KR102277166B1

KR102277166B1 - Masp-2 의존성 보체 활성화와 관련된 질병의 치료 방법

Info

Publication number: KR102277166B1
Application number: KR1020187016413A
Authority: KR
Inventors: 그레고리 에이. 데모풀로스; 토마스 두들러; 한스-윌헬름 쉬웨블
Original assignee: 오메로스 코포레이션; 유니버시티 오브 레스터
Priority date: 2015-11-09
Filing date: 2016-11-09
Publication date: 2021-07-15
Also published as: GEP20247583B; AU2020201500A1; MX2018005165A; EP3373963A1; IL259225A; WO2017083371A1; MX2023001193A; JP6814802B2; EP3373963A4; CN108472347A; CA3004753A1; UA124094C2; PH12018501009A1; SG11201803834UA; AU2016354117A1; CL2018001258A1; BR112018009311A2; AU2016354117B2; BR112018009311A8; EA201891132A1

Abstract

한 양태에서, 본 발명은 조혈모세포 이식과 관련된 TMA를 앓고 있는 인간 대상체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화의 효과를 억제하는 방법을 제공한다. 방법은 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

Description

MASP-2 의존성 보체 활성화와 관련된 질병의 치료 방법

관련 출원에 대한 교차-참조

본 출원은 2016년 10월 11일에 출원된 가출원 번호 62/406,726의 이익을 주장하고, 2015년 11월 9일에 출원된 가출원 번호 62/252,814의 이익을 주장하며, 이것들 둘 다는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

서열 목록에 관한 진술

본 출원과 관련된 서열 목록은 서류 사본 대신에 텍스트 포맷으로 제공되며 참고로 명세서에 포함된다. 서열 목록을 포함한 텍스트 파일의 명칭은 MP_1_0248_PCT_Sequence_Listing_as_Filed_20161109.txt이다. 텍스트 파일은 115 KB이며, 2016년 11월 8일에 생성되었고 본 명세서의 출원과 함께 EFS-Web을 통해 제출된다.

보체 시스템은 인간 및 그 밖의 척추동물에서 미생물 감염 및 그 밖의 심각한 손상에 대한 면역 반응을 개시하고, 증폭시키고 조정하기 위한 조기 작용 메커니즘을 제공한다 (M.K. Liszewski and J.P. Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, edited by W.E. Paul, Raven Press, Ltd., New York). 보체 활성화는 잠재적 병원체에 대하여 중요한 제1 선 방어를 제공하는 한편, 보호적 면역 반응을 촉진하는 보체의 활성은 또한 숙주에게 잠재적 위협을 나타낼 수 있다 (K.R. Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994). 예를 들어, C3 및 C5 단백질 가수분해 생성물은 호중구를 모집하여 활성화시킨다. 숙주 방어에 불가결하긴 하지만, 활성화된 호중구는 무분별하게 파괴적인 효소를 방출하여 장기 손상을 유발할 수도 있다. 이에 더하여, 보체 활성화는 인근의 숙주 세포, 뿐만 아니라 미생물 표적 상에 용해성 보체 성분의 참착을 유발하여, 숙주 세포의 용해를 초래할 수도 있다.

보체 시스템은 또한 다음을 포함한 많은 급성 및 만성 질환 상태의 발병 기전에 관련되어 있는 것으로 나타난다: 심근 경색(myocardial infarction), 뇌졸중(stroke), ARDS, 재관류 손상(reperfusion injury), 패혈성 쇼크(septic shock), 열성 화상에 따른 모세관 누출, 후심폐 바이패스 염증(postcardiopulmonary bypass inflammation), 이식 거부 반응, 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 다발성 관절염(multiple sclerosis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 및 알츠하이머 병(Alzheimer's disease). 이들 질병 중 거의 전부에서, 보체가 원인은 아니지만 발병 기전에 관련된 여러 요인 중 하나이다. 그럼에도 불구하고, 보체 활성화는 주요 생리학적 메커니즘일 수도 있으며 이들 질환 상태 중 다수에서 임상적 통제에 효과적인 지점을 나타낸다. 다양한 질환 상태에서 보체-매개 조직 손상의 중요성에 대한 인식의 증가는 효과적인 보체 억제제의 필요성을 강조한다. 지금까지, 에쿨리쥬맙 (Solaris®), C5에 대한 항체는 단지 인간 사용에 대하여 승인된 보체-표적화제이다. 하지만, C5는 보체 시스템의 "다운스트림(downstream)"에 위치한 여러 여러 효과기 분자 중 하나이며, C5의 차단이 보체 시스템의 활성화를 억제하는 것은 아니다. 그러므로, 보체 활성화의 개시 단계의 억제자는 "다운스트림" 보체 억제자보다 큰 이점을 가질 것이다.

현재, 보체 시스템은 세 개의 별개의 경로, 고전적 경로, 렉틴 경로, 및 대체 경로를 통해 활성화될 수 있다는 것이 널리 수용되고 있다. 고전적 경로는 보통 외래 입자 (즉, 항원)에 결합된 숙주 항체로 구성된 복합체에 의해 야기되며 따라서 특정 항체 반응의 생성을 위해서는 항원으로의 사전 노출이 필요하다. 고전적 경로의 활성화가 숙주에 의한 사전 후천적 면역 반응에 의존하기 때문에, 고전적 경로는 후천적 면역 시스템의 일부이다. 그에 반해, 렉틴 경로 및 대체 경로 둘 다는 후천적 면역력에 독립적이며 선천적 면역 시스템의 일부이다.

보체 시스템의 활성화는 세린 프로테아제 치모겐의 순차적 활성화를 초래한다. 고전적 경로 활성화의 첫 번째 단계는 항원-결합된 IgG 및 IgM 분자로의 특이적 인식 분자, C1q의 결합이다. C1q는 Cl이라고 불리는 복합체로서 C1r 및 C1s 세린 프로테아제 효소 전구체와 회합된다. 면역 복합체로의 C1q의 결합시, C1r의 Arg-Ile 부위의 자가 단백질 가수분해 분열 이후 C1s의 C1r-매개 분열 및 활성화가 이어지며, 이로 인해 C4 및 C2를 분열시키는 능력을 획득한다. C4는 C4a 및 C4b로 지정된 두 개의 단편으로 분열되고, 마찬가지로, C2는 C2a 및 C2b로 분열된다. C4b 단편은 인접한 하이드록실 또는 아미노 기와 공유 결합을 형성하고 활성화된 C2의 C2a 단편과의 비공유 결합에 의한 상호작용을 통해 C3 컨버타제 (C4b2a)를 생성할 수 있다. C3 컨버타제 (C4b2a)는 C3a 및 C3b 하위 구성요소로의 단백질 가수분해 분열에 의해 C3를 활성화시켜서 C5 컨버타제 (C4b2a3b)의 생성을 유도하며, 이것은 C5를 분열시킴으로써 세포막을 파괴시켜 세포 용해를 유도할 수 있는 막 공격 복합체 (C6, C7, C8 및 C-9와 조합된 C5b, "MAC"로도 불림)의 형성을 유도한다. 활성화된 형태의 C3 및 C4 (C3b 및 C4b)는 공유 결합에 의해 외래 표적 표면 상에 침착되며, 이것은 다수의 식균 세포 상에서 보체 수용체에 의해 인식된다.

독립적으로, 렉틴 경로를 통한 보체 시스템 활성화의 첫 번째 단계는 또한 특이적 인식 분자의 결합이며, 이후 회합된 세린 프로테아제 효소 전구체의 활성화로 이어진다. 하지만, C1q에 의한 면역 복합체의 결합 대신에, 렉틴 경로의 인식 분자는 일괄적으로 렉틴이라고 불리는 탄수화물-결합 단백질 (만난-결합 렉틴 (MBL), H-피콜린, M-피콜린, L-피콜린 및 C형 렉틴 CL-11)의 군을 포함한다. J. Lu et al., Biochim. Biophys. Acta 1572:387-400, (2002); Holmskov et al., Annu. Rev. Immunol. 21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000)). See also J. Luet et al., Biochim Biophys Acta 1572:387-400 (2002); Holmskov et al, Annu Rev Immunol 21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000); Hansen et al, J. Immunol 185(10):6096-6104 (2010) 참조.

Ikeda, 등은 처음에, C1q와 마찬가지로, MBL이 효모 만난-코팅된 적혈구로의 결합시 C4-의존적 방식으로 보체 시스템을 활성화시킬 수 있다는 것을 입증하였다 (Ikeda et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, (1987)). 콜렉틴 단백질 패밀리의 구성원인 MBL은 탄수화물을 피라노스 고리의 적도면에서 배향된 3- 및 4-하이드록시 기를 가진 탄수화물에 결합하는 칼슘-의존적 렉틴이다. 따라서 MBL에 대하여 중요한 리간드는 D-만노스 및 N-아세틸-D-글루코사민이지만, 이 입체 구조적 요건에 적합하지 않은 탄수화물은 MBL에 대하여 검출 가능한 친화도를 갖지 않는다 (Weis et al., Nature 360:127-134, (1992)). MBL과 1가 당 간의 상호작용은 매우 약하며, 해리 상수는 전형적으로 한 자릿 수의 밀리몰 범위에 있다. MBL은 결합력에 의해, 즉, 서로 근접하게 위치한 다수의 단당류 잔기와 동시에 상호작용함으로써 글리칸 리간드로의 단단하고, 특이적인 결합을 달성한다 (Lee et al., Archiv. Biochem. Biophys. 299:129-136, (1992)). MBL은 일반적으로 박테리아, 효모, 기생충 및 특정 바이러스와 같은 미생물을 가식하는 탄수화물 패턴을 인식한다. 그에 반해, MBL은 포유류 혈장 및 세포 표면 당단백질 상에 존재하는 "성숙한" 복합 당컨쥬게이트를 일반적으로 가식하는 D-갈락토스 및 시알산, 끝에서 두 번째 및 최후의 당을 인식하지 않는다. 이 결합 특이성은 "외래" 표면의 인식을 촉진하고 "자가-활성화"로부터의 보호를 돕는 것으로 생각된다. 하지만, MBL은 표유류 세포의 소포체 및 골지체에서 격리된 N-결합된 당단백질 및 당지질 상의 고-만노스 "전구물질" 글리칸의 클러스터(cluster)에 높은 친화도로 결합한다 (Maynard et al., J. Biol. Chem. 257:3788-3794, (1982)). 그러므로, 손상된 세포는 MBL 결합을 통한 렉틴 경로 활성화에 대한 잠재적 표적이다.

피콜린은 MBL과는 상이한 유형의 렉틴 도메인, 소위 피브리노겐-유사 도메인을 가지고 있다. 피콜린은 Ca⁺⁺-독립적 방식으로 당 잔류물에 결합한다. 인간에서는, 세 종류의 피콜린 (L-피콜린, M-피콜린 및 H-피콜린)이 식별되었다. 두 개의 혈청 피콜린, L-피콜린 및 H-피콜린은 공통적으로 N-아세틸-D-글루코사민에 대한 특이성을 갖는다; 하지만, H-피콜린은 또한 N-아세틸-D-갈락토사민에 결합한다. L-피콜린, H-피콜린, CL-11, 및 MBL의 당 특이성의 차이는 상이한 렉틴이 상보적이며, 중첩되지만, 상이한 당컨쥬게이트를 표적화할 수도 있다는 것을 의미한다. 이 개념은, 렉틴 경로의 공지된 렉틴 중에서, 단지 L-피콜린만이 리포테이코산, 모든 그람-양성(Gram-positive) 박테리아에서 발견되는 세포벽 당컨쥬게이트에 특이적으로 결합한다는 최근의 보고서에 의해 지지된다 (Lynch et al., J. Immunol. 172:1198-1202, (2004)). 콜렉틴 (즉, MBL) 및 피콜린은 아미노산 서열에서의 유의한 유사성을 갖지 않는다. 하지만, 단백질의 두 군은 유사한 도메인 조직을 갖고, C1q와 마찬가지로, 올리고머 구조로 조립되어, 다중 부위 결합의 가능성을 극대화한다.

MBL의 혈청 농도는 건강한 코호트에서 매우 가변적이고 이것은 MBL 유전자의 프로모터 및 암호화 영역 둘 다에서의 다형성/돌연변이에 의해 유전적으로 제어된다. 급성기 단백질로서, MBL의 발현은 염증 동안에 더 상향조절된다. L-피콜린은 MBL과 유사한 농도로 혈청에 존재한다. 그러므로, 렉틴 경로의 L-피콜린 브랜치(branch)는 강도가 MBL 암(arm)과 잠재적으로 비슷하다. MBL 및 피콜린은 또한 옵소닌으로서 기능할 수 있으며, 이것은 식균 세포가 MBL- 및 피콜린-가식된 표면을 표적화할 수 있게 한다 (Jack et al., J Leukoc Biol., 77(3):328-36 (2004), Matsushita and Fujita, Immunobiology, 205(4-5):490-7 (2002), Aoyagi et al., J Immunol, 174(1):418-25(2005) 참조). 이 옵소닌화는 이들 단백질과 식균 세포 수용체의 상호작용을 필요로 하며 (Kuhlman et al., J. Exp. Med. 169:1733, (1989); Matsushita et al., J. Biol. Chem. 271:2448-54, (1996)), 그 정체성이 확립된 것은 아니다.

인간 MBL은 MBL-관련 세린 프로테아제 (MASP)라고 불리는 고유한 C1r/C1s-유사 세린 프로테아제와 콜라겐-유사 도메인을 통한 특이적이고 고-친화도의 상호작용을 형성한다. 지금까지, 세 개의 MASP가 기술되었다. 먼저, 단일 효소 "MASP"가 식별되었고 보체 캐스케이드 (즉, C2 및 C4의 분열)의 개시의 원인이 되는 효소로서 특성화되었다 (Matsushita et al., J Exp Med 176(6):1497-1502 (1992); Ji et al., J. Immunol. 150:571-578, (1993)). 그 후 MASP 활성은, 사실상, 두 개의 프로테아제, MASP-1 및 MASP-2의 혼합물이라는 것이 결정되었다 (Thiel et al., Nature 386:506-510, (1997)). 하지만, MBL-MASP-2 복합체는 단독으로 보체 활성화에 충분하다는 것이 입증되었다 (Vorup-Jensen et al., J. Immunol. 165:2093-2100, (2000)). 게다가, MASP-2만이 높은 속도로 C2 및 C4를 분열시켰다 (Ambrus et al., J. Immunol. 170:1374-1382, (2003)). 그러므로, MASP-2는 C4 및 C2를 활성화하여 C3 컨버타제, C4b2a를 생성하는 것의 원인이 되는 프로테아제이다. 이것은 고전적 경로의 C1 복합체와의 중요한 차이이며, 두 개의 특이적 세린 프로테아제 (C1r 및 C1s)의 협력 작용은 보체 시스템의 활성화로 이어진다. 이에 더하여, 세 번째의 새로운 프로테아제, MASP-3가 분리되었다 (Dahl, M.R., et al., Immunity 15:127-35, 2001). MASP-1 및 MASP-3는 같은 유전자의 대안으로 스플라이싱된 생성물이다.

MASP는 C1 복합체의 효소적 구성요소인 C1r 및 C1s와 동일한 도메인 조직을 공유한다 (Sim et al., Biochem. Soc. Trans. 28:545, (2000)). 이들 도메인은 N-말단 C1r/C1s/성게 VEGF/골 형성 단백질 (CUB) 도메인, 표피 성장 인자-유사 도메인, 제2 CUB 도메인, 보체 제어 단백질 도메인의 탠덤(tandem), 및 세린 프로테아제 도메인을 포함한다. C1 프로테아제에서와 같이, MASP-2의 활성화는 세린 프로테아제 도메인에 인접한 Arg-I1e 결합의 분열을 통해 일어나는데, 이것은 효소를 이황화-결합된 A 및 B 사슬로 분열시키며, 후자는 세린 프로테아제 도메인으로 구성된다.

MBL은 또한 19 kDa의 MBL-관련 단백질 (MAp19) 또는 작은 MBL-관련 단백질 (sMAP)로 알려져 있는, MASP2의 촉매 활성이 없는, 대안으로 스플라이싱된 형태의 MASP-2와 회합할 수 있다 (Stover, J. Immunol. 162:3481-90, (1999); Takahashi et al., Int. Immunol. 11:859-863, (1999)). MAp19는 MASP-2의 처음 두 개의 도메인에 이어서, 네 개의 고유한 아미노산 추가 서열을 포함한다. Map19의 기능은 불분명하다 (Degn et al., J Immunol. Methods, 2011). MASP-1 및 MASP-2 유전자는 각각 인간 염색체 3 및 1 상에 위치한다 (Schwaeble et al., Immunobiology 205:455-466, (2002)).

여러 증거들이 상이한 MBL-MASP 복합체가 존재하고 혈청 중의 MASP의 큰 분획이 MBL과 복합체를 형성하지 않는다는 것을 제안한다 (Thiel, et al., J. Immunol. 165:878-887, (2000)). MBL과 마찬가지로, H- 및 L-피콜린은 둘 다 모든 MASP에 결합하고 렉틴 보체 경로를 활성화시킨다 (Dahl et al., Immunity 15:127-35, (2001); Matsushita et al., J. Immunol. 168:3502-3506, (2002)). 렉틴 및 고전적 경로는 둘 다 공통의 C3 컨버타제 (C4b2a)를 형성하고 이 단계에서 두 경로가 통합된다.

렉틴 경로는 나이브(naive) 숙주에서의 감염에 대한 숙주 방어에 중요한 역할을 하는 것으로 널리 알려져 있다. 숙주 방어에서 MBL의 포함에 대한 강력한 증거는 기능적 MBL의 혈청 수준이 감소된 환자의 분석으로부터 비롯된다 (Kilpatrick, Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413, (2002)). 이러한 환자는 재발성 박테리아 및 균류 감염에 대한 민감성을 나타낸다. 이들 증상은 보통 삶의 초기에, 모체로부터 유래된 항체 역가가 감소함에 따라 민감성이 명백한 동안에, 하지만 항체 반응의 전체 레퍼토리가 나타나기 전에 분명해진다. 이 증상은 종종 MBL의 콜라겐성 부분의 여러 부위에서 돌연변이를 초래하며, 이것은 MBL 올리고머의 제대로 된 형성을 방해한다. 하지만, MBL이 보체 독립적인 옵소닌으로서 기능할 수 있기 때문에, 어느 정도까지 감염에 대한 민감성의 증가가 손상된 보체 활성화 때문인지는 알려져 있지 않다.

고전적 경로 및 렉틴 경로와는 달리, 대체 경로의 개시자는 C1q 및 렉틴이 다른 두 개의 경로로 수행하는 인식 기능을 실행하지 않는 것으로 발견되었다. 현재 대체 경로가 자발적으로 낮은 수준의 턴오버(turnover) 활성화를 거친다는 것이 널리 수용되고 있으며, 이것은 자발적 보체 활성화를 억제하는 적절한 분자적 요소가 없는 외래의 또는 그 밖의 비정상적인 표면 (박테리아, 효모, 바이러스 감염된 세포, 또는 손상된 조직) 상에서 쉽게 증폭될 수 있다. 네 개의 혈장 단백질이 대체 경로의 활성화에 직접적으로 수반된다: C3, 인자 B 및 D, 및 프로퍼딘.

비-감염성 인간 질환의 발병 기전에서 고전적 경로 및 대체 보체 경로 둘 다에 관련된 광범위한 증거가 존재하지만, 렉틴 경로의 역할은 이제 막 평가되기 시작했다. 최근의 연구는 렉틴 경로의 활성화가 허혈/재관류 손상에서의 보체 활성화 및 관련된 염증의 원인이 될 수 있다는 증거를 제공한다. Collard, 등 (2000)은 산화 스트레스를 받은 배양된 내피 세포가 MBL에 결합하고 인간 혈청에 노출시 C3의 침착을 나타낸다는 것을 보고하였다 (Collard et al., Am. J. Pathol. 156:1549-1556, (2000)). 이에 더하여, 차단 항-MBL 단클론성 항체로의 인간 혈청의 처리는 MBL 결합 및 보체 활성화를 억제하였다. 이들 발견은 심근 허혈-재관류의 래트 모델로 확장되었으며, 여기서 래트 MBL에 대한 차단 항체로 처리된 래트가 관상 동맥의 폐색 시 대조군 항체로 처리된 래트보다 훨씬 더 적은 심근 손상(myocardial damage)을 나타냈다 (Jordan et al., Circulation 104:1413-1418, (2001)). 산화 스트레스 후 혈관 내피(vascular endothelium)로의 MBL 결합의 분자적 메커니즘은 불분명하다; 최근의 연구는 산화 스트레스 후 렉틴 경로의 활성화가 당컨쥬게이트가 아니라, 혈관 내피 사이토케라틴으로의 MBL 결합에 의해 매개될 수도 있다는 것을 제안한다 (Collard et al., Am. J. Pathol. 159:1045-1054, (2001)). 그 밖의 연구는 고전적 경로 및 대체 경로가 허혈/재관류 손상의 발병 기전에 관련되어 있음을 나타내며 이 질환에서 렉틴 경로의 역할은 여전히 논쟁의 여지가 있다 (Riedermann, N.C., et al., Am. J. Pathol. 162:363-367, 2003).

최근의 연구는 MASP-1 (및 아마도 MASP-3 또한)이 대체 경로 활성화 효소 인자 D를 그것의 치모겐 형태에서 효소적으로 활성인 형태로 전환시키는데 필요하다는 것을 나타냈다 (Takahashi M. et al., J Exp Med 207(1):29-37 (2010) 참조). 이 과정의 생리학적 중요성은 MASP-1/3-결핍 마우스의 혈장에서 대체 경로 기능적 활성의 부재에 의해 강조된다. 천연 C3로부터 C3b의 단백질 가수분해에 의한 생성은 대체 경로가 기능하는데 필요하다. 대체 경로 C3 컨버타제 (C3bBb)가 필수적인 서브유닛으로서 C3b를 포함하기 때문에, 대체 경로를 통한 최초의 C3b의 기원에 관한 의문은 난해한 문제를 제공하였고 상당한 연구를 자극하고 있다.

C3는 티오에스터 결합으로 알려져 있는 희귀한 번역 후 변형을 포함하는 단백질의 패밀리에 속한다 (C4 및 α-2 매크로글로불린과 함께). 티오에스터 기는 말단 카보닐 기가 세 개의 아미노산만큼 떨어진 시스테인의 설프하이드릴 기와 공유 티오에스터 결합을 형성하는 글루타민으로 구성된다. 이 결합은 불안정하고 친전자성 글루타밀-티오에스터는 하이드록실 또는 아미노 기와 같은 친핵성 모이어티와 반응할 수 있으며 따라서 그 밖의 분자와 공유 결합을 형성한다. 티오에스터 결합은 온전한 C3의 소수성 포켓 내에서 격리될 때 상당히 안정적이다. 하지만, C3a 및 C3b로의 C3의 단백질 가수분해 분열은 C3b 상에서 고도로 반응성인 티오에스터 결합의 노출을 초래하고, 하이드록실 또는 아미노 기를 포함한 인접한 모이어티에 의한 친핵성 공격 후, C3b는 표적에 공유 결합된다. 보체 표적으로의 C3b의 공유 결합에 의한 부착에서의 잘 문서화된 역할 외에도, C3 티오에스터는 또한 대체 경로를 야기하는데 중추적인 역할을 할 것으로 생각된다. 광범위하게 수용되는 "틱-오버 이론(tick-over theory)"에 따르면, 대체 경로는 유동상 컨버타제, iC3Bb의 생성에 의해 개시되며, 이것은 C3로부터 가수분해된 티오에스터 (iC3; C3(H₂O)) 및 인자 B로 형성된다 (Lachmann, P.J., et al., Springer Semin. Immunopathol. 7:143-162, (1984)). C3b-유사 C3(H₂O)는 단백질 내의 내부 티오에스터의 느린 자발적 가수분해에 의해 천연 C3로부터 생성된다 (Pangburn, M.K., et al., J. Exp. Med. 154:856-867, 1981). C3(H₂O)Bb 컨버타제의 활성을 통해, C3b 분자는 표적 표면 상에 침착되어 대체 경로를 개시한다.

대체 경로 활성화의 개시자에 대해서는 알려진 것이 거의 없다. 활성화 인자는 효모 세포벽 (치모산), 다수의 순수한 다당류, 토끼 적혈구, 특정 면역글로불린, 바이러스, 균류, 박테리아, 동물 종양 세포, 기생충, 및 손상된 세포를 포함하는 것으로 생각된다. 이들 활성화 인자에 공통적인 유일한 특징은 탄수화물의 존재이지만, 탄수화물 구조의 복잡성 및 다양성은 인식되는 공유된 분자적 결정요인을 확립하기 어렵게 만들었다. 대체 경로 활성화가 인자 H, 인자 I, DAF, 및 CR1과 같은 이 경로의 억제 조절 구성요소와 대체 경로의 유일한 양성 조절인자인 프로퍼딘 간의 미세한 균형을 통해 제어된다는 것이 널리 수용되고 있다 (Schwaeble W.J. and Reid K.B., Immunol Today 20(1):17-21 (1999) 참조).

상기 기술된 명확하게 조절되지 않는 활성화 메커니즘에 더하여, 대체 경로는 또한 생성된 임의의 C3b가 인자 B와 함께 추가적인 대체 경로 C3 컨버타제 (C3bBb)를 형성하는데 참여할 수 있기 때문에 렉틴/고전적 경로 C3 컨버타제 (C4b2a)에 대한 강력한 증폭 루프를 제공할 수 있다. 대체 경로 C3 컨버타제는 프로퍼딘의 결합에 의해 안정화된다. 프로퍼딘은 대체 경로 C3 컨버타제 반감기를 6 내지 10배 연장시킨다. 대체 경로 C3 컨버타제로의 C3b의 추가는 대체 경로 C5 컨버타제의 형성을 유발한다.

세 가지 경로 (즉, 고전적 경로, 렉틴 경로 및 대체 경로)는 모두 C5에서 통합되는 것으로 생각되며, 이것은 분열되어 다수의 전염증성 효과를 가진 생성물을 형성한다. 통합된 경로는 말단 보체 경로라고 불린다. C5a는 가장 강력한 아나필라톡신이며, 평활근 및 혈관 긴장도, 뿐만 아니라 혈관 투과성의 변화를 유도한다. 그것은 또한 강력한 케모탁신이고 호중구 및 단핵구 둘 다의 활성화 인자이다. C5a-매개 세포 활성화는 사이토카인, 가수분해 효소, 아라키돈산 대사산물, 및 활성 산소종을 포함하는 다수의 추가적인 염증 매개체의 방출을 유도함으로써 염증 반응을 크게 증폭시킬 수 있다. C5 분열은 막 공격 복합체 (MAC)로도 알려져 있는 C5b-9의 형성을 유발한다. 현재 저용해 MAC 침착이 용해성 기공-형성 복합체로서의 역할 외에도 염증에서 중요한 역할을 할 수 있다는 강력한 증거가 존재한다.

면역 방어에서의 필수적인 역할 외에도, 보체 시스템은 많은 임상 조건에서의 조직 손상에 기여한다. 따라서, 이들 부작용을 방지하기 위해 치료적으로 유효한 보체 억제자를 개발하는 것이 절실하게 필요하다.

이 개요는 하기 상세한 설명에서 더 기술된 단순화된 형태의 개념의 선택을 소개하기 위해 제공된다. 이 개요는 청구된 주제의 주요 특징을 식별하려는 것도 아니고, 청구된 주제의 범위를 결정하는데 도움을 주기 위해 사용하려는 것도 아니다.

한 양태에서, 본 발명은 혈전성 미세혈관증 (thrombotic microangiopathy; TMA)을 앓고 있는 대상체에서 미세혈관 내피 세포 손상 및/또는 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공하며 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 포함한 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 용혈성 요독성 증후군 (hemolytic uremic syndrome; aHUS), 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (thrombotic thrombocytopenic purpura; TTP) 및 비정형 용혈성 요독성 증후군 (atypical hemolytic uremic syndrome; HUS)으로 구성된 군으로부터 선택된 TMA를 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있다. 일부 구체예에서, 조성물의 투여 전에 대상체는 (i) 빈혈증(anemia), (ii) 혈소판 감소증(thrombocytopenia), (iii) 신부전(renal insufficiency) 및 (iv) 크레아티닌 증가로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 증상을 나타내는 것으로 결정되고, 조성물은 유효량으로 및 상기 하나 이상의 증상을 개선하기에 충분한 기간 동안 투여된다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 항체, 또는 이것의 단편이다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 서열 번호:6의 일부에 특이적으로 결합하는 항-MASP-2 단클론성 항체, 또는 이것의 단편이다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 미세혈관 내피 세포 손상을 억제한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)을 앓고 있거나 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 조성물의 투여 전에, 대상체는 (i) 빈혈증, (ii) 혈소판 감소증 (iii) 신부전 및 (iv) 크레아티닌 증가로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 증상을 나타내는 것으로 결정되고, 조성물은 유효량으로 및 상기 하나 이상의 증상을 개선하기에 충분한 기간 동안 투여된다. 한 구체예에서, 대상체는 비-인자 H-의존적 aHUS를 앓고 있거나 또는 이것에 걸릴 위험이 있다. 한 구체예에서, 대상체는 인자 I, 인자 B, 또는 막 공통 인자 CD46과 관련된 aHUS를 앓고 있다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 항체, 또는 이것의 단편, 예컨대 서열 번호:6의 일부에 특이적으로 결합하는 항-MASP-2 단클론성 항체, 또는 이것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 미세혈관 내피 세포 손상을 억제한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 혈전 형성을 억제한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)에 걸릴 위험이 있는 대상체가 aHUS와 관련된 임상적 증상을 앓을 가능성을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 이 양태에 따르는 방법은 (a) 대상체에서 aHUS와 관련된 것으로 알려져 있는 유전자 마커의 존재를 결정하는 단계; (b) 대상체를 주기적으로 모니터링하여 빈혈증, 혈소판 감소증, 신부전 및 크레아티닌 증가로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 증상의 존재 또는 부재를 결정하는 단계; 및 (c) 빈혈증, 혈소판 감소증, 신부전 또는 크레아티닌 증가 중 적어도 하나의 존재의 결정시 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 조성물은 유효량으로 및 상기 하나 이상의 증상을 개선하기에 충분한 기간 동안 투여된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 항체, 또는 이것의 단편, 예컨대 서열 번호:6의 일부에 특이적으로 결합하는 항-MASP-2 단클론성 항체, 또는 이것의 단편이다. 본 발명의 한 구체예에서, 단계 (a)는 대상체로부터 얻어진 샘플에서 유전자 스크리닝 테스트를 수행하는 것과 보체 인자 H (CFH), 인자 I (CFI), 인자 B (CFB), 막 공통 인자 CD46, C3, 보체 인자 H-관련 단백질 (CFHR1), 항응고 단백질 트롬보듈린 (THBD), 보체 인자 H-관련 단백질 3 (CFHR3) 및 보체 인자 H-관련 단백질 4 (CFHR4)로 구성된 군으로부터 선택된 유전자에서 aHUS와 관련된 적어도 하나의 유전자 마커의 존재를 식별하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 방법은 트리거링(triggering) aHUS 임상적 증상과 관련된 것으로 알려져 있는 이벤트의 발생에 대하여 대상체를 모니터링하는 단계 및 트리거링 이벤트의 발생 전에, 동안에, 또는 후에 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 한 구체예에서, 트리거링 aHUS 임상적 증상과 관련된 이벤트는 약물 노출, 감염, 악성 종양, 손상, 장기 또는 조직 이식 및 임신으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 감염은 박테리아 감염이다. 한 구체예에서, 조성물은 피하로 투여된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 미세혈관 내피 세포 손상을 억제한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 혈전 형성을 억제한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 감염에 부차적인 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)을 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, MASP-2 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 대상체는 스트렙토코쿠스 뉴모니아(S. pneumonia) 감염에 관련된 비-장용성 aHUS를 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 항체, 또는 이것의 단편, 예컨대 서열 번호:6의 일부에 특이적으로 결합하는 항-MASP-2 단클론성 항체, 또는 이것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 미세혈관 내피 세포 손상을 억제한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 혈전 형성을 억제한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하는데, MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, MASP-2 억제제의 투여는 정맥 내 카테터(catheter) 또는 그 밖의 카테터 전달 방법을 통해 투여된다. 한 구체예에서, 방법은 혈장 반출법(plasmapheresis)으로 환자를 치료하는 단계를 더 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 혈장 반출법의 부재 하에서 투여된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 제1 기간 동안 카테터를 통해 투여되며, 제2 기간 동안 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 더 포함하고, 조성물은 제2 기간 동안 피하로 투여된다. 한 구체예에서, 방법은 적어도 하나의 보체 인자의 수준을 주기적으로 결정하는 단계를 더 포함하며, 표준치 또는 건강한 대상체와 비교하여 적어도 하나의 보체 인자의 감소된 수준의 결정은 조성물로의 지속적인 처리에 대한 필요성을 나타낸다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 항체, 또는 이것의 단편, 예컨대 서열 번호:6의 일부에 특이적으로 결합하는 항-MASP-2 단클론성 항체, 또는 이것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 미세혈관 내피 세포 손상을 억제한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 혈전 형성을 억제한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP)을 앓고 있거나, 또는 TTP의 진단과 일치하는 증상을 나타내는 대상체를 치료하는 방법을 제공하는데, MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, MASP-2 억제제의 투여는 정맥 내 카테터 또는 그 밖의 카테터 전달 방법을 통해 대상체에게 투여된다. 한 구체예에서, 대상체는 중추신경계 포함, 혈소판 감소증, 중증 심장 포함, 중증 폐 포함, 위장관 경색 및 괴저(gangrene)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 증상을 나타낸다. 한 구체예에서, 대상체는 ADAMTS13의 억제자의 존재에 대하여 양성 반응을 보였고, 방법은 대상체에게 면역억제제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 혈장 반출법의 부재 하에서 제1 기간 동안 투여된다. 한 구체예에서, 대상체는 ADAMTS-13의 억제자의 존재에 대하여 양성 반응을 보였고, 방법은 ADAMTS-13를 투여하는 단계를 더 포함한다. 한 구체예에서, 방법은 혈장 반출법으로 환자를 치료하는 단계를 더 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 혈장 반출법의 존재 하에서 투여된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 제1 기간 동안 카테터를 통해 투여되며, 제2 기간 동안 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 더 포함하고, 조성물은 제2 기간 동안 피하로 투여된다. 한 구체예에서, 방법은 적어도 하나의 보체 인자의 수준을 주기적으로 결정하는 단계를 더 포함하며, 표준치 또는 건강한 대상체와 비교하여 적어도 하나의 보체 인자의 감소된 수준의 결정은 조성물로의 지속적인 처리에 대한 필요성을 나타낸다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 항체, 또는 이것의 단편, 예컨대 서열 번호:6의 일부에 특이적으로 결합하는 항-MASP-2 단클론성 항체, 또는 이것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 미세혈관 내피 세포 손상을 억제한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 혈전 형성을 억제한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 난치성 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP)을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 조성물은 피하로 투여된다. 한 구체예에서, 방법은 적어도 하나의 보체 인자의 수준을 주기적으로 결정하는 단계를 더 포함하며, 표준치 또는 건강한 대상체와 비교하여 적어도 하나의 보체 인자의 감소된 수준의 결정은 조성물로의 지속적인 처리에 대한 필요성을 나타낸다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 항체, 또는 이것의 단편, 예컨대 서열 번호:6의 일부에 특이적으로 결합하는 항-MASP-2 단클론성 항체, 또는 이것의 단편. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 미세혈관 내피 세포 손상을 억제한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 혈전 형성을 억제한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 혈전성 미세혈관증 (TMA)을 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에서 ASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하는데, TMA는 (i) 암에 부차적인 TMA; (ii) 화학요법에 부차적인 TMA, 또는 (iii) 이식에 부차적인 TMA 중 적어도 하나이며, MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 암에 부차적인 TMA를 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있고, MASP-2 억제제는 TMA에 걸릴 위험을 감소시키거나, 또는 TMA의 심각도를 감소시키는데 효과적인 양으로 대상체에게 전신에 투여된다. 일부 구체예에서, 대상체는 화학요법에 부차적인 TMA를 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있고, MASP-2 억제제는 화학요법 전에, 동안에, 또는 후에, TMA에 걸릴 위험을 감소시키거나, 또는 TMA의 심각도를 감소시키는데 효과적인 양으로, 대상체에게 전신에 투여된다. 일부 구체예에서, 대상체는 이식에 부차적인 TMA를 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있고 MASP-2 억제제는 이식 수술 전에, 동안에, 또는 후에, TMA에 걸릴 위험을 감소시키거나, 또는 TMA의 심각도를 감소시키는데 효과적인 양으로, 대상체에게 전신에 투여된다. 일부 구체예에서 이식 수술은 동종 이계 조혈모세포 이식이다. 일부 구체예에서, 대상체는 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자로의 치료를 이전에 받았거나, 또는 현재 받고 있다. 일부 구체예에서, 방법은 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자, 예컨대 인간화 항-C5 항체 또는 이것의 항원-결합 단편, 예컨대 에쿨리쥬맙을 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 업쇼-슐만 증후군 (Upshaw-Schulman Syndrome; USS)을 앓고 있거나 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 USS에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 단계를 포함하며, 방법은 TTP와 관련된 하나 이상의 임상적 증상을 개선하거나 예방하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 일정 기간 동안 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 대상체를 주기적으로 모니터링하는 단계 및 트리거링 TTP 임상적 증상과 관련된 것으로 알려져 있는 이벤트의 존재 하에서 MASP-2 억제제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 대상체를 주기적으로 모니터링하는 단계 및 빈혈증, 혈소판 감소증 또는 크레아틴 증가의 존재의 결정시 MASP-2 억제제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자로의 처리를 이전에 받았거나, 또는 현재 받고 있다. 일부 구체예에서, 방법은 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자, 예컨대 인간화 항-C5 항체 또는 이것의 항원-결합 단편, 예컨대 에쿨리쥬맙을 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 디고스 병(Degos disease)을 앓고 있는 대상체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자로의 처리를 이전에 받았거나, 또는 현재 받고 있다. 일부 구체예에서, 방법은 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자, 예컨대 인간화 항-C5 항체 또는 이것의 항원-결합 단편, 예컨대 에쿨리쥬맙을 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 치명적 항인지질 증후군 (Catastrophic Antiphospholipid Syndrome; CAPS)을 앓고 있는 대상체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자로의 처리를 이전에 받았거나, 또는 현재 받고 있다. 일부 구체예에서, 방법은 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자, 예컨대 인간화 항-C5 항체 또는 이것의 항원-결합 단편, 예컨대 에쿨리쥬맙을 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 개시된 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 억제 항체 또는 이것의 단편이다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 감소된 효과기 기능을 갖는다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 실질적으로는 고전적 경로를 억제하지 않는다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 서열 번호:6의 일부에 특이적으로 결합하는 항-MASP-2 단클론성 항체, 또는 이것의 단편이다. 일부 구체예에서, 항-MASP-2 항체 또는 이것의 단편은 재조합 항체, 감소된 효과기 기능을 갖는 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 Fv, Fab, Fab', F(ab)₂ 및 F(ab')₂로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단편이다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 단일 사슬 분자이다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 IgG1 분자, IgG2 및 IgG4 분자로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 S228P 돌연변이를 포함하는 IgG4 분자이다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 10 nM 이하의 K_D로 인간 MASP-2에 결합한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 MASP-2의 CCP1 도메인에서 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 1% 인간 혈청에서의 시험관 내(in vitro) 검정에서 10 nM 이하의 IC₅₀으로 C3b 침착을 억제한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 90% 인간 혈청에서 30 nM 이하의 IC₅₀으로 C3b 침착을 억제한다.

본 발명의 개시된 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, MASP-2 억제 단클론성 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편은 (a) i) 서열 번호:67의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) 서열 번호:67의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) 서열 번호:67의 95-102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (b) i) 서열 번호:70의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) 서열 번호:70의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) 서열 번호:70의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 단클론성 항체는 서열 번호:67에서 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에서 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 이것의 항원 결합-단편은 서열 번호:67에서 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에서 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 참조 항체에 의해 인식되는 에피토프의 적어도 일부를 특이적으로 인식한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)을 앓고 있는 대상체에서 혈전 형성을 억제하기 위한 방법이 제공되며, MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 aHUS를 앓고 있는 대상체의 혈청에서 미처리 혈청과 비교하여 적어도 40%만큼 혈전 형성을 억제한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 같은 대상체의 혈청에서의 C5b-9 침착에 대한 억제 효과보다 aHUS를 앓고 있는 대상체의 혈청에서 적어도 20% 초과 (예를 들어, 적어도 30% 초과, 적어도 40% 초과, 또는 적어도 50% 초과)의 수준으로 혈전 형성을 억제한다. 일부 구체예에서, 대상체는 대상체는 aHUS의 급성기에 있다. 일부 구체예에서, 대상체는 aHUS의 관해기(차도 phase)에 있다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 서열 번호:6의 일부에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 또는 이것의 단편이다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 이것의 단편은 재조합 항체, 감소된 효과기 기능을 갖는 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 Fv, Fab, Fab', F(ab)₂ 및 F(ab')₂로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단편이다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 단일 사슬 분자이다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 IgG1 분자, IgG2 및 IgG4 분자로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 S228P 돌연변이를 포함하는 IgG4 분자이다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 10 nM 이하의 K_D로 인간 MASP-2에 결합한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 MASP-2의 CCP1 도메인에서 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 1% 인간 혈청에서의 시험관 내 검정에서 10 nM 이하의 IC₅₀으로 C3b 침착을 억제한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 90% 인간 혈청에서 30 nM 이하의 IC₅₀으로 C3b 침착을 억제한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 단클론성 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편은 (a) i) 서열 번호:67의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) 서열 번호:67의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) 서열 번호:67의 95-102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (b) i) 서열 번호:70의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) 서열 번호:70의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) 서열 번호:70의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 단클론성 항체는 서열 번호:67에서 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에서 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호:67에서 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에서 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 참조 항체에 의해 인식되는 에피토프의 적어도 일부를 특이적으로 인식한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 혈장 요법-저항성 aHUS를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제 항체를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 항-MASP-2 단클론성 항체, 또는 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 이것의 단편이다. 한 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 재조합 항체, 감소된 효과기 기능을 갖는 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 및 인간 항체로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 대상체는 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자로의 처리를 이전에 받았거나, 또는 현재 받고 있으며, 예컨대 말단 보체 억제자는 인간화 항-C5 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이다. 한 구체예에서, 방법은 혈장 반출법으로 환자를 치료하는 단계를 더 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체를 포함하는 조성물은 혈장 반출법의 부재 하에서 투여된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 조혈모세포 이식과 관련된 TMA를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제 항체를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 항-MASP-2 단클론성 항체, 또는 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 이것의 단편이다. 한 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 재조합 항체, 감소된 효과기 기능을 갖는 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 및 인간 항체로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 대상체는 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자로의 처리를 이전에 받았거나, 또는 현재 받고 있다. 한 구체예에서, 대상체는 혈소판 수혈로의 처리에 저항성이고 및/또는 혈장 반출법으로의 치료에 저항성인 조혈모세포 이식과 관련된 TMA를 앓고 있다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 조혈모세포 이식과 관련된 TMA와 관련된 적어도 하나 이상의 임상적 파라미터, 예컨대 혈소판 수준 증가 (예를 들어, 처리 전 혈소판 수준의 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배), 합토글로빈 증가, 및/또는 락테이트 데하이드로게나제 감소를 개선하는데 효과적인 양으로 투여된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 조혈모세포 이식 (HSCT-TMA)과 관련된 지속성 TMA를 앓고 있는 인간 대상체를 치료하는 방법을 제공하며 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 방법은 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계 전에 조혈모세포 이식과 관련된 지속성 TMA에 걸린 인간 대상체를 식별하는 단계를 더 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 단클론성 항체, 또는 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 이것의 단편이다. 한 구체예에서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 재조합 항체, 감소된 효과기 기능을 갖는 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 및 인간 항체로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 실질적으로는 고전적 경로를 억제하지 않는다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 90% 인간 혈청에서 30 nM 이하의 IC₅₀으로 C3b 침착을 억제한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:67에서 제시된 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에서 제시된 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 혈장 반출법의 부재 하에서 환자에게 투여된다. 한 구체예에서, 대상체는 인간화 항-C5 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로의 처리를 이전에 받았거나, 또는 현재 받고 있으며, 예컨대 말단 보체 억제자는 인간화 항-C5 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 대상체에게 전신으로 전달된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 조혈모세포 이식과 관련된 지속성 TMA와 관련된 다음 임상적 파라미터 중 적어도 하나 이상을 개선하는데 효과적인 양으로 투여된다: (i) 혈소판 수준 증가 (예를 들어, 처리 전 혈소판 수준의 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배); (ii) 합토글로빈 증가; (iii) 락테이트 데하이드로게나제 (LDH) 감소; 및/또는 (iv) 크레아티닌 감소.

또 다른 양태에서, 본 발명은 MASP-2-의존적 보체 활성화의 부작용을 억제하기 위한 조성물을 제공하며, MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체의 치료적 유효량 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 필요로 하는 살아있는 대상체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화의 부작용을 억제하는데 사용을 위한 의약을 제조하는 방법이 또한 제공되며, 약학적 담체에서 MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 포함한다. 본원에서 하기 기술된 각각의 질병, 질환 및 장애의 치료를 위해 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는데 사용을 위한 의약을 제조하는 방법이 또한 제공된다.

본 발명의 방법, 조성물 및 의약은 본원에서 추가로 기술된 바와 같이 혈전성 미세혈관증 (TMA)을 앓고 있거나 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 인간을 포함한 포유류 대상체의 생체 내에서 MASP-2-의존적 보체 활성화의 부작용을 억제하는데 유용하다.

본 발명의 상기 언급된 양태 및 다수의 부수적인 이점은 같은 것이 하기 상세한 설명에 대한 참조에 의해 더 쉽게 이해되는 것과 마찬가지로, 첨부된 도면과 함께 취해질 때, 더 쉽게 이해될 것이다:
도 1은 인간 MASP-2의 게놈 구조를 도시하는 플롯이다;
도 2A는 인간 MASP-2 단백질의 도메인 구조를 도시하는 개략도이다;
도 2B는 인간 MAp19 단백질의 도메인 구조를 도시하는 개략도이다;
도 3은 쥐 MASP-2 넉아웃(knockout) 전략을 도시하는 플롯이다;
도 4는 인간 MASP-2 꼬마유전자(minigene) 구조를 도시하는 플롯이다;
도 5A는 실시예 2에서 기술된 바와 같이, MASP-2-결핍이 만난 상에 C4b 침착의 결핍에 의해 측정된 바와 같이 렉틴-경로-매개 C4 활성화의 손실을 유발한다는 것을 입증하는 결과를 제공한다;
도 5B는 실시예 2에서 기술된 바와 같이, MASP-2-결핍이 치모산 상에 C4b 침착의 결핍에 의해 측정된 바와 같이 렉틴-경로-매개 C4 활성화의 손실로 이어진다는 것을 입증하는 결과를 제공한다;
도 5C는 실시예 2에서 기술된 바와 같이, 만난 및 치모산 상에 C4b 침착에 의한 측정으로서 MASP-2+/-; MASP-2-/- 및 야생형 계통으로부터 얻어진 혈청 샘플의 상대적 C4 활성화 수준을 입증하는 결과를 제공한다;
도 6은 실시예 2에서 기술된 바와 같이, MASP-2-/- 혈청 샘플로의 쥐 재조합 MASP-2의 추가가 만난 상에서 C4b 침착에 의해 측정된 바와 같이 단백질 농도 의존적 방식으로 렉틴-경로-매개 C4 활성화를 회복한다는 것을 입증하는 결과를 제공한다;
도 7은 실시예 8에서 기술된 바와 같이, 고전적 경로가 MASP-2-/- 계통에서 기능적이라는 것을 입증하는 결과를 제공한다;
도 8A는 실시예 10에서 기술된 바와 같이, 항-MASP-2 Fab2 항체 #11이 C3 컨버타제 형성을 억제한다는 것을 입증하는 결과를 제공한다;
도 8B는 실시예 10에서 기술된 바와 같이, 항-MASP-2 Fab2 항체 #11이 천연 래트 MASP-2에 결합한다는 것을 입증하는 결과를 제공한다;
도 8C는 실시예 10에서 기술된 바와 같이, 항-MASP-2 Fab2 항체 #41이 C4 분열을 억제한다는 것을 입증하는 결과를 제공한다;
도 9는 실시예 10에서 기술된 바와 같이, C3 컨버타제 형성을 억제한, 테스트된 모든 항-MASP-2 Fab2 항체가 또한 C4 분열을 억제하는 것으로 발견되었음을 입증하는 결과를 제공한다;
도 10은 실시예 11에서 기술된 바와 같이, 항-MASP-2 차단 Fab2 항체의 에피토프 매핑(mapping)에 사용된 래트 MASP-2로부터 유래된 재조합 폴리펩타이드를 도시하는 플롯이다;
도 11은 실시예 11에서 기술된 바와 같이, 래트 MASP-2 폴리펩타이드로의 항-MASP-2 Fab2 #40 및 #60의 결합을 입증하는 결과를 제공한다;
도 12는 실시예 12에서 기술된 바와 같이, 신장 허혈/재관류 손상 모델에서 재관류 후 24 및 48시간에 야생형 (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스에 대한 혈액 요소 질소 클리어런스(혈액 요소 nitrogen clearance)를 입증하는 결과를 제공한다;
도 13A는 실시예 13에서 기술된 바와 같이, 야생형 (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스로부터 분리된 RPE-맥락막 복합체 내 베이스라인 VEGF 단백질 수준을 나타내는 결과를 제공한다;
도 13B는 실시예 13에서 기술된 바와 같이, 황반 변성(macular degeneration) 모델에서 레이저 유도된 손상 후 야생형 (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스에서 제3 일에 RPE-맥락막 복합체 내 VEGF 단백질 수준을 나타내는 결과를 제공한다;
도 14는 실시예 13에서 기술된 바와 같이, 야생형 (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스에서 레이저 유도된 손상 후 제7 일에 평균 맥락막 혈관 신생 (choroidal neovascularization; CNV) 부피를 나타내는 결과를 제공한다;
도 15A 및 15B는 실시예 14에서 기술된 바와 같이, 정상 래트 혈청에서 MASP-2 Fab2 항체의 투여 후 C4b 침착의 억제 (도 15A) 및 트롬빈 활성화의 억제 (도 15B)에 대한 용량 반응 곡선을 제공한다;
도 16A 및 16B는 실시예 15에서 기술된 바와 같이, 파종성 혈관 내 응고의 국소화된 슈와츠만 반응 모델(Schwartzman reaction model)에서 미처리 야생형 마우스 및 보체 경로가 고갈제 코브라 독 인자 (CVF) 및 말단 경로 억제자 (C5aR 안타고니스트) (도 16A)에 의해 억제된 야생형 마우스에서의 혈소판 응집과 비교하여 MASP-2 (-/-) 마우스 (도 16B)에서의 측정된 혈소판 응집 (응집 면적으로 표시됨)을 제공한다;
도 17은 실시예 16에서 기술된 바와 같이, WT (+/+) 공여체 신장의 WT (+/+) (B6) 또는 MASP-2 (-/-) 이식 수령체 마우스에서 측정된 혈액 요소 질소 (BUN) 수준을 그래프로 도시한다;
도 18은 실시예 17에서 기술된 바와 같이, 맹장 결찰 및 천공 (CLP) 모델에서 미생물 감염 후 일 수의 함수로서 WT (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스의 퍼센트 생존률을 그래프로 도시한다;
도 19는 실시예 17에서 기술된 바와 같이, 맹장 결찰 및 천공 (CLP) 모델에서 미생물 감염 후 WT (+/+) 및 MASP-2 (-/-)에서 측정된 박테리아의 수를 그래프로 도시한다;
도 20은 실시예 18에서 기술된 바와 같이, 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 비강 내 투여의 시도 후 6일에 WT (+/+), MASP-2 (-/-) 및 C3 (-/-) 마우스의 퍼센트 생존률을 도시하는 카플란-마이어(Kaplan-Meyer) 플롯이다;
도 21은 실시예 19에서 기술된 바와 같이, WT 마우스에서 0.3 mg/kg 또는 1.0 mg/kg의 마우스 항-MASP-2 단클론성 항체의 피하 투약 후 다양한 시점에 채취된 샘플에서, 대조군의 %로서 측정된, C4b 침착의 수준을 그래프로 도시한다;
도 22는 실시예 19에서 기술된 바와 같이, WT 마우스에서 0.6 mg/kg의 마우스 항-MASP-2 단클론성 항체의 ip 투약 후 다양한 시점에 채취된 샘플에서, 대조군의 %로서 측정된, C4b 침착의 수준을 그래프로 도시한다;
도 23은 실시예 20에서 기술된 바와 같이, 0.3 mg/kg 또는 1.0 mg/kg 마우스 항-MASP-2 단클론성 항체의 1회 ip 주사로 전처리된 WT (+/+) 마우스에서 레이저 유도된 손상 후 제7 일에 평균 맥락막 혈관 신생 (CNV) 부피를 그래프로 도시한다.
도 24A는 실시예 21에서 기술된 바와 같이, 5x10⁸/100 μl cfu 네이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis)로의 감염 후 MASP-2 (-/-) 및 WT (+/+) 마우스의 퍼센트 생존률을 그래프로 도시한다;
도 24B는 실시예 21에서 기술된 바와 같이, 5x10⁸ cfu/100 μl 네이세리아 메닝기티디스로 감염된 MASP-2 KO (-/-) 및 WT (+/+) 마우스로부터 채취된 혈액 샘플에서 다양한 시점에 회수된 네이세리아 메닝기티디스의 로그 cfu/ml의 그래프로 도시한다;
도 25A는 실시예 21에서 기술된 바와 같이, 2x10⁸ cfu/100 μl 네이세리아 메닝기티디스로 감염 후 MASP-2 KO (-/-) 및 WT (+/+) 마우스의 퍼센트 생존률을 그래프로 도시한다;
도 25B는 실시예 21에서 기술된 바와 같이, 2x10⁸ cfu/100 μl 네이세리아 메닝기티디스로 감염된 WT (+/+) 마우스로부터 채취된 혈액 샘플에서 다양한 시점에 회수된 네이세리아 메닝기티디스의 로그 cfu/ml를 그래프로 도시한다;
도 25C는 실시예 21에서 기술된 바와 같이, 2x10⁸ cfu/100 μl 네이세리아 메닝기티디스로 감염된 MASP-2 (-/-) 마우스로부터 채취된 혈액 샘플에서 다양한 시점에 회수된 네이세리아 메닝기티디스의 로그 cfu/ml를 그래프로 도시한다;
도 26A는 실시예 22에서 기술된 바와 같이, MASP-2 (-/-) 마우스가 기능적인 고전적 경로를 보유한다는 것을 입증하는 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 도시한다.
도 26B는 실시예 22에서 기술된 바와 같이, MASP-2 (-/-) 마우스가 기능적인 대체 경로를 보유한다는 것을 입증하는, 치모산 코팅된 플레이트 상의 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 도시한다.
도 27A는 실시예 22에서 기술된 바와 같이, C4 (-/-) 마우스 (n=6) 및 일치하는 WT 한배 새끼 대조군 (n=7)에서 관상 동맥 (LAD) 및 재관류의 좌전 하향 브랜치의 결찰 후 심근 허혈/재관류 손상 (MIRI)-유도된 조직 손실을 그래프로 도시하며, 위험 지역 (area at risk; AAR) 및 경색 크기 (INF)를 나타낸다.
도 27B는 실시예 22에서 기술된 바와 같이, 도 42A에서 기술된 바와 같이 처리된 C4 (-/-) 및 WT 마우스에서 위험 지역 (AAR)의 함수로서 경색 크기 (INF)를 그래프로 도시하며, C4 (-/-) 마우스가 WT 대조군만큼 MIRI에 민감하다는 것을 입증한다 (점선);
도 28A는 실시예 22에서 기술된 바와 같이, WT 마우스, C4 (-/-) 마우스의 혈청 및 만난과 함께 사전 인큐베이션된 C4 (-/-) 마우스의 혈청을 사용한 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 도시한다;
도 28B는 실시예 22에서 기술된 바와 같이, 다양한 농도의 항-쥐 MASP-2 mAb (mAbM11)와 혼합된 WT, C4 (-/-), 및 MASP-2 (-/-) 마우스의 혈청 상에서 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 도시한다;
도 28C는 실시예 22에서 기술된 바와 같이, WT (C4 충분)의 인간 혈청 및 C4 결핍 혈청, 및 만난과 함께 사전 인큐베이션된 C4 결핍 대상체의 혈청 상에서 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 도시한다;
도 28D는 실시예 22에서 기술된 바와 같이, WT (C4 충분) 및 항-인간 MASP-2 mAb (mAbH3)와 혼합된 C4 결핍 대상체의 인간 혈청 상에서 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 도시한다;
도 29A는 실시예 22에서 기술된 바와 같이, 렉틴 활성화 경로 특이적 검정 조건, 또는 고전적 활성화 경로 특이적 검정 조건 하에서 테스트된 다양한 보체 결핍 마우스 계통의 혈장에서 C3 컨버타제 활성의 비교 분석을 그래프로 도시한다;
도 29B는 실시예 22에서 기술된 바와 같이, 렉틴 활성화 경로 특이적 조건 하에서 테스트된 다양한 보체 결핍 마우스 계통의 혈장에서 C3 컨버타제 활성의 시간-해소 동역학(시간-해소 kinetics)을 그래프로 도시한다;
도 30은 실시예 23에서 기술된 바와 같이, 트롬빈 기질 FXIa 및 FXa에 의해, a' 사슬의 존재로 나타나는 인간 C3의 활성화를 나타내는 웨스턴 블롯 분석의 결과를 도시한다;
도 31은 실시예 23에서 기술된 바와 같이, WT, MASP-2 (-/-), F11(-/-), F11(-/-)/C4 (-/-) 및 C4 (-/-)로부터 얻어진 혈청 샘플 상에서 C3 침착 검정의 결과를 나타낸다;
도 32A는 실시예 29에서 기술된 바와 같이, 대조군 마우스 및 항-쥐 MASP-2 항체 (mAbM11) 또는 항-인간 MASP-2 항체 (mAbH6)로 처리된 마우스에서 7.0 Gy 방사선에 노출 후 시간이 흐름에 따른 퍼센트 생존률을 나타내는 카플란-마이어 생존 플롯이다;
도 32B는 실시예 29에서 기술된 바와 같이, 대조군 마우스 및 항-쥐 MASP-2 항체 (mAbM11) 또는 항-인간 MASP-2 항체 (mAbH6)로 처리된 마우스에서 6.5 Gy 방사선에 노출 후 시간이 흐름에 따른 퍼센트 생존률을 나타내는 카플란-마이어 생존 플롯이다;
도 33은 실시예 30에서 기술된 바와 같이, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 A Z2491의 2.6 x 10⁷ cfu의 감염량의 투여 후 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존률을 그래프로 도시하는 카플란-마이어 플롯이며, MASP-2 결핍 마우스가 네이세리아 메닝기티디스 유도된 사망으로부터 보호된다는 것을 입증한다;
도 34는 실시예 30에서 기술된 바와 같이, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 계통 MC58의 6 x 10⁶ cfu의 감염량의 투여 후 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존률을 그래프로 도시하는 카플란-마이어 플롯이며, MASP-2 결핍 마우스가 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 계통 MC58 유도된 사망으로부터 보호된다는 것을 입증한다;
도 35는 실시예 30에서 기술된 바와 같이, 6x10⁶ cfu의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 계통 MC58로의 i.p. 감염 후 MASP-2 KO 및 WT 마우스로부터 채취된 혈액 샘플에서 다양한 시점에 회수된 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 계통 MC58의 로그 cfu/ml를 그래프로 도시하며 (두 군의 마우스에 대하여 다양한 시점에서 n=3, 결과는 평균±SEM으로 표시됨) MASP-2 KO 마우스가 WT 마우스와 같은 용량의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 계통 MC58로 감염되었지만, MASP-2 KO 마우스는 WT와 비교하여 향상된 균혈증(bacteraemia)의 클리어런스를 가진다는 것을 입증한다;
도 36은 실시예 30에서 기술된 바와 같이, 6x10⁶ cfu/100 μl 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 혈청군 B 계통 MC58로 감염 후 3, 6, 12 및 24시간에 MASP-2 및 WT 마우스의 평균 질병 점수를 그래프로 도시하며, MASP-2 결핍 마우스가 감염에 대하여 고도의 저항성을 나타냈으며, 6시간에 질병 점수가 훨씬 더 낮다는 것을 입증한다.
도 37은 실시예 31에서 기술된 바와 같이, 4 x 10⁶/100 μl cfu 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 계통 MC58의 감염량의 투여에 이어서 억제 항-MASP-2 항체 (1 mg/kg) 또는 대조군 아이소타입(isotype) 항체의 감염 후 3시간에 투여 후 마우스의 퍼센트 생존률을 그래프로 도시하는 카플란-마이어 플롯이며, 항-MASP-2 항체가 네이세리아 메닝기티디스로 감염된 대상체를 치료하고 상기 대상체의 생존률을 개선하는데 효과적임을 입증한다;
도 38은 실시예 32에서 기술된 바와 같이, (A) 정상 인간 혈청 (NHS) 플러스 인간 항-MASP-2 항체; (B) 정상 인간 혈청 (NHS) 플러스 아이소타입 대조군 항체; (C) MBL-/- 인간 혈청; (D) 정상 인간 혈청 (NHS) 및 (E) 열 비활성화된 정상 인간 혈청 (NHS)의 존재 하에서 인큐베이션 후 0, 30, 60 및 90분에 6.5x10⁶ cfu/100 μl 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 계통 MC58로의 i.p. 감염 후 20% 인간 혈청 농도에서 다른 시점에 회수된 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58의 생균수의 로그 cfu/ml를 그래프로 도시하며, 인간 혈청에서 네이세리아 메닝기티디스의 보체 의존적 살해가 인간 항-MASP-2 항체의 추가에 의해 크게 향상되었음을 나타낸다;
도 39는 실시예 32에서 기술된 바와 같이, 마우스 혈청 샘플에서 다양한 시점에 회수된 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58의 생균수의 로그 cfu/ml를 그래프로 도시하며, MASP-2 -/- 마우스 혈청이 WT 마우스 혈청보다 네이세리아 메닝기티디스에 대하여 더 높은 수준의 살균력을 가진다는 것을 입증한다.
도 40은 실시예 33에서 기술된 바와 같이, 혈청 농도의 범위에 걸쳐 인간 혈청에 의한 만난-코팅된 쥐 적혈구의 용혈 (광도 측정법에 의해 측정된, 상층액으로의 용해된 마우스 적혈구 (Crry/C3-/-)의 헤모글로빈 방출로 측정됨)을 그래프로 도시한다. 테스트된 혈청은 열-비활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, NHS +항-MASP-2 항체 및 NHS 대조군을 포함하였다;
도 41은 실시예 33에서 기술된 바와 같이, 혈청 농도의 범위에 걸쳐 인간 혈청에 의한 비-코팅된 쥐 적혈구의 용혈 (광도 측정법에 의해 측정된, 상층액으로의 용해된 WT 마우스 적혈구의 헤모글로빈 방출로 측정됨)을 그래프로 도시한다. 테스트된 혈청은 열-비활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, NHS +항-MASP-2 항체 및 NHS 대조군을 포함하였으며, MASP-2를 억제하는 것이 비-감작 WT 마우스 적혈구의 보체-매개 용해를 억제한다는 것을 입증한다;
도 42는 실시예 33에서 기술된 바와 같이, 혈청 농도의 범위에 걸쳐 인간 혈청에 의한 비-코팅된 쥐 적혈구의 용혈 (광도 측정법에 의해 측정된, 상층액으로의 마우스 적혈구 (CD55/59 -/-)의 헤모글로빈 방출로 측정됨)을 그래프로 도시한다. 테스트된 혈청은 열-비활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, NHS +항-MASP-2 항체 및 NHS 대조군을 포함하였다;
도 43은 실시예 34에서 기술된 바와 같이, 대조군 마우스 및 항-인간 MASP-2 항체 (mAbH6)로 처리된 마우스에서 8.0 Gy 방사선에 노출 후 시간 (일)이 흐름에 따른 퍼센트 생존률을 그래프로 도시한다;
도 44는 실시예 35에서 기술된 바와 같이, MASP-2 -/- 및 WT 마우스에서 LPS 주사 후 미세혈관 폐색의 발병 시점을 그래프로 도시하여, 60분 동안 측정된 혈전 형성을 가진 마우스의 퍼센트를 나타내며, WT 마우스에서 혈전 형성이 15분 후에 검출되고, WT 마우스의 최대 80%가 60분에 혈전 형성을 입증하였으며; 그에 반해, MASP-2 -/- 마우스 중 어느 것도 60분 기간 동안 혈전 형성을 나타내지 않았다는 것을 입증하였다 (로그 순위: p=0.0005);
도 45는 실시예 36에서 기술된 바와 같이, HUS의 STX/LPS-유도된 모델에서 시간 (시간)이 흐름에 따른 식염수 처리된 대조군 마우스 (n=5) 및 항-MASP-2 항체 처리된 마우스 (n=5)의 퍼센트 생존률을 그래프로 도시하며, 모든 대조군 마우스는 42시간에 사망한 반면, 항-MASP-2 항체-처리된 마우스의 100%가 실험의 시간 경과에 따라 생존하였다는 것을 입증한다;
도 46은 실시예 37에서 기술된 바와 같이, FITC/덱스트란 UV 모델에서 아이소타입 대조군, 또는 FITC/덱스트란의 주사 전 16시간 및 1시간에 투약된 인간 MASP-2 항체 mAbH6 (10mg/kg)으로의 처리 후 미세혈관 폐색을 앓고 있는 마우스의 퍼센트를, 손상 유도 후 시간의 함수로서, 그래프로 도시한다;
도 47은 실시예 37에서 기술된 바와 같이, 인간 MASP-2 항체 (mAbH6) 및 아이소타입 대조군 항체로 처리된 마우스에 대하여 분 단위 폐색 시간을 그래프로 도시하며, 데이터는 평균치 (수평 막대) 및 표준 오차 막대 (수직 막대)와 함께 분산-점으로 보고된다. 분석을 위해 사용된 통계적 테스트는 비쌍형성(unpaired) t 테스트였으며; 부호 "*"는 p=0.0129를 나타낸다;
도 48은 실시예 37에서 기술된 바와 같이, 낮은 광도 (800-1500)를 이용한 혈전증(thrombosis)의 FITC-덱스트란/광 유도된 내피 세포 손상 모델에서 야생형 마우스, MASP-2 KO 마우스, 및 혈전증 유도 전 16시간, 및 다시 1시간에 10mg/kg으로 i.p. 투여된 인간 MASP-2 항체 (mAbH6)로 전처리된 야생형 마우스에 대한, 분 단위의 폐색까지의 시간을 그래프로 도시한다;
도 49는 실시예 39에서 기술된 바와 같이, 인간 MASP-2 억제 항체 (mAbH6) 또는 아이소타입 대조군 항체의 점증 용량으로 처리된 마우스에서 FITC-덱스트란 유도된 혈전성 미세혈관증의 시간의 함수로서 혈전을 가진 마우스의 퍼센트를 나타내는 카플란-마이어 플롯이다;
도 50은 실시예 39에서 기술된 바와 같이, mAbH6 용량의 함수로서 혈전 형성의 발병에 대한 중간 시간 (분)을 그래프로 도시한다 (대조군과 비교하여 *p<0.01);
도 51은 실시예 39에서 기술된 바와 같이, 인간 MASP-2 억제 항체 (mAbH6) 또는 아이소타입 대조군 항체의 점증 용량으로 처리된 마우스에서 FITC-덱스트란 유도된 혈전성 미세혈관증의 시간의 함수로서 미세혈관 폐색을 가진 마우스의 퍼센트를 나타내는 카플란-마이어 플롯이다;
도 52는 실시예 39에서 기술된 바와 같이, mAbH6 용량의 함수로서 미세혈관 폐색에 대한 중간 시간을 그래프로 도시한다 (대조군과 비교하여 *p<0.05);
도 53A는 실시예 40에서 기술된 바와 같이, 렉틴 경로-특이적 검정 조건 아래 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재 하에서 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시하며, OMS646이 대략 1 nM의 IC₅₀ 값으로 렉틴-매개 MAC 침착을 억제한다는 것을 입증한다;
도 53B는 실시예 40에서 기술된 바와 같이, 고전적 경로-특이적 검정 조건 아래 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재 하에서 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시하며, OMS646이 고전적 경로-매개 MAC 침착을 억제하지 않는다는 것을 입증한다;
도 53C는 실시예 40에서 기술된 바와 같이, 대체 경로-특이적 검정 조건 아래 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재 하에서 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시하며, OMS646이 대체 경로-매개 MAC 침착을 억제하지 않는다는 것을 입증한다;
도 54는 실시예 40에서 기술된 바와 같이, 마우스에서 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 약동학 (PK) 프로파일을 그래프로 도시하며, 표시된 용량으로 투여 후 시간의 함수로서 OMS646 농도 (n=3 동물/군의 평균)를 나타낸다;
도 55A는 실시예 40에서 기술된 바와 같이, 정맥 내 투여 후 마우스에서 전신성 렉틴 경로 활성의 하락으로서 측정된 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 약물동역학적 (PD) 반응을 그래프로 도시한다.
도 55B는 실시예 40에서 기술된 바와 같이, 피하 투여 후 마우스에서 전신성 렉틴 경로 활성의 하락으로서 측정된 인간 MASP-2 단클론성 항체 (OMS646)의 약물동역학적 (PD) 반응을 그래프로 도시한다.
도 56은 실시예 41에서 기술된 바와 같이, sCR1과 비교하여, ADP-활성화된 HMEC-1 세포 상에 혈청-유도된 C5b-9 침착에 대한 MASP-2 항체 (OMS646)의 억제 효과를 그래프로 도시한다.
도 57은 실시예 42에서 기술된 바와 같이, sCR1과 비교하여, ADP-활성화된 HMEC-1 세포 상에 aHUS 혈청-유도된 혈전 형성에 대한 MASP-2 항체 (OMS646)의 억제 효과를 그래프로 도시한다.
도 58은 실시예 46에서 기술된 바와 같이, MASP-2 억제 항체 (OMS646)로의 처리 후 지속성 조혈모세포 이식-관련 혈전성 미세혈관증 (HSCT-TMA)을 앓고 있는 대상체에서 시간 (주)이 흐름에 따라 베이스라인으로부터의 혈소판 수준의 평균 변화를 그래프로 도시한다.
도 59는 실시예 46에서 기술된 바와 같이, MASP-2 억제 항체 (OMS646)로의 처리 후 지속성 (HSCT-TMA)를 앓고 있는 대상체에서 시간 (주)이 흐름에 따라 베이스라인으로부터의 LDH의 평균 변화를 그래프로 도시한다.
도 60은 실시예 46에서 기술된 바와 같이, MASP-2 억제 항체 (OMS646)로의 처리 후 지속성 (HSCT-TMA)를 앓고 있는 대상체에서 시간 (주)이 흐름에 따라 베이스라인으로부터의 합토글로빈의 평균 변화를 그래프로 도시한다.

서열 목록의 설명

서열 번호:1 인간 MAp19 cDNA

서열 번호:2 인간 MAp19 단백질 (선도 서열 포함)

서열 번호:3 인간 MAp19 단백질 (성숙한)

서열 번호:4 인간 MASP-2 cDNA

서열 번호:5 인간 MASP-2 단백질 (선도 서열 포함)

서열 번호:6 인간 MASP-2 단백질 (성숙한)

서열 번호:7 인간 MASP-2 gDNA (엑손 1-6)

항원: (MASP-2 성숙한 단백질에 관하여)

서열 번호:8 CUBI 서열 (aa 1-121)

서열 번호:9 CUBEGF 서열 (aa 1-166)

서열 번호:10 CUBEGFCUBII (aa 1-293)

서열 번호:11 EGF 영역 (aa 122-166)

서열 번호:12 세린 프로테아제 도메인 (aa 429 - 671)

서열 번호:13 세린 프로테아제 도메인 비활성 (Ser618의 Ala로의 돌연변이를 가진 aa 610-625)

서열 번호:14 TPLGPKWPEPVFGRL (CUB1 펩타이드)

서열 번호:15 TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLCGQ (CUBI 펩타이드)

서열 번호:16 TFRSDYSN (MBL 결합 영역 코어)

서열 번호:17 FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF (MBL 결합 영역)

서열 번호:18 IDECQVAPG (EGF 펩타이드)

서열 번호:19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV (세린 프로테아제 결합 코어)

펩타이드 억제자:

서열 번호:20 MBL 전장 cDNA

서열 번호:21 MBL 전장 단백질

서열 번호:22 OGK-X-GP (공통 결합)

서열 번호:23 OGKLG

서열 번호:24 GLR GLQ GPO GKL GPO G

서열 번호:25 GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GPO GPO

서열 번호:26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKLGPOG

서열 번호:27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEOGDO (인간 h-피콜린)

서열 번호:28 GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGKAGPOGPNGAOGEO (인간 피콜린 p35)

서열 번호:29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI (C4 분열 부위)

발현 억제자:

서열 번호:30 CUBI-EGF 도메인의 cDNA (서열 번호:4의 뉴클레오타이드 22-680)

서열 번호:31

5' CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC 3'

MASP-2 번역 시작 부위 (센스(sense))를 포함하는 서열 번호:4의 뉴클레오타이드 12-45

서열 번호:32

5'GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAGAAG3'

MASP-2 MBL 결합 부위 (센스)를 포함하는 영역을 암호화하는 서열 번호:4의 뉴클레오타이드 361-396

서열 번호:33

5'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3'

CUBII 도메인을 포함하는 영역을 암호화하는 서열 번호:4의 뉴클레오타이드 610-642

클로닝 프라이머:

서열 번호:34 CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC (CUB에 대하여 5' PCR)

서열 번호:35 GGAATTCCTAGGCTGCATA (CUB에 대하여 3' PCR)

서열 번호:36 GGAATTCCTACAGGGCGCT (CUBIEGF에 대하여 3' PCR)

서열 번호:37 GGAATTCCTAGTAGTGGAT (CUBIEGFCUBII에 대하여 3' PCR)

서열 번호:38-47은 인간화 항체에 대한 클로닝 프라이머이다.

서열 번호:48은 9개의 aa 펩타이드 결합

발현 벡터:

서열 번호: 49는 MASP-2 꼬마유전자 인서트(insert)이다

서열 번호: 50은 쥐 MASP-2 cDNA이다

서열 번호: 51은 쥐 MASP-2 단백질 (선도 서열 포함)이다

서열 번호: 52는 성숙한 쥐 MASP-2 단백질이다

서열 번호: 53은 래트 MASP-2 cDNA이다

서열 번호: 54는 래트 MASP-2 단백질 (선도 서열 포함)이다

서열 번호: 55는 성숙한 래트 MASP-2 단백질이다

서열 번호: 56-59는 인간 MASP-2A를 생성하는데 사용된 인간 MASP-2의 부위-특이적 돌연변이 유발(mutagenesis)을 위한 올리고뉴클레오타이드이다

서열 번호: 60-63은 쥐 MASP-2A를 생성하는데 사용된 쥐 MASP-2의 부위-특이적 돌연변이 유발을 위한 올리고뉴클레오타이드이다

서열 번호: 64-65는 래트 MASP-2A를 생성하는데 사용된 래트 MASP-2의 부위-특이적 돌연변이 유발을 위한 올리고뉴클레오타이드이다

서열 번호: 66 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) 중쇄 가변 영역 (VH) (신호 펩타이드 미포함)을 암호화하는 DNA

서열 번호: 67 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩타이드

서열 번호: 68 17N16mc 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩타이드

서열 번호: 69: 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) 경쇄 가변 영역 (VL)을 암호화하는 DNA

서열 번호: 70: 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩타이드

서열 번호: 71: 17N16_dc17N9 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩타이드

상세한 설명

본 발명은 렉틴 매개된 MASP-2 경로를 억제할 수 있는 한편 고전적 경로는 온전하게 남겨둔다는 본 발명자에 의한 놀라운 발견을 기초로 한다. 본 발명은 또한 렉틴-매개 보체 경로 활성화와 관련된 세포 손상을 억제하는 한편 면역계의 고전적 (C1q-의존적) 경로 구성요소를 온전하게 남겨두기 위한 치료적 표적으로서 MASP-2의 사용을 기술한다.

I. 정의

본원에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 용어는 본 발명의 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 명세서 및 청구범위에서 본 발명을 기술하는데 사용된 용어에 관하여 명확성을 제공하기 위해 하기 정의가 제공된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "MASP-2-의존적 보체 활성화"는 렉틴 경로의 MASP-2- 의존성 활성화를 포함하는데, 이것은 렉틴 경로 C3 컨버타제 C4b2a의 형성을 유발하는 생리학적 조건 하에서 (즉, Ca⁺⁺의 존재 하에서) 및 그 후 C5 컨버타제 C4b2a(C3b)n로의 C3 분열 생성물 C3b의 축적시 일어나며, 이것은 주로 옵소닌화를 유발하는 것으로 결정되었다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대체 경로"는, 예를 들어, 균류 및 효모 세포벽, 그람 음성(Gram negative) 외막의 지질다당류 (LPS), 및 토끼 적혈구, 뿐만 아니라 많은 순수한 다당류, 토끼 적혈구, 바이러스, 박테리아, 동물 종양 세포, 기생충 및 손상된 세포의 치모산에 의해 야기되고, 전통적으로 보체 인자 C3으로부터 C3b의 자발적 단백질 가수분해 생성으로부터 발생하는 것으로 생각되는 보체 활성화를 말한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "렉틴 경로"는 혈청 및 만난-결합 렉틴 (MBL), CL-11 및 피콜린 (H-피콜린, M-피콜린, 또는 L-피콜린)을 포함하는 비-혈청 탄수화물-결합 단백질의 특이적 결합을 통해 일어나는 보체 활성화를 말한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "고전적 경로"는 외래 입자에 결합된 항체에 의해 야기되고 인식 분자 C1q의 결합을 필요로 하는 보체 활성화를 말한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "MASP-2 억제제"는, 항-MASP-2 항체 및 이것의 MASP-2 결합 단편, 천연 및 합성 펩타이드, 소분자, 가용성 MASP-2 수용체, 발현 억제자 및 분리된 천연 억제자를 포함하는, MASP-2에 결합하거나 이것과 직접적으로 상호작용하여 MASP-2-의존적 보체 활성화를 효과적으로 억제하는 임의의 작용제를 말하고, 또한 렉틴 경로에서 또 다른 인식 분자 (예를 들어, MBL, H-피콜린, M-피콜린, 또는 L-피콜린)로의 결합에 대하여 MASP-2와 경합하는 펩타이드를 포함하지만, 이러한 다른 인식 분자에 결합하는 항체를 포함하지 않는다. 본 발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제제는 20% 초과, 예컨대 50% 초과, 예컨대 90% 초과만큼 MASP-2-의존적 보체 활성화를 감소시킬 수도 있다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 90% 초과만큼 MASP-2-의존적 보체 활성화를 감소시킨다 (즉, 단지 10% 이하의 MASP-2 보체 활성화를 초래함).

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 표적 폴리펩타이드, 예를 들어, MASP-2, 폴리펩타이드 또는 이것의 일부에 특이적으로 결합하는, 임의의 항체-생산 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 및 인간을 포함한 영장류), 또는 하이브리도마(hybridoma), 파지 선택, 재조합 발현 또는 트랜스제닉(transgenic) 동물 (또는 항체 또는 항체 단편을 생산하는 다른 방법)로부터 유래된 항체 및 이것의 항체 단편을 포함한다. 용어 "항체"를 항체의 공급원 또는 만들어지는 방식 (예를 들어, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 트랜스제닉 동물, 펩타이드 합성, 등에 의해)에 관하여 제한하려는 것은 아니다. 예시적 항체는 다클론성, 단클론성 및 재조합 항체; 팬(pan)-특이적, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체, 삼중특이적 항체); 인간화 항체; 쥐 항체; 키메라, 마우스-인간, 마우스-영장류, 영장류-인간 단클론성 항체; 및 항-이디오타입(idiotype) 항체을 포함하고, 임의의 온전한 항체 또는 이것의 단편일 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 온전한 다클론성 또는 단클론성 항체, 뿐만 아니라 이것의 단편 (예컨대 dAb, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), 단일 사슬 (ScFv), 이것의 합성 변종, 자연 발생 변종, 필요한 특이성의 항원-결합 단편을 가진 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 키메라 항체, 및 원하는 특이성의 항원-결합 부위 또는 단편 (에피토프 인식 부위)을 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성형태를 포함한다.

"단클론성 항체"는 단클론성 항체가 에피토프의 선택적 결합에 수반되는 아미노산 (자연 발생 및 비-자연 발생)으로 구성되는 균질한 항체 코호트을 말한다. 단클론성 항체는 표적 항원에 대하여 고도로 특이적이다. 용어 "단클론성 항체"는 온전한 단클론성 항체 및 전장 단클론성 항체, 뿐만 아니라 이것들의 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), 단일 사슬 (ScFv), 이것의 변종, 항원-결합 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화 단클론성 항체, 키메라 단클론성 항체, 및 원하는 특이성 및 에피토프에 결합하는 능력의 항원-결합 단편 (에피토프 인식 부위)을 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성형태를 포함한다. 항체의 공급원 또는 만들어지는 방식 (예를 들어, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 트랜스제닉 동물, 등에 의해)에 관하여 제한하려는 것은 아니다. 용어는 "항체"의 정의 하에서 상기 기술된 전체 면역글로불린, 뿐만 아니라 단편 등을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 단편"은 전장 항체, 예를 들어, 항-MASP-2 항체로부터 유래되거나 이것과 관련된 부분을 말하며, 일반적으로 이것의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예시는 Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')₂ 및 Fv 단편, scFv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 V_H 및 V_L 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 더 포함하며, 이것은 scFv가 항원 결합을 위해 바람직한 구조를 형성할 수 있게 한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "키메라 항체"는 비-인간 종 (예를 들어, 설치류) 항체로부터 유래된 가변 도메인 및 상보성-결정 영역을 포함하는 한편, 나머지 항체 분자는 인간 항체로부터 유래된 재조합 단백질이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "인간화 항체"는 인간 항체 프레임워크로 이식된 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 특이적 상보성-결정 영역과 일치하는 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 인간화 항체는 전형적으로 항체 상보성-결정 영역만이 비-인간 기원의 것인 재조합 단백질이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "만난-결합 렉틴" ("MBL")은 만난-결합 단백질 ("MBP")과 동등하다.

본원에서 사용된 바와 같이, "막 공격 복합체" ("MAC")는 막에 삽입되어 막을 파괴시키는 말단의 다섯 개의 보체 성분 (C6, C7, C8 및 C-9와 조합된 C5b)의 복합체 (C5b-9로도 불림)를 말한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "대상체"는 제한되는 것이 아니라 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 말, 양, 염소, 소, 토끼, 돼지 및 설치류를 포함한 모든 포유동물을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 아미노산 잔기는 다음과 같이 축약된다: 알라닌 (Ala;A), 아스파라긴 (Asn;N), 아스파르트산 (Asp;D), 아르기닌 (Arg;R), 시스테인 (Cys;C), 글루탐산 (Glu;E), 글루타민 (Gln;Q), 글리신 (Gly;G), 히스티딘 (His;H), 아이소류신 (Ile;I), 류신 (Leu;L), 리신 (Lys;K), 메티오닌 (Met;M), 페닐알라닌 (Phe;F), 프롤린 (Pro;P), 세린 (Ser;S), 트레오닌 (Thr;T), 트립토판 (Trp;W), 타이로신 (Tyr;Y), 및 발린 (Val;V).

넓은 의미에서, 자연 발생 아미노산은 각각의 아미노산의 측쇄의 화학적 특징에 기초하여 여러 군으로 나누어질 수 있다. "소수성" 아미노산은 Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys 또는 Pro를 의미한다. "친수성" 아미노산은 Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His를 의미한다. 아미노산의 이 분류는 다음과 같이 더 하위분류될 수 있다. "비대전 친수성" 아미노산은 Ser, Thr, Asn 또는 Gln을 의미한다. "산성" 아미노산은 Glu 또는 Asp를 의미한다. "염기성" 아미노산은 Lys, Arg 또는 His를 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이 용어 "보존적 아미노산 치환"은 다음 각각의 군 내의 아미노산 중에서의 치환으로 예시된다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 아이소류신, (2) 페닐알라닌, 타이로신, 및 트립토판, (3) 세린 및 트레오닌, (4) 아스파테이트 및 글루타메이트, (5) 글루타민 및 아스파라긴, 및 (6) 리신, 아르기닌 및 히스티딘.

용어 "올리고뉴클레오타이드"는 본원에서 사용된 바와 같이 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 폴리머 또는 이것들의 모방체를 말한다. 이 용어는 또한 자연 발생 뉴클레오타이드, 당 및 공유 뉴클레오사이드 간 (백본) 결합, 뿐만 아니라 비-자연 발생 변형을 가진 올리고뉴클레오타이드로 구성된 상기 올리고핵염기를 커버한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "에피토프"는 항체에 의해 결합되는 단백질 (예를 들어, 인간 MASP-2 단백질) 상의 부위를 말한다. "중첩 에피토프"는 적어도 하나 (예를 들어, 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 또는 여섯 개)의 공통 아미노산 잔기(들)를 포함하며, 선형 및 비-선형 에피토프를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드", 및 "단백질"은 길이 또는 번역 후 변형에 관계없이 교체 가능하게 사용되고 아미노산의 임의의 펩타이드-결합된 사슬을 의미한다. 본원에서 기술된 MASP-2 단백질은 야생형 단백질을 포함하거나 야생형 단백질일 수 있거나 또는 50개 이하 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50개 이하)의 보존적 아미노산 치환을 가진 변종일 수 있다. 보존적 치환은 전형적으로 다음 군 내의 치환을 포함한다: 글리신 및 알라닌; 발린, 아이소류신, 및 류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌; 리신, 히스티딘 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 타이로신.

일부 구체예에서, 인간 MASP-2 단백질은 서열 번호: 5에서 제시된 아미노산 서열을 가진 인간 MASP-2 단백질에 대하여 70%, 또는 그 이상 (예를 들어, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.

일부 구체예에서, 펩타이드 단편은 길이가 적어도 6개 (예를 들어, 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 또는 600개 또는 그 이상)의 아미노산 잔기 (예를 들어, 서열 번호: 5의 적어도 6개의 인접한 아미노산 잔기)일 수 있다. 일부 구체예에서, 인간 MASP-2 단백질의 항원성 펩타이드 단편은 길이가 500개 미만 (예를 들어, 450, 400, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 또는 6개 미만)의 아미노산 잔기 (예를 들어, 서열 번호: 5 중 어느 하나의 500개 미만의 인접한 아미노산 잔기)이다.

퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 갭(gap)을 도입한 후, 참조 서열의 아미노산과 동일한 후보 서열의 아미노산의 퍼센트로서 정의된다. 퍼센트 서열 동일성을 결정할 목적을 위한 정렬은 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법으로, 예를 들어, 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대한의 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하는데 적절한 파라미터는 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.

II. 본 발명의 개요

렉틴 (MBL, M-피콜린, H-피콜린, L-피콜린 및 CL-11)은 선천적 보체 시스템을 야기하는 특이적 인식 분자이고 시스템은 렉틴 개시 경로 및 말단 보체 효과기 분자의 렉틴-개시된 활성화를 증폭시키는 관련된 말단 경로 증폭 루프를 포함한다. C1q는 획득 보체 시스템을 야기하는 특이적 인식 분자이고 시스템은 고전적 개시 경로 및 말단 보체 효과기 분자의 C1q-개시된 활성화를 증폭시키는 관련된 말단 경로 증폭 루프를 포함한다. 발명자들은 이들 두 개의 주요 보체 활성화 시스템을 각각 렉틴-의존적 보체 시스템 및 C1q-의존적 보체 시스템으로 부른다.

면역 방어에 있어서 그것의 필수적인 역할에 더하여, 보체 시스템은 많은 임상적 질병에서의 조직 손상에 기여한다. 따라서, 이들 부작용을 방지하기 위해 치료적으로 효과적인 보체 억제자를 개발하는 것이 긴급히 필요하다.

렉틴 매개 MASP-2 경로를 억제하는 한편 고전적 경로는 온전하게 남겨두는 것이 가능하다는 인식으로 보체의 면역 방어 능력을 완전히 정지시키지 않으면서 특정 병리상태를 유발하는 보체 활성화 시스템만을 특이적으로 억제하는 것이 매우 바람직하다는 것을 알게 된다. 예를 들어, 보체 활성화가 대부분 렉틴-의존적 보체 시스템에 의해 매개되는 질환 상태에서는, 이 시스템만을 특이적으로 억제하는 것이 유리할 것이다. 이것은 C1q-의존적 보체 활성화 시스템을 온전하게 남겨두어 면역 복합체 프로세싱(processing)을 처리하고 감염에 대한 숙주 방어를 돕는다.

렉틴-의존적 보체 시스템을 특이적으로 억제하기 위한 치료제의 개발을 목표로 하기에 바람직한 단백질 구성요소는 MASP-2이다. 렉틴-의존적 보체 시스템의 모든 공지된 단백질 구성요소 (MBL, H-피콜린, M-피콜린, L-피콜린, MASP-2, C2-C9, 인자 B, 인자 D, 및 프로퍼딘) 중에서도, MASP-2만이 렉틴-의존적 보체 시스템에 고유하고 시스템이 기능하는데 필요하다. 렉틴 (MBL, H-피콜린, M-피콜린, L-피콜린 및 CL-11)은 또한 렉틴-의존적 보체 시스템의 고유한 구성요소이다. 하지만, 렉틴 구성요소 중 어느 하나의 손실이 렉틴 중복으로 인해 시스템 활성화를 반드시 억제하는 것은 아니다. 렉틴-의존적 보체 활성화 시스템의 억제를 보장하기 위해서는 다섯 개의 렉틴 모두를 억제하는 것이 필요하다. 게다가, MBL 및 피콜린이 또한 보체 독립적인 옵소닌 활성을 갖는 것으로 알려져 있기 때문에, 렉틴 기능의 억제는 감염에 대한 이 이로운 숙주 방어 메커니즘의 손실을 초래할 것이다. 그에 반해, 이 보체-독립적 렉틴 옵소닌 활성은 MASP-2가 억제 표적인 경우 온전하게 유지될 것이다. 렉틴-의존적 보체 활성화 시스템을 억제하기 위한 치료 표적으로서 MASP-2의 추가된 이점은 MASP-2의 혈장 농도가 임의의 보체 단백질 중 가장 낮다는 것이다 (

500 ng/ml); 그러므로, MASP-2의 고친화도 억제자의 상응하는 저농도는 완전 억제를 얻기에 충분할 수도 있다 (Moller-Kristensen, M., et al., J. Immunol Methods 282:159-167, 2003).

III. 혈전성 미세혈관증에서 MASP-2의 역할 및 masp-2 억제제를 사용한 치료 방법

개요

혈전성 미세혈관증 (TMA)은 작은 혈관에서의 혈전을 특징으로 하는 병리상태이다 (Benz, K.; et al., Curr Opin Nephrol Hypertens 19(3):242-7 (2010)). 근본적인 혈관 내피에 대한 스트레스 또는 손상이 주요 구동요인(driver)인 것으로 생각된다. TMA의 임상 및 실험 결과는 혈소판 감소증, 빈혈증, 자반증(purpura), 및 신부전(renal failure)을 포함한다. 고전적 TMA는 용혈성 요독성 증후군 (HUS) 및 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP)이다. 특유의 근본적인 생리학적 특징은 혈소판 활성화 및 작은 세동맥 및 세정맥에서 미소혈전의 형성이다. 적어도 부분적으로, 미세혈관 내피에 대한 손상 또는 스트레스에 의해 개시된 보체 활성화는 또한 치명적 항인지질 증후군 (CAPS), 전신 디고스 병, 및 암에 부차적인 TMA, 암 화학요법 및 이식을 포함한 그 밖의 TMA에 관련되어 있는 것으로 나타난다.

