos para la generación de glicoformas modificadas son conocidos en la materia e incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol 17: 176-180; en Davies et al., 2001 Biotechnol Bioeng 74: 288-294; en Shields et al., 2002, J Biol Chem 277: 26733-26740; en Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278: 3466-3473) en el documento US 6.602.684; en el documento USSN 10/277.370; en el documento USSN 10/113.929; en el documento PCT WO 00/61739A1; en el documento PCT WO 01/292246A1; en el documento PCT WO 02/311140A1; en el documento PCT WO 02/30954A1; la tecnología Potillegent™ (Biowa, Inc. Princeton, NJ); la tecnología de modificación de la glicosilación GlycoAcMc™ (GLYCART biotechnology AG, Zúrich, Suiza). Véase, por ejemplo, el documento WO 00061739; el documento EA01229125; el documento US 20030115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49.
La invención engloba además la incorporación de aminoácidos no naturales para generar los diacuerpos de la invención. Dichos métodos son conocidos por los expertos en la materia, tales como aquellos que usan la maquinaria biosintética natural para permitir la incorporación de aminoácidos no naturales en proteínas, véase, por ejemplo, Wang et al., 2002 Chem. Comm. 1: 1-11; Wang et al., 2001, Science, 292: 498-500; van Hest et al., 2001. Chem. Comm. 19: 1897-1904. Las estrategias alternativas se centran en las enzimas responsables de la biosíntesis del amino acil-ARNt, véase, por ejemplo, Tang et al., 2001, J. Am. Chem. 123 (44): 11089-11090; Kiick et al., 2001, FEBS Lett. 505 (3): 465.
En algunas realizaciones, la invención engloba métodos de modificación de un dominio VL, VH o Fc de una molécula de la invención mediante la adición o la deleción de un sitio de glicosilación. Los métodos para modificar los carbohidratos de las proteínas son bien conocidos en la materia y están englobados en la invención véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n° 6.218.149; el documento EP 0359 096 B1; la Publicación de Estados Unidos n° US 2002/0028486; el documento WO 03/035835; la Publicación de Estados Unidos n° 2003/0115614; la Patente de Estados Unidos n° 6.218.149; la Patente de Estados Unidos n° 6.472.511.
Dominios de unión del diacuerpo
Los diacuerpos de la presente invención comprenden dominios de unión al antígeno derivados generalmente de inmunoglobulinas o de anticuerpos. Los anticuerpos a partir de los cuales derivan los dominios de unión usados en los métodos de la invención pueden proceder de cualquier origen animal, incluyendo aves y mamíferos (por ejemplo, de seres humanos, de primates no humanos, murinos, de burro, de oveja, de conejo, de cabra, de cobaya, de camello, de caballo o de pollo). Preferiblemente, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales humanos o humanizados. Según se usa en el presente documento, los anticuerpos “humanos” incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen los anticuerpos aislados a partir de colecciones de inmunoglobulinas humanas o de colecciones de secuencias codificantes de inmunoglobulinas humanas sintéticas o de ratones que expresan los anticuerpos a partir de genes humanos.
La invención contempla el uso de cualquier anticuerpo conocido en la materia para el tratamiento y/o la prevención del cáncer, de una enfermedad autoinmune, de una enfermedad inflamatoria o de una enfermedad infecciosa, como fuente de los dominios de unión para los diacuerpos de la invención. Algunos ejemplos no limitantes de oncoanticuerpos conocidos se proporcionan en la sección 5.7.1, así como otros anticuerpos específicos para los antígenos y anticuerpos objetivo recogidos contra los oncoanticuerpos recogidos en la sección 5.6.1; algunos ejemplos no limitantes de anticuerpos conocidos para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad autoinmune y de una enfermedad inflamatoria se proporcionan en la sección 5.7.2., así como los anticuerpos contra los antígenos y anticuerpos objetivo recogidos contra los antígenos recogidos en la sección 5.6.2; en otras realizaciones pueden usarse anticuerpos contra los epítopos asociados con enfermedades infecciosas, según se recoge en la Sección 5.6.3. En ciertas realizaciones, los anticuerpos comprenden una región Fc variante que comprende una o más modificaciones de aminoácidos, que han sido identificados mediante los métodos de la invención para que tengan una función efectora conferida y/o una afinidad aumentada por el FcyRIIB y una afinidad disminuida por el FcyRIIIA con respecto a una molécula comparable que comprende una región Fc natural. Un ejemplo no limitante de los anticuerpos que se usan para el tratamiento o la prevención de trastornos inflamatorios que pueden ser modificados según la invención se presenta en la Tabla 9, y un ejemplo no limitante de los anticuerpos que se usan para el tratamiento o la prevención de un trastorno autoinmune se presenta en la Tabla 10.
Para algunos usos, incluyendo un uso in vivo de los anticuerpos en seres humanos y en ensayos de detección in vitro, puede ser preferible usar diacuerpos con dominios variables derivados de anticuerpos humanos, quiméricos o humanizados. Los dominios variables de anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para un tratamiento terapéutico de sujetos humanos. Los anticuerpos humanos pueden elaborarse mediante una diversidad de métodos conocidos en la materia que incluyen los métodos de expresión en fago descritos anteriormente usando colecciones de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulinas humanas. Véanse también las Patentes de Estados Unidos n° 4.444.887 y 4.716.111; y las Publicaciones Internacionales n° WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741.
Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo, una variante o un fragmento del mismo que es capaz de unirse a un antígeno predeterminado y que comprende una región en marco que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y una CDR que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana. Un anticuerpo humanizado puede comprender sustancialmente todos los al menos uno, y normalmente dos, dominios variables en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR se corresponden con las de una inmunoglobulina no humana (es decir, de un anticuerpo donante) y todas o sustancialmente todas las regiones en marco son las de una secuencia consenso de una inmunoglobulina humana.
Las regiones en marco y CDR de un anticuerpo humanizado no tienen por qué corresponder de forma precisa con las secuencias parentales, por ejemplo, la CDR donante o la del marco de consenso pueden estar mutadas mediante una sustitución, una inserción o una deleción de al menos un residuo, de forma que el residuo de la CDR o del marco en ese sitio no se corresponda ni con la consenso ni con el anticuerpo donante. Sin embargo, dichas mutaciones preferentemente no son extensivas. Habitualmente, al menos el 75 % de los residuos de anticuerpos humanizados se corresponderán con los de la región en marco parental (FR) y las secuencias de la CDR, más a menudo el 90 % y lo más preferentemente más del 95 %. Los anticuerpos humanizados pueden ser producidos usando una diversidad de técnicas conocidas en la materia que incluyen, pero no se limitan a, un injerto de CDR (Patente Europea n° EP 239.400; Publicación Internacional n° WO 91/09967; y las Patentes de Estados Unidos n° 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089), una inactivación o remodelación superficial (Patentes Europeas n° EP 592.106 y EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7 (6): 805-814; y Roguska et al., 1994, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 91: 969-973), transposiciones de la cadena (Patente de Estados Unidos n° 5.565.332) y las técnicas divulgadas, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 6.407.213, 5.766.886, 5.585.089, en la Publicación Internacional n° Wo 9317105, Tan et al., 2002, J. Immunol.
169: 1119-25, Caldas et al., 2000, Protein Eng. 13: 353-60, Morea et al., 2000, Methods 20: 267-79, Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 10678-84, Roguska et al., 1996, Protein Eng. 9: 895-904, Couto et al., 1995, Cancer Res.
55 (23 Sup.): 5973s-5977s, Couto et al., 1995, Cancer Res. 55: 1717-22, Sandhu, 1994, Gene 150: 409-10, Pedersen et al., 1994, J. Mol. Biol. 235: 959-73, Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525, Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323 y Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596. A menudo, los residuos en marco de las regiones en marco serán sustituidos por el correspondiente residuo del anticuerpo donante de la CDR para alterar, preferentemente para mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones en marco son identificadas mediante métodos bien conocidos en la materia, por ejemplo, mediante el modelado de las interacciones de la CDR y los residuos en marco para identificar los residuos en marco importantes para la unión al antígeno, y la comparación de la secuencia para identificar residuos en marco no habituales en unas posiciones en particular. (Véase, por ejemplo, Queen et al., Patente de Estados Unidos n° 5.585.089; las Publicaciones de Estados Unidos n° 2004/0049014 y 2003/0229208; las Patentes de Estados Unidos n° 6.350.861; 6.180.370; 5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; y 5.530.101 y Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323).
En la realización más preferida, el dominio de unión humanizado se une específicamente al mismo epítopo que el anticuerpo murino donante. El experto en la materia apreciará que la invención engloba el injerto de CDR de anticuerpos en general. Por lo tanto, los anticuerpos donantes y aceptores pueden derivar de animales de la misma especie e incluso de la misma clase o subclase de anticuerpo. Sin embargo, más habitualmente, los anticuerpos donantes y aceptores derivan de animales de especies diferentes. Normalmente, el anticuerpo donante es un anticuerpo no humano, tal como un AcMc de roedor, y el anticuerpo aceptor es un anticuerpo humano.
En algunas realizaciones, al menos una CDR del anticuerpo donante es injertada en el anticuerpo humano. En otras realizaciones, al menos dos y preferentemente las tres CDR de cada una de las regiones variables de la cadena pesada y/o ligera son injertadas en el anticuerpo humano. Las CDR pueden comprender las CDR de Kabat, las CDR de un bucle estructural o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, puede usarse un anticuerpo FcyRIIB humanizado que comprende al menos una cadena pesada con una CDR injertada y al menos una cadena ligera con una CDR injertada.
Los diacuerpos usados en los métodos incluyen derivados que están modificados, es decir, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al diacuerpo. Por ejemplo, pero no como limitación, los derivados de diacuerpos incluyen diacuerpos que han sido modificados, por ejemplo, mediante una glicosilación, una acetilación, una pegilación, una fosforilación, una amidación, una derivatización con grupos protectores/bloqueantes conocidos, una escisión proteolítica, la unión a un ligando celular o a otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas puede llevarse a cabo mediante las técnicas conocidas que incluyen, pero no se limitan a, una escisión química específica, una acetilación, una formilación, la síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.
Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que las diferentes porciones del anticuerpo derivan de diferentes moléculas de inmunoglobulina, tales como anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo no humano y una región constante de una inmunoglobulina humana. Los métodos para la producción de anticuerpos quiméricos son conocidos en la materia. Véase, por ejemplo, Morrison, 1985, Science 229: 1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125: 191-202; y las Patente de Estados Unidos n° 6.311.415, 5.807.715, 4.816.567 y 4.816.397.
A menudo, los residuos en marco de las regiones en marco serán sustituidos por el correspondiente residuo del anticuerpo donante de la CDR para alterar, preferentemente mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones en marco son identificadas mediante métodos bien conocidos en la materia, por ejemplo, mediante el modelado de las interacciones de la CDR y los residuos en marco para identificar los residuos en marco importantes para la unión al antígeno, y una comparación de la secuencia para identificar los residuos en marco no habituales en unas posiciones en particular. (Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n° 5.585.089; y Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323)
Los anticuerpos monoclonales a partir de los cuales pueden prepararse los dominios de unión de los diacuerpos de la invención usando una gran diversidad de técnicas conocidas en la materia incluyen el uso de un hibridoma, de tecnologías recombinantes y de expresión en fago, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando las técnicas de hibridoma que incluyen las conocidas en la materia y las que se enseñan, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); en Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, páginas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981). El término “anticuerpo monoclonal” según se usa en el presente documento no está limitado a los anticuerpos producidos a través de la tecnología del hibridoma. El término “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo que deriva de un único clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o de fago, y no al método mediante el cual es producido.
Los métodos para la producción y el cribado de anticuerpos específicos usando la tecnología del hibridoma son rutinarios y bien conocidos en la materia. En un ejemplo no limitante, puede inmunizarse un ratón con un antígeno de interés o una célula que expresa dicho antígeno. Una vez se detecta una respuesta inmunitaria, por ejemplo, anticuerpos específicos para el antígeno en el suero del ratón, se extrae el bazo del ratón y se aíslan los esplenocitos. Después, los esplenocitos se fusionan mediante técnicas bien conocidas con cualquier célula de mieloma adecuada. Los hibridomas son seleccionados y clonados mediante una dilución limitante. Los clones del hibridoma se ensayan después mediante métodos conocidos en la materia para evaluar las células que secretan anticuerpos capaces de unirse al antígeno. El líquido ascítico, que generalmente contiene unos elevados niveles de anticuerpos, puede ser generado mediante la inoculación de ratones por vía intraperitoneal con clones de hibridoma positivos. Algunos antígenos de interés incluyen, pero no se limitan a, los antígenos asociados con los cánceres proporcionados en la sección 5.8.1, los antígenos asociados con las enfermedades autoinmunes y las enfermedades inflamatorias proporcionadas en la sección 5.8.2, los antígenos asociados con las enfermedades infecciosas proporcionadas en la sección 5.8.3 y las toxinas proporcionadas en la sección 5.8.4.
Los anticuerpos también pueden ser generados usando varios métodos de expresión en fago conocidos en la materia. En los métodos de expresión en fago, los dominios de un anticuerpo funcional se expresan en la superficie de las partículas del fago que porta las secuencias de polinucleótidos que los codifica. En una realización en particular, dicho fago puede utilizarse para expresar los dominios de unión al antígeno, tales como Fab y Fv o Fv estabilizado por un puente de disulfuro, expresados a partir de un repertorio o de una colección combinatoria de anticuerpos (por ejemplo, humanos o murinos). La expresión en fago de un dominio de unión al antígeno que se une al antígeno de interés puede ser seleccionada o identificada con el antígeno usando, por ejemplo, un antígeno marcado o un antígeno unido o capturado en una superficie sólida o en una microesfera. El fago usado en estos métodos es normalmente un fago filamentoso, incluyendo fd y M13. Los dominios de unión al antígeno son expresados en forma de una proteína fusionada recombinantemente en cualquiera del gen III o el gen VIII de la proteína del fago. Algunos ejemplos de métodos de expresión en fago que pueden usarse para crear inmunoglobulinas, o fragmentos de las mismas, incluyen los divulgados en Brinkman et al., J. Immunol. Methods, 182: 41-50, 1995; en Ames et al., J. Immunol. Methods, 184: 177-186, 1995; en Kettleborough et al., Eur. J. Immunol, 24: 952-958, 1994; en Persic et al., Gene, 187: 9-18, 1997; en Burton et al., Advances in Immunology, 57: 191-280, 1994; en la Solicitud PCT n° PCT/GB91/01134; en las Publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y en las Patentes de Estados Unidos n° 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108.
La tecnología de expresión en fago puede usarse para aumentar la afinidad de un anticuerpo por su antígeno. Esta técnica sería útil en la obtención de anticuerpos de alta afinidad. La tecnología, denominada maduración de la afinidad, emplea una mutagénesis o un desplazamiento sobre la CDR y una reselección usando el antígeno análogo para la identificación de los anticuerpos que se unen con una mayor afinidad el antígeno en comparación con el anticuerpo inicial o parental (véase, por ejemplo, Glaser et al., 1992, J. Immunology 149: 3903). La mutagenización de codones completos en lugar de nucleótidos individuales da como resultado un repertorio semialeatorizado de mutaciones de aminoácidos. Pueden construirse colecciones que consisten en un conjunto de clones variantes, cada uno de los cuales difiere por una alteración en un aminoácido individual en una CDR individual, y que contiene variantes que representan cada posible sustitución de aminoácido para cada residuo de la CDR. Los mutantes con un aumento en la afinidad de unión por el antígeno pueden ser cribados poniendo en contacto los mutantes inmovilizados con el antígeno marcado. Puede usarse cualquier método de cribado conocido en la materia para la identificación de los anticuerpos mutantes con un aumento en la avidez por el antígeno (por ejemplo, un ELISA) (véase Wu et al., 1998, Proc Natl. Acad Sci. EE.UU. 95: 6037; Yelton et al., 1995, J. Immunology 155: 1994). También es posible un desplazamiento sobre la CDR que aleatoriza la cadena ligera (véase Schier et al., 1996, J. Mol. Bio. 263: 551).
También se describe el uso de dominios de unión que comprenden la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los dominios de unión descritos en el presente documento o conocidos en la materia con mutaciones (por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácidos) en las regiones en marco o en una CDR. Preferiblemente, las mutaciones en estos dominios de unión mantienen o mejoran la avidez y/o la afinidad de los dominios de unión por el FcyRIIB al que se unen inmunoespecíficamente. Pueden usarse las técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia (por ejemplo, inmunoensayos) para ensayar la afinidad de un anticuerpo por un antígeno en particular.
Pueden usarse las técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia para la introducción de mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, o un fragmento del mismo, incluyendo, por ejemplo, mutagénesis dirigida y mutagénesis mediada por una PCR, lo que da como resultado sustituciones de aminoácidos. Preferiblemente, los derivados incluyen menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos o menos de 2 sustituciones de aminoácidos con respecto al anticuerpo original o un fragmento del mismo. En una realización preferida, los derivados tienen sustituciones conservativas de aminoácidos hechas en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos.
Diacuerpos que comprenden sitios de unión al eptiopo que se unen inmunoespecíficamente al FcYRIIb
En una realización en particular, al menos uno de los dominios de unión de los diacuerpos de la invención agoniza al menos una actividad del FcyRIIB. En una realización de la invención, dicha actividad es la inhibición de la señalización mediada por el receptor de los linfocitos B. En otra realización, el dominio de unión inhibe la activación de los linfocitos B, la proliferación de los linfocitos B, la producción de anticuerpos, el flujo de entrada de calcio intracelular de los linfocitos B, la progresión del ciclo celular o la actividad de una o más moléculas de señalización cascada abajo en la ruta de transducción de señales del FcyRIIB. En otra realización más, el dominio de unión aumenta la fosforilación del FcyRIIB o el reclutamiento de la SHIP. En una realización adicional de la invención, el dominio de unión inhibe la actividad de la cinasa MAP o el reclutamiento de la Akt en la ruta de señalización mediada por el receptor de los linfocitos B. En otra realización, el dominio de unión agoniza la inhibición mediada por el FcyRIIB de la señalización del FceRI. En una realización en particular, dicho dominio de unión inhibe la activación de los mastocitos inducida por el FceRI, la movilización de calcio, la desgranulación, la producción de citocinas o la liberación de serotonina. En otra realización, los dominios de unión de la invención estimulan la fosforilación del FcyRIIB, estimula el reclutamiento de la SHIP, estimula la fosforilación de la SHIP y su asociación con la She, o inhibe la activación de los miembros de la familia de la cinasa MAP (por ejemplo, Erk1, Erk2, JNK, p38, etc.). En otra realización más, los dominios de unión de la invención aumentan la fosforilación de la tirosina de p62dok y su asociación con la SHIP y la rasGAP. En otra realización, los dominios de unión de la invención inhiben la fagocitosis mediada por el FcyR en los monocitos o en los macrófagos.
En otra realización, los dominios de unión antagonizan al menos una actividad del FcyRIIB. En una realización, dicha actividad es la activación de la señalización mediada por el receptor de los linfocitos B. En una realización en particular, los dominios de unión aumentan la actividad de los linfocitos B, la proliferación de los linfocitos B, la producción de anticuerpos, el flujo de entrada de calcio intracelular o la actividad de una o más moléculas de señalización cascada abajo en la ruta de transducción de señales del FcyRIIB. En otra realización en particular más, los dominios de unión disminuyen la fosforilación del FcyRIIB o el reclutamiento de la SHIP. En una realización adicional de la invención, los dominios de unión aumentan la actividad de la cinasa MAP o el reclutamiento de la Akt en la ruta de señalización mediada por el receptor de los linfocitos B. En otra realización, los dominios de unión antagonizan la inhibición mediada por el FcyRIIB de la señalización del FceRI. En una realización en particular, los dominios de unión aumentan la activación de los mastocitos inducida por el FceRI, la movilización de calcio, la desgranulación, la producción de citocinas o la liberación de serotonina. En otra realización, los dominios de unión inhiben la fosforilación del FcyRIIB, inhiben el reclutamiento de la SHIP, inhiben la fosforilación de la SHIP y su asociación con la She, aumentan la activación de los miembros de la familia de la cinasa MAP (por ejemplo, Erk1, Erk2, JNK, p38, etc.). En otra realización más, los dominios de unión inhiben la fosforilación de la tirosina de p62dok y su asociación con la SHIP y la rasGAP. En otra realización, los dominios de unión aumentan la fagocitosis mediada por el FcyR en los monocitos o en los macrófagos. En otra realización, los dominios de unión impiden la fagocitosis, la eliminación de las partículas opsonizadas por los macrófagos esplénicos.
En otras realizaciones, puede usarse al menos uno de los dominios de unión para dirigir los diacuerpos de la invención a las células que expresan el FcyRIIB.
En una realización en particular, uno de los dominios de unión deriva de un anticuerpo monoclonal de ratón producido mediante el clon 2B6 o 3H7, que tiene los números de registro de la ATCC PTA-4591 y PTA-4592, respectivamente. Los hibridomas que producen los anticuerpos 2B6 y 3H7 han sido depositados en la American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209) el 13 de agosto de 2002 conforme a las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedures y se les asignaron los números de registro PTA-4591 (para el hibridoma que produce el 2B6) y PTA-4592 (para el hibridoma que produce el 3H7), respectivamente. En una realización preferida, los dominios de unión son humanos o han sido humanizados, preferentemente derivan de una versión humanizada del anticuerpo producido por el clon 3H7 o 2B6.
La invención también incluye diacuerpos con dominios de unión de otros anticuerpos, que se unen específicamente al FcyRIIB, preferentemente al FcyRIIB humano, más preferentemente al FcyRIIB humano nativo, que derivan de clones que incluyen, pero no se limitan a, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 y 1F2 que tienen los números de registro de la ATCC, PTA-5958, PtA-5961, PTA-5962, PTA-5960 y PTA-5959, respectivamente. Los hibridomas que producen los clones identificados anteriormente fueron depositados conforme a las disposiciones del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209) el 7 de mayo de 2004. En las realizaciones preferidas, los dominios de unión de los anticuerpos descritos anteriormente están humanizados.
En una realización específica, los dominios de unión usados en los diacuerpos de la presente invención son de un anticuerpo o de un fragmento de unión al antígeno del mismo (que comprende, por ejemplo, una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR), preferentemente la totalidad de las 6 c Dr ) del anticuerpo producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1,2H9, 2D11 o 1F2. En otra realización, el dominio de unión se une al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal de ratón producido a partir del clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1 F2 , respectivamente y/o compite con el anticuerpo monoclonal de ratón producido a partir del clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2 según se determina, por ejemplo, en un ensayo de ELISA o en otro inmunoensayo competitivo apropiado, y también se une al FcyRIIB con una mayor afinidad con la que el dominio de unión se une al FcyRIIA.
La presente invención también incluye diacuerpos con dominios de unión que comprenden una secuencia de aminoácidos de una cadena pesada variable y/o de una cadena ligera variable que es idéntica en al menos el 45 %, en al menos el 50 %, en al menos el 55 %, en al menos el 60 %, en al menos el 65 %, en al menos el 70 %, en al menos el 75 %, en al menos el 80 %, en al menos el 85 %, en al menos el 90 %, en al menos el 95 % o en al menos el 99 % a la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable y/o de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2. La presente invención engloba adicionalmente diacuerpos con dominios de unión que se unen específicamente al FcyRIIB con una afinidad mayor con la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une al FcyRIIA y que comprenden una secuencia de aminoácidos de una o más CDR que es idéntica en al menos el 45 %, en al menos el 50 %, en al menos el 55 %, en al menos el 60 %, en al menos el 65 %, en al menos el 70 %, en al menos el 75 %, en al menos el 80 %, en al menos el 85 %, en al menos el 90 %, en al menos el 95 % o en al menos el 99 % a la secuencia de una o más CDR del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2. La determinación del porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos puede ser determinada mediante cualquier método conocido por los expertos en la materia, incluyendo las búsquedas de proteínas mediante BLAST.
La presente invención también incluye el uso de diacuerpos que contienen dominios de unión que se unen específicamente al FcyRIIB con una afinidad mayor con la que el dominio de unión se une al FcyRIIA, que son codificados por una secuencia de nucleótidos que hibrida con la secuencia de nucleótidos del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1 D5 , 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2 en unas condiciones rigurosas. En una realización preferida, el dominio de unión se une específicamente al FcyRIIB con una afinidad mayor que al FcyRIIA y comprende una cadena ligera variable y/o una cadena pesada variable codificada por una secuencia de nucleótidos que hibrida en unas condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera variable y/o de la cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2 en unas condiciones rigurosas. En otra realización preferida, los dominios de unión se unen específicamente al FcyRIIB con una afinidad mayor que al FcyRIIA y comprenden una o más CDR codificadas por una secuencia de nucleótidos que hibrida en unas condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de una o más CDR del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2. Algunas condiciones de hibridación rigurosas incluyen, pero no se limitan a, una hibridación con un ADN unido a un filtro en 6x de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C seguida de uno o más lavados con 0,2x de SSC/SDS al 0,1 % a aproximadamente 50-65 °C, unas condiciones muy rigurosas tal como una hibridación con un ADN unido a un filtro en 6x de SSC a aproximadamente 45 °C seguida de uno o más lavados con 0,1x de SSC/SDS al 0,2 % a aproximadamente 60 °C, o cualquier otra condición de hibridación rigurosa conocida por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Ausubel, F. M. et al., eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol.1, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley and Sons, Inc., NY en las páginas 6.3.1 hasta 6.3.6 y 2.10.3).
También se describe el uso de dominios de unión que comprenden la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los dominios de unión descritas anteriormente con mutaciones (por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácidos) en las regiones en marco o en las CDR. Preferiblemente, las mutaciones de estos dominios de unión mantienen o mejoran la avidez y/o la afinidad de los dominios de unión por el FcyRIIB al que se unen inmunoespecíficamente. Pueden usarse las técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia (por ejemplo, inmunoensayos) para ensayar la afinidad de un anticuerpo por un antígeno en particular.
Pueden usarse las técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia para la introducción de mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, o un fragmento del mismo, incluyendo, por ejemplo, una mutagénesis dirigida y una mutagénesis mediada por una PCR, que da como resultado sustituciones de aminoácidos. Preferiblemente, los derivados incluyen menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos o menos de 2 sustituciones de aminoácidos con respecto al anticuerpo original o a un fragmento del mismo. En una realización preferida, los derivados tienen sustituciones conservativas de aminoácidos hechas en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos.
En las realizaciones preferidas, los dominios de unión derivan de anticuerpos humanizados. Un anticuerpo humanizado específico del FcyRIIB puede comprender sustancialmente todos los al menos uno, y normalmente dos, dominios variables en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR se corresponden con las de una inmunoglobulina no humana (es decir, un anticuerpo donante) y todas o sustancialmente todas las regiones en marco son las de una secuencia consenso de una inmunoglobulina humana.
Los diacuerpos de la presente invención comprenden dominios humanizados variables específicos para el FcyRIIB en los que una o más regiones de una o más CDR de las regiones de la cadena pesada y/o ligera variable de un anticuerpo humano (el anticuerpo receptor) han sido sustituidas por partes análogas de una o más CDR de un anticuerpo monoclonal donante que se une específicamente al FcyRIIB, con una mayor afinidad que al FcyRIIA, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2. En otras realizaciones, los anticuerpos humanizados se unen al mismo epítopo que el 2B6, el 3H7, el 1D5, 2 el E1, el 2H9, el 2D11 o el 1F2, respectivamente.
En una realización preferida, las regiones CDR del dominio de unión al FcyRIIB humanizado derivan de un anticuerpo murino específico para el FcyRIIB. En algunas realizaciones, los anticuerpos humanizados descritos en el presente documento comprenden alteraciones que incluyen, pero no se limitan a, deleciones, inserciones, modificaciones de aminoácidos del anticuerpo aceptor, es decir, las regiones en marco del dominio variable de la cadena pesada y/o ligera humana que son necesarias para conservar la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal donante. En algunas realizaciones, las regiones en marco de los anticuerpos humanizados descritos en el presente documento no consisten necesariamente en la secuencia de aminoácidos precisa de la región en marco de una región variable de un anticuerpo humano natural, sino que contiene varias alteraciones que incluyen, pero no se limitan a, deleciones, inserciones, modificaciones de aminoácidos, que alteran la propiedad del anticuerpo humanizado, por ejemplo, que mejoran las propiedades de unión de una región de un anticuerpo humanizado que es específica para el mismo objetivo que el anticuerpo murino específico para el FcyRIIB. En la mayoría de las realizaciones preferidas se realiza un número mínimo de alteraciones en la región en marco, con objeto de evitar interrupciones a gran escala de residuos en marco no humanos y para asegurar la mínima inmunogenicidad del anticuerpo humanizado en seres humanos. El anticuerpo monoclonal donante es preferentemente un anticuerpo monoclonal producido por los clones 2B6, 3H7, 1D5, 2E1,2H9, 2D 11 o 1F2.
En una realización específica, el dominio de unión engloba los dominios variables de un anticuerpo con una CDR injertada que se une específicamente al FcyRIIB con una mayor afinidad con la que dicho anticuerpo se une al FcyRIIA, en el que el anticuerpo con una CDR injertada comprende un dominio de una región variable de una cadena pesada que comprende los residuos en marco del anticuerpo receptor y los residuos del anticuerpo monoclonal donante, que se une específicamente al FcyRIIB con una mayor afinidad con la que dicho anticuerpo se une al FcyRIIA, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal producido a partir de los clones 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2. En otra realización específica, los diacuerpos de la invención comprenden los dominios variables de un anticuerpo con una CDR injertada que se une específicamente al FcyRIIB con una mayor afinidad con la que dicho anticuerpo se une al FcyRIIA, en el que el anticuerpo con una CDR injertada comprende un dominio de una región variable de una cadena ligera que comprende los residuos en marco del anticuerpo receptor y los residuos del anticuerpo monoclonal donante, que se une específicamente al FcyRIIB con una mayor afinidad con la que dicho anticuerpo se une al FcyRIIA, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal producido a partir de los clones 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2.
Los dominios variables humanizados anti-FcYRIIB usados en la invención pueden tener una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la CDR1 (la SEQ ID NO: 24 o la SEQ ID NO: 25) y/o de la CDR2 (la SEQ ID NO: 26 o la SEQ ID NO: 27) y/o de la CDR3 (la SEQ ID NO: 28 o la SEQ ID NO: 29) y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la CDR1 (la SEQ ID NO: 32 o la SEQ ID NO: 33) y/o de la CDR2 (la SEQ ID NO: 34, la SEQ ID NO: 35, la SEQ ID NO: 36 o la SEQ ID NO: 37) y/o de la CDR3 (la SEQ ID NO: 38 o la SEQ ID NO: 39).
En una realización específica, el diacuerpo comprende los dominios variables de un anticuerpo humanizado 2B6, en el que la región VH consiste en los segmentos FR del segmento VH de la línea germinal humana VH1-18 (Matsuda et al., 1998, J. Exp. Med. 188: 2151062) y JH6 (Ravetch et al., 1981, Cell 27 (3 Pt. 2): 583-91) y una o más regiones CDR del VH de 2B6, que tienen la secuencia de aminoácidos de la SED ID NO: 24, de la SEQ ID NO: 26 o de la SEQ ID NO: 28. En una realización, el VH de 2B6 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En otra realización el dominio VH de 2B6 tiene la secuencia de aminoácidos de Hu2B6VH, la SEQ ID NO: 87, y puede estar codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 88. En otra realización específica, el diacuerpo comprende adicionalmente una región VL, que consiste en los segmentos FR del segmento VL de la línea germinal humana VK-A26 (Lautner-Rieske et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 1023-1029) y JK4 (Hieter et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 1516-22) y una o más regiones CDR de 2B6VL, que tienen la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32, de la SEQ ID NO: 34, de la SEQ ID NO: 35, de la SEQ ID NO: 36 y de la SEQ ID NO: 38. En una realización, el VL de 2B6 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41; de la SEQ ID NO: 42 o de la SEQ ID NO: 43. En una realización específica, el VL de 2B6 tiene la secuencia de aminoácidos de Hu2B6VL, la SEQ ID NO: 89, y puede estar codificado por la secuencia de nucleótidos proporcionada en la SEQ ID NO: 90.
En otra realización específica, el diacuerpo tiene los dominios variables de un anticuerpo humanizado 3H7, en el que la región VH consiste en los segmentos FR del segmento VH de la línea germinal humana y las regiones CDR del VH de 3H7, que tienen la secuencia de aminoácidos de la SED ID NO: 37. En otra realización específica, el anticuerpo humanizado 3H7 comprende adicionalmente una regiones VL, que consiste en los segmentos FR del segmento VL de una línea germinal humana y las regiones CDR de 3H7VL, que tienen la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 44.
En particular, los dominios de unión se unen inmunoespecíficamente a los dominios extracelulares del FcyRIIB humano nativo y comprenden (o como alternativa, consisten en) las secuencias CDR de 2B6, de 3H7, de 1D5, de 2E1, de 2H9, de 2D11 o de 1F2, en cualquiera de las siguientes combinaciones: una CDR1 de un VH y una CDR1 de un VL; una CDR1 de un VH y una CDR2 de un VL; una CDR1 de un VH y una CDR3 de un VL; una CDR2 de un VH y una CDR1 de un VL; VH CDR2 y VL CDR2; una CDR2 de un VH y una CDR3 de un VL; una CDR3 de un VH y una CDR1 de un VH; una CDR3 de un VH y una CDR2 de un VL; una CDR3 de un VH y una CDR3 de un VL; a Vh 1 CDR1, una CDR2 de un VH y una CDR1 de un VL; una CDR1 de un VH, una CDR2 de un VH y una CDR2 de un VL; una CDR1 de un VH, una CDR2 de un VH y una CDR3 de un VL; una CDR2 de un VH, una CDR3 de un VH y una CDR1 de un VL, una CDR2 de un VH, una CDR3 de un VH y una CDR2 de un VL; una CDR2 de un VH, una CDR2 de un VH y una CDR3 de un VL; una CDR1 de un VH, una CDR1 de un VL y una CDR2 de un VL; una CDR1 de un VH, una CDR1 de un VL y una CDR3 de un VL; una CDR2 de un VH, una CDR1 de un VL y una CDR2 de un VL; una CDR2 de un VH, una Cd R1 de un VL y una CDR3 de un VL; una CDR3 de un VH, una CDR1 de un VL y una CDR2 de un VL; una CDR3 de un VH, una CDR1 de un VL y una CDR3 de un VL; una CDR1 de un VH, una CDR2 de un VH, una CDR3 de un VH y una CDR1 de un VL; una CDR1 de un VH, una CDR2 de un VH, una CDR3 de un VH y una CDR2 de un VL; una CDR1 de un VH, una CDR2 de un VH, una CDR3 de un VH y una CDR3 de un VL; una CDR1 de un VH, una CDR2 de un VH, una CDR1 de un VL y una CDR2 de un VL; una CDR1 de un VH, una CDR2 de un VH, una CDR1 de un VL y una CDR3 de un VL; una CDR1 de un VH, una CDR3 de un VH, una CDR1 de un VL y una CDR2 de un VL; una CDR1 de un VH, una CDR3 de un VH, una CDR1 de un VL y una CDR3 de un VL; una CDR2 de un VH, una CDR3 de un VH, una CDR1 de un VL y una CDR2 de un VL; una Cd R2 de un VH, una CDR3 de un VH, una CDR1 de un VL y una CDR3 de un VL; una CDR2 de un VH, una CDR3 de un VH, una CDR2 de un VL y una CDR3 de un VL; una CDR1 de un VH, una CDR2 de un VH, una CDR3 de un VH, una CDR1 de un VL y una CDR2 de un VL; una CDR1 de un VH, una CDR2 de un VH, una CDR3 de un VH, una CDR1 de un VL y una Cd R3 de un VL; una CDR1 de un VH, una CDR2 de un VH, una CDR1 de un VL, una CDR2 de un VL y una CDR3 de un VL; una CDR1 de un VH, una CDR3 de un VH, una CDR1 de un VL, una CDR2 de un VL y una CDR3 de un VL; una CDR2 de un VH, una CDR3 de un VH, una CDR1 de un VL, una CDR2 de un VL y una CDR3 de un VL; o cualquier combinación de las mismas de las CDR de un VH y de las CDR de un VL divulgadas en el presente documento.
Los anticuerpos para la derivación de los dominios de unión que van a ser incluidos en los diacuerpos de la invención pueden están caracterizados adicionalmente por un cartografiado de epítopo, de forma que pueden seleccionarse los anticuerpos que tienen la mayor especificidad por el FcyRIIB con respecto al FcyRIIa . Los métodos de cartografiado de epítopos de los anticuerpos son bien conocidos en la materia. En ciertas realizaciones pueden usarse proteínas de fusión que comprenden una o más regiones del FcyRIIB en el cartografiado del epítopo de un anticuerpo. En una realización específica, la proteína de fusión contiene la secuencia de aminoácidos de una región de un FcyRIIB fusionada con la porción Fc de la IgG2 humana. Cada proteína de fusión puede comprender adicionalmente sustituciones de aminoácidos y/o sustituciones de ciertas regiones del receptor por la correspondiente región de un receptor homólogo, por ejemplo, el FcyRIIA, según se muestra en la siguiente Tabla 2. El pMGXI25 y el pMGXI32 contienen el sitio de unión de la IgG del receptor FcyRIIB, el primero con el C terminal del FcyRIIB y el último con el C terminal del FcyRIIA, y pueden usarse para diferenciar la unión C terminal. Los otros tienen sustituciones del FcyRIIA en el sitio de unión de la IgG y en el N terminal del FcyIIA o del FcyIIB. Estas moléculas pueden ayudar a determinar la parte de la molécula del receptor a la que se unen los anticuerpos.
Tabla 2. Lista de las proteínas de fusión que pueden usarse para investigar el epítopo de los anticuerpos monoclonales anti-FcYRIIB. Los residuos 172 hasta 180 pertenecen al sitio de unión de la IgG del FcyRIIA y B. Los aminoácidos específicos de la secuencia del FcyRIIA están en negrita.
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Las proteínas de fusión pueden usarse en cualquier ensayo bioquímico para la determinación de la unión de un anticuerpo anti-FcYRIIB, por ejemplo, un ELISA. En otras realizaciones, la confirmación adicional de la especificidad de epítopo puede llevarse a cabo mediante el uso de péptidos con residuos específicos sustituidos por aquellos de la secuencia del FcyRIIA.
Los anticuerpos pueden ser caracterizados usando ensayos para la identificación de la función de los anticuerpos, particularmente la actividad para modular la señalización del FcyRIIB. Por ejemplo, los ensayos de caracterización pueden medir la fosforilación de los residuos de tirosina en el motivo ITIM del FcyRIIB, o medir la inhibición de la movilización de calcio generada por el receptor de los linfocitos B. Los ensayos de caracterización pueden estar basados en células o ser ensayos exentos de células.
En la materia ha sido bien establecido que, en los mastocitos, la coagregación del FcyRIIB con el receptor de alta afinidad de la IgE, el FceRI, da lugar a la inhibición de la desgranulación, la movilización de calcio y la producción de citocinas inducidos por el antígeno (Metcalfe D. D. et al. 1997, Physiol. Rev. 77: 1033; Long E. O. 1999 Annu Rev. Immunol 17: 875). Los detalles moleculares de esta ruta de señalización han sido elucidados recientemente (Ott V. L., 2002, J. Immunol. 162 (9): 4430-9). Una vez coagregado con el FceRI, el FcyRIIB es rápidamente fosforilado en la tirosina de su motivo ITIM y entonces recluta la inositol-5-fosfatasa que contiene el Src de homología 2 (SHIP), una 5-fosfatasa de polifosfato de inosital que contiene el dominio SH2, que a su vez es fosforilada y se asocia con la She y la p62dok (la p62dok es el prototipo de una familia de moléculas adaptadoras, que incluye dominios de señalización tales como un dominio de homología de pleckstrina amino terminal (dominio PH), un dominio PTB y una región carboxi terminal que contiene motivos PXXP y numerosos sitios de fosforilación (Carpino et al., 1997 Cell, 88: 197; Yamanshi et al., 1997, Cell, 88: 205).
