JP2018530574A - 患者の加齢黄斑変性を治療する方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、とりわけ、患者の加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を治療する方法であって、有効量のＣ５阻害剤またはＣ５ａ阻害剤を投与するステップを含む方法に関する。

Description

配列表の組み込み
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照により全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１６年９月３０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１９００−４１７ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名前でサイズが５７０４４バイトである。

本発明は、免疫学および免疫学的障害の分野に関する。

ヒトでは、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、先進国における失明の主因である。この疾患は、５０歳以上の成人で最も一般的であり、現在、推定１７５万人のアメリカ人が進行したＡＭＤと診断されている。ＡＭＤは徐々に、ヒトの眼における視覚の微細な調整の中心部位である黄斑の変性をもたらす。進行型ＡＭＤは、ドライ型（萎縮型）および滲出型ＡＭＤの２つの形態で生じる。

萎縮型ＡＭＤは、黄斑網膜色素上皮（ＲＰＥ）の薄化または消失およびブルッフ膜（ＢｒＭ）の肥厚を特徴とし、萎縮領域（地図状萎縮またはＧＡ）をもたらし、ＡＭＤに罹患した人々の大部分に影響を及ぼす。ＲＰＥとＢｒＭとの間で増加する大型ドルーゼン（細胞外物質の結晶沈着物）および線状沈着物（基底膜沈着物）の出現が、ドライ型ＡＭＤの指標である。これらの沈着物は、ＢｒＭの水分伝導度に干渉し、ＲＰＥの完全性を損ない、最終的に光受容体の健康に影響を及ぼし、網膜変性をもたらす。

滲出型ＡＭＤは、ＲＰＥ／ブルッフ膜の破壊、血管新生促進因子ＶＥＧＦの放出増加および脈絡膜新生血管化（ＣＮＶ）の発達を特徴とする。

ＣＮＶでは、新たに形成された脈絡膜血管がＲＰＥ／ＢｒＭを通って増殖する。新しい血管は漏出性なので、ＲＰＥと網膜との間に液体が蓄積し、光受容体とＲＰＥとの間の接続が壊される。液体が排出され、網膜が再接着することができない限り、光受容体が失われ、視力喪失に至る。

新しい、有効なＡＭＤの治療が必要とされている。

本開示は、患者のＡＭＤを治療する方法であって、有効量のＣ５阻害剤（例えば、エクリズマブを含む抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはエクリズマブ変異体もしくはその抗原結合フラグメントなど）またはＣ５ａ阻害剤（抗Ｃ５ａ抗体もしくはその抗原結合フラグメントなど）のいずれか（または両方）である阻害剤を患者に投与するステップを含む方法を提供することによって上記課題を解決する。

多数の他の態様が、本発明のこれらおよび他の態様により提供される。本発明の他の特徴および態様は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。

図１は、経時的な眼内のＴ細胞遺伝子発現を示す。ＣＮＶ後のＩＬ−１７、ＲＯＲγおよびγδＴＲ（γδＴ細胞受容体）の発現を、１２時間、２４時間、２日、３日および６日間で測定した。ＩＬ−１７ ｍＲＮＡのレベルは、ＣＮＶの２４時間後にピークに達し、６日間にわたって上昇したままであった。γδＴＲレベルは、同様に、６日目まで上昇し、２４時間でピークが観察された。ＲＯＲγレベルは、ＣＮＶの存在下で変化しないままであった。示されるデータは、１試料あたりの平均値（±ＳＥＭ）である。 図２は、眼抗原に応答したＴ細胞増殖を示す。ＣＮＶ動物の脾臓に由来するＴ細胞を種々の眼抗原によって刺激し、Ｔ細胞増殖を測定した。ＲＰＥ／脈絡膜（ＲＰＥ）抽出物および網膜タンパク質ＩＲＢＰおよびＳ抗原によって刺激された脾細胞は、対照と比較して増殖の中等度の増加（２〜３倍）を示した；一方、網膜抽出物による刺激はＴ細胞増殖のずっと大きな（６倍）増加をもたらした。示されるデータは、１試料あたりの平均値（±ＳＤ）である。 図３は、抗体の特徴付けを示す。（Ａ）ＰＢＳ、抗Ｃ５、抗Ｃ５ａおよび抗体対照１２Ｂ４を注射したマウスの血清を、溶血アッセイの使用を通して補体活性化について分析した。抗Ｃ５抗体処置動物の血清は、ヒツジ赤血球を溶解することができず、補体活性化の遮断を成功させることが示された。抗Ｃ５ａ、ＰＢＳまたは１２Ｂ４を注射したマウスにおける溶解の間に有意な差は報告されなかった。示されるデータは、１試料あたりの平均値（±ＳＥＭ）である。（Ｂ）バイオレイヤー干渉法（ｂｉｏ−ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）を用いて、マウスＣ５ａに特異的なモノクローナル抗体の特異性がその標的であるマウスＣ５ａに１桁のｎＭ親和性で結合することを確認した。 図４は、抗Ｃ５および抗Ｃ５ａを注射した動物においてＣＮＶが減少することを示す。レーザー誘発ＣＮＶの後、ＯＣＴを使用して、抗Ｃ５、抗Ｃ５ａまたは１２Ｂ４（対照）の存在下での病変サイズを測定した。ＯＣＴ像は、対照（ａ）と比較した場合、抗Ｃ５および抗Ｃ５ａの処理による病変サイズの減少を示す。これらの結果の定量化（ｂ）は、抗Ｃ５および抗Ｃ５ａ（Ｐ≦０．０１）を注射した場合、病変サイズのほぼ４０％の減少を示した。示されるデータは、１病変あたりの平均値（±ＳＥＭ）である。 図５は、抗Ｃ５を注射した動物が、より低い眼抗Ｃ５ａレベルを有することを示す。ＲＰＥ／脈絡膜のＥＬＩＳＡ測定は、ＣＮＶ誘発後のＣ５ａレベルの上昇を示した（Ｐ≦０．００１）。この増加は抗Ｃ５処理マウスで排除された；一方、抗Ｃ５ａおよび１２Ｂ４対照抗体で処理したマウスは、眼Ｃ５ａの対照レベルを有していた。示されるデータは、平均値（±ＳＥＭ）である。 図６は、Ｔ細胞に対するＣ５ａおよびＣ５の効果を示す。ＣＮＶ誘発の６日後に脾臓（ｂ）および眼（ａ）試料を単離し、Ｔｈ−１７（ＲＯＲγ）およびγδＴ細胞（γδＴＲ）に特異的なプライマーを用いてＱＲＴ−ＰＣＲによって分析した。（Ａ）ＣＮＶ後、抗Ｃ５および抗Ｃ５ａで処理したマウスは、ＩＬ−１７およびγδＴＲ遺伝子発現の眼レベルの有意な低下を示したが、ＲＯＲγレベルは変化しなかった。（Ｂ）ＣＮＶマウスのＴ細胞特異的遺伝子の脾臓レベルは、抗Ｃ５および抗Ｃ５ａで処理したマウスにおいてＲＯＲγレベルが対照レベルに戻るが、γδＴＲは上昇したままであることを示した。 図７は、ＲＰＥ細胞に対するＩＬ−１７の効果を示す。（Ａ）成熟ＡＲＰＥ−１９細胞単層で頂端ＩＬ−１７暴露（apical IL-17 exposure）（５ｎｇ／ｍＬ）後の遺伝子発現の変化を測定した。Ｃ３ならびにＩＬ−１７発現レベルは、対照よりも倍数変化の増加を示したが、ＶＥＧＦおよびＣＦＨは変化しなかった。（Ｂ）経上皮抵抗測定値は、４時間後に５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１７の頂端適用に応答してバリア機能の喪失を示した。 図８は、硝子体内（ＩＶＴ）投与が、２０ｍｇ／ｋｇのエクリズマブのＩＶ投与よりも網膜および硝子体内のより高いエクリズマブ（Ｅｃ）濃度をもたらしたことを示す。 図９はＩＶ投与が、血管新生化した眼区画：脈絡膜／強膜、視神経、毛様体および虹彩中ＩＶＴよりも高濃度のエクリズマブ（Ｅｃ）をもたらしたことを示す。 エクリズマブ（Ｅｃ）のＩＶＴ投与が２．８〜３．６日に及ぶ硝子体Ｔ１／２をもたらすことを示す。 エクリズマブのＩＶ投与ではなく硝子体内投与が、ドライ型ＡＭＤ患者において硝子体Ｃ５を飽和させるのに十分であることを示す図である。 エクリズマブが、単回ＩＶＴ投与後６週間を超えて硝子体液中のＣ５結合活性を維持することを示す。 初期治療の５時間後のカニクイザルにおける局所投与後のエクリズマブｓｃＦｖ組織分布を示す図である。組織中のエクリズマブｓｃＦｖ多量体化が有効な網膜濃度の過小評価につながる可能性があることに留意されたい。局所投与されたエクリズマブｓｃＦｖは、ＮＨＰの網膜にアクセスすることができる。エクリズマブの局所投与後に角膜刺激は観察されなかった。血清：０．１２ｎｇ／ｍｇタンパク質であることに留意されたい。 単回点眼（ｐｇ／ｍｇのタンパク質）後の推定エクリズマブｓｃＦｖ可溶性多量体濃度を示す図である。

本明細書で使用される場合、名詞の前の「ａ」または「複数」という単語は、特定の名詞の１つまたは複数を表す。例えば、「哺乳動物細胞（ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ）」という句は、「１個または複数の哺乳動物細胞」を表す。

「抗体」という用語は、当技術分野で公知である。「抗体」という用語は、しばしば「免疫グロブリン」という用語と互換的に使用される。簡潔には、この用語は、２個の軽鎖ポリペプチドおよび２個の重鎖ポリペプチドを含む完全抗体を意味し得る。完全抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体を含む異なる抗体アイソタイプを含む。「抗体」という用語は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ化またはキメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）抗体および完全ヒト抗体を含む。抗体は、種々の種、例えばヒト、ヒト以外の霊長類（例えば、オランウータン、ヒヒまたはチンパンジー）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ラットおよびマウスなどの哺乳動物のいずれかで作製するまたはこれらの哺乳動物のいずれかから得ることができる。抗体は、精製抗体または組換え抗体であり得る。
抗体は、少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む操作されたタンパク質または抗体様タンパク質（例えば、融合タンパク質）であってもよい。操作されたタンパク質または抗体様タンパク質は、二重特異性抗体もしくは三重特異性抗体、または二量体、三量体もしくは多量体抗体、またはダイアボディ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＣＯＤＶ−Ｉｇ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）もしくはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）であってもよい。抗体という用語は、抗体フラグメントも含む。

「抗体フラグメント」、「抗原結合フラグメント」という用語または類似の用語は、当技術分野で公知であり、例えば、標的抗原（例えば、ヒトＣ５またはヒトＣ５ａ）に結合する能力を保持し、標的抗原の活性を阻害する抗体のフラグメントを意味し得る。このような抗体フラグメントには、例えば、一本鎖抗体、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントが含まれる。ｓｃＦｖフラグメントは、ｓｃＦｖが由来する抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方を含む単一ポリペプチド鎖である。さらに、細胞内抗体、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）およびダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）もまた、抗体の定義に含まれ、本明細書に記載される方法における使用に適合する。例えば、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａら（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８（１）：４７〜６６；ＨｕｄｓｏｎおよびＫｏｒｔｔ（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１（１）：１７７〜１８９；Ｐｏｌｊａｋ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２（１２）：１１２１〜１１２３；ＲｏｎｄｏｎおよびＭａｒａｓｃｏ（１９９７）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５１：２５７〜２８３を参照されたい。抗原結合フラグメントはまた、重鎖ポリペプチドの可変領域および軽鎖ポリペプチドの可変領域を含むことができる。したがって、抗原結合フラグメントは、抗体の軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドのＣＤＲを含むことができる。

「抗体フラグメント」という用語はまた、例えば、ラクダ化単一ドメイン抗体などの単一ドメイン抗体を含むことができる。例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ２６：２３０〜２３５；Ｎｕｔｔａｌｌら（２０００）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ １：２５３〜２６３；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２３１：２５〜３８；ＰＣＴ出願公開である国際公開第９４／０４６７８号パンフレットおよび国際公開第９４／２５５９１号パンフレット；ならびに米国特許第６００５０７９号号明細書を参照されたい。「抗体フラグメント」という用語はまた、単一ドメイン抗体が形成されるように修飾を有する２つのＶ_Ｈドメインを含む単一ドメイン抗体も含む。

「抗体フラグメント」はまた、抗体の抗原結合部分（ＣＤＲの１つまたは複数）を含むポリペプチドも含む。

「例えば」および「など」という用語ならびにこれらの文法上の等価物に関して、特に明示的に述べられない限り、「限定されないが」という句が続くと理解される。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、実験誤差による変動を説明することを意味する。本明細書に報告される全ての測定値は、特に明記しない限り、その用語が明示的に使用されているか否かにかかわらず、「約」という用語によって修飾されると理解される。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載される；当技術分野で公知の他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法および実施例は例示的なものに過ぎず、限定することを意図しない。

本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリおよび他の参考文献は、全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。

補体系

免疫系は、自然および適応の２つの異なるタイプに分けられる。自然免疫系は、補体系ならびに食細胞、肥満細胞、好酸球および好塩基球を含む様々な免疫細胞型からなる。病原体暴露が宿主生物において長期防御記憶を与える適応免疫系は、Ｔリンパ球およびＢリンパ球を含む。両方の系は主に疾患状態で侵入病原体から生物を保護するが、自己細胞が破壊の標的となり、侵略免疫細胞が、保護することを意図する宿主に損傷を引き起こす場合がある。最後に、自然免疫応答および適応免疫応答を結ぶ多くの異なる連結が存在し、これは、補体系を含み、Ｂ１細胞およびγδＴ細胞を含む両方の系の機能的特徴を有する細胞型を含む。

補体系は、古典的経路、レクチン経路、および代替経路の３つの別個の独立した経路を通して開始される。これらの３つの経路は、Ｃ３転換酵素、Ｃ４ｂＣ２ａ（古典的およびレクチン経路Ｃ３転換酵素）およびＣ３ｂＢｂ（代替経路Ｃ３転換酵素）の形成に収束し、次いで共通の末端経路の活性化を誘因する。末端経路の一部として、Ｃ３およびＣ５転換酵素活性化が、走化性、炎症および細胞傷害性酸素ラジカルの生成において重要な役割を果たす可溶性アナフィラトキシンＣ３ａおよびＣ５ａの生成をもたらす。