신염군(nephritides)의 숙주에서 보체의 생리학적 역할에 대한 직접적인 증거는 특이적 보체 성분에서 유전적 결핍을 가진 환자의 연구에 의해 제공된다. 많은 보고들이 신장 손상과 보체 조절 인자 H의 결핍의 연관성을 기록하였다 (Ault, B.H., Nephrol. 14:1045-1053, 2000; Levy, M., et al., Kidney Int. 30:949-56, 1986; Pickering, M.C., et al., Nat. Genet. 31:424-8, 2002). 인자 H 결핍은 이들 구성요소의 활성화-관련 소비로 인해 인자 B 및 C3의 낮은 혈장 수준을 초래한다. C5b-9의 순환 수준은 또한 이들 환자의 혈청에서 증가하여, 보체 활성화를 나타낸다. 막증식성 사구체 신염 (membranoproliferative glomerulonephritis; MPGN) 및 특발성 용혈성 요독성 증후군 (HUS)은 인자 H 결핍 또는 인자 H의 돌연변이와 연관성이 있다. 인자 H-결핍 돼지 (Jansen, J.H., et al., Kidney Int. 53:331-49, 1998) 및 인자-H 넉아웃 마우스 (Pickering, M.C., 2002)는 MPGN-유사 증상을 나타내어, 보체 조절에 있어서 인자 H의 중요성을 확인한다. 그 밖의 보체 성분의 결핍은 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus; SLE)의 발병에 부차적인 신장 질환과 연관성이 있다 (Walport, M.J., Davies, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 815:267-81, 1997). C1q, C4 및 C2에 대한 결핍은 면역 복합체 및 아폽토시스성 물질(apoptotic material)의 불완전한 클리어런스에 관련된 메커니즘을 통한 SLE의 발병에 매우 취약하다. 이들 SLE 환자 중 다수에서, 홍반성 신염(lupus nephritis)이 발생하며, 사구체 전체에 걸친 면역 복합체의 침착을 특징으로 한다.

aHUS

비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)은 "혈전성 미세혈관증"이라고 불리는 질병의 군의 일부이다. 비정형 형태의 HUS (aHUS)에서, 질환은 결함성 보체 조절과 연관성이 있고 산발성 또는 가족성일 수 있다. aHUS의 가족성 사례는 보체 인자 H, 인자 I, 인자 B, 막 공통 인자 CD46, 뿐만 아니라 보체 인자 H-관련 단백질 1 (CFHR1) 및 보체 인자 H-관련 단백질 3 (CFHR3)을 포함하는 보체 활성화 또는 보체 조절 단백질을 암호화하는 유전자에서의 돌연변이와 연관성이 있다 (Zipfel, P.F., et al., PloS Genetics 3(3):e41 (2007)). aHUS와 관련된 유전적 돌연변이의 이 다양한 어레이(array)의 통일된 특징은 세포 또는 조직 표면 상에서의 향상된 보체 활성화에 대한 소인이다. 그러므로, 본 발명의 한 양태는 MASP-2 억제제의 유효량을 투여함으로써 인자 H 결핍과 관련된 aHUS를 앓고 있는 환자를 치료하는 것을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태는 MASP-2 억제제의 유효량을 투여함으로써 인자 I, 인자 B, 막 공통 인자 CD46, CFHR1 또는 CFHR3 결핍과 관련된 HUS를 앓고 있는 환자를 치료하는 것을 포함한다.

최근에 다양한 돌연변이 보체 인자에 의해 유발된 aHUS에서 향상된 보체 활성화에 기초가 되는 분자 병리생리학의 이해에 대한 큰 진전이 이루어졌다. 이 메커니즘이 인자 H 돌연변이에 대하여 가장 잘 이해된다. 인자 H는 용액, 뿐만 아니라 숙주 세포 표면 둘 다에서 음성 조절자로서 역할을 하는 20개의 짧은 공통 반복 (SCR) 도메인을 포함하는 풍부한 혈청 단백질이다. 그것은 인자 I 및 그 밖의 공통 인자와 함께 C3의 활성화된 형태를 표적화하고, 그것의 불활성화를 촉진하여, 추가의 보체 활성화를 방지한다. 숙주 세포 표면 상에서 보체 활성화를 효과적으로 제어하기 위해서, 인자 H는 숙주 세포와 상호작용하는 것이 필요하며, 이것은 SCR 도메인 16-20에 의해 매개된다. 지금까지 기술된 aHUS와 관련된 모든 인자 H 돌연변이는 C-말단 영역을 포함하는 (SCR) 도메인 16-20에서 클러스터링된다(clustered). 이들 돌연변이 인자 H 단백질은 용액에서 C3 활성화를 제어하는데 있어서 충분히 기능적이지만, 숙주 세포 표면과 상호작용할 수 없고 그 결과 세포 표면 상에서 C3 활성화를 제어할 수 없다 (Exp Med 204(6):1249-56 (2007)). 따라서, 인자 H의 특정 돌연변이는 돌연변이 인자 H 단백질이 숙주 세포 표면과 상호작용할 수 없으며 따라서 미세혈관 내피를 포함한 숙주 세포 표면 상에서 보체 활성화를 효과적으로 하향조절할 수 없기 때문에 aHUS와 연관성이 있다. 결과로서, 초기 C3 활성화가 일어나면, 미세혈관 내피 표면 상에서의 후속적인 보체 활성화는 인자 H 돌연변이를 가진 환자에서 저하되지 않는다. 보체의 이 제어되지 않는 활성화는 궁극적으로 진행성 혈관 내피에 대한 점진적 손상, 후속적인 혈소판 응집 및 미세혈관 응고, 및 부분적으로 폐색된 미세혈관을 통한 RBC 통로의 전단 응력에 의해 유발된 용혈로 이어진다. 따라서, aHUS 질환 징후와 임상 및 실험 결과는 미세혈관 내피의 표면 상에서 보체의 음성 조절의 결함과 직접적으로 관련되어 있다.

인자 H 돌연변이와 마찬가지로, 음성 보체 조절 인자 I 및 막 공통 인자 단백질 (CD46)의 기능 소실(loss-of-function) 돌연변이가 또한 aHUS와 관련되어 있다. aHUS가 이들 단백질에서 기능 획득(gain-of-function) 돌연변이와 연관성이 있다는 점에서 C3 단백질의 인자 B에 대하여 반대가 관찰되었다 (Pediatr Nephrol 25(12):2431-42 (2010)). 따라서, 통합 데이터의 숙주는 aHUS 발병 기전에서 보체 활성화와 관련되어 있음을 나타낸다. 이 개념은 aHUS의 치료에 있어서 말단 보체 단백질 C5를 차단하는 단클론성 항체인 에쿨리쥬맙의 치료적 효능에 의해 가장 설득력있게 지지된다.

aHUS에서 효과기 메커니즘으로서의 보체의 중심적 역할이 널리 수용되는 한편, 보체 활성화를 개시하는 트리거(trigger) 및 수반된 분자적 경로는 풀리지 않았다. 상기 기술된 돌연변이를 가지고 있는 모든 개체가 aHUS에 걸리는 것은 아니다. 사실상, 가족성 연구는 aHUS의 침투도(penetrance)는 단지 ~50%이라고 제안하였다 (Ann Hum Genet 74(1):17-26 (2010)). 질환의 자연사는 aHUS가 감염 에피소드 또는 손상과 같은 개시 이벤트 이후 가장 자주 발병한다고 제안한다. 감염원은 보체 시스템을 활성화시키는 것으로 널리 알려져 있다. 기존의 후천적 면역력의 부재 하에서, 감염원에 의한 보체 활성화는 주로 렉틴 경로를 통해 개시될 수도 있다. 따라서, 감염에 의해 야기된 렉틴 경로 활성화는 aHUS-취약한 개체에서 보체 활성화의 후속적인 생리학적 증폭에 대한 개시 트리거를 나타낼 수도 있으며, 이것은 궁극적으로 질환의 진행으로 이어질 수도 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 MASP-2 억제제의 유효량을 투여함으로써 감염에 부차적인 aHUS를 앓고 있는 환자를 치료하는 것을 포함한다.

숙주 조직에 대한 손상의 다른 형태, 특히 혈관 내피에 대한 손상은 렉틴 경로를 통해 보체를 활성화시킬 것이다. 산화 스트레스를 받는 인간 혈관 내피 세포는, 예를 들어, 렉틴에 결합하여 보체의 렉틴 경로를 활성화시키는 표면 모이어티를 발현함으로써 반응한다 (Am J. Pathol 156(6):1549-56 (2000)). 허혈/재관류 후 혈관 손상은 또한 생체 내에서 렉틴 경로를 통해 보체를 활성화시킨다 (Scand J Immunol 61(5):426-34 (2005)). 이 설정에서 렉틴 경로 활성화는 숙주에 대한 생리학적 결과를 가져오고, MASP-2의 차단에 의한 렉틴 경로의 억제는 추가의 숙주 조직 손상 및 부작용을 방지한다 (Schwaeble PNAS 2011).

따라서, aHUS를 야기하는 그 밖의 공정은 보체의 렉틴 경로를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 그러므로 렉틴 경로는 aHUS에 유전적으로 취약한 개체에서 조절되지 않는 방식으로 부적절하게 증폭되며, 따라서 aHUS 발병 기전을 개시하는 초기 보체 활성화 메커니즘을 나타낼 가능성이 크다. 추론해보면, 항-MASP-2 항체를 포함한, 렉틴 경로를 통해 보체의 활성화를 차단하는 작용제는 aHUS 민감한 개체에서 질환 진행을 방지하거나 악화를 감소시킬 것으로 예상된다.

이 개념에 대한 추가의 지원으로서, 최근의 연구는 aHUS의 소아의 경우에서 중요한 병인체로서 스트렙토코쿠스 뉴모니아를 식별하였다 (Nephrology (Carlton), 17:48-52 (2012); Pediatr Infect Dis J. 30(9):736-9 (2011)). 이 특정 병인은 부정적인 예후를 갖는 것으로 나타나며, 상당한 치사율 및 장기간 이환률을 갖는다. 특히, 이들 사례는 aHUS에 취약한 것으로 알려져 있는 보체 유전자에서 동시 돌연변이의 증거 없이 미세혈관증, 요독증(uremia) 및 용혈의 징후로 이어지는 비-장용성 감염을 포함한다. 스트렙토코쿠스 뉴모니아가 보체를 활성화시키는데 특히 효과적이고, 대부분 렉틴 경로를 통해 보체를 활성화시킨다는 것에 유의하는 것이 중요하다. 따라서, 폐렴 구균 감염과 관련된 비-장용성 HUS의 사례에서, 미세혈관증, 요독증 및 용혈의 징후는 대부분 렉틴 경로의 활성화에 의해 구동될 것으로 예상되고, 항-MASP-2 항체를 포함한, 렉틴 경로를 차단하는 작용제는 이들 환자에서 aHUS의 진행을 방지하거나 질환 심각도를 감소시킬 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 MASP-2 억제제의 유효량을 투여함으로써 스트렙토코쿠스 뉴모니아 감염과 관련된 비-장용성 aHUS를 앓고 있는 환자를 치료하는 것을 포함한다.

상기 언급된 바에 따르면, 일부 구체예에서, aHUS와 관련된 신부전에 걸릴 위험이 있는 대상체의 설정에서, aHUS에 걸리거나, 또는 aHUS와 관련된 신부전에 걸릴 가능성을 감소시키는 방법이 제공되며, 대상체에서 신부전을 개선하거나 예방하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 일정 기간 동안 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 대상체가 aHUS와 관련된 임의의 증상의 발병 전에 aHUS에 걸릴 위험이 있는지를 결정하는 단계를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 방법은 aHUS를 나타내는 적어도 하나 이상의 증상의 발병시 (예를 들어, 빈혈증, 혈소판 감소증 및/또는 신부전의 존재 하에서) 및/또는 대상체로부터 얻어진 생검에서 혈전성 미세혈관증의 존재 하에서 대상체가 aHUS에 걸릴 위험이 있는지를 결정하는 단계를 포함한다. 대상체가 aHUS에 걸릴 위험이 있는지의 결정은 대상체가 aHUS에 걸릴 유전적 소인을 갖는지를 결정하는 것을 포함하며, 이것은 유전 정보 (예를 들어, 대상체의 유전자형을 포함하는 데이터베이스로부터)를 평가하거나, 또는 게놈 시퀀싱(sequencing) 또는 유전자-특이적 분석 (예를 들어, PCR 분석)을 통해 aHUS와 관련된 유전자 마커의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 대상체에서 적어도 1회의 유전자 스크리닝 테스트를 수행함으로써 (즉, 보체 인자 H (CFH), 인자 I (CFI), 인자 B (CFB), 막 공통 인자 CD46, C3, 보체 인자 H-관련 단백질 1 (CFHR1), 또는 THBD (항응고 단백질 트롬보듈린을 암호화함) 또는 보체 인자 H-관련 단백질 3 (CFHR3), 또는 보체 인자 H-관련 단백질 4 (CFHR4)를 암호화하는 유전자에서 aHUS와 관련된 유전적 돌연변이의 존재 또는 부재를 결정함으로써), 및/또는 대상체가 aHUS의 가족력을 갖는지를 결정함으로써 수행될 수도 있다. aHUS와 관련된 유전적 돌연변이의 존재 또는 부재에 대한 유전자 스크리닝 방법은 널리 확립되어 있으며, 예를 들어, Noris M et al. "Atypical Hemolytic-Uremic Syndrome," 2007 Nov 16 [Updated 2011 Mar 10]. In: Pagon RA, Bird TD, Dolan CR, et al., editors. GeneReviews™, Seattle (WA): University of Washington, Seattle을 참고하면 된다.

예를 들어, 보체 인자 H (CFH)의 돌연변이를 가진 것들에서 질환의 전체적인 침투도는 48%이고, CD46의 돌연변이에 대한 침투도는 53%이고, CFI의 돌연변이에 대해서는 50%이며, C3의 돌연변이에 대해서는 56%이고 THBD의 돌연변이에 대해서는 64%이다 (Caprioli J. et al., Blood, 108:1267-79 (2006); Noris et al., Clin J Am Soc Nephrol 5:1844-59 (2010)). Caprioli et al., (2006), 상기에서 기술된 바와 같이, 보체 인자 H (CFH)의 돌연변이를 가진 상당수의 개체는 aHUS에 걸리지 않으며, 이들 개체에서 차선의 CFH 활성이 생리학적 조건에서 보체 활성화의 효과로부터 숙주를 보호하기에는 충분하지만, 차선의 CFH 활성은 보체를 활성화시키는 작용제에 대한 노출이 정상적인 양의 C3b보다 더 많이 생산할 때 C3b가 혈관 내피 세포 상에 침착되는 것을 방지하기에 충분하지 않은 것으로 가정된다.

따라서, 한 구체예에서는, 비-인자 H-의존적 비정형 용혈성 요독성 증후군을 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기 위한 방법이 제공되며, MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 MASP-2 억제제의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 인자 H-의존적 비정형 용혈성 요독성 증후군에 걸릴 위험이 있는 대상체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기 위한 방법이 제공되며, 빈혈증, 혈소판 감소증 또는 크레아티닌 증가의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 대상체를 주기적으로 모니터링하는 단계, 및 빈혈증 혈소판 감소증, 또는 크레아티닌 증가의 존재의 결정시 MASP-2 억제제로 처리하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 인자 H-의존적 aHUS에 걸릴 위험이 있는 대상체가 aHUS와 관련된 임상적 증상을 앓을 가능성을 감소시키기 위한 방법이 제공되며, 트리거링 aHUS 임상적 증상, 예를 들어, 약물 노출 (예를 들어, 화학요법), 감염 (예를 들어, 박테리아 감염), 악성 종양, 손상, 장기 또는 조직 이식, 또는 임신과 관련된 것으로 알려져 있는 이벤트 전에, 또는 중에, 또는 후에 MASP-2 억제제를 투여하는 단계를 포함한다.

한 구체예에서, aHUS에 걸릴 위험이 있는 대상체가 aHUS와 관련된 임상적 증상을 앓을 가능성을 감소시키기 위한 방법이 제공되며, 빈혈증, 혈소판 감소증 또는 크레아티닌 증가의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 대상체를 주기적으로 모니터링하는 단계, 및 빈혈증, 혈소판 감소증 또는 크레아티닌 증가의 존재의 결정시 MASP-2 억제제로 처리하는 단계를 포함한다.

또 다른 구체예에서, aHUS에 걸릴 위험이 있는 대상체가 aHUS와 관련된 임상적 증상을 앓을 가능성을 감소시키기 위한 방법이 제공되며 트리거링 aHUS 임상적 증상, 예를 들어, 약물 노출 (예를 들어, 화학요법), 감염 (예를 들어, 박테리아 감염), 악성 종양, 손상, 장기 또는 조직 이식, 또는 임신과 관련된 것으로 알려져 있는 이벤트 전에, 또는 중에, 또는 후에 MASP-2 억제제를 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 트리거링 aHUS 임상적 증상과 관련된 이벤트 전에, 중에, 또는 후에, 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 또는 그 이상의 기간 동안 투여되고 질병이 해소되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 대로 반복될 수도 있다. 전-aHUS 설정에서, MASP-2 억제제는 전신으로, 예컨대 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 그 밖의 비경구 투여에 의해 대상체에게 투여될 수도 있다.

일부 구체예에서, aHUS의 초기 진단의 설정에서, 또는 aHUS의 진단과 일치하는 하나 이상의 증상 (예를 들어, 빈혈증, 혈소판 감소증 및/또는 신부전의 존재)을 나타내는 대상체에서, 대상체는 혈장 반출법의 부재 하에서 제1 선 요법으로서, 또는 혈장 반출법과 조합하여 MASP-2 억제제 (예를 들어, 항-MASP-2 항체)의 유효량으로 처리된다. 제1 선 요법으로서, MASP-2 억제제는 전신으로, 예컨대 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 그 밖의 비경구 투여에 의해 대상체에게 투여될 수도 있다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 출혈, 감염, 및 혈장 공여체에서, 또는 혈장 반출법을 꺼리는 대상체에서, 또는 혈장 반출법이 이용 불가능한 설정에서 내재된 장애 및/또는 알레르기에 대한 노출을 포함한 혈장 반출법의 잠재적 합병증을 막기 위해서 혈장 반출법의 부재 하에서 제1 선 요법으로서 대상체에게 투여된다.

일부 구체예에서, 방법은 aHUS를 앓고 있는 대상체에게 제1 기간 (예를 들어, 적어도 1일 내지 1주일 또는 2주일) 동안 카테터를 통해 (예를 들어, 정맥 내로) MASP-2 억제제를 투여한 후 이어서 상기 대상체에게 제2 기간 (예를 들어, 적어도 2주 또는 그 이상의 만성기) 동안 피하로 MASP-2 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 및/또는 제2 기간에서 투여는 혈장 반출법의 부재 하에서 일어난다. 일부 구체예에서, 방법은 치료 전에, 및 선택적으로는 치료 중에 대상체에서 적어도 하나의 보체 인자 (예를 들어, C3, C5)의 수준을 결정하는 단계를 더 포함하며, 표준치 또는 건강한 대조군 대상체와 비교하여 적어도 하나의 보체 인자의 감소된 수준의 결정은 MASP-2 억제제로의 지속적인 처리에 대한 필요성을 나타낸다.

일부 구체예에서, 방법은 aHUS를 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 MASP-2 억제제, 예컨대 항-MASP-2 항체를 정맥 내로, 근육 내로, 또는 바람직하게는, 피하로 투여하는 단계를 포함한다. 처리는 만성적이고 매일 내지 매달, 하지만 바람직하게는 2주마다 투여될 수도 있다. 항-MASP-2 항체는 단독으로, 또는 C5 억제자, 예컨대 에쿨리쥬맙과 조합하여 투여될 수도 있다.

HUS

비정형 HUS와 마찬가지로, 전형적인 형태의 HUS는 TMA의 모든 임상 및 실험 결과를 나타낸다. 하지만, 전형적인 HUS는 종종 소화 질환이고 보통은 가족성 구성요소가 없거나 보체 유전자의 돌연변와의 직접적인 연관성을 갖지 않는다. 전형적인 HUS의 병인은 특정 장 병원체로의 감염과 밀접한 연관이 있다. 환자는 전형적으로

전형적으로 급성 신부전을 가진 환자는 급성 신부전, 혈색소뇨증(hemoglobinuria), 및 혈소판 감소증을 호소하며, 이것은 혈리(bloody diarrhea)의 에피소드에 따른다. 질병은 시겔라 디센테리아(Shigella dissenteria), 살모넬라(Salmonella) 또는 대장균(E. Coli.)의 시가 독소-유사 생산 장출혈 균주, 예컨대 E.coli 0157:h7로의 장용성 감염에 의해 유발된다. 병원체는 오염된 식품 또는 수분 공급으로부터 획득된다. HUS는 의학적 응급상황이며 5-10% 치사율을 갖는다. 생존자 중 상당수는 만성 신장 질환에 걸리고 (Corrigan and Boineau, Pediatr Rev 22 (11): 365-9 (2011)) 신장 이식이 필요할 수도 있다.

전형적인 HUS에서 미세혈관 응고는 배타적인 것은 아니지만, 대부분 신장 미세혈관계에서 일어난다. 근본적인 병리생리학적 상태는 시가 독소 (STX)에 의해 매개된다. 장병성(enteropathic) 미생물에 의해 장 루멘으로 배설되면, STX는 장 벽을 가로질러, 혈류로 진입하고, 우선적으로 사구체 내피에서 발현되어 STX의 독성 효과를 매개하는 블로보트리아오실 세라미드 수용체 CD77을 통해 혈관 내피 세포에 결합한다 (Boyd and Lingwood Nephron 51:207 (1989)). 내피에 결합되면, STX는 혈관 내피를 손상시키고, 백혈구를 활성화시키며 vWF-의존적 혈전 형성을 유발하는 일련의 이벤트를 유도한다 (Forsyth et al., Lancet 2: 411-414 (1989); Zoja et al., Kidney Int. 62: 846-856 (2002); Zanchi et al., J. Immunol. 181:1460-1469 (2008); Morigi et al., Blood 98: 1828-1835 (2001); Guessou et al., Infect. Immun., 73: 8306-8316 (2005)). 이들 미소혈전은 신장 및 그 밖의 장기의 세동맥 및 모세혈관을 막거나 폐색한다. 세동맥 및 모세혈관에서 미소혈전에 의한 혈류의 폐색은 좁아진 혈관을 통해 압박되는 만큼 RBC에 가해지는 전단력을 증가시킨다. 이것은 전단력에 의한 RBC의 파괴 및 분열적혈구(schistocyte)라고 불리는 RBC 단편의 형성을 초래할 수 있다. 분열적혈구의 존재는 HUS에서의 특징적인 발견이다. 이 메커니즘은 미소혈관성 용혈로서 공지되어 있다. 이에 더하여, 혈류의 폐색은 허혈을 초래하여, 병에 걸린 장기에 대한 추가적인 손상을 유발하는 보체-매개 염증 반응을 개시한다.

보체의 렉틴 경로는 두 개의 주요 메커니즘에 의해 HUS의 발병 기전에 기여한다: 1) 내피 손상에 의해 유발된 응고 캐스케이드의 MASP-2-매개 직접적 활성화, 및 2) 미세혈관 혈류의 초기 폐색으로부터 발생하는 허혈에 의해 유도되는 렉틴-매개 후속적 보체 활성화.

STX는 미세혈관 내피 세포를 손상시키고, 손상된 내피 세포는 보체 시스템을 활성화시키는 것으로 공지되어 있다. 상기 상세히 설명된 바와 같이, 내피 세포 손상 이후의 보체 활성화는 대부분 렉틴 경로에 의해 구동된다. 산화 스트레스를 받은 인간 혈관 내피 세포는 렉틴에 결합하여 보체의 렉틴 경로를 활성화시키는 표면 모이어티를 발현함으로써 반응한다 (Collard et al., Am J Pathol. 156(5):1549-56 (2000)). 허혈 재관류 이후의 혈관 손상은 또한 생체 내에서 렉틴 경로를 통해 보체를 활성화시킨다 (Scand J Immunol 61(5):426-34 (2005)). 이 설정에서 렉틴 경로 활성화는 숙주에 대한 생리학적 결과를 가져오고, MASP-2의 차단에 의한 렉틴 경로의 억제는 추가의 숙주 조직 손상 및 부작용을 방지한다 (Schwaeble et al., PNAS (2011)). 보체 활성화에 더하여, MASP-2의 렉틴-의존적 활성화는 프로트롬빈의 분열을 초래하여 트롬빈을 형성하고 응고를 촉진하는 것으로 나타났다. 따라서, 손상된 내피 세포에 의한 보체의 렉틴 경로 활성화는 응고 시스템을 직접적으로 활성화시킬 수 있다. 그러므로, 보체의 렉틴 경로는, MASP-2-매개 프로트롬빈 활성화에 의해, STX에 의한 초기 내피 손상을 HUS에서 일어나는 응고 및 미세혈관 혈전증을 연결하는 우세한 분자 경로일 가능성이 크다. 그러므로, 제한되는 것은 아니지만, MASP-2 기능을 차단하는 항체를 포함하느 렉틴 경로 억제자는 HUS를 앓고 있는 환자에서 미세혈관 응고, 혈전증 및 용혈을 예방하거나 경감시킬 것으로 예상된다. 실제로, 항-MASP-2 항체의 투여는 전형적인 HUS 모델에서 마우스를 완전히 보호한다. 실시예 36에서 기술되고 도 45에서 도시된 바와 같이, STX 및 LPS에 노출된 모든 대조군 마우스는 극심한 HUS에 걸려서 48시간 내에 빈사상태가 되거나 사망하였다. 반면에, 도 45에서 추가로 도시된 바와 같이 항-MASP-2 항체가 처리된 다음 STX 및 LPS에 노출된 모든 마우스는 생존하였다 (피셔 정확 검정(Fisher's exact) p<0.01; N=5). 따라서, 항-MASP-2 요법은 이 HUS 모델에서 마우스를 완전히 보호한다. MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 항체의 투여는 HUS 환자의 치료에 효과적이고 장병성 대장균 또는 그 밖의 STX-생산 병원체로의 감염에 의해 유발된 미세혈관 응고, 혈전증, 및 용혈로부터의 보호를 제공할 것으로 예상된다.

본원에서는 STX에 의해 유발된 HUS에 대하여 나타나있는 한편, 항-MASP-2 요법은 또한 그 밖의 독성 물질에 의해 유발된 내피 손상으로 인한 HUS-유사 증후군에 유익할 것으로 예상된다. 이것은 마이토마이신, 티클로피딘, 시스플라틴, 퀴닌, 사이클로스포린, 블레오마이신과 같은 작용제, 뿐만 아니라 그 밖의 화학요법제 및 면역억제제를 포함한다. 따라서, 항-MASP-2 항체 요법, 또는 MASP-2 활성을 억제하는 그 밖의 양상은 HUS 및 그 밖의 TMA 관련 질환 (즉, aHUS 및 TTP)에서 응고, 혈전 형성, 및 RBC 파괴를 예방하거나 제한하고 신부전을 예방할 것으로 예상된다.

HUS를 앓고 있는 환자는 종종 설사 및 구토를 호소하며, 그들의 혈소판 수준이 보통 감소되고 (혈소판 감소증), RBC가 감소된다 (빈혈증). 전-HUS 설사 단계는 전형적으로 약 4일 동안 지속되며, 그 동안 HUS에 걸릴 위험이 있는 대상체는 전형적으로 극심한 설사에 더하여 다음 증상 중 하나 이상을 나타낸다: 혈관 내 적혈구 파괴의 증거가 있는 30% 미만의 적혈구 용적 수준, 혈소판 감소증 (혈소판 수준 <150 x 10³/mm³), 및/또는 손상된 신장 기능의 존재 (나이에 대한 참조 범위의 상한보다 더 높은 혈청 크레아티닌 농도). 핍뇨(oligoanuria) (>1일 동안 요배설량 =0.5 mL/kg/h)의 존재는 HUS의 발병으로의 진행에 대한 측정으로서 사용될 수 있다 (C. Hickey et al., Arch Pediatr Adolesc Med 165(10):884-889 (2011) 참조). 테스트는 전형적으로 대장균 박테리아 (E.coli O157:H7), 또는 시겔라 또는 살모넬라 종으로의 감염의 존재에 대하여 수행된다. 장성 대장균 (예를 들어, 대장균 0157:H7)으로의 감염에 대하여 양성 반응을 보이는 대상체에서, 항생제의 사용이 금지되어 있는데 항생제의 사용이 증가된 STX의 생산을 통해 HUS에 걸릴 위험을 증가시킬 수도 있기 때문이다 (Wong C. et al., N Engl J. Med 342:1930-1936 (2000) 참조). 시겔라 또는 살모넬라에 대하여 양성 반응을 보이는 대상체에 대하여, 항생제는 전형적으로 감염을 제거하기 위해 투여된다. HUS에 대한 그 밖의 잘 확립된 제1 선 요법은 부피 팽창, 투석 및 혈장 반출법을 포함한다.

상기 언급된 바에 따르면, 일부 구체예에서는, 전-HUS 단계와 관련된 하나 이상의 증상을 앓고 있고 HUS에 걸릴 위험이 있는 대상체 (즉, 대상체는 다음 중 하나 이상을 나타냄: 설사, 혈관 내 적혈구 파괴의 증거가 있는 30% 미만의 적혈구 용적 수준, 혈소판 감소증 (150 x 10³/mm³ 미만의 혈소판 수준), 및/또는 손상된 신장 기능의 존재 (나이에 대한 참조 범위의 상한보다 더 높은 혈청 크레아티닌 농도))의 설정에서, 대상체에서 HUS에 걸릴 위험을 감소시키거나, 또는 신부전의 가능성을 감소시키는 방법이 제공되며, 손상된 신장 기능을 개선하거나 예방하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 일정 기간 동안 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 적어도 1일, 2일, 3일, 4일 또는 그 이상의 기간 동안 투여되고, 질병이 해소되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 대로 반복될 수도 있다. 전-aHUS 설정에서, MASP-2 억제제는 전신으로, 예컨대 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 경구, 피하 또는 그 밖의 비경구 투여에 의해 대상체에게 투여될 수도 있다.

살균성 항생제, 특히 β-락탐으로의 대장균 0157:H7 감염의 치료는 HUS에 걸릴 위험의 증가와 연관성이 있다 (Smith et al., Pediatr Infect Dis J 31(1):37-41 (2012)). 일부 구체예에서, 항생제의 사용이 금지된 장성 대장균 (예를 들어, 대장균 0157:H7)으로 감염된 것으로 알려져 있는, 전-HUS 단계와 관련된 증상을 앓고 있는 대상체의 설정에서, 대상체에서 HUS에 걸릴 위험을 감소시키거나, 또는 신부전의 가능성을 감소시키기 위한 방법이 제공되는데, 제1 기간 (예를 들어, 적어도 1일, 2일, 3일 또는 4일) 동안 대상체에서 핍뇨의 존재를 억제하거나 또는 예방하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 투여하는 단계를 포함하며, 제1 기간 동안 MASP-2 억제제의 투여는 항생제의 부재 하에서 일어난다. 일부 구체예에서, 방법은 대상체에게 제2 기간 (에컨대 적어도 1 내지 2주일) 동안 항생제와 조합하여 MASP-2 억제제를 투여하는 단계를 더 포함한다.

다른 구체예에서, 시겔라 또는 살모넬라로 감염된 것으로 알려져 있는, 전-HUS 단계와 관련된 증상을 앓고 있는 대상체의 설정에서, 방법은 대상체에서 HUS에 걸릴 위험을 감소시키거나, 또는 신부전의 가능성을 감소시키기 위한 방법이 제공되는데, 대상체에서 핍뇨의 존재를 억제하거나 또는 예방하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 일정 기간 동안 투여하는 단계를 포함하며, MASP-2 억제제의 투여는 적합한 항생제의 존재 또는 부재 하에서 이루어진다.

일부 구체예에서, HUS의 초기 진단의 설정에서, 또는 HUS의 진단과 일치하는 하나 이상의 증상 (예를 들어, 신부전, 또는 저 피브리노겐의 부재 하에서의 미소혈관성 용혈성 빈혈증, 또는 혈소판 감소증의 존재)을 나타내는 대상체에서, 대상체는 혈장 반출법의 부재 하에서 제1 선 요법으로서, 또는 혈장 반출법과 조합하여 MASP-2 억제제 (예를 들어, 항-MASP-2 항체)의 유효량으로 처리된다. 제1 선 요법으로서, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 그 밖의 비경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 혈장 반출법의 합병증, 예컨대 출혈, 감염, 및 혈장 공여체에서, 또는 혈장 반출법을 꺼리는 대상체에서 또는 혈장 반출법이 이용 불가능한 설정에서 내재된 장애 및/또는 알레르기에 대한 노출을 막기 위해서 혈장 반출법의 부재 하에서 제1 선 요법으로서 대상체에게 투여된다.

일부 구체예에서, 방법은 HUS를 앓고 있는 대상체에게 제1 기간 (예를 들어, 적어도 1일 내지 1주일 또는 2주일 동안 지속되는 급성기) 동안 카테터를 통해 (예를 들어, 정맥 내로) MASP-2 억제제를 투여한 후 이어서 상기 대상체에게 제2 기간 (예를 들어, 적어도 2주 또는 그 이상의 만성기) 동안 피하로 MASP-2 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 및/또는 제2 기간에서 투여는 혈장 반출법의 부재 하에서 일어난다. 일부 구체예에서, 방법은 치료 전에, 및 선택적으로는 치료 중에 대상체에서 적어도 하나의 보체 인자 (예를 들어, C3, C5)의 수준을 결정하는 단계를 더 포함하며, 표준치 또는 건강한 대조군 대상체와 비교하여 적어도 하나의 보체 인자의 감소된 수준의 결정은 처리의 필요성을 나타내고, 정상 수준의 결정은 개선을 나타낸다.

일부 구체예에서, 방법은 HUS를 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 MASP-2 억제제, 예컨대 항-MASP-2 항체를 피하로 또는 정맥 내로 투여하는 단계를 포함한다. 처리는 바람직하게는 매일 이루어지지만, 매주 또는 매월과 같이 낮은 빈도로 이루어질 수 있다. 처리는 적어도 1주일 동안 및 3개월까지 지속될 것이다. 항-MASP-2 항체는 단독으로, 또는 C5 억제자, 예컨대 에쿨리쥬맙과 조합하여 투여될 수도 있다.

TTP :

혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP)은 생명을 위협하는 혈액 응고 시스템의 장애이며, 응고 캐스케이드 또는 보체 시스템을 활성화시키는 자가면역 또는 유전적 기능장애에 의해 유발된다 (George, JN, N Engl J Med; 354:1927-35 (2006)). 이것은 신체 전반에 걸쳐 작은 혈관에서 많은 미세한 혈전, 또는 혈전증을 발생시킨다. 적혈구는 막을 손상시키는 전단 응력을 받아, 혈관 내 용혈을 유발한다. 결과로 생성된 혈류 감소 및 내피 손상은 뇌, 심장, 및 신장을 포함한 장기의 손상을 초래한다. TTP는 임상적으로 혈소판 감소증, 미소혈관성 용혈성 빈혈증, 신경학적 변화, 신부전 및 열병을 특징으로 한다. 혈장 교환 전에, 치명률은 급성 에피소드 동안에 90%였다. 심지어 혈장 교환으로도, 6개월에서의 생존률은 약 80%이다.

TTP는 효소 ADAMTS-13, 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrand factor; vWF)의 큰 멀티머를 더 작은 유닛으로 분열시키는 원인이 되는 메탈로프로테아제의 유전적 또는 후천적 억제로부터 일어날 수도 있다. ADAMTS-13 억제 또는 결핍은 궁극적으로 응고의 증가를 초래한다 (Tsai, H. J Am Soc Nephrol 14: 1072-1081, (2003)). ADAMTS-13은 vWF의 활성을 조절하고; 그것의 부재 하에서는, vWF가 혈소판에 결합할 가능성이 더 큰 큰 멀티머를 형성하고 환자를 미세혈관계에서의 혈소판 응집 및 혈전증에 취약하게 만든다.

업쇼-슐만 증후군 (USS, 선천성 TTP로도 기술됨)은 ADAMTS13 유전자 돌연변이로 인한 ADAMTS13 활성의 선천성 결핍이다 (Schulman et al., Blood, 16(1):943-57, 1960; Upshaw et al., New Engl. J. Med, 298 (24):1350-2, 1978). 선천성 TTP에 걸린 개체에서 ADAMTS13에서의 많은 돌연변이가 식별되었다 (Kinoshita et al., International Journal of Hematology, 74:101-108 (2001); Levy et al., Nature, 413 (6855):488-494 (2001); Kokame et al., PNAS 99(18):11902-11907 (2002); Savasan et al., Blood, 101:4449-4451 (2003); Matsumoto et al., Blood, 103:1305-1310 (2004) 및 Fujimura et al., Brit. J. Haemat 144:742-754 (2008)). USS에 걸린 대상체는 전형적으로 정상 ADAMTS13 활성의 5-10%를 갖는다 (Kokame et al., PNAS 99(18):11902-11907, 2002). 후천적 TTP 및 USS는 약간의 유사성을 갖지만, USS는 임상적 특징에 있어서 약간의 중요한 차이점을 갖고 있다. USS는 보통 유아 또는 아동에게 나타나고 출생 직후 음성 쿰스 테스트(Coombs test)로의 극심한 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia), 신선한 혈장 투입에 대한 반응, 및 빈번한 재발을 특징으로 한다 (Savasan et al., Blood, 101:4449-4451, 2003). 일부 경우에는, 이 유전된 ADAMTS13 결핍을 가진 환자는 출생시 가벼운 표현형을 가지며 단지 폰 빌레브란트 인자 수준이 증가된 임상적 상황, 예컨대 감염 또는 임신시 TTP와 관련된 증상에 걸린다. 예를 들어, Fujimura, 등은 최초 임신 중에 장애에 걸린 것으로 진단된, 유전적으로 확인된 USS를 가진 6개의 가족으로부터 9명의 일본인 여성을 보고하였다. 혈소판 감소증은 15회의 임신 각각에서 임신 중기 내지 임신 후기에 발생한 후 이어서, 종종 TTP가 발생하였다. 이들 여성은 모두 ADAMTS13 활성이 극심한 결핍인 것으로 발견되었다 (Fujimura et al., Brit. J. Haemat 144:742-754, 2008).

상기 언급된 바에 따르면, 일부 구체예에서는, 업쇼-슐만 증후군 (USS)에 걸린 대상체의 설정에서 (즉, 대상체는 ADAMTS13 활성이 결핍된 것으로 공지되어 있고 및/또는 대상체는 하나 이상의 ADAMTS13 유전자 돌연변이(들)를 갖는 것으로 공지되어 있음), 선천성 TTP와 관련된 임상적 증상 (예를 들어, 혈소판 감소증, 빈혈증, 열병, 및/또는 신부전)에 걸릴 가능성을 감소시기키 위한 방법이 제공되며 TTP와 관련된 하나 이상의 임상적 증상을 개선하거나 예방하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제제 (예를 들어, MASP-2 항체)를 일정 기간 동안 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 대상체가 TTP와 관련된 임의의 증상의 발병 전에, 또는 TTP를 나타내는 적어도 하나 이상의 증상 (예를 들어, 빈혈증, 혈소판 감소증 및/또는 신부전의 존재)의 발병시 선천성 TTP와 관련된 증상에 걸릴 위험이 있는지를 결정하는 단계를 더 포함한다. 대상체가 선천성 TTP와 관련된 증상에 걸릴 위험이 있는지 (즉, 대상체가 USS에 걸림)의 결정은 대상체가 ADAMTS13를 암호화하는 유전자에서 돌연변이를 갖는지를 결정하는 단계, 및/또는 대상체가 ADAMTS13 활성이 결핍된 것인지를 결정하는 단계, 및/또는 대상체가 USS의 가족력을 갖는지를 결정하는 단계를 포함한다. USS와 관련된 유전적 돌연변이의 존재 또는 부재에 대한 유전자 스크리닝 방법은 잘 확립되어 있으며, 예를 들어, Kinoshita et al., International Journal of Hematology, 74:101-108 (2001); Levy et al., Nature, 413 (6855):488-494 (2001); Kokame et al., PNAS 99(18):11902-11907 (2002); Savasan et al., Blood, 101:4449-4451 (2003); Matsumoto et al., Blood, 103:1305-1310 (2004) 및 Fujimura et al., Brit. J. Haemat 144:742-754 (2008)을 참고하면 된다.

한 구체예에서, USS로 진단된 대상체가 TTP와 관련된 임상적 증상을 앓을 가능성을 감소시키기 위한 방법이 제공되며, 빈혈증, 혈소판 감소증 또는 크레아티닌 증가의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 대상체를 주기적으로 모니터링하는 단계, 및 빈혈증, 혈소판 감소증 또는 크레아티닌 증가의 존재의 결정시, 또는 트리거링 TTP 임상적 증상, 예를 들어, 약물 노출 (예를 들어, 화학요법), 감염 (예를 들어 박테리아 감염), 악성 종양, 손상, 이식, 또는 임신과 관련된 것으로 공지된 이벤트의 존재시 MASP-2 억제제 (예를 들어, MASP-2 항체)로 처리하는 단계를 포함한다.

또 다른 구체예에서, USS에 걸리고 TTP와 관련된 임상적 증상을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 방법이 제공되며 TTP와 관련된 하나 이상의 임상적 증상을 개선하거나 예방하는데 효과적인 양의 MASP-2 억제제 (예를 들어, MASP-2 항체)를 일정 기간 동안 투여하는 단계를 포함한다.

TTP는 또한 ADAMTS-13에 대한 자가-항체로 인해 발병할 수 있다. 이에 더하여, TTP는 유방암, 위장관암, 또는 전립선암 (George JN., Oncology (Williston Park). 25:908-14 (2011)), 임신 ((임신 후기 또는 산후), George JN., Curr Opin Hematol 10:339-344 (2003)) 중에 발병할 수 있거나, 또는 HIV 또는 전신성 홍반성 루푸스와 같은 자가면역 질환과 관련된 질환과 연관성이 있다 (Hamasaki K, et al., Clin Rheumatol.22:355-8 (2003)). TTP는 또한 헤파린, 퀴닌, 면역 매개된 성분, 암 화학치료제 (블레오마이신, 시스플라틴, 시토신 아라비노사이드, 다우노마이신 젬시타빈, 마이토마이신 C, 및 타목시펜), 사이클로스포린 A, 구강 피임제, 페니실린, 리팜핀 및 티클로피딘 및 클로피도그렐을 포함하는 항-혈소판제를 포함한 특정 약물 요법에 의해 유발될 수 있다 (Azarm, T. et al., J Res Med Sci., 16: 353-357 (2011)). TTP와 관련된 그 밖의 인자 또는 조건은 독소, 예컨대 벌독, 패혈증(sepsis), 비장 격리, 이식, 맥관염, 혈관 수술, 및 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia) 및 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)와 같은 감염이다 (Moake JL., N Engl J Med., 347:589-600 (2002)). 일시적인 기능적 ADAMTS-13 결핍으로 인한 TTP는 또한 스트렙토코쿠스 뉴모니아 감염과 관련된 내피 세포 손상의 결과로서 일어날 수 있다 (Pediatr Nephrol., 26:631-5 (2011)).

혈장 교환이 TTP에 대한 표준 치료이다 (Rock GA, et al., N Engl J Med 325:393-397 (1991)). 혈장 교환은 유전적 결함을 가진 환자의 ADAMTS-13 활성을 대체하고 후천적 자가면역 TTP에 걸린 상기 환자에서 ADAMTS-13 자가항체를 제거한다 (Tsai, H-M, Hematol Oncol Clin North Am., 21(4): 609-v (2007)). 면역억제제와 같은 추가적인 작용제가 일상적으로 요법에 사용된다 (George, JN, N Engl J Med, 354:1927-35 (2006)). 하지만, 혈장 교환은 약 20%의 환자에 대해서는 성공적이지 못하고, 환자 중 3분의 1보다 많은 수에서 재발이 일어나며, 혈장 반출법은 비용적으로 및 기술적으로 부담이 크다. 게다가, 많은 환자가 혈장 교환을 견딜 수 없다. 그 결과 TTP에 대한 추가적이고 더 나은 치료법이 절실히 필요하다.

TTP는 혈액 응고 캐스케이드의 장애이기 때문에, 보체 시스템의 안타고니스트로의 처리가 질환을 안정시키고 교정하는데 도움이 될 수도 있다. 대체 보체 경로의 생리학적 활성화는 aHUS와 관련되어 있지만, TTP에서 보체 활성화의 역할은 분명하지 않다. ADAMTS13의 기능적 결핍이 TTP의 민감도에 중요하지만, 급성 에피소드를 유발하기에 충분하지는 않다. 환경 요인 및/또는 그 밖의 유전적인 차이가 TTP의 징후에 기여할 수도 있다. 예를 들어, 응고 캐스케이드, vWF, 혈소판 기능, 내피 혈관 표면의 구성요소, 또는 보체 시스템의 조절에 관련된 단백질을 암호화하는 유전자는 급성 혈전성 미세혈관증의 발병에 관련되어 있는 것으로 나타날 수도 있다 (Galbusera, M. et al., Haematologica, 94: 166-170 (2009)). 특히, 보체 활성화가 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다; ADAMTS-13 결핍과 관련된 혈전성 미세혈관증의 혈청은 C3 및 MAC 침착 및 보체 불활성화에 의해 폐지될 수 있는 후속적인 호중구 활성화를 유발하는 것으로 나타났다 (Ruiz-Torres MP, et al., Thromb Haemost, 93:443-52 (2005)). 이에 더하여, 최근에는 TTP의 급성 에피토프 중에 C4d, C3bBbP, 및 C3a의 수준이 증가되는 것으로 나타났으며 (M. Reti et al., J Thromb Haemost. Feb 28.(2012) doi: 10.1111/j.1538-7836.2012.04674.x. [Epub ahead of print]), 고전적/렉틴 및 대체 경로의 활성화와 일치한다. 급성 에피소드에서 이러한 증가된 양의 보체 활성화는 말단 경로 활성화를 개시하고 TTP의 추가의 악화에 대한 원인이 될 수도 있다.

TTP에서 ADAMTS-13 및 vWF의 역할은 분명하게 혈소판의 활성화와 응집이고 미세혈관증에서의 전단 응력 및 침착에 대한 그것들의 후속적인 역할을 한다. 활성화된 혈소판은 보체의 고전적 경로 및 대체 경로 둘 다와 상호작용하여 그것드을 야기한다. 혈소판 매개 보체 활성화는 염증 매개체 C3a 및 C5a를 증가시킨다 (Peerschke E et al., Mol Immunol, 47:2170-5 (2010)). 따라서 혈소판은 유전된 또는 자가면역 TTP에서 고전적 보체 활성화의 표적의 역할을 할 수도 있다.

상기 기술된 바와 같이, 보체의 렉틴 경로는, MASP-2 매개 프로트롬빈 활성화에 의해, 내피 손상을 HUS에서 일어나는 응고 및 미세혈관 혈전증과 연결시키는 우세한 분자적 경로이다. 마찬가지로, 보체의 렉틴 경로 활성화는 TTP에서 응고 시스템을 직접적으로 구동할 수도 있다. 렉틴 경로 활성화는 TTP에서 ADAMTS-13 결핍에 의해 유발된 초기 내피 손상에 반응하여 개시될 수도 있다. 그러므로, 제한되는 것이 아니라, MASP-2 기능을 차단하는 항체를 포함한 렉틴 경로 억제자가 TTP를 앓고 있는 환자에서 미세혈관 응고, 혈전증, 및 용혈과 관련된 미세혈관증을 경감시킬 것으로 예상된다.

TTP를 앓고 있는 환자는 전형적으로 응급실에서 다음 중 하나 이상을 나타낸다: 자반증, 신부전, 저 혈소판, 빈혈증 및/또는 뇌졸중을 포함한 혈전증. TTP에 대한 치유의 현재의 기준은 2주일 이상의 기간 동안, 전형적으로 주 3회, 최대 매일 대체 혈장 반출법의 카테터 내 전달 (예를 들어, 정맥 내 또는 그 밖의 형태의 카테터)을 포함한다. 대상체가 ADAMTS13의 억제자 (즉, ADAMTS13에 대한 내인성 항체)의 존재에 대하여 양성 반응을 보이는 경우, 혈장 반출법은 면역억제 요법 (예를 들어, 코르티코스테로이드, 리툭산, 또는 사이클로스포린)과 조합하여 수행될 수도 있다. 난치성 TTP에 걸린 대상체 (TTP 환자 중 대략 20%)는 적어도 2주일의 혈장 반출법 요법에 반응하지 않는다.

상기 언급된 바에 따르면, 한 구체예에서는, TTP의 초기 진단의 설정에서 또는 TTP의 진단과 일치하는 하나 이상의 증상 (예를 들어, 중추신경계 포함, 중증 혈소판 감소증 (아스피린을 복용하지 않으면 5000/μL 이하, 아스피린 복용시 20,000/μL 이하의 혈소판 수준), 중증 심장 포함, 중증 폐 포함, 위장관 경색 또는 괴저)을 나타내는 대상체에서, 혈장 반출법의 부재 하에서 제1 선 요법으로서, 또는 혈장 반출법과 조합하여 MASP-2 억제제 (예를 들어, 항-MASP-2 항체)의 유효량으로 대상체를 치료하기 위한 방법이 제공된다. 제1 선 요법으로서, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 비강, 피하 또는 그 밖의 비경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 혈장 반출법의 잠재적 합병증, 예컨대 출혈, 감염, 및 혈장 공여체에서, 또는 혈장 반출법을 꺼리는 대상체에서, 또는 혈장 반출법이 이용 불가능한 설정에서 내재된 장애 및/또는 알레르기에 대한 노출을 막기 위해서 혈장 반출법의 부재 하에서 제1 선 요법으로서 대상체에게 투여된다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 면역억제제 (예를 들어, 코르티코스테로이드, 리툭산 또는 사이클로스포린)과 조합하여 (동시-투여 포함) 및/또는 농축된 ADAMTS-13과 조합하여 TTP를 앓고 있는 대상체에게 투여된다.

일부 구체예에서, 방법은 TTP를 앓고 있는 대상체에게 제1 기간 (예를 들어, 적어도 1일 내지 1주일 또는 2주일 동안 지속되는 급성기) 동안 카테터를 통해 (예를 들어, 정맥 내로) MASP-2 억제제를 투여 한 후 이어서 상기 대상체에게 제2 기간 (예를 들어, 적어도 2주 또는 그 이상의 만성기) 동안 피하로 MASP-2 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 및/또는 제2 기간에서 투여는 혈장 반출법의 부재 하에서 일어난다. 일부 구체예에서, 방법은 대상체가 TTP와 관련된 하나 이상의 증상을 앓는 것을 예방하는 것을 유지하는데 사용된다.

또 다른 구체예에서, TTP의 하나 이상의 증상을 감소시키는데 효과적인 양의 MASP-2 억제자를 투여함으로써 난치성 TTP를 앓고 있는 대상체 (즉, 적어도 2주의 혈장 반출 요법에 반응하지 않은 대상체)를 치료하기 위한 방법이 제공된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제자 (예를 들어, 항-MASP-2 항체)는 피하 또는 그 밖의 비경구 투여를 통해 만성적으로, 적어도 2주 이상의 기간 동안 난치성 TTP에 걸린 환자에게 투여된다. 투여는 질병이 해소되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 대로 반복될 수도 있다.

일부 구체예에서, 방법은 치료 전에, 및 선택적으로는 치료 중에 대상체에서 적어도 하나의 보체 인자 (예를 들어, C3, C5)의 수준을 결정하는 단계를 더 포함하며, 표준치 또는 건강한 대조군 대상체와 비교하여 적어도 하나의 보체 인자의 감소된 수준의 결정은 MASP-2 억제제로의 지속적인 처리에 대한 필요성을 나타낸다.

일부 구체예에서, 방법은 TTP를 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 피하로 또는 정맥 내로 MASP-2 억제제, 예컨대 항-MASP-2 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 처리는 바람직하게는 매일 이루어지지만, 2주마다와 같이 낮은 빈도로 이루어질 수 있다. 처리는 대상체의 혈소판 수준이 적어도 연속 2일 동안 150,000/ml보다 높을 때까지 지속된다. 항-MASP-2 항체는 단독으로, 또는 C5 억제자, 예컨대 에쿨리쥬맙과 조합하여 투여될 수도 있다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 다음 특징 중 적어도 하나 이상을 나타낸다: 상기 항체는 10 nM 이하의 K_D로 인간 MASP-2에 결합하고, 상기 항체는 MASP-2의 CCP1 도메인에서 에피토프에 결합하며, 상기 항체는 1% 인간 혈청에서의 시험관 내 검정에서 10 nM 이하의 IC₅₀으로 C3b 침착을 억제하고, 상기 항체는 90% 인간 혈청에서 30 nM 이하의 IC₅₀으로 C3b 침착을 억제하며, 항체는 Fv, Fab, Fab', F(ab)₂ 및 F(ab')₂로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단편이고, 항체는 단일 사슬 분자이며, 상기 항체는 IgG2 분자이고, 상기 항체는 IgG1 분자이며, 상기 항체는 IgG4 분자이고, IgG4 분자는 S228P 돌연변이를 포함하며, 및/또는 항체는 실질적으로는 고전적 경로를 억제하지 않는다. 한 구체예에서, 항체는 MASP-2에 결합하고 렉틴 경로를 선택적으로 억제하며 실질적으로 대체 경로를 억제하지는 않는다. 한 구체예에서, 항체는 MASP-2에 결합하고 렉틴 경로를 선택적으로 억제하며 실질적으로 고전적 경로 또는 대체 경로를 억제하지는 않는다 (즉, 렉틴 경로를 억제하는 한편 고전적 경로 및 대체 보체 경로를 온전하게 남겨둔다).

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 미처리 혈청과 비교하여 TTP를 앓고 있는 대상체의 혈청에서 혈전 형성을 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 최대 99%만큼 억제한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 혈청에서의 C5b-9 침착에 대한 억제 효과보다 TTP를 앓고 있는 대상체의 혈청에서는 적어도 20 퍼센트 이상 (예컨대 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%)의 수준으로 혈전 형성을 억제한다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 미처리 혈청과 비교하여 TTP 환자의 혈청에서 혈전 형성을 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 최대 99%만큼 억제한다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 정맥 내 카테터 또는 그 밖의 카테터 전달 방법을 통해 대상체에게 투여된다.

한 구체예에서, 본 발명은 TTP를 앓고 있는 대상체에서 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공하는데 (I) (a) i) 서열 번호:67의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) 서열 번호:67의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) 서열 번호:67의 95-102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 b) i) 서열 번호:70의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) 서열 번호:70의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) 서열 번호:70의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) 서열 번호:67에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:67에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:70에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 경쇄 가변 영역을 포함하는 이것의 변종을 포함하는, MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구체예에서, 방법은 대상체에게 서열 번호:67에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 대상체에게 서열 번호:70에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구체예에서, 방법은 서열 번호:67에서 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에서 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 참조 항체 OMS646에 의해 인식되는 인간 MASP-2 상의 에피토프의 적어도 일부를 특이적으로 인식하는 MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

디고스 병

악성 위축성 구진증(malignant atrophic papulosis)으로도 알려져 있는 디고스 병은 피부, 위장관, 및 CNS의 소혈관의 내피에 영향을 미치는 매우 드문 TMA이다. 이 혈관병(vasculopathy)은 세정맥 및 세동맥의 폐색을 유발하여, 피부 병변, 장 허혈, 및 뇌졸중, 뇌전증(epilepsy) 및 인지 장애를 포함하는 CNS 장애를 발생시킨다. 피부에서, 결합 조직 괴사는 소동맥의 혈전성 폐색 때문이다. 하지만, 디고스 병의 원인은 알려져 있지 않다. 맥관염, 응고장애, 또는 내피 세포의 1차 기능장애가 관련되어 있는 것으로 나타났다. 디고스 병은 2 내지 3년에 단지 50% 생존률을 갖는다. 디고스 병에 대한 효과적인 치료가 없지만 항혈소판제, 항응고제, 및 면역억제제가 증상을 완화하는데 활용된다.

디고스 병의 메커니즘은 알려져 있지 않지만, 보체 경로가 관련되어 있는 것으로 나타났다. Margo, 등은 디고스 병에 걸린 네 명의 마지막 환자의 피부, 위장관 및 뇌 혈관에서 현저한 C5b-9 침착을 식별하였다 (Margo et al., Am J Clin Pathol 135(4):599-610, 2011). 에쿨리쥬맙으로의 실험적 처리는 피부 및 장 병변의 처리시 초기에는 효과적이었지만, 전신성 질환의 진행을 방지하지 못했다 (Garrett-Bakelman F. et al., "C5b-9 is a potential effector in the pathophysiology of Degos disease; a case report of treatment with eculizumab" (Abstract), Jerusalem: International Society of Hematology; 2010, Poster #156; 및 Polito J. et al, "Early detection of systemic Degos disease (DD) or malignant atrophic papulosis (MAP) may increase survival" (Abstract), San Antonio, TX: American College of Gastroenterology; 2010, Poster #1205 참조).

디고스 병을 앓고 있는 많은 환자들은 혈액 응고의 결합을 갖는다. 피부에서 소동맥의 혈전성 폐색이 질환의 특징이다. 보체 경로가 이 질환과 관련되어 있는 것으로 나타났기 때문에, 다른 TMA에 대하여 본원에서 기술된 바와 같이, 제한되는 것은 아니지만 MASP-2 기능을 차단하는 항체를 포함하는 렉틴 경로 억제자가 디고스 병을 앓고 있는 환자를 치료하는데 유익할 것으로 예상된다.

따라서, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 약학적 담체 중에 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 항체의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 디고스 병 또는 디고스 병으로부터 발생한 질병을 앓고 있는 대상체에게 투여함으로써 디고스 병을 치료하기 위한 방법을 제공한다. MASP-2 억제제는 디고스 병 또는 디고스 병으로부터 발생한 질병을 앓고 있는 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 피하 또는 그 밖의 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로는 비-펩타이드성 작용제의 경구 투여에 의해 투여된다. 항-MASP-2 항체는 단독으로, 또는 C5 억제자, 예컨대 에쿨리쥬맙과 조합하여 투여될 수도 있다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 미처리 혈청과 비교하여 디고스 병을 앓고 있는 대상체의 혈청에서 혈전 형성을 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 최대 99%만큼 억제한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 혈청에서의 C5b-9 침착에 대한 억제 효과보다 디고스 병을 앓고 있는 대상체의 혈청에서는 적어도 20 퍼센트 이상 (예컨대 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%)의 수준으로 혈전 형성을 억제한다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 미처리 혈청과 비교하여 디고스 병 환자의 혈청에서 혈전 형성을 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 최대 99%만큼 억제한다.

한 구체예에서, 본 발명은 디고스 병을 앓고 있는 대상체에서 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공하는데, (I) (a) i) 서열 번호:67의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) 서열 번호:67의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) 서열 번호:67의 95-102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 b) i) 서열 번호:70의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) 서열 번호:70의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) 서열 번호:70의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) 서열 번호:67에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:67에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:70에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 경쇄 가변 영역을 포함하는 이것의 변종을 포함하는, MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구체예에서, 방법은 서열 번호:67에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 서열 번호:70에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

치명적 항인지질 증후군 (CAPS)

치명적 항인지질 증후군 (CAPS)은 항인지질 항체 (APLA) 증후군의 극단적 변종이다. CAPS는 병원성 항체로 인한 정맥 및 동맥 혈전증을 특징으로 한다. CAPS는 다수의 장기 혈전증, 허혈, 및 장기 부전을 동반한 TMA이다. 그 밖의 TMA와 같이, 다양한 장기에서의 소혈관의 폐색이 특징적이다. CAPS에서는 치사율이 약 50%로 높고 그것은 종종 감염 또는 외상과 연관성이 있다. 환자는 항인지질 항체, 일반적으로는 IgG를 갖는다.

임상적으로, CAPS는 소혈관 폐색의 조직생리학적 증거로 적어도 세 개의 장기 또는 조직을 포함한다. 말초 혈전증은 CNS, 심혈관, 신장, 또는 폐 시스템의 정맥 및 동맥을 포함할 수도 있다. 환자는 항생제, 항응고제, 코르티코스테로이드, 혈장 교환, 및 정맥 내 면역글로불린으로 처리된다. 그럼에도 불구하고, 다수의 장기 부전으로부터 사망이 초래될 수도 있다.

보체 경로는 CAPS와 관련된 것으로 나타났다. 예를 들어, 동물 모델에서의 연구는 보체 억제가 CAPS와 관련된 혈전증을 예방하는데 효과적인 수단일 수도 있다는 것을 나타낸다 (Shapira L. et al., Arthritis Rheum 64(8):2719-23, 2012). 더욱이, Shapira, 등에 의해 추가로 보고된 바와 같이, CAPS를 앓고 있는 대상체에게 보체 경로를 차단하는 용량으로 에쿨리쥬맙의 투여는 급성 진행성 혈전성 이벤트 및 반전된 혈소판 감소증을 중지시켰다 (또한 Lim W., Curr Opin Hematol 18(5):361-5, 2011을 참고하면 된다). 그러므로, 그 밖의 TMA에 대하여 본원에서 기술된 바와 같이, 제한되는 것은 아니지만, MASP-2 기능을 차단하는 항체를 포함하는 렉틴 경로 억제자는 CAPS를 앓고 있는 환자를 치료하는데 유익할 것으로 예상된다.

따라서, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 CAPS 또는 CAPS로부터 발생한 질병을 앓고 있는 대상체에게 약학적 담체 중의 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 항체의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 투여함으로써 CAPS를 치료하기 위한 방법을 제공한다. MASP-2 억제제는 CAPS 또는 CAPS로부터 발생한 질병을 앓고 있는 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 피하 또는 그 밖의 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로는 비-펩타이드성 작용제에 대한 경구 투여에 의해 투여된다. 항-MASP-2 항체는 단독으로, 또는 C5 억제자, 예컨대 에쿨리쥬맙과 조합하여 투여될 수도 있다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 미처리 혈청과 비교하여 CAPS를 앓고 있는 대상체의 혈청에서 혈전 형성을 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 최대 99%만큼 억제한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 혈청에서의 C5b-9 침착에 대한 억제 효과보다 CAPS를 앓고 있는 대상체의 혈청에서는 적어도 20 퍼센트 이상 (예컨대, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%)의 수준으로 혈전 형성을 억제한다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 미처리 혈청과 비교하여 CAPS 환자의 혈청에서 혈전 형성을 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 최대 99%만큼 억제한다.

한 구체예에서, 본 발명은 CAPS를 앓고 있는 대상체에서 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공하는데, (I) (a) i) 서열 번호:67의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) 서열 번호:67의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) 서열 번호:67의 95-102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 b) i) 서열 번호:70의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) 서열 번호:70의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) 서열 번호:70의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II)서열 번호:67에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:67에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:70에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 경쇄 가변 영역을 포함하는 변종을 포함하는, MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

암에 부차적인 TMA

어떤 유형의 전신성 악성 종양도 TMA의 임상적 및 병리학적 징후로 이어질 수 있다 (예를 들어, Batts and Lazarus, Bone Marrow Transplantation 40:709-719, 2007 참조). 암-관련 TMA는 종종 폐에서 발견되고 종양 색전증(tumor emboli)과 관련된 것으로 나타난다 (Francis KK et al., Commun Oncol 2:339-43, 2005). 종양 색전증은 혈류를 감소시키며 따라서 영향을 받은 세동맥 및 세정맥의 관류 저하 상태로 이어질 수 있다. 결과로 생성된 조직 스트레스 및 손상은 국소화된 방식으로 보체의 렉틴 경로를 활성화시킬 것으로 예상된다. 활성화된 렉틴 경로는 차례로 트롬빈으로의 프로트롬빈의 MASP-2 의존성 분열을 통해 응고 캐스케이드를 활성화시켜, TMA 특유의 부혈전 상태(pro-thrombotic state)로 이어질 수 있다. 이 설정에서 MASP-2 억제는 트롬빈의 국소화된 활성화를 감소시켜 부혈전 상태를 완화할 것으로 예상된다.

그러므로, 그 밖의 TMA에 대하여 본원에서 기술된 바와 같이, 제한되는 것은 아니지만, MASP-2 기능을 억제하는 항체를 포함하는 렉틴 경로 억제자는 암에 부차적인 TMA를 앓고 있는 환자를 치료하는데 유익할 것으로 예상된다.

따라서, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 암에 부차적인 TMA를 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 약학적 담체 중의 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 항체의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 투여함으로써 암에 부차적인 TMA를 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. MASP-2 억제제는 암에 부차적인 TMA를 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로는 비-펩타이드성 작용제에 대한 경구 투여에 의해 투여된다. 항-MASP-2 항체는 단독으로, 또는 C5 억제자, 예컨대 에쿨리쥬맙과 조합하여 투여될 수도 있다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 미처리 혈청과 비교하여 암에 부차적인 TMA를 앓고 있는 대상체의 혈청에서 혈전 형성을 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 최대 99%만큼 억제한다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 미처리 혈청과 비교하여 암에 부차적인 TMA를 앓고 있는 환자의 혈청에서 혈전 형성을 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 최대 99%만큼 억제한다.

한 구체예에서, 본 발명은 암에 부차적인 TMA를 앓고 있는 대상체에서 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공하는데, (I) (a) i) 서열 번호:67의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) 서열 번호:67의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) 서열 번호:67의 95-102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 b) i) 서열 번호:70의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) 서열 번호:70의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) 서열 번호:70의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) 서열 번호:67에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:67에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:70에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 경쇄 가변 영역을 포함하는 이것의 변종을 포함하는, MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

암 화학요법에 부차적인 TMA

화학요법-관련된 TMA는 젬시타빈, 마이토마이신, 옥살리플라틴 등과 같은 화학치료제로 처리된 악성 신생물의 병력을 가진 환자의 2-10%에서 발병하는, 혈소판 감소증, 미소혈관성 용혈성 빈혈증, 및 신장 기능장애를 포함하는 질병이다. 화학요법-관련된 TMA는 고 치사율의 불량한 임상 결과와 연관성이 있다 (예를 들어, Blake-Haskins et al., Clin Cancer Res 17(18):5858-5866, 2011을 참고하면 된다).

화학요법-관련된 TMA의 병인은 미세혈관 내피에 대한 비-특이적인, 독성 외상을 포함하는 것으로 생각된다. 내피 세포에 대한 직접적 손상은 마이토마이신-유도된 TMA의 동물 모델에서 나타났다 (Dlott J. et al., Ther Apher Dial 8:102-11, 2004). 다양한 메커니즘을 통한 내피 세포 손상은 보체의 렉틴 경로를 활성화시키는 것으로 나타났다. 예를 들어, Stahl, 등은 산화 스트레스에 노출된 내피 세포가 시험관 내 및 생체 내 둘 다에서 보체의 렉틴 경로를 활성화시킨다는 것을 보여주었다 (Collard et al., Am J Pathol. 156(5):1549-56, 2000; La Bonte et al, J Immunol. 15;188(2):885-91, 2012). 생체 내에서, 이 과정은 혈전증으로 이어지고, 렉틴 경로의 억제는 혈전증을 예방하는 것으로 나타났다 (La Bonte et al. J Immunol . 15;188(2):885-91, 2012). 게다가, 본원에서 실시예 37-39에서 입증된 바와 같이, FITC-Dex의 국소화된 광여기(photoexcitation)가 미세혈관계에 대한 국소화된 손상을 유도하여 TMA 반응의 후속적 발병을 유도하는데 사용된 TMA의 마우스 모델에서, 본 발명자들은 MASP-2의 억제가 TMA를 예방할 수 있다는 것을 보여주었다. 따라서, 화학치료제에 의한 미세혈관 내피 손상은 보체의 렉틴 경로를 활성화시킬 수도 있으며 이것은 국소화된 부혈전 상태를 생성하고 TMA 반응을 촉진한다. 렉틴 경로의 활성화 및 부혈전 상태의 생성이 MASP-2-의존적이기 때문에, 제한되는 것은 아니지만, MASP-2 기능을 차단하는 항체를 포함하는 MASP-2 억제자는 TMA 반응을 완화하고 암 화학요법-관련된 TMA의 위험을 감소시킬 것으로 예상된다.

따라서, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 화학요법에 부차적인 TMA를 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 약학적 담체 중의 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 항체의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 투여함으로써 화학요법에 부차적인 TMA를 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. MASP-2 억제제는 화학요법을 받았거나, 받고 있거나, 또는 받을 예정인 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 피하 또는 그 밖의 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로는 비-펩타이드성 작용제에 대한 경구 투여에 의해 투여된다. 항-MASP-2 항체는 단독으로, 또는 C5 억제자, 예컨대 에쿨리쥬맙과 조합하여 투여될 수도 있다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 미처리 혈청과 비교하여 암 화학요법에 부차적인 TMA를 앓고 있는 대상체의 혈청에서 혈전 형성을 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 최대 99%만큼 억제한다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 미처리 혈청과 비교하여 암 화학요법에 부차적인 TMA를 앓고 잇는 환자의 혈청에서 혈전 형성을 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 최대 99%만큼 억제한다.

한 구체예에서, 본 발명은 암 화학요법에 부차적인 TMA를 앓고 있는 대상체에서 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공하는데, (I) (a) i) 서열 번호:67의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) 서열 번호:67의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) 서열 번호:67의 95-102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 b) i) 서열 번호:70의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) 서열 번호:70의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) 서열 번호:70의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) 서열 번호:67에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:67에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:70에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 경쇄 가변 영역을 포함하는 이것의 변종을 포함하는, MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

이식에 부차적인 TMA

이식-관련된 TMA (TA-TMA)는 이식 환자, 예컨대 동종 이계 조혈모세포 이식 수령체에서 일어날 수 있는 치명적인 증후군이다 (예를 들어, Batts and Lazarus, Bone Marrow Transplantation 40:709-719, 2007 참조). 이 질병의 발병 기전은 잘 알려져 있지 않지만, 내피 세포 손상이 절정에 이르는 반응의 합류를 포함할 가능성이 크다 (Laskin B.L. et al., Blood 118(6):1452-62, 2011). 상기 논의된 바와 같이, 내피 세포 손상은 렉틴 경로 활성화 및 부혈전 환경의 생성을 위한 원형의 자극이다.

최근의 데이터는 발병 기전 TA-TMA에서 렉틴 경로를 통한 보체 활성화의 역할을 더 지지한다. Laskin, 등은 신장 소동맥 C4d 침착이 대조군 (8%)과 비교하여 조직학적 TA-TMA에 걸린 대상체 (75%)에서 훨씬 더 일반적이라는 것을 입증하였다 (Laskin B.L., et al., Transplantation, 27; 96(2):217-23, 2013). 따라서, C4d는 TA-TMA의 병리학적 마커이며, 렉틴 또는 고전적 경로를 통한 국소화된 보체 고정과 관련되어 있을 수도 있다.

렉틴 경로의 활성화 및 부혈전 상태의 생성이 MASP-2-의존적이기 때문에, 제한되는 것은 아니지만, MASP-2 기능을 차단하는 항체를 포함하는 MASP-2 억제자는 TMA 반응을 완화하고 이식-관련된 TMA (TA-TMA)의 위험을 감소시킬 것으로 예상된다.

따라서, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 이식에 부차적인 TMA를 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 약학적 담체 중의 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 항체의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 투여함으로써 이식에 부차적인 TMA를 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. MASP-2 억제제는 이식 수술을 받았거나, 받고 있거나, 또는 받을 예정인 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입, 피하 또는 그 밖의 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로는 비-펩타이드성 작용제에 대한 경구 투여에 의해 투여된다. 항-MASP-2 항체는 단독으로, 또는 C5 억제자, 예컨대 에쿨리쥬맙과 조합하여 투여될 수도 있다. 일부 구체예에서, 본 발명은 동종 이계 줄기 세포 이식에 부차적인 TMA를 치료하거나 또는 예방하기 위한 방법을 제공하며 동종 이계 줄기 세포 이식을 받기 전에, 받는 중에 또는 받은 후에 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 미처리 혈청과 비교하여 이식에 부차적인 TMA를 앓고 있는 대상체의 혈청에서 혈전 형성을 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 최대 99%만큼 억제한다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 미처리 혈청과 비교하여 이식에 부차적인 TMA를 앓고 있는 환자의 혈청에서 혈전 형성을 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 최대 99%만큼 억제한다.

한 구체예에서, 본 발명은 이식에 부차적인 TMA를 앓고 있는 대상체에서 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공하는데, (I) (a) i) 서열 번호:67의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) 서열 번호:67의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) 서열 번호:67의 95-102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 b) i) 서열 번호:70의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) 서열 번호:70의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) 서열 번호:70의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) 서열 번호:67에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:67에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:70에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 경쇄 가변 영역을 포함하는 이것의 변종을 포함하는, MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

IV. 그 밖의 질환 및 질병에서 MASP-2의 역할 및 masp-2 억제제를 사용한 치료 방법

신장 질환

보체 시스템의 활성화는 다양한 신장 질환의 발병 기전에 관련되어 있는 것으로 나타났으며; 메산지움 증식성 사구체 신염(mesangioproliferative glomerulonephritis) (IgA-신증(nephropathy), 버거 병(Berger's disease)) (Endo, M., et al., Clin. Nephrology 55:185-191, 2001), 막성 사구체 신염(membranous glomerulonephritis) (Kerjashki, D., Arch B Cell Pathol. 58:253-71, 1990; Brenchley, P.E., et al., Kidney Int., 41:933-7, 1992; Salant, D.J., et al., Kidney Int. 35:976-84, 1989), 막증식성 사구체 신염 (메산지움 모세혈관성 사구체 신염(mesangiocapillary glomerulonephritis)) (Bartlow, B.G., et al., Kidney Int. 15:294-300, 1979; Meri, S., et al., J. Exp. Med. 175:939-50, 1992), 급성 감염 후 사구체 신염(acute postinfectious glomerulonephritis) (연쇄구균 감염 후 사구체 신염(poststreptococcal glomerulonephritis)), 저온 글로불린혈증성 사구체 신염(cryoglobulinemic glomerulonephritis) (Ohsawa, I., et al., Clin Immunol. 101:59-66, 2001), 홍반성 신염 (Gatenby, P.A., Autoimmunity 11:61-6, 1991), 및 헤노흐-쇤레인 자반성 신염(henoch-Schonlein purpura nephritis) (Endo, M., et al., Am. J. Kidney Dis. 35:401-407, 2000)을 포함한다. 신장 질환에서 보체의 포함은 수십 년 동안 인정되어 왔지만 신장 질환의 발병, 발달 및 해소 단계에서 그것의 정확한 역할에 대한 주요 논의가 계속되고 있다. 정상 조건 하에서 보체의 기여는 숙주에게 유익하지만, 보체의 부적절한 활성화 및 침착은 조직 손상에 기여할 수도 있다.

사구체의 염증인 사구체신염이 종종 사구체형 또는 관형 구조로의 면역 복합체의 침착에 의해 개시되며 이것은 보체 활성화, 염증 및 조직 손상을 야기한다는 실질적인 증거가 존재한다. Kahn 및 Sinniah는 다양한 형태의 사구체신염에 걸린 환자로부터 채취한 생검 조직의 관형 기저막에서 C5b-9의 증가된 침착을 입증하였다 (Kahn, T.N., et al., Histopath. 26:351-6, 1995). IgA 신증에 걸린 환자의 연구에서 (Alexopoulos, A., et al., Nephrol. Dial. Transplant 10:1166-1172, 1995), 관형 상피/기저막 구조에서 C5b-9 침착은 혈장 크레아티닌 수준과 연관성이 있다. 막성 신증의 또 다른 연구는 임상 결과와 소변 sC5b-9 수준 간의 관계를 입증하였다 (Kon, S.P., et al., Kidney Int. 48:1953-58, 1995). 높아진 sC5b-9 수준은 불량한 예후와 양의 상관관계에 있었다. Lehto, 등은 혈장 막에서 막 공격 복합체를 억제하는 보체 조절 인자인 CD59, 뿐만 아니라 막성 사구체 신염에 걸린 환자의 소변에서의 C5b-9의 높아진 수준을 측정하였다 (Lehto, T., et al., Kidney Int. 47:1403-11, 1995). 이들 같은 환자로부터 채취한 생검 샘플의 조직생리학적 분석은 사구체에서 C3 및 C9 단백질의 침착을 입증한 반면, 이들 조직에서 CD59의 발현이 정상 신장 조직과 비교하여 감소되었음을 입증하였다. 이들 다양한 연구는 진행 중인 보체-매개 사구체신염이 보체 단백질의 비뇨기 배설을 초래하며 이것은 조직 손상의 정도 및 질환 예후와 연관성이 있다고 제안한다.

사구체신염의 다양한 동물 모델에서 보체 활성화의 억제는 또한 질환의 병인에서 보체 활성화의 중요성을 입증하였다. 막증식성 사구체 신염 (MPGN)의 모델에서, C6-결핍 래트 (C5b-9를 형성할 수 없음)에서 항-Thy1 항혈청의 투입은 C6+ 정상 래트보다 90% 더 적은 사구체 세포 증식, 혈소판 및 대식 세포 침투의 80% 감소, 감소된 콜라겐 IV형 합성 (혈관 사이 바탕질 확대에 대한 마커), 및 50% 더 적은 단백뇨를 초래하였다 (Brandt, J., et al., Kidney Int. 49:335-343, 1996). 이들 결과는 이 래트 항-흉선세포 혈청 모델에서 보체에 의한 조직 손상의 주요 매개체로서 C5b-9와 관련되어 있음을 나타낸다. 사구체신염의 또 다른 모델에서, 토끼 항-래트 사구체 기저막의 차등적 투약량의 투입은 코브라 독 인자로의 전처리 (보체를 소모하기 위해)에 의해 감소된 다형핵 백혈구 (PMN)의 용량-의존적 유입을 일으켰다 (Scandrett, A.L., et al., Am. J. Physiol. 268:F256-F265, 1995). 코브라 독 인자-처리된 래트는 또한 대조군 래트보다 감소된 조직병리학적 상태, 감소된 장기간 단백뇨, 및 낮은 크레아티닌 수준을 나타냈다. 래트의 GN의 세 가지 모델 (항-흉선세포 혈청, Con A 항-Con A, 및 수동형 헤이만 신염(passive Heymann nephritis))을 이용하여, Couser, 등은 재조합 sCR1 단백질을 사용하여 보체를 억제하기 위한 접근법의 잠재적 치료적 효능을 입증하였다 (Couser, W.G., et al., J. Am. Soc. Nephrol. 5:1888-94, 1995). sCR1로 처리된 래트는 대조군 래트에 비해 크게 감소된 PMN, 혈소판 및 대식 세포 유입, 감소된 사구체 간질 용해, 및 단백뇨를 나타냈다. 사구체신염에서 보체 활성화의 중요성에 대한 추가의 증거는 NZB/W F1 마우스 모델에서 항-C5 MoAb의 사용에 의해 제공되었다. 항-C5 MoAb는 C5의 분열을 억제하며, 따라서 C5a 및 C5b-9의 생성을 차단한다. 6개월 동안 항-C5 MoAb로의 지속적인 요법은 사구체신염의 경과의 상당한 개선을 초래하였다. 염증 전 구성요소로의 인간 보체 성분 C5의 분열을 방지하는 인간화 항-C5 MoAb 단클론성 항체 (5G1.1)는 사구체신염에 대한 참재적 치료법으로서 코네티컷 뉴 헤이븐에 위치한 Alexion Pharmaceuticals, Inc.에 의해 개발 중에 있다.

신장 손상에서 보체의 생리학적 역할에 대한 직접적인 증거는 특이적 보체 성분에서 유전적 결핍을 가진 환자의 연구에 의해 제공된다. 많은 보고서에서 신장 질환과 보체 조절 인자 H의 결핍과의 연관성을 기록하였다 (Ault, B.H., Nephrol. 14:1045-1053, 2000; Levy, M., et al., Kidney Int. 30:949-56, 1986; Pickering, M.C., et al., Nat. Genet. 31:424-8, 2002). 인자 H 결핍은 인자 B 및 C3의 낮은 혈장 수준 및 C5b-9의 소모를 초래한다. 비정형 막증식성 사구체 신염 (MPGN) 및 특발성 용혈성 요독성 증후군 (HUS) 둘 다는 인자 H 결핍과 연관성이 있다. 인자 H 결핍 돼지 (Jansen, J.H., et al., Kidney Int. 53:331-49, 1998) 및 인자 H 넉아웃 마우스 (Pickering, M.C., 2002)는 MPGN-유사 증상을 나타내며, 보체 조절에서 인자 H의 중요성을 확인하였다. 그 밖의 보체 성분의 결핍은 신장 질환과 연관성이 있으며, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)의 발달에 부차적이다 (Walport, M.J., Davies, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 815:267-81, 1997). C1q, C4 및 C2에 대한 결핍은 면역 복합체 및 아폽토시스성 물질의 불완전한 클리어런스와 관련된 메커니즘을 통해 SLE의 발달에 매우 취약하다. 이들 SLE 환자 중 다수에서 홍반성 신염이 발생하며, 사구체 전반에 걸친 면역 복합체의 침착을 특징으로 한다.

보체 활성화 및 신장 질환과 관련된 추가의 증거가 환자에서 보체 성분에 대한 자가항체의 식별에 의해 제공되었으며, 이것들 중 일부는 신장 질환과 직접적으로 관련이 있다 (Trouw, L.A., et al., Mol. Immunol. 38:199-206, 2001). 많은 이들 자가항체는 신장 질환과의 이러한 높은 정도의 연관성을 나타내며 용어 신장염 인자 (NeF)가 이 활성을 나타내기 위해 도입되었다. 임상 연구에서, 신장염 인자에 대하여 양성인 환자 중 약 50%가 MPGN에 걸렸다 (Spitzer, R.E., et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 64:177-83, 1992). C3NeF는 대체 경로 C3 컨버타제 (C3bBb)에 대한 자가항체이고 이 컨버타제를 안정화시키며, 이로 인해 대체 경로 활성화를 촉진한다 (Daha, M.R., et al., J. Immunol. 116:1-7, 1976). 마찬가지로, 고전적 경로 C3 컨버타제 (C4b2a)에 대한 특이성을 가진 자가항체, 소위 C4NeF는 이 컨버타제를 안정화시키며 이로 인해 고전적 경로 활성화를 촉진한다 (Daha, M.R. et al., J. Immunol. 125:2051-2054, 1980; Halbwachs, L., et al., J. Clin. Invest. 65:1249-56, 1980). 항-C1q 자가항체는 SLE 환자의 신염과 관련된 것으로 기술되었고 (Hovath, L., et al., Clin. Exp. Rheumatol. 19:667-72, 2001; Siegert, C., et al., J. Rheumatol. 18:230-34, 1991; Siegert, C., et al., Clin. Exp. Rheumatol. 10:19-23, 1992), 이들 항-C1q 자가항체의 역가의 증가는 신염의 발적을 예측하는 것으로 보고되었다 (Coremans, I.E., et al., Am. J. Kidney Dis. 26:595-601, 1995). SLE 환자의 사후 신장으로부터 용출된 면역 침착은 이들 항-C1q 자가항체의 축적을 나타냈다 (Mannick, M., et al., Arthritis Rheumatol. 40:1504-11, 1997). 이 모든 사실들은 이들 네 개의 자가항체에 대한 생리학적 역할을 나타낸다. 하지만, 항-C1q 자가항체를 가진 모든 환자 및 또한 일부의 건강한 개체가 낮은 역가 항-C1q 자가항체를 갖는 것은 아니다 (Siegert, C.E., et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 67:204-9, 1993).

보체 활성화의 대체 경로 및 고전적 경로에 더하여, 렉틴 경로는 또한 신장 질환에서 중요한 생리학적 역할을 가질 수도 있다. 높아진 수준의 MBL, MBL-관련 세린 프로테아제 및 보체 활성화 생성물은 헤노흐-쇤레인 자반성 신염 (Endo, M., et al., Am. J. Kidney Dis. 35:401-407, 2000), 저온 글로불린혈증성 사구체 신염 (Ohsawa, I., et al., Clin. Immunol. 101:59-66, 2001) 및 IgA 신경병증 (Endo, M., et al., Clin. Nephrology 55:185-191, 2001)을 포함한 여러 다른 신장 질환으로 진단된 환자로부터 얻어진 신장 생검 재료 상에서 면역조직화학적 기술에 의해 검출되었다. 그러므로, 보체와 신장 질환의 연관성이 수십 년 동안 알려져 있었다는 사실에도 불구하고, 보체가 어떻게 이들 신장 질환에 정확하게 영향을 주는지에 대한 데이터는 완전하지 않다.

혈액 장애

패혈증는 침입 미생물에 대한 환자의 압도적인 반응에 의해 유발된다. 보체 시스템의 주요 기능은 침입 박테리아 및 그 밖의 병원체에 맞게 염증 반응을 조정하는 것이다. 이 생리학적 역할과 일치하게, 보체 활성화는 많은 연구에서 패혈증의 발병 기전에 있어서 주요 역할을 갖는 것으로 나타났다 (Bone, R.C., Annals. Internal. Med. 115:457-469, 1991). 패혈증의 임상 징후의 정의는 발전하고 있다. 패혈증은 보통 감염에 대한 전신성 숙주 반응으로서 정의된다. 하지만, 많은 경우에, 감염 (예를 들어, 양성 박테리아 혈액 배양물)에 대한 임상적 증거가 패혈증 증상을 나타내는 환자에서 발견되지 않는다. 이러한 불일치는 용어 "전신성 염증 반응 증후군" (SIRS)이 확립되었고, 박테리아 감염의 정의 가능한 존재가 필요하지 않았을 때, 1992년 합의 회의에서 처음 고려되었다 (Bone, R.C., et al., Crit. Care Med. 20:724-726, 1992). 지금은 패혈증 및 SIRS이 염증 반응을 조절할 수 없다는 것에 일반적으로 동의한다. 이 간략한 리뷰의 목적을 위해서, 발명자들은 중증 패혈증, 패혈성 쇼크, 및 SIRS를 포함하도록 패혈증의 임상적 정의를 고려할 것이다.

1980년해 후반 이전에 패혈증 환자에서 감염의 주된 공급원은 그람-음성(Gram-negative) 박테리아였다. 그람-음성 박테리아 세포벽의 주요 구성요소인 지질다당류 (LPS)는 다양한 세포 유형으로부터 염증 매개체의 방출을 자극하고 동물에 주사될 때 급성 감염 증상을 유도하는 것으로 알려져 있었다 (Haeney, M.R., et al., Antimicrobial Chemotherapy 41(Suppl. A):41-6, 1998). 흥미롭게는, 원인이 되는 미생물의 범위는 현재까지 불분명한 이유로 1970년대 후반 및 1980년대에는 주로 그람-음성 박테리아에서 현재는 주로 그람-양성 박테리아로 옮겨간 것으로 나타난다 (Martin, G.S., et al., N. Eng. J. Med. 348:1546-54, 2003).

많은 연구가 염증으 faoro하고 쇼크, 특히 패혈성 및 출혈성 쇼크의 특징에 기여하는데 있어서 보체 활성화의 중요성을 보여주었다. 그람-음성 및 그람-양성 유기체는 둘 다 일반적으로 패혈성 쇼크를 일으킨다. LPS는 주로 대체 경로를 통해 이루어지는 보체의 강력한 활성화 인자이지만, 항체에 의해 매개되는 고전적 경로 활성화가 또한 일어난다 (Fearon, D.T., et al., N. Engl. J. Med. 292:937-400, 1975). 그람-양성 세포벽의 주요 구성요소는 펩티도글리칸 및 리포테이코산이고, 두 구성요소는 대체 보체 경로의 강력한 활성화 인자이지만, 특이적 항체의 존재 하에서 그것들은 또한 고전적 보체 경로를 활성화시킬 수 있다 (Joiner, K.A., et al., Ann. Rev. Immunol. 2:461-2, 1984).

연구원들이 아나필라톡신 C3a 및 C5a가 패혈증 중에 일어날 수 있는 다양한 염증 반응을 매개한다는 것을 언급했을 때 보체 시스템은 처음에는 패혈증의 발병 기전에 관련되어 있는 것으로 나타났다. 이들 아나필라톡신은 패혈성 쇼크에서 중요한 역할을 하는 이벤트인 혈관 확장(vasodilation) 및 미세혈관 투과성의 증가를 유발한다 (Schumacher, W.A., et al., Agents Actions 34:345-349, 1991). 이에 더하여, 아나필라톡신은 기관지 경련, 비만 세포로부터 히스타민 방출, 및 혈소판 응집을 유도한다. 더욱이, 그것들은 과립구에 대하여, 화학주성, 응집, 접착, 리소좀 효소의 방출, 독성 과산화물 음이온의 생성 및 류코트리엔의 형성과 같은, 많은 효과를 발휘한다 (Shin, H.S., et al., Science 162:361-363, 1968; Vogt, W., Complement 3:177-86, 1986). 이들 생물학적 효과는 쇼크 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome; ARDS)과 같은 패혈증 합병증의 발병에서의 역할을 하는 것으로 생각된다 (Hammerschmidt, D.E., et al., Lancet 1:947-949, 1980; Slotman, G.T., et al., Surgery 99:744-50, 1986). 게다가, 높아진 수준의 아나필라톡신 C3a는 패혈증에서의 치명적인 결과와 연관성이 있다 (Hack, C.E., et al., Am. J. Med. 86:20-26, 1989). 쇼크의 일부 동물 모델에서, 특정 보체-결핍 계통 (예를 들어, C5-결핍 계통)은 LPS 투입의 효과에 대하여 더 저항성이다 (Hseuh, W., et al., Immunol. 70:309-14, 1990).

설치류에서 패혈증의 발병 중에 항체를 이용한 C5a 생성의 차단은 생존률을 크게 개선하는 것으로 나타났다 (Czermak, B.J., et al., Nat. Med. 5:788-792, 1999). C5a 수용체 (C5aR)가 항체 또는 소분자 억제자로 차단되었을 때 유사한 결과를 얻었다 (Huber-Lang, M.S., et al., FASEB J. 16:1567-74, 2002; Riedemann, N.C., et al., J. Clin. Invest. 110:101-8, 2002). 원숭이에서의 초기 실험 연구는 C5a의 항체 차단이 대장균-유도된 패혈성 쇼크 및 성인성 호흡 곤란 증후군을 감소시킨다고 제안하였다 (Hangen, D.H., et al., J. Surg. Res. 46:195-9, 1989; Stevens, J.H., et al., J. Clin. Invest. 77:1812-16, 1986). 패혈증에 걸린 인간에서, 덜 심각한 패혈증 환자 및 생존자와 비교할 때 C5a가 높아졌고 다기관 부전과 함께 크게 감소된 생존률과 연관성이 있었다 (Nakae, H., et al., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 84:189-95, 1994; Nakae, et al., Surg. Today 26:225-29, 1996; Bengtson, A., et al., Arch. Surg. 123:645-649, 1988). 패혈증 중에 해로운 효과를 발휘하는 메커니즘은 아직 더 상세히 조사되어야 하지만, 최근의 데이터는 패혈증 중에 C5a의 생성이 혈액 호중구의 선천적 면역 기능 (Huber-Lang, M.S., et al., J. Immunol. 169:3223-31, 2002), 호흡 폭발을 나타내는 능력, 및 사이토카인을 생성하는 능력 (Riedemann, N.C., et al., Immunity 19:193-202, 2003)을 크게 손상시킨다는 것을 제안한다. 이에 더하여, 패혈증 중에 C5a 생성은 응고 촉진 효과를 갖는 것으로 나타난다 (Laudes, I.J., et al., Am. J. Pathol. 160:1867-75, 2002). 보체-조절 단백질 CI INH는 또한 패혈증 및 ARDS의 동물 모델에서 효능을 나타냈다 (Dickneite, G., Behring Ins. Mitt. 93:299-305, 1993).

렉틴 경로는 또한 패혈증의 발병 기전에서의 역할을 가질 수도 있다. MBL은 그람-음성 및 그람-양성 박테리아 둘 다를 포함하는 임상적으로 중요한 미생물의 범위에 결합하여, 렉틴 경로를 활성화시키는 것으로 나타났다 (Neth, O., et al., Infect. Immun. 68:688, 2000). 리포테이코산 (LTA)은 점점 더 LPS의 그람-양성 대응물로서 간주된다. 그것은 단핵 식균 세포 및 전혈로부터 사이토카인 방출을 유도하는 강력한 면역자극제이다 (Morath, S., et al., J. Exp. Med. 195:1635, 2002; Morath, S., et al., Infect. Immun. 70:938, 2002). 최근에는 L-피콜린이 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 포함한 많은 그람-양성 박테리아 종으로부터 분리된 LTA에 특이적으로 결합하여, 렉틴 경로를 활성화시킨다는 것이 입증되었다 (Lynch, N.J., et al., J. Immunol. 172:1198-02, 2004). MBL은 또한 폴리글리세로포스페이트 사슬이 글리코실 기로 치환된 엔테로코쿠스 종(Enterococcus spp)의 LTA에 결합하지만, 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)를 포함한 그 밖의 9개의 종의 LTA에는 결합하지 않는다 (Polotsky, V.Y., et al., Infect. Immun. 64:380, 1996).