Los anticuerpos anti-FcYRIIB para su uso en la invención pueden caracterizarse asimismo por su capacidad para modular una o más respuestas mediadas por la IgE. Preferiblemente, se usarán líneas celulares expresen conjuntamente el receptor de alta afinidad de la IgE y el receptor de baja afinidad del FcyRIIB en la caracterización de los anticuerpos anti-FcYRIIB en la modulación de las respuestas mediadas por la IgE. En una realización específica, se usarán las células de una línea celular de leucemia basófila de rata (RBL-H23; Barsumian E. L. et al.
1981 Eur. J. Immunol. 11: 317) transfectadas con el FcyRIIB humano de longitud completa. La RBL-2H3 es una línea celular de rata a bien establecida que ha sido usada ampliamente para el estudio de los mecanismos de señalización después de la activación celular mediada por la IgE. Cuando es expresado en las células RBL-2H3 y coagregar con el FceRI, el FcyRIIB inhibe la movilización de calcio, la desgranulación y la producción de citocinas inducidos por el FceRI (Malbec et al., 1998, J. Immunol. 160: 1647; Daeron et al., 1995 J. Clin. Invest. 95: 577; Ott et al., 2002 J. of Immunol. 168: 4430-4439).
Los anticuerpos para su uso en la invención también pueden ser caracterizados por la inhibición de la activación de los mastocitos inducida por el FceRI. Por ejemplo, las células de una línea celular de leucemia basófila de rata (RBL-H23; Barsumian E. L. et al. 1981 Eur. J. Immunol. 11: 317) que han sido transfectadas con el FcyRIIB son sensibilizadas con IgE y estimuladas bien con fragmentos F(ab')2 de IgG de conejo anti-ratón, para que agreguen sólo el FceRI, o bien con IgG de conejo anti-ratón completa para que se coagreguen el FcyRIIB y el FceRI. En este sistema, la modulación indirecta de las moléculas de señalización cascada bajo puede ensayarse tras la adición de los anticuerpos a las células sensibilizadas y estimuladas. Por ejemplo, puede ensayarse la fosforilación de la tirosina del FcyRIIB y el reclutamiento y la fosforilación de la SHIP, la activación de los miembros de la familia de la cinasa MAP, incluyendo, pero no se limitan a, Erk1, Erk2, JNK o p38; y la fosforilación de la tirosina de la p62dok y su asociación con la SHIP y la RasGAP.
Un ejemplo de ensayo para la determinación de la inhibición de la activación de los mastocitos inducida por el FceRI por parte de los anticuerpos puede comprender lo siguiente: transfectar las células RBF-H23 con el FcyRIIB humano; sensibilizar las células RBF-H23 con IgE; estimular las células RBF-H23 bien con F(ab')2 de IgG de conejo anti-ratón (para agregar sólo el FceRI y desencadenar la señalización mediada por el FceRI, como control), o bien estimular las células RBF-H23 con IgG de conejo anti-ratón completa para (para coagregar el FcyRIIB y el FceRI, dando como resultado la inhibición de la señalización mediada por el FceRI). Las células que han sido estimuladas con anticuerpos de IgG de conejo anti-ratón completos pueden ser adicionalmente preincubadas con los anticuerpos. La medición de la actividad dependiente del FceRi de las células que han sido preincubadas con los anticuerpos y de las células que han no sido preincubadas con los anticuerpos, y la comparación de los niveles de la actividad dependiente del FceRI en estas células, indicaría una modulación de la actividad dependiente del FceRI por parte de los anticuerpos.
El ejemplo de ensayo descrito anteriormente puede usarse, por ejemplo, para la identificación de los anticuerpos que bloquean la unión del ligando (la IgG) al receptor FcyRIIB y antagonizan la inhibición mediada por el FcyRIIB de la señalización del FceRI, impidiendo la coagregación del FcyRIIB y el FceRI. Este ensayo identifica, asimismo, los anticuerpos que mejoran la coagregación del FcyRIIB y el FceRI y agonizan la inhibición mediada por el FcyRIIB de la señalización del FceRI, promoviendo la coagregación del FcyRIIB y el FceRI.
En algunas realizaciones, los diacuerpos anti-FcYRIIB, que comprenden el dominio de unión del epítopo de los anticuerpos anti-FcYRIIB identificados descritos en el presente documento o conocidos en la materia, se caracterizan por su capacidad para modular una respuesta mediada por la IgE mediante la monitorización y/o la medición de la desgranulación de los mastocitos o de los basófilos, preferentemente en un ensayo basado en células. Preferiblemente, los mastocitos o los basófilos para su uso en dichos ensayos han sido modificadas para que contengan un FcyRIIB humano usando los métodos recombinantes convencionales conocidos por un experto en la materia. En una realización específica, los anticuerpos anti-FcYRIIB se caracterizan por su capacidad para modular una respuesta mediada por la IgE en un ensayo de liberación de p-hexosaminidasa (la enzima contenida en los gránulos) basado en células. La liberación de la p-hexosaminidasa desde los mastocitos y los basófilos es un acontecimiento primario en una afección alérgica aguda e inflamatoria (Aketani et al., 2001 Immunol. Lett. 75: 185-9; Aketani et al., 2000 Anal. Chem. 72: 2653-8). Puede ensayarse la liberación de otros mediadores inflamatorios que incluyen, pero no se limitan a, serotonina e histamina, para la medición de la respuesta mediada por la IgE, según los métodos del presente documento. Aunque sin pretender estar ligados a ningún mecanismo de acción en particular, la liberación de los gránulos, tales como los que contienen la p-hexosaminidasa, desde los mastocitos y los basófilos, es un proceso dependiente de la concentración de calcio intracelular que es iniciado por la reticulación de los FcyRI con un antígeno multivalente.
La capacidad para estudiar los mastocitos humanos ha estado limitada por la ausencia de cultivos celulares de mastocitos humanos a largo plazo adecuados. Recientemente se han establecido dos nuevas líneas celulares de mastocitos humanos dependientes del factor de células madre, denominadas LAD 1 y LAD2, a partir de aspirados de médula ósea de un paciente con sarcoma/leucemia de mastocitos (Kirshenbaum et al., 2003, Leukemia research, 27: 677-82). Se ha descrito que ambas líneas celulares expresan el FceRI y numerosos marcadores de los mastocitos humanos. Las células LAD 1 y 2 pueden usarse para la evaluación del efecto de los anticuerpos sobre las respuestas mediadas por la IgE. En una realización específica, pueden usarse ensayos de liberación de phexosaminidasa basados en células, tales como los descritos supra, en células LAD para determinar cualquier modulación de la respuesta mediada por la IgE por parte de los anticuerpos anti-FcYRIIB. En un ejemplo de ensayo, se ceban mastocitos humanos, por ejemplo, LAD 1, con anti-nitrofenol de IgE humana quimérica (NP) y se exponen a BSA-NP, el antígeno polivalente, y la desgranulación de las células se monitoriza mediante la medición de la phexosaminidasa liberada en el sobrenadante (Kirshenbaum et al., 2003, Leukemia research, 27: 677-682).
En algunas realizaciones, si los mastocitos humanos tienen una baja expresión del FcyRIIB endógeno, según se determina usando los métodos convencionales conocidos en la materia, por ejemplo, una tinción de FACS, puede ser difícil monitorizar y/o detectar las diferencias en la activación de la ruta inhibidora mediada por los diacuerpos anti-FcYRIIB de la invención. También se describen métodos alternativos mediante los cuales la expresión del FcyRIIB puede ser regulada por aumento usando citocinas y unas condiciones de crecimiento en particular. Se ha descrito que el FcyRIIB está muy regulado por aumento en las líneas celulares de monocitos humanos, por ejemplo, THP1 y U937 (Tridandapani et al., 2002, J. Biol. Chem., 277 (7): 5082-5089) y en monocitos humanos primarios (Pricop et al., 2001, J. of Immunol, 166: 531-537) por parte de la IL4. Se ha descrito que la diferenciación de las células U937 con dibutiril AMP cíclico aumenta la expresión del FcyRII (Cameron et al., 2002 Immunology Letters 83, 171-179). Por lo tanto, la expresión endógena del FcyRIIB en mastocitos humanos para su uso en los métodos del presente documento puede ser regulada por aumento usando citocinas, por ejemplo, la IL-4, la IL-13, con objeto de mejorar la sensibilidad de la detección.
Los diacuerpos anti-FcYRIIB también pueden ser ensayados para evaluar la inhibición de la señalización mediada por el BCR del receptor de los linfocitos. La señalización mediada por el BCR puede incluir al menos una o más respuestas biológicas cascada abajo, tales como la activación y la proliferación de los linfocitos B, la producción de anticuerpos, etc. La coagregación del FcyRIIB y el BCR da lugar a la inhibición de la progresión del ciclo celular y de la supervivencia celular. Además, la coagregación del FcyRIIB y el BCR da lugar a la inhibición de la señalización mediada por el BCR.
Específicamente, la señalización mediada por el BCR comprende al menos una o más de las siguientes: la modulación de las moléculas de señalización cascada abajo (por ejemplo, el estado de fosforilación del FcyRIIB, el reclutamiento de la SHIP, la localización de la Btk y/o de la PLCy, la actividad de la cinasa MAP, el reclutamiento de la Akt (una señal antiapoptótica), la movilización del calcio, la progresión del ciclo celular y la proliferación celular. A pesar de que numerosas funciones efectoras de la inhibición mediada por el FcyRIIB de la señalización del BCR están mediadas a través de la SHIP, recientemente se ha demostrado que los linfocitos B activados por el lipopolisacárido (LPS) de ratones deficientes en la SHIP muestran una significativa inhibición mediada por el FcyRIIB de la movilización del calcio, de la producción de Ins(1,4,5)P3 y de la fosforilación de la Erk y de la Akt (Brauweiler A. et al., 2001, Journal of Immunology, 167 (1): 204-211). Consecuentemente, pueden usarse linfocitos B ex vivo de ratones deficientes en la SHIP para la caracterización de los anticuerpos. Un ejemplo de ensayo para la determinación de la inhibición mediada por el FcyRIIB de la señalización del BCR por parte de los anticuerpos puede comprender lo siguiente: aislar linfocitos B esplénicos de ratones deficientes en la sHlP, activar dichas células con lipopolisacárido y estimular dichas células bien con F(ab')2 anti-IgM para agregar el BCR o bien con anti-IgM para coagregar el BCR con el FcyRIIB. Las células que han sido estimuladas con anti-IgM intacta para que coagreguen el BCR con el FcyRIIB pueden ser adicionalmente preincubadas con los anticuerpos. La actividad dependiente del FcyRIIB de las células puede medirse mediante las técnicas convencionales conocidas en la materia. La comparación entre el nivel de actividad dependiente del FcyRIIB en las células que han sido preincubadas con los anticuerpos y en las células que no han sido preincubadas, y la comparación de los niveles, que indicaría una modulación de la actividad dependiente del FcyRIIB por parte de los anticuerpos.
La medición de la actividad dependiente del FcyRIIB puede incluir, por ejemplo, la medición de la movilización del calcio intracelular mediante una citometría de flujo, la medición de la fosforilación de la Akt y/o de la Erk, la medición de la acumulación mediada por el BCR de PI(3,4,5)P3 o la medición de la proliferación mediada por el FcyRIIB de los linfocitos B.
Los ensayos pueden usarse, por ejemplo, para la identificación de diacuerpos o de anticuerpos anti-FcYRIIB para su uso en la invención, que modulan la inhibición mediada por el FcyRIIB de la señalización del BCR mediante el bloqueo del sitio de unión del ligando (la IgG) al receptor FcyRIIB y la antagonización de la inhibición mediada por el FcyRIIB de la señalización del BCR, impidiendo la coagregación del FcyRIIB y el BCR. Los ensayos también pueden usarse para la identificación de los anticuerpos que mejoran la coagregación del FcyRIIB y del BCR y que agonizan la inhibición mediada por el FcyRIIB de la señalización del BCR.
Los anticuerpos anti-FcYRIIB también pueden ensayarse para evaluar la señalización mediada por el FcyRII en monocitos/macrófagos humanos. La coagregación del FcyRIIB con un receptor portador del motivo inmunorreceptor de activación basado en tirosina (ITAM) actúa para regular por disminución la fagocitosis mediada por el FcyR usando la SHIP como su efector (Tridandapani et al. 2002, J. Biol. Chem. 277 (7): 5082-9). La coagregación del FcyRIIA con el FcyRIIB da como resultado una rápida fosforilación del residuo de tirosina del motivo ITIM del FcyRIIB, dando lugar a una mejora en la fosforilación de la SHIP, a una asociación de la SHIP con la She y a la fosforilación de las proteínas que tienen un peso molecular de entre 120 y 60-65 kDa. Además, la coagregación del FcyRIIA con el FcyRIIB da como resultado una regulación por disminución de la fosforilación de la Akt, que es una cinasa de serina-treonina que está implicada en la regulación celular y sirve para suprimir la apoptosis.
Los diacuerpos anti-FcYRIIB también pueden ensayarse para evaluar la inhibición de la fagocitosis mediada por el FcyR en monocitos/macrófagos humanos. Por ejemplo, pueden estimularse las células de una línea celular monocítica humana, la THP-1, bien con fragmentos Fab del anticuerpo monoclonal de ratón IV.3 contra el FcyRII y anticuerpo de cabra anti-ratón (para agregar sólo el FcyRIIA), o con anticuerpo monoclonal de ratón IV.3 completo y anticuerpo de cabra anti-ratón (para coagregar el FcyRIIA y el FcyRIIB). En este sistema, puede ensayarse la modulación de las moléculas de señalización cascada abajo, tal como la fosforilación de la tirosina del FcyRIIB, la fosforilación de la SHIP, la asociación de la SHIP con la She, la fosforilación de la Akt y la fosforilación de las proteínas que tienen un peso molecular de entre 120 y 60-65 kDa tras la adición de las moléculas de la invención a las células estimuladas. Además, puede medirse directamente la eficiencia fagocítica dependiente del FcyRIIB de la línea celular de monocitos en presencia y en ausencia de los anticuerpos.
Otro ejemplo de ensayo para la determinación de la inhibición de la fagocitosis mediada por el FcyR en monocitos/macrófagos humanos por parte de los anticuerpos puede comprender lo siguiente: la estimulación de las células THP-1 bien con un anticuerpo Fab de ratón IV.3 anti-FcYRII y un anticuerpo de cabra anti-ratón (para agregar sólo el FcyRIIA y desencadenar la señalización mediada por el FcyRIIA); o bien con anticuerpo anti-FcYRII de ratón y anticuerpo de cabra anti-ratón (para coagregar el FcyRIIA y el FcyRIIB e inhibir la señalización mediada por el FcyRIIA. Las células que han sido estimuladas con el anticuerpo anti-FcYRII de ratón y el anticuerpo de cabra anti­ ratón puede ser adicionalmente preincubadas con las moléculas de la invención. La medición de la actividad dependiente del FcyRIIA de las células estimuladas que han sido preincubadas con las moléculas de la invención y de las células que no han sido preincubadas con los anticuerpos de la invención, y la comparación de los niveles de actividad dependiente del FcyRIIA en estas células indicaría una modulación de la actividad dependiente del FcyRIIA por parte de los anticuerpos.
El ejemplo de ensayo descrito puede usarse, por ejemplo, para la identificación de los dominios de unión que bloquean la unión del ligando del FcyRIIB y que antagonizan la inhibición mediada por el FcyRIIB de la señalización del FcyRIIA, impidiendo la coagregación del FcyRIIB y el FcyRIIA. Asimismo, este ensayo identifica los dominios de unión que mejoran la coagregación del FcyRIIB y el FcyRIIA y agonizan la inhibición mediada por el FcyRIIB de la señalización del FcyRIIA.
Los dominios de unión del FcyRIIB de interés pueden ser ensayados cuando están comprendidos en los anticuerpos I mediante la medición de la capacidad de las células THP-1 para fagocitar glóbulos rojos sanguíneos de oveja opsonizados con la IgG fluoresceinada (SRBC) mediante los métodos descritos previamente (Tridandapani et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 20480-7). Por ejemplo, un ejemplo de ensayo para la medición de la fagocitosis comprende: el tratamiento de las células THP-1 con los anticuerpos del presente documento o con un anticuerpo de control que no se une al FcyRII, la comparación de los niveles de actividad de dichas células, en la que una diferencia en las actividades de las células (por ejemplo, la actividad de formación de rosetas (el número de células THP-1 que se unen a los SRBC recubiertos con IgG), la actividad de adherencia (el número total de SRBC unidos a las células THP-1) y el índice fagocítico) indicarían una modulación de la actividad dependiente del FcyRIIA por parte de los anticuerpos. Este ensayo puede usarse para la identificación, por ejemplo, de los anticuerpos que bloquean la unión del ligando del receptor FcyRIIB y antagonizan la inhibición mediada por el FcyRIIB de la fagocitosis. Este ensayo también puede identificar los anticuerpos que mejoran la inhibición mediada por el FcyRIIB de la señalización del FcyRIIA.
En una realización preferida, los dominios de unión modulan la actividad dependiente del FcyRIIB en monocitos/macrófagos humanos al menos de una o más de las siguientes formas: la modulación de las moléculas de señalización cascada abajo (por ejemplo, la modulación del estado de fosforilación del FcyRIIB, la modulación de la fosforilación de la SHIP, la modulación de la SHIP y la asociación de la She, la modulación de la fosforilación de la Akt, la modulación de la fosforilación de proteínas adicionales de alrededor de 120 y 60-65 kDa) y la modulación de la fagocitosis.
Dominios de unión a la CD16A
La siguiente sección analiza las proteínas de unión a la CD16A que pueden usarse como fuentes de las regiones variables de la cadena ligera y pesada para la producción de un diacuerpo covalente. Las proteínas de unión a la CD16A incluyen moléculas que comprenden los dominios VL y VH de los anticuerpos anti-CD16A, dominios VH y VL que se usan en la producción de los diacuerpos de la presente invención.
En relación con la presente invención puede usarse una diversidad de proteínas de unión a la CD16A. Algunas proteínas de unión a la CD16A adecuadas incluyen anticuerpos monoclonales humanos o humanizados, así como los fragmentos de los anticuerpos que se unen a la CD16A (por ejemplo, el scFv o anticuerpos de cadena única, fragmentos Fab, minicuerpos) y otras proteínas de tipo anticuerpo que se unen a la CD16A a través de una interacción con un dominio de la región variable de la cadena ligera, un dominio de la región variable de la cadena pesada, o ambas.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a la CD16A comprende un dominio VL y/o VH que tiene una o más CDR con unas secuencias derivadas de un anticuerpo anti-CD16A no humano, tal como un anticuerpo de ratón anti-CD16A, y una o más regiones en marco con las secuencias en marco derivadas de una de o más inmunoglobulinas humanas. Se conoce una diversidad de anticuerpos monoclonales anti-CD16A no humanos, a partir de los cuales puede obtenerse la CDR y otras secuencias (véase, por ejemplo, Tamm y Schmidt, 1996, J. Imm. 157: 1576-81; Fleit et al., 1989, pág.159; LEUKOCYTE TYPING II: HUMAN MYELOID AND HEMATOPOIETIC CELLS, Reinherz et al., eds. Nueva York: Springer-Verlag; 1986; LEUCOCYTE TYPING III: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS McMichael A J, ed., Oxford: Oxford University Press, 1986); LEUKOCYTE TYPING IV: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Kapp et al., eds. Oxford Univ. Press, Oxford; LEUKOCYTE TYPING V: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Schlossman et al., eds. Oxford Univ. Press, Oxford; LEUKOCYTE TYPING VI: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Kishimoto, ed. Taylor & Francis. Además, según se muestra en los Ejemplos, pueden obtenerse nuevas proteínas de unión a la CD16A que reconozcan la CD16A expresada en células usando métodos bien conocidos para la producción y la selección de anticuerpos monoclonales o de proteínas de unión relacionadas (por ejemplo, la tecnología del hibridoma, de expresión en fago, y similares). Véase, por ejemplo, O'Connel et al., 2002, J. Mol. Biol. 321: 49-56; Hoogenboom y Chames, 2000, Imm. Today 21: 371078; Krebs et al., 2001, J. Imm. Methods 254: 67-84; y otras referencias mencionadas en el presente documento. Los anticuerpos monoclonales de una especie no humana pueden ser quimerizados o humanizados usando técnicas que usan las técnicas de humanización de anticuerpos conocidas en la materia.
Alternativamente, pueden producirse anticuerpos completamente humanos contra la CD16A usando animales transgénicos que tienen elementos de un sistema inmunitario humano (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n° 5.569.825 y 5.545.806), usando células sanguíneas periféricas humanas (Casali et al., 1986, Science 234: 476), mediante el cribado de una colección de ADN de linfocitos B humanos según el protocolo general descrito por Huse et al., 1989, Science 246: 1275 y mediante otros métodos.
En una realización preferida, el donante de unión es del anticuerpo 3G8 o una versión humanizada del mismo, por ejemplo, tales como los que se describen en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2004/0010124. Se contempla que, para algunos propósitos, pueda ser ventajoso el uso de proteínas de unión a la CD16A que se unan al receptor de la CD16A en el mismo epítopo unido por el 3G8, o al menos lo suficientemente cerca de este epítopo como para que bloquear la unión mediante el 3G8. Los métodos para el cartografiado de epítopo y los experimentos de unión competitiva para la identificación de las proteínas de unión con las propiedades de unión deseadas son bien conocidos por los expertos en la materia de la inmunología experimental. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, mencionado supra; Stahl et al., 1983, Methods in Enzymology 9: 242-53; Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137: 3614-19; Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25: 7-15; Cheung et al., 1990, Virology 176: 546-52; y Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32: 77-82. Por ejemplo, es posible determinar si dos anticuerpos se unen en el mismo sitio mediante el uso de uno de los anticuerpos para capturar el antígeno en una placa de ELISA y midiendo después la capacidad del segundo anticuerpo para unirse al antígeno capturado. La comparación entre los epítopos también puede llevarse a cabo marcando un primer anticuerpo, directa o indirectamente, con una enzima, un radionúclido o un fluoróforo, y midiendo la capacidad del segundo anticuerpo sin marcar para inhibir la unión del primer anticuerpo al antígeno de las células, en solución o en una fase sólida.
También es posible medir la capacidad de los anticuerpos para bloquear la unión del receptor de la CD16A a los complejos inmunitarios formados en placas de ELISA. Dichos complejos inmunitarios se forman recubriendo en primer lugar la placa con un antígeno tal como fluoresceína, aplicando después un anticuerpo específico antifluoresceína en la placa. Después, este complejo inmunitario sirve como ligando para los receptores Fc solubles, tales como el sFcRIIIa. Alternativamente, puede formarse un complejo inmunitario soluble y marcarse, directa o indirectamente, con una enzima, un radionúclido o un fluoróforo. Después, puede medirse la capacidad de los anticuerpos para inhibir la unión de estos complejos inmunitarios marcados a los receptores Fc en las células, en solución o en una fase sólida.
Las proteínas de unión a la CD16A pueden comprender o no una región Fc de una inmunoglobulina humana. Las regiones Fc no están presentes, por ejemplo, en las proteínas de unión al scFv. Las regiones Fc están presentes, por ejemplo, en anticuerpos monoclonales tetraméricos de IgG humanos o humanizados. Según se ha descrito supra, en algunas realizaciones, la proteína de unión a la CD16A incluye una región Fc que tiene una función efectora alterada, por ejemplo, una afinidad reducida por un ligando efector tal como un receptor Fc o el componente C1 del complemento en comparación con una región Fc no alterada (por ejemplo, la Fc de la IgG1 natural, proteínas). En una realización, la región Fc no está glicosilada en el aminoácido de la región Fc que se corresponde con la posición 297. Dichos anticuerpos carecen de la función efectora de la Fc.
Por lo tanto, la proteína de unión a la CD16A puede no mostrar la unión mediada por el Fc a un ligando efector tal como un receptor Fc o el componente C1 del complemento debido a la ausencia del dominio Fc en la proteína de unión, mientras que, en otros casos, la ausencia de unión o de función efectora es debida a una alteración en la región constante del anticuerpo.
Las proteínas de unión a la CD16A comprenden unas secuencias CDR similares a las secuencias de la CDR del AcMc 3G8.
Las proteínas de unión a la CD16A que pueden usarse en la práctica de la invención incluyen proteínas que comprenden una secuencia CDR derivada de (es decir, que tiene una secuencia que es igual o similar a) las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón 3G8. Los ADNc complementarios que codifican las regiones variables de la cadena ligera y de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal de ratón 3G8, incluyendo la CDR que codifica las secuencias, se clonaron y se secuenciaron según se describe. Las secuencias de los ácidos nucleicos y de las proteínas del 3G8 se proporcionan a continuación. Usando la región variable de ratón y las secuencias de la CDR, se produjo un gran número de anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden las regiones determinantes de la complementariedad derivadas de las CDR del 3G8, y se analizaron sus propiedades. Para identificar los anticuerpos humanizados que se unen a la CD16A con una elevada afinidad y que tienen otras propiedades deseables, se produjeron las cadenas pesadas del anticuerpo que comprenden una región VH con las CDR derivadas de 3G8 y se combinaron (mediante una coexpresión) con las cadenas ligeras del anticuerpo que comprenden una región Vl con las CDR derivadas de 3G8 para producir un anticuerpo tetramérico para su análisis. Las propiedades de los anticuerpos tetraméricos resultantes se determinaron como se describe a continuación. Según se describe a continuación, pueden usarse las proteínas de unión a la CD16A que comprenden las CDR del 3G8, tales como las proteínas del anticuerpo humanizado descritas en el presente documento.
Región VH
En un aspecto, la proteína de unión a la CD16A puede comprender un dominio variable de la cadena pesada en el que al menos una CDR (y habitualmente tres CDR) tiene la secuencia de una CDR (y más normalmente de las tres CDR) de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal de ratón 3G8, y para las cuales, el resto de las porciones de la proteína de unión son sustancialmente humanas (derivadas de, y sustancialmente similares a, la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo o anticuerpos humanos).
También se describe un anticuerpo 3G8 humanizado o un fragmento de anticuerpo que contiene las CDR derivadas del anticuerpo 3G8 en un marco sustancialmente humano, pero en el que al menos una de las CDR del dominio variable de la cadena pesada difiere en su secuencia con respecto a la correspondiente cadena pesada de la CDR del anticuerpo de ratón 3G8. Por ejemplo, en una realización, la(s) CDR difiere(n) de la secuencia de la CDR del 3G8 por tener al menos una o más sustituciones en la CDR mostradas, conocidas en la materia, que afectan a la unión del 3G8 a la CD16A, como se sabe en la materia o según se divulga en las Tablas 3 y 4 A-H. Las proteínas de unión a la CD16 adecuadas pueden comprender 0, 1, 2, 3 o 4, o más de estas sustituciones (y a menudo tienen entre 1 y 4 de estas sustituciones) y opcionalmente también pueden tener sustituciones adicionales.
Tabla 3. Sustituciones en el dominio V h
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Tabla 4A. Secuencias del V h derivadas del V h de 3G8
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* Las letras de la Tabla 4A se refieren a las secuencias de las Tablas 4 B-H.
TABLA 4B
FR1
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TABLA 4C
CDR1
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TABLA 4D
FR2
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TABLA 4E
CDR2
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TABLA 4F
FR3
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TABLA 4G
CDR3
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TABLA 4H
FR4
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En una realización, una proteína de unión a la CD16A puede comprender la secuencia de un dominio variable de la cadena pesada que es el mismo que, o similar a, el dominio VH de la construcción Hu3G8VH-1, cuya secuencia se proporciona en la SEQ ID NO: 70. Por ejemplo, puede proporcionarse una proteína de unión a la CD16A que comprende un dominio VH con una secuencia que (1) difiere del el dominio VH de Hu3G8VH-1 (la SEQ ID NO: 70) en cero, una o más de las sustituciones de CDR establecidas en la Tabla 1; (2) difiere del dominio VH de Hu3G8VH-1 en cero, una o más de las sustituciones en marco establecidas en la Tabla 1; y (3) es idéntica en al menos aproximadamente el 80 %, a menudo en al menos aproximadamente el 90 % y a veces en al menos aproximadamente el 95 %, o incluso en al menos aproximadamente el 98 %, a la secuencia del VH de Hu3G8VH-1 en el resto de las posiciones.
Algunos ejemplos de dominios VH de las proteínas de unión a la CD16 tienen la secuencia de 3G8VH, de Hu3G8VH-5 y de Hu3G8VH-22 (la SEQ ID NO: 81, la SEQ ID NO: 71 y la SEQ ID NO: 72, respectivamente)e. Algunos ejemplos de secuencias de nucleótidos que codifican la secuencias de 3G8VH y de Hu3G8VH-5 (la SEQ ID NO: 81 y la Se Q ID NO: 71, respectivamente) son proporcionados por la SEQ ID NO: 82 y la SEQ ID NO: 83, respectivamente.
El dominio VH puede tener una secuencia que difiere de la de Hu3G8VH-1 (la SEQ ID NO: 70) en al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro 4, al menos cinco o al menos seis de las sustituciones mostradas en la Tabla 3. Se cree que estas sustituciones dan como resultado un aumento en la afinidad por la CD16A y/o reducen la inmunogenicidad de una proteína de unión a la CD16A cuando son administradas a seres humanos. En ciertas realizaciones, el grado de identidad en la secuencia con el dominio VH de Hu3G8VH-1 en el resto de las posiciones es de al menos aproximadamente el 80 %, de al menos aproximadamente el 90 %, de al menos aproximadamente el 95 % o de al menos aproximadamente el 98 %.
Para ilustrar, pero no para limitar, las secuencias de una diversidad de los dominios VH de las proteínas de construcción de la CD16A se muestran en la Tabla 4. Las cadenas pesadas que comprenden estas secuencias fusionadas con la región constante de una Cy1 humana fueron coexpresadas con la cadena ligera de hu3G8VL-1 (descrita a continuación) para formar anticuerpos tetraméricos, y se midió la unión de los anticuerpos a la CD16A para evaluar el efecto de las sustituciones de aminoácidos en comparación con el dominio VH de hu3G8VH-1. Las construcciones en las que el dominio VH tiene una secuencia de hu3G8VH-1, 2, 3, 4, 5, 8, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 42, 43, 44 y 45 mostraron una elevada afinidad de unión, mostrando el hu3G8VH-6 y los dominios VH una unión intermedia. Se considera que las proteínas de unión a la CD16A que comprenden los dominios VH de hu3G8VH-5 y de hu3G8VH-22 (la SEQ ID NO: 71 y la SEQ ID NO: 72, respectivamente) tienen unas propiedades de unión particularmente favorables.
Región VL
Se llevaron a cabo unos estudios similares para identificar las secuencias del dominio variable de la cadena ligera con unas propiedades de unión favorables. Puede proporcionarse una proteína de unión a la CD16A que contenga un dominio variable de la cadena ligera en la que al menos una CDR (y habitualmente tres CDR) tiene la secuencia de una CDR (y más normalmente de las tres CDR) de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal de ratón 3G8 y para la cual, el resto de las porciones de la proteína de unión son sustancialmente humanas (derivadas de, y sustancialmente similares a, la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo o anticuerpos humanos).
También se describe un fragmento de un anticuerpo 3G8 humanizado que contiene las CDR derivadas del anticuerpo 3G8 en un marco sustancialmente humano, pero en el que al menos una de las CDR del dominio variable de la cadena ligera difiere en su secuencia de la CDR de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal de ratón 3G8. En una realización, la(s) CDR(s) difiere(n) de la secuencia de 3G8 por tener al menos una o más sustituciones de aminoácidos en una CDR, tal como una o más de las sustituciones mostradas en la Tabla 2 (por ejemplo, una arginina en la posición 24 de la CDR1; una serina en la posición 25 de la CDR1; una tirosina en la posición 32 de la CDR1; una leucina en la posición 33 de la CDR1; ácido aspártico, triptófano o serina en la posición 50 de la CDR2; una serina en la posición 53 de la CDR2; alanina o glutamina en la posición 55 de la CDR2; una treonina en la posición 56 de la CDR2; una serina en la posición 93 de la CDR3; y/o una treonina en la posición 94 de la CDR3). En varias realizaciones, el dominio variable puede tener 0, 1, 2, 3, 4, 5 o más de estas sustituciones (y a menudo tiene entre 1 y 4 de estas sustituciones) y opcionalmente, puede tener asimismo sustituciones adicionales.
En una realización, una proteína de unión a la CD16A adecuada puede comprender la secuencia de un dominio variable de la cadena ligera que es la misma que, o similar a, el dominio VL de la construcción Hu3G8VL-1 (la SEQ ID NO: 73), cuya secuencia se proporciona en la Tabla 6. También se describe una proteína de unión a la CD16A que comprende un dominio VL con una secuencia que (1) difiere del dominio VL de Hu3G8VL-1 (la SEQ ID NO: 73) en cero, una o más de las sustituciones de CDR establecidas en la Tabla 5; (2) difiere del dominio VL de Hu3G8VL-1 en cero, una o más de las sustituciones en marco establecidas en la en la Tabla 5; y (3) es idéntica en al menos aproximadamente el 80 %, a menudo idéntica en al menos aproximadamente el 90 % y a veces idéntica en al menos aproximadamente el 95 %, o incluso idéntica en al menos aproximadamente el 98 %, a la secuencia VL de Hu3G8VL-1 (la SEQ ID NO: 73) en el resto de las posiciones.
Tabla 5. Sustituciones en el dominio V l de 3G8
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Tabla 6. Secuencias de V l derivadas del V l de 3G8 *
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* Las letras de la Tabla 6A se refieren a las secuencias de las Tablas 6 B-H.
TABLA 6B
FR1
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TABLA 6C
CDR1
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TABLA 6D
FR2
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TABLA 6E
CDR2
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TABLA 6F
FR3
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TABLA
6G CDR3
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TABLA 6H
FR4
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Algunos ejemplos de dominios VL de las proteínas de unión a la CD16 tienen la secuencia de 3G8VL, de Hu3G8VL-1 o de Hu3G8VL-43, (la SEQ ID NO: 84, la SEQ ID NO: 73 y la SEQ ID NO: 74, respectivamente) según se muestran en las Tablas 5 y 6. Algunos ejemplos de las secuencias de nucleótidos que codifican el 3G8VL (la SEQ ID NO: 84) y el Hu3G8VL-1 (la SEQ ID NO: 73) se proporcionan en la SEQ ID NO: 85 y en la SEQ ID NO: 8 6 , respectivamente.
El dominio VL puede tener una secuencia que difiere de la del Hu3G8VL-1 (la SEQ ID NO: 73) en cero, una, al menos dos, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6 , al menos 7, al menos 8 , o al menos 9 de las sustituciones mostradas en la Tabla 2. Se cree que estas sustituciones dan como resultado un aumento en la afinidad por la CD16A y/o reducen la inmunogenicidad de una proteína de unión a la CD16A cuando son administradas a seres humanos. En ciertas realizaciones, el grado de identidad en la secuencia en el resto de las posiciones es de al menos aproximadamente el 80 %, de al menos aproximadamente el 90 % de al menos aproximadamente el 95 % o de al menos aproximadamente el 98 %.
Para ilustrar, pero no para limitar, las secuencias de una diversidad de los dominios VL de las proteínas de unión a la CD16A se muestran en la Tabla 6. Las cadenas ligeras que comprenden estas secuencias fusionadas con un dominio constante de una Ck. humana fueron coexpresadas con la cadena pesada de Hu3G8VH (descrita más arriba) para formar anticuerpos tetraméricos, y se midió la unión de los anticuerpos a la CD16A para evaluar el efecto de las sustituciones de aminoácidos en comparación con el dominio VL de Hu3G8VL-1 (la SEQ ID NO: 73). Las construcciones en las que el dominio VL tiene una secuencia de hu3G8VL-1, 2, 3, 4, 5, 10, 16, 18, 19, 21, 22, 24, 27, 28, 32, 33, 34, 35, 3 6 , 37 y 42 mostraron una elevada afinidad de unión, y las de hu3G8VL-15, 17, 20, 23, 25, 26, 29, 30, 31, 38, 39, 40 y 41 mostraron una unión intermedia. Se considera que las proteínas de unión a la CD16A que comprenden los dominios VL de hu3G8VL-1, de hu3G8VL-22 y de hu3G8VL-43 tienen unas propiedades de unión particularmente favorables (la SEQ ID NO: 73, la SEQ ID NO: 75 y la SEQ ID NO: 74, respectivamente). Combinaciones de los dominios VL y/o VH
Como es conocido en la materia y se describe en cualquier parte del presente documento, las cadenas ligera y pesada de la inmunoglobulina puede ser expresadas recombinantemente en unas condiciones en las que se asocian para producir un diacuerpo, o también pueden combinarse in vitro. Por lo tanto, se apreciará que un dominio VL derivado de 3G8 descrito en el presente documento puede ser un dominio VH derivado de 3G8 combinado descrito en el presente documento para producir un diacuerpo de unión a la CD16A, y se contemplan todas estas combinaciones.
Para ilustrar, pero no para limitar, algunos ejemplos de diacuerpos de la CD16A útiles son aquellos que comprenden al menos un dominio VH y al menos un dominio VL, en los que el dominio VH es de hu3G8VH-1, de hu3G8VH-22 o de hu3G8VH-5 (la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 72 y la SEQ ID NO: 71, respectivamente) y el dominio VL es de hu3G8VL-1, de hu3G8VL-22 o de hu3G8VL-43 (la SEQ ID NO: 73, la SEQ ID NO: 75 y la SEQ ID NO: 43, respectivamente). En particular, los anticuerpos humanizados que comprenden el hu3G8VH-22 (la SEQ ID NO: 22) y bien, el hu3G8VL-1, el hu3G8VL-22 o el hu3G8VL-43 (la SEQ ID NO: 73, la SEQ ID NO: 72 y la SEQ ID NO: 74, respectivamente) o el hu3G8VH-5 (la SEQ ID NO: 71) y el hu3G8VL-1 (la SEQ ID NO: 73) tienen unas propiedades favorables.
Los expertos en la materia apreciarán que las secuencias de los dominios VL y VH aquí descritas pueden ser adicionalmente modificadas mediante métodos conocidos en la materia tales como una maduración por afinidad (véase, Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263: 551-67; Daugherty et al., 1998, Protein Eng. 11: 825-32; Boderet al., 1997, Nat. Biotechnol. 15: 553-57; Boder et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 97: 10701-705; Hudson y Souriau, 2003, Nature Medicine 9: 129- 39). Por ejemplo, las proteínas de unión a la CD16A pueden ser modificadas usando técnicas de maduración por afinidad para identificar las proteínas con un aumento en la afinidad por la CD16A y/o una disminución en la afinidad por la CD16B.