Ｃ５転換酵素は、約７５μｇ／ｍｌ（０．４μＭ）の正常ヒト血清中に見られる１９０ｋＤａ βグロブリンであるＣ５を切断する。Ｃ５はグリコシル化されており、その質量の約１．５〜３％が炭水化物に起因する。成熟Ｃ５は、６５５アミノ酸７５ｋＤａ β鎖とジスルフィド結合した９９９アミノ酸１１５ｋＤａ α鎖のヘテロ二量体である。Ｃ５は単一コピー遺伝子の一本鎖前駆体タンパク質産物として合成される（Ｈａｖｉｌａｎｄら（１９９１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３６２〜３６８）。このヒト遺伝子の転写産物のｃＤＮＡ配列は、１８アミノ酸リーダー配列と共に１６５８アミノ酸の分泌されたプロＣ５前駆体を予測する。例えば、米国特許第６３５５２４５号明細書を参照されたい。

プロＣ５前駆体がアミノ酸６５５および６５９の後に切断されると、β鎖がアミノ末端断片（上記配列のアミノ酸残基＋１〜６５５）としておよびα鎖がカルボキシル末端断片（上記配列のアミノ酸残基６６０〜１６５８）として得られ、４個のアミノ酸（上記配列のアミノ酸残基６５６〜６５９）が２つの間で欠失している。

Ｃ５ａは、α鎖の最初の７４アミノ酸（すなわち、上記配列のアミノ酸残基６６０〜７３３）を含むアミノ末端断片として、代替または古典的Ｃ５転換酵素のいずれかによってＣ５のα鎖から切断される。Ｃ５ａの１１ｋＤａの質量の約２０％が炭水化物に起因する。転換酵素作用のための切断部位は、アミノ酸残基７３３にある、またはそれに直に隣接する。この切断部位にまたはこれに隣接して結合するであろう化合物は、Ｃ５転換酵素の切断部位への接近を遮断し、それによって補体阻害剤として作用する能力を有するだろう。切断部位と遠位の部位でＣ５に結合する化合物は、例えば、Ｃ５とＣ５転換酵素との間の相互作用の立体障害媒介阻害によって、Ｃ５切断を遮断する能力を有し得るだろう。ダニ唾液補体阻害剤であるオルニトドロス・モウバタ（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ ｍｏｕｂａｔａ）Ｃ阻害剤（ＯｍＣＩ）（Ｃ５阻害剤であり得る）の作用機序と一致する作用機序の化合物はまた、Ｃ５のα鎖のＣ３４５Ｃドメインの柔軟性を低下させて、Ｃ５転換酵素のＣ５の切断部位への接近を減少させることによって、Ｃ５切断を防止し得る。例えば、Ｆｒｅｄｓｌｕｎｄら（２００８）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９（７）：７５３〜７６０を参照されたい。

Ｃ５は、Ｃ５転換酵素活性以外の手段によっても活性化され得る。制限されたトリプシン消化（例えば、ＭｉｎｔａおよびＭａｎ（１９９７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１９：１５９７〜１６０２ならびにＷｅｔｓｅｌおよびＫｏｌｂ（１９８２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２８：２２０９〜２２１６）および酸処理（ＹａｍａｍｏｔｏおよびＧｅｗｕｒｚ（１９７８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２０： ２００８ならびにＤａｍｅｒａｕら（１９８９）Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２６：１１３３〜１１４２）もＣ５を切断し、活性Ｃ５ｂを産生することができる。

Ｃ５の切断は、強力なアナフィラトキシンおよび走化性因子であるＣ５ａを放出し、溶解性末端補体複合体Ｃ５ｂ−９の形成をもたらす。Ｃ５ａおよびＣ５ｂ−９はまた、加水分解酵素、反応性酸素種、アラキドン酸代謝産物および種々のサイトカインなどの下流炎症因子の放出を増幅することにより、多面的細胞活性化特性を有する。

末端補体複合体の形成の第１の段階は、標的細胞の表面でＣ５ｂ−８複合体を形成するためのＣ５ｂとＣ６、Ｃ７およびＣ８との組み合わせを含む。Ｃ５ｂ−８複合体がいくつかのＣ９分子と結合すると、膜攻撃複合体（「ＭＡＣ」、Ｃ５ｂ−９、末端補体複合体「ＴＣＣ」）が形成される。十分な数のＭＡＣが標的細胞膜に入ると、これらが形成する開口部（ＭＡＣ細孔）が、赤血球などの標的細胞の急速浸透圧溶解を媒介する。低い非溶解濃度のＭＡＣは、他の効果をもたらし得る。特に、少数のＣ５ｂ−９複合体の内皮細胞および血小板への膜挿入は、有害な細胞活性化を引き起こし得る。場合によっては、活性化が細胞溶解に先行し得る。

適切に機能する補体系は感染微生物に対する堅牢な防御を提供するが、補体の不適切な調節または活性化は、例えば関節リウマチ（「ＲＡ」）；ループス腎炎；喘息；虚血−再灌流傷害；非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）；デンスデポジット病（「ＤＤＤ」）；発作性夜間ヘモグロビン尿症（「ＰＮＨ」）；黄斑変性（例えば、加齢黄斑変性（「ＡＭＤ」）；溶血、肝臓酵素の上昇および低血小板（「ＨＥＬＬＰ」）症候群；血栓性血小板減少性紫斑病（「ＴＴＰ」）；自然胎児喪失；微量免疫型血管炎；表皮水疱症；再発性胎児喪失；多発性硬化症（「ＭＳ」）；外傷性脳損傷；ならびに心筋梗塞、心肺バイパスおよび血液透析に起因する傷害を含む種々の障害の病因に関与している。例えば、Ｈｏｌｅｒｓら（２００８）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２２３：３００〜３１６を参照されたい。補体の阻害（例えば、末端補体形成、Ｃ５切断、または補体活性化の阻害）は、動物モデルとヒトの両方で、いくつかの補体関連障害の治療に有効であることが実証されている。例えば、Ｒｏｔｈｅｒら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５（１１）：１２５６〜１２６４；Ｗａｎｇら（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：８５６３〜８５６８；Ｗａｎｇら（１９９５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：８９５５〜８９５９；Ｒｉｎｄｅｒら（１９９５）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９６：１５６４〜１５７２；Ｋｒｏｓｈｕｓら（１９９５）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６０：１１９４〜１２０２；Ｈｏｍｅｉｓｔｅｒら（１９９３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５０：１０５５〜１０６４；Ｗｅｉｓｍａｎら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１４６〜１５１；Ａｍｓｔｅｒｄａｍら（１９９５）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２６８：Ｈ４４８〜Ｈ４５７；およびＲａｂｉｎｏｖｉｃｉら（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４９：１７４４、１７５０を参照されたい。

Ｃ３ａおよびＣ５ａはアナフィラトキシンである。これらの活性化補体成分は、好塩基球および肥満細胞ならびに炎症の他のメディエーターからヒスタミンを放出し、平滑筋収縮、血管透過性増加、白血球活性化、および細胞過形成をもたらす細胞増殖を含む他の炎症現象をもたらす肥満細胞脱顆粒を誘因し得る。Ｃ５ａはまた、炎症促進性顆粒球を補体活性化部位に引き付けるのに役立つ走化性ペプチドとしても機能する。

アナフィラトキシン受容体は、多くの異なる細胞によって発現されるＧタンパク質共役細胞表面受容体である。これらは機能アッセイに基づいて網膜色素上皮（ＲＰＥ）および脈絡膜内皮細胞上に存在することが実証されており、アナフィラトキシン濃度の増加する方向の白血球の受容体媒介運動が実証されている。

白血球は、骨髄細胞（好中球、単球、好酸球および好塩基球）およびリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞）の２つのカテゴリーに分類される。ＡＭＤの動物モデルで、好中球およびマクロファージ、ナチュラルキラー細胞およびＴ細胞を含むいくつかの細胞が、眼に浸潤することが確認されている；同様に、Ｔ細胞、マクロファージおよび単球ならびに他の免疫細胞が、ＡＭＤ患者の眼で同定されている。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞およびＴｈ１７細胞を含む）、細胞傷害性Ｔ細胞、γδＴ細胞およびＴ調節細胞の４つのカテゴリーからなる。重要なことに、Ｔｈ１７およびγδＴ細胞のサインサイトカインであるＩＬ−１７は、ＡＭＤ８を有するヒトの眼で有意に増加し、焦点性網膜変性を有するマウスの眼におけるＩＬ−１７の遮断は神経保護となることが分かった。そのため、これらの細胞型Ｔｈ１７−およびγδＴ細胞の一方または両方が、ＩＬ−１７サイトカインの産生を通して眼内の炎症および血管新生に寄与すると仮定された。

ＡＭＤの治療

ヒトでは、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、先進国における失明の主因である。この疾患は、５０歳以上の成人で最も一般的であり、現在、推定１７５万人のアメリカ人が進行型ＡＭＤと診断されている。ＡＭＤは徐々に、ヒトの眼の微調整される視覚の中心部位である黄斑の変性をもたらす。進行型ＡＭＤは、ドライ型（萎縮型）および滲出型ＡＭＤの２つの形態で生じる。

萎縮型ＡＭＤは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の薄化または消失およびブルッフ膜（ＢｒＭ）の肥厚を特徴とし、萎縮領域（地図状萎縮またはＧＡ）をもたらし、ＡＭＤに罹患した人々の大部分に影響を及ぼす。ＲＰＥとＢｒＭとの間で増加する大型ドルーゼン（細胞外物質の結晶沈着物）および線状沈着物（基底膜沈着物）の出現が、ドライ型ＡＭＤの指標である。これらの沈着物は、ＢｒＭの水分伝導度に干渉し、ＲＰＥの完全性を損ない、最終的に光受容体の健康に影響を及ぼし、網膜変性をもたらす。

滲出型ＡＭＤは、ＲＰＥ／ブルッフ膜の破壊、血管新生促進因子ＶＥＧＦの放出増加および脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）の発達を特徴とする。

ＣＮＶでは、新たに形成された脈絡膜血管がＲＰＥ／ＢｒＭを通って増殖する。新しい血管は漏出性なので、ＲＰＥと網膜との間に液体が蓄積し、光受容体とＲＰＥとの間の接続が壊される。液体が排出され、網膜が再付着することができない限り、光受容体が失われ、視力喪失に至る。

ある態様では、患者の加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を治療する方法が提供される。ある実施形態では、患者がヒト患者である。この方法は、有効量の阻害剤、Ｃ５阻害剤もしくはＣ５ａ阻害剤のいずれか、またはその両方を患者に投与するステップを含む。

ある実施形態では、阻害剤はＣ５阻害剤である。さらなる実施形態では、Ｃ５阻害剤はポリペプチドまたは抗体である。エクリズマブまたはエクリズマブ変異体が、抗Ｃ５抗体の一例である。ある実施形態では、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体が、約３０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ（約３０ｍｇ／ｍｌおよび約１００ｍｇ／ｍｌを含む）以上で患者に投与される。ある実施形態では、抗Ｃ５抗体は一本鎖抗体である。ある実施形態では、抗Ｃ５抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号５および配列番号６、または配列番号７および配列番号８、または配列番号５０に示されるアミノ酸配列の１つ、あるいは上記のいずれかの抗原結合フラグメントを含むポリペプチドである。他のある実施形態では、抗Ｃ５抗体が、配列番号９〜１６に示されるアミノ酸配列の１つまたは複数を含むポリペプチドである。

ある実施形態では、阻害剤はＣ５ａ阻害剤である。さらなる実施形態では、Ｃ５ａ阻害剤は抗体である。

抗Ｃ５ａ抗体の一例はＣＬＳ０２６である。ＣＬＳ０２６はマウスＣ５ａに特異的なモノクローナル抗体である。ＣＬＳ０２６を、ヒトＣ５に対する陰性選択を用いる従来のパニング技術を用いてファージディスプレイライブラリーから得て、完全長ＩｇＧに変換した。このネオエピトープ特異的抗体は、バイオレイヤー干渉法で示されるように、その標的であるマウスＣ５ａに１桁のｎＭ親和性で結合する。ＣＬＳ０２６をＣＨＯ細胞中で培養し、ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ（ＧＥ）プロテインＡ樹脂を用いた一段階アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。ＣＬＳ０２６は、エンドトキシンを含まず、キャピラリー電気泳動を使用して純度９５％超であると測定された。Ｂｉｏｃｏｍｐａｒｅ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ製の抗Ｃ５ａ抗体も参照されたい。

さらに別の例は、配列番号４７に示される軽鎖および配列番号４８または配列番号４９に示される重鎖を有する抗ヒトＣ５ａ抗体である。

処理前、処理中および処理後の患者のＣ５ａの量を、例えば、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイによって監視することができる。

例えば、ＲＰＥ／脈絡膜組織ホモジネート中のマウスＣ５ａの定量的特定のために、サンドイッチ酵素イムノアッセイを製造者の指示（Ｋａｍｉｙａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）に従って使用する。要するに、プレコートされたプレートを３７℃で２時間抗原に暴露し、洗浄し、Ｃ５ａに対する検出抗体、引き続いてペルオキシダーゼ結合二次抗体とインキュベートし、ＴＭＢ基質を用いて発色させる。眼試料中のＣ５ａの濃度は、試料のＯ．Ｄ．を検量線（キットで提供されるキャリブレーター）と比較することによって決定する。

ある実施形態では、阻害剤は静脈内もしくは硝子体内で、またはその両方で投与される。

ある実施形態では、阻害剤は約５００μｇ〜約１５００μｇ／眼で投与される。さらに他の実施形態では、阻害剤は１眼あたり約０．５ｍｇ、約１．５ｍｇ、約５ｍｇまたは約１０ｍｇで投与される。さらなる実施形態では、阻害剤は１眼あたり約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇで投与される。

ある実施形態では、眼内のγδＴ細胞のレベルが低下する。ある実施形態では、脾臓中のＴｈ１７および／またはγδＴ細胞のレベルが低下する。いくつかの実施形態では、眼内のＩＬ−１７のレベルが低下する。ある実施形態では、眼の炎症が軽減される。いくつかの実施形態では、眼の脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）が低減される。

γδＴ細胞、Ｔｈ１７および／またはγδＴ細胞、ならびにＩＬ−１７を同定および定量化するための任意の方法を使用することができる。このような方法は、当技術分野で公知である。