따라서 본 발명의 양태는 패혈증 또는 제한되는 것이 아니라, 패혈증으로부터 발생한 중증 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡 곤란 증후군, 및 전신성 염증 반응 증후군을 포함하는, 패혈증으로부터 발생한 질병을 앓고 있는 대상체에게 약학적 담체 중의 MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 투여함으로써, 패혈증 또는 패혈증으로부터 발생한 질병을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 약학적 담체 중의 MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을, 출혈성 쇼크, 용혈성 빈혈증, 자가면역 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP), 용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 또는 그 밖의 골수/혈액 파괴 질병을 포함하는, 그 밖의 혈액 장애를 앓고 있는 대상체에게 투여함으로써 이러한 질병을 포함하는, 그 밖의 혈액 장애의 치료를 위한 관련 방법이 제공된다. MASP-2 억제제는 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 흡입 (특히 ARDS의 경우에), 피하 또는 그 밖의 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비-펩타이드성 작용제에 대한 경구 투여에 의해 투여된다. MASP-2 억제제 조성물은 패혈증 및/또는 쇼크의 후유증을 방지하기 위해 하나 이상의 추가적인 치료제와 조합될 수도 있다. 진행된 패혈증 또는 쇼크 또는 그것들로부터 초래된 조난 상태에 대하여, MASP-2 억제 조성물은 적합하게는 속효성 투약 형태로, 예컨대 MASP-2 억제제 조성물을 함유하는 용액의 볼루스(bolus)의 정맥 내 또는 동맥 내 전달에 의해 투여될 수도 있다. 질병이 해소될 때까지 의사가 결정한 대로 반복된 투여가 수행될 수도 있다.

응고장애

파종성 혈관 내 응고 ("DIC"), 예컨대 중대한 신체적 외상에 부차적인 DIC에서 보체 시스템의 역할에 대한 증거가 개발되었다.

이전의 연구는 C4-/- 마우스가 신장 재관류 손상으로부터 보호되지 않았다는 것을 보여주었다 (Zhou, W., et al, "Predominant role for C5b-9 in renal ischemia/reperfusion injury," J Clin Invest 105:1363-1371 (2000)).C4-/- 마우스가 고전적 또는 렉틴 경로를 통해 보체를 활성화시킬 수도 있는지를 조사하기 위해서, C4-/- 혈장에서 C3 턴오버(turn-over)가 고전적, 또는 렉틴 경로 활성화 경로에 특이적인 검정으로 측정되었다. 고전적 경로를 통해 활성화를 야기할 때 C3 분열은 관찰되지 않은 한편, C4 결핍 혈청에서는 C3의 고도로 효율적인 렉틴 경로-의존적 활성화가 관찰되었다 (도 30). 만난 및 치모산 상의 C3b 침착은 실험 조건 하에서 MASP-2-/- 마우스에서 심각하게 손상된다는 것을 알 수 있으며, 대체 경로 활성화에 대하여 이전에 공개된 많은 문서에 따르면, 세 가지 경로 모두에 대하여 허용되어야 한다. 만난 또는 치모산 대신에 면역글로불린 복합체로 코팅된 웰에서 같은 혈청을 사용할 때, MASP-2+/+ 마우스 혈청 및 MASP-2-/- 혈청에서는 C3b 침착 및 인자 B 분열이 나타나지만, C1q 고갈된 혈청에서는 나타나지 않는다. 이것은 초기 C3b가 고전적 활성을 통해 제공될 때 MASP-2-/- 혈청에서 대체 경로 활성화가 촉진된다는 것을 나타낸다. 도 30C는 C3이 C4 결핍 혈장에서 렉틴 경로-의존적 방식으로 효과적으로 활성화될 수 있다는 놀라운 결과를 도시한다.

이 "C4 바이패스"는 가용성 만난 또는 만노스와 함께 혈장의 사전 인큐베이션을 통한 렉틴 경로-활성화의 억제에 의해 폐지된다.

보체 시스템의 일탈적인, 비-면역 활성화는 인간에게 잠재적으로 위험하고 또한 혈액학적 경로 활성화에서, 특히 염증 및 혈액학적 경로가 둘 다 활성화된 중증 외상 상황에서 중요한 역할을 할 수도 있다. 정상적인 건강 상태에서, C3 전환은 총 혈장 C3 단백질의 <5%이다. 패혈증 및 면역 복합체 질환을 포함한 만연한 감염에서, C3 전환은 증가된 이용률 및 풀(pool) 분포의 변화로 인해, 보체 수준이 정상 상태보다 빈번하게 더 낮은 약 30%에서 그 자체를 재정립한다. 30%를 초과한 즉각적인 C3 경로 활성화는 일반적으로 혈관 확장(vasodilatation) 및 조직에 대한 유체 손실의 명백한 임상적 증거를 생성한다. 30% 초과의 C3 전환시, 개시하는 메커니즘은 대부분 비-면역성이고 결과로 생성된 임상적 징후는 환자에게 해롭다. 건강 상태 및 제어된 질환에서 보체 C5 수준은 C3보다 훨씬 더 안정한 것으로 나타난다. C5 수준의 큰 감소 및/또는 전환은 비정상적인 다발 외상 (예를 들어, 도로 교통 사고) 및 쇼크 폐 증후군의 가능한 발병에 대한 환자의 반응과 연관성이 있다. 따라서, 혈관 풀의 30%를 넘어선 보체 C3 활성화 또는 임의의 C5 포함, 또는 둘 다의 임의의 증거는 환자에서 해로운 생리학적 변화의 조짐일 가능성이 큰 것으로 간주될 수도 있다.

C3 및 C5는 둘 다 혈관 확장 화학물질을 방출하는 비만 세포 및 호염기구에 작용하는 아나필라톡신 (C3a 및 C5a)을 유리시킨다. 그것들은 다형핵 세포 (PMN)를 면역학적 장애(immunological disturbance) (유익한 반응)의 중심으로 유도하기 위해 화학주성 구배를 설정하였지 만, 본원에서는 C5a가 이들 대식 세포에 대한 특이적 군집 (응집) 효과를 가져서, 반응 부위로부터의 무작위적인 움직임을 방지하기 때문에 차이가 있다. 감염의 정상 대조군에서, C3는 C5를 활성화시킨다. 하지만, 다발 외상에서, C5는 널리 활성화되어 전신에 C5a 아나필라톡신을 생성하는 것으로 나타난다. 이 제어되지 않은 활성은 다형체가 혈관계 내에서 군집을 형성하게 한 다음, 이 군집은 폐의 모세혈관으로 휩쓸려가며, 그것들은 폐색되고 과산화물 유리의 결과로서 국소적 손상 효과를 발생시킨다. 어떠한 이론에도 결부되지 않으면서, 메커니즘은 아마도 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)의 발병 기전에 중요하지만, 이 견해는 최근에 시험되고 있다. C3a 아나필라톡신은 시험관 내에서 강력한 혈소판 응집체인 것으로 볼 수 있지만, 생체 내에서 그것들의 포함은 덜 한정되고 상처 회복에서 혈소판 물질 및 플라스민의 방출은 2차적으로만 보체 C3를 포함할 수도 있다. C3 활성화의 연장된 증가가 DIC를 생성하는데 필요할 가능성이 있다.

외상 및 DIC 간의 관계를 설명할 수 있는, 상기 개요가 서술된 활성화된 보체 성분의 세포 및 혈관 효과에 더하여, 최근 생겨난 과학적 발견은 보체 및 응고 시스템 간의 직접적인 분자적 관계 및 기능적 상호간섭을 식별하였다. 지원 데이터는 C3 결핍 마우스에서의 연구로부터 얻어졌다. C3가 각각의 보체 경로에 대하여 공유되는 성분이기 때문에, C3 결핍 마우스는 모든 보체 기능이 없을 것으로 예측된다. 하지만, 놀랍게도, C3 결핍 마우스는 말단 보체 성분을 완전하게 활성화시킬 수 있다 (Huber-Lang, M., et al., "Generation of C5a in the absence of C3: a new complement activation pathway," Nat. Med 12:682-687 (2006)). 심도 있는 연구에서 말단 보체 성분의 C3-독립적 활성화는 응고 캐스케이드의 속도 제한 효소인 트롬빈에 의해 매개되는 것으로 나타났다 (Huber et al., 2006). 초기 보체 활성화 이후 트롬빈 활성화를 매개하는 분자 구성요소는 여전히 애매하다.

본 발명자는 보체 및 응고 캐스케이드 간의 상호간섭에 대한 분자적 기초인 것으로 생각되는 것을 설명하였고 두 시스템을 연결하는 중심 제어점으로서 MASP-2를 식별하였다. MASP-2의 기질 특이성으로의 생화학적 연구는 널리 공지된 C2 및 C4 보체 단백질에 더하여, 가능한 기질로서 프로트롬빈을 식별하였다. MASP-2는 기능적으로 관련된 부위에서 프로트롬빈을 특이적으로 분열시켜서, 응고 캐스케이드의 속도 제한 효소인 트롬빈을 생성한다 (Krarup, A., et al., "Simultaneous Activation of Complement and Coagulation by MBL-Associated Serine Protease 2," PLoS. ONE. 2:e623 (2007)). MASP-2-생성된 트롬빈은 한정된 재구성된 시험관 내 시스템에서 피브린 침착을 촉진할 수 있으며, MASP-2 분열의 기능적 관련성을 입증한다 (Krarup et al., 2007). 본원에서 하기 실시예에서 논의된 바와 같이, 본 발명자는 렉틴 경로 활성화 후 정상 설치류 혈청에서의 트롬빈 활성화를 문서화함으로써 이 발견의 생리학적 중요성을 더 확인하였고, 이 과정이 MASP-2 단클론성 항체를 중화시킴으로써 차단된다는 것을 입증하였다.

MASP-2는 렉틴 경로에서 보체 및 응고 시스템 둘 다의 활성화를 촉진할 수 있는 중심 분기점을 나타낼 수도 있다. 렉틴 경로 활성화는 많은 유형의 외상성 손상에 대한 생리학적 반응이기 때문에, 본 발명자는 동시의 전신성 염증 (보체 성분에 의해 매개됨) 및 파종성 응고 (응고 경로에 의해 매개됨)가 MASP-2가 두 경로 모두를 활성화시킬 수 있는 능력에 의해 설명될 수 있다고 생각한다. 이들 결과는 DIC 발병시 MASP-2의 역할 및 DIC를 치료하거나 예방하는데 있어서의 MASP-2 억제의 치료적 이점을 명확하게 제안한다. MASP-2는 보체 및 응고 시스템의 분자적 관련성을 제공할 수도 있고, 외상의 설정에서 일어나는 렉틴 경로의 활성화는 MASP-2-트롬빈 축을 통해 응고 시스템의 활성화를 직접적으로 개시하여, 외상 및 DIC 간의 기계적 관련성을 제공할 수 있다. 본 발명의 양태에 따르면, MASP-2의 억제는 렉틴 경로 활성화를 억제하고 아나필라톡신 C3a 및 C5a 둘 다의 생성을 감소시킬 것이다. C3 활성화의 장기적 증가가 DIC를 생산하는데 필요하다고 생각된다.

미소 순환 응고 (모세혈관 및 소혈관에서의 혈전)는 이러한 패혈성 쇼크의 설정에서 일어난다. 패혈성 쇼크에서 렉틴 경로의 역할이 확립되어 있으며, 실시예 17 및 도 18 및 19에서 기술된, 패혈증의 MASP-2 (-/-) 마우스 모델의 보호된 표현형에 의해 입증된 바와 같다. 게다가, 실시예 15 및 도 16A 및 16B에서 입증된 바와 같이, MASP-2 (-/-) 마우스는 미세혈관의 국소화된 응고의 모델인 파종성 혈관 내 응고 (DIC)의 국소화된 슈와츠만 반응 모델에서 보호된다.

V. MASP-2 억제제

한 양태에서, 본 발명은 혈전성 미세혈관증을 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공한다. MASP-2 억제제는 살아있는 대상체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양으로 투여된다. 본 발명의 이 양태를 실행시, 대표적인 MASP-2 억제제는 MASP-2의 생물학적 활성을 억제하는 분자 (예컨대, 소분자 억제자, 항-MASP-2 항체 또는 MASP-2와 상호작용하거나 또는 단백질-단백질 상호작용을 방해하는 차단 펩타이드), 및 MASP-2의 발현을 감소시키는 분자 (예컨대, MASP-2 안티센스(antisense) 핵산 분자, MASP-2 특이적 RNAi 분자 및 MASP-2 리보자임)를 포함하며, 이로 인해 MASP-2가 렉틴 보체 경로를 활성화시키는 것을 방지한다. MASP-2 억제제는 1차 요법으로서 단독으로 또는 보조 요법으로서 그 밖의 치료제와 조합하여 사용되어 그 밖의 의학적 처리의 치료적 이점을 향상시킬 수 있다.

MASP-2-의존적 보체 활성화의 억제는 본 발명의 방법에 따라 MASP-2 억제제의 투여의 결과로서 일어나는 보체 시스템의 구성요소에서 다음 변화 중 적어도 하나를 특징으로 한다: MASP-2-의존적 보체 활성화 시스템 생성물 C4b, C3a, C5a 및/또는 C5b-9 (MAC)의 생성 또는 생산의 억제 (예를 들어, 실시예 2에서 기술된 바와 같이 측정됨), 미감작 토끼 또는 기니피그 적혈구 세포를 사용하는 용혈 검정에서 평가된 보체 활성화의 감소 (예를 들어, 실시예 33에서 기술된 바와 같이 측정됨), C4 분열 및 C4b 침착의 감소 (예를 들어, 실시예 2에서 기술된 바와 같이 측정됨), 또는 C3 분열 및 C3b 침착의 감소 (예를 들어, 실시예 2에서 기술된 바와 같이 측정됨).

본 발명에 따르면, MASP-2-의존적 보체 활성화 시스템을 억제하는데 효과적인 MASP-2 억제제가 이용된다. 본 발명의 이 양태의 실행에 유용한 MASP-2 억제제는, 예를 들어, 항-MASP-2 항체 및 이것의 단편, MASP-2 억제 펩타이드, 소분자, MASP-2 가용성 수용체 및 발현 억제자를 포함한다. MASP-2 억제제는 MASP-2의 생물학적 기능을 차단함으로써 MASP-2-의존적 보체 활성화 시스템을 억제할 수도 있다. 예를 들어, 억제제는 효과적으로 MASP-2 단백질-대-단백질 상호작용을 차단하고, MASP-2 다이머화 또는 조립을 방해하고, Ca²⁺ 결합을 차단하고, MASP-2 세린 프로테아제 활성 부위를 방해할 수도 있거나, 또는 MASP-2 단백질 발현을 감소시킬 수도 있다.

일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 보체 활성화를 선택적으로 억제하여, C1q-의존적 보체 활성화 시스템을 기능적으로 온전하게 남겨둔다.

한 구체예에서, 본 발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제제는 보체 시스템의 그 밖의 항원보다 적어도 10배 더 높은 친화도로 서열 번호:6을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 특이적 MASP-2 억제제이다. 또 다른 구체예에서, MASP-2 억제제는 보체 시스템의 그 밖의 항원보다 적어도 100배 더 높은 결합 친화도로 서열 번호:6을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. MASP-2 억제제의 결합 친화도는 적합한 결합 검정을 사용하여 결정될 수 있다.

MASP-2 폴리펩타이드는 C1 보체 시스템의 프로테아제인 MASP-1, MASP-3, 및 C1r 및 C1s와 유사한 분자 구조를 나타낸다. 서열 번호:4에서 제시된 cDNA 분자는 MASP-2 (서열 번호:5에서 제시된 아미노산 서열로 구성됨)의 대표적인 예를 암호화하고 분비 후 분열되는 선도 서열 (aa 1-15)을 가진 인간 MASP-2 폴리펩타이드를 제공하며, 성숙한 형태의 인간 MASP-2 (서열 번호:6)를 발생시킨다. 도 2에서 도시된 바와 같이, 인간 MASP 2 유전자는 12개의 엑손을 포함한다. 인간 MASP-2 cDNA는 엑손 B, C, D, F, G, H, I, J, K 및 L에 의해 암호화된다. 대안의 스플라이스(splice)는 도 2에서 도시된 바와 같이 MBL-관련 단백질 19 ("MAp19", "sMAP"로도 불림) (서열 번호:2)로 불리고, 엑손 B, C, D 및 E로부터 발생한 (서열 번호:1)에 의해 암호화된 20 kDa 단백질을 발생시킨다. 서열 번호:50에서 제시된 cDNA 분자는 쥐 MASP-2 (서열 번호:51에서 제시된 아미노산 서열로 구성됨)를 암호화하고 분비 후 분열되는 선도 서열을 가진 쥐 MASP-2 폴리펩타이드를 제공하며, 성숙한 형태의 쥐 MASP-2 (서열 번호:52)를 발생시킨다. 서열 번호:53에서 제시된 cDNA 분자는 래트 MASP-2 (서열 번호:54에서 제시된 아미노산 서열로 구성됨)를 암호화하고, 분비 후 분열되는 선도 서열을 가진 래트 MASP-2 폴리펩타이드를 제공하며, 성숙한 형태의 래트 MASP-2 (서열 번호:55)를 발생시킨다.

당업자는 서열 번호:4, 서열 번호:50 및 서열 번호:53에서 개시된 서열이 각각 인간, 쥐 및 래트 MASP-2의 단일 대립 유전자를 나타내고, 대립 유전자 변이 및 대안의 스플라이싱(splicing)이 일어날 것으로 예상된다는 것을 인식할 것이다. 침묵(silent) 돌연변이를 포함하는 것과 돌연변이가 아미노산 서열 변화를 초래하는 것을 포함한, 서열 번호:4, 서열 번호:50 및 서열 번호:53에서 나타난 뉴클레오타이드 서열의 대립 유전자 변종은 본 발명의 범위 내에 있다. MASP-2 서열의 대립 유전자 변종은 표준 과정에 따라 상이한 개체의 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 탐침함으로써 클로닝될 수 있다.

인간 MASP-2 단백질의 도메인 (서열 번호:6)은 도 1 및 도 2A에서 나타나고 N-말단 C1r/C1s/성게 Vegf/골 형성 단백질 (CUBI) 도메인 (서열 번호:6의 aa 1-121), 표피 성장 인자-유사 도메인 (aa 122-166), 제2 CUBI 도메인 (aa 167-293), 뿐만 아니라 보체 제어 단백질 도메인 및 세린 프로테아제 도메인의 탠덤을 포함한다. MASP 2 유전자의 대안의 스플라이싱은 도 1에서 나타난 MAp19를 발생시킨다. MAp19는 도 1에서 나타난 바와 같이 엑손 E로부터 유래된 네 개의 추가적인 잔기 (EQSL)를 가진 MASP-2의 N-말단 CUB1-EGF 영역을 포함하는 비효소 단백질이다.

여러 단백질이 MASP-2에 결합하거나, 또는 단백질-대-단백질 상호작용을 통해 이것과 상호작용하는 것으로 나타났다. 예를 들어, MASP-2는 렉틴 단백질 MBL, H-피콜린 및 L-피콜린에 결합하여, 이것들과 Ca²⁺ 의존성 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있다. 각각의 MASP-2/렉틴 복합체는 단백질 C4 및 C2의 MASP-2-의존적 분열을 통해 보체를 활성화시키는 것으로 나타났다 (Ikeda, K., et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M., et al., J. Exp. Med. 176:1497-2284, 2000; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502-3506, 2002). 연구는 MASP-2의 CUB1-EGF 도메인이 MASP-2와 MBL의 회합에 필수적이라는 것을 보여주었다 (Thielens, N.M., et al., J. Immunol. 166:5068, 2001). 또한 CUB1EGFCUBII 도메인이 MASP-2의 다이머화를 매개하며, 이것은 활성 MBL 복합체의 형성에 필요한 것으로 나타났다 (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 275:30962-30969, 2000). 그러므로, MASP-2-의존적 보체 활성화에 중요한 것으로 알려져 있는 MASP-2 표적 영역에 결합하거나 또는 이것을 방해하는 MASP-2 억제제가 식별될 수 있다.

항-MASP-2 항체

본 발명의 이 양태의 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2-의존적 보체 활성화 시스템을 억제하는 항-MASP-2 항체를 포함한다. 본 발명의 이 양태에 유용한 항-MASP-2 항체는 임의의 항체 생산 포유동물로부터 유래된 다클론성, 단클론성 또는 재조합 항체를 포함하고 다중특이적, 키메라, 인간화, 항-이디오타입, 및 항체 단편일 수도 있다. 항체 단편은 본원에서 추가로 기술된 바와 같이 Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')₂, Fv 단편, scFv 단편 및 단일 사슬 항체를 포함한다.

여러 항-MASP-2 항체가 문헌에 기술되어 있으며, 이것들 중 일부가 하기 표 1에서 나열된다. 앞서 기술된 이들 항-MASP-2 항체는 본원에서 기술된 검정을 사용하여 MASP-2-의존적 보체 활성화 시스템을 억제하는 능력에 대하여 스크리닝될 수 있다. 본원에서 실시예 10 및 11에서 더 상세히 기술된 바와 같이, 예를 들어, MASP-2 의존성 보체 활성화를 차단하는 항 래트 MASP-2 Fab2 항체가 식별되었다. MASP-2 억제제로서 기능하는 항-MASP-2 항체가 식별되면, 항-이디오타입 항체를 생산하는데 사용될 수 있고 하기 추가로 기술된 그 밖의 MASP-2 결합 분자를 식별하는데 사용될 수 있다.

문헌의 MASP-2 특이적 항체

항원	항체 유형	참고문헌
재조합 MASP-2	래트 다클론성	Peterson, S.V., et al., Mol. Immunol. 37:803-811, 2000
재조합 인간 CCP1/2-SP 단편 (MoAb 8B5)	래트 MoAb (하위 분류 IgG1)	Moller-Kristensen, M., et al., J. of Immunol. Methods 282:159-167, 2003
재조합 인간 MAp19 (MoAb 6G12) (MASP-2와 교차 반응함)	래트 MoAb (하위 분류 IgG1)	Moller-Kristensen, M., et al., J. of Immunol. Methods 282:159-167, 2003
hMASP-2	마우스 MoAb (S/P) 마우스 MoAb (N-말단)	Peterson, S.V., et al., Mol. Immunol. 35:409, April 1998
hMASP-2 (CCP1-CCP2-SP 도메인	래트 MoAb: 하이브리도마 세포주 03050904 (ECACC)에 의해 생산된 Nimoab101	WO 2004/106384
hMASP-2 (전장-his 태그됨)	쥐 MoAb: 하이브리도마 세포주 M0545YM035 (DSMZ)에 의해 생산된 NimoAb104 하이브리도마 세포주 M0545YM029 (DSMZ)에 의해 생산된 NimoAb108 하이브리도마 세포주 M0545YM046 (DSMZ)에 의해 생산된 NimoAb109 하이브리도마 세포주 M0545YM048 (DSMZ)에 의해 생산된 NimoAb110	WO 2004/106384

감소된 효과기 기능을 가진 항-MASP-2 항체

본 발명의 이 양태의 일부 구체예에서, 항-MASP-2 항체는 고전적 보체 경로의 활성화로부터 발생할 수도 있는 염증을 감소시키기 위해 감소된 효과기 기능을 갖는다. IgG 분자가 고전적 보체 경로를 야기할 수 있는 능력은 분자의 Fc 부분 내에 존재하는 것으로 나타났다 (Duncan, A.R., et al., Nature 332:738-740 1988). 분자의 Fc 부분이 효소적 분열에 의해 제거된 IgG 분자는 이 효과기 기능이 없다 (Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988 참조). 따라서, 감소된 효과기 기능을 가진 항체는 효과기 기능을 최소화하거나 인간 IgG₂ 또는 IgG₄ 아이소타입 중 어느 것인 유전적으로 조작된 Fc 서열을 가짐으로써 분자의 Fc 부분의 결핍의 결과로서 생성될 수 있다.

감소된 효과기 기능을 가진 항체는 본원에서 실시예 9에서 기술된 바와 같이 IgG 중쇄의 Fc 부분의 표준 분자 생물학적 조작에 의해 생산될 수 있고 또한 Jolliffe et al., Int'l Rev. Immunol. 10:241-250, 1993, 및 Rodrigues et al., J. Immunol. 151:6954-6961, 1998에서 기술되어 있다. 감소된 효과기 기능을 가진 항체는 또한 보체를 활성화시키고 및/또는 Fc 수용체와 상호작용하는 능력이 감소된 인간 IgG2 및 IgG4 아이소타입을 포함한다 (Ravetch, J.V., et al., Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, 1991; Isaacs, J.D., et al., J. Immunol. 148:3062-3071, 1992; van de Winkel, J.G., et al., Immunol. Today 14:215-221, 1993). IgG2 또는 IgG4 아이소타입으로 구성된 인간 MASP-2에 특이적인 인간화 또는 완전한 인간 항체는 당업자에게 공지된 여러 방법 중 하나에 의해 생산될 수 있으며, Vaughan, T.J., et al., Nature Biotechnical 16:535-539, 1998에서 기술된 바와 같다.

항-MASP-2 항체의 생산

항-MASP-2 항체는 MASP-2 폴리펩타이드 (예를 들어, 전장 MASP-2)를 사용하여 또는 항원성 MASP-2 에피토프-함유 펩타이드 (예를 들어, MASP-2 폴리펩타이드의 일부)를 사용하여 생산될 수 있다. 면역원성 펩타이드는 5개의 아미노산 잔기만큼 작을 수도 있다. 예를 들어, 서열 번호:6의 전체 아미노산 서열을 포함하는 MASP-2 폴리펩타이드는 본 발명의 방법에 유용한 항-MASP-2 항체를 유도하는데 사용될 수도 있다. 단백질-단백질 상호작용에 포함된 것으로 공지되어 있는 특정 MASP-2 도메인, 예컨대 CUBI, 및 CUBIEGF 도메인, 뿐만 아니라 세린-프로테아제 활성 부위를 포함하는 영역은 실시예 3에서 기술된 바와 같이 재조합 폴리펩타이드로서 발현되고 항원으로서 사용될 수도 있다. 이에 더하여, MASP-2 폴리펩타이드 (서열 번호:6)의 적어도 6개의 아미노산의 일부를 포함하는 펩타이드는 또한 MASP-2 항체를 유도하는데 유용하다. MASP-2 항체를 유도하는데 유용한 MASP-2 유래 항원의 추가적인 예는 하기 표 2에서 제공된다. 항체를 발생시키는데 사용된 MASP-2 펩타이드 및 폴리펩타이드는 천연 폴리펩타이드, 또는 재조합 또는 합성 펩타이드 및 촉매 비활성 재조합 폴리펩타이드, 예컨대 MASP-2A로서 분리될 수도 있으며, 실시예 5-7에서 추가로 기술된 바와 같다. 본 발명의 이 양태의 일부 구체예에서, 항-MASP-2 항체는 실시예 8 및 9에서 기술되고 하기 추가로 기술된 바와 같이 트랜스제닉 마우스 계통을 사용하여 얻어진다.

항-MASP-2 항체를 생산하는데 유용한 항원은 또한 융합 폴리펩타이드, 예컨대 MASP-2 또는 이것의 일부와 면역글로불린 폴리펩타이드 또는 말토스-결합 단백질의 융합체를 포함한다. 폴리펩타이드 면역원은 전장 분자 또는 이것의 일부일 수도 있다. 폴리펩타이드 일부가 합텐-유사한 경우, 이러한 일부는 유리하게는 면역화를 위해 고분자 담체 (예컨대, 키홀 림펫 헤모사이아닌 (keyhole limpet hemocyanin; KLH), 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid))에 결합되거나 연결될 수도 있다.

MASP-2 유래 항원

서열 번호:	아미노산 서열
서열 번호:6	인간 MASP-2 단백질
서열 번호:51	쥐 MASP-2 단백질
서열 번호:8	인간 MASP-2의 CUBI 도메인 (서열 번호:6의 aa 1-121)
서열 번호:9	인간 MASP-2의 CUBIEGF 도메인 (서열 번호:6의 aa 1-166)
서열 번호:10	인간 MASP-2의 CUBIEGFCUBII 도메인 (서열 번호:6의 aa 1-293)
서열 번호:11	인간 MASP-2의 EGF 도메인 (서열 번호:6의 aa 122-166)
서열 번호:12	인간 MASP-2의 세린-프로테아제 도메인 (서열 번호:6의 aa 429-671)
서열 번호:13 GKDSCRGDAGGALVFL	세린-프로테아제 inactivated 돌연변이 form (돌연변이된 Ser 618을 가진 서열 번호:6의 aa 610-625)
서열 번호:14 TPLGPKWPEPVFGRL	인간 CUBI 펩타이드
서열 번호:15: TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLCGQ	인간 CUBI 펩타이드
서열 번호:16: TFRSDYSN	인간 CUBI 도메인의 MBL 결합 영역
서열 번호:17: FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF	인간 CUBI 도메인의 MBL 결합 영역
서열 번호:18 IDECQVAPG	EGF 펩타이드
서열 번호:19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV	세린-프로테아제 활성 부위의 펩타이드

다클론성 항체

MASP-2에 대한 다클론성 항체는 당업자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 MASP-2 폴리펩타이드 또는 이것의 면역원성 부분으로 동물을 면역화함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, Green et al., "Production of Polyclonal Antisera," in Immunochemical Protocols (Manson, ed.), page 105를 참조하면 되고, 실시예 6에서 추가로 기술된 바와 같다. MASP-2 폴리펩타이드의 면역원성은 미네랄 겔, 예컨대 알루미늄 하이드록사이드 또는 프로인트 보조제(Freund's adjuvant) (완전 또는 불완전), 표면 활성 물질, 예컨대 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다음이온, 유성 에멀젼, 키홀 림펫 헤모사이아닌 및 디나이트로페놀을 포함하는 보조제의 사용을 통해 증가될 수 있다. 다클론성 항체는 전형적으로 말, 소, 개, 닭, 래트, 마우스, 토끼, 기니피그, 염소, 또는 양과 같은 동물에서 발생된다. 대안으로, 본 발명에 유용한 항-MASP-2 항체는 또한 인간 이하의 영장류로부터 유래될 수도 있다. 개코 원숭이에서 진단적으로 및 치료적으로 유용한 항체를 발생시키기 위한 일반적인 기술은, 예를 들어, Goldenberg et al., 국제 특허 출원 번호 WO 91/11465, 및 Losman, M.J., et al., Int. J. Cancer 46:310, 1990에서 발견될 수도 있다. 그 다음에 면역학적으로 활성인 항체를 포함하는 혈청은 업계에 공지된 표준 과정을 사용하여 이와 같이 면역화된 동물의 혈액으로부터 생산된다.

단클론성 항체

일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 단클론성 항체이다. 항-MASP-2 단클론성 항체는 매우 특이적이며, 단일 MASP-2 에피토프에 대한 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로는 균질한 코호트으로부터 얻어지는 것으로서 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 단클론성 항체는 배양 중인 무한 증식 세포주에 의해 항체 분자의 생산을 제공하는 임의의 기술, 예컨대 Kohler, G., et al., Nature 256:495, 1975에 의해 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 얻어질 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수도 있다 (예를 들어, Cabilly의 미국 특허 번호 4,816,567 참조). 단클론성 항체는 또한 Clackson, T., et al., Nature 352:624-628, 1991, 및 Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991에서 기술된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수도 있다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 이것들의 임의의 하위 분류를 포함하는 임의의 면역글로불린 분류의 것일 수 있다.

예를 들어, 단클론성 항체는 적합한 포유동물 (예를 들어, BALB/c 마우스)에 MASP-2 폴리펩타이드 또는 이것의 일부를 포함하는 조성물을 주사하여 얻어질 수 있다. 사전 결정된 기간 이후, 비장세포는 마우스로부터 제거되어 세포 배양 배지에 현탁된다. 그 다음에 비장세포는 불멸의 세포주와 융합되어 하이브리도마를 형성한다. 형성된 하이브리도마는 세포 배양에서 성장하고 MASP-2에 대한 단클론성 항체를 생산하는 능력에 대하여 스크리닝된다. 항-MASP-2 단클론성 항체의 생산을 추가로 기술하는 예는 실시예 7에서 제공된다 (또한 Current Protocols in Immunology, Vol. 1., John Wiley & Sons, pages 2.5.1-2.6.7, 1991. 참조)

인간 단클론성 항체는 항원성 검사에 반응하여 특이적 인간 항체를 생산하도록 조작된 트랜스제닉 마우스의 사용을 통해 얻어질 수도 있다. 이 기술에서, 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 요소가 내인성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 표적화된 파괴를 포함하는 배아 줄기 세포주로부터 유래된 마우스 계통으로 도입된다. 트랜스제닉 마우스는 인간 항원, 예컨대 본원에서 기술된 MASP-2 항원에 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있고, 마우스는 실시예 7에서 추가로 기술된 통상적인 쾰러-밀스타인(Kohler-Milstein) 기술을 사용하여 이러한 동물의 B-세포를 적합한 골수종(myeloma) 세포주에 융합시킴으로써 인간 MASP-2 항체-분비 하이브리도마를 생산하는데 사용될 수 있다. 인간 면역글로불린 게놈을 가진 트랜스제닉 마우스는 상업적으로 입수 가능하다 (예를 들어, 캘리포니아 퍼몬트의 Abgenix, Inc., 및 뉴저지 애넌데일의 Medarex, Inc.). 트랜스제닉 마우스로부터 인간 항체를 얻기 위한 방법은, 예를 들어, Green, L.L., et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg, N., et al., Nature 368:856, 1994; 및 Taylor, L.D., et al., Int. Immun. 6 :579, 1994에 의해 기술되어 있다.

단클론성 항체는 다양한 잘 확립된 기술에 의해 하이브리도마 배양물로부터 분리되고 정제될 수 있다. 이러한 분리 기술은 단백질-A 세파로스를 이용한 친화도 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 및 이온-교환 크로마토그래피를 포함한다 (예를 들어, Coligan at pages 2.7.1-2.7.12 및 pages 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", in Methods in Molecular Biology, The Humana Press, Inc., Vol. 10, pages 79-104, 1992 참조).

생산되면, 다클론성, 단클론성 또는 파지-유래 항체는 먼저 특이적 MASP-2 결합에 대하여 테스트된다. 당업자에게 공지되어 있는 다양한 검정이 MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체를 검출하는데 사용될 수도 있다. 예시적 검정은 표준 기술에 의한 웨스턴 블롯 또는 면역 침강 분석 (예를 들어, Ausubel, 등에서 기술됨), 면역전기영동법, 효소-결합 면역-흡착 검정, 도트 블롯, 억제 또는 경합 검정 및 샌드위치(sandwich) 검정 (Harlow and Land, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988에서 기술됨)을 포함한다. MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체가 식별되면, 항-MASP-2 항체는 여러 검정들, 예를 들어, 렉틴-특이적 C4 분열 검정 (실시예 2에서 기술됨), C3b 침착 검정 (실시예 2에서 기술됨) 또는 C4b 침착 검정 (실시예 2에서 기술됨) 중 하나에서 MASP-2 억제제로서 기능하는 능력에 대하여 테스트된다.

항-MASP-2 단클론성 항체의 친화도는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다 (예를 들어, Scatchard, A., NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949 참조). 한 구체예에서, 본 발명의 방법에 유용한 항-MASP-2 단클론성 항체는 <100 nM, 바람직하게는 <10 nM 및 가장 바람직하게는 <2 nM의 결합 친화도로 MASP-2에 결합한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제 단클론성 항체는 MASP-2 억제 단클론성 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편이며, (I) (a) i) 서열 번호:67의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) 서열 번호:67의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) 서열 번호:67의 95-102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 b) i) 서열 번호:70의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) 서열 번호:70의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) 서열 번호:70의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) 서열 번호:67에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:67에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:70에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 경쇄 가변 영역을 포함하는 이것의 변종을 포함한다.

키메라/인간화 항체

본 발명의 방법에 유용한 단클론성 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 또는 특정 항체 분류 또는 하위 분류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 이것과 상동성인 한편, 나머지 사슬(들)은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또는 또 다른 항체 분류 또는 하위 분류에 속하는 항체, 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편과 동일하거나 또는 이것과 상동성인 키메라 항체를 포함한다 (Cabilly의 미국 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison, S.L., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984).

본 발명에서 유용한 키메라 항체의 한 형태는 인간화 단클론성 항-MASP-2 항체이다. 비-인간 (예를 들어, 쥐) 항체의 인간화 형태는 키메라 항체이며, 이것은 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함한다. 인간화 단클론성 항체는 비-인간 (예를 들어, 마우스) 상보성 결정 영역 (CDR)을 마우스 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변 사슬로부터 인간 가변 도메인으로 옮김으로써 생산된다. 전형적으로, 인간 항체의 잔기는 비-인간 대응물의 프레임워크 영역에서 치환된다. 게다가, 인간화 항체는 수령체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더 개량하기 위해서 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 모든, 적어도 하나, 및 전형적으로는 두 개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 이것에서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 Fv 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 선택적으로 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 더 상세한 설명을 위해서는, Jones, P.T., et al., Nature 321:522-525, 1986; Reichmann, L., et al., Nature 332:323-329, 1988; 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992를 참고하면 된다.

본 발명에서 유용한 인간화 항체는 적어도 MASP-2 결합 CDR3 영역을 포함하는 인간 단클론성 항체를 포함한다. 이에 더하여, Fc 부분은 IgA 또는 IgM, 뿐만 아니라 인간 IgG 항체를 생산하기 위해 대체될 수도 있다. 이러한 인간화 항체는 인간 MASP-2를 특이적으로 인식하지만 인간에서 항체 그 자체에 대한 면역 반응을 유발하지 않기 때문에 특별한 임상적 유용성을 가질 것이다. 그 결과, 그것들은, 특히 반복되거나 또는 장기간 투여가 필요할 때, 인간에서의 생체 내 투여에 더 적합하다.

쥐 항-MASP-2 단클론성 항체로부터 인간화 항-MASP-2 항체의 생성의 예는 본원에서 실시예 6에서 제공된다. 인간화 단클론성 항체를 생산하기 위한 기술은 또한, 예를 들어, Jones, P.T., et al., Nature 321:522, 1986; Carter, P., et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:4285, 1992; Sandhu, J.S., Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992; Singer, I.I., et al., J. Immun. 150:2844, 1993; Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc., 1995; Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies," in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc., pages 399-434, 1996; 및 1997년 Queen의 미국 특허 번호 5,693,762에 의해 기술되어 있다. 이에 더하여, 특이적 쥐 항체 영역으로부터 인간화 항체를 합성하는 상업적 실체, 예컨대 Protein Design Labs (캘리포니아 마운틴 뷰)이 존재한다.

재조합 항체

항-MASP-2 항체는 또한 재조합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 인간 항체는 인간 항체의 단편 (V_H, V_L, Fv, Fd, Fab 또는 F(ab')₂)을 생산하기 위해 인간 면역글로불린 발현 라이브러리 (예를 들어, 캘리포니아 라 졸라의 Stratagene, Corp.으로부터 입수 가능함)를 사용하여 제조될 수 있다. 이들 단편은 키메라 항체를 생산하기 위한 것들과 유사한 기술을 사용하여 전체 인간 항체를 구성하는데 사용된다.

항-이디오타입 항체

원하는 억제 활성을 가진 항-MASP-2 항체가 식별되면, 이들 항체는 업계에 널리 공지된 기술을 사용하여 MASP-2의 일부와 유사한 항-이디오타입 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, Greenspan, N.S., et al., FASEB J. 7:437, 1993 참조. 예를 들어, MASP-2에 결합하여 보체 활성화에 필요한 MASP-2 단백질 상호작용을 경합적으로 억제하는 항체는 MASP-2 단백질 상의 MBL 결합 부위와 유사하며 그러므로 MASP-2의 결합 리간드, 예를 들어, MBL에 결합하여 이것을 중화시키는 항-이디오타입을 생성하는데 사용될 수 있다.

면역글로불린 단편

본 발명의 방법에서 유용한 MASP-2 억제제는 온전한 면역글로불린 분자, 뿐만 아니라 Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')₂ 및 Fv 단편, scFv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하는 널리 공지된 단편도 포함한다.

항체 분자의 작은 부분, 파라토프만이 에피토프로의 항체의 결합에 수반된다는 것은 업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, Clark, W.R., The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., NY, 1986 참조). 항체의 pFc' 및 Fc 영역은 고전적 보체 경로의 효과기이지만, 항원 결합에는 수반되지 않는다. pFc' 영역이 효소적으로 분열되거나, 또는 pFc' 영역 없이 생산된 항체는 F(ab')₂ 단편으로 지정되고 온전한 항체의 항원 결합 부위 둘 다를 보유한다. 분리된 F(ab')₂ 단편은 두 개의 항원 결합 부위 때문에 2가 단클론성 단편이라고 불린다. 마찬가지로, Fc 영역이 효소적으로 분열되거나, 또는 Fc 영역 없이 생산된 항체는 Fab 단편으로 지정되고, 온전한 항체 분자의 항원 결합 부위 중 하나를 보유한다.

항체 단편은 단백질 가수분해 가수분해, 예컨대 통상적인 방법에 의한 전체 항체의 펩신 또는 파파인 분해에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 펩신을 이용한 항체의 효소적 분열에 의해 생산되어 F(ab')₂로 표시된 5S 단편을 제공할 수 있다. 이 단편은 3.5S Fab' 1가 단편을 생산하기 위해 티올 환원제를 사용하여 더 분열될 수 있다. 선택적으로, 분열 반응은 이황화 결합의 분열로부터 발생한 설프하이드릴 기에 대한 차단기를 사용하여 수행될 수 있다. 대안으로서, 펩신을 사용한 효소적 분열은 직접적으로 두 개의 1가 Fab 단편 및 Fc 단편을 생산한다. 이들 방법은, 예를 들어, Goldenberg의 미국 특허 번호 4,331,647; Nisonoff, A., et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, R.R., Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman, et al., in Methods in Enzymology 1:422, Academic Press, 1967에 의해; 및 Coligan에 의해 2.8.1-2.8.10 및 2.10.-2.10.4 페이지에서 기술되어 있다.

일부 구체예에서, Fc 영역이 결핍된 항체 단편의 사용은 Fc를 Fcγ 수용체에 결합시킬 때 개시되는 고전적 보체 경로의 활성화를 방지하는데 바람직하다. Fcγ 수용체 상호작용을 방지하는 MoAb를 생산할 수 있는 여러 방법이 존재한다. 예를 들어, 단클론성 항체의 Fc 영역은 단백질 가수분해 효소적 부분적 분해 (예컨대, 피신 분해)를 사용하여 화학적으로 제거될 수 있으며, 이로 인해, 예를 들어, 항원-결합 항체 단편, 예컨대 Fab 또는 F(ab)₂ 단편을 생성한다 (Mariani, M., et al., Mol. Immunol. 28:69-71, 1991). 대안으로, Fcγ 수용체에 결합하지 않는 인간 γ4 IgG 아이소타입은 본원에서 기술된 바와 같이 인간화 항체의 구성 중에 사용될 수 있다. Fc 도메인이 결핍된 항체, 단일 사슬 항체 및 항원-결합 도메인은 또한 본원에서 기술된 재조합 기술을 사용하여 조작될 수 있다.

단일 사슬 항체 단편

대안으로, 중쇄 및 경쇄 Fv 영역이 연결된 MASP-2에 특이적인 단일 펩타이드 사슬 결합 분자를 생성할 수 있다. Fv 단편은 단일 사슬 항원 결합 단백질 (scFv)을 형성하기 위해 펩타이드 링커로 연결될 수도 있다. 이들 단일 사슬 항원 결합 단백질은 올리고뉴클레오타이드에 의해 연결된 V_H 및 V_L 도메인을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 구조 유전자를 구성함으로써 제조된다. 구조 유전자는 발현 벡터로 삽입되며, 그 후 대장균과 같은 숙주 세포로 도입된다. 재조합 숙주 세포는 두 개의 V 도메인을 연결하는 링커 펩타이드와 함께 단일 폴리펩타이드 사슬을 합성한다. scFv를 생산하기 위한 방법은, 예를 들어, Whitlow, et　al., "Methods: A Companion to Methods in Enzymology" 2:97, 1991; Bird, et　al., Science　242:423, 1988; Ladner의 미국 특허 번호　4,946,778; Pack, P., et　al., Bio/Technology　11:1271, 1993에 의해 기술되어 있다.

예시적인 예로서, MASP-2 특이적 scFv는 시험관 내에서 림프구를 MASP-2 폴리펩타이드에 노출시키고 파지 또는 유사한 벡터에서 항체 디스플레이 라이브러리를 선택함으로써 (예를 들어, 고정되거나 라벨링된 MASP-2 단백질 또는 펩타이드의 사용을 통해) 얻어질 수 있다. 잠재적 MASP-2 폴리펩타이드 결합 도메인을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는 파지 또는 박테리아, 예컨대 대장균 상에 디스플레이된 무작위 펩타이드 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 이들 무작위 펩타이드 디스플레이 라이브러리는 MASP-2와 상호작용하는 펩타이드에 대하여 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이러한 무작위 펩타이드 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는 기술은 업계에 널리 공지되어 있으며 (Lardner의 미국 특허 번호 5,223,409; Ladner의 미국 특허 번호 4,946,778; Ladner의 미국 특허 번호 5,403,484; Ladner의 미국 특허 번호 5,571,698; 및 Kay et　al., Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996) 무작위 펩타이드 디스플레이 라이브러리 및 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 키트는, 예를 들어, CLONTECH Laboratories, Inc. (캘리포니아 팔로 알토), Invitrogen Inc. (캘리포니아 샌 디에고), New England Biolabs, Inc. (매사츄세츠 베벌리), 및 Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (뉴저지 피스카타웨이)로부터 상업적으로 입수 가능하다.

본 발명의 이 양태에서 유용한 항-MASP-2 항체 단편의 또 다른 형태는 MASP-2 항원 상의 에피토프에 결합하여 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 단일 상보성-결정 영역 (CDR)을 암호화하는 펩타이드이다. CDR 펩타이드 ("최소 인식 유닛")는 관심있는 항체의 CDR을 암호화하는 유전자를 구성함으로써 얻어질 수 있다. 이러한 유전자는, 예를 들어, 항체-생산 세포의 RNA로부터 가변 영역을 합성하기 위해 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 제조된다 (예를 들어, Larrick et　al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology　2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et　al. (eds.), page 166, Cambridge University Press, 1995; 및 Ward　et　al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et　al. (eds.), page　137, Wiley-Liss, Inc., 1995 참조).

본원에서 기술된 MASP-2 항체는 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기 위해 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 고-친화도 인간 또는 인간화 단클론성 항-MASP-2 감소된 효과기 기능을 가진 항체이다.

펩타이드 억제자

본 발명의 이 양태의 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 분리된 천연 펩타이드 억제자 및 합성 펩타이드 억제자를 포함하는, MASP-2-의존적 보체 활성화 시스템을 억제하는 분리된 MASP-2 펩타이드 억제자를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "분리된 MASP-2 펩타이드 억제자"는 MASP-2에 결합하고, 렉틴 경로에서 또 다른 인식 분자 (예를 들어, MBL, H-피콜린, M-피콜린, 또는 L-피콜린)로의 결합에 대하여 MASP-2와 경합하고, 및/또는 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기 위해 MASP-2와 직접적으로 상호작용하여 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하며 실질적으로 순수하고 의도된 용도에 실용적이고 적절한 정도로 자연에서 발견될 수도 있는 그 밖의 물질이 본질적으로는 없는 펩타이드를 말한다.

펩타이드 억제자는 생체 내에서 단백질-단백질 상호작용 및 촉매 부위를 성공적으로 방해하는데 사용되었다. 예를 들어, LFA-1과 구조적으로 관련된 접착 분자에 대한 펩타이드 억제자는 최근에 응고장애에서의 임상적 사용에 대하여 승인되었다 (Ohman, E.M., et al., European Heart J. 16:50-55, 1995). 인테그린-의존적 접착을 방지하거나 이것을 방해하는 짧은 선형 펩타이드 (<30개 아미노산)가 기술되어 있다 (Murayama, O., et al., J. Biochem. 120:445-51, 1996). 길이가 25 내지 200개의 아미노산 잔기의 범위에 있는 더 긴 펩타이드가 또한 인테그린-의존적 접착을 성공적으로 차단하는데 사용되었다 (Zhang, L., et al., J. Biol. Chem. 271(47):29953-57, 1996). 일반적으로, 더 긴 펩타이드 억제자는 짧은 펩타이드보다 더 높은 친화도 및/또는 더 느린 오프-속도(off-rate)를 가지며 그러므로 더 강력한 억제자일 수도 있다. 환형 펩타이드 억제자는 또한 생체 내에서 인간 염증 질환의 치료에 효과적인 인테그린 억제자인 것으로 나타났다 (Jackson, D.Y., et al., J. Med. Chem. 40:3359-68, 1997). 환형 펩타이드를 생산하는 한 가지 방법은 펩타이드의 말단 아미노산이 시스테인이며, 이로 인해 펩타이드가 말단 아미노산 사이의 이황화 결합에 의해 환형 형태로 존재하게 하는 펩타이드의 합성을 포함하며, 이것은 조혈성 신생물의 치료를 위해 생체 내에서 친화도 및 반감기를 개선하는 것으로 나타났다 (예를 들어, Larson의 미국 특허 번호 6,649,592).

합성 MASP-2 펩타이드 억제자

본 발명의 이 양태의 방법에 유용한 MASP-2 억제 펩타이드는 MASP-2 기능에 중요한 표적 영역을 모방한 아미노산 서열로 예시된다. 본 발명의 방법의 실행에 유용한 억제 펩타이드는 크기가 약 5개의 아미노산 내지 약 300개의 아미노산의 범위에 있다. 표 3은 본 발명의 이 양태의 실행에 유용할 수도 있는 예시의 억제 펩타이드의 목록을 제공한다. 후보 MASP-2 억제 펩타이드는, 예를 들어, 렉틴 특이적 C4 분열 검정 (실시예 2에서 기술됨), 및 C3b 침착 검정 (실시예 2에서 기술됨)을 포함한 여러 검정 중 하나에서 MASP-2 억제제로서 기능하는 능력에 대하여 테스트될 수도 있다.

일부 구체예에서, MASP-2 억제 펩타이드는 MASP-2 폴리펩타이드로부터 유래되고 전장 성숙한 MASP-2 단백질 (서열 번호:6), 또는 MASP-2 단백질의 특정 도메인, 예를 들어, CUBI 도메인 (서열 번호:8), CUBIEGF 도메인 (서열 번호:9), EGF 도메인 (서열 번호:11), 및 세린 프로테아제 도메인 (서열 번호:12)으로부터 선택된다. 앞서 기술된 바와 같이, CUBEGFCUBII 영역은 다이머화 및 MBL과의 결합에 필요한 것으로 나타났다 (Thielens et al., supra). 특히, MASP-2의 CUBI 도메인에서 펩타이드 서열 TFRSDYN (서열 번호:16)은 Asp105에서 Gly105로의 동형 접합성 돌연변이를 가지고 있는 인간을 식별하는 연구에서 MBL로의 결합에 포함되는 것으로 나타났으며, MBL 복합체로부터 MASP-2의 손실을 초래한다 (Stengaard-Pedersen, K., et al., New England J. Med. 349:554-560, 2003).

일부 구체예에서, MASP-2 억제 펩타이드는 MASP-2에 결합하는 렉틴 단백질로부터 유래되고 렉틴 보체 경로에 포함된다. 만난-결합 렉틴 (MBL), L-피콜린, M-피콜린 및 H-피콜린을 포함하여, 이 경로에 포함된 여러 상이한 렉틴이 식별되었다 (Ikeda, K., et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M., et al., J. Exp. Med. 176:1497-2284, 2000; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502-3506, 2002). 이들 렉틴은 호모트라이머 서브유닛의 올리고머로서 혈청에 존재하며, 각각 탄수화물 인식 도메인을 가진 N-말단 콜라겐-유사 섬유를 갖는다. 이들 상이한 렉틴은 MASP-2에 결합하는 것으로 나타났고, 렉틴/MASP-2 복합체는 단백질 C4 및 C2의 분열을 통해 보체를 활성화시킨다. H-피콜린은 24개의 아미노산의 아미노-말단 영역, 11개의 Gly-Xaa-Yaa 반복부위를 가진 콜라겐-유사 도메인, 12개의 아미노산의 넥(neck) 도메인, 및 207개의 아미노산의 피브리노겐-유사 도메인을 갖는다 (Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502-3506, 2002). H-피콜린은 GlcNAc에 결합하여 살모넬라 타이피뮤리움(S. typhimurium), 살모넬라 미네소타(S. minnesota) 및 대장균으로부터 유래된 LPS로 코팅된 인간 적혈구를 응집시킨다. H-피콜린은 MASP-2 및 MAp19와 회합되는 것으로 나타났으며 렉틴 경로를 활성화시킨다. 상동. L-피콜린/P35는 또한 GlcNAc에 결합하고 인간 혈청에서 MASP-2 및 MAp19와 회합되는 것으로 나타났으며 이 복합체는 렉틴 경로를 활성화시키는 것으로 나타났다 (Matsushita, M., et al., J. Immunol. 164:2281, 2000). 따라서, 본 발명에서 유용한 MASP-2 억제 펩타이드는 MBL 단백질 (서열 번호:21), H-피콜린 단백질 (Genbank 기탁 번호 NM_173452), M-피콜린 단백질 (Genbank 기탁 번호 O00602) 및 L-피콜린 단백질 (Genbank 기탁 번호 NM_015838)로부터 선택되는 적어도 5개의 아미노산의 영역을 포함할 수도 있다.

더 구체적으로, 과학자들은 MBL 상의 MASP-2 결합 부위가 MBP의 콜라겐-유사 도메인의 C-말단 부분의 힌지 및 넥 사이에 있는 12개의 Gly-X-Y 트리플릿(triplet) "GKD GRD GTK GEK GEP GQG LRG LQG POG KLG POG NOG PSG SOG PKG QKG DOG KS" (서열 번호:26) 내에 있는 것으로 식별하였다 (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 279:14065, 2004). 이 MASP-2 결합 부위 영역은 또한 인간 H-피콜린 및 인간 L-피콜린에서 고도로 보존된다. 아미노산 서열 "OGK-X-GP" (서열 번호:22)을 포함하는 세 개의 렉틴 단백질 모두에 존재하는 공통 결합 부위가 기술되었는데 문자 "O"는 하이드록시프롤린을 나타내고 문자 "X"는 소수성 잔기이다 (Wallis et al., 2004, supra). 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 이 양태에 유용한 MASP-2 억제 펩타이드는 길이가 적어도 6개의 아미노산이고 서열 번호:22를 포함한다. 아미노산 서열 "GLR GLQ GPO GKL GPO G" (서열 번호:24)를 포함하는 MBL로부터 유래된 펩타이드는 시험관 내에서 MASP-2에 결합하는 것으로 나타났다 (Wallis, et al., 2004, supra). MASP-2로의 결합을 향상시키기 위해, 천연 MBL 단백질에서 발견된 바와 같이 삼중 나선의 형성을 향상시키 위해 각 단부에서 두 개의 GPO 트리플릿 ("GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GGP OGP O" 서열 번호:25)에 의해 플랭킹된 펩타이드가 합성될 수 있다 (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 279:14065, 2004에서 더 기술됨).

MASP-2 억제 펩타이드는 또한 H-피콜린의 공통 MASP-2 결합 영역의 서열 "GAO GSO GEK GAO GPQ GPO GPO GKM GPK GEO GDO" (서열 번호:27)를 포함하는 인간 H-피콜린으로부터 유래될 수도 있다. 또한 L-피콜린의 공통 MASP-2 결합 영역의 서열 "GCO GLO GAO GDK GEA GTN GKR GER GPO GPO GKA GPO GPN GAO GEO" (서열 번호:28)를 포함하는 인간 L-피콜린으로부터 유래된 펩타이드가 포함된다.

MASP-2 억제 펩타이드는 또한 항트롬빈 III의 C-말단 부분에 연결된 C4 분열 부위인 "LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI" (서열 번호:29)와 같은 C4 분열 부위로부터 유래될 수도 있다 (Glover, G.I., et al., Mol. Immunol. 25:1261 (1988)).

예시적 MASP-2 억제 펩타이드

서열 번호	공급원
서열 번호:6	인간 MASP-2 단백질
서열 번호:8	MASP-2의 CUBI 도메인 (aa 1-121 of 서열 번호:6)
서열 번호:9	MASP-2의 CUBIEGF 도메인 (aa 1-166 of 서열 번호:6)
서열 번호:10	MASP-2의 CUBIEGFCUBII 도메인 (aa 1-293 of 서열 번호:6)
서열 번호:11	MASP-2의 EGF 도메인 (aa 122-166)
서열 번호:12	MASP-2의 세린-프로테아제 도메인 (aa 429-671)
서열 번호:16	MASP-2의 MBL 결합 영역
서열 번호:3	인간 MAp19
서열 번호:21	인간 MBL 단백질
서열 번호:22 OGK-X-GP, (여기서 "O" = 하이드록시프롤린이고 "X"는 소수성 아미노산 잔기이다)	인간 MBL 및 인간 피콜린의 합성 펩타이드 공통 결합 부위
서열 번호:23 OGKLG	인간 MBL 코어 결합 부위
서열 번호:24 GLR GLQ GPO GKL GPO G	MASP-2로의 인간 MBP 트리플릿 6-10-입증된 결합
서열 번호:25 GPOGPOGLRGLQGPOGKLGPOGGPOGPO	삼중 나선의 형성을 향상시키기 위해 GPO가 추가된 인간 MBP 트리플릿
서열 번호:26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKLGPOGNOGPSGSOGPKGQKGDOGKS	인간 MBP 트리플릿 1-17
서열 번호:27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEOGDO	인간 H-피콜린 (Hataka)
서열 번호:28 GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGKAGPOGPNGAOGEO	인간 L-피콜린 P35
서열 번호:29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI	인간 C4 분열 부위

주: 문자 "O"는 하이드록시프롤린을 나타낸다. 문자 "X"는 소수성 잔기이다.

C4 분열 부위로부터 유래된 펩타이드, 뿐만 아니라 MASP-2 세린 프로테아제 부위를 억제하는 그 밖의 펩타이드는 비가역적 프로테아제 억제자가 되도록 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 적절한 변형은 C-말단, Asp 또는 Glu에서, 또는 기능적 측쇄에 첨부된 할로메틸 케톤 (Br, Cl, I, F); 아미노 기 또는 그 밖의 기능적 측쇄 상의 할로아세틸 (또는 그 밖의 α-할로아세틸) 기; 아미노 또는 카르복시 말단 또는 기능적 측쇄 상의 에폭사이드 또는 이민-함유 기; 또는 아미노 또는 카르복시 말단 또는 기능적 측쇄 상의 이미데이트 에스터를 포함할 수도 있지만, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 변형은 펩타이드의 공유 결합에 의한 부착에 의해 효소를 영구히 억제하는 이점을 제공할 것이다. 이것은 펩타이드 억제자의 유효량이 더 낮아지고 및/또는 덜 빈번한 투여가 필요하게 한다.

상기 기술된 억제 펩타이드에 더하여, 본 발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제 펩타이드는 본원에서 기술된 바와 같이 얻어진 항-MASP-2 MoAb의 MASP-2-결합 CDR3 영역을 포함하는 펩타이드를 포함한다. 펩타이드를 합성하는데 사용되는 CDR 영역의 서열은 업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수도 있다. 중쇄 가변 영역은 길이가 일반적으로 100 내지 150개의 아미노산의 범위에 있는 펩타이드이다. 경쇄 가변 영역은 길이가 일반적으로 80 내지 130개의 아미노산의 범위에 있는 펩타이드이다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내 CDR 서열은 당업자에 의해 쉽게 시퀀싱될 수도 있는 대략 3-25개의 아미노산 서열만을 포함한다.

당업자는 상기 기술된 MASP-2 억제 펩타이드의 실질적으로 상동성인 변종이 또한 MASP-2 억제 활성을 나타낸다는 것을 인식할 것이다. 예시적 변종은 삽입, 결실, 대체, 및/또는 대상 펩타이드의 카르복시-말단 또는 아미노-말단 부분 상에 추가적인 아미노산 및 이것들의 혼합물을 가진 펩타이드를 포함하지만, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, MASP-2 억제 활성을 가진 상기 상동성 펩타이드는 본 발명의 방법에 유용한 것으로 간주된다. 기술된 펩타이드는 또한 복제 모티프(motif) 및 보존적 치환을 가진 그 밖의 변형을 포함할 수도 있다. 보존적 변종은 본원 다른 곳에서도 기술되어 있고, 아미노산의, 유사한 전하, 크기 또는 소수성 등의 또 다른 아미노산에 대한 교환을 포함한다.

MASP-2 억제 펩타이드는 온전한 단백질의 세그먼트와 더 많이 유사해지도록 가용성을 증가시키고 및/또는 양전하 또는 음전하를 극대화하도록 변형될 수도 있다. 유도체는 유도체가 기능적으로 MASP-2 억제의 원하는 성질을 보유하는 한 본원에서 개시된 펩타이드의 정확한 1차 아미노산 구조를 가질 수도 있거나 아닐 수도 있다. 변형은 일반적으로 알려져 있는 20개의 아미노산 중 하나 또는 또 다른 아미노산, 부수적인 바람직한 특징, 예컨대 효소성 저하에 대한 저항성을 가진, 유도되거나 치환된 아미노산 또는 D-아미노산으로의 아미노산 치환 또는 아미노산, 아미노산들 또는 펩타이드의 자연적 확인 및 기능을 모방하는 또 다른 분자 또는 화합물, 예컨대 탄수화물로의 치환; 아미노산 결실; 일반적으로 알려져 있는 20개의 아미노산 중 하나 또는 또 다른 아미노산, 부수적인 바람직한 특징, 예컨대 효소성 저하에 대한 저항성을 가진, 유도되거나 치환된 아미노산 또는 D-아미노산으로의 삽입 또는 아미노산, 아미노산들 또는 펩타이드의 자연적 확인 및 기능을 모방하는, 또 다른 분자 또는 화합물, 예컨대 탄수화물로의 치환; 또는 모체 펩타이드의 자연적 확인, 전하 분포 및 기능을 모방하는, 또 다른 분자 또는 화합물, 예컨대 탄수화물 또는 핵산 모노머로의 치환을 포함할 수 있다. 펩타이드는 또한 아세틸화 또는 아미드화에 의해 변형될 수도 있다.

유도체 억제 펩타이드의 합성은 펩타이드 생합성, 탄수화물 생합성 등의 공지된 기술에 의존할 수 있다. 시작점으로서, 당업자는 관심있는 펩타이드의 구성형태를 결정하는데 적합한 컴퓨터 프로그램에 의존할 수도 있다. 본원에서 개시된 펩타이드의 구성형태가 공지되면, 당업자는 합리적인 디자인 방식으로 모체 펩타이드의 기본적인 구성형태 및 전하 분포를 보유하지만 모체 펩타이드에 존재하지 않거나 모체 펩타이드에서 발견된 것들보다 향상된 특징을 가질 수도 있는 유도체를 제조하기 위해 하나 이상의 부위에서 어떤 종류의 치환이 이루어질 수 있는지를 결정할 수 있다. 후보 유도체 분자가 식별되면, 유도체는 그것들이 MASP-2 억제제로서 기능하는지를 결정하기 위해 본원에서 기술된 검정을 사용하여 테스트될 수 있다.

MASP-2 억제 펩타이드에 대한 스크리닝

MASP-2의 주요 결합 영역의 분자 구조를 모방하고 MASP-2의 보체 활성을 억제하는 펩타이드를 생성하여 이것에 대하여 스크리닝하기 위해 분자 모델링 및 합리적인 분자 설계를 사용할 수도 있다. 모델링에 사용된 분자 구조는 앞서 기술된 바와 같이 항-MASP-2 단클론성 항체의 CDR 영역, 뿐만 아니라 다이머화에 필요한 영역, MBL로의 결합에 포함된 영역, 및 세린 프로테아제 활성 부위를 포함하는, MASP-2 기능에 중요한 것으로 알려져 있는 표적 영역을 포함한다. 특정 표적에 결합하는 펩타이드를 식별하기 위한 방법은 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 분자 각인이 특정 분자에 결합하는 펩타이드와 같은 고분자 구조의 데노보(de novo) 구성에 사용되었다. 예를 들어, Shea, K.J., "Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers: The De　Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sties," TRIP　2(5) 1994 참조.

예로서, MASP-2 결합 펩타이드의 모방체를 제조하는 한 방법은 다음과 같다. 공지된 MASP-2 결합 펩타이드 또는 MASP-2 억제를 나타내는 항-MASP-2 항체의 결합 영역의 기능적 모노머 (주형)가 폴리머화된다. 그 다음 주형이 제거된 후 이어서, 주형에 의해 남겨진 빈 공간에 제2 분류의 모노머를 폴리머화하여, 주형과 유사한 하나 이상의 원하는 성질을 나타내는 새로운 분자를 제공한다. 이 방식으로 펩타이드를 제공하기 위해서, MASP-2 억제제인 그 밖의 MASP-2 결합 분자, 예컨대 다당류, 뉴클레오사이드, 약물, 핵단백질, 지질단백질, 탄수화물, 당단백질, 스테로이드, 지질 및 그 밖의 생물학적 활성 물질이 또한 제조될 수 있다. 이 방법은 그것들이 전형적으로 기능적 모노머의 유리 라디칼 폴리머화에 의해 제조되어, 비생분해성 백본을 가진 화합물을 생성하기 때문에 천연 대응물보다 더 안종한 다양한 생물학적 모방체를 설계하는데 유용하다.

펩타이드 합성

MASP-2 억제 펩타이드는 업계에 널리 공지된 기술, 예컨대 Merrifield, in J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963에 의해 처음에 기술된 고체상 합성 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 자동화된 합성은, 예를 들어, 제조사에 의해 제공된 지침에 따라 Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (캘리포니아 포스터 시티)를 사용하여 달성될 수도 있다. 그 밖의 기술은, 예를 들어, Bodanszky, M., et al., Peptide Synthesis, second edition, John Wiley & Sons, 1976, 뿐만 아니라 당업자에게 알려져 있는 그 밖의 참고서에서 발견될 수도 있다.

펩타이드는 또한 당업자에게 공지되어 있는 표준 유전자 조작 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 펩타이드를 암호화하는 핵산을 발현 벡터로 삽입하여, DNA를 발현시키고, 필요한 아미노산의 존재 하에서 DNA를 펩타이드로 번역함으로써 효소적으로 생산될 수 있다. 그 다음에 펩타이드는 크로마토그래피 또는 전기영동 기술을 사용하여, 또는 담체 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 펩타이드 암호화 서열과 함께 발현 벡터로 삽입함으로써 펩타이드에 융합된 다음 펩타이드로부터 분열될 수 있는 담체 단백질에 의해 정제된다. 융합 단백질-펩타이드는 크로마토그래피, 전기영동 또는 면역학적 기술 (예컨대, 담체 단백질에 대한 항체를 통해 레진에 결합)을 사용하여 분리될 수도 있다. 펩타이드는 화학적 방법론을 사용하여 또는 효소적으로, 예를 들어, 가수분해 효소적으로 분열될 수 있다.

본 발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제 펩타이드는 또한 통상적인 기술에 따라 재조합 숙주 세포에서 생산될 수 있다. MASP-2 억제 펩타이드를 암호화하는 서열을 발현시키기 위해서, 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자는 발현 벡터에서 전사 발현을 제어하는 조절 서열에 작동 가능하게 결합된 다음 숙주 세포로 도입되어야 한다. 전사 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 인핸서 외에도, 발현 벡터는 번역 조절 서열 및 마커 유전자를 포함할 수 있으며, 발현 벡터를 가지고 있는 세포의 선택에 적합하다.

MASP-2 억제 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자는 포스포르아미디트 방법과 같은 프로토콜을 사용하여 "유전자 합성기(gene machine)"로 합성될 수 있다. 화학적으로 합성된 이중-가닥 DNA가 유전자 또는 유전자 단편의 합성과 같은 용도에 필요한 경우, 각각의 상보성 가닥은 별도로 만들어진다. 짧은 유전자 (60 내지 80개의 염기쌍)의 생산은 기술적으로 간단하며 상보성 가닥을 합성한 다음 그것들을 어닐링(annealing)함으로써 달성될 수 있다. 더 긴 유전자의 생산을 위해서, 합성 유전자 (이중-가닥)는 길이가 20 내지 100개의 뉴클레오타이드인 단일-가닥 단편의 모듈 형태로 조립된다. 폴리뉴클레오타이드 합성에 대한 리뷰를 위해서, 예를 들어, Glick and Pasternak, "Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA", ASM Press, 1994; Itakura, K., et　al., Annu. Rev. Biochem.　53:323, 1984; 및 Climie, S., et　al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA　87:633, 1990을 참고하면 된다.

소분자 억제자

일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 낮은 분자량을 가진 천연 및 합성 물질, 예를 들어, 펩타이드, 펩티도모방체 및 비펩타이드 억제자 (올리고뉴클레오타이드 및 유기 화합물 포함)을 포함하는 소분자 억제자이다. MASP-2의 소분자 억제자는 항-MASP-2 항체의 가변 영역의 분자 구조에 기초하여 생성될 수 있다.

소분자 억제자는 또한 컴퓨터 약물 설계를 사용하여 MASP-2 결정 구조에 기초하여 설계되고 생성될 수도 있다 (Kuntz I.D., et al., Science 257:1078, 1992). 래트 MASP-2의 결정 구조가 기술되어 있다 (Feinberg, H., et al., EMBO J. 22:2348-2359, 2003). Kuntz, 등에 의해 기술된 방법을 사용하여, MASP-2 결정 구조 좌표는 DOCK와 같은 컴퓨터 프로그램에 대한 입력값으로 사용되며, 이것은 MASP-2에 결합할 것으로 예상되는 소분자 구조의 목록을 산출한다. 이러한 컴퓨터 프로그램의 사용은 당업자에게 널리 알려져 있다. 예를 들어, HIV-1 프로테아제 억제자의 결정 구조는 프로그램 DOCK를 사용하여 효소의 결합 부위에 대한 캠브리지 결정학 데이터베이스(Cambridge Crystallographic database)에서 발견된 화합물의 적합성을 평가함으로써 HIV-1 프로테아제 억제자인 독특한 비펩타이드 리간드를 식별하는데 사용되었다 (Kuntz, I.D., et al., J. Mol. Biol. 161:269-288, 1982; DesJarlais, R.L., et al., PNAS 87:6644-6648, 1990).

잠재적 MASP-2 억제자로서 컴퓨터를 사용한 방법에 의해 식별되는 소분자 구조의 목록은 실시예 10에서 기술된 바와 같은 MASP-2 결합 검정을 사용하여 스크리닝된다. MASP-2에 결합하는 것으로 발견된 소분자는 그것들이 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는지를 결정하기 위해 실시예 2에서 기술된 바와 같은 기능적 검정으로 검정된다.

MASP-2 가용성 수용체

그 밖의 적합한 MASP-2 억제제는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 생산될 수도 있는 MASP-2 가용성 수용체를 포함하는 것으로 생각된다.

MASP-2의 발현 억제자

본 발명의 이 양태의 또 다른 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제할 수 있는 MASP-2 발현 억제자이다. 본 발명의 이 양태의 실행시 대표적인 MASP-2 발현 억제자는 MASP-2 안티센스 핵산 분자 (예컨대, 안티센스 mRNA, 안티센스 DNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드), MASP-2 리보자임 및 MASP-2 RNAi 분자를 포함한다.

안티센스 RNA 및 DNA 분자는 MASP-2 mRNA에 혼성체화하여 MASP-2 단백질의 번역을 방지함으로써 MASP-2 mRNA의 번역을 직접적으로 차단하는 작용을 한다. 안티센스 핵산 분자는 많은 상이한 방식으로 구성될 수도 있으며 단 그것은 MASP-2의 발현을 방해할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산 분자는 보체의 전사를 허용하기 위해 전사에 대한 정상 배향에 관하여 MASP-2 cDNA (서열 번호:4)의 암호화 영역 (또는 이것의 일부)을 반전시킴으로써 구성될 수 있다.

안티센스 핵산 분자는 보통 표적 유전자 또는 유전자들의 적어도 일부와 실질적으로 동일하다. 하지만, 핵산은 발현을 억제하기 위해서는 완전히 동일할 필요는 없다. 일반적으로, 더 높은 상동성이 더 짧은 안티센스 핵산 분자의 사용을 보충하는데 사용될 수 있다. 최소 퍼센트 동일성은 전형적으로 약 65%보다 더 높지만, 더 높은 퍼센트 동일성은 내인성 서열의 발현의 더 효과적인 억제를 나타낼 수도 있다. 약 80% 초과의 실질적으로 더 높은 퍼센트 동일성이 전형적으로 바람직하지만, 약 95%의 절대적 동일성이 전형적으로 가장 바람직하다.

안티센스 핵산 분자는 표적 유전자와 같은 인트론 또는 엑손 패턴을 가질 필요는 없으며, 표적 유전자의 비-암호화 세그먼트는 암호화 세그먼트로서 표적 유전자 발현의 안티센스 억제를 달성하는데 있어서 동일하게 효과적일 수도 있다. 적어도 약 8개 정도의 뉴클레오타이드의 DNA 서열이 안티센스 핵산 분자로서 사용될 수도 있지만, 더 긴 서열이 바람직하다. 본 발명에서, MASP-2의 유용한 억제제의 대표적인 예는 서열 번호:4에서 제시된 핵산 서열로 구성된 MASP-2 cDNA의 보체와 적어도 90 퍼센트 동일한 안티센스 MASP-2 핵산 분자이다. 서열 번호:4에서 제시된 핵산 서열은 서열 번호:5에서 제시된 아미노산 서열로 구성된 MASP-2 단백질을 암호화한다.

MASP-2 mRNA에 결합하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 표적화는 MASP-2 단백질 합성의 수준을 감소시키는데 사용될 수도 있는 또 다른 메커니즘이다. 예를 들어, 폴리갈락투로나제 및 무스카린 2형 아세틸콜린 수용체의 합성은 그것들 각각의 mRNA 서열에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 억제된다 (Cheng의 미국 특허 번호 5,739,119, 및 Shewmaker의 미국 특허 번호 5,759,829). 게다가, 안티센스 억제의 예는 핵 단백질 사이클린, 다중 약물 저항 유전자 (MDG1), ICAM-1, E-셀렉틴, STK-1, 선조체 GABA_A 수용체 및 인간 EGF로 입증되었다 (예를 들어, Baracchini의 미국 특허 번호 5,801,154; Baker의 미국 특허 번호 5,789,573; Considine의 미국 특허 번호 5,718,709; 및 Reubenstein의 미국 특허 번호 5,610,288 참조).

당업자가 올리고뉴클레오타이드가 본 발명에서 유용한지를 결정할 수 있게 하는 시스템이 기술되어 있으며, 이것은 Rnase H 분열을 사용하여 전사물 내 서열의 접근성에 대한 지표로서 표적 mRNA 내의 적합한 부위를 탐침하는 것을 포함한다. Scherr, M., et al., Nucleic Acids Res. 26:5079-5085, 1998; Lloyd, et al., Nucleic Acids Res. 29:3665-3673, 2001. MASP-2 전사물의 특정 영역에 대하여 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 혼합물이 MASP-2를 발현하는 세포 추출물, 예컨대 간세포에 추가되고, RNAseH 취약 부위를 생성하기 위해 혼성체화된다. 이 방법은 다이머, 헤어핀, 또는 숙주 세포에서 표적 mRNA로의 특이적 결합을 감소시키거나 금지하는 그 밖의 2차 구조를 형성하는 상대적인 능력에 기초하여 안티센스 조성물에 대한 최적의 서열 선택을 예측할 수 있는 컴퓨터-지원형 서열 선택과 조합될 수 있다. 이들 2차 구조 분석 및 표적 부위 선택의 고려사항은 OLIGO 프라이머 분석 소프트웨어 (Rychlik, I., 1997) 및 BLASTN 2.0.5 알고리즘 소프트웨어 (Altschul, S.F., et al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402, 1997)를 사용하여 수행될 수도 있다표적 서열에 대한 안티센스 화합물은 바람직하게는 길이가 약 8 내지 약 50개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 약 9 내지 약 35개 정도의 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 특히 바람직하다. 본 발명자는 9 내지 35개의 뉴클레오타이드의 범위 (즉, those of 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35 또는 so bases in length)에 있는 모든 올리고뉴클레오타이드 조성물이 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드-기반 방법의 실행에 매우 바람직하다는 것을 고려한다. MASP-2 mRNA의 매우 바람직한 표적 영역은 AUG 번역 개시 코돈 또는 그 근처에 있는, 예를 들어, MASP-2 유전자 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호:4)의 -10 내지 +10의 영역에 있는 것들 및 mRNA의 5' 영역에 실질적으로 상보적인 상기 서열이다. 예시적 MASP-2 발현 억제자가 표 4에서 제공된다.

MASP-2의 예시적 발현 억제자

서열 번호:30 (서열 번호:4의 뉴클레오타이드 22-680)	CUBIEGF를 암호화하는 MASP-2 cDNA의 핵산 서열 (서열 번호:4)
서열 번호:31 5'CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC3	MASP-2 번역 시작 부위 (센스)를 포함하는 서열 번호:4의 뉴클레오타이드 12-45
서열 번호:32 5'GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAGAAG3'	MASP-2 MBL 결합 부위 (센스)를 포함하는 영역을 암호화하는 서열 번호:4의 뉴클레오타이드 361-396
서열 번호:33 5'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3'	CUBII 도메인을 포함하는 영역을 암호화하는 서열 번호:4의 뉴클레오타이드 610-642

상기 언급된 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 폴리머 또는 이것의 모방체를 말한다. 이 용어는 또한 자연 발생한 뉴클레오타이드, 당 및 뉴클레오사이드 간 (백본) 공유 결합, 뿐만 아니라 비-자연 발생한 변형을 가진 올리고뉴클레오타이드로 구성된 올리고핵염기를 커버한다. 이들 변형은 독성 성질 감소, 뉴클레아제 분해에 대한 안정성 증가 및 세포 섭취 향상과 같이, 자연 발생한 올리고뉴클레오타이드를 통해 제공되지 않는 어떤 원하는 성질을 도입할 수 있게 한다. 예시의 구체예에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 포스페이트 치환기가 포스포로티오에이트로 대체된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 수명을 연장시키기 위한 포스포다이에스터 백본의 변형에 의해 천연 DNA와는 다르다. 마찬가지로, 올리고뉴클레오타이드의 하나 또는 양 단부는 핵산의 가닥 내 인접한 염기쌍 사이에 개재된 하나 이상의 아크리딘 유도체로 치환될 수도 있다.

안티센스에 대한 또 다른 대안은 "RNA 간섭" (RNAi)의 사용이다. 이중-가닥 RNA (dsRNA)는 포유동물에서 생체 내에서 유전자 침묵을 유발할 수 있다. RNAi의 자연적 기능 및 동시-억제는 레트로트랜스포존(retrotransposon)과 같은 이동성 유전적 요소 및 활성이 될 때 숙주 세포에서 일탈적인 RNA 또는 dsRNA를 생산하는 바이러스에 의한 침입에 대한 게놈의 보호인 것으로 보인다 (예를 들어, Jensen, J., et al., Nat. Genet. 21:209-12, 1999 참조). 이중-가닥 RNA 분자는 이중-가닥 RNA 분자를 혀성할 수 있는 두 개의 RNA 가닥을 합성함으로써 제조될 수도 있으며, 각각 약 19 내지 25개 (예를 들어, 19-23개의 뉴클레오타이드)의 길이를 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 유용한 dsRNA 분자는 표 4에서 나열된 서열 및 그것의 보체에 상응하는 RNA를 포함할 수도 있다. 바람직하게는, RNA의 적어도 하나의 가닥은 1-5개의 뉴클레오타이드의 3' 돌출부(overhang)를 갖는다. 합성된 RNA 가닥은 이중-가닥 분자를 형성하는 조건 하에서 조합된다. RNA 서열은 서열 번호:4의 적어도 8개의 뉴클레오타이드 부분을 포함할 수도 있으며 25개 이하의 뉴클레오타이드의 총 길이를 갖는다. 주어진 표적에 대한 siRNA 서열의 설계는 업계의 기술 범위 내에 있다. siRNA 서열을 설계하고 발현의 적어도 70% 넉다운(knockdown)을 보장하는 상업적인 서비스가 입수 가능하다 (캘리포니아 발렌시아의 Qiagen).

dsRNA는 약학적 조성물로서 투여되고 공지된 방법에 의해 수행될 수도 있으며, 핵산은 원하는 표적 세포로 도입된다. 일반적으로 사용되는 유전자 전달 방법은 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란, 전기천공법, 미세주사법 및 바이러스 방법을 포함한다. 이러한 방법은 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1993에서 교시된다.

리보자임은 또한 MASP-2, 예컨대 MASP-2 mRNA를 표적화하는 리보자임의 양 및/또는 생물학적 활성을 감소시키는데 이용될 수 있다. 리보자임은 리보자임의 서열에 완전히 또는 부분적으로 상동성인 서열을 갖는 핵산 분자를 분열시킬 수 있는 촉매 RNA 분자이다. 표적 RNA와 특이적으로 쌍을 형성하는 RNA 리보자임을 암호화하고 특이적인 위치에서 포스포다이에스터 백본을 분열시키며, 이로 인해 표적 RNA를 기능적으로 비활성화시키는 리보자임 이식 유전자를 설계하는 것이 가능하다. 이 분열을 수행하는데 있어서, 리보자임은 그 자체로 변화되지 않으며, 따라서 그 밖의 분자를 재사용하여 분열시킬 수 있다. 안티센스 RNA 내 리보자임 서열의 포함은 그것들 상에서의 RNA-분열 활성을 부여하며, 이로 인해 안티센스 구조의 활성을 증가시킨다.

본 발명의 실행에 유용한 리보자임은 전형적으로 뉴클레오타이드 서열에서 표적 MASP-2 mRNA의 적어도 일부에 상보적인 적어도 약 9개의 뉴클레오타이드의 혼성체화 영역, 및 표적 MASP-2 mRNA를 분열시키도록 조정된 촉매 영역을 포함한다 (일반적으로 EPA No. 0 321 201; WO88/04300; Haseloff, J., et al., Nature 334:585-591, 1988; Fedor, M.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1668-1672, 1990; Cech, T.R., et al., Ann. Rev. Biochem. 55:599-629, 1986 참조).

리보자임은 리보자임 서열을 포함하는 RNA 올리고뉴클레오타이드의 형태로 세포에 직접적으로 표적화되거나, 또는 원하는 리보자임 RNA를 암호화하는 발현 벡터로서 세포로 도입될 수 있다. 리보자임은 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 대하여 사용된 바와 같은 방식으로 사용되고 적용될 수도 있다.

본 발명의 방법에 유용한 안티센스 DNA, 리보자임 및 RNAi 분자는 DNA 및 RNA 분자의 합성을 위해 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수도 있다. 이것들은 업계에 널리 공지된 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 및 올리고리보뉴클레오타이드를 화학적으로 합성하기 위한 기술, 예를 들어 고체상 포스포르아미디트 화학적 합성을 포함한다. 대안으로, RNA 분자는 안티센스 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열의 시험관 내 및 생체 내 전사에 의해 생성될 수도 있다. 이러한 DNA 서열은 T7 또는 SP6 폴리머라제 프로모터와 같은 적합한 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하는 다양한 벡터로 포함될 수도 있다. 대안으로, 사용된 프로모터에 따라 안티센스 RNA를 구성적으로 또는 유도 가능하게 합성하는 안티센스 cDNA 구조체는 세포주로 안정하게 도입될 수 있다.

DNA 분자의 다양한 널리 공지된 변형은 안정성 및 반감기를 증가시키는 수단으로서 도입될 수도 있다. 유용한 변형은 분자의 5' 및/또는 3' 단부에 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드의 플랭킹 서열의 추가 또는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 백본 내에서 포스포다이에스터라제 결합 대신에 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸의 사용을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

VI. 약학적 조성물 및 전달 방법

투약

또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에서 개시된 질환 또는 질병을 앓고 있는 대상체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화의 부작용을 억제하기 위한 조성물을 제공하며, MASP-2 억제제의 치료적 유효량 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. MASP-2 억제제는 MASP-2-의존적 보체 활성화와 관련된 질병을 치료하거나 개선하기 위해 치료적 유효량으로 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 치료적 유효량은 질환 또는 질병과 관련된 증상의 개선을 초래하기에 충분한 MASP-2 억제제의 양을 말한다.

MASP-2 억제제의 독성 및 치료적 효능은 실험 동물 모델, 예컨대 실시예 1에서 기술된 인간 MASP-2 이식 유전자를 발현하는 쥐 MASP-2 -/- 마우스 모델을 이용하는 표준 약학적 과정에 의해 결정될 수 있다. 이러한 동물 모델의 사용시, NOAEL (관찰된 부작용 수준 없음) 및 MED (최소 유효량)는 표준 방법을 사용하여 결정될 수 있다. NOAEL 및 MED 효과 간의 용량 비율은 치료적 비율이며, 비율 NOAEL/MED로서 표현된다. 큰 치료적 비율 또는 지표를 나타내는 MASP-2 억제제가 가장 바람직하다. 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터가 인간에서 사용을 위한 투약량의 범위를 제형화하는데 사용될 수 있다. MASP-2 억제제의 투약량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없이 MED를 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투약량은 이 범위 내에서 이용되는 투약 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 달라질 수도 있다.

임의의 화합물 제형에 대하여, 치료적 유효량은 동물 모델을 사용하여 추정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 동물 모델에서 MED를 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록 제형화될 수도 있다. 혈장 내 MASP-2 억제제의 정량적 수준은 또한, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수도 있다.

독성 연구에 더하여, 효과적인 투약량은 또한 살아있는 대상체에 존재하는 MASP-2 단백질의 양 및 MASP-2 억제제의 결합 친화도에 기초하여 추정될 수도 있다. 정상 인간 대상체에서 MASP-2 수준은 혈청에서 500 ng/ml의 범위 내의 낮은 수준으로 존재하고, 특정 대상체에서 MASP-2 수준은 Moller-Kristensen M.,　et　al., J.　Immunol. Methods　282:159-167, 2003에서 기술된, MASP-2에 대한 정량적 검정을 사용하여 결정될 수 있다.

일반적으로, MASP-2 억제제를 포함하는 투여된 조성물의 투약량은 대상체의 나이, 체중, 키, 성별, 일반적인 의학적 상태, 및 이전의 병력과 같은 요인에 따라 달라진다. 예로서, MASP-2 억제제, 예컨대 항-MASP-2 항체는 대상체 체중의 약 0.010 내지 10.0 mg/kg, 바람직하게는 0.010 내지 1.0 mg/kg, 더 바람직하게는 0.010 내지 0.1 mg/kg의 투약 범위 내에서 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 항-MASP-2 항체 및 MASP-2 억제 펩타이드의 조합을 포함한다.

주어진 대상체에서 MASP-2 억제 조성물 및 본 발명의 방법의 치료적 효능, 및 적절한 투약량은 당업자에게 널리 공지된 보체 검정에 따라 결정될 수 있다. 보체는 많은 특이적 생성물을 생성한다. 지난 10년간, 민감하고 특이적인 검정이 개발되었으며 작은 활성화 단편 C3a, C4a, 및 C5a 및 큰 활성화 단편 iC3b, C4d, Bb, 및 sC5b-9를 포함하는, 이들 활성화 생성물 대부분에 대하여 상업적으로 입수 가능하다. 이들 검정 중 대부분은 단편 상에 노출되지만, 그것들이 형성된 천연 단백질 상에는 노출되지 않은 새로운 항원 (신항원)과 반응하는 단클론성 항체를 이용하여, 이들 검정을 매우 단순하고 특이적으로 만든다. 대부분은 ELISA 기술에 의존하지만, C3a 및 C5a에 대해서는 방사 면역 검정이 때때로 사용된다. 이들 후자의 검정은 순환에서 발견되는 주요 형태인 미가공 단편 및 그것들의 'desArg' 단편 둘 다를 측정한다. 미가공 단편 및 C5a_desArg는 세포 표면 수용체에 결합하여 신속하게 제거되며 따라서 매우 낮은 농도로 존재하는 반면, C3a_desArg는 세포에 결합하지 않고 혈장에 축적된다. C3a의 측정은 보체 활성화의 민감하고, 경로-독립적인 지표를 제공한다. 대안의 경로 활성화는 Bb 단편을 측정함으로써 평가될 수 있다. 막 공격 경로 활성화의 유동상 생성물, sC5b-9의 검출은 보체가 완성되기 위해 활성화되고 있다는 증거를 제공한다. 렉틴 경로 및 고전적 경로는 둘 다 같은 활성화 생성물, C4a 및 C4d를 생성하기 때문에, 이들 두 개의 단편의 측정은 이들 두 개의 경로 중 어느 것이 활성화 생성물을 생성하였는지에 대한 어떤 정보도 제공할 수 없다.

MASP-2-의존적 보체 활성화의 억제는 본 발명의 방법에 따라 MASP-2 억제제의 투여의 결과로서 발생한 보체 시스템의 구성요소에서 다음 변화 중 적어도 하나를 특징으로 한다: MASP-2-의존적 보체 활성화 시스템 생성물 C4b, C3a, C5a 및/또는 C5b-9 (MAC)의 생성 또는 생산의 억제 (실시예 2에서 기술된 바와 같이 측정됨), C4 분열 및 C4b 침착의 감소 (실시예 10에서 기술된 바와 같이 측정됨), 또는 C3 분열 및 C3b 침착의 감소 (실시예 10에서 기술된 바와 같이 측정됨).

추가적인 작용제

MASP-2 억제제를 포함하는 조성물 및 방법은 하나 이상의 추가적인 치료제를 선택적으로 포함할 수도 있으며, 이것들은 MASP-2 억제제의 활성을 증가시킬 수도 있거나 또는 추가적인 또는 상승 작용의 방식으로 관련된 치료적 기능을 제공한다. 예를 들어, TTP를 앓고 있는 대상체의 치료의 맥락에서, 대상체는 ADAM-TS13의 억제자에 대하여 양성이고, 하나 이상의 MASP-2 억제제가 하나 이상의 면역억제제와 조합하여 (동시-투여 포함) 투여될 수도 있다. 적합한 면역억제제는 코르티코스테로이드, 리툭산, 사이클로스포린, 등을 포함한다. HUS 또는 aHUS를 앓고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체의 치료의 맥락에서, 하나 이상의 MASP-2 억제제가 적합한 항생제와 조합하여 (동시-투여 포함) 투여될 수도 있다. aHUS를 앓고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체의 치료의 맥락에서, 하나 이상의 MASP-2 억제제는 다른 보체 억제제, 예컨대 에쿨리쥬맙 (Soliris), TT-30, 인자 B에 대한 항체, 또는 말단 보체 성분 또는 대체 경로 증폭을 억제하는 그 밖의 작용제와 조합하여 (동시-투여 포함) 투여될 수도 있다.

추가적인 작용제(들)의 포함 및 선택은 원하는 치료적 결과를 달성하기 위해 결정될 것이다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 하나 이상의 항-염증제 및/또는 진통제와 조합하여 투여될 수도 있다. 적합한 항-염증 및/또는 진통제는 다음을 포함한다: 세로토닌 수용체 안타고니스트; 세로토닌 수용체 아고니스트; 히스타민 수용체 안타고니스트; 브라디키닌 수용체 안타고니스트; 칼리크레인 억제자; 뉴로키닌₁ 및 뉴로키닌₂ 수용체 하위 유형 안타고니스트를 포함하는, 타키키닌 수용체 안타고니스트; 칼시토닌 유전자-관련 펩타이드 (CGRP) 수용체 안타고니스트; 인터류킨 수용체 안타고니스트; PLA₂ 아이소폼(isoform) 억제자 및 PLCγ 아이소폼 억제자, 사이클로옥시게나제 (COX) 억제자 (COX-1, COX-2, 또는 비선택적 COX-1 및 -2 억제자일 수도 있음), 리포옥시게나제 억제자를 포함하는, 포스포리파제 억제자를 포함하는, 아라키돈산 대사산물에 대한 합성 경로에서 활성인 효소의 억제자; 에이코사노이드 EP-1 및 EP-4 수용체 하위 유형 안타고니스트 및 트롬복세인 수용체 하위 유형 안타고니스트를 포함하는 프로스타노이드 수용체 안타고니스트; 류코트리엔 B₄ 수용체 하위 유형 안타고니스트 및 류코트리엔 D₄ 수용체 하위 유형 안타고니스트를 포함하는 류코트리엔 수용체 안타고니스트; m-오피오이드, d-오피오이드, 및 k-오피오이드 수용체 하위 유형 아고니스트를 포함하는 오피오이드 수용체 아고니스트; P_2X 수용체 안타고니스트 및 P_2Y 수용체 아고니스트를 포함하는 퓨리노셉터 아고니스트 및 안타고니스트; 아데노신 트라이포스페이트 (ATP)-민감성 칼륨 채널 개방제; MAP 키나제 억제자; 니코틴 아세틸콜린 억제자; 및 알파 아드레날린 수용체 아고니스트 (알파-1, 알파-2, 및 비선택적 알파-1 및 2 아고니스트 포함).