Un ejemplo de la proteína de unión a la CD16 es el anticuerpo 3G8 de ratón. La secuencia de aminoácidos que comprende los dominios VH y VL del 3G8 humanizado se describen en las FIGS. 2, 9, 14 y se establecen en la s Eq ID NO: 9, en la SEQ ID NO: 11, en la SEQ ID NO: 12, en la SEQ ID NO: 14, en la SEQ ID NO: 15, en la SEQ ID NO: 16, en la SEQ ID NO: 18, en la SEQ ID NO: 19, en la SEQ ID NO: 20, en la SEQ ID NO: 21, en la SEQ ID NO: 22, en la SEQ ID NO: 70, en la SEQ ID NO: 71, en la SEQ ID NO: 72, en la SEQ ID NO: 73 y en la SEQ ID NO: 74. Diacuerpos que comprenden las regiones Fc o porciones de las mismas
La invención engloba moléculas de diacuerpos que comprenden dominios Fc o porciones de los mismos (por ejemplo, un dominio CH2 o CH3). En ciertas realizaciones el dominio Fc, o porción(es) del mismo, comprende uno o más dominio(s) constante(s) de la región Fc de la IgG2, de la IgG3 o de la IgG4 (por ejemplo, CH2 o CH3). En otras realizaciones, la invención engloba moléculas que comprenden un dominio Fc o una porción del mismo, en las que dicho dominio Fc o una porción del mismo comprende al menos una modificación de aminoácido (por ejemplo, una sustitución) con respecto a un dominio Fc natural comparable o una porción del mismo. Los dominios Fc variantes son bien conocidos en la materia y se usan principalmente para alterar el fenotipo del anticuerpo que comprende dicho dominio Fc variante según se ensaya en cualquiera de los ensayos de actividad de unión o de función efectora bien conocidos en la materia, por ejemplo, un ELISA, un análisis de SPR o una ADCC. Dichos dominios Fc variantes, o las porciones de los mismos, tienen uso en la presente invención al conferir o modificar la función efectora mostrada por una molécula de diacuerpo de la invención que comprende un dominio Fc (o una porción del mismo) según se ensaya funcionalmente, por ejemplo, en un ensayo dependiente de NK o dependiente de macrófagos. Los dominios Fc variantes identificados que alteran la función efectora se divulgan en la Solicitud Internacional WO04/063351, en las Publicaciones de Solicitud Patente de Estados Unidos 2005/0037000 y 2005/0064514 y en las Solicitudes de Patente de Estados Unidos 11/271.140 (Publicación n° US 2006-0134709 A1), presentada el 10 de noviembre de 2005, y 11/305.787 (Publicación n° US 2006-0177439 A1), presentada el 15 de diciembre de 15, 2005, solicitudes concurrentes de los Inventores.
En otras realizaciones, la invención engloba el uso de cualquier variante de Fc conocida en la materia, tal como las divulgadas en Duncan et al., 1988, Nature 332: 563-564; Lund et al., 1991, J. Immunol 147: 2657-2662; Lund et al., 1992, Mol Immunol 29: 53-59; Alegre et al., 1994, Transplantation 57: 1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl. Acad Sci U S A 92: 11980-11984; Jefferis et al., 1995, Immunol Lett. 44: 111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9: 115­ 119; Jefferis et al., 1996, Immunol Lett 54: 101-104; Lund et al., 1996, J Immunol 157: 49634969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29: 2613-2624; Idusogie et al., 2000, J Immunol 164: 41784184; Reddy et al., 2000, J Immunol 164: 1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200: 16-26; Idusogie et al., 2001, J Immunol 166: 2571-2575; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276: 6591-6604; Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82: 57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30: 487-490); en el documento US 5.624.821; en el documento US 5.885.573; en el documento US 6.194.551; en el documento PCT WO 00/42072; en el documento PCT WO 99/58572.
En ciertas realizaciones, dicha una o más modificaciones de los aminoácidos de la región Fc reducen la afinidad y la
avidez de la región Fc, y por lo tanto, de la molécula de diacuerpo de la invención, para uno o más receptores FcyR.
En una realización específica, la invención engloba diacuerpos que comprenden una región Fc variante, o u porción de la misma, en la que dicha región Fc variante comprende al menos una modificación de aminoácido c respecto a una región Fc natural, región Fc variante que sólo se une a un FcyR, en la que dicho FcyR es el FcyRIIIA.
En otra realización específica, la invención engloba diacuerpos que comprenden una región Fc variante, o u porción de la misma, en la que dicha región Fc variante comprende al menos una modificación de aminoácido c respecto a una región Fc natural, región Fc variante que sólo se une a un FcyR, en la que dicho FcyR es el FcyRIIA.
En otra realización específica, la invención engloba diacuerpos que comprende una región Fc variante, o una
porción de la misma, en la que dicha región Fc variante comprende al menos una modificación de aminoácido con
respecto a una región Fc natural, región Fc variante que sólo se une a un FcyR, en la que dicho FcyR es el FcyRIIB.
En ciertas realizaciones, la invención engloba moléculas que comprenden un dominio Fc variante en la que dicha
variante confiere o media en un aumento en la actividad de ADCC y/o un aumento en la unión al FcyRIIA (CD32A),
con respecto a una molécula que no comprende un dominio Fc o que comprende un dominio Fc natural, según se
mide mediante el uso de los métodos conocidos por un experto en la materia y descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones alternativas, la invención engloba moléculas que comprenden un dominio Fc variante en la
que dicha variante confiere o media en una disminución de la actividad de ADCc (o de otra función efectora) y/o un
aumento en la unión al FcyRIIB (CD32B), con respecto a una molécula que no comprende un dominio Fc o que
comprende un dominio Fc natural, según se mide mediante el uso de los métodos conocidos por un experto en la
materia y descritos en el presente documento.
También se describe el uso de un dominio Fc que comprende dominios o regiones de dos o más isotipos de la IgG.
Como se sabe en la materia, la modificación de aminoácidos en la región Fc puede afectar profundamente a la
función efectora mediada por el Fc y/o a la actividad de unión. Sin embargo, estas alteraciones en las características
funcionales pueden ser adicionalmente refinadas y/o manipuladas cuando son implementadas en el contexto de
isotipos seleccionados de la IgG. De forma análoga, las características nativas del isotipo Fc pueden ser
manipuladas mediante la una o más modificaciones de aminoácidos. Los múltiples isotipos de la IgG (es decir, la
IgG1, la IgG2, la IgG3 y la IgG4) muestran diferentes propiedades físicas y funcionales que incluyen la semivida
sérica, la fijación del complemento, las afinidades de unión por el FcyR y las actividades de la función efectora (por
ejemplo, ADCC, CDC) debido a diferencias en las secuencias de aminoácidos de sus dominios de bisagra y/o Fc. En
ciertas realizaciones, la modificación de los aminoácidos y de la región Fc de la IgG son seleccionadas
independientemente basándose en sus respectivas actividades individuales de unión y/o de función efectora con
objeto de modificar un diacuerpo con las características deseadas. En la mayoría de las realizaciones, dichas
modificaciones de aminoácidos y de las regiones de bisagra/Fc de la IgG se han ensayado por separado para
evaluar la actividad de unión y/o de función efectora según se describe en el presente documento o es conocido en
la materia en el contexto de una IgG1. En ciertas realizaciones, dicha modificación de aminoácidos y de la región de
bisagra/Fc de la IgG muestra una funcionalidad similar, por ejemplo, un aumento en la afinidad por el FcyRIIA,
cuando se ensayan por separado para evaluar la unión al FcyR o la función efectora en el contexto de la molécula
de diacuerpo o de otra molécula que contiene un Fc (por ejemplo, y una inmunoglobulina). La combinación de dicha
modificación de aminoácidos y de la región Fc de la IgG seleccionada actúa entonces de forma aditiva, o más
preferentemente, sinérgicamente, para modificar dicha funcionalidad en la molécula de diacuerpo de la invención,
con respecto a una molécula de diacuerpo de la invención que comprende una región Fc natural. En otras
realizaciones, dicha modificación de aminoácidos y de la región Fc de la IgG muestra unas funcionalidades
opuestas, por ejemplo, una afinidad aumentada y disminuida, respectivamente, por el FcyRIIA, cuando se ensayan
por separado para evaluar la unión al FcyR y/o la función efectora en el contexto de la molécula de diacuerpo o de
otra molécula que contiene un Fc (por ejemplo, una inmunoglobulina) que comprende una región Fc natural según
se describe en el presente documento o se sabe en la materia; la combinación de dichas modificaciones de
aminoácidos y región seleccionada de la IgG “opuestas” actúa entonces para moderar o reducir selectivamente una
funcionalidad específica en el diacuerpo de la invención con respecto a un diacuerpo de la invención que no
comprende una región Fc o que comprende una región Fc natural del mismo isotipo. También se describen regiones
Fc variantes que comprenden combinaciones de modificaciones de aminoácidos conocidas en la materia y regiones
seleccionadas de la IgG que muestran unas nuevas propiedades, propiedades que no eran detectables cuando
dichas modificaciones y/o regiones se ensayaban independientemente según se describe en el presente documento.
Las características funcionales de los múltiples isotipos de la IgG y de los dominios de las mismas, son bien
conocidas en la materia. Las secuencias de aminoácidos de la IgG1, de la IgG2, de la IgG3 y de la IgG4 se
presentan en las FIGS. 1A-1B. La selección y/o las combinaciones de dos o más dominios de unos isotipos
específicos de la IgG para su uso en los métodos del presente documento pueden basarse en cualquier parámetro
conocido de los isotipos parentales, incluyendo la afinidad por el FcyR (Tabla 7; Flesch y Neppert, 1999, J. Clin. Lab.
Anal. 14: 141-156; Chappel et al., 1993, J. Biol. Chem. 33: 25124-25131; Chappel et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 8 8 : 9036-9040). Por ejemplo, el uso de regiones o de dominios de isotipos de la IgG que muestran una
unión limitada o ninguna unión al FcyRIIB, por ejemplo, de la IgG2 o de la IgG4, pueden hallar un uso en particular
cuando se desea un diacuerpo que va a ser modificado para maximizar la unión a un receptor de activación y
minimizar la unión a un receptor de inhibición. De forma análoga, el uso de regiones Fc o de dominios de los isotipos
de la IgG conocidos por unirse preferentemente al C1q o al FcyRIIIA, por ejemplo, la IgG3 (Brüggemann et al., 1987,
J. Exp. Med 166: 1351-1361), puede combinarse con modificaciones de aminoácidos del Fc conocidas en la materia
por mejorar la ADCC, para modificar una molécula de diacuerpo de forma que se maximice la actividad de la función efectora, por ejemplo, la activación del complemento o la ADCC.
Tabla 7. Características generales de la unión de la IgG al FcyR, adaptadas a partir de Flesch y Neonert, 1999, J. Clin. Lab. Anal. 14: 141-156
Figure imgf000046_0001
A sólo se une a la IgG complejada
Conjugados moleculares
Las moléculas de diacuerpos de la invención pueden fusionarse recombinantemente o conjugarse químicamente (incluyendo conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) a polipéptidos heterólogos (es decir, un polipéptido no relacionado; o una porción del mismo, preferentemente al menos a 10, al menos a 20, al menos a 30, al menos a 40, al menos a 50. al menos a 60, al menos a 70, al menos a 80, al menos a 90 o al menos a 100 aminoácidos del polipéptido, para generar las proteínas de fusión. La fusión no tiene por qué ser necesariamente directa, pero puede producirse a través de secuencias conectoras.
Además, las moléculas de diacuerpos de la invención (es decir, los polipéptidos) pueden estar conjugadas con un agente terapéutico o una fracción farmacológica que modifica una respuesta biológica dada. Como una alternativa a la conjugación directa, debido a los múltiples sitios de unión del epítopo de las moléculas de diacuerpos de la invención multivalentes, por ejemplo, tetravalentes, al menos una región de unión del diacuerpo puede estar diseñada para unirse al agente terapéutico o a la fracción farmacológica deseada sin afectar a la unión del diacuerpo.
Los agentes terapéuticos o las fracciones farmacológicas no deben ser interpretados como limitados a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la fracción farmacológica puede ser una proteína o un polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como la abrina, la ricina A, la exotoxina de pseudomonas (es decir, la PE-40) o la toxina diftérica, la ricina, la gelonina y la proteína antivírica de Phytolacca americana, una proteína tal como el factor de necrosis tumoral, interferones que incluyen, pero no se limitan a, el interferón a (IFN-a), el interferón p (IFN-p), el factor de crecimiento nervioso (n Gf ), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el activador tisular del plasminógeno (TPA), un agente apoptótico (por ejemplo, el TNF-a, el TNF-p, el AIM I según se divulga en la Publicación PCT n° WO 97/33899), el AIM II (véase la Publicación PCT n° WO 97/34911), el ligando Fas (Takahashi et al., J. Immunol, 6: 1567-1574, 1994) y el VEGI (Publicación PCT n° WO 99/23105), un agente trombótico o un agente antiangiogénico (por ejemplo, la angiostatina o la endostatina) o un modificador de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfocina (por ejemplo, la interleucina-1 (“IL-1”), la interleucina-2 (“IL-2”), la interleucina-6 (“IL-6”), el factor estimulante de las colonias de granulocitos y macrófagos (“GM-CSF”) y el factor estimulante de las colonias de granulocitos (“G-CSF”), el factor estimulante de las colonias de macrófagos (“M-CSF”) o un factor de crecimiento (por ejemplo, la hormona de crecimiento (“GH”); proteasas o ribonucleasas.
Las moléculas de diacuerpos de la invención (es decir, los polipéptidos) pueden estar fusionadas con secuencias marcadoras, tales como un péptido, para facilitar la purificación. En las realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexahistidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otras, muchas de las cuales están disponibles en el mercado. Según se describe en Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 86: 821-824, por ejemplo, la hexahistidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas peptídicas útiles para la purificación incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta de hemaglutinina “HA”, que se corresponde con un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson et al., Cell, 37: 767 1984) y la etiqueta “flag" (Knappik et al., Biotechniques, 17 (4): 754-761, 1994).
Algunas proteínas de fusión adicionales pueden ser generadas a través de las técnicas de transposiciones genéticas, de transposiciones de motivo, de transposiciones de exón y/o de transposiciones de codón (denominadas en conjunto “transposiciones de ADN”). Las transposiciones de ADN pueden emplearse para alterar las actividades de las moléculas de la invención (por ejemplo, los sitios de unión del epítopo con unas mayores afinidades y unos menores índices de disociación). Véanse, de forma general, las Patentes de Estados Unidos n° 5.605.793; 5.811.238; 5.830.721; 5.834.252; y 5.837.458 y Patten et al., 1997, Curr. Opinión Biotechnol. 8 : 724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16: 76; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287: 265; y Lorenzo y Blasco, 1998, BioTechniques 24: 308. Las moléculas de diacuerpos de la invención, o los ácidos nucleicos que codifican las moléculas de la invención, puede ser alteradas adicionalmente sometiéndolas a mutagénesis aleatorias o mediante una PCR proclive a errores, una inserción aleatoria de nucleótidos u otros métodos previos a la recombinación. Una o más porciones de un polinucleótido que codifica una molécula de la invención pueden ser recombinadas con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.
La presente invención también incluye moléculas de diacuerpos de la invención conjugadas con, o que reconocen inmunoespecíficamente, un agente de diagnóstico o terapéutico o cualquier otra molécula para la cual se desea aumentar/disminuir la semivida sérica y/o ser dirigida a un subconjunto en particular de células. Las moléculas de la invención pueden usarse en diagnóstico, por ejemplo, para monitorizar el desarrollo o la progresión de una enfermedad, de un trastorno o de una infección, como parte de un procedimiento de pruebas clínicas, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse mediante el acoplamiento de las moléculas de la invención a una sustancia detectable o mediante las moléculas que reconocen inmunoespecíficamente la sustancia detectable. Algunos ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos, metales emisores de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radioactivos. La sustancia detectable puede estar acoplada o conjugada bien directamente con las moléculas de la invención o bien indirectamente, a través de un intermedio (tal como, por ejemplo, un conector conocido en la materia) usando técnicas conocidas en la materia, o la molécula puede reconocer inmunoespecíficamente la sustancia detectable: unirse inmunoespecíficamente a dicha sustancia. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n° 4.741.900 para los iones metálicos que pueden ser conjugados con los anticuerpos para su uso en diagnóstico. Dicho diagnóstico y detección puede llevarse a cabo diseñando las moléculas para que reconozcan inmunoespecíficamente la sustancia detectable o mediante el acoplamiento de las moléculas de la invención a sustancias detectables que incluyen, pero no se limitan a, varias enzimas, enzimas que incluyen, pero no se limitan a, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos complejos tales como, pero no se limitan a, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes tales como, pero no se limitan a, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes tales como, pero no se limitan a, luminol; materiales bioluminiscentes tales como, pero no se limitan a, luciferasa, luciferina y aequorina; materiales radioactivos tales como, pero no se limitan a, bismuto (213Bi), carbono (14C), cromo (51Cr), cobalto (57Co), flúor (1SF), gadolinio (153Gd, 159Gd), galio (68Ga, 67Ga), germanio (68Ge), holmio (166Ho), indio (115In, 113In, 112In, 11'in), yodo (131I, 1251, 123I, 121I), lantano (140La), lutecio (177Lu), manganeso (54Mn), molibdeno (99Mo), paladio (103Pd), fósforo (32P), praseodimio (142Pr), promecio (149Pm), renio (186Re, 188Re), rodio (105Rh), rutenio (97Ru), samario (153Sm), escandio (47Sc), selenio (75Se), estroncio (85Sr), azufre (35S), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), estaño (113Sn, 117Sn), tritio (3H), xenón (133Xe), iterbio (169Yb, 175Yb), itrio (90Y), cinc (65Zn); metales emisores de positrones que usan diversas tomografías de emisión de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radioactivos.
Las moléculas de diacuerpos de la invención pueden reconocer inmunoespecíficamente, o estar conjugadas a, una fracción terapéutica tal como una citotoxina (por ejemplo, un agente citostático o citocida), un agente terapéutico o un elemento radioactivo (por ejemplo, emisores alfa, emisores gamma, etc.,). Las citotoxinas o los agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. Algunos ejemplos incluyen paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, y análogos u homólogos de los mismos. Algunos agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6 -mercaptopurina, 6 -tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfano, dibromo manitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisdiclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).
Además, una molécula de diacuerpo de la invención puede ser conjugada con, o estar diseñada para reconocer inmunoespecíficamente, fracciones terapéuticas tales como materiales radioactivos o quelantes macrocíclicos útiles para la conjugación de iones radiometálicos (véase anteriormente para los ejemplos de materiales radioactivos). En ciertas realizaciones, el quelante macrocíclico es el ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-N,NN”,N'”-tetraacético (DOTA), que puede ser unido al polipéptido a través de una molécula conectora. Dichas moléculas conectoras son conocidas habitualmente en la materia y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4: 2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10: 553; y Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26: 943-50.
Las técnicas para la conjugación de dichas fracciones terapéuticas a polipéptidos, incluyendo, por ejemplo, los dominios Fc, son bien conocidas; véase, por ejemplo, Amon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy”, en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), 1985, páginas 243­ 56, Alan R. Fiss, Inc.); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), 1987, páginas 623-53, Marcel Dekker, Inc.); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), 1985, páginas 475-506); “Analysis, Results and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), 1985, páginas 303-16, Academic Press; y Thorpe et al., Immunol. Rev., 62: 119-58, 1982.
La molécula de diacuerpo de la invención puede ser administrada con o sin una fracción terapéutica conjugada a ella, administrada sola o junto con factor(es) citotóxico(s) y/o citocina(s) para su uso como un tratamiento terapéutico. Cuando se administra sola, al menos un epítopo de una molécula de diacuerpo multivalente, por ejemplo, tetravalente, puede estar diseñado para reconocer inmunoespecíficamente un agente terapéutico, por ejemplo, factor(es) citotóxico(s) y/o citocina(s), que puede ser administrado simultáneamente o posteriormente a la molécula de la invención. De esta forma, la molécula de diacuerpo puede dirigirse específicamente al agente terapéutico de una forma similar a una conjugación directa. Alternativamente, una molécula de la invención puede estar conjugada con un anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo según describe Segal en la Patente de Estados Unidos n° 4.676.980. Las moléculas de diacuerpo de la invención también pueden estar unidas a soportes sólidos, que son útiles particularmente para inmunoensayos o para la purificación del antígeno objetivo. Dichos soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno.
Caracterización de la unión de las moléculas de diacuerpos
Las moléculas de diacuerpos de la presente invención pueden ser caracterizadas de una diversidad de formas. En particular, puede ensayarse la capacidad de las moléculas de la invención para unirse inmunoespecíficamente a un antígeno, por ejemplo, el FcRIIIA o el FcRIIB, o, cuando la molécula comprende un dominio Fc (o una porción del mismo), la capacidad de mostrar interacciones Fc-FcyR, es decir, una unión específica de un dominio Fc (o una porción del mismo) a un FcyR. Dicho ensayo puede llevarse a cabo en solución (por ejemplo, Houghten, Bio/Techniques, 13: 412-421, 1992), en microesferas (Lam, Nature, 354: 82-84, 1991, en chips (Fodor, Nature, 364: 555-556, 1993), en bacterias (Patente de Estados Unidos n° 5.223.409), en esporas (Patentes de Estados Unidos n° 5.571.698; 5.403.484; y 5.223.409), en plásmidos (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, 89: 1865-1869, 1992) o en un fago (Scott y Smith, Science, 249: 386-390, 1990; Devlin, Science, 249: 404-406, 1990; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, 87: 6378-6382, 1990; y Felici, J. Mol. Biol, 222: 301-310, 1991). Las moléculas que han sido identificadas por unirse inmunoespecíficamente a un antígeno, por ejemplo, el FcyRIIIA, pueden ensayarse después para evaluar su especificidad y afinidad por el antígeno.
Las moléculas de la invención que han sido diseñadas para que comprendan múltiples dominios de unión al epítopo pueden ser ensayadas para evaluar su unión inmunoespecífica a uno o más antígenos (por ejemplo, oncoantígenos y reactividad cruzada con otros antígenos (por ejemplo, FcyR)) o, cuando las moléculas comprenden un dominio Fc (o una porción del mismo), para evaluar las interacciones Fc-FcyR mediante cualquier método conocido en la materia. Algunos inmunoensayos que pueden usarse para analizar la unión inmunoespecífica, la reactividad cruzada y las interacciones Fc-FcyR incluyen, pero no se limitan a, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como inmunotransferencias western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoadsorción enzimática), inmunoensayos en “sándwich”, ensayos de inmunoprecipitación, reacciones con precipitina, reacciones de difusión en gel de precipitina, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de la proteína A, por nombrar unos pocos. Dichos ensayos son rutinarios y bien conocidos en la materia (véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York).
La afinidad de unión y la disociación de la interacción antígeno-dominio de unión o de la interacción Fc-FcyR puede ser determinada mediante ensayos de unión competitivos. Un ejemplo de un ensayo de unión competitivo es un radioinmunoensayo que comprende la incubación del antígeno marcado, tal como el FcyR tetramérico (por ejemplo, 3H o I125 véase la Sección 5.4.1) con una molécula de interés (por ejemplo, las moléculas de la presente invención que comprenden múltiples dominios de unión al epítopo en presencia de cantidades crecientes del epítopo sin marcar, tal como el FcyR tetramérico (véase la Sección 5.4.1) y la detección de la molécula unida al antígeno marcado. La afinidad de la molécula de la presente invención por un antígeno y las disociaciones de la unión pueden ser determinadas a partir de los datos de la saturación mediante un análisis de Scatchard.
Las afinidades y las propiedades de unión de las moléculas de la invención por un antígeno o un FcyR pueden determinarse inicialmente usando ensayos in vitro (ensayos con una base bioquímica o inmunológica) conocidos en la materia para evaluar las interacciones antígeno-dominio de unión o Fc-FcyR, que incluyen, pero no se limitan a, un ensayo ELISA, un ensayo de resonancia de plasmón superficial, ensayos de inmunoprecipitación. Preferiblemente, las propiedades de unión de las moléculas de la invención también son caracterizadas mediante ensayos funcionales in vitro para la determinación de una o más de las funciones celulares efectoras mediadas por el FcyR, según se describe en la sección 5.4.2. En la mayoría de las realizaciones preferidas, las moléculas de la invención tienen unas propiedades de unión similares en los modelos in vivo (tales como las descritas y divulgadas en el presente documento) a las de los ensayos con una base in vitro. Sin embargo, la presente invención no excluye las moléculas de la invención que no muestran el fenotipo deseado en los ensayos con una base in vitro pero que sí muestran el fenotipo deseado in vivo.
En algunas realizaciones, el cribado y la identificación de las moléculas que comprenden múltiples dominios de unión al epítopo y, opcionalmente, dominios Fc (o porciones de los mismos) se realizan ensayos con una base funcional, preferentemente de una forma de alto rendimiento. Los ensayos con una base funcional pueden ser cualquier ensayo conocido en la materia para la caracterización de una o más funciones celulares efectoras mediadas por el FcyR tales como las descritas en el presente documento en las Secciones 5.4.2 y 5.4.3. Algunos ejemplos no limitantes de funciones celulares efectoras que pueden usarse según los métodos del presente documento incluyen, pero no se limitan a, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), la fagocitosis dependiente de anticuerpo, la fagocitosis, la opsonización, la opsonofagocitosis, la unión celular, la formación de rosetas, la unión al C1q y la citotoxicidad celular dependiente del complemento.
En una realización preferida, se usa un análisis cinético de BIAcore para la determinación de los índices de unión y de disociación de las moléculas de la presente invención a un antígeno o y al FcyR. El análisis cinético de BIAcore comprende el análisis de la unión y la disociación de un antígeno o del FcyR de chips con moléculas inmovilizadas (por ejemplo, moléculas que comprenden un dominio de unión al epítopo o dominios Fc (o porciones de los mismos), respectivamente) en su superficie. El análisis de BIAcore se describe en la Section 5.4.3.
Preferiblemente, se usa una clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), usando cualquiera de las técnicas conocidas por los expertos en la materia, para un ensayo con una base inmunológica o funcional para la caracterización de las moléculas de la invención. Los clasificadores de flujo son capaces de examinar rápidamente un gran número de células individuales que han sido unidas, por ejemplo, opsonizadas, por las moléculas de la invención (por ejemplo, 10-100 millones de células por hora) (Shapiro et al., Practical Flow Cytometry, 1995). Adicionalmente, algunos parámetros específicos usados para la optimización del comportamiento del diacuerpo, incluyen, pero no se limitan a, la concentración del antígeno (es decir, el complejo FcyR tetramérico, véase la Sección 5.4.1), el tiempo de competición cinética o una FACS rigurosa, cada uno de los cuales puede ser modificado con objeto de seleccionar las moléculas de diacuerpos que comprenden las moléculas de la invención que muestran las propiedades de unión específicas, por ejemplo, la unión simultánea a múltiples epítopos. Los citómetros de flujo para la clasificación y el análisis de células biológicas son bien conocidos en la materia. Algunos citómetros de flujo conocidos se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos n° 4.347.935; 5.464.581; 5.483.469; 5.602.039; 5.643.796; y 6.211.477. Otros citómetros de flujo conocidos son el sistema FACS Vantage™ fabricado por Becton Dickinson and Company, y el sistema COPAS™ fabricado por Union Biometrica.
La caracterización de la afinidad de unión del antígeno objetivo o de la afinidad de unión del Fc-FcyR y la evaluación de la densidad del antígeno objetivo o del FcyR en la superficie de una célula puede llevarse a cabo mediante métodos bien conocidos en la materia, tales como un análisis de Scatchard o mediante el uso de kits según las instrucciones del fabricante, tales como Quantum™ Simply Cellular ® (Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN). El uno o más ensayos funcionales puede ser cualquier ensayo conocido en la materia para la caracterización de una o más funciones celulares efectoras mediadas por el FcyR según conocen los expertos en la materia o se describen en el presente documento. En algunas realizaciones específicas, las moléculas de la invención que comprenden múltiples dominios de unión al epítopo y, opcionalmente, y dominio Fc (o una porción del mismo) se ensayan en un ensayo ELISA para evaluar la unión de uno o más antígenos objetivo a uno o más FcyR, por ejemplo, al FcyRIIIA, al FcyRIIA, al FcyRIIA; seguido de uno o más ensayos de ADCC. En algunas realizaciones, las moléculas de la invención se ensayan adicionalmente usando un ensayo basado en la resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIAcore. Los ensayos basados en la resonancia de plasmón superficial son bien conocidos en la materia y se analizan adicionalmente en la Sección 5.4.3 y se ejemplifican en el presente documento, por ejemplo, en el Ejemplo 6.1.
En las realizaciones más preferidas, las moléculas de la invención que comprenden múltiples dominios de unión al epítopo y, opcionalmente un dominio Fc (o una porción del mismo) son caracterizadas tradicionalmente en un modelo animal para la interacción con un antígeno objetivo (por ejemplo, un FcyR) o para una interacción Fc-FcyR. Cuando se van a evaluar las interacciones Fc-FcyR, algunos modelos animales proferidos para su uso en los métodos del presente documento son, por ejemplo, ratones transgénicos que expresan los FcyR humanos, por ejemplo, cualquier modelo de ratón descrito en las Patentes de Estados Unidos n° 5.877.397 y 6.676.927. Algunos ratones transgénicos adicionales para su uso en dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, ratones atímicos inactivados para el FcyRIIIA portadores del FcyRIIIA humano; ratones atímicos inactivados para el FcyRIIIA portadores del FcyRIIA humano; ratones atímicos inactivados para el FcyRIIIA portadores del FcyRIIB humano y del FcyRIIIA humano; ratones atímicos inactivados para el FcyRIIIA portadores del FcyRIIB humano y del FcyRIIA humano; ratones atímicos inactivados para el FcyRIIIA y el FcyRIIA portadores del FcyRIIIA humano y del FcyRIIA humano, y ratones atímicos inactivados para el FcyRIIIA, el FcyRIIA y el FcyRIIB portadores del FcyRIIIA, del FcyRIIA y del FcyRIIB humanos.
Ensayos de unión que comprenden el FcyR
La caracterización de la unión al FcyR por parte de las moléculas que comprenden un dominio Fc (o una porción del mismo) y/o que comprenden un dominio de unión al epítopo específico para un FcyR puede llevarse a cabo usando cualquier FcyR, incluyendo, pero no se limitan a, las variantes polimorfas del FcyR. En algunas realizaciones usa una variante polimorfa del FcyRIIIA, que contiene una fenilalanina en la posición 158. En otras realizaciones, la caracterización se lleva a cabo usando una variante polimorfa del FcyRIIIA que contiene una valina en la posición 158. El FcyRIIIA 158V muestra una mayor afinidad por la IgG1 que el 158F y un aumento en la actividad de ADCC (véase, por ejemplo, Koene et al., 1997, Blood, 90: 1109-14; Wu et al., 1997, J. Clin. Invest. 100: 1059-70); de hecho, este residuo interactúa directamente con la región de bisagra inferior de la IgG1, según se ha demostrado recientemente mediante estudios de cocristalización de IgG1-FcYRIIIA, véase, por ejemplo, Sonderman et al., 2000, Nature, 100: 1059-70. Los estudios han demostrado que en algunos casos los anticuerpos terapéuticos tienen una eficacia mejorada en los pacientes homocigóticos para el FcyRIIIA-158V. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD20 Rituximab era terapéuticamente más eficaz en los pacientes homocigóticos para el FcyRIIIA158V en comparación con los pacientes homocigóticos para el FcyRIIIA 158F (véase, por ejemplo, Cartron et al., 2002 Blood, 99 (3): 754-8). En otras realizaciones, las moléculas terapéuticas que comprenden esta región también pueden ser más eficaces en pacientes heterocigóticos para el FcyRIIIA-158v y el FcyRIIIA-158F y en pacientes con el FcyRIIA-131H. Aunque sin pretender estar ligados a ningún mecanismo de acción en particular, la selección de las moléculas de la invención con alotipos alternativos puede proporcionar variantes que, una vez modificadas en los diacuerpos terapéuticos, serán clínicamente más eficaces para los pacientes homocigóticos para dicho alotipo.
Se desarrolló un ensayo de unión al FcyR para determinar la unión de las moléculas de la invención al FcyR, y, en particular, para determinar la unión de los dominios Fc al FcyR. El ensayo permitía la detección y la cuantificación de las interacciones Fc-FcyR, a pesar de la inherente afinidad débil del receptor por su ligando, por ejemplo, en el intervalo micromolar para el FcyRIIB y el FcyRIIIA. El método se describe con detalle en la Solicitud Internacional WO04/063351 y en las Publicaciones de Solicitudes de Patente de Estados Unidos 005/0037000 y 2005/0064514. En resumen, el método implica la formación de un complejo del FcyR que puede usarse en cualquier inmunoensayo convencional conocido en la materia, por ejemplo, una FACS, un ELISA, una resonancia de plasmón superficial, etc. Adicionalmente, el complejo del FcyR tiene una avidez mejorada por una región Fc, con respecto a un FcyR no complejado. Según la invención, el complejo molecular preferido es un complejo inmunitario tetramérico, que comprende: (a) la región soluble del FcyR (por ejemplo, la región soluble del FcyRIIIA, del FcyRIIA o del FcyRIIB); (b) una secuencia AVITAG de 15 aminoácidos biotinilada (AVITAG) unida operativamente al C terminal de la región soluble del FcyR (por ejemplo, la región soluble del FcyRIIIA, del FcyRIIA o del FcyRIIB); y (c) estreptavidinaficoeritrina (SA-PE); en una proporción molar para formar un complejo FcyR tetramérico (preferentemente en una proporción molar de 5:1). La proteína de fusión es biotinilada enzimáticamente usando, por ejemplo, la enzima Bir A de E. coli, una ligasa de biotina que biotinila específicamente un residuo de lisina de la secuencia AVITAG de 15 aminoácidos. Las proteínas FcyR biotiniladas solubles se mezclan después con la SA-PE en una proporción molar de 1x de SA-PE:5x de FcyR biotinilado soluble para formar un complejo del FcyR tetramérico.
Se ha demostrado que los polipéptidos que comprenden las regiones Fc se unen a los complejos FcyR tetraméricos con una afinidad al menos 8 veces mayor que el FcyR monomérico no complejado. La unión de los polipéptidos que comprenden las regiones Fc a los complejos FcyR tetraméricos puede ser determinada usando las técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, tales como, por ejemplo, una clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), radioinmunoensayos, ensayos ELISA, etc.
También se describe el uso de los complejos inmunitarios que comprenden las moléculas de la invención y se forman según los métodos descritos anteriormente, para la determinación de la funcionalidad de las moléculas que comprenden una región Fc en ensayos basados en células o exentos de células.
Por conveniencia, los reactivos pueden ser proporcionados en un kit de ensayo, es decir, una combinación envasada de reactivos para ensayar la capacidad de las moléculas que comprenden una regiones Fc para unirse a los complejos del FcyR tetraméricos. También se contemplan otras formas de complejos moleculares para su uso en la determinación de las interacciones Fc-FcyR para su uso en los métodos.
Ensayos funcionales de moléculas con cadenas pesadas variantes
También se describe la caracterización de las moléculas de la invención que comprenden múltiples dominios de unión al epítopo y, opcionalmente, dominios Fc (o porciones de los mismos) usando los ensayos conocidos por los expertos en la materia para la identificación de la función celular efectora de las moléculas. También se describe la caracterización de las moléculas de la invención para la función celular efectora mediada por el FcyR. Adicionalmente, cuando al menos uno de los antígenos objetivo de la molécula de diacuerpo de la invención es un FcyR, la unión del FcyR por parte de la molécula de diacuerpo puede servir para activar las rutas mediadas por el FcyR similares a las que son activadas por la unión FcyR-Fc. Por lo tanto, cuando al menos un dominio de unión al eptiopo de la molécula de diacuerpo reconoce un FcyR, la molécula de diacuerpo puede desencadenar una función celular efectora mediada por el FcyR sin que contenga un dominio Fc (o una porción del mismo), o sin la unión concomitante Fc-FcyR. Algunos ejemplos de funciones celulares efectoras que pueden ser ensayadas incluyen, pero no se limitan a, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, la fagocitosis, la opsonización, la opsonofagocitosis, la unión al C1q y la citotoxicidad celular dependiente del complemento. Puede usarse cualquier ensayo basado en células o exento de células conocido por los expertos en la materia para la determinación de la actividad de función celular efectora (para los ensayos de células efectoras, véase Perussia et al., 2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92; Baggiolini et al., 1998 Experientia, 44 (10): 841-8; Lehmann et al., 2000 J. Immunol. Methods, 243 (1-2): 229-42; Brown EJ. 1994, Methods Cell Biol, 45: 147-64; Munn et al., 1990 J. Exp. Med., 172: 231-237, Abdul-Majid et al., 2002 Scand. J. Immunol. 55: 70-81; Ding et al., 1998, Immunity 8 : 403-411).
En una realización, puede ensayarse la fagocitosis mediada por el FcyR en monocitos humanos de las moléculas de la invención. Alternativamente, la fagocitosis mediada por el FcyR de las moléculas de la invención puede ser ensayada en otros fagocitos, por ejemplo, en neutrófilos (leucocitos polimorfonucleares; PMN); monocitos humanos de sangre periférica, macrófagos derivados de monocitos, que pueden obtenerse usando los procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la materia (por ejemplo, véase Brown EJ. 1994, Methods Cell Biol, 45: 147-164). En una realización, la función de las moléculas de la invención se caracteriza mediante la medición de la capacidad de las células THP-1 para fagocitar glóbulos rojos sanguíneos de oveja (SRBC) opsonizados por la IgG fluoresceinados mediante los métodos descritos previamente (Tridandapani et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 20480­ 7).
Otro ejemplo de ensayo para la determinación de la fagocitosis de las moléculas de la invención es un ensayo de opsonofagocitosis dependiente de anticuerpo (ADCP) que puede comprender lo siguiente: el recubrimiento de una biopartícula objetivo tal como Escherichia coli marcada con FITC (Molecular Probes) o Staphylococcus aureus-FITC con (i) un anticuerpo 4-4-20 natural, un anticuerpo contra la fluoresceína (véase Bedzyk et al., 1989, J. Biol. Chem, 264 (3): 1565-1569), como el anticuerpo de control para la ADCP dependiente del FcyR; o (ii) un anticuerpo 4-4-20 portador de la mutación D265A que inactiva la unión al FcyRIII, como control de fondo para la ADCP dependiente del FcyR (iii) un diacuerpo que comprende el dominio de unión al epítopo de 4-4-20 y un dominio Fc y/o un dominio de unión al epítopo específico para el FcyRIII; y la formación de la partícula opsonizada; la adición de cualquiera de las partículas opsonizada (i-iii) a las células efectoras THP-1 (una línea celular monocítica disponible en la ATCC) en una proporción de 1:1, de 10:1, de 30:1, de 60:1, de 75:1 o de 100:1 para permitir que se produzca la fagocitosis mediada por el FcyR; preferentemente, la incubación de las células y de E. coli-FITC/anticuerpo a 37 °C durante 1,5 horas; la adición de trypan blue después de la incubación (preferentemente a la temperatura ambiente durante 2-3 min) a las células para inactivar la fluorescencia de las bacterias que están adheridas al exterior de la superficie de la célula sin haber sido internalizadas; la trasferencia de las células a un tampón de FACS (por ejemplo, BSA al 0,1 %, en PBS, azida de sodio al 0,1 %,), el análisis de la fluorescencia de las células THP1 usando una FACS (por ejemplo, BD FACS Calibur). Preferiblemente, las células THP-1 que se usan en el ensayo son analizadas mediante una FACS para evaluar la expresión del FcyR en la superficie celular. Las células THP-1 expresan tanto la CD32A como la CD64. La CD64 es un FcyR de alta afinidad que es bloqueado en la realización del ensayo de ADCP según los métodos del presente documento. Las células THP-1 se bloquean preferentemente con 100 pg/ml de IgG1 soluble o con suero humano al 10%. Para analizar la magnitud de la ADCP, la clasificación se establece preferentemente en las células THP-1 y se mide la intensidad de la fluorescencia mediana. Se calcula la actividad de la ADCP para los mutantes individuales y se notifica en forma de un valor normalizado al chAcMc 4-4-20 natural obtenido. Las partículas opsonizadas son añadidas a las células THP-1 de tal forma que la proporción entre las partículas opsonizadas y las células THP-1 es de 30:1 o de 60:1. En las realizaciones más preferidas, el ensayo de ADCP se lleva a cabo con controles, tales como E. coli-FITC en medio, E. coli-FITC y células THP-1 (para que sirva como actividad de ADCP independiente del FcyR), E. coli-FITC, células THP-1 y anticuerpo 4-4-20 natural (para que sirva como actividad de ADCP dependiente del FcyR), E. coli-FITC, células THP-1, 4-4-20 D265A (para que sirva como control de fondo para la actividad de ADCP dependiente del FcyR).