ある実施形態では、ＡＭＤは滲出型ＡＭＤである、またはドライ型（萎縮型）ＡＭＤである。ＡＭＤの診断は、当技術分野で公知である。

ある実施形態では、典型的な治療的処置は、通常、所望の臨床結果を達成するために必要とされる際に調整される投与量レベルの臨床的エンドポイントの監視を同時に行いながら投与される一連の投与を含む。ある実施形態では、典型的な治療処置は、ＡＭＤの診断後約１２〜４８時間以内に投与される１つまたは複数の投与とおそらくはその期間後のフォローアップ投与を含む。ある実施形態では、治療は少なくとも数時間または数日間にわたって複数回投与される。ある実施形態では、治療は少なくとも１週間にわたって複数回投与される。ある実施形態では、治療は少なくとも１ヶ月間にわたって複数回投与される。ある実施形態では、治療は少なくとも１年間にわたって複数回投与される。ある実施形態では、治療は患者の余生にわたって複数回投与される。

投与の頻度はまた、種々のパラメータによって調整することができる。これらには、臨床応答、阻害剤の血漿中半減期、および例えば血液、血漿、血清または滑液などの体液中の阻害剤（抗体など）のレベルが含まれる。投与頻度の調整をうまく行うために、体液中の阻害剤のレベルを治療の過程で監視することができる。

ある実施形態では、投与量（複数可）および投与頻度は、治療する医師の裁量で、患者の必要に応じて決定される。

阻害剤の全身投与によるＡＭＤの治療のために、多量の初期用量の投与を行うことができる。このような多量の初期用量に続いて、必要に応じて漸減した用量の定期的反復投与を行うことができる。他の実施形態では、初期投与は、局所経路と全身経路の両方によって与えられ、引き続いて漸減した用量の全身投与が繰り返される。

いくつかの実施形態では、補体Ｃ５タンパク質はヒト補体Ｃ５タンパク質である（ヒトプロタンパク質は配列番号４に示される）。いくつかの実施形態では、補体Ｃ５ａタンパク質はヒト補体Ｃ５ａタンパク質である。

ある実施形態では、治療上有効量の阻害剤（エクリズマブなど）は、患者の視力を改善または維持する量（または複数回投与の場合には種々の量）を含み得る。

ある実施形態では、この方法は、第２の治療薬を患者に投与するステップをさらに含む。任意の適切な第２の治療薬が熟慮される。

抗Ｃ５阻害剤および抗Ｃ５ａ阻害剤

Ｃ５阻害剤は任意のＣ５阻害剤であり得る。ある実施形態では、Ｃ５阻害剤はエクリズマブ、その抗原結合フラグメント、エクリズマブの抗原結合フラグメントを含むポリペプチド、エクリズマブの抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質、またはエクリズマブの一本鎖抗体バージョン、または小分子Ｃ５阻害剤である。

いくつかの実施形態では、Ｃ５阻害剤は小分子化合物である。Ｃ５阻害剤である小分子化合物の一例は、アウリントリカルボン酸である。他の実施形態では、Ｃ５阻害剤は抗体などのポリペプチドである。

Ｃ５阻害剤は、補体Ｃ５タンパク質に結合し、Ｃ５ａの生成を阻害することができるものである。Ｃ５結合阻害剤はまた、例えば、Ｃ５のフラグメントＣ５ａおよびＣ５ｂへの切断を阻害し、よって末端補体複合体の形成を防止することができる。

例えば、抗Ｃ５抗体は、Ｃ５タンパク質（例えば、ヒトＣ５タンパク質）のＣ５ａ活性フラグメントの生成または活性を遮断する。この遮断効果を通して、抗体は、例えば、Ｃ５ａの炎症促進効果を阻害する。抗Ｃ５抗体は、Ｃ５ｂの生成または活性を遮断する活性をさらに有することができる。この遮断効果を通して、抗体は、例えば、細胞の表面でのＣ５ｂ−９膜攻撃複合体の生成をさらに阻害することができる。

いくつかの実施形態では、Ｃ５阻害剤抗体はポリペプチド阻害剤である。なおさらなる他の実施形態では、ポリペプチド阻害剤はエクリズマブである。配列番号５はエクリズマブの重鎖全体を示し；配列番号６はエクリズマブの軽鎖全体を示し；配列番号９〜１１は、それぞれエクリズマブの重鎖のＣＤＲ１〜３を示し；配列番号１２〜１４は、それぞれエクリズマブの軽鎖のＣＤＲ１〜３を示し；配列番号１５はエクリズマブの重鎖の可変領域を示し；配列番号１６は、エクリズマブの軽鎖の可変領域を示す。エクリズマブは、炎症促進反応を誘発する可能性を低減するため、ヒトＩｇＧ２／ＩｇＧ４ハイブリッド定常領域を有するヒト化抗ヒトＣ５モノクローナル抗体（Ａｌｅｘｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）である。エクリズマブは商品名Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）を有し、発作性夜間ヘモグロビン尿症（「ＰＮＨ」）および非典型溶血性尿毒症症候群（「ａＨＵＳ」）の治療に現在承認されている。発作性夜間ヘモグロビン尿症は溶血性貧血の一形態であり、補体調節タンパク質ＣＤ５９およびＣＤ５５の非存在による血管内溶血が顕著な特徴である。ＣＤ５９は、例えば、末端補体複合体の形成を遮断するように機能する。ａＨＵＳは、とりわけ、血栓性微小血管障害症の阻害、体全体の小血管における血餅の形成および急性腎不全をもたらす慢性の制御されない補体活性化を伴う。エクリズマブはヒトＣ５タンパク質に特異的に結合し、強力な炎症促進性タンパク質Ｃ５ａの生成の形成を遮断する。エクリズマブは、末端補体複合体の形成をさらに遮断する。エクリズマブ治療は、ＰＮＨ患者の血管内溶血を減少させ、ａＨＵＳの補体レベルを低下させる。例えば、Ｈｉｌｌｍｅｎら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：５５２〜９；Ｒｏｔｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００７；２５（１１）：１２５６〜１２６４；Ｈｉｌｌｍｅｎら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００６、３５５；１２、１２３３〜１２４３；Ｚｕｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ ８、６４３〜６５７（２０１２）｜米国特許公開番号第２０１２／０２３７５１５号明細書、および米国特許第６３５５２４５号明細書を参照されたい。エクリズマブはまた、近年の臨床試験において、志賀毒素産生大腸菌溶血性尿毒症症候群（「ＳＴＥＣ−ＨＵＳ」）患者に有効であることが示されている。Ａｌｅｘｉｏｎのプレスリリース、「Ｎｅｗ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｄａｔａ Ｓｈｏｗ Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ （Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）） ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＳＴＥＣ−ＨＵＳ」、２０１２年１１月３日（土）を参照されたい。ＳＴＥＣ−ＨＵＳは、全身補体媒介性血栓性微小血管障害症および急性重要臓器損傷を特徴とする。これらの患者へのエクリズマブの投与は、血栓性微小血管障害症の迅速かつ持続的な改善および全身臓器合併症の改善をもたらした。理解されるように、ＰＮＨのように、ａＨＵＳおよびＳＴＥＣ−ＨＵＳは全て不適切な補体活性化に関連する疾患である。例えば、Ｎｏｒｉｓら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０１２ Ｎｏｖ；８（１１）：６２２〜３３；Ｈｉｌｌｍａｎら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：６、５５２〜９；Ｒｏｔｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００７；２５（１１）：１２５６〜１２６４；Ｈｉｌｌｍｅｎら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００６、３５５；１２、１２３３〜１２４３；Ｚｕｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ ８、６４３〜６５７（２０１２）を参照されたい。

なおさらなる他の実施形態では、Ｃ５阻害剤はパキセリズマブ（配列番号１）を含むエクリズマブの一本鎖バージョン（完全抗体エクリズマブの特異的一本鎖バージョン）である。例えば、Ｗｈｉｓｓ（２００２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ ３（６）：８７０〜７；Ｐａｔｅｌら（２００５）Ｄｒｕｇｓ Ｔｏｄａｙ（Ｂａｒｃ）４１（３）：１６５〜７０；Ｔｈｏｍａｓら（１９９６）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３３（１７〜１８）：１３８９〜４０１；および米国特許第６３５５２４５号明細書を参照されたい。さらに他の実施形態では、Ｃ５阻害剤抗体は、パキセリズマブ抗体アミノ酸配列の軽鎖の３８位（Ｋａｂａｔの番号付および配列番号２に示されるアミノ酸配列番号による）のアルギニン（Ｒ）がグルタミン（Ｑ）に変化した、パキセリズマブの一本鎖変異体である。配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する一本鎖抗体は、３８位のアルギニン（Ｒ）がグルタミン（Ｑ）で置換された一本鎖抗体パキセリズマブ（配列番号１）の変異体である。変異型パキセリズマブ抗体中に存在する代表的なリンカーアミノ酸配列を配列番号３に示す。エクリズマブの代表的なＳｃＦｖを配列番号５０に示す。

ある実施形態では、抗Ｃ５抗体は、エクリズマブに対して１つまたは複数の改善された特性（例えば、改善された薬物動態特性）を有するエクリズマブに由来する変異体である。変異エクリズマブ抗体（本明細書ではエクリズマブ変異体、変異エクリズマブなどとも呼ぶ）またはそのＣ５結合フラグメントは、（ａ）補体成分Ｃ５に結合し；（ｂ）Ｃ５ａの生成を阻害し；Ｃ５のフラグメントＣ５ａおよびＣ５ｂへの切断をさらに阻害することができる。変異エクリズマブ抗体は、１０日超または少なくとも１０日（例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３もしくは３４日超または少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３もしくは３４日）のヒトにおける血清半減期を有することができる。このような変異体エクリズマブ抗体は、米国特許第９０７９９４９号明細書に記載されている。

ある実施形態では、エクリズマブ変異抗体は、配列番号７（重鎖）および配列番号８（軽鎖）に示される配列によって定義される抗体またはその抗原結合フラグメントである。この抗体はヒトＣ５に結合し、Ｃ５ａの形成ならびにＣ５のフラグメントＣ５ａおよびＣ５ｂへの切断を阻害し、よって末端補体複合体の形成を防止する。

本発明の方法に使用するためのＣ５結合ポリペプチド抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号５および配列番号６、または配列番号７および配列番号８示されるアミノ酸配列、あるいは上記のいずれかの抗原結合フラグメントを含むことができる、またはからなることができる。このポリペプチドは、配列番号９〜１６に示されるアミノ酸配列の１つまたは複数を含むことができる。

さらに他の実施形態では、Ｃ５阻害剤はＬＦＧ３１６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｂａｓｅｌ、スイスおよびＭｏｒｐｈｏＳｙｓ、Ｐｌａｎｅｇｇ、ドイツ）または米国特許第８２４１６２８号明細書および米国特許第８８８３１５８号明細書の表１の配列によって定義される別の抗体、抗Ｃ５ペグ化ＲＮＡアプタマー（例えば、Ｋｅｅｆｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ９、５３７〜５５０（２０１０年７月））であるＡＲＣ１９０５（Ｏｐｈｔｈｏｔｅｃｈ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪおよびニューヨーク、ＮＹ）、Ｍｕｂｏｄｉｎａ（登録商標）（Ａｄｉｅｎｎｅ Ｐｈａｒｍａ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇａｍｏ、イタリア）（例えば、米国特許第７９９９０８１号明細書）、ｒＥＶ５７６（ｃｏｖｅｒｓｉｎ）（Ｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ−ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｇｅｎｅｖａ、スイス）（例えば、Ｐｅｎａｂａｄら、Ｌｕｐｕｓ、２０１４年１０月；２３（１２）：１３２４〜６参照）、ＡＲＣ１００５（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、デンマーク）、ＳＯＭＡｍｅｒｓ（ＳｏｍａＬｏｇｉｃ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）、ＳＯＢ１００２（Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｏｒｐｈａｎ Ｂｉｏｖｉｔｒｕｍ、ストックホルム、スウェーデン）、ＲＡ１０１３４８（Ｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、アウリントリカルボン酸（「ＡＴＡ」）および抗Ｃ５−ｓｉＲＮＡ（Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）およびオルニトドロス・モウバタ（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ ｍｏｕｂａｔａ）Ｃ阻害剤（「ＯｍＣＩ」）である。

ある実施形態では、阻害剤はＣ５ａ阻害剤である。任意のＣ５ａ阻害剤を使用することができる。Ｃ５ａ阻害剤は、例えば、抗体またはポリペプチドであり得る。

抗Ｃ５ａ抗体の一例はＣＬＳ０２６である。ＣＬＳ０２６はマウスＣ５ａに特異的なモノクローナル抗体である。ＣＬＳ０２６を、従来のパニング技術を用いてヒトＣ５に対する陰性選択でファージディスプレイライブラリーから得て、完全長ＩｇＧに変換した。このネオエピトープ特異的抗体は、バイオレイヤー干渉法で示されるように、その標的であるマウスＣ５ａに１桁のｎＭ親和性で結合する。ＣＬＳ０２６をＣＨＯ細胞中で培養し、ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ（ＧＥ）プロテインＡ樹脂を用いた一段階アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。ＣＬＳ０２６は、エンドトキシンを含まず、キャピラリー電気泳動を使用して純度９５％超であると測定された。Ｂｉｏｃｏｍｐａｒｅ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ製の抗Ｃ５ａ抗体も参照されたい。

いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗Ｃ５ａモノクローナル抗体である。

いくつかの実施形態では、抗体は配列番号４７に示される軽鎖および配列番号４８または配列番号４９に示される重鎖を有する抗Ｃ５ａ抗体である。

いくつかの実施形態では、抗体阻害剤は完全抗体ではない。いくつかの実施形態では、抗体阻害剤は一本鎖抗体である抗体の抗原結合フラグメントである。

いくつかの実施形態では、抗体阻害剤は二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体もしくはヒトモノクローナル抗体、またはこれらのいずれかの抗原結合フラグメントである。

いくつかの実施形態では、抗体は抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはこれらを含むポリペプチドである。抗体はモノクローナル抗体であり得る。他の実施形態では、阻害剤は抗体の可変領域またはそのフラグメント、例えばモノクローナル抗体を含む。他の実施形態では、抗体はＣ５補体タンパク質またはＣ５ａ補体タンパク質に特異的に結合する免疫グロブリンである。他の実施形態では、ポリペプチド剤は操作されたタンパク質または組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、抗体剤は完全抗体ではなく、抗体の部分を含む。いくつかの実施形態では、阻害剤は一本鎖抗体である。いくつかの実施形態では、阻害剤は二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体もしくはヒトモノクローナル抗体、またはこれらのいずれかの抗原結合フラグメントである。抗体を含むポリペプチド剤を作製する方法は、当技術分野で公知である。