본 발명의 MASP-2 억제제는 또한 하나 이상의 그 밖의 보체 억제자, 예컨대 C5의 억제자와 조합하여 투여될 수도 있다. 지금까지, C5에 대한 항체인 에쿨리쥬맙 (Solaris®)이 인간 사용에 대하여 승인된 유일한 보체-표적화제이다. 하지만 몇몇 약리학제는 생체 내에서 보체를 차단하는 것으로 나타났다. K76COOH 및 나팜스타트 메실레이트는 이식의 동물 모델에서 약간의 효과를 나타낸 두 가지 작용제이다 (Miyagawa, S., et al., Transplant Proc. 24:483-484, 1992). 저분자량 헤파린은 또한 보체 활성을 조절하는데 효과적인 것으로 나타났다 (Edens,　R.E.,　et　al., Complement Today, pp.　96-120, Basel: Karger, 1993). 이들 소분자 억제자는 본 발명의 MASP-2 억제제와 조합하여 사용되는 작용제로서 유용할 수도 있다.

그 밖의 자연 발생한 보체 억제자는 본 발명의 MASP-2 억제제와 조합으로 유용할 수도 있다. 보체의 생물학적 억제자는 가용성 보체 인자 1 (sCR1)을 포함한다. 이것은 인간 세포의 외막 상에서 발견될 수 있는 자연 발생 억제자이다. 그 밖의 막 억제자는 DAF, MCP, 및 CD59를 포함한다. 재조합 형태는 시험관 내 및 생체 내 항-보체 활성에 대하여 테스트되었다. sCR1은 이종 기관 이식에 효과적인 것으로 나타났으며, 보체 시스템 (대체 및 고전적 둘 다)은 새로 이식된 장기를 통해 혈액을 관류한지 수분 내에 초과잉성 거부 반응 증후군(hyperactive rejection syndrome)에 대한 계기를 제공한다 (Platt, J.L., et　al., Immunol. Today　11:450-6, 1990; Marino, I.R., et　al., Transplant Proc.　1071:6, 1990; Johnstone, P.S., et　al., Transplantation　54:573-6, 1992). sCR1의 사용은 이식된 장기를 보호하고 이식된 장기의 생존 시간을 연장하며, 보체 경로가 장기 생존의 발병 기전에 관련이 있음을 나타낸다 (Leventhal, J.R., et　al., Transplantation　55:857-66, 1993; Pruitt, S.K., et　al., Transplantation　57:363-70, 1994)

본 발명의 조성물과 조합으로의 사용에 적합한 추가적인 보체 억제자는 또한, 예로서, 코네티컷 뉴 헤이븐의 Alexion Pharmaceuticals, Inc.에 의해 개발 중인 MoAb, 예컨대 항-C5 항체 (예를 들어, 에쿨리쥬맙), 및 항-프로퍼딘 MoAb를 포함한다.

약학적 담체 및 전달 비히클(vehicle)

일반적으로, 그 밖의 임의의 선택된 치료제와 조합된 본 발명의 MASP-2 억제제 조성물은 적합하게는 약학적으로 허용 가능한 담체에 포함된다. 담체는 비-독성이고, 생체 적합성이며 MASP-2 억제제 (및 그것과 조합된 그 밖의 임의의 치료제)의 생물학적 활성에 해로운 영향을 미치지 않도록 선택된다. 펩타이드에 대한 예시적인 약학적으로 허용 가능한 담체는 Yamada의 미국 특허 번호 5,211,657에 기술되어 있다. 본 발명에서 유용한 항-MASP-2 항체 및 억제 펩타이드는 경구, 비경구 또는 수술 투여를 허용하는 고체, 반고체, 겔, 액체 또는 기체 형태, 예컨대 타블렛, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌제, 흡입제 및 주사제의 조제물로 제형화될 수도 있다. 본 발명은 또한 의료 디바이스 등을 코팅함으로써 조성물의 국소적 투여를 고려한다.

주사, 투입 또는 관주법 및 국부적 전달을 통한 비경구 전달에 적합한 담체는 증류수, 생리학적 포스페이트-완충된 식염수, 정상 또는 젖산 링거 용액(lactated Ringer's solution), 덱스트로스 용액, 행크 용액(Hank's solution), 또는 프로판디올을 포함한다. 이에 더하여, 멸균 고정유는 용매 또는 현탁화 매질로서 이용될 수도 있다. 이 목적을 위해서, 합성 모노- 또는 다이글리세리드를 포함하는 임의의 생체 적합성 오일이 이용될 수도 있다. 이에 더하여, 올레산과 같은 지방산은 주사제의 제조에 사용된다. 담체 및 작용제는 액체, 현탁액, 폴리머화 가능한 또는 비-폴리머화 가능한 겔, 페이스트 또는 고약으로서 합성될 수도 있다.

담체는 또한 작용제(들)의 전달을 지속하거나 (즉, 연장하거나, 지연시키거나 또는 조절하거나) 또는 치료제(들)의 전달, 흡수, 안정성 또는 약동학을 향상시키기 위해 전달 비히클을 포함할 수도 있다. 이러한 전달 비히클은 비-제한적 예로서, 단백질, 리포솜, 탄수화물, 합성 유기 화합물, 무기 화합물, 폴리머 또는 코폴리머 하이드로겔 및 폴리머 미셀(micelle)로 구성된 미세입자, 미소구체, 나노구체 또는 나노입자를 포함할 수도 있다. 적합한 하이드로겔 및 미셀 전달 시스템은 WO 2004/009664 A2에서 개시된 PEO:PHB:PEO 코폴리머 및 코폴리머/사이클로덱스트린 복합체 및 미국 특허 출원 공개 번호 2002/0019369 A1에서 개시된 PEO 및 PEO/사이클로덱스트린을 포함한다. 이러한 하이드로겔은 의도된 작용 부위에 국소적으로, 또는 피하로 또는 근육 내로 주사되어 지효성 디폿(depot)을 형성할 수도 있다.

관절 내 전달을 위해, MASP-2 억제제는 주사 가능한 상기 기술된 액체 또는 겔 담체, 주사 가능한 상기 기술된 지효성 전달 비히클, 또는 히알루론산 또는 히알루론산 유도체에 들어있을 수도 있다.

비-펩타이드성 작용제의 경구 투여를 위해, MASP-2 억제제는 불활성 충전제 또는 희석제, 예컨대 수크로스, 옥수수 전분, 또는 셀룰로스에 들어있을 수도 있다.

국부적 투여를 위해, MASP-2 억제제는 연고, 로션, 크림, 겔, 안약, 좌제, 스프레이, 액체 또는 분말, 또는 경피 패치를 통한 겔 또는 마이크로캡슐 전달 시스템에 들어있을 수도 있다.

에어로졸, 계량된 용량 흡입기, 건성 분말 흡입기, 및 분무기를 포함하는 다양한 비강 및 폐 전달 시스템이 개발 중이고 각각 에어로졸, 흡입제, 또는 분무된 전달 비히클로 본 발명의 전달에 맞춰 적합하게 조정될 수도 있다.;

척추강 내 (IT) 또는 뇌실 내 (ICV) 전달, 적절하게는 멸균 전달 시스템 (예를 들어, 액체; 겔, 현탁액, 등)이 본 발명을 투여하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 분산제 또는 습윤제, 현탁화제, 희석제, 버퍼, 흡수 촉진제, 에멀젼화제, 바인더, 점증제, 향미제 (경구 투여용)과 같은 생체 적합성 부형제를 포함할 수도 있다.

항체 및 펩타이드용 약학적 담체

더 구체적으로 항-MASP-2 항체 및 억제 펩타이드에 관하여, 예시적 제형은 물, 오일, 식염수, 글리세롤 또는 에탄올과 같은 멸균 액체일 수 있는 약학적 담체와 함께 생리학적으로 허용 가능한 희석제 중의 화합물의 용액 또는 현탁액의 주사 가능한 투약량으로서 비경구로 투여될 수 있다. 추가적으로, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 에멀젼화제, 계면활성제, pH 완충 물질, 등은 항-MASP-2 항체 및 억제 펩타이드를 포함하는 조성물로 존재할 수 있다. 약학적 조성물의 추가적인 구성요소는 석유 (예컨대, 동물성, 식물성 또는 합성 기원), 예를 들어, 대두 오일 및 미네랄 오일을 포함한다. 일반적으로, 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 주사용액에 바람직한 액체 담체이다.

항-MASP-2 항체 및 억제 펩타이드는 또한 활성제의 지효성 또는 박동성 방출을 허용하는 방식으로 제형화될 수 있는 디폿 주사 또는 이식 조제물의 형태로 투여될 수 있다.

발현 억제자용 약학적으로 허용 가능한 담체

더 구체적으로 상기 기술된 발현 억제자 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 본 발명의 방법에 유용한 발현 억제자에 관하여, 조성물이 제공된다. 조성물은 콜로이드성 분산 시스템을 더 포함할 수도 있다.

발현 억제자를 포함하는 약학적 조성물은 용액, 에멀젼, 및 리포솜-함유 제형을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 조성물은 사전 형성된 액체, 자가-에멀젼화 고체 및 자가-에멀젼화 반고체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 구성요소로부터 생성될 수도 있다. 이러한 조성물의 제조는 전형적으로 발현 억제자를 다음 중 하나 이상과 조합하는 것을 포함한다: 버퍼, 항산화제, 저분자량 폴리펩타이드, 단백질, 아미노산, 글루코스, 수크로스 또는 덱스트린을 포함하는 탄수화물, 킬레이트화제, 예컨대 EDTA, 글루타티온 및 그 밖의 안정화제 및 부형제. 중성 완충된 식염수 또는 비-특이적 혈청 알부민과 혼합된 식염수가 적합한 희석제의 예이다.

일부 구체예에서, 조성물은 전형적으로 액적의 형태로 다른 액체에 분산된 한 액체의 불균질 시스템인 에멀젼으로서 제조 및 제형화될 수도 있다 (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Vol. 1, Rieger and Banker (eds.), Marcek Dekker, Inc., N.Y., 1988 참조). 에멀젼 제형에 사용된 자연 발생한 에멀젼화제의 예는 아카시아, 비즈왁스, 라놀린, 레시틴 및 포스파티드를 포함한다.

한 구체예에서, 핵산을 포함하는 조성물은 마이크로에멀젼으로 제형화될 수 있다. 마이크로에멀젼은, 본원에서 사용된 바와 같이 물, 오일, 및 양친매성 물질의 시스템을 말하며, 이것은 단일 시각적으로 등방성이고 열역학적으로 안정한 액체 용액이다 (Rosoff in Pharmaceutical Dosage Forms, Vol. 1 참조). 본 발명의 방법은 또한 원하는 부위로의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 전송 및 전달을 위해 리포솜을 사용할 수도 있다.

국부적 투여를 위한 발현 억제자의 약학적 조성물 및 제형은 경피성 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 안약, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수도 있다. 통상적인 약학적 담체, 뿐만 아니라 수성, 분말 또는 유성 염기 및 점증제 등이 사용될 수도 있다.

투여 방식

MASP-2 억제제를 포함하는 약학적 조성물은 국소적 또는 전신 투여 방식이 치료되는 질병에 가장 적절한지에 따라 많은 방식으로 투여될 수도 있다. 추가적으로, 체외 재관류 과정에 관하여 상기 본원에서 기술된 바와 같이, MASP-2 억제제는 재순환 혈액 또는 혈장에 본 발명의 조성물의 도입을 통해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 조성물을 이식 가능한 의료 디바이스에 코팅하거나 포함시킴으로써 전달될 수 있다.

전신 전달

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "전신 전달" 및 "전신 투여"는 근육 내 (IM), 피하, 정맥 내 (IV), 동맥 내, 흡입, 혀 밑, 볼, 국부적, 경피성, 비강, 직장, 질 및 의도된 치료 작용의 단일 또는 다수의 부위로 전달된 작용제의 분산을 효과적을 발생시키는 그 밖의 투여 경로를 포함하는 경구 및 비경구 경로를 포함하지만 이제 제한하려는 것은 아니다. 본 조성물에 대한 전신 전달의 바람직한 경로는 정맥 내, 근육 내, 피하 및 흡입을 포함한다. 본 발명의 특정 조성물에 이용되는 선택된 작용제에 대하여 정확한 전신 투여는 부분적으로는 주어진 투여 경로와 관련된 대사 형질전환 경로에 대한 작용제의 민감성을 설명하기 위해 결정될 것이다. 예를 들어, 펩타이드성 작용제는 적합하게는 경구 이외의 경로에 의해 투여될 수도 있다.

MASP-2 억제 항체 및 폴리펩타이드는 임의의 적합한 수단에 의해 필요로 하는 대상체에게 전달될 수 있다. MASP-2 항체 및 폴리펩타이드의 전달 방법은 경구, 폐, 비경구 (예를 들어, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 (IV) 또는 피하 주사), 흡입 (예컨대, 미세 분말 제형을 통해), 경피성, 비강, 질, 직장, 또는 혀 밑 투여 경로에 의한 투여를 포함하고, 각각의 투여 경로에 적절한 투약 형태로 제형화될 수 있다.

대표적인 예로서, MASP-2 억제 항체 및 펩타이드는 폴리펩타이드를 흡수할 수 있는 체막, 예를 들어, 비강, 위장 및 직장 막에 의해 살아있는 신체로 도입될 수 있다. 폴리펩타이드는 전형적으로 침투 인핸서와 함께 흡수성 막에 적용된다 (예를 들어, Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys.　5 :69, 1988; Lee, V.H.L., J.　Controlled Release 13:213, 1990; Lee, V.H.L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York (1991); DeBoer, A.G.,　et　al., J.　Controlled Release　13 :241, 1990. 참조). 예를 들어, STDHF는 담즙산염과 구조가 유사한 스테로이드성 계면활성제인 합성 유도체 of 푸시드산의 합성 유도체이고, 비강 전달을 위한 침투 인핸서로서 사용되었다 (Lee, W.A., Biopharm. 22, Nov./Dec. 1990).

MASP-2 억제 항체 및 폴리펩타이드는 효소성 저하로부터 폴리펩타이드를 보호호기 위해서 또 다른 분자, 예컨대 지질과 공동으로 도입될 수도 있다. 예를 들어, 폴리머, 특히 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 공유 결합에 의한 부착은 신체 내 효소적 가수분해로부터 특정 단백질을 보호하며 따라서 반감기를 연장하는데 사용되었다 (Fuertges, F., et al., J. Controlled Release 11:139, 1990). 많은 폴리머 시스템이 단백질 전달에 대하여 보고되었다 (Bae, Y.H., et al., J. Controlled Release 9:271, 1989; Hori, R., et al., Pharm. Res. 6:813, 1989; Yamakawa, I., et al., J. Pharm. Sci. 79:505, 1990; Yoshihiro, I., et al., J. Controlled Release 10:195, 1989; Asano, M., et al., J. Controlled Release 9:111, 1989; Rosenblatt, J., et al., J. Controlled Release 9:195, 1989; Makino, K., J. Controlled Release 12:235, 1990; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78:117, 1989; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78:219, 1989).

최근에는, 개선된 혈청 반감기 및 순환 반감기를 가진 리포솜이 개발되었다 (예를 들어, Webb의 미국 특허 번호 5,741,516 참조). 게다가, 잠재적 약물 담체로서 리포솜 및 리포솜-유사 제조의 다양한 방법이 검토되었다 (예를 들어, Szoka의 미국 특허 번호 5,567,434; Yagi의 미국 특허 번호 5,552,157; Nakamori의 미국 특허 번호 5,565,213; Shinkarenko의 미국 특허 번호 5,738,868; 및 Gao의 미국 특허 번호 5,795,587 참조).

경피성 적용을 위해, MASP-2 억제 항체 및 폴리펩타이드는 그 밖의 적합한 성분, 예컨대 담체 및/또는 보조제와 조합될 수도 있다. 의도된 투여를 위해 약학적으로 허용 가능해야 하고, 조성물의 활성 성분의 활성을 저하시킬 수 없다는 것을 제외하고는, 이러한 그 밖의 성분의 성질에 대하여 제한되지 않는다. 적합한 비히클의 예는 정제된 콜라겐 유무에 관계없이, 연고, 크림, 겔, 또는 현탁액을 포함한다. MASP-2 억제 항체 및 폴리펩타이드는 또한 바람직하게는 액체 또는 반액체 형태로 경피성 패치, 회반죽, 및 붕대로 함침될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 치료 효과의 원하는 수준을 유지하기 위해 주기적으로 간격을 두고 전신으로 투여될 수도 있다. 예를 들어, 조성물은, 예컨대 피하 주사에 의해 2 내지 4주마다 또는 덜 빈번한 간격으로 투여될 수도 있다. 투약 요법은 작용제의 조합의 작용에 영향을 미칠 수도 있는 다양한 요인을 고려하여 의사에 의해 결정될 것이다. 이들 요인은 치료되는 질병의 진행 정도, 환자의 나이, 성별, 체중, 다른 임상적 요인을 포함할 것이다. 개개의 작용제에 대한 투약량은 조성물에 포함되는 MASP-2 억제제의 기능, 뿐만 아니라 임의의 약물 전달 비히클 (예를 들어, 지효성 전달 비히클)의 존재 및 성질에 따라 달라질 것이다. 이에 더하여, 투약량은 전달된 작용제(들)의 투여 빈도의 변화 및 약동학적 행위를 설명하기 위해 조정될 수도 있다.

국소적 전달

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "국소적"은 의도된 국소화된 작용 부위에 또는 그 주위에 약물의 적용을 포함하고, 예를 들어, 피부 또는 그 밖의 영향을 받는 조직으로와 국부적 전달, 안구 전달, 척추강 내 (IT), 뇌실 내 (ICV), 관절 내, 공동 내, 두개 내 또는 방광 내 투여, 배치 또는 관주법을 포함할 수도 있다. 국소적 투여는 더 낮은 용량의 투여를 가능하게 하기 위해, 전신의 부작용을 막기 위해 및 국소적 전달 부위에 활성제의 전달 시기 및 농도의 더 정확한 제어를 위해 는데 바람직할 수도 있다. 국소적 투여는 대사, 혈류, 등의 환자 간 변동성에 관계없이, 표적 부위에 공지된 농도를 제공한다. 개선된 투약량 제어는 또한 직접적인 전달 방식에 의해 제공된다.

MASP-2 억제제의 국소적 전달은 질환 또는 질병을 치료하기 위한 수술 방법의 맥락에서, 예를 들어, 동맥 바이패스 수술, 죽종 절제술(atherectomy), 레이저 시술, 초음파 시술, 기구 혈관 형성술(balloon angioplasty) 및 스텐트(stent) 배치와 같은 수술 중에 달성될 수도 있다. 예를 들어, MASP-2 억제자는 기구 혈관 형성술과 함께 대상체에게 투여될 수 있다. 기구 혈관 형성술은 수축된 기구를 가진 카테터를 동맥으로 삽입하는 것을 포함한다. 수축된 기구는 죽상 경화 플라크(atherosclerotic plaque)에 근접하게 배치되고 플라크가 혈관 벽에 압착되도록팽창된다. 결과로서, 기구 표면은 혈관의 표면 상의 혈관 내피 세포 층과 접촉된다. MASP-2 억제제는 죽상 경화 플라크의 부위에서 작용제의 방출을 허용하는 방식으로 기구 혈관 형성 카테터에 부착될 수도 있다. 작용제는 업계에 공지된 표준 과정에 따라 기구 카테터에 부착될 수도 있다. 예를 들어, 작용제는 기구가 팽창될 때까지 기구 카테터의 구획에 저장될 수도 있으며, 이 지점에서 국소적 환경으로 방출된다. 대안으로, 작용제는 기구 표면으로 함침될 수도 있으며, 이로써 기구가 팽창됨에 따라 동맥 벽의 세포와 접촉한다. 작용제는 또한 Flugelman, M.Y., et al., Circulation 85:1110-1117, 1992에서 개시된 것들과 같은 천공된 기구 카테터에서 전달될 수도 있다. 또한 기구 혈관 형성술 카테터에 치료 단백지릉ㄹ 부착시키기 위한 예시적 과정에 대하여 공개된 PCT 출원 WO 95/23161을 참고하면 된다. 마찬가지로, MASP-2 억제제는 스텐트에 적용된 겔 또는 폴리머 코팅에 포함될 수도 있거나, 또는 스텐트의 재료로 포함될 수도 있으며, 이로써 스텐트는 혈관 배치 후 MASP-2 억제제를 용출시킨다.

관절염 및 그 밖의 근골격 장애의 치료에 사용되는 MASP-2 억제 조성물은 관절 내 주사에 의해 국소적으로 전달될 수도 있다. 이러한 조성물은 적합하게는 지효성 전달 비히클을 포함할 수도 있다. 국소적 전달이 바람직할 수도 있는 경우의 추가의 예로서, 비뇨 생식기 질병의 치료에 사용되는 MASP-2 억제 조성물은 적합하게는 방광 내로 또는 또 다른 비뇨 생식기 구조 내로 서서히 주입될 수도 있다.

의료 디바이스 상의 코팅

MASP-2 억제제, 예컨대 항체 및 억제 펩타이드는 이식 가능한 또는 부착 가능한 의료 디바이스의 표면으로 (또는 표면 내에) 고정될 수도 있다. 변형된 표면은 전형적으로 동물 신체로 이식 후 살아있는 조직과 접촉될 것이다. "이식 가능한 또는 부착 가능한 의료 디바이스"는 디바이스 (예를 들어, 스텐트 이식 가능한 약물 전달 디바이스)의 정상 작동 중에 동물 신체의 조직에 이식되거나, 또는 이것에 부착되는 임의의 디바이스로 의도된다. 이러한 이식 가능한 또는 부착 가능한 의료 디바이스는, 예를 들어, 나이트로셀룰로스, 디아조셀룰로스, 유리, 폴리스티렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 세파로스, 아가, 전분, 나일론, 스테인리스 강, 티타늄 및 생분해성 및/또는 생체 적합성 폴리머로 만들어질 수 있다. 디바이스로의 단백질의 결합은 결합된 단백질의 생물학적 활성을 파괴하지 않는 임의의 기술에 의해, 예를 들어, 디바이스로의 단백질의 N- C-말단 잔기 중 하나 또는 둘 다를 부착시킴으로써 달성될 수 있다. 부착은 또한 단백질의 하나 이상의 내부 부위에서 이루어질 수도 있다. 다수의 부착 (단백질 내부 및 단부 둘 다에서)이 또한 사용될 수도 있다. 이식 가능한 또는 부착 가능한 의료 디바이스의 표면은 그것으로의 단백질 고정을 위해 작용기 (예를 들어, 카르복실, 아미드, 아미노, 에테르, 하이드록실, 시아노, 나이트로도, 설판아미도, 아세틸린, 에폭사이드, 실란, 시알린, 무수, 숙시님, 아지도)를 포함하도록 변형될 수 있다. 결합 화학법은 에스터, 에테르, 아미드, 아지도 및 설판아미도 유도체, 시아네이트 및 MASP-2 항체 또는 억제 펩타이드 상에서 이용 가능한 작용기로의 그 밖의 결합의 형성을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. MASP-2 항체 또는 억제 단편은 또한 GST (D.B. Smith and K.S. Johnson, Gene 67:31, 1988), 폴리히스티딘 (E. Hochuli et al., J. Chromatog. 411:77, 1987), 또는 비오틴과 같은 단백질로의 친화도 태그 서열의 추가에 의해 비-공유 결합으로 부착될 수 있다. 이러한 친화도 태그는 디바이스로의 단백질의 가역적 부착에 사용될 수도 있다.

단백질은 또한 디바이스 본체의 표면 상에 공유 결합으로, 예를 들어, 의료 디바이스의 표면의 공유 결합에 의한 활성화에 의해 부착될 수 있다. 대표적인 예로서, 모세포 단백질(들)은 반응기의 다음 쌍 중 어느 것 (디바이스 본체의 표면 상에 존재하는 쌍의 한 구성원, 및 모세포 단백질(들) 상에 존재하는 쌍의 다른 한 구성원)에 의해서도 디바이스 본체에 부착될 수 있다: 에스터 결합을 수득하기 위해서는 하이드록실/카르복실산; 에스터 결합을 수득하기 위해서는 하이드록실/무수물; 우레탄 결합을 수득하기 위해서는 하이드록실/아이소시아네이트. 유용한 반응기를 가지고 있지 않은 디바이스 본체의 표면은 모세포 단백질(들)의 침착을 허용하기 위해 반응기를 생성하도록 에칭된 고주파수 방전 플라스마 (radio-frequency discharge plasma; RFGD) (예를 들어, 산소-함유 기를 도입하기 위해 산소 플라스마로의 처리; 아민 기를 도입하기 위해 프로필 아미노 플라스마로의 처리)가 처리될 수 있다.

안티센스, RNAi- 또는 DNA-암호화 펩타이드 억제자와 같은 핵산 분자를 포함하는 MASP-2 억제제는 디바이스 본체에 부착된 다공성 매트릭스에 임베딩될 수 있다 (embedded). 표면층을 만드는데 유용한 대표적인 다공성 매트릭스는 상업적 공급처 (예를 들어, Sigma and Collagen Corporation)로부터 얻을 수도 있는 바와 같이, 힘줄 또는 피부 콜라겐으로부터 제조된 것, 또는 Jefferies의 미국 특허 번호 4,394,370, 및 Koezuka의 4,975,527에서 기술된 바와 같이 제조된 콜라겐 매트릭스이다. 한 콜라겐 물질은 UltraFiber™이라고 불리며 Norian Corp. (캘리포니아 마운틴 뷰)로부터 얻어진다.

예를 들어, Urist의 미국 특허 번호 4,526,909 및 4,563,489에서 개시된 바와 같이, 원하는 경우 특정 폴리머 매트릭스가 또한 이용될 수도 있고, 아크릴산 에스터 폴리머 및 젖산 폴리머를 포함할 수도 있다. 유용한 폴리머의 특정 예는 오르쏘에스터, 무수물, 프로필렌-코푸마레이트의 것들, 또는 하나 이상의 α-하이드록시 카르복실산 모노머, (예를 들어, α-하이드록시 아세트산 (글리콜산) 및/또는 α-하이드록시 프로피온산 (젖산))의 폴리머이다.

치료 요법

예방적 용도로, 약학적 조성물은 MASP-2-의존적 보체 활성화와 관련된 질병에 민감하거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 질병의 증상에 걸릴 위험을 제거하거나 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다. 치료적 용도로, 약학적 조성물은 MASP-2-의존적 보체 활성화와 관련된 질병으로 의심되거나, 또는 이것을 이미 앓고 있는 대상체에게 질병의 증상을 경감하거나, 또는 적어도 부분적으로 감소시키기에 충분한 치료적 유효량으로 투여된다. 예방적 및 치료적 요법 둘 다에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 대상체에서 충분한 치료 결과가 달성될 때까지 다회수 투약량으로 투여될 수도 있다. 본 발명의 MASP-2 억제 조성물의 적용은 급성 질병, 예를 들어, 재관류 손상 또는 그 밖의 외상성 손상의 치료를 위해 조성물의 1회 투여, 또는 제한된 순서의 투여로 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은, 예를 들어, 관절염 또는 건선(psoriasis)의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로 투여될 수도 있다.

본 발명의 방법 및 조성물은 전형적으로 진단적 및 치료적 의료 및 수술 과정으로부터 발생하는 염증 및 관련된 과정을 억제하는데 사용될 수도 있다. 이러한 과정을 억제하기 위해서, 본 발명의 MASP-2 억제 조성물은 수술 부위로 적용될 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이 "수술 부위로"는 수술 전에 및/또는 수술 중에 및/또는 수술 후에, 즉, 수술 전에, 수술 전에 및 중에, 수술 전에 및 후에, 수술 중에 및 후에, 수술 중에, 수술 중에 및 후에, 또는 수술 후에 억제 조성물의 투여를 말한다. 수술 부위 적용은 수술 또는 수술 부위에 조성물의 투여에 의해, 예컨대 부위의 주사 또는 지속적인 또는 간헐적인 관주법에 의해 또는 전신 투여에 의해 수행될 수도 있다. MASP-2 억제제 용액의 국소적 수술 부위 전달에 적합한 방법은 Demopulos의 미국 특허 번호 6,420,432 및 Demopulos의 6,645,168에서 개시된다. MASP-2 억제제(들)를 포함하는 콘드로프로텍티브(chondroprotective) 조성물의 국소적 전달에 적합한 방법은 국제 PCT 특허 출원 WO 01/07067 A2에서 개시된다. MASP-2 억제제(들)를 포함하는 콘드로프로텍티브 조성물의 표적화된 전신 전달에 적합한 방법 및 조성물은 국제 PCT 특허 출원 WO 03/063799 A2에서 개시된다.

본 발명의 한 양태에서, 약학적 조성물은 혈전성 미세혈관증 (TMA)을 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여된다. 한 구체예에서, TMA는 용혈성 요독성 증후군 (HUS), 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP) 및 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, TMA는 aHUS이다. 한 구체예에서, 조성물은 질환의 급성기 중에 aHUS 환자에게 투여된다. 한 구체예에서, 조성물은 관해기 (즉, 예를 들어, Loirat C et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 6:60, 2011에서 기술된 바와 같이, 급성기 aHUS의 에피소드로부터 회복되거나 또는 부분적으로 회복된 환자에서, 예를 들어, 증가된 혈소판 수준 및/또는 감소된 혈청 LDH 농도에 의해 입증된 이러한 차도, 본원에 참조로 포함된다) 중에 aHUS 환자에게 투여된다. 한 구체예에서, 대상체는 (i) 암에 부차적인 TMA; (ii) 화학요법에 부차적인 TMA; 또는 (iii) 이식에 부차적인 TMA (예를 들어, 장기 이식, 예컨대 신장 이식 또는 동종 이계 조혈모세포 이식)인 TMA를 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있다. 한 구체예에서, 대상체는 업쇼-슐만 증후군 (USS)을 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있다. 한 구체예에서, 대상체는 디고스 병을 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있다. 한 구체예에서, 대상체는 치명적 항인지질 증후군 (CAPS)을 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있다. 치료적 용도로, 약학적 조성물은 TMA를 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 혈전 형성을 억제하거나, 질병의 증상을 적어도 부분적으로 완화하거나, 또는 적어도 부분적으로 감소시키기에 충분한 치료적 유효량으로 투여된다.

예방적 및 치료적 요법 둘 다에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 대상체에서 충분한 결과가 달성될 때까지 다회수 투약량으로 투여될 수도 있다. 본 발명의 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 항체를 포함하며, 이것은 적합하게는 0.1 mg 내지 10,000 mg, 더 적합하게는 1.0 mg 내지 5,000 mg, 더 적합하게는 10.0 mg 내지 2,000 mg, 더 적합하게는 10.0 mg 내지 1,000 mg 및 더 적합하게는 50.0 mg 내지 500 mg의 투약량으로 성인 환자 (예를 들어, 70 kg의 평균 성인 체중)에게 투여될 수도 있다. 소아 환자에 대하여, 투약량은 환자의 체중에 비례하여 조정될 수 있다. 본 발명의 MASP-2 억제 조성물의 적용은 TMA의 치료를 위해 조성물의 1회 투여, 또는 제한된 순서의 투여로 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 TMA의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월마다 투여될 수도 있다.

일부 구체예에서, TMA를 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체는 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자로의 처리를 이전에 받았거나, 또는 현재 받고 있다. 일부 구체예에서, 방법은 대상체에게 MASP-2 억제자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계 및 대상체에게 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자를 더 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제자는 인간화 항-C5 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제자는 에쿨리쥬맙이다.

본 발명의 한 양태에서, 약학적 조성물은 aHUS로 의심되거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 질병의 증상에 걸릴 위험을 제거하거나 또는 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다. 치료적 용도로, 약학적 조성물은 aHUS로 의심되거나, 또는 이미 이것을 앓고 있는 대상체에게 질병의 증상을 완화하거나, 또는 이것을 적어도 부분적으로 감소시키기에 충분한 치료적 유효량으로 투여된다. 본 발명의 한 양태에서, 투여 전에, 대상체는 (i) 빈혈증, (ii) 혈소판 감소증 (iii) 신부전 및 (iv) 크레아티닌 증가를 포함하는, aHUS의 하나 이상의 증상을 나타내는지 결정하기 위해 검사될 수도 있고, 그 다음에 본 발명의 조성물은 이들 증상(들)을 개선하기 위해 유효량으로 및 충분한 기간 동안 투여된다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 MASP-2 억제 조성물은 aHUS에 걸릴 위험이 증가된 대상체를 예방적으로 치료하는데 사용될 수 있으며 이로 인해 aHUS를 전달할 가능성을 감소시킨다. aHUS와 관련된 것으로 알려져 있는 대상체에서 유전자 마커의 존재는 먼저 대상체로부터 얻어진 샘플에서 유전자 스크리닝 테스트를 수행하고 aHUS와 관련된 적어도 하나의 유전자 마커, 보체 인자 H (CFH), 인자 I (CFI), 인자 B (CFB), 막 공통 인자 CD46, C3, 보체 인자 H-관련 단백질 (CFHR1), 항응고 단백질 트롬보듈린 (THBD), 보체 인자 H-관련 단백질 3 (CFHR3) 또는 보체 인자 H-관련 단백질 4 (CFHR4)의 존재를 식별함으로써 결정될 수 있다. 그 다음에 대상체는 aHUS의 적어도 하나의 증상, 예컨대 빈혈증, 혈소판 감소증, 신부전 및 크레아티닌 증가의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 주기적으로 (예를 들어, 매월, 분기별로, 1년에 2회 또는 매년) 모니터링된다. 이들 증상 중 적어도 하나의 존재의 결정시, 대상체는 상기 하나 이상의 증상을 개선하기 위해 유효량으로 및 충분한 기간 동안 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제제가 투여될 수 있다. 본 발명의 추가의 양태에서, aHUS와 관련된 유전자 마커 중 하나를 가진 것으로 스크리닝되고 결정된 것으로 인해 aHUS에 걸릴 위험이 증가된 대상체는 약물 노출, 감염 (예를 들어, 박테리아 감염), 악성 종양, 손상, 장기 또는 조직 이식 및 임신을 포함하는 트리거링 aHUS 임상적 증상과 관련된 이벤트의 발생에 대하여 모니터링될 수도 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양의 MASP-2을 포함하는 조성물은 감염에 부차적인 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)을 앓고 있거나 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 감염과 관련된 비-장용성 aHUS를 앓고 있거나 이것에 걸릴 위험이 있는 환자는 본 발명의 조성물로 처리될 수도 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, aHUS을 앓고 있는 대상체는 초기에 제1 기간, 예컨대 1시간, 12시간, 1일, 2일 또는 3일 동안 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 처리될 수도 있으며, 카테터 라인, 예컨대 정맥 내 카테터 라인 또는 피하 카테터 라인을 통해 투여된다. 그 다음에 대상체는 제2 기간 동안 규칙적인 피하 주사, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월마다 주사를 통해 투여되는 MASP-2 억제 조성물로 처리될 수도 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 MASP-2 억제 조성물은 출혈, 감염, 및 혈장 공여체에서, 또는 혈장 반출법을 꺼리는 대상체에서, 또는 혈장 반출법이 이용 불가능한 설정에서 내재된 장애 및/또는 알레르기에 대한 노출을 포함한 혈장 반출법의 잠재적 합병증을 막기 위해서, 혈장 반출법의 부재 하에서 aHUS를 앓고 있는 대상체 (즉, aHUS 증상이 혈장 반출법으로 처리된 적이 없고 MASP-2 억제 조성물로의 처리시 혈장 반출법으로 처리되지 않는 대상체)에게 투여될 수도 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 MASP-2 억제 조성물은 aHUS를 앓고 있는 대상체에게 투여될 수도 있으며 혈장 반출법으로 환자를 처리하는 것과 일치한다. 예를 들어, 혈장 반출법을 받은 대상체는 혈장 교환 이후 또는 혈장 교환과 교대로 MASP-2 억제 조성물이 투여될 수 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, aHUS를 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있으며 MASP-2 억제 본 발명의 조성물로 처리되고 있는 대상체는 적어도 하나의 보체 인자의 수준을 주기적으로, 예컨대 12시간 마다 또는 매일 결정함으로써 모니터링될 수 있으며, 표준치 또는 건강한 대상체와 비교하여 적어도 하나의 보체 인자의 감소된 수준의 결정은 조성물로의 지속적인 처리에 대한 필요성을 나타낸다.

예방적 및 치료적 양생법 둘 다에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 대상체에서 충분한 치료 결과가 달성될 때까지 다회수 투약으로 투여될 수도 있다. 본 발명의 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 항체를 포함하며, 이것은 적합하게는 성인 환자 (예를 들어, 70 kg의 평균 성인 체중)에게 0.1 mg 내지 10,000 mg, 더 적합하게는 1.0 mg 내지 5,000 mg, 더 적합하게는 10.0 mg 내지 2,000 mg, 더 적합하게는 10.0 mg 내지 1,000 mg 및 더 적합하게는 50.0 mg 내지 500 mg의 투약량으로 투여될 수도 있다. 소아 환자에 대해, 투약량은 환자의 체중에 비례하여 조정될 수 있다. 본 발명의 MASP-2 억제 조성물의 적용은 aHUS의 치료를 위해 조성물의 1회 투여, 또는 제한된 순서의 투여로 수행될 수 있다. 대안으로, 조성물은 aHUS의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월마다 투여될 수도 있다.

일부 구체예에서, aHUS를 앓고 있는 대상체는 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자로의 처리를 이전에 받았거나, 또는 현재 받고 있다. 일부 구체예에서, 방법은 대상체에게 MASP-2 억제자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계 및 대상체에게 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자를 더 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제자는 인간화 항-C5 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제자는 에쿨리쥬맙이다.

본 발명의 한 양태에서, 약학적 조성물은 HUS로 의심되거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 질병의 증상에 걸릴 위험을 제거하거나 또는 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다. 치료적 용도로, 약학적 조성물은 HUS로 의심되거나, 또는 이미 이것을 앓고 있는 대상체에게 질병의 증상을 완화하거나, 또는 이것을 적어도 부분적으로 감소시키기에 충분한 치료적 유효량으로 투여된다.

본 발명의 또 다른 양태에서, HUS에 걸릴 위험이 있는 대상체에서 손상된 신장 기능에 걸릴 가능성은 대상체에게 본 발명의 MASP-2 억제 조성물을 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하는데 효과적인 양으로 투여함으로써 감소된다. 예를 들어, HUS에 걸릴 위험이 있고 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 처리되어야 하는 대상체는 설사, 혈관 내 적혈구 파괴의 증거가 있는 30% 미만의 적혈구 용적 수준, 혈소판 감소증 및 크레아티닌 증가 수준을 포함한 HUS와 관련된 하나 이상의 증상을 나타낼 수도 있다. 추가의 예로서, HUS에 걸릴 위험이 있고 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 처리되어야 하는 대상체는 대장균, 시겔라 또는 살모넬라로 감염될 수도 있다. 대장균, 시겔라 또는 살모넬라로 감염된 이러한 대상체는 항생제 처리와 동시에 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 처리될 수도 있거나, 또는 대안으로, 특히, 항생제 처리가 금지된 장성 대장균에 대해서는 항생제와 동시 투여 없이 MASP-2 억제 조성물로 처리될 수도 있다. 항생제로 처리된 장성 대장균으로 감염된 대상체는 HUS에 걸릴 위험이 증가될 수도 있고, 상기 위험을 감소시키기 위해 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 적합하게 처리될 수도 있다. 장성 대장균으로 감염된 대상체는 제1 기간 동안 항생제의 부재 하에서 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 처리된 다음 제2 기간 동안 본 발명의 MASP-2 억제 조성물 및 항생제 둘 다로 처리될 수도 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, HUS를 앓고 있는 대상체는 제 1 기간, 예컨대 1시간, 12시간, 1일, 2일 또는 3일 동안 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 처리될 수도 있으며, 이것은 카테터 라인, 예컨대 정맥 내 카테터 라인 또는 피하 카테터 라인을 통해 투여된다. 그 다음에 대상체는 제2 기간 동안 규칙적인 피하 주사, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월마다 주사를 통해 투여되는 MASP-2 억제 조성물로 처리될 수도 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 MASP-2 억제 조성물은 출혈, 감염, 및 혈장 공여체에서, 또는 혈장 반출법을 꺼리는 대상체에서, 또는 혈장 반출법이 이용 불가능한 설정에서 내재된 장애 및/또는 알레르기에 대한 노출을 포함한 혈장 반출법의 잠재적 합병증을 막기 위해서, 혈장 반출법의 부재 하에서 HUS를 앓고 있는 대상체 (즉, HUS 증상이 혈장 반출법으로 처리된 적이 없고 MASP-2 억제 조성물로 처리시 혈장 반출법으로 처리되지 않는 대상체)에게 투여될 수도 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 MASP-2 억제 조성물은 HUS를 앓고 있는 대상체에게 투여될 수도 있으며 혈장 반출법으로 환자를 처리하는 것과 일치한다. 예를 들어, 혈장 반출법을 받은 대상체는 혈장 교환 이후 또는 혈장 교환과 교대로 MASP-2 억제 조성물이 투여될 수 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, HUS를 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있으며 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 처리되고 있는 대상체는 적어도 하나의 보체 인자의 수준을 주기적으로, 예컨대 12시간 마다 또는 매일 결정함으로써 모니터링될 수 있으며, 표준치 또는 건강한 대상체와 비교하여 적어도 하나의 보체 인자의 감소된 수준의 결정은 조성물로의 지속적인 처리에 대한 필요성을 나타낸다.

예방적 및 치료적 양생법 둘 다에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 대상체에서 충분한 치료 결과가 달성될 때까지 다회수 투약으로 투여될 수도 있다. 본 발명의 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 항체를 포함하며, 이것은 적합하게는 성인 환자 (예를 들어, 70 kg의 평균 성인 체중)에게 0.1 mg 내지 10,000 mg, 더 적합하게는 1.0 mg 내지 5,000 mg, 더 적합하게는 10.0 mg 내지 2,000 mg, 더 적합하게는 10.0 mg 내지 1,000 mg, 더 적합하게는 50.0 mg 내지 500 mg의 투약량으로 투여될 수도 있다. 소아 환자에 대해, 투약량은 환자의 체중에 비례하여 조정될 수 있다. 본 발명의 MASP-2 억제 조성물의 적용은 HUS의 치료를 위해 조성물의 1회 투여, 또는 제한된 순서의 투여로 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 HUS의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월마다 투여될 수도 있다.

일부 구체예에서, HUS를 앓고 있는 대상체는 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자로의 처리를 이전에 받았거나, 또는 현재 받고 있다. 일부 구체예에서, 방법은 대상체에게 MASP-2 억제자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계 및 대상체에게 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자를 더 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제자는 인간화 항-C5 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제자는 에쿨리쥬맙이다.

본 발명의 한 양태에서, 약학적 조성물은 TTP로 의심되거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 질병의 증상에 걸릴 위험을 제거하거나 또는 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다. 치료적 용도로, 약학적 조성물은 TTP로 의심되거나, 또는 이미 이것을 앓고 있는 대상체에게 질병의 증상을 완화하거나, 또는 이것을 적어도 부분적으로 감소시키기에 충분한 치료적 유효량으로 투여된다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 중추신경계 포함, 혈소판 감소증, 중증 심장 포함, 중증 폐 포함, 위장관 경색 및 괴저를 포함하는, TTP의 증상 중 하나 이상을 나타내는 대상체는 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 처리될 수도 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 하락한 ADAMTS13 수준을 갖는 것으로 결정되었고 또한 ADAMTS13의 억제자 (즉, 항체)의 존재에 대하여 양성 반응을 보이는 대상체는 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 처리될 수도 있다. 본 발명의 추가의 양태에서, ADAMTS13의 억제제의 존재에 대하여 양성 반응을 보이는 대상체는 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로의 처리와 동시에 면역억제제 (예를 들어, 코르티코스테로이드, 리툭산, 또는 사이클로스포린)로 처리될 수도 있다. 본 발명의 추가의 양태에서, ADAMTS13의 수준이 감소된 것으로 결정되고 ADAMTS13의 억제자의 존재에 대하여 양성 반응을 보이는 대상체는 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로의 처리와 동시에 ADAMTS13로 처리될 수도 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, TTP를 앓고 있는 대상체는 초기에 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 처리될 수도 있으며, 이것은 제1 기간, 예컨대 1시간, 12시간, 1일, 2일 또는 3일 동안 카테터 라인, 예컨대 정맥 내 카테터 라인 또는 피하 카테터 라인을 통해 투여된다. 그 다음에 대상체는 제2 기간 동안 규칙적인 피하 주사, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월마다 주사를 통해 투여되는 MASP-2 억제 조성물로 처리될 수도 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 MASP-2 억제 조성물은 출혈, 감염, 및 혈장 공여체, 또는 혈장 반출법을 꺼리는 대상체에서, 또는 혈장 반출법이 이용 불가능한 설정에서 내재된 장애 및/또는 알레르기에 대한 노출을 포함한 혈장 반출법의 잠재적 합병증을 막기 위해서, 혈장 반출법의 부재 하에서 HUS를 앓고 있는 대상체 (즉, TTP 증상이 혈장 반출법으로 처리된 적이 없고 MASP-2 억제 조성물로 처리시 혈장 반출법으로 처리되지 않는 대상체)에게 투여될 수도 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 MASP-2 억제 조성물은 TTP를 앓고 있는 대상체에게 투여될 수도 있으며 혈장 반출법으로 환자를 처리하는 것과 일치한다. 예를 들어, 혈장 반출법을 받은 대상체는 혈장 교환 이후 또는 혈장 교환과 교대로 MASP-2 억제 조성물이 투여될 수 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, 난치성 TTP, 즉, 그 밖의 처리, 예컨대 혈장 반출법에 대하여 충분히 반응하지 않는 TTP의 증상을 앓고 있는 대상체는 추가적인 혈장 반출법의 유무에 관계없이 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 처리될 수도 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, TTP를 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있으며 본 발명의 MASP-2 억제 조성물로 처리되고 있는 대상체는 적어도 하나의 보체 인자의 수준을 주기적으로, 예컨대 12시간 마다 또는 매일 결정함으로써 모니터링될 수 있으며, 표준치 또는 건강한 대상체와 비교하여 적어도 하나의 보체 인자의 감소된 수준의 결정은 조성물로의 지속적인 처리에 대한 필요성을 나타낸다.

예방적 및 치료적 양생법 둘 다에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 대상체에서 충분한 치료 결과가 달성될 때까지 다회수 투약으로 투여될 수도 있다. 본 발명의 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 항체를 포함하며, 이것은 적합하게는 성인 환자 (예를 들어, 70 kg의 평균 성인 체중)에게 0.1 mg 내지 10,000 mg, 더 적합하게는 1.0 mg 내지 5,000 mg, 더 적합하게는 10.0 mg 내지 2,000 mg, 더 적합하게는 10.0 mg 내지 1,000 mg 및 더 적합하게는 50.0 mg 내지 500 mg의 투약량으로 투여될 수도 있다. 소아 환자에 대해, 투약량은 환자의 체중에 비례하여 조정될 수 있다. 본 발명의 MASP-2 억제 조성물의 적용은 HUS의 치료를 위해 조성물의 1회 투여, 또는 제한된 순서의 투여로 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 HUS의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월마다 투여될 수도 있다.

일부 구체예에서, TTP를 앓고 있는 대상체는 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자로의 처리를 이전에 받았거나, 또는 현재 받고 있다. 일부 구체예에서, 방법은 대상체에게 MASP-2 억제자를 포함하는 본 발명의 조성물을 투여하는 단계 및 대상체에게 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자를 더 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제자는 인간화 항-C5 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제자는 에쿨리쥬맙이다.

VI. 실시예

다음 실시예는 단지 본 발명을 실시하기 위해 현재 고려되고 있는 최선의 방식을 예시하지만, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에서 모든 인용 문헌은 분명히 참고로 포함된다.

다음의 실시예들은 단지 발명을 실시하기 위해 고려된 최상의 방식을 예시하지만, 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 문헌은 분명하게 참조로 포함된다.

실시예 1

이 실시예는 MAp19 (MAp19+/+)는 충분하지만 MASP-2의 마우스 계통 결핍 (MASP-2-/-)의 생성을 기술한다.

재료 및 방법: 도 3에서 도시된 바와 같이, 세린 프로테아제 도메인을 암호화하는 엑손을 포함한, 쥐 MASP-2의 C-말단 단부를 암호화하는 세 개의 엑손을 파괴시키기 위해 표적화 벡터 pKO-NTKV 1901을 설계하였다. PKO-NTKV 1901을 사용하여 쥐 ES 세포주 E14.1a (SV129 Ola)를 트랜스펙션하였다. 네오마이신-저항성 및 티미딘 키나제-민감성 클론을 선택하였다. 600 ES 클론을 스크리닝하였고, 이것들 중에서, 네 개의 상이한 클론을 서던 블롯에 의해 도 3에서 도시된 바와 같이 예상된 선택적 표적화 및 재조합 이벤트를 포함하는 것으로 식별하고 확인하였다. 배아 이식에 의해 이들 네 개의 양성 클론으로부터 키메라를 생성하였다. 그 다음에 키메라를 유전적 배경 C57/BL6에서 역교배시켜 트랜스제닉 수컷을 생성하였다. 트랜스제닉 수컷을 암컷과 교배하여 자손 중 50%가 파괴된 MASP-2 유전자에 대하여 이형접합성을 나타내는 F1을 생성하였다. 이형접합성 마우스를 이종교배시켜 동형 접합성 MASP-2 결핍 자손을 생성하였으며, 각각 1:2:1 비율의 이형접합성 및 야생형 마우스를 생성하였다.

결과 및 표현형: 결과로 생성된 동형 접합성 MASP-2-/- 결핍 마우스는 생존 가능하고 수태 가능한 것으로 밝혀졌으며 서던 블롯에 의해 올바른 표적화 이벤트를 식별하고, 노던 블롯에 의해 MASP-2 mRNA의 존재를 식별하고, 웨스턴 블롯에 의해 MASP-2 단백질의 부재를 확인하기 위해 MASP-2 결핍인 것으로 확인하였다 (데이터 미도시). MAp19 mRNA의 존재 및 MASP-2 mRNA의 부재를 LightCycler 장치 상에서 시간-해소 RT-PCR을 사용하여 더 확인하였다. MASP-2-/- 마우스는 예상된 바와 같이 MAp19, MASP-1, 및 MASP-3 mRNA 및 단백질을 발현하였다 (데이터 미도시). MASP-2-/- 마우스에서 프로퍼딘, 인자 B, 인자 D, C4, C2, 및 C3에 대한 mRNA의 존재 및 풍부함을 LightCycler 분석에 의해 평가하였고 야생형 한배 새끼 대조군과 동일하다는 것을 발견하였다 (데이터 미도시). 동형 접합성 MASP-2-/- 마우스의 혈장은 실시예 2에서 더 기술된 바와 같이 렉틴-경로-매개 보체 활성가 완전히 결핍된다.

순수한 C57BL6 배경의 MASP-2-/- 계통의 생성: MASP-2-/- 마우스를 실험 동물 모델로서 MASP-2-/- 계통의 사용 전에 순수한 C57BL6 계통과 9세대 동안 역교배시켰다.

쥐 MASP-2-/-, MAp19+/+이고 인간 MASP-2 이식 유전자 (쥐 MASP-2 넉아웃(knock-out) 및 인간 MASP-2 넉인(knock-in))를 발현하는 트랜스제닉 마우스 계통을 다음과 같이 생성하였다:

재료 및 방법: 도 4에서 도시된 바와 같이 인간 MASP 2 유전자의 프로모터 영역을 포함하는, "미니 hMASP-2"라고 불리는 인간 MASP-2를 암호화하는 꼬마유전자 (서열 번호:49)를 구성하였으며, 처음 3개의 엑손 (엑손 1 내지 엑손 3)에 이어서 다음 8개의 엑손의 암호화 서열을 제공하는 cDNA 서열을 포함하여, 내인성 프로모터에 의해 구동되는 전장 MASP-2 단백질을 암호화한다. 결핍 쥐 MASP 2 유전자를 유전자 이식에 의해 발현된 인간 MASP-2에 의해 대체하기 위해 미니 hMASP-2 구조체를 MASP-2-/-의 수정란으로 주사하였다.

실시예 2

이 실시예는 MASP-2가 렉틴 경로를 통한 보체 활성화에 필요하다는 것을 입증한다.

방법 및 재료:

렉틴 경로 특이적 C4 분열 검정: L-피콜린에 결합하는, 스타필로코쿠스 아우레우스의 리포테이코산 (LTA)으로부터 발생한 렉틴 경로 활성화를 측정하는 C4 분열 검정은 Petersen,　et　al., J.　Immunol. Methods　257:107 (2001)에 의해 기술되어 있다. Petersen et al., (2001)에서 기술된 검정을 하기 기술된 바와 같이 ASP-2 -/- 마우스의 혈청을 추가하기 전에 LPS 및 만난 또는 치모산으로 플레이트를 코팅함으로써 MBL을 통한 렉틴 경로 활성화를 측정하도록 맞춰 조정하였다. 고전적 경로로 인한 C4 분열의 가능성을 제거하기 위해 검정을 또한 변형시켰다. 이것을 1 M NaCl을 함유하는 샘플 희석 버퍼를 사용하여 달성하였으며, 이것은 리간드로의 렉틴 경로 인식 구성요소의 고친화도 결합을 허용하지만 내인성 C4의 활성화를 방지하며, 이로 인해 C1 복합체를 해리시킴으로써 고전적 경로의 참여를 배제한다. 간략히 기술된 바와 같이, 변형된 검정에서 혈청 샘플 (고염 (1 M NaCl) 버퍼에 희석됨)을 리간드-코팅된 플레이트에 추가한 후 이어서, 염의 생리학적 농도를 가진 버퍼에서 일정한 양의 정제된 C4를 추가하였다. MASP-2를 함유하는 결합된 인식 복합체는 C4를 분열시키며, C4b 침착을 초래한다.

검정 방법:

1) Nunc Maxisorb 미세역가 플레이트 (Maxisorb, Nunc, 카탈로그 번호 442404, Fisher Scientific)를 코팅 버퍼 (15 mM Na₂CO₃, 35 mM NaHCO₃, pH 9.6)에 희석된 1 μg/ml 만난 (M7504 Sigma) 또는 임의의 그 밖의 리간드 (예를 들어, 하기 나열된 것들)로 코팅하였다.

다음 시약을 검정에 사용하였다:

a. 만난 (100 μl 코팅 버퍼 중의 1 μg/웰 만난 (M7504 Sigma)):

b. 치모산 (100 μl 코팅 버퍼 중의 1 μg/웰 치모산 (Sigma));

c. LTA (100 μl 코팅 버퍼 중의 1μg/웰 또는 20 μl 메탄올 중의 2 μg/웰)

d. 코팅 버퍼 중의 H-피콜린 특이적 Mab 4H5 1 μg

e. 에어로코쿠스 비리단스(Aerococcus viridans)의 PSA (100 μl 코팅 버퍼 중의 2 μg/웰)

f. 코팅 버퍼 중의 포르말린-고정된 스타필로코쿠스 아우레우스 DSM20233 100 μl/웰 (OD₅₅₀=0.5).

2) 플레이트를 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다.

3) 밤새도록 인큐베이션 후, 잔류 단백질 결합 부위를 플레이트를 0.1% HSA-TBS 차단 버퍼 (10 mM Tris-CL, 140 mM NaCl, 1.5 mM NaN₃, pH 7.4 중의 0.1% (w/v) HSA)와 함께 1-3시간 동안 인큐베이션하여 포화시킨 다음, 플레이트를 TBS/tween/Ca²⁺ (0.05% Tween 20 및 5 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, pH 7.4가 들어있는 TBS)로 3회 세척하였다.

4) 텍스트하고자 하는 혈청 샘플의 MBL-결합 버퍼 (1 M NaCl)에서 희석하였고 희석된 샘플을 플레이트에 추가하여 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 단지 버퍼만을 받은 웰을 음성 대조군으로 사용하였다.

5) 4℃에서 밤새도록 인큐베이션 후, 플레이트를 TBS/tween/Ca2+로 3회 세척하였다. 그 다음에 인간 C4 (BBS (4 mM 바비탈, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, pH 7.4)에 희석된 1 μg/ml의 100 μl/웰)를 플레이트에 추가하였고 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 TBS/tween/Ca²⁺로 3회 세척하였다.

6) C4b 침착을 알칼리성 포스파타제-컨쥬게이션된 닭 항-인간 C4c (TBS/tween/Ca²⁺에 1:1000로 희석됨)로 검출하였으며, 이것을 플레이트에 추가하였고 실온에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에 플레이트를 다시 TBS/tween/Ca²⁺로 3회 세척하였다.

7) p-나이트로페닐 포스페이트 기질 용액 100 μl를 추가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하고, 미세역가 플레이트 리더에서 OD₄₀₅를 판독하여 알칼리성 포스파타제를 검출하였다.

결과: 도 5A-B는 MASP-2+/+ (십자형), MASP-2+/- (닫힌 원) 및 MASP-2-/- (닫힌 삼각형)의 혈청 희석액에서 만난 (도 5A) 및 치모산 (도 5B) 상의 C4b 침착의 양을 나타낸다. 도 5C는 치모산 (흰색 막대) 또는 만난 (음영 막대)로 코팅된 플레이트 상에서 야생형 혈청에 대하여 표준화된 C4b 침착의 양의 측정이 기초하여 야생형 마우스 (n=5)에 관하여 MASP-2-/+ 마우스 (n=5) 및 MASP-2-/- 마우스 (n=4)의 상대적 C4 컨버타제 활성을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 도 5A-C에서 도시된 바와 같이, MASP-2-/- 마우스의 혈장은 만난 및 치모산 코팅된 플레이트에서 렉틴-경로-매개 보체 활성화가 완전히 결핍되어 있다. 이들 결과는 MASP-2가 렉틴 경로의 효과기 구성요소임을 분명하게 입증한다.

재조합 MASP-2는 MASP-2-/- 마우스의 혈청에서 렉틴 경로-의존적 C4 활성화를 복원한다.

MASP-2의 부재가 MASP-2-/- 마우스에서 렉틴 경로-의존적 C4 활성화의 손실의 직접적인 원인임을 확립하기 위해서, 혈청 샘플로의 재조합 MASP-2 단백질의 추가의 효과를 상기 기술된 C4 분열 검정에서 검사하였다. 기능적으로 활성인 쥐 MASP-2 및 촉매 비활성 쥐 MASP-2A (여기서 세린 프로테아제 도메인의 활성-부위 세린 잔기가 알라닌 잔기에 대하여 치환됨) 재조합 단백질을 하기 실시예 3에서 기술된 바와 같이 생산하고 정제하였다. 4마리의 MASP-2 -/- 마우스로부터 모아진 혈청을 점증 단백질 농도의 재조합 쥐 MASP-2 또는 비활성 재조합 쥐 MASP-2A와 함께 사전 인큐베이션하였고 C4 컨버타제 활성을 상기 기술된 바와 같이 검정하였다.

결과: 도 6에서 도시된 바와 같이, MASP-2 -/- 마우스로부터 얻어진 혈청에 기능적으로 활성인 쥐 재조합 MASP-2 단백질 (열린 삼각형으로 표시됨)의 추가는 단백질 농도 의존성 방식으로 렉틴 경로-의존적 C4 활성화를 회복시키는 반면, 촉매 비활성 쥐 MASP-2A 단백질 (별표로 표시됨)은 C4 활성화를 회복시키지 않았다. 도 6에서 나타난 결과는 모아진 야생형 마우스 혈청으로 관찰된 C4 활성화 (점선으로 표시됨)에 대하여 표준화된다.

실시예 3

이 실시예는 재조합 전장 인간, 래트 및 쥐 MASP-2, MASP-2 유래된 폴리펩타이드, 및 MASP-2의 촉매에 의해 비활성화된 돌연변이 형태의 재조합 발현 및 단백질 생산을 기술한다.

전장 인간, 쥐 및 래트 MASP-2의 발현:

인간 MASP-2의 전장 cDNA 서열 (서열 번호: 4)을 또한 포유류 발현 벡터 pCI-Neo (Promega)로 서브클로닝하였으며, 이것은 CMV 인핸서/프로모터 영역의 제어 하에서 진핵세포 발현을 구동한다 (Kaufman R.J.　et　al., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)에서 기술됨). 전장 마우스 cDNA (서열 번호:50) 및 래트 MASP-2 cDNA (서열 번호:53)를 각각 pED 발현 벡터로 서브클로닝하였다. 그 다음에 MASP-2 발현 벡터를 Maniatis et al., 1989에서 기술된 표준 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 과정을 사용하여 부착형 중국 햄스터 난소 DXB1으로 트랜스펙션하였다. 이 구조체로 트랜스펙션된 세포를 매우 천천히 성장하였으며, 암호화된 프로테아제가 세포독성이라는 것을 나타낸다.

또 다른 접근법에서, 내인성 프로모터에 의해 구동되는 MASP-2의 인간 cDNA를 포함하는 꼬마유전자 구조체 (서열 번호:49)를 중국 햄스터 난소 세포 (CHO)로 일시적으로 트랜스펙션하였다. 인간 MASP-2 단백질은 배양 배지로 분비되어 하기 기술된 바와 같이 분리된다.

전장 촉매 비활성 MASP-2의 발현:

근거: MASP-2는 인식 하위 구성요소 MBL 또는 피콜린 (L-피콜린, H-피콜린 또는 M-피콜린)이 각각의 탄수화물 패턴에 결합한 후 자가촉매적 분열에 의해 활성화된다. MASP-2의 활성화를 초래하는 자가촉매적 분열은 종종 혈청의 MASP-2의 분리 과정 중에, 또는 재조합 발현 후 정제 중에 일어난다. 항원으로 사용되는 더 안정한 단백질 조제물을 얻기 위해서, MASP-2A로 지정된 MASP-2의 촉매 비활성 형태를 프로테아제 도메인의 촉매 삼중체로 존재하는 세린 잔기를 래트 (서열 번호:55 Ser617 내지 Ala617); 마우스 (서열 번호:52 Ser617 내지 Ala617); 또는 인간 (서열 번호:3 Ser618 내지 Ala618)의 알라닌 잔기로 대체하여 생성하였다.

촉매 비활성 인간 및 쥐 MASP-2A 단백질을 생성하기 위해서, 표 5에서 나타난 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 부위-특이적 돌연변이 유발을 수행하였다. 표 5의 올리고뉴클레오타이드를 효소적 활성 세린을 암호화하는 인간 및 쥐 cDNA의 영역에 어닐링하도록 설계하였고 올리고뉴클레오타이드는 세린 코돈을 알라닌 코돈으로 바꾸기 위해서 미스매치(mismatch)를 포함한다. 예를 들어, 시작 코돈에서 효소적 활성 세린까지 및 세린에서 종결 코돈까지의 영역을 증폭시키기 위해 PCR 올리고뉴클레오타이드 서열 번호:56-59를 인간 MASP-2 cDNA (서열 번호:4)와 조합하여 사용하여 Ser618에서 Ala618로의 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 MASP-2A의 완전한 오픈 리딩 프레임을 생성하였다. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동 및 밴드 제조 후 정제하였고 표준 테일링(tailing) 과정을 사용하여 단일 아데노신 중첩을 생성하였다. 그 다음에 아데노신 꼬리가 달린 MASP-2A를 pGEM-T 이지 벡터로 클로닝하여, 대장균으로 형질전환하였다.

서열 번호:64 및 서열 번호:65를 키나아제 처리하고 어닐링하고, 이들 두 개의 올리고뉴클레오타이드를 같은 몰량으로 조합하고, 100℃에서 2분 동안 가열하고, 서서히 실온으로 냉각시켜서 촉매 비활성 래트 MASP-2A 단백질을 생성하였다. 결과로 생성된 어닐링 단편은 Pst1 및 Xba1 호환성 단부를 가지며 야생형 래트 MASP-2 cDNA (서열 번호:53)의 Pst1-Xba1 단편의 위치에 삽입되어 래트 MASP-2A를 생성하였다.

5 'GAGGTGACGCAGGAGGGGCATTAGTGTTT 3' (서열 번호:64)

5' CTAGAAACACTAATGCCCCTCCTGCGTCACCTCTGCA 3' (서열 번호:65)

하기 기술된 바와 같이 인간, 쥐 및 래트 MASP-2A를 각각 포유류 발현 벡터 pED 또는 pCI-Neo 중 하나에 추가로 서브클로닝하였고 중국 햄스터 난소 세포주 DXB1로 트랜스펙션하였다.

또 다른 접근법에서, 촉매 비활성 형태의 MASP-2를 Chen et al., J. Biol. Chem., 276(28):25894-25902, 2001에서 기술된 방법을 사용하여 구성한다. 간략히 말하면, 전장 인간 MASP-2 cDNA를 포함하는 플라스미드 (Thiel et al., Nature 386:506, 1997에서 기술됨)를 Xho1 및 EcoR1으로 분해하고 MASP-2 cDNA (본원에서 서열 번호:4로 기술됨)를 pFastBac1 바큘로바이러스(baculovirus) 전송 벡터 (Life Technologies, NY)의 상응하는 제한 부위로 클로닝한다. 그 다음에 펩타이드 영역 아미노산 610-625 (서열 번호:13)를 암호화하는 이중 나선 올리고뉴클레오타이를 고유 영역 아미노산　610 내지 625로 치환하여 비활성 프로테아제 도메인을 가진 MASP-2 전장 폴리펩타이드를 생성함으로써 Ser618의 MASP-2 세린 프로테아제 활성 부위를 Ala618로 변화시킨다. 인간 MASP-2로부터 유래된 발현 플라스미드 포함 폴리펩타이드 영역의 구성.

MASP-2의 다양한 도메인을 분비하기 위해 MASP-2 신호 펩타이드 (서열 번호:5의 잔기 1-15)를 사용하여 다음 구조체를 생산하였다. 인간 MASP-2 CUBI 도메인 (서열 번호:8)을 발현하는 구조체를 MASP-2 (서열 번호:6)의 잔기 1-121을 암호화하는 영역 (N-말단 CUB1 도메인에 상응함)을 증폭시키는 PCR에 의해 제조한다. 인간 MASP-2 CUBIEGF 도메인 (서열 번호:9)을 발현하는 구조체를 MASP-2 (서열 번호:6)의 잔기 1-166을 암호화하는 영역 (N-말단 CUB1EGF 도메인에 상응함)을 증폭시키는 PCR에 의해 제조한다. 인간 MASP-2 CUBIEGFCUBII 도메인 (서열 번호:10)을 발현하는 구조체를 MASP-2 (서열 번호:6)의 잔기 잔기 1-293을 암호화하는 영역 (N-말단 CUBIEGFCUBII 도메인에 상응함)을 증폭시키는 PCR에 의해 제조한다. 상기 언급된 도메인을 확립된 PCR 방법에 따라 Vent_R 폴리머라제 및 주형으로서 pBS-MASP-2를 사용한 PCR에 의해 증폭하였다. 센스 프라이머의 5' 프라이머 서열 (5'-CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' 서열 번호:34)은 PCR 생성물의 5' 단부에서 BamHI 제한 부위 (밑줄)를 도입한다. 각각의 PCR 생성물의 단부에서 종결 코돈 (볼드체)에 이어서 EcoRI 부위 (밑줄)을 도입하기 위해, 하기 표 5에서 나타난, MASP-2 도메인 각각에 대한 안티센스 프라이머를 설계한다. 증폭되면, DNA 단편을 BamHI 및 EcoRI로 분해하여 pFastBac1 벡터의 상응하는 부위에 클로닝한다. 결과로 생성된 구조체는 제한 매핑을 특징으로 하고 dsDNA 시퀀싱으로 확인된다.

MASP-2 PCR 프라이머

MASP-2 도메인	5' PCR 프라이머	3' PCR 프라이머
서열 번호:8 CUBI (서열 번호:6의 aa 1-121)	5'CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' (서열 번호:34)	5'GGAATTCCTAGGCTGCATA (서열 번호:35)
서열 번호:9 CUBIEGF (서열 번호:6의 aa 1-166)	5'CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' (서열 번호:34)	5'GGAATTCCTACAGGGCGCT-3' (서열 번호:36)
서열 번호:10CUBIEGFCUBII (서열 번호:6의 aa 1-293)	5'CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' (서열 번호:34)	5'GGAATTCCTAGTAGTGGAT 3' (서열 번호:37)
서열 번호:4 인간 MASP-2	5'ATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGCCTTC 3' (서열 번호: 56) hMASP-2_forward	5'TTAAAATCACTAATTATGTTCTCGATC 3' (서열 번호: 59) hMASP-2_reverse
서열 번호:4 인간 MASP-2 cDNA	5'CAGAGGTGACGCAGGAGGGGCAC 3' (서열 번호: 58) hMASP-2_ala_forward	5'GTGCCCCTCCTGCGTCACCTCTG 3' (서열 번호: 57) hMASP-2_ala_reverse
서열 번호:50 쥐 MASP-2 cDNA	5'ATGAGGCTACTCATCTTCCTGG3' (서열 번호: 60) mMASP-2_forward	5'TTAGAAATTACTTATTATGTTCTCAATCC3' (서열 번호: 63) mMASP-2_reverse
서열 번호:50 쥐 MASP-2 cDNA	5'CCCCCCCTGCGTCACCTCTGCAG3' (서열 번호: 62) mMASP-2_ala_forward	5'CTGCAGAGGTGACGCAGGGGGGG 3' (서열 번호: 61) mMASP-2_ala_reverse

MASP-2의 재조합 진핵세포 발현 및 효소적 비활성 마우스, 래트, 및 인간 MASP-2A의 단백질 생산

상기 기술된 MASP-2 및 MASP-2A 발현 구조체를 표준 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 과정을 사용하여 DXB1 세포로 트랜스펙션하였다 (Maniatis et al., 1989). MASP-2A를 조제물이 다른 혈청 단백질로 오염되지 않았음을 보장하기 위해 무혈청 배지에서 생산하였다. 배지를 격주마다 융합성 세포로부터 수확하였다 (총 4번). 재조합 MASP-2A의 수준은 평균적으로 세 개의 종 각각에 대한 배양 배지의 대략 1.5 mg/리터이다.

MASP-2A 단백질 정제: MASP-2A (상기 기술된 Ser-Ala 돌연변이)를 MBP-A-아가로스 컬럼 상에서 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이 전략은 무관한 태그의 사용 없이 신속한 정제를 가능하게 한다. MASP-2A (동량의 로딩 버퍼 (150 mM NaCl 및 25 mM CaCl₂를 포함하는 50 mM Tris-Cl, pH 7.5)로 희석된 배지 중 100-200　ml)를 로딩 버퍼 10 ml로 사전 평형화된 MBP-아가로스 친화도 컬럼 (4 ml)에 로딩하였다. 추가의 로딩 버퍼 10 ml로 세척 후, 1.25 M NaCl 및 10 mM EDTA를 포함하는 50 mM Tris-Cl, pH 7.5로 1 ml 분획에서 단백질을 용출하였다. MASP-2A를 포함하는 분획을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 식별하였다. 필요한 경우, MASP-2A를 MonoQ 컬럼 (HR 5/5) 상에서 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 단백질을 50 mM NaCl을 포함하는 50 mM Tris-Cl pH 7.5로 투석하였고 같은 버퍼에서 평형화된 컬럼에 로딩하였다. 세척 후, 결합된 MASP-2A를 10 ml에서 0.05-1 M NaCl 구배로 용출하였다.

결과: MASP-2A 단백질의 0.25-0.5 mg의 수율을 배지 200 ml로부터 얻었다. MALDI-MS에 의해 결정된 77.5 kDa의 분자 질량은 글리코실화 때문에 변형되지 않은 폴리펩타이드 (73.5 kDa)의 계산치보다 더 큰 것으로 결정된다. 각각의 N-글리코실화 부위에서 글리칸의 부착은 관찰된 질량을 설명한다. MASP-2A는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 단일 밴드로 이동하며, 생합성 중에 단백질 가수분해로 가공된 것이 아님을 입증한다. 평형 초원심분리에 의해 결정된 중량-평균 분자 질량은 글리코실화된 폴리펩타이드의 호모다이머에 대한 계산치와 일치한다.

재조합 인간 MASP-2 폴리펩타이드의 생산

재조합 MASP-2 및 MASP2A 유래된 폴리펩타이드를 생산하기 위한 또 다른 방법은 Thielens, N.M., et al., J. Immunol. 166:5068-5077, 2001에서 기술되어 있다. 간략히 말하면, 스포도프테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 곤충 세포 (Novagen, Madison, WI로부터 얻어진 Ready-Plaque Sf9 세포를 50 IU/ml 페니실린 및 50 mg/ml 스트렙토마이신 (Life Technologies)로 보충된 Sf900II 무혈청 배지 (Life Technologies)에서 키우고 유지한다. 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) (High Five) 곤충 세포 (Jadwiga Chroboczek, Institut de Biologie Structurale, Grenoble, France에 의해 제공됨)를 50 IU/ml 페니실린 및 50 mg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 10% FCS (Dominique Dutscher, Brumath, France)를 함유하는 TC100 배지 (Life Technologies)에서 유지한다. 재조합 바큘로바이러스를 Bac-to-Bac 시스템 (Life Technologies)을 사용하여 생성하였다. 백미드(bacmid) DNA를 Qiagen midiprep 정제 시스템 (Qiagen)을 사용하여 정제하고 제조사의 프로토콜에서 기술된 바와 같이 Sf900 II SFM 배지 (Life Technologies) 중의 셀펙틴을 사용하여 Sf9 곤충 세포를 트랜스펙션하는데 사용된다. 재조합 바이러스 입자를 4일 후에 수거하고, 바이러스 플라크 검정으로 적정하고, King and Possee, in The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman and Hall Ltd., London, pp.　111-114, 1992에 의해 기술된 바와 같이 증폭시켰다.

High Five 세포 (1.75 x 10⁷개의 세포/175-cm² 조직 배양 플라스크)를 Sf900 II SFM 배지에서 2의 감염 다중도로 MASP-2 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 바이러스로 28℃에서 96 h 동안 감염시켰다. 상층액을 원심분리에 의해 수거하고 디아이소프로필 포스포로플루오리데이트를 1 mM의 최종 농도로 추가한다.

MASP-2 폴리펩타이드는 배양 배지에서 분지된다. 배양 상층액을 50 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 50 mM 트라이에탄올아민 하이드로클로라이드, pH 8.1에 의해 투석하고, 같은 버퍼에서 평형화된 Q-세파로스 Fast Flow 컬럼 (Amersham Pharmacia Biotech) (2.8 x 12 cm)에 1.5 ml/min으로 로딩한다. 같은 버퍼 중의 350 mM NaCl에 1.2 리터 선형 구배를 적용함으로써 용출을 실시한다. 재조합 MASP-2 폴리펩타이드를 포함하는 분획을 웨스턴 블롯 분석에 의해 식별하고, 60% (w/v)까지 (NH₄)₂SO₄를 추가하여 침전시키고, 4℃에서 밤새도록 내버려둔다. 펠릿을 145 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 50 mM 트라이에탄올아민 하이드로클로라이드, pH 7.4에 재현탁시키고, 같은 버퍼로 평형화된 TSK G3000 SWG 컬럼 (7.5 x 600 mm) (Tosohaas, Montgomeryville, PA)으로 적용한다. 그 다음에 정제된 폴리펩타이드를 Microsep 미세농축기 상에서의 초원심분리에 의해 0.3 mg/ml로 농축한다 (m.w. 컷오프(cut-off) = 10,000) (Filtron, Karlstein, Germany).

실시예 4

이 실시예는 MASP-2 폴리펩타이드에 대한 다클론성 항체를 생산하는 방법을 기술한다.

재료 및 방법:

MASP-2 항원: 다클론성 항-인간 MASP-2 항혈청은 다음의 분리된 MASP-2 폴리펩타이드로 토끼를 면역화하여 생산된다: 혈청으로부터 분리된 인간 MASP-2 (서열 번호:6); 재조합 인간 MASP-2 (서열 번호:6), 실시예 3에서 기술된 바와 같이 비활성프로테아제 도메인 (서열 번호:13)을 포함하는 MASP-2A; 및 실시예 3에서 기술된 바와 같이 발현되는 재조합 CUBI (서열 번호:8), CUBEGFI (서열 번호:9), 및 CUBEGFCUBII (서열 번호:10).

다클론성 항체: BCG (바실루스 칼메트-구에린 백신(bacillus Calmette-Guerin vaccine))로 프라이밍된(primed) 6주령 토끼를 MASP-2 폴리펩타이드 100 μg을 멸균 식염수 용액 중에서 100 μg/ml로 주사하여 면역화한다. 주사를 4주마다 실행하며, 항체 역가를 실시예 5에서 기술된 바와 같이 ELISA 검정에 의해 모니터링한다. 배양 상층액을 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의한 항체 정제를 위해 수거한다.

실시예 5

이 실시예는 래트 또는 인간 MASP-2 폴리펩타이드에 대한 쥐 단클론성 항체를 생산하기 위한 방법을 기술한다.

재료 및 방법:

8-12주령 수컷 A/J 마우스 (Harlan, Houston, Tex.)를 포스페이트 완충된 식염수 (PBS) pH 7.4 200 μl 중의 완전 프로인트 보조제 (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) 중의 100 μg 인간 또는 래트 rMASP-2 또는 rMASP-2A 폴리펩타이드 (실시예 3에서 기술된 바와 같이 제조됨)로 피하로 주사한다. 2주 간격으로 마우스를 불완전 프로인트 보조제 중의 인간 또는 래트 rMASP-2 또는 rMASP-2A 폴리펩타이드 50 μg으로 피하로 2회 주사한다. 제4 주에 마우스를 PBS 중의 인간 또는 래트 rMASP-2 또는 rMASP-2A 폴리펩타이드 50 μg으로 주사하고 4일 후에 융합시킨다.

각각의 융합을 위해, 단일 세포 현탁액을 면역화된 마우스의 비장으로부터 제조하고 Sp2/0 골수종 세포로의 융합에 사용한다. 5x10⁸개의 Sp2/0 및 5x10⁸ 비장 세포를 50% 폴리에틸렌 글리콜 (M.W. 1450) (Kodak, Rochester, N.Y.) 및 5% 디메틸설폭사이드 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)를 포함하는 배지에서 융합시킨다. 그 다음에 세포를 10% 태아 소 혈청, 100 유닛/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 0.1 mM 하이포잔틴, 0.4 μM 아미노프테린 및 16 μM 티미딘으로 보충된 Iscove 배지 (Gibco, Grand Island, N.Y.) 중의 현탁액 200 μl 당 1.5x10⁵개의 비장 세포의 농도로 조정한다. 200 마이크로리터의 세포 현탁액을 약 20개의 96-웰 미소 배양 플레이트의 각 웰에 추가한다. 약 10일 후 ELISA 검정에서 정제된 인자 MASP-2와의 반응성에 대하여 스크리닝하기 위해 배양 상층액을 회수한다.

ELISA 검정: Immulon 2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.) 마이크로테스트 플레이트의 웰을 50 ng/ml 래트 rMASP-2 (또는 rMASP-2A)로 50 μl의 정제된 hMASP-2를 추가하여 밤새도록 실온에서 코팅한다. 코팅용 저농도의 MASP-2는 고친화도 항체의 선택을 가능하게 한다. 플레이트를 털어서 코팅 용액을 제거한 후, PBS 중의 BLOTTO (무지방 탈지 분유) 200 μl를 각 웰에 1시간 동안 추가하여 비-특이적 부위를 차단한다. 1시간 후, 웰을 버퍼 PBST (0.05% Tween 20을 포함하는 PBS)로 세척한다. 각 융합 웰의 배양 상층액 50 마이크로리터를 수거하여 BLOTTO 50 μl와 혼합한 다음 마이크로테스트 플레이트의 개개의 웰에 추가한다. 인큐베이션 1시간 후, 웰을 PBST로 세척한다. 결합된 쥐 항체를 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG (Fc 특이적) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.)와의 반응으로 검출하고 BLOTTO에서 1:2,000로 희석한다. 0.1% 3,3,5,5 테트라메틸 벤지딘 (Sigma, St. Louis, Mo.) 및 0.0003% 과산화수소 (Sigma)의 퍼옥시다제 기질 용액을 발색 현상을 위해 30분 동안 웰에 추가한다. 반응을 웰 당 2M H₂SO₄ 50 μl의 추가에 의해 중단시킨다. 반응 혼합물의 450 nm에서의 광학 밀도를 BioTek ELISA Reader (BioTek Instruments, Winooski, Vt.)로 판독한다.

MASP-2 결합 검정:

상기 기술된 MASP-2 ELISA 검정에서 양성 반응을 보이는 배양 상층액을 결합 검정으로 테스트하여 MASP-2에 대하여 MASP-2억제제가 갖는 결합 친화도를 결정할 수 있다. 유사한 검정을 또한 사용하여 보체 시스템에서 억제제가 그 밖의 항원에 결합하는지를 결정할 수 있다.

폴리스티렌 미세역가 플레이트 웰 (96-웰 배지 결합 플레이트, Corning Costar, Cambridge, MA)을 포스페이트-완충된 식염수 (PBS) pH 7.4 중의 MASP-2 (20 ng/100 μl/웰, Advanced Research Technology, San Diego, CA)로 4℃에서 밤새도록 코팅한다. MASP-2 용액을 빨아낸 후, 웰을 실온에서 2 h 동안 1% 소 혈청 알부민 (BSA; Sigma Chemical)을 포함하는 PBS로 블로킹한다. MASP-2 코팅되지 않은 웰은 백그라운드 대조군의 역할을 한다. 하이브리도마 상층액 또는 정제된 항-MASP-2 MoAb의 앨리쿼트를 블로킹 용액 중의 다양한 농도로 웰에 추가한다. 실온에서 2 h 인큐베이션 후, 웰을 PBS로 광범위하게 헹군다. MASP-2-결합된 항-MASP-2 MoAb를 블로킹 용액 중의 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG (Sigma Chemical)의 추가에 의해 검출하며, 이것을 실온에서 1 h 동안 인큐베이션시킨다. 플레이트를 다시 PBS로 충분히 헹구고, 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (TMB) 기질 (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) 100 μl를 추가한다. TMB의 반응을 1M 인산 100 μl의 추가에 의해 퀸칭하고, 플레이트를 마이크로플레이트 리더 (SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에서 450 nm에서 판독한다.

양성 웰의 배양 상층액을 실시예 2에서 기술된 바와 같이 C4 분열 검정과 같은 기능적 검정에서 보체 활성화를 억제하는 능력에 대하여 테스트한다. 양성 웰의 세포를 한계 희석에 의해 클로닝한다. MoAb를 hMASP-2와의 반응성에 대하여 상기 기술된 바와 같이 ELISA 검정에서 다시 테스트한다. 선택된 하이브리도마를 스피너(spinner) 플라스크에서 키우고 소비된 배양 상층액을 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의한 항체 정제를 위해 수거한다.

실시예 6

이 실시예는 인간화 쥐 항-MASP-2 항체 및 항체 단편의 생성 및 생산을 기술한다.

쥐 항-MASP-2 단클론성 항체는 실시예 5에서 기술된 바와 같이 수컷 A/J 마우스에서 생성된다. 쥐 항체는 쥐 불변 영역을 인간 대응물로 대체하여 키메라 IgG 및 항체의 Fab를 생성함으로써 면역원성을 감소시키기 위해 하기 기술된 바와 같이 인간화되며, 이것은 본 발명에 따라 인간 대상체에서 MASP-2-의존적 보체 활성화의 부작용을 억제하는데 유용하다.

1. 쥐 하이브리도마 세포의 항-MASP-2 가변 영역 유전자의 클로닝. 전체 RNA를 제조사 (Biotech, Houston, Tex.)의 프로토콜에 따라 RNAzol을 사용하여 항-MASP-2 MoAb를 분비하는 하이브리도마 세포 (실시예 7에서 기술된 바와 같이 얻어짐)로부터 분리한다. 제1 가닥 cDNA를 프라이머로서 올리고 dT를 사용하여 전체 RNA로부터 합성한다. PCR를 면역글로불린 불변 C 영역-유래 3' 프라이머 및 5' 프라이머로서 쥐 V_H 또는 V_K 유전자의 선도 펩타이드 또는 제1 프레임워크 영역으로부터 유래된 변성 프라이머 세트를 사용하여 수행한다. 고정된 PCR을 Chen and Platsucas에 의해 기술된 바와 같이 수행한다 (Chen, P.F., Scand. J. Immunol. 35:539-549, 1992). V_K 유전자를 클로닝하기 위해, 이중-가닥 cDNA를 Notl-MAK1 프라이머 (5'-TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3' 서열 번호:38)를 사용하여 제조한다. 어닐링된 어댑터 AD1 (5'-GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3' 서열 번호:39) 및 AD2 (5'-TCCGAGAATAACGAGTG-3' 서열 번호:40)를 이중-가닥 cDNA의 5' 및 3' 말단 둘 다에 결찰시킨다. 3' 단부의 어댑터를 Notl 분해에 의해 제거한다. 그 다음에 분해된 생성물을 주형으로서 5' 프라이머로서 AD1 올리고뉴클레오타이드 및 3' 프라이머로서 MAK2 (5'-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3' 서열 번호:41)와 함께 PCR에 사용한다. 대략 500 bp의 DNA 단편을 pUC19로 클로닝한다. 클로닝된 서열이 예상 쥐 면역글로불린 불변 영역을 포함한다는 것을 확인하기 위한 서열 분석을 위해 여러 클론을 선택한다. Not1-MAK1 및 MAK2 올리고뉴클레오타이드를 V_K 영역으로부터 유래되고 각각 C 카파 유전자의 제1 염기쌍의 다운스트림의 182 및 84 bp이다. 완전한 V_K 및 선도 펩타이드를 포함하는 클론을 선택한다.

V_H 유전자를 클로닝하기 위해, Not1 MAG1 프라이머 (5'-CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3' 서열 번호:42)를 사용하여 이중-가닥 cDNA를 제조한다. 어닐링된 어댑터 AD1 및 AD2를 이중-가닥 cDNA의 5' 및 3' 말단 둘 다로 결찰시킨다. 3' 단부의 어댑터를 Notl 분해에 의해 제거한다. 분해된 생성물을 프라이머로서 AD1 올리고뉴클레오타이드 및 MAG2 (5'-CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3' 서열 번호:43)와 함께 주형으로서 PCR에 사용한다. 길이가 500 내지 600 bp의 DNA 단편을 pUC19로 클로닝한다. Notl-MAG1 및 MAG2 올리고뉴클레오타이드를 쥐 Cγ.7.1 영역으로부터 유도하고, 각각 쥐 Cγ.7.1 유전자의 제1 bp의 다운스트림의 180 및 93 bp이다. 완전한 V_H및 선도 펩타이드를 포함하는 클론을 선택한다.

2. 키메라 MASP-2 IgG 및 Fab에 대한 발현 벡터의 구성. 뉴클레오타이드 서열의 5' 단부에 코자크(Kozak) 공통 서열 및 3' 단부에 스플라이스 공여체를 추가하기 위해 상기 기술된 클로닝된 V_H 및 V_K 유전자를 PCR 반응의 주형으로서 사용한다. PCR 오류의 부재를 확인하기 위해 서열을 분석한 후, V_H 및 V_K 유전자를 각각 인간 C.γ1 및 C. 카파를 포함하는 발현 벡터 카세트로 삽입하여 pSV2neoV_H-huCγ1 및 pSV2neoV-huCγ를 제공한다. 중쇄 및 경쇄 벡터의 CsCl 구배-정제된 플라스미드 DNA를 사용하여 전기천공법에 의해 COS 세포를 트랜스펙션한다. 48시간 후, 배양 상층액을 ELISA로 테스트하여 대략 200 ng/ml의 키메라 IgG의 존재를 확인한다. 세포를 수확하여 전체 RNA를 제조한다. 제1 가닥 cDNA를 프라이머로서 올리고 dT를 사용하여 전체 RNA로부터 합성한다. 이 cDNA를 PCR에서 주형으로 사용하여 Fd 및 카파 DNA 단편을 생성한다. Fd 유전자에 대하여, 5' 프라이머로서 5'-AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3' (서열 번호:44) 및 CH1-유래 3' 프라이머 (5'-CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3' 서열 번호:45)를 사용하여 PCR을 수행한다. DNA 서열을 인간 IgG1의 완전한 V_H 및 CH1 도메인을 포함하는지 확인한다. 적절한 효소로의 분해 후, Fd DNA 단편을 발현 벡터 카세트 pSV2dhfr-TUS의 HindIII 및 BamHI 제한 부위에 삽입하여 pSV2dhfrFd를 제공한다. pSV2 플라스미드는 상업적으로 입수 가능하고 다양한 공급원의 DNA 세그먼트로 구성된다: pBR322 DNA (얇은 선)는 DNA 복제의 pBR322 기원 (pBR ori) 및 락타마제 앰피실린 저항성 유전자 (Amp)를 포함하고; 더 넓은 해칭(hatching)으로 나타나고 표시된 SV40 DNA는 DNA 복제의 SV40 기원 (SV40 ori), 초기 프로모터 (dhfr 및 neo 유전자에 대하여 5'), 및 폴리아데닐화 신호 (dhfr 및 neo 유전자에 대하여 3')를 포함한다. SV40-유래 폴리아데닐화 신호 (pA)를 또한 Fd 유전자의 3' 단부에 배치한다.

카파 유전자에 대하여, 5' 프라이머로서 5'- AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3' (서열 번호:46) 및 C_K-유래 3' 프라이머 (5'-CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3' 서열 번호:47)를 사용하여 PCR을 수행한다. DNA 서열을 완전한 V_K 및 인간 C_K 영역을 포함하는지 확인한다. 적절한 제한 효소로의 분해 후, 카파 DNA 단편을 발현 벡터 카세트 pSV2neo-TUS의 HindIII 및 BamHI 제한 부위에 삽입하여 pSV2neoK를 제공한다. Fd 및 카파 유전자의 발현을 HCMV-유래 인핸서 및 프로모터 요소에 의해 구동한다. Fd 유전자가 사슬간 이황화 결합에 포함된 시스테인 아미노산 잔기를 포함하지 않기 때문에, 이 재조합 키메라 Fab는 비-공유 결합에 의해 결합된 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 이 키메라 Fab는 cFab로 지정된다.

중쇄 및 경쇄 간 이황화 결합을 가진 재조합 Fab를 얻기 위해서, 상기 Fd 유전자를 인간 IgG1의 힌지 영역의 추가적인 9개의 아미노산 (EPKSCDKTH 서열 번호:48)에 대한 암호화 서열을 포함하도록 연장시킬 수도 있다. Fd 유전자의 3' 단부에서 30개의 아미노산을 암호화하는 BstEII-BamHI DNA 세그먼트를 연장된 Fd를 암호화하는 DNA 세그먼트로 대체할 수도 있으며, pSV2dhfrFd/9aa를 발생시킨다.

3. 키메라 항-MASP-2 IgG의 발현 및 정제

키메라 항-MASP-2 IgG를 분비하는 세포주를 생성하기 위해, NSO 세포를 전기천공법에 의해 pSV2neoV_H-huC.γ1 및 pSV2neoV-huC 카파의 정제된 플라스미드 DNA로 트랜스펙션한다. 트랜스펙션된 세포를 0.7 mg/ml G418의 존재 하에서 선택한다. 세포를 혈청-함유 배지를 사용하여 250 ml 스피너 플라스크에서 키운다.

100 ml 스피너 배양액의 배양 상층액을 10-ml PROSEP-A 컬럼 (Bioprocessing, Inc., Princeton, N.J.)에 로딩한다. 컬럼을 10배 부피의 PBS로 세척한다. 결합된 항체를 50 mM 시트레이트 버퍼, pH 3.0로 용출시킨다. 동일한 부피의 1 M Hepes, pH 8.0을 정제된 항체를 포함하는 분획에 추가하여 pH를 7.0로 조정한다. 잔류 염을 Millipore 막 한외여과에 의한 PBS로의 버퍼 교환에 의해 제거한다 (M.W. 컷오프: 3,000). 정제된 항체의 단백질 농도를 BCA 방법 (Pierce)에 의해 결정한다.