En otra realización, puede ensayarse la actividad de ADCC mediada por el FcyR de las moléculas de la invención en células efectoras, por ejemplo, en linfocitos citolíticos naturales, usando cualquiera de los métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Perussia et al., 2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92; Weng et al., 2003, J. Clin. Oncol. 21: 3940-3947; Ding et al., Immunity, 1998, 8 : 403-11). Un ejemplo de ensayo para la determinación de la actividad de ADCC de las moléculas de la invención se basa en un ensayo de liberación de 51Cr que comprende: el marcaje de células individuales con [51Cr]Na2CrO4 (esta molécula permeable a la membrana celular se usa habitualmente para el marcaje dado que se une a las proteínas citoplasmáticas, y aunque es liberada espontáneamente desde las células con una cinética lenta, es liberada de forma masiva después de la necrosis de la célula objetivo); la opsonización de las células objetivo con las moléculas de la invención que comprenden cadenas pesadas variantes; la combinación de las células objetivo opsonizadas radiomarcadas con las células efectoras en una placa de microtitulación en una proporción adecuada entre las células objetivo y las células efectoras; la incubación de la mezcla de células durante 16-18 horas a 37 °C; la recolección de los sobrenadantes; y el análisis de la radioactividad. La citotoxicidad de las moléculas de la invención puede ser determinada, por ejemplo, usando la siguiente fórmula: % de lisis = (cpm experimental - cpm filtrada del objetivo) / (cpm de la lisis con detergente - filtrada del objetivo) x 100 %. Alternativamente, % lisis = (ADCC-AICC) / (liberación máxima - liberación espontánea). La lisis específica puede calcularse usando la fórmula: lisis específica = % de lisis con las moléculas de la invención - % de lisis en ausencia de las moléculas de la invención. Puede generarse una gráfica modificando bien la proporción de objetivo:célula efectora o bien la concentración de anticuerpo.
Preferiblemente, las células efectoras usadas en los ensayos de ADCC son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que preferentemente se purifican a partir de sangre humana normal usando los métodos convencionales conocidos por un experto en la materia, por ejemplo, usando una centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Paque. Las células efectoras preferidas para su uso en los métodos del presente documento expresan diferentes receptores FcyR de activación. También se describen células efectoras, THP-1, que expresan el FcyRI, el FcyRIIA y el FcyRIIB, y macrófagos primarios derivados de monocitos derivados de sangre humana completa que expresan tanto el FcyRIIIA como el FcyRIIB, para determinar si los mutantes de la cadena pesada del anticuerpo muestran un aumento de la actividad de ADCC y en la fagocitosis con respecto a los anticuerpos IgG1 naturales.
La línea celular de monocitos humanos, THP-1, activa la fagocitosis a través de la expresión del receptor de alta afinidad FcyRI y del receptor de baja afinidad FcyRIIA (Fleit et al., 1991, J. Leuk. Biol. 49: 556). Las células THP-1 no expresan constitutivamente el FcyRIIA ni el FcyRIIB. La estimulación de estas células con citocinas efectúa el patrón de expresión del FcR (Pricop et al., 2000 J. Immunol. 166: 531-7). El cultivo de las células THP-1 en presencia de la citocina IL4 induce la expresión del FcyRIIB y provoca una reducción en la expresión del FcyRIIA y del FcyRI. La expresión del FcyRIIB también puede aumentarse incrementando la densidad celular (Tridandapani et al., 2002, J. Biol Chem. 277: 5082-9). Por el contrario, se ha notificado que el IFNy puede dar lugar a la expresión del FcyRIIIA (Pearse et al., 1993 PNAS EE.UU. 90: 4314-8). La presencia o la ausencia de receptores en la superficie celular puede ser determinada mediante una FACS usando los métodos habituales conocidos por un experto en la materia. La expresión inducida por citocinas del FcyR en la superficie celular proporciona un sistema para comprobar tanto la activación como la inhibición en presencia del FcyRIIB. Si las células THP-1 son incapaces de expresar el FcyRIIB, puede usarse otra línea celular monocítica humana, la U937. Se ha demostrado que estas células se diferencian a término en macrófagos en presencia de IFNy y de TNF (Koren et al., 1979, Nature 279: 328­ 331).
La destrucción de células tumorales dependiente del FcyR está mediada por los macrófagos y los linfocitos citolíticos naturales en modelos tumorales de ratón (Clynes et al., 1998, PNAS EE.UU. 95: 652-656). También se describe el uso de monocitos elutriados de donantes como células efectoras para analizar la eficiencia de los mutantes Fc para desencadenar la citotoxicidad celular de las células objetivo en ensayos tanto de fagocitosis como de ADCC. Los patrones de expresión del FcyRI, del FcyRIIIA y del FcyRIIB se ven afectados por las diferentes condiciones de cultivo. La expresión del FcyR a partir de monocitos elutriados congelados, de monocitos elutriados frescos, de monocitos mantenidos en un 10% de FBS y de monocitos cultivados en FBS GM-CSF y o en suero humano puede ser determinada usando los métodos habituales conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, las células pueden teñirse con anticuerpos específicos del FcyR y analizarse mediante una FACS para determinar los perfiles del FcR. Las condiciones que mejor simulan la expresión del FcyR en los macrófagos in vivo se usan después para los métodos del presente documento.
También se describe el uso de células de ratón, especialmente cuando no pueden obtenerse células humanas con los perfiles adecuados de FcyR. También se describe la línea celular de macrófagos de ratón RAW264.7 (ATCC) que puede ser transfecteda con el FcyRIIIA humano, y aislarse los transfectantes estables usando los métodos conocidos en la materia, véase, por ejemplo, Ralph et al., J. Immunol 119: 950-4). Puede cuantificarse la expresión del FcyRIIIA de los transfectantes mediante un análisis de FACS usando la experimentación rutinaria y pueden usarse los expresores altos en los ensayos de ADCC descritos en el presente documento. También se describe el aislamiento de macrófagos peritoneales esplénicos que expresan el FcyR humano a partir de ratones transgénicos inactivados tales como los divulgados en el presente documento.
Los linfocitos pueden ser recogidos a partir de donantes de sangre periférica (PBM) usando un gradiente de Ficoll-Paque (Pharmacia). En la población mononuclear aislada de células, la mayor parte de la actividad de ADCC se produce a través de los linfocitos citolíticos naturales (NK) que contienen el FcyRIIIA, pero no el FcyRIIB, en su superficie. Los resultados con estas células indican la eficacia de los mutantes para desencadenar la ADCC de los n K y establecer los reactivos para la prueba con los monocitos elutriados.
Algunas células objetivo usadas en los ensayos de ADCC incluyen, pero no se limitan a, líneas celulares de cáncer de mama, por ejemplo, SK-BR-3 con el número de registro de la ATCC HTB-30 (véase, por ejemplo, Tremp et al., 1976, Cancer Res. 33-41); linfocitos B; células derivadas de un linfoma de Burkitts, por ejemplo, células Raji con el número de registro de la ATCC CCL- 8 6 (véase, por ejemplo, Epstein et al., 1965, J. Natl. Cancer Inst. 34: 231-240) y células Daudi con el número de registro de la ATCC CCL-213 (véase, por ejemplo, Klein et al., 1968, Cancer Res.
28: 1300-10). Las células objetivo deben ser reconocidas por el sitio de unión del antígeno de la molécula de diacuerpo que se va a ensayar.
El ensayo de ADCC se basa en la capacidad de los linfocitos citolíticos naturales para mediar en la muerte celular a través de una ruta apoptótica. Los linfocitos citolíticos naturales median en la muerte celular en parte mediante el reconocimiento por parte del FcyRIIIA de un dominio Fc de una IgG unido a un antígeno en la superficie de una célula. Los ensayos de ADCC usados según los métodos del presente documento pueden ser ensayos con una base radioactiva o ensayos con una base fluorescente. El ensayo de ADCC usado para la caracterización de las moléculas de la invención que comprenden regiones Fc variantes comprende el marcaje de las células objetivo, por ejemplo, de células SK-BR-3, m CF-7, OVCAR3, Raji, Daudi, la opsonización de las células objetivo con un anticuerpo que reconoce un receptor de la superficie celular de la célula objetivo a través de su sitio de unión del antígeno; la combinación de las células objetivo marcadas opsonizadas y de las células efectoras en una proporción apropiada, que puede ser determinada mediante una experimentación rutinaria; la recolección de las células; la detección del marcador en el sobrenadante de las células objetivo lisadas, usando un esquema de detección apropiado basado en el marcador usado. Las células objetivo pueden ser marcadas bien con un marcado radioactivo o bien con un marcador fluorescente usando los métodos convencionales conocidos en la materia. Por ejemplo, algunos marcadores incluyen, pero no se limitan a, [51Cr]Na2CrCO4; y el acetoximetil éster del ligando mejorador de la fluorescencia 2,2':6',2”-terpiridin-6-6”-dicarboxilato (TDA).
En una realización específica, se usa un ensayo fluorimétrico resuelto en el tiempo para la medición de la actividad de ADCC contra las células objetivo que han sido marcadas con el acetoximetil éster del ligando mejorador de la fluorescencia 2,2':6',2”-terpiridin-6-6”-dicarboxilato (TDA). Dichos ensayos fluorimétricos son conocidos en la materia, por ejemplo, véase, Blomberg et al., 1996, Journal of Immunological Methods, 193: 199-206. En resumen, se marcan las células objetivo con el acetoximetil diester del TDA (bis(acetoximetil) 2,2':6',2”-terpiridin-6-6”-dicarboxilato, (BATDA) permeable a la membrana, que difunde rápidamente a través de la membrana celular de las células viables. Las esterasas intracelulares cortan los grupos éster y la molécula de TDA regenerada impermeable a la membrana es atrapada en el interior de la célula. Después de la incubación de las células efectoras y de las objetivo, por ejemplo, durante al menos dos horas, hasta 3,5 horas, a 37 °C, con un 5 % de CO2 , el TDA liberado de las células objetivo lisadas es quelatado con Eu3+ y la fluorescencia de los quelatos de europio-TDA formados se cuantifica con un fluorímetro resuelto en el tiempo (por ejemplo, Victor 1420, Perkin Elmer/Wallace).
En otra realización específica, el ensayo de ADCC usado para la caracterización de las moléculas de la invención que comprenden múltiples sitios de unión del epítopo y, opcionalmente, un dominio Fc (o una porción del mismo) comprenden las siguientes etapas: preferiblemente se marcan 4-5 x 106 células objetivo (por ejemplo, células SK-BR-3, MCF-7, OVCAR3, Raji) con bis(acetoximetil) 2,2':6',2”-terpiridin-t-6”-dicarboxilato (reactivo DELFIA BATDA, Perkin Elmer/Wallac). Para una eficiencia de marcaje óptima, el número total de células objetivo usado en el ensayo de ADCC preferentemente no debería exceder de 5 x 106 Se añade el reactivo BATDA a las células y la mezcla se incuba a 37 °C preferentemente con un 5 % de CO2 , durante al menos 30 minutos. Después, las células se lavan con un tampón fisiológico, por ejemplo, PBS con sulfinpirazol 0,125 mM y medio que contiene sulfinpirazol 0,125 mM. Después, las células objetivo marcadas son opsonizadas (recubiertas) con una molécula de la invención que comprende un dominio de unión al epítopo específico para el FcyRIIA y, opcionalmente, un dominio Fc (o una porción del mismo). En las realizaciones preferidas, la molécula usada en el ensayo de ADCC también es específica para un receptor de la superficie celular, un antígeno tumoral o un oncoantígeno. La molécula de diacuerpo de la invención puede unirse específicamente a cualquier antígeno de un cáncer o de un tumor, tales como los recogidos en la sección 5.6.1. Las células objetivo del ensayo de ADCC se eligen según los sitios de unión del epítopo modificados en el diacuerpo de la invención, de forma que el diacuerpo se une específicamente a un receptor de la superficie celular de la célula objetivo.
Las células objetivos son añadidas a las células efectoras, por ejemplo, a PBMC, para producir unas proporciones de efector:objetivo de aproximadamente 1:1, 10:1, 30:1, 50:1, 75:1 o 100:1. Las células efectoras y las objetivo se incuban durante al menos dos horas, hasta 3,5 horas, a 37 °C, con un 5 % de CO2. Se recogen los sobrenadantes celulares y se añaden a una solución ácida de europio (por ejemplo, la solución de europio DEFFIA, Perkin Elmer/Wallac). La fluorescencia de los quelatos de europio-TDA formados es cuantificada con un fluorímetro resuelto en el tiempo (por ejemplo, Victor 1420, Perkin Elmer/Wallac). La liberación máxima (MR) y la liberación espontánea (SR) se determinan mediante la incubación de las células objetivo con un 1 % de TX-100 y con medio solo, respectivamente. La citotoxicidad celular independiente de anticuerpo (AICC) se mide mediante la incubación de las células efectoras y las objetivo en ausencia de una molécula de prueba, por ejemplo, un diacuerpo de la invención. Cada ensayo se lleva a cabo preferentemente por triplicado. La lisis específica porcentual media se calcula como: liberación experimental (ADCC) - AICC) / (MR-SR) x 100.
También se describe el uso de los ensayos conocidos en la materia y ejemplificados en el presente documento para la caracterización de la unión del C1q y la mediación de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) por parte de las moléculas de la invención que comprenden dominios Fc (o porciones de los mismos). Para determinar la unión del C1q puede llevarse a cabo un ELISA del C1q. Un ejemplo de ensayo puede comprender el siguiente: pueden recubrirse placas de ensayo durante una noche a 4c con un polipéptido que comprende una molécula de la invención o un polipéptido de partida (control) en tampón de recubrimiento. Después, las placas pueden lavarse y bloquearse. Después del lavado puede añadirse una alícuota del C1q humano a cada pocillo e incubarse durante 2 h a la temperatura ambiente. Después de un lavado adicional pueden añadirse 100 pl de un anticuerpo de oveja anti-C1q del complemento conjugado con peroxidasa a cada pocillo e incubarse durante 1 hora a la temperatura ambiente. La placa puede lavarse de nuevo con tampón de lavado y pueden añadirse 100 pl del tampón del sustrato que contiene OPD (diclorhidrato de O-fenilenodiamina (Sigma)) a cada pocillo. La reacción de oxidación, observada por la aparición de un color amarillo, puede dejarse proceder durante 30 minutos y detenerse mediante la adición de 100 pl de H2SO44,5 N. Después puede leerse la absorbancia a (492-405) nm.
Para evaluar la activación del complemento puede llevarse a cabo un ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), por ejemplo, según se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). En resumen, pueden diluirse varias concentraciones de la molécula que comprende un dominio Fc (variante) (o una porción del mismo) y complemento humano con tampón. Las células que expresan el antígeno al que se une la molécula de diacuerpo pueden diluirse hasta una densidad de aproximadamente 1 x 106 células/ml. Pueden añadirse las mezclas de las moléculas de diacuerpos que comprenden un dominio Fc (variante) (o una porción del mismo), el complemento humano diluido, y las células que expresan el antígeno a una placa de cultivo tisular de fondo redondo de 96 pocillos y dejarse en incubación durante 2 h a 37C y un 5 % de CO2 para facilitar la lisis celular mediada por el complemento. Después, pueden añadirse 50 pl de alamar blue (Accumed International) a cada pocillo e incubarse durante una noche a 37 C. La observancia se mide usando un fluorímetro de 96 pocillos con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm. Los resultados pueden ser expresados en unidades de fluorescencia relativa (UFR). Las concentraciones de la muestra pueden ser computadas a partir de una curva patrón, y se notifica la actividad porcentual en comparación con una molécula no variante, es decir, una molécula que no comprende un dominio Fc o que comprende un dominio Fc no variante, para la variante de interés.
Otros ensayos
Las moléculas de la invención que comprenden múltiples dominio de unión al epítopo y, opcionalmente, un dominio Fc, pueden ensayarse usando cualquier ensayo basado en resonancia de plasmón superficial conocido en la materia para la caracterización de los parámetros genéticos de la unión antígeno-dominio de unión o Fc-FcyR. Puede usarse cualquier instrumento de SPR disponible comercialmente incluyendo, pero no se limita a, BIAcore Instruments, disponible en Biacore AB (Uppsala, Suecia); lAsys instruments disponible en Affinity Sensors (Franklin, MA.); el sistema IBIS disponible en Windsor Scientific Limited (Berks, Reino Unido), los sistemas SPR-CELLIA disponibles en Nippon Laser y en Electronics Lab (Hokkaido, Japón), y el SPR Detector Spreeta disponible en Texas Instruments (Dallas, TX). Para una revisión de la tecnología basada en la SPR véase Mullet et al., 2000, Methods 22: 77-91; Dong et al., 2002, Review in Mol. Biotech., 82: 303-23; Fivash et al., 1998, Current Opinión in Biotechnology 9: 97-101; Rich et al., 2000, Current Opinión in Biotechnology 11: 54-61. Adicionalmente, en los métodos se contemplan cualquiera de los instrumentos de SPR y de los métodos basados en la SPR para la medición de las interacciones proteína-proteína descritos en las Patente de Estados Unidos n° 6.373.577; 6.289.286; 5.322.798; 5.341.215; 6.268.125.
En resumen, los ensayos basados en la SPR implican la inmovilización de un miembro de un par de unión en una superficie y la monitorización de su interacción con el otro miembro del par de unión en solución en tiempo real. La SPR se basa en la medición del cambio en el índice de refracción del disolvente cerca de la superficie que se produce tras la formación o la disociación del complejo. La superficie sobre la que se produce la inmovilización es el chip sensor, que es el corazón de la tecnología de SPR; consiste en una superficie de vidrio recubierta con una fina capa de oro y forma la base de un abanico de superficies especializadas diseñadas para optimizar la unión de una molécula a la superficie. En el mercado hay disponibles una diversidad de chips sensores, especialmente en las compañías indicadas supra, todos los cuales pueden usarse en los métodos del presente documento. Algunos ejemplos de chips sensores incluyen los disponibles en BIAcore AB, Inc., por ejemplo, Sensor Chip CM5, SA, NTA y HPA. Una molécula de la invención puede ser inmovilizada en la superficie de un chip sensor usando cualquiera de los métodos y las químicas de inmovilización conocidos en la materia, que incluyen, pero no se limitan a, un acoplamiento covalente directo a través de grupos amino, un acoplamiento covalente directo a través de grupos sulfhidrilo, la unión de biotina a una superficie recubierta con avidina, el acoplamiento de un aldehído a grupos carbohidrato y la unión a través de la etiqueta de histidina con chips NTA.
En algunas realizaciones, los parámetros cinéticos de la unión de las moléculas de la invención que comprenden múltiples sitios de unión del epítopo y, opcionalmente y dominio Fc, a un antígeno o un FcyR, pueden ser determinados usando un instrumento BIAcore (por ejemplo, un instrumento BIAcore 1000, BIAcore Inc., Piscataway, NJ). Como se ha analizado supra, véase la sección 5.4.1, puede usarse cualquier FcyR para evaluar la unión de las moléculas de la invención tanto cuando al menos un sitio de unión del epítopo de la molécula de diacuerpo reconoce inmunoespecíficamente un FcyR, y/o como cuando la molécula de diacuerpo comprende un dominio Fc (o una porción del mismo). En una realización específica, el FcyR es el FcyRIIIA, preferentemente un FcyRIIIA soluble monomérico. Por ejemplo, en una realización, el FcyRIIIA soluble monomérico es la región extracelular del FcyRIIIA unida a la secuencia conectora AVITAG). En otra realización específica, el FcyR es el FcyRIIB, preferentemente un FcyRIIB soluble dimérico.
Para todos los ensayos inmunológicos, el reconocimiento/unión al FcyR por parte de una molécula de la invención puede ser efectuado mediante múltiples dominios: en ciertas realizaciones, las moléculas de la invención reconocen inmunoespecíficamente un FcyR a través de uno de los múltiples dominios de unión al epítopo; en otras realizaciones más, cuando la molécula de la invención comprende un dominio Fc (o una porción del mismo), la molécula de diacuerpo puede reconocer inmunoespecíficamente un FcyR a través de las interacciones Fc-FcyR; en otras realizaciones adicionales más, cuando una molécula de la invención comprende tanto un dominio Fc (o una porción del mismo) como un sitio de unión del epítopo que reconoce inmunoespecíficamente un FcyR, la molécula de diacuerpo puede reconocer un FcyR a través de uno o de ambos de un dominio de unión al epítopo y del dominio Fc (o una porción del mismo). Un ejemplo de ensayo para la determinación de los parámetros cinéticos de una molécula que comprende múltiples dominios de unión al epítopo y, opcionalmente y dominio Fc (o una porción del mismo) a un antígeno y/o a un FcyR usando un instrumento BIAcore comprende lo siguiente: se inmoviliza un primer antígeno en una de las cuatro celdas de flujo de la superficie de un chip sensor, preferentemente a través de una química de acoplamiento de amina, de tal forma que se inmovilicen aproximadamente 5.000 unidades de respuesta (UR) de dicho primer antígeno en la superficie. Una vez se ha preparado la superficie adecuada, las moléculas de la invención que reconocen inmunoespecíficamente dicho primer antígeno se hacen pasar a través de la superficie, preferentemente mediante inyecciones de un minuto de una solución de 20 pg/ml a un caudal de 5 pl/ml. Los niveles de las moléculas de la invención unidas a la superficie en esta fase normalmente varían entre 400 y 700 UR. Después, se inyectan unas series de diluciones de un segundo antígeno (por ejemplo, un FcyR) o de un receptor FcyR en tampón HBS-P (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, a un pH de 7,5) en la superficie a 100 pl/min La regeneración de las moléculas entre las diferentes diluciones del segundo antígeno o del receptor se lleva a cabo preferentemente mediante inyecciones individuales de 5 segundos de NaHCO3 100 mM a un pH de 9,4; NaCl 3 M. Se contempla cualquier técnica de regeneración conocida en la materia en el método del presente documento.
Una vez recogida la totalidad del conjunto de datos, las curvas de unión resultantes se ajustan globalmente usando los algoritmos informáticos suministrados por el fabricante del instrumento SPR, por ejemplo, BIAcore, Inc. (Piscataway, NJ). Estos algoritmos calculan tanto la Kon como la Koff, a partir de las cuales se deduce la constante de unión en equilibrio aparente, Kd, como la proporción entre las dos constantes de velocidad (es decir, Koff/Kon). Pueden encontrarse más tratamientos detallados de cómo se derivan las constantes de velocidad individuales en el BIAevaluaion Softwson Handbook (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). El análisis de los datos generados puede llevarse a cabo usando cualquier método conocido en la materia. Para una revisión de los diversos métodos de interpretación de los datos cinéticos generados, véase Myszka, 1997, Current Opinión in Biotechnology 8 : 50-7; Fisher et al., 1994, Current Opinión in Biotechnology 5: 389-95; O'Shannessy, 1994, Current Opinión in Biotechnology, 5: 65-71; Chaiken et al., 1992, Analytical Biochemistry, 2 0 1 : 197-210; Morton et al., 1995, Analytical Biochemistry 227: 176-85; O'Shannessy et al., 1996, Analytical Biochemistry 236: 275-83.
En algunas realizaciones preferidas pueden usarse los parámetros cinéticos determinados mediante el uso de un análisis de SPR, por ejemplo, BIAcore, como una medida predictiva de cómo funcionará una molécula de la invención en un ensayo funcional, por ejemplo, una ADCC. Un ejemplo de método para la predicción de la eficacia de una molécula de la invención basado en los parámetros cinéticos obtenidos a partir de un análisis de SPR puede comprender lo siguiente: la determinación de los valores de la Koff para la unión de una molécula de la invención al FcyRiIIA y al FcyRIIB (a través de un dominio de unión al epítopo y/o de un dominio Fc (o de una porción del mismo)); la representación gráfica de (1) Koff (nat)/Koff (mut) para el FcyRIIIA; (2) Koff (mut)/Koff (nat) para el FcyRIIB frente a los datos de la ADCC. Las cifras mayores de uno muestran una disminución en la velocidad de disociación para el FcyRIIIA y un aumento en la velocidad de disociación para el FcyRIIB con respecto al natural; y posee y función de ADCC mejorada.
Métodos para la producción de las moléculas de diacuerpos de la invención
Las moléculas de diacuerpos de la presente invención pueden ser producidas usando una diversidad de métodos bien conocidos en la materia, incluyendo la síntesis de proteínas de novo y la expresión recombinante de ácidos nucleicos que codifican las proteínas de unión. Las secuencias de ácidos nucleicos deseadas pueden ser producidas mediante métodos recombinantes (por ejemplo, mutagénesis mediante una PCR de una variante preparada previamente del polinucleótido deseado) o mediante una síntesis de ADN en fase sólida. Habitualmente se usan métodos de expresión recombinante. También se describe un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un VH y/o un VL de una CD16A. También se describe un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un VH y/o un VL de una CD32B. Debido a la degeneración del código genético, diversas secuencias de ácidos nucleicos codifican cada secuencia de aminoácidos de la inmunoglobulina, y la presente invención incluye todos los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de unión descritas en el presente documento.
Polinucleótidos que codifican las moléculas de la invención
La presente invención también incluye una molécula de ácidos nucleicos según la reivindicación 24 del presente documento. Los polinucleótidos que codifican las moléculas de la invención pueden obtenerse, y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos determinarse, mediante cualquier método conocido en la materia.
Una vez se ha determinado la secuencia de nucleótidos de las moléculas mediante los métodos del presente documento, la secuencia de nucleótidos puede ser manipulada usando métodos bien conocidos en la materia, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida, PCR, etc. (véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning. A Laboratory Manual 3a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; y Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, NY), para generar, por ejemplo, anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo, mediante la generación de sustituciones, de deleciones y/o de inserciones de aminoácidos.
En una realización, pueden cribarse colecciones humanas o cualquier otra colección disponible en la materia, mediante las técnicas convencionales conocidas en la materia, para clonar los ácidos nucleicos que codifican las moléculas de la invención.
Expresión recombinante de las moléculas de la invención
Una vez se ha obtenido una secuencia de ácidos nucleicos que codifica las moléculas de la invención (es decir, los anticuerpos), puede producirse el vector para la producción de las moléculas mediante la tecnología del ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en la materia. Pueden usarse métodos que son bien conocidos por los expertos en la materia para la construcción de los vectores de expresión que contienen las secuencias codificantes de las moléculas de la invención y las apropiadas señales de control de la transcripción y de la traducción. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y la recombinación genética in vivo. (Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, y en Ausubel et al. eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, NY).
Puede transferirse un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de una molécula identificada mediante los métodos del presente documento a una célula hospedadora mediante las técnicas convencionales (por ejemplo, electroporación, transfección liposomal y precipitación con fosfato de calcio) y después, las células transfectadas son cultivadas mediante las técnicas convencionales para producir las moléculas de la invención. En algunas realizaciones específicas, la expresión de las moléculas de la invención está regulada por un promotor específico constitutivo, inducible o tisular.
Las células hospedadoras usadas para expresar las moléculas identificadas mediante los métodos del presente documento pueden ser células bacterianas, tales como Escherichia coli, o, preferentemente, células eucariotas, especialmente para la expresión de una molécula de inmunoglobulina recombinante completa. En particular, las células de mamífero tales como las células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector tal como el elemento promotor génico temprano intermedio del citomegalovirus humano, es un sistema de expresión eficaz para las inmunoglobulinas (Foecking et al., 1998, Gene 45: 101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8 : 2).
Puede utilizarse una diversidad de sistemas de hospedador-vector de expresión para la expresión de las moléculas identificadas mediante los métodos del presente documento. Dichos sistemas de hospedador-expresión representan vehículos mediante los cuales pueden producirse las secuencias codificantes de las moléculas de la invención y purificarse posteriormente, pero también representan las células que, cuando son transformadas o transfectadas con las apropiadas secuencias codificantes de nucleótidos, pueden expresar las moléculas del presente documento in situ. Éstas incluyen, pero no se limitan a, microrganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, de ADN de plásmido o de ADN de cósmido que contienen secuencias codificantes de las moléculas identificadas mediante los métodos del presente documento; de levadura (por ejemplo, Saccharomyces Pichia) transformadas con vectores de expresión recombinantes de levadura que contienen las secuencias que codifican las moléculas identificadas mediante los métodos del presente documento; sistemas de células de insecto o infectados con vectores de expresión víricos recombinantes (por ejemplo, baclovirus) que contienen la secuencias que codifican las moléculas identificadas mediante los métodos del presente documento; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión víricos recombinantes (por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y el virus del mosaico del tabaco (TMV) o vectores de expresión transformados con plásmidos recombinantes (por ejemplo, el plásmido Ti) que contienen las secuencias que codifican las moléculas identificadas mediante los métodos del presente documento; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 293T, 3T3, células linfociticas (véase el documento U.S. 5.807.715), células Per C.6 (células de la retina humanas desarrolladas por Crucell) portadoras de construcciones de expresión recombinantes que contienen los promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, el promotor de la metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío del adenovirus; el promotor del virus de la variolovacuna 7.5K).
En los sistemas bacterianos puede seleccionarse ventajosamente una diversidad de vectores de expresión dependiendo del uso previsto para la molécula que se va a expresar. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de dicha proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de un anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de elevados niveles de los productos de la proteína de fusión que sean fácilmente purificables. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), en el que la secuencia codificante del anticuerpo puede ser ligada individualmente en el vector en marco con la región codificante de lac Z, de forma que se produzca una proteína de fusión; los vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; VanHeeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509); y similares. También pueden usarse los vectores pGEX para expresar polipéptidos foráneos en forma de proteínas de fusión con la S-transferasa de glutatión (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de las células lisadas mediante una adsorción y la unión a una matriz de microesferas de glutation-agarosa, seguido de una elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir los sitios de escisión de la trombina o de la proteasa del factor Xa, de forma que el producto genérico objetivo clonado pueda ser liberado desde la fracción de la GST.
En un sistema de insectos se usa el virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) como vector para la expresión de los genes foráneos. El virus crece en las células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante del anticuerpo puede ser clonada individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor del AcNPV (por ejemplo, el promotor de la polihedrina).
En las células hospedadoras de mamífero puede utilizarse una diversidad de sistemas de expresión basados en virus. En los casos en los que se use un adenovirus como vector de expresión, la secuencia codificante del anticuerpo de interés puede ligarse a un complejo de control de la transcripción/traducción del adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede ser insertado después en el genoma del adenovirus mediante una recombinación in vitro o in vivo. La inserción de una región no esencial del genoma vírico (por ejemplo, la región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de inmunoglobulina en los hospedadores infectados (véase, por ejemplo, Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 81: 355-359). También pueden requerirse unas señales de inicio específicas para una traducción eficiente de las secuencias codificantes del anticuerpo insertadas. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG y las secuencias adyacentes. Adicionalmente, el codón de inicio debe estar en fase con el marco lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción de la totalidad del inserto. Estas señales de control de la traducción exógenas y los codones de inicio pueden ser de una diversidad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión puede mejorarse mediante la inclusión de los apropiados elementos mejoradores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc. (véase, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 51-544).
Además, puede elegirse una cepa de célula hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto génico de la forma específica deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, una glicosilación) y el procesamiento (por ejemplo, la escisión) de los productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los polipéptidos que comprenden una molécula de diacuerpo de la invención pueden ser expresados en forma de un producto génico individual (por ejemplo, en forma de una cadena polipeptídica única, es decir, en forma de un precursor de poliproteína), lo que requiere una escisión proteolítica por parte de los mecanismos celulares nativos o recombinantes para formar los polipéptidos individuales de las moléculas de diacuerpos de la invención. También se describe la modificación de una secuencia de ácidos nucleicos para codificar una molécula precursora de poliproteína que comprende los polipéptidos del diacuerpo de la invención, que incluye unas secuencias codificantes capaces de dirigir la escisión post-traduccional de dicho precursor poliproteico. La escisión post-traduccional del precursor poliproteico da como resultado los polipéptidos del diacuerpo de la invención. La escisión post-traduccional de la molécula precursora que comprende los polipéptidos del diacuerpo de la invención puede producirse in vivo (es decir, en la célula hospedadora por parte de los sistemas/mecanismos celulares nativos o recombinantes, por ejemplo, una escisión de furina en un sitio apropiado) o puede producirse in vitro (por ejemplo, la incubación de dicha cadena polipeptídica en una composición que comprende proteasas o peptidasas con una actividad conocida y/o en una composición que comprende unas condiciones o unos reactivos conocidos por fomentar la acción proteolítica deseada). La purificación y la modificación de las proteínas recombinantes son bien conocidas en la materia, de forma que el diseño del precursor poliproteico podría incluir una diversidad de realizaciones fácilmente reconocidas por un trabajador experto. Puede usarse cualquier proteasa o peptidasa conocida en la materia para la modificación descrita de la molécula precursora, por ejemplo, la trombina (que reconoce la secuencia de aminoácidos LVPRAGS (la SEQ ID NO: 91)) o el factor Xa (que reconoce la secuencia de aminoácidos I(E/D)GRA (la SEQ ID NO: 92) (Nagani et al., 1985, pNAS EE.UU. 82: 7252-7255 y revisada en Jenny et al., 2003, Protein Expr. Purif. 31: 1-11)), la enterocinasa (que reconoce la secuencia de aminoácidos DDDDKA (la SEQ ID NO: 93) (Collins-Racie et al., 1995, Biotechno 1. 13: 982-987)), la furina (que reconoce la secuencia de aminoácidos RXXRA , con preferencia por la RX(K/R)RA (la SEQ ID NO: 94 y la SEQ ID NO: 95, respectivamente) (aparece una R adicional en la posición P6 para mejorar la escisión)) y la AcTEV (que reconoce la secuencia de aminoácidos ENLYFQAG (la s Eq ID NO: 96) (Parks et al., 1994, Anal. Biochem. 216: 413)) y la proteasa C3 del virus de la glosopeda. Véase, por ejemplo, la sección 6.4, supra.
Las diferentes células hospedadoras tienen unos mecanismos característicos y específicos para el procesamiento post-traduccional y la modificación de las proteínas y de los productos génicos. Pueden elegirse las apropiadas líneas celulares con sistemas hospedadores para asegurar la correcta modificación y procesado de la proteína foránea expresada. A este respecto, pueden usarse células hospedadoras eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario, la glicosilación y la fosforilación del producto génico. Dichas células hospedadoras de mamífero incluyen, pero no se limitan a, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, CRL7030 y Hs578Bst.
Para una producción a largo plazo de alto rendimiento de las proteínas recombinantes se prefiere una expresión estable. Por ejemplo, pueden modificarse líneas celulares que expresen de forma estable un anticuerpo en lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación víricos, las células hospedadoras pueden ser transformadas con un ADN controlado por los apropiados elementos de control de la expresión (por ejemplo, un promotor, un potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.,) y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN foráneo, las células modificadas pueden dejarse en crecimiento durante 1-2 días en un medio enriquecido y después se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable del plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que, a su vez, pueden ser clonados y expandidos en líneas celulares. Este método puede usarse ventajosamente para modificar líneas celulares que expresen los anticuerpos del presente documento. Dichas líneas celulares modificadas pueden ser particularmente útiles en el cribado y la evaluación de los compuestos que interactúan directa o indirectamente con las moléculas de la invención.
Pueden usarse diversos sistemas de selección que incluyen, pero no se limitan a, la cinasa de timidina del virus del herpes simple (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), la fosforribosiltransferasa de hipoxantina-guanina (Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 4 8 : 202) y la fosforribosiltransferasa de adenina (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) los genes pueden emplearse en células células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. También puede usarse una resistencia antimetabolito como la base de la selección de los siguientes genes: dhfir, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 77: 357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU. 78: 1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU. 78: 2072); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu y Wu, 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol Toxicol 32: 573-596; Mulligan, 1993, Science 260: 926-932; y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; mayo de 1993, TIB TECH 11 (5): 155-215). Los métodos conocidos habitualmente en la materia de la tecnología del a Dn recombinante que pueden usarse se describen en Ausubel et al (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression. A Laboratory Manual. Stockton Press, NY; y en los capítulos 12 y 13, Dracopoli et al (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics. John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol Biol 150: 1; e higro, que confiere resistencia a la higromycina (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147).
Los niveles de expresión de una molécula de la invención pueden aumentarse mediante una amplificación con un vector (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning. Vol. 3 (Academic Press, Nueva York, 1987). Cuando un marcador del sistema de vector que expresa un anticuerpo es amplificable, el aumento en el nivel del inhibidor presente en el cultivo de la célula hospedadora aumentará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada con la secuencia de nucleótidos de un polipéptido de la molécula de diacuerpo, también aumentará la producción del polipéptido (Crouse et al., 1983, Mol Cell Biol 3: 257).
La célula hospedadora puede ser cotransfectada con dos vectores de expresión de la invención, el primer vector que codifica el primer polipéptido de la molécula de diacuerpo y el segundo vector que codifica el segundo polipéptido de la molécula de diacuerpo. Los dos vectores pueden contener unos marcadores seleccionables idénticos que permiten una expresión igualitaria de ambos polipéptidos. Alternativamente, puede usarse un único vector que codifique ambos polipéptidos. Las secuencias codificantes de los polipéptidos de las moléculas de la invención pueden comprender ADNc o ADN genómico.
Una vez que se ha expresado recombinantemente una molécula de la invención (es decir, los diacuerpos), puede ser purificada mediante cualquier método conocido en la materia para la purificación de polipéptidos, de poliproteínas o de diacuerpos (por ejemplo, unos esquemas análogos a la purificación de anticuerpos basándose en la selectividad del antígeno), por ejemplo, mediante una cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, particularmente mediante la afinidad por el antígeno específico (opcionalmente después de una selección con Proteína A en la que la molécula de diacuerpo comprende un dominio Fc (o una porción del mismo)) y una cromatografía en columna por tamaños), una centrifugación, una solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de polipéptidos, de poliproteínas o de diacuerpos.
Métodos profilácticos y terapéuticos
Las moléculas de la invención son particularmente útiles para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad, de un trastorno o de una infección en los que se desea una función celular efectora (por ejemplo, la ADCC) mediada por el FcyR (por ejemplo, un cáncer, una enfermedad infecciosa). Como se ha analizado supra, los diacuerpos de la invención pueden mostrar una funcionalidad de tipo anticuerpo para desencadenar una función efectora aunque la molécula de diacuerpo no comprenda y dominio Fc. Al comprender al menos un dominio de unión al epítopo que reconoce inmunoespecíficamente un FcyR, la molécula de diacuerpo puede mostrar una unión al FcyR y una actividad análoga a las interacciones Fc-FcyR. Por ejemplo, las moléculas de la invención pueden unirse a un antígeno de la superficie celular y a un FcyR (por ejemplo, un FcyRIIIA) de una célula efectora inmunitaria (por ejemplo, un linfocito citolítico natural), estimulando una función efectora (por ejemplo, ADCC, CDC, fagocitosis, opsonización, etc.) contra dicha célula.