上記のように、Ｃ５結合ポリペプチドを含むＣ５阻害剤は、補体成分Ｃ５を阻害することができる。特に、ポリペプチドを含む阻害剤は、Ｃ５ａアナフィラトキシンの生成、または補体成分Ｃ５タンパク質（例えば、ヒトＣ５タンパク質）のｃ５ａおよびＣ５ｂ活性フラグメントの生成を阻害する。したがって、Ｃ５阻害剤は、例えば、Ｃ５ａの炎症促進効果を阻害し、細胞の表面でのＣ５ｂ−９膜攻撃複合体（「ＭＡＣ」）の生成およびその後の細胞溶解を阻害することができる。例えば、Ｍｏｏｎｇｋａｒｎｄｉら（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ １６２：３９７およびＭｏｏｎｇｋａｒｎｄｉら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ １６５：３２３を参照されたい。

Ｃ５切断の阻害を測定するための適切な方法は、当技術分野で公知である。例えば、体液中のＣ５ａおよび／またはＣ５ｂの濃度および／または生理学的活性は、当技術分野で周知の方法によって測定することができる。Ｃ５ａ濃度または活性を測定する方法には、例えば走化性アッセイ、ＲＩＡまたはＥＬＩＳＡが含まれる（例えば、ＷａｒｄおよびＺｖａｉｆｌｅｒ（１９７１）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ５０（３）：６０６〜１６およびＷｕｒｚｎｅｒら（１９９１）Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｉｎｆｌａｍｍ ８：３２８〜３４０参照）。Ｃ５ｂについては、当技術分野で公知の溶血アッセイまたは可溶性Ｃ５ｂ−９のアッセイを使用することができる。当技術分野で公知の他のアッセイも使用することができる。

ＴＣＣ形成も阻害するこれらのＣ５阻害剤について、補体成分Ｃ５の阻害はまた、対象の体液中の補体の細胞溶解能力を低下させることができる。存在する補体の細胞溶解能力のこのような低下は、例えば、ＫａｂａｔおよびＭａｙｅｒ（編者）、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版」、１３５〜２４０、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＩＬ、ＣＣ Ｔｈｏｍａｓ（１９６１）、１３５〜１３９頁によって記載される溶血アッセイなどの慣用的な溶血アッセイ、または例えばＨｉｌｌｍｅｎら（２００４）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５０（６）：５５２に記載されるニワトリ赤血球溶血法などのこのアッセイの慣用的な変形などによって当技術分野で周知の方法によって測定することができる。

いくつかの実施形態では、Ｃ５結合ポリペプチドは、欠失変異体、挿入変異体および／または置換変異体を含む抗原に依然として結合する抗Ｃ５抗体（エクリズマブなど）の変異抗体である。例えば、配列番号１、配列番号２、または配列番号７および配列番号８に示されるポリペプチドを参照されたい。このような変異体を、例えば組換えＤＮＡ技術によって作製する方法は、当技術分野で周知である。

いくつかの実施形態では、阻害剤は融合タンパク質の一部としての抗体を含む。融合タンパク質は、融合タンパク質が融合タンパク質をコードする核酸から発現されるように組換えで構築することができる。融合タンパク質は、１つまたは複数のＣ５結合ポリペプチドセグメント（例えば、配列番号１、配列番号２、または配列番号５および／または配列番号６、配列番号７および／または配列番号８、または配列番号９〜１６のいずれか１つまたは複数に示されるＣ５結合セグメント）と、１つまたは複数のＣ５結合セグメントに対して異種である１つまたは複数のセグメントとを含む。異種配列は、例えば抗原タグ（例えば、ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン、赤血球凝集素（「ＨＡ」）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）またはマルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」）などの任意の適切な配列であり得る。異種配列はまた、診断マーカーまたは検出マーカーとして有用なタンパク質、例えばルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）であり得る。いくつかの実施形態では、異種配列は、Ｃ５結合セグメントを、対象となる細胞、組織または微小環境に標的化する標的化部分であり得る。いくつかの実施形態では、標的化部分は、Ｃ３ｂまたはＣ３ｄに結合するヒト補体受容体（例えば、ヒト補体受容体２）または抗体（例えば、一本鎖抗体）の可溶性形態である。いくつかの実施形態では、標的化部分は、腎臓特異的抗原などの組織特異的抗原に結合する抗体である。例えば組換えＤＮＡ技術によって、このような融合タンパク質を構築する方法は、当技術分野で周知である。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは標的化部分に融合される。例えば、構築物は、Ｃ５結合ポリペプチドと、ポリペプチドを補体活性化部位に標的化する標的化部分とを含むことができる。このような標的化部分は、例えば、補体受容体１（ＣＲ１）の可溶性形態、補体受容体２（ＣＲ２）の可溶性形態、あるいはＣ３ｂおよび／またはＣ３ｄに結合する抗体（またはその抗原結合フラグメント）を含むことができる。

組換えＤＮＡ技術を含む、融合タンパク質（例えば、Ｃ５結合ポリペプチドと、ヒトＣＲ１またはヒトＣＲ２の可溶性形態とを含む融合タンパク質）を生成する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６８９７２９０号明細書；米国特許出願公開第２００５２６５９９５号明細書；およびＳｏｎｇら（２００３）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１（１２）：１８７５〜１８８５に記載されている。

ある実施形態では、阻害剤は二重特異性抗体である。二重特異性抗体（例えば、抗Ｃ５抗体ならびにＣ３ｂおよび／またはＣ３ｄに結合する抗体を含む二重特異性抗体）を生成する方法も、当技術分野で公知である。Ｃ５結合抗体と任意の他の抗体とを含む二重特異性抗体が熟慮される。

多種多様な二重特異性抗体フォーマットは、抗体工学の分野で公知であり、二重特異性抗体（例えば、抗Ｃ５抗体［すなわち、Ｃ５結合抗体］とＣ３ｂ、Ｃ３ｄまたは組織特異的抗原に結合する抗体とを含む二重特異性抗体）を作製する方法は、十分に当業者の理解の範囲内である。例えば、Ｓｕｒｅｓｈら（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０；ＰＣＴ公開番号国際公開第９６／２７０１１号パンフレット；Ｂｒｅｎｎａｎら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１；Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９２）１７５：２１７〜２２５；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８（５）：１５４７〜１５５３；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：６４４４〜６４４８；Ｇｒｕｂｅｒら（１９９４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５２：５３６８；およびＴｕｔｔら（１９９１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７：６０を参照されたい。

二重特異性抗体にはまた、架橋抗体またはヘテロコンジュゲート抗体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）も含まれる。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋方法を用いて作製することができる。適切な架橋剤は当技術分野で周知であり、いくつかの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号明細書に開示されている。米国特許第５５３４２５４号明細書は、例えば、ペプチドカプラー、キレート剤または化学的もしくはジスルフィドカップリングによって連結された一本鎖Ｆｖフラグメントを含むいくつかの異なるタイプの二重特異性抗体を記載している。別の例では、ＳｅｇａｌおよびＢａｓｔ［（１９９５）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｓｕｐｐｌ．１４：２．１３．１〜２．１３．１６］が、２つの単一特異性抗体を化学的に架橋して二重特異性抗体を形成する方法を記載している。二重特異性抗体は、例えば、Ｃ５結合抗体および例えばＣ３ｂ、Ｃ３ｄまたは肺特異的抗原、眼特異的抗原、腎臓特異抗原等に結合する抗体から選択される２つの一本鎖抗体を結合することによって形成することができる。

二重特異性抗体は、リンカー（例えば、ポリペプチドリンカー）によって共有結合された２つの異なるｓｃＦｖフラグメントを含むタンデム一本鎖（ｓｃ）Ｆｖフラグメントであり得る。例えば、Ｒｅｎ−Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈら（２００４）Ｃａｎｃｅｒ １００：１０９５〜１１０３およびＫｏｒｎら（２００４）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ６：６４２〜６５１を参照されたい。リンカーの例としては、それだけに限らないが、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２［ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号１７］、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３［ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号１８］、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_４［ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、配列番号１９］、（Ｇ_３Ｓ）［ＧＧＧＳ、配列番号２０］、ＳｅｒＧｌｙ_４［ＳＧＧＧＧ、配列番号２１］およびＳｅｒＧｌｙ_４ＳｅｒＧｌｙ_４［ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ、配列番号２２］が挙げられる。

いくつかの実施形態では、リンカーは、例えばＧｒｏｓｓｅ−Ｈｏｖｅｓｔら（２００４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１：６８５８〜６８６３に記載されるＣＨ１ドメインなどの重鎖ポリペプチド定常領域の全部または一部を含み得るまたはであり得る。いくつかの実施形態では、２つの抗体フラグメントは、例えば、それぞれ米国特許第７１１２３２４号明細書および同第５５２５４９１号明細書に記載されるように、ポリグリシン−セリンまたはポリセリン−グリシンリンカーによって共有結合され得る。米国特許第５２５８４９８号明細書も参照されたい。二重特異性タンデムｓｃＦｖ抗体を生成する方法は、例えば、Ｍａｌｅｔｚら（２００１）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９３：４０９〜４１６；Ｈａｙｄｅｎら（１９９４）Ｔｈｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ １：３〜１５；およびＨｏｎｅｍａｎｎら（２００４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １８：６３６〜６４４に記載されている。あるいは、抗体は、例えば、Ｚａｐａｔａら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７〜１０６２に記載されるように、「直鎖抗体」であり得る。簡潔には、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１−Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１）を含む。

二重特異性抗体はダイアボディであってもよい。例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：６４４４〜６４４８によって記載されるダイアボディ技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製するための代替の機構を提供した。フラグメントは、同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）と接続された重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む。したがって、一方のフラグメントのＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインは、別のフラグメントの相補的Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈドメインと対形成させられ、それによって２つの抗原結合部位を形成する。Ｚｈｕら（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：１９２〜１９６およびＨｅｌｆｒｉｃｈら（１９９８）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７６：２３２〜２３９も参照されたい。二重特異性一本鎖ダイアボディ（「ｓｃＤｂ」）ならびにｓｃＤｂを生成する方法は、例えば、Ｂｒｕｓｓｅｌｂａｃｈら（１９９９）Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ４：１１５〜１２３；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９９）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３：４１−５６；およびＮｅｔｔｌｅｂｅｃｋら（２００１）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ３：８８２〜８９１に記載されている。

Ｗｕら（２００７）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５（１１）：１２９０〜１２９７に記載される四価二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）などの二重特異性抗体の変異形も本発明の方法に使用することができる。ＤＶＤ−Ｉｇ分子は、２つの異なる親抗体由来の２つの異なる軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）が、直接または組換えＤＮＡ技術によって短いリンカーを介して直列に、引き続いて軽鎖定常ドメインと連結されるように設計される。２つの親抗体からＤＶＤ−Ｉｇ分子を生成する方法は、例えば、ＰＣＴ公開番号国際公開第０８／０２４１８８号パンフレットおよび国際公開第０７／０２４７１５号パンフレットにさらに記載されている。例えば、米国特許出願公開第２００７０００４９０９号明細書に記載される二重特異性フォーマットも包含される。使用することができる別の二重特異性フォーマットは、国際公開第２０１２／１３５３４５号パンフレットに記載される４ドメイン抗体様分子を操作するフォーマットであるクロスオーバーデュアルＶ領域（ＣＯＤＶ−Ｉｇ）である。ＣＯＤＶ−Ｉｇは、Ｃ末端Ｖドメイン（内部）での立体障害がＤＶＤ−Ｉｇの構築を妨げ得る二重特異性抗体様分子の操作に有用であることが示された。

二重特異性抗体分子を形成するために使用されるＣ５結合抗体もしくはＣ５ａ結合抗体および／または標的化部分は、例えば、キメラ、ヒト化、再ヒト化、脱免疫化または完全ヒトであり得、その全てが当技術分野で周知である。

小分子化学化合物であるＣ５およびＣ５ａ阻害剤は、当技術分野で公知の方法によって生成することができる。

ポリペプチドおよび抗体を含むＣ５結合阻害剤およびＣ５ａ結合阻害剤は、分子生物学およびタンパク質化学の分野で公知の種々の技術を用いて生成することができる。

例えば、Ｃ５結合ポリペプチド（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むまたはからなるＣ５結合ポリペプチド）またはＣ５ａ結合ポリペプチドをコードする核酸を、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、転写ターミネーターシグナル、ポリアデニル化シグナル、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を含む、転写および翻訳調節配列を含む発現ベクターに挿入することができる。調節配列は、プロモーターならびに転写開始および停止配列を含む。さらに、発現ベクターは、２つの異なる生物、例えば発現のための哺乳動物または昆虫細胞とクローニングおよび増幅のための原核生物宿主において維持され得るように、２つ以上の複製系を含むことができる。

代表的なＣ５結合ポリペプチド（パキセリズマブ）をコードする代表的な核酸は以下の通りである：ＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＴＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＧＡＡＡＡＣＡＴＣＴＡＴＧＧＣＧＣＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＧＡＡＡＧＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＧＧＴＧＣＧＡＣＧＡＡＣＣＴＧＧＣＡＧＡＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＡＡＣＧＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＣＴＴＣＧＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＡＡＣＧＴＴＴＴＡＡＡＴＡＣＴＣＣＧＴＴＧＡＣＴＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＴＡＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴＣＡＡＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＣＡＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＣＡＡＡＧＴＧＴＣＣＴＧＴＡＡＡＧＣＴＡＧＣＧＧＣＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＣＴＡＡＴＴＡＴＴＧＧＡＴＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＧＡＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＧＧＣＴＣＴＧＧＴＡＧＣＡＣＣＧＡＡＴＡＴＡＣＣＧＡＡＡＡＴＴＴＴＡＡＡＧＡＣＣＧＴＧＴＴＡＣＴＡＴＧＡＣＧＣＧＴＧＡＣＡＣＴＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＡＧＴＡＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＧＡＴＣＧＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＣＧＣＧＣＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＣＴＡＧＣＣＣＧＡＡＴＴＧＧＴＡＴＴＴＴＧＡＴＧＴＴＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＧＡＧＣＴＧＡ（配列番号１）。いくつかの実施形態、例えば、カルボキシル末端融合タンパク質が生成または産生される実施形態では、核酸は配列番号１のヌクレオチド１〜７３８を含む。

当技術分野で周知のいくつかの可能なベクター系（プラスミドベクター系など）は、哺乳動物細胞を含むいくつかの細胞における核酸からのＣ５結合ポリペプチドまたはＣ５ａ結合ポリペプチドの発現に利用可能である。