4. 키메라 항-MASP-2 Fab의 발현 및 정제

키메라 항-MASP-2 Fab를 분비하는 세포를 생성하기 위해, CHO 세포를 전기천공법에 의해 pSV2dhfrFd (또는 pSV2dhfrFd/9aa) 및 pSV2neokappa의 정제된 플라스미드 DNA로 트랜스펙션한다. 트랜스펙션된 세포를 G418 및 메토트렉세이트의 존재 하에서 선택한다. 선택된 세포주를 점증 농도의 메토트렉세이트에서 증폭시킨다. 세포는 제한 희석에 의해 클로닝된 단일 세포이다. 고생산 단일 세포 서브클로닝된 세포주를 무혈청 배지를 사용하는 100 ml 스피너 배양액에서 키운다.

키메라 항-MASP-2 Fab를 MASP-2 MoAb에 대한 마우스 항-이디오타입 MoAb를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 정제된다. 마우스를 키홀 림펫 헤모사이아닌 (KLH)과 컨쥬게이션된 쥐 항-MASP-2 MoAb로 면역화하고 인간 MASP-2와 경합할 수 있는 특이적 MoAb 결합에 대하여 스크리닝하여 항-이디오타입 MASP-2 MoAb를 제조할 수 있다. 정제를 위해서, cFab 또는 cFab/9aa를 생산하는 CHO 세포의 스피너 배양액의 상층액 100 ml를 항-이디오타입 MASP-2 MoAb와 커플링된 친화도 컬럼에 로딩한다. 결합된 Fab가 50 mM 디에틸아민, pH 11.5로 용출되기 전에 컬럼을 PBS로 철저히 세척한다. 잔류 염을 상기 기술된 바와 같이 버퍼 교환에 의해 제거한다. 정제된 Fab의 단백질 농도를 BCA 방법 (Pierce)에 의해 결정한다.

키메라 MASP-2 IgG, cFab, 및 cFAb/9aa가 MASP-2-의존적 보체 경로를 억제하는 능력을 실시예 2 또는 실시예 7에서 기술된 억제 검정을 사용하여 결정될 수도 있다.

실시예 7

이 실시예는 L-피콜린/P35, H-피콜린, M-피콜린 또는 만난을 통해 MASP-2-의존적 보체 활성화를 차단할 수 있는 MASP-2 억제제를 식별하기 위한 기능적 스크리닝으로서 사용된 시험관 내 C4 분열 검정을 기술한다.

C4 분열 검정: C4 분열 검정은 Petersen, S.V.,　et　al., J.　Immunol. Methods 257:107, 2001에 의해 기술되어 있으며, 이것은 L-피콜린에 결합하는 스타필로코쿠스 아우레우스의 리포테이코산 (LTA)으로부터 발생하는 렉틴 경로 활성화를 측정한다.

시약: 포르말린-고정된 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureous) (DSM20233)를 다음과 같이 제조한다: 박테리아를 트립신 처리된 대두 혈액 배지(tryptic soy blood medium)에서 37℃에서 밤새도록 키우고, PBS로 3회 세척한 다음, 실온에서 1 h 동안 PBS/0.5% 포르말린에서 고정하고, 코팅 버퍼 (15 mM Na₂Co₃, 35 mM NaHCO₃, pH 9.6)에 재현탁하기 전에 추가로 PBS로 3회 세척한다.

검정: Nunc MaxiSorb 미세역가 플레이트 (Nalgene Nunc International, Rochester, NY)의 웰을 코팅 버퍼 중의 L-피콜린 1 ug와 함께 코팅 버퍼 중의 포르말린-고정된 스타필로코쿠스 아우레우스 DSM20233 (OD₅₅₀ = 0.5) 100 μl로 코팅한다. 밤새도록 인큐베이션한 후, 웰을 TBS (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, pH 7.4) 중의 0.1% 인간 혈청 알부민 (HSA)으로 블로킹한 다음, 0.05% Tween 20 및 5 mM CaCl₂를 포함하는 TBS (세척 버퍼)로 세척한다. 인간 혈청 샘플을 20 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 10 mM CaCl₂, 0.05% Triton X-100, 0.1% HSA, pH 7.4에 희석하며, 이것은 내인성 C4의 활성화 및 C1 복합체 (C1q, C1r 및 C1s로 구성됨)의 해리를 방지한다. 항-MASP-2 MoAb 및 억제 펩타이드를 포함한 MASP-2 억제제를 다양한 농도로 혈청 샘플에 추가한다. 희석된 샘플을 플레이트에 추가하고 4℃에서 밤새도록 인큐베이션한다. 24시간 후, 플레이트를 세척 버퍼로 철저하게 세척한 다음, 4 mM 바비탈, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, pH 7.4 100 μl 중 정제된 인간 C4 (Dodds, A.W., Methods Enzymol. 223:46, 1993에서 기술된 바와 같이 얻어짐) 0.1 μg을 각 웰에 추가한다. 37℃에서 1.5 h 후, 플레이트를 다시 세척하고 C4b 침착을 알칼리성 포스파타제-컨쥬게이션된 닭 항-인간 C4c (Immunsystem, Uppsala, Sweden으로부터 얻어짐)를 사용하여 검출하고 비색 기질 ρ-나이트로페닐 포스페이트를 사용하여 측정한다.

만난에 대한 C4 검정: 상기 기술된 검정은 다양한 MASP-2 억제제와 혼합된 혈청을 추가하기 전에 LSP 및 만난으로 플레이트를 코팅함으로써 MBL을 통해 렉틴 경로 활성화를 측정하도록 조정된다.

H-피콜린 (Hakata Ag)에 대한 C4 검정: 상기 기술된 검정은 다양한 MASP-2 억제제와 혼합된 혈청을 추가하기 전에 LSP 및 H-피콜린으로 플레이트를 코팅함으로써 H-피콜린을 통해 렉틴 경로 활성화를 측정하도록 조정된다.

실시예 8

다음 검정은 야생형 및 MASP-2-/- 마우스에서 고전적 경로 활성화의 존재를 입증한다.

방법: 실온에서 1시간 동안 10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.4 중의 0.1% 인간 혈청 알부민으로 제자리에서(in situ) 미세역가 플레이트 (Maxisorb, Nunc, 카탈로그 번호 442404, Fisher Scientific)를 코팅한 후 이어서 TBS/tween/Ca²⁺에서 1:1000으로 희석된 양 항 전체 혈청 항혈청 (Scottish Antibody Production Unit, Carluke, Scotland)과 함께 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하여 면역 복합체를 생성한다. 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 혈청 샘플을 얻었고 코팅된 플레이트에 추가하였다. 야생형 및 MASP-2-/- 혈청 샘플로부터 C1q이 고갈된 대조군 샘플을 제조한다. 공급자의 지시에 따라 토끼 항-인간 C1q IgG (Dako, Glostrup, Denmark)로 코팅된 단백질-A-커플링된 Dynabeads (Dynal Biotech, Oslo, Norway)를 사용하여 C1q-고갈된 마우스 혈청을 제조하였다. 플레이트를 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 결합된 C3b를 TBS/tw/ Ca⁺⁺에서 1:1000으로 희석된 다클론성 항-인간-C3c 항체 (Dako A 062)로 검출하였다. 제2 항체는 염소 항-토끼 IgG이다.

결과: 도 7은 야생형 혈청, MASP-2-/- 혈청, C1q-고갈된 야생형 및 C1q-고갈된 MASP-2-/- 혈청에서 IgG로 코팅된 플레이트 상에서의 상대적인 C3b 침착 수준을 나타낸다. 이들 결과는 고전적 경로가 MASP-2-/- 마우스 계통에서 온전하다는 것을 입증한다.

실시예 9

고전적 경로가 면역 복합체에 의해 개시되는 조건 하에서 MASP-2 억제제의 효과를 분석함으로써 MASP-2 억제제가 고전적 경로를 차단하는지를 테스트하기 위해 다음 검정을 사용한다.

방법:

고전적 경로가 면역 복합체에 의해 개시되는 경우 보체 활성화의 조건에 대한 MASP-2 억제제의 효과를 테스트하기 위해서, 90% NHS를 포함하는 3배수의 50 μl 샘플을 10 μg/ml 면역 복합체 (IC) 또는 PBS의 존재 하에 37℃에서 인큐베이션하고, 37℃ 인큐베이션 중에 200 nM 항-프로퍼딘 단클론성 항체를 포함하는 유사한 3배수 샘플 (+/-IC)이 또한 포함된다. 37℃에서 2시간 인큐베이션 후, 13 mM EDTA를 모든 샘플에 추가하여 추가의 보체 활성화를 중단시키고 샘플을 즉시 5℃로 냉각시킨다. 그 다음에 제조사의 지시에 따라 ELISA 키트 (Quidel, 카탈로그 번호 A015 및 A009)를 사용하여 보체 활성화 생성물 (C3a 및 sC5b-9)에 대하여 검정하기 전에 샘플을 -70℃에 저장한다.

실시예 10

이 실시예는 MASP-2 활성을 차단하는 고친화도 항-MASP-2 Fab2 항체 단편의 식별을 기술한다.

배경 및 근거: MASP-2는 다음을 포함하는 많은 별도의 기능적 도메인을 가진 복합 단백질이다: MBL 및 피콜린에 대한 결합 부위(들), 세린 프로테아제 촉매 부위, 단백질 가수분해 기질 C2에 대한 결합 부위, 단백질 가수분해 기질 C4에 대한 결합 부위, MASP-2 치모겐의 자가활성화에 대한 MASP-2 분열 부위, 및 두 개의 Ca⁺⁺ 결합 부위. MASP-2에 고친화도로 결합하는 Fab2 항체 단편을 식별하였고, 확인된 Fab2 단편을 기능적 검정에서 그것들이 MASP-2 기능적 활성을 차단할 수 있는지를 결정하기 위해 테스트하였다.

MASP-2 기능적 활성을 차단하기 위해서, 항체 또는 Fab2 항체 단편은 MASP-2 기능적 활성이 필요한 MASP-2 상의 구조적 에피토프에 결합하여 이것을 방해해야 한다. 그러므로, 많은 또는 모든 고친화도 결합 항-MASP-2 Fab2는 그것들이 MASP-2 기능적 활성에 직접적으로 관련된 MASP-2 상의 구조적 에피토프에 결합하지 않는 한 MASP-2 기능적 활성을 나타내지 않을 수도 있다.

렉틴 경로 C3 컨버타제 형성의 억제를 평가하는 기능적 검정을 항-MASP-2 Fab2의 "차단 활성"을 평가하는데 사용하였다. 렉틴 경로에서 MASP-2의 주요 생리학적 역할은 렉틴-매개 보체 경로의 그 다음의 기능적인 구성요소, 즉, 렉틴 경로 C3 컨버타제를 생성하는 것이라고 알려져 있다. 렉틴 경로 C3 컨버타제는 단백질 가수분해에 의해 C3을 C3a 및 C3b로 분열시키는 중요한 효소 복합체 (C4bC2a)이다. MASP-2가 렉틴 경로 C3 컨버타제의 구조적 구성요소 (C4bC2a)는 아니다; 하지만, MASP-2 기능적 활성은 렉틴 경로 C3 컨버타제를 포함하는 두 개의 단백질 구성요소 (C4b, C2a)를 생성하기 위해 필요하다. 게다가, 상기 나열된 MASP-2의 모든 별도의 활성은 MASP-2가 렉틴 경로 C3 컨버타제를 생성하기 위해 필요한 것으로 보인다. 이러한 이유로, 항-MASP-2 Fab2의 "차단 활성"을 평가하는데 사용하기에 바람직한 검정은 렉틴 경로 C3 컨버타제 형성의 억제를 평가하는 기능적 검정인 것으로 생각된다.

고친화도 Fab2의 생성: 인간 가변 경쇄 및 중쇄 항체 서열의 파지 디스플레이 라이브러리 및 관심있는 선택된 리간드와 반응하는 Fab2를 식별하기 위한 자동화된 항체 선택 기술을 사용하여 래트 MASP-2 단백질 (서열 번호:55)에 대한 고친화도 Fab2를 생성하였다. 래트 MASP-2 (~1 mg, >85% 순도) 단백질의 공지된 양을 항체 스크리닝에 이용하였다. 최고의 친화도를 가진 항체의 선택을 위해 3 라운드의 증폭을 이용하였다. ELISA 스크리닝을 위해 항체 단편을 발현하는 대략 250개의 상이한 히트(hit)를 골랐다. 그 후 고친화도 히트를 시퀀싱하여 상이한 항체의 독특성을 결정하였다.

하기 더 상세히 기술된 바와 같이, 50개의 독특한 항-MASP-2 항체를 정제하였고 각각의 정제된 Fab2 항체 250 μg을 MASP-2 결합 친화도 및 보체 경로 기능적 테스트의 특성화에 사용하였다.

항-MASP-2 Fab2의 억제 (차단) 활성을 억제하는데 사용되는 검정

1. 렉틴 경로 C3 컨버타제 형성의 억제를 측정하기 위한 검정:

배경: 렉틴 경로 C3 컨버타제는 단백질 가수분해에 의해 C3를 두 개의 강력한 전염증성 단편, 아나필라톡신 C3a 및 옵소닌 C3b로 분열시키는 효소 복합체 (C4bC2a)이다. C3 컨버타제의 형성은 염증의 매개에 관하여 렉틴 경로에서 중요한 단계인 것으로 보인다. MASP-2는 렉틴 경로 C3 컨버타제 (C4bC2a)의 구조적 구성요소는 아니며; 그러므로 항-MASP-2 항체 (또는 Fab2)는 기존의 C3 컨버타제의 활성을 직접적으로 억제하지는 않을 것이다. 하지만, MASP-2 세린 프로테아제 활성은 렉틴 경로 C3 컨버타제를 포함하는 두 개의 단백질 구성요소 (C4b, C2a)를 생성하기 위해 필요하다. 그러므로, MASP-2 기능적 활성을 억제하는 (즉, 항-MASP-2 Fab2를 차단하는) 항-MASP-2 Fab2는 렉틴 경로 C3 컨버타제의 데노보 형성을 억제할 것이다. C3은 구조의 일부로서 특이하고 고도로 반응성인 티오에스터 기를 포함한다. 이 검정에서 C3 컨버타제에 의한 C3의 분열시, C3b 상의 티오에스터 기는 에스터 또는 아미드 결합을 통해 플라스틱 웰 바닥에 고정된 고분자에서 하이드록실 또는 아미노 기와 공유 결합을 형성할 수 있으며, 따라서 ELISA 검정에서 C3b의 검출을 용이하게 한다.

효모 만난은 렉틴 경로의 공지된 활성화 인자이다. C3 컨버타제의 형성을 측정하기 위한 다음 방법에서, 만난으로 코팅된 플라스틱 웰을 희석된 래트 혈청과 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 렉틴 경로를 활성화시켰다. 그 다음에 웰을 흘려버리고 표준 ELISA 방법을 사용하여 웰에 고정된 C3b에 대하여 테스트하였다. 이 검정에서 생성된 C3b의 양은 렉틴 경로 C3 컨버타제의 데노보 형성의 직접적인 반영이다. 선택된 농도의 항-MASP-2 Fab2를 이 검정에서 C3 컨버타제 형성 및 그 결과로 일어나는 C3b 생성을 억제하는 능력에 대하여 테스트하였다.

방법:

96-웰 Costar Medium Binding 플레이트를 50 mM 카보네이트 버퍼, pH 9.5에 1 ug/50 Tl/웰로 희석된 만난과 함께 5℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 밤새도록 인큐베이션 후, 각각의 웰을 200 Tl PBS로 3회 세척하였다. 그 다음에 웰을 PBS 중 100 Tl/웰의 1% 소 혈청 알부민으로 블로킹하였고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 그 다음에 각 웰을 200 Tl PBS로 3회 세척하였다. 항-MASP-2 Fab2 샘플을 5℃에서 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 포함 GVB 버퍼 (4.0 mM 바비탈, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl₂, 2.0 mM CaCl₂, 0.1% 젤라틴, pH 7.4)에서 선택된 농도로 희석하였다. 0.5% 래트 혈청을 5℃에서 상기 샘플에 추가하였고 100 Tl을 각 웰로 옮겼다. 플레이트를 덮고 37℃ 수조에서 30분 동안 인큐베이션하여 보체를 활성화시켰다. 플레이트를 37℃ 수조로부터 얼음물 혼합물을 포함하는 용기로 옮김으로써 반응을 중단시켰다. 각 웰을 PBS-Tween 20 (PBS 중의 0.05% Tween 20) 200 Tl로 5회 세척한 다음, 200 Tl PBS로 2회 세척하였다. 1차 항체 (토끼 항-인간 C3c, DAKO A0062)의 1:10,000 희석액의 100 Tl/웰을 2.0 mg/ml 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS에 추가하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl PBS로 5회 세척하였다. 2차 항체 (퍼옥시다제-컨쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG, American Qualex A102PU)의 1:10,000 희석액의 100 Tl/웰을 2.0 mg/ml 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS에 추가하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl의 PBS로 5회 세척하였다. 100 Tl/웰의 퍼옥시다제 기질 TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)를 추가하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 100 Tl/웰의 1.0 M H₃PO₄를 추가하여 퍼옥시다제 반응을 중단시켰고 OD₄₅₀을 측정하였다.

2. MASP-2-의존적 C4 분열의 억제를 측정하기 위한 검정

배경: MASP-2의 세린 프로테아제 활성은 매우 특이적이고 MASP-2에 대하여 단지 두 개의 단백질 기질, C2 및 C4를 식별하였다. C4의 분열은 C4a 및 C4b를 생성하였다. 항-MASP-2 Fab2는 C4 분열에 직접적으로 수반되는 MASP-2 상의 구조적 에피토프 (예를 들어, C4에 대한 MASP-2 결합 부위; MASP-2 세린 프로테아제 촉매 부위)에 결합할 수도 있으며 이로 인해 MASP-2의 C4 분열 기능적 활성을 억제한다.

효모 만난은 렉틴 경로의 공지된 활성화 인자이다. MASP-2의 C4 분열 활성을 측정하기 위한 다음 방법에서, 만난으로 코팅된 플라스틱 웰을 희석된 래트 혈청과 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 렉틴 경로를 활성화시킨다. 이 ELISA 검정에 사용된 1차 항체는 단지 인간 C4만을 인식하기 때문에, 희석된 래트 혈청에는 또한 인간 C4 (1.0 Tg/ml)를 공급한다. 그 다음에 웰을 세척하고 표준 ELISA 방법을 사용하여 웰에 고정된 인간 C4b에 대하여 검정하였다. 이 검정에서 생성된 C4b의 양은 MASP-2 의존성 C4 분열 활성의 측정치이다. 선택된 농도의 항-MASP-2 Fab2를 이 검정에서 C4 분열을 억제하는 능력에 대하여 테스트하였다.

방법: 96-웰 Costar Medium Binding 플레이트를 1.0 Tg/50 Tl/웰로 50 mM 카보네이트 버퍼, pH 9.5에 희석된 만난과 함께 5℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl PBS로 3회 세척하였다. 그 다음에 웰을 PBS 중의 100 Tl/웰의 1% 소 혈청 알부민으로 블로킹하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl의 PBS로 3회 세척하였다. 항-MASP-2 Fab2 샘플을 5℃에서 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 함유 GVB 버퍼 (4.0 mM 바비탈, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl₂, 2.0 mM CaCl₂, 0.1% 젤라틴, pH 7.4)에 선택된 농도로 희석하였다. 1.0 Tg/ml 인간 C4 (Quidel)를 또한 이 샘플에 포함시켰다. 0.5% 래트 혈청을 5℃에서 상기 샘플에 추가하였고 100 Tl을 각 웰로 옮겼다. 플레이트를 덮고 37℃ 수조에서 30분 동안 인큐베이션하여 보체 활성화시켰다. 플레이트를 37℃ 수조로부터 얼음물 혼합물을 포함하는 용기로 옮김으로써 반응을 중단시켰다. 각 웰을 PBS-Tween 20 (PBS 중의 0.05% Tween 20) 200 Tl로 5회 세척한 다음, 각 웰을 200 Tl PBS로 2회 세척하였다. 비오틴-컨쥬게이션된 닭 항-인간 C4c (Immunsystem AB, Uppsala, Sweden)의 1:700 희석액의 100 Tl/웰을 2.0 mg/ml 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 PBS에 추가하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 웰을 200 Tl PBS로 5회 세척하였다. 0.1 Tg/ml의 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 스트렙타비딘 (Pierce Chemical #21126)의 100 Tl/웰을 2.0 mg/ml BSA를 함유하는 PBS에 추가하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 각각의 웰을 200 Tl PBS로 5회 세척하였다. 100 Tl/웰의 퍼옥시다제 기질 TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)을 추가하였고 실온에서 16분 동안 인큐베이션하였다. 100 Tl/웰의 1.0 M H₃PO₄를 추가하여 퍼옥시다제 반응을 중단시켰고 OD₄₅₀을 측정하였다.

3. '고유' 래트 MASP-2에 대한 항-래트 MASP-2 Fab2의 결합 검정

배경: MASP-2는 보통 특이적 렉틴 분자 (만노스-결합 단백질 (MBL) 및 피콜린)를 포함하는 MASP-2 다이머 복합체로서 혈장에 존재한다. 그러므로, 생리학적으로 적절한 형태의 MASP-2로의 항-MASP-2 Fab2의 결합을 연구하는데 관심이 있으면, 정제된 재조합 MASP-2 대신에, 혈장 내 '천연' MASP-2 및 Fab2 간의 상호작용이 사용된 결합 검정을 개발하는 것이 중요하다. 이 결합 검정에서 10% 래트 혈청의 '천연' MASP-2-MBL 복합체를 먼저 만난-코팅된 웰에 고정하였다. 표준 ELISA 방법론을 사용하여 고정된 '천연' MASP-2로의 다양한 항-MASP-2 Fab2의 결합 친화도를 연구하였다.

방법: 96-웰 Costar High Binding 플레이트를 50 mM 카보네이트 버퍼, pH 9.5에서 1 Tg/50 Tl/웰로 희석된 만난과 함께 5℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl PBS로 3회 세척하였다. 웰을 PBST (0.05% Tween 20이 들어있는 PBS) 중의 100 Tl/웰의 0.5% 무지방 탈지 분유로 블로킹하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 각 웰을 TBS/Tween/Ca⁺⁺ Wash 버퍼 (Tris-완충된 식염수, 0.05% Tween 20, 5.0 mM CaCl₂ 함유, pH 7.4) 200 Tl로 3회 세척하였다. 고염 결합 버퍼 (20 mM Tris, 1.0 M NaCl, 10 mM CaCl₂, 0.05% Triton-X100, 0.1% (w/v) 소 혈청 알부민, pH 7.4) 중의 10% 래트 혈청을 얼음 위에서 제조하였다. 100 Tl/웰을 추가하였고 5℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 웰을 TBS/Tween/Ca⁺⁺ 세척 버퍼 200 Tl로 3회 세척하였다. 그 다음에 웰을 200 Tl PBS로 2회 세척하였다. Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 함유 GVB 버퍼 (4.0 mM 바비탈, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl₂, 2.0 mM CaCl₂, 0.1% 젤라틴, pH 7.4)에 희석된 선택된 농도의 항-MASP-2 Fab2의 100 Tl/웰을 추가하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl PBS에서 5회 세척하였다. PBS 중의 2.0 mg/ml 소 혈청 알부민에서 1:5000으로 희석된 HRP-컨쥬게이션된 염소 항-Fab2 (Biogenesis 카탈로그 번호 0500-0099)의 100 Tl/웰을 추가하였고 부드럽게 혼합하면서 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 Tl PBS로 5회 세척하였다. 퍼옥시다제 기질 TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)의 100 Tl/웰을 추가하였고 실온에서 70분 동안 인큐베이션하였다. 100 Tl/웰의 1.0 M H₃PO₄를 추가하여 퍼옥시다제 반응을 중단시켰고 OD₄₅₀을 측정하였다.

결과:

ELISA 스크리닝을 위해 래트 MASP-2 단백질에 대하여 고친화도로 반응한 대략 250개의 상이한 Fab2를 골랐다. 이들 고친화도 Fab2를 시퀀싱하여 상이한 항체의 독특성을 결정하였고, 추가의 분석을 위해 50개의 독특한 항-MASP-2 항체를 정제하였다. 각각의 정제된 Fab2 항체 250 ug를 MASP-2 결합 친화도 및 보체 경로 기능적 테스트의 특성화에 사용하였다. 이 분석의 결과는 하기 표 6에서 나타난다.

렉틴 경로 보체 활성화를 차단하는 항-MASP-2 FAB2

Fab2 항체 #	C3 컨버타제 (IC₅₀ (nM)	K_d	C4 분열 IC₅₀ (nM)
88	0.32	4.1	ND
41	0.35	0.30	0.81
11	0.46	0.86	<2 nM
86	0.53	1.4	ND
81	0.54	2.0	ND
66	0.92	4.5	ND
57	0.95	3.6	<2 nM
40	1.1	7.2	0.68
58	1.3	2.6	ND
60	1.6	3.1	ND
52	1.6	5.8	<2 nM
63	2.0	6.6	ND
49	2.8	8.5	<2 nM
89	3.0	2.5	ND
71	3.0	10.5	ND
87	6.0	2.5	ND
67	10.0	7.7	ND

상기 표 6에서 나타난 바와 같이, 테스트된 50개의 항-MASP-2 Fab2 중에서, 17개의 Fab2가 10 nM Fab2 이하의 IC₅₀로 C3 컨버타제를 강력하게 억제하는 MASP-2 차단 Fab2로 식별되었다 (34% 양성 적중률). 식별된 17개의 Fab2 중 7개는 나노몰 이하의 범위의 IC₅₀을 갖는다. 게다가, 표 6에서 나타난 17개의 MASP-2 차단 Fab2 모두는 렉틴 경로 C3 컨버타제 검정에서 C3 컨버타제 형성의 본질적으로 완전한 억제를 제공하였다. 도 8A는 Fab2 항체 #11에 대한 C3 컨버타제 형성 검정의 결과를 그래프로 도시하며, 이것은 테스트된 그 밖의 Fab2 항체를 대표하고, 이 결과는 표 6에서 나타난다. "차단" Fab2가 각각의 MASP-2 분자가 Fab2에 의해 결합될 때에도 MASP-2 기능을 단편적으로만 억제할 수도 있다는 것이 이론적으로 가능하기 때문에, 이것은 중요한 고려사항이다.

만난은 렉틴 경로의 공지된 활성화 인자이지만, 래트 혈청에서 항-만난 항체의 존재가 고전적 경로를 활성화시키고 고전적 경로 C3 컨버타제를 통해 C3b를 생성할 수도 있다는 것은 이론적으로는 가능하다. 하지만, 이 실시예에서 나열된 17개의 차단 항-MASP-2 Fab2 각각은 C3b 생성을 강력하게 억제하며 (>95 %), 따라서 렉틴 경로 C3 컨버타제에 대한 이 검정의 특이성을 입증한다.

각각에 대하여 분명한 K_d를 계산하기 위해서 17개의 차단 Fab2 모두로 결합 검정을 수행하였다. 차단 Fab2 중 6개에 대하여 천연 래트 MASP-2로의 항-래트 MASP-2 Fab2의 결합 검정의 결과는 표 6에서 나타난다. 도 8B는 Fab2 항체 #11과의 결합 검정의 결과를 그래프로 도시한다. 유사한 결합 검정을 그 밖의 Fab2에 대하여 수행하였으며, 그 결과는 표 6에서 나타난다. 일반적으로, '천연' MASP-2로의 6개의 Fab2 각각의 결합에 대하여 얻어진 분명한 K_d는 C3 컨버타제 기능적 검정에서 Fab2에 대한 IC₅₀과 합리적으로 상응한다. 프로테아제 활성의 활성화시 MASP-2는 '비활성'에서 '활성' 형태로의 구성형태의 변화를 거친다는 증거가 있다 (Feinberg et al., EMBO J 22:2348-59 (2003); Gal et al., J. Biol. Chem. 280:33435-44 (2005)). C3 컨버타제 형성 검정에 사용된 정상 래트 혈장에서, MASP-2는 주로 '비활성' 치모겐 구성형태로 존재한다. 그에 반해, 결합 검정에서, MASP-2는 고정된 만난에 결합된 MBL을 가진 복합체의 일부로서 존재하며; 그러므로, MASP-2는 '활성' 구성형태로 되어 있을 것이다 (Petersen　et　al., J. Immunol Methods 257:107-16, 2001). 그 결과, 각각의 검정에서 Fab2는 MASP-2의 상이한 구성형태에 결합하기 때문에, 이들 두 개의 기능적 검정에서 테스트된 17개의 차단 Fab2 각각에 대한 IC₅₀ 및 K_d 간의 정확한 대응을 예상하지는 않는다. 그럼에도 불구하고, Fab2 #88을 제외하면, 두 검정에서 테스트된 그 밖의 16개의 Fab2 각각에 대한 IC₅₀ 및 분명한 Kd 간에 합리적으로 밀접한 대응이 있는 것으로 보인다 (표 6 참조).

차단 Fab2의 다수를 C4의 MASP-2 매개 분열의 억제에 대하여 평가하였다. 도 8C는 C4 분열 검정의 결과를 그래프로 도시하는데, Fab2 #41로의 억제를 나타내며, IC₅₀=0.81 nM이다 (표 6 참조). 도 9에서 도시된 바와 같이, 테스트된 모든 Fab2는 C3 컨버타제 검정에서 얻어진 것과 유사한 IC₅₀으로 C4 분열을 억제하는 것으로 발견되었다 (표 6 참조).

만난이 렉틴 경로의 공지된 활성화 인자이지만, 래트 혈청에서 항-만난 항체의 존재는 또한 고전적 경로를 활성화시키며 이로 인해 C4의 C1s-매개 분열에 의해 C4b를 생성한다는 것은 이론적으로 가능하다. 하지만, 강력하게 C4b 세대를 억제하는 여러 항-MASP-2 Fab2가 식별되었으며 (>95 %), 따라서 MASP-2 매개 C4 분열에 대한 이 검정의 특이성을 입증한다. C3과 마찬가지로, C4는 구조의 일부로서 특이하고 고도로 반응성인 티오에스터 기를 포함한다. 이 검정에서 MASP-2에 의한 C4의 분열시, C4b 상의 티오에스터 기는 에스터 또는 아미드 결합을 통해 플라스틱 웰의 바닥에 고정된 고분자 상에서 하이드록실 또는 아미노 기와 공유 결합을 형성할 수 있으며, 따라서 ELISA 검정에서 C4b의 검출을 용이하게 한다.

이들 구조는 C4 및 C3 컨버타제 활성 둘 다를 기능적으로 차단하는 래트 MASP-2 단백질에 대한 고친화도 FAB2의 생성을 입증하며, 이로 인해 렉틴 경로 활성화를 방지한다.

실시예 11

이 실시예는 실시예 10에서 기술된 바와 같이 생성된 차단 항-래트 MASP-2 Fab2 항체의 다수에 대한 에피토프 매핑을 기술한다.

방법:

도 10에서 도시된 바와 같이, 모두 N-말단 6X His 태그를 가진 다음 단백질을 pED4 벡터를 사용하여 CHO 세포에서 발현시켰다:

래트 MASP-2A, 전장 MASP-2 단백질, 활성 중심에서 세린을 알라닌 (S613A)으로 변경하여 비활성화됨;

래트 MASP-2K, 자가활성화를 감소시키도록 변화된 전장 MASP-2 단백질 (R424K);

CUBI-II, CUBI, EGF-유사 및 CUBII 도메인만을 포함하는 래트 MASP-2의 N-말단 단편; 및

CUBI/EGF-유사, CUBI 및 EGF-유사 도메인만을 포함하는 래트 MASP-2의 N-말단 단편.

이들 단백질을 이전에 기술된 바와 같이 니켈-친화도 크로마토그래피에 의해 배양 상층액으로부터 정제하였다 (Chen et al., J. Biol. Chem. 276:25894-02 (2001)).

래트 MASP-2의 CCPII 및 세린 프로테아제 도메인을 포함하는 C-말단 폴리펩타이드 (CCPII-SP)는 대장균에서 pTrxFus (Invitrogen)를 사용하여 티오레독신 융합 단백질로 발현된다. 단백질을 Thiobond 친화도 레진을 사용하여 세포 용해물로부터 정제하였다. 티오레독신 융합 파트너는 음성 대조군으로서 빈(empty) pTrxFus로부터 발현된다.

모든 재조합 단백질을 TBS 버퍼로 투석하였고 그 농도를 280 nm에서 OD를 측정하여 결정하였다.

도트 블롯 분석:

상기 기술되고 도 10에서 도시된 다섯 개의 재조합 MASP-2 폴리펩타이드 (및 CCPII-세린 프로테아제 폴리펩타이드에 대한 음성 대조군으로서 티오레독신 폴리펩타이드)의 단계 희석액을 나이트로셀룰로스 막에 스폿팅하였다. 스폿팅된 단백질의 양은 5배 단계에서 100 ng 내지 6.4 pg의 범위에 있다. 이후의 실험에서, 스폿팅된 단백질의 양은 다시 5배 단계에서 50 ng 미만 내지 16 pg의 범위에 있다. 막을 TBS (차단 버퍼) 중의 5% 탈지 분유로 블로킹한 다음 차단 버퍼 (5.0 mM Ca²⁺포함) 중의 1.0 μg/ml 항-MASP-2 Fab2와 함께 인큐베이션하였다. 결합된 Fab2를 HRP-컨쥬게이션된 항-인간 Fab (AbD/Serotec; 1/10,000로 희석됨) 및 ECL 검출 키트 (Amersham)를 사용하여 검출하였다. 한 막을 양성 대조군으로서 다클론성 토끼-항 인간 MASP-2 Ab (Stover et al., J Immunol 163:6848-59 (1999)에서 기술됨)와 함께 인큐베이션하였다. 이 경우에, 결합된 Ab를 HRP-컨쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG (Dako; 1/2,000로 희석됨)를 사용하여 검출하였다.

MASP-2 결합 검정

ELISA 플레이트를 카보네이트 버퍼 (pH 9.0) 중의 1.0 μg/웰의 재조합 MASP-2A 또는 CUBI-II 폴리펩타이드로 4℃에서 밤새도록 코팅하였다. 웰을 TBS 중의 1% BSA로 블로킹한 다음, 항-MASP-2 Fab2의 단계 희석액을 5.0 mM Ca²⁺를 함유하는 TBS에 추가하였다. 플레이트를 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. TBS/tween/Ca²⁺로 3회 세척 후, TBS/Ca²⁺에서 1/10,000으로 희석된 HRP-컨쥬게이션된 항-인간 Fab (AbD/Serotec)를 추가하였고 플레이트를 추가로 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 결합된 항체를 TMB 퍼옥시다제 기질 키트 (Biorad)를 사용하여 검출하였다.

결과:

다양한 MASP-2 폴리펩타이드와의 Fab2의 반응성을 입증하는 도트 블롯 분석의 결과를 하기 표 7에서 제공한다. 표 7에서 제공된 수치는 반-최고 신호 강도를 제공하기에 필요한 스폿팅된 단백질의 양을 나타낸다. 나타난 바와 같이, 모든 폴리펩타이드 (티오레독신 융합 파트너 단독을 제외하면)가 양성 대조군 Ab (다클론성 항-인간 MASP-2 혈청, 토끼에서 발생함)에 의해 인식되었다.

도트 블롯에서 다양한 재조합 래트 MASP-2 폴리펩타이드와의 반응성

Fab2 항체 #	MASP-2A	CUBI-II	CUBI/EGF-유사	CCPII-SP	티오레독신
40	0.16 ng	NR	NR	0.8 ng	NR
41	0.16 ng	NR	NR	0.8 ng	NR
11	0.16 ng	NR	NR	0.8 ng	NR
49	0.16 ng	NR	NR	>20 ng	NR
52	0.16 ng	NR	NR	0.8 ng	NR
57	0.032 ng	NR	NR	NR	NR
58	0.4 ng	NR	NR	2.0 ng	NR
60	0.4 ng	0.4 ng	NR	NR	NR
63	0.4 ng	NR	NR	2.0 ng	NR
66	0.4 ng	NR	NR	2.0 ng	NR
67	0.4 ng	NR	NR	2.0 ng	NR
71	0.4 ng	NR	NR	2.0 ng	NR
81	0.4 ng	NR	NR	2.0 ng	NR
86	0.4 ng	NR	NR	10 ng	NR
87	0.4 ng	NR	NR	2.0 ng	NR
양성 대조군	<0.032 ng	0.16 ng	0.16 ng	<0.032 ng	NR

제2 및 제3 주 동안 경로 활성을 관찰하였으며, 항-MASP-2 MoAb 투여 후 17일까지 마우스에서 완전한 렉틴 경로가 복원되었다. NR = 무반응. 양성 대조군 항체는 다클론성 항-인간 MASP-2 혈청이며, 토끼에서 발생한다.

모든 Fab2가 MASP-2A, 뿐만 아니라 MASP-2K와 반응하였다 (데이터 미도시). 대부분의 Fab2는 CCPII-SP 폴리펩타이드를 인식하였지만 N-말단 단편은 인식하지 않는다. 두 가지 예외는 Fab2 #60 및 Fab2 #57이다. Fab2 #60은 MASP-2A 및 CUBI-II 단편을 인식하지만, CUBI/EGF-유사 폴리펩타이드 또는 CCPII-SP 폴리펩타이드를 인식하지 않으며, 그것은 CUBII의 에피토프에 결합하거나, 또는 CUBII 및 EGF-유사 도메인에 걸쳐있다는 것을 제안한다. Fab2 # 57은 MASP-2A를 인식하지만 테스트된 MASP-2 단편 중 어느 것도 인식하지 않으며, 이 Fab2는 CCP1에서 에피토프를 인식한다. Fab2 #40 및 #49는 완전한 MASP-2A에만 결합하였다. 도 11에서 나타난 ELISA 결합 검정에서, Fab2 #60은 또한 약간 더 낮은 분명한 친화도에도 불구하고, CUBI-II 폴리펩타이드에 결합하였다.

이 결과는 MASP-2 단백질의 다수의 영역에 대한 독특한 차단 Fab2의 식별을 입증한다.

실시예 12

이 실시예는 쥐 신장 허혈/재관류 모델에서 MASP-2-/- 마우스의 분석을 기술한다.

배경/근거: 체온에서 신장의 허혈-재관류 (I/R) 손상은 저혈량성 쇼크(hypovolaemic shock), 신장 동맥 폐색 및 교차-클램핑(cross-clamping) 수술을 포함한 많은 임상 질환과 관련이 있다.

신장 허혈-재관류 (I/R)는 급성 신부전의 중요한 원인이며, 최대 50%의 치사율과 연관성이 있다 (Levy et al., JAMA 275:1489-94, 1996; Thadhani et al., N. Engl. J. Med. 334:1448-60, 1996). 이식 후 신부전은 신장 이식 후 흔히 발생하고 위협적인 합병증이다 (Nicholson et al., Kidney Int. 58:2585-91, 2000). 신장 I/R 손상에 효과적인 치료는 현재 이용할 수 없으며 혈액 투석만이 유일하게 이용 가능한 치료법이다. 신장 I/R 손상의 병리생리학은 복잡하다. 현재의 연구는 보체 활성화의 렉틴 경로가 신장 I/R 손상의 발병 기전에 중요한 역할을 할 수도 있다는 것을 보여주었다 (deVries et al., Am. J. Path. 165:1677-88, 2004).

방법:

MASP-2(-/-) 마우스를 실시예 1에서 기술된 바와 같이 생성하였고 적어도 10세대 동안 C57Bl/6과 역교배시켰다. 22-25 g 중량의 6마리의 수컷 MASP-2(-/-) 및 6마리의 야생형 (+/+) 마우스를 Hypnovel (6.64 mg/kg; Roche products Ltd. Welwyn Garden City, UK)의 복강 내 주사로 투여하였고, 그 후 아이소플루란 (Abbott Laboratories Ltd., Kent, UK)의 흡입으로 마취시켰다. 아이소플루란이 최소한의 간 독성을 가진 가벼운 흡입 마취제이고; 농도가 정확하게 생산되고 동물이 장기적인 마취 후에도 신속하게 회복하기 때문에, 이것을 선택하였다. Hypnovel이 신경 이완성 진통상태(neuroleptanalgesia)의 조건을 생산하고 더 적은 아이소플루란이 투여에 필요하다는 것을 의미하기 때문에 이것을 투여하였다. 일정한 체온을 유지하기 위해서 동물 아래에 따뜻한 패드를 배치하였다. 그 다음에, 정중선 복부 절개를 수행하였고 한쌍의 경인기(retractor)를 사용하여 체강을 열었다. 오른쪽 및 왼쪽 신장 둘 다의 신장 정맥 및 동맥 위 및 아래에서 결합 조직을 제거하였고, 55분의 기간 동안 미세동맥꽈리(microaneurysm) 클램프의 적용을 통해 신장 페디클(pedicle)을 클램핑하였다. 이 혀혈 기간은 초기에는 이 연구실에서 수행된 선행 연구를 기반으로 하였다 (Zhou et al., J. Clin. Invest. 105:1363-71 (2000)). 이에 더하여, 허혈 적정 후 55분의 표준 허혈 시간을 선택하였고, 55분이 가역적인 일정한 손상을 제공하며, 치사율이 5% 미만으로 낮다는 것을 발견하였다. 폐색 후, 따뜻한 식염수 (37℃) 0.4 ml를 복강에 배치한 다음, 허혈 기간 동안 복부를 닫았다. 미세동맥꽈리 클램프의 제거 후, 신장을 신장으로의 혈액 역류의 지표인 색깔이 변할 때까지 관찰하였다. 추가로 따뜻한 식염수 0.4 ml를 복강에 배치하였고 개구부를 봉합하였으며, 동물을 케이지에 되돌려 놓았다. 클램프 제거 후 24시간에 꼬리 혈액 샘플을 채취하였고, 48시간에 마우스를 희생시켜 추가적인 혈액 샘플을 수거하였다.

신장 손상의 평가: 신장 기능을 6마리의 수컷 MASP-2(-/-) 및 6마리의 WT (+/+) 마우스에서 재관류 후 24 및 48시간에 평가하였다. 혈액 크레아티닌 측정치를 질량분석법으로 결정하였으며, 이것은 신장 기능의 재현 가능한 지표를 제공한다 (민감도 < 1.0 μmol/L). 도 12는 재관류 후 24시간 및 48시간에 야생형 C57Bl/6 대조군 및 MASP-2 (-/-)에 대한 혈액 요소 질소 클리어런스를 그래프로 도시한다. 도 12에서 도시된 바와 같이, MASP-2(-/-) 마우스는 야생형 대조군 마우스와 비교하여 24 및 48시간에 혈액 요소의 양의 큰 감소를 나타냈으며, 허혈 재관류 손상 모델에서 신장 손상으로부터의 보호 기능적인 효과를 나타낸다.

전반적으로, 수술 과정 및 허혈성 손상 후 24 및 48시간에 WT (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스 둘 다에서 증가된 혈액 요소를 볼 수 있다. 비-허혈성 WT (+/+) 수술 동물에서 혈액 요소의 수준을 각각 5.8 mmol/L인 것으로 결정하였다. 도 12에서 제공된 데이터에 더하여, 한 MASP-2 (-/-) 동물은 허혈성 손상으로부터 거의 완전한 보호를 나타냈으며, 24 및 48시간에 각각 6.8 및 9.6 mmol/L의 값을 갖는다. 이 동물을 잠재적 이상치로서 군별 분석에서 제외하였으며, 허혈성 손상이 존재하지 않을 수도 있다. 그러므로, 도 12에서 도시된 최종 분석은 5마리의 MASP-2(-/-) 마우스 및 6마리의 WT (+/+) 마우스를 포함하였고 MASP-2 (-/-) 마우스에서 24 및 48시간에 혈액 요소의 통계적으로 유의한 감소를 볼 수 있다 (스튜던트 t-테스트 p<0.05). 이 결과는 허혈성 손상으로 인한 신장 손상으로부터의 보호 또는 치료 효과를 가질 것으로 예상된다는 것을 나타낸다.

실시예 13

이 실시예는 쥐 황반 변성 모델에서 MASP-2-/-의 결과를 기술한다.

배경/근거: 산업화된 세계에서 노화-관련 황반 변성 (AMD)은 55살 이후 실명의 주 원인이다. AMD는 두 가지 주요 형태로 발생한다: 신생 혈관 (습식) AMD 및 위축성 (건식) AMD. AMD에 걸린 개체의 단지 ~20%만이 습식 형태에 걸리지만, 신생 혈관 (습식) 형태는 AMD와 관련된 심각한 시력 상실의 90%에서 원인이 된다. AMD의 임상적 홀마크(hallmark)는 다중 드루젠(drusen), 지도모양 위축(geographic atrophy), 및 맥락막 혈관 신생 (CNV)을 포함한다. 2004년 12월에, FDA는 AMD의 습식 (신생 혈관) 형태의 치료를 위한 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 효과를 특이적으로 표적화하고 차단하기 위한 안과용 약물의 새로운 종류인 Macugen (페가프타닙)을 승인하였다 (Ng et al., Nat Rev. Drug Discov 5:123-32 (2006)). Macugen이 AMD 환자의 하위 코호트에 대한 유망한 새로운 치료 옵션을 제공하지만, 이 복합성 질환에 대한 추가적인 치료법을 개발하는 것이 긴급히 필요하다. 다수의 독립적인 조사 라인은 AMD의 발병 기전에서 보체 활성화에 대한 중심 역할과 관련되어 있음을 나타낸다. AMD의 가장 심각한 형태인 맥락막 혈관 신생 (CNV)의 발병 기전은 보체 경로의 활성화를 포함할 수도 있다.

25년 이상 전에, Ryan은 동물의 CNV의 레이저-유도된 손상 모델을 기술한다 (Ryan, S.J., Tr. Am. Opth. Soc. LXXVII:707-745, 1979). 처음에는 붉은 털 원숭이(rhesus monkey)를 사용하여 모델을 개발하였지만, 같은 기술이 마우스를 포함한 다양한 연구 동물의 CNV의 유사한 모델을 개발하는데 사용되었다 (Tobe et al., Am. J. Pathol. 153:1641-46, 1998). 이 모델에서, 레이저 광 응고를 사용하여 CNV-유사 막의 형성을 유발하는 작용인 부르흐 막(Bruch's membrane)을 파괴하였다. 레이저-유도된 모델은 인간 질병의 중요한 특징 중 다수를 캡쳐한다 (최근의 리뷰를 위해서는, Ambati et al., Survey Ophthalmology 48:257-293, 2003을 참고하면 된다). 레이저-유도된 마우스 모델은 현재 잘 확립되어 있으며, 크고, 점점 증가하는 많은 연구 프로젝트에서 실험 기초로서 사용된다. 일반적으로 레이저-유도된 모델은 인간의 CNV와 충분한 생물학적 유사성을 공유하며 이 모델을 사용한 발병 기전 및 약물 억제의 전임상적 연구가 인간의 CNV와 관련이 있다는 것이 일반적으로 수용된다.

방법:

MASP-2-/- 마우스를 실시예 1에서 기술된 바와 같이 생성하였고 에서 기술된 적어도 10세대 동안 C57Bl/6과 역교배시켰다. 현재의 연구는 MASP-2 (-/-) 및 MASP-2 (+/+) 수컷 마우스가 망막 색소 상피 (RPE)/맥락막에서 레이저 손상 후 ELISA에 의한 조직 손상의 측정 및 VEGF 수준의 결정으로서 레이저 공초점 현미경의 스캔에 의한 레이저-유도된 CNV의 부피에 초점을 맞춘 신생 혈관 AMD의 가속화 모델인 레이저-유도된 CNV의 과정에서 평가될 때 결과를 비교하였다.

맥락막 혈관 신생 (CNV)의 유도: 레이저 광 응고 (532 nm, 200 mW, 100 ms, 75μm; Oculight GL, Iridex, Mountain View, CA)를 약물 군 평가에 가려진 단일 개체에 의해 제0 일에 각 동물의 두 눈에서 수행하였다. 레이저 스폿을 표준화된 방식으로 시신경 주위에 적용하였으며, 세극등 전달 시스템 및 콘택트 렌즈와 같은 커버슬립을 사용하였다. 레이저 손상의 형태학적 종료점은 부르흐 막의 파괴와 상관관계가 있는 것으로 생각되는 징후인, 공동화 기포의 출현이다. 상세한 방법 및 평가되는 종료점은 다음과 같다.

플루오레세인 혈관 조영술: 레이저 광 응고 후 1주일에 플루오레세인 혈관 조영술을 카메라 및 이미지화 시스템 (TRC 50 1A camera; ImageNet 2.01 system; Topcon, Paramus, NJ)으로 수행하였다. 2.5% 플루오레세인 나트륨 0.1 ml의 복강 내 주사 후 산동식 안저 카메라 렌즈와 접촉된 20-D 렌즈로 사진을 캡쳐하였다. 레이저 광 응고 또는 혈관 조영술에 관련되지 않은 망막 전문가가 가려진 방식의 단일 설정에서 플루오레세인 혈관 조영도를 평가하였다.

맥락막 혈관 신생 (CNV)의 부피: 레이저 손상 후 1주일에, 눈에서 핵을 제거하였고 4% 파라포름알데하이드로 4℃에서 30분 동안 고정하였다. 전안부를 제거하여 안배를 얻었고 PBS로 3회 세척한 후 이어서, 메탄올 시리즈를 통해 탈수 및 재수화하였다. 버퍼 (1% 소 혈청알부민 및 0.5% Triton X-100을 포함하는 PBS)로 실온에서 30분 동안 2회 블로킹 후, 안배를 0.2% BSA 및 0.1% Triton X-100을 포함하는 PBS로 희석된 0.5% FITC-아이소렉틴 B4 (Vector laboratories, Burlingame, CA)와 함께 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하였으며, 이것은 내피 세포의 표면에서 말단 β-D-갈락토스 잔기에 결합하여 쥐 맥관 구조를 선택적으로 라벨링한다. 0.1% Triton X-100을 포함하는 PBS로 2회 세척 후, 감각 신경 망막을 부드럽게 떼내어 시신경으로부터 절단하였다. 4번의 이완 방사형 절개가 이루어졌고, 나머지 RPE-맥락막-공막 복합체를 퇴색 방지 배지 (Immu-Mount Vectashield Mounting Medium; Vector Laboratories) 및 커버슬립에 플랫마운트(flatmount)하였다.

플랫마운트를 레이저 공초점 현미경 (TCS SP; Leica, Heidelberg, Germany)으로 검사하였다. 청색 아르곤 파장 (488 nm)으로 여기시키고 515 내지 545 nm에서 방출을 캡쳐하여 혈관을 가시화한다. 40X 유침용 대물렌즈를 모든 이미지화 연구에 사용하였다. 수평 광학 절편 (1 μm 단계)을 RPE-맥락막-공막 복합체의 표면으로부터 얻었다. 병변에 연결된 주위의 맥락막 혈관 네트워크가 식별될 수 있는 가장 깊은 초점면을 병변의 바닥으로 판단하였다. 레이저-표적화된 영역에 있고 이 기준면에 대하여 표면적인 임의의 혈관을 CNV로 판단하였다. 각 섹션의 이미지를 디지털 방식으로 저장하였다. CNV-관련 형광 발광의 영역을 현미경 소프트웨어 (TCS SP; Leica)로의 컴퓨터화된 이미지 분석에 의해 측정하였다. 각각의 수평 섹션에서 전체 형광 영역의 합계를 CNV의 부피에 대한 지표로 사용하였다. 처리군 배치가 가려진 작동자에 의해 이미지화를 수행하였다.

CNV를 발생시키는 각각의 레이저 병변의 확률은 그것이 속한 군 (마우스, 눈, 및 레이저 스폿)에 의해 영향을 받기 때문에, 평균 병변 부피를 분할 플롯 반복-측정 설계된 선형 혼합 모델을 사용하여 비교하였다. 전체 플롯 인자는 동물이 속한 유전적 군인 반면, 분할 플롯 인자는 눈이었다. 통계적 유의성을 0.05 수준에서 결정하였다. 평균의 사후(Post hoc) 비교를 다중 비교를 위한 본페로니(Bonferroni) 조정으로 구성하였다.

VEGF ELISA. 12개의 레이저 스폿에 의한 손상 후 3일에, RPE-맥락막 복합체를 용해 버퍼 (프로테아제 억제자와 함께 20 mM 이미다졸 HCl, 10 mM KCl, 1 mM MgCL₂, 10 mM EGTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 1 mM Na 몰리브데이트, 및 1 mM EDTA)에서 15분 동안 얼음 위에서 초음파 처리하였다. 상층액에서 VEGF 단백질 수준을 450 내지 570 nm에서nm (Emax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 모든 스플라이스 변종을 인식하는 ELISA 키트 (R&D Systems, Minneapolis, MN)로 결정하였고, 전체 단백질에 대하여 표준화하였다. 2배수 측정을 광 응고, 이미지화, 또는 혈관 조영술에 포함되지 않은 작동자에 의해 가려진 방식으로 수행하였다. VEGF 수치를 적어도 세 번의 독립적인 실험의 평균 +/- SEM로 표시하였고 만-휘트니(Mann-Whitney) U 테스트를 사용하여 비교하였다. 귀무 가설은 P<0.05에서 거절되었다.

결과:

VEGF 수준의 평가:

도 13A는 제0 일에 C57Bl6 야생형 및 MASP-2(-/-) 마우스로부터 분리된 RPE-맥락막 복합체의 VEGF 단백질 수준을 그래프로 도시한다. 도 13A에서 도시된 바와 같이, VEGF 수준의 평가는 C57bl 야생형 대조군 마우스에 비해 MASP-2 (-/-) 마우스에서 VEGF의 베이스라인 수준의 증가를 나타낸다. 도 13B는 레이저 유도된 손상 후 제3 일에 측정된 VEGF 단백질 수준을 그래프로 도시한다. 도 13B에서 도시된 바와 같이, VEGF 수준은 레이저 유도된 손상 후 3일에 야생형 (+/+) 마우스에서 유의하게 증가하였으며, 공개된 연구와 일치한다 (Nozaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:2328-33 (2006)). 하지만, 놀랍게도 매우 낮은 수준의 VEGF를 MASP-2 (-/-) 마우스에서 볼 수 있다.

맥락막 혈관 신생 (CNV)의 평가:

레이저 유도된 황반 변성 후 VEGF 수준의 감소에 더하여, 레이저 손상 이전 및 이후에 CNV 영역을 결정하였다. 도 14는 레이저 유도된 손상 후 제7 일에 C57bl 야생형 마우스 및 MASP-2(-/-) 마우스에서 측정된 CNV 부피를 그래프로 도시한다. 도 14에서 도시된 바와 같이, MASP-2 (-/-) 마우스는 야생형 대조군 마우스와 비교하여 제7 일에 레이저 유도된 손상 후 CNV 영역의 약 30% 감소를 나타냈다.

이 결과는 MASP (-/-) 마우스 대 야생형 (+/+) 대조군에서 볼 수 있는 바와 같이 VEGF 및 CNV의 감소를 나타내고 억제자로의 MASP-2의 차단이 황반 변성의 치료에서 예방적 또는 치료적 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.

실시예 14

이 실시예는 생리학적 조건 하에서 렉틴 경로 활성화 후 트롬빈 활성화가 일어날 수 있다는 것을 입증하고, MASP-2 포함의 정도를 입증한다. 정상 래트 혈청에서, 렉틴 경로의 활성화는 보체 활성화 (C4 침착으로 평가됨)와 동시에 트롬빈 활성화 (트롬빈 침착으로 평가됨)로 이어진다. 도 15A 및 15B에서 볼 수 있는 바와 같이, 이 실시예에서 트롬빈 활성화를 MASP-2 차단 항체 (Fab2 포맷)에 의해 억제하였으며, 보체 활성화 (도 15A)와 유사한 억제 농도-반응 곡선 (도 15B)을 나타낸다. 이들 데이터는 렉틴 경로의 활성화가 외상에서 발생한 것처럼 전체적으로 MASP-2에 의존적인 과정에서 보체 및 응고 시스템 둘 다의 활성화로 이어질 것이라고 제안한다. 추론해보면, MASP2 차단 항체는 과도한 전신적 응고, 예를 들어, 파종성 혈관 내 응고를 경감시키는 경우에 효과적일 수 있으며, 이것은 주요 외상 사례에서 사망으로 이어지는 홀마크 중 하나이다.

실시예 15

이 실시예는 DIC에서 렉틴 경로의 역할을 평가하기 위해 MASP-2 -/- 결핍 및 MASP-2 +/+ 충분 마우스에서 파종성 혈관 내 응고 ("DIC")의 국소화된 슈와츠만 반응 모델을 사용하여 발생한 결과를 제공한다.

배경/근거:

상기 기술된 바와 같이, MASP-2의 차단은 렉틴 경로 활성화를 억제하고 아나필라톡신 C3a 및 C5a 둘 다의 생성을 감소시킨다. C3a 아나필라톡신은 시험관 내에서 강력한 혈소판 응집체인 것으로 나타날 수 있지만, 생체 내에서 그것들의 포함은 잘 정의되어 있지 않고 상처 회복에서 혈소판 물질 및 플라스민의 방출은 단지 보체 C3만을 2차적으로 포함할 수도 있다. 이 실시예에서, C3 활성화의 장기적인 평가가 파종성 혈관 내 응고를 발생시키는데 필요한지를 해명하기 위해 렉틴 경로의 역할을 MASP-2 (-/-) 및 WT (+/+) 마우스에서 분석하였다.

방법:

이 연구에 사용된 MASP-2 (-/-) 마우스를 실시예 1에서 기술된 바와 같이 발생시켰고 C57Bl/6과 적어도 10세대 동안 역교배시켰다.

국소화된 슈와츠만 반응 모델을 이 실험에 사용하였다. 국소화된 슈와츠만 반응 (LSR)은 선천적 면역 시스템의 세포 및 체액 요소로부터 잘 특성화된 지질다당류 (LPS)-유도된 반응이다. 보체 상에서 LSR의 의존성은 잘 확립되어 있다 (Polak, L., et al., Nature 223:738-739 (1969); Fong J.S. et al., J Exp Med 134:642-655 (1971)). LSR 모델에서, 마우스를 TNF 알파로 4시간 동안 프라이밍한 다음 (500 ng, 음낭 내), 마우스를 마취하여 고환올림근의 생존 중 현미경법을 준비하였다. 양호한 혈류 (1-4 mm/s)를 가진 후모세혈관 세정맥 (15-60 μm 직경)의 네트워크를 관찰을 위해 선택하였다. 동물을 형광 항체로 처리하여 호중구, 또는 혈소판을 선택적으로 라벨링하였다. 혈관의 네트워크를 순차적으로 스캔하였고 모든 혈관의 이미지를 추후 분석을 위해 디지털 방식으로 기록하였다. 미세순환의 기저 상태를 기록한 후, 마우스는 단독으로 또는 하기 나열된 작용제와 함께 LPS (100 μg)의 단일 정맥 내 주사를 받았다. 그 다음에 혈관의 같은 네트워크를 1시간 동안 10분마다 스캔하였다. 배경 형광 발광을 뺌으로써 형광단의 특이적 축적을 식별하였고 이미지의 임계값을 설정함으로써 증강시켰다. 반응의 규모를 기록된 이미지로부터 측정하였다. 슈와츠만 반응의 주요 측정치는 집합체 데이터이다.

연구는 공지되어 있는 보체 경로 고갈제, 코브라 독 인자 (CVF), 또는 말단 경로 억제자 (C5aR 안타고니스트)에 노출된 MASP-2 +/+ 충분, 또는 야생형 마우스를 비교하였다. 결과 (도 16A)는 CVF, 뿐만 아니라 C5aR 안타고니스트 둘 다가 맥관 구조에서 응집체의 출현을 방지한다는 것을 입증한다. 이에 더하여, MASP-2 -/- 결핍 마우스 (도 16B)는 또한 국소화된 슈와츠만 반응의 완전한 억제를 입증하였으며, 렉틴 경로 포함을 지지한다. 이 결과는 DIC 생성에서 MASP-2의 역할을 분명하게 입증하고 DIC의 치료 및 예방을 위한 MASP-2 억제자의 사용을 지지한다.

실시예 16

이 실시예는 쥐 신장 이식 모델에서 MASP-2 (-/-) 마우스의 분석을 기술한다.

배경/근거:

신장 이식의 기능적 결과에서 MASP-2의 역할을 마우스 모델을 사용하여 평가하였다.

방법:

신장 이식의 기능적 결과를 유니네프레코마이즈드(uninephrecomized) 수령체 마우스, 6마리의 WT (+/+) 이식 수령체 (B6), 및 6마리의 MASP-2 (-/-) 이식 수령체로의 단일 신장 동종이식편을 사용하여 평가하였다. 이식된 신장의 기능을 평가하기 위해서, 나머지 천연 신장을 이식 후 5일에 수령체로부터 제거하여, 신장 기능을 24시간 후 혈액 요소 질소 (BUN) 수준의 측정에 의해 평가하였다.

결과:

도 17은 WT (+/+) 수령체 및 the MASP-2 (-/-) 수령체에서 신장 이식 후 6일에 신장의 혈액 요소 질소 (BUN) 수준을 그래프로 도시한다. 도 17에서 도시된 바와 같이, 강력하게 상승된 BUN 수준을 WT (+/+) (B6) 이식 수령체 (마우스에서 정상 BUN 수준은 < 5 mM이다)에서 관찰하였으며, 신부전을 나타낸다. 그에 반해, MASP-2 (-/-) 동종이식편 수령체 마우스는 실질적으로 더 낮은 BUN 수준을 나타냈으며, 개선된 신장 기능을 제안한다. 이들 결과는 WT (+/+) 신장 공여체의 이식편을 사용하여 얻어지며, 이식 수령체에서 기능적 렉틴 경로의 부재는 단독으로 치료적 이점을 달성하기에 충분하다는 것을 제안한다.

종합해보면, 이들 결과는 MASP-2 억제를 통한 렉틴 경로의 일시적 억제가 이환률 및 신장 이식에서 지연된 이식편 기능을 감소시키는 방법을 제공하고, 이 접근법이 그 밖의 이식 설정에 유용할 가능성이 있다는 것을 나타낸다.

실시예 17

이 실시예는 MASP-2 (-/-) 마우스가 쥐 다균성 패혈증 복막염(Septic Peritonitis) 모델에서 패혈성 쇼크에 대하여 저항성임을 입증한다.

배경/근거:

감염에서 MASP-2 (-/-)의 잠재적 효과를 평가하기 위해, 다균성 패혈증 복막염의 모델인 맹장 결찰 및 천공 (CLP) 모델을 평가하였다. 이 모델은 인간 패혈증 복막염의 과정을 가장 정확하게 모방하는 것으로 생각된다. 맹장 결찰 및 천공 (CLP) 모델은 맹장이 결찰되고 바늘에 의해 천공되어 박테리아가 복강으로 연속적으로 누출되는 것을 유발하여 결국 림프 누수를 통해 혈액에 도달한 후 모든 복부 기관으로 분포됨으로써 복합 장기 부전 및 패혈성 쇼크를 유발하는 모델이다 (Eskandari et al., J Immunol 148(9):2724-2730 (1992)). CLP 모델은 환자들에서 관찰된 패혈증의 과정을 모방하고 초기의 과대한 염증 반응에 이어 뚜렷한 아염증기를 유도한다. 이 단계 동안에, 동물은 박테리아 도전에 매우 민감하다 (Wichterman et al., J. Surg. Res. 29(2):189-201 (1980)).

방법:

맹장 결찰 및 천공 (CLP) 모델을 사용한 다균성 감염의 치사율을 WT (+/+) (n=18) 및 MASP-2 (-/-) (n=16) 마우스에서 측정하였다. 간략히 기술된 바와 같이, MASP-2 결핍 마우스 및 그것들의 야생형 한배 새끼를 마취시키고, 맹장을 적출한 다음 원위 단부로 30% 결찰시켰다. 그 다음에 맹장을 0.4 mm 직경의 바늘로 1회 천공하였다. 그런 다음 맹장을 복강에 배치하고 피부를 클램프로 닫았다. CLP를 받은 마우스의 생존률을 CLP 후 14일의 기간 동안 모니터링하였다. CLP 후 16시간에 복강 세척물을 마우스에서 수거하여 박테리아 로드를 측정하였다. 복강 세척물의 단계 희석을 PBS에서 제조하였고 Mueller Hinton 플레이트에서 접종한 다음 계속해서 37℃에서 혐기 조건하에 24시간 동안 인큐베이션한 후 박테리아 로드를 측정하였다.

박테리아 감염에 대한 TNF-알파 사이토카인 반응을 또한 WT (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스에서 CLP 후 16시간에 폐 및 비장에서 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (qRT-PCR)을 통해 측정하였다. WT (+/+) 및 MASP-2 (-/-) 마우스에서 CLP 후 16시간에 TNF-알파의 혈청 수준을 또한 샌드위치 ELISA에 의해 정량하였다.

결과:

도 18은 CLP 과정 후 일의 함수로서 CLP 처리된 동물들의 퍼센트 생존률을 그래프로 도시한다. 도 18에서 도시된 바와 같이, MASP-2 (-/-) 마우스에서 렉틴 경로 결핍은 WT (+/+) 마우스에 비교하여 맹장 결찰 및 천공 모델을 사용한 다균성 감염 후에 마우스의 치사율을 증가시키기 않는다. 도 19에서 도시된 바와 같이, MASP-2 (-/-) 마우스는 그것들의 WT (+/+) 한배 새끼들과 비교하였을 때 CLP 후 복강 세척물에서 상당히 더 높은 박테리아 로드를 나타냈다 (박테리아 수로 대략 1000-배 증가). 이들 결과는 MASP-2 (-/-) 결핍 마우스가 패혈성 쇼크에 저항성임을 나타낸다. 이 모델에서 MASP-2 결핍 마우스에서 감소된 박테리아 클리어런스는, C3 침착이 MASP-2 의존성인 것으로 입증되었기 때문에, 손상된 C3b 매개된 식세포작용으로 인한 것일 수도 있다.

박테리아 감염에 대한 TNF-알파 사이토카인 반응은 WT (+/+) 대조군에 비교하여 MASP-2 (-/-) 마우스에서 상승되지 않은 것으로 결정되었다 (데이터 미도시). 또한 MASP-2 (-/-) 마우스와 대조적으로, CLP 후 16시간에 WT (+/+) 마우스에서 TNF-알파는 상당히 더 높은 혈청 농도인 것으로 결정되었으며, TNF-알파의 혈청 수준은 거의 변화하지 않은 채로 유지되었다. 이들 결과는 패혈성 조건에 대한 격렬한 염증 반응은 MASP-2 (-/-) 마우스에서 완화되었고 동물이 더 높은 박테리아 수의 존재 하에서도 생존하는 것을 허용하였음을 제안한다.

종합해보면, 이들 결과는 패혈증의 경우 렉틴 경로 보체 활성화의 잠재적인 해로운 효과 및 압도적인 패혈증에 걸린 환자에서 증가된 치사율을 입증한다. 이들 결과는 추가로 MASP-2 결핍이 염증성 면역 반응을 조절하고 패혈증 중에 염증 매개체의 발현 수준을 감소시키는 것을 입증한다. 그러므로, MASP-2에 대한 억제 단클론성 항체의 투여에 의한 MASP-2 (-/-)의 억제가 패혈성 쇼크를 앓고 있는 대상체에서 염증 반응을 감소시키는 데 효과적일 것이라고 생각된다.

실시예 18

이 실시예는 쥐 비강 내 감염 모델에서 MASP-2 (-/-) 마우스의 분석을 기술한다.

배경/근거:

슈도모나스 애루기노사는 특히 면역-손상된 개체에서 광범위한 감염을 유발하는 그람 음성 기회성 인간 박테리아 병원체이다. 그것은 후천적 병원성 감염, 특히 병원-감염 폐렴의 주요 공급원이다. 또한 그것은 낭포성 섬유증 (cystic fibrosis; CF) 환자들에서 상당한 이환률 및 치사율의 원인이 된다. 슈도모나스 애루기노사(P. aeruginosa) 폐 감염은 강력한 호중구 모집 및 상당한 폐 염증과 결과적으로 야기된 광범위한 조직 손상을 특징으로 한다 (Palanki M.S. et al., J. Med. Chem 51:1546-1559 (2008)).

이 실시예에서, MASP-2 (-/-) 마우스에서 렉틴 경로의 제거가 박테리아 감염에 대한 마우스의 민감성을 증가시키는 지를 결정하기 위하여 연구를 수행하였다.

방법:

22마리의 WT (+/+) 마우스, 22마리의 MASP-2 (-/-) 마우스 및 11마리의 C3 (-/-) 마우스를 슈도모나스 애루기노사 박테리아 계통의 비강 내 투여로 도전시켰다. 마우스를 감염 후 6일간 모니터링하였고 퍼센트 생존률을 나타내는 카플란-마이어 플롯을 구성하였다.

결과:

도 20은 감염 후 6일 후의 WT (+/+), MASP-2 (-/-) 또는 C3 (-/-) 마우스의 퍼센트 생존률의 카플란-마이어 플롯이다. 도 20에서 도시된 바와 같이, WT (+/+) 마우스에 대해 MASP-2 (-/-) 마우스에서 차이는 관찰되지 않았다. 하지만, C3 (-/-) 마우스에서 고전적 (C1q) 경로의 제거는 박테리아 감염에 대한 심각한 민감성을 초래하였다. 이들 결과는 MASP-2 억제가 박테리아 감염에 대한 민감성을 증가시키지 않음을 입증하며, 그것은 외상 환자에서 고전적 보체 경로를 사용하여 감염과 싸우는 환자의 능력을 손상시키지 않으면서 MASP-2를 억제함으로써 바람직하지 못한 염증 합병증을 감소시키는 것이 가능한 것을 나타낸다.

실시예 19

이 실시예는 실시예 10에서 기술된 바와 같이 식별된 대표적인 고친화도 항-MASP-2 Fab2 항체의 약물동역학적 분석을 기술한다.

배경/근거:

실시예 10에서 기술된 바와 같이, 래트 렉틴 경로를 차단하는 고친화도 항체들을 식별하기 위하여, 래트 MASP-2 단백질을 활용하여 파지 디스플레이 라이브러리를 만들었다. 이 라이브러리는 높은 면역학적 다양성을 제공하기 위하여 디자인하였고, 전체 인간 면역글로불린 유전자 서열을 사용하여 구성하였다. 실시예 10에서 기술된 바와 같이, ELISA 스크리닝에 의해 래트 MASP-2 단백질에 고친화도으로 결합하는 대략 250개의 개개의 파지 클론을 확인하였다. 이들 클론의 시퀀싱으로 50개의 독특한 MASP-2 항체 암호화 파지를 식별하였다. Fab2 단백질을 이들 클론으로부터 발현시키고, 정제하고, MASP-2 결합 친화도 및 렉틴 보체 경로 기능적 억제에 대해 분석하였다.

실시예 10의 표 6에서 나타난 바와 같이, 이 분석의 결과로서 기능성 차단 활성을 가지는 17개의 항-MASP-2 Fab2를 식별하였다 (차단 항체에 대해 34% 적중률). Fab2에 의한 렉틴 보체 경로의 기능성 억제는 C4 침착 수준에서 나타났으며, 이것은 MASP-2에 의한 C4 분열의 직접적인 척도이다. 중요하게, 억제는 C3 컨버타제 활성이 평가될 때 동등하게 명백하였고, 이것은 렉틴 보체 경로의 기능성 차단을 입증한다. 실시예 10에서 기술된 바와 같이 식별된 17개의 MASP-2 차단 Fab2는 C3 컨버타제 형성을 강력하게 억제하고 IC₅₀ 값은 10 nM 이하이다. 17개의 Fab 중 8개가 나노몰 이하의 범위의 IC₅₀ 값을 가지는 것으로 확인되었다. 게다가, 17개의 MASP-2 차단 Fab2는 모두 도 8A-C에서 도시되고, 실시예 10의 표 6에서 요약된 바와 같이, 렉틴 경로 C3 컨버타제 검정에서 C3 컨버타제 형성의 본질적으로 완전한 억제를 제공하였다. 더욱이, 표 6에 나타낸 17개의 MASP-2 차단 Fab2는 각각 C3b 생성을 강력하게 억제하며 (>95%), 따라서 렉틴 경로 C3 컨버타제에 대한 이 검정의 특이성을 입증한다.

래트 IgG2c 및 마우스 IgG2a 전장 항체 아이소타입 변종을 Fab2 #11로부터 유도하였다. 이 실시예는 약물동역학적 파라미터에 대한 이들 아이소타입의 생체 내 특성화를 기술한다.

방법:

실시예 10에서 기술된 바와 같이, 래트 MASP-2 단백질을 활용하여 Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 만들고, 그것으로부터 Fab2#11을 식별하였다. 래트 IgG2c 및 마우스 IgG2a 전장 항체 아이소타입 변종을 Fab2 #11로부터 유도하였다. 래트 IgG2c 및 마우스 IgG2a 전장 항체 아이소타입을 둘 다 다음과 같이 약물동역학적 파라미터에 대해 생체 내에서 특성화하였다.

마우스에서 생체 내 연구:

약물동역학적 연구를 생체 내에서 혈장 렉틴 경로 활성에 미치는 항-MASP-2 항체 투약의 효과를 조사하기 위해 마우스에서 수행하였다. 이 연구에서, C4 침착을 0.3 mg/kg 또는 1.0 mg/kg의 마우스 항-MASP-2 MoAb (Fab2#11로부터 유도된 마우스 IgG2a 전장 항체 아이소타입)의 피하 (sc) 및 복강 내 (ip) 투여 후 다양한 시점에서 렉틴 경로 분석으로 생체 외에서 측정하였다.

도 21은 0.3 mg/kg 또는 1.0 mg/kg의 마우스 항-MASP-2 MoAb 중 어느 하나의 피하 투여 후 다양한 시점에서 마우스 (n=3 마우스/군)로부터 채취한 미희석 혈청 샘플에서 생체 외로 측정된, 렉틴 경로 특이적 C4b 침착을 그래프로 도시한다. 항체 투여 전 수거된 마우스로부터의 혈청 샘플은 음성 대조군 (100% 활성)으로서 작용한 한편, 시험관 내에서 100 nM의 동일한 차단 항-MASP-2 항체로 보충된 혈청을 양성 대조군 (0% 활성)으로서 사용하였다.

도 21에 나타낸 결과들은 1.0 mg/kg 용량의 마우스 항-MASP-2 MoAb의 피하 투여 후의 C4b 침착의 신속하고 완전한 억제를 입증한다. C4b 침착의 부분적인 억제는 0.3 mg/kg 용량의 마우스 항-MASP-2 MoAb의 피하 투여 후에 볼 수 있었다.

렉틴 경로 회복의 시간 과정은 마우스에서 0.6 mg/kg의 마우스 항-MASP-2 MoAb의 단일 ip 투여 후에 3주 동안 이어졌다. 도 22에서 도시된 바와 같이, 렉틴 경로 활성의 급강하는 항체 투여 후 발생했고 완전한 렉틴 경로 억제가 ip 투여 후 약 7일 동안 지속되었다. 렉틴의 느린 복원.

이들 결과는 Fab2 #11로부터 유도된 마우스 항-MASP-2 MoAb가 전신적으로 전달될 대 용량-반응 방식으로 마우스의 렉틴 경로를 억제하는 것을 입증한다.

실시예 20

이 실시예는 노화-관련 황반 변성에 대한 마우스 모델에서의 효능에 대해 Fab2 #11로부터 유도된 마우스 항-MASP-2 Moab의 분석을 기술한다.

배경/근거:

실시예 10에서 기술된 바와 같이, 래트 MASP-2 단백질을 활용하여 Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 만들고, 그것으로부터 Fab2#11을 기능적으로 활성인 항체로서 식별하였다. 래트 IgG2c 및 마우스 IgG2a 아이소타입의 전장 항체를 Fab2 #11로부터 생성하였다. 마우스 IgG2a 아이소타입의 전장 항-MASP-2 항체를 실시예 19에서 기술된 바와 같이 약물동역학적 파라미터들에 대해 특성화하였다. 이 실시예에서, Fab2 #11로부터 유도된 마우스 항-MASP-2 전장 항체를 Bora P.S. et al, J Immunol 174:491-497 (2005)에서 기술된 바와 같이, 노화-관련 황반 변성 (AMD)의 마우스 모델에서 분석하였다.

방법:

실시예 19에서 기술된 바와 같이, Fab2#11로부터 유도된 마우스 IgG2a 전장 항-MASP-2 항체 아이소타입을 실시예 13에서 기술된 바와 같은 노화-관련 황반 변성 (AMD)의 마우스 모델에서 다음과 같이 변형시켜서 분석하였다.

마우스-항-MASP-2 MoAb의 투여

두 가지 상이한 용량 (0.3 mg/kg 및 1.0 mg/kg)의 마우스 항-MASP-2 MoAb를 아이소타입 대조군 MoAb 치료와 함께 CNV 유도 16시간 전에 WT (+/+) 마우스 (n= 8 마우스/군)에 주사하였다.

맥락막 혈관 신생 (CNV)의 유도

맥락막 혈관신생 (CNV)의 유도 및 CNV의 부피의 측정을 실시예 13에서 기술된 바와 같이 레이저 광 응고를 사용하여 수행하였다.

결과:

도 23은 아이소타입 대조군 MoAb 또는 마우스 항-MASP-2 MoAb (0.3 mg/kg 및 1.0 mg/kg) 중 어느 하나로 처리된 마우스에서 레이저 손상 후 7일에 측정된 CNV 영역을 그래프로 도시한다. 도 23에서 도시된 바와 같이, 1.0 mg/kg 항-MASP-2 MoAb로 사전처리된 마우스에서, CNV의 통계학적으로 유의한 (p <0.01) 대략 50%의 감소가 레이저 처리 후 7일에 관찰되었다. 도 23에서 추가로 도시된 바와 같이, 0.3 mg/kg 용량의 항-MASP-2 MoAb는 CNV 감소에 효능을 나타내지 않은 것으로 관찰되었다. 0.3 mg/kg 용량의 항-MASP-2 MoAb는 실시예 19에서 기술되고 도 21에서 도시된 바와 같이, 피하 투여 후에 C4 침착의 부분적이고 일시적인 억제를 나타냈다.

이 실시예에서 기술된 결과들은 억제제, 예컨대 항-MASP-2 MoAb로의 MASP-2의 차단이 황반 변성의 치료에 예방적 및/또는 치료적 효과를 가지는 것을 입증한다. 이들 결과는 실시예 13에서 기술된, MASP-2 (-/-) 마우스에서 수행된 연구에서 관찰된 결과들과 일치하며, 여기서 레이저 처리 후 7일에 야생형 대조군 마우스에 비교하여 MASP-2 (-/-) 마우스에서 CNV의 30% 감소가 관찰되었다. 더욱이, 이 실시예의 결과들은 추가로 전신적으로 전달된 항-MASP-2 항체가 눈에 국소적인 치료적 이점을 제공하고, 이로써 AMD 환자를 치료하기 위한 전신적 투여 경로에 대한 가능성을 강조한다. 요약하면, 이들 결과는 AMD의 치료에 MASP-2 MoAb의 사용을 지지하는 증거를 제공한다.

실시예 21

이 실시예는 MASP-2 결핍 마우스가 네이세리아 메닝기티디스로 감염된 후에 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유도된 사망으로부터 보호되고 야생형 대조 마우스에 비교하여 균혈증의 증강된 클리어런스를 가지는 것을 입증한다.

근거: 네이세리아 메닝기티디스는 수막염 및 수막염구균균혈증(meningococcemia)과 같은 수막염구균성 질병의 다른 형태에서의 역할에 대해 알려져 있는 종속영양성 그람-음성 쌍구균성 박테리아이다. 네이세리아 메닝기티디스는 아동기 중의 이환 및 사망의 주된 원인이다. 심각한 합병증은 패혈증, 워터하우스-프리데릭센 증후군(Waterhouse-Friderichsen syndrome), 부신 기능부전(adrenal failure) 및 파종성 혈관 내 응고 (DIC)를 포함한다. 예를 들어, Rintala E. et al., Critical Care Medicine 28(7):2373-2378 (2000) 참조. 이 실시예에서, MASP-2 결핍 마우스가 네이세리아 메닝기티디스 유도된 사망에 민감한 지를 해명하기 위하여 MASP-2 (-/-) 및 WT (+/+) 마우스에서 렉틴 경로의 역할을 분석하였다.

방법:

MASP-2 넉아웃 마우스를 실시예 1에서 기술된 바와 같이 생성하였고 적어도 10세대 동안 C57Bl/6과 역교배시켰다. 10주령의 MASP-2 KO 마우스 (n=10) 및 야생형 C57/B6 마우스 (n=10)를 400　mg/kg의 철 덱스트란 중의 5x10⁸ cfu/100 μl, 2x10⁸ cfu/100 μl 또는 3x10⁷ cfu/100 μl의 투약량의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 A Z2491로 정맥 내 주사함으로써 접종하였다. 감염 후 마우스의 생존을 72시간의 기간에 걸쳐 모니터링하였다. 혈액 샘플을 감염 후 매시간 간격으로 마우스로부터 채취하고 감염을 확인하고 혈청으로부터 박테리아의 클리어런스 속도를 결정하기 위하여 네이세리아 메닝기티디스의 혈청 수준 (로그 cfu/ml)을 측정하기 위해 분석하였다.

결과:

도 24A는 5x10⁸ cfu/100 μl의 감염량의 네이세리아 메닝기티디스의 투여 후에 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존률을 그래프로 도시한다. 도 24A에서 도시된 바와 같이, 가장 높은 용량인 5x10⁸/100 μl cfu의 네이세리아 메닝기티디스로의 감염 후에, 100%의 MASP-2 KO 마우스가 감염 후 72시간 동안 내내 생존하였다. 그에 반해, WT 마우스는 단지 20%만이 감염 후 24시간 후에 생존하였다. 이들 결과는 MASP-2 결핍 마우스가 네이세리아 메닝기티디스 유도된 사망으로부터 보호되었음을 입증한다.

도 24B는 5x10⁸ cfu/100 μl의 네이세리아 메닝기티디스로 감염된 MASP-2 KO 및 WT 마우스로부터 채취한 혈액 샘플에서 상이한 시점에 회수된 네이세리아 메닝기티디스의 로그 cfu/ml을 그래프로 도시한다. 도 24B에서 도시된 바와 같이, WT 마우스에서, 혈액 중의 네이세리아 메닝기티디스의 수준은 감염 후 24시간에 약 6.5 로그 cfu/ml의 피크에 도달하였고 감염 후 48시간에는 0으로 떨어졌다. 그에 반해, MASP-2 KO 마우스에서는, 네이세리아 메닝기티디스의 수준이 감염 후 6시간에는 3.5 로그 cfu/ml의 피크에 도달하였고 감염 후 36시간에는 0으로 떨어졌다.

도 25A는 2x10⁸ cfu/100 μl 네이세리아 메닝기티디스로의 감염 후 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존을 그래프로 도시한다. 도 25A에서 도시된 바와 같이, 2x10⁸ cfu/100 μl의 네이세리아 메닝기티디스로의 감염 후에, 100%의 MASP-2 KO 마우스가 감염 후 72시간 동안 내내 생존하였다. 그에 반해, WT 마우스는 단지 80%만이 감염 후 24시간 후에 여전히 생존하였다. 도 24A에 나타낸 결과와 일치하게, 이들 결과는 MASP-2 결핍 마우스가 네이세리아 메닝기티디스 유도된 사망으로부터 보호되었음을 입증한다.

도 25B는 2x10⁸ cfu/100 μl의 네이세리아 메닝기티디스로 감염된 WT 마우스로부터 채취한 혈액 샘플에서 상이한 시점에 회수된 네이세리아 메닝기티디스의 로그 cfu/ml을 그래프로 도시한다. 도 25B에서 도시된 바와 같이, 2x10⁸ cfu로 감염된 WT 마우스의 혈액에서, 네이세리아 메닝기티디스의 수준은 감염 후 12시간에는 약 4 로그 cfu/ml의 피크에 도달하였고 감염 후 24시간에는 0으로 떨어졌다.

도 25C는 2x10⁸ cfu/100 μl의 네이세리아 메닝기티디스로 감염된 MASP-2 KO 마우스로부터 채취한 혈액 샘플에서 상이한 시점에 회수된 네이세리아 메닝기티디스의 로그 cfu/ml을 그래프로 도시한다. 도 25C에서 도시된 바와 같이, MASP-2 KO 마우스의 혈액에서, 네이세리아 메닝기티디스의 수준은 감염 후 2시간에는 3.5 로그 cfu/ml의 피크 수준에 도달하였고 감염 후 3시간에는 0으로 떨어졌다. 도 24B에 나타낸 결과와 일치하게, 이들 결과는 MASP-2 KO 마우스가 WT 마우스와 동일한 용량의 네이세리아 메닝기티디스로 감염되었지만, MASP-2 KO 마우스는 WT에 비교하여 균혈증의 증강된 클리어런스를 나타냈음을 입증한다.

최저 용량의 3x10⁷ cfu/100 μl의 네이세리아 메닝기티디스로 감염 후 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존률은 72시간 기간에 100%였다 (데이터 미도시).

논의

이들 결과는 MASP-2 결핍 마우스가 WT 마우스에 비교하여 네이세리아 메닝기티디스 유도된 사망으로부터 보호되고 균혈증의 증강된 클리어런스를 나타냈음을 보인다. 그러므로, 이들 결과의 관점에서, MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 MoAb의 치료적 적용은 네이세리아 메닝기티디스 박테리아로의 감염의 영향 (즉, 패혈증 및 DIC)을 치료, 예방 또는 경감시키는 데 효력이 있는 것으로 예상될 수 있다. 또한, 이들 결과는 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 MoAb의 치료적 적용이 대상이 네이세리아 메닝기티디스 감염에 걸릴 위험이 증가되도록 만들지는 않을 것이라는 것을 나타낸다.

실시예 22

이 실시예는 보체 C3의 신규한 렉틴 경로 매개되고 MASP-2 의존성 C4-바이패스 활성화의 발견을 기술한다.

근거:

심근 허혈/재관류 손상 (MIRI)을 제한하기 위해 보체 활성화의 억제자를 활용할 때의 원칙적인 치료적 이점은 20년 전 심근 경색의 실험 래트 모델에서 설득력있게 입증되었다: 세포 표면 보체 수용체 유형-1 (CR1)의 가용성 절단된 유도체인 재조합 sCR1을 정맥 내로 제공하고 그것의 영향을 MIRI의 래트 생체 내 모델에서 평가하였다. sCR1으로의 처리는 경색의 부피를 40% 이상 감소시켰다 (Weisman, H.F., et al., Science 249:146-151 (1990)). 이 재조합 억제자의 치료적 가능성은 계속해서 MI에 걸린 환자들에서 sCR1의 투여가 허혈 후 심장의 위축성 기능부전을 방지했음을 보여주는 임상 실험에서 입증되었다 (Shandelya, S., et al., Circulation 87:536-546 (1993)). 하지만, 허혈 조직에서 보체의 활성화를 유도하는 일차적인 메커니즘은 주로 적절한 실험 모델의 결핍, 산소-박탈 세포의 보체 활성화를 유도하는 분자 과정에 대한 제한된 이해 및 상이한 보체 활성화 경로간의 상호간섭 및 상조작용으로 인해 궁극적으로 규정되지 않았다.

면역 반응의 기초적인 성분으로서, 보체 시스템은 항체-의존적 및 -독립적 메커니즘 둘 다를 통해 침입 미생물에 대한 보호를 제공한다. 그것은 많은 세포 및 체액 상호작용, 이를테면 화학주성, 식세포작용, 세포 부착 및 B-세포 분화를 면역 반응 내에서 조정한다. 3가지의 상이한 경로는 보체 캐스케이드를 개시한다: 고전적 경로, 대체 경로 및 렉틴 경로. 고전적 경로 인식 하위 구성요소 C1q는 다양한 표적 -가장 두드러지게는 면역 복합체-에 결합하여 회합된 세린 프로테아제의 단계식 활성화를 개시하고, 적응성 면역 시스템에 의한 맞물림 후에 병원체와 면역 복합체 클리어런스에 대한 주요 메커니즘을 제공한다. 면역 복합체로의 C1q의 결합은 C1r 치모겐 다이머를 분열을 위해 그것의 활성 형태로 전환시키고 이로써 C1s를 활성화시킨다. C1s는 2개의 분열 단계에서 C1q 결합을 보체 활성화로 번역한다: 먼저 C4를 C4a 및 C4b로 전환한 후 C4b-결합된 C2를 분열시켜 C3 컨버타제 C4b2a를 형성한다. 이 복합체는 풍부한 혈장 성분 C3를 C3a와 C3b로 전환한다. C4b2a 복합체와 아주 가까이에 C3b의 축적은 C3에 대한 기질 특이성을 C5로 변동시켜서 C5 컨버타제 C4b2a(C3b)n을 형성하게 한다. 고전적 경로 활성화를 통해 생성된 C3 및 C5 컨버타제 복합체는 렉틴 경로 활성화 루트를 통해 생성된 것들과 동일하다. 대체 경로에서, 성분 C3의 자발적 저-수준 가수분해는 단백질 단편들의 세포 표면위로의 침착을 초래하여 외래 세포에 대한 보체 활성화를 야기하는 한편, 숙주 조직 상의 세포-결합된 조절 단백질들은 활성화를 피함으로써 자체-손상을 방지한다. 대체 경로처럼, 렉틴 경로는 면역 복합체의 부재시에 활성화될 수 있다. 활성화는 주로 박테리아, 균류 또는 바이러스 병원체 상에 존재하는 탄수화물 구조 또는 아폽토시스 세포, 괴사 세포, 악성 종양 세포 또는 산소-박탈된 세포 상의 일탈적인 글리코실화 패턴인 병원체-관련 분자 패턴 (Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP))에 대한 다중-분자 렉틴 경로 활성화 복합체의 결합에 의해 개시된다 (Collard, C.D., et al., Am. J. Pathol. 156:1549-1556 (2000); Walport, M.J., N. Engl. J. Med. 344:1058-1066 (2001); Schwaeble, W., et al., Immunobiology 205:455-466 (2002); 및 Fujita, T., Nat. Rev. Immunol. 2:346-353 (2002)).

만난-결합 렉틴 (MBL)은 MBL-관련 세린 프로테아제 (MASP)로 명명되고 그것들의 발견 순서에 따라 넘버링된 (즉 MASP-1, MASP-2 및 MASP-3), 신규한 세린 프로테아제 군과 복합체를 형성하는 것으로 밝혀진 제 1 탄수화물 인식 하위 구성요소였다. 남자에서, 렉틴 경로 활성화 복합체는 상이한 탄수화물 결합 특이성을 가지는 4개의 대체 탄수화물 인식 하위 구성요소, 즉 MBL 2 및 피콜린 패밀리의 3가지 상이한 구성원, 즉 L-피콜린, H-피콜린 및 M-피콜린 및 MASP로 형성될 수 있다. MBL의두 가지 형태, MBL A 및 MBL C와 피콜린-A는 마우스 및 래트 혈장에서 MASP와 렉틴 활성화 경로 복합체를 형성한다. 본 발명자들은 MASP-2 및 추가의 절단된 19 kDa의 MASP-2 유전자 생성물을 이전에 클론하고 특성화하였고, 인간, 마우스 및 래트에서 MAp19 또는 sMAP로 명명하였다 (Thiel, S., et al., Nature 386:506-510 (1997);. Stover, C.M., et al., J. Immunol. 162:3481-3490 (1999); Takahashi, M., et al., Int. Immunol. 11:859-863 (1999); 및 Stover, C.M., et al., J. Immunol. 163:6848-6859 (1999)). MAp19/ sMAP는 프로테아제 활성은 없지만, MASP의 탄수화물 인식 복합체로의 결합에 대해 경합함으로써 렉틴 경로 활성화를 조절할 수 있다 (Iwaki, D. et al., J. Immunol. 177:8626-8632 (2006)).

세 가지의 MASP 중에서 오직 MASP-2만이 렉틴 경로 인식 복합체의 결합을 보체 활성화로 번역하는 데 필요하다는 것을 제안하는 증거가 있다 (Thiel, S., et al. (1997); Vorup-Jensen, T., et al., J. Immunol. 165:2093-2100 (2000); Thiel, S., et al., J. Immunol. 165:878-887 (2000); Rossi, V., et al., J. Biol. Chem. 276:40880-40887 (2001)). 이 결론은 MASP-1 및 MASP-3이 결핍된 가장 최근에 기술된 마우스 계통의 표현형에 의해 강조된다. 시험관 내에서의 렉틴 경로 매개 보체 활성화의 개시의 지연과 별도로 MASP-1/3 결핍 마우스는 렉틴 경로 기능적 활성을 보유하고 있다. 재조합 MASP-1을 사용한 MASP-1 및 MASP-3 결핍 혈청의 재구성은 이런 렉틴 경로 활성화의 지연을 극복하게 하고, 그것은 MASP-1이 MASP-2 활성화를 용이하게 할 수 있음을 의미한다 (Takahashi, M., et al., J. Immunol. 180:6132-6138 (2008)). 가장 최근의 연구는 MASP-1 (및 아마도 또한 MASP-3)이 대체 경로 활성화 효소 인자 D를 그것의 치모겐 형태로부터 그것의 효소적 활성 형태로 전환시키는 데 필요하다는 것을 밝혔다 (Takahashi, M., et al., J. Exp. Med. 207:29-37 (2010)). 이 과정의 생리적 중요성은 MASP-1/3 결핍 마우스의 혈장의 대체 경로 기능적 활성의 부재에 의해 강조된다.