En otras realizaciones, la molécula de diacuerpo de la invención comprende un dominio Fc (o una porción del mismo). En dichas realizaciones, el dominio Fc puede comprender adicionalmente al menos una modificación de aminoácido con respecto a un dominio Fc natural (o una porción del mismo) y/o puede comprender los dominios de uno o más isotipos de la IgG (por ejemplo, de la IgG1, de la IgG2, de la IgG3 o de la IgG4). Las moléculas de la invención que comprenden dominios Fc variantes pueden mostrar unos fenotipos conferidos o alterados con respecto a las moléculas que comprenden el dominio Fc natural, tal como una actividad de función efectora alterada o conferida (por ejemplo, según se ensaya en un ensayo dependiente de NK o dependiente de macrófagos). En dichas realizaciones, las moléculas de la invención con una actividad de función efectora conferida o alterada son útiles para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad, de un trastorno o de una infección en los que se desea un aumento en la eficacia de la función efectora. En ciertas realizaciones, las moléculas de diacuerpos de la invención que comprenden un dominio Fc (o una porción del mismo) median en la cascada dependiente del complemento. Los dominios Fc variantes identificados por alterar función efectora se divulgan en la Solicitud Internacional WO04/063351, en las Solicitudes de Patente de Estados Unidos 2005/0037000 y 2005/0064514 y en las Solicitudes de Patente de Estados Unidos 11/271.140 (Publicación n°: US 2006-0134709 A1), presentada el 10 de noviembre de 2005, y 11/305.787 (Publicación n° US 2006-0177439 A1), presentada el 15 de diciembre de 2005, solicitudes concurrentes de los Inventores.
También se describen métodos y composiciones para el tratamiento, la prevención o la atención de un cáncer en un sujeto, que comprenden la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más moléculas que comprenden uno o más sitios de unión del epítopo y opcionalmente, un dominio Fc (o una porción del mismo) modificado según la descripción del presente documento, molécula que se une adicionalmente a un oncoantígeno. Las moléculas de la invención son particularmente útiles para la prevención, la inhibición, la reducción del crecimiento o la regresión de tumores primarios, de metástasis de células cancerosas y de enfermedades infecciosas. Aunque sin pretender estar ligados a ningún mecanismo de acción en particular, las moléculas de la invención median en la función efectora, lo que da como resultado la eliminación del tumor, la reducción del tumor o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones alternativas, los diacuerpos de la invención median en la actividad terapéutica mediante la reticulación de los antígenos y/o de los receptores de la superficie celular, y en una mejora de la apoptosis o una señalización reguladora del crecimiento negativo.
Aunque sin pretender estar ligados a ningún mecanismo de acción en particular, las moléculas de diacuerpos de la invención muestran una eficacia terapéutica mejorada con respecto a los anticuerpos terapéuticos conocidos en la materia, en parte, debido a la capacidad del diacuerpo para unirse inmunoespecíficamente a una célula objetivo que expresa un antígeno en particular (por ejemplo, el FcyR) a unos niveles reducidos, por ejemplo, en virtud de la capacidad del anticuerpo para permanecer sobre la célula objetivo más tiempo debido a una avidez mejorada de la interacción diacuerpo-epítopo.
Los diacuerpos de la invención con una afinidad y una avidez mejoradas por los antígenos (por ejemplo, los FcyR) son particularmente útiles para el tratamiento, la prevención o la atención de un cáncer, o de otra enfermedad o trastorno, en un sujeto, en el que los FcyR son expresados a bajos niveles en las poblaciones de células objetivo. Según se usa en el presente documento, la expresión del FcyR en las células se define en términos de la densidad de dichas moléculas por célula según se mide mediante el uso de los métodos habituales conocidos por los expertos en la materia. Las moléculas de la invención que comprenden múltiples sitios de unión del epítopo y, opcionalmente y FcyR (o una porción del mismo) preferentemente tienen también una avidez y una afinidad y/o una función efectora conferidas o aumentadas en las células que expresan un antígeno objetivo, por ejemplo, un oncoantígeno, a una densidad de entre 30.000 y 20.000 moléculas/célula, a una densidad de entre 20.000 y 10.000 moléculas/célula, a una densidad de 10.000 moléculas/célula o menos, a una densidad de 5000 moléculas/célula o menos, o a una densidad de 1.000 moléculas/célula o menos. Las moléculas de la invención tienen utilidad en particular en el tratamiento, la prevención o la atención de una enfermedad o de un trastorno, tal como un cáncer, en una subpoblación, en la que el antígeno objetivo es expresado a unos bajos niveles en la población de células objetivo.
Las moléculas de la invención también pueden utilizarse ventajosamente junto con otros agentes terapéuticos conocidos en la materia para el tratamiento o la prevención de enfermedades, tales como un cáncer, una enfermedad autoinmune, trastornos inflamatorios y enfermedades infecciosas. En una realización específica, las moléculas de la invención pueden usarse junto con anticuerpos monoclonales o quiméricos, linfocinas o factores de crecimiento hematopoyéticos (tales como, por ejemplo, la IL-2, la IL-3 y la IL-7), que sirven, por ejemplo, para incrementar el número o la actividad de las células efectoras que interactúan con las moléculas y para incrementar la respuesta inmunitaria. Las moléculas de la invención también pueden utilizarse ventajosamente junto con uno o más fármacos usados para el tratamiento de una enfermedad, de un trastorno o de una infección, tales como, por ejemplo, agentes antineoplásicos, agentes antiinflamatorios o agentes antivíricos, por ejemplo, según se detalla en la Sección 5.7.
Cánceres
También se describen métodos y composiciones para el tratamiento o la prevención del cáncer en un sujeto, que comprenden la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más moléculas que comprenden múltiples dominios de unión al epítopo. También se describen métodos y composiciones para el tratamiento o la prevención del cáncer en un sujeto con polimorfismos FcyR, tales como aquellos homocigóticos para los alelos FyRIIIA-158V o FcyRIIIA-158F. También se describe la modificación de al menos un dominio de unión al epítopo de la molécula de diacuerpo para que se una inmunoespecíficamente al FcyRIIIA (158F). También se describe la modificación de al menos un dominio de unión al epítopo de la molécula de diacuerpo para que se una inmunoespecíficamente al FcyRIIIA (158V).
La eficacia de la terapia con un anticuerpo monoclonal convencional depende del polimorfismo FcyR del sujeto (Cartón et al., 2002 Blood, 99: 754-8; Weng et al., 2003 J Clin Oncol .21 (21): 3940-7). Estos receptores son expresados en la superficie de las células efectoras y median en la ADCC. Los alelos de alta afinidad, de los receptores de activación de baja afinidad, mejoran la capacidad de las células efectoras para mediar en la ADCC. Al contrario que los que se basan en las interacciones Fc-FcyR para efectuar la función efectora, los métodos del presente documento engloban la modificación de moléculas para que reconozcan inmunoespecíficamente los receptores de activación de baja actividad, permitiendo que las moléculas estén diseñadas para un polimorfismo específico. Alternativa o adicionalmente, la molécula de la invención puede ser modificada para que comprenda un dominio Fc variante que muestren un aumento en la afinidad por el FcyR (con respecto a un dominio Fc natural) en las células efectoras. Las moléculas de la invención modificadas proporcionan mejores reactivos de inmunoterapia para pacientes independientemente de su polimorfismo FcyR.
Las moléculas de diacuerpos modificadas según la descripción del presente documento se prueban mediante una ADCC usando bien una línea celular cultivada o bien células PMBC derivadas de un paciente, para determinar la capacidad de las mutaciones del Fc para mejorar la ADCC. La ADCC convencional se lleva a cabo usando los métodos divulgados en el presente documento. Se recogen linfocitos de sangre periférica usando un gradiente de Ficoll-Paque (Pharmacia). Las células objetivo, es decir, las líneas celulares cultivadas por las células derivadas de un paciente, se cargan con europio (PerkinElmer) y se incuban con los efectores durante 4 h a 37 °C. El europio liberado se detecta usando un lector de placas fluorescentes (Wallac). Los datos resultantes de la ADCC indican la eficacia de las moléculas de la invención para desencadenar una citotoxicidad celular mediada por los linfocitos citolíticos naturales y establecer qué moléculas pueden ser probadas con ambas muestras de pacientes y de monocitos elutriados. Las moléculas de diacuerpos que muestran el mayor potencial para desencadenar una actividad de ADCC se prueban después en un ensayo de ADCC usando las PBMC de pacientes. Se usan PBMC de donantes sanos como las células efectoras.
También se describen métodos para la prevención o el tratamiento de un cáncer caracterizado por un oncoantígeno mediante la modificación de la molécula de diacuerpo para que reconozca inmunoespecíficamente dicho oncoantígeno, de forma que la propia molécula de diacuerpo sea citotóxica (por ejemplo, a través de la reticulación de los receptores de la superficie que da lugar a un aumento en la apoptosis, o a una regulación por disminución de las señales proliferativas) y/o que comprenda un dominio Fc, y/o que medie en una o más funciones efectoras (por ejemplo, la ADCC, la fagocitosis). Los diacuerpos que han sido modificados según la descripción del presente documento son útiles para la prevención o el tratamiento del cáncer, dado que tienen una actividad citotóxica (por ejemplo, un aumento en la destrucción de las células tumorales y/o un aumento, por ejemplo, en la actividad de ADCC o en la actividad de CDC).
Los cánceres asociados con un oncoantígeno pueden tratarse o prevenirse mediante la administración de un diacuerpo que se une al oncoantígeno y que es citotóxico, y/o que ha sido modificado según los métodos del presente documento para que muestre una función efectora. Por ejemplo, pero en modo alguno como limitación, los cánceres asociados con los siguientes oncoantígenos pueden ser tratados o prevenidos mediante los métodos y las composiciones del presente documento: el antígeno KS del pan-carcinoma 1/4 (Perez y Walker, 1990, J. Immunol.
142: 32-37; Bumal, 1988, Hybridoma 7 (4): 407-415), el antígeno del carcinoma ovárico (CA125) (Yu et al., 1991, Cáncer Res. 51 (2): 48-475), el fosfato ácido prostático (Tailor et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18 (1): 4928), el antígeno específico prostático (Henttu y Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 10 (2): 903-910; Israeli et al., 1993, Cancer Res. 53: 227-230), el antígeno asociado al melanoma p97 (Estin et al., 1989, J. Natl. Cancer Instit. 81 (6 ): 445-44), el antígeno del melanoma gp75 (Vijayasardahl et al., 1990, J. Exp. Med. 171 (4): 1375-1380), el antígeno del melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA) (Natali et al., 1987, Cancer 59: 55-3; Mittelman et al., 1990, J. Clin. Invest. 8 6 : 2136-2144)), el antígeno de membrana específico prostático, el antígeno carcinoembrionario (CEA) (Foon et al., 1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13: 294), el antígeno mucínico epitelial polimorfo, el antígeno del glóbulo de grasa láctea humana, los antígenos asociados a tunores colorrectales tales como: CEA, TAG-72 (Yokata et al., 1992, Cancer Res. 52: 3402-3408), el C017-1A (Ragnhammar et al., 1993, Int. J. Cancer 53: 751-758); el GICA 19-9 (Herlyn et al., 1982, J. Clin. Immunol. 2: 135), el CTA-1 y el LEA, el antígeno del linfoma de Burkitt 38.13, el CD19 (Ghetie et al., 1994, Blood 83: 1329-1336), el antígeno del linfoma B humano CD20 (Reff et al., 1994, Blood 83: 435-445), el CD33 (Sgouros et al., 1993, J. Nucl. Med. 34: 422-430), los antígenos específicos de melanoma tales como el gangliósido GD2 (Saleh et al., 1993, J. Immunol, 151, 3390-3398), el gangliósido GD3 (Shitara et al., 1993, Cancer Immunol. Immunother. 36: 373-380), el gangliósido GM2 (Livingston et al., 1994, J. Clin. Oncol. 12: 1036-1044), el gangliósido GM3 (Hoon et al., 1993, Cancer Res. 53: 5244-5250), el antígeno de la superficie celular tumoral específico del tipo de trasplante (TSTA) tales como los antígenos tumorales inducidos por virus, incluyendo antígenos T de virus tumorales de ADN y antígenos de la cubierta de virus tumorales de ARN, el antígeno de la alfa-fetoproteína oncofetal tal como el c Ea de colon, el antígeno tumoral de vejiga oncofetal (Hellstrom et al., 1985, Cancer. Res. 45: 2210-2188), los antígenos de diferenciación tales como el antígeno del carcinoma de pulmón humano L6 , L20 (Hellstrom et al., 1986, Cancer Res. 46: 3917-3923), los antígenos de fibrosarcoma, el antígeno de la leucemia de linfocitos T humana Gp37 (Bhattacharya-Chatterjee et al., 1988, J. of Immun. 141: 1398-1403), la neoglicoproteína, los esfingolípidos, el antígeno del cáncer de mama tal como el EGFR (el receptor del factor de crecimiento epidérmico), el antígeno HER2 (p185HER2), la mucina epitelial polimorfa (PEM) (Hilkens et al., 1992, Trends en Bio. Chem. Sci. 17: 359), el antígeno de linfocitos humano maligno APO-1 (Bernhard et al., 1989, Science 245: 301-304), el antígeno de diferenciación (Feizi, 1985, Nature 314: 53-57) tal como el antígeno I que se encuentra en los eritrocitos fetales y el endodermo primario, el I (Ma) que se encuentra en adenocarcinomas gástricos, el M18 y el M39 que se encuentran en el epitelio mamario, el SSEA-1 que se encuentra en las células mieloides, el VEP8, el VEP9, el Milo, el VIM-D5 y el Di56-22 que se encuentran en el cáncer colorrectal, el TRA-1-85 (grupo sanguíneo H), el C14 que se encuentra en el adenocarcinoma de colon, el F3 que se encuentra en el adenocarcinoma de pulmón, el AH6 que se encuentra en el cáncer gástrico, el hapteno Y, el Ley que se encuentran en las células de carcinoma embrionarias, el TL5 (grupo sanguíneo A), el receptor EGF que se encuentra en las células A431, la serie E1 (grupo sanguíneo B) que se encuentra en el cáncer de páncreas, el FC10.2 que se encuentra en las células de carcinoma embrionarias, de adenocarcinoma gástrico, el CO-514 (grupo sanguíneo Lea) que se encuentra en el adenocarcinoma, el NS-10 que se encuentra en adenocarcinomas, el CO-43 (grupo sanguíneo Leb), el G49, el receptor EGF, (grupo sanguíneo ALeb/Ley) que se encuentra en el adenocarcinoma de colon, el 19.9 que se encuentra en el cáncer de colon, las mucinas del cáncer gástrico, el T5A7 que se encuentra en las células mieloides, el R24 que se encuentra en melanoma, el 4.2, el Gd3 , el D1.1, el OFA-1, el Gm2, el OFA-2, el Gd2, el M1:22:25:8 que se encuentran en las células de carcinoma embrionarias, y el SSEA-3, el SSEA-4 que se encuentra en embriones en la fase de 4-8 células. En otra realización, el antígeno es un péptido derivado del receptor de los linfocitos T de un linfoma cutáneo de linfocitos T (véase, Edelson, 1998, The Cáncer Journal 4: 62).
Algunos cánceres y trastornos relacionados que pueden ser tratados o prevenidos mediante los métodos y las composiciones del presente documento incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: leucemias que incluyen, pero no se limitan a, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemias mielocíticas agudas tales como mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, leucemias eritroleucémicas y síndrome mielodisplásico, leucemias crónicas tales como, pero no se limitan a, leucemia mielocítica (granulocítica) crónica, leucemia linfocítica crónica, tricoleucemia; policitemia vera; linfomas tales como, pero no se limitan a, enfermedad de Hodgkin, enfermedad no Hodgkin; mielomas múltiples tales como, pero no se limitan a, mieloma múltiple quiescente, mieloma no secretor, mieloma osteoesclerótico, leucemia plasmocítica, plasmocitoma solitario y plasmocitoma extramedular; macroglobulinemia de Waldenstrom; gammopatía monoclonal de significación indeterminada; gammopatía monoclonal benigna; enfermedad de la cadena pesada; sarcomas del tejido óseo y conectivo tales como, pero no se limitan a, sarcoma óseo, osteosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, tumor maligno de células gigantes, fibrosarcoma óseo, cordoma, sarcoma periosteal, sarcomas de tejidos blandos, angiosarcoma (hemangiosarcoma), fibrosarcoma, sarcoma de Kaposi, leiomiosarcoma, liposarcoma, linfangiosarcoma, neurilemoma, rabdomiosarcoma, sarcoma sinovial; tumores cerebrales que incluyen, pero no se limitan a, glioma, astrocitoma, glioma del tronco encefálico, ependimoma, oligodendroglioma, tumor no glial, neurinoma acústico, craneofaringioma, meduloblastoma, meningioma, pineocitoma, pineoblastoma, linfoma cerebral primario; cáncer de mama que incluye, pero no se limita a, adenocarcinoma, carcinoma lobular (microcítico), carcinoma intraductal, cáncer de mama medular, cáncer de mama mucinoso, cáncer de mama tubular, cáncer de mama papilar, enfermedad de Pages y cáncer de mama inflamatorio; cáncer adrenal, que incluye, pero no se limita a, feocromocitoma y carcinoma adrenocortical; cáncer de tiroides tal como, pero no se limita a, cáncer de tiroides papilar o folicular, cáncer de tiroides medular y cáncer de tiroides anaplásico; cáncer de páncreas, que incluye, pero no se limita a, insulinoma, gastrinoma, glucagonoma, vipoma, tumor secretor de somatostatina y tumor carcinoide o de las células de los islotes; cánceres de la pituitaria que incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Cushing, tumor secretor de prolactina, acromegalia y diabetes insípida; cánceres oculares que incluyen, pero no se limitan a, melanoma ocular tal como melanoma de iris, melanoma de la coroides y melanoma del cuerpo ciliar y retinoblastoma; cánceres de vagina que incluyen, pero no se limitan a, carcinoma epidermoide, adenocarcinoma y melanoma; cáncer de vulva que incluye, pero no se limita a, carcinoma epidermoide, melanoma, adenocarcinoma, carcinoma de células basales, sarcoma y enfermedad de Paget; cánceres cervicales que incluyen, pero no se limitan a, carcinoma epidermoide y adenocarcinoma; cánceres de útero que incluyen, pero no se limitan a, carcinoma endometrial y sarcoma de útero; cánceres de ovario que incluyen, pero no se limitan a, carcinoma epitelial de ovario, tumor intermedio, tumor de las células germinales y tumor estromal; cánceres de esófago que incluyen, pero no se limitan a, cáncer epidermoide, adenocarcinoma, carcinoma quístico adenoide, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma adenoepidermoide, sarcoma, melanoma, plasmocitoma, carcinoma verrucoso y carcinoma indiferenciado (microcítico); cánceres de estómago que incluyen, pero no se limitan a, adenocarcinoma, neoplásico (polipoide), ulcerativo, de diseminación superficial, de diseminación difusa, linfoma maligno, liposarcoma, fibrosarcoma y carcinosarcoma; cánceres de colon; cánceres rectales; cánceres de hígado que incluyen, pero no se limitan a, carcinoma hepatocelular y hepatoblastoma, cánceres de la vesícula biliar que incluyen, pero no se limitan a, adenocarcinoma; colangiocarcinomas que incluyen, pero no se limitan a, papilar, nodular y difuso; cánceres de pulmón que incluyen, pero no se limitan a, cáncer de pulmón no microcítico, carcinoma epidermoide (carcinoma epidermoide), adenocarcinoma, carcinoma de células grandes y cáncer de pulmón microcítico; cánceres testiculares que incluyen, pero no se limitan a, tumor germinal, seminoma, anaplásico, clásico (típico), espermatocítico, no seminoma, carcinoma embrionario, carcinoma teratoma, coriocarcinoma (tumor del saco vitelino), cánceres de próstata que incluyen, pero no se limitan a, adenocarcinoma, leiomiosarcoma y rabdomiosarcoma; cánceres de pene; cánceres orales que incluyen, pero no se limitan a, carcinoma epidermoide; cánceres basales; cánceres de las glándulas salivares que incluyen, pero no se limitan a, adenocarcinoma, carcinoma mucoepidermoide y carcinoma adenoquístico; cánceres de faringe que incluyen, pero no se limitan a, cáncer epidermoide y verrucoso; cánceres de piel que incluyen, pero no se limitan a, carcinoma de células basales, carcinoma epidermoide y melanoma, melanoma de diseminación superficial, melanoma nodular, melanoma lentigo maligno, melanoma lentiginoso acral; cánceres de riñón que incluyen, pero no se limitan a, cáncer de células renales, adenocarcinoma, hipernefroma, fibrosarcoma, cáncer de células transicionales (de la pelvis renal y/o del utérer); tumor de Wilms; cánceres de vejiga que incluyen, pero no se limitan a, carcinoma de células transitionales, cáncer epidermoide, adenocarcinoma, carcinosarcoma. Además, algunos cánceres incluyen mixosarcoma, sarcoma osteogénico, endoteliosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, mesotelioma, sinovioma, hemangioblastoma, carcinoma epitelial, cistadenocarcinoma, carcinoma broncogénico, carcinoma de las glándulas sudoríparas, carcinoma de las glándulas sebáceas, carcinoma papilar y adenocarcinomas papilares (para una revisión de dichos trastornos, véase Fishman et al., 1985, Medicine, 2a Ed., J. B. Lippincott Co., Philadelphia, y Murphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cáncer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books EE.UU., Inc., Estados Unidos América).
Consecuentemente, los métodos y las composiciones del presente documento también son útiles en el tratamiento o la prevención de una diversidad de cánceres o de otras enfermedades proliferativas anormales que incluyen, (pero no se limitan a) las siguientes: carcinoma, que incluyen, de vejiga, de mama, de colon, de riñón, de hígado, de pulmón, de ovario, de páncreas, de estómago, de próstata, de cuello de útero, de tiroides y de piel; que incluyen, carcinoma epidermoide; tumores hematopoyéticos de la estirpe linfoide que incluyen leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, linfoma de Burketts; tumores hematopoyéticos de la estirpe mieloide que incluyen leucemias mielógenas agudas y crónicas, y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimatoso que incluyen fibrosarcoma y rabdomioscarcoma; otros tumores, que incluyen, melanoma, seminoma, tetratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico que incluyen astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimatoso que incluyen fibrosarcoma, rabdomioscarama y osteosarcoma; y otros tumores, que incluyen, melanoma, xenoderma pegmentosum, queratoactantoma, seminoma, cáncer folicular de tiroides y teratocarcinoma. También se contempla que los cánceres causados por aberraciones en la apoptosis puedan ser tratados también mediante los métodos y las composiciones del presente documento. Dichos cánceres pueden incluir, pero no se limitan a, linfomas foliculares, carcinomas con mutaciones en el p53, tumores de mama hormonodependientes, lesiones precancerosas de próstata y de ovario tales como poliposis adenomatosa familiar y síndromes mielodisplásicos. En algunas realizaciones específicas, los cambios malignos o disproliferativos (tales como las metaplasias y las displasias) o los trastornos hiperproliferativos se tratan o se previenen mediante los métodos y las composiciones del presente documento en el ovario, la vejiga, la mama, el colon, el pulmón, la piel, el páncreas o el útero. En otras realizaciones específicas se trata o se previene el sarcoma, el melanoma o la leucemia mediante los métodos y las composiciones del presente documento.
En una realización específica, una molécula de la invención (por ejemplo, un diacuerpo que comprende múltiples dominios de unión al epítopo y, opcionalmente y dominio Fc (o una porción del mismo)) inhibe o reduce el crecimiento de las células cancerosas en al menos el 99 %, al menos el 95 %, al menos el 90 %, al menos el 85 %, al menos el 80 %, al menos el 75 %, al menos el 70 %, al menos el 60 %, al menos el 50 %, al menos el 45 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 35 %, al menos el 30 %, al menos el 25 %, al menos el 20 % o al menos 10 % con respecto al crecimiento de las células cancerosas en ausencia de dicha molécula de la invención. En una realización específica, una molécula de la invención (por ejemplo, un diacuerpo que comprende múltiples dominios de unión al epítopo y, opcionalmente y dominio Fc (o una porción del mismo)) destruye las células o inhibe o reduce el crecimiento de las células cancerosas al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 100 % mejor que la molécula parental.
Enfermedad autoinmune y enfermedades inflamatorias
En algunas realizaciones, las moléculas de la invención comprenden un dominio de unión al epítopo específico para el FcyRIIB y o/ un dominio Fc variante (o una porción del mismo), modificado según los métodos del presente documento, dominio Fc que muestra una mayor afinidad por el FcyRIIB y una afinidad disminuida por el FcyRIIIA y/o por el FcyRIIA con respecto a un dominio Fc natural. Las moléculas de la invención con dichas características de unión son útiles en la regulación de la respuesta inmunitaria, por ejemplo, en la inhibición de la respuesta inmunitaria en relación con enfermedades autoinmunes o con enfermedades inflamatorias. Aunque sin pretender estar ligados a ningún mecanismo de acción, las moléculas de la invención con una afinidad por el FcyRIIB y/o que comprenden un dominio Fc con una afinidad aumentada por el FcyRIIB y una afinidad disminuida por el FcyRIIIA y/o FcyRIIA pueden dar lugar a una amortiguación en la respuesta de activación del FcyR y a una inhibición en la sensibilidad celular, y por lo tanto, tienen eficacia terapéutica para el tratamiento y/o la prevención de un trastorno autoinmune.
También se describen métodos para la prevención, el tratamiento o la atención de uno o más síntomas asociados con un trastorno inflamatorio en un sujeto que comprenden adicionalmente la administración a dicho sujeto de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes antiinflamatorios. También se describen métodos para la prevención, el tratamiento o la atención de uno o más síntomas asociados con una enfermedad autoinmune que comprenden adicionalmente la administración a dicho sujeto de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes inmunomoduladores. La Sección 5.7 proporciona algunos ejemplos no limitantes de agentes antiinflamatorios y de agentes inmunomoduladores.
Algunos ejemplos de trastornos autoinmunes que pueden ser tratados mediante la administración de las moléculas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido, enfermedad autoinmune de Addison, enfermedades autoinmunes de la glándula adrenal, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, ooforitis y orquitis autoinmune, trombocitopenia autoinmune, enfermedad de Behcet, penfigoide vesicular, cardiomiopatía, dermatitis herpetiforme, síndrome de disfunción inmunitaria por fatiga crónica (CFIDS), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de CREST, enfermedad de la aglutinina fría, enfermedad de Crohn, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, de Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopenia idiopática (ITP), neuropatía por IgA, artritis juvenil, liquen plano, lupus eritematoso, enfermedad de Méniére, enfermedad mixta del tejido conectivo, esclerosis múltiple, diabetes sacarina de tipo 1 o inmunitaria, miastenia gravis, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policrondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriática, fenómeno de Raynauld, síndrome de Reiter, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, síndrome de la persona rígida, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso, arteritis de takayasu, arteristis temporal / arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis tales como dermatitis, vasculitis herpetiforme, vitíligo y granulomatosis de Wegener. Algunos ejemplos de trastornos inflamatorios incluyen, pero no se limitan a, asma, encefilitis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), trastornos alérgicos, choque séptico, fibrosis pulmonar, espondiloartropatía no diferenciada, artropatía no diferenciada, artritis, osteolisis inflamatoria e inflamación crónica resultante de infecciones crónicas víricas o bacterianas. Según se describe en el presente documento en la Sección 2.2.2, algunos trastornos autoinmunes están asociados con una afección inflamatoria. Por lo tanto, hay un solapamiento entre lo que se considera un trastorno autoinmune y un trastorno inflamatorio. Por lo tanto, algunos trastornos autoinmunes también pueden ser caracterizados como trastornos inflamatorios. Algunos ejemplos de trastornos inflamatorios que pueden prevenirse, tratarse o atenderse según los métodos del presente documento incluyen, pero no se limitan a, asma, encefilitis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), trastornos alérgicos, choque séptico, fibrosis pulmonar, espondiloartropatía no diferenciada, artropatía no diferenciada, artritis, osteolisis inflamatoria e inflamación crónica resultante de infecciones crónicas víricas o bacterianas.
Las moléculas de la invención que comprenden al menos un dominio de unión al epítopo específico para el FcyRIIB y/o un dominio Fc variante con una afinidad aumentada por el FcyRIIB y una afinidad disminuida por el FcyRIIIA también pueden usarse para reducir la inflamación experimentada por animales, particularmente mamíferos, con trastornos inflamatorios. En una realización específica, una molécula de la invención reduce la inflamación en un animal en al menos un 99 %, en al menos un 95 %, en al menos un 90 %, en al menos un 85 %, en al menos un 80 %, en al menos un 75 %, en al menos un 70 %, en al menos un 60 %, en al menos un 50 %, en al menos un 45 %, en al menos un 40 %, en al menos un 45 %, en al menos un 35 %, en al menos un 30 %, en al menos un 25 %, en al menos un 20 % o en al menos un 10 % con respecto a la inflamación en un animal al que no se le ha administrado dicha molécula.
Las moléculas de la invención que comprenden al menos un dominio de unión al epítopo específico para el FcyRIIB y/o un dominio Fc variante con una afinidad aumentada por el FcyRIIB y una afinidad disminuida por el FcyRIIIA también pueden usarse para prevenir el rechazo de trasplantes.
Enfermedad infecciosa
También se describen métodos para el tratamiento o la prevención de una enfermedad infecciosa en un sujeto que comprenden la administración de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una o más moléculas de la invención que comprenden al menos un dominio de unión al epítopo específico para un agente infeccioso asociado con dicha enfermedad infecciosa. En ciertas realizaciones, las moléculas de la invención son tóxicas para el agente infeccioso, aumentan la respuesta inmunitaria contra dicho agente o aumentan la función efectora contra dicho agente, con respecto a la respuesta inmunitaria en ausencia de dicha molécula. Algunas enfermedades infecciosas que pueden tratarse o preventirse con las moléculas de la invención están causadas por agentes infecciosos que incluyen, pero no se limitan a, virus, bacterias, hongos, protozoos y virus.
Algunas enfermedades víricas que pueden tratarse o prevenirse usando las moléculas de la invención junto con los métodos del presente documento incluyen, pero no se limitan a, las causadas por la hepatitis de tipo A, la hepatitis de tipo B, la hepatitis de tipo C, la gripe, la varicela, adenovirus, el herpes simple de tipo I (HSV-I), el herpes simple de tipo II (HSV-II), la peste bovina, rinovirus, ecovirus, rotavirus, el virus respiratorio sincitial, el virus del papiloma, papova virus, citomegalovirus, equinovirus, arbovirus, huntavirus, virus coxsackie, el virus de las paperas, el virus del sarampión, el virus de la rubéola, polio virus, viruela, el virus de Epstein Barr, el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo I (VIH-I), el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo II (VIH-II) y agentes de enfermedades víricas tales como meningitis vírica, encefalitis, dengue o viruela.
Algunas enfermedades bacterianas que pueden tratarse o prevenirse usando las moléculas de la invención junto con los métodos del presente documento, que están causadas por bacterias bacteria incluyen, pero no se limitan a, micobacterias rickettsia, micoplasma, neiseria, S. pneumonía, Borrelia burgdorferi (enfermedad de Lyme), Bacillus antracis (carbunco), tétanos, estreptococos, estafilococos, micobacteria, tétanos, pertissus, cólera, peste, difteria, clamidia, S. aureus y legionela.
Algunas enfermedades protozoarias que pueden tratarse o prevenirse usando las moléculas de la invención junto con los métodos del presente documento, que están causadas por protozoos incluyen, pero no se limitan a, leishmania, coccidios, tripanosoma o malaria.
Algunas enfermedades parásitas que pueden tratarse o prevenirse usando las moléculas de la invención junto con los métodos del presente documento, que están causadas por parásitos incluyen, pero no se limitan a, clamidia y rickettsia.
Según un aspecto de la invención, las moléculas de la invención que comprenden al menos un dominio de unión al epítopo específico para un agente infeccioso muestran una función efectora de anticuerpo hacia dicho agente, por ejemplo, una proteína patógena. Algunos ejemplos de agentes infecciosos incluyen, pero no se limitan a, bacterias (por ejemplo, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecials, Candida albicans, Proteus vulgaris, Staphylococcus viridans y Pseudomonas aeruginosa), un patógeno (por ejemplo, papovavirus linfotrópico B (LPV); Bordatella pertussis; el virus de la enfermedad de Borna (BDV); coronavirus bovino; el virus de la coriomeningitis; el virus del Dengue; un virus, E. coli; Ébola; Ecovirus 1; Ecovirus-11 (EV); endotoxina (LPS); bacterias entéricas; el virus huérfano entérico; enterovirus; el virus de la leucemia felina; el virus de la glosopeda; el virus de la leucemia del mono Gibbon (GALV); bacterias gramnegativas; Heliobacter pylori; el virus de la hepatitis B (HBV); el virus del herpes simple; el VIH-1; citomegalovirus humanos; coronovirus humanos; gripe A, B & C; Legionella; Leishmania mexicana; Listeria monocytogenes; el virus del sarampión; meningococos; morbillivirus; el virus de la hepatitis de ratón; el virus de la leucemia murina; el virus del herpes gamma murino; retrovirus murinos; el virus de la hepatitis de ratón coronavirus murino; Mycobacterium avium-M; Neisseria gonorrhoeae; el virus de la enfermedad de Newcastle; el Parvovirus B19; Plasmodium falciparum; el virus de la varicela; Pseudomonas; Rotavirus; Samonella typhiurium; Shigella; estreptococos; el virus linfotrópico de los linfocitos T 1; el virus de la variolovacuna).
Desintoxicación
También se describen métodos de desintoxicación en un sujeto expuesto a una toxina (por ejemplo, una molécula dmg tóxica) que comprenden la administración de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una o más moléculas de la invención que comprenden al menos un dominio de unión al epítopo específico para la molécula de dmg tóxica. En ciertas realizaciones, la unión de una molécula de la invención a la toxina reduce o elimina el efecto fisiológico adverso de dicha toxina. En otras realizaciones más, la unión de un diacuerpo de la invención a la toxina incrementa o aumenta la eliminación, la degradación o la neutralización de la toxina con respecto a la eliminación, la degradación o la neutralización en ausencia de dicho diacuerpo. La inmunotoxicoterapia según los métodos del presente documento puede usarse para el tratamiento de sobredosis o de exposición a fármacos que incluyen, pero no se limitan a, digixina, PCP, cocaína, colchicina y antidepresivos tricíclicos.
Terapia de combinación
También se describe la administración de las moléculas de la invención junto con otras terapias conocidas por los expertos en la materia para el tratamiento o la prevención del cáncer, de una enfermedad autoinmune, de una enfermedad infecciosa o de una intoxicación, incluyendo, pero no se limitan a, las actuales quimioterapias convencionales o experimentales, terapias hormonales, terapias biológicas, inmunoterapias, radioterapias o cirugía. En algunas realizaciones, las moléculas de la invención pueden ser administradas junto con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes, anticuerpos terapéuticos u otros agentes conocidos por los expertos en la materia para el tratamiento y/o la prevención del cáncer, de una enfermedad autoinmune, de una enfermedad infecciosa o de una intoxicación.
En ciertas realizaciones, se administra una o más moléculas de la invención a un mamífero, preferentemente a un ser humano, simultáneamente con uno o más de otros agentes terapéuticos útiles para el tratamiento de cáncer. El término “simultáneamente” no está limitado a la administración de agentes profilácticos o terapéuticos exactamente al mismo tiempo, sino que más bien significa que una molécula de la invención y el otro agente son administrados a un mamífero en una secuencia y en un intervalo de tiempo tal que la molécula de la invención puede actuar junto con el otro agente para proporcionar un aumento en el beneficio con respecto a si fueran administrados de otro modo. Por ejemplo, cada agente profiláctico o terapéutico (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal o terapia biológica) puede ser administrado al mismo tiempo o secuencialmente en cualquier orden en puntos temporales diferentes; sin embargo, si se administran al mismo tiempo, deberían ser administrados lo suficientemente cerca en el tiempo como para proporcionar el efecto terapéutico o profiláctico o deseado. Cada agente terapéutico puede ser administrado por separado, en cualquier forma apropiada y mediante cualquier vía adecuada. En varias realizaciones, los agentes profilácticos o terapéuticos se administran con menos de 1 hora de diferencia, con aproximadamente 1 hora de diferencia, con entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 2 horas de diferencia, con entre aproximadamente 2 horas y aproximadamente 3 horas de diferencia, con entre aproximadamente 3 horas y aproximadamente 4 horas de diferencia, con entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 5 horas de diferencia, con entre aproximadamente 5 horas y aproximadamente 6 horas de diferencia, con entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 7 horas de diferencia, con entre aproximadamente 7 horas y aproximadamente 8 horas de diferencia, con entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 9 horas de diferencia, con entre aproximadamente 9 horas y aproximadamente 10 horas de diferencia, con entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 11 horas de diferencia, con entre aproximadamente 11 horas y aproximadamente 12 horas de diferencia, con no más de 24 horas de diferencia o con no más de 48 horas de diferencia. En las realizaciones preferidas, dos o más componentes son administrados en la misma visita del paciente.
En otras realizaciones, los agentes profilácticos o terapéuticos son administrados con entre aproximadamente 2 y 4 días de diferencia, con entre aproximadamente 4 y 6 días de diferencia, con aproximadamente 1 semana de diferencia, con entre aproximadamente 1 y 2 semanas de diferencia, o con más de 2 semanas de diferencia. En las realizaciones preferidas, los agentes profilácticos o terapéuticos son administrados en un marco temporal en el que ambos agentes todavía son activos. El experto en la materia será capaz de determinar dicho marco temporal mediante la determinación de la semivida de los agentes administrados.
En ciertas realizaciones, los agentes profilácticos o terapéuticos de la invención son administrados cíclicamente a un sujeto. La terapia cíclica implica la administración de un primer agente durante un periodo de tiempo, seguido de la administración de un segundo agente y/o de un tercer agente durante un periodo de tiempo, y la repetición de esta administración secuencial. La terapia cíclica puede reducir al desarrollo de resistencia a una más de las terapias, evitar o reducir los efectos secundarios de una de las terapias y/o mejorar la eficacia del tratamiento.
En ciertas realizaciones, los agentes profilácticos o terapéuticos son administrados en un ciclo de menos de aproximadamente 3 semanas, aproximadamente una vez cada dos semanas, aproximadamente una vez cada 10 días o aproximadamente una vez cada semana. Un ciclo puede comprender la administración de un agente terapéutico o profiláctico mediante una infusión durante aproximadamente 90 minutos cada ciclo, aproximadamente 1 hora cada ciclo, aproximadamente 45 minutos cada ciclo. Cada ciclo puede comprender al menos 1 semana de reposo, al menos 2 semanas de reposo, al menos 3 semanas de reposo. El número de ciclos administrados es de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 12 ciclos, más normalmente de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10 ciclos, y más normalmente de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8 ciclos.
En otras realizaciones más, los agentes terapéuticos y profilácticos de la invención son administrados con unos regímenes de dosificación regulares, bien mediante una infusión continua o bien mediante una administración frecuente sin periodos de reposo prolongados. Dicha administración regular puede implicar la dosificación a unos intervalos constantes sin periodos de reposo. Normalmente, los agentes terapéuticos, en particular los agentes citotóxicos, se usan a las dosis más bajas. Dichos regímenes de dosificación engloban la administración crónica diaria de unas dosis relativamente bajas durante unos periodos prolongados de tiempo. En las realizaciones preferidas, el uso de unas dosis bajas puede minimizar los efectos tóxicos secundarios y eliminar los periodos de reposo. En ciertas realizaciones, los agentes terapéuticos y profilácticos son administrados mediante una infusión crónica a baja dosis o continua que varía entre aproximadamente 24 horas y aproximadamente 2 días, y aproximadamente 1 semana, y aproximadamente 2 semanas, y entre aproximadamente 3 semanas y aproximadamente 1 mes y aproximadamente 2 meses, y aproximadamente 3 meses, y aproximadamente 4 meses, y aproximadamente 5 meses, y aproximadamente 6 meses. La cronología de dichos regímenes de dosificación puede ser optimizada por el oncólogo.