発現ベクターは、当該分野で周知の方法によって、核酸のその後の発現に適した様式で細胞に導入することができる。

抗体またはその抗原結合フラグメントは、任意の適切な宿主細胞中で発現され得る。適切な宿主細胞には、例えば、細菌（大腸菌など）、真菌（出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）など）、昆虫細胞（ＳＦ９など）、哺乳動物細胞株（例えば、ヒト細胞株）、初代細胞株（例えば、初代哺乳動物細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞および適切な骨髄腫細胞株（ＮＳＯなど）を含む酵母、細菌、昆虫、植物および哺乳動物細胞が含まれる。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントをトランスジェニック動物（例えば、トランスジェニック哺乳動物）で発現させ、そこから精製することができる。例えば、Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ（２００２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １３（６）：６２５〜６２９；ｖａｎ Ｋｕｉｋ−Ｒｏｍｅｉｊｎら（２０００）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ ９（２）：１５５〜１５９；およびＰｏｌｌｏｃｋら（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１（１〜２）：１４７〜１５７に記載されるように、Ｃ５結合ポリペプチドをトランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えば、げっ歯類、ヒツジまたはヤギ）中で産生させ、乳から単離することができる。

抗体またはその抗原結合フラグメントを、ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、そのタンパク質の発現を可能にするのに十分な条件下で、十分な量の時間培養することによって、細胞から産生することができる。タンパク質発現のためのこのような条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変化し、日常的実験を通して当業者によって容易に確認されるであろう。例えば、組換えＤＮＡ技術の包括的開示を有する、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ−第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（２００１）を参照されたい。

発現後、抗体またはその抗原結合フラグメントを、当業者に公知の種々の方法で単離または精製することができる。

Ｃ５結合ポリペプチドならびに他のＣ５阻害剤は、ヒト補体成分Ｃ５タンパク質に特異的に結合し；抗Ｃ５ａ剤（抗Ｃ５ａ抗体など）は、ヒト補体成分Ｃ５ａに特異的に結合する。「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は、当技術分野で公知であり、簡潔には、生理学的条件下で比較的安定な複合体（例えば、Ｃ５結合ポリペプチドを含むＣ５阻害剤と補体成分Ｃ５タンパク質との間の複合体）を形成する２つの分子を指し得る。

抗原に「特異的に結合する」ことおよび／または抗体の抗原に対する親和性を含む、抗体が結合するかどうかを決定する方法は、当技術分野で公知である。例えば、抗体と抗原の結合は、それだけに限らないが、ウエスタンブロット、ドットブロット、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの種々の技術を用いて検出および／または定量化することができる。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；Ｂｅｎｎｙ Ｋ．Ｃ．Ｌｏ（２００４）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（ＩＳＢＮ：１５８８２９０９２１）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｋ（１９９２）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、ＮＹ；Ｂｏｒｒｅｂａｅｋ（１９９５）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、第２版、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、Ｏｘｆｏｒｄ；Ｊｏｈｎｅら（１９９３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ １６０：１９１〜１９８；Ｊｏｎｓｓｏｎら（１９９３）Ａｎｎ Ｂｉｏｌ Ｃｌｉｎ ５１：１９〜２６；およびＪｏｎｓｓｏｎら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０〜６２７を参照されたい。

本明細書に開示される方法に使用するための薬剤を作製、同定、精製、修飾などする方法は、当技術分野で周知である。

医薬組成物および製剤

本明細書に開示される方法に使用するための阻害剤を含む組成物を、ＡＭＤを治療するために対象に投与するための医薬組成物として製剤化することができる。任意の適切な医薬組成物および製剤、ならびに適切な製剤化する方法および適切な投与経路および投与部位は、本発明の範囲内であり、当技術分野で公知である。また、投与の任意の適切な１つまたは複数の投与量および投与頻度が熟慮される。

医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。「薬学的に許容される担体」とは、生理学的に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを指し、これらを含む。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩（Ｂｅｒｇｅら（１９７７）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ６６：１〜１９参照）を含むことができる。

ある実施形態では、タンパク質組成物であるものを、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、凍結乾燥（フリーズドライ）粉末、または高濃度での安定した貯蔵に適した他の秩序構造として安定化および製剤化することができる。滅菌注射溶液は、本明細書で開示される方法に使用するためのＣ５結合またはＣ５ａ結合ポリペプチドを、必要に応じて上に列挙される成分の１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒に必要量組み込み、引き続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、Ｃ５結合ポリペプチドを、塩基性分散媒および上記で列挙したものの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製方法は、予め滅菌濾過したその溶液からの阻害剤ポリペプチドと任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥を含む。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。注射用組成物の持続的吸収を、組成物中に吸収を遅延させる試薬、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。非タンパク質阻害剤は、同じまたは類似の方法で製剤化することができる。

エクリズマブ、その抗原結合フラグメント、その抗原結合変異体、エクリズマブの抗原結合フラグメントもしくはエクリズマブ変異体の抗原結合フラグメントを含むポリペプチド、エクリズマブの抗原結合フラグメントもしくはエクリズマブ変異体の抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質、またはエクリズマブもしくはエクリズマブ変異体の一本鎖抗体バージョンなどのＣ５結合ポリペプチドを含むＣ５阻害剤、およびＣ５ａ阻害剤を、水性医薬溶液中比較的高濃度を含む任意の所望の濃度で製剤化することができる。例えば、エクリズマブ、その抗原結合フラグメント、その抗原結合変異体、エクリズマブの抗原結合フラグメントもしくはエクリズマブ変異体の抗原結合フラグメントを含むポリペプチド、エクリズマブの抗原結合フラグメントもしくはエクリズマブ変異体の抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質、またはエクリズマブもしくはエクリズマブ変異体の一本鎖抗体バージョンなどのＣ５結合ポリペプチドを、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬまたはそれ以上（例えば、約９ｍｇ／ｍＬ〜約９０ｍｇ／ｍＬ；約９ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ；約１０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ；約１５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ；約１５ｍｇ／ｍＬ〜約１１０ｍｇ／ｍＬ；約１５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ；約２０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ；約２０ｍｇ／ｍＬ〜約８０ｍｇ／ｍＬ；約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ；約２５ｍｇ／ｍＬ〜約８５ｍｇ／ｍＬ；約２０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ；約２５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ；約３０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ；約３０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ；約４０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ；約５０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ；または約２０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ）の濃度で、溶液中で製剤化することができる。本発明の方法で使用されるＣ５結合ポリペプチドは、約５超（または少なくともこれに等しい）（例えば、以下のいずれか超または少なくともこれに等しい：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、約２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１２０、１３０、１４０もしくは１５０またはそれ以上）ｍｇ／ｍｌで溶液中に存在し得る。エクリズマブ、その抗原結合フラグメント、その抗原結合変異体、エクリズマブの抗原結合フラグメントもしくはエクリズマブ変異体の抗原結合フラグメントを含むポリペプチド、エクリズマブの抗原結合フラグメントもしくはエクリズマブ変異体の抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質、またはエクリズマブもしくはエクリズマブ変異体の一本鎖抗体バージョンなどのＣ５結合ポリペプチドを、約２超（例えば以下のいずれか超；２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４もしくは４５またはそれ以上）ｍｇ／ｍＬであるが、約５５未満（例えば、以下のいずれか未満：５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６または約５未満）ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化することができる。したがって、いくつかの実施形態では、エクリズマブ、その抗原結合フラグメント、その抗原結合変異体、エクリズマブの抗原結合フラグメントもしくはエクリズマブ変異体の抗原結合フラグメントを含むポリペプチド、エクリズマブの抗原結合フラグメントもしくはエクリズマブ変異体の抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質、またはエクリズマブもしくはエクリズマブ変異体の一本鎖抗体バージョンなどのＣ５結合ポリペプチドを、約５ｍｇ／ｍＬ超約５５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で、水溶液中で製剤化することができる。エクリズマブ、その抗原結合フラグメント、その抗原結合変異体、エクリズマブの抗原結合フラグメントもしくはエクリズマブ変異体の抗原結合フラグメントを含むポリペプチド、エクリズマブの抗原結合フラグメントもしくはエクリズマブ変異体の抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質、またはエクリズマブもしくはエクリズマブ変異体の一本鎖抗体バージョンなどのＣ５結合ポリペプチドを、約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で、水溶液中で製剤化することができる。任意の適切な濃度が熟慮される。タンパク質を水溶液中で製剤化する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第７３９０７８６号明細書；ＭｃＮａｌｌｙおよびＨａｓｔｅｄｔ（２００７）、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、第２版、Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７５巻、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；ならびにＢａｎｇａ（１９９５）、「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓに記載されている。

阻害剤薬剤の投与量レベルは、任意の適切なレベルであり得る。ある実施形態では、エクリズマブ、その抗原結合フラグメント、その抗原結合変異体、エクリズマブの抗原結合フラグメントもしくはエクリズマブ変異体の抗原結合フラグメントを含むポリペプチド、エクリズマブの抗原結合フラグメントもしくはエクリズマブ変異体の抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質、またはエクリズマブもしくはエクリズマブ変異体の一本鎖抗体バージョンなどのＣ５結合ポリペプチドの投与量レベルが、一般的に約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ／患者／治療であり得、約５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ／患者／治療であり得る。

達成される最高レベルまたは維持されるレベルにかかわらず、阻害剤薬剤の患者における血漿濃度は、任意の望ましいまたは適切な濃度であり得る。このような血漿濃度は、当該分野で公知の方法によって測定することができる。

いくつかの実施形態では、Ｃ５阻害剤またはＣ５ａ阻害剤のいずれかである阻害剤を、静脈内注射または静脈内注入によって、対象に静脈内投与する（「対象」という用語は本明細書では「患者」という用語と互換的に使用される）。いくつかの実施形態では、Ｃ５阻害剤またはＣ５ａ阻害剤のいずれかである阻害剤を、注射によって、対象に硝子体内または眼内投与する。いくつかの実施形態では、Ｃ５阻害剤またはＣ５ａ阻害剤のいずれかである阻害剤薬剤を、静脈内および硝子体内または眼内投与する。

Ｃ５阻害剤またはＣ５ａ阻害剤のいずれかである阻害剤薬剤を、単独療法として対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、１種または複数のさらなる治療薬などの１つまたは複数のさらなる治療薬を対象に投与するステップを含むことができる。

さらなる治療は、ＡＭＤの実験的治療またはＡＭＤの症状の治療を含む任意のさらなる治療であり得る。他の治療は、患者の健康を改善または安定化する任意の治療（任意の治療薬）であり得る。１種または複数のさらなる治療薬は、水および／または生理食塩水、アセトアミノフェン、慣用的なＡＭＤ治療薬（ＥＹＬＥＡ（登録商標）、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）およびＭａｃｕｇｅｎ等）などのＩＶ流体を含む。１種または複数のさらなる治療薬を別の治療用組成物としてＣ５阻害剤またはＣ５ａ阻害剤と一緒に投与することができる、あるいは１つの治療用組成物を、（ｉ）１種もしくは複数の抗Ｃ５剤または抗Ｃ５ａ剤と（ｉｉ）１種または複数のさらなる治療薬の両方を含むように製剤化することができる。さらなる治療薬は、抗Ｃ５剤または抗Ｃ５ａ剤の投与の前、投与と同時、または投与後に投与することができる。さらなる薬剤と抗Ｃ５薬剤または抗Ｃ５ａ薬剤は、同じ送達方法もしくは送達経路を使用して、または異なる送達方法もしくは送達経路を使用して投与することができる。さらなる治療薬は別のＣ５阻害剤または別のＣ５ａ阻害剤（抗Ｃ５ａ剤）を含む別の補体阻害剤であってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃ５阻害剤またはＣ５ａ阻害剤を、患者のＡＭＤを治療するために有用な１種または複数のさらなる活性剤と共に製剤化することができる。

Ｃ５阻害剤またはＣ５ａ阻害剤を第２の活性剤と組み合わせて使用する場合、剤を別々にまたは一緒に製剤化することができる。例えば、それぞれの医薬組成物を、例えば投与直前に混合し、一緒に投与することができる、または同じ経路もしくは異なる経路によって、同時にもしくは異なる時間に、別々に投与することができる。

いくつかの実施形態では、成分は全体としてＡＭＤを治療するのに治療上有効となるように、組成物を治療量以下のＣ５阻害剤またはＣ５ａ阻害剤と、治療量以下の１種または複数のさらなる活性剤とを含むよう製剤化することができる。治療用抗体などの薬剤の治療上有効用量を決定する方法は、当技術分野で公知である。

組成物を、一部は投与経路に依存する種々の方法を用いて、対象、例えばヒト対象に投与することができる。経路は、例えば静脈内（「ＩＶ」）注射もしくは注入、皮下（「ＳＣ」）注射、腹腔内（「ＩＰ」）注射、肺送達（肺内注射などによる）、眼内注射、関節内注射、硝子体内注射、または筋肉内（「ＩＭ」）注射であり得る。

対象のＡＭＤを治療または予防することができる適切な用量のＣ５阻害剤またはＣ５ａ阻害剤は、例えば治療される対象の年齢、性別および体重、ならびに使用される特定の阻害剤化合物を含む種々の因子に依存し得る。対象に投与される用量に影響を及ぼす他の因子には、例えばＡＭＤのタイプまたは重症度が含まれる。他の因子には、例えば、同時にまたは以前対象が罹っていた他の医学的障害、対象の遺伝的素因、投与時間、排泄率、薬物組み合わせ、および対象に投与される任意の他のさらなる治療薬が含まれ得る。任意の特定の対象のための具体的な投与量および治療レジメンは、治療する医師（例えば、医師または看護師）の判断によることも理解されるべきである。

Ｃ５阻害剤またはＣ５ａ阻害剤は、固定用量として、またはミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）用量で投与することができる。いくつかの実施形態では、用量を、組成物中の活性抗体の１つまたは複数に対する抗体の産生または他の宿主免疫応答を低減または回避するよう選択することもできる。

医薬組成物は、治療上有効量のＣ５阻害剤またはＣ５ａ阻害剤を含むことができる。このような有効量は、当業者によって容易に決定され得る。

本明細書で使用される「治療上有効量」もしくは「治療上有効用量」という用語または類似の用語は、所望の生物学的応答または医学的応答を誘発するＣ５阻害剤またはＣ５ａ阻害剤の量を意味することを意図している。Ｃ５阻害剤またはＣ５ａ阻害剤の治療上有効量は、患者の視力を改善または維持し、眼内のＩＬ−１７レベルを低下させ、眼の炎症を減少させ、眼内のγδＴ細胞のレベルを低下させ、脾臓内のＴｈ１７細胞およびγδＴ細胞の産生を減少させ、ＣＮＶサイズを減少させる、またはこれらの任意の組み合わせの量（または複数回投与の場合、種々の量）を含むことができる。これらのパラメータの全ては、当業者に公知の方法によって確認または測定することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、治療上有効量のＣ５阻害剤またはＣ５ａ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物が全体として治療上有効となるように、組成物がＣ５阻害剤またはＣ５ａ阻害剤のいずれかと、１種または複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１またはそれ以上の）追加の治療薬とを含む。例えば、組成物は、Ｃ５阻害剤またはＣ５ａ阻害剤と、免疫抑制剤とを含むことができ、ポリペプチドおよび薬剤は、それぞれ、組み合わせた場合に、対象のＡＭＤを治療または予防するために治療上有効な濃度である。