렉틴 경로 탄수화물 인식 하위 구성요소 MBL A 및 MBL C의 표적화된 결핍이 조합되어 있는, 최근에 생성된 마우스 계통은 여전히 남아있는 쥐 렉틴 경로 인식 하위 구성요소 피콜린 A를 통해 렉틴 경로 활성화를 개시할 수 있다 (Takahashi, K., et al., Microbes Infect. 4:773-784 (2002)). MASP-2 결핍 마우스의 어떠한 잔류하는 렉틴 경로 기능적 활성의 부재는 건강하거나 병든 선천적 체액 면역성의 이런 효과기 암의 역할을 연구하기 위한 결정적 모델을 내놓게 한다.

C4 및 MASP-2 결핍 마우스 계통을 활용하여 본 발명자들은 보체 C3의 신규한 렉틴 경로 특이적인, 하지만 MASP-2 의존성인 C4-바이패스 활성화 루트를 규정할 수 있었다. 이 신규한 렉틴 경로 매개된 C4-바이패스 활성화 루트의 허혈-후 조직 손실을 향한 본질적인 기여는 MIRI에서 MASP-2 결핍의 우세한 보호형 표현형에 의해 강조되는 한편, 동일 모델에서 시험된 C4-결핍 마우스는 보호를 나타내지 않았다.

이 실시예에서, 본 발명자들은 보체 C3의 신규한 렉틴 경로 매개된 및 MASP-2 의존성 C4-바이패스 활성화를 기술한다. 이 신규한 활성화 루트의 생리적 관련성은 심근 허혈/재관류 손상 (MIRI)의 실험 모델에서 MASP-2 결핍의 보호형 표현형에 의해 확립되며, 여기서 C4 결핍 동물은 보호되지 않았다.

방법:

MASP-2 결핍 마우스는 총체적인 일탈적인을 보이지 않는다. MASP-2 결핍 마우스를 실시예 1에서 기술된 바와 같이 생성하였다. 이형접합성 (+/-) 및 동형접합성 (-/-) MASP-2 결핍 마우스는 건강하고 수태가능하며, 총체적인 일탈적인을 보이지 않는다. 그것들의 기대수명은 WT 한배 새끼들과 유사하다 (>18개월). 이들 마우스의 표현형을 질환의 실험 모델에서 연구하기 전에, 본 발명자들의 MASP-2^-/- 라인을 11세대 동안 C57BL/6 배경에 대해 역교배하였다. MASP-2 mRNA의 총 부재를 폴리 A+ 선택된 간 RNA 조제물의 노던 블롯팅에 의해 확인한 한편, MAp19 또는 sMAP (MASP2 유전자의 절단된 선택적 스플라이싱 생성물)를 암호화하는 1.2kb mRNA가 풍부하게 발현된다.

MASP-2 (B 사슬)의 세린 프로테아제 도메인에 대한 암호화 서열 또는 A-사슬에 대한 암호화 서열의 나머지 중 어느 하나에 특이적인 프라이머쌍을 사용한 qRT-PCR 분석은 B 사슬 암호화 mRNA를 MASP-2 ^-/- 마우스에서는 검출할 수 없는 한편 파괴된 A 사슬 mRNA 전사물의 풍부함은 상당히 증가된 것을 보였다. 마찬가지로, MAp19/sMAP 암호화 mRNA의 풍부함은 MASP-2 ^+/- 및 MASP-2 ^-/- 마우스에서 증가된다. ELISA에 의해 각 유전형의 5마리씩의 동물에 대해 결정된 혈장 MASP-2 수준은 WT 대조군에 대해서는 300 ng/ml (260 내지 330 ng/ml 범위), 이형접합성 마우스에 대해서는 360ng/ml (330 내지 395 ng/ml 범위)였고 MASP-2 ^-/- 마우스에서는 검출할 수 없었다. qRT-PCR을 사용하여, mRNA 발현 프로필을 확립하였고, MASP-2^-/-마우스가 MBL A, MBL C, 피콜린 A, MASP-1, MASP-3, C1q, C1rA, C1sA, 인자 B, 인자 D, C4 및 C3에 대한 mRNA를 MASP-2 충분한 한배 새끼들과 유사한 풍부함으로 발현하는 것을 입증하였다 (데이터 미도시).

MASP-2^-/- (n=8) 및 MASP-2^+/+ (n=7) 한배 새끼들의 혈장 C3 수준을 상업적으로 입수 가능한 마우스 C3 ELISA 키트 (Kamiya, Biomedical, Seattle, WA)를 사용하여 측정하였다. MASP-2 결핍 마우스의 C3 수준 (평균 0.84 mg/ml, +/- 0.34)은 WT 대조군 (평균 0.92, +/- 0.37)과 유사하였다.

결과:

MASP-2는 렉틴 경로 기능적 활성에 필수적이다.

실시예 2 에 기술되고 도 5에서 도시된 바와 같이, MASP-2^-/-혈장의 시험관 내 분석은 C4의 활성화에 대해 활성화하는 만난- 및 치모산-코팅된 표면 상에서 렉틴 경로 기능적 활성이 총체적으로 없음을 보였다. 마찬가지로, 렉틴 경로-의존성 C4나 C3 분열을, MBL A, MBL C 및 피콜린 A와 결합하여 그것을 통해 활성화를 야기하는 N-아세틸 글루코사민으로 코팅된 표면상에서 MASP-2^{-/- 혈장}에서 검출할 수 없었다 (데이터 미도시).

MASP-2-/-마우스의 혈청 및 혈장의 분석은 분명하게 MASP-2가 렉틴 경로를 통해 보체를 활성화하기 위해 필수적으로 필요하다는 것을 입증하였다. 하지만, 렉틴 경로 기능적 활성의 총체적 결핍은 다른 보체 활성화 경로를 온전하게 남겨둔다: MASP-2-/- 혈장은 여전히 고전적 (도 26A) 및 대체 경로 (도 26B)를 통해 보체를 활성화할 수 있다. 도 26A 및 26B에서, 기호 "*"는 WT (MASP-2 (+/+))로부터의 혈청을 나타내고; 기호 "●"는 WT (C1q 고갈됨)로부터의 혈청을 나타내며; 기호 "□"는 MASP-2 (-/-)로부터의 혈청을 나타내고; 기호 "Δ"는 MASP-2 (-/-) (C1q 고갈됨)로부터의 혈청을 나타낸다.

도 26A는 MASP-2-/- 마우스가 기능성 고전적 경로를 보유한 것을 그래프로 도시한다: C3b 침착을 면역 복합체 (BSA로 코팅한 후 염소 항-BSA IgG를 추가함으로써 제자리 생성됨)로 코팅된 미세역가 플레이트상에서 검정하였다. 도 26B는 MASP-2 결핍 마우스가 기능성 대체 경로를 보유한 것을 그래프로 도시한다: C3b 침착을 단지 대체 경로 활성화만을 허용하는 조건하에서 치모산 코팅된 미세역가 플레이트 상에서 분석하였다 (Mg²⁺ 및 EGTA를 함유하는 버퍼). 도 26A 및 도 26B에 나타낸 결과들은 2배수의 평균이고 3번의 독립적인 실험에 전형적인 것이다. 혈장 공급원에 대한 동일한 기호를 전체적으로 사용하였다. 이들 결과는 도 26B에서 도시된 결과들에서 입증되는 바과 같이, 대체 경로를 직접적으로 야기하는 한편 고전적 경로 및 렉틴 경로 둘 다는 비활성화하도록 디자인된 실험 조건하에서 기능성 대체 경로가 MASP-2 결핍 마우스에 존재하는 것을 보여준다.

보체 활성화의 렉틴 경로는 심근 허혈/ 재관류 손상 (MIRI)에서 염증성 조직 손실에 결정적으로 기여한다.

렉틴 경로 기능적 활성의 MIRI에의 기여를 연구하기 위하여, 본 발명자들은 MIRI의 모델에서 관상 동맥의 좌전 하향 분지 (LAD)의 일시적인 결찰 및 재관류 후에 MASP-2^-/- 마우스와 WT 한배새끼 대조군을 비교하였다. 보체 C4의 존재 또는 부재는 MIRI에서 허혈성 조직 손실의 정도에 아무 영향을 미치지 않았다. 본 발명자들은 실험적 MIRI 후에 경색 크기에 미치는 C4 결핍의 영향을 평가하였다. 도 27A 및 도 27B에서 도시된 바와 같이, C4-결핍 마우스 및 그것들의 WT 한배새끼 둘 다에서 동일한 경색 크기를 관찰하였다. 도 27A는 C4-/- 마우스 (n=6) 및 매치되는 WT 한배새끼 대조군 (n=7)에서의 LAD 결찰 및 재관류 후에 MIRI-유도된 조직 손실을 그래프로 도시한다. 도 27B는 C4-/- 마우스가 WT 대조군 (점선)처럼 MIRI에 취약한 것을 분명하게 입증하는, AAR의 함수로서의 INF를 그래프로 도시한다.

이들 결과는 C4 결핍 마우스가 MIRI로부터 보호되지 않는 것을 입증한다. 이 결과는 예상하지 못했던 것인데, 주요 C4 활성화 단편, C4b가 고전적 및 렉틴 경로 C3 컨버타제 C4b2a의 필수 성분이라는 광범위하게 수용된 관점과 충돌하기 때문이다. 그러므로 본 발명자들은 보체 C3의 잔류하는 렉틴 경로 특이적 활성화가 C4-결핍 마우스 및 인간 혈장에서 검출될 수 있는지를 평가하였다.

렉틴 경로는 신규한 MASP-2 의존성 C4-바이패스 활성화 루트를 통해 C4의 부재시에 보체 C3를 활성화할 수 있다.

C4-결핍 기니아 피그 혈청에서 C4-바이패스 활성화 루트의 존재를 가리키는 역사적인 보고 (May, J.E., and M. Frank, J. Immunol. 111:1671-1677 (1973))에 고무되어, 본 발명자들은 C4-결핍 마우스가 잔류하는 고전적 또는 렉틴 경로 기능적 활성을 가질 수 있는 지를 분석하였고 대체 경로의 기여를 배제하는 경로-특이적 분석 조건하에서 C3의 활성화를 모니터링하였다.

C3b 침착을 대체 경로 활성화를 금지할만한 혈장 농도 (1.25% 및 그 아래)에서 재칼슘경화된 혈장을 사용하여 만난-코팅된 미세역가 플레이트상에서 검정하였다. 고전적 경로 활성화에 대해 시험한 C4-결핍 혈장에서 C3의 분열을 검출할 수 없었던 (데이터 미도시) 한편, 렉틴 경로를 통해 보체 활성화를 개시했을 때 C4-결핍 마우스 혈장에서 강력한 잔류 C3 분열 활성이 관찰되었다. 렉틴 경로 의존성을 가용성 만난과 함께 C4-결핍 혈장 희석을 사전인큐베이션한 후에 C3 분열의 경합성 억제에 의해 입증한다 (도 28A 참조). 도 28A-D에서 도시된 바와 같이, C3의 MASP-2 의존성 활성화를 C4가 없을 때 관찰하였다. 도 28A는 C4+/+ (십자형) 및 C4-/- (흰색 원형) 마우스 혈장에 의한 C3 침착을 그래프로 도시한다. 검정 전에 과잉 (1 μg/ml) 유동상 만난과 함께 C4-/- 혈장의 사전 인큐베이션은 C3 침착을 완전히 억제한다 (검은색 원형). 결과들은 3개의 독립적인 실험에 전형적이다. 도 28B는 야생형, MASP-2 결핍 (흰색 사각형) 및 C4-/-마우스 혈장 (1%)이 다양한 농도의 항-래트 MASP-2 mAbM11 (abscissa)과 혼합되고 C3 침착이 만난-코팅된 플레이트 상에서 검정되는 실험의 결과를 그래프로 도시한다. 결과들은 4회 검정 (각 유형의 혈장 중 2개의 2배수)의 평균 (± SD)이다. 도 28C는 인간 혈장에서의 실험 결과들을 그래프로 도시한다: NHS 모음 (십자형), C4-/- 혈장 (흰색 원형) 및 1 μg/ml 만난과 사전-인큐베이션된 C4-/- 혈장 (검은색 원형). 결과들은 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. 도 28D는 항-인간 MASP-2 mAbH3에 의한 C4 충분 및 C4 결핍 인간 혈장 (1%)의 C3b 침착의 억제를 그래프로 도시한다 (3배수 실험의 평균 ± SD). 도 28b에서 도시된 바와 같이, 나란히 분석된 MASP-2-/-혈장에서 렉틴 경로-의존성 C3 활성화는 검출할 수 없었고, 그것은 C3의 이런 C4-바이패스 활성화 루트가 MASP-2 의존성임을 의미한다.

추가로 이들 발견을 확증하기 위하여, 본 발명자들은 재조합 인간 및 래트 MASP-2A (활성 프로테아제 도메인의 세린 잔기가 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 알라닌으로 대체되어 있어서 항원의 자가용해성 분해가 방지됨)에 대한 친화도 스크리닝에 의해 파지 디스플레이 항체 라이브러리로부터 분리된 일련의 재조합 억제 mAb를 확립하였다. MASP-2에 대한 재조합 항체들 (AbH3 및 AbM11)을 Combinatorial Antibody Libraries (Knappik, A., et al., J. Mol. Biol. 296:57-86 (2000))로부터, 항원으로서 재조합 인간 및 래트 MASP-2A를 사용하여 분리하였다 (Chen, C.B. and Wallis, J. Biol. Chem. 276:25894-25902 (2001)). 마우스 혈장 (IC50~1 nM)에서 C4 및 C3의 렉틴 경로-매개된 활성화를 강력하게 억제한 항-래트 Fab2 단편을 전장 IgG2a 항체로 전환시켰다. 다클론성 항-쥐 MASP-2A 항혈청을 래트에서 생성시켰다. 이들 도구로 본 발명자들은 아래에서 더 기술된 바와 같이, 이 신규한 C3의 렉틴 경로 특이적 C4-바이패스 활성화 루트의 MASP-2 의존성을 확인할 수 있었다.

도 28B에서 도시된 바와 같이, 마우스 및 래트 MASP-2에 선택적으로 결합하는 억제 단클론성 항체인 M211은 C4-결핍 마우스에서 C3의 C4-바이패스 활성화뿐 아니라 WT 마우스 혈장의 C3 활성화를, 유사한 IC₅₀ 값을 가지는 농도 의존적인 방식으로 렉틴 경로를 통해 억제하였다. 모든 검정을 대체 경로 활성화 루트를 기능부전으로 만드는 경향이 있는 높은 혈장 희석에서 수행하였다 (최고 혈장 농도는 1.25%임).

인간에서 C3의 유사한 렉틴 경로 특이적 C4-바이패스 활성화의 존재를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 인간 C4 유전자들 (즉 C4A 및 C4B) 둘 다의 고유한 결핍을 가짐으로써 C4의 총체적인 부재를 초래하는 공여체의 혈장을 분석하였다 (Yang, Y., et al., J. Immunol. 173:2803-2814 (2004)). 도 28C는 고혈장 희석 (대체 활성화 경로는 기능부전으로 만든다)에서 이 환자의 혈장이 C3를 효율적으로 활성화하는 것을 나타낸다. 만난-코팅된 플레이트 상에 C3 활성화의 렉틴 경로 특이적 방식은 쥐 C4-결핍 혈장 (도 28A) 및 인간 C4 결핍 혈장 (도 28C)에서 과잉 농도의 유동상 만난을 추가함으로써 입증된다. 인간 C4-결핍 혈장에서 C3의 이런 활성화 메커니즘의 MASP-2 의존성을 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하고 MASP-2 기능적 활성을 제거하는 단클론성 항체인 AbH3을 사용하여 평가하였다. 도 28D에서 도시된 바와 같이, AbH3은 C4-충분 및 C4-결핍 인간 혈장에서 비교할 만한 효능으로 C3b (및 C3dg)의 침착을 억제하였다.

C3의 C4-바이패스 활성화에서 다른 보체 성분들의 가능한 역할을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 MASP-1/3-/- 및 Bf/C2-/-마우스의 혈장을 MASP-2-/-, C4-/- 및 C1q-/- 혈장 (대조군으로서)과 함께 렉틴 경로 특이적 및 고전적 경로 특이적 검정 둘 다의 조건하에서 테스트하였다. C3 분열의 상대적 양을 WT 혈장을 사용하였을 때 침착된 C3의 양에 대해 플롯팅하였다.

도 29A는 렉틴 활성화 경로 또는 고전적 활성화 경로 특이적 검정 조건하에서 테스트된 다양한 보체 결핍 마우스 계통들로부터의 혈장에서 C3 컨버타제 활성의 비교할만한 분석을 그래프로 도시한다. WT 마우스 (n=6), MASP-2-/-마우스 (n=4), MASP-1/3-/- 마우스 (n=2), C4-/- 마우스 (n=8), C4/MASP-1/3-/- 마우스 (n=8), Bf/C2-/- (n=2) 및 C1q-/- 마우스 (n=2)의 희석된 혈장 샘플 (1%)을 나란히 테스트하였다. 2.5 μg/ml의 재조합 래트 C2 (Bf/C2-/- +C2)를 사용한 Bf/C2-/- 혈장의 재구성으로 C3b 침착을 회복시켰다. 결과는 평균 (±SD)이다. **p<0.01 (WT 혈장과 비교됨). 도 29A에서 도시된 바와 같이, 실질적인 C3 침착을 고전적 경로 특이적 조건이 아닌 렉틴 경로 특이적 검정 조건하에서 테스트된 C4-/- 혈장에서 볼 수 있다. 다시 한 번 말하면, C3 침착은 렉틴 경로 활성화 루트를 통해서 MASP-2 결핍 혈장에서 볼 수 없는 한편, 동일한 혈장을 고전적 경로를 통해 C3을 침착시켰다. MASP-1/3-/- 혈장에서, C3 침착은 렉틴 및 고전적 경로 특이적 검정 조건 둘 다에서 발생하였다. C3 침착을 C4 및 MASP-1/3의 결핍이 조합된 혈장에서, 렉틴 경로 또는 고전적 경로 특이적 조건들을 사용하여 볼 수 없었다. C2/Bf-/- 혈장에서, 렉틴 경로를 통해서나 고전적 경로를 통해서 C3 침착을 검출할 수 없다. 하지만, 재조합 C2를 사용한 C2/Bf-/- 마우스 혈장의 재구성은 렉틴 경로 및 고전적 경로-매개된 C3 분열을 둘 다 회복시켰다. 검정 조건은 C1q-/- 혈장을 사용하여 확인하였다.

도 29B는 렉틴 활성화 경로 특이적 검정 조건하에 테스트된 다양한 보체 결핍 마우스 계통 WT, fB-/-, C4-/-, MASP-1/3-/- 및 MASP-2-/- 혈장으로부터의 혈장에서 C3 컨버타제 활성의 시간-해소 동역학을 그래프로 도시한다 (1% 혈장, 결과들은 3개의 독립적 실험의 결과이다). 도 29B에서 도시된 바와 같이, C3 절단을 MASP-2-/-혈장 볼 수 없는 한편, fB-/- 혈장은 WT 혈장에 대한 것과 유사한 동역학으로 C3를 절단하였다. C3의 C3b (및 C3dg)로의 렉틴 경로-의존적 전환의 상당한 지연을 C4-/- 뿐만 아니라 MASP-1/3 결핍 혈장에서 볼 수 있었다. 이런 MASP-1/3-/- 혈장에서의 C3 활성화의 지연은 최근에 MASP-3 의존성이기보다는 MASP-1 의존성인 것으로 밝혀졌다 (Takahashi, M., et al., J. Immunol. 180:6132-6138 (2008)).

논의:

이 실시예에서 기술된 결과들은 MASP-2 기능적 활성이 C4의 존재 및 부재 둘 다의 조건에서 렉틴 경로를 통한 C3의 활성화에 필수적인 것을 강력하게 제안한다. 게다가, C2 및 MASP-1은 이런 C3의 신규한 렉틴 경로 특이적 C4-바이패스 활성화 루트가 작동하는 데 필요하다. MASP-2-/-뿐만 아니라 C4-/- 혈장에서 렉틴 경로 기능적 활성의 비교 분석은 이전에 인식하지 못했던 보체 C3의 C4-독립적, 하지만 MASP-2-의존성 활성화 루트의 존재를 드러냈고, C3이 총체적으로 C4가 없을 때 렉틴 경로-의존적 방식으로 활성화될 수 있음을 나타냈다. 이 신규한 MASP-2 의존성 C3 컨버타제의 활성화 사건의 상세한 분자 조성 및 서열은 아직 설명의 여지가 있는 한편, 본 발명자들의 결과는 이 C4-바이패스 활성화 루트가 보체 C2 뿐만 아니라 MASP-1의 존재를 추가로 필요로 한다는 것을 의미한다. 조합된 C4 및 MASP-1/3 결핍을 가지는 마우스의 혈장에서 렉틴 경로-매개된 C3 절단 활성의 손실은 MASP-2의 직접적인 절단 및 활성화를 통해 MASP-2 의존성 보체 활성화를 증강시키기 위한 MASP-1의 역할에 대해 가장 최근에 기술된 것에 의해 설명될 수 있다 (Takahashi, M., et al., J. Immunol. 180:6132-6138 (2008)). 마찬가지로, MASP-1은 C2를 분열시키는 능력을 통해 MASP-2 기능적 활성을 보조할 수 있다 (Moller-Kristensen, et al., Int. Immunol. 19:141-149 (2007)). 두 가지 활성 모두 렉틴 활성화 경로를 통해 MASP-1/3 결핍 혈장이 C3를 절단하는 속도의 감소 및 MASP-1이 C4-바이패스 활성화 루트를 통해 C3 전환을 지속시키기 위해 필요할 수 있는 이유를 설명해줄 수 있다.

렉틴 경로를 통해 C3을 활성화하지 못하는 C2/fB-/- 혈장의 무능력은 재조합 래트 C2의 C2/fB-/- 혈장에의 추가가 만난-코팅된 플레이트 상에서 재구성된 혈장의 C3을 활성화하는 재구성된 혈장의 능력을 회복시켰기 때문에 C2-의존성인 것으로 나타났다.

C4 결핍이 고전적 보체 활성화 경로를 특이적으로 파괴한 한편 렉틴 경로는 MASP-2 의존성 C4-바이패스 활성화 루트를 통해 C3 컨버타제 활성의 생리적으로 중요한 수준을 보유한다는 발견은 실험적 스트렙토코쿠스 뉴모니아 감염 (Brown, J. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99:16969-16974 (2002); Experimental Allergic Encephalomyelitis (Boos, L.A., et al., Glia 49:158-160 (2005) 및 C3 의존성 쥐 간 재생의 모델 (Clark, A., et al., Mol. Immunol. 45:3125-3132 (2008))을 포함하여, 다양한 질병 모델에서 렉틴 경로의 역할의 재평가를 필요로 한다. 후자의 군은 인자 B 기능적 활성의 항체-매개된 고갈에 의해 대체 경로의 생체 내 억제가 C4-/- 마우스에서 C3 절단-의존성 간 재생에 효과를 나타내지 못하였기 때문에 C4-결핍 마우스가 대체 경로 의존성 방식으로 C3을 활성화할 수 있는 것을 입증하였다 (Clark, A., et al. (2008)). C3의 이런 렉틴 경로 매개된 C4-바이패스 활성화 루트는 또한 본 발명자들의 MIRI 모델에서뿐 아니라 신장 동종이식 거부반응에 대해 이전에 기술된 모델에서 C4 결핍의 보호용 표현형의 결핍을 설명해줄 수 있다 (Lin, T., et al., Am. J. Pathol. 168:1241-1248 (2006)). 그에 반해, 본 발명자들의 최근 결과들은 신장 이식 모델에서 MASP-2-/-마우스의 상당한 보호용 표현형을 독립적으로 입증하였다 (Farrar, C.A., et al., Mol. Immunol. 46:2832 (2009)).

요약하면, 이 실시예의 결과는 C3의 MASP-2 의존성 C4-바이패스 활성화가 C4의 활용이 C3 활성화를 제한하는 조건하에서 중요할 수 있는 생리적으로 관련된 메커니즘이란 관점을 지지한다.

실시예 23

이 실시예는 트롬빈 기질에 의한 C3의 활성화 및 WT (+/+), MASP-2 (-/-), F11 (-/-), F11/C4 (-/-) 및 C4 (-/-) 마우스에서 만난 상의 C3 침착을 기술한다.

근거:

실시예 14에서 기술된 바와 같이, 트롬빈 활성화가 생리적 조건하에서 렉틴 경로 활성화에 이어 일어날 수 있는지 결정되었고, MASP-2 포함의 정도를 입증한다. C3은 보체 시스템의 활성화에서 중심 역할을 한다. C3 활성화는 고전적 및 대체 보체 활성화 경로 둘 다에 필요하다. 트롬빈 기질에 의해 C3이 활성화되는지를 결정하기 위해 실험을 수행하였다.

방법:

트롬빈 기질에 의한 C3 활성화

C3의 활성화를 다음의 트롬빈 기질들의 활성화 형태의 존재하에 측정하였다: 인간 FCXIa, 인간 FVIIa, 소 FXa, 인간 FXa, 인간 활성화된 단백질 C 및 인간 트롬빈. C3을 다양한 트롬빈 기질과 함께 인큐베이션한 후 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 환원 조건하에 분리하였다. 셀룰로오스 막을 사용하여 전기영동에 의해 전달한 후 막을 단클론성 비오틴-결합된 래트 항-마우스 C3와 함께 인큐베이션하고, 스트렙트아비딘-HRP 키트로 검출하고, ECL 시약을 사용하여 전개시켰다.

결과:

C3의 활성화는 무상 a-사슬의 절단된 a'사슬 및 가용성 C3a로의 절단을 포함한다 (도 30에는 도시되지 않음). 도 30은 트롬빈 기질에 의한 인간 C3의 활성화에 대한 웨스턴 블롯 분석의 결과를 도시하고, 여기서 분열되지 않은 C3 알파 사슬 및 활성화 생성물 a' 사슬은 화살표로 표시된다. 도 30에서 도시된 바와 같이, C3의 인간 응고 인자 XI 및 인자 X의 활성화된 형태, 뿐만 아나라 활성화된 소 응고 인자 X와의 인큐베이션은 어떠한 보체 프로테아제의 부재하에 시험관 내에서 C3을 절단할 수 있다.

만난 상의 C3 침착

C3 침착 검정을 WT, MASP-2 (-/-), F11(-/-), F11(-/-)/C4(-/-) 및 C4(-/-)로부터 얻어진 혈청 샘플에 대해 수행하였다. F11은 응고 인자 XI을 암호화하는 유전자이다. C3 활성화를 측정하기 위하여, 미세역가 플레이트를 만난으로 코팅 (1 μg/웰)한 후, TBS/tween/Ca²⁺ 중의 양 항-HSA 혈청 (2 μg/웰)을 추가하였다. 혈장 샘플을 플레이트에 추가된 4 mM 바비탈, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4에 희석하고 1.5시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세척 후 결합된 C3b를 토끼 항-인간 C3c (Dako)와, 이어서 알칼리 포스파타제-컨쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG 및 pNPP를 사용하여 검출하였다.

결과:

도 31은 WT, MASP-2 (-/-), F11(-/-), F11(-/-)/C4 (-/-) 및 C4 (-/-)로부터 얻은 혈청 샘플에 대한 C3 침착 검정의 결과를 나타낸다. 도 31에서 도시된 바와 같이, C4의 완전한 부재시에도 기능적 렉틴 경로가 존재한다. 도 31에서 추가로 도시된 바와 같이, 이 신규한 렉틴 경로 의존성 보체 활성화는 응고 인자 XI을 필요로 한다.

논의:

이 실험 전에 얻어진 결과 전에, 당업자들은 보체의 렉틴 경로는 활성을 위해 C4를 필요로 한다고 믿었다. 따라서, C4 넉아웃 마우스 (및 C4 결핍 인간)로부터의 데이터를 이러한 유기체들이 렉틴 경로가 결핍되었다 (고전적 경로 결핍에 더하여)는 가정으로 간섭하였다. 본 결과들은 이 개념이 잘못되었음을 입증한다. 그러므로, 과거 연구들의 결론은 렉틴 경로가 C4 결핍 동물들의 표현형이 잘못일 수 있다는 것을 기초로 특정 질병 환경에서 중요하지 않았음을 제안한다. 이 실시예에 기술된 데이터는 또한 전체 혈청의 생리적 맥락에서 렉틴 경로는 응고 캐스케이드의 성분들을 활성화시킬 수 있음을 보여준다. 그러므로, 보체와 MASP-2를 포함하는 응고 사이에는 상호간섭이 존재한다는 것이 입증된다.

실시예 24

이 실시예는 발작성 야행성 혈색소뇨증 (Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria; PNH) 환자들로부터 얻어진 혈액 샘플로부터의 적혈구의 용해에 미치는 항-MASP-2 항체의 효과를 평가하기 위한 방법을 설명한다.

배경/근거:

마르키아파바-미켈리(Marchiafava-Micheli) 증후군으로도 언급되는 발작성 야행성 혈색소뇨증 (PNH)은 보체-유도된 혈관 내 용혈성 빈혈을 특징으로 하는, 잠재적으로 생명을 위협하는 혈액의 후천적 질병이다. PNH의 특징은 보체의 대체 경로의 조절되지 않은 활성화의 결과인 만성 혈관 내 용혈이다. Lindorfer, M.A., et al., Blood 115(11) (2010). PNH에서 빈혈은 혈류의 적혈구의 파괴로 인한 것이다. PNH의 증상들은 뇨 중의 헤모글로빈의 출현으로 인한 혈뇨 및 혈전증을 포함한다. PNH의 홀마크는 보체의 대체 경로의 조절되지 않은 활성화의 결과인 만성 혈관 내 용혈이다. Lindorfer, M.A., et al., Blood 115(11) (2010). PNH에서 빈혈증은 혈류에서 적혈구 세포의 파괴로 인한 것이다. PNH의 증상은 소변 중 헤모글로빈의 출현으로 인한 붉은 소변, 및 혈전증을 포함한다. PNH는 "일차 PNH"로 언급되는 자체적으로, 또는 "이차 PNH"로 언급되는 재생불량성 빈혈과 같은 다른 골수 장애의 맥락으로 발달될 수 있다. PNH에 대한 치료는 빈혈에 대한 수혈, 혈전증에 대한 응고 방지 및 보체 시스템을 억제함으로써 면역 파괴에 대해 혈액 세포들을 보호하는 단클론성 항체 에쿨리쥬맙 (Soliris)의 사용을 포함한다 (Hillmen P. et al., N. Engl. J. Med. 350(6):552-9 (2004)). 하지만, 에쿨리쥬맙으로 치료된 PNH 환자들의 상당 부분이 항체가 보체의 대체 경로의 활성화를 차단하지 못하기 때문에 만성적으로 유의미한 면역-매개된 용혈성 빈혈을 보였다. 이 실시예는 ABO-매치된 산성화된 정상인 혈청과 인큐베이션된 PNH 환자들로부터 얻어진 혈액 샘플로부터의 적혈구의 용혈에 미치는 항-MASP-2 항체의 효과를 평가하기 위한 방법을 설명한다.

시약:

정상 공여체로부터 및 PNH에 걸린 환자들 (Solaris로 치료되지 않음)로부터의 적혈구를 정맥 천공에 의해 얻고, Wilcox, L.A., et al., Blood 78:820-829 (1991)에 기술된 바와 같이 제조하며, 본원에 참조로 포함된다. 렉틴 경로의 기능적 차단 활성을 가지는 항-MASP-2 항체를 실시예 10에서 기술된 바와 같이 제조하였다.

용혈 분석:

PNH 환자로부터의 적혈구의 용혈을 차단하는 능력에 미치는 항-MASP-2 항체의 효과를 결정하기 위한 방법을 Lindorfer, M.A., et al., Blood 15(11):2283-91 (2010) 및 Wilcox, L.A., et al., Blood 78:820-829 (1991)에 설명된 방법을 사용하여 수행하며, 둘 다 본원에 참조로 포함된다. Lindorfer 등에 의해 기술된 바와 같이, PNH 환자 샘플로부터의 적혈구를 원심분리하고, 버피 코트를 흡인한 후 각 실험 전에 세포를 젤라틴 베로날 완충액 (GVB)으로 세척한다. 적혈구를 다음과 같이 APC-매개된 용혈에 대한 민감성에 대해 시험한다. ABO-매개된 정상인 혈청을 0.15 mM CaCl₂ 및 0.5 mM MgCl₂ (GVB⁺²)를 함유하고 있는 GVB로 희석하고 50% aNHS 중의 1.6%의 적혈구 용적으로 적혈구를 재구성하기 위해 사용한다. 그런 다음 혼합물을 37℃에서 인큐베이션하고, 1시간 후에 적혈구를 원심분리에 의해 펠릿화한다. 회수된 상층액의 앨리쿼트의 광학 밀도를 405 nM에서 측정하고 퍼센트 용해를 계산하는 데 사용한다. 산성화된 혈청-EDTA에 재구성된 샘플을 유사하게 처리하고 바탕 비보체-매개된 용혈 (전형적으로 3% 미만)을 규정하기 위해 사용한다. 완전한 용해 (100%)는 적혈구를 증류수에서 인큐베이션한 후에 결정한다.

PNH 적혈구의 용혈에 미치는 항-MASP-2 항체의 효과를 측정하기 위하여, PNH 환자로부터의 적혈구를 aNHS에서 점증 농도의 항-MASP-2 항체의 조재하에 인큐베이션하고, 용혈의 존재/양을 계속해서 정량한다.

항-MASP-2 항체가 대체 보체 경로의 후속적인 활성화를 차단하는 것으로 밝혀진 사실의 관점에서, 항-MASP-2 항체가 PNH 적혈구의 대체 경로-매개된 용혈을 차단하는 데 효과적일 것이고 PNH에 걸린 환자들을 치료하기 위한 치료제로서 유용할 것으로 예상된다.

실시예 25

이 실시예는 한랭글로불린혈증(cryoglobulinemia)을 앓고 있는 환자들로부터 얻어진 혈액 샘플에서의 한랭글로불린에 의한 보체 활성화에 미치는 항-MASP-2 차단 항체의 효과를 평가하는 방법을 기술한다.

배경/근거:

한랭글로불린혈증은 혈청 중의 한랭글로불린의 존재를 특징으로 한다. 한랭글로불린은 저온에서 가역적 응집을 진행하는 단일 또는 혼합 면역글로불린 (전형적으로 IgM 항체)이다. 응집은 고전적 경로 보체 활성화 및 염증을 혈관상에서, 특히 말초 혈관상에서 유도한다. 한랭글로불린혈증은 임상적으로 맥관염 및 사구체신염으로 나타날 수 있다.

한랭글로불린혈증은 한랭글로불린 조성을 기초로 다음과 같이 분류될 수 있다: I형 한랭글로불린혈증 또는 단순 한랭글로불린혈증은 단클론성 면역글로불린, 통상 면역글로불린 M (IgM)의 결과이고; II형 및 III형 한랭글로불린혈증 (혼합 한랭글로불린혈증)은 통상적으로 다클론성 IgG의 Fc 부분과 복합체를 형성하는 IgM인 류머티스성 인자 (RF)를 함유한다.

한랭글로불린혈증과 관련된 질병은 C형 간염 감염, 림프증식성 장애 및 다른 자가면역 질환들을 포함한다. 한랭글로불린-함유 면역 복합체는 아마도 보체를 활성화시키는 능력으로 인해 전신성 염증의 임상 증후군을 초래한다. IgG 면역 복합체가 정상적으로 보체의 고전적 경로를 활성화시키는 한편, 복합체를 함유하는 IgM은 또한 렉틴 경로를 통해 보체를 활성화할 수 있다 (Zhang, M., et al., Mol Immunol 44(1-3):103-110 (2007) 및 Zhang. M., et al., J. Immunol. 177(7):4727-34 (2006)).

면역조직학적 연구는 한랭글로불린 면역 복합체가 렉틴 경로의 성분들을 함유하고, 한랭글로불린혈증 사구체신염에 걸린 환자로부터의 생검이 제자리 렉틴 경로 활성화의 면역조직화학적 증거를 나타냈음을 추가로 입증하였다 (Ohsawa, I., et al., Clin Immunol 101(1):59-66 (2001)). 이들 결과는 렉틴 경로가 한랭글로불린혈증 질환에서 염증 및 역효과에 기여할 수 있음을 제안한다.

방법:

한랭글로불린혈증의 부작용을 차단하는 능력에 대한 항-MASP-2 항체의 효과를 결정하기 위한 방법을 Ng Y.C. et al., Arthritis and Rheumatism 31(1):99-107 (1988)에 기술된 것과 같은 유동상 C3 전환에 대한 분석을 사용하여 수행하며, 본원에 참조로 포함된다. Ng 등에서 기술된 바와 같이, 본태성 복합 한랭글로불린혈증 (EMC)에서, 단클론성 류머티스성 인자 (mRF), 보통 IgM은 다클론성 IgG와 복합체화하여 특징적인 저온침전물 면역 복합체 (IC) (II형 한랭글로불린)를 형성한다. 면역글로불린과 C3은 피부, 신경 및 신장과 같은 병에 걸린 조직의 혈관 벽에서 입증되었다. Ng 등에서 기술된 바와 같이, ¹²⁵I-표지된 mRF를 혈청 (정상인 혈청 및 한랭글로불린혈증에 걸린 환자들로부터 얻어진 혈청)에 추가하고, 37℃에서 인큐베이션하여 적혈구에의 결합을 측정한다.

유동상 C3 전환을 항-MASP-2 항체의 존재 또는 부재하에, 다음의 IC의 존재 또는 부재하에 혈청 (정상인 혈청 및 한랭글로불린혈증에 걸린 환자들로부터 얻어진 혈청)에서 결정한다: BSA-항 BSA, mRF, mRF 플러스 IgG 또는 한랭글로불린. IC에의 C3 및 C4의 고정을 F(ab')2 항-C3 및 F(ab')2 항-C4를 사용한 저온침전물 분석을 사용하여 측정한다.

항-MASP-2 항체가 렉틴 경로의 활성화를 차단하는 것으로 밝혀진 사실의 관점에서, 항-MASP-2 항체는 한랭글로불린혈증과 관련된 보체 매개된 부작용을 차단하는 데 효과적일 것이고 한랭글로불린혈증에 걸린 환자들을 치료하기 위한 치료제로서 유용할 것이라고 예상된다.

실시예 26

이 실시예는 빈혈증으로서 나타나는, 저온응집병에 걸린 환자들로부터 얻어진 혈액 샘플에 대한 항-MASP-2 항체의 효과를 평가하는 방법을 기술한다.

배경/근거:

저온응집병 (CAD)은 자가면역 용혈성 빈혈증의 유형이다. 저온응집소 항체 (보통 IgM)는 저온에 의해 활성화되고 적혈구에 결합하여 적혈구를 응집시킨다. 저온응집소 항체는 보체와 조합되어 적혈구 표면 상의 항원을 공격한다. 이것은 적혈구의 옵소닌화 (용혈)을 유도하고 세망내피계에 의해 그것들의 클리어런스를 야기한다. 응집이 일어나는 온도는 환자마다 다르다.

CAD는 빈혈증으로서 나타난다. 적혈구 파괴의 파괴속도가 골수가 적절한 수의 산소-운반 세포를 생성하는 용량을 초과할 때 빈혈이 일어난다. CAD는 "이차 CAD"로서 언급되는 기저 질병 또는 장애, 예컨대 감염성 질환 (미코플라즈마 폐렴, 볼거리, 단핵증), 림프구증식성 질환 (림프종, 만성 림프성 백혈병) 또는 결합 조직 장애에 의해 유발될 수 있다. 일차 CAD 환자들은 저급 림프구증식성 골수 장애를 가지는 것으로 간주된다. 일차 및 이차 CAD 둘 다 후천적 질병이다.

방법:

시약:

정상 공여체 및 CAD에 걸린 환자들로부터의 적혈구를 정맥 천공에 의해 얻는다. 렉틴 경로의 기능적 차단 활성을 가지는 항-MASP-2 항체를 실시예 10에서 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.

렉틴 경로의 저온응집소-매개된 활성화를 차단하는 항-MASP-2 항체의 효과를 다음과 같이 측정할 수 있다. 혈액군 I 양성 환자들로부터의 적혈구를 저온응집소 (즉 IgM 항체)로, 항-MASP-2 항체의 존재 또는 부재하에 감작시킨다. 그런 다음 적혈구를 렉틴 경로를 활성화하는 능력에 대해 C3 결합을 측정함으로써 테스트한다.

항-MASP-2 항체가 렉틴 경로의 활성화를 차단하는 것으로 밝혀진 사실의 관점에서, 항-MASP-2 항체는 저온응집병과 관련된 보체 매개된 부작용을 차단하는 데 효과적일 것이고 저온응집병에 걸린 환자들을 치료하기 위한 치료제로서 유용할 것으로 예상된다.

실시예 27

이 실시예는 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)을 가진 마우스로부터 얻어진 혈액 샘플에서 적혈구의 용혈에 미치는 항-MASP-2 항체의 효과를 평가하는 방법을 기술한다.

배경/근거:

비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)은 용혈성 빈혈증, 혈소판 감소증 및 신장 및 다른 장기의 미세순환계의 혈소판 혈전증에 의해 유발된 신부전증을 특징으로 한다. aHUS는 결함성 보체 조절과 관련되고 산발성이거나 가족성이다. aHUS는 보체 인자 H, 막 조인자 B 및 인자 I, 뿐만 아니라 보체 인자 H-관련 1 (CFHR1) 및 보체 인자 H-관련 3 (CFHR3)을 포함하여 보체 활성화를 코드하는 유전자의 돌연변이와 관련된다 (Zipfel, P.F., et al., PloS Genetics 3(3):e41 (2007)). 이 실시예는 aHUS 마우스로부터 얻어진 혈액 샘플로부터의 적혈구의 용혈에 미치는 항-MASP-2 항체의 효과를 평가하는 방법을 기술한다.

방법:

aHUS를 치료하는 항-MASP-2 항체의 효과는 내인성 마우스 fH 유전자가 aHUS 환자들에서 빈번하게 발견되는 fH의 돌연변이를 암호화하는 인간 상동체로 대체되어 있는 이 질병의 마우스 모델에서 결정할 수 있다 (Pickering M.C. et al., J. Exp. Med. 204(6):1249-1256 (2007) 참조, 본원에 참조로 포함됨). Pickering 등에 의해 기술된 바와 같이, 이러한 마우스는 aHUS 유사 병리를 발달시킨다. aHUS의 치료를 위한 항-MASP-2 항체의 효과를 평가하기 위하여, 항-MASP-2 항체를 돌연변이 aHUS 마우스에 투여하고 항-MASP-2 Ab 처리된 및 미처리된 대조군으로부터 얻어진 적혈구의 용혈을 비교한다. 항-MASP-2 항체가 렉틴 경로의 활성화를 차단하는 것으로 밝혀진 사실의 관점에서, 항-MASP-2 항체는 aHUS를 앓고 있는 포유류에서 적혈구 세포의 용혈을 차단하는 데 효과적일 것으로 예상된다.

실시예 28

이 실시예는 녹내장의 치료를 위한 항-MASP-2 항체의 효과를 평가하는 방법을 기술한다.

근거/배경:

제어되지 않은 보체 활성화는 녹내장에서 망막 신경절 세포 (RGC), 그것들의 시냅스 및 축색돌기에 대한 퇴행성 손상의 진전에 기여하는 것으로 밝혀졌다. Tezel G. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 51:5071-5082 (2010) 참조, 예를 들어, 인간 조직의 조직병리학적 연구 및 상이한 동물 모델을 사용한 시험관 내 연구들은 C1q 및 C3을 포함하여, 보체 성분들이 녹내장성 망막에서 합성되고 말단 보체 복합체가 형성되는 것을 입증하였다 (Stasi K. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 47:1024-1029 (2006), Kuehn M.H. et al., Exp Eye Res 83:620-628 (2006) 참조). 또한 Kuehn M.H. et al., Experimental Eye Research 87:89-95 (2008)에의해 기술된 것과 같이, 보체 합성 및 침착이 망막 I/R에 의해 유도되고 보체 캐스케이드의 파괴가 RGC 변성을 지연시킨다. 이 연구에서, 보체 성분 C3의 표적화된 파괴를 가지고 있는 마우스는 정상 동물과 비교할 때 일시적인 망막 I/R 후에 지연된 RGC 변성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.

방법:

RGC 변성에 미치는 항-MASP-2 항체의 효과를 측정하기 위한 방법은 Kuehn M.H. et al., Experimental Eye Research 87:89-95 (2008)에 의해 기술된 것과 같이 망막 I/R의 동물 모델에서 수행하며, 본원에 참조로 포함된다. Kuehn 등에 의해 기술된 바와 같이, 동물을 마취시킨 후, 포스페이트 완충된 식염수를 함유하고 있는 저장소에 연결된 30-게이지 바늘을 눈의 전실에 삽입함으로써 망막 허혈을 유도한다. 그런 다음 식염수 저장소를 상승시켜서 전실의 압력을 망막 맥관구조를 통해 순환을 완전히 방지하기에 충분한 104 mmHg로 상승시킨다. 상승된 안내 허혈을 홍채 및 망막의 창백해짐에 의해 확인하고 허혈을 왼쪽 눈에서만 45분 동안 유지한다; 오른쪽 눈은 대조군으로서 작용하며 캐뉼라를 삽입하지 않는다. 그런 다음 마우스를 허혈 손상 후 1 또는 3주 후에 안락사시킨다. 허혈성 손상 전에 투여된 항-MASP-2 항체의 효과를 평가하기 위해 항-MASP-2 항체는 눈에 국소적으로 또는 전식적으로 마우스에 투여된다.

눈의 면역조직화학적 연구를, 보체 침착을 검출하기 위하여 C1q 및 C3에 대한 항체들을 사용하여 수행한다. 시신경 손상은 또한 표준 전자 현미경법을 사용하여 평가할 수 있다. 생존하는 동물의 망막의 RGC의 정량을 감마 시누클레인 라벨링을 사용하여 수행한다.

결과:

Kuehn 등에 의해 기술된 바와 같이, 정상적인 대조군 마우스에서, 일시적인 망막 허혈은 시신경의 퇴행성 변화 및 면역조직화학에 의해 검출할 수 있는 C1q 및 C3의 망막 침착을 초래한다. 그에 반해, C3 결핍 마우스는 축색돌기 변성의 현저한 감소를 나타냈고, 유도 후 1주 후에 시신경 손상은 단지 미미한 수준인 것을 나타냈다. 이들 결과를 토대로, 이 분석을 MASP-2 넉아웃 마우스에서 수행할 때, 그리고 허혈 손상 전에 정상 마우스에 항-MASP-2 항체를 투여할 때 유사한 결과가 관찰될 수 있을 것으로 예상된다.

실시예 29

이 실시예는 MASP-2 억제제, 예컨대 항-MASP-2 항체가 방사선 노출의 치료 및/또는 급성 방사선 증후군의 치료, 개선 또는 방지를 위해 효과적인 것을 입증한다.

근거:

고용량의 이온화 방사선에의 노출은 2가지 주요 메커니즘에 의해 사망을 유발한다: 골수에 대한 독성 및 위장 증후군. 골수 독성은 모든 혈액 세포에서의 강하를 초래하여 유기체가 감염 및 출혈에 의해 사망하게 만든다. 위장 증후군은 보다 심각하고 소화관 내피층의 분해 및 장의 내분비 기능의 상실로 인한 장의 장벽 기능의 상실에 의해 구동된다. 이것은 사망을 초래할 수 있는 패혈증 및 관련된 전신성 염증 반응 증후군을 유도한다.

보체의 렉틴 경로는 조직 손상 및 외래 표면 (즉, 박테리아)에 대한 노출에 대한 반응으로 염증을 개시하는 선천성 면역 메커니즘이다. 이 경로의 차단은 허혈성 장 조직 손상 또는 패혈성 쇼크의 마우스 모델에서 더 좋은 결과를 유도한다. 렉틴 경로는 방사선-유도된 조직 손상에 대한 반응으로 과잉의 해로운 염증을 야기할 수 있는 것으로 가설을 세울 수 있다. 그러므로 렉틴 경로의 차단은 이차 손상을 줄일 수 있고 급성 방사선 노출 후의 생존을 증가시킬 수 있다.

이 실시예에서 기술된 바와 같이 수행한 연구의 목적은 항-쥐 MASP-2 항체를 투여함으로써 방사선 손상의 마우스 모델에서 생존에 미치는 렉틴 경로 차단의 효과를 평가하는 것이었다.

방법 및 재료:

재료. 이 연구에서 사용된 테스트 물질은 트랜스펙션된 포유류 세포에서 생성된 렉틴 보체 경로의 MASP-2 단백질을 차단하는 (i) 고친화도 항-쥐 MASP-2 항체 (mAbM11) 및 (ii) 고친화도 항-인간 MASP-2 항체 (mAbH6)였다. 투여 농도는 1 mg/kg의 항-쥐 MASP-2 항체 (mAbM11), 5mg/kg의 항-인간 MASP-2 항체 (mAbH6) 또는 멸균 식염수였다. 각각의 투여 기간에 대해서는, 적당한 부피의 새로운 투여 용액을 제조하였다.

동물. 젊은 성숙한 수컷 Swiss-Webster 마우스를 Harlan Laboratories (Houston, TX)로부터 얻었다. 동물들을 알파-드라이 베딩 (Alpha-Dri bedding)을 포함하고 인증된 PMI 5002 설치류 다이어트 (Animal Specialties, Inc., Hubbard OR)가 제공되며 물은 임의로 공급되는 딱딱한-바닥의 우리에 하우징하였다. 온도를 모니터링하였고 동물 보유실은 12시간 빛/12시간 어둠의 광사이클로 조작하였다.

조사. 2주의 시설 순응 후에 마우스를 6.5 및 7.0 Gy에서 320-kV 고안정성 X-선 발생기, 금속 세라믹 X-선 튜브, 가변 x-선 빔 콜리메이터 및 필터가 장착된 Therapax X-RAD 320 시스템 (Precision X-ray Incorporated, East Haven, CT)을 사용하여 0.78 Gy/분의 투여 속도로 전신 노출에 의해 조사하였다. 용량 수준은 동일한 계통의 마우스로 수행된 선행 연구들을 기초로 선택하였고, LD50/30은 6.5와 7.0 Gy 사이인 것으로 나타난다 (데이터 미도시).

약물 제형 및 투여. 적절한 부피의 농축 스톡 용액을 0.2 mg/ml 항-쥐 MASP-2 항체 (mAbM11) 또는 0.5 mg/ml 항-인간 MASP-2 항체 (mAbH6)의 투여 용액을 제조하기 위하여 프로토콜에 따라 빙냉 식염수로 희석하였다. 항-MASP-2 항체 mAbM11 및 mAbH6을 1 mg/kg mAbM11, 5mg/kg mAbH6 또는 식염수 비히클을 전달하기 위하여 동물 체중을 기초로 25-게이지 바늘을 사용하여 IP 주사를 통해 투여하였다.

연구 디자인. 마우스를 표 8에 기술된 바와 같은 군들로 무작위로 배정하였다. 체중 및 온도를 매일 측정하고 기록하였다. 군 7, 11 및 13의 마우스들을 조사 후 7일에 희생시키고 심층 마취하에 심장 천공에 의해 혈액을 수거하였다. 조사 후 30일에 생존하는 동물들을 동일 방식으로 희생시키고 혈액을 수거하였다. 수거된 혈액 샘플로부터 혈장을 프로토콜에 따라 제조하고 분석을 위해 스폰서에 돌려보냈다.

연구군

군 ID	N	조사 수준 (Gy)	처리	용량 스케줄
1	20	6.5	비히클	조사 전 18시간, 조사 후 2시간째, 매주 부스터
2	20	6.5	항-쥐 MASP-2 ab(mAbM11)	조사 전 18시간에만
3	20	6.5	항-쥐 MASP-2 ab(mAbM11)	조사 전 18시간, 조사 후 2시간째, 매주 부스터
4	20	6.5	항-쥐 MASP-2 ab(mAbM11)	조사 후 2시간째, 매주 부스터
5	20	6.5	항-인간 MASP-2 ab(mAbH6)	조사 전 18시간, 조사 후 2시간째, 매주 부스터
6	20	7.0	비히클	조사 전 18시간, 조사 후 2시간째, 매주 부스터
7	5	7.0	비히클	조사 후 2시간에만
8	20	7.0	항-쥐 MASP-2 ab(mAbM11)	조사 전 18시간에만
9	20	7.0	항-쥐 MASP-2 ab(mAbM11)	조사 전 18시간, 조사 후 2시간째, 매주 부스터
10	20	7.0	항-쥐 MASP-2 ab(mAbM11)	조사 후 2시간째, 매주 부스터
11	5	7.0	항-쥐 MASP-2 ab(mAbM11)	조사 후 2시간에만
12	20	7.0	항-인간 MASP-2 ab(mAbH6)	조사 전 18시간, 조사 후 2시간째, 매주 부스터
13	5	없음	없음	없음

통계학적 분석. 카플란-마이어 생존 곡선을 만들었고 로그-등급과 윌콕슨(Wilcoxon) 방법을 사용하는 처리군 사이의 평균 생존 시간을 비교하는데 사용하였다. 표준편차를 포함한 평균, 또는 평균의 표준오차를 기록한다. 통계학적 비교를 제어된 조사된 동물과 개개의 처리군 사이의 2-방향의 짝이 없는 t-시험을 사용하여 실시하였다.

결과

7.0 및 6.5 Gy 노출군에 대한 카플란-마이어 생존 플롯을 도 32A 및 32B에 각각 제공하고 하기의 표 9에 요약한다. 전체적으로, 항-쥐 MASP-2 ab (mAbM11) 사전-조사로의 처리는 비히클 처리된 조사된 대조 동물에 비교하여 6.5 (20% 증가) 및 7.0 Gy (30% 증가) 노출 수준 둘 다에서 생존을 증가시켰다. 6.5 Gy 노출 수준에서, 조사-후 항-쥐 MASP-2 처리는 비히클 대조 조사된 동물에 비교하여 중간의 생존의 증가 (15%)를 초래하였다.

비교하면, 7.0 Gy 노출 수준에서 처리된 모든 동물은 비히클 처리된 조사된 대조 동물에 비교하여 생존율의 증가를 나타냈다. 생존율의 가장 큰 변화는 mAbH6을 받은 동물에서 발생하였는데, 대조군 동물에 비교하여 45% 증가하였다. 또한 7.0 Gy 노출 수준에서, mAbH6 처리된 군에서의 사망은 비히클 처리된 조사된 대조 동물에 대해 조사 후 8일에 나타난 것에 비해 조사 후 15일에 처음 발생하였고, 대조 동물에 대해 7일의 증가를 보였다. mAbH6를 받은 마우스에 대한 사망까지의 평균 시간 (27.3 ± 1.3일)은 7.0 Gy 노출 수준에서 대조 동물 (20.7 ± 2.0일)에 비교하여 상당히 증가되었다 (p = 0.0087).

체중의 퍼센트 변화를 조사 전날 (제-1 일)에 비교하여 연구하는 내내 기록하였다. 일시적인 체중 손실이 조사된 모든 동물에서 발생하였는데, 대조군에 비교하여 mAbM11 또는 mAbH6 처리로 인한 차등 변화에 대한 증거는 없었다 (데이터 미도시). 연구 종료시, 생존한 모든 동물은 출발시 (제-1 일) 체중으로부터 체중의 증가를 나타냈다.

방사선에 노출된 테스트 동물의 생존률

테스트군	노출	생존 (%)	사망가지의 시간 (평균 ± SEM, 일)	처음/마지막 사망 (일)
대조군 조사	6.5 Gy	65 %	24.0 ± 2.0	9/16
mAbM11 노출 전	6.5 Gy	85 %	27.7 ± 1.5	13/17
mAbM11 노출 전+노출 후	6.5 Gy	65 %	24.0 ± 2.0	9/15
mAbM11 노출 후	6.5 Gy	80 %	26.3 ± 1.9	9/13
mAbH6 노출 전+노출 후	6.5 Gy	65 %	24.6 ± 1.9	9/19
대조군 조사	7.0 Gy	35 %	20.7 ± 2.0	8/17
mAbM11 노출 전	7.0 Gy	65 %	23.0 ± 2.3	7/13
mAbM11 노출 전+노출 후	7.0 Gy	55 %	21.6 ± 2.2	7/16
mAbM11 노출 후	7.0 Gy	70 %	24.3 ± 2.1	9/14
mAbH6 노출 전+노출 후	7.0 Gy	80 %	27.3 ± 1.3*	15/20

*p = 제어된 조사된 동물과 동일한 조사 노출 수준에서의 처리군 사이의 쌍을 이루지 않은 2-방향 t-시험에 의해 0.0087.

논의

급성 방사선 증후군은 3가지 규정된 하위증후군: 조혈성, 위장성 및 뇌혈관 급성 방사선 증후군으로 구성된다. 증후군은 1 Gy를 초과하는 상당한 신체 부분 또는 전신 방사선 노출이 있을 때 방사선 용량에 따라 관찰된 인간에서 관찰된 조혈 효과와 함께 관찰되었다. 조혈성 증후군은 면역 시스템에 대한 손상에 부수적으로 일어나는 혈액 수, 적혈구 및 백혈구 및 혈소판의 변화를 포함하는 범혈구감소증으로 유도하는 골수 기능의 심각한 저하를 특징으로 한다. 말초 혈액에 존재하는 호중구 및 혈소판의 수가 적어지는 최악의 상황이 일어남에 따라, 호중성 백혈구 감소증, 열, 패혈증과 제어불능의 출혈의 합병증이 사망을 유발한다.

본 연구에서, mAbH6의 투여는 7.0 Gy에서 조사된 Swiss-Webster 수컷 마우스에서 전신 x-선 조사의 생존성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 주지할 것은, 7.0 Gy 노출 수준에서, mAbH6을 받은 동물의 80%가 비히클 처리된 조사된 대조 동물의 35%에 비교하여 30일까지 생존하였다. 중요하게도, 이 처리군에서 첫 번째 사망일은 조사 후 15일까지 일어나지 않았고, 비히클 처리된 조사된 대조 동물에서 관찰된 것보다 7-일 증가하였다. 신기하게도, 더 낮은 X-선 노출 (6.5 Gy)에서, mAbH6의 투여는 비히클 처리된 조사된 대조 동물에 비교하여 생존성이나 사망의 지연에 영향을 미치는 것으로 나타나지 않았다. 노출 수준 간 반응의 이런 차이에 대해 여러 이유가 있을 수 있지만, 어떠한 가설이든지 입증하기 위해서는 미생물 배양 및 혈액학적 파라미터들에 대한 중간 샘플 수거을 포함하여 추가의 연구를 필요로 할 것이다. 한 가지 설명은 아마도 군에 배정받은 동물의 수가 어떠한 미묘한 처리-관련 차이를 보는 것을 막았을 것이라고 단순화될 수 있다.

예를 들어 n=20의 군 크기일 때 65% (mAbH6, 6.5 Gy 노출)와 80% (mAbH6, 7.0 Gy 노출) 사이의 생존의 차이는 3마리 동물이다. 다른 한편으로, 35% (비히클 대조군, 7.0 Gy 노출)와 80% (mAbH6, 7.0 Gy 노출) 사이의 차이는 9마리 동물로, 처리-관련 차이의 확실한 증거를 제공한다.

이들 결과는 항-MASP-2 항체가 급성 방사선 증후군의 해로운 영향을 받고 있거나, 받은 위험이 있는 포유류 대상을 치료하는 데 효과적인 것을 입증한다.

실시예 30

이 실시예는 MASP-2 결핍 마우스가 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 A 또는 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 중 어느 하나로의 감염 후에 네이세리아 메닝기티디스 유도된 사망으로부터 보호되는 것을 입증한다.

방법:

MASP-2 넉아웃 마우스 (MASP-2 KO 마우스)를 실시예 1에서 기술된 바와 같이 제조하였다. 10-주령 MASP-2 KO 마우스 (n=10) 및 야생형 (WT) C57/BL6 마우스 (n=10)를 100 μl 부피 중의 2.6 x 10⁷ CFU의 단위용량의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 A Z2491로 복강 내 (i.p.) 주사에 의해 접종하였다. 감염량을 400　mg/kg의 최종 농도에서 철 덱스트란과 함께 마우스에 투여하였다. 감염 후 마우스의 생존을 72시간에 걸쳐 모니터링하였다.

Survival of the 마우스 after 감염 was monitored over a 72-hour time period. An 질병 점수 was also determined for the WT 및 MASP-2 KO 마우스 during the 72-hour time period after 감염, based on the illness scoring 파라미터s described below in TABLE 10, which is based on the scheme of Fransen et al. (2010) with slight 변형s.

별도의 실험으로, 10-주령 MASP-2 KO 마우스 (n=10) 및 야생형 (WT) C57/BL6 마우스 (n=10)를 100 μl 부피 중의 6 x 10⁶ CFU의 단위용량의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58로 i.p. 주사에 의해 접종하였다. 감염량을 400　mg/kg의 최종 농도에서 철 덱스트란과 함께 마우스에 투여하였다. 감염 후 마우스의 생존을 72시간에 걸쳐 모니터링하였다. 질병 점수를 또한 하기 표 10에 기술한, Fransen 등의 계획 (Fransen et al. (2010))을 기초로 약간 변형시킨 질병 점수 파라미터들을 기초로 감염 후 72시간 동안 WT 및 MASP-2 KO 마우스에 대해 측정하였다.

감염된 마우스에서 임상 신호와 관련된 질병 점수

징후	점수
정상	0
약간 주름진 털	1
주름진 털, 둔하고 들러붙는 눈	2
주름진 털, 졸린듯 감기는 눈	3
매우 병들고 자극 후에도 이동이 없음	4
사망	5

감염 후 혈액 샘플을 시간마다 마우스로부터 채취하여 감염을 입증하고 혈청으로부터 박테리아의 클리어런스 속도를 측정하기 위하여 네이세리아 메닝기티디스의 혈청 수준 (로그 cfu/mL)을 측정하여 분석하였다.

결과:

도 33은 2.6 x 10⁷ cfu의 감염량의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 A Z2491의 투여 후에 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존률을 그래프로 나타낸 카플란-마이어 플롯이다. 도 33에서 도시된 바와 같이, MASP-2 KO 마우스는 100%가 감염 후 72시간의 주기 내내 생존하였다. 그에 반해, WT 마우스는 82% (p=0.012)만이 감염 후 24시간에 생존하였고, 감염 후 72시간에는 단지 50%만이 여전히 생존하였다. 이들 결과는 MASP-2-결핍 마우스가 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 A Z2491-유도된 사망으로부터 보호된 것을 입증한다.

도 34는 6 x 10⁶ cfu의 감염량의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 투여 후에 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존을 그래프로 나타낸 카플란-마이어 플롯이다. 도 34에서 도시된 바와 같이, MASP-2 KO 마우스의 90%는 감염 후 72시간의 주기 내내 생존하였다. 그에 반해, WT 마우스는 20% (p=0.0022)만이 감염 후 24시간에 생존하였다. 이들 결과는 MASP-2-결핍 마우스가 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 계통 MC58-유도된 사망으로부터 보호된 것을 입증한다.

도 35는 6 x 10⁶ cfu의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 i.p. 감염 후에 MASP-2 KO 및 WT 마우스로부터 채취한 혈액 샘플에서 상이한 시점에 회수한 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 로그 cfu/mL을 그래프로 도시한다 (마우스의 두 군에 대해 상이한 시점에서 n=3). 결과는 평균±SEM으로서 표시한다. 도 35에서 도시된 바와 같이, WT 마우스에서, 혈액 중의 네이세리아 메닝기티디스의 수준은 감염 후 24시간에 약 6.0 로그 cfu/mL의 피크에 도달하였고 감염 후 36시간에는 약 4.0 로그 cfu/mL로 떨어졌다. 그에 반해, MASP-2 KO 마우스에서, 네이세리아 메닝기티디스의 수준은 감염 후 12시간에 약 4.0 로그 cfu/mL의 피크에 도달하였고 감염 후 36시간에는 약 1.0 로그 cfu/mL로 떨어졌다 (기호 "*"는 p<0.05를 나타내고; 기호 "**"는 p=0.0043을 나타낸다). 이들 결과는 비록 MASP-2 KO 마우스가 WT 마우스와 동일한 용량의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58로 감염되었지만, MASP-2 KO 마우스는 WT에 비교하여 균혈증의 증강된 클리어런스를 가지는 것을 입증한다.

도 36은 6 x 10⁶ cfu의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 감염 후 3, 6, 12 및 24시간째의 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 평균 질병 점수를 그래프로 도시한다. 도 36에서 도시된 바와 같이, MASP-2-결핍 마우스는 감염에 대한 높은 내성을 보였는데, 질병 점수는 WT 마우스에 비교하여 감염 후 6시간에 (기호 "*"는 p=0.0411을 나타냄), 12시간에 (기호 "**"는 p=0.0049를 나타냄) 및 24시간에 (기호 "***"는 p=0.0049를 나타냄) 훨씬 낮았다. 도 36의 결과를 평균±SEM으로서 표시한다.

요약하면, 이 실시예의 결과는 MASP-2-결핍 마우스가 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 A 또는 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 중 어느 하나로의 감염 후 네이세리아 메닝기티디스-유도된 사망으로부터 보호되는 것을 입증한다.

실시예 31

이 실시예는 네이세리아 메닝기티디스로 감염된 후에 항-MASP-2 항체의 투여가 네이세리아 메닝기티디스로 감염된 마우스의 생존률을 증가시키는 것을 증명한다.

배경/근거:

실시예 10에서 기술한 것과 같이, Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝시키기 위하여 래트 MASP-2 단백질을 이용하였는데, 그것으로부터 Fab2 #11을 기능적으로 활성인 항체로서 확인하였다. 래트 IgG2c 및 마우스 IgG2a 아이소타입의 전장 항체를 Fab2 #11로부터 생성하였다. 마우스 IgG2a 아이소타입의 전장 항-MASP-2 항체를 약역학 파라미터에 대해 특성화하였다 (실시예 19에서 설명한 것과 같음).

이 실시예에서, Fab2 #11로부터 유래된 마우스 항-MASP-2 전장 항체를 네이세리아 메닝기티디스 감염의 마우스 모델에서 분석하였다.

방법:

상기 기술된 것과 같이 생성된, Fab2 #11로부터 유래된 마우스 IgG2a 전장 항-MASP-2 항체 아이소타입을 다음과 같이 네이세리아 메닝기티디스 감염의 마우스 모델에서 테스트하였다.

감염 후 마우스-항-MASP-2 단클론성 항체 (MoAb)의 투여

9-주령 C57/BL6 Charles River 마우스를 고용량 (4x10⁶ cfu)의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 계통 MC58로 i.p. 주사후 3시간 후에 억제 마우스 항-MASP-2 항체 (1.0 mg/kg) (n=12) 또는 대조 아이소타입 항체 (n=10)로 테스트하였다.

결과:

도 37은 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 계통 MC58의 4x10⁶ cfu의 감염량을 투여하고, 이어서 감염 후 3시간 후에 억제 항-MASP-2 항체 (1.0 mg/kg) 또는 대조군 아이소타입 항체 중 어느 하나의 투여 후 마우스의 퍼센트 생존률을 그래프로 예시하는 카플란-마이어 플롯이다. 도 37에서 나타난 것과 같이, 항-MASP-2 항체로 처리된 마우스들의 90%가 감염 후 72-시간 기간 내내 생존하였다. 그에 반해, 아이소타입 대조군 항체로 처리된 마우스들의 50%만이 감염 후 72-시간 기간 내내 생존하였다. 기호 "*"는 두 생존률 곡선의 비교에 의해 측정되는 바, p=0.0301을 나타낸다.

이 결과들은 항-MASP-2 항체의 투여가 네이세리아 메닝기티디스로 감염된 대상체에서 치료 및 생존률을 개선시키는데 효과적인 것을 증명한다.

여기서 증명된 것과 같이, 네이세리아 메닝기티디스로 감염된 대상체의 치료에 항-MASP-2 항체의 사용은 감염 후 3시간 이내에 투여될 때 효과적이고, 감염 후 24시간 내지 48시간 이내에도 효과적일 것으로 예상된다. 수막구균성 질환 (수막구균혈증 또는 수막염)은 의학적 응급상황이고, 요법은 전형적으로 수막구균성 질환이 의심된다면 즉시 시작될 것이다 (즉 네이세리아 메닝기티디스가 병인체로서 양성적으로 확인되기 전에).

실시예 30에서 증명된 MASP-2 KO 마우스에서의 결과의 관점에서, 네이세리아 메닝기티디스로의 감염 전에 항-MASP-2 항체의 투여는 또한 감염의 심각성을 예방 또는 개선하기에 효과적일 것이라고 여겨진다.

실시예 32

이 실시예는 항-MASP-2 항체의 투여가 인간 혈청에서 네이세리아 메닝기티디스 감염을 치료하기에 효과적인 것을 증명한다.

근거:

기능성 MBL의 혈청 수준이 감소된 환자들은 재발하는 박테리아 및 진균 감염에 대해 증가된 민감성을 나타낸다 (Kilpatrick et al., Biochim Biophys Acta 1572:401-413 (2002)). 네이세리아 메닝기티디스는 MBL에 의해 인식되고, MBL-결핍 혈청은 네이세리아를 용해하지 않는 것으로 나타났다.

실시예30 및 31에서 기술된 결과의 관점에서, 보체-결핍 및 대조군 인간 혈청에서 네이세리아 메닝기티디스 감염을 치료하는 항-MASP-2 항체의 투여의 효능을 측정하기 위해 일련의 실험을 수행하였다. 실험들을 보체 경로를 보존하기 위하여 고농도의 혈청 (20%)에서 수행하였다.

방법:

1. 인간 항-MASP-2 항체로 치료된 다양한 보체-결핍 인간 혈청 및 인간 혈청에서 혈청 살균력

다음의 보체-결핍 인간 혈청 및 대조군 인간 혈청을 이 실험에 사용하였다:

테스트된 인간 혈청 샘플 (도 38에 도시됨)

샘플	혈청 유형
A	정상 인간 혈청 (NHS) + 인간 항-MASP-2 Ab
B	NHS + 아이소타입 대조군 Ab
C	MBL -/- 인간 혈청
D	NHS
E	열-비활성화된 (HI) NHS

인간 MASP-2에 대한 재조합 항체를 조합 항체 라이브러리 (Knappik, A., et al., J. Mol. Biol. 296:57-86 (2000))로부터, 항원으로서 재조합 인간 MASP-2A를 사용하여 분리하였다 (Chen, C.B. and Wallis, J. Biol. Chem. 276:25894-25902 (2001)). 인간 혈장에서 C4 및 C3의 렉틴 경로-매개 활성화를 강력하게 억제한 항-인간 scFv 단편을 확인하였고 전장 인간 IgG4 항체로 전환시켰다.네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58을 표 11에 나타낸 상이한 혈청과, 각각 20%의 혈청 농도에서, 억제 인간 항-MASP-2 항체 (총 부피 100 μl 중의 3 μg)를 첨가하거나 첨가하지 않은 채로 37℃에서 흔들어주면서 인큐베이션하였다. 샘플을 다음 시점: 0-, 30-, 60- 및 90-분 간격으로 취하고, 플레이팅한 후 생균수를 측정하였다. 열-비활성화된 인간 혈청을 네거티브 대조군으로서 사용하였다.

결과:

도 38은 표 11에서 나타낸 인간 혈청 샘플에서 다양한 시점에 회수된 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58의 생균수의 로그 cfu/mL을 그래프로 도시한다. 표 12는 도 38에 대한 학생 t-테스트 결과를 제공한다.

도 38에 대한 학생 t-테스트 결과 (시점 60분)

	평균 Diff. (Log)	유의미한가? P<0.05?	P 값 요약
A 대비 B	-0.3678	예	***(0.0002)
A 대비 C	-1.1053	예	***(p<0.0001)
A 대비 D	-0.2111	예	**(0.0012)
C 대비 D	1.9	예	***(p<0.0001)

도 38 및 표 12에서 나타난 것과 같이, 인간 20% 혈청에서 네이세리아 메닝기티디스의 보체-의존적 사멸은 인간 항-MASP-2 억제 항체의 첨가에 의해 상당히 향상되었다.2. MASP-2가 결핍된 20% (v/v) 마우스 혈청에서 네이세리아 메닝기티디스의 보체-의존적 사멸.

다음의 보체-결핍 마우스 혈청 및 대조군 마우스 혈청을 이 실험에 사용하였다:

테스트된 마우스 혈청 샘플 (도 39에 도시됨)

샘플	혈청 유형
A	WT
B	MASP-2 -/-
C	MBL A/C -/-
D	WT 열-비활성화된 (HIS)

네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58을 상이한 보체-결핍 마우스 혈청과, 각각 20%의 혈청 농도에서 37℃에서 흔들어주면서 인큐베이션하였다. 샘플을 다음 시점: 0-, 15-, 30-, 60-, 90- 및 120-분 간격으로 취하고, 플레이팅한 후 생균수를 측정하였다. 열-비활성화된 인간 혈청을 네거티브 대조군으로서 사용하였다. 결과:

도 39는 표 13에서 나타낸 마우스 혈청 샘플에서 다양한 시점에 회수된 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58의 생균수의 로그 cfu/mL을 그래프로 도시한다. 도 39에서 나타난 것과 같이, MASP-2 -/- 마우스 혈청은 WT 마우스 혈청보다 네이세리아 메닝기티디스에 대해 더 높은 수준의 살균력을 가진다. 기호 "**"는 p=0.0058을 나타내고, 기호 "***"는 p=0.001을 나타낸다. 표 14는 도 39에 대한 학생 t-테스트 결과를 제공한다.

도 39에 대한 학생 t-테스트 결과

비교	시점	평균 Diff. (LOG)	유의미한가? (p<0.05)?	P 값 요약
A 대비 B	60 분	0.39	예	** (0.0058)
A 대비 B	90 분	0.6741	예	*** (0.001)

요약하면, 이 실시예의 결과는 MASP-2 -/- 혈청이 WT 혈청보다 네이세리아 메닝기티디스에 대해 더 높은 수준의 살균력을 가지는 것을 증명한다.실시예 33

이 실시예는 발작성 야간 혈색소뇨증 (PNH)의 마우스 모델로부터 얻어진 혈액으로부터의 적혈구 세포의 용해에 미치는 MASP-2 결핍의 억제 효과를 증명한다.

배경/근거:

Marchiafava-Micheli 증후군으로도 불리는 발작성 야간 혈색소뇨증 (PNH)은 보체-유도된 혈관 내 용혈성 빈혈증을 특징으로 하는 혈액의 후천성, 잠재적으로 생명에 치명적인 질환이다. PNH의 전형적 특징은 PNH 적혈구 상의 보체 조절자 CD55 및 CD59의 부재로 인한 보체의 대체 경로의 조절되지 않은 활성화의 결과인 만성 보체-매개 혈관 내 용혈이고, 혈색소뇨증 및 빈혈증이 뒤따른다. Lindorfer, M.A., et al., Blood 115(11) (2010), Risitano, A.M, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11:528-535 (2011). PNH의 빈혈증은 혈류의 적혈구 세포의 파괴로 이난 것이다. PNH의 증상들은 뇨에서의 헤모글로빈의 출현, 요통, 피로, 숨가쁨 및 혈전증으로 인한 적색 뇨를 포함한다. PNH는 자체 발달되는 경우, "일차 PNH"로서 언급되거나 또는 재생불량성 빈혈증과 같은 다른 골수 장애의 맥락에서 "이차 PNH"로서 언급될 수 있다. PNH에 대한 치료는 빈혈증에 대한 혈액 투입, 혈전증에 대한 항응고 및 단클론성 항체 에쿨리쥬맙 (Soliris®)의 사용을 포함하며, 그것은 보체 시스템을 억제함으로써 면역 파괴에 반해 혈액을 보호한다 (Hillmen P. et al., N. Engl. J. Med. 350(6):552-9 (2004)). 에쿨리쥬맙 (Soliris®)은 보체 성분 C5를 표적으로 하고, 그것의 분열을 C5 컨버타제에 의해 차단함으로써 C5a의 생성 및 MAC의 조립을 방지하는 인간화 단클론성 항체이다. PNH 환자의 에쿨리쥬맙으로의 치료는 락테이트 데하이드로게나제 (LDH)에 의해 측정되는 바, 혈관 내 용혈의 감소를 초래하였고, 환자의 약 절반에서 헤모글로빈 안정화 및 투입 독립성을 유도하였다 (Hillmen P, et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, vol 11(6) (2011)). 에쿨리쥬맙으로 치료 중인 거의 모든 환자가 정상 또는 거의 정상 LDH 수준을 이룬 한편 (혈관 내 용혈의 제어로 인해), 환자의 단지 1/3만이 11gr/dL보다 높은 헤모글로빈 수준에 도달하였고, 에쿨리쥬맙으로 치료 중인 나머지 환자는 계속해서 약 동등한 비율로 중간 내지 심각한 (즉, 투입-의존적) 빈혈증을 나타냈다 (Risitano A.M. et al., Blood 113:4094-100 (2009)). Risitano et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 11:528-535 (2011)에서 기술된 것과 같이, 에쿨리쥬맙으로 치료 중인 PNH 환자는 그들의 PNH 적혈구의 실질적인 부분에 결합한 C3 단편을 함유하였고 (한편 미처리 환자는 그렇지 못했다), 막-결합된 C3 단편이 PNH 적혈구에서 옵소닌으로서 작용하여 특이적 C3 수용체를 통한 세망내피 세포에서의 그것들의 포획 및 계속해서 혈관외 용혈을 초래하는 것으로 증명되었다. 그러므로, 에쿨리쥬맙의 사용에 더불어 치료 전략이 C3 단편-매개 혈관외 용혈을 발생시킨 그런 환자들에게, 그들이 계속해서 적혈구 투입을 필요로 하기 때문에 필요하다.

이 실시예는 PNH의 마우스 동물 모델로부터 얻어진 혈액 샘플로부터의 적혈구 세포의 용해에 미치는 MASP-2- 결핍 혈청 및 MASP-2 억제제로 처리된 혈청의 효과를 평가하기 위한 방법을 기술하고, PNH를 앓고 있는 대상체들을 치료하는 MASP-2 억제의 효능을 증명하며, 또한 에쿨리쥬맙과 같은 C5 억제제로 치료가 진행중인 PNH 대상체들에서 C3 단편-매개 혈관외 용혈의 효과를 개선하기 위해 MASP-2의 억제자의 사용을 지지한다.

방법:

PNH 동물 모델:

혈액 샘플을 Crry 및 C3가 결핍된 (Crry/C3-/-) 유전자-표적화된 마우스 및 CD55/CD59-결핍 마우스로부터 얻었다. 이 마우스들은 각각의 표면 보체 조절자가 없고, 그러므로 그것들의 적혈구는 PNH 인간 혈액 세포와 같이 자발적 보체 자가용해에 민감하다.

이 적혈구들을 더욱 더 민감하게 만들기 위하여, 이 세포들을 만난에 의한 코팅으로 및 코팅 없이 사용하였고 그런 다음 WT C56/BL6 혈장, MBL null 혈장, MASP-2 -/- 혈장, 인간 NHS, 인간 MBL -/- 혈장, 및 인간 항-MASP-2 항체로 처리된 NHS에서의 용혈에 대해 테스트하였다.

1. MASP-2-결핍/고갈된 혈청 및 대조군에서 Crry/C3 및 CD55/CD59 이중-결핍 쥐 적혈구의 용혈 검정

제1일. 쥐 RBC (± 만난 코팅)의 제조

포함된 재료: 신선한 마우스 혈액, BBS/Mg^2+/Ca²⁺ (4.4 mM 바르비투르산, 1.8 mM 바르비톤 나트륨, 145 mM NaCl, pH7.4, 5mM Mg²⁺, 5mM Ca²⁺), 염화 나트륨, CrCl₃·6H₂0 (BBS/Mg2+/Ca2+ 중의 0.5mg/mL) 및 만난, BBS /Mg2+/Ca2+ 중의 100 μg/mL.

전혈 (2 mL)을 1 내지 2분 동안 2000 xg에서 4℃의 저온 원심분리기에서 회전시켰다. 혈장 연막을 흡인 제거하였다. 그런 다음 샘플을 2 mL의 빙-냉 BBS/젤라틴/Mg2+/Ca2+에 RBC 펠릿을 재현탁시키고 원신분리 단계를 반복함으로써 3회 세척하였다. 세 번째 세척 후, 펠릿을 4 mL의 BBS/Mg2+/Ca2+에 재현탁하였다. RBC의 2 mL 부분표본액을 미코팅 대조군으로서 한쪽에 놓아두었다. 나머지 2 mL에, 2 mL의 CrCl3 및 2 mL의 만난을 첨가하고 샘플을 부드럽게 혼합하면서 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 7.5 mL의 BBS/젤라틴/Mg2+/Ca2+를 첨가함으로써 반응을 종결시켰다. 샘플을 상기와 같이 회전시키고, 2 mL의 BBS/젤라틴/Mg2+/Ca2+에 재현탁하고, 상기와 같이 추가로 2회 세척한 후 4℃에서 보관하였다.

제2일. 용혈 검정

재료는 BBS/젤라틴/Mg²⁺/Ca²⁺ (상기와 같음), 테스트 혈청, 96-웰 둥근-바닥 및 평평한-바닥 플레이트 및 410 내지 414 nm에서 96-웰 플레이트를 판독하는 분광 광도계를 포함하였다.

RBC의 농도를 먼저 측정하였고 세포를 10⁹/mL로 조정하고, 이 농도에서 보관하였다. 사용 전에, 검정 버퍼를 10⁸/mL로 희석한 후, 웰당 100 ul를 사용하였다. 용혈을 410 내지 414 nm (541 nm보다 더 큰 민감성을 허용함)에서 측정하였다. 테스트 혈청의 희석을 빙-냉 BBS/젤라틴/Mg2+/Ca2+에서 제조하였다. 100 μl의 각 혈청 희석을 둥근-바닥 플레이트에 피펫팅하였다 (플레이트 레이아웃 참조). 100 μl의 적절하게 희석된 RBC 제제 (즉, 10⁸ /mL)(플레이트 레이아웃 참조)를 첨가하고, 37℃에서 약 1시간 동안 인큐베이션하고 용해를 관찰하였다. (플레이트는 이 지점에서 사진이 촬영될 수 있다). 그런 다음 플레이트를 최대 속도에서 5분 동안 회전시켰다. 유체상에서 100 μl를 흡인 제거하여, 평평한-바닥 플레이트에 옮기고, OD를 410 내지 414 nm에서 판독하였다. RBC 펠릿이 보유되었다 (이것들은 나중에 물로 용해되어 반대 결과가 얻어질 수 있다).

실험 #1:

신선한 혈액을 CD55/CD59 이중-결핍 마우스로부터 얻었고 Crry/C3 이중-결핍 마우스의 혈액 및 적혈구를 상기 프로토콜에서 상세하게 기술한 것과 같이 준비하였다. 세포를 분열시키고 세포의 절반을 만난으로 코팅하고 다른 절반을 미처리로 남겨두었으며, 최종 농도를 mL당 1x 10⁸로 조정하였고, 그 중 100 μl를 용혈 검정에 사용하였으며, 용혈 검정은 상기에서 기술한 것과 같이 수행하였다.

실험 #1의 결과: 렉틴 경로는 PNH 동물 모델에서 적혈구 용해에 관여한다

초기 실험에서, 비-코팅된 WT 마우스 적혈구는 어떤 마우스 혈청에서도 용해되지 않은 것으로 측정되었다. 추가로 만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구는 WT 마우스 혈청에서 느리게 용해되었지만 (37도에서 3시간 이상), MBL null 혈청에서는 용해되지 않았다. (데이터 미도시).

만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구는 인간 혈청에서 신속하게 용해되었지만 열-비활성화된 NHS에서는 용해되지 않았던 것으로 측정되었다. 중요하게도, 만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구는 1/640으로 점차 희석된 NHS에서 용해되었다 (즉, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 및 1/640 희석은 모두 용해되었다). (데이터 미도시). 이 희석에서, 대체 경로는 작용하지 않는다 (AP 기능성 활성은 8% 혈청 농도 아래로 상당히 감소한다).

실험 #1로부터의 결론

만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구는 고도로 희석된 인간 혈청에서 MBL로 매우 잘 용해되지만, MBL이 없는 혈청에서는 그렇지 않다. 테스트된 모든 혈청 농도에서 효과적인 용해는 이 용해에 대해 대체 경로가 포함되지 않거나 필요하지 않다는 것을 함축한다. MBL-결핍 마우스 혈청 및 인간 혈청이 만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구를 용해하지 못하는 무능력은 고전적 경로 또한 관찰된 용해로 작용하지 않는다는 것을 가리킨다. 렉틴 경로 인식 분자가 필요하기 때문에 (즉, MBL), 이 용해는 렉틴 경로에 의해 매개된다.

실험 #2 :

신선한 혈액을 Crry/C3 및 CD55/CD59 이중-결핍 마우스로부터 얻었고 만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구를 상기 기술된 것과 같이 용혈 검정에서 다음의 인간 혈청의 존재하에 분석하였다: MBL null; WT; 인간 항-MASP-2 항체로 사전처리된 NHS; 및 대조군으로서 열-비활성화된 NHS.

실험 #2의 결과: MASP-2 억제자는 PNH 동물 모델에서 적혈구 용해를 방지한다

만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구와 함께, NHS를 1/640으로 점차 희석된 (즉, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 및 1/640) 희석으로, 인간 MBL-/- 혈청, 인간 항-MASP-2 mAb로 사전처리된 NHS; 및 대조군으로서 열-비활성화된 NHS에서 인큐베이션하였다.

ELISA 미세역가 플레이트를 회전시키고 용해되지 않은 적혈구를 둥근-웰 플레이트의 바닥에 수집하였다. 각 웰의 상층액을 수집하고 용해된 적혈구로부터 방출된 헤모글로빈의 양을 ELISA 판독기에서 OD415를 판독함으로써 측정하였다.

대조군 열-비활성화된 NHS (네거티브 대조군)에서, 예상과 같이, 용해는 관찰되지 않았다. MBL-/- 인간 혈청은 만난-코팅된 마우스 적혈구를 1/8 및 1/16 희석에서 용해하였다. 항-MASP-2-항체-사전처리된 NHS는 만난-코팅된 마우스 적혈구를 1/8 및 1/16 희석에서 용해한 한편 WT 인간 혈청은 1/32의 하향 희석에서 만난-코팅된 마우스 적혈구를 용해하였다.

도 40은 열-비활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, 항-MASP-2 항체로 사전처리된 NHS, 및 대조군으로서의 NHS로부터의 혈청에서 일정 범위의 혈청 농도에 걸쳐 인간 혈청에 의한 만난-코팅된 쥐 적혈구의 용혈 (광도 측정법에 의해 측정된 상층액으로의 용해된 마우스 적혈구 (Cryy/C3-/-)의 헤모글로빈 방출에 의해 측정됨)을 그래프로 도시한다.

도 40에 도시된 결과로부터, 항-MASP-2 항체로의 MASP-2 억제가 CH₅₀을 상당히 변동시켰고 자가 보체 활성화를 보호하지 못하면서 감작 적혈구의 보체-매개 용해를 억제하였음이 증명된다.

실험 #3

비-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구에서 Crry/C3 및 CD55/CD59 이중-결핍 마우스로부터 얻은 신선한 혈액을 다음 혈청의 존재하에 상기 기술된 것과 같이 용혈 검정으로 분석하였다: MBL -/-; WT 혈청; 인간 항-MASP-2 항체로 사전처리된 NHS 및 대조군으로서의 열-비활성화된 NHS.

결과:

도 41은 열-비활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, 항-MASP-2 항체로 사전처리된 NHS, 및 대조군으로서의 NHS로부터의 혈청에서 일정 범위의 혈청 농도에 걸쳐 인간 혈청에 의한 비-코팅된 쥐 적혈구의 용혈 (광도 측정법에 의해 측정된 상층액으로의 용해된 WT 마우스 적혈구의 헤모글로빈 방출에 의해 측정됨)을 그래프로 도시한다. 도 41에 도시된 것과 같이, MASP-2를 억제하는 것은 비-감작 WT 마우스 적혈구의 보체-매개 용해를 억제하는 것이 증명된다.

도 42는 열-비활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, 항-MASP-2 항체로 사전처리된 NHS, 및 대조군으로서의 NHS로부터의 혈청에서 일정 범위의 혈청 농도에 걸쳐 인간 혈청에 의한 비-코팅된 쥐 적혈구의 용혈 (광도 측정법에 의해 측정된 상층액으로의 용해된 마우스 적혈구 (CD55/59 -/-)의 헤모글로빈 방출에 의해 측정됨)을 그래프로 도시한다.

표 12: 혈청 농도로서 표시된 CH ₅₀ 값

주: "CH₅₀"은 보체 매개 용혈이 50%에 도달하는 지점이다.요약하면, 이 실시예에서의 결과는 MASP-2를 억제하는 것이 자가 보체 활성화로부터의 보호가 결핍된 감작 및 비-감작 적혈구의 보체-매개 용해를 억제하는 것을 증명한다. 그러므로, MASP-2 억제자는 PNH를 앓고 있는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있고, 또한 에쿨리쥬맙 (Soliris®)과 같은 C5 억제자로의 치료가 진행중인 PNH 환자에서 혈관외 용혈을 개선 (즉, 억제, 예방 또는 용혈의 심각성을 감소)시키기 위해 사용될 수 있다.

실시예 34

이 실시예는 실시예 29에서 상기 기술된 연구에 대한 추수 연구를 기술하는 것으로, MASP-2 항체와 같은 MASP-2 억제자가 방사선 노풀의 치료 및/또는 급성 방사선 증후군의 치료, 개선 또는 예방에 효과적인 것을 확인하는 추가 증거를 제공한다.

근거: 실시예 29에서 기술된 초기 연구에서, 마우스에서 항-MASP-2 항체로의 사전-방사선 조사(pre-irradiation) 치료가 6.5 Gy 및 7.0 Gy 노출 수준 둘 다에서 비히클 치료된 방사선 조사된 대조군 동물에 비교하여 조사된 마우스의 생존률을 증가시킨 것으로 증명되었다. 추가로 실시예 29에서 6.5 Gy 노출 수준에서, 항-MASP-2 항체로의 사후-방사선 조사 치료가 비히클 대조군 방사선 조사된 동물과 비교하여 생존률의 보통의 증가를 초래한 것으로 증명되었다. 이 실시예는 제1 연구의 결과를 확인하기 위하여 수행된 제2 방사선 연구를 기술한다.

방법:

연구 A의 디자인:

스위스 웹스터 마우스 (n=50)를 이온화 방사선 (8.0 Gy)에 노출시켰다. 방사선에 노출 전 18시간 전 및 노출 후 2시간 후에 투여된, 및 그런 다음 매주 투여된 항-MASP-2 항체 요법 (mAbH6 5mg/kg)이 치사율에 미치는 효과를 평가하였다.

연구 A의 결과:

도 43에 나타낸 것과 같이, 항-MASP-2 항체 mAbH6의 투여는 8.0 Gy에 노출된 마우스에서 생존률을 증가시켰고, 이때 조정된 중간 생존률은 비히클 대조군을 받은 마우스에 비교하여 4에서 6일로 증가하였으며, 치사율은 비히클 대조군을 받은 마우스에 비교할 때 12% 감소한 것으로 측정되었다 (로그-랭크 테스트, p=0.040).

연구 B의 디자인:

스위스 웹스터 마우스 (n=50)를 다음 그룹에서 이온화 방사선 (8.0 Gy)에 노출시켰다: (I: 비히클) 식염수 대조군; (II: 저) 방사선 조사 전 18시간 전 및 방사선 조사 후 2시간 후에 투여된 항-MASP-2 항체 mAbH6 (5 mg/kg); (III: 고) 방사선 조사 전 18시간 전 및 방사선 조사 후 2시간 후에 투여된 mAbH6 (10 mg/kg); 및 (IV: 사후 고) 방사선 조사 후 2시간 후에만 투여된 mAbH6 (10 mg/kg).