En otras realizaciones, los cursos de los tratamientos son administrados simultáneamente a un mamífero, es decir, se administran dosis individuales de los productos terapéuticos por separado todavía en un intervalo de tiempo tal que las moléculas de la invención pueden trabajar junto con el (los) otro(s) agente(s). Por ejemplo, un componente puede ser administrado una vez por semana junto con los otros componentes, que pueden ser administrados una vez cada dos semanas o una vez cada tres semanas. En otras palabras, los regímenes de dosificación de los productos terapéuticos se llevan a cabo simultáneamente incluso si los productos terapéuticos no son administrados simultáneamente o en la misma visita del paciente.
Cuando se usan junto con otros agentes terapéuticos y/o profilácticos, las moléculas de la invención y el agente profiláctico y/o terapéutico pueden actuar aditivamente, o más preferentemente, sinérgicamente. En una realización, una molécula de la invención es administrada simultáneamente con uno o más agentes terapéuticos en la misma composición terapéutica. En otra realización, una molécula de la invención es administrada simultáneamente con uno o más de otros agentes terapéuticos en composiciones farmacéuticas por separado. Todavía en otra realización, una molécula de la invención es administrada antes o después de la administración de otro agente profiláctico o terapéutico. También se describe la administración de una molécula de la invención junto con otros agentes profilácticos o terapéuticos a través de la misma o de diferentes vías de administración, por ejemplo, oral y parenteral. En ciertas realizaciones, cuando se administra una molécula de la invención simultáneamente con otro agente profiláctico o terapéutico que potencialmente produce efectos secundarios adversos que incluyen, pero no se limitan a, toxicidad, el agente profiláctico o terapéutico puede administrarse ventajosamente a una dosis que está por debajo del umbral que desencadena el efecto secundario adverso.
Las cantidades y las frecuencias de las dosis de la administración proporcionada en el presente documento están englobadas por los términos terapéuticamente eficaz y profilácticamente eficaz. La dosis y la frecuencia variarán normalmente según los factores específicos de cada paciente dependiendo del agente terapéutico o profiláctico específico administrado, de la gravedad y del tipo de cáncer, de la vía de administración, así como de la edad, del peso corporal, de la respuesta y de los antecedentes médicos del paciente. Los regímenes adecuados pueden ser seleccionados por el experto en la materia teniendo en consideración dichos factores, y siguiendo, por ejemplo, las dosis indicadas en la bibliografía y recomendadas en el Physician’s Desk Reference (56a ed., 2002).
Agentes antineoplásicos
También se describe la administración de una o más moléculas de la invención con uno o más agentes terapéuticos usados para el tratamiento y/o la prevención de cáncer. En una realización, pueden administrarse inhibidores de la angiogénesis junto con las moléculas de la invención. Algunos inhibidores de la angiogénesis que pueden usarse en los métodos y en las composiciones descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a: Angiostatina (un fragmento de plasminógeno); antitrombina III antiangiogénica; Angiozima; ABT-627; Bay 12-9566; Benefina; Bevacizumab; BMS-275291; inhibidores derivados de cartílago (CDI); CAI; el fragmento del complemento CD59; CEP-7055; Col 3; Combretastatina A-4; Endostatina (un fragmento de colágeno XVIII); un fragmento de fibronectina; Gro-beta; Halofuginona; Heparinasas; un fragmento de hexasacárido de heparina; HMV833; gonadotropina coriónica humana (hCG); IM-862; Interferón alfa/beta/gamma; proteína inducible por interferón (IP-10); Interleucina 12; Kringle 5 (un fragmento de plasminógeno); Marimastat; inhibidores de la metaloproteinasa (TIMP); 2- Metoxiestradio 1; MMI 270 (CGS 27023A); el AcMc IMC-1C11; Neovastat; NM-3; Panzem; PI-88; el inhibidor de la ribonucleasa placentaria; el inhibidor del activador del plasminógeno; el factor plaquetar 4 (PF4); Prinomastat; un fragmento de la prolactina de 16 kDa; la proteína relacionada con la proliferina (PRP); PTK 787/ZK 222594; retinoides; Solimastat; escualamina; SS 3304; SU 5416; SU6668; SU11248; tetrahidrocortisol-S; tetratiomolibdato; talidomida; tromboespondina 1 (TSP-1); TNP-470; el factor de crecimiento transformante beta (TGF-b); vasculostatina; vasostatina (un fragmento de calreticulina); ZD6126; ZD 6474; inhibidores de la transferasa de farnesilo (FTI); y bisfosfonatos.
Algunos agentes antineoplásicos que pueden usarse junto con las moléculas de la invención, incluyen, pero no se limitan a: acivicina; aclarrubicina; clorhidrato de acodazol; acronina; adozelesina; aldesleucina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparraginasa; asperlina; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; benzodepa; bicalutamida; clorhidrato de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; brequinar de sodio; bropirimina; busulfano; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetimer; carboplatino; carmustina; clorhidrato de carrubicina; carzelesina; cedefingol; clorambucilo; cirolemicina; cisplatino; cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; clorhidrato de daunorrubicina; decitabina; dexormaplatino; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diaziquona; docetaxel; doxorrubicina; clorhidrato de doxorrubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; clorhidrato de eflomitina; elsamitrucina; enloplatino; enpromato; epipropidina; clorhidrato de epirrubicina; erbulozol; clorhidrato de esorrubicina; estramustina; fosfato sódico de estramustina; etanidazol; etopósido; fosfato de etopósido; etoprina; clorhidrato de fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fosfato de fludarabina; fluorouracilo; flurocitabina; fosquidona; fostriecina de sodio; gemcitabina; clorhidrato de gemcitabina; hidroxiurea; clorhidrato de idarrubicina; ifosfamida; ilmofosina; interleucina II (incluyendo la interleucina II recombinante, o rIL2), interferón alfa-2a; interferón alfa-2b; interferón alfa-n1; interferón alfa-n3; interferón beta-1 a; interferón gamma-1 b; iproplatino; clorhidrato de irinotecán; acetato de lanreotida; letrozol; acetato de leuprolida; clorhidrato de liarozol; lometrexol de sodio; lomustina; clorhidrato de losoxantrona; masoprocol; maitansina; clorhidrato de mecloretamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalano; menogaril; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato de sodio; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; clorhidrato de mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina; omaplatino; oxisuran; paclitaxel; pegaspargasa; peliomicina; pentamustina; sulfato de peplomicina; perfosfamida; pipobromano; piposulfano; clorhidrato de piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfimer de sodio; porfiromicina; prednimustina; clorhidrato de procarbazina; puromicina; clorhidrato de puromicina; pirazofurina; riboprina; rogletimida; safingol; clorhidrato de safingol; semustina; simtrazeno; esparfosato de sodio; esparsomicina; clorhidrato de espirogermanio; espiromustina; espiroplatino; estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; tecogalan de sodio; tegafur; clorhidrato de teloxantrona; temoporfina; tenipósido; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; fosfato de triciribina; trimetrexato; glucuronato de trimetrexato; triptorrelina; clorhidrato de tubulozol; mostaza de uracilo; uredepa; vapreotida; verteporfina; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinapidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartrato de vinorelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatino; zinostatina; clorhidrato de zorrubicina. Otros fármacos antineoplásicos incluyen, pero no se limitan a: 20-epi-1,25-dihidroxivitamina D3; 5-etiniluracilo; abiratorona; aclarrubicina; acilofulveno; adecipenol; adozelesina; aldesleucina; antagonistas ALL-TK; altretamina; ambamustina; amidox; amifostina; ácido aminolevulínico; amrrubicina; amsacrina; anagrelida; anastrozol; irografolida; inhibidores de la angiogénesis; antagonista D; antagonista G; antarelix; anti-proteína morfogenética dorsalizante 1; antiandrógeno, carcinoma prostático; antiestrógeno; antinaoplaston; oligonucleótidos antisentido; glicinato de afidicolina; moduladores del gen de la apoptosis; reguladores de la apoptosis; ácido apurínico; ara-CDP-DL-PTBA; desaminasa de arginina; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetrón; azatoxina; azatirosina; derivados de bacatina III; balanol; batimastat; antagonistas BCR/ABL; benzoclorinas; benzoilestauroesporina; derivados beta lactámicos; beta-aletina; betaclamicina B; ácido betulínico; inhibidor del bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilespermina; bisnafida; bistratona A; bizelesina; breflato; bropirimina; budotitano; butionina sulfoximina; calcipotriol; calfostina C; derivados de camptotecina; IL-2 de la viruela del canario; capecitabina; carboxamida-amino-triazol; carboxiamidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inhibidor derivado del cartílago; carzelesina; inhibidores de la cinasa de caseína (ICOS); castanoespermina; cecropina B; cetrorelix; clorlnas; cloroquinoxalina sulfonamida; cicaprost; cis-porfirina; cladribina; análogos de clomifeno; clotrimazol; colismicina A; colismicina B; combretastatina A4; análogo de combretastatina; conagenina; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8 ; derivados de la criptoficina A; curacina A; ciclopentantraquinonas; cicloplatam; cipemicina; ocfosfato de citarabina; factor citolítico; citostatina; dacliximab; decitabina; deshidrodidamnina B; deslorelina; dexametasona; dexifosfamida; dexrazoxano; dexverapamilo; diaziquona; didamnina B; didox; dietilnorespermina; dihidro-5-azacitidina; dihidrotaxol, 9-; dioxamicina; difenil espiromustina; docetaxel; docosanol; dolasetrón; doxifluridina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicina SA; ebselen; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflomitina; elemeno; emitefur; epirrubicina; epristerida; análogo de estramustina; agonistas estrogénicos; antagonistas estrogénicos; etanidazol; fosfato de etopósido; exemestano; fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgrastim; finasterida; flavopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabina; clorhidrato de fluorodaunorunicina; forfenimex; formestano; fostriecina; fotemustina; texafirin gadolinio; nitrato de galio; galocitabina; ganirelix; inhibidores de la gelatinasa; gemcitabina; inhibidores del glutatión; hepsulfamo; heregulina; hexametilén bisacetamida; hipericina; ácido ibandrónico; idarrubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosina; ilomastat; imidazoacridonas; imiquimod; péptidos inmunoestimulantes; inhibidor del receptor del factor de crecimiento insulinoide 1 ; agonistas de interferón; interferones; interleucinas; iobenguano; yododoxorrubicina; ipomeanol, 4-; iroplact; irsogladina; isobengazol; isohomohalicondrina B; itasetrón; jasplakinolida; kahalalida F; triacetato de lamelarina-N; lanreotida; leinamicina; lenograstim; sulfato de lentinano; leptolestatina; letrozol; factor inhibidor de la leucemia; interferón leucocítico alfa; leuprolida estrógeno progesterona; leuprorrelina; levamisol; liarozol; análogo de poliamina lineal; péptido disacárido lipófilo; compuestos de platino lipófilos; lisoclinamida 7; lobaplatino; lombricina; lometrexol; lonidamina; losoxantrona; lovastatina; loxoribina; lurtotecán; texafirina de lutecio; lisofilina; péptidos líticos; maitansina; manostatina A; marimastat; masoprocol; maspina; inhibidores de la matrilisina; inhibidores de la metaloproteinasa de la matriz; menogaril; merbarona; meterelina; metioninasa; metoclopramida; inhibidor del MIF; mifepristona; miltefosina; mirimostim; ARN bicatenario malapareado; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafida; factor de crecimiento de fibroblastos mitotoxina-saporina; mitoxantrona; mofaroteno; molgramostim; anticuerpo monoclonal, gonadotropina coriónica humana; monofosforil lípido A sk de la pared celular de miobacterias; mopidamol; inhibidor del gen de la resistencia múltiples fármacos; terapia basada en el supresor de tumores múltiples 1; agente antineoplásico de mostaza; micaperoxida B; extracto de la pared celular de micobacterias; miriaporona; N-acetildinalina; benzamidas N-sustituidas; nafarelina; nagrestip; naloxona pentazocina; napavina; nafterpina; nartograstim; nedaplatino; nemorrubicina; ácido neridrónico; endopeptidasa neutra; nilutamida; nisamicina; moduladores del óxido nítrico; antioxidante de nitróxido; nitrulina; O6 -benciloguanina; octreotida; okicenona; oligonucleótidos; onapristona; ondansetrón; ondansetrón; oacina; inductor de la citocina oral; omaplatino; osatorona; oxaliplatino; oxaunomicina; paclitaxel; análogos de paclitaxel; derivados de paclitaxel; palauamina; palmitoilrizoxina; ácido pamidrónico; panaxitriol; panomifeno; parabactina; pazeliptina; pegaspargasa; peldesina; polisulfato pentosan sódico; pentostatina; pentrozol; perflubron; perfosfamida; alcohol perilílico; fenazinomicina; fenilacetato; inhibidores de la fosfatasa; picibanil; clorhidrato de pilocarpina; pirarrubicina; piritrexim; placetina A; placetina B; inhibidores de la activador del plasminógeno; complejo de platino; compuestos de platino; complejo de platino-triamina; porfimer de sodio; porfiromicina; prednisona; propil bis-acridona; prostaglandina J2; inhibidores del proteasoma; modulador inmunitario basado en la proteína A; inhibidor de la cinasa de proteína C; inhibidores de la cinasa de proteína C, de microalgas; inhibidores de la fosfatasa de tirosina de proteína; inhibidores de la fosforilasa de nucleósido de purina; purpurinas; pirazoloacridina; conjugado de polioxietilén hemoglobina piridoxilado; antagonistas raf; raltitrexed; ramosetrón; inhibidores de la transferasa de la proteína ras de famesilo; inhibidores ras; inhibidor ras-GAP; reteliptina desmetilada; etidronato de renio Re 186; rizoxina; ribozimas; retinamida RII; rogletimida; rohitukina; romurtida; roquinimex; rubiginona B1; ruboxilo; safingol; saintopina; SarCNU; sarcofitol A; sargramostim; miméticos de Sdi 1; semustina; inhibidores derivados de la senescencia 1; oligonucleótidos sentido; inhibidores de la transducción de señales; moduladores de la transducción de señales; proteína de unión al antígeno de cadena única; sizofiran; sobuzoxano; borocaptato de sodio; fenilacetato de sodio; solverol; proteína de unión a la somatomedina; sonarmina; ácido esparfósico; espicamicina D; espiromustina; esplenopentina; espongistatina 1; escualamina; inhibidor de células madre; inhibidor de la división de las células madre; estipiamida; inhibidores de la estromelisina; sulfinosina; antagonista del péptido intestinal vasoactivo superactivo; suradista; suramina; swainsonina; glucosaminoglucanos sintéticos; talimustina; metyoduro de tamoxifeno; tauromustina; tazaroteno; tecogalan de sodio; tegafur; telurapirilio; inhibidores de la telomerasa; temoporfina; temozolomida; tenipósido; tetraclorodecaóxido; tetrazomina; taliblastina; tiocoralina; trombopoyetina; mimético de la trombopoyetina; timalfasina; agonista del receptor de la timopoietina; timotrinano; hormona estimulante del tiroides; etiopurpurina de etil estaño; tirapazamina; bicloruro de titanoceno; topsentina; toremifeno; factor de células madre totipotente; inhibidores de la traducción; tretinoína; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorrelina; tropisetrón; turosterida; inhibidores de la cinasa de tirosina; tirfostinas; inhibidores de la UBC; ubenimex; factor inhibidor del crecimiento derivado del seno urogenital; antagonistas del receptor de la urocinasa; vapreotida; variolina B; sistema de vector, terapia génica eritrocitaria; velaresol; veramina; verdinas; verteporfina; vinorelbina; vinxaltina; vitaxina; vorozol; zanoterona; zeniplatino; zilascorb; y estimalamer zinostatina. Algunos fármacos antineoplásicos adicionales preferidos son 5-fluorouracilo y leucovorina.
Algunos ejemplos de anticuerpos terapéuticos que pueden usarse en los métodos del presente documento incluyen, pero no se limitan a, ZENAPAX® (daclizumab) (Roche Pharmaceuticals, Suiza) que es un anticuerpo monoclonal inmunosupresor humanizado anti-CD25 para la prevención del rechazo agudo de un aloinjerto renal; PANOREX™ que es un anticuerpo murino anti-antígeno de la superficie celular 17-IA de la IgG2a (Glaxo Wellcome/Centocor); BEC2 que es un anticuerpo murino antiidiotípico (epítopo GD3) de la IgG (ImClone System); IMC-C225 que es un anticuerpo quimérico anti-EGFR de la IgG (ImClone System); VITAXIN™ que es un anticuerpo humanizado antiintegrina aVp3 (Applied Molecular Evolution/Medlmmune); Smart M195 que es un anticuerpo humanizado anti-CD33 de la IgG (Protein Design Lab/Kanebo); LYMPHOCIDE™ que es un anticuerpo humanizado anti-CD22 de la IgG (Immunomedics); ICM3 es un anticuerpo humanizado anti-ICAM3 (ICOS Pharm); IDEC-114 es un anticuerpo primatizado anti-CD80 (IDEC Pharm/Mitsubishi); IDEC-131 es un anticuerpo humanizado anti-CD40L (IDEC/Eisai); IDEC-151 es un anticuerpo primatizado anti-CD4 (IDEC); IDEC-152 es un anticuerpo primatizado anti-CD23 (IDEC/Seikagaku); SMArT anti-CD3 es un humanizado anti-CD3 de la IgG (Protein Design Lab); 5G1.1 es un anticuerpo humanizado anti-factor del complemento 5 (C5) (Alexion Pharm); D2E7 es un anticuerpo humanizado anti-TNF-a (CAT/BASF); CDP870 es un anti-fragmento Fab humanizado del TNF-a (Celltech); iDeC-151 es un anticuerpo primatizado anti-CD4 de la IgG1 (IDEC Pharm/SmithKline Beecham); MDX-CD4 es un anticuerpo humano anti-CD4 de la IgG (Medarex/Eisai/Genmab); CDP57l es un anticuerpo humanizado anti-TNF-a de la IgG4 (Celltech); LDP-02 es un anticuerpo humanizado anti-a4p7 (LeukoSite/Genentech); OrthoClone OKT4A es un anticuerpo humanizado anti-CD4 de la IgG (Ortho Biotech); ANTOVA™ es un anticuerpo humanizado anti-CD40L de la IgG (Biogen); ANTEGREN™ es un anticuerpo humanizado anti-VLA-4 de la IgG (Elan); y CAT-152 es un anticuerpo humano anti-TGF-p2 (Cambridge Ab Tech). Otros ejemplos de anticuerpos terapéuticos que pueden usarse se presentan en la Tabla 8 .
Tabla 8: anticuerpos terapéuticos antineoplásicos
Compañía Producto Enfermedad Objetivo
Abgenix ABX-EGF Cáncer receptor del EGF AltaRex OvaRex Cáncer de ovario antígeno tumoral CA125
BravaRex Cánceres metastásicos antígeno tumoral MUC1
Antisoma Theragyn
(pemtumomabitrio-90) Cáncer de ovario antígeno PEM Therex Cáncer de mama antígeno PEM Boehringer
Ingelheim Blvatuzumab Cáncer de cabeza y cuello CD44
Centocor/J&J Panorex Cáncer colorrectal 17-1A
ReoPro PTC A gp Illb/IIIa
ReoPro Infarto agudo de miocardio gp Illb/IIIa
ReoPro Apoplejía isquémica gp Illb/IIIa
Corixa Bexocar NHL CD20
CRC AcMc, idiotípico 105AD7 Cáncer colorrectal gp72
Technology Vacuna
Crucell Anti-EpCAM Cáncer Ep-CAM
Cytoclonal AcMc, cáncer de pulmón Cáncer de pulmón no microcítico NA
Genentech Herceptina Cáncer de mama metastásico HER-2
Herceptina Cáncer de mama en fase temprana HER-2
Rituxan NHL recidivante/resistente de grado
bajo o folicular CD20
Rituxan NHL intermedio y de grado alto CD20
AcMc-VEGF NSCFC, metastásico VEGF
AcMc-VEGF Cáncer colorrectal, metastásico VEGF
Fab de AMD Degeneración macular relacionada
con la edad CD18
E-26 (IgE de 2a gen.) Rinitis alérgica y asma IgE
NHL de grado bajo o folicular,
IDEC Zevalin (Rituxan itrio 90) recidivante o resistente, positivo
para CD2 0 de linfocitos B y NHL CD20
resistente al rituximab
ImClone Cetuximab irinotecán Carcinoma colorrectal resistente receptor del EGF Cetuximab cisplatino y Cáncer de cabeza y cuello recién receptor del EGF
radiación diagnosticado o recurrente
Cetuximab gemcitabina Carcinoma de páncreas metastásico receptor del EGF recién diagnosticado
Cetuximab cisplatino 5FU Cáncer de cabeza y cuello
o Taxol recurrente o metastásico receptor del EGF Cetuximab carboplatino Carcinoma de pulmón no microcítico
paclitaxel recién diagnosticado receptor del EGF Cáncer de cabeza y cuello (local
Cetuximab cisplatino incurable extensivo - enfermedad receptor del EGF regional y metástasis distantes)
Cetuximab radiación Carcinoma de cabeza y cuello
localmente avanzado receptor del EGF BEC2 bacilo de Calmette
Guerin Carcinoma de pulmón microcítico mimetiza un gangliósido GD3 BEC2 bacilo de Calmette
rin Melanoma mi Gue metiza un gangliósido GD3 IMC-1C11 Cáncer colorrectal con metástasis receptor del VEGF hepáticas
ImmonoGen nuC242-DMl Cáncer colorrectal, gástrico y
pancreático nuC242 ImmunoMedics LymphoCide Linfoma no Hodgkin CD22
LymphoCide Y-90 Linfoma no Hodgkin CD22
CEA-Cide Tumores sólidos metastásicos CEA
CEA-Cide Y-90 Tumores sólidos metastásicos CEA
CEA-Scan (arcitumomab
marcado con Tc-99m) Cáncer colorrectal (radioimágenes) CEA
CEA-Scan (arcitumomab
marcado con Tc-99m) Cáncer de mama (radioimágenes) CEA
CEA-Scan (arcitumomab
marcado con Tc-99m) Cáncer de pulmón (radioimágenes) CEA
CEA-Scan (arcitumomab Tumores intraoperatorios CEAmarcado con Tc-99m) (radioimágenes)
LeukoScan (sulesomab Infección de tejidos blandos
marcado con Tc-99m) (radioimágenes) CEA
LymphoScan (marcado con
Tc-99m) Linfomas (radioimágenes) CD22
AFP-Scan (marcado con Tc- Cánceres de hígado de células AFP99m) germinales 7 (radioimágenes)
Intracel HumaRAD-HN (+ itrio 90) Cáncer de cabeza y cuello NA
HumaSPECT Imágenes colorrectales NA
Medarex MDX-101 (CTLA-4) Cánceres de próstata y otros CTLA-4
MDX-210 (sobreexpresión de
her-2 ) Cáncer de próstata HER-2
MDX-210/MAK Cáncer HER-2
Medlmmune Vitaxina Cáncer avp3
Merck KGaA Mab 425 Varios cánceres receptor del EGF
IS-IL-2 Varios cánceres Ep-CAM
Millennium Campath (alemtuzumab) Leucemia linfocítica crónica CD52
NeoRx CD20-estrept
0 a
) vidina (+ Linfoma no Hodgki biotina-itrio 9 n CD20
Avidicina (albúmina
NRLU13) Cáncer metastásico NA
Peregrine Onco lym (+ yodo-131) Linfoma no Hodgkin HLA-DR 10 beta Cotara (+ yodo-131) Glioma maligno no extirpable proteínas asociadas al ADN Pharmacia C215 (+enterotoxina
Corporation estafilocócica) Cáncer de páncreas NA
AcMc, cáncer de
pulmón/riñón Cáncer de pulmón y de riñón NA
nacolomab tafenatox (C242 Cáncer de colon y de páncreas NA
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Agentes inmunomoduladores y agentes antinflamatorios
También se describen métodos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes y de enfermedades inflamatorias que comprenden la administración de las moléculas de la invención junto con otros agentes de tratamiento. Algunos ejemplos de agentes inmunomoduladores incluyen, pero no se limitan a, metotrexato, ENBREL, REMICADE™, leflunomida, ciclofosfamida, ciclosporina A y antibióticos macrólidos (por ejemplo, FK506 (tacrolimus)), metilprednisolona (MP), corticosteroides, esteroides, micofenolato de mofetilo, rapamicina (sirolimus), mizoribina, desoxispergualina, brequinar, malononitriloamindas (por ejemplo, leflunamida), moduladores del receptor de los linfocitos T y moduladores del receptor de citocinas.
Los agentes antiinflamatorios han mostrado éxito en el tratamiento de trastornos inflamatorios y autoinmunes, y ahora son un tratamiento común y convencional para dichos trastornos. En los métodos del presente documento puede usarse cualquier agente antiinflamatorio bien conocido por el experto en la materia. Algunos ejemplos no limitantes de agentes antinflamatorios incluyen fármacos antinflamatorios no esteroideos (AINE), fármacos antinflamatorios esteroideos, agonistas beta, agentes anticolinérgicos y metil xantinas. Algunos ejemplos de AINE incluyen, pero no se limitan a, ácido acetilsalicílico, ibuprofeno, celecoxib (CELEBREX™), diclofenaco (VOLTAREN™), etodolaco (LODINE™), fenoprofeno (NALFON™), indometacina (INDOCIN™), ketoralaco (TORADOL™), oxaprozin (DAYPRO™), nabumentona (RELAFEN™), sulindaco (CLINORIL™), tolmentina (TOLECTIN™), rofecoxib (VIOXX™), naproxeno (ALEVE™, NAPROSYN™), ketoprofeno (ACTRON™) y nabumetona (RELAFEN™). Dichos AINE funcionan inhibiendo una enzima ciclooxigenasa (por ejemplo, la COX-1 y/o la COX-2). Algunos ejemplos de fármacos antinflamatorios esteroideos incluyen, pero no se limitan a, glucocorticoides, dexametasona (DECADRON™), cortisona, hidrocortisona, prednisona (DELTASONE™), prednisolona, triamcinolona, azulfidina y eicosanoides tales como prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos. Un ejemplo no limitante de los anticuerpos que pueden usarse para el tratamiento o la prevención de trastornos inflamatorios junto con las moléculas de la invención se presenta en la Tabla 9, y un ejemplo no limitante de los anticuerpos que pueden usarse para el tratamiento o la prevención de un trastorno autoinmune se presenta en la Tabla 10.
Tabla 9: anticuerpos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias
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Tabla 10: anticuerpos terapéuticos para el tratamiento de trastornos autoinmunes
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Agentes para su uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa
En algunas realizaciones, las moléculas de la invención pueden ser administradas junto con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o de agentes terapéuticos adicionales conocidos por los expertos en la materia para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad infecciosa. También se describe el uso de las moléculas de la invención junto con antibióticos conocidos por los expertos en la materia para el tratamiento y o la prevención de una enfermedad infecciosa. Algunos antibióticos que pueden usarse junto con las moléculas de la invención incluyen, pero no se limitan a, un macrólido (por ejemplo, tobramicina (Tobi®)), una cefalosporina (por ejemplo, cefalexina (Keflex®), cefradina (Velosef®), cefuroxima (Ceftin®), cefprozilo (Cefzil®), cefaclor (Ceclor®), cefixima (Suprax®) o cefadroxilo (Duriccf®)), una claritromicina (por ejemplo, claritromicina (Biaxin®)), una eritromicina (por ejemplo, eritromicina (EMycin®)), una penicilina (por ejemplo, penicilina V (V-Cillin K® o Pen Vee K®)) o una quinolona (por ejemplo, ofloxacino (Floxin®), ciprofloxacino (Cipro®) o norfloxacino (Noroxin®)), antibióticos aminoglucósidos (por ejemplo, apramicina, arbekacina, bambermicinas, butirosina, dibekacina, neomicina, neomicina, undecilenato, netilmicina, paromomicina, ribostamicina, sisomicina y espectinomicina), antibióticos anfenicoles (por ejemplo, azidanfenicol, cloranfenicol, florfenicol y tianfenicol), antibióticos ansamicinas (por ejemplo, rifamida y rifampina), carbacefems (por ejemplo, loracarbef), carbapenems (por ejemplo, biapenem e imipenem), cefalosporinas (por ejemplo, cefaclor, cefadroxilo, cefamandol, cefatrizina, cefazedona, cefozopran, cefpimizol, cefpiramida y cefpiroma), cefamicinas (por ejemplo, cefbuperazona, cefmetazol y cefminox), monobactamas (por ejemplo, aztreonam, carumonam y tigemonam), oxacefems (por ejemplo, flomoxef y moxalactama), penicilinas (por ejemplo, amdinocilina, amdinocilina pivoxilo, amoxicilina, bacampicilina, ácido bencilpenicilinánico, bencilpenicilina sódica, epicilina, fenbenicilina, floxacilina, penamcilina, yodhidruro de penetamato, penicilina o-benetamina, penicilina 0, penicilina V, penicilina V benzatina, penicilina V hidrabamina, penimepiciclina y fencihicilina potásica), lincosamidas (por ejemplo, clindamicina y lincomicina), amfomicina, bacitracina, capreomicina, colistina, enduracidina, enviomicina, tetraciclinas (por ejemplo, apiciclina, clortetraciclina, clomociclina y demeclociclina), 2,4-diaminopirimidinas (por ejemplo, brodimoprim), nitrofuranos (por ejemplo, furaltadona y cloruro de furazolio), quinolonas y análogos de las mismas (por ejemplo, cinoxacino, clinafloxacino, flumequina y grepagtoxacino), sulfonamidas (por ejemplo, acetil sulfametoxipirazina, bencilsulfamida, noprilsulfamida, ftalilsulfacetamida, sulfacrisoidina y sulfacitina), sulfonas (por ejemplo, diatimosulfona, glucosulfona sódica y solasulfona), cicloserina, mupirocina y tuberina.
En ciertas realizaciones, las moléculas de la invención pueden ser administradas junto con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes antifúngicos. Algunos agentes antifúngicos que pueden usarse junto con las moléculas de la invención incluyen, pero no se limitan a, anfotericina B, itraconazol, ketoconazol, fluconazol, intratecal, flucitosina, miconazol, butoconazol, clotrimazol, nistatina, terconazol, tioconazol, ciclopirox, econazol, haloprogrin, naftifina, terbinafina, undecilenato y griseofuldina.
En algunas realizaciones, las moléculas de la invención pueden ser administradas junto con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes antivíricos. Algunos agentes antivíricos que pueden usarse junto con las moléculas de la invención incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de la proteasa, inhibidores de la transcriptasa inversa de nucleósido, inhibidores de la transcriptasa inversa de no nucleósido y análogos de nucleósidos. Algunos ejemplos de agentes antivíricos incluyen, pero no se limitan a, zidovudina, aciclovir, gangciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluridina y ribavirina, así como, amantadina, rimantadina, saquinavir, indinavir, amprenavir, lopinavir, ritonavir, los interferones alfa; adefovir, clevadina, entecavir, pleconaril.
Terapia de vacuna
También se describe una composición para la inducción de una respuesta inmunitaria frente a un agente antigénico o inmunogénico que incluye, pero no se limita a, oncoantígenos y antígenos de enfermedades infecciosas (algunos ejemplos de los cuales se divulgan infra). Las composiciones de vacuna comprenden uno o más agentes antigénicos o inmunogénicos contra los cuales se desea una respuesta inmunitaria, en las que el uno o más agentes antigénicos o inmunogénicos están recubiertos con un anticuerpo variante descrito en el presente documento que tiene un aumento en la afinidad por el FcyRIIIA. Las composiciones de vacunas son particularmente eficaces para desencadenar una respuesta inmunitaria, preferentemente una respuesta inmunitaria protectora contra el agente antigénico o inmunogénico.
En algunas realizaciones, el agente antigénico o inmunogénico de las composiciones de vacuna comprende un virus contra el cual se desea una respuesta inmunitaria. Los virus pueden ser recombinantes o quiméricos, y preferentemente están atenuados. La producción de virus recombinantes, quiméricos y atenuados puede llevarse a cabo usando los métodos convencionales conocidos por un experto en la materia. También se describe una vacuna recombinante de virus vivos o una vacuna recombinante de virus inactivados que va a ser formulada según la descripción del presente documento. Puede preferirse una vacuna de virus vivos debido a que la multiplicación en el hospedador da lugar a un estímulo prolongado de un tipo y una magnitud similar al que se produce en las infecciones naturales, y por lo tanto confiere una sustancial inmunidad duradera. La producción de dichas formulaciones de vacuna recombinantes de virus vivos puede llevarse a cabo usando los métodos convencionales que implican la propagación del virus en un cultivo celular o en la alantoides de embrión de pollo, seguido de una purificación.
En una realización específica, el virus recombinante no es patógeno para el sujeto al que se le va a administrar. A este respecto, el uso de virus modificados genéticamente con propósitos de vacuna puede requerir la presencia de unas características de atenuación en estas cepas. La introducción de las mutaciones apropiadas (por ejemplo, deleciones) en los moldes usados para la transfección puede proporcionar a los nuevos virus unas características de atenuación. Por ejemplo, pueden realizarse mutaciones específicas sin sentido que están asociadas con una sensibilidad a la temperatura o una adaptación al frío en unas mutaciones por deleción. Estas mutaciones deberían ser más estables que las mutaciones puntuales asociadas con los mutantes sensibles al frío o a la temperatura, y las frecuencias de reversión deberían ser extremadamente bajas. Las tecnologías de ADN recombinante para la modificación de virus recombinantes son conocidas en la materia. Por ejemplo, las técnicas para la modificación de virus de ARN de hebra negativa son conocidas en la materia, véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n° 5.166.057.
Alternativamente, pueden construirse virus quiméricos con características “suicidas” para su uso en las formulaciones de vacuna intradérmicas. Dichos virus solo experimentarían una o unas pocas rondas de replicación en el hospedador. Cuando se usa como vacuna, el virus recombinante debería experimentar unos ciclos de replicación limitados e inducir un nivel suficiente de respuesta inmunitaria, pero no iría más allá en el hospedador humano como para causar una enfermedad. Alternativamente, pueden formularse virus inactivados (destruidos). Las formulaciones de vacuna con virus inactivados pueden prepararse usando las técnicas convencionales para “destruir” los virus quiméricos. Las vacunas con virus inactivados están “muertas” en el sentido de que se ha destruido su infectividad. Idealmente, la infectividad del virus es destruida sin afectar a su inmunogenicidad. Con objeto de preparar vacunas con virus inactivados, puede cultivarse el virus quimérico en un cultivo celular o en la alantoides de embrión de pollo, purificarse mediante una ultracentrifugación zonal, inactivarse con formaldehído o ppropiolactona y agruparse.
En ciertas realizaciones, pueden modificarse en el virus epítopos completamente foráneos, incluyendo los antígenos derivados de patógenos víricos o no víricos, para su uso en las formulaciones de vacuna intradérmicas. Por ejemplo, pueden modificarse los antígenos de virus no relacionados tales como el VIH (gp160, gp120, gp41), antígenos parásitos (por ejemplo, malaria), antígenos bacterianos o fúngicos o antígenos tumorales, en la cepa atenuada. Puede construirse prácticamente cualquier secuencia génica heteróloga en el virus quimérico para su uso en las formulaciones de vacuna intradérmicas. Preferiblemente, las secuencias génicas heterólogas son fracciones y péptidos que actúan como modificadores de la respuesta biológica. Preferiblemente, los epítopos que inducen una respuesta inmunitaria protectora frente a cualquiera de una diversidad de patógenos, o los antígenos que se unen a los anticuerpos neutralizantes, pueden ser expresados por, o como parte de, los virus quiméricos. Por ejemplo, las secuencias génicas heterólogas que pueden ser construidas en los virus quiméricos incluyen, pero no se limitan a, neuraminidasa de hemaglutinina de la gripe y la paragripe y glicoproteínas de fusión tales como los genes HN y F del PIV3 humano. En otra realización más, las secuencias génicas heterólogas que pueden ser construidas en los virus quiméricos incluyen aquellas que codifican proteínas con actividades inmunomoduladoras. Algunos ejemplos de proteínas inmunomoduladoras incluyen, pero no se limitan a, citocinas, interferón de tipo 1 , interferón gamma, factores estimulantes de colonias, interleucina 1,2, 4, 5, 6 , 12 y los antagonistas de estos agentes.
También se describen células o virus patógenos, preferentemente virus atenuados, que expresan el anticuerpo variante en su superficie.
En algunas realizaciones alternativas, las composiciones de vacuna comprenden un polipéptido de fusión en el que un agente antigénico o inmunogénico está unido operativamente a un anticuerpo variante descrito en el presente documento que tiene un aumento en la afinidad por el FcyRIIIA. Los polipéptidos de fusión modificados para su uso en las composiciones de vacuna se crean usando los métodos rutinarios de la tecnología del ADN recombinante, y están ampliamente en el nivel de la pericia habitual.
También se describen métodos para la inducción de tolerancia en un sujeto mediante la administración de una composición. Preferiblemente, una composición adecuada para la inducción de tolerancia en un sujeto comprende un agente antigénico o inmunogénico recubierto con un anticuerpo variante descrito en el presente documento, en el que el anticuerpo variante tiene una afinidad mayor por el FcyRIIB. Aunque sin pretender estar ligados a ningún mecanismo de acción en particular, dichas composiciones son eficaces en la inducción de tolerancia mediante la activación de la ruta inhibidora mediada por el FcyRIIB.
Composiciones y métodos de administración
También se describen métodos y composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de la invención (es decir, los diacuerpos) que comprenden múltiples dominios de unión al epítopo y, opcionalmente, un dominio Fc (o una porción del mismo). También se describen métodos de tratamiento, profilaxis y mejora de uno o más síntomas asociados con una enfermedad, un trastorno o una infección mediante la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de una proteína de fusión o de una molécula conjugada según se describe en el presente documento, o de una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión o una molécula conjugada según se describe en el presente documento. En un aspecto preferido, un anticuerpo, una proteína de fusión o una molécula conjugada está sustancialmente purificado (es decir, sustancialmente exento de sustancias que limiten su efecto o que produzcan unos efectos secundarios indeseados). En una realización específica, el sujeto es un animal, preferentemente un mamífero, tal como un no primate (por ejemplo, vacas, cerdos, caballos, gatos, perros, ratas, etc.) y un primate (por ejemplo, un mono, tal como un mono cinomólogo, y un ser humano). En una realización preferida, el sujeto es un ser humano. En otra realización preferida más, el anticuerpo es de la misma especie que el sujeto.
Se conocen diversos sistemas de administración y pueden ser usados para la administración de una composición que comprende las moléculas de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o la proteína de fusión, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432), la construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retrovírico o de otro vector, etc. Algunos métodos de administración de una molécula de la invención incluyen, pero no se limitan a, la administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), epidural y mucosa (por ejemplo, por las vías intranasal y oral). En una realización específica, las moléculas de la invención son administradas por vía intramuscular, intravenosa o subcutánea. Las composiciones pueden ser administradas mediante cualquier vía conveniente, por ejemplo, mediante una infusión o una inyección en bolo, mediante su absorción a través del revestimiento epitelial o mucocutáneo (por ejemplo, la mucosa oral, la mucosa rectal y intestinal, etc.) y pueden ser administradas junto con otro agente biológicamente activo. La administración puede ser sistémica o local. Además, también puede emplearse una administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o de un nebulizador y de una formulación con un agente aerosolizante. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos n° 6.019.968; 5.985.