本明細書で使用される「対象」は、ヒトであり得る。「患者」という用語は、本明細書では「対象」という用語と互換的に使用される。ある実施形態では、患者（または対象）がヒト患者（またはヒト対象）である。

実施例

本発明をより良く理解するために、以下の実施例を示す。これらの実施例は、例示のみを目的とするものであり、少しも本発明の範囲を限定するものと解釈されない。

実施例１ Ｃ５阻害剤および／またはＣ５ａ阻害剤によるマウスモデルの滲出型ＡＭＤの治療

血管新生加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）を特徴とする。過活動補体系はＡＭＤ病因に寄与し、ＩＬ−１７を含む血清炎症促進性サイトカインがＡＭＤ患者で上昇する。ＩＬ−１７は、アナフィラトキシンＣ５ａ受容体発現Ｔ細胞によって産生される。

ＣＮＶ病変を、レーザー光凝固を用いてマウスで生成し、イメージングによって定量化し；Ｔリンパ球をＱＲＴ−ＰＣＲによって特徴付けた。ＣＮＶは、脾臓ＩＬ−１７産生γδＴおよびＴｈ１７細胞の増加をもたらしたが、ＣＮＶ眼では、上昇したレベルのγδＴ細胞のみ観察することができた。

眼内のＣ５ａ産生レベルを低下させるための抗Ｃ５または抗Ｃ５ａ遮断抗体の投与によって、脾臓Ｔｈ１７およびγδＴ細胞のＣＮＶ誘導産生が鈍り、ＣＮＶサイズが減少し、眼のγδＴ細胞浸潤が排除された。ＡＲＰＥ−１９細胞単層において、ＩＬ−１７が炎症促進状態を誘因し、Ｔ細胞増殖が眼タンパク質に応答して上昇した。まとめると、ＣＮＶ病変が全身免疫応答を誘因し、おそらくＣ５ａ依存的に眼に動員されるＩＬ−１７産生γδＴ細胞の浸潤を介して局所的眼炎症を増強する。

Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを交配対（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から作製した。動物を１２：１２時間、明：暗サイクルの下に収容し、自由に食物および水を入手できるようにした。

ＣＮＶ病変を、Ｒｏｈｒｅｒ，Ｂ．ら Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５０、３０５６〜３０６４に記載されるように誘発した。簡単に述べると、アルゴンレーザー光凝固法（５３２ｎｍ、１００μｍスポットサイズ、０．１秒持続時間、１００ｍＷ）を用いて、３〜４ヶ月齢のマウスを麻酔し（キシラジンおよびケタミン、それぞれ２０ｍｇ／ｋｇおよび８０ｍｇ／ｋｇ）、瞳孔を拡張させ（２．５％フェニレフリンＨＣｌおよび１％アトロピン硫酸塩）、コンタクトレンズとして携帯型カバーガラスを使用して、視神経の周りに１眼あたり４つのレーザースポットを作成した。ＩＣＡＭ２染色または光干渉（ＯＣＴ）分析によって、病変を生じないレーザースポット（泡の形成によって示される）または血管が偶発的に破裂したレーザースポットをサイズ決定から除外した。

ＣＮＶサイズの決定を、ＩＣＡＭ２染色またはＯＣＴ分析によって達成した。簡潔に述べると、免疫蛍光のために、眼球除去し、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、洗眼用コップをＣＤ１０２（ＩＣＡＭ２とも呼ばれる；１：２００で０．５ｍｇ／ｍＬ；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）について染色し、引き続いてＡｌｅｘａ−４８８結合二次抗体（１：４００で２ｍｇ／ｍＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で可視化した。ＣＮＶ病変の深さ全体にわたる２ｍの光学切片のＺ−スタックを共焦点顕微鏡法（４０倍の油レンズ；全ての実験について固定レーザー強度設定）を用いて得た。各光学切片について、蛍光の量を決定し、これを深さに対するピクセル強度を決定するために使用した（曲線下面積は、間接的な体積測定を提供する）。Ｒｏｈｒｅｒ，Ｂ．ら Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５０、３０５６〜３０６４、（２００９）。ＣＮＶ病変から離れたＺ−スタックをバックグラウンド減算のために集めた。ＯＣＴを用いたサイズ決定のために、ＳＤ−ＯＣＴ Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ（登録商標）スペクトル領域眼科撮像システム（Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）を利用した。マウスを麻酔し、生理食塩水で眼を水和させた。Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ（登録商標）ＩｎＶｉｖｏＶｕｅソフトウェアを使用して、長方形体積スキャンを行い（１．６×１．６ｍｍ、１００回のＢスキャン、Ｂスキャン１回あたり１０００回のＡスキャン）、システムの顔面眼底再構築ツールを用いて病変の中心を決定し、画像を保存した。次いで、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｗａｙｎｅ Ｒａｓｂａｎｄ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して、眼底画像で生成された過反射スポット周りの面積を測定した。Ｇｉａｎｉ，Ａら Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５２、３８８０〜３８８７。両画像化モダリティのデータを平均±ＳＥＭとして表した。

ＣＬＳ０２６はマウスＣ５ａに特異的なモノクローナル抗体である。ＣＬＳ０２６を、ヒトＣ５に対する陰性選択を用いる従来のパニング技術を用いてファージディスプレイライブラリーから得て、完全長ＩｇＧに変換した。このネオエピトープ特異的抗体は、バイオレイヤー干渉法で示されるように、その標的であるマウスＣ５ａに１桁のｎＭ親和性で結合する。ＣＬＳ０２６をＣＨＯ細胞中で培養し、ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ（ＧＥ）プロテインＡ樹脂を用いた一段階アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。ＣＬＳ０２６は、エンドトキシンを含まず、キャピラリー電気泳動を使用して純度９５％超であると測定された。

ＥＬＩＳＡを用いてマウスＣ５ａのレベルを測定した。ＲＰＥ／脈絡膜組織ホモジネート中のマウスＣ５ａの定量的特定のために、サンドイッチ酵素イムノアッセイを製造者の指示（Ｋａｍｉｙａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）に従って使用した。要するに、プレコートされたプレートを３７℃で２時間抗原に暴露し、洗浄し、Ｃ５ａに対する検出抗体、引き続いてペルオキシダーゼ結合二次抗体とインキュベートし、ＴＭＢ基質を用いて発色させた。眼試料中のＣ５ａの濃度は、試料のＯ．Ｄ．を検量線（キットで提供されるキャリブレーター）と比較することによって決定した。

定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、対象となる遺伝子のｍＲＮＡレベルを評価した。対照およびＣＮＶ眼から単離したＡＲＰＥ−１９細胞またはＲＰＥ−脈絡膜−強膜（ＲＰＥ−脈絡膜と呼ばれる）画分を利用し、前記のように処理した。Ｄｕｎｋｅｌｂｅｒｇｅｒ、Ｊ．Ｒ．＆Ｓｏｎｇ、Ｗ．Ｃ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２０、３４〜５０、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｒ．２００９．１３９（２０１０）；Ｒｏｈｒｅｒ，Ｂ．ら Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５０、３０５６〜３０６４、（２００９）。要するに、標準的なサイクリング条件を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）５７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）でリアルタイムＰＣＲ分析を３連で行った。サイクル数により定量値を得た。有意性は、±２倍の差異と関連比較間のＰ＜０．０５の両方を要した。使用したプライマーを表１に列挙する。

表１ ＱＲＴ−ＰＣＲプライマー配列

ＲＰＥ細胞の分化した表現型を示すヒトＲＰＥ細胞株であるＡＲＰＥ−１９細胞を、以前記載されたように増殖させた。Ｔｈｕｒｍａｎ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８４、１６９３９〜１６９４７、（２００９）。細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１×ペニシリン：ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）中でコンフルエンスに達するまで増殖させた。安定したバリア施設の形成を促進するために、血清は２％に減少した。バリア機能を、経上皮抵抗（ＴＥＲ）測定値に基づいて評価した。細胞を既知の濃度のＩＬ−１７で処理することができるように、２％ＦＢＳを２日間完全に除去したが、これは生存も単層形成も変化させない。

以前に公開されたように、Ｔ細胞増殖アッセイを実施した。Ｈａｑ，Ｅ．、Ｒｏｈｒｅｒ，Ｂ．、Ｎａｔｈ，Ｎ．、Ｃｒｏｓｓｏｎ，Ｃ．Ｅ．＆Ｓｉｎｇｈ，Ｉ．Ｊ．Ｏｃｕｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２３、２２１〜２３１（２００７）。簡潔には、脾細胞の細胞懸濁液を調製し、細胞濃度を５×１０^６個細胞／ｍＬに調整した。ＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、１０％ＦＢＳ、１×ペニシリン：ストレプトマイシン、１ｍＭグルタミン、１ｍＭ非必須アミノ酸および５００μＭ ２−ＭＥ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＲＰＭＩ完全培地で細胞を増殖させた。脾細胞をＩＲＢＰ１６１−１８０（２０ｇ／ｍＬ）、Ｓ抗原（濃度）および可溶化ＲＰＥ／脈絡膜または網膜抽出物の上清で７２時間（ｈ）刺激した。４８時間の増殖のために、１Ｃｉの［メチル−^３Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）をプレートの各ウェルに添加し、チミジンのＤＮＡへの平均取り込みを、１４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｗａｌｌａｃ Ｔｒｉｌｕｘ Ｌｉｑｕｉｄシンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）によって７２時間で測定した。

次に、補体溶血アッセイを使用した。レシピエントマウス血清中の末端補体活性を、標準的な方法によって決定し、以前記載されたように赤血球特異的Ａｂで前感作したニワトリ赤血球を溶解する能力を評価した。Ｗａｎｇ，Ｈ．ら Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６８、１６４３〜１６５１（１９９９）。簡潔には、０．１％ゼラチン、１４１ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１５ｍＭ ＣａＣｌ２および１．８ｍＭナトリウムバルビタールを含有するゼラチンベロナール緩衝生理食塩水（ＧＶＢＳ）中１００、２および０μｇ／ｍｌの精製抗Ｃ５ ｍＡｂをそれぞれ低、中、および１００％溶解対照として使用した。ＧＶＢＳ中にマウス試験血清を１／１０に希釈することによって、実験試料を調製した。対照および実験試料を、ＧＶＢＳ中等体積の１０％正常Ｂａｌｂ／ｃマウス血清および１０％ヒトＣ５欠損血清を含有する９６ウェルプレートのウェルに３連で添加した。５００ｍＭ ＥＤＴＡ ２μｌを、１００％溶解試料と実験試料の両方の３連の第３のウェルに添加して、各条件について「溶血なし」カラーコントロール標準を生成した。ニワトリ赤血球をＧＶＢＳで洗浄し、抗ニワトリＲＢＣポリクローナル抗体（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；０．１％ｖ／ｖ）と４℃で１５分間インキュベートして感作させ、再度洗浄し、ＧＶＢＳ中に最終濃度約７．５×１０^７個細胞／ｍｌで再懸濁した。感作したニワトリ赤血球（約２．５×１０^６個細胞）を対照および試料を含むプレートに添加し、プレートシェーカー上で短時間混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、プレートを再び混合し、３０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清８０μｌを９６ウェル平底マイクロタイタープレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のウェルに移した。プレートをマイクロプレートリーダーを用いてＯＤ４１５で読み取り、以下の式を用いて溶血の百分率を決定した：溶血％＝１００×（ＯＤ試料−ＯＤ試料カラーコントロール）／（ＯＤ１００％溶解対照−ＯＤ１００％溶解カラーコントロール））。

複数の群からなるデータについて統計解析を行い、一元配置ＡＮＯＶＡに続いてフィッシャーのポストホック検定（Ｐ＜０．０５）を使用した；単一の比較をスチューデントのｔ検定分析（Ｐ＜０．０５）によって分析した；正規化したデータを、Ｚ検定を用いて分析した（Ｐ＜０．０５）。

結果

ＣＮＶ眼におけるＩＬ−１７発現は、γδＴ細胞マーカーの存在と相関する。

マウスにおける重度のＣＮＶ（１眼あたり４０〜５０個の熱傷）の誘発は、プールされた眼試料におけるフローサイトメトリーによって測定可能な眼浸潤炎症細胞の一過性の増加をもたらす。病変の誘発から１２時間後と７日後の間に少数のＴ細胞が存在することが判明した。調査下のＴ細胞型に特有のマーカー遺伝子の存在を使用し、４つの慎重に配置された病変を有するＣＮＶ眼を非病変年齢適合対照と比較した。

ＣＮＶを有する眼のＴ細胞の存在および型を調べるために、ＲＰＥ脈絡膜試料をＱＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した。データの解析では、ＣＤ３ａ（成熟Ｔ細胞）およびＣＤ４（Ｔ調節細胞およびＴヘルパー細胞）の発現が対照（ＣＤ３ａ：８．０±１．４；ＣＤ４：９．１±１．８）と比較してレーザー照射眼で上昇していることによって示されるように、ＣＮＶ誘発の６日後にＴ細胞が存在していた。ＩＬ−１７産生Ｔ細胞であるＴｈ１７およびγδＴ細胞を、それぞれ転写因子ＲＡＲ関連オーファン受容体ガンマ（ＲＯＲγ）およびγδＴ細胞受容体（γδＴＲ）の存在に基づいて識別することができた（図１）。図１に示されるように、ＣＮＶ後のＩＬ−１７、ＲＯＲγおよびγδＴＲ（γδＴ細胞受容体）の発現を、１２時間、２４時間、２日、３日および６日間で測定した。ＩＬ−１７ ｍＲＮＡのレベルは、ＣＮＶの２４時間後にピークに達し、６日間にわたって上昇したままであった。γδＴＲレベルは、６日目まで同様に上昇し、２４時間でピークが観察された。ＲＯＲγレベルは、ＣＮＶの存在下で変化しないままであった。示されるデータは、１試料あたりの平均値（±ＳＥＭ）である。したがって、ＩＬ−１７ ｍＲＮＡのレベルは、ＣＮＶ誘発の２４時間後にピークに達し、６日まで連続的に上昇した（最新の時点を測定した）。ＩＬ−１７のレベルの上昇は、γδＴ細胞受容体のレベルと相関していたが、ＲＯＲγのレベルは病変によって変化しなかった。