연구 B의 결과:

방사선 조사 전 및 후의 항-MASP-2 항체의 투여는 비히클 대조군을 받은 동물과 비교하여 4일에서 5일로 평균 생존률을 조정하였다. 항-MASP-2 항체-처리된 마우스에서의 치사율은 비히클 대조군 마우스에 비교하여 6 내지 12% 감소하였다. 추가로 유의미한 해로운 치료 효과는 관찰되지 않았음이 주지된다 (데이터 미도시).

요약하면, 이 실시예에서 나타낸 결과들은 실시예 29에서 나타낸 결과와 일치하며, 추가로 항-MASP-2 항체가 급성 방사선 증후군의 위험이 있는, 또는 그것의 유해 효과로 고생하는 포유류 대상체를 치료하는 데 효과적인 것을 증명한다.

실시예 35

이 연구는 LPS (지질다당류)-유도된 혈전증의 마우스 모델에서 MASP-2-결핍의 효과를 조사한다.

근거:

쉬가 (이질균) 독소-생성 대장균 감염에 의해 유발되는 용혈성 요독 증후군 (HUS)은 아동에서 급성 신부전의 유발 요인이다. 이 실시예에서, MASP-2 억제가 혈관 내 혈전의 형성을 억제하는지 또는 예방하는지를 측정하기 위하여 LPS-유도된 혈전증 (미세혈관 응고)의 슈바르츠만 모델을 MASP-2-/- (KO) 마우스에서 수행하였다.

방법:

MASP-2-/- (n=9) 및 WT (n=10) 마우스를 LPS-유도된 혈전증 (미세혈관 응고)의 슈바르츠만 모델에서 분석하였다. 마우스들에게 세라티아속 LPS를 투여하고 혈전 형성을 시간 경과에 따라 모니터링하였다. 미세혈전 및 LPS-유도된 미세혈관 응고의 발생률의 비교를 수행하였다.

결과:

특히, 테스트된 모든 MASP-2 -/- 마우스 (9마리/9마리)는 세라티아속 LPS 투여 후에 혈관 내 혈전을 형성하지 않았다. 그에 반해, 나란히 테스트된 WT 마우스 10마리 중 7마리에서 미세혈전이 검출되었다 (p=0.0031, 피셔의 정확성 검정). 도 44에서 나타낸 것과 같이, LPS 감염 후에 미세혈관 폐색이 시작되는 시간을 MASP-2-/- 및 WT 마우스에서 측정하였고, 그것은 60분에 걸쳐 측정된 혈전 형성된 WT 마우스의 백분율을 나타내며, 이때 혈전 형성은 약 15분 정도로 일찍 검출되었다. 최대 80%의 WT 마우스가 60분에 혈전 형성을 증명하였다. 그에 반해, 도 44에서 나타난 것과 같이, MASP-2 -/- 중 어느 것도 60분에 혈전 형성을 나타내지 않았다 (로그 순위: p=0.0005).

이 결과들은 MASP-2 억제가 HUS 모델에서 혈관 내 혈전의 발생에 대해 보호적인 것을 증명한다.

실시예 36

이 실시예는 정제된 쉬가 독소 2 (STX2) 플러스 LPS의 복강 내 공동-주사를 사용하여 HUS의 마우스 모델에서 항-MASP-2 항체의 효과를 기술한다.

배경:

HUS의 마우스 모델을 정제된 쉬가 독소 2 (STX2) 플러스 LPS의 복강 내 공동-주사를 사용하여 발생시켰다. 마우스 신장의 생화학적 및 미소어레이 분석은 어느 하나의 제제 단독의 효과로부터 뚜렷해진 STX2 플러스 LPS 도전을 나타냈다. 이 마우스들의 혈액 및 혈청 분석은 호중구증가증, 혈소판 감소증, 적혈구 용혈, 및 증가된 혈청 크레아티닌 및 혈액 요소 질소를 나타냈다. 이에 더하여, 마우스 신장의 조직학적 분석 및 전자 현미경검사는 사구체의 피브린 침착, 적혈구 충혈, 미세혈전 형성, 및 사구체의 초미세구조 변화를 증명하였다. HUS의 이 모델은 인간 질환을 규정하는 혈소판 감소증, 용혈성 빈혈증, 및 신부전을 포함하여 에서 인간 HUS 병리의 모든 임상적 증상을 유도하는 것으로 수립되었다. (J. Immunol 187(1):172-80 (2011)).

방법:

18 내지 20 g의 체중의 C57BL/6 암컷 마우스를 챨스 리버 실험실(Charles River Laboratories)로부터 구매하여 2그룹으로 나누었다 (각 그룹에 5마리씩). 마우스의 한 그룹을 먼저 총 부피 150 μl 식염수에 희석한 재조합 항-MASP-2 항체 mAbM11 (마우스당 100 μg; 5 mg/kg 체중의 최종 농도에 상응함)로 복강 내 (i.p.) 주사에 의해 전처리하였다. 대조군 그룹에는 임의의 항체 없이 식염수를 제공하였다. 항-MASP-2 항체 mAbM11의 i.p. 주사 후 6시간 후에, 모든 마우스에게 세라티아 마르세스센스 (Serratia marcescens)의 LPS (L6136; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)의 치사량에 가까운 용량 (3 μg/동물; 150 μg/kg 체중에 상응함) 및 STX2의 4.5 ng/동물 (225 ng/kg에 상응함)의 용량 (LD50 용량의 2배)을 총 부피 150 μl로 조합하여 i.p 주사를 제공하였다. 대조군에는 식염수 주사를 사용하였다.

마우스의 생존을 투약 후 6시간마다 모니터링하였다. 마우스들을 그것들이 HUS 병리의 혼수상태에 도달하자마자 곧 도태시켰다. 36시간 후에, 모든 마우스를 도태시키고 두 개의 신장을 모두 면역조직화학 및 주사 전자 현미경검사를 위해 제거하였다. 혈액 샘플을 실험이 끝났을 때 심장 천자에 의해 취하였다. 혈청을 분리하고 처리 및 대조군 그룹 둘 다에 대해 BUN 및 혈청 크레아티닌 수준을 측정하기 위해 -80℃에서 냉동 보관하였다.

면역조직화학

각 마우스 신장의 1/3을 4% 파라포름알데하이드에 24시간 동안 고정시키고, 처리한 후, 파라핀에 삽입하였다. 3 마이크론 두께의 절편을 절단하고 H & E 스테인으로의 후속 염색을 위해 대전된 슬라이드 위에 놓았다.

전자 현미경검사

신장의 중간 절편을 대략 1 내지 2 mm³의 블록으로 절단하고, 1x PBS 중의 2.5% 글루타르알데하이드에서 4℃에서 밤새도록 고정시켰다. 그 후 고정된 조직을 레스터 대학교 전자 현미경검사 시설에 의해 처리하였다.

냉동 절편

신장의 다른 1/3을 대략 1 내지 2 mm³의 블록으로 절단하고, 액체 질소에 순간 냉동시켜서 냉동 절편 및 mRAN 분석을 위해 -80℃에서 유지하였다.

결과:

도 45는 시간 (시간)에 따른 STX/LPS-유도된 모델에서의 식염수-처리된 대조군 마우스 (n=5) 및 항-MASP-2 항체-처리된 마우스 (n=5)의 퍼센트 생존률을 그래프로 도시한다. 특히, 도 45에서 나타난 것과 같이, 대조군 마우스는 모두 42시간 내에 죽었다. 그와는 현저하게 대조적으로, 항-MASP-2 항체-처리된 마우스는 100% 실험의 전체 시간경과 내내 생존하였다. 도 45에 나타난 결과와 일관되게, 죽었거나 심각한 질환의 신호를 나타내 도태되어야 했던 미처리 마우스들은 모두 상당한 사구체 손상을 나타냈던 한편, 모든 항-MASP-2-처리된 마우스의 사구체는 정상으로 보인 것으로 관찰되었다 (데이터 미도시). 이 결과들은 항-MASP-2 항체와 같은 MASP-2 억제자가 혈전성 미세혈관증 (TMA), 예컨대 용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 HUS (aHUS), 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP)을 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체들을 치료하기 위해 사용될 수 있는 것을 증명한다.

실시예 37

이 실시예는 혈전증의 쥐 FITC-덱스트란/광 유도된 내피 세포 손상 모델에서 MASP-2 결핍 및 MASP-2 억제의 효과를 기술한다.

배경/근거: 실시예 35 및 36에서 증명된 것과 같이, MASP-2 결핍 (MASP-2 KO) 및 MASP-2 억제 (억제 MASP-2 항체의 투여를 통한)는 전형적 HUS 모델에서 마우스를 보호하는 반면, STX 및 LPS에 노출된 모든 대조군 마우스는 심각한 HUS를 발생시켰고 빈사상태가 되거나 48시간 이내에 죽었다. 예를 들어, 도 54에 도시된 것과 같이, MASP-2 억제 항체로 처리된 후 STX 및 LPS에 노출된 모든 마우스는 생존하였다 (피셔 정확도 검정 p<0.01; N=5). 그러므로, 항-MASP-2 요법은 이 HUS 모델에서 마우스를 보호한다.

다른 병인학으로 HUS, aHUS, TTP, 및 TMA의 치료를 위한 MASP-2 억제자의 유익을 추가로 증명하기 위하여 혈전성 미세혈관증 (TMA)의 플루오레세인 아이소티오시아네이트 (FITC)-덱스트란-유도된 내피 세포 손상 모델에서 MASP-2 결핍 및 MASP-2 억제의 효과를 분석하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.

방법:

생체내 현미경검사

Frommhold et al., BMC Immunology 12:56-68, 2011에 의해 기술된 것과 같이 생체내 현미경검사를 위해 마우스들을 준비하였다. 간략히 말하면, 마우스를 케타민 (125 mg/kg 체중, Ketanest, Pfitzer GmbH, Karlsruhe, Germany) 및 자일라진 (12.5 mg/kg 체중; Rompun, Bayer, Leverkusen, Germany)의 복강 내 (i.p.) 주사로 마취시키고 체온을 37℃에서 유지하기 위하여 가열 패드에 놓았다. 생체내 현미경검사를 식염수 액침 대물렌즈 (SW 40/0.75 개구수, Zeiss, Jena, Germany)를 가진 직립 현미경 (Leica, Wetzlar, Germany)에서 수행하였다. 용이한 호흡을 위해, 마우스를 PE 90 관 (Becton Dickson and Company, Sparks, MD, USA)을 사용하여 삽관하였다. 혈액 샘플추출 및 전신적인 단클론성 항체 (mAb) 투여를 위해 좌측 경동맥에 PE10 관(Becton Dickson and Company, Sparks, MD, USA)으로 캐뉼라를 삽입하였다.

고환거근 제제

생체내 현미경검사를 위한 고환거근의 수술적 제조를 Sperandio et al., Blood, 97:3812-3819, 2001에 의해 기술된 것과 같이 수행하였다. 간략히 말하면, 음낭을 열고 고환거근을 이동시켰다. 근육을 세로 절개하고 커버 글라스 위로 펼친 후, 부고환 및 고환을 제거하고 측면에 핀을 고정하여, 고환거근 미소순환계에 현미경이 완전히 접근하게 하였다. 고환거근 세정맥을 Panasonic S-VHS 리코더 상의 CCD 카메라 (CF8/1; Kappa, Gleichen, Germany)를 통해 기록하였다. 고환거근을 Frommhold et al., BMC Immunology 12:56-68, 20112011에 의해 앞서 기술된 것과 같이 열-제어하면서 (35℃ 중탄산염-완충된 식염수) 과융해하였다.

광 자극 FITC 덱스트란 손상 모델

고환거근 세정맥 및 세동맥의 내피의 제어된 광-용량-의존적 혈관 손상은 광독성 (FITC)-덱스트란 (카탈로그 번호 FD150S, Sigma Aldrich, Poole, U.K.)의 광 자극에 의해 유도되었다. 이 과정은 국소화된 혈전증을 개시한다. 광독성 시약으로서, 60 μL의 FITC-덱스트란의 10% w/v 용액을 좌측 경동맥 접근을 통해 주사하여 순환하는 혈액을 통해 10분 동안 균질하게 확산되도록 허용하였다. 잘-관류된 세정맥을 선택한 후, 재생 가능한, 제어된 방식으로 혈전증을 자극하기 위하여 낮은 세기 내지 미드레인지 세기 (800 내지 1500)의 할로겐 광을 관심의 혈관에 집중시켜서 내피 표면에 FITC-덱스트란 형광 및 가벼운 내지 적당한 광독성을 유도하였다. FITC-덱스트란의 자극을 위해 필요한 광독성 광도를 할로겐 램프 (12V, 100W, Zeiss, Oberkochen, Germany)를 사용하여 생성시켰다. 형광 색소의 광-유도된 자극으로부터 유발된 광독성은 광도의 한계값 및/또는 조명 기간을 필요로 하고 내피 표면의 직접 가열에 의해 또는 Steinbauer et al., Langenbecks Arch Surg 385:290-298, 2000에 의해 기술된 것과 같이 반응성 산소 라디칼의 생성에 의해 유발된다.

각 혈관에 적용된 광도를 저전력 측정 (Labmaster LM-2, Coherent, Auburn, USA)을 위해 파장-보정 다이오드 탐지기에 의한 조정을 위해 측정하였다. 비디오 스캔의 오프-라인 분석을 컴퓨터 지원 미소순환 분석 시스템 (CAMAS, Dr. Zeintl, Heidelberg)에 의해 수행하였고 적혈구 속도를 Zeintl et al., Int J Microcirc Clin Exp, 8(3):293-302, 2000에 의해 기술된 것과 같이 측정하였다.

혈전증의 유도 전 단클론성 항-인간 MASP-2 억제 항체 (mAbH6) 및 비히클 대조군의 적용

맹검 연구 디자인을 사용하여, 생체내 현미경검사의 거고근 모델에서 혈전증의 광독성 유도 전 16시간 전에 9-주령의 수컷 C57BL/6 WT 한배 새끼 마우스에게 재조합 단클론성 인간 MASP-2 항체 (mAbH6), MASP-2 기능적 활성 (10mg/kg 체중의 최종 농도로 제공됨)의 억제자, 또는 동일한 양의 아이소타입 대조군 항체 (MASP-2 억제 활성이 없음)를 i.p. 주사로 제공하였다. 혈전증 유도 1시간 전에, 제2 용량의 mAbH6 또는 대조군 항체를 제공하였다. MASP-2 넉아웃 (KO) 마우스를 또한 이 모델에서 평가하였다.

mAbH6 (재조합 인간 MASP-2에 대해 수립됨)은 인간 MASP-2 기능적 활성의 강력한 억제자이고, 그것의 종 특이성으로 인해 마우스 MASP-2와 교차 반응하고, 그것에 결합하여 억제하지만 친화도는 더 낮다 (데이터 미도시). 마우스 MASP-2에 대한 mAbH6의 더 낮은 친화도를 보완하기 위하여, mAbH6을 종 특이성의 변화를 극복하기 위하여, 생체내 조건하에서 쥐 MASP-2 기능적 활성의 효과적인 차단을 제공하기 위해, 마우스 MASP-2에 대해 더 적은 친화도를 극복하기 위하여, 고농도 (10mg/kg 체중)로 제공하였다.

이 맹검 연구에서, 전체적으로 폐색하기 위하여 테스트된 각각의 개별적인 세정맥에 대해 필요한 시간 (선택 기준은 비슷한 직경 및 혈류 속도에 의한 것임)을 기록하였다.

미세혈관 폐색을 가진 마우스의 백분율, 개시 시간, 및 폐색까지의 시간을 60-분 관찰 기간에 걸쳐 생체내 현미경검사 비디오 기록을 사용하여 평가하였다.

결과:

도 46은, 손상 유도 후 시간의 함수로서, FITC/덱스트란의 주입 전 16시간 및 1시간 전에 투약된 아이소타입 대조군 또는 인간 MASP-2 항체 mAbH6 (10mg/kg)로의 처리 후에 FITC/덱스트란 UV 모델에서 미세혈관 폐색을 가진 마우스의 백분율을 그래프로 도시한다. 도 46에서 나타난 것과 같이, 아이소타입 대조군 항체를 받은 야생형 마우스의 85%가 30분 또는 그 미만의 시간 내에 폐색하였고, 반면 인간 MASP-2 항체 (mAbH6)로 사전-처리된 야생형 마우스의 단지 19%만이 동일한 시간 내에 폐색되었으며, 폐색까지의 시간은 인간 MASP-2 항체-처리된 그룹에서 궁극적으로 폐색되었던 마우스에서 지연되었다. 추가로 MASP-2 mAbH6 처리된 마우스 중 3마리가 모두 60-분 관찰 기간 내에 폐색하지 않았다 (즉, 혈전성 폐색으로부터 보호되었다)는 것이 주지된다.

도 47은 인간 MASP-2 항체 (mAbH6) 및 아이소타입 대조군 항체로 처리된 마우스에 대해 폐색 시간을 분으로 그래프로 도시한다. 데이터를 평균값 (수평 막대) 및 표준 오류 막대 (수직 막대)를 포함한 산란-돗트로서 기록한다. 이 도면은 폐색이 관찰 가능한 마우스에서의 폐색 시간을 나타낸다. 그러므로, 60분 관찰 기간 중에 폐색하지 않았던 3마리의 MASP-2 항체-처리된 마우스는 이 분석에 포함시키지 않았다 (폐색되지 않은 대조군 처리된 마우스는 없었다). 분석에 사용한 통계학적 테스트는 비쌍형성 t 테스트였고; 이때 기호 "*"는 p=0.0129를 가리킨다. 도 47에서 나타난 것과 같이, 폐색된 4마리의 MASP-2 항체 (mAbH6)-처리된 마우스에서, MASP-2 항체로의 치료는 아이소타입 대조군 항체로 처리된 마우스와 비교하여 저 광도 (800 내지 1500)를 사용한 혈전증의 FITC-덱스트란/광-유도된 내피 세포 손상 모델에서 정맥의 폐색 시간을 상당히 증가시켰다. 아이소타입 대조군의 전체 폐색 시간의 평균은 19.75분이었던 한편, MASP-2 항체 처리된 그룹에 대한 전체 폐색 시간의 평균은 32.5분이었다.

도 48은 저 광도 (800 내지 1500)를 사용한 혈전증의 FITC-덱스트란/광-유도된 내피 세포 손상 모델에서 혈전증의 유도 전 16시간 전에 10mg/kg으로 i.p. 투여된 후, 1시간 전에 다시 i.v. 투여된 야생형 마우스, MASP-2 KO 마우스, 및 인간 MASP-2 항체 (mAbH6)로 사전-처리된 야생형 마우스에 대해 폐색까지의 시간을 분으로 그래프로 도시한다. 폐색된 동물만을 도 48에 포함시켰다; 아이소타입 대조군 항체를 받은 야생형 마우스에 대해 n=2; MASP-2 KO에 대해 n=2; 및 인간 MASP-2 항체 (mAbH6)를 받은 야생형 마우스에 대해 n=4. 도 48에 나타난 것과 같이, MASP-2 결핍 및 MASP-2 억제 (10mg/kg으로 mAbH6)는 저 광도 (800 내지 1500)를 사용한 혈전증의 FITC-덱스트란/광-유도된 내피 세포 손상 모델에서 정맥 폐색 시간을 증가시켰다.

결론:

이 실시예의 결과는 추가로, TMA의 마우스 모델에서, 렉틴 경로를 차단하는 MASP-2 억제제 (예를 들어, MASP-2 기능을 차단하는 항체)는 다발성 미세혈관성 장애의 특징인 미세혈관 응고 및 혈전증을 억제하는 것을 증명한다. 그러므로, MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체의 투여는 HUS, aHUS, TTP, 또는 다른 미세혈관성 장애를 앓고 있는 환자에서 효과적인 요법일 것이고, 미세혈관 응고 및 혈전증으로부터 보호할 것으로 예상된다.

실시예 38

이 실시예는 인간 MASP-2 억제 항체 (mAbH6)가 혈소판-풍부 인간 혈장에서 혈소판 기능에 영향을 미치지 않는 것을 증명하는 연구를 기술한다.

배경/근거: 실시예 37에서 기술된 것과 같이, 인간 MASP-2 억제 항체 (mAbH6)로의 MASP-2 억제는 혈전증의 FITC-덱스트란/광-유도된 내피 세포 손상 모델에서 정맥 폐색 시간을 증가시킨 것으로 증명되었다. MASP-2 억제 항체 (mAbH6)가 혈소판 기능에 영향을 미치는지를 측정하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.

방법: 인간 mAbH6 MASP-2 항체의 효과를 다음과 같이 혈소판의 ADP-유도된 응집에 대해 테스트하였다. 40 μL 용액 중의 1 μg/ml 또는 0.1 μg/ml의 농도의 인간 MASP-2 mAbH6을 360 μL의 새롭게 제조한 혈소판-풍부 인간 혈장에 첨가하였다. 아이소타입 대조군 항체를 네거티브 대조군으로서 사용하였다. 항체를 혈장에 첨가한 후, 혈소판 활성화를 2 μM의 최종 농도로 ADP를 첨가함으로써 유도하였다. 용액을 1 mL의 큐벳에서 작은 자석으로 휘저음으로써 검정을 시작하였다. 혈소판 응집을 2-채널 크로노-로그 (Chrono-log) 혈소판 응집측정기 모델 700 전혈/광학 발광-응집측정기에서 측정하였다.

결과:

용액의 퍼센트 응집을 5분의 시간에 걸쳐 측정하였다. 그 결과를 하기 표 13에 나타낸다.

표 13: 5분의 시간에 걸친 혈소판 응집.

상기 표 13에서 나타난 것과 같이, 대조군 항체 또는 MASP-2 mAbH6 항체로 처리된 ADP-유도된 혈소판의 응집 사이에서 유의미한 차이는 관찰되지 않았다. 이 결과는 인간 MASP-2 항체 (mAbH6)가 혈소판 기능에 영향을 미치지 않는 것을 증명한다. 그러므로, 실시예 37에서 기술된 결과는 인간 MASP-2 억제 항체 (mAbH6)로의 MASP-2 억제가 혈전증의 FITC-덱스트란/광-유도된 내피 세포 손상 모델에서 정맥 폐색 시간을 증가시켰고, 혈소판 기능에 대한 mAbH6의 효과로 인한 것이 아니었음을 증명한다. 그러므로, MASP-2 억제는 직접적으로 혈소판 기능에 영향을 주지 않으면서 혈전증을 예방하여, 기존의 항-혈전제와는 구별되는 치료 메커니즘을 나타낸다.

실시예 39

이 실시예는 TMA의 쥐 모델에서 혈전 형성 및 혈관 폐색에 미치는 MASP-2 억제제의 효과를 기술한다.

배경/근거: 렉틴 경로는 내피 세포 스트레스 또는 손상 환경에서 보체 시스템을 활성화하는 데 우세한 역할을 한다. 이런 활성화는 대체 경로에 의해 신속하게 증폭되는데, 그것은 aHUS를 나타내는 많은 환자에서 조절장애를 보인다. 그러므로 MASP-2 및 렉틴 경로의 활성화를 예방하는 것은 막 공격 복합체의 형성, 혈소판 활성화, 및 백혈구 충원을 유도하는 효소 반응의 순서를 정지시킬 것으로 예상된다. 이 효과는 조직 손상을 제한한다.

이에 더하여, MASP-2는 인자 Xa-유사 활성을 가지며 프로트롬빈을 절단하여 트롬빈을 형성한다. 이런 응고 시스템의 MASP-2-구동된 활성화는 지혈을 불균형하게 할 수 있고 TMA의 병리를 초래할 수 있다. 그러므로, 보체 및 응고 시스템의 활성화를 차단하는 MASP-2 억제자, 예컨대 MASP-2 억제 항체를 사용하는 MASP-2의 억제는 aHUS 및 다른 TMA-관련 상태의 결과를 개선할 것으로 예상된다.

실시예 37에서 기술된 것과 같이, 인간 MASP-2 억제 항체 (mAbH6)로의 MASP-2 억제는 혈전증의 FITC-덱스트란/광-유도된 내피 세포 손상 모델에서 정맥 폐색 시간을 증가시켰다. TMA의 이 모델에서, 마우스를 FITC- 덱스트란의 IV 주사, 이어서 마우스 고환거근의 미세혈관계에서 FITC-덱스트란의 국소화된 광-활성화에 의해 감작시켰다 (Thorlacius H et al., Eur J Clin. Invest 30(9):804-10, 2000; Agero et al., Toxicon 50(5):698-706, 2007).

MASP-2 억제 항체 (mAbH6)가 TMA의 쥐 모델에서 혈전 형성 및 혈관 폐색에 대해 용량-반응 효과를 나타내는지를 측정하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.

방법: C57 Bl/6 마우스의 고환거근의 미세혈관계에서 플루오레세인 아이소티오시아네이트-표지된 덱스트란 (FITC-덱스트란)의 광-활성화에 의해 국소화된 혈전증을 유도하고 생체내 현미경검사를 사용하여 실시예 37에서 기술된 방법을 사용하되 다음의 변형을 하여 혈전 형성 및 혈관 폐색의 개시를 측정하였다. mAbH6 (2mg/kg, 10 mg/kg 또는 20 mg/kg) 또는 아이소타입 대조군 항체 (20 mg/kg)를 투약한 마우스의 그룹들에 TMA 유도 1시간 전에 정맥 내 (iv) 주사에 의해 투여하였다. 혈전 형성의 개시 시간 및 완전한 혈관 폐색까지의 시간을 기록하였다. 30 내지 60분에 걸친 생체내 현미경검사 영상의 비디오 재생 분석을 사용하여 혈관 크기, 혈류 속도, 광도, 혈소판 접착과 동등한 것으로서 혈전 형성의 개시율, 혈전 형성의 개시까지의 시간, 총 혈관 폐색률 및 총 혈관 폐색까지의 시간을 평가하였다. 통계학적 분석을 SigmaPlot v12.0을 사용하여 수행하였다.

결과:

혈전 형성의 개시

도 49는 증가하는 용량의 인간 MASP-2 억제 항체 (2 mg/kg, 10mg/kg 또는 20 mg/kg의 mAbH6) 또는 아이소타입 대조군 항체로 처리된 마우스에서 FITC-덱스트란 유도된 혈전성 미세혈관증에서 시간의 함수로서의 혈전을 가진 마우스의 백분율을 보여주는 카플란-마이어 플롯이다. 도 49에서 나타난 것과 같이, 혈전 형성의 개시는 대조군-처리된 마우스에 비해 용량-의존적 방식으로 mAbH6-처리된 마우스에서 지연되었다.

도 50은 mAbH6 용량의 함수로서 혈전 형성의 개시까지의 중간 시간 (분)을 그래프로 도시한다 (대조군과 비교하여 *p<0.01). 도 50에서 나타난 것과 같이, 혈전 형성이 개시되기까지의 중간 시간은 증가하는 용량의 mAbH6과 함께 대조군 그룹의 6.8분으로부터 20 mg/kg mAbH6 처리된 그룹에서 17.7분으로 증가하였다 (p<0.01). 기저의 실험 데이터 및 통계학적 분석을 표 14 및 15에 제시한다.

비디오촬영 기록의 평가를 기반으로 기록된 개별적인 마우스에서 혈전 형성이 개시되기까지의 시간을 하기 표 14에서 상세하게 기술한다.

표 14: 광 염료-유도된 손상 후 혈전 형성의 개시 시간

* 혈관은 표시된 관찰 기간 동안 개시를 나타내지 않았다대조군과 mAbH6 처리된 동물 사이의 폐색의 개시까지의 시간을 비교하는 통계학적 분석을 하기 표 15에 나타낸다.

개시까지의 시간: FITC Dex 용량 반응 연구로부터의 데이터

통계학	대조군	mAbH6 (2 mg/kg)	mAbH6 (10 mg/kg)	mAbH6 (20 mg/kg)
사건 수/동물 수 (%)	11/11(100%)	6/6 (100%)	9/9 (100%)	8/10 (80.0%)
중간 시간 (분) (95% CI)	6.8(2.4, 8.5)	10.4 (5.9, 12.8)	11.7 (2.5, 15.8)	17.7 (10.0, 22.7)
윌콕슨 p-값*		0.2364	0.1963	0.0016
사건=관찰된 개시까지의 시간 중간 (분) 및 그것의 95% CI는 카플란-마이어 산정을 기반으로 하였다 NE=산정할 수 없음 *p-값은 Dunnett-Hsu 다중 비교에 의해 조정하였다

미세혈관 폐색 도 51은 증가하는 용량의 인간 MASP-2 억제 항체 (2 mg/kg, 10mg/kg 또는 20mg/kg의 mAbH6) 또는 아이소타입 대조군 항체로 처리된 마우스에서 FITC-덱스트란 유도된 혈전성 미세혈관증에서 시간의 함수로서의 미세혈관 폐색을 가진 마우스의 백분율을 보여주는 카플란-마이어 플롯이다. 도 51에서 나타난 것과 같이, 완전한 미세혈관 폐색은 대조군 마우스에 비교하여 mAbH6 처리된 그룹에서 지연되었다.

도 52는 mAbH6 용량의 함수로서의 미세혈관 폐색까지의 중간 시간을 그래프로 도시한다 (대조군과 비교하여 *p<0.05). 도 52에서 나타난 것과 같이, 완전한 미세혈관 폐색까지의 중간 시간은 대조군 그룹에서 23.3분으로부터 2mg/kg의 mAbH6으로 처리된 그룹에서 38.6분으로 증가하였다 (p<0.05). 10 mg/kg 또는 20 mg/kg 용량의 mAbH6는 2mg/kg의 mAbH6으로 처리된 그룹과 유사하게 수행되었다 (완전한 미세혈관 폐색에 대한 중간 시간은 각각 40.3 및 38분이었다). 기저 실험 데이터 및 통계학적 분석을 표 16 및 17에 제공한다.

비디오촬영 기록의 일차 평가를 기반으로 기록된 개별적인 마우스에서 완전한 혈관 폐색까지의 시간을 하기 표 16에서 상세하게 기술한다.

광 염료-유도된 손상 후 완전한 폐색까지의 시간

대조군 치료		mAbH6 치료
폐색까지의 시간 (분)	대조군	2 mg/kg	10 mg/kg	20 mg/kg
	37.50	42.3	30.92	38.00
	29.07	21.91	17.53	28.00
	27.12	24.4	51.38	40.58
	19.38	31.38	36.88	33.00
	19.55	61.17*	26.83	39.10
	18.00	61.55*	40.28	32.03
	16.50		55.83	38.53
	23.33		71.93*	21.75*
	14.83		98.22*	32.25*
	30*			33.17*
	61.8*

*혈관은 표시된 관찰 기간 중에 완전히 폐색되지 않았다. 대조군과 mAbH6 처리된 동물 사이의 완전한 폐색까지의 시간을 비교하는 통계학적 분석은 하기 표 17에 나타낸다.

완전한 미세혈관 폐색까지의 시간: FITC Dex 용량 반응 연구로부터의 데이터

통계학	대조군	mAbH6 (2 mg/kg)	mAbH6 (10 mg/kg)	mAbH6 (20 mg/kg)
사건 수/동물 수 (%)	9/11(81.8%)	4/6 (66.7%)	7/9 (77.8%)	7/10 (70.0%)
중간 시간 (분) (95% CI)	23.3(16.5, 37.5)	36.8 (21.9, NE)	40.3 (17.5, NE)	38.0 (28.0, 40.6)
윌콕슨 p-값*		0.0456	0.0285	0.0260
사건=관찰된 폐색까지의 시간 중간 (분) 및 그것의 95% CI는 카플란-마이어 산정을 기반으로 하였다 NE=산정할 수 없음 *p-값은 Dunnett-Hsu 다중 비교에 의해 조정하였다

요약표 18에서 요약한 것과 같이, 혈전 형성의 개시는 대조군-처리된 마우스에 비교하여 용량-의존적 방식으로 mAbH6 처리된 마우스에서 지연되었다 (개시까지의 중간 시간 10.4분 에서 17.7분 대비 6.8분). 완전한 폐색까지의 중간 시간은 대조군-처리된 그룹에 비하여 모든 mAbH6-처리된 그룹에서 상당히 지연되었다 (표 18).

혈전 형성 및 완전한 폐색의 개시까지의 중간 시간

	대조군	mAbH6 (2 mg/kg)	mAbH6 (10 mg/kg)	mAbH6 (20 mg/kg)
혈전 형성까지의 중간# 시간 (분)	6.8	10.4	11.7	17.7*
완전한 미세혈관 폐색까지의 중간# 시간 (분)	23.3	36.8*	40.3*	38.0*

#중간 값은 대조군에 비교하여 카플란-마이어 산정 *p<0.05를 기준으로 한다 (다중 비교를 위해 Dunnett-Hsu에 의해 조정된 윌콕슨)이 결과들은 MASP-2에 결합하고 보체 시스템의 렉틴 경로를 차단하는 인간 단클론성 항체인 mAbH6이 TMA의 실험 마우스 모델에서 용량-의존적 방식으로 미세혈관 혈전증을 감소시킨 것을 증명한다. 그러므로, MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체의 투여가 HUS, aHUS, TTP, 또는 다른 미세혈관성 장애, 예컨대 치명적 항인지질 증후군 (CAPS)을 포함하여 다른 TMA, 전신성 디고스 병, 및 암, 암 화학요법 및 이식에 부차적인 TMA들을 앓고 있는 환자에서 효과적인 요법일 것이고 미세혈관 응고 및 혈전증으로부터 보호를 제공할 것으로 예상된다.

실시예 40

이 실시예는 파지 디스플레이를 사용하여, MASP-2에 결합하고 렉틴-매개 보체 활성화를 억제하는 한편 면역 체계의 고전적 (C1q-의존적) 경로 및 대체 경로 성분들은 온전하게 남기는 완전한 인간 scFv 항체의 확인을 기술한다.

개요:

완전한 인간, 고-친화도 MASP-2 항체를 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인하였다. 항체의 가변 경쇄 및 중쇄 단편을 scFv 포맷 및 전장 IgG 포맷 둘 다로 분리하였다. 인간 MASP-2 항체는 렉틴 경로-매개 대체 보체 경로 활성화와 관련된 세포 손상을 억제하는 한편 면역 체계의 고전적 (C1q-의존적) 경로 성분을 온전하게 남기는 데 유용하다. 일부 구체예에서, 대상체 MASP-2 억제 항체는 다음의 특징을 가진다: (a) 인간 MASP-2에 대한 고친화도 (예를 들어, 10 nM 이하의 K_D), 및 (b) 30 nM 이하의 IC₅₀으로 90% 인간 혈청에서 MASP-2-의존적 보체 활성을 억제한다.

방법:

전장 촉매 비활성 MASP-2의 발현 :

선도 서열 (서열 번호:5)을 가진 인간 MASP-2 폴리펩타이드를 암호화하는 인간 MASP-2 (서열 번호:4)의 전장 cDNA 서열을 CMV 인핸서/프로모터 영역의 제어하에 진핵세포 발현을 유도하는 포유류 발현 벡터 pCI-Neo (Promega)에 하위클로닝하였다 (Kaufman R.J. et al., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)에 기술됨).

촉매 비활성 인간 MASP-2A 단백질을 생성하기 위하여, 부위-특이적 돌연변이 유발을 본원에 참조로 포함된 US2007/0172483에 기술된 대로 수행하였다. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동 후에 정제하고 밴드 제제 및 단일 아데노신 오버랩을 표준 테일링 과정을 사용하여 생성하였다. 그런 다음 아데노신-테일 MASP-2A를 pGEM-T 용이 벡터에 클로닝하고 대장균에 형질전환하였다. 인간 MASP-2A를 추가로 포유류 발현 벡터 pED 또는 pCI-Neo 중 하나에 하위클로닝하였다.

상기 기술된 MASP-2A 발현 구성물을 DXB1 세포에 표준 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 과정을 사용하여 트랜스펙션하였다 (Maniatis et al., 1989). 제제가 다른 혈청 단백질로 오염되지 않았음을 보장하기 위해 MASP-2A를 무혈청 배지에서 제조하였다. 배지를 2일마다 융합성 세포로부터 수득하였다 (총 4회). 재조합 MASP-2A의 수준은 평균 대략 1.5 mg/배양 배지 리터였다. MASP-2A (상기 기술된 Ser-Ala 돌연변이)를 MBP-A-아가로스 컬럼에서의 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

패닝/scFv 전환 및 필터 스크리닝에 의해 확인된 ScFv 후보 클론들에 대한 MASP-2A ELISA

인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열의 파지 디스플레이 라이브러리에 대해 인간 MASP-2 단백질에 대해 고친화도 scFv 항체를 확인하기 위해 항원 패닝과 이어서 자동 항체 스크리닝 및 선택을 수행하였다. HIS-태그된 또는 비오틴-태그된 MASP-2A에 대한 scFv 파지 라이브러리의 패닝을 3 라운드로 수행하였다. 제3 라운드의 패닝을 먼저 MBL로 용출한 후 TEA (알칼리성)로 용출하였다. 표적 MASP-2A에 대해 scFv 단편을 나타내는 파지의 특이적 풍부함을 모니터링하기 위하여, 고정된 MASP-2A에 대한 다클론성 파지 ELISA를 수행하였다. 패닝 라운드 3으로부터의 scFv 유전자를 pHOG 발현 벡터에 클로닝하고 소규모 필터 스크리닝으로 작동시켜서 MASP-2A에 대한 특이적 클론들을 찾았다.

제3 라운드의 패닝으로부터의 scFv 단편을 암호화하는 플라스미드를 함유하는 박테리아 콜로니들을 뽑아서, 나이트로셀룰로스 막 위에 그리딩하고 비-유도 배지에서 밤새도록 성장시켜서 마스터 플레이트를 생성하였다. 제3 패닝 라운드로부터 총 18,000개의 콜로니를 뽑아서 분석하고, 그 중 절반을 경쟁 용출하고 나머지 절반을 TEA 용출하였다. MASP-2A에 대한 scFv 파지플라스미드 복합체 라이브러리의 패닝과 이어서 scFv 전환 및 필터 스크리닝으로 137개의 포지티브 클론을 얻었다. 108/137 클론이 MASP-2 결합에 대한 ELISA 검정에서 포지티브였고 (데이터 미도시), 그 중 45개의 클론을 추가로 정상 인간 혈청에서 MASP-2 활성을 차단하는 능력에 대해 분석하였다.

렉틴 경로 C3 컨버타제의 형성의 억제를 측정하기 위한 검정

렉틴 경로 C3 컨버타제 형성의 억제를 측정하는 기능적 검정을 사용하여 MASP-2 scFv 후보 클론들의 "차단 활성"을 평가하였다. MASP-2 세린 프로테아제 활성은 렉틴 경로 C3 컨버타제를 포함하는 2개의 단백질 성분 (C4b, C2a)을 생성하기 위해 필요하다. 그러므로, MASP-2 기능적 활성을 억제하는 MASP-2 scFv (즉, 차단 MASP-2 scFv)는 렉틴 경로 C3 컨버타제의 데노보 형성을 억제할 것이다. C3은 그것의 구조의 일부로서 흔치 않은 고도로 반응성인 티오에스터 기를 함유한다. 이 검정에서 C3 컨버타제 의한 C3의 분열시에, C3b 상의 티오에스터 기는 플라스틱 웰의 바닥에 고정된 마크로분자 상의 하이드록실 또는 아미노 기와, 에스터 또는 아미드 결합을 통해 공유 결합을 형성함으로써, ELISA 검정에서 C3b의 검출을 용이하게 한다.

효모 만난은 렉틴 경로의 공지된 활성화 인자이다. C3 컨버타제의 형성을 측정하기 위한 다음의 방법에서, 만난으로 코팅된 플라스틱 웰을 렉틴 경로를 활성화시키기 위하여 희석된 인간 혈청과 인큐베이션하였다. 그런 다음 웰을 세척하고 표준 ELISA 방법을 사용하여 웰 상에 고정된 C3b에 대해 검정하였다. 이 검정에서 생성된 C3b의 양은 렉틴 경로 C3 컨버타제의 데노보 형성을 직접 반영한다. 선택된 농도에서 선택한 MASP-2 scFv 클론들은 C3 컨버타제 형성 및 결과적인 C3b 생성을 억제하는 능력에 대해 이 검정에서 테스트하였다.

방법:

상기 기술된 것과 같이 확인된 45개의 후보 클론을 발현시키고, 정제하고 동일한 스톡 농도로 희석하고, 그것을 다시 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 함유 GVB 버퍼 (4.0 mM 바비탈, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl₂, 2.0 mM CaCl₂, 0.1% 젤라틴, pH 7.4)에 희석하여 모든 클론이 동일한 양의 버퍼를 가지도록 확인하였다. scFv 클론들을 각각 2 μg/mL의 농도에서 삼중으로 테스트하였다. 포지티브 대조군은 OMS100 Fab₂였고 0.4 μg/mL에서 테스트하였다. C3c 형성을 scFv/IgG 클론의 존재 및 부재하에 모니터링하엿다.

만난을 50mM 탄산염 버퍼 (15mM Na₂CO₃ + 35mM NaHCO₃ + 1.5 mM NaN₃), pH 9.5로 20 μg/mL (1 μg/웰)의 농도로 희석하고 ELISA 플레이트를 밤새도록 4℃에서 코팅하였다. 다음날, 만난-코팅된 플레이트를 200 μl의 PBS로 3회 세척하였다. 그런 다음 100 μl의 1% HSA 차단 용액을 웰에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 200 μl의 PBS로 3회 세척하고, 샘플을 첨가할 때까지 200 μl의 PBS와 함께 얼음에서 보관하였다.

정상 인간 혈청을 CaMgGVB 버퍼로 0.5%로 희석하고, scFv 클론 또는 OMS100 Fab2 포지티브 대조군을 0.01 μg/mL; 1 μg/mL (OMS100 단독 대조군) 및 10 μg/mL에서 이 버퍼에 삼중으로 첨가하고, 45분 동안 얼음에서 사전인큐베이션한 후 차단된 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 반응을 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션함으로써 시작하였고 플레이트를 얼음조로 이동함으로써 중단시켰다. C3b 침착을 토끼 α-마우스 C3c 항체와 이어서 염소 α-토끼 HRP로 검출하였다. 네거티브 대조군은 항체가 없는 버퍼였고 (항체 없음 = 최대 C3b 침착), 포지티브 대조군은 EDTA가 첨가된 버퍼였다 (C3b 침착 없음). 동일한 검정을 수행하되 웰을 만난이 없게 하여 바탕값을 측정하였다. 만난이 없는 플레이트에 대한 바탕값 신호를 만난-함유 웰의 신호로부터 뺐다. 컷오프 기준을 무관한 scFv 클론 (VZV) 및 버퍼 단독의 활성의 절반으로 설정하였다.

결과: 컷오프 기준을 기준으로, 총 13개의 클론이 MASP-2의 활성을 차단하는 것으로 나타났다. > 50% 경로 억제를 생성하는 모두 13개의 클론을 선택하고 서열을 분석하여 10개의 독특한 클론을 얻었다. 모두 10개의 클론이 동일한 경쇄 하위 분류, 엡실론3을 갖지만, 상이한 3개의 중쇄 하위 분류: VH2, VH3 및 VH6을 가지는 것으로 나타났다. 기능적 검정에서, 10개의 후보 scFv 클론 중 5개가 0.5% 인간 혈청을 사용하여 25 nM 표적 기준보다 적은 IC₅₀ nM 값을 제공하였다.

개선된 효능을 가지는 항체를 확인하기 위하여, 상기와 같이 확인된 3개의 모 scFv 클론에 대해 경쇄 셔플링을 수행하였다. 이 과정은 6개의 건강한 공여체로부터 유래된 나이브, 인간 람다 경쇄 (VL)의 라이브러리와 쌍을 이룬 모 클론의 각각의 VH로 구성되는 조합 라이브러리의 생성을 포함하였다. 이 라이브러리를 그런 다음 개선된 결합 친화도 및/또는 기능성을 가지는 scFv 클론에 대해 스크리닝하였다.

선두 딸 클론 및 그것들의 각각의 모 클론 (모두 scFv 포맷임)의 IC₅₀ (nM)으로의 기능적 효능의 비교

scFv 클론	1% 인간 혈청 C3 검정 (IC ₅₀ nM)	90% 인간 혈청 C3 검정 (IC ₅₀ nM)	90% 인간 혈청 C4 검정 (IC ₅₀ nM)
17D20mc	38	nd	nd
17D20m_d3521N11	26	>1000	140
17N16mc	68	nd	nd
17N16m_d17N9	48	15	230

하기에 상기 표 19에서 나타낸 모 클론 및 딸 클론에 대한 중쇄 가변 영역 (VH) 서열이 제공된다. Kabat CDR들 (31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-107 (H3))은 진하게 표시되고; Chothia CDR들 (26-32 (H1), 52-56 (H2) 및 95-101 (H3))은 밑줄로 표시된다. 17D20_35VH-21N11VL 중쇄 가변 영역 (VH) (서열 번호:67, 서열 번호:66에 의해 암호화됨)

QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLS RG KMGVSWIRQPPGKALEWLA HIFSS DEKSYRTSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTAT YYCARIR RGGIDYWGQGTLVTVSS

d17N9 중쇄 가변 영역 (VH) (서열 번호:68)

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS ST SAAWNWIRQSPSRGLEWLG RTYYR SKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDT AVYYCAR DPFGVPFDIWGQGTMVTVSS

하기에 모 클론 및 딸 클론에 대한 경쇄 가변 영역 (VL) 서열이 제공된다.

Kabat CDR들 (24-34 (L1); 50-56 (L2); 및 89-97 (L3)은 진하게 표시되고; Chothia CDR들 (24-34 (L1); 50-56 (L2) 및 89-97 (L3)은 밑줄로 표시된다. 이 영역들은 Kabat 또는 Chothia 시스템에 의해 넘버링되든 동일하다.

17D20m_d3521N11 경쇄 가변 영역 (VL) (서열 번호:70, 서열 번호:69에 의해 암호화됨)

QPVLTQPPSLSVSPGQTASITCS GEKLGDKYAYW YQQKPGQSPVLVMYQ DKQRPSG IPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQ AWDSSTAVF GGGTKLTVL

17N16m_d17N9 경쇄 가변 영역 (VL) (서열 번호:71)

SYELIQPPSVSVAPGQTATITCA GDNLGKKRVHW YQQRPGQAPVLVIYD DSDRPSG IPDRFSASNSGNTATLTITRGEAGDEADYYCQ VWDIATDHV VFGGGTKLTVLAAAGSEQKLISE

고친화도로 인간 MASP-2에 결합하는 것으로 증명되었고 기능적 보체 활성을 차단하는 능력을 가지는 MASP-2 항체 OMS100 및 MoAb_d3521N11VL (서열 번호:67에서 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에서 제시된 경쇄 가변 영역을 포함함, 또한 "OMS646" 및 "mAbH6"으로도 언급됨)을 돗트 블롯 분석에 의해 에피토프 결합에 관련하여 분석하였다. 그 결과는 OMS646 및 OMS100 항체가 MASP-2에 대해 고도로 특이적이며 MASP-1/3에 결합하지 않는 것을 보여준다. 항체는 MASP-2의 CCP1 도메인을 함유하지 않은 MAp19 또는 MASP-2 단편에 결합되지 않아서, 결합 부위가 CCP1을 포함한다는 결론을 유도하였다.

The MASP-2 항체 OMS646은 에 재조합 MASP-2 (Kd 60-250pM)에 C1s, C1r 또는 MASP-1과 비교할 때 >5000배 선택성으로 왕성하게 결합하는 것으로 측정되었다 (하기 표 20 참조).

고체상 ELISA 연구에 의해 평가되는 OMS646 MASP-2 항체-MASP-2 상호작용의 친화도 및 특이성

항원	K_D (pM)
MASP-1	>500,000
MASP-2	62±23*
MASP-3	>500,000
정제된 인간 C1r	>500,000
정제된 인간 C1s	~500,000

*평균±SD; n=12OMS646은 말단 보체 성분의 렉틴-의존적 활성화를 특이적으로 차단한다

방법:

막 공격 복합체 (MAC) 침착에 대한 OMS646의 효과를 렉틴 경로, 고전적 경로 및 대체 경로에 대한 경로-특이적 조건들을 사용하여 분석하였다. 이 목적을 위해, Wieslab Comp300 보체 스크리닝 키트 (Wieslab, Lund, Sweden)를 제조자의 설명을 따라 사용하였다.

결과:

도 53A는 렉틴 경로-특이적 검정 조건하에서 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시에 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시한다. 도 53B는 고전적 경로-특이적 검정 조건하에서 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시에 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시한다. 도 53C는 대체 경로-특이적 검정 조건하에서 항-MASP-2 항체 (OMS646)의 존재 또는 부재시에 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시한다.

도 53A에서 나타난 것과 같이, OMS646은 대략 1 nM의 IC₅₀ 값으로 MAC 침착의 를 차단한다. 하지만, OMS646은 고전적 경로-매개 활성화 (도 53B)로부터 또는 대체 경로-매개 활성화 (도 53C)로부터 생성된 MAC 침착에는 아무런 효과를 나타내지 않았다.

마우스에의 정맥 내 (IV) 또는 피하 (SC) 투여 후의 OMS646의 약동학 및 약역학

OMS646의 약동학 및 약역학을 마우스에서 28일 단일 용량 PK/PD 연구로 평가하였다. 연구는 피하로 (SC) 투여된 5mg/kg 및 15mg/kg의 OMS646의 용량 수준, 뿐만 아니라 정맥 내로 (IV) 투여된 5mg/kg OMS646의 용량 수준을 테스트하였다.

OMS646의 PK 프로파일과 관련하여, 도 54는 OMS646 농도 (평균 n=3마리 동물/그룹)를 표시된 용량에서 OMS646의 투여 후 시간의 함수로서 그래프로 도시한다. 도 54에서 나타난 것과 같이, 5mg/kg SC에서, OMS646은 투약 후 대략 1 내지 2일 후에 5 내지 6 ug/mL의 최대 혈장 농도에 도달하였다. 5 mg/kg SC에서 OMS646의 생체이용률은 대략 60%였다. 추가로 도 54에서 나타난 것과 같이, 15 mg/kg SC에서, OMS646은 투약 후 대략 1 내지 2일 후에 10 내지 12 ug/mL의 최대 혈장 농도에 도달하였다. 모든 그룹에 대해, OMS646은 대략 8 내지 10일의 말단 반감기로 전신 순환계로부터 서서히 제거되었다. OMS646의 프로파일은 마우스에서 인간 항체에 대해 전형적이다.

OMS646의 활성은 도 55A 및 55B에 그래프로 도시된다. 도 55A 및 55B는 5mg/kg IV (도 55A) 및 5mg/kg SC (도 55B) 그룹에서 각 마우스에 대한 PD 반응 (전신적 렉틴 경로 활성의 강하)을 보여준다. 파선은 검정의 베이스라인을 나타낸다 (최대 억제; 검정 전 과잉 OMS646으로 시험관 내 스파이크된 나이브 마우스 혈청). 도 55A에서 나타난 것과 같이, 5mg/kg의 OMS646의 IV 투여 후에, 전신적 렉틴 경로 활성은 즉시 검출할 수 없는 수준으로 떨어졌고, 렉틴 경로 활성은 28일 관찰 기간에 걸쳐 단지 중간 정도의 회복을 나타냈다. 도 55B에서 나타난 것과 같이, 5mg/kg의 OMS646 SC로 투약된 마우스에서, 렉틴 경로 활성의 시간-의존적 억제가 관찰되었다. 렉틴 경로 활성은 약물 투여 24시간 이내에 거의 검출할 수 없는 수준으로 떨어졌고 적어도 7일 동안 저수준으로 유지되었다. 렉틴 경로 활성은 시간에 따라 점차로 증가하였지만, 28일 관찰 기간 내에 용량-전 수준으로 반전되지는 않았다. 15mg/kg SC의 투여 후 관찰된 렉틴 경로 활성 대비 시간 프로파일은 5 mg/kg SC 용량 (데이터 미도시)과 유사하였고, 그것은 PD 종점의 포화를 나타낸다. 데이터는 추가로 IV 또는 SC로 투여된 5mg/kg의 OMS646의 주마다의 투여가 마우스에서 전신적 렉틴 경로 활성의 연속적인 억제를 이루기에 충분한 것을 나타냈다.

실시예 41

이 실시예는 MASP-2 억제 항체 (OMS646)가 질환의 급성기 및 관해기 중에 얻어진 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS) 환자로부터의 혈청에 대한 노출 후에 활성화된 인간 미세혈관 내피 세포 (HMEC-1)의 표면에서 aHUS 혈청-유도된 보체 C5b-9 침착을 억제하는 것을 증명한다.

배경/근거: MASP-2에 특이적으로 결합하여 렉틴 경로 활성화를 억제하는 MASP-2 항체인 OMS646의 존재 또는 부재시에 (1) 질환의 급성기 중에 및 (2) 관해기 중에 얻어진 aHUS 환자 혈청에 대한 노출 후에 활성화된 HMEC-1 세포의 표면에서 aHUS 혈청-유도된 보체 C5b-9 침착을 분석하기 위하여 다음의 연구를 수행하였다.

방법: HUS/TTP의 국제 등록소에 포함되어 있고 Mario Negri Institute의 이식 및 희귀병의 면역학 및 유전학 실험실에 의해 유전형 분류가 되어 있는 환자들 중에서 질환의 급성기 중이거나 관해기 둘 다에서 연구된, 4명의 aHUS 환자들을 이 연구를 위해 선택하였다. 한 명의 aHUS 환자는 이형접합성 p.R1210C 보체 인자 H (CFH) 돌연변이를 가졌고 한 명은 항-CFH 자가항체를 가진 한편, 다른 두 명의 aHUS 환자들에서는 CFH에 대한 돌연변이나 항체를 발견하지 못하였다.

표 21 및 22는 급성기 중이거나 관해가 있을 때 측정된 임상적 및 생화학적 데이터와 함께 이 연구에서 분석된 4명의 aHUS 환자에게서 보체 유전자 돌연변이 및 항-CFH 자가항체에 대한 스크리닝의 결과를 요약한 것이다.

이 연구에서 4명의 aHUS 환자들의 임상적 파라미터

사례 번호	돌연변이 또는 항-CFH Ab	질환 단계	혈소판 (150-400*10³/μl)	LDH (266-500 IU/l)	헤모글로빈 (14-18g/dl)	s-크레아티닌 (0.55-1.25mg/dl)
#1	돌연변이 없음, 항-CFH Ab 없음	급성	31,000	1396	12.9	2.37
#1	돌연변이 없음, 항-CFH Ab 없음	관해	267,000	n.a.	11.5	3.76
#2	CFH-R1210C	급성	46,000	1962	7	5.7
#2	CFH-R1210C	관해	268,000	440	13.4	7.24
#3	항-CFH Ab	급성	40,000	3362	9.5	1.77
#3	항-CFH Ab	관해	271,000	338	8.8	0.84
#4	돌연변이 없음, 항-CFH Ab 없음	급성	83,000	1219	7.8	6.8
#4	돌연변이 없음, 항-CFH Ab 없음	관해	222,000	495	12.2	13

주: n.a. = 이용할 수 없음

이 연구에서 4명의 aHUS 환자들의 보체 파라미터

사례 번호	항-CFH Ab의 돌연변이	질환 단계	혈청 C3 (83-180 mg/dl)	혈장 SC5b-9 (127-400 ng/ml)
#1	돌연변이 없음, 항-CFH Ab 없음	급성	51	69
#1	돌연변이 없음, 항-CFH Ab 없음	관해	n.a.	117
#2	CFH-R1210C	급성	79	421
#2	CFH-R1210C	관해	119	233
#3	항-CFH Ab	급성	58	653
#3	항-CFH Ab	관해	149	591
#4	돌연변이 없음, 항-CFH Ab 없음	급성	108	n.a.
#4	돌연변이 없음, 항-CFH Ab 없음	관해	n.a.	n.a.

실험 방법: 피부 기원의 인간 미세혈관 내피 세포주 (HMEC-1)로부터의 세포들을 유리 슬라이드 위에 플레이팅하고 융합성이 되었을 때 사용하였다. 융합성 HMEC-1 세포를 10 μM의 ADP (아데노신 다이포스페이트)로 10분 동안 활성화시킨 후 4시간 동안 질환의 급성기 중에 수집된 상기 표 23 및 24에 기술된 4명의 aHUS 환자들로부터의, 또는 관해시의 동일 aHUS 환자들로부터의, 또는 4명의 건강한 대조군 대상체로부터의 혈청들과 함께 인큐베이션하였다. 혈청을 보체 억제의 포지티브 대조표준으로서, 상기 실시예 40에서 기술된 것과 같이 생성된 MASP-2 억제 항체, OMS646 (100 μg/mL)의 존재 또는 부재하에, 또는 가용성 보체 수용체 1 (sCR1) (150 μg/mL)의 존재하에 테스트 배지 (0.5% BSA가 첨가된 HBSS)로 1:2로 희석하였다. 인큐베이션 단계가 끝날 때 HMEC-1 세포를 토끼 항-인간 보체 C5b-9으로, 이어서 FITC-컨쥬게이션된 이차 항체로 처리하였다. 각 실험에서, 한 명의 건강한 대조군으로부터의 혈청을 aHUS 환자 혈청 (급성기 및 관해)과 나란히 테스트하였다. 내피 세포 표면 상에 형광 염색의 축적을 위해 공초점 반전 레이저 현미경을 사용하였다. 샘플당 15개의 필드를 얻었고, 형광 염색이 차지한 면적을 소프트웨어 이미지 J의 빌트-인 특이적 기능을 사용하여 자동 엣지 검출에 의해 평가하였고 분석된 필드당 픽셀²으로서 표시하였다. 필드들은 최저 및 최고값이 계산으로부터 배제되었음을 보여준다. 통계학적 분석 (다중 비교를 위해 일원성 ANOVA와 이어서 Tukey 테스트)을 위해 각각의 환자 및 대조군에 대한 각 실험조건에서 고려된 13 필드의 픽셀²의 결과를 사용하였다.결과:

4명의 aHUS 환자들로부터의 혈청을 사용한 보체 침착 분석의 결과를 하기 표 23A에 요약하고, 4명의 건강한 대상체로부터의 혈청을 사용한 결과를 하기 표 23B에 요약한다.

표 23A 및 23B에 대해: 데이터는 평균 ± SE이다. °P<0.001 대비 대조표준; *P<0.001, **P<0.01 대비 미처리된 aHUS 급성기; §P<0.001, §§P<0.01, §§§P<0.05 대비 미처리된 aHUS 관해기.도 56은 ADP-활성화된 HMEC-1 세포상에서 aHUS 혈청-유도된 C5b-9 침착에 대한 MASP-2 항체 (OMS646) 및 sCR1의 억제 효과를 그래프로 도시한다. 도 56에서, 데이터는 평균 ± SE이다. °P<0.001 대비 대조표준; *P<0.001, **P<0.01 대비 미처리된 aHUS 급성기; ^P<0.0001 대비 aHUS 급성기 + sCR1; §P<0.0001 대비 미처리된 aHUS 관해기 및 #P<0.0001 대비 aHUS 관해기 + sCR1.

표 23A, 23B 및 도 56에서 나타난 것과 같이, aHUS 환자로부터의 혈청 (급성기에서 또는 관해기에서 수집됨)에 4시간 동안 정적 조건에서 노출된 ADP-자극된 HMEC-1 세포들은 공초점 현미경검사에 의해 검출되는 바 세포 표면상에 C5b-9의 강렬한 침착을 나타냈다. C5b-9가 차지한 면적을 측정함으로써, aHUS 혈청이 급성기에서 또는 관해 중에 수집된 것과 무관하게, 건강한 대조군 대상체로부터의 혈청에 노출된 세포들 상에서보다 aHUS 환자들로부터의 혈청에 노출된 세포상에서 상당히 더 많은 양의 C5b-9 침착을 관찰하였다. 혈청-유도된 내피 C5b-9 침착의 차이는 급성기와 관해 사이에 관찰되지 않았다.

추가로 표 23A, 23B 및 도 56에서 나타난 것과 같이, aHUS 혈청 (급성기 중에 또는 관해 중에 환자로부터 얻어진)에 MASP-2 항체 OMS646의 첨가는 미처리된 aHUS 혈청에 비교하여 내피 세포 표면 상에서 C5b-9 침착의 상당한 감소를 유도하였다. 하지만, C5b-9 침착에 미치는 OMS646의 억제 효과는 보체 팬-억제자 sCR1에 의해 나타난 효과보다는 덜 뚜렷하였다. 실제로, OMS646 대비 sCR1의 존재하에 aHUS 혈청-유도된 C5b-9 침착 간에 통계학적으로 유의미한 차이가 관찰되었다 (도 56 및 표 23A 및 23B).

4명의 aHUS 환자의 평균으로서 계산할 때, 보체 억제자의 존재하에 관찰된 C5b-9 침착의 감소의 백분율 (동일 환자로부터의 미처리 혈청에 의해 유도된 C5b- 침착을 100%로 하여 비교함)은 다음과 같았다:

급성기:

sCR1 (150 μg/ml): C5b-9 침착의 91% 감소

OMS646 (100 μg/ml): C5b-9 침착의 40% 감소

관해기:

sCR1 (150 μg/ml): C5b-9 침착의 91% 감소

OMS646 (100 μg/ml): C5b-9 침착의 54% 감소

결론: 이 실시예에서 기술된 결과들은 보체의 렉틴 경로가 활성화된 미세혈관 내피 세포들에 의해 자극되고 이 자극은 aHUS의 특징인 과장된 보체 활성화 반응에 대한 중요한 동인인 것을 증명한다. 또한 렉틴 경로의 이런 자극 및 결과적으로 발생한 과장된 보체 활성화 반응은 aHUS의 급성기 및 임상적 관해기 중에 모두 발생하는 것이 증명된다. 더욱이, 이런 발견은 aHUS와 관련된 임의의 특정 보체 결함에 한정되는 것으로 보이지 않는다. 이 실시예에서 추가로 증명되는 것과 같이, OMS646과 같은 MASP-2 억제 항체를 사용한 렉틴 경로의 선택적 억제는 다양한 병인을 가지는 aHUS 환자들에서 보체 침착을 감소시킨다.

실시예 42

이 실시예는 MASP-2 억제 항체 (OMS646)가 aHUS의 (1) 급성기 및 (2) 관해기 중에 얻어진 aHUS 환자 혈청에 대한 노출 후에 활성화된 인간 미세혈관 내피 세포 (HMEC-1)의 표면에서 aHUS 혈청-유도된 혈소판 응집과 혈전 형성을 억제하는 것을 증명한다.

방법:

환자: aHUS를 가진 3명의 환자 (실시예 41에서 표 21, 22, 23A 및 23B에 기술된 환자 #1, #2 및 #4) (한 명의 환자는 이형접합성 p.R1210C CFH 돌연변이를 가진 한편, 다른 2명의 환자에서는 돌연변이나 항-CFH 항체가 발견되지 않았음)를 질환의 급성기 중에 및 관해기에서 둘 다 연구하였다. 환자들은 HUS/TTP의 국제 등록소에 포함되어 있고 Mario Negri Institute의 이식 및 희귀병의 면역학 및 유전학 실험실에 의해 유전형 분류가 되어 있는 환자들 중에서 이 연구를 위해 선택하였다. 5명의 건강한 대상체를 또한 관류 실험을 위한 혈액 공여체로서 선택하였다.

방법: 융합성 HMEC-1 세포를 10 μM의 ADP로 10분 동안 활성화시킨 후 3시간 동안 질환의 급성기 중에 수집된 3명의 aHUS 환자들 (실시예 41에서 기술된 환자 #1, 2 및 4)로부터의 혈청 또는 관해기의 동일한 환자들로부터의 혈청, 또는 건강한 대상체로부터의 대조군 혈청들과 함께 인큐베이션하였다. 혈청을 보체 억제의 포지티브 대조군으로서, 실시예 40에서 기술된 것과 같이 생성된 MASP-2 억제 항체, OMS646 (100 μg/mL)의 존재 또는 부재하에 테스트 배지 (0.5% BSA가 첨가된 HBSS)로; 또는 sCR1 (150 μg/mL)로 1:2로 희석하였다. 환자 #1 및 #2에 대해, 추가적인 웰을 100 μg/mL의 무관한 아이소타입 대조군 항체를 함유하고 있는 테스트 배지로 또는 20 μg/mL의 OMS646으로 1:2로 희석된 (후자의 경우, 사례 #1은 관해기에서만 테스트하였고, 사례 #2는 급성기 동안과 관해기에서 둘 다 테스트함) 혈청과 함께 인큐베이션하였다.

인큐베이션 단계가 끝날 때, HMEC-1 세포를 건강한 대상체 (혈소판을 표지하는 형광 염료 메파크린을 함유하고 있음)로부터 얻어진 헤파린 처리된 전혈 (10 UI/mL)이 채워진 흐름 챔버에서 미세순환계에서 부딪히는 전단 응력 (60 dynes/cm², 3분)으로 관류시켰다. 3회의 관류 후에, 내피-세포 단층을 아세톤에 고정시켰다. 내피 세포 표면 상의 혈소판 혈전 샘플당 15개의 영상을 공초점 반전 레이저 현미경에 의해 얻었고, 혈전이 차지한 면적을 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. 최저 및 최고값을 보이는 필드들을 계산으로부터 배제하였다.

통계학적 분석 (다중 비교를 위해 일원성 ANOVA에 이어서 Tukey 테스트)을 위해, 각각의 환자 및 대조군에 대한 각 실험조건에서 고려된 13 필드의 픽셀²의 결과를 사용하였다.

결과:

3명의 aHUS 환자들로부터의 혈청을 사용한 혈전 형성 실험의 결과를 하기 표 24A에 요약하고, 5명의 건강한 대상체로부터의 혈청을 사용한 결과를 하기 표 24B에 요약한다.

표 24A 및 24B에 대하여: 데이터는 평균 ± SE이다. °P<0.001 대비 대조표준; *P<0.001, ***P<0.05 대비 미처리된 aHUS 급성기; §P<0.001, §§§P<0.05 대비 미처리된 aHUS 관해기.도 57은 ADP-활성화된 HMEC-1 세포상에서 aHUS 혈청-유도된 혈전 형성에 대한 MASP-2 항체 (OMS646) 및 sCR1의 효과를 그래프로 도시한다. 도 57에서, 데이터는 평균 ± SE이다. °P<0.0001, °°P<0.01 대 대조표준; *P<0.0001, **P<0.01 대 미처리된 aHUS 급성기; §P<0.0001 대 미처리된 aHUS 관해기.

표 24A 및 도 56에서 나타난 것과 같이, 급성기 중에 또는 관해기에서 수집된 aHUS 혈청으로 처리된 HMEC-1 세포 상에서, 건강한 대조군 대상체로부터의 혈청에 노출된 세포들에 비교하여, 혈전이 차지한 면적은 현저하게 증가되었다 (표 24B 및 도 57). 도 57 및 표 24A에서 나타난 것과 같이, OMS646 (100 μg/ml 및 20 μg/ml 둘 다에서)은 급성기 중에 취한 aHUS 혈청에 사전 노출된 세포 상에서 혈전 형성의 부분적인 억제를 나타냈다. 항-혈전형성 효과는 OMS646의 두 가지 상이한 용량 간에 비슷하였고, sCR1의 효과와는 상이하였다 (도 57 및 표 24A). 무관한 아이소타입 대조군 항체의 첨가는 aHUS-혈청-유도된 혈전 형성에 억제 효과를 나타내지 못했다.

추가로 도 57 및 표 24A에서 나타난 것과 같이, 관해기 동안에 수집된 aHUS 혈청에 미치는 OMS646의 억제 효과는 훨씬 더 분명하였다. 실제로, 100 μg/ml 및 20 μg/ml의 두 가지 용량에서 관해기에 수집된 aHUS 환자 혈청에 대한 OMS646의 첨가는, sCR1의 첨가로 관찰된 것과 유사한, 혈전 형성의 거의 완전한 억제를 초래하였다. 무관한 아이소타입 대조군 항체는 유의미한 억제 효과를 나타내지 않았다.

3명의 aHUS 환자의 평균으로서 계산할 때, 보체 억제자들을 사용하여 기록된, 혈전 침착이 차지한 HMEC-1 표면의 감소의 백분율 (동일 환자로부터의 미처리 혈청에 의해 유도된 혈전 면적을 100%로 하여 비교함)은 다음과 같았다:

급성기:

sCR1 (150 μg/ml): 60% 감소

OMS646 (100 μg/ml): 57% 감소

OMS646 (20 μg/ml): 45% 감소

관해기:

sCR1 (150 μg/ml): 85% 감소

OMS646 (100 μg/ml): 79% 감소

OMS646 (20 μg/ml): 89% 감소

결과의 논의:

이 실시예의 결과들은 MASP-2 억제 항체, 예컨대 OMS646 (실시예 40에서 기술한 것과 같이 제조됨)이 HMEC-1 세포 상에서 aHUS 혈청-유도된 혈전 형성에 강력한 억제 효과를 나타낸다는 것을 증명한다. 놀랍게도, 혈전 형성에 미치는 OMS646의 억제 효과는 HMEC-1 상에 유도된 C5b-9 침착에 미치는 효과 (실시예 41에서 기술됨)보다 컸다. 또한 놀라운 것은 관해시에 수집된 aHUS 환자 혈청에의 100 μg/ml 및 20 μg/ml의 용량 둘 다에서의 OMS646의 첨가가 혈전 형성의 거의 완전한 억제를 초래하였다는 것이다. 다른 놀라운 발견은 급성기 및 관해기 둘 다에서 OMS646이 보체 시스템의 광범위하고 거의 완전한 억제자인 포지티브 대조군 sCR1과 같이 효과적이었다는 관찰이다 (Weisman H. et al., Science 249:146-151, 1990; Lazar H. et al., Circulation 100:1438-1442, 1999).

건강한 대상체로부터의 대조군 혈청은 또한 HMEC-1 세포상에서 보통의 혈전 형성을 유도하였음이 주지된다. 본 발명자들은 OMS646 또는 sCR1 중 어느 하나를 사용하여 대조군 혈청 유도된 혈전 형성에 대해 일관된 억제 효과를 관찰하지는 못하였다. 어떠한 특정 이론에 구속되는 것을 바라지는 않지만, 대조군-유도된 혈전은 대조군 혈청과 함께 인큐베이션된 HMEC-1에 대해 관찰된 매우 낮은 C5b-9 침착에 의해 지지되는 바 (실시예 41 참조), 보체에 의존하지 않는 것으로 여겨진다.

결론:

결론적으로, MASP-2 억제 항체, 예컨대 OMS646의 관찰된 항-혈전성 효과는 이 실험 시스템에서 관찰된 C5b-9 침착에 대한 OMS646의 억제 효과를 기반으로 예상할 수 있었던 것 (실시예 41에서 기술되고 도 56에 도시됨)보다 실질적으로 더 큰 것으로 나타난다. 예를 들어, Gastoldi 등에 의해 "C5a/C5aR 상호작용은 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)에서 내피 세포 상의 보체 활성화 및 혈전증을 매개한다"는 제목으로 기술된 것과 같이 (Gastoldi et al., Immunobiology 217:1129-1222 Abstract 48 (2012)), C5b-9 침착을 억제하는 C5 항체의 첨가가 HMEC-1 상에서의 혈전 형성을 비슷한 정도로 (60% 감소) 억제한 (60% 감소) 것으로 측정되었다. 그에 반해, MASP-2 억제 항체 (100 μg/mL에서의 OMS646)는 (급성기 = 40% 감소; 관해기 = 54% 감소)의 평균 값으로 C5b-9 침착을 억제하였고; 실질적으로 더 높은 퍼센트 (급성기 = 57% 감소; 관해기 = 79% 감소)로 혈전 형성을 억제하였다. 비교하면, OMS646은 포지티브 대조군 보체 억제자 (150 μg/mL에서의 sCR1, C5b-9 침착의 급성기 억제 = 91% 감소; 관해기 = 91% 감소)보다 낮은 백분율에서 보체 침착을 억제하였지만 혈전 형성을 억제하는 데 있어서는 sCR1 포지티브 대조군과 동등하게 효과적이었다 (150 μg/mL에서의 sCR1, 급성기 = 60% 감소; 관해기 = 85% 감소). 이 결과들은 MASP-2 억제 항체 (예를 들어, OMS646)가 놀랍게도 급성기 및 관해기 둘 다에서 aHUS 대상체로부터 얻어진 혈청에서 혈전 형성을 억제하는 데 효과적인 것을 증명한다.

상기 언급된 바에 따르면, 한 구체예에서는, 본 발명은 혈전성 미세혈관증 (TMA)을 를 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에서 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공하며, 그 방법은 대상체에게 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제 항체의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, TMA는 용혈성 요독성 증후군 (HUS), 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP) 및 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, TMA는 aHUS이다. 한 구체예에서, 조성물은 질환의 급성기에 aHUS 환자에게 투여된다. 한 구체예에서, 조성물은 관해기 (즉 급성기 aHUS의 에피소드로부터 회복된 또는 부분적으로 회복된 대상에서, 예를 들어 증가된 혈소판 수 및/또는 감소된 혈청 LDH 농도에 의해 증거되는 그런 관해, 예를 들면 Loirat C et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 6:60, 2011 (본원에 참조로 포함됨)에 기술됨) 동안에 aHUS 환자에게 투여된다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 aHUS (급성 또는 관해기)와 같은 TMA를 앓고 있는 대상체의 혈청에서 혈전 형성을, 미처리 혈청과 비교하여, 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 최대 99% 만큼 억제한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 aHUS를 앓고 있는 대상체의 혈청에서 혈전 형성을, 혈청에서의 C5b-9 침착에 대한 억제 효과보다, 적어도 20 퍼센트 이상 (예컨대, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%)으로 억제한다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 관해기의 aHUS 환자로부터의 혈청에서 혈전 형성을, 미처리 혈청과 비교하여, 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 최대 99% 만큼 억제한다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 관해기의 aHUS 환자의 혈청에서 혈전 형성을, 혈청에서의 C5b-9 침착에 대한 억제 효과보다 적어도 20 퍼센트 이상 (예컨대, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%)의 수준으로 억제한다.

한 구체예에서, 본 발명은 TMA를 앓고 있는 대상체에서 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공하며, 그 방법은 (I) (a) i) 서열 번호:67의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) 서열 번호:67의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) 서열 번호:67의 95-102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 b) i) 서열 번호:70의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) 서열 번호:70의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) 서열 번호:70의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) 서열 번호:67에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:67에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:70에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 경쇄 가변 영역을 포함하는 이것의 변종을 포함하는, MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

한 구체예에서, TMA는 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS) (급성 또는 관해기 중 하나), HUS 및 TTP로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 대상체는 aHUS의 급성기에 있다. 한 구체예에서, 대상체는 aHUS의 관해기에 있다.

일부 구체예에서, 방법은 서열 번호:67에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 서열 번호:70에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구체예에서, 방법은 서열 번호:67에서 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에서 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 참조 항체 OMS646에 의해 인식되는 인간 MASP-2 상의 에피토프의 적어도 일부를 특이적으로 인식하는 MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 결합 구성원들 간의 경쟁은 시험관 내에서, 예를 들어 ELISA를 사용하여 및/또는 특이적 리포터 분자를 다른 미태그 결합 구성원(들)의 존재하에 검출될 수 있는 한 결합 구성원에 태그로 붙임으로써 동일한 에피토프 또는 중복하는 에피토프에 결합하는 특이적 결합 구성원들의 확인을 가능하게 함으로써 쉽게 분석할 수 있다. 그러므로, 현재, 인간 MASP-2에의 결합에 대해 참조 항체 OMS646과 경쟁하는, 인간 항체 항원-결합 부위를 포함하는 특이적인 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이 제공된다.

실시예 43

이 실시예는 인간 MASP-2 억제 항체 (OMS646)가 피부 기원의 일차 인간 미세혈관 내피 세포 (MVEC)에서 아폽토시스의 TMA 환자 혈장-매개 유도를 억제할 수 있는 것을 증명한다.

배경/근거:

TMA의 병리학은 다양한 인자들에 의해 유도된 내피 세포 손상과 이어지는 혈소판 플러그 및/또는 피브린 혈전에 의한 소혈관들 (예컨대 작은 세동맥 및 모세혈관)의 폐색을 포함하는 것으로 알려져 있다 (Hirt-Minkowsk P. et al., Nephron Clin Pract 114:c219-c235, 2010; Goldberg R.J. et al., Am J Kidney Dis 56(6):1168-1174, 2010). MVEC는 시험관 내에서 TMA-관련 장애를 가진 환자들로부터의 혈장에 노출된 때 아폽토시스를 진행하는 것으로 알려져 있다 (Stefanescu et al., Blood Vol 112 (2):340-349, 2008; Mitra D. et al., Blood 89:1224-1234, 1997 참조). TMA와 관련된 아폽토시스성 손상은 그런 환자들의 조직 생검 (피부, 뼈, 골수, 비장, 신장, 회장)으로부터 얻어진 MVEC에서 증명되었다. 또한 MVEC에 대한 아폽토시스성 손상은 MVEC에서 막-결합된 보체 조절 단백질의 수준을 감소시키는 것으로 알려져 왔다 (예를 들어, Mold & Morris, Immunology 102:359-364, 2001; Christmas et al., Immunology 119:522, 2006 참조).

말단 보체 성분들을 포함하는 포지티브 피드백 루프는 비정형 용혈성-요독성 증후군 (ahUS)을 포함하는 TMA, 및 치명적 항인지질 증후군 (CAPS)과 관련된 TMA, 디고스 병, 및 암, 암 화학요법, 자가면역 및 이식에 부차적인 TMA의 병리학에 포함되는 것으로 여겨지고, 이들 상태의 각각은 mAb 에쿨리쥬맙을 사용한 항-C5 요법에 대한 반응인 것으로 알려져 있거나 생각된다 (Chapin J. et al., Brit. J. Hematol 157:772-774, 2012; Tsai et al., Br J Haematol 162(4):558-559, 2013); Magro C. M. et al., Journal of Rare Diseases 8:185, 2013).

다음의 실험을 aHUS, ADAMTS13 결핍-관련 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP), CAPS 및 전신성 디고스 병, 뿐만 아니라 암, 이식, 자가면역 질환 및 화학요법에 이차적인 TMA를 앓고 있는 환자들로부터 얻어진 혈장 샘플 중의 일차 인간 피부 MVEC에서 아폽토시스의 TMA 환자 혈장-매개 유도를 차단하는 인간 MASP-2 억제 항체 (OMS646)의 능력을 분석하기 위해 수행하였다.

방법:

문헌에 기술되어 있는 것과 같이, 피부 기원의 일차 인간 MVEC에서 아폽토시스의 TMA 환자 혈장-매개 유도를 차단하는 인간 MASP-2 억제 항체 (OMS646)의 효능을 분석하기 위해 시험관 내 검정을 수행하였다 (Stefanescu R. et al., Blood Vol 112 (2):340-349, 2008, 본원에 참조로 포함됨). 이 검정에서 사용한 혈장 샘플을 건강한 대조군 대상체 코호트으로부터 및 급성기 또는 회복기 혈전성 미세혈관증을 가지는 개체로부터 얻었다. TMA 환자들에서 미세혈관증의 존재는 말초혈 스미어 상에서 분열적혈구를 검출함으로써 평가하였다. 이에 더하여, TTP를 Stefanescu R. et al., Blood Vol 112 (2):340-349, 2008에서 기술한 대로 진단하였다.

내피 세포 (EC) 배양

Stefanescu 등에서 기술된 것과 같이, 피부 기원의 일차 인간 MVEC를 ScienCell Research Labs (San Diego, CA)로부터 구매하였다. MVEC는 CD34를 5 및 6회 계대를 통해 발현하였다 (Blood 89:1224-1234, 1997). MVEC를 내피 세포 성장 보충물, 페니실린, 스트렙토마이신 및 15% 태아 소 혈청을 함유하고 있는 ECM1001 배지 (ScienCell Research Labs)에서 물 중의 0.1% 젤라틴으로 코팅된 폴리스티렌 플라스크에서 유지하였다. 모든 MVEC를 2 내지 6의 계대에서 사용하였다. 하위배양은 0.25% 트립신-EDTA에 대한 5 내지 10분 노출을 포함하였다.

아폽토시스 검정

TTP/HUS 혈장-유도된 아폽토시스에 민감한 것으로 알려져 있는 피부 기원의 대표적인 일차 인간 MVEC를 포스페이트 완충된 식염수 (PBS)로 세척하고 물 중의 0.1% 젤라틴으로 코팅된 12-웰 플레이트의 챔버에 0.15x10⁶ 생존 세포/mL로 플레이팅하였다. 플레이팅된 MVEC 세포를 완전한 배지에서 24시간 동안 굶긴 후 다양한 농도 (2% 내지 20% v/v)의 TMA 환자 혈장 샘플 또는 건강한 공여체 혈장에 18시간 동안 MASP-2 mAb OMS646 (150 μg/mL)의 존재 또는 부재하에 노출시킨 다음 세포를 트립신처리에 의해 수득하였다. 각각의 TMA 환자 샘플을 이중으로 분석하였다. 혈장-매개 아폽토시스의 정도를 프로피듐 요오다이드 (PI) 염색을 사용하여 평가하였고, >5 x10³ 세포를 세포 형광그래프로 분석하고 AO 피크를 컴퓨터 소프트웨어 (MCycle Av, Phoenix Flow Systems, San Diego, CA)에 의해 규정하였다. 세포 용해물로부터의 세포질 히스톤-관련 DNA 단편들의 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)-기반 정량을 또한 제조자 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)의 지시대로 수행하였다.

결과:

MASP-2 mAb (OMS646)의 존재하에 TMA 환자 혈장-유도된 MVEC 아폽토시스 검정의 결과를 아래의 표 25에 나타낸다.

MASP-2 mAb (OMS646)의 존재하에 피부 기원의 일차 인간 MVEC 상에서 테스트된 TMA 환자 혈장

대상체 #	연령/성별	임상적 진단 (TMA) 및 다른 조건	MASP-2 ng/ml	Cre/LDH를 기반으로 한 진단	C5a	sC5-b9	ADAMS 활성	ADAMS 활성을 기반으로 한 진단	OMS646으로의 보호
#2	41/f	TTP	174	TTP	34.42	772	30%	aHUS	응답
#3	52/f	TTP	150	TTP	48.32	1399	70%	aHUS	비-응답
#4	20/m	TTP	224	TTP	36.9	1187	<10%	TTP	응답
#10	60/f	TTP	175.4	TTP	49.5	4406	64%	aHUS	비-응답
#11	59/f	TTP	144.9	TTP	40.3	1352	<10%	TTP	비-응답
#13	49/f	HUS, 암, TTP	142.8	TTP	48.6	3843	86%	aHUS	비-응답
#42	27/m	TTP	341.5	TTP	100.0	5332	<5%	TTP	비-응답
#46	25/f	TTP, 디고스,SLE	225.11	TTP	53.9	3426	ND	ND	응답
#48	53/f	TTP, SLE, 신염 s/p 신장 이식	788.5	aHUS	31.2	1066	66%	aHUS	응답
#49	64/f	TTP, APLAs, CVA	494.5		35.4	2100	ND	ND	응답
#51	25/f	aHUS, APLAs	313.1	TTP	26.8	1595	23%	aHUS	응답
#52	56/f	aHUS,SLE	333.1	TTP	18.9	1103	97%	aHUS	비-응답
#53	56/f	aHUS 관해	189.9	관해 TTP	28.69	344	74%	aHUS	비-응답

표 25에서 사용된 약어: 치명적 항인지질 증후군 (CAPS)과 관련된 "APLAs" = 항인지질 항체."SLE" = 전신성 홍반성 루푸스

"CVA" = 뇌혈관 발작 (뇌졸중)

Stefanescu R. et al., Blood Vol 112 (2):340-349, 2008에 보고된 결과와 일관되게, 유의미한 아폽토시스가 MASP-2 항체의 부재시에 13개의 TMA 환자 혈장 샘플의 존재하에 피부 기원의 일차 MVEC에 대해 관찰되었다. 건강한 인간 대상체로부터의 대조군 혈장 샘플을 나란히 작동시켰고 MVEC에서 아폽토시스를 유도하지 않았다 (데이터 미도시). 표 25에서 알 수 있는 것과 같이, MASP-2 억제 mAb (OMS646)는 테스트한 13개의 환자 혈장 샘플 중 6개에서 (46%) 일차 MVEC에서 아폽토시스의 TMA 환자 혈장-매개 유도를 억제하였다 (표 25에서 "응답"). 특히, MASP-2 억제 mAb (OMS646)는 aHUS, TTP, 디고스 병, SLE, 이식 및 APLA (CAPS)를 앓고 있는 환자들로부터 얻어진 혈장에서 아폽토시스를 억제하였다. MASP-2 mAb가 아폽토시스를 차단하지 못한, 이 검정으로 테스트된 7개의 환자 샘플 (표 25에서 "무응답")에 관해서는, 아폽토시스가 여러 경로에 의해 유도될 수 있었지만, 그것들은 모두 보체 의존성이 아니었음이 주지된다. 예를 들어, Stefanescu R. 등이 주지한 것과 같이 (Stefanescu R. et al., Blood Vol 112 (2):340-349, 2008), EC 검정에서 아폽토시스는 아폽토시스를 유도하기 위해 필요한 손상의 수준을 측정하는 데 역할을 할 수 있는 혈장 인자들에 의해 영향을 받는 기준 EC 활성화 상태에 의존성이다. 추가로 Stefanescu R. 등에서 주지된 것과 같이, 아폽토시스를 조절할 수 있는 추가적인 인자들, 예컨대 사이토킨 및 보체 시스템의 다양한 성분들은 TMA 환자 혈장에 존재할 수 있다. 그러므로, 이들 복합적인 인자들로 인하여, MASP-2 항체가 TMA-혈장 유도된 아폽토시스를 억제한 모든 혈장 샘플에서 차단 효과를 나타내지 못했다는 것은 놀라운 일이 아니다.

나아가 이런 관점에서, 항-C5 항체 에쿨리쥬맙을 사용한 TMA-혈장 유도된 아폽토시스 검정을 사용하여 유사한 분석을 수행하였고 매우 유사한 결과를 관찰하였음이 주지된다 (Chapin et al., Blood (ASH Annual Meeting Abstracts): Abstract #3342, 120: 2012 참조). 매우 성공적인 상업적 제품인 에쿨리쥬맙의 임상적 효능은 이 모델에서 증명된 효능보다 더 크게 나타나고, 그것은 이 시험관 내 모델이 보체 억제 약물의 임상적 가능성을 과소평가했을 것임을 시사한다.

이 결과들은 OMS646과 같은 MASP-2 억제 항체가 aHUS, TTP, 디고스 병, SLE, 이식 및 APLA (CAPS)와 같은 TMA에 걸린 환자들로부터 얻어진 혈장에서 TMA-혈장-유도된 아폽토시스를 억제하는 데 효과적임을 증명한다. 내피 손상 및 아폽토시스는 특발성 TTP 및 산발성 HUS와 같은 TMA의 병리학에서 핵심 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Kim et al., Microvascular Research vol 62(2):83-93, 2001). Dang 등에 의해 기술된 것과 같이, 아폽토시스는 건강한 대조군 대상체에서가 아니라 TTP 환자들의 비장 적색 비수에서 증명되었다 (Dang et al., Blood 93(4):1264-1270, 1999). 아폽토시스의 증거는 또한 HUS 환자의 MVEC 기원의 신장 사구체 세포에서도 관찰되었다 (Arends M. J. et al., Hum Pathol 20:89, 1989). 그러므로, MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체 (예컨대 OMS646)의 투여는 aHUS, TTP 또는 다른 미세혈관병성 장애, 예컨대 CAPS, 전신성 디고스 병 및 암에 이차적인 TMA; 화학요법에 이차적인 TMA 또는 이식에 이차적인 TMA를 포함하는 다른 TMA를 앓고 있는 환자들에서 효과적인 요법이 될 것이라고 예상된다.

상기 언급된 바에 따르면, 한 구체예에서는, 본 발명은 혈전성 미세혈관증 (TMA)을 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에서 내피 세포 손상 및/또는 내피 세포 아폽토시스, 및/또는 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공하며, 그 방법은 대상체에게 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제 항체의 양을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, TMA는 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP) 및 용혈성 요독성 증후군 (HUS)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, TMA는 aHUS이다. 한 구체예에서, 조성물은 질환의 급성기 중의 aHUS 환자에게 투여된다. 한 구체예에서, 조성물은 관해기 (즉, 급성기 aHUS의 에피소드로부터 회복된 또는 부분적으로 회복된 대상체에서, 예를 들면 증가된 혈소판 수 및/또는 감소된 혈청 LDH 농도에 의해 증거되는 그런 관해, 예를 들어 Loirat C et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 6:60, 2011 (본원에 참조로 포함됨)에 기술됨) 중에 aHUS 환자에게 투여된다.

한 구체예에서, 대상체는 (i) 암에 부차적인 TMA; (ii) 화학요법에 부차적인 TMA; 또는 (iii) 이식에 부차적인 TMA (예를 들어, 장기 이식, 예컨대 신장 이식 또는 동종 이계 조혈모세포 이식)인 TMA를 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있다. 한 구체예에서, 대상체는 업쇼-슐만 증후군 (USS)을 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있다. 한 구체예에서, 대상체는 디고스 병을 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있다. 한 구체예에서, 대상체는 치명적 항인지질 증후군 (CAPS)을 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있다.

본원에 개시된 구체예들 중 임의의 구체예에 따르면, MASP-2 억제 항체는 다음 특징 중 적어도 하나 이상을 나타낸다: 상기 항체는 10 nM 이하의 K_D로 인간 MASP-2에 결합하고, 상기 항체는 MASP-2의 CCP1 도메인에서 에피토프에 결합하며, 상기 항체는 1% 인간 혈청에서의 시험관 내 검정에서 10 nM 이하의 IC₅₀으로 C3b 침착을 억제하고, 상기 항체는 90% 인간 혈청에서 30 nM 이하의 IC₅₀으로 C3b 침착을 억제하며, 항체는 Fv, Fab, Fab', F(ab)₂ 및 F(ab')₂로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단편이고, 항체는 단일 사슬 분자이며, 상기 항체는 IgG2 분자이고, 상기 항체는 IgG1 분자이며, 상기 항체는 IgG4 분자이고, IgG4 분자는 S228P 돌연변이를 포함하며, 및/또는 항체는 실질적으로는 고전적 경로를 억제하지 않는다. 한 구체예에서, 항체는 MASP-2에 결합하고 렉틴 경로를 선택적으로 억제하며 실질적으로 대체 경로를 억제하지는 않는다. 한 구체예에서, 항체는 MASP-2에 결합하고 렉틴 경로를 선택적으로 억제하며 실질적으로 고전적 경로를 억제하지는 않는다 (즉, 렉틴 경로를 억제하는 한편 고전적 보체 경로를 온전하게 남겨둔다).

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 aHUS (급성 또는 관해기), 용혈성 요독성 증후군 (HUS), 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP), 암에 부차적인 TMA; 화학요법에 부차적인 TMA; 또는 이식 (예를 들어 장기 이식, 예컨대 신장 이식 또는 동종이계 조혈 줄기세포 이식)에 부차적인 TMA와 같은 TMA를 앓고 있는 대상체로부터의 혈청에서, 또는 업쇼-슐만 증후군 (USS)을 앓고 있는 대상체로부터의 혈청에서, 또는 디고스 병을 앓고 있는 대상체로부터의 혈청에서, 또는 치명적 항인지질 증후군 (CAPS)을 앓고 있는 대상체로부터의 혈청에서 혈장 유도된 MVEC 아폽토시스를 억제하는데, 혈장 유도된 MVEC 아폽토시스는 미처리 혈청과 비교하여 적어도 5%, 예컨대 적어도 10%, 예컨대 적어도 20%, 예컨대 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 최대 99% 억제된다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 TMA (예를 들어, 예컨대 aHUS (급성 또는 관해기), 용혈성 요독성 증후군 (HUS), 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP), 암에 부차적인 TMA; 화학요법에 부차적인 TMA; 이식 (예를 들어, 장기 이식, such as kidney 이식 또는 동종 이계 조혈모세포 이식)에 부차적인 TMA를 앓고 있는 대상체로부터의 혈청에서, 또는 업쇼-슐만 증후군 (USS)을 앓고 있는 대상체로부터의 혈청에서, 또는 디고스 병을 앓고 있는 대상체로부터의 혈청에서, 또는 치명적 항인지질 증후군 (CAPS)을 앓고 있는 대상체로부터의 혈청에서 혈전 형성을, 혈청에서의 C5b-9 침착에 대한 억제 효과보다 적어도 20 퍼센트 이상 (예컨대, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%)의 수준으로 억제한다.