320; 5.985.309; 5.934.272; 5.874.064; 5.855.913; 5.290.540; y 4.880.078; y las Publicaciones PCT n° WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; y WO 99/66903.
También se describe que las moléculas de la invención están envasadas en un recipiente sellado herméticamente tal como una ampolla o un sobrecillo que indica la cantidad de anticuerpo. En una realización, las moléculas de la invención son suministradas en forma de un polvo liofilizado esterilizado seco o de un concentrado exento de agua en un recipiente sellado herméticamente y pueden ser reconstituidas, por ejemplo, con agua o con una solución salina a la concentración apropiada para su administración a un sujeto. Preferiblemente, las moléculas de la invención son suministradas en forma de un polvo liofilizado estéril seco en un recipiente sellado herméticamente a una dosis unitaria de al menos 5 mg, más preferentemente de al menos 10 mg, de al menos 15 mg, de al menos 25 mg, de al menos 35 mg, de al menos 45 mg, de al menos 50 mg o de al menos 75 mg. Las moléculas liofilizadas de la invención deberían ser almacenadas a entre 2 y 8 °C en su recipiente original, y las moléculas deberían ser administradas en las 12 horas, preferentemente en las 6 horas, en las 5 horas, en las 3 horas o en 1 hora después de haber sido reconstituidas. En una realización alternativa, las moléculas de la invención son suministradas en forma líquida en un recipiente sellado herméticamente que indica la cantidad y la concentración de la molécula, de la proteína de fusión o de la molécula conjugada. Preferiblemente, la forma líquida de las moléculas de la invención son suministradas en un recipiente sellado herméticamente con al menos 1 mg/ml, más preferentemente con al menos 2,5 mg/ml, con al menos 5 mg/ml, con al menos 8 mg/ml, con al menos 10 mg/ml, con al menos 15 mg/kg, con al menos 25 mg/ml, con al menos 50 mg/ml, con al menos 100 mg/ml, con al menos 150 mg/ml, con al menos 2 0 0 mg/ml de las moléculas.
La cantidad de la composición que será eficaz en el tratamiento, la prevención o la mejora de uno o más síntomas asociados con un trastorno puede ser determinada mediante las técnicas clínicas habituales. La dosis precisa que va a ser empleada en la formulación también dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la afección, y debería decidirse según el juicio del profesional y de las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de las curvas de dosis-respuesta derivadas a partir de los sistemas de prueba in vitro o de modelos animales.
Para los diacuerpos englobados por la invención, la dosis administrada a un paciente es normalmente de entre 0,0001 mg/kg y 100 mg/kg del peso corporal del paciente. Preferiblemente, la dosis administrada a un paciente es de entre 0,0001 mg/kg y 20 mg/kg, de entre 0,0001 mg/kg y 10 mg/kg, de entre 0,0001 mg/kg y 5 mg/kg, de entre 0,0001 y 2 mg/kg, de entre 0,0001 y 1 mg/kg, de entre 0,0001 mg/kg y 0,75 mg/kg, de entre 0,0001 mg/kg y 0,5 mg/kg, de entre 0 , 0 00 1 mg/kg y 0,25 mg/kg, de entre 0 , 00 01 y 0,15 mg/kg, de entre 0 , 00 01 y 0 , 1 0 mg/kg, de entre 0,001 y 0,5 mg/kg, de entre 0,01 y 0,25 mg/kg o de entre 0,01 y 0,10 mg/kg del peso corporal del paciente. La dosis y la frecuencia de administración de los diacuerpos de la invención puede ser reducida o alterada aumentando la captación y la penetración tisular de los diacuerpos mediante modificaciones tales como, por ejemplo, una lipidación.
En una realización, las dosis de las moléculas de la invención administradas a un paciente son de entre 0,01 mg y 1.000 mg/día, cuando se usan en forma de un agente de monoterapia. En otra realización las moléculas de la invención se usan junto con otras composiciones terapéuticas, y las dosis administradas a un paciente son menores que cuando dichas moléculas se usan en forma de un agente de monoterapia.
En una realización específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas localmente en la zona en necesidad de tratamiento; esto puede conseguirse, por ejemplo y en modo alguno como limitación, mediante una infusión local, mediante una inyección o mediante un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras. Preferiblemente, cuando se administra una molécula de la invención, debe tenerse cuidado en usar materiales en los que no se absorba la molécula.
En otra realización, las composiciones pueden ser administradas en una vesícula, en particular en un liposoma (véase, Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat et al., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer. Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York, páginas 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., páginas 3 17-327; véase de forma general, ibid.).
En otra realización más, las composiciones pueden ser administradas en un sistema de liberación controlada o de liberación sostenida. Puede usarse cualquier técnica conocida por el experto en la materia para la producción de las formulaciones de liberación sostenida que comprenden una o más moléculas de la invención. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n° 4.526.938; la publicación PCT WO 91/05548; la publicación PCT WO 96/20698; Ning et al., 1996, “Intratumoral Radio immunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel”, Radiotherapy & Oncology 39: 179-189, Song et al., 1995, “Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions”, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50: 372-397; Cleek et al., 1997, “Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application”, Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24: 853-854; y Fam et al., 1997, “Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Focal Delivery”, Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24: 759-760. En una realización, puede usarse una bomba en un sistema de liberación controlada (véase Fanger, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507; y Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos para conseguir la liberación controlada de los anticuerpos (véase, por ejemplo, Medical Applications of Controlled Release. Fanger y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, 1983, L, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; véase también Fevy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 105); la Patente de Estados Unidos n° 5.679.377; la Patente de Estados Unidos n° 5.916.597; la Patente de Estados Unidos n° 5.912.015; la Patente de Estados Unidos n° 5.989.463; la Patente de Estados Unidos n° 5.128.326; la publicación PCT n° WO 99/15154; y la publicación PCT n° WO 99/20253). Algunos ejemplos de los polímeros usados en las formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, poli(metacrilato de 2-hidroxi etilo), poli(metacrilato de metilo), poli(ácido acrílico), poli(acetato de etilen-co-vinilo), poli(ácido metacrílico), poliglicólidos (PEG), polianhídridos, poli(N-vinil pirrolidona), poli(alcohol vinílico), poliacrilamida, poli(etilenglicol), polilactidas (PEA), poli(lactida-co-glicólidos) (PLGA) y poliortoésteres. En otra realización más, puede colocarse un sistema de liberación controlada en las proximidades del agente terapéutico (por ejemplo, en los pulmones), y por lo tanto se requiere únicamente una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, páginas 115-138 (1984)). En otra realización, se usan las composiciones poliméricas útiles como implantes de liberación controlada según Dunn et al. (véase el documento U.S. 5.945.155). Este método en particular se basa en el efecto terapéutico de la liberación controlada in situ del material bioactivo desde el sistema polimérico. La implantación puede producirse generalmente en cualquier parte del cuerpo del paciente en necesidad de tratamiento terapéutico. En otra realización se usa un sistema de administración sostenida no polimérico mediante el cual se usa un implante no polimérico en el cuerpo del sujeto como sistema de administración de fármacos. Tras su implantación en el cuerpo, el disolvente orgánico del implante se disipará, se dispersará o lixiviará desde la composición hacia el fluido tisular circundante, y el material no polimérico coagulará o precipitará gradualmente para formar una matriz microporosa sólida (véase el documento U.S. 5.888.533).
Los sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión de Langer (1990, Science 249: 1527-1533). Puede usarse cualquier técnica conocida por el experto en la materia para la producción de formulaciones de liberación sostenida que comprenden uno o más agente terapéuticos de la invención. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n° 4.526.938; las Publicaciones Internacionales n° WO 91/05548 y WO 96/20698; Ning et al., 1996, Radiotherapy & Oncology 39: 179-189; Song et al., 1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50: 372-397; Cleek et al., 1997, Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24: 853-854; y Lam et al., 1997, Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24: 759-760.
En una realización específica, cuando la composición es un ácido nucleico que codifica un diacuerpo de la invención, el ácido nucleico puede ser administrado in vivo para promover la expresión de su diacuerpo codificado, construyéndolo como parte de un vector de expresión del ácido nucleico apropiado y administrándolo de forma que se haga intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retrovírico (véase la Patente de Estados Unidos n° 4.980.286), o mediante una inyección directa, o mediante el uso del bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola génica; Biolistic, Dupont), o un recubrimiento con lípidos o receptores de la superficie celular o con agentes de transfección, o mediante su administración unido a un péptido de tipo homeocaja que se sabe que entra en el núcleo (véase, por ejemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sel EE.UU. 88: 1864-1868), etc. Alternativamente, puede introducirse un ácido nucleico intracelularmente e incorporarse en el ADN de la célula hospedadora para su expresión mediante una recombinación homóloga.
El tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de moléculas de la invención puede incluir un único tratamiento, o preferentemente, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo preferido, se trata un sujeto con las moléculas de la invención en el intervalo de entre aproximadamente 0,1 y 30 mg/kg de peso corporal, una vez por semana durante entre aproximadamente 1 y 10 semanas, preferentemente durante entre 2 y 8 semanas, más preferentemente durante entre aproximadamente 3 y 7 semanas, e incluso más preferentemente durante aproximadamente 4, 5 o 6 semanas. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se administran una vez al día, dos veces al día o tres veces al día. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas se administran una vez por semana, dos veces por semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada seis semanas, una vez cada dos meses, dos veces al año o una vez al año. También se apreciará que la dosis eficaz de las moléculas usadas para el tratamiento puede aumentarse o disminuirse durante el transcurso de un tratamiento en particular.
Composiciones farmacéuticas
Las composiciones incluyen composiciones de fármacos a granel útiles en la elaboración de composiciones farmacéuticas (por ejemplo, composiciones impuras o no estériles) y composiciones farmacéuticas (es decir, composiciones que son adecuadas para su administración a un sujeto o paciente) que pueden usarse en la preparación de formas de dosificación unitarias. Dichas composiciones comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de un agente profiláctico y/o terapéutico divulgado en el presente documento o una combinación de esos agentes y un portador farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, las composiciones descritas en el presente documento comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de una o más moléculas de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de diacuerpo de la invención y otro anticuerpo terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal específico tumoral) que es específico para un oncoantígeno en particular, y un portador farmacéuticamente aceptable.
En una realización específica, el término “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por un organismo sanitario del gobierno federal o estatal, o recogido en la Farmacopea de los Estados Unidos o en otra Farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos. El término “portador” se refiere a un diluyente, a un adyuvante (por ejemplo, el adyuvante de Freund (completo e incompleto), a un excipiente o a un vehículo con el que se administra el producto terapéutico. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen del petróleo, animal, vegetable o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También pueden emplearse soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Algunos excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, caliza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada seca, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Si se desea, la composición también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o de agentes tamponantes del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares.
Generalmente, los ingredientes de las composiciones son suministrados por separado o se mezclan entre sí en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en forma de un polvo liofilizado seco o un concentrado exento de agua en un recipiente sellado herméticamente tal como una ampolla o un sobrecillo que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición va a ser administrada mediante una infusión, puede ser dispensada con un frasco de infusión que contiene agua o solución salina estéril de calidad farmacéutica. Cuando la composición es administrada mediante una inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua o de una solución salina estéril para inyección, de forma que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.
Las composiciones pueden estar formuladas como formas neutras o de sal. Algunas sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, aquellas formadas con aniones tales como las obtenidas a partir de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc. y aquellas formadas con cationes tales como las obtenidas a partir de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
Terapia génica
En una realización específica, los ácidos nucleicos que comprenden las secuencias que codifican las moléculas de la invención, son administrados para el tratamiento, la prevención o la mejora de uno o más síntomas asociados con una enfermedad, un trastorno o una infección, a modo de terapia génica. La terapia génica se refiere a la terapia que se realiza mediante la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. En esta realización de la invención, los ácidos nucleicos producen su anticuerpo o proteína de fusión codificados que median en un efecto terapéutico o profiláctico.
Pueden usarse cualquiera de los métodos de terapia génica disponibles en la materia. Algunos ejemplos de métodos se describen a continuación.
Para las revisiones generales de los métodos de terapia génica, véase Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan, Science 260: 926-932 (1993); y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; mayo de 1993, TIBTECH 11 (5): 155-215. Algunos métodos conocidos habitualmente en la materia de la tecnología del ADN recombinante que pueden usarse se describen en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, NY (1993); y en Kriegler, Gene Transfer and Expression. A Laboratory Manual. Stockton Press, NY (1990).
Una composición puede comprender ácidos nucleicos que codifican un diacuerpo de la invención, siendo dichos ácidos nucleicos parte de un vector de expresión que expresa el anticuerpo en un hospedador adecuado. En particular, dichos ácidos nucleicos tienen promotores, preferentemente promotores heterólogos, unidos operativamente a la región codificante del anticuerpo, siendo dicho promotor inducible o constitutivo, y, opcionalmente, específico tisular. En otra realización en particular, las moléculas de ácido nucleico se usan en las secuencias codificantes del anticuerpo, y cualquier otra secuencia deseada está flanqueada por las regiones que promueven la recombinación homóloga en el sitio deseado del genoma, proporcionando así la expresión intracromosómica de los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo (Roller y Smities, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU. 86: 8932-8935; y Zijlstra et al, 1989, Nature 342: 435-438).
Una composición puede comprender ácidos nucleicos que codifican una proteína de fusión, siendo dichos ácidos nucleicos parte de un vector de expresión que expresa la proteína de fusión en un hospedador adecuado. En particular, dichos ácidos nucleicos tienen promotores, preferentemente promotores heterólogos, unidos operativamente a la región codificante de una proteína de fusión, siendo dicho promotor inducible o constitutivo y opcionalmente, específico tisular. En otra realización en particular, las moléculas de ácido nucleico se usan en las secuencias codificantes de la proteína de fusión, y cualquier otra secuencia deseada está flanqueada por las regiones que promueven la recombinación homóloga en el sitio deseado del genoma, proporcionando así la expresión intracromosómica de la proteína de fusión.
La administración de los ácidos nucleicos a un sujeto puede ser directa, en cuyo caso el sujeto es expuesto directamente al ácido nucleico o a los vectores portadores del ácido nucleico, o indirecta, en cuyo caso las células se transforman en primer lugar con los ácidos nucleicos in vitro, después son trasplantadas al sujeto. Estas dos metodologías se conocen, respectivamente, como terapia génica in vivo o ex vivo.
En una realización específica, las secuencias de ácidos nucleicos son administradas directamente in vivo, donde son expresadas para producir el producto codificado. Esto puede llevarse a cabo mediante cualquiera de los numerosos métodos conocidos en la materia, por ejemplo, mediante su construcción como parte de un vector de expresión del ácido nucleico adecuado y su administración de forma que se hagan intracelulares, por ejemplo, mediante una infección usando retrovirus defectuosos o atenuados u otros vectores víricos (véase la Patente de Estados Unidos n° 4.980.286), o mediante una inyección directa del ADN desnudo, o mediante el uso de un bombardeo con micropartículas (por ejemplo, una pistola génica; Biolistic, Dupont), o un recubrimiento con lípidos o con receptores de la superficie celular o con agentes de transfección, una encapsulación en liposomas, en micropartículas o en microcápsulas, o mediante su administración unidas a un péptido que se sabe que entra en el núcleo, mediante su administración unidas a un antígeno sometido a una endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432) (que puede usarse para los tipos de células objetivo que expresan específicamente los receptores), etc. En otra realización, pueden formarse complejos de ácido nucleico-un antígeno en los que un antígeno comprende un péptido vírico fusogénico para disociar los endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosómica. En otra realización más, el ácido nucleico puede ser dirigido in vivo para una captación y una expresión celular específica, mediante su direccionamiento a un receptor específico (véanse, por ejemplo, las Publicaciones PCT WO 92/06180; WO 92/22635; W092/20316; W093/14188; WO 93/20221). Alternativamente, el ácido nucleico puede ser introducido intracelularmente e incorporado en el ADN de la célula hospedadora para su expresión, mediante una recombinación homóloga (KoHer y Smities, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU. 86: 8932-8935; y Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435-438).
En una realización específica, se usan vectores víricos que contienen las secuencias de ácidos nucleicos que codifican una molécula de la invención (por ejemplo, un diacuerpo o una proteína de fusión). Por ejemplo, puede usarse un vector retrovírico (véase, Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217: 581-599). Estos vectores retrovíricos contienen los componentes necesarios para el correcto empaquetamiento del genoma vírico y su integración en el ADN de la célula hospedadora. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo o una proteína de fusión que se va a usar en la terapia génica son clonadas en uno o más vectores, lo que facilita la administración de la secuencia de nucleótidos a un sujeto. Pueden encontrarse más detalles sobre los vectores retrovíricos en Boesen et al., (1994, Biotherapy 6: 291-302), que describe el uso de un vector retrovírico para la administración del gen mdr 1 a células madre hematopoyéticas con objeto de hacer que las células madre sean más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovíricos en la terapia génica son: Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest. 93: 644-651; Klein et al., 1994, Blood 83: 1467-1473; Salmons y Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141; y Grossman y Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-114.
Los adenovirus son otros vectores víricos que pueden usarse en la terapia génica. Los adenovirus son unos vehículos especialmente atractivos para la administración de genes al epitelio respiratorio. Los adenovirus infectan de forma natural el epitelio respiratorio, donde causan una enfermedad leve. Otros objetivos para los sistemas de administración basados en adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, las células endoteliales y el músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar células que no se están dividiendo. Kozarsky y Wilson (Current Opinion in Genetics and Development 3: 499-503, 1993, presentan una revisión de la terapia génica basada en adenovirus. Bout et al., (Human Gene Therapy, 5: 3-10, 1994) muestran el uso de vectores de adenovirus para la transferencia de genes al epitelio respiratorio de monos rhesus. Otros casos de uso de adenovirus en terapia génica pueden encontrarse en Rosenfeld et al., 1991, Science 252: 431-434; en Rosenfeld et al., 1992, Cell 68: 143­ 155; en Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91: 225-234; en la Publicación PCT W094/12649; y en Wang et al., 1995, Gene Therapy 2: 775-783. En una realización preferida, se usan vectores de adenovirus.
También se han propuesto los virus adenoasociados (AAV) para su uso en la terapia génica (véase, por ejemplo, Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol Med. 204: 289-300 y la Patente de Estados Unidos n° 5.436.146).
Otra metodología de la terapia génica implica la transferencia de un gen a las células de un cultivo tisular mediante métodos tales como una electroporación, una lipofección, una transfección mediada por fosfato de calcio o una infección vírica. Habitualmente, el método de transferencia incluye la transferencia de un marcador seleccionable a las células. Después, las células se colocan bajo la selección para aislar aquellas células que han captado y están expresando el gen transferido. Después, esas células son administradas a un sujeto.
En esta realización, el ácido nucleico es introducido en una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Dicha introducción puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la materia que incluye, pero no se limita a, una transfección, una electroporación, una microinyección, una infección con un vector vírico o un bacteriófago que contiene las secuencias de ácidos nucleicos, una fusión celular, una transferencia génica mediada por un cromosoma, una transferencia génica mediada por una microcélula, una fusión de esferoplastos, etc. En la materia se conocen numerosas técnicas para la introducción de genes foráneos en células (véase, por ejemplo, Loeffler y Behr, 1993, Meth. Enzymol 217: 599-618, Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol 217: 618-644; y Clin. Pharma. Ther. 29: 69-92, 1985) y pueden usarse con la condición de que no se alteren las funciones de desarrollo y fisiológicas necesarias de las células del receptor. La técnica debería proporcionar una transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de forma que el ácido nucleico sea expresable por la célula, y preferentemente heredable y expresable por su progenie celular.
Las células recombinantes resultantes pueden ser administradas a un sujeto mediante diversos métodos conocidos en la materia. Las células recombinantes sanguíneas (por ejemplo, las células madre hematopoyéticas o progenitoras) son administradas preferentemente por vía intravenosa. La cantidad de células contemplada para su uso depende del efecto deseado, del estado del paciente, etc., y puede ser determinada por el experto en la materia. Las células en las que puede ser introducido un ácido nucleico con propósitos de terapia génica engloban cualquier tipo de célula deseado disponible e incluyen, pero no se limitan a, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos; células sanguíneas tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos; diversas células madre o progenitoras, en particular, células madre hematopoyéticas o progenitoras, por ejemplo, según se obtienen a partir de la médula ósea, de la sangre del cordón umbilical, de sangre periférica, de hígado fetal, etc.
En una realización preferida, la célula usada para la terapia génica es autóloga al sujeto.
En una realización en la que se usan células recombinantes en terapia génica, las secuencias de los ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo o una proteína de fusión son introducidas en las células de forma que sean expresables por las células o por su progenie, y después las células recombinantes son administradas in vivo para su efecto terapéutico. En una realización específica, se usan células madre o células progenitoras. Potencialmente puede usarse cualquier célula madre y/o progenitora que pueda ser aislada y mantenida in vitro según esta realización (véase, por ejemplo, la Publicación PCT WO 94/08598; Stemple y Anderson, 1992, Cell 11: 973-985; Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21 A: 229; y Pittelkow y Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61: 771).
En una realización específica, el ácido nucleico que va a ser introducido con propósitos de terapia génica comprende un promotor inducible unido operativamente a la región codificante, de forma que la expresión del ácido nucleico es controlable mediante el control de la presencia o de la ausencia del apropiado inductor de la transcripción.
Kits
También se describe un paquete o un kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes que contienen las moléculas de la invención. Adicionalmente, también puede incluirse uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos útiles para el tratamiento de una enfermedad en el paquete o el kit farmacéutico. También se describe un paquete o un kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes que contienen uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. Opcionalmente, asociado a dicho(s) recipiente(s) puede haber un prospecto en la forma prescrita por un organismo gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, prospecto que refleja la aprobación por parte del organismo de la fabricación, el uso o la venta para su administración a seres humanos.
También se describen kits que pueden ser usados en los métodos anteriores. En una realización, un kit comprende una o más moléculas de la invención. En otra realización, un kit comprende uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos útiles para el tratamiento del cáncer, en uno o más recipientes. En otra realización, un kit comprende adicionalmente uno o más anticuerpos citotóxicos que se unen a uno o más oncoantígenos asociados con un cáncer. En ciertas realizaciones, el otro agente profiláctico o terapéutico es un agente quimioterapéutico. En otras realizaciones, el agente profiláctico o terapéutico es una sustancia terapéutica biológica u hormonal.
Caracterización y demonstración de la utilidad terapéutica
Los diversos aspectos de las composiciones farmacéuticas, de los agentes profilácticos o terapéuticos descritos en el presente documento se prueban preferentemente in vitro, en un sistema de cultivo celular y en un organismo de un modelo animal, tal como un sistema de modelo animal de roedor, para analizar la actividad terapéutica deseada antes de su uso en seres humanos. Por ejemplo, algunos ensayos que pueden usarse para determinar si se desea la administración de una composición farmacéutica específica incluyen ensayos de cultivo celular en los que se cultiva una muestra de tejido del paciente en un cultivo y se expone o se pone en contacto de otro modo con una composición farmacéutica descrita en el presente documento y se observa el efecto de dicha composición sobre la muestra de tejido. La muestra de tejido puede obtenerse mediante una biopsia del paciente. Esta prueba permite a la identificación de la(s) molécula(s) profilácticas o terapéuticas terapéuticamente más eficaces para cada paciente individual. En varias realizaciones específicas pueden llevarse a cabo ensayos in vitro con células representativas de los tipos celulares individuales implicados en un trastorno autoinmune o inflamatorio (por ejemplo, linfocitos T), para determinar si una composición farmacéutica descrita en el presente documento tiene un efecto deseado sobre dicho tipo celular.
Las combinaciones de agentes profilácticos y/o terapéuticos pueden probarse en sistemas de modelos animales adecuados antes de su uso en seres humanos. Dichos sistemas de modelo animal incluyen, pero no se limitan a, ratas, ratones, pollos, vacas, monos, cerdos, perros, conejos, etc. Puede usarse cualquier sistema animal bien conocido en la materia. Las combinaciones de agentes profilácticos y/o terapéuticos pueden probarse en un sistema de modelo de ratón. Dichos sistemas de modelo son ampliamente usados y bien conocidos por el experto. Los agentes profilácticos y/o terapéuticos pueden ser administrados repetidamente. Varios aspectos del procedimiento pueden variar. Dichos aspectos incluyen el régimen temporal de administración de los agentes profilácticos y/o terapéuticos, y si dichos agentes son administrados por separado o en forma de una mezcla.
Algunos modelos de animal preferidos para su uso en los métodos del presente documento son, por ejemplo, ratones transgénicos que expresan los FcyR humanos en células efectoras de ratón, por ejemplo, puede usarse cualquier modelo de ratón descrito en el documento U.S. 5.877.396. Los ratones transgénicos para su uso en los métodos incluyen, pero no se limitan a, ratones portadores del FcyRIIIA humano; ratones portadores del FcyRIIA humano; ratones portadores del FcyRIIB y del FcyRIIIA humano; ratones portadores del FcyRIIB y del FcyRIIA humano. Preferiblemente, se probarán las mutaciones que muestren los mayores niveles de actividad en los ensayos funcionales descritos anteriormente para su uso en los estudios con un modelo de animal antes de su uso en seres humanos. Pueden prepararse unas cantidades suficientes de anticuerpos para su uso en los modelos de animales usando los métodos descritos supra, por ejemplo, usando unos sistemas de expresión de mamífero y los métodos de purificación divulgados y ejemplificados en el presente documento.
Pueden usarse modelos de xenoinjerto de ratón para el análisis de la eficacia de los anticuerpos de ratón generados contra un objetivo tumoral específico basándose en la afinidad y en la especificidad de los dominios de unión al epítopo de la molécula de diacuerpo de la invención, y en la capacidad del diacuerpo para desencadenar una respuesta inmunitaria (Wu et al., 2001, Trends Cell Biol. 1l: S2-9). Los ratones transgénicos que expresan los FcyR humanos en células efectoras de ratón son unos modelos de animal hechos a medida para probar la eficacia de las interacciones Fc-FcyR humano. Pueden usarse pares de líneas de ratón transgénicas FcyRIIIA, FcyRIIIB y FcyRIIA generadas en el laboratorio del Dr. Jeffrey Ravetch (a través de un acuerdo de licenciamiento con la Rockefeller U. y el Sloan Kettering Cancer center), tales como las recogidas en la siguiente Tabla 11.
Tabla 11: cepas de ratón
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La actividad antiinflamatoria de las terapias de combinación puede ser determinada mediante el uso de varios modelos de animal experimentales de artritis inflamatoria conocidos en la materia y descritos en Crofford L. J. y Wilder R. L., “Arthritis and Autoimmunity in Animals”, en Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCarty et al. (eds.), capítulo 30 (Lee y Febiger, 1993). También pueden usarse en modelos de animal experimentales y espontáneos de artritis inflamatoria y de enfermedades reumáticas autoinmunes, para evaluar la actividad antiinflamatoria de las terapias de combinación. Los siguientes son algunos ensayos proporcionados como ejemplos, y no como limitación.
Los principales modelos de animal de artritis o de enfermedad inflamatoria conocidos en la materia y ampliamente usados incluyen: modelos de rata de artritis inducida por un adyuvante, modelos de rata y de ratón de artritis inducida por colágeno, y modelos de rata, de conejo y de hámster de artritis inducida por un antígeno, todos descritos en Crofford L. J. y Wilder R. L., “Arthritis and Autoimmunity in Animals”, en Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCarty et al. (eds.), capítulo 30 (Lee y Lebiger, 1993).
La actividad antiinflamatoria de las terapias de combinación puede evaluarse usando un modelo de rata de artritis inducida por carragenano. La artritis inducida por carragenano también se ha usado en conejos, perros y cerdos en estudios de artritis crónica o de inflamación. Se usa una evaluación histomorfométrica cuantitativa para determinar la eficacia terapéutica. Los métodos que usan dicho modelo de artritis inducida por carragenano se describen en Hansra P. et al., “Carrageenan-Induced Arthritis in the Rat”, Inflammation, 24 (2): 141-155, (2000). También se usan habitualmente los modelos de animal de inflamación inducida por zimosan, como es conocido y se describe en la materia.
La actividad antinflamatoria de las terapias de combinación también puede ser evaluada midiendo en la rata la inhibición del edema en una pata inducido por carragenano, usando una modificación del método descrito en Winter C. A. et al., “Carrageenan-Induced Edema in Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs” Proc. Soc. Exp. Biol Med. Ill, 544-547, (1962). Este ensayo se ha usado como un cribado primario in vivo de la actividad antiinflamatoria de la mayoría de los AINE y se considera predictivo de la eficacia en seres humanos. La actividad antiinflamatoria de los agentes profilácticos o terapéuticos de prueba se expresa como el porcentaje de inhibición del aumento en el peso de la pata trasera del grupo de prueba con respecto al grupo de control al que se le ha administrado vehículo.
Adicionalmente, también pueden usarse modelos de animal de enfermedad inflamatoria del intestino para evaluar la eficacia de las terapias de combinación (Kim et al., 1992, Scand. J. Gastroentrol. 27: 529-537; Strober, 1985, Dig. Dis. Sci. 30 (12 Supl.): 3S-10S). La colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn son enfermedades inflamatorias del intestino humanas que pueden ser inducidas en animales. Pueden administrarse polisacáridos que incluyen, pero no se limitan a, amilopectina, carrageno, sulfato de amilopectina y sulfato de dextrano, o productos químicos irritantes que incluyen, pero no se limitan a, ácido trinitrobencensulfónico (TNBS) y ácido acético a los animales por vía oral, para inducir enfermedades inflamatorias del intestino.
También pueden usarse modelos de animal de trastornos autoinmunes para evaluar la eficacia de las terapias de combinación. Se han desarrollado modelos de animal para trastornos autoinmunes tales como la diabetes de tipo 1, la autoinmunidad tiroidea, el lupus eritematoso sistémico y la glomerulonefritis (Flanders et al., 1999, Autoimmunity 29: 235-246; Krogh et al., 1999, Biochimie 81: 511-515; Foster, 1999, Semin. Nephrol 19: 12-24).
Además, puede usarse cualquier ensayo conocido por los expertos en la materia para evaluar la utilidad profiláctica y/o terapéutica de las terapias de combinación divulgadas en el presente documento para las enfermedades autoinmunes y/o inflamatorias.
La toxicidad y la eficacia de los protocolos profilácticos y/o terapéuticos pueden ser determinadas mediante los procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o en animales experimentales, por ejemplo, para la determinación de la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y de la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede ser expresado como la proporción de DL50/DE50. Se prefieren los agentes profilácticos y/o terapéuticos que muestren unos índices terapéuticos grandes. Aunque pueden usarse agentes profilácticos y/o terapéuticos que muestren unos efectos secundarios tóxicos, debe tenerse cuidado en diseñar un sistema de administración que dirija dichos agentes al sitio de tejido afectado con objeto de minimizar el daño potencial a las células no infectadas, y reducir así los efectos secundarios.
Los datos obtenidos a partir de los ensayos en cultivos celulares y en los estudios con animales pueden usarse en la formulación de un abanico de dosis de los agentes profilácticos y/o terapéuticos para su uso seres humanos. La dosis de dichos agentes está preferentemente en un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar en este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier agente usado en el método descrito en el presente documento, la dosis terapéuticamente eficaz puede ser estimada inicialmente a partir de los ensayos con cultivos celulares. Una dosis puede estar formulada en modelos de animal para conseguir una concentración plasmática en circulación que incluya la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que consigue la mitad de la inhibición máxima de los síntomas) según se determina en el cultivo celular. Dicha información puede usarse para determinar de forma más precisa las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante una cromatografía de líquidos de alta resolución.
La actividad antineoplásica de las terapias usadas según la presente invención también puede ser determinada mediante el uso de varios modelos de animal experimental para el estudio del cáncer, tales como el modelo de ratón SCID o de ratón transgénico o de ratón atímico con xenoinjertos humanos, modelos de animal, tales como hámsteres, conejos, etc. conocidos en la materia y descritos en Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development (1999, eds. Fiebig y Burger); Contributions to Oncology (1999, Karger); The Nude Mouse en Oncology Research (1991, eds. Boven y Winograd); y Anticancer Drug Development Guide (1997 ed. Teicher).
Algunos modelos de animal preferidos para la determinación de la eficacia terapéutica de las moléculas de la invención son modelos de xenoinjerto de ratón. Algunas líneas celulares tumorales que pueden usarse como fuente para los xenoinjertos de tumores incluyen, pero no se limitan a, células SKBR3 y MCF7, que pueden proceder de pacientes con adenocarcinoma de mama. Estas células tienen los receptores tanto erbB2 como de la prolactina. Las células SKBR3 se han usado de forma rutinaria en la materia como modelos de ADCC y de xenoinjerto de tumor. Alternativamente, pueden usarse las células OVCAR3 derivadas de un adenocarcinoma de ovario humano como fuente para los xenoinjertos de tumores.
Los protocolos y las composiciones se prueban preferentemente in vitro y después in vivo, para evaluar la actividad terapéutica o profiláctica deseada, antes de su uso en seres humanos. Los agentes y los métodos terapéuticos pueden ser cribados usando células de un tumor o de una línea celular maligna. Pueden usarse muchos ensayos convencionales en la materia para evaluar dicha supervivencia y/o crecimiento; por ejemplo, la proliferación celular puede ensayarse mediante la medición de la incorporación de 3H-timidina, mediante un recuento celular directo, mediante la detección de los cambios en la actividad de transcripción de genes conocidos tales como protooncogenes (por ejemplo, fos, myc) o de marcadores del ciclo celular; la viabilidad celular puede evaluarse mediante una tinción con trypan blue, la diferenciación puede evaluarse visualmente basándose en los cambios en la morfología, en la disminución en el crecimiento y/o en la formación de colonias en agar blando o la formación de una red tubular en una membrana de base tridimensional o una preparación de matriz extracelular, etc.
Los compuestos para su uso en terapia pueden ser probados en sistemas de modelo animal adecuados antes de su prueba en seres humanos, incluyendo, pero no se limitan a, en ratas, ratones, pollos, vacas, monos, conejos, hámsteres, etc., por ejemplo, los modelos de animal descritos anteriormente. Después, los compuestos pueden usarse en los ensayos clínicos apropiados.
Además, puede usarse cualquier ensayo conocido por los expertos en la materia para evaluar la utilidad profiláctica y/o terapéutica de las terapias de combinación divulgadas en el presente documento para el tratamiento o la prevención del cáncer, de un trastorno inflamatorio o de una enfermedad autoinmune.
Ejemplos
Diseño y caracterización de diacuerpos biespecíficos covalentes
Se construyó un diacuerpo monoespecífico covalente y un diacuerpo biespecífico covalente para evaluar la producción recombinante, la purificación y las características de unión de cada uno. Se encontró que las moléculas de diacuerpos purificadas por afinidad que fueron producidas mediante los sistemas de expresión recombinante descritos en el presente documento, mediante un análisis de SDS-PAGE y de SEC, consistían en especies diméricas individuales. Los análisis de ELISA y de SPR revelaron además que el diacuerpo biespecífico covalente mostraba afinidad por ambos antígenos objetivo y podría unirse simultáneamente a ambos antígenos.
Materiales y métodos:
Construcción y diseño de las moléculas polipeptídicas: se diseñaron vectores de expresión de ácidos nucleicos para producir cuatro construcciones polipeptídicas, representadas esquemáticamente en la FIG. 2. La construcción 1 (la SEQ ID NO: 9) comprendía el dominio VL del anticuerpo 2B6 humanizado, que reconoce el FcyRIIB y el dominio VH del anticuerpo 3G8 humanizado, que reconoce el FcyRIIIA. La construcción 2 (la SEQ ID NO: 11) comprendía el dominio VL de Hu3G8 y el dominio VH de Hu2B6. La construcción 3 (la SEQ ID NO: 12) comprendía el dominio VL de Hu3G8 y el dominio VH de Hu3G8. La construcción 4 (la SEQ ID NO: 13) comprendía el dominio VL de Hu2B6 y el dominio Vh de Hu2B6.
PCR y construcción del vector de expresión: las secuencias codificantes de los dominios VL o VH fueron amplificadas a partir del ADN de molde usando cebadores directos e inversos diseñados de forma que los productos iniciales de la PCR contuvieran secuencias solapantes, permitiendo que la PCR de solapamiento generara las secuencias codificantes de las construcciones polipeptídicas deseadas.
Amplificación inicial mediante una PCR del ADN de molde: se mezclaron suavemente aproximadamente 35 ng del ADN de molde, por ejemplo, la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo de interés; 1 pl de los cebadores directo e inverso 10 pM; 2,5 pl de 10x de tampón pfuUltra (Stratagene, Inc.); 1 pl de dNTP 1o mM; 1 pl de 2,5 unidades/pl de polimerasa de ADN pfuUltra (Stratagene, Inc.); y agua destilada hasta un volumen total de 25 pl, en un tubo de micrófuga, y se rotaron brevemente en una microcentrífuga para recoger la mezcla de reacción del fondo del tubo. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo usando el sistema de PCR GeneAmp 9700 (PE Applied Biosystem) y los siguientes ajustes: 94 °C, 2 minutos; 25 ciclos de 94 °C, cada 15 segundos; 58 °C, 30 segundos; y 72 °C, 1 minuto.
El VL de Hu2B6 fue amplificado a partir de la cadena ligera de Hu2B6 usando los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58, respectivamente. El VH de Hu2B6 fue amplificado a partir de la la cadena pesada de Hu2B6 usando los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 60, respectivamente. El VL de Hu3G8 fue amplificado a partir de la cadena ligera de Hu3G8 usando los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 61, respectivamente. El VH de Hu3G8 fue amplificado a partir de la cadena pesada de Hu3G8 usando los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 63, respectivamente.
Los productos de la PCR fueron electroforetizados en un gel de agarosa al 1 % durante 30 minutos a 120 v. Los productos de la PCR se cortaron del gel y se purificaron usando el kit de extracción MinElute GE1 (Qiagen, Inc.). PCR de solapamiento: los productos iniciales de la PCR se combinaron como se describe a continuación y se amplificaron usando las mismas condiciones de PCR descritas para la amplificación inicial del ADN de molde. Los productos de la PCR de solapamiento también fueron purificados según se ha descrito supra.
La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la construcción 1, la SEQ ID NO: 9 (mostrada esquemáticamente en la FIG. 2), se amplificó mediante la combinación de los productos de la PCR de las amplificaciones del VL de Hu2B6 y del VH de Hu3G8 y los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 63, respectivamente. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la construcción 2, la SEQ ID NO: 11 (mostrada esquemáticamente en la FIG. 2), se amplificó mediante la combinación de los productos de la PCR de las amplificaciones del VL de Hu3G8 y del v H de Hu2B6 y los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 57 y SEQ iD NO: 60, respectivamente. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la construcción 3, la SEQ ID NO: 12 (mostrada esquemáticamente en la FIG. 2), se amplificó mediante la combinación de los productos de la PCR de las amplificaciones del VL de Hu3G8 y del v H de Hu3G8, y los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 57 y SEQ iD NO: 63, respectivamente. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la construcción 4, la SEQ ID NO: 13 (mostrada esquemáticamente en la FIG. 2), se amplificó mediante la combinación de los productos de la PCR de las amplificaciones del VL de Hu2B6 y del VH de Hu2B6 y los cebadores directo e inverso s Eq ID NO: 57 y SEQ ID NO: 60, respectivamente.