脾臓は、Ｂ細胞およびＴ細胞を含み、これらは、血液からこれらを濾過することによって直接抗原に暴露される、または移動性マクロファージもしくは樹状細胞による送達によって間接的に暴露される。抗原提示で、Ｔ細胞が活性化され、クローン増殖をもたらし得る。ＣＮＶ病変誘発の６日後、ＩＬ−１７、ＲＯＲγおよびγδＴＲの同等の増加が脾臓で測定され、脾臓内のＴ細胞の全体的活性化を示唆した（ＩＬ−１７：４．０４±０．３９；ＲＯＲγ：４．９６±１．１６；γδＴＲ：４．６８±０．３４）（図６も参照されたい）。図６はＴ細胞に対するＣ５ａおよびＣ５の効果を示している。ＣＮＶ誘発の６日後に脾臓（ｂ）および眼（ａ）試料を単離し、Ｔｈ−１７（ＲＯＲγ）およびγδＴ細胞（γδＴＲ）に特異的なプライマーを用いてＱＲＴ−ＰＣＲによって分析した。（ａ）ＣＮＶ後、抗Ｃ５および抗Ｃ５ａで処理したマウスは、ＩＬ−１７およびγδＴＲ遺伝子発現の眼レベルの有意な低下を示したが、ＲＯＲγレベルは変化しなかった。（ｂ）。ＣＮＶマウスのＴ細胞特異的遺伝子の脾臓レベルは、抗Ｃ５および抗Ｃ５ａで処理したマウスにおいてＲＯＲγレベルが対照レベルに戻るが、γδＴＲは上昇したままであることを示した。

ＣＮＶマウスの脾臓を回収し、得られた脾細胞を抗原刺激の添加により生体外で刺激した（図２）。ＣＮＶ動物の脾臓に由来するＴ細胞を種々の眼抗原によって刺激し、Ｔ細胞増殖を測定した。図２に示されるように、ＲＰＥ／脈絡膜（ＲＰＥ）抽出物および網膜タンパク質ＩＲＢＰおよびＳ抗原によって刺激された脾細胞は、対照と比較して増殖の中等度の増加（２〜３倍）を示した；一方、網膜抽出物による刺激はＴ細胞増殖のずっと大きな（６倍）増加をもたらした。示されるデータは、１試料あたりの平均値（±ＳＤ）であった。眼の抗原に対する一般的な刺激は、網膜およびＲＰＥ脈絡膜抽出物を用いて提供したが、動物において実験的自己免疫ブドウ膜炎（ＥＡＵ）を引き起こす２つの周知の抗原タンパク質であるＩＲＢＰおよびＳ抗原を用いて特異的抗原刺激を提供した。ＩＲＢＰは相互光受容体マトリックスの糖タンパク質であり、Ｓ抗原は可溶性光受容体細胞タンパク質である。タンパク質および／または他の可溶性網膜およびＲＰＥ由来タンパク質の両方は、その血液網膜バリアを壊すＣＮＶ病変を生成すると血流にアクセスすることができる。ＣＮＶ動物由来のＴ細胞において、ＲＰＥ細胞抽出物への暴露は細胞増殖のわずかな増加を引き起こしたが、網膜抽出物は大量の増加を誘因した。精製網膜タンパク質（ＩＲＢＰおよびＳ抗原）は、網膜抽出物群に見られる増殖の大きな増加を模倣しなかったが、両方とも有意ではあるがわずかな増加を引き起こした。

したがって、ＣＮＶは、適応免疫応答を含む免疫応答を誘因し、Ｔ細胞の増殖および活性化をもたらす。脾臓内、したがっておそらくは血流中のＴｈ１７細胞とγδＴ細胞の両方の増加にもかかわらず、γδＴ細胞の眼への選択的移動のみがＣＮＶに関連する。

ＣＮＶ眼におけるＩＬ−１７発現は、Ｃ５ａ産生またはシグナル伝達を遮断することによって減少する。

γδＴ細胞をＣＮＶマウスの眼に動員する。Ｔ細胞は、その細胞表面上にＣ５ａ受容体（Ｃ５ａＲ）を発現することが示されており、これによってＣＮＶ病変の誘発後に眼内に存在するＣ５ａの供給源に向かって移動することができるだろう。Ｃ５ａ産生およびＣ５ａ受容体シグナル伝達は、Ｃ５転換酵素の上流の補体活性化を阻害する、またはＣ５、Ｃ５ａもしくはＣ５ａＲに対するブロッキング抗体もしくはアンタゴニストをそれぞれ用いることによって減少させることができる。

Ｃ５（マウスＩｇＧ１）に対するブロッキング抗体およびマウスＣ５ａ（マウスＩｇＧ１）に対する新規な抗体を使用した。抗Ｃ５抗体は、Ｃ５依存性抗リン脂質抗体媒介性血栓症をうまく遮断するために使用されるものである。抗体依存性細胞傷害性および補体依存性細胞傷害性がほとんどまたは全くないため、マウスＩｇＧ１抗体を使用した。

抗Ｃ５ブロッキング抗体の有効性を確認するために、マウスに抗Ｃ５および対照抗体を注射し、マウスからの血液を溶血アッセイのために回収した。これは、古典的経路の血清補体成分が、膜攻撃複合体依存的様式で、ヒツジ赤血球を溶解する機能的能力を試験する。抗Ｃ５抗体を注射したマウスの血清はヒツジ赤血球を溶解することができず、補体活性化の遮断の成功を確認した一方で、対照抗体またはＣ５ａに対する抗体を注射したマウスでは溶解が起こった（図３Ａ）。

バイオレイヤー干渉法（ｂｉｏ−ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）を用いて、マウスＣ５ａに特異的なモノクローナル抗体がその標的であるマウスＣ５ａに１桁のｎＭ親和性で結合することを確認した（図３Ｂ）。

図３は抗体の特徴付けを示している。
図３Ａは、ＰＢＳ、抗Ｃ５、抗Ｃ５ａおよび抗体対照１２Ｂ４を注射したマウスの血清を、溶血アッセイの使用を通して補体活性化について分析した。抗Ｃ５抗体処置動物の血清は、ヒツジ赤血球を溶解することができず、補体活性化の遮断を成功させることが示された。抗Ｃ５ａ、ＰＢＳまたは１２Ｂ４を注射したマウスにおける溶解の間に有意な差は報告されなかった。示されるデータは、１試料あたりの平均値（±ＳＥＭ）であった。図３Ｂは、バイオレイヤー干渉法（ｂｉｏ−ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）を用いて、マウスＣ５ａに特異的なモノクローナル抗体の特異性がその標的であるマウスＣ５ａに１桁のｎＭ親和性で結合することを確認した（データは示さず）。

抗体がブロッキング抗体として使用され得るおよび／またはその標的に結合することができることを確認した後、マウスＣＮＶモデルで抗体を試験した。３ヶ月齢の４コホートのマウス（ＰＢＳ、対照抗体、抗Ｃ５または抗Ｃ５ａを４８時間毎に静脈内注射したマウス）において、レーザー光凝固後のＣＮＶ発達を評価した。レーザー誘発ＣＮＶ後５日目に、抗Ｃ５、抗Ｃ５ａまたは１２Ｂ４（対照）の存在下で、ＯＣＴを用いてＣＮＶサイズを測定した（図４Ａ）。ＯＣＴ像は、対照（ａ）と比較した場合、抗Ｃ５および抗Ｃ５ａの処理による病変サイズの減少を示す。レーザー誘発ＣＮＶ誘発の６日後、マウスを屠殺し、組織を回収した。対照抗体注射マウス（５５７２±６３０．６；Ｐ≦０．０１；図４Ｂ）と比較すると、マウスＩｇＧ１抗Ｃ５（３６６６±３５９．９ピクセル）またはＣ５ａブロッキング（３４５３±２５３．８）抗体で処理したマウスにおいて、ＣＮＶ発達が有意に減少したことが実証された。これらの結果の定量化（ｂ）は、抗Ｃ５および抗Ｃ５ａ（Ｐ≦０．０１）を注射した場合、病変サイズのほぼ４０％の減少を示した。示されるデータは、１病変あたりの平均値（±ＳＥＭ）であった。

ＲＰＥ／脈絡膜のＥＬＩＳＡ測定により、ＣＮＶ誘発がＣ５ａレベルの上昇をもたらすことが確認された。Ｃ５ａの生成を防止するＣ５ブロッキング抗体による処理は、Ｃ５ａレベルのＣＮＶ誘発増加の排除をもたらした一方、Ｃ５ａブロッキング抗体で処理した動物は、上昇したＣ５ａレベルを維持したが、Ｃ５ａはおそらく抗体に結合し、それによって不活性化される（図５）。

図５は、抗Ｃ５を注射した動物が、より低い眼抗Ｃ５ａレベルを有することを示している。ＲＰＥ／脈絡膜のＥＬＩＳＡ測定は、ＣＮＶ誘発後のＣ５ａレベルの上昇を示した（Ｐ≦０．００１）。この増加は抗Ｃ５処理マウスで排除された；一方、抗Ｃ５ａおよび１２Ｂ４対照抗体で処理したマウスは、眼Ｃ５ａの対照レベルを有していた。示されるデータは、平均値（±ＳＥＭ）であった。

抗Ｃ５と抗Ｃ５ａの両方が、脾臓γδＴＲレベルのＣＮＶ誘因型増加を減少させるのに、小さいが有意な効果を有した一方、ＲＯＲγレベルのＣＮＶ誘因型増加は処理マウスにおいて完全に防止された（図６Ｂ）。さらに、阻害剤処理は、ＣＮＶマウスの眼内のＩＬ−１７およびγδＴＲの上昇を完全に防止した（図６Ｂ）；明らかに眼内のＣ５ａレベルは、Ｃ５ａ受容体保有Ｔ細胞の動員に寄与する。

図６はＴ細胞に対するＣ５ａおよびＣ５の効果を示している。ＣＮＶ誘発の６日後に脾臓（ｂ）および眼（ａ）試料を単離し、Ｔｈ−１７（ＲＯＲγ）およびγδＴ細胞（γδＴＲ）に特異的なプライマーを用いてＱＲＴ−ＰＣＲによって分析した。（ａ）ＣＮＶ後、抗Ｃ５および抗Ｃ５ａで処理したマウスは、ＩＬ−１７およびγδＴＲ遺伝子発現の眼レベルの有意な低下を示したが、ＲＯＲγレベルは変化しなかった。（ｂ）。ＣＮＶマウスのＴ細胞特異的遺伝子の脾臓レベルは、抗Ｃ５および抗Ｃ５ａで処理したマウスにおいてＲＯＲγレベルが対照レベルに戻るが、γδＴＲは上昇したままであることを示した。

ＩＬ−１７は眼の炎症を促進する

Ｈａｓｅｇａｗａらは近年、γδＴ細胞の枯渇が眼内のＩＬ−１７レベルを低下させ、実験的ＣＮＶを改善することを示した。ＲＰＥ細胞におけるＩＬ−１７の血管新生促進効果が、成熟単層として増殖したＡＲＰＥ−１９細胞を刺激し（Ｔｈｕｒｍａｎ，Ｊ．Ｍ．ら Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８４、１６９３９〜１６９４７，、（２００９））、マーカー遺伝子についての遺伝子発現およびバリア機能を測定することによって確認された。

ここで、ＩＬ−１７刺激後、眼内のＣ３遺伝子発現の４０倍超の増加ならびに眼内のＩｌ−１７の約１０倍の増加が観察された一方、ＶＥＧＦおよびＣＦＨ ｍＲＮＡの発現レベルは眼内で影響を受けなかった（図７Ａ）。ＩＬ−１７Ａ ５ｎｇを単層の頂端チャンバーに添加すると、ボルト−オームメーターを用いて測定される、経上皮抵抗の有意な減少が生じた（図７Ｂ）。

図７はＲＰＥ細胞に対するＩＬ−１７の効果を示している。図７Ａは、成熟ＡＲＰＥ−１９細胞単層で頂端ＩＬ−１７暴露（５ｎｇ／ｍＬ）後の遺伝子発現の変化を測定した。Ｃ３ならびにＩＬ−１７発現レベルは、対照よりも倍数変化の増加を示したが、ＶＥＧＦおよびＣＦＨは変化しなかった。図７Ｂは、経上皮抵抗測定値は、４時間後に５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１７の頂端適用に応答してバリア機能の喪失を示した。

ＣＮＶは、おそらく可溶性網膜またはＲＰＥタンパク質の放出を介して脾臓での免疫応答を誘発し、ＩＬ−１７産生γδＴおよびＴｈ１７細胞の増加をもたらした；しかし、全身γδＴおよびＴｈ１７細胞のこの増加にもかかわらず、ＣＮＶ眼へのγδＴ細胞の移動の証拠のみが存在する。

Ｃ５に対するブロッキング抗体またはＣ５ａシグナル伝達の減少は、マウスの眼のＣＮＶを減少させ、脾臓内のＴｈ１７−およびγδＴ細胞のＣＮＶ誘導産生を鈍らせ、γδＴ細胞のＣＮＶ眼への流入を妨げた。

ＩＣＯＳ^−／−マウスにおけるＩＬ−１７産生の減少は、有意に小さいＣＮＶ病変およびＣＮＶ眼へのγδＴ細胞の侵入の欠如をもたらし；外因性ＩＬ−１７の適用はＲＰＥ細胞の炎症促進状態を誘因し、ＶＥＧＦおよびＣ３産生の増加をもたらした。

したがって、ＣＮＶ病変は、脾臓免疫応答を誘因し、これが局所的に産生される走化性因子Ｃ５ａによって眼に動員されるＩＬ−１７産生γδＴ細胞の浸潤を介して眼炎症を増加させる。

ｎＡｂのネオエピトープがＣＮＶ病変に存在し、ｒａｇ１^−／−がＣＮＶサイズの増加のためにこれらの特異的ｎＡｂで再構成され得る。Ｊｏｓｅｐｈ，Ｋ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、ｄｏｉ：Ｍ１１２．４２１８９１ ［ｐｉｉ］１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１２．４２１８９１（２０１３）。網膜およびＲＰＥ由来抗原に対するＴリンパ球の増殖性脾臓応答が生じたが、Ｂ細胞に対するさらなる効果が生じたらしい。