한 구체예에서, 본 발명은 TMA (예컨대, aHUS (급성 또는 관해기), 용혈성 요독성 증후군 (HUS), 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP), 암에 부차적인 TMA; 화학요법에 부차적인 TMA; 이식 (예를 들어, 장기 이식, 예컨대 신장 이식 또는 동종 이계 조혈모세포 이식)에 부차적인 TMA를 앓고 있는 대상체에서, 또는 업쇼-슐만 증후군 (USS)을 앓고 있는 대상체로부터의 혈청에서, 또는 디고스 병을 앓고 있는 대상체로부터의 혈청에서, 또는 치명적 항인지질 증후군 (CAPS)을 앓고 있는 대상체로부터의 혈청에서 혈전 형성을 억제하는 방법을 제공하며, 그 방법은 (I) (a) i) 서열 번호:67의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) 서열 번호:67의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) 서열 번호:67의 95-102의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 b) i) 서열 번호:70의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) 서열 번호:70의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) 서열 번호:70의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) 서열 번호:67에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:67에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:70에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 경쇄 가변 영역을 포함하는 이것의 변종을 포함하는, MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

한 구체예에서, 대상체는 암에 부차적인 TMA; 화학요법에 부차적인 TMA; 이식 (예를 들어, 장기 이식, 예컨대 신장 이식 또는 동종 이계 조혈모세포 이식)에 부차적인 TMA, 업쇼-슐만 증후군 (USS), 디고스 병, 및 치명적 항인지질 증후군 (CAPS)으로 구성된 군으로부터 선택된 TMA를 앓고 있다.

실시예 44

이 실시예는 혈전성 미세혈관증 (TMA)을 가진 성인에서 완전한 인간 단클론성 MASP-2 억제 항체의 안전성 및 임상적 효능을 평가하기 위해 진행중인 단계 2 임상 실험의 초기 결과들을 기술한다.

배경: TMA는 신체 기관, 가장 통상적으로 신장 및 뇌의 미세혈관계에서 과잉 혈전 (덩어리) - 혈소판의 응집 -이 특징인 드문, 약화시키고 생명을 위협하는 장애들의 패밀리이다.

방법:

개방-표지 단계 2 임상 실험의 제1 스테이지를 일차 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 혈장 요법-저항성 aHUS 및 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP)을 가진 대상체들에서 수행하였다. 이 단계2 임상 실험은 질환의 생명을 위협하는 성질을 제공하는 가짜 암 (placebo arm)이 없다.

대상체들은 스크리닝시 ≥18세였고 그들이 다음 TMA 중 하나로 진단된 경우에만 이 연구에 포함시켰다:

1) 혈장에서 >10%의 ADAMTS13 활성을 가지는 것으로 임상적으로 진단된 일차 aHUS. 환자들은 증명된 보체 돌연변이 또는 항-CFH 항체를 받을 수 있거나 받지 않는다. 환자들은 혈장 요법 (혈장 교환 또는 혈장 투입)에 대한 그들의 반응에 따라 분류된다:

혈장 요법-저항성 aHUS 환자, 이 연구의 목적에 대해 다음을 모두 만족시킨다:

(a) 스크리닝 전 적어도 4가지 혈장 요법에도 불구하고 혈소판 수 < 150,000/μL로 스크리닝됨;

(b) 미소혈관성 용혈의 증거 (분열적혈구의 존재, 혈청 락테이트 데하이드로게나제 (LDH) > 정상의 상한선 (ULN), 합토글로빈 < LLN); 및

(c) 혈청 크레아티닌 > ULN.

만성 혈장 요법-반응성 aHUS 환자 (혈장 요법-민감성)는 혈청 크레아티닌 > ULN을 가진 OMS646의 제1 용량 전에 적어도 주 1회 혈장 요법을 필요로 해야 한다.

2) 다음의 전부를 가지는 것으로 규정된 TTP:

혈소판 수 < 150,000/μL;

미소혈관성 용혈의 증거 (분열적혈구의 존재, 혈청 LDH > ULN, 또는 합토글로빈 < LLN); 및

현재 TTP의 에피소드 중에 또는 이력상 ADAMTS13 활성 ≤ 10%.

주: 대상체들은 그들이 스크리닝 전 3개월 이내에 에쿨리쥬맙 요법을 받았다면 연구로부터 배제시켰다. 혈장 요법-저항성으로서 자격을 얻은 환자에 대한 기준은 이 연구에서 적격성을 규정할 목적에 대한 것이었다. 본 발명의 추가의 측면으로, MASP-2 억제자로 치료받을 혈장 요법-저항성 환자는 이전에 혈장 요법으로 적어도 한 번 치료받았고 그런 혈장 요법 치료 후에도 여전히 그런 혈장 요법 치료에 의해 적당하게 감소되거나 제거되지 않은 aHUS의 하나 이상의 임상적 마커를 가졌다.

이 연구에서 사용한 단클론성 항체, OMS646는 인간 MASP-2에 대해 지시된 완전한 인간 IgG4 mAb이다. 실시예 40에서 증명된 것과 같이, OMS646은 재조합 MASP-2에 강력하게 결합하고 (100 pM 범위의 외관상 평형 해리 상수) 상동성 단백질 C1s, C1r 및 MASP-1을 능가하는 5,000-배 이상의 선택성을 나타낸다. 기능적 검정에서, OMS646은 나노몰 효능 (대략 3 nM의 50% 억제 [IC₅₀]를 유도하는 농도)으로 인간 렉틴 경로를 억제하지만 고전적 경로에는 유의미한 효과를 나타내지 않는다. 마우스, 비-인간 영장류 및 인간에게 정맥 내 (IV) 또는 피하 (SC) 주사에 의해 투여된 OMS646은 생체 외 검정에서 렉틴 경로 활성화의 억제와 관련된 고혈장 농도를 초래하였다. 추가로 실시예 42에서 기술된 것과 같이, OMS646 치료는 TMA의 시험관 내 모델에서 C5b-9 침착 및 혈전 형성 및 TMA의 마우스 모델에서 혈전 형성을 감소시켰고, 그러므로 OMS646은 치료적 활용성을 가진 것이 증명된다.

이 연구에서, OMS646 약물 물질은 100 mg/mL의 농도에서 제공되었는데, 그것을 IV 투여를 위해 추가로 희석하였다. OMS646 100 mg/mL 주사 용액의 적절하게 계산된 부피를 용량 제조를 위해 주사기를 사용하여 바이알로부터 철회하였다. 투입 백을 제조 후 4시간 이내에 투여하였다.

연구의 스테이지 1에서, OMS646을 코호트에 대해 3명의 대상체의 상승 용량 코호트에 투여하였다. 스테이지 1의 각 대상체는 하기 표 26에 제시된 OMS646의 용량을 주 4회 받았다.

스테이지 1에 대한 투약 스케줄

스테이지, 코호트	대상체의 수	OMS646 용량 (mg/kg)
1, 코호트 1	3	0.675, 매주 x 4
1, 코호트 2	3	2.0, 매주 x 4
1, 코호트 3	3	4.0, 매주 x 4

개략적인 스테이지 1 연구 디자인

희석된 연구 약물을 30-분 기간에 걸쳐 정맥 내로 주입하였다.

일차 종점

공동-일차 종점은:

· AE, 바이탈 사인, ECG, 및 임상 실험 테스트에 의해 평가되는 바 안전하다

· 혈소판 수의 변화에 의해 평가되는 바 임상적으로 활성이다

이차 종점

이차 종점은:

· 임상적으로 활성인 TMA

혈청 LDH

혈청 합토글로빈

헤모글로빈

혈청 크레아티닌

TMA-관련 증상

혈장 요법 (혈장 교환 또는 혈장 투입)에 대한 필요성

투석에 대한 필요성

허용된 수반되는 요법

· 혈장 요법-저항성 aHUS - OMS646 치료 중에 혈장 요법은 조사자가 의학적인 표시인 것으로 여긴다면 허용하였다.

· 만성 혈장 요법-반응성 aHUS - TMA에 개선의 사인, 예를 들어, 혈소판 수의 증가, LDH의 감소, 합토글로빈의 증가, 헤모글로빈의 증가, 크레아티닌의 감소가 있을 때까지 혈장 요법이 계속되어야 한다고 조사자는 조언을 받았고, 그 때에 조사자는 혈장 요법을 중단할 수 있을 것인가를 평가하기 위해 혈장 요법을 중단하고 TMA 파라미터를 모니터링할 것을 고려하도록 조언을 받았다.

· TTP - 혈장 요법을 조사자가 의학적인 표시인 것으로 여긴다면 허용하였다.

· 조사자는 신장 투석 요법이 치료 기준에 따라 관리되어야 한다는 조언을 받았다.

· 에쿨리쥬맙을 연구 중에는 투여하지 않았다.

결과:

대상체의 제1 코호트은 최저 용량의 OMS646으로 처리된 3명의 aHUS 환자로 구성되었다. 개선은 이 연구 코호트의 모든 환자에서 TMA 질환 마커들에 걸쳐 관찰되었다. 혈소판 수, 혈청 락테이트 데하이드로게나제 (LDH) 및 혈청 합토글로빈을 질환 활성의 마커로서 측정하였다. 베이스라인 수준에 비교할 때, 혈소판 수는 모든 환자에서 개선되었다. 혈청 LDH 수준은 한 명의 환자에서 정상을 유지하였고, 실질적으로는 다른 환자에서는 정상 범위에 가깝게 감소하였고 세 번째 환자에서는 상승된 채로 유지되었다. 합토글로빈은 두 명의 환자에서 개선되었고, 한 명에서는 정상화되었다. 크레아티닌 수준은 신장 기능과 별개로 한 명의 환자에서 또한 개선되었다.

디자인한 것과 같이, 3명의 환자를 이 임상 실험의 제2의, 중간 용량 코호트에서 치료하였다. 2명의 환자는 혈장 요법-저항성 aHUS를 가졌고 한 명의 환자는 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP)을 가졌다. aHUS를 가진 2명의 환자 모두 연구 등록 전 및 연구 등록시에 신장 투석 중이었다. 제2 또는 중간-용량 코호트에서, 혈장 요법-저항성 aHUS을 가진 2명의 환자는 다음을 나타냈다:

· 평균 혈소판 수의 47% 증가, 2명의 환자에서 정상 범위의 수를 초래함

· 평균 분열적혈구 수의 86% 감소, 한 명의 환자에서는 분열적혈구가 사라짐

· 평균 합토글로빈의 71% 증가, 두 환자 모두 치료 중에 정상 범위에 도달하였고, 한 명은 최종 용량 후 1주째에 정상보다 약간 아래로 떨어짐

· LDH의 평균 수준의 5% 감소, 두 환자에서의 수준은 정상 범위보다 약간 상승된 채로 유지됨.

TTP를 가진 중간-용량-코호트 환자는 연구에 들어가기 전에 반복된 을 필요로 하였다. 실험실 파라미터는 일관된 개선을 보이진 않았지만, 환자는 혈장 요법을 필요로 하지 않았던 한편으로, 치료가 완료되었기 때문에 OMS646으로 치료되지 않았으며, 지금까지도 없었다.

약물은 전체 치료 기간을 통해 모든 환자에 의해 잘 허용되었다. 제2 또는 중간-용량 코호트으로부터의 포지티브 데이터를 기반으로, 제3 또는 고용량 코호트을 시작하였고 aHUS 환자는 이미 연구 치료 기간이 완료되었다. 모든 환자에 대해 참조된 데이터는 최종 용량 후의 한 주간에 대한 측정을 포함한다.

제3 (고용량) 코호트의 제1 환자 - C형 간염, 저온글로불린혈증 및 림프종을 포함하여 추가적인 합병증 장애를 가진 혈장 요법-저항성 aHUS 환자 또한 OMS646으로의 치료가 완료되었다. OMS646 치료 전에, 환자는 반복된 투석을 필요로 하였다. OMS646 과정의 치료 및 이어지는 완료를 통해, 지금까지 환자는 투석 없이 유지되었다. 혈액학적 및 신장 파라미터는 다음을 나타냈다:

· 혈소판 수의 63% 개선, 정상 수준으로 되돌아옴

· 분열적혈구의 100% 감소

· 검출할 수 없는 수준으로부터 증가되고 정상화된 합토글로빈

· LDH의 43% 감소, 정상보다 약간 위의 수준을 초래함

· 크레아티닌 수준의 24% 감소

제1 및 제2 코호트에서와 같이, 약물은 잘 허용되었다.

이 개방-표지 단계 2 임상 실험에서 일차 종점은 혈소판 수의 변화이다. 중간- 및 고용량 코호트에서 모든 3명의 aHUS 환자 (2명의 중간-용량 코호트 및 1명의 고용량 코호트)에서 혈소판 수는 정상으로 복귀되었고, 이때 통계학적으로 유의미한 평균 증가는 베이스라인으로부터 대략 68,000 혈소판/mL (p=0.0055)이다.

요약하면, 지금까지 이 단계 2 임상 실험으로부터 얻어진 데이터는 일차 aHIS, 혈장-요법 저항성 aHUS를 가진 환자에서 및 TTP를 가진 환자에서 OMS646의 효능을 나타낸다.

상기 언급된 바에 따르면, 한 구체예에서는, 본 발명은 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제 항체의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈장 요법-저항성 aHUS를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 방법은 MASP-2 억제 항체를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하기 전에 혈장 요법-저항성 aHUS를 앓고 있는 대상체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다.

본원에 기술된 구체예들 중 임의의 구체예를 따르면, MASP-2 억제 항체는 다음 특징 중 적어도 하나 이상을 나타낸다: 상기 항체는 10 nM 이하의 K_D로 인간 MASP-2에 결합하고, 상기 항체는 MASP-2의 CCP1 도메인에서 에피토프에 결합하며, 상기 항체는 1% 인간 혈청에서의 시험관 내 검정에서 10 nM 이하의 IC₅₀으로 C3b 침착을 억제하고, 상기 항체는 90% 인간 혈청에서 30 nM 이하의 IC₅₀으로 C3b 침착을 억제하며, 항체는 Fv, Fab, Fab', F(ab)₂ 및 F(ab')₂로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단편이고, 항체는 단일 사슬 분자이며, 상기 항체는 IgG2 분자이고, 상기 항체는 IgG1 분자이며, 상기 항체는 IgG4 분자이고, IgG4 분자는 S228P 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 항체는 MASP-2에 결합하고 렉틴 경로를 선택적으로 억제하며 실질적으로 고전적 경로를 억제하지는 않는다 (즉, 렉틴 경로를 억제하는 한편 고전적 보체 경로를 온전하게 남겨둔다).

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 혈소판 수 증가, LDH의 감소, 합토글로빈 증가, 헤모글로빈의 증가 및/또는 크레아티닌 감소와 같은 aHUS와 관련된 적어도 하나 이상의 임상적 파라미터를 개선시키는 데 효과적인 양으로 투여된다.

일부 구체예에서, 방법은 혈장 요법-저항성 aHUS를 앓고 있는 대상체에게 제1 기간 (예를 들어, 적어도 1일 내지 1주일 또는 2주일) 동안 카테터를 통해 (예를 들어, 정맥 내로) MASP-2 억제 항체를 투여하고 이어서 제2 기간 (예를 들어, 적어도 2주 또는 그 이상의 만성기) 동안 대상체 피하로 MASP-2 억제 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 및/또는 제2 기간의 투여는 혈장 요법이 없을 때 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 및/또는 제2 기간의 투여는 혈장 요법의 존재하에 발생한다.

일부 구체예에서, 방법은 혈장 요법-저항성 aHUS를 앓고 있는 대상체에게 정맥 내로, 근육 내로, 또는 바람직하게는, 피하로 MASP-2 억제 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 치료는 만성적일 수 있고 매일 내지 매월 투여될 수 있지만, 바람직하게는 2주마다 투여된다. MASP-2 억제 항체는 단독으로, 또는 에쿨리쥬맙과 같은 C5 억제자와 조합하여 투여될 수 있다.

한 구체예에서, 방법은 혈장 요법-저항성 aHUS를 앓고 있는 대상체를 치료하는 것을 포함하는데, 방법은 (I) (a) i) 서열 번호:67의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) 서열 번호:67의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) 서열 번호:67의 95-107의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 b) i) 서열 번호:70의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) 서열 번호:70의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) 서열 번호:70의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) 서열 번호:67에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:67에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:70에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 경쇄 가변 영역을 포함하는 이것의 변종을 포함하는, MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구체예에서, 방법은 서열 번호:67에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

실시예 45

이 실시예는 실시예 44에서 기술된 혈전성 미세혈관증 (TMA)을 가진 성인에서 완전한 인간 단클론성 MASP-2 억제 항체의 안전성 및 임상적 효능을 평가하기 위해 진행중인 단계 2 임상 실험에서 얻어진 추가적인 결과들을 기술한다.

배경: 실시예 44에서 기술된 것과 같이, TMA는 신체 기관, 가장 통상적으로 신장 및 뇌의 미세혈관계에서 과잉 혈전 (덩어리) - 혈소판의 응집 -이 특징인 드문, 약화시키고 생명을 위협하는 장애들의 패밀리이다. 본원에서 기술된 것과 같이, 이식-관련된 TMA (TA-TMA)는 이식 환자, 예컨대 조혈모세포 이식 (HSCT) 수령체에서 발생할 수 있는 치명적인 증후군이다. 이 실시예는 조혈모세포 이식-관련 TMA를 앓고 있는 환자에서 완전한 인간 단클론성 MASP-2 억제 항체의 안전성 및 임상적 효능을 평가하기 위한 단계 2 임상 실험의 초기 결과들을 기술한다.

방법:

실시예 44에서 기술한 것과 같이, 단계 2 TMA 실험은 MASP-2 억제 항체 OMS646의 3가지 수준의 용량-범위 스테이지와, 이어서 고정-용량 스테이지로 구성된다. 실시예 44에서 추가로 기술된 것과 같이, 포지티브 결과를 aHUS 환자들과 한 명의 TTP 환자로부터, 효능 측정에서 일관되고 왕성한 개선과 함께 얻었다. 저용량 코호트에서와 같이, OMS646은 전체 치료 기간에 걸쳐 중간- 및 고용량 코호트의 모든 환자들에 의해 잘 허용되었다. 전임상적 독성 연구를 완료하였고 안전상의 우려가 없는 것으로 증명되어서 임상 실험에서 만성 투약이 허용되었다.

실시예 44에서 기술한 것과 같이, OMS646 단계 2 TMA 임상 실험으로부터의 데이터를 aHUS 및 TTP 환자로부터 얻었다. 투약을 이제 고용량 코호트의 추가적인 조혈모세포 이식-관련 TMA 환자에 대해 실시예 44에서 기술한 방법을 사용하여 완료하였다. 이것은 조혈모세포 이식이 진행되었던 림프종의 이력을 가진 환자이다. 그의 이식 후 과정은 혈소판 수혈을 필요로 하는 TMA를 포함하여 생명을 위협하는 다양한 장애로 인해 복잡해졌다. 투입에도 불구하고, 그의 줄기 세포 이식-관련 TMA는 지속되었고 OMS646 단계 2 실험에 등록되었다.

결과:

실시예 44에서 기술된 것과 같은 4-주 투약 기간 (고용량 코호트) 후에, 줄기 세포 이식-관련 TMA를 가진 환자는 다음을 나타냈다:

· 혈소판 수는 4배가 되어 100,000 이상의 혈소판 수를 초래함;

· 합토글로빈 수준은 2배 이상이었고 정상이었음;

· 혈관 내 손상의 척도인 혈장 락테이트 데하이드로게나제 수준은 35% 감소하였지만 여전히 정상보다 위였음;

· 분열적혈구 수는 단기 1에서 유지됨.

OMS646으로의 투약 전체에 걸쳐 및 OMS646 치료를 완료한 이래로, 환자는 어떠한 혈소판 수혈 또는 혈장 반출법도 필요로 하지 않았다.

요약하면, 이 단계 2 임상 실험 (실시예 44 및 이 실시예에서 기술된 것과 같은)으로부터 지금까지 얻어진 데이터는 일차 aHUS, 혈장-요법 저항성 aHUS, TTP를 가진 환자 및 조혈모세포 이식과 관련된 TMA를 가진 환자에서 OMS646의 효능을 나타낸다.

상기 언급된 바에 따르면, 한 구체예에서는, 본 발명은 조혈모세포 이식과 관련된 TMA를 앓고 있는 인간 대상체를 치료하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제 항체의 양을 포함하는 조성물을 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 대상체는 혈소판 수혈 및/또는 혈장 반출법으로의 치료에 대해 저항성인 조혈모세포 이식과 관련된 TMA를 앓고 있다. 한 구체예에서, 방법은 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제 항체의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하기 전에 혈소판 수혈 및/또는 혈장 반출법으로의 치료에 대해 저항성인 조혈모세포 이식과 관련된 TMA를 앓고 있는 인간 대상체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다.

본원에 개시된 구체예들 중 임의의 구체예에 따르면, MASP-2 억제 항체는 다음 특징 중 적어도 하나 이상을 나타낸다: 상기 항체는 10 nM 이하의 K_D로 인간 MASP-2에 결합하고, 상기 항체는 MASP-2의 CCP1 도메인에서 에피토프에 결합하며, 상기 항체는 1% 인간 혈청에서의 시험관 내 검정에서 10 nM 이하의 IC₅₀으로 C3b 침착을 억제하고, 상기 항체는 90% 인간 혈청에서 30 nM 이하의 IC₅₀으로 C3b 침착을 억제하며, 항체는 Fv, Fab, Fab', F(ab)₂ 및 F(ab')₂로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단편이고, 항체는 단일 사슬 분자이며, 상기 항체는 IgG2 분자이고, 상기 항체는 IgG1 분자이며, 상기 항체는 IgG4 분자이고, IgG4 분자는 S228P 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 항체는 MASP-2에 결합하고 렉틴 경로를 선택적으로 억제하며 실질적으로 고전적 경로를 억제하지는 않는다 (즉, 렉틴 경로를 억제하는 한편 고전적 보체 경로를 온전하게 남겨둔다).

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 조혈모세포 이식과 관련된 TMA와 관련된 적어도 하나 이상의 임상적 파라미터, 예컨대 혈소판 수 증가 (예를 들어, 처리 전 혈소판 수의 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배), 합토글로빈 증가, 및/또는 락테이트 데하이드로게나제의 감소를 개선하기에 효과적인 양으로 투여된다.

일부 구체예에서, 방법은 조혈모세포 이식과 관련된 TMA를 앓고 있는 대상체에게 제1 기간 (예를 들어, 적어도 1일 내지 1주일 또는 2주일) 동안 카테터를 통해 (예를 들어, 정맥 내로) MASP-2 억제 항체를 투여하고 이어서 제2 기간 (예를 들어, 적어도 2주 또는 그 이상의 만성기) 동안 대상체 피하로 MASP-2 억제 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 및/또는 제2 기간의 투여는 혈장 요법의 부재시에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 및/또는 제2 기간의 투여는 혈장 요법의 존재하에 발생한다.

일부 구체예에서, 방법은 조혈모세포 이식과 관련된 TMA를 앓고 있는 대상체에게 MASP-2 억제 항체를 정맥 내로, 근육 내로, 또는 바람직하게는, 피하로 투여하는 단계를 포함한다. 치료는 만성적일 수 있고 매일 내지 매월 투여될 수 있지만, 바람직하게는 2주마다 투여된다. MASP-2 억제 항체는 단독으로, 또는 에쿨리쥬맙과 같은 C5 억제자와 조합되어 투여될 수 있다.

한 구체예에서, 방법은 (I) (a) i) 서열 번호:67의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) 서열 번호:67의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) 서열 번호:67의 95-107의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 b) i) 서열 번호:70의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) 서열 번호:70의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) 서열 번호:70의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) 서열 번호:67에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:67에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:70에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 경쇄 가변 영역을 포함하는 이것의 변종을 포함하는, MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 조혈모세포 이식과 관련된 TMA를 앓고 있는 대상체를 치료하는 것을 포함한다.

실시예 46

이 실시예는 실시예 44 및 45에서 기술된 혈전성 미세혈관증 (TMA)을 가진 성인에서 완전한 인간 단클론성 MASP-2 억제 항체의 안전성 및 임상적 효능을 평가하기 위해 진행중인 단계 2 임상 실험에어 얻어진 추가적인 결과들을 기술한다.

배경: 실시예 45에서 기술한 것과 같이, 이식-관련된 TMA (TA-TMA)는 이식 환자, 예컨대 조혈모세포 이식 (HSCT) 수령체에서 발생할 수 있는 치명적인 증후군이다. 조혈모세포 이식-관련된 TMA (HSCT-TMA)은 내피 손상에 의해 촉발되는 생명을 위협하는 합병증이다. 신장은 가장 흔하게 영향을 받는 장기지만, HSCT-TMA는 또한 폐, 장, 심장 및 뇌를 포함하는 다중-시스템 질환일 수 있다. 경미할지라도 TMA의 발생은 장기간 신장 손상과 관련된다. 동종 이계 HSCT 후-관련된 TMA의 발달은 자주 달라지는 진단 기준 및 조건화 및 이식편-대비-숙주 질환 예방 처방을 기준으로 차이가 있고, 이때 칼시뉴린 억제자가 가장 빈번하게 관련되는 약물인 것으로 나타난다 (Ho VT et al., Biol Blood Marrow Transplant, 11(8):571-5, 2005). 면역억제성 칼시뉴린 억제자 처방의 변형은 일부 환자에서 칼시뉴린 억제자 투여의 감소 또는 중단 후 수 주 이내에 TMA의 개선을 초래할 수 있다.

TMA는 HSCT의 잠재적으로 생명을 위협하는 합병증이고 현재 크게는 면역억제제 (예를 들어, 칼시뉴린 억제자)의 회피 및 진행중인 감염의 치료, 뿐만 아니라 용혈과 같은 부양 조치를 포함하여 자극 인자들의 개선에 의해 관리된다. 비록 많은 HSCT-TMA 환자가 면역억제제의 감소 또는 중단에 잘 반응하지만, 보존적 치료 조치에도 불구하고 지속성 HSCT-TMA를 보이는 환자의 하위세트가 있다 (즉 TMA는 면역억제의 감소 또는 중단에 반응하지 않았다). 이 보존적 치료 조치에 반응하지 않는 환자는 불량한 예후를 가진다. 혈장 교환은 효능을 나타내지 않으며 다른 요법은 승인되지 않는다.

실시예 45는 지속성 조혈모세포 이식-관련 TMA (HSCT-TMA)를 앓고 있는 환자에서 완전한 인간 단클론성 MASP-2 억제 항체 (OMS646)의 안전성 및 임상적 효능을 평가하기 위한 단계 2 임상 실험의 초기 포지티브 결과를 기술한다. 이 실시예는 보존적 치료 조치에 저항성인 지속성 HSCT-TMA를 앓고 있는 3명의 추가적인 대상체에서 OMS646의 안전성 및 임상적 효능을 평가하기 위해 진행중인 단계 2 임상 실험의 추가적인 결과를 기술한다.

방법:

실시예 44에서 기술한 것과 같이, 단계 2 TMA 실험은 3가지 수준의 용량-범위 스테이지와, 이어서 MASP-2 억제 항체 OMS646의 고정-용량 스테이지로 구성된다. OMS646은 저-, 중간 및 고용량 코호트의 모든 환자에 의해 전체 치료 기간에 걸쳐 잘 허용되었다. 전임상 독성 연구를 완료하였고 안전상의 우려는 없는 것으로 증명되어서 임상 실험에서 만성 투약이 허용되었다.

단계 2 TMA 실험은 이 연구의 목적에 대해 면역억제제 (예를 들어, 칼시뉴린 억제자 치료)의 감소 또는 중단 후 적어도 2주 후에 또는 이식 후 적어도 30일 후에 다음의 모든 것을 가지는 것으로서 규정된, 보존적 치료 조치에 저항성인 지속성 HSCT-관련된 TMA를 앓고 있는 대상체들을 포함한다:

- 혈소판 감소증 (혈소판 수 < 150,000/μL); 및

- 미소혈관성 용혈성 빈혈증의 증거 (분열적혈구의 존재, 혈청 락테이트 데하이드로게나제 (LDH) > 정상의 상한선 (ULN), 또는 합토글로빈 < 정상의 하한선 (LLN).

HSCT-관련된 TMA에 대한 허용된 수반되는 요법들

· OMS646 치료 중에 혈장 요법은 조사자가 의학적인 표시로 여긴다면 허용한다. 혈장 요법을 받은 환자는 OMS646의 추가적인 절반 용량을 받을 수 있었다.

· 조사자들은 신장 투석 요법이 치료 기준에 따라 관리되어야 한다는 조언을 받았다.

· 에쿨리쥬맙은 연구 중에는 투여되지 않았다.

진행중인 TMA 연구는 표준 치료 조치에 저항성인 지속성 HSCT-TMA (즉, 칼시뉴린 억제자 치료의 감소 또는 중단 후 적어도 2주 후에 지속성 TMA)를 앓고 있는 대상체들을 포함한다.

실시예 45에서 기술한 것과 같이, 투약을 실시예 44에서 기술한 방법을 사용하여 고용량 코호트 (4주 동안 주 1회 IV로 투여된 4 mg/kg의 OMS646)에서 지속성 HSCT-TMA를 앓고 있는 환자 (환자 #1)에 대해 완료하였다.

투약을 이제 하기 기술하는 것과 같이, 지속성 HSCT-TMA를 앓고 있는 추가적인 4명의 환자에 대해 완료하였다.

환자 #1 (실시예 44에서 기술됨)을 4주 동안 OMS646 (매주 1회 4mg/kg IV)로 치료하였다;

환자 #2 및 #3을 8주 동안 OMS646 (매주 1회 4mg/kg IV)로 치료하였다;

환자 #4 및 #5를 각각 2주 및 3주 동안 OMS646 (매주 1회 4mg/kg IV)로 치료하였다.

각각 2주 및 3주 후에 연구로부터 철회된 환자 #4 및 #5는 치료에 반응하지 않았고 악화되었다. 이 환자들 중 한 명은 연구 가입시에 현저하게 상승된 크레아티닌을 가졌음이 주지된다.

결과:

지속성 HSCT-TMA를 가진 5명의 환자를 이 연구에 등록시켰다. 모든 대상체는 성인이었고 혈액학적 악성 종양에 대해 HSCT를 받았다. 도 58, 59 및 60은 MASP-2 억제 항체 OMS646으로의 치료 후에 TMA 변수의 베이스라인으로부터의 변화를 제공한다. 이 도면들은 모두 5명의 환자에 대한 데이터를 제공하는데, 그 중 2명은 2-3주 후에 연구를 중단하였고, 그 중 1명은 그 후 재발되었고 다른 1명은 고통완화 치료를 받았다. 도 58, 59 및 60에서 주지된 것과 같이, 제공된 마지막 가능한 치료는 7주에 발생하였다.

도 58은 MASP-2 억제 항체 (OMS646)로의 치료 후에 지속성 조혈모세포 이식-관련된 혈전성 미세혈관증 (HSCT-TMA)을 앓고 있는 대상체에서 시간 (주) 경과에 따른 베이스라인으로부터의 혈소판 수의 평균 변화를 그래프로 도시한다.

도 59는 MASP-2 억제 항체 (OMS646)로의 치료 후에 지속성 (HSCT-TMA)를 앓고 있는 대상체에서 시간 (주) 경과에 따른 베이스라인으로부터의 LDH의 평균 변화를 그래프로 도시한다.

도 60은 MASP-2 억제 항체 (OMS646)로의 치료 후에 지속성 (HSCT-TMA)를 앓고 있는 대상체에서 시간 (주) 경과에 따른 베이스라인으로부터의 합토글로빈의 평균 변화를 그래프로 도시한다.

도 59 및 60에서 나타난 것과 같이, LDH 및 합토글로빈의 통계학적으로 유의미한 개선이 치료 중에 관찰되었다. 도 58에서 나타난 것과 같이, 혈소판 수는 개선되었지만 이 작은 수의 환자에서 통계학적 유의미성에 도달하지는 않았다. 치료가 완료된 3명의 환자 중에서, 한 명은 크레아티닌의 개선을 나타내지 않았지만 부수적인 신장독성 물질을 받고 있었다. 크레아티닌은 다른 2명의 환자에서 개선되었거나 정상을 유지하였다. 연장된 후속 조치에서, 1명의 환자가 이식 실패를 경험하였고 두 번째 이식을 대기중이다. 다른 2명의 환자는 안정상태를 유지한다.

2명의 대상체에서 골수 억제 및 신장독성과 관련된 약물의 잠재적으로 혼동되는 효과에도 불구하고, OMS646으로의 유익한 치료 효과를 지속성 HSCT-TMA를 앓고 있는 대상체들 중 3명에서 관찰하였고 (그 중 한 명은 실시예 45에서 기술됨) 추가로 하기에서 기술한다. 특히, 3명의 응답자 각각에서 치료 효과는 OMS646으로의 치료 후 대략 3주 후에 처음으로 나타났다.

환자 #1 (실시예 45에서 기술한 것과 같이 4주 동안 치료됨). 간단히 요약하면, 혈소판 수는 4배가 되었고, 100,000/μL 이상의 혈소판 수를 초래하였다; 합토글로빈 수준은 2배 이상으로 정상이었고; 혈장 락테이트 데하이드로게나제 수준은 35% 감소하였지만 여전히 정상보다 위였으며; 분열적혈구 수는 단지 1에서 유지되었다.

환자 #2 (8주 동안 치료됨): 혈소판 수는 치료에 반응하지 않았지만, 환자는 또한 발간시클로비로의 동시 치료 및 나중의 이식 실패에 부차적인 골수 억제로 고생하며; 혈장 락테이트 데하이드로게나제 수준은 712 U/L로부터 256 U/L로 낮게 감소하였고; 합토글로빈 수준은 검출할 수 없는 수준으로부터 250 mg/dL로 높게 증가하였다.

환자 #3 (8주 동안 치료됨): 혈소판 수는 13,500/μL에서 133,000/μL로 증가하였고; 혈장 락테이트 데하이드로게나제 수준은 537에서 225 U/L로 감소하였으며, 합토글로빈 수준은 검출할 수 없는 수준으로부터 181 mg/dL로 높게 증가하였다.

결과의 요약:

OMS646으로의 투약이 완료된 지속성 HSCT-관련된 TMA를 앓고 있는 3명의 환자에 대하여, 데이터는 강력하고 일관된 효능 신호를 증명한다. LDH 및 합토글로빈의 통계학적으로 유의미한 개선이 치료 중에 관찰되었다. 혈소판 수는 개선되었지만 이 작은 수의 환자에서 통계학적 유의미성에 도달하지는 못하였다. 치료가 완료된 환자들 중에서, 한 명은 크레아티닌의 개선을 보이지 않았지만 부수적인 신장독성 물질을 받고 있었다. 크레아티닌은 다른 2명의 환자에서는 개선되었거나 정상을 유지하였다.

결론:

OMS646은 보존적 치료 조치에 응답하지 않은 지속성 HSCT-TMA를 앓고 있는 환자에서 TMA 마커를 개선시켰다. OMS646로 치료된 HSCT-TMA 환자는 치료가 가장 어려운 것 중 일부를 나타내고, 그로써 보존적 치료 조치에도 불구하고 고위험 지속성 HSCT-TMA를 가진 환자에서 OMS646의 치료 효과의 임상적 증거를 증명한다.

상기 언급된 바에 따르면, 한 구체예에서는, 본 발명은 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제 항체의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 조혈모세포 이식과 관련된 TMA를 앓고 있는 인간 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 대상체는 보존적 치료 조치에 저항성인 조혈모세포 이식과 관련된 지속성 TMA를 앓고 있다. 한 구체예에서, 방법은 MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제 항체의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계 전에 보존적 치료 조치에 저항성인 조혈모세포 이식과 관련된 지속성 TMA를 앓고 있는 인간 대상체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다.

한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 조혈모세포 이식과 관련된 TMA와 관련된 적어도 하나 이상의 임상적 파라미터, 예컨대 혈소판 수 증가 (예를 들어, 처리 전 혈소판 수의 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배), 합토글로빈 증가, 및/또는 락테이트 데하이드로게나제의 감소를 개선시키기에 효과적인 양으로 투여된다.

일부 구체예에서, 방법은 조혈모세포 이식과 관련된 TMA를 앓고 있는 대상체에게 제1 기간 (예를 들어, 적어도 1일 내지 1주일 또는 2주일 또는 3주일 또는 4주일 또는 그 이상) 동안 카테터를 통해 (예를 들어, 정맥 내로) MASP-2 억제 항체를 투여하고 이어서 제2 기간 (예를 들어, 적어도 2주 또는 그 이상의 만성기) 동안 대상체 피하로 MASP-2 억제 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 및/또는 제2 기간의 투여는 혈장 요법의 부재시에 발생한다. 일부 구체예에서, 제1 및/또는 제2 기간의 투여는 혈장 요법의 존재하에 발생한다.

일부 구체예에서, 방법은 조혈모세포 이식과 관련된 TMA를 앓고 있는 대상체에게 MASP-2 억제 항체를 정맥 내로, 근육 내로, 또는 피하로 투여하는 단계를 포함한다. 치료는 만성적일 수 있고 매일 내지 매월 투여될 수 있지만, 바람직하게는 적어도 2주마다, 또는 적어도 주 1회, 예컨대 주 2회 또는 주 3회 투여될 수 있다. MASP-2 억제 항체는 단독으로, 또는 에쿨리쥬맙과 같은 C5 억제자와 조합되어 투여될 수 있다.

한 구체예에서, 방법은 서열 번호:67에서 제시된 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에서 제시된 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 조혈모세포 이식과 관련된 지속성 TMA를 앓고 있는 대상체를 치료하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 (a) i) 서열 번호:67의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) 서열 번호:67의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) 서열 번호:67의 95-107의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 b) i) 서열 번호:70의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) 서열 번호:70의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) 서열 번호:70의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) 서열 번호:67에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:67에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에 대하여 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 서열 번호:70에 대하여 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가진 경쇄 가변 영역을 포함하는 이것의 변종을 포함하는 MASP-2 억제 항체를 포함한다.

일부 구체예에서, 방법은 보존적 치료 조치에 저항성인 조혈모세포 이식과 관련된 지속성 TMA를 앓고 있는 대상체를 포함하여, HSCT와 관련된 TMA를 앓고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에게, 서열 번호:67에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 억제 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을, 1 mg/kg 내지 10 mg/kg (즉, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg 또는 10 mg/kg)의 투여량으로 적어도 매주 1회 (예컨대, 적어도 매주 2회 또는 적어도 매주 3회) 적어도 3주의 기간 동안, 또는 적어도 4주 동안, 또는 적어도 5주 동안, 또는 적어도 6주 동안, 또는 적어도 7주 동안, 또는 적어도 8주 동안 투여하는 것을 포함한다.

예시의 구체예들이 예시되고 기술된 한편, 다양한 변화들이 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다는 것이 인지될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Omeros Corporation University of Leicester Demopulos, Gregory A. Dudler, Thomas Schwaeble, Hans-Wilhelm <120> METHODS FOR TREATING CONDITIONS ASSOCIATED WITH MASP-2 DEPENDENT COMPLEMENT ACTIVATION <130> MP.1.0248.PCT <140> 62/406,726 <141> 2016-10-11 <140> 62/252,814 <141> 2015-11-09 <160> 71 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 725 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (27)..(584) <400> 1 ggccaggcca gctggacggg cacacc atg agg ctg ctg acc ctc ctg ggc ctt 53 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu 1 5 ctg tgt ggc tcg gtg gcc acc ccc ttg ggc ccg aag tgg cct gaa cct 101 Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro 10 15 20 25 gtg ttc ggg cgc ctg gca tcc ccc ggc ttt cca ggg gag tat gcc aat 149 Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn 30 35 40 gac cag gag cgg cgc tgg acc ctg act gca ccc ccc ggc tac cgc ctg 197 Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu 45 50 55 cgc ctc tac ttc acc cac ttc gac ctg gag ctc tcc cac ctc tgc gag 245 Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu 60 65 70 tac gac ttc gtc aag ctg agc tcg ggg gcc aag gtg ctg gcc acg ctg 293 Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu 75 80 85 tgc ggg cag gag agc aca gac acg gag cgg gcc cct ggc aag gac act 341 Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr 90 95 100 105 ttc tac tcg ctg ggc tcc agc ctg gac att acc ttc cgc tcc gac tac 389 Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr 110 115 120 tcc aac gag aag ccg ttc acg ggg ttc gag gcc ttc tat gca gcc gag 437 Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu 125 130 135 gac att gac gag tgc cag gtg gcc ccg gga gag gcg ccc acc tgc gac 485 Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp 140 145 150 cac cac tgc cac aac cac ctg ggc ggt ttc tac tgc tcc tgc cgc gca 533 His His Cys His Asn His Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala 155 160 165 ggc tac gtc ctg cac cgt aac aag cgc acc tgc tca gag cag agc ctc 581 Gly Tyr Val Leu His Arg Asn Lys Arg Thr Cys Ser Glu Gln Ser Leu 170 175 180 185 tag cctcccctgg agctccggcc tgcccagcag gtcagaagcc agagccagcc 634 tgctggcctc agctccgggt tgggctgaga tggctgtgcc ccaactccca ttcacccacc 694 atggacccaa taataaacct ggccccaccc c 725 <210> 2 <211> 185 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr 1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val 130 135 140 Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn 165 170 175 Lys Arg Thr Cys Ser Glu Gln Ser Leu 180 185 <210> 3 <211> 170 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala 1 5 10 15 Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp 20 25 30 Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His 35 40 45 Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu 50 55 60 Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser 85 90 95 Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe 100 105 110 Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln 115 120 125 Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His 130 135 140 Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg 145 150 155 160 Asn Lys Arg Thr Cys Ser Glu Gln Ser Leu 165 170 <210> 4 <211> 2460 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (22)..(2082) <400> 4 ggccagctgg acgggcacac c atg agg ctg ctg acc ctc ctg ggc ctt ctg 51 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu 1 5 10 tgt ggc tcg gtg gcc acc ccc ttg ggc ccg aag tgg cct gaa cct gtg 99 Cys Gly Ser Val Ala Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val 15 20 25 ttc ggg cgc ctg gca tcc ccc ggc ttt cca ggg gag tat gcc aat gac 147 Phe Gly Arg Leu Ala Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp 30 35 40 cag gag cgg cgc tgg acc ctg act gca ccc ccc ggc tac cgc ctg cgc 195 Gln Glu Arg Arg Trp Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg 45 50 55 ctc tac ttc acc cac ttc gac ctg gag ctc tcc cac ctc tgc gag tac 243 Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr 60 65 70 gac ttc gtc aag ctg agc tcg ggg gcc aag gtg ctg gcc acg ctg tgc 291 Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys 75 80 85 90 ggg cag gag agc aca gac acg gag cgg gcc cct ggc aag gac act ttc 339 Gly Gln Glu Ser Thr Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe 95 100 105 tac tcg ctg ggc tcc agc ctg gac att acc ttc cgc tcc gac tac tcc 387 Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser 110 115 120 aac gag aag ccg ttc acg ggg ttc gag gcc ttc tat gca gcc gag gac 435 Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp 125 130 135 att gac gag tgc cag gtg gcc ccg gga gag gcg ccc acc tgc gac cac 483 Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His 140 145 150 cac tgc cac aac cac ctg ggc ggt ttc tac tgc tcc tgc cgc gca ggc 531 His Cys His Asn His Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly 155 160 165 170 tac gtc ctg cac cgt aac aag cgc acc tgc tca gcc ctg tgc tcc ggc 579 Tyr Val Leu His Arg Asn Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly 175 180 185 cag gtc ttc acc cag agg tct ggg gag ctc agc agc cct gaa tac cca 627 Gln Val Phe Thr Gln Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro 190 195 200 cgg ccg tat ccc aaa ctc tcc agt tgc act tac agc atc agc ctg gag 675 Arg Pro Tyr Pro Lys Leu Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu 205 210 215 gag ggg ttc agt gtc att ctg gac ttt gtg gag tcc ttc gat gtg gag 723 Glu Gly Phe Ser Val Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu 220 225 230 aca cac cct gaa acc ctg tgt ccc tac gac ttt ctc aag att caa aca 771 Thr His Pro Glu Thr Leu Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr 235 240 245 250 gac aga gaa gaa cat ggc cca ttc tgt ggg aag aca ttg ccc cac agg 819 Asp Arg Glu Glu His Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg 255 260 265 att gaa aca aaa agc aac acg gtg acc atc acc ttt gtc aca gat gaa 867 Ile Glu Thr Lys Ser Asn Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu 270 275 280 tca gga gac cac aca ggc tgg aag atc cac tac acg agc aca gcg cag 915 Ser Gly Asp His Thr Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln 285 290 295 cct tgc cct tat ccg atg gcg cca cct aat ggc cac gtt tca cct gtg 963 Pro Cys Pro Tyr Pro Met Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val 300 305 310 caa gcc aaa tac atc ctg aaa gac agc ttc tcc atc ttt tgc gag act 1011 Gln Ala Lys Tyr Ile Leu Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr 315 320 325 330 ggc tat gag ctt ctg caa ggt cac ttg ccc ctg aaa tcc ttt act gca 1059 Gly Tyr Glu Leu Leu Gln Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala 335 340 345 gtt tgt cag aaa gat gga tct tgg gac cgg cca atg ccc gcg tgc agc 1107 Val Cys Gln Lys Asp Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser 350 355 360 att gtt gac tgt ggc cct cct gat gat cta ccc agt ggc cga gtg gag 1155 Ile Val Asp Cys Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu 365 370 375 tac atc aca ggt cct gga gtg acc acc tac aaa gct gtg att cag tac 1203 Tyr Ile Thr Gly Pro Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr 380 385 390 agc tgt gaa gag acc ttc tac aca atg aaa gtg aat gat ggt aaa tat 1251 Ser Cys Glu Glu Thr Phe Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr 395 400 405 410 gtg tgt gag gct gat gga ttc tgg acg agc tcc aaa gga gaa aaa tca 1299 Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser 415 420 425 ctc cca gtc tgt gag cct gtt tgt gga cta tca gcc cgc aca aca gga 1347 Leu Pro Val Cys Glu Pro Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly 430 435 440 ggg cgt ata tat gga ggg caa aag gca aaa cct ggt gat ttt cct tgg 1395 Gly Arg Ile Tyr Gly Gly Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp 445 450 455 caa gtc ctg ata tta ggt gga acc aca gca gca ggt gca ctt tta tat 1443 Gln Val Leu Ile Leu Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr 460 465 470 gac aac tgg gtc cta aca gct gct cat gcc gtc tat gag caa aaa cat 1491 Asp Asn Trp Val Leu Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His 475 480 485 490 gat gca tcc gcc ctg gac att cga atg ggc acc ctg aaa aga cta tca 1539 Asp Ala Ser Ala Leu Asp Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser 495 500 505 cct cat tat aca caa gcc tgg tct gaa gct gtt ttt ata cat gaa ggt 1587 Pro His Tyr Thr Gln Ala Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly 510 515 520 tat act cat gat gct ggc ttt gac aat gac ata gca ctg att aaa ttg 1635 Tyr Thr His Asp Ala Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu 525 530 535 aat aac aaa gtt gta atc aat agc aac atc acg cct att tgt ctg cca 1683 Asn Asn Lys Val Val Ile Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro 540 545 550 aga aaa gaa gct gaa tcc ttt atg agg aca gat gac att gga act gca 1731 Arg Lys Glu Ala Glu Ser Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala 555 560 565 570 tct gga tgg gga tta acc caa agg ggt ttt ctt gct aga aat cta atg 1779 Ser Gly Trp Gly Leu Thr Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met 575 580 585 tat gtc gac ata ccg att gtt gac cat caa aaa tgt act gct gca tat 1827 Tyr Val Asp Ile Pro Ile Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr 590 595 600 gaa aag cca ccc tat cca agg gga agt gta act gct aac atg ctt tgt 1875 Glu Lys Pro Pro Tyr Pro Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys 605 610 615 gct ggc tta gaa agt ggg ggc aag gac agc tgc aga ggt gac agc gga 1923 Ala Gly Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly 620 625 630 ggg gca ctg gtg ttt cta gat agt gaa aca gag agg tgg ttt gtg gga 1971 Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly 635 640 645 650 gga ata gtg tcc tgg ggt tcc atg aat tgt ggg gaa gca ggt cag tat 2019 Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr 655 660 665 gga gtc tac aca aaa gtt att aac tat att ccc tgg atc gag aac ata 2067 Gly Val Tyr Thr Lys Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile 670 675 680 att agt gat ttt taa cttgcgtgtc tgcagtcaag gattcttcat ttttagaaat 2122 Ile Ser Asp Phe 685 gcctgtgaag accttggcag cgacgtggct cgagaagcat tcatcattac tgtggacatg 2182 gcagttgttg ctccacccaa aaaaacagac tccaggtgag gctgctgtca tttctccact 2242 tgccagttta attccagcct tacccattga ctcaagggga cataaaccac gagagtgaca 2302 gtcatctttg cccacccagt gtaatgtcac tgctcaaatt acatttcatt accttaaaaa 2362 gccagtctct tttcatactg gctgttggca tttctgtaaa ctgcctgtcc atgctctttg 2422 tttttaaact tgttcttatt gaaaaaaaaa aaaaaaaa 2460 <210> 5 <211> 686 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr 1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val 130 135 140 Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn 165 170 175 Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln Arg 180 185 190 Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys Leu 195 200 205 Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val Ile 210 215 220 Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr Leu 225 230 235 240 Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His Gly 245 250 255 Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser Asn 260 265 270 Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr Gly 275 280 285 Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Tyr Pro Met 290 295 300 Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val Gln Ala Lys Tyr Ile Leu 305 310 315 320 Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Leu Gln 325 330 335 Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly 340 345 350 Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser Ile Val Asp Cys Gly Pro 355 360 365 Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu Tyr Ile Thr Gly Pro Gly 370 375 380 Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe 385 390 395 400 Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly 405 410 415 Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Glu Pro 420 425 430 Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly Gly Arg Ile Tyr Gly Gly 435 440 445 Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Ile Leu Gly 450 455 460 Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn Trp Val Leu Thr 465 470 475 480 Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His Asp Ala Ser Ala Leu Asp 485 490 495 Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln Ala 500 505 510 Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Asp Ala Gly 515 520 525 Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn Lys Val Val Ile 530 535 540 Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Glu Ser 545 550 555 560 Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala Ser Gly Trp Gly Leu Thr 565 570 575 Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Tyr Val Asp Ile Pro Ile 580 585 590 Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr Glu Lys Pro Pro Tyr Pro 595 600 605 Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser Gly 610 615 620 Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu 625 630 635 640 Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly 645 650 655 Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val 660 665 670 Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser Asp Phe 675 680 685 <210> 6 <211> 671 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala 1 5 10 15 Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp 20 25 30 Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His 35 40 45 Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu 50 55 60 Ser Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser 85 90 95 Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe 100 105 110 Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln 115 120 125 Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His 130 135 140 Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg 145 150 155 160 Asn Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln 165 170 175 Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys 180 185 190 Leu Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val 195 200 205 Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr 210 215 220 Leu Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His 225 230 235 240 Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser 245 250 255 Asn Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr 260 265 270 Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Tyr Pro 275 280 285 Met Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val Gln Ala Lys Tyr Ile 290 295 300 Leu Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Leu 305 310 315 320 Gln Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp 325 330 335 Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser Ile Val Asp Cys Gly 340 345 350 Pro Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu Tyr Ile Thr Gly Pro 355 360 365 Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr 370 375 380 Phe Tyr Thr Met Lys Val Asn 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ctcagggtcg gggggtcccc aaggagtagc 540 cagggttcag ggacacctgg gagcaggggc caggcttggc caggagggag atcaggcctg 600 ggtcttgcct tcactccctg tgacacctga ccccacagct gagctcgggg gccaaggtgc 660 tggccacgct gtgcgggcag gagagcacag acacggagcg ggcccctggc aaggacactt 720 tctactcgct gggctccagc ctggacatta ccttccgctc cgactactcc aacgagaagc 780 cgttcacggg gttcgaggcc ttctatgcag ccgagggtga gccaagaggg gtcctgcaac 840 atctcagtct gcgcagctgg ctgtgggggt aactctgtct taggccaggc agccctgcct 900 tcagtttccc cacctttccc agggcagggg agaggcctct ggcctgacat catccacaat 960 gcaaagacca aaacagccgt gacctccatt cacatgggct gagtgccaac tctgagccag 1020 ggatctgagg acagcatcgc ctcaagtgac gcagggactg gccgggcgcg gcagctcacg 1080 cctgtaattc cagcactttg ggaggccgag gctggcttga taatttgagg gtcaggagtt 1140 caaggccagc cagggcaaca cggtgaaact ctatctccac taaaactaca aaaattagct 1200 gggcgtggtg gtgcgcacct ggaatcccag ctactaggga ggctgaggca ggagaattgc 1260 ttgaacctgc gaggtggagg ctgcagtgaa cagagattgc accactacac tccacctggg 1320 cgacagacta gactccgtct caaaaaacaa aaaacaaaaa ccacgcaggg ccgagggccc 1380 atttacaagc tgacaaagtg ggccctgcca gcgggagcgc tgcaggatgt ttgattttca 1440 gatcccagtc cctgcagaga ccaactgtgt gacctctggc aagtggctca atttctctgc 1500 tccttagaag ctgctgcaag ggttcagcgc tgtagccccg ccccctgggt ttgattgact 1560 cccctcatta gctgggtgac ctcggccgga cactgaaact cccactggtt taacagaggt 1620 gatgtttgca tctttctccc agcgctgctg ggagcttgca gcgaccctag gcctgtaagg 1680 tgattggccc ggcaccagtc ccgcacccta gacaggacct aggcctcctc tgaggtccac 1740 tctgaggtca tggatctcct gggaggagtc caggctggat cccgcctctt tccctcctga 1800 cggcctgcct ggccctgcct ctcccccaga cattgacgag tgccaggtgg ccccgggaga 1860 ggcgcccacc tgcgaccacc actgccacaa ccacctgggc ggtttctact gctcctgccg 1920 cgcaggctac gtcctgcacc gtaacaagcg cacctgctca ggtgagggag gctgcctggg 1980 ccccaacgca ccctctcctg ggatacccgg ggctcctcag ggccattgct gctctgccca 2040 ggggtgcgga gggcctgggc ctggacactg ggtgcttcta ggccctgctg cctccagctc 2100 cccttctcag ccctgcttcc cctctcagca gccaggctca tcagtgccac cctgccctag 2160 cactgagact aattctaaca tcccactgtg tacctggttc cacctgggct ctgggaaccc 2220 ctcatgtagc cacgggagag tcggggtatc taccctcgtt ccttggactg ggttcctgtt 2280 ccctgcactg ggggacgggc cagtgctctg gggcgtgggc agccccaccc tgtggcgctg 2340 accctgctcc cccgactcgg tttctcctct cggggtctct ccttgcctct ctgatctctc 2400 ttccagagca gagcctctag cctcccctgg agctccggct gcccagcagg tcagaagcca 2460 gagccaggct gctggcctca gctccgggtt gggctgagat gctgtgcccc aactcccatt 2520 cacccaccat ggacccaata ataaacctgg ccccacccca cctgctgccg cgtgtctctg 2580 gggtgggagg gtcgggaggc ggtggggcgc gctcctctct gcctaccctc ctcacagcct 2640 catgaacccc aggtctgtgg gagcctcctc catggggcca cacggtcctt ggcctcaccc 2700 cctgttttga agatggggca ctgaggccgg agaggggtaa ggcctcgctc gagtccaggt 2760 ccccagaggc tgagcccaga gtaatcttga accaccccca ttcagggtct ggcctggagg 2820 agcctgaccc acagaggaga caccctggga gatattcatt gaggggtaat ctggtccccc 2880 gcaaatccag gggtgattcc cactgcccca taggcacagc cacgtggaag aaggcaggca 2940 atgttggggc tcctcacttc ctagaggcct cacaactcaa atgcccccca ctgcagctgg 3000 gggtggggtg gtggtatggg atggggacca agccttcctt gaaggataga gcccagccca 3060 acaccccgcc ccgtggcagc agcatcacgt gttccagcga ggaaggagag caccagactc 3120 agtcatgatc actgttgcct tgaacttcca agaacagccc cagggcaagg gtcaaaacag 3180 gggaaagggg gtgatgagag atccttcttc cggatgttcc tccaggaacc agggggctgg 3240 ctggtcttgg ctgggttcgg gtaggagacc catgatgaat aaacttggga atcactgggg 3300 tggctgtaag ggaatttagg ggagctccga aggggccctt aggctcgagg agatgctcct 3360 ctcttttccc gaattcccag ggacccagga gagtgtccct tcttcctctt cctgtgtgtc 3420 catccacccc cgccccccgc cctggcagag ctggtggaac tcagtgctct agcccctacc 3480 ctggggttgc gactctggct caggacacca ccacgctccc tgggggtgtg agtgagggcc 3540 tgtgcgctcc atcccgagtg ctgcctgttt cagctaaagc ctcaaagcaa gagaaacccc 3600 ctctctaagc ggcccctcag ccatcgggtg ggtcgtttgg tttctgggta ggcctcaggg 3660 gctggccacc tgcagggccc agcccaaccc agggatgcag atgtcccagc cacatccctg 3720 tcccagtttc ctgctcccca aggcatccac cctgctgttg gtgcgagggc tgatagaggg 3780 cacgccaagt cactcccctg cccttccctc cttccagccc tgtgctccgg ccaggtcttc 3840 acccagaggt ctggggagct cagcagccct gaatacccac ggccgtatcc caaactctcc 3900 agttgcactt acagcatcag cctggaggag gggttcagtg tcattctgga ctttgtggag 3960 tccttcgatg tggagacaca ccctgaaacc ctgtgtccct acgactttct caaggtctgg 4020 ctcctgggcc cctcatcttg tcccagatcc tcccccttca gcccagctgc accccctact 4080 tcctgcagca tggcccccac cacgttcccg tcaccctcgg tgaccccacc tcttcaggtg 4140 ctctatggag gtcaaggctg gggcttcgag tacaagtgtg ggaggcagag tggggagggg 4200 caccccaatc catggcctgg gttggcctca ttggctgtcc ctgaaatgct gaggaggtgg 4260 gttacttccc tccgcccagg ccagacccag gcagctgctc cccagctttc atgagcttct 4320 ttctcagatt caaacagaca gagaagaaca tggcccattc tgtgggaaga cattgcccca 4380 caggattgaa acaaaaagca acacggtgac catcaccttt gtcacagatg aatcaggaga 4440 ccacacaggc tggaagatcc actacacgag cacagtgagc aagtgggctc agatccttgg 4500 tggaagcgca gagctgcctc tctctggagt gcaaggagct gtagagtgta gggctcttct 4560 gggcaggact aggaagggac accaggttta gtggtgctga ggtctgaggc agcagcttct 4620 aaggggaagc acccgtgccc tcctcagcag cacccagcat cttcaccact cattcttcaa 4680 ccacccattc acccatcact catcttttac ccacccaccc tttgccactc atccttctgt 4740 ccctcatcct tccaaccatt catcaatcac ccacccatcc atcctttgcc acacaaccat 4800 ccacccattc ttctacctac ccatcctatc catccatcct tctatcagca tccttctacc 4860 acccatcctt cgttcggtca tccatcatca tccatccatc 4900 <210> 8 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr 1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala 130 135 <210> 9 <211> 181 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu 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240 Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His Gly 245 250 255 Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser Asn 260 265 270 Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr Gly 275 280 285 Trp Lys Ile His Tyr 290 <210> 11 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys 1 5 10 15 Asp His His Cys His Asn His Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg 20 25 30 Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn Lys 35 40 <210> 12 <211> 242 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ile Tyr Gly Gly Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Leu Ile Leu Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn 20 25 30 Trp Val Leu Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His Asp Ala 35 40 45 Ser Ala Leu Asp Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser Pro His 50 55 60 Tyr Thr Gln Ala Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr 65 70 75 80 His Asp Ala Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn 85 90 95 Lys Val Val Ile Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys 100 105 110 Glu Ala Glu Ser Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala Ser Gly 115 120 125 Trp Gly Leu Thr Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Tyr Val 130 135 140 Asp Ile Pro Ile Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr Glu Lys 145 150 155 160 Pro Pro Tyr Pro Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly 165 170 175 Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala 180 185 190 Leu Val Phe Leu Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile 195 200 205 Val Ser Trp Gly Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr Gly Val 210 215 220 Tyr Thr Lys Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser 225 230 235 240 Asp Phe <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ala Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu 1 5 10 15 <210> 15 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp 1 5 10 15 Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln 35 40 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn 1 5 <210> 17 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr 1 5 10 15 Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe 20 25 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly 1 5 <210> 19 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys 1 5 10 15 Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val 20 25 <210> 20 <211> 960 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (51)..(797) <400> 20 attaactgag attaaccttc cctgagtttt ctcacaccaa ggtgaggacc atg tcc 56 Met Ser 1 ctg ttt cca tca ctc cct ctc ctt ctc ctg agt atg gtg gca gcg tct 104 Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Val Ala Ala Ser 5 10 15 tac tca gaa act gtg acc tgt gag gat gcc caa aag acc tgc cct gca 152 Tyr Ser Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys Pro Ala 20 25 30 gtg att gcc tgt agc tct cca ggc atc aac ggc ttc cca ggc aaa gat 200 Val Ile Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly Lys Asp 35 40 45 50 ggg cgt gat ggc acc aag gga gaa aag ggg gaa cca ggc caa ggg ctc 248 Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln Gly Leu 55 60 65 aga ggc tta cag ggc ccc cct gga aag ttg ggg cct cca gga aat cca 296 Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro 70 75 80 ggg cct tct ggg tca cca gga cca aag ggc caa aaa gga gac cct gga 344 Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro Gly 85 90 95 aaa agt ccg gat ggt gat agt agc ctg gct gcc tca gaa aga aaa gct 392 Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys Ala 100 105 110 ctg caa aca gaa atg gca cgt atc aaa aag tgg ctc acc ttc tct ctg 440 Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser Leu 115 120 125 130 ggc aaa caa gtt ggg aac aag ttc ttc ctg acc aat ggt gaa ata atg 488 Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met 135 140 145 acc ttt gaa aaa gtg aag gcc ttg tgt gtc aag ttc cag gcc tct gtg 536 Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser Val 150 155 160 gcc acc ccc agg aat gct gca gag aat gga gcc att cag aat ctc atc 584 Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile 165 170 175 aag gag gaa gcc ttc ctg ggc atc act gat gag aag aca gaa ggg cag 632 Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln 180 185 190 ttt gtg gat ctg aca gga aat aga ctg acc tac aca aac tgg aac gag 680 Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu 195 200 205 210 ggt gaa ccc aac aat gct ggt tct gat gaa gat tgt gta ttg cta ctg 728 Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu 215 220 225 aaa aat ggc cag tgg aat gac gtc ccc tgc tcc acc tcc cat ctg gcc 776 Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu Ala 230 235 240 gtc tgt gag ttc cct atc tga agggtcatat cactcaggcc ctccttgtct 827 Val Cys Glu Phe Pro Ile 245 ttttactgca acccacaggc ccacagtatg cttgaaaaga taaattatat caatttcctc 887 atatccagta ttgttccttt tgtgggcaat cactaaaaat gatcactaac agcaccaaca 947 aagcaataat agt 960 <210> 21 <211> 248 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Ser Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Val Ala 1 5 10 15 Ala Ser Tyr Ser Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys 20 25 30 Pro Ala Val Ile Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly 35 40 45 Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly 65 70 75 80 Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp 85 90 95 Pro Gly Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg 100 105 110 Lys Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe 115 120 125 Ser Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu 130 135 140 Ile Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala 145 150 155 160 Ser Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn 165 170 175 Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu 180 185 190 Gly Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp 195 200 205 Asn Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu 210 215 220 Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His 225 230 235 240 Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile 245 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Wherein X at position 1 represents hydroxyproline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Wherein X at position 4 represents hydrophobic residue <400> 22 Xaa Gly Lys Xaa Gly Pro 1 5 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Wherein X represents hydroxyproline <400> 23 Xaa Gly Lys Leu Gly 1 5 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(15) <223> Wherein X at positions 9 and 15 represents hydroxyproline <400> 24 Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly Lys Leu Gly Pro Xaa Gly 1 5 10 15 <210> 25 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(27) <223> Wherein X at positions 3, 6, 15, 21, 24, 27 represents hydroxyproline <400> 25 Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly 1 5 10 15 Lys Leu Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa 20 25 <210> 26 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 26 Gly Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly 1 5 10 15 Gln Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly Lys Leu Gly Pro Xaa 20 25 30 Gly Asn Xaa Gly Pro Ser Gly Ser Xaa Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly 35 40 45 Asp Xaa Gly Lys Ser 50 <210> 27 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(33) <223> Wherein X at positions 3, 6, 12, 18, 21, 30, 33 represents hydroxyproline <400> 27 Gly Ala Xaa Gly Ser Xaa Gly Glu Lys Gly Ala Xaa Gly Pro Gln Gly 1 5 10 15 Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Lys Met Gly Pro Lys Gly Glu Xaa Gly Asp 20 25 30 Xaa <210> 28 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(45) <223> Wherein X at positions 3, 6, 9, 27, 30, 36, 42, 45 represents hydroxyproline <400> 28 Gly Cys Xaa Gly Leu Xaa Gly Ala Xaa Gly Asp Lys Gly Glu Ala Gly 1 5 10 15 Thr Asn Gly Lys Arg Gly Glu Arg Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Lys 20 25 30 Ala Gly Pro Xaa Gly Pro Asn Gly Ala Xaa Gly Glu Xaa 35 40 45 <210> 29 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 Leu Gln Arg Ala Leu Glu Ile Leu Pro Asn Arg Val Thr Ile Lys Ala 1 5 10 15 Asn Arg Pro Phe Leu Val Phe Ile 20 <210> 30 <211> 559 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 atgaggctgc tgaccctcct gggccttctg tgtggctcgg tggccacccc cttgggcccg 60 aagtggcctg aacctgtgtt cgggcgcctg gcatcccccg gctttccagg ggagtatgcc 120 aatgaccagg agcggcgctg gaccctgact gcaccccccg gctaccgcct gcgcctctac 180 ttcacccact tcgacctgga gctctcccac ctctgcgagt acgacttcgt caagctgagc 240 tcgggggcca aggtgctggc cacgctgtgc gggcaggaga gcacagacac ggagcgggcc 300 cctggcaagg acactttcta ctcgctgggc tccagcctgg acattacctt ccgctccgac 360 tactccaacg agaagccgtt cacggggttc gaggccttct atgcagccga ggacattgac 420 gagtgccagg tggccccggg agaggcgccc acctgcgacc accactgcca caaccacctg 480 ggcggtttct actgctcctg ccgcgcaggc tacgtcctgc accgtaacaa gcgcacctgc 540 tcagccctgt gctccggcc 559 <210> 31 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 cgggcacacc atgaggctgc tgaccctcct gggc 34 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 32 gacattacct tccgctccga ctccaacgag aag 33 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 33 agcagccctg aatacccacg gccgtatccc aaa 33 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 34 cgggatccat gaggctgctg accctc 26 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 35 ggaattccta ggctgcata 19 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 36 ggaattccta cagggcgct 19 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 37 ggaattccta gtagtggat 19 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 38 tgcggccgct gtaggtgctg tcttt 25 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 39 ggaattcact cgttattctc gga 23 <210> 40 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 tccgagaata acgagtg 17 <210> 41 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 41 cattgaaagc tttggggtag aagttgttc 29 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 42 cgcggccgca gctgctcaga gtgtaga 27 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 43 cggtaagctt cactggctca gggaaata 28 <210> 44 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 44 aagaagcttg ccgccaccat ggattggctg tggaact 37 <210> 45 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 45 cgggatcctc aaactttctt gtccaccttg g 31 <210> 46 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 aagaaagctt gccgccacca tgttctcact agctct 36 <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 47 cgggatcctt ctccctctaa cactct 26 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 48 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 1 5 <210> 49 <211> 4960 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 49 ccggacgtgg tggcgcatgc ctgtaatccc agctactcgg gaggctgagg caggagaatt 60 gctcgaaccc cggaggcaga ggtttggtgg ctcacacctg taatcccagc actttgcgag 120 gctgaggcag gtgcatcgct ttggctcagg agttcaagac cagcctgggc aacacaggga 180 gacccccatc tctacaaaaa acaaaaacaa atataaaggg gataaaaaaa aaaaaaagac 240 aagacatgaa tccatgagga cagagtgtgg aagaggaagc agcagcctca aagttctgga 300 agctggaaga acagataaac aggtgtgaaa taactgcctg gaaagcaact tctttttttt 360 tttttttttt tttgaggtgg agtctcactc tgtcgtccag gctggagtgc agtggtgcga 420 tctcggatca ctgcaacctc cgcctcccag gctcaagcaa ttctcctgcc tcagcctccc 480 gagtagctgg gattataagt gcgcgctgcc acacctggat gatttttgta tttttagtag 540 agatgggatt tcaccatgtt ggtcaggctg gtctcaaact cccaacctcg tgatccaccc 600 accttggcct cccaaagtgc tgggattaca ggtataagcc accgagccca gccaaaagcg 660 acttctaagc ctgcaaggga atcgggaatt ggtggcacca ggtccttctg acagggttta 720 agaaattagc cagcctgagg ctgggcacgg tggctcacac ctgtaatccc agcactttgg 780 gaggctaagg caggtggatc acctgagggc aggagttcaa gaccagcctg accaacatgg 840 agaaacccca tccctaccaa aaataaaaaa ttagccaggt gtggtggtgc tcgcctgtaa 900 tcccagctac ttgggaggct gaggtgggag gattgcttga acacaggaag tagaggctgc 960 agtgagctat gattgcagca ctgcactgaa gccggggcaa cagaacaaga tccaaaaaaa 1020 agggaggggt gaggggcaga gccaggattt gtttccaggc tgttgttacc taggtccgac 1080 tcctggctcc cagagcagcc tgtcctgcct gcctggaact ctgagcaggc tggagtcatg 1140 gagtcgattc ccagaatccc agagtcaggg aggctggggg caggggcagg tcactggaca 1200 aacagatcaa aggtgagacc agcgtagggc tgcagaccag gccaggccag ctggacgggc 1260 acaccatgag gtaggtgggc gcccacagcc tccctgcagg gtgtggggtg ggagcacagg 1320 cctgggccct caccgcccct gccctgccca taggctgctg accctcctgg gccttctgtg 1380 tggctcggtg gccaccccct tgggcccgaa gtggcctgaa cctgtgttcg ggcgcctggc 1440 atcccccggc tttccagggg agtatgccaa tgaccaggag cggcgctgga ccctgactgc 1500 accccccggc taccgcctgc gcctctactt cacccacttc gacctggagc tctcccacct 1560 ctgcgagtac gacttcgtca aggtgccgtc aggacgggag ggctggggtt tctcagggtc 1620 ggggggtccc caaggagtag ccagggttca gggacacctg ggagcagggg ccaggcttgg 1680 ccaggaggga gatcaggcct gggtcttgcc ttcactccct gtgacacctg accccacagc 1740 tgagctcggg ggccaaggtg ctggccacgc tgtgcgggca ggagagcaca gacacggagc 1800 gggcccctgg caaggacact ttctactcgc tgggctccag cctggacatt accttccgct 1860 ccgactactc caacgagaag ccgttcacgg ggttcgaggc cttctatgca gccgagggtg 1920 agccaagagg ggtcctgcaa catctcagtc tgcgcagctg gctgtggggg taactctgtc 1980 ttaggccagg cagccctgcc ttcagtttcc ccacctttcc cagggcaggg gagaggcctc 2040 tggcctgaca tcatccacaa tgcaaagacc aaaacagccg tgacctccat tcacatgggc 2100 tgagtgccaa ctctgagcca gggatctgag gacagcatcg cctcaagtga cgcagggact 2160 ggccgggcgc agcagctcac gcctgtaatt ccagcacttt gggaggccga ggctggctga 2220 tcatttgagg tcaggagttc aaggccagcc agggcaacac ggtgaaactc tatctccact 2280 aaaactacaa aaattagctg ggcgtggtgg tgcgcacctg gaatcccagc tactagggag 2340 gctgaggcag gagaattgct tgaacctgcg aggtggaggc tgcagtgaac agagattgca 2400 ccactacact ccagcctggg cgacagagct agactccgtc tcaaaaaaca aaaaacaaaa 2460 acgacgcagg ggccgagggc cccatttaca gctgacaaag tggggccctg ccagcgggag 2520 cgctgccagg atgtttgatt tcagatccca gtccctgcag agaccaactg tgtgacctct 2580 ggcaagtggc tcaatttctc tgctccttag gaagctgctg caagggttca gcgctgtagc 2640 cccgccccct gggtttgatt gactcccctc attagctggg tgacctcggg ccggacactg 2700 aaactcccac tggtttaaca gaggtgatgt ttgcatcttt ctcccagcgc tgctgggagc 2760 ttgcagcgac cctaggcctg taaggtgatt ggcccggcac cagtcccgca ccctagacag 2820 gacgaggcct cctctgaggt ccactctgag gtcatggatc tcctgggagg agtccaggct 2880 ggatcccgcc tctttccctc ctgacggcct gcctggccct gcctctcccc cagacattga 2940 cgagtgccag gtggccccgg gagaggcgcc cacctgcgac caccactgcc acaaccacct 3000 gggcggtttc tactgctcct gccgcgcagg ctacgtcctg caccgtaaca agcgcacctg 3060 ctcagccctg tgctccggcc aggtcttcac ccagaggtct ggggagctca gcagccctga 3120 atacccacgg ccgtatccca aactctccag ttgcacttac agcatcagcc tggaggaggg 3180 gttcagtgtc attctggact ttgtggagtc cttcgatgtg gagacacacc ctgaaaccct 3240 gtgtccctac gactttctca agattcaaac agacagagaa gaacatggcc cattctgtgg 3300 gaagacattg ccccacagga ttgaaacaaa aagcaacacg gtgaccatca cctttgtcac 3360 agatgaatca ggagaccaca caggctggaa gatccactac acgagcacag cgcacgcttg 3420 cccttatccg atggcgccac ctaatggcca cgtttcacct gtgcaagcca aatacatcct 3480 gaaagacagc ttctccatct tttgcgagac tggctatgag cttctgcaag gtcacttgcc 3540 cctgaaatcc tttactgcag tttgtcagaa agatggatct tgggaccggc caatgcccgc 3600 gtgcagcatt gttgactgtg gccctcctga tgatctaccc agtggccgag tggagtacat 3660 cacaggtcct ggagtgacca cctacaaagc tgtgattcag tacagctgtg aagagacctt 3720 ctacacaatg aaagtgaatg atggtaaata tgtgtgtgag gctgatggat tctggacgag 3780 ctccaaagga gaaaaatcac tcccagtctg tgagcctgtt tgtggactat cagcccgcac 3840 aacaggaggg cgtatatatg gagggcaaaa ggcaaaacct ggtgattttc cttggcaagt 3900 cctgatatta ggtggaacca cagcagcagg tgcactttta tatgacaact gggtcctaac 3960 agctgctcat gccgtctatg agcaaaaaca tgatgcatcc gccctggaca ttcgaatggg 4020 caccctgaaa agactatcac ctcattatac acaagcctgg tctgaagctg tttttataca 4080 tgaaggttat actcatgatg ctggctttga caatgacata gcactgatta aattgaataa 4140 caaagttgta atcaatagca acatcacgcc tatttgtctg ccaagaaaag aagctgaatc 4200 ctttatgagg acagatgaca ttggaactgc atctggatgg ggattaaccc aaaggggttt 4260 tcttgctaga aatctaatgt atgtcgacat accgattgtt gaccatcaaa aatgtactgc 4320 tgcatatgaa aagccaccct atccaagggg aagtgtaact gctaacatgc tttgtgctgg 4380 cttagaaagt gggggcaagg acagctgcag aggtgacagc ggaggggcac tggtgtttct 4440 agatagtgaa acagagaggt ggtttgtggg aggaatagtg tcctggggtt ccatgaattg 4500 tggggaagca ggtcagtatg gagtctacac aaaagttatt aactatattc cctggatcga 4560 gaacataatt agtgattttt aacttgcgtg tctgcagtca aggattcttc atttttagaa 4620 atgcctgtga agaccttggc agcgacgtgg ctcgagaagc attcatcatt actgtggaca 4680 tggcagttgt tgctccaccc aaaaaaacag actccaggtg aggctgctgt catttctcca 4740 cttgccagtt taattccagc cttacccatt gactcaaggg gacataaacc acgagagtga 4800 cagtcatctt tgcccaccca gtgtaatgtc actgctcaaa ttacatttca ttaccttaaa 4860 aagccagtct cttttcatac tggctgttgg catttctgta aactgcctgt ccatgctctt 4920 tgtttttaaa cttgttctta ttgaaaaaaa aaaaaaaaaa 4960 <210> 50 <211> 2090 <212> DNA <213> Murine <220> <221> CDS <222> (33)..(2090) <400> 50 ggcgctggac tgcagagcta tggtggcaca cc atg agg cta ctc atc ttc ctg 53 Met Arg Leu Leu Ile Phe Leu 1 5 ggt ctg ctg tgg agt ttg gtg gcc aca ctt ctg ggt tca aag tgg cct 101 Gly Leu Leu Trp Ser Leu Val Ala Thr Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro 10 15 20 gaa cct gta ttc ggg cgc ctg gtg tcc cct ggc ttc cca gag aag tat 149 Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val Ser Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr 25 30 35 gct gac cat caa gat cga tcc tgg aca ctg act gca ccc cct ggc tac 197 Ala Asp His Gln Asp Arg Ser Trp Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr 40 45 50 55 cgc ctg cgc ctc tac ttc acc cac ttt gac ctg gaa ctc tct tac cgc 245 Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp Leu Glu Leu Ser Tyr Arg 60 65 70 tgc gag tat gac ttt gtc aag ttg agc tca ggg acc aag gtg ctg gcc 293 Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala 75 80 85 aca ctg tgt ggg cag gag agt aca gac act gag cag gca cct ggc aat 341 Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp Thr Glu Gln Ala Pro Gly Asn 90 95 100 gac acc ttc tac tca ctg ggt ccc agc cta aag gtc acc ttc cac tcc 389 Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser 105 110 115 gac tac tcc aat gag aag ccg ttc aca ggg ttt gag gcc ttc tat gca 437 Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala 120 125 130 135 gcg gag gat gtg gat gaa tgc aga gtg tct ctg gga gac tca gtc cct 485 Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg Val Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro 140 145 150 tgt gac cat tat tgc cac aac tac ttg ggc ggc tac tat tgc tcc tgc 533 Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys 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Thr Ile Thr Phe Ala 265 270 275 act gac gag tcg ggg aac cac aca ggc tgg aag ata cac tac aca agc 917 Thr Asp Glu Ser Gly Asn His Thr Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser 280 285 290 295 aca gca cgg ccc tgc cct gat cca acg gcg cca cct aat ggc agc att 965 Thr Ala Arg Pro Cys Pro Asp Pro Thr Ala Pro Pro Asn Gly Ser Ile 300 305 310 tca cct gtg caa gcc acg tat gtc ctg aag gac agg ttt tct gtc ttc 1013 Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr Val Leu Lys Asp Arg Phe Ser Val Phe 315 320 325 tgc aag aca ggc ttc gag ctt ctg caa ggt tct gtc ccc ctg aaa tca 1061 Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser 330 335 340 ttc act gct gtc tgt cag aaa gat gga tct tgg gac cgg ccg atg cca 1109 Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro 345 350 355 gag tgc agc att att gat tgt ggc cct ccc gat gac cta ccc aat ggc 1157 Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly 360 365 370 375 cat gtg gac tat atc aca ggc cct caa gtg act acc tac aaa gct gtg 1205 His Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro Gln Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val 380 385 390 att cag tac agc tgt gaa gag act ttc tac aca atg agc agc aat ggt 1253 Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly 395 400 405 aaa tat gtg tgt gag gct gat gga ttc tgg acg agc tcc aaa gga gaa 1301 Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu 410 415 420 aaa ctc ccc ccg gtt tgt gag cct gtt tgt ggg ctg tcc aca cac act 1349 Lys Leu Pro Pro Val Cys Glu Pro Val Cys Gly Leu Ser Thr His Thr 425 430 435 ata gga gga cgc ata gtt gga ggg cag cct gca aag cct ggt gac ttt 1397 Ile Gly Gly Arg Ile Val Gly Gly Gln Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe 440 445 450 455 cct tgg caa gtc ttg ttg ctg ggt caa act aca gca gca gca ggt gca 1445 Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Gly Gln Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala 460 465 470 ctt ata cat gac aat tgg gtc cta aca gcc gct cat gct gta tat gag 1493 Leu Ile His Asp Asn Trp Val Leu Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu 475 480 485 aaa aga atg gca gcg tcc tcc ctg aac atc cga atg ggc atc ctc aaa 1541 Lys Arg Met Ala Ala Ser Ser Leu Asn Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys 490 495 500 agg ctc tca cct cat tac act caa gcc tgg ccc gag gaa atc ttt ata 1589 Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln Ala Trp Pro Glu Glu Ile Phe Ile 505 510 515 cat gaa ggc tac act cac ggt gct ggt ttt gac aat gat ata gca ttg 1637 His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu 520 525 530 535 att aaa ctc aag aac aaa gtc aca atc aac gga agc atc atg cct gtt 1685 Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr Ile Asn Gly Ser Ile Met Pro Val 540 545 550 tgc cta ccg cga aaa gaa gct gca tcc tta atg aga aca gac ttc act 1733 Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala Ser Leu Met Arg Thr Asp Phe Thr 555 560 565 gga act gtg gct ggc tgg ggg tta acc cag aag ggg ctt ctt gct aga 1781 Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu Thr Gln Lys Gly Leu Leu Ala Arg 570 575 580 aac cta atg ttt gtg gac ata cca att gct gac cac caa aaa tgt acc 1829 Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro Ile Ala Asp His Gln Lys Cys Thr 585 590 595 acc gtg tat gaa aag ctc tat cca gga gta aga gta agc gct aac atg 1877 Thr Val Tyr Glu Lys Leu Tyr Pro Gly Val Arg Val Ser Ala Asn Met 600 605 610 615 ctc tgt gct ggc tta gag act ggt ggc aag gac agc tgc aga ggt gac 1925 Leu Cys Ala Gly Leu Glu Thr Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp 620 625 630 agt ggg ggg gca tta gtg ttt cta gat aat gag aca cag cga tgg ttt 1973 Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe 635 640 645 gtg gga gga ata gtt tcc tgg ggt tcc att aat tgt ggg gcg gca ggc 2021 Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Ile Asn Cys Gly Ala Ala Gly 650 655 660 cag tat ggg gtc tac aca aaa gtc atc aac tat att ccc tgg aat gag 2069 Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Asn Glu 665 670 675 aac ata ata agt aat ttc taa 2090 Asn Ile Ile Ser Asn Phe 680 685 <210> 51 <211> 685 <212> PRT <213> Murine <400> 51 Met Arg Leu Leu Ile Phe Leu Gly Leu Leu Trp Ser Leu Val Ala Thr 1 5 10 15 Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr Ala Asp His Gln Asp Arg Ser Trp 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gac ttt gtc aag 243 His Phe Asn Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys 65 70 75 ttg acc tca ggg acc aag gtg cta gcc acg ctg tgt ggg cag gag agt 291 Leu Thr Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser 80 85 90 aca gat act gag cgg gca cct ggc aat gac acc ttc tac tca ctg ggt 339 Thr Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly 95 100 105 110 ccc agc cta aag gtc acc ttc cac tcc gac tac tcc aat gag aag cca 387 Pro Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro 115 120 125 ttc aca gga ttt gag gcc ttc tat gca gcg gag gat gtg gat gaa tgc 435 Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys 130 135 140 aga aca tcc ctg gga gac tca gtc cct tgt gac cat tat tgc cac aac 483 Arg Thr Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn 145 150 155 tac ctg ggc ggc tac tac tgc tcc tgc cga gtg ggc tac att ctg cac 531 Tyr Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Val Gly Tyr Ile Leu His 160 165 170 cag aac aag cat acc tgc tca gcc ctt tgt tca ggc cag gtg ttc act 579 Gln Asn Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr 175 180 185 190 ggg agg tct ggc ttt ctc agt agc cct gag tac cca cag cca tac ccc 627 Gly Arg Ser Gly Phe Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro 195 200 205 aaa ctc tcc agc tgc gcc tac aac atc cgc ctg gag gaa ggc ttc agt 675 Lys Leu Ser Ser Cys Ala Tyr Asn Ile Arg Leu Glu Glu Gly Phe Ser 210 215 220 atc acc ctg gac ttc gtg gag tcc ttt gat gtg gag atg cac cct gaa 723 Ile Thr Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Met His Pro Glu 225 230 235 gcc cag tgc ccc tac gac tcc ctc aag att caa aca gac aag agg gaa 771 Ala Gln Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Arg Glu 240 245 250 tac ggc ccg ttt tgt ggg aag acg ctg ccc ccc agg att gaa act gac 819 Tyr Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp 255 260 265 270 agc aac aag gtg acc att acc ttt acc acc gac gag tca ggg aac cac 867 Ser Asn Lys Val Thr Ile Thr Phe Thr Thr Asp Glu Ser Gly Asn His 275 280 285 aca ggc tgg aag ata cac tac aca agc aca gca cag ccc tgc cct gat 915 Thr Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Asp 290 295 300 cca acg gcg cca cct aat ggt cac att tca cct gtg caa gcc acg tat 963 Pro Thr Ala Pro Pro Asn Gly His Ile Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr 305 310 315 gtc ctg aag gac agc ttt tct gtc ttc tgc aag act ggc ttc gag ctt 1011 Val Leu Lys Asp Ser Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu 320 325 330 ctg caa ggt tct gtc ccc ctg aag tca ttc act gct gtc tgt cag aaa 1059 Leu Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys 335 340 345 350 gat gga tct tgg gac cgg ccg ata cca gag tgc agc att att gac tgt 1107 Asp Gly Ser Trp Asp Arg Pro Ile Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys 355 360 365 ggc cct ccc gat gac cta ccc aat ggc cac gtg gac tat atc aca ggc 1155 Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly 370 375 380 cct gaa gtg acc acc tac aaa gct gtg att cag tac agc tgt gaa gag 1203 Pro Glu Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu 385 390 395 act ttc tac aca atg agc agc aat ggt aaa tat gtg tgt gag gct gat 1251 Thr Phe Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp 400 405 410 gga ttc tgg acg agc tcc aaa gga gaa aaa tcc ctc ccg gtt tgc aag 1299 Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Lys 415 420 425 430 cct gtc tgt gga ctg tcc aca cac act tca gga ggc cgt ata att gga 1347 Pro Val Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Arg Ile Ile Gly 435 440 445 gga cag cct gca aag cct ggt gac ttt cct tgg caa gtc ttg tta ctg 1395 Gly Gln Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu 450 455 460 ggt gaa act aca gca gca ggt gct ctt ata cat gac gac tgg gtc cta 1443 Gly Glu Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asp Trp Val Leu 465 470 475 aca gcg gct cat gct gta tat ggg aaa aca gag gcg atg tcc tcc ctg 1491 Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Gly Lys Thr Glu Ala Met Ser Ser Leu 480 485 490 gac atc cgc atg ggc atc ctc aaa agg ctc tcc ctc att tac act caa 1539 Asp Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Thr Gln 495 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Leu Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Arg Ile Ile Gly Gly 420 425 430 Gln Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Gly 435 440 445 Glu Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asp Trp Val Leu Thr 450 455 460 Ala Ala His Ala Val Tyr Gly Lys Thr Glu Ala Met Ser Ser Leu Asp 465 470 475 480 Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Thr Gln Ala 485 490 495 Trp Pro Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala Gly 500 505 510 Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr Ile 515 520 525 Asn Arg Asn Ile Met Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala Ser 530 535 540 Leu Met Lys Thr Asp Phe Val Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu Thr 545 550 555 560 Gln Lys Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro Ile 565 570 575 Val Asp His Gln Lys Cys Ala Thr Ala Tyr Thr Lys Gln Pro Tyr Pro 580 585 590 Gly Ala Lys Val Thr Val Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Asp Arg Gly 595 600 605 Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu 610 615 620 Asp Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly 625 630 635 640 Ser Ile Asn Cys Gly Gly Ser Glu Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val 645 650 655 Thr Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Asn Phe 660 665 670 <210> 56 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 56 atgaggctgc tgaccctcct gggccttc 28 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 57 gtgcccctcc tgcgtcacct ctg 23 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 58 cagaggtgac gcaggagggg cac 23 <210> 59 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 59 ttaaaatcac taattatgtt ctcgatc 27 <210> 60 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine <400> 60 atgaggctac tcatcttcct gg 22 <210> 61 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine <400> 61 ctgcagaggt gacgcagggg ggg 23 <210> 62 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine <400> 62 ccccccctgc gtcacctctg cag 23 <210> 63 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine <400> 63 ttagaaatta cttattatgt tctcaatcc 29 <210> 64 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat <400> 64 gaggtgacgc aggaggggca ttagtgttt 29 <210> 65 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat <400> 65 ctagaaacac taatgcccct cctgcgtcac ctctgca 37 <210> 66 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 66 caggtcacct tgaaggagtc tggtcctgtg ctggtgaaac ccacagagac cctcacgctg 60 acctgcaccg tctctgggtt ctcactcagc aggggtaaaa tgggtgtgag ctggatccgt 120 cagcccccag ggaaggccct ggagtggctt gcacacattt tttcgagtga cgaaaaatcc 180 tacaggacat cgctgaagag caggctcacc atctccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240 gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca cgtattactg tgcacggata 300 cgacgtggag gaattgacta ctggggccag ggaaccctgg tcactgtctc ctca 354 <210> 67 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 67 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Gly 20 25 30 Lys Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Ser Asp Glu Lys Ser Tyr Arg Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ile Arg Arg Gly Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 68 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 68 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Phe Gly Val Pro Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 69 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (246)..(246) <223> n is a, c, g, or t <400> 69 cagccagtgc tgactcagcc cccctcactg tccgtgtccc caggacagac agccagcatc 60 acctgctctg gagagaaatt gggggataaa tatgcttact ggtatcagca gaagccaggc 120 cagtcccctg tgttggtcat gtatcaagat aaacagcggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240 gatgangctg actattactg tcaggcgtgg gacagcagca ctgcggtatt cggcggaggg 300 accaagctga ccgtccta 318 <210> 70 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 70 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Glu Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Met Tyr 35 40 45 Gln Asp Lys Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 71 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 71 Ser Tyr Glu Leu Ile Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ala Gly Asp Asn Leu Gly Lys Lys Arg Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Arg Gly Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ile Ala Thr Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly 100 105 110 Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu 115 120

Claims

MASP-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 MASP-2 억제 단클론성 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함하는, 지속성의, 조혈모세포 이식과 관련된 혈전성 미세혈관증(HSCT-TMA: thrombotic microangiopathy associated with hematopoietic stem cell transplant)를 앓고 있는 인간 대상체를 치료하기 위한 약학적 조성물로서,
상기 MASP-2 억제 단클론성 항체는
(a) i) 서열 번호:67의 아미노산 서열 31-35의 CDR-H1,
ii) 서열 번호:67의 아미노산 서열 50-65의 CDR-H2, 및
iii) 서열 번호:67의 아미노산 서열 95-102의 CDR-H3
를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) i) 서열 번호:70의 아미노산 서열 24-34의 CDR-L1,
ii) 서열 번호:70의 아미노산 서열 50-56의 CDR-L2, 및
iii) 서열 번호:70의 아미노산 서열 89-97의 CDR-L3
를 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하고,
상기 약학적 조성물은 적어도 3주의 기간 동안 적어도 매주 투여를 위해 적어도 4mg/kg의 용량으로 투여하기 위한 양의 상기 MASP-2 억제 단클론성 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함하고, 상기 대상체는 면역억제제의 감소 또는 중단에도 불구하고 지속되는 혈전성 미세혈관증(TMA)이 있거나, 상기 대상체는 이식 후 적어도 30일간 지속되는 TMA가 있고, 상기 투여가 지속성의 HSCT-TMA와 관련된 임상적 파라미터인 (i) 혈소판 수준 증가; (ii) 합토글로빈(haptoglobin) 증가; (iii) 락테이트 데하이드로게나제(LDH: lactate dehydrogenase) 감소; 및 (iv) 크레아티닌(creatinine) 감소 중 적어도 하나 이상을 개선시키는, 약학적 조성물.
제1 항에 있어서, 상기 MASP-2 억제 단클론성 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 재조합 항체, 감소된 효과기 기능을 갖는 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 및 인간 항체로 구성되는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1 항에 있어서, 상기 MASP-2 억제 단클론성 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 실질적으로 고전적 경로를 억제하지 않는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1 항에 있어서, 상기 MASP-2 억제 단클론성 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 90% 인간 혈청에서 30 nM 이하의 IC₅₀으로 C3b 침착을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 전신 전달용으로 제형화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1 항에 있어서, 상기 대상체는 인간화 항-C5 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로의 처리를 이전에 받았거나, 또는 현재 받고 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1 항에 있어서, 상기 MASP-2 억제 단클론성 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:67에서 제시된 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:70에서 제시된 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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