Los cebadores directos de los dominios VL (es decir, la SEQ ID NO: 57) y los cebadores inversos de los dominios VH (es decir, la SEQ ID NO: 60 y Sla EQ ID NO: 63) contenían unos sitios de restricción únicos para permitir la clonación del producto final en un vector de expresión. Los productos de la PCR de solapamiento purificados fueron digeridos con las endonucleasas de restricción Nhe I y EcoR I y clonados en el vector de expresión de mamífero pCIneo (Promega, Inc.). Los plásmidos que codifican las construcciones se diseñaron según se identifica en la Tabla 12:
Tabla 12. Construcciones de plásmidos
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Expresión del polipéptido/diacuerpo: el pMGX0669, que codifica la construcción l, fue cotransfectado con el pMGX0667, que codifica la construcción 2, en células HEK-293 usando Lipofectamina 2000 según las instrucciones del fabricante (Invitrogen). La cotransfección de estos dos plásmidos estaba diseñada para que diera lugar a la expresión de un diacuerpo biespecífico covalente (CBD) inmunoespecífico tanto para el FcyRIIB como para el FcyRIIIA (el diacuerpo h2B6-h3G8). El pMGX0666 y el pMGX0668, que codifican las construcciones 3 y 4, respectivamente, fueron transfectados por separado en células HEK-293 para la expresión de un diacuerpo monoespecífico covalente (CMD), inmunoespecífico para el FcyRIIIA (el diacuerpo h3G8) y para el FcyRIIB (el diacuerpo h2B6), respectivamente. Después de tres días en el cultivo, los productos secreteados se purificaron a partir del medio condicionado.
Purificación: los diacuerpos fueron capturados a partir del medio condicionado usando los antígenos pertinentes acoplados a Sepharose 4B activada con CNBr. La resina de afinidad de Sepharose se equilibró en Tris/HCl 20 mM, a un pH de 8,0 antes de la carga. Después de la carga, la resina se lavó con tampón de equilibrado antes de la elución. Los diacuerpos eluyeron desde la resina lavada usando glicina 50 mM a un pH de 3,0. Los diacuerpos eluídos fueron inmediatamente neutralizados con Tris/HCl 1 M a un pH de 8,0 y se concentraron usando una centrifugación de tipo concentrador. Los diacuerpos concentrados fueron purificados adicionalmente mediante una cromatografía de exclusión por tamaños usando una columna Superdex 200 equilibrada con PBS.
SEC: se usó una cromatografía de exclusión por tamaños para analizar el tamaño aproximado y la heterogeneidad de los diacuerpos eluídos desde la columna. El análisis de SEC se llevó a cabo en una columna GE healthcare Superdex 200HR 10/30 y equilibrada con PBS. La comparación con los perfiles de elución de una IgG de longitud completa (~ 150 kDa), de un fragmento Fab (~ 50 kDa) y de un Fv de cadena única (~ 30 kDa) se usaron como controles).
ELISA: la unión de los diacuerpos eluídos y purificados fue caracterizada mediante un ensayo de ELISA, según se describe en 5.4.2. Se recubrieron 50 pl/pocillo de una solución de 2 pg/ml de sCD32B-Ig en una placa de 96 pocillos Maxisorp en tampón de carbonato a 4 °C durante una noche. Se lavó tres veces con PBS-T (PBS, Tween 20 al 0,1 %) y se bloqueó con BSA al 0,5 % en PBS- T durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Posteriormente, se diluyeron el h2B6-h3G8 CBD, el h2B6 CMD o el h3G8 CMD en el tampón de bloqueo en diluciones dobles sucesivas para generar un abanico de concentraciones de diacuerpo, desde 0,5 pg/ml hasta 0,001 pg/ml. Después la placa se incubó a la temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces con PBS-T, se añadieron 50 pl/pocillo de sCD16A-Biotina a 0,2 pg/ml a cada pocillo. La placa se incubó de nuevo a la temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces con PBS-T, se usaron 50 pl/pocillo de una dilución a 1:5.000 de estreptavidina conjugada con HRP (Amersham Pharmacia Biotech) para la detección. La HRP-estreptavidina se dejó en incubación durante 45 minutos a la temperatura ambiente. La placa se lavó tres veces con PBS-T y se reveló usando 80 pl/pocillo de sustrato de TMB. Después de una incubación de 10 minutos, la reacción de HRP-TMB se detuvo mediante la adición de 40 pl/pocillo de H2SO4 al 1 %. Se leyó la DO450 nm mediante el uso de un lector de placas de 96 pocillos y el programa informático SOFTmax, y los resultados se representaron gráficamente usando el programa informático GraphPadPrism 3.03.
Ensayo BIAcore: los parámetros cinéticos de la unión de los diacuerpos eluidos y purificados se analizaron usando un ensayo BIAcore (BIAcore instrument 1000, BIAcore Inc., Piscataway, N. J.) y el programa informático asociado según se describe en la sección 5.4.3.
Se inmovilizaron el sCD16A, el sCD32B o el sCD32A (control negativo) en una de las cuatro celdas de flujo (la celda de flujo 2 ) de la superficie de un chip sensor a través de una química de acoplamiento de amina (mediante la modificación de los grupos carboximetilo con una mezcla de NHS/EDC) de forma que se inmovilizaron aproximadamente 1.000 unidades de respuesta (UR) de cualquiera de los receptores en la superficie. Después de esto, los ésteres activos sin reaccionar fueron “inactivados' con una inyección de Et-NH2 1 M. Una vez preparada una superficie adecuada, se pasaron los diacuerpos biespecíficos covalentes (el CBD h2B6-h3G8) o los diacuerpos monoespecíficos covalentes (el CMD h2B6 o el CMB h3G8) por encima de la superficie mediante inyecciones de 180 segundos de una solución 6,25-200 nM a un caudal de 70 ml/min caudal. También se probó el scFV h3G8 como comparación.
Una vez recogido un conjunto total de datos, las curvas de unión resultantes fueron ajustadas globalmente usando los algoritmos informáticos suministrados por el fabricante, BIAcore, Inc. (Piscataway, Nj). Estos algoritmos calculan tanto la Kon como la Koff, a partir de las cuales se deduce la constante de unión en equilibrio aparente, Kd, como la proporción entre las dos constantes de velocidad (es decir, Kf/Kon). Un tratamiento más detallado de cómo se derivan las constantes de velocidad individuales puede encontrarse en el BIAevaluaion Softwson Handbook (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ).
Las fases de asociación y de disociación se ajustaron por separado. Se obtuvo la constante de velocidad de disociación para un intervalo de 32-34 s de la fase de disociación de 180 s; el ajuste de la fase de asociación se obtuvo mediante un modelo Langmuir 1:1, y el ajuste de la base se seleccionó sobre la base de criterios de Rmáx y chi2 para los diacuerpos biespecíficos y el scFv; se usó el ajuste del analito bivalente para la unión del CMD.
Resultados
El análisis de SDS-PAGE en unas condiciones no reductoras reveló que el producto purificado de los sistemas de expresión CMD h3G8, CMD h2B6 y CBD h2B6-h3G8 era, cada uno, una especie individual con un peso molecular estimado de aproximadamente 50 kDa (FIG. 3, carriles 4, 5 y 6, respectivamente). En unas condiciones reductoras, el producto purificado a partir de cualquiera de los sistemas de expression del CMD corrió como una banda individual (carriles 1 y 2), mientras que se reveló que el producto purificado partir del sistema del CBD h2B6-h3G8 eran 2 proteínas individuales (FIG. 3, carril 3). Todos los polipéptidos purificados a partir del sistema de expresión y visualizados mediante una SDS-PAGE en condiciones reductoras migraron a aproximadamente 28 kDa.
El análisis de SEC de cada de uno de los productos del sistema de expresión también reveló una única especie molecular (FIG. 4B), cada de las cuales eluía aproximadamente al mismo tiempo que un fragmento Fab de la IgG (~ 50 kDa) (FIG. 4A). Los resultados indican que el producto purificado por afinidad era un homodímero covalente homogéneo para el caso del sistema de expresión del CMD, y un heterodímero covalente homogéneo para el caso del CBD h2B6-h3G8.
Se usó un ensayo de ELISA en sándwich para probar la especificidad de unión del CBD h2B6-h3G8 por cualquiera o ambos de la CD32B y/o de la CD16A (FiG. 5). La CD32B sirvió como antígeno objetivo, y se usó la CD16A como la sonda secundaria. La señal positiva del ELISA reveló que el CBD heterodimérico h2B6-h3G8 tenía especificidad por ambos antígenos. Una prueba similar con el CMD h3G8 (que no debería unirse al CD32B) no mostró ninguna señal. El análisis de SPR indicó que el CMD h3G8 reconocía inmunoespecíficamente la sCD16 pero no la sCD32B, que el CMD h2B6 reconocía inmunoespecíficamente la sCD32B pero no la sCD16, y que el CBD h2B6-h3G8 reconocía inmunoespecíficamente tanto la sCD16 como la sCD32B (FIGS. 6A-B). Ninguno de los diacuerpos probados se unió al receptor de control, la sCD32A (FIG. 6C).
El análisis de SPR también se usó para estimar las constantes cinéticas y de equilibrio de los CMD y del CBD h2B6-h3G8 frente a la sCD16 y/o a la sCD32B. Los resultados se compararon con las mismas constantes calculadas para un scFV de h3G8. Las FIGS. 7A-E muestran los resultados gráficos del análisis de SPR. Las constantes cinéticas on y off, así como la constante de equilibrio, calculadas a partir de los resultados representados en la FIG. 7, se proporcionan en la Tabla 13.
Tabla 13. Constantes cinéticas y de equilibrio calculadas a partir de los datos del BIAcore.
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Acoplados con los resultados del análisis del ELISA, los estudios confirman que el heterodímero covalente h2B6-h3G8 retenía la especificidad por ambas CD32B y CD16 y era capaz de unirse a ambos antígenos simultáneamente. La molécula está representada químicamente en la FIG. 8.
Diseño y caracterización de diacuerpos biespecíficos covalentes que comprenden dominios Fc
En un esfuerzo por crear una molécula de tipo IgG, es decir, que comprende un dominio Fc, uno de los polipéptidos que comprende la molécula heterodimérica CBD presentada en el Ejemplo 6.1 fue modificado para que comprendiera adicionalmente un dominio Fc (creando una cadena 'más pesada' y una 'más ligera', análogas a la cadena pesada y ligera de un anticuerpo). La molécula biespecífica heterodimérica contendría entonces un dominio Fc que dimerizaría con una molécula homóloga, formando una molécula de tipo IgG tetramérica con tetravalencia (es decir, formada por una dimerización a través de los dominios Fc de las moléculas biespecíficas heterodiméricas). De forma interesante, dichas moléculas tetraméricas no fueron detectadas en el medio condicionado de los sistemas de expresión recombinantes que usan los ensayos funcionales, por ejemplo, la prueba del medio condicionado para evaluar la unión inmunospecifica a los antígenos objetivo. En su lugar, sólo se detectó una molécula dimérica, que comprende monómeros que consisten en un dominio VL, un VH y un Fc, en dichos ensayos funcionales. Para probar si se cuestionaba la estabilidad de la teórica estructura tetramérica, se diseñaron polipéptidos que comprenden el dominio Fc para que comprendieran adicionalmente una región de bisagra, mientras que los polipéptidos que comprenden la cadena 'más ligera' fueron modificados para que comprendieran adicionalmente los 6 aminoácidos C terminales del dominio constante de la cadena ligera kappa humana. Cuando dichas cadenas rediseñadas 'más pesadas' y 'más ligeras eran coexpresadas en los sistemas de expresión recombinantes, los ensayos funcionales detectaban las moléculas de diacuerpos que eran capaces de unirse inmunoespecíficamente tanto a los antígenos objetivo como a los anticuerpos anti-Fc.
Materiales y métodos
Construcción y diseño de las moléculas polipeptídicas: se diseñaron vectores de expresión de ácidos nucleicos para producir versiones modificadas de las construcciones 1 y 2 presentadas en el Ejemplo 6.1. La construcción 5 (la SEQ ID NO: 14) y la 6 (la SEQ ID NO: 15) fueron creadas mediante la modificación de la construcción 1 y 2, respectivamente, para que comprendieran adicionalmente un dominio Fc. La construcción 7 (la SEQ ID NO: 16) fue creada mediante la modificación de la construcción 1 para que comprendiera adicionalmente la secuencia FNRGEC (la SEQ ID NO: 23) en su C terminal. La construcción 8 (la SEQ ID NO: 18) fue creada mediante la modificación de la construcción 2 para que comprendiera adicionalmente una región de bisagra y un dominio Fc (que comprende la mutación V215A). Una representación esquemática de las construcciones 5-8 se muestra en la FIG. 9.
PCR y construcción del vector de expresión: todos los protocolos de la PCR y de la purificación del producto de la PCR fueron según se describe en el Ejemplo 6.1 Los plásmidos pMGX0669 y pMGX0667 sirvieron como moldes para las secuencias codificantes de las construcciones 1 y 2, respectivamente. Las secuencias codificantes para el dominio Fc de HuIgG y/o el dominio de bisagra eran la SEQ iD NO: 5 o la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 5, respectivamente. Las secuencias codificantes de los ADN de molde se amplificaron usando unos cebadores directo e inverso tales que los productos de la PCR contendrían secuencias solapantes, permitiendo que la PCR de solapamiento generara las secuencias codificantes de los productos deseados.
La secuencia codificante de la construcción 1 fue amplificada a partir del pMGX0669 usando los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 64, respectivamente. La secuencia codificante de la construcción 2 fue amplificada a partir del pMGX0667 usando los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 65, respectivamente. La bisagra HulgG-Fc fue amplificada usando los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68, respectivamente. La construcción 7 (la SEQ ID NO: 16) fue amplificada a partir del pMGX0669 usando los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 69.
PCR de solapamiento: los productos iniciales de la PCR se combinaron como se describe a continuación, se amplificaron y se purificaron según se ha descrito en el ejemplo 6.1.
La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la construcción 5, la SEQ ID NO: 14 (mostrada esquemáticamente en la FIG. 9), fue amplificada mediante la combinación de los productos de la PCR de las amplificaciones de la construcción 1 y el Fc de HuIgG y los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 66, respectivamente. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la construcción 6, la SEQ ID NO: 15 (mostrada esquemáticamente en la FIG. 9), fue amplificada mediante la combinación de los productos de la PCR de las amplificaciones de la construcción 2 y el Fc de HuIgG y los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 66, respectivamente. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la construcción 8, la SEQ iD NO: 18 (mostrada esquemáticamente en la FIG. 9), fue amplificada mediante la combinación de los productos de la PCR de las amplificaciones de la construcción 2 y la bisagra HuIgG-Fc y los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 57 y SEQ iD NO: 68, respectivamente.
Los productos finales se clonaron en el vector de expresión de mamífero pCIneo (Promega, Inc.) según se ha escrito previamente. Las construcciones que codifican el plásmido fueron diseñadas según se identifica en la Tabla 14: Tabla 14. Construcciones de plásmidos
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Expresión del polipéptido/diacuerpo: se llevaron a cabo cuatro cotransfecciones por separado en células HEK-293 usando Lipofectamina 2000, según se describe en la sección 6.1: pMGX0669 y pMGX0674, que codifican las construcciones 1 y 6, respectivamente; pMGX0667 y pMGX0676, que codifican las construcciones 2 y 5, respectivamente; y pMGX0677 y pMGX0678, que codifican las construcciones 7 y 8, respectivamente.
La cotransfección de estos plásmidos se diseñó para que diera lugar a la expresión de un diacuerpo biespecífico (CBD) de tetravalencia con una estructura de tipo IgG, inmunoespecífico tanto para el FcyRIIB como para el FcyRIIIA. También se llevó a cabo una cotransfección adicional: pMGX0674 y pMGX0676, que codifican las construcciones 6 y 5, respectivamente. Después de tres días en cultivo, se recogió el medio condicionado. La cantidad de producto secretado en el medio condicionado se cuantificó mediante un ELISA anti Fc de la IgG usando Fc purificado como patrón. Las concentraciones de producto en las muestras se normalizaron después sobre la base de la cuantificación, y se usaron las muestras normalizadas para el resto de los ensayos.
ELISA: se ensayó la unión de las moléculas de diacuerpos secretadas en el medio mediante un ELISA en sándwich, según se ha descrito, supra. Salvo que se indique, se usó la CD32B para recubrir la placa, es decir, como la proteína objetivo, y se usó la CD16 conjugada con HRP como la sonda.
Resultados
Se usó un ensayo de ELISA para probar las muestras normalizadas de los sistemas de expresión recombinante que comprenden las construcciones 1 y 6 (pMGX669-pMGX674), las construcciones 2 y 5 (pMGX667-pNGX676) y las construcciones 5 y 6 (pMGX674-pMGX676) para evaluar la expresión de las moléculas de diacuerpos capaces de una unión simultánea a la CD32B y a la CD16A (FIG. 10). Los datos del ELISA indicaron que la cotransfección con las construcciones 1 y 6 o la cotransfección con las construcciones 2 y 5 no consiguieron producir un producto que pudiera unirse a alguno o a ambos de los antígenos (FIG. 10, □ y ▲, respectivamente). Sin embargo, la cotransfección de las construcciones 5 y 6 dio lugar a la secreción de un producto capaz de unirse a ambos antígenos CD32B y CD16. El último producto era un dímero de las construcciones 5 y 6, que contiene un sitio de unión para cada antígeno con la estructura representada esquemáticamente en la FIG. 11.
Con objeto de guiar la formación de una estructura heterotetramérica de tipo IgG, se unió la secuencia codificante de seis aminoácidos adicionales al C terminal de la construcción 1, generando la construcción 7 (la SEQ ID NO: 16 y mostrada esquemáticamente en la FIG. 9). Los seis aminoácidos adicionales, FNRGEC (la SEQ ID NO: 23), derivaban del extremo C terminal de la cadena ligera Kappa, y normalmente interactúan con el dominio de bisagra superior de la cadena pesada en una molécula de IgG. Después se modificó un dominio de bisagra en la construcción 6, generando la construcción 8 (la SEQ ID NO: 18 y la FIG. 9). La construcción 8 comprendía adicionalmente una mutación de aminoácido en la región de bisagra superior, A215V. Después se cotransfectaron plásmidos de expresión que codifican la construcción 7 y la construcción 8, pMGX677 y pMGX678, respectivamente, en células HEK-293, y se expresaron según se describe.
Las moléculas de diacuerpos producidas a partir del sistema de expresión recombinante que comprende las construcciones 7 y 8 (pMGX0677 pMGX0678), se compararon en un ensayo de ELISA para evaluar la unión de la CD32B y de la CD16a a las moléculas de diacuerpos producidas a partir de los sistemas de expresión que comprenden las construcciones 1 y 6 (pMGX669 pMGX674), las construcciones 2 y 8 (pMGX669 pMGX678) y las construcciones 6 y 7 (pMGX677 pMGX674) (FIG. 12).
Como antes, la molécula producida mediante el sistema de expresión que comprende las construcciones 1 y 6 (pMGX669 pMGX674) resultó ser incapaz de unirse a la CD32a ni a la CD16A (la FIG. 10 y la FIG. 12). Por el contrario, el producto de la coexpresión de cualquiera de las construcciones 7 y 6 (pMGX0677 pMGX0674) o de la coexpresión de las construcciones 7 y 8 (pMGX0677-pMGX0678) era capaz de unirse tanto a la CD32B como a la CD16 (FIG. 12). Se aprecia que la construcción 7 es análoga a la construcción 1, con la excepción de que la construcción 7 comprende la secuencia C terminal FNRGEC (la SEC ID NO: 23); y que la construcción 8 es análoga a la construcción 6, excepto porque la construcción 8 comprende un dominio de bisagra y la mutación A215V. Los datos indican que la adición de 6 aminoácidos adicionales en el C terminal de la cadena ligera C-kappa (FNRGEC; la SEQ ID NO: 23) a la cadena no portadora del Fc, 'más ligera', ayudó a estabilizar la formación de las moléculas de diacuerpos tetraméricas de tipo IgG, independientemente de si la correspondiente cadena más pesada comprendía un dominio de bisagra (es decir, pMGX0677 pMGX0674 y pMGX0677-pMGX0678, FIG. 12). La adición del dominio de bisagra al polipéptido portador del Fc 'más pesado', sin la adición de la secuencia FNRGEC (la SEQ ID NO: 23) C terminal a la correspondiente cadena 'más ligera', era aparentemente incapaz de efectuar una estabilización similar (es decir, carece de la unión por parte del producto de la cotransfección de las construcciones 2 y 8 (pMGX669 pMGX678)). La estructura de la molécula de diacuerpo tetramérica está representada esquemáticamente en la FIG. 13.
Efecto del orden del dominio y de los puentes de disulfuro adicionales sobre la formación del diacuerpo tetramérico de tipo IgG
Se investigó el efecto de la estabilización adicional entre las cadenas polipeptídicas 'más ligeras' y 'más pesadas' de la molécula de diacuerpo tetramérica de tipo IgG mediante la sustitución de residuos seleccionados de las cadenas polipeptídicas por cisteínas. Los residuos adicionales de cisteína proporcionan puentes de disulfuro adicionales entre las cadenas 'más pesadas' y las 'más ligeras'. Adicionalmente, se investigó el orden del dominio sobre la actividad de unión mediante el desplazamiento del dominio Fc o del dominio de bisagra-Fc desde el extremo C terminal de la cadena polipeptídica al N terminal. Aunque la actividad de unión de la molécula que comprende los puentes de disulfuro adicionales no estaba alterada con respecto a las moléculas de diacuerpos construidas previamente con dichos enlaces, la transferencia del dominio Fc o del bisagra-Fc al N terminal de la cadena polipeptídica 'más pesada' que comprende el diacuerpo sorprendentemente mejoró la afinidad de unión y/o la avidez de la molécula biespecífica por uno o ambos de sus antígenos objetivo.
Materiales y métodos
Construcción y diseño de las moléculas polipeptídicas: se diseñaron vectores de expresión de ácidos nucleicos para producir versiones modificadas de las construcciones 5, 6 y 8 presentadas en el Ejemplo 6.2. La construcción 9 (la SEQ ID NO: 19) y la construcción 10 (la SEQ ID NO: 20) (mostradas ambas esquemáticamente en la FIG. 13) eran análogas a las construcciones 8 y 6, con la excepción de que el dominio Fc o el dominio de bisagra-Fc, respectivamente, se habían desplazado desde el C terminal del polipéptido hasta el N terminal. Adicionalmente, todos los dominios Fc usados eran dominios Fc de la IgG1 natural. La construcción 11, la SEQ ID NO: 21, (mostrada esquemáticamente en la FIG. 14) era análoga a la construcción 2 del Ejemplo 6.1 excepto porque el C terminal se diseñó para que comprendiera adicionalmente la secuencia FNRGEC (la SEQ ID NO: 23). La construcción 12, la SEQ ID NO: 22 (mostrada esquemáticamente en la FIG. 14), era análoga a la construcción 5 del Ejemplo 6.2 excepto porque el dominio Fc comprendía adicionalmente una región de bisagra. También, para las construcciones 11 y 12, el dominio VL de 2B6 y el dominio VH de 2B6 comprendían una única modificación de aminoácido (G105C y G44C, respectivamente) de forma que una glicina de cada dominio estaba sustituida por una cisteína.
PCR y construcción del vector de expresión: todos los protocolos de la PCR y los productos de la purificación de la PCR fueron según se ha descrito en el Ejemplo 6.1 y 6.2
PCR de solapamiento: los productos finales se construyeron, se amplificaron y se purificaron usando los métodos descritos en el ejemplo 6.1 y en el ejemplo 6.2.
Los productos finales se clonaron en el vector de expresión de mamífero pCIneo (Promega, Inc.) según se ha descrito previamente. El plásmido que codifica las construcciones se diseñó según se identifica en la Tabla 15: Tabla 15. Construcciones de plásmidos
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Expresión del polipéptido/diacuerpo: se llevaron a cabo tres cotransfecciones por separado en células HEK-293 usando Lipofectamina 2000, según se describe en la sección 6.1: pMGX0669 y pMGX07l9, que codifican las construcciones 1 y 9, respectivamente; pMGX0669 y pMGX07l8, que codifican las construcciones 1 y 10, respectivamente; y pMGX0617 y pMGX0717, que codifican las construcciones 11 y 12, respectivamente. La cotransfección de estos plásmidos se diseñó para que diera lugar a la expresión de un diacuerpo biespecífico (CBD) de tetravalencia con una estructura de tipo IgG, inmunoespecífico tanto para el FcyRIIB como para el FcyRIIIA. Después de tres días en cultivo, se recogió el medio condicionado. La cantidad de producto secretado en el medio condicionado se cuantificó mediante un ELISA anti Fc de la IgG usando Fc purificado como patrón. Las concentraciones de producto en las muestras se normalizaron después sobre la base de la cuantificación, y se usaron las muestras normalizadas para el resto de los ensayos.
ELISA: se ensayó la unión de las moléculas de diacuerpos secretadas en el medio mediante un ELISA en sándwich, según se ha descrito, supra. Salvo que se indique, se usó la CD32B para recubrir la placa, es decir, como la proteína objetivo, y se usó la CD16 conjugada con HRP como la sonda
Inmunotransferencia Western: se analizaron aproximadamente 15 ml de medio condicionado procedente de las tres cotransfecciones descritas anteriormente mediante una SDS-PAGE en unas condiciones no reductoras. Se tiñó un gel con Simply Blue Safestain (Invitrogen) y se transfirió un gel idéntico a una membrana de PVDF (Invitrogen) usando los métodos de transferencia convencionales. Después de la transferencia, la membrana se bloqueó con leche desnatada en polvo al 5% en 1x de PBS. Después, la membrana se incubó en 10 ml de H+L anti IgG1 humana de cabra conjugada con HRP diluida a 1:8.000 en leche desnatada en polvo al 2 % 1x de PBS/Tween 20 al 0,1 % a la temperatura ambiente durante 1 h con una agitación suave. Después de un lavado con 1x de PBS/Tween 20 al 0,3%, 2x 5 min de cada uno, después 20 min a la temperatura ambiente, la membrana se reveló con un sistema de detección de inmunotransferencia Western ECL (Amersham Biosciences) según las instrucciones del fabricante. La película se reveló en un procesador de rayos X.
Resultados
El medio condicionado de los sistemas de expresión recombinantes que comprenden las construcciones 1 y 9; las construcciones 1 y 10; y las construcciones 11 y 12, se analizó mediante un análisis de SDS-PAGE (en unas condiciones no reductoras) y una inmunotransferencia Western (usando un anti-IgG como la sonda). La inmunotransferencia Western reveló que el producto de los sistemas que comprenden las construcciones 11 y 12 o los que comprenden las construcciones 9 y 1 formaba predominantemente una única especie de molécula de aproximadamente 150 kDa (FIG. 14, carriles 3 y 2, respectivamente). Estos dos productos tienen puentes de disulfuro internos modificados entre las cadenas 'más ligeras' y las 'más pesadas' que comprenden el diacuerpo. Por el contrario, la molécula sin los puentes de disulfuro internos modificados entre las cadenas 'más ligeras' y las 'más pesadas', formada por las construcciones 10 y 1, formaba al menos dos especies moleculares con unos pesos moleculares de ~ 75 y de ~ 100 kDa (FIG. 14, carril 1).
A pesar de los resultados de la inmunotransferencia Western, se averiguó que cada uno de los tres productos era capaz de unirse tanto a la CD32A como a la CD16 (FIG. 15). Sorprendentemente, con respecto al producto que comprende un dominio de bisagra-Fc C terminal (formado por las construcciones 11 y 12), el producto de ambos sistemas en los que el dominio Fc (o el Fc-bisagra) estaba en el amino terminal de la cadena polipeptídica que contiene el Fc (es decir, la cadena 'más pesada') (las construcciones 9 1 y las construcciones 10+1) mostró un aumento en la afinidad y/o en la avidez por uno o ambos de sus péptidos objetivo (es decir, la CD32B y/o la CD16).
Efecto del sitio de escisión interno/externo sobre el procesamiento del precursor de la poliproteína y la expresión del diacuerpo biespecífico covalente; diseño y caracterización de las porciones que comprenden el diacuerpo biespecífico de la cadena lambda y el dominio de bisagra de la IgG humana
Según se describe en el presente documento, las cadenas polipeptídicas individuales del diacuerpo o de la molécula de diacuerpo de la invención puede ser expresadas en forma de una molécula precursora de poliproteína individual. Se probó la capacidad de los sistemas recombinantes descritos en los Ejemplos 6.1-6.3 para procesar y expresar apropiadamente un CBD funcional a partir de dicho precursor de poliproteína mediante la modificación de un ácido para que codificara tanto la primera como la segunda cadena polipeptídica de un CBD separadas por un sitio de escisión interno, en particular, un sitio de escisión de furina. El CBD funcional se aisló a partir del sistema recombinante que comprende la molécula precursora de poliproteína.
Según se analiza en el Ejemplo 6.3, se averiguó que la adición de los 6 aminoácidos C terminales de la cadena ligera kappa humana, FNRg Ec (la SEQ ID NO: 23) estabiliza la formación del diacuerpo — posiblemente a través de un aumento en la interacción intercatenaria entre los dominios que comprenden la SEQ ID NO: 23 y aquellos dominios que comprenden un dominio Fc o un dominio de bisagra-Fc. El efecto estabilizador de esta interacción de tipo cadena lambda/Fc se probó en el CBD en el que ninguna cadena polipeptídica comprendía un dominio Fc. Se modificó una cadena polipeptídica del diacuerpo para que comprendiera la SEQ ID NO: 23 en su C terminal; la cadena polipeptídica compañera se modificó para que comprendiera la secuencia de aminoácidos VEPKSC (la SEQ ID NO: 79), que derivaba del dominio de bisagra de una IgG. La comparación de este CBD con el formado por las construcciones 1 y 2 (del ejemplo 6.1) reveló que el CBD que comprende los dominios derivados del dominio de bisagra y la cadena lambda mostraba una afinidad ligeramente mayor por uno o ambos de sus epítopos objetivo. Materiales y métodos
• Construcción y diseño de las moléculas polipeptídicas: precursor de poliproteína: se diseñaron vectores de expresión de ácidos nucleicos para producir 2 moléculas precursoras de poliproteína, representadas ambas esquemáticamente en la FIG. 17. La construcción 13 (la SEQ ID NO: 97) comprendía desde el N terminal de la cadena polipeptídica, el dominio VL de 3G8, el dominio VH de 2.4G2 (que se une a la mCD32B), un sitio de escisión de furina, el dominio VL de 2.4G2 y el dominio VH de 3G8. La secuencia de nucleótidos que codifica la construcción 13 se proporciona en la SEQ ID NO: 98. La construcción 14 (la SEQ ID NO: 99) (FIG. 17), comprendía desde el N terminal de la cadena polipeptídica, el dominio VL de 3G8, el dominio VH de 2.4G2 (que se une a la mCD32B), un sitio de escisión de furina, un sitio de FMD (la proteasa C3 del virus de la glosopeda), el dominio VL de 2.4G2 y el dominio VH de 3G8. La secuencia de nucleótidos que codifica la construcción 14 se proporciona en la SEQ ID NO: 100.
Se diseñaron vectores de expresión de ácidos nucleicos para producir las versiones modificadas de las construcciones 1 y 2 presentadas en el Ejemplo 6.1. La construcción 15 (la SEQ ID NO: 101) (FIG. 17) era análoga a la construcción 1 (la SEQ ID NO: 9), presentada en ejemplo 6.1, con la excepción de que el C terminal de la construcción 15 comprendía la secuencia de aminoácidos FNRGEC (la SEQ ID NO: 23). La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la construcción 15 se proporciona en la SEQ ID NO: 102. La construcción 16 (la SEQ ID NO: 103) (FIG. 17) era análoga a la construcción 2, presentada en el Ejemplo 6.1, con la excepción de que el C terminal de la construcción 16 comprendía la secuencia de aminoácidos VEPSK (la SEQ ID NO: 79). La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la construcción 16 se proporciona en la SEQ ID NO: 104.
PCR y construcción del vector de expresión: todos los protocolos de la PCR y los productos de la purificación de la PCR fueron según se ha descrito en el Ejemplo 6.1 y 6.2
PCR de solapamiento: los productos finales se construyeron, se amplificaron y se purificaron usando los métodos descritos en el ejemplo 6.1 y en el ejemplo 6.2 con los cebadores apropiados.
Los productos finales se clonaron en el vector de expresión de mamífero pCIneo (Promega, Inc.) según se ha descrito previamente. El plásmido que codifica las construcciones se diseñó según se identifica en la Tabla 16:

Claims (28)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de diacuerpo que comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, en la que:
(a) dicha primera cadena polipeptídica comprende, en la dirección desde N terminal hacia C terminal:
(i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de la cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo,
(ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de la cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo, y
(hi) un tercer dominio que comprende la secuencia de aminoácidos FNRGEC (la SEQ ID NO: 23), la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 79) o la mutación V215A de las mismas que tiene la secuencia AEPKSC (residuos de aminoácidos 245-350 de SEQ ID NO: 18); y en la que dicho primer dominio y segundo dominio están unidos covalentemente entre sí mediante un conector peptídico de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 residuos de aminoácidos, de forma que el primer dominio y el segundo dominio no se asocian para formar un sitio de unión del epítopo; y
(b) dicha segunda cadena polipeptídica comprende, en la dirección desde N terminal hacia C terminal:
(i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de la cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2)
(ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de la cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1), y
(iii) un sexto dominio que comprende la secuencia de aminoácidos FNRGEC (SEQ ID NO: 23), la secuencia de aminoácidos VEPKSC (s Eq ID NO: 79) o la mutación V215A de las mismas que tiene la secuencia AEPKSC (residuos de aminoácidos 245-350 de SEQ ID NO: 18);
y en la que:
(1) cuando dicho tercer dominio comprende dicha secuencia de aminoácidos FNRGEC (SEQ ID NO: 23), dicho sexto dominio comprende dicha secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 79) o la mutación V215A de la misma, y cuando dicho tercer dominio comprende dicha secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 79) o la mutación V215A de la misma, dicho sexto dominio comprende dicha secuencia de aminoácidos FNRGEC (SEQ ID NO: 23);
(2) dicho cuarto dominio y quinto dominio están unidos covalentemente entre sí mediante un péptido de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 residuos de aminoácidos, de forma que el cuarto dominio y el quinto dominio no se asocian para formar un sitio de unión del epítopo;
(3) dicha primera cadena polipeptídica y dicha segunda cadena polipeptídica están unidas covalentemente a través de un puente de disulfuro entre dicho tercer dominio y dicho sexto dominio;
(4) dicho primer dominio y dicho quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1) (VH1) que se une a dicho primer epítopo;
5) dicho segundo dominio y dicho cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que se une al segundo epítopo; y
(6) dicho primer y segundo epítopo son diferentes;
y en la que la molécula de diacuerpo es capaz de unirse simultáneamente al primer y al segundo epítopo.
2. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 1, en la que dicho tercer dominio y/o dicho sexto dominio comprenden adicionalmente un dominio de bisagra.
3. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 1, en la que dicho tercer dominio y/o dicho sexto dominio comprenden adicionalmente un dominio Fc.
4. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 1, en la que dicho tercer dominio y/o dicho sexto dominio comprenden adicionalmente un dominio de bisagra y un dominio Fc.
5. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 1, en la que dicho tercer dominio comprende la secuencia FNRGEC (SEQ ID NO: 23).
6. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 1, en la que dicho tercer dominio comprende la secuencia VEPKSC (SEQ ID NO: 79) o la mutación V215A que tiene la secuencia AEPKSC (residuos de aminoácidos 245-350 de SEQ ID NO: 18).
7. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 1, en la que (i) dicho tercer dominio comprende la secuencia FNRGEC (SEQ ID NO: 23) y dicho sexto dominio comprende la secuencia VEPKSC (SEQ ID NO: 79) o la mutación V215A que tiene la secuencia AEPKSC (residuos de aminoácidos 245-350 de SEQ ID NO: 18) y un dominio Fc; o (ii) dicho tercer dominio comprende la secuencia VEPKSC (SEQ ID NO: 79) o la mutación V215A que tiene la secuencia AEPKSC (residuos de aminoácidos 245-350 de SEQ ID NO: 18) y un dominio Fc, y dicho sexto dominio comprende la secuencia FNRGEC (SEQ ID NO: 23).
8. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 1, en la que (i) dicho tercer dominio comprende la secuencia FNRGEC (SEQ ID NO: 23) y dicho sexto dominio comprende un dominio de bisagra; o (ii) dicho tercer dominio comprende un dominio de bisagra y dicho sexto dominio comprende la secuencia FNRGEC (SEQ ID NO: 23).
9. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 1, en la que (i) dicho tercer dominio comprende la secuencia FNRGEC (SEQ ID NO: 23) y dicho sexto dominio comprende un dominio de bisagra y un dominio Fc; o (ii) dicho tercer dominio comprende un dominio de bisagra y un dominio Fc, y dicho sexto dominio comprende la secuencia FNRGEC (SEQ ID NO: 23).
10. La molécula de diacuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 9, en la que el dominio Fc es un dominio Fc humano.
11. La molécula de diacuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la primera inmunoglobulina o la segunda inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana o humanizada, inmunoglobulina humana o humanizada que es una IgA, una IgE, una IgD, una IgG o una IgM.
12. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 11, en la que la inmunoglobulina humana o humanizada es una IgG, IgG que se selecciona entre la lista que consiste en la IgG1, la IgG2, la IgG3 y la IgG4.
13. La molécula de diacuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que al menos un sitio de unión del epítopo es específico para un receptor FcyRI, FcyRII o FcyRIII.
14. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 13, en la que el receptor Fcy es un receptor FcyRIII, receptor FcyRIII que es un receptor FcyRIIIA (CD16A) o un receptor FcyRIIIB (CD16b ).
15. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 14, en la que el receptor FcyRIII es un receptor FcyRIIIA (CD16A).
16. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 15, en la que el receptor Fcy es un receptor FcyRII, receptor FcyRII que es un receptor FcyRIIA (CD32A) o un receptor FcyRIIB (CD32B).
17. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 16, en la que el receptor FcyRII es el receptor FcyRIIB (CD32B).
18. La molécula de diacuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en la que el primer y el segundo epítopo están en antígenos diferentes.
19. La molécula de diacuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en la que el primer y el segundo epítopo están en células diferentes.
20. La molécula de diacuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en la que al menos un sitio de unión del epítopo es específico para un antígeno patógeno, o para un oncoantígeno.
21. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 13, en la que dicha molécula de diacuerpo tiene un sitio de unión del epítopo específico para la CD32B y un sitio de unión del epítopo específico para la CD16a .
22. La molécula de diacuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en la que al menos un sitio de unión del epítopo es específico para una toxina o un fármaco.
23. La molécula de diacuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 4, o 7 a 22, en la que dicha molécula de diacuerpo es un dímero, comprendiendo dicho dímero:
(a) un primer monómero que comprende un conjunto de dicha primera cadena polipeptídica y dicha segunda cadena polipeptídica; y
(b) un segundo monómero que comprende un conjunto de dicha primera cadena polipeptídica y dicha segunda cadena polipeptídica;
en la que dicho primer y segundo monómero están unidos covalentemente a través de al menos un puente de disulfuro entre al menos un residuo de cisteína en el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica de cada monómero.
24. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica de la molécula de diacuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23.
25. Una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 24.
26. La molécula de diacuerpo de la reivindicación 20 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o de un trastorno caracterizado por dicho antígeno patógeno o dicho oncoantígeno.
27. La molécula de diacuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 para su uso como un producto farmacéutico, en la que el primer epítopo es expresado en un tipo de célula diferente que el segundo epítopo, de forma que el diacuerpo puede juntar las dos células entre sí.
28. La molécula de diacuerpo para su uso según la reivindicación 26, en la que dicha enfermedad o trastorno es cáncer o una enfermedad infecciosa.
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