ＡＭＤにおけるＩＬ−１７

ＩＬ−１７は、関節リウマチ、ブドウ膜炎およびおそらくＡＭＤを含むいくつかの異なる疾患の病因に関連する主要な炎症促進性サイトカインである。滲出型については、ＶＥＧＦ産生および分泌ならびに内皮細胞増殖および血管形成の増加を伴うＡＭＤの発達に関連するＩＬ−１７は、他の系において、ヒト真皮内皮細胞を用いて、ＶＥＧＦの産生を増加させるだけでなく血管新生、細胞移動、および細胞侵入を誘導することが示されている。ＡＭＤに関連する動物モデルでは、ＩＬ−１７は、加齢黄斑変性中ならびにＣＮＶ中にマウスの眼に蓄積することが見出されており、ＩＬ−１７シグナル伝達を妨害することによってＣＮＶの進行を減少させることができる。最後に、ＡＭＤ患者では、ＩＬ−１７の血清レベルの上昇ならびにＩＬ−１７受容体Ｃの低メチル化が報告されている。ＩＬ−１７を産生するいくつかの異なるエフェクター細胞がある；ＩＬ−１７産生Ｔ細胞（Ｔｈ１７）、γδＴ細胞ならびに自然リンパ球（ＩＬＣ）。ＡＭＤに関連するマウスモデルでは、眼内のＩＬ−１７は、Ｔｈ１７細胞ではなくむしろγδＴ細胞の浸潤によるものである。

対照動物の眼で観察されるＩＬ−１７の増加は、Ｔｈ１７細胞に特異的なマーカー（ＲＯＲγ）ではなくγδＴ細胞受容体の増加と相関しているので、Ｔｈ１７細胞ではなくγδＴ細胞が、ＣＮＶに応答して眼内でＩＬ−１７を産生するＴ細胞である。同様に、ＩＬ−１７は、バリア機能に影響を与え、ＶＥＧＦおよび補体産生を増加させ、炎症および補体活性化の悪循環を全体的に発生させることによって、ＲＰＥにおいて炎症促進性環境を明らかに作り出す。

補体と走化性因子としてのＩＬ−１７−Ｃ５ａをどのように結び付けるか

過活動補体系がＡＭＤの発生と結び付いていることが現在受け入れられている。ブルッフ膜の領域には高濃度の補体調節タンパク質および膜攻撃複合体（ＭＡＣ）が存在し、ＲＰＥおよび膜攻撃複合体の沈着密度はＡＭＤリスク遺伝子型と相関する。補体（ＡＰ）の代替経路はＡＭＤの病因にとって重要であると仮定されている。さらに、危険因子としてのＣＦＢ、Ｃ２、Ｃ３、ＣＦＨＲ１／３の遺伝子の変異も報告されており、ＡＭＤとＳＥＲＰＩＮＧ１（Ｃ１阻害剤）との間に逆相関が存在する。最後に、アナフィラトキシンタンパク質Ｃ３ａおよびＣ５ａが、ＡＭＤに関連する病理学的構造において報告されている。補体活性化の間に産生される生物学的エフェクター分子のうち、アナフィラトキシンのみが血管新生および走化性特性を示すことが示されている。Ｃ５ａはＡＭＤ患者由来のＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−２２およびＩＬ−１７発現を促進することが示されており、Ｃ５ａはＡＲＰＥ−１９細胞による別のサイトカイン、ＩＬ−８ならびにＶＥＧＦの産生を促進することが示されている。Ｃ５ａの走化性特性に関しては、Ｔ細胞はＣ５ａ受容体を発現することが示されているが、Ｔ細胞が実際にＣ５ａ勾配に従ってＡＭＤまたはＡＭＤのモデルの眼に入るという考えを支持する眼空間で入手可能なデータはない。

ここでのデータは、ＣＮＶに応答して眼内で産生されるアナフィラトキシンＣ５ａが、Ｃ５ブロッキング抗体に応答して、または補体活性化の低下に応答して減少することを初めて示唆する。眼内のアナフィラトキシンＣ５ａのこの上昇したレベルは、炎症促進性Ｔ細胞の眼への動員を媒介することができた。しかしながら、γδＴ細胞の動員の欠如と共にＲＰＥまたは脈絡膜内皮細胞に対するＣ５ａの直接的効果を除去することの相加効果を排除することができない。重要なことに、ＲＰＥ細胞は、Ｃ５ａ刺激に応答して種々のサイトカインを産生することが示され、Ｃ５ａは免疫抑制剤ＴＧＦの産生を抑制し、免疫細胞増殖を抑制するＲＰＥの能力を低下させることによって、ＲＰＥの抗免疫原性の役割を妨げることが示された。

実施例２．カニクイザルにおける眼科学霊長類試験のための１００ｍｇ／ｍｌまたは３０ｍｇ／ｍｌのエクリズマブ

主な目的は以下である：投与経路を比較する：硝子体内（ＩＶＴ）対静脈内（ＩＶ）；硝子体内用量を決定する；血清および眼の組織分布ならびに投与経路に関連したエクリズマブの硝子体Ｔ_１／２を決定する；ＩＶＴ投与後の種々の時点で硝子体液から回収されたエクリズマブＣ５結合活性を測定する。データは１０匹の霊長類の評価を表す。

表２．カニクイザル試験設計

９つの眼区画を解剖した：強膜／脈絡膜、網膜、視神経、硝子体、水晶体、毛様体、角膜、虹彩および房水。

硝子体内（ＩＶＴ）投与は、２０ｍｇ／ｋｇのエクリズマブのＩＶ投与よりも網膜および硝子体内のより高いエクリズマブ濃度をもたらした。図８を参照されたい。

ＩＶ投与は、血管新生化した眼区画：脈絡膜／強膜、視神経、毛様体および虹彩中ＩＶＴよりも高濃度のエクリズマブをもたらした。図９を参照されたい。

エクリズマブのＩＶＴ投与は２．８〜３．６日に及ぶ硝子体Ｔ１／２をもたらす。図１０を参照されたい。

エクリズマブのＩＶ投与ではなく硝子体内投与は、ドライ型ＡＭＤ患者において硝子体Ｃ５を飽和させるのに十分である。図１１を参照されたい。

エクリズマブは、単回ＩＶＴ投与後に６週間を超えて硝子体液中のＣ５結合活性を維持する。図１２を参照されたい。

カニクイザルにおける眼科毒物学およびＰＫ分析のためのエクリズマブ（１００ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上）

ＮＨＰ（Ｃｙｎｏ）硝子体内およびＩＶ毒性／ＰＫ試験５７０５８９（非ＧＬＰ）

設計：単回ＩＶＴ用量０．５、１．５、５ｍｇ／眼、１日目および２２日目に０．５ｍｇ／眼の２回投与；単回ＩＶ投与２０ｍｇ／ｋｇエクリズマブ。

測定された臨床徴候、体重、眼科学およびＥＲＧ、総剖検。

薬理学

ＩＶＴ投与は、ＩＶ投与より網膜、硝子体および房水中の高いエクリズマブ濃度をもたらした。エクリズマブのＩＶＴ投与は２．８〜３．６日の硝子体Ｔ１／２をもたらした。エクリズマブは、ＩＶＴ投与４３日後の硝子体液中の完全なヒトＣ５（ｈＣ５）結合を保持する。ＩＶ投与は、血管新生化した眼区画：脈絡膜／強膜、視神経、毛様体および虹彩中高濃度のエクリズマブをもたらした。エクリズマブの（２０ｍｇ／ｋｇの）ＩＶ投与ではなく５００ｍｇの単回ＩＶＴは、２２日間超にわたってドライ型ＡＭＤ患者において硝子体Ｃ５を「飽和させる」のに十分である。５００ｍｇのＩＶＴ用量Ｘ２を受けたサルの血清中では、エクリズマブに対する抗体は検出されなかった。

毒物学

用量関連の眼の所見−炎症性：軽度〜中等度の前房内細胞および細胞様の混濁（０．２ｍｇおよび０．５ｍｇ）；最初の週に記録された前房内細胞、フレアおよび／または不完全な瞳孔拡張を含む、１．５ｍｇおよび５．３５ｍｇでのより顕著な急性炎症は、時間の経過とともに解決する傾向があった（７〜１４日目）。他の全身的な効果もＥＲＧへの効果もない。１００ｍｇ／ｍｌでのエクリズマブのＩＶＴ投与は、カニクイザルによって十分に許容される。

ＮＨＰ（Ｃｙｎｏ）硝子体内毒性／ＰＫ試験（非ＧＬＰ）

設計

単回注射、１０ｍｇ／眼

測定された臨床徴候、体重、眼科学およびＥＲＧ、総剖検、病理組織学。

薬理学

エクリズマブのＩＶＴ投与は２．９７日の硝子体Ｔ１／２をもたらした。

毒物学

一過性眼炎症、若干から中等度の前部ブドウ膜炎、硝子体の変化、ある動物の血管／血管周囲炎症。全身的な効果もＥＲＧへの効果もない。

ウサギ硝子体内毒性／ＰＫ試験（非ＧＬＰ）

単回ＩＶＴ用量、０．２、１．５または５ｍｇ／眼

高用量：３日目に軽度のブドウ膜炎、７日目までに重度に進行。１３日目に福祉上の理由で動物を安楽死させた

低および中用量：ブドウ膜炎であるが、１４日目で高用量より重症度は低い

ＡＤＡが存在（全ての用量）

実施例３．エクリズマブｓｃＦｖ：一本鎖抗Ｃ５ ｍＡｂ；
眼局所投与の試験

理論的根拠：ウサギの点眼剤としての単回局所投与後に、エクリズマブ局在化の有意な網膜ｓｃＦｖが観察された。

目的：カニクイザルでの局所投与後、エクリズマブのｓｃＦｖが網膜に到達できるかどうかを調べること。

試験設計

エクリズマブｓｃＦｖ（４４．５ｍｇ／ｍＬ）

１眼あたり１滴を３０分毎に５時間にわたって合計１０回投与した。

眼組織および血清を５時間で集めた

エクリズマブｓｃＦｖ組織濃度をＭＳＤ ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した

表３．試験設計（カニクイザル）

初期治療の５時間後のカニクイザルにおける局所投与後のエクリズマブｓｃＦｖ組織分布を図１３に示す。組織中のエクリズマブｓｃＦｖ多量体化が有効な網膜濃度の過小評価につながる可能性があることに留意されたい。局所投与されたエクリズマブｓｃＦｖは、ＮＨＰの網膜にアクセスした。エクリズマブの局所投与後に角膜刺激は観察されず、血清濃度は０．１２ｎｇ／ｍｇタンパク質であった。

単回点眼（ｐｇ／ｍｇのタンパク質）後の推定エクリズマブｓｃＦｖ可溶性多量体濃度。図１４を参照されたい。

他の実施形態

前記の説明は、本発明の代表的な実施形態のみを開示するものである。

本発明をその詳細な説明と合わせて説明してきたが、前記の説明は例示を意図しており、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。他の態様、利点および修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。したがって、本発明の一定の特徴のみを例示および説明してきたが、当業者には多くの修正および変更が想起されるであろう。そのため、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神に入る全ての修正および変更を包含することを意図していることを理解すべきである。

表４：いくつかの核酸およびアミノ酸配列
配列番号１


配列番号２


配列番号３

配列番号４






配列番号５

配列番号６

配列番号７
重鎖（ｇ_２／４） （４４８アミノ酸）

配列番号８
軽鎖：（κ）（２１４アミノ酸）

配列番号９

配列番号１０

配列番号１１

配列番号１２

配列番号１３

配列番号１４

配列番号１５

配列番号１６

配列番号４７抗ヒト−Ｃ５ａ軽鎖

配列番号４８抗ヒト−Ｃ５ａ重鎖

配列番号４９


配列番号５０ ＳｃＦｖ

配列表１＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリヌクレオチド
配列表２＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表３＜２２３＞人工配列の記載：合成ペプチド
配列表４〜８＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表９〜１４＜２２３＞人工配列の記載：合成ペプチド
配列表１５〜１６＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表１７〜２２＜２２３＞人工配列の記載：合成ペプチド
配列表２３〜４６＜２２３＞人工配列の記載：合成プライマー
配列表４７〜５０＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド

Claims (23)

1. 患者の加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を治療する方法であって、有効量の抗体またはその抗原結合フラグメントを前記患者に投与するステップを含み、前記抗体が抗Ｃ５抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗Ｃ５ａ抗体もしくはその抗原結合フラグメントである方法。
2. 前記抗体が抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１に記載の方法。
3. 前記抗Ｃ５抗体がエクリズマブまたはエクリズマブ変異体である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記エクリズマブまたはエクリズマブ変異体が約３０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、またはそれ以上で投与される、請求項３に記載の方法。
5. 前記抗Ｃ５抗体が、配列番号１、配列番号２、配列番号５０、配列番号５および配列番号６、または配列番号７および配列番号８に示されるアミノ酸配列、あるいは上記のいずれかの抗原結合フラグメントを含むポリペプチドである、請求項１または２に記載の方法。
6. 前記抗Ｃ５抗体が配列番号９〜１６に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントを含むポリペプチドである、請求項１または２に記載の方法。
7. 前記抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメントが抗Ｃ５抗体の抗原結合フラグメントであり、前記フラグメントが一本鎖抗体である、請求項１または２に記載の方法。
8. 前記抗体が配列番号４７に示される軽鎖および配列番号４８または配列番号４９に示される重鎖を有するヒト化抗Ｃ５ａモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
9. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが静脈内投与される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが硝子体内投与される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが約５００μｇ〜約１５００μｇ／眼で投与される、請求項１１に記載の方法。
12. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、約０．５ｍｇ、約１．５ｍｇ、約５ｍｇまたは約１０ｍｇ／眼で投与される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ／眼で投与される、請求項１１に記載の方法。
14. γδＴ細胞のレベルを低下させるステップをさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記脾臓内のＴｈ１７細胞および／またはγδＴ細胞のレベルを低下させるステップをさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記眼内のＩＬ−１７のレベルを低下させるステップをさらに含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
17. 第２の治療薬を前記患者に投与するステップをさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記患者がヒト患者である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記ＡＭＤが滲出型ＡＭＤである、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記ＡＭＤがドライ型（萎縮型）ＡＭＤである、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記眼内の炎症が軽減される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記眼の脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）が減少する、請求項２０に記載の方法。
23. 前記患者の視力の改善または維持、前記眼内のＩＬ−１７レベルの低下、前記眼内の炎症の減少、前記眼内のγδＴ細胞のレベルの低下、前記脾臓内のＴｈ１７細胞およびγδＴ細胞の産生の減少、またはＣＮＶサイズの減少からなる群から選択される１つまたは複数をさらに含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。